JP2020114222A - 抗原特異的tcrの新規生成 - Google Patents
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Abstract
【課題】抗原特異的TCRを有するT細胞を単離するための方法を提供する。【解決手段】以下のステップ:A)抗原提示細胞における、少なくとも1つの抗原またはその断片、前記抗原のN末端の前の小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに前記抗原のC末端の後のエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインを含む少なくとも1つの融合タンパク質の発現、ならびにB)前記抗原提示細胞によって発現される前記抗原に特異的な抗原特異的Tリンパ球を活性化するための、in vitroでのステップA)の前記抗原提示細胞へのTリンパ球を含む細胞集団の曝露を含む、ヒト抗原特異的Tリンパ球を生成する方法。【選択図】なし
Description
本発明は、ヒト抗原特異的Tリンパ球を生成する方法を企図する。この方法は、RNA
コードタンパク質のMHCクラスIおよびII提示を得るために抗原またはその断片と融
合したMHCクラス−IIターゲティングシグナルを利用する。したがって、本発明は、
MHCクラス−IIターゲティングシグナルおよび少なくとも1つの抗原またはその断片
を含む発現ベクターならびに抗原特異的Tリンパ球のin vitro生成のためのその
使用に関する。腫瘍抗原またはウイルス抗原に特異的なT細胞クローンおよびT細胞受容
体(TCR)も記載される。
コードタンパク質のMHCクラスIおよびII提示を得るために抗原またはその断片と融
合したMHCクラス−IIターゲティングシグナルを利用する。したがって、本発明は、
MHCクラス−IIターゲティングシグナルおよび少なくとも1つの抗原またはその断片
を含む発現ベクターならびに抗原特異的Tリンパ球のin vitro生成のためのその
使用に関する。腫瘍抗原またはウイルス抗原に特異的なT細胞クローンおよびT細胞受容
体(TCR)も記載される。
養子T細胞移入は慢性ウイルス感染および腫瘍を制御するためにT細胞ベースの細胞傷
害応答を使用する。患者のがんに対して天然または遺伝子操作された反応性を有するT細
胞がin vitroで生成され、次いで患者に移入して戻される。自己腫瘍浸潤リンパ
球(TIL)の養子移入が進行性腫瘍を有する患者を首尾良く治療するために使用されて
いる。臨床における広範な用途についてのTIL療法の主な制限は、しばしば、腫瘍の不
十分な免疫原性および自己抗原特異性を有するT細胞を効果的に欠失する胸腺における陰
性T細胞選択の機構である。したがって、多くの場合、腫瘍特異的抗原に対して高い親和
性を有するT細胞も、所望の特異性を有するT細胞も、患者の血液または腫瘍切除から単
離することができない。このために、遺伝的にリダイレクトされた末梢血リンパ球(PB
L)の移入がこれらの制限を克服する可能性を与える。
害応答を使用する。患者のがんに対して天然または遺伝子操作された反応性を有するT細
胞がin vitroで生成され、次いで患者に移入して戻される。自己腫瘍浸潤リンパ
球(TIL)の養子移入が進行性腫瘍を有する患者を首尾良く治療するために使用されて
いる。臨床における広範な用途についてのTIL療法の主な制限は、しばしば、腫瘍の不
十分な免疫原性および自己抗原特異性を有するT細胞を効果的に欠失する胸腺における陰
性T細胞選択の機構である。したがって、多くの場合、腫瘍特異的抗原に対して高い親和
性を有するT細胞も、所望の特異性を有するT細胞も、患者の血液または腫瘍切除から単
離することができない。このために、遺伝的にリダイレクトされた末梢血リンパ球(PB
L)の移入がこれらの制限を克服する可能性を与える。
さらに、がん性および慢性感染において、Tリンパ球は機能を喪失し、枯渇する。
T細胞受容体(TCR)遺伝子療法を用いて、数百万の腫瘍反応性T細胞が患者の血液
から迅速に生成され得る。TCR遺伝子療法は、増殖可能であり、機能的に有望なT細胞
亜集団に腫瘍特異性を移入する柔軟な方法への道を開く。それは、必要とされる抗原特異
性をTリンパ球が備えるように、ヒト白血球抗原(HLA)適合ドナーの受容Tリンパ球
への、定義された抗原特異的T細胞クローンの単離されたTCR遺伝子の移入を含む。
から迅速に生成され得る。TCR遺伝子療法は、増殖可能であり、機能的に有望なT細胞
亜集団に腫瘍特異性を移入する柔軟な方法への道を開く。それは、必要とされる抗原特異
性をTリンパ球が備えるように、ヒト白血球抗原(HLA)適合ドナーの受容Tリンパ球
への、定義された抗原特異的T細胞クローンの単離されたTCR遺伝子の移入を含む。
CD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を用いた養子T細胞療法はがん性またはウイ
ルス性疾患のための有望な免疫療法である。臨床応答を増加させるために、CD4+ヘル
パーT細胞の補足的移入がCD8+CTL応答を増強する可能性を与える。CD4+Tリ
ンパ球は、CD8+ CTLに極めて重要な支援を提供すること、および長期のCD8+
記憶T細胞の生成に対して重要な効果を有することが知られている。したがって、腫瘍抗
原特異的CD4+およびCD8+Tリンパ球の迅速および効果的な単離ならびに特徴付け
が重要である。
ルス性疾患のための有望な免疫療法である。臨床応答を増加させるために、CD4+ヘル
パーT細胞の補足的移入がCD8+CTL応答を増強する可能性を与える。CD4+Tリ
ンパ球は、CD8+ CTLに極めて重要な支援を提供すること、および長期のCD8+
記憶T細胞の生成に対して重要な効果を有することが知られている。したがって、腫瘍抗
原特異的CD4+およびCD8+Tリンパ球の迅速および効果的な単離ならびに特徴付け
が重要である。
多くの腫瘍はMHCクラスII分子を発現するので、CD4+T細胞由来のTCRがこ
れらの腫瘍を直接攻撃するのに特に有用である。
れらの腫瘍を直接攻撃するのに特に有用である。
より迅速に成長する腫瘍または慢性ウイルス性疾患を有する患者を治療するために養子
細胞療法(ACT)を使用する能力を拡張するために、正常組織の重度の攻撃を回避しな
がらウイルスまたは腫瘍細胞を効果的に攻撃するためにそれらのリガンド特異性について
選択されている富化されたペプチド特異的エフェクターT細胞(CD4 Tヘルパー細胞
および細胞傷害性Tリンパ球の両方)を移入することが目標である。それらの細胞はex
vivoで多数まで急速に増殖し、次いでACTのために使用される。あるいは、この
ようなリガンド特異的T細胞のT細胞受容体(TCR)は、十分に成長し、正常な宿主組
織を攻撃する能力を有さない定義された特異性を有する受容末梢血リンパ球または活性化
T細胞クローンのいずれかを使用して、活性化リンパ球においてTCR導入遺伝子として
クローニングされ、発現され得る。
細胞療法(ACT)を使用する能力を拡張するために、正常組織の重度の攻撃を回避しな
がらウイルスまたは腫瘍細胞を効果的に攻撃するためにそれらのリガンド特異性について
選択されている富化されたペプチド特異的エフェクターT細胞(CD4 Tヘルパー細胞
および細胞傷害性Tリンパ球の両方)を移入することが目標である。それらの細胞はex
vivoで多数まで急速に増殖し、次いでACTのために使用される。あるいは、この
ようなリガンド特異的T細胞のT細胞受容体(TCR)は、十分に成長し、正常な宿主組
織を攻撃する能力を有さない定義された特異性を有する受容末梢血リンパ球または活性化
T細胞クローンのいずれかを使用して、活性化リンパ球においてTCR導入遺伝子として
クローニングされ、発現され得る。
結果として、抗原特異的TCRおよびそれらのTCRを単離するための効果的な方法が
必要とされる。
必要とされる。
したがって、本発明の目的は、抗原特異的TCRを有するT細胞を単離するための有効
な方法を提供することである。CD4 TCRおよび/またはCD8 TCRを生成する
方法を提供することが望まれる。さらに、本発明の目的は、CDR3領域などのTCRま
たはその機能的部分を提供することである。腫瘍抗原に対して高いおよび/または最適な
親和性を示すTCRを得ることは有益である。
な方法を提供することである。CD4 TCRおよび/またはCD8 TCRを生成する
方法を提供することが望まれる。さらに、本発明の目的は、CDR3領域などのTCRま
たはその機能的部分を提供することである。腫瘍抗原に対して高いおよび/または最適な
親和性を示すTCRを得ることは有益である。
したがって、本発明の第1の態様は、以下のステップ:
A)抗原提示細胞における、
− 少なくとも1つの抗原またはその断片、
− 抗原のN末端の前の小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− 抗原のC末端の後のエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通
および細胞質ドメイン
を含む少なくとも1つの融合タンパク質の発現、ならびに
B)抗原提示細胞によって発現される抗原に特異的な抗原特異的Tリンパ球を活性化す
るための、in vitroでのステップA)の抗原提示細胞へのTリンパ球を含む細胞
集団の曝露
を含む、ヒト抗原特異的Tリンパ球を生成する方法を企図する。
A)抗原提示細胞における、
− 少なくとも1つの抗原またはその断片、
− 抗原のN末端の前の小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− 抗原のC末端の後のエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通
および細胞質ドメイン
を含む少なくとも1つの融合タンパク質の発現、ならびに
B)抗原提示細胞によって発現される抗原に特異的な抗原特異的Tリンパ球を活性化す
るための、in vitroでのステップA)の抗原提示細胞へのTリンパ球を含む細胞
集団の曝露
を含む、ヒト抗原特異的Tリンパ球を生成する方法を企図する。
特にER移行シグナル配列と組み合わせたターゲティング配列の、所望の抗原またはそ
の断片との融合により、通常、MHCクラス−I複合体を介して提示される細胞タンパク
質のためでもある、MHCクラス−II複合体の効果的な負荷が可能となる。また、MH
Cクラス−I複合体の負荷も上記の方法によって達成される。したがって、この方法によ
り、CD4+TCRおよびCD8+TCRの生成が可能となる。
の断片との融合により、通常、MHCクラス−I複合体を介して提示される細胞タンパク
質のためでもある、MHCクラス−II複合体の効果的な負荷が可能となる。また、MH
Cクラス−I複合体の負荷も上記の方法によって達成される。したがって、この方法によ
り、CD4+TCRおよびCD8+TCRの生成が可能となる。
ステップA)における少なくとも1つの融合タンパク質の発現は、例えば、少なくとも
1つの融合タンパク質のためのivt−RNAコードを導入することによる一過性発現ま
たは安定発現、好ましくは一過性発現であってもよい。ivt−RNAの発現は、品質管
理されたivt−RNAを迅速に生産することができ、免疫原性タンパク質夾雑物を保有
しないという点で有益である。
1つの融合タンパク質のためのivt−RNAコードを導入することによる一過性発現ま
たは安定発現、好ましくは一過性発現であってもよい。ivt−RNAの発現は、品質管
理されたivt−RNAを迅速に生産することができ、免疫原性タンパク質夾雑物を保有
しないという点で有益である。
特定の実施形態において、融合タンパク質は少なくとも2つの抗原またはそれらの断片
を含んでもよい。
を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、方法は、活性化Tリンパ球の富化のステップをさらに含
んでもよい。この富化ステップは典型的に以下のステップ:
(a)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、活性化Tリンパ球によって特異的
に発現される少なくとも1つのマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも1つの
結合分子と接触させるステップ、
(b)少なくとも1つの結合分子が結合しているTリンパ球を単離するステップ
を含む。好ましい実施形態において、活性化Tリンパ球によって特異的に発現される少な
くとも1つのマーカータンパク質は、Ox40、CD137、CD40L、PD−1、I
L−2受容体、インターフェロンγ、IL−2、GM−CSFおよびTNF−αを含む群
から選択される。さらに、ステップ(a)において、細胞を、CD4と特異的に結合する
結合分子および/またはCD8と特異的に結合する結合分子とさらに接触させてもよい。
んでもよい。この富化ステップは典型的に以下のステップ:
(a)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、活性化Tリンパ球によって特異的
に発現される少なくとも1つのマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも1つの
結合分子と接触させるステップ、
(b)少なくとも1つの結合分子が結合しているTリンパ球を単離するステップ
を含む。好ましい実施形態において、活性化Tリンパ球によって特異的に発現される少な
くとも1つのマーカータンパク質は、Ox40、CD137、CD40L、PD−1、I
L−2受容体、インターフェロンγ、IL−2、GM−CSFおよびTNF−αを含む群
から選択される。さらに、ステップ(a)において、細胞を、CD4と特異的に結合する
結合分子および/またはCD8と特異的に結合する結合分子とさらに接触させてもよい。
特定の実施形態において、活性化CD4 T細胞を選択するステップは、以下のステッ
プ:
(a1)抗原提示細胞および抗原特異的Tリンパ球のCD40−CD40Lの間の相互作
用を遮断し、Tリンパ球の表面にCD40Lを蓄積するために、ステップB)の細胞集団
を、CD40に対する抗体と接触させるステップ、
(a2)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、抗CD40L抗体と接触させる
ステップ、
(b)抗CD40L抗体および抗CD4抗体によりマークしたTリンパ球を単離するステ
ップ
を含む。
プ:
(a1)抗原提示細胞および抗原特異的Tリンパ球のCD40−CD40Lの間の相互作
用を遮断し、Tリンパ球の表面にCD40Lを蓄積するために、ステップB)の細胞集団
を、CD40に対する抗体と接触させるステップ、
(a2)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、抗CD40L抗体と接触させる
ステップ、
(b)抗CD40L抗体および抗CD4抗体によりマークしたTリンパ球を単離するステ
ップ
を含む。
別の実施形態は、
C2)以下のステップ:
a)
(i)ステップA)において定義される抗原提示細胞、および
(ii)対照抗原提示細胞との
活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団の増殖した細胞クローンのインキュベーショ
ン、
b)各細胞クローンについての(i)および(ii)とのインキュベーションの活性化プ
ロファイルの比較、
c)b)の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Tリンパ球の同定
のステップをさらに含み、(ii)ではなく(i)による活性化が、細胞クローンが抗原
特異的であることを示し、(i)および(ii)による活性化が、細胞クローンが抗原非
特異的であることを示し、(i)にも(ii)にもよらない活性化が、細胞クローンが活
性化されないことを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
C2)以下のステップ:
a)
(i)ステップA)において定義される抗原提示細胞、および
(ii)対照抗原提示細胞との
活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団の増殖した細胞クローンのインキュベーショ
ン、
b)各細胞クローンについての(i)および(ii)とのインキュベーションの活性化プ
ロファイルの比較、
c)b)の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Tリンパ球の同定
のステップをさらに含み、(ii)ではなく(i)による活性化が、細胞クローンが抗原
特異的であることを示し、(i)および(ii)による活性化が、細胞クローンが抗原非
特異的であることを示し、(i)にも(ii)にもよらない活性化が、細胞クローンが活
性化されないことを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
ステップB)において、抗原提示細胞は、少なくとも1回、または少なくとも2回、ま
たは少なくとも3回、または3回、Tリンパ球を含む細胞集団に加えられる。抗原提示細
胞の反復される添加の間の時間間隔は、7〜21日、12〜16日、または13〜15日
、または14日であってもよい。
たは少なくとも3回、または3回、Tリンパ球を含む細胞集団に加えられる。抗原提示細
胞の反復される添加の間の時間間隔は、7〜21日、12〜16日、または13〜15日
、または14日であってもよい。
ER移行シグナル配列はエンドソーム/リソソーム関連タンパク質に由来する。エンド
ソーム/リソソーム関連タンパク質は、LAMP1、LAMP2、DC−LAMP、CD
68またはCD1bからなる群から選択されてもよく、好ましくはエンドソーム/リソソ
ーム関連タンパク質はLAMP1である。好ましくは、ER移行シグナル配列はヒトであ
る。特定の実施形態において、ER移行シグナル配列は配列番号33の配列またはその断
片を含む。より特定の実施形態において、ER移行シグナル配列は以下の配列番号33の
配列からなる。
ソーム/リソソーム関連タンパク質は、LAMP1、LAMP2、DC−LAMP、CD
68またはCD1bからなる群から選択されてもよく、好ましくはエンドソーム/リソソ
ーム関連タンパク質はLAMP1である。好ましくは、ER移行シグナル配列はヒトであ
る。特定の実施形態において、ER移行シグナル配列は配列番号33の配列またはその断
片を含む。より特定の実施形態において、ER移行シグナル配列は以下の配列番号33の
配列からなる。
エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、
LAMP1またはDC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。好まし
くはエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは
ヒトである。
LAMP1またはDC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。好まし
くはエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは
ヒトである。
典型的に、抗原提示細胞は、樹状細胞、活性化B細胞、単球、マクロファージ、EBV
形質転換リンパ芽球様細胞系、好ましくは樹状細胞、より好ましくは単球由来の樹状細胞
から選択される。
形質転換リンパ芽球様細胞系、好ましくは樹状細胞、より好ましくは単球由来の樹状細胞
から選択される。
通常、Tリンパ球を含む細胞集団は末梢血リンパ球の集団である。Tリンパ球を含む細
胞集団は分離されていない末梢血リンパ球の集団であってもよい。細胞集団は、当業者に
公知の手段によってTリンパ球、好ましくはCD8+および/またはCD4+Tリンパ球
について富化されてもよい。
胞集団は分離されていない末梢血リンパ球の集団であってもよい。細胞集団は、当業者に
公知の手段によってTリンパ球、好ましくはCD8+および/またはCD4+Tリンパ球
について富化されてもよい。
本出願の別の態様は、本明細書に記載される方法によって得ることができるTリンパ球
である。
である。
本発明のさらなる態様は、
− ヒト小胞体(ER)移行シグナル、ならびに
− エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメ
イン
を含む発現ベクターを指す。
− ヒト小胞体(ER)移行シグナル、ならびに
− エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメ
イン
を含む発現ベクターを指す。
ベクターはin−vitroでのmRNA転写のためのプロモーターを含んでもよい。
ER移行シグナル配列は、エンドソーム/リソソーム関連タンパク質、例えばLAMP1
、LAMP2、DC−LAMP、CD68、CD1b、最も好ましくはLAMP1に由来
する。好ましくは、ER移行シグナル配列はヒトである。特定の実施形態において、ER
移行シグナル配列は配列番号33の配列またはその断片を含む。より特定の実施形態にお
いて、ER移行シグナル配列は以下の配列番号34の配列からなる。
ER移行シグナル配列は、エンドソーム/リソソーム関連タンパク質、例えばLAMP1
、LAMP2、DC−LAMP、CD68、CD1b、最も好ましくはLAMP1に由来
する。好ましくは、ER移行シグナル配列はヒトである。特定の実施形態において、ER
移行シグナル配列は配列番号33の配列またはその断片を含む。より特定の実施形態にお
いて、ER移行シグナル配列は以下の配列番号34の配列からなる。
エンドソーム/リソソームターゲティング配列は、LAMP1またはDC−LAMP、
好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。エンドソーム/リソソームターゲティング
配列は典型的に膜貫通および細胞質ドメインの一部である。したがって、エンドソーム/
リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、LAMP1または
DC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。好ましくは、エンドソー
ムおよび/またはリソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインはヒ
トである。典型的に、エンドソーム/リソソームターゲティング配列は、モチーフY−X
X(Xは任意の天然に存在するアミノ酸を表す)、その後に疎水性アミノ酸(配列番号3
8)を含む。好ましくは、エンドソーム/リソソームターゲティング配列はYQRI(配
列番号39)である。エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および
細胞質ドメインは配列番号54の配列またはその断片を含んでもよい。例えば、エンドソ
ーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号35
の配列またはその断片を含んでもよい。
好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。エンドソーム/リソソームターゲティング
配列は典型的に膜貫通および細胞質ドメインの一部である。したがって、エンドソーム/
リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、LAMP1または
DC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。好ましくは、エンドソー
ムおよび/またはリソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインはヒ
トである。典型的に、エンドソーム/リソソームターゲティング配列は、モチーフY−X
X(Xは任意の天然に存在するアミノ酸を表す)、その後に疎水性アミノ酸(配列番号3
8)を含む。好ましくは、エンドソーム/リソソームターゲティング配列はYQRI(配
列番号39)である。エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および
細胞質ドメインは配列番号54の配列またはその断片を含んでもよい。例えば、エンドソ
ーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号35
の配列またはその断片を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ER移行シグナル配列と、エンドソー
ム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に制限
部位をさらに含む。他の実施形態において、ベクターは、ヒト小胞体(ER)移行シグナ
ル配列と、エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質
ドメインとの間に挿入される少なくとも1つの抗原またはその断片をさらに含む。
ム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に制限
部位をさらに含む。他の実施形態において、ベクターは、ヒト小胞体(ER)移行シグナ
ル配列と、エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質
ドメインとの間に挿入される少なくとも1つの抗原またはその断片をさらに含む。
特定の実施形態において、ベクターは少なくとも2つの抗原またはその断片をコードす
る配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは抗原の完全長アミノ酸配列をコ
ードする核酸配列を含む。あるいは、ベクターは抗原のアミノ酸配列をコードする核酸配
列の断片を含む。
る配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは抗原の完全長アミノ酸配列をコ
ードする核酸配列を含む。あるいは、ベクターは抗原のアミノ酸配列をコードする核酸配
列の断片を含む。
典型的に、抗原は腫瘍抗原またはウイルス抗原である。腫瘍抗原は、ウイルス腫瘍抗原
、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞に
おいて発現される抗原からなる群から選択されてもよい。腫瘍抗原は腫瘍関連抗原であり
、好ましくは腫瘍関連抗原はがん/精巣抗原(C/T抗原)である。C/T抗原は、MA
GEファミリーメンバー、例えばMAGE−A1、MAGE−A3、MAGE−A4、こ
れらに限定されないが、単一点突然変異、NY−ESO1、腫瘍/精巣抗原1B、GAG
E−1、SSX−4、XAGE−1、BAGE、GAGE、SCP−1、SSX−2、S
SX−4、CTZ9、CT10、SAGEおよびCAGEを含む腫瘍抗原を含む群から選
択されてもよい。好ましくはC/T抗原は、GAGE−1、SSX−4およびXAGE−
1からなる群から選択されてもよい。
、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞に
おいて発現される抗原からなる群から選択されてもよい。腫瘍抗原は腫瘍関連抗原であり
、好ましくは腫瘍関連抗原はがん/精巣抗原(C/T抗原)である。C/T抗原は、MA
GEファミリーメンバー、例えばMAGE−A1、MAGE−A3、MAGE−A4、こ
れらに限定されないが、単一点突然変異、NY−ESO1、腫瘍/精巣抗原1B、GAG
E−1、SSX−4、XAGE−1、BAGE、GAGE、SCP−1、SSX−2、S
SX−4、CTZ9、CT10、SAGEおよびCAGEを含む腫瘍抗原を含む群から選
択されてもよい。好ましくはC/T抗原は、GAGE−1、SSX−4およびXAGE−
1からなる群から選択されてもよい。
本発明の別の態様は、抗原特異的Tリンパ球のin vitro生成のための本明細書
に記載される発現ベクターの使用を指す。
に記載される発現ベクターの使用を指す。
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載される方法によって生成されたTリンパ球を
哺乳動物に投与するステップを含むがんを予防または治療する方法に使用するためのTリ
ンパ球を指す。
哺乳動物に投与するステップを含むがんを予防または治療する方法に使用するためのTリ
ンパ球を指す。
別の態様は、上記の方法のステップを含み、本明細書に記載される方法によって生成さ
れた活性化抗原特異的リンパ球からTCRを単離するステップをさらに含む抗原特異的T
CRを生成する方法を指す。
れた活性化抗原特異的リンパ球からTCRを単離するステップをさらに含む抗原特異的T
CRを生成する方法を指す。
別の態様は、GAGE−1、SSX−4およびXAGE−1のそれぞれに特異的なTC
Rを指す。
Rを指す。
本発明をその好ましい実施形態のいくつかに対して詳細に記載する前に、以下の一般的
定義を提供する。
定義を提供する。
以下に例示的に記載される本発明は、適切には、本明細書に具体的に開示されていない
任意の要素(複数も含む)、制限(複数も含む)の不在下で実施されてもよい。
任意の要素(複数も含む)、制限(複数も含む)の不在下で実施されてもよい。
本発明は、特定の実施形態に対して、および特定の図面を参照して記載されるが、本発
明はそれらによって限定されず、請求項によってのみ限定される。
明はそれらによって限定されず、請求項によってのみ限定される。
「含む」という用語が本説明および請求項に使用される場合、それは他の要素を排除し
ない。本発明の目的のために、「からなる」という用語は、「構成する」という用語の好
ましい実施形態であるとみなされる。本明細書以下において、グループが少なくとも特定
の数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態のみから
なるグループを開示することが理解され得る。
ない。本発明の目的のために、「からなる」という用語は、「構成する」という用語の好
ましい実施形態であるとみなされる。本明細書以下において、グループが少なくとも特定
の数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態のみから
なるグループを開示することが理解され得る。
不定または定冠詞が単数名詞、例えば「一つの(a)」、「一つの(an)」または「そ
の」を参照して使用される場合、これは、何か他のことが明確に述べられない限り、複数
のその名詞を含む。
の」を参照して使用される場合、これは、何か他のことが明確に述べられない限り、複数
のその名詞を含む。
本明細書に使用される場合、「発現」という用語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列
に基づいて産生されるプロセスを指す。したがって、「発現された」タンパク質またはポ
リペプチドという用語は、限定されないが、細胞内、膜貫通および分泌タンパク質または
ポリペプチドを含む。
に基づいて産生されるプロセスを指す。したがって、「発現された」タンパク質またはポ
リペプチドという用語は、限定されないが、細胞内、膜貫通および分泌タンパク質または
ポリペプチドを含む。
専門用語はそれらの一般的な意味によって使用される。特定の意味が特定の用語に伝え
られる場合、用語の定義は、以下においてその用語が使用される文脈において与えられる
。
られる場合、用語の定義は、以下においてその用語が使用される文脈において与えられる
。
本発明の一態様は、以下のステップ:
A)抗原提示細胞における、
− 少なくとも1つの抗原またはその断片、
− 抗原のN末端の前の小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− 抗原のC末端の後のエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通
および細胞質ドメイン
を含む少なくとも1つの融合タンパク質の発現、ならびに
B)抗原提示細胞によって発現される抗原に特異的な抗原特異的Tリンパ球を活性化す
るための、in vitroでのステップA)の抗原提示細胞へのTリンパ球を含む細胞
集団の曝露
を含む、ヒト抗原特異的Tリンパ球を生成する方法を指す。
A)抗原提示細胞における、
− 少なくとも1つの抗原またはその断片、
− 抗原のN末端の前の小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− 抗原のC末端の後のエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通
および細胞質ドメイン
を含む少なくとも1つの融合タンパク質の発現、ならびに
B)抗原提示細胞によって発現される抗原に特異的な抗原特異的Tリンパ球を活性化す
るための、in vitroでのステップA)の抗原提示細胞へのTリンパ球を含む細胞
集団の曝露
を含む、ヒト抗原特異的Tリンパ球を生成する方法を指す。
断片は、この抗原に特異的である抗原の配列であってもよく、すなわち哺乳動物、特に
ヒトの別のタンパク質またはペプチドに存在しない。断片は抗原の配列より短くてもよく
、例えば抗原より少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも30%、少なくとも5
0%、少なくとも70%、少なくとも90%短い。断片は、少なくとも9、少なくとも1
0、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも1
5またはそれより多いアミノ酸の長さを有してもよい。
ヒトの別のタンパク質またはペプチドに存在しない。断片は抗原の配列より短くてもよく
、例えば抗原より少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも30%、少なくとも5
0%、少なくとも70%、少なくとも90%短い。断片は、少なくとも9、少なくとも1
0、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも1
5またはそれより多いアミノ酸の長さを有してもよい。
一実施形態において、融合タンパク質は少なくとも2個の抗原またはその断片を含む。
融合タンパク質は、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個
、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個の抗原またはそ
れらの断片を含んでもよい。融合タンパク質は、100個未満、50個未満、40個未満
、30個未満、20個未満、10個未満の抗原またはそれらの断片を含んでもよい。
融合タンパク質は、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個
、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個の抗原またはそ
れらの断片を含んでもよい。融合タンパク質は、100個未満、50個未満、40個未満
、30個未満、20個未満、10個未満の抗原またはそれらの断片を含んでもよい。
「抗原特異的Tリンパ球を活性化する」という用語は、ナイーブT細胞の活性化(デノ
ボ誘導)およびメモリーTリンパ球の活性化(再活性化)を指す。
ボ誘導)およびメモリーTリンパ球の活性化(再活性化)を指す。
典型的に、Tリンパ球を含む抗原提示細胞および細胞集団は同じドナー由来である。ま
た、欧州特許第1910521号明細書に記載されている同種拘束された(allorestrict
ed)設定も企図され、MHC分子をコードする核酸が、移入される前記MHC分子に対応
するMHC遺伝子を保有しないドナーの抗原提示細胞において発現される。
た、欧州特許第1910521号明細書に記載されている同種拘束された(allorestrict
ed)設定も企図され、MHC分子をコードする核酸が、移入される前記MHC分子に対応
するMHC遺伝子を保有しないドナーの抗原提示細胞において発現される。
ステップA)における少なくとも1つの融合タンパク質の発現は、一過性発現であって
もよいか、または安定発現であってもよい。好ましい実施形態において、発現は、例えば
、少なくとも1つの融合タンパク質をコードするivt−RNAを導入することによる一
過性発現である。ivt−RNAの発現は、品質管理されたivt−RNAを迅速に産生
することができ、免疫原性タンパク質夾雑物を保有しないという点で有益である。
もよいか、または安定発現であってもよい。好ましい実施形態において、発現は、例えば
、少なくとも1つの融合タンパク質をコードするivt−RNAを導入することによる一
過性発現である。ivt−RNAの発現は、品質管理されたivt−RNAを迅速に産生
することができ、免疫原性タンパク質夾雑物を保有しないという点で有益である。
プライミングとも呼ばれるTリンパ球の曝露によって、多くの異なる活性化されたリン
パ球集団がin vitroで出現する。典型的に、ステップB)における曝露はTリン
パ球を含む細胞集団との抗原提示細胞の共培養である。抗原提示細胞のMHC:エピトー
プ複合体を認識するT細胞が活性化され、その画分はステップA)において発現される抗
原のエピトープを提示するMHC分子の複合体に特異的である。これらの非常に望まれる
T細胞は、ステップA)において発現される抗原に由来しないエピトープを提示するペプ
チドまたはMHC分子と関係なくMHC分子を認識するT細胞から分離されなければなら
ない。
パ球集団がin vitroで出現する。典型的に、ステップB)における曝露はTリン
パ球を含む細胞集団との抗原提示細胞の共培養である。抗原提示細胞のMHC:エピトー
プ複合体を認識するT細胞が活性化され、その画分はステップA)において発現される抗
原のエピトープを提示するMHC分子の複合体に特異的である。これらの非常に望まれる
T細胞は、ステップA)において発現される抗原に由来しないエピトープを提示するペプ
チドまたはMHC分子と関係なくMHC分子を認識するT細胞から分離されなければなら
ない。
ステップB)における抗原提示細胞の曝露のために、抗原提示細胞はTリンパ球を含む
集団に少なくとも1回加えられる。抗原提示細胞の1回目の添加もまた、プライミングと
呼ばれる。抗原提示細胞は、数回、例えば、少なくとも2回または少なくとも3回加えら
れてもよい。抗原提示細胞の2回目および全ての後の添加はまた、再刺激とも呼ばれる。
なぜならそれらのステップにおいて、既に活性化されたTリンパ球はさらなる増殖のため
のさらなる刺激を受けるからである。特定の実施形態において、抗原提示細胞は1回加え
られる。他の実施形態において、抗原提示細胞は2回加えられる。別の実施形態において
、抗原提示細胞は3回加えられる。さらなる実施形態は、抗原提示細胞が3回またはそれ
以上の回数加えられる方法に関する。新たなAPCは、7〜21日毎、または12〜16
日毎、または13〜15日毎、または14日毎にT細胞培養に加えられてもよい。当業者
は、定期的に補足サイトカインを含有する新鮮な培養培地が細胞に提供されることを理解
する。
集団に少なくとも1回加えられる。抗原提示細胞の1回目の添加もまた、プライミングと
呼ばれる。抗原提示細胞は、数回、例えば、少なくとも2回または少なくとも3回加えら
れてもよい。抗原提示細胞の2回目および全ての後の添加はまた、再刺激とも呼ばれる。
なぜならそれらのステップにおいて、既に活性化されたTリンパ球はさらなる増殖のため
のさらなる刺激を受けるからである。特定の実施形態において、抗原提示細胞は1回加え
られる。他の実施形態において、抗原提示細胞は2回加えられる。別の実施形態において
、抗原提示細胞は3回加えられる。さらなる実施形態は、抗原提示細胞が3回またはそれ
以上の回数加えられる方法に関する。新たなAPCは、7〜21日毎、または12〜16
日毎、または13〜15日毎、または14日毎にT細胞培養に加えられてもよい。当業者
は、定期的に補足サイトカインを含有する新鮮な培養培地が細胞に提供されることを理解
する。
in vitroでの抗原提示細胞へのTリンパ球を含む細胞集団の曝露とは、曝露が
哺乳動物などの生物において起こらないが、曝露がin vitoro細胞培養において
行われることを意味する。細胞培養条件は当業者に公知であり、サイトカイン、例えば、
生成されるT細胞の種類に応じて、とりわけIL−2、IL−4、IL−7および/また
はIL−15の添加を含む(Schendel, DJ. et al. Human CD8+ T lymphocytes. 1997. I
n: The Immunology Methods Manual. (I. Lefkovits, Ed.) pp 670-690.; Regn, S., et
al. 2001. The generation of monospecific and bispecific anti-viral cytotoxic T l
ymphocytes (CTL) for the prophylaxis of patients receiving an allogeneic bone ma
rrow transplant. Bone Marrow Transplant. 27: 53-64; Su, Z. et al. Antigen presen
ting cells transfected with LMP2a RNA induce CD4+ LMP2a-specific cytotoxic T lym
phocytes which kill via a Fas-independent mechanism. Leuk. Lymphoma 43(8): 1651-
62.)。
哺乳動物などの生物において起こらないが、曝露がin vitoro細胞培養において
行われることを意味する。細胞培養条件は当業者に公知であり、サイトカイン、例えば、
生成されるT細胞の種類に応じて、とりわけIL−2、IL−4、IL−7および/また
はIL−15の添加を含む(Schendel, DJ. et al. Human CD8+ T lymphocytes. 1997. I
n: The Immunology Methods Manual. (I. Lefkovits, Ed.) pp 670-690.; Regn, S., et
al. 2001. The generation of monospecific and bispecific anti-viral cytotoxic T l
ymphocytes (CTL) for the prophylaxis of patients receiving an allogeneic bone ma
rrow transplant. Bone Marrow Transplant. 27: 53-64; Su, Z. et al. Antigen presen
ting cells transfected with LMP2a RNA induce CD4+ LMP2a-specific cytotoxic T lym
phocytes which kill via a Fas-independent mechanism. Leuk. Lymphoma 43(8): 1651-
62.)。
いくつかの実施形態において、方法は、活性化および/または抗原特異的Tリンパ球の
富化のステップをさらに含んでもよい。この富化ステップは典型的に以下のステップ:
(a)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、活性化Tリンパ球によって特異的
に発現されるマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも1つの結合分子または所
望の抗原のエピトープを提示する少なくとも1つのMHC分子と接触させるステップ、
(b)少なくとも1つの結合分子または所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも1
つのMHC分子が結合しているTリンパ球を単離するステップ
を含む。
富化のステップをさらに含んでもよい。この富化ステップは典型的に以下のステップ:
(a)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、活性化Tリンパ球によって特異的
に発現されるマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも1つの結合分子または所
望の抗原のエピトープを提示する少なくとも1つのMHC分子と接触させるステップ、
(b)少なくとも1つの結合分子または所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも1
つのMHC分子が結合しているTリンパ球を単離するステップ
を含む。
特定の実施形態において、方法は、活性化Tリンパ球の富化のステップを含んでもよい
。この富化ステップは典型的に以下のステップ:
(a)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、活性化Tリンパ球によって特異的
に発現されるマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも1つの結合分子と接触さ
せるステップ、
(b)少なくとも1つの結合分子が結合しているTリンパ球を単離するステップ
を含む。
。この富化ステップは典型的に以下のステップ:
(a)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、活性化Tリンパ球によって特異的
に発現されるマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも1つの結合分子と接触さ
せるステップ、
(b)少なくとも1つの結合分子が結合しているTリンパ球を単離するステップ
を含む。
他の特定の実施形態において、方法は、所望の抗原に特異的であるTリンパ球の富化の
ステップを含んでもよい。この富化ステップは典型的に以下のステップ:
(a)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、所望の抗原のエピトープを提示す
るMHC分子と接触させるステップ、
(b)所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも1つのMHC分子が結合しているT
リンパ球を単離するステップ
を含む。
ステップを含んでもよい。この富化ステップは典型的に以下のステップ:
(a)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、所望の抗原のエピトープを提示す
るMHC分子と接触させるステップ、
(b)所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも1つのMHC分子が結合しているT
リンパ球を単離するステップ
を含む。
活性化Tリンパ球によって特異的に発現されるマーカータンパク質に基づいた活性化T
リンパ球の富化は、拘束および特異的エピトープと関係なく広範囲の活性化T細胞を富化
することを可能にする。マーカータンパク質と特異的に結合する結合分子は、限定されな
いが、抗体、抗体の誘導体、抗体の断片、またはさらなる分子との上述のコンジュゲート
であってもよい。結合タンパク質は、例えば、FACSまたはMACSなどの選別手順を
容易にするために標識化されてもよい。
リンパ球の富化は、拘束および特異的エピトープと関係なく広範囲の活性化T細胞を富化
することを可能にする。マーカータンパク質と特異的に結合する結合分子は、限定されな
いが、抗体、抗体の誘導体、抗体の断片、またはさらなる分子との上述のコンジュゲート
であってもよい。結合タンパク質は、例えば、FACSまたはMACSなどの選別手順を
容易にするために標識化されてもよい。
活性化Tリンパ球によって特異的に発現されるマーカータンパク質は、活性化Tリンパ
球によって発現され、非活性化Tリンパ球によって実質的に発現されない任意の表面タン
パク質または分泌タンパク質であってもよい。好ましい実施形態において、活性化Tリン
パ球によって特異的に発現される少なくとも1つのマーカータンパク質は、Ox40、C
D137、CD40L、PD−1、IL−2受容体、インターフェロンγ、IL−2、G
M−CSFおよびTNF−αを含む群から選択される。これらのマーカーを使用すること
により、TCRによって提示される特異的エピトープから独立して活性化Tリンパ球の富
化が可能となる。この方法は、選択された抗原の全ての潜在的な免疫原性エピトープを認
識するT細胞の単離を容易にし、例えば、明らかに定義されていない抗原に特に有用であ
る。
球によって発現され、非活性化Tリンパ球によって実質的に発現されない任意の表面タン
パク質または分泌タンパク質であってもよい。好ましい実施形態において、活性化Tリン
パ球によって特異的に発現される少なくとも1つのマーカータンパク質は、Ox40、C
D137、CD40L、PD−1、IL−2受容体、インターフェロンγ、IL−2、G
M−CSFおよびTNF−αを含む群から選択される。これらのマーカーを使用すること
により、TCRによって提示される特異的エピトープから独立して活性化Tリンパ球の富
化が可能となる。この方法は、選択された抗原の全ての潜在的な免疫原性エピトープを認
識するT細胞の単離を容易にし、例えば、明らかに定義されていない抗原に特に有用であ
る。
富化ステップにおいて、選択された細胞は亜集団にプールされてもよいか、または単一
細胞クローンとして直接単離されてもよい。特定の実施形態において、細胞は第1の富化
ステップにおいてプールされ、さらなる富化ステップにおいて単一クローンに分離される
。単一クローン分離は、限定されないが、限界希釈またはFACSもしくはMACSを利
用した自動単一細胞選別によって行われてもよい。好ましくは単一細胞選別はFACSに
よって実施される。
細胞クローンとして直接単離されてもよい。特定の実施形態において、細胞は第1の富化
ステップにおいてプールされ、さらなる富化ステップにおいて単一クローンに分離される
。単一クローン分離は、限定されないが、限界希釈またはFACSもしくはMACSを利
用した自動単一細胞選別によって行われてもよい。好ましくは単一細胞選別はFACSに
よって実施される。
特定の実施形態において、活性化CD4 T細胞を選択するステップは、以下のステッ
プ:
(a1)抗原提示細胞および抗原特異的Tリンパ球のCD40−CD40Lの間の相互作
用を遮断し、Tリンパ球の表面にCD40Lを蓄積するために、ステップA)の少なくと
も1つの融合タンパク質を発現する抗原提示細胞を、CD40に対する抗体と接触させる
ステップ、
(a2)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を抗CD40L抗体と接触させるス
テップ、
(b)抗CD40L抗体および抗CD4抗体によりマークしたTリンパ球を単離するステ
ップ
を含む。
プ:
(a1)抗原提示細胞および抗原特異的Tリンパ球のCD40−CD40Lの間の相互作
用を遮断し、Tリンパ球の表面にCD40Lを蓄積するために、ステップA)の少なくと
も1つの融合タンパク質を発現する抗原提示細胞を、CD40に対する抗体と接触させる
ステップ、
(a2)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を抗CD40L抗体と接触させるス
テップ、
(b)抗CD40L抗体および抗CD4抗体によりマークしたTリンパ球を単離するステ
ップ
を含む。
分泌タンパク質による活性化T細胞の選択を利用するために、例えば、サイトカイン様
インターフェロン−γ、T細胞表面マーカーを認識する二重特異性分子および標的化サイ
トカインは、Beckerら(Becker, C et al. 2001. Adoptive tumor therapy with T
lymphocytes enriched through an IFN capture assay. Nature Med. 7(10): 1159-1162
.)に記載されているように標識化した検出抗体によって後で検出され得る細胞表面にお
いて分泌サイトカインを捕捉する。
インターフェロン−γ、T細胞表面マーカーを認識する二重特異性分子および標的化サイ
トカインは、Beckerら(Becker, C et al. 2001. Adoptive tumor therapy with T
lymphocytes enriched through an IFN capture assay. Nature Med. 7(10): 1159-1162
.)に記載されているように標識化した検出抗体によって後で検出され得る細胞表面にお
いて分泌サイトカインを捕捉する。
さらに、ステップ(a)において、細胞を、CD4と特異的に結合する結合分子および
/またはCD8と特異的に結合する結合分子とさらに接触させてもよい。
/またはCD8と特異的に結合する結合分子とさらに接触させてもよい。
あるいは、富化は、所望の抗原(すなわちステップAの抗原提示細胞によって外因的に
発現される抗体)のエピトープを提示するMHC分子を利用することによって実施されて
もよい。MHC分子は、例えば、FACSまたはMACSなどの選別手順を容易にするた
めに標識化されてもよい。TCRと対応するペプチド:MHC複合体との間の低い親和性
相互作用は、限定されないが、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体または
八量体などの、Wildeら(Dendritic cells pulsed with RNA encoding allogeneic
MHC and antigen induce T cells with superior antitumor activity and higher TCR f
unctional avidity. Blood 114(10): 2131-2139; 2009)に記載されているようにペプチ
ド:MHC分子の可溶性多量体の構築によって克服され得る。さらに、TCRと可逆的に
結合し、したがって機能的変化または活性化誘発性細胞死を誘発するリスクがなく、高親
和性TCRの単離を可能にする、いわゆるペプチド:MHCストレプタマー(streptamer
)が利用されてもよい(Knabel et al. (2002) Reversible MHC multimer staining for
functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer. Natu
re Medicine, 8(6), 631-7.)。T細胞:ストレプタマー相互作用の可逆的特性は、スト
レプタマーの骨格として作用するストレプトアビジン(ストレプタクチン(strep-tactin
))の修飾型に基づく。
発現される抗体)のエピトープを提示するMHC分子を利用することによって実施されて
もよい。MHC分子は、例えば、FACSまたはMACSなどの選別手順を容易にするた
めに標識化されてもよい。TCRと対応するペプチド:MHC複合体との間の低い親和性
相互作用は、限定されないが、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体または
八量体などの、Wildeら(Dendritic cells pulsed with RNA encoding allogeneic
MHC and antigen induce T cells with superior antitumor activity and higher TCR f
unctional avidity. Blood 114(10): 2131-2139; 2009)に記載されているようにペプチ
ド:MHC分子の可溶性多量体の構築によって克服され得る。さらに、TCRと可逆的に
結合し、したがって機能的変化または活性化誘発性細胞死を誘発するリスクがなく、高親
和性TCRの単離を可能にする、いわゆるペプチド:MHCストレプタマー(streptamer
)が利用されてもよい(Knabel et al. (2002) Reversible MHC multimer staining for
functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer. Natu
re Medicine, 8(6), 631-7.)。T細胞:ストレプタマー相互作用の可逆的特性は、スト
レプタマーの骨格として作用するストレプトアビジン(ストレプタクチン(strep-tactin
))の修飾型に基づく。
この手法により、特定の拘束があるエピトープ特異的TCRの標的化された富化が可能
となる。
となる。
活性化および/または抗原特異的Tリンパ球の単離は、蛍光活性化細胞選別(FACS
)および磁気活性化細胞選別(MACS)によって実施されてもよい。FACSに関して
、マーカータンパク質または所望の抗原のエピトープを提示するMHC分子と特異的に結
合する結合分子は蛍光染料により標識化される。FACSは高純度で少数の単離に特に有
用である。MACSに関して、マーカータンパク質または所望の抗原のエピトープを提示
するMHC分子と特異的に結合する結合分子は、磁性ビーズなどの磁性粒子により標識化
される。MACSはバルク培養物の迅速な選別に特に適している。
)および磁気活性化細胞選別(MACS)によって実施されてもよい。FACSに関して
、マーカータンパク質または所望の抗原のエピトープを提示するMHC分子と特異的に結
合する結合分子は蛍光染料により標識化される。FACSは高純度で少数の単離に特に有
用である。MACSに関して、マーカータンパク質または所望の抗原のエピトープを提示
するMHC分子と特異的に結合する結合分子は、磁性ビーズなどの磁性粒子により標識化
される。MACSはバルク培養物の迅速な選別に特に適している。
さらに、ステップ(a)において、細胞を、CD4をさらに富化するためにCD4と特
異的に結合する結合分子および/またはCD8と特異的に結合する結合分子とさらに接触
させてもよい。
異的に結合する結合分子および/またはCD8と特異的に結合する結合分子とさらに接触
させてもよい。
別の実施形態は、
C2)以下のステップ:
a)
(i)ステップA)において定義される抗原提示細胞、および
(ii)対照抗原提示細胞との、
活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団の増殖した細胞クローンのインキュベーショ
ン、
b)各細胞クローンについての(i)および(ii)とのインキュベーションの活性化プ
ロファイルの比較、
c)b)の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Tリンパ球の同定
のステップをさらに含み、(ii)ではなく(i)による活性化が、細胞クローンが抗原
特異的であることを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
C2)以下のステップ:
a)
(i)ステップA)において定義される抗原提示細胞、および
(ii)対照抗原提示細胞との、
活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団の増殖した細胞クローンのインキュベーショ
ン、
b)各細胞クローンについての(i)および(ii)とのインキュベーションの活性化プ
ロファイルの比較、
c)b)の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Tリンパ球の同定
のステップをさらに含み、(ii)ではなく(i)による活性化が、細胞クローンが抗原
特異的であることを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
抗原特異的Tリンパ球のステップC2)の同定は、活性化Tリンパ球のステップC1)
の富化後に実施されてもよいか、または代替として、富化ステップC1)を行わずにTリ
ンパ球を含む細胞集団を抗原提示細胞に曝露するステップB)の後に実施されてもよい。
の富化後に実施されてもよいか、または代替として、富化ステップC1)を行わずにTリ
ンパ球を含む細胞集団を抗原提示細胞に曝露するステップB)の後に実施されてもよい。
さらなる実施形態は、
C2)以下のステップ:
a)
(i)ステップA)において定義される抗原提示細胞、および
(ii)対照抗原提示細胞との、または抗原提示細胞の不在下での、
活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団の細胞の少なくとも1つの画分のインキュベ
ーション、
b)細胞の少なくとも1つの画分についての(i)および(ii)とのインキュベーショ
ンの活性化プロファイルの比較、
c)b)の比較に基づいた抗原特異的である細胞の画分の同定
を含む、抗原特異的Tリンパ球の同定
のステップをさらに含み、(ii)ではなく(i)による活性化が、細胞の画分が抗原特
異的であることを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
C2)以下のステップ:
a)
(i)ステップA)において定義される抗原提示細胞、および
(ii)対照抗原提示細胞との、または抗原提示細胞の不在下での、
活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団の細胞の少なくとも1つの画分のインキュベ
ーション、
b)細胞の少なくとも1つの画分についての(i)および(ii)とのインキュベーショ
ンの活性化プロファイルの比較、
c)b)の比較に基づいた抗原特異的である細胞の画分の同定
を含む、抗原特異的Tリンパ球の同定
のステップをさらに含み、(ii)ではなく(i)による活性化が、細胞の画分が抗原特
異的であることを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
別の実施形態は、
C2)以下のステップ:
a)
(i)ステップA)において定義される抗原提示細胞、および
(ii)対照抗原提示細胞との、または抗原提示細胞の不在下での、
活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団の増殖したT細胞クローンのインキュベーシ
ョン
b)各細胞クローンについての(i)および(ii)とのインキュベーションの活性化プ
ロファイルの比較、
c)b)の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Tリンパ球の同定
のステップをさらに含み、(ii)ではなく(i)による活性化が、細胞クローンが抗原
特異的であることを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
C2)以下のステップ:
a)
(i)ステップA)において定義される抗原提示細胞、および
(ii)対照抗原提示細胞との、または抗原提示細胞の不在下での、
活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団の増殖したT細胞クローンのインキュベーシ
ョン
b)各細胞クローンについての(i)および(ii)とのインキュベーションの活性化プ
ロファイルの比較、
c)b)の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Tリンパ球の同定
のステップをさらに含み、(ii)ではなく(i)による活性化が、細胞クローンが抗原
特異的であることを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
Tリンパ球の活性化プロファイルは、例えば、活性化誘発性サイトカイン遊離または抗
原指向性(antigen-directed)死滅能力を測定することによって決定され得る。
原指向性(antigen-directed)死滅能力を測定することによって決定され得る。
活性化誘発性サイトカイン分泌を測定するために、T細胞は抗原が負荷されたAPCと
共培養されてもよい。異なるエフェクター細胞対標的細胞(E:T)比が利用されてもよ
い。対照抗原提示、すなわち偽トランスフェクトAPCとインキュベートした、または刺
激細胞の不在下でインキュベートしたT細胞が陰性対照として使用されてもよい。培養上
清は標準的な酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって評価される。マーカーの例
は、限定されないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、インタ
ーフェロン−γ(IFN−γ)、IL−2およびTNF−α分泌である。抗原遭遇時にI
FN−γ、IL−2およびTNF−α分泌は、増強した抗腫瘍機能と相関し、したがって
CD8+細胞傷害性T細胞の抗原誘発性サイトカイン分泌を測定する場合、特に有用であ
る。さらに、IFN−γおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)
は、抗原特異的CD4+Tヘルパー−1(Th1)−極性T細胞クローンを評価するため
の明確に定義されたサイトカインである。
共培養されてもよい。異なるエフェクター細胞対標的細胞(E:T)比が利用されてもよ
い。対照抗原提示、すなわち偽トランスフェクトAPCとインキュベートした、または刺
激細胞の不在下でインキュベートしたT細胞が陰性対照として使用されてもよい。培養上
清は標準的な酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって評価される。マーカーの例
は、限定されないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、インタ
ーフェロン−γ(IFN−γ)、IL−2およびTNF−α分泌である。抗原遭遇時にI
FN−γ、IL−2およびTNF−α分泌は、増強した抗腫瘍機能と相関し、したがって
CD8+細胞傷害性T細胞の抗原誘発性サイトカイン分泌を測定する場合、特に有用であ
る。さらに、IFN−γおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)
は、抗原特異的CD4+Tヘルパー−1(Th1)−極性T細胞クローンを評価するため
の明確に定義されたサイトカインである。
多重抗原が、初代T細胞誘導のために同時に使用される場合、各々のプライミング抗原
を発現する個々のAPC集団は均等な割合で混合され、T細胞共培養に使用されてもよい
。したがって、特異性を評価するために実施される初期スクリーニングアッセイのみによ
り、全ての展開した標的抗原に対する全体の抗原反応性の予測が可能となる。単一の抗原
特異性の評価は、一種類のivtRNAトランスフェクトAPCとの抗原反応性T細胞の
後の共培養を必要とする。
を発現する個々のAPC集団は均等な割合で混合され、T細胞共培養に使用されてもよい
。したがって、特異性を評価するために実施される初期スクリーニングアッセイのみによ
り、全ての展開した標的抗原に対する全体の抗原反応性の予測が可能となる。単一の抗原
特異性の評価は、一種類のivtRNAトランスフェクトAPCとの抗原反応性T細胞の
後の共培養を必要とする。
さらに個々のT細胞クローンの細胞傷害活性は、例えばクロム遊離アッセイによって測
定され得る。このようなアッセイにおいて、標的細胞は放射性クロムにより標識化され、
T細胞に曝露される。死滅すると、放射性クロムは上清に遊離し、共培養の開始後4時間
以内に検出可能になる。特定のクロム遊離は、エフェクター細胞の不在下で標的細胞をイ
ンキュベートすることによって評価される自然遊離に正規化される。したがって、上清中
の多量のクロムは優れた細胞傷害性T細胞活性と相関する。クロム遊離アッセイは好まし
くは腫瘍抗原特異的CD8+T細胞をスクリーニングするために実施される。
定され得る。このようなアッセイにおいて、標的細胞は放射性クロムにより標識化され、
T細胞に曝露される。死滅すると、放射性クロムは上清に遊離し、共培養の開始後4時間
以内に検出可能になる。特定のクロム遊離は、エフェクター細胞の不在下で標的細胞をイ
ンキュベートすることによって評価される自然遊離に正規化される。したがって、上清中
の多量のクロムは優れた細胞傷害性T細胞活性と相関する。クロム遊離アッセイは好まし
くは腫瘍抗原特異的CD8+T細胞をスクリーニングするために実施される。
抗原特異的Tリンパ球の同定における使用に適した抗原提示細胞は、例えば、所望の抗
原および必要とされるMHC分子を発現する腫瘍細胞系、一般的なMHC分子を発現する
樹立抗原提示細胞系、またはTリンパ球を含む集団と同じドナーに由来する抗原提示細胞
であってもよい。
原および必要とされるMHC分子を発現する腫瘍細胞系、一般的なMHC分子を発現する
樹立抗原提示細胞系、またはTリンパ球を含む集団と同じドナーに由来する抗原提示細胞
であってもよい。
樹立抗原提示細胞系の一例は、不完全な固有エピトープ提示を示し、短いペプチド、例
えば合成ペプチドを外部から負荷され得る、高頻度のHLA−A*02:01アレルを発
現するヒトリンパT2細胞系である:この細胞系は、HLA−A*02:01拘束性CD
8+Tリンパ球をスクリーニングするために使用され得る。別の例は、HLAクラスIお
よびII発現を欠失しているヒトK562細胞系であり、その細胞系において目的の任意
のHLA分子が安定にまたは一過性に導入されてもよく、したがってCD8+Tリンパ球
およびCD4+Tリンパ球の両方のスクリーニングに役立ち得る。
えば合成ペプチドを外部から負荷され得る、高頻度のHLA−A*02:01アレルを発
現するヒトリンパT2細胞系である:この細胞系は、HLA−A*02:01拘束性CD
8+Tリンパ球をスクリーニングするために使用され得る。別の例は、HLAクラスIお
よびII発現を欠失しているヒトK562細胞系であり、その細胞系において目的の任意
のHLA分子が安定にまたは一過性に導入されてもよく、したがってCD8+Tリンパ球
およびCD4+Tリンパ球の両方のスクリーニングに役立ち得る。
ドナー由来の抗原提示細胞は、例えば、樹状細胞に成熟する、単離された単球であって
もよい。成熟した樹状細胞は最適な活性化能力を示す。
もよい。成熟した樹状細胞は最適な活性化能力を示す。
有用なドナー由来のAPCについてのさらなる例は、エプスタイン・バール・ウイルス
(Epstein-Barr virus)(EBV)−不死化Bリンパ球、いわゆるリンパ芽球様細胞系(
LCL)である。LCLは天然にB細胞に由来するので、これらのAPCは抗原プロセシ
ングおよび提示における優れた機能を特徴とする。さらに、LCLは、B7.1(CD8
0)およびB7.2(CD86)のような共刺激分子ならびにそれらの刺激能力を増強す
るのに役立つ適切な接着分子を発現する。ゲノム低減突然変異EBV(ミニEBV)株が
、大部分の溶菌サイクル遺伝子を欠失し、したがってTリンパ球のEBV依存性活性化を
低減させるミニEBV形質転換B細胞(mLCL)を生成するために使用されてもよい(
Kempkes, B.et al. (1995) Immortalization of human B lymphocytes by a plasmid con
taining 71 kilobase pairs of Epstein-Barr virus DNA. J Virol 69(1): 231-238., 19
95; Moosmann, et al. (2002) B cells immortalized by a mini-Epstein-Barr virus en
coding a foreign antigen efficiently reactivate specific cytotoxicT cells. Blood
100(5): 1755-1764)。
(Epstein-Barr virus)(EBV)−不死化Bリンパ球、いわゆるリンパ芽球様細胞系(
LCL)である。LCLは天然にB細胞に由来するので、これらのAPCは抗原プロセシ
ングおよび提示における優れた機能を特徴とする。さらに、LCLは、B7.1(CD8
0)およびB7.2(CD86)のような共刺激分子ならびにそれらの刺激能力を増強す
るのに役立つ適切な接着分子を発現する。ゲノム低減突然変異EBV(ミニEBV)株が
、大部分の溶菌サイクル遺伝子を欠失し、したがってTリンパ球のEBV依存性活性化を
低減させるミニEBV形質転換B細胞(mLCL)を生成するために使用されてもよい(
Kempkes, B.et al. (1995) Immortalization of human B lymphocytes by a plasmid con
taining 71 kilobase pairs of Epstein-Barr virus DNA. J Virol 69(1): 231-238., 19
95; Moosmann, et al. (2002) B cells immortalized by a mini-Epstein-Barr virus en
coding a foreign antigen efficiently reactivate specific cytotoxicT cells. Blood
100(5): 1755-1764)。
ドナー由来のLCL/mLCLは、特に多数の単離されたT細胞クローンが評価される
ことを必要とする場合、T細胞特異性を評価するために使用されてもよい。LCL/mL
CLの抗原負荷は、例えばレトロウイルス形質導入ivtRNAトランスフェクションお
よび外部ペプチドまたはタンパク質供給によって達成され得る。
ことを必要とする場合、T細胞特異性を評価するために使用されてもよい。LCL/mL
CLの抗原負荷は、例えばレトロウイルス形質導入ivtRNAトランスフェクションお
よび外部ペプチドまたはタンパク質供給によって達成され得る。
抗原特異的Tリンパ球の単離は、(i)所望の抗原を発現する抗原提示細胞と、および
(ii)対照抗原提示細胞と、または抗原提示細胞の不在下でインキュベートしたTリン
パ球の活性化プロファイルの比較に基づく。
(ii)対照抗原提示細胞と、または抗原提示細胞の不在下でインキュベートしたTリン
パ球の活性化プロファイルの比較に基づく。
(ii)対照抗原提示細胞または抗原提示細胞の不在下ではなく、(i)所望の抗原を
発現する抗原提示細胞による活性化は、T細胞クローンが抗原特異的であることを示す。
非活性化と比較して活性化は、所望の抗原を発現する抗原提示細胞とインキュベートした
Tリンパ球の値(すなわちIFN−γ分泌)の少なくとも30%、少なくとも40%、少
なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%の低下が存在
することを意味する。
発現する抗原提示細胞による活性化は、T細胞クローンが抗原特異的であることを示す。
非活性化と比較して活性化は、所望の抗原を発現する抗原提示細胞とインキュベートした
Tリンパ球の値(すなわちIFN−γ分泌)の少なくとも30%、少なくとも40%、少
なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%の低下が存在
することを意味する。
ER移行シグナル配列はエンドソーム/リソソーム関連タンパク質に由来してもよい。
開示された方法に使用されるER移行シグナル配列は、エンドソーム/リソソーム局在
タンパク質の選別配列であってもよい。本明細書に使用される場合、エンドソーム/リソ
ソーム局在タンパク質とは、細胞のエンドソームおよび/またはリソソームの膜または管
腔に局在するタンパク質を指す。
タンパク質の選別配列であってもよい。本明細書に使用される場合、エンドソーム/リソ
ソーム局在タンパク質とは、細胞のエンドソームおよび/またはリソソームの膜または管
腔に局在するタンパク質を指す。
エンドソームまたはリソソーム局在タンパク質の例は、アルファ−ガラクトシダーゼA
/GLA、エンド−ベータ−N−アセチルグルコサミニダーゼH/Endo H、アルフ
ァ−N−アセチルガラクトサミニダーゼ/NAGA、ガラクトシルセラミダーゼ/GAL
C、アルファ−N−アセチルグルコサミニダーゼ/NAGLU、グルコシルセラミダーゼ
/GBA、アルファ−ガラクトシダーゼ/a−Gal、ヘパラナーゼ/HPSE、アルフ
ァ−L−フコシダーゼ、ヘパリナーゼI、組織アルファ−L−フコシダーゼ/FUCA1
、ヘパリナーゼII、ベータ−ガラクトシダーゼ−1/GLB1、ヘパリナーゼIII、
ベータ−グルクロニダーゼ/GUSB、ヘキソサミニダーゼA/HEXA、ベータ(1−
3)−ガラクトシダーゼ、ヒアルロナンリアーゼ、ベータ(1−4)−ガラクトシダーゼ
、ヒアルロニダーゼ1/HYAL1、キチナーゼ3様1、ヒアルロニダーゼ4/HYAL
4、キチナーゼ3様2、アルファ−L−イズロニダーゼ/IDUA、キチナーゼ3様3/
ECF−L、キトビアーゼ/CTBS、キトトリオシダーゼ/CHIT1、ラクターゼ様
タンパク質/LCTL、コンドロイチンBリアーゼ/コンドロイチナーゼB、リソソーム
アルファ−グルコシダーゼ、コンドロイチナーゼABC、MBD4、コンドロイチナーゼ
AC、NEU−1/シアリダーゼ−1、細胞質ベータ−グルコシダーゼ/GBA3、O−
GlcNAcase/OGA、エンド−ベータ−N−アセチルグルコサミニダーゼF1/
Endo F1、PNGase F、エンド−ベータ−N−アセチルグルコサミニダーゼ
F3/Endo F3、SPAM1などのグリコシダーゼ;AMSH/STAMBP、カ
テプシンH、カテプシン3、カテプシンK、カテプシン6、カテプシンL、カテプシン7
/カテプシン1、カテプシンO、カテプシンA/リソソームカルボキシペプチダーゼA、
カテプシンS、カテプシンB、カテプシンV、カテプシンC/DPPI、カテプシンX/
Z/P、カテプシンD、ガラクトシルセラミダーゼ/GALC、カテプシンF、オエグマ
イン(oegumain)/アスパラギニルエンドペプチダーゼなどのリソソームプロテアーゼ;
アリールスルファターゼA/ARSA、イズロン酸−2−スルファターゼ/IDS、アリ
ールスルファターゼB/ARSB、N−アセチルガラクトサミン−6−スルファターゼ/
GALNSv、アリールスルファターゼG/ARSG、スルファミダーゼ/SGSH、グ
ルコサミン(N−アセチル)−6−スルファターゼ/GNS、スルファターゼ−2/SU
LF2などのスルファターゼ;またはBAD−LAMP/LAMP5などの他のリソソー
ムタンパク質;ヒアルロニダーゼ1/HYAL1;CD63;LAMP1/CD107a
;CD−M6PR;LAMP2/CD107b;クラスリン重鎖1/CHC17;Rab
27a;クラスリン重鎖2/CHC22;UNC13D、CD68、CD1bまたはDC
−LAMPである。
/GLA、エンド−ベータ−N−アセチルグルコサミニダーゼH/Endo H、アルフ
ァ−N−アセチルガラクトサミニダーゼ/NAGA、ガラクトシルセラミダーゼ/GAL
C、アルファ−N−アセチルグルコサミニダーゼ/NAGLU、グルコシルセラミダーゼ
/GBA、アルファ−ガラクトシダーゼ/a−Gal、ヘパラナーゼ/HPSE、アルフ
ァ−L−フコシダーゼ、ヘパリナーゼI、組織アルファ−L−フコシダーゼ/FUCA1
、ヘパリナーゼII、ベータ−ガラクトシダーゼ−1/GLB1、ヘパリナーゼIII、
ベータ−グルクロニダーゼ/GUSB、ヘキソサミニダーゼA/HEXA、ベータ(1−
3)−ガラクトシダーゼ、ヒアルロナンリアーゼ、ベータ(1−4)−ガラクトシダーゼ
、ヒアルロニダーゼ1/HYAL1、キチナーゼ3様1、ヒアルロニダーゼ4/HYAL
4、キチナーゼ3様2、アルファ−L−イズロニダーゼ/IDUA、キチナーゼ3様3/
ECF−L、キトビアーゼ/CTBS、キトトリオシダーゼ/CHIT1、ラクターゼ様
タンパク質/LCTL、コンドロイチンBリアーゼ/コンドロイチナーゼB、リソソーム
アルファ−グルコシダーゼ、コンドロイチナーゼABC、MBD4、コンドロイチナーゼ
AC、NEU−1/シアリダーゼ−1、細胞質ベータ−グルコシダーゼ/GBA3、O−
GlcNAcase/OGA、エンド−ベータ−N−アセチルグルコサミニダーゼF1/
Endo F1、PNGase F、エンド−ベータ−N−アセチルグルコサミニダーゼ
F3/Endo F3、SPAM1などのグリコシダーゼ;AMSH/STAMBP、カ
テプシンH、カテプシン3、カテプシンK、カテプシン6、カテプシンL、カテプシン7
/カテプシン1、カテプシンO、カテプシンA/リソソームカルボキシペプチダーゼA、
カテプシンS、カテプシンB、カテプシンV、カテプシンC/DPPI、カテプシンX/
Z/P、カテプシンD、ガラクトシルセラミダーゼ/GALC、カテプシンF、オエグマ
イン(oegumain)/アスパラギニルエンドペプチダーゼなどのリソソームプロテアーゼ;
アリールスルファターゼA/ARSA、イズロン酸−2−スルファターゼ/IDS、アリ
ールスルファターゼB/ARSB、N−アセチルガラクトサミン−6−スルファターゼ/
GALNSv、アリールスルファターゼG/ARSG、スルファミダーゼ/SGSH、グ
ルコサミン(N−アセチル)−6−スルファターゼ/GNS、スルファターゼ−2/SU
LF2などのスルファターゼ;またはBAD−LAMP/LAMP5などの他のリソソー
ムタンパク質;ヒアルロニダーゼ1/HYAL1;CD63;LAMP1/CD107a
;CD−M6PR;LAMP2/CD107b;クラスリン重鎖1/CHC17;Rab
27a;クラスリン重鎖2/CHC22;UNC13D、CD68、CD1bまたはDC
−LAMPである。
ER移行シグナル配列はエンドソーム/リソソーム関連タンパク質に由来する。エンド
ソーム/リソソーム関連タンパク質は、LAMP1、LAMP2、DC−LAMP、CD
68またはCD1b、好ましくはLAMP1であってもよい。好ましくは、ER移行シグ
ナルはヒトである。ER移行シグナル配列は、配列番号33、配列番号40、配列番号4
2、配列番号44および配列番号46のうちの少なくとも1つの配列を含んでもよい。い
くつかの実施形態において、ER移行シグナル配列は、配列番号34、配列番号41、配
列番号43、配列番号45、配列番号47からなる群から選択される配列のうちの1つか
らなってもよい。特定の実施形態において、ER移行シグナル配列は配列番号33の配列
またはその断片を含む。より特定の実施形態において、ER移行シグナル配列は以下の配
列番号34の配列からなる。
ソーム/リソソーム関連タンパク質は、LAMP1、LAMP2、DC−LAMP、CD
68またはCD1b、好ましくはLAMP1であってもよい。好ましくは、ER移行シグ
ナルはヒトである。ER移行シグナル配列は、配列番号33、配列番号40、配列番号4
2、配列番号44および配列番号46のうちの少なくとも1つの配列を含んでもよい。い
くつかの実施形態において、ER移行シグナル配列は、配列番号34、配列番号41、配
列番号43、配列番号45、配列番号47からなる群から選択される配列のうちの1つか
らなってもよい。特定の実施形態において、ER移行シグナル配列は配列番号33の配列
またはその断片を含む。より特定の実施形態において、ER移行シグナル配列は以下の配
列番号34の配列からなる。
エンドソーム/リソソームターゲティング配列は、LAMP1またはDC−LAMP、
好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。エンドソーム/リソソームターゲティング
配列は典型的に膜貫通および細胞質ドメインの一部である。したがって、エンドソーム/
リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、LAMP1または
DC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。好ましくは、エンドソー
ム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインはヒトである。典
型的にエンドソーム/リソソームターゲティング配列は、モチーフY−XX、続いて疎水
性アミノ酸を含む。好ましくは、エンドソーム/リソソームターゲティングシグナル配列
はYQRIである。エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細
胞質ドメインは配列番号54の配列またはその断片を含んでもよい。例えば、エンドソー
ム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号35の
配列またはその断片を含んでもよい。
好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。エンドソーム/リソソームターゲティング
配列は典型的に膜貫通および細胞質ドメインの一部である。したがって、エンドソーム/
リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、LAMP1または
DC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。好ましくは、エンドソー
ム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインはヒトである。典
型的にエンドソーム/リソソームターゲティング配列は、モチーフY−XX、続いて疎水
性アミノ酸を含む。好ましくは、エンドソーム/リソソームターゲティングシグナル配列
はYQRIである。エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細
胞質ドメインは配列番号54の配列またはその断片を含んでもよい。例えば、エンドソー
ム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号35の
配列またはその断片を含んでもよい。
疎水性アミノ酸という用語は当業者に周知である。疎水性アミノ酸についての例は、A
la、Ile、Leu、Phe、Val、Pro、Gly、Met、Trp、Tyr、P
ro、Cysである。
la、Ile、Leu、Phe、Val、Pro、Gly、Met、Trp、Tyr、P
ro、Cysである。
典型的に、抗原提示細胞は、樹状細胞、活性化B細胞、単球、マクロファージ、EBV
形質転換リンパ芽球様細胞系、好ましくは樹状細胞、より好ましくは単球由来樹状細胞か
ら選択される。
形質転換リンパ芽球様細胞系、好ましくは樹状細胞、より好ましくは単球由来樹状細胞か
ら選択される。
抗原提示細胞は抗原提示細胞の異なる集団を含んでもよく、各集団は異なる抗原融合タ
ンパク質を発現する。
ンパク質を発現する。
いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、以下のステップ:i)単球の準備、i
i)IL−4およびGM−CSFとのステップi)の単球のインキュベーション、iii
)成熟カクテルと組み合わせたIL−4およびGM−CSFとのステップii)の単球の
インキュベーションを含む方法によって生成される成熟樹状細胞である。成熟カクテルは
、IL−β、TNF−α、INF−γ、TLR7/8アゴニスト、PGE2およびTLR
3アゴニストまたはそれらの組合せからなる群から選択される成分のうちの少なくとも1
つを含んでもよい。例えば、TLR7/8アゴニストはR848であってもよく、および
/またはTLR3アゴニストはポリ(I:C)であってもよい。ステップii)のインキ
ュベーションは少なくとも2日間継続してもよい。ステップiii)のインキュベーショ
ンは、少なくとも12時間、好ましくは24時間継続してもよい。
i)IL−4およびGM−CSFとのステップi)の単球のインキュベーション、iii
)成熟カクテルと組み合わせたIL−4およびGM−CSFとのステップii)の単球の
インキュベーションを含む方法によって生成される成熟樹状細胞である。成熟カクテルは
、IL−β、TNF−α、INF−γ、TLR7/8アゴニスト、PGE2およびTLR
3アゴニストまたはそれらの組合せからなる群から選択される成分のうちの少なくとも1
つを含んでもよい。例えば、TLR7/8アゴニストはR848であってもよく、および
/またはTLR3アゴニストはポリ(I:C)であってもよい。ステップii)のインキ
ュベーションは少なくとも2日間継続してもよい。ステップiii)のインキュベーショ
ンは、少なくとも12時間、好ましくは24時間継続してもよい。
通常、Tリンパ球を含む細胞集団は末梢血リンパ球の集団である。Tリンパ球を含む細
胞集団は分離されていない末梢血リンパ球の集団であってもよい。細胞集団は、Tリンパ
球、好ましくはCD8+および/またはCD4+Tリンパ球について富化されてもよい。
胞集団は分離されていない末梢血リンパ球の集団であってもよい。細胞集団は、Tリンパ
球、好ましくはCD8+および/またはCD4+Tリンパ球について富化されてもよい。
本発明のさらなる態様は、
− ヒト小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメ
イン
を含む発現ベクターを指す。
− ヒト小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメ
イン
を含む発現ベクターを指す。
ベクターはin vitroでのmRNA転写のためのプロモーターを含んでもよい。
ER移行シグナル配列は、エンドソーム/リソソーム関連タンパク質、例えば、LAMP
1、LAMP2、DC−LAMP、CD68、CD1b、好ましくはLAMP1に由来す
る。好ましくは、ER移行シグナルはヒトである。特定の実施形態において、ER移行シ
グナルは配列番号33の配列またはその断片を含む。より特定の実施形態において、ER
移行シグナルは以下の配列番号34の配列からなる。
ER移行シグナル配列は、エンドソーム/リソソーム関連タンパク質、例えば、LAMP
1、LAMP2、DC−LAMP、CD68、CD1b、好ましくはLAMP1に由来す
る。好ましくは、ER移行シグナルはヒトである。特定の実施形態において、ER移行シ
グナルは配列番号33の配列またはその断片を含む。より特定の実施形態において、ER
移行シグナルは以下の配列番号34の配列からなる。
エンドソーム/リソソームターゲティング配列は、LAMP1またはDC−LAMP、
好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。エンドソーム/リソソームターゲティング
配列は典型的に膜貫通および細胞質ドメインの一部である。したがって、エンドソーム/
リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、LAMP1または
DC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。好ましくは、エンドソー
ム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインはヒトである。
好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。エンドソーム/リソソームターゲティング
配列は典型的に膜貫通および細胞質ドメインの一部である。したがって、エンドソーム/
リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、LAMP1または
DC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来してもよい。好ましくは、エンドソー
ム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインはヒトである。
典型的にエンドソーム/リソソームターゲティング配列は、モチーフY−XX、続いて
疎水性アミノ酸を含む(Xは任意の天然に存在するアミノ酸を表す)。好ましくは、エン
ドソーム/リソソームターゲティングシグナルはYQRIである。エンドソーム/リソソ
ームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号54の配列または
その断片を含んでもよい。例えば、エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む
膜貫通および細胞質ドメインは配列番号35の配列またはその断片を含んでもよい。
疎水性アミノ酸を含む(Xは任意の天然に存在するアミノ酸を表す)。好ましくは、エン
ドソーム/リソソームターゲティングシグナルはYQRIである。エンドソーム/リソソ
ームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号54の配列または
その断片を含んでもよい。例えば、エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む
膜貫通および細胞質ドメインは配列番号35の配列またはその断片を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ER移行シグナルと、エンドソーム/
リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に制限部位
をさらに含む。他の実施形態において、ベクターは、ヒト小胞体(ER)移行シグナルと
、エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメイン
との間に挿入される少なくとも1つの抗原またはその断片をさらに含む。
リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に制限部位
をさらに含む。他の実施形態において、ベクターは、ヒト小胞体(ER)移行シグナルと
、エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメイン
との間に挿入される少なくとも1つの抗原またはその断片をさらに含む。
特定の実施形態において、ベクターは少なくとも2個の抗原またはそれらの断片をコー
ドする配列を含む。ベクターは、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少
なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個の
抗原またはそれらの断片をコードする配列を含んでもよい。ベクターは、100個未満、
50個未満、40個未満、30個未満、20個未満、10個未満の抗原またはそれらの断
片をコードする配列を含んでもよい。
ドする配列を含む。ベクターは、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少
なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個の
抗原またはそれらの断片をコードする配列を含んでもよい。ベクターは、100個未満、
50個未満、40個未満、30個未満、20個未満、10個未満の抗原またはそれらの断
片をコードする配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、ベクターは抗原の完全長アミノ酸配列をコードする核酸
配列を含む。あるいは、ベクターは抗原のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片を含
む。図12に示されるように、2個の異なる抗原の断片を含むベクターが導入されている
抗原提示細胞は、2個の抗原に特異的な異なるTCRの活性化を誘発し得る。
配列を含む。あるいは、ベクターは抗原のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片を含
む。図12に示されるように、2個の異なる抗原の断片を含むベクターが導入されている
抗原提示細胞は、2個の抗原に特異的な異なるTCRの活性化を誘発し得る。
典型的に、抗原は腫瘍抗原またはウイルス抗原である。腫瘍抗原は、ウイルス腫瘍抗原
、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞に
おいて発現される抗原からなる群から選択されてもよい。
、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞に
おいて発現される抗原からなる群から選択されてもよい。
発がんウイルス抗原とも呼ばれるウイルス腫瘍抗原は、発がんDNAウイルスなどの発
がんウイルス、例えば、B型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルス、ならびに
パピローマウイルスおよび発がんRNAウイルスの抗原である。腫瘍特異的抗原とは、腫
瘍細胞によってのみ発現される腫瘍関連突然変異を指す。腫瘍関連抗原の群は、例えば、
組織特異的がん/精巣抗原またはMART−1、チロシナーゼもしくはCD20などの組
織分化抗原を含む。好ましくは腫瘍抗原は腫瘍関連抗原であり、より好ましくは腫瘍関連
抗原はがん/精巣抗原(C/T抗原)である。C/T抗原は、MAGEファミリーメンバ
ー、例えばMAGE−A1、MAGE−A3、MAGE−A4、これらに限定されないが
、単一点突然変異、NY−ESO1、腫瘍/精巣抗原1B、GAGE−1、SSX−4、
XAGE−1、BAGE、GAGE、SCP−1、SSX−2、SSX−4、CTZ9、
CT10、SAGEおよびCAGEを含む腫瘍抗原を含む群から選択されてもよい。好ま
しくはC/T抗原は、GAGE−1、SSX−4およびXAGE−1からなる群から選択
されてもよい。好ましくは患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞において発現さ
れる抗原は患者の非がん性細胞において発現されない。
がんウイルス、例えば、B型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルス、ならびに
パピローマウイルスおよび発がんRNAウイルスの抗原である。腫瘍特異的抗原とは、腫
瘍細胞によってのみ発現される腫瘍関連突然変異を指す。腫瘍関連抗原の群は、例えば、
組織特異的がん/精巣抗原またはMART−1、チロシナーゼもしくはCD20などの組
織分化抗原を含む。好ましくは腫瘍抗原は腫瘍関連抗原であり、より好ましくは腫瘍関連
抗原はがん/精巣抗原(C/T抗原)である。C/T抗原は、MAGEファミリーメンバ
ー、例えばMAGE−A1、MAGE−A3、MAGE−A4、これらに限定されないが
、単一点突然変異、NY−ESO1、腫瘍/精巣抗原1B、GAGE−1、SSX−4、
XAGE−1、BAGE、GAGE、SCP−1、SSX−2、SSX−4、CTZ9、
CT10、SAGEおよびCAGEを含む腫瘍抗原を含む群から選択されてもよい。好ま
しくはC/T抗原は、GAGE−1、SSX−4およびXAGE−1からなる群から選択
されてもよい。好ましくは患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞において発現さ
れる抗原は患者の非がん性細胞において発現されない。
本発明の別の態様は、
− 少なくとも1つの抗原またはその断片、
− 抗原のN末端の前の小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− 抗原のC末端の後のエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通お
よび細胞質ドメイン
を含む少なくとも1つの融合タンパク質を発現する、抗原提示細胞、特に樹状細胞を指す
。
本発明の別の態様は、抗原特異的Tリンパ球のin vitro生成のための本明細書に
記載される発現ベクターの使用を指す。
− 少なくとも1つの抗原またはその断片、
− 抗原のN末端の前の小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− 抗原のC末端の後のエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通お
よび細胞質ドメイン
を含む少なくとも1つの融合タンパク質を発現する、抗原提示細胞、特に樹状細胞を指す
。
本発明の別の態様は、抗原特異的Tリンパ球のin vitro生成のための本明細書に
記載される発現ベクターの使用を指す。
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載される方法によって生成されたTリンパ球を
哺乳動物に投与するステップを含むがんを予防または治療する方法に使用するためのTリ
ンパ球を指す。
哺乳動物に投与するステップを含むがんを予防または治療する方法に使用するためのTリ
ンパ球を指す。
別の態様は、上記の方法のステップを含み、本明細書に記載される方法によって生成さ
れた活性化抗原特異的リンパ球からTCRを単離するステップをさらに含む抗原特異的T
CRを生成する方法を指す。
れた活性化抗原特異的リンパ球からTCRを単離するステップをさらに含む抗原特異的T
CRを生成する方法を指す。
TCRの単離およびその後の配列分析は、例えばSteinleら(In vivo expansio
n of HLA-B35 alloreactive T cells sharing homologous T cell receptors: evidence
for maintenance of an oligoclonally dominated allospecificity by persistent stim
ulation with an autologous MHC/peptide complex. The Journal of Experimental Medi
cine, 181(2), 503-13; 1995)に記載されている。配列分析は、例えばPCRまたは次世
代シーケンシング法によって実施されてもよい。核酸の配列を同定する方法は当業者に周
知である。
n of HLA-B35 alloreactive T cells sharing homologous T cell receptors: evidence
for maintenance of an oligoclonally dominated allospecificity by persistent stim
ulation with an autologous MHC/peptide complex. The Journal of Experimental Medi
cine, 181(2), 503-13; 1995)に記載されている。配列分析は、例えばPCRまたは次世
代シーケンシング法によって実施されてもよい。核酸の配列を同定する方法は当業者に周
知である。
TCRは2つの異なるタンパク鎖、aおよびbから構成される。TCRα鎖は可変(V
)、結合(J)および定常(C)領域を含む。TCRα鎖は可変(V)、多様性(D)、
結合(J)および定常(C)領域を含む。TCRαおよびTCRβ鎖の両方の再配列され
たV(D)J領域は、超可変領域(CDR、相補性決定領域)を含有し、その中でCDR
3領域は特異的エピトープ認識を決定する。
)、結合(J)および定常(C)領域を含む。TCRα鎖は可変(V)、多様性(D)、
結合(J)および定常(C)領域を含む。TCRαおよびTCRβ鎖の両方の再配列され
たV(D)J領域は、超可変領域(CDR、相補性決定領域)を含有し、その中でCDR
3領域は特異的エピトープ認識を決定する。
本発明の一態様はGAGE−1に特異的なTCRを指す。一実施形態において、GAG
E−1に特異的なTCRは、配列番号48および配列番号49またはそれらの断片からな
る群から選択されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを特異的に認識する。断片は、
少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少
なくとも14、少なくとも15またはそれ以上のアミノ酸の長さを有してもよい。TCR
は、配列番号48および配列番号49またはそれらの断片からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列のうちの少なくとも1つと特異的に結合し得る。
E−1に特異的なTCRは、配列番号48および配列番号49またはそれらの断片からな
る群から選択されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを特異的に認識する。断片は、
少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少
なくとも14、少なくとも15またはそれ以上のアミノ酸の長さを有してもよい。TCR
は、配列番号48および配列番号49またはそれらの断片からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列のうちの少なくとも1つと特異的に結合し得る。
GAGE−1に特異的なTCRは、配列番号7と少なくとも50%、少なくとも60%
、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なく
とも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99
%同一であるアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号8と少なくとも50%、少
なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも
90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含んでもよい。
、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なく
とも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99
%同一であるアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号8と少なくとも50%、少
なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも
90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、
少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含んでもよい。
特定の実施形態は、配列番号7のアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号8の
アミノ酸配列を含むTCRβ鎖を含む、GAGE−1に特異的なTCR受容体に関する。
アミノ酸配列を含むTCRβ鎖を含む、GAGE−1に特異的なTCR受容体に関する。
さらに、本出願は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含む、GAGE−1に特異的なTC
R受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号7と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、配
列番号3の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号8と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、配
列番号4の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関連する。
R受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号7と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、配
列番号3の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号8と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、配
列番号4の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関連する。
特定の実施形態は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含む、GAGE−1に特異的なTC
R受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号7と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも7
0%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるア
ミノ酸配列を含み、配列番号3の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号8と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも7
0%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるア
ミノ酸配列を含み、配列番号4の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関する。
R受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号7と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも7
0%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるア
ミノ酸配列を含み、配列番号3の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号8と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも7
0%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるア
ミノ酸配列を含み、配列番号4の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関する。
特定の実施形態は、配列番号5と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも7
0%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるヌ
クレオチド配列によってコードされるTCRα鎖および配列番号6と少なくとも50%、
少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくと
も90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%
、少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を含む
、GAGE−1に特異的であるTCR受容体を指す。
0%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるヌ
クレオチド配列によってコードされるTCRα鎖および配列番号6と少なくとも50%、
少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくと
も90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%
、少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を含む
、GAGE−1に特異的であるTCR受容体を指す。
特定の実施形態は、配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされるTCRα鎖お
よび配列番号6のヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を含む、GAGE−
1に特異的なTCR受容体に関する。
よび配列番号6のヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を含む、GAGE−
1に特異的なTCR受容体に関する。
さらに、本出願は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含む、GAGE−1に特異的なTC
R受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号5と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によっ
てコードされ、配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領
域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号6と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によっ
てコードされ、配列番号2に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領
域を含む、
TCR受容体に関連する。
R受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号5と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によっ
てコードされ、配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領
域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号6と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によっ
てコードされ、配列番号2に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領
域を含む、
TCR受容体に関連する。
特定の実施形態は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含む、GAGE−1に特異的なTC
R受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号5と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも7
0%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるヌ
クレオチド配列によってコードされ、配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコ
ードされるCDR3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号6と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも7
0%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるヌ
クレオチド配列によってコードされ、配列番号2に示されるヌクレオチド配列によってコ
ードされるCDR3領域を含む、
TCR受容体に関する。
R受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号5と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも7
0%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるヌ
クレオチド配列によってコードされ、配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコ
ードされるCDR3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号6と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも7
0%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であるヌ
クレオチド配列によってコードされ、配列番号2に示されるヌクレオチド配列によってコ
ードされるCDR3領域を含む、
TCR受容体に関する。
本出願の別の態様は、配列番号15と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくと
も70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であ
るアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号16と少なくとも50%、少なくとも
60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、
少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくと
も99%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含むSSX−4に特異的なTCR
を指す。
も70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であ
るアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号16と少なくとも50%、少なくとも
60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、
少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくと
も99%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含むSSX−4に特異的なTCR
を指す。
特定の実施形態は、配列番号15のアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号1
6のアミノ酸配列を含むTCRβ鎖を含むSSX−4に特異的なTCR受容体に関する。
6のアミノ酸配列を含むTCRβ鎖を含むSSX−4に特異的なTCR受容体に関する。
さらに、本出願は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むSSX−4に特異的なTCR受
容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号15と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号11の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号16と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号12の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関連する。
容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号15と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号11の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号16と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号12の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関連する。
特定の実施形態は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むSSX−4に特異的なTCR受
容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号15と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号11の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号16と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号12の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関する。
容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号15と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号11の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号16と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号12の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関する。
特定の実施形態は、配列番号13と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされるTCRα鎖および配列番号14と少なくとも50
%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少な
くとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも9
8%、少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を
含むSSX−4に特異的なTCR受容体を指す。
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされるTCRα鎖および配列番号14と少なくとも50
%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少な
くとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも9
8%、少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を
含むSSX−4に特異的なTCR受容体を指す。
特定の実施形態は、配列番号13のヌクレオチド配列によってコードされるTCRα鎖
および配列番号14のヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を含むSSX−
4に特異的なTCR受容体に関する。
および配列番号14のヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を含むSSX−
4に特異的なTCR受容体に関する。
さらに、本出願は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むSSX−4に特異的なTCR受
容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号13と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号9に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3
領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号14と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号10に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR
3領域を含む、
TCR受容体に関連する。
容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号13と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号9に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3
領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号14と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号10に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR
3領域を含む、
TCR受容体に関連する。
特定の実施形態は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むSSX−4に特異的なTCR受
容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号13と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号9に示されるヌクレオチド配列によって
コードされるCDR3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号14と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号10に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるCDR3領域を含む、
TCR受容体に関する。
容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号13と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号9に示されるヌクレオチド配列によって
コードされるCDR3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号14と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号10に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるCDR3領域を含む、
TCR受容体に関する。
本発明の一態様は、XAGE−1に特異的なTCRを指す。一実施形態において、XA
GE−1に特異的なTCRは、配列番号50および配列番号51またはそれらの断片から
なる群から選択されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを特異的に認識する。断片は
、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、
少なくとも14、少なくとも15またはそれ以上のアミノ酸の長さを有してもよい。TC
Rは、配列番号50および配列番号51またはそれらの断片からなる群から選択されるア
ミノ酸配列のうちの少なくとも1つと特異的に結合し得る。
GE−1に特異的なTCRは、配列番号50および配列番号51またはそれらの断片から
なる群から選択されるアミノ酸配列のうちの少なくとも1つを特異的に認識する。断片は
、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、
少なくとも14、少なくとも15またはそれ以上のアミノ酸の長さを有してもよい。TC
Rは、配列番号50および配列番号51またはそれらの断片からなる群から選択されるア
ミノ酸配列のうちの少なくとも1つと特異的に結合し得る。
XAGE−1に特異的なTCRは、配列番号23と少なくとも50%、少なくとも60
%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも9
9%同一であるアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号24と少なくとも50%
、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なく
とも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98
%、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含んでもよい。
%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも9
9%同一であるアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号24と少なくとも50%
、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なく
とも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98
%、少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含んでもよい。
特定の実施形態は、配列番号23のアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号2
4のアミノ酸配列を含むTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR受容体に関する
。
4のアミノ酸配列を含むTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR受容体に関する
。
さらに、本出願は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号23と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号19の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号24と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号20の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関連する。
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号23と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号19の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号24と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号20の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関連する。
特定の実施形態は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号23と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号19の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号24と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号20の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関する。
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号23と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号19の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号24と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号20の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関する。
特定の実施形態は、配列番号21と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされるTCRα鎖および配列番号22と少なくとも50
%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少な
くとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも9
8%、少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を
含むXAGE−1に特異的なTCR受容体を指す。
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされるTCRα鎖および配列番号22と少なくとも50
%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少な
くとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも9
8%、少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を
含むXAGE−1に特異的なTCR受容体を指す。
特定の実施形態は、配列番号21のヌクレオチド配列によってコードされるTCRα鎖
および配列番号22のヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を含むXAGE
−1に特異的なTCR受容体に関する。
および配列番号22のヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を含むXAGE
−1に特異的なTCR受容体に関する。
さらに、本出願は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号21と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号17に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR
3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号22と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号18に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR
3領域を含む、
TCR受容体に関連する。
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号21と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号17に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR
3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号22と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号18に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR
3領域を含む、
TCR受容体に関連する。
特定の実施形態は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号21と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号17に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるCDR3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号22と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号18に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるCDR3領域を含む、
TCR受容体に関する。
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号21と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号17に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるCDR3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号22と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号18に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるCDR3領域を含む、
TCR受容体に関する。
本出願の別の態様は、配列番号31と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくと
も70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であ
るアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号32と少なくとも50%、少なくとも
60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、
少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくと
も99%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTC
Rを指す。
も70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%
、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一であ
るアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号32と少なくとも50%、少なくとも
60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、
少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくと
も99%同一であるアミノ酸配列を有するTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTC
Rを指す。
特定の実施形態は、配列番号31のアミノ酸配列を有するTCRα鎖および配列番号3
2のアミノ酸配列を含むTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR受容体に関する
。
2のアミノ酸配列を含むTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR受容体に関する
。
さらに、本出願は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号31と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号27の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号32と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号28の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関連する。
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号31と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号27の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号32と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含み、
配列番号28の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関連する。
特定の実施形態は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号31と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号27の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号32と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号28の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関する。
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号31と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号27の配列を有するCDR3を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号32と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
アミノ酸配列を含み、配列番号28の配列を有するCDR3を含む、
TCR受容体に関する。
特定の実施形態は、配列番号29と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされるTCRα鎖および配列番号30と少なくとも50
%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少な
くとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも9
8%、少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を
含むXAGE−1に特異的なTCR受容体を指す。
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされるTCRα鎖および配列番号30と少なくとも50
%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少な
くとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも9
8%、少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を
含むXAGE−1に特異的なTCR受容体を指す。
特定の実施形態は、配列番号29のヌクレオチド配列によってコードされるTCRα鎖
および配列番号30のヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を含むXAGE
−1に特異的なTCR受容体に関する。
および配列番号30のヌクレオチド配列によってコードされるTCRβ鎖を含むXAGE
−1に特異的なTCR受容体に関する。
さらに、本出願は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号29と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号25に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR
3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号30と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号26に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR
3領域を含む、
TCR受容体に関連する。
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号29と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号25に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR
3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号30と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によ
ってコードされ、配列番号26に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR
3領域を含む、
TCR受容体に関連する。
特定の実施形態は、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含むXAGE−1に特異的なTCR
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号29と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号25に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるCDR3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号30と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号26に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるCDR3領域を含む、
TCR受容体に関する。
受容体であって、
− TCRα鎖は、配列番号29と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号25に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるCDR3領域を含み、
− TCRβ鎖は、配列番号30と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも
70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、
少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である
ヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号26に示されるヌクレオチド配列によっ
てコードされるCDR3領域を含む、
TCR受容体に関する。
本出願はまた、上記に定義されるTCRをコードする核酸分子に関する。
核酸配列全体における有用な変化はコドン最適化であり得る。発現されたアミノ酸配列
内の保存的置換を引き起こす変更がなされてもよい。これらの変異は、機能に影響を及ぼ
さないTCR鎖のアミノ酸配列の相補性決定および非相補性決定領域においてなされても
よい。通常、付加および欠失はCDR3領域において実施されるべきではない。
内の保存的置換を引き起こす変更がなされてもよい。これらの変異は、機能に影響を及ぼ
さないTCR鎖のアミノ酸配列の相補性決定および非相補性決定領域においてなされても
よい。通常、付加および欠失はCDR3領域において実施されるべきではない。
「保存的アミノ酸置換」の概念は当業者によって理解され、好ましくは、正電荷を持つ
残基(H、KおよびR)をコードするコドンは正電荷を持つ残基をコードするコドンによ
り置換され、負電荷を持つ残基(DおよびE)をコードするコドンは負電荷を持つ残基を
コードするコドンにより置換され、中性極性残基(C、G、N、Q、S、TおよびY)を
コードするコドンは中性極性残基をコードするコドンにより置換され、中性非極性残基(
A、F、I、L、M、P、VおよびW)をコードするコドンは中性非極性残基をコードす
るコドンにより置換されることを意味する。これらの変異は、自然発生的に生じ得るか、
ランダム突然変異誘発によって導入され得るか、または定方向突然変異誘発によって導入
され得る。それらの変化はこれらのポリペプチドの本質的特徴を破壊せずになされ得る。
当業者は、これらの変異が当該技術分野において公知の方法によってリガンド結合能力を
実質的に低減させるか、または破壊するかどうかを決定するためにバリアントアミノ酸お
よび/またはそれらをコードする核酸を容易におよび慣用的にスクリーニングすることが
できる。
残基(H、KおよびR)をコードするコドンは正電荷を持つ残基をコードするコドンによ
り置換され、負電荷を持つ残基(DおよびE)をコードするコドンは負電荷を持つ残基を
コードするコドンにより置換され、中性極性残基(C、G、N、Q、S、TおよびY)を
コードするコドンは中性極性残基をコードするコドンにより置換され、中性非極性残基(
A、F、I、L、M、P、VおよびW)をコードするコドンは中性非極性残基をコードす
るコドンにより置換されることを意味する。これらの変異は、自然発生的に生じ得るか、
ランダム突然変異誘発によって導入され得るか、または定方向突然変異誘発によって導入
され得る。それらの変化はこれらのポリペプチドの本質的特徴を破壊せずになされ得る。
当業者は、これらの変異が当該技術分野において公知の方法によってリガンド結合能力を
実質的に低減させるか、または破壊するかどうかを決定するためにバリアントアミノ酸お
よび/またはそれらをコードする核酸を容易におよび慣用的にスクリーニングすることが
できる。
エピトープタグは、特異的抗体が惹起し得るアミノ酸の短いストレッチであり、そのエ
ピトープタグにより、いくつかの実施形態において、生物または培養細胞に加えられてい
るタグ化タンパク質を特異的に同定し、追跡することができる。タグ化分子の検出は複数
の異なる技術を使用して達成され得る。そのような技術の例には、免疫組織化学、免疫沈
降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、ELISA、免疫ブロット法(「ウ
ェスタン」)、およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。エピトープタグは
、既知およびしばしば高親和性抗体の結合を提供し、それによって生物または培養細胞に
加えられているタグ化タンパク質を特異的に同定し、追跡することができるように、対象
タンパク質上に既知のエピトープ(抗体結合部位)を加える。
ピトープタグにより、いくつかの実施形態において、生物または培養細胞に加えられてい
るタグ化タンパク質を特異的に同定し、追跡することができる。タグ化分子の検出は複数
の異なる技術を使用して達成され得る。そのような技術の例には、免疫組織化学、免疫沈
降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、ELISA、免疫ブロット法(「ウ
ェスタン」)、およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。エピトープタグは
、既知およびしばしば高親和性抗体の結合を提供し、それによって生物または培養細胞に
加えられているタグ化タンパク質を特異的に同定し、追跡することができるように、対象
タンパク質上に既知のエピトープ(抗体結合部位)を加える。
本発明の文脈において、「機能的」TCRα−および/またはβ−鎖融合タンパク質は
、例えば、少なくとも実質的な生物活性を維持する、アミノ酸の付加、欠失または置換に
よって修飾されるTCRまたはTCRバリアントを意味する。TCRのα−および/また
はβ−鎖の場合、これは、両方の鎖が、特に前記TCRの特異的ペプチド−MHC複合体
と結合する、その生物学的機能、および/または特異的ペプチド:MHC相互作用時に機
能的シグナル伝達を与えるT細胞受容体(非修飾α−および/もしくはβ−鎖または別の
発明の融合タンパク質α−および/もしくはβ−鎖のいずれかを有する)を形成できるま
まであることを意味するものとする。
、例えば、少なくとも実質的な生物活性を維持する、アミノ酸の付加、欠失または置換に
よって修飾されるTCRまたはTCRバリアントを意味する。TCRのα−および/また
はβ−鎖の場合、これは、両方の鎖が、特に前記TCRの特異的ペプチド−MHC複合体
と結合する、その生物学的機能、および/または特異的ペプチド:MHC相互作用時に機
能的シグナル伝達を与えるT細胞受容体(非修飾α−および/もしくはβ−鎖または別の
発明の融合タンパク質α−および/もしくはβ−鎖のいずれかを有する)を形成できるま
まであることを意味するものとする。
特定の実施形態において、TCRは、機能的T細胞受容体(TCR)α−および/また
はβ−鎖融合タンパク質であるように修飾されてもよく、前記エピトープ−タグは、6か
ら15の間のアミノ酸、好ましくは9から11の間のアミノ酸の長さを有する。別の実施
形態において、TCRは、機能的T細胞受容体(TCR)α−および/またはβ−鎖融合
タンパク質であるように修飾されてもよく、前記T細胞受容体(TCR)α−および/ま
たはβ−鎖融合タンパク質は、離れているか、または直接並んでいる2つ以上のエピトー
プ−タグを含む。融合タンパク質の実施形態は、融合タンパク質がその生物活性(複数も
含む)(「機能的」)を維持する限り、2、3、4、5またはさらにそれ以上のエピトー
プ−タグを含有してもよい。
はβ−鎖融合タンパク質であるように修飾されてもよく、前記エピトープ−タグは、6か
ら15の間のアミノ酸、好ましくは9から11の間のアミノ酸の長さを有する。別の実施
形態において、TCRは、機能的T細胞受容体(TCR)α−および/またはβ−鎖融合
タンパク質であるように修飾されてもよく、前記T細胞受容体(TCR)α−および/ま
たはβ−鎖融合タンパク質は、離れているか、または直接並んでいる2つ以上のエピトー
プ−タグを含む。融合タンパク質の実施形態は、融合タンパク質がその生物活性(複数も
含む)(「機能的」)を維持する限り、2、3、4、5またはさらにそれ以上のエピトー
プ−タグを含有してもよい。
本発明による機能的T細胞受容体(TCR)α−および/またはβ−鎖融合タンパク質
が好ましく、前記エピトープ−タグは、限定されないが、CD20もしくはHer2/n
euタグ、またはmyc−タグ、FLAG−タグ、T7−タグ、HA(赤血球凝集素)−
タグ、His−タグ、S−タグ、GST−タグ、またはGFP−タグなどの他の従来のタ
グから選択される。myc、T7、GST、GFPタグは既存の分子に由来するエピトー
プである。対照的に、FLAGは高い抗原性に設計されている合成エピトープタグである
(例えば、米国特許第4,703,004号明細書および同第4,851,341号明細
書を参照のこと)。好ましくはmycタグが使用されてもよい。なぜなら高品質試薬がそ
の検出のために使用可能であるからである。エピトープタグは、もちろん、抗体による認
識以外に1つまたは複数のさらなる機能を有してもよい。これらのタグの配列は文献に記
載されており、当業者に周知である。
が好ましく、前記エピトープ−タグは、限定されないが、CD20もしくはHer2/n
euタグ、またはmyc−タグ、FLAG−タグ、T7−タグ、HA(赤血球凝集素)−
タグ、His−タグ、S−タグ、GST−タグ、またはGFP−タグなどの他の従来のタ
グから選択される。myc、T7、GST、GFPタグは既存の分子に由来するエピトー
プである。対照的に、FLAGは高い抗原性に設計されている合成エピトープタグである
(例えば、米国特許第4,703,004号明細書および同第4,851,341号明細
書を参照のこと)。好ましくはmycタグが使用されてもよい。なぜなら高品質試薬がそ
の検出のために使用可能であるからである。エピトープタグは、もちろん、抗体による認
識以外に1つまたは複数のさらなる機能を有してもよい。これらのタグの配列は文献に記
載されており、当業者に周知である。
本発明の別の態様は、上記に定義されるTCRを発現するT細胞を対象とする。
さらに、本発明は、上記に定義されるTCRをコードする核酸配列の1つまたは複数を
含むベクターを指す。ベクターは、好ましくは、プラスミド、シャトルベクター、ファー
ジミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターま
たは遺伝子療法に使用される粒子および/もしくはベクターである。
含むベクターを指す。ベクターは、好ましくは、プラスミド、シャトルベクター、ファー
ジミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターま
たは遺伝子療法に使用される粒子および/もしくはベクターである。
「ベクター」は、コードされたポリペプチドの合成が行われ得る適切な宿主細胞内に核
酸配列を保有する能力を有する任意の分子または組成物である。典型的におよび好ましく
は、ベクターは、所望の核酸配列(例えば本発明の核酸)を組み込むために、当該技術分
野において公知である組換えDNA技術を使用して操作されている核酸である。ベクター
はDNAもしくはRNAを含んでもよく、および/またはリポソームを含んでもよい。ベ
クターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レ
トロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたは遺伝子療法に使用される粒子およ
び/もしくはベクターであってもよい。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞内で複製
することができる核酸配列を含んでもよい。ベクターはまた、1つまたは複数の選択可能
なマーカー遺伝子および当業者に公知の他の遺伝要素を含んでもよい。ベクターは、好ま
しくは、核酸の発現を可能にする配列に作動可能に連結している本発明による前記核酸を
含む発現ベクターである。
酸配列を保有する能力を有する任意の分子または組成物である。典型的におよび好ましく
は、ベクターは、所望の核酸配列(例えば本発明の核酸)を組み込むために、当該技術分
野において公知である組換えDNA技術を使用して操作されている核酸である。ベクター
はDNAもしくはRNAを含んでもよく、および/またはリポソームを含んでもよい。ベ
クターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レ
トロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたは遺伝子療法に使用される粒子およ
び/もしくはベクターであってもよい。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞内で複製
することができる核酸配列を含んでもよい。ベクターはまた、1つまたは複数の選択可能
なマーカー遺伝子および当業者に公知の他の遺伝要素を含んでもよい。ベクターは、好ま
しくは、核酸の発現を可能にする配列に作動可能に連結している本発明による前記核酸を
含む発現ベクターである。
本発明の別の態様において、上記のTCRをコードする上記の核酸配列が導入されてい
る細胞が提供される。T細胞において、上記のTCRをコードする核酸配列を含む上記の
ベクターが導入されてもよいか、または前記TCRをコードするin vitroで転写
されたRNAが導入されてもよい。細胞はT細胞などの末梢血リンパ球であってもよい。
TCRのクローニングおよび外因性発現の方法は、例えばEngelsら(Relapse or e
radication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex af
finity. Cancer Cell, 23(4), 516-26. 2013)に記載されている。
る細胞が提供される。T細胞において、上記のTCRをコードする核酸配列を含む上記の
ベクターが導入されてもよいか、または前記TCRをコードするin vitroで転写
されたRNAが導入されてもよい。細胞はT細胞などの末梢血リンパ球であってもよい。
TCRのクローニングおよび外因性発現の方法は、例えばEngelsら(Relapse or e
radication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex af
finity. Cancer Cell, 23(4), 516-26. 2013)に記載されている。
本出願の別の態様は、医薬として使用するための上記に定義されるTCRまたはTCR
を発現する細胞に関する。したがって、本出願はまた、上記のTCRまたはTCRを発現
する細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を企図する。特定の実施形態は
、GAGE−1、SSX−4、XAGE−1、またはそれらの混合物を発現する悪性細胞
に関与する疾患を治療する際に使用するための上記に定義されるTCRまたはTCRを発
現する細胞を指す。したがって、本出願はまた、がんの治療に使用するための上記に定義
されるTCRを指す。したがって、本出願は、養子細胞療法を必要とする患者を治療する
方法であって、本明細書に定義される医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、
前記方法を対象とする。患者は、GAGE−1、SSX−4、XAGE−1、またはそれ
らの混合物を発現する悪性細胞に関与する疾患に罹患している可能性がある。
を発現する細胞に関する。したがって、本出願はまた、上記のTCRまたはTCRを発現
する細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を企図する。特定の実施形態は
、GAGE−1、SSX−4、XAGE−1、またはそれらの混合物を発現する悪性細胞
に関与する疾患を治療する際に使用するための上記に定義されるTCRまたはTCRを発
現する細胞を指す。したがって、本出願はまた、がんの治療に使用するための上記に定義
されるTCRを指す。したがって、本出願は、養子細胞療法を必要とする患者を治療する
方法であって、本明細書に定義される医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、
前記方法を対象とする。患者は、GAGE−1、SSX−4、XAGE−1、またはそれ
らの混合物を発現する悪性細胞に関与する疾患に罹患している可能性がある。
本発明のこれらの活性成分は、好ましくは、疾患が治療または少なくとも軽減され得る
、許容される担体または担体材料と混合された用量において、このような医薬組成物中に
使用される。このような組成物は、(活性成分および担体に加えて)充填材料、塩、緩衝
液、安定剤、可溶化剤および最先端の公知である他の材料を含んでもよい。
、許容される担体または担体材料と混合された用量において、このような医薬組成物中に
使用される。このような組成物は、(活性成分および担体に加えて)充填材料、塩、緩衝
液、安定剤、可溶化剤および最先端の公知である他の材料を含んでもよい。
「薬学的に許容される」という用語は、活性成分の生物活性の有効性を妨げない非毒性
材料を定義する。担体の選択は用途に応じる。
材料を定義する。担体の選択は用途に応じる。
医薬組成物は、活性成分の活性を増強するか、または治療を補うさらなる成分を含有し
てもよい。このようなさらなる成分および/または要因は、相乗効果を達成するか、また
は有害もしくは望ましくない作用を最小化するために医薬組成物の一部であってもよい。
てもよい。このようなさらなる成分および/または要因は、相乗効果を達成するか、また
は有害もしくは望ましくない作用を最小化するために医薬組成物の一部であってもよい。
本発明の活性成分の製剤化または調製のための技術および適用/薬剤は、「Remington'
s Pharmaceutical Sciences」, Mack Publishing Co., Easton, PA、latest editionに公
開されている。適切な適用は、非経口適用、例えば筋肉内、皮下、髄内(intramedular)
注射および髄腔内、直接心室内、静脈内、節内(intranodal)、腹腔内または腫瘍内注射
である。静脈内注射が患者の好ましい治療である。
s Pharmaceutical Sciences」, Mack Publishing Co., Easton, PA、latest editionに公
開されている。適切な適用は、非経口適用、例えば筋肉内、皮下、髄内(intramedular)
注射および髄腔内、直接心室内、静脈内、節内(intranodal)、腹腔内または腫瘍内注射
である。静脈内注射が患者の好ましい治療である。
好ましい実施形態によれば、医薬組成物は注入または注射である。
注射可能な組成物は、少なくとも1種の活性成分、例えば、TCRを発現する増殖した
T細胞集団(例えば治療される患者に対して自己または同種異系)を含む薬学的に許容さ
れる流体組成物である。活性成分は、通常、生理的に許容される担体中に溶解または懸濁
され、組成物は、乳化剤、防腐剤、およびpH緩衝剤などの、少量の1つまたは複数の非
毒性補助物質をさらに含んでもよい。本開示の融合タンパク質との使用に有用であるこの
ような注射可能な組成物は慣用されており、適切な製剤は当業者に周知である。
T細胞集団(例えば治療される患者に対して自己または同種異系)を含む薬学的に許容さ
れる流体組成物である。活性成分は、通常、生理的に許容される担体中に溶解または懸濁
され、組成物は、乳化剤、防腐剤、およびpH緩衝剤などの、少量の1つまたは複数の非
毒性補助物質をさらに含んでもよい。本開示の融合タンパク質との使用に有用であるこの
ような注射可能な組成物は慣用されており、適切な製剤は当業者に周知である。
CrossTAgベクターによる効果的なMHCクラス−II交差提示の検証
RNAによりコードされたタンパク質のMHCクラス−II交差提示を得るために、選
択した抗原DNA配列をMHCクラス−IIターゲティングシグナル(CrossTAg
)と結合した。この目的のために、ヒトリソソーム関連膜タンパク質1(LAMP−1)
5’のER移行シグナルを、ヒトDC−LAMPの膜貫通および細胞質ドメインと融合し
た。これらの2つのシグナル成分を、CrossTAgを有するフレーム内の選択した抗
原配列の組み込みを可能にする特有の制限部位によって分離した。LAMP−1シグナル
ペプチドを使用して、ERへの新たに合成されたタンパク質の同時翻訳移行を促進した。
移行後、細胞質DC−LAMPターゲティングシグナル(YXXφモチーフ;Xは任意の
天然に存在するアミノ酸を表し;φは任意の疎水性アミノ酸を表す;配列番号38)は、
エンドソーム/リソソーム区画への効果的なタンパク質輸送を確実にするはずである。
RNAによりコードされたタンパク質のMHCクラス−II交差提示を得るために、選
択した抗原DNA配列をMHCクラス−IIターゲティングシグナル(CrossTAg
)と結合した。この目的のために、ヒトリソソーム関連膜タンパク質1(LAMP−1)
5’のER移行シグナルを、ヒトDC−LAMPの膜貫通および細胞質ドメインと融合し
た。これらの2つのシグナル成分を、CrossTAgを有するフレーム内の選択した抗
原配列の組み込みを可能にする特有の制限部位によって分離した。LAMP−1シグナル
ペプチドを使用して、ERへの新たに合成されたタンパク質の同時翻訳移行を促進した。
移行後、細胞質DC−LAMPターゲティングシグナル(YXXφモチーフ;Xは任意の
天然に存在するアミノ酸を表し;φは任意の疎水性アミノ酸を表す;配列番号38)は、
エンドソーム/リソソーム区画への効果的なタンパク質輸送を確実にするはずである。
本発明者らは、HLA−DRB1*11:01拘束性であるEBNA−3C特異的CD
4+T細胞クローン3H10についての公知のエピトープ(Xiaojun Yu, et al.: Antige
n-armed antibodies targeting B lymphoma cells effectively activate antigen-speci
fic CD4+ T cells. Blood 2015 Mar 5;125(10):1601-10.; http://www.iedb.org/assayId
/2445148に記載されている)を含有する1kb断片をコードする、エプスタイン・バール
・ウイルス(Epstein-Barr virus)核抗原(EBNA)−3Cの部分的コード配列を組み
込んだ。2つのシグナルのうちの1つのみを含むか、またはいずれも含まないさらなる構
築物を使用して、所望のMHCクラス−II交差提示についての各配列の必要性を評価し
た(図1a)。続いてRNAを線状化プラスミドからin vitroで転写し、必要な
拘束要素HLA−DRB1*11:01を発現する異なるAPC内にトランスフェクトし
た。クローン3H10による特異的抗原認識時のIFN−γ産生の測定により、DCとの
共培養実験において内因的に翻訳され、プロセシングされたタンパク質、ならびにEBN
A−3C CrossTAg−RNAをトランスフェクトしたミニ−EBV形質転換リン
パ芽球様細胞系(mLCL)の効果的なMHCクラス−II交差提示の検出が可能となっ
た(図1b)。LAMP−1 ER移行シグナルを含有するivt−RNAのみが検出可
能なT細胞活性化を引き起こした。EBNA−3C−CrossTAg−RNAにより達
成した顕著なMHCクラス−II提示と比較して、LAMP−1シグナルペプチドのみが
少しの交差提示能力を与えた。本発明者らは、EBV−抗原BNRF1のHLA−DRB
1*15:01拘束性エピトープに特異的な1つのさらなるCD4+T細胞クローンを使
用してこのデータを確認した(データは示さず)。
4+T細胞クローン3H10についての公知のエピトープ(Xiaojun Yu, et al.: Antige
n-armed antibodies targeting B lymphoma cells effectively activate antigen-speci
fic CD4+ T cells. Blood 2015 Mar 5;125(10):1601-10.; http://www.iedb.org/assayId
/2445148に記載されている)を含有する1kb断片をコードする、エプスタイン・バール
・ウイルス(Epstein-Barr virus)核抗原(EBNA)−3Cの部分的コード配列を組み
込んだ。2つのシグナルのうちの1つのみを含むか、またはいずれも含まないさらなる構
築物を使用して、所望のMHCクラス−II交差提示についての各配列の必要性を評価し
た(図1a)。続いてRNAを線状化プラスミドからin vitroで転写し、必要な
拘束要素HLA−DRB1*11:01を発現する異なるAPC内にトランスフェクトし
た。クローン3H10による特異的抗原認識時のIFN−γ産生の測定により、DCとの
共培養実験において内因的に翻訳され、プロセシングされたタンパク質、ならびにEBN
A−3C CrossTAg−RNAをトランスフェクトしたミニ−EBV形質転換リン
パ芽球様細胞系(mLCL)の効果的なMHCクラス−II交差提示の検出が可能となっ
た(図1b)。LAMP−1 ER移行シグナルを含有するivt−RNAのみが検出可
能なT細胞活性化を引き起こした。EBNA−3C−CrossTAg−RNAにより達
成した顕著なMHCクラス−II提示と比較して、LAMP−1シグナルペプチドのみが
少しの交差提示能力を与えた。本発明者らは、EBV−抗原BNRF1のHLA−DRB
1*15:01拘束性エピトープに特異的な1つのさらなるCD4+T細胞クローンを使
用してこのデータを確認した(データは示さず)。
次に、本発明者らは3H10T細胞を使用して、CrossTAgシグナルが、1)タ
ンパク質分泌および再取り込みまたは2)細胞内部提示経路を介してMHCクラス−II
提示を引き起こすかどうかを解明した。このために、本発明者らは、HLA−DRB1*
11:01陽性またはHLA−DRB1*11:01陰性DCにEBNA−3C−Cro
ssTAg−RNAをトランスフェクトした。トランスフェクトおよび非トランスフェク
トDCを、全ての可能な組合せ(HLA−DRB1*11:01陽性/陰性)において共
インキュベートし、その後、3H10細胞と共培養した。HLA−DRB1*11:01
陽性DCに抗原−CrossTAg−RNAをトランスフェクトした場合のみAPCの認
識を検出した。潜在的に取り込まれた非トランスフェクトHLA−DRB1*11:01
陽性DC、およびHLA−DRB1*11:01陰性DCによって分泌された、プロセシ
ングされた抗原の認識は検出されなかった(図8)。
ンパク質分泌および再取り込みまたは2)細胞内部提示経路を介してMHCクラス−II
提示を引き起こすかどうかを解明した。このために、本発明者らは、HLA−DRB1*
11:01陽性またはHLA−DRB1*11:01陰性DCにEBNA−3C−Cro
ssTAg−RNAをトランスフェクトした。トランスフェクトおよび非トランスフェク
トDCを、全ての可能な組合せ(HLA−DRB1*11:01陽性/陰性)において共
インキュベートし、その後、3H10細胞と共培養した。HLA−DRB1*11:01
陽性DCに抗原−CrossTAg−RNAをトランスフェクトした場合のみAPCの認
識を検出した。潜在的に取り込まれた非トランスフェクトHLA−DRB1*11:01
陽性DC、およびHLA−DRB1*11:01陰性DCによって分泌された、プロセシ
ングされた抗原の認識は検出されなかった(図8)。
抗原−CrossTAg誘発性CD40L発現
抗原特異的CD4+T細胞を選択的に富化するための迅速な方法を開発するために、本
発明者らは、応答CD4+T細胞においてCD40L発現を誘発する抗原−CrossT
Ag−RNAトランスフェクトDCの能力を評価した。このために、本発明者らは、蛍光
トレーシング染料により3H10T細胞を染色し、それらを総細胞の10%、5%、1%
または0.1%の最終濃度で自己PBLと混合した(図1c)。これらの異なる画分を、
EBNA−3C−CrossTAg ivt−RNAトランスフェクト自己DCと共培養
し、CD40L発現について染色した。6時間の共培養において、本発明者らは、EBN
A−3C特異的3H10細胞上でかなりのCD40L発現を検出したが、自己PBL上で
限界CD40L発現のみを観察した。最低濃度の3H10細胞(0.1%)でさえも、C
D40L陽性CD4+T細胞の後の選別により、66%の3H10細胞の集団が生じた。
抗原特異的CD4+T細胞を選択的に富化するための迅速な方法を開発するために、本
発明者らは、応答CD4+T細胞においてCD40L発現を誘発する抗原−CrossT
Ag−RNAトランスフェクトDCの能力を評価した。このために、本発明者らは、蛍光
トレーシング染料により3H10T細胞を染色し、それらを総細胞の10%、5%、1%
または0.1%の最終濃度で自己PBLと混合した(図1c)。これらの異なる画分を、
EBNA−3C−CrossTAg ivt−RNAトランスフェクト自己DCと共培養
し、CD40L発現について染色した。6時間の共培養において、本発明者らは、EBN
A−3C特異的3H10細胞上でかなりのCD40L発現を検出したが、自己PBL上で
限界CD40L発現のみを観察した。最低濃度の3H10細胞(0.1%)でさえも、C
D40L陽性CD4+T細胞の後の選別により、66%の3H10細胞の集団が生じた。
代替のER移行シグナル配列
クローン3H10による特異的抗原認識時にIFN−γ産生を測定して、本発明者らは
、CrossTAg−RNAによりタグ化した異なるEBNA−3CおよびCrossT
Ag−RNAと異なる代替物をトランスフェクトしたAPCとの共培養実験において内因
的に翻訳され、プロセシングされたタンパク質の効果的なMHCクラス−II交差提示を
検出することができた(図11)。
クローン3H10による特異的抗原認識時にIFN−γ産生を測定して、本発明者らは
、CrossTAg−RNAによりタグ化した異なるEBNA−3CおよびCrossT
Ag−RNAと異なる代替物をトランスフェクトしたAPCとの共培養実験において内因
的に翻訳され、プロセシングされたタンパク質の効果的なMHCクラス−II交差提示を
検出することができた(図11)。
効果的なMHCクラス−IIおよびMHCクラス−I提示
本発明者らは、CrossTAgシグナルの使用が、MHCクラス−II提示だけでな
く、MHCクラス−I提示も促進することを示すことができた(図12)。
本発明者らは、CrossTAgシグナルの使用が、MHCクラス−II提示だけでな
く、MHCクラス−I提示も促進することを示すことができた(図12)。
同じivt−mRNA分子によってコードされるいくつかの抗原の効果的な提示
さらに本発明者らは、同じivt−mRNAによって異なる抗原に由来するいくつかの
エピトープを提示する効果的な手法を確立することができた。図12に示されるように、
異なる抗原に由来する2つのエピトープを含む構築物を発現する抗原提示細胞は、EBN
A−3C特異的クローン3H10およびチロシナーゼ特異的クローンIVSBを活性化す
る。したがって、2つの異なるエピトープを有するivt構築物は両方のエピトープの提
示を促進する。
さらに本発明者らは、同じivt−mRNAによって異なる抗原に由来するいくつかの
エピトープを提示する効果的な手法を確立することができた。図12に示されるように、
異なる抗原に由来する2つのエピトープを含む構築物を発現する抗原提示細胞は、EBN
A−3C特異的クローン3H10およびチロシナーゼ特異的クローンIVSBを活性化す
る。したがって、2つの異なるエピトープを有するivt構築物は両方のエピトープの提
示を促進する。
RNAパルス(RNA-pulsed)DCによるPBLの活性化
ハイスループット手法への途中で、本発明者らは、CD4+T細胞プライミングのため
に並行して複数の候補抗原を使用する可能性を調査した。したがって、分離されていない
PBLに存在するCD4+T細胞を、CrossTAg−シグナルと融合した4個の異な
るC/T抗原(GAGE−1、MAGE−A4、SSX−4およびXAGE−1)をコー
ドするivt−RNA種をトランスフェクトしたDCを使用して活性化した。記載されて
いるように(Javorovic, M.et al. (2008) Inhibitory effect of RNA pool complexity
on stimulatory capacity of RNA-pulsed dendritic cells. J Immunother 31(1): 52-62
.)、エレクトロポレーションにより各々のivt−RNAを個々にDCにトランスフェ
クトした。本発明者らは、フローサイトメトリーによる共刺激分子発現のレベルによって
トランスフェクトしたDCの成熟状態を測定した。本発明者らのDCは、共刺激分子(C
D80、CD83、CD86)およびHLAクラスIIを高発現する成熟表現型を示した
(図9a)。トランスフェクション効率を評価するために、トランスフェクトしたDCか
ら抽出したmRNAに由来する抗原cDNAを定量的RT−PCRによって分析した。獲
得したデータは、エレクトロポレーション後、C/T抗原mRNAコピー数の1.5*1
05〜2*107倍の範囲の増加を示した(図9b)。さらに、対照eGFP ivt−
RNAによるトランスフェクションの12時間後にフローサイトメトリーによって検出さ
れたように、発現されたDCの約68%は緑色蛍光タンパク質(eGFP)を増強した(
データは示さず)。
ハイスループット手法への途中で、本発明者らは、CD4+T細胞プライミングのため
に並行して複数の候補抗原を使用する可能性を調査した。したがって、分離されていない
PBLに存在するCD4+T細胞を、CrossTAg−シグナルと融合した4個の異な
るC/T抗原(GAGE−1、MAGE−A4、SSX−4およびXAGE−1)をコー
ドするivt−RNA種をトランスフェクトしたDCを使用して活性化した。記載されて
いるように(Javorovic, M.et al. (2008) Inhibitory effect of RNA pool complexity
on stimulatory capacity of RNA-pulsed dendritic cells. J Immunother 31(1): 52-62
.)、エレクトロポレーションにより各々のivt−RNAを個々にDCにトランスフェ
クトした。本発明者らは、フローサイトメトリーによる共刺激分子発現のレベルによって
トランスフェクトしたDCの成熟状態を測定した。本発明者らのDCは、共刺激分子(C
D80、CD83、CD86)およびHLAクラスIIを高発現する成熟表現型を示した
(図9a)。トランスフェクション効率を評価するために、トランスフェクトしたDCか
ら抽出したmRNAに由来する抗原cDNAを定量的RT−PCRによって分析した。獲
得したデータは、エレクトロポレーション後、C/T抗原mRNAコピー数の1.5*1
05〜2*107倍の範囲の増加を示した(図9b)。さらに、対照eGFP ivt−
RNAによるトランスフェクションの12時間後にフローサイトメトリーによって検出さ
れたように、発現されたDCの約68%は緑色蛍光タンパク質(eGFP)を増強した(
データは示さず)。
抗原−CrossTAg RNAによるトランスフェクション後、4つの別々のDC集
団をプールし、同時に使用して、健常ドナーの分離されていない自己PBLをプライミン
グした。その後の発現手順は2ラウンドのAPC刺激を含んだ。開始DC調製物の凍結し
たアリコートを解凍し、再刺激培養のために使用した。
団をプールし、同時に使用して、健常ドナーの分離されていない自己PBLをプライミン
グした。その後の発現手順は2ラウンドのAPC刺激を含んだ。開始DC調製物の凍結し
たアリコートを解凍し、再刺激培養のために使用した。
活性化CD4+T細胞の単離
各々、14日間隔のDC共培養後、プライミングした自己PBLは細胞数の3〜4倍の
全体的な増加を示した。CD4:CD8比の変化を複数の時点において測定して、活性化
CD4+T細胞の発現を追跡した。さらに、PBL試料を、CD40遮断抗体の存在下で
抗原が負荷されたDCと共インキュベートし、続いてCD4、CD137およびCD40
Lに対する特異的mAbを使用してフローサイトメトリーによって分析した(図2a)。
モニターした期間にわたって、CD4:CD8比は0日目に1.7から27日目に0.7
に反転し、これはCD8+T細胞の増強した増殖を反映している(データは示さず)。し
かしながら、CD4+T細胞集団内で、CD40L陽性T細胞のパーセンテージは13日
目に4.6%から27日目に30%超に上昇した。対照的に、CD137単一陽性CD4
+T細胞(Schoenbrunn et al., A converse 4-1BB and CD40 ligand expression patter
n delineates activated regulatory T cells (Treg) and conventional T cells enabli
ng direct isolation of alloantigen-reactive natural Foxp3+ Treg.J Immunol. 2012;
189(12):5985-94.)であると記載されている推定調節性T細胞(Treg)の数は約36
%低下した。
各々、14日間隔のDC共培養後、プライミングした自己PBLは細胞数の3〜4倍の
全体的な増加を示した。CD4:CD8比の変化を複数の時点において測定して、活性化
CD4+T細胞の発現を追跡した。さらに、PBL試料を、CD40遮断抗体の存在下で
抗原が負荷されたDCと共インキュベートし、続いてCD4、CD137およびCD40
Lに対する特異的mAbを使用してフローサイトメトリーによって分析した(図2a)。
モニターした期間にわたって、CD4:CD8比は0日目に1.7から27日目に0.7
に反転し、これはCD8+T細胞の増強した増殖を反映している(データは示さず)。し
かしながら、CD4+T細胞集団内で、CD40L陽性T細胞のパーセンテージは13日
目に4.6%から27日目に30%超に上昇した。対照的に、CD137単一陽性CD4
+T細胞(Schoenbrunn et al., A converse 4-1BB and CD40 ligand expression patter
n delineates activated regulatory T cells (Treg) and conventional T cells enabli
ng direct isolation of alloantigen-reactive natural Foxp3+ Treg.J Immunol. 2012;
189(12):5985-94.)であると記載されている推定調節性T細胞(Treg)の数は約36
%低下した。
3回の刺激サイクルの後、CD40L陽性CD4+T細胞をPBL培養物から富化し、
FACSによって96ウェルプレート内に直接クローニングした(図10)。クローニン
グしたCD4+T細胞を増殖させた。クローニング手順からの過剰な細胞を、バルクCD
40L陽性(CD40Lpos)およびCD40L陰性(CD40Lneg)CD4+T
細胞系として樹立した。これらの分析により、CD40Lposにより選別したCD4+
T細胞は、C/T抗原特異的再刺激後、14日の間にほぼ4倍増殖し、RNAトランスフ
ェクトAPCとの共培養後、CD40LnegT細胞と比較して顕著に多い量のIFN−
γを遊離したので、C/T抗原特異的CD4+Tリンパ球の首尾良い富化が示された(図
2b、c)。
FACSによって96ウェルプレート内に直接クローニングした(図10)。クローニン
グしたCD4+T細胞を増殖させた。クローニング手順からの過剰な細胞を、バルクCD
40L陽性(CD40Lpos)およびCD40L陰性(CD40Lneg)CD4+T
細胞系として樹立した。これらの分析により、CD40Lposにより選別したCD4+
T細胞は、C/T抗原特異的再刺激後、14日の間にほぼ4倍増殖し、RNAトランスフ
ェクトAPCとの共培養後、CD40LnegT細胞と比較して顕著に多い量のIFN−
γを遊離したので、C/T抗原特異的CD4+Tリンパ球の首尾良い富化が示された(図
2b、c)。
C/T抗原反応性CD4+T細胞クローンについてのスクリーニング
本発明者らは、FACSクローニングの12日後に開始して、IFN−γ遊離アッセイ
において抗原反応性について96ウェル培養物中で増殖させたT細胞クローンを試験した
(図3a)。4つ全ての抗原−CrossTAg RNAが負荷されたDCの混合物を使
用した共培養により、非反応性および非特異的T細胞クローンと一緒に、複数の抗原反応
性T細胞クローンが存在したことが示された。ごくわずかの例外を除いて、抗原反応性T
細胞クローンは、偽トランスフェクトDCとの共培養においてバックグラウンド活性化が
ないことを示した。
本発明者らは、FACSクローニングの12日後に開始して、IFN−γ遊離アッセイ
において抗原反応性について96ウェル培養物中で増殖させたT細胞クローンを試験した
(図3a)。4つ全ての抗原−CrossTAg RNAが負荷されたDCの混合物を使
用した共培養により、非反応性および非特異的T細胞クローンと一緒に、複数の抗原反応
性T細胞クローンが存在したことが示された。ごくわずかの例外を除いて、抗原反応性T
細胞クローンは、偽トランスフェクトDCとの共培養においてバックグラウンド活性化が
ないことを示した。
これらの観察結果を検証するために、本発明者らは、APCの代替源としてivt−R
NAトランスフェクトmLCLを使用して1日後に選択したクローンを再試験した。IF
N−γおよびGM−CSF遊離アッセイにより、DCによる以前の結果を確認した(図3
b)。さらに、選択したT細胞クローンをCD4およびCD8表面発現について染色し、
全てがCD4共受容体を発現することを見出した(図3c)。
NAトランスフェクトmLCLを使用して1日後に選択したクローンを再試験した。IF
N−γおよびGM−CSF遊離アッセイにより、DCによる以前の結果を確認した(図3
b)。さらに、選択したT細胞クローンをCD4およびCD8表面発現について染色し、
全てがCD4共受容体を発現することを見出した(図3c)。
抗原特異的CD4+T細胞クローンの分子および機能的特徴付け
抗原反応性CD4+T細胞クローンの個々の抗原特異性を分析するために、本発明者ら
は、続いて、単一種の抗原−CrossTAg RNAをトランスフェクトしたAPCの
異なる集団と個々のクローンを共培養した。標準的なELISAを使用してIFN−γ分
泌により応答を測定した(図4)。本発明者らは、プライミングのために使用した4つの
C/T抗原の各々を認識する抗原特異的CD4+T細胞クローンを検出した。T細胞クロ
ーンは、偽トランスフェクトAPCによるバックグラウンド活性化も、それらがプライミ
ングの間に曝露される他の抗原との検出可能な、いかなる交差反応もないことを示した。
抗原反応性CD4+T細胞クローンの個々の抗原特異性を分析するために、本発明者ら
は、続いて、単一種の抗原−CrossTAg RNAをトランスフェクトしたAPCの
異なる集団と個々のクローンを共培養した。標準的なELISAを使用してIFN−γ分
泌により応答を測定した(図4)。本発明者らは、プライミングのために使用した4つの
C/T抗原の各々を認識する抗原特異的CD4+T細胞クローンを検出した。T細胞クロ
ーンは、偽トランスフェクトAPCによるバックグラウンド活性化も、それらがプライミ
ングの間に曝露される他の抗原との検出可能な、いかなる交差反応もないことを示した。
TCRレパートリー分析を使用して、本発明者らは、多数の単離したクローンから4つ
の特有のT細胞受容体配列を同定した。MHC拘束アッセイにより、異なるT細胞が異な
るMHCクラスIIアロタイプによって提示されるエピトープを認識したことが示された
(データは示さず)。本発明者らは、このシグナルを有さないivt−RNAを備えてい
るDCが、単離したCD4+T細胞クローンによってIFN−γ分泌を誘発できなかった
という事実によってCrossTAgシグナルと融合した抗原を有する重要性を実証した
(図5a)。活性化誘発性IFN−γ分泌は、CD4+T細胞クローンが、抗原−Cro
ssTAg RNAをトランスフェクトされたAPCと共培養された場合のみ引き起こさ
れた。1つの例外はGAGE−1−TCR−2を発現するT細胞クローンであり、それは
また、実質的に低いレベルではあるが、それぞれの選別シグナルを欠くRNAをトランス
フェクトされたAPCを認識した。
の特有のT細胞受容体配列を同定した。MHC拘束アッセイにより、異なるT細胞が異な
るMHCクラスIIアロタイプによって提示されるエピトープを認識したことが示された
(データは示さず)。本発明者らは、このシグナルを有さないivt−RNAを備えてい
るDCが、単離したCD4+T細胞クローンによってIFN−γ分泌を誘発できなかった
という事実によってCrossTAgシグナルと融合した抗原を有する重要性を実証した
(図5a)。活性化誘発性IFN−γ分泌は、CD4+T細胞クローンが、抗原−Cro
ssTAg RNAをトランスフェクトされたAPCと共培養された場合のみ引き起こさ
れた。1つの例外はGAGE−1−TCR−2を発現するT細胞クローンであり、それは
また、実質的に低いレベルではあるが、それぞれの選別シグナルを欠くRNAをトランス
フェクトされたAPCを認識した。
本発明者らの単離したCD4+T細胞クローンの抗原特異性を確認するために、本発明
者らは、APCに組換えタンパク質を負荷した。CD4+T細胞クローンは、抗原−Cr
ossTAg RNAトランスフェクトAPCとの共培養において見られる活性化に匹敵
するタンパク質が負荷されたAPCに対する陽性IFN−γ分泌を示した(図5b)。
者らは、APCに組換えタンパク質を負荷した。CD4+T細胞クローンは、抗原−Cr
ossTAg RNAトランスフェクトAPCとの共培養において見られる活性化に匹敵
するタンパク質が負荷されたAPCに対する陽性IFN−γ分泌を示した(図5b)。
直接的なMHCクラス−IIエピトープ同定
これらの4つのクローンに関して、MHCクラス−IIエピトープ(DEPI)を直接
マッピングする方法(Milosevic, S.et al. (2006) Identification of major histocomp
atibility complex class II-restricted antigens and epitopes of the Epstein-Barr
virus)を使用して、それらがMHCクラス−II分子と関連して認識するエピトープと
定義した。本発明者らは、短い重複CrossTAg−RNA構築物を有する単離した抗
原断片の認識を立証し、最小エピトープ配列をさらに引き渡すためにそれらを使用した(
図6a、b)。これによって、GAGE−1−TCR−1は、HLA−DRB5*01:
01によって提示されたGAGE−176−98エピトープを認識することが見出された
。興味深いことに、2つのXAGE−1特異的CD4+T細胞クローンは、2つの異なる
MHCクラス−IIアロタイプ(HLA−DRB1*13:02およびHLA−DRB5
*01:01)によって提示された同一のXAGE−137−49エピトープを認識した
。
これらの4つのクローンに関して、MHCクラス−IIエピトープ(DEPI)を直接
マッピングする方法(Milosevic, S.et al. (2006) Identification of major histocomp
atibility complex class II-restricted antigens and epitopes of the Epstein-Barr
virus)を使用して、それらがMHCクラス−II分子と関連して認識するエピトープと
定義した。本発明者らは、短い重複CrossTAg−RNA構築物を有する単離した抗
原断片の認識を立証し、最小エピトープ配列をさらに引き渡すためにそれらを使用した(
図6a、b)。これによって、GAGE−1−TCR−1は、HLA−DRB5*01:
01によって提示されたGAGE−176−98エピトープを認識することが見出された
。興味深いことに、2つのXAGE−1特異的CD4+T細胞クローンは、2つの異なる
MHCクラス−IIアロタイプ(HLA−DRB1*13:02およびHLA−DRB5
*01:01)によって提示された同一のXAGE−137−49エピトープを認識した
。
C/T−抗原特異的TCRのトランスジェニック発現
TCRレパートリー分析後、本発明者らは、TCR発現ベクターを使用して単離したT
CR配列を再構築した。3H10クローンのCD4+T細胞(EBNA−3C特異的およ
びHLA−DRB1*11:01拘束性)に、CD4+T細胞クローンGAGE−1−T
CR−2、XAGE−1−TCR−1またはTCR−2の対応するTCR−α−およびβ
−鎖をトランスフェクトした。TCRにより操作した3H10細胞をC/T抗原が負荷さ
れたAPCと共培養した(図7)。IFN−γ分泌を測定することによって、本発明者ら
は、全てのCD4+T細胞クローンの特異性が、それらの内因性EBV特異的TCRを損
なわずに3H10細胞に首尾良く移入したことを示した。したがって、TCRトランスフ
ェクション後、3H10細胞は、EBNA−3C−CrossTAg ivt−RNAト
ランスフェクトAPCおよび対応するC/T抗原−CrossTAg ivt−RNAを
トランスフェクトしたAPCを認識した。
TCRレパートリー分析後、本発明者らは、TCR発現ベクターを使用して単離したT
CR配列を再構築した。3H10クローンのCD4+T細胞(EBNA−3C特異的およ
びHLA−DRB1*11:01拘束性)に、CD4+T細胞クローンGAGE−1−T
CR−2、XAGE−1−TCR−1またはTCR−2の対応するTCR−α−およびβ
−鎖をトランスフェクトした。TCRにより操作した3H10細胞をC/T抗原が負荷さ
れたAPCと共培養した(図7)。IFN−γ分泌を測定することによって、本発明者ら
は、全てのCD4+T細胞クローンの特異性が、それらの内因性EBV特異的TCRを損
なわずに3H10細胞に首尾良く移入したことを示した。したがって、TCRトランスフ
ェクション後、3H10細胞は、EBNA−3C−CrossTAg ivt−RNAト
ランスフェクトAPCおよび対応するC/T抗原−CrossTAg ivt−RNAを
トランスフェクトしたAPCを認識した。
方法
遺伝的構築物
pGEM−eGFP−A120ベクターを、CrossTAgベクター(S.Milo
sevic)についての開始構築物として使用した。元のpGEMベクターのこのポリA
120バリアントは転写RNAをより高い安定性にし、改善されたタンパク質発現を導い
た。プラスミドは、eGFP cDNAの5’末端において特有のAgeI部位、および
3’末端において特有のEcoRI部位をさらに含有した。ポリ−A尾部の後にSpeI
部位が続き、これはivt−RNA産生のためのプラスミドの線状化を可能にする。
遺伝的構築物
pGEM−eGFP−A120ベクターを、CrossTAgベクター(S.Milo
sevic)についての開始構築物として使用した。元のpGEMベクターのこのポリA
120バリアントは転写RNAをより高い安定性にし、改善されたタンパク質発現を導い
た。プラスミドは、eGFP cDNAの5’末端において特有のAgeI部位、および
3’末端において特有のEcoRI部位をさらに含有した。ポリ−A尾部の後にSpeI
部位が続き、これはivt−RNA産生のためのプラスミドの線状化を可能にする。
eGFPを、CrossTAgターゲティングシグナルをコードするcDNAと置き換
えることによってpGEM−CrossTAg−A120プラスミドをクローニングした
。CrossTAg配列は、DC−LAMP(受託:NP_055213、aa376−
416)の膜貫通および細胞質ドメインと5’で融合したヒトリソソーム関連膜タンパク
質−1(LAMP−1、受託:NP_005552、aa1−28)のER移行シグナル
からなる。抗原をコードするcDNAの挿入のために、異なるCrossTAg配列を、
LAMP1オープンリーディングフレーム(ORF)を破壊せずにNheI、KpnIお
よびPstI制限部位を含有する18−bpスペーサーによって分離する。コドン最適化
Cross−TAg配列を、コンピュータークローニングソフトウェアを使用して仮想的
に設計し、GeneArt(Regensburg)によって合成した。続いて完全なC
rossTAg配列を、AgeI(5’末端)およびEcoRI(3’末端)制限部位を
使用してプラスミドDNAから切断し、同様に消化したpGEM−A120ベクターのM
CS内にライゲーションした。種々のC/T抗原−CrossTAg構築物(pGEM−
GAGE−1−CrossTAg−A120、pGEM−MAGE−A4−CrossT
Ag−A120、pGEM−NY−ESO−1−CrossTAg−A120、pGEM
−SSX−4−CrossTAg−A120、pGEM−XAGE−1−CrossTA
g−A120)のクローニングのために、抗原cDNAを、フォワードおよびリバース遺
伝子特異的プライマーを使用してPCR(受託:GAGE−1、U19142;MAGE
−A4、NM_001011550;NY−ESO1、AJ003149;SSX−4、
U90841;XAGE−1、AF251237)によってプラスミドから増幅させ、N
heIおよびPstI/NotI制限部位によりライゲーションした。PCR反応のため
に使用したプライマーは要求に応じて全て利用可能である。全ての抗原配列を、開始OR
Fを破壊せずにpGEM−CrossTAg−A120の分割したCrossTAgシグ
ナルに挿入した。CD4+T細胞エピトープの検証のために、相補的オリゴヌクレオチド
を合成し(Metabion)、アニーリングした。アニーリングにより生成した付着末
端を、CrossTAgベクターへのこれらの短い抗原配列の直接的なライゲーションの
ために使用した。
えることによってpGEM−CrossTAg−A120プラスミドをクローニングした
。CrossTAg配列は、DC−LAMP(受託:NP_055213、aa376−
416)の膜貫通および細胞質ドメインと5’で融合したヒトリソソーム関連膜タンパク
質−1(LAMP−1、受託:NP_005552、aa1−28)のER移行シグナル
からなる。抗原をコードするcDNAの挿入のために、異なるCrossTAg配列を、
LAMP1オープンリーディングフレーム(ORF)を破壊せずにNheI、KpnIお
よびPstI制限部位を含有する18−bpスペーサーによって分離する。コドン最適化
Cross−TAg配列を、コンピュータークローニングソフトウェアを使用して仮想的
に設計し、GeneArt(Regensburg)によって合成した。続いて完全なC
rossTAg配列を、AgeI(5’末端)およびEcoRI(3’末端)制限部位を
使用してプラスミドDNAから切断し、同様に消化したpGEM−A120ベクターのM
CS内にライゲーションした。種々のC/T抗原−CrossTAg構築物(pGEM−
GAGE−1−CrossTAg−A120、pGEM−MAGE−A4−CrossT
Ag−A120、pGEM−NY−ESO−1−CrossTAg−A120、pGEM
−SSX−4−CrossTAg−A120、pGEM−XAGE−1−CrossTA
g−A120)のクローニングのために、抗原cDNAを、フォワードおよびリバース遺
伝子特異的プライマーを使用してPCR(受託:GAGE−1、U19142;MAGE
−A4、NM_001011550;NY−ESO1、AJ003149;SSX−4、
U90841;XAGE−1、AF251237)によってプラスミドから増幅させ、N
heIおよびPstI/NotI制限部位によりライゲーションした。PCR反応のため
に使用したプライマーは要求に応じて全て利用可能である。全ての抗原配列を、開始OR
Fを破壊せずにpGEM−CrossTAg−A120の分割したCrossTAgシグ
ナルに挿入した。CD4+T細胞エピトープの検証のために、相補的オリゴヌクレオチド
を合成し(Metabion)、アニーリングした。アニーリングにより生成した付着末
端を、CrossTAgベクターへのこれらの短い抗原配列の直接的なライゲーションの
ために使用した。
ivt−RNAの産生
SpeI線状化後、pGEMプラスミドを、製造業者の指示書に従って、mMESSA
GE mMACHINE T7キット(Ambion)を使用して単一種のin vit
ro転写(ivt)−RNA産生のための鋳型として使用した。品質管理のために、iv
t−RNA産物の長さをアガロースゲル電気泳動によって分析した。濃度および純度をN
anodrop ND−1000分光光度計(Thermo Scientific)に
よって決定した。
SpeI線状化後、pGEMプラスミドを、製造業者の指示書に従って、mMESSA
GE mMACHINE T7キット(Ambion)を使用して単一種のin vit
ro転写(ivt)−RNA産生のための鋳型として使用した。品質管理のために、iv
t−RNA産物の長さをアガロースゲル電気泳動によって分析した。濃度および純度をN
anodrop ND−1000分光光度計(Thermo Scientific)に
よって決定した。
細胞培養
単球由来3d mDCを、Burdekら(Journal of Translational Medicine 2010
, 8:90)に記載されているように生成し、トランスフェクトした。mDCおよびミニエプ
スタイン・バール・ウイルス(mini-Epstein-Barr virus)(EBV)形質転換リンパ芽
球様細胞系(mLCL)のRNAトランスフェクションを、Burdekら(Three-day
dendritic cells for vaccine development: Antigen uptake, processing and presenta
tion. Journal of Translational Medicine 2010, 8:90)に記載されているようにエレク
トロポレーションによって達成した。
単球由来3d mDCを、Burdekら(Journal of Translational Medicine 2010
, 8:90)に記載されているように生成し、トランスフェクトした。mDCおよびミニエプ
スタイン・バール・ウイルス(mini-Epstein-Barr virus)(EBV)形質転換リンパ芽
球様細胞系(mLCL)のRNAトランスフェクションを、Burdekら(Three-day
dendritic cells for vaccine development: Antigen uptake, processing and presenta
tion. Journal of Translational Medicine 2010, 8:90)に記載されているようにエレク
トロポレーションによって達成した。
mLCLを以前に記載されているようにLCL培地中で懸濁培養として成長させた(Mi
losevic, S.et al. (2006) Identification of major histocompatibility complex clas
s II-restricted antigens and epitopes of the Epstein-Barr virus)。mLCLのタ
ンパク質負荷を、25μgの組換えヒトGAGE−1、MAGE−A4、SSX−4また
はXAGE−1タンパク質(HEK−293T細胞内での発現後、6x−cHisタグに
より富化した)の存在下で16時間、2mlのLCL培地入りの24ウェルプレート中で
2*106個の細胞を培養することによって達成した。インキュベーション期間の終わり
に、RPMI 1640を使用して細胞を2回洗浄し、特異的CD4+T細胞クローンと
共培養した。
losevic, S.et al. (2006) Identification of major histocompatibility complex clas
s II-restricted antigens and epitopes of the Epstein-Barr virus)。mLCLのタ
ンパク質負荷を、25μgの組換えヒトGAGE−1、MAGE−A4、SSX−4また
はXAGE−1タンパク質(HEK−293T細胞内での発現後、6x−cHisタグに
より富化した)の存在下で16時間、2mlのLCL培地入りの24ウェルプレート中で
2*106個の細胞を培養することによって達成した。インキュベーション期間の終わり
に、RPMI 1640を使用して細胞を2回洗浄し、特異的CD4+T細胞クローンと
共培養した。
定量的RT−PCR
トランスフェクトおよび非トランスフェクトDCの細胞内RNAを単離し、対応するc
DNAを、RT−PCR用のFirst Strand cDNA Synthesis
Kit(AMV)(Roche)を使用してオリゴ−dTプライマーにより合成した。
抗原鋳型数の差を、製造業者のマニュアルに従って、LightCycler(登録商標
)480SYBR Green I Master Kit(Roche)を使用して定
量的RT−PCR(qRT−PCR)によって決定した。RT−PCR反応のために使用
した遺伝子特異的プライマー(αEnolase、GAGE−1、MAGE−A4、SS
X−4およびXAGE−1)は要求に応じて全て利用可能である。測定をハウスキーピン
グ遺伝子αEnolaseに正規化し、ΔΔCP法に従って分析した。
トランスフェクトおよび非トランスフェクトDCの細胞内RNAを単離し、対応するc
DNAを、RT−PCR用のFirst Strand cDNA Synthesis
Kit(AMV)(Roche)を使用してオリゴ−dTプライマーにより合成した。
抗原鋳型数の差を、製造業者のマニュアルに従って、LightCycler(登録商標
)480SYBR Green I Master Kit(Roche)を使用して定
量的RT−PCR(qRT−PCR)によって決定した。RT−PCR反応のために使用
した遺伝子特異的プライマー(αEnolase、GAGE−1、MAGE−A4、SS
X−4およびXAGE−1)は要求に応じて全て利用可能である。測定をハウスキーピン
グ遺伝子αEnolaseに正規化し、ΔΔCP法に従って分析した。
T細胞およびDCの表面表現型検査
T細胞およびDCによって発現された表面マーカーを以下の抗体により検出した:PE
がコンジュゲートしたCCR7特異的抗体(3D12)(eBioscience)、H
z450がコンジュゲートしたCD4特異的抗体(RPA−T4)、Hz500がコンジ
ュゲートしたCD8特異的抗体(RPA−T8)、FITCがコンジュゲートしたCD1
4特異的抗体(M5E2)、PEがコンジュゲートしたCD40特異的抗体(5C3)、
PEがコンジュゲートしたCD40L特異的抗体(TRAP1)、PEがコンジュゲート
したCD80特異的抗体(L307.4)、FITCがコンジュゲートしたCD83特異
的抗体(HB15e)、FITCがコンジュゲートしたCD86特異的抗体(2331)
、APCがコンジュゲートしたCD137特異的抗体(4B4−1)、FITCがコンジ
ュゲートしたDC−SIGN特異的抗体(DCN46)、PEがコンジュゲートしたHL
A−DR特異的抗体(G46−6)(全てBD Biosciences製)。洗浄後、
細胞を4℃にて30分間染色し、ヨウ化プロピジウム(propidium iodid)(2μg/m
l)を、死細胞を除去するために加えた。全ての表面マーカーの発現をフローサイトメト
リーによって分析した(LSRII、BD)。獲得後、FlowJo8ソフトウェア(T
reeStar)を使用してデータ分析を行った。T細胞上でのCD40L表面発現の分
析を、2μg/mlのαCD40抗体(M.Frentsch、Berlin−Bran
denburg Center for Regenerative Therapie
sによって提供されたクローンG28.5)を使用して記載されるように実施し(Frents
ch, M. et al. (2005) Direct access to CD4+ T cells specific for defined antigens
according to CD154 expression. Nat Med 11(10): 1118-1124)、T細胞:APC共培
養の開始から6時間後に評価した。
T細胞およびDCによって発現された表面マーカーを以下の抗体により検出した:PE
がコンジュゲートしたCCR7特異的抗体(3D12)(eBioscience)、H
z450がコンジュゲートしたCD4特異的抗体(RPA−T4)、Hz500がコンジ
ュゲートしたCD8特異的抗体(RPA−T8)、FITCがコンジュゲートしたCD1
4特異的抗体(M5E2)、PEがコンジュゲートしたCD40特異的抗体(5C3)、
PEがコンジュゲートしたCD40L特異的抗体(TRAP1)、PEがコンジュゲート
したCD80特異的抗体(L307.4)、FITCがコンジュゲートしたCD83特異
的抗体(HB15e)、FITCがコンジュゲートしたCD86特異的抗体(2331)
、APCがコンジュゲートしたCD137特異的抗体(4B4−1)、FITCがコンジ
ュゲートしたDC−SIGN特異的抗体(DCN46)、PEがコンジュゲートしたHL
A−DR特異的抗体(G46−6)(全てBD Biosciences製)。洗浄後、
細胞を4℃にて30分間染色し、ヨウ化プロピジウム(propidium iodid)(2μg/m
l)を、死細胞を除去するために加えた。全ての表面マーカーの発現をフローサイトメト
リーによって分析した(LSRII、BD)。獲得後、FlowJo8ソフトウェア(T
reeStar)を使用してデータ分析を行った。T細胞上でのCD40L表面発現の分
析を、2μg/mlのαCD40抗体(M.Frentsch、Berlin−Bran
denburg Center for Regenerative Therapie
sによって提供されたクローンG28.5)を使用して記載されるように実施し(Frents
ch, M. et al. (2005) Direct access to CD4+ T cells specific for defined antigens
according to CD154 expression. Nat Med 11(10): 1118-1124)、T細胞:APC共培
養の開始から6時間後に評価した。
RNAトランスフェクトDCによるPBLのデノボプライミング
別の集団において、健常ドナーの3d mDCに、C/T−抗原GAGE−1、MAG
E−A4、SSX−4およびXAGE−1をコードする2つの単一種のCrossTAg
−RNAをトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、トランスフェクトmDC
を採取し、この混合物の混合したmDCを、1:2の比の範囲内で末梢血リンパ球(PB
L)と共培養し、それはmDC生成のプロセスにおいてPBMCのプラスチック接着の間
、非接着性であった。細胞を加湿雰囲気において37℃にて培養した。インターロイキン
−2(IL−2、20U/ml;Chiron Behring)および5ngのIL−
7/ml(Promokine)を1日後に加え、次いで1日おきに加えた。PBL共培
養のために使用しなかった混合したmDCを凍結保存し、デノボ誘発性PBL培養の再刺
激のために解凍した。
別の集団において、健常ドナーの3d mDCに、C/T−抗原GAGE−1、MAG
E−A4、SSX−4およびXAGE−1をコードする2つの単一種のCrossTAg
−RNAをトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、トランスフェクトmDC
を採取し、この混合物の混合したmDCを、1:2の比の範囲内で末梢血リンパ球(PB
L)と共培養し、それはmDC生成のプロセスにおいてPBMCのプラスチック接着の間
、非接着性であった。細胞を加湿雰囲気において37℃にて培養した。インターロイキン
−2(IL−2、20U/ml;Chiron Behring)および5ngのIL−
7/ml(Promokine)を1日後に加え、次いで1日おきに加えた。PBL共培
養のために使用しなかった混合したmDCを凍結保存し、デノボ誘発性PBL培養の再刺
激のために解凍した。
抗原特異的CD4+T細胞の単離および増殖
プライミングしたPBLを、2:1の比において、記載されているように(Frentsch,
M., (2005) Direct access to CD4+ T cells specific for defined antigens according
to CD154 expression. Nat Med 11(10): 1118--1124..)、αCD40抗体の存在下で6
時間、CrossTAg−RNAトランスフェクトmDC(4つの抗原ミックス)と共培
養した。刺激期間の後、細胞をαCD4−およびαCD40L−特異的抗体(SK3およ
びTRAP1;BD Biosciences)により染色した。死細胞を除去するため
にDAPIを加えた。FACSAria III(BD Biosciences)を使
用して、生CD40L陽性CD4+T細胞を丸底96ウェルプレートのウェル内に単一細
胞として選別した。96ウェルプレートにおいてCD4+T細胞クローンを、抗原−Cr
ossTAg ivt−RNAトランスフェクトmLCL、支持細胞およびIL−2を使
用して増殖させた。
プライミングしたPBLを、2:1の比において、記載されているように(Frentsch,
M., (2005) Direct access to CD4+ T cells specific for defined antigens according
to CD154 expression. Nat Med 11(10): 1118--1124..)、αCD40抗体の存在下で6
時間、CrossTAg−RNAトランスフェクトmDC(4つの抗原ミックス)と共培
養した。刺激期間の後、細胞をαCD4−およびαCD40L−特異的抗体(SK3およ
びTRAP1;BD Biosciences)により染色した。死細胞を除去するため
にDAPIを加えた。FACSAria III(BD Biosciences)を使
用して、生CD40L陽性CD4+T細胞を丸底96ウェルプレートのウェル内に単一細
胞として選別した。96ウェルプレートにおいてCD4+T細胞クローンを、抗原−Cr
ossTAg ivt−RNAトランスフェクトmLCL、支持細胞およびIL−2を使
用して増殖させた。
サイトカイン遊離アッセイ
活性化誘発性サイトカイン分泌を測定するために、5*104個のT細胞を、加湿雰囲
気において37℃にて、丸底96ウェルプレート内の200μlのT細胞培地中で1*1
05個のivt−RNAが負荷されたAPC(DC/mLCL)と共培養した。偽トラン
スフェクトAPCを有するか、または刺激細胞を有さないT細胞を陰性対照として使用し
た。16時間の共培養後、上清を採取し、OptEIAヒトIFN−γまたはGM−CS
F Set(両方BD Biosciences製)を使用して酵素結合免疫吸着測定法
(ELISA)によって評価した。
活性化誘発性サイトカイン分泌を測定するために、5*104個のT細胞を、加湿雰囲
気において37℃にて、丸底96ウェルプレート内の200μlのT細胞培地中で1*1
05個のivt−RNAが負荷されたAPC(DC/mLCL)と共培養した。偽トラン
スフェクトAPCを有するか、または刺激細胞を有さないT細胞を陰性対照として使用し
た。16時間の共培養後、上清を採取し、OptEIAヒトIFN−γまたはGM−CS
F Set(両方BD Biosciences製)を使用して酵素結合免疫吸着測定法
(ELISA)によって評価した。
ivt−RNAベースのTCR遺伝子移入
TCR−α−およびTCR−β−鎖の再配列および配列を、記載されているように(St
einle, A., et al. (1995) In vivo expansion of HLA-B35 alloreactive T cells shari
ng homologous T cell receptors: evidence formaintenance of an oligoclonally domi
nated allospecificity by persistent stimulationwith an autologous MHC/peptide co
mplex. J Exp Med 181(2): 503-513.)、TCR−Vα−およびTCR−Vβ−特異的プ
ライマーのパネルを使用してPCRによって決定した。それらのネズミ対応物による両方
のTCR鎖の定常領域の置換後、コドン最適化TCR−α−およびTCR−β−鎖配列を
合成し、RNA産生のために発現ベクター内にクローニングした。これらのTCR配列の
特異性を検証するために、T細胞クローン3H10の細胞(HLA−DRB1*11:0
1拘束性、EBV EBNA−3C特異的)をTCR−α−およびTCR−β−ivt−
RNAと共トランスフェクトし、サイトカイン分泌アッセイのために使用した。
TCR−α−およびTCR−β−鎖の再配列および配列を、記載されているように(St
einle, A., et al. (1995) In vivo expansion of HLA-B35 alloreactive T cells shari
ng homologous T cell receptors: evidence formaintenance of an oligoclonally domi
nated allospecificity by persistent stimulationwith an autologous MHC/peptide co
mplex. J Exp Med 181(2): 503-513.)、TCR−Vα−およびTCR−Vβ−特異的プ
ライマーのパネルを使用してPCRによって決定した。それらのネズミ対応物による両方
のTCR鎖の定常領域の置換後、コドン最適化TCR−α−およびTCR−β−鎖配列を
合成し、RNA産生のために発現ベクター内にクローニングした。これらのTCR配列の
特異性を検証するために、T細胞クローン3H10の細胞(HLA−DRB1*11:0
1拘束性、EBV EBNA−3C特異的)をTCR−α−およびTCR−β−ivt−
RNAと共トランスフェクトし、サイトカイン分泌アッセイのために使用した。
本出願は以下の実施形態をさらに含む:
実施形態1:以下のステップ:
A)抗原提示細胞における、
− 少なくとも1つの抗原またはその断片、
− 抗原のN末端の前の小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− 抗原のC末端の後のエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通
および細胞質ドメイン
を含む少なくとも1つの融合タンパク質の発現、
B)抗原提示細胞によって発現される抗原に特異的な抗原特異的Tリンパ球を活性化す
るための、in vitroでのステップA)の抗原提示細胞へのTリンパ球を含む細胞
集団の曝露
を含む、ヒト抗原特異的Tリンパ球を生成する方法。
A)抗原提示細胞における、
− 少なくとも1つの抗原またはその断片、
− 抗原のN末端の前の小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− 抗原のC末端の後のエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通
および細胞質ドメイン
を含む少なくとも1つの融合タンパク質の発現、
B)抗原提示細胞によって発現される抗原に特異的な抗原特異的Tリンパ球を活性化す
るための、in vitroでのステップA)の抗原提示細胞へのTリンパ球を含む細胞
集団の曝露
を含む、ヒト抗原特異的Tリンパ球を生成する方法。
実施形態2:ステップB)における曝露が、抗原提示細胞を、Tリンパ球を含む細胞集
団と共培養するステップである、実施形態1に記載の方法。
団と共培養するステップである、実施形態1に記載の方法。
実施形態3:ステップA)の発現が、一過性発現または安定発現、好ましくは一過性発
現である、実施形態1または2に記載の方法。
現である、実施形態1または2に記載の方法。
実施形態4:一過性発現が、少なくとも1つの融合タンパク質をコードするivt−R
NAを導入することによって実施される、実施形態3に記載の方法。
NAを導入することによって実施される、実施形態3に記載の方法。
実施形態5:C1)活性化および/または抗原特異的Tリンパ球の富化のステップをさ
らに含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
らに含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態6:活性化Tリンパ球の富化が、以下のステップ:
(a)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、活性化Tリンパ球によって特異
的に発現されるマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも1つの結合分子または
所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも1つのMHC分子と接触させるステップ、
(b)少なくとも1つの結合分子または所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも
1つのMHC分子が結合しているTリンパ球を単離するステップ
を含む、実施形態5に記載の方法。
(a)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、活性化Tリンパ球によって特異
的に発現されるマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも1つの結合分子または
所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも1つのMHC分子と接触させるステップ、
(b)少なくとも1つの結合分子または所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも
1つのMHC分子が結合しているTリンパ球を単離するステップ
を含む、実施形態5に記載の方法。
実施形態7:マーカータンパク質と特異的に結合する結合分子が、抗体、抗体の誘導体
、抗体の断片、またはさらなる分子との上述のコンジュゲートである、実施形態6に記載
の方法。
、抗体の断片、またはさらなる分子との上述のコンジュゲートである、実施形態6に記載
の方法。
実施形態8:活性化Tリンパ球によって特異的に発現される少なくとも1つのマーカー
タンパク質が、Ox40、CD137、CD40L、PD−1、IL−2受容体、インタ
ーフェロンγ、IL−2、GM−CSFおよびTNF−αを含む群から選択される、実施
形態6または7に記載の方法。
タンパク質が、Ox40、CD137、CD40L、PD−1、IL−2受容体、インタ
ーフェロンγ、IL−2、GM−CSFおよびTNF−αを含む群から選択される、実施
形態6または7に記載の方法。
実施形態9:ステップ(a)において、細胞を、CD4と特異的に結合する結合分子と
さらに接触させる、実施形態8に記載の方法。
さらに接触させる、実施形態8に記載の方法。
実施形態10:ステップ(a)において、細胞を、CD8と特異的に結合する結合分子
とさらに接触させる、実施形態8または9に記載の方法。
とさらに接触させる、実施形態8または9に記載の方法。
実施形態11:活性化CD4 T細胞を選択するステップが、以下のステップ:
(a1)抗原提示細胞および抗原特異的Tリンパ球のCD40−CD40Lの間の相互
作用を遮断し、Tリンパ球の表面にCD40Lを蓄積するために、ステップB)の細胞集
団を、CD40に対する抗体と接触させるステップ、
(a2)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、抗CD40L抗体と接触させ
るステップ、
(b)抗CD40L抗体および抗CD4抗体によりマークしたTリンパ球を単離するス
テップ
を含む、実施形態6に記載の方法。
(a1)抗原提示細胞および抗原特異的Tリンパ球のCD40−CD40Lの間の相互
作用を遮断し、Tリンパ球の表面にCD40Lを蓄積するために、ステップB)の細胞集
団を、CD40に対する抗体と接触させるステップ、
(a2)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団を、抗CD40L抗体と接触させ
るステップ、
(b)抗CD40L抗体および抗CD4抗体によりマークしたTリンパ球を単離するス
テップ
を含む、実施形態6に記載の方法。
実施形態12:C2)以下のステップ:
a)
(i)ステップA)において定義される抗原提示細胞、および
(ii)対照抗原提示細胞との、または抗原提示細胞の不在下での、
活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団の増殖した細胞クローンのインキュベーショ
ン、
b)各細胞クローンについての(i)および(ii)とのインキュベーションの活性化
プロファイルの比較、
c)b)の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Tリンパ球の同定
のステップをさらに含み、(ii)ではなく(i)による活性化が、細胞クローンが抗原
特異的であることを示す、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
a)
(i)ステップA)において定義される抗原提示細胞、および
(ii)対照抗原提示細胞との、または抗原提示細胞の不在下での、
活性化抗原特異的Tリンパ球を含む細胞集団の増殖した細胞クローンのインキュベーショ
ン、
b)各細胞クローンについての(i)および(ii)とのインキュベーションの活性化
プロファイルの比較、
c)b)の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Tリンパ球の同定
のステップをさらに含み、(ii)ではなく(i)による活性化が、細胞クローンが抗原
特異的であることを示す、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態13:ステップB)において、抗原提示細胞が、少なくとも1回、任意選択で
少なくとも2回、任意選択で少なくとも3回、任意選択で3回、Tリンパ球を含む細胞集
団に加えられる、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
少なくとも2回、任意選択で少なくとも3回、任意選択で3回、Tリンパ球を含む細胞集
団に加えられる、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態14:抗原提示細胞の反復される添加の間の時間間隔が、7〜21日、好まし
くは12〜16日、より好ましくは13〜15日、さらにより好ましくは14日である、
実施形態12に記載の方法。
くは12〜16日、より好ましくは13〜15日、さらにより好ましくは14日である、
実施形態12に記載の方法。
実施形態15:ER移行シグナル配列が、エンドソーム/リソソーム関連タンパク質に
由来する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
由来する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態16:エンドソーム/リソソーム関連タンパク質が、LAMP1、LAMP2
、DC−LAMP、CD68およびCD1b、好ましくはLAMP1を含む群から選択さ
れる、実施形態15に記載の方法。
、DC−LAMP、CD68およびCD1b、好ましくはLAMP1を含む群から選択さ
れる、実施形態15に記載の方法。
実施形態17:エンドソーム/リソソームターゲティング配列が、LAMP1またはD
C−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来する、先行する実施形態のいずれか1つ
に記載の方法。
C−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来する、先行する実施形態のいずれか1つ
に記載の方法。
実施形態18:エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞
質ドメインが、LAMP1またはDC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来する
、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
質ドメインが、LAMP1またはDC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来する
、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態19:ER移行シグナル配列がヒトである、先行する実施形態のいずれか1つ
に記載の方法。
に記載の方法。
実施形態20:エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞
質ドメインがヒトである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
質ドメインがヒトである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態21:ER移行シグナルが、配列番号33の配列またはその断片を含む、先行
する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態22:ER移行シグナル配列が、配列番号34の配列からなる、実施形態20
に記載の方法。
に記載の方法。
実施形態23:抗原提示細胞が、樹状細胞、活性化B細胞、単球、マクロファージ、E
BV形質転換リンパ芽球様細胞系、好ましくは樹状細胞、より好ましくは単球由来樹状細
胞から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
BV形質転換リンパ芽球様細胞系、好ましくは樹状細胞、より好ましくは単球由来樹状細
胞から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態24:抗原提示細胞が抗原提示細胞の異なる集団を含み、各集団が異なる抗原
融合タンパク質を発現する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
融合タンパク質を発現する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態25:抗原提示細胞が、以下のステップ:
i)単球の準備、
ii)IL−4およびGM−CSFとのステップi)の単球のインキュベーション、
iii)成熟カクテルと組み合わせたIL−4およびGM−CSFとのステップii)
の単球のインキュベーション
を含む方法によって生成される成熟樹状細胞である、先行する実施形態のいずれか1つに
記載の方法。
i)単球の準備、
ii)IL−4およびGM−CSFとのステップi)の単球のインキュベーション、
iii)成熟カクテルと組み合わせたIL−4およびGM−CSFとのステップii)
の単球のインキュベーション
を含む方法によって生成される成熟樹状細胞である、先行する実施形態のいずれか1つに
記載の方法。
実施形態26:成熟カクテルが、IL−β、TNF−α、INF−γ、TLR7/8ア
ゴニスト、PGE2およびTLR3アゴニストの組合せを含む、実施形態25に記載の方
法。
ゴニスト、PGE2およびTLR3アゴニストの組合せを含む、実施形態25に記載の方
法。
実施形態27:ステップii)のインキュベーションが少なくとも2日継続する、実施
形態25または26に記載の方法。
形態25または26に記載の方法。
実施形態28:ステップiii)のインキュベーションが、少なくとも12時間、好ま
しくは24時間継続する、実施形態25から27に記載の方法。
しくは24時間継続する、実施形態25から27に記載の方法。
実施形態29:TLR7/8アゴニストがR848であり、TLR3アゴニストがポリ
(I:C)である、実施形態28に記載の方法。
(I:C)である、実施形態28に記載の方法。
実施形態30:Tリンパ球を含む細胞集団が、末梢血リンパ球の集団である、先行する
実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態31:Tリンパ球を含む細胞集団が、分離されていない末梢血リンパ球の集団
である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態32:細胞集団が、Tリンパ球、好ましくはCD8+および/またはCD4+
Tリンパ球について富化される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
Tリンパ球について富化される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
実施形態33:融合タンパク質が少なくとも2つの抗原またはその断片を含む、先行す
る実施形態のいずれかの方法。
る実施形態のいずれかの方法。
実施形態34:実施形態1から33に記載の方法によって得ることができるTリンパ球
。
。
実施形態35:
− ヒト小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメ
イン
を含む発現ベクター。
− ヒト小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメ
イン
を含む発現ベクター。
実施形態36:ベクターが、in vitroでのmRNA転写のためのプロモーター
を含む、実施形態1に記載の発現ベクター。
を含む、実施形態1に記載の発現ベクター。
実施形態37:ER移行シグナル配列が、エンドソーム/リソソーム関連タンパク質に
由来する、実施形態35または36に記載の発現ベクター。
由来する、実施形態35または36に記載の発現ベクター。
実施形態38:エンドソーム/リソソーム関連タンパク質が、LAMP1、LAMP2
、DC−LAMP、CD68、CD1bを含む群から選択される、実施形態35から37
のいずれかに記載の発現ベクター。
、DC−LAMP、CD68、CD1bを含む群から選択される、実施形態35から37
のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態39:エンドソーム/リソソームターゲティング配列が、LAMP1またはD
C−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来する、実施形態35から38のいずれか
に記載の発現ベクター。
C−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来する、実施形態35から38のいずれか
に記載の発現ベクター。
実施形態40:エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞
質ドメインが、LAMP1またはDC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来する
、実施形態35から39のいずれかに記載の発現ベクター。
質ドメインが、LAMP1またはDC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来する
、実施形態35から39のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態41:ER移行シグナル配列がヒトである、実施形態35から40のいずれか
に記載の発現ベクター。
に記載の発現ベクター。
実施形態42:エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞
質ドメインがヒトである、実施形態35から41のいずれかに記載の発現ベクター。
質ドメインがヒトである、実施形態35から41のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態43:ER移行シグナル配列が、配列番号33の配列またはその断片を含む、
実施形態35から42のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態35から42のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態44:ER移行シグナルが、配列番号34の配列からなる、実施形態35から
43のいずれかに記載の発現ベクター。
43のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態45:エンドソーム/リソソームターゲティング配列が、配列番号38のモチ
ーフを含む、実施形態35から44のいずれかに記載の発現ベクター。
ーフを含む、実施形態35から44のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態46:エンドソーム/リソソームターゲティングシグナル配列が、配列番号3
9の配列である、実施形態35から45のいずれかに記載の発現ベクター。
9の配列である、実施形態35から45のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態47:エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞
質ドメインが、配列番号35またはその断片などの、配列番号54の配列またはその断片
を含む、実施形態35から46のいずれかに記載の発現ベクター。
質ドメインが、配列番号35またはその断片などの、配列番号54の配列またはその断片
を含む、実施形態35から46のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態48:ER移行シグナル配列と、エンドソーム/リソソームターゲティング配
列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に制限部位をさらに含む、実施形態35
から47のいずれかに記載の発現ベクター。
列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に制限部位をさらに含む、実施形態35
から47のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態49:ベクターが、ヒト小胞体(ER)移行シグナル配列と、エンドソーム/
リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に挿入され
る少なくとも1つの抗原またはその断片をさらに含む、実施形態35から48のいずれか
に記載の発現ベクター。
リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に挿入され
る少なくとも1つの抗原またはその断片をさらに含む、実施形態35から48のいずれか
に記載の発現ベクター。
実施形態50:ベクターが、ヒト小胞体(ER)移行シグナル配列と、エンドソーム/
リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に挿入され
る少なくとも2つの抗原またはその断片を含む、実施形態49のいずれかに記載の発現ベ
クター。
リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に挿入され
る少なくとも2つの抗原またはその断片を含む、実施形態49のいずれかに記載の発現ベ
クター。
実施形態51:ベクターが、抗原の完全長アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、
実施形態35から50のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態35から50のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態52:ベクターが、抗原のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片を含む、
実施形態35から51のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態35から51のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態53:抗原が腫瘍抗原またはウイルス抗原である、実施形態52に記載の発現
ベクター。
ベクター。
実施形態54:腫瘍抗原が、ウイルス腫瘍抗原、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および
患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞において発現される抗原からなる群から選
択される、実施形態53に記載の発現ベクター。
患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞において発現される抗原からなる群から選
択される、実施形態53に記載の発現ベクター。
実施形態55:腫瘍抗原が腫瘍関連抗原である、実施形態35から54のいずれかに記
載の発現ベクター。
載の発現ベクター。
実施形態56:腫瘍関連抗原が、がん/精巣抗原(C/T抗原)である、実施形態35
から55のいずれかに記載の発現ベクター。
から55のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態57:C/T抗原が、MAGE−A1、MAGE−A3、MAGE−A4、N
Y−ESO1、腫瘍/精巣抗原1B、GAGE−1、SSX−4、XAGE−1、BAG
E、GAGE、SCP−1、SSX−2、SSX−4、CTZ9、CT10、SAGEお
よびCAGEを含む群から選択される、実施形態35から56のいずれかに記載の発現ベ
クター。
Y−ESO1、腫瘍/精巣抗原1B、GAGE−1、SSX−4、XAGE−1、BAG
E、GAGE、SCP−1、SSX−2、SSX−4、CTZ9、CT10、SAGEお
よびCAGEを含む群から選択される、実施形態35から56のいずれかに記載の発現ベ
クター。
実施形態58:C/T抗原が、GAGE−1、SSX−4およびXAGE−1からなる
群から選択される、実施形態35から57のいずれかに記載の発現ベクター。
群から選択される、実施形態35から57のいずれかに記載の発現ベクター。
実施形態59:抗原特異的Tリンパ球のin vitro生成のための実施形態35か
ら58のいずれか1つに記載の発現ベクターの使用。
ら58のいずれか1つに記載の発現ベクターの使用。
実施形態60:実施形態34に記載のTリンパ球を哺乳動物に投与するステップを含む
、がんを予防または治療する方法に使用するためのTリンパ球。
、がんを予防または治療する方法に使用するためのTリンパ球。
実施形態61:実施形態1から33のいずれか1つに記載の方法のステップを含み、活
性化抗原特異的リンパ球からTCRを単離するステップをさらに含む、抗原特異的TCR
を生成する方法。
性化抗原特異的リンパ球からTCRを単離するステップをさらに含む、抗原特異的TCR
を生成する方法。
実施形態62:実施形態34に記載のリンパ球から単離されたTCR。
実施形態63:
− 配列番号5に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む
TCRα鎖、
− 配列番号6に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む
TCRβ鎖
を含む、GAGE−1に特異的なTCR。
− 配列番号5に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む
TCRα鎖、
− 配列番号6に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む
TCRβ鎖
を含む、GAGE−1に特異的なTCR。
実施形態64:
− 配列番号5と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、
配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、TC
Rα鎖、
− 配列番号6と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、
配列番号2に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、TC
Rβ鎖
を含む、実施形態63に記載のGAGE−1に特異的なTCR。
− 配列番号5と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、
配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、TC
Rα鎖、
− 配列番号6と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、
配列番号2に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、TC
Rβ鎖
を含む、実施形態63に記載のGAGE−1に特異的なTCR。
実施形態65:
− 配列番号13に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含
むTCRα鎖、
− 配列番号14に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含
むTCRβ鎖
を含む、SSX−4に特異的なTCR。
− 配列番号13に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含
むTCRα鎖、
− 配列番号14に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含
むTCRβ鎖
を含む、SSX−4に特異的なTCR。
実施形態66:
− 配列番号13と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号9に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、T
CRα鎖、
− 配列番号14と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号10に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、
TCRβ鎖
を含む、実施形態65に記載のSSX−4に特異的なTCR。
− 配列番号13と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号9に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、T
CRα鎖、
− 配列番号14と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号10に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、
TCRβ鎖
を含む、実施形態65に記載のSSX−4に特異的なTCR。
実施形態67:
− 配列番号21に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含
むTCRα鎖、
− 配列番号22に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含
むTCRβ鎖
を含む、XAGE−1に特異的なTCR。
− 配列番号21に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含
むTCRα鎖、
− 配列番号22に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含
むTCRβ鎖
を含む、XAGE−1に特異的なTCR。
実施形態68:
− 配列番号21と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号17に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、
TCRα鎖、
− 配列番号22と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号18に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、
TCRβ鎖
を含む、実施形態66に記載されるXAGE−1に特異的なTCR。
− 配列番号21と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号17に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、
TCRα鎖、
− 配列番号22と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号18に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、
TCRβ鎖
を含む、実施形態66に記載されるXAGE−1に特異的なTCR。
実施形態69:
− 配列番号29に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含
むTCRα鎖、
− 配列番号30に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR領域を含む
TCRβ鎖
を含む、XAGE−1に特異的なTCR。
− 配列番号29に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含
むTCRα鎖、
− 配列番号30に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR領域を含む
TCRβ鎖
を含む、XAGE−1に特異的なTCR。
実施形態70:
− 配列番号29と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号25に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、
TCRα鎖、
− 配列番号30と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号26に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR領域を含む、T
CRβ鎖
を含む、実施形態68に記載のXAGE−1に特異的なTCR。
− 配列番号29と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号25に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む、
TCRα鎖、
− 配列番号30と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ
、配列番号26に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR領域を含む、T
CRβ鎖
を含む、実施形態68に記載のXAGE−1に特異的なTCR。
実施形態71:がんを予防または治療する方法に使用するための実施形態62から70
のいずれか1つに記載のTCR。
のいずれか1つに記載のTCR。
実施形態72:実施形態62から70のいずれか1つに記載のTCRを哺乳動物に投与
するステップを含む、がんを予防または治療する方法。
するステップを含む、がんを予防または治療する方法。
Claims (15)
- 以下のステップ:
A)抗原提示細胞における、
− 少なくとも1つの抗原またはその断片、
− 前記抗原のN末端の前の小胞体(ER)移行シグナル配列、ならびに
− 前記抗原のC末端の後のエンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む膜
貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも1つの融合タンパク質の発現、ならびに
B)前記抗原提示細胞によって発現される前記抗原に特異的な抗原特異的Tリンパ球を
活性化するための、in vitroでのステップA)の前記抗原提示細胞へのTリンパ
球を含む細胞集団の曝露
を含む、ヒト抗原特異的Tリンパ球を生成する方法。 - 前記融合タンパク質が、少なくとも2つの抗原またはその断片を含む、請求項1に記載
の方法。 - C1)以下のステップ:
(a)活性化抗原特異的Tリンパ球を含む前記細胞集団を、活性化Tリンパ球によって
特異的に発現されるマーカータンパク質と特異的に結合する結合分子または所望の抗原の
エピトープを提示するMHC分子と接触させるステップ、
(b)前記結合分子または前記所望の抗原のエピトープを提示する前記MHC分子が結
合しているTリンパ球を単離するステップ
を含む活性化および/または抗原特異的Tリンパ球の富化
のステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。 - 活性化Tリンパ球によって特異的に発現されるマーカータンパク質が、Ox40、CD
137、CD40L、PD−1、IL−2受容体、インターフェロンγ、IL−2、GM
−CSFおよびTNF−αからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。 - C2)以下のステップ:
a)
(i)ステップA)において定義される抗原提示細胞、および
(ii)対照抗原提示細胞との、または抗原提示細胞の不在下での、
活性化抗原特異的Tリンパ球を含む前記細胞集団の増殖した細胞クローンのインキュベー
ション、
b)各細胞クローンについての(i)および(ii)との前記インキュベーションの活
性化プロファイルの比較、
c)b)の前記比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Tリンパ球の同定
のステップをさらに含み、(ii)ではなく(i)による前記活性化が、前記細胞クロー
ンが抗原特異的であることを示す、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ER移行シグナル配列が、エンドソーム/リソソーム関連タンパク質に由来し、前
記エンドソーム/リソソーム関連タンパク質が、LAMP1、LAMP2、DC−LAM
P、CD68およびCD1b、好ましくはLAMP1を含む群から選択される、請求項1
から5のいずれか一項に記載の方法。 - エンドソーム/リソソームターゲティング配列を含む前記膜貫通および細胞質ドメイン
が、LAMP1またはDC−LAMP、好ましくはDC−LAMPに由来する、請求項1
から6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ER移行シグナル配列がヒトであり、エンドソーム/リソソームターゲティング配
列を含む前記膜貫通および細胞質ドメインがヒトである、請求項1から7のいずれか一項
に記載の方法。 - 前記抗原提示細胞が抗原提示細胞の異なる集団を含み、各集団が異なる抗原融合タンパ
ク質を発現する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記抗原提示細胞が、以下のステップ:
i)単球の準備、
ii)IL−4およびGM−CSFとのステップi)の前記単球のインキュベーション
、
iii)成熟カクテルと組み合わせたIL−4およびGM−CSFとのステップii)
の前記単球のインキュベーションであって、前記成熟カクテルはIL−β、TNF−α、
INF−γ、TLR7/8アゴニスト、PGE2およびTLR3アゴニストの組合せを任
意選択で含む、インキュベーション
を含む方法によって生成される成熟樹状細胞である、請求項1から9のいずれか一項に記
載の方法。 - Tリンパ球を含む細胞集団が、分離されていない末梢血リンパ球の集団である、請求項
1から10のいずれか一項に記載の方法。 - Tリンパ球を含む前記細胞集団が、Tリンパ球、好ましくはCD8+および/またはC
D4+Tリンパ球について富化される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1から12のいずれか一項に記載の方法のステップを含み、前記活性化抗原特異
的リンパ球からTCRを単離するステップをさらに含む、抗原特異的TCRを生成する方
法。 - − 配列番号5に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む
TCRα鎖、
− 配列番号6に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含む
TCRβ鎖
を含む、GAGE−1に特異的なTCR。 - − 配列番号5と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、
配列番号1に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含むTCR
α鎖、
− 配列番号6と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、
配列番号2に示されるヌクレオチド配列によってコードされるCDR3領域を含むTCR
β鎖
を含む、請求項14に記載のGAGE−1に特異的なTCR。
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