JP2022538461A - Ｃｄ３８およびｃｄ３に結合するヘテロ二量体抗体 - Google Patents

Abstract

本開示は、２つの異なる標的抗原に同時に結合するヘテロ二量体抗体を提供する。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は二重特異性抗体である。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は３つのポリペプチドを含む：ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む第１のポリペプチド、免疫グロブリン重鎖を含む第２のポリペプチド、および免疫グロブリン軽鎖を含む第３のポリペプチド。一実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドに熱安定性の増加を付与する１つまたは複数の点変異を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８６９，３４３号、２０１９年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８９０，１６３号、および２０１９年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／９４５，３５０号に対して、米国特許法第１１９条の下で優先権の利益を主張する。上記出願のすべての開示は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

本出願全体を通して、様々な刊行物、特許、および／または特許出願が参照される。これらの刊行物、特許、および／または特許出願の開示は、本開示に関する最新技術をより十分に説明するために、ここに参照によりそれらの全体が本出願中に組み込まれる。

本開示は、２つの異なる標的抗原に同時に（ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ）（例えば、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ））結合するヘテロ二量体抗体を提供する。本開示は、ヘテロ二量体抗体、ヘテロ二量体抗体をコードする核酸、ヘテロ二量体抗体を発現する宿主細胞、および使用方法を提供する。

モノクローナル抗体をベースとする治療薬を使用して、がんおよび自己免疫／炎症性障害を処置することに成功してきた。２つの異なるモノクローナル抗体の投与を伴う併用療法の使用もまた、疾患を処置するために承認された治療方法である。併用療法には、２つの異なる抗原に同時に結合する（ｃｏ－ｅｎｇａｇｅ）よう設計された単一の免疫グロブリン分子である二重特異性抗体も用いることができる。免疫細胞シナプスを生じるよう設計された二重特異性抗体は、エフェクター細胞上の抗原および腫瘍によって発現される腫瘍関連抗原と結合することができ、これにより腫瘍選択的細胞傷害性細胞の殺傷（ｔｕｍｏｒ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ）がもたらされる。本開示は、２つの異なる標的抗原に同時に結合するヘテロ二量体抗体を提供する。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は二重特異性抗体である。

本開示は、２つの異なる標的抗原に同時に（ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ）（例えば、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ））結合するヘテロ二量体抗体を提供する。

本開示は、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体と結合するヘテロ二量体抗体であって、（ａ）ｓｃＦｖおよび第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチドであって、ｓｃＦｖが、Ｔ細胞受容体と結合する第１の抗原結合ドメインを形成する、第１のポリペプチド、（ｂ）重鎖可変領域および第２のＦｃ領域を含む第２のポリペプチド、ならびに（ｃ）軽鎖可変領域を含む第３のポリペプチドであって、第２のポリペプチドの重鎖可変領域および第３のポリペプチドの軽鎖可変領域が、腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合ドメインを形成する、第３のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

本開示は、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体と結合するヘテロ二量体抗体であって、（ａ）ｓｃＦｖおよび第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチドであって、ｓｃＦｖが、ペプチドリンカーによって互いに接合された第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）を含み、第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）が、Ｔ細胞受容体と結合する第１の抗原結合ドメインを形成する、第１のポリペプチド、（ｂ）第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）および第２のＦｃ領域を含む第２のポリペプチド、ならびに（ｃ）第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）を含む第３のポリペプチドであって、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）および第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）が、腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合ドメインを形成する、第３のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

本開示は、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体と結合するヘテロ二量体抗体であって、（ａ）ｓｃＦｖおよび第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチドであって、ｓｃＦｖが、ペプチドリンカーによって互いに接合された第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）を含み、ｓｃＦｖが、第１のヒンジ領域によって第１のＦｃ領域に接合されており、第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）が、Ｔ細胞受容体と結合する第１の抗原結合ドメインを形成する、第１のポリペプチド、（ｂ）第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）および第２のＦｃ領域を含む第２のポリペプチドであって、第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）が、第２のヒンジ領域によって第２のＦｃ領域に接合されており、第１および第２のヒンジ領域がジスルフィド結合を形成する、第２のポリペプチド、ならびに（ｃ）第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）を含む第３のポリペプチドであって、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）および第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）が、腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合ドメインを形成する、第３のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ＣＤ３８抗原を含む腫瘍関連抗原と結合する。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ＣＤ３抗原を含むＴ細胞受容体と結合する。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、完全ヒト免疫グロブリン配列を含む。

一実施形態では、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）は、完全ヒト免疫グロブリン配列を含み、第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）は、完全ヒト免疫グロブリン配列を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）は、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６および３８から選択される配列のうちの１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、配列番号２４、２９、３１、３３、３５、３７および３９から選択される配列のうちの１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）は、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６および３８から選択される重鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、配列番号２４、２９、３１、３３、３５、３７および３９から選択される軽鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）は、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６および３８から選択される重鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、第１のポリペプチドの第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、配列番号２４、２９、３１、３３、３５、３７および３９から選択される軽鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。

一実施形態では、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）は、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４から選択される重鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列を含む。

一実施形態では、第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）は、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５から選択される軽鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。一実施形態では、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）は、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４から選択される重鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）は、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５から選択される軽鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）は、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６および３８から選択される重鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、第１のポリペプチドの第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、配列番号２４、２９、３１、３３、３５、３７および３９から選択される軽鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列を含み、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）は、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４から選択される重鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）は、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５から選択される軽鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。

一実施形態では、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）は、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、１９、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４および１０１から選択される配列のうちの１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）は、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５から選択される配列のうちの１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）は、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、１９、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４および１０１から選択される配列のうちの１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）は、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５から選択される配列のうちの１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）は、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６および３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ならびに／または第１のポリペプチドの第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、配列番号２４、２９、３１、３３、３５、３７および３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）は、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ならびに／または第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）は、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）は、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６および３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、第１のポリペプチドの第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、配列番号２４、２９、３１、３３、３５、３７および３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）は、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）は、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

本開示は、３つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体抗体であって、第１のポリペプチドが、配列番号８７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号８９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号８８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体抗体（例えば、ＢＺ１）を提供する。

本開示は、３つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体抗体であって、第１のポリペプチドが、配列番号９０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号９２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号９１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体抗体（例えば、ＢＺ１Ｓ）を提供する。

本開示は、３つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体抗体であって、第１のポリペプチドが、配列番号７１～７７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体抗体（例えば、ＣＤ３８ Ａ２シリーズ）を提供する。

本開示は、３つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体抗体であって、第１のポリペプチドが、配列番号７１～７７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号８４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体抗体（例えば、ＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０ｍ１シリーズ）を提供する。

本開示は、３つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体抗体であって、第１のポリペプチドが、配列番号７１～７７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号８０～８３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、ＣＤ３８ Ｄ８シリーズ）、ヘテロ二量体抗体を提供する。

本開示は、３つのポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体抗体であって、第１のポリペプチドが、配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号１０６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、ＣＤ３８ Ｄ８ ｂｕｍｐ－ｉｎ－ｄｅｎｔシリーズ）、ヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、第１のポリペプチドは配列番号８７のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号８９のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドは配列番号８８のアミノ酸配列を含む（例えば、ＢＺ１）。

一実施形態では、第１のポリペプチドは配列番号９０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号９２のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドは配列番号９１のアミノ酸配列を含む（例えば、ＢＺ１Ｓ）。

一実施形態では、第１のポリペプチドのペプチドリンカーは、可撓性ペプチドリンカーを含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドのペプチドリンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１のヒンジ領域は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第２のポリペプチドの第２のヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。

一実施形態では、第２のポリペプチドの第２のヒンジ領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１のＦｃ領域および第２のポリペプチドの第２のＦｃ領域は、Ｆｃ細胞表面受容体と結合することができるＦｃドメインを形成する。

一実施形態では、第１および第２のＦｃ領域は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）、オプソニン作用および／または細胞結合を含むエフェクター機能を呈するＦｃドメインを形成する。

一実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、Ｆｃエフェクター機能を低下させる変異を含む。

一実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ＬＡＬＡ変異を含む。

一実施形態では、第１および第２のＦｃ領域は、ノブインホール構造を形成するように変異される。

一実施形態では、第１および第２のＦｃ領域は、ｂｕｍｐ－ｉｎ－ｄｅｎｔ構造を形成するように変異される。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１のＦｃ領域は、配列番号２６および２７のアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第２のポリペプチドの第２のＦｃ領域は、配列番号４および５のアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および／または第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、第１のポリペプチドに対して熱安定性の増加を付与する１つまたは複数の点変異を含む。

本開示は、本明細書に開示されるヘテロ二量体抗体のいずれかの第１、第２、および第３のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を提供する。本開示は、本明細書に開示されるヘテロ二量体抗体のいずれかの第１、第２、および第３のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含む１つまたは複数のベクターを提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数のベクターは、第１および第２のベクターを含む。一部の実施形態では、第１のベクターは、第１および第２のポリペプチドをコードし、第２のベクターは、第３のポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、第１のベクターは、第２および第３のポリペプチドをコードし、第２のベクターは、第１のポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、第１のベクターは、第１および第３のポリペプチドをコードし、第２のベクターは、第２のポリペプチドをコードする。

本開示は、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を提供する。

本開示は、第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を提供する。

本開示は、第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を提供する。

本開示は、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸、および第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を提供する。

本開示は、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１のベクター（例えば、第１の発現ベクター）を提供する。

本開示は、第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２のベクター（例えば、第２の発現ベクター）を提供する。

本開示は、第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含む第３のベクター（例えば、第３の発現ベクター）を提供する。

本開示は、（ｉ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸および（ｉｉ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第１のベクター（例えば、第１の発現ベクター）、ならびに第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含む第２のベクター（例えば、第２の発現ベクター）を提供する。

本開示は、（ｉ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸および（ｉｉ）第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含む第１のベクター（例えば、第１の発現ベクター）、ならびに第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第２のベクター（例えば、第２の発現ベクター）を提供する。

本開示は、（ｉ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸および（ｉｉ）第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含む第１のベクター（例えば、第１の発現ベクター）、ならびに第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２のベクター（例えば、第２の発現ベクター）を提供する。

本開示は、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および第２のポリペプチドをコードする第２の核酸、および第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。

本開示は、本明細書に開示される１つまたは複数の核酸またはベクターのいずれかを保有する宿主細胞、または宿主細胞の集団を提供する。

本開示は、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１の発現ベクターを保有する宿主細胞、または宿主細胞の集団を提供する。

本開示は、第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２の発現ベクターを保有する宿主細胞、または宿主細胞の集団を提供する。

本開示は、第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含む第３の発現ベクターを保有する宿主細胞、または宿主細胞の集団を提供する。

本開示は、第１および第２の発現ベクターを保有する宿主細胞、または宿主細胞の集団であって、第１の発現ベクターが、（ｉ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸および（ｉｉ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含み、第２の発現ベクターが、第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含む、宿主細胞、または宿主細胞の集団を提供する。

本開示は、第１および第２の発現ベクターを保有する宿主細胞、または宿主細胞の集団であって、第１の発現ベクターが、（ｉ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸および（ｉｉ）第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含み、第２の発現ベクターが、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む、宿主細胞、または宿主細胞の集団を提供する。

本開示は、第１および第２の発現ベクターを保有する宿主細胞、または宿主細胞の集団であって、第１の発現ベクターが、（ｉ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸および（ｉｉ）第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含み、第２の発現ベクターが、第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む、宿主細胞、または宿主細胞の集団を提供する。

本開示は、（ｉ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸および（ｉｉ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸、（ｉｉｉ）第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含む発現ベクターを保有する宿主細胞、または宿主細胞の集団を提供する。

本開示は、ヘテロ二量体抗体を調製するための方法であって、宿主細胞の集団が第１、第２および第３のポリペプチドを発現するのに好適な条件下で、宿主細胞の集団を培養するステップを含み、宿主細胞の集団における個々の宿主細胞が、ヘテロ二量体抗体をコードする本明細書に開示される１つもしくは複数の核酸または１つもしくは複数のベクターを保有し、必要に応じて、１つまたは複数のベクターが、（ｉ）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードする第１のベクター、ならびに（ｉｉ）第３のポリペプチドをコードする第２のベクターを含む、方法を提供する。

本開示は、ヘテロ二量体抗体を調製するための方法であって、（ａ）宿主細胞の第１の集団が第１のポリペプチドを発現するのに好適な条件下で、宿主細胞の第１の集団を培養するステップであって、宿主細胞の第１の集団における個々の宿主細胞が、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１のベクターを保有する、ステップと、（ｂ）宿主細胞の第２の集団が第２のポリペプチドを発現するのに好適な条件下で、宿主細胞の第２の集団を培養するステップであって、宿主細胞の第２の集団における個々の宿主細胞が、第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２のベクターを保有する、ステップと、（ｃ）宿主細胞の第３の集団が第３のポリペプチドを発現するのに好適な条件下で、宿主細胞の第３の集団を培養するステップであって、宿主細胞の第３の集団における個々の宿主細胞が、第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含む第３のベクターを保有する、ステップとを含む、方法を提供する。一実施形態では、本方法は、それぞれ、第１、第２および第３の細胞集団から、第１、第２および第３のポリペプチドを単離するステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、第１、第２および第３のポリペプチドを、第１、第２および第３のポリペプチドを互いに会合させるのに好適な条件下に供し、ヘテロ二量体抗体を形成するステップをさらに含む。

本開示は、ヘテロ二量体抗体を調製するための方法であって、宿主細胞の集団が第１、第２および第３のポリペプチドを発現するのに好適な条件下で、宿主細胞の集団を培養するステップを含み、宿主細胞の集団における個々の宿主細胞が、第１および第２のベクターを保有し、第１のベクター（例えば、第１の発現ベクター）が、（ｉ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸および（ｉｉ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含み、第２のベクターが、第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含む、方法を提供する。一実施形態では、本方法は、細胞集団から、第１、第２および第３のポリペプチドを単離するステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、第１、第２および第３のポリペプチドを、第１、第２および第３のポリペプチドを互いに会合させるのに好適な条件下に供し、ヘテロ二量体抗体を形成するステップをさらに含む。

本開示は、ヘテロ二量体抗体を調製するための方法であって、宿主細胞の集団が第１、第２および第３のポリペプチドを発現するのに好適な条件下で、宿主細胞の集団を培養するステップを含み、宿主細胞の集団における個々の宿主細胞が、第１および第２のベクターを保有し、第１のベクター（例えば、第１の発現ベクター）が、（ｉ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸および（ｉｉ）第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含み、第２のベクターが、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む、方法を提供する。一実施形態では、本方法は、細胞集団から、第１、第２および第３のポリペプチドを単離するステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、第１、第２および第３のポリペプチドを、第１、第２および第３のポリペプチドを互いに会合させるのに好適な条件下に供し、ヘテロ二量体抗体を形成するステップをさらに含む。

本開示は、ヘテロ二量体抗体を調製するための方法であって、宿主細胞の集団が第１、第２および第３のポリペプチドを発現するのに好適な条件下で、宿主細胞の集団を培養するステップを含み、宿主細胞の集団における個々の宿主細胞が、第１および第２のベクターを保有し、第１のベクター（例えば、第１の発現ベクター）が、（ｉ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸および（ｉｉ）第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含み、第２のベクターが、第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む、方法を提供する。一実施形態では、本方法は、細胞集団から、第１、第２および第３のポリペプチドを単離するステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、第１、第２および第３のポリペプチドを、第１、第２および第３のポリペプチドを互いに会合させるのに好適な条件下に供し、ヘテロ二量体抗体を形成するステップをさらに含む。

本開示は、ヘテロ二量体抗体を調製するための方法であって、宿主細胞の集団が第１、第２および第３のポリペプチドを発現するのに好適な条件下で、宿主細胞の集団を培養するステップを含み、宿主細胞の集団における個々の宿主細胞が、（ｉ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、（ｉｉ）第２のポリペプチドをコードする第２の核酸、および（ｉｉｉ）第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を含むベクターを保有する、方法を提供する。一実施形態では、本方法は、細胞集団から、第１、第２および第３のポリペプチドを単離するステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、第１、第２および第３のポリペプチドを、第１、第２および第３のポリペプチドを互いに会合させるのに好適な条件下に供し、ヘテロ二量体抗体を形成するステップをさらに含む。

本開示は、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体を結合させるための方法であって、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかを、ヘテロ二量体抗体を腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体に結合させるのに好適な条件下で、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体と接触させるステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体を、第１に腫瘍関連抗原と接触させ、第２に（例えば、引き続いて）Ｔ細胞受容体と接触させる。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体を、第１にＴ細胞受容体と接触させ、第２に（例えば、引き続いて）腫瘍関連抗原と接触させる。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体を、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体と同時に（ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ）（例えば、本質的に同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ））接触させる。

一実施形態では、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体を結合させるための方法において、腫瘍関連抗原は、前立腺、乳房、卵巣、頭頚部、膀胱、皮膚、結腸直腸、肛門、直腸、膵臓、肺（非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む）、脳、食道、肝臓、腎臓、胃、結腸、子宮頚部、子宮、子宮内膜、外陰、喉頭、膣、骨、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、口腔咽頭、喉頭、下喉頭（ｈｙｐｏｌａｒｙｎｘ）、唾液腺、尿管、尿道、陰茎、もしくは精巣のがん由来、または平滑筋腫、神経膠腫、もしくは神経膠芽腫由来の細胞によって発現される。

一実施形態では、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体を結合させるための方法において、腫瘍関連抗原は、血液がんによって発現される。一部の実施形態では、血液がんは、Ｂ慢性リンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、ＢおよびＴ急性リンパ球性白血病（ＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）、骨髄異形成症候群、バーキットリンパ腫（ＢＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫（ｐｌａｍｏｃｙｔｏｍａ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫（ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ｍｙｅｌｏｍａ）、ならびに軽鎖またはベンス－ジョーンズ骨髄腫である。

一実施形態では、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体を結合させるための方法において、Ｔ細胞受容体は、エフェクターＴ細胞によって発現される。一実施形態では、エフェクターＴ細胞は、細胞傷害性細胞の殺傷を媒介することによって、腫瘍またはがん細胞を死滅させる。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体を腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体に結合させることにより、細胞シナプスが形成される。一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、エフェクターＴ細胞において発現され、腫瘍関連抗原は、腫瘍またはがん細胞によって発現される。一実施形態では、細胞シナプスにおけるエフェクターＴ細胞は、細胞傷害性細胞の殺傷を媒介することによって腫瘍またはがん細胞を死滅させる。

本開示は、対象における疾患を処置するための方法であって、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかの治療有効量を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。本開示は、疾患を処置するための医薬の製造のための、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかの使用を提供する。本開示は、疾患を処置する際に使用するための、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかを提供する。

一実施形態では、対象における疾患を処置するための方法、使用、または使用のための抗体に関して、疾患は、前立腺、乳房、卵巣、頭頚部、膀胱、皮膚、結腸直腸、肛門、直腸、膵臓、肺（非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む）、脳、食道、肝臓、腎臓、胃、結腸、子宮頚部、子宮、子宮内膜、外陰、喉頭、膣、骨、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、口腔咽頭、喉頭、下喉頭、唾液腺、尿管、尿道、陰茎、もしくは精巣のがん、または平滑筋腫、神経膠腫、もしくは神経膠芽腫を含む。

一実施形態では、対象における疾患を処置するための方法、使用、または使用のための抗体に関して、疾患は、血液がんを含む。血液がんは、Ｂ慢性リンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、ＢおよびＴ急性リンパ球性白血病（ＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）、骨髄異形成症候群、バーキットリンパ腫（ＢＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、または軽鎖もしくはベンス－ジョーンズ骨髄腫であってもよい。

図１は、ヘテロ二量体抗体の非限定的な実施形態を示す概略図である。

図２は、タンパク質操作の繰り返しを通して、プロテインＡ親和性液体クロマトグラフィーによって精製された一過的にＣＨＯで発現したＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像である。

図３Ａは、プロテインＡ精製後にヘテロ二量体抗体の試料の分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＡＮＳＥＣ）から作成したクロマトグラムを示す。示されているデータは、二重特異性抗体ＣＤ３８Ａ２－３Ｈ１０／ＣＤ３ｔｓｍ＃１ノブイントゥホールに関するものである。

図３Ｂは、プロテインＡ精製後にヘテロ二量体抗体の試料の分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＡＮＳＥＣ）から作成したクロマトグラムを示す。示されているデータは、二重特異性抗体ＣＤ３８Ｄ８／ｓｓ４ｘＣＤ３ｂｕｍｐ－ｉｎｔｏ－ｄｅｎｔに関するものである。

図４Ａは、親抗体、Ｈｕｍ２９１ 抗ＣＤ３ ｍＡｂおよび抗ＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０ ｍＡｂと比較した様々な熱安定性を操作したヘテロ二量体抗体の一次Ｔ細胞結合曲線を示す。ヘテロ二量体抗体は、ＣＤ３－ｓｃＦｖ ｔｓｍ＃１、２、３または４とアセンブルしたＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０ｍ１、およびＣＤ３－ｓｃＦｖ ＬＡＬＡとアセンブルしたＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０ｍ１を含む。操作したヘテロ二量体抗体のＥＣ５０値は、ＣＤ３８マイナスＴ細胞において発現されたＣＤ３抗原に対するそれらの結合において互いに類似している。

図４Ｂは、親抗体、Ｈｕｍ２９１ 抗ＣＤ３ ｍＡｂおよび抗ＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０ ｍＡｂと比較した様々な熱安定性を操作したヘテロ二量体抗体の一次Ｔ細胞結合曲線を示す。ヘテロ二量体抗体は、ＣＤ３－ｓｃＦｖ ｔｓｍ＃５、６または７とアセンブルしたＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０ｍ１、およびＣＤ３－ｓｃＦｖ ＬＡＬＡとアセンブルしたＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０ｍ１を含む。操作したヘテロ二量体抗体のＥＣ５０値は、ＣＤ３８マイナスＴ細胞において発現されたＣＤ３抗原に対するそれらの結合において互いに類似している。

図５Ａは、モノクローナル抗体ＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０Ｍ１ ＩｇＧ－ＳＰＰＣのＳＰＲ分析からのセンサーグラムである。

図５Ｂは、配列番号７１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖（ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ＶＨバリアントＭ４８Ｉ／Ｋ６７Ｒ、ｔｓｍ＃１）および配列番号７８のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０ｍ１）を含む二重特異性抗体のＳＰＲ分析からのセンサーグラムである。

図５Ｃは、配列番号７１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖（ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ＶＨバリアントＭ４８Ｉ／Ｋ６７Ｒ、ｔｓｍ＃１）および配列番号７９のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３８ Ａ２）を含む二重特異性抗体のＳＰＲ分析からのセンサーグラムである。

図５Ｄは、配列番号７１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖（ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ＶＨバリアントＭ４８Ｉ／Ｋ６７Ｒ、ｔｓｍ＃１）および配列番号８１のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３８ Ｄ８－３Ａ１）を含む二重特異性抗体のＳＰＲ分析からのセンサーグラムである。

図５Ｅは、配列番号７１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖（ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ＶＨバリアントＭ４８Ｉ／Ｋ６７Ｒ、ｔｓｍ＃１）および配列番号８３のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３８ Ｄ８－１Ｂ５）を含む二重特異性抗体のＳＰＲ分析からのセンサーグラムである。

図５Ｆは、配列番号７１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖（ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ＶＨバリアントＭ４８Ｉ／Ｋ６７Ｒ、ｔｓｍ＃１）および配列番号８０のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３８ Ｄ８）を含む二重特異性抗体のＳＰＲ分析からのセンサーグラムである。

図５Ｇは、配列番号７１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖（ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ＶＨバリアントＭ４８Ｉ／Ｋ６７Ｒ、ｔｓｍ＃１）および配列番号８２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３８ Ｄ８－３Ｅ１）を含む二重特異性抗体のＳＰＲ分析からのセンサーグラムである。

図６は、ＢｉａＣｏｒｅ分析によって決定した場合の、様々なヘテロ二量体抗体に関して決定された結合速度論を列挙する表である。

図７は、フローサイトメトリーによって決定した場合の、６つの異なるＣＤ３８（＋）腫瘍細胞系のＣＤ３８発現レベルを比較する棒グラフを示す。

図８Ａは、刺激されていないヒトＴ細胞による抗体媒介性腫瘍細胞殺傷の結果を示す。二重特異性抗体は、用量依存的にＲＰＭＩ８２２６細胞を死滅させるように、以前には刺激されていないヒトＴ細胞をリダイレクトする。

図８Ｂは、刺激されていないヒトＴ細胞による抗体媒介性腫瘍細胞殺傷の結果を示す。二重特異性抗体は、用量依存的にＲＰＭＩ８２２６細胞を死滅させるように、以前には刺激されていないヒトＴ細胞をリダイレクトする。

図９Ａは、Ｔ細胞集団におけるＣＤ４（＋）／ＣＤ８（＋）の比およびドナーＰＢＭＣにおけるＣＤ５６（＋）ＮＫ細胞のパーセントを示す。

図９Ｂは、ドナー１、２または４由来のヒトＰＢＭＣと混合したＩＭ－９腫瘍細胞のＣＤ３８ｘＣＤ３二重特異性抗体またはダラザレックス（Ｄａｒｚａｌｅｘ）による殺傷の％を示す。

図９Ｃは、ドナー１、２または４由来のヒトＰＢＭＣと混合したＭＭ１．Ｒ腫瘍細胞のＣＤ３８ｘＣＤ３二重特異性抗体またはダラザレックスによる殺傷の％を示す。

図９Ｄは、ドナー１、２または４由来のヒトＰＢＭＣと混合したＮＣＩ－Ｈ９２９腫瘍細胞のＣＤ３８ｘＣＤ３二重特異性抗体またはダラザレックスによる殺傷の％を示す。

図９Ｅは、ドナー１、２または４由来のヒトＰＢＭＣと混合したＲＰＭＩ８２２６腫瘍細胞のＣＤ３８ｘＣＤ３二重特異性抗体またはダラザレックスによる殺傷の％を示す。

図９Ｆは、ドナー１、２または４由来のヒトＰＢＭＣと混合したＲａｊｉ腫瘍細胞のＣＤ３８ｘＣＤ３二重特異性抗体またはダラザレックスによる殺傷の％を示す。

図９Ｇは、ドナー１、２または４由来のヒトＰＢＭＣと混合したＤａｕｄｉ腫瘍細胞のＣＤ３８ｘＣＤ３二重特異性抗体またはダラザレックスによる殺傷の％を示す。

図１０Ａは、２つのモノクローナル抗体の組合せ（ＣＤ３８ ｍＡｂ＋ＣＤ３ ｍＡｂ）と比較した、ヘテロ二量体抗体（ＣＤ３８Ａ／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体および対照ＲＳＶ／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体）のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＦＮγ放出アッセイの結果を示す。

図１０Ｂは、２つのモノクローナル抗体の組合せ（ＣＤ３８ ｍＡｂ＋ＣＤ３ ｍＡｂ）と比較した、ヘテロ二量体抗体（ＣＤ３８Ａ／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体および対照ＲＳＶ／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体）のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＮＦα放出アッセイの結果を示す。

図１０Ｃは、２つのモノクローナル抗体の組合せ（ＣＤ３８ ｍＡｂ＋ＣＤ３ ｍＡｂ）と比較した、ヘテロ二量体抗体（ＣＤ３８Ａ／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体および対照ＲＳＶ／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体）のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＬ－２放出アッセイの結果を示す。

図１１Ａは、ＭＭ１．Ｒ標的腫瘍細胞の存在下で、１ｐＭまたは１０ｐＭまたは１ｎＭの抗体濃度の２つのモノクローナル抗体の組合せ（ＣＤ３８ ｍＡｂ＋ＨｕＭ２９１－ＣＤ３ ｍＡｂ）と比較した、ヘテロ二量体抗体（ＣＤ３８Ａ２－３Ｈ１０ｍ１／ＣＤ３ｔｓｍ＃１－ｓｃＦｖおよび対照ＲＳＶ／ＣＤ３ｔｓｍ＃１－ｓｃＦｖ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す。

図１１Ｂは、ＭＭ１．Ｒ標的腫瘍細胞の非存在下で、１ｐＭまたは１０ｐＭまたは１ｎＭの抗体濃度の２つのモノクローナル抗体の組合せ（ＣＤ３８ ｍＡｂ＋ＨｕＭ２９１－ＣＤ３ ｍＡｂ）と比較した、ヘテロ二量体抗体（ＣＤ３８Ａ２－３Ｈ１０ｍ１／ＣＤ３ｔｓｍ＃１－ｓｃＦｖおよび対照ＲＳＶ／ＣＤ３ｔｓｍ＃１－ｓｃＦｖ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す。

図１２Ａは、Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す棒グラフである。二重特異性抗体（ＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０ｍ１／ＣＤ３ ＩｇＧ－ＳｃＦｖ）は、用量依存的にｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化を媒介した。棒グラフは、図９ＡおよびＢから標的細胞およびＴ細胞のみの条件で観測された活性化レベルを減算することによって得られたＴ細胞活性化の正規化されたパーセントを示す。

図１２Ｂは、Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す棒グラフである。２つの親ｍＡｂの組合せ（ＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０ｍ１および抗ＣＤ３）は、用量依存的にｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化を媒介した。

図１２Ｃは、Ｔ細胞活性化アッセイの結果を示す棒グラフである。対照二重特異性抗体（ＲＳＶ／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化を媒介しなかった。

図１３Ａは、ドナー１由来のＰＢＭＣから調製したＣＤ３８を発現する標的細胞の供給源としてのＤａｕｄｉ細胞およびＮＫ細胞を使用するＡＤＣＣアッセイの結果を示すグラフである。

図１３Ｂは、ドナー２由来のＰＢＭＣから調製したＣＤ３８を発現する標的細胞の供給源としてのＤａｕｄｉ細胞およびＮＫ細胞を使用するＡＤＣＣアッセイの結果を示すグラフである。

図１４Ａは、ルシフェラーゼでタグ付けされたＲＰＭＩ８２２６ ＭＭ播種性腫瘍細胞を生着させ、次いでＴ細胞を投与し、対照抗体または２つの異なるＣＤ３８／ＣＤ３ヘテロ二量体（二重特異性）抗体のうちの１つで３回処置したマウスを使用するｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍マウス研究に関するタイムラインを示す。

図１４Ｂは、図１４Ａにおいて説明したマウスの９つの群に関する処置スケジュールを列挙する表である。

図１４Ｃは、ヘテロ二量体（二重特異性－１）抗体で処置した異種移植マウスモデルの生物発光イメージングを使用しての、腫瘍負荷（ＲＰＭＩ８２２６）を示す。

図１４Ｄは、図１４Ａ～Ｃに示される処置マウスからの平均生物発光シグナルを示す。

図１４Ｅは、図１４Ａ～Ｃに示される処置マウスからの平均生物発光シグナルを示す。

図１５Ａは、ヘテロ二量体（二重特異性－２）抗体で処置した異種移植マウスモデルの生物発光イメージングを使用しての、腫瘍負荷（ＲＰＭＩ８２２６）を示す。二重特異性－２抗体は、図１４Ｃに表した二重特異性－１抗体と比較して、異なる抗ＣＤ３８アームを有する。

図１５Ｂは、図１５Ａに示される処置マウスからの平均生物発光シグナルを示す。

図１５Ｃは、図１５Ａに示される処置マウスからの平均生物発光シグナルを示す。

図１６Ａは、ルシフェラーゼでタグ付けされたＲＰＭＩ８２２６腫瘍細胞を生着させ、次いでＴ細胞を投与しれ、対照抗体または２つの異なるＣＤ３８／ＣＤ３ヘテロ二量体（二重特異性）抗体のうちの１つで３回処置したマウスを使用するｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍マウス研究に関するタイムラインを示す概略図である。

図１６Ｂは、図１６Ａにおいて説明したようにマウスに関する処置スケジュールを列挙する表である。

図１６Ｃは、図１６ＡおよびＢにおいて説明したようにヘテロ二量体抗体で処置した異種移植マウスモデルの生物発光イメージングを使用しての、腫瘍負荷を示す。

図１６Ｄは、図１６Ａ～Ｃにおいて説明した処置マウスにおける腫瘍負荷の生物発光シグナルの総フラックスを示す。

図１６Ｅは、ＩＶＩＳ 平均放射輝度（単位：ｐ／秒／ｃｍ^２／ｓｒ）の平均値およびＳ．Ｅ．Ｍを列挙する表である。

図１６Ｆは、図１６Ｃに示されるマウスから採取された血液中のヒトＴ細胞（ＣＤ３＋Ｔ細胞）の検出を示すグラフである。

図１６Ｇは、図１６Ｃに示されるマウスからの血液で検出したようにＣＤ３８ｘＣＤ３二重特異性抗体投与の１日後のＴ細胞生着を示すグラフである。

図１６Ｈは、図１６Ｃに示されるマウスからの血液で検出したようにＣＤ３８ｘＣＤ３二重特異性抗体投与の１週間後のＴ細胞拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を示すグラフである。

図１６Ｉは、ヒトＣＤ３＋細胞検出（／ｕＬ）の平均値およびＳ．Ｅ．Ｍを列挙する表である。

図１７Ａは、ルシフェラーゼでタグ付けされたＲａｊｉ腫瘍細胞を生着させ、次いでＴ細胞を投与し、対照抗体または２つの異なるＣＤ３８／ＣＤ３ヘテロ二量体（二重特異性）抗体のうちの１つで３回処置したマウスを使用するｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍マウス研究に関するタイムラインを示す概略図である。

図１７Ｂは、ヘテロ二量体抗体で処置した（７９日目まで）異種移植マウスモデルの生物発光イメージングを使用しての、腫瘍負荷（Ｒａｊｉ）を示す。

図１７Ｃは、図１７Ａにおいて説明した処置マウスにおける腫瘍負荷の生物発光シグナルの総フラックスを示す。

図１７Ｄは、図１７Ａにおいて説明した処置マウス（ｔｒｅａｔｅｄ ｍｉｃ）の体重変化のパーセントを示す。

図１７Ｅは、フローサイトメトリーによって検出したように、グラフにおいて図示した日に得られた５０ｕＬのマウスの血液に含有されたＣＤ４５＋ヒトＴ細胞のレベルを示す。移植したヒト免疫細胞をＰＥ／Ｃｙ７抗ＣＤ３、ＡＰＣ／Ｃｙ７抗ＣＤ４５、ＡＰＣ抗ＣＤ３８、ＰＥ抗ＣＤ８ａ 抗体 ＰｅｒＣＰ／シアニン５．５マウス抗ＣＤ４抗体で染色した。

図１７Ｆは、フローサイトメトリーによって検出したように、グラフにおいて図示した日に得られた２５ｕＬのマウスの血液に含有されたＣＤ４５＋細胞由来のＣＤ３＋％ヒトＴ細胞を示す。

図１７Ｇは、フローサイトメトリーによって検出したように、グラフにおいて図示した日に得られた２５ｕＬのマウスの血液に含有されたＣＤ３＋細胞由来のＣＤ４＋％ヒトＴ細胞を示す。

図１７Ｈは、フローサイトメトリーによって検出したように、グラフにおいて図示した日に得られた２５ｕＬのマウスの血液に含有されたＣＤ３＋細胞由来のＣＤ８ａ＋％ヒトＴ細胞を示す。

図１７Ｉは、フローサイトメトリーによって検出したように、グラフにおいて図示した日に得られた２５ｕＬのマウスの血液に含有されたＣＤ４５＋細胞において検出されたＣＤ３８ ＭＦＩのレベルを示す。

図１７Ｊは、図１７Ａに示されるデータに基づく動物の生存分析（Ｍａｙｅｒ生存曲線）を示すグラフである。

図１８Ａは、ヘテロ二量体抗体の安定したプール生成のために試験した２つのアプローチを示す概略図である。

図１８Ｂは、安定したプール生成からのヘテロ二量体抗体発現のクマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。黒塗りの星は過剰な軽鎖を示す。黒塗りの矢印は重鎖を示す。

図１８Ｃは、図１８Ｂにおいて説明したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの抗ヒトＦｃウエスタンブロット分析を示す。

図１８Ｄは、図１８Ｂにおいて説明したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの抗ヒトＦｃおよび抗ヒトラムダウエスタンブロット分析を示す。黒塗りの星は過剰な軽鎖を示す。

図１８Ｅは、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ Ｉｍｐａｃｔカラムでヘテロ二量体抗体（ＢＺ１）のうちの１つを精製した結果を示す。

図１８Ｆは、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ Ｉｍｐａｃｔカラムでヘテロ二量体抗体（ＢＺ１Ｓ）のうちの１つを精製した結果を示す。

図１９Ａは、単離および精製した二重特異性抗体のＬＣ－ＭＳ分析からのＵＶトレースおよびＭＳトレースを示す。

図１９Ｂは、還元条件下で、単離および精製した二重特異性抗体をＣＥ－ＳＤＳに供した結果を示す。

図１９Ｃは、非還元条件下で、単離および精製した二重特異性抗体をＣＥ－ＳＤＳに供した結果を示す。

図１９Ｄは、図１９ＢおよびＣに示されるＣＥ－ＳＤＳの結果を使用して単離および精製した二重特異性抗体の決定したタンパク質質量を列挙する表を示す。

図２０Ａは、還元条件下で、単離および精製した二重特異性抗体（ＢＺ１）をイオン交換クロマトグラフィーに供した結果を示す。

図２０Ｂは、非還元条件下で、単離および精製した二重特異性抗体（ＢＺ１）をイオン交換クロマトグラフィーに供した結果を示す。

図２０Ｃは、図２０ＡおよびＢに示されるイオン交換クロマトグラフィーの結果を使用して単離および精製した二重特異性抗体の決定したタンパク質質量を列挙する表を示す。

図２１Ａは、還元条件下で、単離および精製した二重特異性抗体（ＢＺ１Ｓ）をイオン交換クロマトグラフィーに供した結果を示す。

図２１Ｂは、非還元条件下で、単離および精製した二重特異性抗体（ＢＺ１Ｓ）をイオン交換クロマトグラフィーに供した結果を示す。

図２１Ｃは、図２１ＡおよびＢに示されるイオン交換クロマトグラフィーの結果を使用して単離および精製した二重特異性抗体の決定したタンパク質質量を列挙する表を示す。

図２１Ｄは、ＢＺ１ＳおよびＢＺ１二重特異性抗体の単一細胞クローン上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析である。星は、二重特異性抗体を構成する優先的に正しく対合した第１、第２および第３のポリペプチドを発現する抗体クローンを示す（レーン３：ＢＺ１Ｓ－３２；レーン９：ＢＺ１－１５；レーン１０：ＢＺ１－３７；レーン１１：ＢＺ１－５６；およびレーン１２：ＢＺ１－７１）。

図２２Ａは、二重特異性抗体であるＢＺ１二重特異性抗体のＳＰＲ分析からのセンサーグラムである。

図２２Ｂは、二重特異性抗体であるＢＺ１Ｓ二重特異性抗体のＳＰＲ分析からのセンサーグラムである。

図２２Ｃは、二重特異性抗体であるＢＺ１二重特異性抗体のＳＰＲ分析からのセンサーグラムである。

図２２Ｄは、図２２Ａ～Ｃに示されるＳＰＲ分析から得たセンサーグラムからの結合速度論値を列挙する表である。

定義：

別段に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、別段に定義されていない限り、当業者によって通常理解される意味を有する。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、トランスジェニック細胞生成、タンパク質化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションの技法に関する用語は、当技術分野において周知であり、通常使用されている。本明細書において提供される方法および技法は、一般に、別段に指示されていない限り、本明細書において引用および議論される様々な一般的かつより具体的な参照文献に記載されるように、当技術分野で周知の従来の手順に従って実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ （１９９２）を参照されたい。Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ （ｅｄ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＮＹ， １９９５；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， １９９６；およびＰａｕｌ （１９９５） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｗａｔａ， Ｎ．Ｊ．， １９９５；Ｐａｕｌ （ｅｄ．），Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ， １９９３；Ｃｏｌｉｇａｎ （１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ， ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８９） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （４ｔｈ ｅｄ．） Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ， Ｃａｌｉｆ．、ならびにそれらにおいて引用される参照文献；Ｃｏｄｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （２ｎｄ ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８６、およびＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５－４９７， １９７５を含むいくつかの基礎テキストには、標準的な抗体産生プロセスが記載されている。本明細書において引用される参照文献のすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。酵素反応および富化／精製技法も、周知であり、当技術分野において通常達成されるかまたは本明細書に記載されるように、製造業者の指示に従って実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して使用される用語、ならびにその実験手順および技法は周知であり、当技術分野において通常使用される。標準的技法を、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、および送達、ならびに患者の処置のために使用することができる。

本明細書において提供される見出しは、本開示の様々な態様の限定ではなく、これらの態様は、全体として本明細書を参照して理解することができる。

本明細書の文脈によって別段に必要とされなければ、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。単数形形態の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」、ならびに任意の語の単数形での使用は、１つの指示対象に関して明示的かつ明解に限定されていない限り、複数の指示対象を含む。

本明細書における選択肢（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、選択肢のうちの１つもしくは両方のいずれかまたはそれらの任意の組合せを意味するものと解釈される。

本明細書で使用される用語「および／または」は、他のものを含むかまたは含まない、指定されたフィーチャまたは構成成分のそれぞれの具体的開示を意味するものと解釈されるべきである。例えば、用語「および／または」は、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、ならびに「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用される場合、以下の態様のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。

本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、ならびにそれらの文法上の変形は、本明細書で使用される場合、リスト中の１つの項目または複数の項目が、列挙された項目に置き換えるかまたは加えることができる他の項目を除外しないように、非限定的であることが意図される。態様が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語を用いて本明細書に記載されている場合はいつでも、そうでなければ、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に関して記載された類似の態様も提供されることが理解される。

本明細書で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、当業者によって決定された場合の、特定の値または組成に対して許容される誤差範囲内にある値または組成を指し、これらは、その値または組成が測定または決定される方法、すなわち測定系の限界に依存する。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当技術分野の実践ごとに１または１より大きい標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」または「およそ」は、測定系の限界に応じて、１０％まで（すなわち、±１０％）またはそれより大きい範囲を意味し得る。例えば、約５ｍｇは、４．５ｍｇから５．５ｍｇの間の任意の数値を含み得る。さらに、特に生物システムまたはプロセスに関して、これらの用語は、値の１桁の大きさまでまたは５倍までを意味し得る。本開示において特定の値または組成が与えられる場合、別段に記載されていない限り、「約」または「およそ」の意味は、特定の値または組成に対する許容される誤差範囲内にあると仮定されるべきである。

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」ならびに本明細書で使用される他の関連用語は互換的に使用され、アミノ酸のポリマーを指し、いかなる特定の長さにも限定されない。ポリペプチドは、天然および非天然のアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、組換え形態または化学合成形態を含む。ポリペプチドは、切断、例えば、分泌シグナルペプチドによるかまたはある特定のアミノ酸残基における非酵素切断による切断に未だ供されていない前駆体分子も含む。ポリペプチドは、切断を受けた成熟分子を含む。これらの用語は、天然および人工のタンパク質、タンパク質断片およびタンパク質配列のポリペプチドアナログ（ムテイン、バリアント、キメラタンパク質および融合タンパク質など）ならびに翻訳後に、またはそうでなければ共有結合もしくは非共有結合により修飾されたタンパク質を包含する。２つまたはそれより多いポリペプチド（例えば、３つのポリペプチド鎖）は、共有結合および／または非共有結合による会合によって、互いに会合して、ポリペプチド複合体を形成することができる。ポリペプチド鎖の会合は、ペプチドフォールディングも含み得る。よって、ポリペプチド複合体は、複合体を形成するポリペプチド鎖の数に応じて、二量体、三量体、四量体、またはそれより高次の複合体であってもよい。

用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」ならびに本明細書で使用される他の関連用語は互換的に使用され、ヌクレオチドのポリマーを指し、いかなる特定の長さにも限定されない。核酸は、組換え形態または化学合成形態を含む。核酸は、ＤＮＡ分子（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログ（例えば、ペプチド核酸および天然に存在しないヌクレオチドアナログ）を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、およびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一実施形態では、本開示の核酸分子は、抗体、あるいはその断片もしくはｓｃＦｖ、誘導体、ムテイン、またはバリアントをコードする連続的オープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、核酸は、１つの種類のポリヌクレオチドまたは２種もしくはそれより多い異なる種類のポリヌクレオチドの混合物を含む。ヘテロ二量体抗体をコードする核酸が本明細書に記載されている。

用語「回収する（ｒｅｃｏｖｅｒ）」または「回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）」または「回収すること（ｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇ）」、ならびに他の関連用語は、宿主細胞培養培地からまたは宿主細胞溶解液からまたは宿主細胞膜から、タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合部分）を得ることを指す。一実施形態では、タンパク質は、宿主細胞由来の（例えば、哺乳動物宿主細胞由来の）発現タンパク質の分泌を媒介する分泌シグナルペプチド配列（リーダーペプチド配列）に融合した組換えタンパク質として、宿主細胞によって発現される。分泌されたタンパク質は、宿主細胞培地から回収することができる。一実施形態では、タンパク質は、宿主細胞溶解液から回収することができる分泌シグナルペプチド配列を欠く組換えタンパク質として、宿主細胞によって発現される。一実施形態では、タンパク質は、宿主細胞膜から発現タンパク質を放出させるための界面活性剤を使用して回収することができる膜結合タンパク質として、宿主細胞によって発現される。一実施形態では、タンパク質を回収するために使用される方法と無関係に、タンパク質を、回収されたタンパク質から細胞デブリを除去する手順に供することができる。例えば、回収されたタンパク質を、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および／または透析に供することができる。一実施形態では、クロマトグラフィーは、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび／またはシリカでのクロマトグラフィーを含むいずれか１つまたは任意の組合せまたは２つまたはそれより多い手順を含む。一実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＡまたはＧ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の細胞壁構成成分）を含む。

用語「単離された」は、他の細胞物質を実質的に含まないタンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合部分）またはポリヌクレオチドを指す。タンパク質は、当技術分野で周知のタンパク質精製技法を使用して単離することによって、天然に関連する構成成分（または抗体を産生するために使用される細胞発現系もしくは化学合成方法に関連する構成成分）を実質的に含まないようにすることができる。単離されたという用語は、同じ種の他の分子、例えば、それぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチド配列を有する他のタンパク質またはポリヌクレオチドを実質的に含まないタンパク質またはポリヌクレオチドも指す。所望の分子の均質性の純度は、ゲル電気泳動などの低分解能の方法およびＨＰＬＣまたは質量分析などの高分解能の方法を含む、当技術分野で周知の技法を使用してアッセイすることができる。一実施形態では、本開示のヘテロ二量体抗体が単離される。

用語「リーダー配列」または「リーダーペプチド」または「ペプチドシグナル配列」または「シグナルペプチド」または「分泌シグナルペプチド」は、ポリペプチドのＮ末端に位置するペプチド配列を指す。リーダー配列は、ポリペプチド鎖を細胞分泌経路へと方向付け、ポリペプチドの、細胞膜の脂質二重層への組込みおよびアンカリングを指示することができる。典型的には、リーダー配列は、約１０～５０アミノ酸長である。リーダー配列は、サイトゾルから小胞体への前駆体ポリペプチドの輸送を指示することができる。一実施形態では、リーダー配列は、ＣＤ８α、ＣＤ２８またはＣＤ１６リーダー配列を含むシグナル配列を含む。一実施形態では、シグナル配列は、例えば、マウスまたはヒトＩｇガンマ分泌シグナルペプチドを含む哺乳動物配列を含む。一実施形態では、リーダー配列は、マウスＩｇガンマリーダーペプチド配列ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１１１）を含む。
「抗原結合タンパク質」および本明細書で使用される関連用語は、抗原に結合する部分、必要に応じて抗原結合部分が、抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進する立体構造を取ることを可能にする足場またはフレームワーク部分を含むタンパク質を指す。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体、および抗体アナログが挙げられる。抗原結合タンパク質は、例えば、代替タンパク質足場（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ）または移植ＣＤＲもしくはＣＤＲ誘導体を有する人工の足場を含むことができる。このような足場としては、以下に限定されないが、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入された変異を含む抗体由来の足場、および例えば、生体適合ポリマーを含む完全な合成足場が挙げられる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ５３， Ｉｓｓｕｅ １：１２１－１２９；Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２０：６３９－６５４を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣物（ＰＡＭ）、および足場としてフィブロネクチン構成成分を利用する抗体模倣物に基づく足場を使用することができる。一実施形態では、本開示のヘテロ二量体抗体は、２つの異なる標的抗原と結合し、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質と同様に挙動する。

抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を有し得る。一実施形態では、「免疫グロブリン」は、それぞれの対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成される天然に存在する四量体分子を指す。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００～１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとしての抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内では、可変領域と定常領域は、約１２またはそれより多いアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合され、重鎖は約１０またそれより多いアミノ酸（ａｂｏｕｔ １０ ｍｏｒｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）の「Ｄ」領域も含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ． ７ （Ｐａｕｌ， Ｗ．， ｅｄ．， ２ｎｄ ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９））（参照によりすべての目的でその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。重鎖および／または軽鎖は、分泌のためのリーダー配列を含んでも含まなくてもよい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷免疫グロブリンが２つの抗原結合部位を有するように、抗体結合性部位を形成する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、四量体免疫グロブリン分子とは異なるが、依然として標的抗原と結合するかまたは２つもしくはそれより多い標的抗原と結合する構造を有する合成分子であり得る。例えば、合成抗原結合タンパク質は、抗体断片、１～６もしくはそれより多いポリペプチド鎖、ポリペプチドの非対照アセンブリー、または他の合成分子を含み得る。一実施形態では、本開示のヘテロ二量体抗体は、２つの異なる標的抗原に特異的に結合し、本明細書に記載されている免疫グロブリン様特性を呈する。

免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって接合された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という同じ一般的な構造を示す。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の両方が、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。

１つまたは複数のＣＤＲは、共有結合または非共有結合のいずれかによって分子中に組み込まれ、これを抗原結合タンパク質とすることができる。抗原結合タンパク質は、より大きなポリペプチド鎖の部分としてＣＤＲを組み込むことができるか、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合により連結させることができるか、またはＣＤＲを非共有結合により組み込むことができる。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が目的の特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。

アミノ酸の各ドメインへの割り当ては、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．， ＵＳ Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＰＨＳ， ＮＩＨ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ． ９１－３２４２， １９９１（「Ｋａｂａｔの番号付け」）におけるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．の定義に従う。免疫グロブリン鎖のアミノ酸に関する他の番号付けシステムには、ＩＭＧＴ．ＲＴＭ．（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ， Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９：１８５－２０３； ２００５）およびＡＨｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９（３）：６５７－６７０； ２００１）；Ｃｈｏｔｈｉａ（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７３：９２７－９４８）；Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｍａｃｃａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６２：７３２－７４５）、およびＡｈｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ２００１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３０９：６５７－６７０）が含まれる。

「抗体（１つまたは複数）」および本明細書で使用される関連用語は、無傷免疫グロブリンまたは抗原に特異的に結合するその抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法によって、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成され得る。抗原結合部分としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ならびにポリペプチドに対して特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが挙げられる。

抗体には、組換えによって産生された抗体および抗原結合部分が含まれる。抗体には、非ヒト、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗体が含まれる。抗体には、単一特異性、多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性およびそれより高次の特異性）が含まれる。抗体には、四量体抗体、軽鎖モノマー、重鎖モノマー、軽鎖二量体、重鎖二量体が含まれる。抗体には、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片およびＦａｂ断片が含まれる。抗体には、単一ドメイン抗体、一価の抗体、一本鎖抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）、ミニボディが含まれる。抗体には、モノクローナル集団とポリクローナル集団が含まれる。一実施形態では、本開示のヘテロ二量体抗体は、２つの異なる標的抗原と結合し、本明細書で記載される抗原結合タンパク質のように挙動する。

「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、または「抗原結合部位」および本明細書で使用される他の関連用語は、抗原と相互作用し、抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含有する抗原結合タンパク質の一部を指す。その抗原に特異的に結合する抗体では、これには、そのＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも一部が含まれる。ヘテロ二量体抗体由来の抗原結合ドメインが本明細書に記載されている。

用語「特異的結合」、「特異的に結合する」または「特異的に結合すること」および抗体もしくは抗原結合タンパク質（例えば、ヘテロ二量体抗体）または抗体断片の文脈で本明細書で使用される他の関連用語は、他の分子または部分に対して、抗原に優先的に非共有結合または共有結合により結合することを指す（例えば、抗体は、他の利用可能な抗原に対して、特定の抗原に特異的に結合する）。一実施形態では、抗体は、解離定数Ｋ_Ｄが１０^－５Ｍもしくはそれ未満、または１０^－６Ｍもしくはそれ未満、または１０^－７Ｍもしくはそれ未満、または１０^－８Ｍもしくはそれ未満、または１０^－９Ｍもしくはそれ未満、または１０^－１０Ｍもしくはそれ未満、または１０^－１１Ｍもしくはそれ未満で抗原に結合する場合、標的抗原に特異的に結合する。ＣＤ３８およびＣＤ３と特異的に結合するヘテロ二量体抗体が本明細書に記載されている。

一実施形態では、結合特異性は、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、電気化学発光アッセイ（ＥＣＬ）、免疫放射線定量アッセイ（ＩＲＭＡ）、または酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）によって測定することができる。

一実施形態では、解離定数（Ｋ_Ｄ）は、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して測定することができる。表面プラズモン共鳴は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度において代替物の検出によるリアルタイム相互作用分析を可能にする光学的現象を指す。

「エピトープ」および本明細書で使用される関連用語は、抗原結合タンパク質が（例えば、抗体またはその抗原結合部分が）結合した抗原の一部を指す。エピトープは、抗原結合タンパク質が結合した２つまたはそれより多い抗原の部分を含み得る。エピトープは、抗原の、または２つもしくはそれより多い抗原の非連続部分（例えば、抗原の一次配列において連続的ではないが、抗原の三次および四次構造に関して、抗原結合タンパク質が互いに結合するのに十分近いアミノ酸残基）を含み得る。一般に、抗体の可変領域、特にＣＤＲは、エピトープと相互作用する。ＣＤ３８ポリペプチドのエピトープと結合し、ＣＤ３ポリペプチドのエピトープと結合するヘテロ二量体抗体が本明細書に記載されている。

「抗体断片」、「抗体部分」、「抗体の抗原結合断片」、または「抗体の抗原結合部分」および本明細書で使用される他の関連用語は、無傷抗体が結合する抗原と結合する無傷抗体の一部を含む無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；Ｆｄ；およびＦｖ断片、ならびにｄＡｂ；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分である抗体の少なくとも一部を含有するポリペプチドが挙げられる。抗体の抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法によって、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成され得る。抗原結合部分としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ならびに抗原結合特性を抗体断片に付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが挙げられる。

用語「Ｆａｂ」、「Ｆａｂ断片」および他の関連用語は、軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）、軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）、および第１の定常領域（Ｃ_Ｈ１）を含む一価の断片を指す。Ｆａｂは、抗原と結合することが可能である。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片である。Ｆ（ａｂ’）_２は、抗原結合能を有する。Ｆｄ断片は、Ｖ_Ｈ領域とＣ_Ｈ１領域を含む。Ｆｖ断片は、Ｖ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域を含む。Ｆｖは抗原と結合することができる。ｄＡｂ断片は、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン、またはＶ_ＨもしくはＶＬドメインの抗原結合断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号および同第６，６９６，２４５号；米国特許出願公開第２００２／０２５１２号、同第２００４／０２０２９９５号、同第２００４／００３８２９１号、同第２００４／０００９５０７号、同第２００３／００３９９５８号；ならびにＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６， １９８９）。ヘテロ二量体抗体由来の抗原結合部分を含むＦａｂ断片が本明細書に記載される。

単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、Ｖ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）によって接合され、一価の抗原結合部位を形成することが可能な連続タンパク質鎖を形成する抗体である（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－８３を参照されたい）。ヘテロ二量体抗体由来の抗原結合部分を含む単鎖抗体が本明細書に記載されている。

ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価の抗体であり、各ポリペプチド鎖は、短すぎて、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合することができず、よって、各ドメインが別のポリペプチド鎖の相補的ドメインと対合することが可能になるリンカーによって接合されたＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインを含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４－４８、およびＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－２３を参照されたい）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合、その後、それらの対合によって得られたダイアボディは、２つの同一の抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製することができる。同様に、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）およびテトラボディは、それぞれ３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ同じであっても異なっていてもよい３つおよび４つの抗原結合部位を形成する抗体である。ダイアボディ、トリボディおよびテトラボディ構築物は、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかに由来する抗原結合部分を使用して調製することができる。

用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つまたは複数の可変領域および定常領域を有する抗体を指す。一実施形態では、可変ドメインと定常ドメインのすべては、ヒト免疫グロブリン配列（例えば、完全ヒト抗体）に由来する。これらの抗体は、種々の方法で調製することができ、これらの例は以下に記載されており、組換え方法論またはヒト重鎖および／もしくは軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するよう遺伝子修飾されたマウスの目的の抗原による免疫によるものを含む。完全ヒトヘテロ二量体抗体およびその抗原結合タンパク質が、本明細書に記載されている。

「ヒト化」抗体は、非ヒト種に由来する抗体の配列と、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加によって異なる配列を有する抗体を指し、その結果、ヒト化抗体は、ヒト対象に投与された場合に、非ヒト種抗体と比較して、免疫応答を誘導する傾向が低い、および／またはそれほど重篤でない免疫応答を誘発する。一実施形態では、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークドメインおよび定常ドメインにおけるある特定のアミノ酸を変異させて、ヒト化抗体を作製する。別の実施形態では、ヒト抗体由来の定常ドメイン（複数可）を非ヒト種の可変ドメイン（複数可）に融合させる。別の実施形態では、非ヒト抗体の１つまたは複数のＣＤＲ配列における１つまたは複数のアミノ酸残基を変更して、ヒト対象に投与された場合に生じる可能性がある非ヒト抗体の免疫原性を低下させ、ここで、変更されたアミノ酸残基はいずれも、抗体のその抗原への免疫特異的結合にとって重要ではなく、なされたアミノ酸配列への変更が保存的変更であり、その結果ヒト化抗体の抗原への結合が、非ヒト抗体の抗原への結合よりも有意に悪くない。ヒト化抗体の作製方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号に見出すことができる。ヒト化部分を有するヘテロ二量体抗体が、本明細書に記載されている。

用語「キメラ抗体」および本明細書で使用される関連用語は、第１の抗体に由来する１つまたは複数の領域と１つまたは複数の他の抗体に由来する１つまたは複数の領域とを含有する抗体を指す。一実施形態では、ＣＤＲの１つまたは複数はヒト抗体に由来する。別の実施形態では、ＣＤＲのすべてがヒト抗体に由来する。別の実施形態では、１つより多いヒト抗体由来のＣＤＲをキメラ抗体において混合および適合させる。例えば、キメラ抗体は、第１のヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１、第２のヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第３の抗体由来の重鎖由来のＣＤＲを含んでもよい。別の例では、ＣＤＲは、ヒトおよびマウス、またはヒトおよびウサギ、またはヒトおよびヤギなどの異なる種を起源とする。当業者は、他の組合せが可能であることを十分に理解するであろう。

さらに、フレームワーク領域は、同じ抗体のうちの１つ、１つまたは複数の異なる抗体、例えばヒト抗体、またはヒト化抗体に由来してもよい。キメラ抗体の一例では、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と同一であるか、それに相同であるか、またはそれに由来し、一方、その鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体（複数可）と同一であるか、それに相同であるか、またはそれに由来する。また、所望の生物活性（すなわち、標的抗原と特異的に結合する能力）を呈するこのような抗体の断片も含まれる。キメラ部分を有するヘテロ二量体抗体が、本明細書に記載されている。

本明細書で使用される場合、用語「バリアント」ポリペプチドおよびポリペプチドの「バリアント」は、参照ポリペプチド配列に対して、アミノ酸配列中に挿入された、それから欠失したおよび／またはそれへと置換された１つまたは複数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。ポリペプチドバリアントは、融合タンパク質を含む。同じように、バリアントポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチド配列中に挿入された、それから欠失したおよび／またはそれへと置換された１つまたは複数のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチドバリアントは融合ポリヌクレオチドを含む。

本明細書で使用される場合、用語ポリペプチドの「誘導体」は、例えばポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、リン酸化、およびグリコシル化などの別の化学部分へのコンジュゲーションによって、化学的に修飾されたポリペプチド（例えば、抗体）である。別段に指定されていない限り、用語「抗体」は、２つの完全長重鎖および２つの完全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、バリアント、断片、およびムテインを含み、これらの例は以下に記載される。

用語「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、本明細書で使用される場合、ヒンジ領域で始まるかその後にあって、重鎖のＣ末端で終わる抗体重鎖定常領域の部分を指す。Ｆｃ領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含んでおり、ヒンジ領域の一部を含んでも含まなくてもよい。それぞれＦｃ領域を含有する２つのポリペプチド鎖を二量体化し、二量体Ｆｃ領域を形成することができる。一部の実施形態では、二量体Ｆｃ領域は、Ｆｃ細胞表面受容体および免疫補体系の一部のタンパク質と結合することができる。一部の実施形態では、二量体Ｆｃ領域は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）、オプソニン作用および／または細胞結合を含む２つまたはそれより多い活性のいずれか１つまたは任意の組合せを含むエフェクター機能を呈する。一部の実施形態では、二量体Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩ（例えば、ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（例えば、ＣＤ３２）および／またはＦｃγＲＩＩＩ（例えば、ＣＤ１６ａ）を含むＦｃ受容体と結合することができる。

用語「標識化抗体」または本明細書で使用される関連用語は、標識されていないかまたは検出可能な標識もしくは検出のための部分に接合された抗体およびそのそれらの抗原結合部分を指し、検出可能な標識または部分は、放射性であるか、比色性であるか、抗原性であるか、酵素性であるか、検出可能なビーズ（磁気ビーズまたは高電子密度（例えば、金）ビーズ）であるか、ビオチンであるか、ストレプトアビジンであるか、またはプロテインＡである。放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）を含むがこれらに限定されない様々な標識を用いることができる。本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれも、標識されていなくてもよく、または検出可能な標識もしくは部分に接合されていてもよい。

「同一性パーセント」または「相同性パーセント」および本明細書で使用される関連用語は、２つのポリペプチド配列間または２つのポリヌクレオチド配列間の類似性の定量的測定値を指す。２つのポリペプチド配列間の同一性パーセントは、２つのポリペプチド配列のアラインメントを最適化するために導入される必要のある場合があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れて、２つのポリペプチド配列間で共有されるアラインされた場所での同一のアミノ酸の数の関数である。同様に、２つのポリヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、２つのポリヌクレオチド配列のアラインメントを最適化するために導入される必要のある場合があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れて、２つのポリヌクレオチド配列間で共有されるアラインされた場所での同一のヌクレオチドの数の関数である。配列の比較および２つのポリペプチド配列間、または２つのポリヌクレオチド配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の「同一性パーセント」または「相同性パーセント」は、そのデフォルトパラメーターを使用してＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）の一部）を使用して配列を比較することによって決定することができる。試験配列に関する「Ｙに対して少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」などの表現は、上記のように配列Ｙに対してアラインした場合に、試験配列がＹの残基の少なくともＸ％と同一の残基を含むことを意味する。

一実施形態では、試験抗体のアミノ酸配列は、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体を構成するポリペプチドのアミノ酸配列のいずれかに類似するが同一でなくてもよい。試験抗体とポリペプチドとの間の類似性は、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体を構成するポリペプチドのいずれかと少なくとも９５％、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一であり得る。一実施形態では、類似するポリペプチドは、重鎖および／または軽鎖内にアミノ酸置換を含有してもよい。一実施形態では、アミノ酸置換は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する化学的特性（例えば、荷電または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つまたはそれより多いアミノ酸配列が、保存的置換によって互いに異なる場合には、配列同一性パーセントまたは類似性の度合は、置換の保存的性質を正すために上方に調整され得る。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ （１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４： ３０７－３３１を参照されたい。類似する化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、および（７）硫黄含有側鎖はシステインおよびメチオニンである、が挙げられる。

抗体は、様々な抗原特異性を有する免疫グロブリンを含有する血清または血漿などの供給源から得ることができる。このような抗体を親和性精製に供する場合、これらは、特定の抗原特異性に関して富化され得る。このような抗体の富化調製物は、通常、特定の抗原に対する特異的結合活性を有する約１０％未満の抗体から作製される。これらの調製物を数ラウンドの親和性精製に供することにより、抗原に対する特異的結合活性を有する抗体の比率を増加させることができる。このように調製された抗体は、「単一特異性」と称されることが多い。単一特異性抗体調製物は、特定の抗原に対する特異的結合活性を有する約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または９９．９％の抗体から構成され得る。抗体は、以下に記載したような組換え核酸技術を使用して産生することができる。

「ベクター」および本明細書で使用される関連用語は、外来遺伝物質（例えば、核酸導入遺伝子）に作動可能に連結され得る核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。ベクターをビヒクルとして使用して、外来遺伝物質を細胞（例えば、宿主細胞）中に導入することができる。ベクターは、導入遺伝子のベクター中への挿入のために、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含み得る。ベクターは、ベクター－導入遺伝子構築物を保有する宿主細胞の選択の助けとなる抗生物質耐性または選択可能な特徴を付与する少なくとも１つの遺伝子配列を含み得る。ベクターは、一本鎖核酸分子であっても二本鎖核酸分子であってもよい。ベクターは、直鎖状核酸分子であっても環状核酸分子であってもよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを用いる遺伝子編集方法に使用されるドナー核酸は、１種のベクターであってもよい。１種のベクターは、「プラスミド」であり、導入遺伝子に連結され得る直鎖状または環状の二本鎖染色体外ＤＮＡ分子を指し、宿主細胞内で複製され、導入遺伝子を転写および／または翻訳することが可能である。ウイルスベクターは、典型的には、導入遺伝子に連結され得るウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ主鎖配列を含有する。ウイルス主鎖配列は、修飾されて、感染不能となるが、ウイルス主鎖と共連結した導入遺伝子の宿主細胞ゲノム中への挿入を保持することができる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびエプスタインバーウイルスのベクターが挙げられる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することが可能である（例えば、細菌の複製起点および哺乳動物エピソームベクターを含む細菌ベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと一緒に複製される。

「発現ベクター」は、誘導性および／または構成的プロモーターおよびエンハンサーなどの１つまたは複数の調節配列を含有し得る１種のベクターである。発現ベクターは、リボソーム結合部位および／またはポリアデニル化部位を含み得る。発現ベクターは、１つまたは複数の複製起点配列を含み得る。調節配列は、宿主細胞中に形質導入された発現ベクターに連結された導入遺伝子の転写、または転写と翻訳を指示する。調節配列（複数可）は、導入遺伝子の発現のレベル、タイミングおよび／または位置を制御することができる。調節配列は、例えば、導入遺伝子へのその作用を直接的に、または１つまたは複数の他の分子（例えば、調節配列および／または核酸に結合したポリペプチド）の作用を介して発揮することができる。調節配列は、ベクターの一部であってもよい。調節配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， １９９０， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．およびＢａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：３６０５－３６０６に記載される。発現ベクターは、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかの少なくとも一部をコードする核酸を含んでもよい。

導入遺伝子は、導入遺伝子とベクターとの間に連結が存在する場合、ベクターに「作動可能に連結」し、ベクターに含有される導入遺伝子配列の機能化または発現を可能にする。一実施形態では、導入遺伝子は、調節配列が導入遺伝子の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、または位置）に影響を及ぼす場合に、調節配列に「作動可能に連結」している。

用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」または本明細書で使用される他の関連用語は、外因性核酸（例えば、導入遺伝子）が、宿主細胞中に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」宿主細胞は、外因性核酸（導入遺伝子）をトランスフェクト、形質転換または形質導入されたものである。宿主細胞は、初代対象細胞とその子孫を含む。本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかの少なくとも一部をコードする外因性核酸を宿主細胞中に導入することができる。本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかの少なくとも一部を含む発現ベクターを宿主細胞中に導入することができ、宿主細胞は、ヘテロ二量体抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドを発現することができる。

用語「宿主細胞」または「または宿主細胞の集団」または本明細書で使用される関連用語は、外来の（外因性または導入遺伝子）核酸が導入された細胞（またはその集団）を指す。外来の核酸は、導入遺伝子に作動可能に連結した発現ベクターを含むことができ、宿主細胞を使用して、外来の核酸（導入遺伝子）にコードされた核酸および／またはポリペプチドを発現させることができる。宿主細胞（またはその集団）は、培養細胞であってもよく、または対象から抽出されてもよい。宿主細胞（またはその集団）は、初代対象細胞および継代数に関わりなくその子孫を含む。子孫細胞は、親細胞と比較して、同一の遺伝物質を保有していても保有していなくてもよい。宿主細胞は、子孫細胞を包含する。一実施形態では、宿主細胞は、本明細書で開示されるように、抗体を発現させるためにあらゆる方法で修飾、トランスフェクト、形質導入、形質転換、および／または操作された任意の細胞（その子孫を含む）を説明する。一例では、宿主細胞（またはその集団）に、本明細書に記載の所望の抗体、またはその抗原結合部分をコードする核酸に作動可能に連結された発現ベクターを導入することができる。宿主細胞およびその集団は、宿主のゲノム中に安定して組み込まれた発現ベクターを保有してもよく、または染色体外発現ベクターを保有してもよい。一実施形態では、宿主細胞およびその集団は、数回の細胞分裂後に存在するか、または一過的に存在して、数回の細胞分裂後には失われる染色体外ベクターを保有してもよい。

トランスジェニック宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを含む周知のデザイナーヌクレアーゼを含む非ウイルス方法を使用して調製することができる。導入遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどのゲノム編集技術を使用して宿主細胞のゲノム中に組み込むことができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、それぞれ操作されたジンクフィンガーモチーフ由来のＤＮＡ結合ドメインに融合した制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）の非特異的エンドヌクレアーゼドメインを含有する１対のキメラタンパク質を含む。ＤＮＡ結合ドメインを操作して、宿主のゲノムの特異的配列と結合させることができ、エンドヌクレアーゼドメインは二本鎖切断を行う。ドナーＤＮＡは、導入遺伝子、例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＤＡＲ構築物をコードする核酸のいずれか、および宿主細胞のゲノムにおける意図された挿入部位のいずれかの側の領域に対して相同である隣接配列を有する。宿主細胞のＤＮＡ修復機構は、相同ＤＮＡ修復によって導入遺伝子の正確な挿入を可能にする。トランスジェニック哺乳動物宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して調製されている（米国特許第９，５９７，３５７号、同第９，６１６，０９０号、同第９，８１６，０７４号および同第８，９４５，８６８号）。トランスジェニック宿主細胞は、それらが、正確な導入遺伝子の挿入を送達できるＤＮＡ結合ドメインに融合した非特異的エンドヌクレアーゼドメインを含むという点で、ジンクフィンガーヌクレアーゼに類似するＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ）を使用して調製することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼと同様に、ＴＡＬＥＮも、二本鎖切断を宿主のＤＮＡ中に導入する。トランスジェニック宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）を使用して調製することができる。ＣＲＩＳＰＲは、標的特異的なドナーＤＮＡの組込みのためのガイドＲＮＡに連結したＣａｓエンドヌクレアーゼを用いる。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡのｇＲＮＡ結合領域の上流にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有する保存されたマルチヌクレオチドを含み、宿主細胞標的部位にハイブリダイズし、そこで、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは二本鎖標的ＤＮＡを切断する。ガイドＲＮＡは、特異的標的部位にハイブリダイズするよう設計され得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、挿入部位に対して相同性を有する隣接配列を有するドナーＤＮＡの部位特異的挿入を導入することができる。ゲノムを修飾するために使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の例は、例えば米国特許第８，６９７，３５９号、同第１０，０００，７７２号、同第９，７９０，４９０号、および米国特許出願公開第２０１８／０３４６９２７号に記載される。一実施形態では、トランスジェニック宿主細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して調製することができ、宿主標的部位は、ＴＲＡＣ遺伝子（Ｔ細胞受容体アルファ定常）であってもよい。ドナーＤＮＡは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＤＡＲ構築物をコードする核酸のいずれかを含んでもよい。電気穿孔、ヌクレオフェクションまたはリポフェクションを使用して、ドナーＤＮＡをジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に宿主細胞中に共送達することができる。

宿主細胞は、原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉであってもよく、または真核生物、例えば単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマトの植物細胞）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）もしくはハイブリドーマであってもよい。一実施形態では、宿主細胞には、所望の抗体をコードする核酸に作動可能に連結した発現ベクターが導入され、それによって、トランスフェクト／形質転換された宿主細胞を生じ、これを、トランスフェクト／形質転換された宿主細胞による抗体の発現に好適な条件下で培養し、必要に応じてトランスフェクト／形質転換された宿主細胞から抗体を回収するか（例えば、宿主細胞溶解液から回収する）、または培養培地から回収することができる。一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、およびＹＢ２／０を含む非ヒト細胞を含む。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＴ－１０８０、Ｈｕｈ－７およびＰＥＲ．Ｃ６を含むヒト細胞を含む。宿主細胞の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ－７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｃｅｌｌ ２３： １７５を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯなどのそれらの派生物、および無血清培地（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１を参照されたい）中で成長する関連細胞系またはＤＨＦＲが欠乏しているＣＨＯ株ＤＸ－Ｂ １１（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６－２０を参照されたい）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１を参照されたい）、２９３、２９３ ＥＢＮＡまたはＭＳＲ ２９３などのヒト胚性腎臓細胞、ヒト表皮のＡ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、通常の二倍体細胞、初代組織、初代移植片、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャーカット細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に由来する細胞株が挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、Ｙ０、ＮＳ０またはＳｐ２０などのリンパ系細胞を含む。一実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞であるが、ヒト宿主細胞ではない。典型的には、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸を形質転換またはトランスフェクトすることができる培養細胞であり、核酸は、次いで、宿主細胞において発現され得る。語句「トランスジェニック宿主細胞」または「組換え宿主細胞」を使用して、発現される核酸を形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を意味することができる。宿主細胞は、核酸を含むが、調節配列が核酸と作動可能に連結されるように宿主細胞中に導入されなければ、核酸を所望のレベルで発現しない細胞であり得る。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。ある特定の修飾は、例えば、変異または環境の影響によって後続の世代において生じ得るため、このような子孫は、実際に、親細胞と同一でなくてもよいが、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。１つまたは複数のヘテロ二量体抗体をコードする少なくとも１つの核酸に作動可能に連結したベクター（例えば、発現ベクター）を保有する宿主細胞、または宿主細胞の集団が、本明細書に記載されている。

本開示のポリペプチド（例えば、抗体および抗原結合タンパク質）は、当技術分野で公知のいずれかの方法を使用して生成することができる。一例では、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を組換え発現ベクターに挿入し、これを宿主細胞に導入し、発現を促進する条件下で宿主細胞によって発現させることによる組換え核酸方法によって生成される。

組換え核酸の操作のための一般的技法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｏｌｓ． １－３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２ ｅｄ．， １９８９、またはＦ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）および周期的更新に記載される。ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、哺乳動物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来する１つまたは複数の好適な転写または翻訳調節エレメントを有する発現ベクターに作動可能に連結している。このような調節エレメントは、転写プロモーター、転写を制御する必要に応じたオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。発現ベクターは、宿主細胞に複製能を付与する起点または複製（ａｎ ｏｒｉｇｉｎ ｏｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を含んでもよい。発現ベクターは、トランスジェニック宿主細胞（例えば、形質転換体）の認識を容易にする選択を付与する遺伝子を含んでもよい。

組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するのに有用であり得るいずれかの種類のタンパク質タグ配列をコードしてもよい。タンパク質タグの例としては、以下に限定されないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが挙げられる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞の宿主と共に使用するための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８５）に見出すことができる。

発現ベクター構築物は、宿主細胞に対して適切な方法を使用して、宿主細胞に導入することができる。核酸を宿主細胞中に導入するための種々の方法は当技術分野で公知であり、以下に限定されないが、電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；ウイルストランスフェクション；非ウイルストランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターが感染因子である場合）を含む。好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞を含む。

好適な細菌としては、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．を含む。酵母、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種由来の酵母、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、ポリペプチド生成のために使用することができる。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系も、組換えタンパク質を発現するために用いることができる。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：４７， １９８８）によって検証される。好適な哺乳動物宿主細胞系の例としては、内皮細胞、ＣＯＳ－７サル腎臓細胞、ＣＶ－１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胚性腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞系が挙げられる。精製されたポリペプチドは、好適な宿主／ベクター系を培養して、組換えタンパク質を発現させることによって調製される。多くの適用では、本明細書に開示されるサイズの小さな多くのポリペプチドを、発現のための好ましい方法として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させる。次いで、タンパク質を培養培地または細胞抽出物から精製する。ヘテロ二量体抗体のいずれかは、トランスジェニック宿主細胞によって発現され得る。

本明細書に開示される抗体および抗原結合タンパク質はまた、細胞翻訳系を使用して産生することができる。このような目的のために、ポリペプチドをコードする核酸を修飾し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を可能にし、ｍＲＮＡを生成し、利用される特定の無細胞系（哺乳動物細胞もしくは酵母細胞などの真核生物細胞を含まない翻訳系または細菌細胞などの原核生物細胞を含まない翻訳系）におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にしなければならない。

本明細書に開示される様々なポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成することができる。細胞における発現を改善するためにコドン使用（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を選択することができる。このようなコドン使用は、選択される細胞型に依存する。具体的なコドン使用パターンは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞に対して開発されてきた。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ２００３ １００（２）：４３８－４２；Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ２００２ （１）：９６－１０５；Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｎ Ｄ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１ １２（５）：４４６－９；Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． １９９６ ６０（３）：５１２－３８；およびＳｈａｒｐ ｅｔ ａｌ． Ｙｅａｓｔ． １９９１ ７（７）：６５７－７８を参照されたい。

本明細書に記載の抗体および抗原結合タンパク質は、化学合成によって産生することもできる（例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．， １９８４， Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．に記載の方法によって）。タンパク質に対する修飾を、化学合成によっても生じさせることができる。

本明細書に記載の抗体および抗原結合タンパク質は、タンパク質化学の分野で一般的に公知のタンパク質の単離／精製方法によって精製することができる。非限定的な例としては、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後に、ポリペプチドを異なる緩衝液へと交換する、および／または濾過および透析を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の種々の方法のいずれかによって濃縮することができる。

本明細書に記載の精製された抗体および抗原結合タンパク質は、好ましくは、少なくとも６５％純粋、少なくとも７５％純粋、少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値とは無関係に、ポリペプチドは医薬製品として使用するのに十分に純粋である。本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかは、トランスジェニック宿主細胞によって発現され、その後、任意の当技術分野で公知の方法を使用して、約６５～９８％の純度または高レベルの純度まで精製され得る。

ある特定の実施形態では、本明細書における抗体および抗原結合タンパク質は、翻訳後の修飾をさらに含み得る。例示的な翻訳後のタンパク質修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ－リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が挙げられる。結果として、修飾されたポリペプチドは、脂質、多糖または単糖、およびホスフェートなどの非アミノ酸エレメントを含有し得る。グリコシル化の好ましい形態はシアリル化であり、１つまたは複数のシアル酸部分をポリペプチドにコンジュゲートする。シアル酸部分は、溶解度および血清半減期を改善する、その一方、タンパク質の免疫原性の可能性を低下させる。Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００１ ３１； ４０（３０）：８８６８－７６を参照されたい。

一実施形態では、本明細書に記載の抗体および抗原結合タンパク質を修飾して可溶性ポリペプチドとすることができ、これは抗体および抗原結合タンパク質を非タンパク質性ポリマーに連結させることを含む。一実施形態では、非タンパク質性ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示されたように、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンを含む。

ＰＥＧは、市販されている水溶性ポリマーであるか、または当技術分野で周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合によって調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｖｏｌ． ３， ｐａｇｅｓ １３８－１６１）。用語「ＰＥＧ」は、サイズまたはＰＥＧ末端の修飾に関わらず、任意のポリエチレングリコール分子を包含するように広く使用され、式：Ｘ－Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ（１）（式中、ｎは２０～２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えばＣ_１～４アルキルである）によって表すことができる。一実施形態では、ＰＥＧは、ヒドロキシまたはメトキシを有する一方の末端で終結し、すなわち、ＸはＨまたはＣＨ_３（「メトキシＰＥＧ」）である。ＰＥＧは、結合反応に必要なさらなる化学基を含有することができ、これは、分子の化学合成から生じるか、または分子の部分の最適な距離のためのスペーサーである。さらに、このようなＰＥＧは、互いに連結される１つまたは複数のＰＥＧ側鎖からなり得る。２つ以上のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、マルチアームＰＥＧまたは分岐ＰＥＧと称される。分岐ＰＥＧは、例えばポリエチレンオキシドをグリセロール、ペンタエリスリトール、およびソルビトールを含む様々なポリオールに付加することによって調製することができる。例えば、４つのアームの分岐ＰＥＧは、ペンタエリスリトールと酸化エチレンから調製することができる。分岐ＰＥＧは、例えば、ＥＰ－Ａ ０ ４７３ ０８４および米国特許第５，９３２，４６２号に記載されている。ＰＥＧの１つの形態としては、リシンの一級アミノ基によって連結した２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）を含む（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ６ （１９９５） ６２－６９）。

ＰＥＧ修飾ポリペプチドの血清クリアランス率は、ポリペプチドと結合する未修飾抗体および抗原結合タンパク質のクリアランス率に対して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらには９０％モジュレート（例えば、増加または減少）され得る。ＰＥＧ修飾抗体および抗原結合タンパク質は、未修飾ポリペプチドの半減期（ｔ_１／２）に対して増強された半減期を有し得る。ＰＥＧ修飾ポリペプチドの半減期は、未修飾抗体および抗原結合タンパク質の半減期に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％、またはさらには１０００％増強され得る。一実施形態では、タンパク質の半減期は、緩衝食塩水溶液または血清中などのｉｎ ｖｉｔｒｏで決定される。他の実施形態では、タンパク質の半減期は、動物の血清または他の体液中のタンパク質の半減期などのｉｎ ｖｉｖｏ半減期である。

本開示は、薬学的に許容される賦形剤との混合物中に本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかを含む治療用組成物を提供する。賦形剤は、担体、安定剤および賦形剤を包含する。薬学的に許容される賦形剤の賦形剤としては、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、滑沢剤、滑剤、および抗接着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、またはタルク）が挙げられる。追加の例としては、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤および等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｆｉｅｒ）が挙げられる。

治療用組成物およびそれらを調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０ｔｈ ｅｄ．， ｅｄ． Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ Ｒ．， ２０００， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ．）に見出される。治療用組成物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、賦形剤、滅菌水、食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化ナフタレンを含有してもよく、それを含有し得る。生体適合性の、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマーを使用して、本明細書に記載の抗体（またはその抗原結合タンパク質）の放出を制御することができる。ナノ粒子製剤（例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）を使用して、抗体（またはその抗原結合タンパク質）の生体内分布を制御することができる。他の潜在的に有用な非経口送達系には、エチレン－酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームが含まれる。製剤中の抗体（またはその抗原結合タンパク質）の濃度は、投与される薬物の投薬量、および投与経路を含むいくつかの因子に応じて変わる。

ヘテロ二量体抗体（またはその抗原結合タンパク質）のいずれかを必要に応じて、製薬業において一般的に使用される非毒性酸付加塩または金属錯体などの薬学的に許容される塩として投与することができる。酸付加塩の例としては、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸などの有機酸、タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー酸、および塩酸、臭化水素酸、硫酸 リン酸などの無機酸が挙げられる。金属錯体には、亜鉛、鉄などが含まれる。一例では、抗体（またはその抗原結合タンパク質）は、熱安定性を増加させるために酢酸ナトリウムの存在下で製剤化される。

ヘテロ二量体抗体（またはその抗原結合タンパク質）のいずれかは、経口使用用に製剤化されてもよく、非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に有効成分（複数可）を含有する錠剤を含む。経口使用用製剤は、咀嚼錠、または有効成分が不活性固体希釈剤と混合された硬質ゼラチンカプセル剤、または有効成分が水もしくは油媒体と混合された軟質ゼラチンカプセル剤としても提供することができる。

用語「対象」は、本明細書で使用される場合、脊椎動物、哺乳動物および非哺乳動物を含むヒトおよび非ヒト動物を指す。一実施形態では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネズミ（例えば、マウスおよびラット）、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、オオカミ、カエルまたは魚であってもよい。

用語「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、「投与された（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」および文法上の変形は、当業者に公知の様々な方法および送達系のいずれかを使用する、薬剤の対象への物理的導入を指す。本明細書に開示される製剤に関する例示的な投与経路は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄または例えば、注射または注入による他の非経口投与経路を含む。語句「非経口投与」は、本明細書で使用される場合、経腸および局所投与以外の、通常は注射による投与方式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射および注入、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔を含む。一実施形態では、製剤は、非経口経路以外の経路によって、例えば経口的に投与される。他の非経口経路以外の経路には、局所、表皮または粘膜投与経路、例えば鼻腔内、膣、直腸、舌下または局所が含まれる。投与することは、例えば１回、複数回、および／または１回もしくは複数回の長期間にわたり実施され得る。本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれか（またはその抗原結合タンパク質）は、当技術分野で抗体の方法および送達経路を使用して対象に投与することができる。

用語「有効量」、「治療有効量」または「有効用量」または関連用語は、互換的に使用することができ、対象に投与された場合に、腫瘍またはがん抗原の発現に関連する疾患または障害の測定可能な改善または防止をもたらすのに十分な抗体または抗原結合タンパク質（例えば、ヘテロ二量体抗体）の量を指す。本明細書で提供される抗体の治療有効量は、単独または組み合わせて使用された場合に、抗体および組合せの相対的活性（例えば、細胞成長の阻害において）に応じて変わり、処置される対象および疾患状態、対象の体重および年齢および性別、対象における疾患状態の重症度、投与方式などに応じて変わり、これらは当業者によって容易に決定され得る。

一実施形態では、治療有効量は、処置される対象および処置される障害のある特定の態様に応じて変わり、公知の技法を使用して当業者が確認することができる。一般に、ポリペプチドは、１日当たり約０．０１ｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇで投与される。ポリペプチドは、毎日（例えば、毎日１回、２回、３回、または４回）または好ましくはそれより少ない頻度で（例えば、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月、または１年に４回）投与されてもよい。さらに、当技術分野で公知であるように、年齢ならびに体重、健康全般、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、および疾患の重症度に対する調整が必要である場合がある。

本開示は、１つまたは複数の腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患を有する対象を処置するための方法を提供する。疾患は、がんまたは例えば、ＣＤ３８および／もしくはＣＤ３抗原などの腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞を含む。一実施形態では、がんまたは腫瘍は、前立腺、乳房、卵巣、頭頚部、膀胱、皮膚、結腸直腸、肛門、直腸、膵臓、肺（非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む）、平滑筋腫、脳、神経膠腫、神経膠芽腫、食道、肝臓、腎臓、胃、結腸、子宮頚部、子宮、子宮内膜、外陰、喉頭、膣、骨、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、口腔咽頭、喉頭、下喉頭、唾液腺、尿管、尿道、陰茎、および精巣のがんを含む。

一実施形態では、がんは、白血病、リンパ腫、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫を含む血液がんを含む。血液がんは、多発性骨髄腫（ＭＭ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ慢性リンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＢおよびＴ急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、形質細胞性骨髄腫、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、形質細胞腫、巨細胞骨髄腫、形質細胞性骨髄腫、重鎖骨髄腫、軽鎖またはベンス－ジョーンズ骨髄腫、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、ならびに急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシス、ならびに意義不明の単クローン性γグロブリン血症を含む。

本開示は、２つの異なる標的抗原に同時に結合するヘテロ二量体抗体を提供する。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は二重特異性抗体である。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む第１のポリペプチド、免疫グロブリン重鎖を含む第２のポリペプチド、および免疫グロブリン軽鎖を含む第３のポリペプチドを含む３つのポリペプチドを含む（図１）。一実施形態では、第１のポリペプチドは、熱安定性の増加、Ｆｃエフェクター機能の低下および／またはヘテロ二量体化能の増加を付与する１つまたは複数の点変異を含む。一実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｆｃエフェクター機能の低下および／またはヘテロ二量体化能の増加を付与する１つまたは複数の点変異を含む。

本開示は、Ｔ細胞受容体および腫瘍関連抗原と結合するヘテロ二量体抗体を提供する。一実施形態では、ヘテロ二量体は、ヒト由来のＣＤ３－イプシロン抗原（例えば、配列番号９３、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０７７６６－１）を含むＴ細胞受容体と結合する。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ハムスターおよび／またはサル（例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはマカク）を含む非ヒト動物由来のＣＤ３－イプシロン抗原と交差反応する。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ヒト由来のＣＤ３８抗原を含む腫瘍関連抗原（例えば、配列番号７０、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２８９０７）と結合する。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ハムスターおよび／またはサル（例えば、カニクイザル、アカゲザルまたはマカク）を含む非ヒト動物由来のＣＤ３８抗原と交差反応する。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、カニクイザル由来のＣＤ３８（配列番号１０７、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ５ＶＡＮ０）、マウス由来のＣＤ３８（配列番号１０８、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ５６５２８０）および／またはラット由来のＣＤ３８（配列番号１０９、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ６４２４４）と交差反応する。

本開示は、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体と結合するヘテロ二量体抗体であって、（ａ）ｓｃＦｖおよび第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチドであって、ｓｃＦｖがＴ細胞受容体と結合する第１の抗原結合ドメインを形成する、第１のポリペプチド、（ｂ）重鎖可変領域および第２のＦｃ領域を含む第２のポリペプチド、ならびに（ｃ）軽鎖可変領域を含む第３のポリペプチドであって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合ドメインを形成する、第３のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。一実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＣＤ３８抗原を含む。一実施形態では、ＣＤ３８抗原は、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ３８抗原は、配列番号１０７、１０８および／または１０９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＣＤ３抗原を含む。一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および／または第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、第１のポリペプチドに対して熱安定性の増加を付与する１つまたは複数の点変異を含む。

本開示は、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体と結合するヘテロ二量体抗体であって、（ａ）ｓｃＦｖおよび第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチドであって、ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端の順に、ペプチドリンカーによって互いに接合された第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）を含み、第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）がＴ細胞受容体と結合する第１の抗原結合ドメインを形成する、第１のポリペプチド、（ｂ）第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）および第２のＦｃ領域を含む第２のポリペプチド、ならびに（ｃ）第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）を含む第３のポリペプチドであって、第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）および第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）が、腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合ドメインを形成する、第３のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、第１のポリペプチドは、ｓｃＦｖおよび第１のＦｃ領域を含み、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ペプチドリンカーによって互いに接合された第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）および第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）を含み、第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）および第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）は、Ｔ細胞受容体と結合する第１の抗原結合ドメインを形成する。

一実施形態では、ｓｃＦｖおよび第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチドであって、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーによって互いに接合された第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）を含み、第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、Ｔ細胞受容体と結合する第１の抗原結合ドメインを形成する。一実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＣＤ３８抗原を含む。一実施形態では、ＣＤ３８抗原は、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ３８抗原は、配列番号１０７、１０８および／または１０９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＣＤ３抗原を含む。一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および／または第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、第１のポリペプチドに対して熱安定性の増加を付与する１つまたは複数の点変異を含む。

本開示は、腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体と結合するヘテロ二量体抗体であって、（ａ）ｓｃＦｖおよび第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチドであって、ｓｃＦｖが、ペプチドリンカーによって互いに接合された第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域を含み、ｓｃＦｖが、第１のヒンジ領域によって第１のＦｃに接合されており、第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域が、Ｔ細胞受容体と結合する第１の抗原結合ドメインを形成する、第１のポリペプチド、（ｂ）第２の重鎖可変領域および第２のＦｃ領域を含む第２のポリペプチドであって、第２の重鎖可変領域が、第２のヒンジ領域によって第２のＦｃ領域に接合されており、第１および第２にヒンジ領域がジスルフィド結合を形成する、第２のポリペプチド、ならびに（ｃ）第２の軽鎖可変領域を含む第３のポリペプチドであって、第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域が、腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合ドメインを形成する、第３のポリペプチドを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。一実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＣＤ３８抗原を含む。一実施形態では、ＣＤ３８抗原は、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ３８抗原は、配列番号１０７、１０８および／または１０９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＣＤ３抗原を含む。一実施形態では、ＣＤ３抗原は、配列番号９３のアミノ酸配列を有するヒトＣＤ３イプシロン抗原を含む。一実施形態では、第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および／または第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）は、第１のポリペプチドに対して熱安定性の増加を付与する１つまたは複数の点変異を含む。

本開示は、第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）を含むｓｃＦｖ－Ｆｃ融合ポリペプチドである第１のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体抗体であって、ＶＨａ領域がヒト化または完全ヒト免疫グロブリン配列を含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ＣＤ３抗原と結合することができる第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）領域および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）を含む第１のポリペプチド鎖を含み、第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）は、野生型Ｈｕｍ２９１配列（例えば、配列番号３８）を含むかまたはＭ４８Ｉ／Ｋ６７Ｒ、Ｉ３０Ｖ／Ｋ６７Ｒ、Ｍ４８Ｉ、Ｉ３０Ｖ／Ｍ４８Ｉ／Ｋ６７Ｒ、Ｋ６７Ｒ、またはＩ３０Ｖ（例えば、それぞれ、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６）を含む少なくとも１つの変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの変異は、第１のポリペプチド鎖の熱安定性をモジュレートする（例えば、増加または低下させる）。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６および３８から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）を含む。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号２４、２９、３１、３３、３５、３７および３９から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）を含む。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号７１、７２、７３、７４、７５、７６および７７から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖を含む。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む（例えば、ＢＺ１）。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む（例えば、ＢＺ１Ｓ）。

本開示は、ヒト化または完全ヒト免疫グロブリン配列を含む第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）を含む第２のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、１９、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）を含む。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号２、７、９、１１、１３または１５から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの第２の重鎖定常領域（ＣＨ１）を含む。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号７８、７９、８０、８１、８２および８３から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号８９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む（例えば、ＢＺ１）。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号９２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む（例えば、ＢＺ１Ｓ）。

本開示は、ヒト化または完全ヒト免疫グロブリン配列を含む第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）を含む第３のポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）を含む。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号１７、１９および２１から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドの軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号８４、８５および８６から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖を含む。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む（例えば、ＢＺ１）。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む（例えば、ＢＺ１Ｓ）。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号８９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、および配列番号８８のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む３つのポリペプチド鎖を含む（例えば、ＢＺ１）。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号９２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、および配列番号９１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む３つのポリペプチド鎖を含む（例えば、ＢＺ１Ｓ）。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号７１～７７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号７９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、および配列番号８５のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む３つのポリペプチド鎖を含む（例えば、ＣＤ３８ Ａ２シリーズ）。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号７１～７７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号７８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、および配列番号８４のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む３つのポリペプチド鎖を含む（例えば、ＣＤ３８ Ａ２～３Ｈ１０ｍ１シリーズ）。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号７１～７７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号８０～８３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、および配列番号８６のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む（例えば、ＣＤ３８ Ｄ８シリーズ）３つのポリペプチド鎖を含む。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、配列番号１００のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号１０６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、および配列番号８６のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む（例えば、ＣＤ３８ Ｄ８ ｂｕｍｐ－ｉｎ－ｄｅｎｔシリーズ）３つのポリペプチド鎖を含む。

本開示は、可撓性ペプチドリンカーであり得るペプチドリンカーを含む第１のポリペプチドのペプチドリンカーを含むヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、ペプチドは、（ＳＧ）_ｎ、（ＳＧＧ）_ｎ、（ＳＧＧＧ）_ｎ（配列番号１１２）、（ＳＳＧ）_ｎ、（ＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧ）_ｎ、（ＧＳＧＧＳ）_ｎ（配列番号１１３）、（ＧＳＧ）_ｎ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、（配列番号１１４）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１１５）、（ＧＧＧＧＳＧＳ）_ｎ（配列番号１１６）、（ＧＧＧＧＳＧＧＳ）_ｎ（配列番号１１７）、および（ＧＧＳ）_ｎ（配列中、ｎは１～６の整数である）から選択されるアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、ペプチドリンカーは、ＴＳＧＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第１のポリペプチドのペプチドリンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。

本開示は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ヒンジ領域を含む第１のポリペプチドの第１のヒンジ領域を含むヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１のヒンジ領域は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、配列番号２５のアミノ酸配列を有する第１のヒンジ領域を、ＣＰＰＣがＳＰＰＣに変異するように変異させる。

本開示は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ヒンジ領域を含む第２のポリペプチドの第２のヒンジ領域を含むヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、第２のポリペプチドの第２のヒンジ領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

本開示は、Ｆｃ細胞表面受容体と結合することができるＦｃドメインを形成する第１のポリペプチドの第１のＦｃ領域および第２のポリペプチドの第２のＦｃ領域を含むヘテロ二量体抗体を提供する。

本開示は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）、オプソニン作用および／または細胞結合を含むエフェクター機能を呈するＦｃドメインを形成する第１のポリペプチドの第１のＦｃ領域および第２のポリペプチドの第２のＦｃ領域を含むヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１のＦｃ領域および／または第２のポリペプチドの第２のＦｃ領域は、Ｆｃエフェクター機能を低下させる変異を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１のＦｃ領域および／または第２のポリペプチドの第２のＦｃ領域は、ＬＡＬＡ変異を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１のＦｃ領域および／または第２のポリペプチドの第２のＦｃ領域を、ノブインホール構造を形成するように変異させる。一実施形態では、第１のポリペプチドの第１のＦｃ領域は、配列番号２６および２７のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第２のポリペプチドの第２のＦｃ領域は、配列番号４および５のアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第１のポリペプチドの第１のＦｃ領域および／または第２のポリペプチドの第２のＦｃ領域を、ｂｕｍｐ－ｉｎ－ｄｅｎｔ構造を形成するように変異させる。一実施形態では、第１のポリペプチドの第１のＦｃ領域は、配列番号９８および９９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、第２のポリペプチドの第２のＦｃ領域は、配列番号１０４および１０５のアミノ酸配列を含む。

本開示は、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を提供する。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸は、本明細書に記載の完全長の第１のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第１の核酸を含む。

一実施形態では、第１の核酸は、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６および３８から選択されるアミノ酸配列を有する第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）をコードする。

一実施形態では、第１の核酸は、（ＳＧ）_ｎ、（ＳＧＧ）_ｎ、（ＳＧＧＧ）_ｎ（配列番号１１２）、（ＳＳＧ）_ｎ、（ＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧ）_ｎ、（ＧＳＧＧＳ）_ｎ（配列番号１１３）、（ＧＳＧ）_ｎ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１１４）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１１５）、（ＧＧＧＧＳＧＳ）_ｎ（配列番号１１６）、（ＧＧＧＧＳＧＧＳ）_ｎ（配列番号１１７）、および（ＧＧＳ）_ｎ（配列中、ｎは１～６の整数である）から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーをコードする。一実施形態では、第１の核酸は、ＴＳＧＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーをコードする。一実施形態では、第１の核酸は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーをコードする。

一実施形態では、第１の核酸は、配列番号２４、２９、３１、３３、３５、３７および３９から選択されるアミノ酸配列を有する第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）をコードする。

一実施形態では、第１の核酸は、配列番号２５のアミノ酸配列を有する第１のヒンジ領域をコードする。一実施形態では、第１の核酸は、ＣＰＰＣがＳＰＰＣに変異するように変異させている配列番号２５のアミノ酸配列を有する第１のヒンジ領域をコードする。

一実施形態では、第１の核酸は、配列番号２６のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドのＣＨ２領域をコードする。

一実施形態では、第１の核酸は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドのＣＨ３領域をコードする。

一実施形態では、第１の核酸は、配列番号７１、７２、７３、７４、７５、７６または７７のアミノ酸配列を有する完全長の第１のポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸は、本明細書に記載の完全長の第２のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第２の核酸を含む。

一実施形態では、第２の核酸は、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４から選択されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドの第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）をコードする。

一実施形態では、第２の核酸は、配列番号２、７、９、１１、１３および１５から選択されるアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドの重鎖定常領域（ＣＨ１）をコードする。

一実施形態では、第２の核酸は、配列番号３のアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドの第２のヒンジ領域をコードする。一実施形態では、第２の核酸は、ＣＰＰＣがＳＰＰＣに変異するように変異させている配列番号３のアミノ酸配列を有する第２のヒンジ領域をコードする。

一実施形態では、第２の核酸は、配列番号４のアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドのＣＨ２領域をコードする。

一実施形態では、第２の核酸は、配列番号５のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドのＣＨ３領域をコードする。

一実施形態では、第２の核酸は、配列番号７８、７９、８０、８１、８２または８３のアミノ酸配列を有する完全長の第２のポリペプチドをコードする。

一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸は、本明細書に記載の完全長の第３のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第３の核酸を含む。

一実施形態では、第３の核酸は、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５から選択されるアミノ酸配列を有する第３のポリペプチドの第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）をコードする。

一実施形態では、第３の核酸は、配列番号１７、１９および２１から選択されるアミノ酸配列を有する第３のポリペプチドの軽鎖定常領域（ＣＬ１）をコードする。

一実施形態では、第３の核酸は、配列番号８４、８５または８６のアミノ酸配列を有する完全長の第３のポリペプチドをコードする。

本開示は、配列番号８７のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド、配列番号８９のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および配列番号８８のアミノ酸配列を有する第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を提供する。

本開示は、配列番号８７のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を提供する。

本開示は、配列番号８９のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を提供する。

本開示は、配列番号８８のアミノ酸配列を有する第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を提供する。

本開示は、配列番号９０のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド、配列番号９２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および配列番号９１のアミノ酸配列を有する第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を提供する。

本開示は、配列番号９０のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を提供する。

本開示は、配列番号９２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を提供する。

本開示は、配列番号９１のアミノ酸配列を有する第３のポリペプチドをコードする第３の核酸を提供する。

本開示は、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかを構成する第１、第２および／または第３のポリペプチドのいずれかをコードする１つまたは複数の核酸（例えば、核酸導入遺伝子（複数可））に作動可能に接合された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｊｏｉｎｅｄ）、発現ベクターを含む個々のベクターを提供する。一実施形態では、発現ベクターは、第１、第２または第３のポリペプチドをコードする核酸の転写を制御する１つまたは複数のプロモーターを含む。

一実施形態では、ベクターは、第１、第２または第３のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に接合された、少なくとも１つの調節配列、例えばプロモーターおよび必要に応じてエンハンサーを含み、プロモーターは、モノシストロニック方式で第１、第２または第３のポリペプチドをコードする核酸の転写を制御する。

一実施形態では、ベクターは、第１、第２および／または第３のポリペプチドをコードする複数の核酸のいずれか２つまたは任意の組合せに作動可能に接合されたプロモーター（および必要に応じてエンハンサー）を含み、プロモーターは、第１、第２および／または第３のポリペプチドをコードするポリシストロニック転写物の転写を制御する。

一実施形態では、ベクターは、個々のプロモーターを、第１、第２または第３のポリペプチドをコードする個々の核酸に作動可能に接合させることが可能な複数のプロモーター（および必要に応じて少なくとも１つのエンハンサー配列）を含み、単一ベクター内の複数のプロモーターは、第１、第２および／または第３のポリペプチドをコードする異なる転写物の転写を制御する。

一実施形態では、１つのベクターが宿主細胞中に導入され、宿主細胞内のベクターは、プロモーター（および必要に応じてエンハンサー配列）を有し、ポリペプチド（例えば、第１、第２または第３のポリペプチド）をコードする１つの核酸は、ベクター内のプロモーターに接合されている。よって、宿主細胞は、ヘテロ二量体抗体のいずれかを構成する第１、第２または第３のポリペプチドを発現することができる。

一実施形態では、複数のベクターが宿主細胞中に導入され、宿主細胞内の個々のベクターは、少なくとも１つのプロモーター（および必要に応じてエンハンサー配列）を有し、ポリペプチド（例えば、第１、第２または第３のポリペプチド）をコードする１つの核酸は、１つのベクター内の１つのプロモーターに接合されている。よって、個々の宿主細胞は、ヘテロ二量体抗体のいずれかを構成する第１、第２および／または第３のポリペプチドのいずれか２つまたは任意の組合せを発現する。

ベクターは、誘導性または構成的プロモーターであるプロモーターを含む。ベクターおよび宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかを一過的にまたは安定して発現するトランスジェニック宿主細胞を生じるように選択され得る。

一実施形態では、第１の発現ベクターは、本明細書に記載の完全長の第１のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第１の核酸に作動可能に接合されている。

一実施形態では、第２の発現ベクターは、本明細書に記載の完全長の第２のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第２の核酸に作動可能に接合されている。

一実施形態では、第３の発現ベクターは、本明細書に記載の完全長の第３のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第３の核酸に作動可能に接合されている。

一実施形態では、発現ベクター系は、２つの異なる発現ベクターを含む。一実施形態では、発現ベクター系は、本明細書に記載の完全長の第１のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第１の核酸を含む２つの核酸に作動可能に接合された第１の発現ベクターを含み、第１の発現ベクターは、本明細書に記載の完全長の第２のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第２の核酸に作動可能に接合されている。一実施形態では、発現ベクター系は、本明細書に記載の完全長の第３のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第３の核酸に作動可能に接合された第２の発現ベクターを含む。

一実施形態では、発現ベクター系は、２つの異なる発現ベクターを含む。一実施形態では、発現ベクター系は、本明細書に記載の完全長の第２のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第２の核酸を含む２つの核酸に作動可能に接合された第１の発現ベクターを含み、第１の発現ベクターは、本明細書に記載の完全長の第３のポリペプチドまたはその任意の部分をコードする第３の核酸に作動可能に接合されている。一実施形態では、発現ベクター系は、本明細書に記載の完全長の第１のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第１の核酸に作動可能に接合された第２の発現ベクターを含む。

一実施形態では、発現ベクター系は、２つの異なる発現ベクターを含む。一実施形態では、発現ベクター系は、本明細書に記載の完全長の第１のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第１の核酸を含む２つの核酸に作動可能に接合された第１の発現ベクターを含み、第１の発現ベクターは、本明細書に記載の完全長の第３のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第３の核酸に作動可能に接合されている。一実施形態では、発現ベクター系は、本明細書に記載の完全長の第２のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第２の核酸に作動可能に接合された第２の発現ベクターを含む。

一実施形態では、発現ベクター系は、本明細書に記載の完全長の第１のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第１の核酸を含む３つの核酸に作動可能に接合された単一の発現ベクターを含み、単一の発現ベクターは、本明細書に記載の完全長の第２のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第２の核酸に作動可能に接合されており、単一の発現ベクターは、本明細書に記載の完全長の第３のポリペプチドのいずれかまたはその任意の部分をコードする第３の核酸に作動可能に接合されている。

一実施形態では、第１および／もしくは第２の発現ベクターのいずれか、または単一の発現ベクターは、グルタミン合成酵素をコードする核酸配列を含む。

本開示は、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかを構成する第１、第２および／または第３のポリペプチドのいずれか、またはそれぞれをコードする１つまたは複数のベクターを保有する宿主細胞を提供する。ここでおよび本明細書の全体を通して、ベクターの文脈における「コードする」は、ベクターが、プロモーター（複数可）に作動可能に連結された列挙したポリペプチド（複数可）をコードする配列（複数可）を含有し、その結果、そのベクターを使用してそのポリペプチド（複数可）を発現させることができることを意味する。

本開示は、ヘテロ二量体抗体のいずれかを構成する第１、第２および／または第３のポリペプチドのいずれかをコードする１つまたは複数の核酸に作動可能に接合された単一のベクターを保有する宿主細胞を提供する。

本開示は、ヘテロ二量体抗体のいずれかを構成する第１、第２および／または第３のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸にそれぞれ作動可能に接合されている２つまたはそれより多いベクターを保有する宿主細胞を提供する。

宿主細胞は、細菌または哺乳動物細胞であってもよい。一実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。

一実施形態では、少なくとも１つのベクターは、リポフェクション（例えば、脂質サーファクタントを使用する）、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション、ウイルストランスフェクション、非ウイルストランスフェクション、微粒子銃、および感染（例えば、ベクターが感染因子である場合）によって、宿主細胞中に導入される。

一実施形態では、宿主細胞は、１：１、１：１．５、１．５：１、１：２、２：１、１：３、または３：１のモル比で宿主細胞中に存在する２つのベクターを保有する。当技術分野で周知であるように、他のモル比も可能である。

本開示は、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかを調製するための方法であって、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体をコードする１つまたは複数の核酸を含む宿主細胞の集団を培養するステップを含み、培養するステップが、宿主細胞の集団がヘテロ二量体抗体のポリペプチドを発現するのに好適な条件下で行われる、方法を提供する。本開示は、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかを調製するための方法であって、宿主細胞の集団を培養するステップを含み、集団中の個々の宿主細胞が、本明細書に記載の第１、第２および／または第３のポリペプチドの２つまたはそれより多くのうちのいずれか１つまたは任意の組合せをコードする２つまたはそれより多い第１、第２および／または第３の核酸のいずれか１つまたは任意の組合せに作動可能に連結した少なくとも１つの発現ベクターを保有し、培養するステップが、宿主細胞の集団がポリペプチドを発現するのに好適な条件下で行われる、方法を提供する。

一実施形態では、第１、第２および／または第３のポリペプチドの２つまたはそれより多くのうちのいずれか１つまたは任意の組合せをコードする核酸は、発現されたポリペプチドの分泌のためのシグナルペプチドをさらにコードする。一実施形態では、培養するステップは、宿主細胞の集団による第１、第２および／または第３のポリペプチドの分泌に好適な条件下で行われる。例示的なシグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１１１）またはＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号１１９）を含む。

一実施形態では、第１、第２および／または第３のポリペプチドの２つまたはそれより多くのうちのいずれか１つまたは任意の組合せをコードする核酸は、ポリペプチドを富化するための親和性タグ配列をさらにコードする。例示的な親和性タグ配列は、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、およびＧＳＴタグを含む。

一実施形態では、本方法は、発現した第１、第２および／または第３のポリペプチドを単離するステップをさらに含む。

一実施形態では、培養するステップは、第１、第２および／または第３のポリペプチドのアセンブリーまたは会合に好適である条件下で行われ、ヘテロ二量体抗体を形成する。一実施形態では、第１のポリペプチドがフォールディングして、ＣＤ３抗原と結合することができるｓｃＦｖ－Ｆｃ融合ポリペプチドを形成する。一実施形態では、第２および第３のポリペプチドが互いに会合して、ＣＤ３８抗原と結合することができる抗原結合ドメインを有する免疫グロブリン半分子を形成する。一実施形態では、第１、第２および第３のポリペプチドは互いに会合して、ＣＤ３およびＣＤ３８抗原と結合することができるヘテロ二量体抗体（例えば、二重特異性抗体）を形成する。

一実施形態では、本方法は、会合／アセンブルしたヘテロ二量体抗体を単離または回収するステップをさらに含む。一実施形態では、単離するステップは、親和性クロマトグラフィーを使用して行われる。一実施形態では、単離するステップは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡもしくはＧ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、または免疫親和性を有する親和性クロマトグラフィーを使用して行われる。一実施形態では、カチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合方式クロマトグラフィーならびにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから選択される１回または複数回の追加の単離するステップが行われる。

ヘテロ二量体抗体は、当技術分野で周知である方法を使用して、トランスジェニック宿主細胞発現、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイおよびヒト抗体遺伝子トランスジェニックマウスを使用して調製することができる。一実施形態では、トランスジェニック宿主細胞発現を使用するヘテロ二量体抗体の収率は、形成された総タンパク質複合体の約２０～８０％、または約３０～９０％、または約４０～９５％、または約５０～９９％であり得る。

本開示は、２つの異なる標的抗原と同時に結合することができる、二重特異性抗体として挙動するヘテロ二量体抗体を提供する。例えば、ヘテロ二量体抗体は、腫瘍関連抗原およびエフェクターＴ細胞上に発現された抗原と結合することができる。本明細書に記載のヘテロ二量体抗体は、腫瘍選択的細胞傷害性細胞の殺傷をもたらす免疫細胞シナプスを生じるように設計される。さらに、ヘテロ二量体抗体が機能性Ｆｃドメインを含む場合、ＦｃドメインはＦｃ受容体に結合し、それによって、エフェクターＴ細胞、標的腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞、およびＦｃ受容体（例えば、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞または樹状細胞）に同時に結合するヘテロ二量体抗体を含む三細胞間免疫細胞シナプス（ｔｈｒｅｅ－ｗａｙ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｓｙｎａｐｓｅ）を形成することができる。三細胞間免疫細胞シナプスは、細胞傷害性細胞の殺傷を媒介することができる。

本開示は、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体のいずれかを第１および第２の標的抗原に結合させるための方法であって、第１の標的抗原（例えば、ＣＤ３８抗原）および第２の標的抗原（例えば、ＣＤ３抗原）を、第１の標的抗原と結合するｓｃＦｖ－Ｆｃ融合ポリペプチドを形成する第１のポリペプチドを含むヘテロ二量体抗体と接触させるステップであって、ヘテロ二量体抗体が、第２の標的抗原（例えば、ＣＤ３８抗原）と結合する免疫グロブリン半分子を形成するために会合する第２および第３のポリペプチドを含む、ステップを含む、方法を提供する。

一実施形態では、ヘテロ二量体抗体を、第１および第２の標的抗原と同時に接触させることができる。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体を、第１および第２の標的抗原と、任意の順序で引き続いて接触させることができる。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、第１および第２の標的抗原と同時に結合することができる。
一実施形態では、本方法は、ヘテロ二量体抗体を、第１の標的抗原（例えば、腫瘍またはがん細胞によって発現された）および第２の標的抗原（例えば、エフェクターＴ細胞によって発現された）と結合させて、腫瘍細胞およびエフェクターＴ細胞を互いに近接して存在させることによって、細胞シナプスを形成するステップをさらに含む。

一実施形態では、本方法は、腫瘍またはがん細胞を、細胞傷害性細胞の殺傷を媒介する細胞シナプスにおいて、エフェクターＴ細胞を用いて死滅させるステップをさらに含む。

本開示は、腫瘍関連抗原の発現または過剰発現に関連する疾患を有する対象を処置する方法であって、２つの異なる標的抗原と結合することができるヘテロ二量体抗体を含む組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。組成物またはヘテロ二量体抗体が投与される処置方法の開示は、（１）このような処置用医薬の製造のための組成物またはヘテロ二量体抗体の使用についての開示、および（２）このような処置において使用するための組成物またはヘテロ二量体抗体についての開示も構成する。

一実施形態では、対象は、前立腺、乳房、卵巣、頭頚部、膀胱、皮膚、結腸直腸、肛門、直腸、膵臓、肺（非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む）、脳、食道、肝臓、腎臓、胃、結腸、子宮頚部、子宮、子宮内膜、外陰、喉頭、膣、骨、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、口腔咽頭、喉頭、下喉頭、唾液腺、尿管、尿道、陰茎、および精巣から選択される器官のがん、または平滑筋腫、神経膠腫、もしくは神経膠芽腫を含む疾患を有する。

一実施形態では、対象は、血液がんを含む疾患を有する。一部の実施形態では、血液がんは、Ｂ慢性リンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、ＢおよびＴ急性リンパ球性白血病（ＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）、骨髄異形成症候群、バーキットリンパ腫（ＢＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、または軽鎖もしくはベンス－ジョーンズ骨髄腫である。

本開示は、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体抗体であって、第１または第２の軽鎖可変領域が、κまたはλ鎖由来のアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

本開示は、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体抗体であって、第１または第２の重鎖可変領域が、μ、γ、α、δまたはε鎖由来のアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

本開示は、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体抗体であって、第２のポリペプチドの重鎖可変領域および重鎖定常領域が、いずれの介在するリンカー配列も有さずに互いに直接接合され、免疫原性部位の導入を回避するヘテロ二量体抗体を提供する。

本開示は、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体抗体であって、第３のポリペプチドの軽鎖可変領域および軽鎖定常領域が、いずれの介在するリンカー配列も有さずに互いに直接接合され、免疫原性部位の導入を回避するヘテロ二量体抗体を提供する。

本開示は、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体抗体であって、第１のポリペプチドのＶＨａおよびＶＬａ領域によって形成された第１の抗原結合ドメインが、細胞によって発現された第１の標的抗原と結合することができ、細胞が、Ｔ細胞（例えば、エフェクターＴ細胞）、ＮＫ細胞、単球、好中球またはマクロファージ上の細胞表面抗原から選択される、ヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、第１のポリペプチドのＶＨａおよびＶＬａ領域によって形成された第１の抗原結合ドメインは、第１の標的抗原と結合することができ、１０^－５Ｍもしくはそれより低い、または１０^－６Ｍもしくはそれより低い、または１０^－７Ｍもしくはそれより低い、または１０^－８Ｍもしくはそれより低い、または１０^－９Ｍもしくはそれより低い、または１０^－１０Ｍもしくはそれより低い解離定数Ｋ_ｄを呈する。

本開示は、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体抗体であって、第２および第３のポリペプチドによって形成された第２の抗原結合ドメインが、がん細胞によって発現された腫瘍関連抗原を含む第２の標的抗原と結合することができ、がん細胞が、前立腺、乳房、卵巣、頭頚部、膀胱、皮膚、結腸直腸、肛門、直腸、膵臓、肺（非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む）、平滑筋腫、脳、神経膠腫、神経膠芽腫、食道、肝臓、腎臓、胃、結腸、子宮頚部、子宮、子宮内膜、外陰、喉頭、膣、骨、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、口腔咽頭、喉頭、下喉頭、唾液腺、尿管、尿道、陰茎、および精巣のがんから選択される、ヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、第２の標的抗原と結合することが可能であり、１０^－５Ｍもしくはそれより低い、または１０^－６Ｍもしくはそれより低い、または１０^－７Ｍもしくはそれより低い、または１０^－８Ｍもしくはそれより低い、または１０^－９Ｍもしくはそれより低い、または１０^－１０Ｍもしくはそれより低い解離定数Ｋ_ｄを呈する。

本開示は、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体抗体であって、Ｆｃドメインが、第１のポリペプチド中にＣＨ２およびＣＨ３配列を含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。一実施形態では、ＣＨ２およびＣＨ３は、いずれの介在するアミノ酸もペプチドリンカー配列も有さずに互いに直接接合されている。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２領域のアミノ末端に接合されたヒンジ配列を含む。一実施形態では、ヒンジ配列のＮ末端は、ヒンジリンカー配列ＧＧＳＧＧ（配列番号１１０）を含む。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、エフェクター機能を呈するか、またはエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインを含み、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、Ｆｃエフェクター機能を低下させる変異、例えばＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）またはＬＡＬＡ－ＰＧ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ）を含む。アミノ酸の番号付けはＫａｂａｔ番号付けに基づく。一実施形態では、ヒンジ領域のカルボキシ末端は、いかなる介在するアミノ酸もペプチドリンカー配列も有さずに、ＣＨ２領域のアミノ末端に接合されている。一実施形態では、Ｆｃドメインは、タンパク質複合体の血清半減期を媒介し、Ｆｃドメインの変異は、タンパク質複合体の血清半減期を増加または低下させ得る。例えば、Ｆｃドメインは、Ｋａｂａｔ番号付けによるＹＴＥ変異（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、タンパク質複合体の熱安定性に影響を及ぼし、Ｆｃドメインの変異は、タンパク質複合体の熱安定性を増加または低下させ得る。一実施形態では、Ｆｃドメインは、タンパク質複合体の熱安定性に影響を及ぼし、Ｆｃドメインの変異は、タンパク質複合体の熱安定性を増加または低下させ得る。

本開示は、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体抗体であって、Ｆｃドメインが、第２のポリペプチドにＣＨ２およびＣＨ３配列を含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。一実施形態では、ＣＨ２およびＣＨ３は、いずれの介在するアミノ酸もペプチドリンカー配列も有さずに互いに直接接合されている。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２領域のアミノ末端に接合されたヒンジ配列を含む。一実施形態では、ヒンジ配列のＮ末端は、ヒンジリンカー配列ＧＧＳＧＧ（配列番号１１０）を欠く。一実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、エフェクター機能を呈するか、またはエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインを含み、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性ファゴサイトーシス（ＡＤＰ）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、Ｆｃエフェクター機能を低下させる変異、例えばＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）またはＬＡＬＡ－ＰＧ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ）を含む。アミノ酸の番号付けはＫａｂａｔ番号付けに基づく。一実施形態では、ヒンジ領域のカルボキシ末端は、いかなる介在するアミノ酸もペプチドリンカー配列も有さずに、ＣＨ２領域のアミノ末端に接合されている。一実施形態では、Ｆｃドメインは、タンパク質複合体の血清半減期を媒介し、Ｆｃドメインの変異は、タンパク質複合体の血清半減期を増加または低下させ得る。例えば、Ｆｃドメインは、Ｋａｂａｔ番号付けによるＹＴＥ変異（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、タンパク質複合体の熱安定性に影響を及ぼし、Ｆｃドメインの変異は、タンパク質複合体の熱安定性を増加または低下させ得る。一実施形態では、Ｆｃドメインは、タンパク質複合体の熱安定性に影響を及ぼし、Ｆｃドメインの変異は、タンパク質複合体の熱安定性を増加または低下させ得る。

本開示は、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体抗体であって、第１のポリペプチドのＣＨ２および／またはＣＨ３領域において１つまたは複数のアミノ酸変異を含み、第２のポリペプチドのＣＨ２および／またはＣＨ３領域において１つまたは複数のアミノ酸変異を含み、アセンブルされたタンパク質複合体においてヘテロ二量体の形成を促進し、変異がノブインホール構造を導入すること（Ｒｉｄｇｅｗａｙ １９９６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：６１７－６２１）、追加の鎖間ジスルフィド結合を導入すること（Ｃａｒｔｅｒ ２０１１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：７－１５）、および／または新たな塩架橋を導入することを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

一実施形態では、ポリペプチド鎖の１つ（例えば、第１または第２のポリペプチド）は、小さなアミノ酸をより大きなアミノ酸に置換することによってＦｃ領域（例えば、ＣＨ３領域）において変異され、突出部（例えば、ノブまたはｂｕｍｐ）が作出される。一実施形態では、別のポリペプチド鎖（例えば、第２または第１のポリペプチド）は、より大きなアミノ酸をより小さなアミノ酸に置換することによってＦｃ領域（例えば、ＣＨ３領域）において変異され、ソケット（例えば、ホールまたはｄｅｎｔ）が作出される。一実施形態では、Ｆｃドメインのノブインホール変異は、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｔ３９４、Ｆ４０５、Ｙ４０７およびＫ４０９（番号付けはＫａｂａｔシステムに基づく）から選択されるいずれか１つのＦｃの場所または２つもしくはそれより多いＦｃの場所の任意の組合せに置換変異を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインのノブインホール変異は、以下の変異：Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ（Ｋａｂａｔシステムに基づく番号付け）の２つまたはそれより多くのうちのいずれか１つまたは任意の組合せを含む。一実施形態では、Ｆｃドメインのｂｕｍｐ－ｉｎ－ｄｅｎｔ変異は、Ｆ４０５Ｌ（Ｋａｂａｔシステムに基づく番号付け）を含む。

本開示は、本明細書に記載の任意のヘテロ二量体抗体であって、ヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４免疫グロブリン分子からの上側、コアまたは下側のヒンジ配列を含む２つまたはそれより多い領域のいずれか１つまたは任意の組合せを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１の上側のヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１２０）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１のコアのヒンジ配列

（配列中、

はＰ、ＲまたはＳである）（配列番号１２１）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、下側のヒンジ／ＣＨ２配列ＰＡＰＥＬＬＧＧＰ（配列番号１２２）を含む。一実施形態では、ヒンジは、アミノ酸配列ＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ（配列番号１２３）を有するＦｃ領域（ＣＨ２）に接合されている。一実施形態では、ヒンジ領域は、上側、コアおよび下側のヒンジのアミノ酸配列を含み、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰ ＥＬＬＧＧＰ（配列番号１２４）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、少なくとも１つ、２つ、３つまたはそれより多い鎖間ジスルフィド結合を形成することができる、１つ、２つ、３つまたはそれより多いシステインを含む。

例示的配列

表１：

表２：

表３：

表４：

表５：

表６：

表７：

表８：

表９：

表１０：

表１１：

表１２：

表１３：

表１４：

表１５：

表１６：

表１７：

表１８：

表１９：
抗ＣＤ３８ Ａ２－ＳＶバリアント

表２０：
抗ＣＤ３８ ３Ｈ１０バリアント

表２１：

表２２：

抗ＣＤ３８ ＩｇＧ１：重鎖定常領域：配列番号６６

抗ＣＤ３８ ＩｇＧ１－ＳＰＰＣ：重鎖定常領域：配列番号６７

抗ＣＤ３８ ＩｇＧ４：重鎖定常領域：配列番号６８

抗ＣＤ３８：カッパ軽鎖定常領域：配列番号６９

抗原：ＣＤ３８タンパク質：配列番号７０

抗原：ヒトＣＤ３イプシロン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０７７６６－１）（配列番号９３）

以下の実施例は例示であることを意味し、本開示の実施形態をさらに理解するために使用することができ、いかなるようにも本発明の教示の範囲の限定として解釈されるべきではない。

（実施例１）
二重特異性抗体の発現

Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨＯ－Ｓ）による一過的なＣＨＯ細胞発現系を使用して、それぞれＣＤ３８／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体を発現させた。ＣＨＯ－Ｓ細胞を、Ｆｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ中で液体窒素から解凍および回復させ、ＣＨＯ－ＳＦＭ ＩＩ Ｍｅｄｉｕｍにゆっくりと順応させた。ＣＨＯ－Ｓ細胞は、４×１０^６／ｍＬ以下の細胞密度のＣＨＯ－ＳＦＭ ＩＩ Ｍｅｄｉｕｍ中でさらに成長させることができる。１～２×１０^６／ｍＬの間の細胞密度および９７％より高い生存率のこのようなＣＨＯ－Ｓ細胞培養物は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ ＢｓＡｂ構築物を一過性にトランスフェクトするために使用した。

製造業者のプロトコールに従って、ｐＳＴＩ発現ベクターにおける各ＣＤ３８／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ鎖ＤＮＡ構築物を、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦ ＤＮＡ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して調製した。それぞれ、抗ＣＤ３８軽鎖、ノブおよびＬＡＬＡ変異を有する抗ＣＤ３８重鎖、およびホールおよびＬＡＬＡ変異を有する抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ Ｆｃ融合鎖をコードする３つのＤＮＡ構築物の間の等しいＤＮＡインプット比を、ＣＨＯトランスフェクション前に、１：３の質量比でＰＥＩでパッキングした。ＣＨＯ－Ｓ細胞１ｍＬ当たり合計２ｕｇのＤＮＡインプットをトランスフェクションに使用した。ＰＥＩでパッケージングしたＣＤ３８／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ ＢｓＡｂ構築物を、上記ＣＨＯ－Ｓ培養物中に直接添加した。トランスフェクトしたＣＨＯ－Ｓ細胞培養物を５％ＣＯ２を含む３７℃の細胞培養インキュベーター中のオービタルシェーカーに入れ、終夜回収した。翌日、トランスフェクトしたＣＨＯ－Ｓ培養物として等体積のＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地を添加し、トランスフェクションをクエンチし、トランスフェクトした培養物を、数日間、５％ＣＯ２を含む２８℃の細胞培養インキュベーター中のオービタルシェーカーに移した。

継続した二重特異性抗体力価と細胞生存率を継続したＣＨＯ発現期間を通してモニターした。連続する２～３日中に、細胞生存率が７０％未満に下降するか、または継続した力価の増加が観察されなかった場合に、培養上清を収集した。製造業者の推奨するプロトコールおよび標準物質を使用して、ＯｃｔｅｔシステムでプロテインＡバイオセンサーチップを使用して、二重特異性抗体力価を測定した。Ｃｏｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ細胞計数器で、０．２％のトリパンブルー溶液による細胞培養物の１：１（ｖ：ｖ）希釈物を使用して、細胞生存率を測定した。

（実施例２）
二重特異性抗体の下流精製方法の開発

ＡＫＴＡｐｕｒｅおよびＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ＦＰＬＣ機器を使用して、プロテインＡ親和性液体クロマトグラフィーによって精製したＣＤ３８／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体をさらに洗練するためのＧＭＰ適合性下流精製方法を開発した。ＡＫＴＡソフトウェアＵｎｉｃｏｒｎの内臓スカウティング一式を使用して、複数のＣＩＥＸおよびＨＩＣ ＧＭＰグレードの液体クロマトグラフィー媒体のスクリーニングを実施した。最大５つのＣＩＥＸまたはＨＩＣ媒体を、最大２つの緩衝液セットを用いて、合計１０個の条件の組合せについて一度にスクリーニングし、それぞれ試験したＣＤ３８／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ候補／リードについてスクリーニングした。ＦＰＬＣのランを、試料のローディング、カラムの洗浄、および溶出について、１分当たり１ｍＬの流速に設定した。ＣＩＥＸとＨＩＣの両方の媒体のスクリーニングのために、２０ｃ．ｖ．勾配の溶出方法において典型的な１００％のＢを使用した。媒体スクリーニングの結果に基づいて、有望な媒体が選択されたら、緩衝液条件のいくつかの設定についても、さらに試験した。ＣＩＥＸラン緩衝液は、同じｐＨを有する酢酸Ｎａのペアであり、ローディングおよび洗浄におけるいくつかのＮａＣｌ濃度を、収率、不純物の分離、およびプロセス効率を改善するためにスクリーニングした。ＨＩＣラン緩衝液は、同じｐＨを有する酢酸ＮａまたはＢＴＰのペアであり、ローディングおよび洗浄におけるいくつかの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４濃度を、収率、不純物の分離、およびプロセス効率を改善するためにスクリーニングした。結合に次いで溶出モードの方法（ｂｉｎｄ－ｔｈｅｎ－ｅｌｕｔｅ ｍｏｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）における溶出ピーク画分、または通過モードの方法（ｐａｓｓｉｎｇ－ｂｙ ｍｏｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）におけるフロースルー画分を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）Ｔｅｔｒａ Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｃｅｌｌ電気泳動装置およびＢｉｏ－Ｒａｄ ４～２０％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌを使用するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。試料をＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（４×）と混合し、ゲルローディングの前に８５℃で２分間加熱した。

プロテインＡ精製ＣＤ３８／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体を洗練するため、ＳＥＣ緩衝液において０．５ｍＬ／分で溶出するＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ調製グレードのＳＥＣカラムを使用する、ＳＥＣ方法をまた開発した。

タンパク質操作を数回繰り返すことによるプロテインＡ精製ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを図２に示す。二重特異性抗体ＣＤ３８Ａ２－３Ｈ１０／ＣＤ３ｔｓｍ＃１のノブイントゥホールのサイズ排除クロマトグラムを図３Ａに示す。二重特異性抗体ＣＤ３８Ｄ８／ｓｓ４ｘＣＤ３ ｂｕｍｐ－ｉｎｔｏ－ｄｅｎｔのサイズ排除クロマトグラムを図３Ｂに示す。

（実施例３）
熱安定性抗ＣＤ３（ｈｕｍ２９１）ｓｃＦｖ断片（第１のポリペプチド鎖について）：

ｈｕｍ２９１抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域を、エラープローンＰＣＲを使用して熱安定性を増加させるために操作し、単一、二重または三重変異させた（配列番号２２、２８、３０、３２、３４、および３６を参照されたい；配列番号３８は、野生型Ｈｕｍ２９１重鎖可変領域配列である）。

変異誘発およびファージライブラリーの構築：

Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（タカラバイオ株式会社、カタログ番号６３０７０３）を使用して、変異をＨｕＭ２９１ ＣＤ３－ｓｃＦｖコードフレームに組み込んだ。製造業者によって提供されたユーザーマニュアルの条件５を使用して、１０００ｂｐ当たりおよそ５個のヌクレオチドを生成した。Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲ生成物を、「ＴＳＭ」ファージライブラリーと称されるファージライブラリーへとクローニングした。

熱負荷およびパニング：

標準パニングプロトコールを使用して、以下の修正を加えたＣＤ３－ｓｃＦｖ ＴＳＭファージライブラリーをパニングした。２ラウンドの、熱負荷およびＣＤ３抗原プレゼンターとして初代Ｔ細胞とジャーカット細胞を交互に用いたパニングを以下の３つの異なる条件を使用して実施した：（１）１回目 － ５０℃×１時間、Ｔ細胞でのパニング、２回目 － ５０℃×１時間、ジャーカット細胞でのパニング；（２）１回目 － ５５℃×１時間、Ｔ細胞でのパニング、２回目 － ５８℃×１時間、ジャーカット細胞でのパニング；および（３）１回目 － ６５℃×１時間、Ｔ細胞でのパニング、２回目 － ６５℃×１時間、ジャーカット細胞でのパニング。１条件当たり最大９６個のクローンをピックアップし、ＣＤ３－ｓｃＦｖ変異体ペリプラズムをミニプレップした。

ファージライブラリーのスクリーニング：

選択したファージクローンからミニプレップした変異体ＣＤ３－ｓｃＦｖを、９６ウェルプレートウェル中ジャーカット細胞と一緒に直接インキュベートするか、または別の９６ウェルプレート中でジャーカット細胞とインキュベーションする前に５８℃で３０分間加熱した。ジャーカット細胞のＣＤ３に結合するこれらのＣＤ３－ｓｃＦｖ変異体のフローサイトメトリー分析を、抗ヒトＦｃ二次抗体を使用するＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ ＩＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｐｌｕｓフローサイトメーターで実施し、加熱条件と非加熱条件との間で変化しなかった結合ヒストグラムを有するクローンを検出した。加熱条件および非加熱条件下の野生型ＨｕＭ２９１ ＣＤ３－ｓｃＦｖも、熱負荷前後の変性および機能的ネイティブＣＤ３－ｓｃＦｖバインダーの間の明確な差異を確立するための対照としてジャーカット結合スクリーニングに含めた。

ＴＳＭファージライブラリーからのヒットの分析

熱処理前後に類似するジャーカット細胞結合挙動を有するＣＤ３－ｓｃＦｖ ＴＳＭヒットファージクローンを同定し、配列決定した。ＣＤＲの外側の変異ホットスポットを、それらの潜在的な正の構造安定性効果について分析した。ＣＤ３－ｓｃＦｖ ＴＳＭヒット配列を全合成し、存在する場合、ＣＤＲ変異を排除して、発現ベクター中にクローニングし、その後小規模で一過的にＣＨＯ細胞発現させた。発現したＣＤ３－ｓｃＦｖ ＴＳＭヒットをプロテインＡ親和性液体クロマトグラフィーによって個別に精製し、ＵＮｃｌｅ機器を使用する固有のＴｒｐ蛍光シフトアッセイによってそれらのＴｍを分析した。固有のトリプトファン蛍光シフト測定を使用して、野生型と６つの変異体の抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ断片の熱安定性を決定した。得られたＴｍ値を以下の表２５に列挙する。

表２５

熱安定性について二重特異性抗体を試験した後、ＣＤ３８／ＣＤ３シリーズのＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体のいくつかを、２つのヒンジ変異戦略のうちの１つを組み合わせたＣＨ３ドメイン界面操作を伴うＩｇＧ４重鎖またはＣＨ３ドメイン界面操作を伴うＩｇＧ１重鎖からなるように設計した。重鎖のヘテロ二量体化を駆動するため、ＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン界面操作は、それぞれ、Ｂｕｍｐ－ｉｎｔｏ－Ｄｅｎｔ（ｇ４ＣＨ３ａ－ＷＴ／ｇ４ＣＨ３ｂ－Ｆ４０５Ｌ）、およびノブイントゥホール（ｇ４ＣＨ３ａ－Ｔ３６６Ｗ／ｇ４ＣＨ３ｂ－ Ｔ３６６Ｓ－Ｌ３６８Ａ－Ｙ４０７Ｖ）として示される２つの戦略を利用した。ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン界面操作は、ノブイントゥホール（ｇ１ＣＨ３ａ－Ｔ３６６Ｗ／ｇ１ＣＨ３ｂ－ＳＡ－Ｔ３６６Ｖ）戦略のみを利用する。ＩｇＧ１ヒンジ変異戦略１はＬ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａであり、戦略２はＬ２３４Ｆ－Ｌ２３５Ｅ－Ｄ２６５Ａであり、そのうちの後者を参照として使用する。

別のＣＤ３８／ＣＤ３シリーズのＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体では、ＣＤ３８パラトープのコレクションを、ガンマ－１またはガンマ－４構築物におけるＢｕｍｐおよび／またはノブ変異を含むＣＤ３８重鎖を有するＩｇＧ－ｓｃＦｖ構築物のＦａｂドメイン中に、操作により挿入した。ＣＤ３パラトープは、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインに接続されたグリシンおよびセリン残基のブレンドから構成される２０アミノ酸長のリンカーを有するｓｃＦｖドメイン中に形成された。ＣＤ３－ｓｃＦｖを、ガンマ－４またはガンマ－１鎖のＤｅｎｔおよび／またはホール変異含有Ｆｃ鎖（ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体）のヒンジのＮ末端へと融合させる。グリシンとセリンのブレンドから構成された５アミノ酸長のリンカーも使用して、可撓性を付加するためにＣＤ３－ｓｃＦｖドメインのＣ末端とヒンジの間隔を保った。ＣＤ３－ｓｃＦｖは、Ｖｈ４４Ｃ／Ｖｌ１００Ｃ、またはＶｈＫ６７Ｒ／Ｍ４８Ｉなどの安定性操作変異をさらに含有することができる。

リードヒットの特徴付け：

ＴＳＭヒットにおける総Ｔｍゲインに対する変異（複数可）の影響に関して、統計分析を、実験計画法の原理に適用し、ソフトウェアＭｉｎｉＴａｂを使用して実施した。変異記述子マトリックスを、ＣＤ３－ｓｃＦｖ ＴＳＭヒットからＴｍと位置変異を作表して作成した。各記述子対Ｔｍゲインの相関を計算し、折れ線グラフとその傾きによって評価し、変異記述子が存在する場合の実質的熱安定性ゲインを達成する尤度を予測した。影響を及ぼす変異（複数可）とそれらの位置効果、および組合せによる効果を、ＴＳＭライブラリーヒットのＵＮｃｌｅランで収集したより大きなＴｍゲインに対するそれらの相関に基づいて決定した。

影響力の高い変異の異なる組合せを有する６つの「フォーカス群」ヒットのサブセットを選択して、それらのＴｍゲインを検証し、統計分析の妥当性を調査した。フォーカス群ヒットの配列を合成し、ＣＤ３－ｓｃＦｖ ｇ１ Ｆｃ融合鎖を構築した。ＣＤ３－ｓｃＦｖ ＴＳＭフォーカス群ヒットを、実質的に一過的にＣＨＯ－Ｓ細胞において発現させ、それぞれ、ＵＮｃｌｅおよびフローサイトメトリーによるＴｍおよびＣＤ３親和性の確認のために精製した。

ＣＤ３－ｓｃＦｖ ＴＳＭリードを、以下の特徴に基づいて、このフォーカス群から選択した：（１）このヒットのサブセットにおいて、５℃で、最も高いＴｍゲインを有すること；（２）最も少ない数の変異で最も高いＴｍゲインを達成すること；（３）他のフォーカス群ヒットと比較して、曝露されたよりも埋め込まれた最も多くの変異を有すること；および（４）曝露された変異残基において最も少ない側鎖の化学変化を有すること。

結果：抗ＣＤ３（ｈｕｍ２９１）ｓｃＦｖ断片（第１のポリペプチド鎖に関する）の操作を４回繰り返した後、第１、第２および第３の鎖の鎖会合を改良した。ヘテロ二量体種は、ワンステッププロテインＡ親和性精製後に、最も優勢な種であり、ＨＭＷ種とＬＭＷ種は低下した（図２を参照）。

（実施例４）
ＳＥＣによる分析的分析

ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ ｍＡｂ ＨＲカラム（４μｍ、７．８ｍｍ×３００ｍｍ）および０．２Ｍのリン酸カリウム、０．２５ＭのＫＣｌ（ｐＨ６．２）の移動相を０．８ｍＬ／分の流速で使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）をＣＤ３８／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性操作試料に関して実施した。１ｍｇ／ｍＬで、５０μＬの希釈試料をカラムにロードした。データをモニターし、紫外線（ＵＶ）検出器によって２８０ｎｍで収集した。図３ＡおよびＢを参照されたい。

（実施例５）
ＣＥ－ＳＤＳによる分析的分析：

ＳＯＰ ８０１８に従い、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を使用して、還元および非還元キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）をＣＤ３８／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体に関して実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２３０キットをタンパク質分析に使用した。

（実施例６）
ＤＳＣによるＴｍの分析的分析

ＣＤ３８／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体をプロテインＡで精製し、１２５ｍＭの酢酸Ｎａ（ｐＨ５）中で４℃に保ち、その後、１０ＫＤカットオフの遠心分離濃縮器を使用してＳＥＣ緩衝液へと緩衝液交換し、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度に到達させた。ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－ＤＳＣ機器を以下のパラメーターで設定した：開始温度３０℃、最終温度９０℃、スキャン速度６０℃／時間、スキャン前サーモスタット１０分、およびスキャン後サーモスタット０分。水のランを１２サイクル実施し、その後、緩衝液および二重特異性抗体試料を測定した。試料の熱流束対温度曲線から緩衝液ベースラインを減算した後に、曲線の相転移ピークとしてＴｍを同定し、第１のピークをＴｍ１、第２のピークをＴｍ２とするなど（ａｎ ｓｏ ｏｎ）であった。

（実施例７）
固有のＴｒｐ蛍光シフトによるＴｍの分析的分析

製造業者の指示に従って、Ｕｎｃｌｅ分析を行い、三連でラン当たり試料ごとに９ｕＬをＵＮｃｌｅチップ（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂから入手、カタログ番号ＥＱＮ１６４２）の各試料スロット中にロードした。ＵＮｃｌｅ機器におけるＴｍ／Ｔａｇｇ測定一式を以下のパラメーターで設定した：開始温度２５℃；最終温度９０℃；スキャン速度 温度変化１℃当たり４蛍光データを獲得；温度勾配速度１℃／分；スキャン前サーモスタット１０分；およびスキャン後サーモスタット０分。

各温度のＴｒｐ蛍光ピークのＢＣＭ（重心平均）をＵＮｃｌｅ分析一式によって決定し、温度勾配に対してここでもプロットした。ピーク、相転移が生じる温度として、温度曲線に対するＢＣＭの差異からＴｍを同定した。このようなピークが生じる最も低い温度をＴｍ１として定義し、このようなピークが生じる次の温度をＴｍ２として定義するなどである。

（実施例８）
初代Ｔ細胞結合アッセイ

フローサイトメトリーに基づく初代Ｔ細胞結合アッセイを使用して、細胞表面ＣＤ３抗原に対するＣＤ３８／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体の結合親和性を測定した。ＣＤ３８／ＣＤ３ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ二重特異性抗体による初代ヒトＴ細胞へのＣＤ３抗原の結合を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＩＱｕ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｐｌｕｓフローサイトメーターで実施した。新たに単離したヒトＴ細胞を、実験前のＣＤ３８（－）下位集団に対して陰性選択した。９０％より高い生存率を有するＴ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液、２％ＦＢＳを含有するＤＰＢＳベースの緩衝液で１回洗浄し、同緩衝液中で１Ｅ＋６／ｍＬの細胞密度に調整した。各データ点を生成するためにおよそ２５，０００個の細胞を使用した。ＣＤ３８（－）Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する二重特異性抗体または対照ｍＡｂの各用量依存曲線について、各二重特異性抗体または対照ｍＡｂの最大１２回までの一連の１：３希釈物をＦＡＣＳ緩衝液で調製した。等体積の各二重特異性抗体希釈物とＴ細胞を９６ウェルプレートのウェル中で混合した。各濃度シリーズの二重特異性抗体またはｍＡｂのそれらの対応するＴ細胞との１時間のインキュベーション後に、混合物をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心分離後に上清を除去した。二次抗体としてのマウス抗ヒトＦｃ－ＡＰＣコンジュゲートを、製造業者の推奨する力価で各二重特異性抗体またはｍＡｂ／細胞混合物中に添加し、およそ１５～２０分間インキュベートした。次いで、二重特異性（またはｍＡｂ）／細胞混合物を洗浄し、上記のように上清を除去した。最終の二重特異性／細胞混合物を２５ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、フローサイトメーターにおけるＦＡＣＳ分析に供し、１０ｕＬの各上清を分析した。

Ｔ細胞に結合する各二重特異性抗体または対照ｍＡｂの用量依存結合曲線を、各濃度シリーズの対応する二重特異性（またはｍＡｂ）／細胞混合物中で検出されたシングレット細胞の蛍光高度の幾何平均をプロットすることによって作成した。Ｔ細胞上のＣＤ３に対する各二重特異性または対照ｍＡｂのＥＣ５０を、４パラメーター線形回帰（４ＰＬ）モデルを用いて、曲線を用量依存曲線にフィットさせた後に決定した。図４ＡおよびＢに示した結果は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのタンパク質操作後に、ＣＤ３親和性が保持されたことを示す。

（実施例９）
ＳＰＲによる親和性決定

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を利用して、組換えＣＤ３８抗原に対するＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体および対照抗ＣＤ３８モノクローナル抗体の親和性を測定した。二重特異性抗体とＣＤ３８抗原との間の速度論的相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００表面プラズモン共鳴（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃で測定した。抗ヒト断片結晶性（Ｆｃ）抗体（ヒト抗体捕捉キット（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ））を、標準のＮ－ヒドロキシスクシンイミド／１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）カップリング方法を使用して、およそ１００００ＲＵまでＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ上に固定した。抗体（二重特異性またはｍＡｂ、およそ２μｇ／ｍＬ）を１０μＬ／分の流速で６０秒間捕捉した。組換えヒトＣＤ３８－ｈｉｓタグをランニング緩衝液（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋）中で段階希釈した。すべての測定は、３０μＬ／分の流速で行った。３Ｍ ＭｇＣｌ_２で６０秒間、表面を再生させた。１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを使用して、データをフィッティングした。

最初の唯一のの結合事象として、各個々の抗原に対するＣＤ３８×ＣＤ３二重特異性抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合速度論を、標的組合せ：ＣＤ３８／ＣＤ３について得た。製造業者の推奨に従って、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にアミンカップリングした抗ヒトＦｃ抗体によって、二重特異性抗体をバイオセンサー表面に固定した。０からおよそ１０倍の範囲のＫＤの、各個々の抗原の濃度シリーズを、会合相に関して、対応する二重特異性抗体またはｍＡｂを２分間固定させたバイオセンサー表面に検体として適用し、その後、サイクルの解離相として緩衝液フローを５分間とした。その対応する抗原に対する個々の二重特異性分子結合のセンサーグラムを図５Ａ～Ｇおよび図２２Ａ～Ｃに表す。親ｍＡｂ（抗ＣＤ３８）のいくつかの速度論分析を、２００秒の会合相および３００秒の解離相で実施した。

１：１結合モデルによる標準的評価を上記のすべての速度論シリーズに適用した。会合および解離定数（ｋ－ｏｎおよびｋ－ｏｆｆ）、親和性（ＫＤ）、最大応答（Ｒｍａｘ）、およびフィッティング統計（カイ二乗）を図６に示される表に表す。

図５Ａ～Ｇは、ＣＤ３８抗原と様々な二重特異性抗体との間の結合速度論のセンサーグラムを示す。結合速度論値を以下の表２６に列挙し、ここで、「Ｈ」は高親和性を示し、「Ｍ」は中程度の親和性を示し、「Ｌ」は低親和性を示す。

表２６

ＬＡＬＡ変異を有する二重特異性抗体のＦｃエフェクター機能の決定：

ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器も使用して、組換えＣＤ１６Ａ高および低親和性バリアントに対する、野生型ヒンジまたはヒンジ変異を有し、グリコール操作されたＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体および対照ｍＡｂの親和性を測定した。標準的ストレプトアビジン－ビオチン固定方法を使用して、Ｃ末端Ａｖｉタグによる、市販の（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）ビオチン化ＣＤ１６Ａ １７６Ｖ高親和性、または１７６Ｆ低親和性バリアントを、ＳＡ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ａ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓのフローセル表面におよそ１６０ＲＵまで個々に固定した。抗体（二重特異性またはｍＡｂ、およそ２μｇ／ｍＬ）をランニング緩衝液（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋）中でそれぞれ段階希釈した。すべての測定は、３０μＬ／分の流速で行った。３ＭのＭｇＣｌ_２で６０秒間、表面を再生させた。定常状態結合親和性モデルを使用してデータをフィッティングした。このフィッティングプロセスによって決定した定常状態応答をエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄを使用して、対数目盛で定常状態応答対［Ａｂ］のＭｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ関数フィッティングを実施した。

ＳＡ固定したビオチン化ＣＤ１６Ａ高親和性バリアントＶ１５８および低親和性バリアントＦ１５８を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ速度論分析およびその上定常状態応答分析の両方で、同様に、ＬＡＬＡヒンジ変異を有するＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体（第１、第２および第３の鎖の組合せ：それぞれ、配列番号７１、８９および８４を有する）、および野生型ヒンジを有するか、ＣＨ２ドメイン変異を有するか、または糖鎖操作されたいくつかの他の対照ｍＡｂの親和性を決定した。Ｍｉｃｈａｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ関数でフィッティングした場合、後者は、タンパク質－リガンド結合事象のＫＤと数学的に等しいＫｍを生じる。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－ＭｅｎｔｅｎフィッティングからのＲｍａｘは、ＣＤ１６ｌＡ生着の最大応答および二重特異性抗体またはｍＡｂの達成可能な総結合効率の変化のレベルを表す。

ＳＰＲの結果は、二重特異性抗体ヒンジ領域におけるＬＡＬＡ変異が、ＣＤ１６Ａの高親和性バリアント（１７６Ｖ）と低親和性バリアント（１７６Ｆ）の両方に対するＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体の親和性を、野生型ヒンジ領域を有するＩｇＧ１ ｍＡｂ（抗ＣＤ４７－Ｆ７、抗ＣＴＬＡ４－Ｆ７）と比較して、ならびにバリアントＳＰＰＣヒンジを有するｍＡｂ（抗ＢＣＭＡ－２Ｃ５）およびＬＡＬＡ変異を有するｍＡｂ（抗ＢＣＭＡ－２Ｃ５）と比較して、劇的に低下させたことを実証した（データは示さず）。

（実施例１０）
リダイレクトされたＴ細胞の細胞傷害性（ＲＴＣＣ）

腫瘍細胞系におけるＣＤ３８発現レベルの決定：

６つのＣＤ３８（＋）腫瘍細胞系をそれらの相対的なＣＤ３８発現レベルについて評価した：ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ．１Ｒ、ＩＭ－９、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、およびＮＣＩ－Ｈ９２９。６つの細胞系のそれぞれを、ＣＤ３８抗原染色の前日に、細胞培養フラスコのサブコンフルエントまで培養した。９０％より高い生存率を有する細胞を１ｍＬ当たり１Ｅ＋６の密度に用量設定し、１ウェル当たり５０，０００個の細胞をＶ底９６ウェルプレート中に播種した。細胞を洗浄し、示した未染色対照と一緒に、製造業者の推奨する濃度で、抗ＣＤ３８ ＡＰＣコンジュゲート（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を有するＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。細胞を、暗所で２０分間室温にてインキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析前にＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。

フローサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ ＩＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を、抗ＣＤ３８－ＡＰＣ検出に関して、ＲＬ－１チャネルで設定した。すべての事象のＦＳＣ－Ｈ（前方散乱蛍光高度（ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｈｅｉｇｈｔ））対ＳＳＣ－Ｈ（側方散乱蛍光高度）散布図を使用して、細胞を同定した。次いで、細胞集団をＦＣＳ－Ｈ対ＦＣＳ－Ａ（面積）に関してプロットし、シングレットを同定した。各腫瘍細胞系に対するシングレットのＲＬ１－Ｈチャネルヒストグラムの幾何平均をエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ＣＤ３８発現レベルの表示としてプロットした。結果を図７に示す。

刺激されていないヒトＴ細胞による二重特異性抗体媒介性腫瘍細胞殺傷：

ＣＤ３８抗原を有する腫瘍細胞を死滅させるように、ヒトＴ細胞をリダイレクトするＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体の能力を、固定したＥ／Ｔ（エフェクター細胞／標的細胞）比の等量のヒトＴ細胞および腫瘍細胞を各ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体の濃度勾配に一晩供し、その後、腫瘍細胞におけるアポトーシスマーカーの存在を定量することによって評価した。新たに単離したヒトＴ細胞を、１０％ＦＢＳおよび１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を補充したＲＰＭＩ培地中で、１ｍＬ当たりおよそ２～５Ｅ＋６個の細胞で、３７℃にて定常インキュベーター内で一晩保持した。細胞傷害性アッセイの設定前に、細胞傷害性対ヘルパーＴ細胞比のアッセイを、補正した三色フローサイトメトリー方法を使用して（以下の説明を参照されたい）、総ＣＤ３（＋）Ｔ細胞数における、それぞれＣＤ４（＋）およびＣＤ８（＋）下位集団のパーセンテージを定量することによって、行った。

ＣＤ３８高発現ヒト多発性骨髄腫細胞系であるＲＰＭＩ８２２６を、ＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するレトロウイルス由来のベクターｐＭＹｓ－ＩＲＥＳによる形質導入によって標識し、次に、蛍光および発光検出のために内因性ＧＦＰおよびルシフェラーゼ発現の安定な細胞系を選択した。ＲＰＭＩ ＧＦＰ－Ｌｕｃ細胞とアッセイ設定の日に９０％を超える生存率の新たに単離したＴ細胞とを、それぞれＲＰＭＩ培地で１回洗浄し、密度を調整して各アッセイ条件で２０：１のＥ／Ｔ比を達成し、データ点ごとにおよそ１５，０００個の標的細胞を使用した。各ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体、および２つの親ｍＡｂの混合物の１：３段階希釈物をＲＰＭＩ培地で調製し、９６ウェルプレート中でＲＰＭＩ／Ｔ細胞混合物に添加した。一連の標的細胞およびＴ細胞のみのウェルも、二次抗原のみおよび二重特異性抗体なしの対照として設定した。ＲＰＭＩのみおよびＴ細胞のみのウェルも、各細胞型の固有のアポトーシスベースラインを評価するために含めた。

アッセイプレートを３７℃で一晩インキュベートした。プレートを遠心分離して細胞をペレット化させ、１００ｕＬのアッセイ上清を各ウェルから新たな９６ウェルＰＣＲチューブプレートに移し、別々の時間のサイトカイン含量分析のために－８０℃で取り除いた。細胞ペレットを、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＡＰＣコンジュゲート染色およびフローサイトメトリーによる分析の前に、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。製造業者の推奨および手順に従って、ＡＰＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色を実施した。

次いで、アッセイプレートを、ＧＦＰに関するＢＬ－１チャネルおよびＲＬ－１チャネルＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ検出を有するＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ ＩＱｕｅ Ｐｌｕｓ ＳｃｒｅｅｎｅｒフローサイトメーターでのＦＡＣＳ分析に供した。ＲＰＭＩ ＧＦＰ／Ｆｌｕｃ標的細胞は、ＦＳＣ－Ａ（前方散乱 － 面積）対ＢＬ１－Ｈ（高さ）散布図でＴ細胞から識別可能であり、ＢＬ１－Ｈの高い集団が標的細胞であり、ＢＬ１－Ｈの低い集団がエフェクター細胞である。ＲＰＭＩ細胞をＲＬ１－Ｈ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）対ＢＬ１－Ｈ散布図でさらにゲーティングし、ＲＬ１－Ｈの高い集団はＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ高発現サブセットであった。標的細胞の殺傷％を、各アッセイ条件において％［総標的細胞数マイナス低Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖサブセット数］／［総標的細胞数］として定義する。次いで、ＲＭＰＩの殺傷％を二重特異性抗体または対照ｍＡｂの濃度勾配に対してプロットする。ＥＣ５０を、定義した実験条件に対する最大の観察可能な効果の５０％を生じるのに必要とされる生物剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）濃度として定義する。結果を図８ＡおよびＢに示す。

刺激されていないヒトＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の下位集団の定量：

上記ＲＴＣＣアッセイの前に、新たに単離したヒトＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳおよび１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７を補充したＲＰＭＩ培地中で、１ｍＬ当たりおよそ２～５Ｅ＋６個の細胞で、３７℃の静置インキュベーターにて一晩保持した。細胞傷害性アッセイの設定（以下に記載した）前に、細胞傷害性対ヘルパーＴ細胞比のアッセイを、補正した三色フローサイトメトリー方法を使用して、総ＣＤ３（＋）Ｔ細胞数における、それぞれＣＤ４（＋）およびＣＤ８（＋）下位集団のパーセンテージを定量することによって行った。Ｔ細胞に関してＣＤ３（＋）およびＮＫに関してＣＤ５６（＋）を染色する補正した二色フローサイトメトリー方法による、単離したＰＢＭＣ中のＮＫ細胞含量の並行アッセイも実施した。結果を図９Ａに示す。

刺激されていないヒトＰＢＭＣ細胞による二重特異性抗体媒介性腫瘍細胞殺傷：

ＣＤ３８を発現する腫瘍細胞系を死滅させるように、初代ヒトＴ細胞をリダイレクトするＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体の有効性を、固定したＥ／Ｔ比の等量の新たに単離したヒトＰＢＭＣと各ＣＤ３８（＋）腫瘍細胞系を、９６ウェルプレート中で３７℃で一晩、ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体の濃度勾配に供することによって評価した。６つのＣＤ３８（＋）腫瘍細胞系（ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ．１Ｒ、ＩＭ－９、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、およびＮＣＩ－Ｈ９２９）をこのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性アセスメントに供した。ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体によって媒介されるリダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）の効力を、ＮＫ細胞媒介性のＣＤ３８を標的とする市販のｍＡｂ薬物ダラザレックス依存性腫瘍細胞殺傷現象である抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の効力と比較するために、同じ濃度勾配のダラザレックスも使用して、並行して類似するＰＢＭＣ／ＣＤ３８（＋）腫瘍細胞混合物を処置した。腫瘍細胞におけるアポトーシスマーカーの存在を、フローサイトメトリー方法を使用して翌日に定量した。

腫瘍細胞系（ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ．１Ｒ、ＩＭ－９、およびＲａｊｉ）を、ＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するレトロウイルス由来のベクターであるｐＭＹｓ－ＩＲＥＳによる形質導入によって標識し、次に、蛍光検出のために内因性ＧＦＰおよびルシフェラーゼ発現の安定な細胞系を選択した。これらの細胞を培養して、アッセイ設定前に良好な生存率を維持した。ＮＣＩ－Ｈ９２９およびＤａｕｄｉ細胞を、アッセイ日の前日にＣＦＳＥを使用して標識し、アッセイ設定前に洗浄した。

新たに単離したＰＢＭＣ、ならびに、ＧＦＰ発現およびＣＤ３８抗原レベルで特徴付けした、アッセイ設定の日に生存率が９０％を超える腫瘍細胞をＲＰＭＩ培地で１回洗浄し、データ点ごとにおよそ１５，０００個の標的細胞で、標的細胞ＲＰＭＩ８２２６、ＩＭ－９、ＮＣＩ－Ｈ９２９、Ｄａｕｄｉ、およびＭＭ１．Ｒに関して１０：１ならびにＲａｊｉ細胞に関して４０：１のＥ／Ｔ比を達成するために密度を調整した。抗ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体またはダラザレックス（抗ＣＤ３８ ｍＡｂ）の１：３または１：４段階希釈物をＲＰＭＩ培地で調製し、各９６ウェルプレート中でＥ／Ｔ細胞混合物に添加した。一連の標的細胞およびＴ細胞のみのウェルも、二次抗原のみおよび二重特異性抗体なしの対照として設定した。腫瘍細胞のみおよびＰＢＭＣのみのウェルも、各細胞型の固有のアポトーシスベースラインを評価するために含めた。プレートベースのアッセイのエッジ効果に対処するために、９６ウェルプレートの内側の行および列のみを、アッセイを設定するために使用した。境界の行および列を、内側アッセイウェルとして等体積のＲＰＭＩ培地で満たした。次いで、アッセイプレートを３７℃の静置インキュベーター中で一晩保持した。

一晩のインキュベーションからの細胞を遠心分離によってペレット化させた。細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、遠心分離して上清を除去した。次いで、各アッセイプレート中の細胞ペレットをＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ検出および分析に供した。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃによる市販のＦＡＣＳキットを使用し、製造業者の推奨する条件および手順に従って、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ検出を実施した。

次いで、アッセイプレートを、ＧＦＰ検出のためのＢＬ－１チャネルおよびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ検出のためのＲＬ－１チャネルを有するＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ ＩＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰｌｕｓフローサイトメーターでのＦＡＣＳ分析に供した。ＧＦＰの構成的発現に起因して、腫瘍標的細胞をＦＳＣ－Ａ（前方散乱 － 面積）対ＢＬ１－Ｈの散布図で、エフェクター細胞から識別することができ、ＢＬ１－Ｈの高い集団は標的細胞であり、ＢＬ１－Ｈの低い集団はエフェクター細胞である。ＧＦＰ（＋）腫瘍細胞をＲＬ１－Ｈ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）対ＢＬ１－Ｈ散布図でさらにゲーティングし、ＲＬ１－Ｈの高い集団は高Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖサブセットであり、ＲＬ１－Ｈの低い集団は低Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖサブセットであった。標的細胞の殺傷％を、各アッセイ条件において、０濃度処置条件で高ＧＦＰの総標的細胞数に対する（０濃度処置条件で高ＧＦＰの総標的細胞数－低Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖサブセット）のパーセンテージとして定義する。各アッセイウェルの殺傷％をＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体またはダラザレックス濃度勾配に対してプロットした。

非対称トップ／ボトムフィッティング戦略（Ｓファクター）を用いる５パラメーター非線形回帰（５－ＰＬ）適合用量依存性応答モデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて、これらの殺傷％対Ｌｏｇ［濃度］プロットを当てはめた。複数のドナーに由来するＰＭＢＣを、二連で６つのＣＤ３８（＋）腫瘍細胞のそれぞれに対してプロファイルした。結果を図９Ｂ～Ｇに示す。

（実施例１１）
サイトカイン放出アッセイ

多重ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）方法を使用して、ＣＤ３８／ＣＤ３ヘテロ二量体（二重特異性）抗体のサイトカイン放出能を分析した。刺激されていないヒトＴ細胞とＲＰＭＩ８２２６細胞を、リダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性アッセイにおいて、様々な濃度のＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体または対照抗体と混合した。各リダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性条件に対して同時にアッセイされたＴ細胞細胞傷害性において、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、およびＴＮＦαを含む３つのサイトカインを試験した。以下の試料取り扱いを実践してアッセイを行う際に、製造業者の推奨するアッセイ手順を使用した。

以前に凍結させた上清を室温で解凍し、反転かつ簡易な遠心分離によってホモジナイズした。二重特異性抗体または対照ｍＡｂ濃度勾配で処置したシリーズについて、腫瘍標的細胞ＲＰＭＩの殺傷が観察された場合、ホモジナイズした上清をＭＳＤプレートにロードする前に５０倍に希釈した。細胞のみの対照、すなわち腫瘍標的細胞のみ、Ｔ細胞のみ、または２つの細胞の混合物としてのシリーズについて、細胞死があまり観察されず、サイトカインがあまり期待されない場合、上清をＭＳＤプレートにロードする前に１０倍に希釈した。結果を図１０Ａ～Ｃに示す。

（実施例１２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化アッセイ

ＣＤ３８またはＢＣＭＡ抗原を発現する腫瘍細胞を刺激した際に、以前には刺激されていないヒトＴ細胞を活性化するＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体の能力を、固定したＥ／Ｔ（エフェクター細胞／標的細胞）比のヒトＴ細胞と腫瘍細胞の混合物を、リダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性（上記）において以前に決定されたＥＣ５０の対応する二重特異性抗体を超えるかまたは下回る濃度の各二重特異性抗体に供することによって評価した。このＴ細胞活性化アッセイでは、ＣＤ３８（＋）骨髄腫細胞系ＭＭ１．Ｒ ＧＦＲ／ｌｕｃを使用して、各ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体、および親ｍＡｂ対照の存在下で、新たに単離されたヒトＴ細胞にＴＡＡを提示させた。アッセイ条件ごとに、だいたい１５，０００個のＭＭ１．Ｒ細胞と１５０，０００個の初代ヒトＴ細胞を、１ｐＭ、１０ｐＭ、または１ｎＭの各二重特異性抗体またはｍＡｂ対照の存在下で、９６ウェルプレート中で３７℃の静置インキュベーターで一晩インキュベートした。抗原を含まない対照として、対応する二重特異性抗体または対照ｍＡｂ条件のそれぞれに関して、Ｔ細胞のみも並行して設定に含めた。一晩のインキュベーションからの細胞ペレットを、遠心分離によってペレット化し、ＦＡＣＳ染色および分析の前にＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＢＳで１回洗浄した。細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、製造業者の推奨するアッセイ力価および手順に従って、抗ＣＤ２５－ＡＰＣおよび抗ＣＤ６９－ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．）で二重染色した。二色ＦＡＣＳアッセイに対する適切な補正対照およびＡｂなしの対照もアッセイ設計に含めた。

ＦＡＣＳ分析の前に、洗浄し、二重染色した細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。アッセイ条件ごとにおよそ１／３（または５０，０００～６０，０００個）の細胞をＢＬ－１（ＧＦＰ）、ＲＬ－１（ＣＤ２５－ＡＰＣ）、およびＲＬ－２（ＣＤ６９－ＡＰＣ－Ｃｙ７）チャネルのＦＡＣＳ機器によって分析した。Ｔ細胞を、ＦＳＣ－Ａ（前方散乱 － 面積）対ＢＬ１－Ｈ（高）散布図でＭＭ１．Ｒ標的細胞からゲーティングし、ＢＬ１－Ｈの低い集団をエフェクター細胞とした。次いで、Ｔ細胞集団を、適切な補正が行われた後に、ＲＬ－１（ＣＤ２５－ＡＰＣ）対ＲＬ－２（ＣＤ６９－ＡＰＣ－Ｃｙ７）散布図にプロットした。ＣＤ２５（＋）とＣＤ６９（＋）の両方が高度に発現された右上の四分位を活性化Ｔ細胞集団として定義した。すべての検出されたＴ細胞集団におけるＣＤ２５（＋）／ＣＤ６９（＋）Ｔ細胞のパーセンテージを、対応するアッセイ条件に関する活性化％として計算した。次いで、アッセイ条件ごとの活性化％を、標的細胞およびＴ細胞のみの条件で観察された活性化レベルを減算することによって正規化する。結果を図１１ＡおよびＢ、ならびに図１２Ａ～Ｃに示す。二重特異性抗体（ＣＤ３８Ａ２－３Ｈ１０ｍ１／ＣＤ３ｔｓｍ＃１ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）は、用量に依存して、以前には刺激されていないＴ細胞のＴＡＡ依存性活性化を媒介する（図１１Ａ）。腫瘍標的の非存在下で、二重特異性抗体は、はるかに少ない程度にしかＴ細胞活性化を誘導しない（図１１Ｂ）。

（実施例１３）
ＡＤＣＣアッセイ

このＡＤＣＣアッセイでは、アッセイ設定の前にＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識したＤａｕｄｉ細胞を、ＣＤ３８発現標的細胞として使用してアッセイを実施した。

ＡＤＣＣアッセイのエフェクター集団はＮＫ細胞からなり、ヒトＮＫ細胞富化キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して末梢血単核球から調製した。一旦調製したら、ＮＫ細胞を、直接使用するか、または翌日に、アッセイ設定のために３７℃および５％ＣＯ_２で、ＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中で培養した。ＮＫ細胞を、５００ｇで５分間遠心分離することによって使用前に洗浄し、次いで、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳに再懸濁させ、血球計数器を使用して計数した。

二重特異性抗体ＢＺ１Ｓ（クローンＲ５－Ｅ４）、ダラザレックス、またはＣＤ３８ ３Ｈ１０ｍ１ ｍＡｂを、１０ｎＭまたはその示した希釈物で、９６ウェルプレートのウェルにおいて１２０μＬのＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中１．５×１０^４個のＣＦＳＥ標識Ｄａｕｄｉ細胞に添加した。３７℃および５％ＣＯ_２で３０分インキュベートした後に、次いで、６０ｕＬの１．５×１０^５個のＮＫ細胞を添加して、標的に対するエフェクターの比を１０：１とした。細胞を３７℃および５％ＣＯ_２で一晩インキュベートし、その後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｙｅｌｌｏｗ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡＰＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して染色し、フローサイトメトリー（ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ）で細胞傷害性を決定した。対照は、初代抗体を添加しなかった以外は上記のように処置した細胞、および試験抗体の代わりに無関係なアイソタイプが一致した対照抗体を使用した以外は上記のように処置した細胞からなった。図１３ＡおよびＢは、２つの異なるドナー由来のＰＢＭＣを使用するＡＤＣＣアッセイの結果を示す。

（実施例１４）
ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植マウスモデル（ＲＰＭＩ８２２６）

ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植マウスモデルを使用して、生物発光異種移植動物モデルにおいて、ヘテロ二量体（二重特異性）抗体の殺腫瘍活性（ＲＰＭＩ８２２６）を測定した。処置スケジュールを図１４Ａに示し、処置コホートを図１４Ｂの表に列挙する。陰性対照マウスにはリン酸緩衝食塩水を投与した。対照マウスには、活性化Ｔ細胞または対照ＲＳＶ／ＣＤ３二重特異性抗体のいずれかを投与した。試験マウスには、５０ｕｇ／ｋｇ、５ｕｇ／ｋｇまたは０．５ｕｇ／ｋｇのＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体（Ａｂ１）のいずれかを投与した（図１４Ｃおよび１５Ａ）。図１４Ｃに示された結果は、ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体（Ａｂ１）が抗腫瘍有効性を有し、ＧＶＨＤ症状を遅延させることを示す。図１５Ａに示された結果は、ＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体（Ａｂ２）が抗腫瘍有効性を有さないことを示す。処置マウスからの平均生物発光シグナルを図１４Ｄ～Ｅ（Ａｂ１に関する）および図１５Ｂ～Ｃ（Ａｂ２に関する）に示す。

図１５Ａは、図１４ＡおよびＢに示されるスケジュールに記載されたマウス異種移植モデルからの生物発光シグナルを示す。これらのマウスを、異なるＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体（Ａｂ２）で処置し、図１４Ｃに示されたマウスと比較した。図１５Ｂ～Ｃは、図１５Ａに示された処置マウスからの平均生物発光シグナルを示す。

（実施例１５）
ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植マウスモデル（ＲＰＭＩ８２２６およびＴ細胞）

活性Ｔ細胞：健康なドナーの血液をＳａｎ Ｄｉｅｇｏ血液バンクから入手し、ＰＢＭＣ（ドナー８）を密度勾配遠心分離技法によってＨｉｓｔｏ－ｐａｑｕｅにより単離した。ＰＢＭＣをＯＫＴ３ ５０ｎｇ／ｍｌで活性化し、注射するまで培養した。

ＲＰＭＩ８２２２６ －ＧＦＰ－Ｆｌｕｃ細胞：ＡＴＣＣ（ＣＣＬ－１５５）から入手したヒト多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６、ならびにＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子をもたらすレトロウイルスベクターＰＭＹ－ＭＡ００５を形質導入した。限界希釈法によって、単一細胞クローンを選択し、安定したＲＰＭＩ８２２６－ＧＦＰ－Ｆｌｕｃ細胞系を生成した。ＲＰＭＩ８２２６－ＧＦＰ－Ｆｌｕｃ細胞系を、異種マウス移植多発性骨髄腫モデルのためのＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ培地で培養した。８週齢の雌のＮＳＧ免疫欠損マウスを使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）。

ＲＰＭＩ８２２６－ＧＦＰ－Ｆｌｕｃ細胞を有する全身性ＣＤ３８＋ヒト多発性骨髄腫異種移植動物モデル：ＲＰＭＩ８２２６－ＧＦＰ－Ｆｌｕｃ細胞を培養フラスコ中１０％ウシ胎子血清を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。異種ＭＭを、順化していない成体ＮＳＧに、尾静脈を介して１ｅ７ ＲＰＭＩ８２２６－ＧＦＰ－Ｆｌｕｃ細胞を静脈内接種することによって生成した。腫瘍をＩＶＩＳで検出することができた場合、腫瘍接種の２９日後に、１．２ｅ７の活性Ｔ細胞を、マウス当たり０．２ｍＬの体積で尾静脈を介して動物に注射した（図１６Ａ～Ｂ）。試験二重特異性抗体および対照抗体をＡＴＣ注射後の日数に従って与えた。未処置群のマウスはＡＴＣもいずれの処置も受けなかった。腫瘍負荷をＩＶＩＳによって毎週評価した。

ＩＶＩＳによる腫瘍負荷評価：ＩＶＩＳは、マルチスペクトル蛍光および生物発光を一緒に使用するイメージングシステムである。この実験におけるマウスを、毎週、ＩＶＩＳイメージングシステムを使用して、発光によって腫瘍負荷について評価した。Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙの麻酔機器を使用して全身麻酔を開始し、腹腔内注射によって１５０ｍｇ／ｋｇでルシフェリンをマウスに投与した。注射したマウスを、生物発光シグナルを獲得する前に、イソフルラン誘導チャンバー内に５分間配置した。ＩＶＩＳの製造業者の指示に従って、イメージング手順およびデータ分析を実施した。ステラジアン当たりの１ｃｍ^２当たりフォトン／秒として各マウスについて生物発光シグナルフラックスを分析し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって、色スケールを最小＝１ｅ５および最大＝１ｅ７に設定した。動物のＩＶＩＳイメージングを図１６Ｃに示し、平均放射輝度のグラフを図１６Ｄに示す。

マウスにおけるＴ細胞の移植：尾静脈採血により末梢血を得た（図１６Ｅおよび１６Ｉに示された表を参照されたい）。ＡＰＣ抗ＣＤ３で染色することによって、ヒトリンパ球の移植について試料を調査した。マイクロリットル当たりの最終ＣＤ３＋細胞数を希釈係数２０で計算した。簡潔には、全血を暗所で室温にて１時間関連する抗体とインキュベートし、次に、Ｆｉｘａｔｉｖｅ－Ｆｒｅｅ Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって赤血球を除去した。製造業者の指示に記載されたように、Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して試料を分析した。

式および計算：Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して、マイクロリットル当たりの細胞数として細胞濃度を記録した。血液試料を２０倍に希釈し、実際の濃度は、測定した濃度に２０の希釈倍率を掛けたものであった。

統計分析：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌとＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、統計分析を実施した。すべての測定値の分散を平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。結果をＧａｕｓｓｉａｎ正規分布について評価し、次いで、示したＬｏｇ－Ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）試験によって分析した。Ｐ≦０．０５、≦０．０１、または≦０．００１を、図および表においてそれぞれ^＊、^＊＊、または^＊＊＊として表した場合、データは有意に異なった。

図１６Ｆ～Ｉの結果は、ＣＤ３８×ＣＤ３二重特異性抗体が、二重特異性抗体投与の１日後にＴ細胞の９０％よりも多くに有意にエンゲージすることができ、抗体投与の７日後にはＴ細胞の３倍の拡大をもたらすことを示す。

（実施例１６）
ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植マウスモデル（ＲａｊｉおよびＰＢＭＣ）

ｉｎ ｖｉｖｏ研究を設計し、ＮＳＧマウスの全身性ＣＤ３８＋ヒトバーキットリンパ腫異種移植動物モデルにおける抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体の抗腫瘍有効性を調査した。

ＮＳＧマウスに、ＣＤ３８＋ヒトＢリンパ球細胞系であるＲａｊｉ－１５細胞を静脈内接種し、凍結ＰＢＭＣを解凍して一緒に混合し、その後、ＤＰＢＳもしくは抗ＣＤ３／ＲＳＶ二重特異性抗体または抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置した。

この研究で使用した二重特異性抗体は：ＣＤ３８Ａ２－３Ｈ１０ｍ１／ＣＤ３ｔｓｍ＃１－ｓｃＦｖｇ１ＬＡＬＡ－ノブインホールであった。対照二重特異性抗体は：ＲＳＶ／ＣＤ３ｔｓｍ＃１－ｓｃＦｖｇ１ＬＡＬＡ－ノブインホールであった。

ＮＳＧマウスに１×１０^５個のＲａｊｉ－１５細胞および５×１０^６個のＰＢＭＣを接種した。動物（ｎ＝９）を、複数回用量の（腹腔内投与による）５ｕｇの抗ＣＤ３／ＣＤ３８もしくは対照抗ＣＤ３／ＲＳＶのいずれか、または２００ｕＬのＤＰＢＳで処置した。動物を、６時間、７２時間、７日、１０日、１４日、および１７日に処置した（図１７Ａ）。体重測定および臨床観察を定期的にモニターした（図１７Ｄ）。動物が瀕死状態になるか、または疾患によって体重の１５％より多くが失われた場合、それらを安楽死させた。ＩＶＩＳによって腫瘍負荷を毎週モニターした。免疫細胞および腫瘍細胞を検出するために、血液試料を毎週尾静脈から採取した。

移植したヒト免疫細胞をＰＥ／Ｃｙ７抗ＣＤ３、ＡＰＣ／Ｃｙ７抗ＣＤ４５、ＡＰＣ抗ＣＤ３８、ＰＥ抗ＣＤ８ａ抗体、ＰｅｒＣＰ／シアニン５．５マウス抗ＣＤ４抗体で染色し、フローサイトメトリーによって５０ｕＬの血液について分析した。

循環ＣＤ４５＋細胞数（処置後４日目）、ＣＤ３＋免疫細胞の％（処置後４日目）、ＣＤ４＋免疫細胞の％（処置後１７日目）、およびＣＤ８＋免疫細胞の％（処置後１７日目）を検出することに成功した。総Ｔ細胞数（ＣＤ４５＋）は、ＰＢＭＣを注射したマウスで最も高く、次に対照抗ＣＤ３／ＲＳＶを有するＰＢＭＣであり、抗ＣＤ３／ＣＤ３８は最も少ないＣＤ４５＋数を有した（図１７Ｅ）。総ＣＤ４５＋集団におけるＣＤ３＋の％は、ＣＤ４５＋細胞の増加と共に徐々に増加した（図１７Ｆ）。総ＣＤ３＋集団におけるＣＤ４＋の％は、ＣＤ８＋細胞の％の増加と共に徐々に減少した（図１７Ｇ）。総ＣＤ３＋細胞におけるＣＤ８ａ＋のパーセントを図１７Ｈに示す。ＣＤ４５＋集団のＣＤ３８発現レベルは、処置のおよそ３０日後に増加し、その後およそ４０日で下降した（図１７Ｉ）。

抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体で処置したマウスの腫瘍負荷は、１回目の処置後１６日目までに根絶され、９匹のマウス全部が処置後５週目後に生存していた。対照的に、ＤＰＢＳ処置を受けたかまたは対照抗ＣＤ３／ＲＳＶ二重特異性抗体を受けたマウスでは、すべてのマウスが腫瘍に屈するまで腫瘍が徐々に成長した（Ｔ細胞処置後の生存日数：ＤＰＢＳ群は３２±２．６４日；抗ＣＤ３／ＲＳＶ群は２７±２．５日；抗ＣＤ３／ＣＤ３８群は５８±１５．２１日）。図１７ＢおよびＣを参照されたい。これらの結果は、抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体が、ＣＤ３８陽性バーキットリンパ腫を効果的に根絶し、ｉｎ ｖｉｖｏでの生存を延長することができることを実証する。（Ｌｏｇｒａｎｋ試験によりｐ＜０．０００１）。生存グラフを図１７Ｊに示す。

（実施例１７）
安定なプール生成

グルタミン合成酵素を発現しないＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ細胞系に対してＬＯＮＺＡ ＧＳ Ｘｃｅｅｄ（商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、安定したプールトランスフェクションを行った。ＧＳ Ｘｃｅｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ発現ベクター系は、グルタミン合成酵素遺伝子を有する。

２つの異なるクローニング戦略を試験した（図１８Ａを参照されたい）。アプローチＡでは、第１のポリペプチド（ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＨＣ）をコードする第１のＤＮＡおよび第２のポリペプチド（ＣＤ３８ ＨＣ）をコードする第２のＤＮＡを、グルタミン合成酵素を発現する第１の発現ベクターにクローニングし、第３のポリペプチド（ＣＤ３８ ＬＣ）をコードする第３のＤＮＡを第２の発現ベクターにクローニングした。アプローチＢでは、第２のポリペプチド（ＣＤ３８ ＨＣ）をコードする第１のＤＮＡおよび第３のポリペプチド（ＣＤ３８ ＬＣ）をコードする第２のＤＮＡを、グルタミン合成酵素を発現する第１の発現ベクターにクローニングし、第１のポリペプチド（ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ＨＣ）をコードする第３のＤＮＡを第２の発現ベクターにクローニングした。

ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ細胞に、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体を含む第１、第２および第３のポリペプチドをコードするＤＮＡを有するＬＯＮＺＡ発現ベクターをトランスフェクトした（製造業者の指示に従う）。Ｌ－メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）をブーストストリンジェンシー選択（ｂｏｏｓｔ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）に加えた。標準細胞の選択、回収および拡大を行い、次いで細胞を凍結保存し、これらを成長させ（ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｏｒ ｇｒｏｗｎ）、精製および分析した。細胞は、何週間にもわたり（例えば、７週を超えて）生存率について定期的にモニターした。生存細胞密度（ＶＣＤ）および力価もモニターした。力価は、Ｏｃｔｅｔを使用してモニターした。

一般に、安定した細胞系および安定したプール生成は以下を含んだ：遺伝子合成およびＤＧＶ構築（約４週間）；トランスフェクションおよび組合せ（約２日）；選択および回収（約３～７週間）；拡大（約１～２週間）；プール凍結（約１週間）；フェドバッチ（約２週間）；精製（約１週間）；および抗体分析（約１週間）。

一般に、単一細胞クローニングプロセスは以下を含んだ：プールの解凍（約１～２週間）；５×９６ウェルプレート（約１日）；細胞のイメージング（約２週間）；ウェルの滴定（ｔｉｔｔｅｒｅｄ ｗｅｌｌｓ）（約２日）；２４ウェルへの拡大（約１週間）および力価の獲得とゲル分析；６ウェルへの拡大（約１週間）および力価の獲得とゲル分析；拡大および凍結（約２～３週間）；フェドバッチ（約２週間）；精製（約２週間）；分析（約２週間）；トップクローン選択（約１週間）；ＲＣＢのリスク（約６週間）；トップクローン安定性研究（約１９週間）。

二重特異性抗体を安定したプール細胞から単離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロッティングによって分析した（図１８Ｂ、ＣおよびＤ）。

単離した二重特異性抗体（ＢＺ１と示す）の収量は１５０ｍｇ／Ｌであり、回収は１３５ｍｇ／Ｌであり、回収％は９０％であった。単離したＢＺ１二重特異性抗体（１１２ｍｇ）を、精製するために２０ｍＬのＣａｐｔｏ（商標）Ｓ ＩｍｐＡｃｔカラムにロードした。結果を図１８Ｅに示す。ＢＺ１二重特異性抗体（アイソタイプＩｇＧ１／ＬＡＬＡ）の最終収量：濃度３．６４ｍｇ／Ｌ；体積１２．０ｍＬ；収量４３．６８ｍｇ；回収％３９％；ＰＩ計算値８．１５；最終緩衝液ヒスチジンｐＨ５．０。

単離した二重特異性抗体（ＢＺ１Ｓと示す）の収量は５００ｍｇ／Ｌであり、回収は３４３ｍｇ／Ｌであり、回収％は６９％であった。単離したＢＺ１Ｓ二重特異性抗体（３０ｍｇ）を、精製するために１ｍＬのＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔカラムにロードした。結果を図１８Ｆに示す。ＢＺ１Ｓ二重特異性抗体（アイソタイプＩｇＧ１／ＬＡＬＡ）の最終収量：ｔｒａｎｓ濃度９．２０ｍｇ／Ｌ；体積１．０ｍＬ；回収％３２％；ＰＩ計算値８．１５；最終緩衝液ヒスチジンｐＨ５．０。

ＬＣ－ＭＳを二重特異性抗体に関して行い、トレースしたＵＶおよびＭＳを図１８Ｇに示す。様々なホモ二量体およびヘテロ二量体抗体の形態の概略図がトレースに含まれる。

ＣＥ－ＳＤＳを、還元条件および非還元条件下で二重特異性抗体に関して行い、結果を図１９Ｂ～Ｃに示す。

イオン交換クロマトグラフィーを、還元条件および非還元条件下で（ｕｎｄｅｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａ ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）二重特異性抗体ＢＺ１に関して行い、結果を図２０Ａ～Ｂに示す。

イオン交換クロマトグラフィーを、還元条件および非還元条件下で（ｕｎｄｅｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａ ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）二重特異性抗体ＢＺ１Ｓに関して行い、結果を図２１Ａ～Ｂに示す。

Claims (26)

1. 腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体と結合するヘテロ二量体抗体であって、
   ａ）ｓｃＦｖおよび第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチドであって、前記ｓｃＦｖが、ペプチドリンカーによって互いに接合された第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）を含み、前記ｓｃＦｖが、第１のヒンジ領域によって前記第１のＦｃ領域に接合されており、前記第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）および第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）が、前記Ｔ細胞受容体と結合する第１の抗原結合ドメインを形成する、第１のポリペプチド、
   ｂ）第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）および第２のＦｃ領域を含む第２のポリペプチドであって、前記第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）が、第２のヒンジ領域によって前記第２のＦｃ領域に接合されている、第２のポリペプチド、ならびに
   ｃ）第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）を含む第３のポリペプチドであって、前記第２のポリペプチドの前記第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）および前記第３のポリペプチドの前記第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）が、前記腫瘍関連抗原と結合する第２の抗原結合ドメインを形成する、第３のポリペプチド
   を含み、
   前記腫瘍関連抗原がＣＤ３８を含み、
   前記Ｔ細胞受容体がＣＤ３を含む、
   ヘテロ二量体抗体。
2. ａ）前記第１のポリペプチドの前記第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）が、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６および３８から選択される重鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、
   ｂ）前記第１のポリペプチドの前記第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）が、配列番号２４、２９、３１、３３、３５、３７および３９から選択される軽鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列を含み、
   ｃ）前記第２のポリペプチドの前記第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）が、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４から選択される重鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、
   ｄ）前記第３のポリペプチドの前記第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）が、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５から選択される軽鎖可変領域配列のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３配列を含む、請求項１に記載のヘテロ二量体抗体。
3. ａ）前記第１のポリペプチドの前記第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）が、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６および３８から選択される配列のうちの１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、
   ｂ）前記第１のポリペプチドの前記第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）が、配列番号２４、２９、３１、３３、３５、３７および３９から選択される配列のうちの１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、
   ｃ）前記第２のポリペプチドの前記第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）が、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４から選択される配列のうちの１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、
   ｄ）前記第３のポリペプチドの前記第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）が、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５から選択される配列のうちの１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のヘテロ二量体抗体。
4. ａ）前記第１のポリペプチドの前記第１の重鎖可変領域（ＶＨａ）が、配列番号２２、２８、３０、３２、３４、３６および３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、
   ｂ）前記第１のポリペプチドの前記第１の軽鎖可変領域（ＶＬａ）が、配列番号２４、２９、３１、３３、３５、３７および３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、
   ｃ）前記第２のポリペプチドの前記第２の重鎖可変領域（ＶＨｂ）が、配列番号１、６、８、１０、１２、１４、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、
   ｄ）前記第３のポリペプチドの前記第２の軽鎖可変領域（ＶＬｂ）が、配列番号１６、１８、２０、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のヘテロ二量体抗体。
5. ａ）第１のポリペプチドが、配列番号８７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号８９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号８８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか（例えば、ＢＺ１）、
   ｂ）前記第１のポリペプチドが、配列番号９０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号９２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号９１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか（例えば、ＢＺ１Ｓ）、
   ｃ）前記第１のポリペプチドが、配列番号７１～７７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか（例えば、ＣＤ３８ Ａ２シリーズ）、
   ｄ）前記第１のポリペプチドが、配列番号７１～７７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号８４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか（例えば、ＣＤ３８ Ａ２－３Ｈ１０ｍｌシリーズ）、
   ｅ）前記第１のポリペプチドが、配列番号７１～７７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号８０～８３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか（例えば、ＣＤ３８ Ｄ８シリーズ）、または
   ｆ）前記第１のポリペプチドが、配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、配列番号１０６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチドが、配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、ＣＤ３８ Ｄ８ ｂｕｍｐ－ｉｎ－ｄｅｎｔシリーズ）、請求項１から４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
6. 前記第１および／または第２のＦｃ領域が、ＬＡＬＡ変異を含み、前記第１および第２のＦｃ領域が、ノブインホールまたはｂｕｍｐ－ｉｎ－ｄｅｎｔ構造を形成するように変異されている、先行する請求項のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
7. 前記第１のポリペプチドの前記第１のＦｃ領域が、配列番号２６および２７のアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
8. 前記第２のポリペプチドの前記第２のＦｃ領域が、配列番号４および５のアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
9. 先行する請求項のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体の第１、第２、および第３のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸。
10. 請求項９に記載の１つまたは複数の核酸を含む１つまたは複数のベクターであって、必要に応じて、第１および第２のベクターを含み、
    ａ）前記第１のベクターが、前記第１および第２のポリペプチドをコードし、前記第２のベクターが、前記第３のポリペプチドをコードするか、
    ｂ）前記第１のベクターが、前記第２および第３のポリペプチドをコードし、前記第２のベクターが、前記第１のポリペプチドをコードするか、または
    ｃ）前記第１のベクターが、前記第１および第３のポリペプチドをコードし、前記第２のベクターが、前記第２のポリペプチドをコードする、１つまたは複数のベクター。
11. 請求項９に記載の１つもしくは複数の核酸または請求項１０に記載の１つもしくは複数のベクターを保有する宿主細胞または宿主細胞の集団。
12. ヘテロ二量体抗体を調製するための方法であって、宿主細胞の集団が第１、第２および第３のポリペプチドを発現するのに好適な条件下で、宿主細胞の前記集団を培養するステップを含み、宿主細胞の前記集団における個々の宿主細胞が、請求項９に記載の１つもしくは複数の核酸または請求項１１に記載の１つもしくは複数のベクターを保有し、必要に応じて、前記１つまたは複数のベクターが、（ｉ）前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドをコードする第１のベクター、ならびに（ｉｉ）前記第３のポリペプチドをコードする第２のベクターを含む、方法。
13. 細胞の前記集団から、前記第１、第２および第３のポリペプチドを単離するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第１、第２および第３のポリペプチドを、前記第１、第２および第３のポリペプチドを互いに会合させるのに好適な条件に供し、前記ヘテロ二量体抗体を形成するステップをさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 腫瘍関連抗原およびＴ細胞受容体を結合させるための方法であって、請求項１から８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体を、前記ヘテロ二量体抗体を前記腫瘍関連抗原および前記Ｔ細胞受容体に結合させるのに好適な条件下で、前記腫瘍関連抗原および前記Ｔ細胞受容体と接触させるステップを含む、方法。
16. 前記腫瘍関連抗原が、前立腺、乳房、卵巣、頭頚部、膀胱、皮膚、結腸直腸、肛門、直腸、膵臓、肺（非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む）、脳、食道、肝臓、腎臓、胃、結腸、子宮頚部、子宮、子宮内膜、外陰、喉頭、膣、骨、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、口腔咽頭、喉頭、下喉頭、唾液腺、尿管、尿道、陰茎、もしくは精巣のがん由来、または平滑筋腫、神経膠腫、もしくは神経膠芽腫由来の細胞によって発現される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記腫瘍関連抗原が血液がんによって発現される、請求項１５に記載の方法。
18. 前記血液がんが、Ｂ慢性リンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、ＢおよびＴ急性リンパ球性白血病（ＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）、骨髄異形成症候群、バーキットリンパ腫（ＢＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、または軽鎖もしくはベンス－ジョーンズ骨髄腫である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記Ｔ細胞受容体が、エフェクターＴ細胞において発現され、前記腫瘍関連抗原が、腫瘍またはがん細胞によって発現される、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記エフェクターＴ細胞が、細胞傷害性細胞の殺傷を媒介することによって、前記腫瘍またはがん細胞を死滅させる、請求項１９に記載の方法。
21. 対象における疾患を処置するための方法であって、請求項１から８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法。
22. 疾患を処置するための医薬の製造のための、請求項１から８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体の使用。
23. 疾患を処置する際に使用するための、請求項１から８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
24. 前記疾患が、前立腺、乳房、卵巣、頭頚部、膀胱、皮膚、結腸直腸、肛門、直腸、膵臓、肺（非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む）、脳、食道、肝臓、腎臓、胃、結腸、子宮頚部、子宮、子宮内膜、外陰、喉頭、膣、骨、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、口腔咽頭、喉頭、下喉頭、唾液腺、尿管、尿道、陰茎、もしくは精巣のがん、または平滑筋腫、神経膠腫、もしくは神経膠芽腫由来のがんを含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法、使用、または使用のためのヘテロ二量体抗体。
25. 前記疾患が血液がんを含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法、使用、または使用のためのヘテロ二量体抗体。
26. 前記血液がんが、Ｂ慢性リンパ球性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、ＢおよびＴ急性リンパ球性白血病（ＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）、骨髄異形成症候群、バーキットリンパ腫（ＢＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、または軽鎖もしくはベンス－ジョーンズ骨髄腫である、請求項２５に記載の方法、使用、または使用のためのヘテロ二量体抗体。

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