HU200479B

HU200479B - Process for producing peptides having immunosuppressive activity and pharmaceutical compositions comprising same

Info

Publication number: HU200479B
Application number: HU883270A
Authority: HU
Inventors: Alan Douglas Cardin; Terry L Bowlin; John Leonard Krstenansky
Original assignee: Merrell Dow Pharma
Priority date: 1987-06-29
Filing date: 1988-06-28
Publication date: 1990-06-28
Also published as: CN1030917A; FI883092A0; PT87857B; ZA884504B; KR890000516A; AU1841788A; DK355888D0; JPS6426597A; PT87857A; NZ225167A; IL86896A0; AU610900B2; NO882856L; HUT47135A; FI883092A; EP0297456A3; EP0297456A2; DK355888A; NO882856D0

Description

A találmány tárgya eljárás új, immunszupresszív tulajdonságokkal rendelkező peptidek előállítása.

Az immunrendszer az elsődleges védelem egyik eszközét képviseli magasabbrendű állatokban a betegségeket hordozó mikrobákkal és más idegen antigénekkel szemben. Az immunválaszt specifikus immunsejtek hatása közvetíti, amelyek a specifikus antigénekre reagálnak. A potenciális antigének számos anyag közül kerülhetnek ki; gyakran fehérjék, amelyek az egyén számára testidegenek. Ezek leggyakrabban a sejtek külső felületén helyezkednek el. Potenciális antigének találhatók a pollenszemcséken, szövetátültetéssel bevitt szöveteken, állati parazitákon, vírusokban és baktériumokon.

Emberben számos potenciális antigén egyáltalán nem képes a test első két védelmi vonalának átlépésére, ezért ezek soha nem hozzák működésbe az immunrendszert. Ezek a védelmi vonalak a következők:

- elsősorban a bőr, nyálkahártyával borított membránok, könnyek és a gyomorsav, és

- másodsorban a specializált fehér vérsejtek, granulociták és monociták és a makrofágok, amelyek a patogéneket és más potenciális antigéneket fagocitózissal bontanak el, azaz az idegen anyagot elnyelik és lebontják. Ezeket a fehér vérsejteket és makrofágokat fagocitáknak nevezzük. Az immunválasz akkor kezd megjelenni, amikor patogének vagy más idegen anyagok lépnek át a szervezet első két védelmi vonalán.

Két alapvető immunvédelmi rendszer ismeretes: a humorális és a celluláris; mindkettő reagál az antigénekre. A humorális immunitás keringő antitestekkel függ össze, amelyek a plazmafehérjék gamma globulin frakciójában találhatók. Ha a plazmát nagy sebességgel centrifugáljuk, az összetevő fehérjék molekulatömegük szerint szétválnak, frakcióknak nevezett csoportokra. Antitestek rendszerint abban a frakcióban találhatók, amelyben a komponensek molekulatömege kb. 156,000. Ezt a különleges frakciót gamma globulin frakciónak nevezték el. A humorális immunitás a bakterális fertőzésekkel szemben nyújt nagyobb védelmet. A sejt-immunitás részben a limfociták limfokinek néven ismert termékeinek tulajdonítható. Ez az immunitás-típus felelős az elhúzódó allergiás reakciókért, az idegen szövetek átültetésekor ezek kivetéséért és a ráksejtek kiküszöböléséért. Ez nagyobb védelmet biztosít a vírusokkal, gombákkal és egyes baktériumokkal pl. a tuberkolózist előidéző bacillussal - szemben.

A limfocitáknak nevezett specializált fehér vérsejtek felelősek mind a humorális, mind a sejt-immunitásért. A limfocita prekurzor sejtek a felnőtt ember csontszövetében (a csontvelőben) képződnek, majd ezt követően különböző szervekben vándorolnak, illetőleg a fejlődő embrió peteburkában keletkeznek és innen vándorolnak az embrióba, majd a különböző szervekbe. Embernél egyes ilyen prekurzor sejtek a csecsemőmirigybe vándorolnak; ez egy két lebennyel rendelkező, mirigy-szerű külsejű képződmény, amely a mellkas felső részében, közvetlenül a szegycsont mögött helyezkedik el. Itt a prekurzor sejtek T-limfocitákká alakulnak át, amelyek a sejt-immunitásban játszanak szerepet. Emberben a többi prekurzor sejt a lépbe vándorol, amelyben B-limfocitákká alakulnak át; ezeknek a humorális immunitásban van szerepük. A T- és a B-limfociták szerkezetüket tekintve nem különböztethetők meg, bár működésük különböző; 2 különböző kémiai módszerekkel azonosíthatók. Az érett limfociták a vérben keringenek és ugyancsak megtalálhatók a nyirokcsomókban, valamint a lépben és a csecsemőmirigyben.

A humorális immunitást a B-limfociták közvetítik, amelyek sejtfelületükön receptorokat hordoznak a különböző antigének számára. Úgy tűnik, hogy ezek a B-limfociták nagyon specifikusak és mindegyik B-limfocita típus csak egy antigénnel reagál. Ha baktériumok és vírusok pl. megtámadnak egy szervezetet, a B-limfociták reagálnak a baktérium vagy a vírus felületén levő antigénekre, összekapcsolódnak ezekkel és ez a folyamat a limfociták osztódása irányában hat. A leánysejtek specializált, ún. plazma sejtekké alakulnak át. Ezek a sejtek nagy mennyiségű antitestet termelnek, majd választanak ki az általános keringésbe. Az antitestek specifikusak a termelésüket stimuláló antigénekre és csak ezekkel a antigénekkel reagálnak. Az agglutininekként ismert antitestek több, antigént tartalmazó anyag esetében úgy hatnak, hogy ezek agglutinálódnak vagy összecsapódnak. Ez megakadályozza az anyagot abban, hogy eljusson a szövetekhez és lehetővé teszi, hogy a fagociták elfogják vagy a nyirokcsomók kiszűrjék a támadó anyagot. Más antitestek oly módon hatnak, hogy lyukakat nyitnak a baktérium sejtfalában és így megölik a baktériumokat. Ezeket lizineknek nevezzük. Az antitestek hatására az antitoxinok egyesülnek a baktériumok által termelt toxinokkal és ezáltal semlegesítik ezeket.

Ha egy patogén behatol a szervezetbe és az immunválasz jelentkezik, néhány óra alatt megjelennek az antitestek. Ezt a kezdeti reakciót primer válasznak vagy primer immunizációnak nevezzük. Ezen idő alatt azonban a patogének ugyancsak osztódnak és olykor toxinokat termelnek. Bármelyik ilyen folyamat azt eredményezi, hogy különböző betegség-tünetek lépnek fel. Napokat vagy heteket vehet igénybe, mielőtt elégséges mennyiségű antitest képződik ahhoz, hogy valamennyi patogén elpusztuljon, de mihelyt ezek eltűnnek, a betegség tünetei is megszűnnek. A limfociták, plazma sejtek és az antitestek a vérben visszamaradnak és keringenek, úgy, hogy ha ugyanazok a patogének másodszor is behatolnak a szervezetbe, a limfociták azonnal reagálnak és megkezdik az antitest-termelést. Az érzékenyített limfociták válaszát szekunder válasznak nevezzük. A szekunder válasz eredményeként magasabb antitest-szintek termelődnek, mint a primer válasz esetében. Oly sok antitest képződik és olyan gyorsan, hogy a mikrobák képtelenek osztódni és betegséget okozni. Ez a humorális immunitás típus az „azonnali hiperérzékenység”-ként ismert, annak a ténynek a következtében, hogy egy előzetesen az antigénnek kitett szervezet perceken belül reagálni tud az antigénre, pl. a szénanátha esetében. Az azonnali hiperérzékenységre egy másik példa lenne az anafilaxiás sokk, egy rendkívüli allergiás reakció, amely olykor bekövetkezik, ha valaki olyan antigénnel kerül érintkezésbe, amelyre szenzibilizálódott. Az antigén hatására fellépő ilyen humorális választ esetenként halállal végződhet.

A humorális immunitás mind természetes, mind mesterséges módon indukálható. Az aktív természetes immunitás esetében az egyén limfocitái továbbra is jelen vannak a keringésben és aktiválják antitestek termelését egy fertőzés után. Ez az aktív természetes immunitás sok éven át, vagy az egyén egész életében

HU 200479 Β fennmaradhat Egy csecsemő a fröccstejből, az anyatejből a születését követő néhány első nap folyamán kap antitesteket ami immunitást eredményez az első életév folyamán. Ezt passzív természetes immunitásnak nevezzük, mivel a csecsemő nem vesz részt az antitestek tényleges termelésében. Aktív mesterséges immunitás indukálható oly módon, hogy elhalt vagy legyengített mikrobákat injektálunk egy szervezetbe. Ezek felületi antigénjei még mindig ki tudják váltani a limfocitákban az antitest-termelést, de ezek a mikrobák nem váltanak ki betegség-tüneteket, eltérően a virulensebb alakoktól. Ha az egyén később kapcsolatba kerül a virulens mikróbával, már érzékenyített és azonnal reagál, antitestek nagymértékű termelésével. Az aktív mesterséges immunitás sok éven át tarthat, vagy állandóan megőrizhető, emlékeztető oltások segítségével. A passzív mesterséges immunitásnak van olyan alakja is, amely kb. 1 hónapon át biztosít védelmet Ez az átmenetei immunitás úgy hozható Tétre, hogy egy másik személyből vagy egy állatból kinyert antitesteket injektálunk a szervezetbe. Ezt a módszert rendszerint csak kritikus helyzetekben és járványok idején alkalmazzák. Mivel ezen módszer esetében megkerüljük a limfocitákat, ezek sem nem képeznek antitesteket, sem nem „emlékeznek” az antigénre. Ez az oka a módszer hatása átmeneti voltának.

A sejt-immunitás esetében, a humorális immunitással szemben, nem mutathatók ki keringő antitestek. A T-limfociták, amelyek ezt az immunitás-típust közvetítik, akkor aktiválódnak, amikor egy másik személyből származó sejteken (pl. átültetések esetén), daganatsejteken vagy vírusokon jelenlevő antigénekkel találkoznak. A B-limfocitákhoz hasonlóan a T-limfociták specifikusak és mindegyik típus csak egy antigénnel reagál. A limfociták növekednek, osztódnak és limfokineket termelnek, amelyek részt vesznek az idegen antigén ellen intézett támadásban. Ezek stimulálják a makrofágok fagocita-aktivitását is. Bár az immunológiai memória ekkor is létezik, mint a humorális immunitás esetében, a válasz sokkal lassúbb. 10-12 órát is igénybevehet a válaszreakció kifejlődése egy előzetesen érzékenyített egyén esetében, ezért a sejt-immunitás .késleltetett hiperérzékenységgel” jellemezhető. A sejt-immunitással összefüggő válasz a szömörce, a tölgy és a szömörcefa hatására fellépő allergiás reakció, a pozitív tuberkulin bőrpróbánál látható vörös folt és az átültetett szövetnek a szervezetből való kivetése.

Az immunmoduláló szerek a limfocita-szaporodás folyamatát aktiválják vagy gátolják. A normál limfocita szaporodás különböző reakcióknak tulajdonítható, amelyek antigének, makrofágok, T- és B-limfociták valamint egyes vegyi anyagok között mennek végbe. Egy adott antigén jelenléte pl. aktivál egy konkrét T- vagy B-limfocitát. Ezenkívül bizonyos B-limfociták aktív T-limfociták által aktiválhatók, míg mások függetlenek a T-limfocitáktól és csak antigénekkel aktiválhatók. Az aktivált T-limfociták arra késztethetik a makrofágokat, hogy egy interleukin 1 (IL-1) néven ismert molekulát termeljenek, amely viszont mind a T-, mind a B-limfocitákat aktiválja. Az aktivált T-limfociták képesek egy interleukin 2 (IL-2) néven ismert molekula termelésére is, amely további T-limfocita aktiválódást indukál. A mitogéneknek nevezett vegyi anyagok DNS-szintézist és mitózist indíthatnak be, amelyek a Tvagy B-limfociták aktivitásának jeleinek tekinthetők. Egyes mitogének csak egy limfocita-típusra hatnak, míg mások több típusra.

A különböző típusú és változó mennyiségű immunmoduláló szerek befolyásolják az immunrendszer komponensei között végbemenő komplex reakciókat. Mint a továbbiakban kimutatjuk, a találmány szerinti vegyületek és készítmények immunszupresszorként hatnak és mind a T-, mind a B-limfocitákat befolyásolják.

Bár az immunrendszer igen jelentős védelmet biztosít olyan anyagokkal szemben, amelyek betegség kiváltására képesek, nem képes a pozitív hatású és az ártalmas idegen anyagok megkülönböztetésére és mindkettőt elbontja. Sok esetben előnyös lenne, ha rendelkeznénk egy, az immunrendszert szabályozó eszközzel, anélkül, hogy ezzel ártanánk az egyénnek. A találmány szerinti peptidek ilyen moduláló vagy szabályzó hatásokat fejtenek ki és potenciálisan felhasználhatók a különböző immun-rendellenességek kezelésére.

Az egyén immunológiai válaszreakciói időnként több kárt vagy kényelmetlenséget okoznak, mint a behatoló mikrobák vagy idegen anyagok; ez a helyzet pl. az allergiás reakciók esetében. Ilyenkor kívánatos lenne az immunválasz elnyomása.

Az immunológiai mechanizmusok adott esetben az egyén saját teste valamelyik részére vonatkozóan válnak érzékenyítetté. Ez arra vezet, hogy ezzel a testrésszel kapcsolatban reakciók lépnek fel, vagy ez a rész el is pusztulhat. Károsodik a szervezetnek az a képessége, hogy különbséget tegyen a „saját” és a „nem-saját” között, és a test kezdi elbontani önmagát. Néhány példa az ilyen autoimmun betegségekre emberben: reumás izületi gyulladás; egyes hemolitikus anémiák; reumás láz; pajzsmirigy-gyulladás; fekélyes kolitisz; myasthenia gravis; glomerulonephritis (egy vese-betegség); allergiás agy-gerincvelőgyulladás; folytonos ideg- és máj-károsodás, amely olykor a vírusos májgyulladást követi, és esetleg a sclerosis multiplex, valamint a szisztémás lupus erythematosus. Az autoimmunitás bizonyos formái annak eredményeként jelentkeznek, hogy sérülés ér egy olyan területet - pl. az idegszövetet vagy a szemlencséket -, amelyek rendszerint nincsenek kitéve a limfociták hatásának. Ha az ilyen területek szövetei limfociták hatása alá kerülnek, felületi fehéijéik antigénként képesek hatni és antitesttermelést, valamint sejt-immunválaszok jelentkezését indítják meg, aminek eredményeként megkezdődik az ilyen szövetek lebomlása. Más autoimmun betegségek azután alakulnak ki, hogy a szervezet olyan antigénekkel kerül kapcsolatba, amelyek antigén-jellegüket tekintve hasonlók az egyén saját szövetéhez, azaz azzal keresztreakciót adnak. Az Űyen típusú betegségekre egy példa a reumás láz, amelyben a kórokozó streptococcus antigénje keresztreakcióba lép az emberi szív egyes részeivel. Az antitestek nem tudnak különbséget tenni a baktérium antigénjei és a szívizom antigénjei között, és mindkét ilyen antigént tartalmazó sejtek károsodhatnak. Az immunrendszer működésének elnyomása ezen autoimmun betegségek esetében hasznos lenne a betegség hatásainak minimálisra csökkentése vagy kiküszöbölése érdekében.

A keringő antitestek és a sejt-immunválaszok szerepet játszanak az átültetett szövetek és szervek kivetésében. Hacsak a donor nem ikertestvére a befo3

HU 200479 Β gadónak (vagy nem maga az egyén), a befogadó limfocitái „nem-saját”-nak minősítik az átültetett szövetet és azonnal úgy válaszolnak, hogy lebontják azt Ilyen esetben kivételt képeznek az érrel be nem hálózott területekre (kivételes helyekre) történő átültetések. Ilyen terület pl. a szem szaruhártyája, amelyben limfociták nem cirkulálnak, ezért nem szenzibilizálődnak és nem idézik elő immunválasz fellépését. Jelenleg nehézségekbe ütközik az immunreakció elnyomása, ha az átültetett szövet kivetését kívánjuk megakadályozni, anélkül, hogy a beteg valamilyen más módon ne károsodjék. A betegnek egyidejűleg igen magas antibiotikum dózisokat kell adni, mivel elnyomtuk saját, a fertőzések leküzdésére szolgáló védelmi rendszerét. A találmány szerinti vegyületek és készítmények értékesek lehetnek abból a szempontból, hogy az immunrendszer ellenőrzött modulálása révén kiválthatják a szervezet tűrőképességét az átültetett szövettel szemben.

Jelentősek tehát azok a vegyületek, pl. a találmány szerinti vegyületek, amelyek elnyomják az immunrendszert. Különösen akkor hasznosak, ha a rendszer normális reakcióiban zavarok léptek fel, vagy ez a mechanizmus álrtalmatlan idegen anyagok, pl. átültetett szervek kivetését okozta.

A fent elmondottakat részletesebben ismerteti az ,JmmunoIogy: A Synthesis” E. S. Golub, Sinauer Associates Inc., Suderland, Massachuesetts (1989) kézikönyv.

A találmány tárgya eljárás Tn-A-B-C-D-Tc, azaz (I) általános képletű vegyületek előállítására; e képletben

Tn jelentése hidrogénatom,

A jelentése

-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-,

-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-,

-Leu-Gln-Asn-,

-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-, és valamennyi peptidrészben a Leu helyett Ile, az Asp helyett Glu, az Asn helyett Gin szerepelhet,

B jelentése 2 aminosav-maradékot tartalmazó peptid-fragmentum, amely aminosav Arg vagy Lys lehet,

C jelentése 2 aminosav-maradékot tartalmazó peptid-fragmentum, amely aminosav Gly, Leu, Ile lehet,

D jelentése

-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-, -Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-, -Asp-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Gly-Leu—Leu-, és valamennyi peptidrészben a Leu helyett He, az Asp helyett Glu szerepelhet,

Te jelentése egy karboxi-terminális maradék, mégpedig -OH vagy aminocsoport.

A találmány szerinti vegyületek hasznos immunszupresszív szerek.

A természetben előforduló aminosavak jelölésére a leírásban a következő, általánosan ismert rövidítéseket alkalmazzuk;

Gly - glicin

Alá - alanin

Val - valin

Leu - leucin

De - izoleucin

Phe - fenilalanin

Thr - treonin

Asn - aszparagin

Gin - glutamin

Asp - aszparaginsav

Glu - glutaminsav

Lys - lizin

Arg - arginin

A természetes aminosavak, a glicin kivételével, egy kiralis szénatomot tartalmaznak. Hacsak konkrétan másként nem tüntetjük fel, az itt tárgyalt optikailag aktív aminosavak L-konfigurációjúak. A szokásos módon a peptidek szerkezetét úgy írjuk fel, hogy az amino-terminális vég a lánc baloldalán, a karboxi-terminális vég pedig a lánc jobboldalán helyezkedik el.

A találmány szerinti eljárással előállított peptidekre néhány jellegzetes példa:

H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NH2;

H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-NH2;

H-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly- Gly-Leu-NH2 és

H-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Leu-OH.

A találmány szerinti fehérjék számos eljárással előállíthatók, amelyek a szakember számára általánosan ismertek. Az ilyen eljárások közé tartozik a szilárd fázisú szekvenciális és blokk-szintézis. A szilárdfázisú szekvenciális eljárás a szokásos automatizált eljárásokkal hajtható végre, pl. egy automatikus peptid-szintetizáló berendezés segítségével. Ebben az eljárásban egy alfa-amino-védett aminosavat egy gyanta-hordozóhoz kapcsolunk. Gyanta-hordozóként bármely megfelelő gyantát alkalmazhatunk, amelyet a szakterületen polipeptidek szilárdfázisú előállításához alkalmaznak. Előnyös az olyan polistirol alkalmazása, amelyben 0,5 kb. 3 % divinil-benzol hozzáadásával keresztkötéseket alakítottunk ki és amelyet klórmetileztünk vagy hidroximetileztünk annak érdekében, hogy megfelelő helyeket alakítsunk ki az eredetileg bevitt alfa-amino-védett aminosavval való észter-képzéshez.

Egy példát a hidroximetil-gyantára Bodanszky et al. ír le (Chem. Ind., London, 38, 1597-98, 1966). A Bio Rád Laboratories (Richmond, Kalifornia) hoz foigalomban egy klórmetilezett gyantát és egy ilyen gyanta előállítását írja le Stewart et al. (Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman & Co., San Francisco, 1969, 1. Fejezet, p. 1-6.). A védett aminosav Gisin eljárásával (Helv. Chim. Acta 56, 1476, 1973) köthető a gyantához. A kereskedelemben számos, gyantához kötött védett aminosav férhető hozzá. Egy olyan, a találmány szerinti polipeptid előállítására pl., amelyben a karboxi-terminális vég egy Thr maradék, egy benzilezett, hidroximetilezett fenil-acetamidometil-gyantához (PAM) kötött, terc-butil-oxikarbonil(Boc)~csoporttal védett Thr alkalmazható, amely termék a kereskedelemben hozzáférhető.

HU 200479 Β

Az alfa-amino-védett aminosavnak a hordozó gyantához való kapcsolását követően a védőcsoportot bármilyen megfelelő eljárás alkalmazásával - metilénkloridban oldott trifluor-ecetsavas, trifluorecetsavas vagy dioxánban oldott sósavas kezeléssel - eltávolítjuk. A védőcsoport eltávolítását 0 *C és a szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. Alkalmazhatunk más, szokásos lehasító reagenseket és körülményeket is a specifikus alfa-amino-védőcsoportok eltávolítására. Az alfa-amino-védőcsoport eltávolítása után a többi védett aminosavat szakaszosan, a kívánt sorrendben kapcsoljuk. Egy másik megoldás szerint a gyanta-hordozón rögzített aminosav-szekvenciával való kapcsolás előtt kapcsolható össze több aminosav-csoport, az „oldatos módszerrel”.

A polipeptid szekvenciába bevitt egyes aminosavak esetében alkalmazott alfa-amino-védőcsoport bármilyen, a szakember számára ismert védőcsoport lehet. A számbavehető alfa-amino-védőcsoportok közé tartoznak a következő típusokba sorolható vegyületek:

(1) acil-típusú védőcsoportok, pl. fotmil-, trifluor-acetil-, ftalil-, toluol-szulfonil- (tozil-), benzol-szulfonil-, nitro-fenil-szulfonil-, tritil-szulfenil-, o-nitro-fenoxi-acetil- és gamma-ldór-butiril-csoport;

(2) aromás uretán típusú védőcsoportok, pl. a következők: benziloxikarbonil- és helyettesített benziloxikaibonil-csoport, így p-klór-benziloxikarbonil-, ρ-nitro-benziloxikarbonil-, p-bróm-benziloxikarbonil-, ρ-metoxi-benziloxikarbonil-, 1 -(p- bifenil)-1 -metil-etoxikarbonil-alfa,alfa-dimetil-3,5-dimetoxi-benziloxikar bonil- és benzihidriloxikarbonil-csoport;

(3) alifás uretán védőcsoportok, pl. a terc.butiloxikarbonil-(Boc), diizopropil-metoxikarbonil-, izopropiloxikarbonil-, etoxikarbonil- és alliloxikarbonil-csoport;

(4) cikloalkil-uretán típusú védőcsoportok, pl. ciklopentiloxikarbonil-, adamantiloxikarbonil- és ciklohexiloxikarbonil-csoport;

(5) tiouretán típusú védőcsoportok, pl. fenil-tiokarbonil-csoport;

(6) alkil-típusú védőcsoportok, pl. trifenil-metil (tritil-) és benzil-csoport;

(7) trialkil-szilán-csoportok, pl. trimetil-szilán csoport.

A kitüntetett alfa-amino-védőcsoport a terc.butiloxikarboníl-csoport.

A megfelelő kapcsoló reagens kiválasztása a szakember tudásához tartozik. Különösen megfelelő kapcsoló szer abban az esetben, ha Gin, Asp vagy Arg a hozzáadni kívánt aminosav, az NJ4’- diiziopropil-karbodiimid és az 1-hidroxi-benzotriazol. Ezeknek a reagenseknek az alkalmazása megakadályozza a nitril- és a laktám-képződést. Más kapcsolószerek pl. a következők:

(1) karbodiimidek (pl. az N,N’-diciklohexil-karbodiimid és az N- etil-N’-(gamma-dimetil-amino-propil-karbodiimid);

(2) a ciánamidok (pl. az Ν,Ν-dibenzil-ciánamid);

(3) a ketán-iminek;

(4) az izoxazólium-sók (pl. az N-etil-5-fenil-izoxazólium-3 ’-szulfonát);

(5) az aromás jellegi, a gyűrűben 1-4 nitrogénatomot tartalmazó monociklusos amidok, pl. a imidazolidok, pirazolidok és az 1,2,4- triazolidok. A felhasználható jellegzetes heterociklusos aminok közé tartozik az Ν,Ν’-karbonil-diimidazol és a N,N’-karbonil-di-1,2,4-triazol;

(6) az alkoxilezett acetilének (pl. az etoxi-acetilén);

(7) azok a reagensek, amelyek az aminosav kar5 boxil-csoportjával vegyes anhidridet képeznek, (pl. a klórhangysav-etilészter és a klóihangyasav-izobutilészter); vagy a kapcsolandó aminosav szimmetrikus anhidridje (pl. Boc-Arg-O-Arg-Boc); és (8) az egyik gyűrű-nitrogénatomon hidroxicsopor10 tót hordozó, nitrogén-tartalmú heterociklusos vegyületek (pL az N-hidroxi-ftálimid, N-hidroxi-szukcinimid és az 1-hidroxi-benzotriazol).

További aktiváló reagenseket és ezeknek a peptid-kapcsolás területén való felhasználását Kapoor (J.

Pharm. Sci. 59, p. 1-27., 1970) írja le. Előnyben részesítjük kapcsoló reagensként a szimmetrikus anhidrid alkalmazását.

Mindegyik védett aminosavat vagy aminosav-szekvenciát kb. négyszeres feleslegben visszük be a szilárd fázisú reaktorba és a kapcsolást 1:1 dimetilformamid:metilénklorid elegyben vagy dimetil-formamidban vagy előnyösen metilénkloridban hajtjuk végre. Azokban az esetekben, amikor nem teljes kapcsolás megy végbe, a kapcsolási eljárást megismételjük az alfa-ami25 no-védőcsoport eltávolítása előtt, a következő aminosav kapcsolását megelőzően, a szilárd fázisú reaktorban. A kapcsolási reakció sikerét a szintézis mindegyik fázisában nyomon követjük, az E. Kaiser et al. (Anal. Biochem. 34,595,1970) által leírt ninhidrin reakcióval.

Miután a keresett aminosav-szekvenciát kialakítottuk, a pepiidet eltávolítjuk a gyantáról. Ez hidrolízissel történhet, pl. oly módon, hogy a gyantához kötött polipeptidet dimetil-szulfid, p-krezol és tiokrezol híg vizes hidrgénfluoridos oldatával kezeljük.

Mint ez a szilárd fázisú peptid-szintézis területén jártas szakember számára ismert, sok aminosav hordoz olyan funkciós csoportokat, amelyek védelmet igényelnek a lánc előállítása során. A megfelelő védőcsoport felhasználása és kiválasztása a szakember tudásához tartozik; függ attól, hogy milyen aminosavat kell megvédeni és hogy jelen vannak-e más védett aminosavmaradékok a pepiidben. Az ilyen oldallánc-védőcsoport kiválasztása kritikus olyan vonatkozásban, hogy ennek olyannak kell lennie, hogy ne legyen eltávolít45 ható hasítással az alfa-amino-csoport védőcsoportjának lehasitása során. A llzin esetében pl. megfelelő láncvédő csoport a benziloxikarbonil- és a helyettesített benziloxikarbonil-csoport, mimellett ez a helyettesítő a következő csoportok valamelyike lehet:

- halogénatom (pl. klór-, bróm- vagy fluoratom);

- nitro-csoport (pl. tehát 2-klór-benziíoxikarbonil-, 3,4-diklóibenziloxikarbonil-, p-nitro-benziloxikarbonil-csoport);

- tozilcsoport;

- terc.amiloxikarbonil-, terc.butiloxikarbonil- és diizopropll-metoxikarbonil-csoport.

A treonin és a szerin alkoholos hidroxicsoportja acetil-, benzoil-, terc.butil-, tritil-, benzil-, 2,6-diklór-benzil- vagy benziloxikarbonil-csoporttal védhető. A kitüntetett védőcsoport a benzil.

Ezek a csoportok a szakember számára jól ismert módszerekkel távolíthatók el. A védőcsoport eltávolítását általános esetben azt követően hajtjuk végre, hogy a peptidlánc szintézise befejeződött, de a védőcsopor65 tok bármely megfelelő időpontban eltávolíthatók.

HU 200479 Β

A találmány szerinti peptidek immunszupresszív hatású anyagok és bármely olyan betegség vagy elváltozás kezelésére felhasználhatók, amelyekben kívánatos a Immorális vagy a sejtek által közvetített immunitás elnyomás. Ilyen terület pl. a reumás izületi gyulladás kezelése, valamint a kilökődési reakció megelőzése vese, máj vagy szív átültetését követően. A találmány szerinti peptidek elsősorban azáltal fejtik ki immunszupresszív hatásukat, hogy képesek elnyomni a limfociták szaporodását. Az itt használt értelemben a „beteg” kifejezést az emlősökre, azaz az emberre és a főemlősökre vonatkoztatva használjuk, ideértve a juhokat, lovakat, szarvasmarhákat (teheneket és bikákat), sertéseket, malacokat, kutyákat, macskákat, patkányokat és az egereket.

Bár a találmány szerinti peptidek közül néhány sértetlenül halad át a bélrendszeren, orális bevitel után, előnyben részesítjük a parenterális bevitelt, amely történhet pl. s.c., i.v., i.m. vagy i.p. úton, depó-injekciókkal vagy a készítmények beültetésével.

Parenterális úton a vegyüietek egység-dózisként vihetők be, egy olyan oldat vagy szuszpenziót injektálásával, amely a vegyületet egy fiziológiailag elfogadható hígítószerben tartalmazza egy gyógyászati szempontból megfelelő vívőanyaggal együtt, amely lehet egy steril folyadék, pl. víz vagy olajok, felületaktív anyagok és más, gyógyászati szempontból elfogadható hatásfokozók hozzáadásával, vagy ezek nélkül. Az ilyen készítmények előállításához használt olajokra jellegzetes példák a következők: állati, növényi eredetű vagy szintetikus olajok, pl. mogyoróolaj, szójaolaj és kőolaj. Folyékony vivőanyagként, különösen injektálható oldatok esetében, általában előnyben részesítjük a víz, sóoldat, vizes dextróz és hasonló cukor oldatok és glikolok, pl. propilénglikol vagy polietilénglikol alkalmazását.

A vegyüietek nyújtott hatású injekciók vagy beültetett készítmények alakjában is bevihetők, amelyek oly módon készíthetők ki, hogy lehetővé tegyék az aktív komponens időben elnyújtott felszabadulását. Az aktív komponens pelletekbe vagy kis hengerekké tömöríthető és s.c. vagy i.m. ültethető be, nyújtott hatású injekcióként vagy beültetett preparátumként. A beültetett készítmények előállításához közömbös anyagokat, így biológiai úton lebontható polimereket vagy szintetikus szilikonokat (amilyen pl. Dow-Corning Co. által előállított Silastic, egy szilikongumi) alkalmazhatunk.

A találmány szerinti peptidek hatásának maximális kifejlesztésére, az embergyógyászatban, előnyösen egy makromolekuláris hordozót, pl. szérumalbumint, így humán szérumalbumint alkalmazhatunk. Más vivőanyag pl. a tengeri csiga (keyhole limpet) hemocianin vagy valamely szintetikus polimer, pl. a poli(D-Glu, D-Lys). A pepiidnek a hordozóhoz való kapcsolására többféle módszert alkalmazhatunk; amilyen pl. egy peptid Lys-en keresztül, glutáraldehid felhasználásával történő összekötés (Reichlin, Methods Enzymol. 70, 159-165, 1980) vagy a DCC módszer) 1. pl.: Atassi et al., Biochem. Biophys. Acta 670, 300-302, 1981), a DCC felhasználásával egy peptid-Asp-οπ vagy -Glu-on keresztül való kapcsolás (Bauminger et al., Methods Enzymol. 70, 151-159, 1980), egy peptid-Tyr-on keresztül való kapcsolás bisz(diazotált)-benzidin alkalmazásával (Walter et al., Proc. Nat. Acad.

Sci. USA 77, 5197-5200, 1980), fotokémiai kapcsolódási helyeken keresztül való kapcsolás (Parker et al., Cold Spring Harbor Symp. - Modem Approaches to Vaccines, Ed. Chanock & Lemer, Cold Spring Harbor Press, New York, 1983, sajtó alatt) vagy egy peptid-Cys-en keresztül való összekapcsolás (Liu et al., Biochem. 18, 690-697, 1979). A peptid-hordozó konjugátumokat dialízissel vagy gélszűréssel választjuk el a feleslegben visszamaradó szabad peptidektől. A vivőanyag peptid-terhelésének szintje vagy radioaktív nyomjelző alkalmazásával, egy különleges eljárás szerint) a komplexbe nem kötött ill. a komplexbe kötött peptid HPLC-meghatározásával), vagy a konjugátum kvantitatív aminosav-elemzésével végezhető el, amelyet a peptidet nem horodzó vivőanyag elemzésével párhuzamosan végzünk. Az utóbbi eljárás alkalmazásakor előnyösen egy nem-természetes, különleges aminosav építendő be a peptidbe az N-terminális vagy a C-terminális oldalon (ilyen pl. a Nle), amely, a peptid-beépítés kvantitatív maikereként szolági a konjugátum aminosav-meghatározásakor. Ez az Nle tehát ,köztartóként” funkcionálhat az immunszupresszív szerkezet és a kapcsolás elősegítésére bevitt esetleges aminosavak - pl. az előbbiekben leírtak szerint a Cys, Lys vagy Tfyr - között.

A találmány szerinti peptidek immunszupresszív anyagok és a limfociták szaporodásának gátlásával nyomják el a beteg limfocita rendszerének működését. Míg a találmány szerinti peptidek mind a T-, mind a B-sejtek szaporodását gátolják, egy konkrét peptid kitüntetetten vagy a T-, vagy a B-limfociták szaporodását függesztheti fel. Valamennyi, találmány szerinti peptid azonban elnyomja a T-limfociták szaporodását.

A bevitt peptid mennyisége változhat a betegtől, a bevitel módjától, a betegség vagy elváltozás súlyosságától függően és bármely hatásos mennyiséggel azonos lehet. Kívánatos a peptidek ismételt naponkénti bevitele. A találmány szerinti peptidek immunszupresszió szempontjából hatásos mennyisége és a limfocita rendszer ill. a limfociták szaporodásához szükséges mennyiség kb. 0,001 mg/kg - kb. 10 mg/kg lehet, a beteg testtömegére vonatkoztatva. A peptidet előnyösen egység-adagolási alakban visszük be napi 1-4 alkalommal -, pl. 10 mg-os dózisokban.

Példák

A találmányt a következőkben nem-korlátozó jellegű példákkal szemléltetjük.

1. példa

A H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-ArgAsp-Ala-Asp-Asp-Leu-NH2 előállítása

A peptidet a szilárd-fázisú eljárások valamelyikével szintetizáljuk, 0,1 mmól gyanta felhasználásával (0,48 mmól/g p-metil-benzhidril-amin). A kettős szimmetrikus anhidridekkel való kapcsolást 2,0 mmól N³**³-Boc-aminosav (Peptides International) alkalmazásával végezzük. Az alkalmazott oldallánc-védelem a következő: Asp (Chx), Arg (Tos), Lys (2-CB2S). A szintézis befejezése után az N^-Boc védőcsoportot 50 %-os trifluorecetsav:metilénklorid elegy alkalmazásával távolitjuk el. A gyantát háromszor mossuk metilénkloriddal, semlegesítés céljából háromszor mossuk 10 % diizopropil-etilamint tartalmazó metilénkloriddal, majd háromszor mossuk metilénkloriddal és vákuumban szárítjuk. A peptid védőcsoport-men-61

HU 200479 Β tesítését és a gyantáról való leválasztását 2 % anizolt tartalmazó HF-dal végezzük, 0 ‘C-on, 35 percen át. A HF-t vákuumban 0 C-on távolítjuk el, a peptidet etiléterrel kicsapjuk, a gyantáról 30 %-os vizes ecetsavval extraháljuk és az oldatot liofilizáljuk.

A peptidet sómentesítéssel tisztítjuk - 5 %-os vizes ecetsavban, egy 92 x 2,6 cm-es Sephadex G-15 oszlopon - és liofilizáljuk. A preparatív HPLC-t egy C¹⁸Vydac 2118TP1010 oszlopon (250 x 10 mm) végezzük, 24 % acetonitrilt tartalmazó 0,1 %-os vizes trifluorecetsavval, 5 ml/perc sebességgel. A nagyobb csúcshoz tartozó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk.

TLC:

Merck 5715 20 x 20 cm-es Silica gél 60 lemezek (vastagság 0,25 mm); n-butanol/ecetsav/víz/piridin 6:13:4,8:6 (TLC I) Rf=0,52

FAB-MS: (M+H)= 1879 ± 1 m.E. (számított: 1879,2).

Aminosav-elemzés (6N HCl-lel végzett hidrolízis, 24 óra 106 C- on): Asx 3,06 (3); Alá 0,99 (1); Leu 4,97 (5); Lys 2,01 (2); Arg 4,01 (4).

Peptid-tartalom: 72 tömeg%.

2-4. példa

Lényegében az 1. példa szerinti módon a következő peptideket állítjuk elő:

a példa peptid sorszáma

2. H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NH2

3. H-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Gly-Leu-NH₂

4. H-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Leu-OH

A 2-4. példa szerint előállított peptidek a következő fizikai tulajdonságokkal rendelkeznek:

a példa molekulasúly HPLC sorszáma elméleti FAB-MS(M+H) tr (perc), ± 1 mg 15-40%-os grádiens

2.	1695	1696	9,8
3.	1940	1940	17,6
4.	1295	1297	10,8

Az aminosav-elemzés eredményei a következők (6N HC1, 20 óra 106 C-on):

A példa sorszáma 2. 3. 4.

Asx		2,01(2)	1,03(1)
Thr	3,01(3)
Glx		2,03(2)	2,05(2)
Gly	1,07(1)	3,10(3)	1,05(1)
Alá	2,05(2)
Val			0,95(2)
Leu	3,94(4)	6,06(6)	2,92(3)
Phe		1,00(1)
Lys	2,17(2)	0,99(1)
Arg	2,20(3)	1,81(2)	2,00(2)

5. példa

A H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gty-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NH? BSA konjugátumának előállítása

A peptidet BSA-val (szarvasmarha szérumalbumin) kapcsoljuk össze oly módon, hogy l-etil-3-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidrokloriddal (EDAC) reagáltatjuk. 1 mM peptidet 1,84 ml vízben 15-30 percen át 0,16 ml (25 mg/ml töménységű oldat) MSA-val reagáltatjuk, amelyet előzetesen 1-30 percen át vízben 40 mg EDAC-val kezeltünk. Az aktivált BSA-mintát csepegtetve, kevertetés közben adagoljuk a peptid-oldathoz, majd 10 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk Ezután 2,0 ml 1,0 M glicin oldatot adunk hozzá és az elegyet egy éjjelen át 4 *C-on forgómozgásban tartjuk. A fölösleges reagens és a nem-konjugált peptid eltávolítására a mintákat alaposan dializáljuk 4 C-on, először 15x4 liter vízzel, majd 2x4 liter CELLGRO-val (a Mediatech szövettenyésztéshez használható táptalaja) szemben. A mintákat - közvetlenül a szövettenyészetekhez való hozzáadás előtt - 0,45 pm-es cellulózacetát membrán segítségével sterilre szűrjük. A peptid-kapcsolás mértékét fordított fázisú HPLC-vel határozzuk meg.

Az 1., 3. és 4. peptid BSA-konjugátumát úgy állítjuk elő, hogy először a peptidet az előbbiekben leírtak szerint EDAC-vel aktiváljuk, majd BSA-val reagáltatjuk.

6. példa

A ^H-timidin beépülésének gátlása különböző péptidekkel vegyes limfocita tenyészetekben

Aszeptikusán eltávolított lépet RPMI 1640 tápközegben felaprítunk oly módon, hogy egysejtes szuszpenziót kapjunk. Az eritrocitákat úgy vetjük alá lízisnek, hogy a sejteket ACK pufferben (0,155 M NH4CI, 0,1 mM EDTA, 0,01 M KHCO3) szuszpendáljuk és a visszamaradó leukocitákat mossuk. C57BL/6 (5X10⁵sejt) és DB A/2 (5x 10⁵ sejt) leukocitákat együtt tenyésztünk 0,1 ml RPMI-1640-ben, amelyhez 2 % borjúembrió-szérumot (FCS) adtunk, 96 helyes mikrotitráló lemezeken. A sejttenyésztés megindítására különböző koncentrációkban adagoljuk a peptideket. 120 órás inkubálás után (37 °C) - ez magában foglal, a tenyésztés utolsó 18 órájában, egy 1 pCi (³H)-TdR-rel való besugárzást is - a sejteket egy automatikus sejt-elkülönítő segítségével szűrőpapír-csíkokra választjuk ki és ÁCS szcintillációs folyadékban helyezzük el ezeket a csíkokat (Amersham, Oakville, Ontario). A (³H)TdR beépülés mértékét ezután Beckman LS 7800 folyadékszcintillációs számlálóval mérjük.

Vegyület	Peptid^b μΜ	³H-timidin beépülés, cpm	Gátlás,%
BSA kontroll³	0	6621 ± 442	-
	0	8023 ± 444	-
3. példa	24	1328 ± 421	80
12	3417 ± 263	57
1. példa	18	1800 ± 412	73
9	3267 ± 457	59
2. példa	28	2209 ± 1471	67
14	4406 ± 848	45
4. példa	8	3063 ± 372	54
4	5751 ± 407	28

HU 200479 Β ^a 1 -etil-3-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimidHCl-dal konjugált BSA egyedül ^b a BSA-val konjugált peptid koncentrációja.

7. példa

A ^H-tímidin beépülés gátlása különböző peptidek által anti-Tí-ra érzékenyben limfocitákban

Humán perifériális mononukleáris leukocitákat (MNL) izolálunk vérből, Ficoll-Hypaque sűrűség szerinti útépítéssel. Az MNL-t (105) anti-T3-mal tenyésztjük (1:10,000 hígítás, Ortho Oiagnostics (0,1 nü DNEM-ben, amelyet 2 % FCS-sel egészítettünk ki, 96 helyes mikrotitráló lemezeken. 72 órás inkübálás után (37 ’C) - amely magában foglal, a tenyésztés utolsó 18 órájában, egy 1 gCi (³)TdR-rel végzett besugárzást - a sejteket izoláljuk és az aktivitást a 6. példában leírt módon meghatározzuk.

Vegyület	Peptid^{b 3}H-timidin beépítés	Gátlás,%
μΜ	cpm
BSA kontroll³ 0	43934 ± 5076	—
	0	57388 ±6153	-
3. példa	24	14027 ± 867	68
	12	31667 ± 4729	45
1. példa	18	21984 ± 3824	50
	9	38521 ± 5349	33
2. példa	28	20041 ± 3331	54
	14	44151 ± 2151	23
4. példa	8	39248 ± 5251	11
	4	54331 ± 4717	5

^a 1 -etil-3-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimidHCl-lel konjugált BSA egyedül ^b a BSA-val konjugált peptid koncentrációja.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás Tn-A-B-C-D-Tc általános képletű peptidek - a képletben Tn jelentése hidrogénatom,

A jelentése

-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-,

-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-,

-Leu-Gln-Asn-,

-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-, és valamennyi peptidrészben a Leu helyett Ile, az

Asp helyett Glu, az Asn helyett Gin szerepelhet,

B jelentése 2 aminosav-maradékot tartalmazó peptid-fragmentum, amely aminosav Arg vagy Lys lehet,

C jelentése 2 aminosav-maradékot tartalmazó peptid-fragmentum, amely aminosav Gly, Leu, Öe lehet,

D jelentése

-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-Leu-, -Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-, -Asp-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Gly-Leu-, -Leu-, és

Te jelentése egy karboxi-terminális maradék, mégpedig - OH vagy amino-csoport -, előállítására szilárd fázisú szekvenciális és blokkszintézissel, azzal jellemezve, hogy egy megfelelően védett aminosavat - amely az A csoport karboxil-terminális aminosavának felel meg - hozzákapcsolunk egy aktivált gyanta-hordozóhoz, majd egymás után az A, B, C és D csoport többi, alfa-amino-védett aminosavait visszük fel a növekvő peptidlánc terminális amino-csoportjára, a karboxil-terminálistól az amlno-terminálisig vett sorrendben, miközben a növekvő peptidláncot az amino-védőcsoport eltávolításával szabaddá teszszük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan Tn-A-B-CD-Tc általános képletű vegyületek előállítására, amelyekben C jelentése egy 2 aminosav-maradékot, mégpedig Gly-t vagy Leu-t tartalmazó peptidfragmentum, Tn, A, B, D és Te jelentése az 1. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási anyagot alkalmazzuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás H-Leu-Arg-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Asp-Asp-LeuNH2 képletű vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás H-Thr-Arg-Leu-Thr-Arg-Lys-Arg-Gly-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Ala-Leu-NIfc képletű vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás H-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-LeuPhe-Leu-Lys-Glu-Gly- Gly-Leu-NH2 képletű vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás H-Glu-Val-Val-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Leu-OH képletű vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
7. Eljárás az immunrendszer és a limfocita rendszer működésének, valamint a limfociták szaporodásának elnyomására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított Tn-A-B-C-D-Tc általános képletű peptidet, e képletben a helyettesítők jelentése az 1. igénypontban megadott, vivőanyaggal és adott esetben adalékanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk.

Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető