CN110035765B - 新型hpv16非hla限制性t细胞疫苗、组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新型人类乳头瘤病毒免疫原性组合物及其使用方法。所述组合物包括多表位肽序列的独特组合，所述多表位肽序列被具体的选择和设计为被有效加工和交叉提呈至T细胞。所述组合物中所采用的肽表现出与HLA超型（HLA‑supertypes）高水平结合。所述免疫原性组合物可广泛的适用于大部分的目标人群。所述组合物包括佐剂，例如阳离子脂质。

Description

新型HPV16非HLA限制性T细胞疫苗、组合物及其使用方法

技术领域

本发明的具体实施方式总体涉及新型HPV16疫苗，具体的涉及非HLA限制性T细胞疫苗、组合物及其使用方法。

背景技术

利用HPV E6和E7蛋白抗原进行治疗性疫苗接种已经证明其在治疗HPV诱发的癌症(如宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌和头颈癌)以及癌前瘤样病变中的高度可能性。由于进行抗原交叉提呈以诱发HPV特异性T细胞应答的能力有限，HPV治疗性疫苗接种的最早方法取决于单个CD8+短肽表位的参与和提呈。即使是在经评估的被选定HLA-A2人群中，这些基于肽的HPV疫苗由于HLA-A2表位的限制性展示出非常有限的适用性。克服该癌症疫苗重大缺陷的更近的方法集中在两个关键方法或平台上：1. 被编码进入生物载体(如改良病毒和细菌)的HPV全长蛋白DNA的递送；2. 覆盖整个全长HPV16 E6和E7蛋白质序列的多个重叠长多表位肽的使用。这两个方法的研究方向都是克服使用短的单表位HLA-A2肽所面临的患者基因限制，从而处理广大患者人群，这两个方法在人类临床试验中都显示了潜在的希望。

计算机模拟的肽结合分析已经被有效地用于理解免疫原性肽的潜在结合能力。但该技术尚未被更高效的用于设计特性简单但仍可能用于解决具有各种基因背景的广大患者人群的需求的癌症疫苗。

T细胞介导一系列免疫响应，包括负责清除细胞间病原体、被病毒感染的细胞和肿瘤细胞的免疫响应以及负责移植排斥和自身免疫的免疫响应。T细胞免疫系统适于识别陌生细胞以及变化的自体细胞并将它们从身体里清除。T细胞对肽抗原的识别是通过T细胞受体(TCR)进行的。该过程要求由位于抗原提呈细胞(APC)-例如树突细胞-的表面的主要组织相容性复合体(MHC)分子将肽抗原提呈至TCR。人类MHC分子被称为人类组织相容性白细胞抗原(HLA)。肽抗原与MHC分子相连，其相连的方式使得T细胞受体能够识别由MHC分子和具体肽的组合形成的独特结构。T细胞功能性的限制性方面在于MHC分子中的多态性以及可与MHC相结合的独特肽的范围过宽，从而导致了多样化的识别模式使得给定MHC-肽组合仅可由一小部分T细胞克隆识别。

有两种主要类型的MHC分子涉及抗原提呈：I类和II类。MHC I类分子由带有3个区的alpha链以及跨膜区和胞浆区组成。MHC I类分子广泛的分布和存在于所有有核细胞上。MHC II类分子由自我结合形成异质二聚体的alpha链和beta链组成。每个链具有两个胞外区以及跨膜区和胞内区。MHC II类分子的分布比I类分子更加有限，并存在例如抗原提呈细胞(APCs)上。

已经针对特定抗原被特异性激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)能够杀死含有或表达所述抗原的细胞。CTL的TCR在MHC I类分子环境中识别抗原。辅助性T淋巴细胞(Th细胞)的重要作用是CTL响应的最佳诱导，它们也可以在维持CTL记忆中起作用。Th细胞的TCR在MHC II类分子环境中识别抗原。

对初始抗原识别T细胞的治疗性疫苗接种已经被证明是旨在通过激活患者免疫系统来治疗早期和晚期疾病的主动式癌症免疫疗法的可行选项。通过治疗性疫苗接种激活的各种机能特异性的攻击和摧毁抗原表达癌细胞并忽略正常细胞。治疗性癌症疫苗原则上可以有效的抑制肿瘤生长并治疗常规疗法(如手术、放疗和化疗)束手无策的复发肿瘤。治疗前列腺癌的治疗性癌症疫苗已经被美国食品和药物管理局批准。这一重大突破为可以提供改善的安全性和疗效的治疗性疫苗的新方法铺平了道路。数个此类方法正被进行临床前和临床评估。与一般对健康个人施用的预防性抗体诱导疫苗不同，治疗性癌症疫苗是对癌症患者施用的并被设计为通过增强患者自身免疫响应-具体是指T细胞响应-来根除癌细胞(Lollini PL, Cavallo F, Nanni P, Forni G. Vaccines for tumour prevention.Nature reviews. Cancer. 2006;6:204–216)。

以肿瘤相关抗原为治疗目标

基于来自限定的肿瘤相关抗原(TAAs)的蛋白质的重组疫苗或衍生自TAAs的合成肽疫苗通常与佐剂或免疫调节剂组合施用，这些疫苗相较于自体疫苗和DC疫苗显示出在成本和简单性方面的显著优势。患者样本或试样的可用性以及制备个性化疫苗的复杂过程限制了自体癌症疫苗的广泛应用。MAGE-1是被报告为编码被T细胞识别的人类肿瘤抗原的第一种基因(van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, Van den Eynde B, Knuth A, Boon T. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science. 1991;254:1643–1647)，并且已经被充分研究和应用于临床癌症疫苗。对数种TAA的识别已经提供了开发和设计各种靶向治疗性疫苗以解决大范围癌症的能力。此类TAA已经被划分为数个主要类别。肿瘤-睾丸抗原，例如NY-ESO-1、BAGE、MAGE和SSX-2，被在成人组织内一般保持沉默但在肿瘤细胞中被转录重新激活的基因所编码(De Smet C, Lurquin C, van der Bruggen P, De Plaen E, Brasseur F, Boon T. Sequence and expression pattern of the human MAGE2 gene. Immunogenetics. 1994;39:121–129; Gnjatic S, Ritter E, Buchler MW, Giese NA, Brors B, Frei C, Murray A, Halama N, Zornig I, Chen YT, Andrews C, Ritter G, Old LJ, Odunsi K, Jager D. Seromic profiling of ovarian and pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010;107:5088–5093; Hofmann O, Caballero OL, Stevenson BJ, Chen YT, Cohen T, Chua R, Maher CA, Panji S, Schaefer U, Kruger A, Lehvaslaiho M, Carninci P, Hayashizaki Y, Jongeneel CV, Simpson AJ, Old LJ, Hide W. Genome- wide analysis of cancer/testis gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008;105:20422–20427; Karbach J, Neumann A, Atmaca A, Wahle C, Brand K, von Boehmer L, Knuth A, Bender A, Ritter G, Old LJ, Jager E. Efficient in vivo priming by vaccination with recombinant NY-ESO-1 protein and CpG in antigen naive prostate cancer patients. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2011;17:861–870)。组织分化抗原是来自于正常组织、由正常组织和肿瘤共享但是在肿瘤细胞中升高的抗原，例如黑素瘤(gp100, Melan-A/Mart-1和酪氨酸酶)(Bakker AB, Schreurs MW, de Boer AJ, Kawakami Y, Rosenberg SA, Adema GJ, Figdor CG. Melanocyte lineage-specific antigen gp100 is recognized by melanoma-derived tumor-infiltrating lymphocytes. J Exp Med. 1994;179:1005–1009..Bakker AB, Schreurs MW, de Boer AJ, Kawakami Y, Rosenberg SA, Adema GJ, Figdor CG. Melanocyte lineage-specific antigen gp100 is recognized by melanoma-derived tumor-infiltrating lymphocytes. J Exp Med. 1994;179:1005–1009)、前列腺癌(PSA, PAP)(Correale P, Walmsley K, Nieroda C, Zaremba S, Zhu M, Schlom J, Tsang KY. In vitro generation of human cytotoxic T lymphocytes specific for peptides derived from prostate-specific antigen. J Natl Cancer Inst. 1997;89:293–300; Kantoff PW, Higano CS, Shore ND, Berger ER, Small EJ, Penson DF, Redfern CH, Ferrari AC, Dreicer R, Sims RB, Xu Y, Frohlich MW, Schellhammer PF. Sipuleucel-T immunotherapy for castration- resistant prostate cancer. The New England journal of medicine. 2010a;363: 411–422)和乳腺癌(乳腺珠蛋白-A)(Jaramillo A, Majumder K, Manna PP, Fleming TP, Doherty G, Dipersio JF, Mohanakumar T. Identification of HLA-A3-restricted CD8+ T cell epitopes derived from mammaglobin-A, a tumor-associated antigen of human breast cancer. International journal of cancer. Journal international du cancer. 2002;102:499–506)。与这些分化相关抗原类似，数个其它肿瘤抗原，如CEA(Tsang KY, Zaremba S, Nieroda CA, Zhu MZ, Hamilton JM, Schlom J. Generation of human cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigen epitopes from patients immunized with recombinant vaccinia-CEA vaccine. J Natl Cancer Inst. 1995;87:982–990)、MUC-1(Finn OJ, Gantt KR, Lepisto AJ, Pejawar-Gaddy S, Xue J, Beatty PL. Importance of MUC1 and spontaneous mouse tumor models for understanding the immunobiology of human adenocarcinomas. Immunologic research. 2011;50:261–268)、HER2/Neu (Disis ML, Wallace DR, Gooley TA, Dang Y, Slota M, Lu H, Coveler AL, Childs JS, Higgins DM, Fintak PA, dela Rosa C, Tietje K, Link J, Waisman J, Salazar LG. Concurrent trastuzumab and HER2/neu-specific vaccination in patients with metastatic breast cancer. Journal of clinical oncology, official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2009;27:4685–4692)、肿瘤抑制基因(p53)(Azuma K, Shichijo S, Maeda Y, Nakatsura T, Nonaka Y, Fujii T, Koike K, Itoh K. Mutated p53 gene encodes a nonmutated epitope recognized by HLA-B* 4601-restricted and tumor cell-reactive CTLs at tumor site. Cancer Res. 2003; 63:854–858)、hTERT(Vonderheide RH, Hahn WC, Schultze JL, Nadler LM. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity. 1999;10:673–679)和特定抗凋亡蛋白(如存活素)(Vonderheide RH, Hahn WC, Schultze JL, Nadler LM. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity. 1999;10:673–679)，也会在肿瘤组织中相较于正常对应物被大幅升高。独特的肿瘤特异性抗原常常被称为突变致癌基因(ras, B-raf)(Brichard VG, Lejeune D. Cancer immunotherapy targeting tumour- specific antigens: towards a new therapy for minimal residual disease. Expert opinion on biological therapy. 2008;8:951–968)。靶向这些涉及推动肿瘤进程的肿瘤特异性抗原的优点在于对免疫选择的抗性可能会更加有效。虽然很多此类肿瘤特异性抗原已经被识别和利用，但是由于以下各种原因而要求识别其它此类抗原的需求仍在持续增长：鉴于人群中基因特征类型广泛，需要为特定组群识别特异性更高的抗原，此类组群的划分方式不限，例如按民族或地理位置划分。在医药行业中存在使疫苗生产方法更加准确并降低繁琐度的持续需求，因此将与诱发适当的免疫响应最精确关联的抗原、蛋白质和肽分离出来是当前的目标。

基于蛋白质/肽的疫苗相对于自体疫苗或个体化疫苗具有明显的成本优势。但是，它们仅靶向TAA的一个表位或一些表位的事实可能会被认为是缺点。一般认为抗原特异性CTL和抗原特异性CD4+辅助T细胞两者的诱发对于癌症疫苗实现最佳疗效而言是必需的。一些多肽疫苗(例如Stimuvax®)可能同时包含CD4和CD8表位。另一种提高自体抗原免疫原性的方法是改变TAA的肽序列以引入增强子激动剂表位，这可以增强肽与MHC分子或T细胞受体的结合，从而导致更高水平的T细胞响应和/或亲和性(avidity)更高的T细胞(Dzutsev AH, Belyakov IM, Isakov DV, Margulies DH, Berzofsky JA. Avidity of CD8 T cells sharpens immunodominance. International immunology. 2007;19:497–507; Jordan KR, McMahan RH, Kemmler CB, Kappler JW, Slansky JE. Peptide vaccines prevent tumor growth by activating T cells that respond to native tumor antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010;107:4652–4657; Rosenberg SA, Yang JC, Schwartzentruber DJ, Hwu P, Marincola FM, Topalian SL, Restifo NP, Dudley ME, Schwarz SL, Spiess PJ, Wunderlich JR, Parkhurst MR, Kawakami Y, Seipp CA, Einhorn JH, White DE. Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma. Nat Med. 1998;4:321–327)。

一种治疗性癌症疫苗接种的常见方法是通过衍生自TAA序列的、与MHC人类白细胞抗原(HLA)精确结合的肽来进行接种。T细胞将其靶标抗原识别为由MHC I类分子在细胞表面提呈的具有8-10个氨基酸的肽。此类方法的主要缺点在于人类具有基因多样性，有大量的HLA等位基因来识别和结合不同的肽抗原。因此，基于短肽的癌症疫苗显示了非常有限的适用性，近期获得的方法包括了多个肽，有时包括十个以上的肽，以合理的覆盖人群。

HPV疫苗

HPV E6和E7蛋白质在所有被HPV感染的癌前细胞中组成性共表达，并且是在活检中找到的来自HPV相关的宫颈癌细胞的最大量的病毒转录体(K. Seedorf, T. Oltersdorf, G. Krämmer, W. Röwekamp, Identification of early proteins of the human papilloma viruses type 16 (HPV 16) and type 18 (HPV 18) in cervical carcinoma cells. EMBO J. 6, 139–144 (1987))，由于它们与p53及成视网膜细胞瘤蛋白质的相互作用(D. Pim, A. Storey, M. Thomas, P. Massimi, L. Banks, Mutational analysis of HPV-18 E6 identifies domains required for p53 degradation in vitro, abolition of p53 transactivation in vivo and immortalisation of primary BMK cells. Oncogene 9, 1869–1876 (1994)), E6 和E7是细胞变形的原因并且对HPV相关的恶性肿瘤的维持(maintenance)是必需的(K. Münger, P. M. Howley, Human papillomavirus immortalization and transformation functions. Virus Res. 89, 213–228 (2002))。值得注意的是，E6-和E7-特异性细胞免疫响应和与HPV16相关联的病变消退存在关联(S. Peng, C. Trimble, L. Wu, D. Pardoll, R. Roden, C. F. Hung, T. C. Wu, HLA-DQB1*02–restricted HPV-16 E7 peptide–specific CD4+ T-cell immune responses correlate with regression of HPV-16–associated high-grade squamous intraepithelial lesions. Clin. Cancer Res. 13, 2479–2487 (2007))。Farhat等人报告了以下情况：相较于患有持续性宫颈HPV16感染的女性，最近解决了HPV感染的女性中对HPV16 E6和E7产生阳性酶联免疫斑点(ELISpot)响应的百分比显著提高(S. Farhat, M. Nakagawa, A. B. Moscicki, Cell-mediated immune responses to HPV-16 E6 and E7 antigens as measured by interferon gamma enzyme-linked immunospot in women with cleared or persistent human papillomavirus infection. Int. J. Gynecol. Cancer 19, 508–512 (2009))。因此，HPV E6和E7抗原被认为是前景良好的免疫疗法靶标。目前为止，数个类型的HPV治疗性疫苗，包括蛋白质/肽基的疫苗(L. Muderspach, S. Wilczynski, L. Roman, L. Bade, J. Felix, L. A. Small, W. M. Kast, G. Fascio, V. Marty, J. Weber, A phase I trial of a human papillomavirus (HPV) peptide vaccine for women with high-grade cervical and vulvar intraepithelial neoplasia who are HPV 16 positive. Clin. Cancer Res. 6, 3406–3416 (2000); W.J. van Driel, M.E. Ressing, G.G. Kenter, R.M.P. Brandt, E.J.T. Krul, A.B. van Rossum, E. Schuuring, R. OVringa, T. Bauknecht, A. Tamm-Hermelink, P.A. van Dam, G.J. Fleuren, W.M. Kast, C.J.M. Melief and J.B. Trimbos, Vaccination with HPV16 Peptides of Patients with Advanced Cervical Carcinoma: Clinical Evaluation of a Phase I-II Trial, Eur J Cancer, Vol. 35, No. 6, pp. 946-952, 1999)已经被研发出来，其焦点在于刺激HPV E6和E7特异性T细胞的产生和激活。但是，这些肽基HPV疫苗因其HLA-A2表位受到限制而导致其即使在被评估的选定HLA-A2组群中也仅仅表现出非常有限的适用性。在2009年有报告称，在研究患有VIN3的非限制性患者人群时，含有13个来自HPV16 E6蛋白质的重叠肽和4个来自HPV16 E7肽的4个重叠肽(共计13个肽)的HPV肽疫苗显示了强烈的抗HPV响应。该研究第一次显示了在非HLA限制性人群中广泛作用的HPV肽疫苗(Gemma G. Kenter, Marij J.P. Welters, A. Rob P.M. Valentijn, Margriet J.G. Lowik, Dorien M.A. Berends-van der Meer, Annelies P.G. Vloon, Farah Essahsah, Lorraine M. Fathers, Rienk Offringa, Jan Wouter Drijfhout, Amon R. Wafelman, Jaap Oostendorp, Gert Jan Fleuren, Sjoerd H. van der Burg, and Cornelis J.M. Melief; Vaccination against HPV-16 Oncoproteins for Vulvar Intraepithelial Neoplasia, N Engl J Med 2009;361:1838-47)。

这些参考文献，特别是作者为Kenter等人的最后一个文献，强调了与目前提供广泛HLA覆盖范围的肽疫苗的开发方法的主要缺陷。目前的方法由于无法确定可以提供广泛覆盖范围的免疫原性序列，因此其重点在于覆盖了整个抗原蛋白质序列的长肽。因此，4个主要缺陷导致了：1.疫苗复杂，包含了大量的肽，例如Kenter等人使用了13个肽；2.疫苗比实际所需的更贵；3.患者需要接收不必要的肽，这些肽可能没有任何治疗性或免疫原性作用；4.活性肽可能被其它肽通过竞争性结合而失活(这个具体缺陷由上文所引用的Kenter等人的文献所报告)。

当前发明报告了开发简单、更加经济、高效和广泛HLA覆盖的肽疫苗的高效开发方法。

用于蛋白质/肽基疫苗的免疫刺激性佐剂

鉴于TAA本身的免疫原性较差，在特定情况下可能需要免疫刺激性佐剂来产生有效的免疫响应。铝盐(alum)已经作为非常成功的佐剂使用了近一个世纪，并且在提升保护性体液免疫方面特别有效。但是，铝盐对于需要细胞介导免疫来保护的疾病并不是最有效的。在过去20年中对需要激活先天免疫来驱动适应性免疫响应的认识已经彻底的改变了佐剂如何提升适应性免疫的理论。具体而言，Charles Janeway的前沿研究表明适应性免疫响应在由微生物成分启动的先天免疫受体之后并依赖于由微生物成分启动的先天免疫受体(Janeway CA., Jr. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 1992;13:11–16)。通过模式识别受体(如toll样受体(TLRs))识别与病原体或病原相关分子模式(PAMPs)相关的保守部分引起(engage)针对微生物病原体或受感染细胞经协调的先天和适应性免疫(Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity. Immunity. 2011;34:637–650)。 TLR介导的抗原提呈细胞(如DCs)激活是该方法的重要步骤。的确，许多已研制和实验性疫苗包括PAMPs，不仅是为了防范感染性疾病，也是作为抗癌治疗性免疫法的一部分(Wille-Reece U, Flynn BJ, Lore K, Koup RA, Miles AP, Saul A, Kedl RM, Mattapallil JJ, Weiss WR, Roederer M, Seder RA. Toll-like receptor agonists influence the magnitude and quality of memory T cell responses after prime-boost immunization in nonhuman primates. J. Exp. Med. 2006;203:1249–1258)。使用这些分子限定和功能限定的分子作为佐剂很好的辅助了疫苗的理性设计。

作为该观点的支持者，用于治疗膀胱癌而长期使用的BCG(卡介苗)已经相对有效，并且显示了其可以激活TLR2和TLR4(Heldwein KA, Liang MD, Andresen TK, Thomas KE, Marty AM, Cuesta N, Vogel SN, Fenton MJ. TLR2 and TLR4 serve distinct roles in the host immune response against Mycobacterium bovis BCG. Journal of leukocyte biology. 2003;74:277–286)。LPS是TLR4的天然配体，早在20世纪60年代就有报告称其具有抗癌特性(Mizuno D, Yoshioka O, Akamatu M, Kataoka T. Antitumor effect of intracutaneous injection of bacterial lipopolysaccharide. Cancer research. 1968;28:1531–1537)。单磷酰脂质A(MPL)是明尼苏达州沙门氏菌内毒素（S.Minnesota endotoxin）的化学改性衍生物，其毒性大幅降低，同时保留了大部分LPS的免疫刺激性特性(Mata-Haro V, Cekic C, Martin M, Chilton PM, Casella CR, Mitchell TC. The vaccine adjuvant monophosphoryl lipid A as a TRIF-biased agonist of TLR4. Science. 2007;316:1628–1632)。有足够的研究已经显示MPL有效的增强了患者对病毒和肿瘤相关的抗原的免疫响应(Schwarz TF. Clinical update of the AS04- adjuvanted human papillomavirus-16/18 cervical cancer vaccine, Cervarix. Advances in therapy. 2009;26:983–998)。FDA批准了以MPL和铝盐制成的Cervarix疫苗作为针对人类乳头瘤病毒的预防性疫苗(Schiffman M, Wacholder S. Success of HPV vaccination is now a matter of coverage. The lancet oncology. 2012;13:10–12)。咪喹莫特（Imiquimod(一种TLR7激动剂)）已经于2004年被FDA批准用于人类的光化性角化病和表浅性基底细胞癌(Hoffman ES, Smith RE, Renaud RC., Jr. From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2005;4:879–880)。这些TLR激动剂在提高弱免疫原性TAA的免疫原性中具有强大的潜力。数种与TLR激动剂组合的肽/蛋白质基癌症疫苗确实正在临床试验中被测试，包括靶向TLR3的安普利近（Ampligen）(NCT01355393)、靶向TLR3的Histonol (NCT00773097, NCT01585350, NCT01437605)、靶向TLR4的MELITAC 12.1 (NCT01585350)以及靶向TLR9的雷西莫特（Resiquimod）(NCT00960752)。PRRs组群在近些年已经极大的得到了扩展，因此人们付出了巨大的努力以调查先天免疫通路在确定佐剂作用机制中的功能以及其它PRRs(例如NLR/RLR)在治疗性癌症疫苗的佐剂作用中的功能。

除了感应病原体相关的信号，PRRs还识别内源性‘警报素’，例如应激蛋白/热休克蛋白(HSPs)以及HMGB-1(Lotze MT, Zeh HJ, Rubartelli A, Sparvero LJ, Amoscato AA, Washburn NR, Devera ME, Liang X, Tor M, Billiar T. The grateful dead: damage-associated molecular pattern molecules and reduction/oxidation regulate immunity. Immunol Rev. 2007;220:60–81; Todryk SM, Melcher AA, Dalgleish AG, Vile RG. Heat shock proteins refine the danger theory. Immunology. 2000;99:334–337)。作为细胞内在高度保守蛋白组成部分，这些损伤相关分子模式(DAMPs)还将细胞损伤的性质和程度发送给主免疫系统。虽然已知HSPs作为参与细胞内蛋白质质量控制的分子伴侣(Calderwood SK, Murshid A, Prince T. The shock of aging: molecular chaperones and the heat shock response in longevity and aging--a mini-review. Gerontology. 2009;55:550–558; Mayer MP, Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci. 2005;62:670–684)，最近20年的研究已经确定以下概念：特定HSPs能够整合先天和适应性免疫响应，并可以作为免疫刺激剂用在癌症免疫疗法中(Mayer MP, Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci. 2005;62:670–684; Wang XY, Facciponte JG, Subjeck JR. Molecular chaperones and cancer immunotherapy. Handb Exp Pharmacol. 2006b;172:305–329)。

虽然在疫苗的理性设计中已经出现了显著的进步，对优化的预防性和治疗性疫苗的开发需求仍然持续存在。对大量患者人群具有广泛适用性的疫苗的开发需求依然存在，同时也需要此类疫苗具有特异性和有效性。

发明内容

本发明公开了包括任选的与一个或多个佐剂组合的HPV肽序列的新型组合物，其中所述HPV肽序列对应于HPV16 E6肽和/或HPV16 E7肽，并且其中所述肽序列与五种HLA超类型具有结合亲和力，所述结合亲和力为约IC50值5000nM，并且其中一些肽为多表位肽。在特定具体实施方式中，所述组合物包括由阳离子脂质组成的佐剂；在特定具体实施方式中，所述阳离子脂质由DDA、R-DOTAP、DOTAP、DOTMA或DOEPC、其变体或类似物组成。本发明所公开的新型组合物比现有的疫苗好得多，它们可以有效作用于总人群的80-90%以上。

本发明公开了诱发受试者体内针对HPV感染的免疫响应的方法，所述方法包括向受试者施用包括任选的与佐剂组合的HPV肽序列的组合物，其中所述HPV肽序列对应于HPV16 E6肽和/或HPV16 E7肽，并且其中所述肽序列与五种HLA超类型具有结合亲和力，所述结合亲和力为约IC50值5000nM，并且其中一些肽为多表位肽。该方法可以为预防性方法，也可以为治疗性方法。

附图说明

图1提供的图表显示了通过干扰素γ检测法并按照受试者和访问划分的1mg和3mgR-DOTAP组（Cohort）的抗HPV-16 E6和E7响应。简写：Bkg=背景(条纹柱)；PBMCs=外周血单核细胞；R-DOTAP=1,2-二油酰基-3-三甲基胺-丙烷氯化物的R型对映异构体；SFC=SFU=斑点形成单位；Stim=受刺激的(空白柱)。数据表示三个孔(triplicate wells)中的每4×10⁵PBMCs的平均SFU。条纹柱代表仅用培养基刺激的孔中的背景SFU。空白柱代表用肽池刺激的孔中的SFU。访问2=预接种的第1天；访问3=第15天，接种1后14天；访问5=第36天，接种2后的14天；访问7=第57天,接种3后14天；访问9=第133天,接种3后的90天。

图2提供的图表显示了通过干扰素γ检测法并按照患者和访问划分的10mg R-DOTAP组的抗HPV-16 E6和E7响应。数据表示三个孔中的每4×10⁵PBMCs的平均SFU。条纹柱代表仅用培养基刺激的孔中的背景SFU。空白柱代表用肽池刺激的孔中的SFU。访问2=预接种的第1天;访问=第15天，接种1后14天；访问5=第36天，接种2后的14天；访问7=第57天，接种3后14天；访问9=第133天,接种3后的90天。

图3提供了示范性肿瘤消退图，其显示了肿瘤移植后肽对随时间测定的中等肿瘤大小的效果，肽对应于SEQ ID NO: 1 (空心方块)、SEQ ID NOS: 7、8、31、32和31(黑色实心圆)、 SEQ ID NO: 7 (空心圆)和SEQ ID NO: 8 (黑色实心三角)。在图3中，利用条纹方块标记的图线来表示仅包括R-DOTAP的组合物。

具体实施方式

下文的说明为示例性和说明性的，是为了对本发明的公开内容提供进一步说明。根据本发明的以下详细说明，本发明的其它优点和新特征对于本领域的技术人员将变得显而易见的。本发明所提及的引用文献，包括第62/404,458号美国临时申请在内，都通过引用方式整体纳入本发明。

本发明公开了用于设计和使用独特肽序列的方法，所述肽序列包括独特的多表位肽序列、衍生自HPV16 E6和E7、被设计为被有效的处理并交叉提呈至T细胞，所述肽序列已在HLA-A2人源化转基因小鼠上筛查和验证，并在各种人类受试者身上得到证实。在特定具体实施方式中，新型组合物包括新型肽序列，所述新型肽序列由2-8个肽序列、2-6个肽序列或4个肽序列组成。所述肽可以被整合入免疫原性组合物，如疫苗。如下文所示，电脑模拟的对主要HLA超类型的肽结合分析证实所获得的组合物和疫苗覆盖了80-90%以上的人群。在包括使用了本发明所述的肽组合物的非HLA限制性人类临床试验中，证实了对所有受试者都具有强大的T细胞诱发能力。通过电脑模拟结合分析的新方法并结合对人源化转基因小鼠的测试，本发明的发明人已经开发出第一种简单、有效并具有广泛适用性的肽基HPV16治疗性癌症疫苗。

在被设计为用于在人体中引发CD8+ T细胞生成和响应的肽基疫苗的设计中，一个重要考量是HLA I类分子在人群中的多态性。由于不同的HLA等位基因结合不同的肽，很重要的一点是肽疫苗要包含足够不同的肽，以在大部分人群中具有免疫原性。本发明的发明人设计了新型的多肽疫苗以覆盖HPV16 E6和E7免疫原区，从而在人体内提供正确的CD8+ T细胞处理和提呈：在具体实施方式中，疫苗包括基于结合和免疫原性活性而选定的四种HPV相关肽。如实施例中所详细说明的，发明人进行了ELISpot和肿瘤消退研究以及电脑模拟分析以预测能够结合各种HPV肽的潜在HLA等位基因。然后在人源化转基因小鼠中研究了人类免疫系统提呈和识别所述肽表位的能力，以证实提呈、处理以及之后的抗原特异性CD8+ T细胞响应。最后，在非HLA限制性人类临床试验中研究了诱发人T细胞响应的能力，并证实了制剂在各种HLA子类型的受试者中诱发强烈T细胞响应的能力。

在具体实施方式中,本发明所述的新型组合物包括与佐剂组合的HPV肽序列，其中所述HPV肽序列对应于HPV16 E6肽和/或HPV16 E7肽，并且其中所述肽序列与五种HLA超类型具有结合亲和力，所述结合亲和力为约IC50值5000nM，在特定具体实施方式中，所述肽为多表位肽。所述肽可包括SEQ ID NOS: 5、9、10和11,或包括SEQ ID NOS: 23、24、25和26的它们的脂化版本。在具体实施方式中，所述肽在组合物中可以为单独的肽，也可以(以任何顺序)彼此偶联(conjugated)，无论间隔区是否存在，从而以本领域技术人员所知悉的方法形成包含本发明所保护的序列的单个长肽。在特定具体实施方式中，HLA超类型包括HLA-A^*02:01、HLA-A^*03:01、HLA-A^*24:02、HLA-B^*07:02和HLA-B^*58:01。在一些具体实施方式中，所述组合物可以进一步包括增强子激动剂表位，例如HBV核心辅助肽等，和/或单表位肽，所述单表位肽包括但不限于SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及其类似物如SEQ ID NOS: 27和28所编码的肽。本发明所述的组合物进一步包括改性肽、肽类似物及其活性片段。在特定具体实施方式中，所述肽可以通过氧化、以二硫键交联、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化、棕榈酰化、甲基化、生物素化或本领域技术人员已知的其它方法来改性，以改进效用和免疫原性。在具体实施方式中，组合物的佐剂由阳离子脂质组成，其中所述阳离子脂质可以选自以下物质组成的组：DOTAP、DDA、DOEPC、DOTMA、R-DOTAP、R-DDA、R-DOEPC、R-DOTMA、S-DOTAP、S-DDA、S-DOEPC、S-DOTMA及其变体或类似物。在具体实施方式中，根据本发明的新型组合物包括对应于SEQ ID NOS: 5, 9, 10和11的肽，佐剂包括阳离子脂质，而阳离子脂质包括R-DOTAP。在具体实施方式中，根据本发明的新型组合物包括对应于SEQ ID NOS: 23、24、25或26的肽，佐剂包括阳离子脂质，其中阳离子脂质包括R-DOTAP。在具体实施方式中，根据本发明的新型组合物包括对应于SEQ ID NOS: 5、9、10、11、23、24、 25或26的肽，佐剂包括阳离子脂质，其中阳离子脂质包括R-DOTAP。上述的具体实施方式可以被任选的封装于脂质体中。上述的具体实施方式可以任选的与医学上可接受的载体和赋形剂组合，例如各种缓冲剂(如醋酸盐、磷酸盐)、张力调整剂(如蔗糖、海藻糖等)或表面活性剂(如吐温)和本领域技术人员已知的其它载体和赋形剂。

在具体实施方式中，本发明提供了包括编码多肽的核酸分子的重组载体，所述多肽包括一个或多个SEQ ID NO: 5、9、10、11、或一个或多个SEQ ID NOS: 23、24、 25或26，所述核酸分子与启动子操作性连接。本发明还提供了包括编码多肽的核酸分子的重组载体，所述多肽包括一个或多个SEQ ID NO: 5、9、10、11、或一个或多个SEQ ID NOS: 23、24、25或26，所述核酸分子与启动子操作性连接，并且所述重组载体进一步包括编码增强子激动剂表位和/或单表位肽的核酸分子。在具体实施方式中，上述载体可以包括重组腺病毒。本领域技术人员已经知晓，核酸序列可以利用常规分子生物技术来克隆，或者通过DNA合成来从头生成，这可以由在DNA合成和/或分子克隆领域开展业务的服务公司利用常规步骤来进行。

在具体实施方式中，本发明提供了诱发受试者体内针对HPV感染的免疫响应的方法，所述方法包括向受试者施用包括与一个或多个佐剂组合的HPV肽序列的新型组合物，其中所述HPV肽序列对应于HPV16 E6肽和/或HPV16 E7肽，并且其中所述肽序列与五种HLA超类型具有结合亲和力，所述结合亲和力为约IC50值5000nM，并且其中一些肽为多表位肽。本发明所公开的用于诱发免疫响应的方法可以包括出于预防性或治疗性目的来诱发免疫响应。在特定具体实施方式中，在新型组合物中所使用的肽可包括一种或多种肽，所述一种或多种肽选自以下物质组成的组：SEQ ID NOS: 5、9、10、11、23、24、25、26、31、32或表1-5的实施例所述的其它肽。所述肽可以为单独的肽，也可以(以任何顺序)彼此偶联(conjugated)，无论间隔区是否存在，从而以本领域技术人员所知悉的方法形成包含本发明所保护的序列的单个长肽。该方法可包括使用组合物，所述组合物的佐剂由例如阳离子脂质组成，其中所述阳离子脂质包括DOTAP、DDA、DOEPC、DOTMA、 R-DOTAP、R-DDA、R-DOEPC、R-DOTMA、S-DOTAP、S-DDA、S-DOEPC、S-DOTMA、其变体或其类似物。在具体实施方式中，用于诱发免疫响应的方法可包括对受试者施用包括由SEQ ID NOS: 5、9、10、11组成的肽和R-DOTAP组合物，或包含由SEQ ID NOS: 23、 24、25 或26组成的肽和R-DOTAP的组合物。

本发明所述的方法可包括新型HPV肽组合物在治疗患有HPV感染的受试者中的用途，其中所述感染包括的症状包括但不限于常见疣、足底疣、扁平疣、生殖器疣、肛门生殖器疣、肛门发育不良、生殖器癌(外阴、阴道、子宫颈、阴茎、肛门)、头颈癌、疣状表皮发育不良、局灶性上皮增生、口腔乳头瘤、口咽癌、疣状囊肿和喉乳头状瘤病。

技术人员将会理解可以使用例如常规分子生物方法通过例如氨基酸替换、删除、增加等对肽做出改变。一般地，使用保守性氨基酸替换不会导致多肽的功能或免疫原性受损。这可以由技术人员已熟知的常规方法来检查。

本发明所述的肽的范围还包括肽和肽片段的改性。此类改性包括自然出现的氨基酸在特定位点与其它分子的替换，其它分子包括但不限于自然和非自然出现的氨基酸。此类替换可以改变肽的生物活性并制造生物或药理学激动剂或拮抗剂。此类替换可包括本领域技术人员已知的保守型替换，例如缬氨酸替换丙氨酸。可接受的替换还可以包括氨基酸改性，例如正亮氨酸替换亮氨酸。应当理解的是，用D氨基酸替换L氨基酸是落在本发明的保护范围内的。在Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology（2"a ed., J.Stenesh, John Wiley & Sons, 1989）中描述了一些替换，以引用方式将该字典整体纳入本发明。其它改性包括在肽或其片段的特定位置增加氨基酸(如酪氨酸或其它氨基酸)从而利用放射性或非放射性标记来提高标记能力)、增加分子(如蓖麻毒蛋白)、增加放射性或非放射性标记。

另外，本领域的技术人员将认识到对所公开的肽的氨基酸序列或为编码肽的氨基酸的核苷酸序列的进行个别替换、删除或增加，且改变增加或删除的是编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸(典型的少于5%，更典型的少于1%)，属于保守性改性变体，其中改变导致的结果是一个氨基酸被一个化学性质近似的氨基酸所替代。提供了功能相似的氨基酸的保守性替换表在本领域是已知的。以下六组的每一组都包括可保守性替换另一个氨基酸的氨基酸：

1) 丙氨酸 (A))，丝氨酸 (S))，苏氨酸 (T))；

2) 天门冬氨酸 (D))，谷氨酸 (E))；

3) 天门冬酰胺 (N))，谷氨酰胺 (Q；

4) 精氨酸 (R))，赖氨酸 (K))；

5) 异亮氨酸 (I))，亮氨酸 (L))，蛋氨酸 (M))；缬氨酸 (V))； 及 6) 苯丙氨酸(F))，酪氨酸 (Y))，色氨酸 (W))。

脂质佐剂

已有报告称阳离子脂质具有强烈的免疫刺激性佐剂效果。根据本发明的阳离子脂质可以形成脂质体，其任选的与抗原混合并可以仅包含阳离子脂质或包含与中性脂组合的阳离子脂质。合适的阳离子脂质种类包括：3-β[⁴N-(¹N,⁸-二胍基亚精胺)-氨基甲酰基]胆固醇(BGSC)；3-β[N,N-二胍基乙基-氨基乙烷)- 氨基甲酰基] 胆固醇(BGTC)；N,N¹N²N³四-甲基四棕榈基精胺(cellfectin)；N-t-丁基-N'-十四烷基-3-十四烷基-氨基丙酰-脒(CLONfectin)；二甲基双十八烷基铵溴化物(DDAB)；1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基铵溴化物(DMRIE)；2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸) (DOSPA); 1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基精胺基)-丙基酰胺(DOSPER);4-(2,3-双-棕榈酰基氧基-丙基)-1-甲基-1H-咪唑(DPIM)；N,N,N',N'-四甲基-N,N'-双(2-羟基乙基)-2,3-二油酰基氧基-1,4-丁烷二铵碘化物(Tfx-50)；N-1-(2,3-二油酰基氧基)丙基-N,N,N-三甲基铵氯化物(DOTMA)或其它N-(N,N-1-二烷氧基)-烷基-N,N,N-三代铵表面活性剂; 1,2-二油酰基-3-(4'-三甲基铵基)丁醇-sn-丙三醇(DOBT)或胆固醇基(4'三甲基氨基)丁酸甲酯(ChOTB)，其中所述三甲基氨基团通过丁醇间隔臂连接至双链(DOTB中)或胆固醇基基团(ChOTB中); DORI (DL-1,2-二油酰基-3-二甲基氨基丙基-β-羟基乙基铵)或DORIE (DL-1,2-O-二油酰基-3-二甲基氨基丙基-β-羟基乙基铵) (DORIE) 或WO93/03709所公开的其类似物；1,2-二油酰基-3-琥珀酰基-sn-丙三醇胆碱酯(DOSC)；胆固醇基半琥珀酸酯(ChOSC)； 脂多胺，例如双十八基酰胺基甘氨酰基精胺(DOGS)和二棕榈酰基磷脂酰基乙醇基戊基精胺(DPPES)或第5,283,185号美国专利所公布的阳离子脂质，胆固醇基-3β-羧基-酰胺基-乙烯基三甲基铵碘化物,1-二甲基氨基-3-三甲基胺基-DL-2-丙基-胆固醇基羧酸盐碘化物, 胆固醇基-3-O-羧基酰胺基乙烯胺, 胆固醇基-3-β-氧基琥珀酰胺基-乙烯三甲基铵碘化物,1-二甲基氨基-3-三甲基胺基-DL-2-丙基-胆固醇基-3-β-氧基琥珀酸碘化物，2-(2-三甲基胺基)-乙基甲基氨基乙基-胆固醇基-3-β-氧基琥珀酸碘化物, 3-β-N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基胆固醇(DC-chol)以及3-β-N-(聚乙烯亚胺)- 氨基甲酰基胆固醇；O,O'-二肉豆蔻基-N-赖氨酰基天冬氨酸盐(DMKE)；O,O'-二肉豆蔻基-N-赖氨酰基-谷氨酸盐(DMKD); 1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基铵溴化物(DMRIE);1,2-二月桂酰基-sn-丙三基-3-乙基磷酸胆碱(DLEPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三基-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC); 1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC); 1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-乙基磷酸胆碱(DPEPC); 1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-乙基磷酸胆碱(DSEPC)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)；二油酰基二甲基氨基丙烷(DODAP)；1,2-棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷(DPTAP); 1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷(DSTAP)，1,2-肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷 (DMTAP)；以及十二烷基硫酸钠(SDS)。本发明对本申请所公开的阳离子脂质的结构性变体和衍生物的使用做出了预期。

本发明的特定方面包括非甾族手性阳离子脂质，其结构如下式所表示：

其中R¹是季铵基团，Y¹选自烃链、酯、酮和肽，R²和R³独立的选自饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、与酯相连的烃、磷二酯及其组合。DOTAP、DMTAP、DSTAP、DPTAP、DPEPC、DSEPC、DMEPC、DLEPC、DOEPC、DMKE、DMKD、DOSPA、DOTMA是具有该总体结构的脂质的示例。

在一个具体实施方式中，根据本发明的手性阳离子脂质中的亲脂性基团与氨基基团之间的键在水溶液中是稳定的。因此，根据本发明的复合物的特性是存储稳定性(即它们能够在形成后随着时间过去仍保持小直径并保留生物活性)。用在阳离子脂质中的此类键包括酰胺键、酯键、醚键和氨基甲酰基键。本领域的技术人员将容易理解含有超过一个阳离子脂质种类的脂质体可以被用于制备根据本发明的复合物。举例而言，包括赖酰胺基-磷脂酰乙醇胺和β-丙氨酰基胆固醇基酯两个阳离子脂质种类的脂质体已经在某些药物递送应用[Brunette, E. et al., Nucl. Acids Res., 20:1151 (1992)]中被公开。

应当进一步理解的是，在考虑适于用在本发明中并任选的与抗原混合的手性阳离子脂质体时，根据本发明的方法不仅仅局限于使用上文引用的阳离子脂质，相反，只要阳离子脂质体被制备出来并且所获得的阳电荷密度足以激活和诱发免疫响应，任何脂组合物都可以被使用。

因此，根据本发明的脂质除了阳离子脂质外可以包含其它脂。这些脂包括但不限于溶血脂类(示例为溶血卵磷脂(1-油酰基溶血卵磷脂))、胆固醇、或天然磷脂(包括二油酰基磷脂酰乙醇氨(DOPE)或二油酰基卵磷脂(DOPC))以及各种包含聚乙二醇部分的亲脂性表面活性剂(示例为吐温-80和PEG-PE)。

根据本发明的阳离子脂质还可以包含负电荷脂质及阳离子脂质，只要形成的复合物的净电荷是正的和/或复合物的表面是正电荷。根据本发明的负电荷脂质包括至少一个具有处于或接近生理pH的净负电荷脂种类，或其组合。合适的负电荷脂种类包括但不限于CHEMS(胆固醇半琥珀酸酯)、NGPE(N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺(N-glutarylphosphatidlylethanolanine))、磷脂酰甘油和磷脂酸或相似的磷脂相似物。

制备用于制备包括根据本发明的药物递送复合物的脂的脂质体的方法对于本领域的普通技术人员而言是已知的。脂质体制备方法的文章可以在以下文献中找到：Liposome Technology (CFC Press New York 1984); Liposomes by Ostro (MarcelDekker, 1987); Methods Biochem Anal. 33:337-462 (1988)和第5,283,185号美国专利。此类方法包括冰冻-解冻挤压和超声法。单层脂质体(平均直径小于约200nm)和多层脂质体(平均直径大于约300nm)都可以被用作制造根据本发明的复合物的起始成分。

在用于制造根据本发明的阳离子脂质疫苗的阳离子脂质体中，阳离子脂质在脂质体中占总脂质体脂质摩尔量的约10%-约100%或约20%-约80%。中性脂质被包含在脂质体中时，其摩尔含量可以为总脂质体脂质的约0%-约90%或约20%-约80%或约40%-约80%。负电荷脂质被包含在脂质体中时，其摩尔含量可以为总脂质体脂质的约0%-约49%或约0%-约40%。在一个具体实施方式中，脂质体所含的阳离子脂质和中性脂质的比例为约2：8至6：4之间。应当进一步理解的是，根据本发明的复合物可以包含改性的脂质、蛋白质、聚阳离子或受体配体，其作为靶向因素将复合物指向特定组织或细胞类型。靶向因素的示例包括但不限于脱唾液酸糖蛋白、胰岛素、低密度脂蛋白(LDL)、叶酸及指向细胞表面分子的单克隆和多克隆抗体。另外，为了改善复合物的循环半衰期，可以通过包含含有聚乙二醇部分的亲脂性表面活性剂来空间阻隔正表面电荷。

阳离子脂质疫苗可以在从蔗糖梯度（sucrose gradient）收集后存储在等渗蔗糖或葡萄糖（dextrose）溶液中，或者可以先被冻干然后在使用前在等渗溶液中复原。在一个具体实施方式中，阳离子脂质复合物被存储在溶液中。通过特定检测来测定根据本发明的阳离子脂质复合物的稳定性，以确定存储中的阳离子脂质疫苗随时间变化的物理稳定性和生物活性。利用本领域普通技术人员已知的方法，包括例如电子显微镜分析、凝胶过滤层析或使用实施例所述的Coulter N4SD颗粒尺寸分析仪通过准弹性光散射方法确定阳离子脂质复合物的直径和电荷来测定阳离子脂质疫苗的物理稳定性。相较于阳离子脂质疫苗被提纯时所确定的阳离子脂质复合物的直径，存储的阳离子脂质疫苗的直径增加不超超过100%、或者不超过50%、或者不超过30%，阳离子脂质复合物的物理稳定性就是‘基本不变’。

虽然阳离子脂质可能可以单纯形式或基本单纯形式被施用，优选的是将其作为药物组合物、制剂或配制剂来施用。使用根据本发明的手性阳离子脂质复合物的药物制剂可包括生理上相容的无菌缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水、等渗盐水或低离子强度缓冲液，如醋酸盐或(Hepes)(示例性pH范围为约5.0至约8.0))中的阳离子脂质疫苗。手性阳离子脂质疫苗可以作为喷雾或液体溶液进行肿瘤内、动脉内、静脉内、气管内、腹腔内、皮下和肌肉内给药。

根据本发明的制剂可包括任何本领域已知的稳定剂。示例性稳定剂为胆固醇和可辅助固定脂质体双分子层(bilayer)并防止双分子层崩解或失稳的其它甾醇类。例如聚乙二醇、多糖和单糖的试剂，也可以被包含在脂质体中以对脂质体表面改性并防止其由于与血液组分的互相作用而失稳。其它示例性稳定剂为蛋白质、糖类、无机酸或有机酸，它们都可以单独使用或作为混合物使用。

许多药学方法都可以被用于控制、改变或延长免疫刺激的持续时间。可以通过使用聚合物复合物(例如聚酯、聚氨基酸、甲基纤维素、聚乙烯、聚乳酸和水凝胶)来封装或包裹(entrap)阳离子脂质并将其缓慢释放来实现控释配制剂。类似的聚合物也可以用于吸附脂质体。脂质体可以被包含在乳液制剂中以改变刺激剂的释放性质。或者可以通过在脂质体的表面涂覆能够提升脂质体和乳液的循环时间或半衰期的化合物(例如聚乙二醇或其它聚合物)和其它物质(如糖类)来提升刺激剂在血液循环中的存在时间。

当需要口服配制剂时，手性阳离子脂质可以与本领域已知的典型药学载体(例如蔗糖、乳糖、甲基纤维素、羧甲基纤维素或阿拉伯树胶等)组合。阳离子脂质也可以被封装在胶囊或片剂中以进行全局给药。

施用根据本发明的手性阳离子脂质组合物可以是出于预防性或治疗性目的。当出于防御性目的时，在出现疾病的任何迹象或症状之前施用阳离子脂质。当出于治疗性目的时，在疾病开始时或开始后施用阳离子脂质。进行免疫刺激剂的治疗性给药用于缓解或治愈疾病。在用于这两种目的时，阳离子脂质可以与另一种治疗性药剂或抗原一起施用。当阳离子脂质与另一种治疗性药剂或抗原一起施用时，预防性或治疗性效果可以针对特定疾病，包括例如由HPV导致的疾病或障碍。

根据本发明的兽用和人用制剂包括作为R型和S型对映异构体的混合物的上文所述的单独纯手性阳离子脂质，以及一种或多种治疗性成分(例如抗原或药物分子)。该制剂可以方便的存在于单位剂型中，并且可以通过药学领域已知的任意方法制备。

术语

需要注意的是，术语“a”或“an”是指一个或多个。同样的，“a”(或“an”)、“一个或多个”以“至少一个”在本发明中可互换使用。

术语“包括”、“包含”应当以包含性方式解释为，而不是以排他性方式解释。术语“组成”及其变体应以排他性方式解释，而不是以包含性方式解释。

在本发明中，除非另有说明，“约”字是指给定参考量的10%的可变范围。

在本发明中，“受试者”和“患者”可互换使用，包括哺乳动物，例如人类、大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人类灵长类动物，例如猴子、黑猩猩、狒狒或大猩猩。

在本发明中，“疾病”、“障碍”和“病症”可互换使用，用于指代受试者的异常状态。

除非在说明书中另有定义，本发明所使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解以及参照公开文本所理解的相同含义，所述公开文本为本领域技术人员就本申请中所使用的许多术语提供了总体指导。

本发明所公开的组合物包括的HPV肽组合物的量足以在受试者身上产生免疫原性响应。具体而言，获得治疗性效果的组合物剂量取决于以下因素：制剂、组合物的药理药效、患者的年龄、体重和性别、待治疗的病症、患者症状的严重程度、给药途径以及患者的响应模式。也可以预期组合物的治疗和剂量可以通过单位剂型来施用，以及本领域技术人员可以相应的调整单位剂型以反映相对活性水平。关于使用的特定剂量(以及每日施用的次数)的决定由普通医生酌定，并可以通过剂量滴定法针对特定情形进行改变以获取治疗效果。另外，本领域的技术人员将能够计算由于组合物成分的变化或稀释导致的组合物有效量的任何变化。在一个具体实施方式中，组合物可以被两倍稀释。在另一个具体实施方式中，组合物可以被四倍稀释。在另一个具体实施方式中，组合物可以被八倍稀释。

本发明所公开的组合物有效量可以因此为基于70kg的哺乳类受试者(例如人类)每剂约1mg至约1000mg。在另一个具体实施方式中，治疗有效剂量为每剂约2mg至约250mg。在另一个具体实施方式中，治疗有效剂量为约5mg至约100mg。在另一个具体实施方式中，治疗有效剂量为约25mg至50mg、约20mg、约15mg、约10mg、约5mg、约1mg、约0.1mg、约0.01mg、约0.001mg。

(出于治疗性目的施用的)有效剂量可以按定期频率(即每日、每周、每月或每年)给药，或按不同的给药日、周、月等非常规频率给药。或者，给药的治疗有效量可以不同。在一个具体实施方式中，第一剂的治疗有效量高于一个或多个后续剂的治疗有效量。在另一个具体实施方式中，第一剂的治疗有效量低于一个或多个后续剂的治疗有效量。可以按不同的时长(包括但不限于约每2小时、约每6小时、约每8小时、约每12小时、约每24小时、约每36小时、约每48小时、约每72小时、约每周、约每2周、约每3周、约每月、约每2个月、约每3个月和约每6个月)施用相当的剂量。一个完整疗程的给药次数和频率将根据保健医生的判断来确定。

组合物可以通过任何途径施用，同时考虑所选定的具体病症。组合物可以通过口服、注射、吸入(包括口腔途径、鼻内途径和气管内途径)、眼内、透皮 (通过简单被动扩散制剂或使用例如电离子透入疗法、微针致微孔法、射频消融法或类似方法来进行辅助给药)、血管内、经皮、皮下、肌内、舌下、颅内、硬膜外、直肠、膀胱内、阴道等途径给药。

组合物可以单独制成，也可以与一个或多个药学载体和/或赋形剂制成以给药。药学载体的量可以根据肽的溶解度和化学性质、选择的给药途径和标准药理学实践来确定。药学载体可以为固体或液体，也可以包含固体和液体载体/基质。很多合适的液体载体是已知的，并可以由本领域技术人员轻易选定。此类载体可包括二甲亚砜（DMSO）、盐水、缓冲盐水、环糊精、羟基丙基环糊精（HPβCD）、n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）及其混合物。类似的，许多固体（刚性或柔性）载体和赋形剂对本领域技术人员而言也是已知的。

虽然组合物可以单独给药，它们也可以在一个或多个生理兼容的药学载体存在的情况中给药。载体可以为干型或液体型并且必须是药学上可接受的。液体药学组合物可以为无菌溶液或悬浮液。在使用液体载体时，它们可以为无菌液体。液体载体可用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆剂和酏剂（elixir）。在一个具体实施方式中，组合物可以溶解于液体载体中。在另一个具体实施方式中，组合物可以悬浮于液体载体中。制剂领域的技术人员将能够基于给药途径选定合适的液体载体。组合物也可以用固体载体制成。在一个具体实施方式中，组合物可以精简为单位剂型，即片剂或囊片（caplet）。在另一个具体实施方式中，组合物可以被添加入单位剂型，即胶囊。在另一个具体实施方式中，组合物可为以粉末状态给药而制成。固体载体可提供许多功能，即可以提供下文所述两个或多个赋形剂的功能。举例而言，固体载体也可以作为增味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、压缩辅助剂、粘合剂、崩解剂或封装材料。在一个具体实施方式中，固体载体作为润滑剂、增溶剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂或封装材料。组合物也可以被细分为包含适当的数量的组合物。举例而言，单位剂量可以为包装好的组合物，例如袋装粉末、含有液体的小瓶、安瓿、预装注射器或小袋。

在具体实施方式中，组合物可以通过调释给药装置给药。本发明所使用的“调释”是指本发明所公开的组合物的给药是受到控制的，例如经过至少约8个小时（例如延长递送）至至少约12小时（例如持续递送）。此类装置也可允许速释方式（例如在约1小时以内或约2小时以内达到治疗水平）。本领域的技术人员知晓合适的调释给药装置。

本发明还提供了包括本发明的组合物的试剂盒。试剂盒进一步包括含有用于给药途径而制成的组合物的包装或容器。试剂盒可合适的含有关于服药的说明书以及关于该组合物的插页。

本领域已知的许多包装或试剂盒用于分装药物组合物供定期使用。在一个具体实施方式中，包装含有各个时期的指示。在另一个具体实施方式中，包装为箔或泡罩包装、标签安瓿、小瓶或瓶。

试剂盒的包装手段可以自带给药装置，例如吸入器、注射器、吸移管、滴眼管、导管、膀胱内窥镜（cytoscope）、套管针、套管、压力喷射装置或其它此类装置，制剂可以从这些装置被施加至身体的受影响区域（例如肺），注射进入患者身体，递送至膀胱组织或甚至是施加至试剂盒的其它成分并与之混合。

试剂盒的一种或多种成分也可以以干燥或冻干形式提供。当通过干燥形式提供试剂或成分时，一般通过添加合适的溶剂来复原。可以预见试剂也可以用另一个包装提供。试剂盒可包括用于容纳小瓶的装置或其它适于商业销售的封闭限制包装手段，例如其中置有小瓶的注塑或吹塑容器。无论上述的包装的数量或类型如何，试剂盒都可以包括或包装有单独的用于辅助组合物在动物体内的注射/施用或放置的仪器。此类仪器可以为吸入器、注射器、吸移管、钳子、量匙、滴眼管、导管、膀胱内窥镜（cytoscope）、套管针、套管、压力递送装置或任意此类准予药用的递送装置。

术语“治疗”或其变体包括用于解决患者或受试者健康问题或病症的疗法。在一个具体实施方式中，健康问题或病症可以被永久或短时间解决。在另一个具体实施方式中，健康问题或病症的严重程度，或健康问题或病症的一个或多个症状特性，可以被永久或短时间减轻。可使用任意标准疼痛指数（例如本发明所述的那些指数）或患者对疼痛的主观感受来确定治疗疼痛的有效程度。如果有报告患者疼痛减轻了或对导致疼痛的刺激的反应减轻，则该患者可以被视为“受到治疗”。

现在将通过下述实施例进一步示例性说明本发明，但这些实施例不应以任何方式被解释为对本发明的保护范围加以限制。相反，应当清楚的理解，可以以各种其它具体实施方式、改进和等同方式作为解决手段，通过阅读本说明书，本领域的技术人员将理解这些手段不会背离本发明的精神。

实施例

下文提供的实施例用于辅助对本发明进行完整的理解。迄今为止，为了辅助开发含有覆盖广大患者的肽疫苗，含有覆盖HPV整个蛋白质序列的15-30个氨基酸的重叠肽序列的疫苗已经被研发出来。虽然电脑模拟的肽结合分析能够确定肽与各种HLA分子的结合，该方法已经被保守的用于设计独立于HLA的疫苗，因为可以很好的确定并非所有能够与MHC分子结合的肽都可以被天然地进行细胞内处理，并且实际HLA覆盖范围可能比预期的显著降低。

因此，为了成功开发可提供广泛患者覆盖范围的简单HPV治疗性疫苗而不使用大量的肽，也无需完整表达疫苗中的整个E6和E7蛋白质序列，需要一种替代方法。在本发明开发的方法的设计更简单的制剂的第一步是设计数个来自HPV16 E6和E7蛋白质的肽库。下一步时进行广泛的体内研究来筛选肽，从而确认或理解免疫系统正确处理具体肽以及通过MHC I类和II类将正确的T细胞表位分别提呈至CD8+和CD4+T细胞的能力。正确获取该信息的唯一方法是通过实际体内研究来评估T细胞响应。

在该研究中，利用TC-1肿瘤模型在C57/B6小鼠身上通过肿瘤消退研究并在HLA-A2人源化转基因小鼠身上进行干扰素γ ELISPOT研究来评估T细胞响应。下一步是基于获得的T细胞免疫响应选定合适或优选的肽，并淘汰无T细胞响应或非常弱的T细胞响应的序列。然后通过电脑模拟结合分析来分析选定的活性肽来确定它们与各种HLA分子的结合亲和性。在分析的末尾，结合体内数据和电脑模拟分析，目标是选定源自体内研究的活性肽序列的最小数量，所述最小数量是在组合使用电脑模拟分析时，通过电脑模拟分析预测的覆盖至少90%人群的数量。最后，选定肽组合入疫苗制剂。然后测试该制剂的T细胞诱发效果以确保由于结合位点的竞争，任意选定序列的效能并未大量降低并且仍可获得所有包括在内的肽的T细胞响应。最后，在人类临床试验中确认覆盖范围的幅度。

在本发明中在C57/B6小鼠进行肿瘤退缩研究并在HLA-A2人源化转基因小鼠进行干扰素γ ELISPOT研究来完成序列选定。在使用肿瘤退缩进行的肽评估研究中，阳性T细胞响应是导致细胞退缩的T细胞响应。在HLA-A2小鼠模型ELISPOT研究中，每百万个脾细胞至少20个斑点被认为是阳性响应。

本发明提供的总结性结果显示了阳性或阴性T细胞响应。所提供的细节使任何熟悉本领域的人都会理解将通过体内方式广泛筛选肽序列作为第一步并遵循和复制本发明的所有步骤的必要性。

本发明还提供了图例，其显示了通过电脑模拟结合分析进行的肽HLA结合预测确认和对应于至少90%的患者覆盖范围。这些图例将使熟悉本领域的任何人正确的遵循以下流程：第一，选定具有免疫原性的E6和E7肽序列；第二，对它们进行体内检测来确定处理和提呈；第三，在体内显示出合适的免疫原性的为选定序列，免疫原性较小的序列被淘汰；第四，对肽进行电脑模拟结合分析来确定各个肽与各种HLA类型的结合亲和性；最后，选定被预测为提供至少90%覆盖范围的肽化合物。在本案中，进行人类临床研究来测试和确认预测。

以下实施例例举了制造和实施本发明的示例性模型。但是，本发明的保护范围并不局限于在这些实施例中公开的具体实施方式，它们仅为举例，因为可以用其它方法来获取类似结果。已在表1中提供了本发明例举的肽序列。

表1

体内筛选的肽序列样本及所获得的免疫响应

*不符合用于选定以在结合研究中评估的药效标准

实施例1

在C57/B6小鼠中通过TC-1肿瘤退缩法筛选肽序列。

本实施例例举了在TC-1小鼠肿瘤退缩模型中评估或筛选数个HPV16 E7肽以获取导致HPV特异性T细胞诱发及后续肿瘤退缩的关键表位的有效处理和提呈。

在肿瘤退缩筛选研究中，在第0日向小鼠移植了100000个TC-1细胞。在第7日，一旦确定肿瘤生成，就用单独制备的或与辅助吸收和提呈的阳离子脂质（例如DOTMA、DOEPC或R-DOTAP）组合制备的具体肽序列对小鼠接种。在这些研究中，疫苗含有浓度为0.1-3.0mg/mL的选定肽和浓度为0.2-3.0mg/mL的阳离子脂质体。在通过附加棕榈酰链脂化肽序列的情况下，只要在接种前将肽与阳离子脂质体混合。在非脂化肽的情况下，通过传统薄膜脂质体制备法来制成脂质体并封装肽（F Szoka, and D Papahadjopoulos, ComparativeProperties and Methods of Preparation of Lipid Vesicles (Liposomes), AnnualReview of Biophysics and Bioengineering, Vol. 9:467-508, 1980）。也可以使用本领域技术人员已知的其它方法。

图3显示了示例性肿瘤退缩图，其显示了对应于SEQ ID NO: 1 （空心方块）, SEQID NOS: 7、8、31、32和31 （黑实心圆）, SEQ ID NO: 7 （空心圆）和SEQ ID NO: 8 （黑实心三角）的肽结果。这些结果突出显示了以下事实：一些HPV E7序列导致了有效的肿瘤退缩，而其它的并没有，假定是因为不能有效的提呈所需的CD8+T细胞表位。选定的结果已总结在表1中。

实施例2

通过IFN-G ELISPOT研究在HLA-A2小鼠中筛选的肽序列。

该实施例强调了使用ELISPOT研究在人源化HLA-A2转基因小鼠评估T细胞响应的方法。在这些研究中，疫苗含有浓度为0.1-3.0mg/mL的选定肽以及浓度为0.2-3.0mg/mL的阳离子脂质体（使用时）。在第0日和第7日对具有人免疫系统成分能够识别人类抗原的人源化HLA-A2转基因小鼠接种100uL的疫苗。在第14日，杀死小鼠，使用标准方法通过干扰素γELISPOT对来自小鼠（每组4-8只）的脾细胞评估HPV特异性免疫响应。用所述的CD8+T细胞表位肽或表2所述的长多表位肽来刺激脾细胞。罗列了每百万细胞的IFN-g斑点数量作为详细示例。最少20个斑点为足够效能以及选定用于结合表位结合研究的界限。当用长多表位肽及短单表位肽中每一个刺激时人源化转基因小鼠成功产生T细胞免疫响应（>20斑点）的能力确认选定的肽被有效的处理并提呈至T细胞。在这些研究中，未受刺激的脾细胞和被无关肽所刺激的脾细胞在每个检测中均被共同用作阴性对照。在阳性对照中使用ConA。

表2

IFN-g ELISPOT研究总结–选定序列

*不符合在结合研究中用于评估选定的效用标准

实施例3

选定序列的化学改性（如氧化）和多聚体形成在HPV16疫苗的免疫原性的作用。

本研究用于评估选定肽化学改性对免疫原性及其被处理、提呈至并诱发（prime）人类CD8+ HPV特异性T细胞响应的能力的影响。对应于SEQ ID NO: 23和25的肽包含半胱氨酸，其在氧化后导致二聚体和其它多聚体的形成。制备的两种疫苗制剂包含对应于SEQ IDNO: 23和25的肽。

在制剂A中：两种肽为单体，其具有通过HPLC分析确认的高纯度。该疫苗所包含的每种肽为1.5-1.6mg/mL。

在制剂B中：两种肽的显著氧化和多聚体形成通过HPLC分析确认。

在接种前，两种制剂与5.8mg/mL的R-DOTAP 1:1混合。

通过评估诱发CD8+T细胞的能力来按照上述实施例所述的方式对比10只HLA-A2小鼠中每制剂中肽的免疫原性。依照上述方式进行ELISPOT研究。下文的表3显示了ELISPOT研究的结果及使用Student T检验（student’s T test）的对比。统计分析的结果表明制剂A和B之间的差别不显著符合P<0.05的P值。该研究表明改性（例如氧化）不会对肽序列的免疫原性产生负面影响。

表3

肽序列23和25的化学改性（如氧化）和多聚体形成对肽的CD8+ T细胞免疫原性的作用

实施例4

能够在含有4种选定肽序列的多表位肽疫苗中结合HPV肽的潜在HLA等位基因的电脑模拟分析的总结。

在人源化HLA-A2小鼠中设计和体内评估上述实施例中所述的数个HPV16 E6和E7肽序列中的肽被有效处理及具体表位被提呈诱发抗原特异性T细胞的能力。本领域技术人员清楚知晓，肽表位的相互作用是复杂的，取决于许多因素，包括立体化学、辅因子的存在和环境的生化性质。相应的，选定适当的肽以在疫苗中获取最佳效果既非常规也非可预测的操作。基于用于识别合适的可被有效处理和向T细胞表位提呈的肽序列的广泛的体内研究，选定的肽被基于其诱发生成肿瘤退缩或诱发IFN-γ诱发的HPV特异性T细胞的能力而被进一步选定，然后再通过电脑模拟分析来进行分析以评估其HLA覆盖范围。然后在人类临床试验中验证预测。

HLA超类型HLA-A2占了人群的约42%（Sette, A. and J. Sidney, Nine majorHLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and -Bpolymorphism. Immunogenetics, 1999. 50(3-4): p. 201-12）。HPV16 E6和E7实验性表达了可由HLA A2所提呈的确认表位以及其它HLA类型可提呈的表位。

为此，评估了肽与代表9种主要HLA超类型的9种不同HLA分子的结合亲和性（Sette, A. and J. Sidney, HLA supertypes and supermotifs: a functionalperspective on HLA polymorphism. Curr Opin Immunol, 1998. 10(4): p. 478-82）。所述9种主要HLA超类型占据了人群中98%以上的肽结合可能性（Sette, A. and J.Sidney, Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderanceof HLA-A and -B polymorphism. Immunogenetics, 1999. 50(3-4): p. 201-12）。在本发明所提供的实施例中描述了导致识别用于评估HLA结合的合适序列的广泛筛选体内研究，以及确保当与被组合在疫苗制剂时结合位点的竞争不会降低免疫系统处理和提呈具体T细胞表位的确认性研究。本研究表明，虽然肽选定技术和肽筛选技术是可用的，识别、选定和组合肽以优化创造具有广泛适用性的有效疫苗的方法既非常规也不是可直接获得的。

表4

筛选后4种肽序列的结合活性

表4就公开目的总结了通过T细胞诱发研究识别的四种优选肽序列的肽结合分析的结果以及使用免疫表位数据库（www.iedb.org）中存在的表位预测工具预测的这些序列所覆盖的可能表位。该工具计算了肽与特定HLA I类等位基因的预测结合亲和性（IC50）。IC50值为5000nM或以下时一般被报告为足以进行生物相关结合，而结合亲和性小于500nM的提呈被视为代表高亲和性结合。在当前分析中，选择2000nM作为评估潜在HLA结合肽的界限。如表4所示，代表5种不同HLA超类型的至少5中不同HLA分子被识别为与SEQ ID NOS: 5、9、10及11或23-26内不同肽具有显著生物结合和提呈潜力。已知这5个超类型代表大于90%的人群，无论其种族划分如何[Sette, A. and J. Sidney, Nine major HLA class Isupertypes account for the vast preponderance of HLA-A and -B polymorphism.Immunogenetics, 1999. 50(3-4): p. 201-12]。

实施例5

R-DOTAP之外的其它阳离子脂质与HPV E6和E7肽序列的兼容性以及诱发HPV特异性T细胞响应的能力。

为了确定识别的长HPV16肽是否与DOTAP之外的其它阳离子脂质相兼容，使用对应于SEQ ID NO: 26的肽作为模型肽，并结合使用另外两种阳离子脂质DOTMA和DOEPC。为了评估肽有效的进行处理和提呈的能力，在两种阳离子脂质都存在的情况下，使用普通C57/B6小鼠来进行ELISPOT研究。以上文所述的方式进行ELISPOT研究，用于确定有效的CD8+ T细胞诱发。

在制剂1中，1.35mg/mL的DOTMA与0.5mg/mL对应于SEQ ID NO: 26的肽1:1（体积比）混合。

在制剂2中，1.67mg/mL的DOEPC与0.5mg/mL对应于SEQ ID NO: 26的肽1:1（体积比）混合。

对于每个制剂，在第0日和第7日对4只小鼠接种。在第14日杀死小鼠，将脾细胞用于ELISPOT研究。

表5

含有各种阳离子脂质的HPV肽制剂的ELISPOT结果

该研究表明各种阳离子脂质都可以与被识别出的HPV E6和E7肽一起用于诱发强烈的HPV特异性T细胞响应。

实施例8

脂化肽（SEQ ID NOS: 23-28）与R-DOTAP阳离子脂质在HPV治疗性疫苗中的用途以及在人类临床试验中评估HPV特异性T细胞响应。

在人类临床试验（临床试验政府编号NCT02065973）中评估包含实施例1-4中基于体内T细胞响应和肽结合所设计的用于覆盖90%人群的4种肽（SEQ. ID NOS: 23-26）以及已经包含在SEQ ID NOS: 24和25中的额外2种单表位肽（SEQ ID NOS: 27 and 28）的6肽制剂。该制剂中所包括的2种单表位肽未提供额外覆盖范围，因此它们已经被包含在已包括的2个长肽序列之中。

在该说明性研究中，由于生物系统和人类响应的可变性质，同时利用INF-γ和颗粒酶-B ELISPOT来评估对疫苗的免疫响应。各个受试者接受3次R-DOTAP/肽制剂接种。所有受试者接受3次接种，每3周1次。在预接种前（基线）、每次接种后14-19日以及最后一次接种后第90日采血，以通过ELISPOT进行免疫监视。受试者不局限于HLA类型，目的是验证疫苗的广泛覆盖范围。使用受试者PBMCs并用6-肽混合物进行刺激来进行ELISPOT分析，以确定有效提呈和HPV肽识别了T细胞。

人类临床研究的结果显示在下表6中。疫苗诱发的响应典型的被定义为免疫响应比基线增加2或3倍。在本研究中，免疫响应被定义为用IFN-γ或颗粒酶-b分析测定的接种后T细胞响应相较于基线样本增加了3倍或更多。两个受试者，即受试者2和5具有强烈的T细胞响应，IFN-γ法在基线测定的斑点数超过420个（免疫系统可能已经对最近的HPV感染产生了响应），这种情况被视为异常（表6）。测试所有受试者的HLA类型。不出所料，半数受试者为HLA-A2，因为这是最常见的HLA类型。但是，包括非HLA-A2受试者（HLA-A1、30、3、74、80等）在内的所有受试者都对疫苗产生了强烈的T细胞响应。研究确认了4种多表位肽（SEQ ID NOS:23-26）的组合提供了广泛适用的人类HPV16疫苗，其可以被具有不同基因背景的患者所识别。

表6

通过INF-γ和颗粒酶-B ELISPOT评估包含阳离子脂质和肽（SEQ ID NO: 23-28）的HPV16疫苗制剂在含有不同HLA类型的人类受试者中诱发（prime）包括CD8+ T 细胞在内的抗原特异性T细胞的能力

*基线为访问2（预接种访问）计数减去背景计数。

**最大响应是在受试者身上观察到的最大响应（计数）减去背景计数。

***相对基线增加量因数是最大响应除以基线计数（≥3的因数被视为由于接种^4,5引起的免疫响应）。

****计数减去背景所得结果为负数时，记值为0且0/0 = 0

^#有活性：通过IFN-γ和/或颗粒酶-b ELISPOT法所得的相对基线增加量因数≥3。

Claims (16)

1. 一种组合物，其特征在于，所述组合物包括：

四种HPV肽抗原，所述HPV肽抗原用于诱发针对HPV感染的免疫响应，其中所述HPV肽抗原由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，或它们的棕榈酰化版本构成，其中至少一种HPV肽抗原是多表位肽；和

佐剂，其中所述佐剂包含阳离子脂质。

2.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括：

四种HPV肽抗原，所述HPV肽抗原用于诱发针对HPV感染的免疫响应，其中所述HPV肽抗原由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，或它们的棕榈酰化版本构成，其中至少一种HPV肽抗原是多表位肽；

至少一种单表位肽抗原，所述单表位肽抗原选自SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 28；和

佐剂，其中所述佐剂包含阳离子脂质。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述HPV肽抗原作为单独的肽存在于所述组合物中。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述HPV肽抗原通过间隔区或不通过间隔区彼此偶联形成包含所述序列的单个长肽。

5.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质包括DOTAP、DDA、DOEPC、DOTMA、R-DOTAP、R-DDA、R-DOEPC、R-DOTMA、S-DOTAP、S-DDA、S-DOEPC或S-DOTMA。

6.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括增强子激动剂表位。

7.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述HPV肽抗原包括改性肽、肽类似物及其活性片段。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述HPV肽抗原被氧化。

9. 根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述HPV肽抗原为SEQ ID NO:5、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，并且所述阳离子脂质包括R-DOTAP。

10. 根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述HPV肽抗原为SEQ ID NO:5的棕榈酰化版本、SEQ ID NO:9的棕榈酰化版本、SEQ ID NO:10的棕榈酰化版本和SEQ ID NO:11的棕榈酰化版本，并且所述阳离子脂质包含R-DOTAP。

11.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述HPV肽抗原被包括阳离子脂质的脂质体所封装。

12. 组合物在制备用于诱发针对受试者HPV感染的免疫响应的疫苗中的用途，其特征在于，所述组合物包括：

四种HPV肽抗原，所述HPV肽抗原用于诱发针对HPV感染的免疫响应，其中所述HPV肽抗原由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，或它们的棕榈酰化版本构成，其中至少一种HPV肽抗原是多表位肽；和

佐剂，其中所述佐剂包含阳离子脂质。

13.组合物在制备用于诱发针对受试者HPV感染的免疫响应的疫苗中的用途，其特征在于，所述组合物包括：

四种HPV肽抗原，所述HPV肽抗原用于诱发针对HPV感染的免疫响应，其中所述HPV肽抗原由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，或它们的棕榈酰化版本构成，其中至少一种HPV肽抗原是多表位肽；

至少一种单表位肽抗原，所述单表位肽抗原选自SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 28；和

佐剂，其中所述佐剂包含阳离子脂质。

14.根据权利要求12或13所述的用途，其特征在于，所述阳离子脂质包含DOTAP、DDA、DOEPC、DOTMA、R-DOTAP、R-DDA、R-DOEPC、R-DOTMA、S-DOTAP、S-DDA、S-DOEPC或S-DOTMA。

15. 根据权利要求12或13所述的用途，其特征在于，所述HPV肽抗原为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，并且所述阳离子脂质包括R-DOTAP。

16. 根据权利要求12或13所述的用途，其特征在于，所述HPV肽抗原为SEQ ID NO:5的棕榈酰化版本、SEQ ID NO:9的棕榈酰化版本、SEQ ID NO:10的棕榈酰化版本和SEQ ID NO:11的棕榈酰化版本，并且所述阳离子脂质包含R-DOTAP。