CN114340660A - 开发用于发现治疗性抗体的高效杂交瘤平台 - Google Patents

开发用于发现治疗性抗体的高效杂交瘤平台 Download PDF

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CN114340660A CN202080061072.0A CN202080061072A CN114340660A CN 114340660 A CN114340660 A CN 114340660A CN 202080061072 A CN202080061072 A CN 202080061072A CN 114340660 A CN114340660 A CN 114340660A
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Abstract

本技术总体上涉及用于产生抗体、抗体文库、杂交瘤、杂交瘤文库等的改进方法。例如，这些方法增加产生的抗原特异性B细胞的数量，增加杂交瘤的数量，和/或增加可在给定的产生周期中制造的单克隆抗体的数量。

Description

开发用于发现治疗性抗体的高效杂交瘤平台
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年8月30日提交的美国临时专利申请号62/894,660的优先权，其内容全文据此出于所有目的以引用方式并入本文。
背景技术
数十年来，单克隆抗体一直被用作临床诊断中的关键试剂，并且它们正在成为重要的新一类治疗剂。杂交瘤技术为用于获得单克隆抗体最常用的方法。单克隆抗体是从杂交瘤细胞分泌的，是通过将产生正常抗体的脾脏B细胞与永生骨髓瘤细胞或其他永生细胞融合而产生的。
自数十年前出现以来，杂交瘤产生技术几乎没有变化(Nature 256:495–497(1975))。用于生成杂交瘤的典型方案涉及：(i)用抗原对动物(例如小鼠、大鼠或兔)进行免疫；(ii)收获产生抗体的B细胞，其通常来自脾脏；(iii)将B细胞与非分泌性骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤；(iv)在选择培养基中培养杂交瘤细胞；(v)筛选产生所需抗体的细胞；以及(vi)克隆所需的杂交瘤以获得分泌抗体的同质细胞系。
需要生成更多数量的抗原特异性抗体并且改善单克隆抗体和抗体文库的产生。
发明内容
本技术一般涉及用于产生抗体、抗体文库、杂交瘤、杂交瘤文库等的改进方法，以及来自各种方法步骤的组合物。例如，这些方法可增加产生的抗原特异性B细胞的数量，增加杂交瘤的数量，和/或增加可在给定的产生周期中制造的单克隆抗体的数量。本文所述的方法可用于显著增加抗体、抗体文库、杂交瘤、杂交瘤文库等以及来自各种方法步骤的组合物的产生，以用于治疗多种疾病。例如，本文所述的方法可应用于抗体和/或杂交瘤生成，以用于治疗癌症、免疫疾病、炎性疾病和任何其他可通过抗体疗法治疗的疾病。本文所述的方法可应用于针对挑战性靶标的抗体和/或杂交瘤生成。挑战性靶标为难以生成针对该靶标的抗体的抗原，例如因为可靶向区域的大小很小，蛋白质构象很重要，和/或抗原(例如，通过翻译后修饰，诸如糖基化、磷酸化，乙酰化和甲基化)被修饰。在实施例中，靶抗原为多通道跨膜蛋白。在实施例中，多通道跨膜蛋白为G蛋白偶联受体(GPCR)。在实施例中，多通道跨膜蛋白为离子泵、离子通道或转运蛋白。
在一方面，提供了一种用于产生抗体、抗体文库、杂交瘤或杂交瘤文库的方法。在实施例中，该方法可包括以下项中的一项或多项：
(a)对多只动物注射抗原；
(b)从每只动物收获B细胞；
(c)在B细胞与融合配偶体之间形成杂交瘤；以及
(d)筛选杂交瘤对抗原的结合特异性。
在实施例中，可应用以下条件中的至少一个条件并且优选地两个条件或更多条件：
(i)该动物为远交动物；
(ii)在多个部位处对动物进行注射；
(iii)以两次注射之间不少于每周、不少于每10天、不少于每两周的频率，或持续时间更长的其他频率对动物进行注射；
(iv)对动物进行注射6周至15周；
(v)使用多种佐剂，使得对每只动物注射单一佐剂，并且对至少一些动物注射不同的佐剂；
(vi)在步骤(c)之前富集B细胞；和/或
(vii)使用经改造以表达表面和分泌的IgG两者的融合配偶体。
在一方面，提供了一种用于产生抗体、抗体文库、杂交瘤或杂交瘤文库的方法。在实施例中，该方法可包括以下项中的一项或多项：
(a)对一只或多只动物注射抗原；
(b)从每只动物收获B细胞；
(c)在B细胞与融合配偶体之间形成杂交瘤；以及
(d)筛选杂交瘤对抗原的结合特异性。
在实施例中，可应用以下条件中的至少一个条件并且优选地两个条件或更多条件：
(i)该动物为远交动物；
(ii)在多个部位处对动物进行注射；
(iii)以两次注射之间不少于每周、不少于每10天、不少于每两周的频率，或持续时间更长的其他频率对动物进行注射；
(iv)对动物进行注射6周至15周；
(v)使用多种佐剂，使得对每只动物注射单一佐剂，并且对不同动物注射不同的佐剂；
(vi)在步骤(c)之前富集B细胞；和/或
(vii)使用经改造以表达表面和分泌的IgG两者的融合配偶体。
在实施例中，可应用以下条件中的至少一个条件并且优选地两个条件或更多条件：
(i)该动物为远交动物；
(ii)在多个部位处对动物进行注射；
(iii)以两次注射之间不少于每周、不少于每10天、不少于每两周的频率，或持续时间更长的其他频率对动物进行注射；
(iv)对动物进行注射6周至15周；
(v)使用多种佐剂，使得对每只动物注射单一佐剂，并且对不同动物注射不同的佐剂；和/或
(vi)在步骤(c)之前富集B细胞。
在实施例中，可从引流淋巴结中收获B细胞。
在实施例中，该方法可包括对两只或更多只动物注射抗原。在实施例中，该方法可包括对三只或更多只动物注射抗原。在实施例中，该方法可包括对四只或更多只动物注射抗原。在实施例中，该方法可包括对五只或更多只动物注射抗原。
在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的两个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的三个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的四个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的五个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的六个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的七个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vi)中的两个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vi)中的三个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vi)中的四个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vi)中的五个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vi)中的六个条件。
在实施例中，该方法可包括：
(a)在每只大鼠的多个部位处对多只远交大鼠注射抗原；
(b)每2周重复注射，达至少6周；
(c)从每只大鼠的一个或多个引流淋巴结收获免疫细胞；
(d)通过阴性选择从免疫细胞消耗非B细胞，以形成富集的B细胞样品；
(e)将富集的B细胞样品与多个融合配偶体接触，以便在B细胞与融合配偶体之间形成杂交瘤；以及
(f)筛选杂交瘤对抗原的特异性。
在实施例中，该方法可包括：
(a)在每只大鼠的多个部位处对远交大鼠中的一只或多只注射抗原；
(b)每2周重复注射，达至少6周；
(c)从每只大鼠的一个或多个引流淋巴结收获免疫细胞；
(d)通过阴性选择从免疫细胞消耗非B细胞，以形成富集的B细胞样品；
(e)将富集的B细胞样品与多个融合配偶体接触，以便在B细胞与融合配偶体之间形成杂交瘤；以及
(f)筛选杂交瘤对抗原的特异性。
在实施例中，该动物可为大鼠。在实施例中，该动物可为远交大鼠。远交大鼠的示例包括但不限于Sprague Dawley、Long-Evans、Sentinel、Wistar、Wistar Han和Holtzman大鼠。在实施例中，该动物可为转基因动物。在实施例中，该动物可为转基因大鼠。
在实施例中，可在多个部位处对动物进行注射。在实施例中，所述多个部位可为引流淋巴结附近的部位。在实施例中，所述多个部位可包括背部、肩部、腹膜内、尾根和跗关节中的一个部位或多个部位。
在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.1μg与300μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.5μg与200μg之间。
在实施例中，该方法可包括对两只或更多只远交大鼠注射抗原。在实施例中，该方法可包括对三只或更多只远交大鼠注射抗原。在实施例中，该方法可包括对四只或更多只远交大鼠注射抗原。在实施例中，该方法可包括对五只或更多只远交大鼠注射抗原。
在实施例中，可每两周对动物进行注射。在实施例中，可不超过每周一次对动物进行注射。在实施例中，可不超过每两周一次对动物进行注射。在实施例中，该动物可每5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或更长时间次注射一次，持续时间介于6周与20周之间。在实施例中，对动物进行注射6周至15周。注射时间包括所列举的范围所涵盖的所有值和子范围，包括端点。
在实施例中，可使用多种佐剂，并且可对每只动物(或动物子集)注射不同佐剂。例如，可将动物分为多个组，其中组的每个成员均接受单一佐剂或佐剂组合，并且每种佐剂或组合不同于其他组的至少一些组所接受的佐剂。在实施例中，多种佐剂可包括但不限于完全弗氏佐剂(CFR)、Ribi和/或TLR激动剂混合物。在实施例中，CFR可为机器混合的。
在实施例中，可在形成杂交瘤之前富集B细胞。在实施例中，富集可包括将从引流淋巴结收获的细胞与结合剂接触。在实施例中，可通过阴性选择来富集B细胞。在实施例中，结合剂可对与非B细胞的细胞相关联的分子具有特异性。在实施例中，结合剂可对在非B细胞的细胞表面上表达的分子具有特异性。在实施例中，可通过阳性选择来富集B细胞。在实施例中，结合剂可对与B细胞相关联的分子具有特异性。在实施例中，结合剂可对在B细胞表面上表达的分子具有特异性。在实施例中，结合剂可为抗体。在实施例中，可使用磁分离技术。
在实施例中，融合配偶体可为经改造以表达表面和分泌的IgG两者的细胞。在实施例中，融合配偶体可为Sp2ab融合配偶体。在实施例中，筛选杂交瘤可包括鉴定表达对抗原具有特异性的抗体的杂交瘤。在实施例中，筛选杂交瘤可包括针对IgG抗体的表达的FACS分选，该IgG抗体对抗原具有特异性。
附图说明
图1A示出了当使用Sprague Dawley大鼠(SD大鼠)与Balb/c小鼠以用于产生针对抗原A(靶标A)的抗体时，IgG血清滴度的差异。小鼠与大鼠中的靶标A之间的同源性为98％。*与小鼠相比，p<0.05。
图1B示出了当使用Sprague Dawley大鼠(SD大鼠)与C57 back 6(C57/Bl6)小鼠以用于产生针对抗原B(靶标B)的抗体时，IgG血清滴度的差异。*与小鼠相比，p<0.05。
图2A为大鼠的示意图，示出了用于免疫的抗原注射部位的示例。
图2B示出了在使用每只动物的单个部位注射或多个部位注射的情况下，针对抗原C(靶标C)和抗原D(靶标D)的抗原特异性抗体滴度。*与单次注射相比，p<0.05。
图3A示出了对动物注射抗原的示例性方案，以及基于该方案的预期抗原特异性Ig(IgM和IgG)应答。在第一次注射之前执行本底血清滴度(“滴度检查出血”)。在第0周对动物注射佐剂中的抗原(“初次免疫”)，然后每两周一次注射PBS中的抗原，直至第6周(“加强免疫”)。在最终注射后再次测量血清滴度。
图3B和3C将标准抗原注射方案(每周两次注射，持续9周)与图3A所示的改进方案进行比较。当以Ribi佐剂(图3B)或TLR佐剂(图3C)施用时，改进方案增加了针对抗原E(靶标E)的抗体滴度。
图4A为大鼠的示意图，示出了注射部位附近的引流淋巴结的示例。
图4B示出了与脾脏相比，当从淋巴结收获细胞时，抗原(靶标D)特异性杂交瘤克隆的数量差异。来自LN的IgG+杂交瘤的增加适用于大鼠(与小鼠相反)。
图5A示出了针对抗原J的抗原特异性IgG血清滴度。使用CFA佐剂，并且通过机器混合或手动混合(“注射器混合”)该佐剂。*与注射器混合相比，p<0.01。
图5B和5C示出了当CFA、Ribi或TLR用作佐剂时，针对抗原F(“靶标F”，图5B)或抗原G(“靶标G”，图5C)的抗原特异性IgG血清滴度。*与其他条件相比，p<0.05。
图6示出了衍生自以下项的IgG阳性杂交瘤克隆的数量：完整淋巴结(“未分离”)、消耗已收获淋巴的细胞中的非B细胞后剩余的细胞(“B细胞”)，或来自富集的B细胞的消耗IgM阳性B细胞后剩余的细胞。
图7A示出了使用P3X63AgU.1(“PU.1”；ATCC)或Sp2ab(Enzo Abeome DiSH)作为融合配偶体生成的抗原H(“靶标H”)特异性杂交瘤的数量。
图7B示出了SP2ab杂交瘤的FACS分选曲线图。
图7C和7D示出了使用PU.1或Sp2ab融合配偶体生成的抗原特异性杂交瘤的百分比。
具体实施方式
在阅读本说明书之后，如何在各种替代实施例和替代应用中实现本公开对于本领域技术人员而言将变得显而易见。然而，本文将不描述本技术的全部的各种实施例。应当理解，此处所呈现的实施例仅以示例的方式呈现，而非限制性的。因此，各种替代实施例的详细描述不应被解释为限制如本文所述的本公开的范围或广度。
在公开和描述本技术之前，应当理解，下文描述的方面不限于特定的组合物、制备此类组合物的方法或其用途，因为这些当然可能有所不同。另外应当了解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并非旨在进行限制。
仅为方便读者而划分为各个部分的详细描述和在任何部分中发现的公开内容可与其他部分中的内容相结合。为方便读者，本说明书中可能会使用标题或副标题，其不旨在影响本公开的范围。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。在本说明书和随后的权利要求中，将引用多个定义为具有以下含义的术语：
本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确地指出。
“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能或不可能发生，并且该描述包括该事件或情况发生的情况和不发生的情况。
当在数值表达(例如，温度、时间、量、浓度和此类其他，包括范围)之前使用术语“约”时，表示可能以(+)或(-)10％、5％、1％或它们之间的任何子范围或子值变化的近似值。优选地，术语“约”在用于剂量时是指剂量可变化+/-10％。
如本文所用，术语“附近”旨在表示位于物体或空间点的短物理距离内，或定位在物体或空间点的短距离内。在实施例中，附近可为约0mm至约50mm。在实施例中，附近可介于约0mm至约40mm之间。在实施例中，附近可介于约0mm至约30mm之间。在实施例中，附近可介于约0mm至约20mm之间。在实施例中，附近可介于约0mm至约10mm之间。在实施例中，附近可小于约1mm。在实施例中，附近可小于约5mm。在实施例中，附近可小于约1cm。在实施例中，附近可小于约2cm。在实施例中，附近可小于约5cm。在实施例中，附近可为约1mm。在实施例中，附近可为约2mm。在实施例中，附近可为约3mm。在实施例中，附近可为约4mm。在实施例中，附近可为约5mm。在实施例中，附近可为约1cm。在实施例中，附近可为约2cm。在实施例中，附近可为约3cm。在实施例中，附近可为约4cm。距离可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。
“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”表示出于所述目的，排除对该组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的要素组成的组合物不排除不会实质影响要求保护的技术的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”表示排除其他成分的微量元素以外的部分和实质性方法步骤。这些过渡术语中的每一个所定义的实施例均在本公开的范围内。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的产生过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
如本文所用，术语“融合配偶体”是指可与B细胞结合(融合)以形成杂交瘤的细胞。通常，融合配偶体为骨髓瘤细胞。
如本文所用，术语“远交”是指与相同物种的其他动物在遗传上不同的动物。相反，“近交系”是指由于近交而与该品系中的其他动物在遗传上相同(或几乎相同)的动物。
如本文所用，术语“融合配偶体”是指用于产生杂交瘤的融合配偶体。用于从多种物种产生杂交瘤的方法和细胞在本领域中是众所周知的。通常，融合配偶体为骨髓瘤细胞。融合配偶体可为任何适当的细胞或细胞系，例如骨髓瘤，以用于产生杂交瘤。融合配偶体可衍生自哺乳动物来源。哺乳动物来源可为灵长类动物、人、大鼠、小鼠、啮齿动物或任何其他物种。
方法
在一方面，提供了一种用于产生抗体的方法。在一方面，提供了一种用于产生抗体文库的方法。在一方面，提供了一种用于产生杂交瘤的方法。在一方面，提供了一种用于产生杂交瘤文库的方法。
在实施例中，该方法可包括以下项中的一项或多项：
(a)对一只或多只动物注射抗原；
(b)从每只动物收获B细胞，该B细胞例如来自含有B细胞的引流淋巴结；
(c)在一个或多个或每个B细胞与融合配偶体之间形成杂交瘤；以及
(d)针对对抗原的结合特异性筛选杂交瘤中的一者或多者。
在实施例中，可应用以下条件中的至少一个条件或优选地至少两个条件：
(i)该动物为远交动物；
(ii)在多个部位处对动物进行注射；
(iii)以本文所述的频率(例如不少于每两周)不超过一次对动物进行注射；
(iv)以本文所述的频率在约6周至约15周的时间段内对动物进行注射；
(v)使用多种佐剂，使得与其他动物或其他动物组相比，对不同动物或动物组注射不同的佐剂；
(vi)在步骤(c)之前富集B细胞；和/或
(vii)使用经改造以表达表面和分泌的IgG两者的融合配偶体。
在实施例中，可应用条件(a)至(d)中的至少两个条件。在实施例中，可应用条件(a)至(d)中的至少三个条件。在实施例中，可应用条件(a)至(d)中的四个条件。在实施例中，可明确排除条件(a)至(d)中的一个条件或多个条件。
在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的至少三个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的至少四个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的至少五个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的至少六个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的两个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的三个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的四个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的五个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的六个条件。在实施例中，可应用条件(i)至(vii)中的七个条件。在实施例中，可明确排除条件(i)至(vii)中的一个条件或多个条件。在实施例中，明确排除条件(i)。在实施例中，明确排除条件(ii)。在实施例中，明确排除条件(iii)。在实施例中，明确排除条件(iv)。在实施例中，明确排除条件(v)。在实施例中，明确排除条件(vi)。在实施例中，明确排除条件(vii)。
在实施例中，该方法可包括：
(a)在每只大鼠的多个部位处对一只或多只远交大鼠注射抗原；
(b)每2周重复注射，达至少6周；
(c)从每只大鼠的一个或多个引流淋巴结收获免疫细胞；
(d)通过阴性选择从免疫细胞消耗非B细胞，以形成富集的B细胞样品；
(e)使富集的B细胞样品与多个融合配偶体接触，以在每个B细胞与融合配偶体之间形成杂交瘤；以及
(f)针对对抗原的特异性筛选杂交瘤。
在实施例中，动物可为远交动物。在实施例中，动物可为哺乳动物。在实施例中，动物可为啮齿动物。在实施例中，啮齿动物可为兔、豚鼠、大鼠、仓鼠、小鼠等。在实施例中，动物可为大鼠。在实施例中，动物可为远交大鼠。远交大鼠的示例包括但不限于SpragueDawley、Long-Evans、Sentinel、
Figure BDA0003523892390000111
IGS(Charles River)、
Figure BDA0003523892390000112
Hairless、Wistar、Wistar Han和Holtzman大鼠。
在实施例中，动物可为小鼠。在实施例中，动物可为远交小鼠。远交小鼠的示例包括但不限于Black Swiss、
Figure BDA0003523892390000113
IGS(例如，来自Charles River)、CF-1、CFW、ORL Sencar、SKH1-Elite、Sentinel和Diversity Outbred(Jackson Laboratory)。
在实施例中，该方法可包括在每只大鼠的多个部位处对两只或更多只远交大鼠注射抗原。在实施例中，该方法可包括在每只大鼠的多个部位处对三只或更多只远交大鼠注射抗原。在实施例中，该方法可包括在每只大鼠的多个部位处对四只或更多只远交大鼠注射抗原。在实施例中，该方法可包括在每只大鼠的多个部位处对五只或更多只远交大鼠注射抗原。
在实施例中，可在一个或多个部位处对动物进行注射。在实施例中，在多个部位处对动物进行注射。在实施例中，所述一个或多个部位可为引流淋巴结附近的部位。在实施例中，所述一个或多个部位可包括背部、肩部、腹膜内、尾根、跗关节和静脉内中的一个部位或多个部位。
在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于约0.1μg与约300μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.1μg与200μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.1μg与100μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.1μg与50μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.1μg与25μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.1μg与10μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.5μg与200μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.5μg与100μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.5μg与50μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.5μg与25μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于0.5μg与10μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于1μg与300μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于1μg与200μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于1μg与100μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于1μg与50μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于1μg与25μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于1μg与10μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于5μg与300μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于5μg与200μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于5μg与100μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于5μg与50μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于5μg与25μg之间。在实施例中，在每个部位处注射的抗原的量可介于5μg与10μg之间。该量可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，可在一天或一个时间段在一个部位或多个部位处对动物进行注射，所述一天或一个时间段的发生频率少于每一周至四周，优选地不少于每一周、每10天、每两周、每三周、每4周等。在实施例中，可在不同时间处对一个或多个部位进行注射，但每个部位的注射频率不超过每一周至每四周，优选地频率不超过每两周等。在一些实施例中，不超过每周一次对动物进行注射。在一些实施例中，不超过每两周一次对动物进行注射。
在实施例中，动物可以本文所述的频率接受注射以6周至15周。在实施例中，对动物进行注射7周至15周。在实施例中，对动物进行注射8周至15周。在实施例中，对动物进行注射9周至15周。在实施例中，对动物进行注射10周至15周。在实施例中，对动物进行注射11周至15周。在实施例中，对动物进行注射12周至15周。在实施例中，对动物进行注射13周至15周。在实施例中，对动物进行注射14周至15周。
在实施例中，可最初在至少一个部位对动物注射包含抗原和佐剂的第一组合物，然后在相同或不同部位处每两周一次注射包含抗原的第二组合物。在实施例中，可不超过每两周一次对动物进行注射。在实施例中，可在相同部位处不超过每两周一次对动物进行注射。在一些实施例中，第二组合物不包括佐剂。在一些实施例中，第二组合物包括佐剂。在实施例中，可在第二次、第三次、第四次、第五次或第六次注射后从动物收获淋巴结。第二次、第三次、第四次、第五次或第六次注射可表示第二次、第三次、第四次、第五次或第六次注射至动物体内的同一部位或多个部位，或第二次、第三次、第四次、第五次或第六次注射至动物体内的不同部位。
在实施例中，可在例如初始注射后的6周与10周之间从动物收获淋巴结。在实施例中，可在初始注射后的6周与8周之间从动物收获淋巴结。在实施例中，可在初始注射后约6周从动物收获淋巴结。在实施例中，可在初始注射后约7周从动物收获淋巴结。在实施例中，可在初始注射后约8周从动物收获淋巴结。在实施例中，可在初始注射后约9周从动物收获淋巴结。在实施例中，可在初始注射后约10周从动物收获淋巴结。
在实施例中，可使用多种佐剂，并且可对每只动物(或动物子集)注射不同佐剂。在实施例中，多种佐剂可包括例如完全弗氏佐剂(CFR)、Ribi和/或TLR(Toll样受体)激动剂混合物。在实施例中，佐剂可为不完全弗氏佐剂。在实施例中，佐剂可为
Figure BDA0003523892390000131
(包含嵌段共聚物CRL-8941、角鲨烯和微粒稳定剂的油包水乳液)。
混合一些佐剂以形成乳液。不受理论的束缚，据信与手动混合(例如，使用注射器)相比，机器混合佐剂使得乳化更一致并且结果得到改善。在实施例中，佐剂可为机器混合的。在实施例中，机器混合的佐剂可为CFR。
在实施例中，可在形成杂交瘤之前富集B细胞。在实施例中，富集可包括将从引流淋巴结收获的细胞与结合剂接触。在实施例中，可通过阴性选择来富集B细胞。在实施例中，结合剂可对与非B细胞的细胞相关联的分子具有特异性。在实施例中，结合剂可对在非B细胞的细胞表面上表达的分子具有特异性。在实施例中，可通过阳性选择来富集B细胞。在实施例中，结合剂可对与B细胞相关联的分子具有特异性。在实施例中，结合剂可对在B细胞表面上表达的分子(例如，B细胞特异性细胞表面受体)具有特异性。
结合剂可为与目标分子结合的任何试剂。在实施例中，结合剂可为抗体或其部分。在实施例中，结合剂可为融合蛋白、适体、配体或受体。
在实施例中，可使用磁分离。在实施例中，可使用磁珠。磁珠可与结合剂结合或以其他方式与结合剂缔合。
在实施例中，融合配偶体经改造以表达表面和分泌的IgG两者。参见，例如，美国专利号7,148,040，其所有材料、方法和教导的全部内容以引用方式并入本文。在实施例中，融合配偶体为Sp2ab融合配偶体。Sp2ab骨髓瘤融合配偶体可从Abeome Corporation或EnzoLife Sciences购得。
在实施例中，筛选杂交瘤可包括鉴定表达对抗原具有特异性的抗体的杂交瘤。在实施例中，筛选杂交瘤可包括针对IgG抗体的表达的FACS分选，该IgG抗体对抗原具有特异性。
在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少50％。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少2倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少3倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少4倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少5倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少6倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少7倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少8倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少9倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少10倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少20倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少30倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少40倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少50倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少60倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少70倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少80倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加至少90倍。在实施例中，与不含选自(i)至(vii)中的至少两种条件的产生相比，该方法可使抗体和/或杂交瘤的产生增加超过100倍。
在实施例中，根据本文所述的方法(例如从淋巴结)衍生杂交瘤克隆比(例如，在其他方面类似或相同的方法中)从脾组织衍生杂交瘤克隆时产生多至约15倍高的杂交瘤克隆。参见，例如，实例4中所比较的方法。在实施例中，根据本文所述的方法(例如从淋巴结)衍生杂交瘤克隆比(例如，在其他方面类似或相同的方法中)从脾组织衍生杂交瘤克隆时产生约2倍至约15倍的杂交瘤克隆。在实施例中，根据本文所述的方法(例如从淋巴结)衍生杂交瘤克隆比(例如，在其他方面类似或相同的方法中)从脾组织衍生杂交瘤克隆时产生约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约11倍、约12倍、约13倍、约14倍或约15倍的杂交瘤克隆。该量可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。在一些实施例中，淋巴结来自大鼠，例如野生型大鼠或转基因大鼠。
在实施例中，机器混合佐剂可产生两倍至四倍于注射器混合佐剂的抗原特异性血清IgG滴度。在实施例中，机器混合佐剂可产生两倍于注射器混合佐剂的抗原特异性血清IgG滴度。在实施例中，机器混合佐剂可产生三倍于注射器混合佐剂的抗原特异性血清IgG滴度。在实施例中，机器混合佐剂可产生四倍于注射器混合佐剂的抗原特异性血清IgG滴度。
在实施例中，与使用不同佐剂(诸如Ribi佐剂或TLR激动剂混合物佐剂)时相比，使用完全弗氏佐剂(CFA)时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍或更多倍。在实施例中，使用CFA时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至50倍更高。在实施例中，使用CFA时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至25倍更高。在实施例中，使用CFA时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至20倍更高。在实施例中，使用CFA时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至15倍更高。在实施例中，使用CFA时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至10倍更高。在实施例中，使用CFA时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍至50倍更高。在实施例中，使用CFA时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍至25倍更高。在实施例中，使用CFA时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍至20倍更高。该量可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，与使用不同佐剂(例如，TLR激动剂混合物佐剂)时相比，使用Ribi佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍或更高。在实施例中，使用Ribi佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至50倍更高。在实施例中，使用Ribi佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至25倍更高。在实施例中，使用Ribi佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至20倍更高。在实施例中，使用Ribi佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至15倍更高。在实施例中，使用Ribi佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至10倍更高。在实施例中，使用Ribi佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍至50倍更高。在实施例中，使用Ribi佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍至25倍更高。在实施例中，使用Ribi佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍至20倍更高。该量可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，与使用不同佐剂(例如，Ribi佐剂或CFA)时相比，使用TLR激动剂混合物佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍或更高。在实施例中，使用TLR激动剂混合物佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至50倍更高。在实施例中，使用TLR激动剂混合物佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至25倍更高。在实施例中，使用TLR激动剂混合物佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至20倍更高。在实施例中，使用TLR激动剂混合物佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至15倍更高。在实施例中，使用TLR激动剂混合物佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为2倍至10倍更高。在实施例中，使用TLR激动剂混合物佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍至50倍更高。在实施例中，使用TLR激动剂混合物佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍至25倍更高。在实施例中，使用TLR激动剂混合物佐剂时的抗原特异性IgG滴度值可为10倍至20倍更高。该量可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，与使用富集的LN B细胞时相比，使用消耗IgM的富集的LN B细胞可产生约10倍至约100倍的表达IgG的杂交瘤克隆。在实施例中，使用消耗IgM的富集的LN B细胞产生约10倍至约75倍的表达IgG的杂交瘤克隆。该量可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。在实施例中，使用消耗IgM的富集的LN B细胞产生约10倍至约50倍的表达IgG的杂交瘤克隆。在实施例中，使用消耗IgM的富集的LN B细胞产生约10倍至约25倍的表达IgG的杂交瘤克隆。在实施例中，使用消耗IgM的富集的LN B细胞产生约25倍至约100倍的表达IgG的杂交瘤克隆。在实施例中，使用消耗IgM的富集的LN B细胞产生约50倍至约100倍的表达IgG的杂交瘤克隆。在实施例中，使用消耗IgM的富集的LN B细胞产生约10倍至约75倍的表达IgG的杂交瘤克隆。该量可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。
在一方面，本文提供了抗体文库。在实施例中，使用如本文所述的方法制备抗体文库。
在一方面，本文提供了抗体。在实施例中，使用如本文所述的方法制备抗体。
在一方面，本文提供了杂交瘤文库。在实施例中，使用如本文所述的方法制备杂交瘤文库。
在一方面，本文提供了用于制备如本文所述的杂交瘤文库或抗体文库的试剂盒。在实施例中，试剂盒包括至少一种佐剂。在实施例中，试剂盒包括至少两种不同佐剂。在实施例中，试剂盒包括用于(例如，从淋巴结中的其他细胞)分离、分开或富集B细胞的试剂。在实施例中，试剂盒包括与至少一种试剂相互作用的珠粒(微珠)。在实施例中，试剂盒包括与至少一种试剂相互作用的柱。在实施例中，试剂盒包括用于产生杂交瘤的融合配偶体。
在实施例中，佐剂为CFR、Ribi和/或TLR激动剂混合物。在实施例中，用于分离、分开或富集B细胞的所述至少一种试剂包括对B细胞(例如，鼠或大鼠B细胞)具有特异性的抗体。在实施例中，用于分离B细胞的所述至少一种试剂包括识别除B细胞之外的细胞的抗体。在实施例中，抗体为经标记的。在实施例中，标记结合第二分子。在实施例中，第二分子附接至珠粒或柱。在实施例中，标记为生物素并且第二分子为链霉亲和素。在实施例中，珠粒为磁珠。在实施例中，柱为磁选柱。在实施例中，融合配偶体经改造以表达表面和分泌的IgG两者。
一些实施例涉及设备、装置、组合物、制剂、细胞、抗体、佐剂、杂交瘤、群体或任何相同项中的多项，以及任何相同项的组合，其用于、产生或导致进行本文所述的任何方法或方法的一部分。
应当理解，本文描述的示例和实施例仅用于说明目的，并且其各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和界限内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
实例
本领域技术人员将理解，制备和使用本文所述颗粒的描述仅用于说明的目的，并且本公开不受该说明的限制。
实例1近交对比远交动物
用与完全弗氏佐剂(BD Biosciences)或Ribi佐剂(Sigma-Aldrich)混合的100μg靶标A蛋白(基因泰克公司)对Sprague Dawley大鼠或Balb/c小鼠(Charles River)在尾根处进行皮下免疫，然后每两周用与不完全弗氏佐剂(BD Biosciences)或无菌PBS混合的50μg蛋白质在轮换部位(i.p.、两个跗关节或尾根)处对其进行加强免疫。在五次给药后采集血清并通过ELISA针对免疫蛋白进行测试。
图1A示出了SD大鼠中的IgG表达滴度高于Balb/c小鼠中的IgG表达滴度。抗原特异性IgG滴度值为导致信号为最大信号一半的稀释因子。将靶同源性包括在内以表明滴度差异可能并不基于抗原耐受性的差异。
用与完全弗氏佐剂(BD Biosciences)、Ribi佐剂(Sigma-Aldrich)或TLR激动剂混合物(如图3C所述)混合的50μg靶标B蛋白(基因泰克公司)对Sprague Dawley大鼠(CharlesRiver)或C57BL/6基因敲除小鼠(基因泰克公司)在尾根处进行皮下免疫，然后每两周用与不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)或无菌PBS混合的25μg蛋白质在轮换部位(i.p.、两个跗关节或尾根)处对其进行加强免疫。在六次给药后采集血清并通过ELISA针对免疫蛋白进行测试。
图1B示出了SD大鼠中的IgG表达滴度高于C57BL/6小鼠中的IgG表达滴度。抗原特异性IgG滴度值为导致信号达到最大信号一半的稀释因子。将靶同源性包括在内以表明滴度差异可能并不基于抗原耐受性的差异。
实例2单个对比多个注射部位
图2A示出了用于免疫的多个注射部位的位置。尾根、肩部和跗关节注射是皮下(s.c.)施用的，其中抗原特异性B细胞可能分别引流至腹股沟淋巴结和髂淋巴结、腋窝淋巴结和肱淋巴结以及腘淋巴结。腹膜内(i.p.)注射被施用至腹膜中，其中抗原特异性B细胞可能引流至肠系膜淋巴结和脾脏。
每周用与Ribi佐剂(Sigma-Aldrich)混合的20μg靶标C蛋白或靶标D蛋白(基因泰克公司)对转基因大鼠(Open Monoclonal Technology)进行免疫，该免疫仅i.p.注射或在如图2A所示的多个部位之间进行划分，每两周进行轮换。注射五周后采集血清并通过ELISA针对免疫蛋白进行测试。
图2B示出了单个部位免疫后的抗原特异性滴度低于多个部位免疫后的抗原特异性滴度。抗原特异性IgG滴度值为导致信号达到最大信号一半的稀释因子。
实例3每周两次对比每两周一次给药
图3A示出了每两周一次给药的策略。使用抗原免疫后，抗原特异性免疫应答的预期变化的一般说明；实际数据未示出。在第0周，在多个部位对动物注射与佐剂(如实施例3所述的弗氏、Ribi或TLR激动剂混合物)组合的蛋白质，这刺激了血清IgM水平增加所表示的初次免疫应答。然后每两周对动物进行一次加强免疫，通常使用在无菌PBS中稀释的较少量抗原，不含佐剂。这刺激了二次免疫应答，导致血清IgG水平的增加以及用于B细胞选择和针对靶标的亲和力成熟的生发中心的发展。在多个时间点处采集血清以评估抗原特异性免疫应答的进展。
每周两次(每3天至4天)用与Ribi佐剂(Sigma-Aldrich)混合的2μg靶标E蛋白(基因泰克公司)对C57BL/6基因敲除小鼠(基因泰克公司)进行i.p.免疫，或用与Ribi佐剂混合的100μg靶标E蛋白对其进行i.p.免疫，然后每两周用与Ribi佐剂混合或在无菌PBS中稀释的50μg靶标E蛋白对其进行i.p.加强免疫。给药八周或九周后采集血清并通过ELISA针对免疫蛋白进行测试。
令人惊讶的是，图3B示出来自每周给药两次的大鼠的抗原特异性滴度低于使用Ribi佐剂每两周给药一次的抗原特异性滴度。抗原特异性IgG滴度值为导致信号达到最大信号一半的稀释因子。
每周两次(每3天至4天)用与TLR激动剂的组合(50μg MPL(Sigma-Aldrich)、20μgR848(Invivogen)、10μg PolyI:C(Invivogen)和10μg CpG(Invivogen))混合的2μg靶标E蛋白(基因泰克公司)对C57BL/6基因敲除小鼠(基因泰克公司)进行i.p.免疫，或用与TLR激动剂混合物佐剂混合的100μg靶标E蛋白对其进行i.p.免疫，然后每两周用与Ribi佐剂(Sigma-Aldrich)混合或在无菌PBS中稀释的50μg靶标E蛋白对其进行i.p.加强免疫。给药八周或九周后采集血清并通过ELISA针对免疫蛋白进行测试。
图3C示出来自每周给药两次的大鼠的抗原特异性滴度低于使用TLR激动剂佐剂混合物每两周给药一次的抗原特异性滴度。抗原特异性IgG滴度值为导致信号达到最大信号一半的稀释因子。
实例4淋巴结对比脾脏作为B细胞来源
图4A示出了多个部位注射位置附近的引流淋巴结的位置。多个淋巴结(包括腹股沟淋巴结、髂淋巴结、腋窝淋巴结、肱淋巴结、肠系膜淋巴结和腘淋巴结)经过收获和合并，作为来自在如图2A中所述的多个部位注射了抗原的动物的潜在抗原特异性B细胞来源。
用与完全弗氏佐剂(BD Biosciences)混合的200μg靶标D蛋白(基因泰克公司)对转基因大鼠(Open Monoclonal Technology)在尾根处进行皮下免疫，然后用与不完全弗氏佐剂(BD Biosciences)混合的100μg靶标D蛋白对其进行加强免疫(该加强免疫在如图2A所示的多个部位之间进行划分)，每两周进行轮换，或每周两次(每3天至4天)用与Ribi佐剂(Sigma-Aldrich)或TLR激动剂混合物(如实施例3所述)混合的10μg靶标D蛋白对其进行加强免疫。在最后一次免疫后三天，在免疫开始后大约七周，收获脾脏或多个淋巴结。如实施例6所述，使用磁分离技术(Miltenyi Biotec)从淋巴细胞中纯化来自这些大鼠的B细胞，并经由电融合(Harvard Apparatus)将来自所得B细胞群体的4500万细胞与P3X63-Ag8U.1小鼠骨髓瘤细胞(American Type Culture Collection)进行融合。融合细胞在37℃、7％CO2下在培养基C(StemCell Technologies)中孵育过夜，然后重悬在含有抗大鼠IgG-FITC(Sigma-Aldrich)的半固体培养基D(StemCell Technologies)中并且铺平板至Omniwell托盘(Thermo Fisher Scientific)中。铺平板后七天，使用Clonepix FL(MolecularDevices)来选择荧光菌落并且将其转移至含有培养基E(StemCell Technologies)的96孔培养板(BD Biosciences)中。挑选菌落后七天，通过ELISA针对靶标D蛋白筛选上清液。
图4B示出衍生自淋巴结的抗原特异性杂交瘤克隆的数量显著高于来自脾脏的抗原特异性杂交瘤克隆的数量。如图4B所示，从脾脏衍生杂交瘤克隆比从淋巴结衍生杂交瘤克隆时产生至多约10倍少的杂交瘤克隆。令人惊讶的是，使用本文所述的方法，当衍生自淋巴结而不是脾脏时，可获得多达10倍或更多数量的抗原特异性IgG+克隆。
实例5并行使用多种佐剂
为了确定CFR的机器混合是否对所得滴度有影响，使用机器(Omni Mixer,OmniInc.)或手动使用注射器来将CFR与抗原混合。对大鼠注射佐剂组合物和如本文所述确定的抗原特异性抗体滴度。结果在图5A中示出。如图5A所示，机器混合产生的抗原特异性血清IgG滴度显著多于注射器混合。机器混合样品示出的抗原特异性血清IgG滴度大约是注射器混合样品的两倍。
每周两次用与Ribi佐剂(Sigma-Aldrich)或与如实施例3所述的TLR激动剂混合物佐剂混合的20μg靶标F蛋白(基因泰克公司)对转基因大鼠(Open Monoclonal Technology)进行免疫(该免疫在如图2A所示的多个部位之间进行划分)，或用与完全弗氏佐剂(BDBiosciences)混合的150μg靶标F蛋白在尾根处注射对其进行免疫，然后每两周用与不完全弗氏佐剂(BD Biosciences)或10μg CpG(Invivogen)混合的50μg靶标F蛋白对其进行加强免疫(该加强免疫在如图2A所示的多个部位之间进行划分)。给药10周后采集血清并通过ELISA针对免疫蛋白进行测试。
图5B示出了来自用不同佐剂免疫的动物的抗原特异性滴度。抗原特异性IgG滴度值为导致信号为最大信号一半的稀释因子。如图5B所示，对于该抗原，完全弗氏佐剂(CFA)的抗原特异性IgG滴度值显著高于Ribi佐剂或TLR激动剂混合物佐剂10次方以上。
每周用与Ribi佐剂(Sigma-Aldrich)或与如实施例3所述的TLR激动剂混合物佐剂混合的20μg靶标G蛋白(基因泰克公司)对转基因大鼠(Open Monoclonal Technology)进行免疫(该免疫在如图2A所示的多个部位之间进行划分)。在给药六周后采集血清并通过ELISA针对免疫蛋白进行测试。
图5C示出了来自用不同佐剂免疫的动物的抗原特异性滴度。抗原特异性IgG滴度值为导致信号为最大信号一半的稀释因子。如图5C所示，对于该抗原，Ribi佐剂具有比TLR激动剂混合物佐剂更高的抗原特异性IgG滴度值，对于该抗原是大约10次方。
实例6通过阴性选择来富集B细胞和消耗IgM
用与Ribi佐剂(Sigma-Aldrich)混合的10μg靶标D蛋白(基因泰克公司)对转基因大鼠(Open Monoclonal Technology)在尾根处进行皮下免疫，然后每周两次(每3天至4天)用与Ribi佐剂(Sigma-Aldrich)混合的10μg靶标D蛋白对其进行加强免疫(该加强免疫在如图2A所示的多个部位之间进行划分)。在最后一次免疫后三天，即在免疫开始后大约七周，收获多个淋巴结。淋巴细胞与抗大鼠CD4(BD Biosciences)、抗大鼠CD8a(BDBiosciences)、抗大鼠CD11b/c(BD Biosciences)、抗大鼠CD161a(BD Biosciences)和抗大鼠粒细胞(eBioscience)生物素缀合抗体一起孵育，洗涤，然后与链霉亲和素包被的磁珠(Miltenyi Biotec)一起孵育，并且在磁选柱(Miltenyi Biotec)上运行以捕获未标记的群体。然后对所得富集的B细胞群体进行采集以用于融合，或使其通过额外的消耗步骤。细胞用抗大鼠IgM-生物素(BD Biosciences)进行标记，洗涤，然后与链霉亲和素包被的磁珠(Miltenyi Biotec)一起孵育，并且在磁选柱(Miltenyi Biotec)上运行以捕获未标记的群体。经由电融合(Harvard Apparatus)将来自每个组的细胞与P3X63-Ag8U.1小鼠骨髓瘤细胞(American Type Culture Collection)进行融合。融合细胞在37℃、7％CO2下在培养基C(StemCell Technologies)中孵育过夜，然后重悬在含有抗大鼠IgG-FITC(Sigma-Aldrich)的半固体培养基D(StemCell Technologies)中并且铺平板至Omniwell托盘(ThermoFisher Scientific)中。铺平板后七天，使用Clonepix FL(Molecular Devices)来选择荧光菌落并且将其转移至含有培养基E(StemCell Technologies)的96孔培养板(BDBiosciences)中。挑选菌落后七天，通过ELISA针对靶标D蛋白筛选上清液。针对4500万个B细胞的融合，对示出的IgG阳性克隆数进行归一化。
图6示出了衍生自完整淋巴结、富集的LN B细胞和消耗IgM的富集的LN B细胞的表达IgG的杂交瘤克隆的数量。如图6所示，消耗IgM的富集的LN B细胞产生了最高数量的表达IgG的杂交瘤克隆，其次是富集的LN B细胞和未分离的完整淋巴结。令人惊讶的是，使用此处描述的方法，消耗IgM的富集的LN B细胞可产生比富集的LN B细胞约10倍至约100倍多的表达IgG的杂交瘤克隆。
实例7SP2ab对比PU1抗原特异性杂交瘤生成
图7A：使用流式细胞术将对照杂交瘤(左)与用APC GAM Ig标记后用Igα和Igβ转换的细胞系(右)进行比较。直方图表示活细胞群体。杂交瘤如Harlow和Lane(1988)所述而产生，并且在补充有HAT(Sigma-Aldrich)的培养基中生长。分选的细胞在补充有次黄嘌呤和胸苷(Sigma-Aldrich)的培养基中生长。洗涤细胞，然后用别藻蓝蛋白缀合的山羊抗小鼠IgH+L(Invitrogen)染色。再次洗涤细胞，并且用含有20％FBS(Atlanta BiologicalLaboratories)的IMDM进行重悬。使用碘化丙啶或7-氨基放线菌素D(均购自Invitrogen)将非活细胞从活细胞中分化出来。修改自：Price等人，J.Immunol Methods.2009年3月31日；343(1):28-41。
图7B示出了SP2ab杂交瘤的FACS分选曲线图。如实施例6所述，使用磁分离技术(Miltenyi Biotec)从淋巴细胞中纯化来自免疫大鼠的IgM阴性B细胞，并经由电融合(Harvard Apparatus)与SP2ab小鼠骨髓瘤细胞(Enzo Life Sciences)进行融合。融合细胞在37℃、7％CO2下在培养基C(StemCell Technologies)中孵育过夜，然后铺平板至含有培养基E(StemCell Technologies)(该培养基补充有1X HAT(Sigma-Aldrich))的6孔板中并在37℃、7％CO2下孵育三天。收集细胞并用别藻蓝蛋白标记的抗大鼠IgG(JacksonImmunoresearch)和藻红蛋白标记的靶蛋白(基因泰克公司)染色。杂交瘤细胞群体表达IgG(左直方图)并且IgG+Ag+细胞得到鉴定并使用FACSAria Fusion分选仪(BD Biosciences)进行分选(右点图)。
用与完全弗氏佐剂(BD Biosciences)混合的100μg靶标H蛋白(BiosearchTechnologies)对转基因大鼠(Open Monoclonal Technology)在尾根处进行免疫，然后每两周用与不完全弗氏佐剂(BD Biosciences)混合的50μg靶标H蛋白对其进行i.p.加强免疫。每周两次(每3天至4天)用与TLR激动剂混合物(如实施例3所述)混合的2μg靶标I蛋白(基因泰克公司)对C57BL/6基因敲除小鼠(基因泰克公司)在多个部位(i.p.和两个跗关节)处进行免疫.使用磁分离技术(Miltenyi Biotec)(使用用于小鼠的试剂盒，或如实施例6中所述以用于大鼠)从淋巴细胞中纯化来自免疫动物的IgM阴性B细胞，并经由电融合(Harvard Apparatus)与P3X63-Ag8U.1小鼠骨髓瘤细胞(American Type CultureCollection)进行融合。融合细胞在37℃、7％CO2下在培养基C(StemCell Technologies)中孵育过夜，然后重悬在含有抗物种IgG-FITC(Jackson Immunoresearch)的半固体培养基D(StemCell Technologies)中并且铺平板至Omniwell托盘(Thermo Fisher Scientific)中。铺平板后七天，使用Clonepix FL(Molecular Devices)来选择荧光菌落并且将其转移至含有培养基E(StemCell Technologies)的96孔板中。挑选后七天，通过ELISA针对免疫蛋白筛选上清液。
图7C示出了来自使用PU1融合配偶体的基于IgG的分选的抗原特异性杂交瘤的百分比。抗原阳性百分比示出为表达IgG的孔的函数。
上述相同的细胞群体经由电融合(Harvard Apparatus)与SP2ab小鼠骨髓瘤细胞(Enzo Life Sciences)进行融合。融合细胞在37℃、7％CO2下在培养基C(StemCellTechnologies)中孵育过夜，然后铺平板至含有培养基E(StemCell Technologies)(该培养基补充有1X HAT(Sigma-Aldrich))的6孔板中并在37℃、7％CO2下孵育三天。收集细胞并酌情用别藻蓝蛋白标记的抗大鼠IgG(Jackson Immunoresearch)和藻红蛋白标记的靶标H或I蛋白(基因泰克公司)染色。使用FACSAria Fusion分选仪(BD Biosciences)将IgG+Ag+细胞分选至96孔板中。铺平板后七天，通过ELISA针对免疫蛋白筛选上清液。
图7D示出了来自使用Sp2ab融合配偶体的基于抗原的分选的抗原特异性杂交瘤的百分比。抗原阳性百分比示出为表达IgG的孔的函数。
参考文献
Price,等人，Engineered cell surface expression of membraneimmunoglobulin as a means to identify monoclonal antibody-secretinghybridomas.J.Immunol Methods.2009年3月31日；343(1):28-41。
Harlow,E.；Lane,DP.Antibodies:A Laboratory Manual.CSH LaboratoryPress；Cold Spring Harbor,NY:1988。

Claims (39)

1.一种用于产生抗体文库的方法，所述方法包括：
(a)对一只或多只动物注射抗原；
(b)从每只动物收获包含B细胞的引流淋巴结；
(c)在每个B细胞与融合配偶体之间形成杂交瘤；以及
(d)针对对所述抗原的结合特异性筛选所述杂交瘤；
其中应用以下条件中的至少两个条件：
(i)所述动物为远交动物；
(ii)在多个部位处对所述动物进行注射；
(iii)每两周对所述动物进行注射；
(iv)对所述动物进行注射6周至15周；
(v)使用多种佐剂，使得不同的动物被注射不同的佐剂；
(vi)在步骤(c)之前富集B细胞；和/或
(vii)使用经改造以表达表面和分泌的IgG两者的融合配偶体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中应用条件(i)至(vii)中的两个条件。
3.根据权利要求1所述的方法，其中应用条件(i)至(vii)中的三个条件。
4.根据权利要求1所述的方法，其中应用条件(i)至(vii)中的四个条件。
5.根据权利要求1所述的方法，其中应用条件(i)至(vii)中的五个条件。
6.根据权利要求1所述的方法，其中应用条件(i)至(vii)中的六个条件。
7.根据权利要求1所述的方法，其中应用条件(i)至(vii)中的七个条件。
8.根据权利要求1所述的方法，其中应用条件(i)至(vi)中的至少两个条件。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括对两只或更多只动物注射抗原。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括对三只或更多只动物注射抗原。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括对四只或更多只动物注射抗原。
12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括对五只或更多只动物注射抗原。
13.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述动物为大鼠。
14.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个部位为引流淋巴结附近的部位。
15.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个部位包括背部、肩部、腹膜内、尾根和跗关节中的一个部位或多个部位。
16.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中在多个部位处对所述动物进行注射，并且在每个部位处注射的抗原的量介于0.1μg与300μg之间。
17.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中在多个部位处对所述动物进行注射，并且在每个部位处注射的抗原的量介于0.5μg与200μg之间。
18.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中不超过每周一次对所述动物进行注射。
19.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中不超过每两周一次对所述动物进行注射。
20.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中对所述动物进行注射6周至15周。
21.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种佐剂包括完全弗氏佐剂、Ribi和/或TLR激动剂混合物。
22.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中通过阴性选择来富集所述B细胞。
23.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述融合配偶体为Sp2ab融合配偶体。
24.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中筛选所述杂交瘤包括针对IgG抗体的表达的FACS分选，所述IgG抗体对所述抗原具有特异性。
25.一种用于产生抗体文库的方法，所述方法包括：
(a)在每只大鼠的多个部位处对一只或多只远交大鼠注射抗原；
(b)每2周重复所述注射，达至少6周；
(c)从每只大鼠的一个或多个引流淋巴结收获免疫细胞；
(d)通过阴性选择从所述免疫细胞消耗非B细胞，以形成富集的B细胞样品；
(e)使所述富集的B细胞样品与多个融合配偶体接触，以在每个B细胞与融合配偶体之间形成杂交瘤；以及
(f)针对对所述抗原的特异性筛选所述杂交瘤。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述多个部位为引流淋巴结附近的部位。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述多个部位包括背部、肩部、腹膜内、尾根和跗关节中的一个部位或多个部位。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中在每个部位处注射的抗原的量介于0.1μg与300μg之间。
29.根据权利要求28所述的方法，其中在每个部位处注射的抗原的量介于0.5μg与200μg之间。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中不超过每两周一次对所述动物进行注射。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中对所述动物进行注射6周至10周。
32.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述融合配偶体为Sp2ab融合配偶体。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的方法，其中筛选所述杂交瘤包括针对IgG抗体的表达的FACS分选，所述IgG抗体对所述抗原具有特异性。
34.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括对两只或更多只动物注射抗原。
35.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括对三只或更多只动物注射抗原。
36.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括对四只或更多只动物注射抗原。
37.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括对五只或更多只动物注射抗原。
38.一种抗体文库，所述抗体文库使用根据权利要求1至37中任一项所述的方法进行制备。
39.一种杂交瘤文库，所述杂交瘤文库使用根据权利要求1至37中任一项所述的方法进行制备。
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