JP7171853B2 - 免疫グロブリン産生の増強 - Google Patents
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Description
本願は、2016年2月4日に出願された、USSN62/291,217の優先権を主張するものである。
本発明は、モノクローナル抗体を生成するための抗原特異的抗体分泌細胞の迅速なスクリーニング方法を含む、免疫グロブリン分子の産生に関する。
以下の説明では、いくつかの文献および方法が、背景および導入目的のために記載されている。本明細書に含まれるものは、先行技術の「承認」と解釈されるものではない。出願人は、本明細書で参照されている文献および方法が、該当する法律の規定に基づく先行技術を構成していないことを、必要に応じて証明する権利を明示的に留保する。
本概要は、以下の詳細な説明でさらに説明する概念のうち選択したものを簡略化した形で紹介するために提供される。本概要は、特許請求された主題の鍵となる特徴、または、本質的な特徴を特定することを意図するものではなく、特許請求された主題の範囲を限定するために使用されることも意図していない。特許請求された主題の他の特徴、詳細、有用性、および利点は、添付の図面に例示された局面および添付の請求項に規定された局面を含む、以下に記載された詳細な説明から明らかであろう。
本明細書で用いられる用語は、当業者によって理解される、平易で通常の意味を有することが意図されている。以下の定義は、読み手が本発明を理解することを助けることを意図するものであるが、具体的に示されていない限り、それらの用語の意味を変更または限定することを意図するものではない。
本明細書に記載される技術の実施は、特に断りのない限り、当業者の技能の範囲内である、有機化学、ポリマー技術、分子生物学(組換え技術を含む)、細胞生物学、生化学および配列決定技術の従来の技術および説明を利用することができる。これらの従来の技術には、ポリマーアレイ合成、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、および標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が含まれる。好適な技術の特定の例は、本明細書の実施例を参照することにより得ることができる。しかしながら、他の同等の従来の手順を使用することも、当然可能である。これらの従来の技術および説明は、Green, et al., Eds. (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); Weiner, Gabriel, Stephens, Eds. (2007), Genetic Variation: A Laboratory Manual; Dieffenbach, Dveksler, Eds. (2007), PCR Primer: A Laboratory Manual; Sambrook and Russell (2006), Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual; and Green and Sambrook (2012), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (全て Cold Spring Harbor Laboratory Pressによる); Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, New York N.Y.; Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.; and Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.; Nagy, et al., Eds. (2003) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); Gene Therapy Techniques, Applications and Regulations From Laboratory to Clinic (Meager, ed., John Wiley & Sons 1999); M. Giacca, Gene Therapy (Springer 2010); Gene Therapy Protocols (LeDoux, ed., Springer 2008); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, eds., John Wiley & Sons 1998); およびMammalian Chromosome Engineering - Methods and Protocols (G. Hadlaczky, ed., Humana Press 2011)などの標準的な実験室マニュアルで見つけることができ、これらは全て、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
抗体分泌細胞(ASC)は、通常、発現して分泌する免疫グロブリンを、細胞膜上に提示しないため、磁気選別およびフローサイトメトリー選別などの細胞表面標識に基づく高度な技術を、抗原特異的ASCを選択する方法としては適用できない。本発明は、分泌型免疫グロブリン分子(本明細書では「免疫グロブリン」または「抗体」とも呼ばれる)の細胞表面提示に基づくASCの効率的なスクリーニングを可能にする系の必要性から生まれた。具体的には、本発明は、通常、高レベルの膜結合型免疫グロブリンを発現しない、あるいは、天然に、細胞表面上に免疫グロブリンを保持する能力を有さない、ASCまたはハイブリドーマなどの分泌細胞の表面に、免疫グロブリンを保持および固定することができる免疫グロブリン捕捉分子を発現させるための手段を提供する。ASCは、大量の免疫グロブリン(毎秒数千個の分子)を発現して放出する(例えば、Mitchell, Advances in Immunology 28:451-511 (1979)参照)。それゆえ、これらの細胞上に発現する免疫グロブリン捕捉分子は、他の細胞から分泌される免疫グロブリンよりも、該細胞内から産生される免疫グロブリンによって主に飽和される。従って、免疫グロブリン捕捉分子は、それらが捕捉する免疫グロブリン分子に対して、高い親和性および低い解離速度を有さなければならない。本発明は、これらの、低い解離速度を有し、高い親和性を持つ免疫グロブリン捕捉分子を発現する方法および組成物を提供する。
細胞表面で発現された、本発明の免疫捕捉分子は、以下に詳細に記載されている通り、少なくとも2つの構成成分を含み、また、好ましい実施形態において、さらなる構成成分を含んでよい。シンプルな形態において、免疫グロブリン捕捉分子は、細胞表面テザー構成成分と、免疫グロブリン結合構成成分とを含む。細胞表面テザー構成成分は、発現された免疫グロブリン結合構成成分を細胞表面膜につなぎ止めるか、または固定する膜貫通ペプチドドメインを含んでよく、あるいは、細胞表面テザー構成成分は、免疫グロブリン結合構成成分が細胞表面膜に化学結合を介してつなぎ止められることを可能にする化学的部分(例えば、グリコシルフォスファチジルイノシトール)を含んでもよい。これらの構成成分に加えて、本発明の免疫グロブリン捕捉分子は、ストーク構成成分、1つ以上のリンカー構成成分、および/またはレポーターペプチドを含んでよい。
本発明のいくつかの局面において、免疫グロブリン捕捉分子の発現は、ASCにおいて高度に発現されるが、未熟B細胞または抗原未経験の成熟B細胞においては発現されない遺伝子由来のプロモーターにより、駆動される。これらの遺伝子には、Bリンパ球誘導成熟タンパク質1(Blimp1)、シンデカン1(Sdc1)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17(Tnfrsf17)、およびフコシルトランスフェラーゼ1(Fut1)が含まれるが、これらに限定されない。ASC発現のために選ばれる遺伝子は、マウス起源であってもよく、あるいは、遺伝子が適切に保存された発現パターンを示す別の種由来であってもよい。
本発明のトランスジェニック細胞はまた、ASC表面上の目的の抗体を特定するための発現ライブラリー、好ましくは低複雑性のライブラリーを作製するために用いられる。従って、本発明はまた、ASC上に発現された抗原特異的抗体を特定するための、本発明の細胞技術を用いて作製された抗体ライブラリーを含む。
本発明はまた、ASCの細胞表面上に免疫グロブリン捕捉分子を発現するように遺伝子組換えしたトランスジェニック動物を提供する。
インビトロで細胞を培養することは、多数の治療用バイオテクノロジー産物の産生の基礎となっており、細胞中のタンパク質産物の産生および支持培地への放出を伴う。培養中の増殖する細胞からの経時的なタンパク質産生の量および質は、例えば細胞密度、細胞周期、タンパク質の細胞生合成速度、細胞の生存率および増殖を支持するために用いられる培地の条件、並びに、培養中の細胞の寿命などの、多くの因子に依存する(例えば、Fresney, Culture of Animal Cells, Wiley, Blackwell (2010);および Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Ozturk and Ha, Eds., CRC Press, (2006) 参照)。
したがって、本発明は例えば以下の実施形態を提供する。
[1]
細胞表面に、内因的に産生された免疫グロブリン分子を、結合、保持、および提示し得る膜結合型免疫グロブリン捕捉分子を発現することができる抗体分泌細胞を生成する方法であって、抗体分泌細胞、または、抗体分泌細胞の前駆細胞に、プロモーター、免疫グロブリン結合ペプチドをコードする核酸配列、および細胞表面テザーペプチドをコードする核酸配列を含む核酸ベクターを導入するステップを含む方法。
[2]
免疫グロブリン結合ペプチドが、免疫グロブリンに対して天然に親和性を有する1つ以上の細菌タンパク質に由来する、前記[1]に記載の方法。
[3]
細菌タンパク質が、プロテインAまたはプロテインGである、前記[2]に記載の方法。
[4]
前記[2]に記載の方法によって生成された抗体分泌細胞に由来する、免疫グロブリン分子の一部または全部。
[5]
免疫グロブリン結合ペプチドが、別の免疫グロブリンの任意の部分に親和性を有する免疫グロブリンの、1つ以上の可変ドメインに由来する、前記[1]に記載の方法。
[6]
前記[5]に記載の方法によって生成された抗体分泌細胞に由来する、免疫グロブリン分子の一部または全部。
[7]
抗体分泌細胞が、ハイブリドーマ細胞、または、Bリンパ球系の細胞である、前記[1]に記載の方法。
[8]
前記[7]に記載の方法によって生成された細胞に由来する、免疫グロブリン分子の一部または全部。
[9]
プロモーターが、構成的プロモーターである、前記[1]に記載の方法。
[10]
プロモーターが、抗体分泌細胞において免疫グロブリン捕捉分子を優先的に発現し、抗原遭遇前のB細胞発生中は最小限の発現である、前記[9]に記載の方法。
[11]
プロモーターが、Bリンパ球誘導成熟タンパク質1、シンデカン1、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17、またはフコシルトランスフェラーゼ1遺伝子から選択される、前記[10]に記載の方法。
[12]
プロモーターが、誘導性プロモーターである、前記[1]に記載の方法。
[13]
誘導性プロモーターが、テトラサイクリン応答性プロモーター、または、タモキシフェン応答性プロモーターである、前記[12]に記載の方法。
[14]
細胞表面テザーペプチドが、膜貫通ペプチドである、前記[1]に記載の方法。
[15]
膜貫通ペプチドが、ヒトリンパ球活性化遺伝子3、ヒトCD58、ラットCD2、または、ヒトCD7である、前記[14]に記載の方法。
[16]
細胞表面テザーペプチドが、免疫グロブリン結合ペプチドを抗体分泌細胞の細胞表面につなぎ止めるために翻訳後修飾され得るペプチド配列である、前記[1]に記載の方法。
[17]
C末端ペプチド配列が、細胞膜へのグリコシルフォスファチジルイノシトール結合を媒介する、前記[16]に記載の方法。
[18]
核酸ベクターが、ストーク構造をコードする核酸配列をさらに含む、前記[1]に記載の方法。
[19]
核酸ベクターが、レポーターペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、前記[1]に記載の方法。
[20]
レポーターペプチドが蛍光ペプチドである、前記[19]に記載の方法。
[21]
核酸ベクターが、IRES配列、または、ピコルナウイルス2Aリボソームスキップ配列をさらに含む、前記[19]に記載の方法。
[22]
核酸ベクターが、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、前記[1]に記載の方法。
[23]
核酸ベクターが、IRES配列またはピコルナウイルス2Aリボソームスキップ配列に連結したストーク構造およびレポーターペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、前記[22]に記載の方法。
[24]
前記[1]に記載の方法によって産生される抗体分泌細胞。
[25]
前記[24]に記載の抗体分泌細胞由来の、免疫グロブリン分子の一部または全部。
[26]
抗体分泌細胞が、抗体の大規模産生に用いられる、前記[1]に記載の方法。
[27]
細胞表面テザー部分および免疫グロブリン結合部分を含む免疫グロブリン捕捉分子をコードする遺伝子を含む抗体分泌細胞を含む遺伝子組換え動物であって、免疫グロブリン捕捉分子が、抗体分泌細胞の細胞表面で、内因的に産生された免疫グロブリン分子を、結合、保持、および提示し得る、遺伝子組換え動物。
[28]
抗体分泌細胞が、免疫グロブリン捕捉分子を構成的に発現する、前記[27]に記載の遺伝子組換え動物。
[29]
抗体分泌細胞が、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで免疫グロブリン捕捉分子を発現するように誘導され得る、前記[27]に記載の遺伝子組換え動物。
[30]
動物が哺乳動物である、前記[27]に記載の遺伝子組換え動物。
[31]
動物がげっ歯類である、前記[30]に記載の遺伝子組換え動物。
[32]
げっ歯類が、マウスまたはラットである、前記[30]に記載の遺伝子組換え動物。
[33]
抗体分泌細胞の細部表面に免疫グロブリン分子を、結合、保持、および提示し得る膜結合型免疫グロブリン捕捉分子を発現させるためのベクターであって、プロモーター、免疫グロブリン結合ペプチドをコードする核酸配列、および、細胞表面テザーペプチドをコードする核酸配列を含むベクター。
[34]
IRES配列またはピコルナウイルス2Aリボソームスキップ配列に連結したシグナルペプチド、ストーク構造、および、レポーターペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、前記[33]に記載のベクター。
ストークを有さない免疫グロブリン捕捉分子の小さな膜結合型形態をコードする発現ベクターは、直接的なDNA合成、または、標準的な分子クローニング技術によって生成される。このベクターのタンパク質コード部分(501)の図が、図5Aに示されている。該発現ベクターは、ヒトLAG3(またはCD223)タンパク質由来の膜貫通ドメイン(506)[配列番号17]によって細胞表面につなぎ止められる、連鎖球菌のプロテインGの2つの免疫グロブリン結合ドメイン(504)[配列番号8]をコードする。Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser配列からなる短いリンカー(505)(配列番号28)をコードするDNAのフラグメントは、発現されたタンパク質に構造的可動性を提供するために、プロテインG免疫グロブリン結合ドメイン(504)をコードするDNAフラグメントと、膜貫通ドメイン(506)をコードするDNAフラグメントとの間に配置されている。最後に、シグナルペプチド(リーダーペプチド)(503)をコードする配列が該構築物に含まれ、生合成中の小胞体の内腔への免疫グロブリン捕捉分子の押し出しを可能にする。本実施例におけるシグナルペプチド配列は、免疫グロブリン軽鎖可変(VL)遺伝子セグメントに由来し、その天然のイントロン(503)[配列番号1~3]を含む。プロモーターは、(502)で示されている。本実施例の免疫グロブリン捕捉分子を含む様々な構成成分のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、表1および表2に明記されている。
長いストークを含有する免疫グロブリン捕捉分子の膜結合型形態をコードする発現ベクターを、直接的なDNA合成、または、標準的な分子クローニング技術によって生成する。該発現ベクターは、連鎖球菌のプロテインGのC末端側半分に由来する3つの免疫グロブリン結合ドメイン[配列番号9]をコードする。Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser[配列番号28]配列からなる短いリンカーをコードするDNAフラグメント、ヒトCD22タンパク質由来の6つの免疫グロブリンドメインからなるストーク[配列番号16]、およびヒトCD58に由来する膜貫通ドメイン[配列番号18]を、該ベクターの免疫グロブリン結合ドメインをコードするDNA断片に付加する。最後に、免疫グロブリン捕捉分子のオープンリーディングフレーム全体の前に、シグナルペプチド(リーダーペプチド)をコードする配列を配置して、生合成中の小胞体の内腔への翻訳タンパク質の押し出しを可能にする。本実施例のシグナルペプチドをコードする配列は、免疫グロブリン重鎖可変(VH)遺伝子セグメントに由来し、天然のイントロンを含む[配列番号5~7]。本実施例の免疫グロブリン捕捉分子を含む構成成分の、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、表1および表2に明記されている。
連鎖球菌のプロテインGに由来する2つの免疫グロブリン結合ドメインをコードする発現ベクターを合成する。該発現ベクターのプロテインGをコードする配列の下流には、以下をコードするDNAフラグメントが含まれる:グリシン/セリンリッチリンカー配列、ヒトCD4の2つの免疫グロブリンドメインから成るストーク、およびGPIアンカー配列。最後に、シグナルペプチド配列(リーダー配列)が該構築物に含まれ、生合成中の小胞体の内腔への翻訳タンパク質の押し出しを可能にする。本実施例のシグナルペプチドをコードする配列は、免疫グロブリン軽鎖可変(VL)遺伝子セグメントに由来し、天然のイントロンを含む。本実施例の免疫グロブリン捕捉分子を含む構成成分の、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、表1および表2に明記されている。GPIアンカー配列は、表3に明記されている。
免疫グロブリンの定常ドメインに特異的なscFVをコードする発現ベクターを、標準的な分子クローニングまたは、直接的なDNA合成によって生成する。本実施例において、単鎖抗体は、正常マウスに見られる抗体のうち90%を超える抗体に存在する、マウスκ軽鎖の定常ドメインに特異的である。VL、リンカー、およびVH配列を含むscFvをコードするエクソンは、それぞれ、[配列番号43~48]に明記されている。該発現ベクターのscFvをコードする配列の下流には、以下から成るラットIgG1のFc部分をコードする連続した配列が含まれる:分泌型形態のヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン。ラットIgG1のFcをコードする配列は、[配列番号49]に明記されている。該ベクターはまた、マウスの主要組織適合抗原クラスIタンパク質(ハプロタイプb由来のマウスK分子)の膜貫通ドメインをコードする配列を含み、これらは[配列番号50~54]に明記されている。
トランスジェニックマウスは、ヒトTNFRSF17遺伝子のプロモーター、例えば実施例1~4に示す免疫グロブリン捕捉分子のコード配列、IRES配列、およびGFPを含有する細菌性の人工染色体ベクターを用いて生成される。いくつかのトランスジェニック樹立系統(transgenic founder line)由来の、脾臓、リンパ節、および骨髄を採取して処理し、GFP並びに免疫グロブリン捕捉分子の発現を標準的なフローサイトメトリーで解析する。その後、トランスジェニックマウス由来のGFP陽性細胞をプールし、選別し、免疫グロブリンを分泌する能力について、酵素結合免疫スポット(ELISPOT)によって確認する。検出可能なレベルのGFPおよび免疫グロブリン捕捉分子を安定的に発現するトランスジェニック系統を増殖のために選択する。
Claims (13)
- 細胞表面に、内因的に産生された免疫グロブリン分子を、結合、保持、および提示し得る膜結合型免疫グロブリン捕捉分子を発現することができる遺伝子組換えマウスを生成する方法:
ここで該方法は、マウスの形質細胞、または、マウスの形質細胞の前駆細胞に、シグナルペプチドならびに細胞表面テザー部分および免疫グロブリン結合部分を含む免疫グロブリン捕捉分子をコードする核酸配列に作動可能に連結しているプロモーターを含む核酸ベクターを導入することを含み、プロモーターは形質細胞において免疫グロブリン捕捉分子の発現を駆動するが、未熟B細胞、成熟B細胞または活性化B細胞においては駆動しない;および
細胞表面テザー部分は膜貫通ドメインまたはグリコシルフォスファチジルイノシトールにより翻訳後修飾され得るC末端ペプチド配列を含み、免疫グロブリン結合部分は、プロテインA、プロテインG、プロテインH、プロテインLもしくはそれらの組合せから選択される細菌タンパク質由来の1以上の免疫グロブリン結合ドメイン、または免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖定常領域の保存されたエピトープに特異的に結合する免疫グロブリンの可変ドメインを含む。 - プロモーターが、Bリンパ球誘導成熟タンパク質1、シンデカン1、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17、またはフコシルトランスフェラーゼ1から選択される遺伝子の発現を駆動するプロモーターから選択される、請求項1に記載の方法。
- プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項1または2に記載の方法。
- 誘導性プロモーターが、テトラサイクリン応答性プロモーター、または、タモキシフェン応答性プロモーターである、請求項3に記載の方法。
- 細胞表面テザー部分が、ヒトリンパ球活性化遺伝子3、ヒトCD58、ラットCD2、または、ヒトCD7由来の膜貫通ドメインを含む、請求項1~4のいずれかに記載の方法。
- 細胞表面テザー部分が、グリコシルフォスファチジルイノシトールにより翻訳後修飾され得るC末端ペプチド配列を含む、請求項1~4のいずれかに記載の方法。
- 細胞表面テザー部分が、膜貫通ドメインを含む、請求項1~4のいずれかに記載の方法。
- 核酸ベクターが、ストーク構造をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1~7のいずれかに記載の方法。
- 核酸ベクターが、レポーターペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1~8のいずれかに記載の方法。
- レポーターペプチドが蛍光ペプチドである、請求項9に記載の方法。
- 核酸ベクターが、IRES配列、または、ピコルナウイルス2Aリボソームスキップ配列をさらに含む、請求項9または10に記載の方法。
- 核酸ベクターが、IRES配列またはピコルナウイルス2Aリボソームスキップ配列に連結したストーク構造およびレポーターペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1~11のいずれかに記載の方法。
- 遺伝子組み換えマウスが、抗体の大規模産生に用いられる、請求項1~12のいずれかに記載の方法。
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