CN100548377C - 含经修饰后的树突状细胞的疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及携带EB病毒潜伏膜蛋白2编码基因的重组腺病毒、经所述重组腺病毒转导或修饰的抗原提呈细胞，以及含有所述经转导或修饰后的抗原提呈细胞的疫苗组合物。更具体地说，本发明涉及经所述重组腺病毒转导或修饰的树突状细胞，以及含有所述经转导或修饰的树突状细胞的疫苗组合物。

Description

含经修饰后的树突状细胞的疫苗组合物

技术领域

本发明涉及疫苗领域。具体而言，本发明涉及携带EB病毒潜伏膜蛋白2编码基因的重组腺病毒、经所述重组腺病毒转导或修饰的抗原提呈细胞，以及含有所述经转导或修饰后的抗原提呈细胞的疫苗组合物。更具体地说，本发明涉及经所述重组腺病毒转导或修饰的树突状细胞，以及含有所述经转导或修饰的树突状细胞的疫苗组合物。

发明背景

Epstein-Barr(EB)病毒(EBV)是疱疹病毒科γ亚科中唯一能引起人类感染的病毒。在发展中国家，大多数EB病毒的初次感染发生在患者幼儿时期，而且没有明显的临床症状，一旦感染将终身携带病毒；在成人期，EB病毒原发感染可引起传染性单核细胞增多症(IM)。EB病毒在B细胞内潜伏，但通常在鼻咽部及腮腺上皮细胞内增殖，并通过唾液进行传播。大多数被EB病毒感染的患者处于隐性感染状态。在EB病毒隐性感染的B淋巴细胞中能够发现病毒基因组编码的6种核蛋白(EBNA1、2、3A、3B、3C和LP)、三种膜蛋白(LMP1、2A、2B)和两种小的非聚腺苷酰化的RNA(EBER1和EBER2)。这些病毒产物的作用主要是维持病毒感染处于隐性感染状态，并且促使原来处于静止状态的B淋巴细胞持续增生。EB病毒的隐性感染与许多人类肿瘤密切相关，如Burkitt’s淋巴瘤(BL)、鼻咽癌(NPC)、何杰金氏病(HD)以及各种免疫抑制病人和移植病人的淋巴细胞增生紊乱引起的淋巴瘤(PTLD)等。

鼻咽癌(NPC)是中国南方一些省(自治区)的常见恶性肿瘤之一，有些地区发病率可高达10～50/10万，病死率也很高。目前放射治疗是鼻咽癌治疗的基本方法。鼻咽癌尤其是中晚期鼻咽癌治疗失败的原因大多是局部复发和远处转移。鼻咽癌治疗后远处转移发生率约22～36％。NPC起源于上皮，属于鳞状上皮癌。癌组织中病毒以潜伏方式存在，并且仅表达EBNA1、LMP1和LMP2三种蛋白质。

EB病毒潜伏膜蛋白2(以下简称LMP2)是第8个被确定的EB病毒潜伏膜蛋白，有研究(Rooney，C.M.，Smith，C.A.，The Lancet，1995.345：9-13.)表明，在大多数NPC患者的病理活检组织中，在病变的各时期均有LMP2的表达，其中在未分化或低分化的NPC组织中的表达率100％，其mRNA不仅见于原发癌组织，在转移灶中也存在，因此LMP2提供了一个预防和治疗NPC的良好靶位。EB病毒LMP2的cDNA全序列参见文献Jeffery Sample，DavidLiebowitz，Elliott Kieff.Journal of Virology，Feb.1989，p.933-937。

树突状细胞(DC)在体内分布广泛，膜表面高表达共刺激分子、粘附分子及主要组织相容性复合物分子，是体内功能最强的抗原提呈细胞，也是唯一能激活初始型T细胞的APC，被称为天然“免疫佐剂”，在抗感染、抗肿瘤、移植排斥等过程中发挥重要作用。在许多动物模型及体外试验中^[1]，DC为基础的肿瘤疫苗可以引发有效的抗肿瘤免疫反应。自从1995年首次报道了DC肿瘤疫苗在恶性黑色素瘤病人的临床试验后^[2]，许多研究小组对多种癌症设计并进行了广泛的临床试验。截至2001年，在英文杂志文章以及会议文摘中出现的DC疫苗的报道数量已经超过了1000个^[3]，这些肿瘤疫苗应用的范围超过了20种肿瘤。在DC肿瘤疫苗发展短短的数年中，这种革新性的免疫治疗策略已经进行了非常广泛的临床试验。它的临床试验结果的一个显著特征就是其安全性，除了发烧、局部反应等，极少有副反应，而且没有见到严重威胁生命的副反应。

因此，为了进一步研究LMP2激发特异性CTL的能力，本发明人试图使用EBV-LMP2作为EBV相关肿瘤基因治疗的目的基因，并利用pAdEasy系统构建EBV-LMP2重组腺病毒。同时，选择DC作为抗原提呈细胞，用EBV-LMP2重组腺病毒修饰DC后将其作为抗肿瘤疫苗。在检测了该疫苗在体外诱导LMP2特异性CTL的能力，以及这种体外活化的CTL对肿瘤细胞的抑制作用后，我们尝试在NPC病人体内进行初步临床试验。结果证实，本发明人制备的基于EBV-LMP2重组腺病毒的疫苗，在治疗EBV相关肿瘤特别是鼻咽癌中表现有良好的使用效果，具有很大的临床应用前景。

为了进一步观察DC负载肿瘤抗原特别是LMP2在激发抗肿瘤免疫中的积极效果，判断使用基于EBV-LMP2的重组腺病毒疫苗在体内外激活淋巴细胞以杀伤肿瘤靶细胞的可行性，本发明人试图使用重组腺病毒EBV-LMP2修饰的DC，制成可用于治疗EBV相关肿瘤特别是鼻咽癌的预防及治疗性疫苗。

发明内容

本发明成功构建了一种复制缺陷型重组腺病毒，该病毒携带有编码EB病毒潜伏膜蛋白2(EBV-LMP2)的DNA序列。本发明还提供了经所述重组腺病毒转导或修饰后的抗原提呈细胞。具体而言，本发明还提供了经所述重组腺病毒转导或修饰后的树突状细胞。本发明还提供了制备经所述重组腺病毒转导或修饰后的抗原提呈细胞例如树突状细胞的方法。本发明还提供了含有所述经转导或修饰后的抗原提呈细胞的疫苗组合物。本发明还提供了制备所述含有经转导或修饰后抗原提呈细胞的疫苗组合物的方法。另外，本发明还提供了被所述经转导或修饰后的抗原提呈细胞活化了的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，以及使用活化的CTL进行过继性治疗的方法。

Epstein-Barr(EB)病毒(EBV)与许多人类的肿瘤相关，其中的潜伏膜蛋白2(LMP2)是一种可以很好地引发CTL反应的抗原，这就为基于CTL的肿瘤治疗提供了一个重要的潜在靶位。因此，可以利用LMP2作为体内诱导EB病毒特异性CTL、预防和治疗NPC的良好靶抗原。由于腺病毒具有宿主范围广泛，可感染分裂期细胞，也可感染静止或终末分化细胞，能够诱发较强的细胞免疫等优点。因此，我们使用LMP2编码基因作为目的基因，构建携带EB病毒的LMP2编码基因的重组腺病毒。

本发明的发明人成功构建了一种复制缺陷型的重组腺病毒，该病毒携带有外源基因，所述外源基因编码的蛋白质是一种能够很好地引发CTL反应的抗原。在本发明的一个具体实施方案中，所述外源基因为EB病毒潜伏膜蛋白2的编码基因(EBV-LMP2)，这种携带有EB病毒潜伏膜蛋白2编码基因的复制缺陷型重组腺病毒简称为Ad-LMP2或EBV-LMP2重组腺病毒。所述的Ad-LMP2的病毒滴度不小于1×10⁹pfu/ml，并可在体内诱导EB病毒潜伏膜蛋白2特异性抗体生成反应和细胞毒性淋巴细胞反应。在本发明的一个优选实施方案中，该重组腺病毒的滴度为2-5×10⁹pfu/ml。

在本发明的一个优选实施方案中，所述Ad-LMP2是利用pAdEasy系统构建的。

简而言之，为了得到本发明所述的Ad-LMP2，我们首先由携带LMP 2的DNA编码序列的已知质粒(例如，Psg5-LMP2)中得到LMP 2的全长度cDNA序列，并将其定向克隆到腺病毒穿梭质粒(例如，pShuttle-CMV)中。然后使用所得到的重组腺病毒穿梭质粒与已知的腺病毒骨架质粒(例如，pAdEasy-1)一起共转导宿主细胞(例如，大肠杆菌BJ5183)，并借助宿主细胞的重组酶使两质粒间发生同源重组。然后基于质粒同源重组后获得的抗生素抗性(例如卡那霉素抗性)筛选阳性菌株，并由之得到所需的重组腺病毒质粒。最后，再借助质脂体将重组腺病毒质粒转导已知的腺病毒包装细胞(例如，293细胞)中，并在由所述的包装细胞提供的E1蛋白的反向作用下包装病毒，以进一步扩增病毒。

对病毒进行聚合酶链反应(PCR)扩增后，结果证实病毒DNA中含有了目的基因EBV-LMP2的特异性片段。同时，反转录PCR(RT-PCR)证明了外源基因在真核细胞中得以转录，间接免疫荧光试验和Western印迹试验的结果也表明LMP2蛋白在细胞中得到表达。

另一方面，本发明提供了经携带外源基因的复制缺陷型重组腺病毒修饰后的抗原提呈细胞。在一个具体实施方案中，本发明提供了经本发明所述Ad-LMP2修饰后的抗原提呈细胞。

本发明中所述的抗原提呈细胞可以是任一种抗原提呈细胞，包括但不限于，单核/巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞和朗罕细胞。

树突状细胞(DC)在体内分布广泛，膜表面高表达共刺激分子、粘附分子及主要组织相容性复合物(MHC)分子，是体内功能最强的抗原提呈细胞(APC)，也是唯一能激活初始型T细胞、诱发初次免疫应答的APC，在抗感染、抗肿瘤、移植排斥等过程中发挥重要作用。可以使用各种形式的抗原对DC进行修饰，然后再将经过修饰的DC回输动物模型或人体内，或者在体外激活CTL并用于过继性治疗，结果取得了良好的抗肿瘤治疗效果(Fong，L.，Engleman.E.G.2000，Annu.Rev.Immunol.18：245-73)。因此，在本发明中，所述的抗原提呈细胞优选为树突状细胞。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种一种修饰后的树突状细胞，该树突状细胞经携带外源基因的复制缺陷型重组腺病毒转导后，表达有该外源基因编码的蛋白抗原，其中所述外源基因为EB病毒潜伏膜蛋白2的编码基因。

本申请中所述的“经修饰(后)的”抗原提呈细胞(树突状细胞)是指用本发明所述携带外源基因的复制缺陷型重组腺病毒转导后，并且表达有该外源基因编码蛋白抗原的抗原提呈细胞(树突状细胞)。

另一方面，本发明提供了一种制备经本发明所述Ad-LMP2修饰的树突状细胞的方法，该方法包括：

(1)将编码EB病毒LMP2的DNA序列克隆到适当的腺病毒穿梭质粒(例如，pShuttle-CMV)中，得到携带LMP2之DNA编码序列的重组腺病毒穿梭质粒；

(2)用步骤1的重组穿梭质粒和腺病毒骨架质粒(例如，pAdEasy-1)共转化适当的宿主细胞(例如，大肠杆菌BJ5183)；

(3)在适当条件下使步骤2的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒进行同源重组的，得到携带LMP2之DNA编码序列的重组腺病毒质粒；

(4)将步骤3的重组腺病毒质粒导入适当的腺病毒包装细胞(例如，293细胞)，得到所需的重组腺病毒；

(5)用如上得到重组腺病毒转导(自体)树突状细胞。

在一个具体的实施方案中，其中所述的腺病毒穿梭质粒是质粒pShuttle-CMV。

在一个具体的实施方案中，其中所述的腺病毒骨架质粒是质粒pAdEasy-1。

在一个具体的实施方案中，其中所述的宿主细胞是大肠杆菌BJ 5183。

在一个具体的实施方案中，其中所述的腺病毒包装细胞是293细胞。

试验证明经本发明所述Ad-LMP2修饰后的DC能在体外较强地激发出针对LMP2的特异性CTL反应。

在探讨上述修饰后DC应用的过程中，我们首先使用小鼠脾脏淋巴细胞，模拟人体DC疫苗的模式，进行了初步试验。用本发明所述Ad-LMP2转导小鼠脾脏淋巴细胞。经间接免疫荧光证实LMP2蛋白的表达后，用被转导后的脾淋巴细胞皮下接种免疫小鼠，并以乳酸脱氢酶(LDH)法检测特异性CTL的杀伤作用。结果发现，这种免疫方法可以有效地诱发小鼠针对LMP2的特异性细胞免疫，在效靶比为50∶1、20∶1、10∶1时，杀伤率分别为32.9％、17.9％、4.6％；而用对照组的小鼠则没有引起相应的免疫反应，对应的杀伤率分别为3.2％、0％、0％(参见图1)。

为了研究经Ad-LMP2修饰后的DC是否能在体外活化CTL，我们选择3名志愿者进行了体外试验。首先体外培养DC并诱导其成熟，用Ad-LMP2转导并证实LMP2表达后，用于体外活化自体淋巴细胞(例如，自体外周血单核细胞)作为效应细胞，用被携带有LMP2的病毒(例如，MVA-LMP2病毒)感染致敏后的自体淋巴细胞(例如，T淋巴细胞)作为靶细胞，LDH法检测体外活化CTL对自体致敏淋巴细胞的杀伤活性。结果发现，体外活化的CTL可以有效地杀伤自体致敏的靶细胞。在两个志愿者中，当效靶比为20∶1时杀伤率达到了60.1％和52.5％；而Ad5对照组则没有表现出相应的杀伤活性，对应的杀伤率分别为9.3％和20.2％(参见图2)。

为了检测这种体外活化的CTL能否有效的杀伤肿瘤细胞，我们进行了体外以及小鼠体内的肿瘤细胞生长抑制试验。所使用的靶细胞是来源于鼻咽癌病人的鼻咽癌细胞系CNE-2细胞。CNE-2细胞含有并表达LMP2基因，在体外试验中，我们选择与CNE-2细胞有相同HLA-A11类型的健康志愿者。在体外试验中，首先按照上述方法于体外活化特异性CTL，然后按适当比例将CTL细胞加入到预先接种的CNE-2细胞培养物中，继续培养24小时后采用MTT法检测CNE-2细胞的增殖。结果显示，与用不携带EBV-LMP2的腺病毒修饰的DC(对照组)相比，本发明的LMP2重组腺病毒修饰的DC体外活化的CTL可以在体外有效抑制CNE-2肿瘤细胞的生长。当效靶比例为20∶1时，抑制率达到48.3％，而对照组是15.4％。在小鼠(Nod-Scid小鼠)活体试验中，首先按照上述方法在体外活化CTL，然后用CTL与CNE-2细胞的混合物(10∶1)皮下接种小鼠，然后观察小鼠体内肿瘤生长状况。5周后处死小鼠，取肿瘤组织称重并进行免疫组化分析。结果显示，与未修饰的DC相比，本发明的LMP2重组腺病毒修饰的DC体外活化的CTL可以明显延缓CNE-2细胞在小鼠体内的成瘤作用，并且有效的抑制肿瘤的生长，在效靶比是10∶1时，抑制率达到46.35％(参见图3)。

试验证明：经Ad-LMP2修饰后的DC活化的CTL可有效地抑制或杀灭NPC肿瘤细胞。用经Ad-LMP2修饰后的DC接种小鼠后，可检测(免疫荧光法)到动物体内特异性抗体的生成，并且可检测(LDH方法)到动物的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。

因此，本发明的另一方面提供了被本发明所述修饰后的抗原提呈细胞活化了的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，以及使用该活化的CTL进行过继性治疗的方法，其中该方法包括向受试者施用免疫有效量的活化CTL。

为了检测经Ad-LMP2修饰后的DC能否在NPC病人体内诱导特异性CTL反应，我们在上述体外及动物体内试验的基础上，初步尝试了所述经Ad-LMP2修饰后的DC细胞疫苗临床应用的可行性。临床试验中共选择了9例NPC病人自愿者作为研究对象。这些病例均为放射治疗半年以上的、血清学检测EBV-IgA/VCA升高的非角化性NPC病人。常规体外培养自体DC，然后用Ad-LMP2感染并将细胞诱导成熟。以200拉达剂量的Co60照射后，用如上得到的细胞皮内免疫病人(间隔两周共免疫3次，2×10⁶个细胞/次)。分别于第一次免疫前以及最后一次免疫后4周采血，使用乳酸脱氢酶法(LDH)检测病人体内LMP2特异性CTL水平，以及IgA/VCA抗体滴度。结果显示，9例NPC病人均能够完成全部免疫过程，未见明显副反应。采用LDH法检测CTL显示，有5例NPC病人体内LMP2特异性CTL水平显著上升，在效靶比为50∶1时，5个病人体内的特异性杀伤率分别从28.90％上升至54.77％，30.00％上升至51.01％，42.60％上升至67.45％，22.00％上升至32.10％，10.90％上升至35.60％(参见图5)。同时，有7例NPC病人体内IgA/VCA抗体滴度下降(参见图7)。

试验证明：经Ad-LMP2修饰后的自体DC可以在NPC病人体内诱发针对LMP2的特异性CTL反应。

总之，我们的体内外实验结果清楚地表明，本发明的经Ad-LMP2修饰的DC可以在体内和体外激发针对LMP2的特异性CTL，而且这些活化的CTL还可以有效地杀伤NPC肿瘤细胞。

因此，本发明所述经过转导或修饰的树突状细胞还可用于治疗用途，用于治疗EBV相关肿瘤，特别是鼻咽癌。

另一方面，本发明提供了经转导或修饰后的抗原提呈细胞在制备治疗和预防EBV相关肿瘤的疫苗和药物中的用途。在一个具体实施方案中，所述抗原提呈细胞为DC细胞。在一个具体的实施方案中，其中所述的EBV相关肿瘤是鼻咽癌。

另一方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其中含有经Ad-LMP2修饰的抗原提呈细胞和药物学上可接受的佐剂、载体和/或赋形剂。在一个具体实施方案中，所述抗原提呈细胞为DC细胞。可按照制药工业中已知的方法(如参见Remington’s Pharmaceutical Science.15thed.，Mack Publishing Company，1980)将如上限定的被携带LMP2编码序列的重组腺病毒转导或修饰的树突状细胞与一种或多种药物学上可接受的佐剂、载体、赋形剂或稀释剂按适当的比例混合，并按已知方法除菌后制备本发明的疫苗组合物。

根据给药途径的不同，可将本发明的疫苗组合物配制成适于静脉内、肌肉内、体腔内、组织内、皮内或皮下给药的可注射的溶液剂或分散剂。

为了制备适于胃肠道外途径给药的可注射溶液剂，例如可以使用无菌蒸馏水、注射用水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、以及含有乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇及液态聚乙二醇等)的溶剂或分散介质作为载体或稀释剂。在任何情况下，所述的可注射制剂均应是无菌和可流动并适于通过注射器注射给药的。另外，在生产、运输和储存条件下，所述的制剂还必须是稳定的，并能够对抗细菌和真菌等微生物的污染。

也可使用制药工业中已知的方法和辅助成份，将本发明的疫苗组合物制成脂质体包裹剂。

另一方面，本发明提供了所述疫苗组合物在制备用于预防和治疗EB病毒相关肿瘤，特别是鼻咽癌的疫苗或药物中的应用。

初步的临床试验显示，本发明的DC疫苗可以作为一种有效的治疗性疫苗，用于治疗包括NPC在内的EBV相关肿瘤。

本发明所涉及的核酸序列和用于实现本发明的其他核酸，包括RNA、cDNA、基因组DNA、载体均可从各种来源中分离得到并可经受遗传操作、扩增，和/或被重组表达。另外，也可以使用已知的化学合成技术体外合成这些核酸(例如参见Adams，J.Am.Chem.Soc.105：661，1983；Belousov，Nucleic Acids Res.25：3440-3444，1997；Blommers，Biochemistry33：7886-7896，1994；Narang，Meth.Enzymol.68：90，1997)。

核酸操作技术，例如亚克隆、探针标记、测序、杂交等在科学文献和专利文献都已有充分描述(如参见Sambrook，ed.Molecular Cloning：A Laboratory Manul(2nd.ed.)，Vols.1-3，ColdSpring Harbor Laboratory(1998)；Current Protocols In Molrcular Biology，Ausubel，ed.John wiley& Sons，Inc.New York(1997))。

可以使用许多已知的方法完成核酸、载体、多肽和蛋白质等的定性和定量分析，例如这些方法包括分光光度法、放射显影法、电泳、高效液相层析(HPLC)、免疫沉淀、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验、Southern分析、Northern分析、点印迹分析、凝胶电泳(SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其他核酸或信号扩增技术等。

本发明是在由本发明人此前完成的记载于申请号为03128743.3的专利申请中的发明的基础上完成的。上述专利申请以及本申请中引用的其他文献，其内容在此全文引入作为参考。

本发明具有下列优点：

1.本发明所述的经Ad-LMP2修饰的树突状细胞(DC)能够激发显著的细胞免疫，并且能有效地抑制EBV病毒相关肿瘤细胞的生长。含有经Ad-LMP2修饰的DC的疫苗可用于预防和治疗EBV相关肿瘤，而且对鼻咽癌特别有效。

2.由于本发明可以采用患者自体的DC，这样能够最大限度地减少外源物质进入体内，克服了传统疫苗可能带来的污染和副作用。

3.本发明中的DC疫苗同时还可以适用于HLA基因亚型相同的人群。

本发明的各个方面参考下列附图及实施例提供的试验数据可得到更好的理解。

附图说明

图1图示的是经Ad-LMP2修饰的小鼠脾淋巴细胞在致敏动物体内诱发的特异性细胞免疫反应。

图2图示的是被本发明所述Ad-LMP2修饰的DC体外活化的CTL对CNE-2肿瘤细胞的体外抑制和杀伤活性。

图3图示的是被本发明所述Ad-LMP2修饰的DC体外活化的CTL对体外培养的CNE-2肿瘤细胞的成长抑制作用。

图4图示的是含Ad-LMP2修饰的DC细胞疫苗对荷瘤活体动物(小鼠)的平均肿瘤体积的影响。

图5图示的是患者接受本发明的细胞疫苗前后的CTL杀伤率(效靶比50∶1)的比较。

图6图示的是患者接受本发明的细胞疫苗前后的CTL水平的比较。

图7图示的是患者接受本发明的细胞疫苗前后的IgA/VCA抗体水平的比较。

除另有说明外，本申请中的所有科技术语的都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本申请中描述类似或等同的方法及材料都可用于实施或检验本发明，但是下文仍还是对合适的方法和材料进行了描述。本申请中引用的全部出版物、专利申请、专利及其他参考文献其全部内容在此引入作为参考。如有抵触，包括定义，以本申请为准。

下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而决不构成对本发明的限制。本领域技术人员应该理解的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的待批权利要求范围内。

实施例

在本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的。这些技术在下列文献中有详细地描述：Sambrook等人编著的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编著，1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins编著，1984)；Immnochemical Methods in Cell And MolecularBiology(Academic Press，London)。

材料和方法

本发明方法中所使用的携带LMP2基因的pSG-LMP2质粒由美国哈佛大学惠赠，腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、腺病毒骨架质粒pAdEasy-1、大肠杆菌宿主细胞BJ 5183以及腺病毒包装细胞(293细胞)均购自美国STRATAGENE公司。

试验中使用的EBV-LMP2非复制型痘苗病毒安卡拉株(MVA-LMP2)为英国伯明翰大学Rickinson教授馈赠。

本发明实验研究中使用的Tag酶购自Takara公司，本试验中使用的内切酶如无特别说明均购自Takara公司；细胞因子GM-CSF由华北制药厂提供；IL-4、TNF-α、IL-2以及LDH检测试剂盒购自Promega公司；淋巴细胞分离液和MTT分别购自Pharmacia和Sigma公司。

实施例1：经Ad-LMP2修饰的树突状细胞(DC)的制备和鉴定

本实施例目的在于制备经Ad-LMP2修饰的树突状细胞(DC)

A.树突状细胞的分离和培养

随机选取HLA-A11基因型的自愿者3名。

常规方法(参见《树突状细胞与肿瘤免疫》，张锦堃等编著)分离和培养具有的树突状细胞。采用淋巴细胞分离液通过常规方法分离出外周血单核细胞(PBMC)，在6孔板中培养2小时去除非贴壁细胞。然后加含10％胎牛血清、细胞因子IL-4(25ng/ml)、GM-CSF(50ng/ml)的RPMI 1640培养液，37℃5％CO₂培养7天，中间半换液一次。

B.重组腺病毒Ad-LMP2的构建

本发明方法中所使用的含LMP2基因的pSG-LMP2质粒由美国哈佛大学惠赠，腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、腺病毒骨架质粒pAdEasy-1、大肠杆菌宿主细胞BJ 5183以及腺病毒包装细胞(293细胞)均购自美国STRATAGENE公司。

重组腺病毒Ad-LMP2的构建、鉴定及病毒滴度的测定，均参见本发明人此前完成的记载于CN1548532A的发明，该文献内容在此全文引入作为参考。

重组腺病毒Ad-LMP2的鉴定使用序列表中的引物1和2。

C.经Ad-LMP2修饰的树突状细胞的制备和鉴定

将培养7天的DC细胞用无血清RPMI 1640收集并重悬于100ul RPMI 1640中，用MOI为500-1000的Ad-LMP2重组腺病毒37℃吸附2小时，然后，在含细胞因子(IL-425ng/ml、GM-CSF 50ng/ml、TNF-α20ng/ml)的DC培养基中继续培养48小时后离心收集成熟的即为Ad-LMP2修饰的成熟的树突状细胞。使用FITC标记的CD80，CD83，CD86抗体，采用流式细胞仪进行DC表面分子检测。同时采用间接免疫荧光方法检测LMP2的表达。

实施例2：Ad-LMP2修饰的小鼠脾淋巴细胞产生有效的CTL的体内试验

本实施例使用由小鼠脾组织制备的含树突状细胞在内的淋巴细胞混合物代替DC进行试验，利用。

A.经Ad-LMP2修饰的淋巴细胞的制备

常规方法(参见《树突状细胞与肿瘤免疫》，张锦堃等编著)制备小鼠脾淋巴细胞。这样制得的小鼠脾淋巴细胞是一种混合物，其中含有包括DC细胞在内的所有APC细胞。

用重组腺病毒Ad-LMP2修饰上述小鼠脾淋巴细胞(制备方法同实施例1的部分C)，制备获得经Ad-LMP2转导的淋巴细胞。

相同方法制备经Ad5(腺病毒5型野毒株)修饰的淋巴细胞用作下列试验的对照。

B.免疫接种

取小鼠10只，分为两组，每组5只。

用上述经Ad-LMP2转导的淋巴细胞和经腺病毒Ad5修饰的淋巴细胞分别接种上述两组小鼠，作为试验组和对照组。在接种后第2和第4周，以相同剂量同样方法加强免疫两次；第6周，取脾，分离脾细胞用于下列CTL水平检测试验。

C.含LMP2靶细胞系的建立

用电击法，将pCDNAIII-LMP2导入p815细胞系(

Number：TIB-64^TM)，得到重组P815-LMP2 G418抗性细胞。质粒pCDNAIII-LMP2是将LMP2基因插入到载体质粒pCDNAIII(购自美国Invitrogen公司)中构建而成的。以间接免疫荧光法，检测到该重组细胞中有LMP2表达。

D.CTL水平的检测

使用乳酸脱氢酶(LDH)方法(Cytotox96 ^TM  Non Radioactive Cytotoxicity Assay，Promega 公司)检测小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)水平。用重组痘苗病毒MVA-LMP2吸附后的小鼠淋巴细胞为刺激细胞。取本实施例B部分制备得到的脾组织细胞，与刺激细胞以10∶1的比例混合共培养4-6天后，即为效应细胞。采用本实施例C部分制备的重组P815-LMP2抗性细胞作为靶细胞。结果如表1和图1所示。从CTL试验结果可以看出，经本发明所述重组腺病毒Ad-LMP2修饰的小鼠脾淋巴细胞皮下接种免疫同种小鼠，诱导的CTL的杀伤率明显高于野生病毒株组。(图1)。

表1免疫小鼠产生的LMP2特异性CTL平均活性(杀伤率％)

注：E∶T＝效应细胞∶靶细胞。

同时，以间接免疫荧光的方法检测免疫小鼠血清中抗LMP2抗体的水平，结果显示，LMP2重组腺病毒组小鼠体内的抗体水平为10∶1，而野生病毒对照组未检测到相应的抗体。

试验表明：经本发明所述的重组腺病毒Ad-LMP2修饰的淋巴细胞能够在动物体内激发显著的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。

实施例3：经重组腺病毒Ad-LMP2转导的树突状细胞(DC)体外激发特异性CTL及其特异性抗瘤作用

A.体外活化的CTL杀伤自体致敏靶细胞试验

采用淋巴细胞分离液通过常规方法分离出外周血单核细胞(PBMC)，用实施例1中制备的经Ad-LMP2重组腺病毒和Ad5野毒株修饰的DC作为刺激细胞，刺激自体外周血单核细胞(PBMC)成为效应细胞，以重组MVA-LMP2(AB Rickinson教授惠赠，CRC Institutefor Cancer Studies，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham，B 152TT，U.K)感染的自体T细胞作为靶细胞，采用乳酸脱氢酶法检测CTL杀伤率。

结果显示，与对照相比，本发明所述经Ad-LMP2重组腺病毒修饰的DC在体外有效地活化CTL，并且随着效靶比的升高，CTL的杀伤活性逐渐升高(参见表2)。

表2：经Ad-LMP2修饰的DC体外活化CTL活性(杀伤率％)

B.体外活化CTL对CNE-2鼻咽癌细胞的体外抑制试验

常规方法分离淋巴细胞。

用实施例1制备的经Ad-LMP2修饰的DC和经无关基因重组腺病毒修饰的DC作为刺激细胞，刺激分离的淋巴细胞作为效应细胞。

以细胞膜上表达LMP2的鼻咽癌细胞CNE-2(来源于鼻咽癌病人，由本室分离建立的细胞系，属HLA-A∏)为靶细胞，MTT方法测定杀伤活性。结果显示，经Ad-LMP2修饰的DC体外活化的CTL可以在体外有效的抑制CNE-2细胞的生长。当效靶比为20∶1时，抑制率可以达到48.34％，而对照组是15.4％(参见图2)。

C.体外活化CTL对体内CNE-2肿瘤细胞生长抑制试验

用实施例1制备的经Ad-LMP2修饰的DC刺激自体PBMC活化成杀伤细胞。将杀伤细胞与CNE-2细胞(HLA-A11基因型)以10∶1的比例混匀后，皮下免疫nod/scid小鼠，观察小鼠成瘤情况，并进行免疫组化分析。

结果可见，在效靶比为10∶1时，阴性对照组小鼠肿瘤平均重量是2.19g，Ad-LMP2重组病毒组小鼠肿瘤平均重量是1.18g，与阴性对照组相比抑制率为46.35％。未处理DC活化CTL对照组小鼠肿瘤平均重量是2.54g，与阴性对照组相比抑制率为-11.61％。免疫组化的结果显示，此三组小鼠的移植瘤均为低分化磷癌(参见表3、图3和4)。

表3：经Ad-LMP2修饰的DC对体内肿瘤生长的抑制作用

肿瘤组织平均体积(mm<sup>3</sup>)	1周	2周	3周	4周	5周
						对照组未修饰DC组Ad-LMP2	49120	4121800	2993123178	521547161988	8570102064151

试验表明：用本发明所述的经Ad-LMP2修饰的DC能够在体外有效地活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，而活化后的CTL在体内外均能够有效地抑制或杀灭NPC肿瘤细胞。

实施例4：经Ad-LMP2修饰的DC的临床应用试验

本实施例试验选取的9例患者均为组织学上分型属于非角化性型的三期鼻咽癌患者。试验前所有患者均接受过半年至一年的放射治疗，同时血清学检测都有EBV-IgA/VCA抗体升高。

A.用经Ad-LMP2修饰的DC免疫免疫患者

将实施例1制备的经Ad-LMP2修饰的DC用200拉达的Co60照射，以杀死病毒和细胞。第0周，将照射后的DC皮内免疫患者，然后在第2周和第4周，各加强免疫一次。每次免疫所用的DC的数量平均是2×10⁶细胞。所有患者均能够完成全部治疗过程且耐受性良好，患者注射后局部没有红肿现象和发热等不良副反应。

B.细胞免疫水平和抗体的检测

(1)LDH法检测CTL水平：分别于第0和8周采血，用与实施例2和3相同的LDH法测定CTL水平。结果显示，其中5例患者可见明显的CTL数升高。在效靶比为50∶1时，第1号、2号、4号、7号和8号患者的杀伤率(特异性细胞溶解百分数)分别从28.90％上升至54.77％，30.00％上升至51.01％，42.60％上升至67.45％，22.00％上升至32.10％，10.90％上升至35.60％(参见图5)。

(2)胞内IFN-γ染色实验检测CTL水平：其中4例患者，在采用LDH法检测的同时也使用流式细胞分析仪，采用胞内IFN-γ染色法检测了体内LMP2特异性CTL水平。结果可见，其中的第7号和8号患者的双阳性细胞(IFN⁺CD8⁺细胞)数所占比例分别从0.09％和0.04％上升至0.46％和0.38％(参见图6)。

(3)采用免疫酶的方法测定IgA/VCA抗体水平：将TPA刺激后的B95.8细胞涂片，丙酮固定后，细胞孔用一系列稀释度的患者血清覆盖，37℃孵育45分钟，再分别覆盖HRP标记的羊抗人IgA，(37℃，45分钟)，底物显色反应，终止后于显微镜下观察。结果显示：用经Ad-LMP2转导的DC治疗后，其中的7例患者IgA/VCA抗体水平(滴度)下降至1∶10以下，其中的1例患者下降至1∶20，剩余的另1例患者未见变化(参见图7)。

试验表明：本发明所述的经Ad-LMP2修饰的DC能够在NPC患者体内诱导特异性CTL反应。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120>含经修饰后的树突状细胞的疫苗组合物

<140>

<141>

<160>2

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

GCTGCAGGAA ACAACTCCCA ATATCCA

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

AACTGGAGGG CAGATCTAAT GACC

Claims (4)

1.一种由下述方法制备而成的修饰后的树突状细胞，所述方法包括：

1)分离和培养HLA-A11基因型的树突状细胞；

2)用携带EB病毒潜伏膜蛋白2的编码基因全长序列的复制缺陷型重组腺病毒转导该树突状细胞，使之表达上述基因编码的蛋白抗原；然后

3)将步骤2)中得到的表达外源蛋白抗原的树突状细胞用200拉达的Co60照射。

2.一种疫苗组合物，其中含有权利要求1所述的修饰后的树突状细胞和一种或多种药物学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂。

3.权利要求1所述的修饰后的树突状细胞在制备用于在治疗和预防EBV相关肿瘤的药物中的用途。

4.权利要求3所述的用途，其中所述的EBV相关肿瘤是鼻咽癌。

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