一种抗原表位肽及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程与生物医学技术领域,尤其涉及一种抗原表位肽及其应用。
背景技术
全世界约有3亿人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV),而中国就有约1.2亿人。中国作为乙型肝炎的高流行区,占全球HBV表面抗原(hepatitis B virussurface antigen,HBsAg)总携带率的近50%,60%的人受过HBV的感染,在某些人群中甚至高达79%。8%~10%的人为HBsAg携带者。现患慢性乙型肝炎的病人约为1000万人,近年发病率约为0.158%。此外,患慢性肝炎的病人中约有80%以上为慢性乙型肝炎患者,而受HBV慢性感染的人群罹患原发性肝细胞(hepatocellular carcinoma,HCC)的相对危险性至少增加300倍。
HBV基因组全长约3.2kb,在病毒颗粒中以rcDNA(relaxed circular DNA)形式存在。HBV的外膜为脂蛋白结构,约含25%脂质和75%糖蛋白,后者的主要成分为HBsAg。在电镜下,HBV可呈现3种不同的形态结构。①大球形颗粒结构:又称Dane颗粒,是一种完整的球形HBV颗粒,直径42nm,含有双层衣壳,HBsAg镶嵌于其中,具有很强的感染性。②小球形结构:为HBV患者血清中最常见的颗粒,含量比Dane颗粒高900~1000倍,颗粒直径22nm,呈球形或棒状结构,不含核酸及多聚酶,为组装Dane颗粒时游离到血液中的过剩HBsAg。③管形颗粒:为排列成串的小球形颗粒,直径在50~70nm间。完整的HBV颗粒对热、低温、干燥、紫外线等外界因素的抵抗力很强,在60℃中可耐受4h,37℃可存活7天。但100℃加热10min、0.5%过氧乙酸、0.3%漂白粉、0.2%新洁尔灭可杀灭。
HBV进入血液中并迅速到达肝组织。正常情况下,网状内皮细胞可把HBV清除。但如果病毒量超过机体的清除能力,或机体处于免疫抑制状态,HBV可在肝组织及其他肝外组织中定居、复制。一般认为是免疫因素,特别是细胞免疫应答,可能是HBV导致免疫病理损伤的关键。
尽管目前慢性乙型肝炎(CHB)的发病机制尚不完全清楚,现有的证据表明:影响HBV的致病并不完全依赖于病毒本身,宿主对HBV的免疫反应可能在致病因素中起到了重要的作用。急性HBV感染者,机体针对HBV会产生强烈的多特异性的免疫反应,而慢性HBV感染者则出现弱的免疫反应,这暗示在HBV感染早期,对HBV产生合适的免疫反应可能会使患者完全康复。在免疫清除期而非免疫耐受期给患者应用抗病毒药物会得到更好的效果,这也佐证了机体对HBV的免疫状态与疾病的恢复密切相关。
CHB患者机体的免疫状态与病情密切相关。邢利和等报道:通过检测患者外周血免疫细胞的数量、功能和种类可反映机体的免疫状态,慢性HBV感染者外周血中DC的增殖数量较正常人明显降低;表达于CHB患者树突状细胞(DC)表面的CD83、CD86、CD80和HLA-DR的水平明显低于正常;在混合淋巴细胞反应(MLR)中CHB患者的DC刺激T淋巴细胞增殖的能力也低于健康人;DC产生的IL-12的水平下降,而NO水平升高。由此推测:CHB患者不仅DC表型不成熟,而且也存在功能缺陷。王敏等报道:轻、中度慢性乙型肝炎发展为重度和肝硬化的过程中,外周血淋巴细胞亚群绝对数随病情进展而减少。在清除HBV的过程中,包括溶胞机制及非溶胞机制,而且非溶胞机制中IFN-γ,TNF-α等细胞因子起到主要作用,可以缩短cccDNA的半衰期,从而达到抑制HBV DNA复制的目的。而慢性乙肝患者体内CTL功能减弱是导致乙肝慢性化的关键性因素,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能恢复是免疫治疗CHB的重要目标。
DC是体内最重要的、功能最强的抗原递呈细胞,它能有效的摄取、加工、递呈肿瘤抗原,在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用。利用DC强大的抗原提呈功能,负载HBV相关抗原,与CTL细胞共同培养,可以提高CTL细胞对靶细胞的细胞毒杀伤作用。乙型肝炎特异性抗原既是T细胞活化的第一信号,又能够上调DC表面分子的表达。DC高表达的共刺激分子是活化T细胞的第二信号。DC的抗原提呈功能得以增强,从而打破机体针对HBV的免疫耐受,更有利于刺激机体产生针对HBV的CTL,是树突状细胞诱导的细胞毒性T淋巴细胞(DC-CTL)治疗慢性乙型肝炎及相关疾病策略。
目前尚无根治HBV感染的药物,推荐的乙肝药物包括干扰素和核普(酸)类似物,目前上市的推荐药物对慢性乙型肝炎治疗的长期疗效有限,例如己上市核普类似物虽然口服给药,使用方便,但疗程不确定,仅局限于抑制HBV DNA的复制,对肝细胞核内的复制模板cccDNA无清除作用,而且在抑制HBV复制后,如果没有发生HBeAg和HBsAg的血清学转换,停药后出现较高的复发率,同时,耐药的发生以及何时停药等,也是困扰临床医师和患者的重要问题;干扰素虽然较少出现复发和耐药,但有效率也仅有30%左右,且注射途径应用不便,不良反应较多,并有应用人群的局限性。因此,临床上迫切需要探索新的治疗方法,以解决目前抗病毒治疗过程中存在的问题。
除了抗病毒药物继续发挥抑制病毒复制作用之外,机体的免疫应答承担了进一步清除病毒抗原和cccDNA(covalently closed circle DNA)的重任。cccDNA虽量少却十分稳定,是造成HBV慢性感染以及抗病毒药物停用后病情反复的关键因素之一,只有清除或有效降低cccDNA,才能消除病毒感染或使病情稳定。现有的核苷类似物只能清除循环中的HBVcccDNA,而对肝细胞核中的cccDNA毫无作用,cccDNA的清除只能由免疫系统来完成,机体只有在持续抑制病毒复制的基础上,通过HBV特异性CD8+T细胞(CTL)和细胞因子诱导受病毒感染的肝细胞发生凋亡,从而耗竭cccDNA储备,才能获得持续病毒学应答和最终的病毒清除。许多证据表明,CTL应答在HBV的免疫损伤中发挥重要的作用,CTL在从活体中清除肿瘤细胞、病毒感染的细胞等中发挥重要作用,CTL识别细胞上的抗原肽,并攻击和杀死靶细胞,其靶抗原主要为HBsAg及HBcAg。HBsAg是CTL攻击的理想靶抗原。最早可检测到的特异性T细胞免疫应答的靶抗原为乙肝病毒前SI抗原(pre-SI),在肝细胞损伤前1个月出现,与血清中HBV DNA几乎同时出现。中国学者发现,HBV感染患者的HBsAg特异性细胞免疫检出率与病情大致平行。感染的肝细胞数量较少,免疫应答水平正常,则表现为急性乙型肝炎(acutehepatitis B,AHB);当感染的肝细胞多,免疫应答水平较高时,大量的肝细胞被破坏,常表现为急性暴发性HB或暴发性HB;机体的免疫应答水平低下,HBV的感染及免疫损伤将持续在肝细胞中进行,表现为CHB(慢性乙型肝炎);而当机体对HBV无免疫应答时,即处于一种免疫耐受状态时,HBV不会被清除,也不会导致肝细胞损伤,表现为HBV携带状态。
CHB患者体内存在不同程度的免疫功能低下,其中DC的数量和功能均有缺陷,患者的抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cell,APC)往往不能正确地处理和提呈抗原信号,直接影响了有效的CTL抗病毒反应。因此采用病毒抗原多肽(HBsAg和(或)HBcAg)体外致敏DC再回输给患者,可大大提高DC对病毒抗原的提呈能力,激发特异性CTL的免疫应答反应。
通过体外细胞培养方法激活和大量增殖患者自身的DC,有效负载病毒的抗原多肽,并与大量增殖的CTL联合培养,再回输患者体内,不仅发挥特异性免疫清除作用,还具有重要的免疫调节功能,在机体抗病毒免疫反应中发挥了不可替代的作用。
综上所述,在病毒性乙型肝炎的治疗过程中,在借助抗病毒药物和保肝药物为机体免疫功能恢复“减压”的基础上,实施负载乙肝病毒抗原或抗原肽的DC-CTL免疫调节治疗,增强抗HBV特异性细胞和体液免疫应答,宿主免疫功能是影响HBV感染后疾病进展、预后转归的关键因素,有效调节宿主免疫应答对特异性识别、清除HBV,实现持久免疫控制,并最终延缓或阻断疾病进展具有重要意义。目前,现有的抗原表位肽HBsAg和/或HBcAg、HBVPre-S2负载于抗原提呈细胞,抗原递呈效果较差,细胞因子分泌较少,与淋巴细胞共培养后,不能有效产生特异性细胞毒性杀伤细胞,杀瘤效率较低。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种抗原表位肽及其应用,本发明提供的抗原表位肽能够有效诱导树突状细胞成熟,提高抗原递呈能力,分泌更多的细胞因子,与淋巴细胞共培养后,能产生特异性细胞毒性杀伤细胞,提高杀瘤效率,可有效抑制肿瘤的生长,起到抗肿瘤的作用。
本发明的目的在于提供一种抗原表位肽,其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种上述抗原表位肽在制备抗原递呈细胞中的应用。
本发明还提供一种抗原递呈细胞,将所述抗原表位肽负载于树突状细胞(DC),获得抗原表位肽致敏的抗原递呈细胞。
本发明还提供一种抗原递呈细胞在诱导细胞毒性T淋巴细胞中的应用。
本发明提供一种细胞毒性T淋巴细胞(DC-CTL),通过所述抗原递呈细胞诱导得到。
本发明还提供一种细胞毒性T淋巴细胞在制备治疗乙型肝炎病毒所致疾病的药物中的应用。
本发明提供一种药物,其包含有所述细胞毒性T淋巴细胞(DC-CTL)。
优选的,所述药物还包含有本发明所述抗原表位肽和/或所述抗原递呈细胞。
本发明提供一种上述药物的制备方法,步骤如下:
a)将所述抗原表位肽负载于树突状细胞,得到致敏的抗原递呈细胞;
b)将所述抗原递呈细胞与淋巴细胞共培养,得到抗原递呈细胞诱导的细胞毒性T淋巴细胞(DC-CTL),与载体或辅料混合后制得治疗乙型肝炎病毒所致疾病的药物。
本发明提供一种以上所述抗原表位肽和/或所述抗原递呈细胞和/或DC-CTL细胞和/或所述药物和/或所述制备方法制得的药物在制备治疗乙型肝炎病毒所致疾病药物方面的应用。
从以上技术方案可以看出,本发明具有以下有益效果:
1)本发明提供一种抗原表位肽,能特异性高效负载在DCs上,极大提高在抗原提呈细胞上的负载能力,作为DC疫苗更高效刺激体内产生抗原特异性CTL,进而增强其诱导特异性免疫反应的能力;2)负载了本发明提供的抗原表位肽的DC与淋巴细胞共培养体外高效扩增抗原特异性CTL,这样的DC-CTL治疗具对表达乙肝病毒细胞或相关肿瘤细胞具有特异性杀伤作用,比单一负载核心表位肽HBcAg(或/和HBsAg)和表面抗原表位肽HBV Pre-S2的DC在体内外刺激活化的CTL活性更强,杀伤效果更优;3)本发明提供的抗原表位肽合成方便,不受材料限制,易于制备和纯化,能大量合成高纯度,具有高度可重复性;4)化学性质和热力学性质比蛋白质更稳定,便于运输和保存;5)没有毒性或感染性因子;6)下游加工处理简单易行且成本低。本发明提供的抗原表位肽具有良好的特异性免疫原性,具有治疗乙型肝炎病毒所致疾病的药物的潜力,因此成为一种具有广阔应用前景的免疫治疗佐剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1示表位肽负载DCs的检测示意图;
图2示抗原表位肽负载后DCs表型的检测示意图;
图3示负载了表位肽的DCs与T细胞的混合淋巴细胞反应示意图;
图4示负载了表位肽的DCs活化T细胞分泌IL-2的检测示意图;
图5示负载了表位肽的DCs活化T细胞分泌IFN-γ的检测示意图;
图6示负载了表位肽的DCs活化T细胞分泌TNF-α的检测示意图;
图7示负载了表位肽的DC-CTL体外的杀瘤效率检测示意图;
图8示负载了表位肽的DC-CTL治疗肿瘤模型动物的肿瘤体积变化示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种抗原表位肽,其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
所述的抗原表位肽可以通过人工化学合成的方式制备,也可以通过本领域技术人员知悉的其它生物化学或者分子生物学的方法得到。
本发明提供的一个实施例中采用人工合成的方式制备。所述人工合成的制备方法步骤为:
首选,合成抗原表位肽(SEQ ID NO:1所示)。所述合成方法为,将HBV核心表位肽和HBV表面抗原表位肽串联得到表位肽(SEQ ID NO:1)。所述HBV核心表位肽优选为HBcAg和/或HBsAg,本发明以HBcAg18-27(SEQ ID NO:2所示)为例。所述HBV表面抗原表位肽优选为HBV Pre-S2,本发明以HBV Pre-S2 44-53(SEQ ID NO:3所示)为例。
本发明委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成实施例中所述HBV核心表位肽HBcAg(SEQ ID NO:2)、所述表面抗原表位肽HBV Pre-S2(SEQ ID NO:3)以及所述抗原表位肽(SEQ ID NO:1),并经高效液相色谱和质谱分析鉴定其序列和分子量。所述HBV核心表位肽HBcAg(SEQ ID NO:2)浓度优选为95%以上。所述表面抗原表位肽HBV Pre-S2(SEQ IDNO:3)浓度优选为95%以上。所述抗原表位肽(SEQ ID NO:1)浓度优选为95%以上。
其次,将合成得到的抗原表位肽进行溶解,经过过滤、除菌后,进行分装保存。所述溶解使用的储存液优选为水或者DMSO(二甲基亚砜),储存液浓度优选为8~12mg/ml,更优选为10mg/ml。所述过滤的器具优选为0.22μm的针筒滤器。所述储存的温度优选为-18℃~-22℃,更优选为-20℃。经高效液相色谱和质谱分析鉴定证明合成的表位肽的序列和分子量均正确,且纯度达到95%以上,得到符合实施例使用要求的抗原表位肽(SEQ ID NO:1)。
本发明还提供一种抗原表位肽在制备抗原递呈细胞中的应用。
本发明提供一种抗原递呈细胞,将所述抗原表位肽负载于DCs,得到抗原表位肽致敏的抗原提呈细胞。所述抗原表位肽浓度优选为35~45μg/ml,更优选为40μg/ml。所述DCs优选为淋巴细胞或骨髓细胞,更优选为淋巴细胞。
所述DCs优选按照下述方法获取:首先,将外周血进行离心、洗涤。所述离心前加入肝素抗凝。所述离心的方法为,加入ficoll(聚蔗糖)后进行密度梯度离心,ficoll浓度优选为1~2g/ml,更优选为l.077g/ml。所述梯度离心的条件优选为18℃~20℃,1300~1700r/min,13~17min,更优选为20℃,1500r/min,15min。离心结束后收集细胞进行培养。所述培养方法为,将细胞收集于6孔板中,置于进行二氧化碳培养箱中进行培养。所述培养基为AIM-V培养基。所述培养的孵育时间优选为1.5-2.0h。培养结束后,轻轻取出6孔板,将6孔板中的上清液及悬浮细胞吸出于另一培养皿中,得到待用细胞悬液。其次,向所述待用细胞悬液中加入培养基及细胞因子,置于二氧化碳培养箱中进行培养。所述细胞因子为rhGM-CSF和IL-4,浓度优选为rhGM-CSF750~850IU/ml,IL-4 450~550IU/ml,更优选为rhGM-CSF800IU/ml,IL-4 500IU/ml。所述培养过程中,48h后加一次细胞因子,培养第五天加入TNF-α,继续培养到第7天后,得到成熟的DCs。所述TNF-α的浓度优选为200~300IU/ml,更优选为250IU/ml。
所述负载方法为,将抗原表位肽(SEQ ID NO:1)与成熟的DCs进行培养,培养过程中,每三天半量换液,同时加入细胞因子进行培养。所述细胞因子优选为GM-CSF,rhIL-4和rhIL-2。所述培养的条件优选为于35℃~39℃,3~7%CO2培养箱中进行培养,更优选为37℃,5%CO2。在培养箱中培养7天后,得到抗原表位肽特异性的HBcAg-HBv Pre-S2 DC。
本发明还提供一种抗原递呈细胞在制备DC-CTL中的应用。
本发明提供一种DC-CTL,将抗原递呈细胞与淋巴细胞共培养,得到抗原表位肽诱导的DC-CTL。所述抗原递呈细胞为抗原表位肽特异性的HBcAg-HBv Pre-S2 DC。所述CTL为悬浮细胞培养得到,所述CTL细胞浓度优选为107/ml。
本发明还提供一种DC-CTL在制备治疗乙型肝炎病毒所致疾病的药物中的应用。
本发明还提供一种药物,其包含有所述DC-CTL。
优选的,所述的药物还包含有本发明所述抗原表位肽和/或所述抗原递呈细胞。
本发明提供一种治疗乙型肝炎病毒所致疾病的药物的制备方法,步骤如下:
首先将所述抗原表位肽负载于DCs制成抗原递呈细胞。所述的抗原表位肽可以通过人工化学合成的方式制备,也可以通过本领域技术人员知悉的其它生物化学或者分子生物学的方法得到。
本发明提供的一个实施例中采用人工合成的方式制备。所述人工合成的制备方法步骤为:
首选,合成抗原表位肽(SEQ ID NO:1所示)。所述合成方法为,将抗原HBV核心表位肽和HBV表面抗原表位肽串联得到表位肽(SEQ ID NO:1)。所述HBV核心表位肽优选为HBcAg和/或HBsAg,本发明以HBcAg18-27(SEQ ID NO:2所示)为例。所述HBV表面抗原表位肽优选为HBV Pre-S2,本发明以HBV Pre-S2 44-53(SEQ ID NO:3所示)为例。
本发明委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成实施例所述HBV核心表位肽HBcAg(SEQ ID NO:2)、所述表面抗原表位肽HBV Pre-S2(SEQ ID NO:3)以及所述抗原表位肽(SEQID NO:1),并经高效液相色谱和质谱分析鉴定其序列和分子量。所述HBV核心表位肽HBcAg(SEQ ID NO:2)的浓度优选为95%以上。所述表面抗原表位肽HBV Pre-S2(SEQ ID NO:3)的浓度优选为95%以上。所述抗原表位肽(SEQ ID NO:1)的浓度优选为95%以上。
其次,将合成得到的抗原表位肽进行溶解,经过过滤、除菌后,进行分装保存。所述溶解使用的储存液优选为为水或者DMSO(二甲基亚砜),储存液浓度优选为8~12mg/ml,更优选为10mg/ml。所述过滤的器具优选为0.22μm的针筒滤器。所述储存的温度优选为-18℃~-22℃,更优选为-20℃。经高效液相色谱和质谱分析鉴定证明合成的表位肽的序列和分子量均正确,且纯度达到95%以上,得到符合实施例中使用要求的抗原表位肽(SEQ ID NO:1)。
所述DCs优选按照下述方法获取:首先,将外周血进行离心、洗涤。所述离心前加入肝素抗凝。所述离心的方法为,加入ficoll(聚蔗糖)后进行密度梯度离心,ficoll浓度优选为1~2g/ml,更优选为l.077g/ml。所述梯度离心的条件优选为18℃~20℃,1300~1700r/min,13~17min,更优选为20℃,1500r/min,15min。离心结束后收集细胞进行培养。所述培养方法为,将细胞收集于6孔板中,置于进行二氧化碳培养箱中进行培养。所述培养基为AIM-V培养基。所述培养的孵育时间优选为1.5-2.0h。培养结束后,轻轻取出6孔板,将6孔板中的上清液及悬浮细胞吸出于另一培养皿中,得到待用细胞悬液。其次,向所述待用细胞悬液中加入培养基及细胞因子,置于二氧化碳培养箱中进行培养。所述细胞因子为rhGM-CSF和IL-4,浓度优选为rhGM-CSF750~850IU/ml,IL-4 450~550IU/ml,更优选为rhGM-CSF800IU/ml,IL-4 500IU/ml。所述培养过程中,48h后加一次细胞因子,培养第五天加入TNF-α,继续培养到第7天后,得到成熟的DCs。所述TNF-α的浓度优选为200~300IU/ml,更优选为250IU/ml。
将所述抗原表位肽负载于DCs,得到抗原表位肽致敏的抗原提呈细胞。所述多肽浓度优选为35~45μg/ml,更优选为40μg/ml。所述DCs优选为淋巴细胞或骨髓细胞,更优选为淋巴细胞。
所述负载方法为,将抗原表位肽(SEQ ID NO:1)与成熟的DCs进行培养,培养过程中,每三天半量换液,同时加入细胞因子进行培养。所述细胞因子优选为GM-CSF,rhIL-4和rhIL-2。所述培养的条件优选为于35℃~39℃,3~7%CO2培养箱中进行培养,更优选为37℃,5%CO2。在培养箱中培养7天后,得到抗原表位肽特异性的HBcAg-HBv Pre-S2 DC。
其次,将所述抗原递呈细胞与淋巴细胞共培养,得到DC-CTL。所述CTL为悬浮细胞培养得到,所述CTL细胞浓度优选为107/ml。将DC-CTL与载体或辅料混合后制得治疗乙型肝炎病毒所致疾病的药物。
本发明提供一种以上所述抗原表位肽和/或所述抗原递呈细胞和/或DC-CTL细胞和/或所述药物和/或所述制备方法制得的药物在制备治疗乙型肝炎病毒所致疾病药物方面的应用。
本发明提供的一种多肽能使特异性抗原表位肽能高效负载于DCs上,极大提高其在抗原提呈细胞上的负载能力,进而增强其诱导特异性免疫反应的能力,因此成为一种具有广阔应用前景的免疫治疗佐剂。本发明提供的抗原表位多肽具有良好的特异性免疫原性,具有治疗和/或预防和/或诊断乙型肝炎病毒的药物的潜力;多肽合成方便,不受材料限制;易于制备和纯化,能大量合成高纯度、具有高度可重复性的多肽;化学性质和热力学性质比蛋白质更稳定,便于运输和保存;没有毒性或感染性因子下游加工处理简单易行且成为更清楚起见,下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1抗原表位肽负载DCs
1)制备抗原表位肽
本发明委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成HBV核心表位肽HBcAg(SEQ ID NO:2)、表面抗原表位肽HBV Pre-S2(SEQ ID NO:3)以及抗原表位肽(SEQ ID NO:1),并经高效液相色谱和质谱分析鉴定其序列和分子量,浓度为95%以上。
2)抗原表位肽负载DCs
根据表位肽的溶解性,将其溶解在水或DMSO中,储存液浓度为10mg/ml。用0.22μm的针筒滤器过滤除菌,分装后于-20℃保存。进行表位肽负载DCs时,表位肽的终浓度为40μg/ml。
3)将连接了FITC荧光基团的抗原表位肽对DCs进行负载
实验结果如图1所示,24h后在荧光显微镜下观察负载效率,发现抗原表位肽可有效地被DCs摄取递呈到细胞表面,流式细胞术检测其负载效率可达70%以上。
实施例2DCs和CTL的培养
(1)取外周血,加入肝素抗凝,然后添加ficoll(l.077g/ml)进行密度梯度离心(20℃,1500r/min,15min),取界面细胞,用PBS洗涤2次,400r/min,10min,洗2次。收集细胞并于盛有AIM-V培养基的6孔板中,置于二氧化碳培养箱中孵育1.5~2.0h。轻轻取出6孔板,将上清液及悬浮细胞吸出于另一培养皿中待用。
(2)在盛有贴壁细胞的培养孔中加入培养基及rhGM-CSF 800IU/ml,IL-4500IU/ml,二氧化碳培养箱培养,48h后加一次细胞因子,培养第5天加入TNF-α250IU/ml,继续培养,第7天DC细胞成熟。
(3)T淋巴细胞的培养和DC-CTL的体外诱导
步骤(2)中的悬浮细胞作为T细胞进行培养,细胞浓度调整为107/ml。将负载了HBV核心表位肽HBcAg(SEQ ID NO:2)、HBV表面抗原表位肽HBV Pre-S2(SEQ ID NO:3)以及HBcAg-HBv Pre-S2抗原表位肽(SEQ ID NO:1)的DCs分别与CTL进行培养,DCs与CTL的比例为1:15。分为以下几组:①负载了HBcAg-HBv Pre-S2表位肽的DC与淋巴细胞共培养;②负载了HBcAg表位肽的DC与淋巴细胞共培养;③负载了HBV Pre-S2表位肽的DC与淋巴细胞共培养;④未负载表位肽的DC与淋巴细胞共培养;⑤淋巴细胞空白对照组。每隔三天每三天半量换液,加入细胞因子进行培养。所述细胞因子优选为GM-CSF,rhIL-4和rhIL-2。培养条件优选为于35℃~39℃,3~7%CO2培养箱中进行培养,更优选为37℃,5%CO2。在培养箱中培养7天后,分别得到表位肽特异性的HBcAg-HBv Pre-S2 DC-CTL、HBcAg DC-CTL、HBV Pre-S2DC-CTL和DC-CTL细胞悬液。
实施例3抗原表位肽负载DCs的表型检测
1)DC细胞免疫荧光标记
将实施例2中制备得到的表位肽特异性的HBcAg-HBv Pre-S2 DC、HBcAg DC、HBVPre-S2 DC和DC ctl四种细胞悬液进行三色标记;
2)表型检测
检测所使用的抗体为:CD80、CD83、CD86、HLA-DR,各10μl。在4℃下孵育30min,避光。PBS洗涤2次后,再用PBS悬浮细胞。对四种DCs的表型进行检测,使用流式细胞术进行分析。
结果显示(如图2所示,注:横坐标为抗体,纵坐标为百分比;“**”经显著性分析P<0.01差异极显著,“*”经显著性分析P<0.05差异显著),负载了抗原表位肽(SEQ ID NO:1)的DCs比负载了单一表位肽的DCs表型高,DCs成熟标记和共刺激因子的表达百分比更高,差异极显著。说明本发明提供的抗原表位肽能够更加有效地诱导DCs成熟,提高DCs的抗原递呈能力。
实施例4混合淋巴细胞反应
为了检测负载了抗原表位肽(SEQ ID NO:1)的DCs是否能够促进外周血淋巴细胞增殖,并分泌细胞因子,将表位肽特异性的HBcAg-HBv Pre-S2 DC、HBcAg DC、HBV Pre-S2DC和DC四种细胞悬液与预先用CFSE标记的不同正常人的外周血淋巴细胞(PBL)进行混合培养,六天后进行流式细胞术检测PBL的增殖曲线。
实验步骤如下:
(1)将PBL进行CFSE标记,用PBS洗涤两遍后,用淋巴细胞培养液重悬,调整细胞浓度为106/ml。
(2)将表位肽特异性的HBcAg-HBv Pre-S2 DC、HBcAg DC、HBV Pre-S2DC和DC四种细胞悬液分别进行重悬,调整细胞浓度为3×105/ml。
(3)按比例加入DCs与PBL细胞。DCs与PBL的比例分别为:50000:105,10000:105,5000:105,1000:105,500:105,100:105。并设PBL和DCs的对照孔。
实验结果如图3所示(横坐标表示DCs与PBL的比例,纵坐标表示增殖量;百分比“**”经显著性分析P<0.01差异极显著,“*”经显著性分析P<0.05差异显著)。结果说明,负载了抗原表位肽的HBcAg-HBv Pre-S2 DC对PBL具有明显的促进增殖作用,差异极显著,并且随着DCs与PBL比例的增加,促进效果逐渐增强。其中抗原表位肽(SEQ ID NO:1)负载的DCs对PBL的增殖促进作用最强,单一的表位肽促进PBL增殖的作用次之,说明抗原表位肽(SEQID NO:1)可以更加有效的促进DCs的功能,提高其抗原递呈能力。
实施例5细胞因子分泌检测
为了检测负载了抗原表位肽(SEQ ID NO:1)的DCs是否能够促进淋巴细胞分泌细胞因子,将表位肽特异性的HBcAg-HBv Pre-S2 DC、HBcAg DC、HBV Pre-S2 DC和DC四种细胞悬液与不同正常人的外周血淋巴细胞(PBL)进行混合培养。在第三天,第六天,第十天时收集培养液上清,用ELISA试剂盒检测其中IL-2,IFN-γ,TNF-α的分泌量。
实验结果如图4、图5、图6所示(横坐标表示时间,纵坐标表示分泌量;“**”经显著性分析P<0.01差异极显著,“*”经显著性分析P<0.05差异显著)。实验结果表明,负载了抗原表位肽(SEQ ID NO:1)的DCs可以更加有效地活化T细胞分泌多种细胞因子,差异极显著。IL-2和TNF-α的分泌在第三天达到峰值,IFN-γ的分泌在第六天达到峰值。负载了抗原表位肽(SEQ ID NO:1)的DCs促进T细胞分泌的细胞因子水平均较负载了单独表位肽的DCs能够分泌更多的细胞因子。
实施例6负载了抗原表位肽的DC-CTL的体外杀瘤实验检测
使用负载了抗原表位肽(SEQ ID NO:1)的DC-CTL为效应细胞,肝癌细胞系Hep3B(感染乙肝病毒)作为靶细胞,体外检测杀瘤效率。
具体步骤为:
(1)收集Hep3B,用RPMI1640培养基(含5%FBS)重悬细胞,调整细胞浓度为5×104/ml,加入96孔板中,每孔加入100μl,细胞数量为5000个/孔。37℃,5%CO2培养箱中贴壁过夜。
(2)收集表位肽特异性的HBcAg-HBv Pre-S2 DC、HBcAg DC、HBV Pre-S2 DC和DCctl四种细胞悬液与CTL共培养进行诱导,同时加入不添加DC的进行对照,得到诱导后的HBcAg-HBv Pre-S2 DC-CTL、HBcAg DC-CTL、HBV Pre-S2 DC-CTL、DC-CTL以及CTL共五组,重悬于RPMI1640培养基(含5%FBS)中,调整细胞浓度为106/ml,按照效靶比10:1,5:1,1:1加入效应细胞,用RPMI1640培养基(含5%FBS)补足体积。
(3)置于37℃,5%CO2培养箱中培养4h。
(4)每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml),在培养箱中继续培养4小时。
(5)2000rpm,10min,离心后小心地将上清尽量吸出,注意不要将板底的结晶紫吸出来。然后加入150ul DMSO,避光,震荡10min,将结晶紫全部溶解。酶标仪,波长492nm进行检测。
(6)酶标仪检测,在波长492nm下检测每孔的吸光度值。
(7)计算杀瘤效率。杀瘤效率(%)=[1-(实验组OD值-单独效应细胞OD值)/单独靶细胞OD值]×100%。
采用MTT法检测杀瘤效率。实验结果如图7所示(横坐标表示效靶比,纵坐标表示杀伤率;“**”经显著性分析P<0.01差异极显著,“*”经显著性分析P<0.05差异显著),负载了抗原表位肽(SEQ ID NO:1)的HBcAg-HBv Pre-S2DC-CTL在效靶比为10:1的条件下,对Hep3B的杀瘤效率可达92.1%,高于负载了单独表位肽(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3)的DC-CTL,杀瘤效率随着效靶比的降低而下降。
实施例7负载了抗原表位肽的DC-CTL的动物实验
检测负载了抗原表位肽(SEQ ID NO:1)的HBcAg-HBv Pre-S2 DC-CTL在模型动物裸鼠体内杀伤肿瘤的效果。
(1)取六周龄裸鼠40只,分为8组,每组5只。分别为:①负载了抗原表位肽HBcAg-HBV Pre-S2的DC-CTL;②负载了HBcAg表位肽的DC-CTL;③负载了HBV Pre-S2表位肽的DC-CTL;④未负载表位肽的DC-CTL;⑤CTL only;⑥PBS;⑦模型组;⑧正常组。
(2)收集Hep3B细胞,重悬于PBS中,调整细胞浓度为1.5×107个/ml,①-⑦组裸鼠,每只在腋窝皮下注射200μl,即3×106个。
(3)7天后,裸鼠皮下肿瘤直径约为5mm大小,将各组细胞进行局部注射。每只裸鼠注射的细胞量为107个。隔一周后进行再次注射,共进行两次注射治疗。每隔三天测量一次肿瘤体积。
实验结果如图8所示(横坐标表示天数,纵坐标表示体积;“**”经显著性分析P<0.01差异极显著,“*”经显著性分析P<0.05差异显著),在皮下注射Hep3B的模型动物进行负载了抗原表位肽的DC-CTL治疗后,HBcAg-HBv Pre-S2 DC-CTL治疗组的肿瘤体积增长变缓,较其它几组的肿瘤增殖明显变慢,差异极显著,其它几组的肿瘤体积呈迅速增长趋势。说明负载了抗原表位肽(SEQ ID NO:1)的DC-CTL可有效抑制肿瘤在模型动物体内的生长,可以起到抗肿瘤的作用。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。