JP2021508478A - FcγR非依存性アゴニスト活性がある腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(TNFRSF)受容体活性化抗体融合タンパク質(FcγR非依存性アゴニスト活性があるTNFRSF受容体活性化抗体融合タンパク質;TRAAFFIAA) - Google Patents
FcγR非依存性アゴニスト活性がある腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(TNFRSF)受容体活性化抗体融合タンパク質(FcγR非依存性アゴニスト活性があるTNFRSF受容体活性化抗体融合タンパク質;TRAAFFIAA) Download PDFInfo
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Abstract
Description
腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(TNFRSF)の受容体の大部分は、細胞外ドメインに1〜6の構造的に保存されたシステインリッチドメイン(CRDs)がある1型又は3型の膜貫通タンパク質である。さらに、少数の分泌型又はGPIアンカー型受容体分子が存在し、それらにはCRDがある事実からTNFRSFの一部と考えられる。上記以外、TNFRSFのすべての受容体に共通する構造的性質はない。構造的及び機能的な類似性によれば、TNFRSF内で、以下の3つのサブグループが定義されうる(図1)。
1. i) 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分、及び
ii) 細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメイン、を含む、融合タンパク質。
2.構造が、TNFRSF受容体発現細胞の細胞表面の構造、又はTNFRSF受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞表面の構造である、1に記載の融合タンパク質。
3.構造が、TNFRSF受容体発現細胞の細胞外マトリクスの構造、又はTNFRSF受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞外マトリクスの構造である、1に記載の融合タンパク質。
4.構造が、細胞表面のタンパク質又は糖、好ましくは細胞表面タンパク質である、2に記載の融合タンパク質。
5.構造が、細胞外マトリクスのタンパク質又は糖、好ましくは細胞外マトリクスタンパク質である、3に記載の融合タンパク質。
6.i)の抗体又はその抗原結合部分が、モノクローナルである、1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
7.i)の抗体又はその抗原結合部分が、全長抗体、Fab2断片、Fab断片、又はVH及びVLがTNFRSF受容体特異的scFv断片で置換された抗体である、1〜6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
8.i)の抗体又はその抗原結合部分が、Fcドメインを含まない、1〜7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
9.i)の抗体又はその抗原結合部分が、1又はそれ以上のFcγR型、好ましくはN297A変異を含む、全長抗体への結合能が低下した抗体変異体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
10.i)の抗体又はその抗原結合部分が、IgG1、IgG2若しくはIgG4抗体又はその抗原結合部分である、1〜9のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
11.i)の抗体又はその抗原結合部分が、二価抗体又はその抗原結合部分である、1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
12.i)の抗体又はその抗原結合部分が、抗TNFR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD40抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD95抗体若しくはその抗原結合部分、抗Fn14抗体若しくはその抗原結合部分、抗TRAILR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗TRAILR1抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD27抗体若しくはその抗原結合部分、抗OX40抗体若しくはその抗原結合部分、抗4−1BB抗体若しくはその抗原結合部分、抗BaffR抗体若しくはその抗原結合部分、抗TACI抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗BCMA抗体又はその抗原結合部分からなる群より選択される、1〜11のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
13.i)の抗体又はその抗原結合部分が、抗TNFR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD40抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD95抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗Fn14抗体若しくはその抗原結合部分からなる群より選択される、1〜12のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
14.ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、前記scTNFSFリガンドが、好ましくはTNFR2、GITR、4−1BB、BaffR、TACI、CD40、Fn14又はOX40のリガンドである、1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
15.ii)のドメインが、抗体又は抗体の抗原結合部分を含み、前記抗体又は抗原結合部分が、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、1〜14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
16.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗体又は抗原結合部分が、PD−L1に結合しうるチェックポイント阻害抗体又はその抗原結合部分、好ましくはアベルマブ(Avelumab)又はそのPD−L1結合部分である、15に記載の融合タンパク質。
17.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗体又は抗原結合部分が、抗CD27抗体又はその抗原結合部分である、15に記載の融合タンパク質。
18.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、1又はそれ以上のFcγR型、好ましくはFab2断片、scFv断片又はFab断片、より好ましくはscFv断片又はFab断片への結合能が低下した抗原結合部分である、15〜17に記載の融合タンパク質。
19.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、Fab断片である、15〜18のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
20.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、scFv断片である、15〜18のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
21.細胞表面の構造及び/若しくは細胞外マトリクスの構造又はその抗原結合部分に結合しうる抗原結合部分が、抗CD20抗原結合部分、抗CD70抗原結合部分、抗CD19抗原結合部分、抗EGFR抗原結合部分、抗Her2抗原結合部分、抗Fn14抗原結合部分、抗CD40L抗原結合部分、又は抗PD1L抗原結合部分からなる群より選択される、15〜20のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
22.ii)のドメインが、Fcドメインを含まない、1〜21のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
23.ii)のドメインが、抗体又はその抗原結合断片を含まない、1〜14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
24.ii)のドメインの細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造への結合が抗原非依存性である、1〜14又は23のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
25.ii)のドメインが、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分を含まない、1〜16、及び18〜22のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
26.ii)のドメインが、インターフェロンドメイン又はインターロイキンドメインを含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
27.ii)のドメインが、IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγを含み、好ましくは、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうる、IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγの変異体からなり、かつ、ここで、前記IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγは、好ましくは、ヒトIL−2、ヒトIL−4、ヒトIL−10、ヒトIFNα、ヒトIFNβ又はヒトIFNγである、1〜26のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
28.融合タンパク質は、i)の抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分を含むが、ii)のドメインは含まないタンパク質と比較して、TNFRSF受容体の刺激を高めるうる、1〜27のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
29.細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうる、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分の融合タンパク質。
30.構造に結合すると、TNFRSF受容体の刺激を高めうる、29に記載の融合タンパク質。
31.融合タンパク質は、TNFRSF受容体である、TNFR2、CD40、CD95、Fn14、TRAILR2、TRAILR1、CD27、OX40、4−1BB、BaffR、TACI又はBCMAに結合しうる、29又は30に記載の融合タンパク質。
32.融合タンパク質が、細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるscFvドメイン、又は細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるscTNFSFリガンド若しくは他のタンパク質ドメインとの融合である、29〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
33.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fab2又はFab断片である、29〜32のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
34.前記融合タンパク質が、配列番号19及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号21及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号22及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号24及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号25及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号26及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号28及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号29及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号30及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号32及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号34及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号35及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号118及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号119及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号120及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号121及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号122及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号123及び124のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、及び配列番号125及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、から選択される、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
35.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号37のCDR1アミノ酸配列、配列番号38のCDR2アミノ酸配列、及びCDR3アミノ酸配列LDYを含む重鎖を含み、並びに、配列番号39のCDR1アミノ酸配列、配列番号40のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号41のCDR3アミノ酸配列を含む、抗CD40抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
36.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号42のCDR1アミノ酸配列、配列番号43のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号44のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号45のCDR1アミノ酸配列、配列番号46のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号47のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD95抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
37.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号48のCDR1アミノ酸配列、配列番号49のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号50のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号51のCDR1アミノ酸配列、配列番号52のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号53のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗DR5抗体又はその抗原結合部分である、1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
38.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号54のCDR1アミノ酸配列、配列番号55のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号56のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号57のCDR1アミノ酸配列、配列番号58のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号59のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Fn14抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
39.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号84のCDR1アミノ酸配列、配列番号85のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号86のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号87のCDR1アミノ酸配列、配列番号88のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号89のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Fn14抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
40.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号60のCDR1アミノ酸配列、配列番号61のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号62のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号63のCDR1アミノ酸配列、配列番号64のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号65のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗TNFR2抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
41.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号126のCDR1アミノ酸配列、配列番号127のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号128のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号129のCDR1アミノ酸配列、配列番号130のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号131のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗4−1BB抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
42.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、HBBK4又はその4−1BB結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
43.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号132のCDR1アミノ酸配列、配列番号133のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号134のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号135のCDR1アミノ酸配列、配列番号136のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号137のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗4−1BB抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
44.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、ウレルマブ(urelumab)又はその4−1BB結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
45.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号138のCDR1アミノ酸配列、配列番号139のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号140のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号141のCDR1アミノ酸配列、配列番号142のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号143のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗4−1BB抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
46.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、ウトミルマブ(utomilumab)又はその4−1BB結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
47.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、CD40への結合について、35に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
48.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、CD95への結合について、36に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
49.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、DR5への結合について、37に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
50.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fn14への結合について、38に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
51.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fn14への結合について、39に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
52.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、TNFR2への結合について、40に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
53.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、41に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
54.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、42に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
55.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、43に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
56.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、44に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
57.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、45に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
58.抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、46に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、1〜33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
59.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号66のCDR1アミノ酸配列、配列番号67のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号68のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号69のCDR1アミノ酸配列、配列番号70のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号71のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD20抗体又はその抗原結合部分である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
60.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号72のCDR1アミノ酸配列、配列番号73のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号74のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号75のCDR1アミノ酸配列、配列番号76のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号77のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD19抗体又はその抗原結合部分である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
61.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号78のCDR1アミノ酸配列、配列番号79のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号80のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号81のCDR1アミノ酸配列、配列番号82のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号83のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
62.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号90のCDR1アミノ酸配列、配列番号91のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号92のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号93のCDR1アミノ酸配列、配列番号94のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号95のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
63.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、a)CD20への結合について、59に記載の抗CD20抗体と交差競合しうる、抗CD20抗体又はその抗原結合部分、又はb)CD19への結合について、60に記載の抗CD19抗体と交差競合しうる、抗CD19抗体又はその抗原結合部分、又はc)CD70への結合について、61に記載の抗CD70抗体又はその抗原結合部分と交差競合しうる、抗CD70抗体又はその抗原結合部分、又はd)CD70への結合について62に記載の抗−CD70抗体と交差競合しうる、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
64.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号96のアミノ酸配列を含む抗CD20 scFv断片、又は配列番号96のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD20 scFv断片である、1〜28及び35〜63のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
65.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号98のアミノ酸配列を含む抗CD19 scFv断片、又は配列番号98のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD19 scFv断片である、1〜28及び35〜63のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
66.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号144のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片、又は配列番号144のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片である、1〜28及び35〜63のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
67.ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号145のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片、又は配列番号145のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片である、1〜28及び35〜63のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
68.ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、ここで、前記scTNFSFリガンドは、TNFR2のリガンドであり、前記リガンドは、アミノ酸配列が、配列番号102のアミノ酸配列又は配列番号102と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscTNF80である、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
69.ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、かつscTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号103のアミノ酸配列又は配列番号103と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscBaffである、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
70.ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、前記scTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号104のアミノ酸配列又は配列番号104と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscGITRLである、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
71.ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、かつscTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号105のアミノ酸配列又は配列番号105と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるsc41BBLである、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
72.ii)のドメインが、TNFSFリガンドを含み、前記TNFSFリガンドが、アミノ酸配列が、配列番号106のアミノ酸配列又は配列番号106と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるGITRLである、1〜28及び35〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
73.細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、免疫細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、1〜72のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
74.細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、線維芽細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、1〜73のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
75.細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、腫瘍細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、1〜74のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
76.1〜75のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
77.1〜75のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸又は核酸のセット。
78.少なくとも1のタイプの宿主細胞において、77に記載の核酸又は核酸セットを発現させて、前記融合タンパク質を回収することを含む、1〜75のいずれか一項に記載の融合タンパク質を作製する方法。
示されたTNFRSF受容体を発現しない(又は発現したとしてもせいぜい中等度)Hek293細胞(ATCC)及びFcγRを、マウスFcγR2B又は空ベクターをコードするpCMV−SPORT6(Source Bicoscience)発現プラスミドで一過性トランスフェクトした。Kums et al.,MAbs.2017 Apr;9(3):506-520に記載されているように、ポリエチレンイミン(PEI)を用いて、FcγR発現プラスミド又は空ベクターによるHek293細胞のトランスフェクションを行った。翌日、Hek293トランスフェクタントを回収し、20000個の細胞のアリコートを、前日の細胞が播種された96穴プレートのウェルに加えた(10000〜20000個細胞/穴)。このウェル(穴)には、IL8産生により目的のTNFRSF受容体の活性化に応答する細胞が播種されている。次に、共培養物を、示された抗TNFRSF受容体抗体(3μg/ml)を用いて一晩で三連反復刺激し、最後に、共培養上清のIL8含有量をELISA(BD Biosciences)で評価した。
TNFR2又はFcγRを発現しないHek293細胞(ATCC)を、ヒト活性化FcγR CD32A(FcγR2IIA)、ヒト阻害性FcγR CD32B(FcγRIIB)又は空ベクターをコードするpCMV−SPORT6(Source Bicoscience)発現プラスミドで一過性トランスフェクトした。Kums et al.,MAbs.2017 Apr;9(3):506-520に記載されているように、ポリエチレンイミン(PEI)を用いて、FcγR発現プラスミド又は空ベクターによるHek293細胞のトランスフェクションを行った。翌日、Hek293トランスフェクタントを回収し、20000細胞のアリコートを、前日のTNFR2が安定発現されたHT1080細胞を20000細胞/穴の密度で播種した96穴プレートのウェルに添加した。次いで、共培養物を、細胞内で生成・産生された、示された抗ヒトTNFR2抗体(1μg/ml)と共に三連反復刺激した。抗体により認識されるTNFR2のシステインリッチドメイン(CRD)サブドメインを示す(CRD1〜CRD4)。用いた細胞でTNFR2を活性化すると、IL8産生が増強される。従って、共培養上清のIL8含量を最終的にELISA(BD Biosciences)で評価して、TNFR2活性を測定した。
CD40、BaffR、TACI又はBCMAを発現しないHek293細胞を、Hek293細胞及びFcgR発現ベクター用には、Kums et al.,MAbs.2017Apr;9(3):506-520に記載されるように、BaffR、TACI及びBCMAをコードする発現プラスミド又は空ベクター(=陰性対照)で一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、30.000細胞のアリコートを、前日のHT1080−CD40細胞(CD40で安定トランスフェクトされたHT1080細胞)が20000細胞/穴の密度で播種された96穴プレートのウェルに添加した。あるいは、HT1080−CD40細胞を、BaffR及びTACIを内因性発現する骨髄腫細胞株L363の50.000細胞/穴と共培養した。HT1080−CD40細胞は、CD40の活性化に応答し、大量に産生される。TRAFFIAA抗CD40(G28.5)−IgG1(N297)−scBaffを用いて共培養物を一晩で三連反復刺激し、最後にELISAでIL8産生を測定した。
BaffR、TACI又はBCMAを発現しないHek293細胞及び陰性量のCD95を、BaffR、TACI及びBCMAをコードする発現プラスミド又は空ベクター(=陰性対照)で、Hek293細胞及びFcgR発現ベクター用に、Kums et al.,MAbs.2017Apr;9(3):506-520に記載のように、一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、30,000細胞のアリコートを、前日のHT1080細胞を20000細胞/穴の密度で播種した96穴プレートのウェルに添加した。あるいは、HT1080細胞を、内因性にBaffR及びTACIを発現する骨髄腫細胞株L363の50.000細胞/穴と共培養した。HT1080細胞は、感作物質の非存在下でCD95誘導細胞死に対して感受性を示す。共培養物を、TRAAFFIAA抗−CD95(E09)−IgG1(N297)−scBaffを用いて一晩で三連反復刺激し、最後に、細胞死誘導を、接着成長HT1080細胞のクリスタルバイオレット染色により判定した。
試験は、96穴プレートの技術的三連反復で行った。HT1080細胞をウェル当たり20000細胞で播種した。Jurkat及びBJAB細胞(ウェル当たり30000)を、示された濃度の抗−CD95(E09)−HC:scFv:CD19と共に次の細胞に添加した。細胞死誘導は、接着成長HT1080細胞のクリスタルバイオレット染色により判定した。生存率は、未処理のHT1080細胞(=100%生存率)及びCHX、ベルケイド、及びFc−CD95L(=0生存率)を含む高毒性混合物で処理したHT1080細胞を用いて正規化した。
Hek293細胞を、Hek293細胞及びFcgR発現ベクター用にKums et al.,MAbs.2017Apr;9(3):506-520に記載のように、IL−2受容体のサブユニットをコードする発現プラスミドの混合物、又は陰性対照としての空ベクターで一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、20.000細胞のアリコートを、前日のHeLa−TNFR2細胞を20000細胞/穴の密度で播種した96穴プレートのウェルに添加した。HeLa−TNFR2細胞は、TNFR2活性化に応答してIL8を産生する。TRAFFIAA抗−TNFR2(C4)−HC:IL2を用いて、共培養物を一晩で三連反復刺激し、最後にELISAでIL8産生を測定した。
GITR、41BB又はTNFR2を発現しないHek293細胞を、Hek293細胞及びFcgR発現ベクター用に、Kums et al.,MAbs.2017Apr;9(3):506-520に記載のように、ヒト又はマウスGITR又はマウス41BB又は空ベクター(=陰性対照)をコードする発現プラスミドで一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、20000細胞のアリコートを96穴のpleLa−TNFR2のウェルに20000細胞/穴の密度で播種した。HeLa−TNFR2細胞はTNFR2活性化に応答してIL8を産生する。共培養物を、示されたTRAAFFIASを用いて一晩で三連反復刺激し、最後に、ELISAでIL8産生を測定した。
試験は、96穴プレートの技術的三連反復で行った。HT1080−CD40細胞をウェル当たり20000細胞で播種した。Jurkat(CD20−)及びBJAB細胞(CD20+)(ウェル当たり30000)を、示された濃度の抗CD40−HC:scFv:CD20と共に翌日に添加した。共培養上清のIL8含量を最終的にELISA(BD Biosciences)で評価した。
試験は、96穴プレートの技術的三連反復で行った。HT1080細胞をウェル当たり20000細胞で播種した。Jurkat及びBJAB細胞(ウェル当たり30000)を、示されたTRAAFFIAAと共に次の細胞に添加した。HT1080生存率は、未処理のHT1080細胞(=100%生存率)及びCHX、ベルケイド、及びFc−CD95L(=0生存率)を含む高毒性混合物で処理したHT1080細胞を用いて正規化した。
試験は、96穴プレートの技術的三連反復で行った。上部:HeLa−TNFR2細胞にウェル当たり20000細胞を播種した。Jurkat(CD19−/CD20−)及びRAJI細胞(CD19−/CD20−)(ウェル当たり30000)を、示された濃度の抗TNFR2−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD19(上部)又は抗TNFR2−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(下部)と共に翌日に添加した。TNFR2活性化により産生されたIL8含量は、最後に共培養上清のELISA(BD Biosciences)分析により評価した。
抗体融合タンパク質を作製し、以下のKumsら、2016に記載されているように精製した。SDS−PAGE、銀染色及びウェスタンブロット法を、Langら、2016に記載のように実施した。
図14は、抗CD40 G28.5のIgG1(N297A)及びFAB2変異体のscBaff融合タンパク質は、BaffR及びTACIの内因性発現を伴うリンパ腫/骨髄腫細胞への結合後、CD40刺激活性が高まることを示す。MM1S(BCMA及び中等度のTACIを発現)、L363(BCMA及び中等度のTACIを発現)及びBJAB(BaffRを発現)細胞、又はすべてのBaff結合受容体の発現が欠損する対照Jurkat細胞を、BaffR、BCMA及びTACIを発現せず、CD40刺激後にIL8を強力に産生するHT1080−CD40細胞と共培養した。示された濃度の抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scBaff又は抗CD40(G28.5)−FAB2−HC:scBaffで、共培養物を三連反復刺激した。翌日、異なる共培養物の上清中のヒトIL8の量を測定した。
HT1080−CD40細胞を96穴プレート(ウェル当たり20.000細胞)で一晩培養した。翌日、MM1S、L363、BJAB又はJurkat細胞をウェル当たり20.000個添加し、得られた共培養物を、示された濃度の抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scBaff及び抗CD40(G28.5)−FAB2−HC:scBaffでさらに三連反復刺激した。次いで、細胞上清のIL8産生についてELISAで分析した。MM1S、L363、BJAB及びJurkat細胞は、HT1080−CD40細胞と比較して、IL8は産生されないか、又は産生されたとしても無視できる量であったことに注意されたい。
HT1080−CD40細胞を96穴プレート(ウェル当たり20.000細胞)で一晩培養した。翌日、MM1S、L363、BJAB又はJurkat細胞をウェル当たり20.000個添加し、得られた共培養物を、200ng/mlのCD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scBaff及び抗−CD40(G28.5)−FAB2−HC:scBaffと共に、可溶性TNC−Baff(5μg/ml)の存在下及び非存在下で、テネイシン−Cの三量体化ドメインを含む可溶性Baffの安定化形態(Bergら,2007)でさらに一晩刺激した。次いで、細胞上清のIL8産生についてELISAで分析した。MM1S、L363、BJAB及びJurkat細胞は、HT10890−CD40細胞と比較して、IL8は産生されないか、又は産生されたとしても無視できる量であったことに注意されたい。
図16は、抗CD95 IgG1 E09又はそのFAB2断片のscBaff融合タンパク質が、BaffR及びTACIを内因性発現するリンパ腫/骨髄腫懸濁細胞に結合した後、接着性HT1080細胞において細胞死を誘導することを示す。接着増殖HT1080細胞を、MM1S(BCMA及び中等度のTACIを発現する)、L363(BCMA及び中等度のTACIを発現する)及びBJAB(BaffRを発現する)懸濁細胞と、又は対照Jurkat細胞と共培養した。HT1080及びJurkat細胞は、Baff−相互作用受容体(BaffR、TACI、BCMA)を発現しないことに注意されたい。抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaff又は抗CD95(E09)−FAB2−HC:scBaffの指示された濃度で、1μg/mlのCHXの存在下で共培養を三連反復刺激した。翌日、残存する付着HT1080細胞のクリスタルバイオレット染色により、細胞生存率を測定した。
HT1080細胞を20,000細胞/穴の密度で播種した。翌日、MM1S、L363、BJAB又はJurkat懸濁液細胞をウェル当たり20.000個添加し、得られた共培養物を、1μg/mlの存在下で抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaff又は抗CD95(E09)−FAB2−HC:scBaffと一晩刺激した。最後に、接着成長HT1080細胞のクリスタルバイオレット染色により細胞死誘導を判定した。生存率は、0.03%アジド、50μg/mlのCHX及び500ng/mlのFc−CD95L(=0%生存率)の高毒性混合物で処理した未処理のHT1080細胞(=100%生存率)及びHT1080細胞に対して正規化した。
HT1080細胞を20,000細胞/穴の密度で播種した。翌日、MM1S、L363、BJAB又はJurkat懸濁液細胞をウェル当たり20.000個添加し、得られた共培養物を、20ng/mlの抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaff又は抗CD95(E09)−FAB2−HC:scBaffで、可溶性TNC−Baff(5μg/ml)の存在下及び非存在下で、三連反復刺激した。最後に、細胞死誘導を、接着成長HT1080細胞のクリスタルバイオレット染色により決定した。生存率は、0.03%アジド、50μg/mlのCHX及び500ng/mlのFc−CD95L(=0%生存率)の高毒性混合物で処理した未処理のHT1080細胞(=100%生存率)及びHT1080細胞に対して正規化した。TNC−Baffは、テネイシンCの三量体化ドメインを含む可溶性Baffの安定化形態である(Bergら,2007)。
図18は、抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaffはBaffR発現細胞においてアポトーシスカスパーゼを活性化するが、抗CD95(E09)−IgG1(N297A)は活性化しないことを示す。BJAB細胞(BaffRを発現)、及びBaff受容体(BaffR、TACI、BCMA)を全く発現しない陰性対照Jurkat細胞として、示された濃度の抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scBaff及び抗CD95(E09)−IgG1(N297A)で一晩処理した。翌日、これらのカスパーゼのアポトーシス活性化を示すカスパーゼ−8のp18断片及びカスパーゼ−3のp17断片の生成に関して、全細胞溶解物をウェスタンブロット法で分析した。陽性対照として、Jurkat及びBJAB細胞に500ng/mlのFc−CD95Lを負荷し、両細胞株でアポトーシスを誘導させた。
ウェル当たり20.000のHeLa−TNFR2トランスフェクタント(Weissら、1997)を96穴プレートに播種した。翌日、CD20陽性BJAB細胞又は内因性CD20発現を欠損するJurkat細胞20,000個を陰性対照として添加した。次いで、共培養物を、示された濃度の抗TNFR2(C4)−IgG2−HC:scFvCD20で処理し、その翌日に、IL8産生をELISAで測定した。
図20は、細胞表面抗原CD70に固定化されたIgG1アイソフォーム中のTNFR2特異的抗体C4のscFv融合タンパク質が、CD27L/CD70依存的にTNFR2をより刺激することを示す。図(A)は融合タンパク質の構造を示す。(B)(C)は、Hek293細胞に空のベクター又は発現プラスミドをコードするCD27L(別名CD70)をトランスフェクトしたことを示す。翌日、トランスフェクタントをTNFR2発現時にIL8を産生するHeLa−TNFR2トランスフェクタントと共培養した。共培養物を、示された濃度の抗TNFR2(C4)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD70(1F6)(B)又は抗TNFR2(C4)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD70(2H5)(C)で処理した。最後に、IL8産生をELISAで評価した。
TNFR2又はCD27L(CD70)を発現しないHek293細胞を、Kums et al.,MAbs.2017 Apr;9(3):506-520に記載されているように、CD27L(=陰性対照)をコードする発現プラスミドで一過性トランスフェクトした(Hek293細胞及びFcgR発現ベクター)。トランスフェクタントを回収し、20,000細胞のアリコートを、その前日のHeLa−TNFR2細胞を20,000細胞/穴の密度で播種した96穴プレートのウェルに添加した。TRAAFFIAAs抗TNFR2(C4)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD70(1F6)(B)及び抗TNFR2(C4)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD70(2H5)(C)を用いて、共培養物を一晩刺激した。2H5及び1F6は、2つの異なるヒトCD70特異的抗体である。
HT1080−41BBトランスフェクタント(Wyzgolら,2009)、HT1080−CD40トランスフェクタント(Wyzgolら,2009)及びHT1080細胞(内因性CD95発現)を20.000細胞/穴の密度で播種した。翌日、前日に空ベクター(EV)又はCD27L(=CD70)発現プラスミドをトランスフェクトした20,000個のHek293細胞を添加した。得られた共培養物を、示された濃度の抗41BB(HBBK4)−IgG1(N297A)−HC:scFvCD20(B)、抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scFvCD20(C)及び抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC(D)で一晩刺激した。後者を20μg/mlのZVADの存在下で添加して、アポトーシス誘導を阻害した。IL8をELISAで評価した。
図22は、4−1BB特異的抗体HBK4、CD40特異的抗体G28.5及びCD95特異的抗体E09のIgG1(N297)変異体のscFv:CD20融合タンパク質が、CD20陽性BJAB細胞と共培養したHT1080−41BB、HT1080−CD40及びHT1080(内因性CD95発現)細胞により増強されたIL8産生を誘導することを示す。(A)〜(C)は、示されたHT1080変異体を、CD20陽性BJAB細胞と、又は内因性CD20発現を欠損するJurkat細胞との陰性対照と共培養した。次いで、共培養物を、指示された濃度で、CD20結合性IgG1(N297A)融合タンパク質抗41BB(HBBK4)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(A)、抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(B)及び抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD20(C)で処理した。翌日、IL8産生をELISAで測定した。抗CD95変異体の場合は、カスパーゼ阻害剤ZVADを添加してアポトーシスを阻害した。
HT1080−41BBトランスフェクタント(Wyzgolら,2009)、HT1080−CD40トランスフェクタント(Wyzgolら,2009)及びHT1080細胞(内因性CD95発現)を20.000細胞/穴の密度で播種した。翌日、20,000個のBJAB細胞(CD20陽性)又は20,000個のJurkat細胞(CD20陰性)のいずれかを添加した。得られた共培養物を、示された濃度の抗41BB(HBBK4)−IgG1(N297A)−HC:scFvCD20(A)、抗CD40(G28.5)−IgG1(N297A)−HC:scFvCD20(B)及び抗CD95(E09)−IgG1(N297A)−HC(C)で一晩刺激した。後者を20μg/mlのZVADの存在下で添加して、アポトーシス誘導を阻害した。IL8をELISAで評価した。
図23は、CD70特異的scFv 9G2を備えるIgG1(N297A)アイソフォーム中のTRAILR2特異的抗体コナツムマブ(Cona)の融合タンパク質が、CD70依存的に炎症誘発性(A)及び細胞毒性(B)TRAILR2シグナル伝達をますます刺激する。CD70をコードする発現プラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたHek293細胞を一過性トランスフェクトしたHek293細胞を、TRAILR2応答性HT1080細胞と共培養した(CD70発現なし)。共培養物を2.5μg/mlのCHX(B)又はCHX+20μMのカスパーゼ阻害剤ZVAD(A)で処理して、TRAILR2シグナル伝達用のHT1080細胞を感作した。CHXは、代謝回転が高いTRAILR2シグナル伝達阻害性FLIPタンパク質の発現を抑制する。ZVADはアポトーシスを予防し、TRAILR2の遺伝子誘導特性の評価が可能となる。次いで、共培養物を、示された濃度の抗−TRAILR2(Cona)−IgG1(N297A)−HC:scFv:CD70(9G2)でさらに処理し、その翌日、IL8産生を、ELISA(A)、又はクリスタルバイオレット染色(B)で、生存率により測定した。
定義及び一般技術
以下に特段の定めがない限り、本発明で用いられる用語は、当業者に公知の共通の意味に従って理解されるべきである。
本明細書で引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
−抗体の抗原結合部分であって、前記抗原結合部分は、細胞表面の前記構造及び/又は細胞外マトリクスの前記構造に結合でき、前記抗原結合部分は、1又は複数のFcγR型への結合能が低下しており、前記抗原結合部分は、Fab2断片である;又は
−細胞表面の前記構造及び/又は細胞外マトリクスの前記構造に結合しうる全長抗体;
を含む。
抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分は、化学的結合により、好ましくはクリック化学を用いた化学的結合により融合されることが非常に好ましい。
一般に、本明細書に特段の定めがない限り、本発明で用いられる方法(例えば、クローニング方法又は抗体に関する方法)は、当業界で公知の方法、例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、Sambrookら(「分子クローニング:実験室マニュアル」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York1989)、Ausubelら(“Current Protocols in Molecular Biology.”Greene Publishing Associates and Wiley Interscience;New York 1992)、及びHarlow及びLane(“Antibodies:A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York 1998)に記載される。
本発明による組成物は、医薬組成物の調製のための公知の基準に従って調製される。
本出願で記載されるアミノ酸配列は、1文字アミノ酸コードを用いてN末端からC末端の順序で表される。本出願で記載される核酸配列は、標準的な核酸コードを用いて5’から3’の順序で表される。星印はタンパク質配列の末端を示す。下線がひかれた核酸配列は、制限エンドヌクレアーゼ部位を表す。
以下の配列番号126〜143のアミノ酸配列は、抗4−1BBモノクローナル抗体HBBK4(本出願の非限定的な実施例で用いられる)、URELUMAB及びUTOMILUMABのCDR配列である。用語「CDR1−H」、「CDR2−H」及び「CDR3−H」は各々、CDR1、CDR2及びCDR3配列の重鎖をいい、用語「CDR1−L」、「CDR2−L」及び「CDR3−L」は各々、CDR1、CDR2及びCDR3配列の軽鎖をいうことに留意されたい。
FcγR又はTNFR2発現を示さないCD40発現細胞又は細胞共培養物を、抗CD40(G28.5)−HC:scTNF80で刺激すると、その結果は、例えば、IL8の産生により反映されるCD40活性化が著しく低いか、又は単に生じない。対照的に、FcγR発現細胞の存在下では、上記分子は予想通りCD40を極めて良好に活性化する(上記説明参照)。今回、抗CD40(G28.5)−HC:scTNF80は、親のG28.5抗体とは異なり、TNFR2を発現させると、FcγRの非存在下でも強力にCD40を活性化しうることが明らかになった(図6)。抗CD40(G28.5)−HC:scTNF80の細胞結合TNFR2へのscTNF80ドメイン媒介結合は、Fcドメイン媒介性のG28.5のFcγR発現細胞への結合と同様に、アゴニスト抗体効果を呈しうることが明らかである(図2)。これは、抗TNFRSF受容体抗体又は抗体融合タンパク質の細胞への単なる抗原結合ドメイン非依存性結合が各々、抗体及び抗体融合タンパク質に対して高いアゴニスト活性を与えるのに十分であることを示す。
さらに、本発明者らは、TNFRSF受容体TRAILR2に対する抗体(コナツムマブ;Conatumumab)のscFv融合タンパク質(DR5としても指定)を試験した(図23)。用いたscFv断片はscFv:CD70であった。この融合タンパク質は、そのscFvドメインを介して、scFvドメインにより認識される細胞表面抗原CD70に結合しうる場合は、抗体部分(TRAILR2)により認識されるTNFRSF受容体に対する強力なアゴニストとして、FcγR非依存的に作用することが見いだされた。
実施例からの結論
以下固定化ドメインともいう、抗体に融合される、FcγR及び抗原結合ドメインに非依存性の細胞相互作用に用いられるドメインは、特に限定されない。従って、本発明者らは、細胞結合にIL2リガンド又はscTNFSFリガンドを利用するTRAAFFIAAを製造でき、及び当該TRAAFFIAAとしては、この目的のために異種scFv抗体断片が用いられた。アゴニスト活性を得るためには、抗原結合ドメインがFcγR及び抗原非依存的に細胞に結合することも十分であると考えられる。例えば、CD20特異的scFvとの融合により遺伝的に操作されたCD95特異的抗体E09のFab2断片(図11)により、CD20に依存するTNFRSF受容体刺激活性が強力に高まることが示された。
〔参考文献〕
Claims (68)
- i) 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分、及び
ii) 細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうるドメイン、
を含む、融合タンパク質。 - 構造が、TNFRSF受容体発現細胞の細胞表面の構造、又はTNFRSF受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞表面の構造である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 構造が、TNFRSF受容体発現細胞の細胞外マトリクスの構造、又はTNFRSF受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞外マトリクスの構造である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 構造が、細胞表面のタンパク質又は糖、好ましくは細胞表面タンパク質である、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 構造が、細胞外マトリクスのタンパク質又は糖、好ましくは細胞外マトリクスタンパク質である、請求項3に記載の融合タンパク質。
- i)の抗体又はその抗原結合部分が、モノクローナルである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- i)の抗体又はその抗原結合部分が、全長抗体、Fab2断片、Fab断片、又はVH及びVLがTNFRSF受容体特異的scFv断片で置換された抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- i)の抗体又はその抗原結合部分が、Fcドメインを含まない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- i)の抗体又はその抗原結合部分が、1又はそれ以上のFcγR型、好ましくはN297A変異を含む、全長抗体への結合能が低下した抗体変異体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- i)の抗体又はその抗原結合部分が、IgG1、IgG2若しくはIgG4抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- i)の抗体又はその抗原結合部分が、二価抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- i)の抗体又はその抗原結合部分が、抗TNFR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD40抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD95抗体若しくはその抗原結合部分、抗Fn14抗体若しくはその抗原結合部分、抗TRAILR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗TRAILR1抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD27抗体若しくはその抗原結合部分、抗OX40抗体若しくはその抗原結合部分、抗4−1BB抗体若しくはその抗原結合部分、抗BaffR抗体若しくはその抗原結合部分、抗TACI抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗BCMA抗体又はその抗原結合部分からなる群より選択される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- i)の抗体又はその抗原結合部分が、抗TNFR2抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD40抗体若しくはその抗原結合部分、抗CD95抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗Fn14抗体若しくはその抗原結合部分からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、前記scTNFSFリガンドが、好ましくはTNFR2、GITR、4−1BB、BaffR、TACI、CD40、Fn14又はOX40のリガンドである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、抗体の抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分が、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、1又はそれ以上のFcγR型、好ましくはFab2断片、scFv断片又はFab断片、より好ましくはscFv断片又はFab断片への結合能が低下した抗原結合部分である、請求項15に記載の融合タンパク質。
- 細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、Fab断片である、請求項15又は16に記載の融合タンパク質。
- 細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、scFv断片である、請求項15又は16に記載の融合タンパク質。
- 細胞表面の構造及び/若しくは細胞外マトリクスの構造又はその抗原結合部分に結合しうる抗原結合部分が、抗CD20抗原結合部分、抗CD70抗原結合部分、抗CD19抗原結合部分、抗EGFR抗原結合部分、抗Her2抗原結合部分、抗Fn14抗原結合部分、抗CD40L抗原結合部分、又は抗PD1L抗原結合部分からなる群より選択される、請求項15〜18のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、Fcドメインを含まない、請求項1〜19のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、抗体又はその抗原結合断片を含まない、請求項1〜14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインの細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造への結合が抗原非依存性である、請求項1〜14又は21のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分を含まない、請求項1〜22のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、インターフェロンドメイン又はインターロイキンドメインを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγを含み、好ましくは、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうる、IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγの変異体からなり、かつ、ここで、前記IL−2、IL−4、IL−10、IFNα、IFNβ又はIFNγは、好ましくは、ヒトIL−2、ヒトIL−4、ヒトIL−10、ヒトIFNα、ヒトIFNβ又はヒトIFNγである、請求項1〜24のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質は、i)の抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分を含むが、ii)のドメインは含まないタンパク質と比較して、TNFRSF受容体の刺激を高めるうる、請求項1〜25のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に、FcγR非依存的に結合しうる、抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分の融合タンパク質。
- 構造に結合すると、TNFRSF受容体の刺激を高めうる、請求項27に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質は、TNFRSF受容体である、TNFR2、CD40、CD95、Fn14、TRAILR2、TRAILR1、CD27、OX40、4−1BB、BaffR、TACI又はBCMAに結合しうる、請求項27又は28に記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が、細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるscFvドメイン、又は細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるscTNFSFリガンド若しくは他のタンパク質ドメインとの融合である、請求項27〜29のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fab2又はFab断片である、請求項27〜30のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、配列番号19及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号21及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号22及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号24及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号25及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号26及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号28及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号29及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号30及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号32及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号34及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号35及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号118及び23のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号119及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号120及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号121及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号122及び31のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号123及び124のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、及び配列番号125及び36のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、から選択される、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号37のCDR1アミノ酸配列、配列番号38のCDR2アミノ酸配列、及びCDR3アミノ酸配列LDYを含む重鎖を含み、並びに、配列番号39のCDR1アミノ酸配列、配列番号40のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号41のCDR3アミノ酸配列を含む、抗CD40抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号42のCDR1アミノ酸配列、配列番号43のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号44のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号45のCDR1アミノ酸配列、配列番号46のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号47のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD95抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号48のCDR1アミノ酸配列、配列番号49のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号50のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号51のCDR1アミノ酸配列、配列番号52のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号53のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗DR5抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号54のCDR1アミノ酸配列、配列番号55のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号56のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号57のCDR1アミノ酸配列、配列番号58のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号59のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Fn14抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号84のCDR1アミノ酸配列、配列番号85のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号86のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号87のCDR1アミノ酸配列、配列番号88のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号89のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Fn14抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号60のCDR1アミノ酸配列、配列番号61のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号62のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号63のCDR1アミノ酸配列、配列番号64のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号65のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗TNFR2抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号126のCDR1アミノ酸配列、配列番号127のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号128のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号129のCDR1アミノ酸配列、配列番号130のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号131のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗4−1BB抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、HBBK4又はその4−1BB結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、CD40への結合について、請求項33に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、CD95への結合について、請求項34に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、DR5への結合について、請求項35に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fn14への結合について、請求項36に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、Fn14への結合について、請求項37に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、TNFR2への結合について、請求項38に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、請求項39に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 抗TNFRSF受容体抗体又はその抗原結合部分が、4−1BBへの結合について、請求項40に記載の抗TNFRSF受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号66のCDR1アミノ酸配列、配列番号67のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号68のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号69のCDR1アミノ酸配列、配列番号70のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号71のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD20抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号72のCDR1アミノ酸配列、配列番号73のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号74のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号75のCDR1アミノ酸配列、配列番号76のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号77のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗CD19抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号78のCDR1アミノ酸配列、配列番号79のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号80のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号81のCDR1アミノ酸配列、配列番号82のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号83のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号90のCDR1アミノ酸配列、配列番号91のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号92のCDR3アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号93のCDR1アミノ酸配列、配列番号94のCDR2アミノ酸配列、及び配列番号95のCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、a)CD20への結合について、請求項49に記載の抗CD20抗体と交差競合しうる、抗CD20抗体又はその抗原結合部分、又はb)CD19への結合について、請求項50に記載の抗CD19抗体と交差競合しうる、抗CD19抗体又はその抗原結合部分、又はc)CD70への結合について、請求項51に記載の抗CD70抗体又はその抗原結合部分と交差競合しうる、抗CD70抗体又はその抗原結合部分、又はd)CD70への結合について、請求項52に記載の抗−CD70抗体と交差競合しうる、抗CD70抗体又はその抗原結合部分である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号96のアミノ酸配列を含む抗CD20 scFv断片、又は配列番号96のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD20 scFv断片である、請求項1〜26及び33〜53のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号98のアミノ酸配列を含む抗CD19 scFv断片、又は配列番号98のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD19 scFv断片である、請求項1〜26及び33〜53のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号144のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片、又は配列番号144のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片である、請求項1〜26及び33〜53のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、細胞表面の構造及び/又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号145のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片、又は配列番号145のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む抗CD70 scFv断片である、請求項1〜26及び33〜53のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、ここで、前記scTNFSFリガンドは、TNFR2のリガンドであり、前記リガンドは、アミノ酸配列が、配列番号102のアミノ酸配列又は配列番号102と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscTNF80である、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、かつscTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号103のアミノ酸配列又は配列番号103と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscBaffである、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、前記scTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号104のアミノ酸配列又は配列番号104と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるscGITRLである、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、scTNFSFリガンドを含み、かつscTNFSFリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号105のアミノ酸配列又は配列番号105と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるsc41BBLである、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- ii)のドメインが、TNFSFリガンドを含み、前記TNFSFリガンドが、アミノ酸配列が、配列番号106のアミノ酸配列又は配列番号106と少なくとも90%同一のアミノ酸配列であるGITRLである、請求項1〜26及び33〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、免疫細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、請求項1〜62のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、線維芽細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、請求項1〜63のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、腫瘍細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、請求項1〜64のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜65のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
- 請求項1〜65のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸又は核酸のセット。
- 少なくとも1のタイプの宿主細胞において、請求項67に記載の核酸又は核酸セットを発現させて、前記融合タンパク質を回収することを含む、請求項1〜65のいずれか一項に記載の融合タンパク質を作製する方法。
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