WO2012036437A9 - 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 ｈｐｖ 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 ｈｐｖ 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an immunological peptide and a composition for preventing or treating HPV-related diseases comprising the peptide. More specifically, the HPV type 16 E7 epitope inducing HLA-A * 2402 type cervical cancer patients specific cytotoxic T lymphocyte production. And it relates to a composition for preventing or treating HPV-related diseases comprising the peptide.
  • Cervical cancer is the second most common malignant tumor among women, with more than 350,000 patients dying from cervical cancer each year, and the number continues to rise (Pisani P, et al. Int J). Cancer 2002; 97 (1): 72-81.).
  • the main cause of cervical cancer is known as human papillomavirus (HPV), and over 40 of the more than 100 HPV have been found to work in the female genitalia (de V Amsterdam EM, et al. Virology 2004; 324: 17-27). .
  • HPV type 16 and HPV type 18 are most commonly found in cervical cancer patients, and HPV type 16 is the most common type of cervical cancer.
  • Known (Munoz N, et al. N Engl J Med 2003; 348 (6): 518-27).
  • E6 and E7 are potent oncoproteins that inhibit the actions of tumor suppressors p53 and RB. It has been shown to promote the progression and continued growth of cancer cells (zur Hausen H. Nat Rev Cancer 2002; 2 (5): 342-50). E7 inhibits the function of RB, a tumor suppressor, and promotes the activities of the S-phase genes cyclin A and cyclin E (zur Hausen H. et al.
  • HLA-A * 0201 patients have been shown to have progressed (Kast WM, et al. J Immunol 1994; 152: 3904-12), HLA is another major human leukocyte antigen allele of many humans. Very little research has been found in patients with type A * 2402.
  • the present invention has been made in view of the above necessity, and an object of the present invention is to provide an HPV type 16 E7 peptide that induces cytotoxic T lymphocyte production that can be treated in cervical cancer patients with HLA-A * 2402 type.
  • Another object of the present invention to provide a composition for preventing or treating the HPV-related diseases.
  • the present invention provides a peptide having 9-10 amino acid sequences derived from HPV type 16 E7 protein and functionally identical mutants thereof.
  • the peptide sequence preferably comprises an amino acid sequence of CDSTLRLCV (SEQ ID NO: 16) or LCVQSTHVDI (SEQ ID NO: 35), but is not limited thereto.
  • “functionally identical” and “substantially identical biological function or activity” are each about 50% to about 100% of the biological activity or when the biological activity of each polypeptide is measured by the same procedure. This degree of biological activity means that it is exhibited by the polypeptides being compared.
  • the functionally equivalent peptide of the present invention refers to a peptide that exhibits substantially the same biological activity as the peptide of the present invention in FIGS.
  • the functionally identical peptide preferably has an amino acid sequence of CYQSTHVDI (SEQ ID NO: 43) or CYVTLRVCL (SEQ ID NO: 47), but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the peptide of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 35 of the present invention.
  • the gene encoding the peptide of SEQ ID NO: 16 has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 48
  • the gene encoding the peptide of SEQ ID NO: 35 preferably has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 49, but one of these nucleotide sequences All the mutant genes that cause the above substitutions, deletions, additions and the like and exhibit the same activity as the desired effect of the present invention are included in the scope of the present invention.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the peptide of SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 47, respectively.
  • CYQSTHVDI m3, Substituted Peptide No. 3
  • CYVTLRVCL m7, Substituted Peptide No. 7
  • peptides can be inferred from the gene sequence using RNA codons. , SEQ ID NOs 50-107).
  • Table 1 is a table of gene sequences encoding modified peptide 3, ie, SEQ ID NO: 43 peptide.
  • Table 2 is a table of gene sequences encoding modified peptide 7, ie, SEQ ID NO.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising (a) the peptide and (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition is for the treatment of HPV infection related diseases such as bowenoid papulosis, anal dysplasia, respiratory or conjunctival papilloma, cervical dysplasia, cervical cancer, vulval cancer, or prostate cancer. Or useful for prevention, but not limited thereto.
  • HPV infection related diseases such as bowenoid papulosis, anal dysplasia, respiratory or conjunctival papilloma, cervical dysplasia, cervical cancer, vulval cancer, or prostate cancer.
  • the composition is characterized in that the HLA-A * 2402 type patient specific.
  • the peptides or nucleic acids of the invention may also optionally be incorporated into microparticles, liposomes, or immune stimulating complexes (ISCOM) (which may include only saponins as active ingredients) or other carriers suitable for supplying the peptides of the invention to a subject. It may be formulated. When using microparticles it preferably has a polymer matrix which is a copolymer such as poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA).
  • PLGA poly-lactic-co-glycolic acid
  • an immune response e.g., a cellular immune response comprising an MHC class I-mediated or class II-mediated immune response
  • an immune response is a mammal having an MHC molecule to which an immunogenic peptide binds, ie humans, apes, dogs, cats, and animals. It can be triggered by administering immunogenic peptides to cows, mice, and rats.
  • the peptide of the present invention may be administered as a microparticle, liposome, or ISCOM, or as part of a solution.
  • Another method of administering a peptide of the invention is to use an expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding the peptide of the invention.
  • the nucleic acid sequence may optionally encode a signal sequence linked to the above peptide of the present invention.
  • the nucleic acid encodes a signal sequence, preferably it is a signal sequence Met Ala Ile Ser Gly Val from HLA-DR.alpha. Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala (SEQ ID NO: 108).
  • the sequence of the invention may for example have the sequence of SEQ ID NO: 16 or 35 or a mutant thereof.
  • the nucleic acid does not contain the viral gene causing the nucleic acid infection and does not encode the intact E7 protein.
  • Nucleic acids of the invention can be included in the plasmid and optionally provided in microparticles comprising a polymer matrix.
  • the polymer matrix consists essentially of a copolymer of PLGA.
  • the microparticles have a diameter of, for example, 0.02 to 20 microns or less than about 11 microns.
  • the plurality of microparticles has a diameter of 0.02 to 20 microns or less than about 11 microns.
  • Cells containing the plasmid of the present invention are also within the scope of the present invention.
  • the cell can be, for example, a B cell or other antigen presenting cell (APC).
  • APC antigen presenting cell
  • the cell is cultured or maintained under conditions that allow peptide expression from the plasmid encoding it.
  • Nucleic acids and plasmids of the present invention are useful in methods of inducing an immune response in mammals, eg, humans, by administering the aforementioned plasmids to the mammal, eg, as "naked DNA.”
  • the mammal may have a risk or disease of HPV infection, cervical dysplasia, and / or cervical cancer.
  • Nucleic acids and plasmids of the invention can also be inserted into microparticles, liposomes, ISCOMS, or other suitable means of transport as described above.
  • Peptides disclosed herein and nucleic acids encoding the peptides can be used to elicit an immune response against HPV E7 protein.
  • the peptide of the present invention may be linked to a transporting sequence that carries the peptide to intracellular organs.
  • the transport sequence is an amino acid sequence that functions to regulate intracellular transport (directing movement from organelles to organelles or to the cell surface) of the peptide to which it is attached.
  • Such transport sequences can transport the polypeptides to ER, lysosomes or endosomes and signal peptides (N-terminal sequences that direct the protein to the ER during translation), for example ER retention sequences such as KDEL, and KFERQ, Or a lysosomal target sequence such as QREFK.
  • Short amino acid sequences can act as signals to target proteins to specific intracellular organs. For example, a hydrophobic signal peptide is found at the amino terminus of the protein towards ER.
  • Such a transport sequence may be the HLA-DR.alpha leader sequence Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala (SEQ ID NO: 108). If that portion is sufficient to transport the polypeptide of the invention to the ER, it may comprise only a portion of the above specified 25 residue sequences (eg at least 9 amino acid residues) of the signal peptide.
  • Standard techniques can be used to construct DNA encoding the peptides of the invention (see eg the technique described in WO 94/04171).
  • the construct can be located on additional sequences that increase expression in human cells, such as appropriate promoters, RNA stable 5 'and 3' sequences of coding sequences, introns (5 'or 3' in the sequence being encoded).
  • poly (A) addition sites, as well as their constructs may include replication origin and selection markers that allow for selection and replication for prokaryotic and / or eukaryotic hosts.
  • the plasmid of the present invention may have a kanamycin resistance gene (519-1313 site), an SV40 early promoter (131-484 site), and a thymidine kinase (TK) polyadenylation site (1314-1758 site).
  • Kanamycin resistance genes and related regulatory sequences are for selection purposes only and can be removed from the plasmid if selection is not required or desired.
  • the peptides and nucleic acids of the invention can be used as prophylactic or therapeutic vaccines in subjects known to be infected by HPV, suspected of being infected by HPV, or susceptible to infection by HPV. Other suitable subjects include those who exhibit or are likely to develop symptoms of HPV-related diseases.
  • the peptides and vaccines of the present invention are useful for treating diseases associated with infection of HPV strain 16, such as bowenoid papulosis, anal dysplasia, respiratory or conjunctival papillomas, cervical dysplasia, cervical cancer, and vulvar cancer. vulval cancer, or as a vaccine to treat or prevent prostate cancer.
  • Peptides or nucleic acids of the invention can be administered alone or in combination with other therapies known in the art, such as chemotherapeutic agents, radiation and surgery to treat HPV infection or diseases associated with HPV infection.
  • Peptides and nucleic acids of the invention can also be administered in combination with other therapies designed to enhance an immune response, for example adjuvant or cytokines (or nucleic acids encoding cytokines), as is well known in the art. .
  • Peptides or nucleic acids of the invention can be used in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of HPV infection or a disease associated with HPV infection.
  • the delivery systems of the present invention can be used to deliver a peptide or DNA construct that expresses the peptide to appropriate cells that are intended to promote an immune response against HPV.
  • Peptides of the invention or nucleic acids encoding the peptides are standard methods, for example Donnelly et al., J. Imm. Methods 176: 145, 1994, and Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95: 341, may be administered using a method such as that described in 1995.
  • Peptides or nucleic acids of the invention can be injected in a form known in the art to a subject, such as intramuscular injection, intravenous injection, arterial injection, intradermal injection, intraperitoneal injection, intranasal, intravaginal, enema, subcutaneous or they For example, it may be administered to the gastrointestinal tract, mucosa or respiratory tract by inhalation of a powder or solution containing microparticles. Administration can be local (eg cervical or other infectious site) or systemic.
  • the peptides of the present invention or nucleic acids encoding the peptides can be carried in pharmaceutically acceptable carriers such as colloidal suspensions, powders, saline, lipids, liposomes, microspheres, or nanospheres. They may be complexed with, associated with, or naked with a vehicle and may be lipids, liposomes, microparticles, gold, nanoparticles, polymers, catalyzers, polysaccharides, polyamino acids, dendrimers, saponins, adsorption enhancing substances or fatty acids. The delivery can be carried out using a delivery system known in the art.
  • a dose of about 0.1 to 100 micromoles of peptide or about 1 to 200 micrograms of DNA is administered per kg of body weight once.
  • a dose for a given patient may be based on a number of factors including the patient's height, body surface area, age, the specific compound administered, sex, time and route of administration, general health and other agents administered simultaneously. Depends on Determination of the appropriate dosage is skillful within the capabilities of pharmacists of ordinary skill.
  • APCs antigen presenting cells
  • dendritic cells dendritic cells
  • peripheral blood mononuclear cells or bone marrow cells
  • APCs antigen presenting cells
  • bone marrow cells can be obtained from a patient or a suitable donor and activated in vitro with the present immune composition and then administered to the patient. have.
  • Microparticles including those described in US Pat. No. 5,783,567, can be used as vehicles for transporting macromolecules such as DNA or peptides into cells. They contain macromolecules enclosed within the shell of the polymer or entered into the polymer matrix. Microparticles act to maintain the properties of macromolecules, for example to keep the DNA intact. Microparticles can also be used for pulsed delivery of macromolecules and for delivery to specific locations or to specific cells or target cell populations.
  • the polymer matrix may be a biodegradable copolymer such as poly-lactic-co-glycolic acid, starch, gelatin or chitin.
  • Microparticles can be used in particular to maximize the transport of DNA molecules into the phagocytes of the subject. Or the microparticles can be injected or implanted into tissue.
  • Peptides of the invention can be administered to a subject via lipids, dendrimers or liposomes well known in the art.
  • liposomes carrying an immunopeptide or nucleic acids encoding the peptide are known to cause a CTL response in vivo (Reddy et al., J. Immunol. 148: 1585, 1992; Collins et al., J. Immunol. 148: 3336-3341, 1992; Fries et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 358, 1992; Nabel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 89: 5157, 1992).
  • Peptides and nucleic acids of the invention can be administered using Immune Stimulating Complexes (ISCOMS), a 30-40 nm sized (-) occupied cage-like structure produced by mixing saponin alone or cholesterol and Quil A (saponin) simultaneously. have. Peptides and nucleic acids of the invention can be administered simultaneously or separately from ISCOMS.
  • ISCOMS Immune Stimulating Complexes
  • the ability of the peptides and nucleic acids of the invention to elicit an immune response can be analyzed using methods for measuring immune responses well known in the art.
  • the generation of cytotoxic T cells can be expressed using MHC tetramers, measuring intracellular cytokine expression or in a standard 51 Cr release assay.
  • Standard assays such as ELISA or ELISPOT can also be used to determine cytokine profiles that contribute to T cell activation.
  • T cell proliferation can also be measured using other assays known in the art and assays such as the 3 H-thymidine uptake.
  • B cell responses can be measured using an assay such as ELISA.
  • a PBMC is supplied from a normal HLA-A * 2402 type blood donor, treated with a synthesized E7 peptide, and then cultured for 1 or 2 weeks to measure the expression level of IFN- ⁇ to induce differentiation into CD8 + T cells.
  • Peptide candidates were selected and the actual anticancer effect was confirmed using 51 Cr release assay, a cytotoxicity test.
  • the E7 61-75 (CDSTLRLCVQSTHVD) and E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) peptides showed higher levels of IFN- ⁇ production than the other E7 peptides.
  • E7 61-75 CDSTLRLCVQSTHVD
  • E7 67-81 LCVQSTHVDIRTLED
  • cytometry As a result of measuring the cell death effect, the experimental group treated with E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) epitope showed significantly higher cell death effect than the negative control group.
  • E7 61-75 (CDSTLRLCVQSTHVD) epitopes whose expression levels of IFN- ⁇ and CD69 were similar to those of E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) eptiope in fluid cytometry, showed unexpectedly high cell death effects. It was lower than that ( Figure 2). This result is expected to be due to the different degree of immunity to actual cervical cancer cells due to the difference in amino acid sequence of the two E7 epitopes.
  • CYQSTHVDI (synthesized by replacing the amino acid sequence of the E7 61-69 (CDSTLRLCV) and E7 67-76 (LCVQSTHVDI) peptides with HLA-A * 2402 molecules in a highly binding form using a computer program for predicting molecular binding capacity.
  • m3, substituted peptide 3) and CYVTLRVCL m7, substituted peptide 7 7) peptides were treated with cultured PBMCs and flow cytometry was confirmed to induce higher cytotoxic T cell activity than conventional peptides. ( Figures 6-9).
  • CYQSTHVDI (m3, substituted peptide No.
  • a mouse model was constructed using SiHa, a cervical cancer cell line of HLA-A * 2402 type, to confirm the anticancer efficacy of selected E7 epitopes in vivo. Tumor formation was performed by injecting cervical cancer cell line SiHa into 5 weeks old BALB / c nude mice, and then removing or inhibiting cytotoxic T cells by administering PBMC or CD8 + T cells cultured with selected E7 peptides.
  • CD8 + T cells cultured with E7 61-69 (CDSTLRLCV), E7 67-76 (LCVQSTHVDI), CYQSTHVDI (m3, substituted peptide 3) and CYVTLRVCL (m7, substituted peptide 7) were applied to mice.
  • E7 61-69 CDSTLRLCV
  • E7 67-76 E7 67-76
  • CYQSTHVDI m3, substituted peptide 3
  • CYVTLRVCL m7, substituted peptide 7
  • E7 61-69 CDSTLRLCV
  • E7 67-76 LCVQSTHVDI
  • CYQSTHVDI m3, substituted peptide 3
  • CYVTLRVCL m7, selected from in vitro experiments using animal models using cervical cancer mouse models Peptide No. 7
  • Cytotoxic T cells cultured with peptides were found to have an inhibitory effect on the growth of cervical cancer.
  • HPV type 16 E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) can be used as an epitope to generate cervical cancer-specific cytotoxic T cells through fluid cytometry and cytotoxicity experiments.
  • E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED)
  • E7 67-76 (LCVQSTHVDI) epitopes are expected to be substantially expressed in HLA-A * 2402 to induce immunity.
  • CYQSTHVDI m3, substituted peptide No. 3
  • CYVTLRVCL m7, substituted peptide No. 7
  • CDSTLRLCV E7 61-69
  • E7 67-76 LCVQSTHVDI
  • HPV type 16 E7 15mer length 67-81 (LCVQSTHV DIRTLED) is available as an epitope capable of producing cervical cancer specific cytotoxic T cells, among which E7 61- 69 (CDSTLRLCV) and E7 67-76 (LCVQSTHVDI) epitopes were found to have higher anticancer efficacy, and amino acids of E7 61-69 (CDSTLRLCV) and E7 67-76 (LCVQSTHVDI) peptides were substituted with CYQSTHVDI and CYVTLRVCL Peptides have a higher anticancer effect, suggesting that the epitope is effective for the development of vaccines for HLA-A * 2402 type cervical cancer and the production of cytotoxic T lymphocytes required for adoptive immune cell therapy.
  • E7 61- 69 CDSTLRLCV
  • E7 67-76 LCVQSTHVDI
  • Donor 1 shows the production of HPV type 16 E7 epitope (15mer) specific IFN- ⁇ using fluid cytometry.
  • Donor 1 HLA-A * 2402/2601.
  • Figure 2 confirms the killing effect of HPV type 16 E7 epitope (15mer) specific cervical cancer cells using 51 Cr release assay.
  • Donor 2 HLA-A * 2402/3303.
  • Figure 3 is confirmed the production of HPV type 16 E7 epitope (9mer / 10mer) specific IFN- ⁇ using a fluid cytometry.
  • Donor 3 HLA-A * 0203/2402.
  • Figure 4 confirms the killing effect of HPV type 16 E7 epitope (9mer, 10mer) specific cervical cancer cells using 51 Cr release assay.
  • Donor 4 HLA-A * 2402/3101. (E: effector, T: target cell)
  • Figure 5 is a comparison of cervical cancer cell killing effect of CTL and CTL-free PBMC isolated from PBMC using 51 Cr release assay method.
  • Donor 5 HLA-A * 0206/2402. (E: effector, T: target cell)
  • FIG. 10-12 confirm the anticancer treatment effect of cytotoxic T cells in cervical cancer mouse model.
  • FIG. 10 PBMCs cultured with selected E7 peptides were administered to mice implanted with cervical cancer tumors, and then tumor size changes were measured.
  • FIG. 11 CTLs treated with selected E7 peptides were cultured with cervical cancer. After administration to mice implanted with the tumor, the size change and weight of the tumor (FIG. 12) were measured.
  • Donor 8 HLA-A * 0206/2402
  • Donor 9 HLA-A * 2402/3303.
  • the total amino acid sequence of HPV type 16 E7 protein was synthesized by using computer algorithms to overlap each of 15mer in size, and then purified using high performance liquid chromatography (HPLC). A total of 14 peptides were synthesized by finally selecting more than 95% of the peptides (Table 3). Of the 14 synthesized 15mer peptides, two peptides with high anticancer efficacy were selected through experiments to identify the epitopes that are actually present in the MHC class I molecules, and overlapped with 9mers and 10mers, which are known as the size of epitopes presented in the MHC class I molecules. After synthesis, the total 25 peptides having a purity of 95% or more were synthesized using an HPLC apparatus (Table 4).
  • Table 3 shows the synthesized HPV type 16 E7 peptide (15mer).
  • Table 4 shows the synthesized HPV type 16 E7 peptides (9mer and 10mer).
  • Table 5 shows the synthesized HPV type 16 E7 peptides (amino acid substitutions).
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • Table 6 is a table of HLA-A * 2402 type blood donors.
  • Example 3 Generation of autologous dendritic cells from PBMC
  • PBMC obtained by centrifugation was placed in a T75 flask containing RPMI culture (10% FBS, 5% antibiotics) and incubated at 37 ° C. for 2 hours. After that, the suspended cells are removed and Interleukin-4 (IL-4, 1000 U / ml) and granulocyte-macrophage stimulating factor (GM-CSF, 800 U / ml) are added to the monocytes attached to the flask. 2-4 days after the start of culture, IL-4 (1000U / ml) and GM-CSF (1600U / ml) are added. RPMI culture medium was changed from time to time as the cells grow.
  • IL-4 Interleukin-4
  • GM-CSF granulocyte-macrophage stimulating factor
  • tumor necrosis factor- ⁇ 1000 u / ml
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • PBMCs of cryofreezing HLA-A * 2402 type blood donors were thawed and placed in the appropriate number of cells in a 24 well culture vessel filled with 2 ml of RPMI culture solution per well.
  • peptide (10 ⁇ g / ml) and Interleukin-2 (IL-2, 1000 U / ml) to be tested were added to each well.
  • IL-2 (1000U / ml) was added at intervals of two days during the incubation period, and the culture medium was replaced.
  • the dendritic cells at least 10/10 the number of cytotoxic T cells
  • peptides (20 ⁇ g / ml) generated by the above-mentioned method were added.
  • dendritic cells and cytotoxic T cells to which the peptide was added were incubated at 37 ° C. for 1 hour.
  • phytohemagglutinin PHA, 0.25 ⁇ g / ml
  • BFA brefeldin A
  • cells were collected from each well and washed with PBS (phosphate-buffered saline). After washing, put PBS containing 1 mM concentration of EDTA and incubated for 10 minutes at 37 °C.
  • a fluorescently labeled antibody perdinin-chlorophyll-protein (PerCP) -conjugated mouse anti-human CD3 + antibody and phycoerythrin (PE) -conjugated mouse anti-human CD8 + antibodies were put in a ratio of 1: 100, respectively, and then incubated in a dark state at 4 ° C. for 15 minutes. After incubation, the lysing solution and permeabilization solution were treated, and fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated mouse anti-human IFN- ⁇ antibody was added and incubated in dark at 4 ° C for 30 minutes.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Cytotoxicity experiments were performed using a 51 Cr release assay using cervical cancer cell lines as target cells. Briefly, 0.1 mCi Na 2 51 CrO 4 was added to a HLA-A * 2402 type cervical cancer cell line cultured in RPMI culture and incubated at 37 ° C. for 45 minutes. After washing twice with PBS, an appropriate number of target cells were put in various ratios to cytotoxic T cells and incubated at 37 ° C. for 5 hours. After incubation, centrifuge at 1500 rpm for 5 minutes and transfer 100 ⁇ l to the prepared ⁇ -counter tube. It was measured and analyzed using the ⁇ -ray counter.
  • cytotoxic T cell specific target cell death was calculated using the formula [(experimental cpm-spontaneous cpm) / (maximum cpm-spontaneous cpm)] ⁇ 100 (Bao L, et al. Biol Blood Marrow Transplant 2008; 14: 1156-1162).
  • a peptide-MHC complex model was constructed to calculate the energy difference between the binding state and the separation state, and the complex formation energy was calculated, and the more stable complex had a higher binding affinity. Assumed. First, the peptide-MHC complex structure was modeled based on the structure of PDB id 2BAK, and the complex energy minimization was performed using Insight II (Accelrys Software Inc) program based on the CHARMM (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics) force field.
  • each peptide was treated with PBMCs of blood donor for 1 week.
  • IL-2 negative control
  • pp65 328-336 CMV A24, QYDPVAALF, positive control
  • pp65 495-493 CMV A02
  • NLVPMVATV negative control group
  • E7 61-75 (CDSTLRLCVQSTHVD) and E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) peptides were selected as potential epitope candidates, and the peptides were resynthesized with 9mer and 10mer length to PBMC.
  • E7 61-69 (CDSTLRLCV) was compared with IL-2 (negative control), pp65 328-336 (CMV A24, QYDPVAALF, positive control) and pp65 91-100 (CMV A33, SVNVHNPTGR, negative control).
  • E7 67-76 (LCVQSTHVDI) peptide treatment group showed higher values than the positive control group (Fig.
  • E7 61-69 (CDSTLRLCV) and E7 67-76 (LCVQSTHVDI), candidate peptides of 9mer and 10mer length synthesized based on the E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) peptide were treated with PBMC pp65 495-493 (CMV A02 , NLVPMVATV, negative control group) and the control group treated with the previously selected 15mer long E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) peptide using a 51 Cr release assay, and the two newly synthesized peptides were 15mer long E7 67-81. (LCVQSTHVDIRTLED) showed higher or similar cell killing effect than the peptide ( Figure 4).
  • CD8 + T cells were isolated from PBMC of blood donor using microbead with anti-CD8 + antibody. After treatment with each of the selected E7 peptides, the PBMC from which CD8 + T cells were cultured under the same conditions was compared with the 51 Cr release assay. As a result, the cytotoxic effect was not observed in PBMC from which CD8 + T cells were removed. It was found that the CTL involved was actually involved in cytotoxic activity ( Figure 5).
  • the binding formation energy of the E7 epitope and MHC complex was calculated using the EGAD program, and the binding of the E7 61-69 (CDSTLRLCV) and E7 67-76 (LCVQSTHVDI) peptides to the HLA-A * 2402 complex.
  • the formation energy was estimated to be low as a negative value, indicating a stable bond (Figure 6).
  • E7 61-69 (CDSTLRLCV) and E7 67-76 (LCVQSTHVDI) peptides could be expected to be potent specific E7 epitopes, and when the two peptides were substituted for amino acids in the form of the highest binding capacity with the HLA-A * 2402 molecule, It was found that the activity of toxic T cells was induced more strongly.
  • Tumors were formed by injecting a cervical cancer cell line SiHa into BALB / c nude mice, and the anticancer effects of cytotoxic T cells were confirmed using selected in vitro experiments. As shown in Figs. 10-12, the growth of tumors was suppressed when the PBMCs treated with E7 67-76 (LCVQSTHVDI) were administered to mice compared to the negative control (G1) without any treatment (G1). Figure 10).
  • CD8 + T cells cultured with E7 61-69 (CDSTLRLCV), E7 67-76 (LCVQSTHVDI), CYQSTHVDI (m3, substituted peptide 3) and CYVTLRVCL (m7, substituted peptide 7) were applied to mice.
  • E7 61-69 CDSTLRLCV
  • E7 67-76 E7 67-76
  • CYQSTHVDI m3, substituted peptide 3
  • CYVTLRVCL m7, substituted peptide 7
  • E7 61-69 CDSTLRLCV
  • E7 67-76 LCVQSTHVDI
  • CYQSTHVDI m3, substituted peptide 3
  • CYVTLRVCL selected through flow cytometry and cytotoxicity experiments in animal studies using cervical cancer mouse models

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Abstract

본 발명은 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 HLA-A*2402 타입 자궁 경부암 환자 특이적인 세포 독성 T 림프구 생성을 유도하는 HPV 타입 16 E7 에피토프 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 ＨＰＶ 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 면역성 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 HLA-A*2402 타입 자궁 경부암 환자 특이적인 세포 독성 T 림프구 생성을 유도하는 HPV 타입 16 E7 에피토프 및 그 펩타이드를 포함하는 HPV 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
자궁 경부암은 여성에게서 발생되는 악성 종양 가운데 두 번째로 발병 빈도가 높은 것으로, 매년 전세계적으로 35만 명 이상의 환자가 자궁 경부암으로 사망하고 있으며, 그 수가 계속 증가하고 있다(Pisani P, 등. Int J Cancer 2002;97(1):72-81.). 자궁 경부암의 주원인은 인유두종 바이러스(human papillomavirus : HPV)로 알려져 있으며, 100여종이 넘는 HPV 중 40여종이 여성 생식기에서 작용하는 것으로 밝혀 졌다(de Villiers EM, 등. Virology 2004;324:17-27). 여러 종류의 HPV 중에서 특히 HPV 타입 16과 HPV 타입 18이 자궁 경부암 환자에게서 가장 흔하게 발견되어 종양발생에 중요하게 관여하고 있음을 예측할 수 있으며 그 중 HPV 타입 16은 가장 많은 자궁 경부암 환자가 감염되어 있는 것으로 알려져 있다(Munoz N, 등. N Engl J Med 2003;348(6):518-27).
HPV가 정상 세포에 감염되면 viral oncogene이 숙주세포(host cell)의 유전자에 삽입되어 여러 viral protein을 발현하게 되는 데, 그 중 E6와 E7은 강력한 oncoprotein으로서 tumor suppressor인 p53과 RB의 작용을 억제하여 암세포로의 진행과 지속적인 성장을 촉진하는 것으로 밝혀 졌다(zur Hausen H. Nat Rev Cancer 2002;2(5):342-50). E7은 tumor suppressor 인 RB의 기능을 억제하며, S-phase 유전자인 cyclin A 와 cyclin E의 활성을 촉진하고(zur Hausen H. 등. Nat Rev Cancer 2002;2(5):342-50;Phelps WC, 등. Cell 1988;53(4):539-47), 또한 cyclin-dependent kinase inhibitor인 CIP1(p21)과 KIP1(p27)의 기능을 억제하는 등의 작용으로 감염된 세포의 apoptosis를 저해하고 종양으로의 전환을 유발하는 것으로 알려 졌다(Funk JO, 등. Genes Dev 1997;11(16):2090-100;Zerfass-Thome K, 등 Oncogene 1996; 13(11):2323-30). 이러한 viral oncoprotein들은 정상 세포에서는 발견되지 않아 다양한 종류의 암을 대상으로 하는 면역치료에 있어서 아주 유력한 target이 되고, 또한 자궁 경부암의 치료가 가능한 세포 독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte: CTL)를 생성하기 위해 HPV 에피토프을 규명하고자 하는 연구의 주요 대상이 되고 있다.
현재까지 자궁 경부암 치료를 위해 HPV 타입 16에 특이적인 세포 독성 T 림프구를 생성을 유도하는 특정한 E7 에피토프을 개발하기 위한 연구들은 인류의 인체 백혈구 항원(human leukocyte antigen : HLA) 대립 유전형질(allele) 가운데 대부분을 차지하는 HLA-A*0201 타입의 환자들을 대상으로 진행되어 밝혀진 결과가 있지만(Kast WM, 등. J Immunol 1994;152:3904-12), 많은 인류의 또 다른 주요 인체 백혈구 항원 대립 유전형질인 HLA-A*2402 타입의 환자들에게서 밝혀진 연구 내용이 거의 없는 실정이다.
따라서, 본 발명에서는 유체 세포측정법(flow cytometry)과 세포 독성(cytotoxicity) 실험을 통하여 HLA-A*2402 타입을 가진 자궁 경부암 환자의 치료가 가능한 세포 독성 T 림프구 생성을 유도하는 HPV 타입 16 E7 에피토프을 규명하고자 한다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 HLA-A*2402 타입을 가진 자궁 경부암 환자의 치료가 가능한 세포 독성 T 림프구 생성을 유도하는 HPV 타입 16 E7 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 HPV관련 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 HPV 타입 16 E7 단백질로부터 유래한 9개-10개의 아미노산 서열을 가진 펩타이드 및 그 기능적으로 동일한 돌연변이체를 제공한다.
또 본 발명에 있어서, 상기 펩타이드 서열은 CDSTLRLCV(서열번호 16) 또는 LCVQSTHVDI(서열번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에서 "기능적으로 동일한" 및 "실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성"은 각각 각각의 폴리펩타이드의 생물학적 활성이 동일한 절차에 의해서 측정되는 경우에, 그 생물학적 활성의 약 50% 내지 약 100% 또는 그 이상인 정도의 생물학적 활성이 이것이 비교가 되는 폴리펩타이드에 의해서 나타나는 것을 의미한다. 예를 들어, 도 3의 유체 세포측정법을 이용한 HPV 타입 16 E7 에피토프 특이적인 IFN-γ의 생성 확인 및/또는 도 4의 51Cr release assay 법을 이용한 HPV 타입 16 E7 에피토프(9mer, 10mer) 특이적인 자궁 경부암 세포의 사멸효과 확인 실험결과, 본 발명의 기능적으로 동일한 펩타이드는 도 6b와 같은 절차를 거쳐서 도 6c 및 도 6d에서 본 발명의 펩타이드와 실질적으로 동일한 생물학적을 활성을 나타내는 펩타이드를 의미하며, 바람직하게는 상기 기능적으로 동일한 펩타이드는 CYQSTHVDI(서열번호 43) 또는 CYVTLRVCL(서열번호 47)의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 서열번호 16 또는 서열번호 35의 펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다.
또 본 발명은 상기 서열번호 16의 펩타이드를 코딩하는 유전자는 서열번호 48의 염기서열을 가지고, 서열번호 35의 펩타이드를 코딩하는 유전자는 서열번호 49의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이들 염기서열에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적하는 효과와 동일한 활성을 나타내는 모든 돌연변이 유전자도 본 발명의 범위에 포함된다.
또한 본 발명은 서열번호 43 또는 서열번호 47의 펩타이드를 각각 코딩하는 핵산을 제공한다.
이들 CYQSTHVDI(m3, 치환된 펩타이드 3번)과 CYVTLRVCL (m7, 치환된 펩타이드 7번) 펩타이드는 RNA codon을 이용하여 유전자 서열을 유추할 수는 있는데, 아래와 같이 여러 조합이 나올 수 있다(예를 들어, 서열번호 50-107).
표 1
Figure PCTKR2011006727-appb-T000001
표 1은 modified peptide 3 즉, 서열번호 43 펩타이드를 코딩하는 유전자 서열 표이다.
표 2
Figure PCTKR2011006727-appb-T000002
표 2는 modified peptide 7 즉, 서열번호 47을 코딩하는 유전자 서열 표이다.
또한 본 발명은 (a)상기의 펩타이드 및 (b)약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학용 조성물을 제공한다.
상기의 조성물은 HPV 감염 관련 질환 예를 들어 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암의 치료 또는 예방에 유용하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에 있어서, 상기의 조성물은 HLA-A*2402 타입 환자 특이적인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 펩타이드 또는 핵산은 선택적으로 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM)(활성성분으로 사포닌만을 포함할 수도 있는) 또는 본 발명의 펩타이드를 투여 대상에 공급하기에 적합한 다른 운반수단 속에 제제화될 수 있다. 미세입자를 사용하는 경우 그것은 바람직하게는 poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA)와 같은 공중합체인 중합체 매트릭스를 갖는다.
포유류에서 면역반응(예를 들어 MHC class I-매개 또는 class II-매개 면역 반응을 포함하는 세포 면역 반응)은 면역원성 펩타이드가 결합하는 MHC 분자를 가지는 포유류, 즉 인간, 유인원, 개, 고양이, 또끼, 소, 쥐에 면역원성 펩타이드를 투여하여 촉발될 수 있다. 상기 본 발명의 펩타이드는 미세입자, 리포좀, 또는 ISCOM, 또는 용액의 일부로 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 투여하는 또 다른 방법은 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터를 이용하는 것이다. 그 핵산 서열은 선택적으로 상기의 본 발명의 펩타이드에 연결된 신호 서열을 코딩할 수도 있다.그 핵산이 신호 서열을 코딩할 때 바람직하게는 그것은 HLA-DR.alpha로부터 온 신호 서열 Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala(서열번호 108)을 코딩한다. 그 경우에 본 발명의 서열은 예를 들어 서열번호 16 또는 35 또는 그 돌연변이체의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 그 핵산은 핵산 감염을 일으키는 바이러스 유전자를 포함하지 아니하고 인택트 E7 단백질을 코딩하지 아니한다.
본 발명의 핵산은 프라즈미드 내에 포함될 수 있고, 선택적으로 중합체 매트릭스를 포함하는 미세입자 내에 제공될 수 있다. 바람직한 실시예에서 중합체 매트릭스는 필수적으로 PLGA의 공중합체로 구성된다. 바람직하게 그 미세입자는 예를 들어 0.02에서 20 마이크론 또는 약 11 마이크론 이하의 직경을 가진다. 바람직하게는 복수의 미세입자들이 0.02에서 20 마이크론 또는 약 11 마이크론 이하의 직경을 가진다.
본 발명의 프라즈미드를 포함하는 세포도 본 발명의 범위 내이다. 그 세포는 예를 들어 B 세포 또는 다른 항원 제시 세포(APC)일 수 있다. 그 세포는 그것을 ㅋ코딩하는 프라즈미드로부터 펩타이드 발현을 가능하게 하는 조건에서 배양되거나 유지된다.
본 발명의 핵산 및 프라즈미드는 예를 들어 "naked DNA"로 포유류에 상기 언급한 플라즈미드를 투여하여 포유류 예를 들어 인간에서 면역 반응을 유도하는 방법에 유용하다. 그 포유류는 HPV 감염, 자궁경부 이형성증, 및/또는 자궁경부암의 위험이나 또는 질환을 가질 수 있다. 본 발명의 핵산 및 플라즈미드도 미세 입자, 리포좀, ISCOMS, 또는 상기에 기재된 것과 같은 다른 적당한 운반 수단에 삽입될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명에 개재된 펩타이드들과 그 펩타이드를 코딩하는 핵산은 HPV E7 단백질에 대한 면역 반응을 야기하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 세포내 기관으로 그 펩타이드를 운반하는 수송(trafficking) 서열이 연결될 수 있다. 그 수송서열은 그것이 부착된 펩타이드의 세포내 수송(소기관에서 소기관으로 또는 세포 표면으로 이동을 지시)을 조절하는 기능을 하는 아미노산 사열이다. 그러한 수송 서열들은 ER, 리소좀 또는 엔도좀으로 그 폴리펩타이드들을 수송할 수 있고 시그널 펩타이드들(번역 동안 ER에 단백질을 지시하는 N-말단 서열), 예를 들어 KDEL 과 같은 ER 체류 서열, 및 KFERQ, 또는 QREFK와 같은 와 같은 리소좀 타겟 서열을 포함할 수 있다.
짧은 아미노산 사열들은 특정세포내 기관으로 단백질을 타겟하는 시그널로 작용할 수 있다. 예를 들어 ER로 가는 단백질의 아미노 말단에서 소수성 시그널 펩타이드가 발견된다.
그러한 수송 서열은 HLA-DR.알파 리더 서열인 Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala (서열번호 108)일 수 있다. 만약 그 부분이 본 발명의 폴리펩타이드를 ER로 수송하는데 충분하다면, 그 시그널 펩타이드의 상기 특정된 25개의 잔기 서열 중 일부분(예를 들어 적어도 9개의 아미노산 잔기)만을 포함할 수 있다.
일부 경우에는 시그널 펩티데이즈에 의한 가공(즉 절단)을 가능하게 하기 위하여 본 발명의 HPV E7 항원성 펩타이드를 코딩하는 서열과 수송 서열을 연결하는 부분은 변형되는 것이 바람직하다. 시그널 펩타이드들에 대한 인식 서열들은 Von Heijne, NAR 14:4683, 1986에 기재된다.
본 발명의 펩타이드를 코딩하는 DNA를 구축하는데 표준 기술이 사용될 수 있다(예를 들어 WO 94/04171에 기재된 기술을 참고). 그 구축물은 인간 세포들에서 발현을 증가시키는 부가적인 서열들 예를 들어 적당한 프로모터, 코딩 서열의 RNA 안정 5' 과 3' 서열, 인트론(코딩되는 서열 내에 5' 또는 3' 어느 쪽에도 위치될 수 있음), 및 폴리(A) 부가 자리뿐만 아니라 그 구축물이 원핵 및/또는 진핵 숙주에 대한 선택 및 복제를 가능하게 하는 복제 오리진 및 선택 마커들을 포함할 수 있다.
본 발명의 플라즈미드 내에는 가나마이신 저항 유전자(519-1313 부위), SV40 얼리 프로모터(131-484 부위) 및 thymidine kinase (TK) 폴리아데닐레이션 자리(1314-1758 부위)를 가질 수 있다. 가나마이신 저항 유전자 및 관련 조절 서열은 단지 선택의 목적을 위한 것이고 만약 선택이 필요하지 않거나 바람직하지 않으면 플라즈미드로부터 제거될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 및 핵산은 HPV에 의하여 감염된 것으로 알려졌거나, HPV에 의하여 감염된 것이 의심스럽거나, HPV에 의하여 감염될 수 있는 대상에서 예방 또는 치료적인 백신으로 사용될 수 있다. 다른 적당한 대상들은 HPV-관련 질환의 증상을 나타내거나 질환이 발생할 것 같은 사람들을 포함한다. 본 발명의 펩타이드 및 백신은 HPV 균주 16의 감염과 관련된 질환들, 예를 들어 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암을 치료하거나 예방하는 백신으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 질환들을 치료하기 위하여 단독 또는 당업계에 공지된 다른 치료법 예를 들어 화학요법제, 방사선 및 수술과 같이 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드들 및 핵산들은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 주지된 것과 같은 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산)과 혼합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 HPV 감염 또는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 운반 시스템들은 HPV에 대한 면역 반응을 촉진시키려는 적당한 세포들에 펩타이드 또는 그 펩타이드를 발현하는 DNA 컨스트럭트를 운반하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들은 표준 방법, 예를 들어 Donnelly et al., J. Imm. Methods 176:145, 1994, 및 Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995에 기재된 것과 같은 방법을 사용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 대상에 당업계에 공지된 형태, 예를 들어 근육주사, 정맥주사, 동맥주사, 피내주사, 복강주사, 코의내부, 질내, 관장내, 피하내 주사될 수 있거나 그들은 예를 들어 미세입자를 포함하는 분말 또는 용액의 흡입에 의하여 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 투여는 국소적(예를 들어 자궁경부 또는 다른 감염자리) 또는 전신성일 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들은 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노구형입자와 같은 약학적으로 수용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 그들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련되거나 또는 네이키드될 수 있고 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축하반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 운반될 수 있다.
약 0.1에서 100 마이크로몰의 펩타이드 용량 또는 약 1에서 200 마이크로그램의 DNA의 용량이 1회 체중 kg 당 투여되는 것이 바람직하다. 물론 당업계에 주지된 바와 같이 주어진 환자에 대한 용량은 환자의 키, 체표면적, 나이, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간과 경로, 일반적 건강상태 및 동시에 투여되는 다른 약제를 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 적정 투여량의 결정은 통상의 지식을 가진 약사들의 능력 범위내에서 능숙하다.
바이오리스틱(biolistic) 전달 또는 생체 외(ex vivo) 처리와 같은 다른 표준 전달 방법들이 사용될 수도 있다. 생체 외 처리에서 예를 들어 항원제시 세포들(APCs), 수지상세포들, 말초혈액 단핵구 세포들, 또는 골수세포들을 환자 또는 적당한 공여자로부터 얻어서 본 면역 조성물로 생체 외에서 활성화된 후 그 환자에게 투여될 수 있다.
미국 특허 제 5,783,567에 기재된 것을 포함하는 미세입자들이 세포 속으로DNA, 또는 펩타이드와 같은 거대분자를 운반하기 위한 운송수단으로 사용될 수 있다. 그들은 폴리머의 쉘 내에 둘러 쌓여 있거나 폴리머 매트릭스에 들어간 거대분자들을 포함한다. 미세입자들은 예를 들어 들어있는 DNA를 분해되지 않은 상태로 유지하는 것과 같은 거대분자의 특성을 유지하는 작용을 한다. 미세입자들은 또 거대분자들의 펄스된 운반 및 특정 위치에 운반 또는 특정 세포 또는 타겟 세포군으로 운반에 사용될 수 있다.
폴리머 매트릭스는 poly-lactic-co-glycolic acid, 전분, 젤라틴 또는 키틴과 같은 생분해성 공중합체일 수 있다. 미세입자들은 대상의 식세포로 DNA 분자들의 이동을 최대화하는데 특히 사용될 수 있다. 또는 그 미세입자들은 조직에 주사되거나 이식될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 주지된 지질, 덴드리머 또는 리포좀을 통하여 대상에 투여될 수 있다. 예를 들어 면역 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들을 운반하는 리포좀들은 인 비보에서 CTL 반응을 야기하는 것으로 알려졌다(Reddy et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Collins et al., J. Immunol. 148:3336-3341, 1992; Fries et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:358, 1992; Nabel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 89:5157, 1992).
본 발명의 펩타이드 및 핵산들은 사포닌 단독 또는 콜레스테롤 및 Quil A (사포닌)을 동시에 혼합하여 생성된 30-40 nm 크기의 (-) 차지된 케이지 유사 구조인 Immune Stimulating Complexes (ISCOMS)을 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 및 핵산들은 ISCOMS와 동시 또는 별도로 투여될 수 있다.
보호면역은 항원에 대한 운반 수단으로 ISCOMS을 사용한 톡소플라스마증 및 Epstein-Barr 바이러스 유도된 종양들을 포함하는 감염의 여러 실험 모델에서 생성되어 왔다(Mowat et al., Immunology Today 12:383-385, 1991). ISCOMS에서 캡슐화된 1ug의 낮은 항원 용량이 클래스 I 매개된 CTL 반응을 생성하는 것이 발견되었다(Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990).
면역 반응을 야기하는 본 발명의 펩타이드 및 핵산의 능력은 당업계에 주지된 면역 반응을 측정하는 방법들을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어 세포 독성T 세포들의 생성은 MHC 테트라머를 사용하거나 세포내 사이토카인 발현을 측정하거나 표준 51Cr release 분석에서 나타낼 수 있다. ELISA 또는 ELISPOT와 같은 표준 분석도 T 세포 활성화에 기여하는 사이토카인 프로화일을 측정하는데 사용될 수 있다. T 세포 증식은 또 당업계에 공지된 다른 분석들과 3H-thymidine 업테이크와 같은 분석을 사용하여 측정될 수 있다. B 세포 반응들은 ELISA와 같은 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
디지털 이미징, 세포학적 질확대경 및 조직학적 검사와 같은 다른 방법들이 유두종 바이러스 관련 병소 또는 유두종 바이러스 레벨에 대한 본 발명의 펩타이드와 핵산의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
그 동안 이루어진 HPV 타입 16 E7을 대상으로 하는 adoptive CD8+ T 세포치료에 관한 연구는 HLA-A*0201 타입을 갖는 백인종(cacasian)을 위주로 진행되어 항암효과를 나타내는 몇몇의 특이적인 E7 에피토프을 밝혀내었다. 그러나, 전세계 인구의 절반 이상을 차지하고 있는 아시아인종(Asian) 중 다수를 차지하는 HLA-A*2402 타입 환자의 adoptive CD8+ T 세포치료를 위해 진행되어 나타난 HPV 타입 16 E7 에피토프의 연구 결과물은 전무한 실정이다.
본 발명에서는 정상 HLA-A*2402 타입 혈액 증여자에게서 PBMC를 공급받아 합성된 E7 펩타이드를 처리하여 1주 혹은 2주간 배양한 후 IFN-γ 의 발현 정도를 측정하여 CD8+ T 세포로의 분화를 유도하는 펩타이드의 후보를 선정하고, 세포 독성 실험인 51Cr release assay 을 사용하여 실제적인 항암 효과를 확인해 보았다. 그림 1에서 볼 수 있었듯이, 합성된 14개의 15mer 펩타이드 중 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD), E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 다른 E7 펩타이드에 비해 높은 수치의 IFN-γ의 생성을 나타냈고, 유체 세포측정법을 사용하여 선별한 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프이 실제로 HLA-A*2402 타입의 자궁 경부암 세포에 대해 항암효과를 나타내는 지를 확인하기 위해 51Cr release assay 기법을 이용하여 세포 사멸효과를 측정해 본 결과, E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프을 처리한 실험군에서 음성대조군보다 월등히 높은 세포 사멸효과를 나타내는 것을 알 수 있었다. 반면, 유체 세포측정법에서 IFN-γ와 CD69의 발현 정도가 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) eptiope과 유사하게 나타난 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD) 에피토프은 예상과 달리 세포 사멸 효과가 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프에 비해 낮게 나타났다 (그림 2). 이러한 결과는 두 E7 에피토프의 아미노산 서열 차이에서 기인하는 실제 자궁 경부암 세포에 대한 면역성 유발 정도가 다르기 때문에 나타난 것으로 예상된다.
실제로 암세포의 MHC class I 분자에 제시되는 정확한 에피토프을 찾기 위해 위에서 밝혀진 15mer 펩타이드를 이용해 MHC class I 분자에 결합하는 에피토프의 길이로 알려진 9mer와 10mer로 각각 합성하여 유세포 측정법을 이용하여 분석한 결과 E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 펩타이드가 효과적으로 세포 독성 T 세포의 활성을 유도하는 것으로 나타나 높은 면역성(immunogenic)을 가지고 있음을 예상할 수 있었다 (그림 3). 또한, 선별된 E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 펩타이드를 이용하여 PBMC를 배양한 후 51Cr release assay 기법을 이용하여 자궁 경부암 세포 사멸 효과를 측정한 결과, 두 펩타이드 모두 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프 보다 높은 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다 (그림 4).
이와 더불어, 분자 결합력을 예측하는 컴퓨터 프로그램을 이용해 E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 펩타이드의 아미노산 서열을 HLA-A*2402 분자와 결합력이 높은 형태로 치환하여 합성된 CYQSTHVDI(m3, 치환된 펩타이드 3번) 와 CYVTLRVCL (m7, 치환된 펩타이드 7번) 펩타이드를 처리하여 PBMC를 배양한 뒤 유세포 측정법을 실시한 결과, 기존 펩타이드 보다 높은 세포 독성 T 세포의 활성을 유도함을 확인할 수 있었다 (그림 6∼9). 또한, E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 펩타이드를 HLA-A*2402 분자와 결합력이 높은 형태로 치환하여 합성한 CYQSTHVDI(m3, 치환된 펩타이드 3번) 와 CYVTLRVCL(m7, 치환된 펩타이드 7번) 펩타이드를 처리하여 PBMC를 배양한 뒤 세포 사멸 효과를 측정한 결과, 기존 펩타이드보다 높은 세포 사멸 효능을 나타냄을 알 수 있었다 (그림 6∼9). 따라서, E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76 (LCVQSTHVDI) 에피토프을 이용한 세포 독성 T 세포의 활성 유도가 실제 자궁 경부암 세포의 사멸에 효과적으로 작용할 수 있음을 확인하였고, 그 변형 펩타이드인 CYQSTHVDI(m3, 치환된 펩타이드 3번) 와 CYVTLRVCL(m7, 치환된 펩타이드 7번)가 HLA-A*2402 타입 자궁 경부암 환자의 치료 및 백신 개발에 효과적으로 적용될 수 있음을 확인할 수 있었다 (그림 10∼12).
이전 연구를 통해 자궁 경부암 동물 모델을 이용한 실험에서 세포 독성 T 세포의 항암 효과가 확인되었다(Patel S, 등. Curr Opin Obstet Gynecol 2009;21(1):54-9;Kim TY, 등. Cancer Res 2002;62: 7234-40). 본 발명에서는 선별된 E7 에피토프의 항암 효능을 in vivo상에서 확인하기 위해 HLA-A*2402 타입의 자궁 경부암 세포주인 SiHa를 이용하여 마우스 모델을 구축하였다. 5주 연령된 BALB/c 누드 마우스에 자궁 경부암 세포주인 SiHa를 주입하여 종양을 형성한 후, 선별된 E7 peptide를 처리하여 배양한 PBMC 또는 CD8+ T 세포를 투여하여 세포 독성 T 세포의 종양 제거 혹은 억제 효과를 확인하였다. 결과에서 볼 수 있듯이, E7 67-76(LCVQSTHVDI)을 처리하여 배양한 PBMC를 종양이 생성된 마우스에 투여하였을 때 아무 것도 처리하지 않은 음성대조군에 비해 종양의 성장이 억제되는 것을 알 수 있었고 (그림 10).
또한, E7 61-69(CDSTLRLCV), E7 67-76(LCVQSTHVDI), CYQSTHVDI(m3, 치환된 펩타이드 3번) 와 CYVTLRVCL(m7, 치환된 펩타이드 7번)을 처리하여 배양한 CD8+ T 세포를 마우스에 투여한 후 종양의 크기를 확인하였을 때, 아무것도 처리하지 않은 음성대조군에 비해 종양의 성장이 크게 억제되는 것을 확인할 수 있었다(그림 11, 및 12). 따라서, 자궁 경부암 마우스 모델을 이용한 동물 실험을 통해 in vitro 실험에서 선별된 E7 61-69(CDSTLRLCV), E7 67-76(LCVQSTHVDI), CYQSTHVDI (m3, 치환된 펩타이드 3번) 및 CYVTLRVCL(m7, 치환된 펩타이드 7번) 펩타이드를 처리하여 배양한 세포 독성 T 세포가 자궁 경부암의 성장의 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
결론적으로, 유체 세포측정법과 세포 독성 실험을 통해 HPV 타입 16 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED)가 자궁 경부암 특이적인 세포 독성 T 세포를 생성할 수 있는 에피토프으로 이용이 가능하며, E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED)의 15개 아미노산 서열 가운데 9mer 및 10mer 길이의 E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 에피토프이 HLA-A*2402에 실질적으로 표현되어 면역성을 유도하는 것으로 예측된다.
또한, E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 펩타이드의 아미노산이 치환된 형태의 CYQSTHVDI(m3, 치환된 펩타이드 3번) 와 CYVTLRVCL(m7, 치환된 펩타이드 7번) 펩타이드가 항암 효능이 보다 더 높은 것으로 나타나 HLA-A*2402 타입 자궁 경부암의 백신 개발과 adoptive 면역세포치료에 필요한 세포 독성 T 림프구 생성에 효과적인 에피토프임을 규명할 수 있었다.
본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, HPV 타입 16 E7 가운데 15mer 길이의 67-81(LCVQSTHV DIRTLED)가 자궁 경부암 특이적인 세포 독성 T 세포를 생성할 수 있는 에피토프으로 이용이 가능하며 그 가운데 E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 에피토프 이 보다 높은 항암 효능이 있음을 확인하였으며, E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 펩타이드의 아미노산이 치환된 형태의 CYQSTHVDI와 CYVTLRVCL 펩타이드가 항암 효과가 보다 더 높은 것으로 나타나 HLA-A*2402 타입 자궁 경부암의 백신 개발과 adoptive 면역세포치료에 필요한 세포 독성 T 림프구 생성에 효과적인 에피토프임을 규명할 수 있었다.
도 1은 유체 세포측정법을 이용한 HPV 타입 16 E7 에피토프 (15mer) 특이적인 IFN-γ의 생성 확인. Donor 1: HLA-A*2402/2601.
도 2는 51Cr release assay 법을 이용한 HPV 타입 16 E7 에피토프 (15mer) 특이적인 자궁 경부암 세포의 사멸효과 확인. Donor 2: HLA-A*2402/3303. (E: effector, T: target cell)
도 3은 유체 세포측정법을 이용한 HPV 타입 16 E7 에피토프(9mer/10mer) 특이적인 IFN-γ의 생성 확인. Donor 3: HLA-A*0203/2402.
도 4는 51Cr release assay 법을 이용한 HPV 타입 16 E7 에피토프(9mer, 10mer) 특이적인 자궁 경부암 세포의 사멸효과 확인. Donor 4: HLA-A*2402/3101. (E: effector, T: target cell)
도 5는 51Cr release assay 법을 이용한 PBMC에서 분리된 CTL과 CTL이 제거된 PBMC와의 자궁 경부암 세포 사멸 효과의 비교. Donor 5 : HLA-A*0206/2402. (E: effector, T: target cell)
도 6∼9는 아미노산을 치환하여 합성된 HPV 타입 16 E7 에피토프 특이적인 세포 독성 효과의 확인. (도 6) E7 61-69(9mer; peptide 16) 및 E7 67-76 (10mer, peptide 35)와 HLA-A*2402 분자와의 결합 구조 예측도 (도 7) 아미노산 치환 합성된 HPV 타입 16 E7 펩타이드의 결합 에너지 산정 (도 8) 유체 세포측정법을 이용한 치환 합성된 HPV 타입 16 E7 에피토프 특이적인 IFN-γ의 생성확인. (도 9) 51Cr release assay 법을 이용한 치환 합성된 HPV 타입 16 E7 에피토프 특이적인 자궁 경부암 세포의 사멸효과 확인. (c) Donor 6: HLA-A*2402/2402 (d) Donor 7: HLA-A*2402/3101. (E: effector, T: target cell)
도 10∼12는 자궁 경부암 마우스 모델에서 세포 독성 T 세포의 항암 치료 효과 확인. (도 10) 선별된 E7 펩타이드를 처리하여 배양한 PBMC를 자궁 경부암 종양이 이식된 마우스에 투여한 후, 종양의 크기 변화를 측정 (도 11) 선별된 E7 펩타이드를 처리하여 배양한 CTL을 자궁 경부암 종양이 이식된 마우스에 투여한 후, 종양의 크기 변화 및 무게(도 12)를 측정. (a) Donor 8: HLA-A*0206/2402 (b) Donor 9: HLA-A*2402/3303.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도록 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 펩타이드(peptide) 합성
HPV 타입 16 E7 단백질의 전체 아미노산 서열을 컴퓨터 알고리즘(computer algorithms)을 이용하여 각각 15mer의 크기로 중복(overlapping)되도록 나누어 합성한 후 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography : HPLC)기기를 이용하여 순도가 95% 이상 되는 펩타이드를 최종적으로 선택하여 총 14개를 합성하였다(표 3). 14개의 합성된 15mer 길이의 펩타이드 가운데 실제로 MHC class I 분자에 제시되는 에피토프을 밝히기 위해 실험을 통해 항암효능이 높은 2개의 펩타이드를 선별하여 MHC class I 분자에 제시되는 에피토프의 크기로 알려진 9mer와 10mer로 중복되도록 나누어 합성한 후 HPLC기기를 이용하여 순도가 95%이상 되는 펩타이드를 총 25개 합성하였다(표 4). 합성된 9mer 및 10mer 길이의 25개의 펩타이드 가운데 항암효능이 높은 2개의 펩타이드를 선별하여 이를 바탕으로 컴퓨터 구조분석 프로그램을 이용해 실제로 HLA-A*2402 분자에 가장 결합력이 높은 아미노산 서열을 예측하여 일부 아미노산을 치환 합성하였다(표 5). 이런 식으로 합성된 펩타이드는 1% DMSO PBS에 녹인 후 -20℃에 냉동 보관한 후 사용 직전에 실온에서 해동하여 사용하였다. 본 발명의 펩타이드는 대한민국 연기군 소재 A & Pep 사에 의뢰하여 합성하였다.
표 3
Figure PCTKR2011006727-appb-T000003
표 3은 합성된 HPV 타입 16 E7 펩타이드 (15mer)이다.
표 4
Figure PCTKR2011006727-appb-T000004
표 4는 합성된 HPV 타입 16 E7 펩타이드(9mer 및 10mer)이다.
표 5
Figure PCTKR2011006727-appb-T000005
표 5는 합성된 HPV 타입 16 E7 펩타이드 (아미노산 치환)이다.
실시예 2: 세포의 준비
연구 동의서에 서명한 HLA-A*2402 타입 혈액 증여자(표 4)의 혈액에서 원심분리(centrifugation)를 이용해 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리한다. 간략히 설명하면, Ficoll-Hypaque 1.077를 사용하여 농도기울기(density-gradient)를 형성한 후 그 위에 증여자의 혈액을 조심스럽게 흘려 넣은 뒤 2000 rpm의 속도로 상온에서 15분간 원심분리를 실시한 후 백혈구 층(buffy coat)만을 채취하여 PBS로 2회 세척하여 실험에 사용하였다.
표 6
Figure PCTKR2011006727-appb-T000006
표 6은 HLA-A*2402 타입 혈액 증여자에 대한 표이다.
실시예 3:PBMC로부터 자가 수지상 세포(autologous dendritic cell)의 생성
원심분리를 통해 얻어진 PBMC를 RPMI 배양액(10% FBS, 5% antibiotics)이 들어 있는 T75 플라스크에 넣어 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후, 부유된 세포들을 제거하고 플라스크에 고착된 단핵 세포(monocyte)에 Interleukin-4(IL-4, 1000U/ml)와 granulocyte-macrophage stimulating factor(GM-CSF, 800U/ml)를 첨가한다. 배양 시작 후 2일, 4일째 되는 때에 IL-4(1000U/ml)와 GM-CSF(1600U/ml)을 각각 넣어 준다. 세포의 성장에 맞춰 수시로 RPMI 배양액을 교체해 주었다. 배양 시작 후 5일째 되는 때에 tumor necrosis factor-α(TNF-α, 1000u/ml)를 첨가하였다(Lim JB, 등. Exp Hematol 2006;34(3):296-307;Provenzano M, 등. J Immunother 2002;25:342-351).
실시예 4:펩타이드에 특이적인 polyclonal 세포 독성 T 세포의 생성
초저온 동결되어 있는 HLA-A*2402 타입 혈액 증여자의 PBMC를 해동시켜 각 well당 2ml의 RPMI 배양액이 채워진 24 well 배양용기에 적정한 수의 세포를 넣어 주었다. 배양 시작 후 1일째 되는 때에 시험하고자 하는 펩타이드(10μg/ml)와 Interleukin-2(IL-2, 1000U/ml)를 각 well에 첨가해 주었다. 배양기간 중 이틀 간격으로 IL-2(1000U/ml)을 넣어주고 배양액을 교체해 주었다. 배양 시작 후 7일째 되는 때에 위에 언급한 방법으로 생성된 수지상 세포(세포 독성 T 세포수의 최소 10분의 1 이상의 세포수)와 펩타이드(20μg/ml)를 첨가해 주었다.
실시예 5:유체 세포측정법(flow cytometry)를 이용한 세포내 Interferon-γ(IFN-γ) 생성측정
배양 시작 후 7일째 되는 때에 수지상 세포와 펩타이드가 첨가된 세포 독성 T 세포를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이 때, 실험군 중 한 그룹에 phytohemagglutinin(PHA, 0.25 μg/ml)을 넣어 주었다. 배양 후 10 μg의 brefeldin A(BFA)를 각각 첨가해 준 뒤, 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 그 후, 각각의 well에서 세포를 채취하여 PBS(phosphate-buffered saline)으로 세척해 주었다. 세척 후 1mM 농도의 EDTA가 들어 있는 PBS를 넣어 주고 37℃에서 10분간 배양하였다. 배양이 끝나면, 5% FBS가 포함된 PBS로 2회 세척해 주고, 형광표지된 항체인 perdinin-chlorophyll-protein(PerCP)-conjugated mouse anti-human CD3+항체와 phycoerythrin(PE)-conjugated mouse anti-human CD8+ 항체를 각각 1:100의 비율로 넣어 준 뒤 4℃에서 15분간 dark상태로 배양하였다. 배양 후, lysing solution과 permeabilization solution을 각각 처리해 주고, fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human IFN-γ 항체를 첨가해 준 뒤 4℃에서 30분간 dark상태로 배양하였다. 이 후, 5% FBS가 포함된 PBS로 2회 세척해 주고 1% formaldehyde로 고정시킨 뒤 FACS(fluorescence activated cell sorting)장비를 이용해 측정하여 분석하였다 (Kern F, 등. Eur J Immunol 2000;30:1676-1682;Gratama JW, 등. Cytometry 2004;58:79-86)
실시예 6:세포 독성 실험(cytotoxicity assay)
자궁 경부암 세포주를 목표 세포(target cell)로 하여 51Cr release assay를 사용하여 세포 독성 실험을 실시하였다. 간략히 설명하면, RPMI 배양액에서 배양된 HLA-A*2402 타입의 자궁 경부암 세포주에 0.1 mCi 의 Na2 51CrO4를 첨가하여 37℃에서 45분간 배양하였다. PBS로 2회 세척한 후, 적정수의 목표 세포를 세포 독성 T 세포에 다양한 비율로 넣어 주고 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 1500 rpm으로 5분간 원심분리를 해주고 미리 준비한 γ-counter tube에 100μl씩 옮겨 넣는다. γ-ray counter를 이용해 측정하여 분석하였다. 세포 독성 T 세포 특이적인 목표 세포 사멸의 정도는 [(experimental cpm-spontaneous cpm)/(maximum cpm-spontaneous cpm)]×100의 공식을 이용하여 산정하였다(Bao L, 등. Biol Blood Marrow Transplant 2008;14:1156-1162).
실시예 7: 단백질-MHC 복합체 결합 친화도의 In silico 측정법
펩타이드와 MHC 분자와의 결합 친화도를 측정하기 위해 펩타이드-MHC 복합체 모델을 구성하여 결합 상태와 분리 상태의 에너지 차이를 산정하여 복합체 형성 에너지를 계산하였고, 더 안정적인 복합체가 보다 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 가정하였다. 우선, 펩타이드-MHC 복합체 구조는 PDB id 2BAK의 구조를 바탕으로 모델링하고, 복합체 에너지 최소화는 CHARMM(Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics) force field를 기초로 한 Insight Ⅱ (Accelrys Software Inc) 프로그램을 이용하였다. 에너지 최소화 후, 복합체 형성의 에너지 기여도와 각 잔기(residue)간의 접촉은 단백질 디자인과 결합 친화도 산정 프로그램인 EGAD를 이용하여 산정하였으며, 초기 설정이 복합체 형성 에너지 산정에 사용되었다(Pokala N, 등. J Mol Biol 2005;347:203-27). 프로그램의 산정 결과를 바탕으로 복합체 형성 에너지 비교 측정에 몇 'pseudo_DELTA_G_complex_formation' 수치가 이용되었다. 각 접점(interface) 잔기의 에너지 기여도 측정을 위해, 각 레벨 1 접점 잔기의 dG 수치가 수집되었다.
실시예 8: 자궁 경부암 마우스 모델을 이용한 동물 실험
5주 연령의 BALB/c 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 자궁 경부암 세포주인 SiHa 세포(Friedl F, 등. Proc Soc Exp Biol Med 1970;135(2):543-5)를 5X105 개를 주입하여 종양 형성을 유도하였다. 세포 독성 T 세포의 자궁 경부암에 대한 치료효과를 확인하기 위해 종양의 크기가 일정 수치(40mm3 ~ 50mm3)가 되었을 때, 각각의 펩타이드를 처리한 PBMC(lX107 개) 혹은 분리된 CTL(3X106) 을 마우스의 꼬리 정맥을 통해 말초 혈액으로 주입하였다. 종양의 크기는 매일 캘리퍼(caliper)를 이용하여 측정하고 [(a x b)/2, a는 장축, b는 단축]의 공식을 이용해 평균값을 산정하여 기록하였다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
(1) HLA-A*2402 특이적인 15mer 길이의 HPV 타입 16 E7 에피토프의 규명
합성된 14개의 HPV 타입 16 E7 펩타이드 가운데 HLA-A*2402 타입 환자 특이적으로 세포 독성 T 세포 생성을 유도하는 E7 에피토프의 후보를 선정하기 위해, 혈액 증여자의 PBMC에 각각의 펩타이드를 처리해 주고 1주일 후에 배양된 IL-2(음성대조군), pp65 328-336(CMV A24, QYDPVAALF, 양성대조군)(Szmania S, 등. Blood 2001;98(3):505-12)와 pp65 495-493 (CMV A02, NLVPMVATV, 음성대조군)(Solache A, 등. J Immunol 1999;163:5512-8)을 각각 처리한 대조군과 비교하여 보았다. 그림 1에서 나타났듯이, 14개의 펩타이드 모두 IL-2만을 처리한 대조군 보다 높은 IFN-γ 의 생성을 유도하였고, 음성대조군(negative control)보다 높은 수치의 IFN-γ의 생성을 보이는 펩타이드 중 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드를 처리한 실험군에서 양성대조군(positive control)에 거의 근접한 수준으로 IFN-γ의 생성수치가 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 유체 세포측정법을 이용해 선별한 E7 에피토프이 실제로 HLA-A*2402 타입 자궁 경부암 세포에 작용하여 사멸시키는 효과를 나타내는 지를 확인하기 위해 51Cr release assay 법을 이용해 분석해 보았다. 혈액 증여자의 PBMC에 IL-2, E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD), E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED)과 pp65 495-493 (CMV A02, NLVPMVATV, 음성대조군) 펩타이드를 각각 처리해 주고 1주일 후에 배양된 동일 환자의 수지상 세포와 함께 각각의 펩타이드를 다시 한번 처리해 준 뒤 1주일간 배양 후, 51Cr이 표지된 HLA-A*2402 타입 자궁 경부암 세포와 섞어 5시간 동안 배양하고 감마방사선 측정기를 이용하여 분석하였다. 분석한 결과를 살펴 보면, E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드를 처리한 실험군의 사멸 효과가 IL-2나 pp65 495-493 (CMV A02, NLVPMVATV) 등을 처리한 음성대조군보다 월등히 높은 수치의 세포 사멸 효과를 보여 주었다. E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD) 펩타이드를 처리한 실험군은 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드의 효과에는 미치지 못하는 것을 알 수 있었다 (그림 2).
(2) HLA-A*2402 특이적인 9/10mer 길이의 HPV 타입 16 E7 에피토프 의 규명
위의 결과를 통해 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드를 유력한 에피토프 후보로 선정하였고, 이 펩타이드를 대상으로 각각 9mer와 10mer의 길이로 재합성된 펩타이드를 PBMC에 처리하여 배양한 후 IL-2(음성대조군), pp65 328-336(CMV A24, QYDPVAALF, 양성대조군) 및 pp65 91-100(CMV A33, SVNVHNPTGR, 음성대조군)과 비교한 결과, E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 펩타이드를 처리한 실험군에서 양성대조군에 비해 높은 수치가 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (그림 3). 또한, E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드를 토대로 하여 합성한 9mer 및 10mer 길이의 후보 펩타이드인 E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI)를 PBMC에 처리하여 pp65 495-493 (CMV A02, NLVPMVATV, 음성대조군) 및 앞서 선별된 15mer 길이의 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드를 처리한 대조군과 51Cr release assay 법을 이용해 비교해 본 결과, 새로 합성된 두 펩타이드가 15mer 길이의 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드보다 높거나 유사한 세포 사멸 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다 (그림 4).
(3) CTL에 의한 HPV 16 E7 펩타이드 특이적인 세포독성 효과의 확인
앞서 확인된 HPV 16 E7 펩타이드 특이적인 세포독성 효과가 PBMC에 포함된 CTL에 의한 작용임을 증명하기 위해, anti-CD8+ antibody가 결합된 microbead를 사용하여 혈액 증여자의 PBMC로부터 CD8+ T 세포를 분리한 후, 선별된 E7 peptide를 각각 처리하여 배양한 뒤, 같은 조건으로 배양된 CD8+ T 세포를 제거한 PBMC와 51Cr release assay 법을 이용해 비교해 본 결과, CD8+ T 세포를 제거한 PBMC에서는 세포 독성 효과가 나타나지 않아 PBMC에 포함된 CTL이 실제적으로 세포 독성 작용에 관여함을 알 수 있었다 (그림 5).
(4) 아미노산이 치환된 E7 펩타이드의 세포 독성 효과 확인
앞서 나타난 결과를 뒷받침하기 위해 E7 에피토프과 MHC 복합체의 결합 형성 에너지를 EGAD 프로그램을 이용하여 계산한 결과, E7 61-69(CDSTLRLCV) 및 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 펩타이드와 HLA-A*2402 복합체의 결합 형성 에너지가 음의 값으로 낮게 산정되어 안정된 결합임을 확인할 수 있었다 (그림 6). 따라서, 두 펩타이드가 HLA-A*2402 분자에 결합하여 면역 활성을 일으킬 수 있다는 예측이 가능하였다.
이러한 결과를 토대로 선별된 두 9mer/10mer 길이의 펩타이드와 HLA-A*2402 분자와의 결합력을 Insight Ⅱ 프로그램을 이용해 계산하여, E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 펩타이드의 일부 아미노산 서열을 치환하여 보다 높은 결합력 수치가 산정된 펩타이드를 예측하여 합성한 후(그림 7), PBMC에 1주일간 처리하여 배양한 후 pp65 328-336(CMV A24, QYDPVAALF, 양성대조군), pp65 495-493 (CMV A02, NLVPMVATV, 음성대조군) 및 기존 E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76 (LCVQSTHVDI) 펩타이드와 비교한 결과, 치환된 펩타이드 CYQSTHVDI(m-peptide 3, 치환된 펩타이드 3번)와 CYVTLRVCL(m-peptide 7, 치환된 펩타이드 7번)가 대조군 및 기존 펩타이드에 비해 IFN-γ의 생성을 강하게 유도하는 것으로 확인되었다 (그림 8). 또한, 유체 세포측정법을 통해 선별된 CYQSTHVDI(m-peptide 3, 치환된 펩타이드 3번) 와 CYVTLRVCL(m-peptide 7, 치환된 펩타이드 7번)의 세포 사멸 효과를 확인하기 위해, 두 펩타이드와 기존의 E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 펩타이드를 51Cr release assay 법을 이용해 비교한 결과, 아미노산이 치환된 펩타이드가 기존 펩타이드 보다 높은 세포 사멸 효과를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다 (그림 9). 따라서, E7 61-69(CDSTLRLCV)와 E7 67-76(LCVQSTHVDI) 펩타이드를 유력한 특이적 E7 에피토프으로 예상할 수 있었고 두 펩타이드를 HLA-A*2402 분자와 가장 결합력이 높은 형태로 아미노산을 치환하면 세포 독성 T 세포의 활성을 보다 더 강하게 유도함을 알 수 있었다.
(5) 자궁 경부암 마우스 모델에서 세포 독성 T 세포를 이용한 항암 실험
BALB/c 누드 마우스에 자궁 경부암 세포주인 SiHa를 주입하여 종양을 형성한 후, in vitro 실험을 통해 선별된 이용하여 세포 독성 T 세포의 항암 효과를 확인하였다. 그림 10∼12에서 볼 수 있듯이 E7 67-76(LCVQSTHVDI)을 처리하여 배양한 PBMC를 마우스에 투여하였을 때 아무 것도 처리하지 않은 음성 대조군(G1)에 비해 종양의 성장이 억제되는 것을 알 수 있었다 (그림 10). 또한, E7 61-69(CDSTLRLCV), E7 67-76(LCVQSTHVDI), CYQSTHVDI (m3, 치환된 펩타이드 3번) 및 CYVTLRVCL(m7, 치환된 펩타이드 7번)을 처리하여 배양한 CD8+ T 세포를 마우스에 투여한 후 종양의 크기를 확인하였을 때, 아무것도 처리하지 않은 음성대조군(G1)에 비해 종양의 성장이 크게 억제되는 것을 확인할 수 있었다(그림 11 및 12). 따라서, 자궁 경부암 마우스 모델을 이용한 동물 실험을 통해 유세포 측정법과 세포 독성 실험을 통해 선별한 E7 61-69(CDSTLRLCV), E7 67-76(LCVQSTHVDI) CYQSTHVDI (m3, 치환된 펩타이드 3번) 및 CYVTLRVCL(m7, 치환된 펩타이드 7번)펩타이드를 처리하여 배양한 세포 독성 T 세포가 자궁 경부암의 성장을 억제하여 항암 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (11)

  1. CDSTLRLCV(서열번호 16) 또는 LCVQSTHVDI(서열번호 35)의 아미노산 서열을 가지는 면역성 펩타이드 및 그 기능적으로 동일한 돌연변이체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 기능적으로 동일한 돌연변이체는 CYQSTHVDI(서열번호 43) 또는 CYVTLRVCL(서열번호 47)의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 면역성 펩타이드 및 그 기능적 돌연변이체.
  3. 제 1항의 서열번호 16 또는 서열번호 35의 펩타이드를 코딩하는 핵산.
  4. 제3항에 있어서, 상기 핵산은 각각 서열번호 48 및 서열번호 49의 염기서열을 가진 것을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제 2항의 서열번호 43 또는 서열번호 47의 펩타이드를 코딩하는 핵산.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 50 내지 서열번호 107 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산.
  7. (a)제1항 또는 제 2항의 펩타이드 및 (b)약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기의 HPV 감염 관련 질환은 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM).
  10. 제 3항의 핵산을 유효성분으로 포함하는 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM).
  11. 제 7항에 있어서, 상기의 조성물은 HLA-A*2402 타입 환자 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물.
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