KR0162893B1 - 항응고성 펩타이드 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents

항응고성 펩타이드 및 이를 함유하는 조성물

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KR0162893B1
KR0162893B1 KR1019890017934A KR890017934A KR0162893B1 KR 0162893 B1 KR0162893 B1 KR 0162893B1 KR 1019890017934 A KR1019890017934 A KR 1019890017934A KR 890017934 A KR890017934 A KR 890017934A KR 0162893 B1 KR0162893 B1 KR 0162893B1
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게리 디. 스트리트
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Abstract

내용없음.

Description

항응고성 펩타이드 및 이를 함유하는 조성물
본 발명은 유용한 항응고제인 신규한 펩타이드에 관한 것이다.
항응고제는 예를들어, 급성 심정맥성 혈전증, 폐동맥 색전증, 사지의 급성 동맥혈 색전 형성, 심근경색증 및 전염된 맥관내 응고의 약물학적 치료시 유용한 치료학적 제제이다. 항응고제의 예방학적 투여로 류마티스성 또는 동맥경화성 심장 질환에 걸린 환자에 있어서 색전증의 재발을 예방하며, 수술의 특정한 혈전 색전성 합병증을 예방해 주리라 생각되어진다. 관상동맥 및 뇌관성 질환의 치료시에도 또한 항응고제의 투여가 제시되어 왔다. 특히, 심근 및 뇌에 공급되는 동맥에 있어서의 동맥혈전증은 사망을 초래하는 요인이 된다.
히루딘은 거머리의 타액선에서 분리된 65개 잔기의 폴리펩타이드이다. 이는 트롬빈 특이 억제제인 항응고제이다. 상당한 효능이 있음에도 불구하고, 거머리 추출물로 부터 분리된 히루딘의 임상적 사용은 제한된 양, 비용 및 이러한 크기의 외래 단백질의 투여시 흔히 야기되는 알레르기성 반응으로 인해 가능하지 않은 것으로 여겨지고 있다.
본 발명자들은 적어도 일부가 그의 항응고 활성에 기여하는 것으로 생각되어지는 히루딘의 특정영역을 발견하였다. 이 영역은 화학적으로 합성되어 왔는데, 이의 특정 동족체는 공간적으로 분리되는 효소적 절단 부위가 아닌 트롬빈의 인지 부위에 결합되는 것으로 나타났다. 합성 펩타이드의 결합은 경쟁적으로 피브린 형성 및 응혈 형성의 필수 조건인 트롬빈의 인지 부위에 대한 피브리노겐의 결합을 방지한다. 본 발명의 펩타이드는 현저한 항응고 활성을 지니며, 트롬빈의 절단 부위에 대한 결합없이 인지 부위에만 결합되는 그들의 독특한 수행능으로 항응고성 치료와 관련된 과학적 관심 및 치료학적 중요성이 높아질 수 있다.
하기 일반식 (1)의 펩타이드 유도체
Figure kpo00001
상기식에서,
X는 수소, 하나 또는 두개의 탄소수 1 내지 6의 알킬 그룹이거나, 또는 하나 또는 두개의 탄소수 2 내지 10의 아실 그룹, 카보벤질옥시 또는 3급-부틸옥시카보닐 중에서 선택된 아미노 말단 잔기이고;
A1는 결합이거나 또는 1 내지 11개의 특정 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드이며;
A2는 Phe, SubPhe, β-(2- 및 3- 티에닐)알라닌, β-(2- 및 3- 푸라닐)알라닌, β-(2-, 3-, 및 4-피리딜)알라닌, β-(벤조티에닐-2- 및 3-일)알라닌, β-(1- 및 2- 나프틸)알라닌, Tyr, Trp 이고;
A3은 Glu 또는 Asp이며;
A4는 특정 아미노산 또는 하기의 일반식 (X1) 내지 (X23) 중에서 선택된 그룹이고;
A5는 Ile, Val, Leu, Nle, 또는 Phe이며;
A6은 Pro, Hyp, 3,4-데하이드로 Pro, 티아졸리딘-4-카복실레이트, Sar, NMePgl, D-Ala, 또는 하기 일반식 (X1) 내지 (X23) 중에서 선택된 그룹이고;
A7은 결합이거나 또는 특정 아미노산이며;
A8은 특정 아미노산이고;
A9는 Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha 및 Pro 중에서 선택된 친유성 아미노산이거나 또는 하나 이상의 이들 친유성 아미노산을 함유하는 디펩타이드이며;
A10은 결합이거나 또는 1 내지 5개의 특정 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드 단편이고;
Y 는 OH, (C1-C6)알콕시, 아미노, 모노 또는 디(C1-C4)알킬 치환된 아미노중, 또는 벤질아미노중에서 선택된 카복실 말단 잔기이며;
X1내지 X23 은 하기와 같다;
Figure kpo00002
Figure kpo00003
Figure kpo00004
[여기에서, R7은 H, 알킬, 할로, OH, NH-CO-(C1-C4)알킬,
NH2, NR22R23, NH-CO-(CH2)mPh, (CH2)m-Y, OCO-N(R15)2,
O-알킬, O-(CH2)m-F', (C1-C4) 알킬티오 또는 S-(CH2)m-F' 이며;
Y는 Ph', 티에닐, 푸릴, 사이클로알킬, 피리딜, 1- 또는 2-Nap 이고;
Ph' 는 (R13)p-에 의해 임의로 치환된 페닐이며; Nap는 (R5)p-에 의해 임의로 치환된 나프틸이고; F'는 Ph' 또는 Nap 이며;
R8은 알릴, 할로, -O-CO-N(R15)2, -O-(CH2)m-F' , (C1-C4)알콕시,
(C1-C4)알킬티오 또는 S-(CH2)m-F' 이고; R9는 (C1-C4)알킬, 케토 또는 -(CH2)m-Ph' 이며; R10은 할로 또는 Y'-R16이고; R11, R'11, R12및 R'12는 H 또는 (C1-C4)알킬이거나; 또는 R'11, R12및 R'12는 H이고 R11은 Ph이며;
R13은 (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, (C1-C4)알킬티오,
Cl, Br, F, CF3, OH, 페닐, 펜옥시, 페닐티오 또는 페닐메틸이고;
R5는 (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, (C1-C4) 알킬티오,
Cl, Br, F, CF3또는 OH이며; m은 0 내지 4이고; p는 1 내지 3이며,
단 R13또는 R5가 Me, MeO, Cl, Br 또는 F인 경우 P는 1이상이고;
R14는 H, (C1-C4) 알킬, Ph, 티에닐, 푸릴 또는 피리딜이며;
R15는 H 또는 (C1-C4) 알킬이고; Y' 는 O 또는 S이며; R16은
(C1-C4)알킬 또는 (CH2)m-Ph' 이거나; 또는 R16그룹은 결합되어 하나 이상의 탄소원자가 (C1-C4)알킬 또는 디-(C1-C4)알킬에 의해 임의로 치환된 5- 또는 6- 원환을 형성하고; R17은 H, (C1-C4) 알킬, (C4-C8)사이클로알킬 또는 페닐이며; R18은 H, (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시 또는 페닐이고; v는 0 내지 2이며; R19는 (C1-C4)알킬 또는 (CH2)r-페닐이고;
R20은 H, 알킬, -(CH2)m-Z(단, Z가 비치환된 페닐이 아닌 경우임), 인단-2-일 또는 퍼하이드로인단 -2-일이며; R21은 H, (C1-C4)알킬 또는 (CH2)r-G 이고; G는 페닐, 4-하이드록시- 또는 3,4-디하이드록시 페닐, OH, 1H-인돌-3-일, 1H-이미다졸-4-일, NH2, SH, S-알킬, 구아니디노 또는 CONH2이며; R22는(C1-C4)알킬, 벤질, 또는 펜에틸이고;
R23은 H, (C1-C4)알킬, 벤질 또는 펜에틸이며;
R6은 H, (C1-C4)알킬, 벤질, 벤즈하이드릴, 알칼리 또는 알칼리토 금속염 이온, -CH(R17)-O-COR18또는 (CH2)2SiMe3이다];
단, A4및 A6중 하나 또는 두개는 상기 일반식 (X1) 내지 (X23) 중에서 선택되어야만 하며, A4및 A6은 모두 Pro 는 될 수 없다.
하기의 통상적인 아미노산의 약어가 본 명세서에 사용된다;
Gly-글리신
Ala-알라닌
Val-발린
Leu-로이신
Ile-이솔로이신
Cha-사이클로헥실알라닌
Orn-오르니탄
Pro-프롤린
Phe-페닐알라닌
Trp-트립토판
Met-메티오닌
Ser-세린
Thr-트레오닌
Cys-시스테인
Tyr-티로신
Asn-아스파라긴
Gln-글루타민
Asp-아스파르트산
Glu-글루탐산
Lys-리신
Arg-아르기닌
His-히스티딘
Nle-노르로이신
Hyp-하이드록시프롤린
Glt-글루타릴
Mal-말레일
Npa-β-(2-나프틸)알라닌
3,4-데하이드로 Pro-3,4-데하이드로프롤린
Tyr(SO3H)-티로신 설페이트
Pgl-페닐글리신
NMePgl-N-메틸-페닐글리신
Sar-사코신 (N-메틸글리신)
pSubPhe-파라 치환된 페닐알라닌
SubPhe-오르토, 메타, 또는 파라, 모노-또는 디-치환된 페닐알라닌
DAla-D-알라닌
Ac-아세틸
Suc-석시닐
pClPhe-파라-클로로-페닐알라닌
pNO2Phe-파라-니트로-페닐알라닌
Pip-L-2-피페콜산
Azd-L-아세티딘-2-카복실레이트
Tiq-L-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실레이트
Thz-L-티아졸리덴-4-카복실레이트
알킬 그룹 및 알콕시 그룹의 알킬 부위는 직쇄, 측쇄, 또는 사이클릭 알킬 그룹을 포함하며, 그 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 2급-펜틸, 사이클로펜틸, 헥실, 이소헥실, 사이클로헥실 및 사이클로펜틸메틸이 있다. 탄소수 2 내지 10의 아실 그룹은 그룹당 1 또는 2개의 카보닐 잔기를 갖는 직쇄, 측쇄, 사이클릭, 포화 및 불포화 아실 그룹을 포함하며, 그 예로는 아세틸, 벤조일, 석시닐, 말레일 및 글루타릴이 있다. 할로겐 그룹은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도 그룹이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 특정 아미노산에는 천연 펩타이드의 합성 동족체를 제조할 경우 펩타이드 화학 분야의 전문가에 의해 통상 사용되는 기타 비-단백질(non-protein) α-아미노산 뿐만 아니라 천연 아미노산이 포함된다. 천연적으로 존재하는 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이솔로이신, 세린, 메티오닌, 트레오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 프롤린, 히스티딘, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아르기닌, 오르니틴 및 리신이다.
비-단백질 α-아미노산의 예로는 노르로이신, 노르발린, 알로이솔로이신, 호모아르기닌, 티아프롤린, 데하이드로프롤린, 하이드록시프롤린(Hyp), 호모세린, 사이클로헥실글리신(Chg), α-아미노-n-부티르산(Aba), 사이클로헥실알라닌(Cha), 아미노 페닐부티르산(Pba), 페닐잔기의 오르토, 메타 또는 파라 위치에서 하나 또는 두개의 (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로겐, 또는 니트로 그룹으로 치환되거나 메틸렌디옥시 그룹으로 치환된 페닐알라닌, β-2-및 3-티에닐알라닌, β-2-및 3-푸라닐알라닌, β-2-, 3-, 및 4-피리딜알라닌, β-(벤조티에닐 -2- 및 3-일)알라닌, β-(1-및 2-나프틸)알라닌, 세린, 트레오닌, 또는 티로신의 O-알킬화된 유도체, S-알킬화된 시스테인, 티로신의 O-설페이트 에스테르, 3,5-디요오도티로신 및 천연 아미노산의 D-이성체가 있다.
용어 친유성 아미노산에는 Tyr, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, His 및 Pro가 포함된다.
글리신을 제외한 천연 아미노산은 키랄성 탄소 원자를 포함한다. 달리 구체적으로 제시가 없는 한, 본 명세서에 언급된 광학적으로 활성인 아미노산은 L-배위이다. 예를 들어, A1또는 A10그룹의 아미노산중 일부는 D- 또는 L-배위일 수 있다. 통상적으로, 본 명세서에 기술된 펩타이드의 구조는 아미노 말단부가 쇄의 왼쪽에 위치하고 카복시 말단부는 쇄의 오른쪽에 위치한다.
일반식(1)의 폴리펩타이드는 비독성의 유기 또는 무기산과 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 적절한 염을 형성하는 무기산의 예에는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산 및 산금속염(예: 오르토인산일수소나트륨 및 황화수소칼륨)이 포함된다. 적절한 염을 형성하는 유기산의 예에는 모노-, 디- 및 트리카복실산이 포함된다. 상기 산의 예에는 예를 들어 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 하이드록시말레산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 2-펜옥시벤조산 및 설폰산(예 : 메탄 설폰산 및 2-하이드록시에탄 설폰산)이 있다. 카복시 말단 아미노산의 염에는 적절한 무기 또는 유기 염기와 형성된 비독성 카복실산 염이 포함된다. 예를 들어, 상기 염에는 알칼리 금속(예: 나트륨 및 칼륨); 알칼리토 금속(예 : 칼슘 및 마그네슘); 알루미늄을 포함하는 IIIA족 경금속; 및 유기 1급, 2급 및 3급 아민[예 : 트리에틸아민을 포함하는 트리알킬아민, 프로카인, 디벤질아민, 1-에텐아민, N, N'-디벤질에틸렌디아민, 디하이드로아비에틸아민, N-(저급)알킬피페리딘, 및 기타 적절한 아민]의 염들이 포함된다.
화학적 화합물의 일반적인 그룹에 있어서, 특정 그룹이 바람직하다. 본 발명자들은 X가 수소, 아세틸 또는 석시닐인 일반식(1)의 펩타이드 유도체를 바람직한 것으로 취급하고 있다.
또한 바람직한 것은
Figure kpo00005
Figure kpo00006
A2가 바람직하게는 Phe, β-2-또는 3-티에닐알라닌, Tyr,
Trp, Npa 또는 pClPhe이며 ;
A3이 Glu이고 ;
A4가 Glu, Asp, Pro, Ala, Pip, Azd, Tig 또는 Thz 이며 ;
A5가 Ile, Leu이고 ;
A6이 Pro, Sar, D-Ala, Hyp, NMePgl, Pip, Azd, Tiq, 또는 Thz이며;
A7이 Glu, Gln, Asp 또는 Ala이고 ;
A8이 Glu, Asp 또는 Ala 이며 ;
A9가 Pro, Ala-Tyr, Ala-Cha, Tyr-Cha, Tyr-Leu, Ala-Phe, Tyr-Tyr 이고 ;
A10이 Glu, Asn, Asp-Glu, Pro, Gln, Ala, 결합, D-Lys, Lys, D-Asp 또는 Orn 이며 ;
Y가 OH 또는 NH2인 일반식 (1)의 화합물이다.
특히 바람직한 것은
X 가 아세틸이며, A1은 Gly-Asp 또는 Asp이거나, 또는
X가 석시닐이고, A1은 결합이며 ;
A2가 PHe, β-(2-티에닐알라닌) 또는 Tyr이고 ;
A3이 Glu 이며;
A4가 Glu, Pro, Pip 또는 Azd이고 ;
A5가 Ile이며 ;
A6이 Pro, Pip 또는 Azd이고 ;
A7이 Glu이며 ;
A8이 Glu 또는 Asp이고 ;
A9가 Tyr-Leu, Ala-Tyr, Tyr-Tyr, Ala-Phe, Ala-Cha 또는 Pro이며 ;
A10이 Gln, Asp, Pro, 결합, D-Asp, D-Lys, D-Glu 또는 -Asp-Glu이고 ;
Y가 OH 또는 NH2인 일반식 (1)의 폴리펩타이드이다.
본 발명의 단백질은 당해 분야의 전문가에게 잘 공지된 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 방법에는 고체상 연속 및 블럭(block) 합성, 유전자 클로닝(cloning) 및 이들 기술의 조합이 포함된다. 고체상 연속 방법은 자동조작 펩타이드 합성기의 사용과 같은 알려진 자동 조작 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 방법에서, α-아미노 보호된 아미노산이 수지 지지체에 결합된다. 사용되는 수지 지지체는 폴리펩타이드, 바람직하게는 클로로메틸화되거나 하이드록시메틸화되어 초기에 도입된 α-아미노 보호된 아미노산과 에스테르 형성을 위한 부위를 제공하며, 디비닐벤젠 0.5 내지 약 3%와 가교결합된 폴리스티렌의 고체상 제조를 위해 통상 당해 분야에서 사용되는 적절한 수지일 수 있다.
하이드록시메틸 수지의 예가 문헌[참조 : Bodanszky. et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597-98 (1966)]에 기술되어 있다. 클로로메틸화된 수지가 바이오 래드 래보러토리즈(Bio Rad Laboratories; Richimond, California 소재)에서 시판되고 있으며, 상기 수지의 제조방법이 문헌 [참조 : Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis(Freeman Co., San Francisco 1969), Chapter 1, pp. 1-6]에 기술되어 있다. 보호된 아미노산은 문헌 [참조 : Gisin, Helv. Chem Acta, 56, 1476 (1973)]의 방법에 의해 수지에 결합된다. 다수의 수지 결합된, 보호된 아미노산이 시판되고 있다. 예를 들어, 카복시 말단부가 Thr 잔기인 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하기 위해서는, 벤질화되고 하이드록시 메틸화된 페닐아세트아미도메틸(PAM)수지에 결합된 3급-부틸옥시카보닐(Boc) 보호된 Thr이 사용될 수 있으며, 이는 시판되고 있다.
수지 지지체에 α-아미노 보호된 아미노산을 커플링시킨 다음, 보호 그룹은 적절한 방법(예 : 메틸렌클로라이드 중의 트리플루오로아세트산, 단독의 트리플루오로아세트산, 또는 디옥산중의 HCl)을 사용하여 제거한다. 보호 그룹 제거는 0 ℃ 내지 실온의 온도에서 수행한다. 특정한 α-아미노 보호 그룹의 제거를 위한 기타 표준 분해 시약 및 조건이 사용될 수 있다. α-아미노 보호 그룹의 제거 후, 다른 아미노 보호된 아미노산을 목적하는 순서로 단계별로 커플링시킨다. 또 다른 방법으로, 다양한 아미노산 그룹을 수지 지지된 아미노산 서열과 커플링 시키기 전에 용해법에 의해 커플링시킬 수 있다.
폴리펩타이드 서열에 도입된 각각의 아미노산과 함께 사용되는 α-아미노 보호 그룹은 당해 분야에 공지된 보호 그룹일 수 있다. α-아미노 보호 그룹의 부류로 고려되어질 수 있는 그룹에는
(1) 아실형 보호 그룹[예 : 포밀, 트리플루오로아세틸, 프탈릴, 톨루엔설포닐(토실), 벤젠설포닐, 니트로-페닐설페닐, 트리틸설페닐, o-니트로펜옥시아세틸 및 α-클로로부티릴];
(2) 방향족 우레탄형 보호 그룹[예 : 벤질옥시카보닐 및 치환된 벤질옥시카보닐(예 : p-클로로벤질옥시카보닐, p-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, 1-(p-비페닐릴)-1-메틸 에톡시카보닐, α,α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시 카보닐 및 벤즈하이드릴 옥시카보닐)] ;
(3) 지방족 우레탄 보호 그룹[예 : 3급-부틸옥시카보닐(Boc), 디이소프로필메톡시카보닐, 이소프로필옥시 카보닐, 에톡시카보닐 및 알릴옥시카보닐];
(4) 사이클로알킬 우레탄 형 보호 그룹 (예 : 사이클로펜틸옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐 및 사이클로헥실옥시카보닐 );
(5) 티오 우레탄 형 보호 그룹 (예 : 페닐티오카보닐);
(6) 알킬형 보호 그룹(예 : 트리페닐메틸 (트리틸) 및 벤질 );
및
(7) 트리알킬실란 그룹 (예 : 트리메틸실란)이 있다.
바람직한 α-아미노 보호그룹은 3급-부틸옥시카보닐이다.
적절한 커플링 시약의 선택이 당해 분야에 포함된다. 부가한 아미노산이 Gln, Asn 또는 Arg인 경우, 특히 적절한 커플링 시약은 N,N' -디이소프로필카보디이미드 및 1-하이드록시벤조트리아졸이다. 상기 시약을 사용하면 니트릴 및 락탐의 형성이 방지된다. 기타 커플링제로는 (1) 카보디이미드(예 : N,N' -디사이클로헥실카보디이미드 및 N-에틸-N'-(γ-디메틸아미노프로필카보디이미드); (2) 시안 아미드(예 : N,N' -디벤질 시안아미드); (3)케텐이민; (4)이속사졸륨염 (예 : N-에틸-5-페닐-이속사졸륨-3'-설포네이트); (5) 환내에 1 내지 4개의 질소를 함유하는 방향족 특성의 모노사이클릭 질소 함유 헤테로 사이클릭 아미드(예 : 이미다졸리드, 피라졸리드, 및 1,2,4-트리아졸리드)[이때, 유용한 특정 헤테로사이클릭 아미드에는 N,N' -카보닐-디이미다졸 및 N,N' -카보닐-디-1,2,4-트리아졸이 포함된다]; (6) 알콕시화된 아세틸렌 (예 : 에톡시아세틸렌); (7) 커플링된 아미노산 (예 : 에틸클로로포르메이트 및 이소부틸클로로 포르메이트) 또는 아미노산의 대칭 무수물의 카복실 잔기와 혼합된 무수물을 형성하는 시약 (예 : Boc-Ala-O-Ala); 및 (8) 하나의 환 질소상에 하이드록시 그룹을 갖는 질소 함유 헤테로사이클릭 화합물 (예 : N-하이드록시프탈이미드, N-하이드록시석신이미드 및 1-하이드록시벤조트리아졸)이 있다. 펩타이드 커플링에 있어서의 기타 활성화제 및 그들의 용도가 문헌[참조 : Kapoor, J. Pharm. Sci., 59, pp. 1-27 (1970)]에 기술되어 있다. Arg, Asn 및 Gln 을 제외한 모든 아미노산에 대한 커플링 시약으로서 대칭 무수물을 사용하는 것이 바람직하다.
각기 보호된 아미노산 또는 아미노산 서열은 약 4배 과량으로 고체상 반응기에 도입되며, 커플링을 디메틸포름 아미드; 메틸렌 클로라이드(1:1)의 매질 또는 단독의 디메틸 포름아미드 또는 바람직하게는 단독의 메틸렌클로라이드중에서 수행한다. 커플링이 완결되지 않은 경우, 커플링 공정은 고체상 반응기내에서 다음의 아미노산을 커플링시키기 전에, α-아미노 보호 그룹의 제거전에, 반복 수행한다. 합성의 각 단계에서의 커플링 반응의 성공 여부는 문헌 [ 참조 : E. Kaiser et al., Analyt. BioChem. 34, 595 (1970)]에 기술되어 있는 바와 같은 닌하이드린 반응으로 모니터링한다.
목적하는 아미노산 서열을 수득한 후, 수지로 부터 펩타이드를 제거한다. 이는 수지 결합된 폴리펩타이드를 묽은 수성 불소화수소산중의 디메틸설파이드, p-크레졸 및 티오크레졸의 용액으로 처리하는 것과 같은 가수분해에 의해 수행할 수 있다.
고체상 펩타이드 합성 분야에 있어서, 많은 아미노산이 쇄 제조시 보호되어야 하는 작용기를 갖는 것으로 알려져 있다. 적절한 보호 그룹의 사용 및 선택은 당해 분야의 전분가의 능력에 포함되며, 이는 보호되는 아미노산 및 펩타이드상의 기타 보호된 아미노산 잔기의 존재에 따라 변할 것이다. 이러한 측쇄 보호 그룹의 선택은 엄격하며, 이는 α-아미노잔기의 보호 그룹을 분해시키는 동안 분해에 의해 제거되어서는 안된다. 예를 들어, 리신에 대한 적절한 측쇄 보호 그룹으로서는 벤질옥시카보닐 및 치환된 벤질옥시카보닐[여기서, 치환제는 할로(예 : 클로로, 브로모, 플루오로) 및 니트로(예 : 2-클로로벤질 옥시카보닐, p-니트로벤질 옥시카보닐, 3,4-디클로로벤질 옥시카보닐), 토실, 3급-아밀옥시카보닐, 3급-부틸옥시카보닐 및 디이소프로필메톡시카보닐중에서 선택된다] 이있다. 트레오닌 및 세린의 알콜성 하이드록실 그룹은 아세틸, 벤조일, 3급-부틸, 트리틸, 벤질, 2,6-디클로로벤질 또는 벤질옥시카보닐 그룹으로 보호될 수 있다. 바람직한 보호 그룹은 벤질이다.
이들 그룹은 당해분야에 잘 공지되어 있는 방법으로 제거할 수 있다. 전형적으로, 보호 그룹은 펩타이드 쇄 합성이 완결된 후 제거하지만, 보호 그룹은 다른 적절한 시간에 제거할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 유도체의 항응고 용량은 환자, 치료할 혈전증 질환의 중증도 및 선택된 펩타이드 유도체에 따라 다르나, 환자 체중 kg당 1일 0.2mg 내지 250mg이다. 특별한 환자의 적절한 용량은 쉽게 결정될 수 있다. 바람직하게는 하루에 1 내지 4회 용량으로 전형적으로 용량당 5mg 내지 100mg이 투여된다.
항응고제 치료는 다양한 혈전증 질환, 특히 관상동맥 및 뇌질환의 치료 및 예방에 제시된다. 이 분야의 전문가들은 항응고제 치료가 필요한 상황을 쉽게 인식하고 있다. 본 명세서에 사용된 용어 환자는 사람, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐 및 마우스를 포함하는 영장류와 같은 포유동물을 의미한다.
일부 펩타이드 유도체가 경구 투여후 장을 통과하여도 남을 수 있음에도 불구하고, 비경구 투여, 예를 들어 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내: 데포우(depot) 주사에 의한 투여; 이식 제제에 의하거나 ; 또는 코, 목 및 기관지의 점막에, 예를 들어, 본 발명의 펩타이드 유도체를 함유할 수 있는 에어로졸제, 분무제 또는 무수 분말 제제로 적용시키는 것이 바람직하다.
비경구 투여시, 화합물은 멸균 액체(예 : 물 및 오일)일 수 있는 약제학적 담체와 함께 또는 계면활성제 및 기타 약제학적으로 허용되는 보조제의 첨가없이 생리학적으로 허용되는 희석제중의 화합물의 용액 또는 현탁제의 주사 가능한 용량으로 투여할 수 있다. 상기 제제에 사용될 수 있는 오일의 예로는 석유 오일, 동물성 유, 식물성 유 또는 합성 오일(예: 야자유, 대두유 및 광유)이 있다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로즈 및 관련된 당용액, 에탄올 및 글리콜(예: 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜)이 특히 주사용 액제를 위한 바람직한 액체 담체이다.
화합물은 활성 성분이 서서히 방출되는 방식으로 제형화 될 수 있는 데포우 주사 또는 이식 제제 형태로 투여될 수 있다. 활성 성분을 펠렛(pellets) 또는 작은 실린더에 압착시켜, 데포우 주사제 또는 이식물로써 피하 또는 근육내 이식시킬 수 있다. 이식물은 불활성 물질, 예를 들어 생분해가능한 중합체 또는 합성 실리콘[예 : 다우 코닝 코포레이션에서 제조된 실리콘 고무인 실라스틱(Silastic)] 을 사용할 수 있다.
[실시예]
본 발명은 하기의 비제한된 실시예로 기술된다.
[실시예 1]
[Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pip-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH의 제조방법]
펩타이드는 0.56mmol/g Boc-D-Glu(Bzl)-메레필드(Merefield) 수지 0.5mmol을 사용하여 고체상 방법으로 합성한다. 이중 대칭 무수물 커플링은 단독으로 커플링되는 Boc-Pip의 경우를 제외하고는 2.0mmol Na -Boc-아미노산(펩타이드 인터내셔널)을 사용하여 수행한다. 사용되는 측쇄는 다음과 같이 보호한다 : Glu(Bzl),Tyr(2-BrZ). 말단 Nα-Boc 보호는 메틸렌 클로라이드 중의 50% 트리풀루오로아세트산을 사용하여 제거한다. 수지는 메틸렌 클로라이드로 3회 세척하여, 메틸렌 클로라이드 중의 10% 디이소프로필에틸아민으로 3회 세척하여 중화시키고, 메틸렌 클로라이드로 3회 세척한다. 펩타이드는 디메틸 포름아미드 중의 석신산 무수물(1.0g)로 말단-캡핑시키고, 디메틸포름아미드로 3회 세척한 다음, 메틸렌 클로라이드로 3회 세척하여 유리 아민으로 시험한다. 캡핑 반응을 2회 이상 반복하고, 수지를 건조시킨다. 펩타이드의 보호 그룹을 제거하고, 0 ℃ 에서 45분간 5% 아니솔을 함유하는 HF를 사용하여 수지로 부터 분해시킨다. HF는 진공하에 0 ℃ 에서 제거하고, 펩타이드는 30% 수성 아세토니트릴을 사용하여 수지로 부터 추출하여 동결 건조시킨다.
펩타이드는 0.1% 수성 TFA 중의 33 내지 38% 아세토 니트릴을 사용하여 C18벡크만 (50.8 × 150mm) 컬럼상에서 79ml/분으로 수행하는 예비 HPLC로 정제한다. 주요 피크를 수거하여 동결건조시키고, 80ml/분으로 0.1% 수성 TFA중의 34 내지 35.5% 아세토니트릴 경사를 사용하여 동일한 컬럼상에서 다시 정제시킨다. 주요 피크를 수거하여 동결건조시켜 목적하는 생성물 104mg을 수득한다. 예비 HPLC 는 79ml/분으로 0.1% 수성 트리플루오로아세트산중의 33 내지 38% 아세토니트릴 경사를 사용하여 C18벡크만 (50.8 × 150mm) 컬럼상에서 수행한다. 주요 피크를 수거하여 동결건조시키면 목적하는 생성물 101mg(초기 수지 치환을 기본으로 58% 수율)이 수득된다. 동질성은 HPLC 및 TLC로 측정한다. HPLC Vydac 218TP54 (250 × 4.6mm) C18컬럼, 2ml/분, to=1.9분 : 1%/분으로 0.1% 트리플루오로아세트산 직선 경사중의 15 내지 40% 아세 니트릴을 사용하는 용출 시간은 14.4분이다.
아미노산 분석 (6N HCl 가수분해; 106 ℃ 에서 24시간).
Gl × 4.02(4) ; Pro 0.99(1); Ala 0.99(1); Ile 0.95(1);
Tyr 0.97(1); Pip 1.08(1); 275=1490.
펩타이드 함량은 91.5중량%.
동일한 방법으로, 하기 실시예 2 내지 4의 펩타이드를 제조한다.
[실시예 2]
[Suc-Tyr-Glu-Pip-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH]
[실시예 3]
[Suc-Tyr-Glu-Pip-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH]
[실시예 4]
[Suc-Tyr-Glu-Pip-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH]
Figure kpo00007
Figure kpo00008

Claims (13)

  1. 하기 일반식(1)의 펩타이드 유도체.
    X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y (1)
    상기식에서, X는 수소이거나 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 및 3차-부틸 그룹에서 선택되는 하나 또는 두개의 알킬 그룹이거나, 아세틸 및 석시닐 그룹에서 선택되는 하나 또는 두개의 아실 그룹이고; A1은 결합이며 ; A2는 Tyr이고 ; A3는 Glu 이며; A4는 Pro, Pip, Azd 또는 Tiq 이고 ; A5는 Ile이며 ; A6는 Pro, Pip, Azd, 또는 Tip 이고 ; A7은 Glu이며 ; A8는 Glu 이고 ; A9는 디펩타이드 Ala-Cha 이며 ; A10은 D-Glu 이고 ; Y는 OH, (C1-C6) 알콕시, 및 아미노로부터 선택되는 카복실 말단 잔기이며; 단지 A4와 A6는 모두 Pro가 될 수 없다.
  2. 제1항에 있어서, X가 석시닐인 펩타이드 유도체.
  3. 제1항에 있어서, Y가 OH인 펩타이드 유도체.
  4. 제1항에 있어서, Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pip-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH인 펩타이드 유도체.
  5. 제1항에 있어서, Suc-Tyr-Glu-Pip-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH인 펩타이드 유도체.
  6. 제1항에 있어서, Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Azd-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH인 펩타이드 유도체.
  7. 제1항에 있어서, Suc-Tyr-Glu-Azd-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH인 펩타이드 유도체.
  8. 항응고 유효량의 제1항, 제2 내지 3항 및 제4 내지 7항중 어느 한 항의 펩타이드 유도체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여함을 특징으로 하여, 혈액 응고의 감소를 필요로 하는, 사람을 제외한 동물의 혈액 응고를 감소시키는 방법.
  9. 제1항에서 정의된 바와 같은 일반식 Al 의 적절히 보호된 아미노산을 활성화된 수지 지지체에 결합시키고, 이어서 제1항에서 정의된 바와 같은 다른 일반식 A2 내지 A10 의 α-아미노 보호된 아미노산을, 그의 아미노 보호 그룹을 제거시켜 잠시 노출시킨 펩타이드 쇄의 말단 아미노산 그룹에 결합시킴을 특징으로 하여, 고체상 연속 또는 블럭 합성에 의해 제1항 제2 내지 3항 및 제4 내지 7항 중 어느 한 항의 펩타이드 유도체를 제조하는 방법.
  10. 제1항, 제2 내지 3항 및 제4 내지 7항중 어느 한 항의 펩타이드 유도체를 포함하는 혈액 응고 감소용 약제를 제조하기 위한 조성물.
  11. 제1항, 제2 내지 3항 및 제4 내지 7항 중 어느 한 항의 펩타이드 유도체 항응고 유효량 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 혈액 응고 감소용 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, Suc-Tyr-Glu-Tiq-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH인 펩타이드 유도체.
  13. 제1항에 있어서, Suc-TyrGlu-Pro-Ile-Tip-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OH인 펩타이드 유도체.
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