JP2837866B2 - 口蹄疫に対する合成ワクチンおよびその製造方法 - Google Patents
口蹄疫に対する合成ワクチンおよびその製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は口蹄疫ワクチンおよびその製造方法に関す
る。
る。
口蹄疫（FMD）は、長い間にわたってワクチンが利用
可能となっている今でも牧畜業に大変な損害をもたらし
ている。現在口蹄疫の発生する一つの理由は、死滅また
は不活化FMDウイルスを含む古典的ワクチンに信頼がお
けないことにある。すなわち、ウイルスの不活化が時と
して不完全なために、FMDの「ワクチン接種後」発生が
生じることがある（Ｂhm,Strohmaier,Tierrztl.Ums
chau 39,3〜８（1984）参照）。この危険は合成FMDワク
チンには存在しない。何故なら、後者では完全なウイル
スの機能を持たないあるウイルスタンパク質の部分配列
しか用いられないからである。
可能となっている今でも牧畜業に大変な損害をもたらし
ている。現在口蹄疫の発生する一つの理由は、死滅また
は不活化FMDウイルスを含む古典的ワクチンに信頼がお
けないことにある。すなわち、ウイルスの不活化が時と
して不完全なために、FMDの「ワクチン接種後」発生が
生じることがある（Ｂhm,Strohmaier,Tierrztl.Ums
chau 39,3〜８（1984）参照）。この危険は合成FMDワク
チンには存在しない。何故なら、後者では完全なウイル
スの機能を持たないあるウイルスタンパク質の部分配列
しか用いられないからである。
既に合成FMDワクチンは存在しているが（欧州特許出
願第0,204,480号参照）それらはなお改良が必要とされ
ている。
願第0,204,480号参照）それらはなお改良が必要とされ
ている。
今般、膜係留化合物（membrane−anchoring compoun
d）とFMDウイルスのある部分配列を用いて特に有効なFM
Dワクチンを製造できることを見出した。合成ワクチン
の製造は西独特許出願公開明細書DE 3,546,150 A1にお
いて膜係留剤／活性物質複合体の多くの可能性としての
用途の一つとして記載されてはいるが、膜係留化合物と
FMDウイルスの部分配列の複合体〔膜係留剤／活性物質
複合体（membrane anchor/active substance conjugat
e）〕が比較的少量のワクチンの投与で認められる並外
れた活性を示すというようなことは予期し得なかったこ
とである。
d）とFMDウイルスのある部分配列を用いて特に有効なFM
Dワクチンを製造できることを見出した。合成ワクチン
の製造は西独特許出願公開明細書DE 3,546,150 A1にお
いて膜係留剤／活性物質複合体の多くの可能性としての
用途の一つとして記載されてはいるが、膜係留化合物と
FMDウイルスの部分配列の複合体〔膜係留剤／活性物質
複合体（membrane anchor/active substance conjugat
e）〕が比較的少量のワクチンの投与で認められる並外
れた活性を示すというようなことは予期し得なかったこ
とである。
更に、前記ワクチンは、驚くべきことに、１回のワク
チン投与の後でさえも十分な保護を与えるという点でも
際立っている。更に、それらは、従来のワクチンに比
べ、冷却せずとも実質的に無制限に貯蔵し得るという長
所がある。
チン投与の後でさえも十分な保護を与えるという点でも
際立っている。更に、それらは、従来のワクチンに比
べ、冷却せずとも実質的に無制限に貯蔵し得るという長
所がある。
従って、本発明は、少くとも一つの膜係留化合物と口
蹄疫ウイルスタンパク質の少くとも一つの部分配列との
複合体より成る口蹄疫合成ワクチンに関する。
蹄疫ウイルスタンパク質の少くとも一つの部分配列との
複合体より成る口蹄疫合成ワクチンに関する。
膜係留化合物は、生体膜または合成膜に係留され得る
化合物である。
化合物である。
膜係留化合物についての更なる情報は既掲の西独特許
出願公開明細書第3,546,150号、およびG.Jung el al.in
“Peptides,Structure and Function",V.J.Hrubyおよび
D.H.Rich,176〜182ページ,Pierce Chem.Co.Rockford,Il
linois,（1983）にみられる。
出願公開明細書第3,546,150号、およびG.Jung el al.in
“Peptides,Structure and Function",V.J.Hrubyおよび
D.H.Rich,176〜182ページ,Pierce Chem.Co.Rockford,Il
linois,（1983）にみられる。
好ましい膜係留剤／活性物質複合体は、膜係留化合物
と活性物質、すなわちFMDウイルスの部分配列とが相互
に共有結合されているものである。
と活性物質、すなわちFMDウイルスの部分配列とが相互
に共有結合されているものである。
特に適切な膜係留剤／活性物質複合体は、膜係留化合
物がリポタンパク質であるものであることが判った。格
別に適しているのは次式で示される膜係留化合物であ
る。すなわち、 〔式中、 Ａは、硫黄、酸素、ジスルフイド（−Ｓ−Ｓ−）、メ
チレン（−CH2−）または−NH−であってよく； ｎ＝０〜５、ｍ＝１または２であり、 Ｃ＊はＲまたはＳ立体配置を有する不斉炭素原子であ
り； Ｒ、Ｒ′およびＲ″は同一かまたは異なり、そして各
々水素であるか、または７〜25個の炭素原子を有しそし
てヒドロキシル、アミノ、オキソ、アシル、アルキルま
たはシクロアルキル基により置換されていてもよいアル
キル、アルケニルまたはアルキニル基であり； 式VI中のＢは式Ｉ〜Ｖに列挙された−（CH2）ｎ−
（置換アルキル）ラジカルの各々の意味を有することが
でき； R1およびR2は同一かまたは異なり、そしてＲ、Ｒ′お
よびＲ″と同じ意味を有するが更に−OR、−Ｏ−COR、
−COOR、NHCORまたは−CONHRであってもよく；そして Ｘはウイルスの部分配列が結合される１〜10個のアミ
ノ酸の鎖である〕。
物がリポタンパク質であるものであることが判った。格
別に適しているのは次式で示される膜係留化合物であ
る。すなわち、 〔式中、 Ａは、硫黄、酸素、ジスルフイド（−Ｓ−Ｓ−）、メ
チレン（−CH2−）または−NH−であってよく； ｎ＝０〜５、ｍ＝１または２であり、 Ｃ＊はＲまたはＳ立体配置を有する不斉炭素原子であ
り； Ｒ、Ｒ′およびＲ″は同一かまたは異なり、そして各
々水素であるか、または７〜25個の炭素原子を有しそし
てヒドロキシル、アミノ、オキソ、アシル、アルキルま
たはシクロアルキル基により置換されていてもよいアル
キル、アルケニルまたはアルキニル基であり； 式VI中のＢは式Ｉ〜Ｖに列挙された−（CH2）ｎ−
（置換アルキル）ラジカルの各々の意味を有することが
でき； R1およびR2は同一かまたは異なり、そしてＲ、Ｒ′お
よびＲ″と同じ意味を有するが更に−OR、−Ｏ−COR、
−COOR、NHCORまたは−CONHRであってもよく；そして Ｘはウイルスの部分配列が結合される１〜10個のアミ
ノ酸の鎖である〕。
特に強調すべきこれらの例としては次のものが挙げら
れる：細菌リポタンパク質に存在するＮ−末端、例えば
Ｙ−Ser−Ser−Ser−Asn、Ｙ−Ile−Leu−Leu−Ala、Ｙ
−Ala−Asn−Asn−Gln、Ｙ−Asn−Ser−Asn−Ser、Ｙ−
Gly−Ala−Met−Ser、Ｙ−Gln−Ala−Asn−Tyr、Ｙ−Gl
n−Val−Asn−Asn、Ｙ−Asp−Asn−Ser−Ser（式中、Ｙ
は式Ｉ〜VIIに掲げたラジカルの一つである）。これら
のリポペンタペプチドは短縮された形（リポジ、リポト
リまたはリポテトラペプチド）で膜係留化合物として用
いることもできる。格別に好ましいのはＮ−パルミトイ
ル−Ｓ−〔2,3−（ビスパルミトイルオキシ）プロピ
ル〕−システイニル−セリル−セリン（Pam3Cys−Ser−
Ser）、Ｎ−パルミトイル−Ｓ−〔2,3−ビスパルミトイ
ルオキシ）プロピル〕−システイニル−セリル−グリシ
ンおよびＮ−パルミトイル−Ｓ−〔2,3−（ビスパルミ
トイルオキシ）プロピル〕−システイニル−アラニル−
Ｄ−イソグルタミンである。他の好ましい膜係留化合物
の例は西独特許出願公開明細書第3,546,150号にみられ
る。
れる：細菌リポタンパク質に存在するＮ−末端、例えば
Ｙ−Ser−Ser−Ser−Asn、Ｙ−Ile−Leu−Leu−Ala、Ｙ
−Ala−Asn−Asn−Gln、Ｙ−Asn−Ser−Asn−Ser、Ｙ−
Gly−Ala−Met−Ser、Ｙ−Gln−Ala−Asn−Tyr、Ｙ−Gl
n−Val−Asn−Asn、Ｙ−Asp−Asn−Ser−Ser（式中、Ｙ
は式Ｉ〜VIIに掲げたラジカルの一つである）。これら
のリポペンタペプチドは短縮された形（リポジ、リポト
リまたはリポテトラペプチド）で膜係留化合物として用
いることもできる。格別に好ましいのはＮ−パルミトイ
ル−Ｓ−〔2,3−（ビスパルミトイルオキシ）プロピ
ル〕−システイニル−セリル−セリン（Pam3Cys−Ser−
Ser）、Ｎ−パルミトイル−Ｓ−〔2,3−ビスパルミトイ
ルオキシ）プロピル〕−システイニル−セリル−グリシ
ンおよびＮ−パルミトイル−Ｓ−〔2,3−（ビスパルミ
トイルオキシ）プロピル〕−システイニル−アラニル−
Ｄ−イソグルタミンである。他の好ましい膜係留化合物
の例は西独特許出願公開明細書第3,546,150号にみられ
る。
多くの様々な部分配列を膜係留化合物に係合されたFM
Dウイルスの部分配列として用いることができる。次の
ような部分配列が好ましい： 配列−（134〜154） 〃−（135〜154） 〃−（134〜158） 〃−（134〜160） 〃−（141〜160） 〃−（141〜158） 〃−（200〜213） 〃−（200〜210） 〃−（161〜180） 知られているすべての血清型およびサブタイプの配列
を用いることができる。これに関連して示し得る血清型
の例は次のとおりである： 特に適切な合成ワクチンは、様々な血清型および／ま
たはサブタイプの口蹄疫ウイルスからのペプチド（各々
膜係留化合物に共有結合的に結合されている）の混合物
より成るものである。
Dウイルスの部分配列として用いることができる。次の
ような部分配列が好ましい： 配列−（134〜154） 〃−（135〜154） 〃−（134〜158） 〃−（134〜160） 〃−（141〜160） 〃−（141〜158） 〃−（200〜213） 〃−（200〜210） 〃−（161〜180） 知られているすべての血清型およびサブタイプの配列
を用いることができる。これに関連して示し得る血清型
の例は次のとおりである： 特に適切な合成ワクチンは、様々な血清型および／ま
たはサブタイプの口蹄疫ウイルスからのペプチド（各々
膜係留化合物に共有結合的に結合されている）の混合物
より成るものである。
特に好ましい合成ワクチンは、膜係留化合物Ｎ−パル
ミトイル−Ｓ−〔2,3−（ビスパルミトイルオキシ）プ
ロピル〕システイニル−セリル−セリンに結合した血清
型Ｏ、ＡおよびＣの配列VP 1 134〜160の混合物より成
る。
ミトイル−Ｓ−〔2,3−（ビスパルミトイルオキシ）プ
ロピル〕システイニル−セリル−セリンに結合した血清
型Ｏ、ＡおよびＣの配列VP 1 134〜160の混合物より成
る。
血清型Ｏからの配列134〜154と血清型Ａからの配列13
4〜155とを用いる場合、後者は、Ｃ末端リジンを含んで
いる限り、ε−アミノ基を介して膜係留化合物に結合さ
せることができる。
4〜155とを用いる場合、後者は、Ｃ末端リジンを含んで
いる限り、ε−アミノ基を介して膜係留化合物に結合さ
せることができる。
本発明の特に適切な合成ワクチンはFMDウイルスの部
分配列VP 1（135〜154）を含むものであることが判って
いる。
分配列VP 1（135〜154）を含むものであることが判って
いる。
更に格別に好ましいのは、Ｎ−パルミトイル−Ｓ−
〔2,3−（ビスパルミトイルオキシ）プロピル〕−シス
テイニル−セリル−セリル−VP 1（135〜154）、すなわ
ち下式の化合物より成るワクチンである。
〔2,3−（ビスパルミトイルオキシ）プロピル〕−シス
テイニル−セリル−セリル−VP 1（135〜154）、すなわ
ち下式の化合物より成るワクチンである。
膜係留化合物は、原則として、R,SまたはR,Rジアステ
レオマー、またはジアステレオマー混合物の形であって
よい。しかしながら、R,R−ジアステレオマー膜係留化
合物が特に高活性を有していることが明らかとなってい
る。
レオマー、またはジアステレオマー混合物の形であって
よい。しかしながら、R,R−ジアステレオマー膜係留化
合物が特に高活性を有していることが明らかとなってい
る。
本発明は、更に、FMDウイルスの部分配列を複合体化
反応により膜係留化合物に結合することより成るワクチ
ンの製造方法に関する。複合体化反応は、例えば縮合、
付加、置換、酸化またはジスルフイド形成であってよ
い。好ましい複合体化方法は実施例１に示されている。
更なる複合体化方法は既掲の西独特許出願公開明細書第
3,546,150号に記載されている。
反応により膜係留化合物に結合することより成るワクチ
ンの製造方法に関する。複合体化反応は、例えば縮合、
付加、置換、酸化またはジスルフイド形成であってよ
い。好ましい複合体化方法は実施例１に示されている。
更なる複合体化方法は既掲の西独特許出願公開明細書第
3,546,150号に記載されている。
膜係留化合物の製造も、同じく記述したばかりの西独
特許出願公開明細書に詳述されている。
特許出願公開明細書に詳述されている。
場合によっては必要となるジアステレオマーの分離
も、例えばHoppe−Seyler、Z,Physiolog.Chem.364（198
3）593などに記載の様々な方法により行うこともでき
る。好ましい分離方法は実施例２に記載されている。
も、例えばHoppe−Seyler、Z,Physiolog.Chem.364（198
3）593などに記載の様々な方法により行うこともでき
る。好ましい分離方法は実施例２に記載されている。
特定のFMDタンパク質の部分配列は、文献に知られる
様々な方法、例えばＷnsch et al.Houben−Weyl,vol.
15/1,2,Stuttgart,Thieme−VerlagまたはＷnsch,Ange
w.Chem.83（1971）,773,E.GrossおよびJ.Meienhofer
（編者）、The Peptides,vol.1（1979）,2（1979）,3
（1981）および５（1983）,Academic Press,New York、
または西独特許出願公開第3,546,150号に知られた方法
で構築することができる。部分配列および複合体の製造
に好ましい方法は実施例３に詳述されている。
様々な方法、例えばＷnsch et al.Houben−Weyl,vol.
15/1,2,Stuttgart,Thieme−VerlagまたはＷnsch,Ange
w.Chem.83（1971）,773,E.GrossおよびJ.Meienhofer
（編者）、The Peptides,vol.1（1979）,2（1979）,3
（1981）および５（1983）,Academic Press,New York、
または西独特許出願公開第3,546,150号に知られた方法
で構築することができる。部分配列および複合体の製造
に好ましい方法は実施例３に詳述されている。
本発明は更に、膜係留化合物とFMDウイルスの部分配
列との複合体を含む医薬用または動物医用組成物に関す
る。溶媒のほかには本発明の組成物に対し、付加的な助
剤および担体またはアジュバントを更に添加する必要は
通常ない。しかしながら、場合によっては、かかる助剤
および／または担体、場合によってはアジュバントを本
発明組成物に添加する価値があることもある。関連の物
質は当業者に知られた方法によって混合され、小分けさ
れる。
列との複合体を含む医薬用または動物医用組成物に関す
る。溶媒のほかには本発明の組成物に対し、付加的な助
剤および担体またはアジュバントを更に添加する必要は
通常ない。しかしながら、場合によっては、かかる助剤
および／または担体、場合によってはアジュバントを本
発明組成物に添加する価値があることもある。関連の物
質は当業者に知られた方法によって混合され、小分けさ
れる。
動物の信頼性ある免疫のために必要なワクチン量は、
生物種、膜係留化合物（一種または複数種）、およびFM
Dウイルスの部分配列（一種または複数種）に依存し、
また個々の場合に実験的に定められるべきである。例え
ば、約100〜500μｇの本発明ワクチンを更なる助剤また
は担体を用いることなく一回投与するだけで、FMDウイ
ルス血清型O1Kに対してモルモツトを信頼性をもって免
疫するのに十分である。
生物種、膜係留化合物（一種または複数種）、およびFM
Dウイルスの部分配列（一種または複数種）に依存し、
また個々の場合に実験的に定められるべきである。例え
ば、約100〜500μｇの本発明ワクチンを更なる助剤また
は担体を用いることなく一回投与するだけで、FMDウイ
ルス血清型O1Kに対してモルモツトを信頼性をもって免
疫するのに十分である。
本発明は更に、前述のワクチンを哺乳動物における抗
体増加に用いることに関する。
体増加に用いることに関する。
実施例 １ Pam3Cys−Ser−Ser−OSuまたはPam3Cys−Ser−Ser−O
Hによるペプチド／タンパク質の複合体化 1.DMFに可溶なペプチドおよびタンパク質 ２μmolのペプチド／タンパク質を0.5〜1mlのDMFに溶
解し、そして８μmol（9.2mg）の固体Pam3Cys−Ser−Se
r−OSuを添加する。均質溶液が穏やかな加熱および超音
波処理により得られ、そして４μmolの有機塩基（Ｎ−
エチルモルホリン）を添加する。12時間撹拌後、１〜2m
lのクロロホルム：メタノール（1:1）を添加し、そして
その混合物を氷浴で２時間冷却する。
Hによるペプチド／タンパク質の複合体化 1.DMFに可溶なペプチドおよびタンパク質 ２μmolのペプチド／タンパク質を0.5〜1mlのDMFに溶
解し、そして８μmol（9.2mg）の固体Pam3Cys−Ser−Se
r−OSuを添加する。均質溶液が穏やかな加熱および超音
波処理により得られ、そして４μmolの有機塩基（Ｎ−
エチルモルホリン）を添加する。12時間撹拌後、１〜2m
lのクロロホルム：メタノール（1:1）を添加し、そして
その混合物を氷浴で２時間冷却する。
沈渣を冷クロロホルム：メタノール（1:1）1mlにと
り、tert.ブタノール／水（3:1）で洗浄し（必要に応じ
て超音波処理する）そして凍結乾燥する。
り、tert.ブタノール／水（3:1）で洗浄し（必要に応じ
て超音波処理する）そして凍結乾燥する。
2.水溶性のペプチドおよびタンパク質 ２μmolのペプチド／タンパク質を0.8mlの水に溶解
し、そして４μmol（4.5mg）のPam3Cys−Ser−Ser−OH
を添加する。その混合物を、乳濁液が生じ、そして5.0
〜5.5のpHとなるまで十分超音波処理する。100μのH2
O中に溶解した5mgのEDC（１−３−ジエチルアミノプロ
ピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩）を添加後、
その混合物を室温で18時間撹拌後、各１の蒸留H2Oに
対して２回透析する。透析チューブの内容物を凍結乾燥
する。
し、そして４μmol（4.5mg）のPam3Cys−Ser−Ser−OH
を添加する。その混合物を、乳濁液が生じ、そして5.0
〜5.5のpHとなるまで十分超音波処理する。100μのH2
O中に溶解した5mgのEDC（１−３−ジエチルアミノプロ
ピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩）を添加後、
その混合物を室温で18時間撹拌後、各１の蒸留H2Oに
対して２回透析する。透析チューブの内容物を凍結乾燥
する。
実施例 ２ Ｎ−パルミトイル−Ｓ−〔2,3−（ビスパルミトイルオ
キシ）プロピル〕−システインtert−ブチルエステル
（Pam3Cys−OBut）のジアステレオマーの分離： 2gのPam3Cys−OButを10mlの移動相、ジクロロメタン
／酢酸エチル（20:1）に溶解し、そしてMNシリカゲル6
0、0.063〜0.2mm/70〜230メッシュASTMを充填したカラ
ム（長さ120cm、直径4cm）にかける。２滴／秒の滴下速
度で各10mlの350フラクシヨンを集め、そして各フラク
シヨンのアリコートについてジクロロメタン／酢酸エチ
ル（20:1）中のシリカゲル60プレートでのクロマトグラ
フイにかけそして塩素/TDM試薬で染色後Pam3Cys−CBut
をチエツクする。
キシ）プロピル〕−システインtert−ブチルエステル
（Pam3Cys−OBut）のジアステレオマーの分離： 2gのPam3Cys−OButを10mlの移動相、ジクロロメタン
／酢酸エチル（20:1）に溶解し、そしてMNシリカゲル6
0、0.063〜0.2mm/70〜230メッシュASTMを充填したカラ
ム（長さ120cm、直径4cm）にかける。２滴／秒の滴下速
度で各10mlの350フラクシヨンを集め、そして各フラク
シヨンのアリコートについてジクロロメタン／酢酸エチ
ル（20:1）中のシリカゲル60プレートでのクロマトグラ
フイにかけそして塩素/TDM試薬で染色後Pam3Cys−CBut
をチエツクする。
フラクシヨン280〜315は、Pam3Cys−OButのR,Rジアス
テレオマーを、フラクシヨン316〜335はR,RおよびR,Sの
混合物を、そしてフラクシヨン336〜354はR,S−ジアス
テレオマーを含有する。溶媒を回転蒸発器で蒸発させそ
して残分を温tert.−ブタノールにとりそして凍結乾燥
後、600mgのR,R−、370mgのR,R−およびR,S−混合物、
そして540mgのR,S−Pam3Cys−OButが得られる。
テレオマーを、フラクシヨン316〜335はR,RおよびR,Sの
混合物を、そしてフラクシヨン336〜354はR,S−ジアス
テレオマーを含有する。溶媒を回転蒸発器で蒸発させそ
して残分を温tert.−ブタノールにとりそして凍結乾燥
後、600mgのR,R−、370mgのR,R−およびR,S−混合物、
そして540mgのR,S−Pam3Cys−OButが得られる。
実施例 ３ Ｎ−パルミトイル−Ｓ−〔2,3−（ビスパルミトイルオ
キシ）プロピル〕−システイニル−セリル−セリル−VP
1（135〜154）の合成 FMDウイルス血清型O1KのVP 1ペプチド配列を固相ペプ
チド合成により合成した。Fmoc−アミノ酸を用いた。次
の側鎖保護基を用いた:Lys（Boc）、His（Fmoc）、Arg
（Mtr）、Ser（tBu）、Asp（OtBu）、Tyr（tBu）。Fmoc
−Lys（Boc）−OHで負荷された1gの（ｐ−ベンゾイルオ
キシベンジルアルコール）−樹脂から出発して、以下の
合成サイクルを行った： Ｎ−メチルピロリドン中の55％ピペリジンによるＮ−
活性化（１×２分、１×５分）、Ｎ−メチルピロリドン
（6ml）中でのジイソプロピルカルボジイミド（1.5mmo
l）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（1.5mmo
l）によるFmoc−Ａ−Ａ−OH（1.5mmol）の予備的活性
化、引き続いてのカツプリング（1.5時間）。Ｎ−エチ
ルモルホリン（Ｎ−メチルピロリドン中５％）で洗浄
後、前記予備的活性化とカツプリングを繰り返した。未
反応アミノ基のブロツキングをＮ−メチルピロリドン中
の無水酢酸（2.5mmol）およびジイソプロピルアミン
（1.2mmol）を用いて行った。各ステツプの後で、その
ペプチド−樹脂を数回Ｎ−メチルピロリドン、ジクロロ
メタンで、そして再びＮ−メチルピロリドンで洗浄し
た。
キシ）プロピル〕−システイニル−セリル−セリル−VP
1（135〜154）の合成 FMDウイルス血清型O1KのVP 1ペプチド配列を固相ペプ
チド合成により合成した。Fmoc−アミノ酸を用いた。次
の側鎖保護基を用いた:Lys（Boc）、His（Fmoc）、Arg
（Mtr）、Ser（tBu）、Asp（OtBu）、Tyr（tBu）。Fmoc
−Lys（Boc）−OHで負荷された1gの（ｐ−ベンゾイルオ
キシベンジルアルコール）−樹脂から出発して、以下の
合成サイクルを行った： Ｎ−メチルピロリドン中の55％ピペリジンによるＮ−
活性化（１×２分、１×５分）、Ｎ−メチルピロリドン
（6ml）中でのジイソプロピルカルボジイミド（1.5mmo
l）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（1.5mmo
l）によるFmoc−Ａ−Ａ−OH（1.5mmol）の予備的活性
化、引き続いてのカツプリング（1.5時間）。Ｎ−エチ
ルモルホリン（Ｎ−メチルピロリドン中５％）で洗浄
後、前記予備的活性化とカツプリングを繰り返した。未
反応アミノ基のブロツキングをＮ−メチルピロリドン中
の無水酢酸（2.5mmol）およびジイソプロピルアミン
（1.2mmol）を用いて行った。各ステツプの後で、その
ペプチド−樹脂を数回Ｎ−メチルピロリドン、ジクロロ
メタンで、そして再びＮ−メチルピロリドンで洗浄し
た。
樹脂結合FMDウイルス配列を合成後、トリフルオロ酢
酸による分解によりペプチドの一部を得、そしてHPLC、
MS、アミノ酸分析、キラール相分析および配列分析によ
りチエツクした。２個のセリン残基を樹脂結合ペプチド
に結合後、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイ
ンをカツプリングさせた。４時間後、１当量のＮ−メチ
ルモルホリンを添加し、そして更に１時間後、ポリペプ
チド−樹脂を洗浄した。そのリポペプチドを2mlのトリ
フルオロ酢酸（100μのチオアニソールを含有）を用
いて4 1/2時間内に樹脂から分離した。液を蒸発さ
せ、残分を酢酸にとり、そしてその溶液を冷エーテルに
添加した。沈澱リポペプチドを３回エーテルで洗浄し
た。冷アセトンおよび数滴の水を含むトリフルオロエタ
ノール／クロロホルム（1:3比）から再結晶することに
より更に精製した。そのリポペプチドをtert.−ブタノ
ール／水（3:1）から凍結乾燥した。
酸による分解によりペプチドの一部を得、そしてHPLC、
MS、アミノ酸分析、キラール相分析および配列分析によ
りチエツクした。２個のセリン残基を樹脂結合ペプチド
に結合後、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイ
ンをカツプリングさせた。４時間後、１当量のＮ−メチ
ルモルホリンを添加し、そして更に１時間後、ポリペプ
チド−樹脂を洗浄した。そのリポペプチドを2mlのトリ
フルオロ酢酸（100μのチオアニソールを含有）を用
いて4 1/2時間内に樹脂から分離した。液を蒸発さ
せ、残分を酢酸にとり、そしてその溶液を冷エーテルに
添加した。沈澱リポペプチドを３回エーテルで洗浄し
た。冷アセトンおよび数滴の水を含むトリフルオロエタ
ノール／クロロホルム（1:3比）から再結晶することに
より更に精製した。そのリポペプチドをtert.−ブタノ
ール／水（3:1）から凍結乾燥した。
実施例 ４ 活性試験： 無作為に選ばれた体重450〜500gのモルモツトに筋肉
内または皮下に接種した。0.5mgの凍結乾燥ワクチン
（Ｎ−パルミトイル−Ｓ−〔（2R,R）−2,3−（ビスパ
ルミトイルオキシ）プロピル〕−システイニル−セリル
−セリル−VP 1（135〜154））を0.05Mホスフエート緩
衝液とIntrali−pid （Kabi Vitrum、スエーデン）の
1:1混合物500μ中で乳濁させた。その混合物を10秒間
超音波処理した。接種の21日後の少なくとも500モルモ
ツト単位の発病力あるO1K FMDウイルスを左後足に皮下
注射することにより４匹をFMDウイルスに感染させた。
対照動物には前記ワクチンに代えて膜係留化合物または
ホスフエート緩衝液を注射した。接種動物のすべてに高
力価の中和抗体（log10 SN50＝0.36）が認められた。対
照動物は、抗体力価を有しなかった（ブランク0.17）。
中和抗体の力価は、単層のBHK（babyhamster kidney）
細胞中でウイルス細胞の50％を中和するのに必要な血清
希釈濃度の対数として測定した。接種動物では抗ペプチ
ドELISA（A492）により抗体を検出することができた
が、これは非接種動物では可能でなかった。接種動物は
二次的病変を全く示さなかったのに対し、非接種動物は
口蹄疫感染の完全像を示した。
内または皮下に接種した。0.5mgの凍結乾燥ワクチン
（Ｎ−パルミトイル−Ｓ−〔（2R,R）−2,3−（ビスパ
ルミトイルオキシ）プロピル〕−システイニル−セリル
−セリル−VP 1（135〜154））を0.05Mホスフエート緩
衝液とIntrali−pid （Kabi Vitrum、スエーデン）の
1:1混合物500μ中で乳濁させた。その混合物を10秒間
超音波処理した。接種の21日後の少なくとも500モルモ
ツト単位の発病力あるO1K FMDウイルスを左後足に皮下
注射することにより４匹をFMDウイルスに感染させた。
対照動物には前記ワクチンに代えて膜係留化合物または
ホスフエート緩衝液を注射した。接種動物のすべてに高
力価の中和抗体（log10 SN50＝0.36）が認められた。対
照動物は、抗体力価を有しなかった（ブランク0.17）。
中和抗体の力価は、単層のBHK（babyhamster kidney）
細胞中でウイルス細胞の50％を中和するのに必要な血清
希釈濃度の対数として測定した。接種動物では抗ペプチ
ドELISA（A492）により抗体を検出することができた
が、これは非接種動物では可能でなかった。接種動物は
二次的病変を全く示さなかったのに対し、非接種動物は
口蹄疫感染の完全像を示した。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−292398（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−63600（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−500719（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−213723（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−49321（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−500673（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/135 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)
Claims (12)
- 【請求項１】少くとも一つの膜係留化合物と口蹄疫ウイ
ルスタンパク質の少くとも一つの部分配列との複合体よ
り成る口蹄疫合成ワクチン。 - 【請求項２】膜係留化合物および口蹄疫ウイルスの部分
配列が相互に共有結合的に結合されている請求項１記載
の合成ワクチン。 - 【請求項３】膜係留化合物が細菌膜リポタンパク質であ
る請求項１または２記載の合成ワクチン。 - 【請求項４】膜係留化合物が下記式のうちの一つにより
示される請求項１〜３のいずれかに記載の合成ワクチ
ン。 〔式中、 Ａは、硫黄、酸素、ジスルフイド（−Ｓ−Ｓ−）、メチ
レン（−CH2−）または−NH−であってよく； ｎ＝０〜５、ｍ＝１または２であり、 Ｃ＊はＲまたはＳ立体配置を有する不斉炭素原子であ
り； Ｒ、Ｒ′およびＲ″は同一かまたは異なり、そして各々
水素であるか、または７〜25個の炭素原子を有しそして
ヒドロキシル、アミノ、オキソ、アシル、アルキルまた
はシクロアルキル基により置換されていてもよいアルキ
ル、アルケニルまたはアルキニル基であり； 式VI中のＢは式Ｉ〜Ｖに列挙された−（CH2）ｎ−（置
換アルキル）ラジカルの各々の意味を有することがで
き； R1およびR2は同一かまたは異なり、そしてＲ、Ｒ′およ
びＲ″と同じ意味を有するが更に−OR、−Ｏ−COR、−C
OOR、NHCORまたは−CONHRであってもよく；そして Ｘはウイルスの部分配列が結合される１〜10個のアミノ
酸の鎖である〕。 - 【請求項５】膜係留化合物に結合した口蹄疫ウイルスの
部分配列が 配列−（134〜154） 〃−（135〜154） 〃−（134〜158） 〃−（134〜160） 〃−（141〜160） 〃−（141〜158） 〃−（200〜213） 〃−（200〜210） 〃−（161〜180） またはそのＣ−端末アミド化またはアルキルアミド化体
より成る群より選択され、そして既知のすべての血清型
およびサブタイプの配列を用いることができる、請求項
１〜４のいずれかに記載の合成ワクチン。 - 【請求項６】口蹄疫ウイルスの部分配列VP 1（135〜15
4）が膜係留化合物に結合される請求項１〜５のいずれ
かに記載の合成ワクチン。 - 【請求項７】口蹄疫ウイルスの各種血清型および／また
はサブタイプからのペプチド混合物より成り、それらの
各々が一つまたは複数の膜係留化合物に共有結合的に結
合される請求項１〜６のいずれかに記載の合成ワクチ
ン。 - 【請求項８】膜係留化合物Ｎ−パルミトイル−Ｓ−〔2,
3−（ビスパルミトイルオキシ）プロピル〕−システイ
ニル−セリル−セリンに結合した血清型Ｏ、ＡまたはＣ
の配列VP 1 134〜160の混合物より成る請求項１〜７の
いずれかに記載の合成ワクチン。 - 【請求項９】ワクチンがＮ−パルミトイル−Ｓ−〔2,3
−（ビスパルミトイルオキシ）プロピル〕−システイニ
ル−セリル−セリル−PV1（135〜154）より成り、膜係
留化合物はR,SまたはR,Rジアステレオマーまたはジアス
テレオマー混合物の形であってよい請求項１〜８のいず
れかに記載の合成ワクチン。 - 【請求項１０】膜係留化合物がR,R−ジアステレオマー
の形である請求項１〜９のいずれかに記載の合成ワクチ
ン。 - 【請求項１１】自体知られた方法により製造された口蹄
疫ウイルスの部分配列を複合体化反応により膜係留化合
物に結合することより成る請求項１〜10のいずれかに記
載の合成ワクチンの製造方法。 - 【請求項１２】請求項１〜11のいずれかに記載の合成ワ
クチン、および適切な場合には、慣用の助剤および／ま
たは担体のほかに、アジュバントおよび／または他のワ
クチンを含有する医薬用または動物医用組成物。
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