CN107922950B - T细胞受体文库 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表达所有功能性TCR类型的文库，该文库包含各自编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体，其中编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含以下结构单元：可变AV段AVseg1至AVseg45之一和恒定AC段，并且其中编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含：可变BV段BVseg1到BVseg47之一和恒定BC段。

Description

T细胞受体文库
技术领域
本发明涉及表达所有功能性TCR类型的文库，该文库包含各自编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体。此外，本发明涉及用于表达TCR的表达系统。另外，本发明涉及表达TCR的细胞克隆文库。此外，本发明涉及TCR蛋白质文库。
背景技术
每个T细胞受体是由一种TCRα链和一种TCRβ链组成的异源二聚体蛋白复合物。TCR异源二聚体与CD3复合物联合在T细胞的细胞表面上表达，该CD3复合物由作为TCR的信号传导装置的一系列非多态性蛋白质组成。在分子水平上，在早期T细胞发育过程中，由大量生殖系编码的基因片段随机组装TCRα链和TCRβ链。在称作为V(D)J重组的过程中，由一种多态可变(AV)和连接(AJ)基因片段与单态恒定(AC)区结合而对TCRα链进行组装。TCRβ链的重组部分由一种BV和BJ片段与其它分散的多样化(BD)基因片段组成。在基因片段重排过程中，顺带对与连接区相邻的生殖系编码的序列进行了修饰。所得到的覆盖各个V(D)J片段连接体的高变序列被已知为CDR3区(互补决定区3)，该CDR3区随后决定了TCR对加载肽的MHC分子上的特异性表位的识别。
由于异源二聚体蛋白的表达与CD3联合，因此天然TCR是高度构象依赖性的结构。
TCR基因转移是产生用于过继治疗的抗原特异性T细胞的便利方法。因此，需要用于产生治疗性TCR的有效工具。仅需要对用于治疗的分离TCR的基因片段组成和精准的CDR3区序列进行分析，以便完整地表征各个TCR序列。基于序列信息，可以通过将TCRα链和TCRβ链的相应可变区、恒定区和CDR3区组合而易于对TCR进行再次工程改造。因此，为了以有效且成本有效的方式表达已知序列的TCR，除了包含TCR AC段和TCR BC段之外还包含所有45种功能性TCR AV段和所有47种功能性TCR BV段的完整库的文库仍存在需要。
尽管技术得以进步，但是在需要将大量候选TCR进行功能性表征时，仍然会认为对全长的TCR构建体进行DNA合成是不经济的。按照这种思路，一旦改进的TCR序列得以合成，若C区改进发生变化，则已不能追溯性地改变TCR序列。如果需要评估不同的构象，则需要进行基因合成，并对每个候选TCR进行合成多个完整的DNA序列，成本极高。为了满足以更加灵活且成本效益的方法进行TCR表达克隆的需求，我们开发了TCR文库系统，该TCR文库系统允许快速重建TCR序列并使得能够无限制地交换TCR亚结构域。
具有不同结构单元的模式化系统使得交换不同TCR区(可变的、恒定的、CDR3)成为可能。由此，该系统允许构建具有不同特性的TCR。此外，可以容易地对不同物种来源或经过修饰的序列的区域进行交换，即可以将人类恒定区容易地交换为鼠源恒定区、最小程度鼠源化的区域或半胱氨酸工程改造的区域。此外，可以容易地将TCR构建体整合到不同的表达系统中，允许容易地在瞬时表达和稳定表达之间切换。
此外，复杂的TCR结构强烈地影响可用于区分不同V区的表位的暴露。这表示，利用表达天然构象的人类TCR的全细胞免疫原，V区的构象依赖性呈递是需要的，以便进行V区特异性单克隆抗体的免疫和筛选。因此，为了产生对V区具有特异性的TCR特异性抗体，需要一种有效工具以便允许表达完整的TCR库，该TCR库包含以其天然构象形式的所有不同的功能性TCR可变α链和TCR可变β链。
因此，可以将该TCR文库用于有效地产生TCR以及用于产生TCR特异性抗体。
发明内容
为了满足上述需求，本发明的一个目的是提供表达所有功能性TCR类型的文库，该文库包含各自编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体。
本发明的另一个目的是提供用于表达TCR的表达系统，其包含
-文库，其包含各自编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体，和
-至少一种ivtRNA骨架载体，和/或
-至少一种逆转录病毒骨架载体，和/或
-至少一种慢病毒骨架载体。
因此，本发明的另一目的是提供表达TCR的细胞克隆文库，该细胞克隆文库包含表达45种不同TCRα链的细胞克隆群体和表达47种不同TCRβ链的细胞克隆群体。
本发明的另一目的是提供TCR蛋白质文库，该蛋白质文库包含含有45种不同TCRα链的TCR蛋白质群体和含有47种不同TCRβ链的47种TCR蛋白质群体。
更确切地，在第一方面，本申请涉及用于表达所有功能性TCR类型的文库，该文库包含各自编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体，
其中编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含：
(i)可变AV段AVseg1至AVseg45中的一种；
(ii)对A段具有特异性的接头序列；和
(iii)恒定AC段；和
其中编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含：
(i)可变BV段BVseg1至BVseg47中的一种；
(ii)对B段具有特异性的接头序列；和
(iii)恒定BC段。
具体地，本申请涉及用于表达所有功能性TCR类型的文库，该文库包含各自编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体，
其中编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含以下结构单元：
-编码可变TCRα链区的可变AV段之一，其与SEQ ID No：100至SEQ ID No：144所示序列具有至少80％的同一性，和
-恒定AC段；和
其中编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含：
-编码可变TCRβ链区的可变BV段之一，其与SEQ ID No：145至SEQ ID No：191所示序列具有至少80％的同一性，和
-恒定BC段。
在某些实施方式中，AC段和BC段是鼠源区段、最小程度鼠源化的区段、半胱氨酸工程改造的区段或野生型人类区段或其组合。
在优选的实施方式中，AC段和BC段是鼠源区段或人类区段。
在其它的实施方式中，可变AV段和可变BV段是人类区段或鼠源区段，优选为人类区段。
在具体实施方式中，AC段具有SEQ ID NO：1、2或6所示的序列，并且其中BC段具有SEQ ID NO：3、4、5或7所示的序列。
在某些实施方式中，可变AV1段至AV45段具有SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：52所示的序列，并且其中可变BV1段至BV47段具有SEQ ID NO：53至SEQ ID NO：99所示的序列。
通常，将TCR构建体整合到至少一种骨架载体中。
在某些实施方式中，分别将编码TCRα链的TCR构建体或编码TCRβ链的TCR构建体各自整合到一种骨架载体中。可替换地，将编码一种TCRα链和一种TCRβ链的TCR构建体整合到骨架载体中。
在某些实施方式中，在编码一种TCRα链和一种TCRβ链的TCR构建体中，通过核糖体跳跃元件将编码一种TCRα链的序列和编码一种TCRβ链的序列连接在一起，优选通过P2A元件进行连接。
在某些实施方式中，骨架载体选自由体外转录mRNA(ivtRNA)骨架载体、逆转录病毒骨架载体或慢病毒骨架载体所组成的组。优选地，骨架是ivtRNA骨架载体或逆转录病毒骨架载体。通常，ivtRNA骨架载体包含至少一种RNA稳定序列，例如聚腺嘌呤尾，其中该聚腺嘌呤尾包含至少40个腺嘌呤、优选至少110个腺嘌呤。
以这种方式构建载体，使得可以容易地以单个步骤过程对每个区段或区段变体(可变V段、接头序列和恒定C段)进行交换。例如，可以快速地将接头区交换为所分析的候选TCR的任何CDR3区。因此，开发了高度灵活且经济性的方法以便利用人类TCR库的多样性。此外，可以快速地将鼠源恒定区交换为其最小程度鼠源化的区段、半胱氨酸工程改造的区段或野生型人类对应物，从而提供灵活性最大化的TCR表达克隆策略。
为了实现以上目的，该结构单元包含至少一种5'末端组合位点和至少一种3'末端组合位点。更具体地，第一结构单元的3’末端组合位点与第二结构单元的5’末端组合位点相容，该第二结构单元的5’末端组合位点可以连接到第一结构单元的3’末端。
模式化载体系统允许容易地产生用于瞬时转染和转导的构建体，导致将TCR构建体稳定整合到受体T细胞的基因组中。
可以将受体T细胞的TCR转染用作为优雅和迅速的方法来进一步表征候选TCR，而无论何时初始T细胞克隆不再是可利用的或者应该在何时避免繁琐的T细胞培养。此外，如果过继转移的T细胞的不良治疗性副作用不能被完全排除的话，则根据其瞬时表达，转染有TCR的T细胞是临床环境中永久性TCR工程改造的受体细胞的更安全的替代物。
此外，逆转录病毒骨架载体使得TCR转基因在适当的受体细胞中稳定表达(Schambach等人，2000；Hildinger等人，1999)。由于可以以确定的拷贝数将逆转录病毒和相关的逆转录转座子元件插入并且邻近DNA不发生重排，因此它们是将转基因稳定递送至靶细胞的独特工具。将包含候选TCR构建体的受体质粒(pR)用于产生病毒。随后将携带转基因的逆转录病毒用于转导靶细胞。可以容易地大量产生永久性表达转基因TCR的经过转导的受体细胞，因此该经过转导的受体细胞适合用于TCR表征和高级安全性测试、以及临床应用。
本发明的另一方面涉及用于表达TCR的表达系统，其包含
-文库，其包含各自编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体，
其中编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含：
(i)可变AV段AVseg1至AVseg45中的一种；
(ii)对A段具有特异性的接头序列；
其中编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含：
(i)可变BV段BVseg1至BVseg47中的一种；
(ii)对B段具有特异性的接头序列；和
-选自由以下所组成的组的ivtRNA骨架载体中的至少一种：
(i)包含AC段的ivtRNA骨架载体
(ii)包含BC段的ivtRNA骨架载体
(iii)包含AC段和BC段的ivtRNA骨架载体；和/或
-选自由以下所组成的组的逆转录病毒骨架载体中的至少一种：
(iv)包含AC段的逆转录病毒骨架载体
(v)包含BC段的逆转录病毒骨架载体
(vi)包含AC段和BC段的逆转录病毒骨架载体。
在某些实施方式中，上述表达系统还包含选自由以下所组成的组的慢病毒骨架载体中的至少一种：
(vii)包含AC段的慢病毒骨架载体
(viii)包含BC段的慢病毒骨架载体
(ix)包含AC段和BC段的慢病毒骨架载体。
在类似的方面，本发明涉及用于表达TCR的表达系统，其包含
-文库，其包含各自编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体，
其中编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含可变AV段AVseg 1至AVseg 45中的一种；
其中编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含可变BV段BVseg 1至BVseg 47中的一种；和
-选自由以下所组成的组的ivtRNA骨架载体中的至少一种：
(i)包含AC段和对A段具有特异性的接头序列的ivtRNA骨架载体，
(ii)包含BC段和对B段具有特异性的接头序列的ivtRNA骨架载体，
(iii)包含AC段、对A段具有特异性的接头序列、BC段和对B段具有特异性的接头序列的ivtRNA骨架载体，和/或
-选自由以下所组成的组的逆转录病毒骨架载体中的至少一种：
(iv)包含AC段和对A段具有特异性的接头序列的逆转录病毒骨架载体，
(v)包含BC段和对B段具有特异性的接头序列的逆转录病毒骨架载体，
(vi)包含AC段、对A段具有特异性的接头序列、BC段和对B段具有特异性的接头序列的逆转录病毒骨架载体。
在某些实施方式中，该表达系统还包含选自由以下所组成的组的慢病毒骨架载体中的至少一种：
(vii)包含AC段的慢病毒骨架载体，
(viii)包含BC段的慢病毒骨架载体，
(ix)包含AC段和BC段的慢病毒骨架载体。
在另一方面，本发明提供表达TCR的细胞克隆文库，其包含表达45种不同TCRα链的细胞克隆群体和表达47种不同TCRβ链的细胞克隆群体，
其中表达不同TCRα链的细胞克隆中的每一种均包含根据权利要求1的编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的一种和一种编码TCRβ链的TCR构建体；和
其中表达不同TCRβ链的细胞克隆中的每一种均包含根据权利要求1的编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的一种和一种编码TCRα链的TCR构建体。
本发明的另一方面涉及TCR蛋白质文库，其包含含有45种不同TCRα链的TCR蛋白质群体和含有47种不同TCRβ链的47种TCR蛋白质群体，
其中包含不同TCRα链的TCR蛋白质中的每一种均包含由根据权利要求1的TCR构建体编码的45种不同TCRα链中的一种和TCRβ链；和
其中包含不同TCRβ链的TCR蛋白质中的每一种均包含由根据权利要求1的TCR构建体编码的47种不同TCRβ链中的一种和TCRα链。
附图说明
图1：
图1A：细胞表面上的包含TCRα链和β链以及CD3复合物(ε链、γ链和δ链)的TCR复合物的示意图。TCR由两种不同的蛋白质α链和β链组成，每条链又由可变(V)区和恒定(C)区构成。TCRα链和β链两者的可变区都含有高变区(CDR，互补决定区)，其中CDR3区确定特异性表位识别。
图1B：模式化逆转录病毒TCR表达载体系统。pRAVx(pRBVx)载体系统是基于pMP71骨架的(Schambach A，Wodrich H，Hildinger M，Bohne J，
Figure BDA0001566903780000061
Baum C.，分子治疗(Mol Ther.)2000年11月；2(5)：435-45；Hildinger M，Abel KL，Ostertag W，Baum C.，病毒学报(J Virol.)1999年5月；73(5)：4083-9)。每个载体含有小鼠恒定α恒定区(mCA)或β恒定区(mCB)和45种人类AV区或47种人类BV区(hAVx和hBVx)之一。每个载体含有源自OT-1-特异性T细胞克隆的相同CDR3区。45pRAVx被连续用于产生逆转录病毒(RV)。一种AV特异性RV与编码包含小鼠恒定β区和人类BV区的TRBV链的第二RV联合用于转导受体T细胞。同样地，利用连续的pRBVx载体，使用编码包含小鼠恒定α区和人类AV区的TRAV的pRAV产生表达选定人类BV区的细胞。5'LTR、3'LTR表示5'和3'逆转录病毒长末端重复序列。
图2：经过转导的Jurkat细胞系和选定克隆的表面TCR表达。用逆转录病毒转导Jurkat细胞，并对小鼠β链恒定区(mCB)表面表达进行染色。利用FACS Aria细胞分选仪直接对TCR阳性细胞进行分选或者通过受限的稀释进行手动亚克隆。
图3：TCR细胞文库。a)完成后的小鼠BW-/-TCR文库将表达45种不同的人类AV TCR区和47种不同的人类BV TCR区，如浅灰色(梯度)所示以表示人类序列。以深灰色显示TCR的所有其它区，以表示它们的小鼠来源。小鼠细胞文库用于免疫。b)用选定RV进行逆转录病毒转导后，用抗mCB特异性抗体对细胞染色。分选出阳性细胞并且比较BW-/-亲本细胞、转导前的受体BW-/-细胞、分选前的转导有AV9的BW细胞(BW-AV9细胞系)和分选出的BW-AV9细胞系的TCR表达。c)Jurkat TCR全部文库将表达45种不同的人类AV TCR区和47种不同的人类BVTCR区。将该人类Jurkat文库用于筛选。d)利用来自经过转导且分选出的BW-AV9细胞系的cDNA，采用TRAV9可变区的特异性引物和特异性用于TRAV1区的对照引物进行PCR扩增。随后，将扩增出的DNA条带切下，测序，并通过与IMGT数据库中的AV9序列比对来确认AV9序列。
图4：使用BW-/-和Jurkat-/-细胞进行跨种属筛选。转导有BW-TCR的细胞用于免疫，然而由于这些细胞非特异性地结合小鼠Ig或大鼠Ig而不能用于杂交瘤筛选，如本文针对抗人类AV12-2特异性杂交瘤上清液，以及抗人类BV12-3特异性上清液所示的。杂交瘤上清液都能染色BW-/-细胞，而与它们的TCR表达无关(a和b中的第一行)。相反，只有在它们表达特定的AV TCR链或BV TCR链时，相同的上清液才能染色Jurkat-/-细胞(第二行的a和b)。转导有TCR的BW-/-细胞还稳定转导有CD3-GFP以允许TCR表达，用于说明其中等水平的GFP。为了区分结合在转导有TCR的Jurkat-/-细胞上的非特异性和特异性TCR，将稳定Jurkat-/-细胞克隆转导为表达高水平的GFP并用作在杂交瘤上清液筛选期间的对照。直方图左上角的位置表示非常高的GFP信号，其允许区别于BW-/-细胞中较低水平的GFP。如所示的，Jurkat-GFP细胞在用含有AV-或BV-特异性单克隆抗体的上清液测试时，其保持未标记的(第二行a和b)。这可以通过在含有AV-或BV-特异性单克隆抗体的上清液存在下不能向左移动(shift)而观察到。
图5：初次筛选包含杂交瘤克隆15B4(图5A)和5H4(图5B)的汇合的杂交瘤上清液。利用表达四种不同TCR的Jurkat细胞池和表达10％GFP的阴性对照细胞筛选汇合的杂交瘤上清液。如果在汇合的上清液中存在对各自BV区具有特异性的单克隆抗体，则预计在表达TCR的细胞中，约45％的细胞向alexa fluor 647移动，而在Jurkat-GFP部分中则不发生转移。
图6：二次筛选单个杂交瘤上清液。利用表达四种不同TCR的Jurkat细胞池和表达10％GFP的阴性对照细胞筛选单个板的杂交瘤上清液。图6A示出了包括15B4的二次筛选。图6B示出了包括5B4的二次筛选。
图7：利用簇TCR特异性单克隆抗体体内消耗人类ABab TCR转基因小鼠体内的表达BV簇的T细胞的试验设置。
图8：不同TCR构建体的结构，以减少转基因环境中的TCR错配。野生型TCR包含人类恒定区(huCα，huCβ)和经由两个半胱氨酸残基(Cys)连接两个TCR链的一个二硫键。Cys-突变体包含额外的二硫键，因此增加了修饰的TCR链之间的连接。在鼠源化的构建体中，人类恒定区被小鼠恒定区(muCα)取代以增强稳定的表面表达和优选的配对。为了降低由外源小鼠片段引起的可能的免疫原性，最小程度鼠源化构建体仅包含改善的表面表达和配对所需的关键性小鼠氨基酸。
图9：模式化载体系统
图9A：由以下方式构建TCR构建体，即每个片段或片段变体(可变区，包含CDR3区和恒定C区的接头序列)以及任何载体骨架(例如，逆转录转座子、慢病毒转座子、-ivtRNA)可以容易地以单一步骤进行交换。由此，可以通过交换可变区来产生任何类型的TCR链。可以通过引入所需的CDR3区来转换特异性，该CDR3区可以是例如通过杂交的寡核苷酸而引入的。此外，这些片段也可以在不同物种类型和修饰类型(如人类、小鼠、半胱氨酸工程改造的)之间转换。图9B：可以将重新构建的TRAV链和TRBV链作为由P2A序列分开的整个基因引入到相同载体中。可替换地，可以将AV-CDR3-J和BV-CDR3-J/D引入到已经掺入至载体骨架的小鼠或人类恒定区前方。
图10：具有小鼠恒定片段的示例载体的载体图。图10A示出了携带由人类AV1-1组成的TCRα链、源自OT1TCRα链的CDR3和小鼠α恒定区的逆转录病毒载体的实例。该载体的序列如SEQ ID NO：204所示。图10B示出了携带由人类BV2组成的TCRβ链、源自OT1TCRβ链的CDR3和小鼠β恒定区的逆转录病毒载体的实例。该载体的序列如SEQ ID NO：205所示。
图11：包含人类恒定区的示例载体的载体图。
图11A示出了携带由人类AV14组成的TCRα链、源自T1.8TCRα链的CDR3和小鼠人类恒定区的逆转录病毒载体的实例。该载体的序列示于SEQ ID NO：208中。图11B示出了携带由人类BV27组成的TCRβ链、源自T1.8TCRβ链的CDR3和小鼠β恒定区的逆转录病毒载体的实例。该载体的序列如SEQ ID NO：209所示。
图12：对分离TCR的再次工程改造
图12A：分离的T细胞克隆T1.8-3-200的功能分析。T细胞克隆T1.8-3-200与HLA-匹配的加载有NY-ESO1-X-(与信号肽融合的人类NY-ESO1抗原)的APC的共培养物的干扰素-γ(IFN-γ)测定。图12B：T1.8-3-200TCRα链的IMGT序列分析。图12C：T1.8-3-200TCRβ链的IMGT序列分析。图12D：TCR T1.8-3-200的转基因功能分析。T1.8-3-200TCR转染的PBL与HLA匹配的加载有NY-ESO1-X的APC的共培养物的IFN-γ测定。
具体实施方式
在以本发明的一些优选实施方式详细地描述本发明之前，提供以下常规定义。
如以下说明性描述的本发明可以在不存在任何要素或多个要素、一种或多种限制下适当地进行实施，本文中没有具体公开。
将以具体实施方式并参考某些附图来描述本发明，但是本发明并不限于此，而仅由权利要求限定。
在本说明书和权利要求书中使用术语“包含(comprising)”时，其并不排除其它要素。为了本发明的目的，将术语“由...组成(consisting of)”认为是术语“包含(comprising of)”的优选实施方式。如果在下文中将组定义为包括至少一定数量的实施方式，则这也应被理解为公开了优选地仅由这些实施方式组成的组。
为了本发明的目的，将术语“获得(obtained)”认为是术语“能够获得(obtainable)”的优选实施方式。如果在下文中，例如将抗体限定为能够从特定来源获得，这也应理解为公开了从该来源获得的抗体。
在涉及单数名词而使用不定冠词或定冠词，例如“一个(a)”、“一个(an)”或“该(the)”时，其包括该名词的复数，除非另有特别说明。在本发明的上下文中的术语“大约”或“近似”表示准确性的间隔，本领域技术人员将理解其仍用于确保所讨论特征的技术效果。该术语通常表示偏离±10％的指示数值，优选±5％。
按照公知常识使用技术术语。如果某些术语表示特定意义，则会在下文使用术语的上下文中给出术语的定义。
本发明的一个方面涉及与包含至少两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的部分的T细胞受体可变α链(TCR Vα)结合或与包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的T细胞受体可变β链(TCR Vβ)结合的抗体或其结合片段。
如在本文中所使用的，术语“部分”，“部分的TCR Vα链”或“部分的TCR Vβ链”是指与抗体结合的TCR Vα链或TCR Vβ链的特定组，其少于包含所有TCR Vα链或所有TCR Vβ链的组，但多于仅包含一个特异性TCR Vα链或TCR Vβ链的组。
换言之，根据本发明的抗体或结合片段不仅仅与一种TCR Vα链(即一种TCR Vα链类型)或一种TCR Vβ链(即一种TCR Vβ链类型)结合，还与多种TCR Vα链(即多种TCR Vα链类型)或多种TCR Vβ链(即多种TCR Vβ链类型)结合。
本发明的抗体或结合片段与少于所有功能性TCR Vα链的部分的TCR Vα链结合，或者与少于所有功能性TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链结合。换言之，本发明的抗体不是识别所有TCR Vα链和/或所有TCR Vβ链，特别是所有功能性TCR Vα链或功能性TCR Vβ链的泛特异性抗体。
术语“功能性TCR Vα链”或“功能性TCR Vβ链”或“功能性TCR可变链”涉及在T细胞上表达的TCR可变链。这表示该术语不包括不被表达的TCR可变链，如假基因(即在重组信号中具有移码突变或缺陷的基因)。例如，可以在Folch(“人类T细胞受体β变体(TRBV)基因(The Human T cell Receptor Beta Variable(TRBV)Genes)”，Folch GéraldibemLefranc Maire-Paule，Exp Clin Immunogenet 2000年；17：42-54)或Su等人(Chen Su和Masatoshi Nei，Mol.-Biol.Evol.2001年；18(4)：505-513)中发现关于TCR可变链是否是功能性的或是假基因的注释。相应地，术语“功能性TCR类型”是指由在T细胞上表达的TCR可变链组成的TCR。
在一个实施方式中，抗体或其结合片段与包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种或至少20种不同TCR Vβ链的部分的TCRVβ链结合。因此，本发明考虑了一种抗体或其结合片段，其与包含至少3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39或40种不同TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链结合。与较大数目的不同TCR Vβ链(例如，与2种不同Vβ链相比而言20种不同Vβ链)结合的抗体或其结合片段通常是特别感兴趣的，由于这些抗体可以例如更广泛地用于不同患者的TCR相关疾病，如TCL。
在具体的实施方式中，抗体或其结合片段与由3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种或30种选自由表1的TCR Vβ链组成的组的不同TCR Vβ链组成的部分的TCR Vβ链结合。
在另外的实施方式中，抗体或其结合片段与包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种或至少20种不同TCR Vα链的部分的TCR Vα链结合。因此，本发明考虑了一种抗体或其结合片段，其与包含至少3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、3种、14种、15种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种或40种不同TCR Vα链的部分的TCR Vα链结合。与较大数目的不同TCR Vα链(例如，与2种不同Vα链相比而言20种不同Vα链)结合的抗体或其结合片段通常是特别感兴趣的，由于这些抗体可以例如更广泛地用于不同患者的TCR相关疾病，如TCL。
在具体的实施方式中，抗体或其结合片段与由3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种或30种选自由表1的TCR Vα链组成的组的不同TCR Vα链组成的部分的TCR Vα链结合。
表1
Figure BDA0001566903780000101
表1-已知的功能性TCR Vα链和TCR Vβ链。AV代表可变α链，BV代表可变β链。
Figure BDA0001566903780000102
Figure BDA0001566903780000111
Figure BDA0001566903780000121
Figure BDA0001566903780000131
表2：具有其核酸序列和氨基酸序列的标识片段的TCR Vα链和TCR Vβ链。
编码TCRα链和TCRβ链的可变区的核苷酸序列包含前导序列。在成熟期间，前导序列被切除，这表示TCRα链和TCRβ链的可变区的蛋白质序列不含前导序列。因此，本文公开的TCRα链和TCRβ链的可变区的氨基酸序列不包含前导序列。
TCRα链AV1-1的可变区由AV段AVseg1(SEQ ID No.8)编码，并且具有SEQ IDNo.100的氨基酸序列。
在某些实施方式中，可变AV段AVseg1至AVseg45编码与SEQ ID NO：100至SEQ IDNO：144所示序列具有至少80％同一性的可变TCRα链区，并且其中可变BV段BVseg 1至BVseg47编码与SEQ ID NO：145至SEQ ID NO：191所示序列具有至少80％同一性的可变TCRβ链区。
在某些实施方式中，可变AV段AVseg1至AVseg45编码与SEQ ID NO：100至SEQ IDNO：144所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的可变TCRα链区，并且其中可变BV段BVseg1至BVseg47编码与SEQ ID NO：145至SEQ IDNO：199所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的可变TCRβ链区。
在某些实施方式中，可变AV段AVseg1至AVseg45编码具有SEQ ID NO：100至SEQ IDNO：144所示序列的可变TCRα链区，并且其中可变BV段BVseg1至BVseg47编码具有SEQ IDNO：145至SEQ ID NO：199所示序列的可变TCRβ链区。
在某些实施方式中，可变AV段AVseg1至AVseg45具有与SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：52所示序列具有至少80％同一性的序列，并且可变BV段BVseg1至BVseg47片段具有与SEQID NO：53至SEQ ID NO：99所示序列具有至少80％同一性的序列。
在某些实施方式中，可变AV段AVseg1至AVseg45具有与SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：52所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列，并且可变BV段BVseg1至BVseg47片段具有与SEQ ID NO：53至SEQ ID NO：99所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
在某些实施方式中，可变AV段AVseg1至AVseg45片段具有SEQ ID NO：8至SEQ IDNO：52所示的序列，并且可变BV段BVseg1至BVseg47片段具有SEQ ID NO：53至SEQ ID NO：99所示的序列。
在本发明的一个实施方式中，该部分的TCR Vα链包含属于两种不同TCR Vα亚家族的至少两种不同TCR Vα链，或者其中该部分的TCR Vβ链包含属于两种不同TCR Vβ链亚家族的至少两种不同TCR Vβ链。
如在本文中使用的术语亚家族是指VB基因的常规基因符号。在命名中，每个基因由两个数字表示。第一个数字表示该基因所属的亚家族；第二个数字表明每个亚家族中的基因的发现顺序。例如，可变链BV6-1、BV6-2、BV6-4、BV6-5、BV6-6、BV6-8、BV6-9属于一个亚家族。
因此，可以将TCR Vα链分成34个亚家族，如表3所示。
表3
Figure BDA0001566903780000141
Figure BDA0001566903780000151
表3-分成多个亚家族的TCR Vα链，AV代表可变α链。
可以将TCR Vβ链分成23个亚家族，如表4所示：
Figure BDA0001566903780000152
Figure BDA0001566903780000161
表4分成多个亚家族的TCR Vβ链。BV代表可变的β链
因此，本发明考虑了该部分的TCR Vα链包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种或至少25种属于至少2种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。该至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种或至少25种不同TCR Vα链自然也可以属于多于至少2种的不同TCR Vα链亚家族，如至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23或至少24种不同TCR Vα亚家族。从较大数目的不同TCR Vα链亚家族识别TCR Vα链的抗体或结合片段通常是特别感兴趣的，由于这些抗体可以是例如更广泛地用于不同患者的TCR相关疾病，如TCL。这类抗体或其结合片段可以比识别全部都属于相同亚家族的不同TCR Vα链的TCR特异性抗体或其结合片段具有更广泛的应用。
本发明相应地考虑了该部分的TCR Vα链包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少2种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
因此，本发明考虑了该部分的TCR Vα链包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少3种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vα链包含至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少4种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分TCR Vα链包含至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少5种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vα链包含至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少6种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vα链包含至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少7种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vα链包含至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少8种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了本发明的该部分的TCR Vα链包含至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少9种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vα链包含至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少10种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vα链包含至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少11种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vα链包含至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种、至少30种、至少35种属于至少12种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vα链包含至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种、至少30种、至少35种属于至少15种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vα链包含至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种、至少30种、至少35种属于至少20种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vα链包含至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种、至少30种、至少35种属于至少25种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vα链包含至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种、至少30种、至少35种属于至少30种不同TCR Vα链亚家族的不同TCR Vα链。
因此，本发明考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24或至少25种属于至少2种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。该至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24或至少25种不同TCR Vβ链自然也可以属于多于至少2种不同TCR Vβ链亚家族，如至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种或至少24种不同TCR Vβ链亚家族。从较大数目的不同TCR Vβ链亚家族识别TCR Vβ链的抗体或结合片段通常是特别感兴趣的，由于这些抗体可以是例如更广泛地用于不同患者的TCR相关疾病，如TCL。这类抗体或其结合片段甚至可以比识别全部都属于相同亚家族的不同TCR Vβ链的簇TCR特异性抗体或其结合片段具有更广泛的应用。
本发明相应地考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少2种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
因此，本发明考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少3种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少4种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少5种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少6种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少7种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少8种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了本发明的该部分的TCR Vβ链包含至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少9种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少10种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少11种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少12种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少15种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少18种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少20种、至少21种、至少22种、至少23种、至少24种、至少25种属于至少21种不同TCR Vβ链亚家族的不同TCR Vβ链。
表5示出了可以被簇TCR特异性抗体或其结合片段识别的不同TCR Vβ链的组。
Figure BDA0001566903780000201
Figure BDA0001566903780000211
表5：根据本发明的被抗体识别的TCR Vβ链类型的组
因此，本发明考虑了该部分的TCR Vβ链包含选自表5的T-1至T-21行中限定的组之一的至少两种不同TCR Vβ链。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含选自表5的T-1至T-19行中限定的组之一的至少3种不同TCR Vβ链。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含选自表5的T-1至T-17行中限定的组之一的至少4种不同TCR Vβ链。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含选自表5的T-1至T-15行中限定的组之一的至少5种不同TCR Vβ链。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少两种不同TCR Vβ链，其选自属于至少2种不同TCR Vβ链亚家族的表5的T-1至T-21行中限定的组之一。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少3种不同TCR Vβ链，其选自属于至少2种不同TCR Vβ链亚家族的表5的T-1至T-19行中限定的组之一。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少4种不同TCR Vβ链，其选自属于至少2种不同TCR Vβ链亚家族的表5的T-1至T-17行中限定的组之一。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少5种不同TCR Vβ链，其选自属于至少2种不同TCR Vβ链亚家族的表5的T-1至T-15行中限定的组之一。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少3种不同TCR Vβ链，其选自属于至少3种不同TCR Vβ链亚家族的表5的T-1至T-19行中限定的组之一。
本发明还考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少4种不同TCR Vβ链，其选自属于至少3种不同TCR Vβ链亚家族的表5的T-1至T-17行中限定的组之一。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少5种不同TCR Vβ链，其选自属于至少3种不同TCR Vβ链亚家族的表5的T-1至T-15行中限定的组之一。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少4种不同TCR Vβ链，其选自属于至少4种不同TCR Vβ链亚家族的表5的T-1至T-17行中限定的组之一。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少5种不同TCR Vβ链，其选自属于至少5种不同TCR Vβ链亚家族的表5的T-1至T-15行中限定的组之一。
表6示出了被簇TCR特异性抗体或其结合片段识别的TCR Vβ链可能归属的亚家族的组。
Figure BDA0001566903780000221
Figure BDA0001566903780000231
表6：根据本发明的被抗体识别的TCR Vβ链亚家族的组
因此，本发明考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少两种不同TCR Vβ链，其属于表6的F-1至F-20行中限定的至少两种不同TCR Vβ链亚家族。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少3种不同TCR Vβ链，其属于表6的F-1至F-18行中限定的至少3种不同TCR Vβ链亚家族。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少4种不同TCR Vβ链，其属于表6的F-1至F-15行中限定的至少4种不同TCR Vβ链亚家族。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少5种不同TCR Vβ链，其属于表6的F-1至F-13行中限定的至少5种不同TCR Vβ链亚家族。
本发明进一步考虑了该部分的TCR Vβ链包含至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种不同TCR Vβ链，其属于表6的F-1至F-13行限定的至少5种不同TCR Vβ链亚家族。
如果表明抗体或其片段与可变TCR Vα链或TCR Vβ链结合，则表示该抗体或其片段与所述可变链特异性结合，即以比其它可变链更强的亲和力与该可变链结合。
例如，在抗体或片段的可变区识别并结合同源抗原时，该抗体或片段对其同源抗原是特异性的，由于对结合亲和力的可测定的差异，该抗体或片段具有从序列相似但不相同的其它已知多肽中辨别出该抗原的可检测到的优先性。应在理解的是，特异性抗体和片段还可以通过与抗体的可变区外部的序列相互作用(特别是抗体或片段的恒定区)而与其它蛋白质(例如，ELISA技术中的金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白A或其它抗体)相互作用。确定抗体结合特异性的筛选测定法是在本领域熟知且常规实施的。对于这种测定法的全面讨论(参见例如4.Harlow等人(编辑)，抗体试验室手册(Antibodies A LaboratoryManual)；冷泉港试验室(Cold Spring Harbor Laboratory)；冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约(1988)，第6章)。
在本发明的上下文中使用的抗体及其结合片段可以优选为单克隆抗体，更优选为单克隆嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。适用于本文所描述的所有实施方式的特别优选的方面涉及单克隆人源化抗体或其结合片段。
抗体可以具有不同的亚型，如IgG类或IgM类。IgG类的抗体是特别感兴趣的。
如在本文中所描述的抗体或结合片段能够消耗T细胞的亚群。这表示只有T细胞亚群被消耗，而在消耗后仍然存在剩余群体。
具体地，如本文所描述的抗体或结合片段能够消耗特定的T细胞亚群。这表示本发明的抗体消耗了表达与该抗体结合的至少两种不同TCR Vα链的T细胞亚群，或者消耗了表达与该抗体结合的至少两种不同TCR Vβ链的T细胞亚群。剩余的T细胞不表达与该抗体结合的该至少两种不同TCR Vα链，或者不表达与该抗体结合的该至少两种不同TCR Vβ链。通过与单一抗体结合，不仅一种类型的TCR Vα链或TCR Vβ链，甚至多种不同类型的TCR Vα链或TCR Vβ链允许特异性消耗较大群体T细胞中的不同T细胞。
因此，本文所描述的抗体或结合片段的这些性质可以允许特异性地消耗含有异常T细胞的T细胞亚群，而不包含异常T细胞的剩余T细胞保持完整。因此，如在本文中所描述的抗体或结合片段可以用作治疗剂，特别是用于T细胞相关的恶性肿瘤，如TCL。
鉴于如在本文中所描述的抗体或结合片段可以从例如不同亚家族中识别部分的TCR，这可以允许利用一组有限的抗体或其结合片段或甚至利用单一抗体或其结合片段治愈与异常T细胞有关的不同恶性肿瘤。
而且，在与几种不同T细胞类型的异常有关的病症中，如在本文中所描述的抗体或结合片段可以同时靶向不同的T细胞类型，而不需要用单独的特异性抗体或结合片段靶向每种单独的T细胞类型。根据组合的异常T细胞类型，例如仅一种T细胞类型或组合的例如两种或三种不同抗体是需要的，以便消耗包含较大数目的不同T细胞类型(如3至20种不同T细胞类型)的异常T细胞群体。
而且，如在本文中所描述的抗体或结合片段在被用于治疗目的时，其可能无法诱导以细胞因子风暴形式的促炎细胞因子释放。
因此，本发明还涉及用于作为药物使用的如在本文中所描述的抗体或其结合片段。
具体地，本申请涉及提供用于在治疗T细胞白血病中使用的根据本发明的抗体或其结合片段。
相应地，本申请涉及通过给予根据本发明的抗体及其结合片段来治疗人类或动物体内的T细胞白血病的方法。
此外，本申请涉及在制备用于治疗T细胞白血病的药物中的根据本发明的抗体或其结合片段。
在更具体的方面，优选的实施方式涉及与包含至少两种不同TCR Vβ链的部分结合的抗体或其结合片段。在甚至更优选的实施方式中，该部分包含属于不同TCR Vβ链亚家族的至少两种不同TCR Vβ链。这类抗体或结合片段可用于消耗表达与结合抗体的至少两种不同TCR Vβ链的T细胞亚群。
这类抗体或其结合片段可以包含示例性抗体15B4的可变重链和/或可变轻链，与示例性抗体15B4的可变重链和/或可变轻链具有至少80％序列同一性的可变重链和/或可变轻链。15B4是在试验部分被确定为与人类BV12结合的抗体。因此，该序列可以用来通过改变该序列来获得与15B4具有相似性质的抗体。
因此，其它考虑的示例性抗体或其结合片段在其可变重链和/或可变轻链内可以包含示例性抗体15B4的互补决定区(CDR)。这类抗体在其可变重链和/或可变轻链内还可以包含与示例性抗体15B4的CDR具有至少80％的序列同一性的CDR。
例如，15B4的重链是由SEQ ID No.223编码的。例如，15B4的轻链是由SEQ IDNo.222编码的。因此，15B4的重链具有如SEQ ID No：221所示的氨基酸序列。因此，15B4的轻链具有如SEQ ID No：220所示的氨基酸序列。
15B4的可变重链具有SEQ ID No.219的氨基酸序列。15B4的可变轻链具有SEQ IDNo.218的氨基酸序列。对于15B4的可变重链，CDR1具有SEQ ID No.215的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID No.216的氨基酸序列，并且CDR3具有SEQ ID No.217的氨基酸序列。对于15B4的可变轻链，CDR1具有SEQ ID No.212的氨基酸序列，CDR2具有氨基酸序列“RAS”，且CDR3具有SEQ ID No.214的氨基酸序列。
这类抗体或其结合片段可以包含示例性抗体5H4的可变重链和/或可变轻链，与示例性抗体5H4的可变重链和/或可变轻链具有至少80％序列同一性的可变重链和/或可变轻链。5H4是在试验部分被鉴定为与人类BV12结合的抗体。因此，该序列可以用来通过改变该序列以获得与5H4具有相似性质的抗体。
因此，其它考虑的示例性抗体或其结合片段在其可变重链和/或可变轻链内可以包含示例性抗体5H4的互补决定区(CDR)。这类抗体还可以在其可变重链和/或可变轻链内包含与示例性抗体5H4的CDR具有至少80％序列同一性的CDR。
例如，5H4的重链是由SEQ ID No.237编码的。例如，5H4的轻链是由SEQ ID No.236编码的。因此，5H4的重链具有SEQ ID No.235的氨基酸序列。因此，5H4的轻链具有SEQ IDNo.234的氨基酸序列。
5H4的可变重链具有SEQ ID No.233的氨基酸序列。5H4的可变轻链具有SEQ IDNo.232的氨基酸序列。对于5H4的可变重链，CDR1具有SEQ ID No.229的氨基酸序列，CDR2具有SEQ ID No.230的氨基酸序列，且CDR3具有SEQ ID No.231的氨基酸序列。对于5H4的可变轻链，CDR1具有SEQ ID No.226的氨基酸序列，CDR2具有氨基酸序列“RAS”，且CDR3具有SEQID No.228的氨基酸序列。
优选地，在所有这些实施方式中，序列同一性为至少约85％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％且最优选至少约98％或约99％。可以基于全部长度的各个序列确定序列同一性。
优选采用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：5873-5877的数学算法确定两个序列之间的同一性百分比。这种算法被合并到Altschul等人(1990)J.Mol.Biol,.215:403-410(参见参考文献)的BLASTn和BLASTp程序中，其可以从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)获得。
采用BLASTn和BLASTp程序的标准参数确定同一性百分比。
采用BLASTn程序进行BLAST多核苷酸搜索。
对于常规参数，可以将“最大目标序列(Max Target Sequences)”框设置为100，可以勾选“短查询(Short queries)”框，可以将“期望阈值(Expect threshold)”框设置为10，并且可以将“字长(Word Size)”框设置为28。对于评分参数，可以将“匹配/不匹配评分(Match/mismatch Scores)”设置为1，-2，并且可以将“空位罚分(Gap Costs)”框设置为线性。对于过滤和屏蔽参数，可以不勾选“低复杂度区域(Low complexity regions)”框，可以不勾选“物种特异性重复(Species-specific repeats)”框，可以勾选“仅用于查找表的掩码(Mask for lookup table only)”框，可以不勾选“掩码小写字母(Mask lower caseletters)”框。
用BLASTp程序进行BLAST蛋白质搜索。对于常规参数，可以将“最大目标序列(MaxTarget Sequences)”框设置为100，可以勾选“短查询(Short queries)”框，可以将“期望阈值(Expect threshold)”框设置为10，并且可以将“字长(Word Size)”框设置为“3”。对于评分参数，可以将“矩阵(Matrix)”框设置为“BLOSUM62”，并且可以将“空位罚分(Gap Costs)”框设置为“存在：11扩展：1(Existence:11Extension:1)”，可以将“成分调整(Compositional adjustments)”框设置为“条件成分评分矩阵调整(Conditionalcompositional score matrix adjustment)”。对于过滤和屏蔽参数，可以不勾选“低复杂度区域(Low complexity regions)”框，可以不勾选“仅用于查找表的掩码(Mask forlookup table only)”框，并且可以不勾选“掩码小写字母(Mask lower case letters)”框。
术语“CDR”是指参与或负责抗原结合的抗体的互补决定区或高变区氨基酸残基。根据
Figure BDA0001566903780000261
Figure BDA0001566903780000262
(the international ImMunoGenetics information
Figure BDA0001566903780000263
)(LaFranc等人2005.Nucl Acids Res.33:D593-D597)且记载在(Lefranc等人Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义如在本文中所描述的CDR。
可以将上述轻链可变区和重链可变区的CDR嵌入到源自其它的人类抗体的骨架区和恒定区的人类序列中，特别是如果已经证实这些序列对抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)有效。在这种情况下，可以例如使用已经成功用于治疗性应用的人源化治疗性抗体的恒定区和骨架区的人类序列。优选地将上述的轻链可变区和重链可变区的CDR合并至这种人类IgG类的人源化抗体的骨架区和恒定区中。
此外，可以将上述轻链可变区和重链可变区的CDR基本上嵌入至骨架区和恒定区的人类序列中。然而，特别是骨架区可以包含例如通常发现于小鼠抗体中的已知为增强抗原结合和/或例如ADCC的氨基酸，同时恒定区也可以包含该氨基酸(参见，例如欧洲专利申请EP0451216)。优选地，这些抗体是IgG类。
在下文中，描述了几种已经开发用于减少非人源性抗体的免疫原性的方法，如嵌合或人源化。还可以将这些方法应用于可以使用例如在下文试验中描述的免疫和筛选方法鉴定的其它抗体。因此，可以将它们应用于识别除人类BV12之外的其它人类Vβ链或识别人类Vα链的抗体及其结合片段。
在人源化过程中，对于抗体正确折叠或抗原正确识别非必需的所有氨基酸都与来自人类抗体对应物的氨基酸交换。开发了几种用于单克隆抗体人源化的方法，包括传统的CDR移植或更加新颖的方法(包括计算机建模和生物信息学分析)。使用CDR移植方法进行CL1的重链和轻链的人源化(参见，例如Desmet等人，Kontermann和Dübel(编辑)AntibodyEngineering，第1卷，第341ff页；Bernett等人，J.Mol.Biol.(2010)396，1474-1490)。重链和轻链可变骨架区可以源自相同或不同的人类抗体序列。人类抗体序列可以是天然存在的人类抗体的序列。人类重链和轻链可变骨架区列出于例如Lefranc，M.-P.，Current Protocols inImmunology(2000)-Appendix IP A.1P.1-A.1P.37中，并且可通过IMGT，
Figure BDA0001566903780000271
Figure BDA0001566903780000272
(international ImMunoGeneTics information system)(http://imgt.cines.fr)获取。
可以基于人类IGKV7-3*01(P)、IGKV3-11*01、IGKV3-NL5*01、IGKV3D-7*01、IGKV3-NL1*01和大鼠15B4IGVK链制备15B4的人源化BV簇单克隆抗体IGK链序列，如SEQ ID NO：224所示。
因此，可以基于人类IGHV1-f*0、IGHV1-24*01、IGHJ6*01、IGHD3-10*01和大鼠15B4IGVH链制备15B4的人源化BV簇单克隆抗体IGH链序列，如SEQ ID NO：225所示。
因此，应当理解，15B4和5H4不仅作为识别人类Vβ链而不识别人类VB12的抗体或其结合片段的实例，而且还作为识别包含至少两种不同两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的部分的TCR Vα链或者识别包含至少两种不同两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链的抗体或其结合片段的实例。
因此，本发明还考虑了使用基本上与以上描述的TCR Vα结合抗体及结合片段或TCR Vβ链抗体及其结合片段所结合的相同表位或部分的相同表位结合的TCR Vα链抗体及其结合片段或TCR Vβ链抗体及其结合片段。因此，本发明涉及基本上与如15B4或5H4所结合的相同表位或部分的相同表位结合的TCR Vβ链抗体及其结合片段。本发明涉及基本上与如15B4或5H4所结合的相同表位或部分的相同表位结合的抗体及其结合片段。
此外，本发明考虑了使用与如上所述的TCR Vα链抗体及其结合片段或TCR Vβ链抗体及其结合片段竞争的TCR Vα链抗体及其结合片段或TCR Vβ链抗体及其结合片段。因此，本发明涉及与15B4或5H4竞争的TCR Vα链抗体及其结合片段或TCR Vβ链抗体及其结合片段、抗体及其结合片段。
可以通过产生抗原的不同片段(如TCR Vα链或TCR Vβ链)，然后测试这些片段与抗体或其结合片段的结合，来进行表位比对。可以使用
Figure BDA0001566903780000273
相互作用分析来测定结合。还可以使用可商购的肽阵列(如来自JPT Peptide Technologies GmbH(柏林，德国)的PepSpotTM)或基于蛋白质组学的质谱法。可以使用本领域已知的测定法来确定与特定抗原或表位结合的竞争。例如，可以根据本发明标记抗体并测试其与TCR Vα链或TCR Vβ链的结合。随后，添加未标记的15B4(或任何其它TCR Vα链或TCR Vβ链抗体)，并确定其是否影响与已经标记的抗体的结合，或者在存在或不存在各种浓度的这种未标记的TCR Vα链或TCR Vβ链结合抗体下研究与已经标记的抗体的结合。这种标签可以是放射性的或荧光的或其它种类的可检测标签。
根据本发明通过抗原或表位与抗体的结合减少至少约50％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％或约100％来确定特定抗原或表位的结合竞争。可以利用
Figure BDA0001566903780000274
设备、各种荧光检测技术(例如，荧光相关光谱、荧光交联相关、荧光寿命测定等)或各种类型的放射免疫测定法或其它用于跟踪与靶分子结合的抗体的测定法来测定结合。
如上所述的，本发明考虑了簇特异性TCR Vα链或TCR Vβ链抗体或其结合片段。全长的抗体包括恒定结构域和可变结构域。恒定区应在不存在于抗体的抗原结合片段中。
因此，结合片段可以包括部分的全长完整抗体，如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、F(ab')2、Id和FV段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；多特异性抗体片段，如双特异性、三特异性和多特异性抗体(例如，双抗体、三抗体、四抗体)；微抗体；螯合重组抗体；三抗体或二抗体；胞内抗体；纳米抗体；小模式化免疫药物(SMIP)、结合域免疫球蛋白融合蛋白；骆驼化抗体；含VHH的抗体；嵌合抗原受体(CAR)；和由抗体片段形成的任何其它多肽。技术人员知晓，可以通过全长抗体的多个片段进行抗体的抗原结合功能。
Fab段由VL、VH、CL和CH1结构域组成。F(ab')2片段包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab段。Fd是抗体单臂的VH和CH1结构域。Fv段是抗体单臂的VL和VH结构域。
结合片段还包括单价或多价的、或单体或多聚体(例如四聚体)的CDR衍生的结合域。
双特异性抗体包含两种不同的结合特异性，因此与两种不同的抗原结合。在一个实施方式中，双特异性抗体包含与第一抗原结合的第一抗原识别结构域和与第二抗原结合的第二抗原识别结构域。在一个实施方式中，第一抗原识别结构域与本文限定的部分的T细胞TCR Vα链结合，并且第二抗原识别区与本文限定的部分的T细胞TCR Vα链(包含与由第一抗原识别结构域识别的该部分的T细胞TCR Vα链不同的至少一种TCR Vα链)结合。在一个实施方式中，第一抗原识别结构域与本文限定的部分的T细胞TCR Vβ链结合，并且第二抗原识别区与本文限定的部分的T细胞TCR Vβ链(包含与由第一抗原识别结构域识别的该部分的T细胞TCR Vβ链不同的至少一种TCR Vβ链)结合。
在一些情况下，将识别T细胞抗原的双特异性抗体称为双特异性T细胞衔接分子(BiTE)。本发明不限于使用任何特定的双特异性抗体。相反，可以使用任何双特异性抗体或BiTE。scFv之一通过CD3受体与T细胞结合，另一个通过抗原特异性分子与将被靶向的抗原结合。这导致T细胞通过产生不依赖于MHC I或共刺激分子存在的蛋白质(如穿孔素和颗粒酶)而对表达靶向抗原的细胞发挥细胞毒性活性。本文的其它地方还描述了TCR Vα链或TCRVβ链的实例，双特异性抗体可以靶向所有这些TCR Vα链或TCR Vβ链。在一个实施方式中，双特异性抗体包括人类抗体、人源化抗体或其片段。
在一个实施方式中，第一抗原识别结构域与部分的T细胞TCR Vβ链结合，并且第二抗原识别区与结合于T细胞上的CD3的抗原识别区结合。对本领域技术人员而言，制备双特异性抗体的方法是已知的。可以使用两种免疫球蛋白重链/轻链对的共表达来重组产生双特异性抗体，例如Milstein等人(1983；Nature 305：537)中所描述的。可替换地，可以利用化学连接来制备双特异性抗体(参见，例如Brennan等人(1985))。双特异性抗体包括双特异性抗体片段(参见，例如Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48，Gruber等人(1994)J.Immunol.152：5368)。
嵌合抗原受体CAR包含源自双特异性抗体的抗原结合结构域、跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域。更具体地，如在本文中所使用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指例如嵌合T细胞受体、人造T细胞受体或嵌合免疫受体。CAR可以用于介导单克隆抗体对T细胞的特异性。在本发明的具体实施方式中，例如，CAR指导细胞对TCR Vα链或TCR Vβ链的特异性。在一些实施方式中，CAR包括胞内激活结构域、跨膜结构域和含有指向TCR Vα链或TCR Vβ链的结合区的胞外结构域。在具体方面，CAR包含源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合体，其与CD3-ζ跨膜结构域和胞内结构域融合。在某些情况下，可以修饰抗原识别结构域的间隙以减少激活诱导的细胞死亡。在某些情况下，CAR包含另外的共刺激信号传导的结构域，如CD3-ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。本发明考虑了，可以使用CAR来增强本发明的抗体或片段的功效。例如，如果与包含至少两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的部分的T细胞受体可变α链(TCR Vα)结合或与包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的T细胞受体可变β链(TCR Vβ)结合的抗体没有显现或只显现较小的T细胞消耗活性，则可以将其结合结构域整合到CAR中，以便引发或增强其T细胞消耗能力。还可以预见，通过将本发明抗体的结合结构域或其片段和/或其变体整合到CAR中，可以进一步增强本发明抗体的活性，例如对于消耗特异性T细胞具有显著效果。
结合TCR可变链的抗体及其结合片段还可以涵盖本文公开的示例性抗体、结合片段和序列的变体。变体包括具有一个或多个的氨基酸序列取代、缺失和/或添加的肽和多肽，该肽和多肽具有与本文公开的示例性抗体、片段和序列中的一种或多种具有相同或基本相同的表位结合亲和力和特异性。因此，变体包括对本文公开的示例性抗体、片段和序列而言具有一个或多个的氨基酸序列取代、缺失和/或添加的肽和多肽，而这类取代、缺失和/或添加不引起表位结合的亲和力和特异性的实质性改变。例如，抗体或片段的变体可由包含氨基酸序列SEQ ID NO：218、219或232、233中的一个或多个的抗体或片段的一个或多个变化所产生的，而变化的抗体或片段具有与起始序列的表位结合亲和力和特异性相同或基本相同的表位结合亲和力和特异性。
对于目前的在本发明上下文中通常所指的抗体或其结合片段，其还可以是较大免疫粘附分子的一部分，该较大免疫粘附分子是由该抗体或抗体部分与例如一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价结合而形成的。这类免疫粘附分子的实例包括采用链霉亲和素核心区来制备四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M等人(1995)Human Antibodies andHybridomas 6：93-101)以及采用半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标签来制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M等人(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。如本文所述，可以利用标准重组DNA技术来获得包含免疫粘附分子的抗体和片段。优选的抗原结合部分是完整结构域或完整结构域对。
本发明的结合抗体和结合片段还可以包含由VH结构域组成的结构域抗体(dAb)片段(Ward等人，Nature 341：544-546,1989)。本发明的抗体和结合片段也包括为二价抗体的双抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但所采用的接头太短以至于不能在相同链上的两个结构域之间配对，从而迫使该结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如EP 404,097；WO 93/11161；Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448，1993和Poljak等人，Structure 2：1121-1123,1994)。双抗体可以是双特异性的或单特异性的。
如上所述，本发明的抗体和结合片段还包括单链抗体片段(scFv)。scFv包含可操作地连接于抗体轻链可变区(VL)的抗体重链可变区(VH)，其中该重链可变区和该轻链可变区一起或单独地形成结合位点。scFv可以包含氨基末端的VH区和羧基末端的VL区。可替换地，scFv可以包含氨基末端的VL区和羧基末端的VH区。此外，尽管Fv段的两个结构域(VL和VH)由单独的基因编码，但是可以采用重组方法，通过合成接头将它们连接起来，使得它们可以形成单个蛋白质链，其中VL区和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。
scFv还可以可选地在重链可变区和轻链可变区之间包含多肽接头。这类多肽接头通常包含1至50个氨基酸、或3至12个氨基酸、或2个氨基酸。用于连接scFv中的重链和轻链的接头肽的实例包括含有5个氨基酸的序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：238)。其它实例包括该序列的一个或多个串联重复单元以产生接头(例如，包含Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：238)的两个至四个重复单元的多肽)。
本发明的抗体和结合片段还包括重链抗体(HCAb)。常规抗体的H2L2结构的例外出现在免疫球蛋白的一些同种型中，该免疫球蛋白的同种型发现于骆驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼；Hamers-Casterman等人，1993年Nature 363：446；Nguyen等人，1998年J.Mol.Biol.275:413)、须鲨科(Nuttall等人,Mol Immunol.38:313-26,2001)、护士鲨(Greenberg等人，Nature374：168-73,1995；Roux等人，1998Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95:11804)、和斑点兔银鲛(Nguyen等人,"Heavy-chain antibodies in Camelidae；a case ofevolutionary innovation,"2002Immunogenetics 54(1):39-47)中。这些抗体可以仅利用重链可变区明显地形成抗原结合区，由于这些功能性抗体是仅含有重链的二聚体(称为“重链抗体”或“HCAb”)。因此，本发明抗体和结合片段的一些实施方式可以是与TCR特异性结合的重链抗体(HCAb)。例如，属于IgG类且不含轻链的重链抗体是由骆驼属的动物(包括骆驼、单峰驼和美洲驼)产生的(Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993))。HCAb的分子量为约95kDa，而不是常规IgG抗体的约160kDa分子量。它们的结合结构域仅由重链可变结构域组成，通常将其称为VHH以将它们与常规VH区分开来，Muyldermans等人,J.Mol.Recognit.12:131-140(1999)。重链抗体的可变结构域有时被称为纳米抗体(Cortez-Retamozo等人，Cancer Research64:2853-57,2004)。如Conrath等人描述的，可以由免疫的单峰驼产生纳米抗体文库(Antimicrob Agents Chemother 45:2807-12,2001)或者使用重组方法产生纳米抗体文库。
由于不存在第一恒定结构域(CH1)(由于缺失拼接共识信号而在mRNA加工期间被剪切掉)，可变结构域(VHH)之后紧接着铰链区、CH2结构域和CH3结构域(Nguyen等人，Mol.Immunol.36:515-524(1999)；Woolven等人，Immunogenetics 50:98-101(1999))。据报道，骆驼科VHH与含有铰链区、CH2结构域和CH3结构域且缺失CH1结构域的IgG2恒定区和IgG3恒定区重组(Hamers-Casterman等人，同上)。例如，美洲驼IgG1是常规的(H2L2)抗体同种型，其中VH与含有铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的恒定区重组，而美洲驼IgG2和IgG3是缺乏CH1结构域且不含轻链的仅含重链的同种型。
尽管HCAb不含轻链，但是它们具有抗原结合的全部功能。在Nguyen等人Adv.Immunol79:261-296(2001)和Nguyen等人，Immunogenetics 54:39-47(2002)中综述了HCAb的遗传发生机制。包括护士鲨在内的鲨鱼表现出类似的含有单个单体V结构域的抗原受体。
VHH包含较小的完整抗原结合片段(例如，约15kDa、118-136个残基的片段)。已经发现骆驼科VHH结构域以较高亲和力与抗原结合(Desmyter等人，J.Biol.Chem.276:26285-90,2001)，其中VHH亲和力通常在纳摩尔范围内并且与Fab和scFv段的亲和力相当。VHH是高度可溶的，并且比scFv和Fab段的相应衍生物更稳定。相对难以产生可溶形式的VH片段，但是在将骨架残基改变为与VHH更加接近时，可以获得改善的溶解性和特异性结合(参见，例如Reichman等人，J Immunol Methods 1999,231：25-38)。VHH携带使其更具有亲水性并防止与BiP(免疫球蛋白重链结合蛋白)的延迟性相互作用的氨基酸取代基，该BiP通常在折叠和装配期间在内质网(ER)中与H链结合，直到其被L链替换掉。由于VHH的亲水性增强，从ER分泌VHH得到改善。
功能性VHH可以通过蛋白水解切割经过免疫的骆驼科动物的HCAb、通过直接克隆来自经过免疫骆驼科动物的B细胞的VHH基因产生重组VHH、或从天然或合成文库而获得。也可以通过噬菌体显示方法学获得具有所需抗原特异性的VHH。由于仅需克隆一个结构域并将其表达以获得功能性抗原结合片段，因此在噬菌体显示中使用VHH与Fab或scFv相比更方便有效。Muyldermans,Biotechnol.74:277-302(2001)；Ghahroudi等人，FEBS Lett.414:521-526(1997)；和van der Linden等人，J.Biotechnol.80:261-270(2000)。美国专利公开第20050136049和20050037421号也描述了产生具有骆驼科动物重链的抗体的方法。
结合抗体及其结合片段还可以包含例如前述具体提及的具有一个或多个保守取代基(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个保守取代基)的轻链或重链的氨基酸序列之一。可以确定保守取代基的候选氨基酸序列的位置，并且对于任何特定氨基酸，可以选择进行保守取代的合成和天然存在的氨基酸。选择保守取代的考虑因素包括其中进行任何特定氨基酸取代的环境、侧链的疏水性或极性、侧链的一般大小和生理条件下具有酸性或碱性特征的侧链pK值。例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸通常适合进行彼此间的取代。如本领域所知晓的，这是由于所有这三种氨基酸都具有碱性侧链，不过赖氨酸和精氨酸的侧链pK值(约10和12)彼此间比组氨酸(约6)更接近。类似地，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通常适合进行彼此间的取代，但是通常不适合用甘氨酸取代该组的其它氨基酸。通常适合进行彼此间取代的其它氨基酸组包括但不限于由谷氨酸和天冬氨酸组成的组；由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成的组；和由丝氨酸、苏氨酸和任选的酪氨酸组成的组。
通过对氨基酸序列进行保守修饰或对编码核苷酸进行相应的修饰，可以产生具有与本文公开的示例性抗体和片段类似的功能和化学特性的抗体或其结合片段。
在本发明上下文中提及的结合抗体及其结合片段可以涵盖本文公开的示例性的抗体、片段和序列的衍生物。衍生物包括已经进行化学修饰的多肽或肽、或其变体、片段或其衍生物。实例包括共价连接的一种或多种聚合物，聚合物是例如水溶性聚合物、N-连接的或O-连接的碳水化合物、糖、磷酸酯和/或其它这类分子(如可检测标记，如荧光团)。
可以将标记试剂直接地或间接地偶联至本发明的抗体或抗原上。间接偶联的一个实例是利用间隔部分。此外，本发明抗体可以包含另外的结构域，通过共价键或非共价键连接所述结构域。可以基于本领域已知的上述方法基于基因融合进行连接，或者可以通过例如国际申请WO 94/04686中描述的如化学交联进行连接。可以优选地通过柔性接头、有利的多肽接头连接存在于包含本发明抗体的融合蛋白中的其它结构域，其中所述多肽接头包含多个亲水的肽键合的氨基酸，氨基酸的长度足以跨越所述其它结构域的C-末端和本发明抗体的N-末端之间的距离，反之亦然。可以通过各种方式将治疗性或诊断性活性剂偶联至本发明抗体或其抗原结合片段。例如，这包括单链融合蛋白，其包含通过共价方法(如肽键)与治疗性或诊断性活性剂偶联的本发明抗体的可变区。其它实例包括至少包含共价地或非共价地偶联于其它分子的抗原结合片段的分子，其包括以下非限制性说明性列表中的那些。Traunecker等人，Int.J.Cancer Surp.SuDP 7(1992),51-52描述了双特异性的试剂janusin，其中指向CD3的Fv区与可溶性CD4或其它配体(如OVCA和IL-7)偶联。类似地，可以将指向TCR Vα链或TCR Vβ链的Fv区与部分的例如抗-CD40激动性抗体和/或部分的抗-CTLA4拮抗性抗体偶联。类似地，可以将本发明抗体的可变区构建成Fv分子，并与如所引用文献中举例说明的可替代的配体偶联。Higgins等人，J.Infect Disease 166(1992),198-202描述了异缀合抗体，其由与指向GP120的V3区中的特定序列的抗体交联的OKT3组成。还可以至少利用本发明方法的抗体中所包含的可变区来构建这类异缀合抗体。特异性抗体的其它实例包括Fanger等人，Cancer Treat.Res.68(1993),181-194和Fanger等人，Crit.Rev.Immunol.12(1992),101-124描述的那些。本领域已经广泛描述了为包括常规抗体的免疫毒素的缀合物。可以通过常规偶联技术将毒素与抗体偶联，或者可以将含有蛋白质毒素部分的免疫毒素作为融合蛋白而产生。可以以相应方式使用本发明抗体而获得这种免疫毒素。说明性的这类免疫毒素是由Byers等人，Seminars Cell.Biol.2(1991),59-70和Fanger等人，Immunol.Today 12(1991),51-54所描述的那些。
上述融合蛋白可以进一步包含用于蛋白酶的可切割接头或切割位点。这些间隔部分又可以是不溶性的或可溶性的(Diener等人，Science 231(1986),148)，并且可以选择为能够让药物在靶位点从抗原释放出来。
可以与用于免疫疗法的本发明抗体和抗原偶联的治疗性试剂的实例是药物、放射性同位素、凝集素和毒素。可以与本发明抗体和抗原缀合的药物包括经典地称为如丝裂霉素C、柔红霉素和长春碱的药物的化合物。在利用本发明的放射性同位素缀合的抗体或抗原进行例如肿瘤免疫疗法方面，根据如白细胞分布以及稳定性和排放等因素，某些同位素可能比其它同位素更优选。
有些发射体可能比其它发射体更优选。通常，放射α粒子和β粒子的放射性同位素在免疫疗法中是优选的。优选的是短程高能的α发射体，如212Bi。可以与本发明的抗体或抗原结合用于治疗目的放射性同位素的实例是125I、131I、90Y、67Cu、212Bi、212At、211Pb、47Sc、109Pd和188Re。可以用于体外和体内治疗方案与本发明抗体或抗原偶联的其它治疗性试剂对于本领域普通技术人员而言是已知的，或者可以由本领域普通技术人员轻易地确定其它治疗性试剂。
如上所述，在一些实施方式中本发明还涉及编码抗体及其结合片段的核酸分子、包含这类核酸分子的载体和包含这类核酸序列和载体的宿主细胞。
可以由单一核酸(例如，包含编码抗体的轻链多肽和重链多肽的核苷酸序列的单一核酸)、或由两种或更多种单独的核酸(其中的每一种编码抗体或抗体片段的不同部分)编码抗体及其结合片段。在此方面，本发明提供了编码前述抗体或结合片段中的任一种的一种或多种核酸。核酸分子可以是DNA、cDNA、RNA等。
根据本发明的一个方面，本发明提供了编码抗体重链区或其部分的核酸。SEQ IDNo：223和237示出了示例性的核酸序列。本发明还提供了编码抗体的轻链可变区或其部分的核酸。SEQ ID No：222和236示出了示例性的核酸序列。
本发明还涵盖了编码任何前述轻链或重链的氨基酸序列的核酸，该轻链或重链的氨基酸序列包含一个或多个保守取代基(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个保守取代基，如在关于本发明的抗体和抗体片段部分所讨论的，其中与本文所公开的一种或多种示例性抗体、片段和序列相比，包含取代基的抗体或片段具有相同或基本上相同的表位结合亲和力和特异性。
优选地，本发明的多核苷酸可操作地连接到允许在原核细胞或真核细胞中表达的表达对照序列。所述多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞、优选在哺乳动物细胞中表达的调控元件是本领域技术人员熟知的。该调控元件通常包含确保转录起始的调控序列和确保转录终止和转录物稳定化的可选的多聚A信号。其它调控元件可以包括转录及翻译增强子，和/或天然相关的或异源的启动子区。
可以将本文所述的核酸插入载体，例如核酸表达载体和/或靶向载体中。可以以各种方式使用这类载体，例如用于在细胞或转基因动物中表达抗体或结合片段。因此，本发明提供了包含本发明的任何一种或多种核酸的载体。“载体”是能够携带核酸序列至合适宿主细胞中的任何分子或组合物，在该宿主细胞中可以进行编码多肽的合成。典型且优选地，载体是已经进行过工程改造的核酸，使用本领域已知的重组DNA技术将期望的核酸序列(例如本发明的核酸)掺入至载体中。期望地，载体由DNA组成。然而，不基于核酸的载体(如脂质体)也是本领域已知的，并且可以与本发明结合使用。本发明的载体可以是基于单一类型的核酸(例如，质粒)或非核酸分子(例如，脂质或聚合物)。可替换地，载体可以是核酸和非核酸的组合(即，“嵌合”载体)。例如，带有核酸的质粒可以与脂质或聚合物一起被制备成运载工具。在本文中，这种载体分别被称为“质粒-脂质复合物”和“质粒-聚合物”复合物。可以将本发明的基因转移载体整合到宿主细胞基因组中，或可以以游离基因的形式存在于宿主细胞中。
通常选择在宿主细胞(载体在其中被利用)中起作用的载体(载体是与宿主细胞机构相容的，使得可以进行基因扩增和/或基因表达)。可以在原核生物、酵母、昆虫(杆状病毒系统)和/或真核生物宿主细胞中扩增/表达编码抗体或其结合片段的核酸分子。宿主细胞的选择将部分地取决于抗体或片段是否是被过渡后修饰的(例如，糖基化和/或磷酸化)。如果是的话，优选酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。
表达载体通常含有一种或多种下列元件(如果它们不是已经由核酸分子提供的话)：启动子、一种或多种增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、分泌前导序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待被表达多肽的核酸的多接头区和选择性标记元件。
在一些方面，本发明进一步提供了包含本发明的核酸或载体的细胞(例如，分离的或纯化的细胞)。细胞可以是能够利用本发明核酸或载体进行转化以产生由此编码的多肽的任何类型的细胞。细胞优选为哺乳动物(如人类)细胞，更优选为杂交瘤细胞、胚胎干细胞或受精卵。胚胎干细胞或受精卵可以不是人类胚胎干细胞或人类受精卵。
宿主细胞可以是原核宿主细胞(如大肠杆菌)或真核宿主细胞(如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。在合适条件下培养时，宿主细胞表达的抗体或结合片段可以随后从培养基中收集(如果宿主细胞分泌其到培养基中)，或直接从产生它的宿主细胞收集(如果不进行分泌)。合适宿主细胞的选择将取决于各种因素，如期望的表达水平、活性需要或必需的多肽修饰(如糖基化或磷酸化)和折叠成生物活性分子的容易程度。大量合适的宿主细胞是本领域已知的，并且许多从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，马纳萨斯，弗吉尼亚州是可获得的。实例包括哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC No.CCL61)CHO DHFR-细胞(Urlaub等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97,4216-4220(1980))、人类胚胎肾(HEK)293细胞和293T细胞(ATCC No.CRL1573)、3T3细胞(ATCC No.CCL92)或PER.C6细胞。
可以利用包含本发明的核酸或载体的细胞来产生抗体或其结合片段，或其部分(例如，由核酸或载体编码的重链序列或轻链序列)。在将本发明的核酸或载体导入至细胞后，将细胞培养在适合于表达编码序列的条件中。然后可以从细胞分离抗体、抗原结合片段或部分的抗体。
本发明的另一方面涉及根据前述权利要求中任一项的抗体或其结合片段用于消耗表达包含至少两种不同TCR Vα链的部分的TCR Vα链的T细胞亚群或用于消耗表达包含至少两种不同TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链的T细胞亚群的用途。
本发明的另一方面涉及根据前述权利要求中任一项的抗体或其结合片段用于离体消耗表达包含至少两种不同TCR Vα链的部分的TCR Vα链的T细胞亚群或用于离体消耗表达包含至少两种不同TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链的T细胞亚群的用途。
本发明的另一方面涉及用于作为药物使用的本文所描述的抗体或其结合片段。
具体的实施方式涉及用于在治疗T细胞白血病中使用的根据前述权利要求中任一项的抗体或其结合片段。
显示CL 1与Jurkat细胞(其是T细胞白血病细胞，因而是T细胞白血病的成熟模型)结合的结合数据示出了根据本发明的抗体或结合片段靶向T细胞白血病细胞。因此，本发明的抗体或结合片段可以用于治疗T细胞介导的疾病，如T细胞白血病。
小鼠的体内消耗试验适合于证实在体内消耗特异性T细胞群体(如导致T细胞白血病的异常T细胞)是可行的。
此外，ADCC测定法监测了本发明抗体引发ADCC的能力，即活性裂解靶细胞(例如，恶性T细胞)。
可以将TCR可变链结合抗体或其结合片段配制成组合物，特别是药物组合物。这类组合物包含治疗有效量或预防有效量的抗体或其结合片段，并混合有合适的载体(例如，药学上可接受的试剂)。
用于本发明药物组合物的药学上可接受的试剂包括载体、辅料、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲剂、递送溶剂、张度剂、助溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲试剂、抗微生物剂和表面活性剂。
组合物可以是以液体形式或者冻干或冷冻干燥的形式，并且可以包含冻干保护剂、辅料、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或膨胀剂中的一种或多种(参见，例如美国专利6,685,940、6,566,329和6,372,716)。
组合物可以适合用于肠胃外给药。通过本领域技术人员可利用的任何途径适合将示例性组合物注射或输注至动物体内，该途径是如关节内、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内或病灶内途径。肠胃外制剂通常是无菌、无热原的等渗水溶液，任选地含有药学上可接受的防腐剂。
非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。含水载体包括含有盐水和缓冲介质的水溶液、醇/水溶液、乳液或悬浮液。肠胃外溶剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringers'dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内溶液包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些物质等等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。通常参见Remington's Pharmaceutical Science，第16版，Mack编辑，1980年，通过引用将其并入本文。
可以将本文所描述的药物组合物配制用于受控递送或持续递送，该递送是以提供产品局部浓度(例如，推注、积存作用)和/或特定局部环境下增强的稳定性或半衰期的方式进行的。该组合物可以包含本发明的抗体、结合片段、核酸或载体制剂，颗粒化的聚合化合物制剂(如聚乳酸、聚乙醇酸等)以及如可生物降解基质、可注射微球体、微胶囊颗粒、微胶囊、可生物消化的颗粒珠、脂质体的试剂和可植入的递送装置，该试剂和递送装置提供随后可作为积存式注射递送的活性剂的受控或持续释放。
可生物降解的和不可生物降解的聚合物基质都可以用于递送本发明的组合物，并且这类聚合物基质可以包含天然或合成的聚合物。优选的是可生物降解的基质。释放发生的时间段是基于所选择的聚合物。通常，在几小时和三至十二个月之间的时间段范围内释放是最期望的。
可替换地或另外地，可以通过将已经吸收或包封了本发明的抗体、结合片段、核酸或载体的膜、海绵或其它合适材料植入到受影响的地方而局部给予该组合物。在使用植入装置时，可以将装置植入到任何合适的组织或器官中，并且可以通过装置经由推注或连续给药、或使用连续输注的导管，直接地递送本发明的抗体、结合片段、核酸或载体。
可以将包含结合抗体或其结合片段的药物组合物配制用于吸入，例如例如作为干粉。也可以将吸入溶液配制成用于气溶胶递送的液化推进剂。在另一种制剂中，可以将溶液雾化。
可以将含有抗体或其结合片段的某些制剂进行口服给药。可以利用或不利用通常用于配制固体剂型(如片剂和胶囊)的那些载体，配制以这种方式给予的制剂。例如，可以将胶囊设计为在胃肠道的某处释放制剂的活性部分，从而将生物利用度最大化且将系统前降解最小化。可以包括促进选择性结合剂吸收的其它试剂。也可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
与包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链结合的抗体或其结合片段的EC50为约0.08nM至约0.8nM，优选地约0.1nM至约0.6nM。
现在参考一些实例来描述本发明，然而这些实例不被解释为限制性的。
ADCC指抗体依赖性细胞毒性。为了确定抗体是否能够在原则上介导ADCC，可以通过监测效应器细胞中的基因转录激活(通过NFAT(激活的T细胞的核因子)途径进行的)的萤光素酶测定法在体外测定ADCC。例如，ADCC报道子生物测定法(Promega)利用稳定表达FcγRIIIa受体、V158(高亲和力)变体和NFAT应答元件(驱动萤火虫萤光素酶效应器细胞表达)的工程改造的Jurkat细胞。通过作为NFAT途径激活结果而产生的荧光素酶对抗体在ADCCMOA上的生物活性定量；此外，可以通过所谓的Cr51、Eu、S35和钙黄绿素释放测定法来测定ADCC。可以用这些化合物将在靶细胞表面上显示出感兴趣抗原的靶细胞进行标记。细胞在与治疗性抗体结合之后洗涤细胞，将表达Fc受体的效应器细胞(如FcγRIII)与抗体标记的靶细胞一起孵育，并且可以通过释放的标记来监测靶细胞的裂解。另一种方法采用了所谓的aCella TOXTM测定法。
CDC指补体依赖性细胞毒性。为了确定抗体是否能够在原则上介导CDC，可以通过Delobel A等人，Methods Mol Biol.(2013)；988:115-43或“免疫学最新试验方案(CurrentProtocols in Immunology)”第13章的补充内容(印刷ISSN：1934-3671)中所描述的进行体外测定CDC。
在本文中使用的“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并随后引起靶细胞的吞噬作用。
上述轻链和重链可变区的CDR优选地嵌入在人源化抗体的骨架区和恒定区中，即嵌入如本文所描述的从人类患者获得的抗体所确定的序列中。优选地，这些抗体是IgG类。
然而，上述轻链和重链可变区的CDR也可以嵌入在源自其它的人类抗体的骨架区和恒定区的人类序列中，特别是如果已经证实这类序列对抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)有效。在这种情况下，例如可以使用已经成功用于治疗性应用的治疗性人源化抗体的人类恒定序列和骨架序列。优选地将上述轻链和重链可变区的CDR掺入至这种人类IgG类的人源化抗体的骨架区和恒定区中。
此外，上述轻链和重链可变区的CDR可以被基本上嵌入在骨架区和恒定区的人类序列中。然而，特别是骨架区可以包含例如通常发现于已知增强抗原结合和/或例如ADCC的小鼠抗体中的氨基酸，而且恒定区也可以包含该氨基酸(参见，例如欧洲专利申请EP0451216)。优选地，这些抗体是IgG类。
抗体可以引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或CDC补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)吞噬作用。在本申请的具体实施方式中，抗体引发ADCC。
产生抗体的方法
本发明的另一个方面涉及用于产生与感兴趣的细胞表面蛋白结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供非人类细胞，其不表达内源性感兴趣的细胞表面蛋白但表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的细胞表面蛋白；
(b)用步骤(a)提供的细胞系免疫非人类动物；
(c)由步骤(b)的经过免疫的非人类动物产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与不表达内源性感兴趣的细胞表面蛋白但表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的细胞表面蛋白的人类细胞接触来筛选与感兴趣的表面蛋白结合的抗体。
提供不表达内源性感兴趣的细胞表面蛋白的非人类细胞是指该非人类细胞基本上不能产生内源性的该感兴趣的细胞表面蛋白，但能够产生外源性的该感兴趣的细胞表面蛋白。技术人员知晓抑制该内源性蛋白质表达的不同方法。还可以利用不表达自发产生的内源性感兴趣的表面蛋白的分离的细胞系。通常，在非人类细胞系中，已经使得感兴趣的表面蛋白的基因座/多个基因座不起作用。
如在本文中所使用的，术语“至少一段人类片段”是指该蛋白质的至少一部分或区域。这表示本发明设想了完全为人类细胞表面蛋白和不完全为人类细胞表面蛋白的情形。因此，细胞表面蛋白除了包含至少一段人类片段外，还可以包含另一种来源的片段。例如，细胞表面蛋白的胞内结构域和跨膜结构域可以是来自小鼠的，并且胞外结构域可以是来自人类的。例如，TCR的恒定区可以是来自小鼠的，而可变区可以是来自人类的。如在本文中所使用的，术语“片段”是指部分的蛋白质，例如但不限于结构域或序列段。
术语“感兴趣的细胞表面蛋白”是指被技术人员所知晓为细胞表面蛋白质的任何蛋白质。如在本文中所使用的，“细胞表面蛋白”是其至少一部分暴露于胞外环境的蛋白质。该蛋白质可以嵌入在细胞膜的脂质层中，或者可以与整合在脂质层中的分子结合。细胞表面蛋白的示例性实例是TCR。
外源性感兴趣的细胞表面蛋白可以是瞬时表达或永久表达的。技术人员熟悉基因永久表达或瞬时表达的技术。
可以基于已知方法制备单克隆抗体(C.Milstein,G.
Figure BDA0001566903780000371
Nature 256(1975)495)。采用了不表达内源性感兴趣的细胞表面蛋白但表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的细胞表面蛋白的非人类细胞作为免疫原。
如在本文中所使用的，术语“非人类细胞系”是指适用于对非人类动物进行免疫的本领域技术人员已知的任何非人类细胞系。例如，可以采用小鼠或大鼠细胞系。
可以被免疫的非人类动物的实例是牛、绵羊、山羊、美洲驼、猪、马、小鼠、大鼠、家禽、猴、兔等。在优选的实施方式中，可以对大鼠、小鼠、兔或美洲驼进行免疫。在更优选的实施方式中，可以对大鼠进行免疫。在大鼠中，可以获得大量的脾细胞，特别是与小鼠相比可以获得更多数量的脾细胞。
在一个实施方式中，步骤(b)中的经过免疫的非人类动物是除了步骤(a)所提供的非人类细胞系之外的另一物种。例如，用小鼠细胞系对大鼠进行免疫具有大鼠对小鼠细胞系产生强烈免疫应答的优点。
在具体的实施方式中，待被免疫的非人类动物是大鼠，并且用于免疫的非人类细胞系是小鼠细胞系。还可以采用待被免疫的非人类动物和非人类细胞系的其它组合。
可以通过利用流式细胞术，特别是FACS筛选与感兴趣的表面蛋白结合的抗体。由此将由步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与人类细胞系接触。由于用于免疫的非人类细胞系还与对感兴趣的细胞表面蛋白非特异性的抗体结合，因此不使用用于免疫的该细胞系进行筛选。由于对感兴趣的人类细胞表面蛋白特异性的抗体与表达感兴趣的细胞表面蛋白的人类细胞系结合，但是对该感兴趣的人类细胞表面蛋白非特异性的抗体基本上不与该人类细胞系结合，因此在筛选步骤中采用该表达感兴趣的细胞表面蛋白的人类细胞系是有利的。因此，在筛选步骤中，利用该人类细胞系可以将与感兴趣的细胞表面蛋白特异性结合的抗体和非特异性结合的抗体区分开来。
为了使筛选步骤更加有效，可以将多个板的上清液汇合，并以单个步骤进行分析。例如，可以将2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个孔中的上清液汇合。优选地，可以将4个孔中的上清液汇合并通过初次筛选步骤进行分析。如果从多个孔中汇合的上清液表现出抗体结合，则可以在二次筛选步骤中对单个孔中的上清液进行单独分析。
由步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体可以与不表达内源性感兴趣的细胞表面蛋白的人类细胞混合物接触，该人类细胞混合物包括：
(i)第一限定比例的人类细胞混合物，其表达感兴趣的功能性细胞表面蛋白；和
(ii)第二限定比例的人类细胞混合物，其不表达感兴趣的功能性细胞表面蛋白并包含选择标记物。
如在本文中所使用的，术语“选择标记物”可以是指可以在流式细胞术，特别是FACS中使用的标记物。对于FACS，通常使用荧光标记物。技术人员知晓可以用于FACS的不同荧光标记物，例如但不限于在细胞系中表达的荧光蛋白，例如但不限于GFP、YFP或DsRed或其衍生物。在一些实施方式中，第一限定比例的细胞和第二限定比例的细胞可以包含选择标记物，但是该选择标记物的水平在这两种比例中可以不同，以允许将这两种比例区分开来。例如，选择标记物可以以中等水平存在于第一限定比例中，并且可以以较高水平存在于第二限定比例中。
本发明的一个方面涉及用于产生与感兴趣的细胞表面蛋白结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供小鼠细胞，其不表达内源性感兴趣的细胞表面蛋白但表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的细胞表面蛋白；
(b)用步骤(a)所提供的小鼠细胞系免疫非人类动物；
(c)由步骤(b)的经过免疫的非人类动物产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与不表达内源性感兴趣的细胞表面蛋白的人类细胞混合物接触来筛选与感兴趣的细胞表面蛋白结合的抗体，该人类细胞混合物包含：
(i)第一限定比例的人类细胞混合物，其表达感兴趣的功能性细胞表面蛋白；和
(ii)第二限定比例的人类细胞混合物，其不表达感兴趣的功能性细胞表面蛋白并包含选择标记物。
其中，非人类动物是小鼠或大鼠。
本发明的一个方面涉及用于产生与感兴趣的细胞表面蛋白结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供小鼠细胞，其不表达内源性感兴趣的细胞表面蛋白但表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的细胞表面蛋白；
(b)用步骤(a)所提供的小鼠细胞系免疫大鼠；
(c)由步骤(b)的经过免疫的大鼠产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与不表达内源性感兴趣的细胞表面蛋白的人类细胞混合物接触来筛选与感兴趣的细胞表面蛋白结合的抗体，该人类细胞混合物包含：
(i)第一限定比例的人类细胞混合物，其表达感兴趣的功能性细胞表面蛋白；和
(ii)第二限定比例的人类细胞混合物，其不表达感兴趣的功能性细胞表面蛋白并包含选择标记物。
本发明的另一方面涉及用于产生与感兴趣的细胞表面蛋白结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供小鼠细胞，其不表达内源性感兴趣的细胞表面蛋白但表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的细胞表面蛋白；
(b)用步骤(a)所提供的小鼠细胞系免疫非人类动物；
(c)由步骤(b)的经过免疫的非人类动物产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与不表达内源性感兴趣的细胞表面蛋白但表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的细胞表面蛋白的人类细胞接触来筛选与感兴趣的细胞表面蛋白结合的抗体；
其中非人类动物是小鼠或大鼠。
作为非限制性的实施例，显示了与TCR结合的抗体的产生。
因此，一个实施方式涉及用于产生与感兴趣的TCR结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供非人类细胞，其不表达内源性感兴趣的TCR但表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的TCR；
(b)用步骤(a)所提供的细胞系免疫非人类动物；
(c)由步骤(b)的经过免疫的非人类动物产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与不表达内源性感兴趣的TCR但表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的TCR的人类细胞接触来筛选与感兴趣的表面蛋白结合的抗体。
步骤(a)提供的细胞系可以是小鼠BW-/-细胞系。
术语“BW-/-细胞系”是指源自在AKR小鼠体内自发产生的亲本BW5147胸腺瘤的BW细胞系(Lee NE and Davis MM.,J Immunol.1988Mar 1；140(5):1665-75；Letourneur F.,Malissen B.,Eur J Immunol.1989；19(12):2269-2274)，其既不表达内源性TCRα链也不表达内源性TCRβ链。由于TCR异源二聚体的表面表达依赖于与CD3蛋白质复合体的联合，因此将BW-/-细胞系稳定转导以共表达人类CD3与GFP(BW-/--CD3-GFP；在本文中简称为BW-/-)，使得能够易于识别经过转导的细胞。人类CD3的存在使得这些细胞在细胞表面表达任何人类或小鼠转基因的TCR。
步骤(d)的人类细胞系可以是Jurkat-/-细胞系。
术语“Jurkat-/-”和“Jurkat76-/-”是指人类Jurkat76-/-细胞系，其是不表达人类Vα链和Vβ链的原始的人类TCL细胞系的变体(Abraham RT,Weiss A.,Nat RevImmunol.2004Apr；4(4):301-8)。它具有转基因的TCR表面表达所需要的所有其余的TCR相关的CD3元件。
另一实施方式涉及用于产生与感兴趣的TCR结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供小鼠BW-/-细胞系，其表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的TCR；
(b)用步骤(a)所提供的细胞系免疫非人类动物；
(c)由步骤(b)的经过免疫的非人类动物产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与不表达内源性感兴趣的TCR但表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的TCR的Jurkat-/-细胞接触来筛选与感兴趣的表面蛋白结合的抗体。
另一实施方式涉及用于产生与感兴趣的TCR结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供小鼠BW-/-细胞系，其表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的TCR；
(b)用步骤(a)所提供的细胞系免疫非人类动物；
(c)由步骤(b)的经过免疫的非人类动物产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与不表达内源性感兴趣的TCR的Jurkat-/-细胞的混合物接触来筛选与感兴趣的TCR结合的抗体，该Jurkat-/-细胞的混合物包含：
(i)第一限定比例的Jurkat-/-细胞的混合物，其表达感兴趣的TCR；和
(ii)第二限定比例的Jurkat-/-细胞的混合物，其不表达感兴趣的功能性TCR并且包含选择标记物。
另一个实施方式涉及产生与感兴趣的TCR结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供小鼠BW-/-细胞系，其表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的TCR；
(b)用步骤(a)所提供的细胞系免疫大鼠；
(c)由步骤(b)的大鼠产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与不表达内源性感兴趣的TCR的Jurkat-/-细胞的混合物接触来筛选与感兴趣的TCR结合的抗体，该Jurkat-/-细胞的混合物包含：
(i)第一限定比例的Jurkat-/-细胞的混合物，其表达感兴趣的TCR；和
(ii)第二限定比例的Jurkat-/-细胞的混合物，其不表达感兴趣的TCR并且包含选择标记物。
另一个实施方式涉及产生与感兴趣的TCR结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供小鼠细胞，其不表达内源性感兴趣的TCR但表达包含至少一段人类片段的外源性感兴趣的TCR；
(b)用步骤(a)所提供的细胞系免疫大鼠；
(c)由步骤(b)的大鼠产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与不表达内源性感兴趣的TCR的人类细胞的混合物接触来筛选与感兴趣的表面蛋白结合的抗体，该人类细胞的混合物包含：
(i)第一限定比例的人类细胞的混合物，其表达感兴趣的TCR；和
(ii)第二限定比例的人类细胞的混合物，其不表达感兴趣的TCR并且包含选择标记物。
在具体的实施方式中，本发明涉及产生与至少一种TCR Vα链结合或与至少一种TCR Vβ链结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供非人类细胞，其既不表达内源性TCRα链也不表达内源性TCRβ链但是表达包括可变人类TCR Vα链的外源性TCRα链和包括可变人类TCRβ链的外源性TCRβ链；
(b)用步骤(a)所提供的细胞系免疫非人类动物；
(c)由步骤(b)的经过免疫的非人类动物产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与既不表达内源性TCRα链也不表达内源性TCRβ链的人类细胞的混合物接触来筛选与至少一种TCR Vα链结合或与至少一种TCR Vβ链结合的抗体，该人类细胞的混合物包含：
(i)第一限定比例的人类细胞的混合物，其包含具有由步骤(a)所提供的非人类细胞表达的TCR链的TCR，
(ii)第二限定比例的人类细胞的混合物，其不包含具有由步骤(a)所提供的非人类细胞系表达的TCR链的TCR，但包含具有与由步骤(a)所提供的非人类细胞表达的TCR链不同的TCR链的TCR，和
(iii)第三限定比例的人类细胞的混合物，其不包含功能性TCR但包含选择标记物。
在具体的实施方式中，本发明涉及产生与至少一种T细胞受体可变α链(TCR Vα)结合或与至少一种T细胞受体可变β链(TCR Vβ)结合的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供非人类细胞，其既不表达内源性TCRα链也不表达内源性TCRβ链但是表达包括可变人类TCR Vα链的外源性TCRα链和包括可变人类TCRβ链的外源性TCRβ链；
(b)用步骤(a)所提供的细胞系免疫非人类动物；
(c)由步骤(b)的经过免疫的非人类动物产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与既不表达内源性TCRα链也不表达内源性TCRβ链的人类细胞的混合物接触来筛选与至少一种TCR Vα链结合或与至少一种TCR Vβ链结合的抗体，该人类细胞的混合物包含：
(i)第一限定比例的人类细胞的混合物，其包含具有由步骤(a)所提供的非人类细胞表达的TCR链的TCR，
(ii)第二限定比例的人类细胞的混合物，其不包含具有由步骤(a)所提供的非人类细胞系表达的TCR链的TCR，但包含具有与由步骤(a)所提供的非人类细胞表达的TCR链不同的TCR链的TCR，和
(iii)第三限定比例的人类细胞的混合物，其不包含功能性TCR但包含选择标记物；
其中非人类动物是小鼠或大鼠，并且步骤(a)所提供的非人类细胞是小鼠细胞系。
某些实施方式包括鉴定与包含至少两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的部分的TCR Vα链结合或者与包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链结合的抗体的步骤，包括以下步骤：
(i)将人类外周血淋巴细胞(PBL)与步骤(d)所鉴定出的与至少一种TCR Vα链结合或与至少一种TCR Vβ链结合的抗体一起孵育；
(ii)通过FACS分选，筛选与该抗体结合的细胞；
(iii)分析与步骤(ii)的抗体结合的细胞的TCR Vα链库或TCR Vβ链库；
其中包含至少两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的TCR Vα链库指示该抗体与包含至少两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的部分的TCR Vα链结合，或者包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的TCR Vβ链库指示该抗体与包含至少两种不同TCRVβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链结合。
例如，本发明的一个实施方式涉及产生抗体的方法，该抗体与包含至少两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的部分的TCR Vα链结合或者与包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链结合，该方法包括以下步骤：
(a)提供非人类细胞，其既不表达内源性TCRα链也不表达内源性TCRβ链但是表达包括可变人类TCR Vα链的外源性TCRα链和包括可变人类TCRβ链的外源性TCRβ链；
(b)用步骤(a)所提供的细胞系免疫非人类动物；
(c)由步骤(b)的经过免疫的非人类动物产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与既不表达内源性TCRα链也不表达内源性TCRβ链的人类细胞的混合物接触来筛选与至少一种TCR Vα链结合或与至少一种TCR Vβ链结合的抗体，该人类细胞的混合物包含：
(i)第一限定比例的人类细胞的混合物，其包含具有由步骤(a)所提供的非人类细胞表达的TCR链的TCR，
(ii)第二限定比例的人类细胞的混合物，其不包含具有由步骤(a)所提供的非人类细胞系表达的TCR链的TCR，但包含具有与由步骤(a)所提供的非人类细胞表达的TCR链不同的TCR链的TCR，和
(iii)第三限定比例的人类细胞的混合物，其不包含功能性TCR但包含选择标记物；
其中非人类动物是小鼠或大鼠，并且步骤(a)所提供的非人类细胞是小鼠细胞系。
(e)鉴定与包含至少两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的部分的TCR Vα链结合或者与包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链结合的抗体，包括以下步骤：
(i)将人类外周血淋巴细胞(PBL)与步骤(d)所鉴定出的与至少一种TCR Vα链结合或与至少一种TCR Vβ链结合的抗体一起孵育；
(ii)通过FACS分选，筛选与该抗体结合的细胞；
(iii)分析与步骤(ii)的抗体结合的细胞的TCR Vα链库或TCR Vβ链库；
其中包含不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的TCR Vα链库指示该抗体与包含至少两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的部分的TCR Vα链结合，或者包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的TCR Vβ链库指示该抗体与包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链结合。
本发明的另一实施方式涉及产生抗体的方法，该抗体与包含至少两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的部分的TCR Vα链结合或者与包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链结合，该方法包括以下步骤：
(a)提供小鼠细胞，其既不表达内源性TCRα链也不表达内源性TCRβ链但是表达包括可变人类TCR Vα链的外源性TCRα链和包括可变人类TCRβ链的外源性TCRβ链；
(b)用步骤(a)所提供的细胞系免疫大鼠；
(c)由步骤(b)的经过免疫的大鼠产生杂交瘤；
(d)通过使步骤(c)的杂交瘤分泌的抗体与既不表达内源性TCRα链也不表达内源性TCRβ链的人类细胞的混合物接触来筛选与至少一种TCR Vα链结合或与至少一种TCR Vβ链结合的抗体，该人类细胞的混合物包含：
(i)第一限定比例的人类细胞的混合物，其包含具有由步骤(a)所提供的非人类细胞表达的TCR链的TCR，
(ii)第二限定比例的人类细胞的混合物，其不包含具有由步骤(a)所提供的非人类细胞系表达的TCR链的TCR，但包含具有与由步骤(a)所提供的非人类细胞表达的TCR链不同的TCR链的TCR，和
(iii)第三限定比例的人类细胞的混合物，其不包含功能性TCR但包含选择标记物；
其中非人类动物是小鼠或大鼠，并且步骤(a)所提供的非人类细胞是小鼠细胞系。
(e)鉴定与包含至少两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的部分的TCR Vα链结合或者与包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链结合的抗体，包括以下步骤：
(i)将人类外周血淋巴细胞(PBL)与步骤(d)所鉴定出的与至少一种TCR Vα链结合或与至少一种TCR Vβ链结合的抗体一起孵育；
(ii)通过FACS分选，筛选与该抗体结合的细胞；
(iii)分析与步骤(ii)的抗体结合的细胞的TCR Vα链库或TCR Vβ链库；
其中包含不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的TCR Vα链库指示该抗体与包含至少两种不同TCR Vα链但少于所有TCR Vα链的部分的TCR Vα链结合，或者包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的TCR Vβ链库指示该抗体与包含至少两种不同TCR Vβ链但少于所有TCR Vβ链的部分的TCR Vβ链结合。
例如，可以通过PCR或第二代测序方法来分析TCR Vα链库或TCR Vβ链库。鉴定核酸序列的方法是本领域技术人员熟知的。
TCR文库
另一方面，本申请涉及表达所有功能性TCR类型的文库，该文库包括各自编码45种不同TCRα链中的一种的45种TCR构建体和各自编码47种不同TCRβ链中的一种的47种TCR构建体，
其中编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的一种包含以下结构单元：
-可变AV1段至AV45段中的一种，和
-恒定AC段；和
其中编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的一种包含以下结构单元：
-可变BV1段至BV47段中的一种，和
-恒定BC段。
某些实施方式涉及表达所有功能性TCR类型的文库，该文库包括各自编码45种不同TCRα链中的一种的45种TCR构建体和各自编码47种不同TCRβ链中的一种的47种TCR构建体，
其中编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的一种包含以下结构单元：
(i)可变AV1段至AV45段中的一种；
(ii)对A段具有特异性的接头序列；和
(iii)恒定AC段；和
其中编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的一种包含：
(i)可变BV1段至BV47段中的一种，
(ii)对B段具有特异性的接头序列，和
(iii)恒定BC段。
具体地，本申请涉及用于表达所有功能性TCR类型的文库，其包含各自编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体，
其中编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含以下结构单元：
-编码可变TCRα链区的可变AV段之一，其与SEQ ID No：100至SEQ ID No：144所示序列具有至少80％的同一性，和
-恒定AC段；和
其中编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含：
-编码可变TCRβ链区的可变BV段之一，其与SEQ ID No：145至SEQ ID No：191所示序列具有至少80％的同一性，和
-恒定BC段。
本申请还涉及用于表达功能性TCR类型的文库，其包含至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种选自由各自编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体所组成的组的TCR构建体，和至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种选自由各自编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体所组成的组的TCR构建体，
其中编码45种不同TCRα链之一的TCR构建体中的每一种包含以下结构单元：
-编码可变TCRα链区的可变AV段之一，其与SEQ ID No：100至SEQ ID No：144所示序列具有至少80％的同一性，和
-恒定AC段；
并且其中编码47种不同TCRβ链之一的TCR构建体中的每一种包含：
-编码可变TCRβ链区的可变BV段之一，其与SEQ ID No：145至SEQ ID No：191所示序列具有至少80％的同一性，和
-恒定BC段。
本申请还涉及用于表达功能性TCR类型的文库，其包含
(i)至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种的各自编码45种不同TCRα链之一的TCR构建体和至少一种TCRβ链，或
(ii)至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种的各自编码47种不同TCRβ链之一的TCR构建体和至少一种TCRα链，
其中编码45种不同TCRα链之一的TCR构建体中的每一种包含以下结构单元：
-编码可变TCRα链区的可变AV段之一，其与SEQ ID No：100至SEQ ID No：144所示序列具有至少80％的同一性，和
-恒定AC段；和
其中编码47种不同TCRβ链之一的TCR构建体中的每一种包含：
-编码可变TCRβ链区的可变BV段之一，其与SEQ ID No：145至SEQ ID No：191所示序列具有至少80％的同一性，和
-恒定BC段。
术语“功能性TCR类型”是指由在T细胞上表达的TCR可变链组成的TCR。“TCR受体构建体”是指编码TCRα链或TCRβ链的核酸序列。
如在本文中所使用的，术语“结构单元”是指用于表达TCR的TCR文库和表达系统的元件，如可变AV段和AB段、恒定AC段和BC段、接头序列和骨架载体。
对A段具有特异性的接头序列可以是本领域技术人员认为可用于将可变AV段与恒定AC段连接的任何序列。该接头可以含有可用于重组的序列，例如但不限于一个或多个限制性位点，或者可以含有可用于通过克隆来修饰TCR构建体的序列。此外，该接头可以含有任何的AJ序列和/或CDR3序列，使得构建体由以下组成：(i)一种可变AV段，(ii)对A段具有特异性的接头序列，和(iii)编码功能性TCRα链的恒定AC段。在具体实施方式中，该接头序列具有与SEQ ID No：192所示的序列具有至少90％同一性的序列，或者与SEQ ID No：194所示的序列具有至少90％同一性的序列。在更具体的实施方式中，该接头序列具有SEQ IDNo：192所示的序列和SEQ ID No：194所示的序列。在本申请中，术语“对A段具有特异性的接头序列”和术语“将AV段的3'-末端与AC段的5'-末端连接的接头序列”是可互换使用的。
对B段具有特异性的接头序列可以是本领域技术人员认为可用于将可变BV段与恒定BC段连接的任何序列。该接头可以含有一个或多个限制性位点，或者可以含有可用于通过克隆来修饰TCR构建体的序列。此外，该接头可以含有任何的BD序列、BJ序列和/或CDR3序列，使得构建体由以下组成：(i)一种可变BV段，(ii)对B段具有特异性的接头序列，和(iii)编码功能性TCRβ链的恒定BC段。在具体实施方式中，该接头序列具有与SEQ ID No：193所示的序列具有至少90％同一性的序列，或者与SEQ ID No：195所示的序列具有至少90％同一性的序列。在更具体的实施方式中，该接头序列具有SEQ ID No：193所示的序列和SEQ IDNo：195所示的序列。在本申请中，术语“对B段具有特异性的接头序列”和术语“将BV段的3'末端与BC段的5'末端连接的接头序列”是可互换使用的。
AC段和BC段可以属于鼠源区段、最小程度鼠源化的人类区段、经过半胱氨酸改造的人类区段或野生型人类区段或其组合。
这些修饰可以改善TCRα链和TCRβ链的配对。“经过半胱氨酸改造的”AC段和BC段编码每个TCR链中的单个氨基酸突变成半胱氨酸，并导致将连接TCRα链C区和TCRβ链C区的额外二硫键的形成(Cohen,C.J.,Li,Y.F.,El-Gamil,M.,Robbins,P.F.,Rosenberg,S.a,&Morgan,R.a.(2007),Cancer Research,67(8),3898–903.)。这减少了混合的TCR配对并增强了经过TCR基因修饰的T细胞的功能。因此，具有鼠源C区的人类TCR使得TCR的表达更稳定，这种所谓的“鼠源化”与野生型(wt)人类TCR相比增加了这些杂交TCR的细胞表面表达，并导致用不同TCR修饰的T细胞的功能性亲合力更高(Cohen,C.J.,Zhao,Y.,Zheng,Z.,Rosenberg,S.a,&Morgan,R.a.(2006).Cancer Research,66(17),8878–86)。可替换地，AC段和BC段可以是最小程度鼠源化的，即保证与完全置换的人类C区的TCR细胞表面表达相当的在鼠源TCRα链和β链的C区内的关键氨基酸被交换(Sommermeyer,D.,&Uckert,W.(2010)；Journal of Immunology(Baltimore,Md.:1950),184(11),6223–31.)。还可以参见图8。在优选的实施方式中，AC段和BC段属于鼠源区段或人类区段。
在另一个实施方式中，可变AV段和可变BV段属于人类区段或鼠源区段。在优选的实施方式中，可变AV段和可变BV段属于人类区段。在甚至更优选的实施方式中，AC段和BC段属于鼠源区段，并且可变AV段和可变BV段属于人类区段。
具体地，如果利用TCR以用于非治疗性用途，如产生TCR特异性的抗体，则有利的是AC段和BC段属于鼠源区段且可变AV段和可变BV段属于人类区段。
在另一优选的实施方式中，AC段和BC段属于人类区段，且可变AV段和可变BV段也属于人类区段。
具体地，如果将由本文所描述的文库产生的TCR用于治疗，则有利的是AC段和BC段属于人类区段并且可变AV段和可变BV段也属于人类区段。
可以对TCR构建体的序列进行修饰，例如但不限于其可以是密码子优化的，或者例如可以通过核苷酸交换来插入其它限制性位点。在优选的实施方式中，对TCR构建体的序列进行密码子优化以用于在哺乳动物细胞内表达，优选在人类细胞内表达。可替换地，可以不对TCR构建体的序列进行修饰。
例如，由于SEQ ID No：1还含有DraIII限制性位点，因此SEQ ID No：1是编码人类恒定α区的核苷酸序列SEQ ID No：2的修饰形式。另一实例是SEQ ID No：4，由于它还包含BstEII限制性位点，因而其是编码人类恒定β区的核苷酸序列SEQ ID No：5的修饰形式。
将TCR构建体的结构单元构建为使得它们可以容易地被交换，例如，通过单个克隆步骤。这表示该元件含有相容的组合位点，即所有AV段包含可以与骨架载体的3'-末端组合位点组合的5'末端组合位点，并且其还包含可以与对A段具有特异性的接头序列组合的其3'末端组合位点。此外，所有AC段包含可以与对A段具有特异性的接头序列组合的其5'末端组合位点，并且其还包含可以与骨架载体的5'-末端组合的其3'末端组合位点。因此，对A段具有特异性的接头序列包含可以与AV段的3'-末端组合位点组合的其5'末端组合位点，并且其还包含可以与AC段的5'-末端组合位点组合的其3'末端组合位点。另外，所有BV段包含可以与骨架载体的3'-末端组合位点组合的5'末端组合位点，并且其还包含可以与对B段具有特异性的接头序列组合的其3'末端组合位点。另外，所有BC段包含可以与对B段具有特异性的接头序列组合的其5'末端组合位点，并且其还包含可以与骨架载体的5'-末端组合的其3'末端组合位点。因此，对B段具有特异性的接头序列包含可以与BV段的3'-末端组合位点组合的其5'末端组合位点，并且其还包含可以与BC段的5'-末端组合位点组合的其3'末端组合位点。简而言之，该结构单元包含至少一种5'末端组合位点和至少一种3'末端组合位点。更具体地，第一结构单元的3'末端组合位点与第二结构单元的5'末端组合位点相容，该第二结构单元的5'末端组合位点连接至第一结构单元的3'末端。
如在本文中所使用的，术语“组合位点”是指可用于克隆以交换载体中的序列的任何序列，例如但不限于限制性位点、重组序列或用于无缝克隆技术的同源性区域。
例如，所有AV段包含可以与骨架载体的3'-末端限制性位点组合的5'末端限制性位点，并且其还包含可以与对A段具有特异性的接头序列组合的其3'末端限制性位点。此外，所有AC段包含可以与对A段具有特异性的接头序列组合的其5'末端限制性位点，并且其还包含可以与骨架载体的5'-末端组合的其3'末端限制性位点。因此，对A段具有特异性的接头序列包含可以与AV段的3'-末端限制性位点组合的其5'末端限制性位点，并且其还包含可以与AC段的5'-末端限制性位点组合的其3'末端限制性位点。另外，所有BV段包含可以与骨架载体的3'-末端限制性位点组合的5'末端限制性位点，并且其还包含可以与对B段具有特异性的接头序列组合的3'末端限制性位点。另外，所有BC段包含可以与对B段具有特异性的接头序列组合的其5'末端限制性位点，并且其还包含可以与骨架载体的5'-末端组合的其3'末端限制性位点。因此，对B段具有特异性的接头序列包含可以与BV段的3'-末端限制性位点组合的其5'末端限制性位点，并且其还包含可以与BC段的5'-末端限制性位点组合的其3'末端限制性位点。
在某些实施方式中，该文库可以含有不同类型的AV段，如在其3’末端和其5’末端具有相同限制性位点的鼠源AV段，最小程度鼠源化的、经过半胱氨酸改造的或野生型的人类AV段，从而使得它们可以容易地被交换。因此，该文库可以含有不同类型的BV段，如在其3’末端和其5’末端具有相同限制性位点的鼠源BV段，最小程度鼠源化的、经过半胱氨酸改造的或野生型的人类BV段，从而使得它们可以容易地被交换。
在某些实施方式中，该文库可以含有不同类型的AC段，如在其3’末端和其5’末端具有相同限制性位点的鼠源AC段，最小程度鼠源化的、经过半胱氨酸改造的或野生型的人类AC段，从而使得它们可以容易被交换。因此，该文库可以含有不同类型的BC段，如在其3’末端和其5’末端具有相同限制性位点的鼠源BC段，最小程度鼠源化的、经过半胱氨酸改造的或野生型的人类BC段，从而使得它们可以容易地被交换。
在某些实施方式中，可变AV段的前端是NotI和/或AgeI限制性位点，后端是FspI限制性位点。
在某些实施方式中，对A段具有特异性的接头序列的前端是FspI限制性位点，后端是DraIII限制性位点。在某些实施方式中，对A段具有特异性的接头序列的前端是FspI限制性位点，后端是BspEI和/或DraIII限制性位点。
在某些实施方式中，对A段具有特异性的接头序列的前端是FspI限制性位点，后端是BspEI限制性位点。
在某些实施方式中，恒定AC段的前端是BspEI和/或DraIII限制性位点，后端是MluI和/或ClaI和/或EcoRI限制性位点。
在某些实施方式中，恒定AC段的前端是BspEI限制性位点，后端是MluI和/或ClaI和/或EcoRI限制性位点。
在具体实施方式中，可变AV段的前端是NotI和/或AgeI限制性位点，后端是FspI限制性位点。对A段具有特异性的接头序列的前端是FspI限制性位点，后端是BspEI和/或DraIII限制性位点。恒定AC段的前端是BspEI和/或DraIII限制性位点，后端是MluI和/或ClaI和/或EcoRI限制性位点。
在某些实施方式中，可变BV段的前端是NotI和/或AgeI限制性位点，后端是FspI限制性位点。
在某些实施方式中，对B段具有特异性的接头序列的前端是FspI限制性位点，后端是BstEII限制性位点。
在某些实施方式中，恒定BC段的前端是BspEII限制性位点，后端是MluI、ClaI和EcoRI限制性位点。
在某些实施方式中，恒定BC段的前端是BspEII限制性位点，后端是EcoRI限制性位点。
在具体实施方式中，可变BV段的前端是NotI和/或AgeI限制性位点，后端是FspI限制性位点。对B段具有特异性的接头序列的前端是FspI限制性位点，后端是BstEII限制性位点。恒定BC段的前端是BspEII限制性位点，后端是MluI、ClaI和EcoRI限制性位点。
因此，可以以单个克隆步骤替换可变片段、接头序列和C段。此外，TCR构建体和骨架载体的限制性位点的独特设计不仅允许TCR及其CDR3区的可变链和恒定链进行有效交换，而且还有助于易于ivtRNA产生载体和/或病毒转染载体之间的转换。
因此，具体的实施方式涉及用于表达所有功能性TCR类型的文库，该文库包含各自编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体，和各自编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体，
其中编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含：
(i)可变AV1段至AV45段之一，其包含5'末端的NotI和/或AgeI限制性位点和3'末端的FspI限制性位点
(ii)对A段具有特异性的接头序列，其包含5’末端的FspI限制性位点和3’末端的BspEI限制性位点，和
(iii)恒定AC段，其包含5'-末端的BspEI和/或DraIII限制性位点和3’末端的MluI和/或ClaI和/或EcoRI限制性位点；和
其中编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含：
(i)可变BV1段至BV47段之一，其包含5'末端的NotI和/或AgeI限制性位点和3'末端的FspI限制性位点，
(ii)对B段具有特异性的接头序列，其包含5’末端的FspI限制性位点和3’末端的BstEII限制性位点，和
(iii)恒定BC段，其包含5'-末端的BspEII限制性位点并且之后是3’末端的MluI、ClaI和EcoRI限制性位点。
因此，在用于表达本文所描述的TCR的表达系统中，骨架载体包含用于引入文库构建体的相容性组合位点。在具体实施方式中，在用于表达本文所描述的TCR的表达系统中，骨架载体包含用于引入文库构建体的相容性限制性位点。
例如，AC段可以具有与SEQ ID NO：1、2或6所示的序列具有至少90％同一性的序列，并且BC段可以具有与SEQ ID NO：3、4、5或7所示的序列具有至少90％同一性的序列。特别地，AC段可以具有SEQ ID No：1、2或6所示的序列，并且BC段可以具有SEQ ID No：3、4、5或7所示的序列。
可变AV段AVseg1至AVseg45可以具有与SEQ ID No：8至SEQ ID No：52所示的序列具有至少90％同一性的序列，并且可变BV段(BV1段至BV47段)可以具有与SEQ ID No：53至SEQ ID No：99所示的序列具有至少90％同一性的序列。特别地，可变AV1段至AV45段可以具有SEQ ID No：8至SEQ ID No：52所示的序列，并且可变BV1段至BV47段可以具有SEQ ID No：53至SEQ ID No：99所示的序列。
将TCR构建体整合到至少一个骨架载体中。
如在本文中所使用的，术语“载体”旨在表示一种核酸分子，其能够运输已经与其连接的另一核酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以将另外DNA段与之连接的环状双链DNA环。其它载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外DNA段连接到病毒基因组中。某些载体能够在将其引入的宿主细胞内进行自主复制(例如，具有在宿主细胞内起作用的复制起点的载体)。其它载体可以在导入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些优选的载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。骨架载体可以是环状或线性的核酸分子，可以将插入序列整合至其中，使得插入序列能够进行复制。载体可以包括多个载体元件中的任一种，例如下面所描述的那些。可以采用体外法和体内法的组合来制备载体，如在Sambrook,J.等人，"分子克隆：试验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)"中所描述的那些，通过引用将其并入本文。载体的代表性实例包括但不限于体外转录mRNA(ivtRNA)骨架载体、转座子载体(例如，“睡美人”转座子系统)、腺病毒骨架载体、逆转录病毒骨架载体、慢病毒骨架载体，包括第二代SIN逆转录病毒载体或慢病毒载体。
载体还可以包含插入位点，其可以用于克隆核酸。插入位点可以是内切核酸酶的识别位点，如I型、II型或III型限制酶、归巢内切核酸酶或切口酶。插入位点也可以是用于同源重组的特异性位点。插入位点可以仅在插入位点处存在于载体中。在某些情况下，可能需要从载体中除去其它插入位点。例如，在插入位点是限制酶的识别位点时，可能需要从染色体上除去其它的这类识别位点。
I型限制酶的代表性实例包括但不限于CfrAI、Eco377I、Eco394I、Eco585I、Eco646I、Eco777I、Eco826I、Eco851I、Eco912I、EcoAI、EcoBI、EcoDI、EcoDR2、EcoDR3、EcoDXXI、EcoEI、EcoKI、EcoprrI、EcoR124I、EcoR124II、EcoRD2、EcoRD3、HindI、KpnAI、KpnBI、NgoAV、StyLTIII、StySBLI、StySEAI、StySGI、StySJI、StySKI、StySPI和StySQI。III型限制酶的代表性实例包括但不限于EcoP15I、EcoPI、HinfIII和StyLTI。II型限制酶的代表性实例包括但不限于AarI、AatII、AccI、AceIII、AciI、AclI、AcyI、AflII、AflIII、AgeI、AhaIII、AjuI、AlfI、AloI、AluI、AlwFI、AlwNI、ApaBI、ApaI、ApaLI、ApoI、AscI、AspCNI、AsuI、AsuII、AvaI、AvaII、AvaIII、AvrII、BaeI、Ball、BamHI、BbvCI、BbvI、BbvII、BccI、Bce83I、BcefI、BcgI、BciVI、BelI、BdaI、BetI、BfiI、BglI、BglII、BinI、BmgI、BplI、Bpu10I、BsaAI、BsaBI、BsaXI、BsbI、BscGI、BseMII、BsePI、BseRI、BseSI、BseYI、BsgI、BsiI、BsiYI、BsmAI、BsmI、Bsp1407I、Bsp24I、BspGI、BspHI、BspLU11I、BspMI、BspMII、BspNCI、BsrBI、BsrDI、BsrI、BstEII、BstXI、BtgZI、BtrI、BtsI、Cac8I、CauII、CdiI、Cfr10I、CfrI、CjeI、CjeNII、CjePI、ClaI、CspCI、CstMI、CviJI、CviRI、DdeI、DpnI、DraII、DraIII、DrdI、DrdII、DsaI、Eam1105I、EciI、Eco31I、Eco47III、Eco57I、Eco57MI、EcoNI、EcoRI、EcoRII、EcoRV、Esp3I、EspI、FalI、FauI、FinI、Fnu4HI、FnuDII、FokI、FseI、FspI、GdiII、GsuI、Hael、HaeII、HaeIII、HaeIV、HgaI、HgiAI、HgiCI、HgiEII、HgiJII、HhaI、Hin4I、Hin4II、HindII、HindIII、HinfI、HpaI、HpaII、HphI、Hpy178III、Hpyl88I、Hpy99I、KpnI、Ksp632I、MaeI、MaeII、MaeIII、MboI、MboII、McrI、MfeI、MjaIV、MluI、Mmel、MnlI、MseI、MslI、MstI、MwoI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NheI、NlaIII、NlaIV、NotI、NruI、NspBII、NspI、OliI、PacI、PasI、Pfl1108I、PflMI、PfoI、PleI、PmaCI、PmeI、PpiI、PpuMI、PshAI、PsiI、PspXI、PsrI、PstI、PvuI、PvuII、RleAI、RsaI、RsrII、SacI、SacII、SalI、SanDI、SapI、SauI、ScaI、ScrFI、SduI、SecI、SexAI、SfaNI、SfeI、SfiI、SgfI、SgrAI、SgrDI、SimI、SmaI、SmlI、SnaBI、SnaI、SpeI、SphI、SplI、SrfI、Sse232I、Sse8387I、Sse8647I、SsmI、SspI、Sth132I、StuI、StyI、SwaI、TaqI、TaqII、TatI、TauI、TfiI、TseI、TsoI、Tsp45I、Tsp4CI、TspDTI、TspEI、TspGWI、TspRI、TssI、TstI、TsuI、Tth111I、Tth111II、UbaF10I、UbaF9I、UbaPI、VspI、XbaI、XcmI、XhoI、XhoII、XmaIII和XmnI。归巢内切核酸酶的代表性实例包括但不限于F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、F-TflI、F-TflII、F-TflIV(也称为HegA)、H-DreI、I-AmaI、I-AniI、I-BasI、I-Bmol、I-Ceul、I-CeuAIIP、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HspNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NclIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PbolP、I-PculP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PogI、I-PorI、I-PorIIP、I-PpbIP、I-PpoI、I-ScaI、I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-SneIP、I-SpomI、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiS3bP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-Tsp061I、I-TwoI、I-UarHGPA1P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MgaI、PI-MtuI、PI-MtuHIP、PI-MtuHIIP、PI-PabI、PI-PabII、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-PspI、PI-Rma43812IP、PI-ScaI、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、PI-TliII和PI-ZbaI。其它可能类型的内切核酸酶是以其识别位点的复杂性为特征的酶。这种酶的代表性实例是FseI。
载体可以包含多个插入位点，并且该多个插入位点可以聚集为部分的多克隆位点。载体还可以包含多于一个的可能相同的多克隆位点。
可以通过技术人员已知的克隆技术将构建体整合到骨架载体中。这些包括采用基于I型、II型、IIS型和IIG型限制酶的克隆方法，采用基于重组的克隆方法，如
Figure BDA0001566903780000511
克隆(Life technologies,ThermoFisher)，采用基于同源性的克隆方法，如Gibson
Figure BDA0001566903780000512
(NEB)、
Figure BDA0001566903780000513
(Life technologies，ThermoFisher)或
Figure BDA0001566903780000514
系统(Clonetech)无缝克隆。
在具体实施方式中，骨架是ivtRNA骨架载体或逆转录病毒骨架载体。
术语“ivtRNA骨架载体”是指可以用于体外转录RNA的任何载体。考虑在本发明中使用的ivtRNA骨架载体包括包含T7、T3和/或sp6启动子的那些。这类载体是本领域普通技术人员所熟知的。在一个实施方式中，ivtRNA骨架载体包含T7和/或sp6启动子。此外，ivtRNA骨架载体可以包含至少一种RNA稳定序列，如但不限于聚腺嘌呤尾。聚腺嘌呤尾可以包含至少40个腺嘌呤、至少60个腺嘌呤、至少80个腺嘌呤、至少90个腺嘌呤、至少100个腺嘌呤、至少110个腺嘌呤。
如在本文中所使用的，术语“逆转录病毒骨架载体”是指可以用于将所需DNA构建体整合到真核细胞的宿主基因组中的任何载体。技术人员知晓这类载体。考虑在本发明中使用的载体的非限制性实例是MP71逆转录病毒骨架载体(Schambach A,Wodrich H,Hildinger M,Bohne J,
Figure BDA0001566903780000521
HG,Baum C.,Mol Ther.2000Nov；2(5):435-45；Hildinger M,Abel KL,Ostertag W,Baum C.,J Virol.1999May；73(5):4083-9)。将含有候选DNA构建体的受体质粒(pR)用于病毒生产。随后利用携带转基因的逆转录病毒转导靶细胞。可以很容易地大量生产永久表达转基因蛋白质的经过转导的细胞。本领域技术人员知晓的是，逆转录病毒骨架载体可以包含如长末端重复序列(LTR)的元件。逆转录病毒骨架载体的设计是本领域普通技术人员已知的，并且在相关文本和文献(例如，“(逆转录病毒)Retroviruses”，Coffin JM等人编辑；1997)中进行了描述。
优选地，用CDR3A序列和AJ序列取代对A段具有特异性的接头序列产生编码功能性TCRα链的构建体，以及用CDR3B序列、BD区和BJ区取代对A段具有特异性的接头序列产生编码功能性TCRβ链的构建体。
在优选的实施方式中，寡核苷酸包含CDR3A序列和AJ序列、CDR3序列、BD区和BJ区。由此，在本文中所描述的文库允许通过经由寡核苷酸插入任何CDR3区来有效产生具有任何特异性的TCR。
在某些实施方式中，ivtRNA骨架载体具有与SEQ ID No：196所示序列具有至少90％同一性的序列。在具体实施方式中，ivtRNA骨架载体具有SEQ ID No：196所示的序列。在其它实施方式中，逆转录病毒骨架载体具有与SEQ ID No：200所示序列具有至少90％同一性的序列。在具体实施方式中，逆转录病毒骨架载体具有SEQ ID No：200所示的序列。
优选地，在编码一种TCRα链和一种TCRβ链的TCR构建体中，通过使得能够从载体表达多于一种蛋白质的元件将编码一种TCRα链的序列和编码一种TCRβ链的序列连接在一起。这类示例性元件包括但不限于内部核糖体进入位点(IRES)或核糖体跳跃元件。核糖体跳跃元件允许化学计量地产生由元件侧翼序列编码的蛋白质。这种元件侧翼序列阻止该核糖体与新插入的氨基酸共价连接，并使核糖体继续翻译，导致共翻译切割多聚蛋白质。优选的核糖体跳跃元件是P2A元件。
本发明的另一方面涉及用于表达TCR的表达系统，包含
-包含各自编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体的文库，
其中编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体中的一种包含：
(i)可变AV段AVseg1至AVseg45中的一种；
(ii)对A段具有特异性的接头序列；
其中编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体中的一种包含：
(i)可变BV段BVseg1至BVseg47中的一种；
(ii)对B段具有特异性的接头序列；和
-选自由以下所组成的组的ivtRNA骨架载体中的至少一种：
(i)包含AC段的ivtRNA骨架载体
(ii)包含BC段的ivtRNA骨架载体
(iii)包含AC段和BC段的ivtRNA骨架载体；和/或
-选自由以下所组成的组的逆转录病毒骨架载体中的至少一种：
(iv)包含AC段的逆转录病毒骨架载体
(v)包含BC段的逆转录病毒骨架载体
(vi)包含AC段和BC段的逆转录病毒骨架载体。
在本发明的某些实施方式中，如以上所描述的表达系统还包含选自由以下所组成的组的慢病毒骨架载体中的至少一种：
(vii)包含AC段的慢病毒骨架载体
(viii)包含BC段的慢病毒骨架载体
(ix)包含AC段和BC段的慢病毒骨架载体。
在某些实施方式中，包含AC段的ivtRNA骨架载体具有与SEQ ID NO：197所示的序列具有至少90％同一性的序列，和/或包含BC段的ivtRNA骨架载体具有与SEQ ID NO：198所示的序列具有至少90％同一性的序列，和/或包含AC段和BC段的ivtRNA骨架载体具有与SEQID NO：199所示的序列具有至少90％同一性的序列。在具体实施方式中，包含AC段的ivtRNA骨架载体具有SEQ ID NO：197所示的序列，和/或包含BC段的ivtRNA骨架载体具有SEQ IDNO：198所示的序列，和/或包含AC段和BC段的ivtRNA骨架载体具有SEQ ID NO：199所示的序列。
在其它实施方式中，包含AC段的逆转录病毒骨架载体具有与SEQ ID NO：201所示的序列具有至少90％同一性的序列，和/或包含BC段的逆转录病毒骨架载体具有与SEQ IDNO：202所示的序列具有至少90％同一性的序列，和/或包含AC段和BC段的逆转录病毒骨架载体具有与SEQ ID NO：203所示的序列具有至少90％同一性的序列。在具体实施方式中，包含AC段的逆转录病毒骨架载体具有SEQ ID NO：201所示的序列，和/或包含BC段的逆转录病毒骨架载体具有SEQ ID NO：202所示的序列，和/或包含AC段和BC段的逆转录病毒骨架载体具有SEQ ID NO：203所示的序列。
本发明的另一方面涉及用于表达TCR的表达系统，包含
-包含各自编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体的文库，
其中编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体中的一种包含可变AV段AVseg 1至AVseg 45中的一种；
其中编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体中的一种包含可变BV段BVseg 1至BVseg 47中的一种；和
-选自由以下所组成的组的ivtRNA骨架载体中的至少一种：
(i)包含AC段和对A段具有特异性的接头序列的ivtRNA骨架载体，
(ii)包含BC段和对B段具有特异性的接头序列的ivtRNA骨架载体，
(iii)包含AC段、对A段具有特异性的接头序列、BC段和对B段具有特异性的接头序列的ivtRNA骨架载体，和/或
-选自由以下所组成的组的逆转录病毒骨架载体中的至少一种：
(iv)包含AC段和对A段具有特异性的接头序列的逆转录病毒骨架载体，
(v)包含BC段和对B段具有特异性的接头序列的逆转录病毒骨架载体，
(vi)包含AC段、对A段具有特异性的接头序列、BC段和对B段具有特异性的接头序列的逆转录病毒骨架载体。
在一个实施方式中，该表达系统还包含选自由以下所组成的组的慢病毒骨架载体中的至少一种：
(vii)包含AC段的慢病毒骨架载体，
(viii)包含BC段的慢病毒骨架载体，
(ix)包含AC段和BC段的慢病毒骨架载体。
本领域技术人员理解的是，本发明还涵盖如上所述的包含ivtRNA骨架载体(i)至(iii)和逆转录病毒骨架载体(iv)至(vi)的表达系统。此外，明显的是上述表达系统可以包含ivtRNA骨架载体(i)至(iii)、逆转录病毒骨架载体(iv)至(vi)和慢病毒骨架载体(vii)至(ix)。
另一方面涉及表达TCR的细胞克隆文库，该文库包含表达45种不同TCRα链的细胞克隆群体和表达47种不同TCRβ链的细胞克隆群体，
其中每一种表达不同TCRα链的细胞克隆均包含如本文所述的编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的一种和一种编码TCRβ链的TCR构建体；和
其中每一种表达不同TCRβ链的细胞克隆均包含如本文所述的编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的一种和一种编码TCRα链的TCR构建体。
某些实施方式涉及表达TCR的细胞克隆文库，该文库包含表达45种不同TCRα链的细胞克隆群体和表达47种不同TCRβ链的细胞克隆群体，
其中每一种表达不同TCRα链的细胞克隆均包含根据权利要求1的编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的一种和一种编码TCRβ链的TCR构建体；和
其中每一种表达不同TCRβ链的细胞克隆均包含根据权利要求1的编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的一种和一种编码TCRα链的TCR构建体；
其中细胞克隆既不表达内源性TCRα链也不表达内源性TCRβ链。
在某些实施方式中，细胞克隆是BW-/-细胞系和/或Jurkat-/-细胞系。
术语“BW-/-细胞系”是指源自在AKR小鼠中自发产生的亲本BW5147胸腺瘤的BW细胞系(Lee NE和Davis MM.,J Immunol.1988Mar 1；140(5):1665-75；Letourneur F.,Malissen B.,Eur J Immunol.1989；19(12):2269-2274)，其既不表达内源性TCRα链也不表达内源性TCRβ链。由于TCR异源二聚体的表面表达依赖于与CD3蛋白复合体的联合，因此将BW-/-细胞系稳定转导以共表达人类CD3与GFP(BW-/--CD3-GFP；在本文中简称为BW-/-)，使得能够易于识别经过转导的细胞。人类CD3的存在使得这些细胞在成功地共转导有选定的编码AV和BV的RV后，在细胞表面表达任何人类或小鼠转基因的TCR。
术语“Jurkat-/-”和“Jurkat76-/-”是指人类Jurkat76-/-细胞系，其是不表达人类Vα链和Vβ链的原始人类TCL细胞系的变体(Abraham RT,Weiss A.,Nat RevImmunol.2004Apr；4(4):301-8)。它在转导有合适的经过选择的RV后，具有所有其余的转基因TCR表面表达所需要的TCR相关的CD3元件。
本发明的另一方面涉及TCR蛋白文库，其包含含有45种不同TCRα链的TCR蛋白群体和包含47种不同TCRβ链的47种TCR蛋白群体，
其中每一种包含不同TCRα链的TCR蛋白均包含由根据权利要求1的TCR构建体编码的45种不同TCRα链中的一种和TCRβ链；和
其中每一种包含不同TCRβ链的TCR蛋白均包含由根据权利要求1的TCR构建体编码的47种不同TCRβ链中的一种和TCRα链。
如已经描述的，TCR文库可以用于免疫动物以产生多克隆抗体和单克隆抗体，优选单克隆抗体。TCR文库可以用于产生泛特异性抗体、簇特异性抗体和单特异性抗体。在优选的实施方式中，TCR文库可以用于产生簇特异性抗体。具体地，该文库可以用于免疫动物，以用于抗体产生和筛选TCR特异性抗体。
通过可以使其特异性地适应其应用需求的方式构建文库：
具体地，如果将文库用于产生TCR特异性抗体，则可以使用编码具有小鼠恒定区、人类可变区和接头序列的TCR的TCR构建体。更具体地，如果将文库用于产生TCR特异性抗体，则可以使用编码具有小鼠恒定区、人类可变区和小鼠接头序列的TCR的TCR构建体。优选地，将TCR构建体整合到逆转录病毒骨架载体中。图10示出了可以用于产生TCR特异性抗体的示例性载体。图10A示出了可以用于产生对人类AV1-1区具有特异性的抗体的载体。该载体的序列示于SEQ ID NO：204中。图10B示出了可以用于产生对人类BV2链具有特异性的抗体的示例性载体，其序列示于SEQ ID NO：205中。
另一方面，如果将文库用于构建治疗性TCR，则利用编码具有人类恒定区和人类可变区的TCR的TCR构建体，并通过寡核苷酸引入具有所需特异性的CDR3。
更具体地，为了产生治疗性TCR，如在克隆T1.8的“分离TCR的再次工程改造”一节中详细描述的那样鉴定候选TCR的序列。因此，对CDR3区的特定序列进行测序。此外，对所需TCR的TCRα链的可变区和TCRβ链的可变区的类型进行鉴定，其是采用对可变TCRα链类型和可变TCRβ链类型具有特异性的引物通过PCR进行的，或者通过测序(为了举例说明，SEQ IDNo：210示出了编码分离的T1.8克隆的TCRα链的序列，并且SEQ ID No：211示出了编码分离的T1.8克隆的TCRβ链的序列)进行的。随后通过将对应于针对所需TCR所鉴定出的可变α链和可变β链的AV段和BV段分别与恒定CA段和CB段组合，并且利用具有该CDR3序列的合成寡核苷酸以所需CDR3序列取代接头序列来重建TCR。图11示出了经过再次工程改造的TCR的序列。图11A示出了经过再次工程改造的TCRα链的载体图，其序列示于SEQ ID No：208中。图11B示出了经过再次工程改造的TCRβ链的载体图，其序列示于SEQ ID No：209中。
也可以通过DNA合成来产生TCR文库的结构单元。DNA合成方法是本领域技术人员所熟知的。
此外，可以将如本文所描述的文库用于合成展示筛选以产生抗体，如噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示或细胞展示筛选。本领域技术人员知晓各种展示筛选技术，包括天然的免疫文库和合成文库。
如在本文中所描述的文库可以用于TCR的瞬时表达或稳定表达，以用于其表征和/或其治疗用途。
本申请的另一个方面涉及包含TCRα链和TCRβ链的TCR受体，该TCRα链的氨基酸序列与SEQ ID NO：249具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性，该TCRβ链的氨基酸序列与SEQID NO：250具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。
某些实施方式涉及包含具有氨基酸序列SEQ ID No：249的TCRα链和包含氨基酸序列SEQ ID No：250的TCRβ链的TCR受体。
此外，本申请涉及包含TCRα链和TCRβ链的TCR受体，其中
-TCRα链包含与SEQ ID No：249具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且包含具有SEQ ID No：245的序列的CDR3；
-TCRβ链包含与SEQ ID No：250具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且包含具有SEQ ID No：246的序列的CDR3。
某些实施方式涉及包含TCRα链和TCRβ链的TCR受体，其中
-TCRα链包含与SEQ ID NO：249具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列，并且包含具有SEQ ID No：245的序列的CDR3；
-TCRβ链包含与SEQ ID NO：250具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列，并且包含具有SEQ ID No：246的序列的CDR3。
某些实施方式是指TCR受体，其包含由与SEQ ID No：247具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码的TCRα链，和由与SEQ ID No：248具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码的TCRβ链。
某些实施方式涉及TCR受体，其包含由核苷酸序列SEQ ID No：247编码的TCRα链和由核苷酸序列SEQ ID No：248编码的TCRβ链。
此外，本申请涉及包含TCRα链和TCRβ链的TCR受体，其中
-TCRα链是由与SEQ ID No：247具有至少80％同一性的核苷酸序列编码的，并且包含由SEQ ID No：243所示的核苷酸序列编码的CDR3区；
-TCRβ链是由与SEQ ID No：248具有至少80％同一性的核苷酸序列编码的，并且包含由SEQ ID No：244所示的核苷酸序列编码的CDR3区。
某些实施方式涉及包含TCRα链和TCRβ链的TCR受体，其中
-TCRα链是由与SEQ ID No：247具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码的，并且包含由SEQ ID No：243所示的核苷酸序列编码的CDR3区；
-TCRβ链是由与SEQ ID No：248具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的核苷酸序列编码的，并且包含由SEQ ID No：244所示的核苷酸序列编码的CDR3区。
技术人员清楚的是，本申请还涉及编码如上所限定的TCR的核苷酸分子。
本申请的另一方面涉及用于作为药物使用的如上限定的TCR。因此，本申请还涵盖包含如上限定的TCR和药学上可接受的载体的药物组合物。某些实施方式是指用于在治疗与表达NY-ESO1的恶性细胞有关的疾病中使用的以上限定的TCR。因此，本申请还涉及用于在治疗癌症中使用的如上限定的TCR。
试验
产生TCR特异性的免疫原
由于异源二聚体蛋白的表达依赖于与CD3的联合，因此天然TCR是一种高度构型依赖性的结构。这种复杂结构强烈影响可以用于将不同V区区分开来的表位的暴露。
在第一步中，在受体细胞表面上表达天然构型的TCR Vα链和Vβ链中的每一种。将这些细胞用作为免疫原和初次筛选细胞。分三步发展成为细胞的免疫原。首先，产生编码人类TCR库中的所有45种AV基因片段和所有47种BV基因片段的载体文库。其次，根据需要从该文库中选择载体以产生逆转录病毒(RV)，由该逆转录病毒转导TCR阴性细胞系(Jurkat-76-/-)，由此产生具有单独限定的VαVβ异源二聚体的细胞系。最后，通过流式细胞术选择这些TCR转基因的细胞系，以用于TCR表面表达，并获得高稳定表面表达的各个T细胞克隆。这些T细胞克隆在扩增、通过PCR验证其特异性AV区和BV区和冷冻保藏之后成为主要细胞文库的一部分。
TCR载体文库
利用MP71逆转录病毒载体骨架产生模式化的TCR载体文库(Schambach，2000；Hildinger，1999；图1B)。完整的TCR载体文库由92种不同的载体组成，每种载体包含45种单独的AV可变区或47种单独的BV可变区中的一种。将载体设计为允许不同TCR以正确的天然构型表达。在所有载体中全都使用常见的CDR3区。该CDR3区源自对卵清蛋白蛋白质具有特异性的OT-1小鼠T细胞克隆。其次，将人类可变区与各自的小鼠恒定区(mCA或mCB)组合。由于鼠源恒定区含有在人类恒定区中不存在的多种带电荷氨基酸，这些带电荷氨基酸允许蛋白质相互作用得以改善、TCR异源二聚体配对更佳和表面表达更高，所以该鼠源恒定区促进人类Vα蛋白链和Vβ蛋白链进行更好的配对。
逆转录病毒生产和细胞转导
使用单独的pRAVx载体或pRBVx载体来产生相应的RV。图1示出了展示由这些载体编码的嵌合人类-小鼠TCR链形成在细胞表面具有适当确证的异源二聚体的能力的实例。在本文中，利用pRAVx和pRBVx逆转录病毒的选定组合对T细胞系进行转导。利用对mCB具有特异性的仓鼠抗小鼠抗体，通过流式细胞术评估转基因TCR的表面表达。任何TCR的表面表达需要完全正确地形成α/β异源二聚体并与CD3联合。因此，只有异源二聚体以适当的构型进行折叠和配对，TCR才会进行表面表达。如在该情形下出现的，约40％的细胞亚群在用两种RV进行同时转导后表达出表面TCR。在选择单个克隆后，在所有T细胞上均发现一致稳定的表达。以类似的方式，表达出了几种其它的TCR异源二聚体，其相应的商业化Vβ特异性单克隆抗体是可利用的。经发现，这些TCR异源二聚体与其单克隆抗体结合，证实其构型与人类T细胞的由测试性单克隆抗体所识别的表位相同(数据未显示)。
表达嵌合TCR的TCR细胞文库的开发
利用各自的AV和BV逆转录病毒载体文库开发了两种TCR细胞文库。在用选定的RV进行逆转录病毒转导后，用可用于检测功能性TCR表达的抗体对细胞进行染色，并分选出阳性细胞。为了产生表达具有小鼠恒定区的TCR的TCR细胞文库，采用了抗mCB特异性抗体。为了产生表达具有人类恒定区的TCR的TCR细胞文库，采用了抗CD3抗体。利用经过转化的TCR阴性T细胞来产生细胞文库，以便有效地产生对所选择的AV区或BV区具有特异性的一致TCR表达的细胞试剂。而且，这些细胞具有无限的体外增殖能力。采用鼠源TCR阴性细胞(BW-/-)开发一种细胞文库，并且采用TCR阴性人类Jurkat T细胞开发第二文库(图3)。
将BW-/-TCR细胞文库用于免疫。为此目的，用表达嵌合TCR的BW-/-细胞免疫小鼠，其将在以全细胞免疫原进行免疫期间所观察到的差异最小化。尽管将针对选定V区的TCR免疫原性最小化，但是小鼠仍然能够产生针对由BW-/-细胞表达的其它表面蛋白的抗体。取决于经过免疫的小鼠品系，这些包括对异源基因MHC分子应答。此外，与细胞转化或病毒转导相关的由BW-/-细胞表达的未被限定的表面蛋白也用作为免疫原性表位。最后，发现BW-/-细胞与小鼠Ig或大鼠Ig非特异性地结合。
为了避免在初次筛选中识别出未与TCR结构进行反应的单克隆抗体，采用了相应的Jurkat-/-文库进行筛选(“跨物种筛选”)。由于Jurkat-/-细胞的MHC和其它细胞表面蛋白与BW-/-细胞的并不相同，因此它们不会与采用BW-/-细胞免疫原所产生的这些分子具有特异性的单克隆抗体结合。此外，Jurkat-/-细胞不显示与小鼠Ig或大鼠Ig的非特异性结合。
图4示出了跨物种筛选的实例，其利用两种对人类TCR AV12-2区和BV12-3区具有推定特异性的上清液。如所出现的，由于其非特异性Ig结合的性质，所有这三种BW-/-细胞系都与这两种上清液结合，无论是否具有特异性TCR表达。相反，Jurkat-/-GFP对照细胞对这两种上清液都保持阴性，并且每种上清液仅与具有适当TCR的经过TCR转导的Jurkat-/-细胞系结合。
表达嵌合TCR的小鼠BW-/-细胞文库
小鼠细胞文库是基于BW-/-细胞系的，该BW-/-细胞系源自在AKR小鼠中自发产生的亲本BW5147胸腺瘤(Lee NE和Davis MM.,J Immunol.1988Mar 1；140(5):1665-75；Letourneur F.,Malissen B.,Eur J Immunol.1989；19(12):2269-2274)。如以上描述的，TCR异源二聚体的表面表达依赖于与CD3蛋白复合体的联合。因此，将BW-/-细胞系稳定转导以共表达人类CD3与GFP(BW-/--CD3-GFP)(在本文中简称为BW-/-)，使得能够易于识别经过转导的细胞。人类CD3的存在使得这些细胞在成功地共转导有选定的编码AV和BV的RV后，在细胞表面表达任何人类或小鼠转基因的TCR。如图2所示，可以通过对人类CD3具有特异性的抗体的结合或者利用针对鼠源恒定区的抗体监测表面表达。
表达嵌合TCR的人类Jurkat细胞文库
第二细胞文库是利用人类Jurkat TCL构建的。人类Jurkat76-/-细胞系(以下简称Jurkat-/-)是不表达人类Vα链和Vβ链的原始人类TCL细胞系的变体(Abraham RT,Weiss A.,Nat Rev Immunol.2004Apr；4(4):301-8)。该人类Jurkat76-/-细胞系在用所选择的合适RV进行转导之后，具有所有其余的对转基因TCR表面表达所需要的TCR相关的CD3元件。作为阴性对照，制备表达非常高水平GFP但不表达TCR蛋白的Jurkat-/-细胞。
利用BW-/-细胞和Jurkat-/-细胞进行跨物种筛选
将BW-TCR转导的细胞用于免疫，然而如本文针对抗人类AV12-2特异性杂交瘤上清液以及针对抗人类BV12-3特异性上清液所示的，由于这些细胞与小鼠或大鼠Ig非特异性地结合，因此它们不能用于杂交瘤筛选。无论其TCR表达如何，这两种杂交瘤上清液都能染色BW-/-细胞(图4，a和b中的第一行)。相反，只有在Jurkat-/-细胞表达特异性的AV或BV TCR链时，相同的上清液才能染色Jurkat-/-细胞(图4，第二行a和b)。如前所述的，将转导有TCR的BW-/-细胞也稳定转导有CD3-GFP以允许TCR表达，用于说明其中间水平的GFP。为了区分在转导有TCR的Jurkat-/-细胞上的非特异性和特异性的TCR结合，建立稳定转导有GFP的Jurkat-/-细胞克隆，并在杂交瘤上清液筛选期间将其用作为对照。如所示的，在用含有AV-或BV-特异性的单克隆抗体的上清液进行测试时，Jurkat-GFP细胞保持未标记的(图4，第二行a和b)。
Lewis大鼠免疫
用表达含有小鼠恒定区和TCR或单个TCR的hAV/hBV异源二聚体的BW-/-细胞对Lewis大鼠进行免疫。收获这些大鼠的脾细胞，并与骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合，并且将其铺板在24个96孔板中。两周后，在所有平板中观察到每孔平均3个杂交瘤克隆，产生约6,900个待被评估的杂交瘤。
初次筛选
对于第一次筛选，将来自四个96孔板的上清液汇合在一个收集板中，用于通过流式细胞术进行筛选。这将用于初次流式细胞仪筛选的样品数量从24个96孔板减少到6个96孔板。
为了区分阳性上清液在初次筛选期间是否显示单一TCR特异性、簇TCR特异性或泛TCR特异性，将包含表达hAV3/hBV12-3的群体(45％)、表达Jurkat hAV8-2/hBV24的群体(45％)和一个非TCR转导的Jurkat-GFP细胞群体(10％)的Jurkat细胞克隆池进行分析，以鉴定非TCR特异性的单克隆抗体。
例如，在初次跨物种筛选期间，发现了一种结合了约40％筛选池的不同抗体克隆的汇合上清液(图5)。由于Jurkat-GFP(TCR-阴性)对照细胞在结合方面没有显示出任何移动，因此该单克隆抗体显示了TCR相关的结合模式；图5A示出了包括克隆15B4的初次筛选的结果。图5B示出了包括克隆5H4的初次筛选的结果。
二次筛选
为了鉴定对初次筛选活性负责的单个杂交瘤，对相同的筛选细胞池对在初次筛选中被鉴定为初次筛选的汇合上清液中具有TCR相关结合模式位置处的上清液进行了单独测试。例如，发现了一种重现预期结合模式的上清液，这种杂交瘤克隆作为15B4示于本文中(图6A)。例如，还发现了另一种重现预期结合模式的上清液，这种杂交瘤克隆作为5H4示于本文中(图6B)。这些试验确定15B4以及5H4至少识别BV12-3。在下文中，描述了可以用于确定15B4是簇TCR特异性单克隆抗体的试验。
PBL分选
为了区分候选抗体是单特异性的还是簇特异性的(即，与共享氨基酸同源性的多个BV链反应)，用候选单克隆抗体对单个人类供体的PBL进行染色。通过流式细胞术分选阳性部分的细胞，并对分选出的细胞进行完整的人类TCR AV和BV PCR库分析。
从PBL中，提取分选出的PBL的mRNA并制备cDNA。通过标准的PCR程序(变性：94℃持续2分钟；退火：94℃持续30秒，55℃持续30秒，72℃持续1分钟(35个循环)；延伸：72℃持续1分钟)，利用对每个特定BV链具有特异性的引物对，来分析完整的人类TCR AV和BV库。提取扩增条带并对其测序。显现出不同TCR Vα链或TCR Vβ链的多个扩增子的样品将表明候选抗体对TCR Vα链或TCR Vβ链的簇具有特异性。
对分选出的细胞进行序列分析
对于与多种TCR Vα链或TCR Vβ链结合的抗体，该分选出的群体将会包含表达对该抗体具有特异性的BV链的细胞。然而，由于PCR方法的灵敏度极高，因此一些受到污染的细胞也可能包含在该分选出的群体中，产生阳性的PCR扩增子。为了排除由于污染引起的扩增子，对BV特异性引物所检测到的所有扩增子条带进行测序。在分析序列时，考虑扩增条带的色谱图以及密度。
ADCC报道子生物测定法(Promega)
根据制造商的方法使用ADCC报道子生物测定法(Promega)测定ADCC。简而言之，通过效应器细胞中的用发光读数定量的荧光素酶活性监测该效应器细胞中的通过NFAT(激活的T细胞的核因子)途径进行的基因转录激活。ADCC报道子生物测定法采用稳定表达FcγRIIIa受体、V158(高亲和力)变体和驱动萤火虫荧光素酶效应器细胞表达的NFAT应答元件的工程改造的Jurkat细胞。通过由NFAT途径激活所产生的荧光素酶定量抗体在ADCC MOA中的生物学活性。
人源化TCR小鼠模型内的表达BV12-3相关TCR的T细胞的体内消耗
用鉴定出的抗体(500μg)处理表达人类AV和BV(hAV/hBV)TCR链的ABab小鼠，并且将一只小鼠不进行任何处理以用作为天然对照。对处理前(d0)和处理后第2天、第5天、第7天和第9天的从尾部血液获得的PBL进行分析，用抗-CD3-PE和候选单克隆抗体对该PBL进行染色(还参见图7)。
采用小鼠-抗-大鼠-IgG二抗来检测TCR可变链抗体阳性群体。
在整个试验时间过程中，由抗体鉴定出的CD3+T细胞群体会在天然小鼠体内保持稳定。相比之下，在48小时内在用TCR可变链抗体处理的两组动物体内，结合TCR可变链抗体的T细胞将会消失。在该试验期间，表示为CD3+和TCR可变链抗体阴性群体的其它T细胞会保持稳定在相同水平。
为了详细地检查候选TCR V链单克隆抗体的体内效应，通过与利用对TCR Vα链或TCR Vβ链具有单一特异性的商业化单克隆抗体检测的T细胞群体的大小相比较，来评估相对于候选抗体的T细胞群体的大小。在体内消耗研究之前和之后进行这种比较。该试验包括在第0天和48小时后对人类TCR转基因(ABab)小鼠和野生型C57BL/6小鼠的PBL进行单克隆抗体染色。
为了确定候选单克隆抗体靶向哪条BV链，通过利用单独的BV链特异性引物来制备完整的TCR BV库分析。收集用候选抗体(500μg)消除的人类TCR转基因小鼠(ABab)的PBL，并利用单独的BV特异性引物来确定完整的BV库。
在体内消耗期间的细胞因子测定
靶向T细胞结构的许多单克隆抗体包括对CD3受体具有特异性的抗体或对CD28受体具有特异性的抗体，这些单克隆抗体诱导从T细胞快速地全身释放与免疫反应有关的许多细胞因子。识别不直接参与抗原-MHC复合物的识别并且不涉及TCR信号传导的TCR的结构区域的单克隆抗体对于消除不需要的致病性T细胞是安全可行的，而不会引起有毒细胞因子风暴。
为了测定在体内T细胞消耗期间小鼠体内释放的细胞因子，用两组对照单克隆抗体和候选TCR可变链单克隆抗体来处理三组人类TCR转基因ABab小鼠。每只小鼠接受500μg的经过纯化的单克隆抗体。用大鼠IgG2a同种型的同种型对照单克隆抗体来处理第一组对照。该单克隆抗体识别Epstein-Barr病毒抗原EBNA2。这种单克隆抗体不应该在经过处理的小鼠体内显示出任何效果。第二组对照是仓鼠抗小鼠CD3单克隆抗体(IgG1抗小鼠CD3ζ，克隆145-2C11)，这种单克隆抗体已知为在经过处理的动物体内诱导细胞因子风暴(Hirsch，1988；Penaranda，2011)。在采用标准ELISA法施加单克隆抗体后第0、2、6、12和24小时时测定IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的血清浓度。
用抗EBNA2单克隆抗体处理应该不会对细胞因子的产生具有影响。相比之下，用抗CD3单克隆抗体处理会在施加该单克隆抗体后约2小时诱导IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的释放。然而，候选单克隆抗体应该不会增加动物血清中的细胞因子水平。可以在稍后的时间点(例如12小时时)检测到IL-10和TNF-α的水平升高，这表明可能在体内发生了炎症反应，可能涉及由于时间延迟而导致的通过靶向T细胞的吞噬作用引起的巨噬细胞激活。
组装的文库
构建包含以下TCR构建体的文库：
Figure BDA0001566903780000611
Figure BDA0001566903780000621
Figure BDA0001566903780000631
Figure BDA0001566903780000641
表8：构建的TCR文库
构建了其它文库，其包含TCRA1至TCRA45构建体(其对应于表8中所鉴定的TCRA1至TCRA45构建体)，所不同的是，它们含有人类恒定AC段(SEQ ID No：1)而不含有小鼠恒定AC段(SEQ ID No：6)，并且该文库进一步包含TCRB1至TCRB47构建体(其对应于表8中所鉴定的TCRB1至TCRB47构建体)，所不同的是它们含有人类恒定BC段(SEQ ID No：4)而不含有小鼠恒定BC段(SEQ ID No：7)。
已经将TCR构建体TCRA1至TCRA45和TCRB1至TCRB47整合到ivtRNA骨架载体SEQ IDNo：196中。
已经将TCR构建体TCRA1至TCRA45和TCRB1至TCRB47整合到逆转录病毒骨架载体SEQ ID No：200中。
已经将构建体TCRA1和TCRB12整合到ivtRNA骨架AC-P2A-BC(SEQ ID No：199)中。
已经将构建体TCRA11和TCRB12整合到逆转录病毒骨架载体AC-P2A-BC(SEQ IDNo：203)中。
对分离TCR的再次工程改造
T细胞克隆T1.8-3-200的功能分析
T细胞克隆T1.8-3-200与HLA-匹配的NY-ESO1-X-(与信号肽融合的人类NY-ESO1抗原)加载的APC的共培养物证实了克隆T1.8-3-200的特异性和功能(n.d.，不可检测的；图12A)。
原始T细胞克隆T1.8-3-200的TCR分析
通过5'RACE PCR扩增T细胞克隆T1.8-3-200的重排TCR DNA序列。为此，从T1.8-3-200T细胞(识别与信号肽融合的人类NY-ESO1抗原；NY-ESO1-X)中分离全部RNA并反转录为互补的DNA(cDNA)。随后通过5'RACE扩增来对重排的TCRα序列和β序列进行扩增。使用TOPO克隆，将扩增的DNA片段克隆到适当的受体载体中以在细菌转化后对单个TCR DNA序列进行分离。
DNA测序
通过DNA核苷酸测序分析从单个细菌菌落分离出的载体的TCR序列插入片段。
T1.8-3-200TCRα测序结果(SEQ ID No：210):
atgtcactttctagcctgctgaaggtggtcacagcttcactgtggctaggacctggcattgcccagaagataactcaaacccaaccaggaatgttcgtgcaggaaaaggaggctgtgactctggactgcacatatgacaccagtgatccaagttatggtctattctggtacaagcagcccagcagtggggaaatgatttttcttatttatcaggggtcttatgaccagcaaaatgcaacagaaggtcgctactcattgaatttccagaaggcaagaaaatccgccaaccttgtcatctccgcttcacaactgggggactcagcaatgtacttctgtgcaatttcgaacaccggtaaccagttctattttgggacagggacaagtttgacggtcattccaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatagtcagg
T1.8-3-200TCRβ测序结果(SEQ ID No：211):
atgggcccccagctccttggctatgtggtcctttgccttctaggagcaggccccctggaagcccaagtgacccagaacccaagatacctcatcacagtgactggaaagaagttaacagtgacttgttctcagaatatgaaccatgagtatatgtcctggtatcgacaagacccagggctgggcttaaggcagatctactattcaatgaatgttgaggtgactgataagggagatgttcctgaagggtacaaagtctctcgaaaagagaagaggaatttccccctgatcctggagtcgcccagccccaaccagacctctctgtacttctgtgccagcaataacttagcctcctacaatgagcagttcttcgggccagggacacggctcaccgtgctagaggacctgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaagagcagcgctt
IMGT序列分析
使用IMGT/V-QUEST搜索平台(www.imgt.org)，从检索出的DNA序列分析限定TCR特异性的参数(重排的TCR V-(D)-Jα/β段，CDR3区和所采用的Cα/β区的序列)；图12B和图12C分别示出了TCRα链和TCRβ链的结果。
鉴定出的T1.8-3-200TCRαCDR3序列：
DNA序列：gcaatttcgaacaccggtaaccagttctat(SEQ ID No：243)
蛋白质序列：AISNTGNQFY(SEQ ID No：245)
鉴定出的T1.8-3-200TCRβCDR3序列:
DNA序列：gccagcaataacttagcctcctacaatgagcagttc(SEQ ID No：244)
蛋白质序列：ASNNLASYNEQ(SEQ ID No：246)
TCR载体文库的重建
通过用编码各个T1.8-3-200TCRα/βCDR3+J区(限制性位点：FspI×BspEI(TCRα链；AV14载体)；FspI×BstEII(TCRβ链；BV27载体))的退火DNA寡核苷酸交换通用CDR3接头，采用来自具有人类恒定区的基于pGEM的TCR载体文库的合适载体来重建T1.8-3-200TCRα/β链。
正义T1.8-3-200TCRα寡核苷酸5’->3’(SEQ ID No：239):
GCAATCAGCAACACCGGCAACCAGTTCTACTTCGGCACCGGCACCAGCCTGACCGTGATCCCCAACATCCAGAAT
反义T1.8-3-200TCRα寡核苷酸5’->3’(SEQ ID No：240):
CCGGATTCTGGATGTTGGGGATCACGGTCAGGCTGGTGCCGGTGCCGAAGTAGAACTGGTTGCCGGTGTTGCTGATTGC
正义T1.8-3-200TCRβ寡核苷酸5’->3’(SEQ ID No：241):
GCAAGCAACAACCTGGCCAGCTACAACGAGCAGTTCTTCGGCCCTGGCACCCGGCTGACCGTGCTGGAAGATCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAG
反义T1.8-3-200TCRβ寡核苷酸5’->3’(SEQ ID No：242):
GTCACCTCTGGGGGGAACACGTTCTTCAGATCTTCCAGCACGGTCAG
CCGGGTGCCAGGGCCGAAGAACTGCTCGTTGTAGCTGGCCAGGTTGT
TGCTTGC
重建的T1.8-3-200TCRα质粒的序列示于SEQ ID No：208(基于pMP71的逆转录病毒载体)和SEQ ID No：251(ivtRNA载体)中。重建的T1.8-3-200TCRβ质粒的序列示于SEQ IDNo：209(逆转录病毒载体)和SEQ ID No：252(基于pGEM的ivtRNA载体)中。重建的TCRα链的核苷酸序列示于SEQ ID No：247中，相应氨基酸序列示于SEQ ID No：249中。重建的TCRβ链的核苷酸序列示于SEQ ID No：248中，相应氨基酸序列示于SEQ ID No：250中。
TCR T1.8-3-200的转基因功能分析
从生成的pAV/BV-T1.8-3-200-ivtRNA载体构建体产生编码T1.8-3-200TCRα/β链的RNA并用于转染外周血淋巴细胞(PBL)。T1.8-3-200TCR转染的PBL与HLA匹配的NY-ESO1-X加载的APC的共培养物证实了受体T细胞内的先前限定的T1.8-3-200TCR特异性和功能的恢复(图12D)。
本申请还包括以下实施方式：
实施方式1：一种用于表达所有功能性TCR类型的文库，其包含各自编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体，
其中编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含以下结构单元：
-可变AV段AVseg1至AVseg45中的一种；和
-恒定AC段；和
其中编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含：
-可变BV段BVseg1到BVseg47中的一种，和
-恒定BC段。
实施方式2：根据实施方式1的文库，还包括以下结构单元：
-对A段具有特异性的接头序列；和
-对B段具有特异性的接头序列。
实施方式3：根据实施方式1或2的文库，其中AC段和BC段是鼠源区段、最小程度鼠源化的区段、半胱氨酸工程改造的区段或野生型人类区段或其组合。
实施方式4：根据实施方式3的文库，其中AC段和BC段是鼠源区段或人类区段。
实施方式5：根据前述实施方式中任一项的文库，其中可变AV段和可变BV段是人类区段或鼠源区段，优选为人类区段。
实施方式6：根据前述实施方式中任一项的文库，其中AC段具有与SEQ ID NO：1、2或6所示序列具有至少90％同一性的序列，并且其中BC段具有与SEQ ID NO：3、4、5或7所示序列具有至少90％同一性的序列。
实施方式7：根据前述实施方式中任一项的文库，其中AC段具有SEQ ID NO：1、2或6所示的序列，并且其中BC段具有SEQ ID NO：3、4或7所示的序列。
实施方式8：根据前述实施方式中任一项所述的文库，其中可变AV段AVseg1至AVseg45编码与SEQ ID No：100至SEQ ID No：144所示序列具有至少80％同一性的可变TCRα链区，并且其中可变BV段BVseg1至BVseg47编码与SEQ ID No：145至SEQ ID No：191所示序列具有至少80％同一性的可变TCRβ链区。
实施方式9：根据前述实施方式中任一项的文库，其中可变AV段AVseg1至AVseg45编码具有SEQ ID No：100至SEQ ID No：144所示序列的可变TCRα链区，并且其中可变BV段BVseg1至BVseg47编码具有SEQ ID No：145至SEQ ID No：191所示序列的可变TCRβ链区。
实施方式10：根据前述实施方式中任一项的文库，其中可变AV段AVseg1至AVseg45具有与SEQ ID No：8至SEQ ID No：52所示序列具有至少80％同一性的序列，并且其中可变BV段BVseg1至BVseg47段具有与SEQ ID No：53至SEQ ID No：99所示序列具有至少80％同一性的序列。
实施方式11：根据实施方式10的文库，其中可变AV段AVseg1至AVseg45段具有SEQID No：8至SEQ ID No：52所示的序列，并且其中可变BV段BVseg1至BVseg47段具有SEQ IDNo：53至SEQ ID No：99所示的序列。
实施方式12：根据前述实施方式中任一项的文库，其中将TCR构建体整合到至少一种骨架载体中。
实施方式13：根据实施方式12的文库，其中分别将编码TCRα链的TCR构建体或编码TCRβ链的TCR构建体各自整合到一种骨架载体中，和/或其中将编码一种TCRα链和一种TCRα链的TCR构建体整合到骨架载体中。
实施方式14：根据实施方式13的文库，其中在编码一种TCRα链和一种TCRβ链的TCR构建体中，通过核糖体跳跃元件将编码一种TCRα链的序列和编码一种TCRβ链的序列连接在一起。
实施方式15：根据实施方式14的文库，其中通过P2A元件将编码一种TCRα链的序列和编码一种TCRβ链的序列连接在一起。
实施方式16：根据实施方式12至15的文库，其中至少一种骨架载体是选自由体外转录mRNA(ivtRNA)骨架载体、逆转录病毒骨架载体或慢病毒骨架载体所组成的组。
实施方式17：根据实施方式16的文库，其中至少一种骨架载体是ivtRNA骨架载体或逆转录病毒骨架载体。
实施方式18：根据实施方式17的文库，其中ivtRNA骨架载体包含T7和/或sp6启动子。
实施方式19：根据实施方式17或18的文库，其中ivtRNA骨架载体包含至少一种RNA稳定序列。
实施方式20：根据实施方式19的文库，其中RNA稳定序列是聚腺嘌呤尾。
实施方式21：根据实施方式20的文库，其中聚腺嘌呤尾包含至少40个腺嘌呤。
实施方式22：根据实施方式21的文库，其中聚腺嘌呤尾包含至少110个腺嘌呤。
实施方式23：根据实施方式17的文库，其中逆转录病毒骨架载体包含位于用于整合TCR链构建体的位点两侧的LTR元件。
实施方式24：根据实施方式2至23的文库，其中用CDR3A序列和AJ序列替换对A段具有特异性的接头序列产生编码功能性TCRα链的构建体，并且用CDR3B序列、BD和BJ区替换对B段具有特异性的接头序列产生编码功能性TCRβ链的构建体。
实施方式25：根据前述实施方式中任一项的文库，其中可以以单个克隆步骤取代TCR构建体的结构单元。
实施方式26：根据实施方式2至25的文库，其中可以以单个克隆步骤取代可变区段、接头序列和C段。
实施方式27：根据前述实施方式中任一项的文库，其中TCR构建体的结构单元包含相容的组合位点。
实施方式28：根据前述实施方式中任一项的文库，其中TCR构建体的结构单元包含相容的限制性位点。
实施方式29：根据实施方式2至28的文库，其中可变AV段的前端是NotI和/或AgeI限制性位点，后端是FspI限制性位点。
实施方式30：根据实施方式2至29的文库，其中对A段具有特异性的接头序列的前端是FspI限制性位点，后端是BspEI和/或DraIII限制性位点。
实施方式31：根据实施方式2至30的文库，其中对A段具有特异性的接头序列的前端是FspI限制性位点，后端是BspEI限制性位点。
实施方式32：根据实施方式2至31的文库，其中恒定AC段的前端是BspEI和/或DraIII限制性位点，后端是MluI和/或ClaI和/或EcoRI限制性位点。
实施方式33：根据实施方式2至32的文库，其中恒定AC段的前端是BspEI限制性位点，后端是MluI和/或ClaI和/或EcoRI限制性位点。
实施方式34：根据实施方式2至33的文库，其中可变BV段的前端是NotI和/或AgeI限制性位点，后端是FspI限制性位点。
实施方式35：根据实施方式2至34的文库，其中对B段具有特异性的接头序列的前端是FspI限制性位点，后端是BstEII限制性位点。
实施方式36：根据实施方式2至35的文库，其中恒定BC段的前端是BspEII限制性位点，后端是MluI和/或ClaI和/或EcoRI限制性位点。
实施方式37：根据实施方式2至36的文库，其中可变AV段的前端是NotI和/或AgeI限制性位点且后端是FspI限制性位点，对A段具有特异性的接头序列的前端是FspI限制性位点且后端是BspEI和/或DraIII限制性位点，恒定AC段的前端是BspEI和/或DraIII限制性位点且后端是MluI和/或ClaI和/或EcoRI限制性位点；和
其中可变BV段的前端是NotI和/或AgeI限制性位点且后端是FspI限制性位点，对B段具有特异性的接头序列的前端是FspI限制性位点且后端是BstEII限制性位点，恒定BC段的前端是BspEII限制性位点且后端是MluI和/或ClaI和/或EcoRI限制性位点。
实施方式38：根据前述实施方式中任一项的文库，其中TCR构建体是针对哺乳动物进行的密码子优化的，优选地用于在人类中表达。
实施方式39：根据实施方式16至38的文库，其中产生ivtRNA的骨架载体具有与SEQID No：196所示序列具有至少90％同一性的序列。
实施方式40：根据实施方式39的文库，其中产生ivtRNA的骨架载体具有SEQ IDNo：196所示的序列。
实施方式41：根据前述实施方式16至40中任一项的文库，其中逆转录病毒骨架载体具有与SEQ ID No：200所示序列具有至少90％同一性的序列。
实施方式42：根据实施方式41的文库，其中逆转录病毒骨架载体具有SEQ ID No：200所示的序列。
实施方式43：一种用于表达TCR的表达系统，其包含
-文库，其包含各自编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体，
其中编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含：
(i)可变AV段AVseg1至AVseg45中的一种；
(ii)对A段具有特异性的接头序列；
其中编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含：
(i)可变BV段BVseg 1至BVseg 47中的一种；
(ii)对B段具有特异性的接头序列；和
-选自由以下所组成的组的ivtRNA骨架载体中的至少一种：
(i)包含AC段的ivtRNA骨架载体
(ii)包含BC段的ivtRNA骨架载体
(iii)包含AC段和BC段的ivtRNA骨架载体；和/或
-选自由以下所组成的组的逆转录病毒骨架载体中的至少一种：
(iv)包含AC段的逆转录病毒骨架载体
(v)包含BC段的逆转录病毒骨架载体
(vi)包含AC段和BC段的逆转录病毒骨架载体。
实施方式44：根据实施方式43的表达系统，其还包含选自由以下所组成的组的慢病毒骨架载体中的至少一种：
(vii)包含AC段的慢病毒骨架载体
(viii)包含BC段的慢病毒骨架载体
(ix)包含AC段和BC段的慢病毒骨架载体。
实施方式45：一种用于表达TCR的表达系统，其包含
-文库，其包含各自编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体，
其中编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含可变AV段AVseg 1至AVseg 45中的一种；
其中编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含可变BV段BVseg 1至BVseg 47中的一种；和
-选自由以下所组成的组的ivtRNA骨架载体中的至少一种：
(i)包含AC段和对A段具有特异性的接头序列的ivtRNA骨架载体；
(ii)包含BC段和对B段具有特异性的接头序列的ivtRNA骨架载体；
(iii)包含AC段、对A段具有特异性的接头序列、BC段和对B段具有特异性的接头序列的ivtRNA骨架载体；和/或
-选自由以下所组成的组的逆转录病毒骨架载体中的至少一种：
(iv)包含AC段和对A段具有特异性的接头序列的逆转录病毒骨架载体，
(v)包含BC段和对B段具有特异性的接头序列的逆转录病毒骨架载体，
(vi)包含AC段、对A段具有特异性的接头序列、BC段和对B段具有特异性的接头序列的逆转录病毒骨架载体。
实施方式46：根据实施方式43至45的表达系统，其还包含选自由以下所组成的组的慢病毒骨架载体中的至少一种：
(vii)包含AC段的慢病毒骨架载体，
(viii)包含BC段的慢病毒骨架载体，
(ix)包含AC段和BC段的慢病毒骨架载体。
实施方式47：根据实施方式43至46的表达系统，其包含ivtRNA骨架载体(i)至(iii)和逆转录病毒骨架载体(iv)至(vi)。
实施方式48：根据实施方式43或47的表达系统，其包含ivtRNA骨架载体(i)至(iii)、逆转录病毒骨架载体(iv)至(vi)和慢病毒骨架载体(vii)至(ix)。
实施方式49：一种表达TCR的细胞克隆文库，其包含表达45种不同TCRα链的细胞克隆群体和表达47种不同TCRβ链的细胞克隆群体，
其中表达不同TCRα链的细胞克隆中的每一种均包含根据实施方式1的编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的一种和一种编码TCRβ链的TCR构建体；和
其中表达不同TCRβ链的细胞克隆中的每一种均包含根据实施方式1的编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的一种和一种编码TCRα链的TCR构建体。
实施方式50：根据实施方式49的文库，其中细胞克隆是缺乏功能性TCR的BW-/-细胞系和/或Jurkat细胞系。
实施方式51：一种TCR蛋白质文库，其包含含有45种不同TCRα链的TCR蛋白质群体和含有47种不同TCRβ链的47种TCR蛋白质群体，
其中包含不同TCRα链的TCR蛋白质中的每一种均包含由根据实施方式1的TCR构建体编码的45种不同TCRα链中的一种和TCRβ链；和
其中包含不同TCRβ链的TCR蛋白质中的每一种均包含由根据实施方式1的TCR构建体编码的47种不同TCRβ链中的一种和TCRα链。
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Claims (19)

1.一种用于表达所有功能性TCR类型的文库，包含各自编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体，
其中所述编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含以下结构单元：
-编码可变TCRα链区的可变AV段之一，所述可变AV段编码序列为SEQ ID No：100至SEQID No：144所示序列的可变TCRα链区，和
-恒定AC段；和
其中所述编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含：
-编码可变TCRβ链区的可变BV段之一，所述可变BV段编码序列为SEQ ID No：145至SEQID No：191所示序列的可变TCRβ链区，和
-恒定BC段，
其中所述结构单元包含至少一种5'-末端组合位点和至少一种3'-末端组合位点。
2.根据权利要求1所述的文库，其中第一结构单元的3’末端组合位点与第二结构单元的5’末端组合位点相容，所述第二结构单元的5’末端组合位点连接到所述第一结构单元的3’末端。
3.根据权利要求1所述的文库，包含以下的结构单元：
-将所述AV段的3'-末端与所述AC段的5'-末端连接的接头序列；和
-将所述BV段的3'-末端与所述BC段的5'-末端连接的接头序列。
4.根据权利要求1的文库，其中所述可变AV段的序列是SEQ ID No：8至SEQ ID No：52所示的序列，并且其中所述可变BV段的序列是SEQ ID No：53至SEQ ID No：99所示的序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的文库，其中将所述TCR构建体整合到至少一种骨架载体中，其中所述骨架载体选自由ivtRNA骨架载体、逆转录病毒骨架载体或慢病毒骨架载体所组成的组。
6.根据权利要求5所述的文库，其中所述骨架载体是所述ivtRNA骨架载体或所述逆转录病毒骨架载体。
7.根据权利要求5所述的文库，其中将编码一种TCRα链和一种TCRβ链的TCR构建体整合到所述骨架载体中，其中在所述编码一种TCRα链和一种TCRβ链的TCR构建体中，通过核糖体跳跃元件将编码一种TCRα链的序列和编码一种TCRβ链的序列连接在一起。
8.根据权利要求7所述的文库，其中所述核糖体跳跃元件是P2A。
9.根据权利要求5所述的文库，其中所述ivtRNA骨架载体包含至少一种RNA稳定序列。
10.根据权利要求9所述的文库，其中所述ivtRNA骨架载体包含聚腺嘌呤尾。
11.根据权利要求10所述的文库，其中所述聚腺嘌呤尾包含至少110个腺嘌呤。
12.根据权利要求3所述的文库，其中用CDR3A序列和AJ序列替换将所述AV段的3'-末端与所述AC段的5'-末端连接的所述接头序列来产生编码功能性TCRα链的构建体，并且用CDR3B序列、BD和BJ区替换将所述BV段的3'-末端与所述BC段的5'-末端连接的所述接头序列来产生编码功能性TCRβ链的构建体。
13.根据权利要求12所述的文库，其中可以以单个克隆步骤替换可变区段、所述接头序列和恒定区段。
14.根据权利要求3所述的文库，其中所述可变AV段的前端是NotI和/或AgeI限制性位点且后端是FspI限制性位点，将所述AV段的3'-末端与所述AC段的5'-末端连接的所述接头序列的前端是FspI限制性位点且后端是BspEI和/或DraIII限制性位点，所述恒定AC段的前端是BspEI和/或DraIII限制性位点且后端是MluI和/或ClaI和/或EcoRI限制性位点；和
其中所述可变BV段的前端是NotI和/或AgeI限制性位点且后端是FspI限制性位点，将所述BV段的3'末端与所述BC段的5'末端连接的所述接头序列的前端是FspI限制性位点且后端是BstEII限制性位点，所述恒定BC段的前端是BspEII限制性位点且后端是MluI和/或ClaI和/或EcoRI限制性位点。
15.一种用于表达TCR的表达系统，包含
-文库，包含各自编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体和各自编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体，
其中所述编码45种不同可变TCRα链之一的45种TCR构建体中的每一种包含：
(i)编码可变TCRα链区的可变AV段之一，所述可变AV段编码序列为SEQ ID No：100至SEQ ID No：144所示序列的可变TCRα链区；
(ii)将所述AV段的3'-末端与AC段的5'-末端连接的接头序列；
其中所述编码47种不同可变TCRβ链之一的47种TCR构建体中的每一种包含：
(i)编码可变TCRβ链区的可变BV段之一，所述可变BV段编码序列为SEQ ID No：145至SEQ ID No：191所示序列的可变TCRβ链区；
(ii)将所述BV段的3'末端与BC段的5'末端连接的接头序列；和
-选自由以下所组成的组的ivtRNA骨架载体中的至少一种：
(i)包含所述AC段的ivtRNA骨架载体
(ii)包含所述BC段的ivtRNA骨架载体
(iii)包含所述AC段和所述BC段的ivtRNA骨架载体；和/或
-选自由以下所组成的组的逆转录病毒骨架载体中的至少一种：
(iv)包含所述AC段的逆转录病毒骨架载体
(v)包含所述BC段的逆转录病毒骨架载体
(vi)包含所述AC段和所述BC段的逆转录病毒骨架载体。
16.根据权利要求15所述的表达系统，还包含选自由以下所组成的组的慢病毒骨架载体中的至少一种：
(vii)包含所述AC段的慢病毒骨架载体
(viii)包含所述BC段的慢病毒骨架载体
(ix)包含所述AC段和所述BC段的慢病毒骨架载体。
17.一种表达TCR的细胞克隆文库，包含表达45种不同TCRα链的细胞克隆群体和表达47种不同TCRβ链的细胞克隆群体，
其中所述表达不同TCRα链的细胞克隆中的每一种均包含根据权利要求1所述的编码45种不同TCRα链之一的45种TCR构建体中的一种和一种编码TCRβ链的TCR构建体；和
其中所述表达不同TCRβ链的细胞克隆中的每一种均包含根据权利要求1所述的编码47种不同TCRβ链之一的47种TCR构建体中的一种和一种编码TCRα链的TCR构建体。
18.根据权利要求17所述的细胞克隆文库，其中所述细胞克隆为缺乏功能性TCR的BW-/-细胞系和/或Jurkat细胞系。
19.一种TCR蛋白质文库，包含含有45种不同TCRα链的TCR蛋白质群体和含有47种不同TCRβ链的TCR蛋白质群体，
其中所述包含不同TCRα链的TCR蛋白质中的每一种均包含由根据权利要求1所述的TCR构建体编码的所述45种不同TCRα链中的一种和TCRβ链；和
其中所述包含不同TCRβ链的TCR蛋白质中的每一种均包含由根据权利要求1所述的TCR构建体编码的所述47种不同TCRβ链中的一种和TCRα链。
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