KR20170126500A - Mhc 세포 라이브러리를 이용하여 신규한 면역원성 t 세포 에피토프를 검출하고 신규한 항원-특이적 t 세포 수용체를 단리하는 방법 - Google Patents

Mhc 세포 라이브러리를 이용하여 신규한 면역원성 t 세포 에피토프를 검출하고 신규한 항원-특이적 t 세포 수용체를 단리하는 방법 Download PDF

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크리스티안 엘링저
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Abstract

본 발명은 면역요법 분야, 구체적으로 입양 T 세포 요법, T 세포 수용체 (TCR) 유전자 요법 및 백신접종에 관한 것이다. 본 발명은 주요 조직접합성 복합체 (MHC) 상에서 제시되는 항원의 에피토프에 특이적인 TCR 구조물의 TCR 알파 쇄 구조물 (TRA) 및 TCR 베타 쇄 구조물 (TRB)를 코딩하는 핵산을 제조하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 공여자, 바람직하게는, K562 세포에 존재하는 MHC I 또는 MHC II 대립유전자를 모두 발현시키는 세포를 포함하는 인공 항원 제시 세포(APC)의 라이브러리를 상기 공여자에서 단리된 T 세포에 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 TCR 구조물은 T 세포에서 발현될 수 있는데, 이것은 예를 들어 암, 바이러스 감염 또는 자가면역질환의 입양(adoptive) T 세포 요법에 유용하다. 본 발명은 상기 TCR에 의해 인지되는 에피토트를 동정하는 방법을 더 제공한다. 상기 TCR에 의해 인지되는 면역원성 에피토프를 이용하여 환자에서 항원-특이적 T 세포 면역을 유도하는 백신 제제를 개발할 수 있다. 본 발명은 2개의 TCR 구조물과 본 발명의 방법에 의해 수득된 각각의 면역원성 에피토프의 쌍을 제공하는데, 상기 에피토프는 인간 유두종바이러스 (HPV) 16 (알파 유두종바이러스 9로 또한 지명됨) 종양단백질 E5 및 인간 거대세포바이러스 (CMV) 단백질 pp65의 에피토프이다.

Description

MHC 세포 라이브러리를 이용하여 신규한 면역원성 T 세포 에피토프를 검출하고 신규한 항원-특이적 T 세포 수용체를 단리하는 방법
본 발명은 면역요법 분야, 구체적으로 입양(adoptive) T 세포 요법, T 세포 수용체 (TCR) 유전자 요법 및 백신접종에 관계한다. 본 발명은 주요 조직접합성 복합체 (MHC) 상에서 제시되는 항원의 에피토프에 특이적인 TCR 구조물 (construct)의 TCR 알파 쇄 구조물 (TRA) 및 TCR 베타 쇄 구조물 (TRB)를 코딩하는 핵산의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 공여자, 바람직하게는, K562 세포에 존재하는 MHC I 또는 MHC II 대립유전자를 모두 발현시키는 세포를 포함하는 인공 항원 제시 세포 (APC) 라이브러리를 상기 공여자로부터 단리된 T 세포들에 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 TCR 구조물은 T 세포에서 발현될 수 있는데, 이것은 가령, 암, 바이러스 감염 또는 자가면역질환의 입양 T 세포 요법에 유용하다. 본 발명은 전술한 TCR에 의해 인지되는 에피토트를 동정하는 방법을 더 제공한다. 전술한 TCRs에 의해 인지되는 면역원성 에피토프들을 이용하여 환자들에서 항원-특이적 T 세포 면역을 유도하는 백신 제제를 개발할 수 있다. 본 발명은 2개의 TCR 구조물과 본 발명의 방법에 의해 획득된 각각의 면역원성 에피토프의 쌍을 제공하는데, 이때 상기 에피토프들은 인간 유두종바이러스 (HPV) 16 (알파 유두종바이러스 9로 또한 지명됨) 종양단백질 E5 그리고 인간 거대세포바이러스 (CMV) 단백질 pp65의 에피토프들이다.
T 세포 수용체 (TCR) 유전자 요법은 다양한 바이러스-및 암-관련된 징후를 치료하는 유망한 면역요법 전략이다. 한 가지 주요 장벽은 임상전 환경과 임상 환경에서 분석될 잠재적 TCRs의 이용성이 부족하다는 점이다. 항원-특이적 TCRs을 탐지하고 단리하는 현재 방법들의 기술적 한계로 인하여 특정 MHCs에 한정되거나, 또는 항원 에피토프에 대한 사전 지식이 요구된다. 면역요법의 성공에 있어서 또다른 주요 인자로는 표적 항원의 선택이다. 종양 조직에 특이적으로 발현되지만, 정상 조직에서는 발현되지 않는 항원을 표적으로 하는 것이 특히 관심대상이 된다.
입양 T 세포 요법은 생체외(ex vivo) 활성화 및 T 세포의 확장을 기반으로 하여 환자에게 재주입하기 위한 항원-특이적 작동체 T 세포를 만든다 (1). 이 프로세싱은 T 세포가 새로운 항원 수용체를 가지도록 유전적 변형을 수반할 수 있다. 신속한 생체외 확장 프로토콜은 종양 미세환경의 면역 억제 방벽을 파괴할 수 있는 많은 수의 T 세포를 만들어 표적 세포를 청소하는 것이다. 면역 억제 방벽의 극복으로 APCs에 의한 용해된 종양 세포들이 취입되고, 추가 항원들이 제공될 수 있는데, 이 프로세싱은 에피토프 확산(spreading)으로 불린다. 이 공정에 이어 자가 T 세포들의 새로운(de novo) 프라이밍과 무력한 T 세포의 재활성화에 의해 항종양 면역 반응의 증폭이 이어지고, 이러한 것들은 상기 입양 T 세포 요법에 의해 유도되었다. 유전적으로 변형된 입양 T 세포 요법 뿐만 아니라 항원 수용체-조작된(engineered) T 세포들은 난치성인 암과 바이러스-관련 질환을 치료하는 다른 치료에 성공적으로 이용되어 왔었다 (2).
환자에게 T 세포 면역을 제공하는 제 2 전략은 백신의 적용이다. 백신은 특정 병원체들 또는 암에 대하여 후천적 면역을 제공하는데, 시장에 도입된 많은 백신들은 다수의 생명을 위협하는 질환의 이환율과 치사율을 상당한 감소시켜왔다. 신규 예방 및 치료 백신의 개발을 위하여 항원, 항원 에피토프 및 MHC 제한 요소들의 확인이 전제조건이며, 이러한 항원을 발현하는 병원성 세포로부터 보호하고, 이를 제거할 수 있는 T 세포 반응을 유도한다. 병원성 세포들에 의해 내부적으로 프로세싱되고, 제시되며, 그리고 항원-특이적 TCRs에 의해 인지되는 항원 에피토프들을 식별함으로써 항원-특이적 면역을 유도하는 신규 백신 제제의 개발이 가능하다.
다음에서 항원-특이적 TCRs를 식별하고, 단리하며, 그리고 T 세포 반응을 유도하는 항원 에피토프들을 동정하는 현행 방법들을 검토하였다.
말초 혈액 단핵구 세포들 (PBMCs)은 시험관 분석을 위한 T 세포의 주요 원천이다. 스크리닝을 위하여, 환자 또는 건강한 공여자 혈액의 PBMCs로부터 다량의 T 세포를 용이하게 단리시킬 수 있다. 비교용으로, 종양-침윤 림프구 (TILs)로부터 단리된 T 세포들은 종양 생검에 의해 제한적인 양이 이용가능하다. 생검은 오직 고형 종양에서만 획득가능하다 (3,4). PBMCs 또는 TILs의 TCRs 직접적 서열 분석으로 TCR 서열에 대한 방대한 데이터가 생성될 수 있다. 이 데이터 세트로부터 TCR 특이성과 항원 인지의 예측은 여전히 불가능하다 (5). T 세포 시료로부터 원하는 특이성을 갖는 TCR을 단리하기 위하여, TCR 서열을 분석하기 앞서, 항원 특이적 농축 단계를 도입할 필요가 있다. 또한, TCR 단리에 앞서, T 세포의 항원 특이성을 확인하기 위한 기능적 분석을 수행하는 것이 유용하다(6). T 세포를 농축하는 표준 방법은 배양물에서 특정 T 세포를 확장시키기 위하여, 시험관내 항원-특이적인 자극을 기반으로 한다. 항원-특이적 T 세포의 시험관내 자극의 한 가지 전략은 MHC I 분자에 결합하는 펩티드를 T 세포 배양물에 첨가하는 것이다. 서로 그리고 항원-특이적 CD8+　T 세포에 대한 펩티드가 존재하는 배양물에서 세포는 성장한다. 그러나, 비-생리적 농도에서 대개 실행되는 펩티드 자극은 펩티드/MHC (pMHC) I에 대한 고친화력 TCRs을 품고 있는 T 세포의 과자극 및 활성화-유도된 세포 사멸로 이어질 수 있다 (7). 또한, 에피토프 서열, 프로세싱 성질 그리고 MHC I 결합 제한에 대한 지식이 요구된다. 더욱이, PBMC 또는 TIL 시료 안에 펩티드-특이적 T 세포가 반드시 존재해야 한다. 따라서, 낮은 전구물질 빈도에 의한 펩티드-특이적 T 세포의 스크리닝은 제한적이며, 신규 면역원성 항원-MHC I 조합의 동정을 불가능하게 할 수 있다. 항원-특이성 및 MHC 제한에 대한 T 세포의 기능 테스트는 보통 단일 T 세포 클론으로 실행된다. 확장 및 농축(enrichment) 후, 단일 T 세포 클론은 충분한 양으로 성장될 것이다. T 세포 배양에 있어서 고려되어야할 한 가지 인자는 생성되는 T 세포에 대한 장기(long-term) 배양 조건의 영향이다 (8). 더 분화된 표현형을 가진 T 세포 (Tern 및 Teff)의 성장 능력은 한정되고, 시험관 확장을 방해한다. 장기 배양은 생체내에서 pMHC I에 부딪히고, 공여자에서 확장 및 분화가 실시된 T 세포 클론의 잠재적 TCRs의 상실로 이어질 수 있다.
따라서, 장기 T 세포 배양은 높은 확장 능력을 가진 미분화된 T 세포의 증식에 우호적으로 편향될 수 있다.
항원-특이적 T 세포의 검출 및 분류(sorting)는 신규 항원-특이적 TCRs를 단리하는데 결정적인 단계이다. pMHC에 대한 독특한 특이성을 갖는 TCR의 거대한 레퍼토리는 공지의 pMHC에 특이적인 T 세포를 착색하기 위한 시약으로서 가용성 MHC 다합체(multimers)의 개발을 이끌었다(9-11). 다합체는 항원-특이적 T 세포의 분류에 이용된다. 다합체는 원하는 pMHC에 특이적인 T 세포를 직접 착색할 수 있다 (12,13). 그러나, 시료 안에 항원-특이적 T 세포를 스크리닝하기 위하여 MHC 제한 및 펩티드 특이성에 대한 사전 지식이 필요하다. 다합체의 사용은 T 세포 에피토프들의 시뮬레이션(in silico) 예측에 의존할 수 있고, 따라서 내부적으로 프로세싱되지 않고, 제시되지 않는 에피토프들에 특이적인 TCRs를 단리하는 위험을 안고 있다. 또한, T 세포는 다합체에 결합하는 능력에 근거하여 선별되지만, 그러나 이 세포 표면에서 pMHC 복합체 (complex)에 결합이 필수적인 것은 아니다. 다합체는 맞춤형(custom-made) 시약이며, 상이한 pMHCs 세트를 스크리닝하는데 용이하게 이용할 수 있는 것은 아니다.
1997년, Lemonnier와 Perarnau 단체는 β-2 저분자글로불린 (b-2m)에 융합된 인간 HLA-A*02:01 분자의 단일-쇄 구조물 (HHD)를 안정적으로 발현시키는 유전자삽입(transgenic) 마우스의 탄생을 보고하였다. 또한, 마우스는 뮤린 MHC I 유전자에 대하여 녹아웃(knockout)되었다. 따라서, 면역접종으로 HHD에 독점적으로 제한된 항원-특이적 T 세포가 생성된다 (14). 그 후 HLA-유전자삽입 마우스는 항원-특이적 T 세포의 신규한 원천으로 제공되었다 (15). 뮤린 대응부에 대하여 이들의 서열이 유사하지 않은 인간 항원 및 에피토프들은 비-내성 레퍼토리에서 항원-특이적 T 세포 반응을 유도하기 위하여 HLA-유전자삽입 마우스의 백신 접종에 이용될 수 있는데, 그 이유는 마우스 T 세포들은 흉선에서 제거되지 않았고, 이물질(foreign)로서 인간 항원을 인지하기 때문이다. HLA-유전자삽입 마우스는 흉선 선별로 인하여 인간 레퍼토리에서 제거된 자가-또는 유사-자가-항원을 인지하는 고 친화력 TCRs의 원천을 제공한다. 인간 TCR 레퍼토리를 가지고 있으며, 한편 동시에 뮤린 TCR 좌(locus)는 녹아웃된 첫번째 유전자삽입 마우스가 만들어진 HHD 마우스 모델에 기반을 둔 기술적 진전이 있었다(16). 그러나, MHC-유전자삽입 및/또는 TCR 좌-유전자삽입 마우스의 이용에 있어서 잠재적 문제점이 도출될 수 있는데, 가령, 마우스와 인간의 흉선 선별이 동일한 규정을 따를 지에 대한 예측이 어렵다는 것이다. 유전자삽입 MHC 분자들은 인공 단일-쇄 구조물이며, 이 구조물로 단일-쇄 MHCs에 기능적으로 제한되지만, 고유한 MHC I 복합체에 제한되지 않는 TCRs을 선별하는 편향을 도입시킬 수 있다. 단일 MHC-유전자삽입 마우스의 면역접종은 6개 동계(cognate) MHC:I 복합체들의 선택으로 자연 면역 반응을 반영하지 못한다. 가령, HLA-A*02:01 에피토프들을 함유하지 않은 항원이 존재할 가능성도 있다. 더욱이, 상기 인간 TCR 좌를 휴대하는 마우스는 소수의 TCRs 쇄들이 부족할 수 있는데, 이들이 특정 pMHC I를 표적으로 하는데 결정적인 것일 수 있다 (16). 대조적으로 상기 뮤린 TCR 좌를 나르는 마우스의 면역접종은 뮤린 TCR 서열의 단리를 초래할 것이며, 이로써 인간에게 전달될 때 거부 경향이 있을 수 있다 (17,18). 중요한 경제적 요인은 뮤린 모델을 사용하는 작업에 필수적인 인프라인데, 이는 비용, 관리 규정 요구사항 및 인력과 관련하여, 매우 자원-집약적이다.
성공적인 TCR 유전자 요법은 정교한 특이적 프로파일을 가진 신규 TCRs의 유용성에 달려있다. 이점에 있어서, 본 발명자들은 신규 항원-특이적 TCRs을 동정하고 단리하고, 그리고 이들 TCRs의 에피토프 특이성 및 MHC 제한을 규정하는 신규한 방법을 제공할 필요성을 언급하였다. 항원-특이적 T 세포 반응을 유도하는 신규 백신 개발을 위하여, T 세포에 의해 표적화될 수 있는 신규 면역원성 에피토프들을 규정할 필요가 있다.
이 문제는 본 발명, 특히, 청구범위의 주제에 의해 해결된다.
본 발명은 주요 조직접합성 복합체 (MHC) 상에서 제시되는 규정된 항원의 에피토프에 특이적인 TCR 구조물의 TCR 알파 쇄 구조물 (TRA) 및 TCR 베타 쇄 구조물 (TRB)을 코딩하는 핵산을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다:
(a) 공여자로부터 단리된 T 세포를 전술한 규정된 항원의 에피토프들을 제공하는 전문적 (professional) 항원 제시 세포 (APC)로 자극하여 항원-특이적 T 세포를 농축시키고; 그리고
(b) 전술한 T 세포를 세포 라이브러리와 접촉시키고, 이때 각 세포는 단일 MHC 대립유전자, 이때 상기 라이브러리는 상기 공여자에 존재하는 모든 MHC I 또는 MHC II 대립유전자를 발현시키는 세포를 포함하며, 이때 전술한 라이브러리의 세포는전술한 규정된 항원의 에피토프들을 제공하고; 그리고
(c) 전술한 접촉에 의해 활성화된 T 세포를, 바람직하게는, 전술한 활성화된 T 세포에 의해 발현되는 활성화 표지자 (marker)에 기반하여 선별하고; 그리고
(d) 전술한 T 세포들의 TCR의 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄를 코딩하는 핵산을 단리한다.
본 발명의 내용에서 단수("a")는 배타적으로 "하나"를 의미하는 것이 아니며, "2 또는 그 이상"을 포괄한다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 TCR 구조물의 TRA 및 TRB를 코딩하는 하나 또는 그 이상, 가령, 2개의 별도 핵산을 제조하는데 이용될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 주어진 항원에 "특이적으로 결합할 수 있는" 또는 "인지하는" 또는 주어진 항원에 "특이적인"이란 상기 TCR 구조물이 전술한 에피토프에 바람직하게는 높은 친화력을 가지고 특이적으로 결합하고, 그리고 면역학적으로 인지할 수 있다는 것을 의미한다. 친화력은 당업자에게 잘 알려진 방법들, 가령 BiaCore을 통하여 분석될 수 있다.
본 발명의 장점들중 하나는 특정 MHC 대립유전자에서 제시되는 항원의 면역 에피토프가 공지될 필요는 없다는 점이다. 본 발명의 방법으로, 항원에 대한 T 세포 반응을 분석하는 것이 가능하며, 여기에서 에피토프는 자연적으로 프로세싱되고, 각각의 가능한 MHC를 통해 제시될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 에피토프에 대한 사전 지식없이 규정된 항원에 특이적인 TCR을 동정하는데 사용될 수 있다. 상기 규정된 항원은 단계 a의 항원 제시 세포들과 단계 b의 라이브러리가 모두 전술한 항원의 에피토프들을 제공한다면, 복수의 항원, 가령, 특정 바이러스의 다수의 항원, 또는 특정 바이러스의 모든 항원중 하나 일 수도 있다.
추가 장점은 본 발명의 방법이 면역우세(immunodominant) 펩티드 에피토프에 특이적인 TCR을 동정하고, 전술한 펩티드 에피토프를 제공할 수 있다는 점이다. 특정 펩티드-MHC (pMHC) 조합은 두 조합이 모두 높은 결합 친화력을 가지는 것으로 예측되더라도 동일한 항원으로부터 유도된 다른 pMHC 조합보다 우세한 T 세포 반응을 유도한다는 것이 관찰되었다. 또한, 이 방법은 또한 스크리닝된 PBMC의 수가 크게 증가하는 경우, 준우세(subdominant) 에피토프를 표적으로하는 TCRs의 단리를 또한 가능하게 할 수 있다.
인간의 치료법이 가장 중요하기 때문에, 상기 방법은 인간에서 수행되는 것이 바람직하며, 즉, 공여자는 인간이며, 따라서 인간 MHC I 또는 MHC II, 특히 MHC I 분자들 및 APCs가 사용된다. 물론 인간 MHC 분자 (14,15) 또는 인간 T 세포 수용체를 발현하는 뮤린 T 세포(16)로 제한되는 뮤린 공여자의 T 세포를 사용할 수도 있다. 대안으로, 해당 종의 TCR 제공이 바람직하다면, 가령, 전적으로 뮤린, 렛, 염소, 토끼, 기니피그 계통이 이용될 수 있다.
바람직하게는, 단계 a에서 자극된 T 세포는 다른 단핵 세포로부터 분리되지 않는 즉, PBMC의 형태이다. 이것은 보다 자연스러운 환경을 제공하고, 추가적인 정제 단계가 필요 없기 때문에 유익할 수 있다. 공여자로부터 단리된 TIL도 사용될 수 있다. 대안으로, 정제된 T 세포, 또는 정제된 CD4+　또는, 바람직하게는, CD8+　T 세포가 이용될 수 있다.
전문적인 APCs는 바람직하게는 자가 APCs, 즉, PBMCs와 같은 동일한 공여자로부터 단리된다. 그러나, 이들 APCs가 상기 공여자와 최소한 하나의 MHC 대립유전자, 바람직하게는, 모든 MHC I 또는 II (바람직하게는 MHC I) 대립유전자를 공유한다면, 이종기원의 APCs가 또한 될 수도 있다. 가장 바람직하게는, 상기 전문적인 APCs는 수지상 세포, 구체적으로, 성숙 수지상 세포이다. 상기 전문적인 APCs는 항원의 내인성 프로세싱 후 MHC 상에 규정된 항원의 에피토프를 제공한다. 상기 항원은 APCs에 의한 내인성 프로세싱 및 제시가 가능하도록, 바람직하게는 RNA, DNA, 단백질 또는 폴리펩티드로서 전문적인 APCs의 내부에 제공된다. 따라서, 상기 에피토프에 대한 사전 지식이 요구되지 않는다. 예를 들면, 형질감염(transfection) 후 안정적 또는 일시적 발현이 가능하다.
단계 a에서 T 세포 자극은 7-42 일, 가장 바람직하게는 14-28 일 동안 실행된다. 전문적인 APCs에 대한 PBMCs 비율은 바람직하게는 약 5:1 내지 20:1, 가장 바람직하게는, 약 10:1이다. T 세포는 T 세포 증식에 유리한 사이토킨, 바람직하게는 특정 배양 환경에서 항원-비특이적 T 세포 증식을 방지하기 위하여 저농도의 IL-2 (가령, 15-25 U/ml, 바람직하게는, 약 20 U/ml), IL-7 (가령, 2.5-7.5 U/ml, 바람직하게는, 약 5 U/ml) 또는 IL-15을 함유하는 배지에서 자극된다. 증식하는 PBMCs는 약 1:2 내지 3:4의 비율로 분리될 수 있다. 내인성 프로세싱후 항원의 에피토프를 제공하는 전문적인 APC에 의한 2차 자극이 가능하다.
단계 a에서 항원-특이적 T 세포에 대하여 농축된 세포는 단계 b에서 세포 라이브러리와 추가 접촉되는데, 이때 각 세포는 단일 MHC 대립유전자를 발현하고, 이때 상기 라이브러리는 상기 공여자에 존재하는 모든 MHC I 또는 II 대립유전자를 발현하는 세포들을 포함하며, 이때 전술한 라이브러리의 세포는 전술한 규정된 항원의 에피토프를 제시한다.
본 발명을 통하여 상기 MHC는 MHC I인 것이 바람직하다. MHC I을 발현하는 세포에 의해 자극된 T 세포는 CD8+　T 세포이며, 그리고 전형적으로 세포내 단백질의 에피토프들이 제시될 것이다.
바람직한 구체예에서, 상기 라이브러리는 각 하나의 MHC I 대립유전자를 안정적으로 발현하는 K562 세포로 구성된다. 예시적인 K562 라이브러리는 하기에서 기술되거나 또는 Zeng 등.에 의해 기술된다 (19). 상기 라이브러리의 세포들은 K562 세포이외의 임의의 인간 또는 비-인간 APCs, 가령, 림프아구성 세포 계통 (LCL) 또는 NIH/3T3 세포들을 포함하는 다른 기원의 것일 수 있다.
본 명세서에서 이용된 MHC 세포 라이브러리는 인간 K562 세포 계통 (20,21)에 단일 인간 MHC I 대립유전자 (HLA-A, -B 및 -C)의 안정적 형질도입(transduction)에 의해 만들어졌다. K562 세포는 인간 적혈구혈증 기원이며, 내인성 MHC I 및 MHC II 대립유전자의 발현이 부족하다 (22). 그러나, 이들 세포는 β-2 저분자글로불린을 발현하고, MHC I α 쇄의 유전자삽입 발현시 이들은 완전한 기능적 항원-프로세싱 및 제시 기전을 가진다 (19,23,24). K562 세포들은 효과적인 면역 시냅스를 형성하는데 요구되는 ICAM-1 및 LFA-3을 발현한다 (24). 더욱이, 단일 MHC I 대립유전자를 안정적으로 발현하고, 항원 서열 가령, 시험관 전사된 (ivt) RNA의 형질감염을 통하여 항원 서열을 도입시키기 위하여 레트로바이러스 형질도입을 통하여 이들 세포를 유전적으로 변형시키는 것이 가능하였다.
한 구체예에서, 따라서 본 발명은 K562-기반의 MHC 세포 라이브러리를 또한 제공하는데, 이 라이브러리의 세포들은 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 전술한 라이브러리는 K562 세포들을 포함하는데, 각 세포는 다음의 MHC I 대립유전자중 하나를 발현한다:
K562-기반 MHC 세포 라이브러리
HLA-A* HLA-B* HLA-C*
01:01 07:02 01:02
02:01 07:04 02:02
03:01 08:01 03:03
03:05 15:01 03:04
11:01 18:01 04:01
23:01 27:05 05:01
24:02 35:01 06:02
26:01 35:08 07:01
29:02 38:01 07:02
31:01 40:01 12:03
33:01 41:02 15:02
66:01 44:02 16:01
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68:24 47:01 17:01
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K562 세포들을 인공 APCs 스캐폴드(scaffold)로 이용하면 몇 가지 장점이 있다. LCLs와 비교하여, K562 세포들은 EBV와 같이 헤르페스 바이러스의 바이러스 서열이 부족하다 (25,26). 이것은 EBV-특이적 T 세포를 자연적으로 포함할 수 있는 벌크 T 세포 시료를 분석하는 동안 EBV-특이적 T 세포 활성화를 회피하는 K562-기반 APC 시스템의 중요한 특징이다. 무세포 APC 시스템에서 무세포 인공 APCs와 비교하여, pMHC 제시는 무손상 세포 막의 세포 표면에서 생리학적 수준으로 발생되며, 이것은 TCR 결합의 가장 자연적 환경과 유사하다. 하나의 MHC의 우세 발현은 TCRs의 알로-인지(allo-recognition)를 최소화한다. 세포 표면에 pMHC를 제시하기 위해 MHC-형질도입된 K562의 능력은 모체인 K562에서의 항원 프로세싱 및 MHC 발현이 내인성 MHC 좌의 침묵으로 인하여 것이며, 일반적인 결함이 아니라는 것을 보여준다. K562 세포는 전형적 종양 세포에 의한 항원 프로세싱과 유사한 면역 프로테아좀(proteasome)-발현 DCs와 비교하여 구성적 프로테아제를 발현한다 (27). 표적 항원의 부재 하에 K562 세포와 함께 배양된 TCR-형질도입된 T 세포는 배경 IFNγ 방출 및 T 세포의 비특이적 활성화를 최소화하는 CD137 상향-조절을 보이지 않았다.
상기 논의된 K562 세포 덕분에 에피토프 특이성 및 MHC 제한에 대한 사전 지식없이, TCRs의 분석을 위한 표적으로서 MHC 세포 라이브러리를 확립하기 위해 바람직한 인공 세포 APC 시스템이 만들어졌다. 원칙적으로, 병원체-유도된 항원 뿐만 아니라 종양-관련 항원 (TAA), 암 고환 항원 (CTA) 및 계통 항원을 포함하는 임의의 표적 항원이 K562 세포에서 발현될 수 있다. 암 면역 요법의 경우, 종양 특이적 항원 (TSA)은 바이러스 에피토프 또는 돌연변이-유래된 에피토프에 특이적인 TCRs을 확인하는데 특히 중요하다.
Latouche 및 Sadelain은 단일 인간 MHC 대립 유전자를 안정하게 발현시켰던(28) 마우스 섬유 아세포 NIH/3T3 세포를 이용하여 인간 MHC 복합체와 관련하여 에피토프의 내인성 제시를 실현하였다. NIH/3T3 세포는 이식 후 입양 T 세포 요법에 이용하기 위하여 CMV-특이성 T 세포주의 확장에 성공적으로 사용되었고(29), 본 발명에서 대체(alternative) 라이브러리로 사용될 수 있다.
대안으로, 상기 MHC는 MHC II 일 수 있다. 이 경우, 세포 라이브러리는 바람직하게는 각각 하나의 MHC II 대립 유전자로 형질감염된 K562 세포와 같은 MHC II 발현 세포를 포함한다. 예시적인 라이브러리는 Butler 등,에서 교시된다 (30). 대안으로, 에탄 메틸 설포네이트 (EMS)로 무작위 돌연변이 유발 후 MHC II 좌를 녹아웃시킨 인간 RM3 (Raji) B 세포에 기반을 둔 단일 MHC II-발현 세포 라이브러리를 사용할 수 있다(31). 이들 세포에 의해 자극된 T 세포들은 CD4일 것이고, 전형적으로 분비된 단백질, 상이한 세포 구획의 단백질, 막 단백질 또는 교차 제시 단백질로부터의 에피토프가 제시될 것이다.
상기 라이브러리의 세포, 구체적으로 K562 세포들은 공동자극 분자들, 가령, CD40, CD40L, CD70, CD80, CD83, CD86, ICOSL, GITRL, CD137L 및/또는 CD252을 더 발현시킬 수 있고, 따라서 이들 세포는 T 세포 하위집단의 최적의 접촉을 위하여 맞춤화될 수 있다. 공동자극 분자들의 세트는 CD80, CD86 및 CD137L, 또는 CD80, CD83, CD64 (30), 또는 CD80, CD70 및 CD137L일 수 있다 (19). 이것은 항원 특이적인 IFNγ 방출 및 CD137 발현을 명확하게 검출하기 위해 T 세포 반응을 증폭시킬 수 있으며, 친화력에 대하여 TCRs의 보다 넓은 범위의 검출을 유도할 수 있다. 그러나, 고친화력 TCRs을 단리하기 위해, 바람직하게는 라이브러리의 세포, 특히 K562 세포가 임의의 공동자극 분자를 더 발현하지 않는 것이 바람직할 수 있다. 더욱이, 상기 라이브러리의 세포, 구체적으로 K562 세포는 항원 프로세싱 및 제시를 강화하는 분자들, 가령 HLA-DM 및 CD74를 발현할 수 있다.
상기 라이브러리의 세포들은 내인성 프로세싱 후 이들의 MHC 상에 규정된 항원의 에피토프를 제공한다. 바람직하게는, 이들은 항원-인코딩 ivtRNA로 형질감염시킨 후 완전한 전장 항원을 안정적으로 발현한다. 일시적 발현이 이용될 수도 있다. 따라서, 상기 에피토프에 대한 사전 지식이 요구되지 않는다.
상기 라이브러리와 T 세포의 접촉은 T 세포 시료 내에서 항원-특이적 T 세포의 최적 활성화가 달성되도록 12 내지 36 시간, 바람직하게는 18-22 시간 또는 약 20 시간 동안 수행된다. 바람직하게는, T-세포의 비특이적 활성화를 방지하기 위해 상기 접촉 동안 사이토킨의 첨가는 피한다.
라이브러리의 세포에 의해 제시되는 에피토프에 특이적인 TCR을 갖는 T 세포가 활성화된다. 따라서, 이들은 활성화 표지자 (단계 c)에 기초하여 선별될 수 있으며, 따라서 T 세포 에피토프 및 MHC 제한 요소에 대한 사전 지식이 요구되지 않는다. T 세포는 표적 세포 상의 동족 pMHC 복합체와 TCR의 개입(engagement)이 있을 때 활성화 표지자를 상향-조절한다. 공동자극 신호와 함께 TCR 신호생성은 CD25, CD69, CD 107, CD 137 및/또는 CD 154와 같은 활성화 분자들의 단기 발현을 유도하고, 이들 분자는 항원-특이적 T 세포 (32), 가령, FACS 또는 MACS의 탐지 및 단리를 위한 표지자로 이용될 수 있다. CD137은 항원-특이적 CD8+　T 세포의 단리용 특이적 표지자로 나타났다 (33,34). 가령, FACS에 의한 CD137 발현에 기초한 분류는 특이적 T 세포의 선별을 위한 바람직한 방법이다. 한 구체예에서, 가령 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA) 또는 FACS에 의한 IFNγ의 사이토킨 포획에 의해 IFNγ 방출의 측정은 이 방법에 복합된다. 가령, ELISA에 의한 IFNγ 방출 측정은 T 세포 시료의 기능적 활성을 평가하는 표준 방법이다.
사이토킨 포획 분석은 pMHC 특이성에 대한 사전 지식없이, 기능적으로 활성화된 T 세포를 검출 및 단리하는 대체 도구이다 (35,36). 동족 pMHC I를 통해 활성화된 CD8+ T 세포는 IFNγ 및 TNFα와 같은 사이토킨을 가진 소포를 방출한다. 사이토킨 분비에 대한 개별적인 T 세포의 검출 및 단리는 FACS 또는 MACS 분석과 조합된 사이토킨 포획 분석의 개발을 통해 촉진되었다(36,37). 사이토킨 포획 분석은 TCR 신호생성에 의해 활성화된 T 세포의 분류를 위한 T 세포 활성화 표지자에 대한 매력적인 대안을 제공한다.
활성화된 T 세포의 선별 후, 전술한 T 세포의 T 세포 수용체의 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄를 코딩하는 핵산이 직접 분리된다. 가령, RNA는 단리되어 TCR 알파 및 TCR 베타 유전자의 cDNA 말단 (RACE)의 5 ' 신속한 증폭, 다음 PCR 증폭을 통해 cDNA를 생성할 수 있다. PCR 생성물은 발현 플라스미드 안으로 클론되어 박테리아를 형질변형시킬 수 있다. 각 박테리아 콜로니는 하나의 PCR TCR 알파 또는 TCR 베타 유전자 단편을 갖는 하나의 서열 벡터를 함유하는 것으로 간주될 수 있다. 다수의 박테리아 콜로니의 벡터 DNA가 제조되고, 벡터 삽입물 (TCR 알파 또는 TCR 베타 유전자 단편들)은 서열화될 수 있다. 각 박테리아 콜로니의 서열화 결과는 가령, IMGT/V-Quest을 이용하여 분석될 수 있다. 동일한 TCR 알파 또는 TCR 베타 쇄의 빈도는 분류된 T 세포 시료 안에 동일한 T 세포 클론 타입의 비율을 반영한다. 분류된 T 세포의 TCR 알파 및 TCR 베타 유전자 서열을 분석하는 또 다른 전략은 차세대 시퀀싱 접근법의 사용이다. 예를 들면, 시퀀싱 벡터에 결찰된 TCR 알파 및 TCR 베타 유전자의 PCR 산물을 박테리아 안으로 형질전환시키고, 선택 배지를 함유한 플라스크에서 성장시킨 후 벡터 DNA를 제조할 수 있다. 벡터 DNA 조제물은 차세대 시퀀싱 분석에 직접 사용될 수 있다. 동일한 TCR 알파 또는 TCR 베타 유전자들을 함유하는 벡터의 빈도는 분류된 T 세포의 시료 안에 동일한 클론타입의 T 세포의 초기 양을 나타내는 것으로 간주된다. T 세포 시료 안에 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄들의 정합(matching) 빈도는 기능성 TCRs, 가령, 항원-MHC-특이적 IFNγ 방출 및 CD 137 상향조절을 설명하는 TCRs의 쌍을 분석하는데 사용될 수 있다 (38). 이들 방법의 감도는 T 세포 시료 안의 TCR 레퍼토리의 상세한 분석을 가능하게 한다. TCR 알파 및 TCR 베타 쇄 빈도의 정합은 T 세포 시료로부터 풍부한 TCR 쇄 쌍을 재구성할 수 있으므로, 자원-집약적인 T 세포 클론 배양은 불필요하다. 장기 배양은 배양물에서 T 세포 클론의 확장에 필요하며, 이는 순수한 또는 중앙 기억 표현형을 갖는 T 세포의 파생만을 선호하며, 따라서 시험관내 제한된 성장 능력을 갖는 T 세포들은 분석에서 배제된다. TCR 레퍼토리 분석을 위하여, 단지 14 내지 28일 간의 항원-특이적 농축 후 항원-MHC-특이적 T 세포 반응을 스크린 및 분류하는 것이 유리하다.
따라서, 바람직하게는, 선별된 T 세포 집단의 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄를 코딩하는 핵산 분석 후, 하나 이상의 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄가 확인된다면, 상기 집단에서 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄의 빈도가 분석되고, 에피토프를 인지할 수 있는 TCR로 구성된 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄는 이들의 빈도에 기초하여 정합된다.
대안으로, 예를 들어 상이한 우세 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄의 조합을 운반하는 T 세포의 생성 및 단계 b에서 사용된 라이브러리의 세포에 의한 이들의 활성화 분석이 더 실행될 수 있다.
상기 TCR 알파 및 베타 쇄들이 변형되어 본 발명의 TCR 알파 쇄 구조물 (TRA) 및 TCR 베타 쇄 구조물 (TRB)이 될 수 있다. 선택적으로, TRA 및 TRB의 코돈 사용은 재조합 T 세포에서 TCR의 발현을 강화시키도록 최적화될 수 있다. 더욱이, 인간 가변 영역들은 뮤린 불변 영역들 (39), 또는 최소 뮤린 불변 영역, 즉, 뮤린 불변 영역의 오직 규정된 아미노산만을 함유하고 (40), 또한 추가적인 시스테인 다리를 포함하는 (41,42) 인간 불변 영역들과 복합될 수 있는데, 이것은 서로에 대해 유전자삽입 TCR 쇄의 선호적 결합을 증가시키고, 수령 T 세포에 의해 발현되는 내인성 TCR 쇄와의 쌍 형성(pairing)을 감소시킨다.
도입된 사슬과 내인성 TCR 쇄의 쌍형성을 피하고 기능 활성을 향상시키기 위해, TRA 및 TRB의 가변 영역을 품고있는 단일 쇄 TCR 구조물을 생성시킴으로써, 발현의 추가 최적화가 가능하다. 더욱이, TRA 및 TRB의 쇄 유전자들의 가변 영역들과 가령, 항체 도메인들을 함유하는 가용성 수용체 분자들과 융합 단백질이 생성될 수 있다.
MHC 상에 제공된 규정 항원으로부터의 에피토프에 특이적인 T 세포는 TRA 및 TRB를 코딩하는 핵산을 발현함으로써 생성될 수 있다. 이러한 T 세포가 환자의 치료를 위한 것이라면, 자가 T 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 대안으로, 면역 억제를 사용하여 동종이계형(allogeneic) 설정이 가능하다.
특정 MHC 대립 형질을 발현하는 라이브러리의 세포를 갖는 적절한 TCR 구조물로 형질감염된 T 세포의 활성화 분석을 용이하게 이용하여 TCR의 MHC 제한을 분석할 수 있다.
본 발명은 MHC에서 제시될 수 있는 규정된 항원의 에피토프를 동정하는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 상기에서 설명된 본 발명 방법의 a-d 단계를 실행하고, 전술한 선별된 T 세포 또는 TCR 구조물을 구성하는 TRA 및 TRB를 코딩하는 핵산으로 변형된 T 세포를 활성화시킬 수 있는 에피토프를 동정하는 것을 포함한다. 에피토프 매핑(mapping) 전략은 당분야의 공지된 기술이다. 예를 들면, 관련 MHC 대립유전자를 발현하는 라이브러리의 세포들은 관련 항원의 부분들을 관장하는 미니유전자(minigene)로 형질감염되고, 반응, 가령, IFNγ 분비를 분석하여, 상기 에피토프를 품고있는 부분을 찾을 수 있다. 외부(external) 펩티드들을 이용한 펩티드 펄싱(pulsing) 또한 도움이 될 수 있다. 에피토프 예측은 이러한 전략의 일부로서 사용될 수 있지만, 하기 실험에서 나타난 것과 같이, TCR 특이성이 에피토프 예측 알고리즘으로부터 예측된 데이터와 반드시 일치하지는 않는다는 점은 중요하다.
더욱이, 이 반응을 설명하는 항원 특이적 TCR의 단리에 의해 입증된, 항원 특이적 T 세포 반응을 유도하는 것으로 동정된 에피토프는 이 에피토프 서열을 함유하는 백신 제제를 개발하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서 기술된 방법으로 MHC 상에 내인성으로 프로세싱되고, 규정된 항원을 발현하는 세포에 의해 제시된 에피토프를 인지할 수 있다. 에피토프-함유 백신을 규정된 항원을 자연적으로 발현하는 세포를 청소하는 T 세포 면역을 환자에게 제공할 수 있다.
요약하면, 본 발명의 방법은 예를 들어, 입양 T 세포 요법에 사용될 수 있는 TCR 구조물을 제공하는 종래의 방법과 비교하여 몇 가지 장점을 갖는다. 예를 들면, 주어진 공여자의 모든 동족체 MHC I 제한 요소를 포함한 T 세포의 전체 레퍼토리가 커버된다. 상기 방법으로 또한 원하는 항원 특이성을 갖는 T 세포의 검출은 가능하지만, 에피토프에 대한 사전의 지식을 필요로 하지 않는다. 선택된 에피토프를 미리 결정하지 않고 내인성으로 프로세싱되고 제시된 에피토프의 인지에 기초한다. 하나의 항원으로부터 상이한 에피토프들은 면역 우위로 정의된 발현 계층(hierarchy)을 갖는다. 본 발명의 방법에 의해 동정된 TCR 구조물은 표적 항원 안에 6 가지 MHC I 대립 형질 중 하나에서 가장 효율적으로 제시되는 면역 우세 에피토프들을 인지한다. 상기 방법은 또한 동일한 항원으로부터의 준우세 에피토프를 인지하는 T 세포의 동정을 가능하게 한다. 마지막으로, 이 방법은 동일한 항원을 인지하는 상이한 T 세포 클론타입의 병렬 검출을 허용한다.
본 발명은 본 발명의 방법 및/또는 하기에서 설명된 방법에 의해 얻을 수 있는 신규 TCR 구조물과 이들 TCR 구조물에 의해 인지되는 에피토프들, 뿐만 아니라 핵산, 가령, 벡터, 이를 테면 이들 TCR 구조물 또는 각 TRA 및 TRB 또는 이의 단편들, 이를 테면 TRA 또는 TRB의 가변 단편 또는 CDR3 영역을 코딩하는 발현 벡터, 또는 전술한 핵산을 발현하는 유전자삽입 T 세포를 또한 제공한다.
인간 유두종바이러스 (HPV) 감염은 자궁경부암, 항문성기 암 그리고 두경부 편평세포 암종 발생의 주요 원인이다 (43,44). 발암성 HPV 유형은 전 세계적으로 약 610,000 건의 암의 원인이 된다.
가장 흔하게 발병하는 유형은 자궁 경부암의 50 % 이상을 차지하는 HPV16이다. HPV16 E6 및 E7은 변형 잠재력을 보유하여, 발암 유전자로 간주된다 (45,46). HPV16 E5는 시험관에서 섬유아세포를 형질변환시킬 수 있기 때문에, 발암 잠재력을 보유하는 것으로 나타났다 (47,48). 더욱이, E5가 침윤성 자궁 경부암의 생검에서 발현되어, 악성 각화세포의 형질변환 표현형을 개시하고 유지하는데 있어서 E5가 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (49-51).
의료 스크리닝 및 중재와 함께 예방 백신접종 프로그램으로 몇 세기에 걸쳐 여러 국가에서 HPV 관련 이환율을 감소시키겠지만, HPV는 여전히 심각한 세계적 건강의 문제로 남아있을 것이며, 자궁 경부암 및 기타 HPV-원인의 암의 치료 요법은 필요할 것이다.
많은 연구에서 HPV-관련 악성 종양의 치료법 시도가 보고 되었다. 그러나, HPV16 E6 및 E7 서열 전부를 포함하는 합성된 긴 펩티드를 적용한 한 가지 단계(phase) I/II 연구 만이 환자의 50 % 이상에서 고차(high-grade) 외음부 상피내 신 생물물 (VEST)의 퇴행을 경험한 환자의 데이터로 제시되었다. 이 반응은 HPV-특이적 T 세포 반응과 관련있었다 (52). 그럼에도 불구하고, CIN 병변 및 자궁 경부암을 표적으로 하는 비교 가능한 결과가 부족하여, HPV16 E6 및 E7을 표적으로 하는 치료 백신접종 시도는 HPV의 면역 탈출 기전을 극복하지 못한다는 것을 암시한다 (52,53). 더욱이, E6 및 E7을 표적으로 하는 강력한 TCR이 부족하여, HPV로 유발된 악성 종양의 면역 요법 치료의 타당성을 입증할 수 있다.
추가의 치료 전략은 HPV-유발 암을 치료하는 것임에 따라, 본 발명자들의 노력은 전술한 방법을 사용하여 HPV-유래 항원에 대한 항원-특이적 TCR의 단리 및 이들 항원으로부터의 면역원성 에피토프의 동정에 집중되었다. HPV16 E5, E6, E7 및 L1이 항원으로 이용되었다.
인간 헤르페스 바이러스 5 (HHV-5)로 또한 지정된 거대세포바이러스 (CMV)는 헤르페스 바이러스 패밀리의 구성원이다. CMV-혈청양성 개체에서 매우 높은 전구체 빈도로 발생하는 CMV 감염은 CD8+　및 CD4+　T 세포에 의해 조절가능한 다른 헤르페스 바이러스 감염과 유사하다 (54). CMV 감염은 일반적으로 면역력이 있는 개인에게는 증상이 없으며, 인구의 최대 90 %에서 잠복 단계로 평생 지속된다. CMV 질환은 출생 후 또는 조혈 줄기 세포 이식 또는 고형 장기 이식 후 면역 저하 환자들에게서 나타날 수 있고, 미국에서 연간 총 5,600건의 심각한 질환을 일으키며, 그중 매년 560 명은 사망에 이른다 (54). CMV는 감염이 세포 형질변환을 일으키지 않는 것처럼 보이기 때문에 비-발암성으로 광범위하게 간주되었지만, 악성 세포를 기회 감염으로 감염시킬 수 있다. 최근 연구들은 CMV가 교모세포종과 관련이 있다고 보고 있어, CMV가 비-종양 바이러스라는 것에 의문을 가졌다. (55-58). 이와 같은 견지에서 본 발명자들은 CMV 항원에 특이적인 TCR의 조사를 결정하였다.
MHC 세포 라이브러리의 항원-발현 K562 세포의 스크리닝에서 HLA-B*15:01와 복합된 HPV16 E5에 반응하는 강력한 T 세포가 관찰되었다. 또한, CMV pp65-특이적 T 세포 반응은 HLA-B*07:02에서 관찰되었다. 한 가지 항원-MHC 조합에 반응하는 T 세포 시료를 직접 분류하였고, TCR 유전자 서열을 분석하였다. 시료 안에 우세 TCR 유전자들은 레트로바이러스 발현 벡터 안으로 클로닝되었고, 상이한 TCR 알파 및 베타 쇄 조합을 PBMCs에 형질도입시킴으로써 테스트는 평가되었다. HLA-B*15:01 및 B*07:02에 각각 제공되는 내생적으로 프로세싱된 에피토프를 인지하도록 기능성 HPV16 E5-특이적 TCR 및 기능성 CMV pp65-특이적 TCR는 재구성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 HPV 감염, 구체적으로, HPV-유도된 악성종양을 치료하기 위한 가령, TCR 유전자 요법에 이용될 수 있는 HPV E5-특이적 TCR 구조물을 제공한다. 본 발명은 인간 유두종 바이러스 16 종양 단백질 E5의 에피토프에 특이적인 TCR 구조물의 TRA 및/또는 TRB를 코딩하는 핵산을 인간 MHC I과 복합체로 제공한다. 상기 핵산은 본 명세서에서 설명된 본 발명의 방법에 의해 획득가능하거나, 또는 획득될 수 있다.
본 발명자들은 HLA-B*15:01과 복합된 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 에피토프에 특이적인 TCR 구조물을 제공하는데, 바람직하게는 서열번호 1을 포함한다. 상기 TCR 구조물은 바람직하게는 N-말단이 긴 형태의 에피토프를 또한 인지하는데, 가령, 이것은 서열번호 1, 45, 47, 49, 51, 52 및 57로 구성될 수 있다. 본 발명자들은 이들 펩티드가 내인성 프로세싱되며, HLA-B*15:01에 제시될 수 있고, 따라서 TCR 인지의 표적이 될 수 있음을 최초로 보여주었다. TCR 유전자 요법이외에, 서열번호 1, 45, 47, 49, 51, 52 및 57의 펩티드를 포함하는 백신은 HLA-B*15:01-양성 환자에게 T 세포 면역을 제공하는 차선책이 될 수 있다. 독일 인구의 대략 12%는 최소한 하나의 HLA-B*15:01 대립유전자를 가지고 있다. 중국, 한국 및 일본의 모집단 연구에서 더 높은 빈도의 B*15:01 대립유전자를 보유하고 있는 것으로 밝혀졌다 (59).
TCR 또는 TCR 구조물의 특이성은 이 TCR의 CDR3 영역에 의해 주로 규정된다. HLA-B*15:01에서 제시되는 E5 에피토프에 특이적인 본 발명의 TCR 구조물은 서열번호 2의 CDR3 또는 이에 최소한 84%, 바람직하게는, 즉, 하나 또는 2개의 치환, 삽입 또는 결손이 있을 수 있는, 최소한 92% 서열 동일성을 갖는 CDR3을 포함하는 TRA를 포함한다. 돌연변이가 있다면, 보존적 치환이 바람직하다. 본 발명의 TRA의 CDR3의 바람직한 서열은 서열번호 2이다. 한 구체예에서, 상기 TRA는 서열번호 2의 CDR3, 서열번호 64의 CDR1 그리고 서열번호 65의 CDR2를 포함한다.
상기 TRA의 가변 영역은 바람직하게는 서열번호 3을 포함하거나, 또는 서열번호 3에 대하여 최소한 80%, 바람직하게는, 최소한 90% 또는 최소한 95%의 서열 동일성을 갖고, 이때, 상기 가변 영역은 서열번호 2를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 가변 영역은 서열번호 60의 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 상기 TRA는 바람직하게는 서열번호 4에 대하여 최소한 80%, 바람직하게는, 최소한 90%, 최소한 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 이들로 구성되며, 이때 상기 불변 영역은 전자삽입 TCR 쇄의 쌍형성을 강화시키기 위하여 바람직하게는 뮤린 불변 영역이거나 또는 최소 뮤린 불변 영역이다. 대안으로, 상기 불변 영역은 인간의 것으로, 이는 수령자의 면역 세포에 의한 면역 인지 위험을 최소화시킨다.
본 발명의 HPV E5 에피토프에 특이적인 TCR 구조물의 TRA를 인코딩하는 바람직한 코돈-최적화된 핵산은 서열번호 5이다.
HLA-B*15:01에서 제시되는 E5 에피토프에 특이적인 본 발명의 TCR 구조물은 서열번호 6의 CDR3 또는 이에 최소한 84%, 바람직하게는, 즉, 하나 또는 2개의 치환, 삽입 또는 결손이 있을 수 있는, 최소한 92% 서열 동일성을 갖는 CDR3을 포함하는 TRB를 포함한다.
보존적 치환이 바람직하다. 본 발명의 TRB의 CDR3의 바람직한 서열은 서열번호 6이다. 한 구체예에서, 상기 TRB는 서열번호 6의 CDR3, 서열번호 66의 CDR1 그리고 서열번호 67의 CDR2를 포함한다.
상기 TRB의 가변 영역은 바람직하게는 서열번호 7을 포함하거나, 또는 서열번호 7에 대하여 최소한 80%, 바람직하게는, 최소한 90% 또는 최소한 95%의 서열 동일성을 갖고, 이때, 상기 가변 영역은 서열번호 6을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 가변 영역은 서열번호 61의 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 상기 TRB는 바람직하게는 서열번호 8에 대하여 최소한 80%, 바람직하게는, 최소한 90%, 최소한 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖거나, 또는 이들로 구성되며, 이때 상기 불변 영역은 전자삽입 TCR 쇄의 쌍형성을 강화시키기 위하여 바람직하게는 뮤린 불변 영역이거나 또는 최소 뮤린 불변 영역이다. 대안으로, 상기 불변 영역은 인간의 것으로, 이는 면역 인지 위험을 최소화시킨다. TRB를 인코딩하는 바람직한 코돈-최적화된 핵산은 서열번호 9이다.
본 발명은 가령, HPV 감염, 구체적으로, HPV-유도된 악성종양을 치료하기 위한 TCR 유전자 요법에 적합한 발현 카세트 안에 HPV E5 에피토프에 특이적인 TRA와 TRB 모두를 코딩하는, 가령, 서열번호 40에 따른 서열을 포함하는 핵산을 또한 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 제공되는 서열에 근거하여, TCR 서열의 친화력 성숙을 실행할 수 있다 (60,61). CDR3 서열에서 아미노산 교환을 유도하는 비-유사(non-synonym) 뉴클레오티드 치환은 표적 항원에 대한 TCR의 친화도를 증가시킬 수 있다. 더욱이, 가변 TRA 및 TRB 영역들의 다른 부분에서 TCR 서열의 변화는 pMHC 복합체에 대한 TCR 구조물의 친화력을 변화시키고, 바람직하게는 친화력을 증가시킬 수 있다. 제공된 특정 서열로부터 가변적 TCR 구조물은 제공된 표적 항원에 대해 배타적인 특이성을 보유하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 TCR 구조물을 발현시키는 T 세포의 입양 전달은 건강한 조직에 유의적인 부정적 영향을 미치지 않는 것이 바람직하다.
본 발명은 CMV 감염 또는 CMV-유도된 악성 종양을 치료하기 위한, 예를 들어 TCR 유전자 요법에 사용될 수 있는 CMV pp65-특이적 TCR 구조물을 추가로 제공한다. 본 발명은 인간 CMV 단백질 pp65의 에피토프에 특이적인 TCR 구조물의 TRA 및/또는 TRB를 코딩하는 핵산을 인간 MHC I과 복합체로 제공한다. 상기 핵산은 본 명세서에서 설명된 본 발명의 방법에 의해 획득가능하거나, 또는 획득될 수 있다.
본 발명자들은 HLA-B*07:02과 복합된 인간 CMV 단백질 pp65의 에피토프에 특이적인 TCR 구조물을 제공하는데, 바람직하게는 서열번호 10을 포함하거나, 또는 이것으로 구성된다. 상기 CMV pp65-특이적 TCR은 HLA-B*07:02에 한정된다. HLA-B*07:02는 가장 빈번한 HLA-B 대립유전자중 하나이며, 독일 인구의 약 23%에서 발견된다 (59). T 세포에 의한 에피토프 인지는 HLA-B*07:02-양성 환자들에게서 T 세포 면역을 유도하는 CMV 백신 개발의 기반이 될 수 있다.
이 에피토프/MHC 복합체에 특이적인 본 발명의 TCR 구조물은 본 발명의 TRA의 가장 바람직한 CDR3인 서열번호 11의 CDR3이 포함된 TRA를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 TRA는 서열번호 11의 CDR3, 서열번호 68의 CDR1 그리고 서열번호 69의 CDR2를 포함한다. 상기 TRA의 가변 영역은 서열번호 12을 포함하거나, 또는 서열번호 12에 대하여 최소한 80%, 바람직하게는, 최소한 90% 또는 최소한 95%의 서열 동일성을 갖고, 이때, 상기 가변 영역은 서열번호 11을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 TRA의 가변 영역은 서열번호 62의 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 상기 TRA는 바람직하게는 서열번호 13을 포함하거나, 또는 이것으로 구성되며, 이때 상기 불변 영역은 유전자삽입 TCR 쇄의 쌍형성을 강화시키기 위하여 뮤린 불변 영역이거나 또는 최소 뮤린 불변 영역이다. 대안으로, 상기 불변 영역은 인간의 것으로, 이는 면역 인지 위험을 최소화시킨다. 본 발명의 CMV pp65 에피토프에 특이적인 TCR 구조물의 TRA 쇄를 인코딩하는 바람직한 코돈-최적화된 핵산은 서열번호 14이다.
이 에피토프/MHC 복합체에 특이적인 본 발명의 TCR 구조물은 본 발명의 TRB의 가장 바람직한 CDR3인 서열번호 15의 CDR3이 포함된 TRB를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 TRB는 서열번호 15의 CDR3, 서열번호 70의 CDR1 그리고 서열번호 71의 CDR2를 포함한다. 상기 TRB의 가변 영역은 서열번호 16을 포함하거나, 또는 서열번호 16에 대하여 최소한 80%, 바람직하게는, 최소한 90% 또는 최소한 95%의 서열 동일성을 갖고, 이때, 상기 가변 영역은 서열번호 15를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 TRA의 가변 영역은 서열번호 63의 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 상기 TRB는 바람직하게는 서열번호 17을 포함하거나, 또는 이것으로 구성되며, 이때 상기 불변 영역은 유전자삽입 TCR 쇄의 쌍형성을 강화시키기 위하여 뮤린 불변 영역이거나 또는 최소 뮤린 불변 영역이다. 대안으로, 상기 불변 영역은 인간의 것으로, 이는 면역 인지 위험을 최소화시킨다. TRB 쇄를 인코딩하는 바람직한 코돈-최적화된 핵산은 서열번호 18이다.
본 발명은 가령, CMV 감염, 구체적으로, CMV-질환 및 CMV-유도된 악성종양을 치료하기 위한 TCR 유전자 요법에 적합한 발현 카세트 안에 CMV pp65 에피토프에 특이적인 TRA와 TRB 모두를 코딩하는, 가령, 서열번호 41에 따른 서열을 포함하는 핵산을 또한 제공한다.
본 발명의 핵산은 본 발명의 TRA 및/또는 TRB를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 가령, 상기 TRA 및/또는 TRB가 T 세포, 이를 테면 인간 T 세포에서 발현에 적합한 프로모터에 작동가능하도록 연계되어 있는 벡터로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 전술한 프로모터는 이종기원의 프로모터이며, 즉, 자연 발생 세포, 구체적으로, 인간 T 세포에서 TCR 알파 또는 베타 유전자에 연계되지 않는 프로모터이다. 상기 프로모터는 구성 또는 유도성 프로모터, 바람직하게는 골수증식성 육종 바이러스 (MPSV), CMV, CAG 또는 EF1α 프로모터일 수 있다. 본 발명의 핵산은 RNA, 레트로바이러스 벡터, γ-레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 트랜스포존-기반 벡터로 제공될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 벡터는 인간 환자의 TCR 유전자 요법에 적합하다. 바람직하게는, 상기 벡터는 MP71이다. 가령, TRA 및 TRB을 코딩하는 본 발명의 핵산은 유전적 링커, 바람직하게는 바이러스-유도된 2A 요소(element)를 통하여 융합되어, 기능성 TCR 구조물의 두 쇄를 모두 코딩하는 하나의 이식유전자(transgene) 카세트를 제공할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 단백질, 또는 이의 융합 단백질들, 구체적으로 본 발명의 핵산에 의해 코딩되고, 공개된 항원, 가령, HPV16 종양단백질 E5의 에피토프에 특이적인 TRA 및/또는 TRB를 또한 제공한다. 본 발명의 TRA 및/또는 TRB는 그 고유의 대응물에 상응하는 모든 특성들 또는 도메인을 포함할 수 있지만, 그러나 필수적인 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 TRA 및 TRB는 최소한 가변 영역, 또는 가변 영역과 불변 영역을 포함할 수 있는데, 가령, 인간 가변 또는 불변 TCR 영역에 대하여 최소한 80%, 최소한 90% 또는 최소한 95% 서열 동일성을 갖는 가변 및/또는 불변 영역을 포함한다. 입양 T 세포 요법의 경우, 상기 TCR 구조물은 가변 영역, 불변 영역 및 막경유(transmembrane) 영역을 포함하는 전장 TCR 알파 쇄 및 베타 쇄를 포함하는 TCR이 바람직하다.
상기 구조물은 융합 단백질이 될 수 있는데, 예를 들면, TCR 쇄의 가변 영역들이 Ig 도메인들, 가령, IgG 불변 도메인, 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질에서 항-CD3 항체 도메인들에 융합되어, 가령, 세포 표면에 각 pMHC를 발현시키고, 그리고 가령, 항-CD3 표적 도메인을 통하여 T 세포에 관여하여 이 표적 세포에게 작동체 기능을 제공하는 악성 세포를 표적으로 하는 가용성 단클론 TCR 시약을 제공한다 (63).
단일 쇄 구조물 (scTCR) 뿐만 아니라, 이종이량체(heterodimeric) TCR 구조물도 포괄된다. scTCR은 구조물의 제 1 TCR 쇄 (가령, 알파 쇄)의 가변 영역과 전체(전장의) 제 2 TCR 쇄 (가령, 베타 쇄)의 가변 영역을 포함할 수 있거나, 또는 이 역을 포함할 수 있다. 더욱이, 상기 scTCR은 2개 또는 그 이상의 폴리펩티드를 함께 연결시키는 하나 또는 그 이상의 링커를 선택적으로 포함할 수 있다. 상기 링커는 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 2개의 단일 쇄를 함께 연결시키는, 예를 들면, 펩티드가 될 수도 있다. 본 발명은 사이토킨, 가령, 인간 사이토킨, 이를 테면 IL-2, IL-7 또는 IL-15에 융합된 이러한 scTCR을 또한 제공한다.
본 발명에 따른 TCR 구조물은 최소한 2개의 scTCR 분자를 포함하는 다합체 복합체 형태로 또한 제공될 수 있는데, 이때 전술한 scTCR 분자들은 각각 최소한 하나의 바이오틴 모이어티에 융합되며, 이때 전술한 scTCRs는 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용에 의해 서로 연계되어 전술한 다합체 복합체의 형성이 가능하다. 2개 이상, 가령, 본 발명의 4개 scTCR를 포함하는, 고차 다합체 복합체가 또한 제공된다.
본 발명의 TCR 구조물은 탐지가능한 라벨, 이를 테면, 방사능동위원소, 형광단 (가령, 플루오레세인 이소티오시안산염 (FITC), 피코에리틴 (PE)), 효소 (가령, 알칼리 포스파타제, 홍당무 과산화효소), 및 입자 (가령, 금 입자 또는 자성 입자)를 포함하도록 변형될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 TCR 구조물, 구체적으로 인간 거대세포바이러스 단백질 pp65의 에피토프, 바람직하게는, 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 에피토프에 특이적인 TCR 구조물의 TRA 및 TRB를 코딩하는 핵산을 포함하고, 전술한 TCR 구조물을 발현시키는 숙주 세포, 바람직하게는, CD8 T 세포에 또한 관계한다. 상기 TRA 및 TRB는 상기에서 설명된 바와 같이, 바람직하게는 이종기원의 프로모터로부터 발현된다. 상기 T 세포는 바람직하게는 인간 T 세포이다. 이것은 관련 바이러스에 감염된 환자, 구체적으로, 전술한 바이러스가 관련된 악성종양, 이를 테면 HPV의 경우 자궁경부 암, 항문성기 암 그리고 두경부 암을 앓고 있는 환자로부터 단리될 수 있다. 상기 환자는 TCR에 의해 인지되는 에피토프로 제한된 MHC를 발현한다. 상기 T 세포는 중추 기억 T 세포 또는 순수(naive) T 세포일 수 있다.
본 발명은 의약, 가령, 약학 조성물에 사용하기 위한 이러한 숙주 세포, 가령, T 세포, 또는 본 발명의 핵산에 또한 관계한다. 이러한 약학 조성물은 다음의 것에 감염된 환자의 치료에 이용될 수 있다:
a) 인간 유두종바이러스 16, 이때 TCR은 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 에피토프에 특이적이며, 이때 상기 환자는 HLA-B*15:01-양성이며; 또는
b) 인간 거대세포바이러스, 이때 TCR은 인간 거대세포바이러스 단백질 pp65의 에피토프에 특이적이며, 이때 상기 환자는 HLA-B*07:02-양성이다.
의약에 사용하기 위하여, TRA 및 TRB를 모두 포함하는 TCR 구조물은 핵산, 단백질 또는 T 세포 형태로 이용될 수 있다. 요법을 시행하기에 앞서 E5 항원을 발현하는 HPV-감염된 환자를 스크리닝하여, E5 발현시키는 환자들만 치료하는 것이 도움이 될 수 있다.
상기 약학 조성물은 병원체, 이를 테면 하기 바이러스의 감염 또는 감염을 예방하는데 또한 사용될 수 있다:
a) 인간 유두종바이러스 16, 이때 TCR은 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 에피토프에 특이적이며, 이때 상기 환자는 HLA-B*15:01-양성이며; 또는
b) 인간 거대세포바이러스, 이때 TCR은 인간 거대세포바이러스 단백질 pp65의 에피토프에 특이적이며, 이때 상기 환자는 HLA-B*07:02-양성이다.
예를 들면, TCR은 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 에피토프에 특이적인 약학 조성물은 환자가 HLA-B*15:01-양성인 경우, 가령, 자궁 경부에서 전조가 없는(premalignant) 고-등급 병변이 발견되다면, HPV16에 감염된 환자의 자궁경부암의 예방에 유용할 수 있다. TCR은 인간 거대세포바이러스 단백질 pp65의 에피토프에 특이적인 약학 조성물은 환자가 HLA-B*07:02-양성인 경우, 조혈 줄기 세포를 이식한 후 전술한 환자에서 CMV 질환을 방지하거나 또는 이의 증상을 감소시키기 위하여, 환자를 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 치료를 요하는 환자(가령, 바이러스, 이를 테면 HPV16 또는 CMV에 감염된, 또는 전술한 바이러스와 관련된 악성 종양을 앓는)를 치료하는 방법, 또는 바이러스 감염을 감소시키거나, 또는 전술한 감염을 감소시키는 방법을 또한 교시하는데, 이 방법은 전술한 환자에게 본 발명의 적합한 재조합 T 세포, 또는 핵산을 투여하는 것을 포함한다. CMV pp65 에피토프에 특이적인 본 발명의 TCR을 발현시키는 T 세포 또는 이를 코딩하는 핵산으로 이식 후 CMV 질환의 치료 또는 방지 (64,65)가 또한 가능하다.
본 발명은 에피토프를 포함하는 최대 40개 아미노산 길이를 갖는 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 단편을 코딩하는 핵산, 또는 에피토프를 포함하는 최대 40개 아미노산 길이를 갖는 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 펩티드 단편에 또한 관계하는데, 이때 상기 에피토프는 본 발명의 T 세포의 TCR 구조물에 의해 인지될 수 있다. 이러한 E5 단편들은 백신접종, 가령, 합성된 긴 펩티드 백신접종에 유익하게 이용될 수 있다. 바람직하게는, 에피토프를 코딩하는 핵산, 또는 에피토프로 구성된 펩티드는 본 발명의 에피토프 동정 방법에 의해 동정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 에피토프는 상기에서 설명된 TCR 구조물에 의해 인지가능한 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 에피토프이다. 본 발명의 방법에 의해 처음으로 동정된 E5 에피토프는 본 발명, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하며, 서열번호 1, 45, 47, 49, 51, 52 및 57로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 인간 유두종바이러스 16에 의한 감염 방지(또는 감염 감소)를 위한 약물, 만일 자궁 경부에서 전조가 없는 고-등급 병변이 발견된다면 HPV16에 감염된 환자에게서 자궁경부암의 예방을 위한 약물, 또는 HPV16 감염, 구체적으로, HPV16-유도된 악성종양의 치료를 위한 약물에 사용하기 위한 전술한 E5 펩티드 단편 또는 전술한 에피토프을 코딩하는 전술한 핵산, 또는 전술한 펩티드 단편 또는 에피토프에 또한 관계한다. 전술한 에피토프를 제공하는 백신은 대상, 가령, HLA-B*15:01-양성인 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 이에 범위를 한정하고자 암은 아니다. 본원에 인용된 모든 문헌은 본 명세서에 전문 편입된다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 모든 실시예들은 복합될 수 있다.
도 1 레트로바이러스 HLA 벡터. (a) IRES-GFP 또는 (b) IRES-CFP 발현 표지자에 융합된 상이한 HLA 대립유전자를 휴대하는 γ-레트로바이러스 벡터 MP71의 개략도.
도 2 MHC 클래스 I 세포 라이브러리. (a) MHC-IRES-GFP 또는 (b) MHC-IRES-CFP 카세트를 휴대하고 있는 레트로바이러스 벡터 MP71은 K562 세포에 형질도입되었다. 2개 T 세포 공여자의 모든 MHC 클래스 I 대립유전자를 커버하는 10가지 MHC 형질도입의 FACS 플롯의 선별을 나타낸다. GFP 및 CFP 발현은 형질도입 비율을 나타낸다. MHC 클래스 I 항체 착색에 의해 GFP-또는 CFP-양성 세포들의 MHC 표현 발현을 보여주는데, 백분율로 나타낸다.
도 3 MHC 세포 라이브러리에서 안정적 항원 발현의 예시. IRES-mCherry 표지자에 융합되고, mCherry 발현의 유동세포분석 측정에 의해 탐지되는 항원 (HPV16 E7)이 K562 세포에 안정적으로 형질도입되었다. MHC I 대립유전자는 IRES-GFP 표지자에 융합되며, 발현은 GFP의 유동세포분석 탐지에 의해 나타났다. MHC-IRES-GFP/항원-IRES-mCherry 이중 양성 세포들의 백분율은 FACS 플롯에서 나타내며, (a) E7은 MHC 세포 라이브러리의 K562 세포에 안정적으로 형질도입되었다. (b) E5의 절두된(truncated) 마이크로유전자 구조물은 MHC (HLA-B*15:01)-형질도입된 K562 세포에 안정적으로 형질도입되었고, 이는 에피토프 매핑에 이용되었다 (nt, 뉴클레오티드).
도 4 표적 세포에서 ivtRNA로부터 항원의 발현. IRES-CFP 표지자를 발현하는 단일 MHC-형질도입된 K562 세포는 전기천공을 통하여 GFP를 코딩하는 ivtRNA에 의해 형질감염되었다. GFP의 발현은 전기천공 후 5 h 시점에서 측정되었고, 형질감염 효율의 대조로 이용되었다.
도 5 MHC 세포 라이브러리의 K562 세포와 공동 배양시 항원-특이적 T 세포 반응의 유도. (a) TCR-B23 및 (b) TCR-S51은 T 세포에 안정적으로 형질도입되었으며, CD8과 유전자삽입 TRB 발현에 대하여 착색되었고, 유동세포분석에 의해 분석되었으며, (c) TCR-형질도입된 T 세포는 E7co ivtRNA 형질감염 후 K562-B*27:05 표적 세포와 함께 3h 동안 공동배양되었다. CD137 발현은 유동세포분석에 의해 측정되었다. H20-형질감염된 K562-B*27:05 표적 세포는 음성 대조로 삼았다.
도 6 mDCs는 ivtRNA로부터 GFP를 발현한다. 플레이트-흡착성 단핵구로부터 mDCs가 생성되었다, (a) 유동세포분석의 히스토그램은 이소타입 대조(회색 지역)와 비교하여 T 세포 활성화 분자 CD80, CD83 및 CD86를 발현하는 mDCs를 나타낸다 (검정선), (b) 15 ㎍의 항원 ivtRNA로 형질감염 후 4 내지 6시간 후, GFP의 발현이 측정되었다. GFP+　DCs의 백분율을 나타낸다.
도 7 바이러스-특이적 T 세포의 스크리닝. 자가 mDCs로 항원-특이적으로 자극을 받은 T 세포는 6개의 상응하는 단일 MHC I-발현하는 K562 세포들의 MHC 세포 라이브러리와 함께 공동배양되었다, (a) ELISA를 이용하여 IFNγ 방출에 대하여 공동배양물의 상청액을 테스트한다. (b) 동일한 웰의 세포들을 유동세포분석을 통하여 분석하여 CD8+　T 세포의 CD137+　 백분율을 결정하였다.
도 8 바이러스-특이적 T 세포의 FACS-분류. (a) pp65에 반응성을 보인 T 세포 (도 7b)는 pp65-형질감염된 HLA-B*07:02-발현 K562 세포들의 MHC 세포 라이브러리와 함께 공동배양되었고, (b) E5-반응성 T 세포 (도 7b)는 E5-형질감염된 HLA-B*15:01-발현 K562 세포들의 MHC 세포 라이브러리와 함께 공동배양되었다. 공동배양물의 단일 림프구는 FSC/SSC로 통과되어(gated), CD8+　세포들의 CD137-발현 세포는 후속 TCR 분석을 위하여 FACS-분류되었다.
도 9 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄 조합의 발현 및 기능 분석. (a) TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄 조합은 건강한 공여자의 PBMCs에서 레트로바이러스에 의해 발현되었다. T 세포의 유전자삽입 TCR 발현은 CD8 및 뮤린 불변 TCR 베타 쇄 분절 (segment)에 대한 항체 착색 후 유동세포분석에 의해 측정되었다. 형질도입안된 (ut) T 세포를 음성 대조로 이용하였다. 상이한 PBMC 공여자를 이용한 2개의 별도 실험 결과를 나타낸다, (b) 상이한 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄 조합으로 형질도입된 T 세포는 차례로 항원 (HPV16 E5 또는 CMV pp65)-형질감염된 K562-B*15:01 및 K562-B*07:02 표적 세포와 함께 공동배양되었다. TCR 알파/TCR 베타-형질도입된 T 세포의 IFNγ 방출은 ELISA에 의해 측정되었다. 결과는 중복(duplicates)의 평균 +/-SEM로 나타낸다.
도 10 최적화된 TCR 이식유전자 카세트로 TCR 유전자-변형된 PBMCs의 생성.
TCR 이식유전자 카세트로 PBMCs의 레트로바이러스 형질도입이 실행되었다. 형질도입 비율은 뮤린 TRBC의 항체 착색 및 유동세포분 분석에 의해 평가되었다. 결과는 상이한 2개 공여자 (ut, 형질도입안된 PBMCs)의 PBMCs를 이용한 실험을 대표한다.
도 11 HPV16 E5의 항원 서열의 매핑 (a) 전장 E5 야생형 (wt) (252 nt), E5 코돈-최적화된 (co) (252 nt) 및 E5wt의 3' 절두된 미니유전자 형태 (63-189 nt)는 IRES-mCherry 표지자에 융합되었고, MP71 레트로바이러스 벡터에 클론되었고, 그리고 K562-B*15:01 표적 세포에서 발현되었다. ATG 시작 코돈의 A로 시작되는 유전자 서열의 길이를 표시한다. (b) TCR E5-형질도입된 T 세포는 상기 E5 유전자 형태중 하나를 휴대하는 K562-B*15:01 표적 세포로 18h 동안 공동배양되었다. IFNγ 방출은 ELISA에 의해 측정되었다. 결과는 중복(duplicates)의 평균 +/-SEM로 나타낸다.
도 12 HPV16 E5-특이적 TCR 및 CMV pp65-특이적 TCR의 에피토프 매핑. (a)IEDB에 의해 예측되는 HLA-B*15:01에서 제시되는 잠재적 에피토프로써 HPV16 E5 에피토프들은 서열 유사성에 따라 집합되었다(clustered). 제 1 열 (p4-p17) (서열번호 1, 49-61)은 에피토프 예측에서 펩티드의 등급을 나타낸다 (표 2). 제 2 열 (-mer)은 펩티드 길이를 나타낸다, (b) E5 TCR-형질도입된 PBMCs는 펩티드-펄스된 K562-B*15:01 표적 세포들과 함께 공동배양되었고, 그리고 IFNγ 방출은 ELISA에 의해 측정되었다. 형질도입안된 (ut) T 세포는 음성 대조로 이용되었다, (c) CMV pp65 펩티드 p1 (서열번호 10)은 HLA-B*07:02(66,67)에서 제시된 pp65의 기존 설명된 에피토프를 나타낸다. (d) Pp65 TCR-형질도입된 PMBCs는 pp65 p1-펄스된 K562-B*07:02 표적 세포와 함께 공동배양되었다. IFNγ 방출은 ELISA에 의해 측정되었다. 모든 ELISA 결과는 중복(duplicates)의 평균 +/-SEM로 나타낸다.
실시예
1.1 MHC 벡터 라이브러리의 생성
공통적인 MHC I 대립유전자의 유전자들은 γ-레트로바이러스 벡터 MP71 (68-70)에 클론되어 우선 MHC 벡터 라이브러리를 만들고, 단일-MHC-발현 K562 세포들을 만들었고 (23), 이것들은 인공 APCs를 포함하는 MHC 세포 라이브러리로 이용되었다. HLA-A,-B 또는-C 유전자들의 대립유전자 형태는 매우 다형태적이다(polymorphic). 서열은 IMGT/HLA 데이타베이스에 접근은 개방적이다. 그러나, 상이한 유형의 5' 단부와 3' 단부는 서열 유사성이 상당히 높기 때문에, 세포 cDNA로부터 하나의 특정 HLA 유전자의 PCR 증폭을 어렵게 한다. 이와 같은 문제를 극복하기 위하여 International Histocompatibility Workshop에서 구한 림프아구성 세포들 (LCL)로부터 cDNA를 만들었고, 이것은 원하는 HLA-A,-B 및-C 대립유전자에 동형접합성이기 때문에, PCR에 의한 효율적인 유전자 증폭이 가능하였다. 증폭된 HLA 단편은 IRES-GFP 또는 IRES-CFP 발현 표지자에 융합되었고, 레트로바이러스 발현 벡터 MP71에 클론되었다 (도 1).
1.2 MHC 세포 라이브러리의 생성
적혈구혈증 세포 계통 K562 (20)는 MHC 세포 라이브러리를 만들기 위한 인공 APC 스캐폴드로 이용되었다. K562 세포는 MHC 클래스 I 분자의 내인성 발현이 없지만, 기능적 MHC 복합체의 산재된 성분인 β-2 마이크로글로불린을 발현시킨다. 그러나, MHC 클래스 I α-쇄 대립유전자로 형질감염 시, K562 세포는 MHC 표면 발현을 하는 기능성 항원 프로세싱 기전을 보유하고, 이로 인하여 상기 세포는 인공 APCs 생성을 위한 매력적인 스캐폴드가 될 수 있다(19,23,24). MP71 레트로바이러스 벡터 기반 HLA 라이브러리를 사용하여 단일 HLA 대립 형질이 K562 세포에 안정적으로 형질도입되었다. 293T 패키징 세포에서의 레트로바이러스 상청액의 생성 및 형질 도입이 수행되었으며(72), GFP-또는 CFP-발현 집단이 생성되었고, 이는 유동 세포분석에 의해 확인되었다. 기능적 어셈블리(assembly) 및 MHC 복합체의 표면 발현은 GFP-또는 CFP-양성 세포 집단의 MHC 클래스 I 항체 염색에 의해 나타났다(도 2). K562 세포에서 형질도입된 모든 HLA 대립 형질은 이들 세포 표면에서 발현되었다. 단리된 TCRs의 추후 분석을 위하여, 원래 T 세포 공여자의 6개 MHC 클래스 I 대립유전자 모두를 커버하는 K562 세포 패널을 만들었다.
1.3 MHC 세포 라이브러리에서 항원 발현
MHC 세포 라이브러리의 K562 세포를 인공 APCs로 이용하기 위하여, 레트로바이러스 벡터 MP71을 단일-MHC-발현 K562 세포에 형질도입시켜 단일 MHC 대립유전자에 대하여 항원 구조물이 안정적으로 발현되도록 하였다. 레트로바이러스 형질도입은 기술된 바와 같이 실행되었다 (71). K562 세포에서의 항원 발현은 단일 MHC 대립유전자의 상황에서 에피토프의 내인성 프로세싱 및 제시를 허용하였다. 많은 항원 (HPV16 E5, E6 및 L1, CMV pp65 및 IE-1)이 세포내 FACS 착색에 의해 용이하게 탐지되지 않을 수도 있다. 더욱이, 에피토프 매핑에 이용되었던 HPV16 E5의 절두된 항원(미니유전자 구조물)에 대한 항체들 뿐만 아니라 돌연변이된 뉴클레오티드 서열도 이용할 수 없었다. 따라서, 모든 항원은 IRES-mCherry 표지자에 융합되어, 유동세포분석에 의해 간접적으로 발현이 확인되었다 (도 3).
표적 세포에서 항원 서열을 발현하는 두 번째 전략은 전기천공(electroporation)을 통해 ivtRNA를 형질감염시키는 것이었다. 따라서, mMessage mMachine 및 poly(A) 키트(Ambion (Life Technologies))를 사용하여 ivtRNA의 T7 프로모터-의존적 생성 및 후속 폴리아데닐화가 가능하도록 항원 서열을 발현 벡터에 클로닝하였다. K562 세포 안으로 ivtRNA의 전기천공은 급격한(exponential) 전기 천공 프로토콜을 사용하는 BioRad GenePulser로 수행되었다. 일반적으로, GFP를 코딩하는 ivtRNA는 전기천공 효율의 대조로 사용되었다. 도 4에서 HLA-형질도입된 K562 세포들은 ivtRNA 전기천공 후 GFP를 발현하였다는 것을 보여준다.
1.4 MHC 세포 라이브러리의 세포를 표적으로 하여 항원-특이적 T 세포 반응 유도
기존 실험에서, MHC 세포 라이브러리의 HLA-형질도입된 K562 세포는 레트로바이러스 형질도입 후, 또는 항원 ivtRNA로 형질 감염 후, 규정된 항원을 발현하는 것으로 나타났다. 그 다음 단계는 항원 특이적인 T 세포 반응을 유도하기 위해 에페토프를 내인성 프로세싱하고, 제시하는 MHC 세포 라이브러리의 역량을 시험하는 것이었다. TCR을 통한 T 세포의 HLA 항원 특이적 자극은 조기 활성화 표지자 CD137의 상향 조절을 유도한다고 기술되었다(32-34).
이를 위해, 항원 특이적 T 세포 클론으로부터 단리되고 HLA-B*27: 05에 내재적으로 프로세싱되고, 제시된 에피토프를 인지하는 특성화가 잘 된 2 개의 TCR (B23, S51)을 사용했다. TCR을 발현하도록 조작된 PBMCs (도 5a, b)를 사용하여 MHC 세포 라이브러리의 항원-발현 K562 세포가 항원-특이적 T 세포를 활성화시키는 능력을 분석하였다. T 세포 활성화는 유동세포분석을 통하여 CD 137 발현으로 측정되었다. 도 5c에서 나타낸 바와 같이, 모든 TCR-조작된 PBMCs는 항원 ivtRNA-형질감염된 K562-B*27:05 표적 세포와 20h의 공동배양 후 CD137 활성화 표지자를 발현하였다. CD8+/CD137+　T 세포의 양은 TCR-B23-조작된 T 세포의 경우 대략 6%였고, TCR-S51-조작된 T 세포의 경우 대략 8%였고, 이것은 공동배양에 이용된 TCR-조작된/CD8+　T 세포의 전체 양을 반영한다 (도 5a, b). 결론적으로, K562 세포들은 항원 에피토프를 내인적으로 프로세싱하고 이를 유전자삽입 HLA-B*27:05 상에 제시하며, CD137 발현에 의해 측정된 바와 같이, 시료의 항원-특이적 T 세포의 자극으로 이어졌다. 또한, ELISA에 의해 측정되었을 때, CD137 발현은 TCR-형질도입된 T 세포의 항원-특이적 IFNγ 방출과 상관 관계가 있었다.
2.1 T 세포의 항원-특이적 확장
원하는 항원 특이성을 갖는 TCR을 검출 및 단리하는 스크리닝 접근법의 구성이 다음에 기재되어있다. 이것은 상이한 항원, 예를 들어 상이한 바이러스 또는 상이한 종양-특이 항원으로 전달될 수 있다.
따라서, DCs는 내독소가 없는 배지를 사용하여 플레이트 흡착성 단핵구 (72,73)에서 생성되고 성숙되었다. 성숙한 DCs (mDC)의 성숙 상태는 T 세포 활성화 표지자 CD80, CD83 및 CD86 뿐만 아니라 유동 세포분석법에 이어 MHC II 발현에 대한 착색에 의해 확인되었다(도 6). 항원 ivtRNA은 개방 접근 UniProt 데이타베이스에서 나타낸 바와 같은 HPV16 및 CMV 야생형 유전자의 전장 서열을 나타내는 6개 바이러스 항원 (CMV pp65 및 IE1, HPV16 L1, E5, E6 및 E7)으로부터 생성되었다. mDCs는 항원의 ivtRNA로 형질감염시켜, 이들 세포 표면에 자연적으로 프로세싱되고, 제시된 에피토프가 제시되도록 하였다 (74). GFP를 코딩하는 ivtRNA를 형질감염 대조로 이용하였다. 형질감염 후 4-6h에 발현이 측정되었다 (도 6). 항원-발현 mDCs는 10:1의 PBMC 대 DC 비율로 사용되었다. 10% 인간 혈청을 함유하는 배지를 이용하여 DCs를 이용한 PBMC 자극이 수행되었다 (74,75). T 세포 증식을 돕기 위하여 자극 2일 차부터 배지에 IL-2 (20 U/ml) 및 IL-7 (5 ng/ml)이 제공되었다. 상기 배양물에 주당 3회 IL-2 (20 U/ml) 및 IL-7 (5 ng/ml)이 제공되었다. 증식하는 PBMCs는 약 1:2 내지 3:4의 비율로 분리될 수 있다.
2.2 바이러스-특이적 T 세포의 스크리닝
1 차 자극 후 14일 시점에 상기 6개의 바이러스 항원중 하나를 발현하는 자가 mDCs를 이용하여 2차 자극이 실행되었다. 28일 후, MHC 세포 라이브러리를 이용하는 특정 항원-MHC 조합에 대한 반응성에 대하여 12개의 T 세포 배양물이 스크리닝되었다(도 2). MHC 세포 라이브러리의 세포는 전기천공을 통하여 항원 ivtRNA으로 형질감염되었고, 하나의 항원에 대항하여 생성된 각 T 세포 배양물은 하나의 MHC 유형과 복합된 항원에 대한 반응성에 대하여 스크리닝되었다 상기 라이브러리와 T 세포의 접촉은 T 세포 시료 내에서 항원-특이적 T 세포의 최적 활성화가 달성되도록 바람직하게는 18-22 시간 동안 수행된다. T-세포의 비특이적 활성화를 방지하기 위해 상기 접촉 동안 사이토킨의 첨가는 피하였다. 항원-특이적 T 세포의 IFNγ 방출은 ELISA에 의해 측정되었다. 더욱이, 공동배양물에서 T 세포는 유동세포분석에 의해 CD137의 발현에 대하여 분석되었다 (33).
T 세포는 각각 HLA-B*07:02 및 HLA-B*15:01과 함께 pp65 및 E5의 조합에 특이적 반응을 보였다. 항원-MHC-특이적 T 세포 반응성은 T 세포 표면에서 IFNγ의 방출 및 CD137의 상향조절에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 사이토킨 방출 ELISA 및 T 세포 활성화 표지자의 유동 세포 분석을 조합하여 항원-MHC-특이적 T 세포 반응을 검출하기 위한 견고한 2-방법 판독 시스템이 된다.
2.3 TCR 레퍼토리를 분석하기 위하여 바이러스-특이적 T 세포의 분류
TCR 레퍼토리를 분석하기 위한 FACS 분류를 위해, 두 분석에서 하나의 항원-MHC 조합에 대한 특이적인 반응을 나타내는 T 세포들이 선택되었다. CMV pp65로 확장된 T 세포들은 pp65-형질감염된 K562-B*07:02 표적 세포와 함께 공동배양되었고, CD137+　T 세포들은 배양물에서 분류되었다. 이 설정에서 CD8+　T 세포의 거의 절반이 CD137+　이었다. HPV16 E5-형질감염된 K562-B*15:01 표적 세포와 공동배양시, CD8+　T 세포의 13%는 CD137을 발현하였다.
항원-MHC-특이적 T 세포의 분류 후, RNA는 단리되었고, SMARTer RACE cDNA 증폭 키트(Clontech)를 이용하여 TCR 알파 유전자와 베타 유전자의 5'-RACE PCR을 위한 cDNA를 만들었다. 상기 PCR 증폭으로 TCR 알파 및 베타 유전자 단편이 생성되었는데, 이것들은 FACS-분류된 T 세포 시료 안의 각 T 세포 클론타입의 양을 정량적으로 나타낸다. TCR 알파 단편과 베타 유전자 단편의 PCR 생성물은 TOPO® 클로닝 시스템(Invitrogen, Life Technologies)을 이용하여 시퀀싱 벡터 안에 결찰되었고 (Invitrogen, Life Technologies), 박테리아 안으로 형질변환되었고, 그리고 선택 배지가 포함된 플레이트 상에서 성장되었다. 각 박테리아 콜로니는 하나의 PCR TCR 알파 또는 베타 유전자 단편을 갖는 하나의 서열 벡터를 함유하는 것으로 간주되었다. 다수의 박테리아 콜로니의 벡터 DNA 제조물에 이어 벡터 삽입물 (TCR 알파 또는 베타 유전자 단편들)은 서열화되었다. 각 박테리아 콜로니의 시퀀싱 결과는 웹-기반 IMGT/V-Quest을 이용하여 분석되었다. 동일한 TCR 알파 또는 베타 쇄의 빈도는 FACS-분류된 T 세포 시료 안에 동일한 T 세포 클론 타입의 비율을 반영하였다. 그 다음, TCR 알파 쇄와 베타 쇄의 빈도 정합이 실행되어 기능성 TCRs을 재구성하였고, 이는 항원-MHC-특이적 IFNγ 방출 및 CD 137 상향조절을 설명하였다.
TCR 분석에서 HPV16 E5 및 HLA-B*15:01에 대한 반응시 TRAV17 쇄와 TRAV38-2 쇄는 분류된 모든 T 세포의 거의 40%에서 제시되는 것으로 나타났다. 3가지 TCR 베타 가변 쇄들은 T 세포의 21-32%에서 제시되었다 (표 1). 2 개의 TCR 알파 쇄 각각은 3 개의 TCR 베타 쇄 중 하나와 함께 기능적 E5 특이적 TCR을 어셈블리할 수 있다고 추정되었다. 따라서, 기능성 HPV16 E5 특이적 TCR을 어셈블리하기 위하여 후보 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄의 6 가지 가능한 조합이 존재하였다.
CMV pp65 및 HLA-B*07:02에 대한 반응성으로 분류된 T 세포는 TCR 알파 및 TCR 베타 콜로니 각각의 약 70%에 존재하는 TRAV17 쇄와 TRBV7-9 쇄를 갖는 하나의 우세한 TCR을 보유하였다 (표 1).
요약하면, TCR 분석에서 항원-MHC-특이적 T 세포의 CD 137 분류는 높은 빈도로 나타나며, 기능 항원-MHC-특이적 TCR을 재구성할 수 있는 우세한 TCR 알파 및 베타 쇄에 대한 강한 농축을 동반한다는 것을 보여주었다.
Figure pct00001
2.4 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄 조합의 기능적 분석
TCRs의 유전자삽입 발현을 위하여, 각 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄 유전자는 γ-레트로바이러스 벡터 MP71로 클론되었다. 상이한 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 유전자 조합을 이용하여 PBMCs의 안정적 형질 도입 후 TCRs의 세포 표면 발현 및 기능성 분석이 실행되었다.
펩티드-MHC (pMHC) I 결합을 담당하는 우세 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄 유전자들(TRAV 및 TRBV)의 가변 영역들은 코돈-최적화된 뮤린 불변 TCR 알파 유전자 분절와 TCR 베타 유전자 분절 (mTRAC 및 mTRBC)에 융합되어 T 세포의 레트로바이러스 형질도입 후 유전자삽입 TCR 쇄의 선취적(preferential) 쌍형성이 가능하도록 하였다 (39,40,71). mTRBC에 특이적인 항체로 유전자삽입 TCRs을 착색한 후, 유동 세포 분석을 실시하여, 모든 TRA/TRB 쇄 조합이 PBMCs에서 발현되었다는 것을 보여 주었다(도 9a). 그러나, 상이한 조합의 형질도입 비율은 6-25% 사이에서 가변적이었다. 기능성 분석을 위하여, 전기천공을 통하여 각각 HPV16 E5 또는 CMV pp65 항원 ivtRNA에 의해 형질감염된 K562-B*15:01 또는 K562-B*07:02 표적 세포에 대한 반응성에 대하여 TCR-형질도입된 T 세포를 테스트하였다. 놀랍게도, TRBV6-5 (서열번호 7)와 함께 TRAV17 (서열번호 3)를 발현하는 T 세포는 E5-형질감염된 표적 세포를 인지하였지만, 다른 5개 TRA/TRB 조합중 어느 것도 E5에 대하여 항원-특이적 반응성을 보이지 않았다. (도 9b). 따라서, TRBV6-6와 함께 TRAV17은 기능성 항원-특이적 TCR을 재구성하였다. CMV-반응성 T 세포의 유일한 후보 TRA/TRB 조합 (TRAV17 (서열번호 12) 및 TRBV7-9 (서열번호 16))은 K562-B*07:02 표적 세포의 pp65-특이적 인지를 나타내었다. TRA/TRB-형질도입된 T 세포는 H20-형질감염된 표적 세포에 대한 배경 반응성을 보이지 않았고 (도 9b), 따라서 기능성 항원-MHC-특이적 TCRs의 명백한 동정이 가능하였다.
결론적으로, 항원 특이적 T 세포 클론타입으로부터의 TCR의 재구성은 FACS-분류된 T 세포 시료에서 높은 빈도로 발견된 TRA 쇄 및 TRB 쇄의 조합을 통하여 달성되었다. MHC 세포 라이브러리의 사용에 기초하여, 이 접근법에 의해 원하는 항원 특이성을 갖는 TCR의 스크리닝, 검출 및 단리될 수 있다.
2.5 PBMCs에서 유전자삽입 발현을 위한 HPV -및 CMV -특이적 TCRs의 최적화
유전자삽입 TCR 발현의 효율을 증가시키기 위해, TCR 이식유전자 서열의 몇 가지 최적화가 적용되었다 (71). TRA 및 TRB 쇄 서열은 코돈-최적화되었고, 인간 TRAC 및 TRBC 유전자 분절들은 유전자삽입 TCR 쇄의 선취적 결합을 증가시키고, 수령 T 세포에 의해 발현되는 내인성 TCR 쇄(서열번호 5, 9, 14, 18)와의 쌍형성을 감소시키기 위하여 이들의 뮤린 대응부로 대체되었다. 그 다음 최적화된 TRB 유전자는 P2A 요소를 통하여 TRA 유전자에 연계되고, 생성된 단일 TCR 이식유전자 카세트 (E5-특이적: 서열번호 40, pp65-특이적: 서열번호 41)는 γ-레트로바이러스 벡터 MP71에 분자적으로 클론되었다. 최적화된 TCR 이식유전자 카세트를 보유하는 레트로바이러스 입자는 293T 세포의 3개-플라스미드 형질 감염을 통해 생성되었고, 공여 PBMC는 상기 TCR을 코딩하는 레트로바이러스 입자에 의해 안정적으로 형질도입되었다(70). PBMC 시료 안에 TCR 유전자-변형된 T 세포들은 유전자삽입 뮤린 TRBC의 항체 착색 후 유동세포분석에 의해 분석되었다. PBMCs에서 E5-특이적 TCR (TRAV17 + TRBV6-5, 서열번호 40)에 대한 TCR 형질도입 비율은 45%, pp65-특이적 TCR (TRAV17 + TRBV7-9, 서열번호 41)에 대한 비율은 37%를 얻을 수 있고, 이에 따라 CD8 및 유전자삽입 TCR에서는 각각 27% 및 22%가 양성이었다. 결론적으로, 유전자삽입 TCR 발현은 기능성 TCRs를 재구성하는데 이용하였던 최적화되지 않은 TRA 및 TRB 단일 쇄 이식유전자 카세트를 이용하였을 경우의 6-7%에서 최적화된 TCR 이식유전자 카세트를 이용한 경우 약 40%로 상당히 개선될 수 있다.
2.6 HPV16 E5-특이적 TCR의 에피토프 매핑
면역원성 에피토프들의 사전 지식없이, 면역원성 항원-MHC 조합을 인지하는 T 세포 클론타입의 검출 후, E5-특이적 TCR에 의해 인지되는 항원 HPV16 E5 단백질 내의 정확한 펩티드 서열을 밝히기 위해 에피토프 맵핑을 수행하였다. TRAV17 및 TRBV6-5 서열로 구성된 HPV16 E5-특이적 TCR은 이전에 기술되지 않은 독특한 TCR이었다. 상기 TCR에 의해 인지되는 항원 서열을 매핑하기 위하여, 관심 대상의 유전자 영역을 증폭시키는 프라이머와 함께 PCR을 통하여 HPV16 E5의 3 '-절두된 미니유전자 형태를 만들었다. E5 미니유전자들은 레트로바이러스 벡터 MP71 안에 클론되었고, K562-B*15:01 표적 세포에 안정적으로 형질도입되었다 (도 11a). 최적화된 E5 특이적 TCR 유전자 카세트로 형질도입된 T 세포는 IFNγ 방출에 의해 나타낸 바와 같이, 전장 E5 및 189nt E5 미니유전자 서열을 휴대하는 표적 세포를 인지하였지만, 126 및 63nt E5 미니유전자를 휴대하는 표적 세포는 인지하지 못하였다 (도 11b). 더욱이, 표적 세포가 E5wt 또는 E5co 유전자 서열을 품고있는 지의 여부와는 무관하게, E5 TCR-형질도입된 T 세포는 IFNγ를 방출하였다 (도 11b). 결론적으로, HPV16 E5 TCR은 아미노산 42-63 사이의 E5 단백질 영역 안에 있는 에피토프에 특이적이었다.
E5-특이적인 TCR 인지의 표적이 될 수 있는 후보 에피토프를 좁히기 위해, 시뮬레이션에 의한(in silico) 에피토프 예측은 프로테아좀 분열, TAP 수송, ER 프로세싱 및 MHC 클래스 I 결합이 통합된, 웹-기반 IEDB T 세포 에피토프 복합 예측기를 사용하여 수행되었다. 일회 분석에 8-14-mer 펩티드를 포함하는 통합된 에피토프 예측이 실행되었다. 에피토프 예측 결과는 전체 스코어로 산출되었으며, 이것은 주어진 펩티드가 프로세싱되고, 세포 표면에서 MHC 분자 상에 제시될 확률로 해석될 수 있다. 표 2는 구성적 프로테아좀 예측을 이용하여 전체 양(positive)의 값 스코어를 갖는 예측된 모든 에피토프(p1-p7)를 포함한다. DCs와 대조적으로, K562 세포들은 구성 프로테아좀을 발현하는데, 이것은 종양 세포들에서 발현되는 프로테아좀과 유사하다 (76). HPV16 E5의 아미노산 서열 42-63으로부터 발현되지 않은 모든 에피토프는 추가 분석에서 배제되었다. 놀랍게도, 상위 3개의 예측된 에피토프들 (p1-p3)은 폐기해야만 하였다.
Figure pct00002
HPV16 E5의 통합 에피토프 예측의 결과는 표 2에 열거되어 있다. 최고로 예측된 에피토프는 첫번째에 기재되어 있다. 아미노산 서열 42-63 안에 코딩된 펩티드는 굵게 표시된다. 이들 10 개의 후보 에피토프는 서열 유사성에 따라 군집되고 (도 12a), 펩티드는 K562-B*15:01 표적 세포에 외부적으로 적재된다. E5 TCR-형질도입된 PBMCs는 HPV16 E5 에피토프 p4 (SAFRCFIVY, 서열번호 1)를 특이적으로 인지하였다. 또한, TCR은 MHC I에 비-전통적인 펩티드 길이를 부여하는 12-, 13-및 14-mers가 포함된 SAFRCFIVY (서열번호 1)의 모든 N-말단 연장된 유도체를 명확하게 인지하였다 (도 12b). HLA-B*15:01은 N 말단에서 돌출된 펩티드의 결합을 용인할 수 있다. 대조적으로, 펩티드 p6 및 p3는 p4보다 HLA-B*15:01에 더 높은 결합 친화력을 갖는 것으로 예측되었지만, 다른 펩티드는 인지되지 않았다.
요약하면, 통합된 에피토프 예측은 E5-특이적 TCR에 의해 인지되는 정확한 에피토프의 매핑을 가능하게 하였다. 그러나, 이 알고리즘은 면역원성 에피토프를 예측할 수 없었고, 에피토프 예측에 앞서, E5의 절두된 미니유전자로 항원 서열을 매핑하는 것이 필요하였다.
상기 단리된 TRAV17 및 TRBV7-9 서열은 CMV-특이적 TCR을 어셈블리하였다. CMV pp65에 특이적이고, HLA-B*07:02에 한정된 TCR 서열은 CDR3 영역에서 1 내지 5 개의 아미노산 차이를 갖는 것으로 알려졌었다 (66,67) (표 1). 이들 TCR은 HLA-B*07:02에 제시되었을 때 CMV pp65의 TPRVTGGGAM (서열번호 10)의 10-mer 에피토프를 인지하는 것으로 보고되었다. 여기에서, pp65 TCR-형질도입된 PBMCs는 CMV pp65-유도된 에피토프 p1 (TPRVTGGGAM, 서열번호 10)이 적재된 K562-B*07:02 표적 세포와 함께 공동배양되었다(도 12a). 또한, TCR-형질도입된 T 세포는 p1-펄스된 표적 세포를 인지하였고, IFNγ을 방출하였다(도 12b). pp65 TCR-형질도입된 PBMCs는 이미 공개된 pp65-B*07:02-특이적 TCRs과 비교하여 CDR3 영역에서 서열 차이에도 불구하고, p1에 특이적이었다.
요약하면, 이 접근법에 의해 새로운 면역원성 HPV16 E5 에피토프 및 이에 상응하는 TCR 및 면역우세 CMV pp65 에피토프 및 상응하는 TCR의 동정이 가능하다. 두 TCR은 모두 내인성으로 프로세싱된 에피토프에 특이적이었으며, 초기 MHC 세포 라이브러리 기반 스크리닝에서 단지 하나의 T 세포 클론타입에 의해 야기되는 T 세포 반응을 반영했다. 따라서, 에피토프의 사전 지식없이, 자연적 T 세포 반응에 대한 편견없는 스크리닝 및 항원-특이적 시험관내 자극 후 신속한 TCRs 동정은 본 발명의 방법으로 가능하고, 이로 인하여 규정된 항원에 대한 기능적 T 세포 반응을 예상하는 에피토프 예측 프로그램의 한계를 피할 수 있고, 자원-집약적이고 바람직하지 않은 T 세포 클론 배양을 피할 수 있다. 이 접근법은 TILs 또는 조직-상주 T 세포에 또한 적용될 수 있으며, 스크리닝은 병원균에 의한 그리고 종양-특이적 항원 뿐만 아니라 TCR에 의해 표적화되는 임의의 항원으로 확대될 수 있다.
참고 문헌
Figure pct00003
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> Max-Delbrueck-Centrum fuer Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft, et al. <120> Method of detecting new immunogenic T cell epitopes and isolating new antigen-specific T cell receptors by means of an MHC cell library <130> IPA170927-DE <150> EP15159212.8 <151> 2015-03-16 <160> 71 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Alphapapillomavirus 9 <220> <223> HPV16 E5 epitope restricted to HLA-B*15:01 <400> 1 Ser Ala Phe Arg Cys Phe Ile Val Tyr 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of TRA specific for E5 epitope <400> 2 Cys Ala Glu Ser Glu Tyr Gly Asn Lys Leu Val Phe 1 5 10 <210> 3 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of TRA specific for E5 epitope, TRAV17 <400> 3 Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser 20 25 30 Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser 35 40 45 Ile Asn Asn Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val 50 55 60 His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile 85 90 95 Thr Ala Ser Arg Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Glu Ser 100 105 110 Glu Tyr Gly Asn Lys Leu Val Phe Gly Ala Gly Thr Ile Leu Arg Val 115 120 125 Lys Ser Tyr 130 <210> 4 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRA specific for E5 epitope, optimized <400> 4 Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser 20 25 30 Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser 35 40 45 Ile Asn Asn Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val 50 55 60 His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile 85 90 95 Thr Ala Ser Arg Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Glu Ser 100 105 110 Glu Tyr Gly Asn Lys Leu Val Phe Gly Ala Gly Thr Ile Leu Arg Val 115 120 125 Lys Ser Tyr Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp 130 135 140 Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser 145 150 155 160 Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp 165 170 175 Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala 180 185 190 Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys 195 200 205 Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr 210 215 220 Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn 225 230 235 240 Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe 245 250 255 Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 <210> 5 <211> 804 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRA specific for E5 epitope, optimized <400> 5 atggaaacac tgctgggcgt gtccctcgtg atcctgtggc tgcagctggc tagagtgaac 60 agccagcagg gcgaggaaga tcctcaggcc ctgagcatcc aggaaggcga gaacgccacc 120 atgaactgca gctacaagac cagcatcaac aacctgcagt ggtacaggca gaatagcggc 180 agaggactgg tgcacctgat cctgatccgg tccaacgaga gagagaagca ctccggcaga 240 ctgagagtga ccctggacac ctccaagaag tccagctccc tgctgattac cgccagcaga 300 gccgccgata ccgcctccta cttttgcgcc gagagcgagt acggcaacaa gctggtgttt 360 ggcgccggaa ccatcctgcg cgtgaagtcc tacatccaga accccgagcc cgccgtgtat 420 cagctgaagg accccagaag ccaggacagc accctgtgcc tgttcaccga cttcgacagc 480 cagatcaacg tgcccaagac catggaaagc ggcaccttca tcaccgataa gaccgtgctg 540 gacatgaagg ccatggacag caagagcaac ggcgccattg cctggtccaa ccagaccagc 600 ttcacatgcc aggacatctt caaagagaca aacgccacct accccagcag cgacgtgccc 660 tgtgatgcca ccctgaccga gaagtccttc gagacagaca tgaatctgaa cttccagaac 720 ctgagcgtga tgggcctgag aatcctgctg ctgaaggtgg ccggcttcaa cctgctgatg 780 accctgagac tgtggtccag ctga 804 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of TRB specific for E5 epitope <400> 6 Cys Ala Ser Ser Tyr Arg Gln Gln Glu Thr Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 7 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of TRB specific for E5 epitope, TRBV6-5 <400> 7 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Tyr Arg Gln Gln Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Leu Val Leu 130 <210> 8 <211> 304 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRB specific for E5 epitope, optimized <400> 8 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Tyr Arg Gln Gln Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Leu Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu 130 135 140 Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu 145 150 155 160 Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 165 170 175 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln 180 185 190 Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg 195 200 205 Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln 210 215 220 Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser 225 230 235 240 Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala 245 250 255 Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala 260 265 270 Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val 275 280 285 Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys Lys Asn Ser 290 295 300 <210> 9 <211> 915 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRB specific for E5 epitope, optimized <400> 9 atgtctatcg gcctgctgtg ttgtgccgcc ctgtccctgc tgtgggccgg acctgtgaat 60 gctggcgtga cccagacccc caagttccag gtgctgaaaa ccggccagag catgaccctg 120 cagtgcgccc aggacatgaa ccacgagtac atgagctggt acagacagga ccccggcatg 180 ggcctgcggc tgatccacta ttctgtggga gccggcatca ccgaccaggg cgaagtgccc 240 aatggctaca acgtgtccag aagcaccacc gaggacttcc cactgcggct gctgtctgcc 300 gccccatctc agaccagcgt gtacttctgc gccagcagct accggcagca ggaaacccag 360 tacttcggcc ctggcaccag actgctggtg ctggaagatc tgcggaacgt gacccccccc 420 aaggtgtccc tgttcgagcc tagcaaggcc gagatcgcca acaagcagaa agccaccctc 480 gtgtgcctgg ccagaggctt cttccccgac catgtggaac tgtcttggtg ggtcaacggc 540 aaagaggtgc acagcggcgt gtccaccgat ccccaggcct acaaagagag caactacagc 600 tactgcctga gcagcaggct gcgggtgtcc gccaccttct ggcacaaccc ccggaaccac 660 ttcagatgcc aggtgcagtt ccacggcctg agcgaagagg acaagtggcc tgagggcagc 720 cccaagcccg tgacacagaa tatctctgcc gaagcctggg gcagagccga ctgtggcatt 780 accagcgcca gctaccatca gggcgtgctg agcgccacca tcctgtacga gatcctgctg 840 ggcaaggcca ccctgtacgc cgtgctggtg tcaggcctgg tgctgatggc catggtcaag 900 aagaagaaca gctga 915 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Cytomegalovirus <220> <223> CMV pp65 epitope restricted to HLA-B*07:02 <400> 10 Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met 1 5 10 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of TRA specific for pp65 epitope <400> 11 Cys Ala Thr Val Ile Arg Met Asp Ser Ser Tyr Lys Leu Ile Phe 1 5 10 15 <210> 12 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of TRA specific for pp65 epitope, TRAV17 <400> 12 Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu 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Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile 85 90 95 Thr Ala Ser Arg Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Val 100 105 110 Ile Arg Met Asp Ser Ser Tyr Lys Leu Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Leu Val Arg Pro Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln 130 135 140 Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp 145 150 155 160 Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe 165 170 175 Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser 180 185 190 Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp 195 200 205 Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys 210 215 220 Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn 225 230 235 240 Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val 245 250 255 Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 270 <210> 14 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRA specific for pp65 epitope, optimized <400> 14 atggaaacac tgctgggcgt gtcactcgtg atcctgtggc tgcagctggc tagagtgaac 60 agccagcagg gggaagagga ccctcaggcc ctgagcattc aggaaggcga gaacgccacc 120 atgaactgca gctacaagac cagcatcaac aacctgcagt ggtacaggca gaactccggc 180 agaggactgg tgcacctgat cctgatccgg tccaacgaga gagagaagca ctccggacgg 240 ctgagagtga ccctggacac ctccaagaag tccagctccc tgctgattac cgccagcaga 300 gccgccgata ccgcctccta cttttgcgcc accgtgatcc ggatggacag ctcctacaag 360 ctgatctttg gcagcggcac cagactgctc gtgcggcccg atatccagaa ccctgagcct 420 gccgtgtacc agctgaagga ccccagaagc caggacagca cactgtgcct gttcaccgac 480 ttcgacagcc agatcaacgt gcccaagacc atggaaagcg gcaccttcat caccgacaag 540 acagtgctgg acatgaaggc catggacagc aagagcaacg gcgccattgc ctggtccaac 600 cagaccagct tcacatgcca ggacatcttc aaagagacaa acgccaccta ccccagcagc 660 gacgtgccct gtgatgccac cctgaccgag aagtccttcg agacagacat gaacctgaat 720 ttccagaacc tgtccgtgat gggcctgaga atcctgctgc tgaaggtggc cggcttcaat 780 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Asn Glu Arg 385 390 395 400 Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys 405 410 415 Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg Ala Ala Asp Thr Ala Ser 420 425 430 Tyr Phe Cys Ala Glu Ser Glu Tyr Gly Asn Lys Leu Val Phe Gly Ala 435 440 445 Gly Thr Ile Leu Arg Val Lys Ser Tyr Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala 450 455 460 Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu 465 470 475 480 Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser 485 490 495 Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp 500 505 510 Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr 515 520 525 Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp 530 535 540 Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met 545 550 555 560 Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu 565 570 575 Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser 580 585 590 Ser <210> 59 <211> 600 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCR cassette specific for the pp65 epitope <400> 59 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Thr Gly Val Ser Gln Asp Pro Arg His Lys Ile Thr 20 25 30 Lys Arg Gly Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His 35 40 45 Asn Arg Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe 50 55 60 Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu 65 70 75 80 Ser Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu 85 90 95 Glu Ile Gln Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala 100 105 110 Ser Ser Leu Ile Gly Val Ser Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro 115 120 125 Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro 130 135 140 Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser 180 185 190 Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser 195 200 205 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His 210 215 220 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp 225 230 235 240 Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala 245 250 255 Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr 275 280 285 Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys 290 295 300 Lys Lys Asn Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln 305 310 315 320 Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Leu Leu Gly 325 330 335 Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ala Arg Val Asn Ser Gln 340 345 350 Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly Glu Asn 355 360 365 Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu Gln Trp 370 375 380 Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu Ile Arg 385 390 395 400 Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr Leu Asp 405 410 415 Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg Ala Ala 420 425 430 Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Val Ile Arg Met Asp Ser Ser 435 440 445 Tyr Lys Leu Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Arg Pro Asp 450 455 460 Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser 465 470 475 480 Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn 485 490 495 Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val 500 505 510 Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp 515 520 525 Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn 530 535 540 Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu 545 550 555 560 Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val 565 570 575 Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu 580 585 590 Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 595 600 <210> 60 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of TRA specific for E5 epitope, TRAV17 <400> 60 atggaaactc tcctgggagt gtctttggtg attctatggc ttcaactggc tagggtgaac 60 agtcaacagg gagaagagga tcctcaggcc ttgagcatcc aggagggtga aaatgccacc 120 atgaactgca gttacaaaac tagtataaac aatttacagt ggtatagaca aaattcaggt 180 agaggccttg tccacctaat tttaatacgt tcaaatgaaa gagagaaaca cagtggaaga 240 ttaagagtca cgcttgacac ttccaagaaa agcagttcct tgttgatcac ggcttcccgg 300 gcagcagaca ctgcttctta cttctgtgcc gaatccgaat atggaaacaa actggtcttt 360 ggcgcaggaa ccattctgag agtcaagtcc tat 393 <210> 61 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of TRB specific for E5 epitope, TRBV6-5 <400> 61 atgagcatcg gcctcctgtg ctgtgcagcc ttgtctctcc tgtgggcagg tccagtgaat 60 gctggtgtca ctcagacccc aaaattccag gtcctgaaga caggacagag catgacactg 120 cagtgtgccc aggatatgaa ccatgaatac atgtcctggt atcgacaaga cccaggcatg 180 gggctgaggc tgattcatta ctcagttggt gctggtatca ctgaccaagg agaagtcccc 240 aatggctaca atgtctccag atcaaccaca gaggatttcc cgctcaggct gctgtcggct 300 gctccctccc agacatctgt gtacttctgt gccagcagtt accggcagca agagacccag 360 tacttcgggc caggcacgcg gctcctggtg ctc 393 <210> 62 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of TRA specific for pp65 epitope, TRAV17 <400> 62 atggaaactc tcctgggagt gtcattggtg attctatggc ttcaactggc tagggtgaac 60 agtcaacagg gagaagagga tcctcaggcc ttgagcatcc aggagggtga aaatgccacc 120 atgaactgca gttacaaaac tagtataaac aatttacagt ggtatagaca aaattcaggt 180 agaggccttg tccacctaat tttaatacgt tcaaatgaaa gagagaaaca cagtggaaga 240 ttaagagtca cgcttgacac ttccaagaaa agcagttcct tgttgatcac ggcttcccgg 300 gcagcagaca ctgcttctta cttctgtgct acggttatcc ggatggatag cagctataaa 360 ttgatcttcg ggagtgggac cagactgctg gtcaggcctg at 402 <210> 63 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of TRB specific for pp65 epitope, TRBV7-9 <400> 63 Ala Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys 1 5 10 15 Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala 35 40 45 Gly Ala Thr Cys Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Thr Ala Cys Thr Gly 50 55 60 Gly Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Cys Cys 65 70 75 80 Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr Cys Ala Cys Ala 85 90 95 Ala Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Ala Thr Gly 100 105 110 Thr Ala Ala Cys Thr Thr Thr Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Gly Ala 115 120 125 Thr Cys Cys Ala Ala Thr Thr Thr Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Cys 130 135 140 Ala Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Thr Thr Ala Thr Thr Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Cys Cys Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly 165 170 175 Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Thr Thr 180 185 190 Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr Ala Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala 195 200 205 Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Cys Ala Ala Cys Thr Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys 225 230 235 240 Ala Gly Thr Gly Ala Thr Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Cys Thr Gly 245 250 255 Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Cys Thr Ala Ala Gly Gly Gly 260 265 270 Ala Thr Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly 275 280 285 Gly Ala Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala Cys Ala Gly 290 295 300 Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Thr Cys Gly Gly Cys 305 310 315 320 Cys Ala Thr Gly Thr Ala Thr Cys Thr Cys Thr Gly Thr Gly Cys Cys 325 330 335 Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Ala Ala Thr Ala Gly Gly Gly Gly 340 345 350 Thr Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala 355 360 365 Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Thr Thr Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala 370 375 380 Gly Gly Gly Ala Cys Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Ala Cys Cys Gly 385 390 395 400 Thr Gly Cys Thr Ala 405 <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of TRA specific for E5 epitope <400> 64 Thr Ser Ile Asn Asn 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of TRA specific for E5 epitope <400> 65 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of TRB specific for E5 epitope <400> 66 Met Asn His Glu Tyr 1 5 <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of TRB specific for E5 epitope <400> 67 Ser Val Gly Ala Gly Ile 1 5 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of TRA specific for pp65 epitope <400> 68 Thr Ser Ile Asn Asn 1 5 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of TRA specific for pp65 epitope <400> 69 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of TRB specific for pp65 epitope <400> 70 Ser Glu His Asn Arg 1 5 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of TRB specific for pp65 epitope <400> 71 Phe Gln Asn Glu Ala Gln 1 5

Claims (16)

  1. 인간 MHC I와 복합체를 이룬 에피토프에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR) 구조물의 TCR 알파 쇄 구조물 (TRA) 및/또는 TCR 베타 쇄 구조물 (TRB)를 코딩하는 핵산으로서,
    상기 에피토프는 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 에피토프이며,
    상기 핵산은 바람직하게는
    (a) 공여자로부터 단리된 T 세포를 상기 규정된 항원의 에피토프를 제시하고 상기 공여자와 최소한 하나의 MHC 대립유전자를 공유하는 전문적 항원 제시 세포 (APC)로 자극하여 항원-특이적 T 세포를 농축시키는 단계; 및
    (b) 상기 T 세포를 세포 라이브러리와 접촉시키는 단계로서, 이때 각 세포는 단일 MHC 대립유전자를 발현하고, 상기 라이브러리는 상기 공여자에 존재하는 모든 MHC I 대립유전자를 발현시키는 세포를 포함하며, 상기 라이브러리의 세포는 상기 규정된 항원의 에피토프를 제시하는, 단계; 및
    (c) 상기 접촉에 의해 활성화된 T 세포를 바람직하게는 상기 활성화된 T 세포에 의해 발현되는 활성화 표지자에 기반하여 선별하는 단계; 및
    (d) 상기 T 세포의 TCR의 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄를 코딩하는 핵산을 단리하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 획득가능한 것인, 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 에피토프는 HLA-B*15:01로 제한된 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 에피토프이며, 바람직하게는 서열번호 1을 포함하는, 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 상기 TRA는 서열번호 2에 대하여 최소한 84% 서열 동일성을 갖는 CDR3을 포함하며, 상기 CDR3은 바람직하게는 서열번호 2를 포함하며, 상기 TRA의 가변 영역은 바람직하게는 서열번호 3에 대하여 최소한 80%의 서열 동일성을 갖고, 상기 TRA는 바람직하게는 서열번호 4를 포함하며 서열번호 5에 의해 코딩되고; 및/또는 상기 TRB는 서열번호 6에 대하여 최소한 84% 서열 동일성을 갖는 CDR3을 포함하고, 상기 CDR3은 바람직하게는 서열번호 6을 포함하고, 상기 TRB의 가변 영역은 바람직하게는 서열번호 7에 대하여 최소한 80% 서열 동일성을 갖고, 상기 TRA는 바람직하게는 서열번호 8을 포함하며 서열번호 9에 의해 코딩되는, 핵산.
  4. 인간 MHC I와 복합체를 이룬 에피토프에 특이적인 TCR 구조물의 TRA 및/또는 TRB를 코딩하는 핵산으로서, 상기 TCR 구조물은 HLA-B*07:02와 복합체를 이룬 인간 거대세포바이러스 단백질 pp65의 에피토프에 특이적이며, 이의 에피토프는 서열번호 10으로 이루어지고, 상기 TRA는 서열번호 11에 따른 CDR3을 포함하고 및/또는 상기 TRB는 서열번호 15에 따른 CDR3을 포함하는, 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 상기 TRA의 가변 영역은 서열번호 12에 대하여 최소한 80%의 서열 동일성을 갖고, 상기 TRA는 바람직하게는 서열번호 13을 포함하며 서열번호 14에 의해 코딩되고; 및/또는 상기 TRB는 서열번호 16에 대하여 최소한 80% 서열 동일성을 갖고, 상기 TRB의 가변 영역은 바람직하게는 서열번호 17을 포함하며 서열번호 18에 의해 코딩되는, 핵산.
  6. 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 에피토프 또는 인간 거대세포바이러스 단백질 pp65의 에피토프에 의해 특이적인 TCR 구조물의 TRA 및 TRB를 코딩하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하고, 상기 TCR을 발현시키는 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 바람직하게는 CD8+ T 세포인, 숙주 세포.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 핵산을 코딩하고 바람직하게는 TRA 및 TRB를 포함하는, 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 구조물은, 바람직하게는 하기로 감염된 환자를 치료하기 위한, 약학 조성물에 사용하기 위한, TRA 및 TRB을 포함하는 것인, 단백질, 재조합 T 세포 및 핵산:
    a) 인간 유두종바이러스 16, 이때 상기 TCR 구조물은 HLA-B*15:01과 복합체를 이룬 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 에피토프에 특이적이며, 상기 환자는 HLA-B*15:01-양성임; 또는
    b) 인간 거대세포바이러스, 이때 상기 TCR 구조물은 HLA-B*07: 02와 복합체를 이룬 인간 거대세포바이러스 단백질 pp65의 에피토프에 특이적이며, 상기 환자는 HLA-B*07:02-양성임.
  9. 에피토프를 포함하는 최대 40개 아미노산 길이를 갖는 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 단편을 코딩하는 핵산, 또는 에피토프를 포함하는 최대 40개 아미노산 길이를 갖는 인간 유두종바이러스 16 종양단백질 E5의 펩티드 단편으로서,
    상기 에피토프는 제6항의 T 세포의 TCR 구조물에 의해 인지될 수 있고,
    상기 에피토프는 바람직하게는
    (a) 공여자로부터 단리된 T 세포를 상기 규정된 항원의 에피토프를 제시하고 상기 공여자와 최소한 하나의 MHC 대립유전자를 공유하는 전문적 항원 제시 세포 (APC)로 자극하여 항원-특이적 T 세포를 농축시키는 단계; 및
    (b) 상기 T 세포를 세포 라이브러리와 접촉시키는 단계로서, 이때 각 세포는 단일 MHC 대립유전자를 발현하고, 상기 라이브러리는 상기 공여자에 존재하는 모든 MHC I 대립유전자를 발현시키는 세포를 포함하며, 상기 라이브러리의 세포는 상기 규정된 항원의 에피토프를 제시하는, 단계; 및
    (c) 상기 접촉에 의해 활성화된 T 세포를 바람직하게는 상기 활성화된 T 세포에 의해 발현되는 활성화 표지자에 기반하여 선별하는 단계; 및
    (d) 상기 선별된 T 세포를 활성화시킬 수 있는 에피토프를 동정하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 동정가능한 것인, 핵산 또는 펩티드 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 E5 에피토프는 서열번호 1을 포함하며 서열번호 1, 45, 47, 49, 51, 52 및 57로 구성된 군에서 선택되는, 핵산 또는 펩티드.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 바람직하게는 인간 유두종바이러스 16에 의한 감염 예방 또는 인간 유두종바이러스 16에 감염된 환자의 치료를 위한 약학 조성물에 사용하기 위한, 핵산 또는 펩티드.
  12. MHC 상에 제시되는 규정된 항원으로부터의 에피토프에 특이적인 TCR 구조물의 TRA 및 TRB를 코딩하는 핵산을 제조하기 위한 방법으로서,
    (a) 공여자로부터 단리된 T 세포를 상기 규정된 항원의 에피토프를 제시하는 전문적 항원 제시 세포로 자극하여 항원-특이적 T 세포를 농축시키는 단계; 및
    (b) 상기 T 세포를 세포 라이브러리와 접촉시키고, 이때 각 세포는 단일 MHC 대립유전자를 발현하고, 상기 라이브러리는 상기 공여자에 존재하는 모든 MHC I 또는 MHC II 대립유전자를 발현시키는 세포를 포함하며, 상기 라이브러리의 세포는 상기 규정된 항원의 에피토프를 제시하는, 단계; 및
    (c) 상기 접촉에 의해 활성화된 T 세포를 바람직하게는 상기 활성화된 T 세포에 의해 발현되는 활성화 표지자에 기반하여 선별하는 단계; 및
    (d) 상기 T 세포의 TCR의 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄를 코딩하는 핵산을 단리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 MHC는 MHC I이며, 상기 세포의 라이브러리는 바람직하게는 MHC I-발현 K562 세포를 포함하는, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 방법은 상기 서열을 최적화시키는 단계, 바람직하게는 상기 TRA 및 TRB의 코돈 용도를 최적화시키는 단계, 및 선택적으로 인간 가변 영역을 뮤린 불변 영역 또는 최소 뮤린 불변 영역과 조합하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  15. MHC 상에 제시되는 규정된 항원으로부터의 에피토프에 특이적인 TCR 구조물을 발현하는 T 세포를 제조하는 방법으로서, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 단계 및 T 세포에서 상기 TRA 및 TRB를 코딩하는 상기 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 규정된 항원에서 MHC에 의해 제시될 수 있는 에피토프를 동정하는 방법으로서, 제12항의 단계 (a)-(d)를 수행하는 단계 및 TCR 구조물을 구성하는 단리된 TRA 및 TRB를 코딩하는 핵산에 의해 형질감염된 T 세포를 활성화시킬 수 있는 에피토프를 동정하는 단계를 포함하며, 상기 에피토프는 선택적으로 펩티드 또는 핵산 형태로 제조되는, 방법.

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