CN116635413A - 用于获得结合跨膜蛋白的抗体的方法和生产所述抗体的细胞 - Google Patents

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Abstract

公开了用于获得表达结合跨膜蛋白的抗体的细胞的方法、用于从这样的细胞产生抗体的方法、针对跨膜蛋白的抗体及其片段、以及编码所述抗体的核酸。更具体地，本公开内容涉及用于基于使用脂质双层‑膜支架蛋白复合物将跨膜蛋白抗原呈递给细胞来获得抗体生产细胞的方法，所述抗体生产细胞表达结合跨膜蛋白的抗体。

Description

用于获得结合跨膜蛋白的抗体的方法和生产所述抗体的细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月23日提交的美国临时申请号63/130,044的优先权权益，其整个内容通过引用并入本文。
序列表的通过引用并入
创建于2021年12月7日并通过EFS-Web提交给美国专利和商标局的名为36526_10465WO01_SequenceListing.txt的30KB的ASCII文本文件中的序列表通过引用并入本文。
技术领域
本公开内容一般地涉及表达结合跨膜蛋白的抗体的细胞、用于产生所述抗体的方法、针对跨膜蛋白的抗体及其片段、以及编码所述抗体的核酸。更具体地，本公开内容涉及用于基于使用脂质双层-膜支架蛋白复合物将跨膜蛋白抗原呈递给细胞来获得抗体生产细胞的方法，所述抗体生产细胞表达结合跨膜蛋白的抗体。
背景技术
跨膜蛋白，诸如G-蛋白偶联受体(GPCR)和离子通道，是FDA批准的所有小分子药物中的近一半的靶点，但迄今为止，非常少的抗体被批准用于治疗。参见Santo，等人，Nat.Rev.Drug Disc.16:19(2017)。通常，用于筛选抗体或抗体生产细胞的方法效率低下或无法获得结合跨膜蛋白的抗体。例如，将多跨度跨膜蛋白分离并包装到载体(诸如外核体、病毒样颗粒和脂蛋白体)中会造成关于是否存在足够量的生物活性蛋白或构象准确的跨膜蛋白的不确定性。此外，表达GPCR的细胞作为筛选试剂并不是非常成功，而源自跨膜的跨膜蛋白的小肽由于其缺乏构象背景很少成功地获得相关抗体。因此，需要用于获得和产生针对跨膜蛋白的抗体的新方法。
发明内容
本文公开了用于获得针对跨膜蛋白的抗体的方法，其利用脂质双层-膜支架蛋白复合物将跨膜蛋白抗原呈递给抗体。所述方法采用包括目标跨膜蛋白、以及在天然存在的细胞的膜中常见的脂质和膜支架蛋白的复合物，以将跨膜蛋白以其天然构象呈递给的抗体。因此，在所公开的方法中使用脂质双层-膜支架蛋白复合物以从抗体(或表达抗体的细胞)的群体中鉴定和收集抗体(或表达抗体的细胞)的特定子集，其结合在自然界中可接近的跨膜蛋白上的表位，诸如、例如，细胞外结构域或其部分。因此，本方法无需通过定位诱变和其它已知技术对表位特异性抗体进行费时的筛选、鉴定和选择即可确定特定抗体是否识别目标跨膜蛋白的期望部分。
在一个方面，提供了一种用于获得抗体或表达针对目标跨膜蛋白的抗体的细胞群体的方法，其包括使抗体生产细胞群体与呈递目标跨膜蛋白或其部分的脂质双层-膜支架蛋白复合物接触。
在一些实施方案中，所述方法包括使抗体生产细胞群体与包含目标跨膜蛋白或其部分的脂质双层-膜支架蛋白复合物接触以允许由所述复合物呈递的跨膜蛋白抗原与在细胞表面上的抗体之间的结合和收集结合的抗体生产细胞。
在一些实施方案中，所述抗体生产细胞群体是由来自一种特定类型的组织、器官或细胞的细胞构成的同质细胞群体。在其它实施方案中，所述抗体生产细胞群体是由来自超过一种类型的组织、器官或细胞的细胞构成的异质细胞群体。在某些实施方案中，所述抗体生产细胞群体包括来自脾、淋巴结、骨髓或其它器官中的一种或多种的组织衍生的细胞。在一些实施方案中，所述抗体生产细胞群体包括淋巴细胞。在特定实施方案中，所述抗体生产细胞群体包括血细胞。在某些实施方案中，所述抗体生产细胞群体包括外周血细胞、B细胞、浆细胞、浆细胞性骨髓瘤或其组合。在具体实施方案中，所述抗体生产细胞群体是B细胞群体。在一个实施方案中，所述抗体生产细胞群体包含记忆B细胞。在一个实施方案中，所述抗体生产细胞群体包括重组细胞，诸如、例如，杂交瘤。
在一些实施方案中，所述方法包括从动物获得抗体生产细胞群体。在某些实施方案中，从动物获得抗体生产细胞群体，所述动物在用目标跨膜蛋白或编码它的核酸免疫原免疫接种后产生针对目标跨膜蛋白的抗体。在某些实施方案中，所述动物或免疫的动物是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是小鼠、大鼠、山羊、人、仓鼠、猪、猴或豚鼠。在一些实施方案中，所述哺乳动物不是人。在特定实施方案中，所述非人哺乳动物是小鼠、大鼠或山羊。在具体实施方案中，所述哺乳动物是小鼠。在所述方法的另一个实施方案中，所述哺乳动物是人，诸如、例如，已经暴露于免疫原的人。
在一些情况下，将动物免疫。在某些实施方案中，所述免疫的动物被遗传工程改造过。例如，所述动物可以被遗传工程改造过，使得所述动物不再从内源基因座表达目标跨膜蛋白。在某些实施方案中，所述遗传工程改造的动物是非人哺乳动物，诸如、例如，小鼠、山羊或大鼠，其包括编码人免疫球蛋白重链(IgH)和人免疫球蛋白轻链(IgL)可变区的核酸序列。在一些实施方案中，所述遗传工程改造的动物包括编码人免疫球蛋白重链和人免疫球蛋白轻链可变区的核酸序列，并且也缺乏编码目标跨膜蛋白的内源基因。在具体实施方案中，所述免疫的、遗传工程改造的动物是小鼠或大鼠，诸如、例如，包括人源化的IgH基因座和/或人源化的Igκ轻链基因座的小鼠。在一些实施方案中，所述免疫的、遗传工程改造的动物是包括人源化的IgH基因座和人源化的Igκ轻链基因座的小鼠，其缺乏编码目标跨膜蛋白的内源性小鼠基因。在一个实施方案中，遗传工程改造的小鼠包含编码人免疫球蛋白重链和免疫球蛋白λ轻链(Igλ)可变区的DNA。在一个特定实施方案中，所述遗传工程改造的小鼠包含编码人免疫球蛋白重链和免疫球蛋白λ轻链(Igλ)可变区的DNA，并且也缺乏编码目标跨膜蛋白的内源性小鼠基因。
在一些实施方案中，从用目标跨膜蛋白免疫原免疫的动物获得抗体生产细胞。在某些实施方案中，所述动物已经用编码目标跨膜蛋白的至少一部分的核酸免疫，或用目标跨膜蛋白的至少一部分免疫。在一些实施方案中，所述动物已经用编码目标全长跨膜蛋白的核酸免疫。在其它实施方案中，所述动物已经用编码目标跨膜蛋白的一部分的核酸免疫。在具体实施方案中，所述核酸不编码目标全长跨膜蛋白的氨基端和/或羧基端部分。在其它实施方案中，所述动物已经用编码目标跨膜蛋白或其部分的核酸免疫，所述核酸被包含在能够表达所述核酸的载体(例如，质粒、表达载体、病毒样颗粒(VLP)、细胞、外核体和脂质体)中。在一些实施方案中，所述动物已经用目标跨膜蛋白或其部分免疫。在某些实施方案中，所述动物已经用目标全长跨膜蛋白免疫。在具体实施方案中，所述目标跨膜蛋白免疫原被截短，并且不包括目标全长跨膜蛋白的氨基端和/或羧基端部分。在某些实施方案中，所述目标跨膜蛋白或核酸免疫原被修饰成包括一个或多个可检测元件，诸如标记、标志物或特征。在一些实施方案中，所述免疫原包含可检测标记。在具体实施方案中，所述可检测标记是FLAG-标签、组氨酸标签(His-标签)、Avi-标签、BirA-标签或其组合。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白免疫原具有FLAG-标签和His-标签。在特定实施方案中，所述一种或多种可检测标记位于免疫原的氨基端或羧基端处。在具体实施方案中，所述动物已经用被包含在脂质双层-膜支架蛋白复合物中的目标跨膜蛋白或其部分免疫。
在某些实施方案中，所述动物用编码目标嵌合跨膜蛋白的核苷酸序列免疫，所述目标嵌合跨膜蛋白包含目标人跨膜蛋白的一部分，该部分可操作地连接至目标跨膜蛋白的非人同系物的一部分。所述非人同系物可以来自，例如，人、黑猩猩、恒河猴、兔、马、绵羊、大鼠、小鼠、狗、鸡或山羊。在某些实施方案中，编码目标嵌合跨膜蛋白的核苷酸序列还包括编码可检测元件(诸如、例如，His-标签、FLAG-标签、Avi-标签或Bir-A-标签)的核苷酸序列。在其它实施方案中，所述动物用目标嵌合跨膜蛋白或其部分免疫，所述目标嵌合跨膜蛋白或其部分包括目标人跨膜蛋白的一部分，该部分可操作地连接至目标跨膜蛋白的非人同系物的一部分。在一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括可检测元件(诸如、例如，His-标签、FLAG-标签、Avi-标签或Bir-A-标签)。
在一些情况下，将动物用两种或更多种免疫原诸如、例如蛋白或肽、核酸序列诸如DNA或RNA、经修饰的蛋白或编码DNA、VLP和包含目标跨膜蛋白或其部分的脂质双层-膜支架蛋白复合物免疫。
所述方法包括使抗体生产细胞群体与包括目标跨膜蛋白或其部分的脂质双层-膜支架蛋白复合物接触，以得到表达结合目标跨膜蛋白的抗体的抗体生产细胞群体。
所述脂质双层-膜支架蛋白复合物包括至少一个膜支架蛋白(MSP)和脂质。在一些实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物包括至少一个MSP和多个脂质。在某些实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物包括至少两个或刚好两个MSP。在其它实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物包括三个或更多个MSP。在一些情况下，所述脂质双层-膜支架蛋白包括至少一个膜支架蛋白诸如MSP1E3D1、MSP1D1、MSP2N3和MSP2N2。在一个实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物包含两个MSP1E3D1蛋白。在一些实施方案中，所述MSP是相同的。在其它实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物中的MSP是不同的。
在一些实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物含有至少一个标记的MSP，其包括可检测元件，诸如标记、标志物或特征。在具体实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物含有两个标记的MSP和脂质双层。在一些实施方案中，所述MSP蛋白包含可检测标记诸如荧光团。在具体实施方案中，所述可检测元件是位于复合物的一个或多个MSP上的BirA-标签或Avi-标签。在示例性实施方案中，通过化学地生物素化MSP或通过将Avi-标签遗传上引入MSP编码序列中，将一个或多个MSP生物素化。
所述脂质双层-膜支架蛋白复合物还包括多个脂质，诸如鞘脂和/或磷脂。所述复合物的脂质双层可以包含单个类型的脂质或多个类型的脂质。在一些实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物包括在膜支架蛋白周围形成盘形“盘状”磷脂双层的脂质。在某些实施方案中，所述脂质双层包含下述脂质中的一种或多种：鞘磷脂、磷脂酰胆碱、及其衍生物。在一个具体实施方案中，所述脂质双层包含1-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、1-棕榈酰基2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)或其组合。在一个示例性实施方案中，所述脂质双层包括多个POPC磷脂。
用于所述方法中的脂质双层-膜支架蛋白复合物还包括至少一个目标跨膜蛋白或其部分，其通过所述复合物呈递给细胞群体作为能够结合由抗体生产细胞产生的抗体的抗原。由所述复合物呈递的目标跨膜蛋白可以是具有至少一个细胞外结构域和至少一个跨膜结构域的天然存在的蛋白。在一些实施方案中，由所述复合物呈递的目标跨膜蛋白是人蛋白。在其它实施方案中，所述目标跨膜蛋白是非人蛋白，诸如小鼠、大鼠、灵长类动物、仓鼠、细菌、病毒蛋白等。在某些实施方案中，所述目标跨膜蛋白从其天然存在形式修饰得到。示例性的经修饰的目标跨膜蛋白可以包括对其天然氨基酸序列的下述改变中的一种或多种：氨基酸置换、氨基酸缺失、氨基酸插入。在一个实施方案中，所述目标跨膜蛋白被修饰以删除(即，“截短”)跨膜蛋白的一部分，诸如、例如，全长蛋白的N-端和/或C-端结构域。在一些实施方案中，掺入脂质双层-膜支架蛋白复合物中的目标跨膜蛋白包括在氨基端、一个或多个细胞外环结构域、一个或多个跨膜结构域、一个或多个细胞内结构域、C-端或其组合中的稳定化突变。在一个实施方案中，所述目标跨膜蛋白是配体活化的蛋白，由此所述目标跨膜蛋白在有或没有配体存在下改变构象(即，具有有活性和无活性状态)。在另一个实施方案中，掺入脂质双层-膜支架蛋白复合物中的目标跨膜蛋白是嵌合蛋白，其包括目标人跨膜蛋白的一部分，该部分可操作地连接至目标跨膜蛋白的非人同系物的一部分。在某些实施方案中，所述目标跨膜蛋白包括可检测元件，诸如、例如，His-标签、FLAG-标签、Avi-标签、Bir-A标签或其组合。在特定实施方案中，由所述复合物呈递的目标跨膜蛋白包括His-标签和FLAG-标签。
在某些情况下，所述目标跨膜蛋白是GPCR蛋白、四次穿膜蛋白或离子通道蛋白。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是GPCR蛋白，诸如、例如，CCR5、ADORA2A、ADRB3、C3AR1、ADRA2A、GLP1R、CCR4、CCR8和CXCR4。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是CCR5或其部分。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是ADRA2A或其部分。在某些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是ADORA2A或其部分。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是C3AR1或其部分。
在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是四次穿膜蛋白，诸如、例如，TSPAN 1至TSPAN19、TSPAN21、TSPAN23、TSPAN 31、TSPAN 32、TSPAN 33、UPK1B、PRPH2、CD151、CD53、CD37、CD82、CD63、CD81、CD9、CD82、CD63、CLND6和CLND9。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是CD63或其部分。在其它实施方案中，所述目标跨膜蛋白是离子通道蛋白，诸如、例如，电压门控的离子通道蛋白。在具体实施方案中，所述电压门控的离子通道蛋白是电压依赖性的钙通道或电压门控的钾通道蛋白。在一些实施方案中，所述离子通道蛋白是钙活化的钾通道蛋白、钠通道蛋白、钙通道蛋白或氯离子通道。在所述方法的特定实施方案中，所述目标跨膜蛋白是离子通道蛋白，诸如、例如，BKCa、MaxiK、Sk、NaV1、CACNG1、CAV、CIC或瞬时受体电位通道蛋白(TRP)。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是NaV1蛋白或其部分。在具体实施方案中，所述目标跨膜蛋白是NaV1.7蛋白或其部分。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是CACNG1蛋白或其部分。
在所述方法的某些实施方案中，由所述复合物呈递的目标跨膜蛋白结合在抗体生产细胞的细胞表面上的抗体。在一些实施方案中，所述抗体结合位于目标跨膜蛋白的特定结构域(诸如、例如，目标跨膜蛋白的细胞外结构域)上的表位(存在于目标跨膜蛋白上的结合结构域)。在具体实施方案中，所述抗体结合位于目标跨膜蛋白的N-端结构域的细胞外部分上的表位。在一些实施方案中，所述抗体结合位于目标跨膜蛋白的细胞外环或目标跨膜蛋白的C-端结构域的细胞外部分上的表位。在某些实施方案中，所述抗体结合位于目标跨膜蛋白的C-端结构域上的表位。在一些实施方案中，所述抗体结合位于目标跨膜蛋白的细胞外环上的表位。在一些实施方案中，所述抗体结合位于目标跨膜蛋白的细胞内结构域上的表位。
所述方法还可以包括使抗体生产细胞群体与可检测元件接触，所述可检测元件结合感兴趣的细胞表面蛋白或生物标志物。例如，从免疫的动物获得的抗体生产细胞的异质群体可以与荧光地标记的抗体接触，所述抗体结合B细胞表面蛋白例如IgG。然后通过检测所述抗体和B细胞之间的结合和从所述群体分离结合的细胞，可以从所述群体获得抗体生产细胞B细胞的子集。在某些实施方案中，所述抗体生产细胞群体可以与荧光地标记的结合B细胞表面蛋白的抗体接触，同时所述细胞与含有目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物接触，或者所述细胞可以在不同的时间接触。
在某些实施方案中，所述方法还可以包括使抗体生产细胞群体与阻滞剂接触。例如，抗体生产细胞群体可以与分子(诸如识别或结合目标跨膜蛋白的一部分、MSP蛋白的一部分或可检测标志物诸如His-标签或FLAG-标签的肽或化合物)接触。在这样的实施方案中，将抗体生产细胞与一种或多种阻滞剂一起温育以便允许阻滞剂与由抗体生产细胞产生的抗体之间的结合，所述抗体结合位于所述阻滞剂上的表位。
所述方法还可以包括洗涤细胞(诸如抗体生产细胞)的群体一段时间，其从结合的细胞中除去未结合的材料或细胞。
可以检测由抗体生产细胞产生的抗体与由脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的目标跨膜蛋白上存在的结合结构域(表位)之间的结合，并且可以收集结合至跨膜蛋白的抗体生产细胞。例如，在一些实施方案中，通过目标跨膜蛋白的构象变化、细胞中目标跨膜蛋白的活化或灭活或通过使用一种或多种可检测标志物，检测结合。在某些实施方案中，使用单细胞分离的高处理量技术，诸如荧光激活细胞分选术(FACS)，可以检测呈递与目标跨膜蛋白抗原结合的抗体的抗体生产细胞并与群体中的其它抗体生产细胞分离。在一个实施方案中，通过检测由附着至复合物或其中包含的目标跨膜蛋白的可检测标记发射的信号，使用FACS来鉴定和分离已经结合至由脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的目标脂质跨膜蛋白的单个抗体生产细胞。在具体实施方案中，所述信号由下述可检测标记中的一种或多种发射：生物素/抗生蛋白链菌素-PE复合物或荧光分子。
所述方法还可以包括从抗体生产细胞获得或分离抗体或抗体编码核酸。
在某些实施方案中，将编码抗体(例如，基因)或其部分的核酸从抗体生产细胞分离。在一些实施方案中，所述核酸编码抗体的可变结构域。在某些实施方案中，所述核酸编码抗体重链或其片段。在其它实施方案中，所述核酸编码抗体轻链或其片段。在某些情况下，从抗体生产细胞分离的核酸编码全长抗体。在一些实施方案中，所述方法包括从抗体生产细胞分离包含编码由所述细胞表达的抗体的重链可变区的核苷酸序列的核酸；和包含编码由所述细胞表达的抗体的轻链可变区的核苷酸序列的核酸。
在所述方法的某些实施方案中，在宿主细胞中表达编码抗体的核酸。在一些实施方案中，在表达全长抗体的条件下培养包含核酸的宿主细胞，并且然后可以将所述抗体生产和分离用于进一步使用。在某些实施方案中，所述宿主细胞包含编码抗体的可变结构域的核酸，并且在表达可变结构域的条件下培养所述细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含编码抗体的可变重链(VH)结构域的核酸，并且在表达VH结构域的条件下培养所述细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含编码抗体的可变轻链(VL)结构域的核酸，并且在表达VL结构域的条件下培养所述细胞。在具体实施方案中，所述宿主细胞包含编码抗体的VH结构域的核酸和编码抗体的VL结构域的核酸，并且在表达VH结构域和VL结构域的条件下培养所述细胞。
因此，在本公开内容的一个方面，提供了使用本公开内容的方法分离的细胞，其包括编码对目标跨膜蛋白特异性的抗体的核酸分子。在一些实施方案中，提供了一种细胞，其包含编码对目标跨膜蛋白特异性的抗体的可变重链(VH)结构域的核酸。在一些实施方案中，提供了一种细胞，其包含编码对目标跨膜蛋白特异性的抗体的可变轻链(VL)结构域的核酸。在一些实施方案中，提供了一种细胞，其包含编码对目标跨膜蛋白特异性的抗体的VH结构域的核酸和编码所述抗体的VL结构域的核酸。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述细胞可以是下述细胞类型中的任何一种或多种：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、肾(例如，HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0和MMT细胞和肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述细胞是CHO细胞。
所公开的方法的这些和其它目的、特征和优点将从以下结合附图对所述方法的各个方面的详细描述变得显而易见。
附图说明
图1A-1B证实，由脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的目标跨膜蛋白特异性地结合识别目标跨膜蛋白的抗体，并且使用公开的方法在体外可检测到。关于它们的结合已知会结合GPCR1的示例性抗体(阳性对照AB)和不会结合GPCR蛋白的同种型对照mab(阴性对照AB)的能力，将具有至少两个膜支架蛋白(每个含有可检测的Bir-A标记，并且含有第一种示例性目标跨膜蛋白)的脂质双层-膜支架蛋白复合物(具有GPCR1的复合物)与不包括目标跨膜蛋白的对照脂质双层-膜支架蛋白复合物(空复合物)进行了对比。(A)直方图显示了octet测定的结果，其证实由脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的目标跨膜蛋白特异性地结合阳性对照抗体(0.6nm)，但在以下情况下不结合：抗-GPCR1抗体和空复合物之间(-0.05nm)，阴性对照抗体和包括GPCR1跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物之间(-0.06nm)，或阴性对照抗体和空复合物之间(-0.03nm)。(B)如下分析检测呈递目标跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(具有GPCR1的复合物)并将其与不含有目标跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(空复合物)分离的能力：将含有或没有跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物提供给具有与其连接的抗生蛋白链菌素的平板，并然后与已知结合GPCR1的抗体(阳性对照AB)或阴性对照抗体一起温育。直方图表明，由脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的目标跨膜蛋白特异性地结合阳性对照抗体，但不结合阴性对照抗体。
图2A-2F证实了通过流式细胞计量术检测和分离生产抗体的B细胞，其表达对示例性目标跨膜蛋白特异性的抗体。从未免疫的对照小鼠(A、C、E)以及通过注射编码第一目标跨膜蛋白(GPCR1，B)、第二目标跨膜蛋白(GPCR2，D)或第三目标跨膜蛋白(GPCR3，F)的DNA免疫的遗传工程改造的小鼠收获和分离脾细胞。如下使用FACS检测和收集表达对每种示例性目标跨膜蛋白特异性的抗体的B细胞群体(表面IgG阳性细胞)(抗原结合细胞)：将脾细胞用针对B细胞标志物的荧光标记(即，抗-IgG)染色，和使细胞群体与呈递示例性目标跨膜蛋白之一的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物接触。(A)在一百万个从对照小鼠获得的脾细胞中的仅两个B细胞非特异性地结合通过生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递所呈递的第一目标跨膜蛋白(矩形)。(B)使用本方法检测到一百万个B细胞中的十一个表达对第一种示例性目标GPCR跨膜蛋白(GPCR1)特异性的抗体(矩形)。(C)在一百万个从对照小鼠获得的脾细胞中的仅两个B细胞非特异性地结合通过生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递所呈递的第二目标跨膜蛋白(矩形)。(D)使用本方法检测到一百万个B细胞中的七十八个表达对第二种示例性目标GPCR跨膜蛋白(GPCR2)特异性的抗体(矩形)。(E)从一百万个来自对照小鼠的脾细胞获得了仅十一个B细胞，它们非特异性地结合通过生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递所呈递的第三目标跨膜蛋白(矩形)。(F)使用本方法检测到一百万个B细胞中的六十五个表达对第三种示例性目标GPCR跨膜蛋白(GPCR3)特异性的抗体(矩形)。
图3表明，使用生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物来呈递跨膜蛋白抗原从抗体生产细胞分离的抗体特异性地结合第二种示例性目标GPCR跨膜蛋白，不论使用的免疫原的类型如何。使用呈递目标跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物从遗传工程改造的小鼠获得抗体生产细胞，所述小鼠用编码跨膜蛋白的DNA(DNA)或纯化的目标跨膜蛋白(蛋白)免疫，并产生抗体用于筛选。在细胞中表达目标全长跨膜蛋白抗原(过表达的TMB)，并将抗原表达细胞与未用编码任一种TMB的DNA转染的对照细胞(亲本细胞)进行对比。然后将细胞与抗体一起温育以鉴定特异性地结合示例性目标跨膜蛋白的抗体。在虚线以上的抗体能够结合目标跨膜蛋白。相反，在虚线以下的抗体是弱结合剂或不能结合目标跨膜蛋白，如通过与阳性(正方形)和阴性(三角形)对照抗体的对比所指示的。
图4显示了使用公开的方法从抗体生产细胞分离的抗体，其被表达用于筛选对在细胞表面上表达的目标跨膜蛋白抗原的结合。使用呈递目标跨膜蛋白抗原的n-端截短形式的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物从免疫的遗传工程改造的小鼠获得抗体生产细胞，并产生抗体用于筛选。在细胞中表达目标跨膜蛋白抗原的截短形式(过表达的截短的TMB)，或在细胞中表达目标跨膜蛋白抗原的全长形式(过表达的全长TMB)，并在将细胞与抗体一起温育时将抗原表达细胞与未用编码截短的TMB抗原或全长TMB的DNA转染的对照细胞(亲本细胞)进行对比，以鉴定特异性地结合位于示例性目标跨膜蛋白的细胞外环结构域中的表位的抗体(框)。
表1：从免疫的小鼠分离来自细胞的抗体，所述细胞表达针对各种跨膜蛋白的细胞表面抗体。将已经被遗传工程改造以防止从内源基因表达目标跨膜蛋白的小鼠(没有抗原的遗传修饰的小鼠)或从内源基因表达目标跨膜蛋白的遗传工程改造的小鼠(遗传修饰的小鼠)用以下物质免疫：编码目标跨膜蛋白的DNA(DNA)，编码跨膜蛋白的经修饰形式的DNA(经修饰的DNA)，纯化的跨膜蛋白(蛋白)，包括目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物(含有抗原的复合物)，或其组合。使用本文中公开的分选方法收集抗体生产细胞(细胞分选和含有抗原的复合物)，并从所述细胞分离抗体，并与从使用标准杂交瘤技术获得的细胞分离的抗体(杂交瘤)进行对比。对于分析的每种跨膜蛋白，通过用呈递目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物筛选细胞而从抗体生产细胞获得的结合目标跨膜蛋白的抗体的百分比高于标准杂交瘤技术。
表2：得到抗体生产细胞的细胞分选策略能力的对比，所述抗体生产细胞表达特异性地结合目标跨膜蛋白的抗体。通过注射下述免疫原中的一种或多种，免疫具有(VI)或没有(VI-KO)内源性小鼠基因(其编码所分析的示例性目标跨膜蛋白，即GPCR1或离子通道2)的遗传工程改造的小鼠：编码目标跨膜蛋白的DNA(DNA)，纯化的跨膜蛋白(蛋白)，能够表达目标跨膜蛋白的病毒样颗粒(VLP)，或其组合(VLP和DNA)。然后使用下述分选试剂之一分选从免疫的小鼠获得的B细胞：呈递跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(含有TMB的复合物)、VLP或纯化的跨膜蛋白(蛋白)。然后将产生结合至分选试剂的抗体的细胞收集，并从每种细胞产生抗体用于对比。
表3：从抗体生产细胞产生的抗体的对比，所述抗体生产细胞得自用编码目标人跨膜蛋白的DNA(DNA)或纯化的人跨膜蛋白(蛋白)免疫的遗传工程改造的小鼠，其中使用呈递目标跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(含有TMB的复合物)分选得自每只小鼠的细胞。数据提供了5个代表性免疫接种活动的结果。
表4：抗体生产细胞的分离和从遗传修饰的小鼠产生抗体，所述小鼠不表达两种不同的示例性目标跨膜蛋白的小鼠同系物(VI-KO)，该表对比了不同的免疫接种策略以证实生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物可以用于获得交叉反应性抗体，其结合目标跨膜蛋白的小鼠同系物(小鼠TMB)和目标跨膜蛋白的人同系物(人TMB)。提供的数据是TMB1的四个代表性免疫接种活动和TMB2的四个代表性免疫接种活动的组合。
表5：抗体生产细胞的分离和从遗传修饰的小鼠产生抗体，所述小鼠不表达示例性目标跨膜蛋白的小鼠同系物(VI-KO)，该表证实，用包括人TMB2蛋白(人TMB2)的脂质双层-膜支架蛋白复合物免疫接种遗传修饰的小鼠并用呈递人TMB2蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物(含有人TMB2的复合物)和/或用呈递小鼠TMB2蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物(含有小鼠TMB2的复合物)筛选生产抗体的B细胞，会鉴定出这样的生产抗体的B细胞：其表达能够结合小鼠TMB2和人TMB2蛋白同系物的交叉反应性抗体，以及对人TMB2蛋白特异性的抗体。提供的数据是两个代表性免疫接种活动的组合。
具体实施方式
本文中公开了利用脂质双层-膜支架蛋白复合物将跨膜蛋白抗原呈递给由细胞生产的抗体的方法。所述脂质双层-膜支架蛋白复合物包括目标跨膜蛋白或其部分、以及在天然存在的细胞的膜中常见的脂质和膜支架蛋白，并因而将跨膜蛋白抗原以其天然构象呈递给的抗体。这样，将脂质双层-膜支架蛋白复合物在本方法中用于鉴定和收集在特定群体中的抗体(或表达抗体的细胞)的特定子集，所述特定群体结合在自然界中可接近的跨膜蛋白上的表位，诸如、例如，细胞外结构域。
不受限于任何一种理论，本文中公开的方法揭示，免疫动物，并使用呈递目标跨膜蛋白抗原的脂质双层-膜支架蛋白复合物从免疫的动物中分离抗体生产细胞，可以鉴定产生对构象准确的跨膜蛋白上的表位具有特异性的抗体的细胞。
此外，通过例如单细胞分离和收集技术，诸如FACS，可以直接从抗体生产细胞分离抗体和编码抗体的核酸。因此，本公开内容也提供了一种有作用的(effective)和有效的(efficient)直接从抗体生产细胞群体获得对跨膜蛋白具有亲和力的抗体的方法。所述方法无需通过定位诱变和其它已知技术对表位特异性抗体进行费时的筛选、鉴定和选择即可确定特定抗体是否识别目标跨膜蛋白的期望部分。
在本公开内容的一个方面，提供了一种用于获得抗体或表达针对目标跨膜蛋白的抗体的细胞群体的方法，其包括使抗体生产细胞群体与呈递目标跨膜蛋白或其部分的脂质双层-膜支架蛋白复合物接触。在一个实施方案中，所述方法包括使从动物获得的抗体生产细胞群体与包含目标跨膜蛋白或其部分的脂质双层-膜支架蛋白复合物接触以允许跨膜蛋白(即，抗原)与细胞表面上的抗体之间的结合，和收集在细胞群体内的结合的抗体生产细胞。
在下面的描述中，关于术语的使用将遵循某些惯例。通常，本文使用的术语意图与本领域技术人员已知的那些术语的含义一致地解释。在实施本公开内容时，使用了分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学中的许多常规技术，它们是在本领域的技术范围内。这些技术更详细地描述于，例如，Molecular Cloning:a Laboratory Manual第4版，J.F.Sambrook和D.W.Russell,编.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012；Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Melvyn Little,编.CambridgeUniversity Press 2009；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait,编，1984)；“AnimalCell Culture”(R.I.Freshney,编，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人，编，1987，和定期更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis等人，编，1994)；“A PracticalGuide to Molecular Cloning”(Perbal Bernard V.,1988)；“Phage Display:ALaboratory Manual”(Barbas等人，2001)。这些参考文献和含有本领域技术人员广泛已知的和依赖的标准方案的其它参考文献(包括生产商的说明书)的内容特此通过引用并入作为本公开内容的一部分。
产生抗体生产细胞的免疫接种
通过本领域已知的任何方法，可以完成动物的免疫接种。参见，例如，E.Harlow和D.Lane“Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor”(1988)；Malik和Lillehoj,Antibody techniques:Academic Press,1994,CA。例如，可以将免疫原通过各种途径直接施用给动物诸如哺乳动物，所述途径包括、但不限于静脉内或腹膜内注射，有或没有佐剂，其中佐剂可以辅助刺激免疫应答。本领域已知的佐剂包括、但不限于完全和不完全弗氏佐剂、MPL+TDM佐剂系统(Sigma)或RIBI(胞壁酰基二肽)。参见O'Hagan,VaccineAdjuvant,Human Press,(2000)NJ。术语“免疫原”表示包含抗原(诸如、例如，目标跨膜蛋白或其编码核酸)的组合物，宿主的免疫应答针对所述抗原产生抗原特异性抗体。术语“抗原”表示能够被结合剂(诸如抗体或其片段)结合的分子或分子的一部分。还能够使用抗原产生能够结合每种抗原的表位的抗体。
作为蛋白、编码蛋白或其片段的核酸序列、肽片段、蛋白-融合物或通过含有编码免疫原的目标基因或蛋白免疫原或其肽片段的载体，可以将免疫原施用给宿主动物。免疫接种过程可以诱导宿主的免疫应答，并在体内使用宿主的细胞表达机制表达抗原(诸如，目标跨膜蛋白)。
各种免疫接种技术是本领域已知的，并且可以用于实施所述方法。例如，可以如下免疫动物：注射免疫原，诸如编码目标跨膜蛋白的至少一部分的核酸、目标跨膜蛋白的至少一部分、包括这样的核酸的载体、目标跨膜蛋白或其部分。
在一些情况下，将动物用编码目标跨膜蛋白或其部分的核酸免疫。在某些实施方案中，将动物用编码目标全长跨膜蛋白的核酸免疫。在特定实施方案中，将动物用编码目标全长人跨膜蛋白的核酸免疫。在其它实施方案中，将动物用编码目标全长非人跨膜蛋白的核酸免疫。在特定实施方案中，将动物用编码目标全长小鼠跨膜蛋白的核酸免疫。
术语“核酸”或“核酸序列”或“核苷酸序列”表示单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或经修饰的主链残基或连接的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合性能，并且其以类似于参考核苷酸的方式代谢。术语“编码核酸”或“编码……的核酸”表示编码氨基酸序列(诸如肽、蛋白、可检测元件或标记和/或调节元件)的DNA或RNA序列。“基因”表示编码氨基酸序列(其包含一种或多种多肽、蛋白或酶的全部或部分)的DNA核酸序列，并且可以包括或不包括内含子，以及调节性DNA序列，诸如启动子或增强子序列、5’-非翻译区或3’-非翻译区，其影响例如表达基因或基因产物的条件。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中用于表示通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物。该术语包括氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“蛋白”表示大多肽。例如，在本公开内容中，蛋白可以是全长或内源蛋白。术语“肽”通常表示短多肽，诸如、例如，蛋白或多肽的片段或部分。本文中使用的多肽或蛋白的“片段”或“部分”表示小于全长多肽或蛋白表达产物的多肽的任何部分。片段或部分可以是全长蛋白的“截短”或缺失类似物，其中一个或多个氨基酸残基已经从全长蛋白中除去。例如，在本公开内容中，肽可以被描述为“截短的蛋白”或“蛋白的一部分”或“蛋白的片段”。在某些情况下，目标跨膜蛋白的“一部分”包括目标跨膜蛋白的至少整个跨膜部分。“截短的蛋白”可以是目标跨膜蛋白的一部分，其不包括全长蛋白的氨基端和/或羧基端部分。可以合成合成的多肽、肽和蛋白，例如，使用自动化的多肽合成仪或通过本领域技术人员已知的重组技术。
术语“跨膜蛋白”和“目标跨膜蛋白”在本文中互换地用于指附着并嵌入细胞或细胞器的膜中的蛋白或其多肽部分。因此，跨膜蛋白是一种穿过膜的蛋白，并因此由至少一个跨膜结构域组成。在一些情况下，所述跨膜蛋白还包括至少一个细胞质结构域和/或至少一个细胞外结构域。所述细胞质结构域可以是氨基端结构域、羧基端结构域和细胞内环结构域中的一种或多种。所述细胞外结构域可以是氨基端结构域、羧基端结构域和细胞外环结构域中的一种或多种。在一些情况下，目标跨膜蛋白的细胞外结构域包括N-端细胞外结构域、C-端细胞外结构域和/或在目标跨膜蛋白的一个或多个跨膜结构域之间的细胞外环结构域。所述跨膜蛋白可以是源自任何生物体(包括、但不限于原核生物、真核生物和病毒)的天然存在的蛋白。在某些实施方案中，所述跨膜蛋白可以是人、黑猩猩、恒河猴、兔、马、绵羊、大鼠、小鼠、狗、鸡或山羊蛋白。在一些情况下，所述跨膜蛋白是哺乳动物蛋白，诸如人、小鼠、大鼠或灵长类动物跨膜蛋白。在具体实施方案中，所述目标跨膜蛋白是人蛋白。在特定实施方案中，所述目标跨膜蛋白是非人蛋白。在一个实施方案中，所述目标跨膜蛋白是小鼠蛋白。
在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白如本文所描述经过修饰。示例性的经修饰的目标跨膜蛋白可以包括对其天然氨基酸序列的下述改变中的一种或多种：氨基酸置换、氨基酸缺失、氨基酸插入。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白被修饰以删除(即，“截短”)跨膜蛋白的一部分，诸如、例如，全长蛋白的n-端和/或c-端结构域。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白包括在氨基端中的稳定化突变、一个或多个细胞外环结构域、一个或多个跨膜结构域、一个或多个细胞内结构域、c-端或其组合。在某些实施方案中，所述跨膜蛋白是嵌合跨膜蛋白。在某些实施方案中，所述经修饰的目标跨膜蛋白包括一个或多个可检测元件，诸如、例如，His-标签、FLAG-标签、Avi-标签或Bir-A标签。在特定实施方案中，所述目标跨膜蛋白包括His-标签和FLAG-标签。
在一些实施方案中，所述跨膜蛋白是配体活化的蛋白，由此所述跨膜蛋白在有或没有配体存在下改变构象(即，具有有活性和无活性状态)。例如，配体活化的跨膜蛋白可以结合细胞内或细胞外结构域上的配体，由此结合在跨膜蛋白的一个或多个结构域中诱导构象变化，其调节细胞中的信号传递。在一些情况下，所述目标跨膜蛋白是溶质载体转运蛋白(SLC)、受体、具有激酶活性的受体、I类生长因子受体、G-蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道蛋白或四次穿膜蛋白。在某些情况下，所述目标跨膜蛋白是GPCR蛋白、四次穿膜蛋白或离子通道蛋白。在一个实施方案中，所述目标跨膜蛋白是SLC蛋白。
在一个实施方案中，所述目标跨膜蛋白是GPCR蛋白。用于用在本方法中的GPCR是本领域众所周知的。参见，例如，Foord等人，Pharmacol.Rev.(2005)57:279-288，其整个内容通过引用并入本文。因而，GPCR可以是以下中的任一种：腺苷受体、β-肾上腺素能受体、神经降压肽受体、毒蕈碱样酸(muscarinic acid)受体、5-羟基色胺受体、肾上腺素受体、过敏毒素受体、血管紧张素受体、apelin受体、铃蟾肽受体、缓激肽受体、大麻素受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、多巴胺受体、内皮缩血管肽受体游离脂肪酸受体、胆汁酸受体、甘丙肽受体、促胃动素受体、葛瑞林受体、糖蛋白激素受体、GnRH受体、组胺受体、KiSS1衍生的肽受体、白三烯和脂氧素受体、溶血磷脂受体、黑色素-聚集激素受体、黑皮质素受体、褪黑激素受体、神经介素U受体、神经肽受体、N-甲酰基肽家族受体、烟酸受体、阿片类受体、视蛋白-样受体、食欲素受体、P2Y受体、肽P518受体、血小板-活化因子受体、前动力蛋白受体、催乳素释放肽受体、类前列腺素受体、蛋白酶活化受体、松弛素受体、生长抑素受体、SPC/LPC受体、速激肽受体、痕量氨基受体、促甲状腺素-释放激素受体、硬骨鱼紧张肽受体、加压素/缩宫素受体、孤儿GPCR、降钙素受体、促皮质素释放因子受体、胰高血糖素受体、甲状旁腺受体、VIP/PACAP受体、LNB7TM受体、GABA受体、促代谢谷氨酸受体和钙传感器受体。
在某些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是GPCR蛋白，诸如、例如，CCR5、ADORA2A、ADRB3、C3AR1、ADRA2A、GLP1R、CCR4、CCR8和CXCR4。在一个具体实施方案中，所述跨膜蛋白是GPCR蛋白选自下述GPCR蛋白：CCR5、ADORA2A、ADRB3、C3AR1、ADRA2A、GLP1R、CCR4、CCR8或CXCR4。在一个实施方案中，所述跨膜蛋白是CCR5。在另一个实施方案中，所述跨膜蛋白是ADORA2A。在其它实施方案中，所述跨膜蛋白是C3AR1。在又另一个实施方案中，所述跨膜蛋白是ADRA2A。在其它实施方案中，所述跨膜蛋白是GLP1R。
在一些情况下，所述跨膜蛋白是四次穿膜蛋白。在某些情况下，所述目标跨膜蛋白是四次穿膜蛋白，诸如、例如，TSPAN 1至TSPAN19、TSPAN21、TSPAN23、TSPAN 31、TSPAN 32、TSPAN 33、UPK1B、PRPH2、CD151、CD53、CD37、CD82、CD81、CD9、CD63、TCD63、CLND6和CLND9。在一些实施方案中，所述跨膜蛋白是CD63。在另一个实施方案中，CLDN6。在其它实施方案中，所述跨膜蛋白是CLDN9。
在其它实施方案中，所述目标跨膜蛋白是离子通道蛋白。在一个实施方案中，所述离子通道蛋白是电压门控的离子通道蛋白。在一个具体实施方案中，所述电压门控的离子通道蛋白是电压依赖性的钙通道γ-1亚基(CACNG1)或电压门控的钾通道蛋白，诸如、例如，KVS或KIRS。在其它实施方案中，所述离子通道蛋白是钙活化的钾通道蛋白(例如，BKCa、MaxiK或Sk)，电压门控钠通道蛋白，诸如、例如，NaV1蛋白(例如，电压门控通道α亚基9(NaV1.7)、电压门控通道α亚基2(NaV1.2))、钙通道蛋白(例如，CAV)或氯离子通道蛋白(例如，CIC)。在一些实施方案中，所述离子通道蛋白是瞬时受体电位通道(TRP)蛋白。在具体实施方案中，所述TRP是规范跨膜蛋白(TRPC)、类香草素受体(TRPV)、melastatin(TRPM)、多囊蛋白(TRPP)、粘脂蛋白(TRPML)或锚蛋白跨膜蛋白1(TRPA1)，诸如规范TRP(TRPC)、类香草素受体(TRPV)、melastatin(TRPM)、多囊蛋白(TRPP)、粘脂蛋白(TRPML)、锚蛋白跨膜蛋白1(TRPA1)。在一个特定实施方案中，所述目标跨膜蛋白是BKCa、MaxiK、Sk、NAV 1.7、CACNG1、CAV、CIC或TRP。
在某些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是电压门控钠通道蛋白。电压门控钠通道家族具有九个已知成员，在跨膜区段和细胞外环区域中具有>50％的氨基酸同一性。这些通道的蛋白被命名为NaV1.1至NaV1.9，通常称为“NaV1蛋白”，并且编码NaV1.1-NaV1.9的基因名称被称作Scn1a至Scn11a。每个NaV1蛋白具有四个重复结构域，每个重复结构域包含六个跨膜区段。第四区段是高度保守的，并充当通道的电压传感器。该通道的电压敏感性归因于位于第四区段中每隔三个位置的正氨基酸(Nicholls等人，(2012)“From Neuron toBrain,”第5版第86页，其通过引用整体并入本文)。当受到跨膜电压变化的刺激时，该区段向细胞膜的细胞外侧移动，允许通道变成离子可渗透的。离子通过可以分为两个区域的孔进行传导。孔的更外侧(即更靠近细胞外)部分由四个结构域中的每一个的第五和第六跨膜区段(也被称作“P-环”)之间的区域形成。该区域是孔的较窄部分，并负责其离子选择性。孔的更内侧部分(即更靠近细胞质)由四个结构域的组合第五和第六跨膜区段而成。更具体地，人NaV1.1蛋白对应于在登记号P35498.2中所示的氨基酸序列；人NaV1.2蛋白对应于在登记号Q99250.3中所示的氨基酸序列；人NaV1.3蛋白对应于在登记号Q9NY46.2中所示的氨基酸序列；人NaV1.4蛋白对应于在登记号P35499.4中所示的氨基酸序列；人NaV1.5蛋白对应于在登记号Q14524.2中所示的氨基酸序列；人NaV1.6蛋白对应于在登记号Q9UQD0.1中所示的氨基酸序列；人NaV1.7蛋白对应于在登记号Q15858.3中所示的氨基酸序列；人NaV1.8蛋白对应于在登记号Q9Y5Y9.2中所示的氨基酸序列；和人NaV1.9蛋白对应于在登记号Q9UI33.2中所示的氨基酸序列。
在一个这样的实施方案中，所述目标跨膜蛋白是NaV1蛋白。在具体实施方案中，所述目标跨膜蛋白是NAV1.7。NaV1.7在背根神经节、交感神经元、许旺细胞和神经内分泌细胞的伤害感受性(疼痛)神经元中表达。NaV1.7是膜兴奋性的关键性组分，并且对痛觉重要。人SCN9A基因中的功能获得性突变已经与疼痛综合征相关，而功能丧失性突变则与对疼痛的极度不敏感相关。NaV1.7在物种间高度保守，这从来自以下14个动物物种的NaV1.7蛋白的示例性同系物序列的比对中可以明显看出。人NaV1.7蛋白对应于在登记号Q15858.3中所示的氨基酸序列；黑猩猩NaV1.7同系物对应于在登记号XP_016804947.1中所示的氨基酸序列；恒河猴NaV1.7蛋白对应于在登记号XP_014965766.1中所示的氨基酸序列；马来西亚飞行狐猴NaV1.7蛋白对应于在登记号XP_008588371.1中所示的氨基酸序列；牛NaV1.7蛋白对应于在登记号NP_001104257.2中所示的氨基酸序列；绵羊NaV1.7蛋白对应于在登记号XP_004004679.1中所示的氨基酸序列；阿拉伯骆驼NaV1.7蛋白对应于在登记号XP_010980767.1中所示的氨基酸序列；杀人鲸NaV1.7蛋白对应于在登记号XP_004267302.1中所示的氨基酸序列；马NaV1.7蛋白对应于在登记号XP_001496473.1中所示的氨基酸序列；狗NaV1.7蛋白对应于在登记号XP_022270547.1中所示的氨基酸序列；小鼠NaV1.7蛋白对应于在登记号Q62205.2中所示的氨基酸序列；大鼠NaV1.7蛋白对应于在登记号O08562.1中所示的氨基酸序列；兔NaV1.7蛋白对应于在登记号Q28644.1中所示的氨基酸序列；和鸡NaV1.7蛋白对应于在登记号NP_001280211.1中所示的氨基酸序列。
在一个特定实施方案中，所述目标跨膜蛋白是人NaV1.7。在另一个实施方案中，所述目标跨膜蛋白是小鼠NaV1.7。
在其它实施方案中，所述目标跨膜蛋白是NaV1.2。NaV1.2在中枢神经元和周围神经元中表达。人SCN2A基因(编码NaV1.2)中的突变已经与几种癫痫发作障碍和孤独症谱群障碍有关。NaV1.2在物种间高度保守，这从来自14个动物物种的NaV1.2蛋白的示例性序列的比对中可以明显看出。在比对中包含的示例性序列的登录号是：人NaV1.2同系物对应于在登记号Q99250.3中所示的氨基酸序列；黑猩猩NaV1.2同系物对应于在登记号XP_003820970.1中所示的氨基酸序列；恒河猴NaV1.2蛋白对应于在登记号XP_001100368.1中所示的氨基酸序列；马来西亚飞行狐猴NaV1.2蛋白对应于在登记号XP_008582720.1中所示的氨基酸序列；牛NaV1.2蛋白对应于在登记号NP_001137581.1中所示的氨基酸序列；绵羊NaV1.2蛋白对应于在登记号XP_014948870.1中所示的氨基酸序列；阿拉伯骆驼NaV1.2蛋白对应于在登记号XP_010980763.1中所示的氨基酸序列；杀人鲸NaV1.2蛋白对应于在XP_004283641.1中所示的氨基酸序列登记号；马NaV1.2蛋白对应于在登记号XP_014588001.1中所示的氨基酸序列；小鼠NaV1.2蛋白对应于在登记号NP_001092768.1中所示的氨基酸序列；大鼠NaV1.2蛋白对应于在登记号P04775.1中所示的氨基酸序列；兔NaV1.2蛋白对应于在登记号XP_008256915.1中所示的氨基酸序列；鸡NaV1.2蛋白对应于在登记号NP_001280210.1中所示的氨基酸序列；和绿海龟NaV1.2蛋白对应于在登记号XP_007056690.1中所示的氨基酸序列。
在一个特定实施方案中，所述目标跨膜蛋白是人NaV1.2同系物。在另一个实施方案中，所述目标跨膜蛋白是小鼠NaV1.2同系物。
在一些实施方案中，目标跨膜蛋白是CACNG1蛋白。在一个实施方案中，所述目标跨膜蛋白是人CACNG1蛋白。在另一个实施方案中，所述目标跨膜蛋白是非人CACNG1蛋白。
在某些情况下，所述目标跨膜蛋白是SLC蛋白。SLC蛋白已经被表征并且为本领域普通技术人员所熟知。例如，已经鉴定出数百种人跨膜SLC蛋白，它们被组织成许多SLC蛋白家族，如例如在Lin,L.等人Nat.Rev.Drug Disc.(2015)14:8第543-560页中所述，其整个内容明确地通过引用并入本文。因此，在某些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是SLC蛋白，诸如、例如，SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO1B7、SLCO1C1、SLCO2A1、SLCO2B1、SLCO3A1、SLCO4A1、SLCO4C1、SLCO5A1、SLCO6A1、SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13、SLC2A14、SLC3A1、SLC3A2、SLC4A1、SLC4A2、SLC4A3、SLC4A4、SLC4A5、SLC4A7、SLC4A8、SLC4A9、SLC4A10、SLC4A11、SLC5A1、SLC5A2、SLC5A3、SLC5A4、SLC5A5、SLC5A6、SLC5A7、SLC5A8、SLC5A9、SLC5A10、SLC5A11、SLC5A12、SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10P、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19、SLC6A20、SLC6A21P、SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14、SLC7A15P、SLC8A1、SLC8A2、SLC8A3、SLC8B1、SLC9A1、SLC9A2、SLC9A3、SLC9A4、SLC9A5、SLC9A6、SLC9A7、SLC9A8、SLC9A9、SLC9B1、SLC9B2、SLC9C1、SLC9C2、SLC10A1、SLC10A2、SLC10A3、SLC10A4、SLC10A5、SLC10A6、SLC10A7、SLC11A1、SLC11A2、SLC12A1、SLC12A2、SLC12A3、SLC12A4、SLC12A5、SLC12A6、SLC12A7、SLC12A8、SLC12A9、SLC13A1、SLC13A2、SLC13A3、SLC13A4、SLC13A5、SLC14A1、SLC14A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3、SLC15A4、SLC15A5、SLC16A1、SLC16A2、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A6、SLC16A7、SLC16A8、SLC16A9、SLC16A10、SLC16A11、SLC16A12、SLC16A13、SLC16A14、SLC17A1、SLC17A2、SLC17A3、SLC17A4、SLC17A5、SLC17A6、SLC17A7、SLC17A8、SLC17A9、SLC18A1、SLC18A2、SLC18A3、SLC18B1、SLC19A1、SLC19A2、SLC19A3、SLC20A1、SLC20A2、SLC22A1、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC22A10、SLC22A11、SLC22A12、SLC22A13、SLC22A14、SLC22A15、SLC22A16、SLC22A17、SLC22A18、SLC22A20P、SLC22A23、SLC22A24、SLC22A25、SLC22A31、SLC23A1、SLC23A2、SLC23A3、SLC23A4P、SLC24A1、SLC24A2、SLC24A3、SLC24A4、SLC24A5、SLC25A1、SLC25A2、SLC25A3、SLC25A4、SLC25A5、SLC25A6、UCP1、UCP2、UCP3、SLC25A10、SLC25A11、SLC25A12、SLC25A13、SLC25A14、SLC25A15、SLC25A16、SLC25A17、SLC25A18、SLC25A19、SLC25A20、SLC25A21、SLC25A22、SLC25A23、SLC25A24、SLC25A25、SLC25A26、SLC25A27、SLC25A28、SLC25A29、SLC25A30、SLC25A31、SLC25A32、SLC25A33、SLC25A34、SLC25A35、SLC25A36、SLC25A37、SLC25A38、SLC25A39、SLC25A40、SLC25A41、SLC25A42、SLC25A43、SLC25A44、SLC25A45、SLC25A46、SLC25A47、SLC25A48、MTCH1、MTCH2、SLC25A51、SLC25A52、SLC25A53、SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A10、SLC26A11、SLC27A1、SLC27A2、SLC27A3、SLC27A4、SLC27A5、SLC27A6、SLC28A1、SLC28A2、SLC28A3、SLC29A1、SLC29A2、SLC29A3、SLC29A4、SLC30A1、SLC30A2、SLC30A3、SLC30A4、SLC30A5、SLC30A6、SLC30A7、SLC30A8、SLC30A9、SLC30A10、SLC31A1、SLC31A2、SLC32A1、SLC33A1、SLC34A1、SLC34A2、SLC34A3、SLC35A1、SLC35A2、SLC35A3、SLC35A4、SLC35A5、SLC35B1、SLC35B2、SLC35B3、SLC35B4、SLC35C1、SLC35C2、SLC35D1、SLC35D2、SLC35D3、SLC35E1、SLC35E2A、SLC35E2B、SLC35E3、SLC35E4、SLC35F1、SLC35F2、SLC35F3、SLC35F4、SLC35F5、SLC35F6、SLC35G1、SLC35G2、SLC35G3、SLC35G4、SLC35G5、SLC35G6、SLC36A1、SLC36A2、SLC36A3、SLC36A4、SLC37A1、SLC37A2、SLC37A3、SLC37A4、SLC38A1、SLC38A2、SLC38A3、SLC38A4、SLC38A5、SLC38A6、SLC38A7、SLC38A8、SLC38A9、SLC38A10、SLC38A11、SLC39A1、SLC39A2、SLC39A3、SLC39A4、SLC39A5、SLC39A6、SLC39A7、SLC39A8、SLC39A9、SLC39A10、SLC39A11、SLC39A12、SLC39A13、SLC39A14、SLC40A1、SLC41A1、SLC41A2、SLC41A3、RHAG、RHBG、RHCG、SLC43A1、SLC43A2、SLC43A3、SLC44A1、SLC44A2、SLC44A3、SLC44A4、SLC44A5、SLC45A1、SLC45A2、SLC45A3、SLC45A4、SLC46A1、SLC46A2、SLC46A3、SLC47A1、SLC47A2、SLC48A1、FLVCR1、FLVCR2、SLC49A3、SLC49A4、SLC50A1、SLC51A、SLC51B、SLC52A1、SLC52A2、SLC52A3、XPR1、MPC1、MPC2、MPC1L、LETM1、LETM2、LETMD1、SFXN1、SFXN2、SFXN3、SFXN4、SFXN5、NIPA1、NIPA2、NIPAL1、NIPAL2、NIPAL3、NIPAL4、MAGT1、TUSC3、MFSD2A、MFSD2B、MFSD4A、MFSD4B、MFSD5、ANKH、SPNS1、SPNS2、SPNS3、TMEM165、NPC1、NPC1L1、SLC66A1、SLC66A2、SLC66A3、CTNS和MPDU1。
术语“内源性的”表示在宿主生物体中天然地表达或起源于细胞、组织或生物体之内的多肽或多核苷酸或其它组合物。“外源性的”表示起源于细胞、组织或生物体之外或者对于特定宿主生物体而言是外来的多肽、多核苷酸或其它组合物。
在所述方法的一些实施方案中，将动物用编码目标跨膜蛋白的一部分的核酸免疫。在某些实施方案中，所述核酸编码目标全长跨膜蛋白的截短形式。在一些实施方案中，所述目标截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域、氨基端和/或羧基端部分。在特定实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的氨基端部分。在其它实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的羧基端部分。在一些实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的细胞外环结构域。
在一些实施方案中，将动物用编码目标跨膜蛋白或其部分的核酸免疫，所述核酸被包含在能够表达所述核酸的载体中。用于免疫接种的载体的非限制性例子包括载体，诸如质粒，表达载体，以及病毒样颗粒(VLP)，细胞诸如经照射的细胞，外核体和脂质体。术语“载体”用于表示用于将编码信息转移至宿主细胞的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。载体的一个例子是“表达载体”，它是重组地或合成地产生的核酸构建体，具有一系列允许特定核酸在宿主细胞中转录的特定核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。在某些情况下，表达载体包括可操作地连接至启动子的要转录的核酸。术语“可操作地连接”表示核酸表达控制序列(诸如、例如，启动子或转录因子结合位点的阵列)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列指导与第二序列对应的核酸的转录。
在一些实施方案中，将动物用载体免疫，所述载体包含编码目标跨膜蛋白或其部分的核酸。在具体实施方案中，将动物用表达载体免疫，所述表达载体包含编码目标跨膜蛋白或其部分的核酸。在一个实施方案中，将动物用质粒免疫，所述质粒包含编码目标跨膜蛋白或其部分的核酸。
在一些情况下，通过在一段时间内的一次或多次注射，诸如通过静脉内注射或通过腹膜内注射，将免疫原施用给宿主动物。在某些实施方案中，通过1、2、3、4次或更多次注射，将免疫原施用给宿主哺乳动物。在特定实施方案中，通过3次单独注射施用免疫原。
本领域普通技术人员使用已知方法可以容易地确定施用给动物的免疫原的量。
在一些情况下，以至少0.1mg/mL、至少0.5mg/mL、至少1.0mg/mL、至少1.5mg/mL、至少2.0mg/mL、至少3.0mg/mL、至少4.0mg/mL、至少5.0mg/mL、至少6.0mg/mL、至少7.0mg/mL、至少8.0mg/mL、至少9.0mg/mL、至少9.5mg/mL、至少10.0mg/mL、至少10.5mg/mL或更大的浓度将核酸免疫原注射进动物中。在某些实施方案中，以0.5mg/mL至20mg/mL、0.5mg/mL至15mg/mL、0.5mg/mL至12mg/mL、0.5mg/mL至11mg/mL、1.0mg/mL至15mg/mL、1.0mg/mL至5mg/mL、1.0mg/mL至4mg/mL、1.0mg/mL至3mg/mL、1.0mg/mL至2mg/mL、2.0mg/mL至12mg/mL、5.0mg/mL至12mg/mL、7.0mg/mL至12mg/mL、8.0mg/mL至12mg/mL、8.0mg/mL至11mg/mL、9.0mg/mL至11mg/mL或9.5mg/mL至10.5mg/mL的浓度将核酸免疫原注射进动物中。在具体实施方案中，以0.5mg/mL、0.7mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL、4.0mg/mL、4.5mg/mL、5.0mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL、6.5mg/mL、7.0mg/mL、7.5mg/mL、8.0mg/mL、8.5mg/mL、9.0mg/mL、9.5mg/mL、10.0mg/mL、10.5mg/mL、11.0mg/mL、11.5mg/mL、12.0mg/mL、12.5mg/mL、13.0mg/mL、13.5mg/mL、14.0mg/mL、14.5mg/mL、15.0mg/mL、15.5mg/mL或更大的浓度将核酸免疫原注射进动物中。在一个特定实施方案中，以1.6mg/mL的浓度将核酸免疫原注射进动物中。在一个实施方案中，以10mg/mL的浓度将核酸免疫原注射进动物中。
在一些实施方案中，将动物用目标跨膜蛋白或其部分免疫。在某些实施方案中，所述目标跨膜蛋白或其部分具有人起源。在其它实施方案中，将动物用目标非人跨膜蛋白免疫。在一些实施方案中，将动物用编码目标全长小鼠跨膜蛋白的核酸免疫。在一些实施方案中，将动物用目标全长跨膜蛋白免疫。在具体实施方案中，所述目标跨膜蛋白是截短的。在一些实施方案中，所述目标截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域、氨基端和/或羧基端部分。在特定实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的氨基端部分。在其它实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的羧基端部分。在一个实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的细胞外环结构域。
在某些情况下，以至少0.1mg/mL、至少0.2mg/mL、至少0.3mg/mL、至少0.4mg/mL、至少0.5mg/mL、至少0.6mg/mL、至少0.7mg/mL、至少0.8mg/mL、至少0.9mg/mL、至少1.0mg/mL、至少2.0mg/mL、至少3.0mg/mL、至少4.0mg/mL、至少5.0mg/mL、至少10.0mg/mL或更大的浓度将蛋白或肽免疫原施用给动物。在某些实施方案中，以0.1mg/mL至20mg/mL、0.1mg/mL至15mg/mL、0.1mg/mL至10mg/mL、0.1mg/mL至8.0mg/mL、0.1mg/mL至7.0mg/mL、0.1mg/mL至6.0mg/mL、0.1mg/mL至5.0mg/mL、0.1mg/mL至3.0mg/mL、0.1mg/mL至2.0mg/mL、0.1mg/mL至1.0mg/mL、0.2mg/mL至10.0mg/mL、0.2mg/mL至7.0mg/mL、0.2mg/mL至6.0mg/mL、0.2mg/mL至5.0mg/mL、0.2mg/mL至3mg/mL、0.2mg/mL至2mg/mL、0.2mg/mL至1mg/mL、0.5mg/mL至10.0mg/mL、0.5mg/mL至7.0mg/mL、0.5mg/mL至5.0mg/mL、0.5mg/mL至3.0mg/mL、0.5mg/mL至2.0mg/mL、0.5mg/mL至1.0mg/mL、1.0mg/mL至5.0mg/mL、1.0mg/mL至3.0mg/mL、1.0mg/mL至2.0mg/mL、2.0mg/mL至10.0mg/mL、5.0mg/mL至10.0mg/mL(包括端值)的浓度将蛋白或肽免疫原注射进动物中。在具体实施方案中，以0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.4mg/mL、0.45mg/mL、0.5mg/mL、0.55mg/mL、0.6mg/mL、0.65mg/mL、0.7mg/mL、0.75mg/mL、0.8mg/mL、0.85mg/mL、0.9mg/mL、0.95mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL、4.0mg/mL、4.5mg/mL、5.0mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL、6.5mg/mL、7.0mg/mL、7.5mg/mL、8.0mg/mL、8.5mg/mL、9.0mg/mL、9.5mg/mL、10.0mg/mL、12.0mg/mL、15.0mg/mL、20.0mg/mL或更大的浓度将蛋白或肽免疫原注射进动物中。在一个特定实施方案中，以0.9mg/mL的浓度将蛋白或肽免疫原注射进动物中。在一个实施方案中，以0.5mg/mL的浓度将蛋白或肽免疫原注射进动物中。在另一个实施方案中，以1.9mg/mL的浓度将蛋白或肽免疫原注射进动物中。在一个具体实施方案中，以2.5mg/mL的浓度将蛋白或肽免疫原注射进动物中。
在某些实施方案中，将动物用编码目标嵌合跨膜蛋白的核苷酸序列或目标嵌合跨膜蛋白免疫。本文中使用的术语“嵌合的”表示具有源自不同物种的其部分的蛋白或编码蛋白的核酸。例如，嵌合蛋白可以具有一个或多个人结构域和至少一个非人结构域，或反之亦然。编码嵌合蛋白的核酸可以具有例如编码蛋白的一个或多个结构域的人基因，该人基因可操作地连接到编码该蛋白的至少一个结构域的非人基因。
在一个非限制性实施例中，嵌合核酸包括编码跨膜蛋白的第一部分的人基因的一部分，该部分可操作地连接至编码跨膜蛋白的不同部分的小鼠基因的一部分。在一些实施方案中，将动物用编码目标嵌合跨膜蛋白的DNA免疫，所述DNA包括编码人跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域的人基因序列和编码来自跨膜蛋白的小鼠同系物的氨基端结构域和/或羧基端结构域的小鼠基因序列。在其它实施方案中，将动物用编码目标嵌合跨膜蛋白的DNA免疫，所述DNA包括编码来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和/或羧基端结构域的DNA和编码跨膜蛋白的小鼠同系物的一个或多个细胞外环结构域的DNA。在一个实施方案中，将动物用编码目标嵌合跨膜蛋白的DNA免疫，所述DNA包括编码来自人跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域的基因序列和编码来自跨膜蛋白的小鼠同系物的氨基端结构域的序列。在具体实施方案中，将动物用编码目标嵌合跨膜蛋白的DNA免疫，所述DNA包括编码来自人跨膜蛋白的氨基端结构域的基因序列和编码来自跨膜蛋白的小鼠同系物的一个或多个细胞外环结构域的基因序列。在某些实施方案中，编码目标嵌合跨膜蛋白的核苷酸序列还被修饰成包括编码可检测元件(诸如、例如，His-标签、FLAG-标签、Avi-标签或Bir-A-标签)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，将动物用目标嵌合跨膜蛋白免疫，所述目标嵌合跨膜蛋白包括目标人跨膜蛋白的一部分，该部分可操作地连接至目标跨膜蛋白的非人同系物的一部分。在一些实施方案中，将动物用目标嵌合跨膜蛋白免疫，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自目标人跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域和来自跨膜蛋白的小鼠同系物的氨基端结构域和/或羧基端结构域。在一些实施方案中，将动物用目标嵌合跨膜蛋白免疫，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自人跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域和来自跨膜蛋白的小鼠同系物的氨基端结构域。在一些实施方案中，将动物用目标嵌合跨膜蛋白免疫，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和/或羧基端结构域和来自跨膜蛋白的小鼠同系物的一个或多个细胞外环结构域。在一些实施方案中，将动物用目标嵌合跨膜蛋白免疫，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和来自跨膜蛋白的小鼠同系物的一个或多个细胞外环结构域。在某些实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白还包括可检测元件，诸如、例如，His-标签、FLAG-标签、Avi-标签或Bir-A标签。在一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括His-标签和FLAG-标签。
在某些实施方案中，所述目标跨膜蛋白或核酸免疫原被修饰。在一些实施方案中，所述免疫原是包括一个或多个稳定化氨基酸置换的经修饰的目标跨膜蛋白或其编码DNA。在一些实施方案中，所述经修饰的跨膜蛋白或其编码核酸包括一个或多个可检测元件，诸如标记、标志物或特征。在一个实施方案中，所述经修饰的免疫原是包含可检测标记的目标跨膜蛋白。在一个具体实施方案中，所述可检测标记是FLAG-标签、Avi-标签、组氨酸标签(His-标签)、Bir-A-标签或其组合。在特定实施方案中，所述一个或多个可检测标记位于跨膜蛋白免疫原的氨基端或羧基端处。在一个实施方案中，所述跨膜蛋白免疫原具有FLAG-标签和附着至羧基端的His-标签。
通过本领域已知的方法可以制备用于所述方法中的蛋白。例如，目标跨膜蛋白或其部分可以由合适的核酸编码并在细胞中表达。如本领域众所周知的，使用标准的克隆技术、定位诱变和PCR，可以制备编码目标跨膜蛋白的合适核酸分子。合适的表达系统包括，例如，在细菌或酵母中的组成型或诱导型表达系统，病毒表达系统诸如杆状病毒、西门利克森林病毒和慢病毒，或在昆虫或哺乳动物细胞中的瞬时转染。合适的宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉夜蛾属(Trichoplusiani)细胞。合适的哺乳动物宿主细胞包括HEK 293、COS、CHO、NSO、DT40。合适的昆虫宿主细胞包括Sf9和S2细胞。
在某些实施方案中，将包含目标跨膜蛋白或其部分的蛋白免疫原在细胞中表达，由所述细胞生产免疫原蛋白并纯化以提供纯化的蛋白免疫原用于免疫接种。
在具体实施方案中，可以将动物用被包含在载体(诸如、例如，脂质双层-膜支架蛋白复合物、VLP、细胞、外核体和脂质体)中的目标跨膜蛋白或其部分免疫。
“脂质双层-膜支架蛋白复合物”是指这样的组合物：其包括与至少一个膜支架蛋白(MSP)复合(即，结合)的脂质双层。已经描述了脂质双层-膜支架蛋白复合物。参见，例如，Inagaki,S.等人，Biophysical Characterization of Membrane Proteins inNanodiscs.Methods(2013)59(3):287-300，其整个内容明确地通过引用并入本文。可以形成脂质双层-膜支架蛋白复合物，例如，作为被两个膜支架蛋白包围和稳定化的盘状磷脂双层。不受任何一种理论束缚，复合物形成和功能受MSP：脂质比率和MSP的长度调节。例如，可以调节脂质：MSP比率以产生脂质双层-膜支架蛋白复合物的同质或异质群体。此外，为了提供类似天然的环境，MSP蛋白应该足够大以形成复合物，其为跨膜蛋白或目标蛋白和脂质双层形成提供空间。
本文中使用的术语“膜支架蛋白”或“MSP”表示衍生自两亲性载脂蛋白A-I(Apo-AI)的一类两亲性螺旋蛋白，如在Schuler,M.,等人，Methods Mol Biol.2013；974:415-433中所述，其整个内容通过引用并入本文。膜支架蛋白包括两亲性螺旋，其包含在接触脂质疏水尾巴的螺旋内侧的疏水性残基，以及向外(远离脂质)定向的亲水性残基。通过在MSP氨基酸序列的一部分中删除或插入一个或多个螺旋结构域，这允许不同大小的脂质双层-MSP复合物的形成，膜支架蛋白可能具有不同的大小。MSP的结构和功能被认为不同于脂质结合蛋白的皂化蛋白家族。
在一些情况下，脂质双层-膜支架蛋白复合物包括选自下述示例性MSP的至少一个膜支架蛋白：MSP1、MSP2、MSP1E1、MSP1E2、MSP1E3、MSP1E3D1、MSP1D1、MSP1D2、MSP2N1、MSP2N3和MSP2N2。
在一些实施方案中，膜支架蛋白是包含结构FX-H1-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10[SEQ ID NO:12]的MSP1，其中FX是具有氨基酸序列MGHHHHHHIEGR[SEQ ID NO:1]的膜支架蛋白的N-端结构域，H1是具有氨基酸序列LKLLDNWDSVTSTFSKLREQLG[SEQ ID NO:2]的螺旋1，H2是具有氨基酸序列PVTQEFWDNLEKETEGLRQEMS[SEQ ID NO:3]的螺旋2，H3是具有氨基酸序列KDLEEVKAKVQ[SEQ ID NO:4]的螺旋3，H4是具有氨基酸序列PYLDDFQKKWQEEMELYRQKVE[SEQ ID NO:5]的螺旋4，H5是具有氨基酸序列PLRAELQEGARQKLHELQEKLS[SEQ ID NO:6]的螺旋5，H6是具有氨基酸序列PLGEEMRDRARAHVDALRTHLA[SEQ ID NO:7]的螺旋6，H7是具有氨基酸序列PYSDELRQRLAARLEALKENGG[SEQ ID NO:8]的螺旋7，H8是具有氨基酸序列ARLAEYHAKATEHLSTLSEKAK[SEQ ID NO:9]的螺旋8，H9是具有氨基酸序列PALEDLRQGLL[SEQID NO:10]的螺旋9，且H10是具有氨基酸序列PVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ[SEQ ID NO:11]的螺旋10。在一些实施方案中，所述膜支架蛋白是包含结构FX-H1-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10-GT-H1-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10[SEQ ID NO:13]的MSP2。在一些实施方案中，所述膜支架蛋白是延长的膜支架蛋白，其包括插入MSP1氨基酸序列中的一个或多个22氨基酸两亲性螺旋。在一个这样的实施方案中，所述延长的膜支架蛋白是包含结构FX-H1-H2-H3-H4-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10[SEQ ID NO:14]的MSP1E1，其中MSP1的氨基酸序列通过具有一式两份“H4”而延长。在另一个实施方案中，所述延长的膜支架蛋白是包含结构FX-H1-H2-H3-H4-H5-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10[SEQ ID NO:15]的MSP1E2，其中MSP1的氨基酸序列通过具有一式两份“H4-H5”而延长。在又另一个实施方案中，所述延长的膜支架蛋白是包含结构FX-H1-H2-H3-H4-H5-H6-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10[SEQ ID NO:16]的MSP1E3，其中MSP1的氨基酸序列通过具有一式两份“H4-H5-H6”而延长。
在某些实施方案中，所述膜支架蛋白是包含结构TEV-H1Δ(1-11)-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10[SEQ ID NO:17]的MSP1D1，其中TEV是具有氨基酸序列MGHHHHHHHDYDIPTTENLYFQG[SEQ ID NO:18]的经修饰的N-端结构域，且H1Δ(1-11)是具有氨基酸序列STFSKLREQLG[SEQ ID NO:19]的截短的H1螺旋结构域。在一些实施方案中，所述膜支架蛋白是包含结构TEV-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10[SEQ ID NO:20]的MSP1D2。在其它实施方案中，所述膜支架蛋白是具有结构TEV-H1Δ(1-11)-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10-GT-H1Δ(1-11)-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10[SEQ ID NO:21]的MSP2N1。在另一个实施方案中，所述膜支架蛋白是具有结构TEV-H1Δ(1-11)-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10-GT-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10[SEQ ID NO:22]的MSP2N2。在又另一个实施方案中，所述膜支架蛋白是具有结构TEV-H1Δ(1-11)-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10-GT-H1Δ(1-17)-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10[SEQ ID NO:24]的MSP2N3，其中H1Δ(1-17)是具有氨基酸序列REQLG[SEQ ID NO:23]的截短的H1螺旋结构域。
在某些实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物包括两个MSP。在一个实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物是以带样方式被两个MSP(例如，两个MSP分子)包围的盘状磷脂双层。在一个实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物是被两个MSP1E3D1分子包围的盘状磷脂双层。
在一些实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物包括可检测标记。在某些实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物含有至少两个标记的膜支架蛋白和多个脂质。在具体实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物含有两个标记的膜支架蛋白和脂质双层。在一些实施方案中，所述标记的膜支架蛋白是相同的或不同的。所述可检测标记可以是本领域已知的任何可检测标记。例如，可检测标记包括荧光分子、His-标签和FLAG-标签。在示例性实施方案中，所述膜支架蛋白中的一个或多个被可检测标志物诸如Bir-A标签或Avi-标签标记以进行生物素化。在一个具体实施方案中，在脂质双层-膜支架蛋白复合物中的所有MSP被生物素化。例如，可以如下实现生物素化：化学地生物素化膜支架蛋白，或将Avi-标签或Bir-A标签遗传上引入MSP核酸编码序列中并使用已知技术产生经修饰的蛋白。
将脂质双层-膜支架蛋白复合物的脂质双层部分重构。所述脂质可以形成脂质双层，诸如、例如，鞘脂和/或磷脂。复合物的脂质组成可以变化，例如，基于要在复合物中包含的特定跨膜蛋白或目标蛋白的天然细胞类型。例如，大肠杆菌膜含有70-80％磷脂酰乙醇胺、15-20％磷脂酰甘油和5％心磷脂，而大鼠肝细胞膜由14-20％磷脂酰乙醇胺、32-47％磷脂酰胆碱、8％磷脂酰肌醇、4-8％磷脂酰丝氨酸和13-14％鞘磷脂组成。参见Inagaki,S.等人，Methods(2013)59(3):287-300。因此，脂质双层-膜支架蛋白复合物的脂质组成可以包括单个类型的脂质或超过单个类型的脂质。在某些实施方案中，形成脂质双层-膜支架蛋白复合物的脂质是合成的或重组地生产的脂质。
在一些实施方案中，所述脂质双层包含下述脂质中的一种或多种：鞘磷脂、磷脂酰胆碱、及其衍生物。在一个具体实施方案中，所述脂质双层包含1-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、1-棕榈酰基2-油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)、棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸(1′-消旋-甘油)(POPG)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸L-丝氨酸(POPS)和磷脂酰肌醇(PI)或其组合。在某些实施方案中，所述脂质双层包括多个POPC磷脂。
在一些实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物包括在膜支架蛋白周围形成盘状磷脂双层的脂质，其包含多个下述脂质中的一种或多种：POPC、POPG和POPS。在具体实施方案中，所述脂质双层-膜支架蛋白复合物包括多个POPC脂质，其在两个膜支架蛋白周围形成盘状磷脂双层。在一个这样的实施方案中，MSP：脂质的比率是1:100至1:150、1:110至1:140、1:120至1:140、1:120至1:140、1:120-1:130和1:125至1:135(包括端值)。在其它实施方案中，MSP：脂质的比率是1:100、1:110、1:111、1:112、1:113、1:114、1:115、1:116、1:117、1:118、1:119、1:120、1:121、1:122、1:123、1:124、1:125、1:126、1:127、1:128、1:129、1:130、1:131、1:132、1:133、1:134、1:135、1:136、1:137、1:138、1:139、1:140、1:141、1:142、1:143、1:144、1:145、1:146、1:147、1:148、1:149或1:150(包括端值)。
在某些情况下，脂质双层-膜支架蛋白复合物还包括至少一种抗原。在具体实施方案中，所述抗原是目标跨膜蛋白或其部分。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是目标全长跨膜蛋白、目标截短的跨膜蛋白、目标嵌合跨膜蛋白。在一些实施方案中，所述目标截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域、氨基端和/或羧基端部分。在特定实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的氨基端部分。在某些实施方案中，所述目标截短的跨膜蛋白至少包括目标跨膜蛋白的整个跨膜部分。在其它实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的羧基端部分。在一个实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的细胞外环结构域。在一些实施方案中，所述截短的蛋白包括目标跨膜蛋白的细胞外结构域，诸如N-端细胞外结构域、C-端细胞外结构域和/或在目标跨膜蛋白的一个或多个跨膜结构域之间的细胞外环结构域。在其它实施方案中，所述抗原是如本文所描述的目标嵌合跨膜蛋白或其部分。
在一些实施方案中，包含抗原(诸如目标跨膜蛋白或其部分)的脂质双层-膜支架蛋白复合物包括抗原的单个分子(例如，每个脂质双层-MSP复合物或每个纳米盘一个跨膜蛋白或其部分的拷贝)。在一些实施方案中，包含抗原的脂质双层-膜支架蛋白复合物包括抗原的多个分子(例如，每个脂质双层-MSP复合物或每个纳米盘多个跨膜蛋白或其部分的拷贝)。
使用本领域已知的方法，可以形成脂质双层-膜支架蛋白复合物，包括包含目标跨膜蛋白或其部分的那些。参见，例如，Bayburt TH，等人，Arch Biochem Biophys.(2006)450:215-222，其整个内容通过引用并入本文。通常，脂质双层-膜支架蛋白复合物的形成包括通过混合脂质、MSP和在适用时的跨膜蛋白而自组装复合物。通常，通过使用一种或多种去污剂来纯化跨膜蛋白。在一些实施方案中，将纯化的跨膜蛋白与脂质和MSP混合以形成包含跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物。在一些实施方案中，在一种或多种去污剂的存在下(例如，在去污剂溶解的级分中)提供纯化的跨膜蛋白，并与脂质和MSP混合，并然后除去一种或多种去污剂以诱导复合物结构的形成。
在一些情况下，纯化步骤可以用于将包含目标蛋白的复合物与不包含目标蛋白的复合物(即空复合物)分离。可以如下实现纯化：将一种或多种可检测标记(诸如亲和标签)掺入在复合物所包含的目标跨膜蛋白上，并选择所述一种或多种标记。用于用作亲和标签的示例性可检测标记包括、但不限于可以通过固定化的金属亲和色谱法(IMAC)识别的His-标签、用于FLAG M1抗-FLAG免疫亲和色谱法的FLAG-标签和使用1D4树脂的1D4标签。还可以利用尺寸排阻色谱法，通过进行例如SDS page和蛋白质印迹分析来鉴定和/或确认包括目标跨膜蛋白或其部分的脂质双层-膜支架蛋白复合物的存在。在目标跨膜蛋白和MSP均包括可检测标记的实施方案中，在MSP上的至少一种标记和在目标跨膜蛋白上的一种标记可以不同。
在具体实施方案中，可以如下形成含有目标跨膜蛋白或其部分的脂质双层-膜支架蛋白复合物：首先将目标跨膜蛋白溶解在去污剂(诸如、例如，N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM))中，并然后与胆酸盐溶解的磷脂和膜支架蛋白混合，随后除去去污剂。在某些实施例中，使用生物珠子可以从混合物中提取去污剂，所述生物珠子允许包含纯化的目标跨膜蛋白的盘状脂质-双层膜支架蛋白复合物的组装。然后可以使用亲和纯化珠子将包含目标跨膜蛋白的盘状脂质-双层膜支架蛋白复合物与不包含跨膜蛋白的盘状脂质-双层膜支架蛋白复合物分离。例如，当目标跨膜蛋白含有在其c-端或n-端的对应“标签”序列时，具有抗-”标签”抗体(例如、FLAG-标签、His-标签、HA-标签等，这样的标签是本领域众所周知)的珠子。可以通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。
在某些情况下，以至少0.1mg/mL、至少0.2mg/mL、至少0.3mg/mL、至少0.4mg/mL、至少0.5mg/mL、至少0.6mg/mL、至少0.7mg/mL、至少0.8mg/mL、至少0.9mg/mL、至少1.0mg/mL、至少2.0mg/mL、至少3.0mg/mL、至少4.0mg/mL、至少5.0mg/mL、至少10.0mg/mL或更大的浓度将嵌入脂质双层-膜支架蛋白复合物中的免疫原施用给动物。在某些实施方案中，以0.2mg/mL至20mg/mL、0.5mg/mL至15mg/mL、0.5mg/mL至10mg/mL、0.5mg/mL至7.0mg/mL、0.5mg/mL至5.0mg/mL、1.0mg/mL至10mg/mL、1.0mg/mL至5.0mg/mL、1.0mg/mL至4.0mg/mL、1.0mg/mL至3.0mg/mL、1.0mg/mL至2.0mg/mL或2.0mg/mL至5.0mg/mL(包括端值)的浓度将免疫原注射进动物中。在具体实施方案中，以0.5mg/mL、0.55mg/mL、0.6mg/mL、0.65mg/mL、0.7mg/mL、0.75mg/mL、0.8mg/mL、0.85mg/mL、0.9mg/mL、0.95mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL、4.0mg/mL、4.5mg/mL、5.0mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL、6.5mg/mL、7.0mg/mL、7.5mg/mL、8.0mg/mL、8.5mg/mL、9.0mg/mL、9.5mg/mL、10.0mg/mL、12.0mg/mL、15.0mg/mL、20.0mg/mL或更大的浓度将免疫原注射进动物中。在一个实施方案中，以0.5mg/mL的浓度将嵌入脂质双层-膜支架蛋白复合物中的目标跨膜蛋白免疫原注射进动物中。
在某些实施方案中，可以将动物用表达免疫原的细胞(诸如经照射的细胞)免疫。在一个特定实施方案中，可以将动物用如本文所描述的表达目标跨膜蛋白免疫原、其修饰形式或其部分的细胞免疫。
在一些实施方案中，可以将动物用VLP或外核体免疫，所述VLP或外核体在动物中表达目标跨膜蛋白。在具体实施方案中，可以将动物用VLP免疫，所述VLP包括编码目标跨膜蛋白、其修饰形式或其部分的核酸。
在一些情况下，将动物用两种或更多种免疫原免疫，诸如、例如，蛋白或肽、经修饰的蛋白或肽、核酸、经修饰的核酸、VLP和如本文所描述的包含目标跨膜蛋白或其部分的脂质双层-膜支架蛋白复合物。
要免疫的动物可以是任何动物。在某些实施方案中，所述动物是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是小鼠、大鼠、山羊、人、仓鼠、猪、猴或豚鼠。在一些实施方案中，所述哺乳动物不是人。在特定实施方案中，所述非人哺乳动物是小鼠、大鼠或山羊。在一个具体实施方案中，所述哺乳动物是小鼠。在另一个实施方案中，所述哺乳动物是人，诸如、例如，已经暴露于免疫原的人。
在一些情况下，所述免疫的动物被遗传工程改造过。通过已知方法，诸如用于删除或中断编码蛋白的基因的方法，可以进行遗传修饰。例如，可以对动物进行遗传工程改造，使得所述动物不再从内源基因座(例如，敲除)表达目标跨膜蛋白(即，抗原)。作为例子，遗传工程改造的非人哺乳动物是这样的小鼠：其为不能表达目标内源性小鼠跨膜蛋白的小鼠，例如，由于对内源性小鼠跨膜蛋白的基因座的遗传修饰或内源基因的失活(例如，全部或部分缺失)。
在某些实施方案中，所述遗传工程改造的动物是非人哺乳动物，诸如、例如，小鼠、山羊或大鼠，其在其基因组中包括(例如，经由杂交育种或多基因打靶策略)：(i)人源化的免疫球蛋白重链基因座，其包含一个或多个人可变重链基因区段；(ii)人源化的免疫球蛋白重链基因座，其包含一个或多个人可变轻链基因区段；和/或(iii)人源化的免疫球蛋白轻链基因座(例如，κ和/或λ)，其包含一个或多个人可变轻链基因区段。本文中使用的术语“人源化的”包括被修饰成包括人序列。例如，人源化的基因座是已经被修饰成包括人序列(例如，基因区段或基因)的基因座(例如，内源性基因座)。
在一些实施方案中，所述遗传工程改造的动物是非人哺乳动物，诸如、例如，小鼠、山羊或大鼠，其在其基因组中包括人源化的免疫球蛋白重链基因座，其包含一个或多个人可变重链基因区段。
在一些实施方案中，所述遗传工程改造的动物是非人哺乳动物，诸如、例如，小鼠、山羊或大鼠，其在其基因组中包括人源化的免疫球蛋白轻链基因座，其包含一个或多个人可变轻链基因区段。
在一些实施方案中，所述遗传工程改造的动物是非人哺乳动物，诸如、例如，小鼠、山羊或大鼠，其在其基因组中包括人源化的免疫球蛋白轻链基因座(例如，κ和/或λ)，其包含一个或多个人可变轻链基因区段。在一个实施方案中，所述遗传工程改造的动物包含人源化的免疫球蛋白轻链基因座，其包含一个或多个人κ可变(Vκ))基因区段。在另一个实施方案中，所述遗传工程改造的动物包含人源化的免疫球蛋白轻链基因座，其包含一个或多个人λ可变(Vλ))基因区段。
在一些实施方案中，包含编码人免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸序列和/或编码人免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸序列的遗传工程改造的动物还可以缺少编码目标跨膜蛋白的内源基因。
在其它情况下，所述动物是“野生型”动物，其表达目标跨膜蛋白的内源性同系物。
在一些实施方案中，遗传工程改造的动物(例如，大鼠或小鼠)产生这样的抗体：其尤其包含重链，其中每个重链包含可操作地连接至啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)重链恒定结构域的人重链可变结构域。在一些实施方案中，遗传工程改造的动物(例如，大鼠或小鼠)产生这样的抗体：其尤其包含免疫球蛋白链，其中每个免疫球蛋白链包含可操作地连接至啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)重链恒定结构域的人轻链可变结构域。在一些实施方案中，遗传工程改造的动物(例如，大鼠或小鼠)产生这样的抗体：其尤其包含κ轻链，其中每个κ轻链包含可操作地连接至啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)κ轻链恒定结构域的人κ轻链可变结构域。在一些实施方案中，遗传工程改造的动物(例如，大鼠或小鼠)产生这样的抗体：其尤其包含λ轻链，其中每个λ轻链包含可操作地连接至人λ轻链恒定结构域的人λ轻链可变结构域。在一些实施方案中，遗传工程改造的动物(例如，大鼠或小鼠)产生这样的抗体：其尤其包含轻链，其中每个轻链包含可操作地连接至啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)κ轻链恒定结构域的人λ轻链可变结构域。在一些实施方案中，遗传工程改造的动物(例如，大鼠或小鼠)产生这样的抗体：其尤其包含λ轻链，其中每个λ轻链包含可操作地连接至啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)λ轻链恒定结构域的人λ轻链可变结构域。
在一些实施方案中，本文描述的非人哺乳动物(例如，大鼠或小鼠)是如在例如美国专利号8,502,018、8,642,835、8,697,940、8,791,323、9,226,484和WO2019/113065中所述；它们都通过引用整体并入本文。育种(或“杂交”或“杂交育种”)可以按照本领域容易获得的方案进行；参见，例如，JoVE Science Education Database.Lab Animal Research,Fundamentals of Breeding and Weaning,JoVE,Cambridge,MA,(2018)(视频文章)；Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice,A JacksonLaboratory Resource Manual,The Jackson Laboratory；都通过引用并入本文。可替换地，可以将经工程改造的Igλ轻链基因座工程化到包含人源化的IgH基因座和/或人源化的Igκ基因座的ES细胞中，并将所得ES细胞用于产生遗传工程改造的动物，或包含人源化的Igλ轻链基因座的遗传工程改造的动物可以与包含人源化的IgH基因座和/或人源化的Igκ基因座的另一种遗传工程改造的动物杂交。包含人源化的IgH基因座和/或人源化的Igκ基因座的各种遗传工程改造的动物是已知的，例如，/>品系(参见，例如，美国专利号8,502,018和/或8,642,835；通过引用整体并入本文)，XENO小鼠TM品系(参见，例如，Mendez,M.J.等人，1997,Nat.Genetics15(2):146-56和Jakobovits,A.等人，1995,Ann.NY Acad.Sci.764:525-35，通过引用整体并入)。
在一些实施方案中，本文描述的遗传工程改造的动物包含如在以下文献中描述的有限的免疫球蛋白轻链基因座：美国专利号9,796,788；9,969,814；美国专利申请公开号2011/0195454 A1、2012/0021409 A1、2012/0192300 A1、2013/0045492 A1、2013/0185821A1、2013/0302836 A1；国际专利申请公开号WO 2011/097603、WO 2012/148873、WO 2013/134263、WO 2013/184761、WO 2014/160179、WO 2014/160202；它们都特此通过引用整体并入。在一些实施方案中，本文描述的啮齿动物动物包含如在以下文献中描述的免疫球蛋白轻链基因座：WO2019/113065、WO2017214089、US20180125043和美国专利号9,035,128；9,066,502；9,163,092；9,150,662；9,334,333；9,006,511；9,029,628；9,206,261；9,012,717；9,394,373；9,206,262；9,206,263；9,226,484；9,540,452；和9,399,683，它们都特此通过引用整体并入。
一旦已经对动物进行了免疫，就使用抗原特异性的免疫测定监测动物对免疫原的免疫应答。基于血清中对目标跨膜蛋白(抗原)具有特异性的抗体的滴度，可以确定在动物中的体液免疫应答。可以采用多种测定来确定抗体滴度，包括基于ELISA和流式细胞计量术的测定(参见，例如，David H.Margulies,Induction of Immune Responses,CurrentProtocols in Immunology,89,1,(2.0.1-2.0.3)(2010)；Henri V.van der Heyde等人，“Analysis of antigen-specific antibodies and their isotypes in experimentalmalaria,”Cytometry，第71A(4)卷：242-250(2007)；二者通过引用并入本文)。在一些实施方案中，测定利用在细胞表面上表达或被工程改造成表达目标跨膜蛋白的细胞，并且可以通过测量抗体与细胞的结合来确定抗体滴度。
当已经实现适当的免疫应答时，从免疫的动物中收集细胞群体。可以从许多来源收集细胞，包括、但不限于免疫的动物的脾、淋巴结、骨髓和外周血。在一个实施方案中，所述细胞是从免疫的动物的脾中获得的细胞群体，即脾细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞群体是异质细胞群体，其含有来自免疫的动物的不同组织、器官或区域的细胞。在具体实施方案中，所述细胞群体是同质细胞群体，其得自免疫的动物的一个器官诸如脾。在一个实施方案中，所述细胞群体包括来自脾、淋巴结和骨髓中的一种或多种的组织衍生的细胞。在其它实施方案中，所述细胞群体得自免疫的动物的血液。
从免疫的动物收集的细胞包括“抗体生产细胞”，其表示天然地(作为B细胞活化的结果)或作为重组技术和基因工程的结果(诸如杂交瘤细胞)表达抗体的细胞。因此，术语“抗体生产细胞”涵盖免疫细胞，诸如淋巴细胞。在某些非限制性实施例中，淋巴细胞可以属于抗原依赖性的B细胞谱系，包括记忆B细胞、浆母细胞和表达抗体的终末分化浆细胞，以及重组细胞，诸如被工程改造成表达抗体的杂交瘤和非淋巴样细胞。此外，“抗体生产细胞”涵盖这样的细胞：其中被表达的抗体结合或锚定在细胞膜中，即细胞表面抗体，以及分泌抗体的细胞。
在某些实施方案中，抗体生产细胞群体来自免疫的动物的脾、淋巴结、骨髓或外周血。在具体实施方案中，抗体生产细胞群体包括外周血细胞、B细胞、浆细胞、浆细胞性骨髓瘤或其组合。在一些实施方案中，所述抗体生产细胞群体包括重组细胞，诸如、例如，杂交瘤。在具体实施方案中，所述抗体生产细胞群体是淋巴细胞(诸如、例如，B细胞)群体。在一个实施方案中，所述抗体生产细胞群体由记忆B细胞组成。
此外，在一些情况下，另外的抗体生产细胞可以源自通过本公开内容的方法获得的抗体生产细胞的起始群体。因此，细胞系、浆细胞、记忆B细胞、杂交瘤、浆细胞性骨髓瘤和重组抗体表达细胞可以来源于或获得自抗体生产细胞。例如，可以将抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合以制备杂交瘤，或以其它方式永生化，诸如用病毒(例如，EBV)感染，或者可以通过基于特定B细胞类型所表达的蛋白标志物的细胞分选技术进行区分。
在具体实施方案中，术语“抗体生产细胞”是指表达结合目标跨膜蛋白的抗体的细胞。在一些实施方案中，所述结合目标跨膜蛋白的抗体位于细胞表面上。在某些情况下，所述抗体生产细胞群体是抗体生产细胞的异质群体，其含有表达抗体的抗体生产细胞，所述抗体针对超过一种抗原。在一个特定实施方案中，所述抗体生产细胞群体是抗体生产细胞的异质群体，其含有表达抗体的抗体生产细胞，所述抗体结合目标跨膜蛋白和至少一种其它抗原。在其它实施方案中，所述抗体生产细胞群体可以是抗体生产细胞的同质群体，其含有表达抗体的抗体生产细胞，所述抗体仅结合一种抗原。在一个具体实施方案中，所述抗体生产细胞群体是抗体生产细胞的同质群体，其含有表达抗体的抗体生产细胞，所述抗体结合目标跨膜蛋白。
如在表1-5中所示，用各种不同的免疫原和免疫原的组合对动物的免疫接种导致抗体生产细胞的产生，所述抗体生产细胞包括表达与目标跨膜蛋白结合的抗体的抗体生产细胞群体。表1-5还显示，不表达编码目标跨膜蛋白的内源基因的遗传工程改造的动物的免疫接种产生表达与目标跨膜蛋白结合的抗体的抗体生产细胞。
收集表达针对跨膜蛋白的抗体的抗体生产细胞。
如本文所述，产生针对跨膜蛋白的抗体的障碍包括不能向抗体或产生针对目标跨膜蛋白的抗体的细胞提供足够量的构象准确的跨膜蛋白抗原。例如，纯化的内源性跨膜蛋白在从其天然膜环境中分离时在构象上受损，并且目前基于脂质的和基于细胞的膜制品导致高水平的非特异性结合，难以配制，并且经常提供未折叠的或不适当地折叠的跨膜蛋白抗原的子集。
通过利用脂质双层-膜支架蛋白复合物将跨膜蛋白抗原呈递给抗体生产细胞所产生的抗体，本公开内容克服了这样的障碍。更具体地，本公开内容采用包括目标跨膜蛋白、以及在天然存在的细胞的膜中常见的脂质和膜支架蛋白的复合物，以将跨膜蛋白以其天然构象呈递给抗体。因此，脂质双层-膜支架蛋白复合物在本方法中用于鉴定和收集群体中抗体(或表达抗体的细胞)的特定子集，所述抗体结合在自然界中可接近的跨膜蛋白上的表位。
一旦已经形成包括目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物，所述复合物就可以用作分选试剂来检测和分离表达结合目标跨膜蛋白的抗体的抗体生产细胞群体。例如，可以从如本文所述免疫的哺乳动物中获得抗体生产细胞的异质群体，并然后抗体生产细胞群体可以与脂质双层-膜支架蛋白复合物接触，所述复合物将目标跨膜蛋白抗原呈递至由细胞产生的抗体。然后可以温育所述复合物和抗体生产细胞群体以允许由所述复合物呈递的目标跨膜蛋白与由细胞产生的抗体之间的结合。然后可以检测抗体和目标跨膜蛋白之间的结合，并且可以收集结合的细胞以供进一步使用。
在一些情况下，从免疫的动物获得的抗体生产细胞群体可以是抗体生产细胞的异质群体，其含有表达针对超过一种抗原的抗体的抗体生产细胞。在特定实施方案中，所述抗体生产细胞群体是抗体生产细胞的异质群体，其含有表达结合目标跨膜蛋白的抗体的某些抗体生产细胞和表达结合至少一种其它抗原的抗体的某些抗体生产细胞。在某些实施方案中，所述抗体生产细胞的异质群体包含至少0.01％、至少0.1％、至少0.5％、至少1.0％、至少1.5％、至少2.0％、至少3.0％、至少4.0％、至少5.0％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80、至少90％或更多的表达结合目标跨膜蛋白的抗体的抗体生产细胞。
在其它实施方案中，所述抗体生产细胞群体可以是抗体生产细胞的同质群体，其含有表达抗体的抗体生产细胞，所述抗体仅结合一种抗原。在一个具体实施方案中，所述抗体生产细胞群体是抗体生产细胞的同质群体，其含有表达抗体的抗体生产细胞，所述抗体结合目标跨膜蛋白。在某些实施方案中，所述抗体生产细胞的同质群体包含至少70％、至少80、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多的表达结合目标跨膜蛋白的抗体的抗体生产细胞。
在某些实施方案中，可以在获得抗体生产细胞的同时从得自免疫的动物的异质细胞群体中检测和收集B细胞，以提供生产抗体的B细胞的群体。在一些实施方案中，在从异质细胞群体获得抗体生产细胞之前，可以从得自免疫的动物的异质细胞群体获得B细胞。在又另一个实施方案中，可以在得自免疫的动物的抗体生产细胞群体中检测B细胞以获得生产抗体的B细胞的群体。
在一个特定实施方案中，可以在得自免疫的动物的异质细胞群体中检测表达针对目标跨膜蛋白的抗体的生产抗体的B细胞，并基于细胞表面B细胞标志物通过FACS进行分离。
B细胞标志物是本领域已知的。例如，可以通过使用FACS检测的适用B细胞标志物包括、但不限于IgG、IgM、IgE、IgA、IgD、CD1、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD38、CD40、CD78、CD80、CD138、CD319、TLR4、IL-6、PDL-2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、IL-10和TGFβ。在一个具体实施方案中，可以使用对IgG、IgM或其组合具有特异性的标记来检测B细胞。在一个实施方案中，使用对IgG特异性的抗体检测生产抗体的B细胞。
在一个具体实施方案中，在免疫接种后，从免疫的动物中收获脾细胞。除去红细胞后，使用本文描述的方法从异质细胞群体中分离来自免疫的动物的IgG+-抗原阳性的B细胞群体。例如，使脾细胞与抗-IgG抗体接触并洗涤以除去多余的未结合的细胞和抗体。然后将细胞用与标记的B细胞标志物结合的荧光抗体(即，二级抗体)(诸如，抗-IgG抗体)染色。然后可以通过流式细胞计量术分析被染色的细胞并分离以供进一步使用，如本文所述。
在所述方法的一些实施方案中，从已知对目标抗原具有体液免疫的哺乳动物收获外周血单核细胞(PBMC)。然后可以根据本公开内容的方法分离表达识别目标抗原的抗体的IgG+-抗原阳性的B细胞用于进一步处理。
在所述方法的一些实施方案中，抗体生产细胞群体包括生产抗体的B细胞。在一个这样的实施方案中，抗体生产细胞群体包括表达针对目标跨膜蛋白的抗体的生产抗体的B细胞，其可以在得自免疫的动物的异质细胞群体中检测到，并通过使异质细胞群体与呈递目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物和结合B细胞标志物的分子(例如结合B细胞表面标志物的抗体)接触来分离。例如，在免疫接种后，从免疫的动物中收获脾细胞。除去红细胞后，将异质细胞群体与标记的抗-IgG抗体一起温育，以允许抗-IgG抗体与异质细胞群体中的IgG+-阳性的B细胞之间的结合。在与标记的抗-IgG抗体温育的同时、或之后或之前，将异质细胞群体与呈递目标跨膜蛋白的经标记的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，以允许跨膜蛋白与细胞所产生的抗体的结合。然后可以通过例如流式细胞计量术获得表达针对目标跨膜蛋白的抗体的生产抗体的B细胞群体，以检测和分离(收集)与标记的抗-IgG抗体(B细胞)和标记的脂质双层-膜支架蛋白复合物结合的细胞。
在一些情况下，所述方法包括如本文所述免疫动物。
在包括将细胞群体(诸如、例如，抗体生产细胞群体)与脂质双层-膜支架蛋白复合物接触或温育的情况下，以至少0.1mg/mL、至少0.2mg/mL、至少0.3mg/mL、至少0.4mg/mL、至少0.5mg/mL、至少0.6mg/mL、至少0.7mg/mL、至少0.8mg/mL、至少0.9mg/mL、至少1.0mg/mL、至少2.0mg/mL、至少3.0mg/mL、至少4.0mg/mL、至少5.0mg/mL、至少10.0mg/mL或更大的浓度将脂质双层-膜支架蛋白复合物提供给细胞培养基。在某些实施方案中，以0.2mg/mL至20.0mg/mL、0.2mg/mL至15.0mg/mL、0.2mg/mL至10mg/mL、0.2mg/mL至7.0mg/mL、0.2mg/mL至5.0mg/mL、0.5mg/mL至10.0mg/mL、0.5mg/mL至7.0mg/mL、0.5mg/mL至5.0mg/mL、1.0mg/mL至10.0mg/mL、1.0mg/mL至7.0mg/mL或1.0mg/mL至5.0mg/mL(包括端值)的浓度将所述复合物提供给细胞。在具体实施方案中，以0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.55mg/mL、0.6mg/mL、0.65mg/mL、0.7mg/mL、0.75mg/mL、0.8mg/mL、0.85mg/mL、0.9mg/mL、0.95mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL、3.5mg/mL、4.0mg/mL、4.5mg/mL、5.0mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL、6.5mg/mL、7.0mg/mL、7.5mg/mL、8.0mg/mL、8.5mg/mL、9.0mg/mL、9.5mg/mL、10.0mg/mL、12.0mg/mL、15.0mg/mL、20.0mg/mL或更大的浓度将所述复合物提供给细胞。
在所述方法的一个方面，所述免疫的动物是用目标人跨膜蛋白或其部分、编码它的核酸序列或其组合免疫的非人动物或遗传工程改造的非人动物，诸如、例如，小鼠或大鼠。
在所述方法的某些实施方案中，将非人动物或遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长人跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合免疫，并从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与包含全长人跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育以允许由所述复合物呈递的目标人跨膜蛋白(抗原)与由细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素-标记的(例如，Bir-A)膜支架蛋白之间的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标全长人跨膜蛋白上的表位的抗体。
在所述方法的一些实施方案中，将非人动物或遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长人跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合免疫，并从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，所述复合物包含人跨膜蛋白的一部分，诸如截短的人跨膜蛋白，以允许由所述复合物呈递的目标人跨膜蛋白(抗原)的部分上的表位与由细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合由所述复合物呈递的抗原上的表位的抗体。
在包括脂质-双层-膜支架蛋白复合物(其包含目标跨膜蛋白的一部分)的方法的实施方案中，由所述复合物呈递的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白。在一些实施方案中，所述目标跨膜蛋白是如本文所描述的截短的跨膜蛋白。在某些实施方案中，所述目标截短的跨膜蛋白至少包括目标跨膜蛋白的整个跨膜部分。在某些实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域、氨基端和/或羧基端部分。在一些实施方案中，所述截短的蛋白包括目标跨膜蛋白的细胞外结构域，诸如N-端细胞外结构域、C-端细胞外结构域和/或在目标跨膜蛋白的一个或多个跨膜结构域之间的细胞外环结构域。在一个特定实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的氨基端部分。在另一个实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的羧基端部分。在一些实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的细胞外环结构域。
在所述方法的其它实施方案中，将非人动物或遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长人跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合免疫。从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，所述复合物包含嵌合跨膜蛋白，其包括目标人跨膜蛋白的一部分和目标跨膜蛋白的非人同系物的一部分，以允许由所述复合物呈递的目标嵌合跨膜蛋白(抗原)的人部分与由细胞生产的抗体之间的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标嵌合跨膜蛋白的人部分上的表位的抗体。
在包括使用目标嵌合跨膜蛋白的方法的实施方案中，嵌合蛋白可以包括如本文所描述的来自两个不同物种的目标跨膜蛋白的部分。例如，嵌合跨膜蛋白可以包括人跨膜蛋白的一个或多个部分，所述部分可操作地连接至目标跨膜蛋白的非人同系物的一个或多个部分。在一些情况下，所述嵌合跨膜蛋白包括目标跨膜蛋白的细胞外结构域诸如N-端细胞外结构域、C-端细胞外结构域和/或在目标跨膜蛋白的一个或多个跨膜结构域之间的细胞外环结构域。所述非人同系物可以是任何非人动物，诸如、例如，小鼠、大鼠、山羊、仓鼠、猪、黑猩猩、马、绵羊、猴和豚鼠。在一个特定实施方案中，所述非人哺乳动物是小鼠、大鼠或山羊。在一个具体实施方案中，所述非人哺乳动物是小鼠。
在本方法的示例性实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自目标人跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的氨基端结构域和/或羧基端结构域。在一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括一个或多个细胞外环结构域和来自人跨膜蛋白的羧基端结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的氨基端结构域。在另一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括一个或多个细胞外环结构域和来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的羧基端结构域。在另一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和羧基端结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的一个或多个细胞外环结构域。在一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和一个或多个细胞外环结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的羧基端结构域。在又另一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自非人同系物的一个或多个细胞外环结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的氨基端结构域。
在所述方法的其它实施方案中，将非人动物或遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长人跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合免疫。从免疫的非人动物分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，所述复合物包含跨膜蛋白的非人同系物，以允许由所述复合物呈递的目标非人跨膜蛋白(抗原)与由所述细胞生产的交叉反应性抗体之间的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达交叉反应性抗体，其结合在目标非人跨膜蛋白和目标人跨膜蛋白上存在的表位。
在包括使用目标跨膜蛋白的非人同系物或其部分的本方法的实施方案中，所述非人同系物可以是任何非人生物体。非人生物体的某些例子包括、但不限于非人哺乳动物、爬行动物、鱼、细菌、昆虫和病毒。在一些实施方案中，所述非人蛋白可以来自小鼠、大鼠、山羊、仓鼠、猪、黑猩猩、马、绵羊、猴和豚鼠。在特定实施方案中，所述非人蛋白同系物来自小鼠、大鼠或山羊。在一个具体实施方案中，所述非人同系物是目标跨膜蛋白的小鼠同系物。
在所述方法的一些实施方案中，将非人动物或遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长人跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合免疫，从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞并与目标全长人跨膜蛋白的一部分(肽阻滞剂)一起温育以允许肽阻滞剂与由细胞生产的抗体之间的结合，所述抗体特异性地结合位于阻滞剂上的表位。还将所述细胞与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体，并与包含全长跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育以允许由所述复合物呈递的目标全长跨膜蛋白(抗原)与由所述群体中剩余的未结合的细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后可以洗涤细胞以从分选除去结合至肽阻滞剂的所有细胞、未结合的和多余的PE-抗生蛋白链菌素以及针对B细胞标志物的经标记的抗体。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标全长人跨膜蛋白上的表位的抗体，所述表位不存在于与肽阻滞剂对应的部分上。
在包括使用阻滞剂的方法的实施方案中，所述阻滞剂可以是任何分子，诸如、例如，肽、多肽、化学化合物。在这样的实施方案中，所述阻滞剂可以是对应于目标跨膜蛋白的一部分的多肽或肽、对应于MSP蛋白的一部分的多肽或肽、或可检测标志物诸如His-标签或Flag-标签。在一些实施方案中，所述阻滞剂包括可检测标记。在其它实施方案中，所述阻滞剂不包括可检测标记。在一个实施方案中，所述阻滞剂是目标跨膜蛋白的肽或多肽部分，其可以与抗体生产细胞群体一起温育以允许阻滞剂和由抗体生产细胞产生的抗体之间的结合，所述抗体特异性地结合位于阻滞剂上的表位。在一个实施方案中，阻滞剂是目标截短的跨膜蛋白。在一个特定实施方案中，所述阻滞剂是多肽，其对应于目标全长跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域、氨基端和羧基端部分。在一个特定实施方案中，所述阻滞剂可以是多肽，其包含目标全长跨膜蛋白的氨基端部分。在另一个实施方案中，所述阻滞剂可以是多肽，其包含目标全长跨膜蛋白的羧基端部分。在一个实施方案中，所述阻滞剂可以是多肽，其包含目标全长跨膜蛋白的细胞外环结构域。在一些实施方案中，所述阻滞剂包括目标跨膜蛋白的细胞外结构域，诸如N-端细胞外结构域、C-端细胞外结构域和/或在目标全长跨膜蛋白的一个或多个跨膜结构域之间的细胞外环结构域。在另一个实施方案中，所述阻滞剂是MSP蛋白的肽或多肽部分，其可以与抗体生产细胞群体一起温育以允许阻滞剂和由抗体生产细胞产生的抗体之间的结合，所述抗体特异性地结合位于阻滞剂上的表位。在又另一个实施方案中，所述阻滞剂是位于MSP或目标跨膜蛋白上的肽或多肽可检测标志物，其可以与抗体生产细胞群体一起温育以允许阻滞剂和由抗体生产细胞产生的抗体之间的结合，所述抗体特异性地结合位于阻滞剂上的表位。
在所述方法的其它实施方案中，将非人动物或遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长人跨膜蛋白的一部分、编码它的核酸序列或其组合(免疫原)免疫。
在一些实施方案中，从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与包含全长人跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育以允许由所述复合物呈递的目标全长跨膜蛋白(抗原)与由细胞生产的抗体之间的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合位于目标全长人跨膜蛋白抗原的一部分上的表位的抗体，所述表位也对应于存在于免疫原上或由免疫原编码的氨基酸序列或结构域。
在所述方法的其它实施方案中，将非人动物或遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长人跨膜蛋白的一部分(免疫原)、编码它的核酸序列或其组合免疫，从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，所述复合物包含用作免疫原的人跨膜蛋白的部分，以允许由所述复合物呈递的目标人跨膜蛋白(抗原)的部分上的表位与由细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合由所述复合物呈递的抗原上的表位的抗体。
在包括使用目标跨膜蛋白的一部分的本发明的方法的实施方案中，所述跨膜蛋白的部分是不包括目标全长跨膜蛋白的肽或多肽。在一个实施方案中，目标跨膜蛋白的部分可以是经修饰的跨膜蛋白，其不包括目标全长跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域、氨基端和/或羧基端部分。在一个特定实施方案中，经修饰的目标跨膜蛋白可以是截短的跨膜蛋白。在一些实施方案中，目标跨膜蛋白的部分包括可检测标记。在其它实施方案中，目标跨膜蛋白的部分不包括可检测标记。在某些实施方案中，所述目标截短的跨膜蛋白至少包括目标跨膜蛋白的整个跨膜部分。在某些实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的氨基端部分。在另一个实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的羧基端部分。在一些实施方案中，所述截短的蛋白包括目标跨膜蛋白的细胞外结构域，诸如N-端细胞外结构域、C-端细胞外结构域和/或在目标跨膜蛋白的一个或多个跨膜结构域之间的细胞外环结构域。在一个实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的细胞外环结构域。
在所述方法的另一个方面，将遗传工程改造的动物(其不从内源基因表达目标跨膜蛋白)用目标非人跨膜蛋白或其部分、编码它的核酸序列或其组合免疫。
目标非人跨膜蛋白和遗传工程改造的动物可以来自相同的或不同的动物。目标非人跨膜蛋白可以来自任何非人生物体。非人生物体的非限制性例子包括、但不限于非人哺乳动物、爬行动物、鱼、细菌、昆虫和病毒。在一些实施方案中，所述非人跨膜蛋白来自动物，诸如、例如，小鼠、大鼠、山羊、仓鼠、猪、黑猩猩、马、绵羊、猴和豚鼠。在一个特定实施方案中，所述非人生物体是哺乳动物。在其它实施方案中，所述非人跨膜蛋白来自小鼠、大鼠或山羊。在一个具体实施方案中，所述非人哺乳动物是小鼠。
在所述方法的特定实施方案中，遗传工程改造的动物是用目标全长非人跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合(免疫原)免疫的非人动物，诸如、例如，小鼠或大鼠。从免疫的遗传工程改造的动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与包含全长非人跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，以允许由所述复合物呈递的目标跨膜蛋白(抗原)与由细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素-标记的(例如，Bir-A)膜支架蛋白之间的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标全长非人跨膜蛋白上的表位的抗体。
在所述方法的其它实施方案中，将遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长非人跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合(免疫原)免疫，并从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与包含目标全长人跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，以允许由所述复合物呈递的目标人跨膜蛋白(抗原)与由细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素-标记的(例如，Bir-A)膜支架蛋白之间的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达交叉反应性抗体，其结合目标全长非人跨膜蛋白和目标非人跨膜蛋白上的表位。
在所述方法的一些实施方案中，将遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长非人跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合(免疫原)免疫，并从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，所述复合物包含全长非人跨膜蛋白的一部分，诸如截短的跨膜蛋白，以允许由所述复合物呈递的目标跨膜蛋白的部分上的表位(抗原)与由细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合由所述复合物呈递的抗原上的表位的抗体。
在包括脂质-双层-膜支架蛋白复合物(其包含目标跨膜蛋白的一部分)的方法的实施方案中，由所述复合物呈递的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白。在一个实施方案中，所述目标跨膜蛋白是截短的跨膜蛋白，其不包括目标全长跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域、氨基端和/或羧基端部分。在某些实施方案中，所述目标截短的跨膜蛋白至少包括目标跨膜蛋白的整个跨膜部分。在一些实施方案中，所述截短的蛋白包括目标跨膜蛋白的细胞外结构域，诸如N-端细胞外结构域、C-端细胞外结构域和/或在目标跨膜蛋白的一个或多个跨膜结构域之间的细胞外环结构域。在一个特定实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的氨基端部分。在另一个实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的羧基端部分。在一个实施方案中，所述截短的跨膜蛋白不包括目标全长跨膜蛋白的细胞外环结构域。
在所述方法的某些实施方案中，将遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长非人跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合免疫，从免疫的动物分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，所述复合物包含嵌合跨膜蛋白，其包括目标跨膜蛋白的非人同系物的一部分和目标人跨膜蛋白的一部分，以允许由所述复合物呈递的目标嵌合跨膜蛋白(抗原)的非人部分与由细胞生产的抗体之间的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标嵌合跨膜蛋白的非人部分上的表位的抗体。
在包括使用目标嵌合跨膜蛋白的方法的实施方案中，嵌合蛋白可以包括如本文所描述的来自两个不同物种的目标跨膜蛋白的部分。例如，所述嵌合跨膜蛋白可以包括人跨膜蛋白的一个或多个部分，所述部分可操作地连接至跨膜蛋白的非人同系物的一个或多个部分。在一些情况下，所述嵌合跨膜蛋白包括目标跨膜蛋白的细胞外结构域诸如N-端细胞外结构域、C-端细胞外结构域和/或在目标跨膜蛋白的一个或多个跨膜结构域之间的细胞外环结构域。所述非人同系物可以是任何非人动物，诸如、例如，小鼠、大鼠、山羊、仓鼠、猪、黑猩猩、马、绵羊、猴和豚鼠。在一个特定实施方案中，所述非人哺乳动物是小鼠、大鼠或山羊。在一个具体实施方案中，所述非人哺乳动物是小鼠。
在本方法的示例性实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自人跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的氨基端结构域和/或羧基端结构域。在一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括一个或多个细胞外环结构域和来自人跨膜蛋白的羧基端结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的氨基端结构域。在另一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括一个或多个细胞外环结构域和来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的羧基端结构域。在另一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和羧基端结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的一个或多个细胞外环结构域。在一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和一个或多个细胞外环结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的羧基端结构域。在又另一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自非人同系物的一个或多个细胞外环结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的氨基端结构域。
在所述方法的其它实施方案中，将遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长非人跨膜蛋白的一部分、编码它的核酸序列或其组合(免疫原)免疫。
在一个这样的示例性实施方案中，从免疫的遗传工程改造的动物分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与包含全长非人跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，以允许由所述复合物呈递的目标全长跨膜蛋白(抗原)与由细胞生产的抗体之间的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合位于目标全长非人跨膜蛋白抗原的一部分上的表位的抗体，所述表位也对应于存在于免疫原上或由免疫原编码的氨基酸序列或结构域。
在所述方法的其它实施方案中，将遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用目标全长非人跨膜蛋白的一部分(免疫原)、编码它的核酸序列或其组合免疫，从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，所述复合物包含用作免疫原的非人跨膜蛋白的部分，以允许由所述复合物呈递的目标人跨膜蛋白(抗原)的部分上的表位与由细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合由所述复合物呈递的抗原上的表位的抗体。
在所述方法的另一个方面，将遗传工程改造的动物(其不从内源基因表达目标跨膜蛋白)用目标嵌合跨膜蛋白或其编码核酸免疫。
在包括使用目标嵌合跨膜蛋白的情况下，嵌合蛋白可以包括如本文所描述的来自两个不同物种的目标跨膜蛋白的部分。例如，所述嵌合跨膜蛋白可以包括人跨膜蛋白的一个或多个部分，所述部分可操作地连接至跨膜蛋白的非人同系物的一个或多个部分。在一些情况下，所述目标嵌合跨膜蛋白包括目标人跨膜蛋白的细胞外结构域诸如N-端细胞外结构域、C-端细胞外结构域和/或可操作地连接至目标跨膜蛋白的一个或多个跨膜结构域的细胞外环结构域。所述非人同系物可以是任何非人动物，诸如、例如，小鼠、大鼠、山羊、仓鼠、猪、黑猩猩、马、绵羊、猴和豚鼠。在一个特定实施方案中，所述非人哺乳动物是小鼠、大鼠或山羊。在一个具体实施方案中，所述非人哺乳动物是小鼠。
在本方法的示例性实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自目标人跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的氨基端结构域和/或羧基端结构域。在一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括一个或多个细胞外环结构域和来自人跨膜蛋白的羧基端结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的氨基端结构域。在另一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括一个或多个细胞外环结构域和来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的羧基端结构域。在另一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和羧基端结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的一个或多个细胞外环结构域。在一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括来自人跨膜蛋白的氨基端结构域和一个或多个细胞外环结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的羧基端结构域。在又另一个实施方案中，所述目标嵌合跨膜蛋白包括可操作地连接到跨膜结构域的来自非人同系物的一个或多个细胞外环结构域和来自跨膜蛋白的非人同系物的氨基端结构域。
在所述方法的一个特定实施方案中，将遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用嵌合跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合免疫，所述嵌合跨膜蛋白包括人跨膜蛋白的一部分和跨膜蛋白的非人同系物的一部分，从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与包含目标全长人跨膜蛋白(抗原)的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，以允许由所述复合物呈递的人抗原与由细胞生产的抗体之间的结合，所述抗体对目标嵌合跨膜蛋白的人部分具有特异性。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标嵌合跨膜蛋白的人部分上的表位的抗体。
在所述方法的另一个实施方案中，将遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用嵌合跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合免疫，所述嵌合跨膜蛋白包括目标人跨膜蛋白的一部分和目标跨膜蛋白的非人同系物的一部分，从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，所述复合物包含目标全长人跨膜蛋白的一部分(抗原)，以允许由所述复合物呈递的人抗原与由细胞生产的抗体之间的结合，所述抗体对目标嵌合跨膜蛋白的人部分具有特异性。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标嵌合跨膜蛋白的人部分上的表位的抗体。
在所述方法的又另一个实施方案中，将遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用嵌合跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合免疫，所述嵌合跨膜蛋白包括目标人跨膜蛋白的一部分和目标跨膜蛋白的非人同系物的一部分，从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，所述复合物包含目标全长非人跨膜蛋白(抗原)，以允许由所述复合物呈递的非人抗原与由细胞生产的抗体之间的结合，所述抗体对目标嵌合跨膜蛋白的非人部分具有特异性。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标嵌合跨膜蛋白的非人部分上的表位的抗体。
在所述方法的另一个实施方案中，将遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用嵌合跨膜蛋白、编码它的核酸序列或其组合免疫，所述嵌合跨膜蛋白包括目标人跨膜蛋白的一部分和目标跨膜蛋白的非人同系物的一部分，从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。还将所述细胞与生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，所述复合物包含目标全长非人跨膜蛋白的一部分(抗原)，以允许由所述复合物呈递的非人抗原与由细胞生产的抗体之间的结合，所述抗体对目标嵌合跨膜蛋白的非人部分具有特异性。然后可以洗涤细胞。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标嵌合跨膜蛋白的非人部分上的表位的抗体。
在所述方法的另一个方面，将非人动物或遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用包含目标全长跨膜蛋白或其部分的脂质双层-膜支架蛋白复合物免疫。
在所述方法的一些实施方案中，将非人动物或遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用包含目标全长人跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物免疫。从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与一种或多种阻滞剂一起温育，所述阻滞剂对应于在所述复合物中包含的每种MSP蛋白和在所述复合物中包含或附着至目标跨膜蛋白的每种可检测标志物，诸如His-标签或Flag-标签，以允许所述阻滞剂与由细胞生产的抗体之间的结合，所述抗体特异性地结合位于阻滞剂上的表位。还将所述细胞与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。然后将细胞与包含全长人跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，以允许由所述复合物呈递的目标全长跨膜蛋白(抗原)与由所述群体中剩余的未结合的细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后可以洗涤细胞以从分选除去结合至阻滞剂的所有细胞、以及未结合的和多余的PE-抗生蛋白链菌素以及针对B细胞标志物的经标记的抗体。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标全长人跨膜蛋白上的表位的抗体。
在所述方法的一个实施方案中，将非人动物或遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用包含目标全长人跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物免疫。从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与一种或多种阻滞剂一起温育，所述阻滞剂对应于在所述复合物中包含的每种MSP蛋白和在所述复合物中包含或附着至目标跨膜蛋白的每种可检测标志物，诸如His-标签或Flag-标签，以允许所述阻滞剂与由细胞生产的抗体之间的结合，所述抗体特异性地结合位于阻滞剂上的表位。还将所述细胞与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。然后将细胞与包含人跨膜蛋白的一部分的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育以允许由所述复合物呈递的目标跨膜蛋白的部分(抗原)与由所述群体中剩余的未结合的细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后可以洗涤细胞以从分选除去结合至阻滞剂的所有细胞、以及未结合的和多余的PE-抗生蛋白链菌素以及针对B细胞标志物的经标记的抗体。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合由所述复合物呈递的目标全长人跨膜蛋白的部分上的表位的抗体。
在所述方法的其它实施方案中，将不从内源基因表达目标跨膜蛋白的遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用包含目标全长非人跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物免疫。从免疫的非人动物(例如，大鼠或小鼠)分离脾细胞，并与一种或多种阻滞剂一起温育，所述阻滞剂对应于在所述复合物中包含的每种MSP蛋白和在所述复合物中包含或附着至目标跨膜蛋白的每种可检测标志物，诸如His-标签或FLAG-标签，以允许所述阻滞剂与由细胞生产的抗体之间的结合，所述抗体特异性地结合位于阻滞剂上的表位。还将所述细胞与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。然后将细胞与包含全长非人跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，以允许由所述复合物呈递的目标全长跨膜蛋白(抗原)与由所述群体中剩余的未结合的细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后可以洗涤细胞以从分选除去结合至阻滞剂的所有细胞、以及未结合的和多余的PE-抗生蛋白链菌素以及针对B细胞标志物的经标记的抗体。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标全长非人跨膜蛋白上的表位的抗体。
在所述方法的一些实施方案中，将不从内源基因表达目标跨膜蛋白的遗传工程改造的非人动物(诸如、例如，小鼠或大鼠)用脂质双层-膜支架蛋白复合物免疫，所述复合物包含目标全长非人跨膜蛋白的一部分。从免疫的动物分离脾细胞，并与一种或多种阻滞剂一起温育，所述阻滞剂对应于在所述复合物中包含的每种MSP蛋白和在复合物中包含或附着至目标非人跨膜蛋白的部分的每种可检测标志物，诸如His-标签或FLAG-标签，以允许所述阻滞剂与由细胞生产的抗体之间的结合，所述抗体特异性地结合位于阻滞剂上的表位。还将所述细胞与针对B细胞标志物的经标记的抗体(例如，荧光染料-标记的抗-IgG抗体)一起温育以鉴定B细胞群体。然后将细胞与生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，所述复合物包含全长非人跨膜蛋白或目标全长非人跨膜蛋白的一部分(抗原)，以允许由所述复合物呈递的目标跨膜蛋白与由所述群体中剩余的未结合的细胞生产的抗体之间的结合。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后可以洗涤细胞以从分选除去结合至阻滞剂的所有细胞、以及未结合的和多余的PE-抗生蛋白链菌素以及针对B细胞标志物的经标记的抗体。PE荧光和来自结合的B细胞的信号(例如，荧光染料-标记的抗-IgG信号)可以通过FACS来检测以鉴定和收集生产抗体的B细胞的同质群体，所述B细胞表达结合目标全长非人跨膜蛋白的一部分上的表位的抗体。
在包括使用阻滞剂的方法的实施方案中，所述阻滞剂可以包含任何分子，诸如、例如，肽、多肽、化学化合物。在这样的实施方案中，所述阻滞剂可以是对应于目标跨膜蛋白的一部分的多肽或肽、对应于MSP蛋白的一部分的多肽或肽、或可检测标志物诸如His-标签或FLAG-标签。在一些实施方案中，所述阻滞剂包括可检测标记。在其它实施方案中，阻滞剂不包括可检测标记。在一个实施方案中，所述阻滞剂是目标跨膜蛋白的肽或多肽部分，其可以与抗体生产细胞群体一起温育以允许阻滞剂和由抗体生产细胞产生的抗体之间的结合，所述抗体特异性地结合位于阻滞剂上的表位。在一个实施方案中，阻滞剂是目标截短的跨膜蛋白。在一个特定实施方案中，所述阻滞剂是多肽，其对应于目标全长跨膜蛋白的一个或多个细胞外环结构域、氨基端和羧基端部分。在一个特定实施方案中，所述阻滞剂可以是多肽，其包含目标全长跨膜蛋白的氨基端部分。在另一个实施方案中，所述阻滞剂可以是多肽，其包含目标全长跨膜蛋白的羧基端部分。在一个实施方案中，所述阻滞剂可以是多肽，其包含目标全长跨膜蛋白的细胞外环结构域。在一些实施方案中，所述阻滞剂是截短的蛋白，其包括目标跨膜蛋白的细胞外结构域诸如N-端细胞外结构域、C-端细胞外结构域和/或在目标跨膜蛋白的一个或多个跨膜结构域之间的细胞外环结构域。在另一个实施方案中，所述阻滞剂是MSP蛋白的肽或多肽部分，其可以与抗体生产细胞群体一起温育以允许阻滞剂和由抗体生产细胞产生的抗体之间的结合，所述抗体特异性地结合位于阻滞剂上的表位。在又另一个实施方案中，所述阻滞剂是位于MSP或目标跨膜蛋白上的肽或多肽可检测标志物，其可以与抗体生产细胞群体一起温育以允许阻滞剂和由抗体生产细胞产生的抗体之间的结合，所述抗体特异性地结合位于阻滞剂上的表位。
公开的方法包括检测、分选和收集抗体生产细胞，其结合至由包含目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的抗原。可以将检测、分选和收集组合或作为不同的步骤执行。检测、分选和/或收集可以包括，通过检测复合物上的一种或多种可检测标记来鉴定由复合物呈递的目标跨膜蛋白所结合的细胞。然后可以将结合的细胞与未结合的细胞分离(即分选)并选择以供进一步使用。
在一些实施方案中，如下检测抗体生产细胞与呈递目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物之间的相互作用：通过目标跨膜蛋白的构象变化，细胞中目标跨膜蛋白的活化或灭活，或通过使用可检测标记(例如，荧光分子、FLAG标签，His-标签)以鉴定和捕获与含有目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物结合的细胞。通过使用对标记特异性的抗体进行免疫染色或使用与标记结合的试剂直接染色，可以进行检测。众多检测试剂盒和技术是本领域众所周知的。
在所述方法的某些实施方案中，将细胞用缓冲液洗涤约5分钟至约60分钟的一段时间以除去未结合的抗原；可以使用总计10至120分钟的多次洗涤，例如3次10分钟的洗涤或一次30分钟的洗涤；2-4次各10-15分钟的洗涤。在一个实施方案中，可以使用将细胞洗涤一段时间，包含一(1)次共计约10分钟、或约15分钟或约20分钟、或约25分钟、或约30分钟、或约35分钟、或约40分钟、或约45分钟、或约50分钟、或约55分钟、或约60分钟的洗涤。在一些实施方案中，可以使用将细胞洗涤一段时间，包含两(2)次洗涤，每次洗涤各约5分钟、或约10分钟、或约15分钟或约20分钟、或约25分钟、或约30分钟。考虑另外的洗涤间隔，其基本上等同于本文描述的那些。
在一些实施方案中，可以使用荧光激活细胞分选术(FACS)进行检测、分选和收集，以检测、分选和选择表达跨膜蛋白特异性抗体的单个抗体生产细胞。通过流式细胞计量术分离单个细胞的方案是众所周知的(Huang,J.等人，2013，出处同上)。例如，结合由标记的(例如，荧光标记)脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的抗原(或荧光地标记的抗生蛋白链菌素/生物素化的抗原)的细胞可以被检测并鉴定为表达特异性地结合抗原(即，目标跨膜蛋白)的抗体的细胞，并然后收集在96孔或384孔平板上的单个孔中。
一旦收集，可以将单个抗体生产细胞通过普通细胞培养技术繁殖，用于随后的DNA制备。可替换地，可以直接从单个抗体生产细胞扩增抗体基因，并随后克隆进DNA载体中。
通过本领域已知的替代方法，可以分选和收集单个抗体生产细胞，包括、但不限于手动单细胞挑选、有限稀释和吸附抗原的B细胞淘选，它们都是本领域众所周知的。参见，例如，Rolink等人，J Exp Med(1996)183:187-194；Lightwood,D.等人，J.Immunol.Methods(2006)316(1-2):133-43。
从得自抗体生产细胞的核酸产生抗体，所述细胞表达针对目标跨膜蛋白的抗体。
可以从使用本文描述的方法产生和获得的抗体生产细胞中分离编码抗体或其片段的核酸。
在一些实施方案中，所述核酸编码抗体的片段，诸如可变结构域、恒定结构域或其组合。在某些实施方案中，从抗体生产细胞分离的核酸编码抗体的可变结构域。在一些实施方案中，所述核酸编码抗体重链或其片段。在其它实施方案中，所述核酸编码抗体轻链或其片段。
在某些情况下，在宿主细胞中表达从抗体生产细胞分离的核酸。例如，可以在宿主细胞(诸如哺乳动物细胞、细菌细胞或昆虫细胞)中表达(例如，克隆和重组地复制)从抗体生产细胞分离的核酸。在一些实施方案中，将宿主细胞在表达核酸的条件下培养，并然后可以产生抗体或其部分，并且分离用于进一步使用。用于从分离的核酸产生抗体的方法是本领域众所周知的，并且任何这样的方法都可以与本公开内容结合使用。
在一些实施方案中，将包含一种或多种上述核酸的宿主细胞在表达全长抗体的条件下培养，并然后可以产生和分离抗体以供进一步使用。在某些实施方案中，所述宿主细胞包含编码抗体的可变结构域的核酸，并且在表达可变结构域的条件下培养所述细胞。在其它实施方案中，所述宿主细胞包含编码抗体的可变重链(VH)结构域的核酸，并且在表达VH结构域的条件下培养所述细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞包含编码抗体的可变轻链(VL)结构域的核酸，并且在表达VL结构域的条件下培养所述细胞。在具体实施方案中，所述宿主细胞包含编码抗体的VH结构域的核酸和编码抗体的VH结构域的核酸，并且在表达VH结构域和VL结构域的条件下培养所述细胞。
在一些实施方案中，可以从宿主分离DNA以重组地产生抗体。通常，编码免疫球蛋白可变重链和可变轻链(即，VH、VL、Vκ和Vλ)的基因或核酸可以使用RT-PCR方案回收，其中从抗体生产细胞中分离核酸。这些RT-PCR方案是众所周知的和常规的技术，如例如Wang等人，J.Immunol.Methods(2000)244:217-225所述和本文所述。
一旦回收，可以将编码抗体的基因或核酸克隆进IgG重链和轻链表达载体中，并通过宿主细胞的转染进行表达。例如，可以将编码抗体的基因或核酸插入可复制载体中，用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于在细胞中表达(稳定或瞬时)。许多载体(特别是表达载体)是可用的或可以被工程改造成包含调节抗体编码基因或核酸的表达所需的适当调节元件。
在本公开内容的上下文中的表达载体可以是任何合适的载体，包括如本文所描述的染色体、非染色体和合成核酸载体(包含一组合适的表达控制元件的核酸序列)。这样的载体的例子包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体、以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。
在一些实施方案中，将核酸分子包含在裸露DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(如例如Sykes和Johnston，Nat Biotech(1997)12:355-59中所述)、紧凑的核酸载体(如例如US 6,077,835中所述)或质粒载体诸如pBR322或pUC 19/18。这样的核酸载体及其用途是本领域众所周知的。参见，例如，US 5,589,466和US 5,973,972。
在某些实施方案中，所述表达载体可以是适合于在酵母系统中表达的载体。可以采用适合在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括，例如，包含组成型或诱导型启动子诸如酵母α因子、醇氧化酶和PGH的载体。参见，F.Ausubel等人，编.Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley InterScience New York(1987)；和Grant等人，Methods in Enzymol 153,516-544(1987)。
在某些实施方案中，所述载体包含编码抗体重链的核酸分子(或基因)和编码抗体轻链的核酸分子(或基因)，其中由已经通过本公开内容的方法获得的抗体生产细胞产生抗体。通常，利用的载体包括包含所描述的核酸分子(或基因)的表达载体，其中所述核酸分子(或基因)可操作地连接至适合于在宿主细胞中表达的表达控制序列。
载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。宿主细胞包括、但不限于原核或真核(通常是哺乳动物)来源的细胞。
应当理解，可以随后将全长抗体核酸序列或基因克隆进一种或多种适当载体中。可替换地，可以将分离的抗体的Fab区域克隆进与任何同种型的恒定区一致的一种或多种载体中。因此，任何恒定区都可以用于构建分离的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD和IgE重链恒定区，或嵌合重链恒定区。根据抗体的预期用途，这样的恒定区可以从任何人或动物物种中获得。此外，可以将抗体可变区或Fab区域克隆进合适的载体中以用于以其它形式(诸如ScFv、双体等)表达蛋白。
因此，本公开内容还提供了编码核酸分子的哺乳动物宿主细胞，所述核酸分子包含对目标跨膜蛋白特异性的全长抗体，其中编码抗体的核酸或基因分离自根据本方法获得的抗体生产细胞。在一个实施方案中，所述一级抗体生产细胞是B-细胞，其分离自从免疫的哺乳动物获得的异质细胞群体。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是细菌或酵母细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在其它实施方案中，所述宿主细胞可以是，例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，诸如，CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO细胞；COS(例如，COS-7)；干细胞；视网膜细胞；Vero细胞；CV1细胞；肾细胞，诸如、例如，HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、aHaK、BHK21细胞；HeLa细胞；HepG2细胞；WI38；MRC 5；Colo25；HB 8065；HL-60；Jurkat或Daudi细胞；A431(表皮)细胞；CV-1、U937、3T3或L-细胞；C127细胞、SP2/0、NS-0或MMT细胞、肿瘤细胞和从任何前述细胞衍生出的细胞系。在一个特定实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是CHO K1细胞。
抗体作为本领域已知的那些术语表示免疫系统的抗原结合蛋白。本文提及的术语“抗体”包括具有抗原结合区的完整全长抗体，及其中保留“抗原结合部分”或“抗原结合区域”的其任何片段，或其单链，例如，单链可变片段(scFv)。“全长抗体”是一种糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。所述重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区CL。所述轻链恒定区包含一个结构域CL。所述VH和VL区域可以进一步细分成被称作互补性决定区(CDR)的高变异性区域，其散布有被称作框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL包含从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
如本文证实的，本公开内容可以用于获得结合目标跨膜蛋白的抗体。可以使用本领域已知的方法表征从本文描述的抗体生产细胞获得的抗体。例如，可以确定本文产生的任何抗体的结合亲和力、识别的特定表位或功能能力。
“结合亲和力”通常表示在分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本文中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子对其结合配偶体的亲和力通常可以用解离平衡常数(KD或KD)表示。KD(摩尔，M)值与结合亲和力之间成反比关系，因此KD值(M)越小，分子与其结合表位的结合亲和力越高。
术语“更高亲和力”或“高亲和力”表示通常结合抗原更强和/或更快和/或保持结合更久的抗体。通常，由于强结合相互作用，高亲和力抗体需要较低浓度(M)的抗原即可达到所需的效果。相反，术语“低亲和力”和“更低亲和力”是用来反映较弱结合的术语，诸如与其它结合分子(例如，抗体)相比，降低的在分子与其结合配偶体之间形成相互作用的能力。因此，低亲和力结合分子与其它结合分子相比将具有更大的KD值和/或将缓慢地结合抗原并倾向于容易解离。
术语“kd”(秒-1或1/s)表示特异性抗体-抗原相互作用的解离速率常数，或抗体、Ig、抗体结合片段或分子相互作用的解离速率常数。该值也被称作k-off值。
术语“ka”(M-1x秒-1或1/M)表示特异性抗体-抗原相互作用的结合速率常数，或抗体、Ig、抗体结合片段或分子相互作用的结合速率常数。
术语“KD”或“KD”(M)表示特异性抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，或抗体、Ig、抗体结合片段或分子相互作用的平衡解离常数。通过将ka除以kd获得平衡解离常数。
测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本公开内容的目的。例如，通过表面等离子体共振，例如，BIACORETM或溶液亲和力ELISA，可以测量抗体与抗原的结合亲和力。
在一些实施方案中，抗体与目标跨膜蛋白的结合在表达跨膜蛋白的细胞内(体外、离体或体内)赋予功能活性，或者抗体与目标跨膜蛋白的结合在有或没有目标跨膜蛋白的内源性配体存在下调节目标跨膜蛋白的正常功能活性。
在某些实施方案中，针对目标跨膜蛋白的抗体是跨膜蛋白功能的拮抗剂。拮抗剂抗体是指针对抗原活性位点(即，目标跨膜蛋白)的抗体，并且其能够抑制跨膜蛋白的活性或跨膜蛋白本身的天然配体的活性。例如，抗体与抗原的结合会降低或抑制目标跨膜蛋白的内源性功能。在一个非限制性实施例中，拮抗剂抗体可以结合目标跨膜蛋白，并通过干扰配体与跨膜蛋白的结合、受体活化等来调节跨膜蛋白功能。
在又另一个实施方案中，针对目标跨膜蛋白的抗体是跨膜蛋白激动剂。激动剂抗体是指能够在天然配体本身不存在的情况下活化目标跨膜蛋白(即，抗原)的抗体，其中激动剂抗体可以诱导目标跨膜蛋白的功能活性。例如，抗体与抗原的结合可以诱导或增加目标跨膜蛋白的内源性功能。在一个非限制性实施例中，激动剂抗体可以结合目标跨膜蛋白，并且可以通过活化蛋白或受体(例如通过改变蛋白的构象)来调节跨膜蛋白功能。
用于测量抗体结合和跨膜蛋白功能的测定是本领域普通技术人员众所周知的。例如，用于测量跨膜蛋白内化、构象变化、磷酸化、配体结合等的测定是本领域众所周知的。
本说明书通过以下实施例进一步举例说明，不应将其解释为以任何方式进行限制。所有引用的参考文献(包括贯穿本申请引用的文献参考、授权专利和公布的专利申请)的内容特此明确地通过引用整体并入。
实施例
实施例1.产生和收集抗体生产细胞。
如在表1中所示，为了对比，启动了几个免疫接种活动以在小鼠中产生免疫应答并产生生产针对目标抗原的抗体的细胞(抗体生产细胞)。然后根据本文描述的方法收集抗体生产细胞。
通常，通过注射免疫原来免疫小鼠，诸如、例如，编码目标跨膜蛋白或其部分的DNA、纯化的目标跨膜蛋白或其部分、含有目标跨膜蛋白或其部分的脂质-双层膜支架蛋白复合物、含有目标跨膜蛋白或能够表达编码目标跨膜蛋白的DNA的病毒样颗粒(VLP)、或其组合。在一些情况下，所述免疫原是人跨膜蛋白或其编码DNA。在其它情况下，将小鼠用目标嵌合跨膜蛋白、跨膜蛋白的截短形式、经修饰的目标跨膜蛋白或其编码DNA免疫。
用于本文描述的方法中的跨膜蛋白如下产生。通常，编码跨膜蛋白的核苷酸序列被修饰成包括附着至跨膜蛋白的羧基端的FLAG-标签和组氨酸-标签(10x-His标签)。将修饰的核苷酸序列在Sf9或Expi293细胞(Thermo Fisher Scientific)中表达。然后使用N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)去污剂溶解细胞，并离心以获得含有修饰的跨膜蛋白的去污剂可溶性级分。然后通过使用结合修饰的跨膜蛋白的抗-FLAG亲和珠子进行亲和纯化，将修饰的蛋白从去污剂可溶性级分中分离。然后洗涤亲和珠子和蛋白，并洗脱和收集结合的跨膜蛋白。通过SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白质印迹法验证纯化的跨膜蛋白的分离。
形成了脂质双层-膜支架蛋白复合物，其包含纯化的跨膜蛋白。将纯化的跨膜蛋白包含在由DDM和胆甾醇半琥珀酸酯tris盐(CHS)组成的去污剂混合物中。将这种跨膜蛋白和去污剂混合物与1:130的膜支架蛋白：脂质混合物组合，所述混合物含有修饰的MSP1E3D1膜支架蛋白，其包括用于生物素化的在羧基端的Bir-A标签，以及磷脂酰胆碱(1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸胆碱)脂质，其已经被溶解在胆酸钠去污剂缓冲液中以建立由跨膜蛋白、去污剂、膜支架蛋白、脂质和缓冲液组成的最终混合物，其含有1个纯化的跨膜蛋白：20个膜支架蛋白的比率。然后使用珠子从最终混合物中提取去污剂，以促进包含单一目标跨膜蛋白的盘状脂质-双层膜支架蛋白复合物的组装。然后使用10x-his标签亲和纯化和/或尺寸排阻色谱法将包含目标跨膜蛋白的盘状脂质-双层膜支架蛋白复合物与不包含目标跨膜蛋白的盘状脂质-双层膜支架蛋白复合物分离，以得到包含目标跨膜蛋白的盘状脂质-双层膜支架蛋白复合物用于进一步使用。
被免疫的小鼠可不同。在某些组群中，小鼠经过遗传工程改造，使得目标跨膜蛋白不从内源基因表达。在其它组群中，小鼠是野生型小鼠，其表达目标跨膜蛋白的小鼠同系物。在某些组群中，将小鼠按照美国专利号8,502,018、8,642,835、8,697,940、8,791,323、9,226,484和WO2019/113065中所述进行遗传工程改造；它们都通过引用整体并入本文。在某些组群中，免疫的遗传工程改造的小鼠是小鼠(RegeneronPharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY)如例如在美国专利号8,502,018和/或8,642,835中所述，它们中的每篇的整个内容通过引用并入本文。通常，用于免疫接种的小鼠包含编码人免疫球蛋白重链(IgH)和人免疫球蛋白轻链可变区的DNA，并且也可以缺乏编码目标跨膜蛋白的内源性小鼠基因。在特定组群中，免疫包含人源化的IgH基因座和/或人源化的Igκ基因座的/>小鼠。在某些组群中，给遗传工程改造的小鼠注射免疫原，所述小鼠包含编码人免疫球蛋白重链和免疫球蛋白λ轻链(Igλ)可变区的DNA，其缺乏编码目标跨膜蛋白的内源性小鼠基因。
使用被工程改造成表达目标跨膜蛋白或其部分的细胞，通过细胞结合测定来监测抗体免疫应答。一旦在免疫的小鼠中鉴定期望的免疫应答，就收获它们的脾。获得脾细胞并通过裂解除去红细胞。
在形成和使用杂交瘤的情况下，收获脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其生存力并形成杂交瘤细胞系。然后筛选和选择杂交瘤细胞系以鉴定产生针对目标跨膜蛋白的抗体的细胞系。
抗体生产细胞也与抗原阳性的B细胞一起分离。一旦小鼠被免疫，就收获它们的脾。获得脾细胞并通过裂解除去红细胞。然后用对B细胞表面标志物(诸如IgG)特异性的荧光染料标记的抗体对脾细胞进行染色，以鉴定B细胞。
通常，然后如下鉴定生产抗体的B细胞群体：使B细胞与已知的分选试剂(诸如纯化的跨膜蛋白或其部分、目标嵌合跨膜蛋白、目标截短的跨膜蛋白、在VLP或外核体中的目标跨膜蛋白、或包含目标跨膜蛋白或其部分的脂质双层-膜支架蛋白复合物)接触，以允许目标跨膜蛋白结合存在于B细胞的表面上的抗体。然后使用FACS收集结合的B细胞以提供表达针对目标跨膜蛋白的抗体的生产抗体的B细胞群体。在没有复合物的样品(对照)中，通过FACS使用肽或病毒样颗粒(VLP)进行分选，以从异质B细胞群体获得生产抗体的B细胞。在具有复合物的样品中，通过FACS用荧光地标记的复合物进行分选以获得生产抗体的B细胞。在这里，将B细胞与含有目标跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育。然后洗涤细胞以除去未结合的复合物。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞以除去多余的PE-抗生蛋白链菌素。通过FACS分析B细胞样品的PE荧光，以鉴定表达与目标跨膜蛋白结合的抗体的细胞群体。
实施例2.从抗体生产细胞群体产生抗体。
为了对比，分离抗体以通过传统的杂交瘤技术或细胞分选进行筛选，其中使用或不使用脂质双层-膜支架蛋白复合物。将来自生产抗体的B细胞群体的单个细胞分离到384-孔平板上的各个孔中。根据Wang和Stollar Journal of Immunological Methods(2000)244:217-225(其整个内容特此通过引用并入)描述的方法，进行来自这些分离的生产抗体的B细胞的抗体基因的RT-PCR。简而言之，通过反转录酶(RT)反应(SuperscriptTM III,Invitrogen)合成每个单个生产抗体的B细胞的cDNA。然后将每个所得RT产物分割并转移到两个384-孔平板上的两个相应孔中。首先使用对人IgG重链可变区前导序列特异性的5'简并引物和对小鼠重链恒定区特异性的3'引物通过PCR扩增一组所得RT产物，以形成扩增子。然后将扩增子使用对人IgG重链可变区序列的框架1特异性的5’简并引物集合和对人IgG重链可变区序列的框架4特异性的3’简并引物集合通过PCR再次扩增。将另一组所得RT产物首先使用对人κ或λ轻链可变区前导序列特异性的5’简并引物和对小鼠κ或λ轻链恒定区特异性的3’引物通过PCR进行扩增，以形成扩增子。然后将扩增子使用对人κ或λ轻链可变区序列的框架1特异性的5’简并引物集合和对人κ或λ轻链可变区序列的框架4特异性的3’简并引物集合通过PCR再次扩增。将重链和轻链PCR产物分别克隆进含有人IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区的抗体载体中。通过CHO细胞的瞬时转染产生重组人IgG1抗体。
对从抗体生产细胞获得的抗体的初步筛选进行了细胞结合试验。在BiacoreTMT200(GE Healthcare)上确定目标跨膜蛋白与每种抗体之间的结合的解离常数。在不同条件下进行的几项活动的结果表明，使用呈递目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物的细胞分选在鉴定与目标跨膜蛋白结合的抗体方面最为成功。参见表1。
表1
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实施例3.检测被脂质双层-膜支架蛋白复合物包含的目标跨膜蛋白与抗体之间的结合。
在该实施例中，将编码一种示例性人跨膜蛋白(GPCR1)的核苷酸序列修饰以将FLAG-标签和His-标签(10x-His标签)附着至GPCR1蛋白序列的羧基端，并且将修饰的核苷酸序列在细胞中表达并如在实施例1中所述纯化。然后将示例性的GPCR1目标跨膜蛋白掺入脂质双层-膜支架蛋白复合物中，并如实施例1中所述纯化包含GPCR1目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物。
通过octet测定证实已知的抗-GPCR1抗体的结合包含GPCR1目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物的能力，如在图1A和1B中所示。具体地，将38μg/mL的包含GPCR1跨膜蛋白的盘状脂质双层-膜支架蛋白复合物或10μg/mL的不含GPCR1的对照盘状脂质双层-膜支架蛋白复合物(空复合物)提供至含有固定化的抗-GPCR1抗体(阳性对照AB)或同种型对照抗体(阴性对照AB)的平板。
在阳性对照(抗-GPCR1)抗体和包含GPCR1跨膜蛋白的盘状脂质双层-膜支架蛋白复合物之间检测到结合(0.6nm)，并且在抗-GPCR1抗体和空复合物之间(-0.05nm)、在阴性对照抗体和包含GPCR1跨膜蛋白的盘状脂质双层-膜支架蛋白复合物之间(-0.06nm)或在阴性对照抗体和空复合物之间(-0.03nm)没有检测到结合。参见图1A。证实了由所述复合物呈递的目标跨膜蛋白结合针对目标跨膜蛋白的抗体，但是所述复合物本身不结合。
为了证实呈递目标跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物可以被检测到并与对照脂质双层-膜支架蛋白复合物生物素化的对照脂质双层-膜支架蛋白复合物(空复合物)分离，将呈递GPCR1跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(具有GPCR1的复合物)或对照脂质双层-膜支架蛋白复合物生物素化的对照脂质双层-膜支架蛋白复合物(空复合物)提供给具有与其连接的抗生蛋白链菌素的平板，以实现抗生蛋白链菌素与附着至复合物中的膜支架蛋白的Bir-A标签的结合。然后将平板与50μg/mL的抗-GPCR1抗体(阳性对照AB)或50μg/mL的同种型对照抗体(阴性对照AB)一起温育。参见图1B。
首先，图1B证实，通过抗生蛋白链菌素与附着至复合物中的每种膜支架蛋白的Bir-A标签的结合，可以检测和分离呈递GPCR1目标跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物和生物素化的对照脂质双层-膜支架蛋白复合物。这通过检测连接的抗生蛋白链菌素与生物素化的包含GPCR1跨膜蛋白的盘状脂质双层-膜支架蛋白复合物(3.0nm)和生物素化的空复合物(0.69nm)之间的结合来证实。
在阳性对照(抗-GPCR1)抗体和连接至抗生蛋白链菌素平板的包含GPCR1跨膜蛋白的生物素化的盘状脂质双层-膜支架蛋白复合物(0.69nm)之间检测到结合，但是在抗-GPCR1抗体和生物素化的空复合物之间(-0.04nm)、在阴性对照抗体和包含跨膜蛋白的生物素化的盘状脂质双层-膜支架蛋白复合物之间(-0.05nm)、或在阴性对照抗体和空生物素化复合物之间(-0.06nm)没有检测到结合。参见图1B，该图证实了呈递目标跨膜蛋白的、连接至抗生蛋白链菌素平板的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物特异性地结合抗-GPCR1抗体，但不结合对照抗体。
实施例4.获得表达抗体的抗体生产细胞，所述抗体特异性地结合示例性目标跨膜蛋白。
将编码第一、第二和第三示例性人跨膜蛋白的核苷酸序列修饰成将FLAG标签和His标签(10x-His标签)附着至跨膜蛋白的羧基端，并将修饰的核苷酸序列在细胞中表达并如在实施例1中所述纯化。使用Bir-A标记的膜支架蛋白产生包含第一、第二或第三示例性目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物，并如在实施例1和3中所述进行纯化。
从遗传修饰的小鼠收获脾细胞，所述小鼠包括人源化的IgH基因座和/或人源化的Igκ基因座，其缺乏编码目标跨膜蛋白的内源性小鼠基因。从未免疫的对照小鼠或已经通过注射以下DNA而免疫的遗传修饰的小鼠分离细胞：编码第一目标跨膜蛋白(GPCR1)、第二目标跨膜蛋白(GPCR2)或第三目标跨膜蛋白(GPCR3)的DNA。在这里，每只小鼠都被遗传修饰。将从每只小鼠收集的脾细胞用针对B细胞标志物的荧光标记(即，抗-IgG抗体)染色，并同时与0.2mg/mL至5.0mg/mL生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(其含有嵌入其中的跨膜蛋白)一起温育。然后洗涤细胞以除去未结合的复合物。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞以除去多余的PE-抗生蛋白链菌素。通过FACS检测来自对照小鼠和免疫的小鼠的细胞群体的PE荧光，以鉴定表达抗体的B细胞群体，所述抗体结合由生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的目标跨膜蛋白。参见图2A-2F。
在一百万个对照细胞中的仅两个B细胞非特异性地结合由生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的GPCR1跨膜蛋白(图2A，矩形)，表明含有目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物是一种高度特异性的分选试剂，被用于检测和分离产生针对跨膜蛋白抗原的抗体的细胞。相比之下，使用本方法检测到一百万个生产抗体的B细胞中的11个，它们结合至由生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的第一目标跨膜蛋白(图2B，矩形)。
如在图2C中所示，在一百万个从对照小鼠获得的脾细胞中的两个B细胞被检测为对呈递第二目标跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物的非特异性结合剂(矩形)。相反，使用本方法检测到一百万个B细胞中的七十八个表达对第二种示例性目标GPCR跨膜蛋白(GPCR2)特异性的抗体(矩形)，如在图2D中所示。
在又另一个实施例中，从收获自对照小鼠的一百万个脾细胞得到仅十一个B细胞，它们非特异性地结合呈递第三目标跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(矩形)。参见图2E。然而，检测到一百万个B细胞中的六十五个表达对第三种示例性目标GPCR跨膜蛋白(GPCR3)特异性的一级抗体，并得自从免疫的遗传修饰的小鼠收获的脾细胞。
实施例5.已知细胞分选策略与包括使用脂质双层-膜支架蛋白复合物的分选方法的对比。
为了对比本领域已知的用于获得抗体生产细胞的方法与本文公开的发明方法的效用，根据实施例1纯化编码示例性目标人跨膜蛋白的DNA。为了用编码目标跨膜蛋白的DNA对小鼠组群进行免疫接种，将纯化的人DNA注射进遗传工程改造的小鼠中，所述小鼠表达或不表达编码目标跨膜蛋白的内源性小鼠基因。对于用目标跨膜蛋白免疫的组群，将编码第一种示例性人跨膜蛋白的核苷酸序列在细胞中表达，如在实施例1中所述纯化，并通过注射直接施用给遗传工程改造的/>小鼠，所述小鼠表达或不表达编码目标跨膜蛋白的内源性小鼠基因。
在某些组群中，将小鼠用VLP免疫。产生了含有编码目标人跨膜蛋白的DNA的质粒，并在病毒细胞中表达。将脂质颗粒在病毒细胞中自组装，一旦通过聚乙二醇化(PEG)沉淀发生出芽(budding)，就从病毒细胞中分离和纯化，然后进行等密度离心和病毒细胞培养基的分级分离。使用已知技术将纯化的VLP注射到小鼠中进行免疫接种。
为了对比，通过如表2所示的注射来免疫遗传工程改造的小鼠，所述小鼠包含编码人免疫球蛋白重链(IgH)和人免疫球蛋白轻链可变区的DNA，带有(VI)或不带有(VI-KO)编码目标跨膜蛋白的内源性小鼠基因。
接着，使用表2中描述的分选策略分离了生产抗体的B细胞群体。具体而言，从免疫的遗传修饰的小鼠收集脾细胞。将收集的脾细胞用针对B细胞标志物的荧光标记(即，抗-IgG抗体)染色，并同时与0.2mg/mL至5.0mg/mL的生物素化的目标跨膜蛋白分选试剂(蛋白)或0.2mg/mL至5.0mg/mL的包含目标跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(含有TMB的复合物)或2.0mg/mL至20mg/mL的生物素标记的VLP分选试剂(VLP)一起温育，如表2所示。然后洗涤细胞以除去未结合的分选试剂。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与每种生物素(Bir-A)标记的分选试剂的结合。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞以除去多余的PE-抗生蛋白链菌素，并通过FACS分析B细胞样品的PE荧光以鉴定异质细胞群体中的B细胞，其表达结合由分选试剂呈递的目标跨膜蛋白的抗体。
然后将结合至目标跨膜蛋白的单个生产抗体的B细胞分离到384-孔平板上的各个孔，如在实施例2中所述。根据Wang和Stollar Journal of Immunological Methods(2000)244:217-225描述的方法对来自这些B细胞的抗体基因进行RT-PCR。简而言之，通过反转录酶(RT)反应(SuperscriptTM III,Invitrogen)合成每个单个B细胞的cDNA。然后将每个所得RT产物分割并转移到两个384-孔平板上的两个相应孔中。首先使用对人IgG重链可变区前导序列特异性的5'简并引物和对小鼠重链恒定区特异性的3'引物通过PCR扩增一组所得RT产物，以形成扩增子。然后将扩增子使用对人IgG重链可变区序列的框架1特异性的5’简并引物集合和对人IgG重链可变区序列的框架4特异性的3’简并引物集合通过PCR再次扩增。将另一组所得RT产物首先使用对人κ或λ轻链可变区前导序列特异性的5’简并引物和对小鼠κ或λ轻链恒定区特异性的3’引物通过PCR进行扩增，以形成扩增子。然后将扩增子使用对人κ或λ轻链可变区序列的框架1特异性的5’简并引物集合和对人κ或λ轻链可变区序列的框架4特异性的3’简并引物集合通过PCR再次扩增。将重链和轻链PCR产物分别克隆进含有人IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区的抗体载体中。通过CHO K1细胞的瞬时转染产生重组人IgG1抗体，并分析它们的结合目标跨膜蛋白的能力。
表2
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表2证实，独立于使用的免疫原，与其它分选试剂相比，利用脂质双层-膜支架蛋白复合物来呈递跨膜蛋白的获得抗体生产细胞的方法检测到更多的表达抗体的抗体生产细胞，所述抗体特异性地结合目标跨膜蛋白。
与得自遗传修饰的小鼠(其不表达编码目标跨膜蛋白(VI-KO)的内源性小鼠基因并用呈递跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物分选)的那些相比，用纯化的跨膜蛋白分选试剂(其得自表达编码目标跨膜蛋白(VI)的内源性小鼠基因的遗传修饰的小鼠)分选的细胞产生了更多的结合目标跨膜蛋白的抗体。但是，当分析时，从VI小鼠产生的抗体不是功能性结合剂。证明使用脂质双层-膜支架蛋白复合物来呈递跨膜蛋白的获得抗体生产细胞的方法会获得与跨膜蛋白的功能相关表位结合的抗体。
实施例6.产生和分离结合第二种示例性目标GPCR跨膜蛋白的抗体。
如在实施例1中所述将编码第二种示例性目标GPCR跨膜蛋白(GPCR2)的核苷酸序列修饰成包括附着至GPCR2蛋白的羧基端的FLAG标签和10x-His标签。另外，将下述稳定化突变引入跨膜蛋白：氨基酸置换：A2a-T4L-δ，如在Veli-Pekka Jaakola等人，Science.2008，11月21日；322(5905)第1211-1217页中所述，其整个内容明确地通过引用并入本文。将经修饰的GPCR2核苷酸序列克隆进表达载体中并在Sf9细胞中表达。然后将细胞溶解，获得经修饰的GPCR2跨膜蛋白并如实施例1中纯化。
接着，如实施例1和本文中所述生成含有经修饰的人GPCR2跨膜蛋白的盘状脂质-双层膜支架蛋白复合物。
如在表3中所示，通过注射编码包括稳定化突变的经修饰的人GPCR2蛋白的外源DNA(DNA免疫原)或注射包括稳定化突变的经修饰的人GPCR2蛋白(蛋白免疫原)，免疫遗传修饰的GPCR2敲除的小鼠，即，小鼠，该小鼠包括人源化的IgH基因座和人源化的Igκ基因座，其也缺少编码目标跨膜蛋白的内源性小鼠基因。
从每只小鼠收集脾细胞，并用针对B细胞标志物的荧光标记(即，抗-IgG抗体)染色，并同时与0.2mg/mL至5.0mg/mL生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(其含有嵌入其中的跨膜蛋白)一起温育。然后洗涤细胞以除去未结合的复合物。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞以除去多余的PE-抗生蛋白链菌素。通过FACS检测来自对照小鼠和免疫的小鼠的细胞群体的PE荧光，以鉴定表达抗体的B细胞群体，所述抗体结合由生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的第二种示例性目标GPCR跨膜蛋白。
然后将与目标跨膜蛋白结合的单个生产抗体的B细胞分离到384-孔平板上的各个孔中，从每个细胞分离编码抗体的DNA，如在实施例2中所述产生抗体用于进一步分析。
图3证实，本发明的用于获得抗体生产细胞的方法会检测表达抗体的抗体生产细胞，所述抗体特异性地结合目标跨膜蛋白，不论使用的免疫原的类型如何。具体而言，使用呈递目标跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物，根据公开的方法从遗传工程改造的小鼠得到抗体生产细胞，所述小鼠用编码跨膜蛋白的DNA(DNA)或纯化的目标跨膜蛋白(蛋白)免疫。如在实施例2中所述产生用于筛选的抗体。使用标准的转染技术在293细胞中表达目标全长跨膜蛋白抗原(过表达的TMB)，并将表达抗原的293细胞与未用编码示例性目标跨膜蛋白的DNA转染的对照293细胞(亲本细胞)进行对比。然后将细胞与抗体一起温育以允许在细胞表面上的抗原与特异性地结合示例性目标跨膜蛋白的抗体之间的结合。根据生产商进行MSD(Meso scale diagnostics)免疫测定，以鉴定从得自5只不同免疫小鼠的抗体生产细胞产生的细胞结合抗体。用纯化的人GPCR2跨膜蛋白免疫小鼠1、3、4和5，而用编码人GPCR2跨膜蛋白的DNA免疫小鼠2。在虚线以上的抗体能够结合目标跨膜蛋白。相反，在虚线以下的抗体是弱结合剂或不能结合目标跨膜蛋白，如通过与阳性(正方形)和阴性(三角形)对照抗体的对比所指示的。
结果表明，使用本发明的方法获得的抗体生产细胞产生了足够量的能够结合目标跨膜蛋白的抗体(在虚线以上)，不论用编码目标跨膜蛋白的DNA还是目标跨膜蛋白免疫所述小鼠。
如在表3中所示，使用呈递跨膜蛋白的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(含有TMB的复合物)从每只免疫的小鼠获得B细胞，从收集的B细胞子集产生抗体，并通过免疫测定法试验了所述抗体与目标抗原结合的能力。使用本发明的方法大量获得了表达抗体的抗体生产细胞，所述抗体特异性地结合目标跨膜蛋白(抗原)，不论用编码跨膜蛋白的DNA还是纯化的跨膜蛋白免疫所述小鼠。
表3
实施例7.获得表达抗体的抗体生产细胞，所述抗体结合目标跨膜蛋白的特定结构域。
本发明的方法还用于产生抗体，其特异性地结合位于目标跨膜蛋白的特定结构域上的表位。
在第一个实例中，将编码全长人跨膜蛋白(全长TMB)的核苷酸序列修饰成将FLAG-标签和His-标签(10x-His标签)附着至跨膜蛋白的羧基端，如在实施例1中所述纯化和分离。此外，将编码缺失N-端的细胞外部分的截短人跨膜蛋白的核苷酸序列(截短的TMB)进一步修饰成将FLAG-标签和His-标签(10x-His标签)附着至跨膜蛋白的羧基端，并将修饰的核苷酸序列在细胞中表达和如在实施例1中所述纯化。使用Bir-A标记的膜支架蛋白产生包含截短的TMB的脂质双层-膜支架蛋白复合物，并如在实施例1和3中所述纯化。在这里，截短的TMB蛋白包括野生型人跨膜蛋白的细胞外环结构域、跨膜结构域和细胞内C-端结构域中的每一个，但不包括细胞外N-端结构域。因此，包括截短的TMB的脂质双层-膜支架蛋白复合物仅将野生型人跨膜蛋白的细胞外环结构域呈递给细胞。
用编码全长TMB的DNA免疫遗传工程改造的小鼠，所述小鼠包括编码人免疫球蛋白重链(IgH)和人免疫球蛋白轻链可变区的DNA。监测免疫应答，并从免疫的小鼠收获脾细胞。将从每只小鼠收集的脾细胞用针对B细胞标志物的荧光标记(即，抗-IgG抗体)染色，并同时与0.2mg/mL至5.0mg/mL生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(其呈递嵌入其中的截短的TMB)一起温育，以允许截短的TMB的细胞外结构域上的表位与B细胞表面上的抗体之间的结合。然后洗涤细胞以除去未结合的复合物。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞以除去多余的PE-抗生蛋白链菌素。通过FACS检测从小鼠收集的细胞群体的PE荧光以鉴定B细胞群体，其表达对目标跨膜蛋白的细胞外环结构域特异性的抗体。
然后将与目标跨膜蛋白结合的单个生产抗体的B细胞分离到384-孔平板上的各个孔中，从每个细胞分离编码抗体的DNA，并如在实施例2中所述产生抗体用于进一步分析。
如在图4中所示，使用本发明的方法获得了抗体，其结合位于示例性目标跨膜蛋白的细胞外环结构域中的表位(框)。
在另一个实例中，将编码全长人跨膜蛋白(全长TMB)的核苷酸序列修饰成将FLAG标签和His标签(10x-His标签)附着至跨膜蛋白的羧基端，如在实施例1中所述纯化和分离。此外，产生了编码人跨膜蛋白的一部分(TMB-片段)的核苷酸序列，并将TMB-片段核苷酸序列在细胞中表达和如在实施例1中所述纯化。在此处，TMB-片段多肽TMB对应于目标全长跨膜蛋白的N-端部分。
使用Bir-A标记的膜支架蛋白产生包括全长TMB的脂质双层-膜支架蛋白复合物，并如在实施例1和3中所述纯化。
用编码全长TMB的DNA或纯化的全长TMB蛋白免疫遗传修饰的小鼠，所述小鼠包括编码人免疫球蛋白重链(IgH)和人免疫球蛋白轻链可变区的DNA。监测免疫应答，并从免疫的小鼠收获脾细胞。将从每只小鼠收集的脾细胞与TMB-片段一起温育以允许TMB-片段与细胞表面上的抗体之间的结合，所述抗体对位于全长TMB的N-端上的表位具有特异性。该步骤有效地阻断所有抗体生产细胞(其表达对全长TMB的N-端结构域中的表位具有特异性的抗体)与由生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(其含有嵌入的全长TMB)呈递的全长TMB结合。然后将细胞用针对B细胞标志物的荧光标记(即，抗-IgG抗体)染色以鉴定脾细胞群体中的生产抗体的B-细胞，并且也与0.2mg/mL至5.0mg/mL的包括全长TMB的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，以允许在全长TMB的细胞外环结构域上的表位与在生产抗体的B细胞的表面上的抗体之间的结合。然后洗涤细胞以除去未结合的复合物。将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞以从分选除去多余的PE-抗生蛋白链菌素以及结合至TMB-片段的细胞。通过FACS检测从小鼠收集的细胞群体的PE荧光以鉴定生产抗体的B细胞群体，其表达对目标跨膜蛋白的细胞外环结构域特异性的抗体。
然后将结合目标跨膜蛋白的单个生产抗体的B细胞分离至384-孔平板上的各个孔中，从每个细胞分离编码抗体的DNA，并如在实施例2中所述产生抗体用于进一步分析。
在另一个实例中，将由目标人跨膜蛋白的一部分和目标跨膜蛋白的小鼠同系物的一部分组成的目标嵌合跨膜蛋白用于产生抗体，其特异性地结合位于目标跨膜蛋白的特定结构域上的表位。
在这里，如下创建嵌合跨膜蛋白：产生编码目标人跨膜蛋白的一部分的核苷酸序列，所述部分可操作地连接至目标跨膜蛋白的小鼠同系物的一部分，并进一步将所述核苷酸序列修饰成将FLAG标签和His标签(10x-His标签)附着至嵌合跨膜蛋白的羧基端。然后如在实施例1中所述纯化和分离核苷酸序列。另外，将编码嵌合跨膜蛋白的核苷酸序列在细胞中表达，并如在实施例1中所述纯化以产生标记的目标嵌合跨膜蛋白(嵌合-TMB)。在该情况下，目标嵌合跨膜蛋白具有对应于跨膜蛋白的小鼠同系物的N-端和细胞外环结构域、跨膜结构域以及对应于目标人跨膜蛋白的细胞内C-端结构域。
另外，将编码野生型人跨膜蛋白(人-TMB)的核苷酸序列修饰成将FLAG标签和His标签(10x-His标签)附着至跨膜蛋白的羧基端，纯化并分离；然后将编码人跨膜蛋白的核苷酸序列在细胞中表达并如在实施例1中所述纯化。
使用Bir-A标记的膜支架蛋白产生包括人-TMB或嵌合-TMB的脂质双层-膜支架蛋白复合物，并如在实施例1和3中所述纯化。
用编码人-TMB或纯化的人-TMB蛋白的DNA免疫遗传修饰的小鼠，所述小鼠包括编码人免疫球蛋白重链(IgH)和人免疫球蛋白轻链可变区的DNA。监测免疫应答，并从免疫的小鼠收获脾细胞。将从每只小鼠收集的脾细胞用针对B细胞标志物的荧光标记(即，抗-IgG抗体)染色，并同时与包括嵌合-TMB的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育以允许由所述复合物呈递的嵌合-TMB的人部分上的表位与B细胞表面上的抗体之间的结合。然后洗涤细胞以除去未结合的复合物。
将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞以从分选除去多余的PE-抗生蛋白链菌素以及结合至TMB-片段的细胞。通过FACS检测从小鼠收集的细胞群体的PE荧光以鉴定生产抗体的B细胞群体，其表达对目标跨膜蛋白的细胞外环结构域特异性的抗体。
该免疫接种和分选策略有效地除去所有生产抗体的B细胞，其表达对位于嵌合-TMB的小鼠部分上的人-TMB的表位特异性的抗体。
在另一个免疫接种和分选策略中，用编码嵌合-TMB或纯化的嵌合-TMB蛋白的DNA免疫遗传修饰的小鼠，所述小鼠包括编码人免疫球蛋白重链(IgH)和人免疫球蛋白轻链可变区的DNA。监测免疫应答，并从免疫的小鼠收获脾细胞。将从每只小鼠收集的脾细胞用针对B细胞标志物的荧光标记(即，抗-IgG抗体)染色，并同时与包括人-TMB的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，以允许位于由所述复合物呈递的人-TMB的细胞外部分上的表位与B细胞表面上的抗体之间的结合。然后洗涤细胞以除去未结合的复合物。
将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞以从分选除去多余的PE-抗生蛋白链菌素。通过FACS检测从小鼠收集的细胞群体的PE荧光以鉴定生产抗体的B细胞群体，其表达对目标人跨膜蛋白的细胞外环结构域特异性的抗体。
该特定免疫接种和分选策略也有效地除去所有生产抗体的B细胞，其表达对位于嵌合-TMB的小鼠部分上的表位特异性的抗体。
然后可以将结合由所述复合物呈递的目标跨膜蛋白的单个生产抗体的B细胞分离至384-孔平板上的各个孔中，并从每个细胞分离编码抗体的DNA，用于按照实施例2产生和分析抗体。
实施例8：获得抗体生产细胞，其表达对目标跨膜蛋白特异性的交叉反应性抗体。
本发明的方法也用于产生这样的抗体：其识别示例性目标跨膜蛋白的小鼠和人形式。
将编码两种不同的示例性人跨膜蛋白人TMB1和人TMB2的核酸修饰成将FLAG标签和His标签(10x-His标签)附着至每个人跨膜蛋白氨基酸序列的羧基端，如在实施例1中所述纯化。另外，将编码两种人跨膜蛋白小鼠TMB1和小鼠TMB2中的每一种的小鼠同系物的核酸修饰成将FLAG标签和His标签(10x-His标签)附着至每个小鼠跨膜蛋白氨基酸序列的羧基端，并如在实施例1中所述纯化修饰的核苷酸序列。接着，将分别编码人TMB1、人TMB2、小鼠TMB1和小鼠TMB2的核酸各自在细胞中表达，并如在实施例1中所述分离和纯化每种蛋白。使用Bir-A标记的膜支架蛋白产生脂质双层-膜支架蛋白复合物，其包括人TMB1蛋白、人TMB2蛋白、小鼠TMB1蛋白和小鼠TMB2蛋白之一，并如在实施例1中所述纯化。
通过注射如在表4中所示的编码小鼠或人跨膜蛋白的外源DNA、或编码人TMB1蛋白和小鼠TMB2蛋白的外源DNA的组合，免疫遗传工程改造的小鼠，所述小鼠包括编码人免疫球蛋白重链(IgH)和人免疫球蛋白轻链可变区的DNA，其不表达目标跨膜蛋白的内源性小鼠同系物(即，小鼠TMB1或小鼠TMB2)。
监测免疫应答，并从免疫的小鼠收获脾细胞。将从每只小鼠收集的脾细胞用针对B细胞标志物的荧光标记(即，抗-IgG抗体)染色，并同时与包括特定人TMB蛋白(含有人TMB的复合物)或特定小鼠TMB蛋白(含有小鼠TMB的复合物)的生物素化的脂质-双层膜支架蛋白复合物一起温育，以允许由生物素化的脂质-双层膜支架蛋白复合物呈递的目标跨膜蛋白与B细胞表面上的抗体之间的结合。然后洗涤细胞以除去未结合的复合物，并与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞以从分选除去多余的PE-抗生蛋白链菌素。通过FACS检测从小鼠收集的细胞群体的PE荧光以鉴定生产抗体的B细胞群体，其表达对目标跨膜蛋白特异性的抗体。
然后将与目标跨膜蛋白结合的单个生产抗体的B细胞分离到384-孔平板上的各个孔中，从每个细胞分离编码抗体的DNA，并如在实施例2中所述产生抗体用于进一步分析。
如在表4中所示，单独用编码小鼠TMB1的DNA免疫接种遗传修饰的小鼠并用呈递人TMB1蛋白的脂质-双层膜支架蛋白复合物分选生产抗体的B细胞，会鉴定出生产抗体的B细胞，其表达能够结合小鼠TMB1和人TMB1蛋白的交叉反应性抗体。
另外，一起用编码小鼠TMB1蛋白的DNA和编码人TMB1蛋白的DNA免疫接种遗传修饰的小鼠，并用呈递人TMB1蛋白的脂质-双层膜支架蛋白复合物或呈递小鼠TMB1蛋白的脂质-双层膜支架蛋白复合物分选生产抗体的B细胞，会鉴定出生产抗体的B细胞，其表达能够结合小鼠TMB1和人TMB1蛋白的交叉反应性抗体。
表4也表明，单独用编码小鼠TMB2的DNA免疫接种遗传修饰的小鼠并用呈递人TMB2蛋白的脂质-双层膜支架蛋白复合物分选生产抗体的B细胞或用呈递小鼠TMB2蛋白的脂质-双层膜支架蛋白复合物分选生产抗体的B细胞，会鉴定出生产抗体的B细胞，其表达能够结合小鼠TMB2和人TMB2蛋白的交叉反应性抗体。单独用编码人TMB2的DNA免疫接种遗传修饰的小鼠并用呈递人TMB2蛋白的脂质-双层膜支架蛋白复合物分选生产抗体的B细胞或用呈递小鼠TMB2蛋白的脂质-双层膜支架蛋白复合物分选生产抗体的B细胞，也会鉴定出生产抗体的B细胞，其表达能够结合小鼠TMB1和人TMB1蛋白的交叉反应性抗体。
表4
实施例9：从小鼠获得表达对目标跨膜蛋白特异性的抗体的抗体生产细胞，所述小鼠用含有跨膜蛋白的脂质-双层膜支架蛋白复合物免疫过。
为了确定包括目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物是否可以用作免疫原以得到表达对目标跨膜蛋白特异性的抗体的抗体生产细胞，产生编码示例性人跨膜蛋白人TMB2的核苷酸序列，所述人TMB2包含附着至其羧基端的FLAG标签和His标签(10x-His标签)，并如在实施例8中所述纯化。将编码经修饰的人TMB2蛋白的核苷酸序列在细胞中表达，并将经修饰的TMB2蛋白分离并如在实施例8中所述纯化。使用Bir-A标记的膜支架蛋白产生包括人TMB2蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物，并如在实施例8中所述纯化。
另外，产生编码His标签的核苷酸序列和编码附着至经修饰的人TMB2蛋白的FLAG标签的核苷酸序列，分别在细胞中表达，并如在实施例1中所述纯化，以分别提供FLAG-肽和HIS-肽。接着，产生编码被包括在脂质双层-膜支架蛋白复合物中的膜支架蛋白的核苷酸序列，分别在细胞中表达，并如在实施例1中所述纯化以提供MSP-肽。
如在表5中所证实的，通过注射0.54mg/mL的包括人TMB2蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物(含有人TMB2的复合物)，免疫遗传工程改造的小鼠，其包括编码人免疫球蛋白重链(IgH)和人免疫球蛋白轻链可变区的DNA，其不表达目标跨膜蛋白的内源性小鼠同系物(即，小鼠TMB2)。监测免疫应答，并从免疫的小鼠收获脾细胞。将从每只免疫的小鼠收集的脾细胞用针对B细胞标志物的荧光标记(即，抗-IgG抗体)染色，并同时与MSP-肽、FLAG-肽和HIS-肽一起温育以允许MSP-肽、FLAG-肽和HIS-肽与在B细胞表面上的抗体之间的结合，所述抗体分别对位于MSP-肽、FLAG-肽和HIS-肽上的表位具有特异性。该步骤有效地阻断所有生产抗体的B细胞，其表达对由所述复合物呈递的人TMB2蛋白以外的复合物组分具有特异性的抗体。
随后，将剩余的B细胞与包括人TMB2蛋白(含有人TMB2的复合物)或小鼠TMB2蛋白(含有小鼠TMB2的复合物)的生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物一起温育，以允许由生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的目标跨膜蛋白与B细胞表面上的抗体之间的结合。然后洗涤细胞以除去未结合的复合物，并与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞以从分选除去多余的PE-抗生蛋白链菌素。通过FACS检测从小鼠收集的细胞群体的PE荧光以鉴定生产抗体的B细胞群体，其表达对目标跨膜蛋白特异性的抗体。
然后将与目标跨膜蛋白结合的单个生产抗体的B细胞分离到384-孔平板上的各个孔中，从每个细胞分离编码抗体的DNA，并如在实施例2中所述产生抗体用于进一步分析。
如在表5中所示，用包括人TMB2蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物免疫接种遗传修饰的小鼠并用呈递人TMB2蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物分选生产抗体的B细胞，会鉴定出生产抗体的B细胞，其表达能够结合小鼠TMB2和人TMB2蛋白同系物的交叉反应性抗体以及对人TMB2蛋白特异性的抗体。另外，用包括人TMB2蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物免疫接种遗传修饰的小鼠并用呈递小鼠TMB2蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物分选生产抗体的B细胞，会鉴定出生产抗体的B细胞，其仅表达能够结合小鼠TMB2蛋白和人TMB2蛋白的交叉反应性抗体。
表5
实施例10.产生表达结合示例性目标SLC跨膜蛋白的抗体的抗体生产细胞和从所述细胞获得SLC蛋白特异性抗体。
如在实施例1中所述将编码第一种示例性目标SLC跨膜蛋白的核苷酸序列修饰成包括附着至示例性SLC蛋白的N末端的FLAG标签和10x-His标签。将编码经修饰的SLC跨膜蛋白的核苷酸序列克隆进表达载体中并在Sf9细胞中表达。然后溶解细胞，并获得经修饰的SLC跨膜蛋白，并如在实施例1中所述纯化。
接着，如在实施例1和本文中所述产生含有经修饰的人SLC跨膜蛋白的盘状脂质-双层膜支架蛋白复合物。
如在实施例1中所述，通过注射编码经修饰的人SLC蛋白的外源DNA和注射经修饰的人SLC蛋白，免疫遗传修饰的SLC敲除的小鼠，即，小鼠，其包括人源化的IgH基因座和人源化的Igκ基因座，其也缺乏编码目标SLC跨膜蛋白的内源性小鼠基因。
从每只免疫的小鼠收集脾细胞，并用针对B细胞标志物的荧光标记(即，抗-IgG抗体)染色，并同时与0.2mg/mL至5.0mg/mL生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物(其含有嵌入其中的SLC跨膜蛋白)一起温育。然后洗涤细胞以除去未结合的复合物。随后，将细胞与PE-抗生蛋白链菌素一起温育以实现抗生蛋白链菌素与脂质-双层-膜支架蛋白复合物中的每种生物素(Bir-A)标记的膜支架蛋白的结合。然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞以除去多余的PE-抗生蛋白链菌素。通过FACS检测来自对照小鼠和免疫的小鼠的细胞群体的PE荧光以鉴定表达抗体的B细胞群体，所述抗体结合由生物素化的脂质双层-膜支架蛋白复合物呈递的示例性目标SLC跨膜蛋白。
然后将结合至目标SLC跨膜蛋白的单个生产抗体的B细胞分离至384-孔平板上的各个孔中，从每个细胞分离编码抗体的DNA，并如在实施例2中所述产生抗体用于进一步分析。
尽管本文已经描述和描绘了本公开内容的几个方面，但是本领域技术人员可以影响替代方面以实现相同的目的。因此，所附权利要求意图涵盖落入本公开内容的真实精神和范围内的所有这样的替代方面。
序列表
<110> 再生元制药公司
<120> 用于获得结合跨膜蛋白的抗体的方法和生产所述抗体的细胞
<130> 36526 (10465WO01)
<150> 63/130,044
<151> 2020-12-23
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Met Gly His His His His His His Ile Glu Gly Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys
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Leu Arg Glu Gln Leu Gly
20
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<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly
1 5 10 15
Leu Arg Gln Glu Met Ser
20
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln
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<220>
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Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu
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Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu
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20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Met Gly His His His His His His Ile Glu Gly Arg Leu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln
20 25 30
Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr
35 40 45
Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala
50 55 60
Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu
65 70 75 80
Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln
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Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro
100 105 110
Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu
115 120 125
Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala
130 135 140
Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu
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Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Met Gly His His His His His His Ile Glu Gly Arg Leu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln
20 25 30
Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr
35 40 45
Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala
50 55 60
Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu
65 70 75 80
Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln
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Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro
100 105 110
Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu
115 120 125
Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala
130 135 140
Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu
145 150 155 160
Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala
165 170 175
Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu
180 185 190
Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys
195 200 205
Leu Asn Thr Gln Gly Thr Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val
210 215 220
Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln
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Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu
245 250 255
Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu
260 265 270
Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln
275 280 285
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305 310 315 320
Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro
325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln
405 410
<210> 14
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Met Gly His His His His His His Ile Glu Gly Arg Leu Lys Leu Leu
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Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln
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Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr
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Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala
50 55 60
Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu
65 70 75 80
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Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro
100 105 110
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Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly
165 170 175
Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser
180 185 190
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225 230
<210> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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Met Gly His His His His His His Ile Glu Gly Arg Leu Lys Leu Leu
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Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln
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Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr
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Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala
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165 170 175
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<223> 合成肽
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<223> 合成肽
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<220>
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Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr
145 150 155 160
Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu
165 170 175
Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu
180 185 190
Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln
195 200
<210> 21
<211> 403
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
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1 5 10 15
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln
20 25 30
Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr
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Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln
85 90 95
Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro
100 105 110
Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu
115 120 125
Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala
130 135 140
Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu
145 150 155 160
Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala
165 170 175
Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu
180 185 190
Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys
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Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu
225 230 235 240
Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys
245 250 255
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Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu
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Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu
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Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg
305 310 315 320
Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala
325 330 335
Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr
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His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys
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Asn Thr Gln
<210> 22
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Met Gly His His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr
1 5 10 15
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln
20 25 30
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Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala
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290 295 300
Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg
305 310 315 320
Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala
325 330 335
Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu
340 345 350
Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu
355 360 365
Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu
370 375 380
Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln
385 390
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Arg Glu Gln Leu Gly
1 5
<210> 24
<211> 397
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Met Gly His His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr
1 5 10 15
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln
20 25 30
Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr
35 40 45
Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala
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Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu
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85 90 95
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165 170 175
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Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu
370 375 380
Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln
385 390 395

Claims (54)

1.一种用于获得抗体生产细胞的方法，所述抗体生产细胞表达结合目标跨膜蛋白的抗体，所述方法包含：
(a)使抗体生产细胞群体与包含所述目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物接触，以允许所述目标跨膜蛋白结合在细胞表面上的抗体；以及
(b)收集结合至所述目标跨膜蛋白的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合物包含多个脂质，所述脂质形成被至少一个膜支架蛋白包围的盘状磷脂双层。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体生产细胞群体得自脾、淋巴结、外周血、骨髓或其组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体生产细胞群体包含外周血细胞、B细胞、浆细胞、浆细胞性骨髓瘤或其组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗体生产细胞群体包含B-细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体生产细胞得自预先针对所述目标跨膜蛋白免疫的哺乳动物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述哺乳动物是已经用编码所述目标跨膜蛋白的至少一部分的核酸或用所述目标跨膜蛋白的至少一部分免疫的非人哺乳动物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述非人哺乳动物被遗传工程改造过。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述遗传工程改造的非人哺乳动物不从内源基因表达所述目标跨膜蛋白。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述遗传工程改造的非人哺乳动物包含编码人重链可变区的核酸序列和编码人轻链可变区的核酸序列。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述遗传工程改造的非人哺乳动物是小鼠。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述目标跨膜蛋白是人跨膜蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述遗传工程改造的非人哺乳动物已经用所述跨膜蛋白的非人同系物或编码所述跨膜蛋白的非人同系物的核酸免疫。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在步骤(b)中收集的细胞表达抗体，所述抗体结合所述人跨膜蛋白和所述跨膜蛋白的非人同系物。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述遗传工程改造的非人哺乳动物已经用目标嵌合跨膜蛋白或编码所述目标嵌合跨膜蛋白的核酸免疫，并且其中所述嵌合跨膜蛋白包含所述目标跨膜蛋白的非人同系物的一部分和所述人跨膜蛋白的一部分。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在步骤(b)中收集的细胞表达抗体，所述抗体结合位于所述人跨膜蛋白上的表位。
17.根据权利要求8所述的方法，其中所述目标跨膜蛋白是嵌合跨膜蛋白，其中嵌合蛋白包含可操作地连接至非人跨膜蛋白的一部分的人跨膜蛋白的一部分。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述遗传工程改造的非人哺乳动物已经用所述人跨膜蛋白或编码所述人跨膜蛋白的核酸免疫。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在步骤(b)中收集的细胞表达抗体，所述抗体结合所述嵌合跨膜蛋白的人部分。
20.根据权利要求8所述的方法，其中所述遗传工程改造的非人哺乳动物已经用所述跨膜蛋白的截短形式免疫。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述遗传工程改造的非人哺乳动物已经用所述跨膜蛋白的全长形式或编码它的核酸免疫。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述跨膜蛋白的截短形式不含有所述跨膜蛋白的全长形式的N-端结构域或C-端结构域。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述跨膜蛋白的截短形式包含细胞外环，并且其中在步骤(b)中收集的细胞表达抗体，所述抗体结合位于所述跨膜蛋白的截短形式的细胞外环上的表位。
24.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)进一步包含使所述抗体生产细胞群体与至少一种阻滞剂接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种阻滞剂是结合所述目标跨膜蛋白的一部分的多肽。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述多肽结合所述目标跨膜蛋白的N-端结构域或所述目标跨膜蛋白的C-端结构域。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述跨膜蛋白包含细胞外环，并且其中在步骤(b)中收集的细胞表达抗体，所述抗体结合位于所述目标跨膜蛋白的细胞外环上的表位。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗体生产细胞群体得自已经用所述包含目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物免疫的哺乳动物，其中所述复合物进一步包含第一可检测标记，并且其中所述目标跨膜蛋白包含第二可检测标记。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述至少一种阻滞剂包含(i)结合所述第一可检测标记的第一阻滞剂和(ii)结合所述第二可检测标记的第二阻滞剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一种阻滞剂包含结合所述膜支架蛋白的第三阻滞剂。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标跨膜蛋白选自G-蛋白偶联受体(GPCR)蛋白、四次穿膜蛋白和离子通道蛋白。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述目标跨膜蛋白是GPCR蛋白。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述目标跨膜蛋白是离子通道蛋白。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述目标跨膜蛋白是四次穿膜蛋白。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合物进一步包含缀合至可检测标记的至少一个膜支架蛋白。
36.根据权利要求35所述的方法，其中收集结合至所述目标跨膜蛋白的细胞包含：
检测所述细胞与所述目标跨膜蛋白的结合；
将结合至所述目标跨膜蛋白的细胞与没有结合至所述目标跨膜蛋白的细胞分离；以及
收集结合的细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述可检测标记是生物素。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述检测包含：
将步骤(b)的细胞与抗生蛋白链菌素-藻红蛋白(PE-抗生蛋白链菌素)一起温育；以及
使用荧光激活细胞分选术(FACS)鉴定结合的细胞。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述可检测标记是荧光分子。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述检测包含使用FACS鉴定结合的细胞。
41.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包含(i)从在步骤(b)中收集的细胞中分离：包含编码由所述细胞表达的抗体的重链可变区的核苷酸序列的核酸；和包含编码由所述细胞表达的抗体的轻链可变区的核苷酸序列的核酸。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法在步骤(i)以后进一步包含：
(ii)转染宿主细胞以引入在步骤(i)中分离的包含编码重链可变区的核苷酸序列的核酸和包含编码轻链可变区的核苷酸序列的核酸；以及
(iii)在表达包含所述重链可变区和所述轻链可变区的抗体的条件下，培养来自步骤(ii)的宿主细胞。
43.根据权利要求42所述的方法，其中将在步骤(ii)中的宿主细胞用第一表达载体和第二表达载体转染，所述第一表达载体包含编码重链可变区的核苷酸序列，所述第二表达载体包含编码轻链可变区的核苷酸序列。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
46.通过根据权利要求41-45中任一项所述的方法获得的抗体。
47.根据权利要求46所述的抗体，其中所述抗体结合选自G-蛋白偶联受体蛋白(GPCR)、四次穿膜蛋白和离子通道蛋白的目标跨膜蛋白。
48.根据权利要求47所述的抗体，其中所述目标跨膜蛋白是GPCR蛋白。
49.根据权利要求47所述的抗体，其中所述目标跨膜蛋白是离子通道蛋白。
50.根据权利要求47所述的抗体，其中所述目标跨膜蛋白是四次穿膜蛋白。
51.根据权利要求46所述的抗体，其中所述抗体调节细胞中目标跨膜蛋白的功能。
52.通过根据权利要求1-45中任一项所述的方法制备的哺乳动物宿主细胞，其中所述宿主细胞表达结合所述目标跨膜蛋白的抗体或其片段。
53.根据权利要求52所述的哺乳动物宿主细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
54.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中如下形成所述包含目标跨膜蛋白的脂质双层-膜支架蛋白复合物：混合在一种或多种去污剂的存在下提供的脂质、膜支架蛋白和所述目标跨膜蛋白，以及除去所述一种或多种去污剂以诱导包含所述目标跨膜蛋白的复合物的形成。
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