JP2011111422A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに対する新規のモノクローナル抗体を提供する。
【解決手段】ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩの細胞外ドメインに反応し、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩの細胞内ドメインには反応しないモノクローナル抗体が提供される。当該モノクローナル抗体において、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩのナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を行うことが可能な構成が推奨される。
【選択図】図５

Description

本発明はモノクローナル抗体に関し、詳細には、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに対する新規のモノクローナル抗体に関する。

細胞表面上の膜受容体タンパク質は、細胞外の情報を細胞内へ伝達する極めて重要な働きをしている。そのため、膜受容タンパク質に結合する物質はアゴニスト型医薬品やアンタゴニスト型医薬として候補物質となる。膜受容体タンパク質の中でも特にＧタンパク質共役型受容体（G protein-coupled receptor；ＧＰＣＲ）は、現在市販されている低分子医薬品の約半数がこの受容体を標的としているため、医薬品開発において極めて注目を集めている。また、ＧＰＣＲの約半数は、生体内で機能しているナチュラルリガンドが同定されていないオーファンＧＰＣＲであり、ナチュラルリガンドやその類縁化合物が新規医薬品の候補物質として期待されていることから、オーファンＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングも行われている。

ＧＰＣＲは、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。すなわち、ＧＰＣＲの細胞外ドメインは、Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループ、細胞外第２ループ、および細胞外第３ループから構成されている。同様に、ＧＰＣＲの細胞内ドメインは、細胞内第１ループ、細胞内第２ループ、細胞内第３ループ、およびＣ末端ドメインから構成されている。

アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩ（Angiotensin II receptor type I，以下「ＡＧＴＲ１」と略記することがある。）はＧＰＣＲの一種であり、細胞膜を７回貫通する構造を有している。ヒト由来アンジオテンシン受容体タイプＩ（以下「ｈＡＧＴＲ１」と略記することがある。）の１次構造はすでに解明されており、そのＮ末端ドメイン、各細胞外ドメイン、各細胞内ドメイン、およびＣ末端ドメインに相当する部位も特定されている。

アンジオテンシンＩＩ（Angiotensin II；ＡＴＩＩ）は８個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、昇圧作用を持つ生理活性物質である。そのためアンジオテンシンＩＩは高血圧症と密接に関連する。また、ＡＧＴＲ１の遺伝子異常やアンジオテンシンＩＩ生成の代謝異常によっては、低血圧症にも関連すると考えられる。

ＡＧＴＲ１のアンタゴニストはアンジオテンシンＩＩが関与する高血圧症の治療薬候補となる可能性があり、いくつかの低分子化合物が拮抗薬としてすでに開発されている（非特許文献１）。また、アンジオテンシンＩＩはレニン−アンジオテンシン系において、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によりアンジオテンシンＩから生合成される。そのため、ＡＣＥの阻害剤も高血圧症の治療薬としてすでに開発されている（非特許文献２）。

一方、低血圧治療薬としてのＡＧＴＲ１のアゴニスト、すなわち作動薬はあまり知られていない。低血圧症の一般的な治療薬としては、現在、アドレナリンα１受容体作動薬などの昇圧剤が使われている。そして、現状の低血圧治療薬の副作用としては、動悸、めまい、口の渇き、吐き気などの症状が知られている。これらの副作用が低減された低血圧治療薬開発のためには、非常に高い特異性を持ってｈＡＧＴＲ１に結合し、アゴニスト活性を示す化合物を用いることが好ましい。

受容体に対する非常に高い特異性を持たせるために、受容体に対する抗体をアンタゴニストまたはアゴニストとして医薬品に応用することも一般に試みられている（アンタゴニスト抗体またはアゴニスト抗体）。ＡＧＴＲ１についても、アゴニスト抗体が低血圧症治療薬となる可能性がある。そして、アゴニスト活性を有するためには、当該抗体が天然（native）状態のＡＧＴＲ１に反応するものである必要がある。

モエン（Moen）ら，ドラッグ（Drug），２００５年，第６５巻，第１８号，ｐ２６５７−２６７４ ソング（Song）ら，クリニカル・ファーマコキネティクス（Clinical Pharmacokinetics），２００２年，第４１巻，第３号，ｐ２０７−２２４

しかし、現在市販されているｈＡＧＴＲ１に対する抗体は、いずれもウェスタンブロッティングや固定化組織切片染色に用いるためのものであり、ホルムアルデヒド処理等により変性したｈＡＧＴＲ１に反応するものである。すなわち、これらのｈＡＧＴＲ１に対する抗体は、天然状態のＡＧＴＲ１に反応するものはなく、もちろんアゴニスト抗体として使用できるものでもない。

上記した現状に鑑み、本発明は、新たな医薬品開発等に有用なヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプ１に対する新規のモノクローナル抗体を提供することを目的とする。

本発明者らは、分子シャペロンの一種であるシャペロニンをコードする遺伝子とヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩをコードする遺伝子との融合遺伝子を用いて、ラットに遺伝子免疫を施し、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに対する免疫応答を誘導した。そして、当該ラットの脾臓細胞とミエローマとを融合させてハイブリドーマの集団を作製し、ｈＡＧＴＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを検索した。その結果、２種のクローンを選抜することに成功した。そして、当該ハイブリドーマから所望のモノクローナル抗体を取得することに成功し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下のとおりである。

請求項１に記載の発明は、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩの細胞外ドメインに反応し、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩの細胞内ドメインには反応しないモノクローナル抗体である。

本発明のヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに対するモノクローナル抗体（以下、「抗ｈＡＧＴＲ１モノクローナル抗体」と略記することがある。）は、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩの細胞外ドメインに特異的に反応するものであり、細胞内ドメインには反応しない。本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに対するアンタゴニスト抗体やアゴニスト抗体として有用であり、当該受容体に関係する疾病の治療薬開発に有用である。また、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに関係する疾病の診断や、当該受容体の免疫測定法の構築にも有用である。

請求項１に記載のモノクローナル抗体において、ラット由来のものである構成が推奨される（請求項２）。

請求項２に記載のモノクローナル抗体において、以下の性質を有する構成が推奨される（請求項３）。
（ａ）サブクラス：ＩｇＧ２ａ
（ｂ）軽鎖：κ鎖

請求項４に記載の発明は、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を行うことが可能な請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体である。

かかる構成により、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに対するアゴニストとして使用可能なモノクローナル抗体が提供される。

本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに関係する疾病の治療薬開発に有用である。また、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに関係する疾病の診断や、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩの免疫測定法の構築にも有用である。

ｈＡＧＴＲ１遺伝子導入細胞とＡＧＴＲ１−ｒ０１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。 ｈＡＧＴＲ１遺伝子導入細胞とＡＧＴＲ１−ｒ０３との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。 対照の細胞とＡＧＴＲ１−ｒ０１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。 対照の細胞とＡＧＴＲ１−ｒ０３との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。 各モノクローナル抗体におけるＣａ²⁺シグナル強度を示すグラフである。

前述したように、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩ（ｈＡＧＴＲ１）はＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ｈＡＧＴＲ１をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）はすでに単離されており、ｈＡＧＴＲ１のアミノ酸配列も知られている。配列番号１にｈＡＧＴＲ１遺伝子の塩基配列を、配列番号２にｈＡＧＴＲ１アミノ酸配列のみを示す。

本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩの細胞外ドメインに反応し、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩの細胞内ドメインには反応しないものである。本発明のモノクローナル抗体を製造する方法としては、公知の方法をそのまま採用することができ、例えばケーラーとミルシュタインの細胞融合法を基礎として製造することができる。概説すれば、ｈＡＧＴＲ１に対する免疫応答が誘導されたマウスやラット等の動物の脾臓細胞とミエローマとを融合してハイブリドーマの集団を作製し、該ハイブリドーマの集団から所望のモノクローナル抗体を産生するものを選抜する。そして、選抜したハイブリドーマを培養し、その培養物から所望のモノクローナル抗体を単離・精製することができる。

ｈＡＧＴＲ１に対する免疫応答を誘導する方法としては、動物にｈＡＧＴＲ１（タンパク質）を接種する一般的なタンパク免疫の手法によってもよいが、動物にｈＡＧＴＲ１遺伝子を投与する遺伝子免疫の手法が好ましく用いられる。

遺伝子免疫によれば、ｈＡＧＴＲ１の全長をコードする遺伝子を用いることにより、抗原となる発現したｈＡＧＴＲ１が、動物体内で天然（native）の状態で存在できるので、ｈＡＧＴＲ１の立体構造に特異的な免疫応答を誘導することが可能となる。また遺伝子免疫の手法によれば、ｈＡＧＴＲ１遺伝子さえ入手できれば実施可能であり、精製されたｈＡＧＴＲ１を準備する必要がない。

より好ましくは、動物に接種する遺伝子として、シャペロニンをコードする遺伝子とｈＡＧＴＲ１をコードする遺伝子との融合遺伝子を用いる。当該融合遺伝子を免疫原として用いることにより、ｈＡＧＴＲ１遺伝子を単独で用いる場合よりも免疫応答をより選択的に誘導することができる。当該融合遺伝子を用いた遺伝子免疫の方法については、国際公開第２００６／０４１１５７号パンフレットにその詳細が記載されている。

シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、バクテリア、古細菌、真核生物等の全ての生物に存在している。特に、バクテリアの細胞質、真核細胞のミトコンドリア、葉緑体に多量に存在している。シャペロニンは、タンパク質の折り畳みを促進する活性やタンパク質の変性を阻止する活性を有する。シャペロニンは、分子量約６万のシャペロニンサブユニット（ＨＳＰ６０ともいう）７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。シャペロニンはそのリング状構造体の内部に空洞を有しており、その空洞内に折り畳み途中のタンパク質や変性したタンパク質を一時的に収納して複合体を形成する。そして、空洞内で収納したタンパク質を正しく折り畳み、続いて空洞から正しく折り畳まれたタンパク質を放出することが知られている。

シャペロニンは、バクテリアや真核生物のオルガネラにみられるグループＩ型と、真核生物や古細菌にみられるグループＩＩ型に分類される。本発明のモノクローナル抗体を製造する際に行う遺伝子免疫において、前記した融合遺伝子を用いる場合には、グループＩ型とグループＩＩ型のいずれのシャペロニン遺伝子を採用してもよい。グループＩ型シャペロニンの代表例としては、大腸菌由来のＧｒｏＥＬが挙げられる。グループＩＩ型シャペロニンの代表例としては、古細菌由来のＴＣＰが挙げられる。ＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。

ここで「シャペロニンをコードする遺伝子（シャペロニン遺伝子）」には、シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子（シャペロニンサブユニット遺伝子）に加え、複数のシャペロニンサブユニットがタンデムに連結された「シャペロニンサブユニット連結体」をコードする遺伝子を含む。シャペロニンサブユニット連結体をコードする遺伝子は、複数のシャペロニンサブユニット遺伝子がタンデムに連結された遺伝子と同じである。なお、シャペロニンサブユニット連結体は、天然のシャペロニンと同様のリング状構造体を形成することができる。

前記融合遺伝子の作製方法としては、例えば、ｈＡＧＴＲ１遺伝子とシャペロニン遺伝子とをライゲーション反応によって連結すればよい。なお、融合遺伝子を動物に投与する際には、融合遺伝子が発現ベクターに組み込まれ、プロモーターの制御下にある状態で投与することが好ましい。発現ベクターの例としては、ｐＣＩ、ｐＳＩ、ｐＡｄＶａｎｔａｇｅ、ｐＴｒｉＥＸ、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳが挙げられる。また、発現ベクター上のプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＡＭＬプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。さらに、発現ベクターには、プロモーター活性を増強するエンハンサーを含めてもよい。またさらに、発現ベクターには、ＣｐＧモチーフを含めてもよい。

融合遺伝子を動物に投与する方法としては、例えば、皮内注射、皮下注射、筋肉注射、静脈注射等が挙げられる。またパーティクルガンによる投与も適用可能である。また投与量としては、用いる発現ベクターやプロモーターの種類等に応じて適宜決定すればよいが、１回当たりおおむね１〜３ｍｇ／ｋｇ体重で、これはラットの場合は１２５〜５００μｇ／回になる。また投与の回数は、１回でもよいが、一定間隔をおいて複数回行う方がより高い免疫応答を誘導することができる。

なお、タンパク免疫によって動物に免疫応答を誘導する場合には、一般的に行われている方法をそのまま採用することができる。例えば、精製したｈＡＧＴＲ１を用意し、アジュバントとの混合液を調製する。この混合液をマウスやラット等に皮下注射し、ｈＡＧＴＲ１に対する免疫応答を誘導する。必要に応じて、間隔をあけて複数回投与し、追加免疫してもよい。

免疫される動物としては特に限定はないが、例えば、ラットが用いられる。これにより、ラット由来のモノクローナル抗体を得ることができる。その他、マウス、ニワトリ、ウサギ等の動物を用いることができる。

前述したように、ハイブリドーマの作製は、ケーラーとミルシュタインの方法によって行うことができる。すなわち、上記した手順で遺伝子免疫あるいはタンパク免疫され、ｈＡＧＴＲ１に対する免疫応答が誘導された動物から脾臓を摘出し、脾臓細胞を採取する。そして、脾臓細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマの集団を作製する。ハイブリドーマの選抜は、例えば、ＨＡＴ選択培地を用いて行うことができる。

さらに、ｈＡＧＴＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体を産生しているハイブリドーマの選抜は、例えば、フローサイトメトリーによって行うことができる。例えば、候補となるハイブリドーマの培養上清について、ｈＡＧＴＲ１を細胞膜上に発現している細胞（ｈＡＧＴＲ１発現細胞）に対する結合性を調べることにより、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜することができる。またさらに、アゴニスト活性を有無については、例えば、ｈＡＧＴＲ１発現細胞に対してハイブリドーマの培養上清を接触させた際の、細胞内Ｃａ²⁺濃度の上昇の有無をもって調べることができる。

ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法により行うことができる。

以上のようにして、所望の性質を有する抗ｈＡＧＴＲ１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜ならびにクローニングすることができる。

そして、選抜ならびにクローニングされたハイブリドーマを培養することにより、前記の性質を有する抗ｈＡＧＴＲ１モノクローナル抗体を製造することができる。ハイブリドーマの培養は、動物の腹腔内で行ってもよく、ディッシュ等を用いてインビトロで行ってもよい。動物の腹腔内でハイブリドーマを培養する場合には、腹水を採取し、その腹水からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。インビトロで培養する場合には、その培養液からモノクローナル抗体を単離・精製することができる。

モノクローナル抗体の精製については、各種クロマトグラフィー、塩析、透析、膜分離等の公知の手法を組み合わせて行うことができる。モノクローナル抗体のサブクラスがＩｇＧである場合には、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって簡便に精製することもできる。

本発明のモノクローナル抗体は、種々の用途に使用できる。例えば、ｈＡＧＴＲ１に対するアゴニストとして、医薬品開発に応用することができる。すなわち、ｈＡＧＴＲ１が有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達活性を用いることにより、低血圧症治療に応用することができる。また、本発明のモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を特定し、キメラ化あるいはヒト化すれば、より安全性が高い医薬品とすることができる。また本発明のモノクローナル抗体は、低分子医薬のスクリーニング用試薬、心筋症・高血圧症検査試薬、組織切片・細胞等を用いたＡＧＴＲ１局在検証用研究試薬、組換えＡＧＴＲ１発現細胞調製用検査試薬、ＡＧＴＲ１の結晶構造解析用研究試薬、等の用途にも使用できる。

以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

（１）ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩ遺伝子の単離
ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩ（ｈＡＧＴＲ１）の遺伝子を、NCBIのACCESSION番号NM_000685の情報に基づいて、人工遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）にて取得した。人工合成したｈＡＧＴＲ１遺伝子を鋳型とし、配列番号４及び５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号１に示す塩基配列を有するｈＡＧＴＲ１遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ａ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ａには、プライマーに由来して、５’末端にＮｈｅＩサイト、３’末端にＳａｌＩサイトが導入された。また、同様にして配列番号４及び６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号１に示す塩基配列を有するｈＡＧＴＲ１遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ｂ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ｂには、プライマーに由来して、５’末端にＮｈｅＩサイト、３’末端に停止コドンをコードする配列及びＳａｌＩサイトが導入された。

（２）ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子の単離
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（ノバジェン社）からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。次に、精製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、配列番号３に示す塩基配列を有するＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、「ＤＮＡ断片Ｃ」と称する。）を増幅した。ＤＮＡ断片Ｃには、プライマーに由来して、５’末端にＳａｌＩサイト、３’末端に２個の停止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）をコードする配列及びＮｏｔＩサイトが導入された。

（３）ｈＡＧＴＲ１とＧｒｏＥＬサブユニットとの融合タンパク質を発現する遺伝子免疫用ベクターの構築
哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vector（プロメガ社）を制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）にて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ａを挿入した。さらに、この発現ベクターをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（２）で調製したＤＮＡ断片Ｃを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｈＡＧＴＲ１・ＧｒｏＥＬを構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｈＡＧＴＲ１・ＧｒｏＥＬは、ｈＡＧＴＲ１をコードする遺伝子とＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子との融合遺伝子を有している。一方、同様にして、哺乳動物発現ベクターpCI Mammalian Expression Vectorを制限酵素ＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、ＢＡＰにて末端を脱リン酸化処理した後、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ｂを挿入し、ベクターｐＣＩ−ｈＡＧＴＲ１を構築した。すなわち、ベクターｐＣＩ−ｈＡＧＴＲ１はｈＡＧＴＲ１遺伝子のみを有している。

（４）ｈＡＧＴＲ１安定発現細胞の作製
（３）で構築したｐＣＩ−ｈＡＧＴＲ１・ＧｒｏＥＬを鋳型とし、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｈＡＧＴＲ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＮｈｅＩ−ＮｏｔＩサイトに導入し、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＡＧＴＲ１を構築した。

Lipofectamin溶液３７．５μＬと、ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地６２５μＬと、２０μｇのｐＣＩｎｅｏ−ｈＡＧＴＲ１を含むＯＰＴＩ―ＭＥＭＩ培地６２５μＬとを混和した。この混和液を用いて、ｐＣＩｎｅｏ−ｈＡＧＴＲ１を２×１０⁵個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本住友製薬社）に導入した。対照として、ｐＣＩｎｅｏ１のみをＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。遺伝子が導入された各ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｈａｍ’ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地（ＩＣＮ社）にて３０時間培養した。さらに、各細胞を剥離、懸濁し、１００ｍｍディッシュに５×１０⁵個を播き、抗生物質Ｇ４１８（プロメガ社）を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＨａｍ’ｓＦ１２Ｋ＋１０％ＦＢＳ培地で２週間薬剤処理を行なった。薬剤処理後、限界希釈法により、抗生物質耐性細胞をクローニングした。クローニングした各ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、さらに、２×１０⁴個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養終了後、１０^-6〜１０^-12Ｍの濃度範囲内のアンジオテンシンＩＩ（ペプチド研究所）によって各細胞を刺激したところ、細胞内のＣａ²⁺濃度が一過的に上昇した。Ｃａ²⁺濃度は、Ｃａ²⁺シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ²⁺染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて測定した。このことから、活性型ｈＡＧＴＲ１が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞膜上に正常に安定発現していることを確認した。

（５）遺伝子免疫
生理食塩水にベクターｐＣＩ−ｈＡＧＴＲ１・ＧｒｏＥＬを２５０μｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、８週齢のラットＬＥＷ（雌）の両足大腿筋に各０．６ｍＬずつ注射を行い、免疫した（０日目）。これにより、ｐＣＩ−ｈＡＧＴＲ１・ＧｒｏＥＬを両足に各７５μｇずつ、すなわち、１匹につき１回あたり１５０μｇ投与した。その後、７日目、２１日目、及び２８日目にも同様に繰り返し免疫した。そして、０、７、１４、２１、２８、３５、４２日目に採血を行い、血清を調製した。

（６）フローサイトメトリー法を用いたｈＡＧＴＲ１発現細胞に対する血清の結合評価
ｐＣＩｎｅｏ−ｈＡＧＴＲ１が導入され安定発現を確認したＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、「ｈＡＧＴＲ１遺伝子導入細胞」と称する。）、ｐＣＩｎｅｏが導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞（対照の細胞）をＰＢＳで洗浄した。免疫後３５日目の血清を５００倍希釈し、各細胞と一緒にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、各細胞と血清中の抗ｈＡＧＴＲ１抗体との相互作用を解析した。

その結果、免疫したラット群において、遺伝子免疫前の血清ではフィコエリスリン蛍光の平均値が２．４であり、遺伝子免疫後の血清では平均値が４５．１と検出された個体の存在を確認した。これは、免疫後の血清中の抗ｈＡＧＴＲ１抗体がｈＡＧＴＲ１遺伝子導入細胞に結合することを示していた。

（７）抗ｈＡＧＴＲ１モノクローナル抗体の作製
上記（６）の段階で血清の力価向上が確認されたラット１匹に対して追加免疫を行った。追加免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ＰＥＧ法により、１×１０⁸個の脾細胞と、１×１０⁷個のＢＡＬＢ／Ｃマウス由来のＨＡＴ選択性のミエローマＳＰ２／０細胞とを融合した（細胞融合）。融合した細胞（ハイブリドーマ）の集団をＲＰＭＩ培地に懸濁し、９６穴マイクロプレート１４枚の各穴に播種した。この段階で、１０８２種のハイブリドーマが得られた。

細胞融合の翌日から２週間、３日に１度の頻度で、上記マイクロプレート内の培地をＨＡＴ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）（Ｓｉｇｍａ社、品番：Ｈ０２６２）を添加したＲＰＭＩ培地に置き換えた。

上記（６）と同様のフローサイトメトリーによって抗体結合評価を行い、ｈＡＧＴＲ１遺伝子導入細胞と各穴のハイブリドーマ培養上清中の抗体との結合性を調べた。その結果、２穴において抗体との結合性が確認された。

抗体との結合性が確認された２種のハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングを行った。すなわち、２種のハイブリドーマについて９６穴マイクロプレートに細胞が１個以下／穴になるように播種し、培養した。２週間後、同様にフローサイトメトリーを用いた抗体の結合評価を行い、クローニングされた培養上清中の抗体（抗ｈＡＧＴＲ１モノクローナル抗体）の結合性を確認した。その結果、抗ｈＡＧＴＲ１モノクローナル抗体を産生する２種のハイブリドーマがクローニングされた。

各ハイブリドーマについてＲＰＭＩ培地１００ｍＬ内でフラスコ培養を２週間行った。各培養上清を、プロテインＧカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に供して精製・濃縮し、精製された２種の抗ｈＡＧＴＲ１モノクローナル抗体を各々約２ｍｇ得た。

各々の抗ｈＡＧＴＲ１モノクローナル抗体について、以下に示す試験を行った。それらの結果から、得られた２種の抗ＡＧＴＲ１モノクローナル抗体は、いずれもアゴニスト活性を有することがわかった。これら２種の抗ＡＧＴＲ１モノクローナル抗体を、それぞれクローン番号ＡＧＴＲ１−ｒ０１及びＡＧＴＲ１−ｒ０３とした（以下、クローン番号ＡＧＴＲ１−ｒ０１とＡＧＴＲ１−ｒ０３の抗ｈＡＧＴＲ１モノクローナル抗体を、それぞれ「ＡＧＴＲ１−ｒ０１」、「ＡＧＴＲ１−ｒ０３」と略記することがある。）。ＡＧＴＲ１−ｒ０１とＡＧＴＲ１−ｒ０３についての試験手順とその結果を順次示す。

（８）フローサイトメトリーによるｈＡＧＴＲ１に対する結合性評価
ＡＧＴＲ１−ｒ０１とＡＧＴＲ１−ｒ０３のＰＢＳ溶液（濃度１０μｇ／ｍＬ；以下、「ＡＧＴＲ１−ｒ０１溶液」、「ＡＧＴＲ１−ｒ０３溶液」と称する。）を調製した。一方、ｈＡＧＴＲ１遺伝子導入細胞、および対照の細胞をそれぞれＰＢＳで洗浄した後、ＡＧＴＲ１−ｒ０１溶液、ＡＧＴＲ１−ｒ０３溶液を各細胞と共にインキュベートした。さらに、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社）を添加した後、フローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社）を用いて、各細胞とＡＧＴＲ１−ｒ０１または、ＡＧＴＲ１−ｒ０３との相互作用を解析した。結果を図１〜４に示す。図１はｈＡＧＴＲ１遺伝子導入細胞とＡＧＴＲ１−ｒ０１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図２はｈＡＧＴＲ１遺伝子導入細胞とＡＧＴＲ１−ｒ０３との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図３は、対照の細胞とＡＧＴＲ１−ｒ０１との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図４は、対照の細胞とＡＧＴＲ１−ｒ０３との相互作用の解析結果を表すヒストグラムである。図１〜４において、縦軸は細胞数、横軸はフィコエリスリン（ＰＥ）由来の蛍光強度を表す。また、２つのエリア（Ｒ１、Ｒ２）のうち、Ｒ２（右領域）に属する細胞がＡＧＴＲ１−ｒ０１または、ＡＧＴＲ１−ｒ０３と結合した細胞を表す。

その結果、ｈＡＧＴＲ１遺伝子導入細胞を用いた場合は、Ｒ２のエリアに多くの細胞が検出された（図１、図２）。これは、ＡＧＴＲ１−ｒ０１およびＡＧＴＲ１−ｒ０３がｈＡＧＴＲ１遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、対照の細胞を用いた場合（図３、図４）は、図１，図２におけるＲ２に相当するエリアにはほとんど細胞が検出されなかった。これは、ｈＡＴＡＧＴＲ１−ｒ０１およびＡＧＴＲ１−ｒ０３が、ｈＡＧＴＲ１発現細胞の対照の細胞には結合しないことを示していた。以上のことから、ＡＧＴＲ１−ｒ０１およびＡＧＴＲ１−ｒ０３が細胞上に発現するｈＡＧＴＲ１、すなわち、天然状態のｈＡＧＴＲ１の細胞外ドメインを特異的に認識するものであることが示された。

（１１）細胞内Ｃａ²⁺シグナル伝達活性（アゴニスト活性）評価
ｈＡＧＴＲ１遺伝子導入細胞を、２×１０⁴個／１００μＬの初期細胞濃度にて、９６穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜培養した。培養した各穴に２．５×１０^-7ＭのＡＧＴＲ１−ｒ０１を添加した。また同様にして、５×１０^-7ＭのＡＧＴＲ１−ｒ０３を添加した。さらに対照として、非免疫のラット血清からプロテインＧカラムで精製したラットＩｇＧ（陰性対照）を５×１０^-7Ｍの濃度で添加した。添加した後、各細胞が抗体によって刺激された際の細胞内Ｃａ²⁺濃度の一過的上昇度を測定した。測定はＮ＝３で実施した。Ｃａ²⁺濃度変化測定は、Ｃａ²⁺シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて行った。結果を図５に示す。図５は、各モノクローナル抗体におけるＣａ²⁺シグナル強度を示すグラフである。図５に示す様に、ＡＧＴＲ１−ｒ０１とＡＧＴＲ１−ｒ０３のいずれにおいてもカルシウムシグナルの上昇が見られた。
以上より、ＡＧＴＲ１−ｒ０１とＡＧＴＲ１−ｒ０３は、いずれも、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達（アゴニスト活性）を行えるものであることが示された。

（１２）アイソタイプ解析
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ＡＧＴＲ１−ｒ０１およびＡＧＴＲ１−ｒ０３のアイソタイプを決定した。その結果、ＡＧＴＲ１−ｒ０１およびＡＧＴＲ１−ｒ０３ともサブクラスはＩｇＧ２a、軽鎖はκ鎖であった。

なお、ＡＧＴＲ１−ｒ０１、ＡＧＴＲ１−ｒ０３と同様の性質を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、上記（５）〜（７）の操作を行うことにより、再現性をもって取得することができる。

Claims (4)

1. ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩに対するモノクローナル抗体であって、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩの細胞外ドメインに反応し、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩの細胞内ドメインには反応しないモノクローナル抗体。
2. ラット由来のものである請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 以下の性質を有する請求項２に記載のモノクローナル抗体。
   （ａ）サブクラス：ＩｇＧ２a
   （ｂ）軽鎖：κ鎖
4. ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩが有するナチュラルリガンド特異的なシグナル伝達を行うことが可能な請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。

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