CN1130911A - 用于对抗hiv的多分支型肽构建物 - Google Patents

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Abstract

多分支型肽构建物，系由来自HIV-1的gp120糖蛋白上的V3环的肽所形成，其包含一致序列GPGR，在该序列前有0至4个氨基酸残基，该序列后有2至4个氨基酸残基，较佳的是在GPGR前的3个氨基酸中不包含I，最佳者为GPGRAF，该多分支型肽构建物显示出受体亲和力增加，且可防止细胞—细胞的融合。其具有直接的病毒静电作用。因该构建物呈现出相同肽构建物序列好几次，一些MBPCs在活体外能中和好几株HIV-1和HIV-2的病毒被膜/细胞膜融合和感染细胞膜/未感染细胞膜融合的不同阶段产物。令人注意的是，它们可有效地阻断淋巴细胞和巨噬细胞上的CD4受体与直肠上皮细胞的GaCer受体。这些结果在HIV-1与HIV-2感染的治疗上开辟了具有潜力的用途。

Description

用于对抗HIV的多分支型肽构建物
发明背景
人类免疫缺陷病毒(HIV)被推定是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)之病原体。HIV可在不同类型细胞中建立一持续性的感染；许多细胞可表现出一种抗原CD4受体作为其表面的结合。在此种细胞中，细胞感染的第一步骤通过HIV被膜糖蛋白与细胞CD4表面抗原结合而产生病毒接合。在该接合後随後发生一连串有关病毒被膜与靶细胞膜之融合与内含化的事件，通过这一系列事件细胞受到感染。HIV感染的细胞可感染其它细胞，且形成合胞体(巨大多核细胞)。在HIV-1感染细胞与未感染的CD4+细胞(该细胞具有CD4受体)间的合胞体形成涉及在CD4受体与HIV表面被膜糖蛋白间的相互作用。此步骤可被水溶性CD4、抗-CD4抗体与抗-V3抗体所阻断。
在活体中与细胞-细胞间病毒散布有关的细胞融合步骤可使血浆中和抗体渐不明显，且导致病毒由因淋巴细胞耗尽而已受损的免疫系统中逃逸。由HIV所活化的B淋巴细胞产生不同的抗体群。一些抗体不干扰gP120-CD4的相互作用，但可阻碍膜的融合，即与细胞感染有关的步骤。这些抗体基本上是针对被膜糖蛋白V3环的。
由於在不同的HIV-1分离株中V3环为高变化性的，抗V3抗体一般仅中和已产生抗体之分离株。因此中和作用仅限於该分离株，被称为对分离株特异性的。这些抗体通过抑制细胞融合而起作用，而对细胞-病毒结合不具任何活性。
现已进行了一些尝试，用V3环相关的肽抑制HIV的感染，但这样的肽会引起功效问题。例如De Rossi等人[Virology184，187-196(1991)]发现一些V3环可增强病毒的感染力。其它从V3环合成的肽，无论环型或非环型，在细胞融合的重要步骤上均无作用。因此，与该病毒分离株无关的可阻碍病毒-细胞融合和细胞-细胞融合的拮抗剂肽尚未被开发出来。
近来，一些研究已显示出HIV-1及HIV-2的与CD4无关的细胞感染途径，提示至少有一可替代的病毒受体之存在。近来这些推定为非CD4的HIV受体之一已於CD4 -脑衍生细胞及直肠上皮细胞上鉴定出。此受体为中性糖脂类，称为半乳糖基神经酰胺(GalCer)。脑与肠中CD4-/GalCer+细胞的HIV感染可解释在这些器官中与HIV相关的一些疾病。再者，在一些粘膜上皮细胞顶侧上有GalCer的存在可有助於性交时病毒的进入。尚未由V3环衍生的肽显示具有阻断GalCer受体的能力。
为克服上述问题，在聚合物中使用赖氨酸构架的径向分支系统已被J.P.Tam所使用[Proc Natl.Acad.Sci.USA，85，5409-5413(1988)]，以发展出无需使用载体的抗原。这些抗原被设计以产生对抗各种疾病的疫苗。更具体地说，用於产生对抗HIV感染的疫苗的抗原已被Tam在PCT申请案WO93/03766中所描述，该抗原基本上包含有IGPGR序列(此为对氨基酸的IUPAC传统单字母命名)，且长度为11个氨基酸者在引起有用的免疫反应上是有效的。Id.第13页，第29-31行。但是，这样的抗原被认为并非是对任何疾病的直接潜在治疗方法，而是旨在激发体内免疫原反应。发明的摘要
本发明包括用於治疗HIV感染患者的方法和肽构建物。按照该方法，用於治疗给药的多分支型肽包含有一接合有2至64个肽的核心基质，每一个肽包含有氨基酸序列GPGR，在该序列前有0至4个氨基酸残基，该序列後有2至4个氨基酸残基。附图的简要说明
图1为推测的HIV与CD4+或CD4-细胞的结合机构。
图2为显示多分支型肽构建物(MBPCs)对於以三株不同HIV进行人体外周血液淋巴细胞(PBLs)感染上的功效测定的结果，其量为p24(Pg/ml)，或反转录酶(RT)活性对三种不同的MBPCs作图，1-无；2-[GPGRAF]8-多赖氨酸核心(MLC)；3-[RKSIHIGP-GRAFYT]4-MLC：
4-[PPPYVEPTTTQC]4-MLC。
图3为MBPCs对人体巨噬细胞感染的结果，以MBPCs对p24(Pg/ml)的量作图，使用五种不同的MBPCs：1-无；2-[GPGRAF]8-MLC；3-[GPGRAF]-MLCD；4-[GPG(R)DAF]9-MLC；5-[RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC；6-[PPPYVEPTTTQC]4-MLC。
图4A描绘在无任何MBPCs时感染培养物的合胞体形成。
图4B显示在以[GPGRAF]8-MLC处理的巨噬细胞中不存在合胞体的形成。
图5A显示MBPCs通过GalCer受体对人体上皮细胞感染的作用。
图5B显示MBPCs阻断gp120与GalCer受体结合的能力。
图6A、6B、7A、7B及7C均显示与用长的MBPC所免疫的家兔血清相比，用短的MBPC免疫的家兔血清相对无反应性。发明的详细说明I.结构
本发明涉及多分支型肽构建物(MBPCs)，它可抑制HIV感染与HIV感染的扩散与延续。MBPCs具有肽共价结合于其上的核心基质。该核心基质为树枝状聚合物，实际上是具有分支的，较佳为其每一分支均相同。该核心基质以至少具有两官能团的核心分子作为基础，而具有末端官能团的分子分支共价结合至该核心基质的官能团上。合适的核心分子包含氨或乙二胺。合适的分子分支包含在核心分子上聚合的丙烯酸酯单体。这种分子可被创建而呈现出多少不等的分支，这取决于从中心分子所分支出的单体数目。此处欲使用者为具有2至64分支，较佳是4至16分支之MBPCs。
用於形成该核心基质的例子为赖氨酸。一个中心赖氨酸残基与两个赖氨酸残基相结合，这两个赖氨酸中每一个通过其羰基与中心赖氨酸残基上的一个氨基结合。这提供一个具有4个氨基的分子，该分子可以是具有4个肽的MBPC的核心基质。或者，可提供具有8个分支的分子，通过它们的羧基将4个赖氨酸残基结合到接合於中心赖氨酸的赖氨酸残基上的一个氨基上而制成。此分子可用作为具有8个肽的MBPC的核心基质，或者可得到8个赖氨酸残基以形成具有16个肽的MBPCs的核心基质。可容易地看到，如有需要，同样可构建出更大的MBPCs，例如具有32个分支者。
肽的C-端共价结合到核心基质的每一分支上，以形成MBPC。这些肽可以相同(较佳)，或彼此不同。所得的分子在其表面上具有一簇肽，其内部核心未呈现出来，因此不具抗原性。具有肽但不同於在此所欲的结构的例子，参见J.P.Tam[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5409-5413(1988)]及Tam的美国专利第5229490号及其所引述的参考资料。
如果需要，在肽与核心基质间可包含隔子。第一个赖氨酸残基的羧基可呈游离状、被酰胺化、或偶联到β-丙氨酸或另一阻碍化合物上。
肽可包括D-或L-氨基酸残基。D-氨基酸在活体中持续较久，因其较难为蛋白酶所切割，但是L-氨基酸如下所讨论的具有较佳活性。
此外，肽类似物-使用肽的碳骨架但省略-CONH-肽键的合成构建物可用来取代肽。因此应该理解，有关此处所述的肽的文献亦可被认为包含肽类似物。一般相信肽类似物对肽酶均具有较高的抗性，且在活体中持续较久。
本发明的MBPCs包括从HIV-1病毒表面被膜糖蛋白gpl20的V3环所衍生出的肽，且包括其一致(consensus)氨基酸序列GP-GR(以IUPAC单字母氨基酸命名方式，相当于Gly-Pro-Gly-Arg)。该MBPCs在不同细胞类型的人体细胞培养物中，对抑制HIV感染是有效的。该抑制显然与病毒株无关，而且甚至在对抗HIV-2上亦有效。因此，它们具有极令人吃惊的治疗性质。
应当注意的是，相应的单体肽不具有任何治疗效应。据信，这种差异的发生是由于该核心基质会引起该肽的构象改变。特别是，且意想不到的是，发现了当GPGR单体接合至核心基质上时，在该肽中GPGR後的两个氨基酸会弯曲。因此，较佳是在接合於核心基质的肽中，GPGR後至少有两个氨基酸。但是，若该肽太长会使MBPC变得具有抗原性，不合要求的是在GPGR序列後具有4个以上氨基酸且在该序列前具有4个以上氨基酸。因此，该肽具有12个或更少的氨基酸。
显示对HIV-1和HIV-2反转录病毒所致感染有抑制活性的特殊MBPCs包含如下使用IUPAC命名氨基酸所述的肽：
               表1-例示MBPCsMBPC.1：    (GPGRAFY)8-(K)4-(K)2-K-βA-OH或
        (GPGRAFY)8-(K)4-(K)2-K-βA-NH2MBPC.3：    (GPGRAF)8-(K)4-(K)2-K-βA-OH或
        (GPGRAF)8-(K)4-(K)2-K-βA-NH2MBPC.12     (GPGRAF)16-(K)8-(K)4-(K)2-K-βA-OH或
        (GPGRAF)16-(K)8-(K)4-(K)2-K-βA-NH3
上述β-丙氨酸上所显示出的OH未端是指羧基，其氨基已接在赖氨酸残基的羧基上。而NH2末端则为β-丙氨酸的羧基之修饰，以形成羧酰胺未端；该β-丙氨酸仍然以其氨基接合到赖氨酸的羧基上。在下述的实施例中是使用OH形式的。
虽然肽应含有具有所需疗效的一致序列GPGR，但在GPGR前包含异亮氨酸的构象序列，例如IGPGR或IXXGPGR(其中X为任意的氨基酸残基)，系衍生自V3环，被发现当包含IGPGR序列的肽为12或更少个氨基酸残基时，会使该MBPC在治疗上效用变差或不具效用，故较佳的是在此不使用该序列。在GPGR前3个氨基酸内存在的异亮氨酸(I)序列是相当保守的，是在约98％的HIV基因组中发现的，然而，令人吃惊的是，去发现它不是所需要的。
除了MBPCs含有IGPGR或IXXGPGR序列是不佳的外，若复制的肽长於12个氨基酸残基时，则具有该肽的MBPCs被发现会阻碍合胞体的形成。例如，一可阻碍合胞体形成之较大MBPC为结合到一四分支MBPC的每一分支上的肽为RKSIHIGPGRAFYT。然而，如此大的MBPCs是不合理想的，因为如此的大分子已显示会产生抗体，即使是在低浓度下(10M-4)，且为HIV感染之病人的抗体所识别并抑制，而这两种现象使该大分子被排除在长期用於HIV感染病人之外。这些MBPCs在接近其有效浓度时在细胞培养物上亦显示毒性。而且，这些MBPCs的大小会使其在制造上困难且昂贵，且对蛋白酶的降解更为敏感。
因此，本发明提供一种MBPC，它包含一核心基质，在该核心基质上接有2至64个肽，以4至32个肽为佳，每一个肽包含有氨基酸序列GPGR，在该序列前有0至4个氨基酸残基，在该序列後有2至4氨基酸残基。较佳者为，在G前三个氨基酸内不含有I序列，如IGPGR或IXXGPGR，其中X为氨基酸残基。较佳的是，接合到8或16分支核心基质上的肽为GPGRAF。但是，一般相信当取代的氨基酸具有相同性质时，在AF上的取代是可能的，而是合乎要求的，因为AF显然对蛋白酶敏感，因此在活体中是易损坏的。II.MBPCs的制备
具有肽结合于其上的分支核心MBPC结构体先前被称为多抗原性肽)的制造在现有技术中属已知的。参见于Tam等人J.Im-mun.148，914-920(1992)及Wang等人Scinece，254，285-288(1991)。对制备少量(在1公斤以下)而言，较佳者为使用固相方法得到该MBPCs。该肽键的逐步组合可自动地在4-(氧甲基)-苯基-乙酰氨基甲基共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)上进行。可使用该Boc/苯基技术，该技术包含用羟基苯并三唑活性酯(Boc-氨基酸-OBt)进行的系统双偶联。由树脂上裂解出的最後步骤是以无水氟化氢所达成(0℃下1小时)。然后将MBPC以乙醚洗涤，并溶於水中。在冷冻乾燥後，可将MBPC在以0.1N乙酸平衡的P2或G15型分子过滤柱上作预纯化。将洗脱级分回收。纯化步骤可使用C8或C18反向HPLC来完成。在酸解(在115℃下6N HCl中24小时)和电喷雾式(eletrospray)质谱分析後，以MBPC的氨基酸含量将其定性。III.治疗效应与应用
本发明提供一种治疗HIV感染的方法，系给予病人MBPCs，该MBPCs包含一核心基质，该核心基质上接有2至64个肽，较好为4-32个肽，每一个肽包含有氨基酸序列GPGR，在该序列前有0至4个氨基酸残基，该序列後有2至4个氨基酸残基，较佳者为该氨基酸序列不是IGPGR或IXXPGR(其中X为一氨基酸残基)。所给MBPCs应为使血清中量在10-3M至10-7M间，较佳为在10-6M。
按照本发明所制得的MBPCs，在活体中，可抑制HIV感染和HIV引起的细胞病理作用，因此，可抑制在宿主机体中的病毒多重复制与病毒散布。
按照本发明的MBPCs可中和病毒被膜-细胞膜间之融合步骤还抑制合胞体形成所必须的感染细胞膜-未感染细胞膜的融合步骤，此两步骤的任一步被认为是在宿主机体中的细胞感染、病毒多重复制及病毒散布所不可缺少的。MBPCs能够封锁诸如淋巴细胞或巨噬细胞的细胞(包含HIV的89.6株)上存在的CD4受体，该封锁显然地是由于接合到CD4受体的CDR3区域上。因此，本发明的MBPCs可阻碍由HIV-1和HIV-2所引起的合胞体形成，并可抑制人体外周血液淋巴细胞(PBLs)和巨噬细胞的感染。这样的阻碍并不会造成细胞失去被其它抗原或分裂素所活化的能力，即该淋巴细胞之功能被MBPCs所维持。
用本发明，使得淋巴细胞功能保留，可避免非天然AIDS的潜在问题。因此，本发明的MBPCs接合于融合受体，而非活化T细胞的受体，这是本发明优於任何在先抗HIV治疗之主要进步所在。
除了预防HIV感染，本发明的MBPCs已显示出可抑制在治疗前即已受感染的细胞中HIV的产生。
本发明MBPCs特别是较佳的8×GPGRF与16×GPGRAFMBPCs，有一完全无法预期的特性，即它们显示出可结合于作为HIV受体的GalCer受体的能力。该受体已被证明存在於直肠上皮细胞和中枢神经系统CD4细胞。该结合导致MBPCs抑制人小肠细胞被HIV-1和HIV-2两者关系甚远的分离株所感染。
本发明MBPCs的另一优点为被发现在高剂量下对啮齿动物、家兔与猴无毒，因此，当其作治疗使用时不会伤害病人，而不同於现今许多AIDS的治疗。
本发明的MBPCs的另一优点为在10-4M或更低浓度下不具有免疫原性，因此它们不是疫苗，不同於现有技术使用衍生于V3环的肽或其构建物所作的各种尝试。MBPCs之缺乏免疫原性为一优点，因为，免疫反应会导致可抑制或破坏MBPCs的抗体产生。这样的免疫原性MBPCs，如先前提到的RKSIHIGPGRAFYT，在相同的个体仅可使用几次，其後会变得无效。A.CD4受体的阻断
实验资料显示本发明的MBPCs，特别是MBPC.3和MBPC.12，对CD4 +细胞的HIV感染过程有特殊的抑制效应，并对由HIV-1及HIV-1所诱发的合胞体形成具有总的阻断效应。在体外可观察到具抑制作用的MBPC浓度，对MBPC.3与MBPC.12为10-6M，对其它MBPCs则为较高的浓度。该中和作用已见于所有HIV受试株，即MN、Lai、NDK和HIV-1的89.6与HIV-2的Rod。与之相反，即使在非常高的浓度下，例如5×10-4M下，用于MBPCs的各个肽片断对抑制合胞体形成也不具活性。
MBPCs可与细胞的分子相互作用，该分子涉及细胞感染所需的后结合过程即融合阶段，且为呈现出各式各样的V3环的关系较远的分离株所使用。该推测的V3结合部位的好的候选者为CD4的V1区的CDR3区域，因为i)对该区域具专一性的抗CD4抗体(例如13B8-2)可阻断HIV-感染中的融合步骤，ii)来自CDR3的合成肽在融合试验上有某些抑制作用，且iii)MBPCs可识别对应于CD4的CDR3区域的合成肽。
本发明的MBPCs结合到淋巴细胞上而不改变病毒被膜的结合(通过CDR2区域)，然而，却可防止HIV感染作用。此MBPCs亦可结合于可溶性的CD4。因此，MBPCs的结合在水溶性CD4存主下受到抑制。
研究了在自然环境下，本发明的MBPCs在抗CD4抗体特异结合区域和CD4受体间相互作用上的效应。该抗CDR3单克隆抗体(MAb)13B8-2对巨噬细胞上表达的CD4的原位结合，在本发明MBPCs的存在下，显著且特异性地被降低。在有或无MBPCs存在下，其它抗CD4 MAb，包括识别gp120结合部位的MAb(Leu3a和OKT4a MAb)是相同的。这些资料证明，MBPCs结合于CD4的CDR3区域，因此至少部分通过阻断gp120V3环和CD4的此区域之间的相互作用而起作用。
除了HIV-1的V3环被认为是在HIV-1与其靶细胞间融合过程的重要决定子，在本发明前未有可能在治疗上开发出该特性。其主要理由在于V3为在HIV-1分离株中显示出高度变化的高度可变区。中和抗-V3抗体一般是类型特异性的，在最佳的情况下，仅可中和密切相关的分离株。因为本发明的MBPCs针对细胞而非病毒决定子，故可避开被膜变化性所固有的问题。因此，用于本发明的MBPCs，虽然是来自HIV-1V3环的一致序列，亦可中和各种HIV-1株(包括高度变化的HIV-1(NDK))以及不相关的HIV-2 ROD株。更令人惊奇的是，本发明的MBPCs亦被发现可抑制初级HIV-1分离株的感染，也就是直接由病人收集而得者，包括抗AZT、J-1之种株。
下述实施例并非想要限制前面所述，仅为例示说明在HIV感染上，及其与CD+淋巴细胞和巨噬细胞的结合与融合上使用本发明的MBPCs的效能、实用性和范围。实施例1-合胞体形成的阻断
在含5％CO2的湿环境下，以添加5％胎牛血清、1％谷氨酸、1％链霉素-青霉素之RPMI1640(Gibco of Irvine，Scotland)培养细胞。CEM或C8166细胞分别以HIV-1 Lai或HIV-2 Rod或HIV-1MN慢性感染。将感染的细胞(1×10-4)在96孔的平板上以各种浓度的MBPCs培育2小时。而後加入在100μl培养基中的未感染Molt-4细胞(4×104)。在37℃下18小时後，计算该合胞体数。其结果显示如下表。
                  表2-合胞体的形成
MBPC    MBPC浓度    HIV-IMN     HIV-iLai    HIV-2Rod
MBPC.3    5×10-6M  -        -        -
          10-6M     +        +        -
          10-7M     +++      ++++     +
MBPC.5    5×10-6M  -        -+       -
          10-6M     +        ++++     -
          10-7M     ++++              +
MBPC.4    5×10-6M  ++++     +++      ++++
          10-6M     ++++     ++++     ++++
          10-7M     +++      ++++     ++++
Mono.3    10-5M     ++++     ++++     ++++
          10-6M     ++++     ++++     ++++
          10-7M     ++++     ++++     ++++
MBPC.4为(IGPGRAF)4-(K)2-K-βA-OH。Mono3为六肽GP-GRAF，MBPC.5为十四肽MBPC(RJSIHIGPGRAFYT)4-(K)2-K-βA-OH。MBPC.3如上所述。
出现合胞体以+号表示，其分配与计算出的数量大致成正比。
MBPC.3显示出在浓度为约为10-6M下体外抑制由HIV所诱发的合胞体形成的效应，MBPC.5显示在略高浓度下的抑制效应。MBPC.12(结果未显示出)产生相似於MBPC.3的结果。与其不同的是单体性的Mono.3完全不具活性；对于Mono.3已在较高的10-4M浓度下加以确认。实施例2 PBLs感染的预防
以RT缺乏的HIV-I(IIIB)分离株慢性感染的50×1038E5细胞，於96孔平板中，在所示肽的存在下，与刺激人体外周血液淋巴细胞(PBLs)的植物凝血素(PHA)共培养。所用的MBPCs以其接合于核心赖氨酸基质(被称为MLC)上的肽及其数目加以描述，本实验所使用的所有氨基酸皆为右旋型。
MBPCs的化学合成按上述固相技术进行。该肽链可在4-(氧甲基)PAM树脂上，使用最佳化的叔丁氧基羰基/苯甲基化学技术，加以逐步延长。纯化的MBPCs的氨基酸分析与所推定的氨基酸比例相吻合。
[GPGRAF]8-MLC由电喷雾式质谱分析(实验的Mr＝5672Da)进一步定性。
在连续地在该肽存在下培育24小时后，测定合胞体的数目，结果显示于下表3。+++表示在孔中存在的合胞体数目与未处理孔相似；-表示在孔中完全缺乏合胞体；±表示在孔中偶尔存在一些合胞体。在此测试中合胞体的形成被抗-CD4抗体OKT4A(抗CDR2)和13B8-2(抗CDR-3)抗体所阻断，这与先前的报告相吻合。在此测试中，该核心赖氨酸结构体(被称为MLCs)自身不诱发合胞体的形成。由MTT分析(如下所述)或锥虫蓝排除技术评估毒性。
        表3 MBPCs对HIV-1诱发细胞融合的抑制
                          浓度(M)
肽              5×10-7  5×10-6  5×10-5
GPGRAF            +++       +++      +++
[GPGRAF]8-MLC     ±                  -        -
[IGPGRAF]8-MLC   +++        ±                -
[GPGRA]8-MLC     +++       +++      +++
[GPGR]8-MLC      +++       +++      +++
[GPG(R)DAF]8-MLC+++        -      有毒性
[GPGRAF]8-MLCD  +++       +++      +++
[Ac-GPGRAF]8-MLC +++       +++       -
[RKSIHIGPGRAFYT]4-+++   -    有毒性
MLC
[RKSIHKGPGRAFYT]4-+++   -    有毒性
MLC
[RKSIHTGPGRAFYT]4-+++   -    有毒性
MLC
RAFVTIGK          +++   +++     -
在这些实验条件下，浓度低至5×10-7M的[GPGRAF]8-MLC对合胞体形成产生显著抑制作用，而相应的单体肽GPGRAF，在高於所使用的浓度(直至5×10-5M)下，亦不具活性。N-未端乙酰化([Ac-GPGRAF]8-MLC)、加入异亮氨酸([IGPGRAF]8-MLC)和在GPGRAF序列中插入D-氨基酸皆导致活性显着的丧失。少於6个残基的MBPCs(即[GPGRA]8-MLC或[GPGR]8-MLC)以及具有互关序列的MBPCs均不抑制细胞融合，表明生物活性并不涉及核心基质。
[RKSIHIGPGRAFYT]4-ML(C可在5×10-6M浓度下抑制合胞体的形成。因为在GPGRAF要素序列前的异亮氨酸在HIV-1分离株中被高度保存，两个相关的构建物是以赖氨酸或苏氨酸代替异亮氨酸加以合成的。这三个构建物抗融合活性的显著差异被观察到了。但是应注意的是，[RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC与其衍生物当使用浓度为5×10-5M时会引起一些毒性，因此在人体治疗中是不合要求的。
在这些结果的基础上，更强的抗HIV MBPC看来是[GPGRAF]8-MLC。在另外的试验中，此分子也能阻断HIV-1(LAI)、HIV-1(NDK)或HIV-2慢性感染的T淋巴母细胞样CEM细胞和HTLV-I-构象MT-2细胞之间的融合。实施例3 MBPCs对淋巴细胞功能性的作用
a)MBPCs对抗体和分裂素诱发细胞增生的效应
将来自3位HIV血清阴性健康供血者的外周血液淋巴细胞(PBL)，从用Ficoll-Hypaque技术而肝素化的血液中分离出。培养基为添加1％谷氨酸、1％抗生素和10％经热失活的胎牛血清的RP-MI1640。将细胞(105)在有或无抗原(制念珠菌素，PPD)或分裂素(PHA)的MBPCs(5×10-6M)存在下培育。将抗原或分裂素处理的细胞以1mCi的[3H]胸腺嘧啶核苷脉冲8小时。而后回收细胞，计算DNA中掺入的[3H]胸腺嘧啶核苷。
b)混合物的淋巴细胞反应(MLR)
在此试验中，将来自三位健康供血者的外周血液淋巴细胞和来自10位血清阴性供血者的混合血而得的105个细胞，在各种浓度MBPCs存在或不存在下，于微量平板孔中，以最终体积为200μl进行培育。淋巴细胞混合物在第6天以1μCi[3H]胸腺嘧啶核苷脉冲8小时。回收细胞，用β计数器计算掺入DNA中的[3H]胸腺嘧啶核苷。结果见下表，以MBPC.5如第一个试验所述。
         表4 PBL抗原和分裂素诱发之增生
         [3H]胸腺嘧啶核苷掺入量(cpm)
           对照组           MBPC.3          MBPC.5供血者3
     PHA1  203000           162000          228000
     PHA2  183000           154000          188000
     PPD1  5900             3900            4000
     PPD2  3200             3100            2400
        Cand1   3900        3200          3700
        Cand2   1700        1200          1100供血者2
        PHA1    115000      87000         115000
        PHA2    112000      95000         111000
        PPD1    38000       24000         24000
        PPD2    33000       27000         26000供血者1
        PHA1    ＝＝＝＝    ＝＝＝＝＝    ＝＝＝＝
        PHA2    ＝＝＝＝    ＝＝＝＝＝    ＝＝＝＝
        PPD1    1200        1300          1300
        PPD2    1500        3100          2100
        Cand1   74000       87000         80000
        Cand2   79000       100000        85000
处理组与对照组细胞中胸腺嘧啶核苷的掺入量相似，若PBLs的功能有负的影响，该细胞复制的标记胸腺嘧啶核苷的掺入，在MBPC处理平板中会增加相当量。因此，结果表明，当其丧失对抗原或分裂原的反应能力时，未见PBLs增生。实施例4 MBPCs对人体PBLs感染的作用
外周血液淋巴细胞(PBLs)来自健康供血者，以植物凝血素刺激，在含有10％胎牛血清和白介素-2的RPMI1640(完全培养基)中培养。将6×106个细胞/ml的样品以所示MBPC在浓度为10-5M下处理或不处理，并37℃下暴露于HIV-1或HIV-2(100TCID50)1小时。彻底洗涤后，将PBLs在含有10-5M相应MBPC的完全培养基中进行培养。在HIV-1分离株感染10天后，用RT活性测定(对HIV-1与HIV-2两者)和HIV-1p24gag的测量(Coulter试剂盒，分装成10pg/ml)评估感染状况。处理使用的MBPCs如下，1-无；2-[GPGRAF]8-MLC；3-[RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC；4-[PP-PYVEPTTTQC]4-MLC(非HIV相关性MBPC)(MLC表示核心赖氨酸结构)。图2所示结果代表三个分别的实验。所使用的病毒分离株的性质以PCR(HIV-1对HIV-2分离株)与可在HIV-1(LAI)和HIV-1(NDK)间作区分的RIPA加以检测。
通过测量培养上清液中反转录酶(RT)的活性所作评估，表明[GPGRAF]8-MLC和[RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC处理一致地引起病毒子代产生的延迟：在感染後10天和13天，MBPCs处理组样品的RT活性比对照组低90％以上。因该肽并不干扰RT分析，因而这与MBPCs所引起的病毒产生抑制作用相一致。当病毒产生後，对在培养上清液中作p24gag浓度测定，亦得到相同结果(对于HIV-1分离株)。对HIV-2感染的抑制而言，[RKSIHIGP-GRAFYT]4-MLC比[GPGRAF]8-MLC的强度弱。不含来自V3环的一致序列的MBPCs并不抑制PBLs的感染。实施例5 MBPC对巨噬细胞中合胞体形成的抑制作用
用高度细胞病理之巨噬细胞-热带分离株HIV-1(89，6)，对MBPCs阻断人体初级巨噬细胞感染的能力作出评估。单核细胞是由利用Ficoll-Hypaque密度分离而使单细胞富增之白血球泳动单位中分离而得。巨噬细胞是在添加有10％胎牛血清和5％人体AB血清的RPMI1640中，粘着于塑料而加以纯化的。在GM-CSF(1ng/ml)存在下，将粘着细胞培养5天，该粘着细胞对人体巨噬细胞标记物(Boehringer Mannheim，25F9克隆)呈阳性反应。将5×105个细胞以所示的MBPC在5×10M-5的浓度下处理45分钟，而後暴露于10,000TCID50巨噬细胞-热带分离株HIV-1(89.6)。所使用的MBPCs如下所示：1-无；2-[GPGRAF]8-MLCD；4-[GPG(R)DAF]8-MLC；5-[RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC；6-[PP-PYVEPTTTQC]4-MLC，它所具有的氨基酸，除非指明为D型，否则皆为L型。在彻底洗涤后，将细胞再次以培养基培养，在感染4天後，对HIV-1p24gag的产生与合胞体的形成作分析。结果显示于图3，该图以MBPCs对p24量(ng/ml)作图。亦如图3所示，每孔相对合胞体数目(+++为无抑制作用；++50％的抑制作用；±＞95％抑制作用)与p24gag的浓度有相互关系。
图4A所示巨噬细胞是未处理的对照组，显示在感染的培养物中有许多合胞体存在。图4B(100×)所示巨噬细胞是以[GPGRAF]8-MLC预处理的，显示出很少量的巨大细胞。[RKSIHIGP-GRAFYT]4-MLC和[GPGRAF]8-MLC能抑制感染，用如下事实加以评估，i)在暴露於10,000TCID50的HIV-1(89.4)之巨噬细胞培养物中，在MBPCs存在下可观察到的细胞病理作用大为降低，ii)在培养上清液中HIV-1p24gag浓度和RT活性测量值。对照组MBPCs并不明显影响巨噬细胞被HIV-1(89.6)感染的速率。有趣的是，[GPGRAF]8-MLCD(即具有D-氨基酸残基的[GPGRAF]8-MLC)与[GPG(R)DAF]8-MLC在巨噬细胞感染上，显著地比[GPGRAF]8-MLC活性低。B.GalCer受体
本发明的MBPCs，特别是MBPC.3和MBPC.12及其衍生物，亦可结合于第二受体-半乳糖基神经酰胺受体(见於Harouse等人，Science，253，320-323(1991))，且可完全地阻断HIV对人直肠细胞的感染力。相应的单体肽在该受体上是不具活性的。
为了用MBPC中的GPGRAF肽得到在小肠细胞中GalCer感染路径的完全阻断，该MBPCs的聚合程度必须至少为8。这提示在GalCer识别上V3环的构象要求比结合于CD4的CDR3更为严格。CDR3是一酸性区域(在第87位置上包含一谷氨酸残基，据报道，这是融合步骤中所必须的)，它可能与V3环上碱性氨基酸借助静电效应而相互作用。相对地，GalCer的半乳糖头基，已知其涉及gP120的结合，是中性极性的，对于较佳相互作用，可要求V3结构上不同的原子空间排列。因此，令人吃惊的是，阻断CD4通路的HIV感染的治疗亦可与GalCer受体起作用。
MBPCs的活性可以如下所述的交替感染方式加以评估：HT-29细胞(5×105细胞)以MBPCs(5×10-6)培育45分钟，而後在37℃下暴露於100TCID50的HIV-1(LAI)、HIV-1(NDK)或HIV-2(ROD)1小时。用三次连续的胰蛋白酶作用使残馀的接种物失活，而感染的评估如下：
i)直接测量培养上清液中HIV-1p24gag(对于HIV分离株)和RT活性(对于HIV-1和HIV-2分离株)。
ii)与人PBLs共培养。用如下所示的MBPCs处理细胞：1-无；2-[GPGRAF]8-MLC；3-[GPGRAF]8-MLCD；4-[GPG(R)DAF]8-MLC；5-[GPGRAF]16-MLC；6-[RKSIHIGP-GRAFYT]4-MLC；7-[PPPYVEPTTTQC]4-MLC，所有氨基酸除非指明否则皆为L型。图5A所示结果，对应於以HIV-1(NDK)所感染者，代表三个分别的实验，所使用的MBPC以X轴上的数字表示。在以PBLs共培养期间测量p24gag(pg/ml)的浓度(+++为感染後10天＞10ng/ml；++为感染后13天＞1ng/ml；+为感染後16天＞1ng/ml；-为感染後1个月未检出p24gag)。用HIV-1(LA1)和HIV-2(ROD)也可得到相似的结果。
在以相同的MBPCs进行的另一个实验中，利用高效液相薄层色谱(HPTLC)结合分析法分析MBPCs对gP120结合于GalCer的影响。将MBPCs(10-4M)在室温下与GalCer预培育1小时。在彻底洗涤后，将HPTLC平板与HIV-1重组gp120(2.5μg/ml)一起培育，而後与家兔抗gp120和125I-山羊抗家兔IgG一起培育。将平板在PBS中清洗，且暴露于Amersham超薄膜(hyperfilm)MP中8小时。如图5B所示，以活性MBPCs处理HT-29细胞，可保护该细胞免受HIV-1(NDK分离株)所感染。该抗病毒功效与其阻断gp120结合于GalCer上的能力有关连。单体V3肽与对照MBPCs均不显示出任何抗病毒活性，且不会抑制gp120与GalCer的结合。
因此，本发明还提供一MBPC，它包含有一接合有2至64个肽(较佳为4至32个)的核心基质，每个肽来自HIV-1病毒的表面糖蛋白gP120的V3环，该MBPC能抑制HIV病毒在CD4 +/GalCer4 -和CD4 -/GalCer+细胞中的感染力，C.抗原性、毒性与免疫原性
本发明的MBPCs在体外对人PBLs不具毒性，或者，在体内对无论以腹腔、静脉或皮下反复注射10-3M MBPCs的小鼠，皆不具毒性。此外，猴(macaca sylvana)静脉注射一次，而後皮下注射，每天给予5mg/kg剂量，在30天後，并不显示出任何毒性作用的征兆。此外，注射[GPGRAF]8-MLC的家兔和小鼠不产生抗GPGRAF抗体的显著滴度，这与肽的每一分支上具少于10个氨基酸残基的MBPCs，在低于10-3M的浓度下(所欲使用的浓度下)不具免疫原性之观念相吻合。再者，PBLs在体外保留被其它抗原或分裂素激活的能力。1.抗原性MBPCs免疫原性的酶联免疫吸附试验(ELISA)
在ELISA中，测试MBPC.1、MBPC.2和单体V3一致序列肽对HIV-1+血清或HIV-1-血清的免疫反应性。此测试中，MBPC.2为(RKSIHIGPGRAFYT)4-(K)2-K-βA-OH，MBPC.1为(GPGRAF)8-(K)4-(K)2-K-βA-OH。使用血清/血浆中抗HIV-1抗体检测用的New Lav Blot试剂盒(Diagnostic Pasteur)，用Western印迹试验先确认血清的阳性。将96孔微滴定板以500ng/孔肽加以被覆。在饱和且清洗後，加入HIV-1+血清(1/100稀释度)50μl，在37℃下保温2小时、以过氧化酶偶联的猪抗家兔IgG进行染色。将30份HIV-1阳性反应血清和3份HIV-1阴性反应血清对来自北美/欧洲一致(V3 Cons)序列的V3肽和V3MBPCs在ELISA分析中作分析比较。其结果如下表5所述。
在30份HIV-1阳性反应血清中，26份与V3 Cons和MBPC.2反应强烈，一份与这两种肽反应微弱，一份选择性地与MBPC.2反应，两份血清不与这两个肽中的任一个反应。
有趣的是，MBPC.1不与任何一份HIV-1阳性反应血清反应。与MBPC.2相比，MBPC.1在阻断HIV-1和HIV-2感染上显示出较佳的作用，与较低的毒性。MBPC.1不被HIV-1阳性反应血清识别的事实提示该MBPC可能不干扰抗V3-抗体的中和活性。因此，可协同中和HIV-1感染。
                                      表5
血清号   Western印迹HIV-1   ELISAV3一致 500ng肽/孔MBPC2        MBPC1
   1        +   +++++ +++++     -
   2        +   +++++ +++++     -
   3        +   +++++ +++++     -
   4        +   +++++ +++++     -
   5        +   +++++ +++++     -
   6        +   +++++ +++++     -
   7        +   +++++ +++++     -
   8        +   +++++ +++++     -
   9        +   +++++ +++++     -
   0        +   +++++ +++++     -
   11        +   +++++ +++++     -
   12        +   +++++ +++++     -
   13        +   +++++ +++++     -
   14        +     ++  +++     -
   15        +   +++++ +++++     -
   16        +   +++++ +++++     -
   17        +   +++++ +++++     -
   18        +   +++++ +++++     -
   19        +   +++++ +++++     -
   20        +     -   -     -
   21        +     +   +     -
   22        +     -   -     -
   23        +     -   +     -
   24        +   +++++ +++++     -
   25        +   +++++ +++++     -
   26        +   +++++ +++++     -
   27        +   +++++ +++++     -
   28        +   +++++ +++++     -
   29        +   +++++ +++++     -
   30        +   +++++ +++++     -
   31        -     -   -     -
   32        -     -   -     -
   33        -     -   -     -
2.毒性
利用使用3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物的MTT分析(细胞存活力比色测定)评估MBPCs对细胞存活力的作用。在96孔微量滴定板的孔中，在各种浓度MBPCs存在下，以添加了5％胎牛血清、1％谷氨酸、1％链霉素-青霉素的终体积为200μl的RPMI(得自Gibco of Irvine，Scotland)作培养基，在含5％CO2的潮湿氛围下培养CEM和C8166细胞(5×104)。每3至4天，对100μl的细胞悬浮液进行MTT分析，将MBPCs加入细胞培养物中，使体积最终为200μl 。[GPGRAF]8-MLC，在浓度于10-7至10-4M下，对此测试细胞不具毒性。其它的结果显示於上表3。如上所示，包含IGPGR序列的十四肽MLC具有毒性，因此不适於本申请所考虑的治疗应用。3.抗原性对MBPCs的免疫原性研究
四只C57/BL6黑鼠每天注射剂量为4mg/ml(1mg)的MBPC.3250μl，注射36天，注射途径为腹腔注射。由眼眶下穿刺收集血液样品。该血液样品在37℃下维持1小时，而後4℃下过夜，所得的上清液(血清样品)与块状物分离。利用ELISA对血清测试，找寻特异性的抗MBPC.3抗体。
此外，用[GPGRAF]8-MLC免疫两只新西兰家兔，将400μg[GPGRAF]8-MLC在1ml PBS(pH7.4)中，与等体积完全Freund佐剂混合，在第0天皮内注入每只家兔。在第30、60、90和120天时以不完全Freund佐剂皮下注射重复该步骤。用ELISA作血清测试，找寻特异性的抗MBPC.3抗体。此处所提出的资料来自最後的血清样品(120＋7天)。
96孔微量滴定板(Munc Rotskild，Denmark)每孔以pH7.4之各种浓度的[GPGRAF]8-MLC(500至25ng[GPGRAF]8-MLC，在50μl PBS中)在37℃下被覆2小时。以400μl酪蛋白(5g/100ml)饱和後，加入不同稀释度的血清，37℃下2小时。对照组为得自未免疫过的家兔和小鼠的血清。在淋洗(5×)後，加入1∶5000的过氧化酶-标记的猪抗家兔IgG或抗小鼠IgG(Dakopatts，Copenhagen，Denmark)5μl，在37℃下1小时。进一步淋洗后(5×)，加入100μl邻苯二胺，於暗室室温下30分钟。该反应由加入50μl 4N的硫酸而终止，在492/620nm下测定出光密度(OD)比率。
下表6至10列出结果，表6列出用光密度比率(×10)，由家兔所得结果的概要。Mo为10μg/ml的GPGRAF单体。
                       表6
                                 血清稀释度
                          1∶10    1∶100    1∶1000[GPGRAF]8-MLC(μg/ml)10                     家兔A   +++       +          -
                   家兔B   +         -          -5                      家免A   +++       -          -
                   家兔B   +         -          -1                      家兔A   +++       -          -
                   家兔B   +         -          -0.5                    家兔A   +         -          -
                   家兔B   -         -          -
-，光密度(OD)＜0.2；+，O.D.＝0.2-0.4；++，O.D.＝0.4-0.8；+++，O.D.＞0.8
              表7-微量滴定板n°1
 S10  S10  S5  S5  S1  S1  S.5  S.5   Mo   Mo
  M10-2  1162  1199  1045  933  444  419  382  381  1224  1135
  M10-3  339  291  285  236  126  111  128  135  310  287
  M10-4  172  138  121  132  50  51  56  38  104  185
  Mctrl  622  550  527  551  337  313  360  341  516  591
  Rctrl  1062  1093  986  976  631  662  621  616  945  989
  R10-2  2000  2000  2000  2000  1280  1267  968  981  2000  2000
  R10-3  2000  2000  2000  2000  346  349  318  296  2000  2000
  R10-4  924  823  796  809  182  193  145  140  677  725
说明：S10＝10μg MBPC.3/ml；S5＝5μg MBPC.3/ml
  S1＝1μg MBPC.3/ml；S.5＝0.5μg MBPC.3/ml；
  Mo＝GPGRAF单体，10μg/ml
  M10-2＝[10-2]小鼠；R10-2＝[10-2]家兔
  Mctrl＝[10-2]未免疫小鼠；
  Rctrl＝[10-2]未免疫家兔；
                  表8微量滴定板n°2
 S10  S10  S5  S5  S1    S1    S.5   S.5     Mo     Mo
  M10-2  1540  1457  1514  1344  381   429   315   841    1539    1575
  M10-3  334  291  263  273  54    65    47    82    342    335
  M10-4  132  188   88   97   15    17    13    83     95    126
  Mctrl  490  464  385  231  241   289   235   851    482    500
  Rctrl  437  429  386  345  214   185   117   153    376    395
  R10-2  2000  2000  2000  2000  1922    87    34   716    2000    2000
  R10-3  2000  2000  2000  2000  394    87   197   181    2000    1909
  R10-4  734  689  678  626  113    84    80    74    588    625
说明：S10＝10μg MBPC.3/ml；S5＝5μg MBPC.3/ml
  S1＝1μg MBPC.3/ml；S.5＝0.5μg MBPC.3/ml；
  Mo＝GPGRAF单体，10μg/ml
  M10-2＝[10-2]小鼠；R10-2＝[10-2]家兔
  Mctrl＝[10-2]未兔疫小鼠；
  Rctrl＝[10-2]未免疫家兔；
                表9微量滴定板n°3
 S10  S10  S5  S5  S1  S1  S.5  S.5  Mo  Mo
  M10-2  639  664  636  630  241  200  204  198
  M10-3  172  168  159  163   50   53   48   49
  M10-4   85   84   83   84   22   22   22   21
  Mctrl  513  492  486  459  257  249  286  261
  Rctrl  833  238  222  213   92   92   91   88
  R10-2  818  953  857  868  402  401  416  287
  R10-3  342  328  323  314  168  150  148  155
  R10-4  191  184  170  169   72   89   64   69
说明：S10＝10μg MBPC.3/ml；S5＝5μg MBPC.3/ml
  S1＝1ug MBPC.3/ml；S.5＝0.5μg MBPC.3/ml；
  Mo＝GPGRAF单体，10μg/ml
  M10-2＝[10-2]小鼠；R10-2＝[10-2]家兔
  Mctrl＝[10-2]未免疫小鼠；
  Rctrl＝[10-2]未免疫家兔；
              表10微量滴定板n°4
  S10   S10    S5    S5    S1     S1   S.5   S.5     Mo     Mo
   M10-2   1454   1340   1233   1336    53     439    495    468    1231    1317
   M10-3    334    318    299    297    83     88    90    95     380     386
   M10-4    133    113    124    103    27     21    28    28     123     122
   Mctrl    453    381    349    400    215     235    275    278     468     458
   Rctrl    225    203    285    288    95     86    82    86     283     185
   R10-2    849    843    749    792    419     447    424    425     811     811
   R10-3    332    314    310    304    221     151    163    154     245     194
   R10-4    263    279    255    251    105     101    134    128     214     218
说明：Sl0＝10μg MBPC.3/ml；S5＝5μg MBPC.3/ml
      S1＝1μg MBPC.3/ml；S.5＝0.5μg MBPC.3/ml；
      Mo＝GPGRAF单体，10μg/ml
      M10-2＝[10-2]小鼠；R10-2＝[10-2]家兔
      Mctrl＝[10-2]未免疫小鼠；
      Rctrl＝[10-2]未免疫家兔；
      RABU＝[10-2]家兔，加有肽Abu(无关氨基酸)。
鉴於在一部份结果可观察到高的背景反应值，故须要进行进一步试验以证实用MBPC.1免疫的血清不具反应性。
得自以MBPC.1或MBPC.2免疫的家兔的血清，在ELISA中测试其对MBPC.1、MBPC.2、Mono.1(MBPC.1之单体形式)和北美/欧洲一致V3序列(V3Cons或Cs)的结合能力。
图6A显示得自以MBPC.2免疫的家兔的血清显著地可识别MBPC.1与V3 Cons，然而并未观察到对MBPC.1或相应单体肽的反应活性。图6B表明从MBPC.1免疫的家兔得到的血清并不对MBPC.1(除从家兔A所得的血清有微弱的反应性外)、MBPC.2、V3 Con或Mono.1起反应，用作阳性对照的兔疫前血清，同样不对MBPC、V3 Con或Mono.1起反应。
在另一组实验中，对从MBPC.1或MBPC.2免疫的小鼠所得的血清(1/100至1/1000稀释度)测试其对各种浓度之MBPC.1、MBPC.2和V3 Con的作用。图7A、7B和7C清楚表明，从MBPC.2免疫的家兔得到的血清对MBPC.2和V3 Con呈剂量依赖方式的反应。未检出对MBPC.1的反应性。相对地，由从MBPC.1免疫的小鼠得到的血清对MBPC.2不反应，而对MBPC.1有微弱反应(注意由家兔A得到的血清对MBPC.1有微弱反应，但由家兔B得到的血清则无反应)。有趣的是，後者血清不与单体V3 Cons反应，此单体V3 Cons为34个氨基酸的直链抗原决定基，该抗原决定基模拟如存在於gp120的一致序列。
这些结果显示MBPC.1，一短V3 MBPC，在家兔中不会诱发显著的抗体反应，而MBPC.2，最长的V3肽构建物，则会引起此反应。这些观察结果与HIV-1感染病人血清的MBPC.1免疫反应性结果相吻合。
在小鼠，重覆注射10-3M，偶然会在稀释度为1∶100的血清中检出滴度很低的抗体，在低血清稀释度下基本上无抗体被检出。在家兔中，有一个动物在血清稀释度为1∶100时可检测出抗体。在其它血清稀释度下，抗体滴度与对照组动物所得者可相比拟。如此弱的抗原性表明本发明的MBPCs不具有被用作引发有效抗体反应的抗原的潜能，而这是先前已知肽构建物的用途。事实上，本发明的MBPCs的所欲治疗浓度为约10-6M，在该浓度被预期不会有抗体反应。然而，给予缺少抗原性的MBPCs可给药直至10-3M。

Claims (27)

1.一种多分支型肽构建物，其特征在于包含一接合有2-64个肽的核心基质，每一个肽包含有氨基酸序列GPGR，在该序列前有0-4个氨基酸残基，该序列后有2-4个氨基酸残基，但基本上不具有氨基酸序列IGPGR或IXXGPGR，其中X为氨基酸残基。
2.按权利要求1所述的肽构建物，其中具有接合于核心基质的4-32个肽。
3.按权利要求1或2所述的肽构建物，其中每一个肽是相同的。
4.按权利要求1或2所述的肽构建物，其中每一个肽为GP-GRAF。
5.按权利要求4所述的肽构建物，其中含有8或16个肽GP-GRAF。
6.按前面任一权利要求所述的肽构建物，其中核心基质包含赖氨酸残基。
7.按前面任一权利要求所述的肽构建物，其中核心基质和肽之间有间隔物。
8.按权利要求1所述的肽构建物，其中肽为肽类似物。
9.按权利要求1所述的肽构建物，其中肽或某些肽包含一个或一个以上右旋型氨基酸残基。
10.一种多分支型肽构建物，其特征在于包含一接合有2-64个肽的核心基质，每一个肽均来自HIV病毒的表面被膜糖蛋白gP120的V3环，该多分支型肽构建物在低于10-4摩尔的血清浓度下无免疫原性，且能抑制HIV病毒在CD4+/GalCer-和CD4-/Gal-Cer+细胞中的感染力。
11.一种药物，包含按前面任一权利要求所述的多分支肽构建物和药学上可接受的稀释剂或载体。
12.包含一接合有2-46个肽的核心基质，每一个肽包含有氨基酸序列GPGR，在该序列前有0-4个氨基酸残基，该序列后有2-4个氨基酸残基的多分支型肽构建物在制备治疗HIV病毒感染药物上的应用。
13.治疗HIV感染的方法，其特征在于给患者施用包含一接合有2-64个肽的核心基质，每一个肽包含有氨基酸序列GPGR，在该序列前有0-4个氨基酸残基，该序列后有2-4个氨基酸残基的多分支型肽构建物。
14.治疗HIV感染的方法，其特征在于给患者施用按权利要求1-10之一所述的肽构建物。
15.治疗HIV感染的方法，其特征在于给患者施用按权利要求11所述的肽构建物。
16.一种多分支型肽构建物的制备方法，该多分支型肽构建物包含一接合有2-64个肽的核心基质，每一个肽包含有氨基酸序列GPGR，在该序列前有0-4个氨基酸残基，该序列后有2-4个氨基酸残基，但基本上不具有氨基酸序列IGPGR或IXXGPGR，其中X为氨基酸残基，该方法的特征在于：在树脂上的肽链固相逐步延长，然后从树脂上裂解下该多分支型肽构建物。
17.按权利要求16所述的方法，其中树脂为4-氧甲基-苯基乙酰氨基甲基共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)。
18.按权利要求16或权利要求17所述的方法，其中使用Boc/benzyl技术，包括与羟基苯并三唑活性酯系统双偶联(Boc-氨基酸-OBt)。
19.按权利要求16-18之一所述的方法，其中从树脂上裂解是在0℃用氟化氢进行的。
20.按权利要求16-19之一所述的方法，其中所制备的肽构建物是有4-32个肽接合于核心基质的肽构建物。
21.按权利要求16-20之一所述的方法，其中所制备的肽构建物是每个肽都相同的肽构建物。
22.按权利要求16-21之一所述的方法，其中所制备的肽构建物是每个肽都是GPGRAF的肽构建物。
23.按权利要求22所述的方法，其中所制备的肽构建物是有8或16个肽GPGRAF的肽构建物。
24.按权利要求16-23之一所述的方法，其中所制备的肽构建物是核心基质含赖氨酸残基的肽构建物。
25.按权利要求16-24之一所述的方法，其中所制备的肽构建物是在核心基质和肽之间有间隔物的肽构建物。
26.按权利要求16-19之一所述的方法，其中所制备的肽构建物是其中的肽为肽类似物的肽构建物。
27.按权利要求16-19之一所述的方法，其中所制备的肽构建物是其中的肽或肽中的几个包括一个或一个以上右旋型氨基酸残基的肽构建物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1100564C (zh) * 2001-08-29 2003-02-05 周根发 用于治疗hiv感染的药物、其组合物及其用途
CN102532280A (zh) * 2010-12-08 2012-07-04 吉林大学 一种hiv免疫原及其制备
CN104415739A (zh) * 2013-08-28 2015-03-18 天津市阳权医疗器械有限公司 苯乙烯-二乙烯苯医用树脂的应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2719049B1 (fr) * 1994-04-22 1996-06-14 Pasteur Institut Multireprésentation d'un analogue peptidique du substrat de la DPPIV, notamment de type KPR, afin d'inhiber l'entrée du HIV dans les cellules.
GB9627114D0 (en) * 1996-12-31 1997-02-19 Centre Nat Rech Scient Multiple branch peptide constructions
GB9727424D0 (en) * 1997-12-31 1998-02-25 Armel Sa Liposomes containing multiple branch peptide constructions for use against human immunodeficiency virus
EP1635866A2 (en) * 2003-05-20 2006-03-22 Cellpep S.A. Modified antiviral peptides with increased activity and cell membrane affinity
US7604804B2 (en) 2004-02-09 2009-10-20 University Of Maryland Biotechnology Institute Enhancing anti-HIV efficiency through multivalent inhibitors targeting oligomeric gp120
US20090081249A1 (en) * 2007-08-27 2009-03-26 Massachusetts Institute Of Technology Bi-Functional Polymer-Attached Inhibitors of Influenza Virus

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341285C (en) * 1988-02-12 2001-08-14 Chang Yi Wang Synthetic peptides for the detection of antibodies to hiv gp120 envelope protein for diagnosis of aids and pre-aids conditions and as vaccines
DE69233271T2 (de) * 1991-04-02 2004-09-09 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Therapeutischer- und präventivimpfstoff gegen hiv
WO1993003766A1 (en) * 1991-08-13 1993-03-04 Repligen Corporation Multiple antigen peptides for use as hiv vaccines

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1100564C (zh) * 2001-08-29 2003-02-05 周根发 用于治疗hiv感染的药物、其组合物及其用途
CN102532280A (zh) * 2010-12-08 2012-07-04 吉林大学 一种hiv免疫原及其制备
CN104415739A (zh) * 2013-08-28 2015-03-18 天津市阳权医疗器械有限公司 苯乙烯-二乙烯苯医用树脂的应用

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