CN107250103A - 氨基酸缀合物和肽缀合物以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肽、以及氨基酸缀合物和肽缀合物；用于制备氨基酸缀合物和肽缀合物的方法；通过所述方法产生的缀合物；包含所述肽和缀合物的药物组合物；引出受试者的免疫应答的方法和对受试者进行疫苗接种的方法；所述肽和缀合物用于所述方法的用途；以及所述肽和缀合物用于制造用于所述方法的药物的用途。

Description

氨基酸缀合物和肽缀合物以及其用途
技术领域
本发明涉及氨基酸缀合物和肽缀合物、用于制备氨基酸缀合物和肽缀合物的方法、通过所述方法产生的缀合物、包含所述肽和缀合物的药物组合物、引出受试者的免疫应答的方法和对受试者进行疫苗接种的方法、所述肽和缀合物用于所述方法的用途、以及所述肽和缀合物用于制造用于所述方法的药物的用途。
背景技术
合成肽疫苗一般包含蛋白质抗原的免疫原性部分的合成拷贝。这种用于开发疫苗的方法具有许多优势，包括易于合成、避免潜在有毒的生物副产物以及直接表征。
在开发肽疫苗中的关键问题是缺乏由作为唯一的疫苗组分的肽所显示的免疫原性。通常需要在疫苗中包括佐剂，所述佐剂被设计成激活先天免疫系统的组分(例如弗氏佐剂(Freund's adjuvant))。
肽疫苗设计中的替代策略是形成自佐剂化疫苗，其中所关注的肽表位与适当的佐剂共价连接。与抗原与外部佐剂的简单共同制剂相比，这样的自佐剂化疫苗可以具有增强的抗原摄取、提呈以及树突状细胞成熟。
几种自佐剂化疫苗已经被开发，但是所述疫苗的制备可能是复杂的。
持续需要新的自佐剂化疫苗和制备自佐剂化疫苗的新方法。具体来说，需要涉及治疗爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(Epstein Barr Virus，EBV)相关疾病，如霍奇金氏病(Hodgkin's Disease，HD)或鼻咽癌(NPC)的自佐剂化疫苗，包括例如包含来自EBV潜伏膜蛋白2(LMP2)的一个或多个表位的自佐剂化疫苗。
本发明的目标在于在某种程度上有助于满足这些需求；和/或至少为公众提供有用的选择。
从仅以举例方式给出的以下说明，本发明的其它目标可以变得显而易见。
已经被包括在本说明书中的文件、法案、材料、装置、文章等的任何论述仅仅是为了实现提供本发明的背景的目的。它不应当被视为承认这些内容中的任何或全部因在优先权日之前存在而形成现有技术基础的一部分或是与本发明相关的领域中的公知常识。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种用于制备肽缀合物的方法，所述方法包括
提供脂质化的氨基酸或肽，以及
使所述脂质化的氨基酸或肽与一个或多个氨基酸或肽偶联以提供肽缀合物，并且其中所述肽缀合物包含一个或多个EBV LMP2表位。
在一个方面，本发明提供了一种用于制备肽缀合物的方法，所述方法包括使
含有脂质的缀合配偶体，与
包含氨基酸的缀合配偶体
在有效通过用硫醇将碳-碳双键进行氢硫醇化来使所述含有脂质的缀合配偶体与所述包含氨基酸的缀合配偶体缀合的条件下反应，
所述方法还包括使所述氨基酸缀合物的氨基酸与氨基酸或肽偶联以提供肽缀合物，并且其中所述肽缀合物包含一个或多个EBV LMP2表位。
在另一个方面，本发明提供了一种用于制备肽缀合物的方法，所述方法包括使
含有脂质的缀合配偶体，与
包含肽的缀合配偶体，其中所述包含肽的配偶体包含一个或多个EBV LMP2表位，
在有效通过用硫醇将碳-碳双键进行氢硫醇化来使所述含有脂质的缀合配偶体与所述包含肽的缀合配偶体缀合的条件下反应。
在另一个方面，本发明提供了一种如本文所述的氨基酸缀合物或肽缀合物。在各种实施方案中，所述氨基酸缀合物或肽缀合物包含一个或多个EBV LMP2表位。在一个实施例中，所述氨基酸缀合物或肽缀合物是通过本发明的方法制备的氨基酸缀合物或肽缀合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种肽缀合物，所述肽缀合物包含一个或多个EBV LMP2表位。在各种实施方案中，所述一个或多个EBV LMP2表位是MHCI表位。在各种实施方案中，所述肽缀合物包含选自由SEQ ID NO:76-101中的任一个组成的组的一个或多个EBV LMP2表位。在各种实施方案中，所述肽缀合物包含肽，所述肽包含来自SEQ ID NO:1-75中的任一个的氨基酸序列的12个或更多个连续氨基酸或由所述12个或更多个连续氨基酸组成。在各种实施方案中，所述肽缀合物包含肽，所述肽包含来自SEQ ID NO:1-75中的任一个的氨基酸序列的15个或更多个连续氨基酸或由所述15个或更多个连续氨基酸组成，或包含来自SEQ ID NO:1-75中的任一个的氨基酸序列的20个或更多个连续氨基酸或由所述20个或更多个连续氨基酸组成。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的、纯化的、或重组肽，所述肽包含来自SEQID NO:1-75中的任一个的氨基酸序列的12个或更多个连续氨基酸或由所述12个或更多个连续氨基酸组成。在各种实施方案中，所述分离的、纯化的、或重组肽包含来自SEQ ID NO:1-75中的任一个的氨基酸序列的15个或更多个连续氨基酸或由所述15个或更多个连续氨基酸组成，或包含来自SEQ ID NO:1-75中的任一个的氨基酸序列的20个或更多个连续氨基酸或由所述20个或更多个连续氨基酸组成。
在一个实施方案中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:1-75中的任一个组成的组的氨基酸序列、由所述氨基酸序列组成、或基本上由所述氨基酸序列组成。
本文所述的实施方案中的任一个涉及本文中的方面中的任一个。
在各种实施方案中，所述脂质化的氨基酸或肽包含以下各项中的一种或多种：Pam1Cys、Pam2Cys、以及Pam3Cys。举例来说，所述脂质化的氨基酸或肽包含以下各项中的一种或多种：Pam1CSK4、Pam2CSK4、以及Pam3CSK4。在各种实施方案中，所述脂质化的氨基酸或肽是乙酰化的或酰胺化的，例如，所述脂质化的氨基酸或肽包含乙酰化的Pam1Cys、乙酰化的Pam2Cys、或乙酰化的Pam3Cys、或酰胺化的Pam1Cys、酰胺化的Pam2Cys、或酰胺化的Pam3Cys。
在一个实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体是含有肽的缀合配偶体，并且所述含有脂质的缀合配偶体是与所述含有肽的缀合配偶体的肽偶联的。
在一些实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体是与所述含有氨基酸的缀合配偶体的所述氨基酸或氨基酸或者所述含有肽的缀合配偶体的肽缀合的。
在某些实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体是与所述含有氨基酸的缀合配偶体的所述氨基酸或氨基酸缀合的。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种用于制备肽缀合物的方法，所述方法包括使
含有脂质的缀合配偶体，与
含有肽的缀合配偶体，其中所述包含肽的配偶体包含一个或多个EBV LMP2表位，
在有效通过用硫醇将碳-碳双键进行氢硫醇化来使所述含有脂质的缀合配偶体与所述含有肽的缀合配偶体的肽缀合的条件下反应。
在一个实施方案中，所述缀合物是脂肽，因此所述方法是用于制备脂肽。
在一个实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体包含碳-碳双键，并且所述含有肽的缀合配偶体的肽包含硫醇。
在一个实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体包含一个或多个EBV LMP2表位。在一个实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含一个或多个EBV LMP2表位。在一个实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体包含两个或更多个EBV LMP2表位。在一个实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含两个或更多个EBV LMP2表位。在一个实施方案中，所述肽缀合物包含两个或更多个EBV LMP2表位。在一个实施方案中，所述表位是肽表位。在一个实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体由肽组成。在一个实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体由包含肽表位的肽组成。在一个实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体由肽组成。在一个实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体由包含肽表位的肽组成。
在一些实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体包含与所述缀合配偶体的所述氨基酸或氨基酸结合的表位。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含与所述含有肽的缀合配偶体的肽结合的表位。在一些实施方案中，所述表位是经由连接基团与肽结合的。
在一些实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体包含经由连接基团与所述缀合配偶体的所述氨基酸或氨基酸结合的肽表位。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含经由连接基团与所述肽结合的肽表位。
在一些实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体和/或所述含有肽的缀合配偶体包含抗原肽。在一些实施方案中，所述肽缀合物包含抗原肽。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述氨基酸缀合物的氨基酸与氨基酸或肽偶联以提供肽缀合物，其中所述肽缀合物包含一个或多个EBV LMP2表位。
在一些实施方案中，使肽偶联包括单独地使一个或多个氨基酸和/或一个或多个肽偶联。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述氨基酸缀合物的氨基酸或所述肽缀合物的氨基酸与氨基酸或肽偶联以提供包含连接基团或其一个或多个氨基酸的肽缀合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述包含连接基团或其一个或多个氨基酸的肽缀合物的氨基酸与氨基酸或肽偶联以提供包含一个或多个EBV LMP2表位的肽缀合物，所述表位经由连接基团与和含有脂质的缀合配偶体缀合的氨基酸结合。
在一些实施方案中，所述肽缀合物中与所述含有脂质的缀合物缀合的氨基酸是N末端氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述氨基酸缀合物的氨基酸或所述肽缀合物的氨基酸与氨基酸或肽偶联以提供包含一个或多个EBV LMP2表位的肽缀合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括使一个或多个EBV LMP2表位与所述氨基酸缀合物的氨基酸或所述肽缀合物的氨基酸偶联。在一些实施方案中，所述方法还包括使一个或多个EBV LMP2表位与所述氨基酸缀合物的氨基酸或所述肽缀合物的氨基酸偶联。在一些实施方案中，所述表位是经由连接基团偶联或结合的。
在一些实施方案中，所述方法还包括使表位与所述肽缀合物的肽偶联。在一些实施方案中，所述方法还包括使肽表位与所述肽缀合物的肽偶联。在一些实施方案中，所述表位是经由连接基团与所述肽结合的。在各种实施例中，所述表位是EBV LMP2表位。
在一个实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体由氨基酸组成。在一个实施方案中，所述氨基酸的C末端的羧基是受羧基保护基保护的和/或所述氨基酸的Nα-氨基是受氨基保护基保护的。
在一些实施方案中，所述肽的C末端的羧基是受羧基保护基保护的和/或所述肽的Nα-氨基是受氨基保护基保护的。
在一个实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体包含一个或多个任选取代的直链或支链脂族或杂脂族链，所述链各自含有至少4个链连接原子。在一个实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体包含一个或多个任选取代的直链或支链脂族或杂脂族链，所述链各自含有至少6个链连接原子。在一个具体考虑的实施方案中，所述一个或多个链是脂族的。在一个具体考虑的实施方案中，所述一个或多个链是饱和的。
在一些实施方案中，所述一个或多个链任选被取代。在一些实施方案中，所述一个或多个链任选被一个或多个芳基取代。
在一些实施方案中，所述一个或多个链包含至少4个、6个、8个、10个、12个、或14个链连接原子。在一些实施方案中，所述一个或多个链包含4个-22个、6个-22个、8个-22个、10个-22个、12个-22个、或14个-22个链连接原子。
在一个实施方案中，所述一个或多个链通过含有杂原子的官能团与包含碳-碳双键或硫醇的部分共价结合。含有杂原子的官能团的实例包括但不限于醚基、胺基、硫醚基、亚砜基、砜基、酯基、酰胺基、碳酸酯基、氨基甲酸酯基、以及脲基。
在示例性实施方案中，所述一个或多个链通过酯官能团与所述部分共价结合。
在一个实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体包含一种或多种饱和或不饱和脂肪酸酯。在一些实施方案中，所述脂肪酸是饱和的。在一个实施方案中，一种或多种脂肪酸酯与包含碳-碳双键或硫醇的部分结合。在一个实施方案中，所述酯是脂肪酸的羧基和所述部分的醇的酯。
在一个实施方案中，所述脂肪酸是C4-22脂肪酸。在一个实施方案中，所述脂肪酸是C6-22脂肪酸。在另一个实施方案中，所述脂肪酸是C10-22脂肪酸。在又另一个实施方案中，所述脂肪酸是C12-22脂肪酸。在一个示例性实施方案中，所述脂肪酸是C12、C14、C16、C18、或C20脂肪酸。
在一些实施方案中，所述脂肪酸是月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、棕榈油酸、油酸、反油酸、亚油酸、α-亚麻酸、以及花生四烯酸。在一个实施方案中，所述脂肪酸是月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、或硬脂酸。在一个具体考虑的实施方案中，所述脂肪酸是棕榈酸。
在一个示例性实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体包含一种或两种脂肪酸酯。在一个具体考虑的实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体包含一种脂肪酸酯。
在某些实施方案中，所述脂肪酸酯是包含碳-碳双键或硫醇的醇的酯。在一个实施方案中，所述醇是一元、二元、或三元C2-6脂族醇。在另一个实施方案中，所述醇是一元或二元C2-4脂族醇。在一个示例性实施方案中，所述醇是一元C2脂族醇或一元或二元C3脂族醇。在一个具体考虑的实施方案中，所述醇是一元C2醇。
在某些实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体包含碳-碳双键。
在一个示例性实施方案中，所述醇包含碳-碳双键。在一个具体考虑的实施方案中，所述醇是乙烯醇。
在具体考虑的实施方案中，所述肽是合成肽。
在一个实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体和/或肽缀合物包含合成肽。在一些实施方案中，所述合成肽是通过包括固相肽合成(SPPS)的方法制备的肽。
在一些实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体的所述氨基酸或氨基酸包含碳-碳双键或硫醇。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽的氨基酸残基包含碳-碳双键或硫醇。
在一些实施方案中，所述包含碳-碳双键或硫醇的氨基酸残基是末端氨基酸残基。在一些实施方案中，所述末端氨基酸残基是N末端残基。
在一些实施方案中，所述包含碳-碳双键或硫醇的氨基酸的Nα-氨基是酰化的。
在某些实施方案中，所述方法还包括将所述氨基酸缀合物的氨基酸或所述肽缀合物的与所述含有脂质的缀合配偶体缀合的氨基酸残基的Nα-氨基酰化。在某些实施方案中，所述方法还包括用C2-20脂肪酸将所述Nα-氨基酰化。
在某些实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体的所述氨基酸或氨基酸包含硫醇。在某些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽的氨基酸残基包含硫醇。在某些实施方案中，所述硫醇是半胱氨酸残基的硫醇。
在某些实施方案中，所述半胱氨酸残基是末端残基。在某些实施方案中，所述半胱氨酸残基是N末端残基。
在一些实施方案中，所述半胱氨酸残基的氨基是酰化的。
在一个实施方案中，所述氨基是被C2-20脂肪酸酰化的。
在一个示例性实施方案中，所述C2-20脂肪酸是乙酰基或棕榈酰基。在另一个示例性实施方案中，所述C2-20脂肪酸是乙酰基。
在一些实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体和/或肽缀合物包含8个至220个、8个至200个、8个至175个、8个至150个、8个至125个、8个至100个、8个至90个、8个至80个、8个至70个、8个至60个、8个至50个、8个至40个、8个至30个、8个至25个、8个至20个、或8个至15个氨基酸。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含8个至220个、8个至200个、8个至175个、8个至150个、8个至125个、8个至100个、8个至90个、8个至80个、8个至70个、8个至60个、8个至50个、8个至40个、8个至30个、8个至25个、8个至20个、或8个至15个氨基酸。
在一个示例性实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体和/或肽缀合物包含含有8个至60个氨基酸的肽。在一个示例性实施方案中，所述肽包含8个至60个氨基酸。
在其它实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体和/或肽缀合物包含5个至220个、8个至220个、5个至175个、8个至175个、8个至150个、10个至150个、15个至125个、20个至100个、20个至80个、20个至60个、25个至100个、25个至80个、25个至60个、30个至80个、40个至60个、或50个至60个氨基酸。在其它实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含5个至220个、8个至220个、5个至175个、8个至175个、8个至150个、10个至150个、15个至125个、20个至100个、20个至80个、20个至60个、25个至100个、25个至80个、25个至60个、30个至80个、40个至60个、或50个至60个氨基酸。
在其它实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体和/或肽缀合物包含5个至150个、5个至125个、5个至100个、5个至75个、5个至60个、5个至50个、5个至40个、5个至30个、5个至25个、5个至20个、8个至150个、8个至125个、8个至100个、8个至75个、8个至60个、8个至50个、8个至40个、8个至30个、8个至25个、或8个至20个氨基酸。在其它实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含5个至150个、5个至125个、5个至100个、5个至75个、5个至60个、5个至50个、5个至40个、5个至30个、5个至25个、5个至20个、8个至150个、8个至125个、8个至100个、8个至75个、8个至60个、8个至50个、8个至40个、8个至30个、8个至25个、或8个至20个氨基酸。
在一个实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体和/或肽缀合物包含一个或多个增溶基团。在一个实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含一个或多个增溶基团。
在某些实施方案中，所述增溶基团是在肽链中包含两个或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述增溶基团是在肽链中包含两个或更多个连续亲水性氨基酸残基的序列的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述亲水性氨基酸残基是阳离子氨基酸残基。在一个实施方案中，所述阳离子氨基酸残基是精氨酸残基或赖氨酸残基。在一个具体考虑的实施方案中，所述阳离子氨基酸残基是赖氨酸残基。在一个实施方案中，所述序列包含2个至20个、2个至15个、2个至10个、3个至7个、或3个至5个氨基酸。在一个实施方案中，所述增溶基团是三赖氨酸序列、四赖氨酸序列、五赖氨酸序列、六赖氨酸序列、或七赖氨酸序列。在一个具体考虑的实施方案中，所述增溶基团是四赖氨酸序列。
在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或包含氨基酸的缀合配偶体包含丝氨酸残基，所述丝氨酸残基与和所述含有脂质的缀合配偶体缀合的氨基酸残基相邻。在一个具体考虑的实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽包含丝氨酸残基，所述丝氨酸残基与和所述含有脂质的缀合配偶体缀合的氨基酸残基相邻。在一个示例性实施方案中，所述与所述含有脂质的缀合配偶体缀合的氨基酸残基是N末端。在一个具体考虑的实施方案中，所述肽还包含与所述丝氨酸残基相邻的两个或更多个亲水性氨基酸残基的连续序列。
在某些实施方案中，所述肽缀合物和/或包含氨基酸的缀合配偶体包含与所述丝氨酸残基相邻的两个或更多个亲水性氨基酸残基的连续序列。
在某些实施方案中，所述肽缀合物和/或包含氨基酸的缀合配偶体仅包含天然存在的氨基酸。在某些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体仅包含天然存在的氨基酸。在其它实施方案中，所述肽中氨基酸残基中的75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、或99％或更多是天然存在的氨基酸。
在其它实施方案中，所述肽缀合物和/或包含氨基酸的缀合配偶体中氨基酸残基中的75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、或99％或更多是天然存在的氨基酸。
在示例性实施方案中，所述肽缀合物和/或包含氨基酸的缀合配偶体包含含有EBVLMP2表位的肽。在示例性实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽包含一个或多个EBVLMP2表位。
在各种实施方案中，所述肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列、由所述氨基酸序列组成、或基本上由所述氨基酸序列组成：
(a)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:1]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(b)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:2]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(c)来自序列Xaa1Xaa2DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:3]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(d)来自序列SKKKKDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:4]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(e)来自序列DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:5]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(f)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ IDNO:6]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(g)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:7]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(h)来自序列Xaa1Xaa2SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:8]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(i)来自序列SKKKKSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:9]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(j)来自序列SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:10]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(k)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:11]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(l)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:12]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(m)来自序列Xaa1Xaa2SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:13]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(n)来自序列SKKKKSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:14]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(o)来自序列SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL[SEQ ID NO:15]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(p)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:16]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；(q)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:17]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(r)来自序列Xaa1Xaa2DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQID NO:18]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(s)来自序列SKKKKDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQID NO:19]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(t)来自序列DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA[SEQ ID NO:20]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(u)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[SEQ IDNO:21]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(v)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[SEQ ID NO:22]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(w)来自序列Xaa1Xaa2LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[SEQ ID NO:23]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(x)来自序列SKKKKLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[SEQ ID NO:24]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(y)来自序列LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL[SEQ ID NO:25]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(z)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:26]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(aa)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQID NO:27]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(bb)来自序列Xaa1Xaa2LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ IDNO:28]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(cc)来自序列SKKKKLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:29]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(dd)来自序列LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:30]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(ee)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[SEQ ID NO:31]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(ff)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[SEQ ID NO:32]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(gg)来自序列Xaa1Xaa2LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[SEQ ID NO:33]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(hh)来自序列SKKKKLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[SEQ ID NO:34]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(ii)来自序列LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL[SEQ ID NO:35]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(jj)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:36]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(kk)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:37]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(ll)来自序列Xaa1Xaa2LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:38]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(mm)来自序列SKKKKLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:39]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(nn)来自序列LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA[SEQ ID NO:40]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(oo)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI[SEQ ID NO:41]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(pp)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI[SEQ ID NO:42]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(qq)来自序列Xaa1Xaa2LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI[SEQ ID NO:43]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(rr)来自序列SKKKKLNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI[SEQ ID NO:44]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(ss)来自序列LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI[SEQ ID NO:45]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(tt)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[SEQ ID NO:46]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(uu)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[SEQ ID NO:47]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(vv)来自序列Xaa1Xaa2FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[SEQID NO:48]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(ww)来自序列SKKKKFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[SEQ IDNO:49]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(xx)来自序列FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA[SEQ ID NO:50]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(yy)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[SEQ ID NO:51]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(zz)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[SEQ ID NO:52]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(aaa)来自序列Xaa1Xaa2LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[SEQ ID NO:53]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(bbb)来自序列SKKKKLQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[SEQ ID NO:54]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(ccc)来自序列LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL[SEQID NO:55]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(ddd)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA[SEQ ID NO:56]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(eee)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA[SEQ ID NO:57]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(fff)来自序列Xaa1Xaa2SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA[SEQ ID NO:58]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(ggg)来自序列SKKKKSGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA[SEQ ID NO:59]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(hhh)来自序列SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA[SEQ ID NO:60]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(iii)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[SEQ ID NO:61]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(jjj)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[SEQ ID NO:62]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(kkk)来自序列Xaa1Xaa2SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[SEQ ID NO:63]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(lll)来自序列SKKKKSNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[SEQID NO:64]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(mmm)来自序列SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP[SEQ IDNO:65]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(nnn)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[SEQ ID NO:66]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(ooo)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[SEQ ID NO:67]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(ppp)来自序列Xaa1Xaa2GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[SEQ ID NO:68]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(qqq)来自序列SKKKKGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[SEQ ID NO:69]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(rrr)来自序列GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS[SEQID NO:70]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(sss)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[SEQ ID NO:71]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，Xaa3不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸；
(ttt)来自序列Xaa1Xaa2Xaa3AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[SEQ ID NO:72]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，Xaa2不存在或是亲水性氨基酸，并且Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸；
(uuu)来自序列Xaa1Xaa2AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[SEQ ID NO:73]的8个或更多个连续氨基酸残基，其中Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸，并且Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸；
(vvv)来自序列SKKKKAAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[SEQ ID NO:74]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(www)来自序列AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT[SEQID NO:75]的8个或更多个连续氨基酸残基；
(xxx)SEQ ID NO:1至75中任一个的序列；
(yyy)来自以下各项中任一个的序列的8个或更多个连续氨基酸残基：
ESNEEPPPPY[SEQ ID NO:76]，
SNEEPPPPY[SEQ ID NO:77]，
HSDYQPLGT[SEQ ID NO:78]，
PLGTQDQSL[SEQ ID NO:79]，
PLGTQDQSLY[SEQ ID NO:80]，
PLGTQDQSLY[SEQ ID NO:80]，
LGTQDQSLY[SEQ ID NO:81]，
GTQDQSLYL[SEQ ID NO:82]，
GTQDQSLYL[SEQ ID NO:83]，
GTQDQSLYLG[SEQ ID NO:84]，
QSLYLGLQH[SEQ ID NO:85]，
SLYLGLQHD[SEQ ID NO:86]，
SLYLGLQHD[SEQ ID NO:86]，
GLQHDGNDGL[SEQ ID NO:87]，
GNDGLPPPPY[SEQ ID NO:88]，
GLPPPPYSP[SEQ ID NO:89]，
GLPPPPYSPR[SEQ ID NO:90]，
GLPPPPYSPR[SEQ ID NO:90]，
PRDDSSQHIY[SEQ ID NO:91]，
RDDSSQHIY[SEQ ID NO:92]，
HIYEEAGRG[SEQ ID NO:93]，
ILLARLFLY[SEQ ID NO:94]，
SSCSSCPLSKI[SEQ ID NO:95]，
LLWTLVVLL[SEQ ID NO:96]，
FLYALALLL[SEQ ID NO:97]，
CLGGLLTMV[SEQ ID NO:98]，
LIVDAVLQL[SEQ ID NO:99]，
LTAGFLIFL[SEQ ID NO:100]，
TVCGGIMFL[SEQ ID NO:101]；
(zzz)SEQ ID NO:76-101中任一个的序列；
(aaaa)或上述(a)至(zzz)中两个或更多个的任何组合。
在一个示例性实施方案中，所述肽包含源自于潜伏膜蛋白2(LMP2)，例如源自于全长EBV LMP2(氨基酸1-497)的一个或多个表位。在一个具体考虑的实施方案中，所述肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成：来自SEQ ID NO:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74、或75中的任一个的8个或更多个连续氨基酸残基。
在另一个具体考虑的实施方案中，所述肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成：来自SEQ ID NO:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74、或75中的任一个的12个或更多个连续氨基酸残基。
在另一个具体考虑的实施方案中，所述肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成：来自SEQ ID NO:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74、或75中的任一个的15个或更多个、18个或更多个、20个或更多个、或25个或更多个连续氨基酸残基。
在一个实施方案中，所述肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成：SEQ ID NO:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74、或75中的任一个。
在另一个具体考虑的实施方案中，所述肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成：来自SEQ ID NO:1至75中的任一个的15个或更多个、18个或更多个、20个或更多个、或25个或更多个连续氨基酸残基。
在一个实施方案中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:1至75中的任一个组成的组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:76至101中的任一个组成的组的氨基酸序列。在一个实施例中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:76至93中的任一个组成的组的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:76至101中的任何两个或更多个组成的组的氨基酸序列。在一个实施例中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:76至93中的任何两个或更多个组成的组的氨基酸序列。
在一个具体考虑的实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的氨基酸的反应性官能团是未受保护的。
在某些实施方案中，所述肽缀合物的一个或多个氨基酸的一个或多个反应性官能团是未受保护的。
在某些实施方案中，所述氨基酸缀合物的氨基酸的一个或多个反应性官能团是未受保护的。
在某些实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体的一个或多个氨基酸的一个或多个反应性官能团是未受保护的。
在某些实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体包含肽，其中所述肽的氨基酸的侧链的反应性官能团是未受保护的，除了除待反应的硫醇以外的任何硫醇之外。
在一个具体考虑的实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽的氨基酸的反应性官能团是未受保护的。在一个具体考虑的实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽的氨基酸的反应性官能团是未受保护的，除了除待反应的硫醇以外的任何硫醇之外。
在一个方面，本发明涉及一种制备包含式(A)的结构的肽缀合物的方法：
其中
Z选自由以下各项组成的组：-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NR-、-NRC(O)-、-OC(O)O-、-NRC(O)O-、-OC(O)NR-、以及-NRC(O)NR-；
R是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基，其中所述烃基或环烃基任选被取代；
m是0至4的整数；
n是1或2；
R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R3、R4、R5、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R3是L2-C(O)-OC1-6烃基；
或R9是氨基保护基、L3-C(O)、或A2；
R6和R7在n的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是氨基酸或肽；或A1是OH或OP1，其中P1是羧基保护基，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ IDNO:1-101组成的组的一个或多个肽；
前提条件是：
当R3是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R1不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当m是2至4的整数时，不超过一个R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、L1、L2以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，所述方法包括制备包含式(A)的结构的肽缀合物：
其中
Z选自由以下各项组成的组：-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NR-、-NRC(O)-、-OC(O)O-、-NRC(O)O-、-OC(O)NR-、以及-NRC(O)NR-；
R是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基，其中所述烃基或环烃基任选被取代；
m是0至4的整数；
n是1或2；
R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R3、R4、R5、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R3是L2-C(O)-OC1-6烃基；
或R9是L3-C(O)或A2；
R6和R7在n的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是肽；或A1是OH，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ ID NO:1-101组成的组的一个或多个肽；
前提条件是：
当R9不是A2时，A1是肽；
当R3是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R1不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当m是2至4的整数时，不超过一个R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、L1、L2以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，所述方法包括制备包含式(B)的结构的氨基酸缀合物或肽缀合物：
其中
Z选自由以下各项组成的组：-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NR-、-NRC(O)-、-OC(O)O-、-NRC(O)O-、-OC(O)NR-、以及-NRC(O)NR-；
R是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基，其中所述烃基或环烃基任选被取代；
p是0至4的整数；
q是0至2的整数；
R11和R22在p的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R33、R44、R55、R66、R77、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R33是L2-C(O)-OC1-6烃基；
或R9是氨基保护基、L3-C(O)、或A2；
Ra和Rb在q的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是氨基酸或肽；或A1是OH或OP1，其中P1是羧基保护基，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ IDNO:1-101组成的组的一个或多个肽；
前提条件是：
当R33是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R11不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当p是2至4的整数时，不超过一个R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R11、R22、R33、R44、R55、R66、R77、R8、R9、Ra、Rb、L1、L2、以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，所述方法包括制备包含式(B)的结构的肽缀合物：
其中
Z选自由以下各项组成的组：-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NR-、-NRC(O)-、-OC(O)O-、-NRC(O)O-、-OC(O)NR-、以及-NRC(O)NR-；
R是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基，其中所述烃基或环烃基任选被取代；
p是0至4的整数；
q是0至2的整数；
R11和R22在p的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R33、R44、R55、R66、R77、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R33是L2-C(O)-OC1-6烃基；
或R9是L3-C(O)或A2；
Ra和Rb在q的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是肽；或A1是OH，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ ID NO:1-101组成的组的一个或多个肽；
前提条件是：
当R9不是A2时，A1是肽；
当R33是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R11不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当p是2至4的整数时，不超过一个R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R11、R22、R33、R44、R55、R66、R77、R8、R9、Ra、Rb、L1、L2、以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体是式(A1)的化合物：
其中
Z选自由以下各项组成的组：-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NR-、-NRC(O)-、-OC(O)O-、-NRC(O)O-、-OC(O)NR-、以及-NRC(O)NR-；
R是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基，其中所述烃基或环烃基任选被取代；
m是0至4的整数；
R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R3、R4、以及R5各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R3是L2-C(O)-OC1-6烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
前提条件是：
当R3是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R1不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当m是2至4的整数时，不超过一个R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R1、R2、R3、R4、R5、L1、以及L2中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代，
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在另一个实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体是式(B1)的化合物：
其中
Z选自由以下各项组成的组：-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NR-、-NRC(O)-、-OC(O)O-、-NRC(O)O-、-OC(O)NR-、以及-NRC(O)NR-；
R是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基，其中所述烃基或环烃基任选被取代；
p是0至4的整数；
R11和R22在p的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R33和R44各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R33是L2-C(O)-OC1-6烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
前提条件是：
当R33是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R11不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当p是2至4的整数时，不超过一个R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R11、R22、R33、R44、L1、以及L2中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体是如本文所描述的实施方案中的任一个中所限定的式(II)的化合物。
在一个实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体是如本文所描述的实施方案中的任一个中所限定的式(IIA)的化合物。
在一个实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体是如本文所描述的实施方案中的任一个中所限定的式(III)的化合物。
在一个实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体是如本文所描述的实施方案中的任一个中所限定的式(III)的化合物。
在一个实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体是如本文所描述的实施方案中的任一个中所限定的式(IIIA)的化合物。
在一个实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体是如本文所描述的实施方案中的任一个中所限定的式(IIIA)的化合物。
在一个实施方案中，所述方法包括制备包含式(I)的结构的氨基酸缀合物或肽缀合物：
其中
m是0至4的整数；
n是1或2；
R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R3、R4、R5、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R3是L2-C(O)-OC1-6烃基；
或R9是氨基保护基、L3-C(O)、或A2；
R6和R7在n的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是氨基酸或肽；或A1是OH或OP1，其中P1是羧基保护基，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ IDNO:1-101组成的组的一个或多个肽；
前提条件是：
当R3是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R1不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当m是2至4的整数时，不超过一个R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、L1、L2以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
所述方法包括使式(II)的含有脂质的缀合配偶体
其中m、R1、R2、R3、R4、R5、以及L1如式(I)的化合物中所定义；
与包含式(III)的结构的含有肽的缀合配偶体
其中n、R6、R7、R8、R9以及A1如式(I)的化合物中所定义；
在有效通过用式(III)的化合物中的硫醇将式(II)的化合物中的碳-碳双键进行氢硫醇化来使式(II)的化合物与式(III)的化合物缀合的条件下反应。
在一个实施方案中，所述方法包括制备包含式(I)的结构的肽缀合物：
其中
m是0至4的整数；
n是1或2；
R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R3、R4、R5、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R3是L2-C(O)-OC1-6烃基；
或R9是L3-C(O)或A2；
R6和R7在n的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是肽；或A1是OH，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ ID NO:1-101组成的组的一个或多个肽；
前提条件是：
当R9不是A2时，A1是肽；
当R3是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R1不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当m是2至4的整数时，不超过一个R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、L1、L2以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
所述方法包括使式(II)的含有脂质的缀合配偶体
其中m、R1、R2、R3、R4、R5、以及L1如式(I)的化合物中所定义；
与包含式(III)的结构的含有肽的缀合配偶体
其中n、R6、R7、R8、R9以及A1如式(I)的化合物中所定义；
在有效通过用式(III)的化合物中的硫醇将式(II)的化合物中的碳-碳双键进行氢硫醇化来使式(II)的化合物与式(III)的化合物缀合的条件下反应。
在一个实施方案中，所述方法包括制备包含式(IA)的结构的氨基酸缀合物或肽缀合物
其中
p是0至4的整数；
q是0至2的整数；
R11和R22在p的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R33、R44、R55、R66、R77、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R33是L2-C(O)-OC1-6烃基；
或R9是氨基保护基、L3-C(O)、或A2；
Ra和Rb在q的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是氨基酸或肽；或A1是OH或OP1，其中P1是羧基保护基，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ IDNO:1-101组成的组的一个或多个肽；
前提条件是：
当R33是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R11不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当p是2至4的整数时，不超过一个R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R11、R22、R33、R44、R55、R66、R77、R8、R9、Ra、Rb、L1、L2、以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
所述方法包括使式(IIA)的化合物
其中p、R11、R22、R33、R44、以及L1如式(IA)的化合物中所定义；
与式(IIIA)的化合物
其中q、R55、R66、R77、R8、R9、Ra、Rb、以及A1如式(IA)的化合物中所定义；
在有效通过用式(IIA)的化合物中的硫醇将式(IIIA)的化合物中的碳-碳双键进行氢硫醇化来使式(IIA)的化合物与式(IIIA)的化合物缀合的条件下反应。
在一个实施方案中，所述方法包括制备包含式(IA)的结构的肽缀合物
其中
p是0至4的整数；
q是0至2的整数；
R11和R22在p的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R33、R44、R55、R66、R77、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R33是L2-C(O)-OC1-6烃基；
或R9是L3-C(O)或A2；
Ra和Rb在q的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是肽；或A1是OH，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ ID NO:1-101组成的组的一个或多个肽；
前提条件是：
当R9不是A2时，A1是肽；
当R33是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R11不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当p是2至4的整数时，不超过一个R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R11、R22、R33、R44、R55、R66、R77、R8、R9、Ra、Rb、L1、L2、以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
所述方法包括使式(IIA)的化合物
其中p、R11、R22、R33、R44、以及L1如式(IA)的化合物中所定义；
与式(IIIA)的化合物
其中q、R55、R66、R77、R8、R9、Ra、Rb、以及A1如式(IA)的化合物中所定义；
在有效通过用式(IIA)的化合物中的硫醇将式(IIIA)的化合物中的碳-碳双键进行氢硫醇化来使式(IIA)的化合物与式(IIIA)的化合物缀合的条件下反应。
在一个实施方案中，L1和L2中的至少一个是C5-22烃基。
在一个实施方案中，p是0至2的整数。在另一个实施方案中，p是0或1。
在一些实施方案中，R11和R22在p的每一种情况下各自独立地是氢；或R11是L2-C(O)-OCH2。在一个实施方案中，与L1-C(O)-O相邻的碳上的R11是L2-C(O)-OCH2。
在一个具体考虑的实施方案中，R11和R22在p的每一种情况下各自独立地是氢。
在一个实施方案中，R33是氢或L2-C(O)-OCH2。
在一个实施方案中，R33和R44各自是氢。
在一个具体考虑的实施方案中，q是0或1。在一个具体考虑的实施方案中，q是0。
在一个具体考虑的实施方案中，R55、R66、以及R77各自是氢。
在一些实施方案中，Ra和Rb在q的每一种情况下各自是氢。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；p是1；R11是氢或L2-C(O)-OCH2；R22是氢；R33是氢或L2-C(O)-OCH2；R44是氢；并且L2是C11-21烃基。
在一个实施方案中，R55、R66、R77、Ra、Rb以及R8各自是氢；并且R9是氢、L3-C(O)、或A2。在一个实施方案中，R55、R66、R77、Ra、Rb以及R8各自是氢；并且R9是氢或L3-C(O)。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；p是1；R11是氢或L2-C(O)-OCH2；R22是氢；R33是氢或L2-C(O)-OCH2；R44是氢；L2是C11-21烃基；R55、R66、R77、Ra、Rb以及R8各自是氢；并且R9是氢、L3-C(O)、或A2。
在一个实施方案中，L1是C5-21烃基。在另一个实施方案中，L1是C9-21烃基。在又另一个实施方案中，L1是C11-21烃基。在一个示例性实施方案中，L1是C11、C13、C15、C17、或C19烃基。在一个具体考虑的实施方案中，L1是C15烃基。
在一个实施方案中，L1包含9个-21个碳原子的直链。在一个具体考虑的实施方案中，L1是直链C15烃基。
在一个实施方案中，m是0至2的整数。在另一个实施方案中，m是0或1。在一个具体考虑的实施方案中，m是0。
在一些实施方案中，R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢；或R1是L2-C(O)-OCH2。在一个实施方案中，与L1-C(O)-O相邻的碳原子上的R1是L2-C(O)-OCH2。
在一个具体考虑的实施方案中，R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢。
在一个实施方案中，R3是氢或L2-C(O)-OCH2。在一个具体考虑的实施方案中，R3是氢。
在一个实施方案中，L2是C5-21烃基。在另一个实施方案中，L2是C9-21烃基。在又另一个实施方案中，L2是C11-21烃基。在一个示例性实施方案中，L2是C11、C13、C15、C17、或C19烃基。在另一个示例性实施方案中，L2是C15烃基。
在一个具体考虑的实施方案中，R4和R5各自是氢。
在一个具体考虑的实施方案中，n是1。
在一个具体考虑的实施方案中，R6和R7各自是氢。
在示例性实施方案中，R8是氢。
在一个实施方案中，R8和R9各自是氢；或R9是L3-C(O)或A2。在一个示例性实施方案中，R8是氢并且R9是L3-C(O)。
在一些实施方案中，L3是C1-21烃基。在一个具体考虑的实施方案中，L3是甲基或直链C15烃基。在示例性实施方案中，L3是甲基。
本领域技术人员将了解的是，式(III)和式(IIIA)的结构可以包含所述含有肽的缀合配偶体的肽。如本文所述，所述肽可以任选被取代、修饰、或与如本文所述的各种其它部分结合以提供所述含有肽的缀合配偶体。
在一个实施方案中，A1是包含EBV LMP2表位的肽。在一个实施方案中，A2是包含EBV LMP2表位的肽。
在一个实施方案中，A1是被表位取代的肽。在一个实施方案中，A2是被表位取代的肽。
在一个实施方案中，所述表位是经由连接基团与所述肽结合的。
在一个实施方案中，所述表位是肽表位。
在一些实施方案中，A1和/或A2各自独立地是包含约8个至220个、8个至200个、8个至175个、8个至150个、8个至125个、8个至100个、8个至90个、8个至80个、8个至70个、8个至60个、8个至50个、8个至40个、8个至30个、8个至25个、8个至20个、或8个至15个氨基酸的肽。在一个示例性实施方案中，A1和A2各自独立地是包含约8个至60个氨基酸的肽。
在其它实施方案中，A1和/或A2各自独立地是包含约5个至150个、5个至125个、5个至100个、5个至75个、5个至60个、5个至50个、5个至40个、5个至30个、5个至25个、5个至20个、8个至150个、8个至125个、8个至100个、8个至75个、8个至60个、8个至50个、8个至40个、8个至30个、8个至25个、或8个至20个氨基酸的肽。
在一些实施方案中，A1和/或A2各自独立地是肽，其中所述肽包含8个至60个氨基酸。
在一些实施方案中，A1和/或A2各自独立地是包含肽表位或被肽表位取代的肽，其中所述肽表位包含8个至60个氨基酸。
在一些实施方案中，A1和/或A2各自独立地是包含肽表位或被肽表位取代的肽，其中所述肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列、由所述氨基酸序列组成、或基本上由所述氨基酸序列组成：来自SEQ ID NO:1-101中的任一个的序列，例如来自SEQ ID NO:1-75中的任一个的序列的8个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、或25个或更多个连续氨基酸。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢或L2-C(O)-OCH2；L2是C11-21烃基；并且R4和R5各自是氢。
在一个实施方案中，n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；并且R9是氢、L3-C(O)、或A2。在一个实施方案中，n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；并且R9是氢或L3-C(O)。在一个实施方案中，L3是甲基或直链C15烃基。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢或L2-C(O)-OCH2；L2是C11-21烃基；R4和R5各自是氢；n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；R9是氢、L3-C(O)、或A2。在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢或L2-C(O)-OCH2；L2是C11-21烃基；R4和R5各自是氢；n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；R9是氢或L3-C(O)。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；并且R4和R5各自是氢。
在一个实施方案中，n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；并且R9是氢、L3-C(O)、或A2。在一个实施方案中，n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；并且R9是氢或L3-C(O)。在一个实施方案中，n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；并且R9是氢或L3-C(O)，其中L3是甲基。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；R4和R5各自是氢；n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；R9是氢、L3-C(O)、或A2。在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；R4和R5各自是氢；n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；R9是氢或L3-C(O)。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；R4和R5各自是氢；n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；R9是氢或L3-C(O)，其中L3是甲基。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；并且R4和R5各自是氢。
在一个实施方案中，n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；并且R9是氢、L3-C(O)、或A2。在一个实施方案中，n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；并且R9是氢或L3-C(O)。在一个实施方案中，n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；并且R9是氢或L3-C(O)，其中L3是甲基。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；R4和R5各自是氢；n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；R9是氢、L3-C(O)、或A2。在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；R4和R5各自是氢；n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；R9是氢或L3-C(O)。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；R4和R5各自是氢；n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；R9是氢或L3-C(O)，其中L3是甲基。
在一些实施方案中，A1是包含丝氨酸作为第一个N末端氨基酸残基的肽。在一些实施方案中，A1和/或A2是包含增溶基团的肽。在一些实施方案中，所述增溶基团包含在肽链中包含两个或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。在某些实施方案中，A1是包含增溶基团的肽，所述增溶基团包含在肽链中包含两个或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，A1是包含作为第一个N末端氨基酸残基的丝氨酸和与所述丝氨酸相邻的增溶基团的肽，所述增溶基团包含在肽链中包含两个或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述增溶基团包含在肽链中包含两个或更多个连续亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述亲水性氨基酸残基是阳离子氨基酸残基。在一个实施方案中，所述阳离子氨基酸残基是精氨酸残基或赖氨酸残基。在一个具体考虑的实施方案中，所述阳离子氨基酸残基是赖氨酸残基。在一个实施方案中，所述序列包含2个至20个、2个至15个、2个至10个、3个至7个、或3个至5个氨基酸。在一个实施方案中，所述增溶基团是三赖氨酸序列、四赖氨酸序列、五赖氨酸序列、六赖氨酸序列、或七赖氨酸序列。在一个具体考虑的实施方案中，所述增溶基团是四赖氨酸序列。
在一些实施方案中，R9是氢、氨基保护基或L3-C(O)。在一些实施方案中，R9是氢或L3-C(O)。
在一些实施方案中，R9是氢或氨基保护基，并且所述方法还包括将所述氨基酸缀合物或肽缀合物酰化以用L3-C(O)置换R9处的氢或氨基保护基。在一些实施方案中，将所述氨基酸缀合物或肽缀合物酰化以用L3-C(O)置换R9处的氨基保护基包括去除R9处的氨基保护基以在R9处提供氢。
在一些实施方案中，A1和/或A2是氨基酸或肽。在一些实施方案中，A1和/或A2是肽。
在一些实施方案中，A1是OH或OP1和/或R9是氢、氨基保护基或L3-C(O)。在一些实施方案中，A1是OP1或OH和/或R9是氢、氨基保护基或L3-C(O)。在一些实施方案中，A1是OP1或OH并且R9是氢、氨基保护基或L3-C(O)。
在一些实施方案中，A1是OP1或OH和/或R9是氢、氨基保护基或L3-C(O)，并且所述方法包括使氨基酸或肽偶联以用所述氨基酸或肽置换A1和/或R9。
在一些实施方案中，A1是OP1或OH并且R9是氢、氨基保护基或L3-C(O)，并且所述方法还包括使氨基酸或肽偶联以用所述氨基酸或肽置换A1和/或R9。
在一些实施方案中，使肽偶联包括单独地使一个或多个氨基酸和/或一个或多个肽偶联。
在一些实施方案中，使氨基酸或肽偶联提供了包含肽表位的肽缀合物。在一些实施方案中，使氨基酸或肽偶联提供了包含连接基团或其一个或多个氨基酸的肽缀合物。在一些实施方案中，使氨基酸或肽偶联提供了包含肽表位的肽缀合物，所述肽表位经由连接基团与和含有脂质的缀合配偶体缀合的氨基酸结合。
在一些实施方案中，所述氨基保护基是Boc、Fmoc、Cbz(羧基苯甲基)、Nosyl(邻硝基苯磺酰基或对硝基苯磺酰基)、Bpoc(2-(4-联苯)异丙氧基羰基)以及Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚己基)乙基)。在一些实施方案中，所述氨基保护基是Boc或Fmoc。
在一些实施方案中，所述羧基保护基是叔丁基或苯甲基。在一个实施方案中，式(I)的化合物是式(IV)的化合物：
其中
R3是氢或L2-C(O)-OCH2；
R9是氢、氨基保护基、L3-C(O)、或A2；并且
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是氨基酸或肽；或A1是OH或OP1，其中P1是羧基保护基，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ IDNO:1-101组成的组的一个或多个肽；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，式(I)的化合物是式(IV)的化合物：
其中
R3是氢或L2-C(O)-OCH2；
R9是氢、L3-C(O)、或A2；并且
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是肽；或A1是OH，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ ID NO:1-101组成的组的一个或多个肽；
前提条件是：
当R9不是A2时，A1是肽；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，式(IV)的化合物中的L1、A1、A2、L2、以及L3各自独立地如关于式(I)的化合物的实施方案中的任一个中所定义。
在一个具体考虑的实施方案中，R3是氢。
在另一个具体考虑的实施方案中，R9是乙酰基。
在另一个具体考虑的实施方案中，R3是氢并且R9是乙酰基。
在一些实施方案中，所述方法用于制备式(IV)的化合物，其中L1是C15直链烃基，R3是氢，R9是Fmoc，并且A1是OH，并且所述方法包括使棕榈酸乙烯酯与Fmoc-Cys-OH反应。
在一些实施方案中，所述氨基保护基不是Fmoc。在一些实施方案中，所述氨基保护基是Boc。
在一些实施方案中，所述包含氨基酸的缀合配偶体不是Fmoc-Cys-OH。
在一些实施方案中，所述肽缀合物包含3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述式(I)的化合物包含3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个连续氨基酸。
在一个实施方案中，有效使所述含有脂质的缀合配偶体与所述包含氨基酸的缀合配偶体缀合的条件包括一个或多个自由基的产生。在一个实施方案中，有效使所述含有脂质的缀合配偶体与所述含有肽的缀合配偶体缀合的条件包括一个或多个自由基的产生。
在一些实施方案中，一个或多个自由基的产生是热和/或光化学引发的。在某些实施方案中，一个或多个自由基的产生是由自由基引发剂的热降解和/或光化学降解引发的。在示例性实施方案中，一个或多个自由基的产生是由热引发剂的热降解或光化学引发剂的光化学降解引发的。
在一些实施方案中，自由基引发剂的热降解包括在合适的温度加热反应混合物。在一些实施方案中，在以下温度加热反应混合物：约40℃至约200℃、约50℃至约180℃、约60℃至约150℃、约65℃至约120℃、约70℃至约115℃、约75℃至约110℃、或约80℃至约100℃。在其它实施方案中，在至少约40℃、至少约50℃、至少约60℃、或至少约65℃的温度加热反应混合物。在一个具体考虑的实施方案中，在约90℃的温度加热反应混合物。
在一些实施方案中，自由基引发剂的光化学降解包括用紫外光照射。在一个具体考虑的实施方案中，所述紫外光具有约365nm的波长。在示例性实施方案中，在约环境温度进行自由基引发剂的光化学降解。
在一个具体考虑的实施方案中，所述热引发剂是2,2'-偶氮双异丁腈(AIBN)。在一个具体考虑的实施方案中，所述光引发剂是2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)。
在某些实施方案中，在液体介质中进行所述反应。在一个实施方案中，所述液体介质包括溶剂。在一个实施方案中，所述溶剂选自由以下各项组成的组：N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、1,2-二氯乙烷、以及其混合物。在一个具体考虑的实施方案中，所述溶剂包括NMP、DMSO、或其混合物。
在一个具体考虑的实施方案中，所述溶剂包括DMSO。
在一些实施方案中，在抑制二聚化、调聚、或聚合的一种或多种添加剂存在下进行所述反应。在一些示例性实施方案中，所述添加剂选自由以下各项组成的组：还原型谷胱甘肽(GSH)、2,2'-(亚乙二氧基)二乙烷硫醇(DODT)、1,4-二硫苏糖醇(DTT)、以及蛋白质。在一个具体考虑的实施方案中，所述添加剂是DTT。在一些实施方案中，所述添加剂是DTT或叔丁基硫醇。
在一些实施方案中，所述一种或多种添加剂选自由以下各项组成的组：TFA、叔丁基硫醇、以及其组合。在某些实施方案中，所述一种或多种添加剂是TFA和叔丁基硫醇的组合。在一些实施方案中，将所述反应进行以下的时间段：约5分钟至约48小时、5分钟至约24小时、约5分钟至约12小时、约5分钟至约6小时、约5分钟至约3小时、5分钟至2小时、或约5分钟至约1小时。在示例性实施方案中，将所述反应进行约5分钟至约1小时的时间段。在一些实施方案中，进行所述反应直到所述缀合配偶体中的一种被消耗至少约70％、80％、90％、95％、97％、99％、或100％为止。
在某些实施方案中，在基本上无氧条件下进行所述反应。
在一些实施方案中，所述方法包括
使所述含有脂质的缀合配偶体与包含氨基酸的缀合配偶体反应以提供氨基酸缀合物或肽缀合物；
通过固相肽合成(SPPS)合成肽的氨基酸序列；
通过SPPS使所述氨基酸缀合物的氨基酸或所述肽缀合物的氨基酸与固相结合的肽偶联以提供包含肽表位的肽缀合物、包含连接基团或其一个或多个氨基酸的肽缀合物、或包含经由连接基团与和含有脂质的缀合配偶体缀合的氨基酸结合的肽表位的肽缀合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括将所述氨基酸缀合物的氨基酸或所述肽缀合物中的任一种的与所述含有脂质的缀合配偶体缀合的氨基酸的Nα-氨基酰化。
在一些实施方案中，所述方法包括从固相载体切割所述肽缀合物。
在一些实施方案中，所述方法包括
通过固相肽合成(SPPS)合成所述含有肽的缀合配偶体的肽的氨基酸序列；以及
根据本文所述的实施方案中的任一个使所述含有脂质的缀合配偶体与含有肽的缀合配偶体反应。
在示例性实施方案中，所述方法包括
通过SPPS合成所述含有肽的缀合配偶体的肽的氨基酸序列；
从固相载体切割所述肽；以及
根据本文所述的实施方案中的任一个使所述含有脂质的缀合配偶体与含有肽的缀合配偶体反应。
在一个实施方案中，在与所述含有脂质的缀合配偶体反应之前，所述含有肽的缀合配偶体没有被纯化。
在一些实施方案中，在从固相载体切割肽时去除一个或多个保护基。在某些实施方案中，去除所述肽中存在的所有保护基。
在一个实施方案中，所述SPPS是Fmoc-SPPS。
在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽中带有待反应的碳-碳双键或硫醇的氨基酸残基是N末端氨基酸残基并且所述方法包括在从固相切割所述肽之前将N末端氨基酰化。在示例性实施方案中，所述氨基酸残基是N末端残基。在具体考虑的实施方案中，所述N末端残基是半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，所述方法还包括从反应介质中分离所述肽缀合物以及任选地将所述肽缀合物纯化。
在另一个方面，本发明提供了一种式(V)的化合物：
其中
m是0至4的整数；
n是1或2；
R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
R3、R4、R5、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R9是氨基保护基、L3-C(O)、或A2；
R6和R7在n的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-6烃基或C3-6环烃基；
A1和A2各自独立地是氨基酸或肽；或A1是OH或OP1，其中P1是羧基保护基，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ IDNO:1-101组成的组的一个或多个肽；并且
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、L1、以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代，以及
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在另一个方面，本发明提供了一种式(V)的化合物：
其中
m是0至4的整数；
n是1或2；
R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
R3、R4、R5、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R9是L3-C(O)或A2；
R6和R7在n的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-6烃基或C3-6环烃基；
A1和A2各自独立地是肽；或A1是OH，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ ID NO:1-101组成的组的一个或多个肽；
前提条件是：
当R9不是A2时，A1是肽；并且
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、L1、以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代，以及
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，m、n、R6、R7、A1以及A2各自独立地如关于式(I)的化合物的实施方案中的任一个中所定义。
在一个实施方案中，L1是C5-21烃基。在一个实施方案中，L1是C5-21烃基。在另一个实施方案中，L1是C9-21烃基。在又另一个实施方案中，L1是C11-21烃基。在一个示例性实施方案中，L1是C11、C13、C15、C17、或C19烃基。在一个具体考虑的实施方案中，L1是C15烃基。
在一个实施方案中，L1包含9个-21个碳原子的直链。在一个具体考虑的实施方案中，L1是直链C15烃基。
在一个实施方案中，m是0至2的整数。在另一个实施方案中，m是0或1。在一个具体考虑的实施方案中，m是0。
在一个具体考虑的实施方案中，R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢。
在一个具体考虑的实施方案中，R3是氢。
在一个具体考虑的实施方案中，R4和R5各自是氢。
在一个具体考虑的实施方案中，n是1。
在一个具体考虑的实施方案中，R6和R7各自是氢。
在示例性实施方案中，R8是氢。
在一些实施方案中，R8是氢并且R9是氢、氨基保护基、L3-C(O)、或A2。在一个实施方案中，R8和R9各自是氢；或R9是L3-C(O)或A2。在一个示例性实施方案中，R8是氢并且R9是L3-C(O)。在一个具体考虑的实施方案中，L3是甲基。
在一些实施方案中，A1是OP1或OH并且R9是氢、氨基保护基或L3-C(O)。
在一些实施方案中，A1和/或A2是氨基酸或肽。在一些实施方案中，所述肽包含表位。
在一些实施方案中，A1是丝氨酸或包含丝氨酸作为第一个N末端氨基酸残基的肽。
在一些实施方案中，A1和/或A2是包含增溶基团的肽，所述增溶基团包含在肽链中包含两个或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，A1是包含作为第一个N末端氨基酸残基的丝氨酸和与所述丝氨酸相邻的增溶基团的肽，所述增溶基团包含在肽链中包含两个或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；并且R4和R5各自是氢。
在一个实施方案中，n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；并且R9是氢、L3-C(O)、或A2。在一个实施方案中，n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；并且R9是氢或L3-C(O)。在一个实施方案中，n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；并且R9是氢或L3-C(O)，其中L3是甲基。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；R4和R5各自是氢；n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；R9是氢、L3-C(O)、或A2。在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；R4和R5各自是氢；n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；R9是氢或L3-C(O)。
在一个实施方案中，L1是C11-21烃基；m是0；R3是氢；R4和R5各自是氢；n是1；R6、R7、以及R8各自是氢；R9是氢或L3-C(O)，其中L3是甲基。
在一些实施方案中，在式(V)的化合物中，L1是C15直链烃基；m是0；n是1；R3、R4、R5、R6、R7、以及R8各自是氢；R9是Fmoc，并且A1是OH。
在一些实施方案中，R9的氨基保护基不是Fmoc。在一些实施方案中，R9的氨基保护基是Boc。
在一些实施方案中，式(V)的化合物包含3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个连续氨基酸。
在一些实施方案中，氨基保护基和/或羧基保护基如关于式(I)的化合物的实施方案中的任一个中所定义。
本领域技术人员将了解的是，式(V)的化合物是肽缀合物并且关于本文所述的缀合方法的肽缀合物的某些实施方案也适用于式(V)的化合物。
在一些实施方案中，所述式(V)的化合物是自佐剂化肽。
在一些实施方案中，所述化合物包含连接基团或其一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含连接基团或其一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含经由连接基团与和L1结合的氨基酸结合的肽表位。在一些实施方案中，所述肽包含两个或更多个表位。在一些实施方案中，所述连接基团是具有约2个至20个、2个至18个、2个至16个、2个至14个、2个至12个、2个至10个、或2个至8个氨基酸的长度的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本发明的肽缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、以及药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，所述药物组合物是免疫原性组合物。
在一个实施方案中，所述组合物不包括外在佐剂。
在一些实施方案中，所述组合物是疫苗。
在一个实施方案中，所述药物组合物包含有效量的本发明的两种或更多种肽缀合物，例如，所述药物组合物包含有效量的本发明的三种或更多种肽缀合物。在一个实施例中，所述药物组合物包含有效量的本发明的两种或更多种肽缀合物，其中所述两种或更多种肽缀合物包含LMP2的基本上所有的免疫原性区域。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本发明的肽或其药学上可接受的盐或溶剂化物、以及药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，所述药物组合物包含有效量的本发明的两种或更多种肽，例如，所述药物组合物包含有效量的本发明的三种或更多种肽。
在一个实施方案中，所述药物组合物包含有效量的本发明的一种或多种肽缀合物以及本发明的一种或多种肽、或其任何组合。举例来说，所述药物组合物包含有效量的本发明的两种或更多种肽缀合物和本发明的一种或多种肽、或有效量的本发明的一种或多种肽缀合物和本发明的两种或更多种肽。
在另一个方面，本发明提供了一种在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的肽缀合物或肽。
在另一个方面，本发明提供了本发明的肽缀合物或肽用于在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的用途。
在另一个方面，本发明提供了本发明的肽缀合物或肽用于制造用于在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的药物的用途。
在另一个方面，本发明提供了一种在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了本发明的药物组合物用于在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的用途。
在另一个方面，本发明提供了本发明的一种或多种肽或本发明的一种或多种肽缀合物用于制造用于在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的药物的用途。
在另一个方面，本发明提供了一种引出受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的肽缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在另一个方面，本发明提供了本发明的肽缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物用于引出受试者的免疫应答的用途。
在另一个方面，本发明提供了本发明的肽缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物用于制造用于引出受试者的免疫应答的药物的用途。
在另一个方面，本发明提供了一种对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的肽缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在另一个方面，本发明提供了本发明的肽缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物用于对受试者进行疫苗接种的用途。
在另一个方面，本发明提供了本发明的肽缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物用于制造用于对受试者进行疫苗接种的药物的用途。
在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用本发明的一种或多种肽和/或本发明的一种或多种肽缀合物，例如一种或多种肽与一种或多种肽缀合物的组合。
在一些实施方案中，本发明的一种或多种肽和/或本发明的一种或多种肽缀合物，例如一种或多种肽与一种或多种肽缀合物的组合用于在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答或用于制造用于在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的药物。
在一些实施方案中，使用或施用两种或更多种肽、两种或更多种肽缀合物、或一种或多种肽和一种或多种肽缀合物。在一些实施方案中，同时、依次、或分开使用或施用两种或更多种肽、两种或更多种肽缀合物、或一种或多种肽和一种或多种肽缀合物。
在本文所述的化合物中可以存在不对称中心。所述不对称中心可以被指定为(R)或(S)，这取决于手性碳原子处三维空间中取代基的构型。所述化合物的所有立体化学异构体形式，包括非对映体、对映体、和差向异构体形式、以及d-异构体和l-异构体、以及其混合物，包括立体化学异构体的对映体富集和非对映体富集混合物落入本发明的范围内。
单个对映体可以由可商购获得的对映体纯起始材料或通过制备对映体混合物并且将所述混合物拆分成单个对映体来合成制备。拆分方法包括将对映体混合物转化成非对映体的混合物和通过例如重结晶或色谱分离非对映体、以及本领域已知的任何其它适当的方法。具有限定的立体化学的起始材料可以是可商购获得的或被制备，并且如果需要的话，通过本领域公知的技术来拆分。
本文所述的化合物还可以作为构象异构体或几何异构体存在，包括顺式(cis)、反式(trans)、顺式(syn)、反式(anti)、异侧(E)、以及同侧(Z)异构体。所有这样的异构体和其任何混合物落入本发明的范围内。
所描述的化合物的任何互变异构体或其混合物也落入本发明的范围内。如将由本领域技术人员所了解的那样，多种官能团和其它结构可以表现出互变异构现象。实例包括但不限于酮/烯醇、亚胺/烯胺、以及硫酮/烯硫醇互变异构现象。
本文所述的化合物还可以作为同位素异数体和同位素异构体存在，其中所述化合物中的一个或多个原子被不同的同位素置换。合适的同位素包括例如1H、2H(D)、3H(T)、12C、13C、14C、16O、以及18O。用于将这样的同位素并入到本文所述的化合物中的程序对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本文所述的化合物的同位素异数体和同位素异构体也落入本发明的范围内。
本文所述的化合物的药学上可接受的盐和溶剂化物(包括水合物)也落入本发明的范围内。这样的盐包括酸加成盐、碱加成盐、以及含有碱性氮的基团的季盐。
酸加成盐可以通过使呈游离碱形式的化合物与无机酸或有机酸反应来制备。无机酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、以及磷酸。有机酸的实例包括但不限于乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、硬脂酸、水杨酸、甲烷磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸、对氨基苯磺酸、己二酸、丁酸、以及新戊酸。
碱加成盐可以通过使呈游离酸形式的化合物与无机碱或有机碱反应来制备。无机碱加成盐的实例包括碱金属盐、碱土金属盐、以及其它生理学上可接受的金属盐，例如铝盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐、或锌盐。有机碱加成盐的实例包括胺盐，例如三甲胺盐、二乙胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、以及乙二胺盐。
所述化合物中含有碱性氮的基团的季盐可以通过例如使所述化合物与以下各项反应来制备：烃基卤化物，如甲基、乙基、丙基、以及丁基氯化物、溴化物、以及碘化物；硫酸二烃基酯，如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯、以及硫酸二戊酯等。
本文的化学式中所用的一般化学术语具有它们通常的含义。
术语“脂族”意图包括饱和的和不饱和的、非芳族、直链、支链、无环、以及环状烃。本领域技术人员将了解的是，脂族基团包括例如烷基、烯基、炔基、环烷基以及环烯基。在一些实施方案中，脂族基团是饱和的。
术语“杂脂族”意图包括脂族基团，其中一个或多个链碳原子被杂原子置换。在一些实施方案中，杂脂族基团是饱和的。
术语“烃基”意图包括饱和的或不饱和的直链和支链烃基。饱和烃基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基等。不饱和烃基具有一个或多个碳-碳双键或三键。不饱和烃基的实例包括乙烯基、丙-2-烯基、巴豆基、异戊-2-烯基、2-丁二烯基、戊-2,4-二烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙-3-炔基、丁-3-炔基等。在一些实施方案中，所述烃基是饱和的。
术语“杂烃基”意图包括烃基，其中一个或多个链碳原子被杂原子置换。在一些实施方案中，所述杂烃基是饱和的。
术语“环烃基”意图包括非芳族环状烃基。环烃基的实例包括但不限于环戊基、环己基、环己-1-烯基、环己-3-烯基、环庚基。在一些实施方案中，所述环烃基是饱和的。
术语“杂原子”意图包括氧、氮、硫、或磷。在一些实施方案中，所述杂原子选自由氧、氮、以及硫组成的组。
术语“芳基”意图包括芳族基。实例包括但不限于苯基、甲苯基、萘基、茚满基等。在一些实施方案中，芳基在芳环系中包含4个至8个或6个至8个碳原子。
如本文所用的术语“取代”意图意指所示基团中的一个或多个氢原子被一个或多个独立选择的合适的取代基置换，前提条件是不超过与所述一个或多个取代基连接的每一个原子的正常价，并且所述取代产生稳定化合物。
本文所述的化合物中脂族基团、杂脂族基团、烃基、杂烃基以及环烃基的任选取代基的实例包括但不限于卤代、CN、NO2、OH、NH2、NHR1、NR1R2、C1-6卤代烃基、C1-6卤代烃氧基、C(O)NH2、C(O)NHR1、C(O)NR1R1、SO2R1、OR1、SR1、S(O)R1、C(O)R1、以及C1-6脂族基团；其中R1和R2各自独立地是C1-6烃基。
如本文所用的术语“羧基保护基”意指能够容易地被去除以提供羧基的OH基团并且在合成程序期间保护羧基防止发生不期望的反应的基团。这样的保护基描述于T.W.Greene等编著的《有机合成中的保护基(Protective Groups in OrganicSynthesis)》(约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons),1999)和‘氨基酸保护基(Amino Acid-Protecting Groups)’,Fernando Albericio(以及Albert Isidro-Llobet和Mercedes Alvarez),Chemical Reviews 2009(109)2455-2504中。实例包括但不限于烃基和甲硅烷基，例如甲基、乙基、叔丁基、甲氧基甲基、2,2,2-三氯乙基、苯甲基、二苯甲基、三甲基甲硅烷基、以及叔丁基二甲基甲硅烷基等。
如本文所用的术语“胺保护基”意指能够容易地被去除以提供胺基的NH2基团并且在合成程序期间保护胺基防止发生不期望的反应的基团。这样的保护基描述于T.W.Greene等编著的《有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)》(约翰·威利父子出版公司,1999)和‘氨基酸保护基(Amino Acid-Protecting Groups)’,FernandoAlbericio(以及Albert Isidro-Llobet和Mercedes Alvarez),Chemical Reviews 2009(109)2455-2504中。实例包括但不限于酰基和酰氧基，例如乙酰基、氯乙酰基、三氯乙酰基、邻硝基苯基乙酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、三氟乙酰基、乙酰乙酰基、4-氯丁酰基、异丁酰基、吡啶甲酰基、氨基己酰基、苯甲酰基、甲氧羰基、9-芴基甲氧基羰基、2,2,2-三氟乙氧基羰基、2-三甲基甲硅烷基乙氧羰基、叔丁氧羰基、苯甲氧羰基、对硝基苯甲氧羰基、2,4-二氯-苯甲氧羰基等。另外的实例包括Cbz(羧基苯甲基)、Nosyl(邻硝基苯磺酰基或对硝基苯磺酰基)、Bpoc(2-(4-联苯)异丙氧基羰基)以及Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚己基)乙基)。
如本文所用的术语“和/或”意指“和”、或“或”、或这两者。
名词之后的术语“(s)”考虑了单数形式和复数形式、或这两者。
如本说明书中所用的术语“包含”意指“至少部分由……组成”。当解释本说明书中包括术语“包含(comprising)”的每一个语句时，除该术语之后的那个或那些特征以外的特征也可能存在。相关术语，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”将以相同方式解释。“含有”也以相同方式解释。
本发明还可以被宽泛地认为在于在本申请的说明书中单独或共同提到或指示的部分、要素以及特征、所述部分、要素或特征中两种或更多种的任何或所有组合，并且在本文提到具体的整体方案并且所述整体方案在与本发明相关的领域中具有已知的等同方案的情况下，这些已知的等同方案被认为并入到本文中，如同单独地阐述这些已知的等同方案一般。
意图在提到本文所公开的数值范围(例如1至10)时，也包括了提到该范围内的所有有理数(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9、以及10)以及该范围内有理数的任何范围(例如2至8、1.5至5.5、以及3.1至4.7)，并且因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围在此被明确公开。这些只是具体意图的实例，并且所列举的最低值与最高值之间数值的所有可能的组合均被认为在本申请中以类似方式被明确地陈述。
尽管本发明在广义上如上文所限定，但是本领域技术人员将了解的是，本发明不限于此并且本发明还包括以下说明给出实例的实施方案。
附图说明
将参考附图描述本发明，其中：
图1示出了如本文在实施例4中所述的LMP2S1的RP-HPLC迹线。
图2示出了如本文在实施例4中所述的LMP2S2的RP-HPLC迹线。
图3示出了如本文在实施例5中所述的Pam1-C(Ac)SK4-LMP2 S4的RP-HPLC迹线。
具体实施方式
本发明涉及氨基酸缀合物和肽缀合物、以及制备肽缀合物和使用所述肽和肽缀合物进行免疫治疗性治疗，特别是免疫治疗性治疗与EBV相关的病况的方法。制备所述缀合物的具体方法包括使含有脂质的缀合配偶体与包含氨基酸的缀合配偶体在有效在硫醇-烯反应中使所述含有脂质的缀合配偶体与所述包含氨基酸的缀合配偶体缀合的条件下反应。在一些实施方案中，所述方法包括使含有脂质的缀合配偶体与含有肽的缀合配偶体在有效在硫醇-烯反应中使所述含有脂质的缀合配偶体与所述含有肽的缀合配偶体的肽缀合的条件下反应。
所述硫醇-烯反应涉及将硫醇加成到非芳族碳-碳双键上(即将碳-碳双键进行氢硫醇化)。所述反应经由自由基机制进行。在所述反应中存在三个不同的阶段：引发、聚合或偶联、以及终止。自由基的产生会产生亲电子硫自由基，它传播到烯基上，从而形成以碳为中心的自由基。来自另外的硫醇分子的链转移然后淬灭碳上的自由基以得到最终产物。
在本发明的方法中，一种缀合配偶体包含硫醇并且另一种缀合配偶体包含碳碳双键。
可以在本发明的方法中通过本领域已知的任何方法来产生一种或多种自由基。所述自由基可以热和/或光化学产生。可以使用一种或多种自由基引发剂来引发自由基的产生。合适的自由基引发剂包括热引发剂和光引发剂。
通过加热由热引发剂产生自由基。热引发剂降解和所引起的自由基形成的速率取决于引发剂和加热引发剂的温度。更高的温度一般引起更快的分解。本领域技术人员将能够选择适当的温度来加热引发剂而无需过多的实验。
许多热引发剂是可商购获得的。热引发剂的实例包括但不限于过氧化苯甲酸叔戊酯、1,1'-偶氮双(环己烷甲腈)、2,2'-偶氮双异丁腈(AIBN)、过氧化苯甲酰、叔丁基氢过氧化物、过乙酸叔丁酯、叔丁基过氧化物、过氧化苯甲酸叔丁酯、过氧化异丙基碳酸叔丁酯、过氧化月桂酰、过乙酸、以及过硫酸钾。
可以通过用光照射由光引发剂产生自由基。诱导光引发剂降解和自由基形成所需的光的频率取决于引发剂。许多光引发剂可以用紫外光来引发。
可以使用具有特定波长或波长范围的光来选择性照射引发剂，其中所述含有脂质的缀合配偶体或包含氨基酸的缀合配偶体，例如含有肽的缀合配偶体包含光敏基团。在本发明的方法的某些实施方案中，使用约365nm的频率。该频率的光一般与天然存在的氨基酸的侧链是相容的。
广泛的光引发剂是可商购获得的。光引发剂的实例包括但不限于苯乙酮、茴香偶姻、蒽醌、蒽醌-2-磺酸、苯偶酰、苯偶姻、苯偶姻乙醚、苯偶姻异丁醚、苯偶姻甲醚、二苯甲酮、3,3',4,4'-二苯甲酮四甲酸二酐、4-苯甲酰联苯、2-苯甲基-2-(二甲氨基)-4'-吗啉代苯丁酮、4'-双(二乙氨基)二苯甲酮、4,4'-双(二甲氨基)二苯甲酮、樟脑醌、2-氯噻吨-9-酮、二苯并环庚烯酮、2,2-二乙氧基苯乙酮、4,4'-二羟基二苯甲酮、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、4-(二甲氨基)二苯甲酮、4,4'-二甲基苯偶酰、2,5-二甲基二苯甲酮、3,4-二甲基二苯甲酮、4'-乙氧基苯乙酮、2-乙基蒽醌、3'-羟基苯乙酮、4'-羟基苯乙酮、3-羟基二苯甲酮、4-羟基二苯甲酮、1-羟基环己基苯基酮、2-羟基-2-甲基苯丙酮、2-甲基二苯甲酮、3-甲基二苯甲酮、苯甲酰甲酸甲酯、2-甲基-4'-(甲硫基)-2-吗啉代苯丙酮、菲醌、4'-苯氧基苯乙酮、以及噻吨-9-酮。
本领域技术人员将能够考虑到例如所述含有脂质的缀合配偶体、包含氨基酸的缀合配偶体(例如含有肽的缀合配偶体)、以及反应混合物中存在的任何其它组分的性质来选择用于所述方法中的适当的自由基引发剂。在一些实施方案中，所述引发剂以相对于包含硫醇的起始材料约20:1至约0.05:1、约10:1至约0.05:1、约5:1至约0.05:1、约3:1至约0.5:1的化学计量比存在于反应中。
所述反应中的所述含有脂质的缀合配偶体和包含氨基酸的缀合配偶体，例如含有肽的缀合配偶体如本文所述的实施方案中的任一个中所限定。
所述含有脂质的缀合配偶体和包含氨基酸的缀合配偶体，例如含有肽的缀合配偶体可以使用已知的合成化学技术来制备(例如以下文献中一般描述的方法：Louis FFieser和Mary F,《用于有机合成的试剂(Reagents for Organic Synthesis)》,第1-19卷,纽约的威立出版社(Wiley,New York)(1967年-1999年版)或《拜耳斯坦有机化学手册(Beilsteins Handbuch der organischen Chemie)》,第4版,柏林的斯普林格出版社(Springer-Verlag Berlin)，包括补编(也可经由拜耳斯坦在线数据库获得))或在一些实施方案中，可以是可商购获得的。
式(II)的含有脂质的缀合配偶体化合物
其中m、R1、R2、R3、R4、R5、以及L1各自独立地如对于式(I)的化合物所述的实施方案中的任一个中所定义，可以通过以下反应来制备：使式(VI)的化合物
L1-C(O)-X
(VI)
其中X是OH或合适的离去基，与式(VII)的化合物：
在有效酯化的条件下反应。用于酯化的方法是本领域公知的。举例来说，当X是氯时，可以在碱，如吡啶或三乙胺存在下，在合适的溶剂中进行所述反应。可以将酰氯原位转化成更具反应性的物质(例如使用碘化钠转化成相应的碘化物)。进行反应的温度取决于酸物质的反应性和所使用的溶剂。
许多式(VI)的化合物是可商购获得的。其它可以使用标准合成化学技术由可商购获得的前体制备。举例来说，其中X是氯的式(VI)的化合物可以通过在合适的溶剂或溶剂的混合物中用亚硫酰氯处理相应的羧酸来制备。
式(IIA)的含有脂质的缀合配偶体化合物
其中p、R11、R22、R33、R44、以及L1如式(IA)的化合物中所定义，可以通过以下反应来制备：使如上文所限定的式(VI)的化合物与式(VIII)的化合物：
其中P是合适的保护基，在有效酯化的条件下反应，然后去除所述保护基。
或者，式(IIA)的化合物可以通过以下反应来制备：使如上文所限定的式(VI)的化合物与式(IX)的化合物：
其中P是合适的保护基，在有效酯化的条件下反应，去除所述保护基，然后将相应的醇转化成硫醇。用于将醇转化成硫醇的合适的方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
所述化合物的制备可以涉及各种化学基团的保护和脱保护。对保护和脱保护的需要以及适当的保护基的选择可以容易地由本领域技术人员确定。保护基以及用于保护和脱保护的方法是本领域公知的(参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts,《有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)》,第3版,纽约的约翰·威利父子出版公司(1999))。
类似地，式(VII)、式(VIII)、以及式(IX)的化合物也是可商购获得的或可以使用标准合成化学技术由可商购获得的前体制备。
将所述含有脂质的缀合配偶体和包含氨基酸的缀合配偶体(例如含有肽的缀合配偶体)以及反应混合物中存在的任何其它组分引入到反应容器中的顺序可以变化。所述反应可以作为一锅法程序来进行。
在所述反应中所述含有脂质的缀合配偶体和包含氨基酸的缀合配偶体，例如含有肽的缀合配偶体的化学计量可以变化。在一些实施方案中，包含氨基酸的缀合配偶体与含有脂质的缀合配偶体的化学计量比是约1:0.5至约1:20、约1:1至约1:10、约1:1至约1:5、约1:1至约1:3。在一些实施方案中，含有肽的缀合配偶体与含有脂质的缀合配偶体的化学计量比是约1:0.5至约1:20、约1:1至约1:10、约1:1至约1:5、约1:1至约1:3。
所述反应可以在任何合适的温度进行。在一些实施方案中，在以下温度进行所述反应：约-25℃至约200℃、约-10℃至约150℃、约0℃至约125℃、约环境温度至约100℃。在一些实施方案中，在以下温度进行所述反应：低于约200℃、低于约175℃、低于约150℃、低于约125℃、或低于约100℃。
在一些实施方案中，在高于环境温度的温度进行所述反应。在一个实施方案中，在以下温度进行所述反应：40℃至200℃、50℃至150℃、60℃至100℃、65℃至90℃、或70℃至80℃。在一些实施方案中，在以下温度进行所述反应：大于40℃、大于50℃、大于75℃、大于100℃、或大于150℃。
进行反应的温度可以取决于在反应中如何产生自由基。所使用的温度可以被选择以控制反应的速率。在反应的过程中可以调节温度以控制反应的速率。通过控制反应的速率，可能有可能使不期望的副产物(例如调聚产物或聚合产物)的形成减到最低限度或消除。
如果自由基是热产生的(例如使用热引发剂)，那么所述反应一般将在高于环境温度的温度进行。所述温度将取决于产生自由基的物质的反应性。
如果自由基是光化学产生的，那么所述反应可能有利地在环境温度进行。在某些实施方案中，可能期望冷却反应混合物以减慢反应速率或相反加热反应混合物以提高反应速率。
本领域技术人员将能够考虑到所述含有脂质的缀合配偶体、包含氨基酸的缀合配偶体(例如含有肽的缀合配偶体)以及自由基引发剂(如果使用的话)的反应性来选择执行所述方法的适当的温度。
进行反应的温度可以通过加热或冷却反应混合物来控制。反应混合物的温度可以通过本领域已知的合适的方法来控制。可以向反应混合物施加热，例如使用反应容器内的热交换器、反应容器周围的加热夹套、或通过将反应容器浸在加热的液体(例如油浴或砂浴)中。在某些示例性实施方案中，通过微波照射加热反应混合物。
所述反应的进展可以通过任何合适的手段，例如通过薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)来监测。可以允许所述反应进行到基本完成，如通过起始材料中的至少一种的消耗所监测。在一些实施方案中，允许所述反应进行1分钟至7天、5分钟至72小时、10分钟至48小时、10分钟至24小时的时间段。在其它实施方案中，允许所述反应进行少于72小时、少于48小时、少于24小时、少于12小时、少于6小时、少于4小时、少于2小时、或少于1小时的时间段。
在一些实施方案中，进行所述反应直到至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％的含有脂质的缀合配偶体或包含氨基酸的缀合配偶体(以化学计量较小者为准)已经被消耗为止。在一些实施方案中，进行所述反应直到至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％的含有脂质的缀合配偶体或含有肽的缀合配偶体(以化学计量较小者为准)已经被消耗为止。可以通过任何合适的方法，例如HPLC来监测起始材料的消耗。
可以通过本领域已知的任何合适的方法，例如使用磁力搅拌器或机械搅拌器来混合反应混合物。所使用的方法可以取决于进行反应的规模。
一般在液体反应介质中进行反应。所述液体反应介质可以包括溶剂。合适的溶剂的实例包括二甲基甲酰胺、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳、水、甲醇、乙醇、二甲亚砜、三氟乙酸、乙酸、乙腈、以及其混合物。
所述溶剂可以基于含有脂质的缀合配偶体和包含氨基酸的缀合配偶体，例如含有肽的缀合配偶体在所述溶剂中的溶解度来选择。自由基引发剂的溶解度也可能是相关的。在一些实施方案中，所述含有脂质的缀合配偶体是疏水性的。包含氨基酸的缀合配偶体，例如含有肽的缀合配偶体的疏水性或亲水性可以根据例如含有肽的缀合配偶体的肽的氨基酸序列而变化。含有肽的缀合配偶体中增溶基团的存在可以提高在极性溶剂，如水中的溶解度。本领域技术人员将能够选择适当的溶剂而无需过多的实验。
可以在基本上无氧的条件下进行所述反应。氧气可能淬灭在反应中形成的自由基。可以将反应混合物用基本上无氧的惰性气体(例如氮气或氩气)脱气以在产生自由基之前去除任何溶解氧。或者，可以在反应容器中组合之前将反应混合物的单个组分用基本上无氧的惰性气体脱气。可以在基本上无氧的惰性气体的气氛下进行所述反应。
本发明的方法可以在环境压力下执行。
如果相对于硫醇-烯反应中的传播，链转移的速率较慢，那么不期望的二聚化、调聚或聚合可能发生。
在本发明的方法中的反应混合物中可以包括抑制二聚化、调聚或聚合的添加剂。本申请的发明人已经发现在一些实施方案中，在反应混合物中包括促进链转移的外来硫醇作为添加剂减少了不期望的副产物的形成。在一些实施方案中，所述外来硫醇可以提高所期望的硫醇烯反应的效率。合适的外来硫醇的实例包括但不限于还原型谷胱甘肽、DODT、DTT、蛋白质等。本申请的发明人已经发现在一些实施方案中，包括DTT不产生不期望的副产物。
在某些实施方案中，所述外来硫醇是空间位阻硫醇。合适的空间位阻外来硫醇的非限制性实例包括叔丁基硫醇和1-甲基丙基硫醇。
在一些实施方案中，包括酸也可以抑制二聚化、调聚、或聚合。所述酸可以是强无机酸，例如HCl；或有机酸，例如TFA。在某些实施方案中，所述添加剂是TFA。
本申请的发明人已经发现在一些实施方案中，在反应混合物中包括叔丁基硫醇和TFA这两者作为添加剂可以减少低聚物的形成，并且提高起始材料向所期望的产物的转化。因此，在某些示例性实施方案中，反应混合物包含TFA和叔丁基硫醇的组合。
所述添加剂一般以足以使不期望的副产物的形成减到最低限度而不会不利地影响所述反应或所述方法中的任何、任选的、后续步骤的量使用。在一些实施方案中，所述添加剂以相对于包含硫醇的起始材料约20:1至约0.05:1、约10:1至约0.5:1、约5:1至约1:1、约3:1至约1:1的化学计量比存在于反应中。
在一些实施方案中，在所述反应中所使用的含有脂质的缀合配偶体和包含氨基酸的缀合配偶体起始材料中的少于约50重量％、少于约40重量％、少于约30重量％、少于约25重量％、少于约20重量％、少于约15重量％、少于约10重量％、少于约5重量％、少于约3重量％、或少于约1重量％是由二聚化、调聚或聚合产生的不期望的副产物。在一些实施方案中，在所述反应中所使用的含有脂质的缀合配偶体和含有肽的缀合配偶体起始材料中的少于约50重量％、少于约40重量％、少于约30重量％、少于约25重量％、少于约20重量％、少于约15重量％、少于约10重量％、少于约5重量％、少于约3重量％、或少于约1重量％是由二聚化、调聚或聚合产生的不期望的副产物。所述反应的产物的纯度可以通过例如HPLC来确定。
含有脂质的缀合配偶体和包含氨基酸的缀合配偶体，例如含有肽的缀合配偶体分别在反应混合物中的浓度也可能影响反应。本领域技术人员将能够改变反应混合物中含有脂质的缀合配偶体和含有肽的缀合配偶体的浓度以例如优化产率和纯度而无需过多的实验。
在一些实施方案中，包含硫醇的起始材料以约0.05mM至约1M、约0.5mM至约1M、约1mM至约1M的浓度存在。在一些实施方案中，所述浓度是至少约0.05mM、0.5mM、或1mM。
在一些实施方案中，包含烯烃的起始材料的浓度是至少约0.05mM、0.5mM、或1mM。
在一些实施方案中，可以在反应之后将氨基酸缀合物或肽缀合物从反应介质中分离并且任选地纯化。在一些实施方案中，可以在反应之后将肽缀合物从反应介质中分离并且任选地纯化。可以使用本领域已知的任何合适的方法，例如通过沉淀来从反应介质中分离缀合物。
在一些实施方案中，在将所述氨基酸缀合物或肽缀合物从反应介质中分离之后，将它纯化。在一些实施方案中，在将所述肽缀合物从反应介质中分离之后，将它纯化。在具体考虑的实施方案中，通过HPLC，使用一种或多种合适的溶剂来纯化缀合物。
通过本发明的方法产生的肽缀合物和/或本发明的方法中的含有肽的缀合配偶体可以包含合成肽。合成肽可以使用固相肽合成(SPPS)来制备。
固相肽合成(SPPS)的基本原理是将氨基酸逐步添加到经由连接分子锚定到固相载体的增长的多肽链中，所述固相载体通常是树脂颗粒，一旦多肽链完成，它就允许切割和纯化。简单地说，固相树脂载体和起始氨基酸经由连接分子彼此连接。这样的树脂-连接基团-酸基质是可商购获得的。
待与树脂偶联的氨基酸在它的Nα-末端处是受化学保护基保护的。
所述氨基酸也可以具有侧链保护基。这样的保护基防止在待偶联的氨基酸的羧基与连接到树脂的肽链的未受保护的Nα-氨基之间形成新的肽键的过程期间发生不期望的或有害的反应。
使待偶联的氨基酸与肽链的N末端氨基酸的未受保护的Nα-氨基反应，从而使肽链的链长度增加1个氨基酸。可以用合适的化学活化剂来活化待偶联的氨基酸的羧基以促进与肽链的Nα-氨基的反应。然后去除肽链的N末端氨基酸的Nα-保护基以为与下一个氨基酸残基偶联作准备。这种技术由许多重复步骤组成，从而在任何可能的情况下使自动化具有吸引力。本领域技术人员将了解的是，可以使肽与固相结合的氨基酸或肽的Nα-氨基偶联，而不是单个氨基酸，例如在汇集肽合成是所期望的情况下。
当实现了氨基酸的所期望的序列时，将肽在连接分子处从固相载体切割。
SPPS可以使用连续流动法或分批流动法来进行。连续流动容许经由分光光度计实时监测反应进展，但是有两个明显的缺点，即与树脂上的肽接触的试剂被稀释，并且由于固相树脂的物理尺寸限制，因此规模更受限。分批流动在过滤反应容器中发生并且由于反应物是可及的并且可以手动或自动添加而是有用的。
以下类型的保护基通常用于保护Nα-氨基末端：“Boc”(叔丁氧羰基)和“Fmoc”(9-茀基甲氧羰基)。用于Boc方法的试剂是相对便宜的，但是它们具有高腐蚀性并且需要采用昂贵的设备和更严格的防护措施。使用具有更小的腐蚀性，尽管更昂贵的试剂的Fmoc方法通常是优选的。
对于SPPS，多种固体载体相是可用的。用于合成的固相载体可以是适用于合成目的的合成树脂、合成聚合物膜或硅或硅酸盐表面(例如受控孔径玻璃)。一般来说，使用树脂，通常是聚苯乙烯悬浮液、或聚苯乙烯-聚乙二醇、或聚合物载体，例如聚酰胺。用适用于Boc化学方法的连接基团官能化的树脂的实例包括PAM树脂、肟树脂SS、酚醛树脂、溴化王树脂(Wang resin)以及溴化PPOA树脂。适用于Fmoc化学方法的树脂的实例包括AMPB-BHA树脂、Sieber酰胺树脂、Rink酸性树脂、Tentagel S AC树脂、2-氯三苯甲基氯树脂、2-氯三苯甲基醇树脂、TentaGel S Trt-OH树脂、Knorr-2-氯三苯甲基树脂、肼-2-氯三苯甲基树脂、ANP树脂、Fmoc光不稳定性树脂、HMBA-MBHA树脂、TentaGel S HMB树脂、芳族Safety Catch树脂、BAl树脂以及Fmoc-羟胺2氯三苯甲基树脂。其它树脂包括PL Cl-Trt树脂、PL-肟树脂以及PL-HMBA树脂。
对于每一种树脂，用于连接起始单体或亚单位的适当的偶联条件在文献中是已知的。
固相载体的制备包括将载体在适当的溶剂(例如二甲基甲酰胺)中溶剂化。固相的体积在溶剂化期间通常会增加，这进而增加可用于进行肽合成的表面积。
然后使连接分子连接到载体上以用于使肽链连接到固相载体上。连接分子一般被设计成使得最终的切割在C末端处提供游离酸或酰胺。连接基团一般不具有树脂特异性。连接基团的实例包括肽酸，例如4-羟基甲基苯氧基乙酰基-4'-甲基二苯甲基胺(HMP)；或肽酰胺，例如二苯甲基胺衍生物。
肽序列的第一个氨基酸可以在连接基团连接到固相载体上之后连接到连接基团上或使用包括肽序列的第一个氨基酸的连接基团连接到固相载体上。包括氨基酸的连接基团是可商购获得的。
下一步是将第一个氨基酸的Nα-氨基脱保护。对于Fmoc SPPS，Nα-氨基的脱保护可以用弱碱处理(例如哌嗪或哌啶)来进行。可以通过适度的酸解(例如三氟乙酸(TFA))来去除侧链保护基。对于Boc SPPS，Nα-氨基的脱保护可以使用例如TFA来进行。
在脱保护后，通过形成肽键进行氨基酸链延伸或偶联。这个过程需要活化待偶联的氨基酸的Cα-羧基。这可以使用例如原位试剂、预先形成的对称酐、活性酯、酰卤、或氨基甲酸酯保护的N-羧酸酐来实现。原位方法允许同时活化和偶联。偶联试剂包括碳二亚胺衍生物，例如N,N'-二环己基碳二亚胺或N,N-二异丙基碳二亚胺。偶联试剂还包括苯并三唑的脲盐或磷盐衍生物。这样的脲盐和磷盐的实例包括HBTU(O-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐)、BOP(苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基-三(1-吡咯烷基)磷六氟磷酸盐)、PyAOP、HCTU(O-(1H-6-氯-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TCTU(O-1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐)、HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐)、TOTU(O-[氰基(乙氧羰基)亚甲基氨基]-N,N,N′,N″-四甲基脲四氟硼酸盐)、以及HAPyU(O-(苯并三唑-1-基)氧基双-(1-吡咯烷基)-脲六氟磷酸盐)。在一些实施方案中，偶联试剂是HBTU、HATU、BOP或PyBOP。
在已经合成了所期望的氨基酸序列之后，从树脂切割肽。这一过程中所用的条件取决于肽的氨基酸组成和侧链保护基的敏感性。一般来说，在含有多种清除剂以淬灭源自于保护基和连接基团的反应性碳离子的环境中进行切割。常见的切割剂包括例如TFA和氟化氢(HF)。在一些实施方案中，在肽经由连接基团与固相载体结合的情况下，通过从连接基团切割肽来从固相载体切割肽链。
用于从树脂切割肽的条件可以同时去除一个或多个侧链保护基。
在SPPS中使用保护基是公认的。常见的保护基的实例包括但不限于乙酰胺基甲基(Acm)、乙酰基(Ac)、金刚烷氧基(AdaO)、苯甲酰基(Bz)、苯甲基(Bzl)、2-溴苯甲基、苯甲氧基(BzlO)、苯甲氧羰基(Z)、苯甲氧基甲基(Bom)、2-溴苯甲氧基羰基(2-Br-Z)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁氧羰基(Boc)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁基(tBu)、叔丁硫基(tButhio)、2-氯苯甲氧羰基(2-Cl-Z)、环己氧基(cHxO)、2,6-二氯苯甲基(2,6-DiCl-Bzl)、4,4'-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代-亚环己基)3-甲基-丁基(ivDde)、4-{N-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代-亚环己基)3-甲基丁基]-氨基)苯甲氧基(ODmab)、2,4-二硝基苯基(Dnp)、芴基甲氧基羰基(Fmoc)、甲酰基(For)、均三甲苯-2-磺酰基(Mts)、4-甲氧苯甲基(MeOBzl)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲基苯甲基(MeBzl)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、3-硝基-2-吡啶次磺酰基(Npys)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、2,2,5,7,8-五甲基-色满-6-磺酰基(Pmc)、甲苯磺酰基(Tos)、三氟乙酰基(Tfa)、三甲基乙酰胺基甲基(Tacm)、三苯甲基(Trt)以及呫吨基(Xan)。
在肽的氨基酸的侧链中的一个或多个含有官能团，例如像另外的羧基、氨基、羟基或硫醇基的情况下，可能需要另外的保护基。举例来说，如果使用Fmoc策略，那么可以使用Mtr、Pmc、Pbf来保护Arg；可以使用Trt、Tmob来保护Asn和Gln；可以使用Boc来保护Trp和Lys；可以使用tBu来保护Asp、Glu、Ser、Thr以及Tyr；以及可以使用Acm、tBu、tButhio、Trt以及Mmt来保护Cys。本领域技术人员将了解的是，存在许多其它合适的组合。
用于上文所概述的SPPS的方法是本领域公知的。参见例如Atherton和Sheppard,“固相肽合成：实用方法(Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach)”,纽约：IRL出版社,1989；Stewart和Young:“固相肽合成(第2版)(Solid-Phase PeptideSynthesis 2nd Ed.)”,伊利诺伊州的罗克福德(Rockford,Illinois)：皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.),1984；Jones,“肽的化学合成(The Chemical Synthesis ofPeptides)”,牛津(Oxford)：克拉伦登出版社(Clarendon Press),1994；Merrifield,J.Am.Soc.85:2146-2149(1963)；Marglin,A.和Merrifield,R.B.Annu.Rev.Biochem.39:841-66(1970)；以及Merrifield R.B.JAMA.210(7):1247-54(1969)；以及“固相肽合成：实用方法(Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach)”,(W.C.Chan和P.D.White编著,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)。用于自动化合成肽或多肽的设备是可容易地从诸如珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)/应用生物系统公司(Applied Biosystems)(加利福尼亚州的福斯特城(Foster City,CA))的供应商商购获得的并且可以根据制造商的说明书来操作。
在从树脂切割之后，可以将肽从反应介质中分离，例如通过离心或过滤。然后可以随后纯化肽，例如通过HPLC，使用一种或多种合适的溶剂。
有利的是，本申请的发明人已经发现在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体可以用于本发明的方法中而在从树脂切割肽之后没有经过纯化。
本申请的发明人还已经有利地发现本发明的方法可以使用含有肽的缀合配偶体来进行，其中所述肽不含Nα-氨基保护基或任何侧链保护基。所述反应一般对硫醇与非芳族碳-碳双键的反应具有选择性。
可能需要用保护基保护含有肽的缀合配偶体中(例如肽的半胱氨酸残基中)存在的硫醇基以防止在本发明的方法中不期望的竞争反应。可以用保护基保护硫醇基，所述保护基在用于去除肽中存在的一个或多个其它保护基或从树脂切割肽的条件下是不可去除的。通常，所述肽将使用带有适当的保护基的氨基酸来合成。本领域技术人员将能够选择适当的保护基而无需过多的实验。
在某些实施方案中，除了待反应的碳-碳双键之外，所述包含氨基酸的缀合配偶体和含有脂质的缀合配偶体还包含一个或多个不饱和的碳-碳键。在某些实施方案中，除了待反应的碳-碳双键之外，所述含有肽的缀合配偶体和含有脂质的缀合配偶体还包含一个或多个不饱和的碳-碳键。本领域技术人员将了解的是，在这些实施方案中，硫醇对待反应的碳-碳双键的选择性可以取决于例如相对于一个或多个不饱和碳-碳键，所述碳-碳双键的空间和/或电子环境。在某些实施方案中，相对于包含氨基酸的缀合配偶体和含有脂质的缀合配偶体中任何其它不饱和的碳-碳键活化待反应的碳-碳双键。在某些实施方案中，相对于含有肽的缀合配偶体和含有脂质的缀合配偶体中任何其它不饱和的碳-碳键活化待反应的碳-碳双键。
在一些实施方案中，包含氨基酸的缀合配偶体的包含碳-碳双键或硫醇的氨基酸的Nα-氨基是酰化的，例如乙酰化的。在一些实施方案中，本发明的方法可以包括将包含氨基酸的缀合配偶体的包含待反应的碳-碳双键或硫醇的氨基酸的Nα-氨基酰化，例如乙酰化。
在已经通过SPPS合成了含有肽的缀合配偶体的情况下，可以在从树脂切割之前或之后进行酰化。在一些实施方案中，含有肽的缀合配偶体的带有待反应的碳-碳双键或硫醇的氨基酸残基是N末端氨基酸残基，并且所述方法包括在切割肽之前将N末端氨基酰化。
在一些实施方案中，所述方法还包括将氨基酸缀合物的氨基酸或肽缀合物中与含有脂质的缀合配偶体缀合的氨基酸残基的Nα-氨基酰化。
氨基酸的Nα-氨基的酰化可以通过在合适的溶剂(例如DMF)中在碱存在下使氨基酸或肽与酰化剂反应来进行。酰化剂的非限制性实例包括酰卤，例如酰氯，如乙酰氯；以及酸酐，例如乙酸酐。这样的试剂可以是可商购获得的或可以通过本领域公知的方法来制备。合适的碱的非限制性实例包括三乙胺、二异丙基乙胺、4-甲基吗啉等。
在其它实施方案中，合成含有肽的缀合配偶体的肽包括使如下氨基酸或包含如下氨基酸的肽与一个或多个氨基酸和/或一个或多个肽偶联，所述氨基酸在Nα-氨基处被酰化并且包含待反应的碳-碳双键或硫醇。
在一些实施方案中，所述方法包括使氨基酸缀合物的氨基酸与氨基酸或肽偶联以提供肽缀合物。在一些实施方案中，所述方法包括通过SPPS使氨基酸缀合物的氨基酸与和固相树脂载体结合的氨基酸或肽偶联。在一些实施方案中，所述方法包括通过SPPS使氨基酸缀合物的氨基酸与和固相树脂载体结合的肽偶联。所述方法可以包括通过SPPS合成与固相树脂载体结合的肽。
在一些实施方案中，所述方法还包括使氨基酸缀合物的氨基酸或肽缀合物的氨基酸与一个或多个氨基酸或肽偶联以提供包含一个或多个EBV LMP2表位的肽缀合物。在一些实施方案中，待偶联的肽包含一个或多个EBV LMP2表位。在其它实施方案中，在偶联时形成一个或多个EBV LMP2表位。可以通过如本文所述的SPPS进行偶联。
在一些实施方案中，所述方法包括通过SPPS使氨基酸缀合物的氨基酸与和固相树脂载体结合的肽偶联以提供包含一个或多个EBV LMP2表位的肽缀合物。
在一个实施方案中，待偶联的肽缀合物的肽与固相树脂载体结合，并且所述方法包括使待偶联的肽缀合物的氨基酸与氨基酸或肽偶联以提供包含一个或多个EBV LMP2表位的肽缀合物。
在一个替代的实施方案中，所述方法包括通过SPPS使肽缀合物的氨基酸与和固相树脂载体结合的氨基酸或肽偶联以提供包含肽表位的肽缀合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括使表位，例如肽表位与氨基酸缀合物或肽缀合物偶联。在所述方法包括使肽表位偶联的情况下，可以通过如本文所述的SPPS进行偶联。
在某些实施方案中，表位，例如一个或多个EBV LMP2表位经由连接基团偶联或结合。在某些实施方案中，所述连接基团是氨基序列，例如两个或更多个、三个或更多个、或四个或更多个连续氨基酸的序列。在某些实施方案中，连接基团包含约2个至20个、2个至18个、2个至16个、2个至14个、2个至12个、2个至10个、4个至20个、4个至18个、4个至16个、4个至14个、4个至12个、或4个至10个氨基酸。
本领域技术人员应当了解的是，如本文所述使氨基酸或肽与另一个氨基酸或肽偶联可以包括在一个偶联配偶体的氨基酸或肽的氨基酸的Nα末端与另一个偶联配偶体的氨基酸或肽的氨基酸的C末端之间形成肽键。
在一些实施方案中，本发明的方法包括通过SPPS合成含有肽的缀合配偶体的肽的氨基酸序列；以及使所述含有脂质的缀合配偶体与所述含有肽的缀合配偶体反应。
在一些实施方案中，通过SPPS合成含有肽的缀合配偶体的肽的氨基酸序列包括使氨基酸或肽与和固相树脂载体结合的氨基酸或肽偶联以提供所述肽或其部分的氨基酸序列。在某些实施方案中，通过SPPS合成含有肽的缀合配偶体的整个肽的氨基酸序列。
含有肽的缀合配偶体可以在与固相树脂载体结合同时与含有脂质的缀合配偶体反应。或者，可以在与含有脂质的缀合配偶体反应之前从固相树脂载体切割所述肽，并且任选地将它纯化。
肽缀合物和/或包含氨基酸的缀合配偶体，例如含有肽的缀合配偶体可以包含一个或多个增溶基团。所述一个或多个增溶基团提高例如含有肽的缀合配偶体在极性溶剂(如水)中的溶解度。在示例性实施方案中，所述增溶基团不会不利地影响肽缀合物的生物活性。
增溶基团的存在对于将肽缀合物配制成药物组合物和/或作为药物组合物施用来说可能是有利的。
在一些实施方案中，所述增溶基团与肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体的肽结合。在一些实施方案中，所述增溶基团与含有肽的缀合配偶体的肽结合。在一些实施方案中，肽缀合物的肽和/或含有肽的配偶体的肽包含增溶基团。在一些实施方案中，含有肽的配偶体的肽包含增溶基团。
在一些实施方案中，所述增溶基团与肽链中氨基酸的侧链结合。在一些实施方案中，所述增溶基团与肽链的C末端或N末端结合。在一些实施方案中，所述增溶基团结合在肽链中两个氨基酸残基之间。在一些实施方案中，所述增溶基团与肽链中一个氨基酸残基的Nα-氨基和肽链中另一个氨基酸残基的羧基结合。
合适的增溶基团的实例包括但不限于亲水性氨基酸序列或聚乙二醇(PEG)。
在一个实施方案中，所述增溶基团是在肽链中包含两个或更多个亲水性氨基酸残基的亲水性氨基酸序列。在一些实施方案中，所述增溶基团是在肽链中包含两个或更多个连续亲水性氨基酸残基的序列的氨基酸序列。这样的增溶基团可以通过由SPPS将增溶基团的每一个氨基酸添加到肽链中来形成。
在另一个实施方案中，所述增溶基团是聚乙二醇。在一些实施方案中，所述聚乙二醇与肽链中一个氨基酸残基的Nα-氨基和肽链中另一个氨基酸残基的羧基结合。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇包含约1个至约100个、约1个至约50个、约1个至约25个、约1个至约20个、约1个至约15个、约1个至约10个、约2个至约10个、或约2个至约4个乙二醇单体单元。用于使聚乙二醇与肽偶联的方法是已知的。
在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体包含抗原，例如抗原肽。在一个实施方案中，肽缀合物或含有肽的缀合配偶体的肽是抗原或包含抗原；或抗原与肽结合，任选地经由连接基团与肽结合。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含抗原，例如抗原肽。在一个实施方案中，含有肽的缀合配偶体的肽是抗原或包含抗原；或抗原与肽结合，任选地经由连接基团与肽结合。
在一个实施方案中，所述抗原包含含有表位的肽。在一个实施方案中，包含表位的肽是包含表位的糖肽。在一个实施方案中，所述抗原包含含有表位的糖肽。
在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体包含表位。在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体的肽包含表位。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含表位。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽包含表位。
在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体包含两个或更多个EBV LMP2表位，例如，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体的肽包含两个或更多个EBVLMP2表位。
在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体是或包含含有一个或多个EBV LMP2表位的糖肽。在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体的肽是糖肽。在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体包含含有一个或多个EBV LMP2表位的糖肽，所述糖肽与所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体的肽结合。举例来说，所述含有肽的缀合配偶体是或包含含有一个或多个EBV LMP2表位的糖肽。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽是糖肽。在另一个实施例中，所述含有肽的缀合配偶体包含与所述含有肽的缀合配偶体的肽结合的包含一个或多个EBV LMP2表位的糖肽。
在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体包含蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体的肽包含蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽包含蛋白水解切割位点。
在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体的肽包含一个或多个连接基团。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽包含一个或多个连接基团。
在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体包含连接基团。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含连接基团。
在一些实施方案中，所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体包含经由连接基团与所述肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体的肽结合的表位。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体包含经由连接基团与所述含有肽的缀合配偶体的肽结合的表位。
连接基团的实例包括但不限于氨基酸序列(例如肽)、聚乙二醇、烃基氨基酸等。在一些实施方案中，所述连接基团是或包含蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，所述连接基团是或包含增溶基团。
在一些实施方案中，所述连接基团结合在肽链中两个氨基酸残基之间。
在一些实施方案中，所述连接基团与肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体中一个氨基酸残基的Nα-氨基和含有肽的缀合配偶体中另一个氨基酸残基的羧基结合。在一些实施方案中，所述连接基团与含有肽的缀合配偶体中一个氨基酸残基的Nα-氨基和含有肽的缀合配偶体中另一个氨基酸残基的羧基结合。
在某些实施方案中，所述连接基团是可在体内从与它结合的氨基酸切割的。在某些实施方案中，所述连接基团是可在体内通过水解切割的。在某些实施方案中，所述连接基团是可在体内通过酶水解切割的。连接基团可以通过本领域已知的任何合适的方法引入。
所述方法还可以包括使表位与氨基酸缀合物的氨基酸或肽缀合物的肽偶联。所述表位可以经由连接基团结合，如上文所述。在一些实施方案中，所述表位是肽表位。在一些实施方案中，所述方法包括使包含表位的糖肽偶联。
应当了解的是，在某些所期望的实施方案中，本发明的肽缀合物维持抗原提呈细胞的适当摄取、加工、以及提呈。理想的是，所述含有脂质的缀合物不干扰抗原提呈细胞对所述缀合物中存在的任何抗原肽的提呈。本文所呈现的实施例确定了本发明的缀合物与非缀合的相关肽同等地由抗原提呈细胞提呈。
所合成的肽的身份的确认可以方便地通过例如氨基酸分析、质谱、埃德曼降解(Edman degradation)等来实现。
本发明的方法还可以包括从液体反应介质中分离氨基酸缀合物。或者，本发明的方法还可以包括从液体反应介质中分离肽缀合物。可以使用本领域已知的任何合适的分离方法，例如沉淀和过滤。随后可以纯化缀合物，例如通过HPLC，使用一种或多种合适的溶剂来纯化。
本发明还涉及由本发明的方法制备的氨基酸缀合物和肽缀合物。所述缀合物如本文所述的实施方案中的任一个中所限定。
本发明还涉及一种式(V)的化合物，所述化合物是氨基酸缀合物。
本发明还涉及一种式(V)的化合物，所述化合物是肽缀合物。
所述肽缀合物可以是纯的或经过纯化的、或基本上纯的。
如本文所用的“纯化”不需要绝对纯度；相反，它意图作为相对术语，其中所考虑的材料比在它先前所处的环境中更纯。在实践中，材料通常已经例如经过分级分离以去除各种其它组分，并且所得的材料已经基本上保留它的一种或多种所期望的生物活性。术语“基本上纯化”指的是如下的材料，所述材料的至少约60％不含，优选地至少约75％不含，并且最优选地至少约90％不含、至少约95％不含、至少约98％不含、或更多不含在制造期间可能与它们缔合的其它组分。
术语“α-氨基酸”或“氨基酸”指的是含有与被指定为α-碳的碳结合的氨基和羧基这两者的分子。合适的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的D-异构体和L-异构体这两者以及通过有机合成或其它代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。除非上下文另外明确说明，否则如本文所用的术语氨基酸意图包括氨基酸类似物。
在某些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体仅包含天然氨基酸。术语“天然存在的氨基酸”指的是在自然界中合成的肽中通常存在的并且以如下单字母缩写而为人所知的二十种氨基酸中的任一种：A、R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y以及V。
术语“氨基酸类似物”或“非天然存在的氨基酸”指的是在结构上类似于氨基酸并且可以取代氨基酸的分子。氨基酸类似物包括但不限于除了以下方面之外在结构上与如本文所定义的氨基酸相同的化合物：在氨基与羧基之间包括一个或多个另外的亚甲基(例如α-氨基β-羧酸)、或氨基或羧基被类似反应性基团取代(例如伯胺被仲胺或叔胺取代、或羧基被酯取代)。
除非另外指明，否则本领域技术范围内的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学的常规技术可以用于实施本文所述的方法。这样的技术在文献中被充分解释，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第2版(Sambrook等,1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编著,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编著,1987)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著)；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编著,1987)；《最新分子生物学方案(Current Protocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等编著,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等编著,1994)；《最新免疫学方案(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等编著,1991)；《免疫测定手册(TheImmunoassay Handbook)》(David Wild编著,纽约的斯托克顿出版社(Stockton PressNY),1994)；《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》(Harlow等编著,1987)；以及《免疫分析方法(Methods of Immunological Analysis)》(R.Masseyeff,W.H.Albert以及N.A.Staines编著,魏因海姆(Weinheim)：VCH出版公司(VCH Verlagsgesellschaft mbH),1993)。
术语“肽”等在本文用于指的是任何长度的氨基酸残基的任何聚合物。聚合物可以是线性的或非线性的(例如支化)，它可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物。所述术语还涵盖已经被天然修饰或通过干预，例如通过形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化、或任何其它修饰或操作，例如与标记组分或生物活性组分缀合而被修饰的氨基酸聚合物。
本申请的发明人已经发现本发明的某些肽缀合物具有免疫活性。
细胞介导的免疫主要是由T淋巴细胞介导的。致病性抗原在抗原提呈细胞(如巨噬细胞、B淋巴细胞、以及树突状细胞)的表面上表达，与I类主要组织相容性MHC或II类MHC分子结合。与II类MHC偶联的致病性抗原的提呈激活辅助(CD4+)T细胞应答。在T细胞与抗原-MHC II复合物结合时，CD4+T细胞释放细胞因子并且增殖。
与I类MHC分子结合的致病性抗原的提呈激活细胞毒性(CD8+)T细胞应答。在T细胞与抗原-MHC I复合物结合时，CD8+细胞分泌穿孔素和其它介质，从而引起靶细胞死亡。不希望受任何理论所束缚，本发明的申请人认为在某些实施方案中，增强的CD8+细胞应答是在由CD4+细胞识别的一个或多个表位存在下实现的。
评估和监测受试者的细胞介导的应答的发生或进展的方法是本领域公知的。方便的示例性方法包括其中评估与细胞介导的应答相关的一种或多种细胞因子(如本文所鉴定的那些)的存在或水平的那些方法。类似地，评估或监测细胞介导的应答的发生和进展的基于细胞的方法适用于本发明中，并且可以包括细胞增殖或激活测定，包括旨在鉴定免疫细胞，如T淋巴细胞的一个或多个群体的激活或扩增的测定。
在某些实施方案中，本发明的方法引出细胞介导的免疫应答和体液应答这两者。
体液免疫应答是由B细胞产生的分泌的抗体介导的。分泌的抗体与入侵病原体表面上存在的抗原结合，从而对它们进行标记以破坏。
再次，评估和监测体液应答的发生或进展的方法是本领域公知的。这些包括抗体结合测定、ELISA、皮肤点刺测试等。
不希望受理论所束缚，本申请的发明人认为在一些实施方案中，肽缀合物刺激Toll样受体(TLR)。
Toll样受体(TLR)是高度保守的模式识别受体(PRR)，它们识别病原体相关分子模式并且向细胞传递危险信号(Kawai,T.,Akira,S.,Immunity2011,34,637-650)。TLR2是多种不同的细胞类型上表达的细胞表面受体，所述细胞类型包括树突状细胞、巨噬细胞以及淋巴细胞(Coffman,R.L.,Sher,A.,Seder,R.A.,Immunity 2010,33,492-503)。
TLR2识别广泛的微生物组分，包括脂多糖、肽聚糖以及脂胞壁酸。它在TLR当中是独特的，这是因为它与TLR1或TLR6形成异二聚体；能够与其它PRR形成复合物的能力可以解释TLR2的广泛范围的激动剂(Feldmann,M.,Steinman,L.,Nature 2005,435,612-619)。在配体结合和异二聚化时，经由MyD88通路进行信号转导，从而引起NFκB激活以及随之而来的炎性细胞因子和效应细胞因子的产生。
源自于细菌细胞壁组分的二酰化和三酰化脂肽已经作为TLR2激动剂被广泛研究(Eriksson,E.M.Y.,Jackson,D.C.,Curr.Prot.and Pept.Sci.2007,8,412-417)。已经报道了脂肽促进树突状细胞成熟，从而引起细胞表面上共刺激分子的上调和增强的抗原提呈。还已经报道了脂肽刺激巨噬细胞以释放细胞因子并且促进包括B细胞和CD8+T细胞的淋巴细胞的激活。
在一些实施方案中，肽缀合物具有TLR2激动剂活性。在一些实施方案中，所述肽缀合物具有与Pam3CSK4相当的TLR2激动剂活性。在一些实施方案中，所述肽缀合物具有Pam3CSK4的至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％的TLR2激动剂活性。在一些实施方案中，例如，在其中期望调节的免疫应答的实施方案中，所述肽缀合物具有比Pam3CSK4的活性小的TLR2激动剂活性。举例来说，所述肽缀合物具有Pam3CSK4的小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、或小于约10％的TLR2激动剂活性。
在一些实施方案中，肽缀合物和/或含有肽的缀合配偶体的肽包含与用于使所述含有脂质的缀合配偶体与所述肽缀合的氨基酸相邻的丝氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，所述含有肽的缀合配偶体的肽包含与用于使所述含有脂质的缀合配偶体与所述肽缀合的氨基酸相邻的丝氨酸氨基酸残基。该位置处丝氨酸氨基酸残基的存在可以增强TLR2结合。在一些实施方案中，丝氨酸氨基酸残基与用于使所述含有脂质的缀合配偶体与所述肽缀合的氨基酸的C末端结合。
如本领域技术人员在阅读本公开时所将了解的那样，肽缀合物可以包含表位，包括例如两个或更多个表位。在一些实施方案中，所述表位是肽表位。本领域技术人员将了解的是，在本发明中可以使用广泛的肽表位。
抗原
应当了解的是，许多抗原，例如肿瘤抗原或来自各种致病生物体的抗原已经被表征并且适用于本发明中，例如与包含EBV LMP2表位和本文具体叙述的肽的组合物、疫苗以及缀合物组合。能够引出免疫应答的所有抗原均被考虑，无论目前是否被表征。
本发明的肽和缀合物可应用于广泛的免疫治疗中，包括但不限于治疗和预防与EBV相关的病况或疾病，包括但不限于治疗和预防癌症和赘生性病况，包括霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、淋巴瘤、以及淋巴上皮瘤，包括NPC；以及治疗在免疫抑制期间或之后病毒的重新激活，例如在已经接受骨髓移植或造血干细胞移植的患者中。
还考虑了包含一个或多个氨基酸取代，如一个或多个保守氨基酸取代的抗原，特别是EBV LMP2肽抗原。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有化学上相似的或衍生的侧链的另一个残基置换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族例如已经在本领域中定义。这些家族包括例如具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。氨基酸类似物(例如磷酸化或糖基化的氨基酸)在本发明中也被考虑，被非天然存在的氨基酸取代的肽也被考虑，所述非天然存在的氨基酸包括但不限于N-烃基化的氨基酸(例如N-甲基氨基酸)、D-氨基酸、β-氨基酸、以及γ-氨基酸。
还具体考虑了抗原的片段和变体。
肽的“片段”是肽的亚序列，它执行酶活性或结合活性所需的功能和/或提供肽的三维结构，如多肽的三维结构。
如本文所用的术语“变体”指的是肽序列，包括例如不同于具体鉴定的序列的肽序列，其中一个或多个氨基酸残基缺失、取代、或添加。变体是天然存在的变体、或非天然存在的变体。变体来自相同的物种或来自其它物种并且可以涵盖同源物、旁系同源物以及直系同源物。在某些实施方案中，包括肽的肽的变体具有与野生型肽的活性相同或相似的生物活性。涉及肽的术语“变体”涵盖如本文所限定的肽的所有形式。
本领域技术人员将了解的是，在某些实施方案中，本发明的缀合物特别适用于刺激T细胞应答，例如在治疗包括癌症的赘生性疾病中。考虑了包含一种或多种肿瘤抗原的本发明的缀合物、组合物、以及疫苗。应当了解的是，被考虑用于制备本发明的组合物、疫苗、和/或肽缀合物的肿瘤抗原一般将包含一种或多种肽。在包括例如本发明的药物组合物的本发明的某些实施方案中，可以存在一种或多种另外的肿瘤抗原，包括其中一种或多种肿瘤抗原不包含肽的肿瘤抗原。肿瘤抗原通常被分类为独特抗原或共有抗原，后一组包括分化抗原、癌症特异性抗原、以及过表达抗原。每一类的抗原的实例适用于本发明中。用于对抗包括癌症的赘生性疾病的治疗，例如免疫治疗性治疗或疫苗接种中的代表性肿瘤抗原论述于下文中。具体考虑了包含使用那些免疫接种方法制备的一种或多种抗原的化合物、疫苗以及组合物。
在某些实施方案中，肿瘤抗原是含有肽的肿瘤抗原，如多肽肿瘤抗原或糖蛋白肿瘤抗原。在某些实施方案中，肿瘤抗原是含有糖的肿瘤抗原，如糖脂肿瘤抗原或神经节苷脂肿瘤抗原。在某些实施方案中，肿瘤抗原是表达含有多肽的肿瘤抗原的含有多核苷酸的肿瘤抗原，例如RNA载体构建体或DNA载体构建体，如质粒DNA。
适用于本发明中的肿瘤抗原涵盖多种分子，如(a)含有肽的肿瘤抗原，包括肽表位(长度可以在例如8个-20个氨基酸的范围，尽管该范围外的长度也是常见的)、脂多肽以及糖蛋白；(b)含有糖的肿瘤抗原，包括多糖、粘蛋白、神经节苷脂、糖脂以及糖蛋白，包括以及(c)表达抗原多肽的多核苷酸。再次，本领域技术人员将认识到本发明的缀合物或组合物中存在的肿瘤抗原通常将包含肽。然而，考虑了其中一种或多种缀合物包含本身不包含肽，但是例如与包含氨基酸或含有肽的缀合配偶体结合的肿瘤抗原的本发明的实施方案。类似地，考虑了其中存在本身不包含肽的一种或多种肿瘤抗原的本发明的组合物。
在某些实施方案中，肿瘤抗原是例如(a)与癌细胞相关的全长分子；(b)其同源物和修饰形式，包括具有缺失、添加和/或取代的部分的分子；以及(c)其片段，前提条件是所述片段保留抗原性或免疫原性。在某些实施方案中，肿瘤抗原以重组形式提供。在某些实施方案中，肿瘤抗原包括例如由CD8+淋巴细胞识别的I类限制抗原或由CD4+淋巴细胞识别的II类限制抗原。
共有肿瘤抗原一般被认为是由于允许发育阻遏基因的去阻遏的表观遗传变化而由肿瘤表达的原生的、未突变的序列。因此，共有抗原通常被认为优于过表达或分化相关的抗原，这是因为在正常组织中没有表达。此外，可以在许多癌症患者中靶向相同的抗原。举例来说，癌症-睾丸抗原NY-ESO-1存在于患有许多肿瘤的大多数患者中以及患有其它肿瘤的相当少的患者中。在另一个实施例中，乳腺分化肿瘤抗原NYBR-1和NYBR-1.1在一定比例的乳腺癌患者中被发现。共有肿瘤抗原因此代表了用于开发的有吸引力的靶标。
在本文具体考虑了将共有肿瘤抗原，如癌症-睾丸抗原，包括NY-ESO-1、CTSP-1、CTSP-2、CTSP-3、CTSP-4、SSX2、和SCP1；以及乳腺癌抗原NYBR-1和NYBR-1.1与本发明的肽或缀合物组合使用。
在一个示例性实施方案中，本发明的肽，例如含有肽的缀合配偶体或肽缀合物的肽包含源自于EBV LMP2的一个或多个表位。源自于LMP2的代表性表位示于下表1中。
表1：EBV LMP2表位
在一个具体考虑的实施方案中，本发明的肽，例如分离的、纯化的、或重组肽或含有肽的缀合配偶体或肽缀合物的肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成：来自SEQ ID NO:1至101中的任一个，例如来自SEQ ID NO:1至93中的任一个(包括例如SEQ ID NO:1至75中的任一个)的8个或更多个连续氨基酸、10个或更多个连续氨基酸、12个或更多个连续氨基酸、15个或更多个连续氨基酸、20个或更多个连续氨基酸、或25个或更多个连续氨基酸。
在各种实施方案中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:1至101中的任一个组成的组的多于一个氨基酸序列。在一个实施方案中，所述肽包含选自由SEQ ID NO:76-101组成的组或选自由SEQ ID NO:76-93组成的组的一个或多个氨基酸序列。
在一个具体考虑的实施方案中，本发明的肽，例如分离的、纯化的、或重组肽或含有肽的缀合配偶体或肽缀合物的肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成：来自下表2中所示的序列中的任一个的8个或更多个连续氨基酸、10个或更多个连续氨基酸、12个或更多个连续氨基酸、15个或更多个连续氨基酸、20个或更多个连续氨基酸、或25个或更多个连续氨基酸。
表2：LMP2长肽
类似地，包含抗原前列腺酸性磷酸酶(PAP)的前列腺疫苗Sipuleucel-T(APC8015，ProvengeTM)存在于95％的前列腺癌细胞中。至少部分地由于在显著比例的前列腺癌患者中产生功效的这种潜能，因此Sipuleucel-T在2010年由FDA批准用于治疗无症状的激素难治性前列腺癌。在本发明中具体考虑了在本发明的缀合物中使用PAP抗原。
独特抗原被认为是个体独有的或由小比例的癌症患者共有的那些抗原，并且通常由产生独特蛋白质序列的突变产生。独特肿瘤抗原的代表性实例包括突变的Ras抗原和突变的p53抗原。如已经阅读了本说明书的本领域技术人员所将了解的是，本发明的方法使得能够即可制备包含一种或多种独特肿瘤抗原的缀合物，例如以引出针对一种或多种独特肿瘤抗原的特异性T细胞应答，例如以准备进行患者特异性治疗。
因此，代表性肿瘤抗原包括但不限于(a)抗原，如RAGE、BAGE、GAGE以及MAGE家族多肽，例如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、以及MAGE-12(可以用于例如解决黑色素瘤、肺肿瘤、头颈部肿瘤、NSCLC、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤以及膀胱肿瘤)；(b)突变的抗原，例如p53(与各种实体肿瘤相关，例如结肠直肠癌、肺癌、头颈部癌)、p21/Ras(与例如黑色素瘤、胰腺癌以及结肠直肠癌相关)、CDK4(与例如黑色素瘤相关)、MUM1(与例如黑色素瘤相关)、胱天蛋白酶-8(与例如头颈部癌相关)、CIA 0205(与例如膀胱癌相关)、HLA-A2-R1701、β连环蛋白(与例如黑色素瘤相关)、TCR(与例如T细胞非霍奇金淋巴瘤相关)、BCR-abl(与例如慢性骨髓性白血病相关)、磷酸丙糖异构酶、MA 0205、CDC-27、以及LDLR-FUT；(c)过表达的抗原，例如半乳糖凝集素4(与例如结肠直肠癌相关)、半乳糖凝集素9(与例如霍奇金氏病相关)、蛋白酶3(与例如慢性骨髓性白血病相关)、肾母细胞瘤(Wilm's tumour)抗原-1(WT 1，与例如各种白血病相关)、碳酸酐酶(与例如肾癌相关)、醛缩酶A(与例如肺癌相关)、PRAME(与例如黑色素瘤相关)、HER-2/neu(与例如乳腺癌、结肠癌、肺癌以及卵巢癌相关)、甲胎蛋白(与例如肝细胞瘤相关)、KSA(与例如结肠直肠癌相关)、胃泌素(与例如胰腺癌和胃癌相关)、端粒酶催化蛋白、MUC-1(与例如乳腺癌和卵巢癌相关)、G-250(与例如肾细胞癌相关)、p53(与例如乳腺癌、结肠癌相关)、以及癌胚抗原(与例如乳腺癌、肺癌、以及胃肠道癌(如结肠直肠癌)相关)；(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑色素细胞分化抗原，如MART-1/Melan A、gp100、MC1R、黑色素细胞刺激激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1以及酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(与例如黑色素瘤相关)；(e)前列腺相关抗原，如PAP、前列腺血清抗原(PSA)、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2(与例如前列腺癌相关)；(f)免疫球蛋白独特型(与例如骨髓瘤和B细胞淋巴瘤相关)；以及(g)其它肿瘤抗原，如含有多肽的抗原和含有糖的抗原，包括(i)糖蛋白，如唾液酸Tn和唾液酸Le.sup.x(与例如乳腺癌和结肠直肠癌相关)以及各种粘蛋白；糖蛋白与载体蛋白偶联(例如MUC-1与KLH偶联)；(ii)脂多肽(例如与脂质部分连接的MUC-1)；(iii)多糖(例如Globo H合成己糖)，它们与载体蛋白(例如KLH)偶联；(iv)神经节苷脂，如GM2、GM12、GD2、GD3(与例如脑癌、肺癌、黑色素瘤相关)，它们也与载体蛋白(例如KLH)偶联。
适用于本发明中的其它代表性肿瘤抗原包括TAG-72(参见例如美国专利号5,892,020)；人癌抗原(参见例如美国专利号5,808,005)；来自骨癌细胞的TP1和TP3抗原(参见例如美国专利号5,855,866)；来自腺癌细胞的汤-弗二氏(Thomsen-Friedenreich，TF)抗原(参见例如美国专利号5,110,911)；来自人类前列腺腺癌的KC-4抗原(参见例如美国专利号4,743,543)；人类结肠直肠癌抗原(参见例如美国专利号4,921,789)；来自囊腺癌的CA125抗原(参见例如美国专利号4,921,790)；来自人类乳腺癌的DF3抗原(参见例如美国专利号4,963,484和5,053,489)；人类乳腺肿瘤抗原(参见例如美国专利号4,939,240)；人类黑色素瘤的p97抗原(参见例如美国专利号4,918,164)；癌瘤或血清类粘蛋白相关抗原(CORA)(参见例如美国专利号4,914,021)；人类乳腺癌的糖蛋白中的T和Tn半抗原、MSA乳腺癌糖蛋白；MFGM乳腺癌抗原；DU-PAN-2胰腺癌抗原；CA125卵巢癌抗原；YH206肺癌抗原、甲胎蛋白(AFP)、肝细胞癌抗原；癌胚抗原(CEA)；肠癌抗原；上皮肿瘤抗原(ETA)；乳腺癌抗原；酪氨酸酶；raf致癌基因产物；gp75；gp100；EBV-LMP 1和2；EBV-EBNA 1、2以及3C；HPV-E4、6、7；CO17-1A；GA733；gp72；p53；蛋白酶3；端粒酶；以及黑色素瘤神经节苷脂。这些和其它肿瘤抗原被考虑用于本发明中，无论目前是否被表征。
在某些实施方案中，肿瘤抗原源自于突变或改变的细胞组分。改变的细胞组分的代表性实例包括但不限于ras、p53、Rb、由肾母细胞瘤基因编码的改变的蛋白质、泛素、粘蛋白、由DCC、APC、和MCC基因编码的蛋白质、以及受体或受体样结构，如neu、甲状腺激素受体、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、胰岛素受体、表皮生长因子(EGF)受体、以及集落刺激因子(CSF)受体。
本发明中所用的含有多核苷酸的抗原包括编码多肽肿瘤抗原，如上列的那些的多核苷酸。在某些实施方案中，含有多核苷酸的抗原包括但不限于DNA或RNA载体构建体，如质粒载体(例如pCMV)，它们能够在体内表达多肽肿瘤抗原。
本发明还考虑了制备包含病毒抗原的缀合物，所述病毒抗原能够刺激T细胞以在正受到免疫抑制或已经受到免疫抑制的患者，例如已经接受骨髓移植、造血干细胞移植、或以其它方式正经受免疫抑制的患者中引出有效的抗病毒免疫。
类似地，与癌症的发病率增加相关或被报道会导致癌症的源自于病毒的抗原，如人类乳头瘤病毒、甲型肝炎病毒、以及乙型肝炎病毒被考虑用于本发明中。
举例来说，在某些实施方案中，肿瘤抗原包括但不限于p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒抗原、人类乳头瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7；乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒抗原、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白/亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。
上文所列或所提到的抗原是示例性的，而不限制本发明。
本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本发明的肽缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、以及药学上可接受的载体。
本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本发明的肽或其药学上可接受的盐或溶剂化物、以及药学上可接受的载体。
所述药物组合物可以包含有效量的本发明的两种或更多种肽、本发明的两种或更多种肽缀合物、或本发明的一种或多种肽和本发明的一种或多种肽缀合物的组合。
术语“药学上可接受的载体”指的是可以连同本发明的肽或肽缀合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及药学上可接受的载体一起向受试者施用的载体(佐剂或媒介物)。
可以用于组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(SEDDS)，如d-α-生育酚聚乙二醇1000丁二酸酯；用于药物剂型中的表面活性剂，如Tweens或其它相似的聚合物递送基质；血清蛋白，如人血清白蛋白；缓冲物质，如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇以及羊毛脂。环糊精，如α-环糊精、β-环糊精、和γ-环糊精、或化学修饰的衍生物，如羟基烃基环糊精，包括2-羟基丙基-β-环糊精和3-羟基丙基-β-环糊精、或其它溶解衍生物也可以有利地用于增强递送。油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂、或羧甲基纤维素或类似的分散剂，它们通常用于配制诸如乳液和/或悬浮液的药学上可接受的剂型。
所述组合物被配制以允许通过任何所选择的途径向受试者施用，所述途径包括但不限于口服或肠胃外(包括局部、皮下、肌内和静脉内)施用。
举例来说，所述组合物可以用针对预期施用途径和标准药学实践所选择的适当的药学上可接受的载体(包括赋形剂、稀释剂、辅剂、以及其组合)来配制。举例来说，所述组合物可以作为粉剂、液体、片剂或胶囊口服施用、或作为软膏剂、乳膏剂或洗剂局部施用。合适的制剂可以根据需要含有另外的试剂，包括乳化剂、抗氧化剂、调味剂或着色剂，并且可以适用于立即释放、延迟释放、改良释放、持续释放、脉冲释放或受控释放。
所述组合物可以被配制以优化生物利用度、免疫原性、或将血浆浓度、血液浓度、或组织浓度维持在免疫原性或治疗范围内，包括持续长时间。受控递送制剂也可以用于优化例如作用部位处的抗原浓度。
所述组合物可以被配制用于定期施用，例如以提供持续的暴露。引出有益的免疫应答的策略，例如使用一次或多次“加强”疫苗接种的那些是本领域公知的并且可以采用这样的策略。
可以经由肠胃外途径施用所述组合物。肠胃外剂型的实例包括活性剂的水溶液、等渗盐水或5％葡萄糖、或其它公知的药学上可接受的赋形剂。例如环糊精或本领域技术人员公知的其它增溶剂可以用作药物赋形剂以递送治疗剂。
适用于口服施用的剂型的实例包括但不限于片剂、胶囊、糖锭、或类似形式、或任何液体形式，如糖浆、水溶液、乳液等，它们能够提供治疗有效量的组合物。胶囊可以含有任何标准的药学上可接受的材料，如明胶或纤维素。片剂可以根据常规程序，通过压制活性成分与固体载体和润滑剂的混合物来配制。固体载体的实例包括淀粉和糖、膨润土。活性成分也可以含有粘合剂(例如乳糖或甘露糖醇)、常规填充剂、以及压片剂的硬壳片剂或胶囊的形式施用。
适用于透皮施用的剂型的实例包括但不限于透皮贴剂、透皮绷带等。
适用于局部施用组合物的剂型的实例包括任何洗剂、棒状剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、凝胶剂等，无论是直接施用到皮肤上还是经由中间物，如垫、贴片等。
适用于栓剂施用组合物的剂型的实例包括插入到身体孔道中的任何固体剂型，特别是经直肠、阴道以及尿道插入的那些。
适用于注射组合物的剂型的实例包括经由推注进行的递送，如通过静脉内注射、皮下、真皮下、以及肌内施用或口服施用进行的单次或多次施用。
适用于贮库施用组合物的剂型的实例包括肽或肽缀合物的小丸或其中肽或肽缀合物被包封在可生物降解的聚合物、微乳液、脂质体的基质中或被微封装的固体形式。
用于组合物的输注装置的实例包括用于提供期望次数的剂量或稳态施用的输注泵，并且包括可植入药物泵。
用于组合物的可植入输注装置的实例包括其中肽或肽缀合物被封装在可生物降解的聚合物或合成聚合物内或分散在整个可生物降解的聚合物或合成聚合物中的任何固体形式，所述聚合物诸如有机硅、有机硅橡胶、硅橡胶或类似聚合物。
适用于经粘膜递送组合物的剂型的实例包括用于灌肠剂、子宫托、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂、雾化溶液、粉剂以及类似制剂的储存溶液，除了活性成分之外，它们还含有本领域已知是适当的载体。这样的剂型包括适用于吸入或吹入组合物的形式，包括包含于药学上可接受的水性溶剂或有机溶剂、或其混合物中的溶液和/或悬浮液和/或粉剂的组合物。组合物的经粘膜施用可以利用任何粘膜，但是通常利用鼻、颊、阴道以及直肠组织。适用于经鼻施用组合物的制剂可以液体形式施用，例如喷鼻剂、滴鼻剂、或通过雾化器进行气溶胶施用，包括聚合物颗粒的水性或油性溶液。制剂可以被制备成例如于盐水中的水溶液、使用苯甲醇或其它合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、氟碳化合物、和/或本领域已知的其它增溶剂或分散剂的溶液。
适用于颊面或舌下施用组合物的剂型的实例包括糖锭、片剂等。适用于眼科施用组合物的剂型的实例包括包含于药学上可接受的水性溶剂或有机溶剂中的溶液和/或悬浮液的插入物和/或组合物。
包括疫苗的组合物的制剂的实例可以见于例如Sweetman,S.C.(编著).《马丁代尔药物大典(Martindale.The Complete Drug Reference)》,第33版,芝加哥的医药出版社(Pharmaceutical Press,Chicago),2002,第2483页；Aulton,M.E.(编著)《药剂学：剂型设计科学(Pharmaceutics.The Science of Dosage Form Design)》,爱丁堡的丘吉尔利文斯通出版社(Churchill Livingstone,Edinburgh),2000,第734页；以及Ansel,H.C.,Allen,L.V.和Popovich,N.G.《药物剂型和药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems)》,第7版,利平科特出版公司(Lippincott)1999,第676页。用于制造药物递送系统的赋形剂描述于本领域技术人员已知的各种出版物中，包括例如Kibbe,E.H.《药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》,第3版,华盛顿的美国药学协会(American Pharmaceutical Association,Washington),2000,第665页。《美国药典(United States Pharmacopeia)》也提供了改良释放口服剂型的实例，包括被配制成片剂或胶囊的那些。参见例如美国药典23/国家处方集(National Formulary)18，马里兰州罗克维尔的美国药典委员会公司(The United States Pharmacopeial Convention,Inc.,Rockville MD)，1995年(下文被称作“USP”)，它还描述了确定延长释放和延迟释放片剂和胶囊的药物释放能力的具体测试。延长释放和延迟释放制品的药物释放的USP测试是基于相对于经过的测试时间药物从剂量单位的溶解。各种测试设备和程序的说明可以见于USP中。关于分析延长释放剂型的进一步指导已经由F.D.A.提供(参见《行业指导：延长释放口服剂型：开发、评价、以及体外/体内相关性的应用(Guidance for Industry.Extendedrelease oral dosage forms:development,evaluation,and application of in vitro/in vivo correlations)》,马里兰州罗克维尔(Rockville,MD)：食品和药物管理局的药物评价和研究中心(Center for Drug Evaluation and Research,Food and DrugAdministration),1997)。
虽然组合物可以包含一种或多种外在佐剂，但是有利的是，在一些实施方案中，这不是必需的。在一些实施方案中，所述肽缀合物包含表位并且是自佐剂化的。
本发明提供了一种在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的肽缀合物或肽。本发明还涉及本发明的肽缀合物或肽用于在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的用途、以及本发明的肽缀合物或肽用于制造用于在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的药物的用途。
本发明还提供了一种在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的药物组合物。本发明还涉及本发明的药物组合物用于在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的用途、以及本发明的一种或多种肽或本发明的一种或多种肽缀合物用于制造用于在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的药物的用途。
本发明提供了一种引出受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的肽。本发明还涉及本发明的缀合物用于引出免疫应答的用途、以及本发明的肽缀合物用于制造用于引出受试者的免疫应答的药物的用途。
本发明提供了一种对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的肽。本发明还涉及本发明的缀合物用于引出免疫应答的用途、以及本发明的肽缀合物用于制造用于引出受试者的免疫应答的药物的用途。
在本文考虑了施用或使用本发明的一种或多种肽和/或本发明的一种或多种肽缀合物，例如一种或多种肽以及一种或多种肽缀合物，以在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答。
在施用或使用两种或更多种肽、两种或更多种肽缀合物、或一种或多种肽和一种或多种肽缀合物的情况下，可以同时、依次、或分开施用或使用所述两种或更多种肽、两种或更多种肽缀合物、或一种或多种肽和一种或多种肽缀合物。
“受试者”指的是作为哺乳动物的脊椎动物，例如人类。哺乳动物包括但不限于人类、农畜、竞技动物、宠物、灵长类动物、小鼠以及大鼠。
“有效量”是足以实现有益的或所期望的结果(包括临床结果)的量。可以通过各种施用途径在一次或多次施用中施用有效量。
有效量将根据所示的疾病、疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康情况、所施用的化合物的效力、施用方式和所期望的治疗以及其它因素而变化。本领域技术人员将能够考虑到这些任何其它相关因素来确定适当的剂量。
可以在体外和体内评价组合物的功效。举例来说，可以在体外或体内测试组合物诱导细胞介导的免疫应答的能力。对于体内研究，可以向动物(例如小鼠)喂食或注射组合物，然后评估它在引出免疫应答方面的作用。基于结果，可以确定适当的剂量范围和施用途径。
所述组合物可以按单次剂量或多次剂量方案施用。在初次免疫接种方案和/或加强免疫接种方案中可以使用多次剂量。
在某些实施方案中，引出免疫应答包括提高或增强免疫应答。在示例性实施方案中，引出免疫应答包括引出体液应答和细胞介导的应答。
在某些实施方案中，引出免疫应答提供免疫。
引出免疫应答以治疗疾病或病况。本领域技术人员将了解的是，本文所述的肽和肽缀合物可用于治疗与EBV相关的多种疾病和病况，包括选自以下各项的一种或多种疾病或病况：EBV相关赘生性病况，包括B细胞和T细胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、以及淋巴上皮瘤样癌，包括但不限于鼻咽癌(NPC)。
在一些实施方案中，所述疾病或病况是感染性疾病、癌症、或骨髓移植后或出于任何其它原因诱导深度免疫抑制后的病毒重新激活。
如本文所用的术语“治疗(treatment)”以及相关术语，如“治疗(treating)”和“治疗(treat)”一般指的是治疗人类或非人类受试者，其中实现一定的所期望的治疗作用。所述治疗作用可以例如是抑制、减轻、改善、停止、或预防疾病或病况。
所述组合物可以用于引出全身免疫和/或粘膜免疫。增强的全身免疫和/或粘膜免疫可以反映在增强的TH1和/或TH2免疫应答。增强的免疫应答可以包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA的产生增加。
本发明在于前述内容，并且还设想了如下构想，其中下文仅给出实施例而决不限制其范围。
实施例
实施例1：缀合物200、20、22、以及26的制备
1.1一般细节
可商购获得的起始材料购自阿科斯有机品公司(Acros Organics)、阿贾克斯精细化工公司(Ajax Finechem)、阿法埃莎公司(Alfa Aesar)、CEM公司、GL生物化学公司(GL-Biochem)、默克公司(Merck)、诺瓦生物化学公司(NOVA Biochem)、西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)以及TCI公司并且原样使用。无水溶剂是经由在N2或氩气气氛下蒸馏来制备的。将四氢呋喃(THF)经过钠/二苯甲酮羰游基新鲜蒸馏。将甲醇(MeOH)和甲苯经过氢化钙新鲜蒸馏。除非另有说明，否则产率指的是在色谱和光谱(1H NMR)上均质的材料。
在Merck Kieselgel F254 200μm二氧化硅板上进行薄层色谱(TLC)。使用紫外光作为于碱性水溶液中的高锰酸钾和于乙醇溶液中的香草醛的可视化剂和一般显影剂。所使用的具体显影剂是用于鉴定伯胺的含有酸的茚三酮乙醇溶液。当使用任何显影剂时，进行加热。使用硅胶(0.063mm-0.100mm)进行快速柱色谱。
在室温在以400MHz(对于1H核)和100MHz(对于13C核)操作的Bruker DRX400光谱仪上在CDCl3或D2O中获取核磁共振(NMR)谱。1H谱和13C谱的参考峰分别被设定为δ0.00和δ77.0(CDCl3)以及δ4.79(于D2O中的1H谱)。NMR数据是以作为δ尺度上的百万分率(ppm)的化学位移和以赫兹(Hz)为单位的偶合常数的值报告的。多重性被报告为s＝单峰；d＝双峰；t＝三重峰；q＝四重峰；dd＝双二重峰；dt＝双三重峰；tt＝三三重峰；dq＝双四重峰；dqn＝双五重峰；sx＝六重峰；br s＝宽单峰；以及m＝多重峰。使用Cq的归属来表示季碳。
在Bruker microOTOF-Q II质谱仪上以5000的标称分辨率获得高分辨率质谱。在具有Finnigan Surveyor MSQ Plus质谱仪的Dionex UltiMate 3000HPLC系统或具有Hewlett Packard系列1100MSD质谱仪的Agilent 1120 Compact LC系统上获取分析型高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱(LC-MS)色谱图。使用MeCN/H2O+0.1％TFA溶剂系统进行分析型反相(RP)HPLC。在Dionex UltiMate 3000HPLC系统上，使用MeCN/H2O+0.1％TFA溶剂系统进行半制备型RP HPLC。使用CEM Liberty自动化微波系统进行微波反应。
1.2肽链延长的一般方法
手动合成方法
将溶胀的肽-树脂用于DMF中20％v/v的哌啶(5.0mL)处理并且在室温振荡20分钟。将溶液排出并且用DMF(×2)和DCM(×2)洗涤树脂。添加Fmoc-AA-OH(2.0当量)、HBTU(2.0当量)以及iPr2NEt(4.0当量)于DMF(1mL)中的偶联混合物并且将树脂振荡1小时。将树脂排出并且再次洗涤。对于序列中的其余残基重复所述程序。
自动化合成方法(标准，0.2mmol规模)
将肽-树脂转移到Tribute自动化肽合成器的反应容器中。用Fmoc脱保护和Fmoc-AA-OH偶联步骤的循环来进行自动化合成。通过添加于DMF中20％v/v的哌啶(6.0mL)并且搅拌(2×7分钟)来进行脱保护。在排出树脂和DMF洗涤(4mL×3)之后，用溶解在HBTU中的5当量Fmoc-AA-OH(0.24mM，于DMF中，4mL)进行偶联步骤。在碱添加步骤中利用于DMF中2M的N-甲基吗啉(NMM)(4mL)。偶联进行1小时。在DMF洗涤步骤之后，开始脱保护和偶联的下一个循环，重复直到所有的氨基酸均被偶联为止。
用于偶联半胱氨酸衍生物的程序(0.1mmol规模)
将肽-树脂在1:1的CH2Cl2:DMF中溶胀30分钟，然后排出。将Cys氨基酸(0.2mmol，2当量)、BOP(0.4mmol，4当量)以及HOBt·H2O(0.4mmol，4当量)的偶联混合物溶解在1:1的CH2Cl2:DMF(2mL)中。然后添加2,4,6-三甲基吡啶(0.4mmol，4当量)并且将所得溶液添加到肽-树脂中。将树脂搅拌1小时或直到茚三酮测试指示没有游离胺为止。然后将树脂排出，用DMF(2×)和CH2Cl2(2×)洗涤，并且干燥。
茚三酮测试程序
获取一小部分树脂，用CH2Cl2洗涤并且使其干燥。将各自1滴的5％v/v茚三酮于EtOH中的溶液、80％w/v苯酚于EtOH中的溶液以及2％v/v KCN于吡啶中的溶液添加到树脂中并且将混合物在90℃加热2分钟。蓝色珠粒和溶液指示游离伯胺的存在，而黄色指示不存在游离氨基。
1.3氨基酸缀合物200的制备
N-芴基甲氧羰基-[R]-半胱氨酸
将Fmoc-Cys(Trt)-OH(1.0g，1.7mmol)溶解在CH2Cl2(50mL)中。添加TFA(1.5mL，19.6mmol)和iPr3SiH(0.75mL)，从而使得溶液变成黄色。将溶液在室温搅拌2小时，此时溶液变成无色。通过添加Na2CO3·H2O将混合物碱化到pH 9并且用EtOAc洗涤。将溶液用10MHCl酸化，用EtOAc萃取并且在真空中浓缩，得到白色粉末和粉红色残余物。将粉末和残余物溶解在4:1的MeCN:H2O中并且冻干，得到粗制的粉白色粉末(424mg，粗产率73.1％)。使这一粗产物进行下文所述的硫醇-烯反应。
(R)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-((2-(棕榈酰基氧基)乙基)硫基)丙酸(200)
热引发(Li,J.Dong,S.等,《作为蛋白质科学中扩展资源的化学物质：完全合成和完全活性的人类甲状旁腺激素相关蛋白(1-141)(Chemistry as an Expanding Resourcein Protein Science:Fully Synthetic and Fully Active Human ParathyroidHormone-Related Protein(1-141))》,Angewandte Chemie International Edition2012,51(49),12263-12267)。
将Fmoc-Cys-OH(100mg，0.29mmol)、棕榈酸乙烯酯(476μL，1.5mmol)以及AIBN(9.6mg，59μmol)溶解在经过脱气的1,2-二氯乙烷(3mL)中。然后将反应混合物在回流(90℃)下加热24小时，之后TLC指示Fmoc-Cys-OH完全消耗。然后将溶液冷却到室温。在减压下去除溶剂。通过质谱确认粗制的反应混合物中所期望的产物200的存在。
光引发
将Fmoc-Cys-OH(100mg，0.29mmol)溶解在经过脱气的无水DMF(500μL)中。将棕榈酸乙烯酯(90μL，0.3mmol)和DMPA(5.0mg，20μmol)溶解在经过脱气的CH2Cl2(200μL)中。将这两种溶液组合并且在标准光化学设备中将所得混合物照射6小时(365nm UV)。当通过TLC没有观测到反应混合物发生进一步的变化时，在减压下去除溶剂。将粗产物通过硅胶快速色谱(3:1EtOAc:正己烷+2％AcOH)纯化，继而从1:1H2O:MeCN+0.1％TFA中冻干，得到呈粉末状白色固体状的标题化合物(24mg，13％)。通过质谱确认所期望的产物200的结构。
1.4肽缀合物20、22、以及26的制备
肽
AcN-Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Asp-Arg-His-Ser-Asp-Tyr-Gln-Pro-Leu-Gly-Thr-Gln-Asp-Gln-Ser-Leu-Tyr-Leu-Gly-Leu-Gln-His-Asp-Gly-Asn-Asp-Gly-Leu-OH 25
向在1:1的CH2Cl2:DMF中预先溶胀的氨甲基聚苯乙烯(PS)树脂(0.20g，1.0mmol/g负载，0.2mmol规模)中添加Fmoc-L-Val-O-CH2-phi-OCH2-CH2-COOH(155.2mg，0.3mmol)、HBTU(113.8mg，0.3mmol)以及iPr2NEt(104μL，0.6mmol)于DMF(3mL)中的偶联混合物。将树脂在室温振荡2小时，之后进行茚三酮测试以监测完全偶联。然后通过在室温将树脂用于DMF中20％v/v的哌啶(5mL)处理20分钟将Fmoc-Val氨基脱保护。将树脂转移到Tribute自动化肽合成器中。使用一般自动化偶联方法进行直到并且包括Ser残基的链延长。通过添加Fmoc-Cys(Trt)-OH(235mg，0.4mmol)、BOP(360mg，0.8mmol)、HOBt·H2O(120mg，0.8mmol)以及2,4,6-三甲基吡啶(120μL，0.8mmol)于1:1的CH2Cl2:DMF(2mL)中的混合物来手动进行Fmoc-Cys(Trt)-OH残基的偶联。将树脂在室温振荡1小时，之后进行茚三酮测试以监测完全偶联。通过在室温将树脂用于DMF中20％v/v的哌啶(5mL)处理20分钟来实现最终的Fmoc脱保护。
在Fmoc脱保护之后，通过将于DMF(3mL)中的乙酸酐(50μL)和iPr2NEt(50μL)添加到树脂中来进行N-乙酰化。然后在室温将树脂振荡30分钟，之后进行茚三酮测试以确保没有剩余的游离胺。将树脂排出，用DMF和CH2Cl2洗涤并且空气干燥。将TFA:H2O:DODT:iPr3SiH(94:2.5:2.5:1％v/v，10.0mL)的切割混合物添加到干树脂中并且在室温将混合物振荡4小时。然后用冷乙醚处理切割混合物以使粗制肽沉淀，将其以4000rpm离心5分钟。弃去上清液并且用乙醚洗涤沉淀物，之后重复旋转步骤。然后弃去乙醚相并且用N2流干燥肽。然后将粗制肽从H2O+0.1％TFA中冻干。使粗产物进行下文所概述的硫醇-烯反应步骤。
Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
向在1:1的CH2Cl2:DMF中预先溶胀的氨甲基聚苯乙烯(PS)树脂(0.20g，1.0mmol/g负载，0.2mmol规模)中添加Fmoc-Rink-酰胺-OH(216mg，0.4mmol)、HBTU(151.8mg，0.4mmol)以及iPr2NEt(140μL，0.8mmol)于DMF(2mL)中的偶联混合物。将树脂在室温振荡1小时，之后进行茚三酮测试以确定完全偶联。然后通过在室温将树脂用于DMF中20％v/v的哌啶(5mL)处理20分钟将连接基团氨基脱保护。将树脂转移到Tribute自动化肽合成器中。使用一般自动化偶联方法进行直到并且包括Ser残基的链延长。通过添加Fmoc-Cys(Trt)-OH(235mg，0.4mmol)、BOP(360mg，0.8mmol)、HOBt·H2O(120mg，0.8mmol)以及2,4,6-三甲基吡啶(120μL，0.8mmol)于1:1的CH2Cl2:DMF(2mL)中的混合物来手动进行Cys残基的偶联。将树脂在室温振荡1小时，之后进行茚三酮测试以确定完全偶联。通过在室温将树脂用于DMF中20％v/v的哌啶(5mL)处理20分钟来实现最终的Fmoc脱保护。将树脂排出，用DMF和CH2Cl2洗涤并且空气干燥。将TFA:H2O:DODT:iPr3SiH(94:2.5:2.5:1％v/v，10.0mL)的切割混合物添加到干树脂中并且在室温将混合物振荡2小时。然后用冷乙醚处理切割混合物以使粗制肽沉淀，将其以4000rpm离心5分钟。弃去上清液并且用乙醚洗涤沉淀物，之后重复旋转步骤。然后弃去乙醚相并且用N2流干燥肽。然后将粗制肽从H2O+0.1％TFA中冻干。使粗产物进行下文所概述的硫醇-烯反应步骤。
Ac-Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 24
向在1:1的CH2Cl2:DMF中预先溶胀的氨甲基聚苯乙烯(PS)树脂(0.20g，1.0mmol/g负载，0.2mmol规模)中添加Fmoc-Rink-酰胺-OH(216mg，0.4mmol)、HBTU(151.8mg，0.4mmol)以及iPr2NEt(140μL，0.8mmol)于DMF(2mL)中的偶联混合物。将树脂在室温振荡1小时，之后茚三酮测试指示完全偶联。然后通过在室温将树脂用于DMF中20％v/v的哌啶(5mL)处理20分钟将连接基团氨基脱保护。将树脂转移到Tribute自动化肽合成器中。使用一般自动化偶联方法进行直到并且包括Ser(Trt)残基的链延长。通过添加Fmoc-Cys(Trt)-OH(235mg，0.4mmol)、BOP(360mg，0.8mmol)、HOBt·H2O(120mg，0.8mmol)以及2,4,6-三甲基吡啶(120μL，0.8mmol)于1:1的CH2Cl2:DMF(2mL)中的混合物来手动进行Cys残基的偶联。将树脂在室温振荡1小时，之后进行茚三酮测试以确定完全偶联。在Fmoc脱保护之后，通过将于DMF(3mL)中的乙酸酐(50μL)和iPr2NEt(50μL)添加到树脂中来进行N-乙酰化。然后在室温将树脂振荡30分钟，之后进行茚三酮测试以确定没有剩余的游离胺。将树脂排出，用DMF和CH2Cl2洗涤并且空气干燥。将TFA:H2O:DODT:iPr3SiH(94:2.5:2.5:1％v/v，10.0mL)的切割混合物添加到干树脂中并且在室温将混合物振荡2小时。然后用冷乙醚处理切割混合物以使粗制肽沉淀，将其以4000rpm离心5分钟。弃去上清液并且用乙醚洗涤沉淀物，之后重复旋转步骤。然后弃去乙醚相并且用N2流干燥肽。然后将粗制肽从H2O+0.1％TFA中冻干。使粗产物进行下文所概述的硫醇-烯反应步骤。
肽缀合物
Ac-Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 24和棕榈酸乙烯酯22的硫醇-烯反应产物
向粗制肽24(25mg，32.6μmol)和DMPA(3.3mg，13.1μmol)于NMP(4mL)中的溶液中添加棕榈酸乙烯酯(52.9μL，0.16mmol)。在标准UV光化学设备中将所得混合物在搅拌下以365nm照射1小时。通过质量分析检测所期望的产物22。将粗产物22在Phenomenex GeminiC18柱上，运行5％-65％MeCN:H2O+0.1％TFA(每分钟3％MeCN，50℃)的梯度，经由半制备型RP HPLC来纯化。使用质谱确认所期望的产物22的结构。
Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2和棕榈酸乙烯酯20的硫醇-烯反应产物
使粗制的Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2与5当量的棕榈酸乙烯酯、0.4当量的DMPA在NMP中进行硫醇-烯反应，以365nm照射1小时，得到所期望的产物20(Pam-CSK4)，通过MS分析确定其身份。
AcN-Cys-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Asp-Arg-His-Ser-Asp-Tyr-Gln-Pro-Leu-Gly-Thr-Gln-Asp-Gln-Ser-Leu-Tyr-Leu-Gly-Leu-Gln-His-Asp-Gly-Asn-Asp-Gly-Leu-OH 25和棕榈酸乙烯酯26的硫醇-烯反应产物
向粗制肽25(20mg)和DMPA(1.2mg，4.74μmol)于NMP(3mL)中的溶液中添加棕榈酸乙烯酯(19.2μL，59.3μmol)。在标准光化学设备中将所得混合物在搅拌下以365nm照射1小时。通过质量分析检测所期望的产物26。将粗产物26在Phenomenex Gemini C18柱上，运行5％-65％MeCN:H2O+0.1％TFA(每分钟3％MeCN，50℃)的梯度，经由半制备型RP HPLC来纯化。使用质谱确认所期望的产物26和氧化的Met(O)副产物的结构。
1.5在肽上进行硫醇-烯反应的一般方法
向粗制或纯化的肽(10mM)、DTT(30mM)以及DMPA(4mM)于DMSO中的溶液中添加棕榈酸乙烯酯(50mM)。在标准UV光化学设备中将所得混合物在搅拌下以365nm照射15分钟。通过ESI质量分析检测所期望的产物。为了实现完全转化，有时需要再添加DMPA光引发剂。将粗产物在Phenomenex Gemini C18柱上，运行1％-65％MeCN:H2O+0.1％TFA(每分钟3％MeCN)的梯度，经由半制备型RP HPLC来纯化。将汇集的级分冻干以得到呈白色粉末状的纯产物。
1.6讨论
在1,2-二氯乙烷中，使用5当量的烯烃和0.2当量的作为自由基引发剂的AIBN使Fmoc-Cys-OH与棕榈酸乙烯酯进行热反应。
使所述反应在回流(90度)下进行24小时。在某些实施方案中，还使用微波加热(100W，1小时)。通过TLC检测所期望的产物。在一些实施方案中，还形成许多副产物。
用1当量的棕榈酸乙烯酯和0.2当量的作为光引发剂的DMPA进行所述反应的光引发。在经过脱气的DMF:DCM溶剂混合物中进行反应，在标准光化学设备中用365nm UV光照射1小时。通过TLC监测Fmoc-Cys-OH的接近完全转化。理想的是，形成最少的副产物。纯化以大致合理到高的产率提供产物200。使用2当量的棕榈酸乙烯酯在纯化之后以高产率提供200。
使用NAc-CSK4进行硫醇-烯反应。如上文所述合成所需的肽基序24。在使Rink-酰胺连接基团连接到氨甲基树脂之后，使用自动化Fmoc-SPPS(标准偶联条件)形成SK4序列。然后使用减少差向异构化的条件手动使Fmoc-Cys(Trt)-OH偶联。然后进行N-乙酰化。
使用质量分析确定在从树脂切割肽时是否由于半胱氨酸的叔丁基化(+56)而发生副产物的形成。在某些实施方案中，利用Fmoc-Ser(Trt)-OH代替Fmoc-Ser(t-Bu)-OH重复NAc-CSK4的合成，这用于产生不含半胱氨酸烃基化产物的产物。切割肽，然后将其冻干。
然后使粗制肽24与棕榈酸乙烯酯进行硫醇-烯反应。N-甲基吡咯烷酮(NMP)有效地将亲水性CSK4肽和疏水性棕榈酸乙烯酯分子这两者溶剂化。
使用过量的棕榈酸乙烯酯(最多20当量)对粗制肽和纯化肽这两者进行使用AIBN和微波加热的热引发。在某些实施方案中，反应的光引发将提供更好的结果。在某些实施方案中，在使用DMPA作为光引发剂的情况下使用粗制肽，所述反应将在照射1小时之后进行到完成(5当量棕榈酸乙烯酯、0.4当量DMPA，在2mL NMP中)。通过MS确认所期望的产物(理论上，>90％转化率，60％纯度(HPLC))。
有利的是，在硫醇-烯偶联之前不需要切割之后的纯化。通过RP-HPLC进行的纯化通常是低效的，>50％的材料损失是常见的。一般来说，有利的是，尽可能减少所需的HPLC纯化步骤的数目。
通过半制备型RP-HPLC，使用Phenomenex C18柱，运行5％-95％MeCN:H2O+0.1％TFA(每分钟3％MeCN)的梯度来实现N-乙酰化单酰基脂肽22的纯化。然后将纯化的肽冻干以得到呈白色粉末状的所期望的产物。
在某些实施方案中，将肽浓度增加到25mM将使得副产物形成有小幅减少(例如，>90％转化率，80％纯度(HPLC))。在某些情况下，将浓度降低到5mM将具有相反的影响。
在某些情况下，在NMP:H2O:DMSO(4:2:1)的混合物中，在谷胱甘肽(GSH)(3当量)存在下用5mM的肽浓度进行反应将引起混合的二硫化物形成(例如，50％转化率，75％纯度(HPLC))。在某些情况下，在NMP中使用2,2′-(亚乙二氧基)二乙烷硫醇(DODT)(3当量)用5mM的肽浓度将产生产物的复杂混合物(例如，80％转化率(HPLC))。
在某些实施方案中，将3当量DTT添加到反应混合物(于NMP中10mM的肽)中使得没有观测到由棕榈酸乙烯酯调聚所产生的副产物、或混合的二硫化物，并且所述反应以高转化率进行(例如，>90％转化率，85％纯度(HPLC))。使用DTT，还有可能在DMSO中进行反应(25mM肽)，DMSO是一种良性的和更通用的溶剂(例如，以实现90％转化率，>95％纯度(HPLC))。
还使用非乙酰化类似物CSK4进行硫醇-烯反应。利用上文所述的程序进行CSK4基序的合成。然后从树脂切割肽，并且将其冻干。在某些实施方案中，在NMP中使用5当量的棕榈酸乙烯酯、0.4当量的DMPA，以365nm照射1小时来使粗产物与棕榈酸乙烯酯平稳地进行硫醇-烯反应，得到所期望的产物20(Pam-CSK4)，通过MS分析确认其身份。
还使棕榈酸乙烯酯与包含EBV LMP2表位的长肽LMP2S-1[SEQ ID NO:5]进行硫醇-烯反应。
通过自动化Fmoc-SPPS，使用标准条件形成LMP2S-1序列。然后使K4标签和丝氨酸残基与序列的N末端偶联，在本文被示为SEQ ID NO:4。然后从合成器中取出肽基树脂并且使用标准条件手动使半胱氨酸残基偶联。然后进行N-乙酰化。然后从树脂切割肽并且将其冻干，以良好产率得到白色粉末。
使用光引发使未受保护的肽25与棕榈酸乙烯酯进行硫醇-烯反应，如对于肽20和肽22所述的那样。进行质量分析以确定向棕榈酰化产物26的转化。通过半制备型RP-HPLC，使用Phenomenex C18柱，运行5％-95％MeCN:H2O+0.1％TFA的梯度来实现纯化。将纯化的肽冻干以得到呈白色粉末状的所期望的产物以及相应的Met(O)产物。
还遵循上文所述的一般程序使粗制物25与棕榈酸乙烯酯进行硫醇-烯反应。进行ESI-MS和HPLC分析以确定向棕榈酰化产物26的良好转化。通过半制备型RP-HPLC实现纯化，得到所期望的产物，例如以>95％的纯度。
实施例2：肽缀合物20、22、以及26的生物活性
2.1程序
激活全血中的人类单核白细胞
按一式两份将100μl的肝素化全血(WB)与100nM、1μM以及10μM的每一种化合物一起孵育，并且在5％CO2加湿孵育箱中在37℃孵育过夜。使用Pam3CSK4(10μM；EMCMicrocollections公司)作为阳性对照。为了检测单核白细胞的激活，在室温将WB样品用抗CD14-FITC、抗HLA-DR-Alexa700、抗CD80-PE-Cy7、抗CD40-PE、抗CD86-APC、抗CD16-APC-Cy7(全部均来自Biolegend公司)染色20分钟，避光。在孵育后，添加2ml BD FACS裂解液(碧迪生物科技公司(BD Biosciences))，在室温孵育15分钟，然后用冰冷洗涤缓冲液(PBS、1％人类血清)洗涤两次。在BD FACS Aria II(Becton Dickinson公司)上进行数据采集并且使用FlowJo软件7.6.5版(TreeStar公司)进行分析。通过对CD14+HLADR+细胞进行门控来检测单核白细胞上的CD80受体表达。
使用HekBlue细胞进行的Toll样受体2(TLR2)激动
HEK-BlueTM-hTLR2和HEK-BlueTM-mTLR2购自Invivogen公司。这些HEK-Blue细胞分别是通过共转染报告基因SEAP(分泌的胚胎碱性磷酸酶)和人类TLR2或鼠类TLR2这两者而产生的。SEAP报告基因在与五个AP-1和五个NFkB结合位点融合的IFN-B最小启动子控制下。根据制造商的说明书培养细胞。在测定当天，以所选择的浓度将构建体于20μl体积的无内毒素水中添加到96孔板中。将HEK-BlueTM-hTLR2或HEK-BlueTM-hTLR2细胞以约2.83×104个细胞/毫升重悬于HEK-BlueTM检测培养基中，并且立即添加180ml的细胞悬浮液(每孔约5×104个细胞)。将细胞在37℃在5％CO2中孵育过夜。使用EnSpire板读数器(珀金埃尔默公司)在635nM对SEAP表达进行定量。
用于检测TLR2瞬时转染的Hek293细胞的IL-8分泌的方法
使用含有10％FBS的DMEM(所述培养基没有补充以抗生素)将Hek-293细胞以每孔3×104个细胞/50μl接种到96孔板中。将细胞用pFLAG-TLR2质粒和pcDNA3.1(由Shimizu馈赠，如Shimizu,T.,Y.Kida以及K.Kuwano(2005).“来自肺炎支原体的二棕榈酰化脂蛋白经由TLR1、TLR2、以及TLR6激活NF-κB(A dipalmitoylated lipoprotein from Mycoplasmapneumoniae activates NF-kappa B through TLR1,TLR2,and TLR6)”,J Immunol 175(7):4641-4646中所报道)的组合或仅用对照质粒(pcDNA3.1)转染。在Opti-MEM中以100ngDNA在0.3μl脂染胺(Lipofectamine)中以每个样品50μl的体积构成脂染胺/DNA复合物的主混合物。在孵育20分钟之后，将质粒混合物添加到细胞中。在添加构建体之前诱导蛋白质表达24小时。
将构建体以所选择的浓度添加到孔中以形成每孔200μl的最终体积。在刺激18小时之后，从每一个样品收集上清液并且储存在-20℃直到需要为止。通过流式细胞珠粒阵列(Cytometric Bead Array)(碧迪生物科技公司)，根据制造商的方案确定IL-8分泌，任选地其中有一处改动：可以使用25μl的条件培养基来代替50μl。为了准确地确定分泌的IL-8的浓度，进行11点标准曲线(1ng/ml-5000ng/ml)。使用BD-FACS Aria II(碧迪生物科技公司)分析样品，然后使用FCAP ARRAY软件(1.0.1版)分析数据。
2.2讨论
通过流式细胞术评估脂肽20、22、以及26的生物活性以测量新鲜血液样品中人类单核白细胞上共刺激分子CD80的上调。
通过特征性细胞表面标志物在供体样品中鉴定单核白细胞，并且在暴露于三个剂量的每一种化合物之前和之后确定CD80的表达，可商购获得的Pam3CSK4(10μM)用作阳性对照。
结果显示测试脂肽20、22以及26在所测试的所有剂量下强烈地上调了CD80的表达，例如以与阳性对照Pam3CSK4相比等同或更大效力，这表明了有效的TLR激动。
结果显示测试脂肽20、22以及26在HekBlueTM和IL-8报告基因系统中表现出TLR激动，例如可滴定的TLR激动，这表明了有效的TLR激动。
显示出20、22以及26的高效力的结果支持了抗原肽的缀合不影响TLR2激动的发现。
实施例3：缀合物200、120、121、110-112、112A、以及113-116的制备
3.1一般细节
受保护的氨基酸和偶联试剂购自GL生物化学公司(GL-Biochem)(上海(Shanghai))。用于固体负载合成的树脂是来自Rapp Polymere有限公司(Rapp PolymereGmbH)(图宾根(Tuebingen))的预载tentagel树脂并且其它溶剂和试剂是从西格玛公司(Sigma)(密苏里州的圣路易斯(St Louis,Mo))和诺瓦生物化学公司获得的。
在Tribute肽合成器(亚利桑那州图森的蛋白质技术国际公司(ProteinTechnologies International,Tucson,AZ))上，使用标准的迭代Fmoc固相肽合成技术进行下文所述的肽合成。在0.1mmol规模上进行的典型的脱保护和偶联循环需要使用于DMF中20％的哌啶(4mL×5分钟)，然后用DMF洗涤树脂的两个处理来从树脂结合的氨基酸去除Fmoc保护基。在单独的容器中，将Fmoc氨基酸(0.5mmol)和偶联剂(1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)，0.45mmol)溶解在DMF(1.5mL)中，并且添加碱(4-甲基吗啉，1mmol)。在混合1分钟之后，将该溶液转移到树脂中，将其在室温搅拌1小时，排出并且洗涤。
通过将树脂悬浮在含有5％(v/v)乙烷二硫醇(EDT)的5mL三氟乙酸(TFA)中并且在室温搅拌3小时来实现肽的切割(0.1mmol规模)。然后添加三异丙基硅烷(TIPS)达到1％(v/v)并且再继续搅拌五分钟，之后将TFA排出到冷却的乙醚(40mL)中。通过离心使沉淀的材料沉淀，弃去乙醚，用乙醚(25mL)将沉淀物洗涤一次并且空气干燥或冻干。
使用Dionex Ultimate 3000HPLC系统进行反相(RP)-HPLC。对于半制备型纯化，将肽样品注入到在洗脱剂A(水/0.1％TFA)和洗脱剂B(MeCN/0.1％TFA)的合适混合物中平衡的反相Phenomenex Gemini C18柱(5μ，10mm×250mm)中，然后产生洗脱剂B的递增梯度以洗脱构成组分。类似地使用Phenomenex Gemini C18柱(3μ，4.6mm×150mm)进行分析型HPLC。
使用Agilent Technologies 6120四极质谱仪获得低分辨率质谱。
使用以400MHz(对于1H NMR)和100MHz(对于13C NMR)操作的Bruker BRX400光谱仪获得NMR谱。
在下文所述的氨基酸缀合物和肽缀合物中，缩写AcN-C(Pam-1)-和H2N-C(Pam-1)-意指
其中R在适当时是Ac或H。
3.2通过直接缀合制备肽缀合物
肽
如下文所述和所示来合成肽100和102(包含LMP2S-2，SEQ ID NO:10)、103和104(包含LMP2S-3，SEQ ID NO:15)、以及105和106(包含LMP2 5-2，SEQ ID NO:30)，所述肽如下表3中所示(方案1)。
方案1
(i)迭代Fmoc-SPPS；(ii)Fmoc-Cys(Trt)-OH、HATU、NMM、DMF；(iii)20％哌啶/DMF；(iv)Ac2O/NMM、DMF；(v)TFA/EDT；(vi)棕榈酸乙烯酯、DTT、DMPA、NMP、365nm。
在使用迭代Fmoc-SPPS将肽序列合成到倒数第二个氨基酸之后，通过在DMF中与Fmoc-Cys(Trt)-OH、HATU、以及4-甲基吗啉反应引入Fmoc-半胱氨酸作为树脂上的肽的N末端残基。使用于DMF中20％的哌啶去除Fmoc基团。根据需要，通过用于DMF中20％的乙酸酐(2mL)和4-甲基吗啉(1mmol)的混合物处理将所得的胺基转化成乙酰胺。
在用TFA/EDT从树脂切割肽并且使其在乙醚中沉淀之后，将固体溶解在1:1的水/MeCN中并且冻干。如果所述肽含有甲硫氨酸残基，那么在冷冻干燥之前将溶液在60℃加热1小时以逆转在切割期间可能发生的任何S-烃基化。然后通过RP-HPLC纯化肽，得到>95％的材料。
表3
肽缀合物
然后对肽100和102-106进行硫醇-烯反应以产生相应的肽缀合物110、112以及113-116(表4)。
将DMPA(2.6mg)、二硫苏糖醇(9.2mg)、以及棕榈酸乙烯酯(40mg，mmol)溶解在经过脱气的NMP(2mL)中。然后将100μL该溶液添加到被称取到小聚丙烯容器中的1μmol的肽中，得到含有10mM的肽、5mM的DMPA、30mM的DTT以及50mM的棕榈酸乙烯酯的溶液。NMP与反应条件是相容的并且有效地将反应混合物的所有组分溶剂化。
用氮气吹拂反应容器并且用以365nm操作的手持式6瓦特UV灯(纽约州的Spectronics公司)照射经过剧烈搅拌的混合物。在30分钟之后，通过HPLC分析反应并且确定向所期望的产物的转化率。然后通过RP-HPLC分离产物并且回收未反应的起始材料。
在某些实施方案中，具有非乙酰化的N末端半胱氨酸的肽将形成显著量的二硫化物二聚体，尽管存在还原剂DTT。这在使用相应的N-乙酰化肽的情况下通常不会被观测到。
还通过以下替代程序由肽100和103-106制备肽缀合物110和113-116(表4B)。
在该程序中，使用叔丁基硫醇(tBuSH)硫醇代替DTT。在某些实施方案中，这使得基质肽向所期望的肽缀合物的转化增加并且更彻底。
还将三氟乙酸(TFA)引入到反应混合物中。在某些实施方案中，这进一步改进了反应特征。低聚物，即由产物肽缀合物与第二棕榈酸乙烯酯分子反应得到双棕榈酰化物质所形成的次要副产物的形成由TFA的添加基本上抑制。
在这些条件下甲硫氨酸氧化成相应的亚砜的任何明显的倾向可以通过将具有甲硫氨酸基团的那些肽的粗产物混合物冻干，继而溶解在TFA中并且用四丁基碘化铵处理以将甲硫氨酸氧化物还原回甲硫氨酸来解决。
典型的程序如下。将DMPA(6.5mg)溶解在经过脱气的NMP(0.5mL)中，并且添加叔丁基硫醇(17μL)，并且在单独的容器中，将棕榈酸乙烯酯(11.3mg)溶解在经过脱气的N-甲基吡咯烷酮(NMP)(0.5mL)中。将肽(1μmol)称取到装备有小型搅拌器的小聚丙烯容器中并且添加10μL的DMPA/tBuSH溶液，继而添加100μL的棕榈酸乙烯酯溶液，得到约10mM的肽、5mM的DMPA、30mM的DTT以及80mM的棕榈酸乙烯酯的溶液。然后添加TFA(5.5μL)，得到5％溶液。用氮气吹拂反应容器并且用以365nm操作的手持式6瓦特UV灯(纽约州的Spectronics公司)照射经过剧烈搅拌的混合物。在20分钟之后，再添加DMPA(10μL)和棕榈酸乙烯酯(50μL)并且继续照射20分钟。
对于含有甲硫氨酸的那些肽，添加水(0.5mL)和MeCN(0.5mL)并且将混合物冻干。将所得固体溶解在纯TFA(150μL)中，冷却到0℃并且添加于25μL TFA中的四正丁基碘化铵(3.7mg，10μmol)。在1分钟之后，添加冷却的乙醚(0.5mL)以使还原的脂肽沉淀，通过离心使其沉淀并且将其冻干。
通过HPLC分析反应以显示向所期望的产物的转化率(表4B)，然后将其通过RP-HPLC分离。
表4
表4B
3.3氨基酸缀合物的制备
氨基酸缀合物200、120、以及121分别是由N-α-Fmoc保护的半胱氨酸、N-α-乙酰基保护的半胱氨酸、以及N-α-Boc保护的半胱氨酸制备的，如下文所述和所示(方案2)。
方案2
R＝Fmoc；R＝Ac；R＝Boc 200R＝Fmoc；120R＝Ac；121R＝Boc
(i)自由基引发剂、hυ(365nm)或热
将固体N-α-受保护的半胱氨酸在所示的溶剂(表5)中溶解或悬浮到100mg/mL的浓度并且添加棕榈酸乙烯酯(1.5摩尔当量)，继而添加所示量的引发剂。对于在光解条件下进行的反应，在聚丙烯容器中制备溶液，以所示的摩尔比例(表5)添加DMPA，然后以365nm照射经过搅拌的混合物。对于在热条件下进行的反应，在玻璃管中制备溶液，添加所示量的AIBN(偶氮双异丁腈)并且在油浴中或在微波炉中加热经过搅拌的混合物。
使用薄层色谱监测反应进展并且基于半胱氨酸起始材料的消耗使其进行到完成。然后去除溶剂并且通过硅胶快速柱色谱(用己烷/乙酸乙酯混合物洗脱)纯化残余物。通过1H NMR和13C NMR以及质谱确认Fmoc-Cys(Pam-1)-OH(200)、Ac-Cys(Pam-1)-OH(120)、以及Boc-Cys(Pam-1)-OH(121)的身份。
N-Fmoc-Cys(Pam-1)-OH(200)
N-Ac-Cys(Pam-1)-OH(120)
N-Boc-Cys(Pam-1)-OH(121)
在多种条件下进行缀合反应，这些条件汇总于表5中。
表5
a使用以365nm操作的手持式Spectronics 6瓦特灯进行UV照射；使用以100w和70℃操作的CEM Discover微波反应器进行微波反应。
在某些实施方案中，使用光解条件或热条件将以理想高的产率产生所期望的产物。
3.4经由氨基酸缀合物的偶联制备肽缀合物
如下文所述和所示制备肽缀合物110-116(方案3)。
方案3
(i)迭代Fmoc-SPPS；(ii)Fmoc-Cys(Pam-1)-OH(200)、PyBOP、三甲基吡啶、DMF；(iii)Ac-Cys(Pam-1)-OH(120)或Boc-Cys(Pam-1)-OH(121)、PyBOP、三甲基吡啶、DMF；(iv)20％哌啶/DMF；(v)Ac2O/NMM、DMF；(vi)TFA/EDT。
如先前所述，使用标准的迭代Fmoc SPPS技术，使用Tribute肽合成器合成所期望的肽序列。在使倒数第二个氨基酸残基偶联之后，然后使用PyBOP和三甲基吡啶在DMF中将树脂结合的肽链用氨基酸缀合物N-Fmoc-Cys(Pam-1)-OH 200衍生化。然后使用于DMF中20％的哌啶去除Fmoc基团。
然后使用TFA/EDT从树脂切割所得的肽，同时去除保护基，得到肽缀合物111、113以及115。
或者，通过用于DMF中20％的乙酸酐(2mL)和4-甲基吗啉(1mmol)的混合物处理使所得的肽转化成相应的乙酰胺，然后从树脂切割以得到肽缀合物110、112、114以及116。
或者，将树脂结合的肽用氨基酸缀合物N-Boc-Cys(Pam-1)-OH 121或N-Ac-Cys(Pam-1)-OH 120衍生化。在从树脂切割时，这直接得到肽缀合物110-116，而不会由于Fmoc基团而需要另外的操作。
氨基酸缀合物偶联的条件有利地减小了氨基酸的α-碳在活化时外消旋化的倾向。将氨基酸缀合物(0.075mmol)和PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基三(1-吡咯烷基)磷六氟磷酸盐)(0.1mmol)组合并且溶解在DMF(0.3mL)中。添加纯2,4,6-三甲基吡啶(0.1mmol)并且在混合30秒之后，将溶液转移到0.025mmol的树脂中，然后将其搅拌90分钟，排出并且洗涤(DMF)。
然后通过在室温将0.015mmol的树脂在含有5％(v/v)乙烷二硫醇的1mL三氟乙酸中搅拌3小时来切割肽。然后将上清液经由烧结品排出到冷却的乙醚(10mL)中并且用另外1mL的TFA洗涤树脂，也将其添加到乙醚中。
通过离心使沉淀的材料沉淀并且用乙醚(5mL)将沉淀物洗涤一次，之后溶解在1:1的MeCN/水(+0.1％tfa)中并且冻干。如果所述肽含有甲硫氨酸残基，那么将溶液在60℃加热1小时，之后冷冻干燥。然后通过RP-HPLC将肽纯化(>95％)并且通过分析型RP-HPLC和质谱确认它们的身份。
实施例4：对肽LMP2S1和LMP2S2的分析
1.1一般细节
基本上如上文所述来合成肽LMP2S1(DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL，SEQ IDNO:5)和LMP2S2(SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA，SEQ ID NO:10)。然后通过RP-HPLC将肽纯化(>95％)并且通过分析型RP-HPLC和质谱确认它们的身份。
结果
图1示出了在以下条件下LMP2S1的RP-HPLC迹线：柱：Phenomenex Gemini C18(5μ，4.6mm×150mm)；梯度：0分钟-1分钟，5％B，然后经过30分钟从5％B到65％B，以1毫升/分钟洗脱，Rt：14.4分钟。
ESI-MS迹线m/z[M+2H]2+＝1572.7。
图2示出了在以下条件下LMP2S2的RP-HPLC迹线：柱：Phenomenex Gemini C18(5μ，4.6mm×150mm)；梯度：0分钟-1分钟，1％B，然后经过30分钟从1％B到61％B，以1毫升/分钟洗脱，Rt：16.0分钟。
ESI-MS迹线m/z[M+2H]2+＝1448.2。
实施例5：对缀合的LMP2S4(SK4)的分析
1.1一般细节
基本上如上文所述来合成肽LMP2S4(SK4)(SKKKKSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA，SEQ ID NO:19)，将其乙酰化并且与Pam1Cys缀合，得到Pam1-C(Ac)SK4-LMP2S4：
然后通过分析型RP-HPLC和质谱确认粗制肽的身份。
结果
图3示出了在以下条件下Pam1-C(Ac)SK4-LMP2S4的RP-HPLC迹线：柱：PhenomenexGemini C18(5μ，4.6mm×150mm)；梯度：0分钟-1分钟，5％B，然后经过30分钟从5％B到65％B，以1毫升/分钟洗脱，Rt：21.6分钟。
ESI-MS迹线m/z[M+3H]3+＝1977.0。
不意图将本发明的范围仅限于上述实施例。如本领域技术人员所将了解，许多变化方案是可能的而不脱离本发明的范围。
工业适用性
本发明的肽、以及氨基酸缀合物和肽缀合物以及组合物和构建体可应用于药学和医学领域，包括应用于引出受试者的免疫应答的方法和对受试者进行疫苗接种的方法中。举例来说，具体考虑了包含所述肽或氨基酸缀合物和肽缀合物的药物，所述药物涉及治疗爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(EBV)相关疾病，如霍奇金氏病(HD)或鼻咽癌(NPC)，包括例如包含来自EBV潜伏膜蛋白2(LMP2)的一个或多个表位的自佐剂化疫苗。
序列表
<110> Brimble, Margaret A
Dunbar, Peter R
Williams, Geoffrey M
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<160> 101
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2不存在或是亲水性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln
1 5 10 15
Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25 30
<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2不存在或是亲水性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸
<400> 2
Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp
1 5 10 15
Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25 30
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸
<400> 3
Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25 30
<210> 4
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 4
Ser Lys Lys Lys Lys Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly
20 25 30
Leu
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 5
Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25
<210> 6
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa3不存在或是亲水性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸
<400> 6
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp
1 5 10 15
Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His
20 25 30
Ile Tyr Glu Glu Ala
35
<210> 7
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸
<400> 7
Xaa Xaa Xaa Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly
1 5 10 15
Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile
20 25 30
Tyr Glu Glu Ala
35
<210> 8
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸
<400> 8
Xaa Xaa Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
1 5 10 15
Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr
20 25 30
Glu Glu Ala
35
<210> 9
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 9
Ser Lys Lys Lys Lys Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn
1 5 10 15
Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln
20 25 30
His Ile Tyr Glu Glu Ala
35
<210> 10
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 10
Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu
20 25 30
Ala
<210> 11
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3不存在或是亲水性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa4不存在或是一个或多个亲水性氨基酸
<400> 11
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser
1 5 10 15
Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25
<210> 12
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2不存在或是亲水性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3不存在或是1个至10个亲水性氨基酸
<400> 12
Xaa Xaa Xaa Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25
<210> 13
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1不存在或是S或亲水性氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2不存在或是1个至4个亲水性氨基酸
<400> 13
Xaa Xaa Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 14
Ser Lys Lys Lys Lys Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25 30
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 15
Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly
1 5 10 15
Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25
<210> 16
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 16
Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln
1 5 10 15
Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25 30
Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr
35 40 45
Glu Glu Ala
50
<210> 17
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 17
Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp
1 5 10 15
Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro
20 25 30
Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu
35 40 45
Glu Ala
50
<210> 18
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 18
Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro
20 25 30
Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu
35 40 45
Ala
<210> 19
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 19
Ser Lys Lys Lys Lys Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly
20 25 30
Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile
35 40 45
Tyr Glu Glu Ala
50
<210> 20
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 20
Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala
35 40 45
<210> 21
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 21
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser
1 5 10 15
Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe
20 25 30
Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
35 40
<210> 22
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 22
Xaa Xaa Xaa Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser
1 5 10 15
Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu
20 25 30
Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
35
<210> 23
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 23
Xaa Xaa Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr
20 25 30
Ala Leu Ala Leu Leu Leu
35
<210> 24
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 24
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu
20 25 30
Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
35 40
<210> 25
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 25
Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser
1 5 10 15
Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu
20 25 30
Ala Leu Leu Leu
35
<210> 26
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 26
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile
1 5 10 15
Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg
20 25 30
Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40
<210> 27
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 27
Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu
20 25 30
Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40
<210> 28
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 28
Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser
1 5 10 15
Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe
20 25 30
Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40
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<211> 45
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 29
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala
20 25 30
Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40 45
<210> 30
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 30
Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr
20 25 30
Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 31
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile
1 5 10 15
Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
20 25 30
<210> 32
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 32
Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
20 25
<210> 33
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 33
Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser
1 5 10 15
Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
20 25
<210> 34
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 34
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
20 25 30
<210> 35
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 35
Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
20 25
<210> 36
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 36
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu
20 25 30
Leu Leu Ala
35
<210> 37
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 37
Xaa Xaa Xaa Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser
1 5 10 15
Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
20 25 30
Leu Ala
<210> 38
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 38
Xaa Xaa Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
20 25 30
Ala
<210> 39
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 39
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro
1 5 10 15
Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu
20 25 30
Leu Leu Leu Ala
35
<210> 40
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 40
Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu
1 5 10 15
Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
20 25 30
<210> 41
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 41
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu
1 5 10 15
Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu
35 40 45
Leu Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile
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<210> 42
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 42
Xaa Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp
1 5 10 15
Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu
20 25 30
Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu
35 40 45
Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile
50 55 60
<210> 43
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 43
Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr
1 5 10 15
Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser
20 25 30
Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
35 40 45
Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile
50 55
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<211> 62
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 44
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu
1 5 10 15
Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys
20 25 30
Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala
35 40 45
Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile
50 55 60
<210> 45
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 45
Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val
1 5 10 15
Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile
20 25 30
Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40 45
Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile
50 55
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<211> 48
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
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Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu
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Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
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Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala
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<211> 47
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 47
Xaa Xaa Xaa Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala
20 25 30
Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala
35 40 45
<210> 48
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 48
Xaa Xaa Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile
1 5 10 15
Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg
20 25 30
Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala
35 40 45
<210> 49
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 49
Ser Lys Lys Lys Lys Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu
20 25 30
Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser
35 40 45
Ala
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<211> 44
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 50
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Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
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Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly
20 25 30
Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val
35 40 45
Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu
50 55
<210> 52
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 52
Xaa Xaa Xaa Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly
20 25 30
Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val Leu
35 40 45
Gln Leu Ser Pro Leu Leu
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<210> 53
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 53
Xaa Xaa Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile
1 5 10 15
Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile
20 25 30
Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln
35 40 45
Leu Ser Pro Leu Leu
50
<210> 54
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 54
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys
20 25 30
Gly Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala
35 40 45
Val Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu
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<210> 55
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 55
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1 5 10 15
Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe
20 25 30
Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu Ser
35 40 45
Pro Leu Leu
50
<210> 56
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 56
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr
20 25 30
Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe
35 40 45
Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe Ala
50 55
<210> 57
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 57
Xaa Xaa Xaa Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Ser
1 5 10 15
Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val
20 25 30
Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu
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Ile Phe Leu Ile Gly Phe Ala
50 55
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<211> 54
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 58
Xaa Xaa Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Ser Leu
1 5 10 15
Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met
20 25 30
Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile
35 40 45
Phe Leu Ile Gly Phe Ala
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<211> 57
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 59
Ser Lys Lys Lys Lys Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met
1 5 10 15
Cys Ser Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu
20 25 30
Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly
35 40 45
Phe Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe Ala
50 55
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<211> 52
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 60
Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Ser Leu Gly Gly
1 5 10 15
Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met Ser Asn
20 25 30
Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu
35 40 45
Ile Gly Phe Ala
50
<210> 61
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 61
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro
1 5 10 15
Tyr Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr
20 25 30
Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly
35 40 45
Leu Pro Pro
50
<210> 62
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 62
Xaa Xaa Xaa Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr
1 5 10 15
Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln
20 25 30
Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
35 40 45
Pro Pro
50
<210> 63
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 63
Xaa Xaa Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr Trp
1 5 10 15
Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp
20 25 30
Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro
35 40 45
Pro
<210> 64
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 64
Ser Lys Lys Lys Lys Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp
1 5 10 15
Pro Tyr Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly
20 25 30
Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp
35 40 45
Gly Leu Pro Pro
50
<210> 65
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 65
Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr Trp Gly Asn
1 5 10 15
Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser
20 25 30
Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro
35 40 45
<210> 66
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 66
Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro
1 5 10 15
Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser
20 25 30
Met Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp
35 40 45
Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ser
50 55
<210> 67
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 67
Xaa Xaa Xaa Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg
1 5 10 15
Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met
20 25 30
Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu
35 40 45
Ala Ala Ile Ala Ala Ser
50
<210> 68
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 68
Xaa Xaa Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp
1 5 10 15
Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn
20 25 30
Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala
35 40 45
Ala Ile Ala Ala Ser
50
<210> 69
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 69
Ser Lys Lys Lys Lys Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser
1 5 10 15
Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly
20 25 30
Ser Met Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe
35 40 45
Trp Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ser
50 55
<210> 70
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 70
Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser
1 5 10 15
Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn Pro Val
20 25 30
Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile
35 40 45
Ala Ala Ser
50
<210> 71
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 71
Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val
1 5 10 15
Ser Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu
20 25 30
Ala Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr
35 40 45
Pro Val Thr Val Leu Thr
50
<210> 72
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 72
Xaa Xaa Xaa Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val Ser
1 5 10 15
Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ala
20 25 30
Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr Pro
35 40 45
Val Thr Val Leu Thr
50
<210> 73
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 73
Xaa Xaa Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val Ser Thr
1 5 10 15
Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ala Ala
20 25 30
Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr Pro Val
35 40 45
Thr Val Leu Thr
50
<210> 74
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 74
Ser Lys Lys Lys Lys Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu
20 25 30
Leu Ala Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu
35 40 45
Thr Pro Val Thr Val Leu Thr
50 55
<210> 75
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 75
Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val Ser Thr Val Val
1 5 10 15
Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val Ala
20 25 30
Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr Pro Val Thr Val
35 40 45
Leu Thr
50
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 76
Glu Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr
1 5 10
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 77
Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 78
His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 79
Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu
1 5
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 80
Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr
1 5 10
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 81
Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 82
Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 83
Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu
1 5
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 84
Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly
1 5 10
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 85
Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 86
Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp
1 5
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 87
Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
1 5 10
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 88
Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr
1 5 10
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 89
Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro
1 5
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 90
Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg
1 5 10
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 91
Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr
1 5 10
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 92
Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 93
His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 94
Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr
1 5
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 95
Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile
1 5 10
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 96
Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 97
Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 98
Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 99
Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 100
Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽序列
<400> 101
Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe Leu
1 5

Claims (95)

1.一种用于制备肽缀合物的方法，所述方法包括
提供脂质化的氨基酸或肽，以及
使所述脂质化的氨基酸或肽与一个或多个氨基酸或肽偶联以提供肽缀合物，并且其中所述肽缀合物包含一个或多个EBV LMP2表位。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述包含氨基酸的缀合配偶体是含有肽的缀合配偶体。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述包含氨基酸的缀合配偶体包含表位。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括使所述氨基酸缀合物的氨基酸与氨基酸或肽偶联以提供肽缀合物。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述氨基酸缀合物的氨基酸或所述肽缀合物的氨基酸与氨基酸或肽偶联以提供包含肽表位的肽缀合物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述方法还包括使表位与所述氨基酸缀合物的氨基酸或所述肽缀合物的氨基酸偶联。
7.如权利要求3、5以及6中任一项所述的方法，其中所述表位是肽表位。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述表位是经由连接基团偶联或结合的。
9.如权利要求4至8中任一项所述的方法，其中所述肽缀合物的与所述含有脂质的缀合物缀合的氨基酸是N末端氨基酸残基。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述包含氨基酸的缀合配偶体的所述氨基酸或氨基酸包含碳-碳双键或硫醇。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述包含所述碳-碳双键或硫醇的氨基酸是N末端氨基酸残基。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述包含所述碳-碳双键或硫醇的氨基酸的氨基是酰化的。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述氨基酸缀合物的氨基酸或所述肽缀合物的与所述含有脂质的缀合配偶体缀合的氨基酸残基的氨基酰化。
14.如权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述包含氨基酸的缀合配偶体的所述氨基酸或氨基酸包含所述硫醇。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述硫醇是半胱氨酸残基的硫醇。
16.如权利要求15所述的方法，其中用C2-20脂肪酸将所述半胱氨酸残基的氨基酰化。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述C2-20脂肪酸是乙酰基。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述肽缀合物或包含氨基酸的缀合配偶体包含一个或多个增溶基团。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述增溶基团是在肽链中包含两个或更多个连续亲水性氨基酸残基的序列的氨基酸序列。
20.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述肽缀合物或包含氨基酸的缀合配偶体包含与所述与所述含有脂质的缀合配偶体缀合的氨基酸残基相邻的丝氨酸残基。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述肽还包含与所述丝氨酸残基相邻的两个或更多个亲水性氨基酸残基的连续序列。
22.如权利要求1至3、5、7、8、以及10至21中任一项所述的方法，其中所述包含氨基酸的缀合配偶体的一个或多个氨基酸的一个或多个反应性官能团是未受保护的。
23.如权利要求1至3、5、7、8、以及10至22中任一项所述的方法，其中所述包含氨基酸的缀合配偶体由肽组成。
24.如权利要求1、4至10、以及12至21中任一项所述的方法，其中所述包含氨基酸的缀合配偶体由氨基酸组成。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述氨基酸的羧基受羧基保护基保护和/或所述氨基酸的氨基受氨基保护基保护。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述含有脂质的缀合配偶体包含各自含有至少4个或至少6个链连接原子的一个或多个任选取代的直链或支链脂族或杂脂族链。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述一个或多个链通过含有杂原子的官能团与包含所述碳-碳双键或所述硫醇的部分共价结合。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述含有脂质的缀合配偶体是式(A1)的化合物：
其中
Z选自由以下各项组成的组：-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NR-、-NRC(O)-、-OC(O)O-、-NRC(O)O-、-OC(O)NR-、以及-NRC(O)NR-；
R是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基，其中所述烃基或环烃基任选被取代；
m是0至4的整数；
R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R3、R4、以及R5各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R3是L2-C(O)-OC1-6烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
前提条件是：
当R3是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R1不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当m是2至4的整数时，不超过一个R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R1、R2、R3、R4、R5、L1、以及L2中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代，
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
29.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述含有脂质的缀合配偶体是式(B1)的化合物：
其中
Z选自由以下各项组成的组：-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NR-、-NRC(O)-、-OC(O)O-、-NRC(O)O-、-OC(O)NR-、以及-NRC(O)NR-；
R是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基，其中所述烃基或环烃基任选被取代；
p是0至4的整数；
R11和R22在p的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R33和R44各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R33是L2-C(O)-OC1-6烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
前提条件是：
当R33是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R11不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当p是2至4的整数时，不超过一个R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R11、R22、R33、R44、L1、以及L2中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
30.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述氨基酸缀合物或肽缀合物包含式(A)的结构：
其中
Z选自由以下各项组成的组：-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NR-、-NRC(O)-、-OC(O)O-、-NRC(O)O-、-OC(O)NR-、以及-NRC(O)NR-；
R是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基，其中所述烃基或环烃基任选被取代；
m是0至4的整数；
n是1或2；
R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R3、R4、R5、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R3是L2-C(O)-OC1-6烃基；
或R9是氨基保护基、L3-C(O)、或A2；
R6和R7在n的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是氨基酸或肽；或A1是OH或OP1，其中P1是羧基保护基；
前提条件是：
当R3是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R1不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当m是2至4的整数时，不超过一个R1是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、L1、L2以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
31.如权利要求1至27以及29中任一项所述的方法，其中所述氨基酸缀合物或肽缀合物包含式(B)的结构：
其中
Z选自由以下各项组成的组：-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NR-、-NRC(O)-、-OC(O)O-、-NRC(O)O-、-OC(O)NR-、以及-NRC(O)NR-；
R是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基，其中所述烃基或环烃基任选被取代；
p是0至4的整数；
q是0至2的整数；
R11和R22在p的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；
R33、R44、R55、R66、R77、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R33是L2-C(O)-OC1-6烃基；
或R9是氨基保护基、L3-C(O)、或A2；
Ra和Rb在q的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是氨基酸或肽；或A1是OH或OP1，其中P1是羧基保护基，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ ID NO:1-101组成的组的一个或多个肽；
前提条件是：
当R33是L2-C(O)-OC1-6烃基时，R11不是L2-C(O)-OC1-6烃基；以及
当p是2至4的整数时，不超过一个R11是L2-C(O)-OC1-6烃基；并且
其中R11、R22、R33、R44、R55、R66、R77、R8、R9、Ra、Rb、L1、L2、以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中R9独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
或R9是L3-C(O)或A2；并且
A1和A2各自独立地是肽；或A1是OH；
前提条件是：
当R9不是A2时，A1是肽。
33.如权利要求1至28、30、以及32中任一项所述的方法，其中所述氨基酸缀合物或肽缀合物包含式(I)的结构：
其中m、n、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、L1以及A1如权利要求30中所定义；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物；并且
所述方法包括使式(II)的含有脂质的缀合配偶体
与包含式(III)的结构的含有肽的缀合配偶体
在有效通过用所述式(III)的化合物中的所述硫醇将所述式(II)的化合物中的所述碳-碳双键进行氢硫醇化来使所述式(II)的化合物与所述式(III)的化合物缀合的条件下反应。
34.如权利要求1至27、29、31以及32中任一项所述的方法，其中所述氨基酸缀合物或肽缀合物包含式(IA)的结构：
其中p、q、R11、R22、R33、R44、R55、R66、R77、R8、R9、Ra、Rb、L1以及A1如权利要求31中所定义；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物；并且
所述方法包括使式(IIA)的化合物
与式(IIIA)的化合物
在有效通过用所述式(IIA)的化合物中的所述硫醇将所述式(IIIA)的化合物中的所述碳-碳双键进行氢硫醇化来使所述式(IIA)的化合物与所述式(IIIA)的化合物缀合的条件下反应。
35.如权利要求29、31、32、以及34中任一项所述的方法，其中p是0至2的整数。
36.如权利要求35所述的方法，其中p是0或1。
37.如权利要求29、31、32、以及34至36中任一项所述的方法，其中R11和R22在p的每一种情况下各自独立地是氢。
38.如权利要求29、31、32、以及34至37中任一项所述的方法，其中R33和R44各自是氢。
39.如权利要求31、32、以及34至38中任一项所述的方法，其中q是0或1。
40.如权利要求31、32、以及34至39中任一项所述的方法，其中R55、R66、以及R77各自是氢。
41.如权利要求31、32、以及34至40中任一项所述的方法，其中Ra和Rb在q的每一种情况下各自是氢。
42.如权利要求28、30、32、以及33中任一项所述的方法，其中m是0至2的整数。
43.如权利要求42所述的方法，其中m是0或1。
44.如权利要求28、30、32、33、42、以及43中任一项所述的方法，其中R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢。
45.如权利要求28、30、32、33、以及42至44中任一项所述的方法，其中R4和R5各自是氢。
46.如权利要求30、32、33、以及42至45中任一项所述的方法，其中R6和R7各自是氢。
47.如权利要求30、32、33、以及42至46中任一项所述的方法，其中所述式(I)的化合物是式(IV)的化合物：
其中
R3是氢或L2-C(O)-OCH2；
R9是氢、氨基保护基、L3-C(O)、或A2；并且
L1和L2各自独立地是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-21烃基或C4-20杂烃基；
A1和A2各自独立地是氨基酸或肽；或A1是OH或OP1，其中P1是羧基保护基，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ ID NO:1-101组成的组的一个或多个肽；
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
48.如权利要求47所述的方法，其中R9是氢、L3-C(O)、或A2；并且
A1和A2各自独立地是肽；或A1是OH；
前提条件是：
当R9不是A2时，A1是肽。
49.如权利要求28至48中任一项所述的方法，其中L1是C5-21烃基。
50.如权利要求49所述的方法，其中L1是直链C15烃基。
51.如权利要求28至50中任一项所述的方法，其中L2是C5-21烃基。
52.如权利要求28、30、32、33以及42至51中任一项所述的方法，其中R3是氢。
53.如权利要求30至52中任一项所述的方法，其中R9是氢、氨基保护基或L3-C(O)。
54.如权利要求30至53中任一项所述的方法，其中R9是氢或氨基保护基，并且所述方法还包括将所述氨基酸缀合物或肽缀合物酰化以用L3-C(O)置换R9处的所述氢或氨基保护基。
55.如权利要求30至54中任一项所述的方法，其中L3是甲基或直链C15烃基。
56.如权利要求55所述的方法，其中L3是甲基。
57.如权利要求25至56所述的方法，其中所述氨基保护基是Boc或Fmoc。
58.如权利要求30至57中任一项所述的方法，其中A1和/或A2是氨基酸或肽。
59.如权利要求30至57中任一项所述的方法，其中A1是OP1或OH并且R9是氢、氨基保护基或L3-C(O)。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述方法还包括使氨基酸或肽偶联以用所述氨基酸或肽置换A1和/或R9。
61.如权利要求58或60所述的方法，其中所述肽包含EBV LMP2表位。
62.如权利要求3和5至61中任一项所述的方法，其中所述肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成：
a.来自SEQ ID NO:1至101中任一个的序列的8个或更多个连续氨基酸残基；
b.来自SEQ ID NO:1至101中任一个的序列的10个或更多个连续氨基酸残基；
c.来自SEQ ID NO:1至101中任一个的序列的12个或更多个连续氨基酸残基；
d.来自SEQ ID NO:1至101中任一个的序列的15个或更多个连续氨基酸残基；
e.来自SEQ ID NO:1至101中任一个的序列的20个或更多个连续氨基酸残基；
f.SEQ ID NO:1至101中任一个的序列；
g.来自SEQ ID NO:1至93中任一个的序列的8个或更多个连续氨基酸残基；
h.来自SEQ ID NO:1至93中任一个的序列的10个或更多个连续氨基酸残基；
i.来自SEQ ID NO:1至93中任一个的序列的12个或更多个连续氨基酸残基；
j.来自SEQ ID NO:1至93中任一个的序列的15个或更多个连续氨基酸残基；
k.来自SEQ ID NO:1至93中任一个的序列的20个或更多个连续氨基酸残基；
l.SEQ ID NO:1至93中任一个的序列；
m.来自SEQ ID NO:1至75中任一个的序列的8个或更多个连续氨基酸残基；
n.来自SEQ ID NO:1至75中任一个的序列的10个或更多个连续氨基酸残基；
o.来自SEQ ID NO:1至75中任一个的序列的12个或更多个连续氨基酸残基；
p.来自SEQ ID NO:1至75中任一个的序列的15个或更多个连续氨基酸残基；
q.来自SEQ ID NO:1至75中任一个的序列的20个或更多个连续氨基酸残基；
r.SEQ ID NO:1至75中任一个的序列；
s.或上述(a)至(r)中两个或更多个的任何组合。
63.如权利要求1至62中任一项所述的方法，其中所述有效使所述含有脂质的缀合配偶体与所述包含氨基酸的缀合配偶体缀合的条件包括通过热引发剂的热降解或光化学引发剂的光化学降解引发的一个或多个自由基的产生。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述热引发剂是AIBN。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述光引发剂是DMPA。
66.如权利要求63或65所述的方法，其中所述自由基引发剂的光化学降解包括用具有约365nm的波长的紫外光照射。
67.如权利要求1至66中任一项所述的方法，其中在包含溶剂的液体介质中进行所述反应，其中所述溶剂包括NMP、DMSO、或其混合物。
68.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中在抑制二聚化、调聚、或聚合的一种或多种添加剂存在下进行所述反应。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述添加剂是DTT或叔丁基硫醇。
70.一种氨基酸缀合物或肽缀合物，所述氨基酸缀合物或肽缀合物是通过如权利要求1至69中任一项所述的方法制备的。
71.一种式(V)的化合物：
其中
m是0至4的整数；
n是1或2；
R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
R3、R4、R5、R8、以及R9各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R9是氨基保护基、L3-C(O)、或A2；
R6和R7在n的每一种情况下各自独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；
L1是C5-21烃基或C4-20杂烃基；
L3是C1-6烃基或C3-6环烃基；
A1和A2各自独立地是氨基酸或肽；或A1是OH或OP1，其中P1是羧基保护基，并且其中A1或A2包含一个或多个EBV LMP2表位，或其中A1、A2或A1和A2这两者包含选自由SEQ ID NO:1-101组成的组的一个或多个肽；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、L1、以及L3中的任一个中存在的任何烃基、环烃基或杂烃基任选被取代，以及
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
72.如权利要求72所述的化合物，其中R9独立地是氢、C1-6烃基或C3-6环烃基；或R9是L3-C(O)或A2；并且
A1和A2各自独立地是肽；或A1是OH；
前提条件是：
A1和A2中的至少一个包含EBV LMP2表位；以及
当R9不是A2时，A1是肽。
73.如权利要求72或73所述的化合物，其中L1如权利要求49或50中所定义。
74.如权利要求72至74中任一项所述的化合物，其中m如权利要求42或43中所定义。
75.如权利要求72至75中任一项所述的化合物，其中m是0。
76.如权利要求72至76中任一项所述的化合物，其中R1和R2在m的每一种情况下各自独立地是氢。
77.如权利要求72至77中任一项所述的化合物，其中R3是氢。
78.如权利要求72至78中任一项所述的化合物，其中R4和R5各自是氢。
79.如权利要求72至79中任一项所述的化合物，其中R6和R7各自是氢。
80.如权利要求72至80中任一项所述的化合物，其中R8是氢并且R9是氢、氨基保护基、L3-C(O)、或A2。
81.如权利要求72至81中任一项所述的化合物，其中A1是OP1或OH并且R9是氢、氨基保护基或L3-C(O)。
82.如权利要求72至82中任一项所述的化合物，其中L3是Me。
83.如权利要求72至83中任一项所述的化合物，其中A1和/或A2是氨基酸或肽。
84.如权利要求72至84中任一项所述的化合物，其中所述肽包含选自由SEQ ID NO:76-101中任一个的氨基酸序列组成的组的表位。
85.如权利要求72至81和83至85中任一项所述的化合物，其中A1是丝氨酸或包含丝氨酸作为第一个N末端氨基酸残基的肽。
86.如权利要求72至81和83至86中任一项所述的化合物，其中A1和/或A2是包含增溶基团的肽，所述增溶基团包含在肽链中包含两个或更多个亲水性氨基酸残基的氨基酸序列。
87.如权利要求83至86中任一项所述的化合物，其中所述肽包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列组成、或由所述氨基酸序列组成：
a.来自SEQ ID NO:1至101中任一个的序列的8个或更多个连续氨基酸残基；
b.来自SEQ ID NO:1至101中任一个的序列的10个或更多个连续氨基酸残基；
c.来自SEQ ID NO:1至101中任一个的序列的12个或更多个连续氨基酸残基；
d.来自SEQ ID NO:1至101中任一个的序列的15个或更多个连续氨基酸残基；
e.来自SEQ ID NO:1至101中任一个的序列的20个或更多个连续氨基酸残基；
f.SEQ ID NO:1至101中任一个的序列；
g.来自SEQ ID NO:1至93中任一个的序列的8个或更多个连续氨基酸残基；
h.来自SEQ ID NO:1至93中任一个的序列的10个或更多个连续氨基酸残基；
i.来自SEQ ID NO:1至93中任一个的序列的12个或更多个连续氨基酸残基；
j.来自SEQ ID NO:1至93中任一个的序列的15个或更多个连续氨基酸残基；
k.来自SEQ ID NO:1至93中任一个的序列的20个或更多个连续氨基酸残基；
l.SEQ ID NO:1至93中任一个的序列；
m.来自SEQ ID NO:1至75中任一个的序列的8个或更多个连续氨基酸残基；
n.来自SEQ ID NO:1至75中任一个的序列的10个或更多个连续氨基酸残基；
o.来自SEQ ID NO:1至75中任一个的序列的12个或更多个连续氨基酸残基；
p.来自SEQ ID NO:1至75中任一个的序列的15个或更多个连续氨基酸残基；
q.来自SEQ ID NO:1至75中任一个的序列的20个或更多个连续氨基酸残基；
r.SEQ ID NO:1至75中任一个的序列；
s.或上述(a)至(r)中两个或更多个的任何组合。
88.一种分离的、纯化的、或重组肽，所述肽包含选自由SEQ ID NO:1-75中的任一个组成的组的氨基酸序列、由所述氨基酸序列组成、或基本上由所述氨基酸序列组成。
89.如权利要求88所述的肽，其中所述肽由选自由SEQ ID NO:1-75中的任一个组成的组的氨基酸序列组成。
90.一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的如权利要求71至87中任一项所述的肽缀合物或如权利要求88或89所述的肽或其药学上可接受的盐或溶剂化物、或其任何组合、以及药学上可接受的载体。
91.如权利要求90所述的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的如权利要求71至87中任一项所述的两种或更多种肽缀合物、或如权利要求88或89所述的两种或更多种肽、或如权利要求71至87中任一项所述的一种或多种肽缀合物和如权利要求88或89所述的一种或多种肽的任何组合。
92.一种在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求71至87中任一项所述的肽缀合物或如权利要求88或89所述的肽或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
93.一种在受试者中进行疫苗接种或引出免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求90或91所述的药物组合物。
94.一种用于制备肽缀合物的方法，所述方法包括使
含有脂质的缀合配偶体，与
包含氨基酸的缀合配偶体
在有效通过用硫醇将碳-碳双键进行氢硫醇化来使所述含有脂质的缀合配偶体与所述包含氨基酸的缀合配偶体缀合的条件下反应，
所述方法还包括使所述氨基酸缀合物的氨基酸与氨基酸或肽偶联以提供肽缀合物，并且其中所述肽缀合物包含一个或多个EBV LMP2表位。
95.一种用于制备肽缀合物的方法，所述方法包括使
含有脂质的缀合配偶体，与
包含肽的缀合配偶体，其中所述包含肽的配偶体包含一个或多个EBV LMP2表位，
在有效通过用硫醇将碳-碳双键进行氢硫醇化来使所述含有脂质的缀合配偶体与所述包含肽的缀合配偶体缀合的条件下反应。
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