JP2009268399A - 抗体に結合可能な蛋白質発現ミエローマおよびこれを用いる細胞融合方法並びに交雑細胞およびその選別方法 - Google Patents

Abstract

【課題】抗体に結合可能な蛋白質発現ミエローマおよびこれを用いる細胞融合方法並びに交雑細胞およびその選別方法を提供する。
【解決手段】抗体に結合可能な蛋白質を、細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させてなる、ミエローマ細胞およびこれを用いる細胞融合方法ならびに抗体に結合可能な蛋白質を、細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させた交雑細胞を培養することにより得られる、抗体提示交雑細胞およびその選別方法を用いる。
【選択図】 図２

Description

本発明は、細胞膜表面への目的物質の提示方法に関し、詳しくは、抗体に結合可能な蛋白質発現ミエローマおよびこれを用いる細胞融合方法並びに交雑細胞およびその選別方法に関する。

これまでに、大腸菌、酵母、動物細胞等を宿主として、有用な物質を生産する技術が開発されてきた。生産された物質は、医薬品、診断試薬等、多くの分野で使用されている。生産される有用物は主に蛋白質であるが、本来各生物が持っている蛋白質のみならず、遺伝子組み換え技術によりその機能を向上あるいは変化させた組換え蛋白質も種々生産されている。

これらの組換え蛋白質を作製する場合、その蛋白質をコードする遺伝子に変異を導入することによりその蛋白質の機能を変化させ、変異を入れた遺伝子を宿主に導入し、機能を変化させた蛋白質（変異蛋白質）を生産させる方法が行われている。その場合、変異遺伝子を導入した多数の細胞の中から有効な変異蛋白質を生産する細胞のみを選択する効率的な方法が必要となってくるが、その方法として宿主の細胞膜表層にその細胞が生産する蛋白質を提示させ、提示された蛋白質を指標にして細胞を選択回収する方法がとられている。

これらの細胞膜表層への蛋白質の提示技術はいくつか報告されている。例えばファージディスプレー法は、繊維状ファージを宿主として、目的蛋白質をファージのコート蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、ファージ粒子上に提示させている（例えば、非特許文献１参照）。

酵母表層ディスプレー法は、酵母を宿主として、目的蛋白質をＧＰＩ（グリコシルフォスファチジルイノシトール）アンカー付着シグナルであるαアグルチニンとの融合蛋白質として発現させ、ＧＰＩアンカーを介して酵母細胞壁のグルカン層に共有結合することにより酵母細胞表層に提示させている（例えば、非特許文献２参照）。

生産される有用物質として抗体を産生する場合は、１９７５年にモノクローナル抗体の作製法が考案されて以来（例えば、非特許文献３参照）、動物細胞を宿主として抗体の作製が行われるようになった。これらの作製された抗体は、感染症、ガン、心臓疾患などの病気の診断のために用いられる免疫測定法による診断薬に使用されている。

また近年では、抗体医薬として抗体を治療薬として使用するようになるにつれ、その効率的な作製法の開発が望まれるようになっている。

モノクローナル抗体を作製する場合は、例えばマウスの脾臓細胞とマウスミエローマを細胞融合することにより抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を作製し、作製したハイブリドーマの中から目的抗体を産生している細胞を選択する（例えば、非特許文献３参照）。その場合、作製した細胞群を限界希釈法により一つ一つの細胞に単離し、培養した各細胞の培養上清中に放出された抗体を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）等により評価することにより、目的抗体を産生する細胞を選択している。

Ｓｍｉｔｈ ＧＰ，"Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｈａｇｅ： ｎｏｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ．" ，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２８巻（４７０５）：１， ３１５頁， １９８５年発行 Ｍｕｒａｉ ｅｔ．ａｌ．，"Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．" Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４８巻， ４９９−５０３頁， １９９７年発行 Ｇ． ＫＯＨＬＥＲ（Ｇ． ケーラー） ＆ Ｃ． ＭＩＬＳＴＥＩＮ， "Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ" Ｎａｔｕｒｅ， ２５６巻， ４９５−４９７頁， １９７５年発行

医薬品、診断試薬等に用いられる有用蛋白質を進化工学的手法による遺伝子組み換えにより作製する場合、ライブラリーと呼ばれる無作為に作製した組換え遺伝子を導入した多数の細胞の中から、目的にあった活性を保持した、あるいは遺伝子変異を導入する前の野生型よりも機能の向上した変異蛋白質を生産する細胞のみを選択しなくてはならない。通常このようなライブラリーは、百万個から１億個あるいはそれ以上の細胞群であり、膨大な細胞数であるため、１つ１つの細胞を個々に培養して調べていくことは不可能である。そのためこれらのライブラリーの中から、目的にあった蛋白質を産生する細胞を選択する効率的なスクリーニング方法が必要となるという課題があった。

この様に、膨大な数の細胞群の中から目的蛋白質を産生している細胞を効率的にスクリーニングするには、細胞で生産される組換え蛋白質とその組換え蛋白質を産生する細胞が結合していることが望ましい。このような蛋白質とその産生細胞の対応付けがなされていれば、結合した蛋白質を評価することにより、同時にその蛋白質の産生細胞を回収することが可能だからである。

そのような生産細胞と蛋白質の対応付けの方法として、ファージディスプレー法や酵母表層ディスプレー法が報告されている。

しかしながら、ファージディスプレー法では、ファージ粒子上に蛋白質を発現させた時に蛋白質が活性を保持した状態で高次構造をとらず、活性が消失してしまうという課題があった。また、翻訳後修飾が行われないため、活性に必要な糖鎖の付加やリン酸化が起こらず活性が消失あるいは低減してしまう場合がある。また、高い活性を持った目的蛋白質を発現しているファージの分子数が極めて少ない場合があり、本来選択されるはずの目的細胞を逃してしまう場合があるという課題があった。

また、酵母表層ディスプレー法では、提示された蛋白質に糖鎖が付加されるが、付加される糖鎖の構成単糖の種類、配列順序、モル比、単糖相互の結合が必ずしも元の種のそれらと同一のものではなく、活性の低下や消失が起こる場合がある。特に、発現させる蛋白質が抗体の場合、付加される糖鎖の構造の違いにより、その親和性が低下してしまうことが考えられる。

また、先に挙げたハイブリドーマから目的抗体を産生する細胞を選択する場合、限界希釈法でそれぞれの細胞を単離し、その培養上清を用いて産生された抗体を評価することにより、目的抗体を産生する細胞を選択する必要があるため、多大な時間と労力を必要とするという課題があった。

また、ミエローマと脾臓細胞の細胞融合により得られた細胞の数が少ない場合は、上記の方法により目的細胞を選択することは可能であるが、より高い活性を持つ抗体を生産する細胞が得られない場合があるという課題があった。逆に、細胞融合の効率が向上すれば、得られる細胞数が増加し、膨大な労力と時間がかかり、選択中に細胞の死滅等が起るため、既存の方法による目的細胞の選択は困難であるという課題があった。またこの様に取り扱う細胞数が膨大になった場合、得られた全ての細胞を網羅的に評価し、目的のハイブリドーマを選択回収することは極めて困難である。

哺乳類由来の有用蛋白質を動物細胞により生産する方法は、翻訳後修飾、付加される糖鎖構造の観点から、大腸菌などによる生産方法よりも優位性が高い。しかしながら、これまで述べたように遺伝子組み換え蛋白質を作製する場合、大腸菌、ファージ、あるいは酵母により一度目的物質産生細胞のスクリーニングを行い、得られた細胞から目的蛋白質をコードした遺伝子を抽出し、さらにその遺伝子を動物細胞に導入するという方法をとらなくてはならない。そのため、多大な時間と労力を必要とするという課題があった。またこの場合、得られた動物細胞により産生された蛋白質の機能が、前述した翻訳後修飾が原因で、大腸菌、ファージ、あるいは酵母を用いてスクリーニングした時の機能と異なる場合があるという課題があった。

本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、抗体に結合可能な蛋白質を、細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させたミエローマ細胞を作製した。さらに該ミエローマ細胞と脾臓細胞とを細胞融合して得られる交雑細胞を培養することにより、抗体提示交雑細胞を作製することで課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。以下本発明を詳細に説明する。

すなわち本発明は、抗体に結合可能な蛋白質を、細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させてなる、ミエローマ細胞である。

また本発明は、ミエローマ細胞が、マウスあるいはウサギあるいはラット由来の細胞である、上記のミエローマ細胞である。

また本発明は、上記のミエローマ細胞と脾臓細胞とを細胞融合する方法である。

また本発明は、脾臓細胞が、マウスあるいはウサギあるいはラット由来の細胞である、上記の方法である。

また本発明は、上記の細胞融合により得られる抗体に結合可能な蛋白質を、細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させてなる交雑細胞である。

また本発明は、抗体に結合可能な蛋白質を、細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させた交雑細胞を培養することにより得られる、抗体提示交雑細胞である。

また本発明は、上記の抗体提示交雑細胞を、提示された抗体の抗原に対する親和性または特異性の差により選別する、交雑細胞の選別方法である。

また本発明は、抗体に結合可能な蛋白質がＦｃレセプターである、上記の方法である。

また本発明は、抗体に結合可能な蛋白質がプロテインＧまたはその改変体である、上記の方法である。

本発明における抗体に結合可能な蛋白質とは、抗体の抗原結合部位以外の部分で抗体に結合する能力を持っている蛋白質であればよく、例えば哺乳動物のＦｃレセプター、細菌が作るプロテインＧ、プロテインＡ、イムノグロブリン（免疫グロブリン）を認識する抗体などが挙げられる。

本発明における抗体に結合可能な蛋白質を細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させる形態は、一つの形態として、細胞の膜蛋白質との融合蛋白質として発現させればよく、例えば細胞膜貫通型蛋白質をアンカー蛋白質としてその末端に目的物質に結合可能な蛋白質を結合した状態で発現させればよい。この場合、両蛋白質の結合順序は、細胞膜貫通型アンカー蛋白質のＮ末端と抗体に結合可能な蛋白質のＣ末端が結合していても又はその逆の順序でもよいが、抗体に結合可能な蛋白質が細胞外領域に出ており且つ抗体との結合部位がその結合活性を保持していることが必要である。また、両蛋白質は直接結合しても、両蛋白質の間にリンカーを介して結合してもよい。細胞膜貫通型蛋白質をアンカー蛋白質とする場合は、例えばＦｃレセプターの細胞膜貫通領域、イムノグロブリンの細胞膜貫通領域などを用いればよい。

また、ＧＰＩアンカーを利用して、抗体に結合可能な蛋白質を細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させてもよい。その場合、抗体に結合可能な蛋白質はαアグルチニンとの融合蛋白質として発現させればよく、その結合順序、リンカーの有無等は、上述の細胞膜貫通型蛋白質をアンカー蛋白質として用いた場合と同様である。ここでＧＰＩアンカー（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ：ＧＰＩ）とは、真核細胞の細胞膜に結合し細胞膜の外側に蛋白質を繋ぎ止める役割を持つ糖脂質であり、小胞体でＧＰＩアンカーと蛋白質が結合し、ゴルジ体を経て細胞表面に輸送され、細胞膜の外面に蛋白質を出すものである。

抗体に結合可能な蛋白質を細胞外に発現させる場合は、抗体に結合可能な蛋白質が細胞外領域に出ており且つ抗体との結合部位がその結合活性を保持していることが必要である。

本発明におけるミエローマ細胞は、マウスあるいはウサギあるいはラット由来の細胞のいずれのものでもよいが、一般的にマウスのミエローマ細胞を使用した場合は、次の工程で用いる脾臓細胞は同じ動物種であるマウスの細胞を用いることが好ましい。しかし、場合によってはウサギミエローマ細胞とマウス脾臓細胞の組合せを用いて本発明を行うことも可能である。

上述の様に、本発明における脾臓細胞はマウスあるいはウサギあるいはラット由来の細胞のいずれの細胞でもよく、一般的には使用するミエローマ細胞と同じ動物種の細胞を使用すればよいが、異なる動物種の細胞を使用することも可能である。

本発明における抗体に結合可能な蛋白質の細胞膜へ結合した状態での細胞外への発現方法は、該抗体に結合可能な蛋白質をコードする遺伝子と上述アンカー蛋白質としての細胞の膜蛋白質をコードする遺伝子とを連結した状態で該細胞内に遺伝子導入し、該細胞の持つ細胞外蛋白質発現機構を利用して発現させればよい。

該抗体に結合可能な蛋白質を細胞の蛋白質発現機構を利用して細胞膜表面への発現へ発現させるために必要な遺伝子の構造は、発現プロモーター遺伝子、シグナルペプチドをコードする遺伝子、目的物質に結合可能な蛋白質をコードする遺伝子、上述のアンカー蛋白質をコードする遺伝子、ターミネーター遺伝子がこの順序で並んだ遺伝子が必要である。該発現プロモーター、該シグナルペプチド及び該ターミネーターは、遺伝子導入する宿主細胞で機能するプロモーター、該シグナルペプチド及びターミネーターであればよく、プロモーターはより強力なプロモーターが望ましい。これらの遺伝子を環状あるいは直鎖状に連結したベクターを構築し、細胞に遺伝子導入する。細胞内への遺伝子導入方法は、物理化学的手法、ウイルスベクターを用いた方法等のいずれの方法でもよく、細胞によって適宜選択すればよい。

ミエローマ細胞と脾臓細胞とを細胞融合する方法は、一般的に行われるモノクローナル抗体作製法（前記した、Ｇ． ＫＯＨＬＥＲ（Ｇ． ケーラー） ＆ Ｃ． ＭＩＬＳＴＥＩＮ， “Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ” Ｎａｔｕｒｅ， ２５６巻， ４９５−４９７頁， １９７５年発行
（非特許文献３））に従ってポリエチレングリコール等を用いた方法で行えばよい。該方法に従って、ミエローマ細胞と脾臓細胞との細胞融合を行うことにより、抗体に結合可能な蛋白質を、細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させた交雑細胞を得ることが可能である。

本発明における、抗体提示交雑細胞を得るための交雑細胞の培養は、上記方法により得られた交雑細胞から分泌された抗体を、該交雑細胞の細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させた抗体に結合可能な蛋白質に結合させるため、該交雑細胞の生育に適した培地で該細胞が該目的物質の生産を開始する細胞密度まで培養すればよい。

培養時間は、細胞から分泌された抗体が、抗体に結合可能な蛋白質に結合するために十分な量を分泌する時間であればよい。例えば細胞が対数増殖期後期から定常期に達する細胞密度までに必要な時間、あるいはそれ以上の時間培養すればよい。

抗体に結合可能な蛋白質と抗体の結合部位は、それぞれいずれの部位で結合してもかまわないが、好ましくは抗体の結合活性をつかさどる部位以外の部位で結合することが望ましい。例えば抗体に結合可能な蛋白質がそれぞれ抗体とＦｃレセプターである場合は、抗体の抗原結合部位以外の部位である抗体Ｆｃ部位とＦｃレセプターが結合する。

本発明において、該交雑細胞が分泌する抗体に結合可能な蛋白質を、該細胞の膜表面に結合した状態で発現させ、該蛋白質に該分泌抗体を結合させた細胞を用いて、表面に結合した抗体の親和性あるいは特異性の差を測定することにより、抗体産生交雑を選別することが可能である。その場合、細胞表面に結合している抗体の親和性あるいは特異性の差を測定する方法は、該抗体の親和性あるいは特異性を測定するために通常用いられる方法により行えばよい。

例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）による測定や、フローサイトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いた測定により行えばよい。あるいは、抗原又は抗体を固定化したカラムを通すことにより、抗体提示交雑細胞上に提示された抗体の抗原に対する親和性あるいは特異性の差によって分離を行ってもよい。あるいは、抗原又は抗体を固定化したビーズと抗体提示交雑細胞上に提示された抗体を反応させ、細胞が結合した該ビーズを回収することにより抗体産生細胞を回収すればよい。

本発明におけるＦｃレセプターとは、抗体重鎖のＦｃ部分に結合する蛋白質であり、ヒト、マウス等由来のものが報告されているが、抗体Ｆｃ部分と結合能を持つものであれば、いずれのものでもよい。

本発明におけるプロテインＧとは、主に抗体重鎖のＦｃ部分に結合する蛋白質であり、ストレプトコッカス由来のものが数種類報告されているが、抗体と結合能を持つものであれば、いずれのものでもよい。

本発明によれば次の効果を奏することができる。
（１）交雑細胞が分泌する抗体を該交雑細胞膜表面に抗体結合活性を保持した状態で提示させることができ、抗体とそれを分泌する細胞および抗体産生にかかる遺伝子とを対応させて回収することができる。
（２）細胞を個々に単離することなく、種々の交雑細胞が混ざった状態で、該交雑細胞が分泌する抗体の親和性および特異性を測定することが可能であるため、全ての交雑細胞を網羅的に評価することができる。
（３）本発明は、親和性や特異性に優れた抗体の創出等、既存の抗体の高機能化や全く新しい機能を持った抗体の創出を、進化工学的手法に基づく遺伝子組み換えにより行う場合に有効である。

以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

本発明の全体の流れを、図１に示した。図１に示すフローチャートは、抗体に結合可能な蛋白質を、細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させたミエローマ細胞の作製、該ミエローマ細胞と脾臓細胞とを細胞融合して得られる抗体に結合可能な蛋白質を細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させた交雑細胞の作製、該抗体に結合可能な蛋白質を細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させた交雑細胞を培養することにより得られる抗体提示交雑細胞の作製、及び該抗体提示交雑細胞の提示された抗体の抗原に対する親和性あるいは特異性の差を利用した抗体提示交雑細胞の選別までの流れを示した図である。

（実施例１）ヒトＦｃレセプター発現ミエローマの作製
１−１．ヒトＦｃレセプターＩ発現ベクターの作製
ヒトＦｃγレセプターＩ（以下ｈＦｃγＲＩ）のｃＤＮＡ（ｈｕｍａｎ ＦｃＲＩ ｃＤＮＡ、ＯＲＩＧＥＮＥ社製であり、配列番号１参照）を鋳型とし、ｈＦｃγＲＩのｃＤＮＡをＰｒｉｍｅＳｔａｒＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅し（プライマー１及び２であり、配列番号２および配列番号３参照）、これをＰＣＲ産物とした。

上記ＰＣＲ産物（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ産物）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ（タカラバイオ株式会社製）で切断し、ｈＦｃγＲＩ−ｃＤＮＡ−ＰＣＲ産物とした。

発現ベクターｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のマルチクローニングサイトを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ（タカラバイオ株式会社製）で切断した遺伝子を、アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）（タカラバイオ株式会社製）を用いて脱リン酸化した。

上記のｈＦｃγＲＩ−ｃＤＮＡ−ＰＣＲ産物と、ｐＣＭＶ−ＳｃｒｉｐｔをＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで切断後、脱リン酸化した遺伝子を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結した。作製したプラスミドをヒトＦｃレセプターＩ発現ベクター（ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲＩ）とした。
１−２．ヒトＦｃレセプターＩ発現ベクター（ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲＩ）の調製
実施例１の１−１．で作製したヒトＦｃレセプターＩ発現ベクター（ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲＩ）を用いて、大腸菌のコンピテントセルＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社製）１００マイクロリットル（μｌ）を形質転換した。形質転換はコンピテントセルに添付の資料に従って行った。

得られた形質転換体を、２ｍｌの２ＸＹＴ培地（バクトトリプトン（ベクトンアンドデッキンソン社製）１６ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト（ベクトンアンドデッキンソン社製）１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム（関東化学製）５ｇ／Ｌ）にて３７℃で１８時間培養し、該培養液からＱＩＡ ｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出し、約５マイクログラム（μｇ）のｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲＩを調製した。
１−３．ｈＦｃγＲＩ発現ベクターのミエローマへの導入
Ｅ−ＲＤＦ（極東製薬社製）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地１０ｍｌで対数増殖期後期まで培養したマウスミエローマ（ＳＰ２／０）を、５０ｍｌの遠心チューブに入れ１５００回転／分で５分間遠心分離した。上清を除去し、沈殿した細胞を５ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で２回洗浄した後、１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＰＢＳに細胞を懸濁した。該細胞溶液５００μｌに、１−１で作製したヒトＦｃγＲＩ発現ベクター（ｐＣＭＶＳ−ｈＦｃＲＩ）を１０μｇ加えた溶液を、０．４ｃｍのキュベット（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）に入れ、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｐｏｒｒａｔｏｒ ＥＣＭ８３０（ＥＣＭ社製）を用いて、７３５Ｖ／ｃｍ、１ｍｓ、１回パルスの条件でトランスフェクションを行った。

また、陰性コントロールとして、ｈＦｃＲＩ遺伝子を組み込んでいないベクター（ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔのみ）を同様の方法によりにトランスフェクションした。
１−４．ｈＦｃγＲＩ発現ベクターが導入されたミエローマの培養
１−２で調製したｈＦｃγＲＩ遺伝子をトランスフェクションしたマウスミエローマを、Ｅ−ＲＤＦ、１０％ＦＢＳに４００μｇ／ｍｌのＧ４１８ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を加えた培地で２週間程度選択培養を行うことにより、ｈＦｃγＲＩ発現ミエローマを作製した。

また、陰性コントロールとして、上述１−２でｈＦｃＲ遺伝子を組み込んでいないベクター（ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔのみ）をトランスフェクションしたマウスミエローマを同様の方法で培養し、ｈＦｃγＲＩ非発現ミエローマを作製した。

（実施例２）ｈＦｃγＲＩ発現ハイブリドーマの作製
２−１．マウス脾臓細胞の調整
ウシ血清アルブミンにより適宜免疫したＡ／Ｊマウス（日本ＳＬＣ株式会社）を解剖し、脾臓を摘出した。摘出した脾臓を１０ｍｌのＥ−ＲＤＦ中で脂肪を除去した後、ポリエステルメッシュ（Ｎｅｔｗｅｌｌ，７４μｍ、Ｃｏｓｔｅｒ社）ですり潰し、５０ｍｌの遠心チューブに入れ１５００回転／分で５分間遠心分離した。沈殿を回収し、９ｍｌのＲｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＳＩＧＭＡ製）と１ｍｌのＦＢＳとの混合液に懸濁し、赤血球を破砕した。破砕液を１５００回転／分で５分間遠心分離後、沈殿を２０ｍｌのＥ−ＲＤＦで２回洗浄し、細胞融合用マウス脾臓細胞とした。
２−２．ＦｃγＲＩ発現ミエローマとマウス脾臓細胞との細胞融合
実施例１で作製したヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマを、Ｅ−ＲＤＦ、１０％ＦＢＳで対数増殖期後半になるまで培養し、５０ｍｌの遠心チューブに入れ１５００回転／分で５分間遠心分離した。沈殿を回収し２０ｍｌのＥ−ＲＤＦで２回洗浄した後、１０ｍｌのＥ−ＲＤＦに懸濁し、細胞融合用ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマとした。

該ヒトＦｃγＲＩ発現ミエローマと実施例２−１で調製したマウス脾臓細胞とを、細胞数比１：１で混合し、１０００回転／分で５分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿をタッピングにより攪拌し、あらかじめ用意しておいた２５０μｌのポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ社製）を、ゆっくり側面から加えた。軽くタッピングにより攪拌した後、５ｍｌのＥ−ＲＤＦをゆっくり側面から加えた。続いて１ｍｌのＦＢＳをゆっくり側面から加え、１０００回転／分で５分間遠心分離した。上清を捨て、１０ｍｌのＥ−ＲＤＦで２回洗浄し、１０００回転／分で５分間遠心分離した。上清を捨て、２０ｍｌのＥ−ＲＤＦ、１０％ＦＢＳ、１ｘＨＡＴサプリメント（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に細胞を懸濁し、５％ＣＯ２、３７℃で２週間選択培養した。得られた細胞をｈＦｃγＲＩ発現ハイブリドーマとした。

また、陰性コントロールとして、実施例１の１−３で作製したｈＦｃγＲＩ非発現ミエローマを用いて、上述と同様の方法で、細胞融合を行い、得られた細胞をｈＦｃγＲＩ非発現ハイブリドーマとした。

（実施例３）ハイブリドーマによる抗体提示
実施例２で作製したｈＦｃγＲＩ発現ハイブリドーマ及びｈＦｃγＲＩ非発現ハイブリドーマを、Ｅ−ＲＤＦ、１０％ＦＢＳで数日間培養することにより、抗体提示ハイブリドーマ及び抗体非提示ハイブリドーマを作製した。

（実施例４）抗体提示ハイブリドーマの確認
実施例３で培養したハイブリドーマ２ｍｌを１０００回転／分で５分間遠心分離し、上清を除去した後１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、上清を除去した後、５００μｌのＰＢＳに細胞を懸濁し、１ｍｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を２μｌ添加し、遮光して１時間反応させた。その後１０００回転／分で５分間遠心分離し、上清を除去した後１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、上清を除去した後、５００μｌのＰＢＳに細胞を懸濁し、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ：ベクトンアンドデッキンソン社製）で解析した。なお、遠心分離機はトミー社製、型式ＥＸ−１２６を用いた。

陰性コントロール１として、実施例１から３により作製した抗体非提示ハイブリドーマを、上記実施例４に従って抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣで染色し、同様にフローサイトメトリーで解析した。

結果を図２および図３に示した。図２および図３に示すクロマトグラムは、本技術により実施例１から３により作製したハイブリドーマの細胞膜上に提示された抗体を見たものである。図２のクロマトグラムが実施例４に従って抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣで染色した抗体提示ハイブリドーマであり、図３のクロマトグラム）が、実施例４に従って抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣで染色した細胞膜上に抗体が提示されていないハイブリドーマ（陰性コントロール１）である。

その結果、細胞膜上に抗体が提示されていない陰性コントロール１図３と比較して、細胞膜上に抗体を提示した抗体提示ハイブリドーマ細胞図２は抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣが結合し緑色の蛍光を発するため、ピークが右にシフトした（図２−１）。

また、陰性コントロール２として、上記抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣを反応させていない実施例３で培養したハイブリドーマを同様にフローサイトメトリーで解析した。

結果を図４および図５に示した。図４および図５に示すクロマトグラムは、本技術により実施例１から３により作製したハイブリドーマの細胞膜上に提示された抗体を見たものである。図４のクロマトグラムが、実施例４に従って抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣで染色したハイブリドーマであり、図５のクロマトグラムが、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣで染色していないハイブリドーマ（陰性コントロール２）である。

その結果、細胞膜上に抗体を提示した細胞は抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣが結合し緑色の蛍光を発するため、陰性コントロールと比較して、ピークが右にシフトした。

これらのことは、本法により、ハイブリドーマの分泌する抗体が、ハイブリドーマ細胞膜に結合した状態で細胞外に発現したＦｃγＲＩに結合することにより、抗体を提示したハイブリドーマが作製されたことを示す。

本発明の全体の流れを示すフローチャートである。 本発明の抗体提示ハイブリドーマを用いたフローサイトメトリー解析によるヒストグラムであり、Ｘ軸（横軸）は細胞数（細胞個数）を、Ｙ軸（縦軸）は染色された細胞の蛍光強度（単位は任意）を示す。 抗体非提示ハイブリドーマを用いたフローサイトメトリー解析によるヒストグラムであり、Ｘ軸（横軸）は細胞数（細胞個数）を、Ｙ軸（縦軸）は染色された細胞の蛍光強度（単位は任意）を示す。 本発明の抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣで染色された細胞を用いたフローサイトメトリー解析によるヒストグラムであり、Ｘ軸（横軸）は細胞数（細胞個数）を、Ｙ軸（縦軸）は染色された細胞の蛍光強度（単位は任意）を示す。 本発明の抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣで染色されなかった細胞を用いたフローサイトメトリー解析によるヒストグラムであり、Ｘ軸（横軸）は細胞数（細胞個数）を、Ｙ軸（縦軸）は染色された細胞の蛍光強度（単位は任意）を示す。

Claims (9)

1. 抗体に結合可能な蛋白質を、細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させてなる、ミエローマ細胞。
2. ミエローマ細胞が、マウスあるいはウサギあるいはラット由来の細胞である、請求項１に記載のミエローマ細胞。
3. 請求項１に記載のミエローマ細胞と脾臓細胞とを細胞融合する方法。
4. 脾臓細胞が、マウスあるいはウサギあるいはラット由来の細胞である、請求項３に記載の方法。
5. 請求項３に記載の細胞融合により得られる抗体に結合可能な蛋白質を、細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させてなる交雑細胞。
6. 抗体に結合可能な蛋白質を、細胞膜に結合した状態で細胞外に発現させた交雑細胞を培養することにより得られる、抗体提示交雑細胞。
7. 請求項６に記載の抗体提示交雑細胞を、提示された抗体の抗原に対する親和性または特異性の差により選別する、交雑細胞の選別方法。
8. 抗体に結合可能な蛋白質がＦｃレセプターである、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 抗体に結合可能な蛋白質がプロテインＧまたはその改変体である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。

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