KR100200463B1 - 항혈소판 작용을 갖는 히루딘 동족체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항응고제로서 유용한 다음 일반식(I)의 펩티드 유도체를 개시한다.
상기 식 중, X는 수소 원자, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 1 또는 2개의 알킬기, 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 1 또는 2개의 아실기, 카르보벤질옥시, H2NC(NH)-, 또는 t-부틸옥시 카르보닐기 중에서 선택된 아미노 말단 잔기이고,
A1은 결합이거나 또는 1 내지 11개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드이고,
A2는 다음 구조식(II) 및 (III) 중 어느 하나의 기이고,
[식 중, Z는 결합이거나 또는 -NH- 또는 N(C1-C4알킬)-기이고,
q는 0 또는 1 내지 5의 정수이고,
R'은 -NH- 또는 -N(H)C(=NH)NH2이고,
B는 -C(=O)-N(R)-, -P-C(=O)N(H), -(R)C(=O)-, -CH2N(R)-, -C(=O)N(R)CH2-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-SO-, 또는 -CH2-SO2(여기서, R은 H 또는 C(1-4)알킬임)이고,
P는 오르토-, 메타-, 또는 파라-페닐렌이거나 또는 1,2- 1,3- 또는 1,4-시클로헥사디일임],
A3은 Phe, SubPhe, β-(2- 및 3-티에닐)알라닌, β-(2- 및 3-푸라닐)알라닌, β-(2-, 3-, 및 4-피리딜)알라닌, β-(벤조티에닐-2- 및 3-일)알라닌, β-(1- 및 2-나프틸)알라닌, Tyr 또는 Trp이고,
A4는 Glu, Asp, Ser(OSO3H), Ser(OPO2H), hSer(OSO3H), 시스테인산 또는 호모시스테인산이고,
A5는 아미노산이고,
A6은 Ile, Val, Leu, Nle 또는 Phe이고,
A7는 Pro, Hyp, 3,4-데히드로 Pro, 티아졸리딘-4-카르복실레이트, Sar, NMePgl 또는 D-Ala이고,
A8은 아미노산이고,
A9는 아미노산이고,
A10은 Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha 및 Pro 중에서 선택된 친유성 아미노산이거나 또는 이들 친유성 아미노산을 적어도 한 개 함유하는 디펩티드이고,
A11은 결합이거나 또는 1 내지 5개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 단편이고,
Y는 OH, C1-C6알콕시, 아미노, 모노- 또는 디-(C1-C4)알킬 치환된 아미노 또는 벤질아미노 중에서 선택된 카르복시 말단 잔기이다.

Description

항혈소판 작용을 갖는 하루딘 동족체
본 발명은 항응고제 및 항혈소판제라는 의학적 용도를 갖는 펩티드 동족체에 관한 것이다.
항응고제는 예를 들면, 급성 심부(深部) 정맥 혈전증, 폐동맥 색전증, 사지의 급성 동맥색전, 심근경색증 및 산재성 혈관내 혈액 응고 등을 약리학적으로 치료하는 데 유용한 치료제이다. 항응고제를 예방 투여함으로써 류머티스성 또는 동맥경화성 심장 질환자의 색전증 재발이 방지되고 수술시에 형전색전으로 인한 일부 합병증이 방지되는 것으로 알려져 있다. 또한 항응고제는 관상동맥 및 뇌혈관 질환의 치료에도 처방되어 왔다. 동맥 혈전증, 특히, 심근 및 뇌에 혈액을 공급하는 동맥에서 발생하는 혈전증은 사망의 주된 원인 중 하나이다.
항혈소판제는 동맥에서 주로 시작되는 혈소판 관련 혈전색전 질환의 약리학적 치료에 있어서 유용한 치료제이다. 예를 들면, 항혈소판제는 심근 경색증 및 뇌졸증의 재발을 방지하는 데 사용될 수 있다.
하루딘은 거머리(leeches)의 침샘에서 단리된, 65개의 잔기로 된 폴리펩티드이다. 히루딘은 항응고제로서 트롬빈 특이적 억제제이다. 거머리 추출물에서 단리한 하루딘은 매우 강력하기는 하지만 제한된 양, 비용 및 그 정도 크기의 외래 단백질 투여에 흔히 따르는 알러지 반응으로 인하여 임상적으로 사용할 수 없다고 여겨진다.
본 발명자들은 이미 항응고 작용의 적어도 부분적인 원인이 되는 히루딘의 특정 부위를 발견하였다. 이 부위는 화학적으로 합성되었으며 그의 특정 동족체는 트롬빈의 인식 부위에-공간적으로 떨어져 있는 효소적 절단 부위가 아니라- 결합하는 것으로 나타났다. 이들 합성 펩티드의 결합은 피브린 생성 및 응괴 형성의 선행 조건인, 트롬빈의 인식 부위에 피브리노겐이 결합하는 것을 경쟁적으로 저지한다.
몇몇 문헌에는 올리고펩티드 Arg-Gly-Asp 및 관련 펩티드가 혈소판 의존성 혈전 형성을 억제하는 능력을 가진 것으로 기재되어 있다[카드로이(Y. Cadroy) 등의 J. Clin. Invest. 제84호, pp. 939-944 (1989) 참조]. 본 발명자들은 항혈소판성 Arg-Gly-Asp 단편과 상기한 히루딘 C-말단 단편 안티트롬빈 동족체를, 두 작용을 모두 갖는 단일체로 편입시키는 몇가지 방법을 발견하였다.
다음 일반식 (I)의 펩티드 유도체 및 제약학상 허용되는 그의 염은 유용한 항응고제이다.
식중,
X는 수소 원자, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 1 또는 2개의 알킬기, 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 1 또는 2개의 아실기, 카르보벤질옥시, H2NC(NH)-, 또는 t-부틸옥시카르보닐기 중에서 선택된 아미노 말단 잔기이고, A1은 결합이거나, 또는 1 내지 11개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드이고, A2는 다음 일반식(Ⅱ) 및 (Ⅲ) 중 어느 하나의 기이고,
[식 중, Z는 결합이거나, -NH- 또는 N(C1-C4알킬)-기이고, q는 0 또는 1 내지 5의 정수이고, R'은 -NH2또는 -N(H)C(=NH)NH2이고, B는 -C(=O)-N(R)-, -P-C(=O)N(H), -N(R)C(=O)-, -CH2N(R)-, -C(=O)-N(R)CH2-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-SO-, 또는 -CH2SO2- (여기서, R은 H 또는 C(1-4)알킬임)이고, P는 오르토-, 메타-, 또는 파라-페닐렌이거나 또는 1,2- 1,3- 또는 1,4-시클로헥사디일임],
A3은 Phe, SubPhe, β-(2- 및 3-티에닐)알라닌, β-(2- 및 3-푸라닐)알라닌, β-(2-, 3-, 및 4-피리딜)알라닌, β-(벤조티에닐-2- 및 3-일)알라닌, β-(1- 및 2-나프틸)알라닌, Tyr 또는 Trp이고,
A4는 Glu, Asp, Ser(OSO3H), hSer(OSO3H), 시스테인산 또는 호모시스테인산이고,
A5는 아미노산이고,
A6은 Ile, Val, Leu, Nle 또는 Phe이고,
A7는 Pro, Hyp, 3,4-데히드로 Pro, 티아졸리딘-4-카르복실레이트, Sar, NMePgl 또는 D-Ala이고,
A8은 아미노산이고,
A9는 아미노산이고,
A10은 Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, Cha 및 Pro 중에서 선택된 친지성 아미노산이거나 또는 이들 친유성 아미노산을 적어도 한 개 함유하는 디펩티드이고,
A11은 결합이거나 또는 1 내지 5개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 단편이고,
Y는 OH, C1-C6알콕시, 아미노, 모노- 또는 디-(C1-C4)알킬 치환된 아미노 또는 벤질아미노 중에서 선택된 카르복시 말단 잔기이다.
본 명세서에서는 다음과 같은 통상적인 아미노산 약어를 사용하였다.
Gly - 글리신
Ala - 알라닌
Val - 발린
Leu - 로이신
Ile - 이소로이신
Cha - 시클로헥실알라닌
Orn - 오르니틴
Pro - 프롤린
Phe - 페닐알라닌
Trp - 트립토판
Met - 메티오닌
Ser - 세린
Thr - 트레오닌
Cys - 시스테인
Tyr - 티로신
Asn - 아스파라긴
Gln - 클루타민
Asp - 아스파르트산
Glu - 글루탐산
Lys - 리신
Hly - 호모리신
Arg - 아르기신
Har - 호모아르기닌
His - 히스티딘
Nle - 노르로이신
Hyp - 히드록시프롤린
Gly - 글루타릴
Mal - 말레일
Npa - β-(2-나프틸)알라닌
3,4-데히드로Pro - 3,4-데히드로프롤린
Tyr(SO3H) - 티로신 설페이트
Pgl - 페닐글리신
NMePgl - N-메틸-페닐글리신
Sar - 사르코신 (N-메틸글리신)
pSubPhe - 파라 치환 페닐알라닌
SubPhe - 오르토, 메타, 또는 파라, 모노-, 또는 디- 치환 페닐알라닌
DAla - D-알라닌
Ac - 아세틸
Suc - 숙시닐
pClPhe - 파라-클로로-페닐알라닌
pNO2Phe - 파라-니트로-페닐알라닌
Tyr(Me) - O'-메틸-4-티로신
5GP - 5 구아니디노펜틸
5AP - 5 아미노펜틸
알킬기, 및 알콕시기의 알킬 부분은 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 알킬기, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, sec-펜틸, 시클로펜틸, 헥실, 이소헥실, 시클로헥실 및 시클로펜틸메틸을 포함한다. 2 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 아실기는 직쇄, 분지쇄, 시클릭, 포화 및 불포화 아실기로서 기 당 1 또는 2개의 카르보닐 잔기를 가지며, 예를 들면 아세틸, 벤조일, 숙시닐, 말레일 및 글루타릴이다. 할로겐기는 풀루오로, 클로로, 브로모 또는 요오드기이다.
본 명세서에서 사용된 아미노산에는 천연 아미노산뿐 아니라 천연 펩티드의 합성 동족체를 제조할 때 펩티드 화학 분야의 업자들이 통상적으로 이용하는 비단백질 α-아미노산이 포함된다. 천연 아미노산으로는 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 세린, 메티오닌, 트레오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 프롤린, 히스티딘, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 아르기닌, 오르니틴 및 리신이 있다. 비단백질 α-아미노산의 예로는 노르로이신, 노르발린, 알로이소로이신, 호모아르기닌, 티아프롤린, 데히드로프롤린, 히드록시프롤린(HyP), 호모세린, Ser (OSO3H), hSer(OSO3H), 시스테인산, 호모시스테인산, 시클로헥실글리신(Chg), α-아미노-n-부티르산(Aba), 시클로헥실알라닌(Cha), 아미노페닐부티르산(Pba), 페닐잔기의 오르토, 메타, 또는 파라 위치에서 (C1-C4)알킬, (C1-C4)알콕시, 할로겐 또는 니트로기 중의 1 또는 2개에 의해 치환되거나 메틸렌디옥시기에 의해 치환된 페닐알라닌, β-2- 및 3-티에닐알라닌, β-2- 및 3-푸라닐알라닌, β-2-, 3- 및 4-피리딜알라닌, β-(벤조티에닐-2- 및 3-일)알라닌, β-(1- 및 2-나프틸)알라닌, 세린, 트레오닌 또는 티로신의 O-알킬치환된 유도체, S-알킬 치환 시스테인, 티로신의 O-황산 에스테르, 3,5-디요오드티로신 및 천연 아미노산의 D-이성질체가 있다. 아미노산에는 또한 다음 일반식 (IV), (V) 및 (VI)의 천연 및 비단백질 α-아미노산을 포함시키기로 한다.
식 중, p, q 및 r은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, R은 수소 원자 또는 (C1-C4)알킬기이다.
친지성 아미노산에는 Tyr, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, His 및 Pro가 있다.
글리신을 제외한 천연 아미노산은 비대칭 탄소 원자를 함유한다. 특별히 다른 지시가 없는 한 일반식 (IV), (V) 및 (VI)으로 표시되는 아미노산을 포함하여 본 명세서의 광학 활성 아미노산은 L-배열이다. 예를 들면, A1또는 A10기 중의 어떠한 아미노산도 D- 또는 L-배열일 수 있다. 통상 그러하듯이 본 명세서에 기재된 펩티드의 구조는 아미노 말단이 사슬의 왼쪽이고 카르복시 말단이 사슬의 오른쪽이다. 또한, 마찬가지로 아미노산에 대한 3자 약어를 사용하는 경우에 대문자로 시작되는 3자 약어는 L-배열이고, 소문자로 시작되는 3자 약어는 D-배열이다.
일반식 (I)의 폴리펩티드는 무독성인 유기 또는 무기산과 제약학상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 적당한 염을 형성하는 무기산의 예로는 염산, 브룸화수소산, 황산, 인산, 또는 오르토인산 일수소나트륨 및 황산수소칼륨과 같은 산 금속염을 들 수 있다. 적당한 염을 형성하는 유기한의 예로는 모노, 디 및 트리카르복실산이 있다. 이러한 산의 예를 들면, 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 히드록시말레산, 벤조산, 히드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 2-페녹시 벤조산, 및 메탄술폰산 및 2-히드록시에탄술폰산과 같은 술폰산이 있다. 카르복시 말단 아미노산 잔기의 염에는 적당한 무기 또는 유기 염기와 함께 형성한 무독성 카르복실산염이 포함된다. 이들 염의 예로는, 나트륨 및 칼륨과 같은 알카리 금속, 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속, 알루미늄을 비롯한 IIIA족 경금속, 및 예를 들면, 트라알킬아민(예, 트리에틸아민), 프로카인, 디벤질아민, 1-에텐아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디히드로아비에틸 아민, N-(저급)알킬피페리딘 및 기타 적당한 아민과 같은 1급, 2급 및 3급 유기 아민의 염이 있다.
일반적으로 표시되는 모든 화합물군에서와 마찬가지로 특정한 기들이 바람직하다. 일반식 (I) 중의 X가 수소 원자, 아세틸 또는 숙시닐인 펩티드 유도체가 바람직하다.
또한, 일반식 (I) 중의
A2가 상기 정의된 바와 같으며(여기서, R'은 -N(H)C(=NH)NH2이고, Z는 -NH- 또는 결합이고, B는 -C(=O)-N(H)-임),
A3이 바람직하기로는 Phe, β-2- 또는 3-티에닐알라닌, Tyr, Trp, Npa, pClPhe 또는 Tyr(Me)이며, q가 2 내지 4의 정수이고,
A4가 Glu이며,
A5가 Glu, Asp, Pro 또는 Ala이고,
A6이 Ile, Leu이며,
A7이 Pro, Sar, D-Ala, Hyp 또는 NMePgl이고,
A8이 Glu, Gln, Asp 또는 Ala이며,
A9가 Glu, Asp 또는 Ala이고,
A10이 Pro, Ala-Tyr, Ala-Cha, Tyr-Cha, Tyr-Leu, Ala-Phe, Tyr-Tyr이며,
A11이 Glu, glu, Asn, Asp-Glu, Pro, Gln, Ala, 결합, D-Lys, Lys, asp 또는 Orn이고,
Y가 OH 또는 NH2
인 화합물이 바람직하다.
또한 일반식 (I) 중의
X가 수소 원자이고,
A1이 결합이고,
A2가 상기 일반식 (III)의 구조를 가지며 (여기서, Z는 결합이고, q는 0이고, R' 및 P는 상기 정의한 바와 같음),
A3이 바람직하기로는 Phe, β-2- 또는 3-티에닐알라닌, Tyr, Trp, Npa, pClPhe 또는 Tyr(Me)이고, q가 2 내지 4의 정수이고,
A4가 Glu이며,
A5가 Glu, Asp, Pro 또는 Ala이고,
A6이 Ile, Leu이며,
A7이 Pro, Sar, D- Ala, Hyp 또는 NMePgl이고,
A8이 Glu, Gln, Asop 또는 Ala이며,
A9가 Gln, Asp 또는 Ala이고,
A10이 Pro, Ala-Tyr, Ala-Cha, Tyr-Cha, Tyr-Leu, Ala-Phe, Tyr-Tyr이며,
A11이 Glu, glu, Asn, Asp-Glu, Pro, Gln, Ala, 결합, D-Lys, Lys, asp 또는 Orn이고,
Y가 OH 또는 NH2
인 화합물이 바람직하다.
특히, 일반식 (I) 중의 X가 숙시닐 또는 수소 원자이고 A1이 Gly-Asp 또는 Asp이거나, 또는
X가 숙시닐이고 A1이 결합이고,
A2가 상기 일반식 (II)의 구조를 가지며 (여기서, Z는 -NH- 또는 결합이고, R'은 H2NC(=NH)NH-이며, q는 3이고, B는 -C(=O)NH-임),
A3이 Phe, Tyr, Tyr(Me) 또는 Trp이고,
A4가 Glu이며,
A5가 Glu 또는 Pro이고,
A6이 Ile이며,
A7이 Pro이고,
A8이 Glu이며,
A9가 Glu 또는 Asp이고,
A10이 Tyr-Leu, Ala-Tyr, Tyr-Tyr, Ala-Phe, Ala-Cha 또는 Pro이며,
A11이 Glu, Asp, Pro, 결합, D-Asp, D-Lys, glu 또는 Asp-Glu이고,
Y가 OH 또는 NH2
인 펩티드 유도체가 바람직하다.
또한, 일반식 (I)중의
X가 수소 원자이고,
A1이 결합이며,
A2가 상기 일반식 (III)의 구조를 가지며(여기서, Z는 결합이고, q는 0이고, P는 파라페닐렌 또는 1,4-시클로헥사디일이며, R'는 -NH2또는 -N(H)C(=NH)NH2임),
A3이 Phe 또는 Trp이고,
A4가 Glu 또는 Pro이며,
A5가 Glu 또는 Pro이고,
A6이 Ile이며,
A7이 Pro이고,
A8이 Glu이며,
A9가 Glu 또는 Asp이고,
A10이 Ala 또는 Cha이며,
A11이 glu이고,
Y가 OH 또는 NH2
인 펩티드 유도체가 특히 바람직하다.
본 발명의 단백질은 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법에는 고상 순차 및 블록 합성법, 유전자 클리닝 및 이들 기술을 조합하여 이용하는 것이 포함된다. 고상 순차법은 자동 펩티드 합성기를 사용하는 등의 이미 확립된 자동 합성법을 이용하여 수행할 수 있다. 이 방법에서는, α-아미노 보호된 아미노산을 수지 지지체에 결합시킨다. 수지 지지체로서는 폴리펩티드를 고상으로 제조하는 데 당업계에서 통상적으로 사용되는 적당한 수지이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 디비닐벤젠 0.5 내지 약 3 퍼센트를 써서 가교결합시키고 클로로메틸화 또는 히드록시메틸화하여, 처음에 도입되는 α-아미노 보호된 아미노산과 에스테르를 형성할 수 있는 부위를 제공하도록 한 폴리스티렌이 바람직하다.
히드록시메틸화 수지의 예가 보단츠키(Bodanszky) 등의 문헌 [Chem. Ind. (London) 제 38권, pp. 1597-1598 (1966)]에 기재되어 있다. 클로로메틸화 수지는 미국 캘리포니아주 리치몬드에 소재하는 바이오 라드 레보리토리즈 (Bio Rad Laboratories)에서 구입할 수 있고, 이러한 수지의 제조 방법이 스튜어트(Stewart)등의 문헌[Solid Phase Peptide Synthesis(Freeman Co., 샌프란시스코) 제1장, pp. 1-6 (1969)]에 기재되어 있다. 보호된 아미노산을 지센(Gisin)의 문헌[Helv. Chem. Acta, 제56권, p. 1476 (1973)]에 기재된 방법으로 수지에 결합시킬 수 있다. 수지에 결합시킨 보호된 아미노산이 여러 가지 시판되고 있다. 예를 들면, 카르복시 말단이 Thr 잔기인 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위해서 벤질화, 히드록시메틸화 페틸아세트아미도메틸(PAM) 수지에 결합된 tert-부틸옥시카르보닐(BOC) 보호된 Thr을 사용할 수 있는데, 시판되고 있다.
α-아미노 보호된 아미노산을 수지 지지체에 결합시킨 후에 염화 메틸렌 중의 트리플루오로 아세트산, 트리플루오로아세트산 단독 또는 디옥산 중의 HCl을 사용하는 것과 같은 적당한 방법으로 보호기를 제거한다. 보호기 제거는, 0℃ 내지 실온의 온도에서 수행한다. 특정 α-아미노 보호기를 제거하기 위하여 다른 표준 분해 시약 및 조건을 사용할 수도 있다. α-아미노 보호기를 제거한 후에, 아미노 보호된 다른 아미노산을 목적하는 서열에 따라 순차적으로 결합시킨다. 별법으로, 수지 지지된 아미노산 서열과 결합시키기 전에 여러 개의 아미노산기를 용액법으로 결합시킬 수도 있다.
폴리펩티드 서열에 도입되는 각각의 아미노산에 사용되는 α-아미노 보호기로는 당업계에 알려진 것을 어느 것이나 사용할 수 있다. 바람직한 α-아미노 보호기의 군에는 (1) 아실형 보호기 : 포르밀, 트리플루오로아세틸, 프탈릴, 톨루엔 술포닐(토닐), 밴진술포닐, 니트로페닐술페닐, 트리틸술페닐, o-니트로페녹시아세틸 및 α-클로로부티릴, (2) 방향족 우레탄형 보호기 : 벤질옥시카르보닐 및 치환된 벤질옥시카르보닐(예, p-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카로보닐, p-메톡시벤질옥시카르보닐, 1-(p-비페닐린)-1-메틸에톡시카르보닐 α, α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐 및 벤즈히드릴옥시카르보닐, (3) 지방족 우레탄형 보호기 : tert-부틸옥시카르보닐(BOC), 디이소프로필메톡시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐 및 알릴옥시카르보닐, (4) 시클로알킬 우레탄형 보호기 : 시클로펜틸옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐 및 시클로헥실옥시카르보닐, (5) 티오우레탄형 보호기 : 페닐티오카르보닐, (6) 알킬형 보호기 : 트리페닐메틸(트리틸) 및 벤질, 및 (7) 트리알킬실란 군 : 트리메틸실란이 있다. 바람직한 α-아미노 보호기는 tert-부틸옥시카르보닐이다.
적당한 결합제의 선택은 당업계의 기술수준에서 가능하다. 결합할 아미노산이 Gln, Asn 또는 Arg인 경우 특히 적당한 결합제는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸이다. 이들 시약을 사용함으로써 니트릴 및 락탐 형성을 방지한다. 다른 결합제로는 (1) 카르보디이미드(예, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 및 N-에틸-N'-(γ-디메틸아미노프로필카르보디이미드), (2) 시아나미드 (예, N,N'-디벤질시아나미드), (3) 케텐이민, (4) 이속사졸륨염(예, N-에틸-5-페닐-이속사졸륨-3'-술포네이트), (5) 환 내에 1 내지 4개의 질소 원자를 갖는 방향족성 질소함유 복소단환식 아미드, 예를 들면 이미다졸리드, 피라졸리드 및 1,2,4-트리아졸리드, 특히 카르보닐디이미다졸 및 N,N'-카르보닐-디-1,2,4-트리아졸, (6) 알콕실화 아세틸렌(예, 에톡시아세틸렌), (7) 아미노산의 카르복시 잔기와 함께 혼합 무수물을 형성하는 시약(예, 에틸클로로포르메이트 및 이소부틸클로로포르메이트) 또는 결합될 아미노산의 대칭 무수물(예, BOC-Ala-O-Ala-BOC) 및 (8) 고리의 질소 원자 1개의 히드록시기가 결합된 질소 함유 복소환식 화합물(예, N-히드록시프탈이미드, N-히드록시숙신이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸)이 있다. 카푸어(Kapoor)의 문헌[J. Pharm. Sci. 제59권, pp. 1-27 (1970)]에는 다른 활성화 시약 및 펩티드 결합에서의 그외 용도가 기재되어 있다. Arg, Asn 및 Gln을 제외한 모든 아미노산에 대한 결합제로서 대칭 무수물을 사용하는 것이 바람직하다.
각각의 보호된 아미노산 또는 아미노산 서열을 약 4배 과량으로 고상 반응기에 도입하고 디메틸포름아미드: 염화메틸렌(1:1) 또는 디메틸포름아미드 단독 또는 바람직하기로는 염화메틸렌 단독 매질 중에서 결합을 수행한다. 결합이 완전히 이루어지지 않은 경우에는, 고상 반응기 중에서 다음 차례의 아미노산을 결합시키기 전에 α-아미노 보호기를 제거하지 않은 채로 결합 반응을 반복한다. 합성의 각 단계에서 결합 반응의 성공을 카이저(E, Kaiser) 등의 문헌[Analyt. Bihocem. 제34권, p. 595 (1970)]에 기재된 바와 같이 닌히드린 반응에 의해 확인한다.
목적하는 아미노산 서열을 얻은 후에 수지에서 펩티드를 수거한다. 이것은 수지에 결합된 폴리펩티드를 묽은 플루오르화수소산 수용액 중의 디메틸 설파이드, p-크레졸 및 티오크레졸 용액을 사용하여 처리하는 것과 같은 가수분해법으로 수행할 수 있다.
고상 펩티드 합성 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 다수의 아미노산은 사슬 형성 도중에 보호가 필요한 관능기를 가지고 있다. 당업자라면 적당한 보호기를 사용하고 선택하는 것이 가능할 것이고, 이것은 보호할 아미노산 및 펩티드 상의 다른 보호된 아미노산의 존재에 좌우될 것이다. 이러한 측쇄 보호기의 선택은 α-아미노잔기의 보호기를 절단하는 과정에서 절단되지 않는 것이어야 한다는 점에서 중요하다. 예를 들면, 리신에 대한 적당한 측쇄 보호기로는 벤질옥시카르보닐 및 치환된 벤질옥시카르보닐 [이 치환체는 할로(예, 클로로, 브로모, 플루오로) 및 니트로임 (예, 2-클로로벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, 3,4-디클로로벤질옥시카르보닐)], 토실, t-아밀옥시카르보닐, t-부틸옥시카르보닐 및 디이소프로필메톡시 카르보닐이다. 트레오닌 및 세린의 알콜성 히드록시기는 아세틸, 벤조일, tert-부틸, 트리틸, 벤질, 2,6-디클로로벤질 또는 벤질옥시 카르보닐기를 사용하여 보호할 수 있다. 바람직한 보호기는 벤질이다.
이들 기는 당업계에 잘 알려진 방법으로 제거될 수 있다. 전형적으로는 펩티드 사슬 합성이 완결된 후에 보호기를 제거하지만, 다른 적당한 시기에 제거할 수도 있다.
본 발명의 펩티드 동족체의 항혈소판 용량은 환자, 치료할 혈전 질환의 병세 및 선택된 펩티드 동족체에 따라 1일 체중 1kg 당 0.2mg 내지 250mg이다. 각 환자의 적정 용량은 용이하게 결정할 수 있다. 전형적으로는 1회 투여 당 활성화합물 5mg 내지 100mg을 1일 1 내지 4회 투여하는 것이 바람직하다.
항혈소판 요법은 심근 경색증 및 뇌졸증의 재발 방지뿐만 아니라, 혈소판 응집과 관련된 다른 질환에도 처방된다. 당업자라면 응고 억제 및 항혈소판 요법이 요구되는 상황을 용이하게 알 수 있을 것이다. 본 명세서에서 사용된 환자는 사람을 포함함 영장류, 양, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐 및 마우스와 같은 포유 동물을 뜻한다.
펩티드 유도체의 일부는 경구 투여 후 내장을 통과할 때까지 온전히 유지되지만, 비경구 투여, 예를 들면, 피하, 정맥내, 근육내, 또는 복강내 투여; 데포 주사에 의한 투여; 이식제제; 또는 본 발명의 펩티드 유도체를 분무 또는 건조 분말 형태로 담은 에어로졸 등으로, 코, 인후 및 기관지 등의 점막에 투여하는 것이 바람직하다.
비경구 투여의 경우에, 본 발명의 화합물은 계면활성제 및 기타 제약학적으로 허용되는 보조제를 첨가하거나 하지 않은 물 및 오일과 같은 멸균 액체인 제약담체와 함께 생리학적으로 허용되는 희석제 중의 용액 또는 현탁액으로 하여 주사용 제형으로 투여할 수도 있다. 이들 제제에 사용할 수 있는 오일의 예로는 석유계, 동물성, 식물성 또는 합성 오일, 예를 들면 낙화생유, 대두유, 및 광유가 있다. 일반적으로, 물, 염수, 덱스트로스 및 관련 당 수용액, 에탄올 및 글리콜(예, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜)이 특히 주사용 용액제에 바람직한 액상 담체이다.
본 발명의 화합물은 활성 성분의 지속적 방출이 가능한 방식으로 구성할 수 있는 데포 주사제 또는 이식물의 형태로 투여될 수 있다. 활성 성분은 펠렛 또는 작은 실린더형으로 압축하여 데포 주사제 또는 이식물로서 피하 또는 근육 내에 이식할 수 있다. 이식물의 경우에는 생분해성 중합체 또는 합성 실리콘[예, 실라스틱(Silastic), 다우-코닝 코포레이션(Dow-Corning Corporation)제 실리콘 고무]과 같은 불활성 재료를 사용할 수 있다.
[실시예]
본 발명은 다음 실시예에 의해 예시되나 이에 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
5GP-Gly-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH의 제조
0.66 mmol/g BOC-(Bzl)D-Glu-수지 0.1 밀리몰을 사용하여 고상법으로 펩티드를 합성하였다. Nα-BOC-아미노산[펩티드 인터내셔널(Peptides International )] 2.0 밀리몰을 사용하여 2중 대칭 무수물 커플링을 수행하였다. 사용된 측쇄 보호기는 Asp(Chx), Trp(CHO), Glu(Bzl)이었다. 합성이 완결되었을 때 염화메틸렌 중의 50% 트리플루오로아세트산을 사용하여 Nα-BOC 보호기를 제거하였다. 염화메틸렌을 사용하여 수지를 3회 세척하고, 염화메틸렌 중의 10% 디이소프로필에틸아민을 사용하여 3회 세척하여 중화시키고, 염화메틸렌을 사용하여 3회 세척한 후 진공 중에서 건조시켰다. 0℃에서 35분 동안 2% 아니솔을 함유한 HF를 사용하여 펩티드에서 보호기를 제거하고 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 0℃, 진공 중에서 HF를 제거하고 에틸 에테르를 사용하여 펩티드를 침전시키고, 30% 아세트산 수용액을 사용하여 수지로부터 추출하고, 동결 건조시켰다.
이 조야한 5-AP 동족체의 1/2 량을 5℃에서 16시간 동안 O-메틸이소우레아로 처리하여 조야한 5-GP 동족체를 얻었다.
이 펩티드를 세파덱스 G-15컬럼(92 x 2.6cm) 상에서 5% 아세트산 수용액으로 탈염시켜 정제하고 동결건조시켰다. C18Vydac 218TP1010 컬럼(250 x 10mm)상에서 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 중의 24% 아세토니트릴을 분 당 5ml의 속도로 사용하여 예비 HPLC를 수행하였다. 주 피크의 용출물을 모아서 동결건조시켰다. HPLC 및 TLC에 의해 균질성을 조사하였다.
동일한 방법으로 다음 실시예 2 내지 6의 펩티드를 제조하였다.
[실시예 2]
5AP-Gly-Asp-Trp-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH
[실시예 3]
Arg-Gly-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH
[실시예 4]
5AP-Gly-Asp-TryOCH3)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH
[실시예 5]
Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Arg-Gly-Asp-Phe-glu-OH
[실시예 6]
5GP-Gly-Asp-TryOCH3)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH
[실시예 7]
4-아미노메틸벤조일-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH
[실시예 8]
4-구아니디노메틸벤조일-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH
[실시예 9]
4-아미노메틸-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH
[실시예 10]
4-구아니디노메틸시클로헥실카르보닐-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH
[실시예 11]
[실시예 12]
실시예 1 내지 12의 펩티드는 다음과 같은 성질을 나타내었다.

Claims (12)

  1. 로 이루어진 군에서 선택된 펩티드 동족체 또는 제약학상 허용되는 그의 염 유효양을 함유하는, 항응고 또는 항혈소판 처지용 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 펩티드 동족체가 5GP-Gly-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH인 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 펩티드 동족체가 5AP-Gly-Asp-Trp-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH인 제약 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 펩티드 동족체가 H-Arg-Gly-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH인 제약 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 펩티드 동족체가 5AP-Gly-Asp-Try(Me)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH인 제약 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 펩티드 동족체가 5GP-Gly-Asp-Try(Me)-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH인 제약 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 펩티드 동족체가 4-아미노메틸벤조일-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH인 제약 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 펩티드 동족체가 4-구아니디노메틸벤조일-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH인 제약 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 펩티드 동족체가 4-아미노메틸-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH인 제약 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 펩티드 동족체가 4-구아니디노메틸시클로헥실카르보닐-Asp-Trp-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH인 제약 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 펩티드 동족체가 4-아미노메틸시클로헥실카르보닐-Gly-Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH인 제약 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 펩티드 동족체가 4-구아니디노메틸시클로헥실카르보닐-Gly-Asp-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH인 제약 조성물.
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