ES2330078T3

ES2330078T3 - Acidos nucleicos que codifican polipeptidos poliepitope.

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Publication number: ES2330078T3
Application number: ES00965119T
Authority: ES
Inventors: Mary Lynne Hedley; Robert C. Urban; Roman M. Chicz
Original assignee: Eisai Corp of North America
Current assignee: Eisai Corp of North America
Priority date: 1999-09-16
Filing date: 2000-09-18
Publication date: 2009-12-04
Anticipated expiration: 2020-09-18
Also published as: AU785319B2; WO2001019408A1; EP1214097B3; EP1214097A4; WO2001019408A9; AU7589100A; EP1214097B9; EP1214097B1; EP1214097A1; DK1214097T3; CY1109699T1; EP2100620A1; CA2384987A1; JP2003509035A; PT1214097E; DE60042556D1

Abstract

Un ácido nucleico que codifica un polipéptido híbrido cuya secuencia comprende una secuencia señal y (i) los siguientes segmentos de la cepa 16 E6 del virus del papiloma humano (HPV): AMFQDPQERPRKLPQLCTEL (SEQ ID Nº: 64), LLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPY (SEQ ID Nº: 65), y KISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNK (SEQ ID Nº: 66), (ii) los siguiente segmentos de la cepa 16 H7 de HPV: TLHEYMLDLQPETTDLYSY (SEQ ID Nº: 67), QAEPDRAHYNIVTF (SEQ ID Nº: 68), y LLMGTLGIVCPICSQKP (SEQ ID Nº 69); (iii) los siguiente segmentos de la cepa 18 E6 de HPV: RRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFK (SEQ ID Nº: 152), y SVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQK (SEQ ID Nº: 153), y (iv) los siguientes segmentos de la cepa 18 E7 de HPV: KATLQDIVLHLEPQNEIPV (SEQ ID Nº: 154), HTMLCMCCKCEARI (SEQ ID Nº: 155), y AFQQLFLNTLSFVCPWC (SEQ ID Nº: 156), Siempre que el polipéptido híbrido no comprenda una secuencia idéntica a la secuencia de bien la proteína E6 entera, intacta o bien E7 entera, intacta de la cepa 16 ó 18 de HPV.

Description

Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos poliepítope.

Campo del invento

Este invento se refiere generalmente a vacunas y en particular a vacunas de ácidos nucleicos.

Antecedentes del invento

Los papilomavirus son virus de ADN sin cubierta con un genoma circular de doble hebra de aproximadamente 9.000 pares de base. Más de 75 tipos de HPV han sido tipificados a nivel de ADN, y estos pueden ser agrupados ampliamente en familias en base de su tropismo tisular.

Evidencias histológicas, moleculares y epidemiológicas han implicado algunas cepas de HPV en displasia cervical y cáncer cervical. Muchos estudios apoyan la opinión que la mayoría de neoplasias intraepiteliales cervicales moderadas y severas (CIN) contienen ADN de HPV que son detectadas exclusivamente en el epitelio histológicamente anormal de estas lesiones. La infección persistente con HPV se considera que es el factor de riesgo predominante para el desarrollo del carcinoma cervical. El ADN de HPV se encuentra fácilmente en forma episomal dentro de las células que exhiben un efecto citopático, si bien el ADN de HPV se encuentra integrado dentro de los cromosomas de las células asociadas con la mayoría de las lesiones precancerosas de alto grado y con el cáncer. Aproximadamente 23 tipos de HPV son encontrados comúnmente en los programas de cribado anogenital, pero sólo 10-15 están asociados con enfermedades progresivas. Los tipos 16 y 18 son encontrados comúnmente en asociación con la displasia cervical y el cáncer cervical.

El papilomavirus contiene nueve marcos de lectura abierta. Los genes HPV con propiedades de transformación han sido mapeados en los marcos de lectura abierta E6 y E7. Un trabajo bioquímico sustancial ha demostrado que la proteína E6 HPV inactiva la proteína p53, mientras que la proteína E7 interfiere con la función de la proteína retinoblastoma (Rb). Puesto que el p53 y Rb son proteínas supresoras de tumores, que funcionan como inhibidoras de la división celular, su inactivación por E6 y E7 conduce a la célula a entrar en la fase S del ciclo celular. La expresión de E6 y E7 es suficiente para inmortalizar algunas líneas de células primarias, y el bloqueo de la función E6 o E7 se ha demostrado que invierte el estado transformado.

Boursnell y otros publicó un vector virus recombinante que codifica parte o todas las proteínas E6, E7 de HPV 16 y E6, E7 de HPV 18, (US 5719054, columna 3, líneas 2-35).

Sumario del invento

El invento está basado, en parte, en el descubrimiento de que los segmentos polipeptídicos, cada uno de los cuales contiene uno o más epítopos de unión a anticuerpos o a MHC de clase 1 o clase II, pueden ser unidos en tándem para formar polipéptidos poliepítopo, que son procesados proteolíticamente en las células para liberar los epítopos. Estos polipéptidos híbridos son útiles para estimular una respuesta inmune, particularmente cuando se expresa a partir de un ácido nucleico dentro de una célula presentadora de antígeno (APC).

El invento caracteriza un ácido nucleico que codifica un polipéptido híbrido cuya secuencia comprende una secuencia señal y

(i): los segmentos siguientes de la cepa 16 E6 del papilomavirus humano (HPV):

: AMFQDPQERPRKLPQLCTEL (SEQ ID NO: 64),

: LLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPY (SEQ ID NO: 65), y

: KISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNK (SEQ ID NO: 66);

(ii): los segmentos siguientes de la cepa de HPV16 E7:

: TLHEYMLDLQPETTDLYSY (SEQ ID NO: 67),

: QAEPDRAHYNIVTF (SEQ ID NO: 68), y

: LLMGTLGIVCPICSQKP (SEQ ID NO: 69);

(iii): los segmentos siguientes de la cepa de HPV18 E6:

: RRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFK (SEQ ID NO: 152); y

: SVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQK (SEQ ID NO: 153), y

(iv): los segmentos siguientes de la cepa HPV18 E7

: KATLQDIVLHLEPQNEIPV (SEQ ID NO: 154),

: HTMLCMCCKCEARI (SEQ ID NO: 155), y

: AFQQLFLNTLSFVCPWC (SEQ ID NO: 156),

siempre que el polipéptido híbrido no comprenda una secuencia idéntica a la secuencia de cada proteína de longitud completa, E6 intacta o de longitud completa, intacta E7 de las cepas HPV 16 ó 18.

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Como se usa aquí, un "segmento" es una secuencia de aminoácidos que (a) corresponde a la secuencia de una porción (es decir, fragmento menor que la secuencia total) de una proteína que está presente de manera natural, y (b) contiene uno o más epítopos. Para esclarecer, el término "segmento" es usado aquí para denotar una parte del polipéptido híbrido, mientras que el término "porción" es usado para denotar la parte correspondiente de la proteína que está presente de manera natural. Por "epítopo" se refiere a un péptido que se une al surco de unión de una molécula MHC de clase I o de clase II o a la región de unión del antígeno de un anticuerpo. Un codón metionina es preferentemente incluido en el extremo 5' de esta o de cualquier secuencia codificante del invento para facilitar la traducción. Además, el polipéptido híbrido codifica una señal diana, como se describe con más detalle a continuación.

La relación entre los segmentos y los epítopos en los polipéptidos híbridos se muestra esquemáticamente en la Fig. 1. El polipéptido híbrido ilustrado se compone de los segmentos 1, 2, 3 y 4, cada uno de los cuales corresponde por separado a una porción de una proteína que está presente de manera natural. El segmento 1 puede ser procesado proteolíticamente dentro de una célula para generar epítopos a, b, y c. Similarmente, el segmento 2 puede ser procesado proteolíticamente para generar epítopos d, e, y f; el segmento 3 puede ser procesado para generar epítopos g, h, i, j, y k; y el segmento 4, tras el procesamiento, genera epítopos l, m, n y o. Los segmentos adyacentes pueden ser contiguos, o pueden estar separados por un aminoácido separador o un péptido separador.

El polipéptido puede incluir opcionalmente segmentos adicionales, como por ejemplo, puede incluir al menos 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 90, o incluso 100 o más segmentos, siendo cada uno una porción de una proteína que está presente de manera natural a partir de un agente patogénico y/o de un antígeno de un tumor que está presente de manera natural que puede ser el mismo o diferente a partir de la proteína(s) de la que los otros segmentos son derivados. Cada uno de estos segmentos puede ser de al menos 11 aminoácidos de longitud, y cada uno contiene al menos un epítopo (preferiblemente dos o más) diferente de los epítopos de los otros segmentos. Al menos uno (preferiblemente al menos dos o tres) de los segmentos en el polipéptido híbrido puede contener, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, o incluso 10 o más epítopos, particularmente epítopos de unión a MHC de clase I o clase II. Dos, tres o más de los segmentos pueden estar contiguos en el polipéptido híbrido: es decir, estar unidos extremo con extremo, sin espaciador entre ellos. Alternativamente, cualquiera de los dos segmentos adyacentes puede estar unido por un aminoácido espaciador o un péptido espaciador.

Cuando el polipéptido híbrido es introducido en una célula, es procesado proteolíticamente en al menos alguno de sus epítopos constituyentes. Al menos algunos de los epítopos generados a partir de los segmentos en el polipéptido pueden unirse a las moléculas MHC de clase I o MHC de clase II presentes en la célula, aunque algunos de los epítopos pueden ser específicos para las moléculas MHC de clase I o clase II presentes sólo en otras células. Los epítopos pueden alternativamente ser epítopos de células B, que provocan respuestas inmunes mediadas por anticuerpos tras la unión a los receptores de anticuerpos en la superficie de una célula B.

Un segmento dado dentro del polipéptido híbrido no necesita ser de una longitud especifica, mientras sea lo suficientemente largo para generar al menos un epítopo, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o mas epítopos y es al menos 11 aminoácidos en longitud. Por ejemplo, un segmento dado puede tener una longitud de al menos 12 aminoácidos, por ejemplo, al menos 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40 ó 50 aminoácidos. Un segmento dado corresponde a una proteína particular que está presente de manera natural si cualquiera de los 11 aminoácidos consecutivos (o más) del segmento son encontrados en exactamente el mismo orden en una porción de la proteína que está presente de manera natural. El segmento es preferiblemente menor de 100 aminoácidos (menor e 95 aminoácidos para la proteína E7 de la cepa HPV16) y preferiblemente menor de 70 o menor de 50 aminoácidos (por ejemplo, 20-50). En una realización, es menor de 15. Los segmentos dentro del polipéptido poliepítopo pueden ser dispuestos en cualquier orden dentro del polipéptido. El polipéptido híbrido preferiblemente no contiene una secuencia idéntica a la secuencia de bien E6 de longitud completa, de la proteína intacta o E7de longitud completa, intacta de la cepa HPV 16 ó 18. Las secuencias de estas proteínas se pueden encontrar en el sitio web (ftp://ftp-t10.lanl.gov/pub/papilloma/SWISS-PROT-files/Human-
papilloma/HPV16.swp) y (ftp://ftp-t10.lanl.gov/pub/papilloma/SWISS-PROT-files/Human-papilloma/HPV18.swp)
como se ve a 7 de Diciembre de 1999.

Los segmentos adicionales pueden ser derivados de un antígeno tumoral o proteínas de antígeno que está presente de manera natural de un agente patogénico. Como se usa aquí, "agente patogénico" se refiere a un virus o microorganismo que causa enfermedad en un mamífero. Por "antígeno tumoral" se refiere a una proteína o epítopo que se expresa o en una célula tumoral y no, o en menor grado, en una célula que es el homólogo no tumoral de la célula tumoral. Dichos antígenos tumorales sirven con frecuencia como marcadores para diferenciar las células tumorales de sus homólogos normales. Los ejemplos de los antígenos tumorales se presentan en la Tabla 1, tal como una proteína codificada por el gen Her2/neu, el gen del antígeno específico de próstata, el antígeno de melanoma reconocido por el gen (MART) de las células T, o el gen del antígeno del melanoma (MAGE). Ejemplos de proteínas de los agentes patogénicos incluyen proteínas expresadas de manera natural a partir del genoma de un virus, por ejemplo, un virus que infecta crónicamente células, tales como el papilomavirus (HPV), virus de la inmunodeficiencia (HIV), virus del herpes simple (HSV), virus de la hepatitis B (HBV) o el virus de la hepatitis C (HCV); una bacteria, tal como micobacteria, Helicobacteria spp, por ejemplo, Helicobacter pylori, o Chiamydia spp; un hongo; o un parásito eucariota, tal como la especie Plasmodium.

Una lista representativa de los epítopos de unión de clase I de proteínas apropiadas, cualquiera de las cuales puede ser incluida en los polipéptidos poliepítopo del invento, se incluye en la Tabla 2.

El polipéptido híbrido puede contener un primer epítopo a partir de una proteína HPV y un segundo epítopo que no se traslapa con el primer epítopo y es de la misma proteína HPV o de una diferente. ("Proteína HPV diferente" puede incluir un homólogo no idéntico de la primera proteína, derivado de una cepa HPV diferente que de la que la primera proteína es derivada). El primer epítopo se une a un primer alotipo de un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y el segundo epítopo se une a un segundo alotipo de clase I MHC diferente del primer alotipo de clase I MHC.

Puesto que el polipéptido híbrido está hecho de fragmentos de proteína de las diferentes proteínas, o de los fragmentos no contiguos de una proteína simple, unido opcionalmente por aminoácidos espaciadores o secuencias espaciadoras y unido opcionalmente a un residuo de metionina o a una señal diana (véase más adelante), la secuencia de este polipéptido híbrido no es idéntica a la secuencia aminoacídica de cualquiera de las proteínas presentes de manera natural o a un fragmento de una proteína que está presente de manera natural. Los epítopos se incluyen a partir de la proteína E7 o E6 HPV de la cepa HPV 16 ó 18, otras cepas HPV son 31, 33, 43 ó 45. Así pues, el polipéptido híbrido incluye segmentos de cada una de las proteína de la cepa HPV 16 E6 y E7, y segmentos de cada una de las proteínas E6 y E7de la cepa HPV 18. El polipéptido híbrido es al menos 236 aminoácidos en longitud y puede ser, por ejemplo, al menos 250 o 300 aminoácidos.

Los alotipos MHC de clase I a los que los epítopos en el polipéptido híbrido se unen pueden ser cualquier alotipo de clase I humano, por ejemplo, HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, y/o HLA-A24. Un epítopo dado puede ser promiscuo, es decir, se une a más de un alotipo.

El polipéptido híbrido puede incluir también un tercer epítopo de una proteína HPV. Este epítopo, que puede ser derivado de la misma proteína HPV o diferente como el primer epítopo y/o segundo, se une a un tercer alotipo MHC de clase I diferente del primer y segundo alotipo MHC de clase I. Puede, por supuesto, unirse también al primer y/o segundo alotipo MHC de clase I, además de al tercero. El polipéptido híbrido puede incluir, por ejemplo, al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 35, 40, 50, 60, 80 o incluso 100 o más epítopos de unión con alotipos MHC de clase I a partir de una o más proteínas HPV. Algunos de estos epítopos pueden solaparse.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Antígenos tumorales

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2

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A menos que se especifique lo contrario, los epítopos en los polipéptidos híbridos del invento se pueden solapar en cierto grado, por ejemplo, el primer epítopo puede solapar (es decir, compartir al menos un residuo aminoacídico, y compartir todos excepto un residuo) con el tercer epítopo, o pueden no solaparse.

El polipéptido incluye una señal diana. Una señal diana es un péptido que dirige el transporte intracelular o la secreción de un péptido que es adjuntado. La señal diana puede ser al final del amino, por ejemplo, una secuencia señal o el final carboxi, o dentro del polipéptido híbrido, mientras funcione en ese sitio.

La señal diana puede ser cualquier secuencia señal reconocida, por ejemplo, una secuencia señal de la proteína E3 de adenovirus. Una señal diana preferida es el péptido señal de HLA-Dr\alpha: Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala (SEQ ID No:63).

La señal diana puede ser opcionalmente modificada para introducir una sustitución de aminoácidos en la(s)
unión(es) entre la señal diana y el (los) segmento(s) adyacente(s) para promover el corte de la secuencia diana de los epítopos por ejemplo, una peptidasa señal.

Cualquiera de los segmentos dentro del polipéptido híbrido puede ser separados de los otros por un aminoácido espaciador o una secuencia espaciadora.

El ácido nucleico del invento puede codificar un polipéptido híbrido que incluye un primer epítopo y un segundo epítopo, en el que el primer epítopo es de la primera proteína HPV y el segundo epítopo es de una segunda proteína HPV diferente de la primera proteína HPV, siempre que la secuencia del segundo epítopo no tenga lugar dentro de la primera proteína HPV, es decir, que sean derivadas necesariamente de las diferentes proteínas. Las diferentes proteínas pueden ser de las mismas o distintas cepas de HPV, por ejemplo, de los tipos 16 y 18. El polipéptido híbrido puede, por supuesto, incluir epítopos adicionales de las mismas o diferentes proteínas HPV, o de otros antígenos patógenos o tumorales.

También dentro del invento está un ácido nucleico que codifica un polipéptido híbrido que incluye una pluralidad de epítopos de unión de MHC de clase I de una proteína HPV (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, ó 30). La secuencia del polipéptido híbrido entero no es idéntica a la secuencia de o bien una proteína HPV que está presente de manera natural o un fragmento de una proteína HPV que está presente de manera natural, por virtud de inser-
ciones de secuencia, deleciones internas, o sustituciones, completas, por ejemplo, por técnicas de ingeniería genética.

El ácido nucleico codifica un polipéptido híbrido que incluye una pluralidad de epítopos de unión HLA de una proteína E7 de cepa HPV 16, una pluralidad de epítopos de unión HLA de una proteína E6 de cepa HPV 18 y una pluralidad de epítopos de una proteína E7 de cepa HPV 18. Cada pluralidad de epítopos puede incluir un epítopo seleccionado del grupo que consiste en un epítopo de unión A1-HLA, un epítopo de unión A2-HLA, un epítopo de unión A3-HLA, un epítopo de unión A11-HLA y un epítopo de unión A24-HLA y preferiblemente al menos dos o tres seleccionados de este grupo. Los miembros de cada pluralidad de epítopos son diferentes de los miembros de cada uno de la otra pluralidad de epítopos. Cada pluralidad de epítopos puede incluir al menos dos epítopos de unión A1-HLA, al menos dos epítopos de unión A2-HLA, al menos dos epítopos de unión A3-HLA, al menos dos epítopos de unión A11-
HLA, y/o al menos dos epítopos de unión A24-HLA. Una pluralidad dada puede ser distribuida en más de un segmento.

El ácido nucleico del invento codifica un polipéptido híbrido que comprende los segmentos peptídicos de la Fig. 5 (SEQ ID NO: 157). El polipéptido incluye los segmentos y una secuencia señal y no comprende una secuencia idéntica a la secuencia de o bien la longitud completa de E6 intacta o bien la proteína E7 intacta de longitud completa de la cepa HPV 16 ó 18.

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Los segmentos pueden ser procesados para producir múltiples epítopos. El polipéptido híbrido puede incluir los segmentos peptídicos de la Fig. 5, así como la secuencia adicional E7 o E6 HPV. Más preferiblemente, el segmento es menor que 100, 70, 50, 40, 30 ó 20 aminoácidos. El polipéptido híbrido no contiene una secuencia idéntica a la secuencia de o bien la proteína E7 intacta, de longitud completa o E6 intacta, de longitud completa de la cepa HPV 16 ó 18.

Los ácidos nucleicos descritos anteriormente pueden ser proporcionados en un plásmido, en un vector viral o bacterial. Cuando los ácidos nucleicos son usados in vivo, es preferible usar vectores plasmídicos que contienen los ácidos nucleicos descritos anteriormente. El vector es preferiblemente un vector de expresión que contiene una o más secuencias reguladoras (que pueden incluir un promotor) que permite la expresión en una célula de interés. La(s) secuencia(s) reguladora(s) están operativamente unidas a la secuencia que codifica el polipéptido híbrido, de modo que dirijan la expresión de la última.

Una célula en la que el ácido nucleico del invento ha sido introducido (por ejemplo, por transfección o infección) en la forma del plásmido, vector bacteriano o viral, o bien de modo transitorio o de modo estable puede ser, por ejemplo, una célula B, una célula dendrítica (CD), una célula de Langerhans u otra célula presentadora de antígenos (APC). La célula puede ser cultivada o por el contrario mantenida, en condiciones que permiten la expresión del polipéptido híbrido a partir del ácido nucleico, por ejemplo, del plásmido, que lo codifica.

Como se usa aquí, "ADN aislado" cubre ambos (1) una secuencia de ADN completa que no está presente dentro de ningún ADN presente de manera natural, y (2) una secuencia de ADN completa que no está presente dentro de ningún ADN presente de manera natural, pero que carece de los genes que flanquean la secuencia en el genoma del organismo en el que la secuencia está presente de manera natural. El término por tanto, incluye un ADN recombinante incorporado en un vector, en un plásmido de replicación autónoma o en un virus, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota. También incluye una molécula separada, tal como un cADN, un fragmento genómico, un fragmento producido por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o un fragmento de restricción.

El invento incluye además polipéptidos híbridos codificados por los ácidos nucleicos descritos anteriormente. Los polipéptidos híbridos descritos aquí pueden incluir opcionalmente un residuo metionina amino terminal. Los polipéptidos híbridos descritos aquí pueden también incluir opcionalmente un GLAG (u otro determinante de anticuerpo monoclonal) o un sitio de reconocimiento de anticuerpo (por ejemplo, un myc o su tag) localizado directamente 3' de la última secuencia que codifica el epítopo. También incluidos en el polipéptido híbrido están los segmentos, como se trata anteriormente. Al menos alguno de los segmentos corresponde a las porciones de una o más proteínas presentes de manera natural. Pueden ser separadas por aminoácidos espaciadores o péptidos espaciadores.

El polipéptido híbrido descrito aquí puede ser un polipéptido sustancialmente puro. "Polipéptido sustancialmente puro" cubre ambos (1) un polipéptido de secuencia completa que no es idéntica a la de ningún polipéptido presente de manera natural, y (2) un polipéptido que tiene la secuencia de un polipéptido presente de manera natural, pero que está separado de estos componentes (proteínas y otras moléculas orgánicas presentes de manera natural) que lo acompañan de manerea natural en el contexto biológico (por ejemplo, células) en el que está presente de manera natural. Típicamente, el polipéptido es sustancialmente puro cuando constituye al menos 60%, en peso, de la proteína en la preparación. Preferiblemente, al menos 75%, más preferiblemente al menos 90% y más preferiblemente al menos 99%, en peso, de la proteína en la preparación es el polipéptido.

Los ácidos nucleicos (por ejemplo, vectores virales, bacterianos o plásmidos) o los polipéptidos híbridos pueden ser proporcionados opcionalmente en una macropartícula que incluye también una matriz polimérica. En las realizaciones preferidas, la matriz polimérica consiste esencialmente en ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA), o un copolímero de ácido poliláctico coglicólico (PLGA). La micropartícula tiene preferiblemente un diámetro de, por ejemplo, 0,02 a 20 micrones, o menos de alrededor de 11 micrones. Una pluralidad de las micropartículas tiene preferiblemente un diámetro promedio de, por ejemplo, 0,02 a 20 micrones, menos de alrededor de 11 micrones, o menos de alrededor de 5 micrones.

Los ácidos nucleicos y los polipéptidos híbridos descritos aquí pueden ser incorporados alternativamente en liposomas o complejos de estimulación inmune (ISCOMS) o suministrados con polímeros presentes de manera natural, polímeros sintéticos, biopolímeros, lípidos catiónicos, agentes de condensación, dendrímeros, otros biomateriales, adyuvantes que contienen aceite, y otros adyuvantes tales como el QS21 o saponina. Los ácidos nucleicos y los polipéptidos híbridos descritos aquí pueden ser administrados alternativamente usando cualquiera de los excipientes de suministro adecuado conocidos en la técnica, o pueden ser suministrados sin un excipiente de suministro (aparte de la solución acuosa), por ejemplo, "ADN desnudo".

El invento además incluye una composición terapéutica que contiene los ácidos nucleicos descritos anteriormente o polipéptidos, un soporte farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente, uno de los excipientes de suministro tratados anteriormente.

También se propone un método para generar una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta de anticuerpos o una respuesta inmune celular, que incluye una respuesta inmune mediada por MHC de clase I o de clase II) en un mamífero mediante administración en el mamífero de los ácidos nucleicos descritos anteriormente o de los polipéptidos híbridos. Preferiblemente, el mamífero lleva al menos un alotipo MHC de clase I o II que se une con un epítopo derivado del polipéptido poliepítopo. El mamífero puede ser, por ejemplo, un humano, un primate no humano, un perro, un gato, un conejo, una vaca, un caballo, una oveja, un cerdo, un ganso, un ratón, una rata, una cobaya o un hámster.

Cuando al menos uno de los epítopos es un epítopo HPV, los sujetos apropiados para el método incluyen, por ejemplo, un humano que sufre, o tiene un riesgo de sufrir, condiloma, por ejemplo, condiloma exofítico, condiloma plano, cáncer cervical, otras enfermedades cancerosas o estados asociados a HPV, papiloma respiratorio, papiloma conjuntival, infección por HPV de tracto genital o tracto anal, o displasia cervical. El ácido nucleico o el polipéptido híbrido, o el excipiente de suministro que contiene uno o más de estos compuestos, puede ser administrado directamente en un tejido mucoso, por ejemplo, vaginal, nasal, respiratorio bajo, ocular o aplicado en tejido gastrointestinal (por ejemplo, rectal, cervical o dérmico) del mamífero. Alternativamente, el ácido nucleico o el polipéptido híbrido, o un excipiente de suministro que contiene el mismo puede ser administrado sistémicamente: por ejemplo, intravenoso, intramuscular, intradérmico, oralmente, subcutáneo, intra arterial, intra peritoneal o intratecal.

Por "aminoácido espaciador" se refiere a un residuo único insertado entre dos segmentos vecinos. ("A" y "B", en ese orden) en un polipéptido del invento, donde el residuo es diferente del aminoácido que flanquea el extremo amino de B en las respectivas proteínas de longitud completa de las cuales A y B fueron derivadas ("X" e "Y", respectivamente). Así pues, el aminoácido espaciador forma un punto de discontinuidad a partir de la secuencia A derivada de X y la secuencia B derivada de Y, en el polipéptido del invento. Típicamente, el aminoácido será uno de los veinte aminoácidos presentes de manera natural, por ejemplo, Ala, Leu, Ile, o Gly y en general puede ser cualquier aminoácido excepto (1) el que flanquea de manera natural el extremo carboxilo de A en la proteína X, y (2) el que flanquea de manera natural el extremo amino de B en la proteína Y.

Por "secuencia espaciadora" se refiere a la secuencia de dos o más aminoácidos insertados entre dos segmentos vecinos, por ejemplo, "A" y "B", en un polipéptido del invento. La secuencia del espaciador es diferente de las secuencias que flanquean el extremo carboxilo de A y el extremo amino de B en las respectivas proteínas de longitud completa ("X" e "Y") de las que A y B fueron derivadas. Así pues, la secuencia espaciadora forma un punto de discontinuidad de ambas secuencias A derivada de X y la secuencia B derivada de Y en el polipéptido del invento.

Los ejemplos de las secuencias espaciadoras incluyen Ala Ala, Ala Leu, Leu Leu, Leu Ala, Leu Ile, Ala Ala Ala, Ala Gly Leu, Phe Ile Ile, etc. Generalmente, la secuencia espaciadora incluirá aminoácidos no polares, aunque los residuos polares tales como Glu, Gln, Ser, His y Asn pueden estar también presentes, particularmente para las secuencias espaciadoras mayores de tres residuos. El único límite externo en la longitud total y la naturaleza de cada secuencia espaciadora deriva de las consideraciones de facilidad de síntesis, proceso proteolítico y la manipulación del polipéptido y/o ácido nucleico. No es generalmente necesario y probablemente no es deseado usar secuencias espaciadoras mayores de alrededor de cuatro o cinco residuos, aunque pueden ser, por ejemplo, hasta 6, 8, 10, 15, 20, 30, ó 50 residuos. Por supuesto, pueden ser incluso mayores de 50 residuos.

Los aminoácidos y las secuencias espaciadoras son útiles para promover el proceso de liberación de epítopos. Los espaciadores son típicamente eliminados del polipéptido por un proceso proteolítico en la célula, junto con cualquier secuencia entre epítopos dentro de un segmento dado. Esto deja a los epítopos intactos para unirse con las moléculas MHC o (tras la secreción de la célula) con los anticuerpos. Ocasionalmente un aminoácido espaciador o parte de una secuencia espaciadora permanecerá unida a un epítopo a través del proceso incompleto. Esto generalmente tendrá un pequeño o ningún efecto en la unión con la molécula MHC.

Una ventaja del invento es que permite suministrar epítopos de unión a MHC de clase I o clase II de los polipéptidos que tienen solo una secuencia parcial de una proteína de un antígeno patógeno o tumoral. Así pues, los problemas asociados con la interferencia de la presentación antígena por proteínas virales o efectos perjudiciales vistos en sobreexpresiones de las proteínas virales particulares o los antígenos tumorales, son evitados.

Otra ventaja del invento es que la secuencia de ácidos nucleicos, o los excipientes de suministro que contienen las secuencias de ácidos nucleicos, pueden promover respuestas inmunes asociadas, por ejemplo, IL-12 e \gamma-interferón (IFN) liberados de los macrófagos, células NK y de las células T. Por ejemplo, la fagocitosis de las microesferas que contienen el ADN en general pueden promover la secreción TNF e IFN por APCs humanas.

Una ventaja adicional del invento es que el surtido de epítopos dentro de los polipéptidos poliepítopo descritos aquí aumenta la posibilidad de que al menos uno de los epítopos será presentado por cada uno de una variedad de alotipos HLA. Esto permite la inmunización de una población de individuos polimórficos en el locus HLA, usando un polipéptido híbrido único o un ácido nucleico que codifica el polipéptido. Los polipéptidos híbridos pueden ser específicos para un patógeno particular, que incluye dos o más cepas del mismo patógeno, o pueden contener epítopos derivados de uno o más patógenos. Además, los polipéptidos híbridos pueden ser específicos para un antígeno tumoral particular, o pueden contener epítopos derivados de dos o más antígenos tumorales.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por los profesionales con conocimientos comunes en la técnica a la cual pertenece el invento. Los métodos adecuados y los materiales son descritos a continuación, aunque los métodos y los materiales si-
milares o equivalentes a los descritos aquí pueden ser también usados en la práctica o ensayados en el presente invento.

Además, los materiales, los métodos y los ejemplos son sólo ilustrativos y no intentan ser limitantes.

Otras características y ventajas del invento serán aparentes a partir de la descripción detallada a continuación y de las reclamaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un dibujo esquemático de un polipéptido poliepítopo que incluye cuatro segmentos, cada segmento incluye múltiples epítopos.

La Fig. 2 es un dibujo esquemático de un polipéptido poliepítopo que incluye las secuencias aminoacídicas de los segmentos derivados de las proteínas E6 y E7 de la cepa HPV 16.

La Fig. 3 es un gráfico que ilustra los resultados de un ensayo in vitro en el que las células T humanas estimuladas con el péptido HPV 16 E7 44-52 fueron ensayadas frente a dianas que expresan HLA-A1/A3 infectadas bien con el vector de la vacuna de tipo salvaje (ciclos abiertos) o bien con el vector de la vacuna que codifica el HPV 16 E7 44-52 como parte de un polípeptido poliepítopo HPV 16 E6/E7.

La Fig. 4 es un dibujo esquemático de un polipéptido poliepítopo que incluye las secuencias aminoacídicas de los segmentos derivados de la cepa HPV E6 18 y las proteínas E7.

La Fig. 5 es un dibujo esquemático de un polipéptido poliepítopo que incluye las secuencias aminoacídicas de los segmentos derivados de las proteínas E6 y E7 de las cepas HPV 16 y 18.

La Fig. 6 es un gráfico que ilustra los resultados de un ensayo in vitro en el que las células T de los ratones de ADN inmunizado fueron expandidas in vitro por exposición al péptido 124 o el péptido 272 y ensayadas subsiguientemente contra las células diana infectadas con el vector de la vacuna de tipo salvaje, el vector de la vacuna que codifica el HPV Dra 16/18, o el vector de la vacuna que codifica el HPV 16/18.

Descripción detallada

El presente invento proporciona ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos poliepítopo que incluyen segmentos inmunogénicos múltiples, cada segmento contiene uno o más epítopos restringidos a MHC de clase I o II, o ambos. Los ácidos nucleicos y los polipéptidos del invento son útiles para la generación o la mejora profiláctica o las respuestas inmune terapéuticas contra patógenos, tumores o las enfermedades autoinmunes en una población de individuos que tienen varios alotipos MHC. Además, los ácidos nucleicos y los polipéptidos del invento son también útiles como testigos positivos en los ensayos de estimulación de células T in vitro, y como herramientas para comprender el procesamiento de los epítopos dentro de las células.

Uno o más de los segmentos presentes dentro del polipéptido poliepítopo pueden ser procesados en epítopos definidos múltiples para formar o bien epítopos de unión a MHC de clase I, que están asociados típicamente con las respuestas inmune (CTL) de la célula T citotóxica, o los epítopos de unión a MHC de clase II, que están asociados típicamente con las respuestas inmune de las células T ayudante. Otros epítopos pueden ser los epítopos de la célula B que estimula la producción de los anticuerpos de epítopos específicos.

Incluido en el invento están los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos poliepítopo útiles para la prevención o el tratamiento de las infecciones HPV asociadas, particularmente las infecciones asociadas con las verrugas, la displasia cervical o anal, el cáncer cervical y otros cánceres asociados a HPV. Por ejemplo, los polipéptidos y los ácidos nucleicos del invento pueden ser usados como vacunas profilácticas o terapéuticas en sujetos que se conoce están infectados por HPV, que son sospechosos de estar infectados por HPV, o que tienen probabilidad de estar infectados por HPV. Otros sujetos adecuados incluyen aquellos que muestran síntomas de, o que probablemente desarrollan, los estados asociados a HPV. Los polipéptidos inmunogénicos y los ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos, pueden ser también usados como vacunas para la prevención o el tratamiento de las condiciones asociadas con las infecciones de la cepa HPV 16, por ejemplo, papulosis bowenoide, displasia anal, papilomas respiratorios o conjuntivales, displasia cervical, cáncer cervical, cáncer de la vulva o cáncer de próstata. Pueden ser también usados para tratar condiciones asociadas con otras cepas HPV, especialmente aquellas asociadas con las cepas HPV 6, 11, 18, 31, 33, 35, y 45. Estas condiciones incluyen, por ejemplo, condiloma exofítico (cepas HPV 6 y 11), condiloma plano, especialmente de cérvix (cepas HPV 6, 11, 16, 18, y 31), condiloma gigante (cepas HPV 6 y 11), cáncer cervical (cepas HPV 18, 31, y 33 además de la cepa HPV 16), papilomas conjuntival y respiratorio (HPV 6 y 11), y la infección con HPVs de tracto genital (HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33 y 35).

Identificación de los epítopos de unión a MHC de las proteínas HPV

Para que un epítopo genere respuestas eficaces de célula T citotóxicas (CTL), debe unirse a una molécula MHC de un antígeno que presenta la célula (APC), y el complejo ligando receptor resultante debe ser reconocido por un receptor de la célula T expresado en el CTL. Los epítopos que se unen a un alelo MHC específico pueden ser identificados sintetizando primero una serie de fragmentos peptídicos que se traslapan a partir de una proteína de interés, por ejemplo, una proteína HPV tal como la HPV E6 ó E7, y por el ensayo de los péptidos en los estudios de unión reconocidos en la técnica con un péptido radiomarcado conocido por unirse al alelo MHC. Si un péptido de ensayo demuestra una unión específica a un alelo MHC medido, por ejemplo, por la competencia con el péptido de ensayo radiomarcado(es decir, es un epítopo), el epítopo puede ser combinado con epítopos adicionales (solapados o adjuntos) para producir o definir un segmento.

Alternativamente, los epítopos pueden ser identificados replegando las moléculas MHC solubles en presencia de ®2microglobulina radiomarcada y un péptido de ensayo. El complejo completo replegará y producirá un receptor del tamaño correcto. La ®2 microglobulina se disocia del complejo a una velocidad medible que está correlacionada directamente con la afinidad de unión del péptido de ensayo (Garboczi y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 3429-33, 1992; Parker y otros, J. Biol. Chem. 267: 5451-5459, 1992; y Parker y otros, J. Immunol. 149: 1896-1904, 1992). El análisis de este tipo de datos ha resultado en un algoritmo que predice los tiempos de disociación de un péptido de ensayo dado para un receptor HLA-A2 (Parker y otros, J. Immunol. 152: 163-175, 1994). Una rápida disociación ha sido correlacionada con afinidad baja, y una disociación lenta con alta afinidad. Este algoritmo ha sido expandido y está disponible para predecir la afinidad de unión de los epítopos para los alotipos HLA-A, -A1, -A2, -A3, -A11 y -A24. El algoritmo se puede encontrar en el sitio web (\underbar{http://www.bimas.dort.nih.gov/molbio/hla\_bind/index.html}) La mayoría de los epítopos HPV E6 16 y E7 que se conoce en la técnica que unen uno de los cinco receptores HLA-A listados son predichos por este algoritmo para causar tiempos de disociación de microglobulina ®2 mayores de 2 h.

La unión al epítopo puede ser también determinada usando los epítopos identificados previamente derivados del HPV 16 E6 y E7 (Kast y otros, J. Immunol. 152: 3904-12, 1994). Los estudios de unión adicional en otros epítopos putativos HPV, por ejemplo, los epítopos derivados HPV E6 18 y E7, son realizados usando los 8, 9 ó 10-mers solapantes de las proteínas HPV E6 18 y E7 en los ensayos de unión que implica cada uno de los cinco alotipos HLA-A, usando uno de los protocolos descritos anteriormente.

Alternativamente, los epítopos pueden ser identificados identificando los péptidos de unión a MHC de clase I o clase II usando las técnicas descritas en, por ejemplo, el documento de patente norteamericana No. 5.827.516. y el documento de patente norteamericana 09/372.380.

Ensayos de célula T para los epítopos

Los epítopos que se unen in vitro con las moléculas MHC como se describe anteriormente pueden ser analizados en lo que respecta a su eficacia en la estimulación de respuestas de célula T humanas en un ensayo de inmunización in vitro. El ensayo ha sido usado anteriormente para identificar epítopos de respuesta de célula T humana y murina, que incluyen varios que son derivados de la proteína HPV (Alexander y otros., Amer. J. Obstet y Gynecol. 175: 1586-1593, 1996; Tarpey y otros., Immunology 81: 222-27, 1994). Estos ensayos han sido también usados para generar un amplio número de CTL especifico para la inmunoterapia (Tsai y otros., Crit. Rev. Immunol. 18: 65-75, 1998). Para asegurar la fiabilidad, es deseable realizar la primera ronda de estimulación de la célula T en presencia de las células dendríticas (CDs) pulsadas con el péptido de ensayo. Así mismo, la inclusión de IL-10 durante la estimulación puede suprimir las respuestas no específicas que pueden aumentar a veces durante el cultivo de las células. La activación de la célula T puede ser entonces examinada usando un ensayo ELISA para medir la secreción de ©-IFN, o por el uso de FACS para determinar el aumento en las células CD8+, CD16- que contienen ©-IFN por análisis tricolor. Alternativamente, la activación de la célula T puede ser medida usando un ensayo CTL liberado ^{91}Cr o un ensayo basado en tetrámeros.

Es posible que no todo individuo con un alotipo dado responda a un epítopo particular. Por ejemplo, un individuo cuyas células soportan el alotipo HLA-A2 puede responder a un epítopo dado, mientras que un segundo individuo tal, no pueda. Una razón para esta respuesta diferente puede ser que estos individuos que han sido infectados con HPV previamente tengan una frecuencia de célula T precursora mayor que un individuo naive (no expuesto). Otra puede estar relacionada con las diferencias en el repertorio de células T entre dos individuos. Para superar esta dificultad, las células T de dos donantes e incluso más preferiblemente tres donantes, para cada alotipo HLA pueden ser ensayadas. Para los alelos más comunes (es decir, HLA-A2 y A3) hasta cuatro donantes son ensayados preferiblemente.

Cada epítopo es ensayado inicialmente con las células de un donante. Si un epítopo no estimula una respuesta de la célula T usando células del primer donante, se ensaya de nuevo con células de un segundo donante y después con un tercer donante. Si el epítopo no demuestra una reacción de células T después de dos o tres intentos, es preferible no representarlo en los polipéptidos del invento.

Alterando el método por el cual la presentación in vitro del antígeno es realizada puede potenciar el análisis. Una estimulación inicial de las células T con CDs es típicamente parte de la inmunización in vitro. Para potenciar la inmunización, el CDs se puede añadir en cada vuelta de estimulación para asegurar la presentación del antígeno adecuada y la estimulación de la célula T, por ejemplo, usando CDs previamente generadas y subsiguientemente congeladas.

Leucopaks o muestras de sangre pueden ser obtenidas de individuos con lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (HSIL) o cáncer cervical. Estos individuos pueden haber sido preparados in vivo y pueden haber aumentado el número de las células T en su sangre.

Alternativamente, los epítopos pueden ser seleccionados para ser incluidos en la construcción basándose únicamente en su afinidad de unión con las moléculas HLA, o identificados tras el análisis de los péptidos procesados naturalmente, como se describe aquí y en Chicz y otros, J. Exp. Med. 178: 27-47, 1993 y en el documento de patente norteamericana 5.827.516.

La secuencia aminoacídica de un polipéptido híbrido (SEQ ID NO: 126) basada en las secuencias encontradas en las proteínas E6 y E7 de la cepa HPV 16 se muestra en la Fig. 2. El polipéptido híbrido es creado por la fusión de fragmentos de la proteína E6 (aminoácidos 7-26 (SEQ ID NO:64), 44-67 (SEQ ID NO:65), y 79-101 (SEQ ID NO:66)) y la proteína E7 (aminoácidos 7-25 (SEQ ID NO:67), 44-57 (SEQ ID NO:68), y 82-98 (SEQ ID NO:69)). Para evitar que la proteína retinoblastoma (Rb) se una con el polipéptido híbrido, los aminoácidos 26 y 27 de la proteína E7 no están incluidos. Además, la cisteína en el aminoácido 24 has sido convertido en un residuo de suero. En el contexto definido anteriormente, esto da como resultado del residuo de suero, junto con el residuo 25, una "secuencia espaciadora" entre los segmentos que corresponden a los residuos de la proteína E7 7-23 y 44-57, respectivamente.

La secuencia aminoacídica de un segundo polipéptido híbrido (SEQ ID NO: 159) basada en las secuencias encontradas en las proteínas E6 y E7 de la cepa HPV 18 se muestra en la Fig. 4. El polipéptido híbrido es creado por la fusión de los fragmentos de la proteína E6 (aminoácidos 9-50 (SEQ ID NO: 152), y 84-110 (SEQ ID NO: 153)), y la proteína E7 (aminoácidos 5-23 (SEQ ID NO: 154), 59-72 (SEQ ID NO: 155) y 85-101 (SEQ ID NO: 156)).

La secuencia aminoacídica de un tercer polipéptido híbrido (SEQ ID NO: 157) basada en las secuencias encontradas en las proteína E6 y E7 de las cepas HPV 16 y 18 es mostrada en la Fig. 5. El polipéptido híbrido es creado por la fusión de los fragmentos de la proteína E6 de la cepa HPV 16 (aminoácidos 7-26 (SEQ ID NO: 64), 44-67 (SEQ ID NO: 65) y 79-101 (SEQ ID NO: 66)), la proteína E7 de la cepa HPV 16 (aminoácidos 7-25 (SEQ ID NO: 67), 44-57 (SEQ ID NO: 68) y 82-98 (SEQ ID NO: 69)), la proteína E6 de la cepa HPV 18 (aminoácidos 9-50 (SEQ ID NO: 152), y 84-110 (SEQ ID NO: 153)), y la proteína E7 de la cepa HPV 18 (aminoácidos 5-23 (SEQ ID NO: 154), 59-72 (SEQ ID NO: 155) y 85-101 (SEQ ID NO: 156)). Como se describe anteriormente con respecto al polipéptido híbrido de la SEQ ID NO: 126, estos aminoácidos de la proteína E7 de la cepa HPV 16 que podrían causar la unión del polipéptido con la proteína RB son excluidos. Además, una secuencia espaciadora insertada idéntica a la presente en la SEQ ID NO: 126 yace entre los segmentos correspondientes a los residuos 7-23 y 44-57, respectivamente.

Cualquiera de los polipéptidos híbridos descritos aquí puede incluir opcionalmente una metionina iniciadora, una secuencia líder o cualquier secuencia diana (por ejemplo, un dominio transmembrana). Los términos "secuencia diana" y "secuencia de tráfico" son usados indistintamente aquí. Por ejemplo, cuando el tercer polipéptido híbrido tiene una metionina añadida a su extremo amino, tiene la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 158. Además, cuando el tercer polipéptido híbrido tiene una secuencia líder HLA-DR\alpha añadida a su extremo amino, tiene la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 160.

La Tabla 3 lista otros epítopos de unión a MHC de E6 y E7 de la cepa HPV 16 y los polipéptidos E7 y E6 de la cepa HPV 18. Cualquiera de estos epítopos puede ser incorporado en un polipéptido híbrido del invento.

TABLA 3 Epítopos E7 y E6 de HPV de unión a MHC

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Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que contienen epítopos HPV múltiples

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos poliepítopo que contienen epítopos identificados como se describe anteriormente pueden ser generados usando técnicas estándar, por ejemplo, solapando PCR o uniones de oligonucleótidos. Preferiblemente, los codones son seleccionados por inclusión en la construcción para optimizar la producción de los polipéptidos poliepítopo en los sistemas bacterianos o mamíferos.

Segmentos diferentes en el polipéptido poliepítopo, por ejemplo, los segmentos derivados de las diferentes proteínas, o de las regiones no adyacentes de la misma proteína, pueden ser comprobados usando un programa de análisis de secuencia, por ejemplo, el programa BLAST, para determinar si las secuencias aminoacídicas en las uniones de los segmentos muestran inadvertidamente similitudes con las proteínas humanas. Si existe homología, el polipéptido puede ser rediseñado para alterar el orden de los epítopos en el polipéptido para eliminar las regiones de homología. Si un epítopo en particular es idéntico por encima del 75% a una porción de una proteína humana conocida, preferiblemente no es incluido en el polipéptido poliepítopo.

El orden de los segmentos dentro de un polipéptido poliepítopo dado puede corresponder al orden en el que los segmentos aparecen en la proteína nativa, aunque alguna secuencia del aminoácido (es decir, al menos un residuo) entre los segmentos individuales en la proteína nativa puede ser suprimida. Alternativamente, el orden de los segmentos puede diferir del de la proteína que está presente de manera natural. La última disposición es preferible si una alineación natural resulta en un polipéptido que tiene regiones de homología con una proteína humana.

Para los epítopos derivados de HPV, la construcción de ácidos nucleicos preferiblemente no codifica un epítopo que contiene el sitio conocido de unión de la proteína retinoblastoma (Rb) a la proteína E7 de HPV. La construcción puede codificar, por ejemplo, un polipéptido que incluye los segmentos de cada uno de los E6 de HPV 16, E7 de HPV 16, E6 de HPV 18 y las proteínas E7 de HPV 18, donde cada segmento contiene epítopos para la unión con uno o más de los alelos HLA HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 y HLA-A24. Esto corresponde a alrededor de 12-20 epítopos por alelo HLA, para alrededor de 60-100 epítopos en el polipéptido poliepítopo.

Los elementos reguladores pueden ser incluidos en la construcción para facilitar la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido poliepítopo. Estos elementos incluyen las secuencias para potenciar la expresión en las células humanas o de otros mamíferos, por ejemplo, promotores, secuencias de estabilización de ARN 5' y/o 3' en la secuencia codificantes, intrones (que pueden ser colocados en cualquier sitio dentro o adyacentes a la secuencia codificada), y los sitios de adición poli (A), así como un origen de duplicación y uno o más genes que codifican los marcadores seleccionables que permiten que las construcciones se dupliquen y pueden ser seleccionados en los hospedantes procarióticos y/o eucarióticos. Un promotor polimerasa T7 u otro tipo de promotor (por ejemplo, un promotor específico de tejido tal como un promotor específico de musculo, o un promotor específico de célula tal como un promotor APC específico) está presente opcionalmente en el extremo 5' de la secuencia codificante y una secuencia que codifica un FLAG u otro determinante mAb está presente opcionalmente directamente en el extremo 3' del ultimo epítopo que codifica la secuencia. La construcción puede también contener otras señales transcripcionales y traduccionales, tal como una secuencia Kozak.

La construcción puede además incluir una secuencia que codifica una señal diana que dirige el polipéptido poliepítopo a un compartimento intracelular deseado, estando la señal diana unida al polipéptido poliepítopo. Las señales diana pueden dirigir el polipéptido poliepítopo al reticulo endoplásmico (ER), el Golgi, el núcleo, un lisosoma, un compartimento de carga de péptidos de clase II, o un endosoma e incluye péptidos señal (las secuencias de extremos amino que dirigen las proteínas en el ER durante la traducción), los péptidos de retención del ER tal como KDEL (SEQ ID NO:111) y los péptidos de lisosoma de dirección tal como KFERQ (SEQ ID NO:112), QREFK (SEQ ID NO:113), y otros pentapéptidos que tiene el Q flanqueado en un lado por cuatro residuos seleccionados del K, R, D, E, F, I, V y L. También incluidas están las señales diana que dirigen la inserción del polipéptido en una membrana (por ejemplo, una secuencia transmembrana). Los polipéptidos que incluyen una secuencia de inserción de membrana pueden ser construidos o bien con o sin un extremo citoplasmático.

Un ejemplo de una secuencia diana de ER es la secuencia líder HLA-DR\alpha, Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala (SEQ ID NO: 63). La secuencia diana puede incluir sólo una porción (por ejemplo, al menos diez residuos aminoácidos) de esta secuencia de 25 residuos especificada, siempre que la porción sea suficiente para causar la dirección del polipéptido al ER.

Las secuencias de localización nuclear incluyen señales diana nucleares nucleoplasmina y de tipo SV40, como se describe en Chelsky y otros, Mol. Cell Biol 9: 2487, 1989; Robbins, Cell 64: 615, 1991, y Dingwall y otros, TIBS 16: 478, 1991. Algunas secuencias de localización nuclear incluyen AVKRPAATKKAGQAKKK (SEQ ID NO: 114), RPAATKKAGQAKKKKLD (SEQ ID NO: 115) y AVKRPAATKKAGQAKKKLD (SEQ ID NO: 116).

En algunos casos es deseable modificar la secuencia aminoacídica de la señal diana para facilitar el corte por una señal peptidasa u otro agente proteolítico. Las secuencias de reconocimiento para las señales peptidasas como se describe en Von Heijne, Nucleic Acids Research 14: 4683, 1986. Las reglas -3, -1 de von Heijne pueden ser usadas para seleccionar una secuencia que aumenta la probabilidad de éxito de corte por una señal peptidasa cuando la señal diana está presente.

Los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido poliepítopo descritos aquí pueden codificar opcionalmente un residuo de metionina en el extremo amino del polipéptido para facilitar la traducción.

Si se desea, un aminoácido espaciador o una secuencia espaciadora puede ser insertada entre cada par de segmentos. Los espaciadores alanina han sido usados con éxito para separar los epítopos individuales múltiples codificados en una construcción de ADN única (Toes y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 94: 14660-65, 1997).

Los segmentos que contienen epítopos derivados de una proteína única pueden aparecer en el orden (es decir, a partir del extremo amino al extremo carboxi) en el que aparecen en la proteína. Alternativamente, los segmentos de una proteína dada pueden ser colocados en un orden, distinto de en el que aparecen en la proteína nativa, y pueden ser agrupados juntos o mezclados con segmentos de una o más de las otras proteínas. La construcción puede codificar un polipéptido poliepítopo único o polipéptidos poliepítopo múltiples, cada uno bajo el testigo de un promotor diferente, por ejemplo, vectores promotores duales. Un vector promotor dual permite dos polipéptidos poliepítopo más cortos para remplazar la versión más larga única, sin pérdida en el número de los epítopos producidos a partir de un vector dado. También permite la adición de nuevos epítopos sin alteración de la secuencia y quizás el procesamiento del primer polipéptido poliepítopo.

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos poliepítopo pueden ser usados en cualquier vector que permite la expresión en las células presentadoras de antígeno (APC) del paciente. El vector es preferiblemente un vector viral no integrado o es un vector no viral tal como un vector plásmídico o bacteriano. Un ejemplo de un vector adecuado es la familia de los vectores de expresión de mamífero pcDNA (Invitrogen), que permiten la clonación directa y rápida de los productos de PCR. El vector puede ser modificado para incluir los epítopos adicionales, por ejemplo, los epítopos restringidos a MHC de clase I HLA-A1, -2, -3, -11 y 24 a partir de las proteína E6 y E7 de HPV de las cepas HPV 16 y 18.

Para determinar si el polipéptido es procesado y los epítopos deseados están presentes por HLA, un ensayo de estimulación de la célula T in vitro puede ser realizado usando células PBL autólogos o células transformadas por EBV, infectadas con un virus de vacuna recombinante que contiene el polipéptido poliepítopo que codifica la secuencia. Estas células diana son generadas por incubación del PBL con la vacuna recombinante en un m.o.i de 3-10 pfu/célula a 37ºC durante 2 h. Después de la infección, las células son precipitadas, lavadas y usadas como dianas en el ensayo de estimulación in vitro. Las células T estimuladas de uno o más individuos con los alotipos HLA diferentes son incubadas con las células diana y la capacidad de las células diana para estimular las células T es medida, por ejemplo, por la expresión \gamma-interferon o por secreción.

Alternativamente, el procesamiento epítopo del polipéptido poliepítopo puede ser examinado usando proteasomas purificados de las células humanas (Theobald y otros, J. Exp. Med. 188: 1017, 1998; Kisselev y otros, J. Biol. Chem. 289: 3363, 1999; y Nussbaum y otros, Proc. Nat. Acad. Sci (USA) 95: 12404, 1998).

En adición a los ensayos de las células T, un ensayo que utiliza animales transgénicos puede ser usado para verificar que la construcción funciona (por ejemplo, los epítopos son procesados y presentados correctamente) cuando se suministran in vivo. Para medir la presentación restringida HLA-A2, la construcción poliepítopo en un vector de expresión de mamífero (por ejemplo, un plásmido) es encapsulada en microesferas e introducida en ratones transgénicos HLA-A2 por una ruta tal como inyección intramuscular o subcutánea. La construcción puede ser alternativamente administrada sin el excipiente de suministro micro esférico, por ejemplo, en un virus de vacuna recombinante o como un ADN desnudo. Las respuestas de la célula T son subsiguientemente examinadas in vitro (Hedley y otros, Nature Med. 4: 365-68, 1998). Las células diana son células T2A2 (células T2 transfectadas con ADN que codifica el HLA-A2) o las células EL4.A2 (las células EL4 transfectadas con ADN que codifica el HLA-A2) pulsadas con el epítopo A2 que ha sido ensayado y las células T2A2 en las que se ha introducido un ácido nucleico del invento. Estudios paralelos son realizados usando células T2A2 pulsadas sin péptido o con un péptido irrelevante. De este modo, son identificados los epítopos HLA-A2 que son procesados y presentados in vivo siguiendo la administración del ácido nucleico del invento. Un resultado positivo sugiere que el procesamiento del polipéptido poliepítopo se produce como se predice.

El ácido nucleico que codifica el polipéptido poliepítopo, así como el polipéptido poliepítopo mismo, puede ser usado en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de un tumor o una infección con un patógeno (por ejemplo, HPV) o las condiciones asociadas con dicha infección.

El suministro de epítopos y de los ácidos nucleicos que codifican epítopos inmunogénicos

Diversos sistemas de suministro reconocidos en la técnica pueden ser usados para suministrar polipéptidos poliepítopo, o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos poliepítopo, en las células apropiadas. Una ventaja del suministro de ADN de los epítopos antigénicos MHC de clase I restringida es que los epítopos son producidos dentro de la célula diana misma, donde la interacción con una molécula MHC de clase I con la que el epítopo inmunogénico se une es favorecida cinéticamente. Esto está en contraste con los protocoles de vacunas estándar que no dirigen específicamente los epítopos antigénicos a las moléculas MHC intracelulares de modo que los epítopos puedan unirse con las moléculas MHC antes de la presentación de las moléculas MHC en la superficie celular.

Los polipéptidos poliepítopo y los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos poliepítopo pueden ser suministrados en un soporte farmacéuticamente aceptable tal como salino, o como suspensiones coloidales, o como polvos, con o sin diluyentes. Pueden ser "desnudos" o asociados con los excipientes de suministro y suministrados usando los sistemas de suministro conocidos en la técnica, tal como lípidos, liposomas, microesferas, micro partículas o micro cápsulas, partículas de oro, ISCOMS, nanopartículas, polímeros, agentes de condensación, polisacáridos, ácidos poliaminos, dendrímeros, saponinas, QS21, materiales que potencian la adsorción, adyuvantes o ácidos grasos. Los ejemplos de las micro partículas adecuadas son presentados a continuación.

Los polipéptidos poliepítopo, o los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos poliepítopo, pueden ser administrados usando los métodos estándar, por ejemplo, aquellos descritos en Donnelly y otros, J. Imm. Methods 176: 145, 1994 y Vitiello y otros, J. Clin. Invest. 95: 341, 1995 y pueden ser suministrados en los sujetos de cualquier manera conocida en la técnica, por ejemplo, intramuscular, oral, intravenosa, intraarterial, intratecal, intradérmica, intraperitoneal, intranasal, intrapulmonar, intraocular, intravaginal, intrarectal o subcutáneamente. Pueden ser introducidos en el tracto gastrointestinal o en el tracto respiratorio, por ejemplo, por inhalación de una disolución o de un polvo que contiene las micro partículas. La administración puede ser local (por ejemplo, en el cérvix, en la piel u otro sitio de infección HPV) o sistémica.

Es deseado que una dosis de aproximadamente 0,1 a 100 \mumoles del polipéptido, o alrededor de 1 a 2000 \mug de ADN, fuera administrada por kg de peso corporal por dosis. Donde el paciente es un humano adulto, los regímenes de vacunación pueden incluir, por ejemplo, administraciones intramusculares, intravenosas, orales o subcutáneas de 10-1000 \mug de un ADN plásmido cuando se suministra en una micro partícula, o alrededor de 10-2500 \mug, por ejemplo, 100 a 2000, o 500 a 1000 \mug del ADN plásmido desnudo suministrado intramuscular o intradérmicamente, repetidas de 3-6 veces. Desde luego, como es bien conocido en las técnicas medicas, la dosis para cualquiera de los pacientes dados depende de muchos factores, que incluyen el tamaño del paciente, la salud general, el sexo, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular a ser suministrado, el tiempo y la ruta de administración y otros fármacos que son administrados al mismo tiempo. La determinación de la dosis óptima está dentro de las capacidades de un farmaceuta con conocimiento común.

Otros métodos del suministro estándar, por ejemplo, la transferencia biolística o el tratamiento ex vivo, pueden ser también usados. En el tratamiento ex vivo, las células presentadoras de antígenos (APCs) tales como las células dendríticas, las células mononucleares de sangre periférica, o las células de medula espinal pueden ser obtenidas de un paciente o de un donante apropiado y activadas ex vivo con las composiciones inmunogénicas, y luego implantadas o reinfundidas en el paciente.

Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos poliepítopo, o los polipéptidos poliepítopo mismos, pueden ser administrados solos o en combinación con otras terapias conocidas en la técnica, por ejemplo, los regímenes quimioterapéuticos, las radiaciones y la cirugía, para tratar tumores o infecciones, por ejemplo, las infecciones HPV o las enfermedades asociadas con las infecciones HPV. Además, los polipéptidos y los ácidos nucleicos del invento pueden ser administrados en combinación con otros tratamientos diseñados para potenciar las respuestas inmunes, por ejemplo, por coadministración con adyuvantes o citoquinas (o ácidos nucleicos que codifican las citoquinas), tan bien conocidos en la técnica.

Suministro de microesferas

En un método de suministro preferido, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos poliepítopo o los polipéptidos poliepítopo mismos, son suministrados usando microesferas. Las microesferas, incluidas aquellas descritas en el documento de patente Norteamericana No. 5.783,567, pueden ser usadas como excipientes para el suministro de macromoléculas tales como ADN, ARN o polipéptidos en las células. Las microesferas contienen macromoléculas introducidas en una matriz polimérica o encerradas en una cascara vacía de un polímero. Las microesferas sólidas pueden ser también formadas por ejemplo como en el documento de patente WO 95/24929, incorporado aquí por referencia. El término microesfera, como se usa aquí, incluye micropartículas y microcápsulas. Las microesferas actúan para mantener la integridad de las macromoléculas, por ejemplo, manteniendo el ADN encapsulado en un estado no degradado. Las microesferas de un tamaño apropiado o la combinación de tamaños puede ser también usadas para el suministro pulsado de la macromolécula y para el suministro a un sitio específico o a una población de células diana específicas. La matriz polimérica puede ser un polímero biodegradable tal como el poliláctido-co-glicólido (PLG), el poliglicol, polianhídrido, poliortoéster, policaprolactona, polifosfaceno, polímero proteináceo, polipéptido, poliéster, o un polímero que está presente de manera natural tal como un almidón, alginata, chitosan, y gelatina.

Las microesferas pueden incluir también uno o más compuestos estabilizantes (por ejemplo, un carbohidrato, un compuesto catiónico, un plurónico, por ejemplo, Pluronic-F68^{TM} (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO), un lípido o un agente de condensación de ADN). Un compuesto estabilizante es un compuesto que actúa para proteger el ácido nucleico (por ejemplo, para mantenerlo superenrollado o protegido de la degradación) en cualquier momento durante la producción de microesferas o después del suministro in vivo. El compuesto estabilizador puede mantenerse asociado con el ADN después de una liberación posterior a partir del sistema de suministro polimérico.

Los ejemplos de los compuestos estabilizadores incluyen tris (hicroximetilo) aminometano (TRIS), ácido etilenodiaminetetracetilo (EDTA), o una combinación de TRIS y EDTA (TE). Otros compuestos estabilizadores incluyen dextrosa, sacarosa, lactosa, dextrano, trehalosa, ciclodextrina, dextrano sulfato, péptidos catiónicos, plurónicos, por ejemplo, Plurónico-F68^{TM} (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO) y lípidos tales como bromuro hexadecitrimetilamonio. La preparación de las microesferas que contienen los agentes estabilizadores está descrita en el documento de patente USSN 09/266.463.

El lípido puede ser un lípido cargado tal como un lípido catiónico, un lípido aniónico (tal como PEG-DSPE, ácido taurocólico o fosfatidilinositol) o un lípido zwitteriónico, o puede no tener carga. Los ejemplos de los lípidos incluyen cetiltrimetilamonio y fosfolípidos, por ejemplo, fosfatidilcolina. Las microesferas pueden contener uno o más de un tipo de lípidos, por ejemplo, aquellos lípidos presentes en las preparaciones lipídicas de lecitina y pueden incluir también uno o más compuestos estabilizadores como se describe anteriormente.

Las microesferas pueden ser usadas para maximizar la liberación de las moléculas de ADN en las células fagocitóticas de un sujeto. Alternativamente, las microesferas biodegradables pueden ser inyectadas o implantadas en un tejido, donde forman un depósito. Cuando el depósito se rompe, el ácido nucleico es liberado gradualmente durante un tiempo e incorporado por las células vecinas (incluyendo las APCs) como ADN libre.

Suministro usando otros agentes

Los polipéptidos poliepítopo, o los ácidos nucleicos que los codifican, pueden ser también administrados a los sujetos usando otros agentes tal como lípidos, dendrímeros o liposomas usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los liposomas que llevan o bien los polipéptidos inmunogénicos o los ácidos nucleicos que codifican los epítopos inmunogénicos se conoce que provocan respuestas CTL in vivo (Reddy y otros, J. Immunol. 148: 1585, 1992; Collins y otros, J. Immunol. 148: 3336-3341, 1992; Fries y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 358, 1992; Nabel y otros, Proc Natl. Acad. Sci (USA) 89: 5157, 1992).

Los polipéptidos y los ácidos nucleicos del invento pueden ser también administrados mediante el uso de los Complejos de Estimulación Inmune (ISCOMS), que están cargados negativamente, estructuras tipo jaula de 30-40 nm en tamaño formadas espontáneamente en una mezcla de colesterol y Quil A (saponina) o a partir del saponina solo. Los polipéptidos y los ácidos nucleicos del invento pueden ser acomplejos con ISCOMs, y luego administrados o pueden ser administrados separadamente.

La inmunidad protectora ha sido generada en una variedad de modelos experimentales de infección, incluyendo la toxoplasmosis y los tumores inducidos por virus Epstein-Barr, usando ISCOMs como excipiente de suministro para los antígenos (Mowat y otros, Immunology Today 12: 383-385, 1991). Se ha encontrado que dosis del antígeno tan bajas como 1 \mug encapsulado en ISCOMs producen respuestas CTL mediada por clase I, donde o bien la glicoproteína HIV-1-IIIB gp 160 de la envuelta intacta purificada o bien la hemagglutinina influenza son el antígeno (Takahashi y otros, Nature 344: 873-875, 119).

Midiendo las respuestas inmunes

La capacidad de los polipéptidos poliepítopos, o de los ácidos nucleicos que los codifican, para provocar una respuesta inmune en un mamífero hospedante puede ser ensayada usando los métodos para la medida de las respuestas inmune que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la generación de las células T citotóxicas puede ser demostrada en un ensayo de liberación de ^{51}Cr patrón, midiendo la expresión o secreción de citoquina intracelular, o usando tetrámeros MHC. Los ensayos estándar, tal como ELISA o ELISPOT, pueden ser usados para medir los perfiles de citoquinas atribuibles a la activación de la célula T. La proliferación de la célula T puede ser medida usando ensayos tales como la ingesta de ^{3}H-timidina y otros ensayos conocidos en la técnica. Las respuestas de célula B pueden ser medidas usando los ensayos reconocidos en la técnica tales como ELISA.

Otras metodologías, por ejemplo, imagen digital y citológica, colposcopia y evaluaciones histológicas, pueden ser también usadas para evaluar los efectos de los epítopos inmunogénicos y de los ácidos nucleicos que codifican los epítopos inmunogénicos, en las lesiones asociadas a patógenos o en otros niveles virales o patogénicos generalmente.

Los siguientes son ejemplos de la práctica del invento. No han de ser considerados como limitación del alcance del invento de ninguna manera.

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Ejemplo 1 Identificación de los epítopos de unión a MHC de clase I derivados de HPV

Los alelos HLA son aislados de las líneas celulares que expresan un alotipo HLA-A único. De 10-20 litros de cada línea celular (alrededor de 1-2 x 10^{10} células) crecen en un medio RPMI-1640 completo (10% FCS, HEPES, Pen/Strep, aminoácidos esenciales, glutamina) en botellas rodantes, y las células recogidas por centrifugación (10-15 gm células de peso húmedo/10 L de cultivo). Una preparación de membrana es generada lisando las células en Tris 10 mM, DTT 1 mM, PMSF 0,1 mM, durante 30 min. Los restos celulares son precipitados, después de lo cual el lisado aclarado es homogenizado en un tampón de lisis y precipitado de nuevo. El precipitado es homogenizado en un tampón que contiene 4% de NP-40 y ultra centrifugado. El material soluble en detergente es usado para la purificación de HLA.

La preparación de la membrana disoluble es bombeada a través de columnas de prelavado (matriz cromatográfica y matriz de suero de ratón normal) antes de que la proteína/ligando que contiene el residuo sea dirigido a una, o una serie de, columna(s) inmunoafin(es) específica(s). Las columnas de inmunoafinidad que contiene mAb W6/32 anti pan-clase I pueden ser usadas para aislar las moléculas de clase I del alotipo único que expresan las líneas celulares. Alternativamente, el mAb específico de alotipo tal como BB7.2 es usado para extraer un alotipo HLA único (HLA-A2) de un lisado celular que expresa alotipos múltiples. El acoplamiento de mAb a, los sorbentes de perfusión a través de grandes poros, de fuerza alta (revestidos y entrelazados con una fase estacionaria hidrofílica y unida covalentemente a la Proteina A) pueden ser utilizados para seguir los caudales rápidos. Las columnas de inmunoafinidad son luego lavadas extensamente y el complejo de proteína/ligando es eluído del soporte de inmunoafinidad que usa carbonato/0,1% 50 mM DOC/0,05% NaN_{3} a pH 11,5.

La separación por cromatografía líquida de alta resolución multimodal (HPLC) de las células HLA es conseguida por el acoplamiento de los procedimientos cromatográficos en las series con válvulas de cambio automático, que dirigen la proteína/ligando, que contiene el residuo, a las columnas subsiguientes en la secuencia. Cada residuo de columna puede ser monitorizado a múltiples longitudes de onda de UV, presiones y pH.

Los alelos HLA purificados son después usados en los ensayos de competición de unión a epítopo.

La unión por un epítopo putativo es comparada con la unión de los epítopos de unión HLA descritos anteriormente. Ejemplos de epítopos conocidos y de sus alotipos respectivos incluyen: HLA-A1, YLEPAIAKY (SEQ ID NO: 117); HLA-A2, FLPSDYFPSV (SEQ ID NO: 118); HLA-A3, KVFPYALINK (SEQ ID NO: 119); HLA-A11, AVDLYH
FLK (SEQ ID NO: 120); y HLA-A24, AYIDNYNKF (SEQ ID NO: 121). Las condiciones del ensayo general son como siguen: las proteínas de clase I son incubadas en NP-40/PBS 0,05% con 5 nM de epítopo patrón radiomarcado y el epítopo inhibidor de ensayo en presencia de \beta2microglobulina humana 1 \muM, y una mezcla de los inhibidores de proteasas (concentración final de PMSF 1 mM, 1.10 fenaltrolina 1,3 mM, pepstatin 73 \muM, EDTA 8 mM y
N-\alpha-p-tosil-L-lisina clorometil cetona 200 \muM) a 23ºC durante 48 h. La concentración final de cada alotipo HLA es determinada experimentalmente como se explica a continuación. Las concentraciones de los péptidos inhibidores son valoradas en concentraciones que oscilan entre 1 nM a 100 \muM.

Los péptidos libres y unidos son separados por cromatografía de exclusión de tamaño HPLC que usa una columna SEC TSK 2000^{TM} y NP-40/PBS 0,5%. El residuo es monitorizado por radioactividad y la fracción de la unión del péptido al HLA relativa a la cantidad total del péptido ofrecido es calculada a partir de la relación del péptido en el volumen vacío del péptido total recuperado. La concentración final de HLA-A1, -A2, -A3, -A11 y -A24 para ser usada en los ensayos de unión subsiguientes puede ser determinada experimentalmente basada en la eficacia de unión para el péptido patrón radiomarcado. La concentración de proteína necesaria para los estudios de inhibición cae típicamente entre 10-40 nM. Cada alotipo es ensayado para la unión del péptido radiomarcado por la realización de disoluciones serie de la concentración de la proteína desde 1 nM hasta 1 \muM de la molécula HLA al principio del muestreo.

La afinidad de unión de los epítopos peptídicos potenciales a los receptores del antígeno de leucocitos humano (HLA) puede ser estudiada usando ensayos de unión comparativos (Sette y otros, Molecular Immunology 31: 813-822, 1994). Estos ensayos requieren (1) receptores HLA purificados, (2) un péptido sintético que se une al receptor del HLA de interés y que contiene un aminoácido tirosina en una posición que puede ser marcada con yodo 125 radiactiva sin interrumpir la capacidad del péptido para unir, (3) microglobulina beta-2 (\beta_{2}m) purificada, y los epítopos peptídicos sintéticos que tienen que ser ensayados. Las concentraciones del receptor HLA experimental óptimas son establecidas por la valoración de la cantidad del receptor HLA en cada ensayo de unión requerido para conseguir al menos 10% de unión del péptido marcado total (fijado a 5 nM) (la concentración \beta_{2}m está también fijada a 1 \muM). Con esos tres parámetros (la concentración del receptor, \beta_{2}m, y la concentración del péptido radiomarcado) mantenidos constantes, la valoración del péptido de ensayo sin marcar es realizada. Cada reacción de unión es incubada a temperatura ambiente durante 30-80 h para permitir el intercambio de péptidos. La cuantificación del intercambio del péptido es determinada separando la fracción unida al complejo péptido/receptor radiomarcado del exceso de péptido libre y \beta_{2}m mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Usando un sistema HPLC que encaja con un detector radioisótopo, el porcentaje del péptido radiomarcado unido al receptor HLA puede ser cuantificado. La capacidad del péptido de ensayo sin marcar de inhibir la unión del péptido marcado es después puesta en una gráfico como una función de su concentración. La afinidad del péptido de ensayo es presentada como la concentración del péptido de ensayo requerida para inhibir el 50% del total de la unión del péptido radiomarcado (un valor llamado IC-50).

Diversos péptidos derivados de las proteínas E6 y E7 de las cepas del virus del papiloma humano (HPV) 16 y 18 han sido identificadas como, péptido de unión de alta afinidad a HLA usando este tipo de ensayo. En estos experimentos, los receptores HLA A1 y A11 fueron purificados a partir de las células humanas que habían sido transfectadas con los genes HLA-A*0101 y HLA-A*1101, respectivamente (Gorga y otros, J. Biol. Chem. 262: 16087-16094, 1987). En el caso de los receptores HLA A3 y A24, los receptores recombinantes HLA (HLA-A*0301 y HLA-A*2402) fueron usados, los cuales habían sido producidos en E. coli y replegados (Garboczi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3429-3433, 1992). Los ejemplos de las condiciones experimentales y los datos recogidos son presentados en la Tabla 4.

TABLA 4

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Si se desea, el algoritmo de unión predictivo descrito anteriormente puede ser usado para priorizar los epítopos putativos según los tiempos de disociación para cada alelo, con epítopos que tienen el tiempo de disociación más largo ensayados primero. Después de que 5-10 epítopos con afinidades razonables para cada uno de los alelos HLA-A dominantes (es decir, < 500 nM) son identificados, los ensayos pueden ser detenidos. Si no se encuentran epítopos con una afinidad de unión menor de 500 nM, entonces los 5-10 mejores adaptadores de cada proteína pueden ser seleccionados para los análisis siguientes.

Los péptidos pueden ser también identificados, por ejemplo, según los métodos de Parker y otros (J. Immunol. 149: 1896-1904, 1992; J. Immunol. 149: 2580-3587, 1992; J. Biol. Chem. 267: 5451-5459, 1992) y Garboczi y otros (PNAS 89: 3429-3433, 1992).

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Ejemplo 2 Detección de presentación de epítopos restringida a MHC de clase I in vitro

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de voluntarios normales son purificadas mediante centrifugación de densidad con Ficoll-Paque TM (Pharmacia, Piscataway, NJ) a partir de productos de leucoféresis cribada como HIV, HBV, y HCV seronegativos. Las células dendríticas (CD) son generadas en cultivos tisulares a partir de fracciones de PBMC enriquecidos por monocitos como se describe (Tsai y otros, Crit. Rev. Immunol. 18: 65-75, 1998; Wilson y otros, J. Immunol. 162: 3070-78, 1999). 10^{7} PBMC/ml en medio RPMI 1640 libre de suero(Gibco-BRL) son sembrados en frascos e incubados 1,5-2,0 h a 37ºC. Las células no adherentes son eliminadas mediante lavados suaves, y los monocitos adherentes a plástico que contienen precursores de CD son cultivados en medio completo en presencia de 50 ng/ml de GM-CSF y 1000 U/ml de IL-4 (ambos de R&D Systems, Minneapolis MN) durante 6-7 días. El medio completo consiste en RPMI 1640 suplementado con 5% de suero AB humano reunido (C-6 Diagnostics, Mequon, WI), L-glutamina, penicilina/estreptomicina, 2-ME (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) y HEPES (JRH Biosciences, Lenexa, KS) a las concentraciones recomendadas.

Las células no adherentes son recogidas mediante centrifugación y preparadas directamente para su uso con APC o criopreservadas. Se determina que las células son CD mediante morfología y mediante la expresión de un fenotipo CD3/CD16 negativo, MCH de clase I^{hi}, MHC de clase II^{hi}, CD86-positivo como se evalúa mediante citofluorometría.

A día 0, 5x10^{5} PBL no adherentes son sembrados con 2,5 x 10^{4} CD irradiados estimulados mediante un pulso de CD. Las CD están en placas de 48 pocillos en 0,5 ml de medio RPMI-1640 completo con 10% de suero AB humano normal suplementado con 10 ng/ml de IL-7. Las CD son incubadas con los PBL a 37ºC en un incubador de CO_{2}. 10 ng/ml de IL-10 es añadido 24 h más tarde. A día 7, PBL autólogos son descongelados e irradiados. 1x10^{6} células por pocillo son puestas en placas en una placa de 48 pocillos y dejadas que se adhieran durante 2 h. Los epítopos son añadidos, y las células son estimuladas con un pulso durante 2 h. Las células son lavadas una vez, y las que responden son transferidas a pocillos con estimuladores adherentes. 10 ng/ml de IL-10 es añadido 24 h más tarde. 20 U de IL-2/ml son añadidos a día 9 y 100 U/ml de IL-2 a día 11. Las células son reestimuladas a día 15 de la misma manera. A día 22, las células en 1-2 pocillos de cada cultivo individual son cultivadas y contadas. Las que responden son las células que tienen un número celular aumentado 1,5-3 veces más a día 16 del inicio. Los rendimiento de cultivo totales generalmente deberían ser al menos 2x10^{6} células.

Las células a ser usadas como dianas son cultivadas y ajustadas a 6,67 x 10^{5} células/ml en medio. Dos mls de células son estimuladas con un pulso de 50 ug/ml de cada uno de los epítopos apropiados (por ejemplo, Flu M1, Test nº 1, ensayo nº 2, ensayo nº 3, ensayo nº 4). Los efectores son recogidos y resuspendidos a 1x10^{6} células/ml en medio. 100 \mul son colocados en placas en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo.

150 \mul de cada célula diana respectiva es alicuotada al pocillo que contiene las células efectoras apropiadas para un volumen total de 250 \mul/pocillo. Las placas son incubadas durante 24 h en un incubador de CO_{2} a 37ºC.

Los kits ELISA de INF\gamma de ENDOGEN (Woburn, MA) son usados para medir la secreción de INF\gamma. El ensayo es realizado según las instrucciones del fabricante, y los sobrenadantes son ensayados en duplicado. Patrones de INF\gamma de 1000 pg/ml, 400 pg/ml, 160 pg/ml, 64 pg/ml, 25,6 pg/ml, y 0 pg/ml son ensayados en duplicado. La placa de ensayo es leida en un Lector de microplacas Molecular Devices Kinetics y los resultados analizados con un software Vax Plate Reader/SOFTMAX TM.

Las células T2A2 son dianas adecuadas cuando se ensayan los epítopos E6 y E7 de HPV16 y 18 en el ensayo de células T (el péptido HPV 2,4 (SEQ ID Nº: 61) es incluido como un ejemplo de un epítopo HPV de unión a HLA-A2 a ser ensayado de este modo). Sin embargo, cuando se ensayan otros alotipos (por ejemplo HLA-A1, -A3, -A11 y -A24), las células T2A2 no son APCs apropiadas, y el epítopo FluM1 no es un epítopo testigo positivo apropiado. Dianas apropiadas son células EBV transformadas de modo autólogo o PBL. Epítopos testigos apropiados para estos otros alotipos incluyen los siguientes: HLA-A1, Flu NP 44-52; HLA-A3, Flu NP 265-273; HLA-A11, EBNA3 603-611 y EBNA4 416-424; HLA-A24, EBV LMP 419-427. Testigos de inmunización in vitro adecuados incluyen HLA-A1, MAGE1 61-69; HLA-A2, HBV pol 455-463; HLA-A3, P. Falciparum LSA-1 94-102; HLA-A11, HIV gag 325-333; y HLA-A24, Hiv gp 41 584-591.

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Ejemplo 3 Generación de linfocitos T citotóxicos específicos de péptido primarios in vitro usando células dendríticas pulsadas con péptidos

La efectividad de diversos péptidos derivados de HPV en generar respuestas CTL fue determinada cocultivando células dendríticas (CD) pulsadas por un péptido con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes que tienen alotipos HLA definidos. Los péptidos ensayados incluyen péptidos que tienen secuencias aminoacídicas correspondientes a la siguientes secuencias de aminoácidos de la proteína HPV: cepa HPV 16 E7 89-97 (SEQ ID Nº: 96); cepa HPV 16 E6 92-101 (SEQ ID Nº 77); cepa HPV 18 E7 59-67 (SEQ ID Nº: 122); E6 13-21 de la cepa HPV 18 (SEQ ID Nº: 124), y E6 97-106 de la cepa HPV 18 (SEQ ID Nº: 125).

Las respuestas de las células T primero fueron iniciadas usando una modificación de los protocolos publicados (Tsair y otros, Crit Rev. Immunol. 18: 65-75, 1998; Wilson y otros. J. Immunol. 162: 3070-78, 1999). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron purificadas a partir de productos de leucoforesis a partir de donantes normales definidos por HLA-A que fueron determinados como seronegativos en lo que respecta al virus de la inmunodeficiencia humana y al virus de la hepatitis B. Las células dendríticas (CD) fueron pulsadas durante 2 h a 20ºC con 20 \mug/ml en tampón fosfato salino suplementado con 3 \mug/ml de microglobulina y fueron irradiadas (3000 rad) antes de su uso. 2x10^{5} CD pulsadas con péptido y lavadas fueron cocultivadas con 2x10^{6} PBMC autólogos no adherentes en placas de cultivo de 24 pocillos en presencia de 10 ng/ml de IL-7. Un día después, los cultivos fueron suplementados con 10 ng/ml de IL-10. A días 7 y 14, los cultivos individuales fueron restimulados mediante la transferencia de células PBMC no adherentes que respondieron sobre monocitos autólogos irradiados pulsados con péptidos 20 \mug/ml como se describen anteriormente. 10 ng/ml de Il-10 y 100 U/ml de IL-2 fueron añadidos 1 y 2 días, respectivamente, tras cada ciclo de reestimulación.

La reactividad inmune de los cultivos de PBMC fue evaluada mediante su capacidad para generar una secreción de INF\gamma específica de los cultivos que responden al péptido a día 21 tras su incubación con células presentadoras de antígenos pulsadas bien con el péptido inmunizante o bien con un péptido antigénico irrelevante que se une específicamente a la misma molécula diana HLA de clase 1. 10^{5} células efectoras fueron incubadas con 10^{5} PBMC autólogos, pulsados con un péptido irradiado durante 24 h a 37ºC en 200 \mul de medio completo. Los sobrenadantes de estos cultivos fueron medidos en lo que respecta a la secreción de INF\gamma usando un ensayo ELISA comercial. Los resultados son mostrados en la Tabla 5. Los datos son presentados como picogramos de INF-\gamma/ml. La reactividad específica por un cultivo de PBMC fue definida arbitrariamente como al menos 20 pg/ml por cultivo de ensayo y una diferencia de 1,5 veces o superior de la secreción de IFN-\gamma en respuesta al pulso con un péptido de ensayo versus las células estimuladoras pulsadas con un péptido irrelevante. FluM1 58-66 y los epítopos peptídicos de CTL EBNA4 416-424 fueron usados como testigos irrelevantes A2 y A11, respectivamente.

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TABLA 5 Inducción in vitro de linfocitos T citotóxicos primarios específicos de péptido usando células dendríticas pulsadas con péptido

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Ejemplo 4 Generación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido poliepítopo

Una vez que los epítopos candidatos han sido identificados, se genera un fragmento de ADN que codifica los epítopos de interés. Las secuencias que codifican los epítopos son generadas mediante PCR solapantes o mediante ligación de oligonucleótidos. Los elemento reguladores incluyen un promotor, una secuencia Kozak, un ATG iniciador, un codon stop, un intrón y secuencias de poliadenilación son incluidas en la construcción.

Un promotor T7 de polimerasa está también presente en el extremo 5' de las secuencias codificantes, y una secuencia que codifica un mAb FLAG (u otros) determinantes pueden estar presentes bien directamente 5' de la primera secuencia codificante del epítopo o 3' de la última secuencia codificante del epítopo. Las construcciones con y sin una señal diana (por ejemplo, un péptido líder o secuencia diana de vesículas de carga endosomales/clase II) son creadas. Las reglas -3, -1 de von Jeijne (Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690, 1986) son seguidas para asegurarse la probabilidad de corte con éxito mediante la peptidasa señal cuando el péptido líder está presente.

El fragmento de PCR es clonado en un vector TA (Invitrogen) que permite un clonaje directo y rápido de los productos de PCR. La construcción es secuenciada, y si se han incorporado errores, la PCR es repetida en condiciones más rigurosas o sino optimizadas. El clon de PCR, o alternativamente el ADN producido mediante ligación de oligonucleótidos, es entonces clonado en un vector de expresión de mamíferos tales como p3K o pcDNA (Invitrogen). Además, el fragmento es clonado en un vector vaccinia (tal como pSC11) para la generación de virus de vaccinia recombinante (véase a continuación) y un vector de expresión bacteriano (tal como pGEX-5x (Pharmacia)) que permite la expresión de una proteína de fusión GST del vector de expresión de levadura o de baculovirus del polipéptido poliepítopo. La transcripción/traducción in vitro (los kits de Promega T7 TNT acoplados de transcripción/traducción) es realizada según las instrucciones del fabricante. La proteína traducida, cuando se ha analizado por SDS-PAGE y por autorradiografía, ha sido mostrada que produce un polipéptido del tamaño esperado.

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Ejemplo 5 Identificación de los epítopos procesados de las proteínas poliepítopo

El ensayo de estimulación de células T descrito en el Ejemplo 2 es usado para determinar qué epítopos son procesados del polipéptido poliepítopo codificado por la construcción. Los efectores generados de PBL estimulados in vitro con cada uno de los epítopos codificados e la construcción son ensayados en lo que respecta a la secreción de INF\gamma cuando son incubados con las dianas apropiadas. Las dianas pueden ser células PBL autólogas o células transformadas por EBV infectadas con un virus vaccinia recombinante que codifica el polipéptido poliepítopo (con y sin secuencia líder). El procesamiento de los polipéptidos poliepítopo liberados de los epítopos de células T, que son presentados subsiguientemente en la superficie de las células diana.

La vaccinia recombinante fue producida mediante procedimientos estándar insertando la construcción que codifica el polipéptido poliepítopo en el sitio SmaI del vector pSC11 (Chakrabarti y otros, Mol. Cell. Biol. 5: 3404-09, 1985) y generando después vaccinia recombinante mediante métodos conocidos en la técnica.

Para determinar si el polipéptido poliepítopo codificado es procesado y los epítopos esperados son presentados por moléculas HLA, el ensayo de estimulación in vitro pueden ser realizados como se describe en el Ejemplo 2, con la excepción de que las dianas son APCs tranformadas con EBV autólogo infectadas con el virus vaccinia recombinante que contiene las secuencia codificantes poliepítopo. En el experimento ilustrado en la Fig. 3, las APC tranformadas por EBV a partir de un donante fueron infectadas con virus vaccinia recombinante que codifica el péptido de ensayo 16E7 44-52, a un m.o.i. de 5 pfu. Las células testigo fueron infectadas con virus vaccinia salvaje. Las células fueron incubadas con el virus durante 2,5 h en presencia de ^{51}Cr. Tras el lavado, las células diana infectadas por vaccinia fueron puestas en contacto durante 5 h con células T previamente activadas con 16E7 44-52. Liberación de ^{51}Cr en el sobrenadante fue tomada como medida de lisis de células diana mediante las células efectoras. Como se muestra en la Fig. 3, las células diana infectadas con un vector vaccinia que codifica el péptido de ensayo fueron más eficientemente lisadas mediante células efectoras que fueron las células diana testigo, sugiriendo que el péptido fue expresado en las células y presentadas de modo eficaz mediante las moléculas HLA de las células.

En su lugar, las dianas pueden ser PBL infectados con el virus recombinante, o células 7221 que expresan un HAL único y que son transfectadas con la construcción p3k o pcDNA (o cualquier vector de expresión de mamífero) que codifica el polipéptido poliepítopo.

Los animales transgénicos HLA-A2 pueden ser usados para verifica que la construcción funciona para generar epítopos HLA-A2 cuando son suministrados in vivo. La construcción que codifica para el polipéptido poliepítopo en el vector de expresión del mamífero es encapsulada en micropartículas. Se inyectada en ratones transgénicos para HLA-A2, y las respuestas de las células T son examinadas subsiguientemente como se describen previamente (Hedley y otros, Naure Med. 4: 365-68, 1998). Alternativamente, el vector de expresión puede ser suministrado como ADN desnudo. Las células diana son células que expresan HLA-2 (por ejemplo, células T2A2 o EL4-A2) pulsadas con el epítopo que se une a HLA-A2 que es ensayado, y células similares infectadas con el vector vaccinia que codifica el poliepítopo. De esta manera los epítopos HLA-A2 que son procesados y presentado in vivo tras la administración de la construcción son identificados. Los resultados positivos indican que el procesamiento del polipéptido poliepítopo está presente como se predice, pero no distingue sin embargo entre los epítopos presentado por las moléculas MHC murinas endógenas del ratón y las presentadas por las moléculas HLA-A2 derivadas del transgén. La inmunización de los ratones transgénicos con un plásmido que codifica un polipéptido poliepítopo que contiene un número de epítopos derivados de HPV, algunos de los cuales son conocidos mediante la unión de HLA-A2 y al menos uno de los que se conoce que unen a una molécula MHC murina endógena, fue mostrado que produce una respuesta inmune frente a dos epítopos, incluyendo el que se conoce que se une a la molécula MHC murina.

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Ejemplo 6 Respuestas CTL generadas en ratones transgénicos para HLA-A2 inmunizados por ADN

Las respuestas CTL fueron medidas en ratones inmunizados con ADN encapsulado en microesferas que codifican un polipéptido poliepítopo. El ADN usado para la inmunización fue designado HPV cra 16/18 (secuencia nucleotídica, que codifica el polipéptido de la SEQ ID Nº: 160). Las células efectoras generadas en ratones inmunizados por ADN fueron ensayadas in vitro en lo que respecta a su respuesta en presencia de células diana infectadas con el virus vaccinia que codifican un polipéptido poliepítopo. Dos construcciones poliepítopo fueron evaluadas separadamente en células diana: (1) HPV Dra 16/18 (secuencia aminoacídica de SEQ ID Nº: 160 y (2) HPV 16/18 (secuencia aminoacídica de SEQ ID Nº: 158).

Los ratones de línea 6 HLA-A *0201/H-2K^{b} transgénicos (C57BL/6 x B10.D2) originada a partir de la colonia parental en la Clínica Scripps del Instituto de Investigación y fueron mantenidas en condiciones convencionales limpias. Los ratones *0201/H-2K^{b} transgénicos para HLA-A fueron inyectados intramuscularmente en las extremidades traseras con 30 \mug de ADN p3KHPVDra 16/18 encapsulado en microesferas PEG-DSPE. Los ratones fueron inyectados a día 30 y 48 con 50 \mug de p3KHPVDra 16/18 encapsulado en microesferas PEG-DSPE.

A día 64, los ratones fueron sacrificados y se tomaron sus bazos. Se preparó una suspensión de célula única, las células juntadas, las células rojas de la sangre lisadas, y la población de células enriquecidas para CD3+ obtenidas usando una columna de inmunoafinidad (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los bazos fueron reestimulados in vitro con blastos de células B estimuladas con lipopolisacárido (LPS) singénicos de tres días irradiados (relación 1:1) que han sido preincubados durante dos horas a 37º con 100 \muM de péptido en RPMI 1610 (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Los péptidos usados para la expansión in vitro fueron: (1) HPV16E648-56 (péptido 124: EVYDFAFRD; SEQ ID Nº:161; y (2) HPV16E786-93 (péptido 272; TLGIVCPI; SEQ ID Nº: 61). Los péptidos fueron disueltos en 100% DMSO a 20 mg/ml y almacenados a -20ºC hasta su uso. En cada pocillo de una placa de 6 pocillos 10^{5} efectores fueron puestos en placas en RPMI 1610 suplementado con 10% de suero bovino fetal (JRH Biosciences, Lenexa, KS), antibióticos (50 IU/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina), HEPES (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 30 \muM de 2-ME (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) con la concentración del péptido final de 10 \muM. A día 65, 10 IU/ml de mIL-2 fueron añadidos. Los efectores fueron recogidos a día 71 y ensayados con respecto a las respuestas específicas de péptido midiendo la liberación de INF-\gamma en un ensayo ELISPOT, como se describe a continuación.

La línea celular diana usada en estos experimentos, una línea celular EL4 HLA-A2/H-2Kb, fue generada transfectando células EL4 (C57BL/6 timoma, H-2b) con un plásmido pSV2 que contiene la construcción quimera HLA-A2.1 (dominio a1 y a2)/H-2Kb (dominio a3) y cotransfectando con el plásmido pSV2 neo que contiene el gen de resistencia a neomicina.

Dos vectores vaccinia recombinantes (vVac), Vac HPV Dra 16/18 y Vac HPV 16/18, fueron generados mediante la inserción de bien las construcciones pSC11 HPV Dra 16/18 o bien pSC1 HPV 16/18 en el gen de timidina quinasa del virus vaccinia salvaje (una cepa de Western Reserve adaptada a TC; ATCC Nº VR 1354). El virus recombinante resultante sufrió tres ciclos de cribado usando una selecciona dual con BrdU (inactivación de la actividad timidina quinasa) y X-gal (actividad pSC11 LacZ) en células hospedantes con un fenotipo TK- (143B, ATCC CRL-8303). Las dianas infectadas (células EL4 HLA-A2/H-2Kb) fueron generadas con 10 MOI rVac a 37ºC durante seis horas.

Un kit ELISPOT de IFN-\gamma murino preparado comercialmente (R&D Systems, Minneapolis, MN) fue utilizado según el protocolo sugerido por el fabricante. Cada pocillo de placa de 96 pocillos recubierta de una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) hidrofóbica fue preabsorbida con un anticuerpo monoclonal (mAb) anti IFN-\gamma y bloqueado con 10% RPMI durante 20 minutos. Aproximadamente 10^{4}-10^{5} efectores fueron entonces mezclado con 10^{5} dianas (células EL4 HLA-A2/H-2Kb infectadas con vaccinia) durante 18-20 horas a 37ºC en 5% CO_{2}. A continuación, cada pocillo fue lavado cuatro veces e incubado toda la noche a 4ºC con un mAb anti IFN\gamma no competitivo biotinilado. Los pocillos fueron entonces lavados tres veces, incubados durante dos horas a temperatura ambiente con fosfatasa alcalina estreptavidina, lavado de nuevo tres veces y revelado con una incubación de 30 minutos con BCIP/NBT y lavada extensamente con agua destilada. Las células que secretan IFN-\gamma (manchas(fueron enumeradas en un sistema lector ELISPOT automatizado (Carl Zeiss Inc. Thornwood, NY) con software KS ELISPOT 4.2 por Zellnet Consulting, Inc. (Nueva York, NY).

Como se muestra en la Figura 6, la inmunización de los ratones con ADN que codifica una construcción poliepítopo HPV generó CTLs específicos de péptido. Los datos presentados como la medida de manchas IFN-\gamma^{+} y representan la respuesta específica de antígeno por millón de células CD3^{+}.

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Ejemplo 7 Respuestas CTL en células de bazo frescas de ratones tratados con un ADN que codifica un polipéptido poliepítopo

Los ratones transgénicos HLA-A *0201/H-2KB (descritos en el Ejemplo 6) fueron sujetos secuencialmente a: (1) una inyección de ADN encapsulado en microsferas que codifica un polipéptido poliepítopo; y (2) una infección con virus de vaccinia que codifica el polipéptido poliepítopo. El ensayo IFN-\gamma ELISPOT descrito en el Ejemplo 6 fue usado para detectar y enumerar las células T específicas para epítopos de CTL codificados por ADN en células de bazo frescas, no expandidas.

El régimen del tratamiento fue como sigue (véase Tabla 6). Ratones de diez semanas fueron inyectados con microesferas PEG/DSPE que contiene 100 \mug de ADN. Veintiseis días después de la inyección de la microsfera, los ratones fueron infectados intraperitonealmente con 1x10^{7} unidades formadoras de placas del virus vacuna que codifican el mismo polipéptido poliepítopo.

TABLA 6 Calendario de Vacunación y régimen de inmunización

12

Nueve días después de la inyección de la vacuna, los bazos fueron recogidos, las células T CD3+ fueron enriquecidas (columnas de enriquecimiento de células T; R&D Systems, Minneapoils, MN), y liberación de IFN-\gamma específica de péptido fue detectada usando un ELISPOT de IFN-\gamma murino (R&D Systems, Minneapoils, MN). Para cada tratamiento antigénico, cinco pocillos de 2,5x10^{5} células de bazo enriquecidas de células T fueron coincubadas con 2x10^{5} células estimuladoras EL4-A2/Kb que fueron bien no tratadas o prepulsadas con epítopos peptídicos de clase I definidos. Como testigos, las células de bazo fueron también incubadas con estimuladores bien: (1) infectadas con 20 moi de virus vaccinia salvaje; o (2) tratadas con 25 \mug de Con A/ml. Las placas fueron incubadas a 37ºC en 10% CO_{2} durante 48 horas y después reveladas para la detección de IFN-\gamma. Las respuestas IFN-\gamma específicas de HPV fueron documentadas como el número de células formadoras de manchas (SCF)/1x10^{6} esplenocitos enriquecidos en células T suministradas. (el valor absoluto de SFCs son mostrados en la Tabla 7). La tasa de valor de fondo de la secreción de IFN-\gamma fue definida como SFC/1x10^{6} esplenocitos enriquecidos en células T suministradas incubados con células estimuladores pulsadas con un péptido irrelevante (epítopo cp36 de Plasmodium falciparum restringido a HLA-A2; lote Nº 322). Las respuestas específicas a péptido HPV fueron consideradas positivas si eran dos veces el valor de fondo. La frecuencia de SFC específicas para cp36/1x10^{6} células fue 0, 0 y 12 para los grupos 0, 1, y 2, respectivamente.

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TABLA 7 Respuestas IFN-\gamma en células de bazo recién aisladas

14

Otras realizaciones

Mientras que el invento ha sido descrito conjuntamente con la descripción detallada de la misma, la descripción precedente pretende ilustrar y no limitar el alcance del invento, que se define por el alcance de las reivindicaciones anexas.

<110> Eisai corporation of North America.

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<120> ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN POLIPÉPTIDOS POLIEPÍTOPE

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<130> 27.20.77866

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<140> PCT/US00/25559

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<141> 2000-09-18

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<150> US 09/398.534

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<151> 1999-09-16

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<150> US 60/154.665

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<151> 1999-09-16

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<150> US 09/458.173

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<151> 1999-12-09

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<150> US 60/169.846

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<151> 1999-12-09

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<160> 161

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<170> FastSEQ para windows, versión 4.0

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<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip1cm16

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<210> 2

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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\hskip1cm17

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\hskip1cm18

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<210> 4

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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<210> 6

<Z11> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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<210> 7

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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<210> 8

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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\hskip1cm23

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<210> 9

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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<210> 10

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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<210> 11

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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<210> 12

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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<210> 13

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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\hskip1cm1002

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<210> 14

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

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<210> 15

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

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<210> 16

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

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<210> 17

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

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<210> 18

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 18

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<210> 19

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 19

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<210> 20

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 20

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<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm32

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<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

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\hskip1cm33

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<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

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\hskip1cm34

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm35

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<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm36

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<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 28

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\hskip1cm37

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<210> 29

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm38

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<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm39

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

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<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 33

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\hskip1cm42

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

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\hskip1cm44

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

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\hskip1cm45

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<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

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<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm48

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<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm49

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<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm51

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm52

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm54

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<210> 46

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<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm55

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm56

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm57

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm58

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm59

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm60

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm62

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> S

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm76

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

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\hskip1cm78

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm79

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

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\hskip1cm80

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

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\hskip1cm81

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm82

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

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\hskip1cm83

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

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\hskip1cm84

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

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\hskip1cm85

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

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\hskip1cm86

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

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\hskip1cm87

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

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\hskip1cm88

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

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\hskip1cm89

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<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

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\hskip1cm90

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm91

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm92

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

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<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

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\hskip1cm93

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm94

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm95

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm96

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm97

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

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\hskip1cm98

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<210> 90

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

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\hskip1cm99

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm100

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

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\hskip1cm103

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm104

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm106

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm107

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

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\hskip1cm108

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm109

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

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\hskip1cm113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del Papiloma humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

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\hskip1cm123

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<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

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\hskip1cm124

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 117

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<210> 119

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 120

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<210> 121

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<400> 122

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<210> 123

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<210> 124

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<400> 124

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<210> 125

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

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<210> 126

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<211> 117

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<212> PRT

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<220>

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<223> Secuencia de fusión artificial

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<400> 126

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135

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<210> 127

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<400> 127

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<212> PRT

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<400> 128

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<210> 129

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

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<210> 130

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<211> 10

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<212> PRT

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<400> 142

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<210> 143

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<400> 143

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<213> Virus del Papiloma humano

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<400> 148

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<400> 149

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<213> Virus del Papiloma humano

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<212> PRT

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de fusión artificial

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<400> 157

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166

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<210> 158

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<211> 237

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de fusión artificial

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<400> 158

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167

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<210> 159

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<211> 119

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de fusión artificial

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<400> 159

168

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<210> 160

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<211> 261

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de fusión artificial

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<400> 160

169

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<210> 161

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Virus del Papiloma humano

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<400> 161

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\hskip1cm170

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Claims

1. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido híbrido cuya secuencia comprende una secuencia señal y

(i): los siguientes segmentos de la cepa 16 E6 del virus del papiloma humano (HPV):

: AMFQDPQERPRKLPQLCTEL (SEQ ID Nº: 64),

: LLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPY (SEQ ID Nº: 65), y

: KISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNK (SEQ ID Nº: 66),

(ii): los siguiente segmentos de la cepa 16 H7 de HPV:

: TLHEYMLDLQPETTDLYSY (SEQ ID Nº: 67),

: QAEPDRAHYNIVTF (SEQ ID Nº: 68), y

: LLMGTLGIVCPICSQKP (SEQ ID Nº 69);

(iii): los siguiente segmentos de la cepa 18 E6 de HPV:

: RRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFK (SEQ ID Nº: 152), y

: SVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQK (SEQ ID Nº: 153), y

(iv): los siguientes segmentos de la cepa 18 E7 de HPV:

: KATLQDIVLHLEPQNEIPV (SEQ ID Nº: 154),

: HTMLCMCCKCEARI (SEQ ID Nº: 155), y

: AFQQLFLNTLSFVCPWC (SEQ ID Nº: 156),

Siempre que el polipéptido híbrido no comprenda una secuencia idéntica a la secuencia de bien la proteína E6 entera, intacta o bien E7 entera, intacta de la cepa 16 ó 18 de HPV.

2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que la secuencia señal es la secuencia líder de HLA-Dra (SEQ ID nº: 63).

3. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que el polipéptido híbrido comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº: 157.

4. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que el polipéptido híbrido comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº: 160.

5. Un plásmido o vector viral que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Una microesfera que comprende una matriz o cubierta polimérica y el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. La microesfera de la reivindicación 6, en la que la matriz polimérica o cubierta consiste esencialmente en un polímero de ácido poli-co-glicólico (PLGA).

8. Una composición terapéutica que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. La composición de la reivindicación 8, incluyendo además un adyuvante.

10. Un liposoma que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

11. El polipéptido híbrido que codifica el ácido nucleido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el plásmido o vector viral de la reivindicación 5, la microesfera de la reivindicación 6 ó 7, la composición terapéutica de la reivindicación 8 ó 9, o el liposoma de la reivindicación 10 para su uso como medicamento.

13. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el plásmido o vector viral de la reivindicación 5, la microesfera de la reivindicación 6 ó 7; la composición terapéutica de la reivindicación 8 ó 9, o el liposoma de la reivindicación 10 para su uso en desencadenar una respuesta inmune en un mamífero.

14. El uso del ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el plásmido o vector viral de la reivindicación 5, la microesfera de la reivindicación 6 ó 7; la composición terapéutica de la reivindicación 8 ó 9, o el liposoma de la reivindicación 10 para la fabricación de un medicamento para desencadenar una respuesta inmune en un mamífero.

15. El ácido nucleico, plásmido o vector viral, microesfera, composición terapéutica o liposoma para su uso según la reivindicación 13 o el uso de la reivindicación 14, en el que el mamífero es un humano.

16. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el plásmido o vector viral de la reivindicación 5, la microesfera de la reivindicación 6 ó 7; la composición terapéutica de la reivindicación 8 ó 9, o el liposoma de la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento o prevención del condiloma exofítico, condiloma plano, cáncer cervical, papiloma respiratorio, papiloma conjuntival, infección por HPV del tracto genital, displasia cervical, lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado, o infecciones HPV anales.

17. El uso del ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el plásmido o vector viral de la reivindicación 5, la microesfera de la reivindicación 6 ó 7, la composición terapéutica de la reivindicación 8 ó 9, o el liposoma de la reivindicación 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención del condiloma exofítico, condiloma plano, cáncer cervical, papiloma respiratorio, papiloma conjuntival, infección por HPV del tracto genital, displasia cervical, lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado, o infecciones HPV anales.

18. El ácido nucleico, plásmido o vector viral, microesfera, composición terapéutica o liposoma para su uso según la reivindicación 15 o 16 o el uso de la reivindicación 15 ó 17, en el que el medicamento es formulado para la administración directa al tejido mucoso.

19. El ácido nucleico, plásmido o vector viral, microesfera, composición terapéutica o liposoma para su uso según la reivindicación 18 o el uso de la reivindicación 18, en el que el tejido de la mucosa es tejido vaginal o anal.

20. El ácido nucleico, plásmido o vector viral, microesfera, composición terapéutica o liposoma para su uso según la reivindicación 15 ó 16 o el uso de la reivindicación 15 o 17, en el que el medicamento es formulado para su administración subcutánea o intramuscular.