JP2013520970A - 発現ベクター - Google Patents
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Abstract
Description
(a)本発明のベクターを用いることで該特定のタンパク質を細胞表面に発現する細胞によって、非ヒト動物を免疫化する工程;
(b)工程(a)の非ヒト動物の脾臓細胞を単離する工程;
(c)B細胞ハイブリドーマを作製するために、工程(b)の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合する工程;および
(d)該特定のタンパク質に対する抗体を発現するB細胞ハイブリドーマを同定する工程。
熱帯熱マラリア原虫ORF PFF0620c、ヒトABCA1細胞外ドメイン、およびラットTMEM27細胞外ドメインを、それぞれ発現プラスミドpANITA2-PFF0620C、pANITA2-ABCA1、またはpANITA2-TMEM27を使って、HEK細胞の細胞表面に発現させた。細胞表面での高レベルな発現を保証するために、遺伝子をいくつかの方法で改変した(図1):i.内在性配列のコドンを哺乳動物細胞における発現に関して最適化し、予測細胞外ドメインだけを使用した;ii.内在性分泌シグナル配列を、ハチ毒メリチンの分泌シグナル配列で置き換えた;iii.膜アンカリングのために、予測GPI付着シグナル配列または予測膜貫通ドメインの代わりに、マウスグリコフォリンAの膜貫通ドメインコード配列を使用した;iv.発現分析を可能にするために、FLAGタグを膜貫通ドメインのN末端に挿入し、6×HisタグをC末端に置いた。これら2つのタグは、組換えにより発現された抗原の細胞外局在の立証を容易にするために、膜貫通ドメインの直前と直後に配置した。
PFF0620c-HEKの高発現細胞プールを使ってNMRIマウスを免疫化した。マウスに、106個の細胞の静脈内注射を3日間連続して行い、2週間後にもう一度、3回の連日注射を行った。トランスフェクタントの免疫染色を非トランスフェクトHEK細胞の免疫染色と比較するフローサイトメトリーによって、血清抗体価の発達を分析した。トランスフェクタントで観察された蛍光強度は、非トランスフェクト対照HEK細胞で観察されたものより4倍高かった。これは、トランスフェクトHEK細胞の表面に発現したマラリア抗原に対する抗体応答を、マウスが開始していたことを示した。
本発明者らは、熱帯熱マラリア原虫SCIDマウスモデルにおける抗PFD1130w mAbのインビボ寄生虫阻害活性を評価した。熱帯熱マラリア原虫PFF0620cに対するmAbの作製に使用したものと同じ方法およびベクターを使って、抗PFD1130w mAbを製造した(下記の方法の項を参照されたい)。このモデルでは、熱帯熱マラリア原虫の成長が可能になるように、ヒト赤血球を移植した非骨髄枯渇NOD-scid IL2Rnullマウスを使用する。0.58±0.14%の寄生虫血を有するマウス3匹ずつの各群に、それぞれマウス1匹あたり2.5mgの抗PFD1130w c12 mAb、0.5mgの抗PFD1130w c12 mAb、または2.5mgのアイソタイプ/サブクラス対照mAbを、1回注射した。続く6日間にわたって全てのマウスの寄生虫血を監視した。PBSのみまたは対照mAbを受けたマウスにおける寄生虫血は増加し続けて6日後には11.3±0.8%に達したのに対し、0.5mgの抗PFD1130w c12 mAbを受けたマウスでは寄生虫血の増加の程度がはるかに低く、6日後に5.6±1.3%に達した。2.5mgの抗PFD1130w c12 mAbを受けたマウスの寄生虫血は、実験の終了時まで低いままだった(6日目に1.4±0.3%)。陰性対照群と比較した6日後の寄生虫血の相違は著しく有意だった(両側t検定;P<0.0001)(図6)。
プラスミドの構築および形質転換
ハチ毒メリチンの分泌シグナル配列をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを、NheI消化pcDNA3.1(+)(Invitrogen)にライゲーションすることにより、シグナル配列の3'に1つのNheI部位を保っているプラスミドpcDNA3.1_BVMを得た。骨髄から抽出したRNAをテンプレートとして使用し、rtPCR(Invitrogen SuperScript III First Strand SynthesisキットおよびRoche Expand High Fidelity PCR System)によって、マウスグリコフォリンの細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインcDNAを得た。その結果得られたPCRアンプリコンをpCR2.1クローニングベクター中にクローニングした。マウスグリコフォリンに対するプライマーは5'NotI部位と3'ヒスチジンタグを含有し、その後ろに停止コドンとEagI部位が続いた。グリコフォリン-6HisフラグメントをEagIで切り出し、NotI消化pcDNA3.1_BVMにライゲーションすることにより、グリコフォリン配列の5'端にpcDNA3.1 NotI部位が保存されているプラスミドpcDNA3.1_BVM_GPを得た。発現ベクターの完成品(pANITA2)を作出するために、短いリンカー配列で挟まれたFlagタグをコードしていてFlagタグの5'側にユニークNotI部位をもたらす二本鎖オリゴヌクレオチドを、NotI消化pcDNA3.1_BVM_GP中にライゲーションした。
JetPEI(商標)(PolyPlus)トランスフェクション試薬を製造者のプロトコールに従って使用することにより、293HEK細胞に、pANITA2-TMEM27、pANITA2-PFF0620C、またはpANITA2-ABCA1をトランスフェクトした。抗生物質選択をトランスフェクションの48時間後に開始した。500μg/mlのジェネティシン(Gibco)を含有する選択培地を3〜4日毎に交換した。非抗生物質耐性細胞が死滅し、耐性細胞が正常に増殖し始めた後、FACSによって高発現プールを作製した。細胞を酵素不含解離緩衝液(細胞解離緩衝液、酵素不含、ハンクス平衡塩、Gibco)で解離し、ブロッキング緩衝液(3%BSAを含有するPBS)で洗浄した。次に細胞を、ブロッキング緩衝液で希釈した200μlの100μg/ml抗FLAG mAb=FLAG-27と共に、氷上で15分間インキュベートした。次に細胞をブロッキング緩衝液で洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した200μlの100μg/ml FITC結合ヤギ抗マウスIgG抗体(RAM/IgG(H+L)/FITC、Nordic Immunological Laboratories)と共に、氷上で15分間インキュベートした。最終洗浄後に、標識された細胞を分析し、FACSDivaソフトウェアを実行するBD FACSAriaを使って選別した。分析は全て、細胞片および凝集物を除外するために適切な散乱ゲートを使って行った。高度に標識された細胞が集められるように、ゲーティング設定を設定した。選別後、20%FCSを含む培養培地に細胞を集め、35mmウェルにプレーティングした。
HEK生細胞の免疫蛍光染色には、チャンバースライド(4ウェルチャンバースライド、Lab-Tek(商標)、Nunc(商標))を使用した。ウェルを、H2O中の100mg/lポリ-D-リジンで、湿潤箱中、室温にて、終夜コーティングした。ウェルを滅菌H2Oで3回洗浄した後、1ウェルにつき40,000個の細胞を播種した。3日後に、ウェルを、無血清培養培地で希釈した500μlの適切なmAbと共に、氷上で30分間インキュベートすることによって、免疫染色を行った。無血清培養培地で2回洗浄した後、無血清培養培地で希釈した500μlの100μg/ml FITC結合ヤギ抗マウスIgG抗体(RAM/IgG(H+L)/FITC、Nordic Immunological Laboratories)をウェルに加え、氷上で30分間インキュベートした。最後に、ウェルを無血清培養培地で2回、DPBS(カルシウムを含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、Gibco)で1回、すすいだ。DAPIを含有する封入溶液(DAPIを含むProLong(登録商標)Gold褪色防止試薬、Invitrogen)でスライドを封入し、カバーガラスで覆った。染色を上述の通りに評価した。
106個の安定トランスフェクトHEK細胞の静脈内注射によってNMRIマウスを免疫化した。細胞を解凍し、洗浄し、0.9%NaClに再懸濁した。注射は、3日間連続して行い、2週間後に、再び3日間連続して行った。追加免疫後に、血液を採取し、安定トランスフェクト293HEK細胞を用いるIFAにより、血清を抗PFF0620C抗体の存在について調べた。
Maxisorp(商標)プレート(Nunc)を、PBSに希釈した100μlの5μg/mlヤギ抗マウスIgG(γ鎖特異的)mAb(Sigma)で、湿潤箱中、4℃にて、終夜コーティングした。0.05%Tween-20を含有するPBSで2回洗浄した後、ウェルを、ブロッキング緩衝液(50mMトリス、140mM NaCl、5mM EDTA、0.05%NONidet P40、0.25%ゼラチン、1%BSA)で、37℃にて1時間ブロッキングし、その後、2回洗浄した。50μlのハイブリドーマ上清をウェルに加え、37℃で1時間インキュベートした。4回洗浄した後、プレートを、ブロッキング緩衝液で1:1000希釈した50μlのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG(γ鎖特異的)(Sigma)と共に、湿潤箱中、暗所、室温にて、1時間インキュベートした。4回洗浄した後、TMBペルオキシダーゼ基質溶液を加え、色の変化を監視した。
抗体アイソタイプの同定は、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(ISO2、Sigma)を使って行った。大規模mAb産生のために、ハイブリドーマ細胞株を500mlのローラーボトル(Corning)で培養した。プロテインAまたはプロテインGセファロースを使ったアフィニティクロマトグラフィーによってmAbを精製した。
Claims (17)
- 分泌シグナルペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド配列、
発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を挿入するためのクローニング部位、および
グリコフォリンの膜貫通ドメインをコードする配列を含むポリヌクレオチド配列
を順に含む、タンパク質の細胞表面発現のための核酸発現ベクター。 - グリコフォリンの膜貫通ドメインがグリコフォリンAの膜貫通ドメインである、請求項1記載の核酸ベクター。
- グリコフォリンAの膜貫通ドメインがマウスグリコフォリンA膜貫通ドメインまたはアルメニアンハムスターグリコフォリンAドメインである、請求項1または2記載の核酸ベクター。
- マウスグリコフォリンAドメインが、配列番号1に開示するアミノ酸を含み、かつアルメニアンハムスターグリコフォリンAドメインが、配列番号12に開示するアミノ酸配列を含む、請求項3記載の核酸ベクター。
- 分泌シグナルペプチドがハチ毒メリチンの分泌シグナルペプチドである、請求項1〜4のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- ハチ毒メリチンの分泌シグナルペプチドが、配列番号2に開示するアミノ酸配列を含む、請求項5記載の核酸ベクター。
- 発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を挿入するためのクローニング部位の下流(3')に、配列番号3のアミノ酸配列を含むFLAGタグをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- グリコフォリンの膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列の下流(3')に、Hisタグ、好ましくは配列番号4に開示するアミノ酸配列を含むHisタグをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- クローニング部位が、NheI、KpnI、BamHI、EcoRI、EcoRV、およびNotIの制限酵素切断部位を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- 配列番号5、配列番号13、配列番号14、または配列番号15からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- 発現させるタンパク質が膜結合型タンパク質である、請求項1〜10のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- 請求項1〜11のいずれか一項記載のベクターを含む、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはHEK細胞。
- 抗体作製に適したタンパク質の発現のための、請求項12記載の細胞の使用。
- 抗体作製に向けた、好ましくはモノクローナル抗体作製に向けた、非ヒト動物の免疫化のための、請求項12記載の細胞の使用。
- 特定のタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製するための方法であって、
(a)請求項1〜11のいずれか一項記載のベクターを用いることで該特定のタンパク質を細胞表面に発現する細胞によって、非ヒト動物を免疫化する工程;
(b)工程(a)の非ヒト動物の脾臓細胞を単離する工程;
(c)B細胞ハイブリドーマを作製するために、工程(b)の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合する工程;および
(d)該特定のタンパク質に対する抗体を発現するB細胞ハイブリドーマを同定する工程
を含む、前記方法。 - 非ヒト動物がマウスまたはハムスターである、請求項15記載の方法。
- 上述の発明。
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JPN5013003652; PUTTIKHUNT CHUNYA: 'PRODUCTION OF ANTI-DENGUE NS1 MONOCLONAL ANTIBODIES BY DNA IMMUNIZATION' JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS V109 N1, 200304, P55-61 * |
JPN6014054660; Gene 77, 1989, p.325-332 * |
JPN6014054662; Li J.-H. and Zhang C.-X.: 'Transcription and expression of melittin gene in the venom gland of the Chinese honeybee, Apis ceran' Database UNIPROT [online], Accessin No. P68407, <http://www.uniprot.org/uniprot/P68407.txt?version=2 * |
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