BR112019006831A2 - vacinas de célula t restrita a não hla de hpv16, composições e métodos de uso das mesmas - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a composições imunogênicas de papilomovírus humano e métodos de uso das mesmas. as composições compreendem sequências de peptídeo de múltiplos epítopos especificamente selecionadas e designadas a serem eficazmente processadas e apresentadas de forma cruzada às células t. os peptídeos utilizados nas composições exibem altos níveis de ligação com supertipos de hla. as composições imunogênicas são amplamente aplicáveis a grandes proporções de populações alvo. as composições compreendem adjuvantes tais como lipídios catiônicos.

Description

Relatório Descritivo de Pedido de Patente de Invenção para ’’VACINAS DE CÉLULA T RESTRITA A NÃO HLA DE HPV16, COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS”.

CAMPO TÉCNICO [001] A presente invenção refere-se, de modo geral, às vacina de HPV16, em particular, vacinas de célula T não restrita à HLA, composições e métodos de uso das mesmas.

ANTECEDENTES [002] A vacinação terapêutica com antígenos de proteínas E6 e E7 de HPV tem demonstrado fornecer forte potencial para o tratamento de cânceres induzidos por HPV, como câncer cervical, anal, vulvar, vaginal, de cabeça e pescoço, bem como neoplasias précancerosas. Devido à capacidade limitada de realizar apresentação cruzada de antígeno para induzir respostas de células T específicas para HPV, os primeiros métodos para a vacinação terapêutica contra HPV dependeram da inclusão e apresentação de epítopos de peptídeo CD8 + curtos e simples. Estas vacinas contra o HPV com base em peptídeos, devido aos epitopos HLA-A2 restritos, demonstraram uma aplicabilidade muito limitada, mesmo dentro das populações selecionadas de HLA-A2 avaliadas. Métodos mais recentes para superar essa desvantagem crítica das vacinas contra o câncer têm focado em dois métodos ou plataformas principais: 1. A liberação de DNA proteico de tamanho natural de HPV codificado em vetores vivos tais como bactérias e vírus modificado. 2. O uso de múltiplos peptídeos de múltiplos epítoposs longos que se sobrepõem abrangendo as sequências de proteína E6 e HPV16 de tamanho natural inteiro. Ambos os métodos são voltados para superar as restrições genéticas do paciente enfrentadas com o uso de peptídeos HLA-A2 de epítopo único sim a fim de tratar uma ampla população de pacientes, e ambos os métodos mostram potencial promissor em

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[003] A análise in-silico da ligação de peptídeos foi usada efetivamente para entender a potencial capacidade de ligação de peptídeos imunogênicos. Esta técnica, entretanto, não tem sido usada para projetar de forma mais eficiente as vacinas contra o câncer, que têm as características de serem simples e mesmo assim terem o potencial de atender às necessidades de amplas populações de pacientes com variadas origens genéticas.

[004] As células T mediam uma faixa de respostas imunes, incluindo aqueles responsáveis pela clearance de patógenos intracelulares, células infectadas por vírus e células de tumor, bem como aquelas responsáveis por rejeição de transplante e autoimunidade. O sistema imunológico de célula T é adaptado para reconhecer células estranhas, bem como autocélulas alteradas e eliminá-las do corpo. O reconhecimento de célula T ocorre por meio do receptor de célula T (TCR). O processo requer que o antígeno do peptídeo seja apresentado ao TCR por uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) localizada na superfície de uma célula apresentadora de antígeno (APC) tal como uma célula dendrítica. As moléculas do MHC humano são referidas como antígenos leucocitários de histocompatibilidade humana (HLA). O antígeno peptídico é ligado à molécula do MHC de uma maneira que permite que o receptor da célula T reconheça a estrutura única formada pela combinação da molécula do MHC e do peptídeo específico. Um aspecto limitante da funcionalidade das células T é que os polimorfismos nas moléculas de MHC, bem como o amplo espectro de peptídeos únicos que podem se associar com o MHC, resultam em um padrão de reconhecimento diverso de modo que uma determinada combinação de MHC-peptídeo seja reconhecida apenas por uma fração de clones de células T.

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3/55 [005] Existem dois tipos principais de moléculas de MHC envolvidas na apresentação de antígenos: classe I e classe II. As moléculas do MHC de classe I são compostas por uma cadeia alfa com 3 domínios, bem como domínios transmembranares e citoplasmáticos. As moléculas do MHC de classe I são amplamente distribuídas e estão presentes em todas as células nucleadas. As moléculas da classe II do MHC são compostas por uma cadeia alfa e uma cadeia beta que se autoassociam para formar um heterodímero. Cada cadeia tem dois domínios extracelulares, bem como domínios transmembranares e intracelulares. As moléculas da classe II do MHC são mais restritas na distribuição do que as moléculas da classe I e estão presentes, por exemplo, em células apresentadoras de antígenos (APCs).

[006] Os linfócitos T citotóxicos (CTL) que foram especificamente ativados contra um determinado antígeno são capazes de matar a célula que contém ou expressa o antígeno. O TCR de um CTL reconhece um antigénio no contexto de uma molécula de MHC de classe I. Um papel importante para os linfócitos T auxiliares (células Th) é a indução ideal de uma resposta de CTL e eles também podem desempenhar um papel na manutenção da memória CTL. O TCR de uma célula Th reconhece um antígeno no contexto de uma molécula de MCH de classe II.

[007] A vacinação terapêutica para preparar as células T que reconhecem o antígeno demonstrou ser uma opção viável para a imunoterapia ativa de cânceres que visam tratar a doença em estágio inicial e tardio ativando o sistema imunológico de um paciente. Os vários mecanismos ativados pela vacinação terapêutica atacam e destroem especificamente as células cancerígenas que expressam o antígeno e ignoram as células normais. As vacinas terapêuticas contra o câncer, em princípio, podem, portanto, ser eficazes na inibição do

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4/55 crescimento do tumor, bem como no tratamento de tumores recorrentes que são refratários às terapias convencionais, como cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Uma vacina terapêutica contra o câncer para tratar o câncer de próstata já foi aprovada pela U.S. Food and Drug Administration. Este grande avanço abriu o caminho para novos métodos de vacinação terapêutica que podem proporcionar maior segurança e eficácia. Diversos tais métodos estão atualmente sendo avaliados, tanto pré-clínica quanto clinicamente. Ao contrário das vacinas de indução de anticorpos profiláticos que geralmente são administradas a indivíduos saudáveis, as vacinas terapêuticas contra o câncer são administradas aos pacientes com câncer e projetadas para erradicar as células cancerosas por meio do fortalecimento das respostas imunes do próprio paciente, especificamente das respostas das células T (Lollini PL, Cavallo F, Nanni P, Forni G. Vaccines for tumour prevention. Nature reviews. Cancer. 2006;6:204-216).

Antígenos Associados ao Tumor como Alvos terapêuticos [008] Vacinas recombinantes, que são baseadas nas proteínas de antígenos associados ao tumor (TAAs) definidos, ou vacinas de peptídeo sintético derivadas de TAAs, geralmente administradas em combinação com um adjuvante ou um modulador imunológco, apresentam vantagens significantes em custo e simplicidade em relação às vacinas autológas e DC. A disponibilidade de amostras ou espécimes do paciente e o complexo procedimento de preparação das vacinas individualizadas limitam o amplo uso de vacinas contra o câncer autólogo. MAGE-1 é o primeiro gene reportado codificar um antígeno tumoral humano reconhecido por células T (van der Bruggen P, Traversal C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, Van den Eynde B, Knuth A, Boon T. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science. 1991;254:1643-1647., e foi bem estudado e usado em vacinas contra câncer clínico. A

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Identificação de diversos TAAs forneceu a capacidade de desenvolver e planejar várias vacinas terapêuticas direcionadas para tratar uma ampla faixa de cânceres. Tais TAAs foram classificados em diversas categorias dprincipais. Antígenos de câncer de testículo, tais como NY-ESO-1, BAGE, MAGE e SSX-2, são codificados por genes que são tipicamente silenciados em tecidos adultos, porém reativados transcricionalmente em células tumorais (De Smet C, Lurquin C, van der Bruggen P, De Plaen E, Brasseur F, Boon T. Sequence and expression pattern of the human MAGE2 gene. Immunogenetics. 1994;39:121-129; Gnjatic S, Ritter E, Buehler MW, Giese NA, Brors B, Frei C, Murray A, Halama N, Zornig I, Chen YT, Andrews C, Ritter G, Old LJ, Odunsi K, Jager D. Seromic profiling of ovarian and pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010;107:5088-5093; Hofmann O, Caballero OL, Stevenson BJ, Chen YT, Cohen T, Chua R, Maher CA, Panji S, Schaefer U, Kruger A, Lehvaslaiho M, Carninci P, Hayashizaki Y, Jongeneel CV, Simpson AJ, Old LJ, Hide W. Genome-wide analysis of cancer/testis gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008;105:20422-20427; Karbach J, Neumann A, Atmaca A, Wahle C, Brand K, von Boehmer L, Knuth A, Bender A, Ritter G, Old LJ, Jager E. Efficient in vivo priming by vaccination with recombinant NY-ESO-1 protein and CpG in antigen naive prostate cancer patients. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2011;17:861-870). Os antígenos de diferenciação tecidual são antígenos de origem tecidual normal e compartilhados tanto pelos tecidos quanto tumores normais, porém elevados em células tumorais, tal como o melanoma (gp1OO, Melan~A / Mart~1 e tirosinase).) (Bakker AB, Schreurs MW, de Boer AJ, Kawakami Y, Rosenberg SA, Aderna GJ, Figdor CG. Melanocyte lineage-specific antigen gp100 is

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6/55 recognized by melanoma-derived tumor-infiltrating lymphocytes. J Exp Med. 1994;179:1005-1009..Bakker AB, Schreurs MW, de Boer AJ, Kawakami Y, Rosenberg SA, Adema GJ, Figdor CG. Melanocyte lineage-specific antigen gp100 is recognized by melanoma-derived tumor-infiltrating lymphocytes. J Exp Med. 1994;179:1005-1009), prostate cancer (PSA, PAP) (Correale P, Walmsley K, Nieroda C, Zaremba S, Zhu M, Schlom J, Tsang KY. In vitro generation of human cytotoxic T lymphocytes specific for peptides derived from prostatespecific antigen. J Natl Cancer Inst. 1997;89:293-300; Kantoff PW, Higano CS, Shore ND, Berger ER, Small EJ, Penson DF, Redfern CH, Ferrari AC, Dreicer R, Sims RB, Xu Y, Frohlich MW, Schellhammer PF. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. The New England journal of medicine. 2010a;363:411-422) e carcinomas de mama (mamaglobina-A) (Jaramillo A, Majumder K, Manna PP, Fleming TP, Doherty G, Dipersio JF, Mohanakumar T. Identification of HLA-A3-restricted CD8+ T cell epitopes derived from mammaglobin-A, a tumor-associated antigen of human breast cancer. International journal of cancer. Journal international du cancer. 2002;102:499-506). Similares a estes antígenos associados à diferenciação, diversos outros antígenos tumotais, tal como CEA (Tsang KY, Zaremba S, Nieroda CA, Zhu MZ, Hamilton JM, Schiom J. Generation of human cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigen epitopes from patients immunized with recombinant vaccinia-CEA vaccine. J Natl Cancer Inst. 1995;87:982990), MUC-1(F/nn OJ, Gantt KR, Lepisto AJ, Pejawar-Gaddy S, Xue J, Beatty PL. Importance of MUC1 and spontaneous mouse tumor models for understanding the immunobiology of human adenocarcinomas. Immunologic research. 2011;50:261-268), HER2/Neu (Disis ML, Wallace DR, Gooley TA, Dang Y, Slota M, Lu H, Coveler AL, Childs JS, Higgins DM, Fintak PA, dela Rosa C, Tietje K,

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Link J, Waisman J, Salazar LG. Concurrent trastuzumab and HER2/neu-specific vaccination in patients with metastatic breast cancer. Journal of clinical oncology, official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2009;27:4685-4692), genes supressores de tumor (p53) (Azuma K, Shichijo S, Maeda Y, Nakatsura T, Nonaka Y, Fuji's T, Koike K, Itoh K. Mutated p53 gene encodes a nonmutated epitope recognized by HLA-B*4601-restricted and tumor cell-reactive CTLs at tumor site. Cancer Res. 2003;63:854-858), hTERT (Vonderheide RH, Hahn WC, Schultze JL, Nadler LM. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity. 1999;10:673-679) e certas proteínas antiapoptóticas (por exemplo, survivina) (Vonderheide RH, Hahn WC, Schultze JL, Nadler LM. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity. 1999;10:673-679 ) são também altamente elevados em tecidos tumorais em comparação com contrapartes normais. Antígenos específicos de tumores únicos são frequentemente referidos como oncogenes mutados (ras, B-raf) (Brichard VG, Lejeune D. Cancer immunotherapy targeting tumourspecific antigens: towards a new therapy for minimal residual disease. Expert opinion on biological therapy. 2008;8:951-968). O alvejamento destes antígenos específicos de antígeno envolvidos na condução do processo neoplásico tem a vantagem da resistência à imunosseleção com potencial para ser mais eficaz. Embora numerosos antigénios específicos de tumores tenham sido identificados e utilizados, continua a haver uma demanda crescente para a identificação de tais antígenos adicionais por uma variedade de razões: aada a grande variedade de perfis genéticos entre a população humana, é necessário identificar antígenos com especificidade crescente para grupos particulares, independentemente de como tais grupos são identificados, seja etnia

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8/55 ou localização geográfica, por exemplo. Continua a haver uma necessidade na indústria farmacêutica de tornar o processo de produção de vacinas mais preciso e menos pesado, e, consequentemente, o isolamento de antígenos, proteínas e peptídeos mais precisamente associados com a indução de uma resposta imune apropriada é um objetivo contínuo.

[009] Vacinas com base em proteína/peptídeo têm um a clara vantage de custo com relação às vacinas autólogas ou individualizadas. Entretanto, o fato de que elas visam apenas um epítopo ou alguns epítopos do TAA pode ser considerado uma desvantagem. Geralmente, acredita-se que a indução tanto de CLTs específicos de antígeno quanto células T auxiliadoras de CD4⁺ específicas de antígeno seja necessária para uma vacina contra o câncer ser otimamente eficaz. Algumas vacinas de polipetídeo (por exemplo, Stimuvax®) potencialmente contém tanto epítopos de CD4 quanto CD8. Outro método para realçar a imunogenicidade de um autoantígeno foi alterar a sequência de peptídeo de TAAs para introduzir epítopos agonistas realçadores, que aumentam a ligação do peptídeo à molécula de MHC ou ao receptor de células T, resultando em níveis mais elevados de respostas de células T e/ou células T de avidez mais elevadas (Dzutsev AH, Belyakov IM, Isakov DV, Margulies DH, Berzofsky JA. Avidity of CD8 T cells sharpens immunodominance. International immunology. 2007;19:497-507; Jordan KR, McMahan RH, Kemmler CB, Kappler JW, Slansky JE. Peptide vaccines prevent tumor growth by activating T cells that respond to native tumor antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010;107:4652-4657; Rosenberg SA, Yang JC, Schwartzentruber DJ, Hwu P, Marincola FM, Topalian SL, Restifo NP, Dudley ME, Schwarz SL, Spiess PJ, Wunderlich JR, Parkhurst MR, Kawakami Y, Seipp CA, Einhorn JH, White DE. Immunologic and

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9/55 therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma. Nat Med. 1998;4:321-327).

[0010] Um método comum para vacinação terapêutica contra câncer foi a vacinação com peptídeo de ligação ao antígeno de leucócito humano (HLA) do MHC, derivado da sequência de TAA. As células T reconhecem seus antígenos alvo como peptídeos de 8~10 aminoácidos apresentados por moléculas de MHC de classe I na superfície celular. Uma grande desvantagem deste método é o fato de que os seres humanos são geneticamente diversos com uma ampla faixa de alelos de HLA que reconhecem e se ligam a diferentes antígenos peptídicos. Como um resultado, vacinas contra câncer com base em peptídeos curtos demonstraram aplicabilidade muito limitada e métodos recentes têm requerido a inclusão de diversos peptídeos, às vezes mais de 10 peptídeos, a fim de fornecer uma cobertura razoável da populaçãos.

Vacinas Contra HPV [0011] Proteínas HPV E6 e E7 são constitutivamente coexpressas em todas as células pré-cancerosas infectadas por HPV e são as transcrições virais mais abundantes encontradas em biópsias de células de carcinoma cervical relacionado com HPV (K. Seedorf, T. Oltersdorf, G. Krammer, W. Rõwekamp, Identification of early proteins of the human papilloma viruses type 16 (HPV 16) and type 18 (HPV 18) in cervical carcinoma cells. EMBO J. 6, 139-144 (1987).) Por causa de sua interação com as proteínas p53 e retinoblastoma proteins (D. Pirn, A. Storey, M. Thomas, P. Massimi, L. Banks, Mutational analysis of HPV-18 E6 identifies domains required for p53 degradation in vitro, abolition of p53 transactivation in vivo and immortalisation of primary BMK cells. Oncogene 9, 1869-1876 (1994)), E6 e E7 são responsáveis para a transformação de células e são requeridas para a manutenção de malignidades associadas com (K.

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Münger, P. M. Howley, Human papillomavirus immortalization and transformation functions. Virus Res. 89, 213-228 (2002)). Notavelmente, respostas imunes células específicas de E6 e E7 estão associadas com a regressão de lesões associadas com HPV16 (S. Peng, C. Trimble, L. Wu, D. Pardoll, R. Roden, C. F. Hung, T. C. Wu, HLA-DQB1*02-restricted HPV-16 E7 peptide-specific CD4+ T-cell immune responses correlate with regression of HPV-16-associated high-grade squamous intraepithelial lesions. Clin. Cancer Res. 13, 2479-2487 (2007)). Farhat et al. reportaram que, em comparação com mulheres com infecção por HPV16 cervical persistente, as porcentagens de respostas de imunospot (ELISpot) ligadas à enzima positiva às HPV16 E6 e E7 são significantemente aumentadas entre as mulheres com infecção por HPV recentemente resolvida (S. Farhat,

M. Nakagawa, A. B. Moscicki, Cell-mediated immune responses to HPV-16 E6 and E7 antigens as measured by interferon gamma enzyme-linked immunospot in women with cleared or persistent human papillomavirus infection. Int. J. Gynecol. Cancer 19, 508-512 (2009)). Portanto, os antígenos de HPV E6 e E7 são considerados ser alvos imunoterapêuticos promissores. Até hoje, diversos tipos de vacinas terapêuticas contra HPV, incluindo vacinas com base em proteína/peptídeo (L. Muderspach, S. Wilczynski, L. Roman, L. Bade, J. Felix, L. A. Small, W. M. Kast, G. Fascio, V. Marty, J. Weber, A phase I trial of a human papillomavirus (HPV) peptide vaccine for women with high-grade cervical and vulvar intraepithelial neoplasia who are HPV 16 positive. Clin. Cancer Res. 6, 3406-3416 (2000); W.J. van Driel, M.E. Ressing, G.G. Kenter, R.M.P. Brandt, E.J.T. Krul, A.B. van Rossum, E. Schuuring, R. OVringa, T. Bauknecht, A. TammHermel ink, P.A. van Dam, G.J. Fleuren, W.M. Kast, C.J.M. Melief and J.B. Trimbos, Vaccination with HPV16 Peptides of Patients with Advanced Cervical Carcinoma: Clinical Evaluation of a Phase /-// Trial,

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EurJ Cancer, Vol. 35, No. 6, pp. 946-952, 1999), foram desenvolvidos com um foco sobre a estimulação da produção e ativação de células T específicas de HPV E6 e E7. Entretanto, as vacinas contra HPV com base em peptídeo devido aos epítopos de HLA-A2 restritos demonstraram aplicabilidade muito limitada mesmo dentro das populações de HLA-A2 selecionadas avaliadas. Reportou-se em 2009 que uma vacina de peptídeo de HPV contendo 13 peptídeos sobrepostos da proteína de HPV16 E6 e 4 peptídeos sobrepostos do peptídeo de HPV16 E7, um total de 13 peptídeos demonstrou robusta resposta anti-HPV quando estudados em uma população de paciente não restrita com VIN3. Este estdo forneceu a primeira demonstrada de uma vacina de peptídeo de HPV de ampla ação em uma população não restrita à HLA (Gemma G. Kenter, Marij J.P. Welters, A Rob P.M. Valentijn, Margriet J.G. Lowik, Dorien M.A. Berends-van der Meer, Annelies P.G. Vloon, Farah Essahsah, Lorraine M. Fathers, Rienk Offringa, Jan Wouter Drijfhout, Amon R. Wafelman, Jaap Oostendorp, Gert Jan Fleuren, Sjoerd H. van der Burg, and Cornells J.M. Melief; Vaccination against HPV-16 Oncoproteins for Vulvar Intraepithelial Neoplasia, N Engl J Med 2009;361:1838-47).

[0012] Estas referências, particularmente a última, por Kenter et al. ressaltam as maiores desvantagens associadas com o método atual para o desenvolvimento de vacinas de peptídeo que fornecem ampla cobertura HLA. Os métodos atuais, devido à sua incapacidade de determinar as sequências imunogênicas que podem fornecer uma ampla cobertura, focam no desenvolvimento de peptídeos longos que abrangem toda a sequência da proteína antigênica. Como resultado, 4 grandes desvantagens resultam: 1. As vacinas são complexas e cpntêm um grande número de peptídeos, por exemplo, Kenter at al. usam 13 peptídeos; 2. As vacinas são mais caras do que o necessário;

3. pacientes são submetidos ao recebimento de peptídeos

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12/55 desnecessários que pode não ter nenhum benefício terapêutico ou imunogênico; e 4. peptídeos ativos podem ser inativados através da ligação competitiva com outros peptídeos (esta desvantagem em particular reportada por Kenter et al citados acima).

[0013] A presente invenção reporta um método eficiente para o desenvolvimento de vacinas de peptídeo de ampla cobertura de HLA simples, mais baratas e altamente eficazes.

Adjuvantes Imunoestimulatórios Para Vacinas com Base em Prote ína/Peptíde o [0014] Dado que os TAAs são pouco imunogênicos na natureza, um adjuvante imunoestimulador pode ser necessário em certos casos para a geração de uma resposta imune efetiva. Sais de lumínio (alum) foram usados como adjuvantes com grande sucesso por quase um século e têm sido particularmente eficazes na promoção da imunidade humoral protetora. Entretanto, alum não é idealmente eficaz para doenças onde imunidade mediada por célula é requerida para proteção. O reconhecimento nas últimas duas décadas de que a ativação da imunidade inata é necessária para impulsionar as respostas imunes adaptativas alterou radicalmente as teorias sobre como os adjuvantes promovem a imunidade adaptativa. Em particular, o trabalho pioneiro de Charles Janeway demonstrou que as respostas imunes adaptativas são precedidas por, e dependentes de receptores de imunidade inata impulsionados por componentes microbianos (Janeway CA., Jr. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 1992;13:11~ 16). O reconhecimento de porções conservadas associadas com patógeno ou padrões moleculares associados com patógeno (PAMPs) por meio de receptores de reconhecimento de padrões, por exemplo, receptores semelhantes a dobre de sino (TLRs), envolve imunidade inata e adaptativa coordenada contra patógenos

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13/55 microbianos ou células infectadas (Kawai Γ Akira S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity. Immunity. 2011;34:637-650). Ativação medida por TLR de células de apresentação de antígeno, por exemplo, DCs, é uma etapa crucial neste processo. De fato, muitas vacinas estabelecidas e experimentais incorporam PAMPs, não apenas para proteger contra doenças infecciosas, porém também como parte de imunizações terapêuticas contra o câncer. (Wille-Reece U, Flynn BJ, Lore K, Koup RA, Miles AP, Saul A, Kedl RM, Mattapallil JJ, Weiss WR, Roederer M, Seder RA. Toll-like receptor agonists influence the magnitude and quality of memory T cell responses after prime-boost immunization in nonhuman primates. J. Exp. Med. 2006;203:1249-1258). O uso destas moléculas molecular e funcionalmente definidas como adjuvantes grandemente facilita o projeto racional de vacinas.

[0015] Suportando este ponto de vista, o BCG (Bacillus CalmetteGuerin) usado há muito tempo para o tratamento do carcinoma da bexiga tem sido relativamente eficaz e demonstrou ativar o TLR2 e TLR4 (Heldwein KA, Liang MD, Andresen TK, Thomas KE, Marty AM, Cuesta N, Vogei SN, Fenton MJ. TLR2 and TLR4 serve distinct roles in the host immune response against Mycobacterium bovis BCG. Journal of leukocyte biology. 2003;74:277-286). LPS, um ligante natural de TLR4, foi reportada possuir propriedades anticâncer logo na década dos anos de 1960 (Mizuno D, Yoshioka O, Akamatu M, Kataoka T. Antitumor effect of intracutaneous injection of bacterial lipopolysaccharide. Cancer research. 1968;28:1531-1537). O monofosforil lipídio A (MPL) é um derivado quimicamente modificado de endotoxina S. minnesota que exibe toxicidade grandemente reduzida, porém mantém a maioria das propriedades imunoestimulatórias de LPS (Mata-Haro V, Cekic C, Martin M, Chilton PM, Casella CR, Mitchell TC. The vaccine adjuvant monophosphoryl

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14/55 lipid A as a TRIF-biased agonist of TLR4. Science. 2007,316:16281632). Uma pletora de estudos demonstrou que o MPL potentemente reforça uma resposta imune do paciente contra antígenos associados com tumor e virais (Schwarz TF. Clinical update of the AS04adjuvanted human papillomavirus-16/18 cervical cancer vaccine, Cervarix. Advances in therapy. 2009;26:983-998). FDA aprovou a vacina Cervarix formulada com MPL e sal de alumínio como uma vacina profilática contra o papilomavirus humano (Schiffman M, Wachoider S. Success of HPV vaccination is now a matter of coverage. The lancet oncology. 2012;13:10-12). Imiquimod (urn agonista de TLR7) foi aprovado por FDA em 2004 para uso em humanos contra ceratose actinica e carcinoma de célula base superficial (Hoffman ES, Smith RE, Renaud RC., Jr. From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2005,4:879880). Estes agonistas de TLR têm forte potencial na pormoção da imunogenicidade de TAAs fracamente imunogênicos. De fato, diversas vacinas contra câncer com base em peptídeo/proteína combinadas com agonistas de TLR estão sendo testados em experimentos clínicos; estes incluem Ampligen alvejando TLR3 (NCT01355393), Histonol alvejando TLR3 (NCT00773097, NCT01585350, NCT01437605), MELITAC 12.1 alvejando TLR4 (NCT01585350) e Resiquimod alvejando TLR9 (NCT00960752). A família de PRRs expandiu-se grandemente nos últimos anos, por isso há um tremendo esforço sendo gasto para investigar o papel das vias imunes inatas na definição dos mecanismos de ação adjuvante, bem como os papéis de outros PRRs (por exemplo, NLR, RLR) em atividade adjuvante de vacinas terapêuticas contra câncer.

[0016] Além de detectar sinais associados aos agentes patogênicos, os PRRs também reconhecem ’alarminas’ endógenas, como as proteínas de estresse / choque térmico (HSPs) e HMGB

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Ί (Lotze MT, Zeh HJ, Rubartelli A, Sparvero LJ, Amoscato AA, Washbum NR, Devera ME, Liang X, Tor M, Biliiar T. The grateful dead: damage-associated molecular pattern molecules and reduction/oxidation regulate immunity. Immunol Rev. 2007;220:6081; Todryk SM, Melcher AA, Dalgleish AG, Vile RG. Heat shock proteins refine the danger theory. Immunology. 2000;99:334-337). Como componentes de proteína intrínsecos e altamente conservados da célula, estes padrões moleculares associados com lesão (DAMPs) também comunicam a natureza e magnitude da lesão celular ao sistema imunológico hospedeiro. Embora as HSPs sejam conhecidas agir como acompanhantes moleculares que participam do controle da qualidade das proteínas intracelulares (Calderwood SK, Murshid A, Prince T. The shock of aging: molecular chaperones and the heat shock response in longevity and aging-a mini-review. Gerontology. 2009;55:550-558; Mayer MP, Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci. 2005,62:670684), estudos durante as duas últimas décaas estabeleceram ο conceito de que certas HSPs são capazes de integrar tanto as respostas imunes inatas quanto adaptativas, e podem ser utilizadas como agentes imunoestimulatórios para imunoterapia de câncer (Mayer MP, Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci. 2005;62:670-684; Wang XY, Facciponte JG, Subjeck JR. Molecular chaperones and cancer immunotherapy. Handb Exp Pharmacol. 2006b; 172:305-329).

[0017] Embora avanços significativos tenham sido feitos no projeto racional de vacinas, continua a ter uma necessidade contínua do desenvolvimento de vacinas otimizadas, tanto profiláticas quanto terapêuticas. Existe uma necessidade do desenvolvimento de vacinas que tenham ampla aplicabilidade para grandes populações de pacientes, e uma necessidade de tais vacinas serem específicas e

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16/55 eficazes.

SUMÁRIO [0018] São descritas aqui novas composições compreendendo sequências de peptídeo de HPV opcionalmente combinadas com um ou mais adjuvantes, em que as sequências de peptídeo correspondem aos peptídeos de HPV16 E6, e/ou peptídeos de HPV16 E7 e em que as sequências de peptídeo têm uma afinidade de ligação de aproximadamente IC50 de 5.000 nM com 5 supertipos de HLA, e em que alguns dos peptídeos são pepptídeos de múltiplos epítoposs. Em certas composições, as composições compreendem adjuvantes que consistem em lipídios catiônicos, e em certas composições, os lipídios catiônicos consistem em DDA, R-DOTAP, DOTAP, DOTMA ou DOEPC, variações ou análogos dos mesmos. As novas composições descritas aqui são superiores às vacinas atualmente disponíveis pelo fato de que elas são eficazes para mais de 80 a 90% da população geral.

[0019] Descritos aqui são os métodos para a induzção de uma resposta imunológica contra a infecção por HPV em um indivíduo compreendendo administrar a um indivíduo uma composição compreendendo sequências de peptídeo de HPV opcionalmente combinadas com um adjuvante, em que as sequências de peptídeo de HPV correspondem aos peptídeos de HPV16 E6, e/ou peptídeos de HPV16 E7 e em que as sequências de peptídeo têm uma afinidade de ligação de aproximadamente IC50 de 5.000nM com 5 supertipos de HLA, e em que alguns dos peptídeos são peptídeos de múltiplos epítopos. Os métodos podem ser profiláticos ou terapêuticos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0020] A figura 1 fornece um gráfico mostrando resposta anti-HPV16 E6 e E7 por ensaio de interferon-γ por indivíduo e visita para coortes de 1mg e 3mg de R-DOTAP. Abreviações: Bkg-base (barras

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17/55 listradas); PBMCs-células mononucleadas de sangue periférico; RDOTAP- enantiômero R de cloreto de 1,2-dioleoil-3-trimetilamôniopropano; SFC-SFU-unidades de formação de mancha; Stimestimulada (barras claras). Os dados representam a SFU média por 4x10⁵ PBMCs em cavidades triplicadas. As barras listradas representam a SFU de base em cavidades estimuladas com meios apenas. Barras claras representam SFU em cavidades estimuladas com a mistura de peptídeo. Visita 2-Dia 1 em pré-vacinação; Visita

3-Dia 15, 14 dias após vacinação 1; Visita 5-Dia 36, 14 dias após vacinação 2; Visita 7=Dia 57, 14 dias após vacinação 3; Visita 9-Dia 133, 90 dias após vacinação 3.

[0021] A figura 2 fornece um gráfico mostrando resposta anti-HPV16 E6 e E7 por ensaio de interferon-y por indivíduo e visita para a coorte de 10mg de R-DOTAP. Os dados representam a SFU média por 4x10⁵ PBMCs em cavidades triplicatas. Barras listradas representam SFU de base em cavidades estimuladas com meios apenas. Representam representam SFU em cavidades estimuladas com a mistura de peptídeo. Visita 2-Dia 1 em pré-vacinação; Visita -Dia 15, 14 dias após vacinação 1; Visita 5-Dia 36, 14 dias após vacinação 2; Visita 7-Dia57, 14 dias após vacinação 3; Visita 9-Dia 133, 90 dias após vacinação 3.

[0022] A figura 3 fornece uma plotagem de amostra de regressão tumoral mostrando os resultados do efeito dos peptídeos sobre o tamanho médio do tumor medido ao longo do tempo após a implantação do tumor para peptídeos correspondentes a SEQ ID NO: 1 (quadrado em branco), SEQ ID NOS: 7, 8, 31 32 e 31 (círculo preto sólido), SEQ ID NO: 7 (cíclulo em branco), e SEQ ID NO: 8 (triângulo em branco sólido). Na figura 3, uma composição compreendendo apenas R-DOTAP é representada pela linha de gráfico marcada por quadrados listrados.

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DESCRIÇÃO DETALHADA [0023] A seguinte descrição detalhada é exemplificative e explicativa e destina-se a fornecer explicações adicionais da presente invenção aqui descrita. Outras vantagens, e novas características serão evidentes por aqueles versados na técnica a partir da seguinte descrição detalhada da presente invenção. Referências mencionadas aqui, incluindo Pedido Provisório dos Estados Unidos número de série 62/404.458, são incorporadas por referência em sua totalidade.

[0024] Descritas aqui são métodos para o projeto e uso de sequências de peptídeo único, incluindo sequências de peptídeo de múltiplos epítopos únicos, derivadas de HPV16 E6 e E7, projetadas para serem eficazmente processadas e apresentadas de forma cruzada às células T, como analisado e demonstrado em camundongos transgênicos humanizados de HLA-A2 e confirmado em indivíduos humanos variados. Em certas composições, as novas composições compreendendo as novas sequências de peptídeo consistem em 2-8 sequências de pepetídeo, 2-6 sequências de peptídeo, ou 4 sequências de peptídeo. Os peptídeos podem ser incorporados em composições imunogênicas, tal como vacinas. Como demonstrado abaixo, análise in-silico de ligação de peptídeo aos principais supertipos confirma as composições e vacinas como tratando mais de 80 a 90% da população. Em um experimento clínico humano não restrito a HLA compreendendo o uso das composições de peptídeo descritas aqui, forte indução de célula T foi confirmada em todos os indivíduos. Utilizando o novo método de análise in-siüco combinado com teste em camundongos transgênicos humanizados, os inventores desenvolveram aqui as primeiras vacinas terapêuticas contra câncer de HPV16 com base em peptídeo simple, amplamente eficazes e aplicáveis.

[0025] Uma consideração importante no projeto de vacinas com

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19/55 base em peptídeos projetadas para provocar a resposta e geração de células T CD8⁺ em humanos, é o polimorflsmo das moléculas HLA de classe I na população. Como diferentes alelos HLA se ligam a diferentes peptídeos, é importante que uma vacina peptídica contenha peptídeos diferentes suficientes para ser imunogênica em uma alta porcentagem da população. Os inventores aqui projetaram uma nova vacina de múltiplos peptídeos para abranger regiões imunogênicas das proteínas HPV16 E6 e E7 para fornecer o processamento e aprresentação corretas de epítopos de célula T CD8+: em uma modalidade, a vacina compreende quatro peptídeos relacionados com HPV selecionados com base em sua atividade de ligação ou imunogênica. Como detalhado nos Exemplos, os inventores se envolveram em ELISpot e estudos de regressão de tumor, bem como análise in-silico para predizer alelos de HLA potencial que ligaria vários peptídeos de HPV. A capacidade do sistema imune humano de apresentar e reconhecer os epítopos de peptídeo fole m seguida estudada em camundongos transgênicos humanizados para confirmar a apresentação, processamento e subsequente indução de respostas de célula T CD8+ específicos de antígeno. Finalmente, a capacidade de induzir respostas de célula T foi estudada em um experimento clínico humano não restrito a HLA, e a capacidade da formulação de induzir respostas fortes de células T em indivíduos com subtipos de HLA variados foi confirmada.

[0026] Em uma modalidade, as novas composições como descrito aqui compreendem sequências de peptídeo de HPV combinadas com um adjuvante, em que as sequências de peptídeo de HPV correspondem aos peptídeos de HPV16 E6, e/ou peptídeos de HPV16 E7 e em que as sequências de peptídeo têm uma afinidade de ligação de aproximadamente IC50 de 5.000nM com 5 supertipos de HLA, em certas composições, os peptídeos são peptídeos de múltiplos

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20/55 epítopos. Os peptídeos podem compreender as SEQ ID NOS: 5, 9, 10 e 11, ou suas versões lipidadas compreendendo SEQ ID NOS: 23, 24, 25 e 26. Em uma modalidade, os peptídeos podem estar presentes na composição como peptídeos individuais ou eles podem ser conjugados uns aos outros (em qualquer ordem), seja com um espaçador ou sem um espaçador, para formar um único peptídeo longo abrangendo as sequências reivindicadas de acordo com métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Em certas composições, os supertipos de HLA compreendem HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, HLA-B*07:02, e HLA-B*58:01. Em algumas modalidades, as composições podem também compreender epítopos agonistas potenciadores tais como o peptídeo auxiliar de núcleo HBV etc., e ou peptídeos de epitopo simples incluindo, porém não limitados a peptídeos codificados por SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 15 e análogos dos mesmos tais como SEQ ID NOS: 27 e 28. As composições descritas aqui também compreendem peptídeos modificados, análogos de peptídeo, e fragmentos ativos dos mesmos. Em certas composições os peptídeos podem podem ser modificados sendo oxidados, reticulados por ligações de dissulfeto, pegilados, glicolisados, fosforilados, metilados, biotinilados ou por outros processos conhecidos por aqueles versados na técnica para melhorar a eficácia e imunogenicidade. Em uma modalidade, o adjuvante da composição consiste em um lipídio catiônico, em que o lipídio catiônico pode ser selecionado do grupo que consiste em DOTAP, DDA, DOEPC, DOTMA, R-DOTAP, R-DDA, R-DOEPC, R-DOTMA, SDOTAP, S-DDA, S-DOEPC, S-DOTMA, e variações ou análogos dos mesmos. Em uma modalidade, as novas composições da invenção compreendem peptídeos correspondendo às SEQ ID NOS: 5, 9, 10 e 11,o adjuvante compreende um lipídio catiônico e o lipídio catiônico compreende R-DOTAP. Em uma modalidade, as novas composições

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21/55 da invenção compreendem peptídeos correspondendo às SEQ ID NOS: 23, 24, 25 ou 26, e o adjuvante compreende um lipídio catiônico em que o lipídio catiônico compreende R-DOTAP. Em uma modalidade, as novas composições da invenção compreendem peptídeos correspondendo às SEQ ID NOS: 5, 9, 10, 11, 23, 24, 25 ou 26, e o adjuvante compreende um lipídio catiônico em que o lipídio catiônico compreende R-DOTAP. As modalidades descritas acima podem ser opcionalmente encapsuladas em lipossomas. As modalidades descritas acima podem ser opcionalmente combinadas com veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, vários tampões como acetate, fosfato e ajustadores de tonicidade, tais como sacarose, trehalose etc., ou tensoativos tal como tween e outros conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0027] Em uma modalidade, a invenção aqui fornece vetores recombinantes compreendendo a moléculas de ácido nucleico codificando polipeptídeos compreendendo uma ou mais de SEQ ID NO: 5, 9, 10 11, ou uma ou mais de SEQ ID NOS: 23, 24, 25 ou 26 operavelmente ligadas a um promotor. Também são fornecidos vetores recombinantes compreendendo moléculas de ácido nucleico codificando polipeptídeos compreendendo uma ou mais de SEQ ID NO: 5, 9, 10 11, ou uma ou mais de SEQ ID NOS: 23, 24, 25 ou 26 operavelmente ligadas a promotores também compreendendo moléculas de ácido nucleico codificando epítopos agonistas realçadores e/ou peptídeos de epítopo simples. Em uma modalidade, os vetores descritos acima podem compreender adenovirus recombinante. Como é conhecido por aqueles versados na técnica, sequências de ácido nucleico podem ser clonadas usando técnicas de biologia molecular de rotina, ou geradas de novo por síntese de DNA, que podem ser realizadas usando procedimentos de rotina por empresas de serviços com negócios no campo de síntese de DNA

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22/55 e/ou clonagem molecular.

[0028] Em uma modalidade, a invenção aqui fornece métodos para indução de uma resposta imune contra infecção por HPV em um indivíduo compreendendo administrar a um indivíduo, novas composições compreendendo sequências de peptídeo de HPV combined com um ou mais adjuvantes, em que as sequências de peptídeo de HPV correspondem aos peptídeos de HPV16 E6, e/ou peptídeos de HPV16 E7 e em que as sequências de peptídeo têm uma afinidade de ligação de aproximadamente IC50 de 5.000nM com 5 supertipos de HLA, e em que alguns dos peptídeos são peptídeos de múltiplos epítopos. Os métodos descritos aqui para uma indução de uma resposta imune podem incluir a indução de uma resposta imune para propósitos profiláticos ou terapêuticos. Em certas composições, os peptídeos usados nas novas composições podem compreender um ou mais peptídeos selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 5, 9, 10 11, 23, 24, 25, 26, 31, 32 ou outras descritas aqui, por exemplo, nas tabelas 1 a 5. Os peptídeos podem estar presentes como peptídeos individuais, ou certos peptídeos selcionados podem ser conjugados entre si (em qualquer ordem) com um espaçador, ou sem um espaçador, para formar um único peptídeo simples abrangendo as sequências reivindicadas. Os métodos podem compreender o uso de composições, onde o adjuvante consiste em um lipídio catiônico, por exemplo, em que o lipídio catiônico compreende DOTAP, DDA, DOEPC, DOTMA, R-DOTAP, R-DDA, RDOEPG, R-DOTMA, S-DOTAP, S-DDA, S-DOEPC, S-DOTMA, variações ou análogos dos mesmos. Em uma modalidade, os métodos para uma indução de uma resposta imune podem compreender administrar a um indivíduo uma composição compreendendo os peptídeos que consistem nas SEQ ID NOS: 5, 9, 10 11 e R-DOTAP, ou uma composição os peptídeos que consistem nas SEQ ID NOS:

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23, 24, 25 ou 26 e R-DOTAP.

[0029] Os métodos como descrito aqui, podem compreender o uso de novas composições de peptídeo de HPV para o tratamento de um indivíduo tendo uma infecção por HPV, em que a infecção compreende sintomas incluindo, porém não limitados a, verrugas comuns, verrugas plantares, verrugas planas, verrugas genitals, verrugas anogenitais, displasia anal, cânceres genitais (vulva, vagina, colo do útero, pênis, ânus), câncer de cabeça e pescoço, epidermeodisplasia verruciforme, hiperplasia das epitelias focais, papilomas da boca, câncer orofaríngeo, cisto verrucoso, papilomatose laríngea.

[0030] Será apreciado por uma pessoa versada que alterações podem ser feitas aos peptídeos, por exemplo, por substituições, deleções, adições de aminoácidos, etc., por exemplo, utilizando procedimentos de biologia molecular de rotina. Geralmente, as substituições conservativas de aminoácidos podem ser aplicadas sem perda de função ou imunogenicidade de um polipeptídeo. Isto pode ser verificado de acordo com procedimentos de rotina bem conhecidos para a pessoa versada.

[0031] Também incluídas no escopo dos peptídeos descrito aqui estão as modificações dos peptídeos, e fragmentos de peptídeo. Tais modificações incluem substituições de aminoácidos de ocorrência natural em sítios específicos com outras moléculas, incluindo porém não limitados a aminoácidos de ocorrência natural e não ocorrência natural. Tais substituições podem modificar a bioatividade de peptídeos e produzir agonistas biológicos ou farmacológicos ou antagonistas. Tais substituições podem incluir substituições conservadoras conhecidas por alguém versado na técnica, tais como valina por alanine. As substituições aceitáveis podem também incluir modificações de aminoácidos, como a norleucina pela leucina.

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Entende-se que a substituição de D aminoácidos pelos aminoácidos L é abrangida no escopo da presente inevnção. Algumas substituições são descritas em Dictionary de Biochemistry and Molecular Biology, 2^a ed., J. Stenesh, John Wiley & Sons, 1989, a totalidade do qual é incorporada aqui por referência. Modificações adicionais incluem adição de um aminoácido, tal como uma tirosina ou outro aminoácido em localizações específicas em peptídeos ou fragmentos dos mesmos para realçar o potencial de rotulagem com rótulos radioativos ou não radioativos, adição de moléculas tal como ricina, adição de rótulos radioativos e/ou rótulos não radioativos.

[0032] Além disso, alguém versado na técnica reconhecerá que substituições individuais, deleções ou adições na sequência de aminoácido de peptídeos descritos, ou na sequência de nucleiotídeo codificando os aminoácidos nos peptídeos, que alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos (tipicamente menos de 5% , mais tipicamente menos de 1%) em uma seqüência codificada são variações conservativamente modificadas, em que as alterações resultam na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservativa fornecendo aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na técnica. Os seguintes seis grupos contêm aminoácidos que são substituições conservadoras entre si:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Ácido aspártico (D), Ácido Glutâmico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q;

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M); Valina (V); e

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofan (W).

Adjuvantes Lipídicos

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25/55 [0033] Lipídios catiônicos foram reportados ter forte efeito adjuvante imunoestimulatório. Os lipídios catiônicos da presente invenção podem formar lipossomas que são opcionalmente misturados com antígeno e podem conter os lipídios catiônicos sozinhos ou em combinação com lipídios neutros. Espécies de lipídio catiônico adequadas incluem: 3~β[⁴Ν~(¹Ν, ⁸-diguanidino espermidina)~carbamoil] colesterol (BGSC); 3“P[N,N-diguanidinoetil~aminoetano)-carbamoil] colesterol (BGTC); N,N¹N²N³Tetra“metiltetrapalmitilspermina (celfectina); N~t~butil-N’-tetradecil~3~tetradecil~aminopropion-amidine (CLONfectin); brometo de dimetildioctadecil amônio (DDAB); brometo de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidróxi etil amônio (DMRIE); 2,3dioleoilóxiN-[2(esperminecarboxamido)etil]~N,N~dimetil-1-propanamínio trifluorocetato) (DOSPA); 1,3-dioleoilóxi-2-(6carboxispermil)-propil amida (DOSPER); 4-(2,3“biS“palmitoilóxi-propil)-

1-metil-IH-imidazol (DPIM) N,N,N’,N’-tetrametilN,N'bis(2hydroxietil) 2,3 dioleoilóxi-1,4~butanodiamônio iodeto) (Tfx-50); cloreto de N~1 -(2,3dioleoiloxi) propil-N,N,N-trimetil amônio (DOTMA) ou outros tensoativos de amônio N(N,N1dialcóxi)~alquil~N,N,Ntrissubstituídos; 1,2 dioleoil-3-(4'-trimetilammonio) butanol-sn-glicerol (DOBT) ou butanoato de colesterila (4'trimetilamônia) (ChOTB) onde o grupo trimetilamônio é conectado por meio de uma ramificação espaçadora de butanol para a cadeia dupla (para DOTB) ou grupo colesterila (para ChOTB); DORI (DL-1,2-dioleoil-3-dimetilaminopropil-phidroxietilamônio) ou DORIE (DL-1,2O-dioleoil3dimetilaminopropilP hidroxietilamônio-m) (DORIE) ou análogos dos mesmos como descrito no WO 93/03709; éstes de colina de 1 ^-dioleoil-S-succinil-sn-glicerol (DOSC): éster de hemissuccinato de colesterila (ChOSC); lipopoliaminas tais como dioctadecilamidoglicilspermina (DOGS) e dipalmitoil fosfatidiletanolamilspermina (DPPES) ou os lipídios catiônicos descritos na Patente dos Estados Unidos n° 5.283.185,

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26/55 iodeto de colesteril-Sp-carboxil-amido-etilenetrimetilamônio, iodeto de carboxilato de 1-dimetilamino-3-trimetilammonio-DL-2-propilcolesterila, colesteril-S-O-carboxiamidoetilenoamina, iodeto de colesteril-S^-oxissuccinamido-etilenotrimetilamônio, iodeto de 1dimetilamino-S-trimetilamônio-DL^-propil-colesteril-S-p-oxissuccinato, iodeto de 2~(2~trimetilamônio)~etilmetilamino etil-colesteril-3-β oxissuccinato, 3-p-N-(N',N'-dimetilaminoetano) carbamoil colesterol (DC-col), e 3^“N“(pohetilenoimina)Carbamoilcolesterol; aspartato de Ο,Ο’-diminstil-N-Hsila (DMKE); Ο,ΟΜ^ΙπβΐΙΡΝ-ΗεΗ-ρΙυΐθπίΒΐο (DMKD); brometo de l^-dimiristiloxipropil-S-dimetil-hidroxi etil amônio (DMRIE); 1 ^-dilauroil-sn-gliceo-S-etilfosfocolina (DLEPC); 1,2-di mi ristoil-sngliceo-3-etilfosfocolina (DMEPC); 1 ^-dioleoil-sn-gliceo-S-etilfosfocolina (DOEPC); 1,2-dipalmitoil-sn-gliceo-3-etilfosfocolina (DPEPC); 1,2distearoil-sn-gliceo-3-etilfosfocolina (DSEPC); 1,2-dioleoil3 trimetilammoninum propano (DOTAP); dimetilaminopropano de dioleoíla (DODAP); 1,2palmitoil-3-trimetilamônio propano (DPTAP);

1,2-distearoil-3-trimetilamônio propano (DSTAP), 1,2-miristoil-3- trimetilamônio propano (DMTAP); e sulfato de dodecila de sódio (SDS). A presente invenção contempla o uso de variantes estruturais e derivados dos lipídios catiônicos descritos neste pedido.

[0034] Certos aspectos da presente invenção incluem lipídios catiônicos quirais não esteroidais tendo uma estrutura representada pela seguinte fórmula:

,2 em que em R¹ é um grupo amônio quartenário, Y¹ é escolido de uma cadeia hidrocarboneto, um éster escolhido de uma cadeia hidrocarboneto, um éster, uma cetona, e um peptídeo, R² e R³ são independentemente escolhidos de um ácido graxo saturado, um ácido graxo insaturado, um hidrocarboneto ligado a éster, fosfor-diésteres, e

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27/55 combinações dos mesmos. DOTAP, DMTAP, DSTAP, DPTAP, DPEPC, DSEPC, DMEPC, DLEPC, DOEPC, DMKE, DMKD, DOSPA, DOTMA, são exemplos de lipídios tendo esta estrutura geral· [0035] Em uma modalidade, lipídios catiônicos quirais da invenção são lipídios, em que as ligações entre os grupo lipofílico e o grupo amino são estáveis em solução aquosa. Desse modo, um atributo dos complexos é sua estabilidade durante armazenagem (isto é, sua capacidade de manter um diâmetro pequeno e manter a atividade biológica ao longo do tempo após sua formação). Tais ligações usadas nos lipídios catiônicos incluem ligações de amida, ligações de éster, ligações de éster e ligações de carbamoíla. Aqueles versados na técnica facilmente entenderíam que os lipossomas, contendo mais do que uma espécie de lipídio catiônico, podem ser usados para produzir os complexos da presente invenção. Por exemplo, lipossomas compreendendo duas espécies de lipídio catiônico, lisilfosfatidiletanolamina e β-alanil colesterol éster foram descritos para certas aplicações de liberação de fármaco [Brunette, E. et al., Nucl. Acids Res., 20:1151 (1992)].

[0036] Deve-se também entender que considerando um dos lipossomas catiônicos quirais adequados para uso na invenção e opcionalmente misturando com antígeno, os métodos da invenção não são restritos ao uso dos lipídios catiônicos relacionados acima, porém de preferência, qualquer composição de lipídio pode ser usada, contanto que o lipossoma catiônico seja produzido e a densidade de carga catiônica resultante seja suficiente para ativar e induzir uma resposta imune.

[0037] Desse modo, os lipídios da invenção podem conter outros lipídios além dos lipídios catiônicos. Estes lipídios incluem, porém não estão limitados a, lisolipídios dos quais lisofosfatidilcolina (1-oleoil lisofosfatidilcolina) é um exemplo, colesterol, ou fosfolipídios neutros

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28/55 incluindo dioleoil fosfatidil etanolamina (DOPE) ou dioleoil fosfatidilcolina (DOPC), bem como vários tensoativos lipofílicos, contendo porções de polietileno glicol, das quais Tween~80 e PEG-PE são exemplos.

[0038] Os lipídios catiônicos da invenção podem também conter lipídios negativamente carregados, bem como lipídios catiônicos, contanto que a carga bruta dos complexos formados seja positiva e/ou a superfície do complexo seja positivamente carregada. Lipídios negativamente carregados da invenção são aqueles compreendendo pelo menos uma espécie de lipídio tendo uma carga negativa pura em ou próxima ao pH fisiológico ou combinações destes. Espécies de lipídio negativamente adequados incluem, porém são limitados a, CHEMS (hemissuccinato de colesterila), NGPE (N-glutaril fosfatidliletanolanina), fosfatidil gliceol e ácido fosfatídico ou um análogo de fosfolipídio similar.

[0039] Métodos para produção dos lipossomas a serem na porção do lipídio compreendendo complexos de liberação da presente invenção são conhecidos por aqueles versados na técnica. Uma revisão de metodologias de preparação de lipossomas pode ser encontrada em Liposome Technology (CFG Press Nova Iorque 1984); Liposomes por Ostro (Marcel Dekker, 1987); Methods Biochem Anal. 33:337-462 (1988) e Patente dos Estados Unidos n° 5.283.185. Tais métodos incluem extrusão de congelamento-descongelamento e sonicação. Tanto lipossomas unilamelares (menos do que cerca de 200 nm em diâmetro médio) quanto lipossomas multilamelares (mais do que cerca de 300 nm em diâmetro médio) podem ser usados como componentes de partida para produzir os complexos desta invenção.

[0040] Nos lipossomas catiôncos utilizados para produri as vacinas de lipídio catiônico desta invenção, o lipídio catiônico está presente no lipossoma em cerca de 10 % em mol a cerca de 100 % em mol de

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29/55 lipídio lipossômico total, ou de cerca de 20% em mol a cerca de 80% em mol. O lipídio neutro, quando incluído no lipossoma, pode estar presente em uma concentração de cerca de 0% em mol a cerca de 90% em mol do lipídio lipossômico total, ou de cerca de 20 % em mol a cerca de 80 % em mol, ou de 40% em mol a 80% em mol. O lipídio negativamente carga, quando incluído no lipossoma, podem estar presente em uma concentração variando de cerca de 0% em mol a cerca de 49 % em mol do lipídio lipossômico total, ou de cerca de 0% em mol a cerca de 40 % em mol. Em uma modalidade, os lipossomas contêm um lipídio catiônico e neutro, em relações entre cerca de 2:8 a cerca de 6:4. É também entendido que os complexos da presente invenção podem conter lipídios modificados, proteínas, polications ou ligantes de receptor que funcionam como um fator de direcionamento do complexo para um tecido particular ou tipo celular. Exemplos de fatores de direcionamento incluem, porém não estão limitados a, asialoglicoproteína, insulina, lipoproteínas de baixa densidade (LDL), folato e anticorpos monoclonais e policlonais direcionados contra as moléculas de superfície celular. Além disso, para modificar a meia circulatória dos complexos, a carga de superfície positive pode ser estericamente protegida incorporando os tensoativos lipofílicos que contêm porções de polietileno glicol.

[0041] As vacinas de lipídio catiônico podem ser armazenadas em solução de dextrose ou sacarose isotônica na coleta do gradiente de sacarose ou elas podem ser liofilizadas e em seguida reconstituída em uma solução isotônica antes do uso. Em uma modalidade, os complexos de lipídio catiônico são armazenados em solução. A estabilidade dos complexos de lipídio catiônico da presente invenção é medida por ensaios específicos para determinar a estabilidade física e atividade biológica das vacinas de lipídio catiônico ao longo do tempo em armazenagem. A estabilidade física das vacinas de lipídio catiônico

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30/55 é medida determinando o diâmetro e a carga dos complexos de lipídio catiônico por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, por exemplo, microscopia eleletrônica, cromatografia de filtragem ou por meio de dispersão de luz quase estática usando, por exemplo, um analisador de tamanho de partícula Coulter N4SD como descrito nos Exemplos. A estabilidade física do complexo de lipídio catiônico é substancialmente não alterada durante armazenagem quando o diâmetro das vacinas de lipídio catiônico armazenadas não é aumentada em mais do que 100%, ou em não mais do que 50%, ou em mais do que 30%, com relação ao diâmetro dos complexos de lipídio catiônico como determinado no momento em que as vacinas de lipídio catiônico foram purificadas.

[0042] Enquanto é possível para lipídio catiônico ser administrado em uma forma pura ou substancialmente pura, é preferível apresentálo como uma composição, formulação ou preparação farmacêutica. Formulações farmacêuticas usando os complexos de lipídio catiônico quiral da invenção podem compreender as vacinas de lipídio catiônico em um tampão fisiologicamente compatível tal como, por exemplo, salina tamponado por fosfato, salina isotônica ou tampão de baixa intensidade iônica tal como acetato ou Hepes (um pH exemplar estando na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 8,0). As vacinas de lipídio catiônico quirais podem ser administradas como aerossóis ou como soluções líquidas para administração intratumoral, intra-arterial, intravenosa, intratraqueal, intraperitoneal, subcutânea, e intramuscular. [0043] As formulações da presente invenção podem incorporar qualquer estabilizante conhecido na técnica. Estabilizantes ilustrativos são colesterol e outros esteróis que podem auxiliar a enrijecer a bicamada de lipossoma e impedir a degradação ou destabilização da bicamada. Além disso, agentes tais como polietileno glicol, poli-, e mono-sacarídeos podem ser incorporados no lipossoma para modificar

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31/55 a superfície do lipossoma e impedí-la de ser destabilizada devido à interação com componentes de sangue. Outros estabilizantes ilustrativos são proteínas, sacarídeos, ácidos inorgânicos, ou ácidos orgânicos que podem ser usados por conta propria ou como misturas. [0044] Diversos métodos farmacêuticos podem ser empregados para controlar, modificar ou prolongar a duração da estimulação imune. Preparações de liberação controlada podem ser obtidas através do uso de complexos polímeros tais como polsimters, poliaminoácidos, metilcelulose, polivinila, poli(ácido láctico), e hidrogéis para encapsular ou prender os lipídios catiônicos e lentamente liberá-lo. Polímeros similares podem também ser usado para adsorver os lipossomas. Os lipossomas podem ser contidos em formulações de emulsão a fim de alterar o perfil do estimulante. Alternativamente, a duração da presença do estimulante na circulação sanguínea pode ser realçada realçando a superfície do lipossoma com os compostos tais como polietileno glicol ou outros polímeros e outras substâncias tais como sacarídeos que são capazes de realçar o tempo de circulação ou meia vida de lipossomas e emulsões.

[0045] Quando preparações orais são requeridas, os lipídios catiônicos quirais podem ser combinados com veículos farmacêuticos típicos conhecidos na técnica tal como, por exemplo, sacarose, lactose, metilcelulose, carboximetil celulose, ou goma arábica, entre outros. Os lipídios catiônicos podem também ser encapsulados em cápsulas ou comprimidos para liberação sistêmica.

[0046] A administração das composições de lipídio catiônico quirais da presente invenção podem ser para propósitos profiláticos ou terapêuticos. Quando fornecidos profilaticamente, o lipídio catiônico é fornecido antecipadamente de qualquer evidência ou sintomas de enfermidade. Quando fornecido terapeuticamente, o lipídio catiônico é fornecido emo u após o início da doença. A administração terapêutica

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32/55 do estimulante imunológico serve para atenuar ou curar a doença. Para ambos os propósitos, o lipídio catiônico pode ser administrado com um agente(s) ou antígeno(s) terapêutico adicional. Quando os lipídios catiônicos são administrados com um agente ou antígeno terapêutico adicional, o efeito profilático ou terapêutico pode ser gerado contra uma doença específica, incluindo, por exemplo, doenças ou distúrbios causados por HPV.

[0047] As formulações da presente invenção, tanto para uso veterinário quanto humano, compreendem um lipídio catiônico quiral puro sozinho como descrito acima, como uma mistura de enantiômeros R e S, com um ou mais ingredientes terapêuticos tais como um antígeno(s) ou molécula(s) de fármaco. As formulações podem convenientemente ser apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica farmacêutica.

Termos [0048] Deve-se observar que o termo um, uma (a) ou um, uma (an) refere-se a um ou mais. Como tais, os termos um, uma (a) (ou um, uma (an)), um ou mais, e pelo menos um são usados alternadamene aqui.

[0049] As palavras compreender, compreende, e compreendendo devem ser interpretados inclusivamente em vez de exclusivamente. As palavras consiste, consistindo, e suas variantes, devem ser interpretadas exclusivamente, em vez de inclusivamente.

[0050] Como usado aqui, o termo cerca de significa uma variabilidade de 10 % da referência fornecida, a menos que de outro modo especificado.

[0051] Como usado aqui, os termos indivíduo e paciente são usados alternadamente e incluem um mamífero, por exemplo, um

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33/55 humano, camundongo, rato, cobaia, cão, gato, cavalo, vaca, porco, ou primata não humano, tal como um macaco, chimpanzé, babuíno ou gorila.

[0052] Como usado aqui, os termos doença, distúrbio e condição são usados alternadamente, para indicar um estado anormal em um indivíduo.

[0053] A menos que definido de outro modo nesta especificação, os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que o comumente entendido por alguém versado na técnica e por referência a textos publicados, que provêm alguém versado na técnica com um guia geral para a maioria dos termos usados no presente pedido.

[0054] As composições da invenção compreendem uma quantidade de uma composição de Peptídeos de HPV que é eficaze para gerar uma resposta imunogênica em a indivíduo. Especificamente, a dosagem da composição para atingir um efeito terapêutico dependerá de fatores como a formulação, potência farmacológica da composição, idade, peso e sexo do paciente, condição a ser tratada, gravidade dos sintomas do paciente, rotina de liberação, e padrão de resposta da paciente. Contempla-se também que o tratamento e a dosagem das composições podem ser administrados em uma forma de dosagem unitária e que alguém versado na técnica ajustaria a forma de dosagem unitária, consequentemente, para refletir o nível relative de atividade. A decisão quanto à dosagem em particular a ser empregada (e o número de vezes a ser administrada por dia) está dentro da discrição do técnico versado na técnica, e pode ser variada por titulação da dose para as circunstâncias particulares para produzir o efeito terapêutico. Além disso, alguém versado na técnica seria capaz de calcular quaisquer mudanças em quantidades eficazes das composições devido às

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34/55 mudanças nos componentes ou diluições da composição. Em uma modalidade, as composições podem ser diluídas 2 vezes. Em outra modalidade, as composições podem ser diluídas 4 vezes. Em uma outra modalidade, as composições podem ser diluídas 8 vezes.

[0055] A quantidade eficaz das composições descritas aqui pode, entretanto, ser de cerca de 1 mg a cerca de 1000 mg por dose com base em um mamífero de 70 kg, por exemplo, humano, indivíduo. Em outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz é de cerca de 2 mg a cerca de 250 mg por dose. Em uma outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz é de cerca de 5 mg a cerca de 100 mg. Ainda em outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz é de cerca de 25 mg a 50 mg, a cerca de 20 mg, a cerca de 15 mg, a cerca de 10 mg, a cerca de 5 mg, a cerca de 1 mg, a cerca de 0,1 mg, a cerca de 0,01 mg, a cerca de 0.001 mg.

[0056] As quantidades eficazes (se administradas terapeuticamente) podem ser fornecidas no horário regular, isto é, em uma base diária, semanal, mensal ou anual, em um horário irregular com administração variável dias, semanas, meses, etc. Alternativamente, a quantidade terapeuticamente eficaz a ser administrada pode variar. Em uma modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz para a primeira dose é maior do que a quantidade terapeuticamente eficaz para uma ou mais doses subsequentes. Em outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz para a primeira dose é menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz para uma ou mais doses subsequentes. Dosagens equivalentes podem ser administradas durante vários períodos de tempo incluindo, porém não limitados a, a cerca de a cada 2 horas, a cerca de a cada 6 horas, a cerca de a cada 8 horas, a cerca de a cada 12 horas, a cerca de a cada 24 horas, a cerca de a cada 36 horas, a cerca de a cada 48 horas, a cerca de a cada 72 horas, a

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35/55 cerca de a cada semana, a cerca de a cada 2 semanas, a cerca de a cada 3 semanas, a cerca de a cada month, a cerca de a cada 2 meses, a cerca de a cada 3 meses e a cerca de a cada 6 meses. O número e frequência de dosagens correspondentes a um curso completo de terapia serão determinados de acordo com o julgamento de um profissional de saúde.

[0057] As composições podem ser administradas por qualquer rotina, levando em consideração a condição específica para a qual ela foi selecionada. As composições podem ser liberadas por via oral, por injecção, inalação (incluindo oralmente, intranasalmente e intratraquealmente), ocularmente, transdermicamente (por meio de formulações de difusão passiva simples) ou por meio de liberação facilitada usando, por exemplo, iontoforese, microporação com microagulhas, ablação por radiofrequência ou similares), intravascularmente, cutânea, subcutânea, intramuscular, sublingual, intracranial, epidural, retal, intravesical e vaginal, entre outras.

[0058] As composições podem ser formuladas puras ou com um ou mais veículos farmacêuticos e/ou excipientes para administração. A quantidade de veículo(s) farmacêutico(s) é determinada pela solubilidade e natureza química dos peptídeos, rotina de administração escolhida e prática farmacológica padrão. O(s) veículo(s) farmacêutico(s) pode(s ser sólido(s) ou líquído(s) e pode(m) incorporar veículos/matrizes tanto sólidos quanto líquidos. Uma variedade de líquidos adequados é conhecida e pode ser facilmente selecionada por alguém versado na técnica. Tais veículos podem incluir, por exemplo, dimetilsulfoóxido (DMSO), salina, salina tamponada, ciclodextrina, hidroxipropilciclodextrina (HPpCD), n-dodecil-p-D-maltosida (DDM) e misturas dos mesmos. Similarmente, uma variedade de veículos e excipientes sólidos (rígidos ou flexíveis) é conhecida por aqueles versados na técnica.

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36/55 [0059] Embora as composições possam ser administradas sozinas, elas podem também se administradas na presença de um ou mais veículos farmacêuticos que são fisiologicamente compatíveis. Os veículos podem ser em forma líquida ou seca e devem ser farmaceuticamente aceitáveis. Composições farmacêuticas líquidas podem ser soluções ou suspensões estéreis. Quando os veículos líquidos são utilizados, eles podem ser líquidos estéreis. Os veículos líquidos podem ser utilizados na preparação de soluções, suspensões, emulsões, xaropes e elixires. Em uma modalidade, as composições podem ser dissolvidas em um veículo líquido. Em outra modalidade, as composições podem ser suspensas em um veículo líquido. Alguém versado na técnica de formulações seriam capazes de selecionar um veículo líquido adequado, dependendo da rotina de administração. As composições podem alternativamente se formulada em um veículo sólido. Em uma modalidade, a composição pode ser compactada em uma forma de dosagem unitária, isto é, comprimido ou capsela. Em outra modalidade, a composição pode ser adicionada à forma de dosagem unitária, isto é, uma cápsula. Em uma outra modalidade, a composição pode ser formulada para administração como um pó. O O veículo sólido pode realizar uma variedade de funções, isto é, pode desempenhar as funções de dois ou mais dos excipientes descritos abaixo. Por exemplo, um veículo sólido também pode atuar como agente aromatizante, lubrificante, solubilizante, agente de suspensão, enchimento, deslizante, auxiliar de compressão, aglutinante, desintegrante, ou material encapsulante. Em uma modalidade, um veículo sólido atua como um lubrificante, solubilizante, agente de suspensão, aglutinante, desintegrante, ou material encapsulante. A composição pode também ser subdividida para conter quantidades apropriadas das composições. Por exemplo, as dosagens unitárias podem ser composições empacotadas, por exemplo, pós

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37/55 empacotados, frascos, ampolas, seringas pré-carregadas ou sachês com líquidos.

[0060] Em uma modalidade, as composições podem ser administradas por um dispositivo de liberação de liberação modificada. Liberação modificada como usado aqui refere-se à liberação das composições descritas que é controlada, por exemplo, durante um período de pelo menos cerca de 8 horas (por exemplo, liberação estendida) a pelo menos cerca de 12 horas (por exemplo, liberação prolongada). Tais dispositivos também permitir a liberação imediata (por exemplo, níveis terapêuticos obtidos obtidos em menos de 1 hora, ou em menos do que cerca de 2 horas). Aqueles versados na técnica conhecem dispositivos de liberação de liberação modificada adequados.

[0061] São também fornecidos kits compreendendo as composições descritas aqui. O kit pode também compreender embalagem ou um recipiente com as composições formuladas para a rotina de liberação. Adequadamente, o kit contém instruções sobre a dosagem e um encarte quanto às composições.

[0062] Diversas embalagens ou kits são conhecidos na técnica para dispensar as composições farmacêuticas para uso periódico. Em uma modalidade, a embalagem tem indicadores para cada período. Em outra modalidade, a embalagem é uma embalagem em folha ou bolha, ampola rotulada, frasconete ou garrafa.

[0063] O método de embalagem um um kit pode ser por sis ó direcionado para administração, tal como um inalador, seringa, pipeta, conta gota, cateter, citoscópio, trocarte, cânula, dispositivo de ejeção por pressão, ou outros tais aparatos, dos quais a formulação pode ser aplicada a uma área afetada do corpo, tal como os pulmões, injetada em um indivíduo, liberada para o tecido da bexiga ou mesmo aplicada a e misturada com os outros componentes do kit.

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38/55 [0064] Um ou mais componentes destes kits também podem ser fornecidos em formas secadas ou liofilizadas. Quando os reagentes ou componentes são fornecidos como uma forma seca, a reconstituição geralmente é pela adição de um solvente adequado. Pretende-se que o solvente também possa ser fornecido em outra embalagem. Os kits podem incluir um meio para conter os frasconetes ou outros meios de empacotamento em confinamento fechado para venda comercial tal como, por exemplo, injeção ou recipientes plásticos moldados por sofro, nos quais os fraconetes são mantidos. Independente do número ou tipo de embalagens e como descrito acima, os kits também podem incluir, ou ser empacotados com um instrumento separado para assistir com a injeção/administração ou colocação da composição dentro do corpo de um animal. Tal instrumento pode ser um inalador, seringa, pipeta, fórceps, colher de medição, conta-gotas, cateter, citoscópio, trocarte, cânula, dispositivo de pressão ou qualquer meio de liberação medicamente aprovado.

[0065] O termo tratar, tratamento, ou qualquer variação do mesmo destina-se a incluir terapia utilizada para remediar um problema de saúde ou condição em um paciente ou indivíduo. Em uma modalidade, o problema de saúde ou condição pode ser eliminado permanentemente ou durante um curto período de. Em outra modalidade, a gravidade do problema de saúde ou condição, ou de um ou mais sintomas característicos do problema de saúde ou condição pode ser permanentemente diminuída, ou durante um curto período de tempo. A eficácia de um tratamento de dor pode ser determinada usando qualquer índice de dor padrão, tal como aquele descrita aqui, ou pode ser determinada com base na dor reflexiva do paciente. A paciente é considerado tratado se for reportada redução na dor ou reação reduzida aos estímulos que devem causar dor.

[0066] Esta invenção também é ilustrada pelos seguintes

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39/55 exemplos, que não devem ser construídos de modo algum como impondo limitações no escopo da mesma. Ao contrário, deve ser claramente entendido que o recurso pode ser tido para várias outras modalidades, modificação, e equivalentes dos mesmos, que, após leitura da descrição aqui, podem se sugerir por aqueles versados na técnica sem afastar-se do espírito da presente invenção.

EXEMPLOS [0067] Exemplos são fornecidos abaixo para facilitar uma compreensão completa da invenção. Até o momento, para facilitar o desenvolvimento de vacinas peptídicas com ampla cobertura de pacientes, as vacinas foram desenvolvidas para conter sequências de peptídeo sobrepostas de 15-30 aminoácidos abrangendo a sequência de proteína completa de HPV. A despeito da biodisponibilidade de análise in-silico de ligação de peptídeo capaz de determinar a ligação peptídica à várias moléculas de HLA, este método tem sido usado moderadamente para projetar vacinas independentes de HLA, porque está bem estabelecido que nem todos os peptídeos que são capazes de se ligar às moléculas de MHC são naturalmente processados intracelularmente, e a cobertura real de HLA pode ser significativamente menor do que o previsto.

[0068] Portanto, para desevolver uma vacina terapêutica contra HPV simples que pode fornecer uma ampla cobertura de paciente sem utilizar um grande número de peptídeos e sem a necessidade de apresentar totalmente as sequências de proteína E6 e E7 inteiras na vacina, um método alternativo foi necessário. A primeira etapa no processo desenvolvido aqui para projetar a formulação mais simples foi o projeto de várias bibliotecas de peptídeos das proteínas HPV16 E6 e E7. A etapa seguinte foi realizar extensos estudos in vivo para analisar os peptídeos para confirmar ou entender a capacidade do sistema de corretamente processor os peptídeos específicos e

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40/55 apresentar os epítopos de célula T direito por meio de MHC Classe I e Classe II às células T CD8+ e CD4+ T, respectivamente. A única maneira de obter com precisão essa informação é através de estudos reais in vivo para avaliar a resposta da célula T.

[0069] Neste estudo, a resposta de célula T foi avaliada por estudos de regressão tumoral usando o modelo de tumor TC-1 em camundongos C57/B6 e por estudos ELISPOT de interferon-gama em camundongos transgênicos humanizados para HLA-A2. A etapa seguinte foi a seleção dos peptídeos adequados ou preferidos com base nas respostas imunitárias de células T resultantes, e a eliminação de sequências que resultaram em nenhuma resposta de células T ou respostas muito fracas de células T. Os peptídeos ativos selecionados foram então analisados por análise in-siiico de ligação para determinar sua afinidade de ligação à várias moléculas de HLA. No término da análise, combinando os dados in vivo e análise in-silico, o objetivo foi então selecionar o número mínimo de sequências de peptídeo ativas derivado de estudos in vivo que quando usado em combinação seria previsto pela análise in~silico abranger pelo menos 90% da população humana. Finalmente, os peptídeos selecionados foram combinados em uma formulação de vacina. Esta formulção foi então testada quanto à eficácia de indução de células T para assegurar que, devido à competição por sítios de ligação, a potência de qualquer sequência selecionada não tenha sido substancialmente diminuída e que as respostas de células T a todos os petídeos incluídos ainda pudessem ser obtidas. Finalmente, a amplitude de cobertura prevista foi confirmada em um ensaio clínico em humanos.

[0070] A seleção de sequência foi realizada aqui usando tanto estudos de regressão de tumor em camundongos C57/B6, quanto estudos de interferon-gama ELISPOT em camundongos transgênicos humanizados HLA-A2. Nos estudos de avaliação de peptídeo usando

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41/55 regressão de tumor, uma resposta à célula T positiva foi uma resposta à célula T que resultou na regressão do tumor. No estudo de ELISPOT de modelo de camundongo HLA-A2 ELISPOT, pelo menos 20 pontos por milhão de esplenócitos foi considerado uma resposta positiva.

[0071] São fornecidos resultados sumários mostrando respostas de célula T positivas ou negativas. Os detalhes fornecidos permitem que qualquer pessoa familiarizada com o campo entenda a necessidade de análise extensiva de sequências de peptídeo por meios in vivo como uma primeira etapa, e siga e replique todas as etapas da invenção.

[0072] Também fornecida aqui é uma ilustração mostrando que a predição de ligação do peptídeo HLA por análise in-silico de ligação confirma e corresponde a pelo menos 90% de cobertura de pacientes. Estas ilustrações permitirão que qualquer pessoa experiente no campo siga corretamente o processo de selecionar primeiro as sequências de peptídeo E6 e E7 que podem ser imunogênicas, depois testá-las in vivo para confirmar o processamento e apresentação. Em terceiro lugar, as sequências selecionadas que são mostradas in vivo para serem adequadamente imunogênicas são selecionadas e menos sequências imunogênicas eliminadas. Em quarto lugar, os peptídeos são individualizados para análise in-siíico de ligação para determinar cada afinidade de ligação dos peptídeos aos vários tipos de HLA. Finalmente, uma combinação de peptídeos que são previstos fornecer pelo menos 90% de cobertura é selecionada. No nosso caso, um estudo clínico humano foi realizado para testar e confirmar as previsões.

[0073] Os seguintes exemplos ilustram os modos exemplares de preparar e pratucar a invenção. Entretanto, o escopo da invenção não é limitado às modalidades específicas descritas nestes Exemplos, que são apenas ilustrativos, visto que métodos alternativos podem ser

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42/55 utilizados para obter resultados similares. As sequências de peptídeo usados na ilustração da invenção são fornecidas na Tabela 1.

Tabela 1

Uma amostra de Sequências de peptídeo Analisada In Vivo e

Resultando em Resposta Imune

Sequência ID	Sequência	Correspondendo a	Resposta imune, método
SEQ ID NO: 1	RAHYNIVTF	E7 49-57	Positiva, regressão de tumor
SEQ ID NO: 2*	DRAHYNIVTF	E7 48-57	Negativa, regressão de tumor
SEQ ID NO: 3	PalmKSS RAHYNIVTF	E7 49-57	Positiva, regressão de tumor
SEQ ID NO: 4	KSS RAHYNIVTF	E7 49-57	Positiva, regressão de tumor
SEQ ID NO: 5	GQAEPDRAHYNIVTF	E7 43-57	Positiva, regressão de tumor
SEQ ID NO: 6*	KSS GQAEPDRAHYNIVTF	E7 43-57	Negativa, regressão de tumor
SEQ ID NO: 7	PAGQAEPDRAHYNIVTFC	E7 41-58	Positiva, regressão de tumor
SEQ ID NO: 8*	EPDRAHYNIVTFCCKCDS	E7 46-63	Negativa, regressão de tumor
SEQ ID NO: 9	MHGDTPTLHEYMLDLQPETT	E7 1-20	Positiva, EISPOT
SEQ ID NO: 10	LLMGTLGIVCPICSQKP	E7 82-98	Positiva, ELISPOT
SEQ ID NO: 11	ELQTTIHDIILECVYCKQQLL	E6 25-45	Positiva, ELISPOT
SEQ ID NO: 12*	KFYSKISEYRHCYYSLYGTTL	E7 75-95	Negativa. ELISPOT
SEQ ID NO: 13*	QQLLRREVYDFAFRDLCIVYR	E7 42-62	Negativa, ELISPOT
SEQ ID NO: 14	YMLDLQPETT	E7 11-20	Positiva, ELISPOT
SEQ ID NO: 15	LLMGTLGIV	E7 82-90	Positiva, ELISPOT

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SEQ ID NO: 16	IVCPICSQK	E7 89-96	Avaliada epítopo	como
SEQ ID NO: 17	GTLGIVCPI	E7 85-92	Avaliada epítopo	como
SEQ ID NO: 18	IILECVYCK	E6 33-41	Avaliada epítopo	como
SEQ ID NO: 19	TLHEYMLDL	E7 7-15	Avaliada epítopo	como
SEQ ID NO: 20	TPTLHEYML	E7 5-13	Avaliada epítopo	como
SEQ ID NO: 21	TIHDIILECV	E7 29-38	Positiva, ELISPOT
SEQ ID NO: 22	TLGIVCPIC	E7 86-93	Positiva, ELISPOT
SEQ ID NO: 23	PalmKSS ELQTTIHDIILECVYCKQQLL	E6 25-45	Positiva, ELISPOT
SEQ ID NO: 24	PalmKSS MHGDTPTLHEYMLDLQPETT	E7 1-20	Positiva, ELISPOT
SEQ ID NO: 25	PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP	E7 82-98	Positiva, ELISPOT
SEQ ID NO: 26	PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF	E7 43-57	Positiva regressão tumor	de
SEQ ID NO: 26	PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF	E7 43-57	Positiva, ELISPOT
SEQ ID NO: 27	PalmKSS YMLDLQPETT	E7 11-20	Positiva, ELISPOT
SEQ ID NO: 28	PalmKSS LLMGTLGIV	E7 82-90	Positiva, ELISPOT
SEQ ID NO: 29	FAFRDLCIV	E7 52-60	Avaliada epítopo	como
SEQ ID NO: 30	KISEYRHCY	E7 79-87	Avaliada epítopo	como
SEQ ID NO: 31	RLCVQ STHVDIRTLEDLL	E7 66-83	Avaliada quanto à formulaçãon
SEQ ID NO: 32	CDSTLRLCVQ STHVDIRT	E7 61-78	Positiva, formulação tumor	de

*Não atende aos critérios de eficácia quanto à seleção para avaliar em estudos de ligação

Exemplo 1

Análise de Sequência de Peptídeo Por Regressão de tumor TC-1 em Camundongos C57/B6 [0074] Este exemplo ilustra a avaliação ou análise de diversos

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44/55 peptídeos de HPV16 E7 no modelo de regressão de tumor de camundongo TC-1 quanto ao seu processamento e apresentação eficaz dos principais epítopos levando à indução de célula T específica de HPV e regressão de tumor subsequente.

[0075] Nos estudos de análise de regressão de tumor, os camundongos foram implantados com 100.000 célula TC-1 no dia 0. No dia 7, uma vez que os tumores estavam bem estabelecidos, os camundongos foram vacinados com as sequências específicas de peptídeo, formuladas isoladamente ou em combinação com lipídios catiônicos tais como o DOTMA, DOEPC ou R-DOTAP para facilitar a captação e apresentação. Nestes estudos, as vacinas continham o peptídeo selecionado em uma concentração de 0,1-3,0 mg/mL e lipossomas catiônicos em uma concentração de 0,2-3,0mg/mL Nos casos onde as sequências de peptídeo foram lipidadas ligando uma cadeia de palmitoíla, os peptídeos foram simplesmente misturados com os lipossomas catiônicos antes da vacinação. No caso dos petídeos não lipidados, os lipossomas foram preparados e peptídeos encapsulados por métodos de preparação de lipossoma de película fina (F Szoka, and D Papahadjopouios, Comparative Properties e Methods of Preparation de Lipid Vesicles (Lipossomas), Annual Review de Biophysics e Bioengineering, Vol. 9:467-508, 1980). Outros métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica também podem ter sido usados.

[0076] Uma plotagem de amostra regressão de tumor mostrando resultados para peptídeos correspondendo às SEQ ID NO: 1 (quadrado em branco), SEQ ID NOS: 7, 8, 31 32 e 31 (círculo preto sólido), SEQ ID NO: 7 (cíclulo em branco), e SEQ ID NO: 8 (triângulo em branco sólido) é mostrada na figura 3. Os resultados ressaltaram o fato de que algumas sequências de HPV E7 resultaram na regressão de tumor eficaz, enquanto outras não, presumidamente devido à

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45/55 capacidade ineficaz de apresentar o epítopo de célula T CD8+. Os resultados selecionados são sumariados na Tabela 1.

Exemplo 2

Análise de Sequência de Peptídeo por Estudos ELISPOT de IFN-G Em Camundongos HLA-A2 [0077] Este exemplo realça o método para avaliar as respostas de célula T usando estudos ELISPOT em camundongos transgênicos HLA-A2 humanizados. Nestes estudos, as vacinas continham o peptídeo selecionado em uma concentração de 0,1-3,0 mg/mL e lipossomas catiônicos quando usadas, em uma concentração de 0,23,0 mg/mL. Camundongos transgênicos HLA-A2 humanizados tendo componentes do sistema imune humano capazes de reconhecer antígenos humanos foram vacinados no dia 0 e dia 7 com 100uL da vacina. No dia 14, os camundongos foram sacrificados e resposta imune específica de HPV avaliada por ELISPOT interferon-gama usando métodos padrões com os especócitos dos camundongos (4 a 8 por grupo). Os esplenócitos foram estimulados com os peptídeos de epitópicos de célula T CD8⁺ especificados ou os peptídeos longos de múltiplos epítopos especificados na Tabela 2. O número de pontos de IFN-g por milhões de células é listado para os exemplos especificados. Um mínimo de 20 pontos foi o ponto de corte para a potência adequada, e seleção para estudos de ligação de epitopo de ligação. A capacidade dos camundongos transgênicos humanizados em gerar com sucesso uma resposta imune de células T (> 20 pontos) quando estimuladas com cada um dos peptídeos de múltiplos epítopos longos bem como peptídeos de único epítopo curtos confirma que os peptídeos selecionados são eficazmente processados e apresentados às células T. Nestes estudos, esplenócitos não estimulados e esplenócitos estimulados com peptídeos irrelevantes foram ambos usados juntamente como controles negativos em cada ensaio. Para o

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46/55 controle positivo no ensaio ConA foi usado.

Tabela 2

Sumário de Estudos ELISPOT de IFN-g - sequências selecionadas

SequêncialD	Sequência	Epítopo de célula T Usado como Peptídeo Estimulatório	Resultado de ELISPOT pontos de Av/106 células
SEQ ID NO: 9	MHGDTPTLHEYMLDLQPETT	YMLDLQPETT (SEQ ID NO: 14)	235
SEQ ID NO: 10	LLMGTLGIVCPICSQKP	TLGIVCPIC (SEQ ID NO: 22)	27
SEQ ID NO: 10*	LLMGTLGIVCPICSQKP	LLMGTLGIV (SEQ ID NO: 15)	1
SEQ ID NO: 11	ELQTTIHDIILECVYCKQQLL	TIHDIILECV (SEQ ID NO: 21)	262
SEQ ID NO: 12*	KFYSKISEYRHCYYSLYGTTL	KISEYRHCY (SEQ ID NO: 30)	15
SEQ ID NO: 13*	QQLLRREVYDFAFRDLCIVYR	FAFRDLCIV (SEQ ID NO: 29)	6
SEQ ID NO: 14	YMLDLQPETT	YMLDLQPETT (SEQ ID NO: 14)	580
SEQ ID NO: 15	LLMGTLGIV
SEQ ID NO: 21	TIHDIILECV
SEQ ID NO: 23	PalmKSS ELQTTIHDIILECVYCKQQLL	TIHDIILECV (SEQ ID NO: 21)	612
SEQ ID NO: 23*	PalmKSS ELQTTIHDIILECVYCKQQLL	ELQTTIHDIILECVYCK QQLL (SEQ ID NO: 13)	8
SEQ ID NO: 24	PalmKSS MHGDTPTLHEYMLDLQPETT	YMLDLQPETT (SEQ ID NO: 14)	79
SEQ ID NO: 24	PalmKSS MHGDTPTLHEYMLDLQPETT	MHGDTPTLHEYMLDL QPETT (SEQ ID NO: 9)	284
SEQ ID NO: 25*	PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP	LLMGTLGIV (SEQ ID NO: 15)	5
SEQ ID NO: 25	PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP	TLGIVCPIC (SEQ ID NO: 22)	31

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47/55

SEQ ID NO: 25	PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP	LLMGTLGIVCPICSQK P (SEQ ID NO: 10)	92
SEQ ID NO: 26	PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF	RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 1)	1,552
SEQ ID NO: 26	PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF	GQAEPDRAHYNIVTF (SEQ ID NO: 5)	1,544
SEQ ID NO: 27	PalmKSS YMLDLQPETT	YMLDLQPETT (SEQ ID NO: 14)	280
SEQ ID NO: 28	Pa/mKSSLLMGTLGIV	LLMGTLGIV (SEQ ID NO: 15)	96

*Não atende aos critérios de eficácia quanto à seleção para avaiiar em estudos de iigação

Exemplo 3

Efeito de Modificações Químicas Tais como Oxidação e Formação de Multímero

Formação das Sequências Selecionadas Na Imunogenicidade da Vacina HPV 16 [0078] O presente estudo foi realizado para avaliar o efeito da modificação química de peptídeos selecionados sobre a imunogenicidade e sua capacidade em ser processada, apresentada para iniciar respostas de célula T específicas de HPV de CD8⁺. Peptídeos correspondendo às SEQ ID NO: 23 e 25 contêm cisteínas que na oxidação induzem à formação de dímeros e outros multímeros. Duas formulações de vacina foram preparadas contendo peptídeos correspondendo às SEQ ID NO: 23 e 25.

[0079] Na Formulação A: Ambos os peptídeos foram monoméricos com alta pureza confirmada por análise de HPLC. A vacina continha

1,5-1,6 mg/mL de cada peptídeo.

[0080] Na Formulação B: Oxidação significante e formação de multímero de ambos os peptídeos foram confirmadas por análise de HPLG.

[0081] Ambas as formulações foram misturadas 1:1 com 5,8 mg/mL de R-DOTAP antes da vacinação.

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48/55 [0082] A imunogenecidade dos peptídeos foi comparada como descrito nos exemplos acima em 10 camundongos HLA-A2 por formulação avaliando a capacidade em induzir as células T CD8+. Estudos de ELISPOT foram realizados como acima descrito. A tabela 3 abaixo mostra os resultados do estudo de ELISPOT e comparação usando o teste T de student. Os resultados da análise estatística indicam que as diferenças entre as formulações A e B não atendem ao valor P de P<0,05 para significância. O presente estudo sugere que modificações tais como oxidação não impactarão de forma negative a imunogenicidade das sequências de peptídeo.

Tabela 3

Efeito de modificações qupimicas tais como oxidação e formação de multímero de sequências de peptídeo 23 e 25 sobre a imunogenicidade de célula T CD8+ dos peptídeos

Sequência ID	Sequência	Epítopo de célula T usado como peptídeo estimulatório	Resultado de ELISPOT Pontos de Av/106 células
Formulação A
SEQ ID NO: 23	PalmKSS ELQTTIHDIILECVYCKQQLL	TIHDIILECV (SEQ ID NO: 21)	314
SEQ ID NO: 25	PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP	LLMGTLGIV (SEQ ID NO: 15)	52
Formulação B
SEQ ID NO: 23	PalmKSS ELQTTIHDIILECVYCKQQLL	TIHDIILECV (SEQ ID NO: 21)	158
SEQ ID NO: 25	PalmKSS LLMGTLGIVCPICSQKP	LLMGTLGIV (SEQ ID NO: 15)	48
SEQ ID NO: 23: Formulação A vs. B - P-0,08 SEQ ID NO: 25: Formulação A vs. B - P=0,80

Exemplo 4

Sumário de Análise in-silico dos Alelos de HLA Potenciais que

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49/55

Ligariam Peptídeos de HPV Presentes em uma Vacina de Peptídeo de Múltiplos Epitopos Contendo as 4 Sequências de Peptídeo Selecionadas [0083] Diversas sequências de peptídeo HPV16 E6 e E7 foram planejadas e avaliada in vivo em camundongos HLA-A2 humanizados quanto à capacidade dos peptídeos em serem eficazmente processados e epitopos específicos apresentados para iniciar as células T específicos de antígeno como descrito nos exemplos acima. Como seria evidente por aqueles versados na técnica, interações de peptídeo-epítopo são complexas dependendo de numerosos fatores incluindo estereoquímica, presença de cofatores e propriedades bioquímicas do ambiente. Consequentemente, a seleção de peptídeos apropriados para eficácia ideal em vacinas é nem uma rotina nem uma prática preditável. Com base em estudos in vivo extensivos para identificar sequências de peptídeo adequadas que seriam eficazmente processsadas e epitopos de célula T apresentados, peptídeos selecionados foram então também selecionados com base em sua capacidade de induzir regressão de tumores estabelecidos ou induzir IFN-gama induzindo células T específica de HPV, e em seguida analisados por análise in-silico de ligação para avaliar sua abragência de HLA. As predições foram então confirmadas em um experiment clínico humano.

[0084] O supertipo de HLA, HLA-A2 é responsável por cerca de 42% da população (Sette, A. e J. Sidney, Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderance de HLA-A and ~B polymorphism. Immunogenetics, 1999. 50(3-4): p. 201-12). HPV16 E6 e E7 expressam epitopos experimentalmente verificados que podem ser apresentados por HLA A2, bem como epitopos que podem ser apresentados por outros tipos de HLA.

[0085] Para fazer isso, as afinidades de ligação do peptídeo a 9 moléculas de HLA diferentes representando os 9 supertipos principais

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50/55 de HLA (Sette, A. e J. Sidney, supertypes de HLA and supermotifs: a functional perspective on HLA polymorphism. Curr Opin Immunol, 1998. 10(4): p. 478-82) foram avaliadas. Os 9 principais supertipos de HLA responsáveis por mais de 98% do potencial de ligação de peptídeo da população humana (Sette, A. e J. Sidney, Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A e -B polymorphism. Immunogenetics, 1999. 50(3-4): p. 201-12). Os extensos estudos de análise in vivo induzindo à identificação de sequências adequadas para avaliação de ligação de HLA, bem como estudos confirmatórias para garantir que a competição quanto aos sítios de competição não diminui a capacidade do sistema imune em processar e apresentar os epítopos de célula T específicos quando combinados em uma formulação de vacina são descrito por todos os Exemplos fornecidos aqui. Os presentes estudos demonstram que embora as técnicas de seleção de peptídeo, e técnicas de análise de peptídeo estejam disponíveis, os processos de identificação, seleção e combinação dos peptídeos para otimizar o processo de criação de uma vacina eficaz com ampla aplicabilidade não foi de rotina nem simples. Tabela 4

Atividade de ligação para 4 sequências de peptídeo selecionadas pósanálise

Peptídeo presente na formulação	Supertipo de HLA	Sequência de epítopo de célula T CD8+ de peptídeo	IC50 (nM)
SEQ ID NOS: 10&25	HLA-A*03:01	IVCPICSQK (SEQ ID NO: 16)	155
SEQ ID NOS: 10&25	HLA-A*02:01	LLMGTLGIV (SEQ ID NO: 15)	19
SEQ ID NOS: 10&25	HLA-A*02:01	GTLGIVCPI (SEQ ID NO: 17)	155
SEQ ID NOS: 11 & 23	HLA-A*03:01	IILECVYCK (SEQ ID NO: 18)	126
SEQ ID NOS: 5 & 26	HLA-A*24:02	RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 1)	1699
SEQ ID NOS: 5 & 26	HLA-B*58:01	RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 1)	107
SEQ ID NOS: 9 & 24	HLA-A*02:01	YMLDLQPETT (SEQ ID NO: 14)	5
SEQ ID NOS: 9 & 24	HLA-A*02:01	TLHEYMLDL (SEQ ID NO: 19)	48
SEQ ID NOS: 9 & 24	HLA-B*07:02	TPTLHEYML (SEQ ID NO: 20)	921

[0086] A tabela 4 sumariza para o propósito da invenção, o

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51/55 resultado da análise de ligação de peptídeo das quatro sequências de peptídeo preferidas identificadas pelos estudos de indução de célula T, bem como os possíveis epítopos abrangidos por aquelas sequências usando a ferramenta de predição de epítopo no immune Epitope Database (www.iedb.org). A ferramenta calcula uma afinidade deligação predita (IC50) do peptídeo com um alelo de HLA classe I em particular. Um IC50 de 5.000 nM ou menos é geralmente reportardo ser suficiente para ligação biologicamente relevante e apresentação com uma afinidade de ligação de menos do que 500nM considerada representar ligação de alta afinidade. Na análise atual, 2.000 nM foram escolhidos como um ponto de corte para avaliar os potenciais peptídeos de ligação de HLA. Como mostrado na Tabela 4, pelo menos 5 moléculas de HLA diferentes representando 5 distintos supertipos de HLA são identificados como tendo o potencial para ligação biologicamente significante e apresentação de diferentes peptídeos dentro das SEQ ID NOS: 5, 9, 10 e 11 ou 23-26. Estes 5 supertipos são conhecidos ser representativos de mais do 90% a população humana, independentemente de etnia [ Sette, A. and J. Sidney, Nine major HLA class / supertypes account for the vast preponderance de HLA-A e -B polymorphism. Immunogenetics, 1999.

50(3-4): p. 201-12],

Exemplo 5

Compatibilidade de Outros Lipídios catiônicos Além de R-DOTAP com AS Sequências de Peptídeo HPV-E6 e E7 e Capacidade em Induzir as Respostas de Célula T Específicas de HPV [0087] Para determinar se os peptídeos de HPV16 longos são compatíveis com outros lipídios catiônicos além do DOTAP, o peptídeo correspondendo à SEQ ID NO: 26 foi usado como o modelo de peptídeo em combinação com dois outros lipídios catiônicos DOTMA e DOEPC. Para avaliar a capacidade dos peptídeos para efetivamente

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52/55 passar por processamento e apresentação, na presença de ambos lipídios catiônicos, um estudo de ELISPOT foi conduzido usando camundongos C57/B6 normais. Estudos de ELJSPOT foram realizados como descrito acima e utilizados para determinar a indução de célula T CD8⁺.

[0088] Na formulação 1, 1,35 mg/mL de DOTMA foi misturado 1:1 v/v com 0,5 mg/mL do peptídeo correspondendo à SEQ ID NO: 26.

[0089] Na formulação 2, 1,67 mg/mL de DOEPC perdeu 1:1 v/v com 0,5 mg/mL do peptídeo correspondendo à SEQ ID NO: 26.

[0090] Para cada formulação 4 camundongos foram vacinados no Dia 0 e Dia 7. No Dia 14, os camundongos foram sacrificados e os esplenócitos utilizados no estudo de ELISPOT.

Tabela 5

Resultados de ELISPOT para formulações de peptídeo de HPV com vários lipídios catiônicos

Sequência ID	Sequência	Epítopo de célula T Usado como peptídeo estimulatório	Resultado de ELISPOT Pontos de Av/106 células
DOTMA
SEQ ID NO: 26	PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF	RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 1)	988
DOEPC
SEQ ID NO: 26	PalmKSS GQAEPDRAHYNIVTF	RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 1)	243

[0091] O estudo demonstra que vários lipídios catiônicos podem ser usados com os peptídeos de HPV E6 e E7 identificados para induzir fortes respostas de célula T específica de HPV.

Exemplo 8

Uso de Peptídeos Lipidados (SEQ lD NOS: 23-28) e Lipídio Catiônico R-DOTAP Em Uma Vacina Terapêutica Contra HPV e Avaliação de Respostas de Célula T Específicas de HPV em um Teste Clínico Humano

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53/55 [0092] A formulação de 6 peptídeos contendo os 4 peptídeos (SEQ. ID NOS: 23-26) que foram projetados nos Exemplos 1- 4 para abranger >90% da população com base em respostas de célula T in vivo e ligação de peptídeo, e 2 peptídeos epitópicos únicos adicionais (SEQ ID NOS: 27 e 28) já contidos nas SEQ ID NOS: 24 e 25 foi avaliada em um teste clínico humano (clinicai triais.gov # NCT02065973). Os 2 peptídeos epitópicos únicos incluídos na formulação não fornecem nenhuma abrangência adicional, visto que eles já continham 2 das sequências de peptídeo longas incluídas.

[0093] Neste estudo exploratório, devido à natureza variável dos sistemas biológicos e respostas humanas, a resposta imune à vacina foi avaliada tanto pelo IFN-γ como pelo ELISPOT de granzima-b. Cada indivíduo recebeu 3 vacinações da formulação de R-DOTAP/peptídeo. Todos os indivíduos receberam 3 vacinações, 1 a cada 3 semanas. O sangue foi coletado antes da vacinação (Linha de base) e 14-19 dias após cada vacinação e aos 90 dias após uma última vacina para monitoramento imune por ELISPOT. Os indivíduos não foram restritos por um tipo de HLA a fim de confirmar a ampla abrangência da vacina. A análise de ELISPOT foi realizada usando os PBMCs individuais e estimulados com a mistura de 6 peptídeos para determinar a apresentação eficaz e reconhecimento de célula T dos peptídeos de HPV.

[0094] Os resultados para o estudo clínico humano são mostrados na tabela 6 abaixo. Uma resposta induzida por vacina é tipicamente definida como aumento de 2 ou 3 vezes em resposta imune em relação à linha de base. Neste estudo, uma resposta imune foi definida como um aumento de 3 vezes ou mais em resposta de célula T após vacinação em comparação com a amostra de linha de base por análise de IFN-y ou granzima-b. Dois indivíduos, indivíduos 2 e 5, ambos que tinham respostas de células T muito fortes de mais de 420

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54/55 pontos de IFN~g (sistema imunológico possivelmente já respondendo a uma infecção recente por HPV) no início do estudo eram considerados outliers (Tabela 1). 6). Todos os indivíduos foram testados quanto ao tipo de HLA. Metade dos indivíduos foram HLA-A2 como esperado, visto que este é o tipo mais comum de HLA. Entretanto, todos os indivíduos incluindo os indivíduos de não HLA-A2 (HLA-A1, 30, 3, 74, 80 etc.) geraram fortes respostas de célula T à vacina. O estudo confirmou que a combinação dos 4 peptídeos de múltiplos epítopos, SEQ ID NOS: 23-26 fornece uma vacina contra HPV16 humana amplamente aplicável que pode ser reconhecida por pacientes de bases genéticas variáveis.

Tabela 6

Avaliação de Capacidade de Uma Formulação de Vacina Contra HPV16 Contendo Um lipídio catiônico e Peptídeo (SEQ ID NO: 23-28) Para Iniciar Células T específicas de Antígeno Incluindo Células T CD8⁺ T Por ELISPOT de INF-Γ e Granzima-B Em Indivíduos Humanos com Tipos de HLA Variáveis

Número médio de pontos por 400.000 células
		FN-γ		Granzima-b
Paciente #*	Tipo de HLA	Linha de base**	Aumento de fator com relação à linha de base***		Linha de base**	Aumento de fator com relação à linha de base***	Ativo
1	02	6,0	19,7		N/A		Sim
2	01,02	423,0	Outliers
3	01	69,5	7,3		5,7	3,0	Sim
4	02	22,0	14,8		0,0	10,3	Sim
5	29	464,7	Outliers
6	03	17,8	32,8		6,7	31,8	Sim
7	02,26	3,0	4,8		51,3	1,2	Sim

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55/55

8	02, 68	1,0	72,7		8,0	7,6	Sim
9	03	2,3	10,4		10,0	1,0	Sim
10	74, 80	1,0	53,3		1,0	61,3	Sim
11	02, 30	9,0	1,4		1,0	35	Sim
12	N/A	1,0	10,7		23,3	1,1	Sim
Resposta média	22,8			15,2

Tinha de base são as contagens de visita 2 (visita pré-vacinação) menos as constagens de base **Resposta máxima é a resposta máxima (contagens) observada no indivíduo menos as contagens de base ***Aumento de fator com relação à Linha de base é a resposta máxima dividida por contagens de Linha de base (Fator de > 3 é considerado ser uma resposta imune devido à vacinação^4,5) ““Um resultado negativo resultando de Contagens menos Base é dado o valor de 0, e 0/0 = 0 ^#Ativo: Aumento de valor em relação à Linha de base de > 3 por IFN-γ e/ou Granzíma-b ELISPOT

Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende sequências peptídicas de HPV, sendo que as sequências peptídicas de HPV correspondem aos peptídeos de E6 de HPV16, e/ou peptídeos de E7 de HPV16 e em que as sequências peptídicas têm uma afinidade de ligação de aproximadamente IC50 de 5.000nM com 5 supertipos de HLA, e sendo que alguns dos peptídeos são peptídeos de múltiplos epítopos.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os peptídeos compreendem SEQ ID NOS: 5, 9, 10 e 11, ou suas versões lipídicas que consistem em SEQ ID NOS: 23, 24, 25 e 26.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação2, caracterizada pelo fato de que os peptídeos estão presentesna composição como peptídeos individuais.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação2, caracterizada pelo fato de que os peptídeos são conjugados uns aos outros com um espaçador ou sem um espaçador para formar um único peptídeo longo abrangendo as sequências reivindicadas.
5. 5. Composição de acordo com a reivindicação1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.
6. 6. Composição de acordo com a reivindicação5, caracterizada pelo fato de que o adjuvante consiste em um lipídio catiônico.
7. 7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o lipídio catiônico consiste em DOTAP, DDA, DOEPC, DOTMA, R-DOTAP, R-DDA, R-DOEPC, R-DOTMA, SDOTAP, S-DDA, S-DOEPC, S-DOTMA, variações ou análogos dos mesmos.

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8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os supertipos de HLA consistem em HLAA*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, HLA-B*07:02, e HLA-B*58:01.
9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda epítopos de agonista realçador.
10. 10. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda peptídeos de epítopo simples.
11. 11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que os peptídeos de epítopo simples compreendem SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 15 e análogos dos mesmos, tais como SEQ ID NOS: 27 e 28.
12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os peptídeos compreendem peptídeos modificados, análogos de peptídeo e fragmentos ativos dos mesmos.
13. 13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que os peptídeos são oxidados, reticulados por ligações de dissulfeto, pegilados, glicosilados, fosforilados, palmitoilados, metilados ou biotinilados.
14. 14. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os peptídeos consistem em SEQ ID NOS: 5, 9, 10 11, 23, 24, 25 ou 26, e em que o lipídio catiônico compreende R-DOTAP.
15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato que os peptídeos são encapsulados em lipossomas compreendendo lipídios catiônicos.
16. 16. Uso de sequências peptídicas de HPV, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento e/ou uma composição e/ou um

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    3/3 kit para induzir uma resposta imunológica contra infecção por HPV em um indivíduo,
17. 17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os peptídeos consistem em SEQ ID NOS: 5, 9, 10 11, 23, 24, 25 ou 26.
18. 18. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.
19. 19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o lipídio catiônico consiste em DOTAP, DDA, DOEPC, DOTMA, R-DOTAP, R-DDA, R-DOEPC, R-DOTMA, S-DOTAP, S-DDA, S-DOEPC, S-DOTMA, variações ou análogos dos mesmos.
20. 20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os peptídeos consistem em SEQ ID NOS: 5, 9, 10 11, 23, 24, 25 ou 26, e sendo que o lipídio catiônico compreende R-DOTAP.
21. 21. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, uma embalagem ou um recipiente com as referidas composições formuladas para a rotina de liberação, e instruções sobre a dosagem e um encarte quanto às composições.
22. 22. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretizações ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.