JP2010045996A - がん腫の遺伝子診断のための細胞回収及び単離方法並びにキット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】物質の収集方法であって、第1の支持体の表面に第1の物質が固定された第1の担体と、収集対象物質である第2の物質とを結合させて結合体を生成する第1のステップと、前記第1の支持体に基づいて前記結合体を収集する第2のステップと、前記第1のステップより後に、前記第1の物質と特異的に結合する領域を少なくとも一部に含むプローブを表面に保持する第2の担体を供給し、前記第1の担体と第2の担体の複合体を形成させ、前記結合体を前記第1の担体と前記第2の物質とに解離させる第3のステップと、前記複合体を除去し、前記第2の物質を得る第4のステップを有する前記方法、ならびに該方法を実施するためのキット。
【選択図】図4
Description
(1)物質の収集方法であって、
第1の支持体の表面に第1の物質が固定された第1の担体と、収集対象物質である第2の物質とを結合させて結合体を生成する第1のステップと、
前記第1の支持体に基づいて前記結合体を収集する第2のステップと、
前記第1のステップより後に、前記第1の物質と特異的に結合する領域を少なくとも一部に含むプローブを表面に保持する第2の担体を供給し、前記第1の担体と第2の担体の複合体を形成させ、前記結合体から前記第2の物質を解離させる第3のステップと
前記複合体を除去し、前記第2の物質を得る第4のステップ
を有する前記方法。
(2)前記第1の物質が抗体であることを特徴とする(1)に記載の収集方法。
(3)前記第2の物質は前記抗体が認識する抗原を含む収集対象物質であることを特徴とする請求項(2)に記載の収集方法。
(4)前記第2の物質が細胞であることを特徴とする(3)に記載の収集方法。
(5)前記プローブが前記抗体と特異的に結合する領域を少なくとも一部に含むペプチドであることを特徴とする(2)に記載の収集方法。
(6)前記ペプチドが配列番号1のアミノ酸配列を含むことを特徴とする(5)に記載の収集方法。
(7)物質を収集するためのキットであって、
収集対象物質に特異的に結合する第1の物質と、
前記第1の物質を表面に固定する第1の支持体と、
前記第1の物質と特異的に結合する領域を少なくとも一部に含むペプチドと、
前記ペプチドを表面に保持する第2の支持体
を有する前記キット。
(8)前記第1の物質が抗体であることを特徴とする(7)に記載のキット。
(9)前記第2の支持体がビーズであることを特徴とする(7)に記載のキット。
(10)前記ペプチドが前記抗体のエピトープ配列を含むことを特徴とする(8)に記載のキット。
(11)前記抗体が抗EpCAM抗体であり、前記ペプチドが前記抗EpCAM抗体のエピトープ配列を含むことを特徴とする(10)に記載のキット。
(12)前記エピトープ配列が配列番号1のアミノ酸配列であることを特徴とする(11)に記載のキット。
(13)前記収集対象物質が細胞であることを特徴とする(7)に記載のキット。
(14)前記細胞がヒト上皮細胞であることを特徴とする(13)に記載のキット。
図1は本発明が処理対象とする第2の物質1、つまり収集対象物質である。収集対象物質としては、例えば、細胞、抗体、抗原、蛋白質、ペプチド、糖、核酸(DNAおよびRNAを含む)などの生体分子があげられる。本発明においては、好ましくは細胞を収集対象物質、すなわち標的とする。細胞としては、哺乳動物(例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど)のあらゆる細胞(例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞など)や血球系の細胞(例、白血球、赤血球)があげられる。本発明は、がん細胞の収集において有利であり、例えば、上記細胞のがん細胞、ならびに脳、胃、膵臓、腎臓、肝臓、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、小腸)、前立腺、精巣、卵巣などの組織におけるがんに由来するがん細胞の収集に好適である。これら組織由来の細胞を、一度培養することによって得られる細胞集団でもよい。より具体的には、細胞表面にEpCAM分子を発現している細胞、例えば、HT29細胞があげられる。EpCAM分子のアミノ酸配列は公知であり、公開されたデータベース(GenBank)において、NP_002345(配列番号2)として登録されている。
〔実施例1〕
抗体2の作製
ハイブリドーマの作製は常法に従って行った。遺伝子組み換えによって作製したEpCAM分子をアジュバンド(TiterMax)と混合後、フットパッド法によりBalb/Cマウスに免疫した。免疫を3回繰り返した後、リンパ節を取り出し、リンパ球とミエローマ細胞(P3U1)を融合させ、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマのスクリーニングは、HT29細胞表面への結合量を指標に行った。1×106個のHT29細胞に対し100μLのハイブリドーマ培養上清を添加し、4 ℃、30分間静置した。PBSで洗浄後、ヤギ由来の抗マウスIg抗体-PE標識を2 μg添加し再び4 ℃、30分間静置した。再びPBSで洗浄後、500 μLのPBSで懸濁し、フローサイトメーターを用いて蛍光強度の測定を行った。スクリーニングで陽性を示したハイブリドーマは限界希釈法によりクローニングを2回行った。クローニング後、再びフローサイトメーターでスクリーニングを行い、陽性のクローンを選抜した。このようにして得られたハイブリドーマ並びにそれが産生する抗体のクローン名をhrk29とした。ハイブリドーマhrk29 (Hybridoma hrk29)は、受託番号FERM P-21604として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に寄託されている。モノクローナル抗体hrk29のイムノグロブリンのサブクラスを知るため、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit (Serotec社)を使用しサブクラスを決定した。その結果、モノクローナル抗体hrk29のアイソタイプはIgG1と判明した。
モノクローナル抗体hrk29の認識するエピトープ配列を解析するために、断片化したEpCAM分子(EpCAMのアミノ酸残基24〜62、63〜139、24〜139/EC1、EC2、EC3、図6)を大腸菌で発現させ、モノクローナル抗体hrk29が認識するドメインをウェスタンブロットにより検討した。図9に示すようにEC1(分子量およそ35kDa)とEC3(同43kDa)に対し反応性が認められた。即ち、この抗体は、EpCAMの24〜62番のアミノ酸を含む領域を認識することが確認された。
第1の担体4を以下に示すように作製した。第1の支持体3として、Dynabeads(登録商標)M-450 Sheep anti-mouse IgG、抗体2として前記で作製した抗EpCAM抗体:hrk29を用いた。第1の支持体3を一度PBSで洗浄した後、100μLのPBSで懸濁し、1×106個の第1の支持体3に対して0.03μgの抗体2を添加して室温で30分間撹拌した。その後PBSを用いて2回洗浄を行った後、PBS100μLで懸濁し、第1の担体4を得た。
ペプチド5を表面に有する第2の担体7の作製法を以下に示す。第2の支持体6としてDynabeads(登録商標)MyOne Streptavidin T1を、ペプチド5として本実施例で作製した抗体2(hrk29)が認識するエピトープ配列ICSKLAを含むビオチン化ペプチド(アミノ酸配列ICSKLAANKMKAE;配列番号8)を用いた。第2の支持体6を一度PBSで洗浄した後、100μLのPBSで懸濁し、7×108個のビーズに対して400pmolのペプチド5を添加して室温で30分間撹拌し、エピトープ配列を含むペプチド5を表面に保持する第2の担体7を得た。
抗EpCAM抗体を表面に結合させた磁気ビーズによる細胞回収及び解離方法を以下に示す。標的細胞1であるHT29細胞1×106個を500μLのPBSに分散した。ステップ1としてこの出発材料に第1の担体4を添加し、室温で30分撹拌した。ステップ2として、磁気分離後、0.5% BSA、2mM EDTAを含むPBSで二回洗浄後、精製複合体10を得た。ステップ3として第2の担体7を添加し、室温で30分撹拌した。その後、ステップ4として磁気分離を行い、標的細胞1を回収するとともに、複合体11並びに未反応の精製結合体10を除去した。回収した標的細胞1の数と、精製結合体10に含まれる標的細胞1の数から、抗体2から解離した標的細胞1の割合を算出した。
実施例1と同様の方法であるが、第2の担体7に使用する第2の支持体6として、Qdot(登録商標)565ITKTM Streptavidin Conjugateを使用した。
2…第1の物質(抗体)
3…第1の支持体
4…第1の担体
5…プローブ(ペプチド)
6…第2の支持体
7…第2の担体
8…結合体
9…磁石
10…精製結合体
11…複合体
12…グルタチオンS-トランスフェラーゼ
13…6×Hisタグ
14…EC1〜3
Claims (14)
- 物質の収集方法であって、
第1の支持体の表面に第1の物質が固定された第1の担体と、収集対象物質である第2の物質とを結合させて結合体を生成する第1のステップと、
前記第1の支持体に基づいて前記結合体を収集する第2のステップと、
前記第1のステップより後に、前記第1の物質と特異的に結合する領域を少なくとも一部に含むプローブを表面に保持する第2の担体を供給し、前記第1の担体と第2の担体の複合体を形成させ、前記結合体から前記第2の物質を解離させる第3のステップと
前記複合体を除去し、前記第2の物質を得る第4のステップ
を有する前記方法。 - 前記第1の物質が抗体であることを特徴とする請求項1に記載の収集方法。
- 前記第2の物質は前記抗体が認識する抗原を含む収集対象物質であることを特徴とする請求項2に記載の収集方法。
- 前記第2の物質が細胞であることを特徴とする請求項3に記載の収集方法。
- 前記プローブが前記抗体と特異的に結合する領域を少なくとも一部に含むペプチドであることを特徴とする請求項2に記載の収集方法。
- 前記ペプチドが配列番号1のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項5に記載の収集方法。
- 物質を収集するためのキットであって、
収集対象物質に特異的に結合する第1の物質と、
前記第1の物質を表面に固定する第1の支持体と、
前記第1の物質と特異的に結合する領域を少なくとも一部に含むペプチドと、
前記ペプチドを表面に保持する第2の支持体
を有する前記キット。 - 前記第1の物質が抗体であることを特徴とする請求項7に記載のキット。
- 前記第2の支持体がビーズであることを特徴とする請求項7に記載のキット。
- 前記ペプチドが前記抗体のエピトープ配列を含むことを特徴とする請求項8に記載のキット。
- 前記抗体が抗EpCAM抗体であり、前記ペプチドが前記抗EpCAM抗体のエピトープ配列を含むことを特徴とする請求項10に記載のキット。
- 前記エピトープ配列が配列番号1のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項11に記載のキット。
- 前記収集対象物質が細胞であることを特徴とする請求項7に記載のキット。
- 前記細胞がヒト上皮細胞であることを特徴とする請求項13に記載のキット。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09508534A (ja) * | 1994-06-14 | 1997-09-02 | バクスター インターナショナル インコーポレイテッド | ペプチド放出により媒介されるポジティブ細胞選択およびポジティブ/ネガティブ細胞選択 |
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- 2008-08-20 JP JP2008211934A patent/JP5638747B2/ja not_active Expired - Fee Related
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