ES2621298T3

ES2621298T3 - Vector de expresión

Info

Publication number: ES2621298T3
Application number: ES11708221.4T
Authority: ES
Inventors: Jeremy Beauchamp; Anita Dreyer; Hugues Matile
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2010-03-02
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2017-07-03
Anticipated expiration: 2031-02-28
Also published as: CN102782142A; KR20130048193A; MX2012009942A; EP2542683A1; WO2011107409A1; US20130115219A1; JP2013520970A; US20140335097A1; CA2789063A1; RU2012140065A; EP2542683B1; BR112012020588A2; US9957307B2

Abstract

Un vector de expresión de ácido nucleico, para la expresión de la superficie celular de proteínas, el cual comprende, en orden, una secuencia polinucleotídica, la cual codifica a un péptido señal de secreción de la melitina del veneno de la abeja, un sitio de clonación para insertar un secuencia polinucleotídica, la cual codifica a una proteína a ser expresada, y una secuencia polinucleotídica, la cual comprende una secuencia que codifica a un dominio transmembranario de la glicoforina A.

Description

Vector de expresión

Desde el descubrimiento de los anticuerpos monoclonales, (mAbs), en el año 1975, por parte de Kohler y Milstein,

5 éstos se han convertido en herramientas moleculares, de un valor inestimable. Debido a su alta especificidad, los anticuerpos monoclonales (mAbs), se utilizan para técnicas estándar, de la biología en su totalidad, siendo éstas la clave para la caracterización de la función y la de la distribución de las proteínas. Aparte de su uso en la investigación de base, los mAbs, se utilizan así mismo, también, de una forma muy extensa y generalizada, como agentes de diagnóstico y como agentes terapéuticos. Debido a esta extensa variedad de aplicaciones, la generación

10 de mAbs, se ha convertido en un procedimiento estandarizado. Sin embargo, no obstante, ello puede todavía resultar problemático, debido el hecho de que, para estudios, en escenarios fisiológicos, es importante el que, los mAbs, reconozcan el antígeno, en su configuración o constitución nativa.

De la forma más usual, los mAbs, se postulan contra los péptidos sintéticos derivados de la secuencia pronosticada

15 como la proteína diana. Lamentablemente, estos Abs, a pesar de ser fuertemente reactivos con los péptidos, de una forma frecuente, éstos fallan en la función de reconocer la proteína nativa. Otro procedimiento estándar, para generar mAbs es que utiliza proteína expresada recombinantemente. Los sistemas de expresión procariótica, son los huéspedes de expresión más ampliamente utilizados. Pero, cuando se estudian proteínas de superficie de mamíferos, es a menudo necesario, el utilizar sistemas de expresión de mamíferos, ya que, éstos, son más

20 propensos a producir proteínas funcionales, con los apropiados enlaces de disulfuro, glicolisaciones post-traducción,

o modificaciones proteolíticas. La purificación de proteínas recombinantes es, a menudo, una tarea laboriosa y pesada, representando, frecuentemente, una etapa limitativa, en cuanto a lo referente a la obtención de anticuerpos. Si bien, la introducción de marcajes identificativos de identidad, simplifican la purificación, es no obstante a menudo difícil, el obtener una proteína recombinante, en su constitución o estructura nativa, en una rendimiento productivo y

25 una pureza suficientes. Esto se aplica, de la forma más notable, a las proteínas asociadas a membranas, ya que, éstas, son más propensas a perder su estructura nativa, durante los procesos de producción.

Cuando se intenta generar mAbs, los cuales sean capaces de reconocer la proteína, en su contexto nativo, es también crítico, así mismo, el utilizar proteína, en su constitución o estructura nativa, no únicamente en su etapa de

30 inmunización, sino así mismo, también, para el procedimiento de exploración de rastreo. Muchos protocoles de exploración de rastreo de hibridomas, tal como el consistente en la inmovilización de proteínas recombinantes, sobre soportes sólidos, pueden modificar, de una forma significativa, la estructura o constitución o estructura. Por estas razones, los mAbs seleccionados en base a su unión a proteínas recombinantes, pueden no unirse a la misma proteína, cuando ésta se encuentra en su contexto nativo.

35 El arte anterior de la técnica especializada, incluye, en el trabajo presentado en J. Virol. Methods, vol. 109, 2003, páginas 55 -61, en donde, se da a conocer un vector de expresión, el posibilita la producción de una proteína NS1, del virus del dengue, en la superficie de células, comprendiendo, el vector en cuestión, como elementos esenciales, en orden, una secuencia líder de cadena de ligera de Ig Kappa, murina, una secuencia que codifica a un porción

40 extracelular de NS1, y una secuencia que codifica a una secuencia de anclaje transmembrana, procedente del PDGF-R.

Existe, por lo tanto, una necesidad, en cuanto a hecho de poder disponer de sistemas de expresión de antígenos, adicionales, los cuales permitan la expresión de antígenos, en su estructura o constitución nativa, sobre la superficie

45 celular de las células. La presente invención, se exponen en las reivindicaciones las cuales se adjuntan a este documento de solicitud de patente.

En un primer objeto de la presente revelación de la invención, ésta proporciona un vector de expresión del ácido nucleico, para la expresión de la superficie celular de proteínas, el cual comprende, en orden, una secuencia

50 polinucleotídica, la cual codifica a un péptido señal de secreción, un sitio de clonación para insertar un secuencia polinucleotídica, la cual codifica un proteína a ser expresada, y una secuencia polinucleotídica, la cual codifica a dominio transmembranario de glicoforina.

En una forma preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, de un vector de expresión de 55 ácido nucleico, el dominio transmembranario de glicoforina, es el dominio transmembranario de glicoforina A.

En una forma adicionalmente preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, del vector de expresión de ácido nucleico, el dominio transmembranario de glicoforina A, es la glicoforina A del ratón, o el dominio transmembranario de glicoforina A, del hámster armenio.

60 En una forma adicionalmente preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, del vector de expresión del ácido nucleico, el dominio transmembranario de glicoforina A del ratón, comprende la secuencia de

aminoácidos la cual se da a conocer encuentra en la Seq. Id. No. 1, y el dominio de glicoforina del Hamster Armenio, comprende la secuencia de aminoácidos la cual se da a conocer en la Seq. Id. No. 12

En una forma adicionalmente preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, del vector de 5 expresión de ácido nucleico, el péptido señal de secreción, es el péptido señal de secreción de melitina del veneno de abejas.

En una forma adicionalmente preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, del vector de expresión de ácido nucleico, el péptido señal de secreción de melitina del veneno de abejas, comprende la secuencia de aminoácidos la cual se da a conocer en la Seq. Id. No. 2.

En una forma adicionalmente preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, el vector de expresión de ácido nucleico, comprende, de una forma adicional, el sitio de clonación, aguas abajo (3’) del sitio de clonación para insertar una secuencia polinucleotídica, la cual codifica a una proteína a ser expresada, una

15 secuencia polinucleotídica, la cual codifica a un marcador FAG, el cual comprende la secuencia de aminoácidos de la Seq. Id. No. 3.

En una forma adicionalmente preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, el vector de expresión de ácido nucleico, comprende, aguas abajo (3’) del sitio de clonación, para insertar una secuencia de aminoácidos la cual codifica a un dominio de glicoforina, una secuencia de ácido nucleico, la cual codifica a un marcador His, de una forma preferible, un marcador His, el cual comprende la secuencia de aminoácidos, la cual se da a conocer en la Seq. Id. No. 4.

En una forma adicionalmente preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, del vector de

25 expresión de ácido nucleico, el sitio de clonación, comprende los sitios de segmentación de enzimas de restricción, NheI, KpnI, BamHI, EcoRI, EcoRV y NotI.

En una forma adicionalmente preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, el vector de expresión de ácido nucleico, comprende una secuencia polinucleotídica, la cual se selecciona de entre grupo consistente en las Seq. Id. No. 5, Seq. Id. No. 13, Seq. Id. No. 14 , y Seq. Id. No. 15.

En una forma adicionalmente preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, del vector de expresión de ácido nucleico, la proteína a ser expresada, en una proteína asociada a membrana.

35 En una forma adicionalmente preferida de presentación, del vector de expresión de ácido nucleico, la proteína a ser expresada, es un una proteína asociada a membrana.

En un segundo objeto, la presente revelación de la invención, proporciona una célula, la cual comprende el vector de la presente invención, comprendiendo, de una forma preferible, una célula de mamífero, y de una forma más preferible, una célula HEK.

En un tercer objeto, la presente revelación de la invención, proporciona un procedimiento, para la generación de anticuerpos monoclonales, contra una proteína específica, el cual comprende las etapas de:

45 a) la inmunización de un animal no humano, mediante células que expresan, en sus superficies celulares, la proteína específica, mediante la utilización del vector de la presente invención,

b) el aislamiento de células esplénicas de los animales no humanos de la etapa a),

c) la fusión de las células esplénicas de etapa b), con células de mieloma, para generar hibridomas de células (linfocitos) B, y

d) la identificación de hibridomas de linfocitos B, que expresen anticuerpos dirigidos contra la proteína específica.

55 En una forma preferida de presentación del procedimiento de la presente revelación, en concordancia con la presente invención, el animal no humano, es un ratón, o bien, éste es un hámster armenio.

“El vector de expresión de ácido nucleico”, se refiere a una formación o conjunto, el cual es capaz de dirigir la expresión de una secuencia o gen de interés. El vector de expresión de ácido nucleico, incluye un promotor, el cual se encuentra vinculado, de una forma susceptible de poderse operar, a las secuencias o gen(es) de interés. El vector de expresión de ácido nucleico, incluye a un promotor, el cual es susceptible de poderse operar, vinculado a las secuencias del gen o de los genes de interés. Pueden también encontrarse presentes, así mismo, también, otros elementos de control. De una forma adicional, el vector, puede también incluir, así mismo, un origen bacteriano de replicación, uno o más marcadores los cuales son susceptibles de poderse seleccionar, una señal, la cual permite el 65 hecho de que, el vector, exista como un DNA de hebra individual, (tal como, por ejemplo, el consistente en un origen

de replicación M 13), un sitio de clonación múltiple, y una replicación de origen “mamífero” (tal como el consistente en un origen de replicación ó adenovirus, SV40). Un “vector”, es capaz de transferir secuencias genéticas, a las células objetivizadas como diana (tal como, por ejemplo, los consistentes en los vectores víricos, en los vectores no víricos, en los portadores de partículas, y en los liposomas). El vector en cuestión, se utiliza para transportar el DNA

5 foráneo o heterólogo, en una célula huésped apropiada. Una vez se encuentra en la célula huésped, el vector, puede replicarse de una forma independiente del DNA cromosómico, y pueden generarse diversas copias del vector y de su DNA (foráneo) insertado.

El término “proteína, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, se refiere a un

10 polímero de aminoácidos, y no a una longitud específica. Así, de este modo, en el ámbito de la presente invención, en la definición de polipéptidos, se incluyen péptidos, oligopéptidos, y fragmentos de proteínas.

El término “anticuerpo monoclonal”, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, se refiere a un anticuerpo, el cual se ha obtenido de procedencia de una población de anticuerpos homogéneos,

15 substancialmente homogéneos, a saber, en donde, los anticuerpos individuales, los cuales comprenden la población en cuestión, son idénticos, para posibles mutaciones de origen natural, las cuales pueden encontrarse presentes en cantidades menores. El modificador “monoclonal”, indica el carácter del anticuerpo, como habiéndose obtenido a partir de una población de anticuerpos, substancialmente homogénea, y ésta no debe considerarse como requiriendo la producción de un anticuerpo, de un procedimiento particular. Así, por ejemplo, los anticuerpos

20 monoclonales a ser utilizados en concordancia con la presente invención, pueden producirse mediante el procedimiento de hibridomas, el cual fue descrito, en primer lugar, por parte de kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495, ó bien, éstos pueden producirse mediante procedimientos de DNA recombinante (véase, a dicho efecto, la patente estadounidense U S nº 4. 816. 567 (Cabilly et al.), y el trabajo de Mage y Lamoyi (1987), en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, -Técnicas y aplicaciones de la producción de anticuerpos

25 monoclonales -, páginas 79 -97, Marcel Dekker, Inc., New York). Los anticuerpos monoclanes, pueden también aislarse, así mismo, a partir de bibliotecas de fagos, generadas mediante la utilización de, por ejemplo, las técnicas las cuales se encentran descritas por parte de McCafferty et al. (1990), en Nature 348: 552 – 554.

Descripción resumida de las figuras

30 La figura 1 A, muestra la estructura primaria de las proteínas ABCA1 humana (Seq. Id. No. 7), TMEM27 de la rata (Seq. Id. No. 9) y P. falciparum PFF0620c (Seq. Id. No. 11), las cuales se utilizan en los ejemplos. Los dominios utilizados para las construcciones las cuales se encentran descritas, se encuentran marcadas con las líneas diagonales, con los aminoácidos, en los términos N y C, indicados;

35 La figura 1 B, muestra diagramas esquemáticos de las construcciones de proteínas expresadas, derivadas de los vectores los cuales se encuentran descritos en los ejemplos. Los dominios extracelulares, son equivalentes de aquéllos los cuales se muestran en la figura 1 A;

40 La figura 2, muestra una transferencia Western, mediante la utilización de un anticuerpo conjugado anti-FLAG M2-HRP (de procedencia de la firma Sigma), de lisados celulares globales, procedentes de células HEK 293, transfectadas con pANITA2-ABCA1l y pANITA2-TMEM27. Puede verse una fuerte expresión, mediante bandas, a los apropiados pesos moleculares;

45 La figura 3 A, muestra la expresión de superficie celular de PFF0620C, en células HEK transfectadas. Los micrográficos de contraste por fluorescencia (columna 2 y 3), y de contraste por interferencia diferencial (columna 1) de las células HEK no transfectadas (línea 1), y células KEK que exhiben la PFF0620C (línea 2). Las células, se cultivaron en platinas portaobjetos de cámara, y éstas se marcaron, sin fijación, mediante anticuerpo anti-FLAG, y anticuerpos anti IgG del ratón, marcados con FITC. Los núcleos, se marcaron con DAPI.

50 La figura 3 B, muestra la localización extracelular de la PFF0620C, en células HEK, transfectadas de una forma estable. Los micrográficos de contraste por fluorescencia (línea 1 y 3), y el micrográfico de contraste por interferencia diferencial (línea 2 y 4) de las células PFF0620C-HEK, después de marcaje con anticuerpos anti-FLAG (columna izquierda), o anticuerpos anti-6xHis (columna derecha) y anticuerpos anti-IgG del ratón, marcados con

55 FITC. Mediante el anticuerpo anti-FLAG, se marcaron células vivas y células fijadas con metanol, mientras que, el anticuerpo anti-His, sólo se marcaron células fijadas en metanol, indicando una localización intracelular del marcador His (His-tag), y la localización extracelular del marcador FLAG (FLAG-tag), conjuntamente con un dominio de proteína derivado del P. falciparum.

60 La figura 4, muestra el resultado de una exploración de rastreo de anticuerpos, para la unión a células transfectadas. En una segunda etapa, todos pozos positivos para la producción de la IgG, se sometieron a una exploración de rastreo, para la unión de anticuerpos, a las células transfectadas, mediante IFA (ensayo de inmunotransferencia – [IDA, de sus siglas, en idioma inglés, correspondientes a inmuno fluorescence asay] -). Se procedió a marcar las células HK transfectadas, y no transfectadas, colocadas sobre las platinas portaobjetos de múltiples pozos, con

sobrenadantes de hidridomas individuales, y se procedió a llevar a cabo un análisis de éstas, mediante microscopía de fluorescencia.

La figura 5, muestra un análisis de transferencia western, de la reactividad generada de los anticuerpos

5 monoclonales generados, con las proteínas de P. falciparum recombinantes. La especificidad de anticuerpos monoclonales representativos, para las correspondientes proteínas recombinantes, se demuestra mediante un análisis de transferencia Western. Se procedió a probar lisados de PFF0620c-(línea 1), construcciones de pANITA2 de control, con contenido de proteínas no relacionadas (líneas 2 y 3), y células HEK, no tansfectadas (línea 4), con anti-6xHis mAb y un anti-PFF0620cmAb, generadas, respectivamente, de la forma la cual se describe.

La figura 6, muestra el hecho de que, los anticuerpos monoclonales PFD1130w-específicos, inhiben los parásitos los cuales se han hecho crecer in vivo (cultivados in vivo).

Ejemplos

15 Expresión de proteínas sobre la superficie celular de células de mamíferos.

Se procedió a cultivar el P. falciparum ORF PFF0620c, el dominio extracelular ABCA1 humano, y el dominio extracelular TMEM27 de la rata, en la superficie celular de células HEK, mediante la utilización de los plásmidos pANITA2-PFF0620C; pANITA2-ABCA1, ó pANITA2-TMEM27, respectivamente. Con objeto de asegurar unos altos niveles de expresión, en la superficie celular, los genes, se modificaron mediante diversas vías (véase, a dicho efecto, la figura 1): i.-las secuencias endógenas, se optimizaron mediante codones, para la expresión de células de mamíferos, y únicamente se utilizaron dominios extracelulares previstos; ii.-las secuencias se señal de secreción endógena, se reemplazaron mediante una secuencia de señal de secreción, de la melitina del veneno de la abeja;

25 iii.-para el anclaje de la membrana, se utilizó el dominio transmembranario que codifica a la secuencia de la glicoforina A del ratón, en lugar de la secuencia de señal de unión a GPI, pronosticada, o de los dominios transmembranarios pronosticados; iv.-para permitir el análisis de expresión, se procedió a insertar un marcador FLAF (FLAG-tag), de una forma N-terminal del dominio transmembranario, y un marcador 6xHis (6xHis tag), en el término C. Se procedió a posicionar los dos marcadores, inmediatamente antes y después del dominio transmembranario, con objeto de verificar la localización extracelular de los antígenos expresados de una forma recombinante.

Se procedió a establecer las líneas celulares derivadas de la células HEK, las cuales expresan el P. falciparum PFF0620c, el dominio extracelular ABCA1, y el dominio extracelular TMEM27 de la rata, mediante una transfección

35 estable.

Con objeto de obtener líneas celulares con un alto valor de expresión, se procedió a separar los transfectantes, en bancos de células de alto valor de expresión, mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, después del marcaje de superficie, mediante anticuerpos anti-FLAG. La intensidad media de la fluorescencia de las células cerradas, para la selección, en bancos de alto nivel de expresión, era de un valor 2,1 – 4,3 veces mayor que el correspondiente a la totalidad de los transfectantes.

Las líneas celulares que expresaban el ABCA1, humano, y el TMEM27 de la rata, se sometieron a test de ensayo, mediante análisis de transferencia Western, mostrando un alto nivel de expresión de una proteína, con el peso

45 molecular esperado. (Figura 2) Se mostró la expresión de superficie celular de la proteína P. falciparum PFF0620c, mediante análisis de immunofluorescencia, con anticuerpo anti-FLAG, proporcionando fuertes señales de células vivas. (Figura 3) Como contraste de ello, el marcaje, con anticuerpo anti-6xHis, proporcionó fuertes señales, únicamente, en células fijadas sobre metanol, pero no, en células vivas (Figura 3B). Estos resultados, verificaron el hecho de que, el PFF0620c, se expresa, y se produce su anclaje, en la pared celular, con el marcador FLAG-tag, viviendo de una forma extracelular, y el marcador His, viviendo de una forma intracelular.

Desarrollo de antígenos específicos de la malaria, en ratones inmunizados con células HEK, transfectadas

Se procedió a utilizar los bancos de células de alto nivel de expresión, PFF0620c-HEK, con objeto de inmunizar

55 ratones NMRI. Los ratones en cuestión, recibieron inyecciones intravenosas de 106 células en tres días consecutivos, y otra serie de tres inyecciones diarias, dos semanas después. El desarrollo de los títulos de anticuerpo en suero, se analizó, mediante citometría de flujo, procediendo a comparar el marcaje inmune del transfectante, von células HEK, no transfectadas. La intensidad de la fluorescencia observada con el transfectante, era cuatro veces mayor que la correspondiente a las células HEK de control, no transfectadas. Esto indicaba el hecho de que, los ratones, habían montado una respuesta anticuerpo, contra el antígeno de la malaria, expresado en la superficie de las células HEK transfectadas.

Las células esplénicas de ratones inmunizadas con las células HEK transfectadas, se fusionaron con células de mieloma PAI, para generar hibridomas de células B (linfocitos B). Las células fusionadas, se distribuyeron en pozos 65 de una placa de cultivo de microtítulo. Con objeto de identificar las células de hibridoma, las la cuales producían

anticuerpos PFF0620c-específicos, se procedió a utilizar un procedimiento de exploración de rastreo, de dos etapas, el cual obviaba, de una forma completa, el requerimiento para proteínas recombinantes, purificadas. En primer lugar, la totalidad de los pozos de cultivo, se sometieron a test de ensayo, para la producción de IgG, mediante la técnica ELISA. Un porcentaje correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre un 18 % y 5 un 29 %, de los pozos sometidos a test ensayo, eran positivos. En una segunda etapa, la totalidad de los pozos, los cuales eran positivos para la producción de IgG, se sometieron a una exploración de rastreo, para la unión de anticuepos a las células transfectadas, mediante IFA (ensayo de inmunofluorescencia – [IFA, de sus iniciales, en idioma inglés, correspondientes a immunofluorescence assay] -). Las células HEK transfectadas, y no transfectadas detectadas sobre las platinas portaobjetos de múltiples pozos, se marcaron con sobrenadantes de hibridomas individuales, y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia (véase, a dicho efecto, la figura 4). Las células HEK no transfectadas, servían como control negativo, para cada muestra. Numerosos clones positivos en las células transfectadas, eran también positivas, en células no transfectadas. Sin embargo, no obstante, la fusión, proporcionó así mismo, también, numerosos pozos los cuales contenían anticuerpos fuertemente reactivos con el transfectante, pero que no eran reactivos con las células HEK no transfectadas. La totalidad de los otros anticuerpos, eran

15 específicos para células transfectadas, utilizadas para la inmunización, y no marcaban a los transfectantes de control. A partir de pozos de esta categoría, se derivaron 17 clones de hibridoma, mediante la reclonación a partir de la fusión de PFF0620c.

La especificidad de los anticuerpos monoclonales, se confirmó, de una forma adicional, mediante análisis de transferencia Western (véase, a dicho efecto, la figura 5). 16 de los mAbs, marcaban la proteína recombinante correspondiente, en el lisado del transfectante utilizado para inmunización, pero no, en lisados de células HEK transfectadas o no transfectadas, de control.

Anticuerpos monoclanes PFD1130w-específicos, inhiben el crecimiento parasitario in vivo

25 Se procedió a evaluar la actividad inhibitoria de parásitos, in vivo, de mAbs, en un modelo de ratón SCID, de P. falcilparum. Los mAbs anti-PFD1130w, se produjeron mediante la utilización de los mismos procedimientos y los mismos vectores que se utilizaron para la generación de los mAbs, contra P-falciparum PFF0620c (véase la sección de procedimientos, la cual se facilita abajo, a continuación). Este modelo, utiliza ratones NODscid IL2Rnull, no mieloagotados, injertados con eritrocitos humanos, con objeto de permitir el crecimiento de P. falciparum. Se procedió a injertar grupos de tres ratones, con una parasitemia de 0,58 ± 0,14 %, una vez, con 2,5 mg de anti-PFD1130w c12 mAb, 0,5 mg de anti-PFD1130w c12 mAb, ó 2,5 mg de mAb de isotipo / subclase, de control, por ratón, respectivamente. Se procedió a efectuar un control de seguimiento de la parasitemia, para la totalidad de los ratones, para los seis días siguientes. Mientras que, la parasitema, en los ratones los cuales habían recibido

35 únicamente PBS, o el mAb de control, se incrementaba de una forma continua, alcanzando un valor de 11,3 ± 0,8 %, después de seis días, la parasitemia de los ratones los cuales habían recibido 0,5 mg de mAb anti-PFD1130w c12, se incrementaba en una extensión mucho menor, alcanzando un valor de 5,6 ± 1,3 %, después de seis días. La parasitemia de los ratones los cuales habían recibido 2,5 mg de mAb anti-PFD1130w c12, permaneció baja, hasta el final del experimento (1,4 ± 0,3 %, en el día 6). La diferencia en la parasitemia, después de un transcurso de tiempo de 6 días, en comparación con el grupo de control negativo, era altamente significativa en la prueba t de dos caras [de dos muestras]: P < 0,0001) (Figura 6).

El hecho consistente en que, los mAbs anti-PFD1130w mAbs, inhibían el crecimiento parasitario, in vivo, indica el poder de la tecnología basada íntegramente en células, la cual se describe, para generar mAbs que se une a la

45 proteína endógena, en su contexto nativo.

Procedimientos

Construcción y transformación de plásmidos

Se procedió a ligar un oligonucleótido de doble hebra que codifica la secuencia señal de secreción de la melitina de la abeja, a pcDNA3.1(+) digerida con Nhel (de procedencia de la firma Invitrogen), dando como resultado el plásmido pcDNA3.1_BVM, con un sitio individual NheI retenido, 3’, de la secuencia señal. Se obtuvo así, de este modo, un cDNA de dominio de glicoforina, citoplásmico y transmembranario, de la secuencia señal, mediante rtPCR (equipo a

55 modo de kit, de la firma Invitrogen, del tipo “SuperScript III First Strand Synthesis kit” y sistema de PCR, de Roche, del tipo “Roche Expand High Fidelity PCR System), mediante la utilización de RNA extraído de la médula ósea, como un molde. Clonándose así, de este modo, el amplicón resultante de la PCR, en un vector de clonación pCR2.1. Los cebadores para la glicoforina contenían un sitio NotI 5’ y un marcador de histidina 3’, seguido de un codón de parada y sitio EagI. El fragmento de glicforina-5His, se escindió con EagI, y se ligó a pcDNA3.1_BVM digerido con Notl, dando como resultado un plásmido pcDNA3.1_BVM_GP, con el sitio pcDNA3.1, preservado en el extremo 5’ de la secuencia de glicoforina. Para crear el vector de expresión completado (pANITA), se procedió a ligar un oligonucleótido de doble hebra, al pcDNA3.1_BVM_GP digerido con Notl, que codifica a un marcador Flag (Flag-tag), flanqueado por cortas secuencias de engarce, y dando como resultado un único sitio NotI, en el lado 5’ del marcador Flag.

Se procedió a sintetizar las secuencias de cDNA del dominio extracelular TMEM27 de la rata (aa 15 -130 de la Seq. Id. No. 9); de un dominio extracelular pronosticado del gen P. falciparum PFF0620C (aa 21 -353 de la Seq. Id. No. 11) y de un dominio extracelular ABCA1 humano, N-terminal (aa 43 -640 de la Seq. Id. No. 7), mediante la automatización del uso de un codón, para para proporcionar un alto nivel de expresión, en el cultivo de células de

5 mamíferos. Los genes, se ligaron en los sitios únicos NheI y NotI del vector pANITA2, y la secuencia de los vectores, se confirmó mediante secuenciación de DNA. A los plásmidos resultantes, se les hará referencia, en la parte que sigue de este documento de solicitud de patente, como pANITA2-TMEM27; pANITA2-PFF0620C ó pANTTA2-ABCA1, respectivamente.

10 En los pANITA3.1 y pANITA3.3, se eliminaron, también, los sitios de pcDNA3.1 XbaI y XhoI, nativos, mediante mutagénesis de sitio dirigido. Las características o rasgos distintivos de las secuencias de los múltiples sitios de clonación y de codificación de proteínas de fusión, se muestran en la Tabla 1, la cual se facilita más abajo, a continuación, mediante la numeración a partir del inicio del inserto.

15 La secuencia de la glicoforina del hámster armenio, se determinó mediante clonación por PCR y secuenciación nucleotídica, mediante la utilización de la secuencia de la glicoforina del hámster chino, como una guía para el diseño de cebadores, y el cDNA generado a partir de preparaciones de RNA de la médula ósea del hámster americano. En la Tabla 1, la cual se facilita abajo, a continuación, se encuentran representadas las siguientes secuencias: pANITA2 con secuencia de Kozak = Seq. Id. No. 15 , pANITA3.1 = Seq. Id. No. 13 y pANITA3.3 = Seq.

20 Id. No. 14.

Tabla 1: Comparación de los vectores de expresión

Elemento Vector pANITA2 pANITA3.1 pANITA3.3

25 Secuencia de Kozak 1-12 1-12 1-12 Secuencia señal de la melitina de la abeja 9 -72 9 -72 9 -72 Sitio de restricción único NheI 70 -75 70 -75 70 -75 Sitio de restricción único KpnI 82 -87 82 -87 82 -87

30 Sitio de restricción único BamHI 94 -99 94 -99 94 -99 Sitio de restricción único EcoRI 106 -111 106 -111 106 -111 Sitio de restricción único EcoRV EcoRI 112 -117 112 -117 112 -117 Sitio de restricción único XbaI -118 -123 118 -123 Sitio de restricción único NotI 124 -131 124 -131 124 -131

35 Sitio de segmentación de marcador Flag / Enteroquinasa 133 -156 133 -156 133 -156 Sitio de restricción único HindIII -154 -159 154 -159 Anclaje de la membrana de la glicoforina del ratón 172 -369 163 -369 -Anclaje de la membrana de la glicoforina del hámster armenio 178 -375 6-His tag 382 -399 382 -399 388 -405

40 Codones de parada 400 -405 400 – 405 406 -411

Establecimiento de las líneas celulares HEK 293, que expresan, de una forma estable, los dominios PF0620C, TMEM27 ó ABCA1.

45 Las células HEK 293, se transfectaron con pANITA2-TMEM27; pANITA2-PFF0620C ó pANITA2-ABCA1, mediante la utilización del reactivo de transfección Jet-PEI™ (PolyPlus), siguiendo el protocolo del fabricante. La selección del antibiótico, se inició 48 horas después de la transfección. El medio de selección, el cual contenía 500 µg / ml de geneticina (Genetic®, de procedencia de la firma Gibco), se cambió, cada 3 – 4 días. Después de que hubieran

50 muerto las células no resistentes al antibiótico, y que las células resistentes, hubieran comenzado a crecer, normalmente, se generó un banco de alto nivel de expresión, mediante FACS (selección de células activada mediante fluorescencia – [FACS, de sus siglas, en idioma inglés, correspondientes a Fluorescence-activated cell sorting] -). Las células, se disociaron mediante un tampón de disociación exento de enzimas (Tampón de disociación de células, exento de enzimas, basado en una solución de Hank, de procedencia de la firma Gibco), éstas se

55 lavaron con tampón de bloqueo (PBS con un contenido del 3 % de BSA). A continuación, las células, se incubaron con 200 µl de mAb anti-Flag, a una concentración de 100 µl / ml = FLAG-27 diluido en tampón de bloqueo, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, sobre hielo. Se procedió, a continuación, a lavar las células, con tampón de bloqueo, y éstas se incubaron con 200 µl de anticuerpos anti-IgG del ratón, de cabras, conjugados con FITC (RAM/IgG(H+L)/FITC, de procedencia de la firma Nordic Immunological Laboratories), a una concentración de 100

60 µg / ml, que se diluyeron en tampón de bloqueo, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, en hielo. Después de haber procedido a un lavado final, se procedió a lavar las células marcadas, y éstas se seleccionaron mediante la utilización de un sistema de software informático, del tipo “BD FACSAria running FACSDiva software”. La totalidad de los análisis, se llevaron a cabo mediante la utilización de barreras de dispersión (scatter gates), para excluir los restos y agregados celulares. Los ajustes de barrera, se ajustaron para recopilar células altamente marcadas.

Después de las selección, las células, se recopilaron en un medio de cultivo, con 20 % FCS, y éstas se colocaron en un pozos de 35 mm.

Marcaje de inmunofluorescencia de células HEK, vivas

5 Para el marcaje de inmunofluorescencia de las células HEK, vivas, se procedió a utilizar platinas portaobjetos compartimentadas (platinas portaobjetos de compartimientos de 4 pozos, de los tipos Lab-Tek™, Nunc™). Los pozos, se recubrieron con 100 mg / l de poli-D-lisina, en H2O, en una caja húmeda, a la temperatura ambiente, durante el transcurso de toda la noche. Después de haber procedido al lavado de los pozos, tres veces, con H2O estéril, se sembraron 40.000 células, por pozo. Tres días después, se procedió a llevar a cabo el proceso de inmunomarcaje, procediendo a la incubación de los pozos, con 500 µl de un mAb apropiado, diluido en medio de cultivo exento de suero, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, en hielo. Después de haber procedido a lavar dos veces, con medio de cultivo exento de suero, se procedió a añadir 500 µl de anticuerpos anti-IgG del ratón, de cabras, conjugados con FITC (RAM/IgG(H+L)/FITC, de procedencia de la firma Nordic Immunological

15 Laboratories), a una concentración de 100 µg / m, diluidos en medo de cultivo exento de suero, a los pozos, y éstos se incubaron, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, en hielo. Finalmente, los pozos, se lavaron dos veces, con medio de cultivo exento de suero, y una vez, con DBPD (solución salina tamponada con fosfato, de Dulbecco, con contenido de calcio, de procedencia de la firma Gibco). Las platinas portaobjetos, se ajustaron mediante una solución de que contenía DAPI (reactivo anti-pérdida de color (reactivo anti-pérdida de color, del tipo “ProLong® Gold antifade reagen” con DAPI, de procedencia de la firma Invitrogen), y éstas se cubrieron con un cubreobjetos. Los marcajes, se evaluaron de la forma la cual se describe abajo, a continuación.

Inmunización de ratones

25 Se procedió a inmunizar los ratones NMRI, mediante inyecciones intravenosas de 106 células HEK establemente transfectadas. Las células, se derritieron, y éstas se lavaron y se resuspendieron en 0,9 % NaCl. Las inyecciones, se realizaron en tres días consecutivos, y después de tres semanas, otra vez, en tres días consecutivos. Después de la estimulación, se procedió a recolectar la sangre y, el suero, se sometió a test de ensayo, en cuanto a la presencia de anticuerpos anti-PFF0620C, mediante IFA, con la utilización de células 293 HEK, establemente transfectadas.

Los animales con suero fuertemente reactivo con células de expresión, se seleccionaron, para la fusión. Éstos recibieron una inyección final de 106 células, dos días y un día antes de la fusión. Los ratones, se sacrificaron, y se procedió a retirar su bazo. Las células esplénicas, se recolectaron, mediante trituración, bajo unas condiciones estériles, y se fusionaron con su pareja celular de mieloma (células del mieloma del ratón PAI, derivadas de P-3X63

35 Ag8), mediante la utilización de polietilenglicol 1500 (de procedencia de la firma Roche Diagnostics). La mezcla de fusión, se colocó en placas de múltiples pozos, y se procedió a seleccionar hibridomas, mediante el cultivo en medio HAT, suplementado con un sobrenadante de cultivo de macrófagos de ratón P388. Los pozos, se exploraron para la producción de IgG específica, entre las 2 – 3 semanas post-fusión, mediante ensayos de detección ELISA e IFA, de la forma la cual se describe abajo, a continuación.

Test de ensayo de detección ELISA

Se procedió a cubrir placas del tipo Maxisorp™ (Nunc), durante el transcurso de toda la noche, a una temperatura de 4 °C, en una caja húmeda, con 100 µl de mAb anti-IgG del ratón (específica de la cadena γ) de la cabra (de

45 procedencia de la firma Sigma), a una concentración de 5 µg / ml, diluida en PBS. Después de haber procedido a dos lavados, con PBS, con un contenido de 0,05 % Tween-20, se procedió a bloquear los pozos, con un tapón de bloqueo (50 mM Tris, 140 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05 % NONidet P40, 0,25 % gelatina, 1% BSA), durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37 °C y, procediéndose, posteriormente, a un proceso de lavado, dos veces. Se procedió, a continuación, a añadir 50 µl de sobrenadantes de hibridoma, a los pozos, y a una incubación, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 37 °C. Después de haber procedido a un proceso de lavado, 4 veces, las placas, se incubaron con 50 µl de anti-IgG del ratón (específica de la cadena γ) de la cabra, conjugada con peroxidasa del rábano picante (de procedencia de la firma Sigma), diluida a un valor de 1 : 1000, en tampón de bloqueo, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a la temperatura ambiente, en una caja húmeda, en un entorno medioambiental de oscuridad. Después de haber procedido a un proceso de 4 lavados, se

55 procedió a la adición de una solución del substrato de peroxidasa, y se controló el cambio de color.

Producción y caracterización de los anticuerpos

La identificación de los isótopos de anticuerpos, se llevó a cabo mediante la utilización de un equipo, a modo de “kit”, para la realización de la especificación de los isotipos de anticuerpos monoclonales del ratón, del tipo “Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit ISO2”, (de procedencia de la firma Sigma). Para la producción a gran escala de los mAb, se procedió cultivar líneas celulares, en frascos o botellas giratorias de 500 ml de capacidad útil (de procedencia de la firma Corning). Los mAbs, se purificaron mediante cromatografía de afinidad, mediante la utilización de proteína A sefarosa, o proteína G sefarosa.

Secuencias de DNA y de proteínas

Gen / nombre la proteína: Especie Descripción Seq. Id. No.

Glicoforina A: Ratón Dominio transmembranario + citoplásmico de la glicoforina A 1

Melitina: Abeja Señal de secreción de la melitina del veneno de la abeja 2

Marcador Flag: - Marcador Flag 3

Marcador His: - Marcador His 4

Vector de expresión pANITA2 (sin secuencia de KozaK): - Secuencia del vector de expresión, el cual comprende la señal de secreción de la melitina del veneno de la abeja, sitio de clonación para una proteína a ser expresada, y dominio transmembranario de la glicoforina A del ratón 5

ABCA1: Humana DNA que codifica a la proteína ABCA1, humana 6

ABCA1: Humana Proteína ABCA1 7

TMEM27: Rata DNA que codifica a la TMEM27 de la rata 8

TMEM27: Rata Proteína TMEM27 9

PFF0620C: Plasmodium falciparum DNA que codifica a la proteína 3D7 10

PFF0620C: Plasmodium falciparum Proteína 3D7 11

Glicoforina A: Hamster armenio Dominio transmembranario + citoplasmático de la glicoforina A 12

Vector de expresión pANITA3.1: - Secuencia del vector de expresión, el cual comprende la señal de secreción de la melitina del veneno de la abeja, sitio de clonación para una proteína a ser expresada, y dominio transmembranario de la glicoforina A del ratón 13

Vector de expresión pANITA3.3: - Secuencia del vector de expresión, el cual comprende la señal de secreción de la melitina del veneno de la abeja, sitio de clonación para una proteína a ser expresada, y dominio transmembranario de la glicoforina A del ratón 14

Vector de expresión pANITA2 con secuencia de Kozak (nt 1 – 12): - Secuencia del vector de expresión, el cual comprende la señal de secreción de la melitina del veneno de la abeja, sitio de clonación para una proteína a ser expresada, y dominio transmembranario de la glicoforina A del ratón 15

10 Si bien la invención anteriormente presentada, en este documento de solicitud de patente, se descrito, en cierto detalle, por vía de ilustración y de ejemplos, para los propósitos de claridad y entendimiento, las descripciones y los ejemplos facilitados, no deben no obstante interpretarse como siendo limitativos del ámbito de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS 5

<: 110 > F. Hoffmann-La Roche AG

<: 120 > Vector de expresión de proteína

<: 130 > 26501 WO

<: 150 > EP10155115.8

< 151 > 2010-03-02 15 < 160 >15

<: 170 > PatentIn versión 3.5

<: 210 >1

<: 211 > 66

<: 212 > PRT

<: 213 > Apis mellifera

<: 210 >2

<: 211 > 21

<: 212 > PRT

<: 210 >3

<: 211 >8

<: 212 > PRT

<: 213 > Secuencia Artificial

<: 220 >

<: 223 > Marcador FLAG

<: 400 >3

<: 210 >4

<: 211 > 10

<: 212 > PRT 15 < 213 > Secuencia Artificial

<: 223 > Marcador His

<: 400 >4

<: 210 >5

<: 211 > 390 25 < 212 >DNA

<: 213 > Secuencia Artificial

<: 220 >

<: 220 >

<: 221 > CDS

<: 222 > (314)..(7099)

<: 223 > Construcción de expresión

<: 210 >6

<: 211 > 7140

<: 212 > DNA

<: 213 > Homo sapiens

55 < 400 > 6

10: < 210 > 7 < 211 > 2261 < 212 > PRT < 213 > Homo sapiens < 400 > 7

15

20

<: 212 > DNA

<: 213 > Rattus norvegicus

< 220 > 25 < 221 >CDS

<: 222 > (63)..(731)

<: 400 >8

< 210 >9

< 211 > 222

< 212 > PRT

< 213 > Rattus norvegicus

< 400 >9

< 210 > 10 65 < 211 >1116 33

< 212 > DNA

< 213 > Plasmodium falciparum

< 220 > 5 < 221 >CDS

< 222 > (1)..(1116)

< 400 > 10

<: 210 > 11

<: 211 > 371

<: 212 > PRT

<: 213 > Plasmodium falciparum

<: 400 > 11

<: 211 > 73

<: 212 > PRT

<: 213 > Cricetulus migratorius

45 < 400 >12

<: 210 > 13

<: 211 > 405

<: 212 > DNA

<: 213 > Secuencia Artificial

<: 220 >

<: 223 > Vector de expresión

<: 212 > DNA

<: 213 > Secuencia Artificial

<: 210 > 14

<: 211 > 411

< 220 > 35 < 223 > Vector de expresión

55: < 210 > 15 < 211 > 405 < 212 > DNA < 213 > Secuencia Artificial

< 220 > < 223 > Vector de expresión

65: < 400 > 15

39

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Un vector de expresión de ácido nucleico, para la expresión de la superficie celular de proteínas, el cual comprende, en orden, una secuencia polinucleotídica, la cual codifica a un péptido señal de secreción de la melitina

5 del veneno de la abeja, un sitio de clonación para insertar un secuencia polinucleotídica, la cual codifica a una proteína a ser expresada, y una secuencia polinucleotídica, la cual comprende una secuencia que codifica a un dominio transmembranario de la glicoforina A.
2.-El vector de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde, el dominio transmembranario de glicoforina A, es el 10 dominio transmembranario de la glicoforina A del ratón, o el dominio transmembranario de la glicoforina A, del hámster armenio.
3.-El vector de ácido nucleico de la reivindicación 2, en donde, el dominio transmembranario de la glicoforina A del ratón, comprende los aminoácidos los cuales se dan a conocer encuentra en la Seq. Id. No. 1, y el dominio de la 15 glicoforina A del Hámster Armenio, comprende la secuencia de aminoácidos la cual se da a conocer en la Seq. Id. No. 12.
4.-El vector de ácido nucleico de las reivindicaciones 1 – 3, en donde, el péptido señal de secreción de la melitina del veneno de abejas, comprende la secuencia de aminoácidos la cual se da a conocer en la Seq. Id. No. 2.

20 5.-El vector de ácido nucleico de las reivindicaciones 1 – 4, el cual comprende, de una forma adicional, aguas abajo (3’) del sitio de clonación para insertar una secuencia polinucleotídica, la cual codifica a una proteína a ser expresada, una secuencia polinucleotídica, la cual codifica a un marcador FAG, el cual comprende la secuencia de aminoácidos de la Seq. Id. No. 3.

25 6.-El vector de ácido nucleico de las reivindicaciones 1 – 5, el cual comprende, de una forma adicional, aguas abajo (3’) de la secuencia polinucleotídica, la cual codifica el dominio transmembranario de la glicoforina, una secuencia polinucleotídica, la cual codifica un marcador His, de una forma preferible, un marcador His, el cual comprende la secuencia de aminoácidos, la cual se da a conocer en la Seq. Id. No. 4.

30 7.-El vector de ácido nucleico de las reivindicaciones 1 – 6, en donde, el sitio de clonación, comprende los sitios de segmentación de enzimas de restricción de NheI, KpnI, BamHI, EcoRI, EcoRV y NotI.
8.-El vector de ácido nucleico de las reivindicaciones 1 – 7, el cual comprende una secuencia polinucleotídica, la 35 cual se selecciona de entre grupo consistente en las Seq. Id. No. 5, Seq. Id. No. 13, Seq. Id. No. 14 , y Seq. Id. No.
15.
9.-El vector de ácido nucleico de las reivindicaciones 1 – 8, en donde, la proteína a ser expresada, es una proteína asociada a membrana.

40 10.-Una célula, la cual comprende el vector de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo, de una forma preferible, una célula de mamífero y, de una forma más preferible, una célula HEK.
11.-Uso, in vitro, de una célula de la reivindicación 10, para la expresión de proteínas apropiadas para la generación 45 de anticuerpos.
12.-Uso de una célula de la reivindicación 10, para la inmunización, no terapéutica, de un animal no humano, para la generación de anticuerpos, de una forma preferible, para la generación de anticuerpos monoclonales.

50 13.-Un procedimiento no terapéutico, para la generación de anticuerpos monoclonales, contra una proteína específica, el cual comprende las etapas de:

a) la inmunización de un animal no humano, mediante células que expresan, en sus superficies celulares, la proteína específica, mediante la utilización del vector de las reivindicaciones 1 a 9. 55 b) el aislamiento de células esplénicas de los animales no humanos de la etapa a),

c) la fusión de las células esplénicas de la etapa b), con células de mieloma, para generar hibridomas de linfocitos B, y 60 d) la identificación de hibridomas de linfocitos B, que expresen anticuerpos dirigidos contra la proteína específica.
14.-El procedimiento de la reivindicación 13, en donde, el animal no humano, es un ratón o un hámster.

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