JPH09508534A

JPH09508534A - ペプチド放出により媒介されるポジティブ細胞選択およびポジティブ／ネガティブ細胞選択

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Publication number: JPH09508534A
Application number: JP8502411A
Authority: JP
Inventors: ジャネットテセング−ロウ，; ジョアンエイ．コボリ，; ファハドエイ．アル−アブデリー，; ロイギラーモ，; サムエル．ヘルガーソン，; ロバートジェイ．ディーンズ，
Original assignee: バクスターインターナショナルインコーポレイテッド
Priority date: 1994-06-14
Filing date: 1995-06-13
Publication date: 1997-09-02
Anticipated expiration: 2014-01-20
Also published as: US6017719A; CA2192455A1; DE69503903T2; ES2121400T3; WO1995034817A1; CA2192455C; AU697627B2; DE69503903D1; EP0765478A1; JP2849630B2; DK0765478T3; ATE169409T1; US5968753A; EP0765478B1; AU2826195A

Abstract

(57)【要約】本発明は、不均質な細胞懸濁物から抗体を介したビーズまたは他の固体支持体への結合によりポジティブに選択された細胞を放出するための、非酵素的な方法を提供する。この方法は、細胞懸濁物内での、１次モノクローナル抗体に結合した固体支持体を含有する複合体の形成を伴い、これは、次に標的細胞の細胞表面抗原に結合される。この複合体を細胞懸濁物から分離し、次いで１次抗体に結合する特異的ペプチドと接触させ、抗体を細胞表面抗原と置換し、その結果、標的細胞を複合体から放出させる。本発明はまた、ポジティブ／ネガティブ細胞選択のための方法を提供する。ここで、第１の抗原を有する標的細胞は、第２の抗原を有する所望されない細胞を含有する不均質な細胞懸濁物から選択される。本発明はまた、特異的モノクローナル抗体の結合から標的細胞を放出させるために有用な特異的ペプチドを同定するための方法を提供する。本発明の方法は、CD34+造血幹細胞のポジティブ選択およびそれに付随するポジティブに選択される細胞集団からの所望されない腫瘍細胞またはリンパ球の浄化のために特に有用である。そして、精製されたCD34+細胞組成物は、患者の免疫系を再構成させるための、高容量の治療後のガン患者への再注入のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ペプチド放出により媒介されるポジティブ細胞選択およびポジティブ／ネガティブ細胞選択発明の技術分野本発明は、抗体との結合からの細胞の放出を媒介するために使用されるペプチド、このようなペプチドを単離する方法、および不均質な細胞懸濁物から抗体選択により捕獲された標的細胞を特異的に放出させる方法に関する。一般的な分野は、細胞選択としても知られる。背景不均質な細胞組成物（例えば、血液または骨髄）から１またはそれ以上の特異的細胞表現型を選択することは、細胞療法および遺伝子治療に特定の有用性を有する。例えば、CD34抗原を発現する細胞の選択は、いくつかの治療法（例えば、ガンの付属的処置の一部）において有用性を有することが実証されている（Civi n，米国特許第5,035,994号；第4,965,204号；第5,081,030号；第5,130,144号）。遺伝的操作のための特異的標的細胞の選択はまた、特に興味深い。多数の細胞選択技術が存在する。例えば、静止期のCD34+細胞は、分裂細胞を選択的に殺す5-フルオロウラシルのような化学薬品で造血細胞培養物を処理することにより選択され得る(Berardi,A.C.ら，Science 267: 104-108，1995)。１つの特に有用なアプローチは、抗体の選択的結合を利用する。抗体は、もともと特定の細胞のみで発現される特異抗原に結合する。抗体と特異的細胞抗原とをマッチさせることにより、このような細胞は不均質な細胞集団中で物理的に除去または同定され得る。抗体選択の議論については、Areman,Eら編，Bone Marrow and Stem Cell Processing ，F.A.Davis Company，Philadelphia，1992、およびGee,A .P.ら編，Advances in Bone Marrow Purging and Processing，Wiley-Liss，New York,1993を参照のこと。細胞選択技術は、一般に大きく２つ（ネガティブ細胞選択およびポジティブ細胞選択）に分類される。用語が示するように、ネガティブ選択は集団からの選択細胞表現型の除去を包含し、一方ポジティブ選択は、より大きな不均質な細胞集団からの特異的細胞表現型の選択または単離を包含する。ネガティブ細胞選択技術は、患者またはドナーの血液または骨髄からの潜在的に有害な細胞の除去において使用が見出された。例えば、転移性のガンの処置は、剥離治療(ablative therapy)後に造血細胞を補充するために患者の骨髄細胞を置換することを意図しての、剥離化学療法前または放射線治療前の患者の骨髄サンプルの取り出しを包含し得る。患者への転移性腫瘍細胞の逆行の危険性を最小限にするために、ネガティブ細胞選択または浄化が、再灌注前の患者の骨髄細胞サンプルに適用される。このネガティブ細胞選択を行う方法の１つは、腫瘍細胞を結合させて血液から除去するために、固相（例えば、磁性ビーズ）に結合させた抗腫瘍抗体の使用を包含する(Hardwick,Aら，J Hematotherapy 1:379-386．19 92)。特定の細胞の溶解または酵素的排除を使用する細胞のネガティブ選択もまた行われている(Aremanら、前出)。上述の通り、ポジティブ選択は、不均質な細胞集団からの特異的細胞表現型の標的化および分別を包含する。例えば、CD34抗原を発現する細胞が、骨髄移植における使用のために選択されている(Geeら、前出)。毒性の薬剤（例えば、溶解剤）を用いる選択技術が特定の細胞型を排除するために用いられているが、このようなアプローチの選択性は、特定の細胞の除去または排除に限定され、特異的細胞型の積極的な選択ではない。特異的細胞を結合させるための抗体の使用は、ポジティブ選択技術において幅広く利点が見出されている(Geeら、前出)。１つのアプローチは、蛍光色素を抗体へ標識化または結合する工程、および選別機を通して細胞に結合した抗体を通過させる工程を包含する。抗体が結合している細胞は、蛍光活性化細胞選別(FAC S)により同定され、そして分離される。別の技術は、抗体の固相支持体または粒子への結合を包含する。抗体を有する支持体に細胞混合物を通過させることにより、抗体を細胞に結合させて、そして所望の細胞を保持させることができ、従って、組成物から所望の細胞を除去することができる。細胞組成物と抗体を有する粒子（すなわち、常磁性粒子）をインキュベートすることにより、残りの集団からの粒子に結合する細胞の分離（すなわち、磁性分離を通す）を可能にする(Gee ら、前出、293〜302頁)。捕獲細胞は、選択工程後に任意の固体支持体から放出されなければならないが、これは捕獲細胞の生存力を維持し得るような方法でなければならない。さらに、何人かの研究者は、抗体または抗体フラグメントと細胞の持続的な結合が細胞の有用性をもたらすと主張している(Berardiら、前出)。抗体に基づく機構を用いる任意のポジティブ細胞選択技術について特に関心がもたれるのは、抗体および固相分離物質からの放出をもたらす間の所望の細胞の生存力の維持である。周囲のpHおよび温度の変化を介しての細胞の放出は、pHを約7.0〜7.4に維持しなければならず、そして温度を37℃以上に上昇させ得ないために難しい。特定の細胞タイプは、低レベルの還元剤（例えば、ジチオトレイトール）および／またはキレート剤（例えば、EDTA）に耐え得る。一方、他の標的細胞は、非常に穏やかな還元条件下またはキレート条件下でさえ生存力を残し得ない。ビオチンに対するアビジンの強い親和性は、抗体を有する固体支持体への細胞の結合をもたらすために用いられている。アビジン／ビオチンに基づく技術では、代表的には細胞に特異的な抗体はいくつかの標準的な方法の１つに従ってビオチン化される(Avidin-Biotin Chemistry : A Handbook ，Savade,MDら編，Pierce Chemical Co，1992)。ネガティブ選択のためには、標的細胞はビオチン化抗体に結合し、これは次にアビジンでコートされた固相（通常、カラムの形態）に結合する。次いで、非結合の細胞が回収され、そしてアビジンに結合したネガティブに選択された細胞が捨てられる。しかし、ポジティブ細胞選択のためには、ビオチンに対するアビジンの非常に強い親和性は不利である。なぜなら、標的細胞は、細胞／抗体−ビオチン／アビジン複合体内に強固に保持されているからである。アビジン／ビオチン相互作用は大変強いので、他の結合の破壊が、所望の標的抗原の放出のために提案された。特定のビオチン化剤はそれらのスペーサーアーム内に化学的に開裂可能な共有結合を有するか、または標的タンパク質と開裂可能な共有結合を形成する(Sigle r,G.F.米国特許第4,798,795号および第4.709,037号；Wilchek,M.ら、独国出願第 DE 3629194 A; Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook,前出，41頁)。結合はジチオトレイトール、メルカプトエタノール、またはホウ化水素ナトリウムを用いる還元条件下で開裂されるが、これらの条件は、機能的なままであるべき細胞の選択のためには一般に細胞への損傷が大きすぎると考えられる。他の技術は、細胞にビオチン化抗体を結合したままにした、アビジン支持体からのビオチンの競合的置換を包含する。あるいは、ビオチンアナログは、目的の細胞に結合する１次抗体に共有結合する。細胞／抗体／ビオチンアナログ複合体は、不均質な細胞混合物から分離するために、固体支持体に結合した抗ビオチン２次抗体により結合する。次いで、細胞／抗体／ビオチンアナログ複合体は、ビオチンと競合することにより２次抗体から放出される。この方法は、必然的に抗体を細胞に結合させたままにする(Al-Abdaly,Fら、第PCT/US95/03711号)。ポジティブ細胞選択のためのいくつかの技術は、選択された細胞の放出のための抗体／エピトープ相互作用の破壊のために機械的手段に依存している。組織培養フラスコは、標的細胞に結合する１次抗体でコートされ得；非結合細胞を洗浄後、標的細胞がフラスコの側面を叩くことにより放出される(Lebkowski,JSら，T ransplantation 53: 1101-1019，1992)。ポジティブ細胞選択の別の方法は、「サンドイッチ」技術を用いる。この技術は、１次抗体に結合するビオチン化２次抗体に結合しているアビジンを含み、この１次抗体は次に標的細胞に結合して複合体を形成する。不均質な細胞懸濁物からのこの複合体の分離後、撹拌して１次抗体と２次抗体との間の相互作用を破壊することにより標的細胞をアビジンから取り出す(Berenson,R.J.ら、米国特許第5,215,927号および第5,225,353号)。機械的放出は、細胞が放出プロセスの間に損傷を被るという明らかな理由で不利てあり、そして機械的放出後に回収した生存細胞数は少ないと報告されている(Ege land,T.ら，Scand J Immunol 27: 439-444,1988)。抗体フラグメントが細胞に接着する可能性もまたある。細胞を放出する別の方法は、酵素（例えば、パパインおよびキモパパイン）によるタンパク質分解を包含する。標的細胞は、１次抗体を介して磁性ビーズに結合し得、次いでこの１次抗体は磁性ビーズに結合する。細胞／抗体／ビーズ複合体を不均質な細胞懸濁物から取り出した後、細胞は細胞表面抗原または抗体、あるいはその両方のタンパク質分解によりビーズから放出される(Hardwick,A.ら，J Hematotherapy 1: 379-386．1992; Civin,CEら,Bone Marrow purging and Pro cessing Progress in Clinical And Biological Research ,333巻，S.Grossら編，Alan R.Liss,Inc,New York,387-402頁；Civin,CI，欧州特許第0 395 355 A1号；Hardwick,A.ら，Advances in Bone Marrow Purging and Processing- Progres s in Clinical and Biological Research ，377巻，Worthington-White，DA編，W iley-Liss,Inc.,New York,583-589)。パパインまたはキモトリプシンによるタンパク質分解は、機械的破壊よりも有利である。なぜなら、これらの酵素は一般に細胞に有害ではないからである。しかし酵素は、増殖、分化、および例えば、造血幹細胞の帰還のために重要であり得る細胞表面タンパク質を消化する。さらに、細胞表面タンパク質の消化は、次のネガティブ細胞選択を困難にまたは不可能にする。別の技術は、追加の抗体または抗体フラグメントを使用しての細胞抗原からの抗体の競合的置換を含む。しかし、このアプローチは固体支持体からの細胞の放出をもたらすが、少なくとも抗体の一部は得られる細胞に結合したままであり、これは有害であり得る(Berardiら、前出)。機能的な標的細胞を高収率で生成し、そして生理学的に適合性の溶液中の比較的安価で温和な試薬に依存するポジティブ細胞選択方法の必要が依然として存在する。さらに、細胞表面タンパク質を無傷のままにするポジティブ細胞選択方法の必要が依然として存在する。ポジティブに選択された細胞を細胞表面に抗体または他のリガンドの結合していないままにする方法がまた有利である。発明の要旨本発明は、不均質な細胞懸濁物からの標的細胞のポジティブ選択のための非酵素的な方法を提供する。この方法は、細胞懸濁物内での、細胞分離手段（例えば、１次抗体（これは次に標的細胞の細胞表面の抗原に結合する）に結合してる常磁性ビーズ）を含む複合体の形成を内含する（図１参照のこと）。この複合体は、細胞懸濁物から分離され、次いで１次抗体に結合する特異的ペプチドに接触し、その結果、複合体から標的細胞を放出する。本発明の好ましい方法では、常磁性ビーズは、例えば２次抗体のようなタンパク質手段により１次抗体に連結する。本発明のこの実施態様は、不均質な細胞懸濁物内での、１次抗体（これは次に常磁性ビーズに結合している２次抗体と連結する）に結合している標的細胞を含む複合体の形成を内含する（図２参照のこと）。この複合体は、細胞懸濁物から分離され、次いで１次抗体に結合する特異的ペプチドに接触し、その結果、複合体から標的細胞を放出する。常磁性ビーズは、２次抗体および１次抗体に連結しているが、これは次いで、従来の磁性手段により標的細胞から分離される。本発明はまた、２重ポジティブ細胞選択のための方法を提供する。ここで、２つの所望の抗原を有する標的細胞は、不均質な細胞懸濁物から選択される（図3A および3B参照のこと）。本発明はまた、ポジティブ／ポジティブ細胞選抜のための方法を提供する。ここで、それぞれが異なる所望の抗原を有する２つの異なる標的細胞は、不均質な細胞懸濁物から選択される。本発明はまた、ポジティブ／ネガティブ細胞選抜のための方法を提供する。ここで、１次抗原を有する標的細胞は、第１の抗原ならびに第２の抗原を有する所望しない細胞も含む不均質な細胞懸濁物から選択される（図４参照のこと）。ポジティブ／ネガティブ選択方法はまた、所望の細胞を含む細胞懸濁物中に所望しない細胞が偶然捕獲されている細胞懸濁物に適用され得る（図４）。ポジティブ／ネガティブ細胞選択のための例示的な方法は、不均質な細胞懸濁物内での、第１の１次抗体（これは次に常磁性ビーズに連結している２次抗体に結合する）に結合している第１の抗原を有する標的細胞を含む複合体を形成することを内含する；複合体の常磁性ビーズはまた、所望しない細胞上の第２の抗原に結合する第２の１次抗体に連結する。この複合体は、細胞懸濁物から分離され、次いで第１の１次抗体と結合する特異的ペプチドと接触し、その結果、第１の抗原から１次抗体を置換し、標的細胞を放出する。次いで、１次抗体および２次抗体ならびに所望しない細胞に付着している常磁性ビーズの複合体は、従来の磁性手段により、放出される標的細胞から分離される。この方法は、標的細胞上の細胞表面抗原に結合しているモノクローナル抗体に結合し、細胞表面抗原から抗体を置換し、その結果、抗体から標的細胞を放出するペプチドを提供する。本発明はまた、ATCC HB 11646およびATCC HB 11885と称するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗CD34抗体、ならびに市販の抗体561(Dynal,Oslo ,Norway)に結合する標的ヒト造血幹／前駆細胞のポジティブ選択および特異的放出のための方法および特異的ペプチド組成物を提供する。本発明はまた、ATCC HB 11884と称するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗乳ガン抗体9187に結合する標的ヒト乳ガン細胞のポジティブ選択および特異的放出のための方法および特異的ペプチド組成物を提供する。本発明はまた、特異的なモノクローナル抗体の結合から標的細胞を放出するために有用な特異的ペプチドを同定するための方法を提供する。この方法は、以下の少なくとも１つの手段による候補の放出ペプチドの第１の選択工程を含む： a)ペプチドライブラリーファージディスプレーとそれに続く目的の抗体を用いたバイオパニング(biopanning)； b)抗原の潜在的な抗原性のピークの決定； c)目的の抗体の相補性決定領域(CDR)ペプチド分析； d)ピン上でのランダムペプチドライブラリーディスプレーおよび目的の抗体での結合； e)上記モノクローナル抗体の３次元構造の理論的な分子モデル化。次いで、FACS放出および常磁性ビーズに結合している細胞の放出、または生物特異的相互作用の分析(BIAcore^TM,Pharmacia)によって測定して、候補ペプチドの抗原を置換する能力について試験する。特異的モノクローナル抗体に結合している細胞を放出するために有用なペプチドを同定するための例示的な方法は、ビオチン化または非ビオチン化の形態の抗体を用いて固体支持体をコートする工程、ランダムペプチドライブラリーのペプチドの多数と抗体とを接触させる工程、抗体に特異的に結合する少なくとも１つのペプチドを選択する工程、選択されたペプチドと標的細胞に結合している抗体とを接触させる工程、および標的細胞からの抗体を脱着させて、その結果標的細胞を放出する、選択されたペプチドの能力を決定する工程を包含する。図面の簡単な説明図１は、ポジティブ細胞選択のための方法を描く。ここで、標的細胞は、１次抗体および細胞分離手段に結合し、細胞懸濁物から分離され、次いで１次抗体と結合する特異的ペプチドと接触し、その結果標的細胞を放出する。図２は、ポジティブ選択の好ましい方法を描く。ここで、１次抗体は２次抗体により細胞分離手段に連結する。図3Aおよび3Bは、２重ポジティブ細胞選択および放出のための方法を描く。ここで、２つの所望の抗原を有する標的細胞は、不均質な細胞懸濁物から分離され、次いで、２つの特異的ペプチドとインキュベーションすることにより放出される。図４は、ポジティブ／ネガティブ細胞選択のための方法を描く。ここで、所望の第１の抗原を有する標的細胞は、第２の所望しない抗原を有する所望しない細胞を含有する細胞懸濁物から選択される。この方法により、標的細胞はまた、所望の第１の抗原および第２の所望しない抗原の両方を有する所望しない細胞から分離され得る。発明の詳細な説明本発明は、不均質な細胞懸濁物からの標的細胞のポジティブ選択およびポジティブ／ネガティブ選択のための方法およびペプチド組成物を提供する。この方法は、特異的モノクローナル抗体からの特異的標的細胞の置換および放出をもたらす特異的ペプチドの同定に基づく。ペプチド媒介放出は、酵素を用いず、従って細胞表面タンパク質を無傷のままにする。さらに、ペプチド媒介放出は、標的細胞を結合している抗体または抗体フラグメントが無いままにする。本発明の一般的な方法は、不均質な細胞懸濁物内での、標的細胞、標的細胞上の細胞表面タンパク質に結合しているモノクローナル１次抗体、および１次抗体に連結し、従って標的細胞に連結する細胞分離手段を含む複合体の形成を内含する。次いで、この複合体は、細胞懸濁物から分離され、そして１次抗体と結合する特異的ペプチドと接触し、その結果、１次抗体および細胞分離手段から標的細胞を置換し、そして放出する。次いで、抗体に連結した細胞分離手段は、従来の手段により放出された標的細胞から分離される。本明細書中では、用語「接触」は、弱い分子間力が破壊され得るようにペプチドおよび抗原／抗体複合体を極めて近くにもたらすことをいう。本明細書中では、用語「結合する」または「結合」は、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス力、およびイオン的相互作用を含む比較的弱い非共有的な力の組み合わせによる抗体と抗原の結合をいう。抗体−抗原結合の親和性は、５× 10⁴〜10¹²l/mole、より通常は、10⁶〜10⁹l/moleの範囲である(Alberts,B.ら編，Molecular Biology of the Cell ，Garland Publishing，New York and London， 1983,969-970頁)。本明細書中では、用語「置換」は、本発明のペプチドが上記の弱い非共有結合力を妨害することにより、抗体をその同種の抗原から非結合にすることをいう。本明細書中では、用語「放出」は、細胞が抗体／固体支持体から非結合であり、その結果、分離システムから溶出画分と共に自由に細胞を流出させることをいう。本発明のペプチドは、「エピトープ−模倣」ペプチドとして作用し、従って、抗体の抗原結合部位に競合し得、その結果同種の抗原から抗体を置換し得る。本発明のペプチドの作用機構が未知であるという事実は、本発明の重要性および効力を減じない。本明細書中では、本発明のペプチドは、好ましくは30アミノ酸残基より少ないアミノ酸残基、より好ましくは４〜20アミノ酸残基、最も好ましくは４〜10アミノ酸残基を含有する。以下に列記し請求した特異的なペプチドに加えて、本発明はまた、保存的アミノ酸置換、非天然のアミノ酸の置換、ペプチドの環状、および同定された放出ペプチドをモデルとするペプチド模倣物により形成されたペプチドのアナログを意図する。保存的アミノ酸置換の背後の原理は、１つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換される場合、３次元構造およびペプチドに対する抗体の結合親和性において最小の変化しかないように特定のアミノ酸の対が適合性の側鎖を有することである。保存的置換の法則は、Bowie,J.U.ら，Science 247：1306-1310，1990に説明されている。非天然アミノ酸の置換：合成ペプチドのアナログは、非天然のアミノ酸または普通でないアミノ酸で個々の残基を置換することによって作製され得る。生物活性のあるペプチドの配列は、もともとは天然の20のL-アミノ酸残基からなるタンパク質に由来する。しかし、合成ペプチドを構築するために使用される化学合成のプロセスは、稀に生ずる天然アミノ酸であるD-アミノ酸、または非天然の合成アミノ酸アナログを含む代替残基の置換を可能にする(Bodansky,M，1984，Princ iples of Peptide Synthesis ，Springer-Verlag，Berlin)。これらの代替残基は、(a)化学的に反応性の残基と置き換え、そして合成ペプチドの安定性を改良するため、(b)合成ペプチドの検出に有用な分析的な標識を提供するため、そして( c)ペプチドに対する抗体の結合親和性を増大または減少させることにより合成ペプチドの生物活性を改変するために、使用され得る。ペプチドの環状：合成直鎖状ペプチドのアナログは、化学的に構造を環状形に転換することにより作製され得る。直鎖状ペプチドの環状は、標的タンパク質への結合力を増大または減少させることにより生物活性を改変し得る(Pelton,J.T. ら，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，82:236-239)。直鎖状ペプチドは、非常に曲がりやすく、そして溶液中で多くの異なる立体構造をとる傾向がある。環状は、可能な立体構造の数を制限するように作用し、従って、より活性なまたはより不活性なペプチドを与える。合成ペプチドの免疫原性は、溶液中の実験的に観察される立体構造的採択と相関している(Dyson,H.ら，1988，Annual Review of Biop hysics and Biophysical Chemistry ，17: 305-324)。免疫原性の差異は、環状ペプチドに対する特異的抗体の結合親和性の差異を示し得る。直鎖状ペプチドの環状は、遊離のＮ末端とＣ末端との間のペプチド結合の形成（ホモデチック環状ペプチド）により、あるいはアミノ酸骨格および／またはＮ末端またはＣ末端近くに位置する側鎖基との間の新しい共有結合の形成（ヘテロデチック環状ペプチド）により達成される(Bodanszky,N，1984，前出)。後者の環状では、別の化学的な戦略を使用して共有結合（例えば、ジスルフィド結合、ラクトン結合、エーテル結合、またはチオエーテル結合）を形成させる。５残基より多い直鎖状ペプチドは、比較的容易に環状し得る。中央の４残基中でβターン立体構造を形成するペプチドの性質は、ホモデチック環状ペプチドおよびヘテロデチック環状ペプチドの両方の形成を容易にする。Ｎ末端またはＣ末端でのプロリン残基またはグリシン残基の存在はまた、環状ペプチド、特に６残基長よりも短い直鎖状ペプチドからの環状ペプチドの形成を容易にする。環状した放出ペプチドの例を以下の実施例14に示す。ペプチド模倣物：ペプチド模倣物技術は、ペプチドの分子模造物の設計である。このような分子をうまく設計する能力は、直鎖状ペプチド配列の性質および抗体に対して呈示される立体構造の理解に依存する。模造物の合成は、より大きな生物学的活性、改良された溶解性、および安定性を表す合成物を提供し得る(Nak anishi,H.ら，1993,Peptidomimetics of the immunoglobulin supergene family a review．Gene 137: 51-56)。本明細書中では、用語「細胞分離手段」は、周知の手段（例えば、常磁性ビーズ、カラム、中空繊維、ガラスビーズ、多糖ビーズ、およびポリスチレン組織培養用フラスコ）をいう。本明細書中では以後、用語「常磁性ビーズ」または「ビーズ」は、細胞分離手段を例示するために使用される。しかし、本発明は、分離手段としては常磁性ビーズの使用に限定されない。常磁性ビーズは、細胞懸濁物から磁石を使用することにより分離される(Hardwick,R.A.ら，J Hematotherapy 1: 379-386，1992)。本明細書中では、用語「１次抗体に結合」は、１次抗体と細胞分離手段とを連結させる任意の手段をいう。連結手段の例は、以下を包含する： (1)細胞分離手段と１次抗体との共有結合または吸着による直接連結； (2)細胞分離手段と１次抗体との仲介タンパク質（これは、細胞分離手段と直接結合しており、これはまた１次抗体とも結合している）による間接連結； (3)細胞分離手段と１次抗体とのビオチン／アビジン結合による直接または間接連結、ここで、抗体はビオチン化され、そして細胞分離手段はアビジンを含む。本発明の好ましい実施態様の１つは、１次抗を結合させるためのタンパク質手段と連結している常磁性ビーズの使用を内含する。１次抗体を結合させるためのタンパク質手段は、Staphyloccocus aureusプロテインＡ、StreptococcusプロテインＧ、またはモノクローナル１次抗体に結合する免疫グロブリンであり得る。後者は「２次抗体」として公知である。２次抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体は、代表的には動物（例えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、またはウシの各種）で惹起される。モノクローナル抗体は、代表的には小齧歯類（例えば、マウスまたはラット）にお後、用語「２次抗体」は、１次抗体を結合させるためのタンパク質手段を例示するために使用される。本発明は、任意のタイプの標的細胞のポジティブ選択に適用され得る。本発明を使用するためには、まず第１に標的細胞上の特異的な細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体を提供することが必要である。標的細胞に特異的なモノクローナル抗体が得られれば、以下の実施例を、特異的ペプチド配列（これは、モノクローナル抗体に結合し、そして標的細胞を置換し、その結果、抗体から標的細胞を放出する）の同定のためにたどり得る。所定のモノクローナル抗体は、わずか３〜６アミノ酸残基程度からなるその同種抗原の小さい部分（エピトープとして知られる）に結合すると一般に考えられている(Pellequer,J.L.ら，Methods in Enzymology 208: 176，1991)。このアミノ酸残基は、配列内に存在し得、または抗原配列内で不連続であり得る。抗原配列のアミノ酸残基が不連続である場合、抗原の３次元の折りたたみを通しての同種抗体による認識のためにそれらは極めて近位に存在すると考えられる。本発明の実施のためには、同種抗原上のエピトープからモノクローナル抗体を置換する特異的な小さなペプチドを同定する必要がある。この特異的ペプチドは、「エピトープ模倣」ペプチド（これは、結合部位での直接競合により作用する）、または任意の他の機構で抗体を置換するペプチドであり得る。モノクローナル抗体により結合される小さなペプチドを同定するために、いくつかの最初の選択技術が用いられ得、これは放出ペプチドの候補を選択する。ファージディスプレー技術では、ランダムなアミノ酸配列の大きなライブラリーが、バイオパニングまたは抗体結合アッセイでスクリーニングされる（以下の実施例１参照のこと）。ランダムペプチドライブラリーの例は、ファージに呈示された直鎖状の６量体および15量体のライブラリー、制限された（環状された）XCX₆ CX（以下の実施例14に記載）およびコノトキシンXCCX₃CX₅Cライブラリーである。「ピン」技術では、ランダムペプチドライブラリーは、隔離されたピン上で呈示され、次いでこれは、ELISA型アッセイで出力されるような抗体に結合する能力についてスクリーニングされる。ファージディスプレーまたはピンペプチドディスプレーに基づくランダムペプチドライブラリーは、Wells,J.A.ら，Current Op inion in Biotechnology 3: 355-362，1992およびScott,J.A，Trends in Bioche mical Sciences ，17: 241-245，1992で概説されている。ランダムペプチドライブラリーはまた、ビーズに結合している抗体を使用してスクリーニングされ得る（以下の実施例13を参照のこと）。放出ペプチドの候補はまた、タンパク質抗原中の潜在的な抗原性のピークのコンピューターに援助された分析により同定され得る（以下の実施例11参照のこと）。放出ペプチドの候補はまた、目的の抗体中の相補性決定領域(CDR)の分析により同定され得る。特定の抗体の可変Ｌ鎖および可変Ｈ鎖の入手可能なcDNA配列の翻訳は、書籍Sequences of Proteins of Immunological Interest，５版,１巻， E.A.Kabatら編，1991(xvi頁の表を参照のこと)に編集されているタンパク質配列のデータベースと比較することによりCDRの描写が可能となる。いくつかの場合では、CDRペプチドが抗体分子の活性を模倣し得ることが研究により明らかとなっている(Williams,W.V.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 86: 5537，1989)。CDR ペプチドは、その同種の抗体に結合し得、従って、抗原からの抗体の置換をもたらし得る。放出ペプチドの候補を同定する上記の手順の効率を増大させるために、Pharma cia BIAcore^TMシステムの使用を介しての表面プラスモン共鳴検出を使用する生物特異的相互作用分析が利用され得る。この技術は、抗体−抗原相互作用の結合定数および解離定数を決定する能力を提供する。多数の抗体の解析および強固な結合のコンセンサスペプチド配列を同定するために必要な（設定された抗体濃度での）バイオパニング工程の数は、データベースを提供する。このデータベース上で、動力学的結合パラメーターと強固な結合のペプチドおよびそれらの競合剤としての活性を同定するための能力とが比較される。特定の抗体／抗原相互作用が非常に強固であると決定される場合、次いで、研究者は異なる抗体を用いた研究を選択し得る。BIAcore^TMシステムの使用は、精製された抗体および溶解性の抗原の供給源を必要とする。ファージディスプレーで選択されたクローンは、ペプチド抗原の供給源として使用され得、そして抗体結合について直接分析され得る。本研究では、CD34抗原は、界面活性剤で可溶化したKGla細胞由来のCD34タンパク質から得られた。BIAcore^TM技術はまた、抗CD4抗体に適用され得る；この場合、抗原の供給源は市販の組換え可溶性CD4タンパク質であり得る(Agmed,Bedfor d,MA)。上記の手段により同定される放出ペプチドの候補は、次いで細胞表面抗原からの抗体の置換について、代表的には抗原を有する細胞を使用するアッセイでスクリーニングされる。特異的ペプチドは、以下のいずれかにより標的細胞の置換をもたらし得ると考えられる、(1)細胞表面抗原上のエピトープを模倣し、その結果、抗体結合のためのエピトープに対して競合する、または(2)抗体上の部位に結合して立体構造の変化を生じ、従って、抗体が最早細胞表面抗原上のエピトープに結合できないように抗体を変化させる。本発明の同定されたペプチドの少なくとも１つがその同種抗体に結合することは、標識されたペプチドおよび抗体を使用して証拠が得られた（データは示さず）。本発明の方法は、任意の機構により標的細胞の放出に作用する特異的ペプチドを同定し得る。本明細書中では、用語「標的細胞上の細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体に結合し、細胞表面抗原から抗体を置換し、そして抗体から標的細胞を放出させるペプチド」は、任意の分子機構により標的細胞の放出に作用するペプチドをいう。放出ペプチドの候補は、以下の手段のいすれか１つまたはいくつかにより同定され得る： a)ランダムペプチドライブラリーファージディスプレーとそれに続く目的の抗体を用いたバイオパニング； b)目的のタンパク質抗原の潜在的な抗原性のピークのコンピューターに援助された分析； c)目的の抗体の相補性決定領域(CDR)の分析； d)ランダムペプチドライブラリーピンディスプレーとそれに続く目的の抗体を用いたバイオパニング； e)３次元の抗体構造の理論的な分子モデル化。いったん候補のペプチドが同定されたならば、抗原を置換するそのペプチドの能力が、ペプチドを抗体に結合している細胞と共にインキュベートすることにより試験される。抗体からの細胞の放出は、代表的にはFACScanまたは磁性ビーズからの放出により測定される。本発明の実施において使用され得るランダムペプチドライブラリーの１つのタイプは、ScottおよびSmith(Science 249: 386-390，1990)により記載されたヘキサペプチドファージディスプレーライブラリーである。本発明の前には、モノクローナル抗体は、抗体に結合するペプチドを同定するための充分なシグナルを得るためにアビジンでコートされたプレートに強く結合するように、ビオチン化されるべきであると信じられていた。しかし、多くのモノクローナル抗体は結合機能を減少させる、または破壊することなくビオチン化し得ないことも知られていた。幸運にも、非ビオチン化モノクローナル抗体（下記実施例１を参照のこと）を使用するバイオパニング技術が、標的細胞の表面の同種抗原からの抗体の脱離に有用な、候補のペプチドを同定するための充分にポジティブなシグナルを生じ得ることが見出された。以下に、特異的モノクローナル抗体に結合している標的細胞の放出に有用な特異的ペプチドを同定するための例示的な方法を記載する。この方法は、抗体がプレートに付着するように、まずモノクローナル抗体をプラスチックプレートにコートする工程を包含する。非ビオチン化モノクローナル抗体の場合は、抗体は静電的相互作用と考えられる非特異的な相互作用によりプラスチックに結合する。あるいは、モノクローナル抗体はビオチン化され、次いでビオチンに対するアビジンの強固な結合の活用によりアビジンでコートされたプレートに付着する。さらに別のスキームでは、プロテインＡまたはプロテインＧでコートされたプレートを使用する；生物StaphyococcusおよびStreptococcus由来のプロテインＡおよびプロテインＧは、特定の免疫グロブリンイソタイプ（例えば、IgGおよびIgM）に比較的強固に結合することが周知である。プレートの代わりとして、ビーズがモノクローナル抗体のための固体支持体として使用され得る；抗体は、プレートにコートした方法と同じ方法を使用して、ビーズにコートされるか、結合される。いったんモノクローナル抗体がプレートまたはビーズにコートされたら、付着している抗体は、ランダムペプチドライブラリーを呈示しているファージの大多数と接触し、次いで非結合のファージはリンスされる。次いで、結合しているファージは溶出、増殖、および増幅される。このプロセスは、「バイオパニング」として公知である。最も効果的に抗体と結合するペプチドを選択するためには数回のバイオパニングが好ましい。最終的に、選択されたペプチドをコードするファージDNAが、標的細胞の放出のための候補ペプチドを決定するためのDNA配列分析に供される。次いで、候補のペプチドが従来の方法により合成される。ペプチドの溶解性を増大させるために、親水性のアミノ酸残基（代表的には、極性のあるまたは荷電しているアミノ酸残基）の追加の隣接配列とともに合成され得る。次いで、候補のペプチドは、標的細胞の表面のその同種抗原から抗体を置換する能力について試験される。ペプチドが抗体に結合するという事実だけでは、このペプチドが抗原を置換することを確実にしないことが理解される。候補のペプチドは、抗原が結合するよりもより弱く抗体に結合し得、従って、このペプチドは、結合にうまく競合し得ず、そしてその同種抗原から抗体を置換しない。この問題を示す別の方法は、抗体は候補のペプチドに対して有するよりもその同種抗原に対してより大きな親和性を有し得ることである。候補のペプチドが、その抗原結合部位（エピトープ）に干渉または結合せずに抗体と結合し得ることも大いにありそうである。幸運にも、本発明のこの方法は、抗体に結合するのみでなく、その同種抗原から抗体を置換し、その結果抗体から標的細胞を放出するペプチドをうまく同定し得ることが見出された。いったん適切なペプチドが同定および合成されれば、本発明のポジティブ選択方法およびポジティブ／ネガティブ選択方法が実施され得る。図１に描写したように、細胞懸濁物内で、１次抗体（これは次に細胞分離手段、好ましくは常磁性ビーズに連結する）に結合している標的細胞を含む複合体が形成される。この複合体は、従来の手段、好ましくは磁石により細胞懸濁物から分離される。次いで、分離された複合体内の１次抗体が、１次抗体に結合する特異的抗体と接触し、そして標的細胞から抗体を置換し、その結果、複合体から標的細胞を放出させる。次いで、抗体に連結している常磁性ビーズは、放出された標的細胞から分離され、細胞表面タンパク質が無傷であり、そしてその細胞表面に抗体または抗体フラグメントの無い精製された標的細胞を生じさせる。本発明の好ましい実施態様を、図２に描写する。この実施態様では、１次抗体はビーズに直接結合せず、むしろ２次抗体（これは次いでビーズに結合して複合体を形成する）によりビーズに連結する。図１におけるように、この複合体は、細胞懸濁物から分離され、そして特異的ペプチドと接触し、その結果、標的細胞を放出する。本発明の別の実施態様は、図3Aおよび図3B（２重ポジティブ細胞選択）に描写されており、ここでは、２つの異なる抗原を有する標的細胞がこの抗原の１つしか有しない非標的細胞を含有する不均質な細胞懸濁物からポジティブに選択され得る。細胞懸濁物は、第１および第２の１次抗原と共にインキュベートされ、これらはそれぞれ標的細胞の２つの異なる抗原の１つのみに結合する。細胞懸濁物に両方の１次抗原に結合する２次抗原に結合した常磁性ビーズを添加することにより複合体が形成される。複合体は、細胞懸濁物から分離され、次いで、第１の１次抗体に結合する特異的ペプチドと接触し、その結果、第１の抗原を有するが第２の抗原を有さない細胞を放出する。この細胞は、残りの細胞−抗体−ビーズ複合体から分離される。次いで、残りの標的−細胞−抗体−ビーズ複合体が、第２の１次抗体に結合する第２の特異的ペプチドと接触し、従って第２の１次抗体から標的細胞を置換し、そしてビーズから標的細胞を放出する。このプロセスは、不均質な細胞懸濁物からの２つの異なる細胞タイプの連続的なポジティブ選択を提供する。本発明の別の実施態様を、図４に描写する。ここで、第１の抗原を有する標的細胞は、第１の抗原ならびに第２の抗原を有する所望しない細胞も含有する不均質な細胞懸濁物からポジティブに選択される（ポジティブ／ネガティブ選択）。本発明のポジティブ／ネガティブ選択方法はまた、第１の抗原を有さないで第２の抗原のみを有する混入した所望しない細胞を除去するために有用である。ポジティブ／ネガティブ選択は、例えば、自己CD34+細胞がガン患者の血液または骨髄から選択されるべき場合、特に望ましい。選択されたCD34+細胞は、高用量の化学療法または放射線治療後の骨髄の再構築のために患者への自己輸血が予定される。CD34+細胞のみのポジティブ選択は、数桁で選択細胞サンプル中の腫瘍負荷を減少させると考えられる。しかし、自己輸血されたガン細胞が再発に寄与し得る可能性に対して付加される予防措置として、ガン細胞に対してネガティブに選択することが最も望ましい。ポジティブ／ネガティブ細胞選択は、同時に（付随して）または連続的に行われ得る。同時ポジティブ／ネガティブ細胞選択：細胞懸濁物内で、複合体が形成され得、この複合体は、第１の１次抗体に結合している標的細胞を含有し、この抗体はビーズに連結し、次いでこのビーズは所望しない細胞に結合している第２の１次抗体に連結する。例えば、第１の１次抗体は、抗CD34抗体であり得、一方第２の１次抗体は抗Ｂ細胞抗体または所望しない細胞タイプに対するいくつかの抗体の混合物であり得る。抗Ｂ細胞抗体は、Ｂ細胞リンパ腫を患う患者由来のポジティブに選択されたCD34+細胞集団の浄化に特に有用である。この複合体は細胞懸濁物から分離され、次いで、第１の１次抗体に結合する特異的ペプチドと接触し、その結果、標的細胞表面上の同種抗原から第１の１次抗原を置換し、そして複合体から標的細胞を放出する。しかし、所望しない細胞は、第２の１次抗体を介してビーズに結合したままである。従って、所望しない細胞は、放出された標的細胞から分離され得、所望しない細胞から分離された標的細胞の精製された集団を生じさせる。連続的なポジティブ／ネガティブ細胞選択：この方法では、所望の抗原(例えば、CD34)に対する抗体および特異的ペプチドによる放出のみを使用するポジティブ選択工程がまず上記のように行われ、ポジティブに選択された細胞は、非酵素的なペプチド媒介放出のためにその表面に抗原を保持しており、これは続く選択工程を可能にしている。次いで、ポジティブに選択された細胞は、第２の１次抗体または例えばＢ細胞抗原のような所望しない抗原に対する抗体の混合物と共にインキュベートされる。第２の１次抗体に結合している細胞は、従来の手段により捕獲され、そして非結合の細胞は患者に自己輸血するために回収される。ポジティブ／ネガティブ選択は、ポジティブに選択されたCD34+細胞のさらなる精製に特に重要である。代表的には、ポジティブに選択されたCD34+集団は、9 0％以上純粋であり、これは例えばＢ細胞の10³の減少を表す（実施例19を参照のこと）。ネガティブ選択工程の追加は、所望しない細胞を10⁴の減少まで、またはそれ以上さらに減少させる。ネガティブ選択工程は、「浄化」として知られている。ネガティブ選択は、得られる細胞組成物に実質的に所望しない細胞が無いように最適化され得る。用語、所望しない細胞が「実質的に無い」は、所望しない細胞が標準的なサンプリングおよび分析（例えば、免疫細胞化学、形態学、またはFACScan^TM）を使用して検出されないことを意味する。ネガティブ選択技術はまた、異種移植片からのＴリンパ球の減少のために使用され得、従って、対宿主性移植片病(GVHD)の危険性を大きく減少させ得る。所望しない細胞の減少程度は、他の因子の中でも、利用される抗体／ビーズ／細胞／ペプチドの比率に依存する。これらの比率は、例えば、Ｂ細胞またはＴリンパ細胞の所望の桁の減少を得るように最適化され得る。いくつかの適用例では、腫瘍対白血病反応を誘導するために、患者への自己輸血用の精製したCD34+集団中に少数の腫瘍リンパ細胞を保有することが望ましい。ここで、自己輸血した腫瘍細胞は、残りの腫瘍細胞に対する患者の免疫系を動員させる(Wingard,J.L． 1995，IBC 2nd Annual Conference on Hematopoietic Stem Cells，San Diego， CA)。しかし、患者に自己輸血された腫瘍細胞の３〜４桁の減少は、再発率を減少させると期待される。以下の実験的実施例１〜７は、本明細書中では抗体9069として知られるATCC H B 11646と称されるハイブリドーマから産生される、抗CD34マウスモノクローナル抗体に結合しているヒト造血幹細胞の放出のための特異的ペプチドの同定および使用を記載する。ハイブリドーマATCC HB 11646は、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville，Maryland，USAに、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により寄託されている。以下は、ヒト造血幹細胞を骨髄または末梢血のような不均質な細胞懸濁物からポジティブに選択するためのこれらのペプチドの使用を記載することにより本発明の方法を例示する。ヒト骨髄、末梢血、または臍帯血の不均質な細胞懸濁物は、極少数(代表的には、0.2〜2.0%)の幹細胞を含有する。幹細胞は、インビトロでの培養または患者への自己輸血などのさらなる使用のためのポジティブに選択されるべき標的細胞てある。ヒト造血幹／前駆細胞は、それらは何度も増殖し、そして全ての造血細胞タイプに分化する能力を有するためにそう称されている。本明細書中では以後、用語「幹細胞」は、ヒト造血幹／前駆細胞をいう。幹細胞は、CD34として公知の特徴的な細胞表面抗原を有する。特異的にCD34に結合するいくつかのモノクローナル抗体が生成されている。それぞれのモノクローナル抗体は、CD34抗原のそれぞれ異なるエピトープに結合するとみなされる。なぜなら、いくつかの異なるモノクローナル抗体が同一のエピトープに対して生成されることは統計学的にほとんどありそうにないからである。従って、所定の抗CD34モノクローナル抗体を置換するために効果的であるとして同定されたペプチドは、この特異的抗体のみを置換し、そして他のモノクローナル抗CD34抗体を置換しなさそうである。図２に描写したように、血液または骨髄の懸濁物内では、マウスモノクローナル抗体9069(１°AB)に結合するヒト幹細胞を含有する複合体が形成され、この抗体は次にヒツジ抗マウス抗体(２°AB)に結合し、この抗体は常磁性ビーズに結合する。この複合体は、細胞懸濁物から磁石手段により分離される。次いで、9069 抗体(°１抗体)は、9069抗体に結合し、そして幹細胞上のCD34抗原から9069抗体を置換する特異的ペプチドと接触し、その結果、幹細胞を放出する。次いで、ヒツジ抗マウス抗体および9069抗体に連結している常磁性ビーズは、放出された幹細胞から磁石手段を使用して分離される。これにより、高度に精製されたその表面タンパク質（CD34抗原タンパク質を含む）が無傷である幹細胞の懸濁物が提供される。さらに、幹細胞はその表面に結合したままの抗体または抗体のフラグメントを有さない。本発明はまた、ポジティブ／ポジティブ細胞選択の方法を提供する。ここで、２つの所望の標的細胞は、血液または骨髄からポジティブに選択され得る。例えば、幹細胞およびＴリンパ球の両方をポジティブに選択することが所望され得る。Ｔリンパ球は、CD3として知られる細胞表面抗原を有する。Ｔリンパ球の特異的なサブセットは、CD4およびCD8として知られる細胞表面抗原を有する。Ｔリンパ球の所望のクラスに対するモノクローナル抗体が提供され得、そして以下の実施例１に記載のペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。抗Ｔリンパ球抗体を置換する特異的ペプチドは、抗CD34抗体を置換するペプチドと共に選択され、そして使用される。従って、抗CD34抗体および抗Ｔリンパ球抗体の両方が細胞懸濁物と共にインキュベートされ、そして２つのタイプの標的細胞がそれらの特異的１次抗体により結合される。１次抗体結合細胞は、ビーズに結合している２次抗体と結合し、これらは細胞懸濁物から分離され、次いで２つの特異的ペプチドと接触させることによりビーズから置換される。従って、実質的に純粋な幹細胞とＴリンパ球との混合物が得られる。図3Aおよび3Bに描写したように、本発明は２重ポジティブ細胞選択のための方法を提供する。ここで、例えば他の細胞表面マーカーを有するCD34+細胞のサブセットがポジティブに選択され得る。図４に描写したように、本発明はまたポジティブ／ネガティブ細胞選択のための方法を提供する。ここで、標的CD34+細胞は、例えば腫瘍マーカーのような第２の抗原を有する所望しないCD34+細胞も含有する血液または骨髄の懸濁物からポジティブに選択され得る。多くのガンの異なるタイプについては、高用量の化学治療または放射線療法に続いて、このような処置により破壊された骨髄の造血細胞を補充するために自己幹細胞移植を行うことが望ましい。しかし、自己幹細胞移植の使用は、処置前の患者の骨髄または末梢血の一部の採集を含み、そして骨髄に腫瘍細胞が潜んでいて、次いで、これが患者に自己輸血された時に増殖する危険性がある。ネガティブな浄化工程の追加は、ポジティブ選択された画分に非特異的に捕獲された任意の自己腫瘍細胞の除去を可能にする。自己骨髄移植が必要とされるガンのタイプは、神経芽腫、乳ガン、小細胞肺ガン、および結腸ガンを包含する。CD34+細胞のポジティブ選択は、ガン細胞を導入する危険性を減少させる。なぜなら、転移性の腫瘍細胞であるCD34+細胞はほとんどまたは全くないと信じられているからである。しかし、ポジティブ／ネガティブ細胞選択の使用を通してより高度な信頼性が獲得され得る。細胞の腫瘍的性質の指標として同定されたいくつかの細胞表面抗原があり、そしてこれらの腫瘍抗原に結合する抗体が利用可能である。例えば、神経芽腫細胞を選択するためには、以下の抗原に対する抗体が使用され得る：Ｇ_D2、NCAM、45 9、HSAN、UJ13A、およびUJ167.11(Bone Marrow Processing and Purging，Adria n P.Gee編，CRC Press，Boca Raton，Florida，1991)。乳ガン細胞を選択するためには、広範囲の乳抗原を結合する抗体のパネルが使用され得る。同様に、小細胞肺ガン細胞を選択するためには、神経抗原、上皮抗原、および神経内分泌抗原に対する抗体のパネルが使用され得る。ガン胎児性抗原(CEA)は、多種類の乳ガン細胞および結腸ガン細胞上に存在し、そしてCEAに対する抗体がこれらの腫瘍細胞タイプを選択するために有用である。図４で描写したように、ガン患者由来の骨髄または血液の懸濁物内で、標的CD 34+幹細胞、9069抗CD34抗体(°1AB-I)、ヒツジ抗マウス抗体(２°AB)、ビーズ、第２の１次抗体または腫瘍抗原に対する抗体のパネル(１°AB-II)、および所望しない細胞（これは、CD34+抗原を有し得るかまたは有し得ない）を含む複合体が形成される。この複合体を、懸濁物から分離し、そして9069抗体に結合する特異的ペプチドと接触させ、CD34抗原から9069抗体を置換し、従って、複合体から標的幹細胞を放出させる。次いで、抗体および所望しない細胞に結合しているビーズを、放出された幹細胞から分離し、CD34+幹細胞の精製された懸濁物（これは、腫瘍抗原を有する細胞が浄化されている）を得る。上記の任意の選択方法を使用して、幹細胞をATCC HB 11646により産生される9 069抗体と結合させることによりヒト造血CD34+細胞をポジティブに選択し、次いで9069抗体を以下のリストから選択したペプチドと接触させることにより幹細胞を放出させ得る。本明細書中では、ペプチド配列をIUPAC-ICB Biochemical Nome nclature Committee（the U.S．Patent and Trademark OfficeのPatentIn User Manual、1990年11月、101頁を参照のこと）により推奨される１文字のアミノ酸記号で示す。ここで、Ｊ₁およびＪ₂は、０〜６アミノ酸残基からなる群から選択される。適切には、Ｊ₁およびＪ₂は、水溶液でのペプチドの溶解性を促進するように、親水性、極性、または荷電したアミノ酸残基を含有する。親水性、極性、または荷電したアミノ酸の例は、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＲである。上記に列挙した任意のペプチドは、アセチル化されたアミノ末端アミノ酸残基を有し得る。また、上記に列挙した任意のペプチドは、アミド化されたカルボキシ末端アミノ酸残基を有し得る。本発明はまた、9079と称される抗CD34抗体により結合される細胞を放出し得るペプチドを提供する。この抗体は、ATCCにブダペスト条約により寄託された1995 年５月９日で有効なATCC HB-11885と称されるハイブリドーマから産生される。以下のペプチドは、9079放出ペプチドである：本発明はまた、Dynal，Oslo，Norwayから市販されている561と称される抗CD34抗体により結合される細胞を放出し得るペプチドを提供する。以下のペプチドは、直鎖状561放出ペプチドである：本発明はまた、9187と称される抗ヒト乳ガン抗体により結合される細胞を放出し得るペプチドを提供する。ATCCにブダペスト条約により寄託された1995年５月９日で有効なATCC HB-11884と称されるハイブリドーマから産生される。このペプチドは、化学療法の感受性を決定するための、および患者特異的なワクチンまたは治療的モノクローナル抗体の生産のためのガン細胞集団を提供するためのガン細胞の培養を包含するいくつかの異なる技術のために患者の血液または骨髄から乳ガン細胞をポジティブに選択するために有用である。抗体9187に結合されている細胞を放出させるペプチドは、以下のとおりである：本発明の組成物および方法はまた、細胞の定量のためのエピトープ／抗体アッセイに適用され得る。例えば、アフェレーシス産物またはポジティブに選択された細胞組成物中のCD34+細胞の数を測定するための迅速で、簡単で、そして標準化されたアッセイを有することは、臨床上価値がある。現在、組成物中の特異的な細胞の数は、フローサイトメトリーにより決定されているが、これには高価な装置と熟練した技師を必要とする。細胞表面の抗原決定基を認識する抗体についてのペプチドエピトープの同定はまた、例えば、細胞に基づく診断的なアッセイの構築を可能にする。目的の特異的細胞を特異的なモノクローナル抗体から放出させ得るペプチドが提供される。このペプチドを、抗体結合のための「人工的細胞標的」を構築するために、固体支持体（例えば、合成ビーズ）または他のタイプの固相に結合し得る。次いで、標準的な結合曲線が確立される。ここで、ペプチド／ビーズ複合体の減少する量を一定濃度の特異的モノクローナル抗体と接触させる。この曲線は、ビーズへの抗体結合についてのシグナルの範囲を得る。このシグナルは、いくつかの方法で生成され得る。抗体との結合体化または２次抗体結合体の使用により、磁性ビーズ／ペプチド／抗体複合体の回収が可能になり、そして捕獲された抗体の定量が可能になる。あるいは、抗体分子による蛍光ビーズ／ペプチド複合体の捕獲により、捕獲された蛍光を通しての同様な結合の定量が可能になる。次いで、標準結合曲線の確立により、（例えば、間接的な競合アッセイによる臨床サンプル中の）CD34+細胞の定量が可能になる。これは、RIA（ラジオイムノアッセイ）と類似している。この場合、未知の濃度のCD34+細胞を含有する試験物質の添加は、抗体／ビーズ複合体の形成と競合し得る。次いで、阻害の程度は、試験物質中のCD34+細胞の数と比例する。細胞選択技術の場合、この種の診断的なアッセイにより、出発標的細胞濃度の評価が提供され、そして細胞捕獲剤の最適化およびシステムの性能の改良が可能になる。同様の間接的結合アッセイが、固相に固定化したペプチドエピトープへの抗体結合について行われ得る。未知のCD34+標的細胞数を含有する試験物質は、固相にコートしたペプチドへの抗体の結合を阻害し得る。細胞濃度を、コントロールの標準曲線の確立に従って測定し得る。固相アッセイの価値は、迅速な出力システムへのその適合性である。例えば、抗体の結合に比例する電気シグナルを送達する診断システムが開発されており、そしてこれにより細胞選択機器と連結された標的細胞濃度のインライン定量が可能になり得る。さらに、この種の診断アッセイにより、出発標的細胞濃度の評価が提供され、これにより細胞捕獲剤の最適化およびシステムの性能の改良が可能になる。以下の実験例は例示のために提供され、そして本発明の範囲の限定を意図しない。実施例１抗CD34モノクローナル抗体に対する高親和性結合を有するペプチドエピトープをディスプレイするファージの選択モノクローナル抗CD34抗体(マウス)(「9069」と称する)を、Baxter-Hyland(Lans dorp clone 9.C.5，Terry Fox Laboratories and Becton-Dickinson)より得たハイブリドーマから、標準的な方法によって産生した。抗体9069を産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約のもと、アメリカンタイプカルチャーコレクション，Rockville，Maryland，USAに寄託されている。特異的なヘキサマ−ペプチド配列を、抗CD34抗体、9069に対するそれらの結合能力について選択した。George Smith（University of Missouri）からエピトープファージディスプレイライブラリーを得、そして特定の改変をして彼の手順に従い、スクリーニングを行った。エピトープファージディスプレライブラリーの作製および増幅は、George P.Smith、Science，228:1315-1316，1985によって記載されており、そしてさらに詳細には、Cloning in fUSE Vectors（1992年２月1 0日版）に記載されている。本発明の前には、ファージ粒子が特異的にリガンドに結合するように培養プレート中のアビジンにリガンドを強固に結合させるために、ビオチン化した形態のリガンドを使用することが必要であると一般に考えられてきた。しかし、目的のリガンド（この場合、抗体9069）のビオチン化は、その結合能力に不利に影響することが知られていた。幸運なことに、9069の非ビオチン化形態を用いる方法は、特異的ペプチドを、適切なペプチドの同定を可能にするために十分な特異性で結合することが見出された。 35mmポリスチレンペトリディシュ(Falcon)の底に、10μgまたは１μgの抗体90 69を含む、900μlの水および100μlのフィルター滅菌した1M NaHCO₃(合わせていないpH8.6)からなる１mlの9069抗体溶液をピペットで移した。プレートを４℃で１晩インキュベートした。次いてプレートをTBS/TWEEN(50mM Tris pH7.5/150mM NaCl)で洗浄し、そしてウシ血清アルブミン(BSA)を含むブロッキング溶液とともに４℃で２時間、インキュベートした。プレートを再び洗浄し、そしてファージを加えた。代表的には、インプットしたファージは、100μlの増幅した溶出物であった。結合した9069抗体およびファージを含むプレートを、４時間４℃でインキュベートし、次いでTBS/TWEENで12回洗浄した。結合したファージを400μlの溶出緩衝液（0.1N HCl（pHをグリシンで2.2に調整）＋１mg/ml BSA）を添加することにより溶出し、そして約10分間、緩やかにプレートを振とうした。次いで、溶出物を75μlの1M Tris.HCl(pH9.1)を含む500μlマイクロ遠心チューブにピペットで移し、７〜8.5の最終pHとした。次いで、溶出物を30kD Amicon^TMフィルターを用いて濃縮した。濃縮した溶出物を使用して、K91 Kan欠乏細胞を室温で3 0分間感染させた。gpIIIの産生を0.2μg/mlのTet-NZYを37℃で60分間添加することにより誘導した。次いで、ファージを37℃で１晩、増殖および増幅させた。ファージを回収し、そして２回のポリエチレングリコール(PEG)沈澱に供した。段階希釈を行い、そしてインプットとアウトプットの両方のファージの力価を測定した。さらに３回のバイオパンニングおよび力価の測定を行った。４回目のバイオパンニングおよび力価の測定の後、100クローンを選択し、そして37℃で１晩増殖させた。上清を回収し、２回のPEG沈澱に供し、その後１回の酢酸沈澱に供した。４回のバイオパンニング工程により特異的抗体結合クローンを選択し、このうち200を精製した。異なるバイオパンニング工程を表すクローンをDNA配列分析に供し、pIIIタンパク質に融合されたランダムヘキサマー配列のタンパク質をコードする可能性を決定した。表１に、バイオパンニング工程をまとめる。実施例２ヘキサペプチドモチーフを決定するためのDNA配列分析による高い親和性のファージクローンのスクリーニング DNAテンプレートを調製した。DNA配列分析をApplied Biosystems Inc.（Foste r City,CA）373 Automated DNA Analysis Systemを用いて行った。Applied Bios ystemsの手順に従って、Taqポリメラーゼを利用するサイクルシークエンシングを行った。オリゴヌクレオチドプライマーをOperon Technologies Inc.（Alamed a,CA）から購入した。選択したファージクローンを、pIII遺伝子のランダムヘキサマー領域のDNA配列決定によって分析した。特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを、バクテリオファージflの公開されたヌクレオチド配列（Hill,D.F.ら、J Viology 44:32-4 6,1982）に基づいて設計した。5'プライマーはヌクレオチド1533〜1556に由来し、そして3'プライマーはヌクレオチド1714〜1737の相補であった。 DNA配列分析に供したファージクローンの中から５つの異なるヘキサマー配列を発現させた。各々のヘキサマー型を発現する分析したクローンの配列および数を、表２に列挙する。実施例３ファージ上清が抗CD34モノクローナル抗体に結合する能力の実証 KGlaは、CD34抗原をその細胞膜上で発現するヒト細胞株(ATCC #CCL 246.1)であり、そしてCD34+細胞のポジティブ選択の条件の最初の試験または最適化のためのモデルシステムとして使用される。抗CD34抗体9069(0.0125マイクログラム)を、実施例１のように調製したファージ上清(０、50、または300マイクロリットル)とプレインキュベートした。KGla 細胞(10⁶)との次のインキュベーションを、30分間、室温(約22℃)で行った。異なる抗CD34抗体を用いて選択した無関係なファージクローンを、ネガティブ特異性コントロールとして使用した。細胞結合抗CD34抗体の検出を、10マイクログラムのFITC-ヤギ抗マウスIgG（FITC-GAM）を添加し、次にFACScan分析を行うことによって測定した。この実験を、以下に模式的に描写する：抗CD34抗体9069に対する、ファージディスプレイ選択ファージクローンの結合またはペプチドの結合を試験するためのKGla細胞アッセイ結果：選択されたファージクローンの上清を抗CD34抗体に添加することによって、検出可能な細胞表面の抗体結合の消失が生じた。これらの結果は、KGla細胞の抗体単独の位置(最も右側)から左側に向かう総蛍光のシフトによって示され、これは結合抗体の減少を示す。表３はファージディスプレイ選択クローンの、90 69抗CD34抗体への結合を試験する２回の実験のまとめを提供する。約50〜86%の総抗体結合が、ペプチドエピトープを発現するファージ上清の添加後に観察された。次の試験は、表４に示すような限定される隣接配列を有するヘキサマー配列を示す特異的ペプチドを利用した。ペプチドは、抗CD34抗体9069に結合し得、従って、抗体と結合するKGla細胞の量を減少させた。実施例４FACSに基づくKGla細胞アッセイにおける競合試薬としてのファージディスプレイ選択ペプチドの評価これらの実験を、抗CD34抗体9069をKGla細胞と最初にインキュベートし、次にペプチドを添加した以外は、結合実験と同様の手順に従って実施した。実験の概要を以下に模式的に示す：細胞に結合した9069抗体のペプチドによる放出を試験するためのKGla細胞アッセイ抗CD34抗体、9069(0.1マイクログラム)を、KGla細胞(10⁶)と30分間室温(約22 ℃)でインキュベートした。抗体に対して10⁵〜10⁶倍モル過剰な量のペプチドを予め結合した抗体を置き換える能力について試験した。ペプチドを抗体-細胞複合体と共に30分間室温(約22℃)でインキュベートした。残存する結合抗体を、実施例３に記載のFITC-ヤギ抗マウスIgG試薬を用いて検出した。結果：表５は、試験したペプチド配列および検出された抗体結合の阻害百分率を列挙する。これらのデータは、KGla細胞から予め結合した抗体を置き換えるペプチドの能力を表す。 FACSデータは、ヘキサマーＩ型（正確な配列については表４を参照のこと）を表すペプチド9069Aの増加する濃度により、抗CD34抗体9069の競合置換を生じたことを示す。同様の結果が、ヘキサマーII型を使用して得られた（得られた）。実施例５磁気ビーズで単離されたCD34+ヒト幹細胞のペプチド放出 C)を単離した。抗CD34抗体9069(0.5マイクログラム)を１×10⁶のMNCに添加し、次いで30分間４℃でインキュベートした。非結合の抗体を除去するために、RPMI 、1%HSAで３回洗浄し、次いでヒツジ抗マウスIgG1 Fc（SAM）Dynalビーズを添加した。ビーズを細胞当たり0.5ビーズの割合で添加し、そして30分間、４℃でインキュベートした。ビーズ／細胞複合体を分割し、そして各アリコートに何も与えないか、または種々の濃度のペプチドを与えるかのいずれかをした。抗CD34抗体のペプチド媒介性放出の検出を、細胞上の結合または非結合のビーズ／抗体複合体をモニターすることにより測定した。表６に結果をまとめる。ヘキサマーＩ型を表す9069Aペプチドの濃度およびインキュベーションの時間の関数として、抗体の増加量が細胞から放出された。3mg/mlのペプチドの濃度により、１時間以内の抗体からの約70%の細胞放出が生じた。さらなる実験を、本質的に、同時係属米国特許出願第08/118,068号に記載されるように行った。この方法は、本明細書中に参考として援用される。簡単に述べると、ヒト動員末梢血および骨髄を使用する実験を、デスチオビオチン結合抗体の代わりに非結合9069抗体を使用し、非結合ヒツジ抗マウス２次抗体を使用し、そしてビオチンの代わりに、表中に命名したペプチドを細胞遊離のために使用した以外は、本質的には23頁の実施例６に記載のように行った。表９および表10中の、「短ペプチドA」または「短A」と称するペプチドは、下記の表11において「9069N」と称するペプチドである。 CD34+細胞をまた、同時係属米国特許出願第08/212,479号の自動細胞分離装置、および、本質的に、同時係属米国特許出願第08/212,616号において記載される方法を使用して、ヒト動員末梢血から単離した。08/212,479と08/212,616の両方は、特に、本明細書中に参考として援用される。キモパパインをコントロールの放出剤として使用し、そして25mgのペプチド9069N(表11)を、試験放出剤として使用した。結果：陽性に選択されたCD34+細胞の純度は、キモパパイン放出細胞とペプチド放出細胞の両方について90%より高かった。第１の実験において、ペプチド放出方法は、14×10⁶の細胞を生成し、一方キモパパイン放出方法は、20×10⁶の細胞を生成した。第２の実験において、ペプチド放出方法は、19×10⁶の細胞を生成し、一方キモパパイン放出方法は、22×10⁶の細胞を生成した。第１の実験由来のポジティブに選択されたCD34+細胞をサイトカインを含む培養物中で12日間増殖させた。ペプチド放出細胞は、細胞数において100倍の拡大を示し、一方キモパパイン放出細胞は、68倍の拡大を示した。これらの結果は、ペプチド放出方法がキモパパイン放出方法に匹敵する結果を生じ、そしてポジティブに選択された細胞が、それらの増殖の潜在性を保持したことを示した。実施例６KGla細胞への抗CD34モノクローナル抗体の結合に対する競合試薬としての改変ペプチドの分析実施例４に詳述したように実施したさらなる実験は、ファージディスプレイにより選択されたペプチド配列の特定の特性が、抗CD34抗体に結合するそれらの能力、およびKGla細胞の細胞表面上で発現されるCD34抗原に予め結合した抗体を効果的に置換するそれらの能力において重要であり得ることを実証する。選択されたペプチド配列とヒトCD34抗原の公開されたDNA配列(Simmons,D.L.ら、J Immunol 148:267-271,1992；He,H-Y.ら、Blood 79:2296-2302,1992)との比較により、ヘキサマーＩおよびII型について２つの可能なエピトープの位置が明らかになった。共有されるTQGアミノ酸配列が、翻訳されたCD34配列中の２つの位置で見出された。ファージディスプレイ隣接配列または天然隣接配列のいずれかを有するヘキサマーペプチド配列を、競合的に結合するそれらの能力、およびそれゆえに予め結合した抗CD34抗体9069を、KGla細胞から放出させる能力について試験した。表11は、検討したペプチドヘキサマーモチーフ、試験した正確なペプチド配列、それらの関連する特徴の簡単な記載およびβターンの可能性をまとめる（Prev ilige,P.,Jr.,およびFasman,G.D．タンパク質の２次構造のChou-Fasman予測：Ch ou-Fasman-Previlige アルゴリズム、Prediction of Protein Structure and th e Prinicples of Protein Conformation 、1989，G.D.Fasman編，Plenum Press， New York）。興味深いことに、ファージディスプレイライブラリーのバイオパンニングは、天然の配列に正確に一致するヘキサマー配列を同定し得た。しかし、ペプチドはタンパク質中に見出される同じアミノ酸配列と同じ折り畳み構造を維持しないかもしれないので、βターンの可能性またはループ様構造であると仮定する可能性は、天然のCD34ヘキサマー配列よりもファージディスプレイ選択ペプチドの方が高い。βターンの可能性が競合ペプチドの重要な特徴であったかどうかを決定するために、ヘキサマーVIII型およびIX型を設計した。天然のCD34配列TQGTFSに対する比較、および２つのファージディスプレイ選択ヘキサマーにおけるQG_Fの保存性に対する比較に基づき、QG_F残基を維持するが、βターンの可能性を減少または増加する２つの新しいペプチドを試験した。また、ファージディスプレイ隣接を欠き、そして可溶性のための荷電した残基のみを付加した「最少」オクタマーペプチドを試験した。結果：実際のCD34細胞に由来するヘキサマー配列を含むペプチドは、KGla細胞から予め結合した抗CD34抗体を効果的に競合してはずした。隣接配列の型(天然C D34またはファージディスプレイ)に関わらず、モチーフVIを表すヘキサマー配列は、競合試薬としてより効果的であった。この配列はまた、モチーフＩおよびII によって表されるファージディスプレイ選択ヘキサマー配列に最も近く一致した。ヘキサマーモチーフVIIIおよびIX(表11を参照のこと)を表すペプチドを分析した。良好なβターンの可能性を有すると予測されるヘキサマー配列を有するペプチドのみが、予め結合した抗CD34抗体と競合し得た。このデータは、ループ構造が、9069抗体によるCD34の認識に重要であり得るという考えを支持する。ファージディスプレイ隣接配列(アセチル化されたアミノ末端および可溶性のために付加されたKDを有する)を欠く、短い型のヘキサマーモチーフＩとIIとの比較により、ファージディスプレイ配列が、抗体によるヘキサマーの認識には必要とされないことを示した。さらに、ヘキサマーモチーフＩは、ヘキサマーモチーフIIよりも良好な競合物であるようである。実施例７CD34の不連続なエピトープを表す、２つのペプチドモチーフの同定公開されたCD34 cDNA配列(Simmons、上述；He、上述)の分析により、ファージディスプレイ選択ヘキサマー配列に相同である２つの不連続な領域の同定が示された。成熟な、シグナルペプチドがプロセシングされたCD34タンパク質のアミノ酸14〜19の第１の領域(エピトープ１)は、ヘキサマーモチーフＩ型およびII型に相同である。アミノ酸76〜81の第２の領域(エピトープ２)は、ヘキサマーモチーフIV型およびヘキサマーモチーフIII型の逆に相同である(表12を参照のこと)。アミノ酸SVQSの側鎖を分離する原子距離がSQVSについてと同じであるので、この選択されたペプチド配列は、抗体に結合可能であった。ファージディスプレイライブラリーから選択された５つの異なるヘキサマー配列のうち、ヘキサマーモチーフV型のみがCD34の２つの同定されたエピトープ領域のいずれとも弱く結合した。興味深いことに、ヘキサマーモチーフVのTGQ配列は、エピトープ１のアミノ酸15〜17の逆である。エピトープ１と２との両方を表すペプチドは、CD34+細胞を抗体9069から分離しそして放出させることにおける相乗効果を潜在的に有し得る。実施例８ 9069N幹細胞放出ペプチドにおけるトリプトファンのフェニルアラニンへの置換は、機能的な放出ペプチドを生じるファージディスプレイ分析により、抗CD34モノクローナル抗体9069によって認識される優勢ヘキサペプチド配列が同定された。KGla細胞に結合した9069抗体に対する競合活性について試験した最も短いペプチドは、以下の配列を有した:Ac- QQGWFP-KD。トリプトファンは不安定であることが知られており、それゆえに、トリプトファンがフェニルアラニンに置換される改変ペプチド9069Q2を設計した；Ac-QQGFFP-KD。この後者の配列は、KGla細胞に基づいたFACSアッセイにおいて、競合放出試薬として機能することが示された。抗CD34モノクローナル抗体9069に結合する直鎖状ヘキサペプチド配列を、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを介して同定した。２つの最も共通のヘキサペプチド配列は、成熟CD34抗原中のアミノ酸14〜19でのヘキサペプチド配列に相同であった。可溶性を補助するために荷電した２つの残基およびヘキサペプチドを含むオクタペプチドは、競合的な細胞に基づいたFACSアッセイにおいてCD34+細胞から抗体を置換するように機能することが示された。これらのペプチドは、KGla細胞から予め結合した9069抗体を置換することが示された。Is な幹細胞放出のために十分に機能したことを示した。トリプトファン残基を含むペプチド配列の利用は、特異的分解および構造における安定性の問題を持ち出す。CD34抗原中の相同配列がトリプトファンを含まなかったため、トリプトファンをフェニルアラニン残基に置換した変異体ペプチドを設計した。この後者の残基は、紫外線への曝露に対してはるかに安定である。改変ペプチドが幹細胞放出試薬として機能し得るのであれば、代替のより安定なペプチドに関するさらなる産物開発の研究が開始され得る。本研究は、細胞に基づいたKGla FACSアッセイにおける、変異体9069ペプチドである9069Q2の設計および機能性の試験を実証する。9069Qペプチドは、9069抗体から予め結合したKGla細胞を置換するように作用する。変異体ペプチド9069Q2の分析を、9069Nペプチドと平行して行った。この分析により、抗体9069、および細胞KGlaを含む試薬の品質管理情報を提供する。FACS canアッセイは、KGla細胞単独のネガティブコントロールおよび結した9069抗体を有するKGla細胞のポジティブコントロールサンプルを含み、そして２次抗体、ヤギ抗マウス IgG-FITCを用いて検出した。先に示したように、9069Nペプチドは、KGla細胞から予め結合した9069抗体を置換し得た。 9069Q2ペプチドはKGla細胞から、予め結合した9069抗体を置換し得た。ファージディスプレイを介して定義された9069Nペプチドは、潜在的に不安定なトリプトファン残基を含む。このアミノ酸のフェニルアラニンとの置換は、ペプチド9069Q2が、KGla細胞に結合した9069抗体を効果的に競合してはずす能力を損なわなかった。ヘキサペプチドの以前の分析により、良好なβターンの可能性のために必要であることが明らかとなった（Prevelige,P.Jr.,およびFasman,G.D ．Chous-Fasman Prediction of Secondary Structure of Proteins：The Chou-F asman-Prevelige Algorithm、Prediction of Protein Structure and the Princ iples of Protein Conformation，1989，G.D.Fasman編、Plenum Press、New Yor k）。「弱い」または「強い」βターンの可能性を生じるアミノ酸置換により、機能的活性が最もループの可能性を有するペプチドに対応することが示された。モチーフXQGXFXを維持し、そして放出活性を有するペプチド中に存在することが以前に示されたアミノ酸残基を含むさらなる改変ペプチド配列を設計した(下記、表13)。これらの候補ペプチドを、将来の試験のためならびに9069Nおよび90 69Q2ペプチドとの比較のために作製し得る。試験したペプチドは、ファージディスプレイベクターおよび／または可溶性を補助するための荷電残基のいずれかに由来するさらなる隣接配列を含む。実施例９ファージディスプレイ技術を介する、ヘキサペプチド配列の9079抗体選択 9079抗CD34抗体を使用して、ファージディスプレイライブラリーから直鎖状のヘキサペプチド配列を選択した。CD34抗原に対する直接的な相同性のない多数の関連のないヘキサペプチド配列を３回目および４回目のバイオパンニングファージクローンから同定した。５回目のバイオパンニングにより、優勢なヘキサペプチド配列が明らかになった。Immunotherapy Divisionにより開発された、現在のヒト幹細胞単離システムは、抗CD34抗体9069を利用する。捕獲された幹細胞を放出するためのキモパパイン処理の置換が望ましい。残存キモパパインの残余量の免疫原性の潜在性問題、キモパパインのロット変動およびキモパパイン処理で細胞表面抗原をはがすことに起因するさらなるネガティブ選択を実施し得ないことが、別の放出試薬を研究するための理由であった。 University of MissouriのDr.George Smithから得られた直鎖状ヘキサペプチドライブラリーのファージディスプレイバイオパンニングのためのもとのプロトコルで、ビオチン化抗体の使用を指示した。9079抗体を用いる３回のバイオパンニング工程を実施した。３回目の溶出物を４℃で１年間保存し、次いで、４回目のパンニングの前に増幅に供した。増幅していない４回目のバイオパンニングから、５回目のバイオパンニングを実施した。３、４および５回目のバイオパンニング由来のファージクローンを、DNA配列分析に供した。多数のヘキサペプチド配列が各バイオパンニングにおいて同定された。５回目のバイオパンニングにおいてのみ、優勢な配列が現れた。選択されたヘキサペプチドはいずれも、CD34抗原に対する直接的な相同性を示さなかった。８つのヘキサペプチド配列を合成のために選択した。KGla細胞に基づいたFACS アッセイを用いて、予め結合した9079抗体を置換するそれらの能力について試験した。材料：直鎖状ヘキサペプチドライブラリーをUniversity of MissouriのDr.George Smit hから得た。ランダムヘキサペプチド配列をベクターFUSE5のpIII遺伝子内へ挿入した。9079抗体をBone Marrow Therapies R&D Group,Immunotherapy Division,S anta AnaのGinny Ofsteinから得た。他の材料： NHS-LC-Biotion、Pierce # 21335。ストレプトアビジン、Gibco #5532。 K91kan細胞、(Dr.George Smith、University of Missouriから得た)。 Terrific broth^TM，Gibco BRL #152-02711M NZY broth^TM、Gibco #M36350B。テトラサイクリン塩酸塩 Sigma #T-3383。ポリエチレングリコール8000、Sigma P-2139。塩化ナトリウム、Mallinckrodt #7581。カナマイシン１硫酸塩、Sigma #K-1377。 JTL2 オリゴヌクレオチドプライマー、(Operon,Technologies,Incから購入)。 JTL2:5’GCC CTC ATA GTT AGC GTA ACG ATC 3’ このプライマーは、FUSE5/X6ライブラリークローンのアンチセンス鎖のDNA配列決定を可能にする。 ABI Prism Cycle Sequencing Kit，ABI # 401434。方法ヘキサペプチドライブラリーを、上記のように２LのTerrific broth^TM(2Lフラスコ当たり500ml)中で増幅した。簡単に述べると、K91kan細胞をOD550約2.0まで 225rpm、37℃で増殖させた。線毛再生のための50rpmでの15分間の後、細胞をmoi 約１(細胞当り１ファージ粒子の感染多重度)でライブラリーで感染させた。感染を１晩進行させた。増幅したライブラリーをPEG/NaClで、約２Lから１mlに濃縮した。9079抗体をG . Smithの手順に従ってビオチン化した。３工程のペトリプレート(35mm)バイオパンニングをGeorge Smithの手順に従って実施した。１工程当りに使用したビオチン化9079抗体の量は以下のとおりであった：10μg(１回目のバイオパンニング) 、10μg(２回目のバイオパンニング)、1μg(３回目のバイオパンニング)(「10-1 0-1」)。バイオパンニングの各連続工程は、溶出されたファージの増幅の後に行った。５×1010TUライブラリーを１回目のバイオパンニングに使用した。３回目のバイオパンニング由来のテトラサイクリン／カナマイシン耐性コロニーを増殖させ、そしてバクテリオファージを含む上清をPEG沈殿した。DNAをPEG濃縮ファージからDNA配列分析のために調製した。 DNA配列をApplied Biosystems PRISM蛍光ジデオキシターミネーターおよびオリゴヌクレオチドプライマーJTL2を使用して、「サイクル」配列決定反応に従って決定した。４回目のバイオパンニングを、３回目の溶出物の増幅後に実施した。３つの異なる濃度の非ビオチン化9079抗体を使用した：0.02μg、0.1μgおよび１μg。上記のように、溶出されたクローンを増殖させ、そしてDNAを調製した。DNA配列分析を、上記のように、JTL2プライマーを使用して実施した。１μgの非ビオチン化9079抗体を使用する５回目のバイオパンニングを、増幅しないで、４回目のバイオパンニング溶出物を用いて実施した。 DNA配列分析を、５回目のバイオパンニング由来の14クローンについてJTL2プライマーを使用して実施した。上記の工程を繰り返した。結果全部で５工程のバイオパンニングを9079抗体およびヘキサペプチドライブラリーを用いて実施した。３回目および４回目のバイオパンニングのDNA配列分析により、CD34抗原との明白な相同性を持たない多くの異なるヘキサペプチド配列が示された。0.02μgおよび0.1μgの9079抗体での４回目のパンニングにより、多くの未挿入のクローンが示された。５回目のパンニングを、４回目のパンニングの間の１μgの9079抗体での溶出物を用いて実施した。14クローンのみをDNA配列分析に供し、そして未挿入のベクターを含むクローンはなかった。優勢なヘキサペプチド配列が、５回目のバイオパンニングから現れた。３、４および５回目のバイオパンニングクローンが表わす８つのペプチド配列を、潜在的な幹細胞放出試薬としての機能分析のために選択した。直鎖状ヘキサペプチドを用いる9079抗体のファージディスプレイ分析により、 CD34抗体と明白な直接的な相同性を持たない多数のヘキサペプチド配列が示された。この結果は、ペトリプレート上でバイオパンニングされる場合に561抗体で観測された結果に類似する(下記参照)。9079抗体は、561抗体(Dynal)によるCD34 抗原の認識をブロックし得る。561抗体と9079抗体との両方が６つのシステイン残基および唯一のアルギニン残基を含むCD34の領域(アミノ酸146〜219)を認識する可能性が存在する。荷電したアミノ酸によって安定化された可変性ループの認識により、多くの異なるヘキサペプチド配列の選択を生じ得る。４回目のバイオパンニングクローンの分析において未挿入クローンが同定されたことは、増幅していない３回目の溶出物の１年間の長さの保存の結果であり得る。未挿入クローンは、ヘキサペプチドを含むクローンよりも効率的に増殖することが知られており、そして長期間の保存の間により良好な生存性を有し得る。４回目のバイオパンニングの間の非常に低い9079抗体の濃度(0.02μgおよび0.1 μg)で、多数の非特異的で未挿入のクローンが溶出された。より高い抗体濃度( １μg)では、未挿入クローンはほとんど同定されなかった。５回目のバイオパンニングを、未挿入のクローンの選択の増強を回避するために、４回目の(１μg) バイオパンニングの増幅なしに実施した。５回目のバイオパンニング由来の分析した14のクローンのうち、未挿入クローンは同定されなかった。ビオチン化抗体の使用と非ビオチン化抗体の使用との両方を、ファージディスプレイバイオパンニングのために使用し得る。ビオチン化9079を、最初の３回のバイオパンニング工程のために使用した。非ビオチン化9069抗体を用いた成功したバイオパンニングの結果に基づいて、9079抗体を用いる次のバイオパンニングを非ビオチン化抗体を用いて達成した。 9079抗体を用いるエピトープペプチドファージディスプレイバイオパンニングにより、５回目のバイオパンニング工程が実施されるまでに、多数のヘキサペプチド配列が示された。これらの配列が、実際にCD34抗原の不連続なエピトープの全てまたは部分を表すかどうかは知られていない。多数の配列が同定されたことは、実際のエピトープ配列を模倣するミメトープ(mimetope)が選択され得たことを示唆する。３(１つ)、４(６つ)および５(１つ)回目のバイオパンニングから選択されたヘキサペプチドを表わす８つのペプチドを合成し、そしてKGla細胞に基づいたFACS アッセイにおける放出試薬として作用するそれらの能力について試験した。３回目のバイオパンニングのDNA配列分析(10μg-10μg-1μg)により、少なくとも29の異なる配列が示された。これらの配列のいすれもがCD34抗原配列に直接的な相同性を有さなかった。アルギニンの比較的高い存在が、クローンの約半数に見られた。３つのクローンによって表される下線を付した配列を、ペプチド合成および機能分析のために選択した。下線を付したペプチド配列を注文し、そして試験した。ペプチド配列に続く数字は、同一な、または5/6一致するクローンの数を示す。５回目のバイオパンニング(10-10-1-1-1)は、優勢な配列が現れたことを示す。このバイオパンニングを、４回目のバイオパンニングクローンの分析において見られた未挿入ファージベクターの増幅の間の過剰増殖を回避するために、４回目の溶出物の増幅をしないで実施した。実施例10 細胞に基づいたFACSアッセイを使用する9079抗体の放出試薬としてのペプチドの分析 9079抗体の３、４および５回目のバイオパンニングから選択した８つのヘキサペプチドを、可溶性を確実にするために必要であるとみなされるさらなる荷電した残基を有して合成した。これらのペプチドを、KGla細胞に基づいたFACSアッセイを用いて、可能性のある幹細胞放出試薬としての機能的活性について試験した。予備実験において、６つのペプチドが、細胞に予め結合した9079抗体の少なくとも50%の放出を示した。その高い結合親和性、化学的ビオチン化における機能的活性の維持、およびCD 34抗原の認識のキモパパイン耐性の性質のゆえに、9079抗体をさらなる試験のために選択した。抗CD34抗体9079を用いるファージディスプレイバイオパンニングにより、多数のヘキサペプチド配列が同定された(上記参照)。優勢な配列が、５回目のバイオパンニング中で同定された。３、４および５回目のバイオパンニングにおいて単離されたクローンを表す８つのヘキサペプチドを合成し、そしてKGla細胞に基づいたFACSアッセイにおいて試験した。FACSアッセイにおいて、ペプチドの６つが、KGla細胞に予め結合した 9079抗体の少なくとも50%の放出を示した。ペプチド(表18参照)は、Research Geneticsにより合成され、そしてそれらを精製しないで試験した。9069抗体および9079抗体を、Santa AnaのBaxter Immuno therapy Research groupから得た。9079抗体を特許の目的でブダベスト条約の規定の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託した；寄託番号 ATCC-HB-11885、寄託日1995年５月９日。9609抗体をポジティブコントロールとして使用し、そして9069Nペプチド(Ac-QQGWFP-KD)を用いて放出させた。このコントロールを、KGla細胞およびヤギ抗マウスFITC２次検出抗体について試験するために作用させた。561抗体について同定されたヘキサペプチド配列も、予め結合した9079抗体を置換するその能力について試験した。ペプチド(表18を参照のこと)を、Research Genetics Inc.,Hunstville，ALから購入した。 9079A-Gペプチドを、１%HSAを補充したDulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水(DP BS)中で可溶化した。9079A-Gペプチドを、0.05μgの9079抗体と結合した10^６の KGla細胞を用いて、FACScanアッセイにおいて試験した。561A-Eペプチド(下記の実施例13を参照のこと)を、0.05μgの9079抗体と結合した10^６のKGla細胞を用いて、FACScanアッセイにおいて試験した。9079Hペプチドを0.05μgの9079抗体と結合した10^６のKGla細胞を用いて、FACScanアッセイにおいて試験した。結果ペプチド9079A,B,C,D,FおよびHを可溶化した。9079Eペプチドは不溶性であり、それゆえ試験しなかった。9079A,B,C,D,F,GおよびHペプチドは、全て予め結合した9079の少なくとも50%の放出を示した。561A-Eペプチドはいずれも、予め結合した9079抗体を放出させ得なかった。抗CD34抗体9079について可能性のあるペプチド放出試薬の機能分析を、KGla細胞に基づいたFACSアッセイにおいて実施した。これらのデータは、9079抗体を用いたファージディスプレイバイオパンニングによって定義されたペプチドのみが、細胞結合9079を置換するように作用し得ることを示す。561抗体は、9079抗体とCD34抗原の共通のエピトープ領域を共有すると信じられている。しかし、561 抗体についてファージディスプレイ定義されたペプチドは、9079抗体に対して置換活性をなんら有さない。 9079ペプチドがCD34抗原タンパク質配列に対する直接的な相同性を有さないことは、これらのペプチドが天然のエピトープを模倣し得ることを示唆する。ペプチドの３つにおいてアルギニン残基が存在することは、561抗体によって認識されるペプチドに対する類似性を示唆する。位置付けられたCD34抗原の領域(アミノ酸150〜219)は、５つのみのアルギニン残基を含む。しかし、他のペプチドは疎水性残基を含み、このことは荷電した残基と疎水性残基の両方が、ペプチドが 9079抗体に強固に結合するために重要である可能性を示唆する。実施例11 561抗体および9079抗体についての放出試薬としてCD34抗原に由来する可能性のある抗原性ピークペプチドの分析 CD34抗原の11の可能性のある抗原領域を、MacVector^TM4.1ソフトウエアを使用して決定した。これらの領域の６つを表すペプチドを設計し、そして合成した。 KGla細胞に基づいたFACSアッセイを使用して、9079抗CD34モノクローナル抗体および561抗CD34モノクローナル抗体についての放出試薬としてのこれらのペプチドの実用性について試験した。試験したペプチドはいずれも、9079または561 抗体のどちらにも有意な放出活性を示さなかった。この研究の目的は、9079抗体および561抗体についての可能性のある幹細胞放出試薬を、公開されたCD34抗原タンパク質配列のコンピューター分析を介して定義することであった。ファージディスプレイ技術を介して別の放出試薬を定義することと平行して、本発明者らは、エピトープでありそうな領域についてCD34を研究することを選択した。免疫応答を誘起するためのタンパク質の構造的要求性の膨大な研究が、文献に報告されている。MacVector 4.1ソフトウエアは、タンパク質配列を試験しそして可能性のある抗原性ピークを定義することを可能する。この分析を、親水性、表面可能性(surface probability)およびChou-FasmanおよびRobson-Garnierの２次構造予測を用いるバックボーン可変性(backbone flex ibillty)予測からの情報を組み合わせてタンパク質の可能性のある露出表面ピークを同定するために設計した(MacVector^TM User's Manual,International Biote chnologies,Inc.，B59-B69ページ；Jameson,B.A.ら、1988 Comput．Applic.in t he Biosciences 4:181-186)。 CD34タンパク質の細胞外ドメインの分析により、長さが４個から８個のアミノ酸まで変化する11の可能性のある抗原性ピークが示された。9069抗CD34モノクローナル抗体で選択したファージディスプレイエピトープ配列とCD34抗原との以前の比較により、コンピューターで定義された可能性のある抗原性ピークの２つとの重複が示された。この知見および9079バイオパンニング実験および561バイオパンニング実験(上記を参照のこと)から引き出された結論に基づき、６つの抗原性ピークを、さらなる分析のために選択した。ペプチド(表19を参照のこと)は、Research Geneticsにより合成され、そしてそれらを精製しないで試験した。9079抗体をSanta Ana,CaliforniaのBaxter Imm unotherapy Reserch Groupから購入した。561抗体をDynal,AS.から得た。ペプチド(表19を参照のこと)を、Research Genetics,Inc.,Huntsville,ALから購入した。結果 11の可能性のある抗原性ピークを、CD34抗原配列中に定義した。ポジティブの (+)抗原性指標値を有するアミノ酸残基(+0.009〜＋0.441の範囲)を有意であるとみなした。６つのペプチドを設計し、合成し、そして放出試薬としての活性について試験した。ペプチド34A-Fは、KGla細胞に予め結合した9079抗体に対して放出活性をなんら示さなかった。ペプチド34A-Fは、KGla細胞に予め結合した561抗体に対して放出活性をなんら示さなかった。 9079抗体および561抗体を用いる４回のプレートバイオパンニング工程での、多数のヘキサペプチド配列の同定は、機能試験のためにどのペプチドを合成するかの容易な選択を妨げた。コンピューターで定義された可能性のある抗原性ピークに対応する、9069ファージディスプレイ選択ヘキサペプチド対応の認識は、90 79抗体および561抗体での同様の分析が、試験するべき少数のヘキサペプチドの選択において助けとなり得る可能性を示唆した。真のエピトープペプチドの定義に加えて、この分析は、どのディスプレイヘキサペプチドが、放出活性をより示しそうであり得るかをCD34抗原に対する相同性に基づいて選択することを助ける。 9079抗体および561抗体についての放出試薬としてのCD34抗原の可能性のある抗原性ピークを表すペプチドの機能分析を、KGla細胞に基づいたFACSアッセイにおいて実施した。接触するペプチド合成のコストを制限するために、６つのみの抗原性ピークを分析のために選択した。それらを、長さ(４アミノ酸より長い)、 9069エピトープ領域に対応しないこと、選択されたファージディスプレイ配列に対する類似性(9079および561の両方)、および／またはCD34抗原のアルギニンリッチ領域およびシステインリッチ領域内のそれらの位置ゆえに選択した。公開されたCD34抗原配列から定義された直鎖状の可能性のある抗原性ピークペプチドの機能試験では、9079抗体または561抗体についての新たなペプチド放出試薬の同定を生じなかった。直鎖状のペプチドが実際のエピトープの構造を模倣することができないことが、これらの抗体による認識のために重要であり得る。 561抗体を用いるヘキサペプチドおよび環状ペプチドライブラリーのバイオパンニング実験から引き出された結論は、特異的な非直鎖状構造のエピトープが認識されることを強く示唆する。環状ペプチドライブラリーから561抗体についてのコンセンサス配列を同定した。この配列は、可能性のある抗原性ピークペプチドの１つ(34D)に相同性を示した。このペプチド配列か不連続エピトープを反映するか否かは未知である。さらに、直接磁気ビーズに付着した561抗体を用いるヘキサペプチドライブラリーのバイオパンニングにより、CD34抗原の定義された可能性のある抗原性ピーク(N V S T)と良好な相同性を示す(5/6アミノ酸、CD34中のP A N V S T)３つのヘキサペプチドの１つ(P A N V S L)が同定された。この配列が４アミノ酸のみを有したので、これはペプチドを設計しそして試験したピークの中になかった。しかし、この４アミノ酸を含むペプチドは、561抗体についての放出試薬の良好な候補であると考えられる。 9069、9079および561抗CD34抗体の分析から集積されたデータは、抗原タンパク質の可能性のある抗原性ピークの決定は、可能性のある競合性エピトープペプチドを定義する時間を約し得る。定義されるピークと抗原における任意の既知の構造データとの相関、およびファージディスプレイで定義されるペプチドへの対応は、機能活性を試験するためのペプチド配列の選択において最も良好に教示する推測を可能にする。目的の特定の抗体が9069抗体の連鎖状のエピトープのような直鎖状のエピトープを認識し得るのであれば、このタイプの分析は労力を有するファージディスプレイ作業の開始を不用にし得る。しかし、抗体が構造的なまたは不連続的なエピトープを認識するのであれば、このタイプの分析は機能的な放出活性を有するペプチドを最も良好に支持し得るが、定義し得ない。可能性のある抗原決定基の分析：アルギニン残基およびシステイン残基を同定した。 PANVSTは、ビーズに付着した直接561抗体を用いたバイオパンニングにより同定されたPANVSLヘキサペプチドに相同なCD34抗原ヘキサペプチド配列であった。 TQGTFSは、9069抗体を用いたバイオパンニングにより同定されたTQGSFWおよび QQGWFPヘキサペプチドに相同なCD34抗原ヘキサペプチドであった。 NSSVQSは、9069抗体を用いたバイオパンニングにより同定されたNSSVGLヘキサペプチドに相同なCD34抗原ヘキサペプチドであった。実施例12ファージディスプレイ技術を介したヘキサペプチド配列の561抗体選択４つの優勢なペプチド配列を、それらの基本的性質である主要な特徴(各々が少なくとも２つのアルギニン残基を含有する)で同定した。優勢な配列においてC D34抗原タンパク質に対する直接的な相同性は観察されなかった。しかし、CD34 抗原全体の中て５つのみのアルギニン残基を含有するCD34抗原の領域(aa ＃ 149 〜219)に対する相同性が存在した。これらのデータは、561抗体がCD34抗原内の特異的な構造的エピトープを認識することを示唆した。直鎖状ヘキサペプチドライブラリーおよびK91Kan細胞をUniversity of MissouriのDr.George Smithから得た。ランダムヘキサペプチド配列を、ベクターFUSE5のpIII遺伝子内へ挿入した。561抗体4.7mg/mlをDynal A.S．Oslo,Norwayから得た。バイオパンニング手順は、上記実施例１に記載のとおりであった。他の材料は、以下のように得た：尿素、IBI 10×TBE緩衝液、BRL Amberlite、Sigma,St.Louis,MO アクリルアミド／ビス、BioRad,Richmond,CA TEMED、IBI、過硫酸アンモニウム、IBI、重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)、Sigma、透析BSA、Sigma、アジ化ナトリウム(NaN₃)、Sigma、エチレンジアミン四酢酸(Na₂EDTA)、Sigma、水酸化ナトリウム(NaOH)、RICCA Chemical Company、塩化水素(HCl)、Mallinckrodt、ホルムアミド、USB、カナマイシン、Sigma、塩化カリウム(KCl)、Mallinckrodt、塩化ナトリウム(NaCl)、Sigma、酢酸ナトリウム(NaOAc)、Sigma、氷酢酸、Sigma、リン酸アンモニウム、Mallinckrodt 水酸化アンモニウム(NH₄OH)、Sigma、 NZY、GIBCO、 PEG 8000、Sigma、 Bacto Agar、DIFCO、Cat.＃0140-01 Prism Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit、Perkin E LMER、 CENTRI SEP Spin Columns、Princeton Separations、オリゴヌクレオチドプライマー−Operon,Inc.により合成されたプライマーは公開されたバクテリオファージfl配列(Hill.,D.F.ら、J.Viorogy 4 4:32-46、1982)の1533位〜1556位および1714位〜1737位の相補に同一である。 Gene Amp PCR system 9600、Perkin ELMER Cetus、Metrology 8451A DIODE Arra y Spectrophotometer、Hewlett Packard 373A DNA Sequencer−Applied Biosyst ems MacVector^TM4.1 DNA Sequence Analysis Software-International Biotechn ologies,Inc．方法：ヘキサペプチドライブラリーを２Lのterrific broth(２Lフラスコ当り500ml) 中で増幅した。簡単に述べると、K91kan細胞をOD550約2.0まで225rpm、37℃で増殖させた。線毛再生のための50rpmでの15分間の後、細胞を10μl(約10¹²の物理的粒子)の１次ライブラリーで感染させた。増幅したライブラリーをPEG/NaClで、約２Lから１mlに濃縮した。増幅したライブラリーの力価を測定した。７回のバイオパンニングを上記実施例１に記載のように実施した。１工程当りに使用した561抗体の量は以下のとおりである：28μg(１回目のバイオパンニング)、14μ g (２回目のバイオパンニング)、5〜10μg(３回目のバイオパンニング)、１μg(４回目のバイオパンニング)、１μg(５回目のバイオパンニング)、２μg(６回目のバイオパンニング)、1.5μg(７回目のバイオパンニング)(「28-14-10-1-1-2-1.5 または28-14-5-1-1-2-1.5」)。バイオパンニングの各連続工程を、溶出ファージの増幅の後に行った。５×10¹⁰TUのライブラリーを１回目のバイオパンニングに使用した。３〜７回目のバイオパンニング油来のテトラサイクリン／カナマイシン耐性コロニーを増幅させ、そしてバクテリオファージを含む上清をPEG沈殿した。DNAを、PEG濃縮ファージから、DNA配列分析のために調製した。DNA配列をAp plied Biosystems PRISM蛍光ジデオキシターミネーターおよびオリゴヌクレオチドプライマーJTL2を使用して、「サイクル」配列決定分析に従って決定した。結果：環状ペプチドライブラリーの増幅の結果、2.5×10¹³TU/ml(TU＝形質導入単位) の最終力価、約１mlを得、4℃で保存した。７回のバイオパンニングからの結果を表21に示す。３、４、５、６および７回目のバイオパンニングから選択された220の細菌クローンについてDNA配列分析を決定した。３回目および４回目のバイオパンニングのDNA配列分析により、１つの優勢な配列が示された(表21)。さらに３つの優勢なヘキサペプチド配列が、６回目および７回目のバイオパンニングから現れた(表22)。これらのヘキサペプチド配列の主要な特徴は、それらの基本的な性質である、各々が少なくとも２つのアルギニン残基を含有することである。優勢なペプチド配列とCD34抗原との直接的な相同性は同定されなかった。 CD34抗原中の５つのみのアルギニン残基が、細胞外ドメイン(アミノ酸149〜21 9)中に存在した。３、４、５、６および７回目のバイオパンニングクローンを表す５つのペプチド配列(A〜E)を、可能性のある幹細胞放出試薬としての機能分析のために選択した。直鎖状ヘキサペプチドライブラリーを用いた561抗体のファージディスプレイ分析により、CD34抗原に対して明白な直接的な相同性を有さない４つの優勢なヘキサペプチド配列が示された。この結果は、ペトリプレート上でバイオパンニングを行った場合に9079抗体で観察された結果に類似している。561抗体は、9079 抗体によるCD34抗原の認識をブロックし得る。561抗体と9079抗体との両方が６つのシステイン残基および５つのみのアルギニン残基を含有するCD4の領域を認識する可能性がある。荷電したアミノ酸によって安定化される可変性のループの認識は、不連続なエピトープによって認識されるヘキサペプチド配列の選択を生じ得る。 561抗体を用いるヘキサペプチドライブラリーのバイオパンニングにより、４つの優勢な配列(561ペプチドA〜D)の同定を生じた。これらのヘキサペプチド配列は、高度に荷電した残基および親水性残基の両方を含み、このことは環状ペプチドバイオパンニング分析(実施例12を参照のこと)および561-Dynabeadを使用した直鎖状ヘキサペプチド選択(実施例13を参照のこと)から引き出された結論によっても支持される。アルギニン残基を含有するペプチドの繰り返し選択は、タンパク質の細胞外ドメイン中に５つのみのアルギニン残基を含有するCD34抗原内の領域(a.a.＃149〜219)の特異的認識を示し得る。バイオパンニングから選択されたヘキサペプチドを表す５つのペプチドを合成し、そしてKGlaまたはtHL60細胞に基づいたFACSアッセイにおいて放出試薬として作用するそれらの能力について試験した。これらのペプチドのうち２つ(561C おとび561D)は、KGla細胞に予め結合した561抗体を放出し得る。実施例13 561-直接磁気ビーズを使用するファージディスプレー技術を介してのヘキサペプチド配列の561抗体選択４つの優勢ペプチド配列が、主な特性（高度に荷電しそして疎水性の性質である）により同定された。これらのデータは、561により認識されるCD34エピトープの構造が、おそらく疎水性の残基を含有し、荷電したアミノ酸を介するイオン性相互作用により安定化されたループを含有しそうであることを示唆する。優勢ヘキサペプチドの１つであるPANVSL(561Q)は、CD34抗原(PANVST)に対する直接的な相同性を有する。 561抗体に対する高い親和性を有するファージ保有ペプチドを、固相ペトリ皿上に固定化された561抗体を使用して、低親和性を有するファージ保有ペプチドから、上記の実施例１に記載のように選択した。しかし、精密な親和性識別は困難であった。これはおそらく、結合がファージの親和性と結合活性(avidity)の両方に支配されたからである（Clarkson,T.ら，1991，Nature 352:624-628）。別の選択方法は、溶液中でのDynabeadsに直接結合した561(561-ビーズ)へのファージペプチドの結合に基づいた。次いで、高親和性のファージペプチドを、限られた量の抗体に競合させることにより富化した。このスキームは、多くの低親和性のファージを、稀な高親和性変異体の結合により、競合して除外すると考えられる。溶液中のペプチドエピトープを、２つの異なるロットの561ビーズCEL R21およびCEL R73を有するヘキサペプチドライブラリーを使用することにより選択した。４つの優勢直鎖状ヘキサペプチド配列を、主な特性（それらの高度に荷電しそして疎水性の性質）により選択および同定される。これら４つのペプチドのうちの３つ（561Ｍ、Ｐ、およびＱ）は、予めKGlaまたはtHL60細胞に結合した561抗体を放出し得た。直鎖状ヘキサペプチドライブラリーは、University of MissouriのDr.George Smithより得た。ランダムヘキサペプチド配列を、ベクターFUSE5のpIII遺伝子に挿入した。Dynabeads M-450 CD34(561)バッチCEL R21およびCEL R73は、Dynal A ．S．Oslo，Norwayより得た。バイオパニング手順は、上記の実施例１に記載したように行った。ヘキサペプチドライブラリーを、２Ｌのterrific broth（２Ｌフラスコあたり500ml）中で増幅させた。簡略に述べると、K91Kan細胞を、225rpmで37℃にてOD550約2.0まで増殖させた。繊毛の再生のための50rpmでの15分間後、細胞を10μl（約10^-12の物理的粒子）の１次ライブラリーで感染させた。増幅したライブラリーを、PEG/ NaClで、約２Ｌから１mLに濃縮した。増幅したライブラリーを力価測定した。４回のバイオパニングを、以下の手順に従って行った。561-Dynabead分子に対するファージ粒子の３つの異なる比（100:１、10:１および１：１）を使用した。各々の一連のバイオパニング工程の前に、溶出したファージを増幅した。１×10¹¹ TUのライブラリーを、最初のバイオパニングにおいて使用した。第３回目および第４回目のバイオパニング由来のテトラサイクリン／カナマイシン耐性コロニーを増殖させ、そしてバクテリオファージを含有する上清をPEG 沈殿させた。 DNAを、PEG濃縮したファージから、DNA配列分析のために調製した。 DNA配列を、Applied Biosystems PRISM蛍光ダイデオキシ(dyedeoxy)ターミネーターおよびオリゴヌクレオチドプライマーJTL2を使用する「サイクル」配列分析に従って決定した。DNA配列分析を、CEL R21 561-Dynabeadsを使用する４回目のバイオパニングから選択した160個の細菌クローンについて決定し、２つの優勢配列を同定した。DNA配列分析を、CEL R21 561-Dynabeadsを使用する３回目および４回目のバイオパニングから選択した160個の細菌クローンについて決定し、さらに２つの優勢配列を同定した。これらのヘキサペプチド配列の主な特性は、それらが高度に荷電したおよび疎水性の両方である残基を含有することである。優勢のペプチド配列のCD34抗原に対する直接的な相同性は、全く同定されなかった。電荷および疎水性における類似性が、優勢直鎖状ヘキサペプチドと細胞外ドメインのCD34抗原領域（アミノ酸番号149〜約219）との間に観察された。溶液中でのCEL R21 561ビーズを用いるファージディスプレーバイオパニングは、２つの優勢直鎖状ヘキサペプチド配列561L:TCTNCHおよび561M:ACKWCRを選択した。溶液中での同じバイオパニングを、異なるロットの(CEL R73)561ビーズを使用して繰り返し、ペプチドM:ACKWCRに加えて２つの優勢配列561P:QKTDAYおよび561Q:PANVSLを同定した。４つの優勢ヘキサペプチド配列は全て、高度に荷電しそして疎水性の残基を含有する。(PANVSL)は、CD34抗原（PANVST、アミノ酸番号93〜97）に直接的な相同性を有する。これらのデータは、561抗体により認識されるCD34エピトープの構造が、おそらく荷電したアミノ酸を介するイオン性相互作用により安定化された疎水性残基を含有するループを含有するらしいことを示唆する。561抗体により認識されるCD34抗原のエピトープ全体は、アミノ酸93 〜97のPANVST領域、およびアルギニンリッチ領域内のループを含有する不連続な領域であり得る。これら４つの優勢ペプチド（561 Ｌ、Ｍ、Ｐ、およびＱ）を合成し、そしてKG laまたはtHL60細胞に基づくFACSアッセイにおいて放出剤として作用する能力を試験した。これらのペプチドのうち３つ（561 Ｍ、Ｐ、およびＱ）は、予めKGla またはtHL60細胞に結合した561抗体を放出させ得た。実施例14 ファージディスプレー技術を介する環状ペプチド(XCX₆CX)の561抗体選択優勢環状ペプチド配列を、制限(constrained)ループライブラリ−XCX₆CXから同定した。このライブラリーにおいて、Ｘは、TrpまたはMetを除く任意のアミノ酸であり得る。各々１〜３のファージクローンにより表される複数の変異体配列も同定された。コンセンサス配列については、CD34抗体への直接的な相同性は観察されなかった。しかし、潜在的な抗原性のピークに対応するCD34抗原領域の関連性が同定された。これらのデータは、561抗体が、CD34抗原内の特異的で構造的なエピトープを認識することを示唆する。この研究の目的は、561抗体に対する潜在的な幹細胞放出剤を同定することであった。以前のファージディスプレー研究（上記の実施例12を参照のこと）は、 561抗体を結合する５つの直鎖状ヘキサペプチド配列を同定した。これらのヘキサペプチド配列の主な特性は、各々が少なくとも２つのアルギニン残基を含有する、それらの塩基性の性質である。これらのペプチドのうち２つ（561Cおよび56 1D）は、予めKGla細胞に結合した561抗体を放出し得た（データは示さず）。出版されたCD34抗原タンパク質配列の調査は、直鎖状ヘキサペプチドに対するいかなる直接的な相同性を明らかにしなかった。CD34抗原細胞外ドメイン（アミノ酸150〜219）において、５つのアルギニン残基のみが存在する。この領域はまた、６つのシステイン残基のみを含有するCD34の配列(stretch)（アミノ酸146〜 211）である。この領域におけるCD34抗原の構造は、潜在的に複数の荷電した残基により安定化された３つのジスルフィド結合したループを含有する。この分析は、561抗体が直鎖状ペプチドよりも容易に、制限環状ペプチドに優先的に結合し得るることを示唆する。環状ペプチドループが、fdファージの表面に発現される、制限ライブラリーの 561抗体を用いるバイオパニングを行った。優勢環状ペプチド配列およびこのモチーフの複数の変異体を同定した。優勢ペプチド配列の環状形態の調製は、幹細胞放出剤としての機能的試験に欠くことができない。 Dr.Jamie Scott(Simon Fraser University,Vancouver,British Columbia)から得られた制限環状ペプチドライブラリーを、ベクターF88.4中に構築した。このベクターは、テトラサイクリン耐性遺伝子を有し、そして２つのpVIII遺伝子、すなわち、野生型および環状ペプチド配列を含有する合成遺伝子を有する。pVII I遺伝子は、線状バクテリオファージの主要なコートタンパク質をコードする。F 88.4ベクターにおいて、さらなる環状ペプチドループを含有するコートタンパク質に加えて、正常な野生型のコートタンパク質が作られる。バイオパニング手順を、直鎖状ヘキサペプチドの選択のために上記のように行った。スーパーブロス(super broth)：バクトトリプトン、Difco Lot 9761；酵母エキストラクト、Difco Lot 795698、塩化ナトリウム、Aldrich #7647-14-5、Lot 12327CX。NZYブロス、Gibco #M36350B、Lot 1 1H1026B。Operon,Technologies,I nc.より購入したJTL5オリゴヌクレオチドプライマー。JTL5：5’TTT GAT GCC AA T AGT AGC ACC AAC GAT AAC 3'。このプライマーは、F88.4/XCX6CXライブラリークローンのアンチセンス鎖のDNA配列決定を可能にする。561抗体（4.7mg/ml）は、Dynal ASより得た。他の材料は、上記のとおりであった。方法：環状ライブラリーを、４Ｌのスーパーブロス（２Ｌのフラスコあたり500ml）中で増幅した。簡略に述べると、K91kan細胞を、OD550=1.73まで、225rpmで37℃ にて増殖させた。繊毛再生のための50rpmで15分間後、細胞をmoi=1（１細胞あたり１ファージ粒子の感染多重度）でライブラリーで感染させた。増幅したライブラリーを、PEG/NaClで約4.4Ｌから約９mlに濃縮した。増幅したライブラリーを力価測定した。４工程のバイオパニングを、上記のように行った。工程あたり使用した561抗体の量は、10μg−１回目のバイオパニング、10μg−２回目のバイオパニング、 1μg−３回目のバイオパニング、および1μg−４回目のバイオパニング（「10-1 0-1-1」）であった。バイオパニングのそれぞれの連続的な工程の前に、溶出したファージの増幅を行った。５×10¹⁰TUのライブラリーを、１回目のバイオパニングに使用した。４回目のバイオパニング由来のテトラサイクリン／カナマイシン耐性コロニーを増殖させ、そしてバクテリオファージを含有する上清をPEG沈殿させた。 DNAを、PEG濃縮されたファージからDNA配列分析のために調製した。 DNA配列を、Applied Biosystems PRISM蛍光ジデオキシターミネーターおよびオリゴヌクレオチドプライマーJTL5を使用する「サイクル」配列決定反応に従って決定した。 CD34抗原の潜在的抗原性プロファイルを、MacVector^TM4.1ソフトウェアを使用して決定した。結果環状ペプチドライブラリーの増幅を行い、最終力価2.5×10¹³TU/ml(TU=形質導入単位)（約９ml）を得、４℃にて貯蔵した。４回のバイオパニング工程を行った。DNA配列分析を、４回目のバイオパニング由来の細菌クローンについて決定した。優勢環状ペプチド配列（24クローン）を、DNA配列の翻訳をして同定した（以下の表26）。複数の変異体環状ペプチド配列を同定し、それぞれは、１〜３の異なるクローンにより表された（以下の表26）。 CD34抗原に対する優勢環状ペプチド配列の直接的な相同性は同定されなかった。電荷および疎水性における類似性が、優勢環状ペプチド配列と潜在的な抗原性ピークにも対応するCD34抗原の領域との間に観察された。 561抗体を用いるファージディスプレーバイオパニングは、以下の優勢環状ペプチド配列を選択した：QCIDEFLRCI。この１次モチーフに関連する複数の変異体も同定された。この分析は、ループ内に６つのアミノ酸を含有するループ化ペプチドが、561抗体により結合され得ることを示す。その特異的アミノ酸組成および配列は、おそらくCD34抗原の本来のエピトープに類似するかまたは模倣する。優勢配列の複数の変異体は、主な環状ペプチドの一般的な特徴が、561抗体に結合するために必要とされることを示す。ループ化ペプチド内の高度に荷電しそして疎水性の残基は、直鎖状ヘキサペプチドバイオパニング分析から以前に導かれた結論を支持する（上記の実施例12）。アルギニン残基を含有するペプチドについての繰り返された選択は、タンパク質の細胞外ドメイン内に５つのアルギニン残基のみを含有するCD34抗原内の領域の特異的な認識を示し得る。Ｆ（フェニルアラニン）およびＬ（ロイシン）のような疎水性残基の一貫した存在は、非イオン的相互作用もまた、561抗体により認識されるエピトープの一部であることを示唆する。これらを考え合わせると、このデータは、561抗体が、構造的に制限されたペプチド配列を認識し得ることを示唆する。環状ペプチドライブラリーのバイオパニングにおけるコンセンサス配列および直鎖状ヘキサペプチドライブラリーのバイオパニングにおける複数の配列の同定は、561抗体がC D34抗原のアルギニンリッチでかつシステインを含有する領域内（アミノ酸146〜 219）に提示されるエピトープを認識することを示唆する。561抗体により認識されるCD34エピトープの構造は、おそらく、荷電したアミノ酸を介してイオン性相互作用により安定化された疎水性残基を含有するループを含有するようである。直鎖状のヘキサペプチドライブラリーの直接磁性ビーズに付着した561抗体を用いるバイオパニングは、CD34抗原(PANVST)に直接的な相同性のある１つのヘキサペプチド(PANVSL)の同定を生じた。561抗体により認識されるCD34抗原のエピトープ全体は、アミノ酸93〜98のPANVST領域およびアルギニンリッチ領域内のループを含有する不連続な領域であり得る。幹細胞放出剤としての環状ペプチドの機能試験は、直鎖形態の優勢環状ペプチド配列の充分量の合成およびそれに続く、化学的な環状化、および環状したペプチドのHPLC精製を待つ。最初の試験は、KGlaまたはtHL60細胞に基づくFACSアッセイを使用して行われる。環状ペプチドが競合して予め結合していた561抗体を外し得る場合、そのペプチドは、小規模のビーズアッセイで試験される。最後の A)において行われる。環状ペプチド配列(XCX₆CX)は、F88.4ベクター中のp8遺伝子の合成コピー内のヌクレオチド70〜100位（コード領域の）にコードされている。３位のヌクレオチドは、野生型のコドンから変化し、野生型遺伝子との遺伝的組換えを防止する。p8遺伝子の両方のコピーが発現され、バクテリオファージの１本鎖DNAをパッケージングする環状ペプチドを含有するコートタンパク質と混合された、正常な主なコートタンパク質を生じる。 JTL5オリゴヌクレオチドプライマーは、アンチセンス鎖（逆鎖）のヌクレオチド228〜199位(5'--->3')に位置する。 CD34抗原に対する環状ペプチドの相同性は、直接的ではなく、１つのアミノ酸に対して別のアミノ酸てある。１つのアラインメントは、アミノ酸168〜171およびおそらく175のアルギニンに相同性を有する；別のアラインメントは、おそらくアミノ酸177〜181に相同性を有する。CD34抗原のアミノ酸168〜184に由来する潜在的なジスルフィド結合したループは、ループの始まりと終わりとに相同性を有する環状ペプチドのようなより小さなループにより模倣され得る。下線部は、MacVactor 4.1フトウェアを使用して決定された抗原性潜在性を有する。CD34抗原に対する環状ペプチドの相同性は、直接的ではなく、１つのアミノ酸に対して別のアミノ酸である。アラインメントａは、アミノ酸168〜171およびおそらく175のアルギニンに相同性を有する；アラインメントｂは、アミノ酸1 77〜181に相同性を有する。CD34抗原のアミノ酸168〜184に由来する潜在的なジスルフィド結合したループは、ループの始まりと終わりとに相同性を有する環状ペプチドのようなより小さなループにより模倣され得る。実施例15 561抗体に対する放出剤としてのペプチドにおよぼすpHの効果 561、抗CD34抗体を用いるファージディスプレー技術を介して同定された５つのペプチドを、KGla細胞を使用する細胞に基づくFACSアッセイで試験した。５つのペプチドは全て、予め結合した561抗体に、pH4において有意な放出活性を示し、pH7では示さない。粗製ヘキサペプチドとは異なり、HPLCで精製された561Cおよび561Dペプチドは、放出活性を示さなかった。予め結合した561抗体を置換するペプチドの能力に対するpHの影響を検査した。ペプチド（以下の表27を参照のこと）は、Rasearch Geneticsにより合成され、そして精製せずに試験した。9069抗体をポジティブコントロールとして使用し、 9069Nペプチド(Ac-QQGWFP-KD)を用いて放出した。このコントロールは、KGla細胞およびヤギ抗マウスFITC２次検出抗体を試験するために供された。561抗体について同定されたヘキサペプチド配列を、予め結合した561抗体を置換するそれらの能力について試験した。粗製ペプチド（以下の表27を参照のこと）を、Rasearch Genetics Inc.,Hunts ville,ALより購入した。精製した561Cおよび561Dペプチドを、American Peptide Company,Sunnyvale,C aliforniaから購入した。方法： HPLCで精製したペプチド561CおよびＤを、細胞に基づくKGla FACSアッセイで試験した。粗製のおよび精製した561Cおよび561DペプチドのpHを検査した。精製した561DペプチドのpH４および６での機能的な放出活性を試験した。精製した561Cおよび561DペプチドのpH４、５、６、７、８および９での機能的な放出活性を試験した。 pH７に調整した、またはpH未調整の（約pH3.8〜4.3）粗製561A、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、CDR2H、CDR2L、CDR3H、CDR3L、34B、34C、34D、34E、および34Fペプチドの機能的な放出活性を試験した。結果： HPLCで精製した561CおよびDペプチドは、細胞に基づくFACSアッセイで放出剤として機能しなかった。粗561Cおよび561Dペプチドは、約pH４で溶解した。 HPLCで精製した561CおよびDペプチドは、約pH６で溶解した。約pH４に調整した精製した561CおよびＤペプチドは、放出剤としての機能的な活性を生じた。 pH４〜９で試験した精製した561CおよびＤペプチドは、pH４またはpH９で細胞に基づくFACSアッセイにおける有意な放出活性を示すのみであった。 pH未調整の（約pH3.8〜4.3）粗製ペプチド561C、Ｄ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、CDR2H、およびCDR3Lペプチドは、細胞に基づくFACSアッセイで機能的な放出活性を示した。pH７では、これらのペプチドはどれも放出活性を示さなかった。粗製ペプチド561A、Ｂ、CDR2L、CDR3H、34B、34C、34D、34E、および34Fは、未調整のpH（約pH４）またはpH７で機能的な放出活性を示さなかった。ファージディスプレーで定義されるヘキサペプチドの561抗体放出剤としての有効性を、異なるpH値で分析した。低pH（約４）では、561C、Ｄ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、 CDR2H、およびCDR3Lペプチドは、KGla細胞に基づくFACSアッセイにおいて有意な放出活性を示した。これらのペプチドは、pH６またはpH７で放出活性を示さなかった。放出活性はまた、pH９において561Dペプチドについて観察された。活性な放出ペプチドの有用性は、単離されるべき幹細胞に有害でない条件を必要とする。pH４で30分間インキュベーション後の細胞の短期間の生存性は良好であったが、しかし、長期間の影響は研究しなかった。 561抗体配列の検査は、相補性決定領域(CDR)が、複数の(6)アスパラギン酸残基および２つのヒスチジン残基を含有することを示す。これらのアミノ酸は、より低いpHで影響される。アスパラギン酸基のプロトン化は、CD34抗原とのイオン性相互作用を中和するように作用し得、従って、解離を促進する。ペプチドが低 pHでさえも完全な解離を生じ得ないことは、これらのペプチドが、561抗体により認識される本来のCD34エピトープの真の配列／構造を適切に模倣しないことを示唆する。コンセンサスな環状ペプチドおよび複数の保存的な変異体の同定は、制限ペプチドが、好ましいペプチド結合モチーフであり得ることを示す。放出反応におよぼすpH９の影響は理解されていない。561抗体は、ペプチドの放出を補助する構造変化を被り得る。ファージディスプレーにより定義されたペプチドの放出剤として作用する能力に対する観察されたpHの効果は、561抗体に特異的である。9069NペプチドでのpH の滴定は、KGla細胞に結合した9069抗体に対する放出活性に影響しない。任意の抗体についてのペプチド放出剤を選択し、定義し、そして最適化する能力は、所定の抗体の特異的な生化学的特性およびその抗体とのその特異的相互作用に依存する。 FACSアッセイての561放出の改変のまとめ： 561抗体からの捕獲されたCD34＋細胞のペプチド依存性の放出を増強する化学試薬の能力を検査した。これらの実験の目的は、ファージディスプレーで選択されたペプチドが、結合した抗体の放出を誘引し得る穏やかな条件（pH４より高い）を、確立し得るか否かを決定することであった。以前の研究では、効果的な細胞放出のためには低pH（約pH４）が必要であることが示された。低pHに放出された細胞の長期間の生存性は未知であるため、pHをより中性の値（約pH５〜７）に変え得る条件が望ましかった。タンパク質の静電相互作用および水素結合相互作用に影響することが公知である試薬を、排除体積ポリマーに加えて試験した。これらの研究には、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、ポリエチレングリコール(PEG)、フィコール、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸プロタミン、スペルミン、およびポリブレンが包含される。酢酸ナトリウムのみが、CD34＋選択細胞のペプチド媒介性放出のための増強剤として有意な活性を示した。561抗体可変領域のCDR（相補性決定領域）での複数の(6)アスパラギン酸残基の存在は、抗原／抗体結合裂け目(cleft)の表面での高度に荷電した相互作用を示唆する。酢酸のアスパラギン酸側鎖を模倣する能力は、塩化ナトリウムではなく酢酸ナトリウムの放出を増強する能力を説明し得る。あまり劇的でない結果が、塩化マグネシウムおよびPEGで得られた。試験した他の化合物は全て、ペプチド媒介性細胞放出の有意な増強を示さなかった。実施例16 抗体／エピトープ相互作用の競合剤としてのグルタミン酸リッチペプチドグルタミン酸リッチペプチドを、その抗原に結合している特異的な抗グルタミン酸リッチエピトープ抗体（抗glu-glu）の競合剤として作用するその能力について試験した。この研究を、グルタミン酸リッチ配列を含有する組換え抗CD34分子（次いでこれは特異的な抗glu-glu抗体に捕獲され得る）を構築する可能性を確立するために開始した。競合的ペプチド放出剤を、可能性のある、コストに効果的な薬剤として確立した。この研究はまた、細胞捕獲抗体に対する放出剤として使用するための特異的ペプチドを同定し、そして特徴づけるための計画を支持する。グルタミン酸リッチペプチドを、その抗原に結合している特異的な抗グルタミン酸リッチエピトープ抗体（抗glu-glu）の競合剤として作用する能力について試験した。このアッセイを、競合的ELISA形で行った。この研究を、グルタミン酸リッチ配列を含有する組換え抗CD34抗体（これはヒト幹細胞を捕獲するために使用され得る）を構築する可能性を確立するために開始した。競合的ペプチド放出剤を、捕獲された幹細胞の放出のための可能性のある、コストに効果的な薬剤として確立した。 glu-glu抗原の供給源は、細菌の溶解物の形態の、glu-gluタグ配列(=SCA-EE) を含有するこのglu-glu抗原性配列(TAI)を含有する単鎖抗体であった(Dade Diag nostics,Miami,Florida)。抗glu-gluモノクローナル抗体をまた、この群から得た。試験薬剤は、glu-gluペプチド(AEEEEYMPMEG,American Peptide Company,Sun nyvalle,CA)、グルタミン酸、ジグルタミン酸、ポリグルタミン酸、およびポリアスパラギン酸（全てSigmaから）を包含した。ヤギ抗マウスIgG(H+L)に結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ、TMB基質、および過酸化水素を、KPL(Gaithersburg,MD)から購入した。 SCA-EE(15および30μg/ml)を、マイクロタイターディッシュをコートするために使用した。抗glu-glu抗体(抗EE)を、０〜2187ng/ml添加して、抗体の滴定(titration)を確立した。HRPヤギ抗マウスIgG(H+L)およびTMB薬剤を使用して結合した抗体を検出した。吸光度の読みとりは、450nmで測定した。 SCA-EEを、マイクロタイターディッシュをコートするために使用し、次いで、 50〜300ng/mlの抗EEを添加した。プレートを洗浄し、次いで、競合剤を添加した。 100nM〜100μM ペプチド(A-EEEEYMPME-G) 500nM〜500μM グルタミン酸(Ｅ) 250nM〜250μM ジグルタミン酸(EE) 1nM〜1μM ポリグルタミン酸(EEEEEEEEEEEE) 1nM〜1μM ポリアスパラギン酸(DDDDDDDDDDD) 残存する抗EEモノクローナル抗体の量を、HRP結合ヤギ抗マウスIgG(H&L)およびTMB薬剤により検出した。吸光度の読みとりは、450nmで測定した。抗glu-glu抗体を、SCA-EEを用いて滴定した。分析した５つの異なる試薬のうち、glu-gluペプチドのみが、結合した抗EE抗体を置換し得た。これらの実験は、予め結合した抗体をその抗原から置換する、特異的な短いペプチドの能力を確認した。試験した他の薬剤は、抗体と競合してはずすことにおいて有効でなかった。この観察は、ペプチド抗体相互作用の特異的な性質を支持する。組換えタンパク質へのペプチドエピトープ配列の組込みは、抗glu-glu抗体を用いるそのタンパク質の捕獲、およびそれに続くペプチドを用いる競合的放出を可能にする。抗CD34抗体の組換え形態である9069は、glu-glu配列を含有するように構築され得る。抗glu-glu抗体を、磁性ビーズに結合し得る。捕獲されたCD3 4+細胞の放出は、次いてglu-glu抗体の添加により達成される。放出された細胞は、依然として、抗CD34抗体を結合したままである。実施例17 抗BrCa抗体放出ペプチド上記の実施例１に記載したようにバイオパニングを行い、9178抗乳ガンモノクローナル抗体をこの乳ガン抗原を有する細胞から放出し得るペプチドを同定した。9187モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ(Baxter Hyland,Hayward,C alifornia)を、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville,Maryland に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により寄託した。9187ハイブリドーマには、寄託番号ATCC HB-11884が指定された（199 5年５月９日に有効）。実施例18 ペプチド放出プロセスを使用する正常動員(mobilized)化ヒト末梢血からのCD34+ 細胞の選択ヒト末梢血からのCD34-細胞の選択のためのペプチド放出プロセスの確認を、I 放出剤として9069Nペプチドを用いる10個のCD34+細胞選択を、正常なボランティアドナー由来のG-CSF動員末梢血を使用して行った。アフェレーシス単位全体を、それぞれの選択において処理した。出発末梢血単核細胞生産物は、0.45％〜1.75％の出発CD34+細胞含量を有する2 .4×10¹⁰〜4.48×10¹⁰単核細胞を含有した。捕獲細胞を放出するために使用される 9069Nペプチドは、凍結乾燥形態(N=6実験)または液体形態(N=4実験)にあった。F ACS分析およびコロニーアッセイを全ての選択生産物に対して行った。 G-CSF動員末梢血生産物を、正常なボランティアドナーから得た。凍結乾燥生産物として使用した9069Nペプチド(Ac-Gln-Gln-Gly-Trp-Phe-Pro-Lys -Asp)は、American Peptideから得た。 9069Nペプチド,Bachem,C/N。液体産物として使用した9069Nペプチドは、Baxter( Immunotherapy?)から得た。 9C5 mAb(9069 mABとしても先に記載される、ATCC# HB-11646)を、Baxter Immuno therapy Divから得た。 25％ HSA、Baxter,Hyland Div．４％クエン酸ナトリウム、Baxter Code 4B7867 ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水(Ca²⁺、Mg²⁺非含有)、Bio-Whittaker 滅菌水、Baxter,Hyland Div.、Code 3475および3476 ヒツジ抗マウスIgGでコートしたParamagnetic Beads、Dynal、P/N 420-02 Millex-6V 0.22μm Sterile Filter Unit、Millipore 600mL Transfer Pack、Baxter、Code 4R2023 1,000mL Transfer Pack、Baxter、Code 4R2032 2,000mL Transfer Pack、Baxter、Code 4R2041 Sample Site Coupler、Baxter、Code 4C2405 X-Vivo 10、Bio-Whittaker C/N 04-6950 Plasma Transfer Sets、Baxter、Code 4C2243 Sterile Syringe、Baxter 12×75mm P/P w/cap Tube、Baxter、C/N T1340-102 12×75mm Culture Tube、Baxter、C/N T1225-3 16G１1/2Precision Glide Needle、Becton Dickinson Simultest Control(マウスIgG₁およびIgG_2a)、Becton Dickinson Simultest Leucogate Control、Becton Dickinson CD45-FITC、Becton Dickinson CD34-PE、Becton Dickinson カルセイン、Molecular Probes、Inc．マウスIgG、Calbiochem Beckman GS-6R Centrifuge Sysmex F-500 Automated Particle Counter Terumo SCD 312、Sterile Connecting Device カルセイン（生存性染色）を調製するために、５μLの４mMカルセインを、５mL のDPBSに添加してストック溶液を形成した。これを、暗所４℃にて５日間まで貯蔵した。カルセインの作業溶液(working solution)を、４mMカルセインの１：８希釈でDPBS中に調製した。これを、暗所４℃にて10時間まで貯蔵した。それぞれの末梢血単核細胞(PBMC)産物を、600mLのTransfer Packに移し、次いで、血液産物容量を決定するために計量した(1g=1mL)。総細胞数の計数のために、そしてアクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム(AO/PI)生存性アッセイを使用する生存性決定のために0.5mLのアリコートを取り出した。PBMCを600mLのTransfer Pack 中で１％HSAおよび0.2％クエン酸ナトリウムを含有するCa²⁺およびMg²⁺非含有DP BS（処理緩衝液）500mLにより１回洗浄し、そして室温にて10分間、1,000rpm(20 0×g)で、ブレーキをかけずに遠心分離した。大部分の上清を吸引し、そして細胞を残りの上清に十分に再懸濁させた（通常＜85mL）。細胞の容量を計量により決定し、そして0.5mLの再懸濁細胞を注射器を使用して、総細胞数計数および生存性計数のために無菌的に取り出した。混合物を15分間、室温にてインキュベートした。ず、2.5mgの抗CD34モノクローナル抗体、9C5で感作した。抗体の感作容量を100m Lに設定し、そして、適切な量の処理緩衝液を、注射器を使用して無菌的に、Gam バイアル)を添加した。抗体−細胞混合物を、「回転させながら(end-over-end) 」15分間、室温にて４rpmに設定したローテーター上でインキュベートした。抗体で感作したPBMCを、１回の洗浄あたり500mLの処理緩衝液で２回洗浄し、未結合の抗体を除去した。細胞を、室温にて、7.5分間、1,500rpm(400×g)で、緩いブレーキで遠心分離した。遠心分離後の上清がまだ赤みを帯びていた場合、上清をデカントする前に、PBMCをブレーキをかけずに再び遠心分離した。ときおりこの不完全な細胞のペレット化が、＞3×10¹⁰のPBMCを処理する場合に観察された。最後の洗浄後、大部分の上清を吸引し、そしてペレット化した細胞を、残りの緩衝液に再懸濁し、そして細胞の容量（通常≦80mL)を決定するために計量した。細胞懸濁物の0.5mLのアリコートを、総細胞計数および生存性計数のために、注射器を使用して無菌的に取り出した。１バイアルのヒツジ抗マウスIgGでコートした常磁性のビーズ(4×10⁹ビーズ／バイアル)を、処理される細胞数にかかわらず、１回の選択手順に使用した。ビーズをDynalのMPC 1磁石を使用して20mLの処理緩衝液／洗浄(processing buffer /wash)で３回洗浄した。最後の洗浄後、ビーズを10mLの処理緩衝液に再懸濁し、そして必要なときまで室温においた。 10mLの洗浄したヒツジ抗マウスIgGでコートした常磁性ビーズおよび、続いて10m って行った。理緩衝液中で、３回洗浄した。細胞上清および洗浄上清を回収し、そしてプールした。最終的な上清容量を決定し、そして0.5mLを総細胞計数のために注射器を使用して取り出した。常磁性ビーズに結合したCD34+細胞の放出を、100mLの１mG/mLの9069Nペプチド溶液中で行った。American Peptideにより合成された凍結乾燥した9069Nペプチドについては、約105mgのペプチドを約10.5mLの処理緩衝液中に溶解して、10mg/ mLのストック溶液を得た。このストック溶液を、0.22μm滅菌フィルターを通して濾過滅菌した。Bachemにより合成された凍結乾燥ペプチドについては、約110m gの9069Nを9.5mLのDulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)に添加した。ペプチドを、１Nの水酸化ナトリウムを滴下して添加することにより、ペプチドのpH を約７に調整して溶解した。ヒト血清アルブミンおよびクエン酸ナトリウムを添加して、それぞれ１％および0.2％の溶液を得た。最終容量を、DPBSを用いて約1 1mLに調整し、次いで上記のように濾過滅菌した。Bachemにより製造された液体ペプチドについては、それぞれ５mg/mL濃度の9069Nを５mL含有する４つのバイアルを使用した。最後のネガティブな画分を洗浄した後、調製した9069Nペプチドストック溶液を、約60mLの処理緩衝液を含有するチャンバーに注入した。最終容量を、処理緩衝液を用いて100mLに調整し、1.0mg/mLのペプチド濃度とした。捕獲された細胞の放出を、放出容量を100mLに設定し、そしてインキュベーション時間が30分でされた細胞を、600mLのtransfer packに回収し、次いで無菌的に250mLの円錐形遠心管に移した。細胞懸濁物の容量を決定し、そして0.5mLを総細胞計数のために取り出した。ポジティブな細胞両分を室温にて、５分間、1,500rpm(400×g)で緩いブレーキで遠心分離した。大部分の上清をゆっくりと吸引し、そしてペレット化した細胞を残りの上清に再懸濁した。ポジティブ細胞画分を50mLの遠心管に移し、そして、50mLの処理緩衝液中で、室温にて５分間、1,500rpm(400×g)で緩いブレーキで１回洗浄した。洗浄後、ポジティブ細胞画分を１％HSA/X-Vivo 10に再懸濁した。0.5mLのアリコートを総細胞計数および生存性計数のために取り出した。捕獲％を、以下の等式に基づいて計算した：収率％を、以下の等式に基づいて計算した：純度％は、ポジティブ画分のCD34+細胞の％と同じであった。生存性は、(生存 MNC÷総MNC)×100％と同じであった。選択されたCD34+細胞の捕獲、純度、収率、およびクローニング効率の統計解析を、両側不対スチューデントt-検定(two t ailed unpaired student's t-test)により行った。信頼区間を、95％に設定した。クローニング効率は、(計数した総コロニー数÷プレーティングした細胞数)× 100％と同じであった。結果 G-CSF/GM-CSF動員ヒト末梢血からCD34+細胞を選択するためのペプチド媒介性放出プロセスは、室温で行われる４時間の手順であった。このプロセスは、１回の血小板洗浄および２回の抗体洗浄を7.5分／洗浄で包含した。9C5 mAb（抗CD34 ）での感作およびヒツジ抗マウスIgGでコートした常磁性ビーズでのロゼット形成を、総容量100mL中でそれぞれ15分間および30分間行った。細胞−ビーズロゼットを、9069Nペプチドと共に30分間インキュベートし、ビーズから細胞を放出させた。このプロセスは、１バイアルの9C5抗CD34モノクローナル抗体(2.5mG／バイアル）、１バイアルのヒツジ抗マウスIgGでコートした常磁性ビーズ（４×1 0⁹ビーズ／バイアル）、および100mLの1.0mG/mL 9069Nペプチドを、「方法」に記載のように利用した。このプロセスを、全体のアフェレーシス産物に行った。総単核細胞数を、選択プロセスの異なる段階での単核細胞の損失を追跡するために、各洗浄手順の前後で得た。出発アフェレーシス産物中、洗浄MNC中、抗体洗浄後のMNC中、洗浄前ポジティブ画分中、および洗浄後ポジティブ画分中の単核細胞(MNC)数のまとめを、以下の表29に報告する。平均して、プロセスの最初から血小板洗浄の最後までの単核細胞数は、同じままであった。20.68％および1 9.49％の平均細胞損失が、それぞれ抗体洗浄後MNCと洗浄後ポジティブ画分に観察された。これらのデータは、約20％のMNCが抗体洗浄の間に失われ、そしてさらに20％のMNCがポジティブ画分洗浄中に失われることを示唆する。血小板洗浄では、MNCは全く失われなかった。抗体洗浄およびポジティブ画分洗浄の両方を、緩いブレーキで1,500rpmで遠心分離した。従って、これらの洗浄物のより高い rpmでの遠心分離は、細胞の損失を最小にし得る。全部で10の選択手順を、GCSF動員ヒト末梢血産物に対して行った。10のうち６の手順で、放出剤を凍結乾燥した9069Nから調製した。残りの４つの手順を、放出剤として液体に調製した9069Nペプチドを使用して行った。10の選択手順からの血小板洗浄およびCD34+細胞捕獲後の単核細胞の数およびCD34+細胞の％、純度、および収率のまとめを以下の表30に示す。血小板洗浄後の末梢血産物は、2.43 ×10¹⁰〜4.48×10¹⁰、平均3.48±0.80×10¹⁰の単核細胞を含有していた。血小板洗浄後のMNC中のCD34+細胞は、0.3％〜1.75％、平均0.86±0.51％の範囲であった。CD34+細胞の捕獲は、０％〜90.19％、平均63.91±27.42％の範囲であった。 CD34+細胞の収率は、24.99％〜66.32％、平均47.63±13.85％の範囲であった。これらの値は、凍結乾燥したペプチド調製物を使用して得られた結果(N=6)および放出剤として液体のペプチド調製物から得られた結果(N=4)を組み合わせることにより、得られた。9069Nの２つの処方物により放出される選択されたCD34+細胞の収率および純度との比較により、CD34+細胞の収率における明らかな差異は、洗浄プロセスに起因するのであって、実際の放出工程に起因するのではないことが示された。純度は、68.41％〜96.08％、平均85.70±10.04％の範囲であった。このデータらの大部分の非標的細胞の除去に充分であった。コロニーアッセイを、CD34+細胞最終産物について行った。コロニーを、培養1 4日後に計数した。コロニー数は、ペトリ皿あたりプレーティングされた2,000細胞を含む３連のペトリ皿から計数した平均コロニーに基づく。計数したコロニーの型は、CFU-GM、混合、BFU-E、およびクラスターであった。10のCD34+細胞最終産物から計数されたコロニーの平均数は、207±138 CFU-GM、８±４混合、118± 56 BFU-E、および52±36クラスターであった。形成された平均総コロニー数は、 386±202であり、そしてクローニング効率は、19.28±10.12％であると計算された。凍結乾燥したペプチドを用いて放出されたCD34+細胞のクローニング効率と液体に調製したペプチドを用いて放出されたCD34+細胞のクローニング効率との間には有意差が存在しなかった(p=0.44)。このデータによると、得られたCD34+ 細胞最終産物は、約20％の平均コロニー形成能を有した。出発産物、血小板洗浄、ネガティブ画分、およびポジティブ画分における単核細胞集団を、リンパ球ゲート(gate)（前方および側方への低散乱(scatter)）、単球ゲート、および白血球ゲート(leucogate)染色画分のFL2に対する側方散乱に基づく顆粒球ゲートを使用して、FACScanを使用して分析した。出発、血小板洗浄、およびネガティブ画分MNC産物中の平均約60％のMNCが、リンパ球ゲートにおいて観察された。一方、ポジティブ画分中で平均92.44±4.56％のMNCが、リンパ球ゲートにおいて検出された。このデータによれば、ペプチド放出確認で処理されたアフェレーシス産物は、リンパ球ゲートにおいて約60％の出発MNC産物を有し、そしてポジティブ画分中の約92％のMNCが、リンパ球ゲートにおいて検出された。単球ゲートにおいて見出された平均MNCは、29.56±6.90％であり、そして血小板洗浄後のゲートされた平均MNCは、27.90±6.80％であった。ネガティブ画分の単球ゲートにおける平均MNCは、26.11±7.56％であった。一方、ポジティブ画分は、単球ゲートにおいて平均5.13±3.40％のMNCを有した。従って、単球ゲートにおいて見出された大多数のMNCは、細胞／ビーズロゼットの洗浄段階の間に除去された。顆粒球ゲートにおける出発MNCおよび血小板後MNCの平均は、それぞれ 9.13±3.38％および9.61±5.74％であった。ネガティブ画分は、顆粒球ゲートにおいて平均10.44±6.54％のMNCを有した。一方、ポジティブ両分は、平均2.26± 2.24％のゲートされたMNCを有した。このデータは、血小板洗浄が、顆粒球のアフェレーシス産物を減少させなかった；しかし、顆粒球は、細胞／ビーズロゼットの洗浄の間に除去されたことを示唆する。出発単核細胞産物中のリンパ球、単球、および顆粒球の比率とCD34+細胞の純度、収率、および捕獲との間に相関は見られなかった。これらの結果を、以下の表29および30にまとめる。実施例19 特異的ネガティブ浄化(purge)処理工程を組み込んだペプチド放出を利用するヒト34+幹細胞選択評価した３つのパラメーターは、１工程のポジティブ選択および同時または連続のいずれかのポジティブ／ネガティブCD34+細胞選択である。ポジティブ選択は、抗CD34+抗体(9C5、Baxter Immunotherapy Division,Irvine,CA)での細胞感作、ヒツジ抗マウスでコートした常磁性マイクロスフェア(SAMIgGST beads,Dyna l,Oslo,Norway)でのロゼット形成を組み込み、そして細胞をビーズ複合体からペプチド(9069N,Baxter Immunotherapy Division,Irvine,CA)を使用して放出した。ポジティブなCD34+細胞選択は単独で、自己移植片の腫瘍負担を減少させることが示されている。さらなる浄化工程は、潜在的に腫瘍レベルを検出不可能まで減少させ得る。ポジティブ／ネガティブ選択は、単一特異性抗体の使用を通しての混入細胞のさらなる除去を可能にした。ポジティブ／ネガティブは、以下の２つの方法で達成され得る：同時；すなわち、CD34+抗体および浄化抗体の両方を同時に、手順の最初に添加した、または連続的：ポジティブ選択を最初に行い、続いてネガティブ選択を行った。非ホジキンリンパ腫およびその他のＢ細胞悪性腫瘍は、造血細胞のポジティブ／ネガティブ選択から利益を得る疾患の例である。Ｂ細胞のネガティブ選択は、高用量の化学療法または照射後の自己移植片のために意図される浄化CD34+細胞集団の調製に有用であると期待される。方法：ヒト末梢血アフェレーシス産物を、ヒト成長因子動員正常ドナー(n=3)から得た。単核細胞調製物(MNC)を、１％ヒト血清アルブミンおよび５％クエン酸ナトリウム(Baxter Hyland,Los Angeles,CA,v/v,200×g,室温にて10分間)を含有するダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水(Biowhitaker,Walkersville,MD)からなる作業緩衝液を用いて１回洗浄した。次いで、MNCを手順のために６×10⁹細胞のアリコートに分け、そしてそれぞれを以下のように処理した： Hyland Division,Los Angeles,CA)でブロックした。抗CD34モノクローナル抗体 (0.5mgの9069抗体[9C5],ATCC#HB 11646)を細胞懸濁物に添加し、作業緩衝液を用いて容量を20mLに調整し、そして15分間室温にて緩やかな回転でインキュベーションした。細胞を２回洗浄し（５分間、400×g）、約５mLの作業緩衝液に再懸濁した。SAMビーズを、感作した標的CD34+細胞をロゼット形成するために使用した。ビーズ（試験あたり８×10⁸）を、回収のためのMPC-1磁石(Dynal,Oslo,Norway )への２分間の曝露を使用して作業緩衝液中で３回洗浄した。感作細胞、２mLのいで、容量を作業緩衝液を用いて20mLに調整し、そして30分間室温にて緩やかな２分間の曝露を使用して回収した。未結合細胞を、溶出物を流し出すことにより除去した。ロゼットを、上記のように、磁石を使用して20mLの作業緩衝液で３回洗浄した。溶出物およびネガティブ洗浄物を分析のためにプールした。放出を、ビーズ／細胞ロゼットを9069Nペプチド（１mg/mL；20mL作業緩衝液）とともに30 分間室温にてインキュベーションすることにより行った。ビーズを磁石を使用して回収し、そして放出細胞をチャンバーから流し出した。ビーズを１回洗浄し、そして洗浄物を放出細胞と共にプールした。溶出細胞を１回洗浄し、そして総細胞数および表現型について分析した。CD34+細胞およびＢ細胞を、性能（純度および収率）および浄化（Ｂ細胞の減少）を評価するために、プロセスを通してモニターした。ポジティブ／ネガティブ選択−同時：この手順は、それぞれ200μgのマウス抗 CD-10、CD-19およびCD-20 Ｂ細胞モノクローナル抗体(Baxter Immunotherapy,Mun ich,Germany)を、9069[9C5]抗CD34+感作工程で同時に添加したことを除いて上記の通りであった。マウスモノクローナル抗体を、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定の下に、Deutsche Sammlung von Mikr oorganism und Zellkulturen GmbH、Braunschweig、Germanyに寄託した。この抗体には、1995年５月23日に以下の寄託番号が付けられた：抗CD10(W8E7E7)、DSM ACC2215；抗CD19(HD237)、DSM ACC2216；抗CD20(L27)、DSM ACC2217。ポジティブ／ネガティブ選択一連続：このプロセスは、上記のポジティブ選択手順のおよびそれに続くネガティブ選択工程を組み込んだ。いったん上のポジティブ選択に示すようにCD34+細胞を放出させ、そして回収して、細胞を200μgの各々のＢ細胞浄化抗体(CD10、19、および20、上と同じ３つの抗体)と共に10mL中で１５分間室温にてインキュベートした。次いで、ポジティブ選択された画分を作業緩衝液中で２回洗浄してすべての未結合抗体を除去した。SAMビーズ(４量中で室温にて30分間インキュベートした。Ｂ細胞ロゼットを磁石で回収し、そして溶出物を試験管内に流し出した。ビーズを１回洗浄し、そして溶出細胞とプールした。最終産物を洗浄し、そして上に列記したように分析した。結果を以下の表にまとめた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｙ 0276−2ＪＤ 33/577 0276−2Ｊ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者コボリ，ジョアンエイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 91107, パサデナ，フェアーミードロード 3600 (72)発明者アル−アブデリー，ファハドエイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 90503, トランス，ソノマストリート 3014 (72)発明者ギラーモ，ロイアメリカ合衆国カリフォルニア 90745, カーソン，ウォーターストリート 21810 (72)発明者ヘルガーソン，サムエル. アメリカ合衆国カリフォルニア 91107, パサデナ，エス．ローズミードナンバー219 820 (72)発明者ディーンズ，ロバートジェイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 91711, クレアモント，ファーマンドライブ 415

Claims

【特許請求の範囲】１．不均質な細胞懸濁物からの１またはそれ以上の標的細胞を選択し、そして該選択された標的細胞から少なくとも第１の非所望の細胞を除去する方法であって、該方法は、 (a)該細胞懸濁物中で第１の複数の複合体を形成する工程であって、該工程は、該標的細胞上に存在する第１の細胞表面抗原に結合している第１の１次抗体に連結した細胞分離手段を包含する工程、 (b)該第１の複数の複合体を該細胞懸濁物から分離する工程、 (c)該複合体の該第１の１次抗体を第１のペプチドと接触させる工程であって、該ペプチドは、該第１の１次抗体と結合して該第１の細胞表面抗原から該第１の１次抗体を放出し、その結果、該複合体から該標的細胞を放出して該標的細胞を含有する第１の標的細胞組成物を形成する工程、 (d)該第１の標的細胞組成物の中で第２の複数の複合体を形成する工程であって、該工程は、該非所望の細胞上の第２の細胞表面抗原に結合している第２の１次抗体に連結した細胞分離手段を包含する工程、 (e)該第２の複数の複合体を該第１の細胞組成物から分離して第２の標的細胞組成物を形成する工程、を包含する方法。２．前記第２の標的細胞組成物が、実質的に前記非所望の細胞を含まない、請求項１に記載の方法。３．前記細胞分離手段が前記第１の１次抗体に、前記１次抗体への結合のためのタンパク質手段により連結される請求項１に記載の方法であって、該タンパク質手段は該細胞分離手段にカップリングされており、該１次抗体を結合するためのタンパク質手段が、Staphylococcus aureus プロテインＡ、Streptococcus プロテインＧ、および２次抗体からなる群より選択される、方法。４．前記１次抗体がマウスモノクローナル抗体であり、そして前記１次抗体を結合するための前記タンパク質手段が抗マウス免疫グロブリンを含有する２次抗体である、請求項３に記載の方法。５．前記２次抗体が、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、およびウシの種からなる群より選択される動物において惹起される、請求項４に記載の方法。６．前記２次抗体が、モノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。７．前記２次抗体が、遺伝子操作により産生された組換え抗体である、請求項４に記載の方法。８．前記細胞分離手段が、常磁性ビーズ、カラム、中空繊維、ガラスビーズ、多糖ビーズ、およびポリスチレン組織培養フラスコからなる群より選択される固体支持体である、請求項１に記載の方法。９．標的細胞上の細胞表面抗原に結合したモノクローナル抗体を置換し得るペプチドであって、該モノクローナル抗体が、ATCC HB-11646と称するハイブリドーマにより産生され、該ペプチドが、からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ペプチド。１０．標的細胞上の細胞表面抗原に結合したモノクローナル抗体を置換し得るペプチドであって、該モノクローナル抗体が、ATCC HB-11646と称するハイブリドーマにより産生され、該ペプチドが、からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ここて、Ｊ₁およびＪ₂が、０〜６個のアミノ酸残基からなる群より選択される、ペプチド。１１．前記Ｊ₁および前記Ｊ₂が、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＲからなる群より選択されるアミノ酸残基を含有する、請求項１０に記載のペプチド。１２．標的細胞上の細胞表面抗原に結合したモノクローナル抗体を置換し得るペプチドであって、該モノクローナル抗体が、ATCC HB-11646と称するハイブリドーマにより産生され、該ペプチドが、からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、Ｊ₁およびＪ₂が、０〜６個のアミノ酸残基からなる群より選択される、ペプチド。１３．前記Ｊ₁および前記Ｊ₂が、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＲからなる群より選択されるアミノ酸残基を含有する、請求項１２に記載のペプチド。１４．標的細胞上の細胞表面抗原に結合したモノクローナル抗体を置換し得るペプチドであって、該モノクローナル抗体が、ATCC HB-11885(9079)と称するハイブリドーマにより産生され、該ペプチドが、からなる群より選択される、ペプチド。１５．標的細胞上の細胞表面抗原に結合したモノクローナル抗体を置換し得るペプチドであって、該モノクローナル抗体が、561と称する抗体であり、そして該ペプチドが、からなる群より選択される、ペプチド。１６．標的細胞上の細胞表面抗原に結合したモノクローナル抗体を置換し得るペプチドであって、該モノクローナル抗体が、561と称する抗体であり、そして該ペプチドが、からなる群より選択される環状ペプチドである、ペプチド。１７．標的細胞上の細胞表面抗原に結合したモノクローナル抗体を置換し得るペプチドであって、該モノクローナル抗体が、ATCC HB-11884(9187)と称するハイブリドーマにより産生され、該ペプチドが、からなる群より選択される、ペプチド。１８．細胞表面抗原に結合しているモノクローナル抗体から標的細胞を放出するために有用な特定のペプチドを同定するための方法であって、該方法は、 (a)ランダムペプチドライブラリーファージディスプレイおよび該モノクローナル抗体を用いるバイオパンニング、 (b)ランダムペプチドライブラリーピンディスプレイおよび該モノクローナル抗体を用いる結合、 (c)該細胞表面抗原の潜在的抗原性ピークの分析、 (d)該モノクローナル抗体の相補性決定領域(CDR)の分析、 (e)該モノクローナル抗体の３次元構造の理論的分子モデリング；のうち、少なくとも１つの技術を行うことにより候補ペプチドを選択する工程、および該標的細胞から該抗体を置換し、その結果該標的細胞を放出する、該候補ペプチドの能力を決定する工程を包含する、方法。１９．細胞抗原から抗体を放出するために有用な特異的ペプチドを同定するための方法であって、該方法は、該抗体と該細胞抗原との複合体を形成する工程、該複合体を１またはそれ以上のペプチドと反応的接触させる工程、該抗体が該細胞抗原から放出されるか否かを測定する工程、およびいずれの該ペプチドが、該抗体の該細胞抗原からの放出をもたらすかを同定する工程、を包含する、方法。２０．前記複合体が固体支持体に固定されている、請求項１９に記載の方法。２１．前記１またはそれ以上のペプチドが固体支持体に固定されており、そしてここで該ペプチドが、このようなペプチドに対する前記抗体の結合により同定される、請求項１９に記載の方法。２２．細胞組成物中の特異的な細胞の数をアッセイするための方法であって、該方法は、 a)該特異的な細胞に結合するモノクローナル抗体を提供する工程、 b)該特異的な細胞から該モノクローナル抗体を置換し得るペプチドを提供する工程であって、該ペプチドが、固体支持体に連結されて人工的な細胞標的を形成する、工程、 c)該人工的な細胞標的からのモノクローナル抗体の置換についての標準曲線を確立する工程、 d)該人工的な細胞標的を該モノクローナル抗体および未知数の該特異的細胞を含有するサンプルと接触させる工程であって、該特異的細胞が、該人工的な細胞標的と該モノクローナル抗体との結合について競合する、工程、および e)工程(d)で得られるシグナルと工程(c)で得られるシグナルとを比較する工程、を包含する、方法。２３．不均質な細胞懸濁物から１またはそれ以上の標的細胞を選択する方法であって、該方法は、 (a)該不均質な細胞懸濁物を、少なくとも１つの該標的細胞上の少なくとも第１の抗原を結合し得る少なくとも第１の抗体と接触させる工程、 (b)該抗体に結合している標的細胞を該不均質な細胞懸濁物から分離する工程、 (c)該第１の抗体に結合している標的細胞を、第１のペプチドと接触させる工程であって、該第１のペプチドは、該第１の抗体から該抗原を置換し、その結果、該第１の抗体から該標的細胞を放出する、工程、を包含する、方法。２４．前記分離する工程が、前記第１の抗体を細胞分離手段に結合させる工程および残りの細胞懸濁物を該細胞分離手段から除去する工程を包含する、請求項２３に記載の方法。２５．前記細胞分離手段がカラムであり、そして前記不均質な細胞懸濁物を該カラムに通して該細胞懸濁物を前記第１の抗体と接触させる、請求項２４に記載の方法。２６．前記カラムがビーズにより形成される、請求項２５に記載の方法。２７．前記カラムが中空繊維により形成される、請求項２５に記載の方法。２８．前記細胞分離手段が常磁性ビーズにより形成され、そして前記抗体に結合しているビーズが前記不均質な細胞懸濁物と混合されて該細胞懸濁物を前記第１の抗体と接触される、請求項２４に記載の方法。２９．前記第１の抗体に結合しているビーズおよび前記第１の抗体に結合している標的細胞が、前記不均質な細胞懸濁物から、該第１の抗体に結合している標的細胞と該不均質な細胞懸濁物との混合物を、該第１の抗体に結合しているビーズおよび該第１の抗体に結合している標的細胞とを適切に保持する磁界の存在下におくことにより分離され、一方該不均質な細胞懸濁物が除去される、請求項２８に記載の方法。３０．前記第１の抗体が前記細胞分離手段にタンパク質手段により結合している、請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法。３１．前記タンパク質手段が、前記第１の抗体に対して親和性を有する前記細胞分離手段に結合している抗体である、請求項３０に記載の方法。３２．(d)前記不均質な細胞懸濁物を第２の抗体と接触させる工程であって、該第２の抗体は、少なくとも１つの前記標的細胞上の第２の抗原に結合し得、該第２の抗原は、前記第１の抗原とは異なり；そしてここで、前記分離する工程が、標的細胞に結合している該第１の抗体および該第２の抗体の両方を該不均質な細胞懸濁物から分離する工程を、前記分離する工程の前にさらに包含する、請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法。３３．前記第１の抗体から分離されている前記標的細胞を、前記第２の抗体に結合している標的細胞から分離する工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。３４．前記第２の抗体に結合している標的細胞と、前記抗原を該第２の抗体から置換し、その結果、該標的細胞を該第２の抗体から放出させる第２のペプチドとを接触させる工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。３５．前記第１のペプチドおよび／または（第２のペプチドが用いられる場合）前記第２のペプチドが、３０アミノ酸未満の配列である、請求項２３〜３４のいずれかに記載の方法。３６．前記ペプチドが、４〜２０アミノ酸の配列である、請求項３５に記載の方法。３７．不均質な細胞懸濁物から標的細胞を分離するためのシステムであって、該システムは、 (a)細胞分離手段； (b)該細胞分離手段に結合している少なくとも第１の抗体であって、該第１の抗体が、少なくとも１つの該標的細胞上の少なくとも第１の抗原を結合し得る抗体、を包含し、該システムが (c)該抗原を該第１の抗体から置換し得、その結果、該標的細胞を該第１の抗体から放出し得る、少なくとも第１のペプチド、をさらに包含することを特徴とする、システム。３８．前記細胞分離手段がカラムである、請求項３７に記載のシステム。３９．前記カラムがビーズにより形成される、請求項３８に記載のシステム。４０．前記カラムが中空繊維から形成される、請求項３８に記載のシステム。４１．前記細胞分離手段が、前記第１の抗体が結合している複数の磁性ビーズにより形成される、請求項３７に記載のシステム。４２．細胞分離手段に結合している第２の抗体をさらに包含する、請求項３７〜４１のいずれかに記載のシステムであって、該第２の抗体が、少なくとも１つの前記標的細胞上の少なくとも第２の抗原に結合し得、該第２の抗原が前記第１の抗原とは異なる、システム。４３．前記第１のペプチドおよび／または（第２のペプチドが存在する場合）前記第２のペプチドが、３０アミノ酸未満の配列である、請求項３７〜４２のいずれかに記載のシステム。４４．前記ペプチドが、４〜２０アミノ酸の配列である、請求項４３に記載のシステム。