CN1043134A - 肽类抗凝剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到肽衍生物，其为有效的抗凝剂。
Description
本发明涉及到新的肽，其可用作抗凝剂。
抗凝剂在药理治疗方面是非常有用途的治疗剂，如急性深度静脉血栓形成，肺栓塞，急性肢体动脉栓塞，心肌炎及血管内凝血的扩散。据信预防性地给予抗凝剂可防止风湿性或动脉硬化性心脏病患者的血栓形成，也可防止手术后的某些血栓栓塞综合症。也有报导使用抗凝剂治疗冠状动脉及静脉疾病，动脉血栓栓塞，尤其是分布于心肌和脑部的动脉，是死亡的一主要原因。
水蛭素是从水蛭唾液腺中分离出的65肽，它是一种抗凝剂，并且是血栓栓塞的特异性抑制剂，尽管作用很强，但是从水蛭提取物中分离得到的水蛭素在临床上似不适用，原因在于其提取量的限制，价格昂贵，以及随给予如此大小的任何外来蛋白质而普遍产生的过敏反应。
申请人已经发现水蛭素的一个特定片段可以代表，至少是部分代表其抗凝活性。这个片段已经化学合成，某些其类似物看来是结合于凝血酶的识别部位，而非是空间分离的酶解部位，合成肽的结合竟争性地抑制了纤维蛋白酶原和凝血酶识别部位结合，而这正是纤维蛋白酶生成及血凝形成的先决条件。本发明的肽具有明显的抗凝活性，其只结合于凝血酶的识别部位而不结合于酶解部位的特性在抗凝剂治疗中具有科学的吸引力和临床治疗的重要性。
分子式的肽衍生物
X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-y
于此：X是氨基末端基团，可以为氢、1或2个含有1～6个C原子的烷基、1或2个含2～10个C原子的酰基、 酯基或叔-丁氧酰基。
A1：是一个键或含有1-11个任意氨基酸基团的肽。
A2：是苯丙氨酸，取代苯丙氨酸，β-（2-和3-噻吩基）丙氨酸，β-（2-和3-呋喃基）丙氨酸，β-（2-，3-和4-吡啶基）丙氨酸，β-（苯并噻吩-2-和3-）丙氨酸，β-（1-和2-萘基）丙氨酸，酪氨酸或色氨酸。
A3：谷氨酸或天门冬氨酸
A4：任意氨基酸或X1-X23中的任一基团。
A5：异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、己氨酸或苯丙氨酸。
A6：脯氨酸、羟脯氨酸、3，4-脱H脯氨酸，四氢噻唑-4-羧酸酯，N-甲基甘氨酸，N-甲基-苯基甘氨酸，D-丙氨酸，或X1-X23中的任一基团，
A7：一个键或任意氨基酸。
A8：任意氨基酸。
A9：是亲脂氨基酸，可以是酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、己氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、环己丙氨酸、和脯氨酸，或是含有至少一个如上亲脂氨基酸的二肽。
A10：是一个键或是含有1-5个任意氨基酸基团的肽段。
y：是羧基末端基团。其可以是：OH、（C1-C6）烷氧基、氨基、单一或二-（C1-C4）烷氧基取代的氨基或 
氨基。
X1-X23如下：
于此：
R7：是H、烷基、卤素基团、OH、NH-CO（C1-C4）烷基，NH2，NR22R23，NH-CO-（CH2）mPh，（CH2）m-y，OCO-N（R15）2，O-烷基，O-（CH2）m-F1，（C1-C4）硫代烷基或S-（CH2）m-F1。
y：是Ph1，噻吩基、呋喃基、环烷基、吡啶基1-或2-Nap;
Ph1：苯基被（R13）p-任意取代
Nap：萘基被（R5）p-任意取代
F1：是Ph1或Nap
R8：是烯丙基、卤素基团，-O-CO-N（R15）2，-O-（CH2）m-F1，（C1-C4）烷氧基，（C1-C4）硫代烷基或S-（CH2）mF1，
R9：是（C1-C4）烷基，酮基或-（CH2）m-ph1;
R10：是卤素基团或y1-R16。
R11，R1 11，和R12和R1 12：是H或（C1-C4）烷基;或R1 11，R12和R1 12是H，R11是ph;
R13：是（C1-C4）烷基，（C1-C4）烷氧基，（C1-C4）硫代烷基，Cl，Br，F，CF3，OH，苯基、苯氧基，硫代苯基或苯基甲基。
R5：是（C1-C4）烷基，（C1-C4）烷氧基，（C1-C4）硫代烷基、Cl，Br，F，CF3或OH，
m：是0-4。
p：是1-3，只有当R13或R5是Me，MeO，Cl，Br或F时，p大于1。
R14：是H，（C1-C4）烷基，ph，噻吩基，呋喃基，或吡啶基。
R15：是H或（C1-C4）烷基。
y′：是0或S。
R16：是（C1-C4）烷基或（CH2）m-ph1;或R16基团结合形成一个五元或六元环，其中一个或数个O原子可被（C1-C4）烷基或二-（1-4C）烷基任意取代。
R17：是H，（C1-C4）烷基、（C4-C8）环烷基或苯基。
R18：是H，（C1-C4）烷基、（C1-C4）烷氧基或苯基。
V：是O-2。
R19：是（C1-C4）烷基或（CH2）r-苯基。
R20：是H、烷基、-（CH2）m-Z（当Z未被苯基取代时则否），二氢-2-茚基，全氢化-2-茚基。
R21：是H，（C1-C4）烷基或（CH2）r-G。
G：是苯基，4-羟基，或3，4-二羟基苯基，OH，1H-吲哚-3-，1H-咪唑-4-，NH2，SH，S-烷基，胍基，或
CoNH2;
R22：是（C1-C4）烷基、 
基或苯乙基。
R23：是H（C1-C4）烷基， 
基，或苯乙基。
R6：是H，（C1-C4）烷基， 
基，二苯甲基，碱金属或碱土金属盐离子，-CH（R17）-O-COR18或（CH2）2SiMe3。
条件是：A4和A6之一或二者必须从X1-X23中选择，而且，A4和A6不能同时为脯氨酸。
在本说明书中，使用下列通用氨基酸缩写：
Gly-甘氨酸
Ala-丙氨酸
Val-缬氨酸
Leu-亮氨酸
Ile-异亮氨酸
Cha-环己丙氨酸
Orn-鸟氨酸
Pro-脯氨酸
Phe-苯丙氨酸
Trp-色氨酸
Met-蛋氨酸
Ser-丝氨酸
Thr-苏氨酸
Cys-半胱胺酸
Tyr-酪氨酸
Asn-天门冬酰胺
Gln-谷酰胺
Asp-天门冬氨酸
Glu-谷氨酸
Lys-赖氨酸
Arg-精氨酸
His-组氨酸
Nle-己氨酸
Hyp-羟脯氨酸
Glt-戊二酰基
Mal-马来酰基
Npa-β-（2-萘基）-氨基丙酸
3，4-dehydroPro-，3，4-脱氢脯氨酸
Tyr（SO3H）-酪氨酸硫酸盐
pgl-苯基甘氨酸
NMePgl-N-甲基苯基甘氨酸
Sar-N-甲基甘氨酸
pSubPhe-对位取代苯丙氨酸
SubPhe-邻、间或对位，单或二取代苯丙氨酸
DAla-D-丙氨酸
Ac-乙酰基
Suc-琥珀酰基
pClPhe-对-氯-苯丙氨酸
pNO2Phe-对-硝基-苯丙氨酸
Pip-L-2-呱啶酸
Azd-L-氮杂环丁烷-2-羧酯
Tig-L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酯
Thz-L-四氢噻吩-4-羧酯
烷基基团和烷氧基基团的烷基部分主要包括直链的，支链的和环状的烷基，例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊烷基、仲戊烷基、环戊烷盐、己烷基、异己烷基、环己烷基和环戊烷基甲基。2到10个碳原子的酰基基团通常包括直链的，支链的，环状的，饱和的及不饱和的每个基团含有1或2个羰基部分的酰基基团。例如：乙酰基、苯甲酰基、琥珀酰基、马来酰基及戊二酰基、卤素基团为氟、氯、溴、碘。
这里所用的术语“任何氨基酸”包括天然存在的氨基酸，以及那些在多肽化学中制备天然存在的多肽类似物时通常所用的其它“非蛋白质”的α-氨基酸，天然存在的氨基酸为：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、天门冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸、谷酰胺、精氨酸、鸟氨酸及赖氨酸。“非蛋白”α-氨基酸的例子为正亮氨酸、正缬氨酸、别异亮氨酸、高精氨酸、硫脯氨酸、脱氢脯氨酸、羟脯氨酸（Hyp），高丝氨酸、环己烷基氨基酸（Chg），α-氨基-n-丁氨酸（Aba），环己烷基丙氨酸（Cha），氨苯丁氨酸（Pba），苯丙氨酸苯基部分在邻、间或对位被一或二个下列基团取代：（C1-C4）烷基，（C1-C4）烷氧基，卤素或硝基，或被二氧次甲基取代。β-2-和3-噻吩丙氨酸，β-2-和3-呋喃丙氨酸，β-2-，3-，和4-吡啶丙氨酸，β-（苯并噻吩-2-和3-）丙氨酸，β-（1-和2-萘基）丙氨酸，丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的氧烷基化衍生物。S-烷基化半胱氨酸、酪氨酸的O-硫酸酯，3，5-二碘酪氨酸，以及自然界存在氨基酸的D-异构体。
术语“亲脂性氨基酸”包括酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、己氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、组氨酸和脯氨酸。
天然氨基酸除甘氨酸外，均含有一个手性碳原子。除非在特别指定的情况下，这里指出的旋光活性氨基酸为L-构型。例如，A1或A10基团的任何氨基酸，均可为D-或L-构型。按习惯写法，这里所写的肽结构为：氨基末端在链左侧，而羧基末端在链右侧。
分子式1代表的多肽可以形成药理上可接受的无毒的有机或无机盐。可形成适宜的盐的无机酸例如：盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及酸性金属盐例如：正磷酸氢二钠，及硫酸氢钾。可形成适宜的盐的有机酸例如：单、二或三羧酸、这些酸的例子为：乙酸、乙二酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、枸椽酸，抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸及磺酸类如甲磺酸、2-羟基乙基磺酸。羧基端的氨基酸盐包括与任何适宜的无机或有机碱基所形成的无毒的羧酸盐。例如：这些盐包括碱金属盐、如钠盐、钾盐。碱土金属盐如：钙盐、镁盐、ⅢA族的轻金属盐，如铝盐。以及有机的伯、仲、叔胺盐。例如叔胺包括三乙胺、普鲁卡因、二 胺、1-乙烯胺，N，N′-二 
乙烯二胺盐，二氢松香胺，N-（降）烷基呱啶盐以及任何其它适宜的胺盐。
在化合物中的任何同属基团，有某些基团被优先选择。申请人建议优先选用分子式1的肽衍生物。其中：
X：为氢、乙酰基或琥珀酰基。
同时优先选择的还有那些分子式1的化合物：
A1： 
A2：优先选择Phe，β-2-或3-噻吩丙氨酸，酪氨酸、色氨酸β-（2-萘基）-氨基丙氨酸或对氯苯丙氨酸。
A3：是谷氨酸
A4：是谷氨酸，天门冬氨酸，脯氨酸、丙氨酸L-2-呱啶酸，L-氮杂环丁烷-2-羧酯。L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酯，或L-四氢噻吩-4-羧酯。
A5：是异亮氨酸、亮氨酸、
A6：是脯氨酸，N-甲基甘氨酸、D-丙氨酸，羟脯氨酸，N-甲基-苯基甘氨酸，L-2-呱啶酸、L-氮杂环丁烷-2羧酯，L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酯或L-四氢噻吩-4-羧酯。
A7：是谷氨酸，谷酰胺，门冬氨酸，或丙氨酸。
A8：是谷氨酸，门冬氨酸，或丙氨酸。
A9：是脯氨酸、丙氨酸-酪氨酸，丙氨酸-环己丙氨酸，酪氨酸-亮氨酸、丙氨酸-苯丙氨酸、酪氨酸-酪氨酸
A10：是谷氨酸、门冬酰胺、门冬氨酸-谷氨酸、脯氨酸、谷酰胺、丙氨酸、单键、D-赖氨酸、赖氨酸，D-门冬氨酸、或鸟氨酸
Y：是OH或NH2
尤其优先选择的是那些分子式1的肽衍生物，其中X是乙酰基，
A1是甘氨酸一门冬氨酸或门冬氨酸;或者X是琥珀酰基，A1是单键，其中：
A2：是苯丙氨酸;β-（2-噻吩丙氨酸），或酪氨酸。
A3：是谷氨酸。
A4：是谷氨酸、脯氨酸、L-2-呱啶酸，或L-氮杂环丁烷-2-羧酯。
A5：是异亮氨酸
A6：是脯氨酸、L-2-呱啶酸或L-氮杂环丁烷-2-羧酯
A7：是谷氨酸
A8：是谷氨酸或门冬氨酸
A9：是酪氨酸-亮氨酸、丙氨酸-酪氨酸，酪氨酸-酪氨酸，丙氨酸-苯丙氨酸，丙氨酸-环己丙氨酸，或酪氨酸。
A10：谷酰胺，门冬氨酸、脯氨酸、单键，D-门冬氨酸，D-赖氨酸，D-谷氨酸，或一门冬氨酸一谷氨酸，
Y：是OH或NH2
本发明中的蛋白质可被那些具有这方面工作经验的人，用已知的不同方法进行制备。这些方法包括固相连续反应保护合成，基因克隆，以及这些方法的综合应用，固相连续反应法可以利用已经建立的自动化的方法进行，例如自动肽合成仪。在这方法中，一个α-氨基保护的氨基酸接于一担体树脂上，在多肽的固相制备技术中，所用的担体树脂，可以是常规使用的任何适宜的担体树脂，通常用交联有0.5-3%二乙烯基苯的聚苯乙烯，其已被氯甲基化或羟甲基化，以提供与最初引入的α-氨基保护的氨基酸形成酯的部位。
羟甲基树脂的例子，已由Bodanszky等在《Chem.Ind（London）38，1597-98（1966）》中作过报道，氯甲基化树脂可从加州、Richmond的Bio Rad实验室买到，这种树脂的制备方法由Stewart等人在《Solid phase Peptide Synthesis》（Freeman & Co，San Francisco 1969），第一章，第1-6页中作过报道，被保护的氨基酸可按Gisin在《Helv Chem Acta，56，1476（1973）》中所述的方法接于树脂上，许多接合树脂的、被保护的氨基酸可以买到，例如制备本发明中的多肽，其中羧基末端是苏氨酸、叔丁氧酰基（Boc）保护的苏氨酸接于 
化的、羟甲基化的苯乙酰胺甲基（PAM）树脂是实验中所需要的，并且可以买到。
当α-氨基保护的氨基酸偶连于树脂担体后，保护基可用任何适宜的方法除去，如：用三氟醋酸的二氯甲烷溶液，单一的三氟醋酸、或盐酸二噁烷溶液。脱保护是0℃到室温进行的。其它用来除去特异的α-氨基保护基的解离试剂及条件均可使用。α-氨基保护基除去后，其它氨基保护的氨基酸依次以理想的顺序连接。二者择一，多氨基酸基团也可以在与树脂担体氨基酸序列偶联之前，先用溶液法进行偶联。
引入多肽序列的每个氨基酸所用的α-氨基保护基，可以是该技术中已知的任何保护基，α-氨基保护基的类型有：（1）酰基型保护基，如甲酰基、三氟乙酰基，邻苯二甲酰基、甲苯磺酰基（tosyl），苯磺酰基、硝基苯亚磺酰基，三苯亚磺酰基，邻-硝基苯氧乙酰基，及α-氯丁酰基。（2）芳香氨基酯类保护基，如 氧酰基及取代的 
氧酰基：如对氯 
氧酰基，对硝基 
基酰基，对溴 氧酰基，对甲氧 
氧酰基，1-（对-联苯基）-1-甲基乙氧酰基，α，α-二甲基-3，5-二甲氧基 氧酰基，及二苯甲氧酰基。（3）脂肪氨基酯类保护基，如叔丁氧酰基（Boc），二异丙基甲氧酰基，异丙氧酰基，乙氧酰基，及烯丙氧酰基。（4）环烷氨基酯类保护基，如，环戊烷氧酰基，金刚烷氧酰基，及环己烷氧酰基。（5）硫代氨基酯类保护基，如苯硫代酰基，（6）烷基类保护基，如三苯甲基（trityl）和 基（7）三烃基硅烷类保护基，如三甲基硅烷。最常用的α-氨基保护基为叔丁氧酰基。
选择适宜的偶联试剂也在该项技术范围内，当其中所加氨基酸为谷酰胺，天门冬酰胺，或精氨酸时，特别适用的偶联试剂是N，N′-二异丙基碳化二亚胺及1-羟基-苯并三唑。使用这些试剂可以防止腈和内酰胺的形成。其它的偶联试剂有：（1）碳化二亚胺类（如N，N′-二环己烷基碳化二亚胺及N-Z基-N′-（ν-二甲胺基丙基碳化二亚胺）;（2）氨基氰类，（如N，N-二 基氨基氯;（3）酮亚胺类;（4）异噁唑盐类（如N-乙基-5-苯基-异噁唑-3L磺酸盐;（5）含1-4个氮的芳香单杂环酰胺，如咪唑烷类、吡唑烷类，及1，2，4-三唑烷，有用的特定杂环酰胺包括：N，N′-羰基-二咪唑及N，N-羰基-二-1，2，4-三咪唑;（6）烷氧基化的乙炔类（如：乙氧乙炔）;（7）能与氨基酸的羧基端形成混合脱水物的试剂。（如：乙基甲酰氯及异丁基甲酰氯）或偶联氨基酸的对称脱水物（如：叔丁氧酰基-丙氨酸-O-丙氨酸-叔丁氧酰基）（8）在一环氮上有一个羟基的含氮杂环化合物（如N-羟基苯邻二甲酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺及1-羟基苯并三唑）Kapoor在《J、Pharm.Sci，59，PP、1-27（1970）》中报道了其它活性试剂及其应用。申请者建议使用对称脱水物作为除精氨酸、天门冬酰胺及谷酰胺外其它所用氨基酸的偶联试剂。
每种被保护氨基酸或氨基酸序列，过量4倍加入固相反应仪中，偶联反应在二甲基甲酰胺：二氯甲烷（1∶1）或在单独二甲基甲酰胺，或更好地在单独二氯甲烷中进行。偶联反应在固相反应仪中与下一个氨基酸偶联之前需重复进行，以防不完全偶联。合成每一步中偶联反应成功与否由茆三酮反应检查，E.Kaiser等在《Analyt，Biochem，34，595（1970）》中对此反应进行了论述。
得到所需的氨基酸序列后，肽从树脂上除去，这可以通过水解完成，如：接有多肽的树脂用甲硫醚、对甲苯酚和甲苯硫酚溶液在稀氢氟酸水溶液中进行处理。
正如在固相肽合成技术中所知，在链制备过程中，许多氨基酸具有需要保护的官能团。适当的保护基的使用与选择是这项技术中所需的技巧，并且依赖于保护的氨基酸以及肽链中其它被保护氨基酸的存在。这种侧链保护基的选择非常关键，在于它必须在α-氨基端保护基裂解时，不会被同时裂解除去。例如赖氨酸适合的侧链保护基是 氧酰基及取代代的 氧酰基，所说的取代可以是卤素（如：氯、溴、氟）及硝基。（如2-氯 氧酰基，对硝基 
氧酰基，3，4-二氯 
氧酰基，甲苯磺酰基，叔戊氧酰基及二异丙甲氧酰基、苏氨酸和丝氨酸的醇羟基可以用乙酰基、苯甲酰基、叔丁基，三苯甲基、 
基，2，6-二氯 
基或 氧酰基基团保护。最适合的保护基为 
基。
这些基团可被这项技术中已知方法除去典型的脱保护基是在肽链合成后进行，但也可在其它任何合适的时间脱去保护基。
本发明肽衍生物的抗凝剂是根据病人情况，所治疗的血栓形成的程度，以及所选择的肽衍生物，为每天每公斤体重0.2-250mg。对于特定病人的适宜的剂量很容易决定。通常每日给药1-4次每剂5mg-100mg。
抗凝剂可以用来治疗和预防多种血栓形成性疾病，特别是冠状动脉和脑静脉疾病，在这个领域富于经验者可以很容易地知道需抗凝剂治疗的时机，这里所说的“患者”是指哺乳类动物如灵长目的，包括：人、羊、牛、马、猪、狗、猫、大鼠、小鼠。
尽管一些肽衍生物可口服给药，并能通过肠道而不被灭活，申请者更愿选择非口服途径给药，例如，皮下、静注、肌注或腹腔内给药，也可通过贮库注射，埋植制剂，或粘膜给药，如：鼻、喉及支气管粘膜，例如在气雾剂中含有本发明的肽衍生物，其为喷雾或干粉形式。
非肠道给药时，以该化合物注射剂量的溶液或混悬液形式给药，该注射剂是指该化合物与可灭菌液体（如水或/和油）的药用载体及加或不加表面活性剂和其它药用辅料组成的生理耐受稀释液。可用于这些制剂中油例如：石油、动物、植物及合成油，如：花生油、大豆油、及矿物油，通常，水，生理盐水、葡萄糖溶液及有关的糖溶液。乙醇及二元醇类如：丙二醇或聚乙烯醇是首选的液体载体，尤其用于注射液。
这些化合物可以贮库注射剂或埋植制剂的形式给药，其可使活性成分缓慢释放给药。活性成分可以压入小丸或小圆柱中，埋植于皮下或肌肉中，作为贮库注射剂或埋植剂，埋植剂可以使用惰性材料，如可生物降解的聚合物或合成硅氧烷类例如：Dow Corning公司制造的硅橡胶，硅氧橡胶。
实例
本发明由下列非限定的实例详述，
实例1
琥珀酰-酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-L-2-呱啶酸-谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-环己丙氨酸-D-谷氨酸-OH的制备。
这个肽是通过固相法由0.5mmol的0.56mmol/g叔丁氧基-D-谷氨酸（ 
氧酰基）-Merefietd树脂合成的。双对称脱水偶联是用2.0mmolNα-叔丁氧酰-氨基酸（Peptides Lnternational）进行的，除在叔丁氧-L-呱啶酸情况下为单偶联。所用的侧链保护基为：谷氨酸（ 
氧酰基），酪氨酸（2-BrZ）。Nα-叔丁氧基末端保护用含50%三氟醋酸的二氯甲烷溶液脱除，树脂用二氯甲烷洗三次，用含10%二异丙基乙胺的二氯甲烷溶液冲洗中和三次，用二氯甲烷洗三次。肽用含1.0g琥珀酐的二甲基甲酰胺溶液封端，用二甲基甲酰胺洗三次，用二氯甲烷洗三次，然后用游离氨检查、封端反应再反复二次，干燥树脂。肽脱保护，用含5%苯甲醚的HF在0℃反应45分钟，使与树脂脱离。于0℃真空除去HF，用30%乙腈水溶液从树脂中提取肽，然后冷冻干燥。
制备的肽用高压液相纯化，用50.8×150mm的18C-Beckman柱，流动相为：79ml/min流速的含有33-38%的乙腈的0.1%三氟醋酸水溶液。收集主要峰，冷冻干燥，在同一柱上用含34-35。5%乙腈的0.1%三氟醋酸溶液以80ml/min的流速进一步梯度纯化。收集主要峰，冷冻干燥得到104mg所需产品，制备高压液相层析是在50.8×150mm的18C-Beckman柱上，用含有33-38%乙腈的0.1%三氟醋酸水溶液以79ml/min的流速梯度进行的。收集主峰、冷冻干燥得到101mg所需产品（据最初树脂取代计算，产率为58%，均匀性用HpLC和TLC检测，HPLC型号为Vydac218TP54（250×4.6mm）18C柱，2ml/min，to＝1.9min，用含15-40%乙腈的0.1%三氟醋酸水溶液，以1%/min的线性梯度洗脱，洗脱时间为14.4min。
氨基酸分析：（6N盐酸水解，24hr，106℃）Glu谷氨酸4.02（4）;脯氨酸0.99（1）;丙氨酸0.99（1）;异亮氨酸0.95（1）;酪氨酸0.97（1）;L-2-呱啶酸1.08（1）;ε275＝1490，肽含量为91.5%（重量比）。
以同样方法制备下列实例2-4的肽：
实例2
琥珀酰-酪氨酸-谷氨酸-2-L-呱啶酸-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-环己丙氨酸-D-谷氨酸-OH。
实例3
琥珀酰-酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-L-2-氮杂环丁烷-2-羧酯-谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-环己丙氨酸-D-谷氨酸-OH。
实例4
琥珀酰-酪氨酸-谷氨酸-L-2-氮杂环丁烷-2-羧酯-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-环己丙氨酸-D-谷氨酸-OH。
| 实例号 | 氨基酸分析（6NHC1水解，24hr,106℃) | ||||||
| 谷氨酸 | 脯氨酸 | 丙氨酸 | 异亮氨酸 | 酪氨酸 | L-2-呱啶酸 | 氨基酸含量 | |
| 2 | 3.97(4) | 1.03(1) | 0.98(1) | 0.95(1) | 0.98(1) | 1.09(1) | 84% |
| 3 | 4.04(4) | 1.03(1) | 0.98(1) | 0.97(1) | 0.98(1) | 82% | |
| 4 | 4.01(4) | 1.04(1) | 0.99(1) | 0.96(1) | 1.00(1) | 86% | |
| 物理特性 | |||
| 实例号 | HPLC tr ( min )15-40%梯度洗脱t0 = 1.65min | FAB-质谱（M + H)+ | ε275 |
| 2 | 19.05 | 1344 | 1630 |
| 3 | 15.65 | 1316 | 1610 |
| 4 | 16.25 | 1316 | 1560 |
Claims (38)
1、下列分子式的肽衍生物，
X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y
其中：X：为氢、一或二个含有1-6个碳原子的烷基，或是：一或二个含2-10个碳原子的酰基。
A1：为键或含有1-11个任何氨基酸基团的肽段。
A2：为苯丙氨酸、取代苯丙氨酸，β-(2-和3-噻吩基)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2，3-和4-吡啶基)丙氨酸，β-(苯并噻吩-2-和3-)丙氨酸，β-(1-和2-萘基)丙氨酸，酪氨酸或色氨酸。
A3：为谷氨酸或天门冬氨酸
A4：为任意氨基酸或X1-X23中任一基团。
A5：为异亮氨基酸、缬氨酸、亮氨酸、己氨酸或苯丙氨酸。
A6：为脯氨酸，羟脯氨酸，3，4-脱氢脯氨酸，四氢噁唑-4-羧酸酯，N-甲基甘氨酸，N-甲基-苯基甘氨酸，D-丙氨酸，或X1-X23中任一基团
A7：任意氨基酸
A8：任意氨基酸
A9：亲脂氨基酸，可以是酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，己氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，环己丙氨酸，及脯氨酸，或含有至少1个上述亲脂氨基酸的二肽。
A10：一个键或是含有1-5个任意氨基酸基团的肽段。
Y：一羧基末端基团，其可以是：OH，(C1-C6)烷氧基，氨基，单一或-二(C1-C4)烷基取代氨基X1-X23如下：
其中：R7：为H、烷基、卤素、OH、NH-CO-(C1-C4)烷基，NH2，NR22R23，NH-CO-(CH2)mph，(CH2)m-Y，OCO-N(R15)2，O-烷基O-(CH2)m-F′，(C1-C4硫代烷基，或S-(CH2)m-F′；
Y：为ph′，噻吩基，呋喃基，环烷基，吡啶基，1-或2-Nap；
ph′：为苯基被(R13)p-任意取代，
Nap：为萘基被(R5)P一任意取代，
F′：为ph′或Nap;
R6：为烯丙基、卤素基团，-O-CO-N(R15)2,－(CH2)m-F′，（C1-C4）烷氧基，或S-(CH2)m-F′
R9：为(C1-C4)烷基，酮基或-(CH2)m-Ph′
R10：为卤素基团或Y′-R16，
R11，R′ 11，R12和R′ 12；为H或(C1-C4)烷基；或R′ 11，
R` 12和R12，为H，R11为ph。
R13：为(C1-C4)烷基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)硫代烷基，Cl，Br，F，CF3，OH，苯基，苯氧基，
硫代苯基，或苯基甲基。
R5：为(C1-C4)烷基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)硫代烷基，Cl，Br，F，GF3或OH。
m：为0-4
P：为1-3，只有当R13或R5是Me，Meo，Cl，Br或F时P大于1。
R14：为H，(C1-C4)烷基，Ph，噻吩基，呋喃基，或吡啶基。
R15：为H或(C1-C4)烷基
Y′：为O或S
R16：为(C1-C4)烷基或(CH2)m-Ph′；或R16基团结合形成一个五元或六元环，其中一个或数个C原子可被(C1-C4)烷基或二一(1-4C)烷基任意取。
R17：是H，(C1-C4)烷基，(C4-C8)环烷基或苯基。
R14：为H，(C1-C4)烷基，PH，(C1-C4)烷氧基或苯基。
V：为0-2，
R19：(C1-C4)烷基或(CH2)r一苯基。
R20：为H，烷基，-(CH2)m-Z(但当Z未被基取代时则否)，二氢-Z-茚基，或全氢化-Z-茚基。
R21：为H，(C1-C4)烷基，或(CH2)r-G
G：为苯基，4-羟基-，或3，4-二羟基苯基，OH，
1H-吲哚-3-，1H-咪唑-4-，NH2，SH，S-烷基，胍基，或CONH2
R22：为(C1-C4)烷基，苄基或苯乙基。
R23：为H，(C1-C4)烷基，苄基，或苯乙基。
R6：为H，(C1-C4)烷基，苄基，二苯甲基，碱金属或碱土金属盐离子，-CH(R17)-O-COR16或(CH2)2SiMe3
条件是：A4和A6之一或二者必须从X1-X23中选择，而且，A4和A6不能同时为脯氨酸。
2、权利要求1中的肽衍生物，其中A2为苯丙氨酸，β-（2-或3-噻吩基）丙氨酸，或酪氨酸。
3、权利要求1中的肽衍生物，其中A3为谷氨酸。
4、权利要求1中的肽衍生物，其中A4为谷氨酸，丙氨酸或脯氨酸。
5、权利要求1中的肽衍生物，其中A5为异亮氨酸。
6、权利要求1中的肽衍生物，其中A6为脯氨酸。
7、权利要求1中的肽衍生物，其中A7为谷氨酸或丙氨酸。
8、权利要求1中的肽衍生物，其中A8为谷氨酸或天门冬氨酸。
9、权利要求1中的肽衍生物，其中A9为酪氨酸-亮氨酸，丙氨酸-酪氨酸，或丙氨酸-环己丙氨酸。
10、权利要求1中的肽衍生物，其中A10为谷酰胺，天门冬氨酸、脯氨酸，键，天门冬酰胺，天门冬氨酸-谷氨酸，谷氨酸，丙氨酸，D-赖氨酸，赖氨酸，D-天门冬氨酸，D-谷氨酸或鸟氨酸。
11、权利要求1中的肽衍生物，其中X为H，乙酰基或琥珀酰基。
12、权利要求1中的肽衍生物，其中Y为OH或NH2。
13、权利要求1中的肽衍生物，其中A1为
或一个键
14、权利要求1中的肽衍生物，其中A1为：
15、权利要求1中的肽衍生物，其中A1为
16、权利要求1中的肽衍生物，其为：
琥珀酰-酪-谷-脯-异亮-L-2-呱啶酸-谷-谷-丙-环己丙-D-谷-OH。
17、权利要求1中的肽衍生物，其为：
琥珀酰-酪-谷-L-2-呱啶酸-异亮-脯-谷-谷-丙-环己丙D-谷-OH。
18、权利要求1中的肽衍生物，其为：
琥珀酰-酪-谷-脯-异亮-L-氮杂环丁烷-2-羧酯-谷-谷-丙-环己丙-D-谷-OH。
19、权利要求1中的肽衍生物，其为：
琥珀酰-酪-谷-L-氮杂环丁烷-2-羧酯-异亮-脯-谷-谷-丙-环己丙-D-谷-OH。
20、权利要求1中的肽衍生物，其为：
琥珀酰-酪-谷-脯-异亮-脯-谷-谷-丙-环己丙-D-谷-OH。
21、降低患者血凝的方法，其包括服给患者以权利要求1-20中的任何一个抗凝有效剂量的肽衍生物及药用载体。
22、通过固相连续法或保护合成法、基因克隆或综合方法制备权利要求1-20的任何肽衍生物的方法。
23、通过固相连续法或保护合成法制备权利要求1-20中任何肽衍生物的制备方法包括将：权利要求1所定义的分子式A1的合适的被保护的氨基酸结合于活性树脂担体上，随后将权利要求1中的A2-A10的其它α-氨基保护的氨基酸，结合于肽链的末端氨基酸，其已于同时除去氨基保护基，呈暴露状态。
24、根据权利要求22或23，制备权利要求1中的肽衍生物，其中A1为：
25、根据权利要求22或23制备权利要求1中的肽衍生物的方法其中A2为苯丙氨酸，β-（2-或3-噻吩基）丙氨酸，或酪氨酸。
26、根据权利要求22或23制备权利要求1中的肽衍生物的方法，其中A3为谷氨酸。
27、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，其中A4为谷氨酸、丙氨酸、或脯氨酸。
28、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，其中A5为异亮氨酸。
29、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，其中A6为脯氨酸。
30、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，其中A7为谷氨酸，或丙氨酸。
31、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，其中A8为谷氨酸或天门冬氨酸。
32、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，其中A9为酪氨酸-亮氨酸、丙氨酸-酪氨酸或丙氨酸-环己丙氨酸。
33、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，其中A10为谷酰胺，天门冬氨酸、脯氨酸、键、天门冬酰胺，天门冬氨酸-谷氨酸谷氨酸、丙氨酸，D-赖氨酸，赖氨酸，D-天门冬氨酸，D-谷氨酸、或鸟氨酸。
34、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，此衍生物为琥珀酰-酪-谷-脯-异亮-L-2-呱啶酸-谷-谷-丙-环己丙-D-谷-OH。
35、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，此衍生物为琥珀酰-酪-谷-L-2-呱啶酸-异亮-脯-谷-谷-丙-环己丙-D-谷-OH。
36、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，此衍生物为琥珀酰-酪-谷-脯-异亮-L-2-氮杂环丁烷-2-羧酯-谷-谷-丙-环己丙-D-谷-OH
37、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，此衍生物为：琥珀酰-酪-谷-L-2-氮杂环丁烷-2-羧酯-异亮-脯-谷-谷-丙-环己丙-D-谷-OH。
38、根据权利要求22或23制备权利要求1中肽衍生物的方法，此衍生物为琥珀酰-酪-谷-脯-异亮-脯-谷-谷-丙-环己丙-D-谷-OH。
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