JP2024009895A - 真核細胞ディスプレイ系におけるポリペプチド薬物の開発性のための選択 - Google Patents
真核細胞ディスプレイ系におけるポリペプチド薬物の開発性のための選択 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】インビトロでの培養高等真核細胞上の結合剤(例えば、抗体、受容体)の表面提示レベルを、結合剤の開発性特性、例えば溶解度の予測指標として使用すること。【解決手段】表面表示された結合剤を標的結合の開発性および親和性についてスクリーニングすることにおける使用に適合させた、高等真核細胞、例えば哺乳動物細胞のディスプレイライブラリ。結合剤の溶解度、高濃度で製剤化できる能力、非特異的結合の傾向の低さ、および半減期を含む開発性に対する固有の選択を有するディスプレイライブラリのハイスループットスクリーニング。結合剤コードDNAに作動可能に連結した誘導性プロモーターからの結合剤の細胞表面提示を制御することにより、開発性特性ならびに/または標的結合および親和性などの他の性質について結合剤の集団を富化すること。【選択図】なし
Description
本発明は、溶解度、高濃度で製剤化できる能力、非特異的結合の傾向の低さ、および最適な半減期などの望ましい開発性特性を有する候補ポリペプチド薬物の特定に関する。本発明はさらに、抗体発見を含む創薬における結合剤のスクリーニングに関する。
抗体は、極めて成果を挙げている薬物クラスであることが証明されており、これまでに70を超える治療用抗体が承認され、さらに多くが開発パイプラインにある。しかしながら、抗体などのポリペプチド薬の製造および製剤化は、多くの点で、小分子医薬品よりも複雑な試みである。いくつかの要因が、抗体などのポリペプチド薬の開発の実用性に影響を与え、有力候補の抗体が、効果的であるだけでなく、製造性があり、安定かつ安全である薬物へと首尾よく開発されるかどうかに影響する。このような要因には、化学的安定性(例えば、断片化、脱アミド化、酸化、および異性化への耐性)、物理的安定性(例えば、立体配座安定性、タンパク質の折畳がほどける傾向、凝集および/または沈殿、コロイド安定性)、および溶液特性(例えば、溶解度、溶液中で可逆的に自己会合する性向、および高濃度での粘度)が挙げられる。宿主細胞から分泌されるポリペプチドの量が培地から回収可能な産物の収量を決定するため、ポリペプチドが細胞培養において高収量で発現する能力も、関連性のある検討事項である。抗体またはポリペプチド薬の免疫原性も検討事項である。これらすべての要因は、製品の「開発性」特性と総称される。これらは、製品のコストおよび製造の実用性、安全性プロファイル、投薬スケジュール、および投与様式に影響を与えるため、重要な検討事項である。開発性の問題が発生した場合、それらは抗体の可用性または商業的成功に影響する可能性があり、開発プロセス中に有力な分子の失敗を引き起こし得る。抗体薬の開発性の態様、およびそれらを測定する方法については、概説されている1~3。
患者への投与には、安定した可溶性タンパク質を高濃度で産生させることが所望される。例えば、比較的大きな薬量を少しの体積で投与しなければならない皮下投与には、50mg/ml以上の抗体濃度が求められる。治療用途に理想的なポリペプチドは、緩衝水溶液に非常に溶けやすく、よって高濃度に濃縮できるものである。高濃度での可溶性タンパク質の生産が成功するかどうかは、少なくとも部分的には、自己会合に対するポリペプチドの耐性に依存し、これは、逆に粘度および/または沈殿の増加につながり得る。分子の溶解限度に達すると、溶解濃度をさらに上げることができなくなり、分子が溶液から沈殿するなどの望ましくない影響が生じる。溶解限度に近づくと、溶液が粘稠になることがあり、かつ/または溶解したポリペプチドが溶液中で自己会合することがあり(可逆的または不可逆的に)、このような影響によって、溶液の取扱および製剤化が複雑になる。さらに悪いことに、難溶性および/または不安定なポリペプチドによる凝集体の形成が、製品を患者に投与する際に免疫原性のリスクを高め得る4、5。抗薬物免疫応答(例えば、抗薬物抗体)により治療効果が中和される可能性があり、過感受性により疾病または死亡が生じ得る。
ポリペプチドが高レベルで発現する能力は、生産の経済性に影響し得る。抗体発見の初期段階では、哺乳動物細胞培養における最適化された一過性発現から得られる収量は50μg/ml以上に達し得る。一過性発現は一時的な発現系であり、目的の産物をコードするプラスミドが細胞にトランスフェクトされ、一定期間発現し、通常は、プラスミドが細胞から失われるにつれ2~7日後に減少する。薬物製造用に組換え細胞を安定して発現させるには、コードDNAを細胞ゲノムに安定して組み入れる必要がある。安定した製造用細胞株を創出したら、細胞を1週間または2週間培養して、約1mg/ml以上であり得
る高収量を得ることができる。
る高収量を得ることができる。
一過性発現による低い収量は、候補薬の可能性のある開発性の問題を示し得る。例えば、凝集しやすい抗アンジオポエチン抗体(「Ang2」)の収量はわずか10μg/mlであると報告されたのに対し、抗体の最適化された変異型では260μg/ml6が得られた。しかしながら、良好な収量が一過性発現から得られる場合(例えば、50μg/ml超)、および/または安定した細胞株から得られる場合(例えば、1mg/ml超)であっても、ポリペプチドが1mg/mlを超えて富化されると、生物物理学的問題が生じ得る。Dobsonら(20167)は、抗NGF抗体MEDI1912が、その親抗体MEDI576と比較した場合に重大な生物物理学的問題を抱えていることを見出したが、これは約200μg/mlの一過性培養から報告された発現レベルには反映されなかった。したがって、細胞培養における発現からの収量は、開発性の1つの態様にすぎず、他の重要な態様を予測するものではない場合がある。
過去数十年にかけて、ディスプレイ技術により、所望の標的結合特性を有する個々の変異型を単離することができる、抗体ならびに他のタンパク質およびペプチドの大型かつ多様な集団の創出が可能となった。所望の結合特性には、適切な特異性(例えば、オルソログおよびパラログに対するもの)および適切な親和性による標的上の適切なエピトープへの結合(例えば、受容体-リガンド相互作用を阻害するため)が含まれる。ディスプレイ技術は、いくつかのそのような態様が選択中に富化されるようにすることにより、所望の特性を有する結合剤を発見するのに役立ち得る。例えば、選択を駆動するために限定量の抗原を使用することにより、より高い親和性の抗体を選択することができる。望ましくないパラログへの結合に対する選択解除も説明されている。インビトロの結合剤ディスプレイプラットフォーム、および開発性のいくつかの態様を含む所望の特性を選択する際のそれらの使用については、概説されている8。マウスなどの実験動物の免疫を含む、抗体を生成するインビボ法も既知である。動物の免疫系を使用して抗体のパネルを創出し、これをマルチウェルプレートにおいてまたは流動選別により望ましい特性(例えば、腫瘍関連抗原の結合、サイトカイン中和)についてスクリーニングすることで、多くの承認されている抗体薬物分子が発見されている。
動物から直接取得されるか、または酵母ディスプレイもしくはファージディスプレイなどの組み合わせディスプレイ系に組み込まれるかに関係なく、「天然の」供給源から単離された抗体遺伝子が良好な開発性を呈する抗体をコードするという保証はない。このことは、未感作の供給源から得られた抗体遺伝子だけでなく、免疫後にインビボで生成されたものにも当てはまり、そのような抗体が良好な開発性特性を有すると仮定する先験的な理由はない。免疫系は、医薬品としての工業的製造または製剤化に役立つ抗体を創出するのではなく、高親和性の抗体を作製することを目的とする。インビボまたはインビトロのいずれかで生成された抗体は、必ずしも医薬製剤に好適なレベルに濃縮される能力を有するとは限らない。ヒト血清中のIgGの平均総濃度は12mg/mlであり、いずれの個々の抗体も著しく低い濃度で表される。個々の抗体の割合にも大きな変動があり、免疫応答中、個々のB細胞間で1000倍の発現の違いが観察される6。したがって、抗体の起源(例えば、免疫された動物/ヒトドナー、合成または半合成の供給源)に関係なく、高濃度でのその溶解性を仮定することはできない。
伝統的に、創薬の初期段階は、標的結合特性などの所望の治療作用機序を有する分子の特定に焦点を当てるが、開発性の評価は、後の段階、多くの場合、前臨床開発のための有力な分子または限られた分子パネルが選択された後まで先送りされる。これの不運な結果は、開発性の問題が明らかになるのが創薬の比較的遅い段階であり、このときにはかなりの時間および費用がすでに費やされているということである。このような失敗は高くつく。バイオ医薬品業界では、候補薬の失敗が創薬の普遍的特徴であることが認識されている
ものの(可能性のある薬物の大部分は臨床には届かない)、無駄を減らし、成功がより稀なものに資源を流用できるようにするために、「早期に失敗する」薬物が望まれている。
ものの(可能性のある薬物の大部分は臨床には届かない)、無駄を減らし、成功がより稀なものに資源を流用できるようにするために、「早期に失敗する」薬物が望まれている。
親和性の改善に焦点を当てて抗体を操作すると、自己会合の傾向などの生物物理学的特性に悪影響を与える変異を伴う親和性強化変異型を生成できることが示されている。抗NGF抗体MEDI1912がその一例である。MEDI1912は、親抗体MEDI578から親和性成熟したNGF7に対してpM親和性を有することが報告されている。しかしながら、MEDI578と比較して、親和性成熟したMEDI1912抗体は、溶解度が低く、コロイド安定性が悪く、低濃度で凝集し、かつ半減期が短かった。
開発性のいくつかの態様の選択またはスクリーニングをファージディスプレイなどのインビトロ選択プラットフォームに組み入れる努力がなされてきた。VHまたはVLドメインのみを保有する単一ドメイン抗体またはdAbの場合、熱チャレンジにより、抗原に対する選択の前に、より低い融解温度(Tm)の抗体の割合を低下させることができる。Tmの増加は、可逆的な折畳の解消、凝集に対する耐性、溶解度、細菌における発現および精製収率などの生物物理学的特性の全体的な改善と関連付けられている。しかしながら、Tmが類似している分子は生物物理学的特性の差異を呈し得る(Dobson et al 20167および実施例3を参照されたい)。ScFv分子も、二重特異性プラットフォーム9~11に含めるために安定性を改善するように設計されている。さらに、いずれの可能性のある翻訳後修飾部位(例えば、脱アミド化部位、異性化部位、プロテアーゼ切断部位、および酸化部位)の包含も回避しながら、ライブラリに多様性を導入することを目指すファージディスプレイが構築されている(例えば、Tillerら(2013)12)。
分子挙動のインシリコ予測のために多数のアルゴリズムが創出されており、そのようなアルゴリズムは、比較的多数の可能性のある候補薬物分子の開発性特性の比較を容易にする。この種類のアルゴリズムは、原因となり得るアミノ酸配列の特徴を特定することにより、開発性の問題の根底にある、見込まれる理由を突き止めるのに役立ち得る。例えば、配列中の疎水性パッチは、分子の「粘着性」を引き起こし、ポリペプチドが密接に会合しているために高濃度で発生する可能性が高い非特異的結合および/または自己凝集を呈することが認識されている。タンパク質の折畳み解除は、分子内に本来の構造で埋め込まれている疎水性残基を露出させ得る。
開発プロセス中に予測されるかまたは単純に遭遇するかにかかわらず、開発性の問題が生じる場合、タンパク質工学を使用して困難に対処する試みが成され得る。Dudgeonら13は、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基の導入が生物物理学的特性を改善した抗体VHおよびVLドメインの特定の位置を特定した。得られた抗体は非凝集性であり、十分に発現され、熱による再折畳が可能であると言われた。特定された変異は、抗体配列の残りとは無関係に、特定の位置での局所電荷分布を改変することにより凝集耐性を高めると報告されているため、優れた生物物理学的特性を有するヒト抗体可変ドメインを操作するための一般的なテンプレートとして示されている。他の場合では、特定の抗体配列が、開発性を制約し得る個々の特徴について調査されている。例えば、B細胞ハイブリドーマキャンペーンから特定された抗アンジオポエチン抗体「Ang2」は、一過性培養において低レベルの発現のレベルが低く、凝集しやすいことが見出された6。その配列の分析により、軽鎖可変ドメインフレームワークの49位に不対システインが特定された。20個の個々の変異型が作製され、凝集についての評価を受け、システイン49がトレオニン(C49T)に変化した、溶解度が改善されたバージョンが特定された。この場合、親クローンのベースライン発現は非常に低く、C49T変異型において結合を損なうことなく収量の改善も観察された。
別の例は、開発中に行き詰った7、上述の親和性が向上したMEDI912抗体の「修復」である。水素:重水素交換と構造モデリングとの組み合わせにより、VHドメイン内の3つの非パラトピック(paratopic)疎水性残基が特定され、これらは親抗体に見られる残基に戻された。30位のトリプトファン、31位のフェニルアラニン、56位のロイシンは、それぞれ、セリン、トレオニン、およびトレオニンに変換された(W30S、F31T、L56Tと表され、番号は抗体鎖内のアミノ酸位置を示し、最初の文字は元のアミノ酸を示し、最後の文字は置換アミノ酸を表す)。MEDI1912-STTと称される開発性が改善したバージョンは、凝集の減少を示し、非特異的結合の減少および半減期の増加を含む多数の他の側面において改善された。
Betheaら(2012)14は、13mg/mlで沈殿につながる自己凝集を含む生物物理学的特性が不十分な抗IL-13抗体について説明している。フェニルアラニン、ヒスチジン、およびトリプトファンからなる重鎖のCDR3における芳香族トライアドが可能性のある問題として特定された。著者らは、溶解度を改善し、非特異的相互作用を減少させる単一のアミノ酸変化(100a位のトリプトファン残基へのアラニンの置換)を含むいくつかの変異の導入について説明している。この場合、この変化により、標的結合も減少した。
配列の最適化により、非特異的結合と自己凝集などの他の望ましくない挙動との両方を同時に減少させることができたMEDI912-STTおよび抗IL-13抗体の例は、複数の開発性パラメータが相互に関連し得、共通の根本的な原因を有し得ることを示す。しかしながら、非特異的な相互作用が見られるものの、自己相互作用の証拠がほとんどない他のケースが報告されている2、15。
非特異的相互作用は、薬物分子の性能、特異性、インビボ分布、または半減期に悪影響を与え得るため、創薬において重要な検討事項である。抗体のインビボ半減期は、同じFc領域を有する抗体間で大きく異なり得16、このことは抗体可変ドメインが半減期に与える影響を示している。これは、多くの場合、非特異的相互作用に起因している。投与された薬物が非標的成分との非特異的結合相互作用の「シンク」に引き込まれると、その標的分子への結合にあまり利用できなくなり、標的組織または病変部位に到達または浸透する能力が低下し得る。特に標的が非常に豊富である場合、低親和性の非特異的相互作用でさえ重要になり得る。例えば、循環中の抗体は、0.5mm以上の深さに達すると報告されている内皮グリコカリックスの広大な面積(推定面積350m2)に露出する。負に荷電しているグリコカリックスは、ヒアルロン酸などの様々なグリコサミノグリカンとヘパリン硫酸などのプロテオグリカンとで構成され、これらが一緒になって主成分を構成する。これは、吸収された血漿タンパク質も提示する17、18。このマトリックスおよび循環中の抗体に提示される他の表面との低親和性の会合は、薬物動態に大きな影響を与え得る。
非特異的相互作用をスクリーニングする方法が存在し、これらは、通常、目的の個々の結合剤が特定された後、クローンごとに実行される。Hotzelら(2012)は、ELISAにおいてバキュロウイルス粒子への結合をスクリーニングすることにより、非特異的相互作用を呈する抗体を特定するのに役立つ戦略について説明している16。また、Xuらは、特異性の低い抗体を特定するための、酵母ディスプレイプラットフォームを用いた標識されたタンパク質混合物を使用する多重特異性試薬結合アッセイ(PSR MFI)を説明している19。非特異的相互作用を起こしやすい抗体を特定するのに役立てるために、クロマトグラフィー法も多数開発されている。これらは、典型的には、相互作用パートナー、化合物、または目的の表面をセファロースなどのマトリックスに固定化した後、試験抗体分子をマトリックスに通過させ、保持の程度を、決まったまたは変化する洗浄条件で試験抗体と対照抗体とで比較することを伴う。交差相互作用クロマトグラフィー
(CIC)15、疎水性クロマトグラフィー、およびヘパリンなどの方法が使用されている。
(CIC)15、疎水性クロマトグラフィー、およびヘパリンなどの方法が使用されている。
開発性に関するさらなる検討事項は、インビボでの治療用タンパク質の半減期である。全身投与される多くの薬物の最適な効力を達成するために、それらの血清濃度をある期間特定のレベル(または標的範囲内)に維持することが必要である。ポリペプチドの半減期および/またはインビボでの有効濃度は、上で考察した非特異的結合相互作用の影響をある程度受けることがある。さらに、Fc領域を含む抗体および他の分子の場合、内皮細胞で発現される受容体であるFcRnへのFc領域の結合によって半減期が強く影響され得る。ヒトIgGは、他の循環分子と比較して半減期が比較的長く、これは、それらのFcRnとのpH依存性相互作用に起因するとされている。飲作用およびエンドソーム輸送に続いて、比較的高い親和性相互作用が、抗体をリソソーム分解から保護する抗体Fc受容体とFcRn受容体との間で生じる。中性pHでは、FcとFcRnの間の親和性は低く、細胞表面への再循環時に中性pHが生じる。これらの条件下では、抗体は循環に再放出される。したがって、FcRn受容体へのpH依存性結合は、IgG分子の重要な特性である。ラットIgG2a Fcと複合体化したFcRnの結晶構造20により、CH2およびCH3ドメイン(CH2残基252~254および309~311、ならびにCH3残基434~436)へのFcRn結合が示され、重要なpH依存性結合を説明するのに役立てられる。Fc工学により、半減期が改善したFc変異型が生成されている。
Suzukiら(2010)は、他の要因が寄与し得ることは明らかであるものの、中性pHでの低い親和性と長いインビボ半減期との間の正の相関21を示している。抗IL-12抗体であるブリアキヌマブおよびウステキヌマブの半減期は、Fcドメインが類似しているにもかかわらず、それぞれ8日および22日である。これらの抗体および一連の交差変異型を使用して、Schochら(2015)22は、中性pHでの保持された結合とインビボ半減期との間の良好な相関を示した。Schochらは、FcRnとの静電相互作用の増加を引き起こし、それにより細胞外pHでのFcRn-IgG解離を制限するものとして、ブリアキヌマブのVL上の大型の正に荷電したパッチを指摘した。同様のpH依存性相互作用がKellyら(2016)に記載されているが、他のタンパク質との非特異的相互作用も半減期の短さに寄与し得ると主張している23。
通常、ディスプレイライブラリを使用した創薬における主な狙いは、目的の標的分子への結合に対して高い親和性を有する結合剤を発現するクローンのライブラリを富化することである。ファージディスプレイライブラリを使用して、結合剤を非結合剤から富化し、より低い親和性のクローンと比較してより高い親和性のクローンを富化することができる。親和性に基づく相対的富化により、ファージディスプレイを抗体の親和性成熟に使用できるようになった。典型的には、ビオチン化抗原を使用して、関連するディスプレイパッケージと一緒に抗体:抗原複合体の回収を可能にする(例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを使用)。抗原の濃度が低い場合、集団内の親和性のより高い抗体は、親和性のより低い抗体よりも複合体を形成する可能性が高く、結果としてこれらの抗体が相対的に富化される。
しかしながら、真核細胞で結合剤を表示する場合、ビーズ上での固相回収と組み合わせて制限抗原を使用するアプローチは、高親和性結合剤の富化では、ファージディスプレイよりも効果が低い場合がある。一価のファージディスプレイとは異なり、真核細胞はその表面に同じ結合剤の多くのコピーを有する多価のディスプレイパッケージである。選択中に細胞集団内に提示される結合剤の濃度は、解決しようとする抗原濃度および/または親和性と比較して比較的高い可能性がある。これは、親和性の影響を隠し、混合された集団における異なるクローンに表示される結合剤の親和性の違いを解決することを困難にし、その結果、ファージディスプレイなどのアプローチと比較して達成される富化係数を低減
し得る。
し得る。
BoderおよびWittrup24は、限界濃度の蛍光標識された一価抗原をフローサイトメトリーと併用して親和性を選択し、細胞ごとに結合した抗体の量を測定して、発現の違いを制御することで、真核細胞ディスプレイライブラリにおいて、厳密性を高め、親和性の選択を可能にすると主張する方法について説明している。この系では、結合剤に対するターゲットの濃度を低下させることにより、結合の厳密性が増大したと報告されており、そのため、標的のより多くの分子がより低い親和性の結合剤よりもより高い親和性の結合剤に結合したことを理由に、より高い親和性の結合剤が、標的から検出されたシグナルのレベルに基づいて検出されると言われている。
多くの出版物が、標的結合および抗体発現を同時に調査した場合の選択について説明している。このようにして、達成されたディスプレイのレベルに基づいて、抗原結合の程度を正規化することができる。米国第8,771,960号(DKFZ)は、抗体ライブラリまたは異なる抗原特異的ハイブリドーマ細胞のグループがPE標識された抗原で染色され、FITC標識されたタンパク質Gで対比染色された蛍光活性化細胞選別(FACS)法を使用する、より高い親和性のモノクローナル抗体の選択について説明している。PE染色:FITC染色の商が最大の細胞がFACSで選択され、その後、選択に使用した標的抗原に対して比較的高い親和性を有する抗体を各々産生する個々の細胞が拡大された。このため、抗体に結合した抗原と抗体に結合していない抗原との比率が、その抗原に対する抗体親和性の直接的な尺度として使用された。
Chaoら(2006)25は、酵母凝集素Aga2pサブユニットと遺伝的に融合したscFvのレパートリーをコードする遺伝子について説明している。Aga2p酵母ディスプレイ系では、目的の結合剤(ここではscFv)は、ジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に存在するAga1pサブユニットに結合するAga2pサブユニットに融合される。標的特異的結合分子を発現する酵母細胞は、直接または間接的に標識された標的分子を使用するフローサイトメトリーによって特定され得る。例えば、ビオチン化標的が細胞に追加され、細胞壁内に提示されたscFvへの結合がストレプトアビジン-フィコエリトリンで検出され得る。標的分子の濃度を制限することで、より親和性の高い結合剤を発現するクローンを富化することが可能になり、これは、これらのクローンがより多くの標的分子を捕捉し、結果、より明るい蛍光を呈したためである。異なる細胞におけるscFv発現の変動を制御するために、Chaoら(2006)25は蛍光標識された抗タグ抗体を使用して、各細胞の表面の抗体発現レベルを測定し、発現レベルの変動を正規化した。このため、このアプローチにより、高親和性結合分子を表示する酵母細胞を、高レベルのより低い親和性の抗体を発現する細胞と区別することが可能となった。したがって、この場合の抗体ディスプレイを測定する目的は、発現の違いを正規化し、それにより親和性の選択を容易にすることであった。
提示レベルが分泌型の同じタンパク質の可能性のある発現収量の指標として使用される方法も記載されている。抗体産生のための安定した細胞株の創出中に高度に発現される細胞クローンを特定することを目指し、国際公開第WO2015128509号(Glenmark Pharmaceuticals)では、抗体が分泌形態で発現されるが、細胞表面での提示のために一部が「サンプリング」されるアプローチが説明されている。このサンプリングは、最初の停止コドンを迂回し、抗体mRNAの一部で、抗体遺伝子を、膜貫通ドメインをコードするエクソンにスプライスする、スプライシング事象の結果として生じる。この系では、抗体のディスプレイレベルは、発現された可溶性抗体の量に直接相関すると報告されている。
酵母を用いた多くの研究により、酵母細胞上の結合剤の表面提示のレベル、結合剤の熱
安定性、および/または細胞培養からの結合剤の収量の間の関連が報告されている。Shustaら26は、可溶性単鎖T細胞受容体(scTCR)変異型をAga2pに融合させ、様々な変異体の熱安定性がそれらの可溶性分泌レベルおよび酵母細胞壁上のAga2pへの融合として表示されるscTCRの量と強く相関していることを報告した。Shustaらは、小胞体(ER)の品質管理装置による熱力学的に不安定な変異体の細胞内タンパク質分解が、タンパク質発現の効率を決定づけると提案した。Kowalskiら27、28は、酵母における可溶性ポリペプチドフィブロネクチンIII型(FnIII)ドメインの変異型の可溶性発現を調査し、ポリペプチドの熱力学的安定性と分泌効率(したがって収量)の相関についても報告している。酵母ディスプレイ系を使用して、ハッケルら29は、FnIIIドメインの熱力学的安定性の影響をさらに調査した。Hackelらは、広範なAga2p融合FnIII変異型を発現する酵母を培養して、それらの熱安定性を低下させ、熱安定性と表面コピー数との間に正の相関があることを発見した。したがって、より熱的に不安定な変異体は、減少した表面ディスプレイレベルを呈した。
安定性、および/または細胞培養からの結合剤の収量の間の関連が報告されている。Shustaら26は、可溶性単鎖T細胞受容体(scTCR)変異型をAga2pに融合させ、様々な変異体の熱安定性がそれらの可溶性分泌レベルおよび酵母細胞壁上のAga2pへの融合として表示されるscTCRの量と強く相関していることを報告した。Shustaらは、小胞体(ER)の品質管理装置による熱力学的に不安定な変異体の細胞内タンパク質分解が、タンパク質発現の効率を決定づけると提案した。Kowalskiら27、28は、酵母における可溶性ポリペプチドフィブロネクチンIII型(FnIII)ドメインの変異型の可溶性発現を調査し、ポリペプチドの熱力学的安定性と分泌効率(したがって収量)の相関についても報告している。酵母ディスプレイ系を使用して、ハッケルら29は、FnIIIドメインの熱力学的安定性の影響をさらに調査した。Hackelらは、広範なAga2p融合FnIII変異型を発現する酵母を培養して、それらの熱安定性を低下させ、熱安定性と表面コピー数との間に正の相関があることを発見した。したがって、より熱的に不安定な変異体は、減少した表面ディスプレイレベルを呈した。
国際公開第WO2012/158739号は、インビトロのリボソームディスプレイライブラリからの抗原ベースの選択に続いて、選択した結合剤をさらなる抗原ベースの選択のために酵母ディスプレイライブラリに変換することを伴うFnIIIドメインに基づいてライブラリからポリペプチドを選択するための2段階プロセスを説明している。インビトロのリボソームディスプレイ系により、大部分が凝集したポリペプチドが生成されたが、酵母ディスプレイ選択を含めると、選択した集団における高度に凝集したポリペプチドの数が減少したものの、単量体を産生するクローンの割合は低いままであった。新たなクローンの発現挙動におけるわずかな改善は、酵母系が、誤った折畳の(例えば、熱的に不安定な)タンパク質の発現に対して許容度が低く、その結果、そのようなタンパク質は、酵母ライブラリからの選択にさほど利用可能でなかったことに起因した。ここでも、この作業にはAga1p:Aga2p-FnIIIディスプレイ系が関与した。
一方、Julianら30は、抗原結合と酵母上のVHドメインの表面ディスプレイとを同時に選択すると、親和性はより高いが安定性がより低い抗体が得られることを発見した。最も親和性の高いVHドメインは非常に不安定であった。この研究では、様々な熱安定性にわたって酵母のディスプレイレベルにわずかな変化(1.6倍)しか見られなかったため、著者らは、ディスプレイレベルでは親和性と安定性との両方を一緒に改善する変異体のセットの選択を導くことができなかったと報告している。
抗体の親和性、特異性、安定性、および溶解度の関係に関する最近の報告では、どのようにして1つの特性(例えば、親和性)の改善が他の特性(例えば、安定性)の低下につながるか、およびどのようにしてこれらのトレードオフのバランスを取り、抗体の複数の特性を同時に最適化できるかが説明されている31。
したがって、複数の分野での広範囲にわたる研究は、開発性に影響を与えるポリペプチドの異なる特性間の可能性のある関連性を特定し理解することを目指してきた。それにもかかわらず、特に薬物の溶解性および非特異的結合の回避などの態様について、開発性スクリーニングを候補薬物の選択の初期段階に簡便に組み入れるポリペプチド創薬方法は、依然として欠如したままである。
本発明は、ディスプレイライブラリからの発見の段階におけるポリペプチドの開発性の問題の検出を容易にすることで、不利益な開発性を有する分子を回避し、開発性特性がより良好なものについて候補薬物分子のプールを富化することを可能にする方法および製品を提供する。
発明者らは、驚くべきことに、真核生物宿主細胞の表面に提示されるポリペプチドのレベルが、溶液中のその溶解度およびその自己会合に対する耐性などの溶液中のその特性を含む、ポリペプチドの特定の開発性特性に関連することを発見した。組換え遺伝子からポリペプチドを発現し、その表面上にポリペプチドを表示する宿主細胞は、細胞表面上でのその提示のレベルを決定することにより、ポリペプチドのそのような開発性特性を評価またはスクリーニングするために使用され得る。これは、複数の宿主細胞クローンの並行したハイスループットスクリーニングに役立ち、相対的な表面提示の比較、およびより良好な開発性特性を有するポリペプチドを示すクローンの選択が可能となる。したがって、ポリペプチドの表面提示レベルは、抗体発見など、ポリペプチド結合剤をスクリーニングする方法における開発性の予測指標となる。さらに、表面提示のレベルと自己会合などの生物物理学的特性との間のこの関連により、そのような最適な生物物理学的特性を有する結合剤を結合剤のライブラリから選択するか、そのようなライブラリ内で富化することができるようになる。逆に、生物物理学的特性がより不良(例えば、溶解度がより低い)結合剤は、結合剤のライブラリに対して選択またはライブラリから除外することができる。
発明者らはまた、非特異的結合、血清中または標的器官および組織中の半減期および有効濃度などのポリペプチド薬のインビボ特性に関する開発性の側面について、インビトロで高等真核細胞において発現されるポリペプチドをスクリーニングする方法を考案した。
本発明による方法および使用は、抗体などの結合剤の大型かつ多様なライブラリのスクリーニングを含む、初期段階のスクリーニング中に特定の利点を有する。本発明は、創薬の最も早い段階で候補ポリペプチド薬の開発性スクリーニングを組み入れることにより、費用のかかる後期段階での失敗のリスクを低減する。本発明による開発性スクリーニングはまた、開発性がより良好なポリペプチドについてプールを富化するように、および/または創薬のための有力な分子の選択について決定に情報を与えるように、候補ポリペプチド薬の後期段階のプール、任意選択で、共通系統を共有する抗体の「ファミリー」の中から選択するために使用されてもよい。加えて、本発明の技法は、既存の候補ポリペプチド薬の改善された変異型、例えば、1つ以上の開発性基準を満たせなかった、または1つ以上の開発性特性の改善が望まれる候補薬を特定するために使用されてもよい。したがって、改善された開発性特性を呈する誘導体配列の生成および迅速なスクリーニングのための方法が本明細書に記載される。
哺乳動物細胞におけるポリペプチド発現経路は、小胞体上の翻訳機構(リボソームなど)で始まり、その後、新生ポリペプチドがゴルジ複合体を通過して細胞膜に輸送され、そこで細胞から分泌されるか、または細胞表面で保持される(例えば、膜タンパク質として)。組換え産生されたポリペプチドは、分泌されると、すぐに大量の培地に希釈され、数日/数週間の蓄積後、典型的には1~100μg/mlの濃度で存在するようになる。これは、患者への投与のために製剤化された医薬品におけるポリペプチド薬の望ましい濃度と比較して低い。分泌されたポリペプチドとは対照的に、細胞表面に保持されている発現されたポリペプチドは、細胞表面に高い局所濃度を形成し得る。発現されたポリペプチドが細胞表面に保持されると、ポリペプチドが利用できる量が大幅に減少するため、高濃度を達成する機会がもたらされる。示されたポリペプチドがサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターなどの強力なプロモーターから発現される場合、濃度は特に高くなり得る。したがって、組換え細胞ライブラリ内の哺乳動物および他の真核細胞の表面にポリペプチド結合剤が保持されると、コードされたポリペプチドが全ポリペプチド合成のかなりの割合を占める組換え遺伝子を強力に発現する宿主細胞が使用される場合には特に、結合剤が細胞膜表面において局所的に高い密度で富化されるようになる。ポリペプチドのレパートリーを発現するクローンのパネル全体に適用すると、異なるポリペプチドの表面提示レベルのクローン間変動は、自己会合に対する耐性などのポリペプチドの特性を反映し得る。自己会合する傾向が低いポリペプチドは、細胞表面上でより高いレベルに富化され得、
これは、ポリペプチドが接近したときに凝集に抵抗する能力によって支援される。したがって、培養中の真核細胞ディスプレイライブラリは、良好な開発性特性を呈する結合剤のインビトロ選択環境として機能し得る。これは、本明細書に示される実施例において証拠により裏付けられる。
これは、ポリペプチドが接近したときに凝集に抵抗する能力によって支援される。したがって、培養中の真核細胞ディスプレイライブラリは、良好な開発性特性を呈する結合剤のインビトロ選択環境として機能し得る。これは、本明細書に示される実施例において証拠により裏付けられる。
本発明の第1の態様によれば、培養真核細胞クローンの表面上のポリペプチド結合剤(例えば、抗体)の表面提示レベルは、それらの溶解性、溶液中の自己会合に対する耐性、および/または溶液中での濃縮能などの結合剤の開発性特性の予測指標として使用される。理論に拘束されることを望むものではないが、結合剤の溶解度に関連する1つの要素は、その親水性であり、親水性が高い(疎水性が低い)と、溶解度が高くなり、水溶液中での自己会合への耐性が高くなり、溶液中で到達できる濃度が高くなる。よって、本発明の方法を使用して、親水性の高い結合剤(候補のポリペプチド薬)を、本明細書に記載の真核細胞ディスプレイ系におけるそれらの表面提示の程度に基づいて、親水性の低い結合剤から区別することができる。
本発明は、
各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核(例えば、哺乳動物)細胞クローンのライブラリを提供することと、
クローンを結合剤の発現のための条件下でインビトロで培養することであって、結合剤が細胞表面に提示される、培養することと、
複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを決定することと、
他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する1つ以上のクローンを選択することと、
1つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、開発性特性が良好であるものとして特定することと、を含む方法を提供する。
各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核(例えば、哺乳動物)細胞クローンのライブラリを提供することと、
クローンを結合剤の発現のための条件下でインビトロで培養することであって、結合剤が細胞表面に提示される、培養することと、
複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを決定することと、
他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する1つ以上のクローンを選択することと、
1つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、開発性特性が良好であるものとして特定することと、を含む方法を提供する。
本発明は、結合剤を、それらの開発性特性に従って区別もしくはランク付けするため、および/または開発性特性が良好である1つ以上の結合剤を選択するために使用されてもよい。そのような方法で評価される開発性特性は、本明細書の他箇所で詳細に考察されるように、溶解度、自己会合に対する耐性、および/または水溶液中で富化される能力などの結合剤の溶液特性であってもよい。
表面提示がより高いクローンの選択により、結合剤の表面提示がより高いクローンについて富化された選択された細胞集団がもたらされ、これを、その後、任意選択で、追加の回のスクリーニンなどの1つ以上のさらなる方法で使用してもよい。
表面提示レベルを決定する方法は、本明細書の他箇所で詳述されており、検出可能な(例えば、蛍光)標識を組み込んだ薬剤で結合剤を標識することを任意選択で含む。Fc領域を含む抗体および他の結合剤では、Fc領域に結合する薬剤により標識することが簡便である。例えば、検出剤は標識された抗IgG抗体であってもよい。本方法には、表面提示レベルを決定すること、およびライブラリの細胞における様々な結合剤提示レベルを観察することが含まれ得る。コピー数の範囲の例は、本明細書の他箇所に見られる。
本発明のさらなる態様は、ディスプレイライブラリにおける結合剤発見中の非特異的結合の評価に関する。最初の結合剤発見中に非標的分子との相互作用を特定することが有利である。本発明の方法は、最適な生物物理学的特性およびインビボの非標的分子との非特異的相互作用の低い傾向について、高等真核細胞上に表示される結合剤(例えば、抗体)の集団をスクリーニングする際に用いられてもよい。標的分子(例えば、それがインビボで結合し、生物学的効果を発揮するポリペプチド薬物の分子標的)への望ましい結合のための候補ポリペプチド薬物を選択することが慣例であるが、非標的分子(例えば、核酸の
ような負に荷電したポリマーへの結合など、結合剤が非特異的結合を示す分子の成分またはクラス)に望ましくない結合を呈する候補ポリペプチド薬に対して負の選択を行うことに注意を払う場合にも、開発性に伴う問題は軽減し得る。非標的分子は、非標的分子を認識する結合剤が保持されるのではなく廃棄され、それにより非標的分子を認識しない結合剤を富化することを除いて、結合剤を選択する方法において標的分子の代わりになり得る。
ような負に荷電したポリマーへの結合など、結合剤が非特異的結合を示す分子の成分またはクラス)に望ましくない結合を呈する候補ポリペプチド薬に対して負の選択を行うことに注意を払う場合にも、開発性に伴う問題は軽減し得る。非標的分子は、非標的分子を認識する結合剤が保持されるのではなく廃棄され、それにより非標的分子を認識しない結合剤を富化することを除いて、結合剤を選択する方法において標的分子の代わりになり得る。
本発明は、非特異的結合の傾向が低い結合剤を選択し、非特異的結合の少ないものについて候補薬物のプールを富化し、異なる候補薬物製品の予測される薬物動態性能を比較する方法を提供する。このような方法は、創薬中、任意選択でスクリーニングの初期段階で、または創薬のための有力分子の選択について決定に情報を与えるために使用され得る。
本発明は、
(i)各々結合剤をコードするDNAを含む真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
(ii)結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをインビトロで培養することと、
(iii)結合剤を、非標的分子を含むマトリックスに露出させて、結合を可能にすることと、
(iv)マトリックスへの結合のレベルがより高い細胞を廃棄することと、
(v)マトリックスへの結合のレベルが低い細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、を含む、インビトロのスクリーニング方法を提供する。結合剤、およびそれによりそれらを表示する細胞は、それらのマトリックスへの相対的な結合に従って分離される。マトリックスに結合する細胞は廃棄され、非結合細胞は収集される。
(i)各々結合剤をコードするDNAを含む真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
(ii)結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをインビトロで培養することと、
(iii)結合剤を、非標的分子を含むマトリックスに露出させて、結合を可能にすることと、
(iv)マトリックスへの結合のレベルがより高い細胞を廃棄することと、
(v)マトリックスへの結合のレベルが低い細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、を含む、インビトロのスクリーニング方法を提供する。結合剤、およびそれによりそれらを表示する細胞は、それらのマトリックスへの相対的な結合に従って分離される。マトリックスに結合する細胞は廃棄され、非結合細胞は収集される。
細胞表面に表示される抗体の価数が高いと、親和性の低い交差反応性の検出が容易となる。結合剤を提示する細胞の集団がマトリックス上を通過するとき、マトリックスへの結合は、通過の遅延によって明らかになり得る。相互作用の可能性が低い結合剤を表示する細胞は、より後になって出現する非特異的相互作用を呈する結合剤を表示するクローンとは対照的に、より容易にマトリックスを通って進行し、収集することができる。このように、クローンのライブラリをマトリックスに通すと、マトリックスの1つ以上の構成要素に結合する傾向が高い結合剤を表示するクローンが、マトリックスを通るのにより長い時間がかかることになるか、またはマトリックスからまったく出現しないことさえあり得るため、時間の経過とともにクローンの分離が達成される。本方法は、マトリックスをより素早く通る細胞を収集することと、より緩徐に通る、かつ/またはマトリックスに結合したままである細胞を廃棄することとを含み得る。マトリックスは、一般に、1つ以上の非標的構成要素が固定されている固体または半固体の基質(例えば、任意選択でカラム内に詰められている、ビーズ)を含むことになる。ヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび血流中で遭遇する他の豊富な構成要素など、いくつかの非標的分子が試験され得る。マトリックスは、グリコカリックスの1つ以上の構成要素、例えば、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸を含んでもよい。あるいは、収集パラメータが目的の相互作用パートナー、化合物、または表面への結合の程度に基づく非標的分子を用いて、流動選別または磁気ビーズでの選別を使用してもよい。したがって、本方法を使用して、結合剤が投与される哺乳動物対象において非標的分子とインビボで結合する傾向が低い結合剤を発現する細胞を富化し得る。
結合剤は、
(i)各々結合剤をコードするDNAを含む真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
(ii)結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをイ
ンビトロで培養することと、
(iii)結合剤を、1つ以上の非標的分子に露出させて、結合を可能にすることと、
(iv)1つ以上の非標的分子への結合のレベルがより高い細胞を廃棄することと、
(v)結合のレベルが低い細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、を含む方法において、1つ以上の非標的分子への結合についてスクリーニングされ得る。
(i)各々結合剤をコードするDNAを含む真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
(ii)結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをイ
ンビトロで培養することと、
(iii)結合剤を、1つ以上の非標的分子に露出させて、結合を可能にすることと、
(iv)1つ以上の非標的分子への結合のレベルがより高い細胞を廃棄することと、
(v)結合のレベルが低い細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、を含む方法において、1つ以上の非標的分子への結合についてスクリーニングされ得る。
そのような方法を、結合剤を提示する高等真核細胞のライブラリの細胞(または細胞の試料)に適用して、1つ以上の非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現する細胞についてライブラリを富化してもよい。
非標的分子を認識する結合剤を発現する細胞の特定および/または分離を容易にするために、非標的分子を、例えば蛍光標識で検出可能に標識してもよい。蛍光を使用することで、FACSでの流動選別により細胞を分離できるようになり、ここで、非染色(非標識)細胞が染色(蛍光標識)細胞と区別可能になり、それに応じて収集画分または廃棄画分に送ることができる。好都合に、これを標識化と組み合わせて、FcRn結合の検出、ならびに/または結合剤の表面ディスプレイの存在およびレベルの検出(例えば、Fc領域を含む結合剤に結合するために抗Fc抗体を使用する)、ならびに/または標的結合の検出(例えば、標識抗原を使用する)を行ってもよい。複数の異なる標識、例えば、異なる波長のフルオロフォアを使用すると、組み合わせた特性について同時に標識および選別を行うことが可能となる。
本発明のさらなる態様は、FcRn受容体とのpH依存性相互作用についてポリペプチドをスクリーニングすることに関する。抗体(または他のFc含有薬物)は、FcRnと相互作用して、半減期を延長または短縮し得る。すでに述べたように、Fcドメインを含む結合剤は、内皮細胞上のFcRn受容体と相互作用し、分解から保護され得る。FcRn再循環経路の操作はpHに依存し、ポリペプチドを受容体に安全にドッキングさせるためにエンドソームコンパートメントの低いpH内でより強い結合を必要とし、ポリペプチドを血流に戻して放出するためにより高いpHの細胞外環境でより低い親和性の結合を必要とする。いくつかの場合には、半減期を制御する以上の理由でFcRnへの結合を増大させることが望ましい。例えば、「包括的抗体(sweeping antibody)」アプローチ32を使用して、投与された抗体が中性のpHでFcRnと良好に係合し、血清中の他の天然抗体と比較して優先的な相互作用を確実にすることが望ましい。今度は、この抗体が、結合した標的分子をエンドソームコンパートメントに送達し得、そこで、結合した標的は、低下したpHによって放出され、続いて、例えばリソソーム内で分解される。
開発性の複数の態様の選択(例えば、本明細書に記載される本発明の任意のそのような態様に従い)、または標的への結合の選択と組み合わせることが望まれ得る。この目的のために、結合剤を標的に露出させることにより選択を行うことで、同種結合剤による標的の認識が可能となり、それにより同種結合剤を表示するクローンが標的に結合した状態となり得る。次に、同種結合剤を表示する1つ以上のクローンが選択される。標的は、同種結合剤を表示するクローンの選択を容易にするために、検出可能な(例えば、蛍光)標識を運んでもよい。好都合に、本方法は、結合剤の表面提示レベルと結合剤による標的結合のレベルとを同時に決定し、表面提示がより高い同種結合剤を表示するクローンを同時選択することを含んでもよい。蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用すると、細胞を、それらの発せられた蛍光に従って選別できるようになり、表面提示および標的結合の並列選択が、異なる蛍光標識を使用して表面提示対結合標的を検出することにより実施され得る。したがって、選択された閾値を超える表面提示を呈し、かつ標的結合も呈するクローンが選択され得る。
本発明のさらなる態様は、目的の標的への結合に対して高い親和性を有する結合剤の選択における改善に関する。発明者らは、細胞表面上の結合剤の高レベルの提示がディスプレイライブラリにおいて利点を有し得る一方で、これが標的結合のための親和性に基づく選択の感度または厳密性を望ましくなく制限し得ることに注目した。発明者らは、ディスプレイライブラリにおける結合剤の提示レベルを制限することにより、より親和性の高い結合剤の選択が容易になることを認識した。
この態様によれば、本発明は、
(a)各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核(例えば、哺乳動物)細胞クローンのインビトロのライブラリを提供することであって、コードされた結合剤が、活性の弱いプロモーターから発現され、かつ/または細胞あたり100~60,000個の範囲のコピー数で細胞表面に発現される、提供することと、
(b)ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を表示する細胞を標的に結合した状態にすることと、
(c)標的に結合した細胞を単離して、同種結合剤を表示する選択された細胞の集団を提供することと、を含む方法を提供する。
(a)各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核(例えば、哺乳動物)細胞クローンのインビトロのライブラリを提供することであって、コードされた結合剤が、活性の弱いプロモーターから発現され、かつ/または細胞あたり100~60,000個の範囲のコピー数で細胞表面に発現される、提供することと、
(b)ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を表示する細胞を標的に結合した状態にすることと、
(c)標的に結合した細胞を単離して、同種結合剤を表示する選択された細胞の集団を提供することと、を含む方法を提供する。
こうして、標的に対してより高い親和性を有する結合剤をコードするクローンが富化されたクローンのプールが得られる。本方法は、
(d)選択された細胞の集団を標的における1回以上の選択に露出させることであって、任意選択で、標的の濃度を低下させて選択の厳密性を増加させる、露出させること、および/または
(e)標的に対する所望の結合レベルを有する同種結合剤を表示する1つ以上のクローンを選択すること、を含む方法をさらに含んでもよい。
(d)選択された細胞の集団を標的における1回以上の選択に露出させることであって、任意選択で、標的の濃度を低下させて選択の厳密性を増加させる、露出させること、および/または
(e)標的に対する所望の結合レベルを有する同種結合剤を表示する1つ以上のクローンを選択すること、を含む方法をさらに含んでもよい。
使用される標的の濃度は、あらかじめ決められていてもよく、あるいは様々な標的濃度を使用すること、および細胞結合の程度が対照細胞(例えば、結合剤を発現しない細胞、または標的を認識しない結合剤を発現する細胞)で見られる程度よりも高い抗原濃度を選択することに基づいて実験的に判断されてもよい。
流動選別を使用して、標的濃度の異なる条件下での所望の結合レベルおよび/または結合剤ディスプレイのレベルを有するライブラリ内のクローンの集団を特定してもよい。選択されたクローンは、細胞に結合した蛍光の程度に基づいて特定され得る。結合した分子の数が減少すると(標的濃度の低下および/または結合剤ディスプレイのレベルの低下により)、特に標識されていない細胞が自己蛍光の有意なベースラインを呈する場合に、標識された細胞と標識されていない細胞とを区別する能力が減退する。その場合、回収可能な標的分子(例えば、ビオチン化標的)および磁気ビーズ(例えば、ストレプトアビジンをコーティングしたビーズ)を標識された細胞の分離に使用すると、標識の程度が大幅に低下した細胞を標識されていない細胞から分離できるようになり得る、それにより、増大した厳密性を選択に使用できるようになる。
この方法を使用して、所望の親和性で標的分子を認識する結合剤を特定し、親和性に従って結合剤を選択し、かつ/またはクローンのプールを、標的に対してより高い親和性の結合剤を発現するクローンについて富化し得る。標的は、ヒト受容体、リガンド、酵素、または他のポリペプチドなどの任意の目的の分子であり得る。
本発明は、上記(a)で定義したライブラリ、および標的に対する所望の親和性を有する結合剤の選択のためのそれらの使用を提供する。そのようなライブラリおよびそれらを生成する方法は、本明細書でさらに説明する。
上記で概説したように、細胞ライブラリは、結合剤が細胞表面で発現されるレベルに応じて、異なる特性(開発性および親和性)に基づいて結合剤を区別するために使用され得る。創薬中は、当然、良好な親和性および良好な開発性の両方を選択することが望まれ得、その場合には、本発明の複数の態様を組み合わせてもよい。例えば、比較的低いレベルで結合剤を表示する細胞を使用して目的の標的への結合剤を選択することで、高い親和性の結合剤を表示するクローンについて富化された細胞の集団を得てもよい。次いで、それらのコード化DNAを、より高いレベルで結合剤を発現するクローンに提供して、所望の開発性特質のための結合剤を選択してもよい。これらの選択は、いずれの順序でも実行でき(親和性の選択に続いて開発性の選択、またはその逆)、複数回の選択(例えば、最初の親和性選択、次に開発性の選択、次にさらなる回の親和性選択)が含まれてもよい。
結合剤の表面表現を外部制御スイッチまたは調節可能な要素のもとに置くことにより、親和性および開発性の両方の選択における使用に適合可能である、兼用ディスプレイライブラリを構築することができる。例えば、結合剤をコードするDNAは、細胞培地への誘導因子または抑制因子の添加により発現が調節され得るプロモーターに作動可能に連結されてもよい。次に、細胞外から発現を制御することで、本方法のオペレーターが発現のレベルを自由に上方調節または下方調節できるようになる。したがって、誘導性プロモーターの場合、外部のオペレーターによる誘導因子の添加によりプロモーターが活性化するため、誘導が最終的には細胞内で生じるとはいえ、外部誘導性であるとみなされ得る。いくつかの誘導性プロモーター系が説明されており、典型的な例はテトラサイクリン誘導性プロモーターである33。結合剤DNAの発現が外部制御下にある(例えば、誘導プロモーターの制御下にある)兼用ライブラリには、結合剤遺伝子の発現レベルの変化が迅速かつ単純であり、コード化DNAを新しい細胞集団に再クローニングする必要がないという利点がある。
そのようなライブラリを伴う結合剤ディスプレイの方法は、本発明の一部をなす。標的を認識する結合剤を特定する方法は、
(i)各々結合剤をコードするDNAを含む真核(例えば、哺乳動物)細胞クローンのライブラリを提供することであって、細胞表面における結合剤の発現が外部調節可能であり(例えば、結合剤の表面発現が外部調節可能なプロモーターの制御下にあり)、かつ結合剤が細胞表面位提示される、提供することと、
(ii)ライブラリの細胞を、細胞表面上の低い提示のための(例えば、プロモーターの活性が弱い)条件下で培養することと、
(iii)ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にすることと、
(iv)同種結合剤を示す細胞を選択することで、選択された細胞の集団を提供することと、
(v)選択された細胞の集団を、細胞表面上の増加した提示のための(例えば、プロモーターの活性がより強い、任意選択で活性が最大である)条件下で培養することと、
(vi)複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
(vii)他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する1つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
(i)各々結合剤をコードするDNAを含む真核(例えば、哺乳動物)細胞クローンのライブラリを提供することであって、細胞表面における結合剤の発現が外部調節可能であり(例えば、結合剤の表面発現が外部調節可能なプロモーターの制御下にあり)、かつ結合剤が細胞表面位提示される、提供することと、
(ii)ライブラリの細胞を、細胞表面上の低い提示のための(例えば、プロモーターの活性が弱い)条件下で培養することと、
(iii)ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にすることと、
(iv)同種結合剤を示す細胞を選択することで、選択された細胞の集団を提供することと、
(v)選択された細胞の集団を、細胞表面上の増加した提示のための(例えば、プロモーターの活性がより強い、任意選択で活性が最大である)条件下で培養することと、
(vi)複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
(vii)他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する1つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
したがって、表面提示がより高い結合剤(よってクローン)を選択/富化することにより、開発性特性が良好な結合剤(およびそれらを発現するクローン)が特定、選択、および/または富化される。こうして、本方法は、開発性特性が良好な結合剤を発現するクローンについて富化されたクローンのプールを提供することができる。
そのような方法は、本明細書の他箇所で詳述する本発明の複数の態様、すなわち、標的に対する結合剤の選択および結合剤の表面提示に基づく細胞の選択を効果的に組み合わせる。本明細書の他箇所に記載するこれらの態様の特徴は、例えば、厳密な選択のための標的濃度の選択、結合剤の表面提示のレベル、および細胞を選択する方法を含む、組み合わせた方法において用いられてもよい。
調節可能なプロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。使用される誘導性プロモーター系の種類に応じて、培地中に誘導因子(例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどのテトラサイクリン)の非存在下で、低レベルまたは基礎発現が得られてもよい。あるいは、低濃度の誘導因子を加えてもよい。プロモーターからの発現は、好ましくは最大限のプロモーター活性得るために、誘導因子の添加により、または培地中の誘導因子の濃度を増加させることにより、滴定され得る。誘導性プロモーターの代わりは抑制性プロモーターであり、ここでは、プロモーターの初期状態が活性であり、その活性が、培地への抑制因子の添加により減衰または遮断される。
プロモーターの活性を上方調節して、結合剤の細胞表面提示を増大させ、開発性を選択する前に、基礎発現状態のライブラリから始め、標的に初回(複数可)の選択を実施することが好都合となる場合が多い。しかしながら、いくつかの場合には、親和性の選択を実施する前に、プロモーターを活性化させた状態でまず開発性を選択し、その後、プロモーターの活性を抑制するか、またはその活性を衰退させること(例えば、培地からの誘導因子を除去することにより)が望ましい場合がある。これは、抑制性プロモーターを使用する場合により好都合であり得る。したがって、上記の番号付きの方法ステップを参照して、ステップ(ii)~(iv)に続いて、ステップ(v)~(vii)を実施するか、またはステップ(v)~(vii)に続いて、ステップ(ii)~(iv)を実施してもよい。
本発明はさらに、上記の方法で使用するためのライブラリを提供し、その例は、結合剤のレパートリーをコードするDNAを含む真核生物(例えば、哺乳動物)細胞クローンのインビトロのディスプレイライブラリであり、ここでは、結合剤の発現(および故に細胞表面でのその提示)は、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある。好ましくは、コードDNAは、細胞DNA中の決まった遺伝子座で組み入れられる。そのようなライブラリは、
結合剤をコードするドナーDNA分子、および真核(例えば、哺乳動物)細胞を提供することと、
ドナーDNAを細胞に導入することにより、ドナーDNAが細胞DNAに組み入れられた組換え細胞を創出することであって、
ドナーDNAの発現が、細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、創出することと、
組換え細胞を培養して、クローンを産生させて、
それにより、結合剤のレパートリーをコードするドナーDNAを含む細胞クローンのライブラリを提供することと、を含む方法により生成されてもよい。
結合剤をコードするドナーDNA分子、および真核(例えば、哺乳動物)細胞を提供することと、
ドナーDNAを細胞に導入することにより、ドナーDNAが細胞DNAに組み入れられた組換え細胞を創出することであって、
ドナーDNAの発現が、細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、創出することと、
組換え細胞を培養して、クローンを産生させて、
それにより、結合剤のレパートリーをコードするドナーDNAを含む細胞クローンのライブラリを提供することと、を含む方法により生成されてもよい。
任意選択で、ドナーDNAの組入れは、細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供することにより達成され、ここで、ヌクレアーゼは、細胞DNA中の認識配列を切断して、ドナーDNAが細胞DNAに組み入れられる組入れ部位を創出し、組入れは、細胞の内部のDNA修復機序を通じて生じる。
好ましくは、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、結合剤をコードするドナーDNA分子上にあるが、これは、所望であれば別個に組み入れられてもよい。一般に、組換え
細胞のドナーDNAおよび/または細胞DNAは、発現のためのプロモーターの下流にある結合剤をコードするDNAを含むことになる。ライブラリを構築したら、プロモーターからドナーDNAの発現を誘導することができ、細胞表面に結合剤を提示するための条件下で細胞を培養することができる。
細胞のドナーDNAおよび/または細胞DNAは、発現のためのプロモーターの下流にある結合剤をコードするDNAを含むことになる。ライブラリを構築したら、プロモーターからドナーDNAの発現を誘導することができ、細胞表面に結合剤を提示するための条件下で細胞を培養することができる。
結合剤DNAの発現が誘導性プロモーターの制御下に置かれている細胞はまた、発現クローン上の結合剤の細胞表面提示がある特定のレベルに達する速度を評価し、短時間の誘導後の提示レベルを比較することにより、複数のクローンにわたって速度を比較する機会を提供する。これは、事前に決定されても(例えば、4時間または8時間または12時間)、あるいは誘導後の結合剤提示の外観を観察することによって実験的に導き出されてもよい。誘導性プロモーターからの発現が開始される時点から始めて、経時的に細胞表面提示をプロットし、発現および表面提示の増加速度を観察することができる。ポリペプチドの発現は、典型的には、細胞表面で安定レベルまたは平衡レベルに達するまで、時間とともに増加することになる。最終的な発現レベルに達する前の早い段階で、クローン間の細胞表面提示を決定および比較することにより、開発性の側面の最初の兆候がすでに見られてもよい。これらの開発性の側面には、発現からの回収可能な収量に加えて、ポリペプチドが溶液中で富化される能力、その溶解度、溶液中での自己会合に対する耐性、および/または本明細書で考察される他の開発性特性が含まれる。
高等真核細胞上に表示される結合剤の代謝回転、分解、または内部移行の速度も、そのような開発性特性の指標として使用することができる。これは、表示された結合剤が、新しく発現された結合剤で継続的に補充されない(つまり、細胞表面からの結合剤の枯渇、すなわち、表面提示のレベルの低下として現れる)条件下で、任意選択で評価されてもよい。結合剤を標識し、結合していない標識を洗い流し、分解および/または内部移行により、標識された結合剤が時間とともに細胞表面から枯渇する速度を観察してもよい。いくつかのクローンでは、他のクローンと比べて高いレベルの結合剤の枯渇が観察され得る。表面提示のレベルが高いクローンを選択することで、より優れた開発性特性がより良好な(例えば、溶解度が高く、溶液中での自己会合に対する耐性が良好であり、非特異的結合が少ない)クローンが選択される。
細胞のライブラリにおいて、一部のクローンの表面提示の増加速度が他のクローンよりも優れていることが観察され得る。これは、ライブラリから最適な特性を有するクローンを選択できるようにする、ポリペプチドの開発性の可能性の初期指標として使用され得る。
本発明の方法によれば、一般に、クローンを選択するか、または所望の特性を有するクローンが富化された細胞の集団を選択したら、その後、選択したクローンまたは集団を1つ以上のさらなるスクリーニング方法に使用してもよく、これらの方法の例は本明細書で提供される。選択したクローンは、一緒に培養しても、個々に培養してもよい。本明細書に記載の標的結合および様々な開発性特性を含む複数の特性についてクローンをスクリーニングできるように、方法を組み合わせてもよい。
本発明の方法は、抗体発見の最も初期の段階における高濃度での抗体の挙動を評価するために使用され得る。好ましい実施形態では、高濃度での抗体または他のポリペプチド結合剤の自己相互作用の傾向は、流動選別、ビーズベースの選択、またはクロマトグラフィーなどのライブラリ選択技法を使用してクローンのライブラリをスクリーニングすることによって検出される。
本発明の任意の態様における所望の結合剤をコードするDNAを含む1つ以上のクローンの選択後、結合剤をコードする核酸が回収されてもよく、かつ/または結合剤をコード
する核酸の配列が決定されてもよい。結合剤をコードする核酸(例えば、DNA)は、単離された形態、例えば、組換えベクターで提供されてもよい。
する核酸の配列が決定されてもよい。結合剤をコードする核酸(例えば、DNA)は、単離された形態、例えば、組換えベクターで提供されてもよい。
目的の結合剤コードするDNAは、宿主細胞中インビトロで、任意選択で結合剤の可溶形態における発現のための条件下で、発現されてもよい。したがって、宿主細胞は結合剤を分泌して、細胞培地からのその回収を容易にし得る。結合剤の収量(例えば、安定にトランスフェクトされた宿主細胞に由来する)は、例えば、少なくとも0.5mg/ml、少なくとも1mg/ml、少なくとも2mg/ml、または少なくとも5mg/mlであってもよい。結合剤を精製および/または濃縮して、結合剤の水溶液を提供してもよい。有利には、結合剤は、少なくとも1mg/ml、任意選択で少なくとも10mg/ml、少なくとも50mg/ml、または少なくとも100mg/mlの濃度で溶液中に提供される。いくつかの実施形態では、結合剤は、50mg/ml~200mg/ml、例えば、50mg/ml~100mg/mlの濃度で溶液中に提供される。
本発明による方法を使用して特定または選択される結合剤自体も、実施例に記載のもの(限定されないが、本明細書に示される抗体VHおよび/またはVLドメイン配列などの開示された配列を含む結合剤が挙げられるが、これらに限定されない)および本発明の方法を実施した結果として得られるさらなる結合剤を含めて、本明細書における本発明の態様として提供される。目的の結合剤は、薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に製剤化されてもよい。本発明は、そのような組成物およびそれらの臨床用途にまで及び、治療によるヒトまたは動物の身体の治療方法において使用するための結合剤を含む。本方法には、皮下投与による結合剤を含む組成物の投与が含まれてもよい。溶液中の結合剤を含む組成物は、任意選択で、針、および/または注射、例えば、皮下注射による組成物の投与に関する指示を含む製品情報案内書など、1つ以上の追加の構成要素を含むキットにおいて、注射用の充填済みシリンジ中で提供されてもよい。
本発明の文脈における真核細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞などの高等真核細胞である。哺乳動物細胞は、臨床用途を目的としたポリペプチド製剤(例えば、抗体)の大量発現に一般的に使用される。その結果、創薬における候補ポリペプチドの特性を評価するときに哺乳動物細胞を使用することは有利である。ポリペプチド結合剤は、哺乳動物細胞における発見の初期段階の間に、その意図された最終分子形式で発現され得る。例えば、所望の臨床製品が全長抗体(例えば、IgG)である場合、全長抗体(例えば、IgG)を発現する哺乳動物細胞が、本発明の方法において使用され得る。
本発明は、集団中の異なるクローンにおいて発現される結合剤遺伝子の数またはアイデンティティの差異から生じるコピー数の影響または不均一性を回避するために、ゲノムごとに一定数(好ましくは1つ)の組み入れられた結合剤遺伝子が存在する細胞集団において最も有利に使用され得る。加えて、結合剤をコードするDNAは、さもなければ転写活性が異なるゲノム領域から生じ得るコードDNAの組入れ位置の変動による発現への外的影響の複雑化を回避するために、すべてのクローンの細胞DNAにおいて同じ遺伝子座に組み入れられることが好ましい。これには、結合剤発現の転写正規化という利益がある。したがって、好ましくは、本発明は、異なる結合剤配列をコードするDNAを各々含む複数(例えば、大型ライブラリ)の哺乳動物細胞クローンを用い、ここで、コードDNAは細胞DNA中の決まった遺伝子座にあり、コードされた結合剤は細胞表面に提示される。それにもかかわらず、本発明の利益は、コードDNAが細胞DNAにランダムに組み入れられるかまたは一過性発現のためにプラスミド上に提供されるクローンを使用して、依然として獲得され得る(例えば、実施例11)。単一または限られた数の遺伝子座における結合剤をコードするDNAの組入れにより、必要に応じて、例えば誘導性プロモーターを使用することで、発現をより良好に制御できるようになり、かつ好ましくは、結合剤をコードするDNAは、細胞あたり1回、または2倍体ゲノム中の染色体コピーあたり1回、
存在する。したがって、ライブラリのクローンは、各々、結合剤のレパートリーの1つまたは2つのメンバーのみを発現することが好ましい。
存在する。したがって、ライブラリのクローンは、各々、結合剤のレパートリーの1つまたは2つのメンバーのみを発現することが好ましい。
本発明の様々な特徴を以下でさらに説明する。本明細書全体で使用される見出しは、検索を助けるためのものでしかなく、限定的なものとして解釈されるべきではない。異なる節で説明される実施形態は、適宜組み合わせてもよい。
この文書内の見出しおよび小見出しは、検索を助けるためだけに含まれており、限定的であるものと解釈されるべきではない。本発明の複数の態様および実施形態を組み合わせてもよく、開発性に基づいてポリペプチド薬を選択する方法は、望ましくは、本明細書に記載の個々の特徴およびステップの連続および/または並行した組み合わせを包含することになる。
開発性
複数の開発性特性についてのスクリーニングを創薬の過程に組み入れて、初期段階で開発性に対する洞察を提供し、開発性リスクを低減できるようにすることが望ましい。ここで詳述するように、結合剤(およびそれらのコード細胞クローン)は、1つ以上の望ましい発生性特性について特定および選択されてもよい。本発明における開発性のスクリーニングまたは選択は、概して、予測される開発性を指し、ここでは、開発性特質を示す代理マーカーが評価され、ハイスループット選択および初期段階の発見への開発性選択の組込みを可能にする。本発明は、より好ましい開発性特性を有する結合剤の富化を介して、開発性リスクを特定および低減することを可能にする。次に、個々のポリペプチドの開発性特性(複数可)が、以下に記載されるような方法によって直接確認され得る。したがって、結合剤をある特定の特性を有するものとして特定することは、本発明の方法から得られたデータに基づいて、結合剤がその特性を有することが予測されると結論付けることを含んでもよい。
複数の開発性特性についてのスクリーニングを創薬の過程に組み入れて、初期段階で開発性に対する洞察を提供し、開発性リスクを低減できるようにすることが望ましい。ここで詳述するように、結合剤(およびそれらのコード細胞クローン)は、1つ以上の望ましい発生性特性について特定および選択されてもよい。本発明における開発性のスクリーニングまたは選択は、概して、予測される開発性を指し、ここでは、開発性特質を示す代理マーカーが評価され、ハイスループット選択および初期段階の発見への開発性選択の組込みを可能にする。本発明は、より好ましい開発性特性を有する結合剤の富化を介して、開発性リスクを特定および低減することを可能にする。次に、個々のポリペプチドの開発性特性(複数可)が、以下に記載されるような方法によって直接確認され得る。したがって、結合剤をある特定の特性を有するものとして特定することは、本発明の方法から得られたデータに基づいて、結合剤がその特性を有することが予測されると結論付けることを含んでもよい。
結合剤を開発の候補結合剤として特定すること、または結合剤を開発性特性が良好なものとして特定することは、結合剤を開発性特性が良好なものとして特定する報告を作成することを含んでもよい。結合剤のプールを、開発性特性が良好な結合剤について富化されているものとして特定することは、このプールを、開発性特性が良好な結合剤について富化されているものとして特定する報告を作成することを含んでもよい。同様に、選択された細胞を、開発性特性が良好な結合剤を発現するもの(または結合剤を発現するクローンについて富化されているもの)として特定することは、細胞(例えば、選択された細胞集団)を、開発性特性が良好な結合剤を発現するもの(または結合剤の発現について富化されているもの)として特定する報告を作成することを含んでもよい。報告は、電子形式および/または印刷物で提供され得る書面による報告であってもよい。報告は、例えば、本明細書に記載の1つ以上の方法からのデータを含む、開発性に関する定量的および/または定性的情報を提供し得る。
溶液中の溶解度、濃度、および自己会合
組換え発現されたポリペプチドは、通常、細胞培養物から精製され、例えば医薬品として使用するために、より高い濃度で製剤化される必要がある。例えば、タンパク質は、タンパク質を皮下投与でより高い濃度、例えば50mg/ml以上にて患者に提供する条件で、一時的細胞培養においては100μg/ml、または安定な細胞培養においては1mg/mlで発現されてもよい。
組換え発現されたポリペプチドは、通常、細胞培養物から精製され、例えば医薬品として使用するために、より高い濃度で製剤化される必要がある。例えば、タンパク質は、タンパク質を皮下投与でより高い濃度、例えば50mg/ml以上にて患者に提供する条件で、一時的細胞培養においては100μg/ml、または安定な細胞培養においては1mg/mlで発現されてもよい。
Walkerら(2008)34、Jansonら(2012)35など、抗体などの可溶性結合剤の発現、精製、および定量のためのいくつかの単純な技法が当業者の知ると
ころとなる。溶液中の精製されたポリペプチド結合剤の濃度は、いくつかの方法で決定することができる。例えば、280nmの波長での溶液の吸光度を測定し、その値を使用して、ポリペプチドの吸光係数に基づいて濃度を決定することができる。あるいは、試験試料を既知の濃度の標準タンパク質と比較してもよく、このための様々な比色および蛍光アッセイが当業者に知られている。
ころとなる。溶液中の精製されたポリペプチド結合剤の濃度は、いくつかの方法で決定することができる。例えば、280nmの波長での溶液の吸光度を測定し、その値を使用して、ポリペプチドの吸光係数に基づいて濃度を決定することができる。あるいは、試験試料を既知の濃度の標準タンパク質と比較してもよく、このための様々な比色および蛍光アッセイが当業者に知られている。
望ましい開発性特性は、水溶液への高い溶解度である。ポリペプチドは、望ましくは、10mg/ml、20mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、またはそれ以上で可溶性であってもよい。溶液は、PBSなどの水性緩衝溶液であってもよい。ポリペプチドの溶解限度は、10mg/ml超、20mg/ml超、50mg/ml超、75mg/ml超、100mg/ml超、150mg/ml超、または200mg/ml超であってもよい。分子の自己相互作用および溶解限界にさらに近づくと起こり得る他の望ましくない影響を最小限に抑えるために、溶解限界を大きく下回る濃度で溶液中にポリペプチドを提供することが有利である。ポリペプチドの自己会合は、粘度の増加または相分離を含む製品の品質および安定性の点で望ましくない結果を招き得る。分子の溶解限度に達すると、溶解濃度をさらに増大させることができなくなり、分子の沈殿などの望ましくない影響が発生することになる。いくつかの実施形態では、選択されたポリペプチド結合剤(例えば、改善された変異型)の溶解限度は、10mg/ml~200mg/ml、例えば、50mg/ml~100mg/mlである。
ポリペプチド溶液を沈殿点に至らせて、次に濾過または遠心分離を行った後、残りの可溶性物質の濃度を決定して、その溶解限度を決定することが可能であり得る。これは、タンパク質の最大溶解度とも称され得る。しかしながら、沈殿に必要な濃度よりも低い濃度で生じ得る、自己会合の開始を測定するためのより感受性の高い方法がある。例えば、臨界濃度では、単量体分子が二量体および高次の可溶性凝集体を形成し始める。このような凝集体は、様々な方法で検出することができる。「臨界濃度」は、これらの方法のうちの1つ以上を使用して自己相互作用が明らかである濃度として定義される。結合剤の所望の開発性特性は、その臨界濃度が高いことであり、その結果、溶液中の結合剤の医薬製剤が臨界濃度を優に下回る。臨界濃度は、好ましくは、10mg/ml超、20mg/ml超、50mg/ml超、75mg/ml超、100mg/ml超、150mg/ml超、または200mg/ml超である。いくつかの実施形態では、選択されたポリペプチド結合剤(例えば、改善された変異型)の臨界濃度は、10mg/ml~200mg/ml、例えば、50mg/ml~100mg/mlである。
沈殿などの自己相互作用の結果の一部は、長期間にわたって生じてもよく、これは製品の貯蔵期間に関連する。緩衝液の組成、pH、および温度も影響し得る。したがって、濃度などのパラメータは、一連の参照条件下で、例えば、pH7.4のPBSなどの標準緩衝液を用いて4℃で、決定され得る。自己相互作用に対するポリペプチドの耐性は、長期間の後に、例えば、これらの条件下での4週間の貯蔵後(および任意選択でその間の追加の時点)の試験により、確認され得る。ポリペプチドは、任意選択で、そのような条件下で少なくとも6か月間自己相互作用に抵抗することができ、溶液がその臨界濃度を下回ることが確認される。
この点で開発性が不良なポリペプチドとは、例えば4℃で、PBSなどの標準緩衝液中1mg/ml以下など、溶液中の濃度がより低くても、自己凝集の兆候が明白なものである。理想的なポリペプチドは、100mg/ml以上の臨界濃度を有するもの、すなわち、そのような自己相互作用に抵抗して、100mg/mlへの濃縮が可能なものである。これらの両極端の間で、本明細書に概説される方法を使用して選択された改善されたポリペプチドが、出発ポリペプチドよりも1.5倍以上改善された臨界濃度を呈する場合があ
り得る。したがって、「改善」は、変異型を親結合剤と比較する本明細書の他箇所に記載する方法においてなど、出発ポリペプチドに関して定義することができる。ナイーブライブラリであるか、別の方法に由来富化された集団(任意選択で、ファージディスプレイ選択の出力に由来するクローンの集団、または免疫化に由来する抗体集団)であるかにかかわらず、差異は、親結合剤の異なる誘導体もしくは変異型の間、またはライブラリ内のクローンの集団にわたってなど、より一般的に異なるクローンからの結合剤間で比較することができる。本発明を使用して細胞表面により高いレベルで存在する結合剤をコードするクローンを、選択解除された同じ集団内の表面提示レベルがより低いポリペプチドをコードするクローンと比較してもよい。選択されたクローンからのポリペプチドの生物物理学的挙動は、同じ集団からの表面提示レベルがより低い選択解除されたクローンに由来するポリペプチドと比較することができる。本発明を使用する発見の恩恵を受ける抗体または他の結合剤は、自己相互作用の開始前により高い濃度レベルが達成され得ることを、いずれかの方法により示すことができるもの、または比較ポリペプチドと比較して、所与のアッセイ内で自己相互作用の程度が減少するものとなる。例えば、10mg/mlで自己凝集の証拠を示す開始ポリペプチドは、15mg/ml以上に改善され得る。あるいは、ライブラリから選択された最適なポリペプチドは、10mg/mlで自己凝集に抵抗してもよいが、同じ集団内の拒絶されたクローンに由来する他のポリペプチドは10mg/ml以下で自己相互作用を呈してもよい。いずれの場合も、親ポリペプチドまたは拒絶されたクローンに由来するポリペプチドは「比較ポリペプチド」と称される。
り得る。したがって、「改善」は、変異型を親結合剤と比較する本明細書の他箇所に記載する方法においてなど、出発ポリペプチドに関して定義することができる。ナイーブライブラリであるか、別の方法に由来富化された集団(任意選択で、ファージディスプレイ選択の出力に由来するクローンの集団、または免疫化に由来する抗体集団)であるかにかかわらず、差異は、親結合剤の異なる誘導体もしくは変異型の間、またはライブラリ内のクローンの集団にわたってなど、より一般的に異なるクローンからの結合剤間で比較することができる。本発明を使用して細胞表面により高いレベルで存在する結合剤をコードするクローンを、選択解除された同じ集団内の表面提示レベルがより低いポリペプチドをコードするクローンと比較してもよい。選択されたクローンからのポリペプチドの生物物理学的挙動は、同じ集団からの表面提示レベルがより低い選択解除されたクローンに由来するポリペプチドと比較することができる。本発明を使用する発見の恩恵を受ける抗体または他の結合剤は、自己相互作用の開始前により高い濃度レベルが達成され得ることを、いずれかの方法により示すことができるもの、または比較ポリペプチドと比較して、所与のアッセイ内で自己相互作用の程度が減少するものとなる。例えば、10mg/mlで自己凝集の証拠を示す開始ポリペプチドは、15mg/ml以上に改善され得る。あるいは、ライブラリから選択された最適なポリペプチドは、10mg/mlで自己凝集に抵抗してもよいが、同じ集団内の拒絶されたクローンに由来する他のポリペプチドは10mg/ml以下で自己相互作用を呈してもよい。いずれの場合も、親ポリペプチドまたは拒絶されたクローンに由来するポリペプチドは「比較ポリペプチド」と称される。
本発明において選択される自己会合および他の生物物理学的特性の対照として、既知の望ましい特性を有する抗体を使用してもよく、親抗体およびその改善された誘導体(または選択されたライブラリメンバー対選択解除されたメンバー)の相対的性能をこれと比較する。National Institute of Standards and Technologyは、NIST RM 8671抗体を「ゴールドスタンダード」参照抗体として使用しており、これは、American Chemical Society36が発行している3巻の一部として公開されている比較を用いて、100人を超える共同研究者により大規模に特性評価されている。NIST RM 8671抗体は、自己相互作用が最小限であることが示された(Saro D et al,Developability Assessment of a proposed NIST monoclonal antibody37)。あるいは、アダリムマブ抗体は、自己相互作用および交差相互作用が最小限であることが示されており、いくつかの研究において、例えば、Jainら(2017)2およびSunら(2013)38により、対照として使用されている。本明細書に記載されている結合剤、特に抗体の臨界濃度または溶解度を、ベンチマークの目的で、1つ以上のそのような参照抗体と比較してもよい。
自己相互作用は、より低いディスプレイレベルに基づいて選択解除された抗体と比較した、高レベルの表面提示について選択された抗体間の直接的かつ定量可能な比較を可能にするいくつかの方法で決定することができる。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、例えば、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)により、ポリペプチドの単量体および多量体形態(二量体およびより高次の形態を含む)の分離が可能となる。二量体および/または多量体形態の材料の割合は定量化することができ、多量体形成の程度は結合剤間(例えば、親結合剤と改善された変異型との間)で比較することができ、これは、保持時間の増加および/またはカラム通過後のより広い溶出ピークとして検出され得る。HPLC-SECプロファイルは、単一の濃度で決定してもよく、多量体の割合、および/または保持時間を比較する。保持時間またはピーク幅のいずれの検出可能かつ再現可能な減少も、改善と見なされることになる。多量体ピークが親クローンでのその値の60%に低下すると、改善とみなされる。あるいは、多量体化の閾値が生じる臨界濃度は、濃度の範囲を試験し、この多量体化の閾値(例えば、5%)が生じる濃度を決定することにより、各クローンについて決定することができる。あるいは、多量体化の増加を経時的にプロット
し、多量体の蓄積速度を比較することもできる2。いずれの場合も、臨界濃度の増加は改善を表す。臨界濃度の改善の大きさは、例えば、少なくとも1.5倍、または少なくとも2倍であってもよい。
し、多量体の蓄積速度を比較することもできる2。いずれの場合も、臨界濃度の増加は改善を表す。臨界濃度の改善の大きさは、例えば、少なくとも1.5倍、または少なくとも2倍であってもよい。
溶解限度の改善、または臨界濃度の改善は、任意選択で、1.5倍~50倍、例えば、1.5倍~15倍、1.5倍~10倍、または2倍~10倍である。
ポリペプチドの自己会合を決定する方法には、自己相互作用クロマトグラフィー(SIC)が含まれる。この技法では、抗体などの結合剤がマトリックス上に固定され、同じ結合剤の溶液がマトリックス上を通過する。対照抗体と比較して延長した保持時間は、自己相互作用38(またはマトリックスとの相互作用)を示す。あるいは、ハイスループットアプローチを使用することができ、これにおいては、異なる結合剤を生物層干渉法チップ(BLI)に固定し、その可溶性形態の溶液を浸漬することにより自己相互作用について試験して、結合する可溶性結合剤の量に関する信号を得る。この「生物層干渉法を使用する抗体クローン自己相互作用(Antibody Clone Self-Interaction using Biolayer Interferometry)」(CSI-BLI)アプローチは、SICなどのより手間のかかるアプローチと良好に相関し、必要な材料が少ないことが示された。いずれの場合も、試験結合剤の保持時間(SICの場合)および(CSI-BLI)の場合に達成される信号を、親結合剤および自己凝集に抵抗することが分かっている対照結合剤(上述のベンチマーク抗体など)と比較することができる。
親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法(AC-SINS)では、試験抗体が細胞表面に提示され、それらが他のビーズに提示された抗体と強く自己相互作用する可能性を評価する39~41。相互作用の結果として起こる粒子間距離の減少は、金コロイド溶液のプラズモン波長の増加として検出され得る。AC-SINSは、感度が高く単純なアッセイであるため、臨界濃度の決定に好ましい技法である。好ましい実施形態では、結合剤の開発性の改善は、溶液中のポリペプチドの臨界濃度の増加として検出可能であり、臨界濃度は、AC-SINSアッセイでプラズモン波長の変化を測定することにより測定可能である。
自己会合は、静的および動的光散乱(DLS)42、43により測定することもでき、この場合、試料中の分子の流体力学的半径および多分散性パーセントを計算して、溶液中の分子のサイズおよび形状に関する情報を得ることができる。DLSでは、相互拡散係数を自己会合の尺度として抗体濃度に関連して評価する。分析的超遠心分離44、膜浸透圧測定45、および中性子散乱46などの自己相互作用を測定する他の方法を使用することができる。
本発明の方法は、結合剤の表面提示が他のクローンと比較して高い1つ以上のクローンを選択することと、1つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、溶液中の溶解度および/または自己会合に対する耐性が良好なものとして特定することとを含み、ここで、結合剤(単数または複数)の臨界濃度は、集団内の1つ以上の他のクローンによりコードされる結合剤と比較して、または選択された結合剤が変異型である親結合剤と比較して、少なくとも10%、少なくとも25%、または少なくとも50%増加し、かつ/あるいは結合剤(単数または複数)の臨界濃度は、集団内の1つ以上の他のクローンによりコードされる結合剤と比較して、または選択された結合剤が変異型である親結合剤と比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、または少なくとも100倍増加する。
考察したように、本明細書の方法を使用して、開発性の不良な結合剤を除外し(または
その頻度または普及率を低下させ)、開発性特性がより良好な結合剤の(その頻度または普及率の増大、その富化による)選択を奨励することができる。そのような方法は、「問題のある」結合剤を単に特定して回避することに留まらない。本明細書に記載の技術の感度により、それらを、溶解度が良好な複数の結合剤のなかから最良の(例えば、最も溶解度の高い)候補を区別することに使用できるようになる。本発明はまた、親和性に基づく選択中に維持または増強された開発性に有利な選択圧をかけるために使用することができる。
その頻度または普及率を低下させ)、開発性特性がより良好な結合剤の(その頻度または普及率の増大、その富化による)選択を奨励することができる。そのような方法は、「問題のある」結合剤を単に特定して回避することに留まらない。本明細書に記載の技術の感度により、それらを、溶解度が良好な複数の結合剤のなかから最良の(例えば、最も溶解度の高い)候補を区別することに使用できるようになる。本発明はまた、親和性に基づく選択中に維持または増強された開発性に有利な選択圧をかけるために使用することができる。
比較ポリペプチドは、選択されていないクローン集団(または結合剤提示レベルが決定された閾値レベル未満であるクローン)からのいずれの結合剤であってもよい。比較ポリペプチドは、溶解限界が、例えば本明細書に記載の任意の方法により決定して、少なくとも5mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも20mg/ml、少なくとも30mg/ml、少なくとも40mg/ml、または少なくとも50mg/mlであってもよい。比較ポリペプチドは、任意選択で、臨界濃度が、例えば本明細書に記載の任意の方法により決定して、少なくとも5mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも20mg/ml、少なくとも30mg/ml、少なくとも40mg/ml、または少なくとも50mg/mlであってもよい。選択したクローンからの結合剤は、比較ポリペプチド(例えば、選択されていない集団からのクローン、または親結合剤)と比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも100%の開発性特性、例えば溶解限界または臨界濃度の改善を呈してもよい。選択されたクローンからの結合剤は、比較ポリペプチドと比較して、少なくとも1.5倍の開発性特性の改善、例えば、溶解限界の増加または臨界濃度の増加を呈してもよい。比較ポリペプチドは、任意選択で、臨界濃度が、少なくとも10mg/ml、少なくとも20mg/ml、少なくとも30mg/ml、少なくとも40mg/ml、または少なくとも50mg/mlであってもよい。ポリペプチドの特性を比較ポリペプチドと比較する場合、比較は、当該技術分野における対照の使用について標準である条件と同一の条件下で行われることが理解されよう。
この方法には、例えば、AC-SINSアッセイにおいてプラズモン波長の変化を決定することにより臨界濃度を実験的に測定することにより、臨界濃度の改善を確認することが含まれてもよい。溶解限度および臨界濃度などのパラメータを決定するための標準的な緩衝液条件には、4℃でpH7.4のPBSが含まれる。パラメータは、新たに合成されたポリペプチドが該水性緩衝溶液に製剤化された直後に測定してもよい。あるいは、パラメータは、貯蔵期間、例えば、標準的な緩衝液条件下で、1時間、1週間、2週間、28日間、または6か月間の貯蔵時間の後に測定してもよい。
パラメータを高温に露出させた後に決定することが望まれてもよく、その場合、溶液を測定のために4℃に戻す前の貯蔵期間中に、温度を、例えば、25℃、37℃、または50℃に上昇させてもよい。
非特異的結合
非特異的結合、「多反応性」、「多特異性」、または「低特異性」は、その同種標的に加えて、結合剤と複数の非標的分子との相互作用を指し、例えば、ポリペプチドは、疎水性の表面、負に荷電した表面、または正に荷電した表面に非特異的に結合してもよい。多反応性ポリペプチドは、結合剤ポリペプチドとその標的との間の特異的認識に加えて、この種類の相互作用による非標的分子へのその結合を反映して、「粘着性」を示すと説明され得る。多くの場合、非特異的結合は親和性の低い相互作用として現れるが、それでも非標的分子が豊富な場合は問題になり得る。多反応性は、結合剤ポリペプチドの表面上のクラスター化した疎水性または荷電アミノ酸残基(抗体の場合、これは、重および/または
軽可変ドメインにあり得る)に起因してもよく、他の(非標的)分子との非特異的相互作用のクラスにつながる。例えば、ポリペプチドは疎水性表面への結合を呈してもよく、これは、ポリペプチドがその表面上に1つ以上の疎水性パッチを提示する場合、または疎水性パッチが溶液中のポリペプチドの折畳解除によって露出される場合に起こり得る。あるいは、ポリペプチドは、負に荷電した表面またはDNAの負に荷電した骨格などの正味の負電荷(中性pH)を運ぶ分子、またはヘパリンもしくはヘパラン硫酸などの他の負に荷電したポリマーへの結合を呈してもよい。これらの非特異的相互作用の原因となる根本的な分子モチーフに関係なく、多反応性は、一般に、候補ポリペプチド薬にとって望ましくない特徴である。ポリペプチド薬の多反応性は、インビボでの短い半減期などの不良な薬物動態、および/または循環からの組織への薬物の不良な取込みがと関連する。
非特異的結合、「多反応性」、「多特異性」、または「低特異性」は、その同種標的に加えて、結合剤と複数の非標的分子との相互作用を指し、例えば、ポリペプチドは、疎水性の表面、負に荷電した表面、または正に荷電した表面に非特異的に結合してもよい。多反応性ポリペプチドは、結合剤ポリペプチドとその標的との間の特異的認識に加えて、この種類の相互作用による非標的分子へのその結合を反映して、「粘着性」を示すと説明され得る。多くの場合、非特異的結合は親和性の低い相互作用として現れるが、それでも非標的分子が豊富な場合は問題になり得る。多反応性は、結合剤ポリペプチドの表面上のクラスター化した疎水性または荷電アミノ酸残基(抗体の場合、これは、重および/または
軽可変ドメインにあり得る)に起因してもよく、他の(非標的)分子との非特異的相互作用のクラスにつながる。例えば、ポリペプチドは疎水性表面への結合を呈してもよく、これは、ポリペプチドがその表面上に1つ以上の疎水性パッチを提示する場合、または疎水性パッチが溶液中のポリペプチドの折畳解除によって露出される場合に起こり得る。あるいは、ポリペプチドは、負に荷電した表面またはDNAの負に荷電した骨格などの正味の負電荷(中性pH)を運ぶ分子、またはヘパリンもしくはヘパラン硫酸などの他の負に荷電したポリマーへの結合を呈してもよい。これらの非特異的相互作用の原因となる根本的な分子モチーフに関係なく、多反応性は、一般に、候補ポリペプチド薬にとって望ましくない特徴である。ポリペプチド薬の多反応性は、インビボでの短い半減期などの不良な薬物動態、および/または循環からの組織への薬物の不良な取込みがと関連する。
本発明の態様では、結合剤を発現する細胞(例えば、ライブラリ、またはライブラリからの細胞の試料)は、1つ以上の非標的分子または「多反応性プローブ」に露出する。これは、該多反応性プローブと相互作用する結合剤を提示する集団内の細胞クローンを、そのようなプローブへの結合が存在しないかまたは小さい細胞クローンから区別するために使用することができる。多反応性プローブは、核酸(例えば、DNA)、ストレプトアビジン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、カルボキシルデキストラン、他の硫酸化プロテオグリカン、インスリン、リポ多糖、バキュロウイルス、KLH、FcRn、ラミニン、コラーゲン、トリガー因子、Hsp70、Hsp90、または他の熱ショックタンパク質もしくはシャペロンタンパク質、ヒアルロン酸または他のグリコカリックス成分のうちのいずれか1つ以上を含んでもよい。非標的分子は、単離された形態で、または混合調製物として提示されてもよく、例えば、哺乳動物細胞(例えば、CHO細胞)からの膜調製物は、多反応性を試験するために使用され得る。非標的分子は、インビボで、例えば哺乳動物に、例えばヒトに見られるものであってもよい。これは、細胞外マトリックスもしくは血流中、および/または細胞表面上に見られてもよい。非標的分子の合成代用物を調製し、多反応性プローブとして使用してもよい。
多反応性プローブは、非特異的結合の特定の様式をスクリーニングするように、例えば、負に荷電した表面への非特異的結合を検出するように選択され、ヘパリン硫酸、DNA、もしくはストレプトアビジン、および/またはFcRnなどの負に荷電した表面領域を保有する分子のような、中性pHでの正味の負電荷を帯びる多反応性プローブが選択されてもよい。好適な多反応性プローブは、それらの計算された等電点(pI)に基づいて特定され得る。pIは、タンパク質の電荷の測定値であり、タンパク質が正味の電荷を帯びないpHとして定義される。負に荷電した表面への非特異的結合を示す結合剤を検出するためには、pIが6未満の多反応性プローブが選択され得る。例については、当業者には既知であり、ストレプトアビジン、核酸、およびヘパリン硫酸またはカルボキシルデキストランなどの硫酸化プロテオグリカンが挙げられる。逆に、正に荷電した表面への非特異的結合を検出するためには、正に荷電した表面領域および/または基本pI(例えば、8超のpI)を有する多反応性プローブが選択され得る。そのようなプローブはまた、インビボでの負に荷電した細胞表面からの望ましくない静電反発力をもたらし得る、負に荷電した表面パッチを有する結合剤を検出するために使用されてもよい。疎水性引力を介して多反応性をプローブするには、表面に1つ以上の疎水性領域を有する多反応性プローブ、例えばHsp70またはHsp90が選択され得る。
個々のクローンを低い特異性についてスクリーニングするために、いくつかの方法が利用可能である。交差相互作用クロマトグラフィー(CIC)47は、標的分子または混合物、多くの場合ポリクローナル抗体調製物を、クロマトグラフィーマトリックスに固定化し、様々な抗体の保持時間を測定する方法である。固定された分子または樹脂自体との相互作用による保持の遅延は、特異性が低いことを示す。このアプローチは、組み換え抗体を特徴評価するためにいくつかの研究において使用されている(例えば、2、15、38
)。上に記載されるように、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、結合剤とマトリックスとの相互作用を決定してもよい。本文脈において、目的の非標的分子(複数可)は、これらの方法における「標的」の場所を占め、結合剤の相互作用が試験されている分子成分であることが理解されるであろう。
)。上に記載されるように、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、結合剤とマトリックスとの相互作用を決定してもよい。本文脈において、目的の非標的分子(複数可)は、これらの方法における「標的」の場所を占め、結合剤の相互作用が試験されている分子成分であることが理解されるであろう。
抗体および他のポリペプチドの特性評価には、代替マトリックスまたはタ標的分子との相互作用も使用されている。例えば、細胞を、グリコカリックス、例えば、ヘパラン硫酸(HS)グリコサミノグリカン(GAG)鎖が結合したコアタンパク質で構成されるヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)に存在する豊富な分子へのそれらの結合についてスクリーニングしてもよい。グリコカリックスにおいてそのような分子の表面積および量が大きいことを考えると、これは試験に特に適切なクラスの分子である。ヘパリン親和性クロマトグラフィーは、固定化ヘパリンを含むマトリックスに試料を通すことを伴う48。既製の樹脂は、いくつかの供給元から利用可能である(Heparin Sepharose(Pharmacia)、Bio-Gel Heparin(Bio-Rad,Vienna,Austria)、Eupergit Heparin(Riihm Pharma,Weiterstadt,Germany)、およびToyopearl Heparin 650M(TosoHaas,Stuttgart,Germany))。結合物質は、保持されるか、またはそれらの通過が遅延することになる。非結合物質は、通過するか、または洗浄時に除去されることになる。結合した物質は、変更された緩衝液条件、例えば、塩濃度の増加を使用して除去される。この方法は、可溶性抗体をスクリーニングし、それらがヘパリンと相互作用する程度を決定するために使用することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーも、抗体を、それらが疎水性マトリックスと相互作用する傾向によって特性評するために使用し得る49、50。
1つ以上の非標的分子がマトリックス上に提示される場合、マトリックスへの結合剤の結合は、マトリックスへの細胞の結合の増加、例えば、マトリックスを通過する細胞の遅延、または非標的分子(複数可)でコーティングされたビーズ(例えば、磁気ビーズ)への結合として現れる。したがって、1つ以上の非標的分子への結合がより大きい結合剤は、結合がより大きい細胞の画分を除去する(破棄する、または選択しない)ことにより分離されてもよく、一方、結合がより小さい細胞は、回収して、任意選択でさらなるステップのために選択されてもよい。上記のように、比較ポリペプチドおよび対照ポリペプチドを使用して、本発明から得られる改善を確認することができる。改善は、非特異的相互作用が明白である濃度を特定することにより決定されてもよく、濃度は、任意選択で、標準的な条件下で定義される。あるいは、非特異的相互作用の程度は、決まった濃度で決定されてもよい。非特異的結合をアッセイする方法により、結合剤の「粘着性測定」が生成され、他の結合剤と比較され得る非特異的結合の定量的測定が提供される。したがって、任意の所与のアッセイの「粘着性測定」は、非特異的相互作用が非常に低いことが知られている対照ポリペプチドと比較した、試験ポリペプチドの値の間の差である。例えば、承認された抗体アダリムマブ2、38または抗体NIST RM 8671は、自己相互作用クロマトグラフィー(SIC)および交差相互作用クロマトグラフィー(CIC)法により推定して、他のポリクローナルIgG分子との自己相互作用または会合が最小限である。(Saro D et al,Developability Assessment of a proposed NIST monoclonal antibody37)。本発明による承認されたポリペプチドは、比較クローンと比較して「粘着性測定」の改善が観察されるものである。比較クローンは、改善されている開始クローンであってもよく、または本発明の使用によって選択解除されたクローンであってもよい。
1つ以上の非標的分子がマトリックス上に提示される場合、マトリックスへの結合剤の結合は、マトリックスへの細胞の結合の増加、例えば、マトリックスを通過する細胞の遅延、または非標的分子(複数可)でコーティングされたビーズ(例えば、磁気ビーズ)への結合として現れる。したがって、1つ以上の非標的分子への結合がより大きい結合剤は、結合がより大きい細胞の画分を除去する(破棄する、または選択しない)ことにより分離されてもよく、一方、結合がより小さい細胞は、回収して、任意選択でさらなるステップのために選択されてもよい。上記のように、比較ポリペプチドおよび対照ポリペプチドを使用して、本発明から得られる改善を確認することができる。改善は、非特異的相互作用が明白である濃度を特定することにより決定されてもよく、濃度は、任意選択で、標準的な条件下で定義される。あるいは、非特異的相互作用の程度は、決まった濃度で決定されてもよい。非特異的結合をアッセイする方法により、結合剤の「粘着性測定」が生成され、他の結合剤と比較され得る非特異的結合の定量的測定が提供される。したがって、任意の所与のアッセイの「粘着性測定」は、非特異的相互作用が非常に低いことが知られている対照ポリペプチドと比較した、試験ポリペプチドの値の間の差である。例えば、承認された抗体アダリムマブ2、38または抗体NIST RM 8671は、自己相互作用クロマトグラフィー(SIC)および交差相互作用クロマトグラフィー(CIC)法により推定して、他のポリクローナルIgG分子との自己相互作用または会合が最小限である。(Saro D et al,Developability Assessment of a proposed NIST monoclonal antibody37)。本発明による承認されたポリペプチドは、比較クローンと比較して「粘着性測定」の改善が観察されるものである。比較クローンは、改善されている開始クローンであってもよく、または本発明の使用によって選択解除されたクローンであってもよい。
これらのクロマトグラフィー法を含むいくつかの方法は、典型的には、個々の抗体を特徴評価し、「粘着性測定」を生成するために使用される。クロマトグラフィーマトリックスは、細胞を、その固定された分子との相互作用に基づいて分離するために使用することができる。例えば、臭化シアン活性化セファロースに固定されたレクチンは、T細胞集団
を分離するために使用されている51。そのような系は、抗体を発現している細胞を、ポリクローナル抗体、ヘパリン硫酸、または他の試験分子などの固定された標的とのその相互作用に基づいて分離するように改変され得る。固定された標的または支持マトリックスとの相互作用がある場合、そのような抗体を担持する細胞は、相互作用しない細胞と比べて保持または遅延される。結合傾向が異なる抗体を提示する細胞を分離するために使用する場合、ローディングまたは洗浄緩衝液を改変して、目的の厳密性を達成し得る。
を分離するために使用されている51。そのような系は、抗体を発現している細胞を、ポリクローナル抗体、ヘパリン硫酸、または他の試験分子などの固定された標的とのその相互作用に基づいて分離するように改変され得る。固定された標的または支持マトリックスとの相互作用がある場合、そのような抗体を担持する細胞は、相互作用しない細胞と比べて保持または遅延される。結合傾向が異なる抗体を提示する細胞を分離するために使用する場合、ローディングまたは洗浄緩衝液を改変して、目的の厳密性を達成し得る。
非クロマトグラフィー法を使用して、個々の抗体内の低い特異性を特定および定量することも可能である。例えば、Hotzelら(2012)は、ELISAにおいてバキュロウイルス粒子への抗体の結合を使用して、非特異的相互作用を呈する抗体を特定する16。同様の方法で、他の試験分子(例えば、ヘパリン硫酸)をビーズに固定するかまたは提示させて、個々の抗体との相互作用を試験し得る。これらのような非クロマトグラフィー法は、高等真核生物に表示されたライブラリから低い特異性を呈するクローンを特定するために適合させ得る。
特異性が低い抗体を表示する酵母ライブラリ内でクローンを特定するために、界面活性剤で可溶化された膜タンパク質の混合物が調製され、ビオチン化され、使用されている19。界面活性剤の存在は、酵母ライブラリを使用して許容され得るが、哺乳動物細胞などの高等真核生物に基づくディスプレイ系には好適でない可能性がある。特異性が低い相互作用を特定するために使用される試験分子または混合物は、フルオロフォアまたはビオチンなどの分子で標識され、ストレプトアビジンでコーティングされた表面上の分子およびその複合体の標識または回収を容易にする。例えば、フルオロフォアで標識されたコンドロイチン硫酸またはヘパリン硫酸などの分子(例えば、AMSカタログ番号AMS.CSR.FACS-A1、C1、またはD1、またはE1、またはAMS.CSR.FAHS-P1由来のもの)を使用して、標識された試験分子との相互作用の程度に応じて流動選別においてクローンを分離し得る。細胞表面でのポリペプチドの高親和力発現は、特に多価標的分子が使用される場合に、このアプローチの感度を高める。ライブラリ内のクローンは、蛍光分子の結合に基づいてフローサイトメトリーにより分離され得る。標的への結合などの他の望ましい特性、またはFc受容体などの目的の他の分子の他の結合/回避に関して、事前に、同時に、または続いて選択するために、これらの試験分子を他の標識された分子と併用し得る。他の方法には、上述のAC-SINSが含まれる。この技法では、試験結合剤が細胞表面に提示され、他の細胞またはビーズに提示された1つ以上の非標的構成要素とのそれらの相互作用の可能性が評価される39。相互作用の結果として起こる粒子間距離の減少は、金コロイド溶液のプラズモン波長の増加として検出され得る。
結合剤を発現する細胞を、クローンの混合物(例えば、ライブラリまたはそこからの試料)が1つの容器にまとめられている1つ以上の非標的分子に露出させてもよく、これは、例えばFACSなどの方法、またはクロマトグラフィー技法で簡便である。他の場合には、結合剤を発現する細胞を、別個の容器、例えば、容器ごとに1つのクローンで、1つ以上の非標的分子に露出させ、その後、結果として得られる相互作用または結合のレベルを個々に測定および比較してもよく、これは、AC-SINSなどの粒子間距離を測定する方法、または比較的少数の結合剤発現クローンを比較する場合により簡便であり得る。
したがって、蛍光標識された多反応性プローブを細胞の集団と混合することができ、多反応性結合剤を発現する細胞性クローン(多反応性プローブへの結合によって特定される)を、そうでない結合剤を発現するクローンから区別するために、検出または分離方法が使用される。標識プローブに結合できない細胞クローンは、流動選別、磁気ビーズ分離、および他の分離方法により分離され、多反応性抗体を発現するクローンよりも富化され得る。実施例6は、集団内の多反応性クローンと非多反応性クローンとの間の十分な区別を達成することが可能であるだけでなく、これを、それらの分離を可能にする単純かつ実用
的なステップを使用して行うことができることを実証する。
的なステップを使用して行うことができることを実証する。
候補薬の開発可能な変異型の特定
本発明は、結合剤の初期段階の選択(例えば、ナイーブライブラリ、または免疫化もしくは他のディスプレイアプローチから得られた選択された集団から)を含む創薬のすべての段階で、および後に候補分子の選考に残ったパネルの品質を比較するために使用され得るが、目的の結合剤がすでに特定されているものの、後になって1つ以上の開発性特性の改善が必要であることが分ったという状況においても使用が見出される。任意の供給源から特定された結合剤は、理想的とは言えない開発性特性を呈することが判明することがあり、そのような場合、代替の分子を見出すために新しい創薬プログラムを最初からやり直すよりも、既存の分子の配列を改良する方が好ましくあり得る。
本発明は、結合剤の初期段階の選択(例えば、ナイーブライブラリ、または免疫化もしくは他のディスプレイアプローチから得られた選択された集団から)を含む創薬のすべての段階で、および後に候補分子の選考に残ったパネルの品質を比較するために使用され得るが、目的の結合剤がすでに特定されているものの、後になって1つ以上の開発性特性の改善が必要であることが分ったという状況においても使用が見出される。任意の供給源から特定された結合剤は、理想的とは言えない開発性特性を呈することが判明することがあり、そのような場合、代替の分子を見出すために新しい創薬プログラムを最初からやり直すよりも、既存の分子の配列を改良する方が好ましくあり得る。
本発明の方法は、結合剤の変異型を特定するために使用されてもよく、ここでは、結合剤は、1つ以上の開発性特性(例えば、自己会合、溶解度、非特異的結合、および/または考察される他のもの)の改善を必要とすると特定されており、発明を使用して、1つ以上の変異型が改善された開発性を呈するか否かが予測される。したがって、本発明の選択方法は、「親」結合剤の変異型を表示する細胞の集団に対して行われてもよい。これらは、ライブラリと称されてもよく、かついくつかの場合には、変異型結合剤の大型かつ多様な集団を表示するが、いくつかの場合における比較対象のクローンの数は、比較的少ない、例えば最大で10個であり得る。したがって、本発明の方法は、ライブラリまたは複数のクローンを提供することを含んでもよく、ここでは、結合剤は細胞表面に提示され、クローンは、親結合剤配列の生成された変異型配列、および変異型をコードするDNAを細胞に導入してDNAが細胞DNAに組み入れられるようにすることにより産生される。好適な方法および技法については、本文書の他の節で詳述する。
変異型が生成される元である「親」結合剤は、1つ以上の開発性アッセイの性能が低いため、改善が必要であると特定されたものであってもよい。あるいは、配列の変化によってその開発性を改善できるかどうかを調査することが単に所望されてもよい。開発性の様々な態様が本明細書で考察され、親分子はこれらのうちのいずれかの改善を必要とするものとし特定され得る。親分子は、50mg/ml未満、20mg/ml未満、10mg/ml未満、5mg/ml未満、または1mg/ml未満の溶解限界(最大溶解度)を有することが判明し得る。親分子は、50mg/ml未満、20mg/ml未満、10mg/ml未満、5mg/ml未満、または1mg/ml未満の臨界濃度を有することが判明し得る。親は、溶液中で望ましくない凝集を呈することがあり、かつ/または凝集および/もしくは沈殿せずに溶液中で1mg/mlを超えて濃縮できないことがある。親は、1つ以上の非標的分子への非特異的結合を示してもよい。親は、FcRnへの結合および/またはFcRnからの解離を改善する必要があると特定されてもよい。
任意選択で、親ポリペプチド配列のバイオインフォマティクス評価を行って、変異が予測される配列の可能性のある特徴を特定し、特定された開発性の問題を軽減することで、性能を改善する。故に、開発性(例えば、溶解度、自己会合、非特異的結合)に関連すると予測される1つ以上のアミノ酸位置が特定され得る。
このようなバイオインフォマティクス評価は、変異戦略に情報を与えるために使用することができる。故に、バイオインフォマティクス評価で特定された1つ以上のアミノ酸位置の変異を任意選択で含む、親ポリペプチド配列の変異型を生成することができる。したがって、自己会合、凝集、および/または非特異的結合を促進し、かつ/または溶解度を低下させると予測される親結合剤のポリペプチド配列の1つ以上のアミノ酸残基で変異が行われ得る。変異により、親配列の1つ以上の変異型をコードするDNAが生成され、これを、高等真核細胞に導入して、変異型結合剤をコードする細胞の集団を生成させてもよ
い(その方法は本明細書に記載する)。細胞を、結合剤が細胞表面に提示される結合剤の発現のための条件下で培養してもよい。結合剤を発現する複数の細胞を本明細書に記載のライブラリとして使用してもよく、改善された開発性特性の指標として、結合剤の表面提示がより高いクローンを特定するために選択を行ってもよい。
い(その方法は本明細書に記載する)。細胞を、結合剤が細胞表面に提示される結合剤の発現のための条件下で培養してもよい。結合剤を発現する複数の細胞を本明細書に記載のライブラリとして使用してもよく、改善された開発性特性の指標として、結合剤の表面提示がより高いクローンを特定するために選択を行ってもよい。
本明細書に記載の様々な例では、問題となる可能性のある残基を特定するために配列分析が使用される。あるいは、ランダムな配列変動が使用され得る。変異型および派生ライブラリを生成する方法については、本明細書の他箇所に記載する。個々の変異型を作製し、生物物理学的特性の改善について評価することができる。多くのそのような変異型の大型ライブラリを創出し、自己凝集に対する耐性などの改善された特性を直接選択できることで、最適な溶解特性を有する抗体および他の結合剤の発見が大幅に促進される。溶解度に利益をもたらす変化は同時に標的結合を減退させ得るため、特にパラトピック残基が関与する場合14、本発明の方法は、開発性の選択と保持された標的結合の選択とを組み合わせてもよい。このような選択は任意選択で同時に行われ、親和性および溶解度を同時にまたは順次スクリーニングするための方法が説明される。
考察したように、結合剤の表面提示のレベルに基づく選択を含む本発明の方法を使用して、改善された溶液特性が改善された変異型を特定してもよい。例えば、「親」結合剤(例えば、抗体)の開発性特性を改善する方法は、
結合剤のアミノ酸配列に変異を導入して、変異型を生成することと、
変異型をコードするDNAを真核(例えば、哺乳動物)細胞に導入して、誘導体抗体をコードするDNAを各々含む複数の細胞クローンを提供することと、
親結合剤をコードするDNAを真核(例えば、哺乳動物)細胞に導入して、親をコードするDNAを含む細胞クローンを提供することと、
細胞表面に結合剤を提示するための条件下で、インビトロでクローンを培養することと、
複数のクローンにおける結合剤の表面提示レベルを決定することと、
誘導体抗体の表面提示が親を発現するクローンと比較して高い1つ以上のクローンを選択することと、
1つ以上の選択されたクローンによってコードされる1つ以上の変異型結合剤を、開発性特性が親抗体と比較して改善したものとして特定することと、を含んでもよい。
結合剤のアミノ酸配列に変異を導入して、変異型を生成することと、
変異型をコードするDNAを真核(例えば、哺乳動物)細胞に導入して、誘導体抗体をコードするDNAを各々含む複数の細胞クローンを提供することと、
親結合剤をコードするDNAを真核(例えば、哺乳動物)細胞に導入して、親をコードするDNAを含む細胞クローンを提供することと、
細胞表面に結合剤を提示するための条件下で、インビトロでクローンを培養することと、
複数のクローンにおける結合剤の表面提示レベルを決定することと、
誘導体抗体の表面提示が親を発現するクローンと比較して高い1つ以上のクローンを選択することと、
1つ以上の選択されたクローンによってコードされる1つ以上の変異型結合剤を、開発性特性が親抗体と比較して改善したものとして特定することと、を含んでもよい。
自己相互作用の傾向と非標的相互作用の傾向との間には関係がある。少数のアミノ酸変化(1~3)が両方の側面に有益な効果をもたらし得ることが分かっている6、7、14。他の場合には、特異性が低いという証拠を示して、自己相互作用が制限され得る。いずれの場合でも、非特異的結合がより小さい結合剤の選択を含む本発明の方法も使用され得る。したがって、本明細書の他箇所で考察するように、本系は、「低特異性」および「多重特異性」とも称される他の分子との望ましくない非特異的相互作用を特定するために使用されてもよい。本発明は、臨床で使用される製品の製造に典型的に使用される産生細胞株に見られるものをより密に反映するグリコシル化などの修飾を伴う、哺乳動物細胞などの高等真核細胞上の発現という背景で、そのようなスクリーニングを実施する利益を有する。細胞上のポリペプチドの高い提示レベル23は、任意の相互作用の親和力を増大させることにより、親和性の低い望ましくない相互作用を検出する際の本系の感度を増大させる働きをすることになる。さらに、高等真核生物自体の表面(または小胞体およびゴルジ装置の環境)は、結合剤が比較的高い濃度で多様なポリペプチドに露出することで、特異性が低い結合剤を同じ分子または隣接する分子上で非標的分子と相互作用するのを可能にし得るマトリックスとして機能することができる。これにより、提示レベルの低下が生じる。これはまた、集団内の他の細胞との提示細胞の凝集を生じさせてもよい。結果として得られる細胞凝集体は、除去されて(例えば、濾過または沈降により)、そのようなクローンを集団から枯渇させ得る。凝集した細胞の除去は、自己相互作用クローンの表示を減
少させるためにも使用され得る。
少させるためにも使用され得る。
さらなる用途では、内因性または外因性の遺伝子からの望ましくない標的を発現する宿主細胞を使用して、交差反応性クローンを枯渇させ得る。例えば、目的の遺伝子でトランスフェクトされたグリコカリックスまたは哺乳動物細胞の成分を発現する内皮細胞。標的に結合するクローンは、低い表面発現または細胞凝集に基づいて枯渇されてもよい。
単一濃度のポリペプチドでの生物物理学的測定値を、本発明を使用して生成した開始クローンと改善したクローンとの間で比較してもよい。あるいは、不要な生物物理学的パラメータが測定される濃度を比較してもよい。方法は、1つ以上の所望の開発性特性、例えば、より高い溶解度、溶液中での自己会合のより低い傾向、非標的分子へのより低い非特異的結合、より高い臨界濃度などが改善した変異型を選択することを含んでもよい。倍数差異または差異%が測定可能であってもよく、値の例は本明細書の他箇所に示す。比較は、通常、親結合剤に対して行われることになる。しかしながら、本発明により選択されたクローンからの変異型ポリペプチドと本発明により選択解除された比較ポリペプチドとの比較は、本発明が本明細書に記載の他の生物物理学的特性を選択するために使用される場合、改善を確認および定量するためにも使用され得る。
変異型および派生ライブラリを生成する方法
本明細書で考察する任意の選択方法に従って、表示された結合剤をコードするDNAを1つ以上の選択された細胞から回収し、任意選択で変異させて変異型を生成し、かつ/またはサブクローニングして、例えば、第2のディスプレイ系内で追加の回の選択を可能にすることができる。これは、異なるレベルの表面提示をもたらす別の真核生物ディスプレイ系であり得るか、またはファージディスプレイなどの完全に異なるディスプレイ系であり得る。第2の系は、分泌発現を使用してもよく、かつ/または前述のように、直接的な機能選択を可能にしてもよい(参考文献52~54および国際公開第WO2015/166272号を参照されたい)。あるいは、結合剤をコードする入力DNAは、選択されていないライブラリからの結合剤の集団、あるいは免疫化、または酵母もしくはファージディスプレイなどの別のディスプレイ技術に由来する集団であり得る。
本明細書で考察する任意の選択方法に従って、表示された結合剤をコードするDNAを1つ以上の選択された細胞から回収し、任意選択で変異させて変異型を生成し、かつ/またはサブクローニングして、例えば、第2のディスプレイ系内で追加の回の選択を可能にすることができる。これは、異なるレベルの表面提示をもたらす別の真核生物ディスプレイ系であり得るか、またはファージディスプレイなどの完全に異なるディスプレイ系であり得る。第2の系は、分泌発現を使用してもよく、かつ/または前述のように、直接的な機能選択を可能にしてもよい(参考文献52~54および国際公開第WO2015/166272号を参照されたい)。あるいは、結合剤をコードする入力DNAは、選択されていないライブラリからの結合剤の集団、あるいは免疫化、または酵母もしくはファージディスプレイなどの別のディスプレイ技術に由来する集団であり得る。
したがって、本発明の方法によるライブラリの生成に続いて、1つ以上のライブラリクローンが選択され、さらなる第2世代ライブラリを生成するために使用されてもよい。本明細書に記載するように真核細胞にDNAを導入することによりライブラリが生成された場合、ライブラリを培養して結合剤を発現させ、例えば、本明細書の他箇所で説明するように標的に対して結合剤を選択することにより、目的の結合剤を発現する1つ以上のクローンを回収してもよい。続いて、これらのクローンを使用して、結合剤の第2のレパートリーをコードするDNAを含む派生ライブラリを生成してもよい。
他の例では、開発性特性が改善した変異型を選択するための複数の変異型を提供するために、親結合剤の変異型を生成することが望ましい。
派生ライブラリを生成するために、1つ以上の回収されたクローンのドナーDNAを変異させて、結合剤の第2のレパートリーを提供する。同様に、変異型を生成するために、親結合剤をコードするDNAを変異させる。変異は、1つ以上のヌクレオチドの付加、置換、または欠失であってもよい。変異は、1つ以上のアミノ酸の付加、置換、または欠失によって、コードされた結合剤の配列を変化させる。変異は、抗体分子の1つ以上のCDRなどの1つ以上の領域に焦点を当ててもよく、本明細書の他箇所に記載するように、多様性の1つ以上の領域が異なる共通構造クラスの結合剤のレパートリーを提供する。
一般に、核酸配列の操作および/または修飾は、DNAまたはRNAレベルで行われ得
る。したがって、本明細書におけるDNAへの言及は、文脈により別途求められない限り、等価の他の核酸(例えば、RNA)を含むように一般化され得る。故に、結合剤をコードするRNAの提供、単離、または変異は、結合剤をコードするDNAの提供、単離、または変異の代替である。RNAは、cDNAを生成するために任意選択で使用される。
る。したがって、本明細書におけるDNAへの言及は、文脈により別途求められない限り、等価の他の核酸(例えば、RNA)を含むように一般化され得る。故に、結合剤をコードするRNAの提供、単離、または変異は、結合剤をコードするDNAの提供、単離、または変異の代替である。RNAは、cDNAを生成するために任意選択で使用される。
派生ライブラリの生成には、1つ以上の回収されたクローンから結合剤をコードする核酸を単離すること(例えば、ドナーDNAまたはそのコードされたRNAを単離すること)と、核酸(例えば、DNA)に変異を導入して、結合剤の第2のレパートリーをコードするドナーDNA分子の派生集団を提供することと、ドナーDNA分子の派生集団を細胞に導入して、結合剤の第2のレパートリーをコードするDNAを含む細胞の派生ライブラリを創出することとが含まれる。
結合剤をコードする核酸(例えば、ドナーDNA)の単離には、クローンからのDNAまたはRNAの入手および/または特定が伴ってもよい。そのような方法には、例えばPCRによって、結合剤をコードするDNAを回収されたクローンから増幅し、変異を導入することが包含されてもよい。DNAの配列決定を行い、変異したDNAを合成する。
あるいは、クローン内でDNAの変異を誘発することにより、1つ以上の回収されたクローンのドナーDNAに変異を導入してもよい。したがって、DNAの単離を必要とせずに、例えば、鳥類DT40細胞における内因性変異を介して、1つ以上のクローンから派生ライブラリを創出してもよい。あるいは、結合剤をコードする遺伝子は、ゲノム内に存在してもよく、変異誘発は、短い相同性アームを有するオリゴヌクレオチドの導入によって行われる。欠陥のあるGFP遺伝子を修復するために80bpの一本鎖オリゴヌクレオチドを使用することで、最大45%のトランスフェクション効率が達成されることが示されている(Igoucheva,O.,Alexeev,V.,Yoon,K.,2001.Targeted gene correction by small single-stranded oligonucleotides in mammalian cells.Gene Ther.8(5),391-39955,Liang,et al(2017).Enhanced CRISPR/Cas9-mediated
precise genome editing by improved design and delivery of gRNA,Cas9 nuclease,and donor DNA.J.Biotechnology,241,136-14656)。
precise genome editing by improved design and delivery of gRNA,Cas9 nuclease,and donor DNA.J.Biotechnology,241,136-14656)。
抗体ディスプレイは、派生ライブラリの創出に特に役立つ。抗体遺伝子が単離されると、様々な変異誘発アプローチ(例えば、エラープローンPCR、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、鎖シャッフリング)を使用して、改善された変異型を選択できる関連クローンのディスプレイライブラリを創出することが可能である。例えば、選択されたVHクローンの集団をコードするDNAの鎖シャッフリングを用いると、オリゴクローナルミックスまたは集団を、好適な抗体形式をコードし、VL鎖の適切にフォーマットされたレパートリーをコードするベクターにサブクローニングすることができる57。あるいは、またここでも、VHの例を使用して、VHクローンのオリゴミックスまたは集団を、適切にフォーマットされた軽鎖パートナー(例えば、IgGまたはFabフォーマットされた重鎖との会合のためのVL-CL鎖)の集団をコードし発現する真核細胞の集団に導入し得る。VH集団は、免疫された動物のB細胞または選択されたファージ集団からのscFv遺伝子を含む、上で考察した供給源のうちのいずれかから生じ得る。後者の例では、選択したVHを軽鎖のレパートリーにクローニングすることで、1つのステップで鎖シャッフリングと再フォーマット(例えば、IgGフォーマットへの)とを組み合わせ得る。
結合剤の細胞表面提示
細胞表面での結合剤の保持は、結合剤とコードDNAとの間の物理的な会合を提供して、所望の特性を有する結合剤を発現する細胞の物理的単離後のDNAの回復を容易にするので、ディスプレイライブラリの特徴である。結合剤の表面提示(または単に「提示」)は、結合剤のディスプレイまたは表面発現と称されてもよい。結合剤の表面提示のレベルは、細胞表面での高濃度に長時間露出した後の、その発現レベルおよびその保持された提示レベルを反映する。本明細書に記載の方法では、結合剤の表面提示の相対レベルは、異なる結合剤を発現するクローン間で比較され、自己会合の傾向が低く、溶解度が高く、医薬用途に好適な濃度で水性緩衝溶液に製剤化することができる結合剤を特定するために使用される。したがって、提示レベルは、所望の特性を有するクローンを選択するために使用することができる。このため、ディスプレイライブラリ上の結合剤の表面提示は、開発性特性の選択に使用することができる固有の特徴を示す。
細胞表面での結合剤の保持は、結合剤とコードDNAとの間の物理的な会合を提供して、所望の特性を有する結合剤を発現する細胞の物理的単離後のDNAの回復を容易にするので、ディスプレイライブラリの特徴である。結合剤の表面提示(または単に「提示」)は、結合剤のディスプレイまたは表面発現と称されてもよい。結合剤の表面提示のレベルは、細胞表面での高濃度に長時間露出した後の、その発現レベルおよびその保持された提示レベルを反映する。本明細書に記載の方法では、結合剤の表面提示の相対レベルは、異なる結合剤を発現するクローン間で比較され、自己会合の傾向が低く、溶解度が高く、医薬用途に好適な濃度で水性緩衝溶液に製剤化することができる結合剤を特定するために使用される。したがって、提示レベルは、所望の特性を有するクローンを選択するために使用することができる。このため、ディスプレイライブラリ上の結合剤の表面提示は、開発性特性の選択に使用することができる固有の特徴を示す。
細胞表面での様々な固定化手段を用いることができる。結合剤は、結合剤の細胞外提示のために、膜貫通ドメインなどの膜アンカーを含んでもよく、あるいはそれに連結してもよい。これには、GPI認識配列などの膜局在化シグナルまたはPDGF受容体の膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインへの結合剤の直接融合が関与し得る58。
細胞表面上の結合剤の保持を達成する他の方法には、結合剤と、同じ細胞内で発現される別の細胞表面に保持された分子との間接的な会合が含まれる。この会合分子は、それ自体が、直接係留されていない軽鎖パートナーと会合している係留された抗体重鎖などのヘテロ二量体結合剤の一部であり得る。国際公開第WO2015/166272号(参照により本明細書に組み込まれる)は、分泌された発現および膜ディスプレイの組み合わせを可能にする方法を含む、発現された結合剤をそれらの宿主細胞上に保持するための様々な技法を説明している。したがって、発現された結合剤の一部は細胞表面に保持されてもよいが、同じ結合剤の他のコピーは同じ細胞から可溶性形態で分泌される。細胞は、細胞表面に提示された結合剤の大部分(例えば、80%以上、または90%以上)を保持し、少数は培地に分泌される。任意選択で、結合剤は、細胞表面に保持されるだけで、可溶性形態で分泌されることはない。
実施例1に例示するように、抗体の重鎖は、PDGFR TMドメインに融合され、全長免疫グロブリン、例えばIgGの表面提示のためにその同種軽鎖とともに発現されてもよい。細胞内の結合剤をコードする遺伝子またはそのポリペプチドサブユニット(例えば、抗体重鎖)は、小胞体(ER)を介した細胞表面への分泌のためのリーダー配列をコードするDNAを含んでもよい。結合剤をコードする遺伝子は、膜貫通ドメイン、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト)タンパク質のTMドメインなどの膜アンカーをコードするDNAを含んでもよい。あるいは、この遺伝子は、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーなどの翻訳後膜アンカーの付着シグナルをコードするDNAを含んでもよい。ポリペプチド結合剤のC末端領域は、通常、膜アンカーの付着またはTMドメインの融合のために選択される。
細胞表面発現のレベルに影響を与える方法は、例えばプロモーターを使用して、結合剤がそのコードDNAから発現されるレベルを制御することを含み、そのための方法は本明細書の他箇所に記載されている。あるいは、例えば国際公開第WO2015128509号(Glenmark Pharmaceuticals)に記載されているように、発現された結合剤をコードするDNAが膜貫通ドメインをコードするエクソンにスプライスされる程度に影響を与えることにより、表面発現レベルを制御することができる。このアプローチも本明細書で例示されており、様々なレベルの結合剤の表面提示が所望される本発明の方法において有用に用いられ得る発現系を説明する、実施例8aおよび実施例8bを参照されたい。
本発明の実施形態では、結合剤は細胞で発現され、細胞膜に輸送され、そこで膜タンパク質として細胞表面に保持される。例えば、結合剤は、少なくとも1つの膜貫通ドメインまたは膜アンカーを有する1つ以上のポリペプチドを含んでもよい。例えば、ポリペプチド結合剤が抗体重鎖(またはその一部)および抗体軽鎖(またはその一部)を含み、かつ重鎖および/または軽鎖に連結した膜貫通ドメインまたは膜アンカーを含む場合、結合剤は、ER内で合成され、ゴルジ装置に出芽し、そこから細胞膜と融合する細胞内小胞中の細胞表面に輸送された後、結合剤は、その膜貫通ドメインまたは膜アンカーによって保持され、細胞外に提示される。したがって、結合剤の膜への組入れは、細胞表面への輸送前に細胞内で生じる。適用可能な場合、マルチサブユニット結合剤(例えば、別個の重鎖および軽鎖、またはそれらの一部を含む抗体)のアセンブリも、典型的には細胞内で生じ得る。
細胞表面提示のレベルは、コピー数(細胞あたりの表示された結合剤の数)で測定されてもよい。較正ビーズとの比較、ならびにリガンド濃度および受容体占有率のスキャッチャードプロットを含む、いくつかの方法が利用可能である59~61。細胞半径の知識、および利用可能な体積または表面積に関する一定の仮定により、これを使用して、それぞれ濃度または密度を推定することができる(実施例3)。本発明が関係する一般論のレベルでは、コピー数は、提示レベルが増加するにつれて見られる、より高い濃度で達成される濃度に関係する。コピー数と細胞表面の濃度との関係は、細胞サイズにも影響される。小さい細胞および大きい細胞上で同じ数の結合剤が提示されると、抗体はより大きい細胞においてより大きな体積を占めることになるため、異なる濃度をもたらすことになる(細胞サイズと達成された濃度とを比較する実施例3を参照されたい)。
多数の組換え発現系が利用可能であり、細胞表面に表示される結合剤の絶対数は、系により異なることになる。当業者は、異なる細胞(例えば、異なるサイズ)、異なるプロモーター、異なる誘導機序、異なるスプライシング機序、輸送効率などを使用するときに観察される提示レベルの範囲に応じて、本発明の方法を適切に較正することができるであろう。しかしながら、以下の指針を例として提供する。
活性の弱いプロモーターでは、結合剤は、細胞あたり100~100,000個の範囲のコピー数で細胞表面に提示されてもよい。細胞あたりの結合剤の数は、少なくとも100個、少なくとも1,000個、または少なくとも10,000個であってもよい。細胞あたりの結合剤の数は、最大1,000個、最大10,000個、または最大100,000個であってもよい。好ましい実施形態では、コピー数は、約80,000個以下、細胞あたり約60,000個以下、細胞あたり約50,000個以下、または細胞あたり約40,000個以下である。細胞あたりの結合剤の数は、少なくとも100個、少なくとも1,000個、または少なくとも10,000個であってもよい。したがって、コピー数は、例えば、細胞あたり1,000~60,000個の範囲であってもよい。これは、約10,000個、約50,000個、または約60,000個であってもよい。
活性の強いプロモーターでは、結合剤は、細胞あたり100,000~10,000,000個の範囲のコピー数で細胞表面に提示されてもよい。細胞あたりの結合剤の数は、少なくとも100,000個、または少なくとも1,000,000個であってもよい。細胞あたりの結合剤の数は、最大1,000,000個、または最大10,000,000個であってもよい。これは、約1,000,000個であってもよい。
言うまでもなく、単一のクローンであっても、異なる細胞上の結合剤の正確な数には変動があるが、クローンの細胞間のコピー数のこのような変動は、本明細書に記載の選択および富化方法が活用するクローン間のコピー数の変動と比較すると小さいものである。例となる数値および範囲は、おおよその平均(average)(平均(mean))コピ
ー数を表す。コピー数は、集団内の細胞の平均(average)(平均(mean))コピー数であってもよい。親和性を選択するときには、結合の厳密性を高め、高親和性クローンを富化するために小さいコピー数が好ましいが、開発性、例えば、結合剤の溶液特性を選択するときには、大きいコピー数が好ましい。
ー数を表す。コピー数は、集団内の細胞の平均(average)(平均(mean))コピー数であってもよい。親和性を選択するときには、結合の厳密性を高め、高親和性クローンを富化するために小さいコピー数が好ましいが、開発性、例えば、結合剤の溶液特性を選択するときには、大きいコピー数が好ましい。
結合剤を発現する細胞のライブラリ内のコピー数は、比較的小さい数(例えば、細胞あたり10,000、50,000、100,000、または250,000コピー)から比較的大きい数(例えば、細胞あたり1,000,000コピー)の範囲であってもよい。ここで引用するコピー数は指針でしかなく、半径が10μmほどである、懸濁培養中のHEK細胞のライブラリで観察されたコピー数に基づく95。大型の細胞の表面に所与の密度で提示されたポリペプチドは、小型の細胞に同じ密度で提示された場合よりも大きいコピー数となるため、大型の細胞または小型の細胞から生成されたライブラリで観察される絶対コピー数は、それに応じて異なり得る。実施例3bを参照されたい。
本発明の方法を実施する場合、通常は、クローン間で比較した相対的な提示レベルに関心が向けられ、この場合、重要なのは、結合剤の絶対数(細胞あたりの絶対コピー数)ではなく、結合剤が細胞表面に表示される様々なレベルに応じてクローンをランク付けまたは区別する能力である。
ライブラリからのクローンの代表的な試料の表面提示レベルを決定し、これを使用して、ライブラリのクローンに存在する表面提示レベルの平均(最頻値(mode)、平均(mean)、および中央値(median))および広がり(範囲)を推定することができる。
任意の好適な方法を使用して、ポリペプチドが細胞表面に存在するレベルを決定することにより、それらの相対量を比較することができる。細胞間の結合剤提示の相対的差異を測定する好ましい方法は、検出可能な(例えば、蛍光)標識を担持する薬剤に細胞を曝露出させ、薬剤の結合剤への結合を可能にし、細胞上の標識の相対量を検出することであり、これにおいて、検出可能な標識からのより強いシグナル(例えば、より多くの蛍光ユニット)は、細胞上の結合剤のより高い提示レベルを示す。検出可能な標識が蛍光である場合、蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して選別を行ってもよい。あるいは、またはFACSに加えて、磁気ビーズによる選択を使用することができる。
一般に、結合剤の定常領域に結合する薬剤が選択される、すべての結合剤をそれらの配列とは無関係に等しく標識することができる。Fc領域を含む抗体および他の結合剤では、Fc領域に結合する薬剤で標識することが簡便である。例えば、結合剤がIgG抗体である場合、細胞を、IgG Fc領域に結合する検出可能な物質、例えば、標識された抗IgG抗体と接触させてもよい。適切な場合、例えば、ライブラリが、それらのFc領域の配列が異なる結合剤を含み、Fcの非多様性部分または結合剤分子の他の領域に結合する薬剤を用いることができる場合に、本方法を適合させることができる。ペプチド発現タグ(例えば、ヘマグルチニン(HA)、c-Myc)は、結合剤ポリペプチドに組み込まれ(例えば、抗体足場に組み込まれ)てもよく、タグに結合した薬剤を検出することにより、表示された結合剤を検出することを可能にする。これは、抗体発現レベルに基づいて抗原結合シグナルを正規化するために、正しく組み立てられた抗体を選択するという背景ですでに説明されている24、62。結合剤の表面提示レベルを検出するための薬剤は、単独で、すなわち、抗原結合または標的特異性などの他の特徴の同時検出または同時選択なしで使用してもよい。したがって、いくつかの実施形態では、結合剤の定常領域に結合する薬剤を使用して結合剤提示レベルを検出するステップは、標識された標的を使用して結合剤を検出することを含まない。他の実施形態では、マルチパラメータ選択を行ってもよい。広範な表面提示レベルがライブラリの結合剤発現クローンによって呈されてもよく
、これは高レベルのクローン間変動を反映する。ライブラリからの細胞の代表的な試料について、例えば、FACSによる検出後、表面提示レベルをその提示レベルが観察された頻度に対してプロットすることができる。このいくつかの実施形態は、図31を参照して、そこに例示されている、実施例10に記載されている。試料について検出された表面提示レベルまたは最頻値の表面提示レベル、ならびに提示レベルの広がりおよび中央値または最頻値からのそれらの偏差を、観察および/または計算し得る。最頻値表面提示は、細胞数に対する表面提示レベルのプロットの最高ピークとして簡便に視覚化することができる。
、これは高レベルのクローン間変動を反映する。ライブラリからの細胞の代表的な試料について、例えば、FACSによる検出後、表面提示レベルをその提示レベルが観察された頻度に対してプロットすることができる。このいくつかの実施形態は、図31を参照して、そこに例示されている、実施例10に記載されている。試料について検出された表面提示レベルまたは最頻値の表面提示レベル、ならびに提示レベルの広がりおよび中央値または最頻値からのそれらの偏差を、観察および/または計算し得る。最頻値表面提示は、細胞数に対する表面提示レベルのプロットの最高ピークとして簡便に視覚化することができる。
クローンの集団で観察された表面提示レベルの広がりは、最頻値(modal value)(最頻値(mode))からの分散の程度によって表されてもよい。クローンの集団は、特に結合剤が構造に大きな変動を呈する場合(例えば、異なる一次配列)、クローン間の表面提示のレベルに幅広い変動を示してもよく、その結果、一部のクローンは他よりはるかに高い密度で結合剤を表示する。一部のクローン集団では、表面提示レベルのクローン間変動はより低くてもよいが、それでも本方法を使用して、閾値提示レベルを設定し、より提示が高いクローンをより提示が低いクローンと区別してもよい。広がりのひとつの統計的尺度は、上位四分位点(第三四分位数)と下位四分位点(第一四分位数)との差である四分位範囲である。第三四分位数(上位四分位点の下限として表される)でのコピー数は、第一四分位数(下位四分位点の上限で表される)でのコピー数とは、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4倍、少なくとも4.5倍、または少なくとも5倍異なってもよい。
いくつかの実施形態では、表面提示レベルの範囲、および上述の基準点間の表面提示の倍率差は、結合剤の高い表面提示を有するクローンについて細胞の集団が次第に富化されるため、表面提示レベルの各回の選択とともに減少することが観察され得る。いくつかの実施形態では、最頻値は、より高い表面提示についての各富化とともに次第に増加することが観察され得る。選択に続いて、結合剤の集団における表面提示レベルの増加を決定または観察する方法には、例えば、FACSまたは本明細書に記載の類似の方法により測定される平均(例えば、中央または最頻)コピー数の増加を決定または観察することが含まれてもよい。選択された集団(またはそのクローン)は、平均表面提示レベルが、選択されていない集団または比較ポリペプチドを発現するクローンの平均表面提示レベルよりも、例えば、集団が由来する親結合剤を発現するクローンの平均表面提示レベルよりも高いことが観察され得る。例えば、選択したクローンまたは選択した集団の最頻値または中央値のコピー数は、比較または親のコピー数よりも、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、または少なくとも25%高く、そのクローンは、表面提示レベルのその改善に基づいて選択され得る。
結合剤のより高い表面提示を発現するクローンを選択するため、または表面提示がより高い結合剤をコードするクローンについて富化されたクローンの集団を選択するために、細胞を、細胞における結合剤の表面提示のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別し得る。表面提示が所定の閾値を上回る細胞は、収集画分に選別され、表面提示が所定の閾値を下回る細胞は、廃棄画分に選別される。表面提示は、任意選択で、このステップ中に選択/富化が行われる唯一の基準である。これは、任意選択で結合剤による標的認識の検出のない状態で、すべての結合剤を標識する検出可能な薬剤を使用することにより促進され得る。
結合剤の表面提示がより低い細胞の画分を廃棄することにより、開発性特性が不良な結合剤を発現するクローンが集団から枯渇する。残りの細胞のすべてまたは一部を選択することで、他のクローンと比較して結合剤の表面提示が高い結合剤を発現するクローンが富化された、選択された細胞集団が得られる。こうして、選択された細胞、クローン、また
は集団が、開始集団またはライブラリと比較して、および選択されていない細胞、クローン、または集団と比較して、開発性特性が良好であるものとして特定され得る。
は集団が、開始集団またはライブラリと比較して、および選択されていない細胞、クローン、または集団と比較して、開発性特性が良好であるものとして特定され得る。
上記のように、細胞表面上の結合剤の絶対数は変動し、使用中の系に好適な閾値は当業者により決定されることになる。例えば、閾値は、例えばライブラリの最初の試験試料に基づいて、結合剤の最も高い表面提示を発現する集団内の特定のパーセンテージのクローンを選択するように予め決定されてもよい。閾値は、例えば、細胞の上位50%、上位30%、上位25%、上位20%、上位15%、上位10%、または上位5%を選択するように設定されてもよい。
ライブラリからの細胞の代表的な試料の表面提示レベルを決定し、試料のコピー数の最頻値、中央値、広がり、および/または四分位範囲を観察または計算したら、適切な閾値コピー数を設定し得る。FACSを使用する場合、これは細胞あたりの閾値蛍光強度に対応することになり、例えば、細胞の収集に関するFACS閾値が、試料の最頻値に対応する中央値の蛍光強度を有するライブラリの細胞を収集するように設定されている場合、その蛍光レベルまたはそれを上回るレベルを有する細胞が収集されることになる。表面提示レベルをさらによく富化するためには、細胞の収集のためのFACS閾値を、試料中の細胞の第三四分位数の蛍光強度に相当する蛍光強度を有するライブラリの細胞を収集するように設定してもよい。
閾値は、少なくとも約100,000個、少なくとも約500,000個、または少なくとも約1,000,000個の、細胞あたりの提示される結合剤の数を表し得る。
選択および富化
クローンの選択、細胞の選択、または集団の選択には、クローン、細胞、または集団を、他のクローンもしくは細胞から、またはより広い集団もしくはライブラリから物理的に分離させることが含まれてもよい。選択されたクローン、細胞、または集団は、単離された形態で提供されてもよい。
クローンの選択、細胞の選択、または集団の選択には、クローン、細胞、または集団を、他のクローンもしくは細胞から、またはより広い集団もしくはライブラリから物理的に分離させることが含まれてもよい。選択されたクローン、細胞、または集団は、単離された形態で提供されてもよい。
複数の細胞またはクローンの物理的分離が選択に含まれる場合、これには、典型的には、収集画分および廃棄画分の生成が含まれることになる。収集画分は、本方法において選択された特性を有する結合剤を表示するクローンについて富化されることになる。富化とは、集団におけるこれらのクローンの相対的存在量が増加することを意味する。富化は、選択ステップの前の細胞またはクローンのプール、例えばライブラリまたは開始集団に対するものである。選択中に細胞の一部(例えば、結合剤の表面提示がより低い細胞、親和性がより低い細胞など)を廃棄することにより、あまり望ましくない特性(例えば、不良な開発性特性)を有する結合剤を発現するクローンが除外される。したがって、選択ステップの結果として、あまり望ましくない特性を有する細胞/結合剤の相対的存在量が、集団において減少する。所望であれば、選択した細胞のすべてまたは一部(収集画分)をさらなる選択方法に進めてもよく、任意選択で、1つ以上のクローンを、単独での個々の培養に対して選択する。任意選択で、1つ以上の選択された細胞もしくは結合剤または選択された集団を、本明細書の他箇所に記載するように、派生ライブラリの創出に使用してもよい。
クローンの収集画分を選択する際に、本方法のオペレーターは、「上位」または「最良」のクローンの設定されたパーセンテージまたは割合を得てもよい。この原理の実施形態は、高い表面提示のための選択を参照して詳細に考察されている。標的分子または非標的分子への結合などの他の特性を選択するときにも同じ原理が適用されることを理解されたい。したがって、標的を認識する結合剤を発現するクローンを選択する場合(例えば、親和性選択)、オペレーターは、標的への結合が最も高いクローン(例えば、標識された標
的を使用する方法においてクローンに結合した検出可能な標識の量により測定して)の設定されたパーセンテージまたは割合を選択してもよい。非標的分子への非特異的結合の減少(または不在)を示す結合剤を発現するクローンを選択する場合、オペレーターは、非標的分子への結合が最も低いクローン(例えば、本明細書で言及する様々な多反応性プローブのうちのいずれかなど、標識された非標的分子を使用する方法におけるクローンに結合した検出可能な標識の量により測定して)の設定されたパーセンテージまたは割合を選択してもよい。一般に、「良好な」特性(例えば、表面提示レベル、標的への親和性)についてポジティブ選択するときには、その特性のレベルが他のクローンと比べて高いクローンを選択し、「不良な」特性(例えば、非特異的結合)に対して選択するときには、その特性のレベルが他のクローンと比較して低いクローンを選択することになる。
的を使用する方法においてクローンに結合した検出可能な標識の量により測定して)の設定されたパーセンテージまたは割合を選択してもよい。非標的分子への非特異的結合の減少(または不在)を示す結合剤を発現するクローンを選択する場合、オペレーターは、非標的分子への結合が最も低いクローン(例えば、本明細書で言及する様々な多反応性プローブのうちのいずれかなど、標識された非標的分子を使用する方法におけるクローンに結合した検出可能な標識の量により測定して)の設定されたパーセンテージまたは割合を選択してもよい。一般に、「良好な」特性(例えば、表面提示レベル、標的への親和性)についてポジティブ選択するときには、その特性のレベルが他のクローンと比べて高いクローンを選択し、「不良な」特性(例えば、非特異的結合)に対して選択するときには、その特性のレベルが他のクローンと比較して低いクローンを選択することになる。
本明細書の他箇所で考察するように、選択閾値は、手元の状況に従ってオペレーターによって決定されてもよく、集団の試料(例えば、ライブラリからのクローンの代表的な試料)の初期評価により導かれてもよい。閾値は、所望の特性の場合、シグナルレベルが最も高いクローン、例えば、細胞の上位50%、上位30%、上位25%、上位20%、上位15%、上位10%、または上位5%を富化するように設定されてもよい(例えば、表面提示のレベルもしくは標的結合のレベルを表す、結合した検出可能な標識の量に基づいて、またはAC-SINSにより決定した粒子間距離に基づいて、または溶液中の単量体産生に基づいて)。選択された上位%のクローンが収集画分となり、他のクローンは破棄される。望ましくない特性に対する選択では、例えば、多反応性プローブに結合した検出可能な標識の量、または非特異的結合を検出するためのマトリックス上の遅延の程度に基づいて、閾値は、シグナルレベルが最も低いクローンを富化するように、例えば、結合した検出可能な標識の量が最も少ないか、またはマトリックス上の遅延の程度が最も低いクローンのパーセンテージ(例えば、50%、30%、25%、20%、15%、10%、または5%)を選択するように、設定されてもよい。収集の例示的な%は、言うまでもなくガイドラインでしかなく、オペレーターが本方法の原則を順守している限り、数値の正確さは重要ではない。
差異の定量化および測定
本発明の様々な方法には、例えば、提示レベル、結合、濃度(例えば、臨界濃度)、溶解限界などといった特性について、結合剤および/またはそれらのコード化クローンの特性を比較することが含まれる。方法には、集団内の他の結合剤と比較して(例えば、1つ以上の他のものと比較して、または集団平均(平均(mean))と比較して)良好な結合剤、および/またはそれらが由来する親分子と比べて1つ以上の特性が改善した結合剤を特定することが含まれてもよい。また、ベンチマーク結合剤に対して比較を行ってもよく、抗体の例では、これはNIST RM 8671抗体であってもよい(Saro D
et al,Developability Assessment of a proposed NIST monoclonal antibody37)。選択および改善のための望ましい特性は、本明細書の他箇所で考察されており、これらの特性には、より高い溶解度、より高い臨界濃度、より小さい非特異的結合、および/または標的に対するより高い親和性が含まれる。「より大きい」または「より少ない」、「より高いレベル」または「より低いレベル」、「より良好」または「より不良」、「より多い」または「より少ない」などの相対語は、一般に、結合剤またはクローンをそれらの特性に基づいて区別するのを可能にする、関連性のある実験的背景において観察される差を指す。差は統計的に有意であり得る。差は、任意選択で、少なくとも10%、少なくとも25%、または少なくとも50%の差など、%の観点で定量化されてもよい。あるいは、任意選択で、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、または少なくとも100倍など、倍数差が考慮され得る。
本発明の様々な方法には、例えば、提示レベル、結合、濃度(例えば、臨界濃度)、溶解限界などといった特性について、結合剤および/またはそれらのコード化クローンの特性を比較することが含まれる。方法には、集団内の他の結合剤と比較して(例えば、1つ以上の他のものと比較して、または集団平均(平均(mean))と比較して)良好な結合剤、および/またはそれらが由来する親分子と比べて1つ以上の特性が改善した結合剤を特定することが含まれてもよい。また、ベンチマーク結合剤に対して比較を行ってもよく、抗体の例では、これはNIST RM 8671抗体であってもよい(Saro D
et al,Developability Assessment of a proposed NIST monoclonal antibody37)。選択および改善のための望ましい特性は、本明細書の他箇所で考察されており、これらの特性には、より高い溶解度、より高い臨界濃度、より小さい非特異的結合、および/または標的に対するより高い親和性が含まれる。「より大きい」または「より少ない」、「より高いレベル」または「より低いレベル」、「より良好」または「より不良」、「より多い」または「より少ない」などの相対語は、一般に、結合剤またはクローンをそれらの特性に基づいて区別するのを可能にする、関連性のある実験的背景において観察される差を指す。差は統計的に有意であり得る。差は、任意選択で、少なくとも10%、少なくとも25%、または少なくとも50%の差など、%の観点で定量化されてもよい。あるいは、任意選択で、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、または少なくとも100倍など、倍数差が考慮され得る。
標的結合
結合剤は、任意選択で受容体、酵素などの別のポリペプチド、および/または腫瘍関連抗原などの疾患関連ポリペプチドであってもよい、目的の標的分子への結合について選択され得る。他の標的分子クラスには、核酸、炭水化物、脂質、および小分子が含まれる。例示的な結合剤および標的は、本明細書の他箇所で詳述する。古典的な例は抗体分子のライブラリであり、これを目的の標的抗原への結合についてスクリーニングしてもよい。他の例には、標的MHC:ペプチド複合体に対するTCRのライブラリのスクリーニング、または標的TCRに対するMHC:ペプチド複合体のライブラリのスクリーニングが含まれる。
結合剤は、任意選択で受容体、酵素などの別のポリペプチド、および/または腫瘍関連抗原などの疾患関連ポリペプチドであってもよい、目的の標的分子への結合について選択され得る。他の標的分子クラスには、核酸、炭水化物、脂質、および小分子が含まれる。例示的な結合剤および標的は、本明細書の他箇所で詳述する。古典的な例は抗体分子のライブラリであり、これを目的の標的抗原への結合についてスクリーニングしてもよい。他の例には、標的MHC:ペプチド複合体に対するTCRのライブラリのスクリーニング、または標的TCRに対するMHC:ペプチド複合体のライブラリのスクリーニングが含まれる。
標的を認識する結合剤(同種結合剤)をコードするクローンについての選択には、本明細書に記載のディスプレイライブラリを標的と接触させることにより、結合剤を標的に露出させて、同種結合剤(存在する場合)によるターゲットの認識を可能することと、標的が同種結合剤により認識されるかどうかを検出することとが含まれてもよい。その後、同種結合剤を表示する1つ以上のクローンを選択してもよい。
標的は可溶性形態で提供されてもよい。標的は、検出を容易にするために標識されてもよく、例えば、標識は、蛍光標識を保持してもよく、またはビオチン化されてもよい。標的特異的結合剤を発現する細胞は、直接または間接的に標識された標的分子を使用して特定されてもよく、ここでは、結合剤が標識された分子を捕捉する。例えば、結合剤:標的相互作用を介して、蛍光標識された標的に結合している細胞を、フローサイトメトリーによって検出および選別して、所望の細胞を単離することができる。サイトメトリーを伴う選択には、直接蛍光標識されているか、または二次試薬で検出できる分子で標識されている標的分子が必要となり、例えば、ビオチン化標的を細胞に加えて、ストレプトアビジン-フィコエリトリンなどの蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて細胞表面への結合を検出することができる。さらなる可能性は、磁気ビーズまたはアガロースビーズなどの固体表面上の標的に結合する標的分子または二次試薬を固定して、標的に結合する細胞の富化を可能にすることである。例えば、結合剤:標的相互作用を介してビオチン化標的に結合する細胞は、ストレプトアビジンでコーティングされた基質、例えばストレプトアビジンでコーティングされたビーズ上で単離することができる。磁気ビーズは、ビーズの磁気回収による、ビオチン化抗原に結合した細胞の捕捉に便利である。最適な標的濃度は、事前に決定されてもよく、または広範な濃度を使用し。バックグラウンド対照と比較することにより実験的に決定されてもよい。
標的への結合を選択する方法には、細胞を、細胞上の結合した標的のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別することが含まれ、それにより、所定の閾値を上回る結合した標的を有する細胞が収集画分に選別され、所定の閾値を下回る結合した標的を有する細胞が廃棄画分に選別される。閾値は、同種結合剤を表示しない陰性対照に対して設定されてもよい。FACSでは、典型的には、同種および非同種結合剤を表示する細胞を選別するときに、陰性対照のピークが観察される。閾値は、陰性対照よりも統計的に有意に高いレベルで蛍光を表示するすべての細胞が収集画分に選別されるように設定されてもよく、あるいは同種結合剤の選択および同種結合剤を表示するクローンのより優れた富化においてより優れた信頼度を達成するように、より高い閾値が選択されてもよい。結合剤の細胞表面提示の決定に関してすでに考察したように、細胞の試料を使用して較正を行い、好適な閾値を決定してもよい。非結合剤からの結合剤の富化を達成することができる。より高い親和性の結合剤を富化する方法は、本明細書の他箇所でさらに説明する。
標的に対する選択は、本発明の他の方法の前もしくは後の追加のステップとして組み込むか、またはその中に含めてもよい。溶解度または低特異性または最適なFcRn結合などの開発性の側面を改善するための開始ドメインの変異誘発による変異型のライブラリの構築は、一部のライブラリメンバーにおいて、標的への結合を損ない得る(例えば、接触
CDRの変異誘発が実行される場合)。例えば、結合剤提示レベルについて選択されたクローンは、その後、標的に対して選択されてもよい。表面提示レベルと標的結合とを同時決定することも、高い表面提示レベルで同種結合剤を表示しているクローンの同時選択を使用することにより可能である。そのような方法は、本明細書の他箇所に記載するように、結合剤提示レベルを決定するために検出可能な標識を組み込んだ薬剤の使用を含んでもよく、また結合剤を標的に露出させることをさらに含んでもよく、ここで、標的は、標的結合の検出を可能にするために、第2の検出可能な標識を組み込んだ第2の薬剤で標識される。蛍光標識を使用する場合には、FACSを使用して、細胞を結合剤の提示と標的認識との両方のために同時に選別してもよい。異なる波長で発光する標識を選択して、それらの異なるシグナルを区別できるようにしてもよい。
CDRの変異誘発が実行される場合)。例えば、結合剤提示レベルについて選択されたクローンは、その後、標的に対して選択されてもよい。表面提示レベルと標的結合とを同時決定することも、高い表面提示レベルで同種結合剤を表示しているクローンの同時選択を使用することにより可能である。そのような方法は、本明細書の他箇所に記載するように、結合剤提示レベルを決定するために検出可能な標識を組み込んだ薬剤の使用を含んでもよく、また結合剤を標的に露出させることをさらに含んでもよく、ここで、標的は、標的結合の検出を可能にするために、第2の検出可能な標識を組み込んだ第2の薬剤で標識される。蛍光標識を使用する場合には、FACSを使用して、細胞を結合剤の提示と標的認識との両方のために同時に選別してもよい。異なる波長で発光する標識を選択して、それらの異なるシグナルを区別できるようにしてもよい。
したがって、本発明の方法は、各々に異なる検出可能な標識を使用する、結合剤提示レベルおよび標的結合レベルの同時検出を含んでもよい。他の実施形態では、標的結合は、細胞上の結合剤提示レベルを決定することなく検出され、例えば、標識された標的を使用して結合剤を検出するステップは、結合剤の定常領域に結合する薬剤を使用して結合剤提示レベルを検出することを含まない。
同種結合剤による標的認識の検出後、同種結合剤をコードするDNAを含む選択されたクローンの細胞を回収してもよい。次に、結合剤をコードするDNAを特定し、増幅し、かつ/または単離形態で提供することで、標的を認識する結合剤をコードするDNAを得てもよい。
複数選択
複数選択を並行して実行する考えは、本明細書に記載の任意の2つ以上の特徴に基づいて細胞の共選別に拡張され得る。上記の議論において、細胞の同時共選択は、結合剤の表面提示レベルおよび結合剤による標的結合のレベルを同時に決定し、より高い表面提示を呈する同種結合剤を表示するクローンを共選択することによって行われる。本発明の他の方法も、並行して採用され得る。方法は、以下、
(i)表面提示レベル
(ii)非標的分子への非特異的結合のレベル
(iii)標的結合のレベル
(iv)FcRn結合のレベル、
のうちいずれか2つ以上を同時に決定することと、それに応じてクローンを共選択することと、を含むことができる。FACSは、並列選択が異なる波長で蛍光を発する複数の標識を使用して実行されることを可能にする。
複数選択を並行して実行する考えは、本明細書に記載の任意の2つ以上の特徴に基づいて細胞の共選別に拡張され得る。上記の議論において、細胞の同時共選択は、結合剤の表面提示レベルおよび結合剤による標的結合のレベルを同時に決定し、より高い表面提示を呈する同種結合剤を表示するクローンを共選択することによって行われる。本発明の他の方法も、並行して採用され得る。方法は、以下、
(i)表面提示レベル
(ii)非標的分子への非特異的結合のレベル
(iii)標的結合のレベル
(iv)FcRn結合のレベル、
のうちいずれか2つ以上を同時に決定することと、それに応じてクローンを共選択することと、を含むことができる。FACSは、並列選択が異なる波長で蛍光を発する複数の標識を使用して実行されることを可能にする。
利点と相乗効果は、複数のタイプの選択を直列または並列に実行することで、例えば、溶解度についての選択を非特異的結合に対する選択と組み合わせることによって得られることができる。ライブラリにおけるクローンの集団に適用される各選択は、その選択基準を満たす変異型を優先して進化圧を生成する(例えば、高い表面提示レベル)。単一のパラメータの繰り返された選択は、枯渇または消失するリスクがある他の品質(例えば、標的結合に対する親和性)を犠牲にして、この特徴(例えば、高い溶解度)への進化を駆動することができる31。このことは、例えば、溶解度を増加させる変異が親和性も低下させる際に発生し得る。選択方法の賢明な組み合わせは、複数の所望の特徴を有するポリペプチドを発現するクローンへの集団の進化を誘導し、ポリペプチド薬物の要求される要件の全範囲にわたって最適に(または少なくとも許容可能に)実行するポリペプチドの特定を可能にすることができる。
非特異的結合に対する選択は、増加した表面提示レベルについての選択の前または後に実行され得る。例えば、溶液中のそれらの溶解度および/もしくは自己会合に対する耐性
に従って結合剤を区別またはランク付けする方法、ならびに/または溶液中の自己会合に対するより高い溶解度および/もしくはより高い耐性を呈する結合剤について富化する方法を実行して選択されたクローンの集団をもたらし、次いで選択された集団を1つ以上の非ターゲット分子に結合する低い傾向を呈する結合剤を発現するクローンについてスクリーニングし、それにより非特異的結合も有する1つ以上のクローンを特定することができる。
に従って結合剤を区別またはランク付けする方法、ならびに/または溶液中の自己会合に対するより高い溶解度および/もしくはより高い耐性を呈する結合剤について富化する方法を実行して選択されたクローンの集団をもたらし、次いで選択された集団を1つ以上の非ターゲット分子に結合する低い傾向を呈する結合剤を発現するクローンについてスクリーニングし、それにより非特異的結合も有する1つ以上のクローンを特定することができる。
いくつかの実施形態では、非特異的結合についてのスクリーニングは、表面提示レベルについてのスクリーニングと同時に組み入れられ得る。例えば、(i)検出可能な標識(例えば、蛍光的に標識された抗Fc)を担持する、すべての提示された結合剤を結合するための薬剤、および(ii)(例えば、異なる蛍光波長の)異なる検出可能な標識を担持する1つ以上の非標的分子(例えば、非特異的結合が回避されるヘパリンまたは他の分子)への細胞の二重露出は、実行され得る。クローンの二重染色は、表面提示レベルおよび非特異的またはオフターゲット結合の両方に基づいてクローンが区別されることを可能にする。選別閾値は、より高い表面提示レベルおよび非標的分子へのより小さい結合を呈する細胞を収集するように設定され得る。このことは、選択されたクローンにおいて開発性の乏しい抗体を排除するか、または少なくともその有病率を低下させる。
同様に、非標的分子(例えば、ヘパリンまたは非特異的結合が回避される他の分子)への結合に対する選択は、本明細書に記載の方法におけるFcRn結合についての選択と組み合わされ得る。
いくつかの状況において、1つの特徴を選択すること(例えば、高いレベルの表面提示を選択すること)は、開発性のあるある特定の態様の連関する結果として、複数の有益な品質を有する結合剤について富化するであろう。例えば、いくつかのクローンは、細胞表面上の非標的分子(例えば、プロテオグリカン)と相互作用する多反応性結合剤を発現することができる-例えば、それらはヘパリンに非特異的に結合することができる。高等真核細胞ディスプレイ系では、結合剤発現細胞クローン自体は、同じまたは類似の非標的分子(例えば、細胞に内因性のプロテオグリカン)を発現することができ、結果として生じる効果は、表面表示された結合剤がそれが表示される細胞上の1つ以上の分子と非特異的に相互作用することである。このことは、結合剤が細胞内に内在化され、したがってより低いレベルの表面提示を呈することにつながり、その発現するクローンの選択解除をもたらすことができる。そのような場合において、結合剤のより高いレベルの表面提示を表示するクローンを選択することは、複数のフロントでより優れた開発性を有する結合剤を発現するクローン、例えば、より溶解度が高く非特異的結合の対象になりにくい両方である、について並行して富化または選択するであろう。
このことの別の例は、自己凝集についてのより低い傾向を有する結合剤を富化することにより、方法が、医薬品製剤において使用される場合に免疫原性凝縮物を形成する傾向があるそれらの結合剤を選択から除外することにより、インビボでより低い程度の免疫原性を示す結合剤の選択を促進することができることである。
このことに加えて、前述のように、並列選択のさらなる次元は、さらに標識された検出剤、例えば標識されたFcRn、標識された標的、他の標識された多反応性プローブを含むことにより組み込まれ得る。異なる標識(例えば、異なる波長のフルオロフォア)の範囲の迅速な利用可能性、およびマルチプレックス検出および選別を実行するFACS機械の能力は、そのような並列選択の設計に役立つことができる。
親和性選択
標的への結合剤の選択において、親和性に基づいて結合剤を選択できることはしばしば
有用であり、標的結合に対して高い親和性を有する結合剤を発現するクローンについて富化を可能にする。
標的への結合剤の選択において、親和性に基づいて結合剤を選択できることはしばしば
有用であり、標的結合に対して高い親和性を有する結合剤を発現するクローンについて富化を可能にする。
親和性は、一般的にKd、平衡解離定数として表現される。Kdは、結合剤とその標的との間(例えば、抗体とその抗原との間)の相互作用についての比率k(オフ)/k(オン)である。Kd値は結合剤の濃度に関し、Kd値がより低くなると(より低い濃度)結合剤の親和性がより高くなる。その標的を特異的に認識する結合剤は、その抗原を認識する抗体の様式で、同種結合剤として称され得る。同種結合剤による標的の認識は、望ましくは高親和性相互作用である。結合剤のKd:標的相互作用は、1μM未満、好ましくは10nM未満であり得る。
本発明の方法は、標的へのより高い親和性の結合剤をコードする(および提示する)細胞の集団を富化することを含むことができる。選択のストリンジェンシーは、親和性についての選択を駆動するために、結合剤が比較的低いコピー数で提示されている真核細胞を使用することにより、増強され得る。目的の標的に結合する結合剤を選択する方法は、各々が結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを採用することができ、結合剤は細胞表面に提示され、コードされた結合剤は活性の弱いプロモーターから発現されるか、および/または比較的低いコピー数で細胞表面に発現される。このことは、活性の弱いプロモーターから駆動される発現にからのものか、転写産物不安定性もしくは最適でないスプライシング、翻訳、表面への輸送、または細胞表面上の保持の結果としてであり得る。
高等真核細胞の高密度懸濁液の提示(例えば、107/mlの高レベルの表面提示(例えば、6×105結合部位/細胞は、比較的高濃度の抗体(この例では10nM)を提示する。その状況において、低濃度の抗原が選択のストリンジェンシー、例えば0.1nMを駆動しようとして使用された際でも、高濃度の抗体は高親和性クローンと低親和性クローンと間の相対的富化を限定して会合を駆動する(例8aおよび例8b)。1nM以下の結合剤の投入濃度が好ましいだろう。細胞密度がより低い場合でも、高密度の固定化された結合剤の存在における標的の再結合という潜在的な問題がある。この問題は、表面プラズモン共鳴などの表面ベースの親和性測定(BIAcoreマニュアル)において特によく認識され、文書化されている。したがって、コピー数は、例えば、細胞あたり100~100,000の範囲であり得る。好ましい実施形態では、コピー数は、細胞あたり約60,000以下、任意選択で細胞あたり約50,000以下、または細胞あたり約40,000以下である。検出を促進するために、コピー数は、細胞あたり少なくとも100、少なくとも1,000、または少なくとも10,000であり得る。したがって、コピー数は、例えば、細胞あたり1,000~60,000個の範囲であってもよい。結合剤の表面提示の文脈におけるコピー数およびコピー数を決定する方法は、本明細書の他の箇所で考察される。
ライブラリは標的に露出され(例えば、ライブラリの結合剤を発現する細胞の懸濁液に標的を添加することにより)、結合剤を標的と接触させ、したがって、存在する場合は同種結合剤による標的の認識を可能にする。同種結合剤を表示する細胞は、標的に結合される。限られた濃度の標的を使用することにより、より高い親和性の結合剤が標的によって優先的に結合される。標的を認識しないか、またはより低い親和性を有する標的を認識する結合剤を表示する細胞は、より高い親和性の結合剤を表示する細胞と比較して、標的に結合しないか、細胞あたりの標的のより少ない分子を表示するだろう。次いで、標的に結合した細胞は単離され、それにより、同種結合剤を提示する細胞について富化された細胞の集団を選択することができる。
選択手順は、選択のストリンジェンシーを次第に増加させ、より高い親和性のクローン
について富化の程度を増加させるために、標的の濃度を減少させることを使用して任意選択で繰り返され得る。高親和性結合剤についてのさらなる富化の前に、変異は、変異型を生成するために選択された集団の結合剤に導入され得る。派生ライブラリの生成は、本明細書の他の場所に記載される。
について富化の程度を増加させるために、標的の濃度を減少させることを使用して任意選択で繰り返され得る。高親和性結合剤についてのさらなる富化の前に、変異は、変異型を生成するために選択された集団の結合剤に導入され得る。派生ライブラリの生成は、本明細書の他の場所に記載される。
使用される標的の濃度は、方法により単離されることが求められている結合剤の相互作用のKd未満であり得る。
次いで、標的に対する所望の親和性を有する1つ以上のクローンは選択され、次いで任意選択でコードDNAは回収され、結合剤は本明細書の他の場所に記載されるように、個々に培養された組換え細胞から発現され得る。
細胞上の低レベルの表面提示を達成するために、結合剤遺伝子は低レベルで発現され得、例えば、活性の弱いプロモーターに動作可能に連結されるか、または転写産物不安定性もしくは最適でないスプライシング、翻訳、表面への輸送、もしくは細胞表面上の保持の結果としてであり得る。誘導性プロモーターおよび他の制御可能な発現系は、本明細書の他の場所に詳細に記載される。例えば、例8aまたは例8bを参照されたい。
ライブラリ
各々が結合剤をコードする組換えDNAを含む細胞クローンのコレクションは、一緒にライブラリを形成する。ライブラリの多様性は、クローンによってコードされた異なる結合剤の数の関数である。創薬において、すべての所望の基準を満たす結合剤を特定する可能性を最大化するために、大きく多様なライブラリを提供することは有利である。ライブラリの各クローンは、本明細書の他の場所に記載されるように、結合剤をコードするDNAを細胞DNAに組み入れて組換え細胞を形成することにより生成され得る。DNAは、各々が多様なレパートリーからの少なくとも1つの結合剤をコードする組換え細胞の集団を生成するために、並行して多くの細胞に導入され得る。ドナーDNAの細胞DNAへの組入れ後、結果として生じた組換え細胞は、それらの複製を可能にするために培養され、各最初に産生された組換え細胞から細胞のクローンを生成する。したがって、各クローンは、ドナーDNAが組み入れられた1つの元の細胞に由来する(例えば、部位特異的なヌクレアーゼによって、または本明細書に記載される他の方法によって創出される組入れ部位)。本発明に従うライブラリは、少なくとも100、103、104、105、106、107、108、109または1010個のクローンを含むことができる。
各々が結合剤をコードする組換えDNAを含む細胞クローンのコレクションは、一緒にライブラリを形成する。ライブラリの多様性は、クローンによってコードされた異なる結合剤の数の関数である。創薬において、すべての所望の基準を満たす結合剤を特定する可能性を最大化するために、大きく多様なライブラリを提供することは有利である。ライブラリの各クローンは、本明細書の他の場所に記載されるように、結合剤をコードするDNAを細胞DNAに組み入れて組換え細胞を形成することにより生成され得る。DNAは、各々が多様なレパートリーからの少なくとも1つの結合剤をコードする組換え細胞の集団を生成するために、並行して多くの細胞に導入され得る。ドナーDNAの細胞DNAへの組入れ後、結果として生じた組換え細胞は、それらの複製を可能にするために培養され、各最初に産生された組換え細胞から細胞のクローンを生成する。したがって、各クローンは、ドナーDNAが組み入れられた1つの元の細胞に由来する(例えば、部位特異的なヌクレアーゼによって、または本明細書に記載される他の方法によって創出される組入れ部位)。本発明に従うライブラリは、少なくとも100、103、104、105、106、107、108、109または1010個のクローンを含むことができる。
本発明に一致するライブラリは、以下の特徴のうちの1つ以上を有することができる。
多様性。ライブラリは、少なくとも100、103、104、105、106、107、108または109個の異なる結合剤をコードおよび/または発現することができる。様々な配列の結合剤がレパートリーを構成する。
多様性。ライブラリは、少なくとも100、103、104、105、106、107、108または109個の異なる結合剤をコードおよび/または発現することができる。様々な配列の結合剤がレパートリーを構成する。
均一な組入れ。ライブラリは、決まった遺伝子座で、または細胞DNAの限られた数の決まった遺伝子座で組み入れられたドナーDNAを含むクローンからなることができる。したがって、ライブラリにおける各クローンは、好ましくは決まった遺伝子座でまたは決まった遺伝子座のうちの少なくとも1つでドナーDNAを含む。好ましくは、クローンは、細胞DNAにおける1つまたは2つの決まった遺伝子座で組み入れられたドナーDNAを含む。本明細書の他の場所で説明されるように、組入れ部位は、部位特異的ヌクレアーゼに対する認識配列であり得る。組換えDNAを産生するためのドナーDNAの組入れは、本明細書の他の場所に詳細に記載され、組入れ部位の数に応じて異なる結果を生成できる。ライブラリを生成するために使用される細胞において単一の潜在的な組入れ部位がある場合、ライブラリは、単一の決まった遺伝子座に組み入れられたドナーDNAを含むクローンのライブラリであるだろう。したがって、ライブラリのすべてのクローンは、細胞
DNAにおける同じ位置で結合剤遺伝子を含む。あるいは、複数の潜在的な組入れ部位がある場合、ライブラリは、複数のおよび/または異なる決まった遺伝子座で組み入れられたドナーDNAを含むクローンのライブラリであり得る。好ましくは、ライブラリの各クローンは、第1および/または第2の決まった遺伝子座に組み入れられたドナーDNAを含む。例えば、ライブラリは、ドナーDNAが第1の決まった遺伝子座で組み入れられるクローン、ドナーDNAが第2の決まった遺伝子座で組み入れられるクローン、ならびにドナーDNAが第1および第2の決まった遺伝子座の両方で組み入れられるクローンを含むことができる。好ましい実施形態では、ライブラリにおけるクローンにおいて1つまたは2つの決まった遺伝子座しかないが、特定の用途のために望ましい場合、複数の遺伝子座でドナーDNAを組み入れることが可能である。したがって、いくつかのライブラリでは、各クローンは、いくつかの決まった遺伝子座、例えば3、4、5、または6つの決まった遺伝子座のうちの任意の1つ以上で組み入れられたドナーDNAを含むことができる。
DNAにおける同じ位置で結合剤遺伝子を含む。あるいは、複数の潜在的な組入れ部位がある場合、ライブラリは、複数のおよび/または異なる決まった遺伝子座で組み入れられたドナーDNAを含むクローンのライブラリであり得る。好ましくは、ライブラリの各クローンは、第1および/または第2の決まった遺伝子座に組み入れられたドナーDNAを含む。例えば、ライブラリは、ドナーDNAが第1の決まった遺伝子座で組み入れられるクローン、ドナーDNAが第2の決まった遺伝子座で組み入れられるクローン、ならびにドナーDNAが第1および第2の決まった遺伝子座の両方で組み入れられるクローンを含むことができる。好ましい実施形態では、ライブラリにおけるクローンにおいて1つまたは2つの決まった遺伝子座しかないが、特定の用途のために望ましい場合、複数の遺伝子座でドナーDNAを組み入れることが可能である。したがって、いくつかのライブラリでは、各クローンは、いくつかの決まった遺伝子座、例えば3、4、5、または6つの決まった遺伝子座のうちの任意の1つ以上で組み入れられたドナーDNAを含むことができる。
別個の部位で組み入れられた結合剤サブユニットを含むライブラリについて、ライブラリのクローンは、第1の決まった遺伝子座で組み入れられた第1の結合剤サブユニットをコードするDNAと、第2の決まった遺伝子座で組み入れられた第2の結合剤サブユニットをコードするDNAと、を含み、クローンは、第1および第2のサブユニットを含む多量体結合剤を発現する。
均一な転写。ライブラリの異なるクローン間の結合剤の転写の相対レベルは、制御された数の遺伝子座で、および異なるクローンにおける同じ遺伝子座(決まった遺伝子座)で組み入れられるドナーDNAにより、制御された限度内に保たれる。結合剤遺伝子の比較的均一な転写は、ライブラリにおけるクローン上またはクローンからの同等レベルの結合剤の発現につながる。ライブラリの細胞の表面上に表示される結合剤は、同じ細胞上に表示される他の結合剤と同一(同じアミノ酸配列を有する)であり得る。ライブラリは、各々が結合剤のレパートリーの単一のメンバーを表示する細胞のクローン、または細胞あたりの結合剤のレパートリーの複数のメンバーを表示するクローンからなることができる。あるいは、ライブラリは、結合剤のレパートリーの単一のメンバーを表示するいくつかのクローン、および結合剤のレパートリーの複数のメンバー(例えば、2つ)を表示するいくつかのクローンを含むことができる。好ましくは、ライブラリのクローンは、結合剤のレパートリーの1つまたは2つのメンバーを発現する。
例えば、本発明に従う真核細胞クローンのライブラリは、少なくとも103、104、105、106、107、108または109個の異なる結合剤のレパートリー、例えば、IgG、Fab、scFvまたはscFv-Fc抗体断片を発現することができる。各細胞は、細胞DNAに組み入れられたドナーDNAを含む。ドナーDNAは、結合剤をコードし、ドナーDNAが組み入れられる細胞の選択のための遺伝的要素をさらに含むことができる。ライブラリの細胞は、外因性の部位特異的ヌクレアーゼをコードするDNAを含むことができる。
ライブラリの細胞の表面上に表示される結合剤は、同じ細胞上に表示される他の結合剤と同一(同じアミノ酸配列を有する)であり得る。ライブラリは、各々が結合剤のレパートリーの単一のメンバーを表示する細胞のクローン、または細胞あたりの結合剤のレパートリーの複数のメンバーを表示するクローンからなることができる。あるいは、ライブラリは、結合剤のレパートリーの単一のメンバーを表示するいくつかのクローン、および結合剤のレパートリーの複数のメンバー(例えば、2つ)を表示するいくつかのクローンを含むことができる。したがって、本発明に従うライブラリは、結合剤のレパートリーの2つ以上のメンバーをコードするクローンを含むことができ、ドナーDNAは、重複した決まった遺伝子座または複数の独立した決まった遺伝子座で組み入れられる。
対応するクローンが1つの結合剤のみを発現する場合、結合剤について対応するコードDNAを特定することは最も簡単である。典型的には、ドナーDNAの分子は、単一の結合剤をコードするであろう。結合剤は、多量体であり得、ドナーDNAの分子は、多量体結合剤の様々なサブユニットに対応する複数の遺伝子またはオープンリーディングフレームを含む。
述べたように、本発明に従うライブラリは、少なくとも100、103、104、105または106、107、108、109または1010個の異なる結合剤をコードすることができる。結合剤が多量体である場合、多様性は、結合剤の1つ以上のサブユニットによって提供され得る。多量体結合剤は、1つ以上の可変サブユニットを1つ以上の定常サブユニットと組み合わせることができ、定常サブユニットは、ライブラリのすべてのクローンにわたって同じ(またはより限定された多様性)である。多量体結合剤のライブラリを生成する際に、結合剤サブユニットの第1のレパートリーが結合剤サブユニットの第2のレパートリーのいずれかと対合することができる組み合わせ多様性が可能である。
本発明に従うライブラリのこれらおよび他の特徴は、本明細書の他の場所でさらに説明され、適切なライブラリならびにそれらの構築および使用のための方法の例は、WO2015/166272(Iontas Limited)にも示され、その内容は、本明細書に参照により組み込まれる。適切な遺伝子座は、細胞染色体へのコード化DNAの標的化組入れのために特定され得、そしていくつかの例は、当該技術分野で既知である。AAVS遺伝子座は、本明細書に例示されるように使用され得る。他の適切な組入れ部位は、ROSA26、HPRTおよびFUT8遺伝子座(例えば、CHO細胞内)を含む。標的化された組入れは利点を有することができるが、ランダム組入れは、適切な代替手段であり、多くの状況で使用され得る。ヌクレアーゼ媒介性の標的化された組入れとは別に、表面発現ポリペプチドのライブラリを生成する方法は、真核細胞をポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトすること、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、もしくはトランズポゾンを使用すること、またはFlp、Bxb2リコンビナーゼ、もしくはphiリコンビナーゼ部位などの内因性の潜在的リコンビナーゼ部位のようなゲノム的に埋め込まれたリコンビナーゼ部位を使用することを含む。これらまたは任意の他の技法によって創出されたライブラリは、本明細書に記載の方法で使用され得る。本発明は、他の真核細胞の不在下でのライブラリクローンの集団としての純粋な形態、または他の真核細胞と混合されたいずれかのライブラリに拡張する。他の細胞は、同じタイプの真核細胞(例えば、同じ細胞株)または異なる細胞であり得る。さらなる利点は、スクリーニングを促進または拡大するためか、または本明細書に記載のもしくは当業者には明らかであろう他の用途のために、本発明に従う2つ以上のライブラリを組み合わせるか、または本発明に従うライブラリを第2のライブラリもしくは細胞の第2の集団と組み合わせることにより、得られることができる。
本発明に従うライブラリ、ライブラリから得られた1つ以上のクローン、またはライブラリからの結合剤をコードするDNAが導入されている宿主細胞は、細胞培養培地に提供され得る。細胞は、培養され、次いで濃縮されて便利な輸送または貯蔵のための細胞ペレットを形成することができる。
ライブラリは通常、インビトロで提供されるであろう。ライブラリは、培養培地に懸濁されたライブラリの細胞を含む細胞培養フラスコのような容器、またはライブラリを含む真核細胞のペレットまたは濃縮懸濁液を含む容器中にあり得る。ライブラリは、容器内の真核細胞の少なくとも75%、80%、85%または90%を構成することができる。選択ステップは、混合培養におけるライブラリで実行され得、したがって、ハイスループットを促進する。
ライブラリのクローンの混合物を共培養する代わりに、各々をそれら自体の別個のフラスコまたは他の容器において個々にクローンを培養することが便利な場合があり得る。個々の培養物は、例えば、親結合剤が1つ以上の変異型(例えば、最大10の変異体)を生成するために変異されており、本発明が親および/または相互に相対的な変異体の質を比較するために使用される場合などの、比較的少数のクローンが比較される場合に使用され得る。
本明細書に記載の選択方法は、ナイーブライブラリ、すなわち、親和性ベースの選択を受けていないライブラリに適用され得る。したがって、方法は、親和性ベースの選択を実行する前に、高い溶解度および/またはより低い非特異的結合を有するクローンについてのライブラリを富化する(逆に、低い溶解度および/またはより高い非特異的結合を呈するクローンにおいてライブラリを枯渇させる)ために使用され得る。次いで、より開発性のあるクローンについて「事前選択」されているそのようなライブラリは、目的の標的を使用して親和性ベースの選択を実行するのに非常に適している。親和性選択ステップにおいて得られたクローンは、開発性について事前スクリーニングされていないライブラリから選択されたクローンと比較して、良好な溶解度、高い臨界濃度、低い非特異的結合、および/または他の開発可能な質をより呈しそうである。
真核細胞
本発明に従う真核細胞は、好ましくは、12×106塩基対(bp)のゲノムサイズを有するSaccharomyces cerevisiaeのものよりも大きいゲノムを有する細胞として本明細書に定義される高等真核細胞である。高等真核細胞は、例えば、2×107塩基対よりも大きいゲノムサイズを有することができる。これは、例えば、哺乳動物、鳥類、昆虫または植物細胞を含む。本発明の真核細胞は、好ましくは、細胞壁を欠く。好ましくは、それらは、酵母細胞または他の真菌細胞ではない。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞、例えばマウスまたはヒトである。細胞は、初代細胞であり得るか、または細胞株であり得る。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、抗体およびタンパク質発現に一般的に使用されるが、本発明において、任意の代替の安定した細胞株は、使用され得る。HEK293細胞は、本明細書のいくつかの実施例において使用される。
本発明に従う真核細胞は、好ましくは、12×106塩基対(bp)のゲノムサイズを有するSaccharomyces cerevisiaeのものよりも大きいゲノムを有する細胞として本明細書に定義される高等真核細胞である。高等真核細胞は、例えば、2×107塩基対よりも大きいゲノムサイズを有することができる。これは、例えば、哺乳動物、鳥類、昆虫または植物細胞を含む。本発明の真核細胞は、好ましくは、細胞壁を欠く。好ましくは、それらは、酵母細胞または他の真菌細胞ではない。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞、例えばマウスまたはヒトである。細胞は、初代細胞であり得るか、または細胞株であり得る。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、抗体およびタンパク質発現に一般的に使用されるが、本発明において、任意の代替の安定した細胞株は、使用され得る。HEK293細胞は、本明細書のいくつかの実施例において使用される。
哺乳動物細胞などの高等真核生物を使用する結合剤のディスプレイは、研究、診断、および治療用途のための抗体の製造が、典型的にはこれらの細胞で行われるため、利点を有する。同じ発現環境および同じ翻訳後修飾を呈する哺乳動物細胞で創薬を実行することは、最適な発現特性を有するクローンの早期特定を可能にするダウンストリーム製造についての潜在的な問題または利益のよりよい指標を与えるであろう。対照的に、細菌および酵母細胞は、高等真核生物のグリコシル化、発現、および分泌機構を完全に再現しない。したがって、哺乳動物細胞でのディスプレイは、将来の研究の使用または下流の製造についての影響を有する、より良い提示レベルまたは安定性特性を有するクローンを特定するのに役立ち得る。哺乳動物細胞の表面上に抗体の大規模なライブラリを表示する能力は、抗体開発の発見段階中に製造細胞株を使用する可能性を有する結合および提示特性について、数百万のクローンを直接スクリーニングすることを可能にするであろう。
CHO細胞株は、1957年に最初に単離され63、この細胞株の派生物は、治療用抗体の大部分の生産細胞株となっている64。例えば、ハーセプチン(乳がんを治療するために承認された抗HER-2抗体)は、CHO細胞における発現により、年間1メトリックトン超生産される。CHO細胞は、ヒト細胞と比較して、それらがほとんどのヒト病原性ウイルスを増殖させないため、ヒトへの投与のための製品を製造するための利点を有する。加えて、それらはそれらのゲノムへの外来DNAの組入れを可能にし、迅速かつ頑健に成長する。生物物理学的特性、安定性薬物動態および免疫原性を含む抗体および他のポ
リペプチド結合剤の特性は、小胞体(ER)およびゴルジ体などの細胞の分泌経路内で獲得されるグリコシル化65などの翻訳後修飾によって影響され得る。ここでは、マンノース(Man)、ガラクトース(Gal)、フコース(Fuc)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、シアル酸などの単糖単位は、特定のアミノ酸に共有結合する。「O連結型」または「N連結型」グリコシル化は、セリンもしくはスレオニン残基の酸素原子に結合したグリカン、またはアスパラギン残基のアミド窒素原子に結合したグリカンのいずれかを指す。グリコシル化の複雑性は、線状または分岐のいずれかであるグリコシル化と、単糖単位内の様々な位置でのグリコシド結合(例えば、αまたはβ)の原子位置および立体構造によって導入され得る。抗体グリコシル化プロファイルの正確な性質は、発現のために使用される宿主細胞株によって影響され得る65。したがって、抗体および治療用タンパク質のスクリーニング中に、最終生産細胞株に可能な限り近い宿主細胞株において組換えタンパク質を生産することは、有利である。これにより、スクリーニングされるポリペプチドの翻訳後修飾、および、したがってそれらの特性が、それらの大規模製造中に取得されるであろうものと同一または可能な限り類似することが保証される。ヒト治療用抗体の大部分がCHO細胞で産生されるため、したがってCHO宿主細胞株において高等真核生物ディスプレイを実施することは有利。実施例12は、CHO細胞ライブラリにおける候補ポリペプチド薬物の開発性ベースの選択を実証する。
リペプチド結合剤の特性は、小胞体(ER)およびゴルジ体などの細胞の分泌経路内で獲得されるグリコシル化65などの翻訳後修飾によって影響され得る。ここでは、マンノース(Man)、ガラクトース(Gal)、フコース(Fuc)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、シアル酸などの単糖単位は、特定のアミノ酸に共有結合する。「O連結型」または「N連結型」グリコシル化は、セリンもしくはスレオニン残基の酸素原子に結合したグリカン、またはアスパラギン残基のアミド窒素原子に結合したグリカンのいずれかを指す。グリコシル化の複雑性は、線状または分岐のいずれかであるグリコシル化と、単糖単位内の様々な位置でのグリコシド結合(例えば、αまたはβ)の原子位置および立体構造によって導入され得る。抗体グリコシル化プロファイルの正確な性質は、発現のために使用される宿主細胞株によって影響され得る65。したがって、抗体および治療用タンパク質のスクリーニング中に、最終生産細胞株に可能な限り近い宿主細胞株において組換えタンパク質を生産することは、有利である。これにより、スクリーニングされるポリペプチドの翻訳後修飾、および、したがってそれらの特性が、それらの大規模製造中に取得されるであろうものと同一または可能な限り類似することが保証される。ヒト治療用抗体の大部分がCHO細胞で産生されるため、したがってCHO宿主細胞株において高等真核生物ディスプレイを実施することは有利。実施例12は、CHO細胞ライブラリにおける候補ポリペプチド薬物の開発性ベースの選択を実証する。
本発明の方法および使用において、一般に、複数の細胞クローンは、任意選択で、単一の容器内の同じ培養培地において一緒に培養された、少なくとも1000個のクローンのライブラリであり得る。それは、ナイーブライブラリ、すなわち、標的への結合するための選択を以前に受けていない結合剤のレパートリーをコードするものであり得る。このことは多くの場合、初期段階の発見における場合となるであろうが、標的への結合についての選択の1つ以上の以前のラウンドの結果である結合剤のレパートリーをコードするライブラリを使用することが望ましくあり得る。例えば、ファージディスプレイライブラリの選択出力は、真核細胞ライブラリに導入され得る。
本発明は哺乳動物細胞を特に参照して本明細書に記載され、哺乳動物細胞は、実施例において本発明を例示するために使用された。しかしながら、文脈が別途必要としない限り、他の高等真核細胞が代わりに使用され得ることが理解されるべきである。例えば、昆虫またはニワトリ細胞が、使用され得る。
結合剤
本発明に従う「結合剤」は、結合分子であり、別の分子の特異的結合パートナーを表す。特異的結合パートナーの典型的な例は、抗体-抗原および受容体-リガンドである。本発明の多くの原理は、酵素、補因子、凝固因子およびそれらの阻害剤、補体因子およびそれらの阻害剤など、古典的に「結合剤」とみなされ得ないポリペプチドに拡張する。多くの場合、そのようなポリペプチドは、大規模に生産することおよび/または高濃度で提供することが望ましい候補臨床薬物を表す。したがって、それらの開発性の質は、重要な検討事項である。例えば、第VIII因子は血友病において使用されるが、検討すべき開発性の問題を有する。開発性に関する本発明の態様は、すべてのそのようなポリペプチドに適用され得る。したがって、文脈が別途必要としない限り、本発明が、抗体のような古典的な特異的結合分子に限定されると解釈されるべきではなく、一般に、1つ以上の他の分子と相互作用するように設計されたポリペプチドに拡張すると理解されるべきである。
本発明に従う「結合剤」は、結合分子であり、別の分子の特異的結合パートナーを表す。特異的結合パートナーの典型的な例は、抗体-抗原および受容体-リガンドである。本発明の多くの原理は、酵素、補因子、凝固因子およびそれらの阻害剤、補体因子およびそれらの阻害剤など、古典的に「結合剤」とみなされ得ないポリペプチドに拡張する。多くの場合、そのようなポリペプチドは、大規模に生産することおよび/または高濃度で提供することが望ましい候補臨床薬物を表す。したがって、それらの開発性の質は、重要な検討事項である。例えば、第VIII因子は血友病において使用されるが、検討すべき開発性の問題を有する。開発性に関する本発明の態様は、すべてのそのようなポリペプチドに適用され得る。したがって、文脈が別途必要としない限り、本発明が、抗体のような古典的な特異的結合分子に限定されると解釈されるべきではなく、一般に、1つ以上の他の分子と相互作用するように設計されたポリペプチドに拡張すると理解されるべきである。
本発明は、細胞においてコードDNAから発現され、任意選択で、切断、グリコシル化などのような翻訳後修飾を受けるポリペプチド、すなわちアミノ酸のポリマーである結合剤に関する。結合剤は、およそ、例えば、10~30アミノ酸の短いペプチドを含むことができる。結合剤はまた、より長いポリペプチドであり得、任意選択で複数のサブユニッ
トを含むことができる。
トを含むことができる。
結合剤は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒト起源のポリペプチドを含む。結合剤は、ヒト抗体(任意選択で、ヒト抗体を含むキメラ抗原受容体(CAR))、ヒトTCRまたは他の受容体、または他のヒトポリペプチドを含むことができる。結合剤は、可溶性ペプチドまたはポリペプチド(例えば、サイトカイン、ケモカイン、補体タンパク質または補体調節因子、酵素(産業使用のための酵素を含む)、血液凝固因子、例えば第VIII因子)であり得る。結合剤は、哺乳動物(例えば、ヒト)膜タンパク質であり得、または1つ以上のTMドメインまたは他の膜アンカーを含むように操作された可溶性哺乳動物(例えば、ヒト)タンパク質/ペプチドであり得る。結合剤は、天然の天然型ポリペプチドであってもよく、または(頻繁に)合成変異型であろう。例えば、ヒト第VIII因子ポリペプチドのライブラリは、ヒト第VIII因子と少なくとも70%のアミノ酸配列同一性(例えば、少なくとも80%、または少なくとも90%)を有する結合剤を含むことができる。
ライブラリによってコードされた結合剤のレパートリーは、通常、共通の構造を共有し、1つ以上の多様性の領域を有するであろう。したがって、ライブラリは、ペプチドまたはscFv抗体分子などの分子の所望の構造クラスのメンバーの選択を可能にする。したがって、本発明に従う結合剤のライブラリまたは集団において、結合剤ポリペプチドは、共通の構造(例えば、任意選択で、非常に類似したまたは同一のアミノ酸配列の領域-「定常領域」を含む、関連する二次および/または三次構造)を共有し、アミノ酸配列多様性の1つ以上の領域-「可変領域」を有することができる。
このことは、抗体のレパートリーを検討することによって例示され得る。これらは、それらの配列の1つ以上の領域が異なる、共通の構造クラス、例えば、IgG、Fab、scFv-FcまたはscFvの抗体であり得る。抗体は、典型的には、主に抗原認識に関与する領域である相補性決定領域(CDR)において配列のばらつきを有する。本発明における結合剤のレパートリーは、1つ以上のCDRにおいて異なる抗体分子のレパートリーであり得、例えば、6つすべてのCDR、または重鎖CDR3および/もしくは軽鎖CDR3などの1つ以上の特定のCDRがあり得る。
抗体および他の結合剤は、本明細書の他の場所でより詳細に説明される。しかしながら、本発明の可能性は、抗体ディスプレイを超えて、受容体、リガンド、個々のタンパク質ドメインおよび代替タンパク質足場を含むペプチドまたは操作されたタンパク質のライブラリのディスプレイを含むように拡張する66~68。例は、DARPinおよびリポカリン、アフィボディ(affibody)およびアドヒロン(adhiron)などの単量体結合ドメインを有するポリペプチドである。本発明は、複雑な多量体結合剤とともにも使用され得る。例えば、T細胞受容体(TCR)はT細胞上で発現され、抗原提示細胞上のMHC分子と複合体で提示されるペプチドを認識するように進化している。TCRのレパートリーをコードおよび発現するライブラリは、生成され、MHCペプチド複合体への結合を特定するためにスクリーニングされ得る。
多量体結合剤について、結合剤をコードするドナーDNAは、1つ以上のDNA分子として提供され得る。例えば、個々の抗体のVHおよびVLドメインが別個に発現される場合、これらはドナーDNAの別個の分子上でコードされ得る。ドナーDNAは、複数の組入れ部位で細胞DNAに組み入れられ、すなわち、1つの遺伝子座でVHに対する結合遺伝子、および第2の遺伝子座でVLに対する結合遺伝子である。別個の結合剤サブユニットをコードするドナーDNAを導入する方法は、本明細書の他の場所および参照により本明細書に組み入れられるWO2015/166272(Iontas Limited)にさらに詳細に説明される。あるいは、多量体結合剤の両方のサブユニットまたは部分は
、決まった遺伝子座に組み入れるドナーDNAの同じ分子にコードされ得る。
、決まった遺伝子座に組み入れるドナーDNAの同じ分子にコードされ得る。
結合剤は、抗原結合部位を含む抗体または非抗体タンパク質であり得る。抗原結合部位は、フィブロネクチンやシトクロムBなどのような非抗体タンパク質足場上のペプチドループの配置の手段によって、またはタンパク質足場内のループのアミノ酸残基をランダム化または変異させることによって、所望の標的へ結合を付与するよう提供され得る。(Haan & Maggos(2004)BioCentury,12(5):A1-A669、70、抗体模倣体のタンパク質足場は、発明者が少なくとも1つのランダム化されたループを有するフィブロネクチンIII型ドメインを含むタンパク質(抗体模倣体)を説明するWO/0034784に開示される。1つ以上のペプチドループ、例えば、抗体VH CDRループのセットを移植するための好適な足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーによって提供され得る。足場は、ヒトまたは非ヒトタンパク質であり得る。
非抗体タンパク質足場における抗原結合部位の使用は、以前にレビューされている(Wess,L.In:BioCentury,The Bernstein Report
on BioBusiness,12(42),A1-A7,2004)。典型的なものは、安定した骨格および1つ以上の可変ループを有するタンパク質であり、アミノ酸配列のループまたはループが特異的またはランダムに変異して、標的抗原に結合することを示す抗原結合部位を創出する。そのようなタンパク質は、S.aureusからのプロテインAのIgG結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン(例えば、第10のフィブロネクチンIII型ドメイン)およびリポカリンを含む。他のアプローチは、例えば、「ノッチン」およびシクロチド足場に基づく小さな制約されたペプチドを含む71。特にジスルフィド結合の正しい形成に関連して小さなサイズおよび複雑性を考えると、これらの足場に基づく新規結合剤の選択のために真核細胞の使用は利点があり得る。これらのペプチドの一般的な機能を考えると、これらの足場に基づく結合剤のライブラリは、イオンチャネルとプロテアーゼをブロッキングする際に特定の用途を有する小さな高親和性結合剤を生成することに有利であり得る。WO2017/118761(Iontas Limited)は、各々がシステインリッチタンパク質のようなドナー多様性骨格ドメインを含む融合タンパク質を含み、抗体定常または可変ドメインなどのレシピエント多様性骨格ドメイン内に挿入された結合メンバーのライブラリを説明した。WO2017/118761に記載されるようなそのような結合剤およびライブラリは本発明において使用され得、文献は参照により本明細書に組み込まれる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に従う結合剤は、抗体可変ドメイン内に挿入されたシステインリッチタンパク質を含む「ノットボディ(knotbody)」である。本明細書の実施例15を参照されたい。
on BioBusiness,12(42),A1-A7,2004)。典型的なものは、安定した骨格および1つ以上の可変ループを有するタンパク質であり、アミノ酸配列のループまたはループが特異的またはランダムに変異して、標的抗原に結合することを示す抗原結合部位を創出する。そのようなタンパク質は、S.aureusからのプロテインAのIgG結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン(例えば、第10のフィブロネクチンIII型ドメイン)およびリポカリンを含む。他のアプローチは、例えば、「ノッチン」およびシクロチド足場に基づく小さな制約されたペプチドを含む71。特にジスルフィド結合の正しい形成に関連して小さなサイズおよび複雑性を考えると、これらの足場に基づく新規結合剤の選択のために真核細胞の使用は利点があり得る。これらのペプチドの一般的な機能を考えると、これらの足場に基づく結合剤のライブラリは、イオンチャネルとプロテアーゼをブロッキングする際に特定の用途を有する小さな高親和性結合剤を生成することに有利であり得る。WO2017/118761(Iontas Limited)は、各々がシステインリッチタンパク質のようなドナー多様性骨格ドメインを含む融合タンパク質を含み、抗体定常または可変ドメインなどのレシピエント多様性骨格ドメイン内に挿入された結合メンバーのライブラリを説明した。WO2017/118761に記載されるようなそのような結合剤およびライブラリは本発明において使用され得、文献は参照により本明細書に組み込まれる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明に従う結合剤は、抗体可変ドメイン内に挿入されたシステインリッチタンパク質を含む「ノットボディ(knotbody)」である。本明細書の実施例15を参照されたい。
抗体配列および/または抗原結合部位に加えて、結合剤は、他のアミノ酸を含むことができ、例えば、折り畳みドメインなどのペプチドまたはポリペプチドを形成するか、または抗原に結合する能力に加えて、別の機能的特徴を分子に付与する。結合剤は、検出可能な標識を担持することができるか、または毒素または標的化部分または酵素に(例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して)複合体化され得る。例えば、結合剤は、抗原結合部位と同様に触媒部位(例えば、酵素ドメインにおける)を含むことができ、抗原結合部位は、抗原に結合し、したがって、触媒部位を抗原に標的化させる。触媒部位は、例えば切断により、抗原の生物学的機能を阻害することができる。
任意選択で、ライブラリの結合剤は、熱安定性(例えば、融解温度によって決定される)が結合剤の溶解度または溶液中での自己会合に対する耐性を予測しないポリペプチドの集団である。熱安定性と溶液中の溶解度/自己会合に対する耐性との間のこの無相関は、少なくとも10mg/mlの溶解度または臨界濃度を有するライブラリにおけるすべての
結合剤を検討する際に適用することができる(本明細書の他の場所で説明されるいずれかを決定するための方法)。それは、少なくとも103、細胞あたり少なくとも104、細胞あたり少なくとも105、または細胞あたり少なくとも106個の表面提示を有するすべての結合剤を検討する際に適用することができる(本明細書の他の場所で説明されるいずれかを決定するための方法、例えば、FACSゲーティング)。任意選択で、それは、ライブラリにおける表面発現結合剤の総集団を検討する際に適用することができる。
結合剤を検討する際に適用することができる(本明細書の他の場所で説明されるいずれかを決定するための方法)。それは、少なくとも103、細胞あたり少なくとも104、細胞あたり少なくとも105、または細胞あたり少なくとも106個の表面提示を有するすべての結合剤を検討する際に適用することができる(本明細書の他の場所で説明されるいずれかを決定するための方法、例えば、FACSゲーティング)。任意選択で、それは、ライブラリにおける表面発現結合剤の総集団を検討する際に適用することができる。
抗体
抗体は、好ましい結合剤である。それらは、4つのポリペプチド鎖-2つの同一の重鎖および2つの同一の軽鎖を有する、抗体全体または免疫グロブリン(Ig)であり得る。重鎖および軽鎖はペアを形成し、各々が抗原結合部位を含むVH-VLドメインペアを有する。重鎖および軽鎖は、定常領域、軽鎖CL、ならびに重鎖CH1、CH2、CH3、および時にはCH4も含む。2つの重鎖は、柔軟なヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合されている。抗体分子は、VHおよび/またはVLドメインを含むことができる。
抗体は、好ましい結合剤である。それらは、4つのポリペプチド鎖-2つの同一の重鎖および2つの同一の軽鎖を有する、抗体全体または免疫グロブリン(Ig)であり得る。重鎖および軽鎖はペアを形成し、各々が抗原結合部位を含むVH-VLドメインペアを有する。重鎖および軽鎖は、定常領域、軽鎖CL、ならびに重鎖CH1、CH2、CH3、および時にはCH4も含む。2つの重鎖は、柔軟なヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合されている。抗体分子は、VHおよび/またはVLドメインを含むことができる。
抗体分子の最も一般的な天然形式は、2つの同一の重鎖と2つの同一の軽鎖からなるヘテロ四量体であるIgGである。重鎖および軽鎖は、単一のジスルフィド結合によって安定化された4本鎖逆平行ベータシートおよび3本鎖逆平行ベータシートからなる保存された二次構造を有するモジュラードメインで構成される。抗体重鎖は、各々N末端可変ドメイン(VH)および3つの比較的保存された「定常」免疫グロブリンドメイン(CH1、CH2、CH3)を有し、軽鎖は1つのN末端可変ドメイン(VL)および1つの定常ドメイン(CL)を有する。ジスルフィド結合は個々のドメインを安定化させ、共有結合を形成して安定した複合体において4つの鎖を結合する。軽鎖のVLとCLは重鎖のVHとCH1に会合し、これらの要素は単独で発現されてFab断片を形成することができる。CH2およびCH3ドメイン(「Fcドメイン」とも呼ばれる)は、別のCH2:CH3ペアと会合して、「Y」の先端で重鎖および軽鎖からの可変ドメインを有する四量体Y型分子を与える。CH2およびCH3ドメインは、エフェクター細胞との相互作用および免疫系内の補体構成要素に関与する。組換え抗体は、以前はIgG形式またはFabs(VH:CH1の二量体および軽鎖からなる)として発現されていた。追加的に、1本鎖Fv(scFv)と呼ばれる人工構築物は、使用され得柔軟なリンカーをコードするDNAと遺伝的に融合したVHおよびVL断片をコードするDNAからなる。
IgGは、治療用途のための抗体の好ましいクラスのうちの1つである。高等真核細胞、特に哺乳動物細胞を使用する利点は、IgG形式での抗体で研究できることである。このことは、創薬およびスクリーニングがIgG製造のために使用される生産細胞型において直接実施されることを可能にする。
結合剤は、ヒト抗体分子であり得る。したがって、定常ドメインが存在する場合、これらは好ましくはヒト定常ドメインである。
結合剤は、抗体断片または1本鎖抗体分子などのより小さな抗体分子形式であり得る。例えば、抗体分子は、リンカーペプチドによって結合されたVHドメインおよびVLドメインからなるscFv分子であり得る。scFv分子において、VHおよびVLドメインは、VHおよびVLの相補性決定領域が一緒に抗原結合部位を形成するVH-VLペアを形成する。
抗体抗原結合部位を含む他の抗体断片は、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFab断片、(ii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、(iii)単一の抗体のVLおよびVHドメインからなるFv断片、(iv)VHまたはVLドメインからなるdAb断片72~74、(v)単離されたCDR領域、(vi)2価の断片
が2つの連結されたFab断片を含むF(ab’)2断片(vii)VHドメインおよびVLドメインが2つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されるscFv75、76(viii)二重特異性1本鎖Fvダイマー(PCT/US92/09965)ならびに(ix)遺伝子融合物(WO94/13804、77)によって構築された多価または多重特異断片である二重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。Fv、scFv、または二重特異性抗体分子は、VHおよびVLドメインを連結するジスルフィド架橋を組み込むことによって安定化され得る78。
が2つの連結されたFab断片を含むF(ab’)2断片(vii)VHドメインおよびVLドメインが2つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されるscFv75、76(viii)二重特異性1本鎖Fvダイマー(PCT/US92/09965)ならびに(ix)遺伝子融合物(WO94/13804、77)によって構築された多価または多重特異断片である二重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。Fv、scFv、または二重特異性抗体分子は、VHおよびVLドメインを連結するジスルフィド架橋を組み込むことによって安定化され得る78。
例えばFab2、Fab3、二重特異性抗体、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)およびミニボディ(minibody)(小さな免疫タンパク質)を含む、1つ以上の抗体抗原結合部位を含む様々な他の抗体分子が操作されている。抗体分子およびそれらの構築および使用のための方法は、説明されている79。
結合フラグメントの他の例は、抗体ヒンジ領域からの1つ以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端で数個の残基の添加だけFab断片とは異なるFab’、および定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つFab’であるFab’-SHである。
dAb(ドメイン抗体)は、抗体の小さな単量体抗原結合断片、つまり抗体の重鎖または軽鎖の可変領域である。VH dAbは、ラクダ科(例えば、ラクダ、ラマ)において自然に発生し、ラクダ科を標的抗原で免疫化し、抗原特異的B細胞を単離し、個々のB細胞からdAb遺伝子を直接クローニングすることにより産生され得る。dAbは、細胞培養物においても産生可能である。それらの小さなサイズ、良好な溶解度および温度安定性は、それらを特に生理学的に有用で選択および親和性成熟に適するようにする。ラクダ科VH dAbは、「nanobodies(商標)」の名前で治療用のために開発されている。
合成抗体分子は、例えば、Knappik et al.またはKrebs et alにより説明されるように、好適な発現ベクター内で合成され組み立てられたオリゴヌクレオチドの手段により生成された遺伝子からの発現により創出され得る80、81。
二重特異性または二機能性抗体は、2つの異なる可変領域が同じ分子において組み合わされる第2世代のモノクローナル抗体を形成する63。それらの使用は、新しいエフェクター機能を動員する能力、または腫瘍細胞の表面上のいくつかの分子を標的化するそれらの能力から、診断分野および治療分野の両方において実証されている。二重特異性抗体が使用される場合、これらは、様々な方法で製造され得る、例えば、化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製される従来の二重特異性抗体であり得るか、または上記の二重特異性抗体断片のいずれかであり得る82。これらの抗体は、化学的方法83、84または体細胞方法85、86)によって、しかし同様に優先的に、ヘテロ二量体化(heterodimerisation)が強制されることを可能にし、したがって求められる抗体の精製のプロセスを促進する遺伝子工学技法によって得られる87。二重特異性抗体の例は、異なる特異性を有する2つの抗体の結合ドメインが使用されて短い柔軟なペプチドを介して直接され得るBiTE(商標)技術のものを含む。これは、短い単一のポリペプチド鎖上で2つの抗体を組み合わせる。二重特異性抗体およびscFvは、可変ドメインのみを使用し、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低減してFc領域なしで構築され得る。
本発明のいくつかの実施形態では、結合剤は二重特異性抗体であり、それらのコードクローンは2つの異なる抗体重鎖および任意選択で2つの異なる抗体軽鎖または好ましくは
共通の軽鎖を含む。成功した重鎖間のヘテロ二量体ペアリングは、二重特異性抗体の細胞表面提示をもたらし、各抗体は重鎖のヘテロ二量体ペアを含み、任意選択で、各重鎖は軽鎖、任意選択で、共通の軽鎖と対合する(すなわち、各重鎖とペアになった軽鎖は同じアミノ酸配列を有する)。Fc領域が含まれる場合、本発明は、ヘテロ二量体化を改善することができるFc配列変異型を評価するために使用され得る。Fc領域がヘテロ二量体化を改善するように操作されていた以前の研究では、開発性プロファイルは、変化によって損なわれた67。本発明は、それらのヘテロ二量化の可能性とともに、そのような変異型を開発性(例えば、溶解度および多重特異性)についてスクリーニングする機会を提供する。
共通の軽鎖を含む。成功した重鎖間のヘテロ二量体ペアリングは、二重特異性抗体の細胞表面提示をもたらし、各抗体は重鎖のヘテロ二量体ペアを含み、任意選択で、各重鎖は軽鎖、任意選択で、共通の軽鎖と対合する(すなわち、各重鎖とペアになった軽鎖は同じアミノ酸配列を有する)。Fc領域が含まれる場合、本発明は、ヘテロ二量体化を改善することができるFc配列変異型を評価するために使用され得る。Fc領域がヘテロ二量体化を改善するように操作されていた以前の研究では、開発性プロファイルは、変化によって損なわれた67。本発明は、それらのヘテロ二量化の可能性とともに、そのような変異型を開発性(例えば、溶解度および多重特異性)についてスクリーニングする機会を提供する。
二重特異性抗体は、IgG全体として、二重特異性Fab’2として、Fab’PEGとして、二重特異性抗体として、または他に二重特異性scFvとして構築され得る。さらに、2つの二重特異性抗体は、四価抗体を形成するために当該技術分野で既知の日常的な方法を使用して連結され得る。
二重特異性完全抗体(bispecific whole antibody)とは対照的に、二重特異性二重特異性抗体(bispecific diabody)は、特に有用でもあり得る。適切な結合特異性の二重特異性抗体(および抗体断片のような多くの他のポリペプチド)は、容易に選択され得る。二重特異性抗体の一方のアームが、例えば、目的の抗原に対して指向した特異性で一定に保たれる場合、他方のアームが変更されて適切な特異性の抗体が選択されるライブラリが作製され得る。二重特異性完全抗体は、Ridgeway et al.(Protein Eng.,9,616-621,(1996))に説明されるような代替的な工学的手法によって作製され得る。
二重特異性抗体の代替的な形式は、CH3のループ領域が抗原結合部位を提供するように操作されている免疫グロブリンを含むmAb2(「mAb二乗」)分子を含む(例えば、WO2006072620、WO2008003103、WO2008003116を参照されたい)。修飾されたCH3領域は、Fcabと称される。1つの結合特異性はFv領域の抗体抗原結合部位によって提供され、異なる結合特異性(またはさらなる原子価)はFcabにおける結合部位によって提供される。
本発明に従うライブラリは、目的の1つ以上の抗原に結合する抗体を選択するために使用され得る。ライブラリからの選択は、本明細書の他の場所で詳細に説明される。選択後、抗体は異なる形式へと設計され、および/または追加的な機能を含むように設計され得る。例えば、選択された抗体は、上に記載される抗体形式のうちの1つなどの異なる形式に変換され得る。選択された抗体、および選択された抗体分子のVHおよび/またはVL
CDRを含む抗体は、本発明の態様である。抗体およびそれらのコード核酸は、単離された形態で提供され得る。
CDRを含む抗体は、本発明の態様である。抗体およびそれらのコード核酸は、単離された形態で提供され得る。
抗体断片は、酵素、例えば、ペプシンまたはパパインによる消化などの方法により、および/または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断により、抗体分子から出発して得られることができる。別の様式では、抗体断片は、当業者に周知の遺伝的組換えの技術によって、または、他に、例えば、自動ペプチド合成機の手段によるペプチド合成によって、もしくは核酸合成および発現によって得られることができる。
モノクローナルおよび他の抗体を取り、組換えDNA技術の技法を使用して、標的抗原に結合する他の抗体またはキメラ分子を生成することが可能である。そのような技法は、抗体の免疫グロブリン可変領域、またはCDRをコードする核酸(例えば、DNA)を、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域とフレームワーク領域に導入することを伴うことができる。例えば、EP-A-184187、GB 2188638Aまたは
EP-A-239400、および多数のその後の文献を参照されたい。
EP-A-239400、および多数のその後の文献を参照されたい。
抗体分子は、ライブラリから選択され、次いで修飾され得、例えば、抗体分子のインビボ半減期は、化学的修飾、例えばPEG化により、またはリポソームへの取り込みにより増加され得る。
結合剤は、任意選択で、1つ以上の相補性決定領域において配列多様性を呈する抗体可変ドメインを含むことができる。結合剤はまた、またはあるいは、任意選択で配列多様性を呈する抗体定常領域またはFc領域を含むことができる。Fc領域の機能は、以下でさらに説明される。
FC領域
結合剤は、Fc領域を含むポリペプチドであり得る。結合剤は、Fc領域を含む、抗体、ノットボディまたは他のポリペプチド、任意選択で融合タンパク質であり得る。Fc領域は、結合剤の定常領域であり得るか、またはそれを含み得、すなわち、ライブラリの結合剤間で比較した場合、非常に類似したまたは同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの場合において、抗体の定常ドメイン(例えば、Fc領域、またはCLもしくはCH1ドメイン)は、可変アミノ酸配列であり得るか、またはそれを含むことができ、したがって、ライブラリにおける結合剤のレパートリーにわたって配列多様性を呈する。配列多様性は、任意選択で、FcのCH3ドメインにあり得る。例えば、結合剤は、Fcabの結合ループがライブラリにおいて多様であるFcabまたはmAb2を含むことができる。mAb2は、多様なFcab領域およびFv領域の非変異型(non-variant)または多様な抗原結合部位のいずれかを含むことができる。結合剤のアミノ酸配列の多様性は、Fc領域に制限され、任意選択でCH3ドメインに制限され得る。
結合剤は、Fc領域を含むポリペプチドであり得る。結合剤は、Fc領域を含む、抗体、ノットボディまたは他のポリペプチド、任意選択で融合タンパク質であり得る。Fc領域は、結合剤の定常領域であり得るか、またはそれを含み得、すなわち、ライブラリの結合剤間で比較した場合、非常に類似したまたは同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの場合において、抗体の定常ドメイン(例えば、Fc領域、またはCLもしくはCH1ドメイン)は、可変アミノ酸配列であり得るか、またはそれを含むことができ、したがって、ライブラリにおける結合剤のレパートリーにわたって配列多様性を呈する。配列多様性は、任意選択で、FcのCH3ドメインにあり得る。例えば、結合剤は、Fcabの結合ループがライブラリにおいて多様であるFcabまたはmAb2を含むことができる。mAb2は、多様なFcab領域およびFv領域の非変異型(non-variant)または多様な抗原結合部位のいずれかを含むことができる。結合剤のアミノ酸配列の多様性は、Fc領域に制限され、任意選択でCH3ドメインに制限され得る。
本発明のディスプレイライブラリを使用して、Fcドメインのライブラリは、改変された機能および開発性の基準について、任意選択で同時にスクリーニングされ得る。
様々な工学アプローチは、Fcドメインとその相互作用パートナーとの相互作用を操作するために取られている。例えば、「ノブイントゥホール(knobs into hole)」アプローチは、細胞からの共発現(または共培養細胞におけるそれらの発現)が主に2つの変異型Fcsドメイン間のヘテロ二量体形成をもたらすように2つの対合したFc配列を修飾し、このことは二重特異性抗体の生成において有利である。残念ながら、そのような変異は、開発性に対する影響を有することができる88。本発明は、開発性の可能性について、候補「ノブイントゥホール」変異を含むFcドメインを含むFc変異型を評価するために使用され得る。
Fcエンジニアリングは、Fcガンマ受容体との親和性または特異性を改変するため、例えば、低下したFcガンマ受容体相互作用で「ヌル変異型」を創出するためにも使用されている。抗体定常ドメインの変異と、所望の結合品質を有する変異型の選択は、安定性と製造性を低下させることができる。さらにまた、本発明は、変異型Fcドメインのライブラリを評価して、改善された特性を有するものについて富化するために使用され得る。
修飾は、半減期を正または負に修飾する目的で、FcのFcRnとの相互作用を増加または減少するためにもなされている89。例えば、M252Y/S254T/T256E(いわゆる「YTE変異」)の変異のトリプレットは、半減期を延長し、投与頻度とコストを低下させる増加したIgG半減期を有する。
Fcドメインへの変異の導入が、凝集および乏しい開発性の低下につながり、変異型の生物物理学的特性に対する有害な影響も有することが理解される。例えば、Borrok
et al(2017)90は、FcRnとの相互作用に影響する変異および他のFc受容体との相互作用に影響する変異をレビューする。彼らは、半減期を増加させる変異(M252Y、S254T、T256E、いわゆる「YTE変異」)を組み合わせた抗体およびCH2ドメインのFcガンマ受容体との相互作用を低下させる抗体(L234F、L235E、P331S、いわゆるTM変異体)90を組み合わせる抗体を説明する。野生型と比較して、このTM-YTE変異体は、低下した熱安定性、より高い立体構造柔軟性、増加した自己会合が増加し、より乏しい溶解度およびより乏しい凝集プロファイルを有した。候補変異を選択することにより、彼らは、延長した半減期ならびに抗体依存性細胞媒介性細胞毒性および補体依存性細胞毒性活性の欠乏を保持した一方で、有意に改善した立体構造およびコロイド安定性を有する新しいFQQ-YTE変異型(L234F/L235Q/K322Q/M252Y/S254T/T256E)を創出することができた。
et al(2017)90は、FcRnとの相互作用に影響する変異および他のFc受容体との相互作用に影響する変異をレビューする。彼らは、半減期を増加させる変異(M252Y、S254T、T256E、いわゆる「YTE変異」)を組み合わせた抗体およびCH2ドメインのFcガンマ受容体との相互作用を低下させる抗体(L234F、L235E、P331S、いわゆるTM変異体)90を組み合わせる抗体を説明する。野生型と比較して、このTM-YTE変異体は、低下した熱安定性、より高い立体構造柔軟性、増加した自己会合が増加し、より乏しい溶解度およびより乏しい凝集プロファイルを有した。候補変異を選択することにより、彼らは、延長した半減期ならびに抗体依存性細胞媒介性細胞毒性および補体依存性細胞毒性活性の欠乏を保持した一方で、有意に改善した立体構造およびコロイド安定性を有する新しいFQQ-YTE変異型(L234F/L235Q/K322Q/M252Y/S254T/T256E)を創出することができた。
本発明は、自己凝集または低い特異性などの開発性基準とともに、Fcドメインの改変された結合特性について多数の変異型を同時にスクリーニングする機会を提供する。したがって、本発明の様々な実施形態では、結合剤は、例えば、CH3ドメインの1つ以上のアミノ酸残基において、配列多様性を提示するFc領域を含むことができる。Fcドメイン外の1つ以上の可変領域(例えば、抗体重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメイン)において配列多様性を呈し、任意選択で不変配列の定常Fcドメインを有する結合剤は、スクリーニングされ得る。FcRn相互作用に対する可変領域配列の効果を特定するためにスクリーニングされ得る(実施例9を参照されたい)。そのような効果は、例えば、可変領域の受容体への直接結合を欠く場合、分子の立体構造に影響するか、さもなければより遠くの結合に影響する、間接的なものであり得る。
ポリペプチドのFcRn結合特性についてのスクリーニングは、創薬に組み入れられ得る。方法は、配列変異型のライブラリ内の最適なpH依存性FcRn相互作用について選択することを含むことができる。本明細書に記載されるのは、FcRnとのそれらの相互作用の性質に起因する延長または低下したインビボ半減期を有する結合剤を特定または選択する方法である。
本発明に従う方法は、
Fcドメインを含む結合剤をコードするDNAを各々が含む複数の真核細胞(例えば、哺乳動物)細胞クローンを提供することと、
細胞表面上に結合剤を提示するための条件下でインビトロでクローンを培養することと、
FcドメインによるFcRnの認識を可能にする低pH(例えば、約pH6.0)または中性pH(例えば、約pH7.4)でFcRn受容体にクローンを露出させることと、
より高いpH(例えば、約pH7.4)で溶出し、より高いpH(例えば、約pH7.4)での結合と比較して約pH6.0でより高い親和性結合を呈する結合剤を発現する1つ以上のクローンを選択することと、を含むことができる。
Fcドメインを含む結合剤をコードするDNAを各々が含む複数の真核細胞(例えば、哺乳動物)細胞クローンを提供することと、
細胞表面上に結合剤を提示するための条件下でインビトロでクローンを培養することと、
FcドメインによるFcRnの認識を可能にする低pH(例えば、約pH6.0)または中性pH(例えば、約pH7.4)でFcRn受容体にクローンを露出させることと、
より高いpH(例えば、約pH7.4)で溶出し、より高いpH(例えば、約pH7.4)での結合と比較して約pH6.0でより高い親和性結合を呈する結合剤を発現する1つ以上のクローンを選択することと、を含むことができる。
選択されたクローンは、溶出画分から得られることができる。溶出されたクローンの結合剤は、インビボでの延長した半減期を有するものとして特定され得る。
あるいは、より高いpHへの切り替え後に保持される結合剤は、例えば、低下した半減期のためまたは「掃引抗体」アプローチでの使用のために、より高いpHで保持された結合が望まれる場合に収集され得る32。そのような場合、方法は、
Fcドメインを含む結合剤をコードするDNAを各々が含む複数の真核細胞(例えば、哺乳動物)細胞クローンを提供することと、
細胞表面上に結合剤を提示するための条件下でインビトロでクローンを培養することと、
FcドメインによるFcRnの認識を可能にする低pH(例えば、約pH6.0)でFcRn受容体にクローンを露出させることと、
より高いpH(例えば、約pH7.4)で洗浄し、より高いpH(例えば、約pH7.4)での結合と比較して約pH6.0でより低いまたは類似の親和性結合を呈する結合剤を発現する1つ以上のクローンを選択することと、を含むことができる。
Fcドメインを含む結合剤をコードするDNAを各々が含む複数の真核細胞(例えば、哺乳動物)細胞クローンを提供することと、
細胞表面上に結合剤を提示するための条件下でインビトロでクローンを培養することと、
FcドメインによるFcRnの認識を可能にする低pH(例えば、約pH6.0)でFcRn受容体にクローンを露出させることと、
より高いpH(例えば、約pH7.4)で洗浄し、より高いpH(例えば、約pH7.4)での結合と比較して約pH6.0でより低いまたは類似の親和性結合を呈する結合剤を発現する1つ以上のクローンを選択することと、を含むことができる。
選択されたクローンは、より高いpHの洗浄では溶出されない保持された画分から得られることができる。そのようなクローンは、pH7.4超またはpH6未満のより極端なpHで溶出され得る。より低いpH(例えば、約pH6.0)でのより高い親和性結合は、選択中にそのpHで使用されるFcRnの濃度を低下させ、それにより選択のストリンジェンシーを増加させることによって選択され得る。
2つのpH間の親和性のより大きな差を呈する結合剤は、これらが最大半減期の延長を示すことができるため、優先的に選択され得る。逆に、より短い半減期が求められる場合、2つのpH間のFcRnに対する親和性のより小さい差がある(または有意差がない)結合剤を発現するクローンを選択するであろう。したがって、方法は、より短いまたはより長い半減期についていずれかを選択するように適合され得る。したがって、クローンの集団は、所望の半減期を有する結合剤を発現するクローンについて富化される。
ビオチン化FcRnへの結合は、結合が発生していることを確認するためにpH6.0で行われ得、溶出した試料は、増加するpHの緩衝液で洗浄した後収集され得る。あるいは、蛍光標識の保持または消失の選択は、フローソーティングを使用して行われ得る。pH勾配溶出法と組み合わせたFcRnベースのアフィニティクロマトグラフィー法は、抗体を特徴付けることについて説明されている91。そのような方法は、細胞上に表示された抗体変異型のライブラリとともに使用され得、そこでは、所望のpH依存性結合特性を有するクローンが収集され得、抗体遺伝子が回収され得る。
本発明のいくつかの実施形態は、結合剤の表面提示のレベルを決定するために抗Fc検出剤を使用する。そのような薬剤は、多様性が検出可能な薬剤の結合に影響しない限り、Fc配列の多様性を有する結合剤と関連して依然として使用され得、例えば、結合剤が共通の配列を共有するFcの領域に検出剤が結合することが保証され得る。代替的な実施形態では、結合剤は、配列多様性を呈しないFc領域を含む。
細胞培養および結合剤発現
目的の標的に対するスクリーニングおよび/または開発性の特徴のための結合剤のレパートリーを提供するために、ライブラリは、培養されてコードDNAから結合剤を発現することができる。議論されたように、結合剤は、膜貫通ドメイン、膜アンカーを含むことができるか、または細胞外ディスプレイのために膜結合パートナー分子と会合することができる。結合剤の発現のために細胞を培養することは、一般に、適切な培養培地において、任意選択で懸濁培養において、および細胞の増殖の助けになる温度(例えば、哺乳動物細胞については37℃)でインキュベートすることを伴うであろう。コードDNAからのポリペプチド結合剤の発現は、プロモーター(および任意選択でエンハンサーなどの他の要素)の制御下で開始され、結合剤の表面提示は、しばらくすると観察され始め、例えば、12時間以内に検出可能になるはずであるが、結合剤の提示が細胞表面上の最終濃度または平衡濃度に達するには、より長い期間(例えば、24時間または48時間)が必要とされ得る。
目的の標的に対するスクリーニングおよび/または開発性の特徴のための結合剤のレパートリーを提供するために、ライブラリは、培養されてコードDNAから結合剤を発現することができる。議論されたように、結合剤は、膜貫通ドメイン、膜アンカーを含むことができるか、または細胞外ディスプレイのために膜結合パートナー分子と会合することができる。結合剤の発現のために細胞を培養することは、一般に、適切な培養培地において、任意選択で懸濁培養において、および細胞の増殖の助けになる温度(例えば、哺乳動物細胞については37℃)でインキュベートすることを伴うであろう。コードDNAからのポリペプチド結合剤の発現は、プロモーター(および任意選択でエンハンサーなどの他の要素)の制御下で開始され、結合剤の表面提示は、しばらくすると観察され始め、例えば、12時間以内に検出可能になるはずであるが、結合剤の提示が細胞表面上の最終濃度または平衡濃度に達するには、より長い期間(例えば、24時間または48時間)が必要とされ得る。
プロモーター
本発明に従う細胞において、結合剤をコードするDNAは、発現のためのプロモーターに動作可能に連結されている。異種プロモーターは使用され得、これは、それが天然にコ
ードDNAと関連するプロモーターではないことを意味し、例えば、抗体をコードするDNAは、免疫グロブリンからのプロモーター以外のプロモーターに動作可能に連結され得る。プロモーターを細胞DNAに任意選択でシスで(結合剤をコードする配列と同じドナーDNAに)組み入れることは一般的に便利であるが、代替案は組み入れられた結合剤DNAを宿主細胞に内在するプロモーターから発現させることである。
本発明に従う細胞において、結合剤をコードするDNAは、発現のためのプロモーターに動作可能に連結されている。異種プロモーターは使用され得、これは、それが天然にコ
ードDNAと関連するプロモーターではないことを意味し、例えば、抗体をコードするDNAは、免疫グロブリンからのプロモーター以外のプロモーターに動作可能に連結され得る。プロモーターを細胞DNAに任意選択でシスで(結合剤をコードする配列と同じドナーDNAに)組み入れることは一般的に便利であるが、代替案は組み入れられた結合剤DNAを宿主細胞に内在するプロモーターから発現させることである。
結合剤をコードするDNAの発現が強力なプロモーター、例えば、発現が最大限に誘導されている構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある場合、高レベルの結合剤提示は、達成され得る。逆に、結合剤をコードするDNAの発現が活性の弱いプロモーター、例えば、発現が最小限に誘導されているか、または基礎レベルの活性のみを示す弱いプロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある場合、低レベルの結合剤提示は、達成され得る。プロモーターの強度は、レポーター遺伝子を使用して定量化され得、レポーターの発現、例えば、GFPの発現のレベルは、定量化され得る蛍光として検出され得る。活性の弱いまたは弱いプロモーターは、例えば、CMVプロモーターと比較して、例えば、活性が十分なまたは構成的プロモーターの活性の約1~10%を示すことができる。
結合剤の細胞表面提示を制御するための便利な方法は、細胞における結合剤コードDNAに動作可能に連結された誘導性プロモーターを提供することである。テトラサイクリン誘導性プロモーターは好適であり、これらの様々なものが利用可能である。Gossen
et al.は、第1世代のrtTAタンパク質を説明した(EP0804565およびGossen et al.,199592)。VP16活性化ドメインは、特定のDNA結合のためにある特定のテトラサイクリン(Tc)誘導体を必要とする転写トランス活性化因子「rtTA」を生成するために、Escherichia coliからの変異体Tetリプレッサーと融合された。ドキシサイクリンはこの系において誘導因子であり、遺伝子発現がrtTAの制御下にある培養細胞へのその添加は、誘導性プロモーターからの発現において1000倍の増加を受けることができる。pTightまたはPtet-14という名前の第2世代の「TetO/CMV」プロモーターは、最適化された7
TetO間隔と、低下した基本発現レベルを呈する切断された最小CMVプロモーターで設計された(Clontech:pTRE-Tight Vectors.Clontechniques 2003,18(3):13-14)。プロモーター配列は、以下のとおりである。
TTCGTCTTCACACGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTATCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCC
et al.は、第1世代のrtTAタンパク質を説明した(EP0804565およびGossen et al.,199592)。VP16活性化ドメインは、特定のDNA結合のためにある特定のテトラサイクリン(Tc)誘導体を必要とする転写トランス活性化因子「rtTA」を生成するために、Escherichia coliからの変異体Tetリプレッサーと融合された。ドキシサイクリンはこの系において誘導因子であり、遺伝子発現がrtTAの制御下にある培養細胞へのその添加は、誘導性プロモーターからの発現において1000倍の増加を受けることができる。pTightまたはPtet-14という名前の第2世代の「TetO/CMV」プロモーターは、最適化された7
TetO間隔と、低下した基本発現レベルを呈する切断された最小CMVプロモーターで設計された(Clontech:pTRE-Tight Vectors.Clontechniques 2003,18(3):13-14)。プロモーター配列は、以下のとおりである。
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この誘導性プロモーター、または様々な他の調節可能なプロモーターは、本発明において結合剤提示レベルを制御するために使用され得る。DNA結合ドメインが、タンパク質立体構造変化またはDNA認識配列に対する親和性の変化をもたらす誘導因子分子に結合することができるタンパク質ドメインに融合される場合、任意の誘導性系が採用され得る。このことは、タンパク質発現につながる転写の抑制解除または活性化のいずれかをもたらすであろう。例えば、T-Rexまたはクメート(cumate)スイッチ系の場合、誘導因子のリプレッサータンパク質への結合は、DNA結合の消失および転写の抑制解除をもたらす。あるいは、転写活性化ドメイン融合タンパク質に融合したDNA結合ドメイ
ンへの誘導因子の結合は、Tet-on92、114またはGAL4 GeneSwitch系121の場合のように、DNA結合および転写因子の動員をもたらすであろう。
ンへの誘導因子の結合は、Tet-on92、114またはGAL4 GeneSwitch系121の場合のように、DNA結合および転写因子の動員をもたらすであろう。
上記のテトラサイクリン誘導性プロモーター系は、1~6へのTetO反復配列の数の減少118によって、またはrTAタンパク質の修飾によってより調整可能な均一かつ滴定可能な誘導に変換可能であり得る。実施例8bは、改善された範囲の発現を達成した第3世代の誘導性tetプロモーター系を説明する。詳細は図37に例示される。代替的な誘導性発現系は、クメートスイッチ119、T-Rex120またはGAL4系121を含み採用もされ得る。
結合剤およびコード核酸の回収
ライブラリから目的の結合剤またはクローンの選択後、一般的な次のステップは、結合剤をコードする核酸(例えば、DNAまたはRNA)を単離、特定、および/または増幅することである。任意選択で、結合剤をコードする核酸を修飾すること、例えば、結合剤を再構築すること、および/またはコード配列を異なるベクターに挿入することが望ましくあり得る。表示された結合剤をコードする核酸(DNAまたはRNA)は、選択された細胞から回収され、発現ベクターにクローニングされ、コードされたポリペプチドは分泌形態でまたはディスプレイ用のいずれかで発現され得る。このことは、個々のクローンでなされ得る。
ライブラリから目的の結合剤またはクローンの選択後、一般的な次のステップは、結合剤をコードする核酸(例えば、DNAまたはRNA)を単離、特定、および/または増幅することである。任意選択で、結合剤をコードする核酸を修飾すること、例えば、結合剤を再構築すること、および/またはコード配列を異なるベクターに挿入することが望ましくあり得る。表示された結合剤をコードする核酸(DNAまたはRNA)は、選択された細胞から回収され、発現ベクターにクローニングされ、コードされたポリペプチドは分泌形態でまたはディスプレイ用のいずれかで発現され得る。このことは、個々のクローンでなされ得る。
ライブラリを創出するために使用されるドナーDNA分子の集団が同じ配列の複数のコピーを含む場合、同じ結合剤をコードするDNAを含む2つ以上のクローンが得られることができる。例えば、本明細書の他の箇所で詳述されるように、部位特異的ヌクレアーゼに対する2つ以上の認識配列がある場合、クローンが2つ以上の異なる結合剤をコードするドナーDNAを含むことができる場合もあり得る。したがって、コード化または発現された異なる結合剤の数の点で、ライブラリの多様性は、得られたクローンの数とは異なり得る。
ライブラリにおけるクローンは、好ましくは、結合剤のレパートリーの1つまたは2つのメンバーをコードするドナーDNAを含み、および/または好ましくは、結合剤のレパートリーの1つまたは2つのメンバーのみを発現する。細胞あたりの限定された数の異なる結合剤は、所与の標的に対してライブラリをスクリーニングする際に特定の特定された結合剤をコードするクローンおよび/またはDNAを特定することに関すると、有利である。このことは、クローンが結合剤のレパートリーの単一のメンバーをコードする際に最も簡単である。しかしながら、ライブラリから選択されたクローンが少数の異なる結合剤をコードする、例えば、クローンが結合剤のレパートリーの2つのメンバーをコードできる場合、所望の結合剤に関連するコードDNAを特定することも簡単である。本明細書の他の箇所で議論されるように、1つまたは2つの結合剤をコードするクローンは、2倍体細胞が重複した固定遺伝子座を各染色体コピーに1つずつ含むため、2倍体ゲノムにおいて染色体コピーあたり1回発生する部位特異的ヌクレアーゼに対する認識配列を選択することによって生成するのに特に便利であり、ドナーDNAは、一方または両方の固定遺伝子座で組み入れることができる。したがって、ライブラリのクローンは、各々、結合剤のレパートリーの1つまたは2つのメンバーのみを発現することができる。
結合剤が抗体分子である場合、方法は、抗体分子をコードするDNAをクローンの細胞から単離することと、少なくとも1つの抗体可変領域、好ましくはVHおよびVLドメインの両方をコードするDNAを増幅することと、および抗体分子をコードするベクターを提供するためにDNAをベクターに挿入することと、を含むことができる。定常ドメインを持つ多量体抗体分子は、可溶性分泌形式での発現のために1本鎖抗体分子に変換され得る。抗体は様々な形式で提示され得るが、抗体が選択された形式が何であれ、抗体遺伝子
が単離されると、それをいくつかの異なる形式で再構成することが可能である。VHまたはVLドメインが単離されると、それらは必要なパートナードメインを包含する発現ベクターに再クローニングされ得る。
が単離されると、それをいくつかの異なる形式で再構成することが可能である。VHまたはVLドメインが単離されると、それらは必要なパートナードメインを包含する発現ベクターに再クローニングされ得る。
選択された結合剤をコードするDNAは、発現のために宿主細胞染色体に組み入れられ得る。組換えタンパク質の発現は、典型的には、その細胞で発現されるプロモーターの制御下で所望のタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入することを伴う。例えば、遺伝子は、サイトメガロウイルスエンハンサー/プロモーターの制御下にあり得、一般的に使用されるヒト胚性腎臓293(HEK293)細胞またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳動物細胞に導入され得る。発現構築物を宿主細胞に導入するための標準的な方法は、周知である。分泌された可溶性タンパク質の産生のために、コードされた遺伝子の前に、コードされたタンパク質を小胞体に導くリーダー配列が続く。膜貫通ドメインが存在しない場合、コードされた遺伝子は、それが精製および濃縮され得る培養培地に分泌される。
本発明の任意の方法に従って、例えば、結合剤の発現のために安定的にトランスフェクトされた宿主細胞からの分泌後に、所望の結合剤は、溶液中で単離された形態で提供され得る。次いで、可溶性結合剤の特性は、その性能を確認するため、例えば、溶解度、自己会合、非特異的結合、FcRn相互作用などのような開発性特性を評価するため、または親和性を評価するため、試験され得る。これらの特徴の各々を決定するための適切なアッセイは、この文書の関連セクションに提供され、結合剤が所望の特性を呈する、および/または関連特徴の改善を示すこと、例えば、それが親分子と比較して改善されることを確認するために実行され得る。
結合剤の医薬製剤
本発明の方法を使用して得られた結合剤は、精製および/または単離された形態で提供され得、1つ以上の追加的な構成要素を含む組成物に製剤化され得る。組成物は、好適な担体、賦形剤、および改善された移動、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる他の薬剤を含むことができる。例示的な製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesに記載される。インビボでの使用を意図される結合剤は、例えば注射用の液体(任意選択で、水溶液)において、患者への所望の投与経路のために製剤化され得る。様々な送達系が既知であり、結合剤を含む医薬組成物を投与するために使用され得る。投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含む。組成物は、注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚ライニング(例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など)を通じた吸収によって、任意の便利な経路によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与され得る。投与は全身的または局所的であり得る。
本発明の方法を使用して得られた結合剤は、精製および/または単離された形態で提供され得、1つ以上の追加的な構成要素を含む組成物に製剤化され得る。組成物は、好適な担体、賦形剤、および改善された移動、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる他の薬剤を含むことができる。例示的な製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesに記載される。インビボでの使用を意図される結合剤は、例えば注射用の液体(任意選択で、水溶液)において、患者への所望の投与経路のために製剤化され得る。様々な送達系が既知であり、結合剤を含む医薬組成物を投与するために使用され得る。投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含む。組成物は、注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚ライニング(例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など)を通じた吸収によって、任意の便利な経路によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与され得る。投与は全身的または局所的であり得る。
結合剤、またはそれを含む組成物は、薬瓶、注射器、静脈内容器または注射装置などの医療用容器に含まれ得る。実施例では、治療法における使用のための結合剤、パッケージングおよび説明書を含むキットが提供される。方法は、患者への皮下投与を含むことができる。
結合剤は、少なくとも(またはそれを超える)、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/mlまたは100mg/mlの濃度で結合剤を含む組成物、任意選択で、水性緩衝溶液に製剤化され得る。結合剤は、50~200mg/ml、例えば、50~150mg/ml、例えば、50~100mg/mlの濃度であり得る。
発現された組換えタンパク質を濃縮するための多くの方法は、当業者に既知であるが、
カラムクロマトグラフィー(例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー)および限外濾過27を含むことができる。
カラムクロマトグラフィー(例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー)および限外濾過27を含むことができる。
項
以下の番号付けされた項は、発明の陳述を表し、説明の部分である。
以下の番号付けされた項は、発明の陳述を表し、説明の部分である。
1.インビトロでの培養高等真核細胞上の結合剤の表面提示レベルを、溶液中の結合剤の溶解度および/またはそれらの自己会合に対する耐性の予測指標として使用すること。
2.培養細胞が、結合剤の多様なレパートリーを発現するディスプレイライブラリのクローンである、項1に記載の使用。
3.溶液中のより高い溶解度および/または自己会合のより低い傾向について結合剤をインビトロで選択するための高等真核細胞の培養ライブラリの使用であって、
ライブラリが、各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリであり、コードされた結合剤が、細胞表面に提示される、使用。
ライブラリが、各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリであり、コードされた結合剤が、細胞表面に提示される、使用。
4.ディスプレイライブラリの培養高等真核細胞クローンの表面における結合剤の表面提示レベルが、溶液中の結合剤および/または自己会合に対するそれらの耐性の予測指標として使用される、結合剤発見方法。
5.結合剤を、それらの溶液中の溶解度および/または自己会合に対する耐性に従って区別およびランク付けし、溶液中でより高い溶解度および/または自己会合に対するより高い耐性を呈する結合剤を富化する方法であって、
(i)各々が結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
(ii)結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをインビトロで培養することと、
(iii)クローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
(iv)他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する1つ以上のクローンを選択することと、
(v)1つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、溶液中の溶解度および/または自己会合に対する耐性が良好であるものとして特定することと、任意選択で、選択されたクローンを、1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するために提供することと、を含む、方法。
(i)各々が結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
(ii)結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをインビトロで培養することと、
(iii)クローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
(iv)他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する1つ以上のクローンを選択することと、
(v)1つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、溶液中の溶解度および/または自己会合に対する耐性が良好であるものとして特定することと、任意選択で、選択されたクローンを、1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するために提供することと、を含む、方法。
6.結合剤が膜貫通ドメイン含有ポリペプチドである、項1~3のいずれかに記載の使用、または項4もしくは項5に記載の方法。
7.クローン上での結合剤の表面提示レベルを、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することを含み、薬剤が結合剤の定常領域に結合し、任意選択で、結合剤がFc領域を含み、薬剤がFc領域に結合する、項4または項5に記載の方法。
8.細胞を、細胞上の結合剤の表面提示のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別し、それにより、所定の閾値を上回る表面提示を示す細胞が収集画分に選別され、所定の閾値を下回る表面提示を示す細胞が廃棄画分に選別される、項4~7のいずれかに記載の方法。
9.廃棄画分が、少なくとも10mg/mlの臨界濃度を有する比較ポリペプチドを発現する細胞を含み、収集画分が、廃棄画分中の比較ポリペプチドよりも少なくとも1.5倍高い臨界濃度を有する結合剤を発現する細胞を含む、項8に記載の方法。
10.選別が蛍光活性化細胞選別機(FACS)により行われる、項8または項9に記載の方法。
11.ステップ(ii)が、ライブラリのクローンを1つの容器内で混合物として培養することを含む、項4~10のいずれかに記載の方法。
12.ステップ(ii)が、ライブラリの各クローンを別個の容器内で培養することを含む、項4~10のいずれかに記載の方法。
13.結合剤が親結合剤の配列変異型である、項4~12のいずれかに記載の方法。
14.親結合剤が、溶液中の溶解度または自己会合に対する耐性の改善が必要であると特定されている、項13に記載の方法。
15.方法が、親結合剤の配列変異型を生成することと、配列変異型をコードするDNAを高等真核細胞の細胞DNAに組み入れて、結合剤をコードするDNAを含む細胞クローンのライブラリを提供することと、を含み、
任意選択で、方法が、親のポリペプチド配列を分析することと、自己会合を促進し、かつ/または溶解度を低下させることが予測される1つ以上のアミノ酸残基を特定することと、1つ以上のアミノ酸残基において変異を生成することと、を含む、項13または項14に記載の方法。
任意選択で、方法が、親のポリペプチド配列を分析することと、自己会合を促進し、かつ/または溶解度を低下させることが予測される1つ以上のアミノ酸残基を特定することと、1つ以上のアミノ酸残基において変異を生成することと、を含む、項13または項14に記載の方法。
16.親結合剤が、リン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)中50mg/ml未満の臨界濃度を有し、かつ/またはリン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)中50mg/ml未満の溶解限度を有し、
かつ/または方法が、1つ以上の選択されたクローンによりコードされた結合剤を、親結合剤のものよりも少なくとも1.5倍高い臨界濃度および/もしくは溶解限度を有すると特定することを含む、項13~15のいずれかに記載の方法。
かつ/または方法が、1つ以上の選択されたクローンによりコードされた結合剤を、親結合剤のものよりも少なくとも1.5倍高い臨界濃度および/もしくは溶解限度を有すると特定することを含む、項13~15のいずれかに記載の方法。
17.結合剤の親水性を、細胞クローン上のそれらの表面提示レベルに基づいて予測すること、および/または1つ以上の選択されたクローンの結合剤を、より親水性であると特定することを含む、項4~16のいずれかに記載の方法。
18.結合剤を示す高等真核細胞のライブラリをスクリーニングして、インビボで哺乳動物において1つ以上の非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現する細胞についてライブラリを富化するインビトロの方法であって、
(i)各々が結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
(ii)結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをインビトロで培養することと、
(iii)結合剤を1つ以上の非標的分子に露出させて、結合剤と1つ以上の非標的分子との結合を可能にすることと、
(iv)1つ以上の非標的分子への結合がより大きい細胞を廃棄することと、
(v)1つ以上の非標的分子への結合が小さい細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための選択された集団を提供することと、を含む、方法。
(i)各々が結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
(ii)結合剤が細胞表面に提示される、結合剤の発現のための条件下で、クローンをインビトロで培養することと、
(iii)結合剤を1つ以上の非標的分子に露出させて、結合剤と1つ以上の非標的分子との結合を可能にすることと、
(iv)1つ以上の非標的分子への結合がより大きい細胞を廃棄することと、
(v)1つ以上の非標的分子への結合が小さい細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための選択された集団を提供することと、を含む、方法。
19.(iii)結合剤を、1つ以上の非標的分子を含むマトリックスに露出させて、マトリックスへの結合を可能にすることと、
(iv)マトリックスへの結合がより大きい細胞を廃棄することと、
(v)マトリックスへの結合が小さい細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための選択された集団を提供することと、を含む、項18に記載の方法。
(iv)マトリックスへの結合がより大きい細胞を廃棄することと、
(v)マトリックスへの結合が小さい細胞を選択し、非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための選択された集団を提供することと、を含む、項18に記載の方法。
20.非標的分子が、DNA、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、シャンペロンタンパク質、ヒアルロン酸、またはグリコカリックスの1つ以上の構成要素を含む、項18または項19に記載の方法。
21.非標的分子への結合が、低親和性非特異的結合である、項18~20のいずれかに記載の方法。
22.ライブラリのクローンを1つの容器内の混合物として培養し、混合物をマトリックスに露出させることを含む、項18~21のいずれかに記載の方法。
23.ライブラリの各クローンを別個の容器内で培養することを含む、項18~21のいずれかに記載の方法。
24.結合剤が親結合剤の配列変異型である、項18~23のいずれかに記載の方法。
25.親結合剤が、1つ以上の非標的分子への結合の減少を必要とすると特定されている、項24に記載の方法。
26.方法が、親結合剤の配列変異型を生成することと、配列変異型をコードするDNAを高等真核細胞の細胞DNAに組み入れて、結合剤をコードするDNAを含む細胞クローンのライブラリを提供することと、を含み、
任意選択で、方法が、親のポリペプチド配列を分析することと、非特異的結合を促進することが予測される1つ以上のアミノ酸残基を特定することと、1つ以上のアミノ酸残基において変異を生成することと、を含む、項24または項25に記載の方法。
任意選択で、方法が、親のポリペプチド配列を分析することと、非特異的結合を促進することが予測される1つ以上のアミノ酸残基を特定することと、1つ以上のアミノ酸残基において変異を生成することと、を含む、項24または項25に記載の方法。
27.親結合剤が、1つ以上の非標的分子への顕著な結合を呈する、項24~26のいずれかに記載の方法。
28.(iii)結合剤を、1つ以上の非標的分子を提示する細胞またはビーズに露出させることを含む、項18~27のいずれかに記載の方法。
29.結合剤発現細胞と1つ以上の非標的分子を提示する細胞またはビーズとの相互作用を検出することを含む、項28に記載の方法。
30.AC-SINSを使用して粒子間距離を検出し、より大きい粒子間距離を呈する細胞により提示される結合剤を選択することを含む、項29に記載の方法。
31.1つ以上の非標的分子が検出可能に標識される、項18に記載の方法。
32.1つ以上の非標的分子が蛍光標識される、項31に記載の方法。
33.細胞を、1つ以上の非標的分子への結合レベルに従って、FACSにより収集画分と廃棄とに流動選別し、それにより、所定の閾値を上回る標識された非標的分子からの蛍光を示す細胞が収集画分に選別され、所定の閾値を下回る標識された非標的分子からの蛍光を示す細胞が廃棄画分に選別される、項32に記載の方法。
34.結合剤をコードするDNAの発現が、強力なプロモーターの制御下にある、項4~33のいずれかに記載の方法。
35.プロモーターが構成的プロモーターである、項34に記載の方法。
36.プロモーターがCMVプロモーターである、項35に記載の方法。
37.プロモーターが、発現が最大限に誘導された誘導性プロモーターである、項34に記載の方法。
38.項5~17のいずれかに記載の方法を後に行うことをさらに含む、項18~37のいずれかに記載の方法。
39.項5~17のいずれかに記載の方法を最初に行うことをさらに含む、項18~37のいずれかに記載の方法。
40.標的に1つ以上の結合剤を選択する方法であって、
項5~39のいずれかに定義の方法を行うことを含み、
同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞が標的に結合した状態にするために、結合剤を標的に露出させることと、
同種結合剤を示す1つ以上のクローンを選択することと、をさらに含む、方法。
項5~39のいずれかに定義の方法を行うことを含み、
同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞が標的に結合した状態にするために、結合剤を標的に露出させることと、
同種結合剤を示す1つ以上のクローンを選択することと、をさらに含む、方法。
41.(i)結合剤の表面提示レベルと結合剤による標的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して表面提示がより高い同種結合剤を示すクローンを同時選択すること、または
(ii)結合剤の表面提示レベルと非標的分子への非特異的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して、表面提示がより高く、非特異的結合がより小さい結合剤を示すクローンを同時選択すること、または
(iii)標的結合のレベルと結合剤による非標的分子への非特異的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して非特異的結合がより小さい同種結合剤を示すクローンを同時選択すること、を含む、項1~40のいずれかに記載の方法。
(ii)結合剤の表面提示レベルと非標的分子への非特異的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して、表面提示がより高く、非特異的結合がより小さい結合剤を示すクローンを同時選択すること、または
(iii)標的結合のレベルと結合剤による非標的分子への非特異的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して非特異的結合がより小さい同種結合剤を示すクローンを同時選択すること、を含む、項1~40のいずれかに記載の方法。
42.所望の親和性を有する標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
(a)各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのインビトロのライブラリを提供することであって、結合剤が細胞表面に提示され、コードされた結合剤が、活性の弱いプロモーターから発現され、かつ/または細胞あたり100~60,000個の範囲のコピー数で細胞表面に発現される、提供することと、
(b)同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にするために、ライブラリを標的に露出させることと、
(c)標的に結合した細胞を単離して、同種結合剤を示す細胞が富化された、選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
(d)選択された細胞の集団を標的における1回以上の選択に露出させることであって、
任意選択で、標的の濃度を低下させて選択の厳密性を増加させる、露出させることと、任意選択で
(e)標的に対する所望の親和性を有する同種結合剤を示す1つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
(a)各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのインビトロのライブラリを提供することであって、結合剤が細胞表面に提示され、コードされた結合剤が、活性の弱いプロモーターから発現され、かつ/または細胞あたり100~60,000個の範囲のコピー数で細胞表面に発現される、提供することと、
(b)同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にするために、ライブラリを標的に露出させることと、
(c)標的に結合した細胞を単離して、同種結合剤を示す細胞が富化された、選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
(d)選択された細胞の集団を標的における1回以上の選択に露出させることであって、
任意選択で、標的の濃度を低下させて選択の厳密性を増加させる、露出させることと、任意選択で
(e)標的に対する所望の親和性を有する同種結合剤を示す1つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
43.同種結合剤を示す細胞が富化された選択された細胞の集団を提供することと、その後、
高等真核細胞クローンのインビトロライブラリ内の活性の強いプロモーターの制御下にある選択された細胞の集団からの結合剤コードDNAを提供することと、
項5~17のいずれかに記載の方法を行うことと、を含む、項42に記載の方法。
高等真核細胞クローンのインビトロライブラリ内の活性の強いプロモーターの制御下にある選択された細胞の集団からの結合剤コードDNAを提供することと、
項5~17のいずれかに記載の方法を行うことと、を含む、項42に記載の方法。
44.項5~17のいずれか一項に定義の方法を行って、結合剤の表面提示がより高い選択されたクローンを提供することと、その後、
各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのインビトロライブラリ中の活性の弱いプロモーターから結合剤を発現させることと、その後、
項42に記載の方法を行うことと、を含む、項42に記載の方法。
各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのインビトロライブラリ中の活性の弱いプロモーターから結合剤を発現させることと、その後、
項42に記載の方法を行うことと、を含む、項42に記載の方法。
45.標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
(i)各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することであって、結合剤の発現が、細胞表面における提示のための誘導性プロモーターの制御下にある、提供することと、
(ii)ライブラリの細胞を、誘導性プロモーターの活性が弱い条件下で培養することと、
(iii)ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にすることと、
(iv)同種結合剤を示す細胞を選択することで、選択された細胞の集団を提供することと、
(v)選択された細胞の集団を、誘導性プロモーターからの結合剤の増加した発現のための条件下で培養することと、
(vi)複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
(vii)他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する1つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
(i)各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することであって、結合剤の発現が、細胞表面における提示のための誘導性プロモーターの制御下にある、提供することと、
(ii)ライブラリの細胞を、誘導性プロモーターの活性が弱い条件下で培養することと、
(iii)ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にすることと、
(iv)同種結合剤を示す細胞を選択することで、選択された細胞の集団を提供することと、
(v)選択された細胞の集団を、誘導性プロモーターからの結合剤の増加した発現のための条件下で培養することと、
(vi)複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
(vii)他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する1つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。
46.標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
(i)各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することであって、結合剤の発現が、細胞表面における提示のための誘導性プロモーターの制御下にある、提供することと、
(ii)ライブラリを、誘導性プロモーターからの結合剤の強力な発現のための条件下で培養することと、
(iii)複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
(iv)他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈するクローンの集団を選択することと、
(v)選択された集団を、誘導性プロモーターからの結合剤の弱い発現のための条件下で培養することと、
(vii)ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にすることと、
(iv)同種結合剤を示す1つ以上のクローンを選択することと、をさらに含む、方法。
(i)各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することであって、結合剤の発現が、細胞表面における提示のための誘導性プロモーターの制御下にある、提供することと、
(ii)ライブラリを、誘導性プロモーターからの結合剤の強力な発現のための条件下で培養することと、
(iii)複数のクローン上での結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により結合剤を標識することにより決定することと、
(iv)他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈するクローンの集団を選択することと、
(v)選択された集団を、誘導性プロモーターからの結合剤の弱い発現のための条件下で培養することと、
(vii)ライブラリを標的に露出させ、同種結合剤による標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を標的に結合した状態にすることと、
(iv)同種結合剤を示す1つ以上のクローンを選択することと、をさらに含む、方法。
47.プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、項42~46のいずれかに記載の方法。
48.標的が、蛍光標識などの検出可能な薬剤で標識される、項42~47のいずれかに記載の方法。
49.方法が、細胞を、細胞上の結合した標的のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別することを含み、それにより、所定の閾値を上回る結合した標的を示す細胞が収集画分に選別され、所定の閾値を下回る結合した標的を示す細胞が廃棄画分に選別される、項48に記載の方法。
50.選別が蛍光活性化細胞選別機(FACS)により行われる、項49に記載の方法。
51.1つ以上の選択されたクローンから、結合剤をコードするDNAの配列を決定することと、
結合剤をコードする単離された核酸を提供することと、を含む、項5~50のいずれかに記載の方法。
結合剤をコードする単離された核酸を提供することと、を含む、項5~50のいずれかに記載の方法。
52.1つ以上の選択されたクローンから、結合剤をコードするDNAの配列を決定することと、
結合剤の可溶形態における分泌のための条件下、インビトロで、宿主細胞において、結合剤をコードするDNAを発現させることと、をさらに含む、項5~51のいずれかに記載の方法。
結合剤の可溶形態における分泌のための条件下、インビトロで、宿主細胞において、結合剤をコードするDNAを発現させることと、をさらに含む、項5~51のいずれかに記載の方法。
53.分泌された結合剤が、少なくとも1mg/mlの収量で得られる、項52に記載の方法。
54.結合剤を精製および/または濃縮して、結合剤の水溶液を少なくとも10mg/mlの濃度で得ることをさらに含む、項52または項53に記載の方法。
55.濃度が少なくとも50mg/mlである、項54に記載の方法。
56.濃度が少なくとも100mg/mlである、項55に記載の方法。
57.薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に結合剤を製剤化することを含む、項52~56のいずれかに記載の方法。
58.任意選択で針および/または注射による組成物の投与に関する指示を含む製品情報案内書などの1つ以上の追加の構成要素を含むキットにおいて、組成物を注射用の充填済みシリンジ中で提供することを含む、項57に記載の方法。
59.FcRnと相互作用する結合剤を特定する方法であって、
Fcドメインを有する異なる結合剤をコードするDNAを各々含む複数の高等真核細胞クローンを提供することと、
細胞表面上に結合剤を提示するための条件下でインビトロでクローンを培養することと、
クローンを約pH6.0および約pH7.4でFcRn受容体に露出させて、Fcドメ
インによるFcRnの認識を可能にすることと、
約pH7.4の場合と比較して約pH6.0でより高い親和性結合を呈する結合剤、約pH7.4の場合と比較して約pH6.0でより低い親和性結合を呈する結合剤、または約pH7.4の場合と比較して約pH6.0でほぼ同じ親和性結合を呈する結合剤、を発現する1つ以上のクローンを選択することと、
任意選択で、1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための選択されたクローンを提供することと、を含む、方法。
Fcドメインを有する異なる結合剤をコードするDNAを各々含む複数の高等真核細胞クローンを提供することと、
細胞表面上に結合剤を提示するための条件下でインビトロでクローンを培養することと、
クローンを約pH6.0および約pH7.4でFcRn受容体に露出させて、Fcドメ
インによるFcRnの認識を可能にすることと、
約pH7.4の場合と比較して約pH6.0でより高い親和性結合を呈する結合剤、約pH7.4の場合と比較して約pH6.0でより低い親和性結合を呈する結合剤、または約pH7.4の場合と比較して約pH6.0でほぼ同じ親和性結合を呈する結合剤、を発現する1つ以上のクローンを選択することと、
任意選択で、1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための選択されたクローンを提供することと、を含む、方法。
60.約pH7.4の場合と比較して約pH6.0でより高い親和性結合を呈する結合剤を発現する1つ以上のクローンを選択することと、1つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、インビボでの半減期が延長したものと特定することと、を含む、項59に記載の方法。
61.結合剤が、配列多様性を呈する可変ドメインを、任意選択で1つ以上の相補性決定領域に含む、項59または項60に記載の方法。
62.結合剤が、配列多様性を呈するFc領域を、任意選択でそれらのCH3ドメインに含む、項59~61のいずれかに記載の方法。
63.結合剤のFc領域が、配列多様性を呈しない、項59~61のいずれかに記載の方法。
64.実質的に本明細書に記載され、かつ/あるいは項1~63のいずれかに記載の方法により特定または選択される、クローン、クローンによる発現される結合剤、または結合剤をコードする核酸。
65.結合剤をコードするDNAを各々含む高等真核細胞クローンであって、コードDNAが、任意選択で、細胞DNA中の決まった遺伝子座にあり、コードされた結合剤が、細胞あたり100~1000個の範囲のコピー数で細胞表面に発現される、高等真核細胞クローン。
66.標的に対する結合剤の親和性に基づく選択のための項65に定義のライブラリの使用。
67.結合剤のレパートリーをコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのインビトロのディスプレイライブラリであって、結合剤の発現が、細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、ディスプレイライブラリ。
68.結合剤のレパートリーをコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを作製する方法であって、
結合剤をコードするドナーDNA分子、および高等真核細胞を提供することと、
ドナーDNAを細胞に導入することにより、ドナーDNAが細胞DNAに組み入れられた組換え細胞を創出することであって、
結合剤の発現が、細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、創出することと、
組換え細胞を培養して、クローンを産生させて、
それにより、結合剤のレパートリーをコードするドナーDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、を含む、方法。
結合剤をコードするドナーDNA分子、および高等真核細胞を提供することと、
ドナーDNAを細胞に導入することにより、ドナーDNAが細胞DNAに組み入れられた組換え細胞を創出することであって、
結合剤の発現が、細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、創出することと、
組換え細胞を培養して、クローンを産生させて、
それにより、結合剤のレパートリーをコードするドナーDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、を含む、方法。
69.組換え細胞が、ドナーDNAを細胞に導入すること、および細胞内に部位特異的
ヌクレアーゼを提供することにより創出され、ヌクレアーゼが、細胞DNA中の認識配列を切断し、ドナーDNAが細胞DNAに組み入れられる組入れ部位を創出し、組入れが細胞の内部のDNA修復機序を通して生じる、項68に記載の方法。
ヌクレアーゼを提供することにより創出され、ヌクレアーゼが、細胞DNA中の認識配列を切断し、ドナーDNAが細胞DNAに組み入れられる組入れ部位を創出し、組入れが細胞の内部のDNA修復機序を通して生じる、項68に記載の方法。
70.テトラサイクリン誘導性プロモーターからのドナーDNAの発現を誘導することと、細胞を、結合剤の発現のための条件下で培養し、細胞表面における結合剤の提示を得ることと、をさらに含む、項68または項69に記載の方法。
71.ライブラリを、項1~70のいずれかに定義の方法または使用において使用することをさらに含む、項69または項70に記載の方法。
72.高等真核細胞が哺乳動物細胞である、項1~71のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
73.哺乳動物細胞が、ヒト細胞株またはCHO細胞株である、項1~72のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
74.高等真核細胞が懸濁培養中にある、項1~73のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
75.結合剤をコードするDNAが、細胞DNA中の決まった遺伝子座で組み入れられる、項1~74のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
76.結合剤が抗体である、項1~75のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
77.抗体が全長免疫グロブリンである、項76に記載の使用、方法、またはライブラリ。
78.抗体がIgGである、項77に記載の使用、方法、またはライブラリ。
79.抗体が、膜貫通ドメインに融合した重鎖と軽鎖とを含む、項76~78のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
80.結合剤が、融合タンパク質であって、レシピエント多様性骨格ドメインに挿入されたドナー多様性骨格ドメインを含み、任意選択で、融合タンパク質と関連するパートナードメインを含む、融合タンパク質であり、
ドナー多様性骨格ドメインが、ドナー骨格とドナー相互作用配列とを含み、レシピエント多様性骨格ドメインが、レシピエント骨格とレシピエント相互作用配列とを含む、項1~79のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
ドナー多様性骨格ドメインが、ドナー骨格とドナー相互作用配列とを含み、レシピエント多様性骨格ドメインが、レシピエント骨格とレシピエント相互作用配列とを含む、項1~79のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
81.融合タンパク質が、抗体可変ドメインに挿入されたシステインリッチペプチドを含むノットボディである、項80に記載の使用、方法、またはライブラリ。
82.ノットボディが、膜貫通ドメインに融合した抗体重鎖と抗体軽鎖とを含む、項81に記載の使用、方法、またはライブラリ。
83.結合剤が、配列多様性を呈する抗体可変ドメインを、任意選択で1つ以上の相補性決定領域に含む、項1~82のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
84.結合剤が、配列多様性を呈するFc領域を、任意選択でそれらのCH3ドメインに含む、項1~83のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
85.結合剤が、第1の標的のための第1の結合部位と、第2の標的のための第2の結合部位とを含む、多重特異性である、項1~84のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
86.ライブラリが、少なくとも103個のクローンを含む、項1~85のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
87.ライブラリがナイーブライブラリである、項1~86のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
88.ライブラリのクローンが、選択された標的への結合について事前選択されている、項1~86のいずれかに記載の使用、方法、またはライブラリ。
89.標的がヒトポリペプチドである、項88に記載の使用、方法、またはライブラリ。
90.ライブラリのクローンが、2つの異なる標的への二重特異性結合について事前選択されている、項88または項89に記載の使用、方法、またはライブラリ。
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本発明の他の態様および実施形態は、用語「を含む」が用語「からなる」に置き換えられた上に記載される態様および実施形態と、用語「を含む」が用語「から本質的になる」に置き換えられた上に記載される態様および実施形態を提供する。
文脈が別途要求しない限り、本出願が、上記の態様および上に記載される実施形態のいずれかの互いのすべての組み合わせを開示することを理解されたい。同様に、本出願は、文脈が別途要求しない限り、単独でまたは他の態様のいずれかと一緒に、好ましいおよび/または任意の特徴のすべての組み合わせを開示する。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の組成物および方法が本開示の方法の実施または試験において使用され得るが、例示的な組成物および方法は、本明細書に記載される。本明細書に記載される開示の態様および実施形態のいずれかも、組み合わされ得る。例えば、本明細書で開示される従属または独立請求項の主題は、複数組み合わされ得る(例えば、各従属請求項からの1つ以上の記載は、それらが依存する独立請求項に基づいて単一の請求項に組み合わされ得る)。
本明細書および請求項で使用される場合、単数形「a」、「and」、および「the」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「ペプチド鎖」への言及は、1つ以上のペプチド鎖への言及であり、当業者に既知のその均等物を含む。
この明細書で言及されるすべての文書および配列データベースのエントリは、すべての
目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「および/または」は、他方を伴うまたは伴わない2つの特定の特徴または構成要素の各々の特定の開示としてみなされるべきである。例えば、「Aおよび/またはB」は、各々が本明細書で個々に示されているかのように、(i)A、(ii)Bならびに(iii)AおよびBの各々の特定の開示とみなされるべきである。
次に、本発明の実施形態が、以下の図面を参照してより詳細に説明される。
[図1]pINT17-BSD、表面発現用デュアルプロモーター抗体IgG発現カセット
pINT17-BSD、主要な特徴(1~7500bp)を示す概略図が示される
pINT17-BSD-D1.3、抗リゾチーム抗体D1.3の表面発現用のデュアルプロモーター抗体発現カセット。注釈付きの完全な核酸配列が示される。特徴:
AAVS左相同性アーム 9~812
ブラストサイジン耐性遺伝子 853~1254
pEFプロモーター 1522~2705
BM40リーダー 2745~2799
ヒト化D1.3 VL 2799~3130
ヒトCカッパ 3138~3443
BGHポリA 3468~3682
CMVプロモーター 3701~4273
イントロンを有するマウスVHリーダー 4299~4426
ヒト化D1.3 VH 4432~4779
最適化されたヒトIgG1 CH1-CH3 4780~5775
Mycタグ 5776~5805
PDGFRアンカー 5806~5961
BGHポリA 6011~6225
AAVS右相同性アーム 6288~7124
f1複製起点 7282~7695
pUC複製起点 7916~8590
カナマイシン耐性遺伝子 9310~10104
[図2]細胞表面でのIgGの発現。
FL3チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。FL3チャネルにおける染色に対して陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。AAVS TALENの存在下でpINT17抗体でHEK293細胞をトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの14日後、抗Fc PE(FL2)で細胞を染色した。蛍光強度(抗Fc-PE、x軸)を示すパネルは、細胞数(y軸)に対してプロットしCNTO607(a)、MEDI1912(b)、およびAng2mAb(c)のペアを含む。すべてのパネルについて、プロットは、染色されたHEK293細胞(点線)、親抗体(破線)、改善された変異体(黒の実線)を含む。
[図3]MEDI-1912およびMEDI-1912-STTの分取サイズ排除クロマトグラフィー。プロテインAアフィニティ精製および透析が後に続くExpi293細胞の一過性トランスフェクションにより抗体を発現させた。精製されたMEDI-1912(0.5ml、1.1mg/ml)またはMEDI-1912 -STT(0.5ml、1.7mg/ml)を、PBS(pH7.4)泳動用緩衝液(running buffer)を使用してAKTA Pure系に接続されたSuperdex 200 10/300カラムに負荷した。y軸の280nm(mAU)での吸光度に対してx軸にプ
ロットされた溶出量(ml)us。MEDI-1912およびMEDI-1912-STTの溶出量(Ve)は、それぞれ10.3mlおよび11.7mlであった。MEDI-1912は、自己相互作用を示す以前の溶出量を示す。
[図4]MED-1912可変重鎖(VH)のDNAおよびタンパク質配列。
ライブラリ作成のために採用されるプライマーは、核酸配列の上に標識される。
[図5]混合細胞のFACS分離は、抗体発現に基づく抗体集団を表示した。
MEDI-1912とMEDI-1912_STT IgG遺伝子の均等な混合は、HEK293細胞のAAVS遺伝子座へのヌクレアーゼ指向組入れを介して標的化された。トランスフェクションから15日後、BD Influx選別機を使用してFACSによる抗体発現に基づいて、この混合細胞集団を分離した。フィコエリトリン(PE)で標識された抗Fcおよびアロフィコシアニン(APC)で標識されたNGF-ビオチン/ストレプトアビジンで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λem=450/40、λexc=355チャネルでの染色に対する陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。
a.混合入力集団(破線)、およびMEDI-1912(灰色線)とMEDI-1912_STT(黒色線)を表示するモノクローナルHEK293細胞株についての細胞数に対する抗Fc-PEの蛍光強度のヒストグラムプロット。
b.ドットプロットは、抗体発現レベルを表す抗Fc-PE(x軸)についての蛍光強度を示し、y軸上で抗原結合(NGF-ビオチン/NGF-ビオチン/ストレプトアビジン-APC)についての蛍光強度に対してプロットされる。高抗体発現集団と低抗体発現集団とを分離するために選択されたゲートは、P5およびP6と標識され、ドットプロット上に黒色ボックスとして示される。総イベント数は3.9×106個の細胞であり、P5およびP6ゲートにおいて選別された細胞の数は、それぞれ2.5×105および2.8×105個の細胞であった。
[図6]哺乳動物細胞のディスプレイレベルにより選択された抗体の富化。
ゲート5および6において選別された細胞(図5)を拡大し、ゲノムDNAを調製し、PCRによって抗体VH遺伝子を単離した。2つの抗体集団をNextgen配列決定によって分析して、2つのゲーティングされた集団におけるMEDI-1912およびMEDI-1912_STTの割合を決定した。ヒストグラムは、低抗体発現集団(ゲート6)および高抗体発現集団(ゲート5)におけるMEDI-1912(斜線の棒)およびMEDI-1912_STT(黒色の棒)のパーセンテージ頻度を示す。
[図7]抗体発現に基づくMEDI-1912ライブラリ抗体集団のFACS分離。NNSオリゴヌクレオチド指向変異誘発がW30、F31、およびL56をコードするコドンをランダムに変異させるために使用される、MENS-1912 IgG遺伝子のライブラリを、HEK293細胞のAAVS遺伝子座へのヌクレアーゼ指向組入れを介して標的化した。トランスフェクションから15日後、BD Influx選別機を使用してFACSによる抗体発現および抗原結合に基づいて、この混合細胞集団を分離した。フィコエリトリン(PE)で標識された抗Fcおよびアロフィコシアニン(APC)で標識されたNGF-ビオチン/ストレプトアビジンで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λem=450/40、λexc=355チャネルでの染色に対する陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。ドットプロットは、抗体発現レベルを表す抗Fc-PE(x軸)についての蛍光強度を示し、モノクローナル細胞株を表示する親MEDI-1912(a)、モノクローナル細胞株を表示するMEDI-1912_STT(b)ならびにMEDI-1912アミノ酸30位、31位および56位ランダムライブラリ(c)についてy軸上で抗原結合(NGF-ビオチン/NGF-ビオチン/ストレプトアビジン-APC)についての蛍光強度に対してプロットされる。分析用に選択されたゲートは、P5およびP6と標識され、ドットプロット上にボックスとして示される。
[図8]選択されたMEDI-1912変異型の配列分布。
哺乳動物ディスプレイ後のMEDI-1912 VHライブラリについてのMEDI-1
912 VH30位、31位、および56位、ならびにFc発現およびNGF結合に対してゲーティングされたFACSでのアミノ酸同一性頻度のヒストグラムプロット(P5ゲート、図7)。アミノ酸(1文字コード)は、隣接するアミノ酸30、斜線の棒および31、黒色の棒(a)およびアミノ酸56(b)についてy軸上に頻度(発生パーセンテージ)に対してx軸上にプロットされる。56位のロイシンを分析から除外した。
[図9]ボコシズマブマウス親抗体5A10 VH(A)およびVL(B)とヒト化中間抗体5A10-iおよびボコシズマブとのアラインメント。
CDRは配列の上のバーで示され、変異される残基は太字および下線で強調される。パラトピック残基(PCSK9への直接結合に寄与するアミノ酸)は、斜体および下線で強調される。ドットは親マウスmAb 5A10との同一性を示す。
[図10]抗体哺乳動物はボコシズマブおよび親ヒト化中間抗体5A10-iの発現を表示する
ボコシズマブまたは5A10-i)IgGをコードする標的化ベクターpINT17を、TALEヌクレアーゼを介してHek293細胞のAAVS遺伝子座に組み入れた。トランスフェクションの1、8、または21日後(dpt)、細胞(106)を抗Fc-PEで染色し、106の細胞をiQue Intellicyteフローサイトメーターでフローサイトメトリーによって分析した。死んだ細胞を分析から除外した。ヒストグラムプロットは、陰性対照としてインキュベートされた野生型HEK293細胞の染色を有するトランスフェクションの1、8、および21日後(dpt)でのボコシズマブおよび5A10-i細胞ディスプレイ集団についての細胞数に対する蛍光強度(抗Fc-PE)を示す。
[図11]ボコシズマブVHのヒト生殖細胞系列配列(IMGT)とのアラインメント。
ボコシズマブVH(Query_1)は、ヒトVDJデータベースに対するIg Basic Local Alignment Search(IgBLAST)に関するものであった。結果は、フレームワーク領域1(FR1)、相補性決定領域1(CDR1)、FR2、CDR2、FR3を包含するクエリ配列(同一性のパーセント順)(第2列)に対するアラインメントとして提示される。ヒト生殖細胞系列細胞は列1に示される。ボコシズマブVH配列(.)および差異(単一アミノ酸コード)に対する残基の同一性は、マルチプルアラインメントにおいて表示される。
[図12]ボコシズマブのVH変異型およびVLに加え停止コドンテンプレートをコードするDNA配列。元の「野生型」ボコシズマブ(行f)と比較した変動は、太字および下線で強調される。隣接する5’および3’ VH制限部位(NcoIおよびXhoI)またはVL制限部位(NheIおよびNotI)に下線が引かれている。VL停止コドンは太字および下線で強調される。
[図13]ボコシズマブライブラリのMACS精製後の分析フローサイトメトリー分析
ボコシズマブライブラリでトランスフェクトされたHek293細胞を、抗FcまたはPCSK9iのいずれかで7dptにMACS精製した。(a)フローサイトメトリードットプロットは、MACS後の精製ライブラリ、HEK293細胞ならびに未選別ライブラリ、ボコシズマブおよび5A10iトランスフェクタント、9dptについてのPCSK9結合(FL4、y軸)に対してプロットされた抗Fc発現(FL2、x軸)について示される。(b)細胞数に対してプロットされた蛍光強度のヒストグラム(抗Fc、FL2、x軸)。プロットは、(上から下に)HEK293コントロール、ボコシズマブ、5A10i、ボコシズマブライブラリ、抗PCSK9 MACS精製ボコシズマブライブラリ、および抗Fc MACS精製ボコシズマブライブラリである。
[図14]抗原結合または抗Fcに基づいて以前にMACS精製されたボコシズマブライブラリのBD Influx選別機ドットプロット。
ボコシズマブIgG遺伝子のライブラリを、HEK293細胞のAAVS遺伝子座へのヌクレアーゼ指向組入れを介して標的化した。PCSK9結合(a)または抗Fc(b)に
基づいて、この混合細胞集団をまずMACS精製した。トランスフェクションの16日後、BD Influx選別機を使用して、FACSによる抗体発現と抗原結合に基づいて、MACS富化ライブラリを分離した。フィコエリトリン(PE)で標識された抗Fcおよびアロフィコシアニン(APC)で標識されたPCSK9-ビオチン/ストレプトアビジンで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λem=450/40、λexc=355チャネルでの染色に対する陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。ドットプロットは、抗体発現レベルを表す抗Fc-PE(x軸)についての蛍光強度を示し、y軸上に抗原結合(PCSK9-ビオチン/ストレプトアビジン-APC)についての蛍光強度に対してプロットされる。分析用に選択されたゲートはP5と標識され、P6はドットプロット上のボックスとして示される。
[図15]哺乳動物ディスプレイ選択後のボコシズマブVH分布。
ランダムな選択されていない入力クローン(84)、選別された抗原(75)、および選択されたFc(85)を配列決定し、VH同一性を決定した。ヒストグラムプロットは、入力(白色の塗りつぶされた棒)、選択された抗原および抗Fc FACSが後に続く抗原MACS(黒色の塗りつぶされた棒)ならびに選択された抗原および抗Fc FACSが後に続く抗Fc MACS(灰色の塗りつぶされた棒)哺乳動物細胞選択集団についての発生パーセンテージに対してプロットされたx軸上にVH生殖細胞系列同一性を示す。
[図16]哺乳動物ディスプレイ選択後のボコシズマブVL配列分析。
ランダムな選択されていない入力クローン(84)、選別された抗原(75)、および選択されたFc(85)を配列決定し、VL配列を決定した。3つの変異コドンについて平均pIと脂肪族インデックスを計算した。これは、哺乳動物ディスプレイ選択抗体についてのpIおよび脂肪族指数の両方の低下を示した。
[図17]抗体ディスプレイレベル(抗Fc)および抗原結合の両方についてFACS富化が後に続くMACSによって抗原結合について富化された、哺乳動物ディスプレイボコシズマブクローンを列挙した表。
クローンを配列決定し、VH CDR1およびCDR2ならびにVL CDR2およびCDR3の1文字のアミノ酸配列が、太字と赤色で強調される元のボコシズマブ配列からの変動で示される。ボコシズマブ配列を保持した標的化されたアミノ酸には、下線が引かれている。元の親抗体ボコシズマブおよび5A10-iを含む抗体の、キャプチャーELISAにおける抗原への結合を実行し、蛍光ユニットにおける結合シグナルが列2に示される。Liu et al,201430によって以前に説明されたようにAC-SINSアッセイを実行し、列3は無抗体PBS対照と比較した最大吸光波長シフトを示す(nm)。選択されたヒトVH生殖細胞系列は、実施例5において詳述されるように、列6にも文字で示される。
a:VH Y33A-IGHV1-3*01
b:VH Y33D-IGHV1-8*01
c:VH S52N、F54S、R57S-IGHV1-46*01
d:VH Y33A、S52N、F54S、R57S(a.およびc.の変異体は組み合わせられた)
e:VH Y33D、S52N、F54S、R57S(b.およびc.の変異体は組み合わせられた)
f:ボコシズマブ「野生型」配列
[図18]抗PCSK9 IgG1抗体のHPLC-SEC。
抗体を、Expi-293細胞の一過性トランスフェクションにより発現させ、プロテインAクロマトグラフィーでアフィニティ精製し、透析した。Agilent 1100
HPLC機器を使用して0.35ml/minの流量でAgilent AdvancedBio SEC 300A、2.7um、4.6×300mmカラム(Agilent Technologies,Cat.No.PL1580-5301)上に試料(1mg/mlで2μl)を負荷した。選択された抗体について吸光度に対する保持時間のプ
ロットが示される。黒から次第に薄い灰色への色合いは、5A10-i、884_01_G01(哺乳動物細胞ディスプレイによって特定される)、ボコシズマブ、アリロクマブである。
[図19]ゲル濾過分析ニボルマブ(a)およびベセンクマブ(b)。
プロテインAアフィニティ精製および透析が後に続くExpi293細胞の一過性トランスフェクションにより抗体を発現させた。精製されたニボルマブ(0.5ml、1.3mg/ml)またはベセンクマブ(0.5ml、1.2mg/ml)を、PBS(pH7.4)泳動用緩衝液を使用してAKTA Pure系に接続されたSuperdex 200 10/300カラムに負荷した。y軸の280nm(mAU)での吸光度に対してx軸にプロットされた溶出量(ml)us。ニボルマブおよびベセンクマブについての溶出量(Ve)は、それぞれ12.0 mlおよび13.7 mlであった。
[図20]4oCで2週間貯蔵後のニボルマブ(a)およびベセンクマブ(b)の安定性決定。
サイズ排除クロマトグラフィー(図19を参照されたい)によってベセンクマブおよびニボルマブを精製し、PBS(pH7.4)において0.5mg/mlに濃度を調整した。次いで、抗体を4℃で2週間保存した。製造業者の指示に従って、Zetasizer APS(Malvern Instruments、Malvern、UK)を使用して20oCで動的光散乱測定を実行した。流体力学的半径を、アインシュタイン・ストークス方程式で評価し、散乱強度に対してプロットした。ベセンクマブについての複数の凝集ピーク(b)と比較して、ニボルマブ(a)について単一の単分散ピークを観察した。
[図21]細胞表面上のIgGに結合するヒト血清。
FL3チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。FL3チャネルにおける染色に対して陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。AAVS TALENの存在下で、pINT17-ニボルマブまたはpINT17-ベセンクマブで細胞をトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの20日後、抗Fc PE(FL2)およびDylight 633(325-0000、Innova)で標識されたヒト血清(H4522、Sigma)で細胞を染色した。パネルは、トランスフェクトされていないHEK293細胞(a)、pINT17-ニボルマブ(b)またはpINT17-ベセンクマブ(c)でトランスフェクトされたHEK293細胞である。
[図22]親和性、抗原の濃度、および抗体の濃度の間の関係
a KD 10nM(破線)または0.1nM(実線)のいずれかの抗体の異なる濃度を有する0.1nM抗原を使用した複合体の濃度。
bi 異なる抗体濃度でのより低い親和性(KD 10nM)に対するより高い親和性抗体(KD 0.1nM)についての0.1nM抗原への結合の相対的選択性
低い抗原濃度(「ストリンジェントな」)である場合でさえも、高い抗体濃度では比較的低い選択性があるが、これは抗原濃度が低下するにつれて増加する。
[図23]抗体ディスプレイレベルを制御するためのスプライスアクセプター/ドナー変異型。
スプライスドナー領域を含むHindIII部位から5’イントロンまでの核酸配列は、pINT17-J9、J10、J29およびJ30変異型について示される。元のヒト「野生型」配列はJ9であり、J10、J29、J30についてのスプライスジャンクションでJ9と異なるヌクレオチドには下線が引かれている。
[図24]pINT17-J30、低下したディスプレイ表面発現についてのデュアルプロモーター抗体IgG発現カセット。注釈付きの核酸配列は、XhoI(4804)およびSbfI(8387)の制限部位の間に示される。特徴:
IgG1 CH1-3 4805~5808
スプライスジャンクション 5801~5802
イントロン 5802~7104
M1エクソン 7105~7239
BGH pA 7264~7478
AAVS右相同性アーム 7544~8381
3’β-グロビンインスレーター8421~8492
[図25]代替膜貫通ドメインおよびスプライス変異型を使用する細胞表面上のIgGの低下した表面発現。
FL3チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。FL3チャネルにおける染色に対して陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。AAVS TALENの存在下で、pINT17標的化ベクターで細胞をトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの27日後、抗Fc PE(FL2)で細胞を染色した。フローサイトメトリーのドットプロットパネルは、pINT17-J9-ニボルマブ(a)、pINT17-J10-ニボルマブ(b)、pINT17-J29-ニボルマブ(c)、pINT17-J30-ニボルマブ(d)およびpINT17-BSD-ニボルマブ(e)を含む。
[図26]pINT17-BSDまたはpINT17-J30標的化ベクターから発現された抗体についての細胞表面上のIgGディスプレイレベルの定量化
マウスIgG-PE標識で染色されたQuantum Simply Cellular抗マウスIgGビーズ(カタログ番号815、Bangs Laboratories Inc)の製造業者の説明書に記載されるように、キャリブレーションビーズFL2染色を実行した。(a)標識されたヒストグラムプロットは、それぞれ12257、72745、283360、886417のビーズコピー数を表す、1、2、3、および4と標識されたピークを有するキャリブレーションビーズセットの染色を示す。ブランクのピークは、捕捉抗体のないビーズを表す。(b)コピー数(y軸)に対してプロットされた蛍光強度の中央値(x軸)を示すキャリブレーショングラフ。pINT17-BSDまたはpINT17-J30発現カセットのいずれかからの337_1_C08(c)およびニボルマブ(d)を表示する細胞株を、抗Fc-PE(5μl、0.1mg/ml;105細胞)で染色した。FL3チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。FL3チャネルにおける染色に対して陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。ヒストグラムのプロットは、PDGFR TMを有するpINT17-BSD(標識されかつ黒色の線)、pINT17-J30(標識されかつ点線)ならびに337_1_C08(c)およびニボルマブ(d)を表示する細胞についての野生型HEK293細胞株(灰色の実線)についての細胞数に対して蛍光強度をそれぞれ示す。
[図27]細胞ディスプレイのコピー数の低下によって、哺乳動物ディスプレイによるそれらの標的に対する異なる親和性を有する抗体の分離が可能になる。
ニボルマブおよび337_1_C08抗体を表示するHek293細胞を、それぞれ50nMセルトラッカー緑色および50nMセルトラッカー赤色で標識した。(a)J30スプライスバリアントを使用したディスプレイを示し、(b)pINT17-BSDベクターによってコードされたPDGFR膜貫通ドメインを使用したディスプレイを実証する。標識された細胞を均等に混合し、抗原結合に基づいてMACSを選別した。インテリサイト(intellicyt)フローサイトメーターを使用して選別された細胞を分析した。ドットプロットは、x軸(FL1)上にニボルマブを、y軸(FL4)上に337_1_C08を表す。パネルi、ii、iii、およびivは、それぞれMACS精製のために採用された10nM、1nM、0.1nMの抗原、抗原がないことを表す。
[図28]pINT18-Tet1、低下したディスプレイ表面発現のための誘導性プロモーター抗体IgG発現ベクター。注釈付きの核酸配列は、AsiSI(5)およびSbfI(7672)制限部位の間に示される。複製の起点およびカナマイシン耐性遺伝子を包含する、AsiSIおよびSbfI部位(7673~10922および1~4)の外側のベクター骨格は、pINT17-BSDと同一である(図1)。
主要な特徴:
AAVS左相同性アーム 9~812
ブラストサイジン耐性遺伝子 853~1254
CMVプロモーター 1540~2112
逆Tet活性化因子(tTA)CDS 2164~3168
SV40 pA 3178~3395
tetOヘプタマー 3679~3932
最小限のCMVプロモーター(PminCMV)3946~4005
BM40リーダー 4016~4066
抗PD1 MK3475 VL 4068~4413
ヒトCカッパ 4421~4738
フューリン切断部位 4745~4756
P2Aペプチド 4757~4816
イントロンを有するマウスVHリーダー 4829~4960
抗PD1 MK3475 VH 4962~5321
最適化されたヒトIgG1 CH1-CH3 5322~6317
Mycタグ 6318~6347
PDGFRアンカー 6348~6503
BGHポリA 6553~6767
AAVS右相同性アーム 6829~7666
3’β-グロビンインスレーター7706~7777
f1複製起点 7824~8237
pUC複製起点 8458~9132
カナマイシン耐性遺伝子 9852~10646
[図29]誘導性哺乳動物ディスプレイ発現
pINT18-Tet1-377_1_C08およびTALEヌクレアーゼで同時トランスフェクトされたHEK293細胞株ならびにブラストサイジンの存在下で20日間選択された安定した細胞集団からの染色結果を表すヒストグラム。試料を、20mlで5×105細胞/mlに分割し、20ng/ml、2ng/mlおよび0ng/mlのドキシサイクリンで誘導した。誘導の24時間後、各ドキシサイクリン誘導サンプルからの1×106個の細胞を使用してフロー染色を行った。抗Fc-PEおよびTOPRO-3生存率染色を使用して細胞を染色した。ヒストグラムは、細胞数に対してプロットされたFL2チャネル(抗Fc-PE)に関する蛍光強度を示す。HEK293 WT対照(灰色の実線)、0ng/mlドキシサイクリン(黒色の破線)、2ng/mlドキシサイクリン(黒い点線)および20ng/mlドキシサイクリン(黒色の実線)で誘導されたHEK293-pINT18-Tet1-377_1_C08安定細胞株。
[図30]細胞の結合はFcRnに対する抗体を表示した。
ブリアキヌマブおよびウステンキヌマブ(Ustenkinumab)を発現するHEK293細胞を、異なる緩衝液を使用して、ストレプトアビジンPE(11nM)と事前複合体化したビオチン化FcRn(50nM)で染色した。
a.Hek293 WT
b.ストレプトアビジンPE対照
c.緩衝液pH6.0で染色された細胞
d.緩衝液pH7.4で染色された細胞
[図31]HEK293細胞のFACS分離は、抗メソテリンIgGをディスプレイレベルで表示した。
抗メソテリン抗体遺伝子の集団を、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子導入により、HEK293細胞のヒトAAVS遺伝子座に組み入れた。抗体を表示したHEK293細胞のポリクローナル集団を、抗ヒトFc-PEで染色することにより、抗体ディスプレイレベルに従ってFACSによって分離した。トランスフェクションの16日後、BD Influx選別機を使用したFACSによる抗体発現に基づいて、MACS富化ライブラリを分離した
。フィコエリトリン(PE)で標識された抗Fcで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λem=450/40、λexc=355チャネルでの染色に対する陽性の細胞(DAPIを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。ヒストグラムは、抗体発現レベルを表す抗Fc-PEについての蛍光強度(x軸)を示し、y軸上の細胞数に対してプロットされる。分析用に選択されたゲートは、それぞれ低、中、高のディスプレイレベルの集団をすP4、P6、およびP5と標識される。
[図32]高ディスプレイレベルグループ(実線)および低ディスプレイレベルグループ(点線)にそれぞれ由来する2つの抗メソテリンIgG1抗体クローンのHPLC-SEC。
[図33]MACSを使用したDNA結合とDNA結合剤の枯渇。(A)HEK293細胞(灰色の実線)、またはストレプトアビジンPEで検出されたビオチン化DNAで染色されたウステキヌマブ(破線)、ブリアキヌマブ(長破線)およびアマツキシマブ(点線)を表示するHEK293細胞のオーバーレイ、(B)MACS選別の前にDNAで染色されたウステキヌマブ(標識なし、Q4)、アマツキシマブ(CellTace Far赤色で標識された、X軸)およびブリアキヌマブ(CellTrace CFSEで標識された、Y軸)を表示する3つの抗体細胞集団の混合物を表すドットプロット、(C)DNA結合剤の枯渇を示すフロースルーのドットプロット。
[図34]ヘパリン-FITC(x軸)および抗ヒトFc APC(y軸)での二重染色。(a)ウステキヌマブ(灰色)とブリアキヌマブ(黒色)のオーバーレイを示すドットプロット。(b)ウステキヌマブ(灰色)とガニツマブ(黒色)のオーバーレイを示すドットプロット。オーバーレイプロット内のゲートは、細胞が高発現因子およびヘパリンに対する非結合剤であることを示す。
[図35]DyLight 633(x軸)および抗ヒトFc PE(y軸)で複合体化されたシャペロンでの二重染色。(a)Hsp70-DyLight 633および抗ヒトFc PEで二重染色されたウステキヌマブ(灰色)およびブリアキヌマブ(黒色)のオーバーレイを示すドットプロット。(b)Hsp90-DyLight 633および抗ヒトFc PEで二重染色されたウステキヌマブ(灰色)およびブリアキヌマブ(黒色)のオーバーレイを示すドットプロット。オーバーレイプロット内のゲートは、細胞が高発現因子およびシャペロン(Hsp70およびHsp90)に対する非結合剤であることを示す。(cおよびd)オーバーレイヒストグラムプロットは、レンジルマブおよびブレンツキシマブの結合Hsp70およびHsp90をそれぞれ示す。
[図36]抗ヒトFc PEで染色した抗体および多反応性プローブについてのヒストグラムプロット。抗体の選択を表示する安定したモノクローナルHEK293細胞株は、ヌクレアーゼ媒介性の遺伝子組入れによって創出された。蛍光強度(x軸)に対する細胞数(y軸)のヒストグラムプロットは、次のプローブでHEK293細胞の表面上に表示された様々な抗体について表示される:(a)抗ヒトFc-PE、(b)ストレプトアビジンPEを使用して検出されたビオチン化DNA、(c)ヘパリン-FITC、(d)ストレプトアビジンPE、(e)Hsp70-DyLight 633、(f)Hsp90-DyLight 633、および(g)ストレプトアビジンPEと事前複合体化したFcRn。
[図37]pINT17-Tet-D1.3、誘導性抗体IgG哺乳動物ディスプレイ発現ベクター。注釈付きの完全な核酸配列は、AAVS相同性アームとBglIIからBstZ171制限部位までのプロモーターレスブラストサイジン遺伝子との間に示される。番号付けはBglII制限部位からのものである。主要な特徴は以下に列挙される。BGHポリA 223~9(逆鎖(reverse strand))
ヒトCカッパ 544~236(逆鎖)
D1.3 VL 877~549(逆鎖)
イントロンを有するヒトVLリーダー 1168~883(逆鎖)
TRE3Gプロモーター 1230~1618
CMVプロモーター 1237~1809
イントロンを有するVHリーダー 1644~1782
D1.3 VH 1783~2127
IgG1 CH1-3 2125~3120
Mycタグ 3121~3150
PDGFRアンカー 3151~3306
BGHポリA 3356~3570
pEFプロモーター 3621~4955
rtTA-3G 5063~5809
SV40ポリA 5832~6274
[図38]誘導性IgG哺乳動物ディスプレイ細胞株。1549_02_D06(1)、1535_01_E03(2)、および337_1_C08(3)、ボコシズマブ(4)、884_01_G01(5)、5A10i(6)、およびアリロクマブ(7)。27dptで、0(a)、2(b)、4(c)、または100(d)ng/mlドキシサイクリンの添加により細胞株を誘導した。誘導の24時間後、細胞を抗Fc-PEで染色した。細胞数に対してプロットされた蛍光強度のヒストグラム(抗Fc、FL2、x軸)。
[図39]誘導性IgG哺乳動物ディスプレイ細胞株:細胞表面IgGターンオーバー
抗PD1抗体のVHとVLを含むpINT17-Tet:1549_02_D06(1)、1535_01_E03(2)、および337_1_C08(3)および抗PCSK9抗体ボコシズマブ(4)、884_01_G01(5)、5A10i(6)およびアリロクマブ(7)を、AAVS TALEヌクレアーゼ媒介性遺伝子組入れおよびブラストサイジン選択によって安定したHEK293細胞株を創出するために使用した。27dptで、100ng/mlドキシサイクリンの添加により細胞株を誘導した。誘導の48時間後、細胞を抗Fc-PEで染色した。蛍光強度のヒストグラム(抗Fc、FL2、x軸)は、細胞数に対してプロットされて示される。
[図40]抗PD1抗体1549_02_D06(PD-1についてKD=2.9nM)および337_1_C08(PD-1についてKD=74nM)を表示する細胞株を、(a)0、(b)2、(c)4および(d)100ng/mlドキシサイクリンでそれぞれ誘導した。前方側方散乱(FSC、x軸)に対するFL1チャネル(y軸)における蛍光のドットプロットが示される。1549_02_D06を表示する標識された細胞は、各ドットプロットの上部の象限に示され、337_1_C08を表示する標識されない細胞は、下部の象限に示される。パネルi、ii、iii、およびivは、それぞれMACS精製のために採用されたPD-1-ビオチンの0.1、1、10nM濃度を表す。パネルivは、入力されたMACS前の集団を表す。各細胞集団のパーセンテージは、各象限内に示される。
[図41]ウステキヌマブ(灰色)とブリアキヌマブ(黒色)の二重染色集団のオーバーレイドットプロット。ストレプトアビジンPE(x軸)および抗ヒトFc APC(y軸)と事前複合体化した50nM FcRn-Aviタグでの二重染色。プロット内のゲートは、FcRn結合剤からFACSで選別され得るFcRn非結合剤としてウステキヌマブを表す。
[図42]抗メソテリン可変重(VH)ドメイン抗体集団の生殖細胞系列分析。図は、各VH生殖細胞系列について、入力および低、中、高の哺乳動物のディスプレイゲーティングされた集団における発生の頻度をプロットする。
[図43]抗メソテリン可変光カッパ(VLκ)ドメイン抗体集団の生殖細胞系列分析。図は、各VLκ生殖細胞系列について、入力および低、中、高の哺乳動物のディスプレイゲーティングされた集団における発生の頻度をプロットする。
[図44]抗メソテリン可変軽λ(VLλ)ドメイン抗体集団の生殖細胞系列分析。図は、各VLλ生殖細胞系列について、入力および低、中、高の哺乳動物のディスプレイゲーティングされた集団における発生の頻度をプロットする。
[図45]抗メソテリンIgG1抗体のHPLC-SEC。抗体を、Expi-293細胞の一過性トランスフェクションにより発現させ、プロテインAクロマトグラフィーでアフィニティ精製し、透析した。Agilent 1100 HPLC機器を使用して0.35ml/minの流量でAgilent AdvancedBio SEC 300A、2.7um、4.6×300mmカラム(Agilent Technologies,Cat.No.PL1580-5301)上に試料(1mg/mlで2μl)を負荷した。保持時間に対する215nmでの吸光度のプロットが、選択された抗メソテリン抗体について示される:高ディスプレイレベルグループに由来する932_01_A03(黒色の線)および930_01_A12(交互の点線および破線)930_01_B02(長い破線)、低ディスプレイレベルグループに由来する930_01_C12(短い破線)。
[図46]ヒトおよびCHO AAVSイントロン1 TALE-ヌクレアーゼ(TALEN)標的結合部位のアラインメント。CHO AAVSイントロン1のDNA配列を、ENSEMBL注釈付きCHO-K1グルタミンシンセターゼ(GS)ノックアウト細胞株から得た、アクセッション:CHOK1GS_HDv1:scaffold_52:2374828:2406177:1。番号付けは、ヒトPPP1R12Cイントロン1の開始を参照される。太字は、ヒトTALEN標的部位の左右のアームを示す。アスタリスクはヒトおよびCHO配列の間の相同性を示し、破線(-)は欠失を示す。下線および斜体は、pINT17標的化ベクター内のAAVS左および右相同性アームの端を示す。このアラインメントを、pINT17-CHO標的化ベクター内のCHO AAVS相同性アーム、および比較のために、CRISPR/Cas9ガイドRNAを設計するために使用した。1~3と番号付けされたセンスまたはアンチセンスCRISPRガイドRNA認識部位は、それぞれ配列の上または下に表示される。
[図47]ベクターpINT17-BSD-CHO内のCHO AAVS相同性アーム、CHO細胞上の表面発現用のデュアルプロモーター抗体IgG発現カセット。注釈付きDNA配列が、ベクター内の左右のCHO AAVS相同性アームについて示される。この図に示されていないものを含む、デュアルプロモーター抗体発現カセットを包含するすべての残りの特徴は、ベクターpINT17-BSD(図1)について説明されるとおりであり、以下に列挙される。
特徴:
CHO AAVS左相同性アーム 9~899
ブラストサイジン耐性遺伝子 942~1343
pEFプロモーター 1611~2794
BM40リーダー 2834~2885
ヒト化D1.3 VL 2888~3219
ヒトCカッパ 3227~3532
BGHポリA 3468~3682
CMVプロモーター 3790~4362
イントロンを有するマウスVHリーダー 4388~4515
ヒト化D1.3 VH 4521~4868
最適化されたヒトIgG1 CH1-CH3 4869~5864
Mycタグ 5865~5894
PDGFRアンカー 5895~6050
BGHポリA 6100~6314
CHO AAVS左相同性アーム 6376~7266
f1複製起点 7424~7837
pUC複製起点 8058~8732
カナマイシン耐性遺伝子 9452~10246
[図48]TALENまたはCRISPR/Cas9ヌクレアーゼ媒介性遺伝子組入れによるCHO細胞の表面上の抗体のディスプレイ。細胞数に対してプロットされた蛍光
強度のヒストグラム(抗Fc、FL2、x軸)。プロットは(上から下に)、CHO対照、pINT17-BSD-CHO V2-ニボルマブマイナスヌクレアーゼ、pINT17-BSD-CHO V1-ニボルマブマイナスヌクレアーゼ、pINT17-BSD-CHO V1-ニボルマブプラスCHO TALEN、pINT17-BSD- CHO
V1-ニボルマブプラスCRISPR3、pINT17-BSD-CHO V1-ニボルマブプラスCRISPR2、pINT17-BSD-CHO V1-ニボルマブプラスCRISPR1である。
[図49]CHOの表面上の抗体のディスプレイレベル。CHO細胞の細胞数(塗りつぶされたプロット)に対してプロットされた蛍光強度(抗Fc、FL2、x軸)のヒストグラム(a)ボコシズマブ(実線)および884_01_G01(破線)。(b)MEDI-1912(実線)およびMEDI-1912-STT(破線)。
[図50]その後の結合選択のために哺乳動物ディスプレイを使用する「開発性が増強された」集団の作成
a.抗PD1 337_1_C08 VH(i)およびVL(ii)鎖の配列。ヌクレオチド配列は、コドンの上に翻訳1文字のアミノ酸コードで示される。CDRは注釈付き(下線付き)であり、CDR3アミノ酸は太字で強調された部位指向変異誘発を対象とする。
b.抗PD1抗体のVHおよびVL CDR3哺乳動物ディスプレイライブラリを、高、中、低の抗体細胞ディスプレイレベルに基づいてFACSで分離し、抗Fc-PEでの染色による分析フローサイトメトリーで分析した。Fc発現(x軸)に対する細胞数(y軸)のヒストグラムプロットは、高(i)、中(ii)、および低(iii)抗PD1集団として(上から下に)示される。参考のために、抗Fc MACS集団(iv)、「野生型」337_1_C08親クローン(v)、および表示された抗体を有しないHEK293細胞(vi)が示される。
[図51]pINT17-Bi-CMV-エミシズマブ、二重特異性「ノブイントゥホール」の細胞表面発現のためのプラスミドを含む双方向性のCMVおよび伸長因子(pEF)プロモーター、共通の軽鎖IgGエミシズマブ。これは、3つの遺伝子、抗FIXa重鎖、抗FX重鎖、および共通の軽鎖の発現を駆動する3つのプロモーターを有する三シストロン性標的化ベクターである。注釈付きの完全な核酸配列は、BglIIからBstZ171制限部位までのAAVS相同性アームの間に示される。番号付けはBglII制限部位からのものである。主要な特徴は以下に列挙される。
BGHポリA 222~8(逆鎖(reverse strand))
ヒトCカッパ 546~232(逆鎖)
エミシズマブVL 876~547(逆鎖)
イントロンを有するヒトVLリーダー 1143~884(逆鎖)
最小限のCMVプロモーター 1230~1167(逆鎖)
CMVプロモーター 1237~1809
イントロンを有するマウスVHリーダー 1835~1973
エミシズマブ抗FIXa VH 1974~2339
エミシズマブ抗FIXa CH1-3 2340~3317
Mycタグ 3318~3347
PDGFRアンカー 3348~3503
BGHポリA 3553~3767
pEFプロモーター 3818~5152
イントロンを有するヒトVHリーダー 5260~5401
エミシズマブ抗FX VH 5402~5758
エミシズマブ抗FX CH1-3 5759~6733
Mycタグ 6734~6763
PDGFRアンカー 6764~6916
SV40ポリA 6942~7384
[図52]HEK293細胞の表面上に表示されたFIXaおよびFXの二重特異性抗体エミシズマブへの結合
pINT17-Bi-CMV-エミシズマブまたはpINT17-BSD-抗FIXaを、AAVS TALENをコードするプラスミドの存在下でHEK293細胞をトランスフェクトするために使用した。トランスフェクションの24時間後、細胞を分析した抗体ディスプレイおよび抗原FIXaまたはFXに結合する能力。ヒストグラムプロットは、左から右に染色された際の蛍光強度に対する細胞数を示す:(a)二重特異性エミシズマブ(黒色の破線)、(b)抗FIXa IgG(黒色の実線)、(c)HEK293細胞を表示するHEK293細胞について、抗Fc-APC、ストレプトアビジン-PEと事前複合体化したFX-ビオチンもしくはFIXa-ビオチンまたはストレプトアビジン-PEのみ。
[図53]エミシズマブVLの親エミシズマブVLとのアラインメント。
CDRは配列の上の棒によって示される。ドットは、最終的なエミシズマブVLとの同一性を示す。正電荷パッチに寄与する残基は、太字で強調される。
[図54]HEK293細胞の表面上のノットボディのディスプレイとそれらの生物物理学的性質との関係
(a)HEK293細胞を、AAVS TALENの存在下でpINT17-ノットボディでトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの7日後、細胞を、抗Fc PE(FL2)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ヒストグラムは、蛍光強度(抗Fc-PE、x軸)に対する細胞数(y軸)プロットを示し、KB_A12 EETI-II(黒色の実線)、KB_A12 Hstx1(点線)およびKB_A12 ProTxIII(破線)を含む。KB_A12 Hstx1(点線)およびKB_A12 ProTxIII(破線)の跡が重なり、合わさったように見える。
ノットボディを、Expi293細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ノットボディを上に記載されるようにHPLC-SECで分析し、溶出量に対する吸光度のプロットは(b)KB_A12 EETI-II、(c)トラスツズマブおよび(d)KB_A12 ProTx-IIIについて示される。
[図55]ノットボディの変異体ライブラリは、親ノットボディと比較して改善したディスプレイレベルを有するクローンを含む。ノットボディを表示するHEK293細胞を、抗Fc-PEで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。蛍光強度に対する細胞数のヒストグラムプロットは、細胞株を表示する関連する親ノボディ(knobody)対照と比較して3つのライブラリ(抗Fc MACS精製後)について表示される。(左から右へ):(a)KB_A12 ProTxIIIライブラリセットA(点線)とKB_A12 ProTxIII対照(黒線)、(b)KB_A12 ProTxIIIライブラリセットB(点線)とKB_A12 ProTxIII対照(黒線)、(c)KB_A12 HsTx1ライブラリ(点線)とKB_A12 HsTx1対照(黒線)。
pINT17-BSD、主要な特徴(1~7500bp)を示す概略図が示される
pINT17-BSD-D1.3、抗リゾチーム抗体D1.3の表面発現用のデュアルプロモーター抗体発現カセット。注釈付きの完全な核酸配列が示される。特徴:
AAVS左相同性アーム 9~812
ブラストサイジン耐性遺伝子 853~1254
pEFプロモーター 1522~2705
BM40リーダー 2745~2799
ヒト化D1.3 VL 2799~3130
ヒトCカッパ 3138~3443
BGHポリA 3468~3682
CMVプロモーター 3701~4273
イントロンを有するマウスVHリーダー 4299~4426
ヒト化D1.3 VH 4432~4779
最適化されたヒトIgG1 CH1-CH3 4780~5775
Mycタグ 5776~5805
PDGFRアンカー 5806~5961
BGHポリA 6011~6225
AAVS右相同性アーム 6288~7124
f1複製起点 7282~7695
pUC複製起点 7916~8590
カナマイシン耐性遺伝子 9310~10104
[図2]細胞表面でのIgGの発現。
FL3チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。FL3チャネルにおける染色に対して陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。AAVS TALENの存在下でpINT17抗体でHEK293細胞をトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの14日後、抗Fc PE(FL2)で細胞を染色した。蛍光強度(抗Fc-PE、x軸)を示すパネルは、細胞数(y軸)に対してプロットしCNTO607(a)、MEDI1912(b)、およびAng2mAb(c)のペアを含む。すべてのパネルについて、プロットは、染色されたHEK293細胞(点線)、親抗体(破線)、改善された変異体(黒の実線)を含む。
[図3]MEDI-1912およびMEDI-1912-STTの分取サイズ排除クロマトグラフィー。プロテインAアフィニティ精製および透析が後に続くExpi293細胞の一過性トランスフェクションにより抗体を発現させた。精製されたMEDI-1912(0.5ml、1.1mg/ml)またはMEDI-1912 -STT(0.5ml、1.7mg/ml)を、PBS(pH7.4)泳動用緩衝液(running buffer)を使用してAKTA Pure系に接続されたSuperdex 200 10/300カラムに負荷した。y軸の280nm(mAU)での吸光度に対してx軸にプ
ロットされた溶出量(ml)us。MEDI-1912およびMEDI-1912-STTの溶出量(Ve)は、それぞれ10.3mlおよび11.7mlであった。MEDI-1912は、自己相互作用を示す以前の溶出量を示す。
[図4]MED-1912可変重鎖(VH)のDNAおよびタンパク質配列。
ライブラリ作成のために採用されるプライマーは、核酸配列の上に標識される。
[図5]混合細胞のFACS分離は、抗体発現に基づく抗体集団を表示した。
MEDI-1912とMEDI-1912_STT IgG遺伝子の均等な混合は、HEK293細胞のAAVS遺伝子座へのヌクレアーゼ指向組入れを介して標的化された。トランスフェクションから15日後、BD Influx選別機を使用してFACSによる抗体発現に基づいて、この混合細胞集団を分離した。フィコエリトリン(PE)で標識された抗Fcおよびアロフィコシアニン(APC)で標識されたNGF-ビオチン/ストレプトアビジンで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λem=450/40、λexc=355チャネルでの染色に対する陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。
a.混合入力集団(破線)、およびMEDI-1912(灰色線)とMEDI-1912_STT(黒色線)を表示するモノクローナルHEK293細胞株についての細胞数に対する抗Fc-PEの蛍光強度のヒストグラムプロット。
b.ドットプロットは、抗体発現レベルを表す抗Fc-PE(x軸)についての蛍光強度を示し、y軸上で抗原結合(NGF-ビオチン/NGF-ビオチン/ストレプトアビジン-APC)についての蛍光強度に対してプロットされる。高抗体発現集団と低抗体発現集団とを分離するために選択されたゲートは、P5およびP6と標識され、ドットプロット上に黒色ボックスとして示される。総イベント数は3.9×106個の細胞であり、P5およびP6ゲートにおいて選別された細胞の数は、それぞれ2.5×105および2.8×105個の細胞であった。
[図6]哺乳動物細胞のディスプレイレベルにより選択された抗体の富化。
ゲート5および6において選別された細胞(図5)を拡大し、ゲノムDNAを調製し、PCRによって抗体VH遺伝子を単離した。2つの抗体集団をNextgen配列決定によって分析して、2つのゲーティングされた集団におけるMEDI-1912およびMEDI-1912_STTの割合を決定した。ヒストグラムは、低抗体発現集団(ゲート6)および高抗体発現集団(ゲート5)におけるMEDI-1912(斜線の棒)およびMEDI-1912_STT(黒色の棒)のパーセンテージ頻度を示す。
[図7]抗体発現に基づくMEDI-1912ライブラリ抗体集団のFACS分離。NNSオリゴヌクレオチド指向変異誘発がW30、F31、およびL56をコードするコドンをランダムに変異させるために使用される、MENS-1912 IgG遺伝子のライブラリを、HEK293細胞のAAVS遺伝子座へのヌクレアーゼ指向組入れを介して標的化した。トランスフェクションから15日後、BD Influx選別機を使用してFACSによる抗体発現および抗原結合に基づいて、この混合細胞集団を分離した。フィコエリトリン(PE)で標識された抗Fcおよびアロフィコシアニン(APC)で標識されたNGF-ビオチン/ストレプトアビジンで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λem=450/40、λexc=355チャネルでの染色に対する陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。ドットプロットは、抗体発現レベルを表す抗Fc-PE(x軸)についての蛍光強度を示し、モノクローナル細胞株を表示する親MEDI-1912(a)、モノクローナル細胞株を表示するMEDI-1912_STT(b)ならびにMEDI-1912アミノ酸30位、31位および56位ランダムライブラリ(c)についてy軸上で抗原結合(NGF-ビオチン/NGF-ビオチン/ストレプトアビジン-APC)についての蛍光強度に対してプロットされる。分析用に選択されたゲートは、P5およびP6と標識され、ドットプロット上にボックスとして示される。
[図8]選択されたMEDI-1912変異型の配列分布。
哺乳動物ディスプレイ後のMEDI-1912 VHライブラリについてのMEDI-1
912 VH30位、31位、および56位、ならびにFc発現およびNGF結合に対してゲーティングされたFACSでのアミノ酸同一性頻度のヒストグラムプロット(P5ゲート、図7)。アミノ酸(1文字コード)は、隣接するアミノ酸30、斜線の棒および31、黒色の棒(a)およびアミノ酸56(b)についてy軸上に頻度(発生パーセンテージ)に対してx軸上にプロットされる。56位のロイシンを分析から除外した。
[図9]ボコシズマブマウス親抗体5A10 VH(A)およびVL(B)とヒト化中間抗体5A10-iおよびボコシズマブとのアラインメント。
CDRは配列の上のバーで示され、変異される残基は太字および下線で強調される。パラトピック残基(PCSK9への直接結合に寄与するアミノ酸)は、斜体および下線で強調される。ドットは親マウスmAb 5A10との同一性を示す。
[図10]抗体哺乳動物はボコシズマブおよび親ヒト化中間抗体5A10-iの発現を表示する
ボコシズマブまたは5A10-i)IgGをコードする標的化ベクターpINT17を、TALEヌクレアーゼを介してHek293細胞のAAVS遺伝子座に組み入れた。トランスフェクションの1、8、または21日後(dpt)、細胞(106)を抗Fc-PEで染色し、106の細胞をiQue Intellicyteフローサイトメーターでフローサイトメトリーによって分析した。死んだ細胞を分析から除外した。ヒストグラムプロットは、陰性対照としてインキュベートされた野生型HEK293細胞の染色を有するトランスフェクションの1、8、および21日後(dpt)でのボコシズマブおよび5A10-i細胞ディスプレイ集団についての細胞数に対する蛍光強度(抗Fc-PE)を示す。
[図11]ボコシズマブVHのヒト生殖細胞系列配列(IMGT)とのアラインメント。
ボコシズマブVH(Query_1)は、ヒトVDJデータベースに対するIg Basic Local Alignment Search(IgBLAST)に関するものであった。結果は、フレームワーク領域1(FR1)、相補性決定領域1(CDR1)、FR2、CDR2、FR3を包含するクエリ配列(同一性のパーセント順)(第2列)に対するアラインメントとして提示される。ヒト生殖細胞系列細胞は列1に示される。ボコシズマブVH配列(.)および差異(単一アミノ酸コード)に対する残基の同一性は、マルチプルアラインメントにおいて表示される。
[図12]ボコシズマブのVH変異型およびVLに加え停止コドンテンプレートをコードするDNA配列。元の「野生型」ボコシズマブ(行f)と比較した変動は、太字および下線で強調される。隣接する5’および3’ VH制限部位(NcoIおよびXhoI)またはVL制限部位(NheIおよびNotI)に下線が引かれている。VL停止コドンは太字および下線で強調される。
[図13]ボコシズマブライブラリのMACS精製後の分析フローサイトメトリー分析
ボコシズマブライブラリでトランスフェクトされたHek293細胞を、抗FcまたはPCSK9iのいずれかで7dptにMACS精製した。(a)フローサイトメトリードットプロットは、MACS後の精製ライブラリ、HEK293細胞ならびに未選別ライブラリ、ボコシズマブおよび5A10iトランスフェクタント、9dptについてのPCSK9結合(FL4、y軸)に対してプロットされた抗Fc発現(FL2、x軸)について示される。(b)細胞数に対してプロットされた蛍光強度のヒストグラム(抗Fc、FL2、x軸)。プロットは、(上から下に)HEK293コントロール、ボコシズマブ、5A10i、ボコシズマブライブラリ、抗PCSK9 MACS精製ボコシズマブライブラリ、および抗Fc MACS精製ボコシズマブライブラリである。
[図14]抗原結合または抗Fcに基づいて以前にMACS精製されたボコシズマブライブラリのBD Influx選別機ドットプロット。
ボコシズマブIgG遺伝子のライブラリを、HEK293細胞のAAVS遺伝子座へのヌクレアーゼ指向組入れを介して標的化した。PCSK9結合(a)または抗Fc(b)に
基づいて、この混合細胞集団をまずMACS精製した。トランスフェクションの16日後、BD Influx選別機を使用して、FACSによる抗体発現と抗原結合に基づいて、MACS富化ライブラリを分離した。フィコエリトリン(PE)で標識された抗Fcおよびアロフィコシアニン(APC)で標識されたPCSK9-ビオチン/ストレプトアビジンで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λem=450/40、λexc=355チャネルでの染色に対する陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。ドットプロットは、抗体発現レベルを表す抗Fc-PE(x軸)についての蛍光強度を示し、y軸上に抗原結合(PCSK9-ビオチン/ストレプトアビジン-APC)についての蛍光強度に対してプロットされる。分析用に選択されたゲートはP5と標識され、P6はドットプロット上のボックスとして示される。
[図15]哺乳動物ディスプレイ選択後のボコシズマブVH分布。
ランダムな選択されていない入力クローン(84)、選別された抗原(75)、および選択されたFc(85)を配列決定し、VH同一性を決定した。ヒストグラムプロットは、入力(白色の塗りつぶされた棒)、選択された抗原および抗Fc FACSが後に続く抗原MACS(黒色の塗りつぶされた棒)ならびに選択された抗原および抗Fc FACSが後に続く抗Fc MACS(灰色の塗りつぶされた棒)哺乳動物細胞選択集団についての発生パーセンテージに対してプロットされたx軸上にVH生殖細胞系列同一性を示す。
[図16]哺乳動物ディスプレイ選択後のボコシズマブVL配列分析。
ランダムな選択されていない入力クローン(84)、選別された抗原(75)、および選択されたFc(85)を配列決定し、VL配列を決定した。3つの変異コドンについて平均pIと脂肪族インデックスを計算した。これは、哺乳動物ディスプレイ選択抗体についてのpIおよび脂肪族指数の両方の低下を示した。
[図17]抗体ディスプレイレベル(抗Fc)および抗原結合の両方についてFACS富化が後に続くMACSによって抗原結合について富化された、哺乳動物ディスプレイボコシズマブクローンを列挙した表。
クローンを配列決定し、VH CDR1およびCDR2ならびにVL CDR2およびCDR3の1文字のアミノ酸配列が、太字と赤色で強調される元のボコシズマブ配列からの変動で示される。ボコシズマブ配列を保持した標的化されたアミノ酸には、下線が引かれている。元の親抗体ボコシズマブおよび5A10-iを含む抗体の、キャプチャーELISAにおける抗原への結合を実行し、蛍光ユニットにおける結合シグナルが列2に示される。Liu et al,201430によって以前に説明されたようにAC-SINSアッセイを実行し、列3は無抗体PBS対照と比較した最大吸光波長シフトを示す(nm)。選択されたヒトVH生殖細胞系列は、実施例5において詳述されるように、列6にも文字で示される。
a:VH Y33A-IGHV1-3*01
b:VH Y33D-IGHV1-8*01
c:VH S52N、F54S、R57S-IGHV1-46*01
d:VH Y33A、S52N、F54S、R57S(a.およびc.の変異体は組み合わせられた)
e:VH Y33D、S52N、F54S、R57S(b.およびc.の変異体は組み合わせられた)
f:ボコシズマブ「野生型」配列
[図18]抗PCSK9 IgG1抗体のHPLC-SEC。
抗体を、Expi-293細胞の一過性トランスフェクションにより発現させ、プロテインAクロマトグラフィーでアフィニティ精製し、透析した。Agilent 1100
HPLC機器を使用して0.35ml/minの流量でAgilent AdvancedBio SEC 300A、2.7um、4.6×300mmカラム(Agilent Technologies,Cat.No.PL1580-5301)上に試料(1mg/mlで2μl)を負荷した。選択された抗体について吸光度に対する保持時間のプ
ロットが示される。黒から次第に薄い灰色への色合いは、5A10-i、884_01_G01(哺乳動物細胞ディスプレイによって特定される)、ボコシズマブ、アリロクマブである。
[図19]ゲル濾過分析ニボルマブ(a)およびベセンクマブ(b)。
プロテインAアフィニティ精製および透析が後に続くExpi293細胞の一過性トランスフェクションにより抗体を発現させた。精製されたニボルマブ(0.5ml、1.3mg/ml)またはベセンクマブ(0.5ml、1.2mg/ml)を、PBS(pH7.4)泳動用緩衝液を使用してAKTA Pure系に接続されたSuperdex 200 10/300カラムに負荷した。y軸の280nm(mAU)での吸光度に対してx軸にプロットされた溶出量(ml)us。ニボルマブおよびベセンクマブについての溶出量(Ve)は、それぞれ12.0 mlおよび13.7 mlであった。
[図20]4oCで2週間貯蔵後のニボルマブ(a)およびベセンクマブ(b)の安定性決定。
サイズ排除クロマトグラフィー(図19を参照されたい)によってベセンクマブおよびニボルマブを精製し、PBS(pH7.4)において0.5mg/mlに濃度を調整した。次いで、抗体を4℃で2週間保存した。製造業者の指示に従って、Zetasizer APS(Malvern Instruments、Malvern、UK)を使用して20oCで動的光散乱測定を実行した。流体力学的半径を、アインシュタイン・ストークス方程式で評価し、散乱強度に対してプロットした。ベセンクマブについての複数の凝集ピーク(b)と比較して、ニボルマブ(a)について単一の単分散ピークを観察した。
[図21]細胞表面上のIgGに結合するヒト血清。
FL3チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。FL3チャネルにおける染色に対して陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。AAVS TALENの存在下で、pINT17-ニボルマブまたはpINT17-ベセンクマブで細胞をトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの20日後、抗Fc PE(FL2)およびDylight 633(325-0000、Innova)で標識されたヒト血清(H4522、Sigma)で細胞を染色した。パネルは、トランスフェクトされていないHEK293細胞(a)、pINT17-ニボルマブ(b)またはpINT17-ベセンクマブ(c)でトランスフェクトされたHEK293細胞である。
[図22]親和性、抗原の濃度、および抗体の濃度の間の関係
a KD 10nM(破線)または0.1nM(実線)のいずれかの抗体の異なる濃度を有する0.1nM抗原を使用した複合体の濃度。
bi 異なる抗体濃度でのより低い親和性(KD 10nM)に対するより高い親和性抗体(KD 0.1nM)についての0.1nM抗原への結合の相対的選択性
低い抗原濃度(「ストリンジェントな」)である場合でさえも、高い抗体濃度では比較的低い選択性があるが、これは抗原濃度が低下するにつれて増加する。
[図23]抗体ディスプレイレベルを制御するためのスプライスアクセプター/ドナー変異型。
スプライスドナー領域を含むHindIII部位から5’イントロンまでの核酸配列は、pINT17-J9、J10、J29およびJ30変異型について示される。元のヒト「野生型」配列はJ9であり、J10、J29、J30についてのスプライスジャンクションでJ9と異なるヌクレオチドには下線が引かれている。
[図24]pINT17-J30、低下したディスプレイ表面発現についてのデュアルプロモーター抗体IgG発現カセット。注釈付きの核酸配列は、XhoI(4804)およびSbfI(8387)の制限部位の間に示される。特徴:
IgG1 CH1-3 4805~5808
スプライスジャンクション 5801~5802
イントロン 5802~7104
M1エクソン 7105~7239
BGH pA 7264~7478
AAVS右相同性アーム 7544~8381
3’β-グロビンインスレーター8421~8492
[図25]代替膜貫通ドメインおよびスプライス変異型を使用する細胞表面上のIgGの低下した表面発現。
FL3チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。FL3チャネルにおける染色に対して陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。AAVS TALENの存在下で、pINT17標的化ベクターで細胞をトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの27日後、抗Fc PE(FL2)で細胞を染色した。フローサイトメトリーのドットプロットパネルは、pINT17-J9-ニボルマブ(a)、pINT17-J10-ニボルマブ(b)、pINT17-J29-ニボルマブ(c)、pINT17-J30-ニボルマブ(d)およびpINT17-BSD-ニボルマブ(e)を含む。
[図26]pINT17-BSDまたはpINT17-J30標的化ベクターから発現された抗体についての細胞表面上のIgGディスプレイレベルの定量化
マウスIgG-PE標識で染色されたQuantum Simply Cellular抗マウスIgGビーズ(カタログ番号815、Bangs Laboratories Inc)の製造業者の説明書に記載されるように、キャリブレーションビーズFL2染色を実行した。(a)標識されたヒストグラムプロットは、それぞれ12257、72745、283360、886417のビーズコピー数を表す、1、2、3、および4と標識されたピークを有するキャリブレーションビーズセットの染色を示す。ブランクのピークは、捕捉抗体のないビーズを表す。(b)コピー数(y軸)に対してプロットされた蛍光強度の中央値(x軸)を示すキャリブレーショングラフ。pINT17-BSDまたはpINT17-J30発現カセットのいずれかからの337_1_C08(c)およびニボルマブ(d)を表示する細胞株を、抗Fc-PE(5μl、0.1mg/ml;105細胞)で染色した。FL3チャネルにおける前方散乱と染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。FL3チャネルにおける染色に対して陽性の細胞(7-AADを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。ヒストグラムのプロットは、PDGFR TMを有するpINT17-BSD(標識されかつ黒色の線)、pINT17-J30(標識されかつ点線)ならびに337_1_C08(c)およびニボルマブ(d)を表示する細胞についての野生型HEK293細胞株(灰色の実線)についての細胞数に対して蛍光強度をそれぞれ示す。
[図27]細胞ディスプレイのコピー数の低下によって、哺乳動物ディスプレイによるそれらの標的に対する異なる親和性を有する抗体の分離が可能になる。
ニボルマブおよび337_1_C08抗体を表示するHek293細胞を、それぞれ50nMセルトラッカー緑色および50nMセルトラッカー赤色で標識した。(a)J30スプライスバリアントを使用したディスプレイを示し、(b)pINT17-BSDベクターによってコードされたPDGFR膜貫通ドメインを使用したディスプレイを実証する。標識された細胞を均等に混合し、抗原結合に基づいてMACSを選別した。インテリサイト(intellicyt)フローサイトメーターを使用して選別された細胞を分析した。ドットプロットは、x軸(FL1)上にニボルマブを、y軸(FL4)上に337_1_C08を表す。パネルi、ii、iii、およびivは、それぞれMACS精製のために採用された10nM、1nM、0.1nMの抗原、抗原がないことを表す。
[図28]pINT18-Tet1、低下したディスプレイ表面発現のための誘導性プロモーター抗体IgG発現ベクター。注釈付きの核酸配列は、AsiSI(5)およびSbfI(7672)制限部位の間に示される。複製の起点およびカナマイシン耐性遺伝子を包含する、AsiSIおよびSbfI部位(7673~10922および1~4)の外側のベクター骨格は、pINT17-BSDと同一である(図1)。
主要な特徴:
AAVS左相同性アーム 9~812
ブラストサイジン耐性遺伝子 853~1254
CMVプロモーター 1540~2112
逆Tet活性化因子(tTA)CDS 2164~3168
SV40 pA 3178~3395
tetOヘプタマー 3679~3932
最小限のCMVプロモーター(PminCMV)3946~4005
BM40リーダー 4016~4066
抗PD1 MK3475 VL 4068~4413
ヒトCカッパ 4421~4738
フューリン切断部位 4745~4756
P2Aペプチド 4757~4816
イントロンを有するマウスVHリーダー 4829~4960
抗PD1 MK3475 VH 4962~5321
最適化されたヒトIgG1 CH1-CH3 5322~6317
Mycタグ 6318~6347
PDGFRアンカー 6348~6503
BGHポリA 6553~6767
AAVS右相同性アーム 6829~7666
3’β-グロビンインスレーター7706~7777
f1複製起点 7824~8237
pUC複製起点 8458~9132
カナマイシン耐性遺伝子 9852~10646
[図29]誘導性哺乳動物ディスプレイ発現
pINT18-Tet1-377_1_C08およびTALEヌクレアーゼで同時トランスフェクトされたHEK293細胞株ならびにブラストサイジンの存在下で20日間選択された安定した細胞集団からの染色結果を表すヒストグラム。試料を、20mlで5×105細胞/mlに分割し、20ng/ml、2ng/mlおよび0ng/mlのドキシサイクリンで誘導した。誘導の24時間後、各ドキシサイクリン誘導サンプルからの1×106個の細胞を使用してフロー染色を行った。抗Fc-PEおよびTOPRO-3生存率染色を使用して細胞を染色した。ヒストグラムは、細胞数に対してプロットされたFL2チャネル(抗Fc-PE)に関する蛍光強度を示す。HEK293 WT対照(灰色の実線)、0ng/mlドキシサイクリン(黒色の破線)、2ng/mlドキシサイクリン(黒い点線)および20ng/mlドキシサイクリン(黒色の実線)で誘導されたHEK293-pINT18-Tet1-377_1_C08安定細胞株。
[図30]細胞の結合はFcRnに対する抗体を表示した。
ブリアキヌマブおよびウステンキヌマブ(Ustenkinumab)を発現するHEK293細胞を、異なる緩衝液を使用して、ストレプトアビジンPE(11nM)と事前複合体化したビオチン化FcRn(50nM)で染色した。
a.Hek293 WT
b.ストレプトアビジンPE対照
c.緩衝液pH6.0で染色された細胞
d.緩衝液pH7.4で染色された細胞
[図31]HEK293細胞のFACS分離は、抗メソテリンIgGをディスプレイレベルで表示した。
抗メソテリン抗体遺伝子の集団を、ヌクレアーゼ媒介性遺伝子導入により、HEK293細胞のヒトAAVS遺伝子座に組み入れた。抗体を表示したHEK293細胞のポリクローナル集団を、抗ヒトFc-PEで染色することにより、抗体ディスプレイレベルに従ってFACSによって分離した。トランスフェクションの16日後、BD Influx選別機を使用したFACSによる抗体発現に基づいて、MACS富化ライブラリを分離した
。フィコエリトリン(PE)で標識された抗Fcで細胞を染色した。前方散乱および染色を使用して生存細胞について分析に焦点を当てた。λem=450/40、λexc=355チャネルでの染色に対する陽性の細胞(DAPIを取り込んだ非生存細胞を表す)を除外した。ヒストグラムは、抗体発現レベルを表す抗Fc-PEについての蛍光強度(x軸)を示し、y軸上の細胞数に対してプロットされる。分析用に選択されたゲートは、それぞれ低、中、高のディスプレイレベルの集団をすP4、P6、およびP5と標識される。
[図32]高ディスプレイレベルグループ(実線)および低ディスプレイレベルグループ(点線)にそれぞれ由来する2つの抗メソテリンIgG1抗体クローンのHPLC-SEC。
[図33]MACSを使用したDNA結合とDNA結合剤の枯渇。(A)HEK293細胞(灰色の実線)、またはストレプトアビジンPEで検出されたビオチン化DNAで染色されたウステキヌマブ(破線)、ブリアキヌマブ(長破線)およびアマツキシマブ(点線)を表示するHEK293細胞のオーバーレイ、(B)MACS選別の前にDNAで染色されたウステキヌマブ(標識なし、Q4)、アマツキシマブ(CellTace Far赤色で標識された、X軸)およびブリアキヌマブ(CellTrace CFSEで標識された、Y軸)を表示する3つの抗体細胞集団の混合物を表すドットプロット、(C)DNA結合剤の枯渇を示すフロースルーのドットプロット。
[図34]ヘパリン-FITC(x軸)および抗ヒトFc APC(y軸)での二重染色。(a)ウステキヌマブ(灰色)とブリアキヌマブ(黒色)のオーバーレイを示すドットプロット。(b)ウステキヌマブ(灰色)とガニツマブ(黒色)のオーバーレイを示すドットプロット。オーバーレイプロット内のゲートは、細胞が高発現因子およびヘパリンに対する非結合剤であることを示す。
[図35]DyLight 633(x軸)および抗ヒトFc PE(y軸)で複合体化されたシャペロンでの二重染色。(a)Hsp70-DyLight 633および抗ヒトFc PEで二重染色されたウステキヌマブ(灰色)およびブリアキヌマブ(黒色)のオーバーレイを示すドットプロット。(b)Hsp90-DyLight 633および抗ヒトFc PEで二重染色されたウステキヌマブ(灰色)およびブリアキヌマブ(黒色)のオーバーレイを示すドットプロット。オーバーレイプロット内のゲートは、細胞が高発現因子およびシャペロン(Hsp70およびHsp90)に対する非結合剤であることを示す。(cおよびd)オーバーレイヒストグラムプロットは、レンジルマブおよびブレンツキシマブの結合Hsp70およびHsp90をそれぞれ示す。
[図36]抗ヒトFc PEで染色した抗体および多反応性プローブについてのヒストグラムプロット。抗体の選択を表示する安定したモノクローナルHEK293細胞株は、ヌクレアーゼ媒介性の遺伝子組入れによって創出された。蛍光強度(x軸)に対する細胞数(y軸)のヒストグラムプロットは、次のプローブでHEK293細胞の表面上に表示された様々な抗体について表示される:(a)抗ヒトFc-PE、(b)ストレプトアビジンPEを使用して検出されたビオチン化DNA、(c)ヘパリン-FITC、(d)ストレプトアビジンPE、(e)Hsp70-DyLight 633、(f)Hsp90-DyLight 633、および(g)ストレプトアビジンPEと事前複合体化したFcRn。
[図37]pINT17-Tet-D1.3、誘導性抗体IgG哺乳動物ディスプレイ発現ベクター。注釈付きの完全な核酸配列は、AAVS相同性アームとBglIIからBstZ171制限部位までのプロモーターレスブラストサイジン遺伝子との間に示される。番号付けはBglII制限部位からのものである。主要な特徴は以下に列挙される。BGHポリA 223~9(逆鎖(reverse strand))
ヒトCカッパ 544~236(逆鎖)
D1.3 VL 877~549(逆鎖)
イントロンを有するヒトVLリーダー 1168~883(逆鎖)
TRE3Gプロモーター 1230~1618
CMVプロモーター 1237~1809
イントロンを有するVHリーダー 1644~1782
D1.3 VH 1783~2127
IgG1 CH1-3 2125~3120
Mycタグ 3121~3150
PDGFRアンカー 3151~3306
BGHポリA 3356~3570
pEFプロモーター 3621~4955
rtTA-3G 5063~5809
SV40ポリA 5832~6274
[図38]誘導性IgG哺乳動物ディスプレイ細胞株。1549_02_D06(1)、1535_01_E03(2)、および337_1_C08(3)、ボコシズマブ(4)、884_01_G01(5)、5A10i(6)、およびアリロクマブ(7)。27dptで、0(a)、2(b)、4(c)、または100(d)ng/mlドキシサイクリンの添加により細胞株を誘導した。誘導の24時間後、細胞を抗Fc-PEで染色した。細胞数に対してプロットされた蛍光強度のヒストグラム(抗Fc、FL2、x軸)。
[図39]誘導性IgG哺乳動物ディスプレイ細胞株:細胞表面IgGターンオーバー
抗PD1抗体のVHとVLを含むpINT17-Tet:1549_02_D06(1)、1535_01_E03(2)、および337_1_C08(3)および抗PCSK9抗体ボコシズマブ(4)、884_01_G01(5)、5A10i(6)およびアリロクマブ(7)を、AAVS TALEヌクレアーゼ媒介性遺伝子組入れおよびブラストサイジン選択によって安定したHEK293細胞株を創出するために使用した。27dptで、100ng/mlドキシサイクリンの添加により細胞株を誘導した。誘導の48時間後、細胞を抗Fc-PEで染色した。蛍光強度のヒストグラム(抗Fc、FL2、x軸)は、細胞数に対してプロットされて示される。
[図40]抗PD1抗体1549_02_D06(PD-1についてKD=2.9nM)および337_1_C08(PD-1についてKD=74nM)を表示する細胞株を、(a)0、(b)2、(c)4および(d)100ng/mlドキシサイクリンでそれぞれ誘導した。前方側方散乱(FSC、x軸)に対するFL1チャネル(y軸)における蛍光のドットプロットが示される。1549_02_D06を表示する標識された細胞は、各ドットプロットの上部の象限に示され、337_1_C08を表示する標識されない細胞は、下部の象限に示される。パネルi、ii、iii、およびivは、それぞれMACS精製のために採用されたPD-1-ビオチンの0.1、1、10nM濃度を表す。パネルivは、入力されたMACS前の集団を表す。各細胞集団のパーセンテージは、各象限内に示される。
[図41]ウステキヌマブ(灰色)とブリアキヌマブ(黒色)の二重染色集団のオーバーレイドットプロット。ストレプトアビジンPE(x軸)および抗ヒトFc APC(y軸)と事前複合体化した50nM FcRn-Aviタグでの二重染色。プロット内のゲートは、FcRn結合剤からFACSで選別され得るFcRn非結合剤としてウステキヌマブを表す。
[図42]抗メソテリン可変重(VH)ドメイン抗体集団の生殖細胞系列分析。図は、各VH生殖細胞系列について、入力および低、中、高の哺乳動物のディスプレイゲーティングされた集団における発生の頻度をプロットする。
[図43]抗メソテリン可変光カッパ(VLκ)ドメイン抗体集団の生殖細胞系列分析。図は、各VLκ生殖細胞系列について、入力および低、中、高の哺乳動物のディスプレイゲーティングされた集団における発生の頻度をプロットする。
[図44]抗メソテリン可変軽λ(VLλ)ドメイン抗体集団の生殖細胞系列分析。図は、各VLλ生殖細胞系列について、入力および低、中、高の哺乳動物のディスプレイゲーティングされた集団における発生の頻度をプロットする。
[図45]抗メソテリンIgG1抗体のHPLC-SEC。抗体を、Expi-293細胞の一過性トランスフェクションにより発現させ、プロテインAクロマトグラフィーでアフィニティ精製し、透析した。Agilent 1100 HPLC機器を使用して0.35ml/minの流量でAgilent AdvancedBio SEC 300A、2.7um、4.6×300mmカラム(Agilent Technologies,Cat.No.PL1580-5301)上に試料(1mg/mlで2μl)を負荷した。保持時間に対する215nmでの吸光度のプロットが、選択された抗メソテリン抗体について示される:高ディスプレイレベルグループに由来する932_01_A03(黒色の線)および930_01_A12(交互の点線および破線)930_01_B02(長い破線)、低ディスプレイレベルグループに由来する930_01_C12(短い破線)。
[図46]ヒトおよびCHO AAVSイントロン1 TALE-ヌクレアーゼ(TALEN)標的結合部位のアラインメント。CHO AAVSイントロン1のDNA配列を、ENSEMBL注釈付きCHO-K1グルタミンシンセターゼ(GS)ノックアウト細胞株から得た、アクセッション:CHOK1GS_HDv1:scaffold_52:2374828:2406177:1。番号付けは、ヒトPPP1R12Cイントロン1の開始を参照される。太字は、ヒトTALEN標的部位の左右のアームを示す。アスタリスクはヒトおよびCHO配列の間の相同性を示し、破線(-)は欠失を示す。下線および斜体は、pINT17標的化ベクター内のAAVS左および右相同性アームの端を示す。このアラインメントを、pINT17-CHO標的化ベクター内のCHO AAVS相同性アーム、および比較のために、CRISPR/Cas9ガイドRNAを設計するために使用した。1~3と番号付けされたセンスまたはアンチセンスCRISPRガイドRNA認識部位は、それぞれ配列の上または下に表示される。
[図47]ベクターpINT17-BSD-CHO内のCHO AAVS相同性アーム、CHO細胞上の表面発現用のデュアルプロモーター抗体IgG発現カセット。注釈付きDNA配列が、ベクター内の左右のCHO AAVS相同性アームについて示される。この図に示されていないものを含む、デュアルプロモーター抗体発現カセットを包含するすべての残りの特徴は、ベクターpINT17-BSD(図1)について説明されるとおりであり、以下に列挙される。
特徴:
CHO AAVS左相同性アーム 9~899
ブラストサイジン耐性遺伝子 942~1343
pEFプロモーター 1611~2794
BM40リーダー 2834~2885
ヒト化D1.3 VL 2888~3219
ヒトCカッパ 3227~3532
BGHポリA 3468~3682
CMVプロモーター 3790~4362
イントロンを有するマウスVHリーダー 4388~4515
ヒト化D1.3 VH 4521~4868
最適化されたヒトIgG1 CH1-CH3 4869~5864
Mycタグ 5865~5894
PDGFRアンカー 5895~6050
BGHポリA 6100~6314
CHO AAVS左相同性アーム 6376~7266
f1複製起点 7424~7837
pUC複製起点 8058~8732
カナマイシン耐性遺伝子 9452~10246
[図48]TALENまたはCRISPR/Cas9ヌクレアーゼ媒介性遺伝子組入れによるCHO細胞の表面上の抗体のディスプレイ。細胞数に対してプロットされた蛍光
強度のヒストグラム(抗Fc、FL2、x軸)。プロットは(上から下に)、CHO対照、pINT17-BSD-CHO V2-ニボルマブマイナスヌクレアーゼ、pINT17-BSD-CHO V1-ニボルマブマイナスヌクレアーゼ、pINT17-BSD-CHO V1-ニボルマブプラスCHO TALEN、pINT17-BSD- CHO
V1-ニボルマブプラスCRISPR3、pINT17-BSD-CHO V1-ニボルマブプラスCRISPR2、pINT17-BSD-CHO V1-ニボルマブプラスCRISPR1である。
[図49]CHOの表面上の抗体のディスプレイレベル。CHO細胞の細胞数(塗りつぶされたプロット)に対してプロットされた蛍光強度(抗Fc、FL2、x軸)のヒストグラム(a)ボコシズマブ(実線)および884_01_G01(破線)。(b)MEDI-1912(実線)およびMEDI-1912-STT(破線)。
[図50]その後の結合選択のために哺乳動物ディスプレイを使用する「開発性が増強された」集団の作成
a.抗PD1 337_1_C08 VH(i)およびVL(ii)鎖の配列。ヌクレオチド配列は、コドンの上に翻訳1文字のアミノ酸コードで示される。CDRは注釈付き(下線付き)であり、CDR3アミノ酸は太字で強調された部位指向変異誘発を対象とする。
b.抗PD1抗体のVHおよびVL CDR3哺乳動物ディスプレイライブラリを、高、中、低の抗体細胞ディスプレイレベルに基づいてFACSで分離し、抗Fc-PEでの染色による分析フローサイトメトリーで分析した。Fc発現(x軸)に対する細胞数(y軸)のヒストグラムプロットは、高(i)、中(ii)、および低(iii)抗PD1集団として(上から下に)示される。参考のために、抗Fc MACS集団(iv)、「野生型」337_1_C08親クローン(v)、および表示された抗体を有しないHEK293細胞(vi)が示される。
[図51]pINT17-Bi-CMV-エミシズマブ、二重特異性「ノブイントゥホール」の細胞表面発現のためのプラスミドを含む双方向性のCMVおよび伸長因子(pEF)プロモーター、共通の軽鎖IgGエミシズマブ。これは、3つの遺伝子、抗FIXa重鎖、抗FX重鎖、および共通の軽鎖の発現を駆動する3つのプロモーターを有する三シストロン性標的化ベクターである。注釈付きの完全な核酸配列は、BglIIからBstZ171制限部位までのAAVS相同性アームの間に示される。番号付けはBglII制限部位からのものである。主要な特徴は以下に列挙される。
BGHポリA 222~8(逆鎖(reverse strand))
ヒトCカッパ 546~232(逆鎖)
エミシズマブVL 876~547(逆鎖)
イントロンを有するヒトVLリーダー 1143~884(逆鎖)
最小限のCMVプロモーター 1230~1167(逆鎖)
CMVプロモーター 1237~1809
イントロンを有するマウスVHリーダー 1835~1973
エミシズマブ抗FIXa VH 1974~2339
エミシズマブ抗FIXa CH1-3 2340~3317
Mycタグ 3318~3347
PDGFRアンカー 3348~3503
BGHポリA 3553~3767
pEFプロモーター 3818~5152
イントロンを有するヒトVHリーダー 5260~5401
エミシズマブ抗FX VH 5402~5758
エミシズマブ抗FX CH1-3 5759~6733
Mycタグ 6734~6763
PDGFRアンカー 6764~6916
SV40ポリA 6942~7384
[図52]HEK293細胞の表面上に表示されたFIXaおよびFXの二重特異性抗体エミシズマブへの結合
pINT17-Bi-CMV-エミシズマブまたはpINT17-BSD-抗FIXaを、AAVS TALENをコードするプラスミドの存在下でHEK293細胞をトランスフェクトするために使用した。トランスフェクションの24時間後、細胞を分析した抗体ディスプレイおよび抗原FIXaまたはFXに結合する能力。ヒストグラムプロットは、左から右に染色された際の蛍光強度に対する細胞数を示す:(a)二重特異性エミシズマブ(黒色の破線)、(b)抗FIXa IgG(黒色の実線)、(c)HEK293細胞を表示するHEK293細胞について、抗Fc-APC、ストレプトアビジン-PEと事前複合体化したFX-ビオチンもしくはFIXa-ビオチンまたはストレプトアビジン-PEのみ。
[図53]エミシズマブVLの親エミシズマブVLとのアラインメント。
CDRは配列の上の棒によって示される。ドットは、最終的なエミシズマブVLとの同一性を示す。正電荷パッチに寄与する残基は、太字で強調される。
[図54]HEK293細胞の表面上のノットボディのディスプレイとそれらの生物物理学的性質との関係
(a)HEK293細胞を、AAVS TALENの存在下でpINT17-ノットボディでトランスフェクトした。安定した個体群は、ブラストサイジンで選択された。トランスフェクションの7日後、細胞を、抗Fc PE(FL2)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ヒストグラムは、蛍光強度(抗Fc-PE、x軸)に対する細胞数(y軸)プロットを示し、KB_A12 EETI-II(黒色の実線)、KB_A12 Hstx1(点線)およびKB_A12 ProTxIII(破線)を含む。KB_A12 Hstx1(点線)およびKB_A12 ProTxIII(破線)の跡が重なり、合わさったように見える。
ノットボディを、Expi293細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ノットボディを上に記載されるようにHPLC-SECで分析し、溶出量に対する吸光度のプロットは(b)KB_A12 EETI-II、(c)トラスツズマブおよび(d)KB_A12 ProTx-IIIについて示される。
[図55]ノットボディの変異体ライブラリは、親ノットボディと比較して改善したディスプレイレベルを有するクローンを含む。ノットボディを表示するHEK293細胞を、抗Fc-PEで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。蛍光強度に対する細胞数のヒストグラムプロットは、細胞株を表示する関連する親ノボディ(knobody)対照と比較して3つのライブラリ(抗Fc MACS精製後)について表示される。(左から右へ):(a)KB_A12 ProTxIIIライブラリセットA(点線)とKB_A12 ProTxIII対照(黒線)、(b)KB_A12 ProTxIIIライブラリセットB(点線)とKB_A12 ProTxIII対照(黒線)、(c)KB_A12 HsTx1ライブラリ(点線)とKB_A12 HsTx1対照(黒線)。
実施例1.可溶性発現についての標的化ベクターおよび細胞表面の構築はIgG形式の抗体を表示した
高等真核細胞の表面上での抗体を含む結合剤分子のディスプレイおよびそれらのその後の遺伝的選択を可能にするために、ベクターは、結合剤遺伝子を宿主ゲノムの特定の位置に標的化するために使用され得る。ベクターは、選択可能なマーカーをコードして、安定した細胞株の選択を可能にすることができ、この選択可能なマーカーは、ブラストサイジン、G418/ジェネティシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する遺伝子をコードすることができる。標的化ベクターは、選択可能なマーカーをコードする遺伝子の発現を駆動する外因性プロモーターを含むことができる。あるいは、導入遺伝子は、内因性プロモーターの下流の位置で細胞DNAに組み入れられ
て、正しく組み入れられた導入遺伝子の優先的な選択を可能にすることができる。標的化ベクターはまた、相同性アームをコードして、関連する染色体遺伝子座およびプロモーターへの相同組換えを可能にし、結合剤分子およびポリアデニル化(pA)部位の発現を駆動するであろう。結合剤分子遺伝子は、小胞体(ER)を介して細胞表面および膜貫通ドメインまたはグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーのような膜アンカーへの分泌を可能にするリーダー配列をコードするDNAに融合されるであろう。
高等真核細胞の表面上での抗体を含む結合剤分子のディスプレイおよびそれらのその後の遺伝的選択を可能にするために、ベクターは、結合剤遺伝子を宿主ゲノムの特定の位置に標的化するために使用され得る。ベクターは、選択可能なマーカーをコードして、安定した細胞株の選択を可能にすることができ、この選択可能なマーカーは、ブラストサイジン、G418/ジェネティシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはゼオシンに対する耐性を付与する遺伝子をコードすることができる。標的化ベクターは、選択可能なマーカーをコードする遺伝子の発現を駆動する外因性プロモーターを含むことができる。あるいは、導入遺伝子は、内因性プロモーターの下流の位置で細胞DNAに組み入れられ
て、正しく組み入れられた導入遺伝子の優先的な選択を可能にすることができる。標的化ベクターはまた、相同性アームをコードして、関連する染色体遺伝子座およびプロモーターへの相同組換えを可能にし、結合剤分子およびポリアデニル化(pA)部位の発現を駆動するであろう。結合剤分子遺伝子は、小胞体(ER)を介して細胞表面および膜貫通ドメインまたはグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーのような膜アンカーへの分泌を可能にするリーダー配列をコードするDNAに融合されるであろう。
本明細書で使用される標的化ベクターの概略図が図1aに示され、注釈付きの完全なDNA配列が図1bに示される。プラスミドは、発現カセットに隣接するAAVS相同性アームを含み、導入遺伝子のヒトAAVS部位への相同組換えを可能にする。AAVS遺伝子座は、最初にアデノ随伴ウイルスの共通の組入れ部位として特定され、ヒト細胞における異種遺伝子の挿入および発現のための「安全な港」の遺伝子座である93。AAVS部位内でのヌクレアーゼ媒介性切断後、標的化ベクターにおけるAAVS相同性アームは、相同組換えによる発現カセットの組入れを促進する。ブラストサイジン遺伝子は、ベクター内のプロモーターを欠くが、AAVS遺伝子座の上流のエクソンとインフレーム融合を創出するスプライスアクセプターがその前に続く。抗体重鎖および軽鎖発現カセットの詳細は、以下および図1で説明される。
標的化ベクターpINT17-BSD(図1aおよび1b)を、その後のアセンブリを可能にする制限部位を有する前述のベクター(WO2015166272A2)から選択された断片のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって構築した。次に、pINT17-BSDの様々な要素の起源が説明される。5’ AsiSIおよび3’ BglII制限酵素の添加を伴うPCR増幅(1511bp)によるpD2プラスミド(WO2015166272A2)に由来する、AAVS左相同性アーム、スプライスアクセプター、ブラストサイジン耐性遺伝子、ポリアデニル化部位、および伸長因子1アルファプロモーター(pEF1α)をコードするDNA。MycタグおよびPDGFR膜貫通ドメインをコードするDNAを、pD2プラスミドから5’IgG1 CH3相同性配列および3’- HindIII部位を添加してPCR増幅した。軽鎖BM40リーダー、抗リゾチーム抗体D1.3の可変軽鎖(VL)94、ヒト定常光(CL)、ウシ成長ホルモン(BGH)pA、最初期サイトメガロウイルスプロモーター(CMVプロモーター)、イントロンにより分割されたマウス重鎖リーダー、抗リゾチーム抗体D1.3の可変重鎖(VH)およびIgG1抗体定常重ドメイン1~3(IgG1 CH1-3)をコードするDNAを、5’ BglII部位およびMycタグをコードするDNAの3’添加を有する、前述のpINT3プラスミド(WO2015166272A2)からPCR増幅した。BglIIからHindIIIまでのpINT17-BSDの4446bp領域をコードする2つのフラグメントを、PCRアセンブリで組み合わせて、PDGR膜貫通ドメインを直接CH3末端に添加した。AAVS右相同性アームをコードするHindIIIからSbfIまでの領域を、HindIIIおよびSbfI制限部位の添加を有するpD2プラスミド(WO2015166272A2)からPCR増幅(1168bp)した。f1およびpUC複製起点ならびにpSF-EF1alpha(Oxford Genetics
OG43)に由来するSbfIからAsiSI部位までのカナマイシン耐性遺伝子を包含するベクター骨格。図1bに示される例は、ヒト抗リゾチーム抗体のVLとVHをコードするが、これは、標準的な分子生物学的技術(例えば、隣接する制限酵素を使用してVL遺伝子とVH遺伝子を置き換える)を使用して、他の特異性を簡単に置き換えられ得る。
OG43)に由来するSbfIからAsiSI部位までのカナマイシン耐性遺伝子を包含するベクター骨格。図1bに示される例は、ヒト抗リゾチーム抗体のVLとVHをコードするが、これは、標準的な分子生物学的技術(例えば、隣接する制限酵素を使用してVL遺伝子とVH遺伝子を置き換える)を使用して、他の特異性を簡単に置き換えられ得る。
実施例2.3対の抗体に対する親および開発性が強化されたクローンの表面提示レベルの比較
3つの抗体対を調査したが、元の親抗体は、不十分な開発性プロファイルと、それらの自己相互作用および交差相互作用の特性を改善するために改変された、それらの再操作さ
れた娘分子と、を保持する。このパネルは、インターロイキンIL-13に対するモノクローナル抗体であるCNTO607と、その修飾された対応物であるCNTO607 W100A14を含んだ。CNTO607は、中性pHで溶解性が不十分であり、PBS緩衝液において高濃度で沈殿し、親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法(AC-SINS)アッセイ39で測定された自己相互作用を表示する。CNTO697の構造決定は、重鎖CDR3における疎水性パッチを明らかにした。VH CDR3変異W100Aは、その抗体溶解度および交差相互作用クロマトグラフィー(CIC)プロファイルの両方を改善した47。CICは、カラムマトリックスに固定化されたヒト血清ポリクローナル抗体への結合を測定する。第2の例は、Tie2受容体の可溶性リガンドであり、病的な血管新生の調節因子であるアンジオポエチン2を標的化するAng2mAbという名前のモノクローナル抗体である。しかしながら、Ang2mAbは不十分な発現および凝集両方を呈することが報告されている。19の変異型の構造モデリングと実験的スクリーニングの組み合わせは、不対システイン残基を変異させた、よりよく発現するAng2mAb C49T6の操作につながる。最後に、TrkAおよびp75受容体を介したシグナル伝達を阻害する抗神経成長因子(NGF)抗体であるMEDI-1912を含めた7。MEDI-1912は、慢性疼痛の治療に潜在的に使用され得るが、溶液における沈殿および凝集ならびに不十分な薬物動態プロファイルを示す。MEDI-1912はピコモルの親和性でNGFに結合し、自己凝集の点で良好に動作したMEDI-578という名前の「祖父母」抗体から親和性成熟された。水素/重水素交換-質量分析(HDX-MS)および分子モデリングにより、VHドメイン上にVH CDR1およびCDR2内の残基によって引き起こされる疎水性パッチを特定した。このことは、自己会合および結果として生じる凝集の原因となるアミノ酸の予測を可能にした。このことは、次いでNGF7についての効力と親和性を保持しながら自己相互作用インターフェースを中断する変異W30S、F31T、およびL56Tを有する三重変異体(MEDI-1912_STT)の設計を可能にした。
3つの抗体対を調査したが、元の親抗体は、不十分な開発性プロファイルと、それらの自己相互作用および交差相互作用の特性を改善するために改変された、それらの再操作さ
れた娘分子と、を保持する。このパネルは、インターロイキンIL-13に対するモノクローナル抗体であるCNTO607と、その修飾された対応物であるCNTO607 W100A14を含んだ。CNTO607は、中性pHで溶解性が不十分であり、PBS緩衝液において高濃度で沈殿し、親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法(AC-SINS)アッセイ39で測定された自己相互作用を表示する。CNTO697の構造決定は、重鎖CDR3における疎水性パッチを明らかにした。VH CDR3変異W100Aは、その抗体溶解度および交差相互作用クロマトグラフィー(CIC)プロファイルの両方を改善した47。CICは、カラムマトリックスに固定化されたヒト血清ポリクローナル抗体への結合を測定する。第2の例は、Tie2受容体の可溶性リガンドであり、病的な血管新生の調節因子であるアンジオポエチン2を標的化するAng2mAbという名前のモノクローナル抗体である。しかしながら、Ang2mAbは不十分な発現および凝集両方を呈することが報告されている。19の変異型の構造モデリングと実験的スクリーニングの組み合わせは、不対システイン残基を変異させた、よりよく発現するAng2mAb C49T6の操作につながる。最後に、TrkAおよびp75受容体を介したシグナル伝達を阻害する抗神経成長因子(NGF)抗体であるMEDI-1912を含めた7。MEDI-1912は、慢性疼痛の治療に潜在的に使用され得るが、溶液における沈殿および凝集ならびに不十分な薬物動態プロファイルを示す。MEDI-1912はピコモルの親和性でNGFに結合し、自己凝集の点で良好に動作したMEDI-578という名前の「祖父母」抗体から親和性成熟された。水素/重水素交換-質量分析(HDX-MS)および分子モデリングにより、VHドメイン上にVH CDR1およびCDR2内の残基によって引き起こされる疎水性パッチを特定した。このことは、自己会合および結果として生じる凝集の原因となるアミノ酸の予測を可能にした。このことは、次いでNGF7についての効力と親和性を保持しながら自己相互作用インターフェースを中断する変異W30S、F31T、およびL56Tを有する三重変異体(MEDI-1912_STT)の設計を可能にした。
CNTO607、CNTO607-W100A、Ang2mAb、Ang2mAb-C49T、MEDI-1912およびMEDI-1912_STTの重および軽可変ドメイン(配列について表1)を参照されたい)をコードする合成DNAを、哺乳動物ディスプレイベクターpINT17-BSDにクローニングし(ベクターマップおよび配列については実施例1を参照されたい)、DNA配列を確認し、トランスフェクション品質のプラスミドDNAを調製した。トランスフェクションの1日前に、懸濁液適合HEK293細胞を、HEK FreeStyle 293発現培地に5×105個の細胞/mlで播種した。細胞が10ml中1×106細胞/mlの密度に達した際に、PEIトランスフェクションを実行した。pINT17を保持する抗体遺伝子(1ug)、左右のTALENプラスミド(各5ug)を、混合し、無添加のHEK FreeStyle 293発現培地(1ml)において希釈した。ポリエチレンイミン(PEI)、線形、25000 Da MW(10ul、1mg/ml、Polysciences)を、添加し、室温で10分間インキュベートした。次いで、プラスミドDNA/PEI混合物をHEK293懸濁細胞に添加した(10mlのHEK FreeStyle 293発現培地中1×106細胞/ml)。トランスフェクションの48時間後に、7μg/mlの濃度でブラストサイジン選択を開始した。実験期間中、集団を選択下に保った。トランスフェクション15日後(dpt)、抗ヒトFc PE(Biolegend)で細胞を染色した。次いで、抗体を表示するモノクローナル細胞株を以下のプロトコルによって染色した。抗体または野生型HEK293細胞(100万個の細胞)を表示するHEK293細胞株を、ペレット化した(200g、エッペンドルフチューブ(1.5ml)で3分)。ペレットをPBS(1ml)に再懸濁し、遠心分離した(600g、2.5分)。ペレットを、1%BSA、抗Fc PE(5μl、Biolegend)を含むPBS(100μl)に再懸濁した。混合物を、遮光して、4℃で30分間インキュベートした。0.1%BSA、PBS(900μl)を添加し、細胞をペレット化した(600g、2.5分)。細胞を
0.1%BSA、PBS(1ml)に再懸濁し、この洗浄ステップを1回繰り返した。細胞を、7-AAD(100万個の細胞あたり5μl)を含む0.1%BSA、PBS(200μl)に再懸濁した。標識された細胞(50μl)を、Intellicyte iQueスクリーナーを使用して分析した。フローサイトメトリー分析(図2)は、元の問題のある親分子と比較して、3つすべての抗体対についての改善された娘分子について改善されたディスプレイレベルに対して、増加した抗体ディスプレイレベルを示した。
0.1%BSA、PBS(1ml)に再懸濁し、この洗浄ステップを1回繰り返した。細胞を、7-AAD(100万個の細胞あたり5μl)を含む0.1%BSA、PBS(200μl)に再懸濁した。標識された細胞(50μl)を、Intellicyte iQueスクリーナーを使用して分析した。フローサイトメトリー分析(図2)は、元の問題のある親分子と比較して、3つすべての抗体対についての改善された娘分子について改善されたディスプレイレベルに対して、増加した抗体ディスプレイレベルを示した。
実施例3a.高濃度での細胞表面提示レベルと自己相互作用との関係
実施例2に記載される抗体の特性を調査するために、抗体発現および精製を実施した。CNTO607、CNTO607-W100A、Ang2mAb、Ang2mAb-C49T、MEDI-1912およびMEDI-1912_STTの重および軽可変ドメインをコードする合成DNA(配列については表1を参照されたい)を、pINT3(WO2015/166272A2)に基づくデュアルプロモーターIgG可溶性発現ベクターにクローニングし、DNA配列によって正しいクローニングを確認した。
実施例2に記載される抗体の特性を調査するために、抗体発現および精製を実施した。CNTO607、CNTO607-W100A、Ang2mAb、Ang2mAb-C49T、MEDI-1912およびMEDI-1912_STTの重および軽可変ドメインをコードする合成DNA(配列については表1を参照されたい)を、pINT3(WO2015/166272A2)に基づくデュアルプロモーターIgG可溶性発現ベクターにクローニングし、DNA配列によって正しいクローニングを確認した。
プラスミドDNAを調製し、これを使用して、製造業者の指示(A14525、ThermoFisher Scientific)に従ってトランスフェクション試薬ExpiFectamineを使用してExpi293細胞(最終培養体積スケール30ml)にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間前に、25.5mlのExpi293発現培地に2×106個の細胞/mlの密度で細胞を播種した。プラスミドDNA(30μg)をOpti-MEM培地(1.5ml)で希釈し、ExpiFectamine 293試薬(80μl)をOpti-MEM培地(1.5ml)で希釈して、室温で5分間インキュベートした。次いで、希釈したプラスミドDNA(1.5mlのOpti-MEM培地中30μg)を希釈したExpiFectamine 293試薬(1.5mlのOpti-MEM培地中80μlのExpiFectamine)に添加し、室温で20分間インキュベートした。細胞を37℃、5%CO2、5%湿度でインキュベートし、130rpmで撹拌した(25mm軌道スロー、ISF1-X、Climo-Shaker、Kuhner)。発現の5日後、培養上清を遠心分離(2000g、20分)によって採取した。
50ml遠沈管中の培養上清を1/10容量のPBS(pH7.4)の添加によりpH調整し、プロテインAセファロースFF樹脂(300μl、Generon、PC-A100)を添加し、室温で1時間攪拌してインキュベートした。50mlチューブを2000gで5分間遠心分離してビーズを回収し、おおよそ1mlのビーズスラリーを残して上清を廃棄した。このスラリーを、フリットを有するカラムに負荷し(Proteus「1ステップバッチ」ミディ(midi)遠心カラム。Generon、GEN-1SB08)、遠心分離し(50g、4℃で1分間)、フロースルーを廃棄した。カラムを2xPBS(2×10ml)で洗浄した後、各洗浄ステップ後に遠心分離(50g、4℃で1分)した。カラムマトリックスに添加された溶出緩衝液(900ul、0.2MグリシンpH2.6)を使用して抗体を溶出し、中和緩衝液(300ul、1M Tris-HCl、pH8)を使用して溶出液を直ちに中和した。次いで、抗体をプロテインAセファロースカラムから遠心分離(50g、4℃で1分)により直接中和緩衝液に溶出した。抗体を、GeBAflexマキシチューブ(8kDa分子量カットオフ、Generon、D045)への移動で緩衝液交換し、4リットルのPBSおよびインキュベーション中において4℃で少なくとも3~18時間透析した。この透析ステップを、第2の4L PBS透析ステップで繰り返した。抗体の収量および濃度を、280nmでの吸光度の測定によって決定し、濃度を見積もるために1.4の推定吸光係数を使用してランバート・ベールの法則を使用して計算することによって決定した。
一過性発現によって生成されたポリペプチドの収量は、開発性の指標と考えられ得る。実施例2からの3対の抗体間の一過性トランスフェクションにおける発現収量を比較は親抗体のより低い発現を示したが、開発性の可能性の有意差は、一過性トランスフェクションの収量を単に比較するだけでは、明らかではなかった(表2)。例えば、親CNTO607抗体の発現収量は34mg/Lであったが、改善した溶解度CNTO607-W100A抗体発現収量は55mg/Lであった。同様に、MEDI-1912の親抗体の発現収量は、改善したバージョンについての53mg/Lと比較して33であった。Ang2mAbの収量は、操作された子孫Ang C49Tについての34mg/Lと比較して1
3mg/Lであった。
3mg/Lであった。
ポリペプチドの融解温度は、「開発性」を予測するための代用物とみなされることがあり、場合によっては、抗体は、より開発可能な抗体9~11の生成を期待して、改善した融解温度のために選択されている。融解温度(Tm)および凝集開始温度(Tagg)を、製造業者の指示に従ってプロメテウスNT.4B(Nanotemper)を使用して決定した。小さな毛細血管を使用して、0.5mg/mlでの抗体溶液を約8~10μl採取した。次いで、キャピラリーを適所にクリップして、熱溶融分析用のPrometheus装置による蛍光スキャンを行った。Prometheusフィッティングソフトウェアを使用して、融解の開始温度と散乱の開始温度を決定した。抗体の融解温度(Tm)および凝集温度(Tagg)は、抗体対セットの間および臨床的に承認された陽性対照抗PD1抗体と比較しての両方で、類似していた(表2を参照されたい)。このデータは、この抗体セットの融解温度および凝集温度が自己相互作用および非特異的交差相互作用の生物物理学的プロファイルを予測するものでないことを示す。
分取サイズ排除クロマトグラフィー中に、MEDI-1912はMEDI-1912_STT(図3)と比較してより早い溶出プロファイルを表示し、かつそれが高分子量種として存在し自己相互作用を起こしやすいことを示す。残りの抗体は、ニボルマブと同様のプロファイルで溶出した。動的光散乱(DLS)による抗体自己相互作用の測定を可能にするために、サイズ精製された抗体を限外濾過のよって濃縮した。各抗体対について達成された抗体濃度を表2に示す。これは、限外濾過膜を遮断する抗体沈殿が起こる前に、親抗体MEDI-1912およびCNTO607をそれぞれ1.4mg/mlおよび1.8mg/mlを超えて濃縮することが不可能であることを明らかにした。対照的に、溶解度が増強された娘分子MEDI-1912_STTおよびCNTO607_W100Aを、沈殿の証拠を伴わずそれぞれ29および30mg/mlに濃縮することは可能であった。濃縮されたAng2mAb対については沈殿は観察されなかった。動的光散乱(DLS)は、親抗体MEDI-1912およびCNTO607(表2)について高次の凝集種を検出したが、計算された多分散指数(PDI)およびキュムラント(またはz平均)サイズから判断すると、娘分子MEDI-1912_STTおよびCNTO607_W100Aについては検出しなかった。例えば、親CNTO607およびMEDI-1912についてのPDIはそれぞれ0.22と0.15であったが、娘分子についてのPDIはそれぞれ0.1および0.12であり、より均一な単分散状態を示す(表2)。同様に、親MEDI-1912の平均粒子サイズはそれぞれ22nmでしたが、娘分子MEDI-1912-STTの平均粒子サイズは13nmであり、低次の凝集状態を示す(表2)。したがって、有意な自己相互作用が発生しており、より低い濃度での検出可能な自己相互作用がおよびより高い濃度での沈殿をもたらす。
この実施例は、抗体の哺乳動物細胞ディスプレイレベルと3つの異なる抗体対の生物物理学的特性との非常に明確な関係を実証する。自己相互作用、交差相互作用、および不十分な薬物動態(MEDI-1912)に関する文書化された問題を有するIL-13(CNTO607)、アンジオポエチン2(Ang2mAb)、神経成長因子(MEDI-1912)に特異的な親抗体はすべて、溶解度が増強された娘分子と比較してより低い細胞ディスプレイレベルをもたらした(図2)。
実施例3b.細胞表面での抗体濃度に関する支持理論
この実施例は、真核細胞における強力なポリペプチド発現がポリペプチドが細胞表面に保持されている場合に潜在的に高い局所濃度を達成できるという発明者の提案を理解することに役立ち得る根本的な理由を提示する。
この実施例は、真核細胞における強力なポリペプチド発現がポリペプチドが細胞表面に保持されている場合に潜在的に高い局所濃度を達成できるという発明者の提案を理解することに役立ち得る根本的な理由を提示する。
本明細書に記載の研究において、懸濁液適合HEK293細胞が抗体ディスプレイに使用される。HEK293細胞株は哺乳動物(ヒト)由来である。細胞は半径10ミクロンのほぼ球形である95。懸濁液HEK293細胞を球として扱うと、その表面上の抗体が占める体積を計算できる。(この実施例のために、細胞表面のすべての領域が抗体ディスプレイのために等しくアクセス可能であると仮定する。このことが事実でなければ、抗体のより高い局所濃度が達成されるであろう。)球の半径(r)は、式4/3πr3=4.18r3から算出され得る。抗体の高さを150オングストローム(Å)(=15nm)とすると、それは容積4.18(r + 150 Å)3のより大きな球に存在するであろう。したがって、抗体の体積は、これと細胞の体積との差異である。
半径10ミクロンの細胞の体積は、
4.18×10-15m3(4180×10-15リットル)である。
4.18×10-15m3(4180×10-15リットル)である。
抗体を含むより大きな球の体積は、
4.198×10-15m3(4198×10-15リットル)である。
4.198×10-15m3(4198×10-15リットル)である。
したがって、表示される抗体は、
0.018×10-15m3の(18×10-15リットル)の体積を占める。
0.018×10-15m3の(18×10-15リットル)の体積を占める。
同様に、異なるサイズの細胞について体積の差異を計算できる。
抗体/細胞の数、分子量、および占有体積が分かれば、細胞表面で達成される濃度を計算できる。Avogadroの定数を使用すると、6×1023抗体分子/lが150,000mg/mlの濃度になることがわかる。したがって、6×1018抗体分子/mlの濃度は1.5mg/ml(10μM)になる。このアプローチにより、表3に示される濃度が計算される。
これらの計算では、細胞表面上の抗体の数は106コピー/細胞とみなされる。コピー数を実験的に決定する方法は、本明細書の他の場所で詳述されており、実施例7に例示される。
表3から、半径10ミクロンの細胞(懸濁培養のHEK293細胞など)上での106抗体/細胞のディスプレイが10mg/mlを超える濃度であると推定される。そのような濃度では、タンパク質自己相互作用の問題が起こり得る。したがって、凝集する傾向を有する抗体は、小胞体の通過の減少96および分解の増加により、細胞表面上での低下した表示を有し得る。結果として、より低いレベルのディスプレイは、自己相互作用しない抗体と比較して、自己凝集しやすい抗体について観察されるであろう。
実施例4.表面提示レベルに基づいて「開発性が強化された」抗NGF抗体を富化する
実施例3では、抗体の生物物理学的特性、特に自己凝集とそれらの哺乳動物細胞ディス
プレイレベルとの間の関係が説明された。このことは、元の親抗体が自己および交差相互作用の点で不十分な生物物理学的特性を備有する3つの抗体対を取ることによって例示され、これらの特性は、選択されたアミノ酸を変更して改善された生物物理学的特性を有する娘分子を創出することによって改善された。3つすべての場合で、問題のある親抗体と比較して、改善された生物物理学的特性を有する娘分子がHEK293細胞の表面上に増加したレベルで表示する。この実施例では、哺乳動物のディスプレイによってクローンの混合集団から優れた生物物理学的特性を有する抗体を富化することが可能であることを実証する。マウスモデル7で自己相互作用特性および不十分な薬物動態を有する親抗NGF
MEDI-1912、および改善された娘MEDI-1912_STTがこの研究のために選択された。モデル実験が行われ、以前説明されたように(WO2015166272A2)、AAVS遺伝子座にドナープラスミドを誘導するTALEヌクレアーゼ対をコードするプラスミドとともに親および修飾されたTEKをコードするプラスミドとともに親抗体と修飾抗体をコードする哺乳類ディスプレイプラスミド(実施例1)を等量でHEK293細胞にトランスフェクトすることにより、MEDI-1912またはMEDI-1912_STTを表示するHEK293細胞の混合集団を創出した薬物選択後、蛍光活性化細胞選別(FACS)を行い、高い抗体提示レベル、選択された抗体遺伝子および配列の単離に基づいて細胞を選択した混合集団からの改善された生物物理学的特性を有する抗体の選択された富化を実証する。
実施例3では、抗体の生物物理学的特性、特に自己凝集とそれらの哺乳動物細胞ディス
プレイレベルとの間の関係が説明された。このことは、元の親抗体が自己および交差相互作用の点で不十分な生物物理学的特性を備有する3つの抗体対を取ることによって例示され、これらの特性は、選択されたアミノ酸を変更して改善された生物物理学的特性を有する娘分子を創出することによって改善された。3つすべての場合で、問題のある親抗体と比較して、改善された生物物理学的特性を有する娘分子がHEK293細胞の表面上に増加したレベルで表示する。この実施例では、哺乳動物のディスプレイによってクローンの混合集団から優れた生物物理学的特性を有する抗体を富化することが可能であることを実証する。マウスモデル7で自己相互作用特性および不十分な薬物動態を有する親抗NGF
MEDI-1912、および改善された娘MEDI-1912_STTがこの研究のために選択された。モデル実験が行われ、以前説明されたように(WO2015166272A2)、AAVS遺伝子座にドナープラスミドを誘導するTALEヌクレアーゼ対をコードするプラスミドとともに親および修飾されたTEKをコードするプラスミドとともに親抗体と修飾抗体をコードする哺乳類ディスプレイプラスミド(実施例1)を等量でHEK293細胞にトランスフェクトすることにより、MEDI-1912またはMEDI-1912_STTを表示するHEK293細胞の混合集団を創出した薬物選択後、蛍光活性化細胞選別(FACS)を行い、高い抗体提示レベル、選択された抗体遺伝子および配列の単離に基づいて細胞を選択した混合集団からの改善された生物物理学的特性を有する抗体の選択された富化を実証する。
pINT17-MEDI-1912およびpINT17-MEDI-1912_STT(説明については実施例2を参照されたい)を、1:1の比率で混合し、この混合物を、HEK293細胞へのヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化を使用してHEK293細胞のゲノムに組み入れた。対数増殖期中期のHEK293懸濁細胞(1×106細胞/mlの細胞密度まで増殖)を200gで10分間遠心分離して回収し、MaxCyte電気穿孔緩衝液に1×108細胞/mlの密度で再懸濁した。pINT17-MEDI-1912(1μg)、pINT17-MEDI-1912_STT(1μg)、AAVS指向性TALENベクター対(各10μg)からなるプラスミドDNA混合物を、HEK293細胞(100μl、MaxCyte電気穿孔緩衝液において合計1×107細胞)に添加し、OC100電気穿孔キュベットに移し、MaxCyte STX電気穿孔系を使用して電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を37℃で20分間回収し、HEK FreeStyle
293発現培地で希釈し、5%CO2下、120rpm、37℃で維持した。トランスフェクションの48時間後に、7μg/mlの濃度でブラストサイジン選択を開始した。実験期間中、集団を選択下に保った。トランスフェクションの15日後、DAPI染色が7-AAD染色に置き換わり、NGF-ビオチン/ストレプトアビジン-APC染色を採用して抗原結合を検出し、1,000万個の細胞を染色するまでスケールアップした以外は、実施例2に記載のように細胞を染色した。MEDI-1912/MEDI-1912_STT混合HEK293哺乳動物ディスプレイ集団を、フローサイトメトリー(図5a)によって抗体提示レベルについて分析し、これは、異なる抗体レベルを表示する2つの主要な細胞集団を明らかにした。2つの集団は、オーバーレイプロット(図5a)に示されるように、モノクローナルMEDI-1912およびMEDI-1912_STT抗体のディスプレイレベルと相関した。混合集団は、FACSによって2つの集団に選別された:抗体提示レベルの低および高提示レベルグループ(それぞれゲート5および6、図5b)。
293発現培地で希釈し、5%CO2下、120rpm、37℃で維持した。トランスフェクションの48時間後に、7μg/mlの濃度でブラストサイジン選択を開始した。実験期間中、集団を選択下に保った。トランスフェクションの15日後、DAPI染色が7-AAD染色に置き換わり、NGF-ビオチン/ストレプトアビジン-APC染色を採用して抗原結合を検出し、1,000万個の細胞を染色するまでスケールアップした以外は、実施例2に記載のように細胞を染色した。MEDI-1912/MEDI-1912_STT混合HEK293哺乳動物ディスプレイ集団を、フローサイトメトリー(図5a)によって抗体提示レベルについて分析し、これは、異なる抗体レベルを表示する2つの主要な細胞集団を明らかにした。2つの集団は、オーバーレイプロット(図5a)に示されるように、モノクローナルMEDI-1912およびMEDI-1912_STT抗体のディスプレイレベルと相関した。混合集団は、FACSによって2つの集団に選別された:抗体提示レベルの低および高提示レベルグループ(それぞれゲート5および6、図5b)。
ゲノムDNAは、FACSで選別された細胞集団から調製された(ゲート5および6、図5b)。IgGインサートをコードするDNAを、KOD Hot Start DNAポリメラーゼ(Merck Millipore)を使用したネステッド(nested)PCRによって増幅した。アウターPCRは、以下のゲノム特異的プライマーで実行した。フォワード:CCGGAACTCTGCCCTCTAACおよびリバース:TCCTGGGATACCCCGAAGAG。外側のPCRからのPCR産物をテンプレートと
して使用し、組み入れられたIgGインサートを以下のプライマーで増幅した。KODポリメラーゼ(71086、Merck)を製造元の条件に従って使用する、フォワード:GAGGGCCTGGATCTTCTTTCTCおよびリバース:GAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG。PCR産物を、製造業者の指示(20015964、Illumina)に従ってバーコード化し、Illumina MiSeq配列決定プラットフォームで配列決定した。おおよそ100万の読み取りを分析し、このことは、高い抗体提示レベル(ゲート5、図5b)について選別された集団がMEDI-1922_STT抗体(96%、図6)に富むことを明らかにした。低い抗体提示について選別された集団を、親MEDI-1912抗体について富化した(85%、図6)。この実施例は、抗体細胞表面ディスプレイレベルに基づいてクローンを選択することによって、混合集団から、哺乳動物細胞ディスプレイによって改善された生物物理学的特性を有する抗体の選択された富化を示す。これは、安定した細胞株の混合集団からの親抗体MEDI-1912と比較して優れた生物物理学的特性を有するMEDI-1912_STTの富化によって例示される。
して使用し、組み入れられたIgGインサートを以下のプライマーで増幅した。KODポリメラーゼ(71086、Merck)を製造元の条件に従って使用する、フォワード:GAGGGCCTGGATCTTCTTTCTCおよびリバース:GAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG。PCR産物を、製造業者の指示(20015964、Illumina)に従ってバーコード化し、Illumina MiSeq配列決定プラットフォームで配列決定した。おおよそ100万の読み取りを分析し、このことは、高い抗体提示レベル(ゲート5、図5b)について選別された集団がMEDI-1922_STT抗体(96%、図6)に富むことを明らかにした。低い抗体提示について選別された集団を、親MEDI-1912抗体について富化した(85%、図6)。この実施例は、抗体細胞表面ディスプレイレベルに基づいてクローンを選択することによって、混合集団から、哺乳動物細胞ディスプレイによって改善された生物物理学的特性を有する抗体の選択された富化を示す。これは、安定した細胞株の混合集団からの親抗体MEDI-1912と比較して優れた生物物理学的特性を有するMEDI-1912_STTの富化によって例示される。
混合集団において優れた生物物理学的特性を有する抗体を富化することが可能であることを示し、哺乳動物ディスプレイによる提示レベルのみに基づく変異型の大規模なライブラリから改善された抗体を特定することが可能であることを実証する。説明したように、VH MEDI1912上の残基W30、F31、およびL56は、この抗体の表面上に疎水性パッチを形成する可能性を有する7。これらの残基をランダム化のために選択し、VHライブラリを合成DNAテンプレートからPCRアセンブリ変異誘発によって構築した(アミノ酸および核酸の配列ならびにプライマーの位置については図4を参照されたい)。製造業者の指示に従って、KODポリメラーゼ(71086-3、Merck)を使用して、3つのPCR産物をVHテンプレートから増幅した。
a.プライマーMEDI-1912-F3(CCATGGCCCAGGTTCAGCTG)およびMEDI1912_W30NNS_F31NNS(CTGTCGGACCCATGTAAAGGCGCCSNNSNNAAAGGTGCCGCCGCTTGCTTTGCA)で増幅されたVH1(95bp)。
b.プライマーMEDI-1912-F(GGCGCCTTTACATGGGTCCGACAG)およびMEDI-1912_L56NNS(CTGGAAGTTCTGGGCCAGATTGGTSNNGCCGAAGATAGGGATGATGCCGCC)で増幅されたVH2(102bp)。
c.プライマーMEDI-1912-F2(ACCAATCTGGCCCAGAACTTCCAG)およびMEDI-1912-R(ACTCGAGACGGTGACCATTGTG)で増幅されたVH3(213bp)
a.プライマーMEDI-1912-F3(CCATGGCCCAGGTTCAGCTG)およびMEDI1912_W30NNS_F31NNS(CTGTCGGACCCATGTAAAGGCGCCSNNSNNAAAGGTGCCGCCGCTTGCTTTGCA)で増幅されたVH1(95bp)。
b.プライマーMEDI-1912-F(GGCGCCTTTACATGGGTCCGACAG)およびMEDI-1912_L56NNS(CTGGAAGTTCTGGGCCAGATTGGTSNNGCCGAAGATAGGGATGATGCCGCC)で増幅されたVH2(102bp)。
c.プライマーMEDI-1912-F2(ACCAATCTGGCCCAGAACTTCCAG)およびMEDI-1912-R(ACTCGAGACGGTGACCATTGTG)で増幅されたVH3(213bp)
上記に列挙された3つのPCR産物(VH1、VH2、およびVH3)を、組み合わせ(各10ng)、メーカーの指示に従ってKODポリメラーゼ(71086-3、Merck)を使用する外側プライマーMEDI-1912-F3およびMEDI-1912-RでのPCR反応において組み立てた)。PCR産物をNcoIおよびXhoIで消化し、Nco1/Not 1で消化したpINT17-MEDI-1912(MEDI1912のVLをコードするpINT17哺乳動物ディスプレイベクター(図1))、(100ng)とライゲーションした。次いで、このライゲーション混合物をmini-Elute PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製し、精製したライゲーション混合物を50μlのE.cloni 10G eliteエレクトロコンピテント細胞(60061-1、Lucigen)に形質転換した。0.1cmのキュベットを使用して細胞をパルスし、2mlの回収培地で回収し、37℃、250rpmで1時間増殖させた。ライブラリサイズを計算するために、細胞を1000分の1に希釈し、直径10cmの2TY-カナマイシンプレートに10μlと100μlを播種した。残りの細胞を遠沈し、直径2×10cmの2TY-カナマイシンプレートに播種し、37℃で一晩インキュベート
した。コロニーを10ulプレートからカウントし、1.1×106のライブラリサイズを計算した。NNSコドンを使用して3つの残基をランダム化して構築されたライブラリは32,768の変異型をコードするため、実験的なライブラリのサイズは理論的なライブラリのサイズを34倍超えた。形質転換体プレートをかき取り、細胞密度を600nmでの吸光度(OD600)を読み取ることにより測定し、培地の2 ODユニット(2xOD600)の均等物を50mlのCirclegrow培地に接種するために使用し、250mlバッフルフラスコにおいて37℃で3~4時間培養し、おおよそ400xOD600ユニットを回収し、ミディプレップ(midiprep)プラスミドDNAを調製した(pINT17-MEDI-1912-ライブラリ)。
した。コロニーを10ulプレートからカウントし、1.1×106のライブラリサイズを計算した。NNSコドンを使用して3つの残基をランダム化して構築されたライブラリは32,768の変異型をコードするため、実験的なライブラリのサイズは理論的なライブラリのサイズを34倍超えた。形質転換体プレートをかき取り、細胞密度を600nmでの吸光度(OD600)を読み取ることにより測定し、培地の2 ODユニット(2xOD600)の均等物を50mlのCirclegrow培地に接種するために使用し、250mlバッフルフラスコにおいて37℃で3~4時間培養し、おおよそ400xOD600ユニットを回収し、ミディプレップ(midiprep)プラスミドDNAを調製した(pINT17-MEDI-1912-ライブラリ)。
pINT17-MEDI-1912-ライブラリを、HEK293細胞へのヌクレアーゼ媒介性遺伝子標的化のために使用した。対数増殖期中期のHEK293懸濁細胞(1×106細胞/mlの細胞密度まで増殖)を200gで10分間遠心分離して回収し、MaxCyte電気穿孔緩衝液に1×108細胞/mlの密度で再懸濁した。pINT17-MEDI-1912-ライブラリ(8μg)、AAVS指向性TALENベクター対(各40μg)からなるプラスミドDNA混合物を、HEK293細胞(400μl、MaxCyte電気穿孔緩衝液において合計4×107細胞)に添加し、OC400電気穿孔キュベットに移し、MaxCyte STX電気穿孔系を使用して電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を37℃で20分間回収し、HEK FreeStyle 293発現培地で希釈し、5%CO2下、120rpm、37℃で維持した。トランスフェクションの48時間後に、7μg/mlの濃度でブラストサイジン選択を開始した。実験期間中、集団を選択下に保った。トランスフェクション15日後、実施例3に記載のように細胞を分析し染色した。MEDI-1912ライブラリ(図7c)を表示したHEK293のフローサイトメトリー分析は、ライブラリが、MEDI-1912_STTモノクローナル細胞株と同等の抗体ディスプレイレベル(図7b)と、親MEDI-1912モノクローナル細胞株より高いディスプレイレベル(図7a)とを示した混合集団内で細胞を保持することを示した。このことは、ディスプレイレベルの点でMEDI-1912_STTと同等のクローンがMEDI-1912集団に存在することを示唆した。
ライブラリ集団を抗体提示レベル(図7c)に従ってFACSによって選別し、抗体遺伝子をP5およびP6ゲーティングされた集団から回収し、VH遺伝子を上に記載されるように「次世代配列決定」(NextGen)によって配列決定した。図8は、哺乳動物ディスプレイで選択された集団について残基30、31、56についてのアミノ酸同一性ヒストグラムプロットを示す。このことは、31位でのアミノ酸S、T、Pの濃縮、32位のアミノ酸S、P、Nの富化、ならびに56位でのアミノ酸R、S、TおよびPの富化を示した。
哺乳動物のディスプレイで選択された抗体の生物物理学的特徴付けを可能にするために、VH遺伝子を、実施例3で説明されるように、選択された集団のゲノムDNAからPCR増幅した(ゲートP5およびP6図7)。上に記載されるように、VHインサートをpINT17-MEDI-1912、NcoIおよびMEDI-1912 VLを収容するXhoIカットベクターにクローニングし、ライゲーション混合物を使用してE.coli DH10B細胞を形質転換した。188個の形質転換体を選び、プラスミドDNAを調製し、これらをDNA配列決定して、30、31および56位でのコドンの同一性を特定した。次に、NextGen配列決定(図8)による出現頻度に基づいて選択されたクローンを、実施例2に記載されているように、一過性トランスフェクションおよびアフィニティ精製による発現用に選んだ。限外濾過による動的光散乱(DLS)による分析の前に、抗体を濃縮した。すべての抗体は、親MEDI-1912抗体より8倍~29倍まで濃縮されることができ(表4)、これらの濃度での沈殿の証拠はなく、選択された抗体が親の抗体よりも高い溶解度を有することを示した。DLSは、選択された抗体が親抗体M
EDI-1912よりも小さな平均粒子サイズ(Z-Ave)および低い多分散性(PDI)を有することも示した(表4)。4つの選択されたクローン(P5_C06、P5_F01、P6_C08およびP6_F02)は、以前に報告された改善されたクローンMEDI-1912_STTと比較して、優れたまたは同等の単分散性を示した。ランダムなサブライブラリの作成と哺乳動物のディスプレイの選択によって選択された改善された変異型は、平均して元の疎水性残基を親水性残基に変更した。
EDI-1912よりも小さな平均粒子サイズ(Z-Ave)および低い多分散性(PDI)を有することも示した(表4)。4つの選択されたクローン(P5_C06、P5_F01、P6_C08およびP6_F02)は、以前に報告された改善されたクローンMEDI-1912_STTと比較して、優れたまたは同等の単分散性を示した。ランダムなサブライブラリの作成と哺乳動物のディスプレイの選択によって選択された改善された変異型は、平均して元の疎水性残基を親水性残基に変更した。
この実施例は、不十分な生物物理学的特性を有する抗体を哺乳動物ディスプレイ選択による溶解度およびより低い自己相互作用の点で改善された特性を有するものに形質転換することが可能であることを示す。このことは、選択された残基のランダム変異誘発と、HEK293細胞の表面上に表示される大きなランダム抗体変異型ライブラリの作成とによって達成された。抗体の開発性プロファイル(例えば、溶解度)を評価する現在の最新技術は、完全な生物物理学的およびPK測定を可能にするために、マルチmgスケールでの大規模な発現および精製を必要とする。ポリペプチド提示レベルの差異を使用するこの実施例では、平均蛍光強度(MFI)の違いによって判断されるように、数百万の変異型を作成し、改善した生物物理学的特性有することがその後示された抗体を選択することが可能であることを実証する。このプロセスは、新規抗体がナイーブライブラリまたはファージディスプレイのような別の系で事前選択されたライブラリから選択される場合に適用され得る。あるいは、本発明はまた、変異型のライブラリが創出されて哺乳動物細胞の表面上に提示される抗体の親和性成熟またはヒト化の間に適用され得る。
実施例5.変異型ライブラリの構築および開発性が増強された抗PSK9クローンの選択
ボコシズマブは、血清中の低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)を低減するためにPfizerによって開発されていた、抗プロプロテイン転換酵素サブスチリシン/ケキシン9型(PCSK9)mAbである。ボコシズマブの作用機序は、LDL受容体(LDLR)のPCSK9介在性分解を阻害し、それによって血清LDLコレステロール(LDL-C)を減少させることある97。この抗体は2016年11月に開発から取り下げられ、Pfizerが「患者、医師、株主に価値を提供することはなさそうだ」と発表した。ボコシズマブの生物物理学的特性は最適ではないことが報告されており2、このことはその臨床的失敗の理由であり得る。例えば、ボコシズマブは、様々なアッセイで自己凝集および交差相互作用の両方を表示した2。対照的に、FDA承認の抗PCSK9アリロクマブ(Regeneron)抗体は、同じアッセイにおいて同じレベルの自己凝集および交差相互作用を表示しなかった。
ボコシズマブは、血清中の低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)を低減するためにPfizerによって開発されていた、抗プロプロテイン転換酵素サブスチリシン/ケキシン9型(PCSK9)mAbである。ボコシズマブの作用機序は、LDL受容体(LDLR)のPCSK9介在性分解を阻害し、それによって血清LDLコレステロール(LDL-C)を減少させることある97。この抗体は2016年11月に開発から取り下げられ、Pfizerが「患者、医師、株主に価値を提供することはなさそうだ」と発表した。ボコシズマブの生物物理学的特性は最適ではないことが報告されており2、このことはその臨床的失敗の理由であり得る。例えば、ボコシズマブは、様々なアッセイで自己凝集および交差相互作用の両方を表示した2。対照的に、FDA承認の抗PCSK9アリロクマブ(Regeneron)抗体は、同じアッセイにおいて同じレベルの自己凝集および交差相互作用を表示しなかった。
ボコシズマブは当初、PCSK9ノックアウトマウスの免疫化と、それらのPCSK9活性を阻害する能力についてハイブリドーマクローンを産生するモノクローナル抗体(mAb)をスクリーニングすることと、によって発見された98。次いで、マウスmAb 5A10(米国特許:US 8399646 B2)を、VH CDR1およびVH CDR2におけるアミノ酸置換で、可変重(VH)および可変軽(VL)ドメインから相補性決定領域(CDR)をコードするDNAをヒトフレームワーク99にクローニングすることによってヒト化し、ヒト化mAb 5A10-iを得た。このヒト化抗体5A10-iを、以前に説明されたようにさらに親和性成熟させ100、ボコシジマブ(Bococizimab)を得た。親マウスmAb 5A10、ヒト化中間抗体5A10-i、およびボコシズマブについてVHおよびVLドメインについての配列アラインメントが図9に示される。PCSK9に対する5A10、5A10-i、およびボコシジマブの親和性(平衡解離定数またはKD)は、表面プラズモン共鳴(SPR)またはKinExA(米国特許:US 8399646 B2)によって決定されると、それぞれ1nM、1.5nM、7pMである。PCSK9と複合体化したボコシジマブFab断片の結晶構造は決定されており98、このことは、VH CDR3を通じた主な寄与を伴い、抗体が軽鎖および重鎖の両方を通じてPSK9の触媒ドメインに結合することを示している。
HEK293細胞へのヌクレアーゼ媒介性抗体遺伝子組入れおよび細胞表面上のディスプレイ後、それが由来するヒト化中間バージョン5A10-iと比較して、ボコシズマブの低下した細胞表面提示を観察した(図10)。この実施例の目的は、変異型のライブラリから、ボコシズマブの変異型が、安定性の改善された生物物理学的特性、低下した自己凝集、低下した交差相互作用特性または保持された標的抗原結合を有する「粘着性」を示す、良好な提示レベルを有する哺乳動物ディスプレイにより選択され得ることを示すことである。その不十分な生物物理学的特性に寄与し得る抗体の領域または「パッチ」を最初に特定することが重要である。例えば、ポリペプチド配列内の隣接する疎水性アミノ酸残基は、そのタンパク質の不十分な発現レベルをもたらし得ることが知られている101。また、抗体上の疎水性パッチは不十分な生物物理学的特性をもたらし得る6、7、14。同様に、クラスター化されたリジンまたはアルギニン残基から抗体表面上の正電荷のパッチはまた、新生児Fc受容体(FcRn)22またはヘパリン硫酸などの負に荷電した分子を発現した細胞23への非特異的結合により交差相互作用をもたらし得る。
本発明を使用して改善された結合剤を作成するプロセスは、ライブラリ内で変更するための候補としての配列内の残基の特定から始まる。これらの位置は、2つ以上の代替的なアミノ酸を使用するランダム化のための部位として機能するか、または単一のアミノ酸での置換のための部位であり得る。変異誘発は、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発などの当業者に既知のアプローチを使用して行われ得る(102Molecular Clon
ing:a Laboratory Manual:3rd edition,Russell et al.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press、およびその中の参考文献)。このボコシズマブの場合、三次元構造が利用可能であり、これを分析し、候補アミノ酸残基を変異誘発のために特定した。構造モデリングは、変異誘発のための標的アミノ酸を特定するのに役立てるため、代替として使用され得る。
ing:a Laboratory Manual:3rd edition,Russell et al.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press、およびその中の参考文献)。このボコシズマブの場合、三次元構造が利用可能であり、これを分析し、候補アミノ酸残基を変異誘発のために特定した。構造モデリングは、変異誘発のための標的アミノ酸を特定するのに役立てるため、代替として使用され得る。
本発明内で数百万の変異型を創出およびスクリーニングする機能は、配列変異型の徹底的な検索が、例えば、線形配列を見ることによる3D構造情報またはモデルがなくても行われ得ることを意味する。このことは、疎水性や電荷クラスタリングなどの特徴に対する線形配列を分析することで実行され得る。代替として、個々のアミノ酸に焦点を当てた変異スキャンは、親和性成熟キャンペーン中に大規模な組み合わせ変異誘発キャンペーンを導くために行われ得る103。同じアプローチにより、個々のアミノ酸は、代替的なアミノ酸セットで置換され、生物物理学的特性を改善する可能性を有する個々の残基を特定することができる。これらはその後、複数の位置が同時に変化される組み合わせ変異誘発の基礎を形成することができる。抗体遺伝子の場合、生殖細胞系列配列とのアラインメントは、発現を改善するための最適なアミノ酸変化を特定するのに役立ち得る。このアプローチを、VH上の非パラトピックアミノ酸残基に対して行った。疎水性パッチまたは電荷パッチに貢献した残基は、VH CDR1内のY33、VH CDR2内のF54およびR57であった(図9)。ヒトVH生殖細胞系列配列とのマルチプルアラインメントが、図11に示される。このアラインメントに基づいて、疎水性または電荷パッチに貢献する非パラトピックのボコシズマブVHアミノ酸は、以下にリストされた生殖細胞系列配列に戻された。
a.VH Y33A(生殖細胞系列IGHV1-3*01への復帰)
b.VH Y33D(生殖細胞系列IGHV1-8*01への復帰)
c.VH S52N、F54S、R57S(生殖細胞系列IGHV1-46*01への三重変異体復帰)
d.VH Y33A、S52N、F54S、R57S(a.およびc.変異体が組み合わされた)
e.VH Y33D、S52N、F54S、R57S(b.およびc.変異体が組み合わされた)
a.VH Y33A(生殖細胞系列IGHV1-3*01への復帰)
b.VH Y33D(生殖細胞系列IGHV1-8*01への復帰)
c.VH S52N、F54S、R57S(生殖細胞系列IGHV1-46*01への三重変異体復帰)
d.VH Y33A、S52N、F54S、R57S(a.およびc.変異体が組み合わされた)
e.VH Y33D、S52N、F54S、R57S(b.およびc.変異体が組み合わされた)
パラトピック残基については、ランダム変異ライブラリを創出して、提示と保持された抗原結合との両方の選択を可能にした(図9)。VL内の問題のある残基の候補は、Y53、L94、およびW95であった。PCSK9を有するボコシズマブの共結晶構造から、これらの残基は、アロステリック相互作用を通じて標的と直接的に相互作用するか、または結合に間接的に貢献する(例えば、VL CDR3残基W95はVH CDR3残基に対して集まり、PCSK9に対する最適な結合についてのVH CDR3立体構造を維持することができる。これらの位置へのランダムライブラリの構築および選択により、保持された抗原結合を有する改善された生物物理学的特性のための最適なアミノ酸の組み合わせがあるかどうかを調べることができる。代替的なライブラリ設計は、VH CDR1およびCDR2内の選択された非パラトピック残基のランダム変異誘発に関与することができたかもしれない。
合成VH遺伝子ブロックを、上記の(a)~(e)および元の野生型ボコシズマブ(f)に列挙された以下の構築物をコードして設計および合成した。これらの合成遺伝子をコードするDNA配列を図12に示す。これらの遺伝子ブロックを、プライマー3054および3055(表5)でPCR増幅して、375bpの産物を得た。この産物をスピンカラム精製し、NcoI/XhoIで消化し、スピンカラム精製した。次いで、6つの消化されたVHインサートを、pINT17-ブラストサイジンNcoI/XhoIカットベ
クターでライゲーションし、ライゲーションを使用してE.coli DH5αを形質転換し、個々のコロニーを選び、ミニプレッププラスミドDNAを調製し、DNA配列を確認した。
クターでライゲーションし、ライゲーションを使用してE.coli DH5αを形質転換し、個々のコロニーを選び、ミニプレッププラスミドDNAを調製し、DNA配列を確認した。
VL Y53、L94、W95コドンを、変異誘発の対象となる位置で停止コドンを含むVL遺伝子テンプレートを使用して、NNS PCRアセンブリ変異誘発によってランダム化した(VL遺伝子テンプレート配列については図12を参照されたい)。以下のPCRを行った。
a)ボコシズマブVLプラス停止遺伝子ブロック(配列については図12を参照されたい)を、プライマー3071/3047(表5)でPCR増幅して、353bpの産物を得た。
b)プライマー3071/3069(表5)を含む上記のテンプレート(a)を使用してPCRを行い、191bpの産物を得た。
c)プライマー3073/3070を含む上記のテンプレート(a)を使用してPCRを行い、146bpの産物を得た。
d)外側プライマー3071/3075を含む上記のPCR反応bおよびcの産物でPCRアセンブリ反応を行い、353bpのインサートを得た。産物をNheI/NotIで消化し、スピンカラムによって精製した。
a)ボコシズマブVLプラス停止遺伝子ブロック(配列については図12を参照されたい)を、プライマー3071/3047(表5)でPCR増幅して、353bpの産物を得た。
b)プライマー3071/3069(表5)を含む上記のテンプレート(a)を使用してPCRを行い、191bpの産物を得た。
c)プライマー3073/3070を含む上記のテンプレート(a)を使用してPCRを行い、146bpの産物を得た。
d)外側プライマー3071/3075を含む上記のPCR反応bおよびcの産物でPCRアセンブリ反応を行い、353bpのインサートを得た。産物をNheI/NotIで消化し、スピンカラムによって精製した。
上記の6つのVHバリアントa~f(図12を参照)は、定常カッパ軽鎖(CL-カッパ)、ポリA、CMVプロモーター、シグナル配列、およびVL NNSライブラリをコードする「スタッファー」フラグメントでPCR組み立てした。スタッファー断片を、プ
ライマーカッパスタッファーF4(GTACCGCGGCCGCACCTTCCG)およびラムダスタッファーR3(CAGCCATGGCGCCTGTGGAGAGAAAGG)を使用して、pINT3プラスミド(WO2015166272A2)から増幅した。組み立てられたインサートを、NheIおよびXhoIで消化し、スピンカラム精製し、NheIおよびXhoIで事前に消化したpINT17-BSD標的化ベクター(100ng)でライゲーションした(ライゲーション反応あたり50ngインサート)。ライゲーション混合物(20μl)を、mini-Elute PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製し、精製したライゲーション混合(4μl)を、E.cloni 10G eliteエレクトロコンピテント細胞(50μl、600512、Lucigen)に形質転換した。0.1cmのキュベットを使用して細胞をパルスし、2mlの回収培地で回収し、37℃、250rpmで1時間増殖させた。ライブラリサイズを計算するために、細胞を1000分の1に希釈し、直径10cmの2TY-カナマイシンプレートに播種した(10μlおよび100μl)。残りの細胞を遠沈し、直径2×10cmの2TY-カナマイシンプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。コロニーを10μlのプレートからカウントし、ライブラリサイズを2×106個の形質転換体であると計算した。すべての変異型を表すために、必要なライブラリサイズは1.2×105個のクローンであり(323=ライブラリあたり3.4×104×6個のVH変異体)、したがって、生成されたライブラリは、必要なライブラリ多様性の16倍の過剰表現を表した。形質転換体プレートをかき取り、OD600を測定し、2個のOD600を使用して50mlのサークルグロー培養に接種し、培養物を250mlのバッフル付きフラスコで、37oCで3~4時間増殖させ、約400個のOD600ユニットを採取し、6個のミディプレッププラスミドDNAを調製し、3つのNNSコドンVLライブラリと組み合わせた6つのVHボコシズマブ変異型を表した(図12)。6つのミディプレッププラスミドDNAを、260nmでの吸光度を読み取り、等モル比で混合することによって定量化し、ボコシズマブ標的化ベクターライブラリpINT17-BSD-Boco1-ライブラリを得た。
ライマーカッパスタッファーF4(GTACCGCGGCCGCACCTTCCG)およびラムダスタッファーR3(CAGCCATGGCGCCTGTGGAGAGAAAGG)を使用して、pINT3プラスミド(WO2015166272A2)から増幅した。組み立てられたインサートを、NheIおよびXhoIで消化し、スピンカラム精製し、NheIおよびXhoIで事前に消化したpINT17-BSD標的化ベクター(100ng)でライゲーションした(ライゲーション反応あたり50ngインサート)。ライゲーション混合物(20μl)を、mini-Elute PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製し、精製したライゲーション混合(4μl)を、E.cloni 10G eliteエレクトロコンピテント細胞(50μl、600512、Lucigen)に形質転換した。0.1cmのキュベットを使用して細胞をパルスし、2mlの回収培地で回収し、37℃、250rpmで1時間増殖させた。ライブラリサイズを計算するために、細胞を1000分の1に希釈し、直径10cmの2TY-カナマイシンプレートに播種した(10μlおよび100μl)。残りの細胞を遠沈し、直径2×10cmの2TY-カナマイシンプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。コロニーを10μlのプレートからカウントし、ライブラリサイズを2×106個の形質転換体であると計算した。すべての変異型を表すために、必要なライブラリサイズは1.2×105個のクローンであり(323=ライブラリあたり3.4×104×6個のVH変異体)、したがって、生成されたライブラリは、必要なライブラリ多様性の16倍の過剰表現を表した。形質転換体プレートをかき取り、OD600を測定し、2個のOD600を使用して50mlのサークルグロー培養に接種し、培養物を250mlのバッフル付きフラスコで、37oCで3~4時間増殖させ、約400個のOD600ユニットを採取し、6個のミディプレッププラスミドDNAを調製し、3つのNNSコドンVLライブラリと組み合わせた6つのVHボコシズマブ変異型を表した(図12)。6つのミディプレッププラスミドDNAを、260nmでの吸光度を読み取り、等モル比で混合することによって定量化し、ボコシズマブ標的化ベクターライブラリpINT17-BSD-Boco1-ライブラリを得た。
トランスフェクションの2日前に、懸濁液適合HEK293細胞を、HEK FreeStyle 293発現培地に1mlあたり2.5×105個の細胞で播種した。トランスフェクションの日に細胞を遠心分離し、pINT17-BSD-ボコシズマブ-ライブラリ(20μgならびにAAVS左および右TALEヌクレアーゼ(TALEN、各100μg)をコードするプラスミドを含む製造業者の電気穿孔用緩衝液(1ml、Maxcyte電気穿孔用緩衝液、Thermo Fisher Scientific、カタログ番号NC0856428)中108個の細胞/mLの最終体積に再懸濁した。HEK293/プラスミドDNA混合(0.4ml)を、単一のOC-400キュベット(MaxCyte、カタログ番号OC-400R10)に移し、MaxCyte STXG2で、HEK293設定でパルスした。対照(TALENおよびpINT17-BSD-ボコシズマブおよびpINT17-BSD-5A10-iを差し引く)を、同じ設定でOC-100キュベット(MaxCyte、カタログ番号OC-100R10)を使用してトランスフェクトした。電気穿孔した細胞を三角フラスコ(250ml)に移した後、細胞を30分間静置してから、FreeStyle 293発現培地(40ml、LifeTech.カタログ番号12338018)を添加した。細胞を完全に再懸濁し、130RPM、37℃、および5%CO2に設定された軌道振盪インキュベーターに置いた。
24時間後、1×106個の細胞を、抗ヒトFc PE(Cambridge Bioscience、カタログ番号409304)で染色し、一過性発現を確認した。簡潔には、細胞を600xgで2.5分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を0.1%BSA(7.5%溶液から希釈:LifeTech、カタログ番号15260037)に再懸濁した。これらを再度遠心分離し、1μlの抗ヒトFc PEを添加した100μlの1%BSA、PBSに再懸濁した。これらを4℃の暗所で30分間インキュベートした。細胞
を1mlの0.1%BSA、PBSで2回洗浄し、5μlの7-AAD(eBioscience、カタログ番号00-6993-50)を含む0.5mlの0.1%BSA、PBSに再懸濁した。50μlを取り除き、96ウェルプレートのウェルに添加した。IntelliCytフローサイトメーターを使用して掲示レベルを分析し、これはトランスフェクションに対して一過性細胞表面抗体を示した。一過性発現が観察されたため、培養物を、7.5μg/mlの濃度で抗生物質のブラストサイジンS HCl(LifeTech、カタログ番号R21001)を使用して選択のために進めた。細胞を三角フラスコに1mlあたり0.25×106個の細胞で播種した。細胞を、10,000個の細胞または10ml中1000個の細胞のいずれかで、10%FBS(Sigma Aldrich、カタログ番号F9665-500ML)および1%ペニシリンストレプトマイシン(Sigma Aldrich、カタログ番号P0781-100ML)を含むDMEM(LifeTech、カタログ番号41965039)中10cmディッシュ(Corning、カタログ番号353003)に播種した。これらは、ブラストサイジンS HCl(LifeTech、カタログ番号R21001)を7.5μg/mlで添加する前に、24時間付着させた。トランスフェクションの12日後、プレートを2%メチレンブルーで染色した。トランスフェクション効率のパーセンテージを、全細胞の所与のインプットを達成したブラストサイジンコロニーの数をカウントすることによって計算した。統合効率を2%であると計算し、40百万の細胞トランスフェクションを達成したライブラリサイズは800,000であり、必要な理論ライブラリサイズ(120,000)の7倍であった。したがって、哺乳動物ディスプレイライブラリを、変異型の可能なすべての組み合わせをコードして構築した。
を1mlの0.1%BSA、PBSで2回洗浄し、5μlの7-AAD(eBioscience、カタログ番号00-6993-50)を含む0.5mlの0.1%BSA、PBSに再懸濁した。50μlを取り除き、96ウェルプレートのウェルに添加した。IntelliCytフローサイトメーターを使用して掲示レベルを分析し、これはトランスフェクションに対して一過性細胞表面抗体を示した。一過性発現が観察されたため、培養物を、7.5μg/mlの濃度で抗生物質のブラストサイジンS HCl(LifeTech、カタログ番号R21001)を使用して選択のために進めた。細胞を三角フラスコに1mlあたり0.25×106個の細胞で播種した。細胞を、10,000個の細胞または10ml中1000個の細胞のいずれかで、10%FBS(Sigma Aldrich、カタログ番号F9665-500ML)および1%ペニシリンストレプトマイシン(Sigma Aldrich、カタログ番号P0781-100ML)を含むDMEM(LifeTech、カタログ番号41965039)中10cmディッシュ(Corning、カタログ番号353003)に播種した。これらは、ブラストサイジンS HCl(LifeTech、カタログ番号R21001)を7.5μg/mlで添加する前に、24時間付着させた。トランスフェクションの12日後、プレートを2%メチレンブルーで染色した。トランスフェクション効率のパーセンテージを、全細胞の所与のインプットを達成したブラストサイジンコロニーの数をカウントすることによって計算した。統合効率を2%であると計算し、40百万の細胞トランスフェクションを達成したライブラリサイズは800,000であり、必要な理論ライブラリサイズ(120,000)の7倍であった。したがって、哺乳動物ディスプレイライブラリを、変異型の可能なすべての組み合わせをコードして構築した。
ブラストサイジンS HCl(LifeTech、カタログ番号R21001)選択の5日後、MACSビーズおよびカラム(Miltenyi、カタログ番号130-048-801およびカタログ番号130-042-401)を使用して細胞を富化した。ライブラリは200百万個を超える細胞に拡張された。100百万個の細胞を200xgで遠心分離し、0.1%BSA-PBSで洗浄した。これらを9.9mlの1%BSA-PBSに再懸濁し、100μlの抗ヒトFc PE抗体(Cambridge Bioscience、カタログ番号409304)を添加した。残りの100百万個も遠沈し、洗浄し、ビオチン化PCSK9抗原(10nM、PC9-H82E7、AcroBiosystems、10ml、1%BSA-PBSで希釈)とともにインキュベートした。両方を暗所で、4℃で30分間インキュベートした。この時点から、autoMACSすすぎ溶液(Miltenyi、カタログ番号130-091-221)を使用した。細胞をautoMACSすすぎ溶液(10ml、1xPBS+2mM EDTA+0.5%BSA)で洗浄し、200xgで遠心分離し、800μlのautoMACSすすぎ溶液に再懸濁した。200μlの抗PE(Miltenyi、カタログ番号130-048-801)マイクロビーズまたはストレプトアビジン(Miltenyi、カタログ番号130-048-101)マイクロビーズのいずれかを添加した。これらを暗所で、4℃で10分間インキュベートした後、10mlのautoMACSすすぎ溶液で洗浄し、5mlに再懸濁してカラムに適用する準備ができた。MACS LSカラム(Miltenyi、カタログ番号130-042-401)を、細胞を添加する前に、3mlのautoMACSすすぎ溶液で事前洗浄した。細胞の各セットに4xカラムを使用した。1/4(約1.25ml)の細胞を各カラムに添加すると、カラムを3mlの緩衝液で3回洗浄した。LSカラムを磁気ホルダーから取り外し、5mlの緩衝液を添加した。これを、プランジャーを使用してカラムを通して15ml Falconチューブに押し込み、結合した細胞を溶出した。集団をさらに精製するために、この5mlを新鮮なカラム(以前のように事前洗浄した)に添加し、以前のように処理した。細胞をカウントし、5ml中約1.5×106個の細胞/mlであることを見出した。これらを遠沈し、7.5μg/mlのブラストサイジンを含む30mlのFreeStyle培地FreeStyle 293発現培地(LifeTech.カタログ番号12338018)に再懸濁し、継代の準備ができ
るまで37℃、5%CO2でインキュベートした。
るまで37℃、5%CO2でインキュベートした。
MACSの48時間後、細胞をFc提示および抗原結合について染色した(図13)。したがって、2つの集団を、抗原またはFc発現のいずれかに関する最初のラウンドの選択に基づいて創出した(それぞれ選択番号884および885)。これらをその後、フローサイトメトリーによる抗原およびFc発現の組み合わせで選択した。手順は、以前に記載される24時間染色と同じであったが、次のように調整した:細胞を10nMビオチン化ヒトPCSK9、Avi-Tag(カタログ番号PC9-H82E7-25ug、ACRObiosystems)とともに4℃で30分間インキュベートした後、洗浄し、抗ヒトFc PE(1×106個の細胞あたり1μl)(Cambridge Bioscience、カタログ番号409304)およびAnti-strep APC(Invitrogen、カタログ番号SA1005)(1×106個の細胞あたり0.5μl)の混合とともにインキュベートした。7-AAD(eBioscience、カタログ番号00-6993-50)を使用して、以前のように生存率を評価した。細胞を洗浄し、以前に記載のIntelliCyt機器を使用して分析した(図10)。選択の14日後、BD Influxを使用してFACSを実施した。抗原結合またはFc掲示で選別されたMACS選別集団の20×106個の細胞を、10nMビオチン化ヒトPCSK9(PC9-H82E7-25ug、ACRObiosystems)ともに(以前のように)インキュベートした後、洗浄し、抗ヒトFc PE(1×106個の細胞あたり1μl)(Cambridge Bioscience、カタログ番号409304)および抗Strep APC(1×106あたり0.5μl、SA1005、Invitrogen)の混合とともにインキュベートした。選別の直前にDAPIを添加した(1μl/100万個の細胞)。図14に示されるように、細胞を、より高い抗原結合集団(ゲートP5)およびより低い抗原結合集団(ゲートP6)の2つのさらなる集団に選別した。これらのFACS精製された集団を、ブラストサイジンなしであるが、細胞選別プロセスからの汚染を回避するために1%ペニシリンストレプトマイシンを用いて増殖した。培養の4日後、各集団の1x106個の細胞をゲノムDNA抽出のために採取した。
IgGをコードするDNAを、実施例4に記載されるように、KODホットスタートDNAポリメラーゼ(Merck Millipore)を使用するネステッドPCRによって増幅した。PCR産物をゲル精製し、NheIおよびXhoIで消化し、pINT3哺乳動物発現ベクターにクローニングし、E.coli DH10B細胞を形質転換するために使用した。
ランダムな選択されていない入力クローン(84)、選別された抗原(75)、および選択されたFc(85)を配列決定し、VH特異性を決定した。哺乳動物ディスプレイ選択のサイクルに由来する配列決定されたクローンのセットから、元のボコシズマブVH遺伝子を有したものはなく、IGHV1-46*01生殖細胞系列から構成される変異型に対する強いバイアスが存在した(図15を参照されたい)。同じクローンセットについてVL配列を決定した。平均pIおよび脂肪族インデックスを、3つの変異コドンについて計算した。これは、哺乳動物ディスプレイで選択された抗体(図16)のpIおよび脂肪族インデックスの両方の低減を示し、CDR2および3の元の疎水性アミノ酸からの切り替えを示した。
哺乳動物ディスプレイで選択されたボコシズマブ変異型が、親抗体と比較して優れた生物物理学的特性を有したことを示すために、選択された抗体を次に発現させた。クローンを選択ごとに96ウェルプレートへと選んだ(集団あたり91個):PCSK9上のMACS(選択884という名前)または抗Fc上のMACS(選択885という名前)。これらのコロニーを使用して、製造業者の指示に従ってQiagenプラスミドプラス96ミニプレップキット(Qiagen、カタログ番号16181)を使用してトランスフェ
クション用の2つのDNAプレートを調製した。このDNAを使用して、製造業者の指示に従ってExpi293トランスフェクション系(LifeTech、カタログ番号A14525)を使用して、Expi293細胞の2つの96ウェルプレートにトランスフェクトした。5日後、これらを採取し、上清を4℃に保った。抗体が凝集する傾向を決定するために、AC-SINS(親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法)と称される方法を使用した。使用した方法は、本質的には、次の改変を伴うLiu et al.,201439によって説明されるとおりであった。金ナノ粒子(AuNP、クエン酸安定化20nm金ナノ粒子、15705、Ted Pella Inc.)を、PEGチオールでブロックし、AuNPを必要になるまで(最大1週間)4℃で保管した。シリンジフィルターを使用して10倍に濃縮するのではなく、AuNPを15,000RPMで、4℃で10分間遠心分離し、上清の95%を除去して、同じ条件でさらに遠心分離した。最終的なAuNPを、開始体積の1/10で再懸濁した。ポリプロピレン96ウェルプレートの各ウェルに10μlを添加した(上清またはPBSで精製したもののいずれかに100μlの試験抗体を含む)。プレートを、700RPMに設定された振盪台で、室温で2時間インキュベートした。Liu et al.(2014)39に記載されているように、内容物をポリスチレンUV透明プレートに慎重に移した。吸光度データを、BMG Pherastar装置を使用して、2nm単位で450~650nmで収集する。最大吸光度の波長を特定し、ノイズによるエラーを低減するために、いずれかの側の10ポイントを直前および直後のポイントで平均化する。これらの平均の最高点が最大吸光度としてみなされる。図17は、AC-SINSアッセイの結果を抗体のCDR配列と一緒に示す。選択された変異型クローンの大部分(86/91)は、ヒト化中間クローン5A10-iと同等である、12nm以下のAC-SINS波長シフトを表示した。この波長は、これらの試料では自己会合がそれほど発生していないことを示す。対照的に、ボコシズマブはAC-SINSによって26nmの波長シフト(図17)を示し、選択されたセットの5つのクローンのみが20nmを超える波長シフトをもたらした。したがって、ボコシズマブ変異型クローンは、AC-SINSアッセイによって判断されるように、元の親クローンよりも自己凝集するより低い傾向を有する哺乳動物細胞ディスプレイによって選択されている。
クション用の2つのDNAプレートを調製した。このDNAを使用して、製造業者の指示に従ってExpi293トランスフェクション系(LifeTech、カタログ番号A14525)を使用して、Expi293細胞の2つの96ウェルプレートにトランスフェクトした。5日後、これらを採取し、上清を4℃に保った。抗体が凝集する傾向を決定するために、AC-SINS(親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法)と称される方法を使用した。使用した方法は、本質的には、次の改変を伴うLiu et al.,201439によって説明されるとおりであった。金ナノ粒子(AuNP、クエン酸安定化20nm金ナノ粒子、15705、Ted Pella Inc.)を、PEGチオールでブロックし、AuNPを必要になるまで(最大1週間)4℃で保管した。シリンジフィルターを使用して10倍に濃縮するのではなく、AuNPを15,000RPMで、4℃で10分間遠心分離し、上清の95%を除去して、同じ条件でさらに遠心分離した。最終的なAuNPを、開始体積の1/10で再懸濁した。ポリプロピレン96ウェルプレートの各ウェルに10μlを添加した(上清またはPBSで精製したもののいずれかに100μlの試験抗体を含む)。プレートを、700RPMに設定された振盪台で、室温で2時間インキュベートした。Liu et al.(2014)39に記載されているように、内容物をポリスチレンUV透明プレートに慎重に移した。吸光度データを、BMG Pherastar装置を使用して、2nm単位で450~650nmで収集する。最大吸光度の波長を特定し、ノイズによるエラーを低減するために、いずれかの側の10ポイントを直前および直後のポイントで平均化する。これらの平均の最高点が最大吸光度としてみなされる。図17は、AC-SINSアッセイの結果を抗体のCDR配列と一緒に示す。選択された変異型クローンの大部分(86/91)は、ヒト化中間クローン5A10-iと同等である、12nm以下のAC-SINS波長シフトを表示した。この波長は、これらの試料では自己会合がそれほど発生していないことを示す。対照的に、ボコシズマブはAC-SINSによって26nmの波長シフト(図17)を示し、選択されたセットの5つのクローンのみが20nmを超える波長シフトをもたらした。したがって、ボコシズマブ変異型クローンは、AC-SINSアッセイによって判断されるように、元の親クローンよりも自己凝集するより低い傾向を有する哺乳動物細胞ディスプレイによって選択されている。
発現されたプレートからの上清もまた使用して、PCSK9への結合を保持する抗体の能力を比較した。単量体抗原を用いた捕捉ELISAアッセイでこれを行い、これは、それらの標的と結合するための抗体の親和性ランク付けに効果的な方法であることが示されている。簡潔には、96ウェルMaxisorpプレート(Nunc、カタログ番号437111)を、4℃で一晩、PBS中3μg/mlで、抗ヒトFc抗体(Jackson
ImmunoResearch、カタログ番号209-005-098)でコーティングした。翌日、プレートを1xPBSで3回洗浄し、続いて1xPBS(M-PBS)中の300μlの3%(w/v)乾燥ミルク(Marvel)で、室温で1時間ブロックした。これらを1xPBSで3回洗浄し、30μlの6%(w/v)乾燥ミルク(Marvel)を各ウェルに添加した。30μlの各上清を添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを1xPBS-Tween(0.1%)で3回、次いで1xPBSで3回洗浄した。60μl/ウェルの0.1nMビオチン化ヒトPCSK9、Avi-Tag(ACRObiosystems、カタログ番号PC9-H82E7)を各ウェルに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを以前のように1xPBS-Tweenで洗浄し、その後1xPBSで洗浄した。DELFIAアッセイバッファー(Perkin Elmer、カタログ番号1244-111)中の60μl/ウェルのストレプトアビジンユウロピウム(Perkin Elmer、カタログ番号1244-360)(500分の1希釈)を添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを最後に1xPBS-Tweenおよび1xPBSで洗浄した後、50μl/ウェルのDELFIA強化溶液(Perkin Elmer、カタログ番号4001-0010)を添加した。プレートをプレートシェーカーに300RPMで5分間置き、BMG La
btech PHERAStarプレートリーダー(励起340nm、発光615nm)で読み取った。これは、大部分の抗体がPCSK9への結合を保持し、いくつかはボコシズマブ(KD=7pM)および5A10-i(KD=1.5nM)中間体クローンと同等の捕捉ELISAシグナルを表示したことを示した(図17)。これは、ライブラリ創出および哺乳動物ディスプレイの選択により、抗体パラトープ残基を標的とし、かつ同時に、改善された生物物理特性および標的抗原と結合する保持された能力を有する抗体を選択することが可能であることを示す。
ImmunoResearch、カタログ番号209-005-098)でコーティングした。翌日、プレートを1xPBSで3回洗浄し、続いて1xPBS(M-PBS)中の300μlの3%(w/v)乾燥ミルク(Marvel)で、室温で1時間ブロックした。これらを1xPBSで3回洗浄し、30μlの6%(w/v)乾燥ミルク(Marvel)を各ウェルに添加した。30μlの各上清を添加し、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを1xPBS-Tween(0.1%)で3回、次いで1xPBSで3回洗浄した。60μl/ウェルの0.1nMビオチン化ヒトPCSK9、Avi-Tag(ACRObiosystems、カタログ番号PC9-H82E7)を各ウェルに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを以前のように1xPBS-Tweenで洗浄し、その後1xPBSで洗浄した。DELFIAアッセイバッファー(Perkin Elmer、カタログ番号1244-111)中の60μl/ウェルのストレプトアビジンユウロピウム(Perkin Elmer、カタログ番号1244-360)(500分の1希釈)を添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを最後に1xPBS-Tweenおよび1xPBSで洗浄した後、50μl/ウェルのDELFIA強化溶液(Perkin Elmer、カタログ番号4001-0010)を添加した。プレートをプレートシェーカーに300RPMで5分間置き、BMG La
btech PHERAStarプレートリーダー(励起340nm、発光615nm)で読み取った。これは、大部分の抗体がPCSK9への結合を保持し、いくつかはボコシズマブ(KD=7pM)および5A10-i(KD=1.5nM)中間体クローンと同等の捕捉ELISAシグナルを表示したことを示した(図17)。これは、ライブラリ創出および哺乳動物ディスプレイの選択により、抗体パラトープ残基を標的とし、かつ同時に、改善された生物物理特性および標的抗原と結合する保持された能力を有する抗体を選択することが可能であることを示す。
次いで、低AC-SINS波長シフトのAC-SINS培養上清スコアおよび抗原結合の保持に基づいて、クローンを選択した(図17)。次いで、これらのクローンを、ボコシズマブ、5A10-i、およびアリロクマブ(承認された抗PCSK9抗体)と一緒に、Expi-293細胞(50mlスケール)の一過性トランスフェクションによって発現させ、プロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製し、その後、実施例3に記載されるように透析した。次いで、抗体をHPLC-SECにより分析したところ、これは選択したすべての抗体が、対照のアリロクマブ抗体および5A10-iで同等のHPLC保持時間およびピーク幅を表示したことを示した(図18)。対照的に、ボコシズマブはカラムで遅延し、より長い保持時間を表示した。また、ボコシズマブは非対称のピークを示し、また交差相互作用特性を有し、カラムマトリックスに非特異的に結合していたことも示した。精製された抗体もAC-SINSによって分析し、これは、アリロクマブおよび5A10-i(Δλ=8~12nm)と同等の波長シフトを示したが、ボコシズマブは、より長いAC-SINS波長シフトを表示し、自己相互作用特性を有したことを示した(Δλ=39nm)。発現収量、AC-SINS波長シフト、HPLC-SEC保持時間、およびHPLC-SECピーク幅を表6に要約する。
したがって、この実施例は、高次真核細胞で結合剤ディスプレイを使用して、標的への結合を保持しながら、低減された自己相互作用を含む改善された開発性プロファイルおよび低減された非特異的相互作用を有する変異型を選択することが可能であることを例示した。この実施例では、最初に抗体の表面の疎水性および正電荷パッチを特定し、ランダムまたは標的変異誘発を行い、変異型ライブラリを創出し、ヌクレアーゼ媒介結合剤遺伝子標的化を使用して細胞ごとに単一の遺伝子コピーを可能にすることによってこれを達成した。次いで、細胞ディスプレイライブラリを、細胞ディスプレイレベルおよび抗原結合に基づいて選別し、改善された生物物理学的特性を有する親抗体の変異型を特定した。
実施例6a.非交差相互作用クローンの選択による開発性の向上
それらの標的以外の分子への非特異的結合の特性を有する抗体は、インビボで短い半減期を有する傾向があり、「オフターゲット」結合を引き起こし、不十分な薬物動態(PK)および薬力学(PD)をもたらし得る。さらに、交差相互作用または「粘着性」の特性は、抗体の製造中に問題、例えば、精製または製剤の問題の間にカラムマトリックスへの遅延をもたらし得る。
それらの標的以外の分子への非特異的結合の特性を有する抗体は、インビボで短い半減期を有する傾向があり、「オフターゲット」結合を引き起こし、不十分な薬物動態(PK)および薬力学(PD)をもたらし得る。さらに、交差相互作用または「粘着性」の特性は、抗体の製造中に問題、例えば、精製または製剤の問題の間にカラムマトリックスへの遅延をもたらし得る。
この実施例は、抗体哺乳動物ディスプレイを使用して、既知の「粘着性」または交差相互作用の問題がある抗体と、良好に動作し、臨床使用が承認されている抗体とを区別することが可能であることを実証する。抗ニューロピリン-1抗体ベセンクマブ(またはMNRP1685A)を、「粘着性」抗体の例として選択した。この抗体は、サイズ排除クロマトグラフィー中に遅延することが知られており、カラムマトリックスと非特異的に結合する。これは、動物モデルにおけるその短い半減期に寄与すると考えられている104。さらに、タンパク尿の副作用の観察後、この抗体の臨床開発を中止した105。抗PD1抗体ニボルマブを、臨床使用が承認されている良好に動作する抗体の一例として選んだ106。ベセンクマブはまた、親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法(AC-SINS)アッセイ39でいくつかの自己相互作用を表示した。
ベセンクマブおよびニボルマブの重および軽可変ドメインをコードする合成DNA(配列については表7を参照されたい)を、pINT3(WO2015166272A2)に基づくデュアルプロモーターIgG可溶性発現ベクターにクローニングし、DNA配列を確認した。可溶性抗体の特性を調べるために、pINT3-ベセンクマブおよびpINT3-ニボルマブのプラスミドDNAを調製し、これを使用して、製造業者の指示(A14525、ThermoFisher Scientific)に従ってトランスフェクション試薬ExpiFectamineを使用してExpi293細胞(最終培養体積スケール30ml)にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間前に、25.
5mlのExpi293発現培地に2×106個の細胞/mlの密度で細胞を播種した。プラスミドDNA(30μg)をOpti-MEM培地(1.5ml)で希釈し、ExpiFectamine 293試薬(80μl)をOpti-MEM培地(1.5ml)で希釈して、室温で5分間インキュベートした。次いで、希釈したプラスミドDNA(1.5mlのOpti-MEM培地中30μg)を希釈したExpiFectamine 293試薬(1.5mlのOpti-MEM培地中80μlのExpiFectamine)に添加し、室温で20分間インキュベートした。細胞を37℃、5%CO2、5%湿度でインキュベートし、200rpmで撹拌した(50mm軌道スロー、ISF1-X、Climo-Shaker、Kuhner)。発現の5日後、培養上清を遠心分離(2000g、20分)によって採取し、上に記載されるように(実施例3)プロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製した。抗体の収量および濃度を、280nmでの吸光度の測定によって決定し、濃度を見積もるために1.4の推定吸光係数を使用してランバート・ベールの法則を使用して計算することによって決定した。ベセンクマブおよびニボルマブの発現収量は類似していた(それぞれ95mg/Lおよび103mg/L)。一過性のトランスフェクション効率で達成される発現収量はまた、抗体の濃度が増加したときに差し迫った問題を導くものではない。
5mlのExpi293発現培地に2×106個の細胞/mlの密度で細胞を播種した。プラスミドDNA(30μg)をOpti-MEM培地(1.5ml)で希釈し、ExpiFectamine 293試薬(80μl)をOpti-MEM培地(1.5ml)で希釈して、室温で5分間インキュベートした。次いで、希釈したプラスミドDNA(1.5mlのOpti-MEM培地中30μg)を希釈したExpiFectamine 293試薬(1.5mlのOpti-MEM培地中80μlのExpiFectamine)に添加し、室温で20分間インキュベートした。細胞を37℃、5%CO2、5%湿度でインキュベートし、200rpmで撹拌した(50mm軌道スロー、ISF1-X、Climo-Shaker、Kuhner)。発現の5日後、培養上清を遠心分離(2000g、20分)によって採取し、上に記載されるように(実施例3)プロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製した。抗体の収量および濃度を、280nmでの吸光度の測定によって決定し、濃度を見積もるために1.4の推定吸光係数を使用してランバート・ベールの法則を使用して計算することによって決定した。ベセンクマブおよびニボルマブの発現収量は類似していた(それぞれ95mg/Lおよび103mg/L)。一過性のトランスフェクション効率で達成される発現収量はまた、抗体の濃度が増加したときに差し迫った問題を導くものではない。
ニボルマブおよびベセンクマブの生物物理学的特性は、いくつかの技法によって決定した。融解温度(Tm)および凝集開始温度(Tagg)を、上に記載されるように(実施例3)プロメテウスNT.4B(Nanotemper)を使用して決定した。2つの抗体の融解温度(Tm)および凝集温度(Tagg)は類似していた(表8aを参照されたい)。これもまた、溶融温度が差し迫った問題を予測するものではないことを実証する。
しかしながら、以前に記載されるように、分取サイズ排除クロマトグラフィーの実行中、重要なカラムマトリックスの結合および遅延が観察された(表8aおよび図19)。ニボルマブおよびベセンクマブの溶出量(Ve)は、それぞれ12.0mlおよび13.7mlであり、ベセンクマブの遅延およびカラムマトリックスとの非特異的相互作用を示す。10.4mlでの追加の溶出ピークは、いくつかのより高い分子量の凝集した抗体の存在を示し、ニボルマブについては観察されなかった。貯蔵中の抗体の安定性を調べるため
に、サイズ精製された抗体をPBS pH7.4中で、4℃で2週間インキュベートした。動的光散乱(DLS)により、ベセンクマブでは高次凝集種を検出されたが、ニボルマブでは検出されなかった(方法論については、図20および図の凡例を参照されたい)。動的光散乱測定は、Zetasizer APS(Malvern Instruments、Malvern,UK)を使用して、4℃で2週間保存された試料に対して行った。計算された多分散性パーセンテージ、多分散性指数(PDI)、キュムラント(またはz平均)サイズ、および平均分子量のDLS由来の生物物理学的パラメータを、表8に示し、同じ条件下で保存された場合に単分散であるニボルマブと比較して、4℃で2週間の貯蔵によるベセンクマブの著しい凝集を示すことを示す。
に、サイズ精製された抗体をPBS pH7.4中で、4℃で2週間インキュベートした。動的光散乱(DLS)により、ベセンクマブでは高次凝集種を検出されたが、ニボルマブでは検出されなかった(方法論については、図20および図の凡例を参照されたい)。動的光散乱測定は、Zetasizer APS(Malvern Instruments、Malvern,UK)を使用して、4℃で2週間保存された試料に対して行った。計算された多分散性パーセンテージ、多分散性指数(PDI)、キュムラント(またはz平均)サイズ、および平均分子量のDLS由来の生物物理学的パラメータを、表8に示し、同じ条件下で保存された場合に単分散であるニボルマブと比較して、4℃で2週間の貯蔵によるベセンクマブの著しい凝集を示すことを示す。
ベセンクマブおよびニボルマブの重および軽可変ドメインをコードする合成DNAを、哺乳動物のディスプレイベクターpINT17-BSD(ベクターマップおよび配列については実施例1を参照されたい)にクローン化し、DNA配列を確認し、トランスフェクション品質のプラスミドDNAを調製した。HEK293細胞を、実施例2で上に記載されるように創出したTALEヌクレアーゼおよび安定した細胞株でトランスフェクトした。トランスフェクション(dpt)後から14日後、細胞を、4℃で30分間抗ヒトFc
PE(409303、Biolegend)で染色して、抗体ディスプレイ提示レベルを決定した(実施例2を参照されたい)。次いで、ニボルマブまたはベセンクマブのいずれかを表示するモノクローナル細胞株を、以下のプロトコルによって標識ヒト血清で染色した。
PE(409303、Biolegend)で染色して、抗体ディスプレイ提示レベルを決定した(実施例2を参照されたい)。次いで、ニボルマブまたはベセンクマブのいずれかを表示するモノクローナル細胞株を、以下のプロトコルによって標識ヒト血清で染色した。
熱不活性化された、ヒトAB血清(5μl、40mg/ml H4522、Sigma)を、PBS(195μl)で希釈して、1mg/mlの最終濃度を得た。次いで、この希釈されたヒト血清を、製造業者の指示に従って、Lightning-Link(登録商標)Rapid Dylight(登録商標)633キット(325-0000、Innova)を使用してDylight 633で標識した。ニボルマブまたはベセンクマブまたは野生型HEK293細胞(100万個の細胞)を表示するHEK293細胞株をペレット化した(200g、エッペンドルフチューブ(1.5ml)で3分)。ペレットをPBS(1ml)に再懸濁し、ペレット化した(600g、2.5分)。ペレットを、1%BSA、抗Fc PE(0.5μl、409303、Biolegend)を含むPBS(100μl)に再懸濁し、いずれかのAB血清Dylight 633で標識した(5μl、0.5mg/ml)。混合物を、遮光して、4℃で30分間インキュベートした。0.1%BSA、PBS(900μl)を添加し、細胞をペレット化した(600g、2.5分)。細胞を0.1%BSA、PBS(1ml)に再懸濁し、この洗浄ステップを1回繰り返した。細胞を、7-AAD(100万個の細胞あたり5μl)を含む0.1%BSA、PBS(200μl)に再懸濁した。標識された細胞(50μl)を、Intellicyte iQueスクリーナーを使用して分析した。フローサイトメトリー分析(図21)は、ニボルマブ(それぞれ12.3%および3.7%)と比較して、ベセンクマブを表示するHEK293細胞への標識されたヒト血清の増加された結合を示した(それぞれ抗体およびヒト血清結合に対して二重陽性)。
ベセンクマブは、第1相臨床試験105を超えて開発することに失敗した抗体であり、既知の自己凝集および交差相互作用特性39、104を有する抗体である。また、この抗体は、サイズ排除クロマトグラフィーの間、交差相互作用を示さない臨床的に承認された抗PD1抗体ニボルマブと比較して、サイズ排除カラムマトリックス(図19)との非特異的相互作用を示し、貯蔵時に凝集すること(図20および表8)を示し、貯蔵後も単分散のままであることを示した。ここでは、交差相互作用フローサイトメトリーアッセイでHEK293細胞の表面に表示されたときに、ベセンクマブおよびニボルマブを区別することができることを示す。このアッセイを最適化して、「粘着性のある」抗体と良好に動作する抗体とのさらに大きな区別を可能にすることができる可能性が高い。例えば、ヒト
血清をビオチン化し、親和力を増大させるために複合体化したフルオロフォア標識ストレプトアビジンに複合体化することができる。あるいは、任意の数の以前に記載されるフローサイトメトリーの交差相互作用アッセイ2を改変することができ、これらに限定されないが、標識されたバキュロウイルス16、19またはタンパク質、DNA、およびヘパリン硫酸含有分子107の標識された混合物が含まれる。
血清をビオチン化し、親和力を増大させるために複合体化したフルオロフォア標識ストレプトアビジンに複合体化することができる。あるいは、任意の数の以前に記載されるフローサイトメトリーの交差相互作用アッセイ2を改変することができ、これらに限定されないが、標識されたバキュロウイルス16、19またはタンパク質、DNA、およびヘパリン硫酸含有分子107の標識された混合物が含まれる。
実施例6b.多反応性スクリーニングの改善
既知の多反応性プロファイルを有する既知の抗体を使用して、非標的分子(多反応性プローブ)への結合の違いに基づいて、結合剤ディスプレイ細胞クローンの集団内で多反応性結合剤と非多反応性結合剤とを区別する可能性をさらに例示する。多反応性プローブと結合することに失敗するクローンの富化を実証する。
既知の多反応性プロファイルを有する既知の抗体を使用して、非標的分子(多反応性プローブ)への結合の違いに基づいて、結合剤ディスプレイ細胞クローンの集団内で多反応性結合剤と非多反応性結合剤とを区別する可能性をさらに例示する。多反応性プローブと結合することに失敗するクローンの富化を実証する。
HEK293細胞の個々の集団を、ヌクレアーゼ指向組入れを使用して調製し、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ、およびアマツキシマブを発現した。個々の集団を、ビオチン化DNAで染色した。DNAへの結合は、ブリアキヌマブおよびアマツキシマブを発現する細胞で検出されたが、ウステキヌマブを発現する細胞は染色されなかった。DNA結合を、モードに正規化した。図33A.抗Fc抗体での染色は、ブリアキヌマブ集団が、集団内でDNA結合細胞およびDNA非結合細胞のおおよそ50:50混合を占める、IgG発現細胞および非発現細胞の混合物であったことを明らかにした。異なる細胞集団を、セルトラッカー色素で標識し、同じ割合で混合した。アマツキシマブ細胞を、CellTrace Far Red(図33BおよびCのQ3のx軸に示される)で標識し、ブリアキヌマブをCellTrace CFSE(図33BおよびCのQ1のy軸に示される)で標識し、ウステキヌマブは標識しないままであった(図33BおよびCのQ4の二重陰性集団)。混合集団を、ビオチン化DNA(200μl 1%BSA中100万個の細胞あたり20μg DNA)で染色し、抗ビオチンマイクロビーズで標識した。集団を、MSカラムと組み合わせてMiniMACSビーズを使用して選別した。MACS選別からのフロースルー画分を、Intellicytフローサイトメーターを使用して分析し、細胞をカウントした。7-AADを生存率染色として使用し、死細胞を分析から除外した。DNAと結合しなかったウステキヌマブは、ブリアキヌマブおよびアマツキシマブと比較して富化されていることが観察された(図33B、図33C、表8b)。
ウステキヌマブを表示する細胞と比較して、ブリアキヌマブを表示する細胞の相対的なパーセンテージは37%に低減され、アマツキシマブを表示する細胞は10%に低減された。ブリアキヌマブの入力集団には比較的高割合の非抗体発現細胞が含まれ、これらはここで選択される「非結合集団」に保持されるため、富化係数はさらにより高くなり得る可能性が高い。このバックグラウンドは、前に記載されるようにIgG発現または抗原結合について細胞を事前選別、事後選別、または共選別することによってさらに低減され得る。
ここではMACSを順調に使用したが、FACSによる流動選別により、解像度および効果的な富化がさらにより向上することが予期される。
追加の多反応性プローブもまた、多反応性抗体および非多反応性抗体のいずれかを発現する細胞クローンを区別するそれらの能力について試験した。
ウステキヌマブを発現する細胞は、ヘパリン硫酸結合の程度に基づいて、ブリアキヌマブまたはガニツマブを発現する細胞から区別および分離され得ることを見出した。簡潔には、実施例5で以前に記載されるように標準的な染色プロトコルを使用して、250,000個の細胞を9μMヘパリン-FITC(Creative PEGWorks)で染色した。ブリアキヌマブおよびガニツマブは、ヘパリン結合を示した。オーバーレイプロットを図34に示す。この非特異的結合は、ブリアキヌマブおよびガニツマブの重鎖CDRの正に荷電されたパッチを通じて生じる可能性がある。
シャペロンタンパク質は、多重特異性結合剤を選択解除するための非標的分子として使用され得るさらなる多反応性プローブを表す。シャペロンは機能的に関連しており、タンパク質の折り畳みを助ける。熱ショックタンパク質(Hsp)は、高温などのストレス条件で過剰発現される。ほとんどのシャペロンはまた、それらが非天然タンパク質を認識および結合し、したがって凝集を防ぐ正常細胞で豊富に発現される。
様々な治療用抗体は、HEK293細胞で表示され、Hsp70およびHsp90への結合について試験した。
本実験で試験された抗体のうち、ブレンツキシマブおよびレンジルマブは、Hsp70およびHsp90への結合を示した。ブレンツキシマブ(ベドチン)は、ホジキンリンパ腫を治療するための臨床試験に失敗した抗CD30抗体-薬物複合体である。それは以前に、自己相互作用および交差相互作用2を呈することが示されていた。レンジルマブは、重度の喘息の第II相試験に失敗した抗GM-CSF(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)抗体である。
図35は、DyLight 633と複合体化した抗ヒトFc PEおよび熱ショックタンパク質(Hsp70および90)で二重染色したウステキヌマブおよびブリアキヌマブのオーバーレイを示す。オーバーレイプロット内のゲートは、シャペロン(Hsp70およびHsp90)との検出可能な相互作用を示さず、かつFACSで選別されて、シャペロンを認識する結合剤が枯渇している(および好ましくは除去されている)クローンの選択された集団を提供し得る細胞を示す。
様々な異なる抗体および異なる多反応性プローブを用いた複数の実験からのプールされたデータを図36に示す。個々のアンプルは別個の独立した実験で試験したが、Intellicytフローサイトメーターは固定電圧を有するため、蛍光強度がすべての試料で一定であると予期される。さらに、Hek293、各実験の内部コントロールとして使用した。以下の表8cは、多反応性プローブへの結合について試験された抗体のパネルからのデータを要約する。
アマツキシマブ、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、およびレンジルマブは、シャペロンタンパク質への結合を示した。これらの抗体の多反応性は、抗体可変ドメイン内のアミノ酸の疎水性クラスターに起因して発生し得、シャペロンタンパク質などの疎水性領域も保持するタンパク質とのファンデルワールス相互作用をもたらす。多反応性の他の理由は、DNAまたはヘパラン硫酸などの正味の負電荷を有する分子と、またはそれらの表面22に正電荷パッチを有するFcRnなどのタンパク質と相互作用するアミノ酸(例えば、アルギニンまたはリジン残基からなる)の正荷電パッチの存在であり得る。本実験では、アマツキシマブ、ブリアキヌマブ、ガニツマブ、およびレンズリマブはすべて、DNAおよびヘパリンと結合した。それらの表面に疎水性パッチおよび正に荷電されたパッチの両方を保持する抗体は、増加された多反応性を有し得る。本データに基づくと、疎水性パッチを介してシャペロンタンパク質に結合すること、および中性pHでDNA、ヘパリン硫酸、またはFcRnと結合することの両方が可能である抗体の例としては、ブリアキヌマブ、アマツキシマブ、およびレンズズリマブが挙げられる。これらのデータは、ブリアキヌマブ2によって示される非特異的結合に関する以前の報告と一致している。
実施例7.親クローンおよび改善されたクローンのディスプレイレベルの定量化
実施例2では、HEK293細胞へのヌクレアーゼ媒介導入遺伝子組入れおよび安定した細胞株の選択後に、3対の抗体について高等真核細胞ディスプレイレベルの差を観察した。PE標識抗Fcで細胞を染色し、フローサイトメトリーで平均蛍光強度を測定することによって判断されるディスプレイレベルは、抗体の自己相互作用および交差相互作用の特性によって相関する(実施例3)。この実施例7では、細胞表面上の抗体ディスプレイコピー数を定量化し、ディスプレイコピー数が抗体生物物理学的特性と相関することを示す。ビーズが正確に定義された数のFc特異的捕捉抗体を有するビーズベースの較正曲線を使用して定量的測定を行った。
実施例2では、HEK293細胞へのヌクレアーゼ媒介導入遺伝子組入れおよび安定した細胞株の選択後に、3対の抗体について高等真核細胞ディスプレイレベルの差を観察した。PE標識抗Fcで細胞を染色し、フローサイトメトリーで平均蛍光強度を測定することによって判断されるディスプレイレベルは、抗体の自己相互作用および交差相互作用の特性によって相関する(実施例3)。この実施例7では、細胞表面上の抗体ディスプレイコピー数を定量化し、ディスプレイコピー数が抗体生物物理学的特性と相関することを示す。ビーズが正確に定義された数のFc特異的捕捉抗体を有するビーズベースの較正曲線を使用して定量的測定を行った。
Quantum Simply Cellular(QSC)ミクロスフェアキット(815、Bangs Laboratories,Inc.)は、Fc特異的捕捉抗体(ヤギ抗マウスIgG)の量の増加とともに、5つのビーズ集団-1つのブランクおよび4つのビーズ集団を有する。QSCビーズを、細胞を標識するために使用される同じフロロクロム複合体化抗体で染色し、製造業者の指示に従ってフローサイトメーターで分析する。簡潔には、1滴のQSCミクロスフェアをマイクロ遠心チューブに添加し、50μLの染色緩衝液(1%BSA)を添加し、チューブを軽くはじいた。5μlのPE抗ヒトIgG Fc抗体を、QSCミクロスフェアに添加し、穏やかに混合し、暗所で30分間インキュベートした。2500xGで5分間遠心分離することによって、QSCミクロスフェ
アを1ml洗浄緩衝液(0.1%BSAを含むPBS)で2回洗浄した。ビーズペレットを150ul洗浄緩衝液に再懸濁した。染色されたビーズの集団およびブランクの集団を、単一のウェルで組み合わせ(集団あたり10ul)、Intellicytで実行する。並行して、実施例2に記載されるように、細胞表面上に異なる抗体を発現するHEK293細胞に対して細胞染色を行った。
アを1ml洗浄緩衝液(0.1%BSAを含むPBS)で2回洗浄した。ビーズペレットを150ul洗浄緩衝液に再懸濁した。染色されたビーズの集団およびブランクの集団を、単一のウェルで組み合わせ(集団あたり10ul)、Intellicytで実行する。並行して、実施例2に記載されるように、細胞表面上に異なる抗体を発現するHEK293細胞に対して細胞染色を行った。
較正曲線を、各ビーズ集団の蛍光強度の中央値(図26)をその割り当てられた抗体結合能力に対してプロットすることによって生成する。抗体発現集団の蛍光強度を、ビーズの抗体結合能力と比較し、QuickCal(Bangs laboratories,Inc.)を使用して線形回帰を計算し、抗体ディスプレイコピー数を計算することを可能にする(表9)。
低い自己相互作用特性2の点で良好な生物物理学的特性を有することが知られている、臨床的に承認された抗PD1抗体であるペンブロリズマブは、この試験セットの最も高いコピー数を有した。最も強力な較正ビーズは、886,000個のコピー/ビーズを有し、これはそれを超えていた(おおよそ910,000個のコピー/細胞)。同様に、クローン病の臨床治療のために承認された抗IL12抗体であるウステキヌマブは、抗IL-12抗体であるブリアキヌマブ(273,000個のコピー)と比較して、細胞上でより高いコピー数(706,000)を示し、それは乾癬を治療するための第III相ヒト臨床試験で乏しい有効性を示した。ブリアキヌマブは、自己相互作用アッセイAC-SINSと、多重特異性試薬およびバキュロウイルス粒子2、23を用いる交差相互作用アッセイとを含むウステキヌマブと比較して、様々なアッセイで測定されるように、増加された自己相互作用および交差相互作用の特性を有するとして説明される。
3つの抗体対すべてについて、コピー数は対照よりも低く、改善された生物物理学的特性を有する再操作された娘クローンは、より高い細胞ディスプレイコピー数を有した。例えば、改善された娘抗体CNTO607-W100A、MED-1912_STT、およびAng2mAb_C49は、自己相互作用および交差相互作用の既知の問題を伴う元の親分子と比較して、コピー数の2.8倍、9倍、および4.6倍の増加を表す、それぞれ313千、433千、および570千のディスプレイコピー数を有した。
3つの抗体対すべてについて、コピー数は対照よりも低く、改善された生物物理学的特性を有する再操作された娘クローンは、より高い細胞ディスプレイコピー数を有した。例えば、改善された娘抗体CNTO607-W100A、MED-1912_STT、およびAng2mAb_C49は、自己相互作用および交差相互作用の既知の問題を伴う元の親分子と比較して、コピー数の2.8倍、9倍、および4.6倍の増加を表す、それぞれ313千、433千、および570千のディスプレイコピー数を有した。
この実施例では、宿主ゲノムへのヌクレアーゼ媒介導入遺伝子組入れおよび安定した細胞株の選択後、細胞表面に表示される抗体コピー数と、表示される抗体の生物物理学的特性との明確な関係を示す。自己相互作用および交差相互作用の特性を有する抗体は、自己相互作用および交差相互作用を測定するために設計されたアッセイで高度にスコアしなか
った抗体と比較して、より低いコピー数を表示した。低い自己相互作用および低い交差相互作用の特性の良好な生物物理学的プロファイルを有する、より良好に動作する抗体は、高次真核細胞の表面に高いコピー数を表示した。
った抗体と比較して、より低いコピー数を表示した。低い自己相互作用および低い交差相互作用の特性の良好な生物物理学的プロファイルを有する、より良好に動作する抗体は、高次真核細胞の表面に高いコピー数を表示した。
実施例8a.開発性のための高レベル発現および親和性厳密性のための低レベル発現の組み合わせ
例えば、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子が強力な構成的プロモーターによって駆動される抗体の高レベルのポリペプチド発現は、低い自己相互作用などの優れた生物物理学的特性を有する抗体の集団からの富化に有用であることが実証されている(実施例3、4、および5に上に記載されるとおり)。細胞上の高ポリペプチド濃度の提示は、自己相互作用を検出するのに役立ち得、増大された親和力は、他の分子との所望でない非特異的相互作用の高感度検出を可能にする。しかしながら、この1つの不利な結果は、低濃度の抗原を使用して厳密性を促進した場合でも、低親和性よりも高親和性の富化の達成率の低減が存在し得ることである。この「低出力」富化の追加の結果は、目標がより高い親和性の結合剤を富化することである場合でも、実際には表面提示の優先的な選択が存在し得ることである。しかしながら、富化速度は、細胞表面のより低い密度の結合剤掲示を使用することによって高められ得る。以下の説明では、異なる親和性の結合剤の相互作用を一般的に表す例として、抗体およびそれらの抗原を使用する。
例えば、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子が強力な構成的プロモーターによって駆動される抗体の高レベルのポリペプチド発現は、低い自己相互作用などの優れた生物物理学的特性を有する抗体の集団からの富化に有用であることが実証されている(実施例3、4、および5に上に記載されるとおり)。細胞上の高ポリペプチド濃度の提示は、自己相互作用を検出するのに役立ち得、増大された親和力は、他の分子との所望でない非特異的相互作用の高感度検出を可能にする。しかしながら、この1つの不利な結果は、低濃度の抗原を使用して厳密性を促進した場合でも、低親和性よりも高親和性の富化の達成率の低減が存在し得ることである。この「低出力」富化の追加の結果は、目標がより高い親和性の結合剤を富化することである場合でも、実際には表面提示の優先的な選択が存在し得ることである。しかしながら、富化速度は、細胞表面のより低い密度の結合剤掲示を使用することによって高められ得る。以下の説明では、異なる親和性の結合剤の相互作用を一般的に表す例として、抗体およびそれらの抗原を使用する。
100マイクロリットルの体積で106個の細胞を考慮すると、6×105一価の結合部位/細胞が表示され、6×1011個の分子/100マイクロリットルまたは6×1015個の分子/Lを有する。この体積でのこの結合部位の数は、10nMの濃度と同等である。この状況で10nM未満の抗原濃度を使用することは、抗体が抗原よりも過剰になることを意味し、比較的高い抗体濃度は、より低い親和性の抗体でも会合を駆動するのに役立つ。例えば、KD 0.1nMの抗体を発現する稀な細胞を、KD 10nMのより低い親和性を有する抗体を発現する過剰な細胞から分離しようとする場合、上記の条件下(すなわち、10nMの抗体濃度と同等)で、抗原のかなりの割合は、より低い親和性の抗体と複合するであろう。
質量作用の法則は、複合体を形成する2つの相互作用する分子を扱う。これらの式は、自由溶液での相互作用を網羅することを意図し、懸濁細胞に固定化された抗体を扱っている。以下の選択性の計算では、溶液中の単一の抗体についてそれぞれの場合に形成される複合体の濃度を考慮する。それにもかかわらず、質量作用の法則からの溶液中の分子の挙動に関するこの知識を使用して、それが表面提示抗体に影響を与え得るため、親和性、抗体濃度、抗原濃度、および複合体の形成の間の関係をよりよく理解することができる。
2つの相互作用する分子、例えば、一価抗体(A)および抗原(B)が混合されると、それらは複合体(A:B)を形成し、最終的に平衡状態に達することができる。平衡の位置は、抗体および抗原の濃度に依存するが、解離定数KDによって次のように説明することができる([A]、[B]および[AB]は平衡状態での濃度を示す)。
この方程式は、KD、Aの濃度、およびBの濃度の様々な条件下で形成される複合体(AB)の濃度を計算するために再編成することができる。
平衡状態にある結合反応を有する場合、
解離定数(KD)は次のように定義され、
式中、[A]、[B]、および[AB]は、平衡状態での反応物の濃度である。反応物の総濃度(「試験チューブ」に添加した濃度であるATおよびBT)は次のとおりである。
方程式3および方程式4を方程式2に代入する。
以下の方程式を再編成する:
それを乗算して、以下を、
以下の形態に再編成し(明確にするために、濃度の括弧は削除する)、
式中、以下のとおりであり、
これは、以下の二次方程式を介して解くことを可能にする。
0.1nMの抗原濃度が使用されると仮定すると、図22aは、異なる親和性の2つの抗体(Ab1の場合は10nMまたはAb2の場合は0.1nMに等しいKD)に対する抗体(A)の濃度の変化の影響を示す。図22bは、抗体が0.1nMの抗原および異なる抗体濃度で個々にインキュベートされたときに形成される複合体の濃度の比率である2つの抗体間の相対的な「選択性」を示す。
これは、相互作用のKDをはるかに下回る抗原濃度を使用しているにもかかわらず、Ab1が10nMの濃度で存在する場合、複合体の濃度は50pMであり、複合体中の抗原の50%を表す。(10nMは、6×105個のコピー/細胞での細胞表面ディスプレイの上記の例で計算された濃度である)。高い親和性Ab2抗体を使用する同じ条件下で、複合体の濃度は、99pM(抗原の99%を表す)になるため、選択性において、2倍の差のみ存在する(表10)。しかしながら、抗体濃度を0.1nMに低減すると(この実施例ではディスプレイレベルを100倍低減することに相当)、Ab1の場合は複合体の濃度が1pMに下がるが、一方でAb2では38.2pMの複合体の濃度が達成され(表10)38倍の選択性を表す。低減された密度は、標的再結合の可能性を低減するという利点も有する。高密度の固定化結合剤の存在下での再結合の問題は、表面プラズモン共鳴などの表面ベースの親和性測定(BIAcoreマニュアル)で特によく認識され、文書化されている。
流動選別では、細胞表面の蛍光標識抗原(直接または間接的に標識された)の存在を検出することにより、複合体の相対濃度を測定する。したがって、フローサイトメーター内で検出された細胞の蛍光シグナルは、使用される条件下で細胞上に形成された複合体の濃度の指標である。したがって、抗体提示のより限定的な条件下では、高親和性抗体および低親和性抗体を提示するクローン間でより大きな分離が達成される。
最適な抗体を選択するプロセス中、抗体発見キャンペーン中に、それらの標的に対してより高い親和性を有する抗体を選択することが望ましい場合がある。抗体ファージディスプレイ選択中に厳密性を増加させ、それらの標的に対する改善された親和性を有するクローンを富化する方法は、選択中に標的抗原の濃度を低減させることである57(Fellouse FA,Sidhu SS:Making antibodies in bacteria.In:Making and Using Antibodies:A Practical Handbook.Edited by Howard GC,Kaser MR:CRC Press;2007:157-180108)。哺乳動物のディスプレイ選択では、標識された抗原濃度をFACSまたはMACSの間に低減して、改善された親和性を有するクローンの選択的富化を可能にすることもできる。しかしながら、抗体発現が強力な構成的プロモーターによって駆動される場合に達成される高いディスプレイレベルは、所望の標的親和性を超える抗体の濃度と同等であり得る。したがって、上の実施例では、HEK293細胞の抗体細胞ディスプレイレベルを、例えば、細胞あたり60,000以下に低減して、10nM~0.1nMの10倍の選択性を与えることが望ましい場合がある。これにより、より低い親和性のクローンよりも改善された親和性を有する抗体の優れた富化が可能になる。
抗体ディスプレイレベルは、抗体の転写段階、転写後段階、翻訳段階、または翻訳後段階でいくつかの異なる方法で低減され得る。例えば、弱いプロモーターを用いて、一次mRNA転写産物の生成速度を低減させることができ、非最適スプライス/アクセプター部
位を組み込み、成熟mRNAの生成および核から細胞質への輸出の効率および速度を低減することができる。mRNAの安定性が低減し得るため、転写産物の半減期および有効濃度が低減する。発現の翻訳制御は、コザックコンセンサス配列を変更して、mRNAへのリボソームの結合に影響を与えることによるものであり得る。翻訳後制御の例は、非最適リーダー配列を使用して、小胞体への輸送効率を低減することによるものであり得る。
位を組み込み、成熟mRNAの生成および核から細胞質への輸出の効率および速度を低減することができる。mRNAの安定性が低減し得るため、転写産物の半減期および有効濃度が低減する。発現の翻訳制御は、コザックコンセンサス配列を変更して、mRNAへのリボソームの結合に影響を与えることによるものであり得る。翻訳後制御の例は、非最適リーダー配列を使用して、小胞体への輸送効率を低減することによるものであり得る。
この実施例では、抗体ディスプレイレベルを低減するためのスプライス/アクセプター部位操作の使用を示す。この低減されたディスプレイ系は、それらの標的に対して異なる親和性を有する抗体を表示するHEK293細胞株混合物のより効率的な分離を可能にすることが示された。
B細胞で使用される自然な系に基づく、表面ディスプレイを抗体分泌と組み合わせる方法を考案した。B細胞の成熟中、抗体は膜結合型で発現し、形質細胞が成熟するにつれて、これは主に分泌型に切り替わる。これは、細胞表面のディスプレイの能力が膜貫通型の発現に依存する真核生物のディスプレイの要件と一致する。あるいは、クローンが選択されると抗体を分泌型で発現する能力により、さらなる特徴付けのための遊離の可溶性抗体の即時生成が可能になる。
B細胞における表面ディスプレイおよび分泌の間のバランスは、ポリA添加(分泌されたIgGにつながる)およびスプライシング(膜テザリングにつながる)109、110の間のバランスによって大きく駆動される。「近位」ポリアデニル化部位は、CH3ドメインの末端の後100~200bpに見出され、これは、CH3ドメインの末端で翻訳を停止し、分泌生成物をもたらすmRNAを生成する。CH3ドメインの末端の近くには、下流のエクソン(M1)にスプライスして、「ヒンジ」および膜貫通ドメインとのフレーム内融合を創出することができる、潜在的なスプライスドナー部位も存在する。(M1エクソンは、次いで、細胞内ドメインをコードするM2エクソンにスプライスする)。分泌型対膜結合型のIgG提示のバランスは、近位ポリA部位でのポリアデニル化およびM1エクソンへのスプライシングの間のバランスに依存する。これは、2つの代替エクソンのうちの1つを使用して、分泌型および膜結合型111を切り替える最近公開された方法とは異なる。
スプライシングは通常、スプライソソームアセンブリを開始してイントロンの除去につなげるために必要なU1核内低分子RNA(snRNA)を介して生じる。CH3の末端のスプライスドナー部位は、コンセンサススプライスドナー部位と比較して最適ではない。非最適スプライスドナーは、進化全体にわたって保存され、U1 snRNAに非最適な塩基対を与えることが予期される。実際、非最適スプライスドナー部位のコンセンサススプライスドナー配列の変異が、増加されたスプライシングの結果として、主に分泌型をコードする処理されたRNAから主に膜結合にバランスを変化させることが示されている86。これは、スプライシングドナーを修飾してスプライシング対ポリアデニル化のバランスを変更し、分泌およびポリアデニル化のバランスの著しい変化に影響する初期の例を表す。Peterson et al 109,110の研究に基づいて、スプライスドナーの最適化の程度が、スプライシングおよびポリアデニル化のバランスに影響を与え、したがって、ディーゼル抗体の比率に影響を与えることが予想される。膜および分泌型の最適なバランスを見つけるために、CH3エクソンの末端でいくつかの代替スプライスドナー部位を創出した。
スプライシング開始に関与するU1 snRNAの配列を、IgG2 CH3ドメインから生成されたmRNA配列の上に示す。不一致の位置には下線が引かれている。
図23に示されるように、野生型(J9-GG/GTAAT)、部分最適化(J10-AG/GTAAA)、部分最適化(J29-GG/GTAAG)、および完全最適化(J30-AG/GTAAG)を含む、4つの変異型をスプライスドナーの周りに設計した。U1snRNAとのハイブリダイゼーションから、J30変異型が最も効率的なスプライシングを可能にし、より低い効率のスプライシングがより低いレベルの膜テザリングされた抗体およびより大きな割合の分泌をもたらす「野生型」配列J9と比較して、細胞表面でのより大きな割合の膜テザリングされた抗体をもたらすことが予期される。部分最適化変異型であるJ10およびJ29は、J9およびJ30の中間の抗体ディスプレイレベルをもたらすと期待される。
抗体ディスプレイ標的化ベクターpINT17-BSDの変異型は、埋め込まれたHindIII制限部位がIgG1 CH3ドメインのC末端ならびにヒトIgGイントロンおよびM1エクソンをコードするDNAに添加されるところで構築され、pINT17-BSDによってコードされたPDGFR膜貫通ドメインを置き換えた膜貫通ドメインをコードする(実施例1)。スプライスドナー変異型J9、10、29、および30を、合成遺伝子合成、PCRアセンブリ、および制限酵素クローニングの組み合わせにより構築した。pINT17-J30ベクターの注釈付きDNA配列を、XhoIからSbfI制限酵素部位まで図24に示す。XhoI-SbfI挿入の外側にあり、図24には示されていないベクター骨格は、pINT17-BSD(図1)と同一である。
抗PD1抗体ニボルマブのVHおよびVL鎖をコードするDNAを、実施例2に記載されるように、4つのスプライスドナー変異型標的化ベクターpINT17-J9、pINT17-J10、pINT17-J29、およびpINT17-J30にクローニングし、ヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れによって安定した細胞株を創出するために使用した。比較のために、ニボルマブを、図1に示される標準pINT17_BSDベクターにクローン化した。この構築物は、スプライシングなしで抗体CH3ドメインをPDGFr膜貫通ドメインに直接融合し、この実施例ではpINT17-PDGFRと称される。ブラストサイジン選択の27日後、細胞をPEで標識した抗Fcで染色し、上に記載されるようにフローサイトメトリーによって分析した(図25)。これは、CH3および膜貫通ドメイン(図25a~d)の間に配置されたイントロンを有する陰性IgG膜貫通ドメインを含む構築物と比較して、IgG1 CH3ドメインおよびPDGFR膜貫通(図25e)の間の直接融合で発現された抗体であるpINT17-PDGFRの抗体ディスプレイレベルが、より高いことを示した。J30は、U1 snRNAと完全に相補的であるため、J9、J10、またはJ29変異型よりも膜貫通ドメインをコードするM1エクソンとのより効率的なスプライシングをもたらすことが予期される。図25dは、これが実際に最高レベルを示すJ30変異型の場合であることを示す。しかしながら、以前の実施例を通じて使用されたpINT17-PDGFr構築物(図25d)で見出されたものと比べて、J30変異型でも発現レベルは著しくより低いことも示す。
抗体ディスプレイコピー数の低減が、異なる親和性を有する抗体の区別および分離を助けることができることを実証するために、抗PD1抗体の試験対をそれらの標的に対して異なる親和性で選択した。選択された抗体は、それぞれ3nM112および74nMの、表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定された、平衡解離定数(KD)親和性を有するニボルマブおよび別のPD1抗体(337_1_C08)であった。抗PD1抗体のVHおよびVL鎖をコードするDNAを、標的化ベクターpINT17-J30およびpI
NT17-PDGFr(pINT17-BSDとも称される)にクローン化し、実施例2に記載されるように、ヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れにより安定した細胞株を創出するために使用した。定量的フローサイトメトリー分析による抗体ディスプレイレベルの定量化は、ブラストサイジンの選択から21日後の細胞について、以前に記載されるように113および製造業者の指示(Quantum Simply Cellular抗マウスIgGビーズ、カタログ番号815、Bangs Laboratories Inc)で行った(図26)。細胞のコピー数を、参照ビーズセット(カタログ番号815、Bangs Laboratories Inc)と比較して抗Fc-PEで染色された細胞の蛍光強度の中央値の測定から計算した(図26)。表11Aに示されるように、pINT17-J30(加えてイントロン)発現カセットの細胞ディスプレイコピー数は、両方の抗体について、CH3ドメインおよび膜貫通ドメインの間にイントロンを有さない、pINT17-BSD発現カセットと比較して低減した。
NT17-PDGFr(pINT17-BSDとも称される)にクローン化し、実施例2に記載されるように、ヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れにより安定した細胞株を創出するために使用した。定量的フローサイトメトリー分析による抗体ディスプレイレベルの定量化は、ブラストサイジンの選択から21日後の細胞について、以前に記載されるように113および製造業者の指示(Quantum Simply Cellular抗マウスIgGビーズ、カタログ番号815、Bangs Laboratories Inc)で行った(図26)。細胞のコピー数を、参照ビーズセット(カタログ番号815、Bangs Laboratories Inc)と比較して抗Fc-PEで染色された細胞の蛍光強度の中央値の測定から計算した(図26)。表11Aに示されるように、pINT17-J30(加えてイントロン)発現カセットの細胞ディスプレイコピー数は、両方の抗体について、CH3ドメインおよび膜貫通ドメインの間にイントロンを有さない、pINT17-BSD発現カセットと比較して低減した。
抗体のコピー数および抗原の濃度が低下するにつれて、フローサイトメトリーにより観察されるシグナルの強度も低下する(図25)。磁気ビーズ選別を使用して、フローサイトメトリーの感度限界以下で標識細胞を富化することが可能であり、これをここで採用した。細胞表面での低減されたコピー数が、異なる親和性を有する抗体の分離に役立つかどうかを試験するために、ニボルマブまたは337_1_C08発現細胞株をそれぞれ異なるフルオロフォア色素で染色した。これは、他方よりも一方の細胞の相対的な富化が観察されるのを可能にする。標識細胞を混合し、異なる濃度のビオチン化PD1とともにインキュベートし、MACSによって分離した。次いで、フローサイトメトリー分析を行い、PD1に対するより高い親和性を有する抗体を発現する細胞の富化が存在したかどうかを判定した。この実施例では、4つのHEK293細胞株を試験したが、最初は以下でトランスフェクションした。
a.pINT17-BSD-ニボルマブ
b.pINT17-J30-ニボルマブ
c.pINT17-BSD-337_1_C08
d.pINT17-J30-337_1_C08
a.pINT17-BSD-ニボルマブ
b.pINT17-J30-ニボルマブ
c.pINT17-BSD-337_1_C08
d.pINT17-J30-337_1_C08
pINT17-BSD発現カセット(抗体CH3および膜貫通ドメインの間の直接融合)は、pINT17-J30発現カセットよりも高い抗体ディスプレイレベルを発現することが上記に示された。製造業者の指示に従って、ニボルマブ発現細胞(5×106)をCell Tracker Green(50nM、C7025、Thermo Fisher)で染色し、337_1_C08発現細胞をCell Tracker Deep
Red(50nM、C34565、Thermo Fisher)で染色した。簡潔には、細胞をPBSで洗浄し、トラッカー色素(50nM)を含むPBSとともにインキュベートし、37℃で10分間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで洗浄した。pINT17-J30発現カセットに由来するニボルマブまたは337_1_C08を発現する事前染色された細胞を、1:1の比率で混合した(10mlの体積でそれぞれ5×106個の細胞)。混合細胞をペレット化し(100g、3分)、各細胞ペレットを0、0.1、1、または10nMビオチン化PD1(PD1-H82E4、AcroBiosystems)のいずれかを含むPBS(1ml)に再懸濁し、これを4℃で30分間イン
キュベートした。細胞を0.1%BSA、PBS、およびストレプトアビジンビーズ(10μl)で洗浄し、90μlsの1%BSAを各試料に添加して混合した。試料を冷蔵庫(4℃)で15分間インキュベートした。2mlの0.1%BSAを使用して細胞を洗浄し、200xGで4分間遠沈した。ペレットを500μlsの分離緩衝液(1xPBS+2mM EDTA+0.5%BSAからなるMACSすすぎ緩衝液)に再懸濁した。LSカラムを3mlの分離緩衝液で洗浄した。細胞懸濁液をカラムに添加し、カラムあたり1試料とした。カラムを3mlの分離緩衝液で3回洗浄することにより、未捕捉の細胞を収集し、フロースルーを収集した。カラムを新しい収集チューブに入れ、5mlの分離緩衝液を各カラムに添加し、付属のカラムプランジャーを使用してすぐに洗い流した。溶出試料およびフロースルー試料を、セルカウンターおよびトリパンブルーを使用してカウントし、細胞回収率を決定した。各試料の1×106個の細胞を、500μlの0.1%BSA、PBSに希釈した。50μlの希釈細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
Red(50nM、C34565、Thermo Fisher)で染色した。簡潔には、細胞をPBSで洗浄し、トラッカー色素(50nM)を含むPBSとともにインキュベートし、37℃で10分間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで洗浄した。pINT17-J30発現カセットに由来するニボルマブまたは337_1_C08を発現する事前染色された細胞を、1:1の比率で混合した(10mlの体積でそれぞれ5×106個の細胞)。混合細胞をペレット化し(100g、3分)、各細胞ペレットを0、0.1、1、または10nMビオチン化PD1(PD1-H82E4、AcroBiosystems)のいずれかを含むPBS(1ml)に再懸濁し、これを4℃で30分間イン
キュベートした。細胞を0.1%BSA、PBS、およびストレプトアビジンビーズ(10μl)で洗浄し、90μlsの1%BSAを各試料に添加して混合した。試料を冷蔵庫(4℃)で15分間インキュベートした。2mlの0.1%BSAを使用して細胞を洗浄し、200xGで4分間遠沈した。ペレットを500μlsの分離緩衝液(1xPBS+2mM EDTA+0.5%BSAからなるMACSすすぎ緩衝液)に再懸濁した。LSカラムを3mlの分離緩衝液で洗浄した。細胞懸濁液をカラムに添加し、カラムあたり1試料とした。カラムを3mlの分離緩衝液で3回洗浄することにより、未捕捉の細胞を収集し、フロースルーを収集した。カラムを新しい収集チューブに入れ、5mlの分離緩衝液を各カラムに添加し、付属のカラムプランジャーを使用してすぐに洗い流した。溶出試料およびフロースルー試料を、セルカウンターおよびトリパンブルーを使用してカウントし、細胞回収率を決定した。各試料の1×106個の細胞を、500μlの0.1%BSA、PBSに希釈した。50μlの希釈細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
低密度ディスプレイベクターpINT17-J30を用いた場合、低親和性抗PD1抗体337_1_C08を表示する細胞株を、より高い親和性抗PD1抗体ニボルマブ発現細胞から選択的に分離することが可能であった。これを、MACS溶出またはフロースルー集団のいずれかについてドットプロットフローサイトメトリーの結果を表す図27aに示す。各パネルは、溶出および0、0.1、1、または10nMビオチン化PD1で事前インキュベートしたフロースルー画分について、x軸(FL1、ニボルマブ発現細胞)に緑色の蛍光強度がプロットされ、y軸(FL4、337_C08発現細胞)に赤色の蛍光強度がプロットされているドットプロットを示す。例えば、細胞株混合を1nMビオチン化PD1とともにインキュベートし、続いてMACS分離を行うと、これは、赤色色素で染色されたより低い親和性抗PD1 337_1_C08抗体と比較して、緑色色素で染色された高親和性抗PD1ニボルマブディスプレイ細胞の95%富化をもたらした。対照的に、フロースルーの非結合細胞は、主により低い親和性の赤色染色抗PD1 337_1_C08抗体ディスプレイ細胞を含んでいた。また、10nM PD1インキュベーションと比較して、1nM PD1で優れた分離が観察された。しかしながら、pINT17-BSDカセットに由来するより高いコピー数の細胞株で同じ実験を行った場合、ニボルマブおよび337_1_C08発現細胞の間に優先的な富化は観察されなかった(図27b)。
したがって、この実施例は、細胞表面の抗体ディスプレイレベルを低減することが、特に集団内で高親和性が達成されるため、より低い親和性の抗体よりも高親和性の抗体の富化を増加させることができることを例示した。その標的に対するより低い親和を有する抗体からの高親和性抗体の最適な細胞ディスプレイ分離は、抗体ディスプレイレベルの低減と、選択中に用いられる標識された標的抗原の濃度の低減との組み合わせによって達成された。真核細胞ディスプレイ選択中に、親和性に従って抗体を分離する能力は、所望の抗体の必要な標的候補プロファイルに応じて、抗体発見キャンペーン中に重要である。親和性成熟の間、それらの標的に対する改善された親和性を有する抗体を富化することも重要である。この実施例は、それらの標的に対して高い親和性を有する抗体を区別するのを助ける上での細胞ディスプレイコピー数の重要性を示した。
実施例8b.誘導性tetプロモーターを使用した改善
哺乳動物細胞提示抗体の誘導性発現を可能にするベクターを作製することが有利である。これは、異なる表面提示レベルでの選択ステップの組み合わせを容易にし、例えば、厳密な選択に必要な低いディスプレイレベルの選択に続いて、実施例4および5に例示されるように、改善された生物物理学的特性を有する抗体の選択に必要な高ディスプレイレベルの誘導があり得る。
哺乳動物細胞提示抗体の誘導性発現を可能にするベクターを作製することが有利である。これは、異なる表面提示レベルでの選択ステップの組み合わせを容易にし、例えば、厳密な選択に必要な低いディスプレイレベルの選択に続いて、実施例4および5に例示されるように、改善された生物物理学的特性を有する抗体の選択に必要な高ディスプレイレベルの誘導があり得る。
誘導性抗体ディスプレイ標的化ベクター(pINT18-Tet1)を、合成遺伝子合
成、PCRアセンブリ、および制限酵素媒介クローニングの組み合わせによって構築した(図28)。pINT18-Tet1は、pINT17-BSDと同じベクター骨格、AAVS相同性アーム、およびプロモーターレスブラストサイジン耐性遺伝子を含む。図28は、AAVS相同性アーム間のpINT18-Tet1の注釈付き核酸配列を示す。このベクターの主要な特徴には、逆Tet活性化因子(rtTA)タンパク質114の発現を駆動するCMVプロモーター、Tetオペレーター(TetO)テトラド、続いて最小CMVプロモーター、軽鎖遺伝子(VLおよびCL)に融合したBM40リーダー、リボソームの「スキップ」を可能にするP2Aペプチド115、続いて抗体重鎖コード配列が挙げられる。ペンブロリズマブ、ニボルマブ、および337_1_C03の重および軽可変遺伝子(VHおよびVL)を、この誘導性標的化ベクターにクローニングし、安定したHEK293細胞株を、上に記載されるようにヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れによって創出した。図29は、細胞を抗Fc-PEで染色し、フローサイトメトリーによって分析した場合の、ドキシサイクリンの不在下での低基礎抗体ディスプレイを示す。しかしながら、20ng/mlの添加後24時間でドキシクリン抗体の発現が細胞表面に観察される。このディスプレイレベルは、ドキシクリン濃度を2ng/mlに滴定すると、Fc染色の低減によって示されるように調整することができる。このように、誘導性細胞ディスプレイ結合剤の例示を示し、誘導因子の濃度を変えることによりディスプレイレベルを調整する能力を示す。
成、PCRアセンブリ、および制限酵素媒介クローニングの組み合わせによって構築した(図28)。pINT18-Tet1は、pINT17-BSDと同じベクター骨格、AAVS相同性アーム、およびプロモーターレスブラストサイジン耐性遺伝子を含む。図28は、AAVS相同性アーム間のpINT18-Tet1の注釈付き核酸配列を示す。このベクターの主要な特徴には、逆Tet活性化因子(rtTA)タンパク質114の発現を駆動するCMVプロモーター、Tetオペレーター(TetO)テトラド、続いて最小CMVプロモーター、軽鎖遺伝子(VLおよびCL)に融合したBM40リーダー、リボソームの「スキップ」を可能にするP2Aペプチド115、続いて抗体重鎖コード配列が挙げられる。ペンブロリズマブ、ニボルマブ、および337_1_C03の重および軽可変遺伝子(VHおよびVL)を、この誘導性標的化ベクターにクローニングし、安定したHEK293細胞株を、上に記載されるようにヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れによって創出した。図29は、細胞を抗Fc-PEで染色し、フローサイトメトリーによって分析した場合の、ドキシサイクリンの不在下での低基礎抗体ディスプレイを示す。しかしながら、20ng/mlの添加後24時間でドキシクリン抗体の発現が細胞表面に観察される。このディスプレイレベルは、ドキシクリン濃度を2ng/mlに滴定すると、Fc染色の低減によって示されるように調整することができる。このように、誘導性細胞ディスプレイ結合剤の例示を示し、誘導因子の濃度を変えることによりディスプレイレベルを調整する能力を示す。
改善された(「第3世代」)誘導性標的化ベクターを、改善された範囲の抗体ディスプレイレベルを可能にするために後に構築した。pINT17-Tetを、合成遺伝子合成、PCRアセンブリ、および制限酵素媒介クローニングの組み合わせによって構築した。pINT17-Tetは、pINT17-BSDと同じベクター骨格、AAVS相同性アーム、およびプロモーターレスブラストサイジン耐性遺伝子を含む。図37は、AAVS相同性アーム間のpINT17-Tetの注釈付き核酸配列を示す。このプラスミドは、逆Tet活性化因子(rtTA-3G)の発現を駆動する伸長因子プロモーターを含む。rtTA-3Gは、誘導因子であるドキシサイクリン116に対してより高い感受性を示すように進化した元のrtTAタンパク質114の修飾型である。pINT17-Tetはまた、抗体の重鎖および軽鎖の発現を駆動するb方向誘導性プロモーター(pTRE3G)を含む。pTRE3Gを、誘導後の低基礎発現および高最大発現の間のウィンドウを広げるために最適化した117。それは、2つの隣接する最小CMVプロモーターとの19bpのtetオペレーター(TetO)配列の7つの繰り返しからなる。
抗PD-1抗体のVHおよびVL遺伝子:1549_02_D06、1535_01_E03および337_1_C08、抗PCSK9抗体のボコシズマブ、884_01_G01、5A10i、ならびにアリロクマブを、pTet17-Tetにクローニングした。抗PD1抗体337_1_C08を、74nMのPD1に対する親和性で実施例8に記載した。抗体1549_02_D06および1535_01_E03は、それぞれ2.9nMおよび17nMのPD-1に対する親和性(KD)を有する親抗体337_1_C08の親和性成熟娘クローンである。抗PCSK9抗体であるボコシズマブ、884_01_G01、5A10i、およびアリロクマブのVHおよびVL遺伝子(すべて実施例5で以前に説明される)もpINT17-Tetにクローニングした。
抗PD1および抗PCSK9抗体の遺伝子を含むpINT17-Tet標的化ベクターを使用して、上に記載されるようにAAVS TALEヌクレアーゼをコードするプラスミドでHEK293細胞をトランスフェクトした。ブラストサイジン薬物選択の25日後、安定した細胞株を、0、2、4、または100ng/mlのドキシサイクリンで誘導した。誘導の24時間後、誘導された細胞株を抗Fc-PEで染色し、細胞をフローサイトメトリーで分析した。細胞株のヒストグラムプロットを、蛍光強度に対して細胞数をプロットすることによって生成した。
細胞株は、ドクスサイクリンの不在下で非常に低い基礎発現を示した(図38a)。誘導の24時間後、100ng/mlの濃度でのドキシサイクリンの添加により、完全な誘導を観察した(図38d)。中間誘導は、2および4ng/mlのドキシサイクリン濃度の添加により達成した(図38bおよび38c)。これは、完全な誘導と比較してより低い平均ディスプレイレベルをもたらしたが、7つのTetO繰り返しで以前に観察されたバイモーダル遺伝子発現に似た誘導の広がりをもたらした118。
抗体の平均ディスプレイコピー数を、実施例7に記載される方法により定量化した。ここで、様々な量のドキシサイクリンで誘導された細胞株の平均蛍光強度中央値(MFI)を決定し、これを使用して、マウスIgG-PE標識で染色したQuantum Simply Cellular抗マウスIgGビーズ(カタログ番号815、Bangs Laboratories Inc)を使用して生成された較正プロットを使用してコピー数に変換した。表11cおよび11dは、誘導(hpi)の24または48時間後の計算されたディスプレイコピー数を示す。ドキシサイクリンの不在下での抗体では、非常に低い基礎発現が観察され、いくつかの例では、抗Fc-PEで染色すると検出限界を下回った。すべての抗体について48hpiの検出可能な基礎発現が存在したが、これは、細胞が24hpiと比較して定常成長期に達したためであり得る。ドキシサイクリンの濃度が、100ng/mlのドキシサイクリンに対して2ng/mlから4ng/mlに増加すると、すべての抗体の平均ディスプレイレベルが増加した。100ng/mlを超えるドキシサイクリンの濃度の増加は、ディスプレイレベルの増加をもたらさなかったため、100ng/mlのドキシサイクリンの濃度で最大の誘導を達成した。
自己相互作用および多反応性2を起こしやすい抗PCSK9 IgGボコシズマブと、良好に動作する親抗体5A10iの間で、ディスプレイレベルの違いが観察された。親抗体5A10iを、235,000のコピー数でHEK293細胞の表面に表示したが、ボコシズマブは、細胞が100ng/mlのドキシサイクリンで誘導されると、36,000のコピー数でHEK293細胞の表面に表示され、ディスプレイレベルは誘導の24時間後に決定した(hpi)。これは、親抗体5A10iと比較して、ボコシズマブのディスプレイレベルの6.5倍低減を表す。5A10iと比較したボコシズマブの細胞ディスプレイコピー数のこの観察された低減を、抗体発現が構成的プロモーターによって駆動されたときに以前に観察した(実施例5、図10)。したがって、この誘導性系は、完全誘導で、構成的プロモーターディスプレイ系で以前に実証したように、自己相互作用および多反応性の点で異なる開発性プロファイルを有する抗体を区別することができる。
また、884_01_G01という名前の哺乳動物ディスプレイライブラリスクリーニングによって同定されたボコシズマブの変異型を表示した(実施例5)。この抗体は、AC-SINSアッセイおよびHPLC-SECで生物物理的に良好に動作することが示された(表6、実施例5および図18、実施例5)。この抗体は、HEK293細胞の表面に768,000のディスプレイコピー数で、24hpi(100ng/mlのドキシサイクリン)の高レベルで表示した(表11B)。良好に動作する抗体アリロクマブ2もまた、完全な誘導条件下でHEK293細胞の表面に24hpiの高レベルで表示した(表11B)。
ドキシサイクリンは、培養条件によって応じて、培養上清では約1日の半減期で分解することが知られている。ドキシサイクリンを補充せずに誘導後の異なる時点での抗体のディスプレイレベルを調べることは、細胞表面での抗体の動的ターンオーバーに関するいくつかの証拠を提供する。あるいは、誘導は、24時間の期間ドキシサイクリンの存在下で生じることができ、その後完全な培地交換により、細胞がドキシサイクリンにもはや露出されないようにすることができる。ここでは、誘導の48時間後のディスプレイレベルを
簡単に再調査した(表11C)。アリロクマブなどのいくつかの良好に動作する抗体は、それらの細胞表面のディスプレイレベルを48hpiに維持または増加した。ボコシズマブなどの他の抗体は、24hpiと比較して、48hpiで細胞表面ディスプレイレベルの2倍を超える低減を示した(図39)。ディスプレイ抗体が新しく発現された抗体で継続的に補充されていない、細胞に表示された抗体のターンオーバー、分解、または内部移行の速度は、自己相互作用および安定性に関するそれらの開発性特性に基づいて、抗体を選択する追加の手段である(例11も参照)。
簡単に再調査した(表11C)。アリロクマブなどのいくつかの良好に動作する抗体は、それらの細胞表面のディスプレイレベルを48hpiに維持または増加した。ボコシズマブなどの他の抗体は、24hpiと比較して、48hpiで細胞表面ディスプレイレベルの2倍を超える低減を示した(図39)。ディスプレイ抗体が新しく発現された抗体で継続的に補充されていない、細胞に表示された抗体のターンオーバー、分解、または内部移行の速度は、自己相互作用および安定性に関するそれらの開発性特性に基づいて、抗体を選択する追加の手段である(例11も参照)。
したがって、pINT17-Tetは、抗体自己相互作用および多反応性スクリーニングの上に記載される開発性スクリーニングを可能にするために高発現、完全誘導モードに切り替えられ得るヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れによってモノクローナル細胞株を創出するために使用され得る、誘導性哺乳動物ディスプレイ標的化ベクターの例を表す。pINT17-Tetで創出された細胞株は、誘導因子の不在下での基礎ディスプレイレベル、または制限濃度のドキシサイクリンを添加することのいずれかによって、低コピーディスプレイモードに切り替えることもできる。この低コピー数ディスプレイモードは、実施例8aに記載されるように、異なる親和性を有する抗体クローンのより効率的な分離を可能にするであろう。
それらの標的に対して異なる親和性で細胞表面に表示された抗体の分離のための誘導性哺乳動物ディスプレイ細胞株の有用性を実証するために、高親和性抗PD1抗体1549_02_D06(PD-1についてKD=2.9nM)または低親和性抗PD-1抗体337_1_C08(PD-1についてKD=74nM)を表示するHEK293細胞を、pINT17-Tet標的化ベクターとのヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れによって創出した。1549_02_D06抗体を表示するHek293細胞を、CellTrace CFSE細胞増殖キット(Thermo、カタログ番号C34554-励起/発光波長-492nm/517nm)で標識し、337_1_C08抗体を表示する細胞は標識しなかった。細胞を、0、2、4、または100ng/mlのドキシサイクリンで誘導した。誘導の48時間後(hpi)、1549_02_D06を表示する細胞を、CellTrace CFSE細胞増殖キット(C34554、ThermoFisher Scientific)で染色し、337_1_C08を表示する非標識細胞と混合した。標識細胞および非標識細胞を等しく混合し、次いで、実施例8aで詳細に記載されるように、0.1、1、または10nM PD-1-ビオチンを含む混合IgGディスプレイ細胞集団に対してMACS精製を行った。次いで、細胞をフローサイトメトリー(図40)によって分析し、低親和性抗PD1 IgGと比較した高親和性抗PD1 IgGの相対的富化を決定した。
高親和性および低親和性の抗PD-1抗体を表示する細胞の最も効率的な分離は、表示された抗体レベルを低減するために2ng/mlの制限ドキシサイクリン濃度で細胞が誘導され、MACS精製で0.1nM PD-1ビオチンが使用されたときに生じた。ここでは、集団の96%に対する高親和性クローンについて、集団の富化を達成した(図40bi)。細胞を2ng/mlのドキシサイクリンで誘導した場合、細胞コピー数48hpiは、高親和性および低親和性抗PD-1クローンでそれぞれ11,000および20,000であった。対照的に、細胞株が完全に誘導されると、0.1nM PD-1でのMACSは、高親和性クローンの77%の富化のみを達成した(図40di)。細胞を100ng/mlのドキシサイクリンで完全に誘導した場合、細胞コピー数48hpiは、高親和性および低親和性抗PD-1クローンでそれぞれ317,000および294,000であった。これは、実施例8のデータに加えて、細胞表面抗体ディスプレイレベル(コピー数)の低減が、それらの標的に対して異なる親和性を有するディスプレイ抗体の分離の効率を増加させるであろうというさらなる証拠を提供する。MACSに使用されるPD-1の濃度が増加すると、これは、実施例8の理論分析から予測されるように、高親和性クローンのより低い効率の富化をもたらした(図40biiおよび40iii)。
この実施例では、自己相互作用および凝集傾向のスクリーニングのための高コピーディスプレイと、高親和性抗体の厳格な選択のための低コピー数ディスプレイの両方を可能にする、高次真核細胞ディスプレイへの誘導性プロモーター系の有用性を実証した。ここでは、誘導因子の制限濃度を使用して、同じ標的に対して74nMの親和性を有する第2のクローンから2.9nMのその標的に対する親和性を有するクローンの効率的な分離のための低ディスプレイレベルを得た。細胞表面の表示された抗体のコピー数およびMACS分離に使用される標的抗原の濃度を調整することによって、1桁のnM親和性を有するクローンから1nM未満のその標的に対する親和性(KD)を有する別個のクローンの効率を増加させることが想定される。
実施例9.Fc受容体との最適な相互作用のための選択による開発性の向上
実施例6は、異なる交差相互作用特性を有する真核細胞の表示された抗体を区別することが可能であることを実証した。これは、細胞を標識ヒト血清とともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって結合を検出することによって達成された。第1相臨床試験82よりも先に進まなかった、既知の交差相互作用特性39を有する抗体であるベセンクマブは、良好に動作する抗体と見なされる臨床的に承認された抗体であるニボルマブと
比較して、ヒト血清へのより大きな結合をもたらした。ベセンクマブは、インビボで短い半減期を有する105。抗体の「粘着性」または交差相互作用特性は、一般に、乏しい薬物動態と相関しており、インビボでの短い半減期は、播種性組織への非特異的結合による全身クリアランスによって引き起こされると考えられている23、122、123。
実施例6は、異なる交差相互作用特性を有する真核細胞の表示された抗体を区別することが可能であることを実証した。これは、細胞を標識ヒト血清とともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって結合を検出することによって達成された。第1相臨床試験82よりも先に進まなかった、既知の交差相互作用特性39を有する抗体であるベセンクマブは、良好に動作する抗体と見なされる臨床的に承認された抗体であるニボルマブと
比較して、ヒト血清へのより大きな結合をもたらした。ベセンクマブは、インビボで短い半減期を有する105。抗体の「粘着性」または交差相互作用特性は、一般に、乏しい薬物動態と相関しており、インビボでの短い半減期は、播種性組織への非特異的結合による全身クリアランスによって引き起こされると考えられている23、122、123。
インビボでの抗体半減期はまた、そのCH2およびCH3ドメインを介したIgGと、新生児のFc受容体(FcRn)124との間の相互作用に決定的に依存している。循環における長い抗体半減期は、非特異的飲作用またはFc受容体媒介取り込みによるIgGの細胞内在化によって達成される。内在化すると、IgGは、pH5~6でエンドソーム内のFcRnと高い親和性で結合し、それによってIgGをリソソーム分解から保護する。最後に、IgGおよびFcRnの間の親和性が生理学的pH7.4で非常に弱いため、IgGを細胞表面に輸送し、循環に戻す。抗IL12ブリアキヌマブ20は、乾癬を治療する第III相臨床試験で有効性を示さず、インビボで短い半減期を有することが知られている。ブリアキヌマブは、FcRn上の負電荷パッチと結合して、pH7.4でFcRnへの結合に対する増加された親和性をもたらすことができるその可変ドメイン内にアルギニンおよびリジン残基からなる正電荷パッチを有する。pH7.4でのブリアキヌマブのFcRnへの結合は、マウスのインビボでの短い半減期と相関していることが示されている。また、クローン病の治療に臨床的に承認された抗IL12抗体ウステキヌマブは、その可変ドメイン内に正電荷パッチを保有せず、pH7.4でFcRnと弱く結合することが知られており、ブリアキヌマブと比較して優れたインビボ半減期を有する。この実施例では、高次真核細胞ディスプレイおよびフローサイトメトリーによるFcRn結合の検出によって、pH7.4でFcRnに対する既知の異なる親和性を有する抗体を区別することが可能であることを示す。
ブリアキヌマブおよびウステニクマブの重および軽可変ドメインをコードする合成DNA(配列については表12を参照されたい)を、pINT17-BSD標的化ベクター(ベクターマップおよび配列については実施例1を参照されたい)にクローニングし、DNA配列を確認した。
トランスフェクションの1日前に、懸濁液適合HEK293細胞を、HEK FreeStyle 293発現培地に5×105個の細胞/mlで播種した。トランスフェクションの日に細胞を遠心分離し、製造業者の電気穿孔用緩衝液(Maxcyte Electroporation buffer、Thermo Fisher Scienti
fic、カタログ番号NC0856428)に108個の細胞/mlの最終体積で再懸濁した。OC-100キュベット(Maxcyte)を使用して100μlをパルスした。トランスフェクションの2日後、細胞を2.5×105個の細胞/mlで播種し、7.5ug/mlのブラストサイジンを添加した。トランスフェクションの57日後に、ストレプトアビジンPE(11nM)と事前複合体化したビオチン化FcRn(50nM)で細胞を標識した。事前複合体化は、異なるpHの染色緩衝液(1%BSA、pH7.4を含むPBS、または140mM NaClおよび1%BSA、pH6.0を含む20mM MES)のいずれかで行った。簡潔には、1×106個の細胞を遠沈し、pH7.4のPBSまたはpH6.0の20mM MES緩衝液のいずれかで1回洗浄した。細胞ペレットを100ulの染色緩衝液に再懸濁し、1.0mlの洗浄緩衝液(0.1%BSA、pH7.4を含むPBSまたは140mM NaClおよび0.1%BSA、pH6.0を含む20mM MES)で2回洗浄した。細胞ペレットを、生存色素7AAD(100万個の細胞あたり5ul)を含む500ulの洗浄緩衝液に再懸濁した。Intellicytフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。死細胞を分析中に除外した。ヒストグラムプロットを、FlowJoソフトウェアを使用して生成した(図30)。
fic、カタログ番号NC0856428)に108個の細胞/mlの最終体積で再懸濁した。OC-100キュベット(Maxcyte)を使用して100μlをパルスした。トランスフェクションの2日後、細胞を2.5×105個の細胞/mlで播種し、7.5ug/mlのブラストサイジンを添加した。トランスフェクションの57日後に、ストレプトアビジンPE(11nM)と事前複合体化したビオチン化FcRn(50nM)で細胞を標識した。事前複合体化は、異なるpHの染色緩衝液(1%BSA、pH7.4を含むPBS、または140mM NaClおよび1%BSA、pH6.0を含む20mM MES)のいずれかで行った。簡潔には、1×106個の細胞を遠沈し、pH7.4のPBSまたはpH6.0の20mM MES緩衝液のいずれかで1回洗浄した。細胞ペレットを100ulの染色緩衝液に再懸濁し、1.0mlの洗浄緩衝液(0.1%BSA、pH7.4を含むPBSまたは140mM NaClおよび0.1%BSA、pH6.0を含む20mM MES)で2回洗浄した。細胞ペレットを、生存色素7AAD(100万個の細胞あたり5ul)を含む500ulの洗浄緩衝液に再懸濁した。Intellicytフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。死細胞を分析中に除外した。ヒストグラムプロットを、FlowJoソフトウェアを使用して生成した(図30)。
pH6では、抗体がHEK293細胞の表面に表示されると、ブリアキヌマブおよびウステキヌマブの両方がFcRnと結合した(図30)。pH7.4では、FcRnの結合が観察されなかったウステキヌマブとは異なり、ブリアキヌマブのみがFcRnへの有意な結合を表示した。この実施例は、より高い高次真核細胞ディスプレイおよびフローサイトメトリーによるFcRn結合の分析によって、pH7.4でFcRnへの異なる結合親和性のクローンを区別することが可能であることを実証する。これは、抗体の薬物動態(PK)プロファイルの予測を可能にするであろう。また、細胞ディスプレイ結合剤のライブラリから選択すると、この技法を使用いて、pH7.4でFcRnと結合するクローンを排除し、したがって、良好なPKプロファイルを保有すると予期されるクローンを選択することができた。例えば、MACSビーズへの細胞ディスプレイ抗体の結合は、pH6で達成することができた。pH7.4でビーズを洗浄すると、pH7.4で低い親和性のクローンを溶出するはずであり、これらのクローンは、pH7.4で結合を保持する結合クローンと比較して、インビボでより長い半減期を示すと予期される。
IgGへのFcRn結合は、IgGの翻訳後グリコシル化に部分的に依存することが知られている。したがって、高次真核細胞で説明される選択を実行することは、酵母などの未修飾の低次真核細胞ディスプレイ系でのディスプレイとは異なり、FcRn結合を可能にするために本物のグリコシル化が生じるという利点を有する。
さらに、混合抗体集団からFcRnへの低減された結合を示す抗体を単離することが可能であることを実証した。異なる抗IL-12抗体を発現する高次真核細胞クローンの2つの集団、それぞれ、ブリアキヌマブおよびウステキヌマブを共培養した。ブリアキヌマブを発現する細胞は、pH7.4でFcRnと結合することが示された(図30)。結合は、FcRnの負に荷電された側鎖と結合するその可変ドメイン内の正電荷パッチに起因し得る(ブリアキヌマブが負に荷電された多反応性プローブと結合することが示された実施例6を参照されたい)。ウステキヌマブは、pH7.4でFcRnへの結合を示さなかった(図30)。混合抗体発現集団を二重染色し、ウステキヌマブを表示する細胞についてFACSによって富化した。図41。したがって、FcRn結合剤も含む混合集団からFcRn非結合剤を富化することが可能であることを実証した。同じ技法を、クローンのより多様な混合物、例えば、数百万の異なる抗体を含むライブラリに適用してもよい。
抗体のFc領域は、Fc受容体139および補体結合140を含む複数のエフェクター機能を誘発することが知られている。Fcドメインのライブラリの作成後、Fcガンマ受容体、NK受容体、FcRn、または補体カスケードのメンバーなどの既知のエフェクタ
ー分子で選択することにより、高次真核細胞ディスプレイを使用して、エフェクター機能分子への結合を増強または低減する変異型を選択することが可能である。これは、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)を増強、低減、または抑制するFc変異型を選択するか、またはインビボでの抗体半減期を増加させる。Fc受容体と結合して標的受容体のそれらのアゴニズムを増加させ、したがってそれらの効力141、142を増加させるFc変異型も選択することができる。Fc変異型は抗体の安定性を低減し、それらの生物物理学的特性に悪影響を与え得る134、143。高次真核生物細胞ディスプレイによるFc変異型の選択の利点は、細胞表面に高レベルで表示される変異型を選択することができ、これらの変異型は優れた生物物理学的特性を有することが予期されることである。
ー分子で選択することにより、高次真核細胞ディスプレイを使用して、エフェクター機能分子への結合を増強または低減する変異型を選択することが可能である。これは、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)を増強、低減、または抑制するFc変異型を選択するか、またはインビボでの抗体半減期を増加させる。Fc受容体と結合して標的受容体のそれらのアゴニズムを増加させ、したがってそれらの効力141、142を増加させるFc変異型も選択することができる。Fc変異型は抗体の安定性を低減し、それらの生物物理学的特性に悪影響を与え得る134、143。高次真核生物細胞ディスプレイによるFc変異型の選択の利点は、細胞表面に高レベルで表示される変異型を選択することができ、これらの変異型は優れた生物物理学的特性を有することが予期されることである。
実施例10.哺乳動物ディスプレイによる選択された集団内の最適な開発性クローンの選択(メソテリン選択)
ここでは、高次真核生物(哺乳動物)の細胞ディスプレイを使用して、抗体の非常に多様な入力パネルから最適な開発性を有する抗体を選択することが可能であることを実証する。異なる生殖細胞系列配列の抗体の錯体混合物を分離し、それらの自己相互作用特性に基づいて抗体をグループ化および選択することができるにした。
ここでは、高次真核生物(哺乳動物)の細胞ディスプレイを使用して、抗体の非常に多様な入力パネルから最適な開発性を有する抗体を選択することが可能であることを実証する。異なる生殖細胞系列配列の抗体の錯体混合物を分離し、それらの自己相互作用特性に基づいて抗体をグループ化および選択することができるにした。
まず、抗体ファージディスプレイ選択によって抗メソテリン抗体の富化パネルを生成し、次いで、抗体を哺乳動物細胞ディスプレイライブラリにクローニングし、それぞれ高、中、または低表面提示を呈する細胞クローンからの結合剤の特性を比較することによってこれを示す。
メソテリンは、いくつかのヒト腫瘍で過剰発現される抗原であり、したがって、癌を治療するための治療用抗体標的として興味深い。抗ヒトメソテリンの富化集団を生成するために、以前に記載されているように、抗原がポリスチレン表面に直接固定化された2ラウンドの抗体ファージディスプレイ選択を行った8。以前に記載され、かつ以前に記載されるヒト未感作抗体ライブラリ8と同様の方法で構築された、未感作ヒト抗体ライブラリを採用した(WO2015166272A2)。選択を、VLラムダおよびVLカッパ生殖細胞系列で別個に行い、第1ラウンドの出力数は2×105(平均)であった。以前に説明されるように(WO2015166272A2)、IgG形式への変換およびpINT17-BSD標的化ベクターへのクローニングを、「まとめて」行った。ラムダおよびカッパ富化集団のE.coli形質転換体を、実施例4および5に記載されるように寒天プレート上に播種して、2.4×106個のクローンの複合ライブラリサイズを創出した(入力抗体集団の12倍過剰)。トランスフェクション品質のプラスミドDNAを、pINT17-BSDベクター内の抗メソテリン抗体をコードして調製した。MaxCyte STXG2のHEK293設定で、単一のOC-400キュベット(合計108個の細胞、MaxCyte、カタログ番号OC-400R10)を使用して、上に記載されるように(実施例2、4、および5)AAVS TALEヌクレアーゼでライブラリをトランスフェクトした。対照を、同じ設定でOC-100キュベット(MaxCyte、カタログ番号OC-100R10)を使用してトランスフェクトした。電気穿孔した細胞を適切なサイズの三角フラスコに移した後、細胞を、適切な量のFreeStyle 293発現培地(LifeTech.カタログ番号12338018)を添加する前に30分間休ませた。細胞を再懸濁し、130rpm、37℃、5%CO2に設定された軌道振盪インキュベーターに置いた。安定したトランスフェクション効率を、4.2%であると上に記載されるように(実施例4および5)計算し、4.2×106個の安定した抗体ディスプレイHEK293細胞株の合計ライブラリサイズを得た。ブラストサイジン選択の19日後、BD Influx細胞選別機を使用して、上に記載されるように(実施例4および5)FACSを実施した。100×106個の細胞を、抗ヒトFc PE(1×106個の細胞あたり1μL)(Cambridge Bioscience、カタログ番号409
304)とともにインキュベートし、選別の直前にDAPIを添加した(1μL/百万個の細胞)。低ディスプレイレベルの集団(P4)、中ディスプレイレベルの集団(P6)、および高ディスプレイレベルの集団(P5)を可能にする3つのゲートを描いた。Influx選別機は、一度に2つの集団のみを選別することができ、したがって、50×106個の細胞を、ゲートP4およびP5のために選別し、他の50×106個の細胞を、P6のため選別した(図31)。上に記載されるように(実施例4および5)3つの集団からゲノムDNAを抽出し、抗体遺伝子をpINT3ベクター(WO2015166272A2)にクローニングし、VHおよびVL遺伝子を配列決定した。
304)とともにインキュベートし、選別の直前にDAPIを添加した(1μL/百万個の細胞)。低ディスプレイレベルの集団(P4)、中ディスプレイレベルの集団(P6)、および高ディスプレイレベルの集団(P5)を可能にする3つのゲートを描いた。Influx選別機は、一度に2つの集団のみを選別することができ、したがって、50×106個の細胞を、ゲートP4およびP5のために選別し、他の50×106個の細胞を、P6のため選別した(図31)。上に記載されるように(実施例4および5)3つの集団からゲノムDNAを抽出し、抗体遺伝子をpINT3ベクター(WO2015166272A2)にクローニングし、VHおよびVL遺伝子を配列決定した。
配列分析は、すべてのサブ集団内で大きな多様性を明らかにした(表13)。これがサンプリングの問題によるものではなかったことを確認するために、異なるクローングループの異なるディスプレイグループへの「ビニング」が生じていたどうかを判定するために、1回を超えて出現したクローンの分析に焦点を当てた。したがって、重複分析を、低、中、高ディスプレイレベルの集団で複製クローンが識別された(VHおよびVL CDR3配列に基づいて)抗体に対して行った(表14)。高ディスプレイレベルの集団には13個のそのようなクローンがあり、低ディスプレイレベルの集団には複数回出現した28個のクローンあり、それらの間に重複はなかった。「中程度の発現因子」として識別されたクローンのグループは、1回を超えて出現した11個の配列を有し、これらもまた他のグループでは見出されなかった。「中」グループに出現した4個のクローンがあり、それは低グループでは3ケース、高グループでは1ケースで重複していた。この結果は、哺乳動物細胞でのディスプレイレベルに基づく選別が、そのグループに対して固有の配列の特定のサブ集団を選択する証拠である。
表面提示に基づいて選択された細胞集団の違いは、次世代配列決定(NGS)を使用した抗体集団の詳細な分析によって確認した。簡潔には、高、中、および低ディスプレイレベルの集団ならびに入力集団からの抗体の対合した可変ドメイン遺伝子を増幅し、配列決定し、非対称バーコード125、126を使用して逆多重化し、次いで、出力BAMファイルを、FASTQファイル形式に変換して、Geneious Biologicsソフトウェアによる抗体配列分析を可能にした。
この分析の結果から合計19792個の対合したVLおよびVH遺伝子読み取りを得た。集団を逆多重化した後、これは、それぞれ入力レベル集団と高、中、および低ディスプレイレベル集団に対して2998、1516、6180、および9098 CCS読み取りを発生もたらした。抗体配列に注釈を付け、それらのフレームワークおよび相補性決定領域(CDR)をマッピングし、重鎖および軽鎖生殖細胞系列をIMGTデータベース127に従って割り当てた。停止コドンを含まない注釈が付けられたVHおよびVL CDR3配列を有したクローンについてのこの分析の結果の要約を表15に示す。未感作抗体ファージディスプレイライブラリ8を使用してメソテリンに対して2ラウンドの抗体ファージディスプレイ選択を行うことによって事前に選択された抗体入力集団は、VH CDR3配列固有であるクローンの51%およびVHおよびVL CDR3配列固有であるクローンの88%で非常に多様であった。この入力集団はまた、配列決定された1000個のクローンあたりそれぞれ識別された19、18、および10のVH、VLκ、およびVLλ生殖細胞系列を有する多様な抗体生殖細胞系列であった。CDR3配列および生殖細胞系列の両方に関するこの多様性は、高、中、および低の哺乳動物ディスプレイゲーティングされた集団を分析すると低減した。VH CDR3固有抗体の数が4%未満に低下し、配列決定された1000個のクローンあたりのVH、VLκ、およびVLλ生殖細胞系列の数がそれぞれ4、2、および3に低下すると、低ディスプレイレベルの集団の多様性が著しく低減した。入力集団と比較した抗体多様性のこの低減は、特定のクローンがディスプレイレベルのゲーティングされた抗体集団で富化されていることを示し、したがって、集団の冗長性が増加する。
VLκおよびVLλ生殖細胞系列の比率もまた異なる集団で調査した。開始入力集団は、VLκ抗体と比較してほぼ2倍過剰のVLλを有したが、この比率は、4倍過剰のVLκ抗体を有した低ディスプレイレベルのゲーティングされた集団では逆転した。これらの結果は、低ディスプレイグループが特定の軽鎖生殖細胞系列配列を有する抗体の特定のサブセットを富化していることを示す。
入力集団と、低、中、および高ディスプレイレベルに基づいて高次真核生物の哺乳動物ディスプレイを使用して選択されたクローンとのより詳細な生殖細胞系列分析を可能にするために、抗体をそれらの最も一致するVH、VLκ、およびVLλ生殖細胞系列に割り当てて、生殖細胞系列の発生頻度を、各グループについて計算した。結果を表形式(表16、17、および18)およびヒストグラムプロット(図42、43、および44)の両方で示す。これは、配列決定された集団において、いくつかの生殖細胞系列が低または高ディスプレイレベルグループで富化していたかまたは不在であったことを示し、抗体ディスプレイレベルに基づく哺乳動物ディスプレイ選択が抗体生殖細胞系列の選択的富化を可能にすることを示す。例えば、IGHV3-23およびIGHV1-2生殖細胞系列を、低ディスプレイグループと比較して高ディスプレイグループでそれぞれ105倍および9倍に富化した。IGHV3-53、IGHV3-21、およびIGHV4-34生殖細胞系列は、高ディスプレイグループではそれぞれ2.7%、1.1%、および0.9%の頻度で発生したが、低ディスプレイグループでは完全に不在であった。IGHV3-23生殖細胞系列は、良好に動作する生殖細胞系列であると考えられ、アリロクマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、デュピルマブ、エミシズマブ、オクレリズマブ、ラニビズマブ、およびシルツキシマブを含む、臨床使用が承認されているいくつかの治療用抗体に表される。IGHV3-21およびIGHV3-53生殖細胞系列は、良好に動作すると考えられ、ヒト合成抗体ライブラリ設計12に含まれている。IGHV1-69D、IGH3-30、IGHV5-51、IGHV1-58、およびIGH3-64Dの5つのFV生殖細胞系列は、低ディスプレイグループで富化されていることが見出された。以前に、IGH3-30生殖細胞系列は、特定の軽鎖と対合した場合、動的光散乱測定12によって決定されるように、自己相互作用する傾向があることが観察さ
れている。
れている。
抗体軽鎖生殖細胞系列の発生頻度の分析は、低ディスプレイグループと比較して高ディスプレイグループの特定の生殖細胞系列の富化も示した。例えば、IGKV1D-13およびIGKV3-19は、高ディスプレイグループではそれぞれ3.5%および6%の頻度で発生したが、低ディスプレイグループでは完全に不在であった。IGKV1-17、IGKV2-28、IGKV2D-29、およびIGKV6-21生殖細胞系列を、低ディスプレイグループと比較して高ディスプレイグループでそれぞれ11倍、22倍、6倍、11倍、および132倍に富化した。IGKV2-28および関連する生殖細胞系列IGKV2D-29は、良好に動作すると考えられ、カンツズマブ、デュピルマブ、ルカツマブ、モガムリズマブ、オビヌツズマブ、セビルマブ、テナツモマブ、およびザツキシマブを含む、臨床使用が承認されているか、または臨床評価中のいくつかの抗体に表される。IGKV1-16、IGKV1-33、IGKV2-30、およびIGKV4-1の4つのVLκ生殖細胞系列は、低ディスプレイグループで富化されていることが見出された。入力集団(IGLV3-19)で単一のVHλ生殖細胞系列が優勢であるため、VHλ生殖細胞系列分析はあまり明確ではない。それにもかかわらず、以下のVHλ生殖細胞系列が高ディスプレイグループで富化された:IGLV1-47、IGLV2-11、IGLV2-14、IGLV2-23、IGLV2-8、IGLV3-10およびIGLV6-57。Vλ1-47およびVλ2-14軽鎖は、良好に動作することが知られており、合成ライブラリ設計12、128において足場として含まれている。IGLV2-14は、良好に動作する抗体2である臨床的に承認された抗PCSK9抗体であるエボロクマブに存在する軽鎖である。
この分析は、ヒト抗体生殖細胞系列の哺乳動物ディスプレイの高または低ディスプレイグループのいずれかへの「ビニング」を可能にする。高レベルディスプレイは、タンパク質自己相互作用の低い傾向に関して、良好に動作する生物物理学的特性と相関することが以前に示された(実施例3)。したがって、哺乳動物ディスプレイの高ディスプレイレベルグループにおける特定の生殖細胞系列の富化の観察は、それらの固有の生物物理学的特性によるものである。したがって、哺乳動物ディスプレイは、自己相互作用の低い傾向に関して、良好に動作する生物物理学的特性を有する抗体生殖細胞系列の富化および識別を可能にする。
クラスター分析を行い、4つの抗メソテリン抗体集団の各々について、それらの発生頻度とともに、配列固有VHおよびVL CDR3クローンの一覧を生成した。発生頻度による上位10個のクローンを、図31に示されるようにゲーティングされた高、中、および低ディスプレイレベルの抗メソテリン抗体FACSについて表19に示す。比較のために、入力集団および代替集団におけるクローンの発生頻度も示す。より限定されたクローンセットで以前に示されたように、高ディスプレイレベルグループの上位7個の最も豊富なクローンおよび低ディスプレイグループの間に重複はなかった。高ディスプレイレベルグループで7個の最も豊富なクローンは、低ディスプレイレベルグループでは完全に不在であった。低ディスプレイレベルグループで9個の最も豊富なクローンは、高ディスプレイレベルグループでは完全に不在であった。最も豊富な中ディスプレイレベルグループでは、高および低ディスプレイレベルグループとのいくつかの重複があった:3個のクローンは中ディスプレイレベルグループにのみ存在し、2個のクローンは中および高ディスプレイレベルグループにのみ存在し、3個のクローンは3つのディスプレイレベルグループすべてに存在した。低ディスプレイレベルグループといくつかの重複があった高ディスプレイレベルグループに由来するクローン(例えば、クローン8、9、および10)について、41倍を超える高ディスプレイレベルグループこれらのクローンの富化があった。
それらの配列に従う高、中、および低ディスプレイレベルグループへの抗体のビニングは、真核細胞の抗体ディスプレイレベルに基づく分離が、それらのポリペプチド配列によって決定されるその抗体の特性に起因することを示す。PacBio NGS分析によって決定されるような抗体の出現頻度は、サンガー配列決定によってより限定されたセットのクローンを配列決定することからの結果とよく一致した。PacBio NGSによって、低、中、および高ディスプレイレベルグループの上位10の最も豊富なクローンのうちの9、8、および6は、サンガー配列決定によって以前に識別されていた。
次いで、高および低ディスプレイレベルグループから選択した抗体を発現させて精製し、それらの生物物理学的特性をAC-SINS41またはHPLC-SECで決定した。AC-SINSの結果を、表19の最後から2番目の列に示す。高または低ディスプレイグループに由来するクローンの平均AC-SINS波長シフトは、それぞれ1.9および15.2であった。高ディスプレイレベルグループと比較して、低ディスプレイレベルグループに由来するクローンから観察された有意により高い平均AC-SINS波長シフトは、低ディスプレイレベルグループの抗体が、高ディスプレイレベルグループの抗体よりも自己相互作用および凝集をより起こしやすいことを示す。選択された抗体はまた、HPLC-SECによって検査した。図45は、HPLC-SECによって発現および精製および分析された、1つが高ディスプレイグループからのもの(932_01_A03)であり、3つが低ディスプレイグループからのもの(930_01_A12、930_01_B02、および930_01_C12)である4つのクローンの例を示す。これは、高ディスプレイレベルグループから単離された抗体932_01_A03が、96%単量体であることを示す。対照的に、抗体930_01_C12は、18%二量体の82%単量体であり、その後の溶出プロファイルでカラムでの一部の遅延が見られ、カラムとのいくつかの非特異的相互作用を示す。このクローンは、小さな断片(分子量16kDa)を含み、発現または精製中に断片化した場合があることを示す。低ディスプレイグループからの2つの追加のクローン(930_01_A12、930_01_B02)もまた、カラムでの保持時間の遅延を示し、抗体がカラムマトリックスに非特異的に吸収されたことを示す。HPLC-SEC保持体積(最後の列、表19)は、カラムマトリックスと相互作用する非特異性抗体の測定値である。ここで、より大きな保持体積は、より広いHPLC-SECピークをもたらし、HPLC-SECカラムマトリックスとの非特異的相互作用を示すことができる。高ディスプレイグループクローンの平均HPLC-SEC保持体積は、1.55mlであったが、低ディスプレイグループクローンの平均HPLC-SEC保持体積は、1.6mlであり、低ディスプレイグループのクローンが高ディスプレイグループのクローンよりも非特異的HPLC-SECカラムマトリックス相互作用を起こしやすかったという証拠を提供する。限外濾過による濃縮を試みた後、低ディスプレイレベルグループの1個のクローン(930_01_C07)が沈殿した。低ディスプレイレベルグループの2番目のクローンは、発現および精製に失敗した。高ディスプレイレベルグループに由来するクローンは、発現、精製、およびその後の分析中にいかなる問題も実証しなかった。これには、PBS(pH7.4)中12mg/ml超に限外濾過によって濃縮される能力が含まれた。
したがって、この実施例では、高次真核生物の哺乳動物細胞ディスプレイを使用して、それらの自己相互作用および交差相互作用特性に基づいて、異なる生殖細胞系列配列を有する抗体を含む、錯体混合物内に存在する抗体を分離することが可能であることを示した。
実施例11.細胞表面への急速な蓄積に基づく開発性クローンの選択
上記の実施例では、高次真核細胞の安定した集団の表面における構成的抗体ディスプレイレベルと、その抗体の生物物理学的特性との関係に言及した。ここでは、また、トラン
スフェクションの24時間後にディスプレイレベルの違いが観察されることにも言及する。実施例5、図10では、トランスフェクションの1日後(1dpt)の時点で、ボコシズマブおよび親抗体5A10iの間のディスプレイレベルの違いを観察した(図10、左パネル)。表示された抗体のこの初期蓄積率の違いは、平衡状態で安定した細胞株(図10、右パネル、21dpt)のディスプレイレベルの違い、および抗体の生物物理学的特性と相関している。実施例5において、ボコシズマブは、AC-SINSアッセイおよびHPLC-SECで測定される親抗体5A10-iと比較して、高い自己相互作用および交差相互作用特性を有することが示された。ボコシズマブは、親抗体5A10-iと比較して、トランスフェクションの24時間後の移行相およびトランスフェクションの21日後の安定した細胞株相の両方で、より低いレベルで表示された(図10)。したがって、最初の一過性抗体細胞ディスプレイレベルは、数日間の薬物選択後に作成された安定した細胞株の抗体細胞ディスプレイレベルを予測するものである。
上記の実施例では、高次真核細胞の安定した集団の表面における構成的抗体ディスプレイレベルと、その抗体の生物物理学的特性との関係に言及した。ここでは、また、トラン
スフェクションの24時間後にディスプレイレベルの違いが観察されることにも言及する。実施例5、図10では、トランスフェクションの1日後(1dpt)の時点で、ボコシズマブおよび親抗体5A10iの間のディスプレイレベルの違いを観察した(図10、左パネル)。表示された抗体のこの初期蓄積率の違いは、平衡状態で安定した細胞株(図10、右パネル、21dpt)のディスプレイレベルの違い、および抗体の生物物理学的特性と相関している。実施例5において、ボコシズマブは、AC-SINSアッセイおよびHPLC-SECで測定される親抗体5A10-iと比較して、高い自己相互作用および交差相互作用特性を有することが示された。ボコシズマブは、親抗体5A10-iと比較して、トランスフェクションの24時間後の移行相およびトランスフェクションの21日後の安定した細胞株相の両方で、より低いレベルで表示された(図10)。したがって、最初の一過性抗体細胞ディスプレイレベルは、数日間の薬物選択後に作成された安定した細胞株の抗体細胞ディスプレイレベルを予測するものである。
したがって、高次真核生物の細胞表面の表面での抗体のディスプレイ率と抗体の生物物理学的特性との関係を示した。抗体の最初の一過性ディスプレイとそれらの生物物理学的特性との実証された関係は、安定した細胞株の生成と比較してより早い段階で、抗体の集団またはライブラリから優れた生物物理学的特性を有する抗体を富化するのに有用となる。また、個々のモノクローナルトランスフェクションによる抗体の個々のセットのスクリーニングにも有用となる。また、抗体の細胞表面ディスプレイの最初の比率の違いは、抗体発現が誘導性プロモーターによって調節され、細胞表面ディスプレイレベルに基づく集団の選択が誘導後に開始される場合に有用であり得る。
実施例12.CHO細胞ライブラリの表面提示レベルに基づくIgGの開発性の選択
IgG抗体は、自己相互作用および凝集するその傾向を含む個々の抗体の生物物理学的特性と相関しているディスプレイレベルで、CHO細胞の表面に表示することができる。この実施例では、2つの代替ヌクレアーゼ媒介抗体遺伝子組入れ方法の後のCHO細胞の表面上の抗体ディスプレイを示し、ディスプレイレベルが、表示された抗体の生物物理学的特性と相関していることを実証する。
IgG抗体は、自己相互作用および凝集するその傾向を含む個々の抗体の生物物理学的特性と相関しているディスプレイレベルで、CHO細胞の表面に表示することができる。この実施例では、2つの代替ヌクレアーゼ媒介抗体遺伝子組入れ方法の後のCHO細胞の表面上の抗体ディスプレイを示し、ディスプレイレベルが、表示された抗体の生物物理学的特性と相関していることを実証する。
遺伝子標的化ベクターを設計し、実施例1に記載されるヒトAAVSゲノム遺伝子座93にオーソロガスであるCHO AAVS遺伝子のイントロン1への抗体遺伝子発現カセットの組入れのために使用した。CHO AAVS遺伝子座のイントロン1を標的とするTALENヌクレアーゼは、この位置で二本鎖切断を創出した。比較のために、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼもまた平行法で試験した。
TALEN指向およびCRISPR/Cas9指向組入れ方法の両方を使用して、CHO細胞での抗体ディスプレイを無事に達成した。TALENヌクレアーゼ対またはCRISPR 1設計を使用して、最高のディスプレイレベルうぃ達成した。代替CRISPR設計(CRISPR 2およびCRISPR 3)も成功したが、わずかにより低いレベルの抗体ディスプレイが観察された。図48.
さらに、CHO細胞に表示された抗体の細胞表面レベルが、HEK293細胞で見られた結果を反映して、表示された抗体の生物物理学的特性と相関していたことを実証した。選択された抗体を、pINT17-BSD-CHO標的化ベクターにクローニングした:MEDI-1912、MEDI-1912-STT、ボコシズマブ、884_01_G01。
MEDI-1912(抗NGF)は、自己凝集するその傾向に関して乏しい生物物理学的特性を有する7。溶解度が増強された娘クローンMEDI1012-STTと比較して、MEDI-1912のCHO細胞では、低減された細胞表面ディスプレイレベルが観察
された。
された。
884_01_G01は、ボコシズマブの誘導体であり、ディスプレイレベルおよびPCSK9への保持された結合に基づいて、変異誘発および哺乳類動物ディスプレイの選択によって特定した(実施例5)。884_01_G01は、HPLC-SECにより低いAC-SINSスコアおよび単量体のピークを与えるという点で、「良好に動作する」ことが以前に示された。改善された娘クローン884_01_G01と比較して、ボコシズマブでは、低減されたCHO細胞表面ディスプレイレベルも観察された。図49.
したがって、この実施例は、それらの細胞表面ディスプレイレベルに基づいて、抗体のディスプレイおよび異なる生物物理学的特性を有する抗体の区別のためのCHO細胞の有用性を確認する。異なる生物物理学的特性を有する抗体は、フローサイトメトリーによって十分に分離することができ、錯体混合物内のCHO細胞ディスプレイにより、より良好な生物物理学的特性を有する抗体の分離を可能にする。
材料および方法
CHO AAVSの左および右の相同性アームをコードするDNAを、プライマー対3165/3166および3169/3170(表20)でCHO細胞から単離した、懸濁液適合CHO細胞株ゲノムDNAからPCR増幅して、それぞれサイズが1.2kbおよび1.35kbのPCR産物を生成した。次いで、これらのPCR産物をテンプレートとして使用して、その後の抗体遺伝子クローニングに必要な様々な制限部位を同時にノックアウトしながら、左および右のCHO AAVS相同性アームを生成した。上に記載されるCHO AAVS左アームテンプレートを使用して、PCRプライマー対3195/3196、3197/3198、3199/3200でのPCR増幅による既存のNcoI、NheI、NsiI、およびDraIII部位の変異とともに、CHO左AAVSホモロジーアームを創出して、それぞれ241bp、576bp、および142bpのサイズの3つのPCR産物を創出した。次いで、プライマー3199および3196(表20)を使用してフラグメントを組み立て、サイズが893bpの産物を生成した。3196の代わりにプライマー3123を用いてわずかにより短いAAVS左相同性アーム(880bp)を得たことを除いて、追加のアセンブリPCR反応を行った。このわずかに短い左相同性アームを生成する理由は、標的化ベクター内のCRISPR 2および3設計認識部位を回避するためである(図46)。組み立てられたAAVS左相同性アームを、AsiSIおよびNsiI制限酵素で消化し、AsiSIおよびNsiIで事前に切断されたpINT17-BSDベクターにクローニングした。CHO AAVS相同性アームをPCR増幅して、BclI制限をノックアウトするために、プライマー対3201/3202および3203/3204で2つの別個のPCR反応を行い、それぞれ707bpおよび208bpのサイズのPCR産物を創出し、次いで、それらをプライマー3201および3204で、PCRで組み立てし、900bpのサイズのPCR産物を生成した。組み立てられたAAVS右相同性アームを、BstZ171およびSbfI制限酵素で消化し、BstZ171およびSbfIで事前に切断されたpINT17-BSDベクターにクローニングし、次いで、左CHO AAVS相同性アームをすでに保持していたBstZ171およびSbfI切断pINT17-BSD切断ベクターにクローニングした。次いで、これは、CHO標的化ベクターpINT17-BSD-CHOを創出し、これは、ヒトAAVS相同性アームがCHO AAVS相同性アームにより置き換えられていることを除いて、pINT17-BSD(図1)と同一である。
CHO AAVSの左および右の相同性アームをコードするDNAを、プライマー対3165/3166および3169/3170(表20)でCHO細胞から単離した、懸濁液適合CHO細胞株ゲノムDNAからPCR増幅して、それぞれサイズが1.2kbおよび1.35kbのPCR産物を生成した。次いで、これらのPCR産物をテンプレートとして使用して、その後の抗体遺伝子クローニングに必要な様々な制限部位を同時にノックアウトしながら、左および右のCHO AAVS相同性アームを生成した。上に記載されるCHO AAVS左アームテンプレートを使用して、PCRプライマー対3195/3196、3197/3198、3199/3200でのPCR増幅による既存のNcoI、NheI、NsiI、およびDraIII部位の変異とともに、CHO左AAVSホモロジーアームを創出して、それぞれ241bp、576bp、および142bpのサイズの3つのPCR産物を創出した。次いで、プライマー3199および3196(表20)を使用してフラグメントを組み立て、サイズが893bpの産物を生成した。3196の代わりにプライマー3123を用いてわずかにより短いAAVS左相同性アーム(880bp)を得たことを除いて、追加のアセンブリPCR反応を行った。このわずかに短い左相同性アームを生成する理由は、標的化ベクター内のCRISPR 2および3設計認識部位を回避するためである(図46)。組み立てられたAAVS左相同性アームを、AsiSIおよびNsiI制限酵素で消化し、AsiSIおよびNsiIで事前に切断されたpINT17-BSDベクターにクローニングした。CHO AAVS相同性アームをPCR増幅して、BclI制限をノックアウトするために、プライマー対3201/3202および3203/3204で2つの別個のPCR反応を行い、それぞれ707bpおよび208bpのサイズのPCR産物を創出し、次いで、それらをプライマー3201および3204で、PCRで組み立てし、900bpのサイズのPCR産物を生成した。組み立てられたAAVS右相同性アームを、BstZ171およびSbfI制限酵素で消化し、BstZ171およびSbfIで事前に切断されたpINT17-BSDベクターにクローニングし、次いで、左CHO AAVS相同性アームをすでに保持していたBstZ171およびSbfI切断pINT17-BSD切断ベクターにクローニングした。次いで、これは、CHO標的化ベクターpINT17-BSD-CHOを創出し、これは、ヒトAAVS相同性アームがCHO AAVS相同性アームにより置き換えられていることを除いて、pINT17-BSD(図1)と同一である。
TALEN対を、図46に示されるように、TAL標的配列:TCCCCGTCATCCAAAAGCおよびTCTGCTGTGACTAATCTTを認識したCHO AAVS遺伝子座を認識するように設計した。TALENによる部位特異的DNA切断に対する
比較のために、代替ヌクレアーゼ-核酸誘導ヌクレアーゼCRISPR/Cas9の性能もまた試験した。3つのCRISPR/Cas9ガイドRNAを、CHO AAVS遺伝子座を標的とするように設計し、認識配列を図46に示す。
比較のために、代替ヌクレアーゼ-核酸誘導ヌクレアーゼCRISPR/Cas9の性能もまた試験した。3つのCRISPR/Cas9ガイドRNAを、CHO AAVS遺伝子座を標的とするように設計し、認識配列を図46に示す。
標的化ベクターにクローニングされたCHO AAVS相同性アームの核酸配列を図47に示す。U6 RNAポリメラーゼプロモーターガイドRNAおよびtracrRNAをコードする合成遺伝子ブロックを設計し、プライマー3222および3223でPCR増幅した(表21)。CRISPR/Cas9ベクター(A21177、Geneart)をプライマー3220/3221でPCR増幅して、9375bpの産物を生成した。次いで、NEB Builder(New England Biolabs)を使用して3つのCRISPR遺伝子ブロック(表20)でこれを組み立て、図46に示される3つのガイドRNAをコードする3つのCRISPR/Cas9ベクターを生成した。
ニボルマブ抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を含む893bpまたは880bp AAVS左相同性アーム(それぞれV1またはV2と名づけられている)を含む標的化ベクターpINT17-BSD-CHOを使用して、CHO AAVS TAL-1FおよびCHO
AAVS TAL-1R TALEN対(M3770、Thermo Fisher Scientific)、またはCHO AAVS特異的ガイドRNAを含むCRISPR/Cas9のいずれかをコードするプラスミドの不在または存在下で、Freestyle CHO-S細胞(Thermo Fisher Scientific)をトランスフェクトし、ブラストサイジン薬物選択に晒した(7.5μg/ml)。トランスフェクション法は、TALENトランスフェクションについて実施例2に記載されるとおりで
あった。CRISPR/Cas9トランスフェクションには、10:1のCRISPR/Cas9、pINT17-BSD-CHOプラスミドDNA比を用いた。トランスフェクションの14日後(dpt)、細胞を抗Fc PEで染色した。蛍光強度(抗Fc)を細胞カウントに対してプロットした。
AAVS TAL-1R TALEN対(M3770、Thermo Fisher Scientific)、またはCHO AAVS特異的ガイドRNAを含むCRISPR/Cas9のいずれかをコードするプラスミドの不在または存在下で、Freestyle CHO-S細胞(Thermo Fisher Scientific)をトランスフェクトし、ブラストサイジン薬物選択に晒した(7.5μg/ml)。トランスフェクション法は、TALENトランスフェクションについて実施例2に記載されるとおりで
あった。CRISPR/Cas9トランスフェクションには、10:1のCRISPR/Cas9、pINT17-BSD-CHOプラスミドDNA比を用いた。トランスフェクションの14日後(dpt)、細胞を抗Fc PEで染色した。蛍光強度(抗Fc)を細胞カウントに対してプロットした。
2つの抗体対の重鎖および軽鎖遺伝子を、893bpのAAVS左相同性アームを使用してCHO標的化ベクターpINT17-BSD-CHOにクローニングした(図47):抗NGF抗体MEDI-1912またはMED-1912-STT7または抗PCSK9ボコシズマブまたはボコシズマブ誘導体クローン884_01_G01(実施例5を参照されたい)。得られた標的化ベクターを使用して、CHO AAVS TAL-1FおよびCHO AAVS TAL-1R TALEN対(M3770、Thermo Fisher Scientific)をコードするプラスミドの存在下で、Freestyle CHO-S細胞(Thermo Fisher Scientific)をトランスフェクトし、ブラストサイジン薬物選択に晒した(7.5μg/ml)。実施例2に記載されるように、15dptの細胞を抗Fc-PEで染色した。抗体を表示する15dptのCHO細胞を抗Fc-PE MACSで精製し、抗Fc PEで染色した。蛍光強度(抗Fc)をCHO細胞カウントに対してプロットした。
実施例13.その後の結合選択に哺乳動物ディスプレイを使用した「開発性が増強された」集団の創出
実施例10は、抗原(この実施例では、ファージディスプレイ選択から)で予め選択されたクローンの集団が、生物物理的特性と順に相関する異なる提示レベルに基づいてさらに解明され得ることを実証する。他で記載されるように、多反応性プローブへの結合はまた、多反応性特性を有するクローンを特定および除去するためにも使用することができる。したがって、それ以外の場合はさらなる特徴付けまたは開発のために選択され得る問題のあるクローンを排除することができる。
実施例10は、抗原(この実施例では、ファージディスプレイ選択から)で予め選択されたクローンの集団が、生物物理的特性と順に相関する異なる提示レベルに基づいてさらに解明され得ることを実証する。他で記載されるように、多反応性プローブへの結合はまた、多反応性特性を有するクローンを特定および除去するためにも使用することができる。したがって、それ以外の場合はさらなる特徴付けまたは開発のために選択され得る問題のあるクローンを排除することができる。
実施例10では、抗体集団を、最初に(この実施例ではファージディスプレイを使用して)結合特性に基づいて選択し、続いてその後の生物物理学的特性に基づく選択によって選択した。高次真核生物の提示レベルまたは多反応性プローブへの結合に基づいて、選択の順序を逆にし、最適な生物物理学的特性のために選択されたクローンの集団を生成することも可能である。例えば、結合剤のディスプレイライブラリを、哺乳動物細胞または他の高次真核生物で創出し、結合剤の定常領域と結合する薬剤を使用して掲示レベルを選択することができ、それによりすべての結合剤をそれらの配列とは無関係に等しく標識することができる。例えば、結合剤がIgG抗体である場合、細胞は、IgG Fc領域と結合する検出可能な物質、例えば、標識された抗IgG抗体と接触し得る。次いで、モードまたは中央値よりも高い提示レベルを示す集団の画分を、例えば、フローサイトメトリーによって選択することができる。例えば、提示レベルに基づくクローンの上位5%、10%、または25%は、本明細書に記載の方法を使用して、1ラウンド以上の選別で選択することができる。これにより、異なる抗原への結合に基づくその後の選択に使用され得る、結合剤の「開発性が増強された」集団が創出されるであろう。
実施例10のアプローチを使用して、4×1010個のクローンの大きなファージディスプレイライブラリを選択し、結合剤のサブ集団を生成し、次いで、それらを掲示レベルに基づく選択のために哺乳動物ディスプレイライブラリに組み込んだ。順序を逆にする1つの潜在的な欠点、すなわち、結合剤の選択の前に高次真核生物の生物物理特性を事前に選択することは、リボソームディスプレイまたは細菌系(例えば、ファージディスプレイ)などのインビトロ系で使用するためのライブラリを創出するよりも、哺乳動物細胞での大きなライブラリの創出の方がより困難かつ費用がかかることである。したがって、例えば、107個のクローンの開始哺乳動物ディスプレイライブラリが使用され、上位10%
が掲示レベルに基づいて選択される場合、抗原結合のその後の選択に使用されるライブラリの潜在的な多様性は、例えば、高親和性結合剤を選択する可能性を低減する106個のクローンに低減される。代替戦略は、例えば、最適なVHおよび最適なVL構成要素に別個に選択された抗体の場合に、哺乳動物ディスプレイでライブラリの構成要素を事前に選択することであり、次いで、それらを組み合わせて、組み合わせ多様性の恩恵を受けることである。
が掲示レベルに基づいて選択される場合、抗原結合のその後の選択に使用されるライブラリの潜在的な多様性は、例えば、高親和性結合剤を選択する可能性を低減する106個のクローンに低減される。代替戦略は、例えば、最適なVHおよび最適なVL構成要素に別個に選択された抗体の場合に、哺乳動物ディスプレイでライブラリの構成要素を事前に選択することであり、次いで、それらを組み合わせて、組み合わせ多様性の恩恵を受けることである。
したがって、1つの分岐で、哺乳動物ディスプレイライブラリは、最適なVH遺伝子を選択するために、VLの単一または限定された選択およびVH鎖の大きな多様性を含むIgGまたはscFv形式の抗体で創出することができる。単一または限定されたパートナーVL遺伝子は、ランダムに選択されるか、パートナーチェーンの不十分な生物物理学的特性を救うVH遺伝子を選択する目的で、不十分な生物物理学的特性に基づいて選択される。あるいは、良好な生物物理学的特性を有するVL遺伝子を選択して、掲示レベルを損なうVH遺伝子を特定および除去してもよい。上の実施例と同じ数を使用して、VH多様性を有する107個のクローンのライブラリを創出して、掲示レベルに基づいてVH遺伝子の上位10%を選択し、106個の選択されたVHクローンを潜在的に生成し得る。並列分岐では、単一または限定された数のVH遺伝子を、多様なVL遺伝子と組み合わせて、最適なVL遺伝子を選択してもよい。異なる選択されたVHおよびVL遺伝子を一緒にする組み合わせ多様性は、個々の選択された鎖の数よりも著しく高くなるであろう。したがって、各分岐の上位106個のVH遺伝子および上位106個のVL遺伝子を選択により、1012変異型の潜在的な組み合わせ多様性を創出する。選択されたVHおよびVLドメインは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、および高次真核生物でのディスプレイを含む標的結合の選択を可能にする任意のディスプレイ系内に掲示されてもよい。このようにして、本発明を使用する最適な生物物理学的特性の選択を使用して、他のディスプレイ系内に「開発性が増強された」ライブラリを生成してもよい。例えば、最適な生物物理学的特性を有するクローンを産出するように事前に配置されているファージディスプレイライブラリ。
上記のアプローチのさらなる実施例において、最適な生物物理学的特性の選択は、個々のドメイン内の領域に指向されてもよい。例えば、VHドメインには、3つの異なる相補性決定領域(CDR1、CDR2、およびCDR3)が含まれ、生物物理学的な責任は、個々のCDRまたはCDRの組み合わせ内の配列によって引き起こされ得る。例えば、非免疫化抗体レパートリーのVH遺伝子のCDR1および2領域は、最適な生物物理学的性質のために選択されたCDR1および2内に焦点を絞った多様性とともに、単一または限定された数のVH CDR3領域およびVLパートナー鎖、ならびに得られる抗体集団と組み合わせて回収されてもよい。次いで、選択されたCDR1および2領域は、CDR3セグメントおよびVLセグメントの多様性と組み合わせることができ、これらは選択されていないか、同様の方法で最適な生物物理学的特性のために選択されていてもよい。この「シャッフル」アプローチにより、潜在的な組み合わせ多様性が増加する。上に記載される実施例は、CDR 1およびCDR2セグメントの最適な生物物理特性の選択を記載しているが、同じアプローチを異なるCDR領域だけで、または組み合わせてどのように使用され得るかは明らかである。いくつかの場合によっては、最適な生物物理学的特性のために選択される入力ライブラリは、非免疫化源からの、または開始足場の多様化からのナイーブライブラリであり得る。あるいは、入力ライブラリは、親和性とともに潜在的に生物物理学的特性を改善する目的で、入力開始クローンまたはクローンの選択に基づく多様化ライブラリであってもよい。
それぞれの場合において、上に記載されるアプローチは、当業者に既知である標準的な分子生物学技術を使用する。加えて、鎖がシャッフルされたライブラリを含むライブラリの構築および使用のための方法もまた、WO2015/166272(Iontas L
imited)に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。VHまたはVLドメイン内の異なる領域を組み合わせることは、最適なPCRプライマーを使用してVHおよびVLドメイン内の個々の領域を増幅することから利益を得るであろう。抗体VHおよびVL遺伝子の生殖細胞系列配列は、容易に入手可能であり、例えば、IMGTデータベース132はそのようなプライマーの設計を可能にする。さらに、WO2017/118761(Iontas Limited)の実施例は、多様性を導入し、異なるCDR領域を組み合わせて、無傷のVH:VLの組み合わせを再構成する方法を記載している。
imited)に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。VHまたはVLドメイン内の異なる領域を組み合わせることは、最適なPCRプライマーを使用してVHおよびVLドメイン内の個々の領域を増幅することから利益を得るであろう。抗体VHおよびVL遺伝子の生殖細胞系列配列は、容易に入手可能であり、例えば、IMGTデータベース132はそのようなプライマーの設計を可能にする。さらに、WO2017/118761(Iontas Limited)の実施例は、多様性を導入し、異なるCDR領域を組み合わせて、無傷のVH:VLの組み合わせを再構成する方法を記載している。
以下の実施例を例示のために使用する。最初のPD1結合抗体クローンのVH CDR3およびVL CDR3に多様性を導入し、得られた集団を哺乳動物細胞での最適な提示のために選択した。同じアプローチを採用して、生殖細胞系列コード化遺伝子のCDR 1および2を含む他の開始フレームワークおよび他のCDRに多様性を導入することができた。例えば、表16は、哺乳動物細胞、例えば、IGHV1-2、IGHV3-23、およびIGKV6-21で高レベルの掲示のために選択された集団に頻繁に出現する生殖細胞系列遺伝子を特定し、これらは、さらなる多様化および開発性の選択ために開始フレームワークとして選択してもよい。同様に、抗体以外の結合ドメインのサブ領域を、最適な生物物理学的特性の別個の選択のために特定することができる。
例として、PD-1のPD-L1との相互作用をブロックした抗PD1抗体(337_1_C08)を、ファージディスプレイによって特定した(図50a)。PD-1に対する337_1_C08の親和性(KD)は74nMである。これを使用して、VH CDR3およびVL CDR3に焦点を当てた多様化を有する変異誘発されたライブラリを創出した。多様化のための様々な方法が当業者に知られている。多様化は、例えば、NNS(32個のコドン内のすべての20個のアミノ酸をコードする)などのランダム化コドンを使用する飽和変異誘発による変異誘発されたライブラリの創出を含み得る。代替案は、周囲の配列空間を探索しながら配列情報を保持することである。これを達成するために、オリゴヌクレオチドを、すべてのアミノ酸(システインを除く)を使用して、可能なすべての2量体および1量体の変異型が含まれるように、VHおよびVLのCDR3における8個のアミノ酸の連続ストレッチに設計した(図50a)。
したがって、ライブラリを、各CDR3領域の元の8個のアミノ酸のうち少なくとも6個のアミノ酸を保持するように設計した。VH CDR3またはVL CDR3の各々に向けられた9216個のオリゴヌクレオチドの合成によってこれを達成することが可能であった。VHおよびVLのGeneblockは、すべての2量体アミノ酸の変動が8-アミノ酸ウィンドウ(9216個の変異型)内に包含され、TWIST Biosciencesによって合成した。各セット内のすべての9216個のオリゴヌクレオチドの存在を、ハイスループット配列決定(Twist Bioscience)によって確認した。プライマー対プライマーフォワード:5’-CTTTCTCTCCACAGGCGCCCATGGCCGAAGTGCAGCC-3’およびリバース:5’-TTTTTTCTCGAGACGGTGACCAGGGTTC-3’を使用して、VH遺伝子を増幅した。プライマー対プライマーフォワード:5’-TTTTTTGCTAGCTCCTATGAGCTGACTC-3’およびリバース:5’-GTCACGCTTGGTGCGGCCGCGGGCTGACCTAG-3’を使用して、VL遺伝子を増幅した。プライマー対フォワード:5’-GGCCGCACCAAGCGTGAC-3’およびリバース:5’-GGCGCCTGTGGAGAGAAAG-3’を使用して、pINT17-BSDベクターから定常光(CL)およびCMVプロモートをコードする「スタッファー」断片をPCR増幅した。3つの遺伝子断片を、最初に「モック」PCRで、増幅プライマーなしで組み立て、部分的なアセンブリおよびその後の増幅によってバイアスが導入されないことを確実にした。上記の3つのPCR産物を等モル比(各90nM)で混合し、60℃
のアニーリング温度および68℃(45秒)の伸長温度で製造業者の指示に従ってKOD
Hot Start Master Mix(Sigma、71842)を使用して、PCR反応を行うことによって、模擬PCRを行った。プライマー対プライマーフォワード:5’-TTTTTTGCTAGCTCCTATGAGCTGACTC-3’およびリバース:5’-TTTTTTCTCGAGACGGTGACCAGGGTTC-3’を使用して、組み立てられた産物を続いて増幅した。組み立てられた抗PD-1 VHおよびVL CDR3ライブラリを、NheIおよびXhoI制限酵素で消化し、pINT17-BSD標的化ベクターにクローニングし、E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells(Lucigen、カタログ番号60081-1)の電気穿孔により、形質転換混合物の希釈液で播種された寒天プレート上で個々のカナマイシン耐性コロニーをカウントすることによって決定されるように、1.1×108個のライブラリサイズを創出した。トランスフェクション品質のプラスミドDNAを調製して使用し、Tale AAVSの左および右アームヌクレアーゼでMaxcyte電気穿孔によりHEK293懸濁細胞(1.35×109個の細胞)を同時トランスフェクトして、単一コピー抗体遺伝子組入れを可能にした。トランスフェクション後の希釈プレートでブラストサイジン耐性コロニー形成単位(CFU)をカウントすることによって判定された場合、遺伝子標的化の効率は0.8%であり、10.8百万の哺乳動物ディスプレイライブラリサイズを得た。ライブラリをブラストサイジン選択下で7日間増殖させ、次に抗Fc MACSによって選択して、IgGを発現していなかったクローンを除去した。
のアニーリング温度および68℃(45秒)の伸長温度で製造業者の指示に従ってKOD
Hot Start Master Mix(Sigma、71842)を使用して、PCR反応を行うことによって、模擬PCRを行った。プライマー対プライマーフォワード:5’-TTTTTTGCTAGCTCCTATGAGCTGACTC-3’およびリバース:5’-TTTTTTCTCGAGACGGTGACCAGGGTTC-3’を使用して、組み立てられた産物を続いて増幅した。組み立てられた抗PD-1 VHおよびVL CDR3ライブラリを、NheIおよびXhoI制限酵素で消化し、pINT17-BSD標的化ベクターにクローニングし、E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells(Lucigen、カタログ番号60081-1)の電気穿孔により、形質転換混合物の希釈液で播種された寒天プレート上で個々のカナマイシン耐性コロニーをカウントすることによって決定されるように、1.1×108個のライブラリサイズを創出した。トランスフェクション品質のプラスミドDNAを調製して使用し、Tale AAVSの左および右アームヌクレアーゼでMaxcyte電気穿孔によりHEK293懸濁細胞(1.35×109個の細胞)を同時トランスフェクトして、単一コピー抗体遺伝子組入れを可能にした。トランスフェクション後の希釈プレートでブラストサイジン耐性コロニー形成単位(CFU)をカウントすることによって判定された場合、遺伝子標的化の効率は0.8%であり、10.8百万の哺乳動物ディスプレイライブラリサイズを得た。ライブラリをブラストサイジン選択下で7日間増殖させ、次に抗Fc MACSによって選択して、IgGを発現していなかったクローンを除去した。
実施例10に記載されるように、Fc陽性細胞の集団を、蛍光標識された抗Fc抗体の結合を使用して、発現レベルに基づいてフローサイトメトリーによって分離した(図50b)。別個の集団を数日間培養し、Fc発現について再分析した。図50bは、発現の異なるモーダル値を有する個別のサブ集団が生成されていることを示す。これには、提示レベルが劣る集団、ならびに親と同等の提示レベルを有する集団が含まれる。実施例10に記載されているように、抗体遺伝子をこれらの細胞から回収して、最適な生物物理学的特性を有するサブ集団を生成することができる。この実施例では、細胞を生物物理学的特性のみに基づいて選別したが、抗原結合に基づいて一緒に、または順番に選別を行うことも可能である。
実施例14.哺乳動物細胞の表面での二重特異性抗体のディスプレイ
二重特異性抗体または代替形式(Spiess et al,2015129によって概説される)により、以前は単一特異性抗体またはタンパク質では不可能であった新しい治療作用機序(MOA)が可能になった。二重特異性治療薬の使用例は、T細胞の細胞毒性活性を癌治療薬として再指向すること、血液脳関門の通過を可能にすること、2つのシグナル伝達経路を同時にブロックすること、および抗体の組織特異的送達または活性130を含む。二重特異性形式は、自己または交差相互作用特性のそれらの傾向に関して、従来の単一特異性抗体と同じ開発性の障害に直面し得る。各結合領域は、その自己相互作用または交差相互作用特性を補償または複合し得る異なる特性を有し得るため、二重特異性部分の最終形式をスクリーニングすることが有利である。親和力は、ヘパリン硫酸などのオフターゲット分子に対する親和性を数桁増加させることができるため、二重特異性の個々の結合「アーム」をスクリーニングする場合、これらの特性は明らかでない場合がある。自己相互作用特性は、疎水性などの全体的な表面特性が変化し得るため、その個々の結合領域と比較して二重特異性分子でも異なり得る。二重特異性抗体(bsAb)形式は、多くの異なる形態で129に存在することができるが、κ/λ-体131などのIgG様bsAb、共通の軽鎖、ノブイントゥホール132、電荷対、およびクロスマブ形式130;BiTE形式などの断片ベースのbsAb、DVD-IgGなどの付加されたIgG、またはFcabもしくはmAb2形式133などのそれらの定常ドメインに追加の結合領域を有するように操作された抗体へと広義に分類することができる。しかしながら、F
cabsのCH3ドメインの構造的フレームワークの変化は、それらの開発性134を増加させるために必要とされたトFcab分子のそれらの熱安定性134および追加のエンジニアリングを低減することが見出された。この実施例では、HEK293細胞の表面に二重特異性抗体エミシズマブを表示し、これが抗原FIXaおよびFXと結合することができることを示すことによって、高次真核生物の哺乳動物ディスプレイを二重特異性抗体の表示に適用することができることを実証する。
二重特異性抗体または代替形式(Spiess et al,2015129によって概説される)により、以前は単一特異性抗体またはタンパク質では不可能であった新しい治療作用機序(MOA)が可能になった。二重特異性治療薬の使用例は、T細胞の細胞毒性活性を癌治療薬として再指向すること、血液脳関門の通過を可能にすること、2つのシグナル伝達経路を同時にブロックすること、および抗体の組織特異的送達または活性130を含む。二重特異性形式は、自己または交差相互作用特性のそれらの傾向に関して、従来の単一特異性抗体と同じ開発性の障害に直面し得る。各結合領域は、その自己相互作用または交差相互作用特性を補償または複合し得る異なる特性を有し得るため、二重特異性部分の最終形式をスクリーニングすることが有利である。親和力は、ヘパリン硫酸などのオフターゲット分子に対する親和性を数桁増加させることができるため、二重特異性の個々の結合「アーム」をスクリーニングする場合、これらの特性は明らかでない場合がある。自己相互作用特性は、疎水性などの全体的な表面特性が変化し得るため、その個々の結合領域と比較して二重特異性分子でも異なり得る。二重特異性抗体(bsAb)形式は、多くの異なる形態で129に存在することができるが、κ/λ-体131などのIgG様bsAb、共通の軽鎖、ノブイントゥホール132、電荷対、およびクロスマブ形式130;BiTE形式などの断片ベースのbsAb、DVD-IgGなどの付加されたIgG、またはFcabもしくはmAb2形式133などのそれらの定常ドメインに追加の結合領域を有するように操作された抗体へと広義に分類することができる。しかしながら、F
cabsのCH3ドメインの構造的フレームワークの変化は、それらの開発性134を増加させるために必要とされたトFcab分子のそれらの熱安定性134および追加のエンジニアリングを低減することが見出された。この実施例では、HEK293細胞の表面に二重特異性抗体エミシズマブを表示し、これが抗原FIXaおよびFXと結合することができることを示すことによって、高次真核生物の哺乳動物ディスプレイを二重特異性抗体の表示に適用することができることを実証する。
エミシズマブは、血友病を治療するために開発され、かつ第VIII因子模倣135として作用する、記載以前に記載される共通の軽鎖との重鎖「ノブイントゥホール」技術132を用いて生成された二重特異性抗体である。エミシズマブの1つのアームは第IXa因子(FIXa)に特異的であり、第2のアームは第X因子(FX)に特異的である。エミシズマブの抗FIXa重鎖、抗FX重鎖、および共通の軽鎖遺伝子(表22)を誘導性標的化ベクターpINT17-Tetにクローニングすることによって、三シストロン性標的化ベクターを構築した。下流のポリアデニル化(pA)部位を含む共通の軽鎖遺伝子を、pINT17-TetのBglIIおよびNheI制限部位にクローニングした。PDGFR膜貫通ドメインを含む抗FIXa重鎖遺伝子を、pINT17-TetのNcoIおよびHindIII制限部位の間にクローニングした。シグナルペプチド、PDGFR膜貫通ドメイン、およびSV40 pAを含む抗FX重鎖遺伝子を、pINT17-TetのEcoRIおよびBstZ171制限部位の間にクローニングした。最終ベクター(pINT17-Bi-CMV-エミシズマブ)には、AAVS相同性アーム間にコード配列が含まれていた。図51.エミシズマブの抗FIXaおよびVL遺伝子もまた、pINT17-BSD標的化ベクターにクローニングし、単一特異性抗FIXa IgG抗体のディスプレイを可能にした。
二重特異性抗体エミシズマブのHEK293細胞表面ディスプレイを実証するために、pINT17-Bi-CMV-エミシズマブまたはpINT17-BSD-抗FIXaを使用して、上に記載されるようにAAVS TALENをコードするプラスミドの存在下でHEK293細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、抗Fc-APCで抗体ディスプレイについて細胞を分析した(図52)。これは、IgG形式の単一特異性抗FIXaアームまたは二重特異性抗体エミシズマブでトランスフェクトされたHEK293細胞が、細胞表面で検出可能な抗体発現を有したことを示した。しかしながら、「ノブインホール(knobs-in-hole)」重鎖を有する二重特異性エミシズマブの発現は、標準的な単一特異性抗体形式と比較して低減された。Fc変異型のライブラリを創出し、その後哺乳動物ディスプレイによる高レベル発現を選択することにより、Fc変異型を選択して、より効率的な異種重鎖対合および増加された細胞ディスプレイレベルを可能にすることができたと考えられる。この方法では、両方が二重特異性抗体を創出するための異種重鎖対合においてより効率的であるが、また自己凝集の低い傾向を含む優れた開発性特性も有する、新しい抗体CH2もしくはCH3変異型またはCH2およびCH3変異型の組み合わせを選択することができた。Fc変異型ライブラリは、他の分子と交差相互作用する低い傾向についてもスクリーニングすることができた。
表示された二重特異性エミシズマブがその標的抗原に結合する能力も、フローサイトメトリーによって実証した。FIXaおよびFX(Complement Technology Inc)を、化学的にビオチン化した(EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin、ThermoFisher Scientific)。FIXaおよびFXに対するエミシズマブの親和性は比較的低いため(マイクロモル範囲のKD
136)。100nMの抗原複合体濃度で細胞を染色する前に、結合親和力を増大させるために、抗原を四量体ストレプトアビジン-PEで事前に複合体化した。二重特異性エミシズマブを表示するHEK293細胞は、非複合体化ストレプトアビジン-PEと結合せずに、FIXaおよびFXの両方と結合することが示された(図52a)。これは、HEK293細
胞の表面の二重特異性抗体の機能的ディスプレイを実証する。HEK293細胞の表面でのIgG形式の単一特異性抗FIXaアームのディスプレイはまた、FIXaと結合した(図52b)。抗FIXa抗体もまた、FXとの一部の結合を示したが、エミシズマブよりも低いレベルであったが、これは共通の軽鎖またはFXと交差反応する抗FIXa重鎖のいずれかが原因であり得る。
胞の表面の二重特異性抗体の機能的ディスプレイを実証する。HEK293細胞の表面でのIgG形式の単一特異性抗FIXaアームのディスプレイはまた、FIXaと結合した(図52b)。抗FIXa抗体もまた、FXとの一部の結合を示したが、エミシズマブよりも低いレベルであったが、これは共通の軽鎖またはFXと交差反応する抗FIXa重鎖のいずれかが原因であり得る。
実施例6bは、HEK293細胞の表面に提示された抗IL12抗体であるブリアキヌマブおよびウステキヌマブへの硫酸ヘパリンの示差的結合を説明した。ブリアキヌマブは、その可変ドメイン内に正電荷パッチを有し、これは、FcRn22上の負電荷パッチのその結合に寄与する可能性が高い。ブリアキヌマブの正電荷パッチもまた、負電荷の硫酸ヘパリンとのその交差相互作用の原因である可能性が高い。ヘパリン硫酸への抗体の結合は、インビボでの増加された非特異的クリアランスをもたらし、減少された半減期をもたらし得る137、138。したがって、二重特異性分子を含む、抗体または治療用タンパク質のヘパリンへの結合は、所望でない特性である。実施例6bは、ヘパリン硫酸と結合する抗体を区別することが可能であるため、高次真核哺乳動物ディスプレイ選択によってヘパリン硫酸結合タンパク質を分離および排除することが可能であることを実証した。この実施例で提示されたデータから、ヘパリン硫酸と結合するそれらの能力に基づく一連の抗FIXa/抗FX二重特異性抗体の区別の実証を想定することが可能である。
エミシズマブの開発の過程の間、hBS106136という名前の前駆体ヒト化抗体を発見した。この分子は、ヒトIgG4と比較して、急速なクリアランスおよび短いインビボ半減期を有するマウスでは、不十分な薬物動態を有することが見出された。このインビボでの急速なクリアランスは、VHおよびVL抗FIXaアームの正電荷パッチに起因した。正電荷パッチに寄与する共通の軽鎖上のアミノ酸には、VL CDR1内のK24、R27、およびR31、VL CDR2内のR53およびR54、ならびにFW3内のR61が含まれていた(図53)。正電荷パッチに寄与するVHアミノ酸には、R60およびR95が含まれていた。正電荷パッチに寄与するリジンおよびアルギニン残基は、FIXa結合に不可欠なパラトピック残基であった。したがって、負に荷電されたアミノ酸残基(グルタミン酸またはアスパラギン酸)を導入して、正電荷パッチを破壊し、また抗体の等電点(pI)も低下させた。共通の軽鎖への負に荷電されたアミノ酸変化の導入は、マウスのクリアランス率の8倍の低減、および最大インビボ血漿中濃度(Cmax)のほぼ6倍の増加をもたらした。図53は、最終的なエミシズマブVLと比較して3~1個少ない負電荷アミノ酸を有する一連の前駆体VL(US2016/0222129)とのエミシズマブの共通のVL鎖のアラインメントを示す。エミシズマブの親抗体の命名は、エミシズマブに関連している。例えば、クローン:E30Y_E55Y_D93Sは、エミシズマブと比較して、それぞれグルタミン酸、グルタミン酸、およびアスパラギン酸の代わりに30、55、および93位にチロシン、チロシン、およびセリン残基を有する。
エミシズマブ前駆体VL抗FIXa遺伝子(表23)を、pINT17-Bi-CMV-エミシズマブ標的化ベクターにクローニングし、これを使用して上に記載されるようなヒトAAVS TALEN対でHEK293細胞を同時トランスフェクトし、ヌクレアーゼ媒介抗体遺伝子組入れを可能にした。14dpt後、HEK293細胞を、実施例Bに記載されるように、ヘパリン硫酸(FITC標識)および抗Fc-PEで染色することができた。フローサイトメトリー分析は、哺乳動物細胞が、抗FIXaエミシズマブクローンE30Y_K54R_E55Y_D93SおよびE30Y_E55Y_D93Sが抗FIXaエミシズマブおよびE30Y VLクローンと比較してヘパリン硫酸への増強された結合を表示すると表示したことを示す。E30Y_K54R_E55Y_D93SおよびE30Y_E55Y_D93Sクローンは、最も完全な正電荷パッチを有し、これらのクローンは、これらの抗体を表示する細胞への検出可能なヘパリン硫酸結合をもたらす。この実施例は、高次真核生物の哺乳動物ディスプレイを使用して、ヘパリン硫酸と結合す
るそれらの能力に点変異の違いがあるクローンを区別することが可能な方法を示した。これにより、ヘパリン硫酸と結合する錯体ライブラリ内の二重特異性クローンの排除が可能になり、したがって、インビボでの不十分な薬物動態に寄与し得るそれらの可変ドメイン内に正電荷パッチを有するクローンを除去することができるであろう。
るそれらの能力に点変異の違いがあるクローンを区別することが可能な方法を示した。これにより、ヘパリン硫酸と結合する錯体ライブラリ内の二重特異性クローンの排除が可能になり、したがって、インビボでの不十分な薬物動態に寄与し得るそれらの可変ドメイン内に正電荷パッチを有するクローンを除去することができるであろう。
この実施例は、哺乳動物ディスプレイによる二重特異性抗体または代替二重特異性形式のスクリーニングの可能性を例示した。二重特異性発見キャンペーンでスクリーニングする必要のある変異型の数は、単一の標的抗体発見プロジェクトと比較して数桁乗じられる。例えば、エミシズマブの発見キャンペーンでリード開始分子を特定するために、200個の抗FIXa抗体を、200個の抗FX抗体を交差させて、40,000個の二重特異性分子を創出し、次いで困難なプレートベースのスクリーニングによりスクリーニングした。次いで、リード二重特異性分子は、可変ドメインの正電荷パッチ136の破壊による硫酸ヘパリンとの交差相互作用の低減に関して、ヒト化、親和性および特異性の最適化、および開発性の向上を含むいくつかの反復を行わなければならなかった。標的(複数可)に対する親和性、特異性、ディスプレイレベル(自己凝集する低い傾向をスクリーニングする)、および交差相互作用を含む哺乳動物ディスプレイにより、数百万の二重特異性抗体クローンに対して多次元FACSを行う能力は、より大きなスクリーニング深度で、より多くのクローンに対するより速く、より効率的な二重特異性抗体スクリーニングプロセスを可能にする。
実施例15.表面掲示レベルに基づくノットボディの開発性の選択
実施例14は、「ノブインホール」二重特異性抗体エミシズマブをHEK293細胞の
表面に表示することが可能であることを実証した。二重特異性分子はまた、抗体の重鎖または軽鎖へのポリペプチドの融合、または重鎖もしくは軽鎖のエンジニアリングによって創出され、新規の結合特異性を付与することができる133。哺乳動物細胞の表面に二重特異性分子を表示する能力は、上に記載されるように良好に動作する生物物理学的特性を有する二重特異性分子の選択と組み合わせて、両方の標的への結合のスクリーニングを可能にする。ノットボディは、システインリッチペプチド(ノッチン)が抗体ドメイン(WO2017/118761)の末梢CDRループに組み込まれ、VHまたはVLドメインが同じ抗原または異なる抗原の2番目のエピトープと結合するために利用可能である新規の抗体融合形式である。この実施例の目的は、哺乳動物ディスプレイ技術が、それらの自己相互作用および多反応性特性に関して異なる特性を有するノットボディを区別および分離する能力を実証することであった。
実施例14は、「ノブインホール」二重特異性抗体エミシズマブをHEK293細胞の
表面に表示することが可能であることを実証した。二重特異性分子はまた、抗体の重鎖または軽鎖へのポリペプチドの融合、または重鎖もしくは軽鎖のエンジニアリングによって創出され、新規の結合特異性を付与することができる133。哺乳動物細胞の表面に二重特異性分子を表示する能力は、上に記載されるように良好に動作する生物物理学的特性を有する二重特異性分子の選択と組み合わせて、両方の標的への結合のスクリーニングを可能にする。ノットボディは、システインリッチペプチド(ノッチン)が抗体ドメイン(WO2017/118761)の末梢CDRループに組み込まれ、VHまたはVLドメインが同じ抗原または異なる抗原の2番目のエピトープと結合するために利用可能である新規の抗体融合形式である。この実施例の目的は、哺乳動物ディスプレイ技術が、それらの自己相互作用および多反応性特性に関して異なる特性を有するノットボディを区別および分離する能力を実証することであった。
ノットボディの特許WO2017/118761は、トリプシン結合ノッチンEETI-IIを抗体のVL CDR2位置に挿入することによる2つのトリプシン結合ノットボディ(KB_A07およびKB_A12)の生成について説明する。この実施例で試験されたノットボディは、KB_A12 ProTx-III 2M(以後、KB_A12 ProTx-IIIと称される)およびKB_A12 HsTx1であった。これらのノットボディを、KB_A12ノットボディのVL CDR2位置にあるEETI-IIノッチンを、イオンチャネルブロッキングノッチンまたは毒素ペプチドProTx-III
2M(2018年7月11日出願のPCT/EP2018/068855)およびHsTxI(2018年7月11日出願のPCT/EP2018/068856)で置き換えることによって創出した。KB_A12 EETI-II、KB_A12 ProTx-III、およびKB_A12 HsTx1のVL配列を表24に示す。
2M(2018年7月11日出願のPCT/EP2018/068855)およびHsTxI(2018年7月11日出願のPCT/EP2018/068856)で置き換えることによって創出した。KB_A12 EETI-II、KB_A12 ProTx-III、およびKB_A12 HsTx1のVL配列を表24に示す。
ノットボディKB_A12 EETI-II、ProTx-III、およびHsTxIをコードする遺伝子を、標的化ベクターpINT17-BSDにクローニングし、これを使用して、上に記載されるようにHEK293細胞へのヌクレアーゼ媒介遺伝子組入れによって安定した細胞株を創出した。図54aは、HEK293細胞の表面のKB_A12
EETI-IIのディスプレイレベルが、KB_A12 ProTx-IIIまたはKB_A12 HsTxIよりも高かったことを示す。HEK293細胞の表面に比較的低レベルで表示されたKB_A12 ProTx-IIIまたはKB_A12 HsTxIと、Fc発現に対する細胞カウントのフローサイトメトリーヒストグラムプロット(図54a)は同等である。ノットボディを、Expi293細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、プロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製し、HPLC
-SECによって分析した。図54bは、KB_A12 EETI-IIが、良好に動作する抗HER2抗体であるトラスツズマブと同等の保持時間および体積を有する単量体ピークを表示したことを示す(図54c)。対照的に、KB_A12 ProTx-IIIは、より早い保持時間によって示されるように二量体および多量体の形成の証拠を例示した(図54d)。トラスツズマブおよびKB_A12 EETI-IIと比較してKB_A12 ProTx-IIIのより大きな溶出量は、KB_A12 ProTx-III異種多量体および凝集体形成の証拠である。KB_A12 ProTx-IIIおよびKB_A12 HsTxIは、KB_A12 ProTx-IIIおよびKB_A12 HsTxIがKB_A12 EETI-IIと比較してより長いAC-SINS波長シフトを表示したAC-SINSアッセイでのKB_A12 EETI-IIと比較して自己相互作用する増加された傾向も表示した(表25)39。したがって、以前にIgGディスプレイで見られたように、ノットボディの高次真核細胞ディスプレイレベルと、自己相互作用および凝集する傾向のそれらの生物物理学的特性との間には関係がある。ノットボディは二重特異性抗体の例であり、したがって、高次真核生物細胞ディスプレイレベルと、表示された分子の生物物理学的特性との間のこの関係は、代替的な二重特異性モダリティに移行する可能性が高い129。
EETI-IIのディスプレイレベルが、KB_A12 ProTx-IIIまたはKB_A12 HsTxIよりも高かったことを示す。HEK293細胞の表面に比較的低レベルで表示されたKB_A12 ProTx-IIIまたはKB_A12 HsTxIと、Fc発現に対する細胞カウントのフローサイトメトリーヒストグラムプロット(図54a)は同等である。ノットボディを、Expi293細胞の一過性トランスフェクションによって発現させ、プロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製し、HPLC
-SECによって分析した。図54bは、KB_A12 EETI-IIが、良好に動作する抗HER2抗体であるトラスツズマブと同等の保持時間および体積を有する単量体ピークを表示したことを示す(図54c)。対照的に、KB_A12 ProTx-IIIは、より早い保持時間によって示されるように二量体および多量体の形成の証拠を例示した(図54d)。トラスツズマブおよびKB_A12 EETI-IIと比較してKB_A12 ProTx-IIIのより大きな溶出量は、KB_A12 ProTx-III異種多量体および凝集体形成の証拠である。KB_A12 ProTx-IIIおよびKB_A12 HsTxIは、KB_A12 ProTx-IIIおよびKB_A12 HsTxIがKB_A12 EETI-IIと比較してより長いAC-SINS波長シフトを表示したAC-SINSアッセイでのKB_A12 EETI-IIと比較して自己相互作用する増加された傾向も表示した(表25)39。したがって、以前にIgGディスプレイで見られたように、ノットボディの高次真核細胞ディスプレイレベルと、自己相互作用および凝集する傾向のそれらの生物物理学的特性との間には関係がある。ノットボディは二重特異性抗体の例であり、したがって、高次真核生物細胞ディスプレイレベルと、表示された分子の生物物理学的特性との間のこの関係は、代替的な二重特異性モダリティに移行する可能性が高い129。
これらのノットボディの生物物理学的特性を改善するために、3つのノットボディ哺乳動物ライブラリを、ノッチン配列の疎水性残基または正に荷電された残基の標的化された変異誘発によって創出した。各ノッチンの標的化された変異誘発のための疎水性残基または正に荷電された残基は、太字および下線で強調されている(以下を参照されたい)。これらの残基を、VNSコドン(アミノ酸配列ではXとして表される)またはNSGコドン(アミノ酸配列ではZとして表される)をコードするプライマーを使用して変異させた。VNSコドン(V=A/C/G、N=A/G/C/T、およびS=G/C)は、23個のコドンの組み合わせから16個のアミノ酸(システイン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、および停止コドンを除く)をコードするが、一方でNSGコドン(N=A/G/C/TおよびS=G/C)は、8個のコドンの組み合わせから7個のアミノ酸(アルギニン、トリプトファン、グリシン、スレオニン、セリン、アラニン、およびプロリン)をコードする。NSGコドンを、野生型トリプトファン残基がイオンチャネルへの結合接触に関与し得る位置で使用する。
ライブラリを、ノットボディVL遺伝子の2断片アセンブリPCRによって生成した。各ライブラリの個々の断片を、表26に記載されているプライマーおよびテンプレートを使用して増幅した。各ライブラリに対応する増幅された断片を、プライマーpINT BM40リードフォワードおよびpINT CLambda非リバースを使用して組み立てた。すべてのプライマー配列が表27に示される。組み立てられたPCR断片を、NheIおよびNotI制限酵素を使用して消化し、D1A12またはD12 VH(WO2017/118761に記載されている、ノットボディ構築物に使用される重鎖)をコードするpINT17-ブラストサイジンベクターにライゲーションした。ライゲーション産物を、MinElute PCR精製キット(Qiagen、カタログ番号28004)を使用して精製した。3x2.5μlの精製されたライゲーション混合を、3x50μlのE.coli細胞(E.cloni 10G Supreme、Lucigen、カタログ番号60080-2)に電気穿孔した。簡潔には、50μlの細胞を、0.1cmのキュベットを使用してパルスし、2mlの回収培地で回収し、37℃、250rpmで1時間増殖させ、希釈播種によってライブラリサイズを推定した。KB_A12 ProTx-IIIセットA、KB_A12 ProTx-IIIセットB、およびKB_A12
HsTx1ライブラリについて得られたライブラリサイズは、それぞれ9×107、7×107、および2×107であった。哺乳動物ディスプレイライブラリを創出するために、製造業者の指示に従ってMacherey Nagel Midiプレップキット(Macherey Nagel、カタログ番号740410.10)を使用して、これらのライブラリストックからトランスフェクション品質のDNAを調製した。
HsTx1ライブラリについて得られたライブラリサイズは、それぞれ9×107、7×107、および2×107であった。哺乳動物ディスプレイライブラリを創出するために、製造業者の指示に従ってMacherey Nagel Midiプレップキット(Macherey Nagel、カタログ番号740410.10)を使用して、これらのライブラリストックからトランスフェクション品質のDNAを調製した。
各ライブラリのDNAを、MaxCyte STXG2を使用して、懸濁液適合HEK293F細胞に電気穿孔した(実施例5を参照されたい)。同様に、野生型KB_A12
ProTx-IIIおよびKB_A12 HsTx1構築物をクローニングし、対照としてHEK293F細胞に電気穿孔した。各ライブラリには100百万個の細胞を使用し、各対照構築物には10百万個の細胞を使用した。トランスフェクションの2日後、抗生物質のブラストサイジンS HCl(LifeTech、カタログ番号R21001)を7.5μg/mlの濃度で添加した。細胞を三角フラスコに1mlあたり0.25×106個の細胞で播種した。遺伝子組入れ効率を計算するために、実施例5に記載されるように、細胞を10cmディッシュに播種した。組入れ効率は、KB_A12 ProTx-IIIライブラリセットA、KB_A12 ProTx-IIIライブラリセットB、お
よびKB_A12 HsTx1ライブラリで、それぞれ3%、2.5%、および2%であると計算した。したがって、1億回の細胞トランスフェクションを達成したライブラリサイズは、それぞれ、3×106、2.5×106、および2×106であった。ブラストサイジンS HCl(LifeTech、カタログ番号R21001)選択の5日後、実施例5に記載されるように、抗Fc MACSビーズを使用して細胞を富化した。選択の14日後、ノットボディの発現レベルについてフローサイトメトリーによってライブラリを分析した。図55に示されるように、3つすべてのノットボディライブラリは、HEK293細胞に表示された親ノットボディと比較して、改善された平均発現レベルを表示した。これは、親ノットボディ分子と比較して改善された生物物理学的特性を有するノットボディ変形型が生成されている証拠を提供する。
ProTx-IIIおよびKB_A12 HsTx1構築物をクローニングし、対照としてHEK293F細胞に電気穿孔した。各ライブラリには100百万個の細胞を使用し、各対照構築物には10百万個の細胞を使用した。トランスフェクションの2日後、抗生物質のブラストサイジンS HCl(LifeTech、カタログ番号R21001)を7.5μg/mlの濃度で添加した。細胞を三角フラスコに1mlあたり0.25×106個の細胞で播種した。遺伝子組入れ効率を計算するために、実施例5に記載されるように、細胞を10cmディッシュに播種した。組入れ効率は、KB_A12 ProTx-IIIライブラリセットA、KB_A12 ProTx-IIIライブラリセットB、お
よびKB_A12 HsTx1ライブラリで、それぞれ3%、2.5%、および2%であると計算した。したがって、1億回の細胞トランスフェクションを達成したライブラリサイズは、それぞれ、3×106、2.5×106、および2×106であった。ブラストサイジンS HCl(LifeTech、カタログ番号R21001)選択の5日後、実施例5に記載されるように、抗Fc MACSビーズを使用して細胞を富化した。選択の14日後、ノットボディの発現レベルについてフローサイトメトリーによってライブラリを分析した。図55に示されるように、3つすべてのノットボディライブラリは、HEK293細胞に表示された親ノットボディと比較して、改善された平均発現レベルを表示した。これは、親ノットボディ分子と比較して改善された生物物理学的特性を有するノットボディ変形型が生成されている証拠を提供する。
次いで、BioRad S3e細胞選別機を使用してノットボディライブラリでFACSを実施した。MACSにより選別された集団の30×106個の細胞を(以前のように)抗ヒトFc PE(1×106個の細胞あたり1μl)(Cambridge Bioscience、カタログ番号409304)とともにインキュベートした。ゲートを、3つのライブラリの高いFc発現のヒストグラムプロットに描画した。これには、KB_A12 ProTxIIIセットAライブラリのゲーティングされたセ細胞8.16%が必要であったが、対照KB_A12 ProTxIIIの0.15%がこの領域で見出された。KB_A12 ProTxIIIセットBライブラリのゲーティングされた細胞の7.25%を採取したが、対照の0.10%がこの領域で見出された。KB_A12 HsTxIライブラリの12.6%を採取したが、KB_A12 HsTxI対照の0.03%がこの領域で見出された。各集団の0.5×106個の細胞をゲノムDNA抽出のために採取した。IgGをコードするDNAを、実施例4に記載されるように、KODホットスタートDNAポリメラーゼ(Merck Millipore)を使用するネステッドPCRによって増幅した。PCR産物をゲル精製し、NheIおよびXhoIで消化し、pINT3哺乳動物発現ベクターにクローニングし、E.coli DH10B細胞を形質転換するために使用した。
哺乳動物細胞ディスプレイ変異体ライブラリが創出され、次いでそれを表面ディスプレイレベルに基づいて選択した実施例4および5に記載されるものと同じ方法に従うことにより、個々のノットボディクローンを、それらの親分子と比較して改善された生物物理学的特性により特定する。したがって、この実施例は、ノットボディまたは任意の代替的な二重特異性形式の生物物理学的特性を改善するための高次真核生物の哺乳動物ディスプレイの有用性について説明した。ここで説明される方法は、多重パラメータFACSを使用して、高ディスプレイレベルおよび標的分子への特異的結合の両方を選択することができるノットボディまたは二重特異性発見プロジェクト中にも行うことができた。
Claims (90)
- インビトロでの培養高等真核細胞上の結合剤の表面提示レベルの、溶液中の前記結合剤の溶解度および/またはそれらの自己会合に対する耐性の予測指標としての使用。
- 前記培養細胞が、結合剤の多様なレパートリーを発現するディスプレイライブラリのクローンである、請求項1に記載の使用。
- 溶液中のより高い溶解度および/または自己会合のより低い傾向について結合剤をインビトロで選択するための高等真核細胞の培養ライブラリの使用であって、
前記ライブラリが、各々結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリであり、前記コードされた結合剤が、前記細胞表面に提示される、使用。 - ディスプレイライブラリの培養高等真核細胞クローンの表面における前記結合剤の表面提示レベルが、溶液中の前記結合剤の溶解度および/または自己会合に対するそれらの耐性の予測指標として使用される、結合剤発見方法。
- 結合剤を、それらの溶液中の溶解度および/または自己会合に対する耐性に従って区別およびランク付けし、溶液中でより高い溶解度および/または自己会合に対するより高い耐性を呈する結合剤を富化する方法であって、
(i)各々が結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
(ii)前記結合剤が前記細胞表面に提示される、前記結合剤の発現のための条件下で、前記クローンをインビトロで培養することと、
(iii)前記クローン上での前記結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により前記結合剤を標識することにより決定することと、
(iv)他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する1つ以上のクローンを選択することと、
(v)前記1つ以上の選択されたクローンによりコードされる結合剤を、溶液中の溶解度および/または自己会合に対する耐性が良好であるものとして特定することと、任意選択で、前記選択されたクローンを、1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するために提供することと、を含む、方法。 - 前記結合剤が膜貫通ドメイン含有ポリペプチドである、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用または請求項4もしくは請求項5に記載の方法。
- 前記クローン上での前記結合剤の表面提示レベルを、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により前記結合剤を標識することにより決定することを含み、前記薬剤が前記結合剤の定常領域に結合し、任意選択で、前記結合剤がFc領域を含み、前記薬剤が前記Fc領域に結合する、請求項4または請求項5に記載の方法。
- 細胞を、前記細胞上の結合剤の前記表面提示のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別し、それにより、所定の閾値を上回る表面提示を示す細胞が前記収集画分に選別され、前記所定の閾値を下回る表面提示を示す細胞が廃棄画分に選別される、請求項4~7のいずれか一項に記載の方法。
- 廃棄画分が、少なくとも10mg/mlの臨界濃度を有する比較ポリペプチドを発現する細胞を含み、前記収集画分が、前記廃棄画分中の前記比較ポリペプチドよりも少なくとも1.5倍高い臨界濃度を有する結合剤を発現する細胞を含む、請求項8に記載の方法。
- 選別が蛍光活性化細胞選別機(FACS)により行われる、請求項8または請求項9に記載の方法。
- ステップ(ii)が、前記ライブラリの前記クローンを1つの容器内で混合物として培養することを含む、請求項4~10のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(ii)が、前記ライブラリの各クローンを別個の容器内で培養することを含む、請求項4~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合剤が親結合剤の配列変異型である、請求項4~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親結合剤が、溶液中の溶解度または自己会合に対する耐性の改善が必要であると特定されている、請求項13に記載の方法。
- 前記方法が、前記親結合剤の配列変異型を生成することと、前記配列変異型をコードするDNAを高等真核細胞の細胞DNAに組み入れて、前記結合剤をコードするDNAを含む細胞クローンのライブラリを提供することと、を含み、
任意選択で、前記方法が、前記親の前記ポリペプチド配列を分析することと、自己会合を促進し、かつ/または溶解度を低下させることが予測される1つ以上のアミノ酸残基を特定することと、前記1つ以上のアミノ酸残基において変異を生成することと、を含む、請求項13または請求項14に記載の方法。 - 前記親結合剤が、リン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)中50mg/ml未満の臨界濃度を有し、かつ/またはリン酸緩衝生理食塩溶液(PBS)中50mg/ml未満の溶解限度を有し、
かつ/または前記方法が、前記1つ以上の選択されたクローンによりコードされた結合剤を、前記親結合剤のものよりも少なくとも1.5倍高い臨界濃度および/もしくは溶解限度を有すると特定することを含む、請求項13~15のいずれか一項に記載の方法。 - 結合剤の親水性を、前記細胞クローン上のそれらの表面提示レベルに基づいて予測すること、および/または1つ以上の選択されたクローンの結合剤を、より親水性であると特定することを含む、請求項4~16のいずれか一項に記載の方法。
- 結合剤を示す高等真核細胞のライブラリをスクリーニングして、インビボで哺乳動物において1つ以上の非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現する細胞についてライブラリを富化するインビトロの方法であって、
(i)各々が結合剤をコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、
(ii)前記結合剤が前記細胞表面に提示される、前記結合剤の発現のための条件下で、前記クローンをインビトロで培養することと、
(iii)前記結合剤を前記1つ以上の非標的分子に露出させて、前記結合剤と1つ以上の非標的分子との結合を可能にすることと、
(iv)前記1つ以上の非標的分子への結合がより大きい細胞を廃棄することと、
(v)前記1つ以上の非標的分子への結合が小さい細胞を選択し、前記非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための前記選択された集団を提供することと、を含む、方法。 - (iii)前記結合剤を、前記1つ以上の非標的分子を含むマトリックスに露出させて、前記マトリックスへの結合を可能にすることと、
(iv)前記マトリックスへの結合がより大きい細胞を廃棄することと、
(v)前記マトリックスへの結合が小さい細胞を選択し、前記非標的分子に結合する傾向が低い結合剤を発現するクローンについて富化された選択された細胞の集団を提供することと、任意選択で、
1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための前記選択された集団を提供することと、を含む、請求項18に記載の方法。 - 前記非標的分子が、DNA、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、シャンペロンタンパク質、ヒアルロン酸、またはグリコカリックスの1つ以上の構成要素を含む、請求項18または請求項19に記載の方法。
- 前記非標的分子への結合が、低親和性非特異的結合である、請求項18~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライブラリの前記クローンを1つの容器内の混合物として培養し、前記混合物を前記マトリックスに露出させることを含む、請求項18~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライブラリの各クローンを別個の容器内で培養することを含む、請求項18~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合剤が親結合剤の配列変異型である、請求項18~23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親結合剤が、1つ以上の非標的分子への結合の減少を必要とすると特定されている、請求項24に記載の方法。
- 前記方法が、前記親結合剤の配列変異型を生成することと、前記配列変異型をコードするDNAを高等真核細胞の細胞DNAに組み入れて、前記結合剤をコードするDNAを含む細胞クローンのライブラリを提供することと、を含み、
任意選択で、前記方法が、前記親の前記ポリペプチド配列を分析することと、非特異的結合を促進することが予測される1つ以上のアミノ酸残基を特定することと、前記1つ以上のアミノ酸残基において変異を生成することと、を含む、請求項24または請求項25に記載の方法。 - 前記親結合剤が、1つ以上の非標的分子への顕著な結合を呈する、請求項24~26のいずれか一項に記載の方法。
- (iii)前記結合剤を、前記1つ以上の非標的分子を提示する細胞またはビーズに露出させることを含む、請求項18~27のいずれか一項に記載の方法。
- 結合剤発現細胞と前記1つ以上の非標的分子を提示する前記細胞またはビーズとの相互作用を検出することを含む、請求項28に記載の方法。
- AC-SINSを使用して粒子間距離を検出し、より大きい粒子間距離を呈する細胞により提示される結合剤を選択することを含む、請求項29に記載の方法。
- 前記1つ以上の非標的分子が検出可能に標識される、請求項18に記載の方法。
- 前記1つ以上の非標的分子が蛍光標識される、請求項31に記載の方法。
- 細胞を、前記1つ以上の非標的分子への結合レベルに従って、FACSにより収集画分と廃棄とに流動選別し、それにより、前記所定の閾値を上回る前記標識された非標的分子からの蛍光を示す細胞が前記収集画分に選別され、前記所定の閾値を下回る前記標識された非標的分子からの蛍光を示す細胞が前記廃棄画分に選別される、請求項32に記載の方法。
- 前記結合剤をコードする前記DNAの発現が、強力なプロモーターの制御下にある、請求項4~33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項34に記載の方法。
- 前記プロモーターがCMVプロモーターである、請求項35に記載の方法。
- 前記プロモーターが、発現が最大限に誘導された誘導性プロモーターである、請求項34に記載の方法。
- 請求項5~17のいずれかに記載の方法を後に行うことをさらに含む、請求項18~37のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項5~17のいずれかに記載の方法を最初に行うことをさらに含む、請求項18~37のいずれか一項に記載の方法。
- 標的に1つ以上の結合剤を選択する方法であって、
請求項5~39のいずれか一項に定義の方法を行うことを含み、
同種結合剤による前記標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞が前記標的に結合した状態にするために、前記結合剤を前記標的に露出させることと、
同種結合剤を示す1つ以上のクローンを選択することと、をさらに含む、方法。 - (i)前記結合剤の表面提示レベルと前記結合剤による標的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して表面提示がより高い同種結合剤を示すクローンを同時選択すること、または
(ii)前記結合剤の表面提示レベルと非標的分子への非特異的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して、表面提示がより高く、非特異的結合がより小さい結合剤を示すクローンを同時選択すること、または
(iii)標的結合のレベルと前記結合剤による非標的分子への非特異的結合のレベルとを同時に決定し、他のクローンと比較して非特異的結合がより小さい同種結合剤を示すクローンを同時選択すること、を含む、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。 - 所望の親和性を有する標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
(a)結合剤をコードするDNAを各々含む高等真核細胞クローンのインビトロのライブラリを提供することであって、前記結合剤が前記細胞表面に提示され、前記コードされた結合剤が、活性の弱いプロモーターから発現され、かつ/または細胞あたり100~60,000個の範囲のコピー数で前記細胞表面に発現される、提供することと、
(b)同種結合剤による前記標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を前記標的に結合した状態にするために、前記ライブラリを前記標的に露出させることと、
(c)前記標的に結合した細胞を単離して、同種結合剤を示す細胞が富化された、選択さ
れた細胞の集団を提供することと、任意選択で、
(d)前記選択された細胞の集団を前記標的における1回以上の選択に露出させることであって、任意選択で、前記標的の濃度を低下させて選択の厳密性を増加させる、露出させることと、任意選択で
(e)前記標的に対する前記所望の親和性を有する同種結合剤を示す1つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。 - 同種結合剤を示す細胞が富化された前記選択された細胞の集団を提供することと、その後、
高等真核細胞クローンのインビトロライブラリ内の活性の強いプロモーターの制御下にある前記選択された細胞の集団からの結合剤コードDNAを提供することと、
請求項5~17のいずれか一項に記載の方法を行うことと、を含む、請求項42に記載の方法。 - 請求項5~17のいずれか一項に定義の方法を行って、結合剤の表面提示がより高い選択されたクローンを提供することと、その後、
結合剤をコードするDNAを各々含む高等真核細胞クローンのインビトロライブラリ中の活性の弱いプロモーターから前記結合剤を発現させることと、その後、
請求項42に記載の方法を行うことと、を含む、請求項42に記載の方法。 - 標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
(i)結合剤をコードするDNAを各々含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することであって、前記結合剤の発現が、前記細胞表面における提示のための誘導性プロモーターの制御下にある、提供することと、
(ii)前記ライブラリの細胞を、前記誘導性プロモーターの活性が弱い条件下で培養することと、
(iii)前記ライブラリを前記標的に露出させ、同種結合剤による前記標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を前記標的に結合した状態にすることと、
(iv)同種結合剤を示す細胞を選択することで、選択された細胞の集団を提供することと、
(v)前記選択された細胞の集団を、前記誘導性プロモーターからの結合剤の増加した発現のための条件下で培養することと、
(vi)前記複数のクローン上での前記結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により前記結合剤を標識することにより決定することと、
(vii)他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈する1つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。 - 標的を認識する結合剤を特定する方法であって、
(i)結合剤をコードするDNAを各々含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することであって、前記結合剤の発現が、前記細胞表面における提示のための誘導性プロモーターの制御下にある、提供することと、
(ii)前記ライブラリを、前記誘導性プロモーターからの結合剤の強力な発現のための条件下で培養することと、
(iii)前記複数のクローン上での前記結合剤の表面提示レベルを、任意選択で、検出可能な(例えば、蛍光)標識が組み込まれた薬剤により前記結合剤を標識することにより決定することと、
(iv)他のクローンと比較してより高い結合剤の表面提示を呈するクローンの集団を選択することと、
(v)前記選択された集団を、前記誘導性プロモーターからの結合剤の弱い発現のための
条件下で培養することと、
(vii)前記ライブラリを前記標的に露出させ、同種結合剤による前記標的の認識を可能にすることで、同種結合剤を示す細胞を前記標的に結合した状態にすることと、
(iv)同種結合剤を示す1つ以上のクローンを選択することと、を含む、方法。 - 前記プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項42~46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的が、蛍光標識などの検出可能な薬剤で標識される、請求項42~47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、細胞を、前記細胞上の結合した標的のレベルに従って、収集画分と廃棄画分とに選別することを含み、それにより、所定の閾値を上回る結合した標的を示す細胞が前記収集画分に選別され、前記所定の閾値を下回る結合した標的を示す細胞が廃棄画分に選別される、請求項48に記載の方法。
- 選別が蛍光活性化細胞選別機(FACS)により行われる、請求項49に記載の方法。
- 前記1つ以上の選択されたクローンから、前記結合剤をコードする前記DNAの配列を決定することと、
前記結合剤をコードする単離された核酸を提供することと、を含む、請求項5~50のいずれか一項に記載の方法。 - 前記1つ以上の選択されたクローンから、前記結合剤をコードする前記DNAの配列を決定することと、
前記結合剤の可溶形態における分泌のための条件下、インビトロで、宿主細胞において、前記結合剤をコードするDNAを発現させることと、をさらに含む、請求項5~51のいずれか一項に記載の方法。 - 前記分泌された結合剤が、少なくとも1mg/mlの収量で得られる、請求項52に記載の方法。
- 前記結合剤を精製および/または濃縮して、前記結合剤の水溶液を少なくとも10mg/mlの濃度で得ることをさらに含む、請求項52または請求項53に記載の方法。
- 前記濃度が少なくとも50mg/mlである、請求項54に記載の方法。
- 前記濃度が少なくとも100mg/mlである、請求項55に記載の方法。
- 薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に前記結合剤を製剤化することを含む、請求項52~56のいずれか一項に記載の方法。
- 任意選択で針および/または注射による前記組成物の投与に関する指示を含む製品情報案内書などの1つ以上の追加の構成要素を含むキットにおいて、前記組成物を注射用の充填済みシリンジ中で提供することを含む、請求項57に記載の方法。
- FcRnと相互作用する結合剤を特定する方法であって、
Fcドメインを有する異なる結合剤をコードするDNAを各々含む複数の高等真核細胞クローンを提供することと、
細胞表面上に前記結合剤を提示するための条件下でインビトロでクローンを培養するこ
とと、
前記クローンを約pH6.0および約pH7.4でFcRn受容体に露出させて、前記FcドメインによるFcRnの認識を可能にすることと、
約pH7.4の場合と比較して約pH6.0でより高い親和性結合を呈する結合剤、約pH7.4の場合と比較して約pH6.0でより低い親和性結合を呈する結合剤、または約pH7.4の場合と比較して約pH6.0でほぼ同じ親和性結合を呈する結合剤、を発現する1つ以上のクローンを選択することと、
任意選択で、1つ以上のさらなるスクリーニングステップに使用するための前記選択されたクローンを提供することと、を含む、方法。 - 約pH7.4の場合と比較して約pH6.0でより高い親和性結合を呈する結合剤を発現する1つ以上のクローンを選択することと、前記1つ以上の選択されたクローンによりコードされる前記結合剤を、インビボでの半減期が延長したものと特定することと、を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記結合剤が、配列多様性を呈する可変ドメインを、任意選択で1つ以上の相補性決定領域に含む、請求項59または請求項60に記載の方法。
- 前記結合剤が、配列多様性を呈するFc領域を、任意選択でそれらのCH3ドメインに含む、請求項59~61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合剤の前記Fc領域が、配列多様性を呈しない、請求項59~61のいずれか一項に記載の方法。
- 実質的に本明細書に記載され、かつ/あるいは請求項1~63のいずれか一項に記載の方法により特定または選択される、クローン、クローンによる発現される結合剤、または前記結合剤をコードする核酸。
- 結合剤をコードするDNAを各々含む高等真核細胞クローンのインビトロライブラリであって、前記コードDNAが、任意選択で、前記細胞DNA中の決まった遺伝子座にあり、前記コードされた結合剤が、細胞あたり100~1000個の範囲のコピー数で前記細胞表面に発現される、ライブラリ。
- 標的に対する結合剤の親和性に基づく選択のための請求項65に定義のライブラリの使用。
- 結合剤のレパートリーをコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのインビトロのディスプレイライブラリであって、結合剤の発現が、前記細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、ディスプレイライブラリ。
- 結合剤のレパートリーをコードするDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを作製する方法であって、
前記結合剤をコードするドナーDNA分子、および高等真核細胞を提供することと、
前記ドナーDNAを前記細胞に導入することにより、ドナーDNAが前記細胞DNAに組み入れられた組換え細胞を創出することであって、
前記結合剤の発現が、前記細胞表面における提示のためのテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にある、創出することと、
前記組換え細胞を培養して、クローンを産生させて、
それにより、前記結合剤のレパートリーをコードするドナーDNAを含む高等真核細胞クローンのライブラリを提供することと、を含む、方法。 - 前記組換え細胞が、前記ドナーDNAを前記細胞に導入すること、および前記細胞内に部位特異的ヌクレアーゼを提供することにより創出され、前記ヌクレアーゼが、細胞DNA中の認識配列を切断し、前記ドナーDNAが前記細胞DNAに組み入れられる組入れ部位を創出し、組入れが前記細胞の内部のDNA修復機序を通して生じる、請求項68に記載の方法。
- テトラサイクリン誘導性プロモーターからのドナーDNAの発現を誘導することと、前記細胞を、前記結合剤の発現のための条件下で培養し、前記細胞表面における結合剤の提示を得ることと、をさらに含む、請求項68または請求項69に記載の方法。
- 前記ライブラリを、請求項1~70のいずれか一項に定義の方法または使用において使用することをさらに含む、請求項69または請求項70に記載の方法。
- 前記高等真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項1~71のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞株またはCHO細胞株である、請求項1~72のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記高等真核細胞が懸濁培養中にある、請求項1~73のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記結合剤をコードするDNAが、前記細胞DNA中の決まった遺伝子座で組み入れられる、請求項1~74のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記結合剤が抗体である、請求項1~75のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記抗体が全長免疫グロブリンである、請求項76に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記抗体がIgGである、請求項77に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記抗体が、膜貫通ドメインに融合した重鎖と軽鎖とを含む、請求項76~78のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記結合剤が、融合タンパク質であって、レシピエント多様性骨格ドメインに挿入されたドナー多様性骨格ドメインを含み、任意選択で、前記融合タンパク質と関連するパートナードメインを含む、融合タンパク質であり、
前記ドナー多様性骨格ドメインが、ドナー骨格とドナー相互作用配列とを含み、前記レシピエント多様性骨格ドメインが、レシピエント骨格とレシピエント相互作用配列とを含む、請求項1~79のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。 - 前記融合タンパク質が、抗体可変ドメインに挿入されたシステインリッチペプチドを含むノットボディである、請求項80に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記ノットボディが、膜貫通ドメインに融合した抗体重鎖と抗体軽鎖とを含む、請求項81に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記結合剤が、配列多様性を呈する抗体可変ドメインを、任意選択で1つ以上の相補性決定領域に含む、請求項1~82のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記結合剤が、配列多様性を呈するFc領域を、任意選択でそれらのCH3ドメインに含む、請求項1~83のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記結合剤が、第1の標的のための第1の結合部位と、第2の標的のための第2の結合部位とを含む、多重特異性である、請求項1~84のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記ライブラリが、少なくとも103個のクローンを含む、請求項1~85のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記ライブラリがナイーブライブラリである、請求項1~86のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記ライブラリの前記クローンが、選択された標的への結合について事前選択されている、請求項1~86のいずれか一項に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記標的がヒトポリペプチドである、請求項88に記載の使用、方法、またはライブラリ。
- 前記ライブラリの前記クローンが、2つの異なる標的への二重特異性結合について事前選択されている、請求項88または請求項89に記載の使用、方法、またはライブラリ。
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