CN100355777C - 乙型肝炎病毒pre－S突变蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了乙型肝炎病毒pre-S突变蛋白及其制备方法与应用。本发明所提供的HBVpre-S突变蛋白，是野生型HBVpre-S蛋白15或/和123位点上的一个或/和两个天冬酰胺被组氨酸残基取代得到的蛋白质。本发明所提供的HBVpre-S突变蛋白的制备方法，包括：a)将编码pre-S蛋白的基因插入载体中；b)使具有pre-S基因的载体产生位点专一性突变，将突变后的载体转染宿主细胞；c)通过在培养基中培养转化体而产生pre-S突变蛋白。本发明提供的HBV疫苗成本低廉，使用方便。本发明提供的佐剂，可以诱导很强的体液免疫和细胞介导免疫。

Description

乙型肝炎病毒pre-S突变蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域中一种突变蛋白及其制备方法与应用，特别涉及乙型肝炎病毒pre-S突变蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)主要是通过涉及与血液或来自血液的流体的接触行为而传播的，然后通过血液传播给其它肝细胞。

大多数感染了HBV的个体可以通过身体的免疫应答从病毒感染状态完全恢复，但大约5％成为慢性携带者。当婴儿在围产期通过慢性携带者母亲(超过90％受到感染)或从其它来源受到感染时，情况会变得很糟糕。另外，通过器官移植的感染导致几乎100％携带HBV。许多病人维持不表现出严重症状的携带状态，但这些病人中10～30％要转化成慢性肝炎，他们慢慢地发展为肝硬化，然后最终发展为肝癌。

一旦感染了乙型肝炎病毒，通常会发展为急性肝炎，并且产生强烈的多克隆免疫应答，该应答会自然地治愈肝炎。自然治愈与多种特异的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)应答和强烈的多克隆体液免疫应答有关。也就是，病毒专一性抗体的有效中和，和诱导的CTL特定杀伤感染病毒的细胞导致成功地从感染中恢复。相反，HBV慢性携带者表现出很弱的低克隆免疫应答，这一结论也从HBV转基因小鼠的实验中得到了证实。

慢性携带者的血清中存在的42纳米丹氏粒是乙型肝炎病毒的传染形式。其它的22纳米颗粒和棒状形式不是传染颗粒。每一传染颗粒由被膜、衣壳(HbcAg)、病毒专一性DNA聚合酶和一个32kb的环状双链DNA组成。另一个病毒专一性蛋白-HBV e抗原(HbeAg)，在血清中以可溶形式存在。

从被膜基因可以产生三种不同的表面抗原。它们是大乙型肝炎表面抗原(L-HbsAg)，中等乙型肝炎表面抗原(M-HbsAg)和也被称作S-抗原的小型乙型肝炎表面抗原(S-HbsAg)。大抗原是由包括pre-S1-，pre-S2-和S-区的DNA序列的完全被膜基因产生的，中等抗原仅来源于pre-S2-和S-区，而小抗原仅来源于S-区。病毒颗粒中的这三种抗原成分中S-HbsAg在数量上占最大比例，M-HbsAg和L-HbsAg仅占很小的比例，只占全部被膜抗原的2～5％。

所有可通过商业途径获得的针对HBV的疫苗，几乎均含有乙型肝炎病毒小表面抗原(HbsAg)。真正的乙型肝炎病毒S抗原可以从慢性HBV携带者的血浆中以大约22纳米的颗粒回收，其包括两种蛋白，已知为P24及其糖基化衍生物GP28，这两种蛋白都由HBV基因组上的含有226个氨基酸的编码序列编码，该编码序列为S蛋白编码序列，或HBV S基因。然而，动物和人类试验都已经表明，pre-S蛋白部分比S抗原具有更强的免疫原性，从而可以比S抗原更快地形成抗体(比S抗原快至少20周)。事实上，人类临床研究已经表明用含有pre-S蛋白的疫苗仅仅注射两次就可以达到用仅含有S抗原的疫苗注射三次所达到的相同保护水平。与仅有S抗原的疫苗相比，含有pre-S蛋白的疫苗可以更有效地诱导针对非应答者的抗体应答。而且已知在病毒感染过程中，pre-S蛋白首先附着在肝细胞上，很可能作为病毒受体配体。如果这是事实，针对这一部分的抗体可以中和病毒，并且防止新的肝细胞受到感染。

尽管存在所有这些可能性，但pre-S蛋白的批量生产还没有实现，因而限制了它被用作疫苗。当整个被膜基因在动物细胞(CHO细胞)中进行表达时，主要表达S抗原，以致pre-S蛋白抗原的含量低至2～3％。从动物细胞产生抗原的费用太高，从乙型肝炎病毒的慢性携带者的血清纯化的病毒颗粒所含的pre-S抗原低于总抗原的5％，也不是生产疫苗抗原的有效方法。

目前，用干扰素和拉咪呋啶(lamivudine)来治疗慢性HBV携带者。干扰素治疗HBV慢性携带者的效力在20～25％之间，这些被治疗者中大约10％遭受非常严重的副作用，以至于必须停止治疗。干扰素也很昂贵，并且有引起肝炎复发的危险。另外，由于需要住院治疗，所以干扰素使用很不方便。拉咪呋啶是一种核酸衍生物，对于急性肝炎病人表现出40～70％的相当大的效力，但它限于治疗急慢性肝炎病人。而且，对拉咪呋啶具有抗性的病毒会很快出现，在一年内出现的几率为大约20～30％，在两年内为大约40％。

有效的治疗性疫苗成本低廉且使用起来方便。使用目前可以获得的预防性疫苗来治疗慢性HBV携带者的可能性在小规模的人类临床试验中已经得到了检验。从该研究，M.L.Michel等人证明了用疫苗来治疗慢性HBV携带者的可能性，但他们的结论是，为了有效地治疗需要很强的疫苗。另一个相关观察是，含有pre-S2和S抗原的巴思德玛里斯(Pasteur-Merieux)疫苗比仅含有S抗原的疫苗稍微好一些。该研究也表明了，包含多种抗原，例如pre-S1、pre-S2和S抗原将改进疫苗，并且表明治疗性疫苗需要一种很强的佐剂，其可以诱导很强的体液免疫和细胞介导免疫。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种HBVpre-S突变蛋白。

本发明所提供的HBVpre-S突变蛋白，是野生型HBVpre-S蛋白15或/和123位点上的一个或/和两个天冬酰胺被选自如下的氨基酸残基取代得到的：丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

所述pre-S突变蛋白优选的是Pre-S-15m(SEQ ID NO：9)蛋白、Pre-S-123m(SEQ IDNO：10)蛋白和Pre-S-dm(SEQ ID NO：11)蛋白。

所述野生型HBVpre-S蛋白选自HBV的adr、ayw、adw、adw2和adyw亚型家族中pre-S蛋白的一种。野生型HBV(adw亚型、ayw亚型、adw亚型)pre S基因及它们所编码的蛋白质见序列表中的SEQ ID NO：1-6。

所述HBVpre-S突变蛋白可以是非糖基化的，也可以是部分糖基化的，还可以是糖基化的。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述HBVpre-S突变蛋白的pre-S突变基因，它是一种包括pre-S1基因和pre-S2基因编码区的突变多核苷酸序列。

所述pre-S突变基因优选于HBV的adr、ayw、adw、adw2或adyw亚型家族中的任一种。

优选的pre-S突变基因是编码SEQ ID NO：9中所示的Pre-S-15m蛋白、SEQ ID NO：10中所示的Pre-S-123m蛋白或SEQ ID NO：11中所示的Pre-S-dm蛋白的基因中的任一种。

本发明的第三个目的是提供一种包括所述pre-S突变基因的重组载体。

本发明所提供的重组载体包括：

a)一个启动子；

b)一个权利要求5至7中任意一项所述的pre-S突变基因；

c)一个转录终止子。

所述重组载体优选的是pIL20-pre-S(15m)、pIL20-pre-S(123m)或pIL20-pre-S(dm)。

本发明的第四个目的是提供一种所述重组载体的转化体。

所述转化体优选的是酵母。所述酵母优选自酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(15m)(KCTC 0987BP)、酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(123m)(KCTC 1004BP)和酿酒酵母2805pIL20-pre-S(dm)。

本发明的第五个目的是提供一种上述转化体产生的pre-S突变蛋白。所述pre-S突变蛋白可以是完全糖基化的，部分糖基化的或非糖基化的。所述pre-S突变蛋白是用糖苷酶处理的。

本发明的第六个目的是提供一种以所述HBVpre-S突变蛋白为活性成分的佐剂。

所述pre-S突变蛋白可以是非糖基化、部分糖基化或完全糖基化的。

利用本发明提供的佐剂，可以诱导很强的体液免疫和细胞介导免疫。

本发明的第七个目的是提供一种以所述HBVpre-S突变蛋白为活性成分的疫苗。

为了增强疫苗的效力，所述HBV疫苗中还包括HBV S抗原。

所述HBV S抗原和所述pre-S突变蛋白的重量份数比为1∶1-10。所述pre-S突变蛋白是非糖基化的，部分糖基化的或完全糖基化的。

为了使疫苗效果更好，所述疫苗还包括一种或多种药学上可接受的载体。所述药物载体优选为赋形剂、释放剂、或佐剂。所述赋形剂或释放剂为盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油和乙醇。所述疫苗的剂型可以是口服的，也可以是注射的。

本发明提供的HBV疫苗成本低廉，且使用方便。使用本发明的HBV疫苗可以对乙型肝炎病毒产生有效的免疫性。

本发明的第八个目的是提供一种以所述HBVpre-S突变蛋白为活性成分的诊断组合物，它可以用于检测HBV、HBV表面抗原或由pre-S基因编码的抗原的抗体的形成。

本发明的第九个目的是提供一种HBVpre-S突变蛋白的制备方法。

本发明所提供的HBVpre-S突变蛋白的制备方法，包括：

a)将编码pre-S蛋白的基因插入载体中；

b)使具有pre-S基因的载体产生位点专一性突变，用突变后的载体转染宿主细胞；

c)通过在培养基中培养转化体而产生pre-S突变蛋白。

本发明的第十个目的是提供一种增强抗原对抗体应答的方法。

一种增强抗原对抗体应答的方法，是将上述佐剂以抗体增强有效量施用于哺乳动物或鸟类。

所述抗原可以衍生于病毒、细菌、酵母或真菌。所述病毒是HIV、HBV、HCV或轮状病毒。所述哺乳动物可以是人类、畜牧动物、实验室试验动物、家畜和被俘的野生动物。所述鸟类可以是鸡或其它家鸟。

附图说明

图1为本发明的pIL20-pre-S载体的结构图谱

图2a为SDS-PAGE分析的图片

图2b为Western印迹分析的结果

图3a为SDS-PAGE分析的图片

图3b为Western印迹分析的结果

图4a为SDS-PAGE分析的图片

图4b为Western印迹分析的结果

图4c为SDS-PAGE分析的图片

图4d为Western印迹分析的结果

图5a为SDS-PAGE分析的图片

图5b为Western印迹分析的结果

图6为用HPLC分析pre-S突变蛋白的曲线图

图7为用本发明乙型肝炎病毒疫苗在小鼠中测量免疫原性的结果

图8为用本发明乙型肝炎病毒疫苗在大鼠中测量免疫原性的结果

图9为用本发明乙型肝炎病毒疫苗在兔子中测量免疫原性的结果

图10为在小鼠中测量针对S抗原的免疫应答的结果

图11a-d为在小鼠中测量针对S抗原的IgG亚型免疫应答的结果

图12为用本发明pre-S突变蛋白检测HBV抗体的结果。

具体实施方式

实施例1、表达pre-S蛋白的酵母细胞系的制备。

(1)pIL20-pre S载体的制备

为了克隆pre-S基因，选择韩国变体HBV315(序列登录号AF286594)作为乙型肝炎病毒的adr亚型的主要类型，并且用PCR方法对pre-S基因进行扩增。所用的引物是SEQ ID NO：7的正义引物，和SEQ ID NO：8的反义引物。正义引物在HBV基因的位点2848上结合，并且其包括KEX2和Xbal限制酶切位点。而且，反义引物在位点130上是专一性的，并且其包括终止密码子(TAG)和一个BamHI限制酶切位点。

在变性(94℃，1分钟)，退火(45℃，1分钟)和聚合(72℃，1分钟)条件下进行PCR，循环三十多次，从而产生SEQ ID NO：1的522bp PCR产物。用限制性内切酶Xbal和BamHI消化PCR产物，使其具有粘性末端。将具有粘性末端的PCR产物插入用相同酶消化过的pIL20载体中，从而构建pIL20-pre-S(adr)载体，其结构如图1对重组载体的结构做了示意性的说明。

(2)载体pIL20-pre-S(ayw)的制备

将HBV ayw亚型(序列号X02496)用作模板，构建pIL20-pre-S(ayw)载体。

(3)转化体的制备

用传统转化方法将pIL20-pre-S载体(adr)或pIL20-pre-S(ayw)载体转化酵母(酿酒酵母2805)。酿酒酵母2805是具有基因型Matapep4::HIS3prb1-1.6Rcan1GAL2his3-200ura3-52的ura^-宿主。

通过在ura^-、ade^-和trp^-选择培养基(CAA-葡萄糖)上进行培养，来选择转化体/pIL20-pre-S(adr)或/pIL20-pre-S(ayw)。

用pIL20-pre-S(adr)载体转化的酵母被命名为酿酒酵母2805/pIL20-pre-S，并且于2001年4月16日保藏于Korean Collection for Type Cultures(“KCTC”)，编号KCTC 0987BP，KCTC是一个国际保藏机构。用pIL20-pre-S(ayw)载体转化的酵母被命名为酿酒酵母2805/pIL20-pre-S，并且于2001年5月8日保藏于Korean Collectionfor Type Cultures(“KCTC”)，编号KCTC 1004BP。

实施例2、表达pre-S突变蛋白的酵母细胞系的制备。

为了增加pre-S蛋白的免疫原性，通过位点定向诱变将pre-S蛋白区的糖基化位点(氨基酸15和123天冬酰胺)突变成为组氨酸或谷氨酰胺，其中位点定向诱变使用质粒pIL20-pre-S载体作为模板。

将在氨基酸#15上编码天冬酰胺的核苷酸密码子AAT突变成编码组氨酸的密码子CAC，构建pIL20-pre-S(15m)载体。将在氨基酸#123上编码天冬酰胺的核苷酸密码子AAC突变成编码组氨酸的密码子CAC，构建pIL20-pre-S(123m)载体。将在氨基酸#15和#123上编码天冬酰胺的两个密码子突变成编码组氨酸的核苷酸密码子CAC，构建双重突变体质粒pIL20-pre-S(dm)载体。

将pIL20-pre-S(15m)载体，pIL20-pre-S(123m)载体或pIL20-pre-S(dm)载体再次用于转化酵母，酿酒酵母2805。通过上边所述的同样筛选方法，选择具有重组蛋白的最高表达率的菌落作为用于制备的细胞系，从而建立一个原细胞库。转化体为2805/pIL20-pre-S(15m)(KCTC 0987BP)、酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(123m)(KCTC1004BP)和pIL20-pre-S(dm)。

实施例3、pre-S突变蛋白的制备。

(1)pre-S突变蛋白制备的确认

在顺序分批发酵培养液(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中在30℃的温度下，将转化体(酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(adr)、酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(ayw)和酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(dm))分别培养大约24小时。当600nm的OD水平达到20～30时，慢慢地加入含有2％的半乳糖的补料分批培养液(1％酵母提取物、2％蛋白胨)，其中该培养液所含的半乳糖是pre-S基因表达的诱导物，并且是诱导培养基中唯一的碳源，然后将培养继续大约24小时，以诱导pre-S基因的表达。

将20～30ul的培养基进行SDS-PAGE分析，用pre-S蛋白专一性单克隆抗-pre-S蛋白抗体来进行Western印迹分析，以确认pre-S基因的表达。

图2a是培养基的SDS-PAGE分析的图片，验证了在酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(adr)中表达的pre-S蛋白，图2b显示在图2a中的电泳凝胶的Western印迹分析的结果。图2的泳道1和泳道2表明了蛋白分子量标准的大小，泳道3是用不含pre-S基因的pIL20载体转化的酿酒酵母2805的培养基，泳道4和泳道5是酿酒酵母2805/pIL20-pre-S的培养基，泳道6和泳道7是酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(ayw)的培养基。对从转化体表达的pre-S蛋白进行了广泛的糖基化，这样SDS-PAGE分析可以显示分子大小在150～250kDa之间的宽带。

图3a和3b显示使用单克隆抗-pre-S蛋白抗体，对酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(dm)培养基进行的SDS-PAGE(a)和Western印迹(b)分析。泳道1是蛋白的大小标志，泳道2是野生型pre-S蛋白，泳道3是酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(dm)的培养基。从酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(dm)表达的pre-S突变蛋白被部分糖基化，并且该pre-S突变蛋白表现出大约50kDa的分子大小。

(2)发酵

将产生pre-S突变蛋白的重组酵母在一个10L的发酵瓶中培养。用25ml和500ml的烧瓶在碱性培养液(0.6％水解酪蛋白氨基酸、2％葡萄糖、1x酵母氮碱基(1x yeastnitrogen base))中建立种子培养液。

当在补料分批发酵培养液中培养了36小时时，用葡萄糖试验试剂盒来确认葡萄糖是否用尽。然后，慢慢地加入培养液(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％半乳糖)，并且培养36小时，以诱导pre-S的表达。在600nm下，细胞的密度为OD水平大约50，pre-S的浓度大约在50～60mg/L之间。

(3)纯化

3-1.收集和过滤阶段

在转化酵母中表达的pre-S突变蛋白分泌进培养液中。用离心法从培养液中去除细胞，然后用0.45um大小的Durapore膜将培养溶液精过滤几次。

3-2.超细过滤阶段

用分子量截断值为30kDa的超细滤膜将上述培养溶液进行超滤和渗滤。

3-3.离子交换层析

将滤液加入用25mM的乙酸缓冲液(pH4.5)平衡的SP-琼脂糖凝胶FF柱中，并且用同一缓冲液洗涤该柱，随后用氯化钠浓度梯度(0.2M NaCl)洗脱。

3-4.大小差异分离阶段

通过超细滤膜将上述用离子交换层析分离的洗脱液再次浓缩，然后装入聚丙烯酰胺葡聚糖S-300(或S-200)凝胶过滤柱中。然后，使磷酸缓冲盐水(PBS，pH7.0)通过该柱来洗脱pre-S突变蛋白。

在上述洗脱组分中，将含有pre-S突变蛋白的组分[Kav＝0.440-0.475，Kav＝Ve-Vo/Vt-Vo，Ve：蛋白质的洗脱体积，Vo：蓝色葡聚糖的洗脱体积，Vt：柱的总体积]集中起来，并且使其通过0.22nm滤膜，然后存储在冷冻机中。

下述表2给出了纯化产率。

表2

步骤	总的蛋白	总的pre-S蛋白	比活性(mgpre-S/mg蛋白)	纯化产率	纯度(倍数)
						过滤阶段	309,440mg	347.8mg	0.00112	100％	1
超滤阶段	14,780mg	336.4mg	0.02276	96.7％	20.3
						离子交换层析	360mg	235.5mg	0.65417	67.7％	584.1
大小差异分离	157.9mg	155.43mg	0.98486	44.7％	878.9

图4a～4d显示从纯化过程的每一步骤对样品进行纯化的SDS-PAGE和Western印迹分析。图4a显示在酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(adr)的培养基上进行的SDS-PAGE分析，4b是在同一培养基上进行的Western印迹分析。图4c是在酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(dm)上进行的SDS-PAGE分析，4d是在同一培养基上进行的Western印迹分析。在图4a和4b中，泳道1是培养基，泳道2是在过滤阶段纯化的样品，泳道3是在离子交换层析阶段(Sp-琼脂糖凝胶)纯化的样品，泳道4是在大小差异分离阶段(S300)纯化的样品，泳道5是大小标志物。在图4c和4d中，泳道1是培养基，泳道2是在过滤阶段纯化的样品，泳道3是在离子交换层析阶段(Sp-琼脂糖凝胶)纯化的样品，泳道4是在离子交换层析阶段(Q-琼脂糖凝胶)纯化的样品，泳道5是在大小差异分离阶段(S200)中纯化的样品，泳道6是大小标志物。

酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(adr)表达高糖基化的pre-S蛋白，酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(dm)表达部分糖基化的pre-S突变蛋白。因此可以通过纯化步骤得到具有高纯度的pre-S突变蛋白。

实施例4、pre-S突变蛋白的物理和化学特性。

为了观察pre-S突变蛋白是否被糖基化，用N-糖苷酶F(Calbiochem)来消化用酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(dm)生产的pre-S突变蛋白，并且进行Western印迹分析。

图5a和5b显示根据本发明纯化的pre-S突变蛋白的SDS-PAGE(a)和Western印迹(b)分析。泳道1是纯化的pre-S突变蛋白，泳道2是用N-糖苷酶F处理的pre-S突变蛋白。在去除糖基部分之后，观察到pre-S突变蛋白的分子量是大约20kDa。

为了证实实施例3的pre-S突变蛋白的纯度，进行了HPLC分析。TSK G3000SW被用作柱，并且在PBS上的流速是1ml/分钟，是在214nm检测的。

图6显示pre-S突变蛋白的HPLC曲线图。图表上的单一峰值证实了pre-S突变蛋白的高纯度，并且没有任何其它物质污染的迹象。

而且，在蛋白序列分析系统(Procise cLC 492，Applied Biosystems)中对在上述实施例3中纯化的pre-S突变蛋白的N-末端氨基酸序列进行了分析，并且将其与从pre-S基因的序列推断的氨基酸序列进行了比较。

表3显示pre-S突变蛋白的氨基酸序列和从pre-S基因的碱基序列推断的氨基酸序列。表3中的“ND”指“没有确定”。除了一个之外，它们完全匹配。

表3

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
															pre-S突变蛋白	Met	Gly	Gly	Trp	Ser	Ser	Lys	Pro	ND	Gln	Gly	Met	G1y	Thr
衍生氨基酸	Met	Gly	Gly	Trp	Ser	Ser	Lys	Pro	Arg	Gln	Gly	Met	Gly	Thr

实施例5、用单克隆抗-pre S验证突变pre-S蛋白。

检查突变pre-S蛋白的专一性抗原-抗体反应性。用N-糖苷酶F(Calbiochem)对用酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(adr)产生的突变pre-S蛋白进行消化，并且进行Western印迹分析。

与单克隆抗-pre-S2抗体反应的突变pre-S蛋白显示出大小在150～250kDa之间，并且在去除糖基部分之后显示为大约20kDa。因此，突变pre-S蛋白保持了不依赖于糖基化的抗原抗体反应性的专一性。

实施例6、HBV疫苗的制备。

将10ug的实施例3的pre-S突变蛋白吸附进0.8mg的氢氧化铝中，以配制疫苗。用0.8mg的氢氧化铝吸附20ug的pre-S突变蛋白是可能的。

实施例7、HBV疫苗的制备。

将5～20ug的实施例3的pre-S突变蛋白用于疫苗配方。

实施例8、HBV疫苗的制备。

用完全Freud’s佐剂(CFA)来混合1～200ug的pre-S突变蛋白，以制备用于免疫原性测试的免疫原。

实施例9、pre-S突变蛋白的免疫原性的验证。

(1)免疫原性试验-小鼠试验

将实施例6，7和8制备HBV疫苗10ug以0，2和4周的时间间隔从肌肉注射进每一Balb-c小鼠中。在第一次注射后的30天，抽取血液用ELISA方法观察针对抗pre-S突变蛋白的抗体的形成。

图7显示了在小鼠中测量HBV的pre-S突变蛋白的免疫原性的结果。●是用实施例6制备的疫苗诱导的抗体滴定量，○是用实施例7制备的疫苗诱导的抗体滴定量，是用实施例8制备的疫苗诱导的抗体滴定量。正如图7中所示，单独用pre-S突变蛋白或与佐剂共同注射对小鼠免疫，并且当与实施例6和7的疫苗进行比较时，实施例8的疫苗显示出显著增强的免疫原性。

(2)免疫原性试验-大鼠试验

检验实施例6的疫苗和用PAMIII配制的疫苗在大鼠体内的免疫原性，其中PAMIII为一种已证明对人体无害的脂肽。

实施例8的疫苗被用作阳性对照组，不含pre-S突变蛋白的组合物被用作阴性对照组。

将20ug的疫苗(实施例6的疫苗，用PAMIII配制的疫苗，正对照，和负对照)分别在0，2和4周的时间间隔从肌肉注射进Sprague Dawley大鼠。在第一次注射后的30天，用ELISA方法来检验用这些疫苗免疫的大鼠血清中针对pre-S突变蛋白的抗体。

图8显示了在大鼠中测量HBV的pre-S突变蛋白的免疫原性的结果。●是用实施例6的疫苗诱导的抗体滴定量，○是用阳性对照组诱导的抗体滴定量，是用PAMIII配制的疫苗诱导的抗体滴定量，是用阴性对照组诱导的抗体滴定量。正如在图8中可以看到的，实施例6的疫苗和用PAMIII配制的疫苗在大鼠体内诱导了针对pre-S突变蛋白的免疫应答。而且，脂肽PAMIII也诱导了针对pre-S抗原的抗体，这显示了它作为免疫支持试剂的潜力。

(3)免疫原性试验-兔子试验

为了观察pre-S突变蛋白的免疫原性，将100ug的pre-S突变蛋白在0，2和6周的时间间隔连同完全Freund佐剂从肌肉三次注射进兔子中。在最后一次注射后的10天，抽取血液并且分离血清以便用ELISA方法评价pre-S突变蛋白专一性抗体滴定量。

图9显示了在兔子中测量HBV的pre-S突变蛋白免疫原性的结果。●是正常的兔子血清，○是免疫的兔子#1的血清，是免疫的兔子#2的血清。

pre-S突变蛋白在兔子中显示出高抗体滴定量。

(4)pre-S突变蛋白的免疫原性

同样地，在Balb/c小鼠和ICR小鼠中试验的免疫原性，测试了两个单一突变体(Pre-S-15m和Pre-S-123m))，一个双重突变体(Pre-S-dm)，和一个与破伤风类毒素序列连接的双重突变体的免疫原性。用完全Freund佐剂配制时，所有这些具有高度免疫性，但以氢氧化铝作为佐剂时，其抗体滴定度非常低。

实施例10、pre-S突变蛋白的佐剂活性的验证。

pre-S突变蛋白被用于增强免疫应答。

当pre-S突变蛋白(Pre-S-dm)和S抗原的混合物(下文被称作“LPVac-HBV”)被吸附到氢氧化铝(alum)，并且通过腹膜内注射使用时，LPVac-HBV的免疫原性比单独使用S抗原(“HbsAg”)增加了好几倍(结果如图10所示)。

血清是从用LPVac-HBV或HBbsAg免疫的小鼠获得的，并且也确定了IgG亚型(如图11a-d所示，图中●是LPVac-HBV，○是HbsAg，其中a-d分别是用IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3滴定)。从图中可以看出，IgG2a比单独使用S抗原增加了大约10倍。

因此，可以将pre-S突变蛋白包括在预防性疫苗配方中，以提高目前可以获得的含有S抗原的疫苗的总质量，并且可以包括在治疗性疫苗配方中。

实施例11、毒性试验-单一施用毒性试验(急性)。

将实施例6的疫苗从腹部注射到ICR小鼠中，注射量为0，0.125，0.25，0.5，1和2mg/kg(体重)。对测试组的体重、临床症状和病理发现进行观察，并且与没有注射疫苗的阴性对照组进行比较。在试验中，没有观察到不正常的症状。甚至在最大剂量(2mg/kg)下，也没有一只小鼠死亡；所以不能确定LD₅₀。因此，可以看到，实施例6的疫苗对小鼠没有急性毒性。

实施例12、毒性试验-重复施用毒性试验(亚急性)。

将实施例6的疫苗皮下注射到Sprague Dawley大鼠中，每周注射五次，注射量为0，50，100和200ug/kg(体重)，然后观察变化。与没有注射疫苗的对照组进行比较，用实施例6的疫苗免疫的SD大鼠在体重、临床症状或病理学上没有显示出任何变化。

实施例13、毒性试验-皮肤试验。

从New Zealand白兔上去掉2.5cm×2.5cm大小的毛，其中一只兔子用皮下注射的针去除角质层，另一只没有处理。将0.5mg实施例6的疫苗涂抹在外科纱布上，然后置于两块区域上以便将其覆盖住。用同一方法用PBS处理对照组。在皮肤接触24，48和72小时后，根据Draize评分系统观察被处理部分，以测定药物治疗的安全性。

与对照组相比，用pre-S突变蛋白处理过的New Zealand白兔的皮肤没有表现出临床变化，如红斑、焦痂和浮肿。

实施例14、pre-S突变蛋白作为诊断试剂的用途。

测试了实施例3的pre-S突变蛋白捕捉抗-pre-S蛋白抗体的效力。

根据标准方法，用pre-S突变蛋白以50ng/孔的用量涂敷96孔板(Nunc Maxicorp)。用PBST(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄)将涂敷的板洗涤3次，然后将100ul的1％的牛血清白蛋白(“BSA”)加入每一孔中，以封闭板上的剩余抗原结合位点。在37℃的温度下孵育1小时后，用PBS洗涤板子，并且存储于4℃下直到使用。

在该试验中，将具有确定的抗体滴定量的用小鼠或人血清制备的抗-pre-S2蛋白抗体用作阳性对照组，将PBS用作阴性对照组。每一孔的反应体积是100ul，并且它们在37℃的温度下反应90分钟。用相同的方式，将100ul的每一种人血清和连续稀释人血清用于抗-pre-S蛋白抗体的试验。在室温下，将山羊抗鼠IgG或山羊抗人IgG与辣根过氧化物酶(“HRP”)结合作为第二抗体使用，然后加入邻苯二胺(“OPD”)作为底物来显色。在用3M HCl终止显色反应后，在492nm测量OD水平。

图12显示pre-S突变蛋白可以在与阳性对照组相似水平的HBV-阳性人血清中(例如单克隆pre S2抗体)捕捉抗-pre S抗体。因此，可以用pre-S突变蛋白来开发诊断试剂盒，来检测临床样品中的HBV-专一性抗体。

序列表

<210>1

<211>522

<212>DNA

<213>HBV(adr亚型)pre S基因

<400>1

atgggaggtt ggtcttccaa acctcgacaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat     60

cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat    120

ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggcaaatca ggtaggagtg    180

ggagcattcg ggccagggtt caccccacca cacggcggtc ttttggggtg gagccctcag    240

gctcagggca tattgacaac agtgccagca gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag    300

tcaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggccatg    360

cagtggaact ccaccacatt ccaccaagct ctgctagatc ccagagtgag gggcctatat    420

tttcctgctg gtggctccag ttccggaaca gtaaaccctg ttccgactac tgcctcaccc    480

atatcgtcaa tcttctcgag gactggggac cctgcaccga ac                       522

<210>2

<211>522

<212>DNA

<213>HBV(ayw亚型)pre S基因

<400>2

atgggaggtt ggtcttccaa acctcgacaa ggcatggggc agaatctttc caccagcaat     60

cctctgggat tctttcccga ccaccagttg gatccagcct tcagagcaaa caccgcaaat    120

ccagattggg acttcaatcc caacaaggac acctggccag acgccaacaa ggtaggagct    180

ggagcattcg ggctgggatt caccccacca cacggaggcc ttttggggtg gagccctcag    240

gctcagggca tactagaaac gttgccagca aatccgcctc ctgcctctac caatcgccag    300

tcaggaaggc agcctacccc gctgtctcca cctttgagaa acactcatcc tcaggccatg    360

cagtggaact ccacaacctt ccaccaaact ctgcaagatc ccagagtgag aggcctgtat    420

ttccctgctg gtggctccag ttcaggaaca gtaaaccctg ttccgactac tgtctctccc    480

atatcgtcaa tcttctcgag gattggggac cctgcgctga ac                       522

<210>3

<211>522

<212>DNA

<213>HBV(adw亚型)pre S基因

<400>3

atgggaggtt ggtcatcaaa acctcgcaaa ggcatgggga cgaacctttc tgttcccaac     60

cctctgggat tctttcccga tcatcagttg gaccctgcat tcggagccaa ttcaaacaat    120

ccagattggg acttcaaccc catcaaggac cactggccac aagccaacca ggtaggagtg    180

ggagcatttg ggccagggtt cactccccca cacggaggtg ttttggggtg gagccctcag    240

gctcagggca tattggccac cgtgccagcg atgcctcctc ctgcctccac caatcggcag    300

tcaggaaggc agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggccatg    360

cagtggaatt ccacagcttt ccaccaagct ctgcaagatc ccagagtcag gggcctgtat    420

tttcctgctg gtggctccag ttcaggaaca ctcaaccctg ttccaactat tgcctctcac    480

atctcgtcaa tctcctcgag gattggggac cctgcaccga ac                       522

<210>4

<211>174

<212>PRT

<213>HBV(adr subtype)pre S蛋白

<400>4

Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu

  1               5                  10                  15

Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro

             20                  25                  30

Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn

         35                  40                  45

Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly

    50                  55                  60

Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln

 65                  70                  75                  80

Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser

                 85                  90                  95

Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu

            100                 105                 110

Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His

        115                 120                 125

Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly

    130                 135                 140

Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro

145                 150                 155                 160

Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn

                165                 170

<210>5

<211>174

<212>PRT

<213>HBV(ayw亚型)pre S蛋白

<400>5

Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Gln Asn Leu

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro

             20                  25                  30

Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn

         35                  40                  45

Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly

     50                  55                  60

Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln

 65                  70                  75                  80

Ala Gln Gly Ile Leu Glu Thr Leu Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser

                 85                  90                  95

Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu

            100                 105                 110

Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His

        115                 120                 125

Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly

    130                 135                 140

Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Val Ser Pro

145                 150                 155                 160

Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn

                165                 170

<210>6

<211>174

<212>PRT

<213>HBV(adw亚型)pre S蛋白

<400>6

Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu

  1               5                  10                  15

Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro

             20                  25                  30

Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile

         35                  40                  45

Lys Asp His Trp Pro Gln Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly

     50                  55                  60

Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln

 65                  70                  75                  80

Ala Gln Gly Ile Leu Ala Thr Val Pro Ala Met Pro Pro Pro Ala Ser

                 85                  90                  95

Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu

            100                 105                 110

Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His

        115                 120                 125

Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly

    130                 135                 140

Gly Ser Ser Ser Gly Thr Leu Asn Pro Val Pro Thr Ile Ala Ser His

145                 150                 155                 160

Ile Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ile Gly Asp Pro Ala Pro Asn

                165                 170

<210>7

<211>39

<212>DNA

<213>引物

<400>7

gtctctagac aagagaatgg gaggttggtc ttccaaacc

<210>8

<211>37

<212>DNA

<213>引物

<400>8

atcggatccc tagttcggtg cagggtcccc agtcctc

<210>9

<211>174

<212>PRT

<213>PreS-15m蛋白

<400>9

Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr His Leu

  1               5                  10                  15

Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro

             20                  25                  30

Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn

         35                  40                  45

Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly

     50                  55                  60

Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln

 65                  70                  75                  80

Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser

                 85                  90                  95

Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu

            100                 105                 110

Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His

        115                 120                 125

Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly

    130                 135                 140

Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro

145                 150                 155                 160

Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn

                165                 170

<210>10

<211>174

<212>PRT

<213>PreS-123m蛋白

<400>10

Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu

  1               5                  10                  15

Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro

             20                  25                  30

Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn

         35                  40                  45

Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly

     50                  55                  60

Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln

 65                  70                  75                  80

Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser

                 85                  90                  95

Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu

            100                 105                 110

Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp His Ser Thr Thr Phe His

        115                 120                 125

Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly

    130                 135                 140

Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro

145                 150                 155                 160

Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn

                165                 170

<210>11

<211>174

<212>PRT

<213>PreS-dm蛋白

<400>11

Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr His Leu

  1               5                  10                  15

Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro

             20                  25                  30

Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn

         35                  40                  45

Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly

     50                  55                  60

Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln

 65                  70                  75                  80

Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser

                 85                  90                  95

Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu

            100                 105                 110

Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp His Ser Thr Thr Phe His

        115                 120                 125

Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly

    130                 135                 140

Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro

145                 150                 155                 160

Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn

                165                 170

Claims (27)

1、一种HBV pre-S突变蛋白，是野生型HBV pre-S蛋白15或/和123位点上的天冬酰胺被组氨酸残基取代得到的蛋白。

2、根据权利要求1所述的HBV pre-S突变蛋白，其特征在于：所述HBV pre-S突变蛋白为氨基酸残基序列如SEQ ID NO：9所示的HBVPre-S-15m蛋白、氨基酸残基序列如SEQ ID NO：10所示的HBVPre-S-123m蛋白或氨基酸残基序列如SEQ ID NO：11所示的HBVPre-S-dm蛋白。

3、根据权利要求1所述的HBVpre-S突变蛋白，其特征在于：所述野生型HBV pre-S蛋白选自HBV的adr、ayw、adw、adw2和adyw亚型家族中pre-S蛋白的一种。

4、根据权利要求1所述的HBV pre-S突变蛋白，其特征在于：所述HBV pre-S突变蛋白是非糖基化、部分糖基化或糖基化的。

5、一种编码权利要求1所述的HBV pre-S突变蛋白的pre-S突变基因，它是一种包括pre-S1基因和pre-S2基因编码区的突变多核苷酸序列。

6、根据权利要求5所述的pre-S突变基因，其特征在于：所述pre-S突变基因来源于HBV的adr、ayw、adw、adw2或adyw亚型家族中的任一种。

7、根据权利要求5所述的pre-S突变基因，其特征在于：所述pre-S突变基因为编码SEQ ID NO：9所示的Pre-S-15m蛋白、SEQ ID NO：10所示的Pre-S-123m蛋白或SEQ ID NO：11所示的Pre-S-dm蛋白的基因。

8、一种pre-S突变基因的重组载体，它包括：

a)一个启动子；

b)一个权利要求5至7中任意一项所述的pre-S突变基因；

c)一个转录终止子。

9、根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于：所述载体是pIL20-pre-S(15m)、pIL20-pre-S(123m)或pIL20-pre-S(dm)。

10、一种包括权利要求8所述重组载体的转化体。

11、根据权利要求10所述的转化体，其特征在于：所述转化体为酵母。

12、根据权利要求11所述的转化体，其特征在于：所述酵母为酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(15m)、酿酒酵母2805/pIL20-pre-S(123m)或酿酒酵母2805pIL20-pre-S(dm)。

13、一种用权利要求10所述转化体产生的pre-S突变蛋白。

14、根据权利要求13所述的pre-S突变蛋白，其特征在于：所述pre-S突变蛋白是完全糖基化的，部分糖基化的或非糖基化的。

15、根据权利要求14所述的pre-S突变蛋白，其特征在于：所述pre-S突变蛋白是用糖苷酶处理的。

16、一种以权利要求1至2所述HBVpre-S突变蛋白为活性成分的佐剂。

17、根据权利要求16所述的佐剂，其特征在于：所述pre-S突变蛋白是非糖基化、部分糖基化或完全糖基化的。

18、一种以权利要求1所述HBVpre-S突变蛋白为活性成分的HBV疫苗。

19、根据权利要求18所述的HBV疫苗，其特征在于：所述HBV疫苗还包括HBV S抗原。

20、根据权利要求19所述的HBV疫苗，其特征在于：所述HBV S抗原和所述pre-S突变蛋白的重量份数比为1∶1-10。

21、根据权利要求18所述的HBV疫苗，其特征在于：所述pre-S突变蛋白是非糖基化的，部分糖基化的或完全糖基化的。

22、根据权利要求18所述的HBV疫苗，其特征在于：所述疫苗还包括一种或多种药学上可接受的药物载体。

23、根据权利要求22所述的HBV疫苗，其特征在于：所述药物载体为赋形剂、释放剂、或佐剂。

24、根据权利要求23所述的HBV疫苗，其特征在于：所述赋形剂或释放剂为盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油和乙醇中的一种或几种。

25、根据权利要求18所述的HBV疫苗，其特征在于：所述疫苗为口服剂或注射剂。

26、一种以权利要求1所述HBVpre-S突变蛋白为活性成分的检测HBV、HBV表面抗原或由pre-S基因编码的抗原的抗体形成的诊断组合物。

27、权利要求1所述HBVpre-S突变蛋白的制备方法，包括：

a)将编码pre-S蛋白的基因插入载体中；

b)使具有pre-S基因的载体产生位点专一性突变，用突变后的载体转染宿主细胞；

c)通过在培养基中培养转化体而产生pre-S突变蛋白。

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