KR20190065318A - 세포에 의해 발현되는 생물학적 활성을 조절하는 결합 분자 - Google Patents

세포에 의해 발현되는 생물학적 활성을 조절하는 결합 분자 Download PDF

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마크 스로스비
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린쎄 클루스터
파울러스 조한너스 타켄
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Abstract

본 발명은 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성을 자극하는 수단 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 결합 분자, 예컨대 적어도 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 부위들은 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있고, 제2 항원 결합 부위는 제2 (상이한) 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있다.

Description

세포에 의해 발현되는 생물학적 활성을 조절하는 결합 분자
본 발명은 결합 분자의 분야에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 비정상 세포를 수반하는 질병의 치료를 위한 치료 결합 분자의 분야에s 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 둘 이상의 상이한 막 관련 단백질의 세포외 부분에 결합하여 세포에 의해 발현되는 생물학적 활성을 조절하는 결합 분자에 관한 것이다.
암은, 이 질병의 치료에서 이루어 온 많은 진보 및 암으로 이어지는 분자 사건의 증가된 지식에도 불구하고, 여전히 전세계적으로 이환율 및 사망의 주요 원인이다. 암은 전세계적으로 사망의 두 번째 주요 원인이다. 세계보건기구(World Health Organization)에 따르면, 암은 2015년에 880만건의 사망사건을 차지하였다. 전세계적으로, 6건의 사망건수 중 거의 1건이 암에 기인한다. 예를 들어, 결직장암 (CRC)은 전세계적으로 세 번째로 가장 일반적인 암이다. 2008년도에, 123만명의 사람들이 이 질병으로 진단받았다. 그것은 유럽에서 두 번째로 가장 일반적인 암으로, 2012년도에는 약 447,000건의 새로운 사례가 진단되었다 (전체의 13%). 결직장암은 암 사망의 네 번째로 가장 일반적인 원인으로, 해마다 608,000건 (EU 148,000건)의 사망사건을 차지하는 것으로 추정된다. 일부 새로운 치료가 CRC에서 진전되어 왔지만, 다수가 임상 시험에서 실패하였고; 전이성 CRC는 여전히 대체로 불치 상태이다.
전통적으로, 대부분의 암 약물 발굴은 본질적인 세포 기능을 차단하고 분열 세포를 사멸하는 작용제에 초점을 맞추어 왔다. 그러나, 진행된 암의 경우에, 아무리 공격적으로 적용되더라도, 심지어는 환자가 치료로부터 생명을 위협하는 부작용으로 고통스러운 상황에 이르게 될 때조차도, 화학요법은 완전한 치유를 거의 가져오지 못한다. 대부분의 경우에, 환자 내의 종양은 성장을 정지하거나 일시적으로 축소되지만 (관해(remission)라 지칭됨), 결국 다시, 여러회 더 급속히 증식을 시작하게 되고 (재발(relapse)이라 지칭됨), 치료하기가 더욱 더 어려워지게 된다. 보다 최근에는, 암 약물 개발의 초점이 광범위하게 세포독성인 화학요법으로부터 더 적은 독성을 갖는 표적화된 세포분열억제(cytostatic) 요법으로 옮겨져 왔다. 진행된 암의 치료가 백혈병 및 일부 다른 암에서 임상적으로 검증되어 왔다. 그러나, 대부분의 암종에서, 표적화된 접근법은 환자의 대부분에서 암을 완전히 제거하기에는 충분히 효과적이지 않은 것으로 여전히 입증되고 있다. 흑색종은 매우 빈번하게 발생하는 암의 다른 예이다. 검출이 초기에 충분하지 않을 때, 암은 전이될 가능성이 높은데, 전이 단계에서 그것은 치료하기가 매우 어렵다. 면역-개입 치료가 전이된 흑색종을 갖는 환자들 중 적어도 일부에 효과적인 것으로 밝혀져 있다. 비소세포 폐암은 수술하기에 충분한 초기 단계에서 거의 발견되지 않는 암 유형이다. 또한, 이들 유형의 암은 면역-개입 치료에 의해 성공적으로 치료되어 왔다.
암의 표적화는, 예를 들어 암의 생존 및/또는 성장을 좌우하는 신호전달 단백질에 대해 유도된 소분자; 종양 특이적 단백질을 갖는 백신; 종양 세포를 능동적으로 사멸시키는 면역 세포에 의한 세포 요법; 및 세포독성 분자가 종양을 향하도록 표적화하고/하거나, 신호전달을 방해하고/하거나, 숙주의 면역 시스템을 종양 세포로 지향(방향전환)시키는 항체를 포함한 다양한 방법을 사용하여 달성되어 왔다. CTLA-4 또는 PD-1 축을 차단하는 단일클론 항체는 흑색종, NSCLC, 신세포 암종 및 요로상피세포 암종 환자의 하위세트에서 지속적인 임상 반응을 유도하는 것으로 밝혀져 있다.
본 발명은 면역 시스템 구성요소를 지향 (방향전환)시키기 위한 신규한 수단 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 세포에 의해 발현되는 생물학적 활성을 조절하기 위한 수단 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성을 자극하는 방법을 제공하며, 본 방법은 제1 세포 및 제2 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 이 중 상기 제1 세포는 세포막 상에 상기 구성원을 갖고, 상기 제2 세포는 세포막 상에 제2 막 단백질을 가지며, 상기 방법은 상기 세포들을, 제1 항원 결합 부위는 상기 구성원 (제1 막 단백질)의 세포외 부분과 결합할 수 있고, 제2 항원 결합 부위는 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는, 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 분자와 접촉시켜, 상기 제1 세포 상의 상기 구성원의 활성을 자극하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 시험관내(in vitro) 방법이다. 일부 실시 형태에서, TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원은 CD137 또는 OX40, 바람직하게는 CD137이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 B7 패밀리의 구성원이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 PD-L1이다.
일 바람직한 실시 형태에서, 본 방법은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 추가의 결합 분자 (제2 결합 분자)를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제1 결합 분자와 제2 결합 분자는,
- 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들;
- 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들; 또는
- 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들 및 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들과 결합하며;
상기 방법은 상기 제1 및 제2 세포를 상기 제1 및 제2 결합 분자와 함께 인큐베이션하여, 상기 제1 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 활성화를 자극하거나 향상시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원 (제1 막 단백질)의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 결합 분자를 제공한다. TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원은 바람직하게는 CD137 또는 OX40, 바람직하게는 CD137이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다. 상기 제2 막 단백질은 바람직하게는 B7 패밀리의 구성원이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 PD-L1이다.
본 발명은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원 (제1 막 단백질)의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 하나 이상의 결합 분자를 포함하는 조성물 또는 파트 키트(kit of parts)를 추가로 제공한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 2개 이상의 그러한 결합 분자를 포함하는 조성물 또는 파트 키트를 제공하며; 상기 결합 분자들 중 적어도 2개는,
- 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들;
- 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들; 또는
- 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들 및 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들과 결합할 수 있다. 적어도 2개의 결합 분자는 상기 제1 막 단백질 상의 동일한 에피토프와 결합하고, 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들과 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명은 추가로 세포 상의 CD137 또는 OX40의 활성을 자극하는 방법을 제공하며, 본 방법은, 제1 세포 및 제2 세포를 제공하는 단계로서, 상기 제1 세포는 세포막 상에 CD137 또는 OX40을 갖고, 상기 제2 세포는 세포막 상에 제2 막 단백질을 갖는, 단계, 및 상기 제1 세포 및 제2 세포를 상기 CD137 또는 OX40 (제1 막 단백질)의 세포외 부분에 결합할 수 있는 항원 결합 부위; 및 제2 막 단백질의 세포외 부분에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 결합 분자 (제1 결합 분자)와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 방법은 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포를 상기 제1 결합 분자와 함께 인큐베이션하여, 상기 제1 세포 상의 상기 CD137 또는 OX40의 활성을 자극하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다.
일 바람직한 실시 형태에서, 본 방법은 상기 제1 구성원 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 추가의 결합 분자 (제2 결합 분자)를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제1 결합 분자와 제2 결합 분자는,
- 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들;
- 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들; 또는
- 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들 및 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들과 결합하며;
상기 방법은 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포를 상기 제1 및 제2 결합 분자와 함께 인큐베이션하여, 상기 제1 세포 상의 CD137 또는 OX40의 활성을 자극하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 결합 분자는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 결합 분자의 항원 결합 부위들은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 결합 분자는 CD137의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 결합 분자의 항원 결합 부위들은 CD137의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 결합 분자는 CD137과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 PD-L1과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 결합 분자의 항원 결합 부위들은 CD137과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 PD-L1과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 결합 분자는 2개 이하의 항원 결합 부위를 갖는다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 결합 분자는 바람직하게는 항체이다.
본 발명은 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성을 자극하는 방법을 추가로 제공하며, 제1 세포 및 제2 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 제1 세포는 세포막 상에 상기 구성원 (제1 막 단백질)을 갖고, 상기 제2 세포는 세포막 상에 제2 막 단백질을 가지며, 상기 방법은 상기 세포들을, 하나의 가변 도메인은 상기 제1 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위를 포함하고, 다른 가변 도메인은 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 적어도 2개의 가변 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 항체와 접촉시켜, 상기 제1 세포 상의 상기 구성원의 활성을 자극하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다.
본 발명은 하기를 포함하는 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 추가로 제공한다:
- TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원 (제1 막 단백질)의 세포외 부분에 결합할 수 있는 가변 도메인; 및
- 제2 막 단백질의 세포외 부분에 결합할 수 있는 가변 도메인. 제1 막 단백질은 바람직하게는 CD137 또는 OX40, 바람직하게는 CD137이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다.
결합 분자는 바람직하게는 이중특이성 항체이다. 본 발명은 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성을 자극하는 방법을 추가로 제공하며, 제1 세포 및 제2 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 제1 세포는 세포막 상에 상기 구성원 (제1 막 단백질)을 갖고, 상기 제2 세포는 세포막 상에 제2 막 단백질을 가지며, 상기 방법은 상기 세포들을, 하나의 가변 도메인은 상기 제1 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위를 포함하고, 다른 가변 도메인은 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 2개의 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체와 접촉시켜, 상기 제1 세포 상의 상기 구성원의 활성을 자극하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 또한, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원 (제1 막 단백질)의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 가변 도메인 및 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다. 제1 막 단백질은 바람직하게는 CD137 또는 OX40, 바람직하게는 CD137이다. 제2 막 단백질은 바람직하게는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 항체는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 항체의 항원 결합 부위들은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 항체는 CD137의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 항체의 항원 결합 부위들은 CD137의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 항체는 CD137과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 PD-L1과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 항체의 항원 결합 부위들은 CD137과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 PD-L1과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 항체는 2개 이하의 항원 결합 부위를 갖는다.
본 발명의 하나 이상의 결합 분자, 바람직하게는 항체 또는 그의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물이 추가로 제공된다.
또한, 본 발명의 항체 또는 그의 변이체의 중쇄(들) 또는 중쇄 가변 영역(들)을 코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자들의 집합이 제공된다.
또한, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자들의 집합이 제공된다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 도 3에 나타낸 바와 같은 MF의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 항체는 도 1에 나타낸 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 경쇄는 도 1a에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 중쇄는 IgG1 항체, 바람직하게는 인간 IgG1 항체의 불변 영역을 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 상기 IgG1 불변 영역의 CH2 영역은 항체의 ADCC 및/또는 CDC 활성을 감소시키도록 조작된다. 일 바람직한 실시 형태에서, CH2 영역은 도 2e에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 항체의 CH3-영역은 중쇄의 이종이량체화를 용이하게 하도록 조작된다. 일 바람직한 실시 형태에서, 하나의 중쇄는 도 2f에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하고, 다른 중쇄는 도 2g에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
또한, 본 발명의 항체 또는 그의 변이체를 단독으로 또는 함께 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 세포가 제공된다. 또한, 기재된 바와 같은 세포를 사용하여 본 발명의 항체 또는 그의 변이체를 생성하는 방법이 제공되는데, 이는, 바람직하게는 세포의 배양물로부터 항체 또는 그의 변이체를 수집하는 것과 함께 행해진다.
본 발명의 항체 또는 그의 변이체를 포함하는 세포 시스템이 추가로 제공된다.
또한, 비정상 세포를 수반하는 질병, 예컨대 암을 갖거나 바이러스 또는 기생충에 의한 만성 감염을 갖는 개체의 치료 방법이 제공되며, 본 방법은 본 발명의 결합 분자, 바람직하게는 항체 또는 그의 변이체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 비정상 세포를 수반하는 질병, 예컨대 암, 또는 바이러스 또는 기생충을 갖는 만성 감염을 갖는 개체의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 결합 분자, 바람직하게는 항체 또는 그의 변이체; 바람직하게는 본 발명의 이중특이성 항체 또는 그의 변이체를 추가로 제공한다.
일 바람직한 실시 형태에서, 기생충은 세포내 기생충이다.
개체에서 상기 개체 내의 비정상 세포에 대한 면역 반응을 자극하는 방법이 추가로 제공되며, 본 방법은 본 발명의 결합 분자, 바람직하게는 항체 또는 그의 변이체, 바람직하게는 이중특이성 항체 또는 그의 변이체를 상기 개체에 제공하는 (투여하는) 단계를 포함한다. 비정상 세포는 바람직하게는 암 세포, 바이러스-감염된 세포, 기생충 또는 기생충-감염된 세포이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 세포는 암 세포 또는 신생물성 세포이다.
도 1. 단일특이성 및 이중특이성 IgG에 사용되는 공통 경쇄.
도 1a: 공통 경쇄 아미노산 서열. 도 1b: 공통 경쇄 가변 도메인 DNA 서열 및 번역 (IGKV1-39/jk1). 도 1c: 공통 경쇄 불변 영역 DNA 서열 및 번역. 도 1d: IGKV1-39/jk5 공통 경쇄 가변 도메인 번역. 도 1e: V-영역 IGKV1-39A
도 2. 이중특이성 분자의 생성을 위한 IgG 중쇄. 도 2a: VH는 도 3에 나타낸 MF에 대한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산이다. 도 2b: CH1 영역. 도 2c: 힌지 영역. 도 2d: CH2 영역. 도 2e: L235G 및 G238R 치환을 함유하는 CH2. 도 2f: 치환 L351K 및 T366K (KK)를 함유하는 CH3 도메인. 도 2g. 치환 L351D 및 L368E (DE)를 함유하는 CH3 도메인.
도 3. 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열. 도 3a: CD137 특이적 클론의 VH 서열. 도 3b: PD-L1 특이적 클론의 VH 서열. 도 3c: OX40 특이적 클론의 VH 서열. 도 3d: PD-L1 특이적 클론의 VH 서열.
표기 MF는 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 공통 경쇄를 함유하는 fab를 지칭한다. 경쇄의 아미노산 서열은 도 1a에 나타나 있다. 밑줄친 서열은, 아미노산 서열에 대해, 카밧(Kabat) 넘버링에 따른 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 각각 나타낸다.
도 4. pIRES-Neo3 (MV1363)의 벡터 맵 및 특징.
도 5. pVAX1의 벡터 맵 및 특징.
도 6. '면역' 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 데 사용되는 파지미드 벡터 MV1473의 벡터 맵 및 특징.
도 7. 이중특이성 IgG 생성을 위해, KK-변이체 중쇄 또는 DE 변이체 중쇄 각각 내의 CD137, PD-1, PD-L1 및 OX40 특이적 Fab 아암의 발현에 사용된, IgG 발현 벡터 MV1452 또는 MV1453의 벡터 맵 및 특징.
도 8. MF1337로서 공통 경쇄와 조합될 때 특이적인 파상풍 독소이고, PD-L1×TT 이중특이성 IgG 분자를 생성하는 데 사용된 DE-변이체 중쇄에 존재하는 VH 유전자의 아미노산 서열. 밑줄친 서열은, 아미노산 서열에 대해, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 각각 나타낸다.
도 9. 이중특이성 IgG 생성을 위해, DE-변이체 중쇄 내의 TT 특이적 Fab 아암 MF1337의 발현에 사용된, IgG 발현 벡터 MV1377의 벡터 맵 및 특징.
도 10. PD-1/PD-L1 차단 검정.
10 ㎍/ml 이중특이성 IgG의 농도에서, 코팅된 PD-L에 대한 PD-L1의 상호작용을 차단하기 위한 항-PD-L1 항체 패널의 능력의 평가. 10 ㎍/ml 농도의 2가 벤치마크 PD-L1 항체 MPDL3280A에 의해 얻어진 데이터 (100% 차단)에 대해 데이터를 정규화한다. PD-L1 패널의 대표적인 예가 나타나 있다. 비-PD-1/PD-L1 특이적 인간 동종형 항체와의 인큐베이션에 의해 최대 결합 (0% 차단으로 정규화됨)을 확립하였다. 도 3에 나타나 있고 본 명세서에 나타내지 않은 MF 서열을 포함하는 모든 PD-L1 가변 도메인은 70%를 초과하여 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단한다.
도 11. 2가 CD137 항체에 의한 Jurkat CD137-NFkBluc 세포에서의 CD137의 활성화
도 12. IgG 교차결합 항체의 부재 (좌측) 또는 존재 (우측) 하에서의 CD137ХPD-L1 항체에 의한 Jurkat CD137-NFkBluc 세포에서의 CD137의 활성화. MF 번호는 CD137×PD-L1 이중특이성 항체에 존재하는 CD137 Fab를 지칭한다.
도 13. IL-2 방출에 의해 측정된 바와 같은, PD-L1 Fab 아암 (MF5594)과 조합된 2가 CD137 항체 (상측) 또는 1가 항체 (하측)에 의한 1차 T 세포의 활성화.
PG6744: 2개의 MF6744 아암 (6744×6744로도 표기됨)을 함유하는 2가 CD137 항체.
PG6783: 2개의 MF6783 아암 (6783×6783으로도 표기됨)을 함유하는 2가 CD137 항체.
PG6860: 2개의 MF6860 아암 (6860×6860으로도 표기됨)을 함유하는 2가 CD137 항체.
20H4.9: 국제 특허 출원 공개 WO 2005/035584호에 기초한 항-CD137 참조 항체.
도 14. PD-L1을 과발현하는 CHO 세포 또는 CHO 야생형 세포의 존재 하에서의 Jurkat-CD137-luc 세포 상에서의 CD137의 활성화. CD137 활성화를 루시페라제 발현에 의해 측정하였다.
PG6744: 2가 CD137 항체 (6744×6744)
PB14671: 이중특이성 CD137×PD-L1 항체 (6744×5361)
PB14580: 이중특이성 CD137×PD-L1 항체 (6744×5594)
PB14890: 이중특이성 CD137×TT 항체 (6744×1337)
PG6783: 2가 CD137 항체 (6783×6783)
PB14681: 이중특이성 CD137×PD-L1 항체 (6783×5361)
PB14590: 이중특이성 CD137×PD-L1 항체 (6783×5594)
PB15855: 이중특이성 CD137×TT 항체 (6783×1337)
20H4.9: 국제 특허 출원 공개 WO 2005/035584호에 기초한 항-CD137 참조 항체
도 15. PD-L1을 과발현하는 CHO 세포 또는 CHO 야생형 세포의 존재 하에서의 2가 CD137 항체, CD137×PD-L1 이중특이성 항체 또는 CD137×PD-L1 Oligoclonics® 병용물에 의한 1차 T 세포의 활성화. IL-2 방출에 의해 활성화를 측정하였다.
PG6744: 2가 CD137 항체 (6744×6744)
PB14671: 이중특이성 CD137×PD-L1 항체 (6744×5361)
PB14580: 이중특이성 CD137×PD-L1 항체 (6744×5594)
PB14890: 이중특이성 CD137×TT 항체 (6744Х1337)
20H4.9: 국제 특허 출원 공개 WO 2005/035584호에 기초한 항-CD137 참조 항체
MOR7480: 미국 특허 제8,337,850호에 기초한 항-CD137 참조 항체
도 16. IL-2 생성의 SEB-자극은 건강한 공여자 혈액 세포에서 항-CD137×PD-L1 이중특이성 항체 또는 항-CD137×PD-L1 Oligoclonics®에 의해 향상된다.
PB14580: 이중특이성 CD137×PD-L1 항체 (6744Х5594)
PB14671: 이중특이성 CD137×PD-L1 항체 (6744×5361)
MPDL3280A: 국제 특허 출원 공개 WO 2010/077634호에 기초한 항-PD-L1 참조 항체
PB9469: 이중특이성 PD-L1×TT 항체 (5594×1337)
PB14890: 이중특이성 CD137×TT 항체 (6744×1337)
20H4.9: 국제 특허 출원 공개 WO 2005/035584호에 기초한 항-CD137 참조 항체
대조 항체: PG2708p213; 항 RSV-G
도 17. 건강한 공여자 혈액 세포에서의 IL-2 생성의 SEB-자극은 항-CTLA-4 항체 10D1 (이는 이필루무맙에 기반함)과 대비하여 항-CD137×PD-L1 이중특이성 항체에 의해 대폭 향상된다.
도 18. PD-L1을 과발현하는 CHO 세포 (좌측 패널) 또는 CHO 야생형 세포 (우측 패널)의 존재 하에서의 Jurkat-OX-40 NFkB-luc 세포 상에서의 OX-40의 활성화. 루시페라제 발현을 측정함으로써 활성화를 결정하였다. PD-L1 Fab 아암 MF5561; PD-1 Fab 아암 MF6256 (도 43에 나타낸 서열).
도 19. T-세포 활성화 검정에서의 CD137 × PD-L1 항체 (12개의 CD137 Fab 아암)의 스크리닝. 단일 공여자로부터의 T 세포를, PD-L1을 과발현하는 CHO 세포 (상측 패널) 또는 CHO 야생형 세포 (하측 패널)의 존재 하에서 하기에 지시된 항체 패널의 용량 의존성 적정으로 37℃에서 72시간 동안 자극하였다. AlphaLISA를 사용하여 IL-2의 방출에 의해 CD137 활성화를 측정하였으며, 이는 IL-2 카운트로 표현하였다. 양성 대조 항체 20H4.9 (이 도면에서 PG6619로 지칭됨), 및 항-TT 음성 대조 항체 PG1337 (음성 대조 항체)
Figure pct00001

도 20. SEB PBMC 검정에서의 CD137 × PD-L1 항체 (12개의 CD137 Fab 아암)의 스크리닝. CD137×PD-L1 항체를 2 ㎍/ml SEB의 존재 하에서 SEB PBMC 검정에서 시험하였다. AlphaLISA를 사용하여 IL-2의 방출에 의해 CD137 활성화를 측정하였으며, 이는 IL-2 카운트로 표현하였다. 양성 대조 항체; 항-CTLA-4 양성 대조 항체 (이필리무맙에 기반함, 10D1) 및 항-RSV-G 음성 대조 항체 PG2708 (음성 대조 항체).
Figure pct00002

도 21. SEB PBMC 검정에서의 CD137 × PD-L1 항체 (8개의 CD137 Fab 아암)의 스크리닝. CD137×PD-L1 항체를 2 ㎍/ml SEB의 존재 하에서 SEB PBMC 검정에서 시험하였다. AlphaLISA를 사용하여 IL-2의 방출에 의해 CD137 활성화를 측정하였으며, 이는 IL-2 카운트로 표현하였다. 양성 대조 항체; 항-CTLA-4 양성 대조 항체 (이필리무맙에 기반함, 10D1) 및 항-RSV-G 음성 대조 항체 PG2708 (음성 대조 항체).
Figure pct00003

도 22. 이중특이성 항-CD137×PD-L1 항체 및 그의 모(parental) 2가 항-CD137 항체는 유세포측정에 의해 결정되는 바와 같이 인간 및 사이노몰거스 CD137에 결합한다.
도 23. 이중특이성 항-CD137×PD-L1 항체 및 그의 모 2가 항-PD-L1 항체는 유세포측정에 의해 결정되는 바와 같이 인간 및 레서스 마카크(rhesus macaque) PD-L1에 결합한다.
도 24. 이중특이성 항-CD137×PD-L1 항체 및 그의 모 2가 항-CD137 항체는 유세포측정에 의해 결정되는 바와 같이 활성화된 T 세포에 결합한다.
도 25. 이중특이성 항-CD137×PD-L1 항체 및 그의 모 2가 항-PD-L1 항체는 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 PD-L1 리간드 결합을 차단한다.
도 26. 이중특이성 항-CD137×PD-L1 항체 및 그의 모 2가 항-PD-L1 항체는 유세포측정에 의해 결정되는 바와 같이 CD137 리간드 결합을 차단한다.
도 27. 이중특이성 항-CD137×PD-L1 항체 및 그의 모 2가 항체는 시험관내 차단 리포터 검정에서 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용을 차단한다.
도 28a. CHO 야생형 세포와 대비하여, 세포당 상이한 PD-L1 결합 부위들을 발현하는 CHO 세포의 존재 하에서의 Jurkat-CD137-luc 세포 상에서의 CD137의 전사활성화. CD137 활성화를 루시페라제 발현에 의해 측정하였다.
도 28b. 세포 PD-L1당 상이한 PD-L1 결합 부위들을 발현하는 인간 종양 세포의 존재 하에서의 Jurkat-CD137-luc 세포 상에서의 CD137의 전사활성화. CD137 활성화를 루시페라제 발현에 의해 측정하였다.
도 28c. CHO-PD-L1, ES-2 또는 CHO 야생형 세포의 존재 하에서의 Jurkat-CD137-luc 세포 상에서의 CD137의 전사활성화. IgG를 10 ㎍/ml로 3회 반복하여 시험하였다. CD137 활성화를 루시페라제 발현에 의해 측정하였다. 시험된 항체 및 그의 조성이 하기에 나타나 있다.
Figure pct00004

도 29. T-세포 활성화 검정에서 CD137 × PD-L1 항체를 단일 참조 대조군 및 참조 대조군 병용물과 대비함. CD137 활성화를, IL-2 및 TNFα 사이토카인 방출로서 측정하고 루미넥스(Luminex) 분석에 의해 측정하였다.
도 30. 단일 참조 대조 항체 및 참조 대조 항체 병용물과 대비하여 T-세포 활성화 검정에서의 CD137 × PD-L1 항체 PB17311의 활성. CD137 활성화를, 다회 사이토카인 방출에 의해 측정하고 루미넥스 분석 (25plex)에 의해 측정하였다.
도 31. 이중특이성 항-CD137×PD-L1 항체는 PBMC 공여자 또는 SEB 농도에 관계없이 SEB 자극 검정 동안 PBMC에 의한 IL-2 방출을 일관되게 향상시킨다. CD137 활성화를 IL-2 방출로서 측정하고 루미넥스 분석에 의해 측정하였다.
도 32. 이중특이성 항-CD137×PD-L1 항체는 SEB 자극 검정 동안 사이토카인 방출을 향상시키는 데 있어서 항-CD137 벤치마크 항체 또는 항-CD137 및 항-PD-L1 벤치마크 항체의 등몰 혼합물보다 더 강력하다. CD137 활성화를, IL-2, IFNγ 및 TNFα 사이토카인 방출로서 측정하고 루미넥스 분석에 의해 측정하였다.
도 33. PB17311은 IFNγ 방출의 향상에 의해 입증된 바와 같이 항-CD3/CD28-자극 PBMC의 M2 거대파지-매개 억제를 억제한다.
도 34. PB17311은 CD8+ T 세포 프라이밍 후 T 세포 증폭을 향상시킨다.
도 35. PB17311은 프라이밍 후 미감작 T 세포의 중추 기억 세포 및 이펙터 T 세포로의 분화를 향상시킨다. TN/SCM : 미감작/줄기 세포 기억; TCM, 중추 기억, TEM, 이펙터 기억; TE, 말단 이펙터 세포.
도 36. 총 T 세포 집단에서의 CD107a 및 사이토카인의 발현에 대한 PB17311의 효과. TEM, 이펙터 기억; TE, 말단 이펙터 세포
도 37. T 세포 하위세트에서의 CD107a 및 사이토카인의 발현에 대한 PB17311의 효과.
도 38. 결직장암 (LM-CRC) 및 간 암종 (HCC)에서 간 전이로부터 유래된 종양-침윤 CD4 및 CD8 T 세포의 증식에 대한 PB17311의 효과.
도 39. PB17311에 대한 CD137 내의 주요 잔기의 확인 및 시각화. (A) 각각의 돌연변이된 클론에 대하여, 평균 결합값이 대조 항체 결합에 의해 측정된 바와 같은 클론의 평균 CD137 발현값 (회색원)의 함수로서 도표로 나타나 있다. 결합은 WT 클론에 의해 얻어진 것의 백분율로서 표현되어 있다. 점선은 주요 클론 (흑색점)을 확인하는 데 사용되는 역치를 나타낸다. (B) 이 표는 확인된 모든 주요 잔기에 대한 평균 결합 반응성 (및 범위)을 열거한다. PB17311 Ab 결합에 대한 주요 잔기 (흑색으로 표시됨)는 PB17311 Ab 결합에 대해서는 음성이었지만 (WT에 대한 결합의 20% 미만), 대조 항체, 555955 MAb에 대해서는 양성이었다 (WT의 70% 초과). (C) 주요 잔기 (박스로 표시된 윤곽선)가 인간 OX40 (PDB ID# 2HEY, 문헌[Compaan et al., 2006])에 결합된 뮤린 OX40L의 구조에 기초하여 CD137 모델 상에 시각화되어 있다. 검증되지 않은 잔기, C133은 회색으로 표시되어 있다.
도 40. 이종이식편 마우스 모델에서 일수 19에서의 중위 종양 부피에 대한 CD137×PD-L1 이중특이성 항체 PB17311의 효과. MTV, 중위 종양 부피; TGI, 종양 성장 억제; 만-휘트니 검정(Mann-Whitney test)에서의 통계적 유의성이 군 1과 비교하여 * (0.01 < P < 0.05) 및 *** (P < 0.001)로 나타남.
도 41. T-세포 활성화에 의한 sCD137의 방해. 인간 1차 T 세포를 활성화시키는 이중특이성 CD137×PD-L1 항체의 능력에 대한 가용성 CD137의 효과의 평가.
도 42. CD137 세포외 도메인의 아미노산 서열.
도 43. MF6256의 아미노산 서열.
종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 (TNFRSF)는 수용체들의 군이다. 이들은 전형적으로 세포외 시스테인-풍부 도메인을 통해 종양 괴사 인자 (TNF)와 결합하는 능력에 의해 특징지어진다. 신경 성장 인자 (NGF)를 제외하고, 모든 TNF는 원형 TNF-알파와 상동성이다. 대부분의 TNF 수용체는, 이들의 활성 형태에서, 원형질막에서 삼량체 복합체를 형성한다. 따라서, 대부분의 TNF 수용체는 막관통 도메인 (TMD)을 함유하고 세포막 상에 위치되어 있다. 그러나, 일부는 가용성 형태로 절단될 수 있고 (예를 들어, TNFR1), 일부는 전적으로 TMD가 결여되어 있다 (예를 들어, DcR3). TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원에 결합하는 본 발명의 항체는 수퍼패밀리의 막 결합 구성원에 결합한다. 세포막과 관련되지 않은 형태로만 존재하는 구성원은 본 발명의 범주 내에 있지 않다.
TNF 수용체는 수용체의 리간드의 결합 시에 세포 내부로의 신호전달에 관여한다. 일부 수용체는 하류 신호전달을 위하여 TRADD, TRAF, RIP 및 FADD와 같은 특정 어댑터 단백질을 필요로 한다. 본 발명과 관련하여, TNF 수퍼패밀리의 다양한 구성원이 바람직하다. 이들은 종양 괴사 인자 수용체 1; 종양 괴사 인자 수용체 2; 림프독소 베타 수용체; OX40; CD40; Fas 수용체; CD27; CD30; CD137; 사멸 수용체 3; 사멸 수용체 4; 사멸 수용체 5; 사멸 수용체 6; RANK; TROY; BAFF 수용체; B-세포 성숙 항원 (BCMA); 및 막관통 활성화 인자 및 칼슘-조절 사이클로필린 리간드-상호작용 단백질 (TACI)을 포함한다.
종양 괴사 인자 수용체 1은 종양 괴사 인자-알파에 대한 주요 수용체들 중 하나이다. 이 수용체는 다수의 대체명을 가지며, 이들 중 일부는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 1A; TNFRSF1A; TNF-R1; TNF-RI; TNFR-I; TNFR1; TNFAR; P60; P55; 종양 괴사 인자 수용체 1A 아이소형(Isoform) 베타; 종양 괴사 인자 결합 단백질 1; 종양 괴사 인자 수용체 유형 1; 종양 괴사 인자 수용체 유형 I; 종양 괴사 인자-알파 수용체; 종양 괴사 인자 수용체 1; CD120a 항원; TNFR1-D2; TNF-R-I; TNF-R55; CD120a; TNFR55; TNFR60; TNF-R; P55-R; Tbp1; FPF; 및 MS5를 포함한다. 종양 괴사 인자 수용체 1에 대한 외부 ID는 HGNC: 11916; Entrez Gene: 7132; Ensembl: ENSG00000067182; OMIM: 191190 및 UniProtKB: P19438이다.
종양 괴사 인자 수용체 2는 종양 괴사 인자-알파 (TNFα)와 결합하는 막 수용체이다. 이 수용체는 다수의 대체명을 가지며, 이들 중 일부는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 1B; TNFRSF1B; 종양 괴사 인자 수용체 유형 II; 종양 괴사 인자 수용체 2; P80 TNF-알파 수용체; TNF-RII; TNF-R2; TNFR2; TNFBR; P75; 종양 괴사 인자 결합 단백질 2; 종양 괴사 인자 베타 수용체; P75 TNF 수용체; CD120b 항원; 에타네르셉트(Etanercept); TNF-R-II; TNF-R75; P75TNFR; TNFR-II; CD120b; TNFR1B; TNFR80; TBPII이다. 종양 괴사 인자 수용체 2에 대한 외부 ID는 HGNC: 11917; Entrez Gene: 7133; Ensembl: ENSG00000028137; OMIM: 191191 및 UniProtKB: P20333이다.
림프독소 베타 수용체는 상피 및 골수계 계통의 세포를 포함한 대부분의 세포 유형의 표면 상에서 발현되지만, 전형적으로 정상 T 및 B 림프구 상에서는 발현되지 않는다. 이 단백질은 림프독소 막 형태 (림프독소-알파 및 림프독소-베타의 복합체)와 결합한다. 이 단백질 및 그의 리간드는 림프계 조직 및 형질전환된 세포의 개발 및 조직화에 있어서 역할을 한다. 이 단백질의 활성화는 경우에 따라 아폽토시스(apoptosis)를 촉발할 수 있다. 이 단백질은 다수의 별칭으로 알려져 있으며, 이들 중에는 LTBR; 종양 괴사 인자 수용체 2-관련 단백질; 종양 괴사 인자 수용체 유형 III; 종양 괴사 인자 C 수용체; D12S370; TNFRSF3; TNFCR; TNFR3; 림프독소 베타 수용체 (TNFR 수퍼패밀리, 구성원 3); 림프독소 B 수용체; LT-BETA-R; TNF-R-III; TNFR2-RP; TNF-RIII; TNFR-III; TNFR-RP; 및 CD18이 있다. 림프독소 베타 수용체에 대한 외부 ID는 HGNC: 6718; Entrez Gene: 4055; Ensembl: ENSG00000111321; OMIM: 600979 및 UniProtKB: P36941이다.
OX40은 CD28과 달리, 휴지기 미감작 T 세포
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상에서 구성적으로 발현되지 않으며, OX40은 활성화 이후 24 내지 72시간 후에 발현되는 2차 공동자극성 면역 관문 분자이며, 그의 리간드인 OX40L이 또한 휴지기 항원 제시 세포 상에서 발현되지 않지만, 그의 활성화 이후 발현된다. OX40의 발현은 T 세포의 활성화에 의존적이다. CD28이 없으면, OX40의 발현은 전형적으로 지연되고 더 낮은 수준으로 존재한다. 이 단백질은 다수의 별칭으로 알려져 있으며, 이들 중에는 TNFRSF4; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 4; TAX 전사-활성화 당단백질 1 수용체; OX40L 수용체; ACT35 항원; CD134 항원; TXGP1L; Tax-전사 활성화 당단백질 1 수용체; 림프계 활성화 항원 ACT35; OX40 세포 표면 항원; ATC35 항원; OX40 항원; ACT35; CD134; 및 IMD16이 있다. OX40에 대한 외부 ID는 HGNC: 11918; Entrez Gene: 7293; Ensembl: ENSG00000186827; OMIM: 600315 및 UniProtKB: P43489이다.
CD40은 항원 제시 세포 상에서 발견되는 공동자극성 단백질이고 항원 제시 세포의 활성화에 관여한다. T-헬퍼 세포 상의 CD154 (CD40L)의 CD40에 대한 결합은 항원 제시 세포를 활성화시키고, CD40에 의한 세포내 신호전달 및 다양한 하류 효과를 유도한다. 이 단백질은 다수의 상이한 별칭으로 알려져 있으며, 이들 중에는 CD40 분자; CD40 분자 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 5; CD40L 수용체; TNFRSF5; CDW40; Bp50; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 5; B 세포 표면 항원 CD40; B-세포 표면 항원 CD40; B 세포-관련 분자; CD40 항원; 및 P50이 있다. CD40에 대한 외부 ID는 HGNC: 11919; Entrez Gene: 958; Ensembl: ENSG00000101017; OMIM: 109535 및 UniProtKB: P25942이다.
Fas 수용체는 프로그래밍된 세포 사멸 (아폽토시스)로 이어지는 세포의 표면 상에 있는 사멸 수용체이다. 이것은 보다 중요한 아폽토시스 경로들 중 하나의 일부를 형성한다. 이것은 하기와 같은 다수의 대체명으로 알려져 있다: Fas 세포 표면 사멸 수용체; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 6; 아폽토시스-매개성 표면 항원 FAS; TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 6; FASLG 수용체; CD95 항원; TNFRSF6; APT1; FAS1; APO-1 세포 표면 항원; 아폽토시스 항원 1; Apo-1 항원; Fas AMA; ALPS1A; APO-1; FASTM; 및 CD95. FAS에 대한 외부 ID는 HGNC: 11920; Entrez Gene: 355; Ensembl: ENSG00000026103; OMIM: 134637 및 UniProtKB: P25445이다.
CD27은 T 세포 면역의 생성 및 장기간 유지를 위해 중요한 것으로 여겨진다. 이것은 리간드 CD70에 결합하고, B-세포 활성화 및 면역글로불린 합성을 조절하는 데 있어서 역할을 한다. CD27은 NF-κB 및 MAPK8/JNK의 활성화로 이어지는 신호를 전달한다. 프로아포톱시스 단백질인 CD27-결합 단백질 (SIVA)이 이 수용체에 결합할 수 있으며, 이 수용체에 의해 유도된 아폽토시스에 있어서 역할을 하는 것으로 여겨진다. 이 단백질에 대한 대체명은 특히, CD27 분자; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 7; T-세포 활성화 항원 CD27; CD27L 수용체; TNFRSF7; T14; T 세포 활성화 항원 S152; CD27 항원; s152; LPFS2; S152 및 Tp55이다. CD27에 대한 외부 ID는 HGNC: 11922; Entrez Gene: 939; Ensembl: ENSG00000139193; OMIM: 186711 및 UniProtKB: P26842이다.
CD30은 활성화된 T 및 B 세포에 의해 발현된다. TRAF2 및 TRAF5가 이 수용체와 상호작용하고, NF-카파B의 활성화로 이어지는 신호 전달을 매개하는 것으로 여겨진다. 이것은 아폽토시스의 양성 조절인자이며, 또한 자가반응성 CD8 이펙터 T 세포의 증식능을 제한하고 자가면역에 대해 신체를 보호하는 것으로 밝혀져 있다. 이것은 하기와 같은 다수의 상이한 명칭으로 알려져 있다: TNFRSF8; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 8; 림프구 활성화 항원 CD30; CD30L 수용체; Ki-1 항원; D1S166E; CD30; 사이토카인 수용체 CD30; CD30 항원; 및 Ki-1. CD30에 대한 외부 ID는 HGNC: 11923; Entrez Gene: 943; Ensembl: ENSG00000120949; OMIM: 153243 및 UniProtKB: P28908이다.
CD137은 활성화된 T-세포에 의해 발현될 수 있다. 이것은 또한 다른 세포, 예컨대 수지상 세포, 자연 살해 세포, 과립구, 및 염증 부위에서의 혈관벽의 세포 상에서 발견된다. 이 단백질은 T-세포의 활성화를 위한 그의 공동자극 활성에 대해 알려져 있다. CD137은 하기와 같은 다수의 상이한 명칭으로 알려져 있다: TNFRSF9; TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 9; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 9; T-세포 항원 4-1BB 상동체; 4-1BB 리간드 수용체; T-세포 항원 ILA; CD137 항원; CDw137; ILA; 인터류킨-활성화 수용체, 마우스 Ly63의 상동체; 림프구 활성화에 의해 유도 (ILA); 마우스 4-1BB의 상동체; 수용체 단백질 4-1BB; T 세포 항원 ILA; 및 4-1BB. CD137에 대한 외부 ID는 HGNC: 11924; Entrez Gene: 3604; Ensembl: ENSG00000049249; OMIM: 602250 및 UniProtKB: Q07011이다. CD137은 활성화된 CD8+ T 세포 상에서 가장 일반적으로 상향조절되는 유도성 수용체이다. CD137 신호전달은 NF-κB를 활성화시킴으로써 T 세포 기능을 향상시킨다 (문헌[Arch et al, 1998]). CD4+ T 세포, 단핵구, B 세포, 수지상 세포 (DC) 아집단 및 과립구 및 NK 세포를 포함한 다른 세포 면역 세포 유형이 다양한 수준으로 CD137을 발현할 수 있다 (문헌[Shao et al, 2011]). 단핵구에서, CD137은 지질다당류 (LPS) 및 IL-1β에 의한 활성화에 의해 유도가능하다. B 림프구에서, CD137 발현은 세포-표면 면역글로불린에 대한 항체에 의해 그리고 EBV에 의한 형질전환에 의해 유도된다. DC에서, CD137 연결(ligation)은, 염증성 사이토카인 (IL-6 및 IL-12)의 생성 및 이들의 생존을 향상시키는 것에 더하여, B7 공동자극성 분자 (CD80 및 CD86)의 상향조절을 통해 DC의 성숙을 유도한다 (문헌[Makkouk et al, 2015]). 호중구 상에서의 CD137 연결의 자연적 기능은 세균성 및 기생충성 감염의 식세포작용의 증가이다. 게다가, CD137의 연결은 시험관내(in vitro)에서 호중구 및 호산구 내의 IL-3/IL-5/GM-CSF 수용체에 의해 매개되는 항-아폽토시스 신호를 차단함으로써, 과립구 축적을 방지한다 (문헌[Simon, 2001]; 문헌[Vinay et al, 2011]). 연골세포, 내피 세포 및 종양 세포와 같은 비-림프계 세포에서, CD137 발현은 사이토카인 자극에 의해, 예컨대 연골세포의 경우 IL-1β, 내피 세포의 경우 염증성 사이토카인 TNF알파/ IFNγ/IL-1β, 그리고 종양 세포의 경우 IFNγ에 의해 유도된다. CD137을 자극하는 리간드 (CD137L)는 활성화된 항원 제시 세포 상에서 발현된다. CD137은 단량체 및 이량체로서 막 내에 존재한다 (문헌[Pollok et al, 1993]).
사멸 수용체 3은 활성화 및 항원-경험된 T 림프구에 의해 발현된다. 이 수용체는 또한 FoxP3 양성 조절성 T 림프구에 의해 발현된다. 이 수용체에 대한 리간드는 TL1A (TNFSF15)이며, 이는 톨-유사 수용체 또는 Fc 수용체 활성화 이후의 일부 내피 세포 및 항원 제시 세포에서 상향조절된다. 별개의 아이소형을 코딩하는 다양한 대안적으로 스플라이싱된 전사 변이체가 보고되어 있으며, 이들 중 대부분은 잠재적 분비 분자(potentially secreted molecule)이다. 이 수용체는 T-세포 활성화에 의해 유도된 림프구 증식을 제어하는 데 관여하는 것으로 여겨진다. 활성화는 T 세포 수용체의 이전의 결합에 의존적인 것으로 여겨진다. 리간드의 결합은 IL-2 수용체를 통해 내인성 IL-2에 대한 T 세포의 감수성을 증가시키고 T 세포 증식을 향상시킨다. 생체내(in vivo) 활성화는 동종 항원에 접하고 있는 T 세포에 특이적일 가능성이 높다. 휴지기 시에, 그리고 근본적 자가면역이 없는 개체에 있어서, 동종 항원에 규칙적으로 접하게 되는 T 세포의 대부분은 FoxP3+ 조절성 T 세포이다. 임의의 다른 외인성 신호의 부재 하에서의 사멸 수용체 3의 자극은 FoxP3+ 조절성 (CD4 양성) T 세포의 현저하고 특이적인 증식을 자극한다. 사멸 수용체 3의 치료적 효능제는 Treg 증폭을 자극하는 데 사용될 수 있는데, 이러한 Treg 증폭은 천식, 동종이계 고형 기관 이식 및 각막염의 실험 모델에서 염증을 감소시킬 수 있다. 다른 한편으로, 이 수용체와 자가항원 또는 백신 항원의 공동자극은 각각 면역병리의 증악 또는 증강된 백신-자극된 면역을 야기할 수 있다. 수용체 자극은 T 세포 매개 면역에 특이적이며, 이는 자가-항원 입수가능성 대비 외부 항원의 시간적 상황 및 품질에 따라 염증을 강화시키거나 둔화시키는 데 사용될 수 있다. 인간에서의 TNFRSF25의 자극은 CTLA-4 및 PD-1과 같은 공동자극성 차단 표적화 분자와 유사하지만 더 제어가능한 효과를 야기할 수 있다. 사멸 수용체 3은 또한 하기와 같은 다수의 상이한 명칭으로 알려져 있다: TNFRSF25; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 25; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 12 (전위 쇄-관련 막 단백질); 림프구-관련 사멸 수용체; 아폽토시스-매개성 수용체 TRAMP; 아폽토시스-매개성 수용체 DR3; 아폽토시스-유도성 수용체 AIR; 단백질 WSL-1; TNFRSF12; APO-3; DDR3; LARD; DR3; 아폽토시스 유도성 수용체; 사멸 수용체 베타; 단백질 WSL; WSL-LR; TRAMP; WSL-1; APO3; WSL1; TR3; 및 WSL. 사멸 수용체 3에 대한 외부 ID는 HGNC: 11910; Entrez Gene: 8718; Ensembl: ENSG00000215788; OMIM: 603366 및 UniProtKB: Q93038이다.
사멸 수용체 4는, TRAIL과 결합하고, 세포 사멸 신호를 전달하고 세포 아폽토시스를 유도하는 것으로 여겨지는 TNF-수용체 수퍼패밀리의 세포 표면 수용체이다. 이것은 하기와 같은 다수의 명칭으로 알려져 있다: TNFRSF10A; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 10a; TNF-관련 아폽토시스-유도성 리간드 수용체 1; 사멸 수용체 4; TRAIL 수용체 1; TRAIL-R1; TRAILR1; APO2; DR4; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 10a 변이체 2; 세포독성 TRAIL 수용체; CD261 항원; TRAILR-1 및 CD261. 사멸 수용체 4에 대한 외부 ID는 HGNC: 11904; Entrez Gene: 8797; Ensembl: ENSG00000104689; OMIM: 603611 및 UniProtKB: O00220이다.
사멸 수용체 5는, TRAIL과 결합하고 아폽토시스를 매개하는 TNF-수용체 수퍼패밀리의 세포 표면 수용체이다. 이 수용체는 종양 괴사 인자-관련 아폽토시스 유도성 리간드 (TNFSF10/TRAIL/APO-2L)에 의해 활성화될 수 있으며, 아폽토시스 신호를 전달한다. 이 수용체는 다수의 상이한 명칭으로 알려져 있으며, 이들 중에는 TNFRSF10B; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 10b; TNF-관련 아폽토시스-유도성 리간드 수용체 2; 사멸 수용체 5; TRAIL-R2; TRAILR2; KILLER; TRICK2; ZTNFR9; DR5; P53-조절된 DNA 손상-유도성 세포 사멸 수용체 (킬러(Killer)); 종양 괴사 인자 수용체-유사 단백질 ZTNFR9; TRAIL/Apo-2L에 대한 사멸 도메인 함유 수용체; 아폽토시스 유도성 단백질 TRICK2A/2B; 아폽토시스 유도성 수용체 TRAIL-R2; TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 10b; 세포독성 TRAIL 수용체-2; Fas-유사 단백질; TRAIL 수용체 2; CD262 항원; KILLER/DR5; TRICK2A; TRICK2B; TRICKB; 및 CD262가 있다. 사멸 수용체 5에 대한 외부 ID는 HGNC: 11905; Entrez Gene: 8795; Ensembl: ENSG00000120889; OMIM: 603612 및 UniProtKB: O14763이다.
사멸 수용체 6은 활성화 시에 세포 아폽토시스를 유도할 수 있다. 마우스에서의 녹아웃(knockout) 연구는 이 수용체가 T 헬퍼 세포 활성화에 있어서 역할을 하고, 염증 및 면역 조절에 관여할 수 있음을 시사한다. 또한, 이 수용체는 뇌에서 알츠하이머병을 야기하는 신경변성뿐만 아니라 스트레스 반응 및 세포 생존에 있어서의 신호 전달에 관여하는 것으로 여겨진다. 과발현은 발현 세포의 아폽토시스를 유도한다. APP (아밀로이드 전구체 단백질)는 이 수용체의 천연 리간드이며, 먼저 Aβ 및 N-APP로 절단된다. N-APP는, DR6과 상호작용하여 알츠하이머 환자의 축삭 변성을 촉발하는 단편이다. 사멸 수용체 6은 또한 하기와 같은 다수의 상이한 명칭으로 알려져 있다: TNFRSF21; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 21; DR6; TNFR-관련 사멸 수용체 6; CD358 항원; BM-018; 및 CD358. 사멸 수용체 6에 대한 외부 ID는 HGNC: 13469; Entrez Gene: 27242; Ensembl: ENSG00000146072; OMIM: 605732; UniProtKB: O75509이다.
RANK는 RANK-리간드 (RANKL)에 대한 수용체이고, 파골세포 분화 및 활성화를 조절하는 RANK/RANKL/OPG 신호전달 경로의 일부이다. 이는 골 재형성 및 수복, 면역 세포 기능, 림프절 발달, 체온 조절, 및 유선 발달과 관련되어 있다. 골단백질 (OPG)은 RANK에 대한 유인(decoy) 수용체이고, RANKL에 대해 경쟁함으로써 RANK 신호전달 경로의 자극을 조절한다. RANK의 세포질 도메인은 하류 표적, 예컨대 NF-κB 및 JNK에 신호를 전달한다. RANK는 골격근, 흉선, 간, 결장, 소장, 부신, 파골세포, 유선 상피 세포, 전립선, 혈관 세포, 및 췌장에서 발현된다. NF-κB의 활성화는 종종 RANKL에 의해 매개되지만, RANK 단독의 과발현이 또한 NF-κB 경로를 활성화시킬 수 있다. RANK는 하기와 같은 다수의 상이한 명칭으로 알려져 있다: TNFRSF11A; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 11a NFKB 활성화 인자; 이형접합성, 18, 염색체 영역 1의 손실; 파골세포 분화 인자 수용체; NF-KB의 수용체 활성화 인자; 골의 파제트병 2; ODFR; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 11a, NFKB의 활성화 인자; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 11a, NFKB 활성화 인자; 핵 인자-카파 B의 수용체 활성화 인자; CD265 항원; LOH18CR1; TRANCER; CD265; OPTB7; OSTS; PDB2; FEO 및 OFE. RANK에 대한 외부 ID는 HGNC: 11908; Entrez Gene: 8792; Ensembl: ENSG00000141655; OMIM: 603499 및 UniProtKB: Q9Y6Q6이다.
BAFF 수용체는 BAFF를 인식하는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 막 단백질이다. B-세포 활성화 인자 (BAFF)는 시험관내에서 B-세포 생존을 향상시키며, 말초 B-세포 집단의 조절인자이다. BAFF 수용체는 BAFF에 대한 수용체이며, 단일 세포외 페닐알라닌-풍부 도메인을 함유하는 III형 막관통 단백질이다. 이 수용체는 BAFF-매개 성숙 B-세포 생존에 필요한 주요 수용체인 것으로 여겨진다. BAFF는 또한 TNF 수용체, B-세포 성숙 항원 (BCMA), 및 막관통 활성화 인자 및 칼슘-조절 사이클로필린 리간드-상호작용 단백질 (TACI)에 의해 결합된다. BAFF-수용체는 하기와 같은 다수의 상이한 명칭으로 알려져 있다: TNFRSF13C; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 13C; B-세포-활성화 인자 수용체; BLyS 수용체 3; BAFF-R; BAFFR; B 세포-활성화 인자 수용체; CD268 항원; 프롤릭신; BROMIX; CD268; CVID4; 및 BR3. BAFF-수용체에 대한 외부 ID는 HGNC: 17755; Entrez Gene: 115650; Ensembl: ENSG00000159958; OMIM: 606269 및 UniProtKB: Q96RJ3이다.
B-세포 성숙 항원 (BCMA)은, B-세포 활성화 인자 (BAFF)를 인식하는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 세포 표면 수용체이다. 이 수용체는 성숙 B 림프구에서 우선적으로 발현되며, B 세포 발생 및 자가면역 반응에 중요한 것으로 여겨진다. 이 수용체는 종양 괴사 인자 (리간드) 수퍼패밀리, 구성원 13b (TNFSF13B/TALL-1/BAFF)에 특이적으로 결합하고, NF-카파B 및 MAPK8/JNK 활성화를 유도하는 것으로 밝혀져 있다. B-세포 성숙 항원은 또한 하기와 같은 다수의 별칭으로 알려져 있다: TNFRSF17; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 17; B-세포 성숙 단백질; BCM; B-세포 성숙 인자; CD269 항원; TNFRSF13A; 및 CD269. BCMA에 대한 외부 ID는 HGNC: 11913; Entrez Gene: 608; Ensembl: ENSG00000048462; OMIM: 109545 및 UniProtKB: Q02223이다.
막관통 활성화 인자 및 칼슘-조절 사이클로필린 리간드-상호작용 단백질 (TACI). 이 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 수퍼패밀리의 림프구-특이적 구성원이다. 이것은 칼슘-조절인자 및 사이클로필린 리간드 (CAML)와 상호작용한다. 이 단백질은 또한 BAFF 및 APRIL (TNSF13 또는 CD256)과 결합할 수 있다. TACI는 전사 인자 NFAT, AP1, 및 NF-카파-B의 활성화를 유도하고, TNF 리간드와 상호작용함으로써 체액성 면역에 있어서 역할을 한다. TACI가 결핍된 마우스는 비장 B 세포 및 혈청 Ig를 증가시켰는데, 이는 B 세포 생존에서 TACI에 대한 잠재적인 음성 조절 역할을 의미하는 것으로 제시되었다. 그러나, TACI의 결여가 더 많은 순환 BAFF가 이용가능해질 수 있게 하고, 이는 BR3에 결합하고 B 세포 구성원을 증가시킬 수 있다고 더 간단하게 설명할 수 있을 것이다. TACI와 관련된 질병은 공통 가변성 면역결핍 2(immunodeficiency, common variable, 2) 및 면역글로불린 A 결핍 2(immunoglobulin a deficiency 2)를 포함한다. TACI를 코딩하는 유전자는 17번 염색체 상의 스미스-마제니스 증후군 영역 내에 위치되어 있다. TACI는 또한 하기와 같은 다수의 다른 명칭으로 알려져 있다: TNFRSF13B, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 13B; 막관통 활성화 인자 및 CAML 상호작용 인자; 종양 괴사 인자 수용체 13B; CD267 항원; TNFRSF14B; CD267; CVID2; IGAD2; CVID; 및 RYZN 3. TACI에 대한 외부 ID는 HGNC: 18153; Entrez Gene: 23495; Ensembl: ENSG00000240505; OMIM: 604907 및 UniProtKB: O14836이다.
TROY는 배아 발생 동안 발현된다. 이것은 세포에서 과발현될 때 JNK 신호전달 경로를 활성화시키는 것으로 밝혀져 있다. 이 수용체의 활성화는 아폽토시스를 유도할 수 있다. 이 수용체는 배아 발달에 있어서 역할을 하는 것으로 여겨진다. 별개의 아이소형을 인코딩하는 대안적으로 스플라이싱된 전사 변이체가 기재되어 있다. TROY는 또한 하기와 같은 다수의 다른 명칭으로 알려져 있다: TNFRSF19; 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 19; 독성 및 JNK 유도인자; TRADE; TAJ; 및 TAJ-알파. TROY에 대한 외부 ID는 HGNC: 11915; Entrez Gene: 55504; Ensembl: ENSG00000127863; OMIM: 606122 및 UniProtKB: Q9NS68이다.
B7 패밀리는 면역 반응을 조절하는 림프구 상의 수용체에 결합하는, 다수의 구조적으로 관련된 세포-표면 단백질을 포함한다. 림프구의 활성화는 세포-표면, 항원-특이적 T-세포 수용체 또는 B-세포 수용체의 결합에 의해 개시된다. B7 리간드에 의해 동시에 전달되는 추가의 신호는 이들 세포의 면역 반응을 추가로 결정한다. 이른바 '공동자극성' 또는 '공동억제성'으로 불리는 이들 신호는 림프구 상의 CD28 수용체 패밀리를 통해 B7 패밀리 구성원에 의해 전달된다. B7-패밀리 구성원과 공동자극성 수용체의 결합은 면역 반응을 증강시키고, 이와 공동억제성 수용체의 결합은 면역 반응을 약화시킨다. 현재, 하기 구성원들이 이러한 패밀리의 일부인 것으로 여겨진다: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), 유도성 공동자극 리간드 (ICOS-L), 프로그래밍된 사멸-1 리간드 (PD-L1), 프로그래밍된 사멸-2 리간드 (PD-L2), B7-H3 (CD276), B7-H4, B7-H5, B7-H6 및 B7-H7. B7 패밀리 구성원은 림프계 및 비-림프계 조직에서 발현된다. 면역 반응의 조절에 대한 구성원의 효과는 B7-패밀리 유전자에 돌연변이를 갖는 마우스에서의 면역결핍 및 자가면역 질병의 발생에서 확인된다. B7 리간드에 의해 전달되는 신호의 조작은 자가면역, 염증성 질병 및 암의 치료에 있어서 잠재성을 보여주어 왔다.
TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분 및 B7 패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합하는 본 발명에 따른 결합 분자 또는 그의 항체 또는 변이체는 원하는 면역 반응이 특히 잘 촉진될 수 있다는 이점을 제공하는데, 이는 B7 패밀리 구성원이 림프구에 '공동자극성' 또는 '공동억제성' 신호를 전달하여 면역 반응을 증강 또는 약화시키기 때문이다. 따라서, B7 패밀리의 구성원을 표적화함으로써, 자극성 신호를 향상시키고/시키거나 억제성 신호를 상쇄시킴으로써, 예를 들어 비정상 세포에 대해, 원하는 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 것이 가능하다.
CD80은 활성화된 B 세포 및 단핵구 상에서 발견되는 단백질로서, 이는 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공동자극성 신호를 제공한다. 이것은 T 세포 표면 상의 하기 2개의 상이한 단백질에 대한 리간드이다: CD28 및 CTLA-4. CD28에 결합될 때, 이것은 공동자극과 관련되어 있는 반면, CTLA4에 대한 결합은 면역 반응의 약화와 관련되어 있다. CD80은 CD86과 동시에 작용하여 T 세포를 활성화시킨다. CD80은 PD-L1과도 결합하는 것으로 보고되어 있다. CD80은 하기와 같은 다수의 다른 명칭으로 알려져 있다: CD80 분자; CD80 항원; CD28 항원 리간드 1; B7-1 항원; B-림프구 활성화 항원 B7; CTLA-4 역-수용체(Counter-Receptor) B7.1; 활성화 B7-1 항원; CD28LG1; CD28LG; LAB7; BB1; B7; 공동자극성 인자 CD80; CD80 항원; 및 B7-1. CD80에 대한 외부 ID는 HGNC: 1700; Entrez Gene: 941; Ensembl: ENSG00000121594; OMIM: 112203 및 UniProtKB: P33681이다.
CD86은 항원-제시 세포 상에서 발현되는 단백질이다. 이것은 T 세포 활성화 및 생존을 위한 공동자극성 신호를 제공할 수 있다. 이것은 T 세포 표면 상의 하기 2개의 상이한 단백질에 대한 리간드이다: CD28 및 CTLA-4. CD28에 결합될 때, 이것은 공동자극과 관련되어 있는 반면, CTLA4에 대한 결합은 면역 반응의 약화와 관련되어 있다. CD86은 CD80과 동시에 작용하여 T 세포를 활성화시킨다. 이것은 하기와 같은 다수의 상이한 명칭으로 알려져 있다: CD86 분자; CD86 항원; CD28 항원 리간드 2; B7-2 항원; CTLA-4 역-수용체 B7.2; CD28LG2; FUN-1; BU63; B70; B-림프구 활성화 항원 B7-2; B-림프구 항원 B7-2; 활성화 B7-2 항원; CD86 항원; LAB72; 및 B7-2. CD86에 대한 외부 ID는 HGNC: 1705; Entrez Gene: 942; Ensembl: ENSG00000114013; OMIM: 601020 및 UniProtKB: P42081이다.
유도성 T-세포 공동자극 리간드 (ICOSL 또는 CD275)는 APC뿐만 아니라 다수의 비혈액학적 조직에 의해 구성적으로 발현된다. 발현은 진행 중인 염증에 의해 하향-조절될 수 있다. ICOSL은 인간에서 ICOS, CD28 및 CTLA-4와 상호작용하는 것으로 현재 알려져 있다. ICOSL/CD28 상호작용은 동종이계 항원에 대한 인간 T 세포의 1차 반응 및 기억 회상 반응을 공동자극하는 것으로 나타난다. ICOSL/CTLA-4는 공동억제성 신호를 발생시키는 것으로 여겨진다. ICOSL은 ICOSLG; B7-관련 단백질 1; B7 호모로그 2; B7-유사 단백질 Gl50; B7 상동체 2; B7RP-1; B7-H2; B7RP1; B7H2; 막관통 단백질 B7-H2 ICOS 리간드; CD275 항원; KIAA0653; ICOS-L; LICOS; 및 GL50으로도 알려져 있다. ICOSL에 대한 외부 ID는 HGNC: 17087; Entrez Gene: 23308; Ensembl: ENSG00000160223; OMIM: 605717 및 UniProtKB: O75144이다.
PD-L1은 임신, 조직 동종이식편, 자가면역 질병 및 다른 질병 상태 (예컨대, 간염)와 같은 특정 사건 동안 면역 반응을 억제하는 데 있어서 역할을 하는 1형 막관통 단백질이다. PD-L1은 다양한 유형의 암에서, 특히 NSCLC (문헌[Boland et al., 2013]; 문헌[Velcheti et al., 2014]), 흑색종, 신세포 암종, 위암, 간세포뿐만 아니라 다양한 백혈병 및 다발성 골수종 (문헌[Bernstein et al., 2014]; 문헌[Thompson et al., 2005])에서 발현된다. PD-L1은 암 세포의 세포질막 및 원형질막에 존재하지만, 종양 내의 모든 세포 또는 모든 암이 PD-L1을 발현하는 것은 아니다 (문헌[Dong et al., 2002]). 다수의 종양 미세환경 세포는 PD-L1 발현을 상향조절함으로써 면역 억제에 기여한다. 활성화된 T 세포에 의해 생성된 IFN-γ에 반응하여 PD-L1을 유도함으로써 종양이 그 자체를 보호하기 때문에, 이러한 효과는 "적응 면역 저항성"이라고 불린다 (문헌[Sharma et al., 2017]). PD-L1은 또한 발암유전자에 의해 조절될 수 있으며, 이러한 기전은 고유 면역 저항성으로 알려져 있다 (문헌[Akbay et al., 2013]). 종양 미세환경 내에서, PD-L1은 또한 골수계 세포 및 활성화된 T 세포 상에서 발현된다 (문헌[Tumeh et al., 2014]). PD-L1의 발현은 I형 및 II형 IFN-γ, TNF-α, LPS, GM-CSF 및 VEGF뿐만 아니라 사이토카인 IL-10 및 IL-4를 포함한 다수의 전염증성 분자에 의해 유도되며, IFN-γ가 가장 강력한 유도인자이다 (문헌[Kondo et al., 2010]; 문헌[Sznol and Chen, 2013]).
PD-1 또는 B7.1 (CD80)에 대한 PD-L1의 결합은 PD-1 발현 T 세포의 증식을 감소시키는 억제성 신호를 전달한다. PD-1은 아폽토시스를 통해 외래 항원 특이적 T 세포의 축적을 제어할 수 있는 것으로 여겨진다. PD-L1은 다양한 암 세포에 의해 발현되며, 그의 발현은, 적어도 부분적으로, 암 세포에 대한 면역 반응의 둔화의 원인이 되는 것으로 여겨진다. PD-L1은 단백질의 B7-패밀리의 구성원이며, 하기와 같은 다양한 다른 명칭으로 알려져 있다: CD274 분자; CD274 항원; B7 호모로그 1; PDCD1 리간드 1; PDCD1LG1; PDCD1L1; B7H1; PDL1; 프로그래밍된 세포 사멸 1 리간드 1; 프로그래밍된 사멸 리간드 1; B7-H1; 및 B7-H. CD274에 대한 외부 ID는 HGNC: 17635; Entrez Gene: 29126; Ensembl: ENSG00000120217; OMIM: 605402; UniProtKB: Q9NZQ7이다.
PD-L2는 PD-1에 대한 제2 리간드이다. PD-L2에 의한 PD-1의 결합은 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인 생성 및 T 세포 수용체 (TCR)-매개 증식을 억제한다. 낮은 항원 농도에서, PD-L2/PD-1 결합은 B7-CD28 신호를 억제한다. 높은 항원 농도에서, PD-L2/PD-1 결합은 사이토카인 생성을 감소시킨다. PD-L 발현은 인터페론 감마 처리에 의해 항원-제시 세포에서 상향-조절된다. 이것은 일부 정상 조직 및 다양한 종양에서 발현된다. PD-L1과 PD-L2는 기능이 중첩되어 있고 T 세포 반응을 조절하는 것으로 여겨진다. 이 단백질은 하기와 같은 다수의 다른 명칭으로 알려져 있다: 프로그래밍된 세포 사멸 1 리간드 2; B7 수지상 세포 분자; 프로그래밍된 사멸 리간드 2; 부티로필린 B7-DC; PDCD1 리간드 2; PD-1 리간드 2; PDCD1L2; B7-DC; CD273; B7DC; PDL2; PD-1-리간드 2; CD273 항원; BA574F11.2; 및 Btdc. PD-L2에 대한 외부 ID는 HGNC: 18731; Entrez Gene: 80380; Ensembl: ENSG00000197646; OMIM: 605723 및 UniProtKB: Q9BQ51이다.
B7-H3 (CD276) 발현은 다양한 악성종양에서 증가되며, 정상 순환 내피 세포와 종양-유래 순환 내피 세포 사이에서 구별될 수 있다 (문헌[Kraan et al British Journal of Cancer (2014) 111, 149
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156]). 이 수용체의 자극은 인간 골수 간질 세포의 골아세포로의 분화를 유도한다 (문헌[Xu et al 2011; Immunobiology 216 (2011) 1311
Figure pct00007
1317]). 이 단백질은 인간에서 4개의 Ig-유사 도메인을 함유하며, 한편 마우스 단백질은 그러한 도메인들 중 2개를 갖는 것으로 나타난다. 이 단백질은 골수계 세포 상에서 발현되는 촉발 수용체 (TREM)-유사 전사체 2 (TLT-2 또는 TREMML2)에 대해 첫 번째로 확인된 리간드인 것으로 여겨진다. 후자의 단백질은 B7-H3 (4Ig-B7-H3)과 결합하고, CD8 T-세포의 활성화를 공동자극한다 (문헌[Hofmeyer et al 2009 PNAS 105; 10277-10278]). CD276은 폭넓게 발현된다. 이것은 T 세포 공동자극인자로서 작용한다. CD276은 또한 하기와 같은 다수의 다른 명칭으로 알려져 있다: CD276 분자; 공동자극성 분자; CD276 항원; B7 호모로그 3; 4Ig-B7-H3; B7-H3; B7H3; 및 B7RP-2. CD276에 대한 외부 ID는 HGNC: 19137; Entrez Gene: 80381; Ensembl: ENSG00000103855; OMIM: 605715 및 UniProtKB: Q5ZPR3이다.
B7-H4 (VTCN1) mRNA는 폭넓게 발현되는 것으로 나타나지만, 단지 몇 개의 세포만이 막 상에 단백질을 능동적으로 발현한다. B7-H4 발현 및 활성화된 T 세포에 대한 결합은 세포 주기 정지, 감소된 증식, 및 감소된 IL-2 생성을 통해 T-세포 이펙터 기능을 억제한다. B7-H4는 다양한 인간 암에서 암 세포의 표면 및 면역억제 종양-관련 대식세포 (TAM) 상에서 상향 조절된다. B7-H4 경로를 통한 신호전달은 TCR-매개 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식, 세포-주기 진행, 및 IL-2 생성의 억제로 이어진다. B7-H4는 또한 하기와 같은 다수의 다른 명칭으로 알려져 있다: V-세트 도메인 함유 T 세포 활성화 억제인자 1; 면역 공동자극성 단백질 B7-H4; T-세포 공동자극성 분자 B7x; B7 수퍼패밀리 구성원 1; B7 호모로그 4; B7h.5; B7H4; T-세포 공동자극성 분자 B7x; B7 패밀리 구성원, H4; 단백질 B7S1; PRO1291; VCTN1; B7S1; B7X; 및 H4 2. B7-H4에 대한 외부 ID는 HGNC: 28873; Entrez Gene: 79679; Ensembl: ENSG00000134258; OMIM: 608162 및 UniProtKB: Q7Z7D3이다.
B7-H5 (VISTA)는 B7 패밀리의 55 내지 65 kDa 구성원이다. 이것은 골에서, 배아 줄기 세포 (ESC) 상에서, 그리고 종양 세포 표면 상에서 발현되는 막관통 분자이다. 종양 세포 상에서, 이 단백질은 MT1-MMP 발현 및 활성 둘 모두를 촉진하고, MT1-MMP에 대한 기질로서의 역할을 한다. 이것은 세포 운동성에 대한 잠재성을 증가시킨다. 이 단백질은 하기와 같은 다수의 다른 명칭으로 알려져 있다: 크로모좀 10 오픈 리딩 프레임 54(Chromosome 10 Open Reading Frame 54); V-세트 도메인-함유 면역조절 수용체; T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자; 스트레스-유도 분비 단백질-1; Sisp-1; SISP1; 스트레스 유도 분비 단백질 1; 혈소판 수용체 GI24; 혈소판 수용체 Gi24; 사멸 도메인1알파; DD1알파; B7H5; 및 GI24. 이 단백질에 대한 외부 ID는 HGNC: 30085; Entrez Gene: 64115; Ensembl: ENSG00000107738; OMIM: 615608 및 UniProtKB: Q9H7M9이다.
B7-H6은 B7 패밀리에 속하고 (MIM 605402 참조), 종양 세포 상에서 선택적으로 발현된다. B7-H6과 NKp30 (NCR3; MIM 611550)의 결합은 자연 살해 (NK) 세포 활성화 및 세포독성을 야기한다 (문헌[Brandt et al., 2009 J Exp Med. 2009 Jul 6;206(7):1495-503]). 자연 살해 (NK) 세포는 종양의 제거에 참여하는 선천 면역 시스템의 림프구이다. B7-H6은 항종양 NK 세포 세포독성 및 사이토카인 분비를 촉발하는 인간 수용체인 NKp30과 결합하는 종양 세포 표면 분자이다. B7-H6에 대한 다른 명칭은 NCR3LG1; 천연 살해 세포 세포독성 수용체 3 리간드 1; B7 호모로그 6; B7H6; 추정 Ig-유사 도메인-함유 단백질 DKFZp686O24166/DKFZp686I21167; 및 DKFZp686O24166이다. B7-H6에 대한 외부 ID는 HGNC: 42400; Entrez Gene: 374383; Ensembl: ENSG00000188211; OMIM: 613714 및 UniProtKB: Q68D85이다.
B7-H7 (HHLA2) 단백질은 태반의 영양아세포성 세포 및 장, 신장, 담낭, 및 유방의 상피에서 검출되었지만, 대부분의 다른 기관에서는 검출되지 않았다. HHLA2 단백질은 유방, 폐, 갑상선, 흑색종, 췌장, 난소, 간, 방광, 결장, 전립선, 신장, 및 식도로부터 유래되는 인간 암에서 널리 발현된다. 높은 HHLA2 발현은 국부 림프절 전이 및 단계와 관련되어 있다 (문헌[Janakiram et al. Clin Cancer Res; 21(10): 2359-66; May 15, 2015]). TMIGD2는 HHLA2에 대한 수용체들 중 하나로서 확인된다. B7-H7은 하기와 같은 다수의 상이한 명칭으로 알려져 있다: HERV-H LTR-관련 2; 인간 내인성 레트로바이러스-H 긴 말단 반복-관련 단백질 2; B7H7 및 B7y. B7-H7에 대한 외부 ID는 HGNC: 4905; Entrez Gene: 11148; Ensembl: ENSG00000114455; OMIM: 604371 및 UniProtKB: Q9UM44이다.
프로그래밍된 세포 사멸 1 단백질 (PD-1)은, CD28 수용체 패밀리에 속하고 T 세포 및 프로-B 세포 상에서 발현되는 세포 표면 수용체이다. PD-1은 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2와 결합하는 것으로 현재 알려져 있다. 면역 관문으로서 기능하는 PD-1은 T-세포의 활성화를 억제함으로써 면역 시스템을 하향 조절하는 데 있어서 중요한 역할을 하며, 다시 이는 자가면역을 감소시키고 자가-관용을 촉진시킨다. PD-1의 억제 효과는 림프절에서 항원 특이적 T-세포에서 아폽토시스 (프로그래밍된 세포 사멸)를 촉진하면서 동시에 조절성 T 세포 (억제인자 T 세포)에서 아폽토시스를 감소시키는 이중 기전을 통해 달성되는 것으로 여겨진다. PD-1은 또한 하기와 같은 다수의 상이한 별칭으로 알려져 있다: PDCD1; 프로그래밍된 세포 사멸 1; 전신 홍반성 루푸스 감수성 2; 단백질 PD-1; HPD-1; PD1; 프로그래밍된 세포 사멸 1 단백질; CD279 항원; CD279; HPD-L; HSLE1; SLEB2; 및 PD-1. PD-1에 대한 외부 ID는 HGNC: 8760; Entrez Gene: 5133; Ensembl: ENSG00000188389; OMIM: 600244 및 UniProtKB: Q15116이다. PD-1의 활성을 차단하는 새로운 부류의 약물, 즉 PD-1 억제제는 면역 시스템을 활성화시켜 종양을 공격하고, 이에 따라 일부 유형의 암을 치료하는 데 성공적으로 사용된다.
CLEC12A는 또한 C형 렉틴 도메인 패밀리 12, 구성원 A; C형 렉틴 단백질 CLL-1; MICL; 수지상 세포-관련 렉틴 2; C형 렉틴 수퍼패밀리; 골수계 억제성 C형 렉틴-유사 수용체; C형 렉틴-유사 분자-1; CLL-1; DCAL2; CLL1; C형 렉틴-유사 분자 1; DCAL-2; 살해 세포 렉틴 유사 수용체 서브패밀리 L, 구성원 1 (KLRL1); CD371 (문헌[Bakker A. et al. Cancer Res. 2004, 64, p8843 50]; GenBankTM 수탁 번호: AY547296; 문헌[Zhang W. et al.]; GenBankTM 수탁 번호: AF247788; 문헌[A.S. Marshall, et al. J Biol Chem 2004, 279, p14792―802]; GenBankTM 수탁 번호: AY498550; 문헌[Y.Han et al. Blood 2004, 104, p2858 66]; 문헌[H.Floyd, et al.]; GenBankTM 수탁 번호: AY426759; 문헌[C.H.Chen, et al. Blood 2006, 107, p1459 67])로 지칭된다. ID: HGNC: 31713; Entrez Gene: 160364; Ensembl: ENSG00000172322; OMIM: 612088; UniProtKB: Q5QGZ9. CLEC12A는 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 백혈병 줄기 세포 상에서 그리고 백혈병 아세포 상에서 발현되는 항원이며, 이에는 CD34 음성 또는 CD34 저발현 백혈병 줄기 세포 (측면 집단)가 포함된다 (문헌[A.B. Bakker et al. Cancer Res 2004, 64, p8443 50]; 문헌[Van Rhenen et al. 2007 Blood 110:2659]; 문헌[Moshaver et al. 2008 Stem Cells 26:3059]). CLEC12A의 발현은 조혈 계통으로, 특히 말초 혈액 및 골수 내의 골수계 세포, 즉 과립구, 단핵구 및 수지상 세포 전구체로 제한되는 것으로 달리 여겨진다. 더 중요하게는, CLEC12A는 조혈 줄기 세포 상에 존재하지 않는다. 이러한 발현 프로파일은 AML에서 CLEC12A를 특히 유리한 표적이 되게 한다. CLEC12A의 전장(full length) 형태는, 대부분의 다른 아이소형에는 부재하는 10개의 아미노산의 추가의 세포내 신전(cellular stretch)을 포함하는 275개의 아미노산 잔기를 포함하며, 엄격한 골수계 발현 프로파일 (표면 발현 및 mRNA 수준)을 나타낸다. 용어 'CLEC12A 또는 그의 기능적 등가물'은 문헌[Bakker et al. Cancer Res 2004, 64, p8443-50] 및 문헌[Marshall 2004 - J Biol Chem 279(15), p14792―802]에 기재된 바와 같이 엄격한 골수계 발현 프로파일 (표면 발현 수준 및 mRNA 수준 둘 모두)을 보유하는 상기 언급된 모든 (예컨대, 스플라이스 및 돌연변이) 변이체 및 이들의 아이소형을 의미한다. 본 발명의 CLEC12A 결합 항체는 인간 CLEC12A와 결합한다. 본 명세서에서 CLEC12A에 대해 언급되는 경우, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 이러한 언급은 인간 CLEC12A에 대한 것이다.
'ErbB1' 또는 'EGFR'은 Her- 또는 cErbB-1, -2, -3 및 -4로 불리는 4가지 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 패밀리의 구성원이다. EGFR은 4개의 하위-도메인으로 구성된 세포외 도메인 (ECD)을 갖는데, 이들 중 2개는 리간드 결합에 관여하고, 이들 중 하나는 동종-이량체화 및 이종-이량체화에 관여한다. 이 섹션에 사용된 참조 번호는 "본 명세서에 인용된 참고문헌"으로 제목을 붙인 목록에 있는 참고문헌의 번호를 지칭한다. EGFR은 다양한 리간드로부터의 세포외 신호들을 통합하여 다양한 세포내 반응을 생성한다. EGFR에 의해 활성화되는 주요 신호 전달 경로는 Ras-미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK) 유사분열촉진 신호전달 캐스케이드로 구성된다. 이러한 경로의 활성화는 티로신 인산화 EGFR에 대한 Grb2의 동원에 의해 개시된다. 이는 Grb2-결합된 Ras-구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 SOS (Son of Sevenless)를 통한 Ras의 활성화로 이어진다. 게다가, PI3-키나제-Akt 신호 전달 경로가 또한 EGFR에 의해 활성화되지만, 이러한 활성화는 Her3의 동시발현이 존재하는 경우에 훨씬 더 강하다. EGFR은 몇몇 인간 상피 악성종양, 특히 유방암, 방광암, 비소세포 폐암, 폐암, 결장암, 난소암, 두경부암 및 뇌암에 관여한다. 유전자에서의 활성화 돌연변이가 발견되었을 뿐만 아니라 수용체 및 그의 리간드의 과발현이 발견되었는데, 이는 자가분비 활성화 루프를 발생시킨다. 따라서, 이 RTK는 암 요법에 대한 표적으로서 광범위하게 사용되어 왔다. RTK를 표적화하는 소분자 억제제 및 세포외 리간드-결합 도메인에 대해 유도된 단일클론 항체 (mAb) 둘 모두가 개발되어 왔고 지금까지 몇몇 임상 성공이 밝혀졌을지라도, 이는 대개 선택된 환자군에 대해서 그러하다. 인간 EGFR 단백질 및 그것을 인코딩하는 유전자에 대한 데이터베이스 수탁 번호는 (GenBank NM_005228.3)이다. 이러한 수탁 번호는 표적으로서의 EGFR 단백질의 확인을 위한 추가의 방법을 제공하기 위하여 주로 주어지고, 항체에 의해 결합된 EGFR 단백질의 실제의 서열은, 예를 들어 인코딩 유전자 내의 돌연변이, 예컨대 일부 암에서 발생되는 것들 등 때문에 변동될 수 있다. 본 명세서에서 EGFR을 언급하는 경우, 이러한 언급은 달리 언급되지 않는 한 인간 EGFR을 지칭한다. EGFR과 결합하는 항원-결합 부위는 EGFR 및 그의 다양한 변이체, 예컨대 일부 EGFR 양성 종양 상에서 발현되는 것들과 결합한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 'ErbB-2' 또는 'HER2'는 인간에서 ERBB-2 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 지칭한다. 상기 유전자 또는 단백질에 대한 대체명은 CD340; HER-2; HER-2/neu; MLN 19; NEU; NGL; TKR1을 포함한다. ERBB-2 유전자는 종종 HER2 (인간 표피 성장 인자 수용체 2로부터 유래됨)로 불린다. 본 명세서에서 ErbB-2를 언급하는 경우, 이러한 언급은 인간 ErbB-2를 지칭한다. ErbB-2와 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항체는 인간 ErbB-2와 결합한다. ErbB-2 항원-결합 부위는, 인간과 다른 포유류 오르토로그(ortholog) 사이의 서열 및 3차 구조 유사성에 기인하여, 그러한 오르토로그와 또한 결합하지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 인간 ErbB-2 단백질 및 그것을 인코딩하는 유전자에 대한 데이터베이스 수탁 번호는 (NP_001005862.1, NP_004439.2, NC_000017.10, NT_010783.15, NC_018928.2)이다. 이러한 수탁 번호는 표적으로서의 ErbB-2의 확인을 위한 추가의 방법을 제공하기 위하여 주로 주어지고, 항체에 의해 결합된 ErbB-2 단백질의 실제의 서열은, 예를 들어 인코딩 유전자 내의 돌연변이, 예컨대 일부 암에서 발생되는 것들 등 때문에 변동될 수 있다. ErbB-2 항원 결합 부위는 ErbB-2 및 그의 다양한 변이체, 예컨대 일부 ErbB-2 양성 종양 세포에 의해 발현되는 것들과 결합한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 'ErbB-3' 또는 'HER3'은 인간에서 ERBB-3 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 지칭한다. 상기 유전자 또는 단백질에 대한 대체명은 HER3; LCCS2; MDA-BF-1; c-ErbB-3; c-erbb-3; erbb-3-S; p180-Erbb-3; p45-sErbb-3; 및 p85-sErbb-3이다. 본 명세서에서 ErbB-3을 언급하는 경우, 이러한 언급은 인간 ErbB-3을 지칭한다. ErbB-3과 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항체는 인간 ErbB-3과 결합한다. ErbB-3 항원-결합 부위는, 인간과 다른 포유류 오르토로그 사이의 서열 및 3차 구조 유사성에 기인하여, 그러한 오르토로그와 또한 결합하지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 인간 ErbB-3 단백질 및 그것을 인코딩하는 유전자에 대한 데이터베이스 수탁 번호는 (NP_001005915.1,NP_001973.2, NC_000012.11, NC_018923.2, NT_029419.12)이다. 이러한 수탁 번호는 표적으로서의 ErbB-3의 확인을 위한 추가의 방법을 제공하기 위하여 주로 주어지고, 항체에 의해 결합된 ErbB-3 단백질의 실제의 서열은, 예를 들어 인코딩 유전자 내의 돌연변이, 예컨대 일부 암에서 발생되는 것들 등 때문에 변동될 수 있다. ErbB-3 항원 결합 부위는 ErbB-3 및 그의 다양한 변이체, 예컨대 일부 ErbB-2 양성 종양 세포에 의해 발현되는 것들과 결합한다.
LGR4는 류신-풍부 반복 함유 G-단백질-결합된 수용체 4이다. 상기 유전자 또는 단백질에 대한 대체명은 GPR48; G 단백질-결합된 수용체 48; BNMD17; 류신-풍부 반복-함유 G-단백질-결합된 수용체 4; 류신-풍부 반복-함유 G-단백질 결합된 수용체 4; G-단백질 결합된 수용체 48이다.
LGR4와 결합하는 본 발명의 단백질 또는 항체는 인간 LGR4와 결합한다. 본 발명의 LGR4 결합 단백질 또는 항체는, 인간과 다른 포유류 오르토로그 사이의 서열 및 3차 구조 유사성에 기인하여, 그러한 오르토로그와 또한 결합하지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 인간 LGR4 단백질 및 그것을 인코딩하는 유전자에 대한 데이터베이스 수탁 번호는 (NC_000011.10; NC_018922.2; NT_009237.19; NP_060960.2)이다. 이러한 수탁 번호는 표적으로서의 LGR4의 확인을 위한 추가의 방법을 제공하기 위하여 주로 주어지고, 결합된 LGR4 단백질의 실제의 서열은, 예를 들어 인코딩 유전자 내의 돌연변이, 예컨대 일부 암에서 발생되는 것들 등 때문에 변동될 수 있다. LGR4 항원 결합 부위는 LGR4 및 그의 다양한 변이체, 예컨대 일부 LGR4 양성 종양 세포에 의해 발현되는 것들과 결합한다.
LGR5는 류신-풍부 반복 함유 G 단백질-결합된 수용체 5이다. 상기 유전자 또는 단백질에 대한 대체명은 류신-풍부 반복 함유 G 단백질-결합된 수용체 5; 류신-풍부 반복-함유 G 단백질-결합된 수용체 5; G-단백질 결합된 수용체 HG38; G-단백질 결합된 수용체 49; G-단백질 결합된 수용체 67; GPR67; GPR49; 고아 G 단백질-결합된 수용체 HG38; G 단백질-결합된 수용체 49; GPR49; HG38 및 FEX이다.
LGR5와 결합하는 본 발명의 단백질 또는 항체는 인간 LGR5와 결합한다. 본 발명의 LGR5 결합 단백질 또는 항체는, 인간과 다른 포유류 오르토로그 사이의 서열 및 3차 구조 유사성에 기인하여, 그러한 오르토로그와 또한 결합하지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 인간 LGR5 단백질 및 그것을 인코딩하는 유전자에 대한 데이터베이스 수탁 번호는 (NC_000012.12; NT_029419.13; NC_018923.2; NP_001264155.1; NP_001264156.1; NP_003658.1)이다. 이러한 수탁 번호는 표적으로서의 LGR5의 확인을 위한 추가의 방법을 제공하기 위하여 주로 주어지고, 결합된 LGR5 단백질의 실제의 서열은, 예를 들어 인코딩 유전자 내의 돌연변이, 예컨대 일부 암에서 발생되는 것들 등 때문에 변동될 수 있다. LGR5 항원 결합 부위는 LGR5 및 그의 다양한 변이체, 예컨대 일부 LGR5 양성 종양 세포에 의해 발현되는 것들과 결합한다.
ZNRF3은 징크 앤드 링 핑거(Zinc And Ring Finger) 3이다. 상기 유전자 또는 단백질에 대한 대체명은 징크 앤드 링 핑거 3; 징크/링 핑거 단백질 3; 링 핑거 단백질 203; KIAA1133; RNF203; 신규 C3HC4 유형 징크 핑거 (링 핑거); E3 유비퀴틴-단백질 리가제 ZNRF3; CTA-292E10.6; EC 6.3.2.; 및 BK747E2.3 3.이다.
ZNRF3과 결합하는 본 발명의 단백질 또는 항체는 인간 ZNRF3과 결합한다. 본 발명의 ZNRF3 결합 단백질 또는 항체는, 인간과 다른 포유류 오르토로그 사이의 서열 및 3차 구조 유사성에 기인하여, 그러한 오르토로그와 또한 결합하지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 인간 ZNRF3 단백질 및 그것을 인코딩하는 유전자에 대한 데이터베이스 수탁 번호는 (NC_000022.11; NT_011520.13; NC_018933.2; NP_001193927.1; NP_115549.2)이다. 이러한 수탁 번호는 표적으로서의 ZNRF3의 확인을 위한 추가의 방법을 제공하기 위하여 주로 주어지고, 결합된 ZNRF3 단백질의 실제의 서열은, 예를 들어 인코딩 유전자 내의 돌연변이, 예컨대 일부 암에서 발생되는 것들 등 때문에 변동될 수 있다. ZNRF3 항원 결합 부위는 ZNRF3 및 그의 다양한 변이체, 예컨대 일부 ZNRF3 양성 종양 세포에 의해 발현되는 것들과 결합한다.
RNF43은 링 핑거 단백질 43이다. 상기 유전자 또는 단백질에 대한 대체명은 링 핑거 단백질 43; RNF124; E3 유비퀴틴-단백질 리가제 RNF43; 링 핑거 단백질 43; EC 6.3.2.; URCC이다.
RNF43과 결합하는 본 발명의 단백질 또는 항체는 인간 RNF43과 결합한다. 본 발명의 RNF43 결합 단백질 또는 항체는, 인간과 다른 포유류 오르토로그 사이의 서열 및 3차 구조 유사성에 기인하여, 그러한 오르토로그와 또한 결합하지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 인간 RNF43 단백질 및 그것을 인코딩하는 유전자에 대한 데이터베이스 수탁 번호는 (NC_000017.11; NT_010783.16; NC_018928.2; NP_001292473.1; NP_001292474.1; NP_060233.3)이다. 이러한 수탁 번호는 표적으로서의 RNF43의 확인을 위한 추가의 방법을 제공하기 위하여 주로 주어지고, 결합된 RNF43 단백질의 실제의 서열은, 예를 들어 인코딩 유전자 내의 돌연변이, 예컨대 일부 암에서 발생되는 것들 등 때문에 변동될 수 있다. RNF43 항원 결합 부위는 RNF43 및 그의 다양한 변이체, 예컨대 일부 RNF43 양성 종양 세포에 의해 발현되는 것들과 결합한다.
서열 식별자에 대한 언급은 어느 단백질이 표적화되는지를 확인하기 위해 행해진다. 결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체는, 항체의 각각의 가변 도메인에 의해 인식되는 에피토프가 영향을 받고 있지 않는 한, 이들의 적어도 일부의 변이체, 예컨대 이들의 대립유전자 변이체, 스플라이스 변이체 및 돌연변이 변이체를 또한 인식한다. 상기 대체명들 중 일부는 다른 단백질을 지칭하는 데 사용되었을 수 있거나 또한 그렇지 않을 수 있다. 상기 명칭은 단지 참고 목적을 위해 주어진다. 결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체는 세포 상에서 발현된 그대로의 단백질에 결합한다. 이것은 또한, 결합 분자가 결합하는 에피토프가 이용가능한 한, 단백질의 변이체에 결합할 수 있다. 따라서, 에피토프가 이용가능한 한, 스플라이싱 변이체 또는 돌연변이 단백질 (존재하는 경우)이 또한 결합될 것이다. 결합 분자가 지시된 단백질에 결합한다는 사실은 그것이 특성(property)으로서 단백질에 결합할 수 있음을 의미하고 결합 분자가 표적에 실제로 결합됨을 내포하지는 않지만, 그것은 가능할 수 있다. 이는 또한 항체가 다른 단백질에 결합하지 않음을 의미하는 것은 아니다. 그러한 교차-반응성은 결합 분자, 예컨대 본 발명의 항체에 대해 현재 알려져 있지 않지만; 그러한 교차-반응성이 존재할 수 있음이 명시적으로 배제되지는 않는다.
본 발명은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원 (제1 막 단백질)의 세포외 부분 및 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합하는 결합 분자를 개시한다. 상기 제2 막 단백질은 바람직하게는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다. 그러한 결합 분자는 추가로 "본 발명의 결합 분자"로도 지칭된다. 결합 분자는 바람직하게는 결합 단백질이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 결합 분자는 항체 또는 그의 변이체, 바람직하게는 이중특이성 항체 또는 그의 변이체이다. 또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 2개 이상의 결합 분자를 포함하는 조성물 및 파트 키트가 제공된다.
본 발명의 결합 분자는 바람직하게는 항체 (또는 본 출원의 어딘가 다른 곳에 기재된 바와 같은 그의 변이체), 항체 모방체(antibody mimetic), 폴리펩티드, 압타머(aptamer) 또는 이들의 조합이다. 이러한 단백질 또는 압타머는 전형적으로 하나의 표적에 결합한다. 본 발명의 결합 분자는 2개 이상의 표적에 결합한다. 결합 분자는 바람직하게는 2개의 표적과 결합한다. 항체 또는 이중특이성 항체의 변이체는 이러한 양상을 유지한다. 결합 단백질 또는 압타머는 결합 부위 (항원 결합 부위)를 가지며, 표적이 이와 결합된다. 결합 단백질 또는 압타머는 바람직하게는 표적 (항원)에 대한 결합 부위를 갖는 2개 이상의 도메인을 포함하며, 바람직하게는 도메인당 하나의 결합 부위를 갖는다. 그러한 도메인은 바람직하게는 항체 가변 도메인 또는 그의 변이체이다. 항체 가변 도메인은 많은 연구 대상이 되어 왔다. 정상 가변 도메인의 결합 특이성을 보유하는 가변 도메인 또는 그의 부분과 유사한 많은 변이체가 제조된다. 그러한 변이체의 비제한적인 예가 본 명세서의 어딘가 다른 곳에 기재되어 있다.
이러한 항체, 항체 모방체, 폴리펩티드 및 압타머의 임의의 조합이 당업계에 알려진 방법에 의해 함께 연관될 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 본 발명의 결한 분자는 접합체 또는 융합 단백질이다. 항체의 경우, 다중특이성 항체를 제조하는 기술이 진행되어 왔는데, 이에는 정상 단일특이성 항체와 동일한 전체 구조를 갖지만 항체의 2개의 아암(arm) 각각이 상이한 표적과 결합하는 이중특이성 항체가 또한 포함되어 왔다.
항체 모방체는, 항체와 마찬가지로, 항원과 특이적으로 결합할 수 있지만 항체와 구조적으로 관련 없는 폴리펩티드이다. 항체 모방체는 통상, 몰질량이 약 3 내지 20 kDa인 인공 펩티드 또는 단백질이다. 항체에 비하여 일반적인 이점은 더 우수한 용해성, 조직 침투, 열 및 효소에 대한 안정성, 및 비교적 낮은 제조 단가이다. 항체 모방체의 비제한적인 예는 아피바디(affibody) 분자 (전형적으로, 단백질 A의 Z 도메인을 기반으로 함); 아필린(affilin) (전형적으로, 감마-B 결정질 또는 유비퀴틴을 기반으로 함); 아피머(affimer) (전형적으로, 시스타틴을 기반으로 함); 아피틴(affitin) (전형적으로, 설폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius) 유래 Sac7d를 기반으로 함); 알파바디(alphabody) (전형적으로, 삼중 나선 코일드 코일(Triple helix coiled coil)을 기반으로 함); 안티칼린(anticalin) (전형적으로, 리포칼린을 기반으로 함); 아비머(avimer) (전형적으로, 다양한 막 수용체의 A 도메인을 기반으로 함); DARPin (전형적으로, 안키린 반복 모티프(ankyrin repeat motif)를 기반으로 함); 피노머(fynomer) (전형적으로, Fyn 7의 SH3 도메인을 기반으로 함); 쿠니츠(kunitz) 도메인 펩티드 (전형적으로, 다양한 프로테아제 억제제의 쿠니츠 도메인을 기반으로 함); 및 모노바디(monobody) (전형적으로, 피브로넥틴의 III형 도메인을 기반으로 함)이다.
모노바디는 분자 스캐폴드로서 피브로넥틴 III형 도메인 (FN3)을 사용하여 구성되는 합성 결합 단백질이다. 모노바디는 표적-결합 단백질을 생성하기 위한 항체에 대한 간단하고 확실한 대체물이다. 용어 "모노바디"는 인간 피브로넥틴의 10번째 FN3 도메인을 사용하여 모노바디 개념을 보여준 최초의 논문을 발표한 Koide 그룹에 의해 1998년에 만들어졌다.
모노바디 및 다른 항체 모방체는 전형적으로 조합 라이브러리(combinatorial library)로부터 생성되는데, 조합 라이브러리에서는 스캐폴드의 일부분들이 분자 디스플레이 및 지향 진화(directed evolution) 기술, 예컨대 파지 디스플레이, mRNA 디스플레이 및 효모 표면 디스플레이를 사용하여 다양화된다. 다수의 항체 모방체는 그들 각각의 표적에 대해 높은 친화도 및 높은 특이성을 갖는다.
압타머는 특이적 표적 분자에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 분자이다. 압타머는 통상, 대형 랜덤 서열 풀(sequence pool)로부터 그것을 선택함으로써 생성되지만, 천연 압타머가 또한 리보스위치(riboswitch) 내에 존재한다. 압타머는 거대분자로서 기초 연구 및 임상 목적 둘 모두에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "접합체"는, 선택적으로 연결 영역에 의해 공유 결합된 둘 이상의 분자를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 접합체는 제1 단백질 또는 비단백질 모이어티(moiety)가 연결 영역에 의해 제2 단백질 또는 비단백질 모이어티에 결합된 것이다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자의 일부 실시 형태에서, 그것은 공유 결합된 둘 이상의 항체를 포함하거나 그로 이루어진다. 접합체는 제1 및 제2 모이어티로 제한되지 않고 일부 실시 형태에서는 또한 제3, 제4 또는 그 이상의 모이어티가 추가의 연결 영역에 의해 결합될 수 있다. 본 출원의 어딘가 다른 곳에 기재된 바와 같이, 단백질 모이어티의 예에는 폴리펩티드, 펩티드 모방체 또는 항체 (또는 본 출원의 어딘가 다른 곳에 기재된 바와 같은 항체의 일부, 유도체, 또는 유사체)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 비단백질 모이어티의 예에는 압타머가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 다수의 유형의 링커(linker)가 사용될 수 있고, 링커는 접합체 내의 분자 유형에 따라 그리고 링커의 원하는 특성 (길이, 가요성, 프로테아제 활성에 대한 저항성 및 다른 유사한 특성)에 따라 적절하게 선택될 것이다. 그러한 링커는 뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 적합한 합성 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 가요성 펩티드 링커일 수 있다. 소정 실시 형태에서, 링커는 절단가능한 링커일 수 있어서, 접합체의 부분들이 서로 분리될 수 있게 한다. 다른 실시 형태에서, 펩티드 링커는 나선형 링커일 수 있다. 단백질 및 다른 분자를 연결하기 위한 다양한 예 및 키트는 당업계에 알려져 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은, 재조합에 의해 DNA 수준에서 결합되어 있고 단일 폴리펩티드로서 함께 발현되는 둘 이상의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 단백질을 지칭한다. 융합 단백질은 또한 펩티드 연결 영역을 포함할 수 있는데, 이 또한 DNA에 의해 인코딩되고 융합 단백질과 함께 발현된다. 융합 단백질의 일부인 펩티드 링커는 가요성, 친수성, 프로테아제-저항성, 절단성 등과 같은 특정 특성을 갖도록 설계될 수 있다. 이들 모든 특성은 DNA 서열 내에서 설계될 수 있고, 링커를 설계하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 항체들은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해, 그리고 본 명세서에 기재된 바와 같이 함께 연결되어 이중특이성 또는 다중-표적화 항체를 형성할 수 있다. 더욱이, 이중특이성 항체는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해, 예를 들어 Biclonics®와 같은 기술 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2013/157954호 참조)을 사용함으로써 구성될 수 있다. 이중특이성 단일클론 항체 (BsMAb, BsAb)는 전형적으로, 2개의 상이한 단일클론 항체의 도메인들을 결합한 것을 포함하고, 결과적으로 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. Biclonics® 분자, 그러나 또한 다른 전장 IgG 이중특이성 항체는 scFv의 Fab의 전장 IgG 분자의 2개의 상이한 가변 영역에 의해 인코딩된 2개의 상이한 항원 결합 특이성을 갖는다. Biclonics®는 본 명세서의 어딘가 다른 곳에 상세히 기재된 바와 같이 2개의 상이한 공통 경쇄 (cLC) 항체를 인코딩하는 유전자 작제물들에 의한 개별 세포들의 공동-형질감염에 의해 생성될 수 있다. CH3 조작(engineering)은 효율적인 이종-이량체화(hetero-dimerization) 및 본질적으로 순수한 이중특이성 항체의 형성을 보장한다.
본 발명의 결합 분자는 바람직하게는 항체 또는 그의 변이체이다. 본 발명의 결합 분자는 바람직하게는 이중특이성 항체 또는 그의 변이체이다.
항체는 전형적으로 이른바 항원 결합 부위를 통해 그의 표적과 결합한다. 비변형 항원-결합 부위는 전형적으로 항체의 가변 도메인에 의해 형성되고 거기에 존재한다. 가변 도메인은 상기 항원-결합 부위를 함유한다. 항원과 결합하는 가변 도메인은 항원과 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 가변 도메인이다.
일 실시 형태에서, 항체 가변 도메인은 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 항원-결합 부위는 조합된 VH/VL 가변 도메인 내에, 또는 단지 VH 영역 또는 단지 VL 영역에만 존재할 수 있다. 항원-결합 부위가 가변 도메인의 2개의 영역 중 하나에 존재하는 경우, 상대(counterpart) 가변 영역은 결합 가변 영역의 접힘 및/또는 안정성에 기여할 수 있지만, 항원 그 자체의 결합에는 유의하게 기여하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 항원-결합은 항체의 그의 항원에 대한 전형적인 결합 능력을 지칭한다. 항원에 대한 항체의 결합은 다양한 방법으로 평가될 수 있다. 한 가지 방법은 항체를 항원 (바람직하게는, 항원을 발현하는 세포)과 함께 인큐베이션하고, (바람직하게는 세척 단계에 의해) 결합되지 않은 항체를 제거하고, 결합된 항체에 결합하는 표지된 항체에 의해 결합된 항체를 검출하는 것이다.
항체에 의해 결합되는 항원은 전형적으로 항체의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 항원 및 가변 도메인 둘 모두의 특이적 3차원 구조를 통해 매개되는데, 상기 특이적 3차원 구조는 이들 2개의 구조가 정밀하게 함께 결합될 수 있게 하며 (자물쇠 및 열쇠와 유사한 상호작용), 이는 단백질의 랜덤 비특이적 점착(random, non-specific sticking)과 대조적이다. 항체는 전형적으로 항원의 에피토프라 불리는 항원의 일부를 인식하기 때문에, 그리고 그러한 에피토프는 다른 화합물에도 마찬가지로 존재할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 항체는 다른 단백질이 동일한 에피토프를 함유한다면, 그러한 다른 화합물도 마찬가지로 인식할 수 있다. 따라서, 용어 "결합하는"은 동일한 에피토프를 함유하는 다른 단백질 또는 단백질(들)에 대한 항체의 결합을 배제하지 않는다. 그러한 다른 단백질(들)은 바람직하게는 인간 단백질이 아니다.
본 발명의 단백질, 예컨대 항체는 전형적으로 생후 인간, 바람직하게는 성인에서의 세포의 막 상의 지정된 표적 단백질 이외의 단백질에는 결합하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 항원 상의 에피토프와 결합하는 하나 이상의 가변 도메인을 함유하는, 바람직하게는 단백질의 면역글로불린 부류에 속하는 단백질성 분자를 의미하는데, 여기서 그러한 도메인은 항체의 가변 도메인으로부터 유래되거나 그와 서열 상동성을 공유한다. 치료적 용도를 위한 항체는 바람직하게는 가능한 한 치료하고자 하는 대상체의 천연 항체와 근접한다 (예를 들어, 인간 대상체의 경우 인간 항체). 결합하는 항체는 특이성 및 친화도의 관점에서 표현될 수 있다. 특이성은 어느 항원 또는 그의 에피토프가 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는지를 결정한다. 친화도는 특정 항원 또는 에피토프에 대한 결합의 강도에 대한 척도이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체의 별개의 아암들의 친화도는 나노몰 범위 내에 있다. 항체, 예컨대 본 발명의 이중특이성 항체는 전형적으로 천연 항체의 불변 도메인 (Fc 부분)을 포함하는데, 이는, 예를 들어 ADCC 및/또는 CDC 활성을 감소시키도록, 본 명세서의 어딘가 다른 곳에 기재된 바와 같이 조작될 수 있다. 본 발명의 항체는 전형적으로 이중특이성 전장 항체이며, 바람직하게는 인간 IgG 하위부류의 것이다.
용어 '가변 도메인', 'VH/VL 쌍', 'VH/VL'은 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용된다. 가변 도메인은 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된다. 중쇄의 가변 영역은 전형적으로 재배열된 VDJ 영역에 의해 형성된다. 경쇄의 가변 영역은 전형적으로 재배열된 VJ 영역에 의해 형성된다. 이제, VDJ/VJ 영역은 또한, 예를 들어 기능성 항체에 대해 입수가능한 많은 서열 정보를 사용하여 인공적으로 생성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 결합 분자 또는 항체 또는 변이체는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 결합 분자 또는 항체 또는 변이체는 CD137의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 결합 분자 또는 항체 또는 변이체는 CD137과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 PD-L1과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 결합 분자 또는 항체 또는 변이체는 2개 이하의 항원 결합 부위를 갖는다. 이는, 그러한 결합 분자 또는 항체 또는 변이체의 항원 결합 부분이 추가의 항원 결합 부위의 존재 없이 2개의 항원 결합 부위로 이루어짐을 의미한다. 2개의 항원 결합 부위 각각은 바람직하게는 면역글로불린 VH/VL 쌍을 함유한다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 분자 또는 항체 또는 변이체의 항원 결합 부분은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인 및 제2 막 단백질과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인으로 이루어진다. 소정의 바람직한 실시 형태는 IgG 포맷을 갖는 면역글로불린이며, 이는 본 발명에 따른 2가 결합 분자/항체/변이체의 반감기가 다가 화합물과 대비하여 전형적으로 더 길다는 이점을 제공한다. 더욱이, 본 발명에 따른 2가 결합 분자의 면역원성은 전형적으로 다가 화합물과 대비하여 더 낮다. 이들 실시 형태에 따른 분자/항체/변이체는 바람직하게는 천연 IgG의 구조를 유지하며, 이에 따라 천연 IgG의 구조와 관련된 모든 이점을 유지한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다가"는 3 이상의 특이성을 포함하며, 이는, 예를 들어 3가 및 4가 결합 분자에 존재한다.
일부 실시 형태는 본 발명에 따른 결합 분자 또는 항체 또는 변이체를 제공하며, 상기 결합 분자 또는 항체 또는 변이체의 항원 결합 부위들은, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 결합 분자 또는 항체 또는 변이체의 항원 결합 부위들은 CD137의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 결합 분자 또는 항체 또는 변이체의 항원 결합 부위들은 CD137과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 PD-L1과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위로 이루어진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 부위"는 항원의 에피토프와 특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 항체의 부위를 의미한다. 그러한 항원 결합 부위는 바람직하게는 항체의 가변 도메인, 특히 그의 CDR 영역으로부터 유래되거나, 또는 그와 서열 상동성을 공유한다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 상기 항원 결합 부위는 면역글로불린 VH/VL 쌍에 의해 형성된 면역글로불린 가변 도메인이다. 다른 실시 형태에서, 상기 항원 결합 부위는 항체 모방체, 예컨대 본 명세서에 전술된 아피바디 분자, 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린, 아비머, DARPin, 피노머, 쿠니츠 도메인 펩티드 또는 모노바디로부터로부터 유래된다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 "전장" 항체이다. 본 발명에 따른 용어 '전장'은, 20개 초과 크기의 아미노산 잔기를 갖는 하나 이상의 인공적으로 추가된 모이어티, 예컨대 추가의 항원 결합 부위 또는 추가의 활성화 부위 또는 추가의 리간드 또는 추가의 리간드-결합 모이어티를 함유하지 않는, 본질적으로 완전한 항체를 포함하는 것으로 정의된다. 그러나, 전장 항체는 온전한 항체의 모든 기능을 반드시 갖는 것은 아니다. 오해를 피하기 위하여, 전장 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유한다. 각각의 쇄는 불변 (C) 및 가변 (V) 영역을 함유하며, 이들은 중쇄의 경우 CH1, CH2, CH3, VH로 그리고 경쇄의 경우 CL, VL로 지정된 도메인들로 분해될 수 있다. 중쇄의 도메인들은 바람직하게는 천연 항체의 순서로 존재한다 (VH-CH1-CH2-CH3; 이는 VH 도메인이 CH1 도메인에 인접하고, 그 뒤로 CH2 도메인이 이어지고, 후속으로 CH3 도메인이 이어짐을 의미함). 경쇄의 도메인들은 또한 바람직하게는 천연 항체의 순서로 존재한다 (VL-CL; 이는 VL 도메인이 CL 도메인에 인접함을 의미함). 항체는 Fab 단편 부분 내에 함유된 가변 도메인을 통해 항원에 결합한다. 항체는 불변 도메인을 통해, 대개 Fc 부분을 통해 면역 시스템의 분자 및 세포와 상호작용할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 IgG, 바람직하게는 전장 IgG이다. 전장 IgG 항체가 바람직한데, 그의 전형적으로 유리한 반감기, 및 면역원성을 이유로 완전 자가 (인간) 분자와 가깝게 유지되어야 할 요망 때문이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 전장 IgG1, 전장 IgG2, 전장 IgG3 또는 전장 IgG4 항체이다.
본 발명에 따른 전장 항체는, 원하는 특성을 제공하거나 원래 쇄 내의 것들에 대한 단지 대체물인 돌연변이가 존재할 수 있는 항체를 포함한다. 그러한 돌연변이는 임의의 영역의 실질적인 부분의 결실이어서는 안 된다. 그러나, 생성되는 항체의 항원 결합 특성을 본질적으로 변경시키지 않고서, 한 개 또는 수 개의 아미노산 잔기가 산 삽입되거나, 결실되거나, 치환되거나 또는 이들이 조합된 항체는 용어 "전장 항체" 내에 포함된다. 예를 들어, IgG 항체는 불변 영역 내에 1 내지 20개의 아미노산 잔기의 삽입, 치환, 결실 또는 이들의 조합을 가질 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 이것은 감소된 이펙터 기능을 갖는 이중특이성 IgG 항체이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 이중특이성 전장 항체이다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 이중특이성 전장 IgG 항체, 바람직하게는 CH2/하부 힌지 영역에서 돌연변이되어 이펙터 기능을 감소시킨 이중특이성 전장 IgG 항체이다. CH2/하부 힌지 영역에서 돌연변이되어 이펙터 기능을 감소시킨 IgG1은 인간에서 그의 긴 순환 반감기에 기초하여 유리하다. 인간에서의 임의의 면역원성을 방지하기 위하여, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 인간 항체인 것이 바람직하다.
용어 '이중특이성' (bs)은 (상기에 정의된 바와 같은) 항체의 하나의 부분이 항원 상의 하나의 에피토프에 결합하고, 한편 제2 부분이 동일한 항원 또는 상이한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 것을 의미한다. 상이한 에피토프는 전형적으로 상이한 항원 상에 존재한다. 그러나, 상이한 에피토프는 또한 동일한 항원 상에 존재할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 제1 및 제2 항원은 실제로 2개의 상이한 단백질이다. 바람직한 이중특이성 항체는, 2개의 상이한 단일클론 항체의 부분들을 포함하고 결과적으로 2개의 상이한 에피토프, 바람직하게는 2개의 상이한 항원 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 항체이다. 이중특이성 항체에 의해 인식되는 2개의 항원의 발현 수준, (하위-)세포 국재화 및 화학량론에 따라, 항체의 Fab 아암 둘 모두는 그들의 에피토프와 동시에 결합할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 이중특이성 항체의 한쪽 아암은 전형적으로 하나의 항체의 가변 도메인을 함유하고, 다른 한쪽 아암은 다른 항체의 가변 도메인을 함유한다 (즉, 이중특이성 항체의 한쪽 아암은 하나의 중쇄가 하나의 경쇄와 쌍을 이룸으로써 형성되고, 한편 다른 한쪽 아암은 상이한 중쇄가 경쇄와 쌍을 이룸으로써 형성된다). 본 발명의 이중특이성 항체의 중쇄 가변 영역들은 전형적으로 서로 상이하고, 한편 경쇄 가변 영역들은 바람직하게는 본 발명의 이중특이성 항체 내에서 동일하다. 상이한 중쇄 가변 영역들이 동일하거나 공통된 경쇄 가변 영역과 관련된 이중특이성 항체는 또한 공통 경쇄 가변 영역 (cLcv)을 갖는 이중특이성 항체로 지칭된다. 경쇄 불변 영역이 또한 동일한 것이 바람직하다. 그러한 이중특이성 항체는 공통 경쇄 (cLc)를 갖는 것으로 지칭된다. 따라서, 양쪽 아암이 공통 경쇄를 포함하는, 본 발명에 따른 이중특이성 항체가 추가로 제공된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 이중특이성 항체는 바람직하게는 공통 경쇄 가변 도메인, 바람직하게는 공통 경쇄를 포함한다. 본 발명에 따른 용어 '공통 경쇄'는, 동일할 수 있거나, 또는 전장 항체의 결합 특이성에 영향을 주지 않으면서 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있는 경쇄를 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 공통 경쇄의 정의의 범위 내에서는, 예를 들어 보존적 아미노산 변화, 중쇄와 쌍을 이룰 때 결합 특이성에 기여하지 않거나 단지 부분적으로 기여하는 영역 내에서의 아미노산의 변화 등을 도입 및 시험함으로써, 동일하지 않지만 여전히 기능적으로 등가인 경쇄를 제조하거나 찾아내는 것이 가능하다. 용어 '재배열된'이 추가되거나 추가되지 않은 용어 '공통 경쇄', '공통 LC', 'cLC', '단일 경쇄'는 모두 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용된다. 용어 '재배열된'이 추가되거나 추가되지 않은 용어 '공통 경쇄 가변 영역', '공통 VL', '공통 LCv', 'cLCv', '단일 VL'은 모두 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용된다. 이중특이성 항체가, 상이한 결합 특이성의 적어도 2개, 그리고 바람직하게는 복수의 중쇄 (가변 영역)와 조합하여 기능성 항원 결합 도메인을 갖는 항체를 형성할 수 있는 공통 경쇄 (가변 영역)를 갖는 것이 본 발명의 바람직한 태양이다 (국제 특허 출원 공개 WO2004/009618호, WO2009/157771호). 공통 경쇄 (가변 영역)는 바람직하게는 인간 경쇄 (가변 영역)이다. 공통 경쇄 (가변 영역)는 바람직하게는 생식세포계열(germline) 서열을 갖는다. 바람직한 생식세포계열 서열은, 인간 레퍼토리에서 빈번하게 사용되고 우수한 열역학적 안정성, 수율 및 용해성을 갖는 경쇄 가변 영역이다. 바람직한 생식세포계열 경쇄는 O12이다. 공통 경쇄는 바람직하게는 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01이다 (도 1a). 공통 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01의 가변 영역이다. 공통 경쇄는 바람직하게는, 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 1b 또는 도 1d에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다. 공통 경쇄는 바람직하게는 경쇄 불변 영역, 바람직하게는 카파 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 공통 경쇄를 인코딩하는 핵산은 공통 경쇄 단백질을 발현하는 데 사용되는 세포 시스템에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 인코딩 핵산은 생식세포계열 핵산 서열로부터 벗어날 수 있다.
일 바람직한 실시 형태에서, 경쇄는, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 1a에 나타낸 바와 같은 O12 / IgVκ1-39*01 유전자 세그먼트의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 영역을 포함한다. 어구 "O12 경쇄"가 본 명세서 전체에 걸쳐, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 1a에 나타낸 바와 같은 O12 / IgVκ1-39*01 유전자 세그먼트의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄에 대한 축약어로서 사용될 것이다. IgVκ1-39는 면역글로불린 가변 카파 1-39 유전자에 대한 축약어이다. 이 유전자는 또한 면역글로불린 카파 가변 1-39; IGKV139; IGKV1-39; O12a 또는 O12로 알려져 있다. 이 유전자에 대한 외부 ID는 HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371이다. IgVκ1-39에 대한 바람직한 아미노산 서열이 도 1e에 제공되어 있다. 이것은 V-영역의 서열을 열거한다. V-영역은 5개의 J-영역들 중 하나와 조합될 수 있다. 도 1b 및 도 1d는 J-영역과 조합된 IgVκ1-39에 대한 2개의 바람직한 서열을 기재한다. 합쳐진 서열들은 IGKV1-39/jk1 및 IGKV1-39/jk5로 나타내며; 대체명은 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJ
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5*01 (imgt.org에 있는 IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹에 따른 명명법)이다.
경쇄 가변 영역을 포함하는 O12 / IgVκ1-39*01은 생식세포계열 서열인 것이 바람직하다. 경쇄 가변 영역을 포함하는 IGJκ1*01 또는 /IGJκ5*01은 생식세포계열 서열인 것이 추가로 바람직하다. 일 바람직한 실시 형태에서, IGKV1-39/jk1 또는 IGKV1-39/jk5 경쇄 가변 영역은 생식세포계열 서열이다.
일 바람직한 실시 형태에서, 경쇄 가변 영역은 생식세포계열 O12 / IgVκ1-39*01을 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 경쇄 가변 영역은 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, IgVκ1-39*01/IGJκ1*01이다. 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 생식세포계열 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 생식세포계열 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01, 바람직하게는 생식세포계열 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01을 포함한다.
O12 경쇄를 갖는 항체를 생성하는 성숙 B-세포는 종종 생식세포계열 서열, 즉 유기체의 비-림프계 세포에서의 정상 서열에 대해 하나 이상의 돌연변이를 겪은 경쇄를 생성한다. 이들 돌연변이를 담당하는 과정은 종종 체세포 (초)돌연변이로 지칭된다. 생성된 경쇄는 친화성 성숙된(affinity matured) 경쇄로 지칭된다. O12 생식세포계열 서열로부터 유래되는 경우, 그러한 경쇄는 O12-유래 경쇄이다. 본 명세서에서, 어구 "O12 경쇄"는 O12-유래 경쇄를 포함할 것이다. 물론, 체세포 초돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이는 또한 실험실에서 인공적으로 도입될 수 있다. 실험실에서는 또한 다른 돌연변이가, 반드시 양에 있어서는 아니고, 종류에 있어서 경쇄의 특성에 영향을 주지 않으면서 도입될 수 있다. 경쇄가, 0 내지 10개, 바람직하게는 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 1a, 도 1b, 도 1d 또는 도 1e에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 경우, 그것은 적어도 O12 경쇄이다. 일 바람직한 실시 형태에서, O12 경쇄는, 0 내지 9개, 0 내지 8개, 0 내지 7개, 0 내지 6개, 0 내지 5개, 0 내지 4개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 1a, 도 1b, 도 1d 또는 도 1e에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄이다. 일 바람직한 실시 형태에서, O12 경쇄는, 0 내지 5개, 바람직하게는 0 내지 4개, 더 바람직하게는 0 내지 3개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 1a, 도 1b, 도 1d 또는 도 1e에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄이다. 일 바람직한 실시 형태에서, O12 경쇄는, 0 내지 2개, 더 바람직하게는 0개 또는 1개, 가장 바람직하게는 0개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 1a, 도 1b, 도 1d 또는 도 1e에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄이다. 일 바람직한 실시 형태에서, O12 경쇄는, 언급된 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 1a 또는 도 1b에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 경쇄는 도 1a의 서열을 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 경쇄 가변 영역은 도 1b의 서열을 포함한다.
공통 경쇄 (가변 영역)는 람다 경쇄일 수 있으며, 이에 따라 이것은 본 발명과 관련하여 또한 제공되지만, 카파 경쇄가 바람직하다. 본 발명의 공통 경쇄의 불변 부분은 카파 또는 람다 경쇄의 불변 영역일 수 있다. 그것은 바람직하게는 카파 경쇄의 불변 영역이며, 바람직하게는 여기서 상기 공통 경쇄는 생식세포계열 경쇄, 바람직하게는 IgVKl-39 유전자 세그먼트를 포함하는 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄, 가장 바람직하게는 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVKl-39*01/IGJKl*01 (도 1)이다. 용어 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01, IGKV1-39/IGKJ1, huVκ1-39 경쇄 또는 짧게 줄여 huVκ1-39, 또는 간단히 1-39는 본 출원 전체에 걸쳐 상호교환 가능하게 사용된다. 명백하게, 당업자는 "공통"이 또한 동일하지 않은 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 기능적 등가물을 지칭함을 인식할 것이다. 상기 경쇄의 많은 변이체가 존재하는데, 이러한 변이체에는 기능성 결합 영역의 형성에 영향을 주지 않는 돌연변이 (결실, 치환, 부가)가 존재한다.
IgVκ1-39는 면역글로불린 가변 카파 1-39 유전자에 대한 축약어이다. 이 유전자는 또한 면역글로불린 카파 가변 1-39; IGKV139; IGKV1-39; O12a 또는 O12로 알려져 있다. 이 유전자에 대한 외부 ID는 HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371이다. IgVκ1-39에 대한 바람직한 아미노산 서열이 도 1에 제공되어 있다. 이것은 V-영역의 서열을 열거한다. V-영역은 5개의 J-영역들 중 하나와 조합될 수 있다. 도 1은 J-영역과 조합된 IgVκ1-39에 대한 2개의 바람직한 서열을 기재한다. 합쳐진 서열들은 IGKV1-39/jk1 및 IGKV1-39/jk5로 나타내며; 대체명은 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (imgt.org에 있는 IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹에 따른 명명법)이다.
공통 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 카파 경쇄 불변 영역에 연결된다. 일 바람직한 실시 형태에서, 경쇄는 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, IgVκ1-39*01/IGJκ1*01이다.
공통 경쇄를 생성하는 세포는, 예를 들어 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 및 람다 불변 영역에 융합된 언급된 경쇄의 가변 영역을 포함하는 경쇄를 생성할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 이중특이성 항체 또는 그의 변이체는 바람직하게는, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합하는 하나의 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역 (VH/VL) 조합 및 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합하는 제2 VH/VL 조합을 가지며, 상기 제2 막 단백질은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 이중특이성 항체 또는 그의 변이체는 바람직하게는, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합하는 하나의 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역 (VH/VL) 조합 및 B7 패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합하는 제2 VH/VL 조합을 갖는다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이것은 원하는 면역 반응이 특히 잘 촉진될 수 있다는 이점을 제공하는데, 이는 B7 패밀리 구성원이 림프구에 '공동자극성' 또는 '공동억제성' 신호를 전달하여 면역 반응을 증강 또는 약화시키기 때문이다. 따라서, B7 패밀리의 구성원을 표적화함으로써, 자극성 신호를 향상시키고/시키거나 억제성 신호를 상쇄시킴으로써, 예를 들어 비정상 세포에 대해, 원하는 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 것이 가능하다.
일 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 VH/VL 조합에서의 VL은 상기 제2 VH/VL 조합에서의 VL과 유사하다. 더 바람직한 실시 형태에서, 제1 VH/VL 조합에서의 VL과 제2 VH/VL 조합에서의 VL은 동일하다. 일 바람직한 실시 형태에서, 이중특이성 항체는, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합하는 하나의 중쇄/경쇄 (H/L 쇄) 조합 및 B7 패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합하는 하나의 H/L 쇄 조합을 갖는 전장 항체이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 H/L 쇄 조합에서의 경쇄는 상기 제2 H/L 쇄 조합에서의 경쇄와 유사하다. 더 바람직한 실시 형태에서, 제1 H/L 쇄 조합에서의 경쇄와 제2 H/L 쇄 조합에서의 경쇄는 동일하다.
이중특이성 항체의 생성에 유리한 몇 가지 방법이 공개되어 있거나, 또는 역으로, 단일특이성 항체에 대해서도 그러하다. 본 발명에서, 세포는 각각의 단일특이성 항체의 생성에 비하여 이중특이성 항체의 생성에 유리한 것이 바람직하다. 이는 전형적으로 중쇄의 불변 영역을 변형시켜, 이들이 동종이량체화에 비하여 이종이량체화 (즉, 다른 중쇄/경쇄 조합의 중쇄와의 이량체화)를 유리하게 함으로써 달성된다. 일 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 이중특이성 항체는 양립가능한 이종이량체화 도메인들을 갖는 2개의 상이한 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 다양한 양립가능한 이종이량체화 도메인들이 당업계에 기재되어 있다. 양립가능한 이종이량체화 도메인들은 바람직하게는 양립가능한 면역글로불린 중쇄 CH3 이종이량체화 도메인들이다. 야생형 CH3 도메인이 사용되는 경우, 2개의 상이한 중쇄 (A 및 B)와 공통 경쇄의 동시발현은 3개의 상이한 항체종, AA, AB 및 BB를 생성할 것이다. AA 및 BB는 2개의 단일특이성 2가 항체에 대한 표기이고, AB는 이중특이성 항체에 대한 표기이다. 원하는 이중특이성 생성물 (AB)의 백분율을 증가시키기 위하여, CH3 조작이 사용될 수 있거나, 또는 다시 말하면, 이하에서 정의된 바와 같은 양립가능한 이종이량체화 도메인을 갖는 중쇄를 사용할 수 있다. 당업계에는 그러한 중쇄 이종-이량체화가 달성될 수 있는 다양한 방법이 기술되어 있다. 한 가지 방법은 '놉 인투 홀(knob into hole)' 이중특이성 항체를 생성하는 것이다. 미국 특허 출원 공개 제20030078385호 (Arathoon et al.)를 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 '양립가능한 이종이량체화 도메인'은, 조작된 도메인 A'이 조작된 도메인 B'과 함께 이종이량체를 우선적으로 형성하도록 하고 역으로도 성립되도록 하며, A'-A' 및 B'-B' 사이의 동종이량체화는 감소되도록 조작된 단백질 도메인을 지칭한다.
미국 특허 출원 제13/866,747호 (현재 미국 특허 제9,248,181호로 허여됨), 미국 특허 출원 제14/081,848호 (현재 미국 특허 제9,358,286호로 허여됨) 및 PCT/NL2013/050294호 (국제 특허 출원 공개 WO2013/157954호로 공개됨) (이들은 본 명세서에 참고로 포함됨)에는, 양립가능한 이종이량체화 도메인들을 사용하여 이중특이성 항체를 생성하기 위한 방법 및 수단이 개시되어 있다. 이들 수단 및 방법은 또한 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 이중특이성 항체는 바람직하게는 본질적으로 단지 이중특이성 전장 IgG 분자만을 생성하기 위한 돌연변이를 포함한다. 바람직한 돌연변이는 제1 CH3 도메인 내의 아미노산 치환 L351K 및 T366K (EU 넘버링) ('KK-변이체' 중쇄) 및 제2 도메인 내의 아미노산 치환 L351D 및 L368E ('DE 변이체' 중쇄)이거나, 또는 역으로도 성립된다. 미국 특허 제9,248,181호 및 미국 특허 제9,358,286호뿐만 아니라 PCT 출원인 국제 특허 출원 공개 WO2013/157954호에서, DE-변이체와 KK-변이체가 우선적으로 쌍을 이루어서 이종이량체 (이른바, 'DEKK' 이중특이성 분자)를 형성하는 것으로 이미 입증되었다. DE-변이 중쇄들의 동종이량체화 (DEDE 동종이량체)는 동일한 중쇄들 사이의 CH3-CH3 계면에서의 하전된 잔기들 사이의 강한 반발력으로 인해 거의 발생되지 않는다.
이중특이성 항체는 이중특이성 항체의 효율적인 이종이량체화 및 형성을 보장하도록 CH3 조작된 2개의 상이한 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 플라스미드 또는 플라스미드들의 (일시적) 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 단세포에서의 이들 쇄의 생성은 단일특이성 항체의 형성에 비하여 이중특이성 항체의 유리한 형성으로 이어진다. 본질적으로 단지 이중특이성 전장 IgG1 분자만을 생성하기 위한 바람직한 돌연변이는 제1 CH3 도메인 내의 위치 351 및 366에서의 아미노산 치환, 예를 들어 L351K 및 T366K (넘버링은 EU 넘버링에 따름) ('KK-변이' 중쇄) 및 제2 CH3 도메인 내의 위치 351 및 368에서의 아미노산 치환, 예를 들어 L351D 및 L368E ('DE-변이' 중쇄)이거나, 또는 그 역으로도 성립된다.
일 실시 형태에서, CD137과 결합하는 가변 도메인을 포함하는 중쇄/경쇄 조합은 중쇄의 DE 변이체를 포함한다. 이 실시 형태에서, CD137 이외의 항원에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함하는 중쇄/경쇄 조합은 중쇄의 KK 변이체를 포함한다. 본 발명의 실시 형태는 또한 CD137과 결합하는 가변 도메인을 포함할 수 있으며, 중쇄의 KK 변이체뿐만 아니라, CD137 이외의 항원에 결합할 수 있는 가변 도메인과의 이종이량체화를 용이하게 하는 데 사용되는 당업자에게 공지된 다른 변이를 포함한다는 것이 인식될 것이다.
Fc 영역은 항체의 이펙터 기능, 예컨대 보체-의존성 세포독성 (CDC), 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및 항체-의존성 세포 식세포작용 (ADCP)을 매개한다. 치료적 항체 또는 Fc 융합 단백질 응용에 따라, 이펙터 기능을 감소 또는 증가시킬 것이 요구될 수 있다. 감소된 이펙터 기능이 본 발명에서 바람직하다. 본 발명의 일부 실시 형태에서와 같이 면역 반응이 활성화, 증강 또는 자극될 때 감소된 이펙터 기능이 요구될 수 있다. 감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 특히 면역 세포의 세포-표면 분자를 표적화하는 데 사용될 수 있다.
FcγR 또는 C1q에 대한 IgG의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인 내에 위치된 잔기를 필요로 하는 것으로 확인되었다. CH2 도메인 (도 2d)의 2개의 영역은 FcγR 및 C1q 결합에 관한 것이다. 위치 233-236에서 IgG2 잔기를 그리고 위치 327, 330 및 331에서 IgG4 잔기를 인간 IgG1 내로 치환함으로써 ADCC 및 CDC를 크게 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌[Armour et al., 1999. Eur J Immunol. 29(8):2613-24]; 문헌[Shields et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604]). 더욱이, Idusogie et al.은 K322를 비롯한 상이한 위치에서의 알라닌 치환이 보체 활성화를 유의하게 감소시켰음을 입증하였다 (문헌[Idusogie et al., 2000. J Immunol. 164(8):4178-84]).
감소된 이펙터 기능으로 인해, IgG4 항체는 세포 고갈 없이 수용체 차단을 위한 IgG 하위부류를 나타낸다. IgG4 분자는 Fab-아암 교환이라 불리는 동적 과정에서 하프-분자를 교환할 수 있다. 이러한 현상은 치료적 항체와 내인성 IgG4 사이에서 일어날 수 있다. S228P 돌연변이는 Fab-아암 교환에 대한 감소된 능력을 보장하는 돌연변이의 예이다 (문헌[Labrijn. et al., 2009. Nat Biotechnol. 27(8):767-71]).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 바람직하게는, 예를 들어 Fc-수용체 상호작용을 감소시키거나 C1q 결합을 감소시키도록 변형된 CH2/하부 힌지 영역을 포함하는 IgG 항체이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 돌연변이 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인을 갖는 IgG 항체여서, Fc-감마 수용체에 대한 이중특이성 IgG 항체의 상호작용이 감소되게 된다. 돌연변이 CH2 영역을 포함하는 항체는 바람직하게는 IgG1 항체이다. 그러한 돌연변이 IgG1 CH2 및/또는 하부 힌지 도메인은 바람직하게는 위치 235 및/또는 236 (EU 넘버링)에서의 아미노 치환, 바람직하게는 L235G 및/또는 G236R 치환을 포함한다 (도 2e).
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항체의 변이체는 항체 또는 이중특이성 항체의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 포함한다. 변이체는 (이중특이성) 항체의 결합 특이성을 유지한다. 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 (이중특이성) 항체의 결합 특이성을 유지한다. 결합 특이성은 본 명세서에 기재된 바와 같이 제1 막 단백질 및 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합하는 능력에 의해 정의된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체의 기능성 부분, 또는 바람직하게는 이중특이성 항체의 기능성 부분은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합하는 가변 도메인 및 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합하는 가변 도메인을 포함하는 부분이다. 적합한 부분은, 예를 들어, 펩신에 의한 이중특이성 항체의 분해에 의해 생성된 그대로의 F(ab')2 단편이다. 상기 가변 도메인들을 포함하는 다른 부분이 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체의 기능성 유도체, 또는 바람직하게는 이중특이성 항체의 기능성 유도체는 링커에 의해 연결된 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합하는 가변 도메인 및 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합하는 가변 도메인을 포함하는 단백질이다. 상기 가변 도메인들은 그 자체로서의 가변 도메인들일 수 있거나, 또는 링커를 통해 함께 연결된 VH 및 VL을 포함하는 단일쇄 Fv 단편과 같은 가변 도메인 유사 분자일 수 있다. 가변 도메인 유사 분자의 다른 예는 이른바 단일 도메인 항체 단편이다. 단일-도메인 항체 단편 (sdAb)은 단일 단량체 가변 항체 영역을 갖는 항체 단편이다. 전 항체(whole antibody)와 마찬가지로, 특이적 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 분자량이 단지 12 내지 15 kDa인 단일-도메인 항체 단편은 2개의 단백질 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 공통 항체 (150 내지 160 kDa)보다 훨씬 더 작고, 심지어는 Fab 단편 (약 50 kDa, 하나는 경쇄이고 절반은 중쇄임) 및 단일쇄 가변 단편 (약 25 kDa, 2개의 가변 영역, 하나는 경쇄로부터 유래되고 하나는 중쇄로부터 유래됨)보다 더 작다. 단일-도메인 항체 그 자체는 정상 항체 (전형적으로 90 내지 100 kDa임)보다 그다지 작지 않다. 단일-도메인 항체 단편은 대개 카멜리드(camelid)에서 발견되는 중쇄 항체로부터 조작되며; 이것은 VHH 단편 (Nanobodies®)으로 불린다. 일부 어류는 또한 중쇄로만 이루어진 항체 (IgNAR, '면역글로불린 새로운 항원 수용체')를 가지며, 이로부터 VNAR 단편이라 불리는 단일-도메인 항체 단편이 얻어질 수 있다. 대안적인 접근법은 인간 또는 마우스 유래 공통 면역글로불린 G (IgG)로부터의 이량체 가변 도메인을 단량체로 분할하는 것이다. 단일-도메인 항체에 대한 대부분의 연구는 현재 중쇄 가변 도메인에 기반하고 있지만, 경쇄로부터 유래된 나노바디가 또한 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 가변 도메인-유사 분자의 다른 비제한적인 예는 VHH, 인간 도메인 항체(Human Domain Antibody; dAb) 및 유니바디(Unibody)이다. 바람직한 기능성 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 부분이다. 그러한 가변 도메인의 비제한적인 예는 F(ab)-단편 및 단일쇄 Fv 단편이다. 가변 도메인(-유사) 결합에 대한 이중특이성 포맷은, 예를 들어 2개의 상이한 scFv에 결합된 인간 혈청 알부민 (HSA); 이량체화 모티프(dimerization motif) 또는 자기-회합성(self-associating) 2차 구조, 예컨대 나선 번들(helix bundle) 또는 코일드 코일을 통해 함께 결합되어 scFv 단편들의 이량체화를 가져오는 2개의 상이한 scFv를 포함하는 이중특이성 미니-항체이다 (문헌[Morrison (2007) Nat. Biotechnol 25:1233-34]). 적합한 링커 및 그러한 링커에 scFv를 결합시키는 방법의 예가 국제 특허 출원 공개 WO2009/126920호에 기재되어 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체 또는 바람직하게는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 인간에 사용된다. 이를 위하여, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 폴리펩티드에 대한 인간의 내성은 많은 다양한 양상에 의해 좌우된다. 면역은, 그것이 T-세포 매개, B-세포 매개 또는 다른 것이든, 폴리펩티드에 대한 인간의 내성에 포함되는 변수들 중 하나이다. 본 발명의 이중특이성 항체의 불변 영역은 바람직하게는 인간 중쇄 불변 영역, 바람직하게는 도 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 인간 중쇄 불변 영역; 및 인간 경쇄 불변 영역, 바람직하게는 도 1c에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하는 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다. 불변 영역은 천연 발생 인간 항체의 불변 영역과 1개 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 불변 부분은 천연 발생 인간 항체로부터 전체적으로 유래되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 생성되는 다양한 항체는 국제 특허 출원 공개 WO2009/157771호에 기재된 바와 같이 각각의 표적으로 면역화된 공통 경쇄 마우스로부터 유래된다. 본 발명에서 생성되는 다양한 항체는 인간 항체 가변 도메인 라이브러리로부터 유래된다. 그렇기 때문에, 이들 가변 도메인은 인간이다. 특유의 CDR 영역은 인간으로부터 유래될 수 있거나, 합성될 수 있거나, 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 가변 영역은, 그것이, CDR 영역을 제외하고, 천연 발생 인간 항체의 가변 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가질 경우, 적어도 인간 가변 영역이다. 그러한 실시 형태에서, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원 또는 B7 패밀리의 막 관련 구성원과 결합하는 항체의 가변 도메인의 VH, 또는 본 발명의 항체 내의 경쇄는, CDR 영역의 아미노산 서열의 가능한 차이를 계수하지 않고서, 천연 발생 인간 항체의 가변 영역과 1개 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러한 돌연변이는 또한 체세포 초돌연변이와 관련하여 자연계에서 발생된다.
항체는, 적어도 중쇄 가변 영역에 관련하여, 다양한 동물종으로부터 유래될 수 있다. 그러한 예를 들어 뮤린 중쇄 가변 영역을 인간화하는 것은 일반적인 실무이다. 이것이 달성될 수 있는 다양한 방법이 있으며, 이들 중에는 뮤린 중쇄 가변 영역의 3D-구조와 매칭되는 3D-구조를 갖는 인간 중쇄 가변 영역 내로의 CDR-그래프팅; 뮤린 중쇄 가변 영역의 탈면역화 - 이는 바람직하게는 뮤린 중쇄 가변 영역으로부터 기지의 또는 의심되는 T- 또는 B-세포 에피토프를 제거함으로써 행해짐 - 가 있다. 제거는 전형적으로 에피토프 내의 아미노산들 중 하나 이상을 다른 (전형적으로, 보존적) 아미노산으로 치환하여, 에피토프의 서열을 변형시켜 그것이 더 이상 T- 또는 B-세포 에피토프가 아니도록 함으로써 행해진다.
탈면역화된 뮤린 중쇄 가변 영역은 원래의 뮤린 중쇄 가변 영역보다 인간에서 덜 면역원성이다. 바람직하게는, 본 발명의 가변 영역 또는 도메인은 추가로 인간화, 예를 들어 베니어링(veneering)된다. 베니어링 기법을 사용함으로써, 면역 시스템에 의해 용이하게 접하게 되는 외부 잔기가 인간 잔기로 선택적으로 대체되어 혼성 분자를 생성하는데, 이러한 혼성 분자는 약면역원성이거나 실질적으로 비면역원성인 베니어링된 표면을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 바와 같은 동물은 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 영장류, 가장 바람직하게는 인간이다.
본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 인간 항체의 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 도메인의 차이에 따라, 항체는 다음 5가지 부류 또는 동종형(isotype)으로 그룹화된다: IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE. 이들 부류 또는 동종형은 상응하는 그리스 문자로 명명된 상기 중쇄들 중 적어도 하나를 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 제공하며, 여기서 상기 불변 영역은 IgG 불변 영역들의 군으로부터 선택되며, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 불변 영역은 IgG4 또는 IgG1 불변 영역 (도 2), 더 바람직하게는 돌연변이된 IgG1 불변 영역이다. IgG1의 불변 영역 내의 일부 변이는 자연계에서 발생되고/되거나, 생성되는 항체의 면역학적 특성을 변화시키지 않고서 허용된다. 전형적으로 약 1 내지 10개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합이 불변 영역에서 허용된다. 불변 영역은 효율적인 이종이량체화를 가능하게 하기 위하여, 이펙터 기능을 감소시키기 위하여, 또는 반감기, 안정성 등을 포함한 다른 이유로 본 명세서에 지시된 바와 같이 돌연변이될 수 있다.
인간과 관련하여 비인간 잔기의 함량을 최소화하는 방향으로 합리적인 방법이 발전되어 왔다. 항체의 항원-결합 특성을 다른 항체 상에 성공적으로 그래프트하기 위한 다양한 방법이 이용가능하다. 항체의 결합 특성은 주로 CDR3 영역의 정확한 서열에 기초할 수 있는데, 이는 종종 전체로서의 가변 도메인의 적절한 구조와 조합된 가변 도메인 내의 CDR1 및 CDR2 영역의 서열에 의해 지지된다. CDR 영역을 다른 항체의 적합한 가변 도메인 상에 그래프트하기 위하여 다양한 방법이 현재 이용가능하다. 이들 방법 중 일부는 문헌[J.C. Almagro1 and J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633]에 검토되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다.
도 3에 나타낸 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함하는 가변 도메인의 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 O12의 또는 그를 기반으로 한 생식세포계열 경쇄이며, 바람직하게는 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 그의 단편 또는 기능성 유도체이다 (명명법은 imgt.org에 있는 IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹에 따름). 용어 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01, IGKV1-39/IGKJ1, huVκ1-39 경쇄 또는 짧게 줄여 huVκ1-39가 사용된다. 상기 경쇄는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 언급된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이고, 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게는 VL 쇄의 CDR3 영역 내에서 행해지지 않으며, 바람직하게는 VL 쇄의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역 또는 FR4 영역 내에서 행해지지 않는다. 공통 경쇄에 대한 바람직한 순서가 도 1에 나타나 있다.
이중특이성 항체를 생성하기 위하여 다양한 방법이 이용가능하다. 한 가지 방법은 세포 내에서의 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄의 발현 및 세포에 의해 생성된 항체의 수집을 포함한다. 이러한 방법으로 생성된 항체는 전형적으로 중쇄 및 경쇄의 상이한 조합으로 항체들의 수집물을 함유할 것이며, 이들 중 일부가 원하는 이중특이성 항체이다. 후속으로, 이중특이성 항체가 수집물로부터 정제될 수 있다. 세포에 의해 생성되는 이중특이성 항체 대 다른 항체의 비는 다양한 방법으로 증가될 수 있다. 본 발명의 일 바람직한 실시 형태에서, 이 비는 세포 내에서 2개의 상이한 경쇄가 아닌 2개의 본질적으로 동일한 경쇄를 발현시킴으로써 증가된다. 2개의 본질적으로 동일한 경쇄는 본질적으로 동일한 경쇄 가변 영역 및 상이한 경쇄 불변 영역, 또는 바람직하게는 2개의 본질적으로 동일한 경쇄 불변 영역을 갖는 경쇄일 수 있다. 이러한 개념은 당업계에서 "공통 경쇄" 방법으로도 지칭된다. 본질적으로 동일한 경쇄들이 2개의 상이한 중쇄와 함께 작용하여 상이한 항원-결합 부위 그리고 이에 수반되는 상이한 결합 특성을 갖는 가변 도메인의 형성을 가능하게 하는 경우, 세포에 의해 생성되는 이중특이성 항체 대 다른 항체의 비는 2개의 본질적으로 상이한 경쇄의 발현에 비하여 유의하게 개선된다. 세포에 의해 생성되는 이중특이성 항체의 비는 2개의 동일한 중쇄의 쌍 형성에 비하여 2개의 상이한 중쇄의 서로의 쌍 형성을 자극함으로써 추가로 개선될 수 있다. 당업계에는 그러한 중쇄 이종-이량체화가 달성될 수 있는 다양한 방법이 기술되어 있다. 바람직한 방법은 미국 가출원 제61/635,935호에 기재되어 있으며, 미국 정규 출원 제13/866,747호 및 PCT 출원 PCT/NL2013/050294호 (국제 특허 출원 공개 WO 2013/157954 A1호)가 그 뒤를 이었으며, 이들은 본 명세서에 참고로 포함된다. (단세포로부터) 이중특이성 항체를 생성하기 위한 방법 및 수단이 개시되며, 그럼으로써 단일특이성 항체의 형성에 비하여 이중특이성 항체의 형성을 유리하게 하는 수단이 제공된다. 이들 방법은 또한 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 (단세포로부터) 본 발명에 따른 이중특이성 항체를 생성하기 위한 방법을 제공하며, 상기 이중특이성 항체는 계면을 형성할 수 있는 2개의 CH3 도메인을 포함하고, 상기 방법은 상기 세포 내에 a) 제1 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 제1 핵산 분자, b) 제2 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 제2 핵산 분자를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자들에는 상기 제1 CH3 도메인을 포함하는 중쇄와 상기 제2 CH3 도메인을 포함하는 중쇄의 우선적인 쌍 형성을 위한 수단이 제공되어 있고, 상기 방법은 상기 숙주 세포를 배양하고 상기 2개의 핵산 분자의 발현을 가능하게 하는 단계 및 배양물로부터 상기 이중특이성 항체를 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 동일한 핵산 분자, 벡터 또는 유전자 전달 비히클의 일부일 수 있고, 숙주 세포의 게놈의 동일한 부위에서 통합될 수 있다. 대안적으로, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 상기 세포에 개별적으로 제공된다. 숙주 세포는 적어도 하나의 경쇄, 그리고 바람직하게는 공통 경쇄를 포함한다.
일 바람직한 실시 형태는 단세포로부터 본 발명에 따른 이중특이성 항체를 생성하기 위한 방법을 제공하며, 상기 이중특이성 항체는 계면을 형성할 수 있는 2개의 CH3 도메인을 포함하고, 상기 방법은
- a) TNF 수용체 수퍼패밀리의 막 관련 구성원의 세포외 부분에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하고 제1 CH3 도메인을 함유하는 중쇄를 인코딩하는 제1 핵산 분자, 및 b) 막 관련 제2 단백질의 세포외 부분에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하고 제2 CH3 도메인을 함유하는 중쇄를 인코딩하는 제2 핵산 분자를 갖는 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자들에는 상기 제1 CH3 도메인과 상기 제2 CH3 도메인의 우선적인 쌍 형성을 위한 수단이 제공되어 있고,
상기 방법은 상기 세포를 배양하고 상기 2개의 핵산 분자에 의해 인코딩된 단백질의 발현을 가능하게 하는 단계 및 배양물로부터 상기 이중특이성 IgG 항체를 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 또한 공통 경쇄를 인코딩하는 제3 핵산 분자를 갖는다. 상기 제1, 제2 및 제3 핵산 분자는 동일한 핵산 분자, 벡터 또는 유전자 전달 비히클의 일부일 수 있고, 숙주 세포의 게놈의 동일한 부위에서 통합될 수 있다. 대안적으로, 상기 제1, 제2 및 제3 핵산 분자는 상기 세포에 개별적으로 제공된다. 바람직한 공통 경쇄는 O12를 기반으로 하며, 바람직하게는 그것은 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1 39*01/IGJκ1*01이며, 이는 전술된 바와 같다. 상기 제1 CH3 도메인과 상기 제2 CH3 도메인의 우선적인 쌍 형성을 위한 수단은 바람직하게는, 중쇄 코딩 영역들의 CH3 도메인 내의 상응하는 돌연변이이다. 본질적으로 단지 이중특이성 항체만을 생성하기 위한 바람직한 돌연변이는 제1 CH3 도메인 내의 아미노산 치환 L351K 및 T366K (넘버링은 EU 넘버링에 따름) 및 제2 CH3 도메인 내의 아미노산 치환 L351D 및 L368E이거나, 또는 그 역으로도 성립된다 (도 2). 따라서, 이중특이성 항체를 생성하기 위한 본 발명에 따른 방법이 추가로 제공되며, 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 치환 L351K 및 T366K (넘버링은 EU 넘버링에 따름)를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 치환 L351D 및 L368E를 포함하고, 상기 방법은 상기 세포를 배양하고 상기 핵산 분자들에 의해 인코딩된 단백질의 발현을 가능하게 하는 단계 및 배양물로부터 상기 이중특이성 항체를 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 또한, 이중특이성 항체를 생성하기 위한 본 발명에 따른 방법이 제공되며, 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 치환 L351D 및 L368E (넘버링은 EU 넘버링에 따름)를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 치환 L351K 및 T366K를 포함하고, 상기 방법은 상기 세포를 배양하고 상기 핵산 분자들의 발현을 가능하게 하는 단계 및 배양물로부터 상기 이중특이성 항체를 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 이들 방법에 의해 생성될 수 있는 항체가 또한 본 발명의 일부이다. CH3 이종-이량체화 도메인은 바람직하게는 IgG1 이종-이량체화 도메인이다. CH3 이종-이량체화 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역은 바람직하게는 IgG1 불변 영역이다.
TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원 (제1 막 단백질)은 바람직하게는 CD137; OX40; CD40 또는 CD30이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 제1 막 단백질은 CD137 또는 OX40, 바람직하게는 CD137이다. 본 발명의 결합 분자는 바람직하게는 상기 제1 막 단백질에 대한 하나의 (항원) 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 결합 분자는 상기 제1 막 단백질에 대해 1가이다. 결합 분자는 바람직하게는 상기 제2 막 단백질에 대한 하나의 (항원) 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 결합 분자는 상기 제2 막 단백질에 대해 1가이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 결합 분자는 상기 제1 막 단백질에 대해 1가이고, 상기 제2 막 단백질에 대해 1가이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 결합 분자는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원에 대해 1가이고, B7 패밀리의 구성원에 대해 1가이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 결합 분자는 CD137에 대해 1가이고, B7 패밀리의 구성원에 대해 1가이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 결합 분자는 CD137에 대해 1가이고, PD-L1에 대해 1가이다. 2가 단일클론 항 CD137 항체는 CD137을 활성화시키는 것으로 당업계에 알려져 있는 반면, 종래 기술의 1가 CD137 결합 분자는 전형적으로 활성화시키지 않는다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 막 단백질은 세포막 단백질인 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이다. 단백질은, 그것이 위에 존재하는 세포의 세포막 내에 존재하는 막관통 영역을 갖는다면, 세포 상의 막 단백질이라고 한다. 이것은 전형적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 세포이다. 이 단백질은 추가의 막관통 영역을 가질 수 있다. 그러한 경우에, 세포막 내에 존재하는 모든 막관통 영역은 동일한 세포의 세포막 내에 존재한다. 제1 막 단백질은 세포막 상에 존재할 때 세포외 부분을 갖는 세포막 단백질이다. 세포막은 세포의 내부를 세포의 외부로부터 분리하는 세포의 막이다. 제1 막 단백질은 전형적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 세포의 세포막 상에 존재한다. 본 발명의 결합 분자 또는 본 발명의 방법 또는 용도와 관련하여, 제1 막 단백질은 전형적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 세포의 세포막 상에 존재한다. 제1 막 단백질은 상기 제2 세포 상에 존재할 수 있지만, 상기 제2 세포 상에서의 제1 막 단백질의 발현은 무시할 수 있는 것이 바람직하다. 전형적으로 상기 제2 세포 상의 상기 제1 막 단백질의 수준은 제1 세포 상에서의 제1 막 단백질의 발현과 대비하여 최대 10%이다. 제2 세포는 바람직하게는 상기 제1 막 단백질을 유의하게 발현하지 않는다. 제1 막 단백질이, 상기 제1 막 단백질에 특이적인 항체를 사용한 FACS 검정에서 면역 형광에 의해 (백그라운드를 초과하여) 검출될 수 없다면, 발현은 적어도 유의하지 않다.
제2 막 단백질은 마찬가지로 세포막 단백질이다. 제2 막 단백질은, 그것이 위에 존재하는 세포의 세포막 내에 존재하는 막관통 영역을 갖는다. 이것은 전형적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 세포이다. 제2 단백질은 추가의 막관통 영역을 가질 수 있다. 그러한 경우에, 세포막 내에 존재하는 모든 막관통 영역은 동일한 세포의 세포막 내에 존재한다. 제2 막 단백질은 세포막 상에 존재할 때 세포외 부분을 갖는 세포막 단백질이다. 본 발명의 결합 분자 또는 본 발명의 방법 또는 용도와 관련하여, 제2 막 단백질은 전형적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 세포의 세포막 상에 존재한다. 제2 막 단백질은 상기 제1 세포 상에 존재할 수 있지만, 상기 제1 세포 상에서의 제2 막 단백질의 발현은 무시할 수 있는 것이 바람직하다. 전형적으로 상기 제1 세포 상의 상기 제2 막 단백질의 수준은 제2 세포 상에서의 제2 막 단백질의 발현과 대비하여 최대 10%이다. 제1 세포는 바람직하게는 상기 제2 막 단백질을 유의하게 발현하지 않는다. 제2 막 단백질이, 상기 제2 막 단백질에 특이적인 항체를 사용한 FACS 검정에서 면역 형광에 의해 (백그라운드를 초과하여) 검출될 수 없다면, 발현은 적어도 유의하지 않다.
일부 실시 형태에 따르면, 본 발명에 따른 결합 분자 또는 (이중특이성) 항체 또는 변이체는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위, 및 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아닌 제2 막 단백질과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 갖는다. 이는, TNF 수용체 수퍼패밀리의 몇몇 상이한 구성원들을 발현하는 T 세포와 같은 (면역) 세포의 인 시스(in cis) 활성화가 적어도 부분적으로 회피되어, 비특이적 T 세포 활성화로 인한 잠재적인 유해한 부작용 및 독성을 감소시키는 이점을 제공한다. 본 발명의 이들 실시 형태는 TNF 수퍼패밀리의 수용체에 결합하는 결합제, 특히 TNF 수퍼패밀리의 적어도 2개의 상이한 수용체에 결합하는 결합제와 관련된 종래 기술의 접근법과는 대조적이다. 그러한 종래 기술의 접근법은 제2 표적의 부재 하에 있음을 의미하는 인 시스 T 세포 활성화를 초래할 수 있고 과도한 T 세포 반응의 위험을 수반할 수 있어서, 예를 들어 사이토카인 스톰(storm)을 야기할 수 있다. 결과적으로, 그러한 종래 기술의 접근법은, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위, 및 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아닌 막 단백질과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 갖는 본 발명에 따른 결합 분자와 대비하여 유해한 부작용의 증가된 잠재성을 갖는다.
또한, CD137 또는 OX40의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하며, 상기 제2 막 단백질은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아닌, 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다. 또한, 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성을 자극하는 방법이 제공되며, 본 방법은 제1 세포 및 제2 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 제1 세포는 세포막 상에 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원을 갖고, 상기 제2 세포는 세포막 상에 제2 막 단백질을 가지며, 상기 방법은 상기 세포들을, 하나의 가변 도메인은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위를 포함하고, 다른 가변 도메인은 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 2개의 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체와 접촉시켜, 상기 제1 세포 상의 상기 구성원의 활성을 자극하는 단계를 포함하며; 상기 제2 막 단백질은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다.
일부 실시 형태에서, 상기 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아닌 상기 제2 막 단백질과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 상기 항체 또는 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 항원 결합 부분은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인 및 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아닌 상기 제2 막 단백질과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인으로 이루어진다. 상기 이중특이성 항체는 바람직하게는 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 전장 IgG, 즉 전장 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 전장 IgG1 또는 전장 IgG4이다.
CD137 또는 OX40의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하며, 상기 제2 막 단백질은 B7 패밀리의 구성원, 바람직하게는 PD-L1인, 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다. 또한, 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성을 자극하는 방법이 제공되며, 본 방법은 제1 세포 및 제2 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 제1 세포는 세포막 상에 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원을 갖고, 상기 제2 세포는 세포막 상에 제2 막 단백질을 가지며, 상기 방법은 상기 세포들을, 하나의 가변 도메인은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위를 포함하고, 다른 가변 도메인은 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 2개의 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체와 접촉시켜, 상기 제1 세포 상의 상기 구성원의 활성을 자극하는 단계를 포함하며; 상기 제2 막 단백질은 B7 패밀리의 구성원, 바람직하게는 PD-L1이다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다.
일부 실시 형태에서, 상기 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 B7 패밀리의 구성원, 바람직하게는 PD-L1인 상기 제2 막 단백질과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 상기 항체 또는 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 항원 결합 부분은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인 및 B7 패밀리의 구성원, 바람직하게는 PD-L1인 상기 제2 막 단백질과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인으로 이루어진다. 상기 이중특이성 항체는 바람직하게는 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 전장 IgG, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 전장 IgG1 또는 전장 IgG4이다.
상기 제1 막 단백질이 그의 결합 파트너에 결합하는 것을 "차단하는" 가변 도메인이 상기 결합 파트너에 대한 제1 막 단백질의 결합을 방해한다. 그러한 가변 도메인은 제1 막 단백질과 결합할 수 있다. 그러한 차단 가변 도메인은 상기 제1 막 단백질 상의 에피토프와 결합하고, 에피토프에 결합하기 위하여 제1 막 단백질의 결합 파트너와 경쟁할 수 있다. 그러한 차단 가변 도메인 및 제1 막 단백질의 결합 파트너는 또한 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다. 그러한 경우에, 차단 활성은, 예를 들어 결합 파트너의 감소된 결합 및/또는 결합 파트너가 상기 제1 막 단백질에 이미 결합되어 있는 경우 그것의 치환에 기인할 수 있고/있거나, 차단 가변 도메인은 입체 장애를 통해 제1 막 단백질에 대한 결합 파트너의 결합을 방지할 수 있다. 이들 및 다른 모든 기전은 적어도 부분적으로 상기 결합 파트너가 상기 제1 막 단백질에 결합하는 것을 방지할 수 있다.
일 실시 형태에서, TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원과 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 도메인은 상기 구성원의 리간드에 대한 상기 구성원의 결합을 차단한다. TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원-리간드 상호작용은 당업계에서 광범위하게 연구되어 왔다. 일반적으로, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원들은 전형적으로 적어도 하나의 리간드를 갖는 것으로 알려져 있다. 알려진 수용체 리간드 쌍의 예는 TNF 수용체인 종양 괴사 인자 수용체 1 및 2와 리간드 TNF-알파; 수용체 OX40과 리간드 OX40L; 수용체 CD40과 리간드 CD154; Fas 수용체와 리간드 FasL; CD30 수용체와 리간드 CD153; 및 수용체 CD137과 리간드 CD137L이다. 일부 실시 형태에서, TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원과 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 상기 구성원의 리간드에 대한 상기 구성원의 결합을 차단하지 않는다.
일부 실시 형태에서, 도메인은, TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원과 결합하고 그의 TNF 수용체 수퍼패밀리 표적 막 단백질의 그의 결합 파트너에 대한 결합을 차단하는 항원 결합 부위를 포함한다. 상기 가변 도메인은, 2개의 상기 가변 도메인을 포함하는 단일특이성 2가 항체로 제공될 때, 그것은 교차결합 없이 세포 상의 TNF-수용체 수퍼패밀리 구성원의 활성을 자극하지 않는 것으로 추가로 특징지어질 수 있다. 일부 실시 형태에서, TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원과 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 도메인은 CD137의 CD137L에 대한 결합을 차단하는 가변 도메인을 포함하며, 상기 가변 도메인은, 2개의 상기 가변 도메인을 포함하는 단일특이성 2가 항체로 제공될 때, 세포 상의 CD137의 활성을 자극하지 않는다는 사실에 의해 추가로 특징지어진다.
용어 결합 파트너; 결합 쌍; 수용체 리간드 쌍 등은 서로 결합하고 결합의 결과로서 활성을 발휘할 수 있는 단백질을 지칭한다. 파트너 또는 쌍의 적어도 하나는 세포의 세포막 상의 막 단백질이다. 활성은 전형적으로 세포 상에 이러한 막 단백질을 갖는 세포 상에서 발휘된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 결합 쌍의 막 단백질들의 결합을 차단하는 가변 도메인은 전형적으로 가변 도메인의 부재 하에서의 결합과 대비하여 쌍의 결합을 감소시킨다. 이것은 바람직하게는 시험관내 검정에서 측정된다. 전형적으로 이것은 가변 도메인을, 이것이 결합할 수 있는 막 단백질과 인큐베이션하고, 후속으로 혼합물을 쌍의 다른 하나의 구성원과 함께 인큐베이션함으로써 행해진다. 이어서, 쌍의 결합을 가변 도메인의 부재 하에서의 쌍의 결합과 비교한다. 가변 도메인은 제1 막 단백질의 결합 파트너에 대한 결합을 완전히 방지할 수 있다. 이것은 또한 결합 쌍의 결합을 부분적으로 방지할 수 있다. 특정 결합 쌍의 막 단백질들의 결합을 차단하는 가변 도메인은, 가변 도메인의 부재 하에서의 결합과 대비하여, 바람직하게는 쌍의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 그리고 더 바람직하게는 적어도 90% 감소시킨다. 본 명세서에서, 가변 도메인에 의한 결합의 차단은 2개의 상기 가변 도메인을 포함하는 2가 단일클론 항체를 사용하여 얻어진 차단으로서 정의된다. 물론, 가변 도메인은 상기 가변 도메인 및 제2 막 단백질과 결합하는 가변 도메인을 포함하는 항체 내에 존재할 때 또한 결합을 차단한다.
CD137의 세포외 부분과 결합할 수 있고 CD137 리간드의 CD137에 대한 결합을 적어도 부분적으로 차단하는 특정 가변 도메인은 MF6783; MF6861; MF6795; MF6808; MF6798; MF6754; MF6763; MF6744; MF6785; MF6825; MF6737; MF6749; MF6788; 또는 MF6797의 VH의 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인이다.
PD-L1의 세포외 부분과 결합할 수 있고 PD1의 PD-L1에 대한 결합을 차단하는 특정 가변 도메인은 MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5359; MF5377; MF5382; MF5424; MF5426; MF5439; MF5442; MF5553; MF5557; MF5561; MF5576; MF5594; 또는 MF5708의 VH의 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인이다. 아미노산 서열은 도 3에 나타나 있다.
TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원과 결합하는 가변 도메인은 바람직하게는, 2개의 상기 도메인을 포함하는 단일특이성 2가 항체로 제공될 때, 세포 상의 TNF-수용체 수퍼패밀리 구성원의 활성을 자극하지 않는 가변 도메인이다. 2가 단일특이성 항체와 관련하여 상기 가변 도메인은 2개의 상기 가변 도메인을 포함하고, TNF-수용체 수퍼패밀리 구성원을 포함하는 세포의 활성을 자극하지 않는다.
세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성의 자극은 전형적으로 세포의 생물학적 활성을 측정함으로써 측정된다. 활성의 유형은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 어느 구성원이 분석되는지에 좌우된다. 예를 들어, OX40 및 CD137의 경우, OX40 및/또는 CD137 양성 T-세포의 활성화 상태가 측정될 수 있다. OX40 및 CD137은 활성화된 T-세포의 활성화를 자극하는 이른바 공동자극성 단백질이다. T-세포의 활성화를 측정하기에 적합한 방법이 실시예 섹션에 제공된다. 한 가지 방법은 활성화된 T-세포 또는 상기 T-세포를 포함하는 조성물에 의한 IL-2, IFNγ 및/또는 TNFα 생성을 측정하는 것이다. 다른 TNF 수용체는 상이한 생물학적 활성을 갖는다. 예를 들어, CD30은 활성화된 T- 및 B-세포 상에서 발현되며, 아폽토시스의 양성 조절인자이다. CD30의 자극은 본 발명의 결합 분자에 반응하여 활성화된 B- 또는 T-세포의 아폽토시스를 측정함으로써 측정될 수 있다. CD40은 항원 제시 세포, 예컨대 대식세포 상에서 발견되는 공동자극성 단백질이며, 항원 제시 세포의 활성화를 추가로 자극한다. 본 명세서에 논의된 바와 같은 결합 분자의 존재 하에서, 바람직하게는 본 발명에 따른 항체 또는 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 존재 하에서 측정된 활성이 상기 결합 분자, 바람직하게는 본 발명에 따른 항체 또는 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 부재 하에서 달리 동일한 조건 하에서 측정된 활성보다 더 높을 때, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성은 자극된다. 활성의 자극은 활성의 유도 및 이미 존재하는 활성의 향상을 포함한다.
CD137 또는 OX40의 활성의 자극은 바람직하게는 CD137 또는 OX40을 포함하는 세포의 생물학적 활성을 측정함으로써 측정된다. 생물학적 활성은 바람직하게는 CD137 또는 OX40 발현 세포의 활성화 상태이다. CD137 및 OX40은 활성화된 T 세포를 포함한 면역 세포 상에서 발현되는 공동자극성 분자이다. CD137 또는 OX40의 활성의 자극은 바람직하게는 면역 세포, 예를 들어 활성화된 T-세포의 활성화 수준을 결정함으로써 측정된다. 개체에서, CD137 또는 OX40의 활성의 자극은 바람직하게는 개체의 면역 세포 및/또는 T-세포의 활성화를 측정함으로써 측정된다. 대안적으로, 이것은 또한, 적용가능한 경우, 개체에서의 종양 반응; 개체의 바이러스 부하; 또는 개체의 기생충 부하를 측정함으로써 결정될 수 있다.
본 발명은 T-세포를 결합 및/또는 활성화시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 T 세포 및 상기 T-세포가 결합되거나 활성화되게 하는 세포 (제2 세포)를 포함하는 시스템을 제공하는 단계, 및 상기 시스템에 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원과 결합할 수 있는 가변 도메인 및 제2 단백질의 세포외 부분에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함하는 적어도 하나의 항체, 바람직하게는 적어도 하나의 이중특이성 항체를 제공하는 단계, 및 T-세포가 결합 및/또는 활성화되게 하는 조건 하에서 상기 시스템을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원은 바람직하게는 CD137 또는 OX40, 가장 바람직하게는 CD137이고, 상기 제2 막 단백질은 바람직하게는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다. 상기 제2 막 단백질은 바람직하게는 B7 패밀리의 구성원, 가장 바람직하게는 PD-L1이다. 상기 T-세포가 결합되거나 활성화되게 하는 세포는 바람직하게는 면역 세포 (예를 들어, 항원 제시 세포, 또는 대식세포), 신생물성 세포, 바이러스 감염된 세포, 또는 세포내 기생충 감염된 세포이다. T-세포의 결합 및/또는 활성화는 T-세포를 특정 표적으로 지향시킨다. T-세포의 활성화는 상기 T-세포의 T-세포 수용체를 활성화시키는 것이다. T-세포의 결합은 전형적으로 T-세포를 활성화시키는 것이다. 결합은 또한 이미 활성화된 T-세포를 항체에 의해 특정된 표적으로 지향시킬 수 있다. 상기 T-세포가 결합 및/또는 활성화되게 하는 조건은 전형적으로 배양 조건이지만, 또한 비인간 동물에서의 인큐베이션일 수 있다. 조건은 T-세포가 항체의 부재 하에서 결합되지 않도록 하는 것이다. T-세포의 수집물이 측정되는 경우, 이들 중 일부는 이미 결합 또는 활성화될 수 있되, 단, 수집물은 결합되지 않거나 활성화되지 않은 충분한 T-세포를 함유한다.
본 발명의 항체는 2개의 세포를 매우 근접하게 집합시킬 수 있는데, 이는 본 발명의 항체에 의해 결합된 TNF 수용체 수퍼패밀의 구성원 및 제2 막 단백질 이외의 단백질들에 의해 매개되는 세포들 사이의 상호작용을 가능하게 한다. 하나의 그러한 상호작용은 하나의 세포의 T-세포 수용체와 다른 하나의 세포 상의 MHC의 상호작용이다.
상기 제1 및 제2 세포는 바람직하게는 상이한 세포이다. 상이한 세포들은 둘 모두 상기 제1 및 제2 막 단백질을 발현할 수 있다. 그러나 전형적으로, 제1 막 단백질은 상기 제1 세포 상에서만 발현되고, 상기 제2 막 단백질은 상기 제2 세포 상에서만 발현된다. 생물학적 활성은 제1 세포가 상기 제2 막 단백질을 발현하지 않거나; 상기 제2 세포가 상기 제1 막 단백질을 발현하지 않거나; 또는 더 바람직하게는 이들의 조합인 경우에 전형적으로 더 자극된다. TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원이 OX40; CD137; CD30 또는 CD40인 경우, 상기 제1 세포는 면역 세포, 바람직하게는 T 세포인 것이 바람직하다. 이들 경우에, 제2 세포는 비정상 세포, 종양 세포 또는 면역 세포 (예를 들어, 대식세포 또는 항원 제시 세포)인 것이 바람직하다. 비정상 세포는 건강한 개체에서는 통상 존재하지 않는 세포이다. 그러한 세포의 비제한적인 바람직한 예는 암 세포, 바이러스-감염된 세포, 기생충 감염된 세포, 또는 제2 막 단백질을 발현하도록 유도된 세포이다. 적합한 제2 세포는 또한 면역 세포이다. 그러한 세포의 바람직한 예는 수지상 세포, 대식세포, 골수계 계통의 다른 세포 또는 B 세포이다. 일부 경우에, 세포는 면역 세포, 섬유아세포 또는 암 세포와 같은 이웃하는 세포들에 의해 방출되는 억제 인자의 결과로서 제2 막 단백질을 발현할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 세포는 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 관련하여 종양 항원 또는 병원성 항원, 예컨대 바이러스 항원 또는 기생충 항원을 제시하는 항원 제시 세포이다. 상기 MHC 복합체는 바람직하게는 인간 백혈구 항원 (HLA) 복합체이다. 이와 관련하여, 본 발명의 항체는 시험관내에서의 항원 미감작 T 세포의 증폭 및 분화 둘 모두를 향상시킬 수 있다. 종양 항원에 대한 신규한 T 세포 반응을 유도하고 증강시킴으로써 전형적으로 더 효과적인 종양 면역 및 암 세포 근절이 얻어질 것이다.
CD137은 활성화된 T-세포에 의해 발현될 수 있다. 이것은 또한 다른 세포, 예컨대 수지상 세포, 자연 살해 세포, 과립구, 및 염증 부위에서의 혈관벽의 세포 상에서 발견된다. 이 단백질은 T-세포의 활성화를 위한 그의 공동자극 활성에 대해 알려져 있다. 리간드 CD137L은 단핵구, 대식세포 및 다른 세포 상에서 발현된다. CD137의 CD137 리간드에 대한 결합은 수용체 및 리간드 함유 세포 둘 모두에서 효과를 발휘한다. 리간드 또는 수용체의 활성화는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 일반적인 방법은 조직-배양 플레이트 상에 코팅하거나 항체를 통해 교차결합시키는 것이다 (검토를 위해, 문헌[Schwartz, 2004] 참조). 항종양 반응을 증강시키는 CD137의 능력과 결합되어, 선천 면역 세포 및 적응 면역 세포 둘 모두 상에서의 CD137 발현은 그것을 종양 면역을 증강시키기 위한 치료적 표적으로서 확립시켰다. 다양한 CD137-표적화된 면역요법제가 임상 개발에 도달하였다 (검토를 위해, 문헌[Makkouk et al 2016] 참조). 수용체 또는 리간드의 활성화는 그들의 효과를 발휘하기 위하여 세포막에서 동종이량체성 회합을 필요로 하는 것으로 나타난다. CD137에 대한 2개의 결합 부위를 갖는 항체는 수용체 또는 리간드를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 그러한 항체는 CD137에 대해 2가이다. CD137에 대한 하나의 결합 부위만을 갖는 분자를 또한 생성하였다. 종래 기술의 그러한 1가 결합 분자는 수용체를 활성화시킬 수 없었다 (문헌[McNamara 2008]). 대조적으로, 본 발명에 따른 결합 분자 또는 항체 또는 변이체는 그것이 CD137에 대해 1가일 때에도 CD137을 활성화시킬 수 있다.
OX40은 T-세포 상에서 발현되는 2차 공동자극성 면역 관문 분자이다. OX40 발현은 구성적이지 않으며, 그것은 전형적으로 활성화 이후 24 내지 72시간 후에 발현되며; 그의 리간드인 OX40L이 또한 휴지기 항원 제시 세포 상에서 발현되지 않지만, 그의 활성화 이후 발현된다.
본 발명에서는, TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 (제1 막 단백질)에 대한 단지 하나의 결합 부위를 갖는 결합 분자가, 상기 결합 분자가 또한 다른 세포 (제2 세포) 상의 제2 막 단백질에 대한 결합 부위를 갖는다면 - 이는 제2 막 단백질이 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 구성원이 아닌 경우를 포함함 -, 활성화될 수 있는 것으로 확인되었다. 제2 막 단백질은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 수용체에 대한 리간드일 수 있다. 그러나, 전형적으로 이것은 제1 막 단백질인 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 리간드가 아니다. 제2 막 단백질은 제1 막 단백질의 리간드가 아닌 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원에 대한 리간드일 수 있다.
세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성의 자극은 전형적으로 2개 이상의 수용체 복합체를 집합시킬 것을 필요로 한다. 세포 표면 막 상에 배열된 동종삼량체 리간드는 전형적으로 이웃하는 세포 상의 다수의 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 복합체를 결합시킴으로써 이를 달성한다. TNF 수용체 수퍼패밀리 복합체들의 클러스터링은 세포의 활성의 자극을 촉진시키는 것으로 여겨진다. 이것은, 예를 들어, CD137 수용체의 세포질 부분만을 갖는 인공 수용체로부터도 명백하다. 다양한 인공 수용체의 세포질 부분들의 매우 가까운 근접은 또한 인공 수용체 함유 세포를 자극한다. TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원에 특이적인 2가 단일특이성 항체는 또한 리간드 효과를 모방할 수 있고 활성을 자극한다. 항체의 아암들은 수용체들을 집합시키거나 클러스터링하는 것으로 여겨진다. 그러한 활성은 또한 수용체들의 교차결합으로 지칭된다. 이러한 활성은 경우에 따라 항-항체 항체를 제공함으로써 추가로 자극될 수 있으며, 이는 수용체의 추가의 교차결합을 제공한다. TNF-수용체 수퍼패밀리 구성원에 대한 단지 하나의 결합 부위를 갖는 종래 기술의 결합 분자는 전형적으로 이러한 활성을 자극할 수 없다. 그러한 분자는 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원을 클러스터링하거나 교차결합시키지 못한다. 그러나, 본 발명에 따른 결합 분자 또는 항체 또는 변이체는, 그것이 상기 TNF-수용체 수퍼패밀리 구성원에 대해 1가인 경우를 포함하여, TNF-수용체 수퍼패밀리 구성원의 활성을 자극할 수 있다. 어떠한 이론에도 구애됨이 없이, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 또한 TNF 수용체 수퍼패밀리 수용체 복합체들을 클러스터링하여, TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 활성화를 촉진시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 이는, 본 발명에 따른 항체에 의해 결합된 제2 막 단백질이 PD-L1과 같은 B7 패밀리의 구성원일 때 특히 그러하다.
본 발명의 일 태양에서, 제2 막 단백질은 상기 제2 막 단백질의 2개 이상의 인스턴스를 포함하는 다량체 단백질의 일부로서 세포막 상에 존재한다. 그러한 다량체 단백질은 본 발명의 결합 분자의 항원 결합 부위에 대한 2개 이상의 에피토프를 제공할 수 있다. 그러한 경우에, 다른 하나의 세포 상의 결합된 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원은 클러스터링되고 TNF 수용체 함유 세포의 활성을 자극할 것이다. 본 발명의 결합 분자는 상이한 세포 상의 다른 단백질에 대한 결합을 통해 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 근접을 강제로 행할 수 있다. 이는, 동일한 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 2개 이상의 인스턴스와 결합하는 결합 분자들에 의한 시스-교차결합의 반대어로서 트랜스-교차결합으로도 지칭되는 특징이다. 일부 실시 형태에서, 제2 막 단백질은 동종이량체 또는 동종삼량체이다. 동종이량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 단위로 구성된 단백질이다. 동종삼량체는 3개의 동일한 폴리펩티드 단위로 구성된 단백질이다. 어떠한 이론에 의해서도 구애됨이 없이, 제2 막 단백질의 항원 결합 부위에 대한 에피토프들은 다수의 결합 분자와 집합적으로 결합하는 것으로 여겨진다. 이로써, 이들은 2개 이상의 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 매우 가까운 근접을 강제로 행하는 앵커(anchor)로서 기능한다. 근접은 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 활성을 자극하기에 충분히 가깝다.
다른 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 세포막 상의 하나 이상의 별개의 구역 내에 존재하는 단백질이다. 세포막은 세포막의 모든 성분들의 균질한 분포를 제공하지는 않는다. 세포막은, 세포막의 하나 이상의 성분이 막의 다른 부분보다 더 빈번하게 존재하는 구역을 갖는 것으로 현재 알려져 있다 (검토를 위해, 문헌[Vereb, G., et al. 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. 100.14: 8053-8058] 참조). 상기 구역은 바람직하게는 세포막 상의 단백질 클러스터, 도메인, 마이크로-도메인 또는 구획, 바람직하게는 면역학적 시냅스이다. 어떠한 이론에 의해서도 구애됨이 없이, 비-랜덤 분포는 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 매우 가까운 근접을 용이하게 하는 것으로 여겨진다.
다른 실시 형태에서, 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 활성의 자극은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원 (제1 막 단백질) 및 상기 제2 막 단백질과 결합하는 2개 이상의 결합 분자를 제공함으로써 달성된다. 2개 이상의 결합 분자를 수반하는 실시 형태는 또한 Oligoclonics® 실시 형태로도 지칭된다. 예를 들어 도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, Oligoclonics® 실시 형태는 T 세포 활성화를 가져올 수 있다. 그러한 Oligoclonics® 제품의 일반적인 제조 방법이 국제특허 공개 WO 2013/157953호 및 WO2004/009618호에 개시되어 있으며, 이들은 본 명세서에 참고로 포함된다. 용어 'Oligoclonics'는 ®로 표시된 등록상표이다. Oligoclonics® 실시 형태에서, 결합 분자들 중 적어도 2개는 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들; 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들; 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들 및 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들과 결합한다. Oligoclonics® 실시 형태는 제1 및/또는 제2 막 단백질의 동일한 분자에 2개 이상의 결합 분자의 결합을 가능하게 함으로써, 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 활성을 자극한다. 결합 분자들 중 적어도 2개는 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들과 결합하거나; 또는 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들 및 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들과 결합하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 적어도 2개의 결합 분자는 상기 제1 막 단백질 상의 동일한 에피토프 및 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프와 결합한다. 일부 Oligoclonics® 실시 형태에서, 2개의 결합 분자는 TNF-수용체 수퍼패밀리 구성원-리간드 상호작용을 차단한다. 다른 Oligoclonics® 실시 형태에서, 2개의 결합 분자는 TNF-수용체 수퍼패밀리 구성원-리간드 상호작용을 차단하지 않는다.
제1 및 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들은 바람직하게는, 에피토프들 중 하나와 결합하는 결합 분자와 상이한 에피토프에 결합하는 결합 분자의 동시 결합이 가능하도록 하는 것이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 상이한 에피토프들은 비경쟁 에피토프들이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 상기 결합 분자들 중 제1 및 제2 결합 분자는 CD137 또는 OX40의 동일한 도메인과 결합할 수 있다. 일 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 및 제2 결합 분자는 CD137 또는 OX40 상의 동일한 에피토프와 결합한다.
제2 막 단백질은 바람직하게는 다량체 사이토카인 수용체, B7 패밀리의 구성원, CD28 패밀리의 구성원; ATP-결합 카세트 수송체 (ABC 수송체)의 구성원; 아쿠아포린; 세린/트레오닌 키나제 수용체 패밀리의 구성원; 수용체 티로신 키나제 패밀리의 구성원이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 제2 막 단백질은 B7 패밀리의 구성원이다. 일 바람직한 실시 형태에서, B7 패밀리 구성원은 CD80; CD86; PD-L1; PD-L2; ICOSL; B7-H3; B7-H4; B7-H5; B7-H6; 또는 B7-H7이다. 제2 막 단백질은 B7-패밀리의 공동억제성 단백질인 것이 바람직하다. 이러한 바람직한 실시 형태에서, 제2 막 단백질과 결합하는 가변 도메인은 B7-패밀리 구성원의, CD28 패밀리의 그의 결합 파트너에 대한 결합을 차단하는 것이 바람직하다. 이러한 방법으로, 제1 세포에 대한 제2 막 단백질에 의해 제공되는 잠재적인 공동억제성 신호가 감소된다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 제2 막 단백질은 PD-L1 또는 PD-L2, 바람직하게는 PD-L1이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 제2 막 단백질은 EGF 수용체 패밀리 (ErbB); 인슐린 수용체 패밀리; IGF 수용체 패밀리; FGF 수용체 패밀리; VEGF 수용체 패밀리; HGF 수용체 패밀리; 또는 AXL 수용체 패밀리의 구성원이다. 제2 막 단백질은 바람직하게는 EGF 수용체 패밀리 (ErbB)의 구성원, 바람직하게는 EGFR; ErbB-2 또는 ErbB-3, 바람직하게는 ErbB-2이다. EGF 수용체 패밀리의 EGFR, ErbB-3 또는 ErbB-4 구성원과 결합하는 가변 도메인은 상기 구성원에 대한 성장 인자의 결합을 차단하는 것이 바람직하다. 이러한 실시 형태에서, 상기 제2 세포 상의 EGF 수용체 패밀리 구성원의 활성은 감소된다.
본 발명의 실시 형태에서, 제2 막 단백질은 결합 쌍의 구성원이다. 예를 들어, EGF 수용체 (EGFR)와 EGF는 결합 쌍을 형성한다. 적합한 결합 쌍의 다른 비제한적인 예는 HER3과 헤레귤린(heregulin); LGR5-R스폰딘; LGR4-R스폰딘; 또는 B7 패밀리 구성원 리간드와, CD28 패밀리의 그의 수용체이다. 본 발명의 일 바람직한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 결합 분자는 결합 쌍의 상보적 구성원에 대한 제2 막 단백질의 결합을 차단한다. 그러한 결합 분자는 전형적으로 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성을 자극하고, 제2 막 단백질의 활성을 차단한다. 그러한 결합 분자는 제2 세포가 종양 세포인 상황에, 또는 암을 갖는 개체의 치료에 특히 매우 적합하다. 일 바람직한 실시 형태에서, 제2 막 단백질은 B7 패밀리의 구성원, 바람직하게는 PD-L1 또는 PD-L2, 바람직하게는 PD-L1이고, 상기 적어도 하나의 결합 분자는 바람직하게는 상기 B7 패밀리 구성원의, CD28 패밀리의 그의 정상 수용체에 대한 결합을 차단한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 제2 막 단백질은 PD-L1이고, 상기 적어도 하나의 결합 분자는 바람직하게는 PD-L1의 PD-1에 대한 결합을 차단한다.
본 발명은 CD137 발현 세포에서 생물학적 효과를 향상시키는 방법을 제공하며, 본 방법은, 제1 세포 및 제2 세포를 갖는 시스템을 제공하는 단계로서, 상기 제1 세포는 세포막 상에 CD137을 포함하고, 상기 제2 세포는 세포막 상에 단백질을 포함하며, 상기 단백질은 상기 단백질의 세포외 부분 상의 동일한 에피토프의 2개 이상의 인스턴스 (즉, 동일한 에피토프의 2개 이상의 카피가 존재함)를 갖는, 단계, 및 CD137의 세포외 부분에 대한 결합 부위 및 상기 에피토프에 대한 결합 부위를 포함하는 결합 분자를 상기 시스템에 제공하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 상기 생물학적 활성이 향상될 수 있게 하는 조건 하에서 상기 시스템을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 CD137 발현 세포는 면역 세포, 바람직하게는 T 세포이고, 상기 제2 세포는 종양 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 CD137 발현 세포는 면역 세포, 바람직하게는 T 세포이고, 상기 제2 세포는 다른 면역 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 CD137 발현 세포는 면역 세포, 바람직하게는 T 세포이고, 상기 제2 세포는 골수계 계통의 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 CD137 발현 세포는 면역 세포, 바람직하게는 T 세포이고, 상기 제2 세포는 항원 제시 세포이다. 상기 항원 제시 세포는 바람직하게는 MHC와 관련하여, 바람직하게는 HLA와 관련하여 종양 항원 또는 병원성 항원을 제시한다.
세포는, 막 상의 TNF-수용체 수퍼패밀리의 구성원이 그러한 세포에 의해 발현된다면, 전형적으로 그러한 구성원을 갖는다. 발현은 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 정량적 RNA 특이적 PCR이 종종 사용된다. 면역조직화학 또는 면역-형광을 사용한 FACS 분석이 또한 종종 사용된다.
제1 세포 및 제2 세포가 제공되는 적합한 시스템은 세포 배양물이다. 다른 적합한 시스템은 제1 세포 및 제2 세포를 포함하는 비인간 동물이다. 다른 적합한 시스템은 생체외(ex vivo) 시스템이며, 여기서는 세포가 활성 형태로 유지되지만 세포의 성장이 반드시 촉진되는 것은 아니다. 제1 세포와 제2 세포는, 예를 들어, 성장을 반드시 촉진시키지는 않지만 생물학적 활성이 측정될 수 있게 하는 검정 조건 하에서 함께 인큐베이션될 수 있다.
세포가 상기 제1 막 단백질과 상기 제2 막 단백질의 결합에 의해 매개되는 상기 생물학적 활성을 발현하게 하는 조건 하에서 상기 시스템을 인큐베이션하는 단계는, 상기 시스템이 제1 및 제2 세포가 결합 파트너의 결과로서 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 조건 하에서 유지되는 것을 의미한다. 생체내 또는 시험관내 인큐베이션은 생물학적 활성이 명백하게 되게 하기에 충분한 경과 시간보다 더 많은 시간을 수반할 필요는 없다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 결합 쌍의 막 단백질들의 결합을 차단하지 않는 가변 도메인은 전형적으로 가변 도메인의 부재 하에서의 결합과 대비하여 쌍의 결합을 감소시키지 않는다. 이것은 바람직하게는 시험관내 검정에서 측정된다. 전형적으로 이것은 가변 도메인을, 이것이 결합할 수 있는 막 단백질과 인큐베이션하고, 후속으로 혼합물을 쌍의 다른 하나의 구성원과 함께 인큐베이션함으로써 행해진다. 이어서, 쌍의 결합을 가변 도메인의 부재 하에서의 쌍의 결합과 비교한다. 가변 도메인은, 그것이, 가변 도메인의 부재 하에서의 결합과 대비하여, 쌍의 결합을 50% 이하, 바람직하게는 40% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 그리고 더 바람직하게는 10% 이하로 감소시킨다면, 특정 결합 쌍의 막 단백질들의 결합을 차단하지 않는 것으로 여겨진다. 가변 도메인에 의한 결합 및 결합 쌍의 다른 하나의 구성원에 대한 결합의 차단 또는 비차단은 동일한 상기 가변 도메인들 중 상기 2개를 포함하는 2가 단일클론 항체를 사용하여 얻어진 차단으로 본 명세서에 정의된다. 차단 또는 비차단은 동일한 상기 가변 도메인들 중 상기 2개를 포함하는 2가 단일특이성 항체를 사용하여 얻어진 것으로 정의된다.
CD137의 세포외 도메인과 결합할 수 있고 CD137의 CD137L에 대한 결합을 차단하지 않는 특정 가변 도메인은 MF6860; MF6848; MF6805; MF6832; MF6870; MF6862; MF6875; 또는 MF6873의 VH의 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인이다.
PD-L1의 세포외 도메인과 결합할 수 있고 PD1의 PD-L1에 대한 결합을 차단하지 않는 특정 가변 도메인은 MF5361의 VH의 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인이다.
반드시 양에 있어서는 아니고, 종류에 있어서의 가변 도메인의 기능적 양상, 예컨대 항원에 대한 결합, 수용체 리간드 상호작용의 차단 능력, 가변 도메인의 생물학적 활성 등이 다양한 방법으로 결정될 수 있다. 적합한 포맷은 Fab 단편 또는 항체이다. 적합한 항체 포맷은 2개의 가변 도메인을 포함하는 단일특이성 2가 항체이다. 다른 적합한 포맷은, 예를 들어, 시험하고자 하는 가변 도메인 및 다른 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체이다. 다른 하나의 가변 도메인은 바람직하게는 수행될 검정에 대하여 중성 특이성을 갖는 가변 도메인이다. 적합한 중성 가변 도메인은 파상풍 톡소이드와 결합할 수 있는 가변 도메인이다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 그의 TNF 수용체 수퍼패밀리 표적 막 단백질의 그의 결합 파트너에 대한 결합을 차단하는 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는, 그의 TNF 수용체 수퍼패밀리 표적 막 단백질의 그의 결합 파트너에 대한 결합을 차단하고, 2개의 상기 가변 도메인을 포함하는 단일특이성 2가 항체로 제공되는 경우, 세포 상의 TNF-수용체 수퍼패밀리 구성원의 활성을 자극하지 않는 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는, CD137의 CD137L에 대한 결합을 차단하고, 2개의 상기 가변 도메인을 포함하는 단일특이성 2가 항체로 제공되는 경우, 세포 상의 CD137의 활성을 자극하지 않는 가변 도메인을 포함한다.
본 발명은 또한 암을 갖는 개체를 치료하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 본 발명의 결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 항체 또는 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체 또는 본 발명의 이중특이성 항체를 암의 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 개체는 바람직하게는 암을 갖는 개체이다. 일부 실시 형태에서, 암은 상기 제2 막 단백질을 발현하는 암 세포를 포함하는 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은 B7 패밀리의 구성원을 발현하는 암 세포를 포함하는 암이다. 일부 실시 형태에서, 상기 개체의 면역 세포 및/또는 골수계 계통의 세포는 상기 제2 막 단백질, 바람직하게는 B7 패밀리의 구성원을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 개체의 항원 제시 세포 (APC)는 상기 제2 막 단백질, 바람직하게는 B7 패밀리의 구성원을 발현한다. 이들 실시 형태에 따르면, 암 세포는 상기 제2 막 단백질을 발현할 수 있거나 발현하지 않을 수 있다. APC가 상기 제2 막 단백질을 발현할 때, 상기 암의 항원은 개체의 그러한 APC에 의해 제시되고, 면역 세포 (바람직하게는 T 세포)의 전사활성화가 본 발명의 항체 또는 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체에 의해 유도될 수 있으며, 이들은 개체의 면역 세포, 및 면역 세포, APC 또는 종양 세포와 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD137 및 B7 패밀리의 구성원, 바람직하게는 PD-L1과 결합하는 본 발명의 항체 또는 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 사용된다. 본 발명의 그러한 항체 또는 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 CD137-발현 면역 세포 (바람직하게는 T 세포) 및 종양 세포 및/또는 면역 세포 및/또는 골수계 계통의 세포 및/또는 B7 패밀리의 상기 구성원을 발현하는 APC를 결합시킴으로써 면역 세포를 전사활성화시킬 수 있다.
암은 바람직하게는 선암종이다. 바람직한 암은 결직장암; 췌장암; 폐암; 유방암; 간암; 전립선암; 난소암; 자궁경부암; 자궁내막암; 두경부암; 흑색종; 고환암; 요로상피암; 신장암; 위선암(stomach cancer); 또는 카르시노이드 암(carcinoid cancer)이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 암은 결직장암; 췌장암; 폐암; 유방암; 간암; 전립선암; 난소암; 자궁경부암; 자궁내막암; 두경부암; 또는 흑색종이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 암은 결직장암; 췌장암; 폐암; 유방암; 또는 간암이다. 특정 바람직한 실시 형태에서, 암은 위장암이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 암은 결직장암이다. 이러한 실시 형태에서, 결합 분자, 바람직하게는 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 CD137 또는 OX40과 결합할 수 있는 가변 도메인 및 PD-L1과 결합할 수 있는 가변 도메인을 갖는 항체이다. CD137 또는 OX40과 결합하는 가변 도메인은 바람직하게는 CD137의 CD137 리간드에 대한 결합을 차단하거나, 또는 OX40의 경우 OX40의 OX40 리간드에 대한 결합을 차단한다. PD-L1과 결합하는 가변 도메인은 바람직하게는 PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 차단한다.
본 발명의 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체, 또는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체, 및 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포를 포함하는 생체외 시스템이 추가로 제공된다. 상기 제1 및 제2 세포는 바람직하게는 세포막 상의 상기 제1 및 상기 제2 막 단백질을 각각 발현한다. 상기 시스템은 바람직하게는 상기 제1 세포의 유지 및/또는 성장에 적합한 세포 시스템이다. 세포 시스템은 바람직하게는 상기 제2 세포의 유지 및/또는 성장에 적합하다. 예를 들어, 그러한 시스템은 비정상 세포를 향해 지향되는 면역 세포를 상승 및/또는 증배시키기에 적합하다. 후속으로, 그러한 면역 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어 암 환자에게 투여될 수 있다. 면역 세포는 바람직하게는 T-세포 또는 NK-세포, 바람직하게는 세포독성 T-세포를 포함한다. 면역 세포는 바람직하게는 이를 필요로 하는 개체에 대해 자가성(autologous)이다.
개체에서 상기 개체 내의 비정상 세포에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 방법이 추가로 제공되며, 본 방법은 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 상기 개체에 제공하는 단계를 포함한다. 비정상 세포는 바람직하게는 암 세포, 바이러스-감염된 세포, 기생충 또는 기생충-감염된 세포이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 세포는 암 세포 또는 신생물성 세포이다. 이러한 실시 형태에서, 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 CD137 또는 OX40의 세포외 부분과 결합할 수 있는 가변 도메인 및 PD-L1과 결합할 수 있는 가변 도메인을 갖는 항체이다. CD137 또는 OX40과 결합하는 가변 도메인은 바람직하게는 CD137의 CD137 리간드에 대한 결합을 차단하거나, 또는 OX40의 경우 OX40의 OX 리간드에 대한 결합을 차단한다. PD-L1과 결합하는 가변 도메인은 바람직하게는 PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 차단한다.
신생물은 조직의 비정상적인 성장이고, 그것이 또한 덩어리를 형성할 때 일반적으로 종양으로 지칭된다. 본 발명에서의 신생물은 전형적으로 덩어리를 형성한다. 신생물성 세포는 덩어리를 형성한 신생물로부터 유래된 세포이다. 세계보건기구 (WHO)는 신생물을 다음 4가지 주요 그룹으로 분류한다: 양성 신생물, 원위치 신생물, 악성 신생물, 및 불명확하거나 알려져 있지 않은 거동의 신생물. 악성 신생물은 또한 암으로 간단히 알려져 있다.
면역 반응을 자극하는 것은 면역 반응을 유도하는 것 및 기존의 면역 반응을 증강시키는 것을 포함한다. 개체에서의 면역 반응은, 적용가능한 경우, 개체의 종양 부하; 개체의 바이러스 부하; 개체의 기생충 부하를 측정함으로써 측정될 수 있다.
상기 바이러스-감염된 세포는 바람직하게는 면역-결핍 바이러스, 헤르페스 바이러스, 바람직하게는 단순 포진 바이러스, 수두-대상포진 바이러스, 거대세포바이러스 또는 엡스타인-바 바이러스, 파필로마 바이러스, 간염 바이러스, 바람직하게는 A형, B형 또는 C형 간염 바이러스, 홍역 바이러스 또는 아데노바이러스로 감염된 세포이다. 바이러스는 바람직하게는 개체에서 지속될 수 있는 것으로 알려진 바이러스이다. 지속 감염은 바이러스가 제거되지 않고 감염된 개체의 특정 세포 내에 남아 있는 것으로 특징지어진다. 지속 감염은 숙주 세포를 신속하게 사멸시키지 않거나 심지어는 그의 과도한 손상을 야기하지 않으면서 침묵 감염 및 증식 감염 둘 모두의 단계를 수반할 수 있다. 지속적인 바이러스-숙주 상호작용은 잠재성, 만성 및/또는 지발성 감염일 수 있다.
기생충-감염된 세포는 세포내 기생충으로 감염된 세포이다. 그러한 기생충은 숙주의 세포 내부에서 성장 및 증식할 수 있는 기생성 미생물이다. 일부 세포내 기생충은 또한 세포 외부에서 살아갈 수 있다. 그러한 기생충은 이른바 통성 세포내 기생충이다. 비제한적인 예는 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 레지오넬라(Legionella), 소정 미코박테리움 종 및 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)이다. 바람직한 세포내 기생충은 숙주 세포 밖에서 성장할 수 없는 기생충이며, 바람직한 예는 클라미디아(Chlamydia) 및 근연종, 소정 미코박테리움 종, 예컨대 미코박테리움 레프라이(Mycobacterium leprae), 소정 원생동물, 예를 들어 에피콤플렉산(Apicomplexan) 플라스모듐 종(Plasmodium spp.), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii) 및 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum) 및 트리파노소마티드(trypanosomatid)이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자 (전형적으로, 시험관내, 단리된 또는 재조합 핵산 분자)는 바람직하게는 도 3에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역들 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 도 3에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 인코딩한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 핵산 분자는 도 3에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다. 핵산 분자는 바람직하게는 사용될 항체 생성 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 사용한다. 바람직하게는, 도 3에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 도 3에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산은 인간 세포, 바람직하게는 Per.C6TM; 또는 중국 햄스터, 바람직하게는 CHO에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 본 발명은, 도 2의 중쇄 불변 영역과 함께, 언급된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 제공한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 핵산 분자는 전형적으로 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)이지만 제한적이지는 않다. 대체 핵산이 당업자에게 이용가능하다. 본 발명에 따른 핵산 분자는, 예를 들어 세포 내에 포함된다. 상기 핵산 분자가 상기 세포 내에서 발현되는 경우, 상기 세포는 본 발명에 따른 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 일 실시 형태에서 본 발명에 따른 항체 및/또는 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 항체는 상기 세포가 중쇄 및 경쇄를 생성할 때 생성된다. 본 발명의 항체를 생성할 수 있는 세포가 제공된다. 상기 세포는 바람직하게는, 공통 경쇄와 조합될 때 상기 제1 막 단백질과 결합할 수 있는 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 상기 세포는 바람직하게는, 공통 경쇄와 조합될 때 상기 제2 막 단백질과 결합할 수 있는 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 상기 세포는 바람직하게는 공통 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 상기 세포는 바람직하게는 동물 세포, 더 바람직하게는 포유동물 세포, 더 바람직하게는 영장류 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다. 본 발명의 목적을 위하여, 적합한 세포는 본 발명에 따른 항체 및/또는 본 발명에 따른 핵산을 포함할 수 있는, 그리고 바람직하게는 생성할 수 있는 임의의 세포이다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 세포를 추가로 제공한다. 또한, 본 발명의 항체를 단독으로 또는 함께 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 세포가 제공된다. 하나 이상의 핵산 분자는 발현가능한 핵산 분자이며, 이는 이들이 단백질 코딩 도메인의 RNA 전사 및 번역을 위한 인 시스 필요 신호를 함유함을 의미한다. 바람직하게는 상기 세포 (전형적으로, 시험관내, 단리된 또는 재조합 세포)는 상기 항체를 생성한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 하이브리도마 세포, 중국 햄스터 나소 (CHO) 세포, NS0 세포 또는 PER-C6TM 세포이다. 특정 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따른 세포를 포함하는 세포 배양물이 추가로 제공된다. 다양한 기관 및 회사는 항체의 대규모 생성을 위하여, 예를 들어 임상 사용을 위하여 세포주를 개발해 왔다. 그러한 세포주의 비제한적인 예는 CHO 세포, NS0 세포 또는 PER.C6TM 세포이다. 이들 세포는 또한 단백질의 생성과 같은 다른 목적으로 사용된다. 단백질 및 항체의 산업적 규모 생성을 위해 개발된 세포주는 본 명세서에서 산업적 세포주로 추가로 지칭된다. 따라서 일 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 생성을 위한 항체의 대규모 생성을 위해 개발된 세포주의 사용을 제공한다. 본 발명은 도 3, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같은 VH, VL, 및/또는 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 항체를 생성하기 위한 세포를 추가로 제공한다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같은 서열을 포함한다.
본 발명은 항체를 생성하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 본 방법은 본 발명의 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양물로부터 상기 항체를 수확하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포는 무혈청 배지 중에서 배양된다. 바람직하게는, 상기 세포는 현탁 성장에 적합하다. 본 발명에 따른 항체를 생성하기 위한 방법에 의해 얻을 수 있는 항체가 추가로 제공된다. 항체는 바람직하게는 배양물의 배지로부터 정제된다. 바람직하게는, 상기 항체는 친화성 정제된다.
본 발명의 세포는, 예를 들어 하이브리도마 세포주, CHO 세포, 293F 세포, NS0 세포 또는 임상 목적을 위한 항체 생성에 있어서의, 특히 인간에서의 투여에 사용되는 항체 생성에 있어서의 적합성에 대해 당업계에 알려진 임의의 다른 세포 유형이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 인간 세포, 바람직하게는 아데노바이러스 E1 영역 또는 그의 기능적 등가물에 의해 형질전환된 세포이다. 그러한 세포주의 바람직한 예는 PER.C6TM 세포주 또는 그의 등가물이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 CHO 세포 또는 그의 변이체, 바람직하게는 항체의 발현을 위한 글루타민 신테타제 (GS) 벡터 시스템을 사용하는 변이체이다.
본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 항체 또는 그의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 그의 변이체는 표지, 바람직하게는 생체내 이미징을 위한 표지를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 표지는 전형적으로 치료적 응용에 반드시 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 진단 환경에서, 표지는 유용할 수 있다. 예를 들어, 체내의 표적 세포를 가시화하는 데 유용할 수 있다. 다양한 표지가 적합하고, 많은 것들이 당업계에 잘 알려져 있다. 일 바람직한 실시 형태에서, 표지는 검출용 방사성 표지이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 표지는 적외선 표지이다. 바람직하게는, 적외선 표지는 생체내 이미징에 적합하다. 다양한 적외선 표지가 당업자에게 이용가능하다. 바람직한 적외선 표지는, 예를 들어 IRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; IRDye 700 포스포라미다이트; IRDye 800 포스포라미다이트 (LI-COR USA; 미국 네브래스카주 링컨 4647 수페리어 스트리트 소재)이다.
환자에게 투여되는 본 발명에 따른 항체의 양은 전형적으로 치료적 창(therapeutic window) 내에 있어야 하는데, 이는 치료적 효과를 얻는 데 충분한 양이 사용되지만, 그 양은 허용 불가능한 정도의 부작용으로 이어지는 역치 값을 초과하지 않음을 의미한다. 원하는 치료적 효과를 얻는 데 필요한 항체의 양이 낮을수록, 전형적으로 치료적 창은 더 클 것이다. 따라서, 낮은 투여량에서 충분한 치료적 효과를 발휘하는 본 발명에 따른 항체가 바람직하다. 투여량은 니볼루맙의 투여 계획(dosing regimen)의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 더 낮을 수 있다.
종양 억제 환경에서, 주위 세포 상에서의 PD-L1의 발현은, 실시예 8에 기재된 바와 같이 T 세포 상에서의 CD137의 활성화를 야기할 밀도 역치에 도달할 것으로 예상된다 (도 28a 및 도 28b). 그렇기 때문에, 이중특이성 항체는 종양 내의 T 세포를 활성화시키고, 낮은 PD-L1 세포 표면 수준을 나타내는 세포에 대해서는 작용하지 않을 - 또는 유의하게 더 낮은 정도로 작용할 - 것이다. 게다가, CD137×PD-L1 이중특이성 항체가 PD-L1 차단 Fab 아암을 함유하는 경우에, 항체는 PD-1/PD-L1 차단을 극복할 것이다. '트랜스'로 작용함으로써, CD137×PD-L1 항체는 PD-1/PD-L1 차단을 해제시키고 동시에, CD137을 활성화시킴으로써 T 세포를 활성화시킬 것이다. 그 결과, CD137×PD-L1 항체는 국소 T-세포 반응을 증강시켜 다수의 사이토카인의 방출로 이어질 수 있으며 (실시예 9), 이는 다시 종양 미세환경에서 다른 면역 세포를 활성화시키고 종양에서의 국소 면역 억제를 적어도 부분적으로 극복할 수 있다. 본 발명에 따른 이중특이성 항체가 동일한 종류의 특이성을 갖는 종래 기술의 벤치마크 항체에 기반한 항체, 예컨대 실시예에서의 우렐루맙에 기반한 항체 (항-CD137) 또는 아테졸리주맙에 기반한 항체 (항-PD-L1)와 대비하여 종종 더 우수한 T 세포 활성화 특성을 가지며, 더 강한 T 세포 활성화 활성이 그러한 벤치마크-기반 항체들 중 2개 항체의 혼합물과 비교하여 본 발명에 따른 이중특이성 항체에 의해 달성되었음이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 이것은, 예를 들어, 본 실시예의 T 세포 전사활성화 검정 및 SEB 자극 검정에 나타나 있다. 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 종양-관련 M2 대식세포에 의해 유도된 면역 억제를 역전시킬 수 있고, 시험관내에서의 환자 종양으로부터 단리된 종양 특이적 T 세포를 (재)자극할 수 있는 것으로 또한 입증되었다. 본 발명에 따른 이중특이성 항체는 종양-특이적 CD4+ 이펙터 기억 T 세포, 종양-특이적 CD8+ 이펙터 기억 T 세포 및 종양-특이적 CD8+ 최종 분화된 T 세포를 (재)자극할 수 있는 반면, 아테롤리주맙을 기반으로 한 벤치마크 항-PD-L1 항체는 전형적으로 단지 CD4+ T 세포만을 (재)자극한다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체는, CD8+ T 세포를 포함하여, 벤치마크 항체와 대비하여 항원-특이적 T 세포들의 더 가변적인 하위세트를 (재)자극하는 효력을 갖는다.
항원-경험된 CD8 T 세포를 활성화시킴으로써 종양에 대한 기존의 세포독성 T 세포 반응을 증강시킨 다음에, CD137×PD-L1 이중특이성 항체는 드 노보(de novo) CD8+ T 세포 항-종양 반응을 증강시킬 수 있다. 항원 제시 세포에 의해 에워싸인 종양 세포 또는 죽어가는 종양 세포에 의해 환경 내로 유입된 종양 (신생)항원은 종양 조직 내에서 발견되는 전위성 림프계 형성물인 배출 림프절 또는 삼차 림프계 구조로 수송된다. 국소 종양 환경에서, 종양 항원은 미감작 CD8+ T 세포에 제시되며, 이는 항원-인식 시에 증폭 및 분화될 것이다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 항체는, 우렐루맙 또는 아테졸리주맙에 기반한 벤치마크 항체와 대비하여 더 높은 정도로 CD8+ T 세포 프라이밍 후 T 세포 증폭을 향상시킬 수 있다. 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 우렐루맙 및 아테졸리주맙을 기반으로 한 벤치마크 항체들의 혼합물보다 더 큰, 항원-특이적 CD8+ T 세포의 증폭 및 분화 둘 모두를 유도할 수 있음이 입증되었는데, 이는 종양-특이적 기억 및 최종 분화된 살해 T 세포의 큰 집단의 생성을 촉진시킬 것이다.
본 발명에 따른 항체 또는 그의 변이체, 및 특히 이중특이성 항체 또는 그의 변이체는 가변 도메인을 갖는 2가 단일특이성 항체들의 병용물보다 더 적은 부작용을 가질 수 있다. 억제성 및/또는 공동자극성 분자를 차단하는 항체들의 병용물은 기존의 면역요법에 반응하지 않는 환자에게 유익하다. 그러나, 면역-조절성 수용체 (iMOD)의 이중 차단은 면역-관련 독성을 증가시키는 것으로 밝혀져 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 그의 변이체, 및 특히 이중특이성 항체 또는 그의 변이체는 iMOD의 이중 차단에 대처하기에 적합한데, 이들은 단일클론 항체 병용물에 의해 재현될 수 없는 기능적 활성을 발휘할 수 있고, 특정 세포 집단을 더 선택적으로 표적화할 수 있으며, 이는 환자에서 안전성 문제를 감소시키기 때문이다. 어떠한 이론에도 구애됨이 없이, 단일특이성 항체들(의 병용물)과 대비하여, 본 발명의 이중특이성 항체 또는 변이체의 유해한 부작용의 감소된 가능성은, 적어도 부분적으로, 본 발명의 이중특이성 항체 또는 변이체는 전형적으로 인 트랜스(in trans)로 T 세포 활성화를 나타내는 반면, 이것은 낮은 인 시스 T 세포 활성화 활성을 갖기 때문이다. 본 발명과 관련하여 낮은 인 시스 T 세포 활성화 활성을 갖는 항체의 사용이 바람직한데, 그 이유는 이것이 잠재적인 비특이적 T 세포 반응을 저하시키기 때문이다. 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 가변 도메인을 갖는 2가 단일특이성 항체들의 병용물보다 더 적은 면역-관련 독성을 갖는다.
상기 관점에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항체, 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 치료적 응용에 바람직하다.
중쇄의 이종-이량체화를 유도하는 CH3 영역 내에 돌연변이를 함유하는 상보적 발현 벡터 내로 클로닝함으로써 이중특이성 항체로서 항체를 생성하였다. 많은 이중특이성 항체를 소규모로 생성하고, 결합 및 기능적 검정에서 암 세포주에 대해 시험하였다. 본 발명의 항체, 특히 본 발명의 이중특이성 항체는 낮은 독성 프로파일과 고효능을 겸비할 수 있다. 본 발명의 항체는 다양한 유형 및 라인의 면역 표적화 요법에 유용할 수 있다. 본 발명의 항체는 양쪽 아암을 사용하여 동일한 항원(들)과 결합하는 항체에 비하여 증가된 치료적 창을 가질 수 있다.
비정상 세포, 종양 및/또는 전이의 형성의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 용도가 추가로 제공된다. 상기 전이의 기원이 되는 종양은 바람직하게는 상기 제2 세포막 단백질에 대해 양성인, 바람직하게는 B7 패밀리의 구성원에 대해 양성인 종양이다.
본 발명의 항체는 현탁 293F 세포 중에서의 일시적 형질감염 후에 50 mg/L 초과의 수준으로 생성될 수 있다. 이중특이성 항체는 70% 초과의 수율로 98% 초과의 순도로 정제될 수 있다. 분석적 특성화 연구는 2가 단일특이성 IgG1과 비견되는 이중특이성 IgG1 항체 프로파일을 보여준다.
본 발명은 또한, TNF 수용체 수퍼패밀리의 막 관련 구성원의 세포외 부분 및 막 관련 제2 막 단백질, 바람직하게는 B7 패밀리의 구성원의 세포외 부분에 결합할 수 있는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 또는 유사체는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 상기 제2 단백질, 바람직하게는 B7 패밀리의 상기 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 상기 이중특이성 항체 또는 기능성 부분, 유도체 또는 유사체의 항원 결합 부분은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인 및 B7 패밀리의 상기 구성원과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인으로 이루어진다. 상기 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 또는 유사체는 바람직하게는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원에 대해 1가이고 B7 패밀리의 상기 구성원에 대해 1가이다. 상기 이중특이성 항체는 바람직하게는 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 전장 IgG, 즉 전장 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 전장 IgG1 또는 전장 IgG4이다.
본 발명은 또한 CD137의 세포외 부분 및 PD-L1의 세포외 부분에 결합할 수 있는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다. 상기 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 또는 유사체는 바람직하게는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 상기 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 또는 유사체는 바람직하게는 CD137과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위 및 PD-L1과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 상기 이중특이성 항체 또는 기능성 부분, 유도체 또는 유사체의 항원 결합 부분은 CD137의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인 및 PD-L1과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인으로 이루어진다. 상기 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 또는 유사체는 바람직하게는 CD137에 대해 1가이고, PD-L1에 대해 1가이다. 일부 실시 형태에서, CD137과 결합할 수 있는 항원 결합 부위는 CD137의 CD137L에 대한 결합을 차단할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD137과 결합할 수 있는 항원 결합 부위는 CD137의 CD137L에 대한 결합을 차단할 수 없다. 일부 실시 형태에서, PD-L1과 결합할 수 있는 항원 결합 부위는 PD-L1의 PD-1에 대한 결합을 차단할 수 있다. 일부 실시 형태에서, PD-L1과 결합할 수 있는 항원 결합 부위는 PD-L1의 PD-1에 대한 결합을 차단할 수 없다. 상기 이중특이성 항체는 바람직하게는 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 전장 IgG, 즉 전장 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 전장 IgG1 또는 전장 IgG4이다.
또한, 암을 갖는 개체를 치료하기 위한 방법이 제공되며, 본 방법은 본 발명의 결합 분자 또는 본 발명의 이중특이성 항체 또는 기능성 부분, 유도체 또는 유사체를 암의 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 암을 갖는 개체의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 결합 분자 또는 본 발명의 이중특이성 항체 또는 기능성 부분, 유도체 또는 유사체를 추가로 제공한다.
본 발명의 항체 또는 이중 특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체, 및 TNF 수용체 수퍼패밀리의 막 관련 구성원을 발현하는 제1 세포 및 막 관련 제2 막 단백질, 바람직하게는 B7 패밀리의 구성원을 발현하는 제2 세포를 포함하는 세포 시스템이 추가로 제공된다.
본 발명은 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성을 자극하는 방법을 제공하며, 본 방법은 제1 세포 및 제2 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 제1 세포는 세포막 상에 상기 구성원을 갖고, 상기 제2 세포는 세포막 상에 제2 막 단백질을 가지며, 상기 방법은 상기 세포들을, 하나의 가변 도메인은 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위를 포함하고, 다른 가변 도메인은 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 2개의 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 변이체와 접촉시켜, 상기 제1 세포 상의 상기 구성원의 활성을 자극하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 바람직한 실시 형태에서, TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원은 CD137 또는 OX40이다. 상기 제2 막 단백질은 바람직하게는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다. 상기 이중특이성 항체는 바람직하게는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원에 대해 1가이고, 상기 제2 막 단백질에 대해 1가이며, 바람직하게는 B7 패밀리의 구성원에 대해 1가이다. 상기 이중특이성 항체는 바람직하게는 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 전장 IgG, 즉 전장 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 전장 IgG1 또는 전장 IgG4이다.
상기 제1 세포는 바람직하게는 세포막 상에서 상기 제2 막 단백질을 유의하게 발현하지 않는다. 상기 제2 막 단백질은 바람직하게는 세포막 상의 하나 이상의 구역 내에 존재하는 단백질이다. 상기 구역은 바람직하게는 세포막 상의 클러스터, 도메인, 마이크로-도메인 또는 구획, 바람직하게는 면역학적 시냅스이다. 상기 제2 막 단백질은 바람직하게는 상기 제2 막 단백질의 2개 이상의 인스턴스를 포함하는 다량체 단백질의 일부로서 세포막 상에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 동종이량체 또는 동종삼량체의 일부로서 세포막 상에 존재한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 다량체 사이토카인 수용체, B7 패밀리의 구성원, CD28 패밀리의 구성원; ATP-결합 카세트 수송체 (ABC 수송체)의 구성원; 아쿠아포린; 세린/트레오닌 키나제 수용체 패밀리의 구성원; 수용체 티로신 키나제 패밀리의 구성원이다. 제2 막 단백질은 바람직하게는 B7-패밀리의 구성원, 바람직하게는 PD-L1 또는 PD-L2, 바람직하게는 PD-L1이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 제2 막 단백질은 EGF 수용체 패밀리 (ErbB); IGF 수용체 패밀리; FGF 수용체 패밀리; VEGF 수용체 패밀리; HGF 수용체 패밀리; 또는 AXL 수용체 패밀리의 구성원이다. 제2 막 단백질은 바람직하게는 EGF 수용체 패밀리 (ErbB)의 구성원, 바람직하게는 EGFR; ErbB-2 또는 ErbB-3, 바람직하게는 ErbB-2이다. 바람직하게는, TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원과 결합하는 가변 도메인은 구성원에 대한 리간드의 결합을 차단한다. TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합하는 가변 도메인은 바람직하게는, TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원과 결합하는 2개의 상기 가변 도메인을 포함하는 2가 단일특이성 항체 포맷일 때, 세포 상의 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 활성을 자극하지 않는 가변 도메인으로서 정의된다. 방법은 바람직하게는, TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 추가의 이중특이성 항체를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제1 이중특이성 항체와 상기 제2 이중특이성 항체는,
- 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들;
- 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들; 또는
- 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들 및 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들과 결합하며;
상기 방법은 상기 제1 및 제2 세포를 상기 제1 및 제2 이중특이성 항체와 함께 인큐베이션하여, 상기 제1 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 활성을 자극하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 일 바람직한 실시 형태에서, TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원은 CD137 또는 OX40이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 상기 제2 이중특이성 항체는 각각 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위를 포함한다. 상기 제2 막 단백질은 바람직하게는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다. 상기 제1 및/또는 상기 제2 이중특이성 항체는 바람직하게는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원에 대해 1가이고, 상기 제2 막 단백질에 대해 1가이며, 바람직하게는 B7 패밀리의 상기 구성원에 대해 1가이다. 상기 제1 및/또는 상기 제2 이중특이성 항체는 바람직하게는 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 이중특이성 항체는 전장 IgG, 즉 전장 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 전장 IgG1 또는 전장 IgG4이다.
상기 제2 막 단백질과 결합할 수 있는 제1 및 제2 이중특이성 항체의 항원 결합 부위들은 바람직하게는 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분 상의 상이한 에피토프들과 결합한다. 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분 상의 상이한 에피토프들은 바람직하게는 비경쟁 에피토프들이다.
또한, CD137 또는 OX40의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 상기 CD137 또는 OX40과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위를 포함한다. 상기 제2 막 단백질은 바람직하게는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아니다. 제2 막 단백질은 바람직하게는 T-세포에 의해 유의한 정도로 발현되지 않는다. 제2 막 단백질은 바람직하게는 면역 세포, 골수계 계통의 세포, 항원 제시 세포, 종양 세포, 바이러스 감염된 세포 또는 기생충 감염된 세포 상에서 발현된다. 바람직하게는, 상기 제2 막 단백질은 세포막 상의 하나 이상의 구역 내에 존재하는 단백질이다. 상기 구역은 바람직하게는 세포막 상의 클러스터, 도메인, 마이크로-도메인 또는 구획, 바람직하게는 면역학적 시냅스이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 2개 이상의 상기 제2 막 단백질을 포함하는 다량체 단백질의 일부로서 세포막 상에 존재하는 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 막 단백질은 동종이량체 또는 동종삼량체의 일부로서 세포막 상에 존재한다. 바람직하게는, 상기 제2 막 단백질은 다량체 사이토카인 수용체, B7 패밀리의 구성원, CD28 패밀리의 구성원; ATP-결합 카세트 수송체 (ABC 수송체)의 구성원; 아쿠아포린; 세린/트레오닌 키나제 수용체 패밀리의 구성원; 수용체 티로신 키나제 패밀리의 구성원이다. 제2 막 단백질은 바람직하게는 B7-패밀리의 구성원, 바람직하게는 PD-L1 또는 PD-L2, 바람직하게는 PD-L1이다. 일부 실시 형태에서, 제2 막 단백질은 EGF 수용체 패밀리 (ErbB); 인슐린 수용체 패밀리; IGF 수용체 패밀리; FGF 수용체 패밀리; VEGF 수용체 패밀리; HGF 수용체 패밀리; 또는 AXL 수용체 패밀리의 구성원이다. 일부 실시 형태에서, 제2 막 단백질은 EGF 수용체 패밀리 (ErbB)의 구성원, 바람직하게는 EGFR; ErbB-2 또는 ErbB-3, 바람직하게는 ErbB-2이다. 상기 CD137 또는 OX40과 결합하는 가변 도메인은 바람직하게는 상기 구성원에 대한 리간드의 결합을 차단한다. 상기 CD137 또는 OX40의 세포외 부분과 결합하는 가변 도메인은 바람직하게는, 상기 CD137 또는 OX40과 결합하는 2개의 상기 가변 도메인을 포함하는 2가 단일특이성 항체 포맷일 때, 세포 상의 상기 CD137 또는 OX40의 활성을 자극하지 않는 가변 도메인으로서 정의된다. 상기 이중특이성 항체는 바람직하게는 CD137 또는 OX40에 대해 1가이고, 상기 제2 막 단백질에 대해 1가이다. 상기 이중특이성 항체는 바람직하게는 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 전장 IgG, 즉 전장 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 바람직하게는 전장 IgG1 또는 전장 IgG4이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 이중특이성 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 2개 이상의 이중특이성 항체를 포함하는 조성물 또는 파트 키트가 제공되며, 여기서 제1 및 제2 이중특이성 항체의 CD137 또는 OX40과 결합할 수 있는 항원 결합 부위들은 상기 CD137 또는 OX40 상의 상이한 에피토프들과 결합한다. 또한, 세포 상의 CD137 또는 OX40의 활성을 자극하는 방법이 제공되며, 본 방법은 제1 세포 및 제2 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 제1 세포는 세포막 상에 CD137 또는 OX40 (제1 막 단백질)을 갖고, 상기 제2 세포는 세포막 상에 제2 막 단백질을 가지며, 상기 방법은 상기 세포들을, 하나의 가변 도메인은 상기 제1 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위를 포함하고, 다른 가변 도메인은 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 2개의 가변 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 이중특이성 항체 (제1 이중특이성 항체)와 접촉시켜, 상기 제1 세포 상의 상기 제1 막 단백질의 활성을 자극하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 이중특이성 항체는 상기 제1 막 단백질과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 상기 방법은 바람직하게는, 상기 제1 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 가변 도메인; 및 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 갖는 가변 도메인을 포함하는 본 발명의 따른 추가의 이중특이성 항체 (제2 이중특이성 항체)를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제1 이중특이성 항체와 상기 제2 이중특이성 항체는,
- 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들;
- 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들; 또는
- 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들 및 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들과 결합하며;
상기 방법은 상기 제1 및 제2 세포를 상기 제1 및 제2 이중특이성 항체와 함께 인큐베이션하여, 상기 제1 세포 상의 CD137 또는 OX40의 활성을 자극하는 단계를 추가로 포함한다. 제2 막 단백질은 바람직하게는 B7 패밀리의 구성원, 더 바람직하게는 PD-L1이다.
본 명세서에서 하기에 나타낸 바와 같은 MF 서열에 의해 정의된 항체는 바람직하게는 2개의 상이한 가변 도메인을 갖는 이중특이성 항체이며, 여기서 이들 가변 도메인 중 하나는 지시된 서열을 포함한다.
CD137의 세포외 부분에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는, MF6754; MF6763; MF6785; 또는 MF6797 (도 3)의 가변 중쇄 영역의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
CD137의 세포외 부분에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는, MF6754; MF6763; MF6785; 또는 MF6797 (도 3)에 대해 나타낸 VH 중 하나의 가변 중쇄 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 바람직하게는 동일한 VH 영역으로부터 선택된다.
CD137의 세포외 부분에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는, MF6754; MF6763; MF6785; 또는 MF6797의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 상기 지시된 MF의 가변 중쇄 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 존재하는 경우, 아미노산 삽입(들), 결실(들), 치환(들) 또는 이들의 조합은 바람직하게는 CDR 영역의 아미노산 서열 내에 존재하지 않는다.
PD-L1의 세포외 부분에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는, MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5424; MF5561; MF5439; MF5553; MF5594; MF5426; MF5442 또는 MF5361 (도 3)의 가변 중쇄 영역의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
PD-L1의 세포외 부분에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는, MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5424; MF5561; MF5439; MF5553; MF5594; MF5426; MF5442 또는 MF5361 (도 3)에 대해 나타낸 VH 중 하나의 가변 중쇄 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 바람직하게는 동일한 VH 영역으로부터 선택된다.
PD-L1의 세포외 부분에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는, MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5424; MF5561; MF5439; MF5553; MF5594; MF5426; MF5442 또는 MF5361의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 상기 지시된 MF의 가변 중쇄 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 존재하는 경우, 아미노산 삽입(들), 결실(들), 치환(들) 또는 이들의 조합은 바람직하게는 CDR 영역의 아미노산 서열 내에 존재하지 않는다.
항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 CD137 리간드에 대한 CD137의 결합을 차단하는 CD137의 세포외 부분에 결합할 수 있는 가변 도메인 및 PD-L1에 대한 PD-1의 결합을 차단하는 PD-L1의 세포외 부분에 결합할 수 있는 가변 도메인을 포함한다. 이러한 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체 내의 PD-L1의 세포외 부분과 결합하는 가변 도메인은 바람직하게는, MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5424; MF5561; MF5439; MF5553; MF5594; MF5426; MF5442 또는 MF5361 (도 3)의 VH 중 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, PD-L1의 세포외 부분과 결합하는 가변 도메인은 MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5424; MF5561; MF5439; MF5553; MF5594; MF5426; MF5442 또는 MF5361의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 상기 지시된 MF의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함한다.
이러한 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체 내의 CD137의 세포외 부분과 결합하는 가변 도메인은 바람직하게는, MF6754; MF6763; MF6785; 또는 MF6797 (도 3)의 VH 중 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함한다. 일 바람직한 실시 형태에서, CD137의 세포외 부분과 결합하는 가변 도메인은 MF6754; MF6763; MF6785; 또는 MF6797의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 상기 지시된 MF의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함한다. 존재하는 경우, 아미노산 삽입(들), 결실(들), 치환(들) 또는 이들의 조합은 바람직하게는 CDR 영역의 아미노산 서열 내에 존재하지 않는다. 이러한 항체 또는 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체에서의 특히 바람직한 조합은 MF6763과 MF7702; MF6785와 MF7702; MF6797과 MF5553; MF6763과 MF5553; MF6785와 MF5553; MF6754와 MF5424; MF6763과 MF5561; MF6785와 MF5439; MF6797과 MF5553; MF6744와 MF5594; MF6744와 MF5361; MF6783과 MF5361; 또는 MF6783과 MF5594의 지시된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 가변 도메인들의 조합이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 하기를 포함한다:
- MF6754의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5594; MF5424; MF5426; MF5553; MF5442; MF5561; MF5439 또는 MF5361 (도 3)의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 하기를 포함한다:
- MF6754의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6754의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5594; MF5424; MF5426; MF5553; MF5442; MF5561; MF5439 또는 MF5361 (도 3)의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 상기 지시된 MF의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 하기를 포함한다:
- MF6763의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5594; MF5424; MF5426; MF5553; MF5442; MF5561; MF5439 또는 MF5361 (도 3)의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 하기를 포함한다:
- MF6763의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6763의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5594; MF5424; MF5426; MF5553; MF5442; MF5561; MF5439 또는 MF5361 (도 3)의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 상기 지시된 MF의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 하기를 포함한다:
- MF6785의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5594; MF5424; MF5426; MF5553; MF5442; MF5561; MF5439 또는 MF5361 (도 3)의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 하기를 포함한다:
- MF6785의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6785의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5594; MF5424; MF5426; MF5553; MF5442; MF5561; MF5439 또는 MF5361 (도 3)의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 상기 지시된 MF의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 하기를 포함한다:
- MF6797의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5594; MF5424; MF5426; MF5553; MF5442; MF5561; MF5439 또는 MF5361 (도 3)의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 하기를 포함한다:
- MF6797의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6797의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5554; MF5576; MF5578; MF9375; MF9376; MF7702; MF5594; MF5424; MF5426; MF5553; MF5442; MF5561; MF5439 또는 MF5361 (도 3)의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 상기 지시된 MF의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
실시예에 나타낸 바와 같이, MF5553에 기반한 PD-L1 결합 가변 도메인을 갖는 항체는, MF6754, MF6763, MF6785 및 MF6797을 포함한, 상이한 CD137 결합 가변 도메인들과 조합하여, 특히 우수한 T 세포 활성화 결과를 제공한다.
따라서, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다:
- MF6754의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6754의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6754의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6754의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5553의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다:
- MF6763의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6763의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6763의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6763의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5553의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다:
- MF6785의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6785의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6785의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6785의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5553의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다:
- MF6797의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6797의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6797의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6797의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5553의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5553의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
더욱이, MF7702에 기반한 PD-L1 결합 가변 도메인을 갖는 항체는, MF6763, MF6785 및 MF6797을 포함한, 상이한 CD137 결합 가변 도메인들과 조합하여, 특히 우수한 T 세포 활성화 결과를 제공하는 것으로 실시예에 나타나 있다.
따라서, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다:
- MF6797의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF7702의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6797의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF7702의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6797의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6797의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF7702의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF7702의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다:
- MF6763의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF7702의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6763의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF7702의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6763의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6763의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF7702의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF7702의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다:
- MF6785의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF7702의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6785의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF7702의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6785의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6785의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF7702의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF7702의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
더욱이, MF6744에 기반한 CD137 결합 가변 도메인 및 MF5594에 기반한 PD-L1 결합 가변 도메인을 갖는 이중특이성 항체가 특히 우수한 T 세포 활성화를 제공하는 것으로 실시예에 나타나 있으며; 예를 들어, 도 14 내지 도 16을 참조한다. 중요하게는, 그러한 항체는 항체 우렐루맙에 기반한 항체와 대비하여 더 강한 T 세포 활성화 잠재력을 갖는다.
따라서, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다:
- MF6744의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5594의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6744의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5594의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6744의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6744의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5594의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5594의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
더욱이, MF6744에 기반한 CD137 결합 가변 도메인 및 MF5361에 기반한 PD-L1 결합 가변 도메인을 갖는 이중특이성 항체가 특히 우수한 T 세포 활성화를 제공하는 것으로 실시예에 나타나 있으며; 예를 들어, 도 14 내지 도 16을 참조한다. 중요하게는, 그러한 항체는 항체 우렐루맙에 기반한 항체와 대비하여 더 강한 T 세포 활성화 잠재력을 갖는다.
따라서, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다:
- MF6744의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5361의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6744의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5361의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6744의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6744의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5361의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5361의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
더욱이, MF6783에 기반한 CD137 결합 가변 도메인 및 MF5361에 기반한 PD-L1 결합 가변 도메인을 갖는 이중특이성 항체가 특히 우수한 T 세포 활성화를 제공하는 것으로 실시예에 나타나 있으며; 예를 들어, 도 14 및 도 15를 참조한다. 중요하게는, 그러한 항체는 항체 우렐루맙에 기반한 항체와 대비하여 더 강한 T 세포 활성화 잠재력을 갖는다.
따라서, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다:
- MF6783의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5361의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6783의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5361의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6783의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6783의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5361의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5361의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
더욱이, MF6783에 기반한 CD137 결합 가변 도메인 및 MF5594에 기반한 PD-L1 결합 가변 도메인을 갖는 이중특이성 항체가 특히 우수한 T 세포 활성화를 제공하는 것으로 실시예에 나타나 있으며; 예를 들어, 도 14 및 도 15를 참조한다.
따라서, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다:
- MF6783의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5594의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6783의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5594의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
또한, 하기를 포함하는 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제공된다:
- MF6783의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6783의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인; 및
- MF5594의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5594의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
게다가, MF6744에 기반한 CD137 결합 가변 도메인 및 MF5361에 기반한 PD-L1 결합 가변 도메인을 갖는 이중특이성 항체와 MF6744에 기반한 CD137 결합 가변 도메인 및 MF5594에 기반한 PD-L1 결합 가변 도메인을 갖는 이중특이성 항체의 병용물 (이중 이중특이성, 예를 들어 Oligoclonics® 실시 형태로서 적용됨)은 월등한 T 세포 활성화를 제공하고 (도 14 내지 도 16 참조), 우렐루맙에 기반한 항체보다 더 월등하다.
따라서, 하기를 포함하는 혼합물 또는 파트 키트가 추가로 제공된다:
- MF6744의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5594의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제1 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체; 및
- MF6744의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5361의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제2 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체.
또한, 하기를 포함하는 혼합물 또는 파트 키트가 제공된다:
- MF6744의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5594의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제1 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체; 및
- MF6744의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5361의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제2 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체.
또한, 하기를 포함하는 혼합물 또는 파트 키트가 제공된다:
- MF6744의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6744의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5594의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5594의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제1 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체; 및
- MF6744의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6744의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5361의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5361의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제2 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체.
게다가, MF6744에 기반한 CD137 결합 가변 도메인 및 MF5361에 기반한 PD-L1 결합 가변 도메인을 갖는 이중특이성 항체와 MF6783에 기반한 CD137 결합 가변 도메인 및 MF5594에 기반한 PD-L1 결합 가변 도메인을 갖는 이중특이성 항체의 병용물 (이중 이중특이성, 예를 들어 Oligoclonics® 실시 형태로서 적용됨)은 우렐루맙에 기반한 항체와 대비하여 월등한 T 세포 활성화를 제공한다.
따라서, 하기를 포함하는 혼합물 또는 파트 키트가 추가로 제공된다:
- MF6783의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5594의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제1 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체; 및
- MF6744의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5361의 VH의 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제2 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체.
또한, 하기를 포함하는 혼합물 또는 파트 키트가 제공된다:
- MF6783의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5594의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제1 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체; 및
- MF6744의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5361의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제2 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체.
또한, 하기를 포함하는 혼합물 또는 파트 키트가 제공된다:
- MF6783의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6783의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5594의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5594의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제1 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체; 및
- MF6744의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF6744의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 CD137 결합 가변 도메인, 및 MF5361의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 MF5361의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인을 포함하는 제2 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체.
또한, 우수한 T 세포 활성화 특성을 갖는, MF6797의 CD137-특이적 VH의 결합은 도 42에 나타낸 바와 같은 CD137 아미노산 서열의 Arg66, Gly70 및 Phe72를 포함하는 아미노산의 존재와 관련되어 있는 것으로 실시예에 나타나 있다.
따라서, 본 발명은 CD137에 결합할 수 있는 단리된, 합성 또는 재조합 항체, 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 또한 제공하며, CD137에 대한 상기 항체 또는 기능성 부분, 유도체 또는 유사체의 결합은 도 42에 나타낸 바와 같은 CD137 아미노산 서열의 Arg66, Gly70 및 Phe72를 포함하는 아미노산의 존재와 관련되어 있다. CD137에 대한 상기 항체 또는 기능성 부분, 유도체 또는 유사체의 결합은 바람직하게는 또한 도 42에 나타낸 바와 같은 CD137 아미노산 서열의 Val71을 포함하는 아미노산과 관련되어 있다.
용어 "Arg66"은 도 42에 나타낸 바와 같은 CD137 서열의 위치 66에 있는 아르기닌 잔기를 지칭한다. 용어 "Gly70"은 도 42에 나타낸 바와 같은 CD137 서열의 위치 70에 있는 글리신 잔기를 지칭한다. 용어 "Val71"은 도 42에 나타낸 바와 같은 CD137 서열의 위치 71에 있는 발린 잔기를 지칭한다. 용어 "Phe72"는 도 42에 나타낸 바와 같은 CD137 서열의 위치 72에 있는 페닐알라닌 잔기를 지칭한다.
CD137에 대한 항체 또는 기능성 부분, 유도체 또는 유사체의 결합은, 언급된 아미노산 잔기들 중 어느 하나가 알라닌에 의해 치환될 때, 생성된 CD137 단백질에 대한 항체 또는 기능성 부분, 유도체 또는 유사체의 결합이 감소된다면, 이들 잔기의 존재와 관련되어 있다.
일부 실시 형태는 CD137에 결합할 수 있는 단리된, 합성 또는 재조합 항체, 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공하며, 상기 항체 또는 기능성 부분, 유도체 또는 유사체는 도 42에 나타낸 바와 같은 CD137 아미노산 서열의 아미노산 Arg66, Gly70 및 Phe72와 특이적으로 결합한다. 상기 항체 또는 기능성 부분, 유도체 또는 유사체는 바람직하게는 또한 도 42에 나타낸 바와 같은 CD137 아미노산 서열의 아미노산 Val71과 특이적으로 결합한다.
일부 바람직한 실시 형태는, CD137 및 PD-L1에 결합할 수 있고 MF6797에 기반한 CD137 결합 가변 도메인 및 MF7702에 기반한 PD-L1 결합 가변 도메인을 갖는 이중특이성 항체, 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다. CD137 및 PD-L1에 대한, 특히 우수한 T 세포 활성화 특성을 갖는 그러한 이중특이성 항체의 결합은 상기 언급된 CD137 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산과 관련되어 있다.
이제 상기 언급된 CD137 아미노산 잔기들이 확인되었으므로, 이들 아미노산 잔기와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 변이체를 생성하거나 선택하는 것이 가능해졌다. 소정 아미노산 잔기와 특이적으로 결합하는 결합 분자의 생성 및/또는 선택은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 표적 아미노산 잔기를 포함하는 특정 도메인을 함유하는 항원 단편을 사용하여 항체를 생성할 수 있는 유전자도입 비인간 동물을 면역화함으로써 행해질 수 있다. 대안적으로, 확인된 아미노산 잔기에 결합하는 파지에 대해, 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 행해질 수 있다.
CD137 및/또는 PD-L1에 결합하기 위해 항체 PB17311과 경쟁하는 항체 또는 그의 변이체가 추가로 제공된다. 경쟁 항체 또는 그의 변이체는, 예를 들어, CD137 및/또는 PD-L1을 포함하는 세포가 PB17311 및 그의 후보 항체 또는 변이체와 함께 인큐베이션되는 경쟁 검정을 사용하여 확인된다. CD137 및/또는 PD-L1을 포함하는 세포가 후보 항체 또는 그의 변이체 없이 PB17311과 함께 인큐베이션되는 대조군과 대비하여, 결합된 PB17311의 양을 감소시킬 수 있는 후보 항체 또는 그의 변이체가 경쟁 항체 또는 변이체이다.
일부 실시 형태는 CD137 및/또는 PD-L1에 결합하기 위해 항체 PB17311과 경쟁하는, 단리된, 합성 또는 재조합 항체, 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다.
일부 실시 형태는 도 42에 나타낸 바와 같은 CD137 아미노산 서열의 아미노산 Arg66, Gly70 및 Phe72에 결합하기 위해, 더 바람직하게는 도 42에 나타낸 바와 같은 CD137 아미노산 서열의 아미노산 Arg66, Gly70, Val71 및 Phe72에 결합하기 위해 항체 PB17311과 경쟁하는, 단리된, 합성 또는 재조합 항체, 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다.
일부 실시 형태는 CD137 및/또는 PD-L1에 결합하기 위해 항체 PB17309와 경쟁하는, 단리된, 합성 또는 재조합 항체, 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다.
일부 실시 형태는 CD137 및/또는 PD-L1에 결합하기 위해 항체 PB17310과 경쟁하는, 단리된, 합성 또는 재조합 항체, 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다.
CD137 및/또는 PD-L1에 결합하기 위해 PB17309 또는 PB17310과 경쟁하는 항체 또는 그의 변이체는, 예를 들어, 후보 항체 또는 그의 변이체의 부재 하에서의 CD137 및/또는 PD-L1을 포함하는 세포에 대한 PB17309 또는 PB17310의 결합이, 상기 후보 항체 또는 그의 변이체의 존재 하에서의 D137 및/또는 PD-L1을 포함하는 세포에 대한 PB17309 또는 PB17310의 결합과 비교하는 경쟁 검정을 사용하여 단리된다. CD137 및/또는 PD-L1을 포함하는 세포가 상기 후보 항체 또는 그의 변이체 없이 PB17309 또는 PB17310과 함께 인큐베이션되는 대조군과 대비하여, 결합된 PB17309 또는 PB17310의 양을 감소시킬 수 있는 후보 항체 또는 그의 변이체가 경쟁 항체 또는 그의 변이체로서 확인된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 OX40 × PD-L1 이중특이성 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 하기를 포함한다:
- MF6629; MF6630; MF6637; MF6643; MF6645; MF6648; MF6655; MF6658; MF6660; MF6675; MF6686; MF6690; MF6692; MF6700; MF6706; MF6714; MF6721; MF6722; MF6724; MF6728; MF6729; MF6826; MF6940; MF6942; MF6943; MF6944; MF6947; MF6949; MF7331; MF7332; MF7334; MF7341; MF7345; MF7350; MF7351; MF7352; MF7353; MF7356; MF7358; MF7365; MF7366; MF7371; MF7372; MF7374; MF7378; MF7382; MF7383; MF7394; MF7395; 또는 MF7397의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 OX40 결합 가변 도메인; 및
- PD-L1 결합 가변 도메인. PD-L1 결합 가변 도메인은 바람직하게는 도 3에 나타낸 바와 같은 PD-L1 특이적 VH의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열 또는 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서는, MF5594; MF5424; MF5426; MF5553; MF5442; MF5561; MF5426; 또는 MF5439 (도 3)에 대해 나타낸 바와 같은 PD-L1 특이적 VH의 것이다.
항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 하기를 포함한다:
- MF6629; MF6630; MF6637; MF6643; MF6645; MF6648; MF6655; MF6658; MF6660; MF6675; MF6686; MF6690; MF6692; MF6700; MF6706; MF6714; MF6721; MF6722; MF6724; MF6728; MF6729; MF6826; MF6940; MF6942; MF6943; MF6944; MF6947; MF6949; MF7331; MF7332; MF7334; MF7341; MF7345; MF7350; MF7351; MF7352; MF7353; MF7356; MF7358; MF7365; MF7366; MF7371; MF7372; MF7374; MF7378; MF7382; MF7383; MF7394; MF7395; 또는 MF7397의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 상기 지시된 MF의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 OX40 결합 가변 도메인; 및
- PD-L1 결합 가변 도메인. 바람직하게는, MF5594; MF5424; MF5426; MF5553; MF5442; MF5561; MF5426; 또는 MF5439 (도 3)의 VH의 아미노산 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는 상기 지시된 MF (도 3)의 VH의 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 PD-L1 결합 가변 도메인.
언급된 H, VH, L 및 VL 영역 내의 언급된 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 그리고 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이고, 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게는 H, VH, L 또는 VL 쇄의 CDR3 영역 내에서 행해지지 않으며, 바람직하게는 VH 또는 VL 쇄의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역 내에서 행해지지 않으며, 바람직하게는 FR4 영역 내에서 행해지지 않는다.
명료성 및 간결한 설명을 위해, 특징들은 본 명세서에 동일하거나 개별적인 실시 형태의 일부로서 기재되지만, 본 발명의 범주는 개시된 특징들 중 전부 또는 일부의 조합을 갖는 실시 형태를 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명되어 있다. 이들 실시예는 본 발명의 범주를 제한하지 않고, 단지 본 발명을 명확하게 하는 역할을 한다.
실시예
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "MFXXXX" (여기서, X는 독립적으로 숫자 0 내지 9임)는 가변 도메인을 포함하는 Fab를 지칭하며, 여기서 VH는 4자리로 확인되는 아미노산 서열을 갖는다. 달리 나타내지 않는 한, 가변 도메인의 경쇄 가변 영역은 전형적으로 도 1a, 전형적으로는 도 1b의 서열을 갖는다. "MFXXXX VH"는 4자리로 확인되는 VH의 아미노산 서열을 지칭한다. MF는 경쇄의 불변 영역, 및 경쇄의 불변 영역과 통상적으로 상호작용하는 중쇄의 불변 영역을 추가로 포함한다. PG는 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단일특이성 항체를 지칭한다. PB는 2개의 상이한 중쇄를 갖는 이중특이성 항체를 지칭한다. 중쇄의 가변 영역 (VH)은 상이하고, 전형적으로 또한 CH3 영역도 상이하며, 중쇄들 중 하나는 그의 CH3 도메인의 KK 돌연변이를 갖고, 다른 하나는 그의 CH3 도메인의 상보적인 DE 돌연변이를 갖는다 (참고를 위하여, PCT/NL2013/050294호 (국제 특허 출원 공개 WO2013/157954호로 공개됨) 참조).
실시예 1
선택 및 스크리닝을 위한 재료의 생성
세포주의 배양
인간 ES-2 세포 (카탈로그 번호 CRL-1978)를 ATCC로부터 구매하고, 10% FBS (Lonza)가 보충된 McCoy's 5A (Gibco) 중에 일상적으로 유지하였다. Freestyle 293F 세포 (카탈로그 번호 p/n51-0029)를 Invitrogen으로부터 입수하고, 293 FreeStyle 배지 중에 일상적으로 유지하였다. HEK293T (카탈로그 번호 ATCC-CRL-11268) 및 CHO-K1 (카탈로그 번호 DSMZ ACC110) 세포주를 ATCC로부터 구매하고, L-글루타민 (Gibco) 및 FBS (Lonza)가 보충된 DMEM/F12 (Gibco) 중에 일상적으로 유지하였다.
면역화를 위한, 그리고 안정한 세포주의 생성을 위한 OX40, CD137 및 PD-L1 발현 벡터의 생성
클로닝을 위한 특유의 제한 부위 및 효율적인 번역을 위한 코작 공통 서열을 포함하는 각각의 표적의 전장 cDNA를, 클로닝을 위한 특유의 제한 부위 및 효율적인 번역을 위한 코작 공통 서열을 도입한 특정 프라이머를 사용하여, 표적 cDNA를 함유하는, 구매가능한 발현 작제물 상에서의 PCR 증폭을 통해 얻거나, 합성하였다. 각각의 표적의 cDNA를 NheI/EcoRI를 통해 진핵생물 발현 작제물, 예컨대 pIRES-Neo3 (Clontech; 도 4) 또는 pVAX1 (Thermo Fisher Scientific; 도 5) 내로 클로닝하여, 각각 pIRES-Neo3_[표적_명칭] 및 pVAX1_[표적_명칭]을 얻었다. 삽입 서열을 NCBI 기준 아미노산 서열과의 비교에 의해 검증하였다. pIRES-Neo3 작제물은 안정한 세포주의 생성에 사용하였다. pVAX1 작제물은 면역화 목적으로 사용하였다. 생성된 작제물의 명칭의 개요에 대해서는 표 1을 참조한다.
(GenBank: NP_001552.2와 동일한) 세포 표면 상에서의 발현을 위한 (pIRES-Neo3 및 pVAX1 둘 모두에서의) 아미노산 서열 전장 huCD137 삽입:
Figure pct00009
이 중:
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRS: 신호 펩티드.
Figure pct00010
: huCD137의 ECD.
IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV: 예측된 TM 영역.
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL: 세포내 꼬리.
(GenBank: ABY47575.1과 동일한) 세포 표면 상에서의 발현을 위한 (pIRES-Neo3 및 pVAX1 둘 모두에서의) 아미노산 서열 전장 마카크 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) CD137 삽입:
Figure pct00011
이 중:
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRS: 신호 펩티드.
Figure pct00012
: maCD137의 ECD.
IIFFLALTSTVVLFLLFFLVLRFSVV: 예측된 TM 영역.
KRSRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL: 세포내 꼬리.
(GenBank: XP_008762505.1과 동일한) 세포 표면 상에서의 발현을 위한 (pIRES-Neo3 및 pVAX1 둘 모두에서의) 아미노산 서열 전장 래트 CD137 삽입:
Figure pct00013
이 중:
MGSSCYNMVVTVLLVVGTEEVRA: 신호 펩티드.
Figure pct00014
: raCD137의 ECD.
VLTLFLALTLALLLFLIFIILWF: 예측된 TM 영역.
SVPKWLRKKFPHIFKQPFKKAVRTAQEEDACSCRFPEEEEGGGGSYEL: 세포내 꼬리.
(GenBank: AAI13735.1과 동일한) 세포 표면 상에서의 발현을 위한 (pIRES-Neo3 및 pVAX1 둘 모두에서의) 아미노산 서열 전장 huPD-L1 삽입:
Figure pct00015
이 중:
MRIFAVFIFMTYWHLLNA: 신호 펩티드.
Figure pct00016
: huPD-L1의 ECD.
THLVILGAILLCLGVALTFIF: 예측된 TM 영역.
RLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET: 세포내 꼬리.
(GenBank: AABO33161.1과 동일한) 세포 표면 상에서의 발현을 위한 (pIRES-Neo3 및 pVAX1 둘 모두에서의) 아미노산 서열 전장 마카크 (마카카 물라타(Macaca mulatta) PD-L1 삽입:
Figure pct00017
이 중:
MRIFAVFIFTIYWHLLNA: 신호 펩티드.
Figure pct00018
: maPD-L1의 ECD.
THLVILGAIFLLLGVALTFIF: 예측된 TM 영역.
YLRKGRMMDMKKSGIRVTNSKKQRDTQLEET: 세포내 꼬리.
(GenBank: NP_003318.1과 동일한) 세포 표면 상에서의 발현을 위한 (pIRES-Neo3 및 pVAX1 둘 모두에서의) 아미노산 서열 전장 인간 OX40 삽입:
Figure pct00019
이 중:
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTG: 신호 펩티드.
Figure pct00020
VAAILGLGLVLGLLGPLAILL: 예측된 TM 영역.
ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI: 세포내 꼬리.
(GenBank: NP_037181.1과 동일한) 세포 표면 상에서의 발현을 위한 (pIRES-Neo3 및 pVAX1 둘 모두에서의) 아미노산 서열 전장 래트 (라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)) OX40 삽입:
Figure pct00021
이 중:
MYVWVQQPTAFLLLGLSLG: 신호 펩티드.
Figure pct00022
AFAVILGLGLGLLAPLTVLLALYLL: 예측된 TM 영역.
RKAWRSPNTPKPCWGNSFRTPIQEEQTDTHFTLAKI: 세포내 꼬리.
(GenBank: XP_005545179.1과 동일한) 세포 표면 상에서의 발현을 위한 (pIRES-Neo3 및 pVAX1 둘 모두에서의) 아미노산 서열 전장 마카크 (마카카 파시쿨라리스) OX40 삽입:
Figure pct00023
이 중:
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTTAK: 신호 펩티드.
Figure pct00024
VAAILGLGLALGLLGPLAMLL: 예측된 TM 영역.
ALLLLRRDQRLPPDAPKAPGGGSFRTPIQEEQADAHSALAKI: 세포내 꼬리.
CD137, OX40 또는 PD-L1을 발현하는 안정한 세포주의 생성
pIRES-Neo3_[표적_명칭] 발현 작제물 (표 1)을 사용하여 각각의 단백질들을 안정하게 발현하는 Freestyle 293F 또는 CHO-K1 클론을 생성하였다. 작제물을 리포펙타민 형질감염을 사용하여 CHO-K1 세포에서 일시적으로 형질감염시키거나, 또는 Freestyle 293F 세포의 경우에는 PEI 형질감염을 사용하여 행하고, 각각의 단백질들과 반응하는 항체들을 사용하여 FACS에 의해 스크리닝하였다. 발현의 확인 후, 일시적으로 형질감염된 세포를 제한 희석(limiting dilution)으로 시딩(seeding)하고, 사용된 발현 작제물에 관련된 선택 압력 하에서 배양하여 안정한 세포 클론을 얻었다. 2 내지 3주의 선택 후에, 클론을 FACS에 의해 스크리닝하였다. 선택된 클론을 연속 계대배양에 의해 증폭시키고, FACS에서 재시험하고, -150℃로 냉동시켰다. 이종 단백질을 안정하게 발현하는 클론의 명칭은 CHO-K1_[표적_명칭] 세포 또는 Freestyle 293F_[표적_명칭] 세포이다. 안정한 세포주를 생성하는 데 사용된 작제물의 개요 및 그들에 대해 얻어진 명칭에 대해서는 표 1을 참조한다.
실시예 2
면역화, 선택 및 스크리닝
면역화를 위해 사용된 마우스
huCD137, huOX40 및 huPD-L1에 결합하는 인간 항체의 생성을 위하여, 인간 VK1-39 경쇄 (공통 경쇄 마우스, 국제 특허 출원 공개 WO2009/157771호 참조) 및 인간 중쇄 (HC) 미니유전자좌(minilocus) (인간 V 유전자 세그먼트, 모든 인간 Ds 및 모든 인간 Js의 선택을 포함함)의 유전자도입 마우스를 하기에 간략하게 기재된 바와 같은 재조합 단백질 또는 그러한 단백질을 인코딩하는 DNA로 면역화하였다. 이들 마우스는 'MeMo®' 마우스로 지칭된다.
단백질 면역화
'MeMo®' 마우스를 재조합 단백질 및 Gerbu 애쥬번트(adjuvant) MM (Gerbu Biotechnik c#3001)의 피하 주사에 의해 면역화하였다. 재조합 huPD-L1-His (SinoBiological; 카탈로그 번호 10084-H08H), huOX40-Fc (R&D; 카탈로그 번호 3388-OX) 및 huOX40-His (SinoBiological; 카탈로그 번호 10481-H08H) 단백질을 면역화에 사용하였다. CD137 항체 패널 생성에 대해서는 단백질 면역화를 수행하지 않았다. 100 μl의 총 부피로 40 μl의 애쥬번트와 혼합된 PBS 중 40 ㎍의 재조합 단백질로 마우스를 면역화하였다. 후속으로, 마우스를 일수 14 및 일수 28에서, 50 μl의 총 부피로 20 μl의 애쥬번트와 함께 PBS 중 20 ㎍의 재조합 단백질로 증진시켰다. 마우스 혈청을 일수 35에서 수집하여 혈청 역가(serum titer)를 결정하였다. 혈청 역가가 낮은 마우스는 증진 면역화 및 혈청 분석의 추가 사이클을 제공받았다. 매 사이클은, 50 μl의 PBS 중 20 ㎍의 재조합 단백질을 사용하여 2주간 면역화하고, 이어서 1주 후에 역가 분석을 위한 혈청 수집을 행하는 것으로 이루어졌다. 인간 및 마카크 표적에 대해 높은 혈청 역가를 나타내는 마우스는 연속 3일 50 μl의 PBS 중 20 ㎍의 재조합 단백질의 매일 주사로 이루어진 최종 증진 면역화를 제공받았다. 최종 주사 후 1일째에, 마우스 림프계 조직을 수집하였다.
DNA 면역화
'MeMo®' 마우스를 미세색소침착 장치를 사용하여 DNA 타투잉(tattooing)에 의해 면역화하였다. 표적 항원을 인코딩하는 20 ㎍의 플라스미드 DNA (pVAX1_[표적_명칭], 표 1)를 사용하여 DNA 타트 면역화를 수행하였다. 마우스를 인간 표적만 (PD-L1)을 인코딩하는 DNA로 면역화하거나, 또는 인간 및 래트 표적 (CD137, OX40)을 인코딩하는 DNA로 교번 면역화하여 종 교차-반응성 항체를 얻었다. PD-L1 면역화의 경우, 0.5 mg의 항-CD25 항체 PC61.5 (Bioceros)를 마우스에 주사함으로써 면역화 시작 4일 전에 Treg 세포를 고갈시켜 관용(tolerance)을 파괴하였다. 마우스를 일수 0, 3, 6, 14, 17, 28 및 31에 면역화하였다. 마우스 혈청을 일수 35에서 수집하여 혈청 역가를 결정하였다. 인간 및/또는 마카크 표적에 대해 낮은 혈청 반응성을 갖는 마우스는 인간, 래트 또는 마카크 DNA 항원에 의한 증진 면역화 및 혈청 분석의 추가의 사이클을 제공받았다. 매 사이클은, 2주간의 DNA 면역화 이후, 1주 후에 역가 분석을 위한 혈청 수집으로 이루어졌다. 인간 및 마카크 표적을 발현하는 세포에 대해 강한 혈청 반응성을 나타내는 마우스는 최종 증진 면역화를 제공받은 이후 3일 후에 림프계 조직의 수집을 행하였다.
단백질 및 DNA 면역화의 조합 (단지 OX40)
마우스를 재조합 huOX40-His (SinoBiological; 카탈로그 번호 10481-H08H)에 의해 면역화하고, DNA (pVAX1_ raOX40) 및 단백질 (huOX40-His)의 교번 면역화에 의해 증진시켜 종 교차-반응성 항체를 얻었다. 따라서, 100 μl의 총 부피로 40 μl의 애쥬번트와 혼합된 PBS 중 40 ㎍의 재조합 단백질로 마우스를 면역화하였다. 후속으로, 마우스를 일수 14 및 일수 17에서 20 ㎍의 pVAX1_raOX40으로 타투잉한 후, 일수 28에서 50 μl의 총 부피로 20 μl의 애쥬번트와 함께 PBS 중 20 ㎍의 huOX40-His 단백질로 단백질 면역화를 행하였다. 마우스 혈청을 일수 35에서 수집하여 혈청 역가를 결정하였다. 인간 및/또는 마카크 혈청 역가가 낮은 마우스는 증진 면역화 및 혈청 분석의 추가 사이클을 제공받았다. 매 사이클은, 20 ㎍의 huOX40-His, pVAX1_raOX40 또는 pVAX1_maOX40에 의한 2주간의 단백질 또는 DNA 면역화 이후, 1주 후에 역가 분석을 위한 혈청 수집으로 이루어졌다. 인간 및 마카크 표적에 대해 높은 혈청 역가를 나타내는 마우스는 연속 3일 50 μl의 PBS 중 20 ㎍의 재조합 단백질의 매일 주사로 이루어진 최종 증진 면역화를 제공받았다. 최종 주사 후 1일째에, 마우스 림프계 조직을 수집하였다.
혈청 역가의 결정
인간 및 마카크 표적 항원을 발현하는 세포주 (표 1)를 사용하여 FACS 분석에 의해 혈청 역가를 결정하였다.
합성 파지 Fab 라이브러리의 생성
표준 서열 다양성 및 천연 레퍼토리에 있어서의 빈번한 사용에 대해 선택된 생식세포계열 인간 VH 유전자의 레퍼토리에 기초하여 합성 라이브러리를 작제하였다. 합성 HCDR3 영역을 PCR을 사용하여 이들 VH 유전자에 부가하였다. 이는, VH 유전자의 프레임워크 1에 어닐링되고 클로닝을 위한 SfiI 제한 부위를 포함하는 정방향 프라이머를 사용하여 수행하였다. 역방향 프라이머는, VH 유전자의 프레임워크 3에 어닐링되는 서열, 이어서 HCDR3 다양성을 인코딩하는 무작위화된 서열 및 클로닝을 위한 BstEII 및 XhoI 제한 부위를 또한 함유하는 프레임워크 4 인코딩 서열을 포함하였다. 합성 CDR3 영역은 완전히 무작위적이거나, 또는 HCDR3 내의 소정 위치에서의 아미노산 잔기의 사용 빈도에 기초하여 더 제한된 다양성을 인코딩하였다. VH 유전자를 인코딩하는 PCR 산물을, 상기 언급된 제한 효소를 사용하여 파지 M13 유전자 3 단백질과 융합되고 또한 공통 경쇄 인코딩 유전자를 함유하는 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝하였다. E. 콜라이(E. coli) TG1의 대규모 연결(ligation) 및 형질전환은 파지 상에 디스플레이된 합성 Fab 단편의 큰 라이브러리를 생성하였으며, 이를 항원 또는 세포 상에서 패닝(panning)하여 항원-특이적 Fab 단편을 확인하였다.
면역화된 마우스의 조직으로부터의 RT-PCR에 의한 '면역' 파지 Fab 라이브러리의 생성
비장 및 배출 림프절을 마우스로부터 제거하였으며, 이러한 마우스에 대한 각각의 표적 단백질에 대해 유의한 체액성 반응이 관찰되었다.
단세포 현탁액을 비장 및 서혜부 림프절 둘 모두로부터 생성하고, 후속으로 이들 조직을 Trizol LS 시약 (Thermo Scientific c#10296028) 중에 용해시키고, 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다.
'면역' 파지 항체 레퍼토리의 작제를 위하여, 성공적으로 면역화된 마우스로부터, 서혜부 림프절을 사용하였다. 림프계 조직의 단세포 현탁액으로부터 RNA를 추출하였다. 1 ㎍의 총 RNA를 IgG-CH1 특이적 프라이머를 사용하는 RT 반응에서 사용하였다. 이어서, 생성된 cDNA를 사용하여, 자체(in-house) 개조된 VH-특이적 프라이머를 사용하여 VH-인코딩 cDNA의 다중클론 풀(pool)을 증폭시켰는데, 이는 본질적으로 문헌[Marks et al. (J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97)]에 기재된 바와 같다. 이어서, 생성된 PCR 산물을, 경쇄 (도 1a 및 도 1b)가 모든 항체에 대해 동일하고 벡터에 의해 인코딩되는 것을 제외하고는, 문헌[de Haard et al. (J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18218-30)]에 기재된 바와 같이, 파지 상에서의 Fab 단편의 디스플레이를 위하여 파지미드 벡터 (도 6)에서 클로닝하였다. 연결 후에, 파지미드를 사용하여 E. 콜라이 TG1 세균을 형질전환시키고, 형질전환된 세균을 암피실린 및 글루코스를 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 모든 파지 라이브러리는 4×105개 초과의 형질전환체를 함유하였고, 90% 초과의 삽입 빈도를 가졌다. 세균을 하룻밤 성장 후에 수집하고, 이를 사용하여 확립된 프로토콜에 따라 파지를 제조하였다 (문헌[de Haard et al., J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18218-30]).
재조합 단백질을 사용한 합성 및 '면역' 파지 Fab 라이브러리로부터 인간 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 담지하는 파지의 선택
생성된 파지 Fab 라이브러리를 사용하여, 직접 코팅된 재조합 단백질 상에서 파지 디스플레이를 사용하여 표적 특이적 Fab를 선택하였다. PD-L1의 경우, huPD-L1-His (Sinobiological; 카탈로그 번호 10084-H08H), huPD-L1-Fc (R&D; 카탈로그 번호 156-B7), 및 maPD-L1-His (Sinobiological; 카탈로그 번호 90251-C08H)를 사용하였다. CD137의 경우, huCD137-Fc (R&D; 카탈로그 번호 838-4B), raCD137-Fc (R&D; 카탈로그 번호 7968-4B), moCD137-Fc (R&D; 카탈로그 번호 937-4B), huCD137-His (SinoBiological; 카탈로그 번호 10041-H08H) 및 huCD137-Fc (Enzo; 카탈로그 번호 ALX-522-031-C050)를 사용하고, OX40의 경우, huOX40-Fc (R&D; 카탈로그 번호 3388-OX) 및 huOX40-His (Sinobiological; 카탈로그 번호 10481-H08H)를 사용하였다.
재조합 단백질에 의한 선택을 위하여, 단백질을 MAXISORP™ ELISA 플레이트의 웰 상에 코팅하였다. MAXISORP™ ELISA 플레이트를 PBS 중 4% 건조 탈지유 (Marvel)로 차단하였다. 파지 Fab 라이브러리를 또한 4% Marvel로, 그리고 Fc 태그된 재조합 단백질을 사용한 경우에는, 또한 과량의 인간 IgG로 차단하여, 코팅된 항원에 대한 파지 라이브러리의 첨가 전에 Fc 영역 결합제를 고갈시켰다.
파지 라이브러리와 코팅된 단백질과의 인큐베이션을 진탕 조건 하에서 실온에서 1.5시간 동안 수행하였다. 이어서, 플레이트 또는 튜브를 PBS 중 0.05% Tween-20으로 15회 세척한 후, PBS로 5회 세척하였다. 결합된 파지를 트립신을 사용하여 20분 동안 용리하고, 이후에 AEBSF 트립신 억제제 (Sigma)로 트립신을 중화시켰다.
용리액을 E. 콜라이 TG-1에 첨가하고, 파지 감염을 위하여 37℃에서 인큐베이션하였다. 후속으로, 감염된 세균을 암피실린 및 글루코스가 담긴 한천 플레이트 상에서 플레이팅하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 선택 산출물로부터의 단일 클론을 표적에 따라 ELISA 또는 FACS에서 표적 결합에 대하여 스크리닝하였다.
합성 파지 Fab 라이브러리에 대한 선택을 위하여, 제1 라운드 선택에 대해 상기에 개략적으로 설명된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 제1 라운드 선택 산출물을 구조(rescue)한 후에 제2 라운드 선택을 수행하였다.
표적 단백질을 안정하게 발현하는 세포를 사용하여 '면역' 파지 Fab 라이브러리로부터 인간 표적에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 담지하는 파지의 선택
표적 면역화된 마우스로부터 생성된 파지 Fab 라이브러리를 각각의 표적을 발현하는 세포 상에서 파지 디스플레이를 사용하여 선택하였다. CD137, OX40 또는 PD-L1을 발현하는 안정한 세포주 (표 1)를 제1 라운드 선택을 위해 사용하였다. 세포를 PBS 중 10% FBS로 차단하였다. 차단 후, 구조된 파지를 차단된 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포 + 파지를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 중 10% FBS 1 ml를 사용하여 세포의 세척 (5회)을 수행하였다. 결합된 파지를 트립신을 사용하여 20분 동안 용리하고, 이후에 AEBSF 트립신 억제제 (Sigma)로 트립신을 중화시켰다. 용리액을 E. 콜라이 TG-1에 첨가하고, 파지 감염을 위하여 37℃에서 인큐베이션하였다. 후속으로, 파지-감염된 세균을 암피실린 및 글루코스가 담긴 한천 플레이트 상에서 플레이팅하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다.
PD-L1의 경우, 제1 라운드 선택에 대해 사용된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여, huPD-L1을 내인적으로 발현하는 ES-2 세포에 의한 제2 라운드 선택을 수행하였다. 선택 후, 단일 클론을 FACS에서의 표적 결합에 대하여 스크리닝하였다.
ELISA에서의 표적 특이적 Fab 클론에 대한 스크리닝
단일 클론들 중에서, 가용성 Fab 또는 파지를 제조하였다 (문헌[J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97]; 문헌[J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18218-30]). 얻어진 가용성 Fab 또는 파지 샘플을 PBS 중 4% 건조 탈지유 (Marvel) (차단 완충액) 중에 (각각 1:5 또는 1:10으로) 희석시키고, raCD137-Fc (R&D; 카탈로그 번호 7968-4B) 또는 moCD137-Fc (R&D; 카탈로그 번호 937-4B)를 사용하여 수행된 모든 선택 산출물에 대하여 huCD137-Fc (R&D; 카탈로그 번호 838-4B)로, 또는 선택을 위해 사용된 것과 동일한 항원으로 코팅된 웰에 대한 ELISA에서의 결합에 대해 시험하였다.
결합된 Fab는, 차단 완충액 중에 1:1000으로 희석된 항-myc 항체 (Roche; 카탈로그 번호 11667203001)에 이어서, 차단 완충액 중에 1:5000으로 희석된 HRP-접합된 항-마우스 IgG 항체 (Jackson Immunoresearch; 카탈로그 번호 715-035-150)로 염색함으로써 검출되었다. 결합된 파지는, 차단 완충액 중에 1:5000으로 희석된 HRP-접합된 단일클론 항-M13 항체 (GE healthcare; 카탈로그 번호 27-9421-01)로 염색함으로써 검출되었다.
각각의 항체를 염색한 후, 웰을 PBS-T (PBS-0.05% v/v Tween 20)로 세척하였다. 결합된 2차 항체를 TMB/H2O2 염색에 의해 시각화하고, 염색을 OD450nm 측정에 의해 정량화하였다. OD450nm가 음성 대조군 Fab를 사용하여 얻어진 백그라운드 신호보다 적어도 3배 더 높을 때, 클론은 표적과 결합하는 것으로 간주되었다.
모든 표적-특이적 클론의 VH-인코딩 cDNA를 서열분석하였다. 이어서, 서열 동일성 및 클러스터 분석에 기초한 특유의 클론의 선택을, 세포 선택 산출물로부터 얻어진 클론에 대해 하기에 기재된 바와 같이, FACS에서 세포 상에서 발현되는 표적에 대한 결합에 대해 분석하였다.
FACS에서의 표적 특이적 Fab 클론에 대한 스크리닝
각각의 표적을 발현하는 세포 상에서 선택된, 단일 클론들 중에서, 가용성 Fab 또는 파지를 기재된 바와 같이 제조하였다 (문헌[J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97]; 문헌[J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18218-30]). Fab 샘플을 FACS 완충액 (PBS 중 0.5% HI-FBS) 중 1:5 희석 Fab 샘플과 1:1000 희석 항-myc 항체 (Gentaur; 카탈로그 번호 04-CMYC-9E10)의 혼합물과 함께 인큐베이션함으로써, FACS에서 인간 및 마카크 표적 (표 1)을 발현하는 세포에 대한 결합에 대해 시험하였다. 결합된 Fab/항-myc 복합체를, FACS 완충액 중에 1:500으로 희석된 APC-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체 (BD Bioscience; 카탈로그 번호 550826)와 인큐베이션함으로써 검출하였다.
파지 샘플을 차단 완충액 중에 1:3으로 희석시키고 표적 발현 세포와 1시간 동안 인큐베이션함으로써, 파지 샘플을 FACS에서의 결합에 대해 시험하였다. 결합된 파지를 비오티닐화된 항-M13 항체 (Fitzgerald, 카탈로그 번호 61R-M101ABTB62-FEZ, FACS 완충액 중 1:125, 얼음 상에서 30분) 및 PE-표지 스트렙타비딘 (Invitrogen, 카탈로그 번호 SA1004-4; FACS 완충액 중 1:400, 얼음 상에서 15분 동안)으로 염색함으로써 검출하였다. 각각의 항체를 인큐베이션한 후, 웰을 FACS 완충액으로 3회 세척하였다. 염색된 세포를 FACS Accuri C6 기기 (Becton and Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 평균 형광 세기가 음성 대조군 Fab를 사용하여 얻어진 백그라운드 신호보다 적어도 3배 더 높을 때, 클론은 양성인 것으로 간주되었다.
결과
상기 언급된 방법에 의해 얻어진 24개의 CD137-특이적 클론, 14개의 PD-L1-특이적 클론 및 50개의 OX40-특이적 클론의 VH 서열이 도 3에 나타나 있다.
실시예 3
IgG 포맷의 huCD137, huOX40 및 huPD-L1 특이적 Fab 클론의 특성화
인간 CD137, OX40 및 PD-L1 특이적 Fab의 IgG 포맷으로의 재클로닝
이어서, 세포 상에서 발현된 인간 및 마카크 표적 단백질에 결합된, CDR3 서열 및 VH 생식세포계열 차이에 기초하여 선택된 특유의 클론을, 표준화된 분자 생물학적 기법에 따라 Sfi1-BstEII 분해 및 분해된 cDNA의 풀(pool)의 연결을 사용하여, 공통 경쇄 (도 1)를 함유하는 IgG 발현 플라스미드, 예컨대 MV1452 (도 7)로 재클로닝하였다.
인간 CD137, OX40 또는 PD-L1 특이적 Fab 및 파상풍 독소 특이적 Fab를 함유하는 이중특이성 IgG의 발현
이중특이성 항체의 효율적인 이종-이량체화 및 형성을 보장하기 위하여 독점적인 CH3 조작 기술을 사용하여, 상이한 VH 도메인을 갖는 IgG를 인코딩하는 2개의 플라스미드의 일시적 공동-형질감염에 의해 이중특이성 항체를 생성하였다. 중쇄를 함유하는 둘 모두의 플라스미드 상에 존재하는 공통 경쇄는 또한 동일한 세포 내에서 공동-형질감염된다. 본 발명자들의 공계류 중인 출원 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2013/157954호 및 국제 특허 출원 공개 WO2013/157953호; 본 명세서에 참고로 포함됨)에서, 본 발명자들은 단세포로부터 이중특이성 항체를 생성하기 위한 방법 및 수단을 알아내었는데, 여기서는 단일특이성 항체의 형성에 비하여 이중특이성 항체의 형성을 유리하게 하는 수단이 제공된다. 이들 방법은 또한 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 본질적으로 단지 이중특이성 전장 IgG 분자만을 생성하기 위한 바람직한 돌연변이는 제1 CH3 도메인 내의 위치 351 및 366에서의 아미노산 치환, 예를 들어 L351K 및 T366K (넘버링은 EU 넘버링에 따름) ('KK-변이' 중쇄) 및 제2 CH3 도메인 내의 위치 351 및 368에서의 아미노산 치환, 예를 들어 L351D 및 L368E ('DE-변이' 중쇄)이거나, 또는 그 역으로도 성립된다. 본 발명자들의 공계류 중인 출원에서, 음으로 하전된 DE-변이 중쇄와 양으로 하전된 KK-변이 중쇄는 우선적으로 쌍을 이루어서 이종이량체 (이른바, 'DEKK' 이중특이성 분자)를 형성한다는 것이 이미 입증되었다. DE-변이 중쇄의 동종이량체화 (DE-DE 동종이량체) 또는 KK-변이 중쇄의 동종이량체화 (KK-KK 동종이량체)는 동일한 중쇄들 사이의 CH3-CH3 계면에서의 하전된 잔기들 사이의 강한 반발력으로 인해 거의 발생되지 않는다.
전술된 인간 CD137, OX40 및 PD-L1과 결합하는 항체를 인코딩하는 VH 유전자를 양으로 하전된 CH3 도메인을 인코딩하는 MV1452와 같은 IgG 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 파상풍 독소 (TT) 표적화 항체 (도 8)를 음으로 하전된 CH3 도메인을 인코딩하는 MV1377 IgG 발현 벡터 (도 9) 내로 클로닝하였다. 또한, IgG 포맷의 CD137 항체 패널의 발현을 위하여, 전체 패널을 음으로 하전된 CH3 도메인 벡터 내로 클로닝하여 단일특이성 CD137xCD137 2가 IgG를 생성할 수 있었다.
현탁 성장-적응화된 293F Freestyle 세포를 밀도가 3.0 × 106개 세포/ml가 될 때까지 진탕기 받침대(shaker plateau) 상의 T125 플라스크 내에서 배양하였다. 세포를 24-딥(deep) 웰 플레이트 (24웰 포맷)의 각각의 웰 내에서 0.3 내지 0.5 × 106개 생존가능 세포/ml의 밀도로 시딩하였다. 세포를 상이한 항체를 인코딩하는 2개의 플라스미드의 혼합물로 일시적으로 형질감염시키고, 독점적인 벡터 시스템 내로 클로닝하였다. 형질감염 후 7일째에, 세포 상층액을 수집하고, 0.22 μM 필터 (Sartorius)를 통해 여과하였다. 항체의 정제 시까지 멸균 상층액을 4℃에서 저장하였다.
(이중특이성) IgG의 정제
IgG의 정제를 단백질-A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 소규모 (500 ㎍ 미만)로 수행하였다. 소규모 정제는 24웰 필터 플레이트 내에서 멸균 조건 하에서 여과를 사용하여 수행하였다. 먼저, 배지의 pH를 pH 8.0으로 조정하고, 후속으로, IgG-함유 상층액을 600 rpm으로 진탕 플랫폼 상에서 25℃에서 2시간 동안 단백질 A 세파로스(Sepharose) CL-4B 비드 (50% v/v) (Pierce)와 함께 인큐베이션하였다. 다음으로, 비드를 여과에 의해 수집하였다. 비드를 PBS (pH 7.4)로 2회 세척하였다. 이어서, 결합된 IgG를 0.1 M 시트르산 완충액을 사용하여 pH 3.0에서 용출시키고, 용출액을 Tris (pH 8.0)를 사용하여 즉시 중화시켰다. 멀티스크린 Ultracel 10 멀티플레이트 (Millipore)를 사용한 원심분리에 의해 완충액 교환을 수행하였다. 샘플을 마지막으로 PBS (pH 7.4) 중에 수집하였다. IgG 농도를 옥텟(Octet)을 사용하여 측정하였다. 단백질 샘플을 4℃에서 저장하였다.
옥텟을 사용한 IgG 정량화
정제된 IgG의 양을 결정하기 위하여, 표준물로서 총 인간 IgG (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 I4506)를 사용하여 단백질-A 바이오센서 (Forte-Bio, 공급자의 권장사항에 따름)를 사용하여 옥텟 분석에 의해 항체의 농도를 결정하였다.
huCD137xCD137 2가 IgG 및 huOX40×TT 및 huPD-L1×TT 이중특이성 IgG의 특이성 분석
huCD137×CD137 2가 IgG, 및 huOX40×TT 및 huPD-L1×TT 이중특이성 IgG를, FACS에서, 관련 인간 및 마카크 오르토로그를 발현하는 안정한 세포주 (표 1) 및 WT 세포에 대한 결합에 대해 시험하였다. 따라서, 세포를 수집하고, FACS 완충액 (PBS/0.5% BSA/0.5 mM EDTA) 중에 106개 세포/ml로 희석시켰다. 1 내지 2 × 105개 세포를 U-바닥 96웰 플레이트 내의 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 300 g로 4℃에서 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트(들)를 역전시켜 상층액을 폐기하였다. 10 ㎍/ml 농도의 50 μl의 각각의 IgG 샘플을 첨가하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1회 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포를 150 μl의 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 50 μl의 1:400 희석 염소 항 인간 IgG PE (Invitrogen)를 첨가하고, 암실에서 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충액을 첨가한 후에, 세포를 1회 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 HTS 세팅에서 FACSCanto 유세포측정기 (Becton and Dickinson) 상에서 분석하였다. 염색된 세포 집단의 평균 형광 세기 (MFI)를 측정함으로써 세포에 대한 항체의 결합을 평가하였다. 항체는, MFI가 (음성 대조) 비결합 항체 (파상풍 톡소이드에 대해 유도됨)로 염색된 동일한 세포 집단의 MFI의 적어도 5배일 때 그의 표적과 결합하는 것으로 여겨졌다.
CD137L과의 CD137 상호작용을 차단하는 능력에 대한 CD137xCD137 2가 IgG에 존재하는 huCD137 특이적 Fab 아암의 비닝(binning)
2가 IgG 포맷의 huCD137 결합 클론을 CD137L과 CD137의 상호작용을 차단하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 따라서, Maxisorp 96웰 플레이트의 웰을 PBS 중 1.25 ㎍/ml의 재조합 CD137-Fc (R&D; 카탈로그 번호 838-4B)로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 웰을 PBST (PBS 중 0.05% v/v Tween 20)로 2회 세척하고, 후속으로 실온에서 1시간 동안 PBS 중 2% BSA (차단 완충액)로 차단하였다. 이후에, 웰을 20 ㎍/ml의 IgG의 존재 또는 부재 하에서 차단 완충액 중에 희석된 0.25 ㎍/ml의 CD137L-muCD8 비오틴 (Ancell; 카탈로그 번호 503-030)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세척 단계를 반복하고, 웰을 실온에서 30분 동안 차단 완충액 중에 1:2000으로 희석된 HRP-접합된 스트렙타비딘 (Becton Dickinson; 카탈로그 번호 554066)과 함께 인큐베이션하였다. 결합된 스트렙타비딘의 검출을 위해, 웰을 PBST로 3 회 세척하고, TMB 기질 성분 A 및 B (1:1 비) (Becton Dickinson; 각각 카탈로그 번호 51-2606KC 및 51-2607KC)와 함께 인큐베이션하였다. 1 M H2SO4를 사용하여 10분 후에 반응을 정지시키고, ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 OD450nm를 측정하였다. 결과에 기초하여, 클론들을 4개의 상이한 군에 비닝하였다: "차단 클론"은 ELISA 신호가 TT 특이적 경쟁 항체를 첨가한 대조군 (0% 차단)과 대비하여 20 ㎍/ml의 IgG (CD137×CD137) 농도에서 70%를 초과하여 감소되었을 때 CD137과 CD137L의 상호작용을 완전히 차단하는 것으로 간주되었으며; "부분 차단 클론"은 신호를 25 내지 70%로 감소시켰으며; "비차단 클론"은 최대 25%까지 감소되거나, 또는 최대 25%까지 향상된 ELISA 신호를 나타내었으며; "향상 클론"은 25%를 초과하는 ELISA 신호의 증가를 나타내었다. CD137×CD137 이중특이성 분자로서 시험된 CD137 항체 패널의 대표적인 선택으로 얻어진 결과가 표 2에 나타나 있다.
도메인 특이성에 대한 CD137×CD137 2가 IgG에 존재하는 HuCD137 특이적 Fab 아암의 비닝
또한, 2가 IgG 포맷의 상기 언급된 huCD137 결합 클론들을, 8개의 상이한 pIRES-Neo3 마우스/인간 CD137 하이브리드 발현 작제물, FL 마우스 CD137 pIRES-Neo3 발현 작제물 (하기 아미노산 삽입 서열 참조) 또는 안정한 huCD137 발현 Freestyle 293F 세포의 생성에 사용된 pIRES-Neo3_huCD137 발현 작제물 (표 1)로 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포 상에서 FACS에서 도메인 특이성에 대해 시험하였다. 항체 패널의 특이성 분석 동안 전술된 바와 동일한 FACS 프로토콜을 사용하였다. 하이브리드 작제물의 생성을 위하여, 마우스 및 인간 CD137의 세포외 도메인을 5개의 도메인으로 나누었는데; 4개는 Uniprot 기준 서열 Q07011 (huCD137) 및 P20334 (moCD137)에 기반한 시스테인 풍부 도메인이고, 1개는 시스테인 풍부 도메인 4의 말단부터 막관통 도메인까지의 힌지 도메인이다. 하기 아미노산 삽입 서열을 NheI/EcoRI를 통해 pIRES-Neo3 (도 4) 내로 클로닝하였으며; 볼드체의 텍스트는 신호 펩티드이다. 밑줄 표시된 텍스트는 인간 CD137과 동일한 서열이다. 이탤릭체의 텍스트는 막관통 및 세포내 도메인 서열을 나타낸다.
전장 마우스 CD137의 아미노산 서열.
Figure pct00025
mo/huCD137 키메라 삽입물 A의 아미노산 서열 (인간 시스테인 풍부 도메인 1; 시스테인 풍부 도메인 2로부터 정방향으로 마우스 서열).
Figure pct00026
mo/huCD137 키메라 삽입물 B의 아미노산 서열 (인간 시스테인 풍부 도메인 1 및 2; 시스테인 풍부 도메인 3으로부터 정방향으로 마우스 서열).
Figure pct00027
mo/huCD137 키메라 삽입물 C의 아미노산 서열 (인간 시스테인 풍부 도메인 1 내지 3; 시스테인 풍부 도메인 4로부터 정방향으로 마우스 서열).
Figure pct00028
mo/huCD137 키메라 삽입물 D의 아미노산 서열 (인간 시스테인 풍부 도메인 1 내지 4; 힌지 도메인으로부터 정방향으로 마우스 서열).
Figure pct00029
mo/huCD137 키메라 삽입물 E의 아미노산 서열 (마우스 시스테인 풍부 도메인 1; 시스테인 풍부 도메인 2로부터 정방향으로 인간 서열).
Figure pct00030
mo/huCD137 키메라 삽입물 F의 아미노산 서열 (마우스 시스테인 풍부 도메인 1 및 2; 시스테인 풍부 도메인 3으로부터 정방향으로 인간 서열).
Figure pct00031
mo/huCD137 키메라 삽입물 G의 아미노산 서열 (마우스 시스테인 풍부 도메인 1 내지 3; 시스테인 풍부 도메인 4로부터 정방향으로 인간 서열).
Figure pct00032
mo/huCD137 키메라 삽입물 H의 아미노산 서열 (마우스 시스테인 풍부 도메인 1 내지 4; 힌지 도메인으로부터 정방향으로 인간 서열).
Figure pct00033
키메라 및 전장 마우스 및 인간 CD137 작제물을 사용하여 얻어진 FACS 결과에 기초하여, 관찰된 결합 패턴에 기초하여 클론들을 비닝하였다. 항체는, MFI가 (음성 대조) 비결합 항체 (파상풍 톡소이드에 대해 유도됨)로 염색된 동일한 세포 집단의 MFI의 적어도 3배일 때 (키메라) CD137과 결합하는 것으로 여겨졌다.
결과
CD137-특이적 Fab 아암의 도메인 특이성이 표 2에 나타나 있다.
OX40L과의 OX40 상호작용을 차단하는 능력에 대한 OX40×TT 이중특이성 IgG에 존재하는 huOX40 특이적 Fab 아암의 비닝
이중특이성 IgG 포맷 (OX40×TT)의 huOX40 결합 클론을 OX40L과 OX40의 상호작용을 차단하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 따라서, Maxisorp 96웰 플레이트의 웰을 PBS 중 0.156 ㎍/ml의 재조합 huOX40-Fc (R&D; 카탈로그 번호 3388-OX)로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 웰을 PBST (PBS 중 0.05% v/v Tween 20)로 2회 세척하고, 후속으로 실온에서 1시간 동안 PBS 중 4% 건조 탈지유 (ELK) (차단 완충액)로 차단하였다. 이후에, 웰을 20 ㎍/ml의 이중특이성 OX40×TT IgG의 존재 또는 부재 하에서 차단 완충액 중에 희석된 0.016 ㎍/ml의 OX40L (R&D; 카탈로그 번호 1054-OX)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 웰을 PBST로 3회 세척하고, 후속으로 2% BSA/PBS 중에 0.5 ㎍/ml로 희석된, 비오티닐화된 항-OX40L 항체 (R&D; 카탈로그 번호 BAF1054)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 세척 단계를 반복하고, 웰을 실온에서 30분 동안 2% BSA/PBS 중에 1:2000으로 희석된 HRP-접합된 스트렙타비딘 (Becton Dickinson; 카탈로그 번호 554066)과 함께 인큐베이션하였다. 결합된 스트렙타비딘의 검출을 위해, 웰을 PBST로 3 회 세척하고, TMB 기질 성분 A 및 B (1:1 비) (Becton Dickinson; 각각 카탈로그 번호 51-2606KC 및 51-2607KC)와 함께 인큐베이션하였다. 1 M H2SO4를 사용하여 10분 후에 반응을 정지시키고, ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 OD450nm를 측정하였다.
결과에 기초하여, 클론들을 2개의 상이한 군에 비닝하였다: "차단 클론"은 TT 특이적 경쟁 항체를 첨가한 대조군 (0% 차단)과 대비하여 20 ㎍/ml의 IgG (OX40×TT) 농도에서 ELISA 신호를 24% 이상 감소시켰으며; "비차단 클론"은 ELISA 신호가 24% 미만으로 감소되거나 향상된 ELISA 신호를 나타내었다. 이중특이성 IgG 포맷 (OX40×TT)의 huOX40 결합 클론들의 상이한 하위세트를 사용하여, 이 실험을 2회 수행하였다. OX40×TT 이중특이성 분자로서 시험된 OX40 항체 패널의 결과가 표 5에 제공되어 있다.
도메인 특이성에 대한 OX40×TT 이중특이성 IgG에 존재하는 huOX40 특이적 Fab 아암의 비닝
이중특이성 OX40×TT IgG 포맷의 huOX40 결합 클론들을, 8개의 상이한 pIRES-Neo3 래트/인간 OX40 하이브리드 발현 작제물 (하기 아미노산 삽입 서열 참조), 안정한 raOX40 및 huOX40 발현 Freestyle 293F 세포의 생성에 사용된 pIRES-Neo3_raOX40 또는 pIRES-Neo3_huOX40 발현 작제물 (표 1)로 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포 상에서 FACS에서 도메인 특이성에 대해 시험하였다. 항체 패널의 특이성 분석 동안 전술된 바와 동일한 FACS 프로토콜을 사용하였다. 하이브리드 작제물의 생성을 위하여, 래트 및 인간 OX40의 세포외 도메인을 5개의 도메인으로 나누었는데; 4개는 Uniprot 기준 서열 P43489 (huOX40) 및 P15725 (raOX40)에 기반한 시스테인 풍부 도메인이고, 1개는 시스테인 풍부 도메인 4의 말단부터 막관통 도메인까지의 힌지 도메인이다. 하기 아미노산 삽입 서열을 NheI/EcoRI를 통해 pIRES-Neo3 (도 4) 내로 클로닝하였으며; 볼드체의 텍스트는 신호 펩티드이다. 밑줄 표시된 텍스트는 인간 OX40과 동일한 서열이다. 이탤릭체의 텍스트는 막관통 및 세포내 도메인 서열을 나타낸다.
ra/huOX40 키메라 삽입물 A의 아미노산 서열 (인간 시스테인 풍부 도메인 1; 시스테인 풍부 도메인 2로부터 정방향으로 래트 서열).
Figure pct00034
ra/huOX40 키메라 삽입물 B의 아미노산 서열 (인간 시스테인 풍부 도메인 1 및 2; 시스테인 풍부 도메인 3으로부터 정방향으로 래트 서열).
Figure pct00035
ra/huOX40 키메라 삽입물 C의 아미노산 서열 (인간 시스테인 풍부 도메인 1 내지 3; 시스테인 풍부 도메인 4로부터 정방향으로 래트 서열).
Figure pct00036
ra/huOX40 키메라 삽입물 D의 아미노산 서열 (인간 시스테인 풍부 도메인 1 내지 4; 힌지 도메인으로부터 정방향으로 래트 서열).
Figure pct00037
ra/huOX40 키메라 삽입물 E의 아미노산 서열 (래트 시스테인 풍부 도메인 1; 시스테인 풍부 도메인 2로부터 정방향으로 인간 서열).
Figure pct00038
ra/huOX40 키메라 삽입물 F의 아미노산 서열 (래트 시스테인 풍부 도메인 1 및 2; 시스테인 풍부 도메인 3으로부터 정방향으로 인간 서열).
Figure pct00039
ra/huOX40 키메라 삽입물 G의 아미노산 서열 (래트 시스테인 풍부 도메인 1 내지 3; 시스테인 풍부 도메인 4로부터 정방향으로 인간 서열).
Figure pct00040
ra/huOX40 키메라 삽입물 H의 아미노산 서열 (래트 시스테인 풍부 도메인 1 내지 4; 힌지 도메인으로부터 정방향으로 인간 서열).
Figure pct00041
키메라 및 전장 래트 및 인간 OX40 작제물을 사용하여 얻어진 FACS 결과에 기초하여, 관찰된 결합 패턴에 기초하여 클론들을 비닝하였다. 항체는, MFI가 (음성 대조) 비결합 항체 (파상풍 톡소이드에 대해 유도됨)로 염색된 동일한 세포 집단의 MFI의 적어도 3배일 때 (키메라) OX40과 결합하는 것으로 여겨졌다.
이중특이성 OX40×TT IgG 포맷의 huOX40 결합 클론의 결과가 표 5에 제공되어 있다.
PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하는 능력에 대한 PD-L1×TT 이중특이성 IgG에 존재하는 huPD-L1 특이적 Fab 아암의 비닝
14개의 huPD-L1 결합 클론 (도 3에 나타낸 VH 서열)을 PD-L1과 PD-1의 상호작용을 차단하는 그들의 능력, 및 PD-L1과 CD80 사이의 상호작용을 차단하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 따라서, PD1-Fc (R&D Systems; 카탈로그 번호 1086-PD) 또는 CD80-Fc (R&D Systems; 카탈로그 번호 140-B1)를 각각 1 및 3 ㎍/ml로 Maxisorp 플레이트에 코팅하였다. 코팅된 웰을 PBS 중 4% BSA로 차단하였다. 이후에, 0.55 ㎍/ml의 비오티닐화된 PD-L1 (BPS Bioscience; 카탈로그 번호 71105)을 0.15 내지 20 ㎍/ml 범위의 huPD-L1×TT 이중특이성 IgG의 존재 또는 부재 하에서 첨가하였다. 결합된 비오티닐화된 PD-L1을, 차단 완충액 중에 1:2000으로 희석된 HRP-접합된 스트렙타비딘 (BD Bioscience: 카탈로그 번호 554066)을 사용하여 검출하였다. 각각의 인큐베이션 단계 후에, ELISA 플레이트를 PBS-T (PBS-0.05% v/v Tween 20)로 3회 세척하였다. 결합된 스트렙타비딘을 TMB/H2O2 염색에 의해 시각화하고, 염색을 OD450nm 측정에 의해 정량화하였다. ELISA 신호가 TT 특이적 경쟁 항체를 첨가한 대조군과 대비하여 10 ㎍/ml의 IgG (PD-L1×TT) 농도에서 70%를 초과하여 감소되었을 때, 클론은 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 차단하는 것으로 간주되었다. PD-L1×TT 이중특이성 분자로서 시험된 PD-L1 항체 패널의 대표적인 선택에 의해 얻어진 결과에 대해서는 도 10을 참조한다. MF5361을 제외하고는, 도 10에 나타낸 PD-L1-특이적 Fab 아암은 PD-1/PD-L1 상호작용을 70%를 초과하여 차단한다. 게다가, 도 3에 나타낸 MF 서열을 포함하는 모든 다른 PD-L1-특이적 Fab 아암은 또한 PD-1/PD-L1 상호작용을 70%를 초과하여 차단한다 (데이터는 나타나 있지 않음).
결론적으로, 시험된 huPD-L1 특이적 Fab 아암은 MF5361을 제외하고는 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단한다.
CD137×CD137, OX40×TT 및 PD-L1×TT 이중특이성 IgG에 존재하는 huCD137, huOX40 및 huPD-L1 특이적 Fab 아암의 친화도 순위
FACS에서 각각의 인간 및 마카크 오르토로그와 결합하는 것으로 밝혀진 이중특이성 항체들을 FACS에서 두 오르토로그 모두에 대한 겉보기 친화도에 대해 순위를 매겼다. 따라서, 각각의 오르토로그들을 발현하는 안정한 세포주 (표 1)를 수집하고, FACS 완충액 (PBS/0.5% BSA/0.5 mM EDTA) 중에 1×106개 세포/ml로 희석시켰다. 세포를 300 g로 4℃에서 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트(들)를 역전시켜 상층액을 폐기하였다. 10 내지 0.01 ㎍/ml 범위의 11 단계의 연속 2배 희석물로 50 μl의 각각의 IgG 샘플을 첨가하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1회 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포를 150 μl의 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 50 μl의 1:400 희석 염소 항 인간 IgG PE (Invitrogen)를 첨가하고, 암실에서 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충액을 첨가한 후에, 세포를 1회 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 HTS 세팅에서 FACSCanto 유세포측정기 (Becton and Dickinson) 상에서 분석하였다. 염색된 세포 집단의 평균 형광 세기 (MFI)를 측정함으로써 세포에 대한 항체의 결합을 평가하였다. 항체는, MFI가 (음성 대조) 비결합 항체 (파상풍 톡소이드에 대해 유도됨)로 염색된 동일한 세포 집단의 MFI의 적어도 5배일 때 그의 표적과 결합하는 것으로 여겨졌다.
참조 항체
PD-L1 및 CD137 및 CTLA-4의 기능을 억제하는 항체는 당업계에 알려져 있다. 단일클론 2가 항체를 공개된 정보에 따라 작제하고, 293F Freestyle 또는 CHO-S 세포에서 발현시켰다. 항-PD-L1 항체 MPDL3280A (아테졸리주맙에 기반한 대용물)는 국제 특허 출원 공개 WO2010077634A1호에 개시된 정보에 기초하였다. 항-CD137 항체 20H4.9 (우렐루맙에 기반한 대용물) 및 PF-05082566 (우토밀루맙에 기반한 대용물)의 정보는 각각 국제 특허 출원 공개 WO 2005/035584호 및 WO2015119923호로부터 입수하였다.
MOR7480의 VH 정보는 US8337850 B2호로부터 입수하고 IgG1 골격에 재클로닝하였다. 항-CTLA-4 항체 10D1 (이필리무맙에 기반한 대용물)에 관한 정보는 PCT 공개 WO 01/14424호로부터 입수하였다.
실시예 4
재료 및 방법
PBMC 단리
인간 전혈을 버피 코트(buffy coat) (Sanquin)로부터 얻고, PBS로 1:1로 희석시켰다. Leucosep 튜브 (Greiner Bio-One 카탈로그 번호 227 290)를 실온 (RT)에서 가온된 17.5 m Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences 카탈로그 번호 17-1440-02)로 충전하였다. Ficoll-Paque Plus를 실온에서 1000 × g로 30초 동안 스핀 다운하였다. 30 ml의 희석된 전혈을 상부에 부었다. 튜브를 실온에서 10분 동안 1000 × g로 회전시키고, 단핵 PBMC 계면을 수집하고, PBS 중에서 2회 세척하고, 250 μl PBS 중에 재현탁시켰다. PBMC를 계수하고, 조직 배양 배지 (10% FCS를 함유하는 DMEM) 중에서 1×106/ml로 재조정하고, 동일 부피의 빙랭 동결 배지 (80% 배양 배지/20% DMSO)를 첨가함으로써 동결시켰다. 추가로 사용할 때까지, -150℃의 1 ml 분취량으로 세포를 저장하였다.
T 세포 활성화 검정
PBMC를 해동시키고, 9 부피의 배양 배지 (L-글루타민 및 10% 열 불활성화 FBS를 함유하는 RPMI1640)를 첨가하였다. 세포를 150 g로 실온에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 10 ml의 배양 배지 중에 재현탁시키고, 세포를 95% 상대 습도에서 37℃, 5% CO에서 50 ml 팔콘 튜브 내에서 하룻밤 인큐베이션함으로써 정치되게 하였다. 다음날, 제조자 (Stem Cell Technologies 카탈로그 번호 19051)에 의해 기재된 바와 같은 Easy Sep T 세포 농축 (pan CD3) 정제 절차를 사용하여 T 림프구를 단리하였다. EasySep 절차는 음성 선택을 사용한다. 간략하게 말하면, PBMC를 150 g로 실온에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 1 mM EDTA를 함유하는 PBS + 2% FBS 2 ml 중에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 30 μm 메시 나일론 스트레이너(strainer)를 통해 여과하였다. 세포를 계수하고, 1 mM EDTA를 함유하는 PBS + 2% FBS 중에서 5 × 107개 세포/ml로 재조정하였다. 50 μl의 EasySep 인간 T 세포 풍부화 칵테일을 매 2 ml 세포 부피마다 첨가하고, 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션되게 하였다. 다음으로, 50 μl의 EasySep D 자성 입자를 매 2 ml 세포 부피마다 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션되게 하였다. 총 부피는 1 mM EDTA를 함유하는 PBS + 2% FBS에 의해 2.5 ml로 되었다. 다음으로, 튜브를 자석 내에 넣어서, 원치 않는 세포 분획이 실온에서 5분 동안 자석에 결합되게 하였다. 다음으로, 튜브를 뒤집고, 정제된 T 세포 분획을 새로운 튜브에 붓고, 세포를 실온에서 150 g로 10분 원심분리함으로써 수집하고, 후속으로 배양 배지 중에 1×105개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. T 세포 활성화 검정을 위하여, 96웰 플레이트 (96웰 편평 바닥 플레이트 - Cellstar #655180)의 내부 웰을 PBS 중 항-CD3 UCHT1 30 ㎍/mL로 하룻밤 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBS로 세척하였다. 항체 희석물 (80 ㎍/ml)을 제조하고, 실온에서 15분 동안 교차결합 항체 aHuIgG-Fc (Bethyl 카탈로그 번호 #A80-104A)와 함께 1:1 비로 인큐베이션하였다. 다음으로, 혼합물의 연속 희석물을 제조하였다. 100 μL의 교차결합된 항체를 각각의 웰에 첨가한 후, 100 μL의 정제된 T-세포 현탁액을 첨가하였다. 각각의 플레이트에는 참조 대조군으로서의 역할을 하는 음성 대조 항체 (PG1337) 및 양성 대조 항체 (우렐루맙)의 연속 희석물이 담겨 있었다. IL-2 분비 및/또는 항원의 세포 표면 발현에 대해 시험하기 전에, T 세포 배양물을 95% 상대 습도에서 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 자극하였다. 방출된 IL-2의 농도를 AlphaLISA (Perkin Elmer 카탈로그 번호 AL221C)에 의해 결정하였다. 관문 억제 또는 공동자극성 항원과 관련된 세포 표면 항원의 발현을 유세포측정에 의해 결정하였다.
SEB 검정
포도상구균 장독소 B (SEB)에 의해 자극된 PBMC를 사용함으로써 이중특이성 항체의 기능적 활성을 결정하였다. SEB는 Vβ3 및 Vβ8 T 세포 수용체 쇄를 발현하는 T 세포를 특이적으로 활성화시킨다. 3명의 공여자로부터의 PBMC를 해동시키고, 세척하고, 계수하고, 배양 배지 (RPMI1640 + 10% 열 불활성화 FBS) 중에서 2×106개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 세포를 SEB (2000 또는 125 ng/ml)의 존재 하에서 편평 바닥 96웰 플레이트 (2×105개 세포/웰)에 시딩하였다. 20 ㎍/ml로 출발하여 항체 연속 희석물을 첨가하였다. 각각의 플레이트에는 참조 대조군으로서의 역할을 하는 음성 대조 항체 (PG1337) 및 양성 대조 항체 (이필루무맙에 기반함)의 연속 희석물이 담겨 있었다. 사이토카인 분비 및/또는 항원의 세포 표면 발현에 대해 시험하기 전에, 세포를 95% 상대 습도에서 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 자극하였다.
PD-1/PD-L1 차단 리포터 검정
사용된 PD-1/PD-L1 차단 리포터 검정은 Promega에 의해 개발되었으며, 다음과 같은 2-세포 시스템에 기초한다: PD-L1 및 T 세포 활성화 인자를 발현하는 CHO 세포, 및 PD-1을 과발현하는 Jurkat/NFAT-RE 리포터 세포주. PD-1/PD-L1 차단 리포터 검정은 Promega의 해동 및 사용 포맷을 사용하여 수행하였다. PD-L1 발현 CHO 세포 (카탈로그 번호 C187103)를 14.5 ml의 세포 회복 배지 (10% FBS를 함유하는 DMEM/F12) 중에서 해동시켰다. 다음으로, 50 μl의 세포 현탁액을 96웰 절반 면적 플레이트 (Corning, 카탈로그 번호 3688)의 내부 웰에 첨가하였다. 플레이트를 95% 상대 습도에서 37℃, 5% CO에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 배양 배지를 제거하고, 연속 희석물 (출발 농도 10 ㎍/ml)로의 검정 배지 (4% FBS를 함유하는 RPMI 1640) 중 20 μl의 시험 항체를 각각의 웰에 첨가하였다. 각각의 플레이트에는 참조 대조군으로서의 역할을 하는 음성 대조 항체 (PG1337) 및 양성 대조 항체 (니볼루맙/MPDL3280A에 기반함)의 연속 희석물이 담겨 있었다. PD-1 이펙터 세포 (카탈로그 번호 C187105)를 5.9 ml의 검정 배지 중에서 해동시키고, 20 μl의 세포 현탁액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 95% 상대 습도에서 37℃, 5% CO에서 6시간 동안 또는 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 40 μl의 루시페라제 (Bio-Glo Luciferase Assay System, 카탈로그 번호 G794L)를 첨가하고, BioTek Synergy 2 멀티-모드 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 루시페라제 활성의 양을 측정하였다. 효력은 음성 대조 항체와 대비하여 루시페라제 활성으로서 측정되었다.
PD-L1 항체 패널의 스크리닝
PD-L1 항체 패널로부터의 VH를 하전된 조작된 Fc-침묵된 벡터 내로 재클로닝하여, 항체 중쇄의 발현 시에 중쇄의 이종이량체화가 강제로 수행되도록 하여 형질감염 후에 이중특이성 항체의 생성을 일으키도록 하였다. PD-L1 Fab 아암을 MV1624 벡터 내에 재클로닝하였다. PD-L1 항체를 TT 표적화 Fab 아암인 MF1337과 조합하여, 1가 방식으로 PD-L1을 표적화하는 이중특이성 항체를 생성하였다. 1가 포맷의 PD-L1 항체의 패널은 표 3에 나타낸 바와 같이 활성 순위가 매겨졌다.
사이토카인 검정
ELISA: 다양한 시간에 T-세포 또는 PBMC를 자극한 후, 플레이트를 원심분리하고, 배지를 제거하였다. 사이토카인 수준을 제조자의 설명서 (Perkin Elmer)에 따라 AlphaLISA에 의해 검출하였다. 표준 곡선에 기초하여 농도를 계산하였다.
루미넥스 검정: 시험관내 사이토카인 생성을 결정하기 위해 사용된 다른 방법은 eBioscience에 의해 개발된 멀티플렉스 분석의 사용이었다. IFN-γ, IL-2, 및 TNF-α의 수준을 제조자의 설명서에 따라 배양 상층액에서 측정하였다. 결과를 eBioscience 분석 소프트웨어에 의해 분석하였다.
Jurkat CD137-NFkBluc의 생성
Jurkat E6 세포 내에 전장 CD137 작제물 및 NF-κB 루시페라제 리포터 작제물을 안정하게 통합시킴으로써 Jurkat CD137-NFkBluc 안정한 리포터 세포주를 생성하였다. 따라서, 전장 CD137 MV1604 [pIRESneo3] (Clontech)를 형질감염시키고, CD137을 발현하는 안정한 클론을 항생제 선택에 따라 생성하였다. 다음으로, NF-κB 루시페라제 리포터 작제물 pGL4.32 [luc2P/NF-κB-RE/Hygro] (Promega)를 최고의 CD137 발현을 갖는 클론 중에서 형질감염시키고, CD137 및 NF-κB 루시페라제 둘 모두를 발현하는 안정한 클론을 항생제 선택에 따라 선택하였다. 플레이트 결합된 CD3 항체 (클론 OKT-3) 및 PMA/이오노마이신에 의한 초기 활성화 후에 CD137L에 반응하는 능력에 대해 클론을 선택하였다. 최고의 활성화 창을 나타낸 클론을 CD137 리포터 검정에서 해동 및 사용 포맷으로서 사용하였다.
CD137 리포터 검정
직접 CD137 활성화 검정을 위하여, 96웰 플레이트 (Costar, 카탈로그 번호 3917)를 PBS 중 2 ㎍/ml 항-CD3 (OKT3)로 하룻밤 코팅하였다. 교차결합에 의해 매개되는 CD137 활성화 검정을 위하여, 96웰 플레이트 (Costar, 카탈로그 번호 3917)를 PBS + 10 ㎍/ml의 항-인간 IgG (Bethyl, 카탈로그 번호 A80-104A) 중 2 ㎍/ml의 항-CD3로 하룻밤 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBS로 세척하였다. 상기 언급된 Jurkat CD137-NFkBluc 세포를 해동시키고, 10% 열 불활성화 소태아 혈청을 함유하는 DMEM/F12 배지 (검정 배지)로 세척하였다. 세포를 2×106개 세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 25 μl의 세포 현탁액을 코팅된 96웰 검정 플레이트의 내부 웰 내로 플레이팅하였다. 연속 희석물로의 25 μl의 시험 항체를 각각의 웰에 첨가한 후 (출발 농도 20 ㎍/ml), 25 μl의 검정 배지를 첨가하였다. 각각의 플레이트에는 참조 대조군으로서의 역할을 하는 음성 대조 항체 (PG1337) 및 양성 대조 항체의 연속 희석물이 담겨 있었다. 플레이트를 95% 상대 습도에서 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 50 μl의 루시페라제 (Promega, Bright-Glo™, 카탈로그 번호 E2610)를 첨가하고, BioTek Synergy 2 멀티-모드 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 루시페라제 활성의 양을 측정하였다.
대규모 이중특이성 항체의 생성
PEI/DNA 질량비가 2.5:1인 형질감염 시약으로서 폴리에틸렌이민 (PEI)을 사용하여 FreeStyle? 293-F 세포 (Invitrogen)에서 단백질을 생성하였다. 0.4 내지 2 L 규모로 1:1 DNA 질량비를 사용하여 이중특이성 항체를 형질감염시켰다. 세포 상층액을 MabSelect SuRe LX 세파로스 (GE Healthcare)와 함께 배치식으로 인큐베이션한 후, 산성 용리 및 Tris를 사용한 중화에 의해 정제하였다. 결과적으로, 단백질을 탈염하고 원심분리한 후, 25 mM 인산염 완충액 (pH 6.0) 중에서 평형화된 Resource S (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여 양이온 교환 정제를 수행하였다. 1 M NaCl에 대한 구배 용리를 사용하여 단백질을 용리하고, 단백질 함유 분획을 수집하고, NuPAGE 4 내지 12% Bis-Tris 단백질 겔 (Invitrogen)을 사용하여 분석하였다. 이중특이성 항체를 함유하는 분획을 풀링하고, PBS 중에서 평형화된 Superdex200 26/600 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare)에 적용하였다. 분획을 수집하고 NuPAGE 상에서 분석하고, 이후에 단량체 항체-함유 분획을 풀링하고 멸균 여과하였다 (0.22 μm).
결과
CD137 리포터 검정
CD137 2가 항체의 패널을 상기 언급된 CD137 직접 활성화 리포터 검정에서 스크리닝하였다. 항체의 선택의 대표적인 도면이 도 11에 나타나 있다. 항체 패널의 60%는 CD137을 변동가능한 정도로 직접 활성화시킬 수 있었다.
CD137ХPD-L1 항체 패널의 스크리닝
암 약물 개발에 있어서의 CD137 2가 항체의 한 가지 제한은 CD137 발현 세포의 전신 활성화이다. 이는 비특이적 표적화로 인해 항체의 독성으로 이어질 수 있다 (문헌[Melero, 2013]). 이중특이성 항체는 두 표적 모두, 예컨대 2개의 종양 항원을 동시발현하는 세포를 표적화함으로써, 또는 표적들 중 하나를 각각 발현하는 2개의 상이한 세포를 표적화함으로써, 세포를 선택적으로 표적화함으로써 이러한 제한을 극복할 수 있다. 후자는 세포들이 서로 매우 근접해 있는 경우에만 일어날 수 있다. CD137의 선택적 활성화의 가능성을 조사하기 위하여, CD137을 표적화하는 하나의 Fab 아암 및 PD-L1을 표적화하는 하나의 Fab 아암으로 구성된 이중특이성 항체를 생성하였다. 이때, PD-L1은 종양 세포 상에 고농도로 존재하는 항원뿐만 아니라 종양 부위에 존재하는 활성화된 T 세포 상에서 고도로 발현되는 항원 둘 모두를 나타낸다 [문헌[Pulko et al, 2011]). 그렇기 때문에, 이중특이성 CD137×PD-L1 항체는 동일한 세포 상의 CD137 및 PD-L1을 표적화할 때는 '시스'로, 또는 면역 세포 상의 CD137 및 인접 세포 상의 PD-L1을 표적화함으로써 '트랜스'로 CD137을 활성화시킬 수 있다. 이러한 기전의 상위에서, PD-1차단 Fab 아암의 포함은 억제성 신호를 자극성 신호로 전환시킬 수 있을 것이다.
CD137 및 PD-L1 항체 패널로부터의 VH를 하전된 조작된 Fc-침묵된 벡터 내로 재클로닝하여, 항체 중쇄의 발현 시에 중쇄의 이종이량체화가 강제로 수행되도록 하여 형질감염 후에 이중특이성 항체의 생성을 일으키도록 하였다. 40개의 상이한 CD137 Fab 아암 및 표 3에 나타낸 8개의 상이한 PD-L1 Fab 아암을 포함하는 총 320개의 CD137×PD-L1 이중특이성 항체를 24웰 포맷으로 생성하고 IgG 정제하였다. 모든 항체를 직접적으로 또는 항-인간 IgG 교차결합 항체의 존재 하에서 CD137-luc 리포터 시스템에서 용량 의존성 루시페라제 발현을 유도하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. 대리 항체 20H4.9 및 MOR7480을 각각의 검정에서 참조 항체로서 포함시켰다.
항-인간 IgG 교차결합 항체의 부재 또는 존재 하에서의 몇몇 CD137×PD-L1 이중특이성 항체의 CD137-luc 리포터 검정에서의 기능적 활성의 예가 도 12에 나타나 있다. 이 도면은 CD137 유도 루시페라제 활성을 활성화시키는 CD137×PD-L1 이중특이성 항체의 능력이 항-인간 IgG 항체에 의한 교차결합에 매우 의존적임을 보여주는데, 그 이유는 이것이 루시페라제 활성의 크기를 25%만큼 증가시키기 때문이다. CD137 연결 후의 IFN-γ 생성의 유의한 향상이 또한 20H4.9로서 당업계에 알려진 항-CD137 항체에 대해 관찰되었다 (국제 특허 출원 공개 WO 2005/035584호). 이중특이성 항체 패널의 상위 25%의 CD137×PD-L1은 8개의 PD-L1 Fab 아암의 총 패널의 1 내지 7개의 PD-L1 Fab 아암과 조합된 22개의 CD137 Fab 아암으로 구성되었다.
다음으로, 상위 25%의 CD137×PD-L1 이중특이성 항체 패널을 파상풍 톡소이드를 표적화하는 비관련 Fab 아암과 조합된 모 CD137 Fab 아암 및 2가 모 CD137 항체와 대비하여 1차 T 세포 활성화 검정에서 IL-2 방출을 유도하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 이러한 실험 셋업에서는, 1가 활성화 vs. 2가 활성화가 모니터링될 수 있다. 도 13의 상측 패널은 20H4.9 참조 항체의 범위에서 CD137×CD137 2가 포맷으로 존재하는 경우 CD137 활성화 시에 IL-2 분비를 유도하는 3개의 항체의 세트의 예를 나타낸다. 대조적으로, 도 13의 하측 패널에 나타낸 바와 같이, CD137×PD-L1 이중특이성 항체들 중 어느 것도 2가 CD137 모 Fab의 수준까지 IL-2 분비를 유도할 수 없었다. CD137×PD-L1 이중특이성 항체는 CD137×TT 변이체와 동일한 활성을 나타내었는데, 이는 CD137 신호전달 복합체가 동일한 세포 표면에서 CD137 및 PD-L1에 결합함으로써 ('시스'로의 결합) 효과적으로 형성될 수 없음을 나타낸다. 이러한 CD137×PD-L1 이중특이성 항체 패널의 인 시스 T 세포 활성화의 결여가 유리한데, 그 이유는 이것이 비특이적 T 세포 활성화로 인한 생체내 독성의 잠재성을 저하시키기 때문이다.
전사활성화 검정
이중특이성 CD137×PD-L1 항체가 '트랜스'로 CD137을 활성화시킬 수 있는지를 시험하기 위하여, 이중특이성 항체를 2개의 세포 검정에서 시험하였는데, 여기서는 면역 세포에서의 CD137 신호전달이 제2 세포에 의한 교차결합을 통해 일어날 것이다. 시험관내 검정은 2개의 상이한 세포주, 즉 PD-L1을 발현하는 종양 세포를 모방한 CHO-PD-L1 세포, 및 면역 세포를 나타내는 Jurkat CD137-luc 리포터 세포로 구성되었다. 제1 T 세포 활성화 신호를 제공하는 코팅된 항-CD3을 갖는 CD137-luc 리포터에서와 동일한 검정 셋업을 사용하였다. 사용된 이펙터 표적 세포 비는 4:1이었으며, 이때 표적 세포는 CHO 야생형 또는 CHO-PD-L1 세포이다. 도 14는, 동일한 CD137 Fab 아암 (MF6744) 및 2개의 상이한 PD-L1 Fab 아암 (각각 MF5361 또는 MF5594)으로 구성된 CD137 이중특이성 항체 PB14671 및 PB14580이 둘 모두 CHO-PD-L1 세포의 존재 하에서는 CD137 리포터 세포 활성을 유도할 수 있었던 반면, 야생형 CHO 야생형 세포의 존재 하에서는 CD137 자극이 일어나지 않았던 예를 보여준다. 게다가, 동일한 CD137 Fab 아암 (MF6783) 및 2개의 상이한 PD-L1 Fab 아암 (각각 MF5361 또는 MF5594)으로 구성된 CD137 이중특이성 항체 PB14681 및 PB14590이 둘 모두 CHO-PD-L1 세포의 존재 하에서는 CD137 리포터 세포 활성을 유도할 수 있었던 반면, 야생형 CHO 야생형 세포의 존재 하에서는 CD137 자극이 일어나지 않았다. 더욱이, 모든 CD137×PD-L1 이중특이성 항체는 참조 대조 항체 20H4.9만큼 강력하였다. CD137×PD-L1 이중특이성 항체 PB14580 및 PB14671의 병용물 (Oligoclonics® 포맷)은 높은 루시페라제 활성을 유도하였다.
1차 T-세포에 의한 전사활성화 검정
T 세포 활성화 검정에서 CHO 야생형 또는 CHO-PD-L1 세포를 첨가함으로써, 전사활성화 검정을 1차 세포로 재포맷하였다. CHO-PD-L1 및 CHO 야생형 세포에 대하여 검정 출발 시점에서 1:1.8의 이펙터 표적 세포 비를 사용하였다. T 세포 활성화 검정을 위하여, 96웰 플레이트 (96웰 편평 바닥 플레이트 - Cellstar #655180)의 내부 웰을 PBS 중 항-CD3 OKT-3 30 ㎍/mL로 하룻밤 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBS로 세척하였다. 50 μL의 항체 용액을 첨가한 후, 2 × 106개 세포/웰의 25 μ L의 정제된 T-세포 현탁액 및 상기에 나타낸 바와 같은 비의 25μL의 정제된 CHO-K1 또는 CHO-PD-L1을 웰당 첨가하였다. IL-2 분비에 대해 시험하기 전에, 배양물을 95% 상대 습도에서 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 자극하였다. 방출된 IL-2의 농도를 AlphaLISA (Perkin Elmer 카탈로그 번호 AL221C)에 의해 결정하였다.
2개의 CD137×PD-L1 이중특이성 항체 (PB14671 및 PB14580)뿐만 아니라 Oligoclonics® 포맷 및 CD137×TT 포맷을 시험하였다. 도 15에 나타낸 일수 3에서의 IL-2 방출은 CD137×PD-L1 항체가 CHO-PD-L1 세포의 존재 하에서, 대조 항체 20H4.9보다 더 높은 정도로, T 세포에서 IL-2 생성을 유도하였음을 보여준다. 더욱이, CD137×TT 포맷은 IL-2 방출을 유도하는 데 실패하였다. CHO 야생형 세포의 존재 하에서는, 대조 항체 20H4.9를 제외하고는 백그라운드 수준에서 IL-2 수준이 생성된다. 2개의 CD137×PD-L1 이중특이성 항체의 병용물 (Oligoclonics® 포맷)은 높은 루시페라제 활성을 유도하여, 이전의 실험을 확인시켜 주었다. Oligoclonics® 포맷은 동일한 CD137 에피토프 및 2개의 상이한 PD-L1 에피토프를 표적화할 수 있거나 (도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같음) 또는 2개의 상이한 CD137 도메인 및 2개의 상이한 PD-L1 도메인을 표적화할 수 있다.
SEB 검정
PD-L1을 발현하는 APC가 존재하는 생리학적 환경에서 CD137×PD-L1 이중특이성 항체를 시험하기 위하여, CD137×PD-L1 항체 (PB14671 및 PB14580), CD137ХTT 항체 및 Oligoclonics® 포맷을 모두 SEB 검정에서 시험하였다. CD137×PD-L1 이중특이성 항체들 중 하나 (PB14580)는 음성 대조 항체와 대비하여 더 높은 활성화를 나타내었으며, CD137 (20H4.9) 또는 PD-L1 (MPDL3280A) 중 어느 하나를 표적화하는 참조 항체와 대비하여 훨씬 더 강력하였으며; 도 16을 참조한다. CD137×PD-L1 Oligoclonics® 포맷에 의한 IL-2의 유도가 또한 강력하였다.
추가 시험
11개의 상이한 CD137 빈 A-K를 나타내는 24개의 항-CD137 Fab 아암의 패널 (표 2)을 7개의 PD-L1 특이적인 차단 Fab 아암 및 1개의 PD-L1 특이적인 비차단 Fab 아암 (표 3)과 조합하고, 24웰 포맷으로 생성하였다. 후속으로, 생성된 CD137×PD-L1 이중특이성 항체를 CHO-PD-L1 세포 또는 CHO 야생형 세포의 존재 하에서 CD137-luc 리포터 시스템에서 용량 의존성 루시페라제 발현을 유도하는 그들의 능력에 대해 연속 적정으로 시험하였다. 20H4.9 및 음성 대조 항체를 참조 항체로서 포함시켰다 (도 19). 루시페라제의 최고 유도를 나타낸 항체 (총 56개)를 선택하고, CHO-PD-L1 세포 또는 CHO 야생형 세포의 존재 또는 부재 하에서 활성화된 T 세포 검정에서 연속 적정으로 시험하였다. 동시에, 항체를 SEB 검정에서 시험하였다. CD137 활성화를 위한 판독으로서, IL-2 방출을 측정하였다. T-세포 활성화 검정에서 시험된 24개의 이중특이성 항체의 특성 및 활성의 개요가 표 7에 나타나 있다.
활성화된 T 세포 및 SEB 검정 둘 모두에서 두 PD-L1 아암 모두에 대해 활성인 것으로 확인된 12개의 CD137 Fab 아암을 7개의 상이한 PD-L1 Fab 아암과의 조합을 위해 선택하였다. 12개의 CD137 아암은, 2가 단일특이성 IgG로서 생성될 뿐만 아니라, 이중특이성/1가 CD137×PD-L1 항체로서 생성되었으며, 이들 각각은 7개의 상이한 PD-L1 아암 중 하나와 조합되었다. 따라서, 총 84개의 이중특이성 CD137×PD-L1 항체를 SEB 검정에서 용량 의존성 적정으로 시험하였으며, 이때 판독으로서 IL-2 방출을 사용하였다. 도 20에서의 데이터는 CD137×PD-L1 포맷으로 존재할 때, 12개의 CD137 Fab 아암 중 4개 (MF6783, MF6749, MF6737 및 MF6788)는 다른 Fab 아암과 대비하여 SEB 검정에서 더 낮은 효력을 나타내었음을 보여준다. 따라서, 이들 4개의 CD137 Fab 아암을 포함하는 CD137×PD-L1 이중특이성 항체는 추가의 시험을 위해 배제하였다. 추가의 SEB 시험 동안, MF6808, MF6763, MF6754, MF6785 및 MF6797을 포함하는 CD137×PD-L1 병용물은 최고의 IL-2 사이토카인 방출을 유도하였다. (도 21). MF6805, MF6744 및 MF6825를 포함하는 CD137×PD-L1 병용물은 더 적은 양의 IL-2 사이토카인 분비를 유도하였다. MF6808, MF6763, MF6754, MF6785 및 MF6797을 포함하는 CD137×PD-L1 병용물의 효력을 루미넥스 멀티플렉스에 의해 결정되는 바와 같은 IL-2, IFNγ 및 TNFα 방출의 유도를 측정함으로써 연속 적정으로 SEB 검정 동안 추가로 분석하였다. 다음으로, IL-2 방출의 EC50 값에 대해 항체를 순위화하였다 (표 4). 4개의 상이한 CD137 Fab 아암을 포함하는 28개의 CD137×PD-L1 이중특이성 항체의 패널 (표 4)은 SEB 검정에서 최고 활성을 나타내었다. 이들 4개의 CD137 Fab 아암은 CD137 내의 동일한 결합 영역 (결합 도메인 2)에 맵핑될 수 있었으며, 더욱이 이들 모두는 CD137과 CD137L 사이의 상호작용을 완전히 차단하였다. 이들 중 어느 것도 2가 단일클론으로서 Jurkat CD137 리포터 스크린에서 효능적 활성을 나타내지 않았다 (도 17). 28개의 CD137×PD-L1 이중특이성 항체의 CIEX 프로파일은 MF7702와 같은 MF5553에 기반한 PD-L1 Fab 아암을 포함하는 CD137×PD-L1 항체가 제조를 위한 유력 후보 항체로서의 고려의 관점에서 최적의 CIEX 프로파일을 가졌음을 입증하였다.
실시예 5
항-CD137 항체 패널의 친화도 순위화
트랜스로 PD-L1 Fab 아암과 조합하여 T 세포 활성화를 유도한 항-CD137 Fab의 패널의 친화도를 T Biacore에 의해 결정하였다.
이를 위하여, 인간 재조합 CD137 단백질을 칩에 결합시키고, Biacore T100 기기에 의해 하기 1가 이중특이성 포맷의 상이한 항-CD137 항체들의 친화도를 분석하였다: 하나의 Fab 아암은 CD137에 특이적이고, 다른 하나는 비관련 리간드, 즉 파상풍 톡소이드 (TT)에 특이적이었다.
이들 실험에서는, 이중특이성 항-(CD137×TT) IgG를 소규모 생성으로 Freestyle 293F 세포에서 인코딩 작제물의 일시적 형질감염에 의해 생성하였다 (24웰 포맷, 실시예 2 참조). 각각의 형질감염에서는, 선택된 항-CD137 서열들 중 하나를 인코딩하는 작제물을 항-TT 서열을 인코딩하는 MF1337과 조합하였다.
이어서, Biacore T100 기기 상에서의 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 항체의 친화도를 결정하였다. 이를 위하여, huCD137-Fc 단백질 (RND Systems# 838-4B)을 소듐 아세테이트 결합 완충액 (pH 5.0) 중에 5 ㎍/ml로 희석시키고, CM5 바이오센서 칩의 셀 2의 표면에 150 공명 단위 (RU)의 수준으로 결합시켰다. 플로우 셀 1은 음성 대조 표면으로서의 역할을 하였다. 속도론적 해리 속도 상수 (Koff 값)를 결정하기 위하여, 시험 항체를 HEPES 완충 식염수 (HBS) 중에 15 ㎍/ml (100 nM)로 희석시키고, 30 μl/min으로 CD137-코팅된 센서 칩의 플로우 셀 1 및 2 둘 모두 위로 이동시켰다. 10 μl의 100 mM HCl의 펄스로 재생을 수행하였다. BIAevaluation 소프트웨어에 있는 곡선 적합화를 사용하여 획득된 센서그램 (즉, 응답 대 시간의 그래프)으로부터 해리 속도 상수를 결정하였다.
항체 패널의 결합 반응속도를 측정하고 CD137에 대한 항체 결합의 속도론적 회합 및 해리 속도 상수를 얻기 위하여, 상이한 농도의 이러한 시험 항체 하위세트를 새로 코팅된 칩의 플로우 셀 1 및 2의 표면 위로 이동시켰다. 항체를 HBS 중에 200 nM (즉, 30 ㎍/ml)로 희석시키고, 2배 연속 희석시키고 (4개의 희석물, 100 nM - 50 nM -25 nM -12.5 nM), 이어서 높은 유량 (30 μl/min)으로 속도론적 이동으로 칩에 결합시키기 위해 시험하였다. 10 μl의 100 mM HCl의 펄스로 재생을 수행하였다. 획득된 센서그램을 BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 분석하였으며, 속도론적 회합 (Ka) 및 해리 (Kd) 속도 상수를 결정함으로써, 상이한 항-CD137 Fab 아암의 친화도 (KD 값)에 대한 데이터를 생성하였다. 각각의 항체 농도에 대하여, 결합 속도(on-rate) 및 해리 속도(off-rate)를 개별적으로 결정하고, 이어서 평균하였다.
결과가 표 6에 나타나 있다. 모든 시험된 항-CD137 Fab는 낮은 nM 범위의 친화도를 가졌다.
실시예 6
Jurkat OX40-NFkBluc의 생성
Jurkat E6 세포 내에 전장 OX-40 작제물 및 NF-κB 루시페라제 리포터 작제물을 안정하게 통합시킴으로써 Jurkat OX-40-NFkBluc 안정한 리포터 세포주를 생성하였다. 따라서, 전장 OX-40 MV1616 [pIRESneo3] (Clontech)을 형질감염시키고, OX-40을 발현하는 안정한 클론을 항생제 선택에 따라 생성하였다. 다음으로, NF-κB 루시페라제 리포터 작제물 pGL4.32 [luc2P/NF-κB-RE/Hygro] (Promega)를 최고의 OX-40 발현을 갖는 클론 중에서 형질감염시키고, OX-40 및 NF-κB 루시페라제 둘 모두를 발현하는 안정한 클론을 항생제 선택에 따라 선택하였다. 플레이트 결합된 CD3 항체 (클론 OKT-3) 및 PMA/이오노마이신에 의한 초기 활성화 후에 OX-40L에 반응하는 능력에 대해 클론을 선택하였다. 최고의 활성화 창을 나타낸 클론을 OX-40 리포터 검정에서 해동 및 사용 포맷으로서 사용하였다.
OX-40 리포터 검정
직접 OX-40 활성화 검정 및 교차결합에 의해 매개되는 OX-40 활성화 검정을 위하여, 96웰 플레이트 (Costar, 카탈로그 번호 3917)를 PBS 중 2 ㎍/ml 항-CD3 (OKT3)로 하룻밤 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBS로 세척하였다. Jurkat OX-40-NFkBluc를 해동시키고, 10% 열 불활성화 소태아 혈청을 함유하는 DMEM/F12 배지 (검정 배지)로 세척하였다. 세포를 5×105개 세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 25 μl의 세포 현탁액을 코팅된 96웰 검정 플레이트의 내부 웰 내로 플레이팅하였다. 시험 항체를 2.5배 aHuIgG-Fc (Bethyl, 카탈로그 번호 A80-104A) 항체와 조합하고, 연속 희석물을 제조하였다 (출발 농도 시험 IgG 20 ㎍/ml). 항체 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 50 μl의 항체 혼합물을 세포에 첨가한 후, 25 μl의 검정 배지를 첨가하였다. 각각의 플레이트에는 참조 대조군으로서의 역할을 하는 음성 대조 항체 (PG1337) 및 양성 대조 항체의 연속 희석물이 담겨 있었다. 플레이트를 95% 상대 습도에서 37℃, 5% CO에서 6시간 인큐베이션하였다. 50 μl의 루시페라제 (Promega, Bright-Glo™, 카탈로그 번호 E2610)를 첨가하고, BioTek Synergy 2 멀티-모드 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 루시페라제 활성의 양을 측정하였다.
OX-40 2가 항체의 패널을 OX-40 직접 활성화 리포터 검정에서 그리고 T 세포 활성화 검정에서 스크리닝하였다. 이중특이성 OX40×PD-L1 또는 OX40×PD-1 항체가 '시스' 또는 '트랜스'로 OX40을 활성화시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해 4개의 상이한 OX-40 Fab 아암을 선택하였다. 따라서, 이중특이성 항체는, PD-L1을 과발현하는 CHO 세포 및 Jurkat OX-40-NFkBluc를 사용하여 2-세포 시스템에서 시험하였다. PD-L1은 CHO 세포 상에서 '트랜스'로 제공되었고, PD-1은 활성화된 Jurkat OX-40-NFkBluc 리포터 세포 상에서 '시스'로 제공되었다. 제1 T 세포 활성화 신호를 제공하는 코팅된 항-CD3을 갖는 Jurkat OX-40-NFkBluc 검정에서와 동일한 검정 셋업을 사용하였다. 사용된 이펙터 표적 세포 비는 4:1이었으며, 이때 표적 세포는 CHO 야생형 또는 CHO-PD-L1 세포이다. 도 18은 PD-L1 (MF5561) 또는 PD-1 (MF6256) 차단 Fab 아암과 조합된 4개의 상이한 OX40 Fab 아암의 예를 나타낸다. OX40×PD-L1 항체는 CHO-PD-L1 세포의 존재 하에서, 이필루무맙에 기반한 항-CTLA4 항체와 동일한 수준으로 OX40 리포터 세포 활성을 유도하였다. 대조적으로, OX40×PD-1 항체는 기본적인 활성을 나타내었다. PD-L1을 발현하는 세포의 부재 하에서, OX40×PD-L1 항체의 활성은 기준선으로 돌아갔다.
실시예 7
실시예 4에서는, 5개의 CD137-특이적 Fab 아암이 그들의 T 세포 전사활성화 능력을 고려하여 바람직한 것으로 판정되었다.
본 실시예에서는, 3개의 후보 CD137 아암 (6763, 6785 및 6797) 및 1개의 PD-L1 아암 (7702)으로 이루어진 3개의 이중특이성 항체의 패널을 사용하였다. 이중특이성 항체를 293F Freestyle 세포에서 생성하고, protA, CIEX 및 겔 여과를 통해 정제하였다. 후속으로, 항체를 몇몇 검정에서 시험하였다. 4개의 Fab 아암을 모 2가 단일특이성 포맷 (항-CD137 또는 항-PD-L1) 및 이중특이성 포맷 (항-CD137×PD-L1) 둘 모두로 시험하고, 이들 항체를 벤치마크 항-CD137 항체 20H4.9, 벤치마크 항-PD-L1 항체 YW243.55.S70, 및 음성 대조 항체 (항-RSV 항체 PG2708)와 비교하였다.
본 실시예에 기재된 검정의 재료 및 방법에 대해서는, 실시예 4를 또한 참조한다.
항체를 하기에 열거한다.
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FACS 분석
항원 특이성 및 친화성
인간 (hu) 및 사이노몰거스 (cy) CD137에 대한 단일특이성 및 이중특이성 IgG의 결합을 huCD137 또는 cyCD137 중 어느 하나를 발현하는 293FF 안정한 세포 클론을 사용하여 FACS 분석에 의해 검증하였다. 이를 위하여, 세포를 8-단계 연속 적정의 항체와 함께 인큐베이션하고, 2차 항체인, 형광 염료 피코에리트린 (PE)에 결합된 항-인간 IgG의 후속 결합을 통해 결합 세기를 분석하였다. 시험된 각각의 항체에 대한 평균 PE 형광으로서 표현되는 결합 세기가 도 22에 나타나 있다. 단일특이성 모 항-CD137 항체들 중에서, PG6785가 최고의 친화도로 인간 CD137에 결합되었으며, 그 뒤를 PG6797이, 그리고 이어서 PG6763이 뒤따랐다. 이중특이성 PB17311 (6797×7702)이 최고의 친화도로 huCD137에 결합되었으며, 그 뒤를 PB17309 (6763×7702)가, 그리고 이어서 PB17310 (6785×7702)이 뒤따랐다. 모 항-CD137 항체들 중에서, PG6785가 다시 최고의 친화도로 사이노몰거스 CD137에 결합되었으며, 이번에도 그 뒤를 PG6797이, 그리고 이어서 PG6763이 뒤따랐다. 이중특이성 PB17311 (6797×7702)이 최고의 친화도로 cyCD137에 결합되었으며, 그 뒤를 PB17309 (6763×7702)가, 그리고 이어서 PB17310 (6785×7702)이 뒤따랐다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 3개의 CD137-특이적 Fab 아암이 이중특이성 1가 항체에 존재할 때, 이들은 huCD137 및 cyCD137 둘 모두에 마찬가지로 우수하게 결합할 수 있음이 주목되는데, 이는 또한 단일특이성 2가 모 항체에 대해 관찰된 바와 같다.
인간 (hu) 및 레서스 마카크 (re) PD-L1에 대한 단일특이성 및 이중특이성 IgG의 결합을 huPD-L1 또는 rePD-L1 중 어느 하나를 발현하는 CHO-K1 안정한 세포 클론을 사용하여 FACS 분석에 의해 검증하였다. 이를 위하여, 세포를 8-단계 연속 적정의 항체와 함께 인큐베이션하고, 2차 항체인 항-인간 IgG-PE의 후속 결합을 통해 결합 세기를 분석하였다. 시험된 각각의 항체에 대한 평균 형광 세기 (MFI)로서 표현되는 결합 세기가 도 23에 나타나 있다. 예상된 바와 같이, 모 항-CD137 항체는 인간 또는 레서스 마카크 PD-L1에 결합하지 않은 반면, 모 항-PD-L1 PG7702 항체는 결합하였다. 중요하게는, 3개의 모든 이중특이성 항체는 PD-L1에 강하게 결합하였으며, 이때 이들 모두는 양성 대조 항체보다 더 높은 친화도로 결합하였다. 이는, 1가 이중특이성 항체에 존재하는 경우에도, MF7702 아암은 2가 대조 항체 YW243.55.S70과 대비하여 PD-L1에 대해 더 높은 친화도를 가짐을 의미한다.
활성화된 T 세포에 대한 결합
활성화된 T 세포에 대한 항체 패널의 결합 친화도를 시험하였다. 이를 위하여, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 공여자로부터 수집하고, 하룻밤 그대로 정치시켰다. 후속으로, T 세포를 단리하고, 항-CD3 항체 OKT3로 코팅된 플레이트 상에서 3일 동안 이들을 인큐베이션함으로써 활성화시켰다. 활성화된 T 세포를 수집하고, 항체 패널 내의 IgG의 연속 적정으로 그리고 대조 IgG로 염색하였다. 항체 결합을 2차 항체인 항-인간 IgG-PE의 후속 결합을 통해 FACS 상에서 측정하였다. 시험된 각각의 항체에 대해 MFI로서 표현된 결합 세기는 도 24에 나타나 있는데, 이때 이중특이성 IgG의 결합은 좌측에, 그리고 단일특이성 IgG의 결합은 우측에 나타나 있다. PB17311 (6797×7702)이 가장 강력한 결합을 나타내었다. 중요하게는, 양성 대조 항체의 결합 친화도는 이중특이성 항체의 결합 친화도보다 더 낮았다. 이는, 본 발명의 이중특이성 항체가 PD-L1 특이적 벤치마크 항체 YW243.55.S70 (아테졸리주맙에 기반함) 및 CD137 특이적 벤치마크 항체 20H4.9 (이는 우렐루맙에 기반함)와 대비하여 활성화된 T 세포에 대해 더 높은 친화도를 가짐을 의미한다.
리간드-차단 검정
PD-1/PD-L1 경쟁 검정
PD-L1 리간드 결합을 차단하는 이중특이성 및 단일특이성 IgG의 능력을 PD-1/PD-L1 경쟁 ELISA에서 시험하였으며, 여기서는 항-PD-L1 아암을 함유하는 항체의 증가하는 양이 PD-1 Fc로 코팅된 플레이트에 결합할 수 있는 비오티닐화된 PD-L1의 양을 감소시킬 것으로 예상되었다. 이를 위하여, 1 ㎍/ml의 PD-1-Fc (R&D; #. 1086-PD)를 Maxisorp 플레이트에 코팅하고, 비오티닐화된 PD-L1 (BPS Bioscience; 카탈로그 번호 71105)을 10 ㎍/ml의 농도에서 출발하는 각각의 항체의 연속 희석물의 존재 또는 부재 하에서 용액으로 첨가하였다. 결합된 PD-L1을 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 스트렙타비딘의 후속 결합, 및 HRP가 촉매하여 착색된 생성물을 형성하는 무색 기질의 첨가를 통해 검출되었다. ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 측정된, 용액의 광학 밀도 (OD)는 결합된 PD-L1의 지표이다. 결합 곡선이 도 25에 나타나 있는데, 이때 이중특이성 IgG의 결합은 좌측에, 그리고 단일특이성 IgG의 결합은 우측에 나타나 있다. 예상된 바와 같이, 양성 대조 항-PD-L1 항체는 높은 수준의 차단 활성을 나타내었으며, 음성 대조 항체는 아무것도 나타내지 않았다. 단일특이성 항-CD137 항체는 또한 PD-L1 차단에 대해 음성이었다. 적어도 하나의 항-PD-L1 아암을 함유하는 IgG의 경우에는, 이들 모두가 PD-1/PD-L1 결합을 차단할 수 있었다. 모 단일특이성 항-PD-L1 항체 PG7702는 PD-L1과의 결합에 있어서 벤치마크 항-PD-L1 항체 YW243.55.S70만큼 효과적인 것으로 확인되었다. 이중특이성 IgG는 모두 유사한 수준의 우수한 차단 활성을 가졌다.
세포-기반 huCD137 리간드 차단 검정
CD137 리간드 결합을 차단하는 이중특이성 및 단일특이성 IgG의 능력을 또한 시험하였다. 3개의 후보 CD137 아암 (6763, 6785 및 6797) 및 PD-L1 아암 (7702)을 모 2가 단일특이성 포맷 (항-CD137 또는 항-PD-L1) 및 이중특이성 포맷 (항-CD137×PD-L1) 둘 모두로 시험하고, 이들 항체를 벤치마크 항-CD137 항체 20H4.9 및 PF-05082566, 및 음성 대조 항체 (항-RSV 항체 PG2708)와 비교하였다.
생리학적으로 관련된 조건 하에서 CD137 리간드 차단을 분석하기 위하여, 이중특이성 및 단일특이성 IgG를 유세포측정을 사용하여 세포-기반 huCD137 리간드 차단 검정에서 시험하였다. 이 검정에서는, 항-CD137 아암을 함유하는 항체의 증가하는 양이 huCD137을 안정하게 발현하는 CHO-K1 세포에 결합할 수 있는 huCD137L 재조합 단백질의 양을 감소시킬 것으로 예상되었다. 이를 위하여, CHO (huCD137) 세포를 각각의 항체의 연속 희석물과 함께 huCD137L 단백질과 동시-인큐베이션하였다. 결합된 huCD137L을 2차 비오틴-접합된 항-huCD137L 항체로 검출한 후, 피코에리트린 (PE)에 접합된 스트렙타비딘으로 염색하였다.
방법
huCD137을 안정하게 발현하는 CHO 세포를 수집하고, 계수하고, FACS 완충액 중에 5×105개 세포/ml로 희석시키고, 200 μl (1×105개의 세포를 함유함)를 U-바닥 96웰 미세적정 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 얼음 상에 유지하였다. 세포를 4℃에서 300 g로 3분 동안 회전시키고, 200 μl의 빙랭 FACS 완충액을 첨가함으로써 세척하였다. 세포를 4℃에서 300 g로 3분 동안 다시 회전시키고, 펠릿을 FACS 완충액 중 항체 희석물 (25 내지 0.034 ㎍/ml의 3배 연속 희석물) 25 μl + huCD137L-FLAG 단백질의 용액 (Adipogen # AG-40A-0198T; 최종 농도 0.06 ㎍/ml) 25 μl 중에 재현탁시켰다. 플레이트를 암실에서 얼음 상에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 200 μl의 빙랭 FACS 완충액을 첨가하고 4℃에서 300 g로 3분 동안 회전시킴으로써 세포를 2 회 세척하였다. 이어서, 빙랭 FACS 완충액 중에 1 ㎍/ml로 희석된 비오티닐화된 다중클론 염소 huCD137L 항체 (R&D Systems# BAF2295) 50 μl/웰을 첨가하였다. 세포를 재현탁시키고, 플레이트를 암실에서 얼음 상에서 60분 동안 인큐베이션한 후, 앞에서와 같이 2회 세척하였다. 이어서, 빙랭 FACS 완충액 중에 1:200으로 희석된 스트렙타비딘-PE 50 μl/웰을 첨가하였다. 세포를 재현탁시키고, 플레이트를 암실에서 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 앞에서와 같이 2회 세척하였다. 세포를 웰당 100 μl의 FACS 완충액 중에 재현탁시키고, 100 μl의 4% 파라포름알데하이드 (PFA) 용액을 첨가하여 고정시켰다. BD 매뉴얼의 설명서에 따라 BD FACSCanto 유세포측정기를 사용하여 샘플을 측정하였다. huCD137 리간드의 결합 정도는 결합된 스트렙타비딘-PE의 평균 형광 세기 (MFI)로서 표현되었다.
결과
얻어진 결합 곡선이 도 26에 나타나 있다. 예상된 바와 같이, 음성 대조군은 CD137 리간드 결합을 차단하지 않았다. 양성 대조 항체에 의한 리간드 결합의 차단은 다음과 같이 상이하였다: 벤치마크 항체 PF-05082566은 강한 차단을 나타내었지만, 20H4.9는 비교적 약하고 불완전한 차단을 나타내었다. 3개의 단일특이성 항-CD137 항체들 중, PG6785는 최상의 차단제였으며, PG6797 (PB17311의 모)은 두 번째로 최상이었다. 3개의 상응하는 이중특이성 항-CD137 × 항-PD-L1 항체는 또한 CD137 리간드 결합을 차단할 수 있었다. 이는 세포-기반 검정이기 때문에, 이들 결과는 생리학적으로 관련된 조건을 표시한다.
PD-1/PD-L1 리포터 검정
후보 항-CD137×PD-L1 항체의 특성화에서의 다른 단계는 이들이 PD-1/PD-L1 경로를 차단할 수 있는지의 여부를 결정하는 것과, 이것을 PD-L1에 특이적인 대조 항체의 활성과 비교하는 것이었다. 이러한 차단 활성은 다음과 같은 2-세포 시스템에 기반하여 Promega에 의해 개발된 생리학적으로 관련된 PD-1/PD-L1 차단 리포터 검정에서 시험관내에서 시험하였다: PD-L1 및 T-세포 수용체 활성화 인자를 발현하는 CHO 세포, 및 PD-1을 과발현하는 Jurkat/NFAT-RE 리포터 세포주. Jurkat T 세포는 NFAT (활성화된 T-세포의 핵 인자) 경로를 통해 활성화될 수 있는 루시페라제 리포터 유전자를 함유한다. PD-1과 PD-L1의 상호작용은 이러한 경로의 활성화를 억제한다. 그러나, PD-1 또는 PD-L1에 대한 항체와의 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단은 NFAT 경로를 활성화시킬 수 있다. 따라서, PD-1/PD-L1 차단의 정도가 클수록, 루시페라제 리포터 유전자의 활성화는 커진다. 이를 위하여, 각각의 항체의 연속 희석물을 PD-L1-발현 CHO 세포에 첨가한 후, PD-1을 과발현하는 Jurkat/NFAT-RE 리포터 세포를 첨가하였다. 리포터 유전자의 유도 배수로서 표현된 24시간 후의 차단의 정도가 도 27에 나타나 있는데, 이때 이중특이성 IgG의 결합은 좌측에, 그리고 단일특이성 항-PD-L1 IgG의 결합은 우측에 나타나 있다. 역시, 2가 모 항체 7702는 양성 대조 벤치마크 항체 YW243.55.S70보다 더 강력하였다. 이중특이성 IgG는 모두 유사한 수준의 우수한 차단 활성을 가졌다.
실시예 8
CD137×PD-L1 이중특이체에 의한 CD137의 전사활성화에 대한 PD-L1 발현 수준의 효과
세포주의 배양
MDA-MB231 세포 (카탈로그 번호 CRM-HTB-26)를 ATCC로부터 구매하고, 100 mM 소듐 피루베이트 (Gibco), MEM 비필수 아미노산 (Gibco) 및 10% FBS (Lonza)가 보충된 DMEM 고 글루코스 (Gibco) 중에 일상적으로 유지하였다. BxPC-3 세포 (카탈로그 번호 CRL-1687)를 ATCC로부터 입수하고, 10% FBS (Lonza)가 보충된 RPMI-1640 (Gibco) 중에 일상적으로 유지하였다.
CD137×PD-L1 항체의 작용 모드
Jurkat CD137-luc 리포터 전사활성화 검정을 사용하여, CD137×PD-L1 항체-매개 전사활성화가 생리학적 PD-L1 발현 수준에서 일어날 것인지 여부 및 그것이 PD-L1 발현 수준과 상관되는지 여부를 결정하였다. 따라서, 다양한 CHO-PD-L1 세포주 및 인간 종양 세포주 상의 PD-L1 결합 부위의 수를 QIFIKIT 분석 (DAKO)에 의해 결정하였다. 하기의 인간 종양 세포주에 상응하는 PD-L1 발현 수준을 나타내는 3개의 CHO-PD-L1 세포주를 선택하였다: 비교적 높은 (ES-2 세포), 중간 (MDA-MB231) 또는 낮은 (BxPC-3) 수준의 PD-L1을 발현하는 인간 종양 세포주. 도 28a는 세포당 약 6,000 내지 약 72,000개의 PD-L1 결합 부위를 발현하는 3개의 선택된 CHO 세포주의 사용에 있어서의 3개의 CD137×PD-L1 이중특이성 항체의 예를 나타낸다. 이 데이터는 3.8 104개 초과의 PD-L1 카피가 세포 상에 존재할 때 CD137×PD-L1 이중특이성 항체가 높은 활성화를 나타냄을 보여준다. 낮은 PD-L1 수준에서는, 세포당 단지 약 6000개의 PD-L1 결합 부위를 발현하는 CHO 세포의 존재 하에서 낮은 수준의 활성화가 관찰된다. 따라서, CD137×PD-L1 이중특이성 항체에 의한 전사활성화는 면역억제 종양 미세환경에서 발생하는 것과 같이 고수준의 PD-L1을 발현하는 세포 부근에서 일어날 것이며, 이에 따라 CD137×PD-L1 이중특이성 항체에 대한 최적의 치료적 창을 제공할 것이다.
도 28a는 시험된 모든 항체에 대한 CHO 세포 상에서의 PD-L1 발현 수준과 CD137×PD-L1 이중특이성 항체-매개 NF-kB 활성화 사이의 양의 상관관계를 나타낸다.
도 28b는 Jurkat CD137-luc 리포터 전사활성화 검정의 예를 나타내는데, 여기서는 CHO-PD-L1 세포를 높은, 중간 그리고 낮은 표면 PD-L1 수준을 발현하는 인간 종양 세포주 대신 사용하였다. 이 실험은, CD137×PD-L1 이중특이성 항체-매개 전사활성화가 보조 세포 PD-L1 발현 수준과 관련되어 있고, CD137×PD-L1 이중특이성 항체가 고수준의 PD-L1을 발현하는 종양 세포의 존재 하에서 전사활성화가 가능하다는 것을 확인시켜 주었다.
다음으로, PD-L1 발현 보조 세포의 존재 하에서의 CD137 전사활성화가 CD137×PD-L1 이중특이성 항체의 특이적 형질인지의 여부를 평가하였다. 도 28c는, PD-L1 발현 보조 세포의 존재 하에서의 Jurkat CD137-luc 리포터 세포 전사활성화를 CD137×PD-L1 이중특이성 항체, 이들의 모 단일특이성 2가 (CD137xCD137) 및 모 단일특이성 1가 CD137 (CD137×TT) 및 PD-L1 (TT×PD-L1) 항체에 대해 평가한 예를 나타낸다. 모든 IgG를 10 ㎍/ml로 시험하였다. 이 데이터는 PD-L1 발현 CHO 또는 ES-2 세포의 존재 하에서 단지 CD137×PD-L1 이중특이성 항체만이 전사활성화를 매개하였음을 보여준다. 예상된 바와 같이, 참조 대조 항체 20H4.9는 Jurkat CD137-luc 리포터 세포를 직접 활성화하였고, 보조 세포에 의한 PD-L1 발현과는 독립적이었다.
실시예 9
CHO-PD-L1 × T 세포 전사활성화 검정
이중특이성 IgG 사용의 부가 가치를 결정하기 위하여, 전사활성화 검정에서 T 세포에 의한 사이토카인 방출을 유도하는 수 개의 이중특이성 항-CD137×PD-L1 항체의 능력을 평가하고, 그들의 활성화를 PD-L1에 대한 벤치마크 2가 항체 (YW243.55.S70) 및 CD137에 대한 벤치마크 2가 항체 (20H4.9)의 활성화와 비교하였다. 이들 벤치마크 항체를 단독으로 그리고 등몰 조합으로 시험하였다. 이를 위하여, 단일 건강한 공여자로부터의 정제 및 활성화된 T 세포를 CHO-PD-L1 세포 및 연속 적정의 시험 항체와 함께 3일 동안 동시-인큐베이션하였다 (이 검정에 대한 상세한 설명에 대해서는 실시예 4를 또한 참조한다). 후속으로, IL-2, IFNγ 및 TNFα의 수준을 미희석 배양 상층액에서 측정하였다. 이러한 전사활성화 검정에서 측정된 사이토카인 방출의 정도가 도 29에 나타나 있다. 도 29에 나타낸 바와 같이, 3개의 모든 이중특이성 항체는 참조 항체들 중 어느 것보다도 사이토카인 방출을 유도하는 데 있어서 더 강력하였다. 중요하게는, 3개의 이중특이성 항체 각각은 또한 2개의 참조 항체의 병용물보다 사이토카인 방출을 유도하는 데 있어서 더 강력하였는데, 이는, 그들의 월등한 T 세포 활성화 특성을 입증한다.
T 세포 전사활성화 검정 동안의 사이토카인 방출
이중특이성 IgG 사용의 부가 가치를 결정하기 위하여, 전사활성화 검정에서 T 세포에 의한 사이토카인 방출을 활성화시키는 그들의 능력의 관점에서, 이중특이성 항체들 중 하나 (PB17311; 6797 × 7702)를 그의 모 단일특이성 2가 항체 IgG들의 혼합물 및 PD-L1 및 CD137에 대한 벤치마크 2가 항체들과 비교하였다. 이들 벤치마크 항체는 다음과 같이 임상에서 사용되는 치료적 항체에 기반한다: 항-PD-L1 클론 YW243.55.S70은 아테졸루주맙에 기반하며, 항-CD137 클론 20H4.9는 우렐루맙에 기반하며, 항-CD137 클론 PF-05082566은 우토밀루맙에 기반한다. 이들 벤치마크 항체를 단독으로 그리고 등몰 조합으로 시험하였다.
이들 실험에서는, 항체를 20 ㎍/ml에서 출발하여 6-단계 10배 적정으로 시험하였다. 2명의 공여자로부터의 PBMC를 해동시키고, 9 부피의 배양 배지 (L-글루타민 및 10% 열 불활성화 FBS를 함유하는 RPMI1640)를 첨가하였다. 세포를 150 g로 실온에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 10 ml의 배양 배지 중에 재현탁시키고, 세포를 95% 상대 습도에서 37℃, 5% CO에서 50 ml 팔콘 튜브 내에서 하룻밤 인큐베이션함으로써 정치되게 하였다. 전사활성화 검정을 위한 준비에서, 96웰 플레이트 (Cellstar, 카탈로그 번호 655180)의 내부 웰을 PBS 중 항-CD3 항체 (클론 OKT3) 5 ㎍/mL로 하룻밤 코팅하였다.
다음날, 제조자 (Stem Cell Technologies 카탈로그 번호 19051)에 의해 기재된 바와 같은 Easy Sep T 세포 농축 (pan CD3) 정제 절차를 사용하여 T 림프구를 단리하였다. EasySep 절차는 음성 선택을 사용한다. 간략하게 말하면, PBMC를 150 g로 실온에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 1 mM EDTA를 함유하는 PBS + 2% FBS 2 ml 중에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 30 μm 메시 나일론 스트레이너를 통해 여과하였다. 세포를 계수하고, 1 mM EDTA를 함유하는 PBS + 2% FBS 중에서 5×107개 세포/ml로 재조정하였다. 50 μl의 EasySep 인간 T 세포 풍부화 칵테일을 매 2 ml 세포 부피마다 첨가하고, 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션되게 하였다. 다음으로, 50 μl의 EasySep D 자성 입자를 매 2 ml 세포 부피마다 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션되게 하였다. 총 부피는 1 mM EDTA를 함유하는 PBS + 2% FBS에 의해 2.5 ml로 되었다. 다음으로, 튜브를 자석 내에 넣어서, 원치 않는 세포 분획이 실온에서 5분 동안 자석에 결합되게 하였다. 다음으로, 튜브를 뒤집고, 정제된 T 세포 분획을 새로운 튜브에 붓고, 세포를 실온에서 150 g로 10분 원심분리함으로써 수집하고, 후속으로 배양 배지 중에 106개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다.
같은 날에, 사전-코팅된 96웰 플레이트를 PBS로 세척하고, 25 μl의 사전희석된 항체를 첨가한 후, 50 μl의 정제된 T 세포 (50,000개 세포/웰) 및 25 μl의 CHO-PD-L1 세포 (30,000개 세포/웰)를 첨가하였다. 세포를 370℃에서 72시간 동안 인큐베이션되게 하였다. 이어서, 상층액을 수집하고, 새로 시험하거나 -80℃에서 저장하였다. 제조자의 설명서에 따라 루미넥스 멀티플렉스 검정에 의해 미희석 배양 상층액에서 사이토카인의 수준을 측정하였다. 결과를 eBioscience 분석 소프트웨어에 의해 분석하였다.
16개의 사이토카인의 하위세트에 대해, 전사활성화 검정에서 PB17311에 의해 유도된 수준은 단독으로의 벤치마크 항-CD137 항체 20H4.9에 의해 또는 벤치마크 항-PD-L1 항체 YW243.55.S70과의 병용물에 의해 유도된 수준보다 높았다 (도 30 참조). 이 하위세트는 GM-CSF, IL-2, IL-13, IFNγ, TNFβ, IL-17A, TNFα, IL-18, IL-1α, IL-22, IL-4, IL-31, IL-6, IL-5, IL-21 및 IL-9로 구성되었다. PB17311에 의해 유도된 사이토카인 수준의 최대 증가는 GM-CSF, IL-2, IL-13, IL-17A, IFNγ, TNF-α, TNF-β, IL-18, IL-22, 및 IL-4에 대해 관찰되었다. IL-1β, IL-1RA, IL-7, IL-10, IL-12p70, IL-15, IL-23, 또는 IL-27에 대해서는 주목할 만한 항체-매개 사이토카인 방출이 관찰되지 않았다. 세포들이 단독으로의 항-PD-L1 항체 YW243.55.S70 또는 항-CD137 항체 PF-05082566과 함께, 또는 모 6797 (CD137) 또는 PD-L1 (7702) 2가 항체와 함께 인큐베이션될 때 사이토카인 방출의 증가는 관찰되지 않았다.
결론적으로, 이 실험은 이중특이성 항체 PB17311이 단독으로의 벤치마크 항-CD137 항체 20H4.9, 또는 벤치마크 항-PD-L1 항체 YW243.55.S70과의 병용물과 대비하여 개선된 T 세포 활성화 능력을 갖는다는 것을 보여준다.
PB17311의 중요한 이점은 이러한 이중특이성 항체가 2개의 벤치마크 항체의 혼합물보다 T 세포를 활성화시키는 데 있어서 더 강력하다는 점이다.
실시예 10
SEB 검정
3개의 CD137×PD-L1 이중특이성 항체 PB17309, PB17310 및 PB17311을 추가로 특성화하기 위하여, 포도상구균 장독소 B (SEB)의 존재 하에서 PBMC에 의한 사이토카인 방출을 향상시키는 그들의 능력을 결정하였다. 이를 위하여, 3명의 공여자로부터의 정제된 PBMC를 SEB (2000 또는 125 ng/ml) 및 3개의 후보 이중특이성 항체 또는 대조 항체의 연속 희석물의 존재 하에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 이 실험에서 참조 대조 항체는 이 검정에서 강력한 사이토카인 방출을 유도하는 것으로 밝혀진 항-CTLA4 항체 10D1이었다.
사이토카인 수준을 루미넥스 멀티플렉스 검정에 의해 배양 상층액에서 측정하였다. 2개의 상이한 SEB 농도에서 3명의 상이한 공여자로부터의 PBMC에 의한 IL-2 방출의 결과가 도 31에 나타나 있다. 이러한 비교는 3개의 모든 2가 CD137×PD-L1 항체의 활성 프로파일이 3명의 공여자 사이에서 일관되었음을 입증한다. 이들은 또한 PB17309 및 PB17311이 이중특이성 항체들 중 가장 효과적이었음을 보여준다. 3개의 모든 PB17309 (6763x7702), PB17310 (6785×7702) 및 PB17311 (6797×7702)은 양성 대조 항체보다 더 강력하였다. 2000 ng/ml의 SEB 농도에서 단일 공여자로부터의 PBMC (번호 1038)에 의해 방출된 IL-2, IFNγ 및 TNFα의 수준에 대한 결과가 도 32에 나타나 있으며, 여기서는 CD137×PD-L1 이중특이성 항체에 의해 유도된 사이토카인 방출을 단독으로의 또는 등몰 혼합물로의 CD137 (20H4.9) 또는 PD-L1 (YW243.55.S70)에 대한 벤치마크 2가 항체에 의해 유도된 것과 비교하였다. 이러한 비교는 CD137×PD-L1 이중특이성 항체가 각각의 벤치마크 2가 항체보다 PBMC를 활성화시키는 데 있어서 명백히 더 효율적임을 입증한다. 중요하게는, 각각의 CD137×PD-L1 이중특이성 항체는 또한 YW243.55.S70과 20H4.9의 혼합물보다 PBMC를 활성화시키는 데 있어서 더 효율적이었는데, 이 역시, 이중특이성 분자의 인 트랜스 활성화를 제공할 수 있는 PD-L1을 발현하는 세포의 존재 하에서 이들 이중특이성 항체의 월등한 T 세포 활성화 특성을 입증한다.
실시예 11
항-CD3/CD28-자극된 PBMC의 M2 대식세포-매개 억제에 대한 PB17309, PB17310 및 PB17311의 효과
고전적으로 활성화된 대식세포 (M1 대식세포)는 발암의 초기 단계 동안 종양을 사멸시킬 수 있다. 그러나, 초기 형질전환으로부터 진행된 종양 단계로의 전이 동안, 종양 미세환경의 동적 변화는 M1 대식세포에서 M2 대식세포로의 스위치를 점진적으로 구동한다. 종양-관련 M2 대식세포는 면역억제 사이토카인을 분비하고 PD-1에 대한 연결에 의해 면역 억제를 유도한다. 이와 같이, M2 대식세포는 T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 억제한다.
Aquila Biomedical에 의해 개발된 M2 대식세포 억제 검정은 항-PD-1 항체가 T 세포 증식에 대한 M2 대식세포의 억제 효과를 부분적으로 역전시킬 수 있음을 입증하는 데 사용되어 왔다. 이 검정을 사용하여, M2 대식세포의 재분극에 대한 PB17309, PB17310 및 PB17311의 효과를 시험하고 (이때, 판독으로서 IFN-γ 발현을 사용함), 그것을 음성 동종형 대조군 (항-RSV-G 항체 PG2708) 및 2개의 참조 항체 (항-CD137 벤치마크 항체 20H4.9 및 항-PD-L1 벤치마크 항체 YW243.55.570)에 의해 매개되는 효과와 비교하였다.
M2 억제 검정
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 5명의 건강한 지원자로부터 수집된 신선한 혈액으로부터 단리하였다. 자기 세포 분류(magnetic cell sorting)를 사용하여 (CD16 고갈 없이) 음성 선택에 의해 단핵구를 단리하였다. 또한, 5명의 공여자 각각으로부터의 PBMC의 하위세트를 추후에 PBMC/M2 공동배양을 위한 검정에서 사용하기 위해 동결보존하였다. 단리된 단핵구를 RPMI-10 (RPMI-1640, 10% 열 불활성화 FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민, 50 μM β-메르캅토에탄올) 중 M-CSF (50 ng/mL)와 함께 96웰 둥근바닥 플레이트 내에서 8일 동안 배양함으로써 M2 대식세포를 생성하였다. 배양 기간 동안, 세포에 일수 3 및 일수 6에서 M-CSF가 보충된 신선한 RPMI-10을 보충하였다. 일수 8에서, 배지를 제거하고, 신선한 배지 (M-CSF를 함유하지 않음)를 첨가하고, 세포를 LPS (0.1 ㎍/mL)로 2시간 동안 활성화시켰다. 이어서, 대식세포를 세척하여 LPS를 제거하고, 신선한 배지 (M-CSF를 함유하지 않음)를 보충하였다. M2 대식세포를 시험 항체 또는 동종형 대조군 (10 ㎍/ml)의 존재 또는 부재 하에서 자가 PBMC (해동되고 세척됨)와 4:1의 비 (PBMC:M2)로 3회 반복하여 공동배양하였다. 24시간의 크로스-토크(cross-talk) 후에, 배양물을 항-CD3 (1 ㎍/mL) 및 항-CD28 (2 ㎍/mL)로 3일 동안 자극하여 TCR 수용체 복합체를 통해 T 세포를 활성화시켰다. 이어서, ELISA에 의해 배양 상층액에서 IFN-γ를 측정하였는데, 이때, 상층액을 적절한 ELISA 희석제 중에 1:10 또는 1:20으로 희석시켜 키트의 검출 범위 내의 값이 되도록 하였다. (대조군과 다수의 군 사이의 비교를 위한) 사후 던넷(post-hoc Dunnett) 다중 비교 검정 또는 (모든 군들 사이의 비교를 위한) 홀름-시닥(Holm-Sidak) 다중 비교 검정과 함께 다중 비교를 위한 비 쌍별 t-검정(ratio paired t-test) 또는 일원분산분석(one way-ANOVA)을 사용하여 시험 물질과 적절한 대조군 사이의 통계학적 분석을 행하였다. P < 0.05일 때 통계학적 유의성이 있는 것으로 가정하였다.
결과
결과가 도 33에 나타나 있으며, 데이터는 PBMC의 항-CD3/CD28 자극 후에 ELISA에 의해 검출된 3회 반복시험의 IFN-γ의 평균 수준으로서 제시되어 있다. 이들 결과로부터, M2 대식세포의 부재 하에서 배양된 PBMC는 CD3 및 CD28에 의한 자극 후에 더 높은 수준의 IFN-γ를 생성하였음이 명백하다 ("PBMC 단독"을 "비자극" 조건과 비교함; *는 P < 0.05를 나타냄). 상이한 공여자들에 대해 얻어진 결과의 불균일성에도 불구하고, 3개의 모든 이중특이성 항체가 M2:PBMC 공동배양물 중에서 IFN-γ의 생성을 증가시킨 것으로 결론내렸다. 통계학적으로 유의하지는 않지만, PB17309 및 PB17310은 PG2708 동종형 대조군으로 처리된 것과 대비하여 증가된 IFN-γ 생성의 경향을 나타낸다. 중요하게는, PB17311의 첨가는 PG2708 동종형 대조군으로 처리된 것과 대비하여 M2:PBMC 공동배양물 중에서 IFN-γ의 생성을 유의하게 증가시켰다 (**는 P < 0.01을 나타냄). PB17309 및 PB17310에 의해 얻어진 결과는 항-CD137 벤치마크 항체 20H4.9 및 항-PD-L1 벤치마크 항체 YW243.55.570에 의해 얻어진 결과와 비견된다. PB17309 및 PB17310에 의해 얻어진 결과는 또한 두 참조 항체의 병용물에 의해 얻어진 결과와 비견된다.
실시예 12
미감작 인간 CD8+ T 세포 프라이밍에 대한 PB17311의 효과
본 발명에 따른 CD137 × PD-L1 이중특이성 항체는 T 세포 상의 CD137과 보조 세포 상의 PD-L1을 가교시킴으로써 T 세포의 활성화를 유도한다. 이는 CD137 신호전달을 가져오고 PD-1/PD-L1 경로를 차단함으로써 항원-의존성 TCR 활성화를 향상시키는 것으로 여겨진다. PD-L1 발현 종양의 존재 하에서, 본 발명에 따른 CD137 × PD-L1 이중특이성 항체는 본 실시예에 나타낸 바와 같이 항원-특이적 T 세포의 (재)활성화를 용이하게 한다. 이는 CD137 공동자극이 T 세포의 증폭, 사이토카인 생성 및 생존을 가능하게 하는 것으로 알려져 있다는 사실과 일치한다 (문헌[Bertram et al 2004]). 그러나, 본 발명자들은 또한 본 발명에 따른 CD137 × PD-L1 이중특이성 항체가 종양 신생항원에 대한 드 노보(de novo) 유효 T 세포 반응을 촉진한다는 것을 입증하고 싶었다. 마우스 감염 모델에서 미감작 CD8+ T 세포의 프라이밍은 CD137 공동자극이 중추 기억 및 이펙터 T 세포 집단의 형성을 촉진함을 보여주었다 (문헌[Zhao et al 2012]). 따라서, 미감작 인간 CD8+ T 세포의 프라이밍에 대한 본 발명의 이중특이성 항체들 중 하나 (PB17311; 6797 × 7702)에 의해 매개되는 효과를 평가하였다.
적은 수의 미감작 T 세포 전구체 세포로 인해, 인간 T 세포의 항원-특이적 프라이밍은 평가하기가 어렵다. 그러나, 흑색종에서 과발현되는 항원 ― 종양-관련 항원 Melan-A - 은 인간 T 세포에서 미감작 T-세포 반응을 평가하기에 특히 적합한 것으로 확인되었다. 이는, 이러한 HLA-A0201-제한 Melan-A 27-35 펩티드 에피토프에 특이적인 T 세포의 수준이 다른 자기- 또는 종양-관련 항원에 대한 T 세포의 수준보다 약 10배 더 높기 때문이며; 에피토프는 1000개의 미감작 T 세포에서 약 1개만큼 인식된다. 이러한 에피토프에 기초하여, 문헌
Figure pct00043
은 CD8+ T 세포에 대한 프라이밍 조건을 신뢰성 있게 평가하는 시험관내 프라이밍 시스템을 개발하였다. 이 방법은 인간 CD8 T 세포의 항원-특이적 활성화 및 프라이밍, 또는 ASAP-T8로서 알려져 있다. ASAP-T8 검정에서는, 단리된 미감작 CD8+ T 세포를 10일 동안 펩티드 항원-로딩된 자가 단핵구-유래 수지상 세포와 공동배양한 후, 항원-특이적 T 세포의 정량적 및 정성적 분석을 행한다.
본 실시예에서는, 2명의 독립적인 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC; 번호 1064 및 1066)를 사용하여 문헌
Figure pct00044
에 기재된 상세한 방법에 따라 ASAP-T8 검정을 수행하였다. 이 검정에서 시험된 항체 및 대조군은 항-CD137×PD-L1 항체 PB17311, 항-CD137 벤치마크 항체 20H4.9, 항-PD-L1 벤치마크 항체 YW243.55.570, 두 벤치마크 항체의 등몰 혼합물 및 음성 대조 항-RSV-G 항체 PG2708이었다. 시험 항체를 DC:T 세포 배양의 시작부터 그리고 다시 제1 공급 동안에 첨가하였다.
단핵구-유래 성숙 수지상 세포 (mDC)의 생성
문헌
Figure pct00045
에 기재된 바와 같은 상세한 방법에 따른 프로토콜을 사용하여 단핵구-유래 성숙 수지상 세포를 생성하였다. 이를 위하여, ASAP-T8 검정의 시작 4일 전에, HLA-A2+ 공여자로부터의 PBMC를 해동시키고, 실온에서 5분 동안 300 g로 회전시키고, 배양 배지 (CellGro 수지상 세포 배지 (CellGenix, 카탈로그 번호 2005) + 1% 인간 혈청) 중에 1×107/ml로 재현탁시켰다. 이어서, 2 ml의 이 세포 현탁액을 6웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃에서 2 내지 3시간 인큐베이션하여 플라스틱에 부착되게 한 후에, 배지를 제거하고, PBS에 의한 세척을 통해 비부착성 세포를 제거하였다. 10 ng/ml의 IL-4 및 1600 IU/ml의 GM-CSF가 보충된 3 ml의 가온된 배양 배지를 각각의 웰에 첨가한 후, 37℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. IL-4 및 GM-CSF가 보충된 1.5 ml의 신선한 배양 배지를 추가로 첨가한 후, 세포를 추가 24시간 동안 인큐베이션하였다.
이어서, 3 ml의 상층액을 제거하여 미성숙 DC를 수집한 후에, 남아 있는 배지 중에 세포를 격렬하게 재현탁시키고, 빙랭 PBS로 세척하여 임의의 남아 있는 세포를 제거하였다. 세포를 풀링하고, 계수하고, 실온에서 5분 동안 300 g로 회전시켰다. GM-CSF (800 IU/ml), IL-4 (10 ng/ml), LPS (10 ng/ml) 및 IFNγ (100 IU/ml)가 보충된, 사전가온된 배양 배지 중에 1×106개 세포/ml로 펠릿을 재현탁시켰다. 2 ml의 세포 현탁액 (2Х106개의 세포)을 새로운 6웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. DMSO 중에 5 ㎍/μl로 용해된 Melan-A 항원 펩티드 (JPT, 카탈로그 번호 SP-MHCI-0006)를 2.5 ㎍/ml로 적절한 웰에 첨가하고, 세포를 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.
DC 모폴로지에 대한 검사 후에, 피펫에 의한 격렬한 재현탁을 통해 mDC를 수집하고, 빙랭 PBS로 빈 웰을 플러싱(flushing)하여 모든 부착성 세포의 제거를 보장하였다. 펩티드로 플러싱된 mDC와 그렇지 않은 것들을 개별적으로 풀링하고, 살아있는 세포를 계수하였다. mDC를 갖는 튜브를 항상 얼음 상에 유지하고, 30 Gy (3000 Rad)로 조사하여, 후속으로의 세포의 연장된 공동배양 동안 오염 세포의 잠재적인 증식을 방지하였다. 이어서, 세포를 실온에서 5분 동안 300 g로 회전시키고, 5×105개 세포/ml로 CellGro DC 배지 + 5% 인간 혈청 (HS) 중에 재현탁시켰다.
미감작 CD8 T 세포의 생성
ASAP-T8 검정을 시작하기 1일 전에, mDC를 생성하는 데 사용된 것과 동일한 HLA-A2+ 공여자로부터의 PBMC를 해동시키고, 실온에서 5분 동안 300 g로 회전시키고, 5x107개 세포/ml로 차가운 PBS/HS/EDTA 완충액 (2% HS 및 1 mM EDTA를 함유하는 PBS) 중에 재현탁시켰다. 세포를 EasySEP 인간 미감작 CD8+ T 세포 단리 키트 (STEMCELL, 카탈로그 번호 19258)를 사용하여 미감작 CD8 T 세포 단리에 사용하였다.
세포 샘플 ml당, 50 μl의 EasySep 단리 칵테일을 첨가한 후, 실온에서 10분 동안 혼합 및 인큐베이션하였다. 이어서, EasySep 자성 입자를 30초 동안 와동시키고, 샘플 ml당 100 μl의 입자를 첨가하여, 제거를 위한 원치 않는 세포를 표적화하였다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 세포 현탁액을 EasySep 완충액의 첨가에 의해 2.5 ml의 총 부피가 되도록 하고, 온화한 피펫팅에 의해 세포를 혼합한 후, 5 ml 팔콘 튜브에 옮겼다. 캡을 제거하고, 튜브를 EasySep 자석 내에 넣었다. 실온에서 5분 후에, 자석 및 튜브를 1회 연속 동작으로 도치시킴으로써, 원하는 분획을 새로운 5 ml 팔콘 튜브 내로 부어서, 원래의 튜브 내부에 결합된 자기적으로 표지된 원치 않는 세포를 남겼다. 자석 및 튜브를 3초 동안 도치된 자세로 둔 후, 직립 자세로 복귀시켜, 튜브의 입구로부터 매달린 채로 남아 있는 임의의 방울을 남겼다. 원치 않는 세포를 갖는 오래된 튜브를 자석으로부터 제거하고, 음성적으로 풍부화된 세포 분획을 갖는 새로운 튜브를 두 번째 분리를 위해 자석 내에 넣었다. 실온에서 5분 후에, 원하는 분획을 동일한 방식으로 부었다.
음성적으로 선택된 풍부화된 세포를 계수하고, 이어서 실온에서 5분 동안 300 g로 회전시키고, 5% HS가 보충되고 5 ng/ml의 IL-7을 함유하는 CellGro DC 배양 배지 중에 3×106개 세포/ml의 최종 세포 농도로 재현탁시켜 최적의 T 세포 프라이밍을 가능하게 하였다. 세포를 2 ml/웰로 6웰 플레이트에 옮기고 하룻밤 인큐베이션하였다.
ASAP-T8 검정
문헌
Figure pct00046
에 기재된 바와 같은 상세한 방법에 따라, 이 검정을 각각의 공여자에 대해 3회 반복하여 수행하였다. IL-7과 함께 사전-인큐베이션된 T 세포를 수집하고, 풀링하고, 계수하고, 이어서 실온에서 5분 동안 300 g로 회전시켰다. 펠릿을 2×106개 세포/ml로 배양 배지 중에 재현탁시키고, IL-21을 60 ng/ml로 첨가하여 CD8+ T 세포 프라이밍을 향상시켰다. 펩티드-펄싱된 mDC 또는 비-펄싱된 DC를 T 세포와 1:1 v/v 비로 혼합하여, 4:1 T 세포:DC 비 및 30 ng/ml의 최종 IL-21 농도가 되도록 함으로써 2개의 DC/T 세포 혼합물을 제조하였다. 시험 항체를 10 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 이어서, 500 μl의 각각의 세포 혼합물을 48웰 플레이트의 개별 웰에 옮겼다.
세포를 총 10일 동안 37℃에서 공동배양하였으며, 이는 2회의 공급 단계 및 신선한 플레이트로의 전달을 수반하였다. 20 ㎍/ml의 시험 항체 (최종 IgG 농도 10 ㎍/ml)의 존재 또는 부재 하에서 5% HS 및 10 ng/ml의 IL-15 및 10 ng/ml의 IL-7 (사이토카인의 최종 농도 5 ng/ml)을 함유하는 추가의 500 μl의 가온된 배양 배지와 함께 72시간 후에 세포를 먼저 공급하고, 48시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 더 많은 증폭 공간을 허용하고 DC 조제물로부터의 잔류 (플라스틱-부착성) 골수계 세포의 수를 감소시키기 위하여, 세포 및 배지를 24웰 플레이트 내의 신선한 웰로 옮겼는데, 여기에는 5% HS 및 10 ng/ml의 IL-15 및 IL-7을 함유하는 1 ml의 배지가 이미 첨가되어 있었다. 추가 120시간의 인큐베이션 후에, 세포를 분석할 준비가 되었다.
공동배양의 일수 10에서, 개별 웰로부터 세포를 수집하고 계수하여 웰당 절대 세포 카운트를 결정하였다. 이어서, T 세포를 형광-표지된 Melan-A-특이적 덱스트라머 (Immudex, 카탈로그 번호 WB2162-APC)로 염색하였다. 이 덱스트라머에서, 덱스트란 중합체 골격은 10개 초과의 MHC-펩티드 복합체 및 형광색소 분자 (알로피코시아닌)를 보유하며, 이로써 FACS 분석에 의한 Melan-A-펩티드-특이적 CD8+ T 세포의 검출을 가능하게 한다. 또한, 세포를 특정 T 세포 하위세트 상의 마커에 대한 다른 항체로 염색하였다. 이를 위하여, 개별 웰로부터 유래된 세포를 50,000개 세포/웰로 96웰 FACS 플레이트의 웰에 옮겼다. 세포를 300 g로 5분 동안 회전시키고, 상층액을 제거한 후, 40 μl의 덱스트라머 (PBS + 5% FBS 중 1:50 희석물)를 첨가하고, 암실에서 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, CD8, CD45RA 및 CCR7에 특이적인 추가의 항체 (5배 농축됨)를 10 μl의 FACS 완충액 중에 첨가하였다. 세포를 암실에서 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하고, 이어서 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 4℃에서 10분 동안 인큐베이션 후에, 세포는 FACS에 의해 분석할 준비가 되었다.
결과
T 세포 증폭
덱스트라머-양성 집단은, 프라이밍 시에 증폭되었고 총 CD8 T 세포 집단의 5 내지 24%를 구성한 항원-특이적 세포를 나타낸다. 덱스트라머-양성, CD8-양성 T 세포 집단의 상대 크기 및 절대 세포수를 사용하여 웰당 항원-특이적 CD8+ T 세포의 수를 계산하였으며, 각각의 공여자로부터의 데이터는 항체를 함유하지 않은 샘플과 대비하여 배양 중 항원-특이적 CD8+ T 세포의 수로 표현되었다 (도 34 참조). 도시된 데이터는 3회 반복하여 수행된 실험으로부터의 것이고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
이러한 결과로부터, 덱스트라머-양성 항원-특이적 CD8+ T 세포의 집단은 프라이밍 동안에 펩티드 항원이 존재할 때 증폭된다는 것이 명백하다 (도 34에서 "무펩티드 대조군" 및 "무항체" 조건을 비교함).
항-CD137 참조 항체 20H4.9는 음성 대조 항체와 대비하여 항원-특이적 CD8+ T 세포의 증폭을 향상시켰지만, 단지 한 명의 공여자 (PBMC1064)에서만 그러하였다.
항-PD-L1 참조 항체 YW243.55.S70은 증폭에 영향을 주지 않았다.
CD137×PD-L1 항체 PB17311은 음성 대조 항체와 대비하여 양쪽 공여자에서 항원-특이적 CD8+ T 세포의 증폭을 유의하게 향상시켰다. PB17311은 항-CD137 참조 항체 20H4.9보다 더 높은 정도로 항원-특이적 CD8+ T 세포의 증폭을 향상시켰다. PB17311은 항-PD-L1 항체 YW243.55.S70과 항-CD137 참조 항체 20H4.9의 병용물과 대비하여 더 높은 CD8+ T 세포 증폭 활성을 가졌다. 이는, 이러한 CD137 × PD-L1 이중특이성 항체가 CD137-특이적 벤치마크 항체 및 PD-L1-특이적 벤치마크 항체보다 미감작 CD8+ T 세포를 프라이밍하는 데 있어서 더 강력함을 의미한다.
T 세포 분화
항원-특이적 프라이밍 시에, 미감작 T 세포는 분화되기 시작한다. 이러한 분화 과정 동안, 세포의 표면 상에서의 CCR7 및 CD45RA의 발현은 하향조절되며, 이때 CD45RA는 최종 분화된 이펙터 T 세포 상에서 재발현된다. 따라서, CCR7 및 CD45RA 발현의 하향조절은 분화의 지표이다. CD8+덱스트라머+ 세포 상에서 게이팅하고, 이어서 상이한 T 세포 하위세트들 내의 세포의 상대수를 결정함으로써 분화 마커 CCR7 및 CD45RA의 발현을 분석하였다. 하위세트들은 T 미감작/기억 줄기 세포 (TN/TSCM): CD45RA+CCR7+; 중추 기억 T 세포 (TCM): CD45RA-CCR7+; 이펙터 기억 T 세포 (TEM): CD45RA-CCR7-; 및 최종 분화된 이펙터 T 세포 (TTE): CD45RA+CCR7-로 규정되었다. 각각의 공여자로부터의 데이터는 CD8+덱스트라머+ T 세포 집단 내의 각각의 T 세포 하위세트의 백분율로 표현되었다 (도 35 참조).
CD137×PD-L1 항체 PB17311은 음성 대조 항체와 대비하여 양쪽 공여자에서 항원-특이적 CD8+ T 세포의 분화를 향상시켰다. 음성 대조 항체의 존재 하에서 프라이밍되었던 T 세포와 항체의 존재 하에서 프라이밍된 T 세포와 비교하였을 때, PB17311은 미감작 세포 표현형을 갖는 항원-특이적 CD8+ T 세포 (TN/TSCM)의 상대수를 감소시키고, 이펙터 기억 및 최종 분화된 이펙터 세포 집단 (도 35에서의 TEM 및 TTE)의 상대수를 증가시킨다는 것을 알아내었다. PB17311은 20H4.9 인큐베이션된 CD8+ T 세포 집단과 대비하여 PB17311 인큐베이션 CD8+ T 세포 집단 내의 이펙터 기억 및 최종 분화된 이펙터 세포 집단의 상대수의 증가에 의해 보여지는 바와 같이 항원-특이적 CD8+ T 세포의 분화를 참조 항체 20H4.9보다 더 높은 정도로 향상시켰다. PB17311은 항-PD-L1 항체 YW243.55.S70과 항-CD137 참조 항체 20H4.9의 병용물과 대비하여 항원-특이적 CD8+ T 세포의 분화를 더 높은 정도로 더욱 향상시켰다. 이는, 이러한 CD137 × PD-L1 이중특이성 항체가 CD137-특이적 벤치마크 항체 및 PD-L1-특이적 벤치마크 항체보다 프라이밍 시에 미감작 T 세포의 분화를 향상시키는 데 있어서 더 강력함을 의미한다.
어떠한 이론에도 구애됨이 없이, CD8+ T 세포 프라이밍에 대한 CD137×PD-L1 항체 PB17311의 강력한 효과는 T 세포에서의 CD137 신호전달의 유도에 주로 좌우되는 것으로 여겨진다. 항원 인식 후 T 세포 표면 상에서 발현된 CD137과 성숙 DC 상의 PD-L1을 결합함으로써, PB17311은 CD137 신호전달에 필요한 CD137 수용체 클러스터링을 가능하게 한다.
요약하면, 이들 결과는 CD137/PD-L1 이중특이성 항체 PB17311이 시험관내에서의 미감작 CD8+ T 세포의 증식 및 분화 둘 모두를 향상시킴을 입증한다.
PB17311은 항-PD-L1 벤치마크 항체 YW243.55.S70 및 항-CD137 벤치마크 항체 20H4.9(의 병용물)와 대비하여 증가된 증폭 및 분화 잠재력을 갖는다. 이는, PB17311이 기존의 종양에 대한 신규한 T 세포 반응을 유도하거나 증강시키는 데 더 효과적임을 입증한다.
실시예 13
T 세포에 의한 CD107a 및 사이토카인 발현에 대한 PB17311의 효과
실시예 10에 입증된 바와 같이, CD137×PD-L1 이중특이성 항체는 SEB-활성화된 PBMC의 상층액에서의 IL-2, TNFα 및 IFNγ의 생성을 향상시킬 수 있다. 여기서, 세포내 사이토카인 염색 및 FACS 분석을 사용하여, CD137×PD-L1 이중특이성 항체 PB17311에 의한 처리 시에 향상된 사이토카인 생성을 담당하는 T 세포 하위세트를 확인하였다. 또한, CD8+ T 세포 세포독성에 대한 마커로서 CD107a 발현을 평가하였다. PB17311의 효과를 항-CD137×PD-L1 항체 PB17311, 항-CD137 벤치마크 항체 20H4.9, 항-PD-L1 벤치마크 항체 YW243.55.570, 두 참조 항체의 등몰 혼합물, 및 음성 대조 항-RSV-G 항체 PG2708의 효과와 비교하였다.
이를 위하여, 24시간 동안 항체의 존재 또는 부재 하에서 PBMC를 SEB (320 ng/ml)로 자극하고, 생존력 염료(viability dye)를 사용하여 사이토카인 IL-2, IFNγ 및 TNFα에 대하여, 마커 CD3, CD4, CD8, CCR7, CD45RO 및 CD107a에 대해 염색하였다. SEB 및 항체의 부재 하에서 배양된 PBMC를 SEB 자극에 대한 대조군 (비자극됨)으로서 포함시켰다. CD107a 및 사이토카인의 발현을 총 T 세포 집단 (CD3+ 세포)에서 그리고 하기의 CD4 및 CD8 T 세포 하위세트에서 분석하였다: 미감작 T 세포 (CD45RO-CCR7+), 중추 기억 T 세포 (CD45RO+CCR7+), 이펙터 기억 T 세포 (CD45RO+CCR7-) 및 최종 분화된 이펙터 T 세포 (CD45RO-CCR7-). 결과는 가장 현저한 차이가 관찰된 하기 하위세트에 대해서만 나타나 있다: CD4 이펙터 기억 (EM) 세포, CD8 EM 세포 및 CD8 최종 분화된 이펙터(TE) 세포.
방법
FACS 분석에서 세포내 및 세포외 표적을 검출하는 데 사용된 항체의 목록.
Figure pct00047
단일 건강한 공여자로부터 유래된 동결보존된 PBMC를 해동시키고, 하룻밤 그대로 정치시켰다. 이어서, 세포를 계수하고, 200 g로 12분 동안 원심분리하고, 펠릿을 PBMC 배지 (RPMI1640, 10% 열 불활성화 FBS 및 1 페니실린-스트렙토마이신) 중 2×106개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 100 μl의 세포 현탁액을 2개의 96웰 둥근바닥 플레이트의 웰에 첨가하였는데, 여기에는 SEB 및 시험 항체를 함유하는 100 μl의 PBMC 배지가 이미 첨가되어 있었다. 최종 SEB 농도는 320 ng/ml였다. 각각의 항체를 1 ㎍/ml의 단일 농도에서 3회 반복하여 시험하였다 (YW243.55.570 및 20H4.9의 병용물은 제외하는데, 이는 0.5 + 0.5 ㎍/ml에서 시험됨). SEB 또는 항체가 없는 대조군 웰도 또한 포함시켰다. 자극은 37℃, 5% CO2, 95% 습도에서 24시간 동안 행하였다. 항-CD107a, 및 브레펠딘(Brefeldin) A (Golgiplug, BD)와 몬넨신(Monensin) (Golgistop, BD)의 혼합물을 마지막 12시간의 인큐베이션 동안 각각의 웰에 첨가하였다.
이어서, 2개의 반복실험 플레이트를 풀링하고, 관련 마커 및 사이토카인에 특이적인 항체들로 PBMC를 염색하였다 (개요는 항체들의 상기 목록에 제공되어 있다). CD3, CD4, 및 CD8의 검출이 고정 후에 손상되지 않기 때문에, 이들 표적에 대한 항체를 세포내 염색 단계에서, 세포내 사이토카인에 대한 항체와 함께 첨가하였다. 고정에 대한 알려진 민감성으로 인해, 세포외 표적 CCR7 및 CD45RO는 고정 단계 전에 염색하였다. 이를 위하여, 플레이트들을 350 g로 3분 동안 원심분리하고, 세포를 웰당 100 μl의 PBS 중에 재현탁시키고, 2개의 반복실험 플레이트로부터의 세포를 풀링하였다. 플레이트들을 앞에서와 같이 원심분리하고, 세포를 웰당 100 μl의 1:1000으로 희석된 고정가능한 생존력 염료 중에 재현탁시켰다 (eBioscience, 카탈로그 번호 65-0866). 암실에서 실온에서 10분 인큐베이션한 후에, 150 μl의 FACS 완충액 (PBS (pH 7.4), 0.5% BSA, 0.5 mM EDTA)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트들을 원심분리하고, FACS 완충액 중에 희석된 항-CCR7 항체 25 μl 중에 세포를 재현탁시켰다. 37℃, 5% CO2, 95% 습도에서 15분 인큐베이션한 후에, FACS 완충액 중에 희석된 항-CD45RO 항체 25 μl를 첨가하였다. 암실에서 실온에서 30분 인큐베이션한 후에, 150 μl의 FACS 완충액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트들을 앞에서와 같이 원심분리하고, 세포를 200 μl의 FACS 완충액 중에 재현탁시켰다. 플레이트들을 원심분리하고, 세포를 100 μl의 BD 고정/투과화 용액 (BD Biosciences, 카탈로그 번호 554714) 중에 재현탁시켰다. 암실에서 실온에서 10분 인큐베이션한 후에, 100 μl의 BD Perm/Wash 완충액 (BD Biosciences, 카탈로그 번호 554714)을 첨가하였다. 이어서, 플레이트들을 350 g로 3분 동안 원심분리하고, 세포를 200 μl의 BD Perm/Wash 완충액 중에 재현탁시켰다.
이러한 고정 및 투과화 단계 후에, 플레이트들을 500 g로 3분 동안 원심분리하고, 세포내 표적에 특이적인 항체를 함유하는 BD Perm/Wash 완충액의 용액 50 μl 중에 세포를 재현탁시켰다. 이 용액은 세포내 표적 IFNγ, IL-2, 및 TNFα에 대한 항체 및 CD3, CD4, 및 CD8에 대한 항체를 함유하였다. 플레이트들을 암실에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 150 μl의 BD Perm/Wash 완충액을 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트들을 350 g로 3분 동안 원심분리하고, 세포를 200 μl의 BD Perm/Wash 완충액 중에 재현탁시켰다. 플레이트들을 다시 350 g로 3분 동안 원심분리하고, 세포를 100 μl의 고정 용액 (PBS (pH 7.4), 0.5% BSA, 0.5 mM EDTA, 1% 포름알데하이드) 중에 재현탁시키고, 다음날 획득 시까지 4℃에서 저장하였다.
BD Fortessa 유세포측정기를 사용하여 샘플을 측정하고, FlowJo 소프트웨어 버전 10을 사용하여 데이터를 분석하였다. 세포 집단들을 하기와 같이 분석하였다: FSC-A vs. FSC-H를 도표로 나타냄으로써 단일선을 이중선으로부터 식별하였다. 생존력 염색에 대해 음성인 집단 상에서 게이팅함으로써 죽은 세포를 제외시켰다. T 세포는 CD3+로 확인되었으며, CD4+ 및 CD8+ 하위세트로 세분하였다. 이들 T 세포 하위세트는, CCR7 및 CD45RO의 발현에 기초하여, 미감작, 중심 기억, 이펙터 기억, 및 최종 분화된 이펙터 세포로 추가로 세분하였다. 사이토카인 및 CD107a의 발현을 총 T 세포 집단 내에서 그리고 하위집단 내에서 평가하고, T 세포의 총 집단의 백분율로서 표현하였다.
결과
총 T 세포 집단에서의 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNFα의 세포내 수준이 도 36에 나타나 있으며, 3개의 개별 T 세포 하위세트 (CD4 TEM, CD8 TEM 및 CD8 TTE)에 의해 발현된 수준이 도 37에 나타나 있다. 이들 도면에서, 점선은, SEB 및 음성 대조 항체 PG2708로 자극될 때, 지시된 마커에 대해 양성인 세포의 평균 백분율을 나타낸다. 막대는 단일 공여자로부터 유래된 세포를 사용하여 3회 반복하여 수행된 실험의 평균값 ± SD를 나타낸다. 유의한 차이를 시험하기 위하여, 일원분산분석을 수행한 후, 던넷 다중 비교 검정을 수행하여, 각각의 조건을 음성 대조 항체 PG2708 (음성 대조 항체)과 대비하였다. P 값은 하기와 같이 별표로 표시된다: * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.
음성 대조 항체와 대비하여, PB17311은 총 T 세포 집단에서 CD107a, IL-2 및 IFNγ 생성을 향상시켰다 (도 36). 항-CD137 벤치마크 항체 20H4.9, 항-PD-L1 벤치마크 항체 YW243.55.570과 대비하여, 그리고 또한 두 참조 항체의 등몰 혼합물과 대비하여, PB17311에 의해 CD107a 생성이 더욱 향상되었음이 주목된다. 이로부터, CD8+ T 세포 세포독성은 PB17311과의 인큐베이션 후에 20H4.9, YW243.55.570 또는 이들의 혼합물과 대비하여 더욱 향상되는 것으로 결론지어진다. IL-2 및 IFNγ의 생성은 또한 PB17311과의 인큐베이션 후에 20H4.9 및 YW243.55.570과 대비하여 더 높은 것으로 나타난다.
개별 T 세포 하위세트들에서 더 상세히 조사하였을 때, PB17311은 CD4 TEM 세포에서 3개의 모든 사이토카인의 발현을 향상시킨다는 것을 확인하였다. PB17311은 또한 벤치마크 항체 20H4.9, YW243.55.570 및 이들의 혼합물보다 더 높은 정도로 CD8 TEM 및 TTE 집단에서 CD107a의 발현을 증강시켰는데, 이는, PB17311이 이들 벤치마크 항체의 혼합물보다 더 우수하게 CD8 T 세포 세포독성을 향상시킴을 나타낸다.
결론
이들 결과는 CD137×PD-L1 이중특이성 항체가 SEB 자극 시에 PBMC에 의한 IL-2, TNFα 및 IFNγ 생성을 향상시킨다는 이전의 관찰과 일치한다. 이들은, PB17311이 사이토카인을 발현하는 T 세포의 수의 유의한 증가를 야기하고, PB17311이 CD8 TEM 및 TTE 하위세트 상에서의 세포독성 마커 CD107a의 발현을 20H4.9 및 YW243.55.S70 벤치마크 항체보다 더 강력하게 유도함을 입증한다. CD8 TEM 및 TTE 집단의 IFNγ 및 TNFα 생성이 또한 PB17311과의 인큐베이션 후에, 20H4.9, YW243.55.570 또는 이들의 혼합물과의 인큐베이션 후의 IFNγ 및 TNFα 생성과 대비하여 더 높았음이 주목되는데, 이는 PB17311이 CD8+ T 세포 활성화의 더 높은 잠재력을 가짐을 나타낸다. CD4 TEM 집단의 IL-2 생성은 또한 PB17311과의 인큐베이션 후에, 20H4.9와의 인큐베이션과 대비하여 그리고 더 적은 정도로 YW243.55.570과의 인큐베이션과 대비하여 더 높은 것으로 나타난다.
실시예 14
종양-침윤 T 세포의 증식에 대한 PB17311의 효과
항-CD137×PD-L1 이중특이성 항체의 초기 스크리닝은 1차 T 세포에 기초한 검정을 사용하였다. 그러나, 그러한 검정은 종양 및 그의 미세환경의 동시발생(co-evolution)을 유발하는 세포 상호작용의 복잡성이 결여되어 있다. 종양-관련 환경에서 본 이중특이성 항체를 시험하기 위하여, 환자 종양 물질로부터 단리된 T 세포에 기초하여 최근에 개발된 검정을 또한 사용하였다. Zhou et al.은 간세포 암종 (HCC) 또는 결직장암 (CRC)을 갖는 환자로부터 신선한 종양 물질을 획득하는 단계 및 종양 침윤 세포 (골수계 및 림프구성 세포)를 단리하여 종양-침윤 T 세포의 기능에 대한 면역 관문 억제제를 표적화하는 항체의 효과를 시험하는 단계로 된 방법을 개발하였다 (문헌[Zhou et al., 2017]). 여기서, 본 발명자들은 항-CD137×PD-L1 이중특이성 항체 PB17311이 이들 환자로부터 유래된 종양-침윤 CD4 및 CD8 T 세포를 재활성화시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해 HCC를 갖거나 CRC에서의 간 전이 (LM-CRC)를 갖는 환자로부터 물질을 얻었다.
[방법]
이를 위하여, 종양의 외과적 절제에 적격인 HCC를 갖는 3명의 환자로부터, 그리고 LM-CRC를 갖는 4명의 환자로부터 신선한 종양 물질을 획득하였다. 환자들 중 어느 누구도 수술 전 적어도 3개월 이내에는 화학요법 또는 면역억제 치료를 제공받지 않았다. 문헌[Zhou et al. (2017)]에 의해 기재된 바와 같은 방법은 다음과 같았다: 종양-침윤 골수계 및 림프구성 세포를 작은 조각으로 절단함으로써 신선한 조직으로부터 단리한 후, 0.5 mg/ml의 콜라게나아제 IV (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich) 및 0.2 mg/ml의 DNAse I (미국 인디애나폴리스 소재의 Roche) 중에서 37℃에서 20 내지 30분 동안 분해하였다. 생성된 세포 현탁액을 100 μm 기공 세포 스트레이너 (벨기에 에렘로데겜 소재의 BD Biosciences)를 통해 여과하고, 피콜 밀도 구배 원심분리에 의해 단핵 백혈구를 얻었다. 트리판 블루 배제에 의해 생존력을 결정하였다. 이어서, 세포를 0.1 μM의 형광 염료 카르복시플루오레세인 다이아세테이트 석신이미딜 에스테르 (CFSE, Invitrogen)로 표지하고, 10% 인간 AB 혈청, 2 mM L-글루타민, 50 mM HEPES 완충액, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 5 mM 소듐 피루베이트 및 1% 최소 필수 배지 비필수 아미노산 (MEM NEAA)이 보충된 RPMI 배지 중에 현탁시켰다. HCC의 경우 100 μl 중 1×105개 세포를, 그리고 LM-CRC의 경우 100 μl 중 1 내지 2×105개 세포를 96웰 둥근바닥 플레이트의 각각의 웰에 옮겼다. 이어서, 종양-침윤 림프구 (TIL)를 자극하여 하기와 같이 시험 항체의 부재 또는 존재 하에서 활성화를 유도하였다: HCC 환자로부터 유래된 TIL이 담긴 웰에, 1×105개의 자가 CD40-활성화된 B 세포 아세포 (이는 증폭되고, 후속으로 전장 종양 항원 글리피칸-3 (GPC3) 또는 흑색종-관련 항원 C2 (MAGEC2)를 인코딩하는 mRNA로 형질감염되었음) 및 시험 항체를 함유하는 동일한 배지 100 μl를 첨가하였다. 이들 세포를 6일 동안 동시-인큐베이션하였다. LM-CRC 환자로부터 유래된 TIL을 함유하는 웰에, 시험 항체 및 4일 동안 항-인간 CD3/CD28 (노르웨이 소재의 Gibco-Life Technologies AS)로 코팅된 다이나비드(dynabead)를 함유하는 동일한 배지 100 μl를 첨가하였다. 인큐베이션 후에, CFSE-표지 세포를 수집하고, CD8, CD4, CD3 항체로 염색하였다. 죽은 세포를 7-아미노악티노마이신 D (7AAD; 영국 페이즐리 소재의 Invitrogen)를 사용하여 배제시키고, 유세포측정 분석에 의해 CFSE 희석에 기초하여 T 세포 증식을 결정하였다. 세포를 FACSCanto II 유세포측정기 (미국 샌디에고 소재의 BD Biosciences)에 의해 측정하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
CD137×PD-L1 이중특이성 항체 PB17311을 그의 단일특이성 2가 모 항체 PG6797 및 PG7702와 비교하고, 항-CD137 참조 항체 20H4.9, 항-PD-L1 참조 항체 YW243.55.S70, 및 비관련 RSV-G 항원에 대한 음성 대조 항체 PG2708과 비교하였다. 항체를 함유하지 않은 샘플을 대조군으로서 포함시켰고, 모든 조건은 10 ㎍/ml의 IgG 농도로 2회 반복하여 시험하였다.
LM-CRC로부터 유래된 샘플의 경우, 항체의 존재 하에서의 CD4 T 세포 증식은 4명 중 3명의 공여자에서만 결정될 수 있었는데, 그 이유는 CD4 T 세포 증식의 제4 공여자의 기저선 수준이 이미 이례적으로 높았기 때문이다 (60% 초과의 증식 세포). CD8 T 세포 증식은 4명의 모든 LM-CRC 공여자로부터의 샘플에서 결정될 수 있었다. HCC로부터 유래된 샘플에 관하여, GPC3을 발현하는 자가 B 세포는 3명의 모든 공여자에 대해 생성되었지만, MAGEC2 발현은 3명 중 2명에 대해서만 가능하였다. 이로써, 3명의 HCC 공여자로부터의 세포를 사용하여 총 5회의 증식 실험이 얻어졌다.
결과는 평균 ± SEM으로 제시되었다.
결과
결과가 도 38에 나타나 있다. CD4 TIL (상측의 우측 패널) 및 CD8 TIL (하측의 우측 패널)의 기저선 증식을 음성 대조 항체의 존재 하에서 증식 T 세포 (낮은 수준의 CFSE)의 백분율을 측정함으로써 결정하였다. 샘플의 CD4 (상측의 좌측) 및 CD8 (하측의 좌측) 증식을 기저선에 대한 증식의 백분율 증가로서 계산하였다. 값은 평균 ± SEM (LM-CRC: CD4 n=3, CD8 n=4; HCC: CD4 및 CD8 n=5)이다.
CD137×PD-L1 이중특이성 항체 PB17311은 두 종양 유형 모두에서 CD4 TIL 및 CD8 TIL 둘 모두의 증식을 분명히 향상시켰으며, 그 결과는 그것이 그의 모 항체 PG6797 및 PG7702를 능가하였음을 나타낸다. 이 결과는 또한 YW243.55.S70이 CD4 및 CD8 T 세포 증식을 동일한 수준으로 자극하였음을 나타낸다. PB17311 및 20H4.9는 또한 CD4 T 세포의 증식을 향상시켰지만, CD8 T 세포 증식을 더 강력하게 향상시켰다.
이들 실험은 이중특이성 CD137 × PD-L1 항체를 사용하는 것의 부가 가치를 입증하고, PB17311이 HCC 및 LM-CRC를 갖는 환자로부터 유래된 CD4 및 CD8 TIL의 증식을 향상시킴을 입증한다. 중요하게는, 이는, 본 발명에 따른 이중특이성 항체가 암 환자의 항원-특이적 CD4+ T 세포 및 항원-특이적 CD8+ T 세포 둘 모두를 재자극할 수 있고, 그것이 CD8+ TIL의 증식을 벤치마크 항체 YW243.55.S70보다 더 강력하게 자극할 수 있음을 의미한다.
실시예 15
알라닌 스캐닝을 통한 PB17311 에피토프 분석
에피토프 분석을 수행하여, PB17311에 존재하는 항-CD137 Fab 아암 (MF6797)에 의해 인식되는 에피토프들을 포함하거나 또는 그들의 일부인 잔기 세트를 확인하였다.
PB17311이 결합하는 CD137 항원의 잠재적으로 비선형인 에피토프의 분석은 CD137의 3차원 단백질 구조의 지식을 필요로 한다. CD137은 명확히 구별되는 도메인들이 없는, 25.4 kDa (17.3 kDa 세포외)의 비교적 작은 단백질이다. 그러나, 명확한 '반복 영역' 또는 시스테인-풍부 도메인 (CRD)이 CD137에 대해 기재되어 있다. CD137의 단백질 구조에 관한 문헌의 보고가 제한되어 있다. 문헌[Yi et al. (2014)]은 절두된 발현 작제물에 의한 결합 연구에 기초하여, CD137의 영역 3에 위치되는 CD137의 리간드 결합 부위를 기재하고 있다. CD137에 대해 결정 구조가 이용가능하지 않지만, TNFR1에 기초한 호몰로지 모델이 공개되어 있다 (문헌[Won et al., 2010]). TNFR1은 CD137이 또한 구성원인 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 내의 막-결합 단백질이다. 인간/마우스 CD137 키메라 작제물을 수반하는 도메인/교체(domain/swap) 실험의 결과는 항-CD137 Fab 아암 (MF6797)이 CRD 1 및/또는 2에 결합함을 시사한다. CD137L 차단 데이터는 또한 MF6797 에피토프가 CD137 리간드 결합 부위 부근에 있거나 그와 중첩되고 있음을 시사한다.
PD-L1은 또한 31.1 kDa (25.2 kDa 세포외)의 비교적 작은 단백질이며, 이에 대해서는 구별되는 영역들 또는 도메인들이 규정되어 있지 않다. 그러나, PD-L1의 결정 구조가 알려져 있으며, PD-L1과의 그의 복합체의 결정 구조도 마찬가지이다.
이들 실험에서는, 샷건(shotgun) 돌연변이생성을 사용하여, 단일 잔기가 알라닌 잔기로의 치환을 통해 돌연변이된 일련의 돌연변이 단백질을 생성하였다. 이어서, 돌연변이 CD137 단백질을 인간 세포에서 발현시켜, 복합 단백질, 또는 인간 세포에서만 발현되고 적절히 접힐 수 있는 단백질의 분석을 가능하게 하였다. 항체에 대한 기능적 결합은 형광 염색에 의해 측정되었는데, 이는 결합 맵(binding map)을 생성하고 항체 결합에 중요한 잔기를 확인시켜 준다. 샷건 돌연변이생성 실험 및 분석은 문헌[Davidson and Doranz(2014)]에 기재된 방법을 사용하여 Integral Molecular에 의해 수행하였다.
먼저, 야생형 CD137 cDNA를 보유하는 플라스미드에 기초하여, 표적 단백질에 대해 돌연변이 라이브러리 (Xxx 내지 Ala, Ala 내지 Ser)를 생성하였다. 이는, CD137에 대한 163개의 돌연변이 cDNA 클론을 생성하였으며, 이들 모두는 돌연변이의 확증을 위해 서열분석되었다. 결과적으로, 이들 돌연변이 cDNA 클론은, 비교를 위해 야생형 (WT) 작제물과 함께, HEK-293 T 세포 내로 형질감염되었다. 후속으로, 각각의 돌연변이 클론을 발현하는 HEK-293 T 세포를 유세포측정에 의해 분석하였는데, 여기서는 PB17311에 대한 각각의 돌연변이 단백질의 결합을 CD137에 특이적인 대조 항체 (마우스 IgG1, BD Biosciences 카탈로그 번호 555955)에 대한 결합과 비교하였다. 이 대조 항체는 결합을 위해 PB17311과 경쟁하지 않는다. 인간 또는 마우스 IgG에 대한 형광-표지 2차 항체를 사용하여 PB17311 또는 대조 항체의 결합을 검출하였다.
높은 CD137 발현을 가졌지만 PB17311과의 낮은 결합을 제공하는 클론을 확인하기 위하여, PB17311 결합을 관련 대조 항체의 결합과 비교하였다 (도 39a 참조). 각각의 클론에 대하여, 평균 결합값을 대조 항체 결합에 의해 측정된 바와 같은 클론의 평균 발현값의 함수로서 도표로 나타내었다. 예비 주요 클론을 확인하기 위하여, 대조 항체에 대한 WT 결합의 70% 초과 및 PB17311 Ab에 대한 WT 반응성의 20% 미만의 역치를 적용하였다. 이들 역치를 사용하여 확인된 예비 주요 클론은 도 39a에 흑색원으로 나타나 있다.
결과는 PB17311의 결합을 위한 CD137 내의 중요한 잔기가 Arg66, Gly70, 및 Phe72임을 나타낸다. Val71이 또한 PB17311의 결합과 관련된 것으로 나타난다 (도 39b 참조). Cys133은 결합 역치에 기초하여 주요 잔기로서 초기에 확인되었지만, 이는 다른 주요 잔기로부터 비교적 멀리 떨어져 있고, 시스테인 돌연변이는 이황화 결합의 파괴로 인해 단백질 입체구조에서 약간의 일탈을 야기하는 경향이 있다. 따라서, Cys133은 PB17311 에피토프의 일부로 간주되지 않았다. Arg66, Gly70 및 Phe72에서 돌연변이된 단백질의 PB17311과의 낮은 반응성은, 이들 잔기가 PB17311 결합에 대한 주요 활동 기여인자이고, Val71에 의한 기여는 더 적음을 나타낸다.
실시예 16
이종이식편 마우스 모델에서의 CD137×PD-L1 이중특이성 항체의 항-종양 효능
클론들 중 예시적인 하나의 항-종양 효능을 시험하기 위하여, CD137×PD-L1 이중특이성 항체 PB17311을 실험 동물에서 실험하고 그것을 참조 항체들과 비교하였으며, 항체 PB17311을 이종이식된 종양을 갖는 마우스에 투여하였다. 선택된 마우스 모델은, 면역손상된 마우스가 인간 암 세포주를 주사하기 전에 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 생착에 의해 인간화된 것이다. 이어서, 피하 고형 종양 성장이 3주의 기간에 걸쳐 평가된다.
CD137×PD-L1 이중특이성 항체의 항-CD137 및 항-PD-L1 Fab는 인간 및 사이노몰거스 오르토로그와 교차반응하지만 마우스 단백질과는 그렇지 않다. 상기 모델은 항체의 생체내 활성이 인간화된 시스템에서 시험될 수 있게 하기 때문에 선택되었으며, 여기서는 항체의 항-종양 반응이 인간 T 세포에 의해 매개되고 마우스 T 세포에 의해서는 그렇지 않다. 이러한 유형의 모델은, 몇몇 항-CD137 단일클론 항체를 포함한, 다양한 면역조절 표적화된 요법을 평가하는 데 성공적으로 사용되어 왔다.예를 들어, 20H4.9의 효능은 HT29 세포를 보유하는 PBMC-인간화 Rag2-/-IL2Rgnull 마우스에서 평가되어 왔으며 (문헌[Sanmamed et al 2015]), 우토밀루맙 효능은 PBMC와 인간 종양 세포 PC3, LoVo 또는 WM-266의 혼합물로 이종이식된 SCID-베이지 마우스에서 평가되어 왔다 (문헌[Fisher et al., 2012]). 두 모델 모두에서, 항-CD137 단일클론 항체는 대조군 IgG-처리된 동물과 대비하여 유의한 T-세포 매개 항-종양 활성을 나타내었다.
여기서 사용된 이종이식편 마우스 모델에서, PBMC-인간화 마우스에 주사된 암 세포는 비교적 높은 수준의 PD-L1을 발현하지만 CD137은 발현하지 않는 잘 확립된 인간 결장 암종 세포주인 RKO 세포였다. 면역손상된 마우스 내로 주사된 PBMC가 이식 후 5일 정도로 일찍 CD137을 발현하고 적어도 일수 22까지 계속된 것으로 밝혀졌다 (문헌[Sanmamed et al 2015])는 사실은 RKO 세포를 보유하는 PBMC-인간화 마우스가 "트랜스" 구성의 CD137×PD-L1 이중특이성 항체의 표적들 (RKO 세포 상의 PD-L1 및 T 세포 상의 CD137)을 발현하기 위한 이상적인 모델임을 나타낸다. 게다가, PBMC 공여자는 생착 후 적어도 40일 동안 이식편 대 숙주 질병을 초래하지 않는다. 따라서, 이러한 모델은 면역조절제의 효능을 평가하는 데 있어서 견고하다.
방법
9주령된 암컷 NOD SCID 감마 (NSG) 마우스에 꼬리-정맥 주사에 의해 3 × 107개의 인간 PBMC를 생착시켰다. 7일 후에, 각각의 시험 마우스는 우측 옆구리에 0.1 mL의 50% Matrigel 중 5 × 106개의 RKO 종양 세포의 피하 주사를 제공받았다. 평균 종양 부피가 50 내지 80 ㎣의 목표 범위에 접근함에 따라 종양 성장을 캘리퍼스에 의해 모니터링하였다. 연구 일수 1로서 지정된 종양 세포 이식 후 4일째에, 40 내지 63 ㎣의 개별 종양 부피를 갖는 동물들을 8 마리의 동물로 된 4개의 군으로 분류하였다.
각각의 군에서의 종양-보유 동물은 일수 1, 4, 8, 11, 15 및 18에서 100 μL의 PBS 중 100 ㎍의 용량으로 항체의 6회 복막내 주사를 제공받았다. 4개의 상이한 군은 음성 대조군 (IgG), 또는 벤치마크 항체 20H4.9 (항-CD137) 또는 YW243.55.S70 (항-PD-L1), 또는 PB17311 (항-CD137×PD-L1)을 제공받았다. 종양 성장의 억제를 평가할 때, 일수 19의 연구 종료 시점까지 주 3회 캘리퍼를 사용하여 종양 부피를 측정하였다.
종양 성장 억제 (TGI)는 처리된 마우스와 대조군 마우스의 일수 19의 중위 종양 부피 (MTV) 사이의 퍼센트 차이로서 정의하였으며, 이때 군들 사이의 차이는 만-휘트니 검정을 사용하여 p ≤ 0.05에서 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다. 치료 내성(treatment tolerability)을 체중 측정 및 치료-관련 유해 사건의 임상 징후의 빈번한 관찰에 의해 평가하였다.
도 40은 군에 의한 종양 부피 분포의 상자 수염 도표(box and whisker plot)를 제공한다. 일수 19에서, IgG 대조군에서의 마우스의 중위 종양 부피 (MTV)는 517 ㎣였으며, 이때 개별 종양 부피 범위는 429 내지 807 ㎣였다. 3개의 처리군 중에서, PB17311은 YW243.55.S70 (MTV 283 ㎣, 45% TGI) 및 20H4.9 (MTV 339 ㎣, 34% TGI)만큼 효과적이었다 (MTV 264 ㎣, 49% TGI). 모든 처리는 대조군에서의 MTV보다 유의하게 더 낮은 MTV를 가져왔다 (20H4.9의 경우 P < 0.05; PB17311 및 YW243.55.S70의 경우 P < 0.001). 20H4.9를 제공받은 한 마리의 동물은 일수 8에서 사망하였으며; 부검은 분홍색 폐 및 반점화된 간을 보여주었다. 이 군 내의 동물들은 또한 최대 평균 BW 손실 (일수 15에서 최저 지점에서 -8.0%)을 경험하였다. 그렇지 않으면, 처리는 우수한 내성을 나타내었다.
요약하면, CD137×PD-L1 이중특이성 항체 PB17311은 인간 PBMC가 생착된 NSG 마우스에서의 인간 RKO 결장 암종에 대한 치료로서 통계학적으로 유의한 생존 이득을 제공하였다. PB17311에 의한 처리 결과는 20H4.9와 대비하여 더 우수하고 부작용은 더 적었다.
실시예 17
CD137 표적화 항체의 효능적 활성에 대한 sCD137의 방해
가용성 CD137은 2가 CD137 항체보다 이중특이성 CD137×PD-L1 항체의 효능적 활성을 덜 방해한다
CD137 발현은 세포 표면으로부터의 항원 탈락(antigen shedding)에 의해 조절된다. 탈락된 항원 (sCD137)은 혈액 중에서 발견될 뿐만 아니라 세포외 공간 내에서도 발견되며, 이에 따라 CD137 표적화 항체의 제거를 위한 경쟁 싱크로서 작용할 수 있다.
연구는 sCD137이 고수준의 CD137을 발현하는 면역 세포, 예컨대 조절성 T 세포로부터 탈락된다는 것 (문헌[Ridgway et al., 2014])과 sCD137 및 sCD137L 둘 모두가 결직장 환자의 암 세포에 의해 생성된다는 것 (문헌[Dimberg et al., 2006])을 보여주어 왔다. 게다가, 저산소 조건에 대한 종양 세포주의 노출은 CD137 발현을 촉진하며, 가장 우세한 형태는 가용성 변이체이다 (문헌[Labiano et al, 2016]). 건강한 공여자에서의 sCD137의 평균 혈청 수준은 0.02 내지 0.2 ng/ml의 범위이지만, 수준은 다양한 질병 상태에서 0.2 내지 3.6 ng/ml 범위로 더 높은 것으로 알려져 있다 (문헌[Michel et al, 1998]; 문헌[Shao et al, 2012]). sCD137은 활성화된 T 세포를 조절하는 것으로 나타난다: 종양 미세환경 내로 유입될 때, 그것은 면역 시스템의 활성을 둔화시켜, 면역 탈출을 매개한다. sCD137은 CD137L에 결합하기 위해 막-결합 CD137과 경쟁하여, T 세포 상에서 발현되는 CD137을 통한 신호전달을 차단하는 것으로 여겨진다.
전술된 기전을 고려하여, sCD137이 시험관내에서 인간 1차 T 세포를 활성화시키는 이중특이성 CD137×PD-L1 항체 PB17311 및 참조 항체의 능력에 영향을 미칠 것인지의 여부를 결정하였다. 그러한 활성화를 과량의 sCD137의 부재 또는 존재 하에서 Jurkat 리포터/CHO-PD-L1 전사활성화 검정에서 측정하였다. 이 검정에서, Jurkat 리포터 T 세포주는 CD137을 발현하고, 리포터 유전자는 CD137에 특이적인 항체에 의해 활성화된다. T 세포를 PD-L1을 과발현하는 CHO 세포와 공동배양하는데, 상기 CHO 세포는 PD-L1을 발현하는 종양 세포를 모방하고, 이중특이성 CD137×PD-L1 항체에 의한 T 세포의 활성화를 위해 필요하다.
이를 위하여, 편평 바닥 96웰 플레이트 (Costar, 카탈로그 번호 3917)를 PBS 중 2 ㎍/mL의 항-CD3 항체 OKT-3 (eBioscience, 카탈로그 번호 16-0037-85)로 하룻밤 코팅하였다. 다음날, Jurkat CD137-NFkBluc 리포터 세포를 해동시키고, 10% 열 불활성화 소태아 혈청을 함유하는 DMEM/F12 배지 (검정 배지)로 세척하였다. 세포를 2×106개 세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 사전-코팅된 96웰 플레이트를 PBS로 2회 세척한 후, 25 μL의 시험 항체 (최종 농도 200 ng/mL)에 이어서, 20 ㎍/mL (최종 농도)에서 출발하여 5-단계 3배 희석물의 sCD137 (R&D, 카탈로그 번호 9220-4B)의 혼합물 25 μL를 첨가하였다. 이어서, 25 μL의 Jurkat NFκBluc (50000개 세포/웰, 2×106개 세포/ml)를 첨가한 후, 25 μL의 CHO-K1/CHO.huPD-L1 세포 (12500개 세포/웰, 5Х105개 세포/ml)를 첨가하였다. 다음날, 플레이트들을 실온으로 평형화시키고, 100 μl의 Bright-Glo/웰 (실온)을 첨가한 후 (한 번에 최대 4개의 플레이트), 실온에서 5분 인큐베이션하였다. 플레이트들을 Biotek Synergy 2 멀티-모드 마이크로플레이트 판독기 (발광 모드) 상에서 측정하였다. 루시페라제 활성의 관점에서의 활성화는 재조합 단백질의 첨가 없이 얻어진 것의 백분율로서 표현하였다.
결과는 도 41에 나타나 있으며, 고농도의 가용성 CD137이 실제로 두 시험 항체 모두의 효능적 활성을 방해할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 중요하게는, sCD137 경쟁이 이중특이성 CD137×PD-L1 항체 PB17311보다 항-CD137 참조 항체 (클론 20H4.9)에 대해 훨씬 더 큰 효과를 갖는 것으로 나타난다. 이로부터, PB17311의 생체내 효과는 벤치마크 항체 20H4.9와 대비하여 면역 억제 기전에 덜 민감할 것으로 결론지어진다.
표
[표 1]
Figure pct00048
[표 2]
Figure pct00049
[표 3]
Figure pct00050
[표 4]
Figure pct00051
[표 5]
Figure pct00052
[표 6]
Figure pct00053
[표 7]
Figure pct00054
MF, 고유 ID Fab; CDR3, CDR3의 서열; VH 생식세포계열, 유래된 VH; 빈, 빈으로의 특정 그룹화 (P1306-S33); 도메인, 마우스 인간 교체된-도메인 작제물을 사용하여 항체가 맵핑된 CD137 도메인 (1 또는 2는 항체가 2개의 도메인 중 하나에 명확하게 맵핑될 수 없었음을 의미함); 효능적 2가, Jurkat-NFκB-luc-CD137을 활성화시키는 2가 항체의 능력; % CD137L 차단, CD137과의 상호작용을 차단하는 Fab 아암의 능력; 리포터, 리포터 검정으로부터의 데이터; T 세포, T 세포 검정으로부터의 데이터; PD-L1 NB, PD-L1 비-차단 Fab 아암과 조합된 CD137 Fab; PD-L1 B, PD-L1 차단 Fab 아암과 조합된 CD137 Fab.
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Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 104 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Common light chain constant region DNA sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 104 cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 324 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 105 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 105 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 106 <211> 108 <212> PRT <213> 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Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 108 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG heavy chain CH1 region <220> <221> CDS <222> (1)..(294) <400> 108 gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc gtc gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aga gtt 294 Arg Val <210> 109 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 109 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 110 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG heavy chain hinge region <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <400> 110 gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 45 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 111 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial 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tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 288 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa 330 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 113 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 113 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 114 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG heavy chain CH3 domain containing L235G and G236R silencing substitutions <220> 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MF7353 <400> 195 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Leu Gly Trp Asp Pro Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 196 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF7356 <400> 196 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 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Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Gly Gln Ser Gln Tyr His Ser Tyr Pro Phe Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 199 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF7366 <400> 199 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 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Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Tyr Asp Met Tyr Gly Gly Trp Gly Ala Trp Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 206 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF7394 <400> 206 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Pro Ala Trp Ala Tyr Ser Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 207 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF7395 <400> 207 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Tyr Trp Tyr Tyr Leu Ser Asp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 208 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF7397 <400> 208 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp His Trp Gly Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 209 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF5554 <400> 209 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Lys Tyr Val Thr Asn Trp Val Phe Ala Glu Asp Phe 100 105 110 Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 210 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF5576 <400> 210 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Asp Arg Gly Tyr Met Ser Asn Trp Val Phe Ala Glu Tyr Phe 100 105 110 Pro His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 211 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF5578 <400> 211 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Arg Gly Tyr Ile Ser Ser Trp Val Phe Ala Glu Asp Phe 100 105 110 Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 212 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF7702 <400> 212 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Lys Tyr Val Thr Asn Trp Val Phe Ala Glu Asp Phe 100 105 110 Gln His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 115 120 <210> 213 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF9375 <400> 213 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 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Trp Val Phe Ala Glu Asp Phe 100 105 110 Gln His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 215 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TTX specific VH combined with common light chain <400> 215 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Ser Ala Asn Thr Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Leu Phe Lys Thr Glu Thr Ala Pro Tyr Tyr His Phe 100 105 110 Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 216 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD137 extracellular domain <400> 216 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 217 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF6256 <400> 217 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile Ile Pro Val Phe Asp Thr Ser Ser Tyr Glu Lys Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ile Thr Ile Ile Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Val Glu Ala Thr Leu Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (44)

  1. 세포 상의 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원의 활성을 자극하는 방법으로서,
    제1 세포 및 제2 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 제1 세포는 세포막 상에 상기 구성원을 갖고, 상기 제2 세포는 세포막 상에 제2 막 단백질을 가지며, 상기 방법은 상기 세포들을, 하나의 가변 도메인은 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위를 포함하고, 다른 가변 도메인은 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 2개의 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체와 접촉시켜, 상기 제1 세포 상의 상기 구성원의 활성을 자극하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아닌, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 2개의 항원 결합 부위를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 항원 결합 부위들은 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인 및 상기 제2 막 단백질과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인으로 이루어지는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 전장(full length) 항체인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 IgG인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포는 상기 세포막 상에서 상기 제2 막 단백질을 유의하게 발현하지 않는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 상기 세포막 상의 하나 이상의 구역 내에 존재하는 막 단백질인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 구역은 상기 세포막 상의 클러스터, 도메인, 마이크로-도메인 또는 구획, 바람직하게는 면역학적 시냅스인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 상기 제2 막 단백질의 2개 이상의 인스턴스(instance)를 포함하는 다량체 막 단백질의 일부로서 상기 세포막 상에 존재하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 동종이량체 또는 동종삼량체의 일부로서 상기 세포막 상에 존재하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 B7 패밀리의 구성원인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 PD-L1 또는 PD-L2, 바람직하게는 PD-L1인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원과 결합하는 상기 가변 도메인은 상기 구성원에 대한 리간드의 결합을 차단하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합하는 상기 가변 도메인은, 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원과 결합하는 2개의 상기 가변 도메인을 포함하는 2가 단일특이성 항체 포맷일 때, 세포 상의 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원의 활성을 자극하지 않는 가변 도메인으로서 정의되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 추가의 이중특이성 항체를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제1 이중특이성 항체와 상기 제2 이중특이성 항체는,
    - 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들;
    - 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들; 또는
    - 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들 및 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들과 결합하며;
    상기 방법은 상기 제1 및 제2 세포를 상기 제1 및 제2 이중특이성 항체와 함께 인큐베이션하여, 상기 제1 세포 상의 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 활성을 자극하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제1 및 상기 제2 이중특이성 항체는 각각 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위를 포함하는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 제2 막 단백질과 결합할 수 있는 상기 제1 및 제2 이중특이성 항체의 항원 결합 부위들은 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분 상의 상이한 에피토프들과 결합하는, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분 상의 상기 상이한 에피토프들은 비경쟁 에피토프들인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원은 CD137 또는 OX40인, 방법.
  21. CD137의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위 및 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는, 이중특이성 항체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이 아닌, 이중특이성 항체.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 2개의 항원 결합 부위를 포함하는, 이중특이성 항체.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체의 항원 결합 부위들은 상기 TNF 수용체 수퍼패밀리의 상기 구성원의 세포외 부분과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인 및 상기 제2 막 단백질과 결합할 수 있는 하나의 면역글로불린 가변 도메인으로 이루어지는, 이중특이성 항체.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 전장 항체인, 이중특이성 항체.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 IgG인, 이중특이성 항체.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD137과 결합할 수 있는 하나의 항원 결합 부위를 포함하는, 이중특이성 항체.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 T-세포에 의해 유의한 정도로 발현되지 않는, 이중특이성 항체.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 항원 제시 세포, 종양 세포, 바이러스 감염된 세포 또는 기생충 감염된 세포 상에서 발현되는, 이중특이성 항체.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 상기 세포막 상의 하나 이상의 구역 내에 존재하는 막 단백질인, 이중특이성 항체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 구역은 상기 세포막 상의 클러스터, 도메인, 마이크로-도메인 또는 구획, 바람직하게는 면역학적 시냅스인, 이중특이성 항체.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 2개 이상의 상기 제2 막 단백질을 포함하는 다량체 막 단백질의 일부로서 상기 세포막 상에 존재하는, 이중특이성 항체.
  33. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 동종이량체 또는 동종삼량체의 일부로서 상기 세포막 상에 존재하는, 이중특이성 항체.
  34. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 B7 패밀리의 구성원인, 이중특이성 항체.
  35. 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 PD-L1 또는 PD-L2, 바람직하게는 PD-L1인, 이중특이성 항체.
  36. 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD137과 결합하는 상기 가변 도메인은 상기 CD137에 대한 리간드의 결합을 차단하는, 이중특이성 항체.
  37. 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, CD137의 세포외 부분과 결합하는 상기 가변 도메인은, CD137과 결합하는 2개의 상기 가변 도메인을 포함하는 2가 단일특이성 항체 포맷일 때, 세포 상의 CD137의 활성을 자극하지 않는 가변 도메인으로서 정의되는, 이중특이성 항체.
  38. 제21항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 이중특이성 항체를 포함하는, 조성물 또는 파트 키트(kit of parts).
  39. 제21항 내지 제37항 중 어느 한 항의 2개 이상의 이중특이성 항체를 포함하는 조성물 또는 파트 키트로서,
    제1 및 제2 이중특이성 항체의 CD137 또는 OX40과 결합할 수 있는 상기 항원 결합 부위들은 상기 CD137 또는 OX40 상의 상이한 에피토프들과 결합하는, 조성물 또는 파트 키트.
  40. 세포 상의 CD137의 활성을 자극하는 방법으로서,
    제1 세포 및 제2 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 제1 세포는 세포막 상에 상기 CD137 (제1 막 단백질)을 갖고, 상기 제2 세포는 세포막 상에 제2 막 단백질을 가지며, 상기 방법은 상기 세포들을, 하나의 가변 도메인은 상기 제1 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위를 포함하고, 다른 가변 도메인은 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하는, 2개의 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체 (제1 이중특이성 항체)와 접촉시켜, 상기 제1 세포 상의 상기 제1 막 단백질의 활성을 자극하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 제1 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 가변 도메인; 및 상기 제2 막 단백질의 세포외 부분과 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 가변 도메인을 포함하는 추가의 이중특이성 항체 (제2 이중특이성 항체)를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제1 이중특이성 항체와 상기 제2 이중특이성 항체는,
    - 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들;
    - 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들; 또는
    - 상기 제1 막 단백질 상의 상이한 에피토프들 및 상기 제2 막 단백질 상의 상이한 에피토프들과 결합하며;
    상기 방법은 상기 제1 및 제2 세포를 상기 제1 및 제2 이중특이성 항체와 함께 인큐베이션하여, 상기 제1 세포 상의 CD137의 활성을 자극하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 제2 막 단백질은 B7 패밀리의 구성원인, 방법.
  43. CD137 및 PD-L1과 결합할 수 있는, 항체 또는 그의 기능성 부분, 유도체 및/또는 유사체.
  44. 제43항에 있어서, 이중특이성 항체인, 항체 또는 기능성 부분 또는 유도체 또는 유사체.
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