HUT75092A - Multiple branch peptide constructions for use against hiv - Google Patents

Description

DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA Kft.

HIV-vírus ellen alkalmazható többszörösen elágazó láncú peptidkonstrukciók

A találmány tárgyát többszörösen elágazó láncú peptidkonstrukciók (“Multiple Branch Peptide Constructions”, rövidítve; MBPC-k) képezik, amelyek a HIV-l-vírus gpl20-proteinjének V3-hurokrégiójából származó peptidekből épülnek fel, és tartalmazzák a GPGR konszenzus aminosavszekvenciát, mely szekvenciát 0-4 aminosav előz meg és 2-4 aminosav követ, a GPGR-szekvenciát közvetlenül megelőző három aminosav között előnyösen nem fordul elő I, és a szekvencia legelőnyösebben GPGRAF.

A találmány szerinti peptidkonstrukciók fokozott receptor-aktivitást mutatnak, és gátolják a sejt-sejt fúziót. Közvetlen virosztatikus hatással rendelkeznek. Mivel a találmány szerinti MBPC-k ismétlődően ugyanazt a peptid-szekvenciát tartalmazzák, in vitro több HIV-1- és HIV-2-törzs esetében képesek neutralizálni a vírusburok és sejtmembrán fúzióját, valamint a fertőzött sejt membránja és a nem-fertőzött sejt membránja közt létrejövő fúzió különböző lépéseit. Különösen jelentős, hogy a találmány szerinti MBPC-k mind a limfocitákon és makrofágokon található CD4-receptorokon, mind vastagbél epiteliális sejteken található GalCer-receptorokon hatékonyak.

A fentiek értelmében a találmány szerinti MBPC-k alkalmasak HIV-1és HIV-2-fertőzések kezelésére.

Aktaszámunk: 83401-4174/PÁ

-2 A humán immundefíciencia-vírus (HÍV) feltételezetten a szerzett immunhiányos szindróma (AIDS) kiváltója. A HÍV különböző sejttípusokban tartósan fennálló fertőződést okoz; ezen sejtek közül számos expresszál egy CD4-receptomak nevezett antigént, amely a sejtek felszínén kötőhelyül szolgál. Ilyen sejtekben a sejt fertőződésének első lépését a vírus kötődése jelenti, mely során a HIV-vírus külső burok-glikoproteinje a sejt CD4elnevezésű felületi-antigénjéhez kötődik. Ezt a kötődést események sora követi, ide tartozik a vírusburok és a célzott-sejt membránjának fúziója és a vírus bejutása a sejtbe, miáltal a sejt fertőzötté válik. A HIV-vírussal fertőzött sejtek ezután szincíciumok (többmagvú óriás-sejtek) képződésén keresztül más sejteket képesek fertőzni. A HÍV-1-vírussal fertőzött sejtek és nem-fertőzött CD4⁺-sejtek (CD4-receptorral rendelkező sejtek) közti szincícium-képződés a CD4-receptor és a HIV-vírus felszíni burokglikoproteinje közti kölcsönhatáson keresztül jön létre. Ezt a folyamatot oldható CD4-antigén, valamint anti-CD4- és anti-V3-ellenanyagok blokkolni képesek.

A vírusnak in vivő sejtről-sejtre történő terjedésért felelős sejtfuziósfolyamat következtében a plazmában található neutralizáló ellenanyagok funkciójukat nem képesek betölteni, és a vírus a limfocitaszám csökkenése következtében már eleve károsodott immunrendszer támadása elől megmenekül. HIV-vírus által aktivált B-limfociták különböző ellenanyagpopulációkat termelnek. Egyes ellenanyagok nem gátolják a gpl20-CD4kölcsönhatást, de blokkolják a sejtfertőzésért felelős membránfuziót. Ezek az ellenanyagok elsősorban a burok glikoproteinben található V3-hurokrégió ellen irányulnak.

A különböző HIV-l-izolátumokban a V3-hurok nagymértékű változékonyságának következtében az anti-V3-ellenanyagok rendszerint csak azt az

-3 izolátumot neutralizálják, amellyel szemben az ellenanyagok termelődtek. A neutralizáció ezért az adott izolátumra korlátozódik, és azt izolátumspecifíkusnak nevezzük. Az ellenanyagok hatékonyan gátolják a sejtfúziót, anélkül, hogy bármely hatással lennének a sejt-vírus kötődésre.

Többen próbálkoztak a HIV-fertőzés gátlásával a V3-hurokkal rokonságot mutató peptidek alkalmazásán keresztül, mely próbálkozások kérdésessé tették az ilyen peptidek hatékonyságát. Például Rossi és munkatársai [Virology 184. 187 (1991)] azt találták, hogy egyes V3-peptidek fokozták a vírus fertőzőképességét. Más, a V3-hurokból származó szintetikus peptidek - ciklikus vagy nem-ciklikus peptidek - hatástalanok voltak a sejtfúzió kritikus lépésének gátlásában. Nem sikerült tehát olyan antagonista peptideket kifejleszteni, amelyek képesek lettek volna a vírus-izolátumtól függetlenül a vírus-sejt fúzió és sejt-sejt fúzió gátlására.

Legújabban, több tanulmány a HIV-1-, valamint HIV-2-vírusokkal történő sejtfertőződésnek egy CD4-antigéntől független útjára derített fényt, ami legalább egy, másik vírusreceptor jelenlétére utal. A feltételezett vírusreceptorok egyikét nemrégiben agyi eredetű CD4' sejteken és vastagbél hámsejteken azonosították. Ez a receptor egy galaktozil-ceramidnak (GalCer) nevezett semleges glikolipid. Az agyban és bélben a CD4' /GalCer⁺-sejtek HIV-vírussal történő fertőződése szerepet játszhat a fenti szervekben HIV-fertőzéssel kapcsolatosan létrejövő egyes rendellenességben. Továbbá, egyes nyálkahártya-hámsejtek tetején a GalCerreceptor jelenléte szexuális kapcsolat során elősegítheti a vírus bejutását. Eddig egyik V3-hurok-eredetű pepiidről sem sikerült kimutatni, hogy képes lenne a GalCer-receptoron gátló hatást kifejteni.

Válaszként több fenti problémára, J.P. Tam polimerekben lizin-vázak felhasználásával sugarasan elágazó rendszereket alkalmazott antigének kifej-4lesztésére hordozók felhasználása nélkül [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5409 (1988)]. Ezeket az antigéneket úgy tervezték, hogy alkalmasak legyenek különböző betegségekkel szembeni vakcinák előállítására. Közelebbről, Tam HIV-fertőzéssel szembeni vakcinákban alkalmazható antigének előállítását írja le [a WO93/03766 sz. PCT szabadalmi bejelentésben], ezek lényegében tartalmazzák a IGPGR-szekvenciát (az IUPAC-egyezmény szerinti, egy-betűs aminosav-jelöléssel jelölve), és ahhoz, hogy hatékonyak legyenek hasznos immunválasz kiváltására, tizenegy aminosav hosszúságúak (lásd 13. oldal, 29-31. sor). Az ilyen antigéneket azonban, egy betegség esetében sem tekintjük esetleges közvetlen terápiás eszközöknek, hanem azokat a szervezetben immunválasz kiváltására szánjuk.

A találmány tárgyát HIV-fertőzött betegek terápiás célú kezelésére alkalmazható eljárások és peptidkonstrukciók képezik. A fenti eljárás szerint, a terápiás célú beadásra szánt többszörösen elágazó láncú peptidkonstrukció egy belső mátrixot és ahhoz csatlakoztatva 2-64 peptidet tartalmaz, melyek mindegyike tartalmazza a GPGR aminosav-szekvenciát, mely szekvenciát 04 aminosav előz meg és 2-4 aminosav követ.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábra a HIV-vírus és a CD4⁺- vagy CD4'-sejtek közötti kötődés létrejöttének mechanizmusát szemlélteti.

A 2. ábra többszörösen elágazó láncú peptidkonstrukciók (“Multiple Branch Peptide Constructions”, MBPC-k) hatását ábrázolja humán perifériás vérből származó limfociták (PBL-ek) három különböző HIV-törzzsel történő fertőződésére; a grafikonon a p24 mennyiségét (pg/ml) vagy a reverz transzkriptáz (RT) aktivitást ábrázoltuk három különböző MBPC esetében; 1; semmi, 2; [GPGRAF]₈-összetett lizin-magmátrix (“Multiple Lysine

- 5 Core”, MLC); 3: [RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC; 4: [PPYVEPTTTQC]₄MLC.

A 3. ábra az MBPC-k humán makrofág-fertőzésre kifejtett hatásának vizsgálati-eredményeit ábrázolja, a grafikonon az egyes MBPC-k esetében ábrázoltuk a p24 mennyiségét (ng/ml). Öt különböző MBPC-t alkalmaztunk; 1: semmi; 2: [GPGRAF]₈-MLC; 3: [GPGRAF]₈-MLC_D; 4: [GPG(R)dAF]₈MLC; 5: [RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC; és 6: [PPYVEPTTTQC]₄-MLC.

A 4.A ábra fertőzött tenyészetekben létrejövő szincícium-képződést ábázolja MBPC-k hiányában.

A 4.B ábra a szincícium-képződés hiányát ábázolja [GPGRAF]₈-MLCkonstrukcióval kezelt makrofágokban.

Az 5.A ábra MBPC-k hatását szemlélteti humán epiteliális sejtek GalCer-receptoron keresztül történő fertőződésére.

Az 5.B ábra az MBPC-k gpl20-glikoproteinnek GalCer-receptorhoz történő kötődését gátló képességét ábrázolja.

A 6.A, 6.B, 7.A és 7.B ábrák hosszabb MBPC-vel immunizált nyúlszérumokkal szemben, a rövid MBPC-vel immunizált nyúlszérumok viszonylagos reaktivitás-hiányát ábrázolják.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

I. Struktúra

A találmány tárgyát többszörösen elágazó láncú peptidkonstrukciók (MBPC-k) képezik, amelyek képesek HIV-vírussal történő fertőződés, valamint HIV-fertőzés továbbterjedésének és súlyosbodásának gátlására. Az MBPC-k belső mátrixszal rendelkeznek, melyhez kovalens kötéssel peptidek kapcsolódnak. A belső mátrix egy dentritikus polimer, amely elágazó, és amelynek előnyösen valamennyi ága azonos. A belső mátrix egy mag-molekulán alapul, amely legalább két olyan funkcionális csoporttal ren-6delkezik, amelyhez kovalens kötéssel terminális funkcionális-csoportokkal rendelkező molekula-ágak kapcsolódnak. Alkalmazható mag-molekulák például az ammónia vagy etilén-diamin. Alkalmas molekula-ágak akrilészter monomerek, melyek a mag-molekulára vannak polimerizálva. Ilyen molekulák, a mag-molekulából elágazó monomerek számától függően előállíthatok úgy, hogy különböző számú ágakat hordozzanak. A találmány tárgyát képezik 2-64-ággal, előnyösen 4-16 ággal rendelkező MBPC-k.

A belső mátrix kialakítására alkalmazható például lizin. Egy központi lizint két lizinnel kapcsolunk össze, úgy, hogy a központi lizin aminocsopotjainak egyikéhez a két lizin karboxilcsoporton keresztül kötődjék. Ily módon négy aminocsoporttal rendelkező molekulát nyerünk, amely négy pepiidet hordozó MBPC belső mátrixát képezheti. Más eljárás szerint, előállíthatunk nyolc ággal rendelkező molekulát, oly módon, hogy négy lizint karboxilcsoportjaikon keresztül a központi lizinhez kapcsolódó lizinek aminocsoportjainak egyikéhez kötünk. Az így kapott molekula nyolc pepiidet hordozó MBPC belső mátrixát képezheti, vagy ahhoz nyolc lizint kapcsolva, tizenhat pepiidet hordozó MBPC belső mátrixát képezheti. Könnyen belátható, hogy szükség szerint nagyobb, például 32 ágú MBPC-k hasonló módon állíthatók elő.

Az MBPC-kben a peptidek C-végei kovalens kötéssel kapcsolódnak a belső mátrixát egyes ágaival. A peptidek előnyösen azonosak, vagy el is térhetnek egymástól. Az így kapott pepiid felszínén peptidek csoportját hordozza, és egy olyan belső mátrixszal rendelkezik, amely a felszínen nem jelenik meg, és ezért antigén-hatása nincs. A találmány szerinti peptídektől eltérő peptidekkel rendelkező, de hasonló struktúrákat ír le például J.P. Tam [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5409 (1988); valamint az 5229490 számú

-7 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], melyek teljes egészükben a kitanítás részét képezik.

A peptidek és a belső mátrix közé kívánt esetben távtartó (“spacer”) molekulákat iktathatunk. Az első lizin karboxilcsoportja szabadon maradhat, aminálódhat vagy b-alaninnal vagy más blokkoló vegyülettel kapcsolódhat.

A peptidek D- vagy L-aminosavakat tartalmazhatnak. A D-aminosavakat tartalmazó peptidek in vivő tovább fennmaradnak, mivel ellenállóbbak a peptidázok hasításával szemben, de az L-aminosavakból álló peptidek, amint azt az alábbiakban ismertetjük, nagyobb aktivitással rendelkeznek.

Peptidek helyett alkalmazhatunk továbbá peptid-analógokat, azaz peptidek szénvázával rendelkező, azonban a -CONH peptid-kötést nem tartalmazó szintetikus konstrukciókat. Nyilvánvaló tehát, hogy a leírásban peptidekre történő utalás peptid-analógokra is vonatkozhat. A peptidanalógok feltehetőleg ellenállóbbak a peptidáz hatásával szemben, és in vivő tovább fennmaradnak.

A találmány szerinti MBPC-k a HÍV-1-vírus gpl20 felszíni burokglikoproteinjének V3-hurokrégiójából származó peptideket tartalmaznak, a peptidek tartalmazzák az abból származó GPGR konszenzus aminosavszekvenciát (az IUPAC-egyezmény egy-betűs aminosav-jelölése szerint, azaz a Gly-Pro-Gly-Arg -szekvenciát). Az említett MBPC-k különböző sejttípusokhoz tartozó humán sejt-tenyészetekben hatékonyan gátolják a HIVvírussal történő fertőződést. A gátlás úgy tűnik, független az adott vírustörzstől, és HIV-2-vírussal történő fertőzéssel szemben is hatékony. Azok tehát egészen meglepő terápiás sajátságokkal rendelkeznek.

Megjegyzendő, hogy a megfelelő monomer-peptidek semmilyen terápiás hatással nem rendelkeznek. Az eltérés oka feltehetően az, hogy a belső mátrix a peptidek konformációjának megváltozását hozza létre. Közelebbről,

- 8és váratlan módon, a pepiidben a GPGR-szekvenciát követő két aminosavról kimutattuk, hogy meghajlanak, amennyiben a GPGR-monomer a maghoz van kötve. Előnyös tehát, ha a belső mátrixhoz kapcsolt peptidekben a GPGR-szekvenciát követően legalább két aminosav van jelen. De ha a pepiid túl hosszú, az MBPC antigén-hatásúvá válik, ezért nem kívánatos, hogy a GPGR-szekvenciát követően több, mint négy aminosav legyen, és az említett szekvenciát megelőzően több, mint négy aminosav legyen. A pepiid tehát tizenkettő, vagy annál kevesebb aminosavat tartalmaz.

HIV-1- és HIV-2-retrovírusokkal történő fertőzéssel szemben gátló hatást mutató MBPC-k közelebbről a felsoroltak, amelyeket az IUPAC szerinti aminosav-jelöléssel tüntettünk fel:

1, táblázat

Példaként szolgáló MBPC-k MBPC. 1: (GPGRAFY)₈-(K)₄ (K)₂-K-bA-OH vagy (GPGRAFY)₈-(K)₄ (K)₂-K-bA-NH₂ MBPC. 3: (GPGRAF)₈-(K)₄-(K)₂-K-bA-OH vagy (GPGRAF)₈-(K)₄-(K)₂-K-bA-NH₂ MBPC. 12: (GPGRAF)i₆-(K)₈-(K)₄-(K)₂-K-bA-OH vagy (GPGRAF)i6-(K)₈-(K)₄-(K)₂-K-bA-NH₂.

A b-alaninon a terminális OH-csoport annak karboxilcsoportját jelöli, az amino-csoport pedig a lizin karboxilcsoportjához kapcsolódik. Az NH₂vég a b-alanin karboxilcsoportjának módosítását jelöli, úgy, hogy karboxamid-vég keletkezzék; a b-alanin ebben az esetben is aminocsoportjával a lizin karboxilcsoportjához kapcsolódik. Az alábbi példákban az OH-formákat alkalmaztuk.

-9Bár a peptideknek a kívánt terápiás hatás eléréséhez tartalmazniuk kell a GPGR konszenzus-szekvenciát, a GPGR-szekvenciát megelőzően egy, szintén a V3-hurokból származó, izoleucint tartalmazó konformációs szekvencia, például IGPGR- vagy IXXGPGR-szekvencia beiktatása (ahol X valamely aminosav), amennyiben az IGPGR-szekvenciát tartalmazó peptidek tizenkét vagy kevesebb aminosavból állnak, az MBPC terápiás kezelésben kimutatható hatékonyságát nagymértékben csökkenti, vagy azt hatástalanná teszi, ezek alkalmazása a találmány szerinti megoldásban tehát nem előnyös. Az izoleucin (I) jelenléte a GPGR-szekvenciát megelőző három aminosavat tartalmazó szekvencián belül viszonylag állandó, és a HIV-genomok körülbelül 98 %-ában megtalálható, meglepő módon azonban úgy találtuk, hogy jelenléte nem kívánatos.

Annak ellenére, hogy az IGPGR- vagy IXXGPGR-szekvenciát tartalmazó MBPC-k nem előnyösek, a fenti peptid-szekvenciával rendelkező MBPC-kről kimutattuk, hogy azok gátolják a szincícium-képződést, amenynyiben az ismétlődő peptid hosszabb, mint tizenkét aminosav hosszúságú. Egy ilyen, szincícium-képződést gátló nagyobb MBPC például az a konstrukció, amelyben a négy-ágú MBPC mindegyik ágához RKSIHIGPGRAFYT-szekvenciával rendelkező peptid kapcsolódik. Az ilyen nagy méretű MBPC-k azonban nem kívánatosak, mivel az ilyen nagy molekulák még alacsonyabb koncentrációk (KP⁴ mól/1) alkalmazása esetében is ellenanyagok termelődését váltják ki, és azokat a HIV-fertőzött betegekben található ellenanyagok felismerik és gátolják; mindkét tény kizárja azok hosszú távú alkalmazását HIV-fertőzött betegekben. Ezek az MBPC-k sejt-tenyészetekben hatékony koncentrációjuk közelében alkalmazva toxikusnak is bizonyultak. Ezenkívül, a fenti MBPC-k mérete előállításukat bo-10nyolulttá és költségessé, valamint azokat proteázok lebontó hatásával szemben sokkal érzékenyebbé teszi.

A találmány tárgyát képezik tehát MBPC-k, amelyek egy belső mátrixot tartalmaznak, amelyhez 2-64, előnyösen 4-32 peptid kapcsolódik, melyek mindegyike tartalmazza a GPGR-szekvenciát, amelyet 0-4 aminosav előz meg és 2-4 aminosav követ. A peptidek előnyösen a G-t megelőzően található három aminosavból álló szekvencián belül nem tartalmaznak Izoleucint (I) tartalmazó szekvenciát, például IGPGR- vagy IXXGPGRszekvenciát, ahol X valamelyik aminosav. Előnyösen a 8-16 ágú belső mátrixhoz kötött peptidek a GPGRAF-szekvenciával rendelkeznek. Az AFszekvencián belül feltehetően szubsztitúciók hozhatók létre, amennyiben a behelyettesített aminosavak ugyanolyan sajátságokkal rendelkeznek, és az ilyen szubsztitúciók előnyösek is lehetnek, mivel az AF-szekvencia peptidáz-hasítással szemben érzékenynek tűnik, és ezért in vivő törékenynek bizonyulhat.

II. MBPC-k előállítása

Az MBPC struktúrájának előállítása olyan elágazásokkal rendelkező magként, melyhez peptidek kapcsolódnak, és amelyet a korábbiakban összetett antigén-hatású peptideknek (MAP) neveztek, ismert volt a technika állása szerint. [Lásd: Tam és mtsai.: J. Immun. 148. 914 (1992); valamint Wang és mtsai.: Science 254, 285 (1991)]. Kis mennyiségek (1 kg-nál kisebb mennyiségek) esetében az MBPC-k előállítására szilárd fázisú eljárás alkalmazható. A peptid-láncok lépésről-lépésre történő összeállítását automatikus módon végezhetjük 4-(oximetil)-fenil-acetamido-metil-kopoli(sztirén-1 % divinil-benzén)-fázison. Alkalmazható a Boc/benzil-stratégia, amely magába foglal egy hidroxibenzo-triazol aktív észterek (Boc-aminosav-OBt) alkalmazásán alapuló szisztematikusan végrehajtott kétszeres kapcsolásokból álló

-11reakciósémát. A töltetről való végső lehasítás vízmentes hidrogén-fluoriddal történik (1 órán át, 0 °C-on). Az MBPC-ket ezután dietil-éterrel mossuk, és vízben szolubilizáljuk. Liofilizálást követően az MBPC-k P2- vagy G15típusú, 0,1 normál/1 ecetsavval ekvilibrált molekulaszürő-oszlopon előzetesen tisztíthatok. Az eluált frakció ezt követően kinyerhető. A tisztítási lépést Cg vagy Cis reverz fázisú HPLC-oszlop alkalmazásával végezzük. A MBPC-k savas hidrolízist (6 normál/1 HC1, 115 °C, 24 óra) és elektrospraytömegspektrometriát követően aminosav-tartalmuk alapján jellemezhetők.

III. Terápiás hatás és alkalmazhatóság

A találmány tárgyát HIV-fertőzés kezelésére szolgáló eljárás képezi, mely szerint betegeknek olyan MBPC-ket adunk be, amelyek tartalmaznak egy belső mátrixot, amelyhez 2-64, előnyösen 4-32 peptid kapcsolódik, valamennyi peptid tartalmazza a GPGR-szekvenciát, amelyet 0-4 aminosav előz meg és 2-4 aminosav követ, de előnyösen nem tartalmazza az IGPGRvagy IXXGPGR-szekvencát, ahol X valamely aminosav. Az MBPC-ket úgy adagoljuk, hogy 10'³-10'⁷ mól/1 szérumszintet, előnyösen körülbelül 10'⁶ mól/1 szérumszintet érjenek el.

A találmány szerint előállított MBPC-k in vitro mind a HIV-fertőzést, mind a HIV-vírus által kiváltott citopátiás hatást gátolják, ezért a gazdaszervezetben képesek lehetnek a vírusszaporodás és a vírus-terjedés gátlására.

A találmány szerint előállított MBPC-k gátolják a vírusburok és sejtmembrán közt létrejövő fúziós-folyamatot, valamint a fertőzött sejtmembrán és nem-fertőzött sejtmembrán közt létrejövő fúziót, mely utóbbi lépés a szincícium-képződés feltétele; mindkét lépést elengedhetetlennek tartjuk a sejt fertőződéséhez, a vírus-szaporodáshoz és a vírusnak a gazdaszervezeten belül történő terjedéséhez. A MBPC-k képesek gátolni a sejteken, például limfocitákon és makrofágokon megtalálható CD4-receptorokat, ezen belül

-12képesek gátolni a HÍV 89.6-törzs kötődését, amely a CD4-receptor CDR3doménjához kapcsolódik. A találmány szerinti MBPC-k tehát gátolják a HIV-1- és HIV-2-vírusok által kiváltott szincícium-képződést, és gátolják humán perifériás vér eredetű limfociták (PBL-ek) és makrofágok fertőződését. A fenti gátlás nem akadályozza meg azt, hogy a sejtek más antigének vagy mitogének által aktiválódjanak, azaz, a limfociták működőképessége az MBPC-k jelenlétében megtartott.

A limfociták működőképességének megmaradása következtében a találmány szerinti megoldás alkalmazásával elkerülhető egy mesterséges AIDS-szindróma létrehozásának esetleges problémája. Az, hogy a találmány szerinti MBPC-k a fúziós-receptorhoz, és nem a T-sejtek aktiválásában szerepet játszó receptorhoz kötődnek, óriási előnyt jelent a HIV-fertőzés ellen alkalmazott valamennyi korábbi terápiás eljárással szemben.

Azon felül, hogy képesek megelőzni a HIV-fertőzés létrejöttét, a találmány szerinti MBPC-kről kimutattuk, hogy a kezelést megelőzően fertőződött sejtekben gátolják a HIV-vírusok termelődését.

Az MBPC-k, és különösen az előnyös 8x GPGRAF és 16x GPGRAF MBPC-k egy teljesen váratlan sajátsága az volt, hogy képesnek bizonyultak a HIV-vírus receptoraként szolgáló GalCer-receptorhoz történő kötődésre. Ezt a receptort kimutatták vastagbél hámsejtekben és a központi idegrendszer CD4'-sejtjeiben. Ez a kötődés azt eredményezi, hogy az MBPC-k gátolják humán bélsejtek távoli rokonságot mutató HIV-1- és HIV-2izolátumokkal történő fertőződését.

A találmány szerinti MBPC-k további előnye az, hogy azokat rágcsálókban, nyulakban és majmokban nagy dózisok esetében sem találtuk toxikusnak, és számos jelenleg alkalmazott AIDS-terápiával szemben, terápiás alkalmazásuk nem fog károsodást létrehozni a betegekben.

» » · · « · ·· • · · · ♦ ··*

-13Α találmány szerinti MBPC-k további előnye, hogy 10^ mól/1 vagy annál kisebb koncentráció alkalmazása esetében nincs immunogén hatásuk, és V3 -hurok eredetű peptidek vagy azokból származó konstrukciók alkalmazására irányuló valamennyi korábbi próbálkozással szemben, nem vakcinák. Az MBPC-k immunogenitásának hiánya előnyös tulajdonság, mivel egy immunreakció ellenanyag-termelést váltana ki, ami gátolná az MBPC-ket vagy elpusztítaná azokat. Ilyen immunogén-hatású MBPC-k, például a korábbiakban említett RKSIHIGPGRAFYT-konstrukció, csupán néhány alkalommal lennének ugyanabban az egyénben alkalmazhatóak, ezt követően hatástalanná válnának.

A. A CD4-receptor gátlása

Kísérleti adatokkal szemléltettük a találmány szerinti MBPC-k, különösen az MBPC.3- és MBPC.12-konstrukciók CD4⁺-sejtek HIV-vírussal történő fertőződésére kifejtett specifikus gátló hatását, valamint a HIV-1- és HIV-2-vírusok által kiváltott szincícium-képződés teljes mértékű gátlását. Az alábbi MBPC-koncentrációk alkalmazása mellett figyeltünk meg in vitro gátló hatást: az MBPC.3 és MBPC. 12 esetében körülbelül 10~⁶ mól/1 mellett, egyéb MBPC-k esetében magasabb koncentrációk alkalmazása mellett. A neutralizáció valamennyi vizsgált HIV-törzs esetében kimutatható volt, azaz az MN-, Lai-, NDK- és 89.6-jelzésű HIV-l-törzsek és a Rod-elnevezésű HIV-2-törzs esetében. Ezzel szemben, az MBPC-kben felhasznált egyes peptid-fragmensek még igen magas (5x10^ mól/1) koncentrációk alkalmazása mellett is hatástalannak bizonyultak a szincícium-képződés gátlásában.

Az MBPC-k tehát kölcsönhatásba léphetnek egy olyan sejtmolekulával, amely a kötődést követően történő, a sejt fertőződéséhez szükséges események során, például a íuziós-folyamat során játszik szerepet, és amelyet távoli rokonságban álló, eltérő V3-hurokrégiót prezentáló HIV-1- és

9 9 ··· 9 9

999 9 999 ·

-14HIV-2-izolátumok egyaránt felhasználnak. A feltételezett V3-kötőhely számára megfelelő jelöltnek látszik a CD4 VI-régiójának CDR3-doménja, mivel i) erre régióra specifikus anti-CD4-ellenanyagok (például a 13B8-2-ellenanyag) blokkolják a HIV-fertőzés során a fúziós-folyamatot, ii) CDR3eredetű szintetikus peptidek bizonyos mértékű gátló hatást mutatnak a fúziós-vizsgálatokban, és iii) MBPC-k felismernek egy, a CD4 CDR3-doménjának megfelelő szintetikus peptidet.

A találmány szerinti MBPC-k anélkül kötődnek a limfocitákhoz, hogy megváltoztatnák a vírusburok kötődését (a CDR2-doménon keresztül), ennek ellenére megakadályozzák a HIV-fertőzés létrejöttét. Az MBPC-k oldható CD4-antigénekhez is képesek kötődni. Az MBPC-k kötődését tehát oldható CD4 gátolja.

A találmány szerinti MBPC-knek régió-specifikus anti-CD4ellenanyagok és a CD4-receptor közti kölcsönhatásra kifejtett hatását annak természtetes környezetében vizsgáltuk. A 13B8-2-jelzésű anti-CDR3 monoklonális ellenanyag (Mab) makrofágokon expresszálódott CD4receptorhoz történő in situ kötődése a találmány szerinti MBPC-k jelenlétében igen nagy mértékben és specifikusan csökkent. Más anti-CD4-MAb-k, például a gpl20-kötőhelyet felismerő ellenanyagok (a Leu3A- és OKT4ajelzésű monoklonális ellenanyagok) kötődése MBPC-k jelenlétében és azok hiányában azonos mértékű volt. Ezek az adatok azt mutatják, hogy MBPC-k a CD4-antigén CDR3-régiójához kötődnek, és hatásukat legalább részben úgy fejtik ki, hogy gátolják a gpl20 V3-hurokrégiója és a fenti CD4-domén közti kölcsönhatást.

Annak ellenére, hogy a HÍV-1-vírus V3-hurokrégióját a HIV-1 és annak célsejtje közt végbemenő fúziós-folyamat lényeges meghatározójának tekintjük, mostanáig nem sikerült a fenti sajátság terápiás kiaknázása. Ennek

-15fő oka az, hogy a V3-régió hipervariábilis-régió, amelyet a HIV-1 izolátumok között nagyfokú változékonyság jellemez. A neutralizáló hatású anti-V3-ellenanyagok általában típus-specifikusak, és legjobb esetben, csupán a közeli rokonságot mutató izolátumokat képesek neutralizálni. Mivel a találmány szerinti MBPC-k sejt-, és nem vírus-determinánsokkal szemben irányulnak, azok alkalmazása áthidalja a burok variabilitásából eredő problémákat. A találmány szerinti MBPC-k tehát, bár a HIV-1 V3hurokrégiójának konszenzus-szekvenciájából származnak, képesek különböző HÍV-1-törzsek neutralizálására, ezen belül a nagymértékben eltérő NDK-jelzésű HIV-l-törzs, valamint az azzal rokonságot nem mutató HIV-2 ROD-törzs neutralizálására. Meglepő módon, a találmány szerinti MBPCkről kimutattuk azt is, hogy képesek elsődleges HIV-l-izolátumokkal, azaz közvetlenül betegekből gyűjtött izolátumokkal, ezen belül AZT- vagy Jlkezelésre rezisztens törzsekkel történő fertőződés gátlására.

Az alábbi konkrét megvalósítási példákkal az MBPC-k HIV-fertőzés vonatkozásában kimutatható hatékonyságát, alkalmazhatóságát és alkalmazási körét, valamint azok CD4⁺-limfocitákkal és -makrofágokkal történő kötődését és fúzióját kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

1, példa

Szincícium-képződés gátlása

A sejteket 5 % fötális borjúszérummal, 1 % glutaminnal és 1 % streptomycin-penicillin antibiotikum-eleggyel (Gibco of Irvin, Skócia) kiegészített RPMI-1640-tápfolyadékban tenyésztettük, 5 % CO₂-vel telített párásított atmoszférában. CEM- vagy C8166-sejteket HIV-1 Lai-, HIV-2Rod- vagy HIV-1 MN-törzsekkel fertőztünk krónikusan. A fertőzött sejteket

-16(lxl0⁴) 96-mélyületű lemezeken, 2 órán át, különböző koncentrációjú MBPC-k jelenlétében inkubáltuk. A mélyületekbe ezt követően 100 μΐ tápfolyadékban, nem-fertőzött Molt-4-sejteket (4xl0⁴) adtunk. Tizennyolc (18) órán át, 37 °C-on végzett inkubálást követően megszámoltuk a szincíciumokat. Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaltuk össze:

2. táblázat

Szincícium-képződés

MBPC	MBPC koncentráció	HÍV-1 MN	HIV-lLai	HIV-2Rod
MBPC.3	5x106 mól/1	-	-	-
	ΙΟ45 mól/1	+	+	-
	ΙΟ'7 mól/1	+++	++++	+
MBPC.5	5x10'6 mól/1	-	-	-
	10’6 mól/1	++	+	-
	ΙΟ*7 mól/1	++++	++++	+
MBPC.4	5x10'6 mól/1	++++	+++	++++
	ΙΟ6 mól/1	++++	++++	++++
	ΙΟ'7 mól/1	+++	++++	++++
Mono.3	10’5 mól/1	++++	++++	++++
	10'6 mól/1	+++4-	++++	++++
	10’7 mól/1	++++	++++	++++

Az MBPC.4 összetétele a következő volt: (IGPGRAF)₄-(K)₂-K-bAOH. A Mono.3 a GPGRAF-hexapeptidnek, az MBPC.5 a (RKSIHIGPGRAFYT)4-(K)2-K-bA-OH-tetradekapeptidnek felelt meg. Az MBPC.3 összetételét lásd fent.

-17A színeiciumok jelenlétét (+)-jellel jelöltük a számolt mennyiséggel körülbelül arányosan.

Az MBPC.3 10‘⁶ mól/1 koncentráció mellett in vitro gátolta a HIVvírus által kiváltott szincícium-képződést, az MBPC.5 pedig kicsit magasabb koncentráció alkalmazása mellett mutatott gátló hatást. Az MBPC.12 az MBPC.3-konstrukcióhoz hasonló eredményeket adott (az adatokat nem tüntettük fel). Ezzel szemben, a Mono.3 monomer-változat teljes mértékben inaktívnak bizonyult; ezt a Mono.3 esetében magasabb koncentráció (10⁴ mól/1) alkalmazása mellett is igazoltuk.

2. példa

Perifériás vérből származó limfociták (PBL-ek) fertőződésnek gátlása

50xl0³, RT-defíciens HIV-I(IIIB)-izolátummal krónikusan fertőzött 8E5-sejtet 15OxlO³, fitohemagglutininnel (PHA) stimulált, humán perifériás vérből származó limfocitával tenyésztettünk együtt 96-mélyületű lemezeken, a jelzett peptidek jelenlétében. Az alkalmazott MBPC-ket az MLC-nek nevezett belső lizin-magmátrixhoz csatolt peptidek és azok száma alapján jellemeztük. A fenti kísérletben felhasznált valamennyi aminosav dextroformában volt.

Az MBPC-k kémiai szintézisét a fent leírtak szerint, szilárd fázisú technikával végeztük. A peptid-láncokat lépésről-lépésre hosszabbítottuk meg 4-(oximetil)-PAM-gyantán, optimalizált t-butiloxi-karbonil/benzilkémia alkalmazásával. A tisztított MBPC-k aminosav-analízise megfelelt a következtetett aminosav-arányoknak.

A [GPGRAFjs-MLC-konstrukciót elektrospray-tömegspektrometriával tovább jellemeztük (kísérleti Μ_τ=5672 D).

-18A szincíciumok számát a peptidek folyamatos jelenléte mellett történő 24 órás inkubációt követően határoztuk meg, az eredményeket az alábbi, 3. táblázatban összegeztük. A (+++)-jelölés arra utal, hogy a mélyületben hasonló számú szincícium volt jelen, mint a nem-kezeit kontroll sejteket tartalmazó mélyületben; a (-)-jel azt jelenti, hogy a mélyületben a szincíciumok teljesen hiányoztak; a (+/-)-jel a mélyületben esetenként néhány szincícium jelenlétére utal. Ebben a vizsgálatban, korábbi szakirodalmi leírásokkal összhangban, a szincícium-képződést az 0KT4A (anti-CDR2) és 13B8.-2 (anti-CDR3) anti-CD4-ellenanyagok gátolták. A fenti vizsgálatban a belső mátrixot alkotó lizin-struktúrák (“MLC”-k) önmagukban nem váltottak ki szincícium-képződést. A toxicitást MTT vizsgálati eljárással (lásd az alábbiakban) vagy tripánkék-kizárásos technikával határoztuk meg.

3. táblázat

HIV-l-vírus által kiváltott sejtfúzió gátlása MBPC-k alkalmazásával koncentráció (mól/1)

5xl0'⁶ 5xl0'⁵

5x10’⁷

Peptid

GPGRAF +++ [GPGRAF]₈-MLC +[IGPGRAF]₈-MLC +++ [GPGRA]₈-MLC +++ [GPGR]₈-MLC +++ [GPG(R)_DAF]₈-MLC +++ [GPGRAF]₈-MLC_d +++ [Ac-GPGRAF]₈-MLC +++ [RKSIHIGPGRAFYT]„-MLC +++ [RKSIHKGPGRAFYTJ.-MLC +++ [RKSIHTGPGRAFYTK-MLC +++ +++ +++ +++ ++++ +++ +++ +++ toxikus +++ +++ +++ toxikus toxikus toxikus +++

RAFVTIGK

-19A fenti kísérleti feltételek mellett, a [GPGRAF]₈-MLC még 5x10'⁷ koncentráció mellett is jelentős mértékben gátolta a szincícium-képződést, míg a megfelelő, GPGRAF monomer-peptid az alkalmazott koncentrációtartományban (5x10'⁵ mól/1 koncentrációig) nem mutatott aktivitást. A GPGRAF-szekvenca N-terminális acetilezése ([Ac-GPGRAF]₈-MLC), ahhoz egy izoleucin (I) hozzáadása ([IGPGRAF]₈-MLC), valamint Daminosavak beépítése a GPGRAF-szekvenciába szignifikánsan csökkentette az aktivitást. Hat aminosavnál kevesebbet tartalmazó MBPC-k ([GPGRA]₈MLC vagy [GPGR]₈-MLC), valamint egyéb, hasonlóságot nem mutató szekvenciával rendelkező MBPC-k nem gátolták a sejtfúziót, igazolva, hogy a belső mátrix nem játszik szerepet a biológiai aktivitásban.

A [RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC 5x10'⁶ mól/1 mellett képes volt gátolni a szincícium-képződést. Mivel a GPGRAF ismétlődő motívumot megelőző izoleucin jelenléte a HIV-l-izolátumok között nagymértékben állandó, két hasonló konstrukciót szintetizáltunk, amelyekben az izoleucin helyén lizin vagy treonin található. A fenti három konstrukció fúziót gátló hatásában nem volt lényeges különbség megfigyelhető. Megjegyzendő azonban, hogy a [RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC és származékai 5x10'⁵ mól/1 koncentráció mellett bizonyos mértékű toxicitást mutattak a 8E5-sejtekben, ezért humán terápiában történő alkalmazásuk nem kívánatos.

A fenti eredmények alapján a leghatékonyabb anti-HIV MBPC-nek a [GPGRAF] s-MLC bizonyult. Egyéb vizsgálatok során ez a molekula képes volt blokkolni a HIV-l(LAI)-, HIV-1(NDK)- vagy HIV-2(ROD)-törzsekkel krónikusan fertőzött T-limfoblasztoid CEM-sejtek és a HTLV-Itranszformált ΜΤ-2-sejtek közti fúziót.

-203. példa

Az MBPC-k hatása a limfociták működőképességére

a) MBPC-k hatása az antigénnel vagy mitogénnel indukált sejtproliferációra

Perifériás vér eredetű limfocitákat (PBL-eket) három egészséges, HIV-szeronegatív donorból származó heparinezett vérből izoláltunk a FicollHypaque-techmkával. Tenyésztő folyadékként, 1 % glutaminnal, 1 % antibiotikum-eleggyel és 10 %, hővel inaktivált fötális borjúszérummal kiegészített RPMI-1640-tápfolyadékot alkalmaztunk. A sejteket (10⁵) MBPC-k jelenlétében (5x10⁶ mól/1), antigénnel (candidine, PPD) vagy mitogénnel (PHA) együtt, vagy azok hiányában inkubáltuk. Az antigénnel vagy mitogénnel kezelt sejteket nyolc órán át, lökésszerűen 1 mCi [³H]-timidinnel kezeltük. Ezt követően a sejteket összegyűjtöttük, és számlálóval meghatároztuk a DNS-be történt [³H]-timidin-beépülést.

b) Kevert limfocita-válaszreakció (“Mixed Lymphocyte Response”,

MLR)

Ebben a vizsgálatban három egészséges, HIV-szeronegatív donorból származó, perifériás vér eredetű limfocitákat (10⁵) inkubáltunk együtt mikrotitráló lemezeken, 200 μΐ végtérfogatban, 10⁵, összesen 10 szeronegatív donorból gyűjtött sejttel, különböző koncentrációjú MBPC-k jelenlétében vagy azok hiányában. A limfocita-elegyet a 6. napon 8 órán át, lökésszerűen 1 pCi [³H]-timidinnel kezeltük. Ezt követően a sejteket összegyűjtöttük, és béta-számlálóval meghatároztuk a DNS-be történt [³H]timidin-beépülést. Az eredményeket az alábbi, 4. táblázatban összegeztük; az MBPC. 5-konstrukció leírását lásd az első vizsgálatnál.

-214, táblázat

Perifériás vér eredetű limfociták (PBL-ek) antigén és mitogén által indukált proliferációia

[3H]-timidin-beépülés (cpm)	MBPC.3	MBPC. 5
	Kontroll
3. Donor
PHA1	203000	162000	228000
PHA2	183000	154000	188000
PPD1	5900	3900	4000
PPD2	3200	3100	2400
Candl	3900	3200	3700
Cand2	1700	1200	1100
2. Donor
PHA1	115000	87000	115000
PHA2	112000	95000	111000
PPD1	38000	24000	24000
PPD2	33000	27000	26000
Candl	28000	17000	15000
Cand2	13000	11000	9000
1. Donor
PHA1	= = =	= = =	= = =
PHA2	= = =	= = =	= = =
PPD1	1200	1300	1300
PPD2	1500	3100	2100
Candl	74000	87000	80000
Cand2	79000	100000	85000

-22A sejtekbe történő timidin-beépülés a kezelt- és kontroli-lemezek esetében hasonló mértékű volt. Amennyiben a PBL-ek funkciója károsodott volna, az MBPC-kkel kezelt lemezekben a sejt-reprodukciós markerként szolgáló timidinbeépülés lényegesen megnövekedett volna. A fenti eredmények szerint tehát, a PBL-ek nem proliferálódtak, ami egyébként megfigyelhető lenne abban az esetben, ha a limfociták nem lennének képesek antigénekre vagy mitogénekre válaszreakciót adni.

4. példa

MBPC-k hatása humán PBL-ek fertőződésére

Egészséges donorokból perifériás vér eredetű limfocitákat (PBL-eket) nyertünk, azokat fitohemagglutininnal stimuláltuk, és 10 % fötális borjúszérumot, valamint interleukin-2-t tartalmazó RPMI-1640-tápfolyadékban (komplett tápfolyadékban) inkubáltuk. Milliliterenként 6x10⁶ sejtet tartalmazó mintákat 10'⁵ mól/1 koncentráció mellett a megadott MBPC-kkel kezeltünk vagy azokat nem kezeltük, majd 1 órán át, 37 °C-on, az MBPC-k folyamatos jelenléte mellett HIV-1- vagy HlV-2-vírussal (100 TCrD50) érintkeztettünk. Alapos mosást követően a PBL-eket komplett tápfolyadékban, 10'⁵ mól/1 megfelelő MBPC-vel együtt tenyésztettük. A fertőződés tényét a fertőzést követő 10. napon az RT-aktivitás meghatározásával (a HIV-1- és EHV-2-izolátumok esetében egyaránt), valamint a HIV-l-izolátumok esetében a HIV-1 p24^sag meghatározásával (Coulter reagenskészlet, vágás: 10 pg/ml)állapítottuk meg. Az alábbi MBPC-kkel végzett kezeléseket alkalmaztuk: 1: semmi; 2: [GPGRAF]8-MLC; 3: [RKSIHIGPGRAFYT]₄-MLC; 4: [PPPYVEPTTTQC]₄-MLC (egy, nem HIV-eredetű MBPC) (az MLC a belső mátrixot alkotó lizin-struktúrát jelenti). A 2. ábrán bemutatott eredmények három külön kísérletből származó reprezentatív eredményeket képvi-23selnek. Az alkalmazott vírus-izolátumok természetét PCR-eljórásai (a HIV1-izolátumokat a HIV-2-izolátumokkal szemben), valamint a HIV-l(LAI) és HIV-l(NDK)-izolátumok elkülönítése céljából RIPA-eljórással ellenőriztük.

A [GPGRAF]₈-MLC és [RKSIHIGPGRAFYTb-MLC konstrukciókkal végzett kezelés következetesen késleltette az utódvírusok termelődését, amint azt a tenyészet felülúszójában a reverz transzkriptáz (RT) aktivitás meghatározása alapján megállapítottuk; a fertőzést követő 10. és 13. napokon az RT-aktivitás több, mint 90 %-kal alacsonyabb volt az MBPC-kkel kezelt mintákban, mint a kontroli-mintákban. Mivel a peptidek nem gátolják az RT-meghatározást, a megfigyelés összhangban van az MBPC-k vírustermelődést gátló hatásával. Hasonló eredményeket kaptunk (HIV-1izolátumok esetében) akkor is, amikor a vírustermelődést a tenyészet felülúszójában a p24^gag koncentrációjának meghatározásával követtük. A HIV-2vírussal történő fertőződés létrejöttének gátlásában az [RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC kevésbé bizonyult hatásosnak, mint az [GPGRAFjg-MLC. Azok az MBPC-k, amelyek nem tartalmaztak V3hurokrégió eredetű konszenzus-szekvenciát, nem gátolták a PBL-ek fertőződését.

5. példa

A szincícium-képződés gátlása makrofágokban MBPC-k alkalmazásával

Megvizsgáltuk az MBPC-k humán elsődleges makrofágok fertőződését gátló képességét is, egy makrofágokra különösen citopatogén izolátum, a HIV-l(89.6)-izolátum alkalmazásával. Ficoll-Hypaque-sűrüséggradines elválasztási technikával monocitákra nézve feldúsított leukoforézis-egységekből mononukleáris sejteket izoláltunk. Makrofágokat műanyaghoz történő leta-24padás alapján tisztítottunk 10 % fötális borjúszérummal és 5 % humán ABszérummal kiegészített RPMI-1640-tápfolyadékban. A letapadt sejteket 5 napig GM-CSF (1 ng/ml) jelenlétében tenyésztettük, és azok a humán makrofág-markerre (Boehringer Mannheim, 25F9-klón) nézve pozitívnak bizonyultak. 5xl0⁵ sejtet 45 percig, 5xl0'⁵ mól/1 koncentráció alkalmazása mellett a jelzett MBPC-kkel kezeltünk, majd 10 000 TCID50 makrofág-tróp HIV-l(89.6)-izolátummal érintkeztettünk. Az alábbi MBPC-ket alkalmaztuk: 1: semmi; 2: [GPGRAF]₈-MLC_D; 4: [GPG(R)dAF]₈-MLC; 5: [RKSfflIGPGRAFYT]₄-MLC; és 6: [PPYVEPTTTQC]₄-MLC, L-fonnájú aminosavakat alkalmaztunk, hacsak nem jelöltük, hogy az adott aminosav D-formájú. Alapos mosást követően a sejteken a tápfolyadékot kicseréltük, majd a fertőzést követen 4. nappal a sejteket HIV-1 p24^gag termelésre, valamint szincícium-képződésre nézve analizáltuk. Az eredményeket a 3. ábrán foglaltuk össze, az MBPC-ket a p24^gag mennyiségével (ng/ml) szemben ábrázoltuk. Amint az a 3. ábrán szintén látható, az egyes mélyületekben a szincícium-képződés relatív mennyisége (+++: nincs gátlás; ++: 50 %-os gátlás; +-: 95 %-os gátlás) arányos volt a p24^gag koncentrációjával.

A 4.A ábrán bemutatott makrofágok kezeletlen kontroli-sejtek, a fertőzött tenyészetekben számos szincícium jelenléte látható. A 4.B ábrán 100szoros nagyításban ábrázolt, [GPGRAF]₈-MLC-konstrukcióval kezelt makrofágok esetében igen kevés óriássejt látható. Az [RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC- és [GPGRAF]₈-MLC-konstrukciók képesek voltak a fertőződés gátlására, amint azt az alábbi ismérvek alapján megállapítottuk: i) 10 000 TCED50 HIV-l(89.6)-vírussal érintkeztetett makrofágtenyészetekben az MBPC-k jelenlétében megfigyelhető citopátiás hatás nagymértékű csökkenése alapján, valamint ii) a tenyésztő-folyadék felülúszóiban a HIV-1 p24^gag-koncentráció és RT-aktivitás meghatározása alap-25ján. Kontroll-MBPC-k nem befolyásolták jelentős mértékben a makrofágok HIV-l(89.6)-vírussal történő fertőződésének arányát. Érdekes módon, a [GPGRAF]₈-MLCd (azaz, D-aminosavakat tartalmazó [GPGRAF]₈-MLC), valamint a [GPG(R)dAF]₈-MLC a makrofág-fertőzési kísérletben lényegesen kisebb aktivitást mutatott, mint a [GPGRAF]₈-MLC.

B. GalCer receptor

A találmány szerinti MBPC-k, különösen az MBPC.3- és MBPC. 12konstrukciók, valamint azok származékai, egy második receptorhoz, a Galaktozil-Ceramid receptorhoz is képesek kötődni, [lásd, Harouse és mtsai.; Science 253, 320 (1991)], és humán vastagbél-sejétkén teljesen gátolják a HIV-vírussal történő fertőződést. A megfelelő monomer-peptidek a fenti receptoron nem mutatnak aktivitást.

Ahhoz, hogy az MBPC-ben a GPGRAF-peptid alkalmazásával bélsejtekben teljes mértékben gátoljuk a GalCer receptoron keresztül végbemenő fertőzést, az MBPC polimerizációs fokának legalább nyolcnak kell lennie. Ez azt jelenti, hogy a GalCer-receptor felismeréséhez a V3-hurok szerkezetének sokkal szigorúbb konformációs feltételeknek kell megfelelnie, mint a CD4-antigén CDR3-doménjához történő kötődéshez. A CDR3 egy savas régió, (amely a 87. pozícióban glutaminsavat tartalmaz, amelyről leírták, hogy elengedhetetlen a fúziós folyamat létrejöttéhez), és amely régió elektroszatikus kölcsönhatások révén feltehetően a V3-hurokban található bázikus aminosavakkal lép kölcsönhatásba. Ezzel szemben, a GalCerreceptor galaktóz-fejét alkotó csoport, amely ismereteink szerint a gpl20kötődésben játszik szerepet, semleges töltésű, és az optimális kölcsönhatás kialakításához a V3-struktúrában az atomok eltérő térbeli elrendeződésére

-26lehet szükség. Meglepő módon tehát, a HIV-fertőzés CD4-antigénen keresztül végbemenő útját gátló terápia a GalCer-receptor esetében is hatásos.

Az MBPC-k hatását a fenti eltérő fertőzési útra az alábbiak szerint vizsgáltuk: ΗΤ-29-sejteket (5xl0⁵ sejtet) 45 percig, MBPC-k jelenlétében (óxlO⁶ mól/1) inkubáltunk, majd 1 órán át, 37 °C-on, 100 TdD50 HIV1(LAI)-, HÍV-1 (NDK)- vagy HIV-2(ROD)-izolátumokkal érintkeztettünk. A megmaradó inokulumot három egymást követő tripszinezéssel inaktiváltuk, és a fertőződést az alábbi ismérvek alapján állapítottuk meg: i) a tenyésztőfolyadékok felülúszóiban a HIV-1 p24^gas-koncentráció (HIV-l-izolátumok esetében) és RT-aktivitás (HIV-1- és HIV-2-izolátumok esetében) közvetlen meghatározása alapján, ii) humán PBL-ekkel történő együtt tenyésztéssel. A sejteket MBPC-kkel kezeltük az alábbiak szerint: 1: semmi; 2: [GPGRAF]8MLC; 3: [GPGRAF]₈-MLC_D; 4: [GPG(R)_DAF]₈-MLC; 5: [GPGRAP]i₆MLC; 6: [RKSIHIGPGRAFYT]4-MLC; és 7: [PPYVEPTTTQC]₄-MLC, Lformájú aminosavakat alkalmaztunk, hacsak másképp nem jelöltük. Az 5.A ábrán bemutatott eredmények, amelyek HIV-l(NDK)-izolátummal történő fertőzésnek felelnek meg, három külön kísérlet eredményeinek reprezentatív adatait képviselik, az alkalmazott MBPC-ket azok számozásával az Xtengelyen tüntettük fel. A PBL-ekkel történő együtt tenyésztés során meghatároztuk a p24^gag koncentrációját (pg/ml) (a fertőzést követő 10. napon: +++, >10 ng/ml; a fertőzést követő 13. napon: ++, > 1 ng/ml; a fertőzést követő 16. napon: +, > 1 ng/ml; a fertőzést követően egy hónappal: -, nincs kimutatható p24^gag). Hasonló eredményeket kaptunk a HIV-1 (LAI)- és HIV2(ROD)-izolátumokkal.

Egy, ugyanazon MBPC-kkel végzett további kísérlet során az MBPCknek a gpl20 GalCer-receptorhoz történő kötődésére kifejtett hatásást analizáltuk nagy teljesítményű vékonyréteg-kromatográfiás (HPTLC) kötődés-27vizsgálati eljárás alkalmazásával. Az MBPC-ket (1CT⁴ mól/1) 1 órán át, szobahőmérsékleten GalCer-dal előinkubáltuk. Alapos mosást követően a HPTLC-lemezeket rekombináns HIV-1 gpl20-glikoproteimiel (2,5 pg/rnl), majd nyálban termelt, anti-gpl20-ellenanyaggal és ¹²⁵I-jelölt, kecskében termelt, anti-nyúl IgG-vel inkubáltuk. A lemezeket PBS-ben mostuk, és 8 órán át “Amersham Hyperfilm MP” filmmel érintkeztettük. Amint azt az 5:B ábra mutatja, a ΗΤ-29-sejtek kezelése aktív MBPC-kkel megakadályozta a sejtek HIV-l(NDK)-izolátummal történő fertőződését. Ez a vírus-ellenes hatás összhangban volt a konstrukció gpl20-glikoproteinnek GalCerreceptorhoz történő kötődését gátló képességével. Sem a monomer V3peptidek, sem a kontroll MBPC-k nem mutattak vírus-ellenes hatást, és nem gátolták a gpl20 GalCer-receptorhoz történő kötődését.

A találmány tárgyát képezik tehát olyan belső mátrixot tartalmazó MBPC-k, amelyekhez 2-64, (előnyösen 4-32), a HIV-l-vírus gpl20 felszíni burok-glikopoteinjének V3-hurokrégiójából származó peptid kapcsolódik, és amely MBPC-k mind CD4⁺/GalCer'-, mind CD47GalCer⁺-sejekben képesek HIV-vírusok fertőzőképességének gátlására.

C. Antigenitás. Toxicitás és Imunogenitás

A találmány szerinti MBPC-k humán PBL-ekre in vitro, valamint MBPC-kkel 10'³ mól/1 koncentrációban intraperitoneálisan (hasüregbe), intravénásán vagy bőr alá ismételten injektált egerekben in vivő nem toxikusak. Egy (1) mg MBPC-t tartalmazó dózissal intraperitoneálisan és intravénásán ismételten injektált egerekben nem jelentkeztek káros hatások. Ezenkívül, 5 mg/kg dózissal egy alkalommal intravénásán, majd minden egyes nap bőr alá injektált majmokban (macaca sylvana) harminc nap elteltével nem mutatkozott semmilyen toxikus hatásra utaló jel. Továbbá, [GPGRAFJs-MLC-konstrukcióval injektált nyulakban és egerekben nem

-28termelődött jelentős titerü anti-[GPGRAF]₈-MLC-ellenanyag, ami megfelel annak az elméletnek, hogy a pepiid egyes ágaiban 10 aminosavnál kevesebb aminosavat tartalmazó MBPC-knek 10'³ mól/1, azaz az alkalmazandó koncentráció alatt nincs immunogén hatásuk. Ezenkívül, a PBL-ek más antigénekkel vagy mitogénekkel aktiválhatok maradnak.

1. Antigenitás

Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati-eljárás fELISA) az MBPCk immuno genitásának meghatározására

Az MBPC.l-, MBPC.2-konstrukciókat és monomer V3-konszenzuspeptidet teszteltünk ELISA-eljárásban HIV-l⁺-szérumokkal, valamint HIVΓ-szénunokkal szemben mutatott immunreaktivitásra nézve. A fenti vizsgálatban az MBPC.2 [RKSIHIGPGRAFYT]₄-(K)₂-K-bA-OH, az MBPC.l pedig [GPGRAF]₈-(K)₄-(K)₂-K-bA-OH szerkezettel rendelkezett. A szérumok pozitivitását először Westem-blot-analízissel igazoltuk a szérumban / plazmában található anti-HIV-1-ellenanyagok kimutatására szolgáló “NEW LAV-BLOT’-reagenskészlet alkalmazásával (Diagnostic Pasteur). Kilencvenhat-mélyületü mikrotitráló lemezeket mélyületenként 500 ng peptiddel fedtünk. Telítést és mosást követően a mélyületekbe 50 μΐ HIV-l⁺-szérumot adtunk (1/100 hígításban), és azokat 2 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. A festést peroxidázzal konjugált, sertésben termelt anti-nyúl IgG-vel végeztük. Harminc (30) HIV-l-pozitív és 3 HIV-l-negatív szérum összehasonlítóanalízisét végeztük el ELISA vizsgálati-eljárásban az észak-amerikai / európai konszenzus-szekvenciából (V3-Cons) származó V3-peptiddel és V3MBPC-kkel szemben. Az eredményeket az alábbiakban, az 5. táblázatban foglaltuk össze.

A 30 HÍV-1-pozitív szérum közül 26 erős reakciót adott a V3-Consszekvenciával és az MBPC.2-konstrukcióval, egy szérum mindkét peptiddel

-29gyengén reagált, egy szelektív módon reagált az MBPC.2-vel, és két szérum nem reagált egyik peptiddel sem.

Érdekes módon, az MBPC.l nem reagált egyik HÍV-1-pozitív szérummal sem. Az MBPC.2-vel összehasonlítva, az MBPC.l sokkal hatékonyabban gátolta a HIV-1- és HIV-2-fertőződést, és annál kevésbé volt toxikus. Az a tény, hogy az MBPC.l-konstrukciót a HÍV-1-pozitív szérumok nem ismerték fel, feltehetően azt jelenti, hogy az ilyen MBPC nem képes gátolni az anti-V3-ellenanyagok neutralizáló aktivitását. Ezért, azok szinergista módon hathatnak a HÍV-1-fertőzés semlegesítésében.

5. táblázat
Szérum No.	Westem-blot	ELISA V3-	500 ng peptid/mélyület
	HIV-1	Konszenzus	MBPC.2	MBPC.l
1	+	+++++	+++++	-
2	+	+++++	+++++	-
3	+	+++++	+++++	-
4	+	+++++	+++++	-
5	+	+++++	+++++	-
6	+	+++++	+++++	-
7	+	+++++	+++++	-
8	+	+++++	++-H-+	-
9	+	H—1—H—h	H—H—1—H	-
10	+	+++++	+-H-++	-
11	+	+++++	+++++	-
12	+	4—1—H—h	+++++	-
13	+	+++++	+++++	-
14	+	++	+++	-
15	+	+++++	+++++	-
16	+	+++++	+++++	-
17	+	+++++	+++++	-
18	+	+++++	4-+H—1—h	-
19	+	+++++	+++++	-
20	+	-	-	-
21	+	+	+	-
22	+	-	-	-
23	+	-	+	-
24	+	+++++	H—H—1—H	-
25	+	+++++	+++++	-
26	+	+++++	+++++	-
27	+	+++++	+++++	-
28	+	Η—1—H—h	+++++	-
29	+	+++++	H—H—1—H	-
30	+	+++++	+++++	-
31	-	-	-	-
32	-	-	-	-
33

• · · · · · * · • ··· « ··· ·

-312. Toxicitás

Az MBPC-knek sejtek életképességére kifejtett hatását MTT vizsgálati-eljárásban, egy sejtek életképességének meghatározásra szolgáló kolorimetriás eljárásban teszteltük 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]2,5-difentiltetrazoliumbromid alkalmazásával. CEM- vagy C8166-sejteket (5x10⁴) tenyésztettünk folyamatos tenyészetben (15 napig), 96-mélyületű mikrotitráló lemezek mélyületeiben, különböző koncentrációjú MBPC-k jelenlétében, 200 μΐ végtérfogatú, 5 % fötális borjúszérumai, 1 % glutaminnal és 1 % streptomycin/penicillin antibiotikum-eleggyel (Gibco of Irvine, Skócia) kiegészített RPMI-1640-tápfolyadékban, 5 % CO₂-dal telített párásított atmoszférában. Minden 3-4. napon 100 μΐ sejtszuszpenzió felhasználásával MTT vizsgálati-eljárást végeztünk, majd a tenyészetekhez MBPC-ket adtunk, és a térfogatot 200 μΐ-re egészítettük ki. A fenti vizsgálati-eljárásban a [GPGRAFjg-MLC 10'⁷-l θ’⁴ mól/1 koncentráció-tartományban nem volt toxikus a sejtekre. A további eredményeket a fentiekben, a 3. táblázatban összegeztük. Jeleztük, hogy az IGPGR-szekvenciát tartalmazó tetradekapeptid toxikus, tehát a találmány szerinti terápiás alkalmazás céljára nem felel meg.

3. MBPC-k alkalmazásával végzett antigenitási-immunogenitási vizsgálatok

Négy fekete C57/BL6-egeret 36 napon át, naponta 250 μΐ MBPC.3konstrukcióval injektáltunk 4 mg/ml koncentráció mellett (1 mg). Az injektálást intraperitoneálisan végeztük. Vérmintákat az orbita (szemüreg) alatt végzett punkcióval vettünk. A vérmintákat 1 órán át, 37 °C-on, majd egy éjszakán át, 4 °C-on állni hagytuk, ezután az így kapott felülúszókat (szérummintákat) szétválasztottuk az üledéktől. A szérumokat ELISA-eljárassal teszteltük specifikus anti-MBPC.3-ellenanyagokra nézve.

-32Ezenkívül, két “New Zeland”-nyulat immunizáltunk [GPGRAF]₈MLC-konstrukcióval: 1 ml PBS-ben (pH=7,4) oldott 400 pg [GPGRAF]₈MLC-konstrukciót elegyítettünk azzal megegyező térfogatú komplett Freund-féle adjuvánssal, és ezzel az eleggyel a 0. napon az egyes nyulakat intradermálisan (a bőrbe adva) injektáltuk. Ezt az eljárást a 30., 60., 90. és 120. napokon inkomplett Freund-féle adjuvánssal, bőr alá injektálva megismételtük. A szérumokat ELISA-eljárással teszteltük specifikus antiMBPC. 3-ellenanyagokra nézve. A bemutatott adatok az utolsó (120+7 nap) szérumminták vizsgálatából származtak.

Kilencvenhat-mélyületű mikrotitráló lemezeket (Nunc, Rotskild, Dánia) 2 órán át, 37 °C-on különböző koncentrációjú [GPGRAF]₈-MLC-konstrukcióval [mélyületenként 50 pl PBS-ben (pH=7,4), 500-25 ng [GPGRAF]₈MLC-konstrukcióval] fedtünk. 400 pl kazeinéi történő blokkolást követően a mélyületekbe különböző szérumhígításokat adtunk, és azokat 2 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. Kontrollként nem-immunizált nyulakból és egerekből származó szérumokat alkalmaztunk. Ötszöri mosást követően a mélyületekbe 1:5000 hígításban, 50 pl, peroxidázzal konjugált, sertésben termelt antinyúl IgG-t vagy anti-egér IgG-t adtunk (Dakopatts, Koppenhága, Dánia), és 1 óráig, 37 °C-on inkubáltuk. További mosást (5x) követően a mintákhoz 100 μΐ orto-fenilén-diamint adtunk, és a lemezeket 30 percig, szobahőmérsékleten, sötétben tartottuk. A reakciót 50 pl, 4 normál/1 kénsavval állítottuk le, és az optikai denzitás arányát (OD) 492/620 nm hullámhosszokon meghatároztuk.

Az eredményeket az alábbi 6-10. táblázatok tartalmazzák; a 6 táblázatban a nyulak esetében az optikai denzitás arányainak alkalmazásával kapott eredményeket összegeztük (xlO³). A “Mo”-rövidítés a GPGRAF-monomert jelöli, amelyet 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztunk.

-336. táblázat

Szérumhígítás

	1:10	1:100	1:1000
[GPGRAF]8-
MLC
(pg/ml)
10	nyúl-A	+++	+	-
	nyúl-B	+	-	-
5	nyúl-A	+++	-	-
	nyúl-B	+	-	-
1	nyúl-A	+++	-	-
	nyúl-B	+	-	-
0,5	nyúl-A	+	-	-
	nyúl-B	-	-	-

optikai denzitás (OD) < 0,2; +: OD = 0,2-0,4; ++: OD = 0,4-0,8; +++: OD > 0,8.

-347. táblázat

1. mikrotitráló lemez

	S10	S10	S5	S5	SÍ	SÍ	S.5	S.5	Mo	Mo
M(egér)	1162	1199	1045	933	444	419	382	381	1224	1135
10-2 M10-3	339	291	285	236	126	111	128	135	310	287
M 10-4	172	138	121	132	50	51	56	38	104	185
M-kontroll	622	550	527	551	337	313	360	341	516	591
R-kontroll	1062	1093	986	976	631	662	621	616	945	989
R 10-2	2000	2000	2000	2000	1280	1267	968	981	2000	2000
R 10-3	2000	2000	2000	2000	346	349	318	296	2000	2000
R10-4	924	823	796	809	182	193	145	140	677	725

Leírás: S10 = 10 gg MBPC.3 /ml; S5 = 5 pg MBPC.3 /ml

SÍ = 1 gg MBPC.3 /ml; S.5 = 0,5 gg MBPC.3 /ml Mo = GRGRAF-monomer, 10 gg/ml M 10-2 = [10'²]-hígítású egérszérum; R 10-2 [10'²] -hígítású nyúlszérum

M-kontroll = [10“²]-hígítású, nem-immunizált egérből származó szérum;

R-kontroll = [10'¹]-hígítású, nem-immunizált nyálból származó szérum.

-358, táblázat

2. mikrotitráló lemez

	S10	S10	S5	S5	SÍ	SÍ	S.5	S.5	Mo	Mo
M (egér)	1540	1457	1514	1344	381	429	315	841	1539	1575
10-2 M 10-3	334	291	263	273	54	65	47	82	342	335
M 10-4	132	188	88	97	15	17	13	83	95	126
M	490	464	385	231	241	289	235	851	482	500
kontroll
R (nyúl) kontroll	437	429	386	345	214	185	117	153	376	395
R 10-2	2000	2000	2000	2000	1922	87	34	716	2000	2000
R 10-3	2000	2000	2000	2000	394	87	197	181	2000	1909
R 10-4	734	689	678	626	113	84	80	74	588	625

Leírás: S10 = 10 pg MBPC.3 /ml; S5 = 5 pg MBPC.3 /ml

SÍ = 1 pg MBPC.3 /ml; S.5 = 0,5 pg MBPC.3 /ml Mo = GRGRAF-monomer, 10 pg/ml M 10-2 = [10'²]-hígítású egérszérum; R 10-2 [10²] -hígítású nyúlszérum

M-kontroll = [10'²]-hígítású, nem-ímmunizált egérből származó szérum;

R-kontroll = [10‘] -hígítású, nem-immunizált nyúlból származó szérum.

-369. táblázat

3. mikrotitráló lemez

	S10	S10	S5	S5	SÍ	SÍ	S.5	S.5
M (egér)	639	664	636	630	241	200	204	198
10-2
M 10-3	172	168	159	163	50	53	48	49
M 10-4	85	84	83	84	22	22	22	21
M	513	492	486	459	257	249	286	261
kontroll
R (nyúl)	833	238	222	213	92	92	91	88
kontroll
R 10-2	818	953	857	868	402	401	416	287
R 10-3	342	328	323	314	168	150	148	155
R 10-4	191	184	170	169	72	89	64	69

Mo

Leírás; S10 - 10 gg MBPC.3 /ml; S5 = 5 gg MBPC.3 /ml SÍ = 1 gg MBPC.3 /ml; S.5 = 0,5 gg MBPC.3 /ml Mo = GRGRAF-monomer, 10 gg/ml M 10-2 = [10’²]-hígítású egérszérum; R 10-2 [10'²] -hígításul nyúlszérum

M-kontroll = [10'²]-hígítású, nem-immunizált egérből származó szérum;

R-kontroll = [ 10^_1]-hígítású, nem-immunizált nyálból származó szérum.

-3710, táblázat

4. mikrotitráló lemez

	S10	S10	S5	S5	SÍ	SÍ	S.5	S.5	Mo	Mo
M (egér)	1454	1340	1233	1336	553	439	495	468	1231	1317
10-2
M 10-3	334	318	299	297	83	88	90	95	380	386
M 10-4	133	113	124	103	27	21	28	28	123	122
M	453	381	349	400	215	235	275	278	468	458
kontroll
R (nyúl)	225	203	285	288	95	86	82	86	283	185
kontroll
R 10-2	849	843	749	792	419	447	424	425	811	811
R 10-3	332	314	310	304	221	151	163	154	245	194
RABU	263	279	255	251	105	101	134	128	214	218

Leírás: S10 = 10 gg MBPC.3 /ml; S5 = 5 gg MBPC.3 /ml

SÍ = 1 gg MBPC.3 /ml; S.5 = 0,5 gg MBPC.3 /ml

Mo = GRGRAF-monomer, 10 gg/ml

M 10-2 = [10'²]-hígítású egérszérum; R 10-2 [10²] -hígítású nyúlszérum

M-kontroll = [10²]-hígítású, nem-immunizált egérből származó szérum;

R-kontroll = [10'¹]-hígítású, nem-immunizált nyúlból származó szérum.

R ABU = az Abu-peptiddel (azaz hasonlóságot nem mutató aminosav-szekvenciával) szemben termelt, [10’²]higítású nyúlszérum.

-38Az egyes eredmények esetében megfigyelhető magas szintű háttérreaktivitás figyelembe vételével, az MBPC. 1-konstrukcióval történő immunizálással kapott szérumok reaktivitás-hiányának igazolására további vizsgálatokat végeztünk.

MBPC.l- vagy MBPC.2-konstrukciókkal immunizált nyulakból származó szérumokat ELISA-eljárással teszteltünk arra nézve, hogy képesek-e kötődni az MBPC.l-, MBPC.2-konstrukciókhoz és a Mono.lkonstrukcióhoz (az MBPC.l monomer-formájához), valamint az északamerikai / európai konszenzus V3-szekvenciához (V3-Cons-, vagy Csszekvenciához). A 6.A ábra azt mutatja, hogy MBPC.2-konstrukcióval immunizált nyulakból származó szérum szignifikáns módon felismerte az MBPC.2- és V3-Cons-konstrukciókat, míg MBPC.l-konstrukcióval vagy a megfelelő monomer-peptidekkel szemben nem volt reaktivitás kimutatható. A 6.B ábra azt szemlélteti, hogy MBPC.l-konstrukcióval immunizált nyulakból származó szérumok nem reagáltak MBPC.l- (az A-jelzésű nyúl széruma esetében megfigyelt gyenge reaktivitástól eltekintve), MBPC.2-, V3Cons- vagy Mono. 1-konstrukciókkal. A negatív kontrollként használt preimmun-szérumok szintén nem reagáltak az MBPC-, V3-Cons- vagy Mono. 1 -konstrukciókkal.

Egy további kísérletsorozatban MBPC.l- vagy MBPC.2konstrukciókkal immunizált nyulakból származó szérumokat teszteltünk (1/100 és 1/1000 hígításban) MBPC.l-, MBPC.2- vagy V3-Conskonstrukciókkal szemben. A 7.A, 7.B és 7.C ábrák világosan mutatják, hogy az MBPC.2-konstrukcióval immunizált nyulakból származó szérumok dózisfüggő módon reagáltak MBPC.2-konstrukcióval és V3-Cons-konstrukcióval. Az MBPC.l-konstrukcióval szemben nem volt reaktivitás kimutatható. Ezzel szemben, az MBPC.l-konstrukcióval immunizált nyulakból származó

-39szérumok nem reagáltak MBPC. 2-konstrukció val, míg gyenge reakciót adtak az MBPC. 1-konstrukcióval (nevezetetsen, az A-jelzésű nyúl széruma esetében gyenge reaktivitás volt megfigyelhető az MBPC. 1-konstrukcióval szemben, a B-jelzésű nyúl széruma esetében nem volt reaktivitás megfigyelhető). Érdekes módon, az utóbbi szérumok nem reagáltak a monomer V3Cons-konstrukcióval, a gpl20-glikoproteinen jelenlevő konszenzusszekvenciát utánozó, 34 aminosavból álló lineáris epitóppal.

Ezek az eredmények azt jelentik, hogy az MBPC.l, amely egy rövid V3-MBPC, nyulakban nem vált ki jelentős ellenanyagválaszt, míg az MBPC.2, amely a leghosszabb V3-peptidkonstrukció, kivált ilyen válaszreakciót. Ezek a megfigyelések összhangban vannak azokkal az eredményekkel, amelyeket az MBPC.l HÍV-1-vírussal fertőzött betegek szérumaival szemben mutatott immunreaktivitásának vizsgálatakor kaptunk.

10'³ mól/1 koncentrációval ismételten injektált egerekben, 1:100 arányban hígított szérumok alkalmazása mellett esetenként nagyon kis titerben ellenanyagok voltak kimutathatók, kisebb szérumhígítások mellett lényegében nem volt ellenanyag kimutatható. Nyulak esetében, 1:100 szérumhígítás mellett egy állatban volt ellenanyag kimutatható. Valamennyi egyéb szérumhígítás alkalmazása mellett az ellenanyag-titerek összehasonlítható mértékűek voltak a kontroli-állatokban mért értékekkel. Ez a gyenge antigenitás azt jelenti, hogy a találmány szerinti MBPC-k nem alkalmazhatók antigénként hatékony ellenanyag-válasz kiváltására, mely célra a korábbiakban ismert peptidkonstrukciókat használták. Valójában, a találmány szerinti MBPC-k előnyös terápiás koncentrációja körülbelül 10'⁶ mól/1, és emellett a koncentráció mellett nem várható ellenanyag-válasz létrejötte. Az antigenitás hiányának köszönhetően azonban, az MBPC-k egészen 10'³ mól/1 koncentrációig alkalmazhatók.

Claims (9)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Többszörösen elágazó láncú peptidkonstrukció, azzal jellemezve, hogy egy belső mátrixot és ahhoz kötve 4-16 olyan pepiidet tartalmaz, melyek mindegyike tartalmazza a GPGR-aminosav-szekvenciát, mely szekvenciát 0-4 aminosav előz meg és 2-4 aminosav követ, de lényegében mentes az IGPGR- vagy IXXGPGR-szekvencáktól, ahol X jelentése bármely aminosav, és a peptidkonstrukciónak 10⁴ mól/l-nél kisebb szérumkoncentrációban nincs immunogén hatása.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti peptidkonstrukció, azzal jellemezve, hogy azonos szekvenciájú peptideket tartalmaz.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti peptidkonstrukció, azzal jellemezve, hogy kizárólag GPGRAF-szekvenciájú peptideket tartalmaz.
4. 4. A 3. igénypont szerinti peptidkonstrukció, azzal jellemezve, hogy 8 vagy 16 GPGRAF-peptidet tartalmaz.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti peptidkonstrukció, azzal jellemezve, hogy lizin-aminosavakból felépülő belső mátrixot tartalmaz.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptidkonstrukció, azzal jellemezve, hogy a belső mátrix és a peptidek között távtartó (“spacer”) szekvenciákat tartalmaz.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti peptidkonstrukció, azzal jellemezve, hogy egy vagy több D-aminosavat tartalmazó pepiidet vagy peptideket is tartalmaz.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti peptidkonstrukció, azzal jellemezve, hogy kizárólag a HIV-vírus gpl20 felszíni burokglikoproteinjének V3-hurokrégiójából származtatott szekvenciájú peptideket tartalmaz.

   ···

   -419. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti peptidkonstrukció, azzal jellemezve, hogy a HIV-vírus fertőzőképességét mind CD4⁺/GalCer'-, mind pedig CD4'/GalCer⁺-sejekben gátolni képes peptidkonstrukció.
9. 10. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti többszörösen elágazó láncú peptidkonstrukciót tartalmaz, gyógyászatilag elfogadható hígító vagy hordozó segédanyaggal elegyítve.