UA127449C2 - Зв'язувальна молекула, яка модулює біологічну активність, що експресується клітиною - Google Patents

Зв'язувальна молекула, яка модулює біологічну активність, що експресується клітиною Download PDF

Info

Publication number
UA127449C2
UA127449C2 UAA201902889A UAA201902889A UA127449C2 UA 127449 C2 UA127449 C2 UA 127449C2 UA A201902889 A UAA201902889 A UA A201902889A UA A201902889 A UAA201902889 A UA A201902889A UA 127449 C2 UA127449 C2 UA 127449C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cell
still
antibody
bind
antigen
Prior art date
Application number
UAA201902889A
Other languages
English (en)
Inventor
Сесілія Анна Вільгельміна Гьоін
Сесилия Анна Вильгельмина Гьоин
Марк Тросбі
Марк Тросби
Крьойф Корнеліс Адріан де
Крёйф Корнелис Адриан де
Рінсе Клостер
Ринсе Клостер
Паулус Йоханнес Таккен
Тон ЛОГТЕНБЕРГ
Original Assignee
Мерус Н.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мерус Н.В. filed Critical Мерус Н.В.
Publication of UA127449C2 publication Critical patent/UA127449C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Винахід стосується способу стимулювання активності CD137 або OX40 на клітині, який включає забезпечення першої клітини та другої клітини, де вказана перша клітина має CD137 або OX40, відповідно, на клітинній мембрані та вказана друга клітина має PD-L1 на клітинній мембрані, причому спосіб включає контактування вказаних клітин із біспецифічним антитілом, яке містить два варіабельні домени, де один варіабельний домен містить перший антигензв’язувальний сайт, що може зв’язувати позаклітинну частину CD137 або OX40, відповідно, і де інший варіабельний домен містить другий антигензв’язувальний сайт, що може зв’язувати позаклітинну частину PD-L1, таким чином стимулюючи активність CD137 або OX40, відповідно, на вказаній першій клітині. Винахід також стосується біспецифічного антитіла для застосування як лікарського засобу, де біспецифічне антитіло містить два варіабельні домени, при цьому один варіабельний домен містить перший сайт зв’язування антигену, який може зв’язувати позаклітинну частину CD137 або OX40 на першій клітині, а інший варіабельний домен містить другий сайт зв’язування антигену, який може зв’язувати позаклітинну частину PD-L1 на другій клітині, тим самим стимулюючи активність CD137 або OX40, відповідно, на вказаній першій клітині, та композиції для лікування раку.

Description

(54) ЗВ'ЯЗУВАЛЬНА МОЛЕКУЛА, ЯКА МОДУЛЮЄ БІОЛОГІЧНУ АКТИВНІСТЬ, ЩО ЕКСПРЕСУЄТЬСЯ
КЛІТИНОЮ
(57) Реферат:
Винахід стосується способу стимулювання активності СО137 або ОХ40 на клітині, який включає забезпечення першої клітини та другої клітини, де вказана перша клітина має СО137 або ОХ40, відповідно, на клітинній мембрані та вказана друга клітина має РО-І1 на клітинній мембрані, причому спосіб включає контактування вказаних клітин із біспецифічним антитілом, яке містить два варіабельні домени, де один варіабельний домен містить перший антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину СО137 або ОХ40, відповідно, і де інший варіабельний домен містить другий антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину РО-11, таким чином стимулюючи активність СО137 або ОХ40, відповідно, на вказаній першій клітині. Винахід також стосується біспецифічного антитіла для застосування як лікарського засобу, де біспецифічне антитіло містить два варіабельні домени, при цьому один варіабельний домен містить перший сайт зв'язування антигену, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137 або ОХ40 на першій клітині, а інший варіабельний домен містить другий сайт зв'язування антигену, який може зв'язувати позаклітинну частину РО-11 на другій клітині, тим самим стимулюючи активність СО137 або ОХ40, відповідно, на вказаній першій клітині, та композиції для лікування раку.
Цей винахід стосується області зв'язувальних молекул. Зокрема він стосується області терапевтичних зв'язувальних молекул для лікування захворювань, які викликані аберантними клітинами. Більш конкретно він стосується зв'язувальних молекул, які зв'язують позаклітинну частину двох або більше мембрано зв'язаних білків, і таким чином модулює біологічну активність, що експресується клітиною.
Незважаючи на великий успіх, досягнутий у лікуванні захворювання, і розширення знань про молекулярні явища, що призводять до злоякісних новоутворень, злоякісні новоутворення залишаються головною причиною захворюваності та смертності у світі. Вони є другою головною причиною смертності в усьому світі. Згідно з даними Всесвітньої організації охорони здоров'я злоякісні новоутворення були причиною 8,8 мільйона смертей у 2015 р. У світі майже 1 із 6 смертей зумовлена злоякісним новоутворенням. Наприклад, колоректальний рак (КРР) є третім найбільш поширеним видом злоякісного новоутворення у світі. У 2008 р., це захворювання діагностували у 1,23 мільйона осіб. Воно є другим із найпоширеніших злоякісних новоутворень у
Європі, де у 2012 році діагностували 447 000 нових випадків захворювання (13 95 від загальної кількості). Колоректальний рак є четвертою найпоширенішою причиною смертності від злоякісних новоутворень, який за оцінками призводить до 608 000 (148 000 - у ЄС) смертей щорічно. Хоча були створені деякі нові методи лікування КРР, багато з них не пройшли успішного клінічного дослідження; метастатичний КРР залишається здебільшого невиліковним.
Традиційно відкриття більшості препаратів для лікування злоякісних новоутворень зосереджене на засобах, які блокують основні функції клітин і знищують клітини, які діляться.
Однак у випадках розповсюдженого злоякісного новоутворення хіміотерапія рідко призводить до повного вилікування незалежно від ступеня агресивності її застосування, навіть коли лікування зумовлює виникнення в пацієнтів побічних ефектів, що загрожують життю. У більшості випадків пухлини в пацієнтів припиняють ріст або тимчасово зменшуються в розмірах (називається ремісією), а потім знову починається їхня проліферація, інколи більш швидка (називається рецидивом), і вони стають прогресивно складнішими для лікування. Зовсім недавно фокус розробки препаратів для лікування злоякісних новоутворень перемістився від хіміотерапії з широкою цитотоксичністю до цільових цитостатичних методів терапії з менш вираженою цитотоксичністю. Лікування розповсюдженого злоякісного новоутворення було клінічно підтверджене при лейкемії та деяких інших видах злоякісних новоутворень. Однак при більшості карцином цільові підходи залишаються недостатньо ефективними для повного усунення злоякісного новоутворення в більшості пацієнтів. Іншим прикладом злоякісного новоутворення, яке дуже часто зустрічається, є меланома. Коли її виявляють недостатньо рано, існує висока ймовірність утворення метастазів злоякісного новоутворення, яке на цій стадії дуже важко лікувати. Методи лікування з втручанням в імунну систему продемонстрували ефективність принаймні в деяких пацієнтів із метастатичною меланомою. Не дрібноклітинний рак легені - це тип злоякісного новоутворення, який рідко виявляють на стадії, достатньо ранній для проведення хірургічного лікування. Також ці типи злоякісних новоутворень успішно лікували за допомогою терапевтичних методів із втручанням в імунну систему.
Цільового впливу на злоякісні новоутворення досягали з використанням низки різних способів, що включають, наприклад, невеликі молекули, спрямовані на сигнальні білки, від яких залежить виживання й/або ріст злоякісного новоутворення; вакцини з білками, специфічними для пухлин; методи клітинної терапії імунними клітинами, які активно вбивають пухлинні клітини, і антитілами, які спрямовують до пухлини цитотоксичні молекули; перешкоджання сигналізації й/або процесам які (пере)спрямовують імунну систему хазяїна на пухлинні клітини.
Моноклональні антитіла, які блокують вісь СТІ А-4 або РО-1, продемонстрували індукцію тривалих клінічних відповідей у підгрупі пацієнтів із меланомою, не дрібноклітинним раком легені (НДКРЛ), нирковоклітинною карциномою й уротеліальною карциномою.
У цьому винаході представлені новітні засоби та способи (пере)спрямування компонентів імунної системи. Винахід також стосується засобів і способів модуляції біологічної активності, що експресується клітинами.
СУТЬ ВИНАХОДУ
У винаході запропоновано спосіб стимулювання активності представника над родини рецепторів фактора некрозу пухлини (ФНП) на клітині, який включає надання першої та другої клітини, з яких перша клітина має вказаного представника на клітинній мембрані та вказана друга клітина має другий мембранний білок на клітинній мембрані, причому спосіб включає контактування вказаних клітин зі зв'язувальною молекулою, яка містить два антигензв'язу вальні сайти, де перший антиген зв'язувальний сайт може зв'язувати позаклітинну частину вказаного представника (перший мембранний білок), а другий антиген зв'язувальний сайт може зв'язувати 60 позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, таким чином стимулюючи активність указаного представника на вказаній першій клітині. У деяких варіантах втілення вказаний спосіб є способом іп міо. У деяких варіантах втілення вказаний представник над родини рецепторів ФНП - це СО137 або ОХ40, переважно СО137. У деяких варіантах втілення вказаний другий мембранний білок не є представником над родини рецепторів ФНП. У деяких варіантах втілення вказаний другий мембранний білок є представником родини В7. У деяких варіантах втілення вказаний другий мембранний білок - це РО-Ї 1.
У переважному варіанті втілення спосіб додатково включає надання додаткової зв'язувальної молекули (другої зв'язувальної молекули), яка містить антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного представника над родини рецепторів ФНП, і антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, де вказана перша та друга зв'язувальна молекула зв'язує: - різні епітопи на вказаному першому мембранному білку; - різні епітопи на вказаному другому мембранному білку; або - різні епітопи на вказаному першому мембранному білку й різні епітопи на вказаному другому мембранному білку; причому спосіб додатково включає інкубування вказаної першої клітини та другої клітини з указаною першою та другою зв'язувальною молекулою, таким чином стимулюючи або посилюючи активацію вказаного представника над родини рецепторів ФНП на вказаній першій клітині.
У винаході також представлена зв'язувальна молекула, що містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП (перший мембранний білок), і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину другого мембранного білка. Представник над родини рецепторів ФНП- це переважно
СО0137 або ОХ40, переважно СО137. У деяких варіантах втілення вказаний другий мембранний білок не є представником над родини рецепторів ФНП. Указаний другий мембранний білок є переважно представником родини В7. У деяких варіантах втілення вказаний другий мембранний білок - це РО-Ї 1.
У винаході додатково представлені композиція або комплект частин, які містять одну або більше зв'язувальних молекул, що містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати
Зо позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП (перший мембранний білок), і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину другого мембранного білка. У переважному варіанті втілення винаходу представлені композиція або комплект частин, що містять дві або більше таких зв'язувальних молекул; причому принаймні дві з указаних зв'язувальних молекул можуть зв'язувати: різні епітопи на вказаному першому мембранному білку; різні епітопи на вказаному другому мембранному білку; або різні епітопи на вказаному першому мембранному білку й різні епітопи на вказаному другому мембранному білку. Переважним є зв'язування принаймні двома зв'язувальними молекулами одного епітопу на вказаному першому мембранному білку та зв'язування різних епітопів на вказаному другому мембранному білку.
У винаході додатково представлений спосіб стимулювання активності СО137 або ОХ40 на клітині, який включає забезпечення першої клітини та другої клітини, причому вказана перша клітина має СО137 або ОХ40 на клітинній мембрані, а вказана друга клітина має другий мембранний білок на клітинній мембрані, і контактування вказаних першої клітини та другої клітини зі зв'язувальною молекулою (першою зв'язувальною молекулою), яка містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною вказаного СО137 або
ОХ40 (першого мембранного білка); і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною другого мембранного білка; причому спосіб додатково включає інкубування вказаної першої клітини та вказаної другої клітини зі вказаною першою зв'язувальною молекулою, таким чином стимулюючи активність указаного СО137 або ОХ40 на першій вказаній клітині. У деяких варіантах втілення вказаний другий мембранний білок не є представником над родини рецепторів ФНП. У деяких варіантах втілення вказаний спосіб є способом іп міїго.
У переважному варіанті втілення спосіб додатково включає надання додаткової зв'язувальної молекули (другої зв'язувальної молекули), яка містить антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного першого мембранного білка; і антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, де вказана перша та друга зв'язувальна молекула зв'язують: різні епітопи на вказаному першому мембранному білку; 60 різні епітопи на вказаному другому мембранному білку; або різні епітопи на вказаному першому мембранному білку; і різні епітопи на вказаному другому мембранному білку; причому спосіб додатково включає інкубування вказаної першої клітини та вказаної другої клітини зі вказаною першою та другою зв'язувальною молекулою, таким чином стимулюючи активність СО137 або ОХ40 на вказаній першій клітині.
У деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула згідно з винаходом містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення антиген зв'язувальні сайти вказаної зв'язувальної молекули згідно з винаходом складаються 3 одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, і одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення вказана зв'язувальна молекула згідно з винаходом містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137, і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення антиген зв'язувальні сайти вказаної зв'язувальної молекули згідно 3 винаходом складаються з одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137, і одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення вказана зв'язувальна молекула згідно з винаходом містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати СО137, і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати РО-11. У деяких варіантах втілення антиген зв'язувальні сайти вказаної зв'язувальної молекули згідно з винаходом складаються з одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати СО137, і одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати РО-І 1. У деяких варіантах втілення вказана зв'язувальна молекула згідно з винаходом має не більше ніж два антиген зв'язувальні сайти.
Зв'язувальна молекула, як описано в цьому документі, є переважно антитілом.
У винаході додатково представлений спосіб стимулювання активності представника над родини рецепторів ФНП на клітині, який включає надання першої клітини та другої клітини, де вказана перша клітина має вказаного представника на клітинній мембрані (перший мембранний
Зо білок) і вказана друга клітина має другий мембранний білок на клітинній мембрані, причому спосіб включає контактування вказаних клітин із антитілом згідно з цим винаходом, яке містить принаймні два варіабельні домени, де один варіабельний домен містить перший антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного першого мембранного білка, а інший варіабельний домен містить другий антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, таким чином стимулюючи активність указаного представника на вказаній першій клітині. У деяких варіантах втілення вказаний спосіб є способом іп міїго.
У винаході додатково представлене антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною представника надродини рецепторів ФНП (першим мембранним білком); і варіабельний домен, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною другого мембранного білка. Перший мембранний білок - це переважно СО137 або ОХ40, переважно
СО137. У деяких варіантах втілення вказаний другий мембранний білок не є представником над родини рецепторів ФНП.
Зв'язувальна молекула є переважно біспецифічним антитілом. У винаході додатково представлений спосіб стимулювання активності представника над родини рецепторів ФНП на клітині, який включає надання першої та другої клітини, де вказана перша клітина має вказаного представника на клітинній мембрані (перший мембранний білок) і вказана друга клітина має другий мембранний білок на клітинній мембрані, причому спосіб включає контактування вказаних клітин із біспецифічним антитілом, яке містить два варіабельні домени, де один варіабельний домен містить перший антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного першого мембранного білка, а інший варіабельний домен містить другий антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, таким чином стимулюючи активність указаного представника на вказаній першій клітині. У деяких варіантах втілення вказаний спосіб є способом іп мйго. Також пропонується біспецифічне антитіло, яке містить варіабельний домен із антиген зв'язувальним сайтом, який може зв'язувати позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП (перший мембранний білок), і варіабельний домен із антиген зв'язувальним сайтом, який може 60 зв'язувати позаклітинну частину другого мембранного білка. Перший мембранний білок - це переважно СО137 або ОХ40, переважно СО137. Другий мембранний білок переважно не є представником над родини рецепторів ФНП.
У деяких варіантах втілення антитіло згідно з винаходом містить варіабельний домен, що містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення антиген зв'язувальні сайти вказаного антитіла згідно з винаходом складаються з одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, їі один антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення вказане антитіло згідно з винаходом містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137, і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення антиген зв'язувальні сайти вказаного антитіла згідно з винаходом складаються з одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137, і одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення вказане антитіло згідно з винаходом містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати СО137, і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати РО-І 1. У деяких варіантах втілення антиген зв'язувальні сайти вказаного антитіла згідно з винаходом складаються з одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати СО137, і одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати РО-11. У деяких варіантах втілення вказане антитіло згідно з винаходом має не більше ніж два антиген зв'язувальні сайти.
Додатково пропонується фармацевтична композиція, яка містить одну або більше зв'язувальних молекул, переважно антитіл або їхніх варіантів згідно з винаходом.
Також пропонується молекула нуклеїнової кислоти або сукупність молекул нуклеїнової кислоти, що кодує важкий (-ї) ланцюг (-и) або варіабельну (-ї) область (-ї) важкого ланцюга антитіла згідно з винаходом або його варіанта.
Також пропонується молекула нуклеїнової кислоти або сукупність молекул нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло згідно з винаходом.
Антитіло згідно з винаходом переважно містить варіабельну область важкого ланцюга, що
Зо містить амінокислотну послідовність МЕ, як показано на Фіг. 3. У переважному варіанті втілення антитіло додатково містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність варіабельної області легкого ланцюга, зображену на Фіг. 1. У переважному варіанті втілення легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, як зображено на Фіг. 1А. У переважному варіанті втілення важкий ланцюг містить константну область антитіла Ід, переважно антитіла Ї401 людини. У переважному варіанті втілення область СН2 константної області вказаного 401 створена для зменшення активності антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АЮСС) і/або комплементзалежної цитотоксичності (СОС) антитіла. У переважному варіанті втілення область СНІ містить послідовність, як зображено на Фіг. 2Е. У переважному варіанті втілення СНЗ-область антитіла створена для сприяння гетеродимеризації важких ланцюгів. У переважному варіанті втілення один важкий ланцюг містить послідовність, як зображено на Фіг. 2Е, а інший важкий ланцюг містить послідовність, як зображено на Фіг. 20.
Також пропонується клітина, яка містить одну або більше молекул нуклеїнової кислоти, які окремо або разом кодують антитіло або його варіант згідно з винаходом. Також пропонуються способи утворення антитіла або його варіанта згідно з винаходом із використанням клітини, як описано, переважно разом із отриманням антитіла або його варіанта з культури клітин.
Додатково пропонується клітинна система, що містить антитіло або його варіант згідно з винаходом.
Також пропонується спосіб лікування особи, яка має захворювання, пов'язане з аберантними клітинами, таке як рак, або має хронічну інфекцію, викликану вірусом або паразитом, причому спосіб включає введення особі, яка цього потребує, зв'язувальної молекули, переважно антитіла або його варіанта згідно з винаходом.
У винаході додатково пропонується зв'язувальна молекула, переважно антитіло або його варіант згідно з винаходом; переважно біспецифічне антитіло або його варіант згідно з винаходом з метою використання для лікування особи, яка має захворювання, що пов'язане з аберантними клітинами, таке як рак або хронічна інфекція, викликана вірусом або паразитом.
У переважному варіанті втілення паразит є внутрішньоклітинним паразитом.
Додатково пропонується спосіб стимулювання імунної відповіді в особи до аберантної клітини в указаної особи, причому спосіб включає надання (введення) вказаній особі зв'язувальної молекули, переважно антитіла або його варіанта, переважно біспецифічного бо антитіла або його варіанта згідно з винаходом. Аберантна клітина є переважно раковою клітиною, інфікованою вірусом клітиною, паразитом або інфікованою паразитом клітиною. У переважному варіанті втілення такою клітиною є ракова клітина або неопластична клітина.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Над родина рецепторів фактора некрозу пухлини (ТМЕНБЕ) є групою рецепторів. Як правило, вони характеризуються здатністю зв'язувати фактори некрозу пухлини (ФНП) за допомогою позаклітинного багатого на цистеїн домену. За винятком фактора росту нервів (МОРЕ), усі ФНП є гомологічними до архетипного ФНП-альфа. У своїй активній формі більшість рецепторів ФНП утворюють тримерні комплекси в плазматичній мембрані. Відповідно, більшість рецепторів ФНП містять трансмембранні домени (ТМО) і розміщуються на клітинній мембрані.
Однак деякі можна роз'єднати на розчинні форми (наприклад, ТМЕНІ), а деякі зовсім не містять
ТМО (наприклад, ОсНАЗ). Антитіло згідно з винаходом, яке зв'язується з представником над родини рецепторів ФНП, зв'язується з мембрано зв'язаним представником над родини.
Представники, які існують тільки в формах, що не пов'язані з клітинною мембраною, є поза рамками цього винаходу.
Рецептори ФНП залучаються до сигналізації всередину клітини при зв'язуванні ліганду рецептора. Для залучення до низхідної сигналізації деякі рецептори потребують специфічного білка-адаптера, такого як домен смерті, пов'язаний із АТ ФНП (ТВАОБ), фактор, пов'язаний із рецептором ФНП (ТРАРЕ,), білок, що взаємодіє з рецептором (ВІР), і ЕА5- асоційований через домен смерті (ЕАОО). У контексті цього винаходу переважними є різні представники над родини
ФНП. Вони включають рецептор 1 фактора некрозу пухлини; рецептор 2 фактора некрозу пухлини; рецептор лімфотоксину бета; ОХ40; 0040; рецептор Раз; СбОр27; СОр30; СО137; рецептор смерті З; рецептор смерті 4; рецептор смерті 5; рецептор смерті 6; активатор рецептора МЕ-Каррав (ВАМК); ТО; рецептор фактора, що активує В-клітини (ВАЕРЕ); антиген дозрівання В-клітин (ВСМА) і трансмембранний активатор і білок, що взаємодіє з кальціймодулюючим лігандом циклофіліну (ТАСІ).
Рецептор 1 фактора некрозу пухлини є одним із головних рецепторів фактора некрозу пухлини-альфа. Рецептор має велику кількість альтернативних назв, деякі з яких є представниками ТА над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; ТМЕВБЕТА; ТМЕ-В1; ТМЕ-
ВІ; ТМЕВ-Ї; ТМЕНІТ; ТМЕАВ; РбО; Р5Б5; ізоформа бета рецептора 1А фактора некрозу пухлини;
Зо білок 1, що зв'язує фактор некрозу пухлини; рецептор типу 1 фактора некрозу пухлини; рецептор типу 1 фактора некрозу пухлини; рецептор фактора некрозу пухлини - альфа; рецептор 1 фактора некрозу пухлини; антиген СО120а; ТМЕН1-02; ТМЕ-В-І; ТМЕ-Н55; СО120а;
ТМЕВ5Б5; ТМЕВНбО; ТМЕ-А; РББ-В; ТЬрі1; ЕРЕ; і М55. Зовнішні ідентифікатори для рецептора 1 фактора некрозу пухлини такі: база даних Комітету з номенклатури генів Міжнародної організації з вивчення геному людини (НОМС) 11916; ЄЕпіге» Сепе: 7132; Епзетрі:
ЕМ5ЗОа00000067182; база даних "Менделівська спадковість у людини онлайн" (ОМІМ): 191190 і
ОпіРтоїКкВ: Р19438.
Рецептор 2 фактора некрозу пухлини є мембранним рецептором, який зв'язує фактор некрозу пухлини-альфа (ФНПа). Рецептор має велику кількість альтернативних назв, деякі з яких є такими: представник 18 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; ТМЕВ5Е1В; тип ІЇ рецептора фактора некрозу пухлини; рецептор 2 фактора некрозу пухлини; Р8О, рецептор
ФНП-альфа; ТМЕ-ВІІ; ТМЕ-Н2; ТМЕН2; ТМЕВЕ; Р75; білок 2 фактора некрозу пухлини; рецептор фактора некрозу пухлини-бета; рецептор Р75 ФНП; антиген СО120Б; етанерцепт; ТМЕ-В-ІІ; ТМЕ-
В75; Р7БТМЕВ; ТМЕВ-Ії; СО1206; ТМЕВТВ; ТМЕН8ВО; ТВРІЇ. Зовнішні ідентифікатори для рецептора 2 фактора некрозу пухлини: НОМС: 11917; Епітєї (Сепе: 7133; Епзетрі:
ЕМЗСОСО0О0000028137; ОМІМ: 191191; ії ОпіРтоїКкВ: Р2О333.
Рецептор лімфотоксину бета експресується на поверхні більшості типів клітин включно з клітинами епітеліальної та мієлоїдної ліній, але, як правило, не експресується на нормальних Т- і В-лімфоцитах. Білок зв'язує форму мембранного лімфотоксину (комплекс лімфотоксину-альфа й лімфотоксину-бета). Кодований білок і його ліганд відіграють роль у розвитку й організації лімфоїдної тканини та трансформованих клітин. Активація білка в деяких випадках може ініціювати апоптоз. Білок відомий під великою кількістю назв, серед яких є: рецептор лімфотоксину-бета (І ТВЕР); білок, пов'язаний із рецептором 2 фактора некрозу пухлини; тип ПІ рецептора фактора некрозу пухлини; рецептор С фактора некрозу пухлини; 0125370;
ТМЕВЗЕЗ; ТМЕСА; ТМЕВЗ; рецептор лімфотоксину бета (представник З над родини ТМЕВ); рецептор лімфотоксину В; ГТ-ВЕТА-А; ТМЕ-В-І; ТМЕВ2-ВР; ТМЕ-ВИ; ТМЕВ-П; ТМЕВ-ВР; і
СО18. Зовнішні ідентифікатори для рецептора бета лімфотоксину такі: Нам: 6718; Епіге:
Сепе: 4055; Епзетбрі: ЕМ5С100000111321; ОМІМ: 600979 ї ОпіРтоїКВ: РЗб6941.
ОХ40 не експресується конститутивно на наївних Т-клітинах у спокої, на відміну від СО28, бо ОХ40 є вторинною костимуляторною молекулою імунної контрольної точки, що експресується через 24-72 години після активації; її ліганд, ОХ40Ї, також не експресується на антигенпрезентуючих клітинах у спокої, а слідує за їхньою активацією. Експресія ОХ40 залежить від активації Т-клітини. Без СО28 експресія ОХ40, як правило, затримується й має більш низькі рівні. Білок відомий під великою кількістю назв, серед яких є: ТМЕН5Е4; представник 4 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; рецептор ТАХ транскрипційноактивованого глікопротеїну 1; рецептор ОХ40Ї!; антиген АСТЗ5; антиген СО134; ТХОРІІ; рецептор транскрипційноактивованого Тах глікопротеїну 1; антиген активації лімфоїдної тканини АСТЗ5; антиген клітинної поверхні ОХ40; антиген АТС35; антиген ОХ40; АСТЗ35; СО134; і ІМО16.
Зовнішні ідентифікатори для ОХ40 є такими: НОМС: 11918; Епіге7 Сепе: 7293; Епзетрі:
ЕМ5ЗСОО00000186827; ОМІМ: 600315 ії ОпіРтоїКкВ: Р43489.
СбО40 є костимуляторним білком, що знаходиться на антигенпрезентуючих клітинах і залучений до їхньої активації. Зв'язування СО154 (СО401) на клітинах Т-хелперах із СО40 активує антигенпрезентуючі клітини й індукує внутрішньоклітинну сигналізацію через 2040 і низку низхідних ефектів. Білок відомий під багатьма назвами, серед яких є: молекула СО40; молекула СО40, представник 5 рецепторів над родини ФНП; рецептор СО40І; ТМЕВ5ЗЕ5;
СОМУ40; Вр50; представник 5 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; поверхневий антиген СО40 В-клітини; поверхневий антиген СО40 В-клітини; молекула, асоційована з В- клітинами; антиген СО40; ії РБ5БО. Зовнішні ідентифікатори для СО40 є такими: НОаМС: 11919;
Епіте7 Сепе: 958; Епзетрі: ЕМ5С00000101017; ОМІМ: 109535; ії ОпіРгтоїкВ: Р25942.
Рецептор Раз є рецептором смерті на поверхні клітин, який призводить до програмованої смерті клітини (апоптозу). Він утворює частину одного або більше відомих шляхів апоптозу. Він відомий під низкою альтернативних назв, таких як: поверхневий рецептор смерті клітини Еав; представник б над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; поверхневий антиген, який опосередковує апоптоз, ЕАБ; представник б над родини рецепторів ФНП; рецептор ЕАБІ С; антиген С095; ТМЕН5ЗЕб; АРТ; ГАБ5І1; поверхневий антиген клітини АРО-1; антиген 1 апоптозу; антиген Аро-1; Газ АМА; А РОТА; АРО-1; ЕА5ТМ; і СО95. Зовнішні ідентифікатори для ЕА5 такі:
НОМО: 11920; Епігє2 Сепе: 355; Епзетрі: ЕМ5С00000026103; ОМІМ: 134637; і ОпіРгоїКкВ:
Р25445.
Вважається, що С027 відіграє важливу роль для утворення та довготривалої підтримки Т-
Зо клітинного імунітету. Він зв'язується з лігандом СО70 і відіграє роль у регуляції активації В- клітин і синтезу імуноглобулінів. СО27 передає сигнали, які призводять до активації шляхів МЕ- кВ Її МАРКВ/с-дип М- термінальної кінази (МК). Проапоптотичний СО27-зв'язувальний білок (БІМА) може зв'язуватися з цим рецептором, і вважається, що він відіграє роль у апоптозі, індукованому цим рецептором. Альтернативними назвами для цього білка є, серед інших: молекула СО27; представник 7 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; антиген СО27 активації Т-клітин; рецептор СО271; ТМЕВ5Е?7; Т14; антиген 5152 активації Т клітин; антиген
СОр27;5152.1 РЕ52; 5152 і Тр55. Зовнішні ідентифікатори для СО27: НИМ: 11922; Епіге7 Сепе: 939; Епветрі: ЕМ5С00000139193; ОМІМ: 186711; ії ОпіРтоїКкВ: Р26842.
СОЗО експресується активованими Т- і В-клітинами. Вважається, що ТВАБ2 і ТВАЕ5 взаємодіють із цим рецептором і опосередковують передачу сигналу, що призводить до активації ядерного фактора "каппа бі" (МЕ-КарраВ). Він є позитивним регулятором апоптозу і також продемонстрував обмеження проліферативного потенціалу автореактивних ефекторних
Т-клітин СОВ8 і захист організму від авто імунності. Він відомий під низкою різних назв, таких як:
ТМЕВБЕ8; представник 8 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; антиген СОЗ0 активації лімфоцитів; рецептор СОЗОЇ ; антиген Кі-1; 015166Е; СО30; рецептор СОЗО цитокінів; антиген СОЗ30; ї Кі-1. Зовнішні ідентифікатори для СОЗ30: Нам: 11923; Епіге7 Сепе: 943;
Епзетбі: ЕМ5С100000120949; ОМІМ: 153243; ії ОпіРгтоїКкВ: Р28908.
СО0137 може експресуватись активованими Т-клітинами. Він також зустрічається на інших клітинах, таких як дендритні клітини, природні клітини-кілери, гранулоцити та клітини стінки кровоносних судин у місцях запалення. Білок відомий своєю костимуляторною активністю завдяки активації Т-клітин. СО137 відомий під низкою різних назв, таких як: ТМЕВ5Е9; представник У над родини рецепторів ФНП; представник 9 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; гомолог 4-1888 антигена Т-клітин; рецептор ліганду 4-188; антиген ІСА Т- клітин; антиген СО137; СОм137; ІІ А; інтерлейкінактивований рецептор, гомолог І убЗ3 миші; індукований активацією лімфоцитів (ПА); гомолог 4-18В миші; рецепторний білок 4-188; антиген ІГ А Т-клітин; і 4-188. Зовнішні ідентифікатори для СО137 є такими: НаМС: 11924; Епіге7
Сепе: 3604; Епветрі: ЕМ5ЗО100000049249; ОМІМ: 602250; і ОпіРтоікКВ: 007011. С0137 є індуцибельним рецептором, який найчастіше стимулюється на активованих Т-клітинах СОв-.
Сигналізація СО137 стимулює функцію Т-клітин шляхом активації МЕ-кВ ГАгсп еї аї, 1998). Інші бо клітинні типи імунних клітин, що включають Т-клітини СО4-, моноцити, В-клітини, субпопуляції дендритних клітин (ОС) і гранулоцити, і природні клітини-кілери, можуть експресувати СО137 на різних рівнях (Зпао єї аї, 2011|Ї. У моноцитах СО137 індукується активацією за допомогою ліпополісахариду (І РБ) та інтерлейкіном-1 (1/-1)Д3. У В-лімфоцитах експресія СО137 індукується антитілами до імуноглобуліну клітинної поверхні та шляхом трансформації за допомогою вірусу
Епштейна - Барр (ЕВМ). У ОС зшивання СО137 індукує їхнє дозрівання через стимулювання костимуляторних молекул В7 (СО80 і 2086) на додаток до посилення вироблення ними запальних цитокінів (ІІ -6 і 11-12) і їхнього виживання (Маккоик еї аї, 2015). Природна функція зшивання СО137 на нейтрофілах полягає в посиленні фагоцитозу при бактеріальних і паразитарних інфекціях. Крім того, зшивання СО137 блокує антиапоптозні сигнали, опосередковані рецепторами 1І/-ЗЛІ/-5/аМ-С5Е у нейтрофілах і еозинофілах іп міо, попереджуючи таким чином накопичення гранулоцитів |Зітоп, 2001; Міпау еї аї, 2011). У нелімфоїдних клітинах, таких як хондроцити, ендотеліальні клітини та пухлинні клітини, експресія СО137 посилюється стимулюванням цитокінами, такими як ІЇ/-1Д8 для хондроцитів, запальними цитокінами ФНПальфа/ інтерфероном-у (ІЕМУ)/ І. -1Д для ендотеліальних клітин і
ІЕРМу для пухлинних клітин. Ліганд, який стимулює СО137 (С0О1371), експресується на активованих антигенпрезентуючих клітинах. СО137 існує в мембрані у вигляді мономерів і димерів |РоїокК еї аї, 1993).
Рецептор З смерті експресується активованими й навченими антигеном Т-лімфоцитами.
Рецептор також експресується БГохРЗ Т-лімфоцитами з позитивною регуляцією. Ліганд для рецептора - це ТІТА (ТМЕ5Е15), який стимулюється в антигенпрезентуючих клітинах і деяких ендотеліальних клітинах після активації толл-подібного рецептора або рецептора Ес.
Відзначено різні варіанти транскриптів із альтернативним сплайсингом, які кодують різні ізоформи, більшість із яких є потенційно секретованими молекулами. Вважається, що рецептор залучений до контролю проліферації лімфоцитів, яка індукується активацією Т-клітин.
Вважається, що активація залежить від попередньої взаємодії рецептора Т-клітин. Зв'язування ліганду збільшує чутливість Т-клітин до ендогенного ЇЇ -2 за допомогою рецептора І! -2 і посилює проліферацію Т-клітин. Активація іп мімо, ймовірно, є специфічною до тих Т-клітин, які зустрічають споріднений антиген. У спокої та в осіб без фонового автоїмунного процесу більшість Т-клітин, які регулярно зустрічають споріднений антиген, є регуляторними Т-клітинами
Зо ЕГохРЗж. Стимулювання рецептора смерті З за відсутності якихось інших екзогенних сигналів стимулює глибоку та специфічну проліферацію регуляторних (СО4-позитивних) Т-клітин
ЕохРЗх. Терапевтичні агоністи рецептора смерті З можна використовувати для стимулювання розмноження регуляторних Т-клітин, які можуть зменшувати запалення в експериментальних моделях астми, алогенної трансплантації паренхіматозного органа й кератиту ока. З іншого боку, костимулювання рецептора разом із автоантигсеном або антигеном вакцини може призводити до загострення імунної патології або посиленого стимульованого вакциною імунітету відповідно. Стимулювання рецепторів є специфічною для імунітету, опосередкованого
Т-клітинами, який можна використати для посилення або пригнічення запалення, залежно від часових умов і якості доступності чужорідного антигена порівняно з автоантигеном.
Стимулювання ТМЕНеР25 у людини може призвести до подібних, але більш контрольованих ефектів, таких як костимуляторні молекули, спрямовані на блокаду, наприклад СТІ А-4 і РО-1.
Рецептор З смерті також відомий під низкою інших назв, таких як ТМЕВ5Е25; представник 25 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; представник 12 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини (транслокуючий ланцюг-асоційований мембранний білок); лімфоцит- асоційований рецептор смерті; апоптоз-опосередковуючий рецептор транслокуючий ланцюг- асоційований мембранний білок (ТВАМР); апоптоз-опосередковуючий рецептор ЮОВЗ; апоптоз- індукуючий рецептор АЇІВ; білок М/5І -1; ТМЕВ5Е12; АРО-3; 0ОНВЗ; рецептор смерті, пов'язаний із лімфоцитами (ГА); ОНАЗ; апоптоз-індукуючий рецептор; рецептор смерті бета; білок МУ/5І ;
М/51І1-І А; ТВАМР; М/5І-1; АРОЗ; МУ5І 1; ТАЗ; і М/5І. Зовнішні ідентифікатори для рецептора З
БО смерті є такими: НЕМС: 11910; Епіте2 Сепе: 8718; Епзетврі: ЕМ5С:00000215788; ОМІМ: 603366; і
ОпіРгоїкв: 093038.
Рецептор 4 смерті є рецептором поверхні клітини з над родини рецепторів ФНП, який зв'язує апоптоз-індукуючий ліганд, пов'язаний із фактором некрозу пухлини альфа (ТРАЇМ), ії, як вважається, може передавати сигнал смерті клітини й індукувати клітинний апоптоз. Він відомий під низкою назв, таких як: ТМЕВ5ЕТОА; представник 10а над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; рецептор 1 апоптоз-індукуючого ліганду, пов'язаного з ФНП; рецептор 4 смерті; рецептор 1 ТВА; ТАВАЇІ-А1; ТВА ВІ; АРО2; ОВУ; варіант 2 представника 1ба над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; цитотоксичний ТВАЇЇ- рецептор; антиген СО261;
ТАВАЇСВ-1 ї 20261. Зовнішні ідентифікатори для рецептора 4 смерті є такими: НИМС: 11904; 60 Епіте? Сепе: 8797; Епзетрі: ЕМ5С0500000104689; ОМІМ: 603611; і ОпіРгоїКкВ: 000220
Рецептор 5 смерті є рецептором поверхні клітини з над родини рецепторів ФНП, який зв'язує
ТВАЇ!. і опосередковує апоптоз. Рецептор може бути активований апоптоз-індукуючим лігандом, пов'язаним із фактором некрозу пухлини (ТМЕ5ЕТО/Т ВА ЛАРО-2І), і передає сигнал апоптозу.
Рецептор відомий під низкою різних назв, серед яких є: ТМЕВ5Е1ОВ; представник 106 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; рецептор 2 апоптоз-індукуючого ліганду, пов'язаного з ФНП; рецептор 5 смерті; ТВА -82; ТВА Н2; КІ ЕВ; ТАІСК2; 2ТМЕВО; ОВО; Р53- регульований рецептор (кілер) смерті клітини, що індукується пошкодженням ДНК; білок 2ТМЕНВО, подібний до рецептора фактора некрозу пухлини; рецептор для ТВАП/Аро-2І, який містить домен смерті; апоптоз-індукуючий білок ТВІСК2А/2В; апоптоз-індукуючий рецептор
ТВА -Н2; представник 106 над родини рецепторів ФНП; рецептор-2 цитотоксичного ТВАЇ/; Рав- подібний білок; рецептор 2 ТВАЇЇ; антиген СО262; КІ ЕВ/ОН5; ТВІСК2А; ТВІСК2В; ТАІСКВ; і
СОр262. Зовнішніми ідентифікаторами для рецептора 5 смерті є: НОМ: 11905; Епігте7 Сепе: 8795; Епзетбрі: ЕМ5С200000120889; ОМІМ: 603612; і ОпіРтоїКкВ: 014763.
При активації рецептор смерті 6 може індукувати апоптоз клітини. Нокаутні дослідження в мишей дозволяють припустити, що рецептор відіграє роль в активації клітин Т-хелперів і може бути залучений до запалення й імунної регуляції. Вважається, що рецептор також залучений до нейродегенерації в головному мозку, яка зумовлює хворобу Альцгеймера, а також до передачі сигналу при стресовій відповіді та клітинного виживання. Надмірна експресія індукує апоптоз експресуючої клітини. АРР (білок-попередник амілоїду) є природним лігандом рецептора, і він спершу роз'єднується на АД ії М-АРР. М-АРР є фрагментом, який взаємодіє з ОНб для активації аксональної дегенерації в пацієнтів із хворобою Альцгеймера. Рецептор смерті 6 також відомий під низкою інших назв, таких як ТМЕВ5Е21; представник 21 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; ОНб; рецептор смерті 6, пов'язаний з ТМЕВ; антиген СО358; ВМ-018; і СОЗ358.
Зовнішні ідентифікатори для рецептора 6 смерті є такими: НИМС: 13469; Епіте7 Сепе: 27242;
Епзетбі: ЕМ5СИ00000146072; ОМІМ: 605732; ОпіРтоїКкВ: 075509.
ВАМК є рецептором ВАМК- ліганду (ВАМКІ) і частиною сигнального шляху
ВАМК/ВАМКІ/ОРС, який регулює диференціацію й активацію остеокластів. Він пов'язаний із ремоделюванням і загоєнням кісток, функцією імунних клітин, розвитком лімфатичних вузлів, терморегуляцією та розвитком молочних залоз. Остеопротегерин (ОРС) є рецептором-пасткою
Зо для ВАМК і регулює стимулювання сигнального шляху НАМК шляхом конкурування за ВАМКІ..
Цитоплазматичний домен ВАМК передає сигнали до розміщених нижче мішеней, таких як МЕ-кВ і /МК. ВАМК експресується в скелетних м'язах, тимусі, печінці, товстій кишці, тонкій кишці, надниркових залозах, остеокластах, епітеліальних клітинах молочної залози, простаті, клітинах судин і підшлунковій залозі. Активація МЕ-кВ часто опосередковується ВАМКІ, однак надмірна експресія тільки ВАМКІ може також активувати шлях МЕ-кВ. ВАМК відомий під низкою різних назв, таких як: ТМЕВЗЕТТ1А; представник 11а над родини рецепторів фактора некрозу пухлини, активатор МЕКВ; втрата гетерозиготності, 18, область 1 хромосоми; рецептор фактора диференціації остеокластів; активатор рецептора МЕ-КВ; кістковий фактор 2 хвороби Педжета; рецептор фактора диференціації остеокластів (ООЕРН); представник 11а над родини рецепторів фактора некрозу пухлини, МЕКВ-активатор; представник 11а над родини рецепторів фактора некрозу пухлини, активатор МЕКВ; активатор рецептора ядерного фактора-каппа В; антиген
Ср2г65; !ОнНІВСА1; ТВАМСЕН; СО265; ОРТВ7; О5Т5; РОВ2; фактор сімейного експансивного остеолізу (ГЕО) і фактор остеолізу сімейного експансивного (ОРЕ). Зовнішні ідентифікатори для
ВАМК: НОМС: 11908; Епше? Сепе: 8792; Епзетрі: ЕМ5О0200000141655; ОМІМ: 603499 і
ОпіРтоїкВ: 0ОУ6Об.
Рецептор фактора, що активує В-клітини, (ВАЕЕ), є мембранним білком над родини рецепторів ФНП, який розпізнає ВАБЕ. Фактор, що активує В-клітини (ВАЕЕ), покращує виживання В-клітин іп міїго і є регулятором популяції периферичних В-клітин. Рецептор ВАЕЕ є рецептором для ВАЕБЕ і трансмембранним білком типу ПІ, що містить один позаклітинний домен, багатий на фенілаланін. Вважається, що цей рецептор є головним рецептором, що необхідний для ВАРЕ-опосередкованого виживання зрілих В-клітин. ВАЕРЕ також зв'язується антигеном дозрівання В-клітин (ВСМА) рецепторів ФНП і трансмембранним активатором і білком, що взаємодіє з кальціймодулюючим лігандом циклофіліну (ТАСІ). Рецептор ВАЕРЕ відомий під низкою різних назв, таких як ТМЕНЗЕ1З3С; представник 13С над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; рецептор фактора, який активує В-клітини; рецептор З ВІ у5; ВАЕЕ-В; ВАРЕВ; рецептор фактора, який активує В-клітини; антиген СО268; Ргоїїхіп; ВВОМІХ; СО268; СМІО4; і
ВАЗ. Зовнішні ідентифікатори для рецептора ВАЕРЕ такі: НОаМС: 17755; Епігте7 Сепе: 115650;
Епзетбі: ЕМ5С100000159958; ОМІМ: 606269; і ОпіРтоїкКВ: 09683.
Антиген дозрівання В-клітин (ВСМА) є рецептором поверхні клітини з над родини рецепторів бо ФНП, який розпізнає фактор активації В-клітин (ВАРЕ). Рецептор переважно експресується на зрілих В-лімфоцитах і вважається важливим для розвитку В-клітин та автоіїмунної відповіді.
Рецептор продемонстрував здатність специфічно зв'язуватися з представником 130 (ТМЕ5ЗЕ1ЗВ/ТАГІ -1/ВАРЕ) надродини фактора некрозу пухлини (ліганду) і призводити до активації МЕ-Каррав і МАРКВ/МК. Антиген дозрівання В-клітин також відомий під низкою інших назв, таких як ТМЕВБЗЕ17; представник 17 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; білок дозрівання В-клітин; ВСМ; фактор дозрівання В-клітин; антиген СО269; ТМЕН5Е1ЗА; і
СОр269. Зовнішні ідентифікатори для ВСМА є такими: НЕОМС: 11913; Епіте7 Сепе: 608; Епзетрі:
ЕМ5ЗСОСО0000048462; ОМІМ: 109545; і ОпіРтоїКкВ: 002223.
Трансмембранний активатор і білок, що взаємодіє з кальціймодулюючим лігандом циклофіліну (ТАСІ). Білок, який кодується цим геном є лімфоцитспецифічним представником над родини рецепторів фактора некрозу пухлини (ФНП). Він взаємодіє з модулятором кальцію та лігандом циклофіліну (САМІ). Білок може також зв'язувати ВАРЕЕ і ліганд, який індукує проліферацію (АРАВІЇ) (ТМЗЕ13 або СО0256). ТАСІ індукує активацію транскрипційних ядерних факторів активованої Т-клітини (МЕАТ), АРТ ії МЕ-Карра-В і відіграє роль у гуморальному імунітеті шляхом взаємодії з лігандом ФНП. Миші з недостатністю ТАСІ мають збільшену кількість В-клітин селезінки й імуноглобулінів сироватки, що може свідчити про можливу роль негативної регуляції ТАСІ щодо виживання В-клітин. Однак простішим поясненням може бути те, що недостатність ТАСІ зумовлює більшу доступність циркулюючого ВАЕЕ, який може зв'язуватися з ВАЗ і збільшувати кількості В-клітин. Захворювання, пов'язані з ТАСІ, включають імунодефіцит, варіабельний некласифікований, 2 та імуноглобулінову недостатність 2. Ген, який кодує ТАСІ, розміщений у області синдрому Сміт - Магеніс на хромосомі 17. ТАСІ також відомий під низкою інших назв, таких як ТМЕВЗЕ1ЗВ, представник 13В над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; трансмембранний активатор та інтерактор кальціймодулюючого ліганду циклофіліну (САМІ); рецептор 138 фактора некрозу пухлини; антиген СО2б7; ТМЕВЗЕ148; бОр267; СМІр2; ІСАО02; варіабельний некласифікований імунодефіцит (СМІОВ); і ВЖА2М 3. Зовнішні ідентифікатори для ТАС! є такими: НОМС: 318153; Епігєї Сепе: 23495; Епзетрі:
ЕМ5ЗСОСО00000240505; ОМІМ: 604907; і ОпіРтоїКкВ: 014836.
ТАОМ експресується під час ембріонального розвитку. При його надмірній експресії в клітинах була продемонстрована його здатність активувати сигнальний шлях /МК. Активація
Зо рецептора може індукувати апоптоз. Вважається, що рецептор відіграє роль у ембріональному розвитку. Були описані варіанти альтернативного сплайсингу транскрипту, які кодують різні ізоформи. ТВОМ також відомий під низкою інших назв, таких як ТМЕВ5Е19; представник 19 над родини рецепторів фактора некрозу пухлини; індуктор токсичності та МК; ТААОЕ; ТА); ї ТА0- альфа. Зовнішні ідентифікатори для ТОМ є такими: НОМС: 11915; Епігтє2 Сепе: 55504;
Епзетбі: ЕМ5С100000127863; ОМІМ: 606122; ії ОпіРтІікКВ: 09М568.
Родина В7 містить ряд структурно пов'язаних білків клітинної поверхні, які зв'язуються з рецепторами на лімфоцитах, що регулюють імунні відповіді. Активація лімфоцитів стимулюється взаємодією розміщених на клітинній поверхні антигенспецифічних Т-клітинних рецепторів або В-клітинних рецепторів. Додаткові сигнали, які одночасно забезпечуються лігандами В7, додатково визначають імунну відповідь цих клітин. Ці так звані "костимуляторні" або "коінгібіторні" сигнали забезпечуються представниками родини В7 через рецептори родини
СОр28 на лімфоцитах. Зв'язування представників родини В7 з костимуляторними рецепторами посилює імунні відповіді, а зв'язування з коінгібіторними рецепторами послаблює імунні відповіді. Наданий час вважається, що до цієї родини належать такі представники: В7.1 (СО80),
В7.2 (2086), індуцибельний костимуляторний ліганд (ІСО5-І), ліганд програмованої смерті клітин-1 (РО-І 1), ліганд програмованої смерті клітин-2 (РО-І2), В7-НЗ (Сб0276), В7-Н4, В7-Н5,
В7-Нб ї В7-Н7. Представники родини В7 експресуються в лімфоїдних і нелімфоїдних тканинах.
Вплив представників на регуляцію імунних відповідей продемонстрований у розвитку імунодефіцитних і автоїмунних захворювань у мишей із мутаціями в генах родини В7.
Маніпулювання сигналами, які передаються лігандами В7 продемонструвало потенціал у лікуванні автоїмунних реакцій, запальних захворювань і раку.
Зв'язувальна молекула або антитіло, або його варіант згідно з винаходом, що зв'язує позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП і позаклітинну частину представника родини В7, забезпечує перевагу, яка полягає в тому, що бажана імунна відповідь може бути особливо добре стимульована, оскільки представники родини В7 передають "костимуляторні" або "коінгібіторні" сигнали до лімфоцитів, таким чином посилюючи або послаблюючи імунну відповідь. Тому шляхом спрямування представника родини В7 можна посилювати стимуляторні сигнали й/або нейтралізувати інгібіторні сигнали, таким чином індукуючи або посилюючи бажану імунну відповідь, наприклад проти аберантних клітин.
СОВ80 є білком, що знаходиться на активованих В-клітинах і моноцитах, який забезпечує костимуляторний сигнал, необхідний для активації й виживання Т-клітин. Це ліганд для двох різних білків на поверхні Т-клітини: СО28 і СТІ А-4. При зв'язуванні з СО28 він пов'язаний із костимулюванням, тоді як зв'язування з СТІ А4 пов'язане з посиленням імунної відповіді. СО80 активує Т-клітини в тандемі з СО86. Відзначено, що СО80 також зв'язує РО-І1. СО80 відомий під низкою інших назв, таких як молекула СО80; антиген СО80; ліганд 1 антигена СО28; антиген
В7-1; антиген В7 активації В-лімфоцитів; СТІ А-4-протирецептор В7.1; антиген В7-1 активації;
Ср2гв8іс1; СбО281с; ГАВ7; ВВ1; В7; костимуляторний фактор СО80; антиген СО80; і В7-1.
Зовнішні ідентифікатори для СО80 є такими: НОМС: 1700; Епіг72 Сепе: 941; Епзетрі:
ЕМ5ЗОа00000121594; ОМІМ: 112203; ії ОпіРгоїКкВ: РЗЗ681.
СО86б є білком, що експресується на анти ген презентуючих клітинах. Він може забезпечувати костимуляторні сигнали для активації й виживання Т-клітин. Це ліганд для двох різних білків на поверхні Т-клітини: СО28 і СТІ А-4. При зв'язуванні з СО28 він пов'язаний із костимулюванням, тоді як зв'язування з СТІ А4 пов'язане з посиленням імунної відповіді. СО8б6 активує Т-клітини в тандемі з СО80. Він відомий під низкою різних назв, таких як молекула
СО86; антиген СО86; ліганд 2 антигена СО28; антиген В7-2; СТІ А-4-протирецептор В7.2;
Ср2гв8і 22; ГОМ-1; ВО63; В70; антиген В7-2 активації В-лімфоцитів; антиген В7-2 В-лімфоцитів; антиген В7-2 активації; антиген СО86; ГАВ72; і В7-2. Зовнішні ідентифікатори для СО86 є такими: НОМС: 1705; Епіге2 Сепе: 942; Епзетрі: ЕМ5С00000114013; ОМІМ: 601020; і ОпіРгоїКкВ:
Р4А2081.
Індуцибельний костимуляторний ліганд Т-клітини (СбО5І або СО275) конститутивно експресується антигенпрезентуючими клітинами (АПК), а також низкою не гематологічних тканин. Експресія може зменшуватися внаслідок запалення, що триває. На даний час відомо, що в людей ІСОБІ взаємодіє з ІСО5, СО28 і СТІ А-4. Ймовірно, взаємодія. ІСОБІ /С028 костимулює первинні відповіді Т-клітин людини до алогенних антигенів і відповіді відтворення з пам'яті. Вважається, що ІСОБІ/СТІ А-4 призводить до коінгібіторних сигналів. ІСОБІЇ також відомий як ІСОБІ С; білок 1, пов'язаний із В7; гомолог 2 В7; В7-подібний білок 150; гомолог 2
В7; В7ВР-1; В7-Н2г; В7ВРІ; В7Н2; трансмембранний білок В7-Н2 ліганд ІСО5; антиген СО275;
КІААОб653; ІСО5-ЇІ ; 1 ІСО5; і СІ 50. Зовнішні ідентифікатори для ІСОБ5І є такими: НОаМС: 17087;
Зо Епіте? Сепе: 23308; Епзетрі: ЕМ50200000160223; ОМІМ: 605717; і ОпіРтоїКкВ: 075144.
РО-І1 є трансмембранним білком типу 1, який відіграє роль у пригніченні імунної відповіді під час певних явищ, таких як вагітність, тканинні алотрансплантати, автоїмунне захворювання й інші захворювання, такі як гепатит. РО-І1 експресується в різних типах злоякісних новоутворень, особливо при М5СІС (Воїапа єї аїЇ., 2013; МеїЇсНеїї єї аї., 2014), меланомі, нирковоклітинній карциномі, раку шлунку, гепатоцелюлярній карциномі, а також при різних лейкеміях і множинній мієломі (Вегпвівіп еї аїІ., 2014; Тпотрзоп еї аї., 2005). РО-І1 присутній у цитоплазмі та плазматичній мембрані ракових клітин, але не всі злоякіСН1 новоутворення або не всі клітини в пухлині експресують РО-І1 (опо еї аї., 2002). Багато клітин мікрооточення пухлини сприяють імунній супресії шляхом посилення експресії РО-1І1. Цей ефект називається "адаптивною імунною резистентністю", оскільки пухлина захищає себе шляхом індукції РО-11 у відповідь на ІЕМ-у, що виробляється активованими Т-клітинами (ЗНпатта еї аї!., 2017). РО-/ 1 також може регулюватися онкогенами, цей механізм відомий як "вроджена імунорезистентність" (Акбрау єї а!., 2013). У мікрооточенні пухлини РО-11 також експресується на мієлоїдних клітинах і активованих Т-клітинах (Титенй єї аїЇ,, 2014). Експресія РО-Ї1 індукується багатьма прозапальними молекулами включно з типами І! ї Ії ІЕМ-у, ФНП-а, ліпополісахаридом (І РБ), гранулоцитарно-макрофагальним колонієстимулюючим фактором 2М-С5Е і фактором росту ендотелію судин (МЕС), а також цитокінами ІІ-10 і Ії -4, найсильнішим індуктором серед яких є
ІЕМ-у (Копоао єї аї!., 2010; 52п0ї апа Спеп, 2013).
Зв'язування РО-І1 із РО-1 або В7.1 (СО80) передає інгібіторний сигнал, який зменшує проліферацію Т-клітин, що експресують РО-1. Вважається, що РО-1 здатний шляхом апоптозу контролювати накопичення специфічних до чужорідного антигена Т-клітин. РО-1 експресується низкою ракових клітин, і його експресію вважають принаймні частково відповідальною за пригнічення імунної відповіді до ракових клітин. РО-1 є представником родини В7 білка та відомий під низкою інших назв, таких як молекула СО274; антиген СО274; гомолог 1 В7; ліганд 1
РОСО1; РОСОТІ Сс1; РОСО111; В7НІ; РОІ 1; ліганд 1 програмованої смерті клітин 1; ліганд 1 програмованої смерті клітин; В7-НІ; ії В7-Н. Зовнішніми ідентифікаторами для СО274 є такі:
НОМО: 17635; Епігє2 Сепе: 29126; Епзетрі: ЕМ50200000120217; ОМІМ: 605402; ОпіРгоїКкВ: 09297.
РО-ії2 є другим лігандом для РО-1. Взаємодія РО-1 із РО-І2 викликає пригнічення бо опосередкованої рецептором Т-клітин (ТОВ) проліферації та продукції цитокінів Т-клітинами бСОра4ч. За низьких концентрацій антигена зв'язування РО-І 2/РО-1 інгібує сигнали В7-С028. За високих концентрацій антигена зв'язування РО-Ї 2/РО-1 знижує утворення цитокінів. При обробці інтерфероном гамма посилюється експресія РО-Ї на антигенпрезентуючих клітинах. Він експресується в деяких здорових тканинах і в низці пухлин. Вважається, що РО-11 ї РО-І2 мають подібні функції та регулюють відповіді Т-клітин. Білок відомий під низкою інших назв, таких як ліганд 2 програмованої смерті клітин 1; молекула дендритної клітини В7; ліганд 2 програмованої смерті клітин; бутирофілін В7-ЮОС; ліганд 2 РОСОТ1; ліганд 2 РО-1; РОСО112; В7- оС; СбО273; В70ОС; РОІ2; РО-1-ліганд 2; антиген СО273; ВАБ74Е11.2; і Відйс. Зовнішні ідентифікатори для РО-Ї2 є такими: НОМС: 18731; Епігбєї Сепе: 80380; Епзетрі:
ЕМ5ЗСОО00000197646; ОМІМ: 605723; і ОпіРтікКВ: 098051.
Експресія В7-НЗ (00276) підвищена при різних злоякісних захворюваннях і може відрізнятися між нормальними циркулюючими ендотеліальними клітинами й такими клітинами, що походять від пухлини (Кгаап еї а! ВійївзА доцтпаї ої Сапсег (2014) 111, 149-156).
Стимулювання рецепторів скеровує диференціацію стромальних клітин кісткового мозку людини в остеобласти (Хи єї а! 2011; Іттипобіооду 216 (2011) 1311-1317). У людей білок містить 4 Ід- подібні домени, тоді як білок у мишей, імовірно, має 2 такі домени. Вважається, що білок є першим ідентифікованим лігандом для рецептора запуску, який експресується на транскрипті 2, подібному до мієлоїдних клітин (ТВЕМ) (ТІ Т-2 або ТАЕММІ2). Останній білок зв'язує В7-НЗ (41д-87-НЗ) і костимулює активацію Т-клітин СО8 (Ноїтеуег єї а! 2009 РМАБЗ 105; 10277-10278). 60276 широко експресується. Він виступає в ролі костимулятора Т-клітин. СО276 також відомий під низкою інших назв, таких як молекула СО276; костимуляторна молекула; антиген СО276; гомолог З В7; 41д-87-НЗ; В7-НІЗ; В7НЗ; і В7ВР-2. Зовнішні ідентифікатори для
СО276 є такими: НОМС: 19137; Епіте? Сепе: 80381; Епзетрі: ЕМ5С00000103855; ОМІМ: 605715; і ОпіРгоїкВ: 0527 РАЗ.
Вважається, що мРНК 8В7-Ні4 (МТОМІ) широко експресується, але тільки деякі клітини активно експресують білок на мембрані. Експресія та зв'язування В7-Ні4 з активованими Т- клітинами пригнічує Т-клітинну ефекторну функцію шляхом зупинки клітинного циклу, зниження проліферації та зменшення продукції І -2. Стимулювання В7-НА на поверхні ракових клітин та імуносупресивних макрофагах, пов'язаних із пухлиною (ТАМ), відбувається в різних видах
Зо злоякісних новоутворень у людини. Сигналізація через шлях В7-Н4 призводить до інгібування
ТОВ-опосередкованої проліферації Т-клітин СО4-- і Ов, перебігу клітинного циклу та продукції
І/-2. ЩВ7-Н4 також відомий під низкою інших назв, таких як інгібітор 1 активації Т-клітин, який містить домен М-5еї; імунний костимуляторний білок В7-Н4; Т-клітинна костимуляторна молекула В7х; представник 1 над родини В7; гомолог 4 В7; В7п.5; В7Н4; костимуляторна молекула В7х Т-клітин; представник родини В7, Н4; білок В751; РО 1291; МСТМ1; В751; ВХ; і
НА 2. Зовнішні ідентифікатори для В7-НА є такими: НаМС: 28873; Епігте7 Сепе: 79679; Епзетрі:
ЕМ5ЗСОО00000134258; ОМІМ: 608162 і ОпіРтоїКкВ: 072703.
В7-Н5 (МІЗТА) є представником родини В7 із молекулярною масою 55-65 кДа. Він є трансмембранною молекулою, що експресується в кістках, на ембріональних стовбурових клітинах (Е5С) і на поверхнях пухлинних клітин. На пухлинних клітинах цей білок одночасно сприяє експресії й активності МТ1-ММР і слугує субстратом для МТ1-ММР. Це збільшує потенціал рухливості клітин. Білок відомий під низкою інших назв, таких як відкрита рамка зчитування 54 хромосоми 10, імунорегуляторний рецептор, який містить домен М-5еї М- доменний Ід супресор активації Т-клітин; стрес-індукований секретований білок-1; бізр-1; 5ІЗР 1; стрес-індукований секретований білок 1; тромбоцитарний рецептор (124; тромбоцитарний рецептор (124; домен смертіальфа; ООТаїрна; В7Н5; і Сс1І24. Зовнішніми ідентифікаторами для білка є: НОМС: 30085; Епігте?2 Сепе: 64115; Епзетрі: ЕМ5С00000107738; ОМІМ: 615608; і
ОпіРгоїкв: О9Н7МО.
В7-Нб належить до родини В7 (див. МІМ 605402) і селективно експресується на пухлинних клітинах. Зв'язування В7-Нб із МКр3О (МСАЗ; МІМ 611550) призводить до активації природних клітин-кілерів (МК) та до цитотоксичності (Вгапаії еї аїІ., 2009 У Ехр Мед. 2009 ди! 6;206(7): 1495- 503). Природні клітини-кілери (МК)- це лімфоцити вродженого імунітету, які беруть участь у знищенні пухлин. В7-Нб є молекулою поверхні пухлинної клітини, яка зв'язує МКрзо - рецептор людини, який викликає протипухлинну цитотоксичність МК- клітин і секрецію цитокінів. ІНШИМИ назвами для В7-Нб є: МСВЗІ С1; ліганд 1 рецептора З цитотоксичності природної клітини-кілера; гомоОлог 6 В; в7нб; передбачуваний Ід- подібний доменвмісний білок
ОКЕ2рб86024166/ОКЕ7рбв6І21167; і ОКЕ2рб86024166. Зовнішні ідентифікатори для В7-Нб є такими: НаИМС: 42400; Епігє7 Сепе: 374383; Епзетрі: ЕМ5С00000188211; ОМІМ: 613714; і
ОпіРгоїкв: 068085.
Білок В7-Н7 (ННІ Аг) було виявлено на трофобластичних клітинах плаценти й епітелії кишечника, нирок, жовчного міхура та молочних залоз, однак не в більшості інших органів. Білок
ННГА?2 широко експресується в злоякісних новоутвореннях людини в тканинах молочної залози, легені, щитоподібної залози, меланоми, підшлункової залози, яєчника, печінки, сечового міхура, товстої кишки, простати, нирки та стравоходу. Інтенсивна експресія ННІ А2 пов'язана з метастазами в регіонарні лімфатичні вузли та стадією (дапакКігат єї аї. Сіїп Сапсег Вев; 21(10): 2359-66; Мау 15, 2015). ТМІ2О2 визначають як один із рецепторів для ННІ А2. В7-Н7 відомий під низкою різних назв, таких як: НЕНВМ-Н І ТВ- асоційований 2; білок 2, асоційований з довгим кінцевим повтором ендогенного ретровірусу-Н людини; В7Н? і В7у. Зовнішні ідентифікатори для
В7-Н7 є такими: НаОМС: 4905; Епігте? Сепе: 11148; Епзетрі: ЕМ50200000114455; ОМІМ: 604371 і
ОпіРгоїкВ: 0О9О0М44.
Білок програмованої смерті клітин 1 (РО-1) є рецептором клітинної поверхні, що належить до родини рецепторів СО28 і експресується на Т-клітинах або про-В-клітинах. На даний час відомо, що РО-1 зв'язує два ліганди: РО-І1 ї РО-І2. РО-1, який функціонує як імунна контрольна точка, відіграє важливу роль у пригніченні імунної системи шляхом інгібування активації Т-клітин, що, в свою чергу, пригнічує автоїмунність і сприяє автотолерантності. Вважається, що інгібіторний вплив РО-1 досягається через подвійний механізм стимулювання апоптозу (програмованої смерті клітин) в антигенспецифічних Т-клітинах у лімфатичних вузлах за одночасного зменшення апоптозу в регуляторних Т-клітинах (Т-супресорах). РО-1 також відомий під низкою різних назв, таких як РОСО1; програмована смерть клітини 1; сприйнятливість до системного червоного вовчака 2; білок РО-1; НРО-1; РО1; білок програмованої смерті клітини 1; антиген
Ср279; бО0279; НРО-І; НО Е1; 51 ЕВ2; ї РО-1. Зовнішні ідентифікатори для РО-1 є такими:
НОаМоС: 8760; Епігє? Сепе: 5133; Епветрі: ЕМ5ЗОаО0О0000188389; ОМІМ: 600244; ї ОпіРтоїКВ: 015116. Нові класи препаратів, які блокують активність РО-1 - інгібітори РО-1 - активують атаку імунної системи на пухлини й, таким чином, успішно використовуються для лікування деяких видів злоякісних новоутворень.
СІ ЕС1Т2А також називають представником А родини 12 домену лектину С-типу; білком лектину С-типу СІ 1-1; МІСІ; лектином 2, пов'язаним із дендритними клітинами; над родиною лектинів С-типу; мієлоїдним інгібіторним лектиноподібним рецептором С-типу; лектиноподібною
Зо молекулою-1ї С-типу; СІІ-1; ОСАІ2; СІ11; лектиноподібною молекулою 1 С-типу; ОСАЇ -2; представником 1 підродини І лектиноподібних рецепторів клітин-кілерів (КІ ВІ 1); СОЗ371 (ВакККег
А. еї а. Сапсег Вев. 2004, 64, рв843 50; обліковий номер у СепВапктМ: АУ547296; 7папд МУ. єї аІ. обліковий номер у сСепВапктТМ: Аг247788; А.5. Маїгзпаї), єї аї. ) Віої Снет 2004279, р14792- 802; обліковий номер у СепВапктМ: АУ498550; У.Нап еї аї. Віоса 2004, 104, р2858 66; Н.Рісуа, еї аі. обліковий номер у СепВапктМ: АУ426759; С.Н.СНеп, єї аї. Віоса 2006, 107, р1459 67).
Ідентифікатори: НОМС: 31713; Епіге7 Сепе: 160364; Епбзетрі: ЕМ5Оа00000172322; ОМІМ: 612088; ОпіРгтікКВ: 050029. СІЕСТ2А є антигеном, який експресується на лейкемічних бластних клітинах і на лейкемічних стовбурових клітинах при гострій мієлоїдній лейкемії (ГМЛ) включно з лейкемічними стовбуровими клітинами з відсутньою експресією СОЗ34 або з низькою експресією СОЗ4 (бічна популяція) (А.В. ВакКккег" єї а). Сапсег Нез 2004, 64, р8в443 50; Мап ВНепеп еї аі. 2007 Віоса 110:2659; Мознамег єї аІ. 2008 бієт СеїІє 26:3059). Вважається, що в інших випадках експресія СІ ЕСТ2А обмежена гематопоетичною лінією, зокрема мієлоїдними клітинами в периферичній крові та кістковому мозку, тобто гранулоцитами, моноцитами й попередниками дендритних клітин. Ще важливішою є відсутність СІ ЕСТ12А на гемопоетичних стовбурових клітинах. Цей профіль експресії робить СІ ЕС12А особливо сприятливою ціллю при
ГМЛ. Повнорозмірна форма СІЕСТ2А містить 275 амінокислотних залишків включно з додатковим внутрішньоклітинним відрізком із 10 амінокислот, який відсутній у більшості інших ізоформ, і демонструє виключно мієлоїдний профіль експресії (поверхнева експресія та рівень матричної РНК |мРНКІ). Термін "СГ ЕСТ2А або його функціональний еквівалент" означає всі (наприклад, сплайсовані й мутовані) варіанти, які згадуються вище, і їхні ізоформи, що зберігають чіткий профіль мієлоїдної експресії (як на рівні поверхневої експресії, так і на рівні
МРНК), як описано в ВакККег єї аі. Сапсег Ве 2004, 64, р8443-50 і Магїгпаї! 2004-У Віо! Снет 279(15), рі4792-802. Антитіло винаходу, що зв'язує СІ ЕС12А, зв'язує СІ ЕС12А людини. При посиланні в цьому документі на СІ ЕСТ2А посилання стосується СІ ЕСТ2А людини, якщо спеціально не вказано інше. "ЕТВІ1" або "ЕСЕВ" є представником родини чотирьох рецепторних тирозинкіназ (ВТК), які називаються Нег- або сЕгВ-1, -2, -3 і -4. ЕБЕСЕВ має позаклітинний домен (ЕСО), який складається з чотирьох субдоменів, два з яких беруть участь у зв'язуванні ліганду й один із яких залучений до гомодимеризації та гетеродимеризації. Довідкові номери, що використовуються в бо цьому розділі, стосуються нумерації посилань у списку з заголовком "Посилання, що цитуються в описі". ЕСЕВ об'єднує позаклітинні сигнали від низки лігандів для отримання різних внутрішньоклітинних відповідей. Головний шлях передачі сигналу, що активується ЕСЕВ, складається з Вабз-мітогенактивованого протеїнкіназного (МАРК) мітогенного сигнального каскаду. Активація цього шляху ініціюється залученням СтЬ2 до тирозин-фосфорильованого
ЕСЕНВ. Це призводить до активації Вах5 через Стр2-зв'язаного Наз-фактора обміну гуанінових нуклеотидів боп ої бЗемепієз5 (505). Крім того, шлях передачі сигналу РіЗ-кіназа-АКІ також активується ЕСЕНВ, хоча ця активація є значно сильнішою за наявності спільної експресії Негз.
ЕСЕВ бере участь у розвитку декількох епітеліальних злоякісних пухлин людини, особливо раку молочної залози, сечового міхура, не дрібноклітинного раку легені, раку товстої кишки, яєчника, голови та шиї й головного мозку. Було виявлено активувальні мутації в гені, а також надмірну експресію рецептора та його лігандів, що призводить до утворення автокринних активаційних петель. Таким чином, ця ВТК широко використовується в ролі мішені для терапії злоякісних новоутворень. Були розроблені як низькомолекулярні інгібітори, спрямовані на ВТК, так і моноклональні антитіла (тАбБ), спрямовані на позаклітинні ліганд зв'язувальні домени, і на даний час вони продемонстрували ряд успішних клінічних результатів, хоча здебільшого для вибраної групи пацієнтів. Обліковий номер у базі даних білла ЕСЕВ людини й гена, що його кодує: (СепВапк ММ 005228.3). Обліковий номер здебільшого наданий для отримання додаткового способу ідентифікації білла ЕСЕВ у ролі мішені, а фактична послідовність білка
ЕСЕВ, зв'язаного антитілом, може відрізнятися, наприклад, внаслідок мутації в кодуючому гені, подібному до тих, які зустрічаються в деяких злоякісних новоутвореннях тощо. При посиланні в цьому документі на ЕСЕВ посилання стосується ЕСЕВ людини, якщо не вказано інше. Антиген зв'язувальний сайт, який зв'язується з ЕСЕВ, зв'язує ЕСЕНВ і низку його варіантів, таких як ті, що експресуються на деяких ЕСЕВ- позитивних пухлинах.
У цьому документі термін "ЕГРОВ-2" або "НЕР2" стосується білка, який у людини кодується геном ЕВВВ-2. Альтернативні назви цього гена або білка включають СОЗ340; НЕВ-2; НЕВ-2/пеєи;
МІ-М 19; МЕО; МО; ТКА. Ген ЕВВВ-2 часто називають НЕВАЗ (від "рецептор 2 епідермального фактора росту людини"). При посиланні в цьому документі на Е(В-2 посилання стосується
ЕпЬВ-2 людини. Антитіло, що містить антиген зв'язувальний сайт, який зв'язує ЕгОВ-2, зв'язує
ЕтВ-2 людини. Внаслідок подібності послідовності та третинної структури між ортологами
Зо людини та ссавця антиген зв'язувальний сайт Еї0бВ-2 може зв'язувати такий ортолог, але не обов'язково. Облікові номери в базі даних білка Е(В-2 людини й гена, що його кодує: (МР 001005862.1, МР 0044392 МС 00001710 МТ 010783.15 МС 018928.2). Облікові номери здебільшого надані для забезпечення додаткового способу ідентифікації ЕТОВ-2 у ролі мішені, а фактична послідовність білка ЕгЬВ-2, зв'язаного з антитілом, може змінюватися, наприклад, у результаті мутації кодуючого гена, подібного до тих, які зустрічаються при деяких злоякісних новоутвореннях тощо. Антиген зв'язувальний сайт ЕгпВ-2 зв'язує ЕпВ-2 і множину його варіантів, подібних до тих, що експресуються деякими ЕгбВ-2-позитивними пухлинними клітинами.
У цьому документі термін "ЕГРОВ-3" або "НЕВЗ" стосується білка, який у людини кодується геном ЕВВВ-3. Альтернативними назвами гена або білка є НЕНЗ; І СС52; МОА-ВЕ-1; с-ЕгтЬВ-3; с-егтрр-3; егрр-3-5; р180-ЕгрЬ-3; р45-5ЕтЬр-3; і рв5-5ЕтЬр-3. При посиланні в цьому документі на
ЕїВ-3 посилання стосується ЕТтОВ-3 людини. Антитіло, що містить антиген зв'язувальний сайт, який зв'язує ЕтОВ-3, зв'язує ЕТОВ-3 людини. Внаслідок подібності послідовності та третинної структури між ортологами людини та ссавця антиген зв'язувальний сайт ЕВ-3 також може зв'язувати такий ортолог, але не обов'язково. Облікові номери в базі даних білка ЕГОВ-3 людини й гена, що його кодує: (МР 001005915.1 МР 0019732, МС 00001211 МС 0189232
МТ 029419.12). Облікові номери в першу чергу надані для забезпечення додаткового способу ідентифікації ЕГОВ-3 у ролі мішені, а фактична послідовність білка ЕГТЬВ-3, зв'язаного антитілом, може змінюватися, наприклад, у результаті мутації кодуючого гена, подібного до тих, які зустрічаються при деяких злоякісних новоутвореннях тощо. Антиген зв'язувальний сайт ЕгВ-3 зв'язує ЕТЬВ-3 і множину його варіантів, подібних до тих, що експресуються деякими ЕгрВ-2- позитивними пухлинними клітинами.
І2Н4 є рецептором 4, що містить багатий на лейцин повтор, пов'язаний із білком а.
Альтернативними назвами для гена або білка є: СРА48; рецептор 48, пов'язаний із білком С;
ВММО17; рецептор 4, що містить багатий на лейцин повтор, пов'язаний із С- білком; рецептор 4, у якому міститься багатий на лейцин повтор, пов'язаний із (3- білком; рецептор 48, пов'язаний із
С- білком;
Білок або антитіло винаходу, що зв'язує І 284, зв'язує І 484 людини. Внаслідок подібності послідовності та третинної структури між ортологами людини та ссавця І СіВ4-зв'язувальний 60 білок або антитіло винаходу може також зв'язувати такий ортолог, але не обов'язково. Облікові номери в базі даних білка І (384 людини й гена, що його кодує: (МС 000011.10; МС 0189222;
МТ 009237.19; МР 060960.2). Облікові номери здебільшого надані для забезпечення додаткового способу ідентифікації І 84 у ролі мішені, а фактична послідовність білка І 284, зв'язаного антитілом, може змінюватися, наприклад, у результаті мутації кодуючого гена, подібного до тих, які зустрічаються при деяких злоякісних новоутвореннях тощо. Антиген зв'язувальний сайт І 284 зв'язує І СА і різні його варіанти, подібні до тих, що експресуються деякими І СН4-позитивними пухлинними клітинами.
ІЯВ5 є рецептором 5, що містить багатий на лейцин повтор, пов'язаний із білком а.
Альтернативними назвами для гена або білка є: рецептор 5, що містить багатий на лейцин повтор, пов'язаний із Сі- білком; рецептор 5, у якому міститься багатий на лейцин повтор, пов'язаний із С- білком; рецептор НОЗ8, пов'язаний із (3- білком; рецептор 49, пов'язаний із С- білком; рецептор 67, пов'язаний із С- білюом; СРАб7; аРА49; рецептор НОЗ8, пов'язаний із (- білком, що не має відомого ліганду; рецептор 49, пов'язаний із білком Сі; ЧРНА49; НОЗ8 і ЕГЕХ.
Білок або антитіло винаходу, що зв'язує І 85, зв'язує І 2485 людини. Внаслідок подібності послідовності та третинної структури між ортологами людини та ссавця І СА5-зв'язувальний білок або антитіло винаходу може також зв'язувати такий ортолог, але не обов'язково. Облікові номери в базі даних білка І 285 людини й гена, що його кодує: (МС 000012.12; МТ 029419.13;
МО 0189232; МР 001264155.1; МР 001264156.1; МР 003658.1). Облікові номери здебільшого надані для забезпечення додаткового способу ідентифікації І (385 у ролі мішені, а фактична послідовність білка І СНА5, зв'язаного антитілом, може змінюватися, наприклад, у результаті мутації кодуючого гена, подібного до тих, які зустрічаються при деяких злоякісних новоутвореннях тощо. Антиген зв'язувальний сайт І! СНА5 зв'язує ГСН85 і різні його варіанти, подібні до тих, що експресуються деякими І СА5б-позитивними пухлинними клітинами. 7МАЕЗ є "цинковим пальцем" із доменом АРМ 3. Альтернативні назви гена або білка: "цинковий палець" із доменом ВІМС З; білок, що містить цинковий палець/ВІМС З; білок 203 палець із доменом ВІМС; КІААТ133; АМЕ203; новий білок-цинковий палець (Віпд-палець) типу
СЗНнС4; ЕЗ убіквітин-протеїнлігаза 7МАЕЗ; СТА-292Е10.6; ЕС 6.3.2.; і ВК7АТЕ2.3 3.
Білок або антитіло винаходу, що зв'язує 2МАЕЗ, зв'язує 2МАЕЗ людини. Внаслідок подібності послідовності та третинної структури між ортологами людини та ссавця 2МАЕЗ-
Зо зв'язувальний білок або антитіло винаходу може також зв'язувати такий ортолог, але не обов'язково. Облікові номери в базі даних білка 2МАЕЗ людини й гена, що його кодує: (МС 000022.11;МТ 011520.13; МО 0189332; МР 001193927.1; МР 115549.2). Облікові номери здебільшого надані для забезпечення додаткового способу ідентифікації 2МАЕЗ у ролі мішені, а фактична послідовність білка 27МАЕЗ, зв'язаного антитілом, може змінюватися, наприклад, у результаті мутації кодуючого гена, подібного до тих, які зустрічаються при деяких злоякісних новоутвореннях тощо. Антиген зв'язувальний сайт 7МАЕЗ зв'язує 27МАЕЗ ії різні його варіанти, подібні до тих, що експресуються деякими 27МАЕЗ- позитивними пухлинними клітинами.
ВАМЕ43 є білком "палець ВІМО" 43. Альтернативними назвами гена або білка є: білок "ВІМО- палець" 43; ВМЕ124; ЕЗ убіквітин-протеїнлігаза АМЕ43; білок-палець ВІМО 43; ЕС 6.3.2.; ОНСС.
Білок або антитіло винаходу, що зв'язує АМЕ43, зв'язує ВМЕ43 людини. Внаслідок подібності послідовності та третинної структури між ортологами людини та ссавця АМЕ43-зв'язувальний білок або антитіло винаходу може також зв'язувати такий ортолог, але не обов'язково. Облікові номери в базі даних білка АМЕ43 людини й гена, що його кодує: (МС 000017.11; МТ 010783.16;
МО 0189282; МР 001292473.1; МР 001292474.1; МР 060233.3). Облікові номери здебільшого надані для забезпечення додаткового способу ідентифікації ВМЕ43 у ролі мішені, а фактична послідовність білка АМЕ43, зв'язаного антитілом, може змінюватися, наприклад, у результаті мутації кодуючого гена, подібного до тих, які зустрічаються при деяких злоякісних новоутвореннях тощо. Антиген зв'язувальний сайт ВАМЕ43 зв'язує ВМЕ43З і різні його варіанти, подібні до тих, що експресуються деякими АМЕ43- позитивними пухлинними клітинами
Посилання на ідентифікатори послідовностей виконується для того, щоб указати, який білок є цільовим. Зв'язувальна молекула, така як антитіло цього винаходу, також упізнає принаймні деякі його варіанти, такі як алельні варіанти, варіанти сплайсингу та його мутантні варіанти, за умови, що епітоп, який розпізнається відповідним варіабельним доменом антитіла, не зазнав впливу. Деякі з альтернативних назв також можуть застосовуватися або не застосовуватися для позначення інших білків. Назви представлені тільки з довідковою метою. Зв'язувальна молекула, така як антитіло за винаходом, зв'язується з білком у тому вигляді, у якому він експресується на клітинах. Вона також може зв'язуватися з варіантами білка за умови доступності епітопу, з яким зв'язується зв'язувальна молекула. Таким чином, сплайсингові варіанти або мутантні білки (якщо такі є) також будуть зв'язані, поки доступний епітоп. Той факт, бо що зв'язувальна молекула зв'язується з указаним білком, означає, що можливість зв'язуватися з білком є її властивістю, але не передбачає, що зв'язувальна молекула фактично зв'язана з мішенню, хоча така можливість існує. Це також не означає, що антитіло не зв'язується з іншими білками. Така перехресна реактивність наразі не відома для такої зв'язувальної молекули, як антитіло цього винаходу; однак можливість існування такої перехресної реактивності повністю не виключена.
У винаході описана зв'язувальна молекула, яка зв'язує позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНІП (перший мембранний білок) і позаклітинну частину другого мембранного білка. Указаний другий мембранний білок переважно не є представником над родини рецепторів ФНП. Така зв'язувальна молекула додатково також називається "зв'язувальною молекулою винаходу". Зв'язувальна молекула переважно є зв'язувальним білком. У переважному варіанті втілення зв'язувальна молекула є антитілом або його варіантом, переважно біспецифічним антитілом або його варіантом. Також запропоновано композиції й набори компонентів, що містять дві або більше зв'язувальних молекул, як описано в цьому документі.
Зв'язувальна молекула винаходу переважно є антитілом (або його варіантом, як описано в інших розділах цієї заявки), міметиком антитіла, поліпептидом, аптамером або їхньою комбінацією. Ці білки або аптамери, як правило, зв'язуються з однією мішенню. Зв'язувальна молекула винаходу зв'язується з однією або більше мішеней. Зв'язувальна молекула переважно зв'язує дві мішені. Варіант антитіла або біспецифічного антитіла зберігає цей аспект.
Зв'язувальні білки або аптамери мають зв'язувальні сайти (антиген зв'язувальні сайти), з якими зв'язуються мішені. Зв'язувальний білок або аптамер переважно містить два або більше доменів, які переважно мають зв'язувальний сайт для мішені (антигена), переважно один зв'язувальний сайт на домен. Такі домени переважно є варіабельними доменами антитіла або їхніми варіантами. Варіабельним доменам антитіл присвячено багато досліджень. Отримано багато варіантів, що нагадують варіабельні домени або їхні частини, які зберігають специфічність зв'язування нормального варіабельного домену. Приклади, що не мають обмежувального характеру, таких варіантів описані в інших розділах цього документа.
Слід розуміти, що будь яка комбінація цих антитіл, міметиків антитіла, поліпептидів і аптамерів може бути з'єднана разом за допомогою способів, відомих у цій галузі. Наприклад, у
Зо деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула винаходу є кон'югатом або гібридним білком.
Стосовно антитіл технологія отримання мультиспецифічних антитіл була вдосконалена й також включає біспецифічні антитіла, які мають аналогічну загальну структуру, що й нормальне моноспецифічне антитіло, але в яких кожне з двох фрагментів антитіла зв'язує різну мішень.
Міметик антитіла є поліпептидом, який, подібно до антитіл, може специфічно зв'язувати антиген, однак який структурно не пов'язаний із антитілами. Міметики антитіл, як правило, є штучними пептидами або білками з молярною масою приблизно від З до 20 кДа. Загальними перевагами над антитілами є краща розчинність, проникність у тканини, стійкість до нагрівання та ферментів і відносно низька вартість отримання. Необмежувальними прикладами міметиків антитіл є молекули-афітіла (як правило, на основі домену 7 білка А); афіліни (як правило, на основі гамма-В-кристаліну або убіквітину); афімери (як правило, на основі цистатину); афітини (як правило, на основі форми бЗас7й із БипоЇобив5 асідосаЇІдагіив); альфатіла (як правило, на основі потрійної закрученої спіралі); антикаліни (як правило, на основі ліпокалінів); авімери (як правило, на основі доменів А різних мембранних рецепторів); ОАВРІп (як правило, на основі мотиву з анкіриновими повторами); фіномери (як правило, на основі домену ЗНЗ Руп 7); пептиди з доменом Кунітца (як правило, на основі доменів Кунітца різних інгібіторів протеази); і монотіла (як правило, на основі типу ЇЇ домену фібронектину).
Монотіла є синтетичними зв'язувальними білками, які сконструйовані з використанням домену фібронектину типу ШІ (ЕМЗ) у ролі молекулярного каркаса. Монотіла є простою та надійною альтернативою до антитіл для створення мішень-зв'язувальних білків. Термін "монотіло" був запропонований у 1998 г. групою Койде, яка опублікувала першу статтю, що демонструвала концепцію монотіла з використанням десятого домену ЕМЗ фібронектину людини.
Монотіла й інші міметики антитіла, як правило, отримують із комбінаторних бібліотек, у яких різноманіття частин каркаса збільшується з використанням молекулярного дисплею та технологій спрямованої еволюції, таких як фаговий дисплей, дисплей мРНК і дріжджовий поверхневий дисплей. Велика кількість міметиків антитіла має високу афінність і високу специфічність до своїх відповідних мішеней.
Аптамери є молекулами олігонуклеотидів або пептидів, які зв'язуються зі специфічною молекулою-мішенню. Аптамери зазвичай створюють шляхом їх відбору з великого пулу бо випадкових послідовностей, однак природні аптамери також існують у рибоперемикачах.
Аптамери можна використовувати як для базових досліджень, так і з клінічною метою як макромолекули.
У цьому документі термін "кон'югат" стосується двох або більше молекул, з'єднаних ковалентно, необов'язково за допомогою зв'язувальної області. Наприклад, у деяких варіантах втілення кон'югатом є перша білкова або небілкова функціональна група, з'єднана з другою білковою або небілковою функціональною групою з допомогою зв'язувальної області.
Наприклад, у деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула цього винаходу містить або складається з двох або більше антитіл, які були ковалентно з'єднані. Кон'югат не обмежений першою та другою функціональною групою, а в деяких варіантах втілення може також мати третю, четверту або більше функціональних груп, з'єднаних додатковими зв'язувальними областями. Як описано в іншій частині цієї заявки, приклади білкових функціональних груп включають, серед іншого: поліпептид, поліпептидоміметик або антитіло (або частину антитіла, похідне або аналог, як описано в іншій частині цієї заявки). Приклади небілкових функціональних груп включають, серед іншого, аптамери. Можна застосовувати множину типів лінкерів, а відповідний лінкер буде вибраний згідно з типами молекул у кон'югаті та з урахуванням бажаних властивостей лінкерів (довжина, гнучкість, стійкість до протеазної активності й інші подібні характеристики). Такі лінкери можуть містити нуклеотиди, поліпептиди або придатний синтетичний матеріал. Наприклад, лінксер може бути пептидним лінкером. У певних варіантах втілення лінкер може бути розщеплювальним лінкером, що дозволяє відділяти частини кон'югату одна від одної. В інших варіантах втілення пептидний лінкер може бути спіралеподібним лінкером. Різні приклади й набори для з'єднування білків та інших молекул відомі в цій галузі. У цьому документі термін "гібридний білок" стосується білка, який містить два або більше поліпептидів, або білків, які були з'єднані на рівні ДНК шляхом рекомбінації й експресуються разом як один поліпептид. Гібридний білок може також містити пептидну зв'язувальну область, яка також кодується ДНК і експресується разом із гібридним білком.
Пептидний лінкер, який є частиною гібридного білка, може бути розроблений таким чином, щоб мати конкретні характеристики, такі як гнучкість, гідрофільність, стійкість до протеази, розщеплюваність тощо. Усі ці властивості можна створити в межах послідовності ДНК, а способи для створення лінкерів добре відомі в галузі. Наприклад, антитіла можна з'єднати
Зо разом із використанням способів, добре відомих у галузі і як описано в цьому документі, для утворення біспецифічних антитіл або багатоцільових антитіл. Крім того, біспецифічні антитіла можна сконструювати різними способами, відомими в галузі, наприклад, з використанням технології, такої як Вісіопісе? (див., наприклад, М/О2013/157954). Біспецифічне моноклональне антитіло (В5МАБ, В5АБ), як правило, містить зв'язувальні домени двох різних моноклональних антитіл і в результаті зв'язує два різні епітопи. Молекули Вісіопіс5"У, а також інші повнорозмірні біспецифічні антитіла (ДС мають дві різні антиген зв'язувальні специфічності, що кодуються двома різними варіабельними областями молекули повнорозмірного ІдСь ділянки Еаб фрагмента з5сгЕм. Вісіопісв можна отримати шляхом котрансфекції окремих клітин генетичними конструктами, що кодують два різні антитіла зі спільним легким ланцюгом (сі С), як показано в інших частинах цього документа. Конструювання СНЗ забезпечує ефективну гетеродимеризацію й утворення по суті чистих біспецифічних антитіл.
Зв'язувальна молекула винаходу переважно є антитілом або його варіантом. Зв'язувальна молекула винаходу переважно є біспецифічним антитілом або його варіантом.
Антитіла, як правило, зв'язують свою мішень за допомогою так званого антиген зв'язувального сайту. Не модифікований антиген зв'язувальний сайт, як правило, утворюється за допомогою варіабельного домену антитіла та присутній у ньому. Варіабельний домен містить вказаний антиген зв'язувальний сайт. Варіабельний домен, який зв'язує антиген, - це варіабельний домен, що містить антиген зв'язувальний сайт, який зв'язує антиген.
В одному варіанті втілення варіабельний домен антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга (МН) і варіабельну область легкого ланцюга (МІ). Антиген зв'язувальний сайт може бути присутній у комбінованому варіабельному домені МН/МІ, тільки в області МН або тільки в області ММ. Коли антиген зв'язувальний сайт присутній у одній із двох областей варіабельного домену, друга варіабельна область може сприяти фолдингу й/або стабільності зв'язувальної області, але не відіграє суттєвої ролі у зв'язуванні самого антигена.
У контексті цього документа "антиген зв'язувальний" стосується типової здатності антитіла зв'язуватися зі своїм антигеном. Зв'язування антитіла з антигеном можна оцінити різними способами. Одним зі способів є інкубування антитіла з антигеном (переважно з клітинами, що експресують антиген), видалення незв'язаного антитіла (переважно за допомогою стадії промивання) і виявлення зв'язаного антитіла за допомогою міченого антитіла, що зв'язується зі бо зв'язаним антитілом.
Зв'язування антигена антитілом, як правило, опосередковується через області, що визначають комплементарність (СОР), антитіла та специфічну тривимірну структуру як антигена, так і варіабельного домену, що дозволяє цим двом структурам точно зв'язуватися одна з одною (взаємодія, подібна до роботи замка та ключа), на противагу випадковому, неспецифічному злипанню білків. Оскільки антитіло, як правило, розпізнає частину антигена під назвою "епітоп антигена", і такий епітоп також може бути присутній у інших сполуках, антитіла згідно з цим винаходом також можуть розпізнавати інші білки, якщо такі інші сполуки містять той самий епітоп. Таким чином, термін "зв'язування" не виключає зв'язування антитіл з іншим білком або білками, які містять той самий епітоп. Такий (-ї) інший (-ї) білок (-ки) переважно не є білком людини.
Білок винаходу, такий як антитіло, як правило, не зв'язується з іншими білками, крім вказаного білка-мішені на мембрані клітин у постнатальному періоді, переважно в дорослої людини.
Термін "антитіло" в контексті цього документа означає білкову молекулу, яка переважно належить до імуноглобулінового класу білків, що містить один або більше варіабельних доменів, які зв'язують епітоп на антигені, причому такі домени отримані з варіабельного домену антитіла або мають з ним спільні гомологічні послідовності. Антитіла для терапевтичного застосування переважно мають якомога ближчу подібність до природних антитіл суб'єкта, що підлягає лікуванню (наприклад, антитіла людини для суб'єктів, які є людьми). Зв'язування антитіла можна виразити за допомогою специфічності й афінності. Специфічність визначає, який антиген або його епітоп специфічно зв'язаний зв'язувальним доменом. Афінність є показником сили зв'язування з конкретним антигеном або епітопом. Переважно афінність окремих фрагментів антитіл згідно з винаходом знаходиться в наномолярному діапазоні.
Антитіла, такі як біспецифічні антитіла цього винаходу, як правило, містять константні домени (Ес- ділянку) природного антитіла, які можна сконструювати, як описано в інших частинах цього документа, наприклад, для зменшення активності антитілозалежної клітинноопосередкованої цитотоксичності (АЮСС) і/або комплемент залежної цитотоксичності (СОС). Антитіло винаходу, як правило, є біспецифічним повнорозмірним антитілом, переважно підкласу ІДС людини.
Терміни "варіабельний домен", "пара МН/МІ", "МН/МІ" використовуються в цьому документі
Зо взаємозаміно. Варіабельний домен складається з варіабельного домену важкого ланцюга й варіабельного домену легкого ланцюга. Варіабельна область важкого ланцюга, як правило, утворена областю МБ, яка пройшла реаранжування. Варіабельна область легкого ланцюга, як правило, утворена областю Му, яка пройшла реаранжування. Області МОД/У) тепер також можна отримати штучно з використанням, наприклад, великої кількості інформації в послідовностях, що є доступною для функціональних антитіл.
У деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула або антитіло, або варіант згідно з винаходом містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину представника надродини рецепторів ФНП, і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула або антитіло, або варіант згідно з винаходом містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137, і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула або антитіло, або варіант згідно з винаходом містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати СО137, і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати РО-11.
У деяких варіантах втілення, зв'язувальна молекула або антитіло, або варіант згідно з винаходом має не більше ніж два антиген зв'язувальні сайти. Це означає, що антиген зв'язувальна частина такої зв'язувальної молекули або антитіла, або варіанта складається з двох антиген зв'язувальних сайтів, за відсутності додаткових антиген зв'язувальних сайтів.
Кожен із двох антиген зв'язувальних сайтів переважно містить пару ланцюгів МН/М/. імуноглобуліну. Переважно антиген зв'язувальна частина зв'язувальної молекули або антитіла, або варіанта винаходу складається з одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, їі одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати другий мембранний білок. Деякі переважні варіанти втілення є імуноглобулінами, які мають формат ІдСь що забезпечує перевагу того, що періоди напівжиття двовалентних зв'язувальних молекул/антитіл/варіантів згідно з винаходом, як правило, є більшими порівняно з мультивалентними з'єднаннями. Крім того, імуногенність двовалентних зв'язувальних молекул згідно з винаходом, як правило, є меншою порівняно з мультивалентними з'єднаннями. Молекули/антитіла/варіанти згідно з цими варіантами втілення переважно зберігають структуру природних Іда і, відповідно, зберігають усі бо переваги, пов'язані з цією структурою природних да.
У контексті цього документа термін "мультивалентний" охоплює три або більше специфічності, які, наприклад, присутні у тривалентних і чотирьохвалентних зв'язувальних молекулах.
У деяких варіантах втілення представлена зв'язувальна молекула або антитіло, або варіант згідно з винаходом, де антиген зв'язувальні сайти вказаної зв'язувальної молекули або антитіла, або варіанта складаються з одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, і одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення антиген зв'язувальні сайти вказаної зв'язувальної молекули або антитіла, або варіанта згідно з винаходом складаються з одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137, і одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати представника родини В7. У деяких варіантах втілення антиген зв'язувальні сайти вказаної зв'язувальної молекули або антитіла, або варіанта згідно з винаходом складаються з одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати СО137, і одного антиген зв'язувального сайту, який може зв'язувати РО-1 1.
У контексті цього документа термін "антиген зв'язувальний сайт" означає сайт зв'язувальної молекули або антитіла, який специфічно зв'язує епітоп антигена. Такий антиген зв'язувальний сайт переважно походить від варіабельного домену антитіла або розділяє гомологічність його послідовності, зокрема його СОВ-областей. У деяких переважних варіантах втілення вказаний антиген зв'язувальний сайт є варіабельним доменом імуноглобуліну, утвореним парою МН//. імуноглобуліну. В інших варіантах втілення вказаний антиген зв'язувальний сайт походить від міметика антитіла, такого як, наприклад, молекула афітіла, афілін, афімер, альфатіло, антикалін, авімер, САРРІп, фіномер, пептид із доменом Кунітца або монотіло, які описані вище в цьому документі.
Антитіло винаходу переважно є повно розмірним антитілом. Термін "повно розмірний" згідно з винаходом визначається як такий, що містить по суті повне антитіло без однієї або більше штучно доданих функціональних груп із розміром більше ніж 20 амінокислотних залишків, таких як, наприклад, додаткові антиген зв'язувальні сайти або додаткові сайти активації, або додаткові ліганди, або додаткові ліганд зв'язувальні функціональні групи. Проте повно розмірне
Зо антитіло не обов'язково має всі функції інтактного антитіла. Для уникнення сумнівів повно розмірне антитіло містить два важкі й два легкі ланцюги. Кожен ланцюг містить константну (С) і варіабельну (МУ) області, які можна розбити на домени під назвами СНІ, СН2, СНЗ, МН для важкого ланцюга та Сі, Мі для легкого ланцюга. Домени важких ланцюгів переважно присутні в порядку природного антитіла (МН-СНІ-СН2-СНЗ; це означає, що домен УН є прилеглим до домену СНІ, після якого йде домен СНАа і за яким слідує домен СНЗ). Домени легких ланцюгів також переважно присутні в порядку природного антитіла (МІ-СіІ; це означає, що домен МІ. є прилеглим до домену Сі). Антитіло зв'язується з антигеном через варіабельні домени, що містяться в ділянці фрагмента Бар Антитіло може взаємодіяти з молекулами та клітинами імунної системи через константні домени, головним чином через ділянку Ес. У деяких варіантах втілення антитіло винаходу є ІДС, переважно повно розмірним Ідс. Повнорозмірні антитіла є переважними завдяки своєму, як правило, сприятливому періоду напівжиття та схильності залишатися якомога ближчими до повністю автологічних (людських) молекул із причин імуногенності. У деяких варіантах втілення антитіло винаходу є повнорозмірним дат, повнорозмірним Іда2, повнорозмірним ІдДаЗ або повнорозмірним Ідся4 антитілом.
Повнорозмірні антитіла згідно з винаходом уміщують антитіла, де можуть бути присутні мутації, які надають бажані характеристики або є обгрунтованими альтернативами до таких у початковому ланцюгу. Такі мутації не повинні бути делеціями суттєвих ділянок будь-якої області. Однак антитіла, у яких була проведена інсерція, делеція або заміна, або комбінація цих дій щодо одного або більше амінокислотних залишків без суттєвої зміни антиген зв'язувальних характеристик антитіла, що утворилося в результаті, охоплюються терміном "повно розмірне антитіло". Наприклад, у константній області антитіла Ід може бути 1-20 інсерцій, замін, делецій або комбінацій цих дій щодо амінокислотних залишків.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог за винаходом переважно є біспецифічним антитілом або його функціональною частиною, похідним і/або аналогом. У переважному варіанті втілення воно є біспецифічним антитілом да зі зменшеною ефекторною функцією. У переважному варіанті втілення антитіло за цим винаходом є біспецифічним повнорозмірним антитілом. Антитіло винаходу є переважно біспецифічним повнорозмірним антитілом с, переважно мутованим у області СН2/нижній шарнірній області для зменшення ефекторної функції. Перевага надається ІДС1, який пройшов мутацію в області СН2г/нижній бо шарнірній області для зменшення ефекторної функції, з огляду на його тривалий циркуляторний період напіврозпаду в людини. Із метою попередження будь-якої імуногенності в людини перевага надається біспецифічному антитілу згідно з винаходом, яке є антитілом людини.
Термін "біспецифічний" (рб5) означає, що одна частина антитіла (як визначено вище) зв'язується з епітопом на антигені, тоді як друга частина зв'язується з іншим епітопом або на тому ж антигені, або на іншому антигені. Різні епітопи, як правило, присутні на різних антигенах.
Проте різні епітопи можуть також бути присутні та тому ж антигені. Згідно з цим винаходом указаний перший і другий антигени фактично є двома різними білками. Переважним біспецифічним антитілом є антитіло, що містить частини двох різних моноклональних антитіл і, як наслідок, може зв'язуватися з двома різними епітопами переважно на двох різних антигенах.
Залежно від рівня експресії, (суб-)клітинної локалізації та стехіометрії двох антигенів, що розпізнаються біспецифічним антитілом, обидва Рар-фрагменти антитіла можуть одночасно зв'язувати або не зв'язувати свій епітоп. Один фрагмент біспецифічного антитіла, як правило, містить варіабельний домен одного антитіла, а інший фрагмент містить варіабельний домен іншого антитіла (тобто один фрагмент біспецифічного антитіла утворений одним важким ланцюгом, спареним із одним легким ланцюгом, тоді як інший фрагмент утворений іншим важким ланцюгом, спареним із легким ланцюгом). У біспецифічних антитілах винаходу варіабельні області важкого ланцюга біспецифічного антитіла винаходу, як правило, відрізняються одна від одної, тоді як варіабельні області легкого ланцюга є переважно однаковими. Біспецифічне антитіло, у якому різні варіабельні області важкого ланцюга зв'язані з такою ж або спільною областю, варіабельну область легкого ланцюга також називають біспецифічним антитілом зі спільною варіабельною областю легкого ланцюга (сі су). Перевага надається антитілам, у яких константна область легкого ланцюга є також однаковою. Такі біспецифічні антитіла називаються антитілами, що мають спільний легкий ланцюг (сі с). Таким чином, додатково пропонується біспецифічне антитіло згідно з винаходом, у якому обидва фрагменти містять спільний легкий ланцюг.
Біспецифічні антитіла, як описано в цьому документі, переважно містять спільний варіабельний домен легкого ланцюга, переважно спільний легкий ланцюг. Термін "спільний легкий ланцюг" згідно з винаходом стосується легких ланцюгів, які можуть бути ідентичними або мати деякі відмінності в амінокислотній послідовності, тоді як зв'язувальна специфічність повно
Зо розмірного антитіла не зазнає впливу. У межах обсягу визначення спільних легких ланцюгів у контексті цього документа можливо, наприклад, підготувати або знайти легкі ланцюги, які не є ідентичними, однак є функціонально еквівалентними, наприклад, шляхом введення й дослідження консервативних змін амінокислот, змін амінокислот у областях, які не беруть участі або беруть тільки часткову участь у зв'язувальній специфічності при паруванні з важким ланцюгом тощо. Терміни "спільний легкий ланцюг", "спільний І С", "сі С", "один легкий ланцюг" із додаванням терміну "леаранжований" або без нього всі застосовуються в цьому документі взаємозамінно. Терміни "спільна варіабельна область легкого ланцюга", "спільна Мі", "спільна сі бу", "одна МІ" із додаванням терміну "реаранжована" або без нього всі застосовуються в цьому документі взаємозамінно. Переважним аспектом цього винаходу є те, що біспецифічне антитіло має спільний легкий ланцюг (варіабельну область), який може комбінуватися з принаймні двома й переважно з множиною важких ланцюгів (варіабельних областей) із різною зв'язувальною специфічністю для утворення антитіл із функціональними антиген зв'язувальними доменами (МО2004/009618, УМ/02009/157771). Спільний легкий ланцюг (варіабельна область) є переважно легким ланцюгом (варіабельною областю) людини.
Спільний легкий ланцюг (варіабельна область) переважно має послідовність генеративної лінії.
Переважна послідовність генеративної лінії є варіабельною областю легкого ланцюга, яка часто застосовується в спектрі людини та має хорошу термодинамічну стабільність, продуктивність і розчинність. Переважним легким ланцюгом генеративної лінії є 012. Спільним легким ланцюгом переважно є реаранжований легкий ланцюг каппа генеративної лінії людини Ідмк1-
З9"01ЛОаУКІТ01 (Фіг. 1А). Спільна варіабельна область легкого ланцюга - це переважно реаранжований легкий ланцюг каппа генеративної лінії людини Ідмк1-3901/С)к1701. Спільний легкий ланцюг переважно містить варіабельну область легкого ланцюга, як показано на Фіг. 18 або 10, із 0-5 амінокислотними вставками, делеціями, заміщеннями, додаваннями або їхньою комбінацією. Спільний легкий додатково містить константну область легкого ланцюга, переважно константну область легкого ланцюга каппа. Нуклеїнова кислота, яка кодує спільний легкий ланцюг може бути кодоном, оптимізованим для клітинної системи, що використовується для експресії спільного легко ланцюгового білка. Кодуюча нуклеїнова кислота може відхилятися від послідовності нуклеїнової кислоти генеративної лінії.
У переважному варіанті втілення легкий ланцюг містить область легкого ланцюга, що 60 містить амінокислотну послідовність генного сегмента 012 / ІДМк1-39701, як зображено на Фіг.
1А, із 0-10, переважно 0-5 амінокислотними вставками, делеціями, заміщеннями, додаваннями або їхньою комбінацією. Вираз "легкий ланцюг 012" буде використовуватися в усьому детальному описі як скорочена форма виразу "легкий ланцюг, який містить варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність генного сегмента О12/дмМк1-39701, як зображено на Фіг. ТА, із 0-10, переважно 0-5 амінокислотними вставками, делеціями, заміщеннями, додаваннями або їхньою комбінацією. ІдМк1-39 є скороченням для варіабельного гена 1-39 каппа імуноглобуліну. Ген також відомий як варіабельний каппа імуноглобулін 1-39;
ІСКМ139; ІКМ1-39; О12а або 012. Зовнішні ідентифікатори для гена є такими: НОМС: 5740;
Епіге2 Сепе: 28930; Епветрі: ЕМ5С200000242371. Переважна амінокислотна послідовність для
ІдМк1-39 представлена на фіг. 1Е. Сюди включена послідовність У-області. М-область можна комбінувати з однією з п'яти д-областей. На Фіг. 18 і 10 зображено дві переважні послідовності
ІдМк1-39 у комбінації з /)-областю. З'єднані послідовності вказані як МаКМ1-З39/КІ1 ії ІМКМ1-39/К5; альтернативними назвами є: ІдМк1-3901/ЛСУк1701 або Ідмк1-39'01/ЛСк5"01 (номенклатура відповідно до бази даних ІМТ у всесвітній мережі за адресою ітаї.ого).
Переважним вважається, якщо 012 / |ІДМк1-39701, що містить варіабельну область легкого ланцюга, є послідовністю генеративної лінії. Додатково переважним вважається, якщо ІСик1701 або ЛОук5"01, що містять варіабельну область легкого ланцюга, є послідовністю генеративної лінії. У переважному варіанті втілення варіабельні області легкого ланцюга ІШКМ1-39/К1 або
ІСКМ1-39/кК5 є послідовностями генеративної лінії.
У переважному варіанті втілення варіабельна область легкого ланцюга містить генеративну лінію О12/дМк1-39701. У переважному варіанті втілення варіабельна область легкого ланцюга містить легкий ланцюг каппа Ідмк1-3901/ЛСк1701 або ІдМк1-39"01/ЛСУк57"01. У переважному варіанті втілення ІдмМмк1-39"01/ЛСУк17"01. Варіабельна область легкого ланцюга переважно містить легкий ланцюг каппа генеративної лінії ІдМк1-3901/ЛСк1701 або легкий ланцюг каппа генеративної лінії ІдМк1-39701/ЛСУк5701, переважно генеративної лінії ІдМк1-3901/ЛСУк1701.
Зрілі В-клітини, які виробляють антитіло з легеим ланцюгом 012, часто виробляють легкий ланцюг, що пройшов одну або більше мутацій стосовно послідовності генеративної лінії, тобто нормальної послідовності в нелімфощних клітинах організму. Процес, відповідальний за ці мутації, часто називають соматичною (гіпер)мутацією. Утворений у результаті легкий ланцюг
Зо називають легким ланцюгом, що пройшов афінне дозрівання. Такі легкі ланцюги у випадку їхнього походження з послідовності генеративної лінії 012 є легсими ланцюгами, що походять від 012. У цьому детальному описі фраза "легкі ланцюги 012" включатиме легкі ланцюги, що походять від 012. Звичайно, мутації, які вводяться соматичною гіпермутацією, можна також вводити штучно в лабораторії. У лабораторії також можна вводити інші мутації без впливу на властивості легкого ланцюга щодо типу, не обов'язково щодо кількості. Легкий ланцюг - це принаймні легкий ланцюг О12, якщо він містить послідовність, як зображено на Фіг. 1А, Фіг. 18;
Фіг. 10 або Фіг. МЕ, із 0-10, переважно 0-5 амінокислотними вставками, делеціями, заміщеннями, додаваннями або їхньою комбінацією. У переважному варіанті втілення легкий ланцюг О12- це легкий ланцюг, що містить послідовність, як показано на Фіг. ТА; 18; 10 або 1Е, із 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4 амінокислотними вставками, делеціями, заміщеннями, додаваннями або їхньою комбінацією. У переважному варіанті втілення легкий ланцюг 012 - це легкий ланцюг, що містить послідовність, як показано на Фіг. 1А, Фіг. 18, Фіг. 10 або Фіг. 1Е, із 0-5, переважно 0-4, більш переважно 0-3 амінокислотними вставками, делеціями, заміщеннями, додаваннями або їхньою комбінацією. У переважному варіанті втілення легкий ланцюг 012 - це легкий ланцюг, що містить послідовність, як показано на Фіг. 1А, Фіг. 18, Фіг. 10 або Фіг. 1Е, із 0- 2, більш переважно 0-1, найбільш переважно 0 амінокислотних вставок, делецій, заміщень, додавань або їхньою комбінацією. У переважному варіанті втілення легкий ланцюг О12 - це легкий ланцюг, що містить послідовність, як показано на Фіг. ТА або фіг. 18, зі згаданими амінокислотними вставками, делеціями, заміщеннями, додаваннями або їхньою комбінацією. У переважному варіанті втілення легкий ланцюг містить послідовність із Фіг. ТА. У переважному варіанті втілення варіабельна область легкого ланцюга містить послідовність із Фіг. 18.
Спільний легкий ланцюг (варіабельна область) може бути легким ланцюгом лямбда, і він, таким чином, також пропонується в контексті цього винаходу, однак переважним є легкий ланцюг каппа. Константна частина спільного легкого ланцюга винаходу може бути константною областю легкого ланцюга каппа або лямбда. Вона є переважно константною областю легкого ланцюга каппа, переважно в якій вказаний спільний легкий ланцюг є легким ланцюгом генеративної лінії переважно реаранжованим легким ланцюгом каппа генеративної лінії людини, що містить генний сегмент ІДУК1-39, найбільш переважно реаранжованим легким ланцюгом каппа генеративної лінії людини ІДМК1-39701/ЛСУК1 701 (Фіг. 1). У всьому тексті заявки терміни "реаранжований легкий ланцюг каппа генеративної лінії людини Ідмк1-3901/ЛСк17017", "акмМ1-39ЛОКОТ", "легкий ланцюг НиМк1-39" або скорочено "пиМк1-39", або просто "1-39" використовуються взаємозаміно. Очевидно, фахівці в цій галузі зрозуміють, що "спільний" також стосується функціональних еквівалентів легкого ланцюга, амінокислотна послідовність якого не є ідентичною. Багато варіантів вказаного легкого ланцюга існують там, де присутні мутації (делеції, заміщення, додавання), які не впливають на формування функціональних зв'язувальних областей.
ІдМк1-39 є скороченням для варіабельного гена 1-39 каппа імуноглобуліну. Ген також відомий як варіабельний каппа імуноглобулін 1-39; І(2КМ139; І2КМ1-39; О12а або 012. Зовнішні ідентифікатори для гена є такими: НОМ: 5740; Епігї Сепе: 28930; Епзетрі:
ЕМ5ЗСОСО00000242371. Переважна амінокислотна послідовність для ІдМк1-39 представлена на Фіг. 1. Сюди включена послідовність М-області. М-область можна комбінувати з однією з п'яти .- областей. На фіг. 1 зображено дві переважні послідовності ІдМк1-39 у комбінації з дУ-областю.
З'єднані послідовності вказані як МКМ1-39/ЛК1 ії ІЯКМ1-39/К5; альтернативними назвами є:
ІдМк1-39"01/ЛСк1701 або Ідмк1-3901/ЛСк5"01 (номенклатура відповідно до бази даних ІМОТ у всесвітній мережі за адресою ітоа/ї.огу).
Спільна варіабельна область легкого ланцюга переважно з'єднана з константною областю легкого ланцюга каппа. У переважному варіанті втілення легкий ланцюг містить легкий ланцюг каппа ІдМк1-3901/ЛСУк1701 або ІдмМк1-3901/ЛСУк5"01. У переважному варіанті втілення ІдмМк1-
З9"О1/ЛОук1701.
Клітина, яка продукує спільний легкий ланцюг, може продукувати, наприклад, реаранжований легкий ланцюг каппа генеративної лінії людини Ідмк1-3901/Ск1701 і легкий ланцюг, що містить варіабельну область згаданого легкого ланцюга, гібридно з'єднаний із константною областю лямбда.
Біспецифічні антитіла або їхні варіанти, як описано в цьому документі, переважно мають одну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга/варіабельної області легкого ланцюга (МН/УУ), що зв'язує позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, і другу комбінацію МН/МІ, яка зв'язує позаклітинну частину другого мембранного білка, причому вказаний другий мембранний білок не є представником над родини рецепторів ФНП.
Зо Біспецифічні антитіла або їхні варіанти, як описано в цьому документі, переважно мають одну комбінацію варіабельної області важкого ланцюга/варіабельної області легкого ланцюга (МН/УУ), що зв'язує позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, ї другу комбінацію МН/МІ, яка зв'язує позаклітинну частину представника родини В7. Як описано в цьому документі, це надає перевагу в тому, що бажану імунну відповідь можна особливо добре посилити, оскільки представники родини В7 доставляють "костимуляторні" або "коінгібіторні" сигнали до лімфоцитів, таким чином посилюючи або послаблюючи імунну відповідь. Тому шляхом спрямування представника родини В7 можна посилювати стимуляторні сигнали й/або нейтралізувати інгібіторні сигнали, таким чином індукуючи або посилюючи бажану імунну відповідь, наприклад проти аберантних клітин.
У переважному варіанті втілення МІ у вказаній першій комбінації МН//І. є подібним до МІ. у вказаній другій комбінації МН/М/І. У більш переважному варіанті втілення МІ у першій і другій комбінаціях УН/МІ. є ідентичними. У переважному варіанті втілення біспецифічне антитіло - це повно розмірне антитіло, яке має одну комбінацію важкого/легкого (Н//) ланцюгів, що зв'язує позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, і одну комбінацію Н/. ланцюгів, що зв'язує позаклітинну частину представника родини В7. У переважному варіанті втілення легкий ланцюг у вказаній першій комбінації ланцюгів МН/МІ! є подібним до легкого ланцюга у вказаній другій комбінації ланцюгів МН//І. У більш переважному варіанті втілення легкі ланцюги у першій і другій комбінаціях ланцюгів Н/. є ідентичними.
Було опубліковано декілька способів для сприяння продукції біспецифічного антитіла або, навпаки, моноспецифічних антитіл. У цьому винаході переважним є сприяння продукції клітиною біспецифічного антитіла, а не продукції відповідних моноспецифічних антитіл. Як правило, цього досягають модифікацією константної області важких ланцюгів таким чином, що вони сприяють гетеродимеризації (тобто димеризації з важким ланцюгом іншої комбінації важкого/легкого ланцюгів), а не гомодимеризації. У переважному варіанті втілення біспецифічне антитіло винаходу містить два різні важкі ланцюги імуноглобуліну з сумісними доменами гетеродимеризації. У цій галузі були описані різні сумісні домени гетеродимеризації. Сумісні домени гетеродимеризації є переважно сумісними доменами гетеродимеризації СНЗ важкого ланцюга імуноглобуліну. Коли використовують домени СНЗ дикого типу, спільна експресія двох різних важких ланцюгів (А та В) і спільного легкого ланцюга буде призводити до утворення 60 трьох різних видів антитіла: АА, АВ та ВВ. АА та ВВ є позначеннями для двох моно специфічних, бівалентних антитіл, а АВ є позначенням для біспецифічного антитіла. Для збільшення частки бажаного біспецифічного продукту (АВ) можна застосувати конструювання
СНЗ або, іншими словами, можна використати важкі ланцюги з сумісними доменами гетеродимеризації, як визначено далі в цьому документі. У галузі описані різні методи, якими можна досягти такої гетеродимеризації важких ланцюгів. Один метод полягає у створенні біспецифічних антитіл типу "виступ у западину". Див. заявку на патент США 20030078385 (Агайпоогп 6ї аї.).
Термін "сумісні домени гетеродимеризації" в контексті цього документа стосується білкових доменів, які конструюються таким чином, що сконструйований домен А переважно формуватиме гетеродимери зі сконструйованим доменом В", а гомодимеризація між А"-А' і В'-В' навпаки є послабленою.
У патенті США О513/866,747 (тепер виданий як 05 9,248,181), 0514/081,848 (тепер виданий як 05 9,358,286) і РСТ/МІ 2013/050294 (опублікований як М/О2013/157954); включені в цей документ шляхом посилання) пропонуються способи та засоби продукції біспецифічних антитіл із використанням доменів гетеродимеризації. Ці засоби та способи можна також сприятливо застосувати в цьому винаході. Зокрема біспецифічне антитіло винаходу переважно містить мутації для продукції по суті тільки молекул біспецифічного повнорозмірного Ідс. Переважні мутації - це амінокислотні заміщення ІЗ51К і Т366К (нумерація ЄЮ) у першому домені СНЗ (важкий ланцюг "КК-варіанта") і амінокислотні заміщення І! 3510 і І1368Е у другому домені (важкий ланцюг "ОЕ-варіанта") або навпаки. У наших патентах 05 9,248,181 їі 05 9,358,286, а також у заявці РСТ М/О02013/157954 раніше було продемонстровано, що ОЕ-варіант і КК-варіант переважно попарно зв'язуються з утворенням гетеродимерів (так звані біспецифічні молекули "РЕКК")М. Гомодимеризація важких ланцюгів ОЕ- варіанта (гомодимери ОЕОЕ) майже не відбувається внаслідок відштовхування між зарядженими залишками на контактній поверхні
СНЗ-СНЗ між ідентичними важкими ланцюгами.
Біспецифічні антитіла можуть бути створені за допомогою (проміжної) трансфекції плазміди або плазмід, що кодують легкий ланцюг, і двох різних важких ланцюгів, які конструюються з СНЗ для забезпечення ефективної гетеродимеризації та утворення біспецифічних антитіл. Продукція цих ланцюгів у одній клітині призводить до схильності до утворення біспецифічних антитіл, а не
Зо утворення моноспецифічних антитіл. Переважними мутаціями для утворення по суті тільки біспецифічних повно розмірних молекул ІдСс1 є амінокислотні заміщення в позиціях 351 і 366, наприклад І! З351К ї Т366К (нумерація відповідно до нумерації ЄЮ) у першому домені СНЗ (важкий ланцюг "КК-варіанта"), і амінокислотні заміщення в позиціях 351 і 368, наприклад І 3510 і! 368Е у другому домені СНЗ (важкий ланцюг "ОЕ- варіанта"), або навпаки.
В одному варіанті втілення комбінація важкого ланцюга/легкого ланцюга, що містить варіабельний домен, який зв'язує СО137, містить варіант ОЕ важкого ланцюга. У цьому варіанті втілення комбінація важкого ланцюга/легкого ланцюга, що містить варіабельний домен, який може зв'язуватися з антигеном, відмінним від СО137, містить варіант КК важкого ланцюга. Буде очевидно, що варіант втілення винаходу може також містити варіабельний домен, який зв'язує
СО137, і містить варіант КК важкого ланцюга, а також інші варіанти, відомі фахівцям у цій галузі, які використовують для посилення гетеродимеризації з варіабельним доменом, який може зв'язуватися з антигеном, відмінним від СО1 37.
Ес- область опосередковує ефекторні функції антитіла, такі як комплементзалежна цитотоксичність (СОС), антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АЮСС) і антитілозалежний клітинний фагоцитоз (АОСР). Залежно від застосування терапевтичного антитіла або гібридного білка Ес бажаним може бути або зниження, або збільшення ефекторної функції. Знижені ефекторні функції є переважними в цьому винаході. Знижена ефекторна функція може бути бажаною, коли імунну відповідь потрібно активувати, посилити або стимулювати, як у деяких варіантах втілення цього винаходу. Антитіла зі зниженими ефекторними функціями можна використовувати для націлювання на молекули клітинної поверхні імунних клітин, серед інших.
Було виявлено, що зв'язування ідС; із Есуй5 або Сід вимагає розміщення залишків у шарнірній області та домені СН2. Дві області домену СНІ (Фіг. 20) стосуються зв'язування
ЕсувВв5 і Стд. Було продемонстровано, що заміщення в ДС! людини залишків ЇД22 в позиціях 233-236 і залишків ІДС4 в позиціях 327, 330 і 331 значно зменшують АОСС і СОС (Аптоитг евї аї., 1999. Єиг ) Іттипої. 29(8):2613-24; ЗНівЇа5 еї а!., 2001. у Віої Снет. 276(9):6591-604). Крім того,
Ідивзодіє еї а. продемонстрували, що заміщення аланіну в різних позиціях включно з КЗ22 суттєво зменшувало активацію комплементу (Ідизодіє еї а!., 2000. У Іттипої. 164(8):41 78-84.
Завдяки своїм зниженим ефекторним функціям антитіла ІдДс24 представляють підклас Ідсаї для блокування рецепторів без виснаження клітин. Молекули ІдДй4 можуть обмінювати бо напівмолекули в динамічному процесі, який називається обміном Рар-фрагмента. Це явище може відбуватися між терапевтичними антитілами й ендогенним Ід(4. Мутація 5228Р є прикладом мутації, що забезпечує зменшену здатність до обміну Гар-фрагмента. (І абгі|п. єї аї., 2009. Маї Віотесппої. 27(8):767-71.
Антитіла зі зменшеними ефекторними функціями - це переважно антитіла ІДС, що містять модифікований СНог/нижню шарнірну область, наприклад, для зменшення взаємодії Ес- рецептора або для зменшення зв'язування С14. У деяких варіантах втілення антитіло винаходу- це антитіло ІДСь; із мутантним СН2 і/або нижнім шарнірним доменом, так що взаємодія біспецифічного антитіла Ідсї їз рецептором Ес-гамма знижена. Антитіло, що містить мутантну область СН2 - це переважно антитіло ІДС21. Такий мутантний СН2 Ід і/або нижній шарнірний домен переважно містять амінозаміщення в позиції 235 і/або 236 (нумерація Е)), переважно заміщення І 2352 і/або С23З6В (Фіг. 2Е).
Варіант антитіла або біспецифічного антитіла, як описано в цьому документі, містить функціональну частину, похідне й/або аналог антитіла або біспецифічного антитіла. Варіант зберігає зв'язувальну специфічність (біспецифічного) антитіла. Функціональна частина, похідне й/або аналог зберігає зв'язувальну специфічність (біспецифічного) антитіла.
Зв'язувальна специфічність визначається здатністю зв'язувати позаклітинну частину першого мембранного білка та другого мембранного білка, як описано в цьому документі.
Функціональна частина антитіла або переважно функціональна частина біспецифічного антитіла, як описано в цьому документі, - це частина, що містить варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, і варіабельний домен, який позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка. Придатною частиною є, наприклад, фрагмент К(аб)2, що утворюється при обробці біспецифічного антитіла пепсином.
Інші частини, що містять вказані варіабельні домени, включені до цього винаходу.
Функціональне похідне антитіла або переважно функціональне похідне біспецифічного антитіла, як описано в цьому документі, - це білок, що містить варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, і варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, які з'єднані за допомогою лінкера. Варіабельні домени можуть бути варіабельними доменами як такими або фрагментами
Бар, або молекулами, подібними до варіабельних доменів, такими як одно ланцюгові
Зо фрагменти Ем, що містять МН їі Мі, з'єднані разом за допомогою лінкера. Іншим прикладом молекул, подібних до варіабельного домену, є так званий фрагмент одно доменного антитіла.
Фрагмент одно доменного антитіла (заАБ) - це фрагмент антитіла з однією мономерною варіабельною областю антитіла. Подібно до цілого антитіла він здатний селективно зв'язуватися зі специфічним антигеном. За молекулярної маси тільки 12-15 кДа фрагменти одно доменного антитіла є набагато меншими, ніж звичайні антитіла (150-160 кДа), що складаються з двох важких білкових ланцюгів і двох легких ланцюгів, і навіть меншими, ніж фрагменти Раб (- 50 кДа, один легкий ланцюг і половина важкого ланцюга) і одно ланцюгові варіабельні фрагменти (- 25 кДа, дві варіабельні області одна з легкого й одна з важкого ланцюга).
Однодоменні антитіла самі по собі не набагато менші, ніж нормальні антитіла (як правило 90- 100 кДа). Фрагменти одно доменного антитіла здебільшого конструюють із антитіл із важкими ланцюгами, знайдених у родини верблюдових; вони називаються фрагментами УНН (МапородіевзУ). Деякі риби також мають антитіла, що містять тільки важкі ланцюги (ІДМАВ, "новий рецептор антигена імуноглобуліну"), із яких можна отримати фрагменти одно доменного антитіла під назвою "фрагменти ММАВ". Альтернативний підхід полягає у розділенні на мономери димерних варіабельних доменів зі звичайного імуноглобуліну С (ІДС) від людини або миші. Хоча більшість досліджень одно доменних антитіл на даний час грунтується на варіабельних доменах важкого ланцюга, нанотіла, отримані з легких ланцюгів, також продемонстрували специфічне зв'язування з цільовими епітопами. Іншими не обмежувальними прикладами молекул, подібних до варіабельних доменів, є МНН, антитіла домену людини (дАбБз) та унітіла. Переважні функціональні частини - це частини, що містять варіабельні домени, які містять варіабельну область важкого ланцюга й варіабельну область легкого ланцюга. Не обмежувальними прикладами таких варіабельних доменів є Е(ар)- фрагменти й одно ланцюгові фрагменти Ру. Біспецифічними формами для з'єднання (подібного до) варіабельного домену є, наприклад, сироватковий альбумін людини (НБ5БА), зв'язаний із двома різними 5сЕм; біспецифічні мініантитіла, що містять два різні 5сЕм, з'єднані разом за допомогою мотивів димеризації або само зв'язувальних вторинних структур, таких як спіральні пучки або спіральні спіралі, що викликають димеризацію фрагментів 5сЕм (Моітізоп (2007) Маї. ВіоїесппоЇ! 2571233-34).
Приклади придатних лінкерів НБА та спосіб зв'язування 5сЕм із лінкером описані у
МО2009/126920.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, або переважно біспецифічне антитіло, або його функціональна частина, похідне й/або аналог згідно з винаходом переважно застосовують у людини. З цією метою антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог згідно з винаходом - це переважно людське або гуманізоване антитіло. Стійкість людини до поліпептиду регулюється багатьма аспектами. Імунітет, чи то опосередкований Т-клітинами, опосередкований В-клітинами або інший, є однією зі змінних величин, які охоплюються стійкістю людини до поліпептиду. Константна область біспецифічного антитіла цього винаходу переважно містить константну область важкого ланцюга людини, що переважно містить послідовність, як зображено на Фіг. 2; і константну область легкого ланцюга людини, що переважно містить послідовність, як зображено на Фіг. 1С. Константна область може містити одну або більше, переважно не більше ніж 10, переважно не більше ніж 5 амінокислотних відмінностей із константною областю природного антитіла людини.
Переважною є константна частина, яку повністю отримано з природного антитіла людини. Різні антитіла, утворені згідно з цим документом, отримують із простого легкого ланцюга мишей, імунізованих відповідною мішенню, як описано в М/О2009/157771. Різні антитіла, що утворені згідно з цим документом, отримують із бібліотеки варіабельних доменів антитіл людини. По суті ці варіабельні домени є людськими. Унікальні області СОВА можуть бути отримані від людини, можуть бути синтетичними або можуть бути отримані від інших організмів. Варіабельна область є принаймні варіабельною областю людини, коли вона має, за винятком областей СОН, амінокислотну послідовність, що є ідентичною до амінокислотної послідовності варіабельної області природного антитіла людини. У таких варіантах втілення МН варіабельного домену антитіла, що зв'язує представника над родини рецепторів ФНІП або мембрано зв'язаного представника родини В7, або легкий ланцюг в антитілі цього винаходу може містити одну або більше, переважно не більше ніж 10, переважно не більше ніж 5 амінокислотних відмінностей із варіабельною областю природного антитіла людини без урахування можливих відмінностей у амінокислотній послідовності областей СОВ. Такі мутації також виникають у природі в умовах соматичної гіпермутації.
Антитіла можна отримати від різних видів тварин, принаймні стосовно варіабельної області важкого ланцюга. Звичайною практикою є їх гуманізація, наприклад, варіабельних областей важкого ланцюга миші. Існують різні методи, за допомогою яких можна цього досягти, серед яких є пересадка СОМ у варіабельну область важкого ланцюга людини за допомогою 30- структури, що збігається з 30- структурою варіабельної області важкого ланцюга миші; деімунізація варіабельної області важкого ланцюга миші, переважно виконана шляхом видалення відомих або підозрюваних епітопів Т- або В-клітин із варіабельної області важкого ланцюга миші. Видалення відбувається, як правило, шляхом заміщення однієї або більше амінокислот в епітопі іншою амінокислотою (як правило, консервативною), такою, щоб послідовність епітопу модифікувалася так, щоб вона більше не була епітопом Т- або В-клітини.
Деїімунізовані варіабельні області важкого ланцюга миші мають меншу імуногенність у людини, ніж первинна варіабельна область важкого ланцюга миші. Переважно варіабельна область або домен винаходу проходить додаткову гуманізацію, таку як, наприклад, вініринг. Із використанням технологій вінірингу зовнішні залишки, які з готовністю зустрічаються імунною системою, селективно заміщують залишками людини для отримання гібридної молекули, що містить або слабо імуногенну, або по суті неімуногенну поверхню, що пройшла вініринг. У контексті цього винаходу тварина - це переважно ссавець, більш переважно примат, найбільш переважно людина.
Антитіло або біспецифічне антитіло, або його функціональна частина, похідне й/або аналог згідно з винаходом переважно містить константну область антитіла людини. Антитіла групуються в п'ять класів, або ізотипів, відповідно до відмінностей у своїх константних доменах важкого ланцюга: да, ІДдА, ІМ, Ід9ЧО і ІдЕ. Ці класи або ізотипи містять принаймні один із указаних важких ланцюгів, який позначається відповідною грецькою літерою. У переважному варіанті втілення винаходу пропонується антитіло згідно з винаходом, у якому вказана константна область вибрана з групи константних областей ІДС, тобто вибрана з групи, що складається з да, Іде, ІдаЗз ії 94. Переважно вказана константна область - це константна область Ідс4 або Ідст (Фіг. 2), більш переважно мутована константна область Ідс1. Певні варіації в константній області Ідс1 зустрічаються в природі й/(або їх допускають без змін імунологічних властивостей антитіла, що утворилося. Як правило, у константній області допускають між приблизно 1-10 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхніх комбінацій.
Можливе проведення мутації константної області як показано в цьому документі, для полегшення ефективної гетеродимеризації, для зменшення ефекторної функції або з інших бо причин, включно з періодом напіврозпаду, стабільністю тощо.
Практичні способи розвинулися в бік мінімізації вмісту залишків, що не належать людині, у контексті організму людини. Доступні різні способи успішної пересадки антиген зв'язувальної властивості антитіла на інше антитіло. Зв'язувальні властивості антитіл можуть знаходитися головним чином у точній послідовності області СОВЗ, часто підтримуються послідовністю областей СОВІ ії СОВ2 у варіабельному домені в комбінації з відповідною структурою варіабельного домену в цілому. На даний час доступні різні способи пересадки областей СОВ на відповідний варіабельний домен іншого антитіла. Деякі з цих способів розглянуті в публікації
У. б. АІтадгої апа у. Егапозоп (2008) Егопіїєтв іп Віозсієпсе 13, 1619-1633, включеній у цей документ шляхом посилання.
Варіабельна область легкого ланцюга варіабельного домену, що містить варіабельну послідовність важкого ланцюга, як зображено на Фіг. 3, є переважно легким ланцюгом генеративної лінії 012 або базується на ньому, є переважно реаранжованим легким ланцюгом каппа генеративної ліні людини Ідмк1-39'01/ЛСУк1"01 або його фрагментом або функціональним похідним (номенклатура згідно з базою даних ІМСТ у всесвітній мережі за адресою ітаї.ог9). Використовуються терміни "реаранжований легкий ланцюг каппа генеративної лінії людини ІдМк1-3901/ЛСУк1701", "сКМ1-39Лаку1", "легкий ланцюг пиМк1-39" або скорочено "пиМк1-39". Легкий ланцюг може мати 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхніх комбінацій. Згадані 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних заміщень є переважно консервативними амінокислотними заміщеннями, вставками, делеціями або їхніми комбінаціями, переважно не в області СОВЗ ланцюга МІ, переважно не в області СОВІ, СОВ2 або СОВЗ, або області ЕН4 ланцюга МІ. Переважну послідовність для спільного легкого ланцюга зображено на фіг. 1.
Для отримання біспецифічних антитіл доступні різні способи. Один спосіб включає експресію двох різних важких ланцюгів і двох різних легких ланцюгів у клітині й отримання антитіла, що продукується клітиною. Утворене таким чином антитіло буде, як правило, містити набір антитіл із різними комбінаціями важких і легких ланцюгів, деякі з яких є бажаними біспецифічними антитілами. Біспецифічне антитіло пізніше можна виділити з набору за допомогою очищення. Співвідношення біспецифічних до інших антитіл, що продукуються клітиною можна збільшити різними шляхами. У переважному варіанті втілення винаходу співвідношення збільшують експресією не двох різних легких ланцюгів, а двох по суті ідентичних легких ланцюгів у клітині. Два по суті ідентичні легкі ланцюги можуть бути легкими ланцюгами з по суті однаковими варіабельними областями легкого ланцюга та різними константними областями легкого ланцюга або переважно двома по суті ідентичними константними областями легкого ланцюга. Це поняття відоме в даній галузі ц також називається способом "спільного легкого ланцюга". Коли по суті ідентичні легкі ланцюги працюють разом із двома різними важкими ланцюгами, що забезпечує утворення варіабельних доменів із різними антиген зв'язувальними сайтами та супутніми різними зв'язувальними властивостями, співвідношення біспецифічних антитіл до інших антитіл, що продукується клітиною, суттєво покращується порівняно з експресією двох по суті різних легких ланцюгів. Співвідношення біспецифічного антитіла, що продукується клітиною, може бути додатково збільшене шляхом стимулювання попарного з'єднання двох різних важких ланцюгів один із одним замість попарного з'єднання двох ідентичних важких ланцюгів. У галузі описані різні методи, якими можна досягти такої гетеродимеризації важких ланцюгів. Переважний спосіб описаний у попередній заявці США 61/635,935, за якою було подано звичайну заявку на патент США Мо 13/866,747 і заявку РСТ Мо
РСТ/МІ 2013/050294 (М/О2013/157954 АТ), які включені в цей документ шляхом посилання.
Розкриті способи та засоби для утворення біспецифічних антитіл (від однієї клітини), на основі яких запропоновано засоби, у яких перевага надається утворенню біспецифічних антитіл над утворенням моно специфічних антитіл. Ці способи можна також сприятливо застосувати в цьому винаході. Таким чином, винахід представляє спосіб продукції біспецифічного антитіла згідно з винаходом (з однієї клітини), де вказане біспецифічне антитіло містить два домени СНЗ, які здатні утворювати контактну поверхню, причому вказаний спосіб включає забезпечення в указаній клітині а) першої молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує 1-й домен СНЗ, що містить важкий ланцюг, Б) другої молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує 2-й домен СНЗ, що містить важкий ланцюг, при цьому вказані молекули нуклеїнової кислоти запропоновані з засобами для селективного попарного з'єднання вказаних 1-го та 2-го доменів СНЗ, що містять важкі ланцюги, причому вказаний спосіб додатково включає етап культивування вказаної клітини-хазяїна й забезпечення експресії вказаних двох молекул нуклеїнової кислоти, і отримання вказаного біспецифічного антитіла з культури. Указані перша та друга молекули нуклеїнової кислоти можуть бути частиною тієї ж молекули нуклеїнової кислоти, вектора або засобу доставки генів і бо можуть бути вбудовані в один і той самий сайт геному клітини-хазяїна. Альтернативно, вказані перша та друга молекули нуклеїнової кислоти окремо постачаються в указану клітину. Клітина- хазяїн містить принаймні один легкий ланцюг і переважно спільний легкий ланцюг.
У переважному варіанті втілення пропонується спосіб для продукції біспецифічного антитіла згідно з винаходом з однієї клітини, де вказане біспецифічне антитіло містить два домени СНЗ, які здатні утворювати контактну поверхню, причому вказаний спосіб включає отримання: клітини, що має а) першу молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг, що місить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною мембранозв'язаного представника над родини рецепторів ФНПІ і який місить 1 -й домен СНЗ, і Б) другу молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує важкий ланцюг, що містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину мембрано зв'язаного другого білка і який містить 2-й домен СНЗ, причому вказані молекули нуклеїнової кислоти запропоновані з засобами селективного попарного з'єднання вказаних 1-го та 2-го доменів СНЗ, причому вказаний спосіб додатково включає етап культивування вказаної клітини й забезпечення експресії білків, що кодуються вказаними двома молекулами нуклеїнової кислоти, і отримання вказаного біспецифічного антитіла ІДС; із культури. В особливо переважному варіанті втілення вказана клітина також має третю молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує спільний легкий ланцюг. Указана перша, друга й третя молекули нуклеїнової кислоти можуть бути частиною тієї ж молекули нуклеїнової кислоти, вектора або засобу доставки генів і може бути вбудована в той самий сайт геному клітини-хазяїна. Альтернативно, вказані перша, друга й третя молекули нуклеїнової кислоти окремо постачаються в указану клітину. Переважний спільний легкий ланцюг базується на 012, переважно це реаранжований легкий ланцюг каппа генеративної лінії людини ІдМкі З9"01/СУк1701, як описано вище. Засоби для селективного попарного з'єднання вказаного 1-го та вказаного 2-го домену СНЗ - це переважно відповідні мутації в домені СНЗ кодуючих областей важкого ланцюга. Переважними мутаціями для отримання по суті тільки біспецифічних антитіл є амінокислотні заміщення І/З51К і Т366Кк (нумерація відповідно до нумерації Е)) у першому домені СНЗ і амінокислотні заміщення І 3510 і І 368Е у другому домені СНЗ або навпаки (Фіг. 2). Тому додатково пропонується спосіб згідно з винаходом для продукції біспецифічного антитіла, де вказаний перший домен СНЗ містить амінокислотні заміщення І 351К і 7366К (нумерація відповідно до нумерації Є)) і де вказаний
Зо другий домен СНЗ містить амінокислотні заміщення І 3510 і Ї368Е, причому вказаний спосіб додатково включає етап культивування вказаної клітини й забезпечення експресії білків, що кодуються вказаними молекулами нуклеїнової кислоти, і отримання вказаного біспецифічного антитіла з культури. Пропонується також спосіб згідно з винаходом для продукції біспецифічного антитіла, де вказаний перший домен СНЗ містить амінокислотні заміщення
Г3510 і 1368Е (нумерація відповідно до нумерації Е)) і де вказаний другий домен СНЗ містить амінокислотні заміщення І! З51К ії Т366К, причому вказаний спосіб додатково включає етап культивування вказаної клітини й забезпечення експресії вказаних молекул нуклеїнової кислоти й отримання вказаного біспецифічного антитіла з культури. Антитіла, які можна отримати за допомогою цих способів, також є частиною цього винаходу. Домени гетеродимеризації СНЗ - це переважно домени гетеродимеризації Ідс1. Константні області важкого ланцюга, що містять домени гетеродимеризації СНЗ, - це переважно константні області ІДС1.
Представник над родини рецепторів ФНІП (перший мембранний білок) - це переважно
Сбр137; оХ40; 040 або СОЗ30. У переважному варіанті втілення перший мембранний білок - це
СО0137 або ОХ40, переважно СО137. Зв'язувальна молекула винаходу переважно містить один (антиген) зв'язувальний сайт для вказаного першого мембранного білка. У деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула винаходу є моновалентною для вказаного першого мембранного білка. Зв'язувальна молекула переважно містить один (антиген) зв'язувальний сайт для вказаного другого мембранного білка. У деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула винаходу є моновалентною для вказаного другого мембранного білка. У деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула винаходу є моновалентною для вказаного першого мембранного білка й моновалентною для вказаного другого мембранного білка. У деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула винаходу є моновалентною для представника надродини рецепторів ФНП і моновалентною для представника родини В7. У деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула винаходу є моновалентною для СО137 і моновалентною для представника родини В7. У деяких варіантах втілення зв'язувальна молекула винаходу є моновалентною для СО137 і моновалентною для РО-11. У цій галузі відомо, що бівалентні моноклональні антитіла до СО137 активують СО137, тоді як моновалентні СО137-зв'язувальні молекули попереднього рівня техніки, як правило, не активують його.
Перший мембранний білок, як описано в цьому документі, є представником над родини 60 рецепторів ФНП, який є білком клітинної мембрани. Білок вважають мембранним білком на клітині, якщо він має трансмембранну область, яка присутня в клітинній мембрані клітини, на якій юна знаходиться. Як правило, це перша клітина, як описано в цьому документі. Білок може мати додаткові трансмембранні області. У такому випадку всі трансмембранні області, які присутні на клітинній мембрані, присутні на клітинній мембрані тієї ж клітини. Перший мембранний білок - це мембранний білок клітини, який має позаклітинну частину, коли він присутній на клітинній мембрані. Клітинна мембрана - це мембрана клітини, яка відділяє внутрішню частину клітини від зовнішньої частини клітини. Перший мембранний білок є, як правило, на клітинній мембрані першої клітини, як описано в цьому документі. У контексті зв'язувальної молекули винаходу або способу, або застосування винаходу перший мембранний білок є, як правило, на клітинній мембрані першої клітини, як описано в цьому документі.
Перший мембранний білок може бути присутній на вказаній другій клітині, але переважним є, коли експресія першого мембранного білка на вказаній другій клітині є незначною. Як правило, рівень указаного першого мембранного білка на вказаній другій клітині становить не більше 1095 порівняно з експресією першого мембранного білка на першій клітині. Друга клітина переважно не демонструє суттєвої експресії вказаного першого мембранного білка. Експресія є принаймні несуттєвою, якщо перший мембранний білок неможливо виявити (вище фонового рівня) за допомогою імунної флуоресценції в аналізі методом сортування клітин з активацією флуоресценції (ЕАС5) із антитілом, специфічним до вказаного першого мембранного білка.
Другий мембранний білок також є білком клітинної мембрани. Він має трансмембранну область, яка є присутньою в клітинній мембрані клітини, на якій вона розміщена. Як правило, це друга клітина, як описано в цьому документі. Другий білок може мати додаткові трансмембранні області. У такому випадку всі трансмембранні області, які присутні на клітинній мембрані, присутні на клітинній мембрані тієї ж клітини. Другий мембранний білок - це мембранний білок клітини, який має позаклітинну частину, коли він присутній на клітинній мембрані. У контексті зв'язувальної молекули винаходу або способу, або застосування винаходу другий мембранний білок є, як правило, на клітинній мембрані другої клітини, як описано в цьому документі. Другий мембранний білок може бути присутній на вказаній першій клітині, але переважним є, коли експресія другого мембранного білка на вказаній першій клітині є незначною. Як правило, рівень вказаного другого мембранного білка на вказаній першій клітині становить не більше 10 95
Зо порівняно з експресією другого мембранного білка на другій клітині. Перша клітина переважно не має суттєвої експресії вказаного другого мембранного білка. Експресія є принаймні несуттєвою, якщо другий мембранний білок неможливо виявити (вище фонового рівня) за допомогою імунної флуоресценції в аналізі ЕАС5 із антитілом, специфічним для вказаного другого мембранного білка.
Відповідно до деяких варіантів втілення зв'язувальна молекула або (біспецифічне) антитіло, або варіант згідно з винаходом має один антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, і другий антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати другий мембранний білок, який не є представником над родини рецепторів ФНП. Це забезпечує перевагу в тому, що активації в цис-положенні (імунних) клітин, таких як Т-клітини, що експресують декілька представників над родини рецепторів ФНП, можна принаймні частково уникнути, таким чином зменшивши можливі небажані побічні ефекти й токсичність внаслідок неспецифічної активації Т-клітин. Дані варіанти втілення цього винаходу відрізняються від підходів попереднього рівня техніки, що стосуються зв'язувальних агентів, які зв'язуються з рецепторами над родини ФНП, зокрема зв'язувальних агентів, що зв'язуються з принаймні двома різними рецепторами над родини ФНП. Такі підходи попереднього рівня техніки можуть призвести до активації Т-клітин у цис-положенні, тобто за відсутності другої мішені, і можуть бути пов'язані з ризиком надмірної відповіді Т-клітин, що призведе, наприклад, до цитокінової бурі. У результаті такі підходи попереднього рівня техніки мають збільшений потенціал появи небажаних побічних ефектів, порівняно зі зв'язувальною молекулою згідно з винаходом, що має перший антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину представника над родини рецепторів ФНП, і другий антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати мембранний білок, що не є представником над родини рецепторів ФНП.
Також пропонується антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137 або
ОХ40, ії антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину другого мембранного білка, причому вказаний другий мембранний білок не є представником над родини рецепторів ФНП. Також пропонується спосіб стимулювання активності представника над родини рецепторів ФНП на клітині, який включає забезпечення першої та другої клітини, де вказана перша клітина має вказаного представника над родини рецепторів ФНП на клітинній мембрані й 60 указана друга клітина має другий мембранний білок на клітинній мембрані, причому спосіб включає контактування вказаних клітин із антитілом або його функціональною частиною, похідним і/або аналогом, що містить два варіабельні домени, де один варіабельний домен містить перший антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину вказаного представника над родини рецепторів ФНП, а інший варіабельний домен містить другий антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, таким чином стимулюючи активність указаного представника на вказаній першій клітині; причому вказаний другий мембранний білок не є представником над родини рецепторів ФНП. У деяких варіантах втілення вказаний спосіб є способом іп міїто.
У деяких варіантах вказане антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог містить один антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати вказаного представника над родини рецепторів ФНП, і один антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати вказаний другий мембранний білок, який не є представником над родини рецепторів ФНП. У деяких варіантах антиген зв'язувальна частина вказаного антитіла або його функціональна частина, похідне й/або аналог згідно з винаходом складається з одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати позаклітинну частину вказаного представника над родини рецепторів ФНП, і одного варіабельного домену імуноглобуліну, що може зв'язувати вказаний другий мембранний білок, який не є представником над родини рецепторів ФНП. Указане біспецифічне антитіло - це переважно повно розмірне антитіло. У деяких варіантах втілення вказане біспецифічне антитіло- це повно розмірний Ідс, тобто повно розмірний Іде, Ідс2, ІЗ або Ідс4, переважно повно розмірний Ідс1 або повно розмірний Ідаса4.
Додатково пропонується антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137 або
ОХ40, і антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину другого мембранного білка, причому вказаний другий мембранний білок є представником родини В7, переважно РО-І1. Також пропонується спосіб стимулювання активності представника над родини рецепторів ФНПІ на клітині, який включає забезпечення першої клітини та другої клітини, де вказана перша клітина має вказаного представника над родини рецепторів ФНП на клітинній мембрані й указана друга клітина має другий мембранний білок на клітинній мембрані, причому спосіб включає контактування вказаних клітин із антитілом або його функціональною частиною, похідним і/або аналогом, що містить два варіабельні домени, де один варіабельний домен містить перший антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину вказаного представника над родини рецепторів ФНП, а інший варіабельний домен містить другий антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, таким чином стимулюючи активність указаного представника на вказаній першій клітині; причому вказаний другий мембранний білок є представником родини
В7, переважно РО-1| 1. У деяких варіантах втілення вказаний спосіб є способом іп міїго.
У деяких варіантах втілення вказане антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог містить один антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати вказаного представника над родини рецепторів ФНП, і один антиген зв'язувальний сайт, що може зв'язувати вказаний другий мембранний білок, який є представником родини В7, переважно РО- 1. У деяких переважних варіантах втілення антиген зв'язувальна частина вказаного антитіла або його функціональна частина, похідне й/або аналог згідно з винаходом складається з одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати позаклітинну частину вказаного представника над родини рецепторів ФНП, і з одного варіабельного домену імуноглобуліну, що може зв'язувати вказаний другий мембранний білок, який є представником родини В7, переважно РО-І1. Указане біспецифічне антитіло - це переважно повнорозмірне антитіло. У деяких варіантах втілення вказане біспецифічне антитіло - це повно розмірний Ідс, тобто ІДС,
Іа, аз або да, переважно повно розмірний да або повно розмірний Ідна.
Варіабельний домен, який "блокує" зв'язування вказаного першого мембранного білка з його зв'язувальним партнером, перешкоджає зв'язуванню першого мембранного білка з указаним зв'язувальним партнером. Такий варіадбельний домен може зв'язувати перший мембранний білок. Таке блокування варіабельного домену може призвести до зв'язування епітопу на вказаному першому мембранному білку та конкурування зі зв'язувальним партнером першого мембранного білка за зв'язування епітопу. Такі блокувальний варіабельний домен і зв'язувальний партнер першого мембранного білка можуть також зв'язуватися з різними епітопами на вказаному першому мембранному білку. У таких випадках блокувальна активність може, наприклад, виникати внаслідок зменшеного зв'язування зв'язувального партнера й/або переміщення зв'язувального партнера, коли він уже зв'язаний із указаним першим мембранним білком, і/або блокування варіабельного домену може попередити зв'язування зв'язувального бо партнера з першим мембранним білком шляхом стеричної перешкоди. Усі ці й інші механізми можуть принаймні частково попереджати зв'язування вказаного зв'язувального партнера з указаним першим мембранним білком.
В одному варіанті втілення домен, що містить антиген зв'язувальний сайт, який зв'язує представника над родини рецепторів ФНП, блокує зв'язування представника з лігандом представника. Взаємодії представника над родини рецепторів ФНП з лігандом були докладно вивчені в даній галузі. Загалом відомо, що представники над родини рецепторів ФНП, як правило, мають принаймні один ліганд. Прикладами відомих пар лігандів рецепторів є рецептори ФНП рецептор 1 і 2 фактора некрозу пухлини та ліганд ФНП - альфа; рецептор ОХ40 і ліганд ОХ40І; рецептор СО40 і ліганд СО154; рецептор Раз і ліганд Равзі; рецептор СОЗО і ліганд СО153; і рецептор СО137 і ліганд СО1371Ї. У деяких варіантах втілення варіабельний домен, що містить антиген зв'язувальний сайт, який зв'язує представника над родини рецепторів ФНП, не блокує зв'язування представника з лігандом представника.
У деяких варіантах втілення домен містить антиген зв'язувальний сайт, що зв'язує представника над родини рецепторів ФНП і блокує зв'язування його цільового мембранного білка над родини рецепторів ФНП із його зв'язувальним партнером. Указаний варіабельний домен можна додатково характеризувати так, що при його забезпеченні в моно специфічному бівалентному антитілі, яке містить два вказані варіабельні домени, він не стимулює активність представника над родини рецепторів ФНП на клітині без перехресного зшивання. У деяких варіантах втілення домен, що містить антиген зв'язувальний сайт, який зв'язує представника над родини рецепторів ФНП, містить варіабельний домен, що блокує зв'язування СО137 із
СО1371, причому вказаний варіабельний домен додатково характеризують тим фактом, що при його забезпеченні в моно специфічному бівалентному антитілі, яке містить два з указаних варіабельних доменів, він не стимулює активність СО137 на клітині.
Терміни "зв'язувальні партнери"; "зв'язувальна пара"; "пара рецептора та ліганду" тощо стосуються білків, які можуть зв'язуватися один із одним і проявляти активність у результаті зв'язування. Принаймні один із партнерів або пари - це мембранний білок на клітинній мембрані клітини. Активність, як правило, проявляється на клітині, яка має цей мембранний білок на клітині.
Варіабельний домен, що блокує зв'язування специфічної зв'язувальної пари мембранних
Зо білків, як описано в цьому документі, як правило, зменшує зв'язування пари порівняно зі зв'язуванням за відсутності варіабельного домену. Це переважно вимірюють в аналізі іп міо. Як правило, це проводять шляхом інкубування варіабельного домену з мембранним білком, із яким він може зв'язуватись, і наступного інкубування суміші з іншим представником пари. Потім зв'язування пари порівнюють зі зв'язуванням пари за відсутності варіабельного домену.
Варіабельний домен може повністю попередити зв'язування першого мембранного білка з його зв'язувальним партнером. Він може також частково попередити зв'язування зв'язувальної пари.
Варіабельний домен, який блокує зв'язування специфічної зв'язувальної пари мембранних білків, переважно зменшує зв'язування пари мембранних білків на принаймні 50 95, переважно принаймні 60 95, переважно принаймні 70 956, переважно принаймні 80 95 і більш переважно принаймні 90 95 при порівнянні зі зв'язуванням за відсутності варіабельного домену. Блокування зв'язування варіабельним доменом визначається в цьому документі як блокування, яке отримують із використанням бівалентного моноклонального антитіла, що містить два аналогічні вказані варіабельні домени. Варіабельний домен безумовно також блокує зв'язування, коли він присутній в антитілі, що містить указаний варіабельний домен і варіабельний домен, який зв'язує другий мембранний білок.
Специфічні варіабельні домени, які можуть зв'язувати позаклітинну частину СО137 і які принаймні частково блокують зв'язування ліганду СО137 із СО137,- це варіабельні домени, що містять амінокислотну послідовність МН: МЕ6783; МЕ6861; МЕ6795; МЕ6808; МЕ6798; МЕ6754;
МЕ6763; МЕ6744; МЕ6785; МЕ6825; МЕ6737; МЕ6749; МЕ6788; ії МЕ6797.
Специфічні варіабельні домени, які можуть зв'язувати позаклітинну частину РО-І11 і які блокують зв'язування РОЇ із РО-1І1,- це варіабельні домени, які містять амінокислотну послідовність МН МЕ5554; МЕ5576; МЕ5578; МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5359; МЕ5377;
МЕ5382; МЕ5424; МЕ5426; МЕ5439; МЕ5442; МЕ5553; МЕ5557; МЕ5561; МЕ5576; МЕ5594; або
МЕ5708. Амінокислотні послідовності зображені на Фіг. 3.
Варіабельний домен, який зв'язує представника над родини рецепторів ФНП, - це переважно варіабельний домен, який при його забезпеченні в моно специфічному бівалентному антитілі, що містить два вказані домени, не стимулює активність представника над родини рецепторів ФНІП на клітині. У контексті бівалентного моноспецифічного антитіла вказаний варіабельний домен містить два аналогічні вказані варіабельні домени й не стимулює бо активність клітин, що містять представника над родини рецепторів ФНП.
Стимулювальну активність представника над родини рецепторів ФНП на клітині, як правило, вимірюють шляхом вимірювання біологічної активності клітини. Тип активності залежить від того, аналіз якого представника над родини рецепторів ФНП проводять. Для ОХ40 їі СО137, наприклад, може бути виміряний стан активації ОХ40- і/або СО137-позитивної Т-клітини. ОХ40 і
СО137 - це так звані костимуляторні білки, що стимулюють активацію активованої Т-клітини.
Відповідні способи для вимірювання активації Т-клітини запропоновані в розділі з прикладами.
Один спосіб призначений для вимірювання продукції ІЇ-2, ІЕМу і/або ФНПо активованою Т- клітиною або композицією, яка містить указану Т-клітину. Інші рецептори ФНП мають різну біологічну активність. Наприклад, СОЗО експресується на активованих Т- і В-клітинах і є позитивним регулятором апоптозу. Стимулювання СОЗО можна виміряти за допомогою вимірювання апоптозу активованих В-або Т-клітин у відповідь на зв'язувальну молекулу винаходу. СО40 - це костимуляторний білок, що знаходиться на антигенпрезентуючих клітинах, таких як макрофаги, а його стимулювання додатково стимулює активацію антигенпрезентуючої клітини. Активність представника над родини рецепторів ФНП стимулюється, коли активність, яку вимірюють у присутності зв'язувальної молекули, як описано в цьому документі, переважно в присутності антитіла або функціональної частини, похідного й/або аналога згідно з винаходом,
Є більшою, ніж активність, яку вимірюють в умовах з ідентичними параметрами, але за відсутності зв'язувальної молекули, переважно антитіла або функціональної частини, похідного й/"або аналога згідно з винаходом. Стимулювання активності включає індукцію активності та посилення вже наявної активності.
Стимулювальну активність СО137 або ОХ40 переважно вимірюють шляхом вимірювання біологічної активності клітини, що містить СО137 або ОХ40. Біологічна активність - це переважно стан активації клітини, що експресує СО137 або ОХ40. С0137 і ОХ40 є костимуляторними молекулами, що експресуються на імунних клітинах включно з активованими
Т-клітинами. Стимулювання активності СО137 або ОХ40 переважно вимірюють шляхом визначення рівня активації імунних клітин, наприклад активованих Т-клітин. Стимулювання активності СО137 або ОХ40 у особи переважно вимірюють шляхом вимірювання в особи активації імунних клітин і/або Т-клітин. Альтернативно, його можна також визначити шляхом, де доречно, вимірювання відповіді пухлини в особи; вірусного навантаження особи; або
Зо паразитарного навантаження особи.
У винаході також пропонується спосіб залучення й/або активації Т-клітин, що включає забезпечення системи, яка містить Т-клітину та клітину (другу клітину), до якої вказану Т-клітину потрібно залучити або активувати, і забезпечення вказаній системі принаймні одного антитіла, переважно принаймні одного біспецифічного антитіла, яке містить варіабельний домен, що може зв'язувати представника над родини рецепторів ФНП, і варіабельний домен, який може зв'язувати позаклітинну частину другого білка, і інкубування вказаної системи за умов, що дозволяють залучення й/або активацію Т-клітини. У деяких варіантах втілення вказаний спосіб є способом іп міо. Указаний представник над родини рецепторів ФНП - це переважно СО137 або
ОХ40, найбільш переважно СО137, а вказаний другий мембранний білок переважно не є представником надродини рецепторів ФНП. Указаний другий мембранний білок - це переважно представник родини В7, найбільш переважно РО-І1. Клітина, із якою буде залучатися або активуватися вказана Т-клітина, - це переважно імунна клітина (наприклад, антигенпрезентуюча клітина або макрофаг), неопластична клітина, інфікована вірусом клітина або клітина, інфікована внутріклітинним паразитом. Залучення й/або активування Т-клітин спрямовує Т- клітини до специфічної мішені. Активація Т-клітини - це активація Т-клітинного рецептора вказаної Т-клітини. Залучення Т-клітини, як правило, є активацією Т-клітини. За допомогою залучення Т-клітина також може спрямовуватися до мішені, визначеної антитілом. Умови, які забезпечують можливість залучення й/або активації вказаної Т-клітини, як правило, є умовами культури, але можуть також полягати в інкубуванні у тварини, відмінної від людини. Ці умови є такими, що Т-клітина не залучається за відсутності антитіла. Якщо вимірюється набір Т-клітин, деякі з них уже можуть бути залучені або активовані за умови, що набір містить достатню кількість Т-клітин, які не є залученими або активованими.
Антитіло винаходу може зближувати дві клітини на близьку відстань, що дозволяє взаємодію між клітинами, опосередковані білками, відмінними від представника над родини рецепторів ФНІП і другого мембранного білка, зв'язаного антитілом винаходу. Одна така взаємодія - це взаємодія рецептора Т-клітини однієї клітини та головного комплексу гістосумісності (МНС) на іншій клітині.
Указані перша та друга клітини є переважно різними клітинами. Різні клітини можуть експресувати як указаний перший, так і другий мембранний білок. Однак, як правило, перший бо мембранний білок експресується тільки на вказаній першій клітині, а вказаний другий
Зо мембранний білок тільки на вказаній другій клітині. Біологічна активність, як правило, стимулюється більше, якщо перша клітина не експресує вказаний другий мембранний білок; вказана друга клітина не експресує вказаний перший мембранний білок; або більш переважно їхню комбінацію. Коли представником над родини рецепторів ФНП є ОХ40; 20137; СО30 або
СО40, переважним є, коли вказана перша клітина є імунною клітиною, переважно Т-клітиною. У цих випадках переважним є, коли друга клітина є аберантною клітиною, пухлинною клітиною або імунною клітиною (наприклад, макрофагом або антигенпрезентуючою клітиною). Аберантні клітини - це клітини, які в нормі відсутні в здорової особи. Не обмежувальними переважними прикладами таких клітин є ракові клітини, клітини, інфіковані вірусами, клітини, інфіковані паразитами, або клітини, індуковані для експресії другого мембранного білка. Придатна друга клітина також є імунною клітиною. Переважними прикладами таких клітин є дендритні клітини, макрофаги, інші клітини мієлоїдного ряду або В-клітини. У деяких випадках клітина може експресувати другий мембранний білок у результаті дії супресивних факторів, що вивільняються сусідніми клітинами, такими як імунні клітини, фібробласти або ракові клітини. У деяких варіантах втілення вказана друга клітина є антигенпрезентуючою клітиною, яка презентує пухлинний антиген або патогенний антиген, як, наприклад, вірусний антиген або паразитарний антиген, у середовищі головного комплексу гістосумісності (МНС). Указаний комплекс МНС - це переважно комплекс лейкоцитарних антигенів людини (НІ А). У цьому середовищі антитіло винаходу може посилювати як ріст, так і диференціацію наїВних до антигена Т-клітин іп міт. Індукування й посилення відповідей нових Т-клітин до пухлинних антигенів, як правило, призведе до більш ефективного пухлинного імунітету та знищення ракових клітин.
СО0137 може експресуватись активованими Т-клітинами. Він також зустрічається на інших клітинах, таких як дендритні клітини, природні клітини-кілери, гранулоцити та клітини стінки кровоносних судин у місцях запалення. Білок відомий своєю костимуляторною активністю завдяки активації Т-клітин. Ліганд СО137Ї експресується на моноцитах, макрофагах та інших клітинах. Зв'язування СО137 із лігандом СО137 викликає ефекти як у рецептор -, так і в лігандвмісній клітині. Активації ліганду або рецептора можна досягти різними способами.
Звичайними способами є нанесення покриття на планшети тканинної культури або перехресне
Зо зшивання через антитіла (огляд див. у спа, 2004). Експресія СО137 як на вроджених, так і на адаптивних імунних клітинах, поєднана з її здатністю посилювати протипухлинні відповіді, зробила її терапевтичною мішенню для посилення пухлинного імунітету. Різні імунотерапевтичні засоби, мішенню яких є СО137, досягли стадії клінічної розробки (огляд див. у Маккоик еї а! 2016). Для здійснення свого впливу активація рецептора або ліганду очевидно потребує гомомерного зв'язку в клітинній мембрані. Антитіла з двома зв'язувальними сайтами для СО137 здатні активувати рецептор або ліганд. Таким чином, такі антитіла є бівалентними для СО137. Також було отримано молекули, які мають лише один зв'язувальний сайт для
СО137. Такі моновалентні зв'язувальні молекули попереднього рівня техніки не могли активувати рецептор (МеМатага 2008). На противагу, зв'язувальна молекула або антитіло, або варіант згідно з цим винаходом здатний активувати СО137, навіть коли він є моновалентним до
С0137.
ОХха40 - це вторинна костимуляторна молекула імунної контрольної точки, яка експресується на Т-клітинах. Експресія ОХ40 не є конститутивною, як правило, вона експресується через 24-72 години після активації; її ліганд, ОХ4А0ОЇ, також не експресується на антигенпрезентуючих клітинах у спокої, а супроводжує їх активацію.
У цьому винаході було встановлено, що зв'язувальна молекула тільки з одним зв'язувальним сайтом для представника надродини рецепторів ФНП (першого мембранного білка) може бути активувальною, якщо зв'язувальна молекула також має зв'язувальний сайт для другого мембранного білка на іншій клітині (другій клітині), включно з випадком, коли другий мембранний білок не є представником над родини рецепторів ФНП. Другий мембранний білок може бути лігандом для рецептора над родини рецепторів ФНП. Однак, як правило, він не є лігандом представника над родини рецепторів ФНП, який є першим мембранним білком. Другий мембранний білок може бути лігандом для представника над родини рецепторів ФНП, який не є лігандом першого мембранного білка.
Стимулювання активності представника над родини рецепторів ФНП на клітині, як правило, потребує зближення двох або більше рецепторних комплексів. Гомотримерний ліганд, розміщений на поверхні клітинної мембрани, як правило, досягає цього шляхом залучення множини комплексів представника над родини рецепторів ФНП на сусідній клітині. Вважається, що кластеризація комплексів над родини рецепторів ФНП посилює стимулювання активності бо клітини. Це, наприклад, також є очевидним у штучних рецепторів, які мають тільки цитоплазматичну частину рецептора СО137. Близьке розміщення цитоплазматичних частин різних штучних рецепторів також стимулює клітину, що містить штучний рецептор. Бівалентні моно специфічні антитіла, специфічні для представника над родини рецепторів ФНП, також здатні до імітації ефекту ліганду та стимулювання активності. Вважається, що фрагменти антитіла зближують або утворюють кластер рецепторів. Така активність також називається перехресним зшиванням рецепторів. Активність можна іноді додатково стимулювати шляхом забезпечення антитіла до антитіла, що забезпечує додаткове перехресне зшивання рецептора.
Зв'язувальні молекули попереднього рівня техніки, які мають тільки зв'язувальний сайт для представника над родини рецепторів ФНП, як правило, не здатні до стимулювання активності.
Такі молекули не можуть утворювати кластер або перехресно зшивати представників над родини рецепторів ФНП. Однак зв'язувальна молекула або антитіло, або варіант згідно з цим винаходом здатний до стимулювання активності представника над родини рецепторів ФНП включно з випадком, коли він є моновалентним до вказаного представника над родини рецепторів ФНП. Без обмеження будь-якою теорією вважається, що біспецифічне антитіло згідно з цим винаходом може також утворювати кластери комплексів рецепторів над родини рецепторів ФНП, таким чином стимулюючи активацію представника над родини рецепторів
ФНП. Це твердження особливо справедливе, коли другий мембранний білок, який зв'язаний антитілом згідно з цим винаходом, є представником родини В7, таким як РО-І1 1.
В одному аспекті цього винаходу другий мембранний білок присутній на клітинній мембрані як частина мультимерного білка, що містить два або більше екземплярів указаного другого мембранного білка. Такі мультимерні білки можуть забезпечувати два або більше епітопів для антиген зв'язувального сайту зв'язувальної молекули винаходу. У такому випадку зв'язаний представник над родини рецепторів ФНІП она іншій клітині стане кластеризований і стимулюватиме активність клітини, яка містить рецептор ФНП. Зв'язувальна молекула винаходу може форсувати зближення представника над родини рецепторів ФНП шляхом зв'язування з іншим білком на іншій клітині. Ця властивість також називається транс-перехресним зшиванням на противагу цис-перехресному зшиванню зв'язувальними молекулами, які з'єднують два або більше екземплярів представника над родини рецепторів ФНП на тій самій клітині. У деяких варіантах втілення другий мембранний білок є гомодимером або гомотримером. Гомодимер - це білок, що складається з двох ідентичних поліпептидних одиниць. Гомотример - це білок, що складається з трьох ідентичних поліпептидних одиниць. Без обмеження будь-якою теорією вважається, що епітопи для антиген зв'язувального сайту другого мембранного білка спільно зв'язують низку зв'язувальних молекул. Вони, таким чином, діють як якір, що форсує зближення двох або більше представників над родини рецепторів ФНП. Зближення є достатньо близьким для стимулювання активності представника над родини рецепторів ФНП на клітині.
В іншому варіанті втілення вказаний другий мембранний білок - це білок, що присутній у одній або більше дискретних зонах на клітинній мембрані. Клітинні мембрани не забезпечують гомогенного розподілу всіх компонентів клітинної мембрани. На даний час відомо, що клітинні мембрани мають зони, у яких один або більше компонентів клітинної мембрани присутні частіше, ніж інші частини мембрани (огляд див. у Мегер, с, єї аі. 2003 Ргос. Маї). Асад. 5сі. 100.14: 8053-8058). Указана зона є переважно кластером білків, доменом, мікродоменом або компартментом на клітинній мембрані, переважно імунологічним синапсом. Без обмеження будь-якою теорією вважається, що невипадковий розподіл сприяє безпосередній близькості представника над родини рецепторів ФНП.
В інших варіантах втілення стимулювання активності представника над родини рецепторів
ФНП на клітині досягають забезпеченням двох або більше зв'язувальних молекул, які зв'язують того ж представника над родини рецепторів ФНП (першого мембранного білка) і того ж другого мембранного білка. Варіанти втілення, що залучають дві або більше зв'язувальні молекули, також називають варіантами втілення Оіїдосіопіс5У. Як, наприклад, показано на Фіг. 15 і 16, варіанти втілення Оіїдосіопісб? можуть призвести до активації Т-клітин. Загальні способи створення таких продуктів Оіїдосіопіс5? розкриті в УМО2013/157953 ії ММО2004/009618 і включені в цей документ шляхом посилання. Термін "Оіїдосіопісв" є зареєстрованим торговим знаком, позначениме. У варіанті втілення Оіїдосіопіс5? принаймні дві зі зв'язувальних молекул зв'язують різні епітопи на вказаному першому мембранному білку; різні епітопи на вказаному другому мембранному білку; або різні епітопи на вказаному першому мембранному білку й різні епітопи на вказаному другому мембранному білку. Варіант втілення Оіїдосіопіс5? дозволяє зв'язування двох або більше зв'язувальних молекул із тією ж молекулою першого ц/або другого мембранного білка, стимулюючи таким чином активність представника над родини рецепторів
ФНП на клітині. Переважним є, коли принаймні дві зі зв'язувальних молекул зв'язують різні бо епітопи на вказаному другому мембранному білку; або зв'язують різні епітопи на вказаному першому мембранному білку й різні епітопи на вказаному другому мембранному білку. В особливо переважному варіанті втілення принаймні дві зв'язувальні молекули зв'язують той самий епітоп на вказаному першому мембранному білку й різні епітопи на вказаному другому мембранному білку. У деяких варіантах втілення Оіїдосіопісб? дві зв'язувальні молекули блокують взаємодію представника над родини рецепторів ФНП з лігандом. В інших варіантах втілення Оіїдосіопісб? дві зв'язувальні молекули не блокують взаємодію представника над родини рецепторів ФНП з лігандом.
Різні епітопи на першому та другому мембранному білку є переважно такими, що є можливим одночасне зв'язування зв'язувальної молекули, яка зв'язує один із епітопів, і зв'язувальної молекули, що зв'язується з іншим епітопом. У переважному варіанті втілення різні епітопи є не конкуруючими епітопами. У переважному варіанті втілення перша та друга з указаних зв'язувальних молекул може зв'язувати той самий домен СО137 і ОХ40. У переважному варіанті втілення вказана перша та друга зв'язувальна молекула може зв'язувати той самий епітоп на СО137 і ОХ40.
Другий мембранний білок переважно є мультимерним рецептором цитокінів, представником родини В7, представником родини СО28; представником АТФ - зв'язувальних касетних транспортерів (АВОС- транспортерів); аквапорином; представником родини рецепторів серин- /греонінкінази; представником родини рецепторів тирозинкінази. У переважному варіанті втілення другий мембранний білок є представником родини В7. У переважному варіанті втілення представником над родини В7 є СО80; СО86; РО-І 1; РО-І 2; ІСОБ5І; В7-НЗ; В7-НАІ; В7-
НО; В7-Нб; або В7-Н7. Переважним є, коли другий мембранний білок є коінгібіторним білком родини В7. У цьому переважному варіанті втілення переважним є те, що варіабельний домен, який зв'язує другий мембранний білок, блокує зв'язування представника родини В7 з його зв'язувальним партнером з родини СО28. У такий спосіб зменшується потенційний коінгібіторний сигнал, який забезпечується другим мембранним білком першій клітині. В особливо переважному варіанті втілення другий мембранний білок - це РО-І1 або РО-І2, переважно РО-І1. В іншому переважному варіанті втілення другий мембранний білок є представником родини рецепторів епідермального фактора росту (ЕСЕ) (ЕВ); родини рецепторів інсуліну; родини рецепторів інсуліноподібного фактора росту (СЕ); родини
Зо рецепторів фактора росту фібробластів (ЕСЕ); родини рецепторів фактора росту ендотелію судин (МЕСІЕ); родини рецепторів фактора росту гепатоцитів (НС); або родини рецепторів АХІ.
Другий мембранний білок є переважно представником родини рецепторів ЕСЕ (ЕВ), переважно ЕСЕВ; ЕтЬВ-2 або ЕгВ-3, переважно ЕгВ-2. Переважним є, коли варіабельний домен, який зв'язує представника ЕСЕВН, ЕтЬВ-3 або ЕтЬВ-4 родини рецепторів ЕСЕ, блокує зв'язування фактора росту з указаним представником. У цьому варіанті втілення активність представника родини рецепторів ЕСЕ на вказаній другій клітині знижена.
У варіантах втілення винаходу другий мембранний білок є представником зв'язувальної пари. Наприклад, ЕСЕ- рецептор (ЕСЕН) і ЕСЕ утворюють зв'язувальну пару. Іншими не обмежувальними прикладами придатних зв'язувальних пар є НЕНЗ ії герегулін; ГГ СІВБ-В- спондин; І СН4-В-спондин; або ліганд представника родини В7 і його рецептор із родини СО28.
У переважному варіанті втілення винаходу зв'язувальна молекула, як описано в цьому документі, блокує зв'язування другого мембранного білка з комплементарним представником зв'язувальної пари. Такі зв'язувальні молекули, як правило, стимулюють активність представника над родини рецепторів ФНІП на клітині та блокують активність другого мембранного білка. Такі зв'язувальні молекули особливо добре підходять для випадків, коли друга клітина є пухлинною клітиною, або для лікування осіб зі злоякісним новоутворенням. У переважному варіанті втілення другий мембранний білок є представником родини В7, переважно РО-І1 або РО-Ї2, переважно РО-Ї1, а вказана принаймні одна зв'язувальна молекула переважно блокує зв'язування вказаного представника родини В7 із його звичайним рецептором із родини СО28. У переважному варіанті втілення другий мембранний білок - це РО- 1, а вказана принаймні одна зв'язувальна молекула переважно блокує зв'язування РО-11 із
РО-1.
У винаході пропонується спосіб посилення біологічного ефекту клітини, яка експресує
СО0137, причому спосіб включає забезпечення системі першої клітини та другої клітини, де вказана перша клітина містить СО137 на клітинній мембрані, а вказана друга клітина містить білок на клітинній мембрані з двома або більше екземплярами (тобто присутні дві або більше копії того самого епітопу) того самого епітопу на позаклітинній частині вказаного білка, і забезпечення вказаної системи зв'язувальною молекулою, що містить зв'язувальний сайт для позаклітинної частини СО137 і зв'язувальний сайт для вказаного епітопу, причому спосіб 60 додатково включає інкубування вказаної системи за умов, які дозволяють посилення вказаної біологічної активності. У деяких варіантах втілення вказаний спосіб є способом іп міо. У деяких варіантах втілення вказана клітина, що експресує СО137, - це імунна клітина, переважно Т- клітина, а вказана друга клітина - це пухлинна клітина. У деяких варіантах втілення вказана клітина, що експресує СО137, - це імунна клітина, переважно Т-клітина, а вказана друга клітина - це інша імунна клітина. У деяких варіантах втілення вказана клітина, що експресує СО137, - це імунна клітина, переважно Т-клітина, а вказана друга клітина - це клітина мієлоїдного ряду. У деяких варіантах втілення вказана клітина, що експресує СО137, - це імунна клітина, переважно
Т-клітина, а вказана друга клітина- це антигенпрезентуюча клітина. Указана антигенпрезентуюча клітина переважно представляє пухлинний антиген або патогенний антиген у середовищі МНС, переважно в середовищі НІ А.
Клітина, як правило, має представника над родини рецепторів ФНП на мембрані, якщо представник експресується клітиною. Експресію можна виміряти різними способами. Часто застосовують кількісну РНК-специфічну ПЛР. Також часто застосовують імуногістохімічний аналіз або ЕАСЗ5 із використанням імунофлуоресценції.
Відповідною системою, у якій забезпечені перша клітина та друга клітина, є клітинна культура. Інша відповідна система має тваринне походження, відмінне від людини, і містить першу клітину та другу клітину. Іншими відповідними системами є системи ех мімо, у яких клітини підтримуються в активній формі, але в яких ріст клітин не обов'язково посилюється.
Першу та другу клітину можна інкубувати разом за, наприклад, умов аналізу, які не обов'язково сприяють росту, але дозволяють вимірювати біологічну активність.
Інкубування вказаної системи за умов, які дозволяють клітинам експресувати вказану біологічну активність, опосередковану зв'язуванням вказаного першого мембранного білка та вказаного другого мембранного білка, означає, що система підтримується в умовах, коли перша та друга клітини можуть демонструвати біологічну активність у результаті зв'язування партнерів.
Інкубування іп мімо або іп міо не обов'язково повинно передбачати більше, ніж проходження достатнього часу, щоб біологічна активність стала очевидною.
Варіабельний домен, що не блокує зв'язування специфічної зв'язувальної пари мембранних білків, як описано в цьому документі, як правило, не зменшує зв'язування пари порівняно зі зв'язуванням за відсутності варіабельного домену. Це переважно вимірюють в аналізі іп міо. Як
Зо правило, це проводять шляхом інкубування варіабельного домену з мембранним білком, із яким він може зв'язуватись, і наступного інкубування суміші з іншим представником пари. Потім зв'язування пари порівнюють зі зв'язуванням пари за відсутності варіабельного домену.
Варіабельний домен не вважається таким, що блокує зв'язування специфічної зв'язувальної пари мембранних білків, якщо він зменшує зв'язування пари не більше ніж на 50 95, переважно не більше ніж на 40 95, переважно не більше ніж на 30 95, переважно не більше ніж на 20 95 і більш переважно не більше ніж на 1095 при порівнянні зі зв'язуванням за відсутності варіабельного домену. Зв'язування варіабельним доменом і блокування або не блокування зв'язування з іншим представником зв'язувальної пари визначається в цьому документі як блокування, досягнуте з використанням бівалентного моноклонального антитіла, що містить указані два однакові з указаних варіабельних доменів. Блокування або не блокування визначається як таке, що досягається бівалентним моноспецифічним антитілом, що місить указані два однакові з указаних варіабельних доменів.
Специфічні варіабельні домени, які можуть зв'язувати позаклітинний домен СО137 і які не блокують зв'язування СО137 із СО137!, - це варіабельні домени, які містять амінокислотну послідовність МН МЕ6860; МЕ6848; МЕ6805; МЕ6832; МЕ6870; МЕ6862; МЕ6875; або МЕ6873.
Специфічні варіабельні домени, які можуть зв'язувати позаклітинний домен РО-11 і які не блокують зв'язування РОЇ із РО-ІЇ1, - це варіабельні домени, що містять амінокислотну послідовність МН МЕ5361.
Функціональні аспекти варіабельних доменів за типом, не обов'язково за кількістю, такі як зв'язування з антигеном, блокувальна здатність взаємодії рецептора та ліганду, біологічна активність варіабельного домену тощо, можна визначити за допомогою різних способів.
Придатними формами є Рар- фрагмент або антитіло. Придатна форма антитіла - це моно специфічне бівалентне антитіло, що містить два з варіабельних доменів. Інша придатна форма - це, наприклад, біспецифічне антитіло, що містить варіабельний домен, який будуть досліджувати, та інший варіабельний домен. Інший варіабельний домен є переважно варіабельним доменом із нейтральною специфічністю стосовно аналізу, який будуть проводити.
Придатний нейтральний варіабельний домен - це варіабельний домен, який може зв'язувати правцевий анатоксин.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог за винаходом переважно 60 містить варіабельний домен, який блокує зв'язування його цільового мембранного білка над родини рецепторів ФНП із його зв'язувальним партнером. У деяких варіантах втілення антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог за винаходом містить варіабельний домен, який блокує зв'язування його цільового мембранного білка над родини рецепторів ФНП із його зв'язувальним партнером і який при забезпеченні в моно специфічному бівалентному антитілі, що містить два вказані варіабельні домени, не стимулює активність представника над родини рецепторів ФНІП на клітині. У деяких варіантах втілення антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог за винаходом містить варіабельний домен, який блокує зв'язування СО137 із СО137Ї і який при забезпеченні в моно специфічному бівалентному антитілі, що містить два вказані варіабельні домени, не стимулює активність
СО137 на клітині.
У винаході також пропонується спосіб лікування особи, яка має злоякісне новоутворення, причому спосіб включає введення зв'язувальної молекули за винаходом, переважно антитіла або функціональної частини, похідного й/або аналога за винаходом, або біспецифічного антитіла за винаходом особі, яка цього потребує. Особою є переважно особа, яка має злоякісне новоутворення. У деяких варіантах втілення злоякісне новоутворення є злоякісним новоутворенням, що містить ракові клітини, які експресують вказаний другий мембранний білок.
У деяких варіантах втілення злоякісне новоутворення є злоякісним новоутворенням, що містить ракові клітини, які експресують представника родини В7. У деяких варіантах втілення імунні клітини й/або клітини мієлоїдного ряду вказаної особи експресують вказаний другий мембранний білок, переважно представника родини В7. У деяких варіантах втілення антигенпрезентуючі клітини (АПК) вказаної особи експресують вказаний другий мембранний білок, переважно представника родини В7. Відповідно до цих варіантів втілення ракові клітини можуть експресувати або не експресувати вказаний другий мембранний білок. Коли АПК експресують другий вказаний мембранний білок, антигени вказаного злоякісного новоутворення презентуються такими АПК особи, і трансактивацію імунних клітин (переважно Т-клітин) можна індукувати антитілом або функціональною частиною, похідним і/або аналогом за винаходом, який здатний зв'язувати імунну клітину й імунну клітину, АПК або пухлинну клітину особи. У деяких варіантах втілення використовують антитіло або функціональну частину, похідне й/або аналог за винаходом, що зв'язує СО137 і представника родини В7, переважно РО-І 1. Таке антитіло або функціональна частина, похідне й/або аналог за 5 винаходом може трансактивувати імунну клітину шляхом зв'язування СО137-експресуючої імунної клітини (переважно Т-клітини) і/або пухлинної клітини, і/або імунної клітини, і/або клітини мієлоїдного ряду, і/або АПК, що експресує вказаного представника родини В7.
Злоякісне новоутворення є переважно аденокарциномою. Переважними злоякісними новоутвореннями є колоректальний рак; рак підшлункової залози; рак легені; рак молочної залози; рак печінки; рак простати; рак яєчника; рак шийки матки; рак ендометрію; рак голови та шиї; меланома; рак яєчка; рак уротелію; рак нирок; рак шлунка; або карциноїдний рак. У переважному варіанті втілення злоякісне новоутворення є коло ректальним раком; раком підшлункової залози; раком легені; раком молочної залози; раком печінки; раком простати; раком яєчника; раком шийки матки; раком ендометрію; раком голови та шиї; або меланомою. В особливо переважному варіанті втілення злоякісне новоутворення є колоректальним раком; раком підшлункової залози; раком легені; раком молочної залози або раком печінки. В особливо переважному варіанті втілення злоякісним новоутворенням є гастроіїнтестинальний рак. У переважному варіанті втілення злоякісним новоутворенням є колоректальний рак. У цьому варіанті втілення зв'язувальна молекула, переважно антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, - це переважно антитіло з варіабельним доменом, що може зв'язувати
СО137 або ОХ40, і варіабельним доменом, що може зв'язувати РО-І 1. Варіабельний домен, який зв'язує СО137 або ОХ40, переважно блокує зв'язування СО137 із лігандом СО137 або, у випадку з ОХ40, блокує зв'язування ОХ40 ліганду ОХ40. Варіабельний домен, який зв'язує РО- 11, переважно блокує зв'язування РО-1 із РО-І 1.
Додатково пропонується система ех мімо, що містить антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, або біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог за винаходом, і вказану першу клітину, вказану другу клітину. Перша та вказана друга клітина переважно експресують відповідно вказаний перший і вказаний другий мембранний білок на клітинній мембрані. Система переважно є клітинною системою, придатною для підтримування й/або росту вказаної першої клітини. Клітинна система є переважно придатною для підтримування й/або росту вказаної другої клітини. Така система є, наприклад, придатною для вирощування й/або розмноження імунних клітин, які спрямовані на аберантні клітини. Такі імунні клітини можна згодом застосовувати в особи, яка цього потребує, наприклад бо у пацієнта, що має злоякісне новоутворення. Імунні клітини переважно містять Т-клітину або МК-
клітину, переважно цитотоксичну Т-клітину. Імунні клітини є переважно автологічними для особи, яка їх потребує.
Додатково пропонується спосіб стимулювання імунної відповіді в особи до аберантної клітини в указаної особи, причому спосіб включає надання вказаній особі антитіла або його функціональної частини, похідного й/або аналога за винаходом. Аберантна клітина є переважно раковою клітиною, інфікованою вірусом клітиною, паразитом або інфікованою паразитом клітиною. У переважному варіанті втілення такою клітиною є ракова клітина або неопластична клітина. У цьому варіанті втілення антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, - це переважно антитіло з варіабельним доменом, що може зв'язувати позаклітинну частину СО137 або ОХ40, і варіабельним доменом, що може зв'язувати РО-11. Варіабельний домен, який зв'язує СО137 або ОХ40, переважно блокує зв'язування СО137 із лігандом СО137 або, у випадку з ОХ40, блокує зв'язування ОХ40 ліганду ОХ. Варіабельний домен, який зв'язує
РО-І1, переважно блокує зв'язування РО-1 із РО-І 1.
Неоплазма - це аномальний ріст тканини, коли він також формує масу, яку, як правило, називають пухлиною. Неоплазма в цьому винаході, як правило, утворює масу. Неопластична клітина - це клітина з неоплазми, яка утворила масу. Всесвітня організація охорони здоров'я (В0О3) класифікує неоплазми на чотири основні групи: доброякісні неоплазми, неоплазми іп зіш, злоякісні неоплазми та неоплазми з неточними або невідомими властивостями. Злоякісні неоплазми також просто відомі як злоякісні новоутворення.
Стимулювання імунної відповіді охоплює індукцію імунної відповіді та посилення вже наявної імунної відповіді. Імунну відповідь в особи можна виміряти шляхом вимірювання, де доречно, пухлинного навантаження в особи; вірусного навантаження в особи; паразитарного навантаження в особи.
Указана вірус-інфікована клітина є переважно клітиною, інфікованою вірусом імунодефіциту, вірусом герпесу, переважно вірусом простого герпесу, вірусом вітряної віспи, цитомегаловірусом або вірусом Епштейна - Барр, вірусом папіломи, вірусом гепатиту, переважно вірусом гепатиту А, В або С, вірусом кору або аденовірусами. Вірус є переважно вірусом із відомою здатністю зберігатися в людини. Хронічні інфекції характеризуються як такі, при яких вірус не усувається, а залишається в специфічних клітинах інфікованих осіб. Хронічні
Зо інфекції можуть залучати стадії як без симптомної, так і симптоматичної інфекції без швидкого знищення або навіть завдання суттєвої шкоди клітинам хазяїна. Хронічна взаємодія вірусу та хазяїна може проявлятися латентною, хронічною й/або уповільненою інфекцією.
Інфікована паразитом клітина - це клітина, яка інфікована внутрішньоклітинним паразитом.
Такі паразити є паразитарними мікроорганізмами, які здатні до росту й розмноження всередині клітин хазяїна. Деякі внутрішньоклітинні паразити можуть також жити поза межами клітини. Такі паразити є так званими факультативними внутрішньоклітинними паразитами. Не обмежувальними прикладами є І івієта топосуїюдепев, І едіопеІПа, деякі види мікобактерії та
Стуріососсив пеоїоптапе. Переважними внутрішньоклітинними паразитами є паразити, які не можуть рости поза межами клітин хазяїна, переважними прикладами є хламідії (Снпіатуаіа) і близькоспоріднені види, певні види мікобактерії, такі як паличка Гансена (Мусобасієгіт Іергає), певні найпростіші, що включають: апікомплекси (Ріабтодішт в5рр., Тохоріаєта допаїї і
Стуріозрогідіит рагу/ит) і трипаносоматиди.
У винаході також пропонується молекула нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну область важкого ланцюга антитіла згідно з цим винаходом. Молекула нуклеїнової кислоти (як правило, іп міїго, ізольована або рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти) переважно кодує будь-яку одну з варіабельних областей важкого ланцюга, як показано на фіг. 3, або варіабельну область важкого ланцюга, як показано на фіг. 3, що має 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію. У переважному варіанті втілення молекула нуклеїнової кислоти містить послідовність, як зображено на Фіг. 3. У молекулі нуклеїнової кислоти переважно застосовують кодони, які оптимізовані для експресії в клітині, що виробляє антитіло, яку будуть використовувати. Переважно нуклеїнова кислота, що кодує варіабельну область важкого ланцюга, як показано на Фіг. 3, або варіабельну область важкого ланцюга, як показано на Фіг. 3, що має 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію, - це кодон, оптимізований для експресії в клітині людини, переважно Рег.СбТМ; або китайського хом'яка, переважно СНО. У винаході додатково пропонується молекула нуклеїнової кислоти, що кодує згадану варіабельну область важкого ланцюга разом із константною областю важкого ланцюга на Фіг. 2.
Молекула нуклеїнової кислоти в контексті цього винаходу, як правило, але не виключно, є рибонуклеїновою кислотою (РНК) або дезоксирибонуклеїновою кислотою (ДНК). Альтернативні бо нуклеїнові кислоти доступні особі, яка є спеціалістом у даній галузі. Молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, наприклад, міститься в клітині. Коли вказана молекула нуклеїнової кислоти експресується в указаній клітині, указана клітина може утворювати антитіло згідно з винаходом. Таким чином, винахід в одному варіанті втілення забезпечує клітину, що містить антитіло згідно з винаходом і/або молекулу нуклеїнової кислоти згідно з винаходом. Антитіло утворюється, коли вказана клітина продукує важкий ланцюг і легкий ланцюг. Пропонується клітина, що може продукувати антитіло згідно з винаходом. Клітина переважно містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг антитіла, який містить варіабельну область важкого ланцюга антитіла, що при комбінації зі спільним легким ланцюгом може зв'язувати вказаний перший мембранний білок. Указана клітина переважно додатково містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг антитіла, який містить варіабельну область важкого ланцюга антитіла, що при комбінації зі спільним легким ланцюгом може зв'язувати вказаний другий мембранний білок. Указана клітина переважно додатково містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує спільний легкий ланцюг. Указана клітина переважно є тваринною клітиною, більш переважно клітиною ссавця, більш переважно клітиною примата, найбільш переважно клітиною людини. Для цілей винаходу придатна клітина є будь-якою клітиною, яка здатна містити й переважно утворювати антитіло згідно з винаходом і/або нуклеїнову кислоту згідно з винаходом.
У винаході також додатково пропонується клітина, що містить антитіло згідно з винаходом.
Також пропонується клітина, яка містить одну або більше молекул нуклеїнової кислоти, які окремо або разом кодують антитіло згідно з винаходом. Одна або більше молекул нуклеїнової кислоти - це молекули нуклеїнової кислоти, які можуть експресуватися, що означає, що вони містять необхідні сигнали у цис-положенні для транскрипції РНК та трансляції доменів, що кодують білок. Переважно вказана клітина (як правило, іп міїго, ізольована або рекомбінантна клітина) продукує вказане антитіло. У переважному варіанті втілення вказана клітина є клітиною-гібридомою, клітиною яєчника китайського хом'яка (СНО), М5О-клітиною або РЕВ-
СбТМ-клітиною. В особливо переважному варіанті втілення вказана клітина - це клітина СНО.
Додатково пропонується клітинна культура, що містить клітину згідно з винаходом. Різні установи та компанії розробили клітинні лінії для продукції антитіл у великому масштабі, наприклад, для клінічного застосування. Необмежувальними прикладами таких клітинних ліній є
Зо клітини СНО, М5О-клітини або РЕН.СбЄТМ-клітини. Ці клітини також використовують із іншими цілями, такими як продукція білків. Клітинні лінії, розроблені для виробництва білків та антитіл у промислових масштабах, у цьому документі додатково називають промисловими клітинними лініями. Так, у переважному варіанті втілення винаходу пропонується застосування клітинної лінії, розробленої для продукції антитіл у великому масштабі, для продукції антитіла винаходу.
У винаході додатково пропонується клітина для продукції антитіла, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує МН, МІ і/або важкий ланцюг, як зображено на фіг. 3, 1 і 2.
Переважно вказана молекула нуклеїнової кислоти містить послідовність, як зображено на фіг. 1 і 2.
У винаході додатково пропонується спосіб отримання антитіла, що включає культивування клітини згідно з винаходом і отримання вказаного антитіла з указаної культури. Переважно вказана клітина культивується в середовищі, вільному від сироватки. Переважно вказана клітина адаптована для росту в суспензії. Додатково пропонується антитіло, яке можна отримати за допомогою способу продукції антитіла згідно з винаходом. Антитіло переважно виділяють очищенням із середовища культури. Переважно вказане антитіло очищують із використанням афінної хроматографії.
Клітина винаходу є, наприклад, гібридомною клітинною лінією, СНО-клітиною, 293Б- клітиною, М5О-клітиною або будь-яким іншим типом клітини, відомим у галузі з огляду на придатність для продукції антитіла для клінічних цілей, зокрема для продукції антитіл, що використовуються для застосування в людей. В особливо переважному варіанті втілення вказана клітина є клітиною людини, переважно клітиною, що пройшла трансформацію областю
Е1 аденовірусу або його функціональним еквівалентом. Переважним прикладом такої клітинної лінії є клітинна лінія РЕВ.С6ЄТМ або її еквівалент. В особливо переважному варіанті втілення вказана клітина - це клітина СНО або її варіант, переважно варіант, у якому для експресії антитіла використовують векторну систему глутамінсинтетази (5).
У винаході додатково пропонується фармацевтична композиція, що містить одне або більше антитіл або їхніх варіантів згідно з винаходом. Фармацевтична композиція переважно містить фармацевтично прийнятні середовище або носій.
Антитіло або його варіант за винаходом може додатково містити мітку, переважно мітку для візуалізації іп мімо. Така мітка, як правило, не є обов'язковою для терапевтичного застосування. 60 Наприклад, мітка може бути корисною в умовах діагностики. Наприклад, для отримання зображення клітин мішеней у організмі. Придатними є різні мітки, і багато з них є відомими в цій галузі. У переважному варіанті втілення мітка є радіоактивною міткою для детектування. В іншому переважному варіанті втілення мітка є інфрачервоною міткою. Переважно інфрачервона мітка призначена для отримання зображень іп мімо. Особі, яка є спеціалістом у даній галузі, відомі різні інфрачервоні мітки. Переважними інфрачервоними мітками є, наприклад, ІНОує 800;
ІВОує 68080; ІАОСує 6801; ІНОуе 750; ІАОує 7000ОХ; ІАОуе 80085 ІАОує 650; ІНОує 700 фосфорамідит; ІНОуе 800 фосфорамідит (ГІ-СОВ США; 4647 Бирепог 5ігееї; м. Лінкольн, штат
Небраска).
Кількість антитіла згідно з винаходом, яку необхідно вводити пацієнту, як правило, перебуває в межах терапевтичного діапазону; це означає, що використовують достатню кількість для отримання терапевтичного ефекту, причому рівень не перевищує порогове значення, яке призводить до неприйнятних побічних ефектів. Чим нижча кількість антитіла потрібна для отримання бажаного терапевтичного ефекту, тим більшим, як правило, буде терапевтичний діапазон. Антитіло згідно з винаходом, яке проявляє достатні терапевтичні ефекти за низького дозування є, таким чином, переважним. Дозування може бути в діапазоні режиму дозування ніволумабу. Дозування також може бути нижчим.
Очікується, що в середовищі пригнічення пухлини експресія РО-І 1 на навколишніх клітинах досягне порогу щільності, який призведе до активації СО137 на Т-клітинах, як описано в прикладі 8 (Фіг. 284А і 288). По суті, біспецифічне антитіло матиме здатність до активації Т-клітин у пухлині й не впливатиме або суттєво меншою мірою впливатиме на клітини, що експресують низькі рівні РО-І1 на клітинних поверхнях. У випадку, коли біспецифічне антитіло ФО137хРО-І 1 містить РО-І1, що блокує Рар-фрагмент, антитіло на додаток долатиме блокаду РО-1/РО-Ї 1.
Шляхом дії в "транс" формі антитіло СО137ХхРО-І 1 зніматиме блокаду РО-1/РО-І 1 і одночасно активуватиме Т-клітину шляхом активації СО137. У результаті цього антитіло СО137хРО-Ї 1 може посилювати місцеві відповіді Т-клітини, що призводить до вивільнення великої кількості цитокінів (приклад 9), які, у свою чергу, можуть активувати інші імунні клітини в мікрооточенні пухлини й долати, принаймні частково, місцеву імуносупресію в пухлині. Винахідниками цього винаходу було продемонстровано, що біспецифічне антитіло згідно з винаходом часто має кращі властивості щодо активації Т-клітин порівняно з антитілами на основі еталонних антитіл попереднього рівня техніки з однаковим типом специфічності, як-от, наприклад, антитіла на основі урелумабу (антитіла до СО137) або на основі атезолізумабу (антитіла до РО-11). У прикладах сильнішої активності щодо активації Т-клітин було досягнуто за допомогою біспецифічного антитіла згідно з винаходом порівняно з сумішшю двох таких антитіл на основі еталонних. Це, наприклад, продемонстровано в аналізах трансактивації Т-клітини й аналізах стимулювання 5ЕВ у поточних прикладах. Також було продемонстровано, що біспецифічне антитіло згідно з цим винаходом здатне викликати зворотний розвиток імуносупресії, індукованої макрофагами М2, пов'язаними з пухлиною, і здатне (повторно) стимулювати специфічні для пухлин Т-клітини, виділені іп міо з пухлин пацієнтів. Біспецифічне антитіло згідно з цим винаходом може (повторно) стимулювати специфічні для пухлин ефекторні Т- клітини пам'яті СО4-, специфічні для пухлин ефекторні Т-клітини пам'яті СО8-- і специфічні для пухлин кінцеводиференційовані Т-клітини СОв8х, тоді як еталонне антитіло до РО-І| 1 на основі атезолізумабу, як правило, (повторно) стимулює тільки Т-клітини СО4ж. Таким чином, біспецифічне антитіло відповідно до цього винаходу має потенціал щодо (повторного) стимулювання більш життєздатного підкласу антигенспецифічних Т-клітин порівняно з еталонним антитілом включно з Т-клітинами СОВ8-..
Разом із повторним пожвавленням уже наявних відповідей цитотоксичних Т-клітин до пухлини шляхом активації навчених антигеном Т-клітин СО8 біспецифічні антитіла СО137хРО-
Ї1 можуть знову посилювати протипухлинні відповіді Т-клітин СОв. (Нео)антигени пухлини, що виділяються в оточувальне середовище пухлинними клітинами, які помирають, або пухлинними клітинами, поглиненими антигенпрезентуючими клітинами, транспортуються до дренувальних лімфатичних вузлів або третинних лімфощних структур, які є ектопічними лімфоїдними утвореннями, що знаходяться в пухлинних тканинах. У місцевому пухлинному оточенні пухлинні антигени презентуються наївним Т-клітинам СОв8», які будуть рости й диференціюватися після розпізнання антигена.
Як показано в прикладах, антитіло згідно з винаходом може більшою мірою посилювати ріст
Т-клітин після примування Т-клітин СОвбж порівняно з еталонними антитілами на основі урелумабу або на основі атезолізумабу. У прикладах було продемонстровано, що антитіло згідно з винаходом може індукувати як ріст, так і диференціацію антигенспецифічних Т-клітин
Сов краще, ніж суміш еталонних антитіл на основі урелумабу й на основі атезолізумабу, що сприятиме утворенню великих популяцій Т-клітин-кілерів із специфічною до пухлин пам'яттю й термінальною диференціацією.
Антитіло або його варіант і, зокрема, біспецифічне антитіло або його варіант згідно з винаходом може мати менше побічних ефектів, ніж комбінація бівалентних моноспецифічних антитіл із варіабельними доменами. Комбінації антитіл, які блокують інгібіторні й/або костимуляторні молекули, є корисними для пацієнтів, що не демонструють відповіді на існуючі види імунотерапії Однак подвійне блокування імуномодуляторних рецепторів (МОЮ) продемонструвало збільшення імунопов'язаної токсичності. Антитіло або його варіант і, зокрема, біспецифічне антитіло або його варіант згідно з винаходом підходить для вирішення проблеми подвійної блокади МОЮ, оскільки вони можуть демонструвати функціональну активність, яку неможливо відтворити комбінаціями моноклональних антитіл, і можуть більш селективно спрямовуватися до специфічних популяцій клітин, що зменшує відповідальність щодо безпеки пацієнтів. Без обмеження будь-якою теорією вважається, що знижена ймовірність небажаних побічних ефектів біспецифічного антитіла або його варіанта згідно з винаходом порівняно з моно специфічними антитілами (їхньою комбінацією) принаймні частково зумовлена тим, що біспецифічне антитіло або варіант згідно з винаходом, як правило, демонструє активацію Т-клітин у транс-положенні, тоді як він має низьку активність щодо активації Т-клітин у цис-положенні. Використання антитіла з низькою активацією Т-клітин у цис-положенні в контексті цього винаходу є переважним, оскільки це зменшує ймовірність неспецифічної відповіді Т-клітин. Антитіло або біспецифічне антитіло, або його функціональна частина, похідне й/або аналог згідно з винаходом має меншу імунопов'язану токсичність, ніж комбінація бівалентних моно специфічних антитіл із варіабельними доменами.
Із урахуванням вищесказаного, біспецифічне антитіло згідно з цим винаходом або його функціональна частина, похідне й/або аналог є переважним для терапевтичного застосування.
Антитіла отримували у вигляді біспецифічних антитіл шляхом клонування їх у вектори комплементарної експресії, які містять мутації області СНЗ3, що стимулює гетеродимеризацію важких ланцюгів. Багато біспецифічних антитіл отримували в невеликій кількості й досліджували за допомогою аналізів на зв'язування та функціонування на ракових клітинних лініях. Антитіло винаходу, зокрема біспецифічне антитіло винаходу, може поєднувати низькі
Зо профілі токсичності з високою ефективністю. Антитіло винаходу може бути корисним у різних типах і лініях націленої імунотерапії. Антитіло винаходу може мати збільшений терапевтичний діапазон порівняно з антитілом, яке обома фрагментами зв'язує той самий (ті самі) антиген (-и).
Додатково пропонується застосування біспецифічного антитіла згідно з винаходом або його функціональної частини, похідного й/або аналога для приготування лікарського засобу для лікування або попередження утворення аберантних клітин, пухлини і/або виникнення метастазів. Пухлина, від якої походять указані метастази, - це переважно пухлина, яка є позитивною на наявність вказаного другого мембранного білка клітини, переважно позитивною на наявність представника родини В7.
Після перехідної трансфекції в суспензії 293Е- клітин антитіла винаходу можна отримати в кількостях » 50 мг/л. Для отримання більше ніж 9895 чистоти з продуктивністю » 70 95 специфічні антитіла можна очистити. Дослідження аналітичних характеристик демонструють профілі біспецифічного антитіла ІДС, що є зіставними з бівалентним моно специфічним Ідса1.
У винаході також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що може зв'язуватися позаклітинною частиною мембрано зв'язаного представника над родини рецепторів ФНІП і позаклітинною частиною мембрано зв'язаного другого мембранного білка, переважно представника родини В7. У деяких варіантах втілення вказане біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог містить один антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати вказаного представника над родини рецепторів ФНП, і один антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати вказаний другий білок, переважно вказаного представника родини В7. У деяких переважних варіантах втілення антиген зв'язувальна частина вказаного біспецифічного антитіла або його функціональної частини, похідного або аналога згідно з винаходом складається з одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати позаклітинну частину вказаного представника над родини рецепторів ФНП, і з одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати вказаного представника родини В7. Указане біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне або аналог є переважно моно валентним до вказаного представника надродини рецепторів ФНП і моновалентним до вказаного представника родини В7. Указане біспецифічне антитіло - це переважно повнорозмірне антитіло. У деяких варіантах втілення вказане біспецифічне антитіло - це повнорозмірний Ідс, тобто повнорозмірний Іде, аг, ІдаЗ 60 або Ідс4, переважно повно розмірний Ідс1 або повнорозмірний Ідсаа.
У винаході також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що може зв'язуватися з позаклітинною частиною СО137 і позаклітинною частиною РО-11. Указане біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне або аналог переважно містить два антиген зв'язувальні сайти. Указане біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне або аналог переважно містить один антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати СО137, і один антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати РО-
Її. У деяких переважних варіантах втілення антиген зв'язувальна частина вказаного біспецифічного антитіла або його функціональної частини, похідного й/або аналога згідно з винаходом складається з одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137, і одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати РО-11. Указане біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне або аналог переважно є моновалентним до СО137 і моновалентним до РО-І1 1. У деяких варіантах втілення антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати СО137, здатний блокувати зв'язування СО137 із СО1371Ї. У деяких варіантах втілення антиген зв'язувальний сайт, який може зв'язувати СО137, не здатний блокувати зв'язування СО137 із СО1371. У деяких варіантах втілення антигензв'язувальний сайт, який може зв'язувати РО-1І1, здатний блокувати зв'язування РО-11 із РО-1. У деяких варіантах втілення антигензв'язувальний сайт, який може зв'язувати РО-ІЇ1, не здатний блокувати зв'язування РО-Ї1 із РО-1. Указане біспецифічне антитіло - це переважно повнорозмірне антитіло. У деяких варіантах втілення вказане біспецифічне антитіло - це повнорозмірний Ідс, тобто повнорозмірний ІдасІ1, Ідсег, Из або
Ід4с24, переважно повнорозмірний Іда1 або повнорозмірний Ід.
Також пропонується спосіб лікування особи, у якої є злоякісне новоутворення, причому спосіб включає введення зв'язувальної молекули за винаходом або біспецифічного антитіла, або функціональної частини, або похідного, або аналога за винаходом особі, яка цього потребує.
У винаході додатково пропонується зв'язувальна молекула винаходу або біспецифічне антитіло, або функціональна частина, похідне або аналог за винаходом для застосування в лікуванні особи, що має злоякісне новоутворення.
Додатково пропонується клітинна система, що містить антитіло або біспецифічне антитіло,
Зо або його функціональну частину, похідне й/або аналог за винаходом, і першу клітину, яка експресує мембранозв'язаного представника надродини рецепторів ФНП, і другу клітину, яка експресує мембранозв'язаний другий мембранний білок, переважно представника родини В7.
У винаході додатково пропонується спосіб стимулювання активності представника надродини рецепторів ФНП на клітині, який включає забезпечення першої клітини та другої клітини, де вказана перша клітина має вказаного представника на клітинній мембрані й указана друга клітина має другий мембранний білок на клітинній мембрані, причому спосіб включає контактування вказаних клітин із біспецифічним антитілом або його варіантом, що містить два варіабельні домени, де один варіабельний домен містить перший антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного представника надродини рецепторів ФНПІ, і де інший варіабельний домен містить другий антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, таким чином стимулюючи активність указаного представника на вказаній першій клітині. У деяких варіантах втілення вказане біспецифічне антитіло містить один антигензв'язувальний сайт, який може зв'язувати вказаного представника над родини рецепторів ФНП. У деяких варіантах втілення вказаний спосіб є способом іп міо. У переважному варіанті втілення вказаний представник надродини рецепторів ФНП - це СО137 або ОХ40. Указаний другий мембранний білок переважно не є представником надродини рецепторів ФНП. Указане біспецифічне антитіло є переважно моновалентним до вказаного представника надродини рецепторів ФНП і моновалентним до вказаного другого мембранного білка, переважно моновалентним до представника родини В7.
Указане біспецифічне антитіло - це переважно повнорозмірне антитіло. У деяких варіантах втілення вказане біспецифічне антитіло - це повнорозмірний ІдС, тобто повнорозмірний ІДС,
Іа, аз або да, переважно повнорозмірний Іда1 або повнорозмірний да.
Указана перша клітина переважно не має суттєвої експресії вказаного другого мембранного білка на клітинній мембрані. Указаний другий мембранний білок - це переважно білок, що присутній у одній або більше зонах на клітинній мембрані. Указана зона є переважно кластером, доменом, мікродоменом або компартментом на клітинній мембрані, переважно імунологічним синапсом. Указаний другий мембранний білок переважно присутній на клітинній мембрані як частина мультимерного білка, що містить два або більше екземплярів указаного другого мембранного білка. У деяких варіантах втілення вказаний другий мембранний білок присутній бо на клітинній мембрані як частина гомодимера або гомотримера. У переважному варіанті втілення вказаний другий мембранний білок є мультимерним рецептором цитокінів, представником родини В7, представником родини СО28; представником АТФ-зв'язувальних касетних транспортерів (АВС-транспортерів); аквапорином; представником родини рецепторів серин-/треонінкінази; представником родини рецепторів тирозинкінази. Другий мембранний білок - це переважно представник родини В7, переважно РО-11 або РО-І2, переважно РО-11. У переважному варіанті втілення другий мембранний білок є представником родини рецепторів
ЕСЕ (ЕВ); родини рецепторів ІСЕ; родини рецепторів ЕСЕ; родини рецепторів МЕСЕ; родини рецепторів НИЄ; або родини рецепторів АХІ. Другий мембранний білок є переважно представником родини рецепторів ЕСЕ (ЕВ), переважно ЕСЕВ; ЕГЬВ-2 або ЕгрВ-3, переважно
ЕгЬВ-2. Переважно варіабельний домен, що зв'язує представника надродини рецепторів ФНП, блокує зв'язування ліганду з представником. Варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину вказаного представника надродини рецепторів ФНП, переважно визначений як варіабельний домен, який, коли він у формі бівалентного моноспецифічного антитіла, що містить два вказані варіабельні домени, які зв'язують вказаного представника надродини рецепторів ФНП, не стимулює активність указаного представника надродини рецепторів ФНП на клітині. Спосіб переважно додатково включає забезпечення додаткового біспецифічного антитіла, яке містить антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного представника надродини рецепторів ФНП, і антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, де вказане перше та друге біспецифічні антитіла зв'язують: - різні епітопи на вказаному першому мембранному білку; - різні епітопи на вказаному другому мембранному білку; або - різні епітопи на вказаному першому мембранному білку й різні епітопи на вказаному другому мембранному білку; причому спосіб додатково включає інкубування вказаної першої та другої клітини з указаним першим і другим біспецифічними антитілами, таким чином стимулюючи активність указаного представника надродини рецепторів ФНІП на вказаній першій клітині. У деяких варіантах втілення вказаний спосіб є способом іп мйго. У переважному варіанті втілення представник надродини рецепторів ФНІП - це СО137 або ОХ40. У деяких варіантах втілення кожне з
Зо указаного першого й указаного другого біспецифічного антитіла містить один антигензв'язувальний сайт, який може зв'язувати вказаного представника надродини рецепторів
ФНП. Указаний другий мембранний білок переважно не є представником надродини рецепторів
ФНП. Указане перше й/або вказане друге біспецифічне антитіло є переважно моновалентним до вказаного представника надродини рецепторів ФНП і моновалентним до вказаного другого мембранного білка, переважно моновалентним до вказаного представника родини В7. Указане перше й/або вказане друге біспецифічне антитіло є переважно повнорозмірним антитілом. У деяких варіантах втілення вказане перше й/або вказане друге біспецифічне антитіло - це повнорозмірний дес, тобто повнорозмірний дес, Ідсе, ІдшЗ або 1Ідс4, переважно повнорозмірний ІдС1 або повнорозмірний Ідс4.
Антигензв'язувальні сайти першого та другого біспецифічного антитіла, що можуть зв'язувати вказаний другий мембранний білок, переважно зв'язують різні епітопи на позаклітинній частині вказаного другого мембранного білка. Різні епітопи на позаклітинній частині вказаного другого мембранного білка є переважно неконкуруючими епітопами.
Також пропонується біспецифічне антитіло, яке містить антигензв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137 або ОХ40, і антигензв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину другого мембранного білка. У деяких варіантах втілення вказане біспецифічне антитіло містить один антигензв'язувальний сайт, який може зв'язувати вказаний СО137 або ОХ40. Указаний другий мембранний білок переважно не є представником надродини рецепторів ФНП. Другий мембранний білок переважно експресується Т-клітиною в незначній мірі. Другий мембранний білок переважно експресується на імунній клітині, клітині мієлоїдного ряду, антигенпрезентуючій клітині, пухлинній клітині, інфікованій вірусом клітині або інфікованій паразитом клітині. Переважно вказаний другий мембранний білок - це білок, що присутній у одній або більше зонах на клітинній мембрані. Зона є переважно кластером, доменом, мікродоменом або компартментом на клітинній мембрані, переважно імунологічним синапсом. У деяких варіантах втілення вказаний другий мембранний білок - це білок, який присутній на клітинній мембрані як частина мультимерного білка, що містить два або більше вказаних других мембранних білків. У деяких варіантах втілення вказаний другий мембранний білок присутній на клітинній мембрані як частина гомодимера або гомотримера. Переважно вказаний другий мембранний білок є мультимерним рецептором цитокінів, представником 60 родини В7, представником родини СО28; представником АТФф-зв'язувальних касетних транспортерів (АВС-транспортерів); аквапорином; представником родини рецепторів серин- /греонінкінази; представником родини рецепторів тирозинкінази. Другий мембранний білок - це переважно представник родини В7, переважно РО-1І1 або РО-І2, переважно РО-І1. У деяких варіантах втілення другий мембранний білок є представником родини рецепторів ЕСЕ (ЕгбВ); родини рецепторів інсуліну; родини рецепторів ІСЕ; родини рецепторів ЕСЕ; родини рецепторів
УЕаБРЕ; родини рецепторів НО; або родини рецепторів АХІ. У деяких варіантах втілення другий мембранний білок є представником родини рецепторів ЕСЕ (ЕВ), переважно ЕСЕВ; ЕгрВ-2 або ЕгтбВ-3, переважно ЕгрВ-2. Варіабельний домен, який зв'язує вказаний СО137 або ОХ40, переважно блокує зв'язування ліганду з представником. Варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину вказаного СО137 або ОХ40, переважно визначений як варіабельний домен, який, коли він у формі бівалентного моноспецифічного антитіла, що містить два вказані варіабельні домени, які зв'язують вказаний СО137 і ОХ40, не стимулює активність СО137 або
ОХ40 на клітині. Указане біспецифічне антитіло є переважно моновалентним до СО137 або
ОХ40 і моновалентним до вказаного другого мембранного білка. Указане біспецифічне антитіло - це переважно повнорозмірне антитіло. У деяких варіантах втілення вказане біспецифічне антитіло - це повнорозмірний ІдС, тобто повнорозмірний да, да, дз або ІдДСс4, переважно повнорозмірний ІдС1 або повнорозмірний Ідс4.
У винаході також пропонується композиція, що містить одне або більше біспецифічних антитіл згідно з винаходом. Також пропонується композиція або комплект частин, що містить два або більше біспецифічних антитіл згідно з винаходом, де антигензв'язувальні сайти, які можуть зв'язувати СО137 або ОХ40 першого та другого біспецифічного антитіла, зв'язують різні епітопи на вказаних СО137 або ОХ40. Також пропонується спосіб стимулювання активності
СО137 або ОХ40 на клітині, який включає забезпечення першої клітини та другої клітини, де вказана перша клітина має вказаний СО137 або ОХ40 (перший мембранний білок) на клітинній мембрані, а вказана друга клітина має другий мембранний білок на клітинній мембрані, причому спосіб включає контактування вказаних клітин із біспецифічним антитілом згідно з винаходом (першим біспецифічним антитілом), яке містить два варіабельні домени, де один варіабельний домен містить перший антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного першого мембранного білка, а інший варіабельний домен містить другий
Зо антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, таким чином стимулюючи активність указаного першого мембранного білка на вказаній першій клітині. У деяких варіантах втілення вказане біспецифічне антитіло містить один антигензв'язувальний сайт, який може зв'язувати вказаний перший мембранний білок. У деяких варіантах втілення вказаний спосіб є способом іп міо. Спосіб переважно додатково включає забезпечення додаткового біспецифічного антитіла згідно з винаходом (другого біспецифічного антитіла), яке містить варіабельний домен із антигензв'язувальним сайтом, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного першого мембранного білка; і варіабельний домен із антигензв'язувальним сайтом, що може зв'язувати позаклітинну частину вказаного другого мембранного білка, де вказане перше та друге біспецифічне антитіло зв'язують: - різні епітопи на вказаному першому мембранному білку; - різні епітопи на вказаному другому мембранному білку; або - різні епітопи на вказаному першому мембранному білку; і різні епітопи на вказаному другому мембранному білку; причому спосіб додатково включає інкубування вказаної першої та другої клітини зі вказаним першим і другим біспецифічним антитілом, таким чином стимулюючи активність
СО137 або ОХ40 на вказаній першій клітині. Другий мембранний білок - це переважно представник родини В7, більш переважно РО-І 1.
Антитіло, що визначається за послідовністю МЕ, як показано в цьому документі нижче, є переважно біспецифічним антитілом, що має два різні варіабельні домени, причому один із цих варіабельних доменів містить указану послідовність.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною СО137, переважно містить варіабельну область важкого ланцюга з областю СОВЗ, яка містить амінокислотну послідовність області СОВЗ варіабельної області важкого ланцюга МЕ6754; МЕ6763; МЕ6785; або МЕ6797 (Фіг. 3).
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною СО137, переважно містить варіабельну область важкого ланцюга з областю СОВІ, СОВ2 і СОВЗ, яка містить амінокислотну послідовність області СОВІ, СОВ2 і СОВЗ варіабельної області важкого ланцюга одного з МН, зображених для МЕ6754; МЕ6763; МЕ6785; або МЕ6797 (фіг. 3). Послідовності
СОН, СОвВ2 і СОВЗ переважно вибирають з тієї ж області УН.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною СО137, переважно містить амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга МЕ6754; МЕ6763; МЕ6785; або МЕ6797, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН указаного МЕ. Амінокислотна (-ї) вставка (-и), делеція (-ї), заміщення або їхня комбінація, якщо така є, переважно розміщені не в амінокислотній послідовності областей СОВ.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною РО-І1, переважно містить варіабельну область важкого ланцюга з областю СОВЗ, яка містить амінокислотну послідовність області СОВЗ варіабельної області важкого ланцюга МЕ5554; МЕ5576; МЕ5578;
МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5424; МЕ5561; МЕ5439; МЕ5553; МЕ5594; МЕ5426; МЕ5442 або
МЕ53З61 (Фіг. 3).
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною РО-І1, переважно містить варіабельну область важкого ланцюга з областю СОВІ, СОВ2 і СОВЗ, яка містить амінокислотну послідовність області СОВІ, СОВ2 і СОВЗ варіабельної області важкого ланцюга одного з МН, зображених для МЕ5554; МЕ5576; МЕ5578; МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5424;
МЕ5561; МЕ5439; МЕ5553; МЕ5594; МЕ5426; МЕ5442 або МЕ5361 (Фіг. 3). Послідовності СОВ'І,
СОН і СОВЗ переважно вибирають з тієї ж області УН.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною РО-І1, переважно містить амінокислотну послідовність варіабельної області важкого ланцюга МЕ5554; МЕ5576; МЕ5578;
МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5424; МЕ5561; МЕ5439; МЕ5553; МЕ5594; МЕ5426; МЕ5442 або
МЕ5361, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з
Зо амінокислотною послідовністю МН указаного МЕ. Амінокислотна (-ї) вставка (-и), делеція (-ї), заміщення або їхня комбінація, якщо така є, переважно розміщені не в амінокислотній послідовності областей СОВ.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог переважно містить варіабельний домен, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною СО137, що блокує зв'язування СО137 із лігандом СО137, і варіабельний домен, який може зв'язуватися з позаклітинною частиною РО-11, що блокує зв'язування РО-1 із РО-І 1. Варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину РО-11 у цьому антитілі або його функціональній частині, похідному й/або аналогу, переважно містить область МН із амінокислотною послідовністю СОВЗ або амінокислотною послідовністю СОВІ, СОВ2 і СОВЗ одного з МН МЕ5554; МЕ5576; МЕ5578;
МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5424; МЕ5561; МЕ5439; МЕ5553; МЕ5594; МЕ5426; МЕ5442 або
МЕ5361 (Фіг. 3). У переважному варіанті втілення варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину РО-І1, містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5554; МЕ5576;
МЕ5578; МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5424; МЕ5561; МЕ5439; МЕ5553; МЕ5594; МЕ5426;
МЕ5442 або МЕ5361, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН указаного МЕ.
Варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину СО137 у цьому антитілі або його функціональній частині, похідному й/або аналогу, переважно містить область МН із амінокислотною послідовністю СОВЗ або амінокислотною послідовністю СОВІ, СОВ2 і СОВЗ одного з МН МЕ6754; МЕ6763; МЕ6785; або МЕ6797 (Фіг. 3). У переважному варіанті втілення варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину СО137, містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6754; МЕ6763; МЕ6785; або МЕ6797, що має щонайбільше 15, переважно 0,1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН вказаного МЕ. Амінокислотна (-ї) вставка (-и), делеція (-ї), заміщення або їхня комбінація, якщо така є, переважно розміщені не в амінокислотній послідовності областей СОНЯ. Особливо переважна комбінація в цьому антитілі або функціональній частині, похідному й/або аналогу є комбінацією варіабельних доменів, що містять указану послідовність або її варіант МЕ6797 і
МЕ7702; МЕ6763 ії МЕ7702; МЕ6785 і МЕ7702; МЕ6797 і МЕ5553; МЕ6763 і МЕ5553; МЕ6785 і
МЕ5553; МЕ6754 і МЕ5424; МЕ6763 і МЕ5561; МЕ6785 і МЕ5439; МЕ6797 і МЕ5553; МЕ6744 і
МЕ5594; МЕ6744 і МЕ5361; МЕ6783 і МЕ5361; або МЕ6783 і МЕ5594.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, як описано в цьому документі, переважно містить - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю СОВЗ або амінокислотною послідовністю СОВІ, СОВ2 і СОВЗ із МН МЕ6754; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю СОВЗ або амінокислотною послідовністю СОВІ, СОВ2 ії СОВЗ із МН МЕ5554;
МЕ5576; МЕ5578; МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5594; МЕ5424; МЕ5426; МЕ5553; МЕ5442;
МЕ5561; МЕ5439 або МЕ53З61 (Фіг. 3).
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог переважно містить - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6754, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2,3,4,5,6, 7,8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ6754
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5554; МЕ5576; МЕ5578; МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5594; МЕ5424;
МЕ5426; МЕ5553; МЕ5442; МЕ5561; МЕ5439 або МЕ5361 (Фіг. 3), що має щонайбільше 15, переважно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН указаного МЕ.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, як описано в цьому документі, переважно містить - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю СОВЗ або амінокислотною послідовністю СОВІ, СОВ2 і СОВЗ із МН МЕ6763; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю СОВЗ або амінокислотною послідовністю СОВІ, СОВ2 ії СОВЗ із МН МЕ5554;
МЕ5576; МЕ5578; МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5594; МЕ5424; МЕ5426; МЕ5553; МЕ5442;
Зо МЕ5561; МЕ5439 або МЕ53З61 (Фіг. 3).
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог переважно містить - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6763, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ676З
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5554; МЕ5576; МЕ5578; МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5594; МЕ5424;
МЕ5426; МЕ5553; МЕ5442; МЕ5561; МЕ5439 або МЕ5361 (Фіг. 3), що має щонайбільше 15, переважно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН указаного МЕ.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, як описано в цьому документі, переважно містить - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю СОВЗ або амінокислотною послідовністю СОВІ, СОВ2 і СОВЗ із МН МЕ6785; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю СОВЗ або амінокислотною послідовністю СОВІ, СОВ2 ії СОВЗ із МН МЕ5554;
МЕ5576; МЕ5578; МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5594; МЕ5424; МЕ5426; МЕ5553; МЕ5442;
МЕ5561; МЕ5439 або МЕ53З61 (Фіг. 3).
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог переважно містить - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6785, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ6785
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5554; МЕ5576; МЕ5578; МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5594; МЕ5424;
МЕ5426; МЕ5553; МЕ5442; МЕ5561; МЕ5439 або МЕ5361 (Фіг. 3), що має щонайбільше 15, 60 переважно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН указаного МЕ.
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, як описано в цьому документі, переважно містить - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю СОВЗ або амінокислотною послідовністю СОВІ, СОВ2 і СОВЗ із МН МЕ6797; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю СОВЗ або амінокислотною послідовністю СОВІ, СОВ2 ії СОВЗ із МН МЕ5554;
МЕ5576; МЕ5578; МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5594; МЕ5424; МЕ5426; МЕ5553; МЕ5442;
МЕ5561; МЕ5439 або МЕ53З61 (Фіг. 3).
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог переважно містить - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6797, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2,3,4,5,6, 7,8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ6797
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5554; МЕ5576; МЕ5578; МЕ9375; МЕ9376; МЕ7702; МЕ5594; МЕ5424;
МЕ5426; МЕ5553; МЕ5442; МЕ5561; МЕ5439 або МЕ5361 (Фіг. 3), що має щонайбільше 15, переважно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН указаного МЕ.
Як показано в прикладах, антитіло з варіабельним доменом, що зв'язує РО-11, який базується на МЕ5553, забезпечує особливо добру активацію Т-клітин, призводить до комбінації з різними варіабельними доменами, що зв'язують СО137, включно з МЕ6754, МЕ6763, МЕ6785 і
МЕ6797.
Додатково пропонується, відповідно, біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною
Зо послідовністю області СОВЗ із МН МЕб6754; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5553.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ6754; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ5553.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6754, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕб6754 і; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5553, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5553.
Додатково пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне
БО й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕб6763; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5553.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ6763; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною 60 послідовністю областей СОВІ, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ5553.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6763, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ676З
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5553, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5553.
Додатково пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕб6785; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5553.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ6785; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ5553.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6785, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ6785
Зо Ї; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5553, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5553.
Додатково пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ6797; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5553.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ6797; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ5553.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6797, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ6797
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5553, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5553.
У прикладах додатково показано, що антитіло з варіабельним доменом, що зв'язує РО-І 1, яке базується на МЕ7702, забезпечує особливо добру активацію Т-клітин, призводить до комбінації з різними варіабельними доменами, які зв'язують СО137, включно з МЕ6763, МЕ6785 і МЕ6797.
Додатково пропонується, відповідно, біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕб6797; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ7702.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ6797; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ7702.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6797, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ6797
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ7702, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ7702.
Додатково пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕб6763; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ7702.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ6763; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ7702.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6763, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ676З
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ7702, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2,3,4,5,6, 7,8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ7702.
Додатково пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне
БО й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕб6785; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ7702.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ6785; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною 60 послідовністю областей СОВІ, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ7702.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6785, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ6785
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ7702, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2,3,4,5,6, 7,8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ7702.
У прикладах додатково показано, що біспецифічне антитіло з варіабельним доменом, що зв'язує СО137, який базується на МЕб6744, і варіабельним доменом, що зв'язує РО-11, який базується на МЕ5594, забезпечує особливо добру активацію Т-клітин; див., наприклад, Фіг. 14- 16. Важливо, що таке антитіло має сильніший потенціал активації Т-клітин порівняно з антитілом, яке базується на антитілі урелумаб.
Додатково пропонується, відповідно, біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕб744;і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5594.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ6744; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ5594.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6744, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ6744
Ї; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5594, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5594.
У прикладах додатково показано, що біспецифічне антитіло з варіабельним доменом, що зв'язує СО137, який базується на МЕб6744, і варіабельним доменом, що зв'язує РО-11, який базується на МЕ5361, забезпечує особливо добру активацію Т-клітин; див., наприклад, Фіг. 14- 16. Важливо, що таке антитіло має сильніший потенціал активації Т-клітин порівняно з антитілом, яке базується на антитілі урелумаб.
Додатково пропонується, відповідно, біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕб744;і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною
БО послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5361.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ6744; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ5З61.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною 60 послідовністю МН МЕ6744, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ6744
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5361, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5361.
У прикладах додатково показано, що біспецифічне антитіло з варіабельним доменом, що зв'язує СО137, який базується на МЕ6783, і варіабельним доменом, що зв'язує РО-11, який базується на МЕ5361, забезпечує особливо добру активацію Т-клітин; див., наприклад, Фіг. 14- 15. Важливо, що таке антитіло має сильніший потенціал активації Т-клітин порівняно з антитілом, яке базується на антитілі урелумаб.
Додатково пропонується, відповідно, біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕб6783; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5361.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ6783; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ5З61.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6783, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ6783
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5361, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5361.
У прикладах додатково показано, що біспецифічне антитіло з варіабельним доменом, що зв'язує СО137, який базується на МЕ6783, і варіабельним доменом, що зв'язує РО-11, який базується на МЕ5594, забезпечує особливо добру активацію Т-клітин; див., наприклад, Фіг. 14- 15.
Додатково пропонується, відповідно, біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕб6783; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5594.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ6783; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОН2 і СОВЗ із МН МЕ5594.
Також пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що містить: - варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6783, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН МЕ6783
І; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною 60 послідовністю МН МЕ5594, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5594.
Крім того, у прикладах показано, що комбінація біспецифічного антитіла з варіабельним доменом, що зв'язує СО137, який базується на МЕ6744, і варіабельним доменом, що зв'язує
РО-І1, який базується на МЕ53З61, разом із біспецифічним антитілом з варіабельним доменом, що зв'язує СО137, який базується на МЕ6744, і варіабельним доменом, що зв'язує РО-І 1, який базується на МЕ5594 (застосовується як подвійний специфічний, наприклад, варіант втілення
Оіїдосіопіс5У), забезпечує високу активацію Т-клітин (див. Фіг. 14-16) і кращу порівняно з антитілом, що базується на урелумабі.
Додатково пропонується, таким чином, суміш або комплект частин, що містить: - перше біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ6744, і варіабельний домен, що зв'язує РО-11, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5594; і - друге біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ6744, і варіабельний домен, що зв'язує РО-11, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5З61.
Додатково пропонується суміш або комплект частин, що містить: - перше біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОВ2 ії СОВЗ із МН МЕб6744, і варіабельний домен, що зв'язує
РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОВ2 і СОВЗ із МН МЕ5594; і - друге біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОВ2 ії СОВЗ із МН МЕб6744, і варіабельний домен, що зв'язує
РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОВ2 і СОВЗ із МН МЕ53З61.
Зо Додатково пропонується суміш або комплект частин, що містить: - перше біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей МН МЕ6744, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2,3,4,5,6, 7,8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕб6744, і варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5594, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5594; і - друге біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6744, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН
МЕ6744, і варіабельний домен, що зв'язує РО-11, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5361, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5361.
Крім того, у прикладах показано, що комбінація біспецифічного антитіла з варіабельним
БО доменом, що зв'язує СО137, який базується на МЕ6744, і варіабельним доменом, що зв'язує
РО-І1, що базується на МЕ5361, разом із біспецифічним антитілом з варіабельним доменом, що зв'язує СО137, який базується на МЕ6783, і варіабельним доменом, що зв'язує РО-11, що базується на МЕ5594 (застосовується як подвійний специфічний, наприклад, варіант втілення
ОіїїдосіопісеФ), забезпечує високу активацію Т-клітин порівняно з антитілом, що базується на 55 урелумабі.
Додатково пропонується, таким чином, суміш або комплект частин, що містить: - перше біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕб6783, і варіабельний домен, що зв'язує РО-11, який 60 містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5594; і
- друге біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ6744, і варіабельний домен, що зв'язує РО-11, який містить область МН із амінокислотною послідовністю області СОВЗ із МН МЕ5З61.
Додатково пропонується суміш або комплект частин, що містить: - перше біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОВ2 їі СОВЗ із МН МЕб6783, і варіабельний домен, що зв'язує
РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОВ2 і СОВЗ із МН МЕ5594; і - друге біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ, СОВ2 ії СОВЗ із МН МЕб6744, і варіабельний домен, що зв'язує
РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей СОВІ1, СОВ2 і СОВЗ із МН МЕ5З61.
Додатково пропонується суміш або комплект частин, що містить: - перше біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю областей МН МЕ6783, що має щонайбільше 15, переважно 0,1,2,3,4,5,6,7,8,9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕб6783, і варіабельний домен, що зв'язує РО-І1, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5594, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5594; і - друге біспецифічне антитіло або його функціональну частину, похідне й/або аналог, що містить варіабельний домен, що зв'язує СО137, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6744, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності МН
МЕ6744, і варіабельний домен, що зв'язує РО-11, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5361, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю МН МЕ5361.
У прикладах також показано, що зв'язування СО137-специфічного МН МЕ6797, що має добрі властивості щодо активації Т-клітин, пов'язане з присутністю амінокислот, які містять Аг9б6б,
СпІу7О ї Рне72 з амінокислотної послідовності СО137, як зображено на Фіг. 42.
У винаході, таким чином, також пропонується ізольоване, синтетичне або рекомбінантне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що здатне зв'язуватися з
СО137, причому зв'язування вказаного антитіла або функціональної частини, похідного або аналога з СО137 пов'язане з присутністю амінокислот, що містять Аг9бб, СІуУ7/0 ії Рне72 з амінокислотної послідовності СО137, як показано на Фіг. 42. Зв'язування вказаного антитіла або функціональної частини, похідного або аналога з СО137 переважно також пов'язане з амінокислотою, що містить Ма171 із амінокислотної послідовності СО137, як показано на Фіг. 42.
Термін "Агдбб" стосується залишку аргініну в позиції 66 послідовності СО137, як показано на
Фіг. 42. Термін "Сіу70" стосується залишку гліцину в позиції 70 послідовності СО137, як показано на Фіг. 42. Термін "МаІ71" стосується залишку валіну в позиції 71 послідовності СО137, як показано на Фіг. 42. Термін "Рпе72" стосується залишку фенілаланіну в позиції 72 послідовності
СО137, як показано на Фіг. 42.
Зв'язування антитіла або функціональної частини, похідного або аналога з СО137 пов'язане з присутністю перелічених залишків амінокислот, якщо при заміщенні будь-якого одного з цих залишків аланіном зв'язування антитіла або функціональної частини, похідного або аналога з утвореним білком СО137 зменшене.
У деяких варіантах втілення пропонується ізольоване, синтетичне або рекомбінантне антитіло, або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що здатний зв'язуватися з
СО0137, причому вказане антитіло або функціональна частина, похідне або аналог специфічно зв'язує амінокислоти Агабб, СІу70 і Рне72 з амінокислотної послідовності СО137, як показано на
Фіг. 42. Указане антитіло або функціональна частина, похідне або аналог переважно також специфічно зв'язує амінокислоту Ма1/71 із амінокислотної послідовності СО137, як показано на 60 Фіг. 42.
У деяких переважних варіантах втілення пропонується біспецифічне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, яке здатне зв'язуватися з СО137 і з РО-11 і яке має варіабельний домен, що зв'язує СО137, на основі МЕ6797 і варіабельний домен, що зв'язує
РО-І1, на основі МЕ7702. Зв'язування такого біспецифічного антитіла, яке має особливо добрі властивості щодо активації Т-клітин, із СО137 і РО-І1 пов'язане з амінокислотами, що містять вищезгадані амінокислотні залишки СО137.
Наданий час, після ідентифікації вищезгаданих амінокислотних залишків СО137, стало можливим утворювати або вибирати антитіла або їхні варіанти, які специфічно зв'язують ці амінокислотні залишки. Утворення й/або вибір зв'язувальних молекул, які специфічно зв'язують певні амінокислотні залишки, можна здійснювати з використанням способів, добре відомих у галузі, таких як, наприклад, за допомогою імунізації трансгенної відмінної від людини тварини, здатної до вироблення антитіл із фрагментом антигена, що містить певний домен, який містить цільові амінокислотні залишки. Альтернативно, за допомогою скринінгу бібліотеки фагового дисплея антитіл для пошуку фага, який зв'язується з визначеними амінокислотними залишками.
Додатково пропонується антитіло або його варіант, що конкурує з антитілом РВ17311 за зв'язування з СО137 і/або РО-Ї1. Конкуруюче антитіло або його варіант ідентифікують, наприклад, із використанням конкурентного аналізу, у якому клітини, які містять СО137 і/або РО-
І1, інкубують із РВ17 311 і з антитілами-кандидатами або їхніми варіантами. Антитіла-кандидати або їхні варіанти, які здатні зменшувати кількість зв'язаного РВ17311, порівняно з контролем, у якому клітини, що містять СО137 і/або РО-11, інкубують із РВ17311 без антитіл-кандидатів або їхніх варіантів, є конкуруючими антитілами або варіантами.
У деяких варіантах втілення пропонується ізольоване, синтетичне або рекомбінантне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що конкурує з антитілом
РВ17311 за зв'язування з СО137 і/або РО-І 1.
У деяких варіантах втілення пропонується ізольоване, синтетичне або рекомбінантне антитіло, або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що конкурує з антитілом
РВ17311 за зв'язування з амінокислотами Аг9бб, Спіу70 і Рне72 з амінокислотної послідовності
СО137, як показано на Фіг. 42, більш переважно за зв'язування з амінокислотами Аг9бб, СІу70,
Ма!171 і Рпе72 з амінокислотної послідовності СО137, як показано на Фіг. 42.
Зо У деяких варіантах втілення пропонується ізольоване, синтетичне або рекомбінантне антитіло, або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що конкурує з антитілом
РВ17309 за зв'язування з СО137 і/або РО-І 1.
У деяких варіантах втілення пропонується ізольоване, синтетичне або рекомбінантне антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог, що конкурує з антитілом
РВ17310 зазв'язування з СО137 і/або РО-І 1.
Антитіла або їхні варіанти, які конкурують із РВ17309 або РВ17310 за зв'язування з СО137 іабо РО-11, виділяють, наприклад, із використанням конкурентного аналізу, у якому зв'язування
РВІ17309 або РВІ17310 із клітинами, які містять СО137 і/або РО-11, за відсутності антитіла- кандидата або його варіанта, порівнюють зі зв'язуванням РВ17309 або РВ17310 із клітинами, що містять СО137 і/або РО-І 1 у присутності вказаного антитіла-кандидата або його варіанта.
Антитіло-кандидат або його варіант, який здатний зменшувати кількість зв'язаного РВ17309 або
РВ17310, порівняно з контролем, у якому клітини, що містять СО137 і/або РО-111, інкубують із
РВІ17309 або РВ17310 без указаного антитіла-кандидата або його варіанта, визначають як конкуруюче антитіло або його варіант.
Біспецифічне антитіло ОХ40 х РО-І 1 або його функціональна частина, похідне й/або аналог, як описано в цьому документі, переважно містить - варіабельний домен, що зв'язує ОХ40, який містить область МН із амінокислотною послідовністю СОНЗ або амінокислотною послідовністю СОНІ, СОН2 ії СОВЗ з МН МЕб6629;
МЕ6630; МЕ6б637; МЕ66б43; МЕб6б45; МЕ6648; МЕ6655; МЕ6658; МЕ666бО; МеЕ6675; МЕ6686;
МЕ6690; МЕ6692; МЕб6700; МЕб6706; МЕб6714; МЕ6721; МЕ6722; МЕб6724; МЕ6728; МЕ6729;
МЕ6826; МЕ6940; МЕ6942; МЕ6943; МЕ6944; МЕ6947; МЕ6949; МЕ7331; МЕ7332; МЕ7334;
МЕ7341; МЕ7345; МЕ7350; МЕ7351; МЕ7352; МЕ7353; МЕ7356; МЕ7358; МЕ7365; МЕ7366;
МЕ7371; МЕ7372; МЕ7374; МЕ7378; МЕ7382; МЕ7383; МЕ7394; МЕ7395; або МЕ7397; і - варіабельний домен, що зв'язує РО-І 1. Варіабельний домен, що зв'язує РО-І 1, переважно містить область МН із амінокислотною послідовністю СОВЗ або амінокислотною послідовністю
СОН, СОВ2 і СОВЗ із МН із РО-Ї 1-специфічного УН, як зображено на Фіг. 3. У переважному варіанті втілення РО-І 1-специфічний УН, як зображено для МЕ5594; МЕ5424; МЕ5426; МЕ5553;
МЕ5442; МЕ5561; МЕ5426; або МЕ5439 (Фіг. 3).
Антитіло або його функціональна частина, похідне й/або аналог переважно містить
- варіабельний домен, що зв'язує ОХ40, який містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ6629; МЕ6630; МЕ6637; МЕ6643; МЕ6645; МЕ6648; МЕ6655; МЕ6658;
МЕ66б6О; МЕ6б6б75; МЕб6686; МЕб6690; МЕ6692; МЕ6700; МЕ6706; МЕб6714; МЕ6721; МЕ6722;
МЕ6724; МЕ6728; МЕб6729; МЕ6826; МЕ6940; МЕ6942; МЕ6943; МЕ6944; МЕ6947; МЕ6949;
МЕ7331; МЕ7332;МЕ7334; МЕ7341; МЕ7345; МЕ7350; МЕ7351; МЕ7352; МЕ7353; МЕ7356;
МЕ7358; МЕ7365; МЕ7366; МЕ7371; МЕ7372; МЕ7374; МЕ7378; МЕ7382; МЕ7383; МЕ7394;
МЕ7395; або МЕ7397, що має щонайбільше 15, переважно 0, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю амінокислотної послідовності вказаного
МН; - варіабельний домен, що зв'язує РО-І 1. Варіабельний домен, що зв'язує РО-І 1, переважно містить область МН із амінокислотною послідовністю МН МЕ5594; МЕ5424; МЕ5426; МЕ5553;
МЕ5442; МЕ5561; МЕ5426; або МЕ5439 (Фіг. 3), що має щонайбільше 15, переважно 0, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10, і переважно має 0, 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних вставок, делецій, заміщень або їхню комбінацію порівняно з амінокислотною послідовністю УН указаного МЕ (Фіг. 3).
Згадані щонайбільше 15, переважно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, і переважно 1, 2, 3, 4 або 5 амінокислотних заміщень у згаданих областях Н, МН, І їі МІ є переважно консервативними амінокислотними заміщеннями, вставками, делеціями або їхньою комбінацією, переважно не в області СОВАЗ ланцюга Н, МН, І або МІ, переважно не в області СОВІ1, СОВ2 або СОВЗ ланцюга
МН або У і переважно не в області ЕН4.
З метою ясності та стислості опису ознаки описані в цьому документі як частина одного або окремих варіантів втілення, однак буде зрозуміло, що обсяг винаходу може включати варіанти винаходу, які мають комбінації всіх або деяких із описаних ознак.
Винахід додатково пояснено в наведених нижче прикладах. Ці приклади не обмежують обсягу винаходу, а служать тільки для пояснення винаходу.
Короткий опис графічних зображень
Фіг. 1. Спільний легкий ланцюг, який використовують у моно- та біспецифічному Іда.
Фіг. ТА. Амінокислотна послідовність спільного легкого ланцюга.
Фіг. 18. Послідовність ДНК варіабельного домену спільного легкого ланцюга й трансляція
Зо (па КМ1-39/кК1).
Фіг. 1С. Послідовність ДНК константної області спільного легкого ланцюга й трансляція.
Фіг. 10. Трансляція варіабельного домену спільного легкого ланцюга І2КМ1-39/К5.
Фіг. 1Е. М-область ІКМ1-39А
Фіг. 2. Важкі ланцюги Ідсї для утворення біспецифічних молекул. Фіг. 2А. МН є нуклеїновою кислотою, що кодує амінокислотну послідовність для МЕ, зображеного на Фіг. З. фіг. 28.
Область СНІ. фіг. 2С. Шарнірна область. Фіг. 20. Область СН2. Фіг. 2Е. СН2, що містить заміщення І 2352 і С238Н. Фіг. 2Е. Домен СНЗ, який містить заміщення І З51К і Т366К (КК). Фіг. га. Домен СНЗ, який містить заміщення 1 3510 і І З68Е (ОЕ).
Фіг. 3. Амінокислотні послідовності варіабельних областей важкого ланцюга. Фіг. ЗА.
Послідовності МН клонів, специфічних до СО137. Фіг. ЗВ. Послідовності МН клонів, специфічних до РО-І1. Фіг. ЗС. Послідовності МН клонів, специфічних до ОХ40. Фіг. 30. Послідовності УН клонів, специфічних до РО-Ї 1.
Позначення МЕ стосується Таб, що містить варіабельну область важкого ланцюга, як зображено, і спільний легкий ланцюг. Амінокислотна послідовність легкого ланцюга показана на
Фіг. 1А. Підкреслені послідовності вказують на амінокислотну послідовність відповідно до області СОВІ, СОВ2 і СОВЗ, згідно з нумерацією за Набаї.
Фіг. 4. Карта й ознаки вектора рІВЕ5-Меоз (ММ1363).
Фіг. 5. Карта й ознаки вектора рМАХ1.
Фіг. 6. Карта вектора й ознаки фазмідного вектора ММ1473, який використовують для створення бібліотек "імунного" фагового дисплея.
Фіг. 7. Карта вектора й ознаки вектора експресії ІДС ММ1452 або МУ1453, які використовували для експресії Гар-фрагментів, специфічних до СО137, РО-1, РО-І1 ї ОХ40, у важкому ланцюзі КК-варіанта або важкому ланцюзі ЮОЕ-варіанта відповідно для утворення біспецифічного Ід.
Фіг. 8. Амінокислотна послідовність гена МН, який при комбінації зі спільним легким ланцюгом як МЕ1337 є специфічним для токсину правця і який присутній у важкому ланцюзі варіанта ОЕ, який використовували для утворення біспецифічних молекул дес РО-11х1ТТт.
Підкреслені послідовності вказують амінокислотну послідовність відповідно до області СОВ'І,
СОвг і СОВЗ.
Фіг. 9. Карта вектора й ознаки вектора експресії (ІД ММ1377, який використовували для експресії Гар-фрагмента, специфічного до ТТ, МЕ1337 у важкому ланцюзі варіанта ОЕ для утворення біспецифічного Ід.
Фіг. 10. Аналіз блокування РО-1/РО-І 1.
Оцінка здатності панелі антитіла до РО-Ї1 блокувати взаємодію РО-І 1 з нашаруванням із
РО-1 за концентрації біспецифічного Ідсї 10 мкг/мл. Дані нормалізували за даними, отриманими з бівалентним еталонним антитілом до РО-Ї1 МРОЇ 3280А за концентрації 10 мкг/мл (100 95 блокування). Типовий приклад продемонстровано для панелі РО-І| 1. Максимальне зв'язування (нормалізоване до блокування 095) встановлювали шляхом інкубування ізотипу антитіла людини, неспецифічного до РО-1/РО-І1. Усі варіабельні домени РО-Ї1, що містять послідовності МЕ, зображені на Фіг. З і не представлені в цьому документі, блокують взаємодію 0-1/РБ-11 » 70 об.
Фіг. 11. Активація СО137 у клітинах УиїКаї СО137-МЕКВІінс за допомогою бівалентних антитіл до СО137.
Фіг. 12. Активація СО137 у клітинах диїкаї СО137-МЕКВІнс за допомогою антитіл до
СО137хХРО-І 1 за відсутності (зліва) або в присутності перехресного зшиваючого антитіла Ідс (справа). Номери МЕ відповідають Раб СО137, присутнім у біспецифічних антитілах до
СО137хРБО-І1.
Фіг. 13. Активація первинних Т-клітин бівалентними антитілами до СО137 (вгорі) або моновалентними антитілами (внизу) у комбінації з РО-І1-специфічним ЕРаб-фрагментом (МЕ5594), яку вимірюють за вивільненням ЇЇ -2.
РОаб744: бівалентне антитіло до СО137, що містить два фрагменти МЕб6744 (також позначено як 6744 х 6744).
РОб783: бівалентне антитіло до СО137, що містить два фрагменти МЕб6783 (також позначено як 6783 х 6783).
РОб860: бівалентне антитіло до СО137, що містить два фрагменти МЕб6860 (також позначено як 6860 х 6860). 20Нн4.9: еталонне антитіло до СО137 на основі УУО 2005/035584.
Фіг. 14. Активація СО137 на клітинах УиїКаї-СО0137-Іис у присутності клітин СНО із надмірною
Зо експресією РО-І1 або клітин СНО дикого типу. Активацію СО137 вимірювали за експресією люциферази. раб744: бівалентне антитіло до СО137 (6744 х 6744)
РВ14671:біспецифічне антитіло до СО137хХРО-І 1 (6744 х 5361)
РВ14580: біспецифічне антитіло до СО137хХРО-І 1 (6744 х 5594)
РВ14890: біспецифічне антитіло до СО137хХТ (6744 х 1337) рРОаб783: бівалентне антитіло до СО137 (6783 х 6783)
РВ14681: біспецифічне антитіло до СО137хРО-І1 (6783 х 5361)
РВ14590: біспецифічне антитіло до СО137хХРО-І1 (6783 х 5594)
РВ15855: біспецифічне антитіло до СО137хХ ТТ (6783 х 1337) 20Нна4.9: еталонне антитіло до СО137 на основі УМО 2005/035584
Фіг. 15. Активація первинних Т-клітин бівалентними антитілами до СО137, біспецифічними антитілами до СО137ХхРО-І 1 або комбінаціями СО137ХхРО-І 1 Оіїдосіопіс5б у присутності клітин
СНО, що надмірно експресують РО-1| 1, або клітин СНО дикого типу. Активування вимірювали за вивільненням ЇЇ -2. раб744: бівалентне антитіло до СО137 (6744 х 6744)
РВ14671: біспецифічне антитіло до СО1З37хХРО-І 1 (6744 х 5361)
РВ14580: біспецифічне антитіло до СО137хХРО-І 1 (6744 х 5594)
РВ14890: біспецифічне антитіло до СО137хХТ (6744 х 1337) 20Нна4.9: еталонне антитіло до СО137 на основі УМО 2005/035584
МОН7480: еталонне антитіло до СО137 на основі О5 8,337,850
Фіг. 16. 5ЕВ-стимуляцію вироблення 1//-2 посилюють біспецифічними антитілом до
СО137хРО-І 1 або до СО137хХРО-І 1 Оіідосіопіс5Ф у клітинах крові здорових донорів.
РВ14580: біспецифічне антитіло до СО137хХРО-І 1 (6744 х 5594)
РВ14671: біспецифічне антитіло до СО1З37хХРО-І 1 (6744 х 5361)
МРОІ 32804А: еталонне антитіло до РО-І 1 на основі МО 2010/077634
РВО469: біспецифічне антитіло до РО-І 1х ТТ (5594 х 1337)
РВ14890: біспецифічне антитіло до СО137хХТ (6744 х 1337) 20Нна4.9: еталонне антитіло до СО137 на основі УМО 2005/035584
Контрольне антитіло: Ра2708рг213; до НБМ-С
Фіг. 17. БЕВ-стимуляцію вироблення 1/-2 у клітинах здорових донорів суттєво посилюють біспецифічними антитілами до СО137хХРО-І1 порівняно з антитілом до СТІ А-4 1001 (яке базується на іпілімумабі)
Фіг. 18. Активація ОХ-40 на клітинах диїкаї-ОхХ-40 МЕКВ-Ійс у присутності клітин СНО із надмірною експресією РО-Ї1 (ліва панель) або клітин СНО дикого типу (права панель).
Активацію визначали за допомогою вимірювання експресії люциферази. РО-І1-специфічний
Еаб-фрагмент МЕ5561; РО-1-специфічний Рар-фрагмент МЕ6256 (послідовність показано на
Фіг. 43).
Фіг. 19. Скринінг антитіл до СО137хХРО-І 1 у аналізі активації Т-клітин (12 СО137-специфічних
Еаб-фрагментів). Т-клітини від одного донора стимулювали протягом 72 год. за 37 "С із дозозалежним титруванням указаної нижче панелі антитіл у присутності клітин СНО із надмірною експресією РО-І1 (верхні панелі) або клітин СНО дикого типу (нижні панелі).
Активацію СО137 вимірювали за вивільненням І/-2 з використанням аналізу АїГІрнагІ5ЗА, виражали за кількістю ІЇ-2. Антитіло позитивного контролю 20НА.9 (на цій фігурі називається
РОабб19) і антитіло негативного контролю до ТТ Ра1337 (ант. нег. контр.")
РВ | МЕТ ме2г | Рв | ме | мг2 | РВ | ме! | мег | вв | ме | мег 14143 6783 |6б783 |14183 |6763 67/63 |14145 16785 |6785 Щ|1413416737 /|6737 14590 16783 5594 |14815 16763 |5561 14821 16785 |5561 |1480816737 /|5561 14820 16783 |5561 |15143 6763 |5426 |15149 16785 |5426 |1513616737 /|5426 15190 6783 5424 |17100 |6763 |5553 |17103 |6785 |5553 |171061|6737 /|5553 15148 6783 5426 |14585 16763 |5594 |14591 16785 |5594 |1457816737 /|5594 17085 6783 |5442 |15185 6763 5424 )|15191 1|6785 |5424 |15178|6737 |5424 17097 |6783 |5553 |17088 |6763 |5442 |17091 16785 |5442 |17094 6737 )|5442
17109 | 6783 | 5439 | 17112 | 6763 | 5439 | 17115 | 6785 | 5439 ) 17118 | 6737 | 5439 14203 /|6808 6808 114179 |6754 |6754 )|14162 |6825 |6825 |14195 16797 |6797 17050 /|6808 |5561 14814 6754 |5561 |14829р 16825 1|5561 14823 |6797 15561 17074 /|6808 5426 |15142 |6754 |5426 |15157 |6825 |5426 |15151 6797 |5426 17098 |6808 5553 117101 16754 |5553 17104 |6825 |5553 |17107 16797 |5553 16841 6808 5594 |14584 |6754 |5594 |14605 6825 5594 |14593 16797 /|5594 17062 |6808 15424 |15184 |6754 |5424 )|15199 |6825 |5424 |15193 |6797 |5424 17086 6808 5442 |17089 |6754 |5442 )|17092 |6825 |5442 |17095 16797 |5442 17110 6808 15439 |17113 |6б754 |5439 |17116 |6825 |5439 |17119 6797 |5439 14149 6805 16805 114135 |67/44 |6744 )|14138 |6749 |6749 |14193 6788 |6788 14826 /805 5561 14810 6744 |5561 |14813 |6749 15561 17060 6788 І|5561 15154 /)6805 15426 |15136р|67/44 |5426 )/|15141 |6749 |5426 |17084 |6788 |5426 17099 |6805 15553 117102 |6744 |5553 |17105 16749 |5553 |17108 16788 |5553 14596 6805 15594 |14580р|б7/44 |5594 )/|14583 6749 |5594 |16856 |6788 |5594 15196 /)6805 5424 |15180 |6б7/44 |5424 )|15183 |6749 |5424 |17072 |6788 |5424 17087 /|6805 15442 |17090 |6744 |5442 )|17093 |6749 |5442 |17096 6788 |5442 17111 |6805 5439 |17114 |6б7/44 |5439 )|17117 |6749 |5439 |17120 |6788 |5439
Фіг. 20. Скринінг антитіл до СО137хХРО-1 1 у аналізі зі стимулюванням мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК) стафілококовим ендотоксином В (ЗЕВ) (12 СО137-специфічних Рар- фрагментів). Антитіла до СО137ХхРО-1Ї1 досліджували в аналізі ФЕВ МКПК у присутності 2 мкг/мл 5ЕВ. Активацію СО137 вимірювали за вивільненням ІЇ-2 з використанням аналізу
АІрнаг! ІЗА, виражали за кількістю ІЇ-2. Антитіло позитивного контролю; антитіло позитивного контролю до СТІ А-4 (на основі іпілімумабу, 1001) і антитіло негативного контролю до НОМ-(
Ра2708 (ант. нег. контр.").
о РВ | МЕ мг2 | РєРВ | ме мг2 | РВ | ме | мег2г | рРВ | ме | мег 14143 6783 |6783 14183 6763 6763 |14145 6785 |6785 14134 | 6737 6737 14590 16783 |5594 14815 |6763 |5561 14821 |6785 |5561 14808 | 6737 5561 14820 16783 |5561 15143 6763 5426 |15149 6785 |5426 15136 5426 15190 16783 |5424 17100 16763 5553 |17103 6785 |5553 17106 5553 15148 6783 |5426 14585 16763 5594 |14591 6785 |5594 14578 | 6737 5594 17085 16783 |5442 15185 16763 5424 |15191 |6785 15178 | 6737 5424 17097 |6783 |5553 17088 |6763 5442 |17091 |6785 )5442 17094 | 6737 5442 17109 16783 |5439 17112 16763 5439 |17115 16785 |5439 17118 | 6737 5439 14203 6808 |6808 14179 16754 |6754 |14162 16825 |6825 14195 | 6797 6797 17050 16808 |5561 14814 |6754 |5561 14829р|6825 |5561 14823 | 6797 5561 17074 |6808 15142 |6754 5426 |15157 |6825 |5426 15151 |6797 5426 17098 6808 |5553 17101 16754 |5553 |17104 16825 |5553 17107 | 6797 5553 16841 |6808 |5594 14584 |6754 5594 |14605 6825 |5594 14593 | 6797 5594 17062 |6808 |5424 15184 |6754 |5424 |15199 |6825 |5424 15193 | 6797 5424 17086 | 6808 | 5442 | 17089 | 6754 | 5442 | 17092 | 6825) 5442 |17095| 6797 ) 5442 17110 6808 5439 |17113 16754 15439 |17116 |6825 15439 /|17119 16797 |5439 14149 |6805 |6805 |14135 16744 |6744 |14138 6749 6749 |14193 16788 |/|6788 14826 |6805 |5561 /|14810 |6744 |5561 14813 І|6749 |5561 17060 6788 )/)|5561 15154 6805 15426 /|151368р/|6744 |5426 |15141 |6б7/49 5426 |17084 6788 /|5426 17099 |6805 |5553 117102 16744 |5553 |17105 16749 15553 |17108 16788 |5553 14596 6805 15594 )/|14580р)/|6744 5594 |14583 )|б/49 15594 |16856 16788 /|5594 15196 6805 15424 )|15180 6744 |5424 |15183 )|6б/49 5424 |17072 16788 |5424 17087 6805 15442 )|17090 6744 |5442 |17093 |6б7/49 5442 |17096 16788 /|5442 17111 6805 |5439 )|17114 )|6744 |5439 |17117 |6б/49 |5439 |17120 6788 |5439
Фіг. 21. Скринінг антитіл до СО137 х РО-І1 у аналізі зі стимулюванням мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК) стафілококовим ендотоксином В (ЗЕВ) (8 СО137-специфічних
Еар-фрагментів). Антитіла до СО1З37ХРО-11 досліджували в аналізі ФЕВ МКПК у присутності 2 мкг/мл 5ЕВ. Активацію СО137 вимірювали за вивільненням ІЇ-2 з використанням аналізу
АІрнаг! ІЗА, виражали за кількістю ІЇ-2. Антитіло позитивного контролю; антитіло позитивного контролю до СТІ А-4 (на основі іпілімумабу, 1001) і антитіло негативного контролю до НОМ-(
Ра2708 (ант. нег. контр.").
РВ | МЕ | мЕ2 | РВ | ме | мЕ2 | РВ | ме | ме
РВІ4585 |МО6763 |МО5594 РВІ5149 |МОб785 |МО5426 | -:
ІРВІ5185 |МОеб6763 |МО5424 |РВІ7103 |МОаб6785 |мМс5553
Фіг. 22. Біспецифічні антитіла до СО13З7хХРО-Ї 1 і їхні батьківські бівалентні антитіла до
СО137 зв'язуються з СО137 людини та довгохвостої макаки, що визначають за допомогою проточної цитометрії.
Фіг. 23. Біспецифічні антитіла до СО1З37хХРО-Ї1 1 і їхні батьківські бівалентні антитіла до РО-Ї 1 зв'язуються з РО-Ї1 людини та макаки резус, що визначають за допомогою проточної цитометрії.
Фіг. 24. Біспецифічні антитіла до СО137хХРО-11 і їхні батьківські бівалентні антитіла зв'язуються з активованими Т-клітинами, що визначають за допомогою проточної цитометрії.
Фіг. 25. Біспецифічні антитіла до СО1З37хХРО-Ї1 1 і їхні батьківські бівалентні антитіла до РО-Ї 1 блокують зв'язування ліганду РО-І 1, що визначають за допомогою ЕГІЗА.
Фіг. 26. Біспецифічні антитіла до СО1З37хХРО-Ї1 1 і їхні батьківські бівалентні антитіла до РО-Ї 1 блокують зв'язування ліганду СО137, що визначають за допомогою проточної цитометрії.
Фіг. 27. Біспецифічні антитіла до СО137хХРО-Ї1 1 і їхні батьківські бівалентні антитіла блокують взаємодію між РО-1 1 і РО-1 у аналізі блокади репортерного гена іп мійго.
Фіг. 28А. Трансактивація СО137 на клітинах Удиїжкаї-СОр137-ІШс у присутності клітин СНО, що експресують різні сайти зв'язування РО-11 на кожній клітині, порівняно з клітинами СНО дикого типу. Активацію СО137 вимірювали за експресією люциферази.
Фіг. 288. Трансактивація СО137 на клітинах Удиїкаї-СО137-Ішс у присутності пухлинних клітин людини, що експресують різні сайти зв'язування РО-Ї1 на кожній клітині РО-І1. Активацію
СО0137 вимірювали за експресією люциферази
Фіг. 28С. Трансактивація СО137 на клітинах диїкаї-СО137-Ійс у присутності СНО-РО-І 1, Е5-2 або клітин СНО дикого типу. Дослідження да проводили тричі за 10 мкг/мл.
Активацію СО137 вимірювали за експресією люциферази. Нижче вказані досліджувані антитіла та їхній склад.
Фіг. 29. Порівняння антитіл до СО137 х РО-І 1 у аналізі активації Т-клітин із одним еталонним контролем і їхньою комбінацією. Активацію СО137 вимірювали за вивільненням цитокінів ІІ -2 і
ФНПоа й вимірювали за допомогою аналізу І штіпех.
Фіг. 30. Активність антитіла до СО137хХРО-І1 РВІ17311 у аналізі активації Т-клітин із одним еталонним контрольним антитілом і їхньою комбінацією. Активацію СО137 вимірювали за вивільненням множини цитокінів і вимірювали за допомогою аналізу І штіпех (25ріеєх).
Фіг. 31. Біспецифічні антитіла до СО1З37ХхРО-1І1 послідовно посилюють вивільнення 1Ї-2 за допомогою МКПК під час аналізу зі стимулюванням 5ЕВ незалежно від донора МКПК або концентрації ФЕВ. Активацію СО137 вимірювали за вивільненням цитокінів ІІ-2 і вимірювали за допомогою аналізу І итіпех.
Фіг. 32. При аналізі зі стимулюванням ФЕВ біспецифічні антитіла до СО137ХхРО-11 є більш ефективними для посилення вивільнення цитокінів, ніж еталонне антитіло до СО137 або еквімолярна суміш еталонних антитіл до СО137 і до РО-І1. Активацію СО137 вимірювали за вивільненням цитокіну ІІ--2, ІЕМу ії ФНПа й вимірювали за допомогою аналізу І итіпех.
Фіг. 33. РВ17311 інгібує опосередковане макрофагами М2 пригнічення МКПК, стимульованих антитілами до СОЗ/С028, продемонстроване посиленням вивільнення ІЄМУу.
Фіг. 34. РВ17311 посилює ріст Т-клітин після примування Т-клітин СОВ к.
Фіг. 35. Після примування РВ17311 посилює диференціацію наївних Т-клітин у Т-клітини центральної пам'яті й ефекторні Т-клітини. Тм/єсм - наївні/ стовбурові клітини пам'яті; Тсм - центральна пам'ять, Тем - ефекторна пам'ять; Те - термінальні ефекторні клітини.
Фіг. 36. Вплив РВ17311 на експресію СО107а й цитокінів у загальній популяції Т-клітин. Тем - ефекторна пам'ять; Те - термінальні ефекторні клітини.
Фіг. 37. Вплив РВ17311 на експресію СО107а й цитокінів у субпопуляціях Т-клітин.
Фіг. 38. Вплив В17311 на проліферацію Т-клітин СО4 і СО8, які інфільтрують пухлину, отриманих із печінкових метастазів при колоректальному раку (ГМ-СВС) і карциномі печінки (НСС).
Фіг. 39. Визначення й отримання зображення критичних залишків у СО137 для РВ17311. (А)
Зо Для кожного мутованого клону середній показник зв'язування зображений на графіку у вигляді функції середнього показника експресії СО137 клону (сірі кільця), що вимірюють за зв'язуванням контрольних антитіл. Зв'язування виражають у відсотках від значення, отриманого за допомогою клону дикого типу (М/Т). Пунктирні лінії позначають пороги, які використовували для визначення критичних клонів (чорні крапки). (В) У таблиці перелічені середні показники реактивної здатності до зв'язування (і діапазони) для всіх визначених критичних залишків.
Критичні залишки для зв'язування антитіла РВ17311 (обведено чорним) дали негативний результат щодо зв'язування антитіла РВ17311 («20 95 зв'язування з М/Т), але позитивний для контрольного антитіла МАБ 555955 (57095 М/Т). (С) Критичні залишки (обведені рамкою) зображені на моделі СО137 на основі структури ОХ40Ї миші, зв'язаного з ОХ40 людини (ідентифікаційний Ме у базі даних білків (РОВ ІФ| 2НЕУ, Сотраап еї а!., 2006). Непідтверджений залишок С133 показаний сірим кольором.
Фіг. 40. Вплив біспецифічного антитіла РВ1І7311 до СО137хРО-І1, на медіанний об'єм пухлини на день 19 у моделі ксенотрансплантата в мишей. МТУ - медіана об'єму пухлини; Та - інгібування росту пухлини; статистична значимість критерію Манна - Уітні позначена "7 (О01«Р«0,05) їі и (Р«0,001) при порівнянні з групою 1.
Фіг. 41. Інтерференція 520137 з активацією Т-клітин. Оцінка впливу розчинного СО137 на здатність біспецифічного антитіла до СО137ХхРО-І 1 до активації первинних Т-клітин людини.
Фіг. 42. Амінокислотна послідовність позаклітинного домену СО137.
Фіг. 43. Амінокислотна послідовність МЕб256.
Приклади
У контексті цього документа "МЕХХХХ", де Х є самостійним цифровим показником 0-9, стосується Раб, який містить варіабельний домен, у якому МН має амінокислотну послідовність, позначену 4 цифрами. Якщо не вказано інше, варіабельна область легкого ланцюга з варіабельного домену, як правило, має послідовність із Фіг. ТА, як правило 18. "МЕХХХХ УНН" стосується амінокислотної послідовності МН, позначеної 4 цифрами. МЕ додатково містить константну область легкого ланцюга й константну область важкого ланцюга, що звичайно взаємодіє з константною областю легкого ланцюга. Ре стосується моноспецифічного антитіла, що містить ідентичні важкий і легкий ланцюги. РВ стосується біспецифічного антитіла з двома різними важкими ланцюгами. Варіабельна область важких ланцюгів (МН) відрізняється та, як правило, відрізняється також область СНЗ, де один із важких ланцюгів має мутацію КК свого домену СНЗ, а інший має комплементарну мутацію ОЕ свого домену СНЗ (для довідки див.
РСТ/МІ 2013/050294 (опублікований як М/О2013/157954).
Приклад 1
Отримання матеріалів для відбору та скринінгу
Культивування клітинних ліній
Клітини Еб-2 людини (кат. Мо САІ-1978) купували в АТСС і весь час тримали їх у середовищі МеСоу БА (С1ібсо) із додаванням 10 95-ої фетальної бичачої сироватки (ЕВ5) (опа). Клітини Егеезіує 293Е (кат. Ме р/п51-0029) отримували в Іпмійтодеп і постійно підтримували в середовищі 293 Егеесіує. Клітинні лінії НЕК29ЗТ (кат. Мо АТОС-СВІ -11268) і
СНО-КІ (кат. Ме 05М2 АСС110) купували в АТСС і постійно підтримували в середовищі
ОМЕМ/Е12 (Сібсо) із додаванням І -глутаміну (Сірсо) і ЕВ5 (І оплга).
Створення векторів експресії Х40, СО137 і РО-І 1 для імунізації та для отримання стабільних клітинних ліній
Повнорозмірну кКДНК кожної мішені включно з унікальними сайтами рестрикції для клонування та консенсусною послідовністю Козак для ефективної трансляції або синтезували, або отримували за допомогою ПЛР-ампліфікації на доступній у продажі експресійній конструкції, що містить цільову кКДНК зі специфічними праймерами, які внесли унікальні сайти рестрикції для
Зо клонування й консенсусну послідовність Козак для ефективної трансляції. Молекулу кКДНК кожної мішені клонували в еукаріотичну експресійну конструкцію, таку як рІВЕ5-МеоЗ (Сіопіесн;
Фіг. 4) або рМАХІ (ТНепто Різпег Зсієпійіс; Фіг 5) через МпеіЕсоВІ, що призводило до утворення рІВНЕ5-Меоз |(ТАНСЕТ МАМЕ)Ї і рМАХІ |(ТАВСЕТ МАМЕ)| відповідно. Послідовності вставки підтверджували шляхом порівняння з еталонними амінокислотними послідовностями
МСВІ. Для отримання стабільних клітинних ліній використовували конструкції РІВЕ5-Мео3. З метою імунізації використовували конструкції РМАХІ. Загальний огляд назв конструкцій, що утворилися, див. у ТАБЛИЦІ 1.
Амінокислотна послідовність повнорозмірної вставки пиСО137 (як у рІВЕ5-Мео3, так і рУАХТ) для експресії на клітинній поверхні (ідентична до сепВапк: МР 001552.2):
МОм УМІЖАТ УЧЕТ ОСС АТ КСО МО КСВ АСКИ
ЕРИ ОСКОСУККЕТ КАСКО МА ВТО АС МСЕК ОО СТЕК КОЮ
КСО ТЕМОЮ ВО САУ У ОТ КЕКВ УСВА ЗРО АКУ ТЕ
АВАКОВ КАС ТЕТА СВО ЕС КЕ У УА ЕКО КОВЕМЕВУГТО
ЕТО СКСВЕРЕЕЕНКАК у якій:
МИМО АТМ МРКАТИХ сигнальний центид.
ОВО МСВАСТ ДОМ МОСС МКАС СТИСКУ ВККС Там
СЕТ РО НС ОМА МС НК ЧК НО ТЕКС СКС ТЕ МОСК СЕРЕ
СОСОК УСУКИКЕВОВУ УСИРХВАГМ ЯРОА ЗУ ГРРАВАКЕРОНЯРОЄ ВС г ВОСЯХ,
ПЕРЕРАБ ТАСЬВСБЕЕТІКРВУ У: передінеуюана облають УМ.
ЕКОВКК У КОРМ УСТ ТЕКС СВЕВЕКЕ ЕС: внуУХОВОНТНиНИВ хв.
Амінокислотна послідовність повнорозмірної вставки СО137 макаки (Масаса газсісціагів) (як у рІВЕ5-Мео3, так і рМАХІ) для експресії на клітинній поверхні (ідентична до СепВапк:
АВУ47575.1):
МОм мА ТЬМОУМЧЕЕ КТ НСС АСТМИ РОСВР МЕРА
ЕРСЕМСВОСВОСУКЕ ТЕ ККОСВЕТУМАКТЮТВОН У НСС АОС НКТ ЕКО
ЕКО ЕК ВМ СКРАУ ТСН ОК ВУС УМО КЕ ПУУСОРУРАГН РОСА АТРЕ
АРАКЕРОУНОРОПЕЕСАСТОТУУ Р СРЕС УТ КЕ УУ КАК ККУ Р КОРЕМУУСУГ ТС
МКК ЕН у якій:
МЕМ УА ТЯ УБМЕЕНКТНУ: свовальний певтид,
ПИВ СВО РАХЕЕСТВ МЕС ВСЕМ ГАНОК ТИС КОУКК ВККСУ
АЕС У НС АВС ННОКЧКНОИ ТК СК ОСС ТЕМОЮ К ВО СВ ЕМВ
ОЗ УБУМОТ КЕКВ У УКОСКР АТ РИ ЯКАТВЕВАРА ВЕРСИЯ: КСО із в ХУ,
ПЕРБАБТУРУ УКВ У КВУ У: передпачуваня подають ТМ,
КЕЗАККЦОК ТТ КОТИ МАРТ ТОБ ОО ССВЕРЕВВ ЕС: вилУкруютвУний хе,
Амінокислотна послідовність повнорозмірної вставки СО137 щура (як у рІВЕ5-Мео3, так і рУАХТ) для експресії на клітинній поверхні (ідентична до СсСепВапк: ХРООВ8 762 505.1):
МОБ УММУУ ТУ УТ КСУВАТЕМАСОВОСПАСТВСВК УР УЄСТОСВРЕ УВУ НИ
РНК У СКУ ВК КЕКРСКАТНМАВСЕС УКОСІВ КСТЕСЕКЕ КРОК ТО
КМ ТЕМІ АС У СКРУТІ ВУ МО КЕКВ УСРР У УБЕРУТТРІА
УТТРЕКЕХОКК ВСТАВ Т АТ ТЕ ЦЕ УКУВЕ ЖІ ККККВЕККОВЕККАУК
АОБКЕВАСВСКУ РЕК НИНЕ ХК. у якій:
МОБ ММУЄТУ ТУ УСЕ ВА: сягаВльНей пептид.
ТЕМРООВСКАСЦІ СВК ВУЄ ТКС ГУБ СВ КСТНСЕ СОСКА ККРСВВТНКА
СЕС НССагРКС ТКС КОСИНО ТЕ ОК СМС ОТ МАСУ СКЕ Ж КСВІ,
ІОВА У КМОТКЕКОУУЄОВРУ У БРУТТРІАУТЕРВЕКЕСВАК ТК БОС З СЮ Я У,
УБРЬЕБА ТАС ЛЕНЬ КЕ: передбичувани оєлають КМ.
УВК ЖСВККЕРНККОРЕК КА УКТАОБЕПАСВСКВ РЕВЕ ОСС
ВнУПНЕЮТНИНЕ Хвіст.
Амінокислотна послідовність повнорозмірної вставки пПиШРО-І 1 (як у рІВЕ5-Мео3, так і РМАХ1) для експресії на клітинній поверхні (ідентична до СепВапкК: ААІ13735.1):
МЕ БА КІМ ТУ КН МАКРУ ТУРІ УКУСУ ПЕ СКЕвУСКО ОАЕ мМЕОКМІОре НОВЕ КУН УКОВ АК КІН МААМН ТУКА У УВС
БУСОАВУКАПУКУМАВУМЕІМОКІ УВУ ТЕН ТАКО РЕАК У С НИКУ
ГСК РМЕЕЕСЕКЕМУТУ ТІ КІТ ТТ УСТАВ ТАВЕ РЕЕ АНРЕ
МЕН Уа КУ АЛЕ КЕ ЕСЕ МОУ КК МК КОБТН ВТ у якій:
МВА УК МАГУ УНІ МА: снрнальний ПЕН ТНА.
ТТ УРКІ У УКУСУММ ПЕСКЕВУККМНЛМ ААУ ЖЕНЕ УНОКВГ ЯКУ
ОНЕУ КОКАКЮ Ю АКОМААН ТУКА СУС САВКА УКУМАВ
ВЕК ПУ ПВ У ТЕН СО АБО УРКАВУрУТ НСТУ КТГ МКК ЕМ
УТ КСО ТЕМ УСТАВ ЕЕМЕТАВАЛВЕООЯ АНВЕМЕВ ССТ т вв,
МЕ УНИЛА ПТС ОО УАКТЕН перед увана снасть ЕМ.
ВІКОМ УККОСОСВБМ ММК НЕТ: явутоканинине ХВгст.
Амінокислотна послідовність повнорозмірної вставки РО-Ї1 макаки (тасаса тшиапца) (як у рІВЕ5-Мео3, так і рмМАХІ) для експресії на клітинній поверхні (ідентична до СепВапк:
АВОЗ3161.1):
МІШКА УК ТРУ НЕ ЧАКТУ ГТ УРКН У УЧБОВІ ЕС УЄКС КНТУ Ж ВМ
ОКО УНИОКЕ НК КУСНеМУ КОВАНІ КТК ММА УК ОВ АСУ ЄВС
ТОПАПУККІТУКУМАРУМКІЧОНИ У УЮРУТЗЕНЕ ТООАКОУ АКА КУПУ ТОНОМ,
КОКТТТТМЕКИ КЕ КУТИ КМТ ТАМЕЕ УСЕ ОВЕН АБУ ТВЕР АРМ
ВЕНИ ЗА РУ АБ ЕЕ ЖЕ ВКА Я МКК ОН ВУ ТАК ОА КТ у якій:
МЕККА УКІКТРУ ЖІН МА: каву надевнй нет,
ЕТУТУКІСТ УВС СКВЕРУ ЄКОС ТБ У У ТЕМНО УНОВ ОКУ
СНЕМ ЕВОВАСВІ КК НО ОМА АВ У КИТ ТУ УВС МІВ ХОЛ АСУКВІТУКУМАР
УККІМОКІС У ЄП У КЕНЕ ПОЗАХ ЕКАБУ ВУ ТОНУ ТЕЗ КА ВЕК
УТ АП Т ТАКУ СТЕ ВОВЕМНТАВСМІВ КІ ВСАБВЕМЕВ СТ мг.
ТЕСТОВА УМА КТК деревчуваня сна ех ТМ
У ВКСЕММОМКККТЕУТМЕКОВО ТСН ЕК: внутпикнтнинній квіт.
Амінокислотна послідовність повнорозмірної вставки ОХ40 людини (як у рІВЕ5-Мео3, так і рУАХТ) для експресії на клітинній поверхні (ідентична до сбепВапк: МР 003318.1):
СУА ОВО ВСАА АННУ КН СУС УВС ЕС РОМОМ У ВК СЯ
ВОМ УС Я ВН К У АО У НЕ РОС РТ С ВОК КОТ АТО УСВА
ВО УКРО МС АВСРЕОВРКВ МО АСК ТТ АСК ТОРА КВАС КОКОВЕ
АТОРОСТОСРВАЙРІТ ТОКТЕАУРЕ ТУТ УТЕРУБУВТА У ЛАНКИ ДР,
АБАСТ ОО КВОСВЧ РРО АНЬРЕОССКЕТРЮВЕОЗІЗАНЕТАКІ у якій:
МЕТО СВО ВСАА ЯНАНАТУТКИ свунанний пегптна.
СУС ГТУВяК СЕС кам У ОВТ УВО УМ УВК ВСІ
ЖСКІЕКБИОВЕККОСТАТОПТУСЕСЕА СТ ОВУКРОМОСАРВСВАОВНКЕВ ОМВО АСК
КТС АКТ СОВА ЗАТОК ОРВА ТРОС ТОСРВАВВМ ТУ СИТА ЖЕК
ВЕТКРУКУРКН УВА: ВСЮ,
ЗчААВОО БАЧ НОРЕАНЯ передбачувана сонають ЇМ
АБУ АСВВОАНКАР ЗВТ ЮК АВАНЕТЕ АК: внукВІЛІННВийЙ ХВікч»
Амінокислотна послідовність повнорозмірної вставки ОХ40 щура (Найив5 погуєдісив) (як у рІВЕ5-Мео3, так і рмМАХІ) для експресії на клітинній поверхні (ідентична до СепВапк:
МР 037181.1):
МУ ДУ ВАК СУ РУК КСУКИТУРЕС КОС ЕС НО МУ КСО ТУ
ТУСНРОВРОР УМА КУ ОКО ОМА КСВЕ КОСТКТЕ М СК иО Г ОРКО
НКУ УРСР НЕБО АСКВЮ ТТ ЧОКОВНВАЖМ ОТ УСЕСКК АТ
ФЕТОКТТЕВЕРТГУРКТ ТУКА ТО РУТА УАРКОВАКАУНВОНСНО АРКУ АСУ
МЕККА ЖКОРЧТ КРОС ТЕКСТ ГНЕ АК у якій:
Му КНТ АРІЯ КИ сна нМ пеки.
УГТУКЕОеКТГ УВК СВОГО НОМ УВУ УС СРО У КАЖУ Т
КОСТІ НЕВИаЕ КОСТИК РО ТОР КОМИКС ОСС
КОДОМ КО КНР АЖМВ ТИ УСИК Я АТО КТОКТІТЕНЕТТУРУТТУ
РАТНЕ ТЕТСУ АРЕНІ БОМ
АВАМИНА НКАУ М АТ: передбеувана облаєть КМ.
ВЕКАЖКОРМТЕК РОК СМЕРВ ЧОВЕН ТАКЕ виуУКМНКЛІТНАНИЙ ХВ
Амінокислотна послідовність повнорозмірної вставки ОХ40 макаки (Масаса Гавзсісціагів) (як у рІВЕ5-Мео3, так і рмМАХІ) для експресії на клітинній поверхні (ідентична до СепВапк:
ХР 005545179.1):
МВСУ сАВК ВО РСАА ПСО КТ ТАККНСУЄСИВ ГУМОК ССО СК РЕМОМУБВНОСМ
КОМ УСРР КУ МОУ УХАКРОКАСТУСМ КЕКС ТАТООВТУСЄКСВАЄТО
БУРЕ УЄСАРСВРОНЕВВООВМОАСКРКТСТІ МИТ ОР АВІА КЕТІ
РТОРОБТОСРРАКРТТУЮРТ СА ЖРЕ ТОРТУ УРКИРА ААУ,
АМЕСАВЛА ККООВСВВОАРКАРОСОЗЕК ТРК АБВАНЯАТАКІ у якій:
МОПАССАНА ЯН ОТГ ТАК ємучальний пептид,
ИСУО УМ ССО СК чом УС МАО ТТ УСВРОСРОК УМ УЗАКРСКАЄТ
СТА БОВЕАКОРСТА ГОЛ УЄВТИ АС ТОВ ЛУ КРОУОСАРСРРОНЕКРЕН ЧО АСК
ВАМ АСК ТП ОВА ЗМУ АСКОЕ ТОР ТОСРВАКВ ТУР ТЕАЖРАТХОВ
РЕК УВУРВВОВА: КС
УААН ОСОБАССНІО ОР АМС передсвчевана облаєть ЕМ.
АЛІ ПОВЕ РРОАРКАРОСОЮВЕВА ТРЕК ЕОАСАНВАВАКЕ внут ТИНИ Й хВіЄт.
Отримання стабільних клітинних ліній, що експресують СО137, ОХ40 або РО-І 1
Для утворення клонів Егеевзіуїє 293Е або СНО-КІ, що стабільно експресували відповідні білки, використовували експресійні конструкції рІВЕ5-Мео3 (ІТАВСЕТ МАМЕЇ (ТАБЛИЦЯ 1).
Конструкції транзієнтно трансфікували в клітини СНО-КІ1 із використанням трансфекції ліпофектаміном або з використанням трансфекції поліетиленіміном (ПЕЇ) для клітин ЕгеевіуЇє 293Е і проводили скринінг за допомогою РАС із використанням антитіл, що реагували з відповідними білками. Після підтвердження експресії транзієнтно трансфіковані клітини висівали в граничному розведенні й культивували під тиском відбору відповідно до використаної конструкції для експресії з отриманням стабільних клонів клітин. Через 2-3 тижні відбору проводили скринінг клонів за допомогою ЕАС5. Відібрані клони розмножували за допомогою серійного пасажу, проводили повторне дослідження БАС і заморожували до температури -150 "С. Назви клонів, які стабільно експресують гетерологічні білки - клітини СНО-
КІ ІПАВОСЄЕТ МАМЕЇ| або клітини Егеевзіуїє 293Е |(ТАВСЕТ МАМЕЇ. Огляд конструкцій, які використовували для утворення стабільних клітинних ліній, і їхню підсумкову назву див. у
ТАБЛИЦІ 1.
Приклад 2
Імунізація, відбір і скринінг
Миші, яких використовували для імунізацій
Для утворення антитіл людини, що зв'язуються з пиСО137, пиОХ40 і пиРО-І 1, мишей, трансгенних за легсим ланцюгом МК1-39 людини (миші зі спільним легким ланцюгом, див.
М02009/157771) і за мінілокусом важкого ланцюга людини (НС) (який містить вибірку генних
Зо сегментів М людини, усі Ю людини й усі )/ людини), імунізували або рекомбінантним білком, або
ДНК, що кодує білки, як коротко описано нижче. Цих мишей називають мишами Мемо?.
Імунізації білками
Мишей Мемо? імунізували за допомогою підшкірних ін'єкцій рекомбінантного білка й ад'юванта ММ Сети (Сегри Віоїєснпік сж3001). Для імунізацій використовували рекомбінантні білки пиРО-І1-Нів (ЗіпоВіоіодіса!; кат. Мо 10084-НО8ВН), пиОХ40-Рс (ВО; кат. Мо 3388-ОХ) і пиОХа40-Нів (5іпоВіоіодіса!; кат. Мо 10481-НОВН). Для утворення панелі антитіла до СО137 імунізацію білками не проводили. Мишей імунізували 40 мкг рекомбінантного білка у фосфатному буферному розчині (ФБР) разом із 40 мкл ад'юванту в загальному об'ємі 100 мкл.
Після цього мишей повторно стимулювали надень 14 і день 28 за допомогою 20 мкг рекомбінантного білка в ФБР разом із 20 мкл ад'юванту в загальному об'ємі 50 мкл. Сироватку мишей збирали на день 35 для визначення титрів у сироватці. Миші з низькими сироватковими титрами проходили додаткові цикли бустерних імунізацій і аналізів сироватки. Кожен цикл складався з двох щотижневих імунізацій із використанням 20 мкг рекомбінантного білка у 50 мкл
ФБР і збору сироватки через тиждень для аналізу титрів. Миші, які демонстрували високі сироваткові титри до мішені людини й макаки, отримували заключну бустерну імунізацію, що складалася зі щодобових ін'єкцій 20 мкг рекомбінантного білка в 50 мкл ФБР три доби поспіль.
Удень після заключної ін'єкції збирали лімфоїдну тканину мишей.
Імунізації ДНК
Мишей МемоФ імунізували за допомогою ДНК-татуажу з використанням пристрою для мікропігментації. Імунізації методом ДНК-татуажу проводили за допомогою 20 мкг плазмідної
ДНК, що кодує цільовий антиген (РрМАХІ (ТАВСЕТ МАМЕ)Ї, ТАБЛИЦЯ 1). Мишей імунізували за допомогою ДНК, що кодує тільки мішень людини (РО-І1), або за допомогою поперемінних імунізацій ДНК, що кодує мішень людини та щура (СО137, ОХ40), з метою отримання перехресно-реактивних антитіл цих видів. Для імунізацій РО-/1 клітини Тгтед виснажували за чотири доби до початку імунізації за допомогою ін'єкції мишам 0,5 мг антитіл до СО25 РСб61.5 (Віосего5) для подолання імунологічної толерантності. Мишей імунізували надень 0, 3, 6, 14, 17, 28 і 31. Сироватку мишей збирали на день 35 для визначення титрів у сироватці. Миші з низькою реактивністю сироватки проти мішені людини й/або макаки проходили додаткові цикли бустерної імунізації антигеном ДНК людини, щура або макаки й аналізів сироватки. Кожен цикл складався з двох щотижневих імунізацій ДНК і наступного збору сироватки через тиждень для аналізу титрів. Миші, які демонстрували виражену реактивність сироватки проти клітин, що експресували мішень людини, щура й макаки, отримували заключну бустерну імунізацію з наступним збором лімфоїдної тканини через З доби.
Комбінація імунізацій білком і ДНК (тільки ОХ40)
Мишей імунізували рекомбінантним пиОХ40-Нів (5іпоВіоІодіса!; кат. Мо 10481-НОВН) і
Зо стимулювали за допомогою почергових імунізацій ДНК (рУАХ!1 гаоха0) і білком (пиОХ40-НІів) для отримання перехресно-реактивних антитіл цих видів. Отже, мишей імунізували 40 мкг рекомбінантного білка у ФБР, змішаного з 40 мкл ад'юванту в загальному об'ємі 100 мкл. Після цього мишей стимулювали на день 14 і 17 за допомогою ДНК-татуажу за допомогою 20 мкг руУАХІ гаоха40 із наступною імунізацією білком пиИОХ40-Ніє 20 мкг у ФБР разом із 20 мкл ад'юванту в загальному об'ємі 50 мкл надень 28. Сироватку мишей збирали надень 35 для визначення титрів у сироватці. Миші з низькими сироватковими титрами до білків людини й/або макаки проходили додаткові цикли бустерних імунізацій і аналізів сироватки. Кожен цикл складався з двох щотижневих імунізацій білюоом або ДНК за допомогою 20 мкг пиОХ40-Нів, руУАХІ таОхХ40 або руУАХІ таохеа0 і наступного збору сироватки через тиждень для аналізу титрів. Миші, які демонстрували високі сироваткові титри до мішені людини й макаки, отримували заключну бустерну імунізацію, що складалася зі щодобових ін'єкцій 20 мкг рекомбінантного білка в 50 мкл ФБР три доби поспіль. Удень після заключної ін'єкції збирали лімфоїдну тканину мишей.
Визначення сироваткових титрів
Сироваткові титри визначали за допомогою аналізу ЕАС5 із використанням клітинних ліній, що експресують цільові антигени людини й макаки (таблиця 1).
Утворення синтетичних фагових бібліотек ар
Синтетичні бібліотеки конструювали на основі репертуару генів МН генеративної лінії людини, які відбирали за частим використанням у природних репертуарах і різноманітністю канонічних послідовностей. До цих генів МН додавали синтетичні області НСОВНЗ з використанням ПЛР. Це виконували з використанням прямих праймерів, які гібридизуються з каркасом 1 генів МН і включають сайт рестрикції 51Ї для клонування. Зворотні праймери включали послідовності для гібридизації з каркасом З генів МН з наступними випадковими послідовностями для кодування різноманітності НСОВЗ і послідовність, яка кодує каркас 4, що також містить сайт рестрикції В5їЕЇ! і ХноЇ для клонування. Синтетичні області СОВЗ були або повністю випадковими, або кодували більш обмежену різноманітність на основі частоти використання амінокислотних залишків у певних позиціях у межах НСОНЗ. Продукти ПЛР, що кодували гени МН, клонували у вектори фагового дисплея, гібридно з'єднані з білком гена З фага М13, з використанням вищезгаданих ферментів рестрикції, і також містили ген, що кодує бо спільний легкий ланцюг. Зшивання й трансформація ТИ1 Е. соїї у великому масштабі дозволяли отримувати великі бібліотеки синтетичних фрагментів Гар, що відображаються на фагові, які використовували для пеннінгу на антигенах або клітинах для визначення антигенспецифічних фрагментів Раб.
Утворення "імунних" фагових бібліотек Раб із тканин імунізованих мишей за допомогою ПЛР зі зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР)
У мишей, у яких спостерігали суттєву гуморальну відповідь до відповідних цільових білків, видаляли селезінку й дренувальні лімфатичні вузли.
Як із селезінки, так і з пахвинних лімфатичних вузлів утворювали одноклітинні суспензії, а далі ці тканини лізували в реагенті Тгі20! І 5 (Тнепто Зсієпійіс сЯ10296028) і зберігали за -80 С до використання.
Пахвинні лімфатичні вузли від успішно імунізованих мишей використовували для створення репертуарів "імунних" фагових антитіл. РНК екстрагували з одноклітинних суспензій лімфоїдної тканини. У реакції ЗТ з використанням специфічного праймера Іда-СНІ використовували 1 мкг загальної РНК. Отриману кДНК після цього використовували для ампліфікації поліклонального пулу кКДНК, що кодує МН, із використанням отриманих на місці адаптованих праймерів, специфічних до УН, по суті як описано в МагкКз еї аї!. (У Мої! Віої. 1991 Оес 5; 222(3):581-97). Далі отриманий продукт ПЛР клонували у фазмідний вектор (Фіг. б) для дисплея фрагментів Раб на фазі, як описано в де Нааго еї аї. () Віої Снет. 1999 дип 25; 274(26): 18218-30), за винятком того, що легкий ланцюг (Фіг. ТА ії 18) був однаковим для кожного антитіла й кодувався вектором.
Після зшивання фазміди використовували для трансформації бактерій ТС1 БЕ. сої, а трансформовані бактерії висівали на планшети з агаром Луріа - Вертані (18), що містили ампіцилін і глюкозу. Усі фагові бібліотеки містили » 4х105 трансформантів і мали частоту вставок » 90 95. Бактерії збирали після росту протягом ночі й використовували для приготування фагів відповідно до встановлених протоколів (дає Наага еї аї., ) Віої Спет. 1999 дип 25; 274(26): 18218-30).
Відбір фага, який несе фрагменти Раб, що специфічно зв'язуються з цільовим білком людини з синтетичних та "імунних" фагових бібліотек Рар, із використанням рекомбінантних білків
Створені фагові бібліотеки Раб використовували для відбору специфічних до мішеней Га із
Зо використанням фагового дисплея на рекомбінантних білках, нанесених у вигляді покриття. Для
РО-І1 використовували пишРО-ІЇ 1-Нів (5іпобріоіодіса!; кат. Мо 10084-НОВН), пиРО-І 1-Рс (НУО; кат.
Мо156-87) і таРр-І1-Нів (5іпобріоіодіса!; кат. Мо 90251-СО8Н). Для СО137 використовували пиСО137-Рс (Ва; кат. Мо 838-48), таСОр137-Ес (НО; кат. Мо 7968-48), тоС0О137-Ес (НЕО; кат.
Мо 937-48), пиСО137-Нів (біпоВіоіодіса!; кат. Мо 10041-НОВН) і пиСО137-Ес (Еп20о; кат. Мо АЇ Х- 522-031-С0050), а для ОХ40 використовували пиОХ40-Ес (НУО; кат. Мо 3388-ОХ) і пиИОХ40-Нів (біпоріоіодісаї; кат. Мо 10481-НОВН).
Для відбору рекомбінантним білком білки наносили на лунки планшета для ЕГІБА
МАХІБОВР "М. Планшети для ЕГІЗА МАХІЗОВР М блокували 4 95-м сухим знежиреним молоком (Магуєї) у ФБР. Фагові бібліотеки Раб також блокували 4 95-м Магуєї! і, коли використовували Ес- мічений рекомбінантний білок, також надлишком дб: людини для виснаження зв'язувачів області Ес перед додаванням фагової бібліотеки до нанесеного антигена.
Інкубацію фагової бібліотеки з нанесеним білком проводили протягом 1,5 год. за кімнатної температури в умовах струшування. Потім планшети або пробірки п'ятнадцять разів промивали 0,05 у5-м Гиуееп-20 у ФБР із наступним 5-разовим промиванням ФБР. Зв'язаний фаг елюювали протягом 20 хвилин із використанням трипсину, після чого трипсин нейтралізували інгібітором трипсину АЕВ5Е (5Зідта).
Елюати додавали до Та-1 Е. соїї й інкубували за температури 37 "С для інфікування фагом.
Після цього інфіковані бактерії висівали на планшети з агаром, що містили ампіцилін і глюкозу, та інкубували за температури 37 "С протягом ночі. Одиночні клони з продуктів відбору проходили скринінг щодо цільового зв'язування мішені в аналізі ЕГІЗА або ГАС5 залежно від мішені.
Для відборів із використанням синтетичних фагових бібліотек Бар другий цикл відбору проводили після отримання продуктів відбору першого циклу з використанням того самого протоколу, що описаний вище для першого циклу відбору.
Відбір фага, що несе фрагменти Рар, які специфічно зв'язуються з мішенню людини, з "їмунних" фагових бібліотек баб із використанням клітин, які стабільно експресують білок- мішень
Фагові бібліотеки Рар, які отримували від імунізованих мішенню мишей, відбирали з використанням фагового дисплея на клітинах, що експресують відповідну мішень. Для 179 циклу 60 відборів використовували стабільні клітинні лінії що експресують СО137, ОХ40 або РО-І/1
(таблиця 1). Клітини блокували за допомогою 10 95-ої ЕВ5 у ФБР. Після блокування виділений фаг інкубували з заблокованими клітинами. Клітини з фагом інкубували протягом 1 год. за 4 "с.
Промивання клітин (5-кратне) проводили з використанням 1 мл 10 95-ої ЕВ5 у ФБР. Зв'язаний фаг елюювали протягом 20 хвилин із використанням трипсину, після чого трипсин нейтралізували інгібітором трипсину АЕВБЕ (5Зідта). Елюат додавали до ТО0-1 Е. сої) й інкубували за 37 "С для інфікування фагом. Після цього інфіковані фагом бактерії висівали на планшети з агаром, що містили ампіцилін і глюкозу, та інкубували за температури 37 "С протягом ночі.
Другий цикл відборів для РО-Ї1 проводили за допомогою клітин Е5-2, які ендогенно експресують пПиРО-І1, із використанням того самого протоколу, який застосовували для 179 циклу відбору. Після відбору проводили скринінг одиночних клонів щодо зв'язування з мішенню з використанням ЕАС5.
Скринінг на специфічні до мішені клони Раб за допомогою ЕГІЗА
Із одиночних клонів готували розчинний Раф або фаг () Мої Віої!. 1991 Оеєс 5; 222(3):581-97;
Віої Спет. 1999 дип 25; 274(26): 18218-30). Отримані зразки розчинного Бар або фага розводили (у співвідношенні 1:5 або 1:10 відповідно) у 4 У5-му сухому знежиреному молоці (Магуєї) У ФБР (блокувальному буфері) й досліджували на зв'язування за допомогою ЕГІЗА в лунках, вкритими таким самим антигеном, що використовували для відбору, або пиСО137-Ес (840; кат. Мо 838-48) для всіх продуктів відбору, виконаного за допомогою або гтаСо137-Ес (840; кат. Мо 7968-48), або тоС0О137-Ес (Нар; кат. Мо 937-4В).
Зв'язані Раб виявляли шляхом фарбування антитілом до тус (Коспе; кат. Мо 11667203001), розведеним у блокувальному буфері у співвідношенні 1:1000, а далі кон'югованим із пероксидазою хрону (НАР) антитілом до Ід миші (Часквоп Іттипогезеагсі; кат. Мо 715-035- 150), розведеним у блокувальному буфері 1:5000. Зв'язаний фаг виявляли за допомогою фарбування моноклональним антитілом до М13, кон'югованим із НЕР (СЕ Неайнсаге; кат. Мо 27- 9421-01), розведеним у блокувальному буфері 1:5000.
Після кожного фарбування антитіл лунки промивали ФБР-Т (ФБР-0,05 95 об./06. Тмеєп 20).
Зв'язане вторинне антитіло візуалізували фарбуванням ТМВ/НгО» і зафарбовування кількісно оцінювали за допомогою вимірювання оптичної густини (00)450 нм. Клони вважали такими, що
Зо зв'язують мішень, коли 00450 нм була принаймні втричі вищою за фоновий сигнал, отриманий для Раб негативного контролю.
Проводили секвенування кДНК, які кодують МН, усіх специфічних до мішені клонів. Далі проводили аналіз вибірки унікальних клонів на основі ідентичності послідовності та кластерного аналізу за допомогою БАС щодо зв'язування з мішенню, що експресується на клітинах, як описано нижче для клонів, отриманих із продуктів відбору клітин.
Скринінг на специфічні до мішені клони Раб за допомогою ЕАС5
З одиночних клонів, відібраних на клітинах, що експресують відповідну мішень, готували розчинний Раб або фаг, як описано () Мої Віої. 1991 Оес 5; 222(3):581-97; у) Віої Спет. 1999 дип 25; 274(26): 18218-30). За допомогою інкубації з сумішшю розведеного 1:5 зразка Рар із розведеним 1:1000 антитілом до тус (Сепіацг; кат. Мо 04-СМУС-9Е10) у буфері ЕАС5 (0,5 95 НІ-
ЕВ5 у ФБР) зразки Раб досліджували на зв'язування з клітинами, що експресують мішень людини або макаки (таблиця 1) з використанням ЕАС5. Зв'язані комплекси Рар/антитіло до тус виявляли шляхом інкубації з кон'юЮпгтованим із АПК козячим антитілом до Ідс миші (ВО
Віозсієпсе; кат. Мо 550826), розведеним 1:500 у буфері ЕАС5.
Зразки фага досліджували на зв'язування за допомогою ЕАС5 шляхом розведення зразків фата 1:3 у блокувальному буфері й інкубації з клітинами, що експресують мішень, протягом 1 години. Зв'язаний фаг виявляли за допомогою фарбування біотинільованим антитілом до М1З (Ейгодегаід, кат. Мо 618-МІ01АВТВб62-ЕЕ/, 1:1125 у буфері ГАС5, 30 хвилин на льоду) і РЕ- міченим стрептавідином (Іпуйтодеп, кат. Мо БАТ004-4; 1:400 у буфері ЕАС5 протягом 15 хвилин на льоду). Після кожної інкубації антитіл лунки тричі промивали буфером ЕАС5. Зафарбовані клітини аналізували з використанням приладу БАС Ассигі Сб (Весіоп бісКіпбвоп). Клони вважали позитивними, коли середня інтенсивність флуоресценції була принаймні втричі вищою за фоновий сигнал, отриманий для Рар негативного контролю.
Результати
Послідовності МН 24 СО137-специфічних клонів, 14 РО-ІЇ 1-специфічних клонів і 50 ОХ40- специфічних клонів, які отримали за допомогою вищезгаданих способів, зображені на Фіг. 3.
Приклад З
Визначення характеристик клонів Раб, специфічних до пиСО137, пиОХ40 і пиРО-І1, у формі
Іа 60 Переклонування Раф, специфічних до пиСО137, пиОХ40 ії пиРО-І1 людини, у формі да
Вибірку унікальних клонів на основі послідовності СОВЗ і відмінностей генеративної лінії УН, які зв'язують цільовий білок людини й макаки, що експресується на клітинах, далі переклоновували в плазміду експресії ІДС, таку як ММ1452 (Фіг. 7), що містила спільний легкий ланцюг (Фіг. 1), із використанням ферментативного розщеплення та зшивання 511і1-В51ЕЇЇ пулу розщеплених кДНК, відповідно до стандартних методик молекулярної біології.
Експресія біспецифічного ДС, що містить Габ, специфічний до СО137, ОХ40 або РО-Ї 1 людини, і Раб, специфічний до правцевого токсину
Біспецифічні антитіла отримували шляхом транзієнтної котрансфекції двох плазмід, що кодують дСт із різними доменами МН, із використанням запатентованої технології конструювання СНЗ для забезпечення ефективної гетеродимеризації й утворення біспецифічних антитіл. Спільний легкий ланцюг, присутній на обох плазмідах, що містять важкий ланцюг, також котрансфікують у ту ж клітину. У наших заявках, які одночасно розглядаються (наприклад, УУМО2013/157954 і М/О2013/157953; включені в цей документ шляхом посилання), ми розкрили способи й засоби отримання біспецифічних антитіл із однієї клітини, відповідно пропонуються засоби, у яких перевага надається утворенню біспецифічних антитіл над утворенням моноспецифічних антитіл. Ці способи можна також сприятливо застосувати в цьому винаході. Зокрема, переважними мутаціями для утворення по суті тільки біспецифічних повнорозмірних молекул Ідс є амінокислотні заміщення в позиціях 351 і 366, наприклад І ЗО1К і т366К (нумерація відповідно до нумерації ЕЮ) у першому домені СНЗ (важкий ланцюг "КК- варіанта"), і амінокислотні заміщення в позиціях 351 і 368, наприклад 13510 і І З368Е у другому домені СНЗ (важкий ланцюг "ОЕ-варіанта"), або навпаки. У наших заявках, які одночасно розглядаються, попередньо було продемонстровано, що негативно заряджений важкий ланцюг
ОЕ-варіанта й позитивно заряджений важкий ланцюг КК-варіанта переважно попарно зв'язуються для утворення гетеродимерів (так званих біспецифічних молекул "ОЕКК").
Гомодимеризація важких ланцюгів ОЕ-варіанта (гомодимери ОЕ-ОЕ) або важких ланцюгів КК- варіанта (гомодимери КК-КК) майже не відбувається внаслідок сильного відштовхування між зарядженими залишками на контактній поверхні СНЗ-СНЗ між ідентичними важкими ланцюгами.
Гени МН, які кодують антитіла, що зв'язують СО137, ОХ40 і РО-І1 людини, описані вище, клонували у вектор експресії Ід, такий як ММ1452, що кодує позитивно заряджений домен СНЗ.
Зо Антитіло, мішенню якого є токсин правця (ТТ) (Фіг. 8), клонували у вектор експресії (Ід ММ1377 (Фіг. 9), що кодує негативно заряджений домен СНЗ. Для експресії панелі антитіл СО137 у формі ІдСсї усю панель також клонували у вектор із негативно зарядженим доменом СНЗ, щоб можна було отримати моноспецифічний бівалентний /Ідс СО137х00137. Суспензію адаптованих до росту клітин 293Е Егеезіуіє культивували у флаконах Т125 на плоскому шейкері до отримання щільності 3,0х105 клітин/мл. Клітини висівали зі щільністю 0,3-0,5х106 життєздатних клітин/мл у кожній лунці планшета з 24 глибокими лунками (24-лунковий формат).
Клітини транзієнтно трансфікували сумішшю двох плазмід, що кодують різні антитіла, клоновані в запатентовану векторну систему. Через сім діб після трансфекції клітинну надосадову рідину збирали й фільтрували через фільтр 0,22 мкМ (Запогійи5). Стерильну надосадову рідину зберігали за температури 4 "С до очищення антитіл.
Очищення (біспецифічного) ІДС
Очищення Ід; проводили в невеликому масштабі («х 500 мкг) із використанням афінної хроматографії з білюком-А. Очищення в невеликому масштабі проводили в стерильних умовах у 24-пункових фільтрувальних планшетах із використанням фільтрації. Спочатку рН середовища коригували до рН 8,0, а потім інкубували надосадову рідину, що містить ІДС, з гранулами сефарози СІ-4В із білком А (50 95 об./06.) (Ріегсє) протягом 2 год. за 25 "С на шейкерній платформі за 600 об/хв. Далі гранули збирали шляхом фільтрації. Гранули двічі промивали ФБР за рН 7,4. Потім зв'язаний (ІД елюювали за рН 3,0 із 0,1 М цитратним буфером, а елюат негайно нейтралізували з використанням Трис рН 8,0. Заміну буфера проводили за допомогою центрифугування з використанням планшетів Мийібстеєп ОПйгасеї 10 (МіПірогє). Зрештою, зразки збирали у ФБР рН 7,4. Концентрацію Ід: вимірювали з використанням Осієї. Зразки білків зберігали за температури 4 "с.
Кількісне визначення да із використанням Осіеєї
Для визначення кількості очищеного Ідсї концентрацію антитіла визначали за допомогою аналізу Осієї із використанням біосенсорів білка-А (Бопе-Віо згідно з рекомендаціями постачальника) з використанням загального (ДС людини (бідта Аїагіснй, кат. Мо 14506) у ролі стандарту.
Аналіз специфічності бівалентного (ДС пиИСО137хС20137 і біспецифічних ІДС пиОХаОХТ і
ПиРєРО-ГлхХТТ
Бівалентний Ід пиСО137хС0137 і біспецифічні ДС пиОХ4ОХТтТ і пиРО-І1ХхТТ досліджували з використанням ЕАСО щодо зв'язування зі стабільними клітинними лініями, що експресують відповідні ортологи людини й макаки (таблиця 1) і клітини дикого типу. Отже, клітини збирали й розводили до 105 клітин/мл у буфері ЕАС5 (ФБР/О,5 95 ВБА/0,5 мМ етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТК)). До кожної лунки 96-лункового планшета з О-подібним дном додавали 1-2х105 клітин. Клітини центрифугували протягом 2 хвилин за 300 д за температури 4 "С. Надосадову рідину видаляли шляхом перевертання планшета (-ів). Додавали по 50 мкл кожного зразка ІДС за концентрації 10 мкг/мл та інкубували протягом 1 год. на льоду. Клітини центрифугували один раз, надосадову рідину видаляли, а клітини двічі промивали 150 мкл буфера ЕАС5. Додавали 50 мкл розведених 1:400 козячих антитіл до ЇдСї людини з фікоеритрином (РЕ) (Іпийгодеп) та інкубували протягом 30 хвилин на льоду в темряві. Після додавання буфера ГАС5 клітини центрифугували один раз, надосадову рідину видаляли, а клітини двічі промивали буфером
ЕАС5. Клітини аналізували в проточному цитометрі ЕАС5Сапіо (Весіоп ОісКіпзоп) у режимі
НТ5. Зв'язування антитіл із клітинами оцінювали за допомогою вимірювання середньої інтенсивності флуоресценції (СІФ) популяції зафарбованих клітин. Антитіла вважалися такими, що зв'язуються зі своєю мішенню, коли кількість СІФ була принаймні вп'ятеро більшою, ніж у популяції однієї й тієї ж клітини, зафарбованої (негативний контроль) незв'язувальним антитілом (до правцевого анатоксину).
Сортування Рар-фрагментів, специфічних до йиСО137, присутніх у бівалентному дай
Ср137хС00137, за здатністю до блокування взаємодії СО137 із СО1371.
Клони, що зв'язують пиИСО137, у формі бівалентного ІДС досліджували щодо їхньої здатності блокувати взаємодію СО137 і СО1371. Отже, лунки в 96б-лунковому планшеті Махівзогр покривали рекомбінантним СО137-Ес (ВО; кат. Мо 838-4В) за 1,25 мг/мл у ФБР та інкубували протягом ночі за температури 4 "С. Лунки двічі промивали ФБРТ (0,05 95 об./06. Тжмеєпг2г0 у
ФБР), а потім блокували за допомогою 2 95 В5А у ФБР (блокувальному буфері) протягом однієї години за кімнатної температури. Потім планшети інкубували протягом однієї години за кімнатної температури з 0,25 мкг/л біотину СО1 371 -тиСО8 (Апсеї; кат. Мо 503-030), розведеного в блокувальному буфері в присутності або за відсутності 20 мкг/мл да. Далі повторювали етапи промивання й лунки інкубували зі стрептавідином, кон'югованим з НАР (Весіюп бісКіпзоп; кат. Мо
Зо 554066), розведеним до 1:2000 у блокувальному буфері протягом 30 хвилин за кімнатної температури. Для виявлення зв'язаного стрептавідину лунки тричі промивали ФБРТ та інкубували з компонентами А і В субстрату тетраметилбензидину (ТМВ) (співвідношення 1:1) (Весіоп ОісКіпзоп; кат. Мо 51-2606КС і 51-2607КС відповідно). Через 10 хвилин реакцію зупиняли за допомогою 1М Не50О5» і вимірювали ОЮ»45о0 ни з використанням зчитувача планшетів для ЕЇ І5А.
На основі результатів проводили розподіл клонів на 4 різні групи: "Блокувальні клони" вважали такими, що повністю блокують взаємодію СО137 із СЮО137!Ї, коли сигнал зменшувався більше ніж на 70 95 за концентрації ІД (СО137хС0137) 20 мкг/мл, порівняно з контролем, у який додавали ТТ-специфічне конкуруюче антитіло (0 95 блокування); "частково блокувальні клони" зменшували сигнал на 25-70 95; "неблокувальні клони" демонстрували сигнал ІФА, який був знижений на до 2595 або посилений на до 2595; "посилювальні клони" демонстрували збільшення сигналу ІФА ЕЕГ ІБА на понад 2595. Результати, отримані за репрезентативного відбору панелі антитіл СО137, досліджували як біспецифічні молекули СО137хС0137, як показано в таблиці 2.
Сортування ЕРаб-фрагментів, специфічних до пиИСО137, що присутні у бівалентному Ід
Ср137хС00137, за доменною специфічністю
Також проводили аналіз вищезгаданих клонів у формі бівалентного ІДС, що зв'язують пиСО137, на доменну специфічність за допомогою ГАС5 на клітинах НЕК29З3Т, які транзієнтно трансфікували вісьмома різними гібридними експресійними конструкціями рІВЕ5-Мео3 з СО137 миші/людини, експресійною конструкцією (див. послідовності амінокислотної вставки нижче)
СО137 ріІВЕ5-Мео3 мишей Бі або експресійною конструкцією рівВЕ5-Мео3 пиСО137, які використовували для створення стабільних клітин Егеевіуїє 293Е, що експресують пиИСО137 (таблиця 1). Під час аналізу специфічності панелі антитіл використовували той самий протокол
ЕАС5. Для створення гібридних конструкцій позаклітинний домен СО137 миші й людини ділили на 5 доменів: 4 багаті на цистеїн домени на основі еталонних послідовностей Опіргої 007011 (пиСО137) ії Р2гО334 (тоСО137) і 1 шарнірний домен із кінця багатого на цистеїн домену 4 до трансмембранного домену. Указані далі послідовності амінокислотної вставки клонували в рІВЕ5-МеоЗ (Фіг. 4) за допомогою МНе1І/ЕсоВіІ; текст, виділений жирним шрифтом, позначає сигнальний пептид. Підкреслений текст позначає послідовність, ідентичну до СО137 людини.
Текст курсивом позначає послідовності трансмембранних і внутріклітинних доменів. бо Повнорозмірна амінокислотна послідовність СОТ 37 миші.
МОВУ УТУ СЕК УвА ОМС ТЕСЕК УВУ СВаСВВяТЕ КОЮ
М ТВ УСАСТУРВЕККРСКТНМАВСЕСТЕСКНС ЧМТ ЦЕ КК СВ ОО ТКС
Кто ОМВО то УСТ СМ ККУ УСРР УУ Бе ПУТ
ООН У о НЯ КАК ААК КР ВКОВЕККУ ТО ОККО
ОСС КЕ СОН ЕК
Амінокислотна послідовність химерної вставки А то/лиСО0137 (багатий на цистеїн домен 1 людини; послідовність миші від багатого на цистеїн домену 2 і далі). меха тк З КЕКВ Ов СА СОМ МО СВ СТРЕТ ВОНО
РЕСМЮСВУСАСТРКЕЕКРСКТНАЕС СВБ ОСКНСТЧ ТС РОСОСКЕ ТКС
ТОК АЕМО М ГО Усе вУКТОТТКУУССсевуУ КРУТЕ опе СНнМ ОУН Я СЯ ЕТЕЕ ВУ АТІКА КО ЕКС Я КО
МСОАСВОВЕЕ НА А КК,
Амінокислотна послідовність химерної вставки В то/лиСО137 (багатий на цистеїн домен 1 і 2 людини; послідовність миші від багатого на цистеїн домену З і далі).
МЕХВСКВ АТ МКК ТЕН ОО РОМАНС КМ ВЕ ССЕ В ЕВА
СДС ВО У Е КЕ Б АЕСЕСТЕВЕ НС ОВО СЕК ОС РОШЕН
КТС НОМО ТР ВеЖжТМОВООсва Кто ТТ ОУУЄОВРУУВЕВРКТКУТЕ иа ат Я ЕЕ КК КА КЕР АПК КОРА КАТЯ ОК
ССС КЕ,
Амінокислотна послідовність химерної вставки С то/пиСО137 (багатий на цистеїн домен від 1 до З людини; послідовність миші від багатого на цистеїн домену 4 і далі). щи АТ ХОМ ТЕ ОБР МСАТ КЕ МО ЕСЕ А
ОКО КОКО УКВ ТЕКС ЕКС ОСТ ВОК НС ЛА ЦСМ ВНС КООО БЕХ с С ЕМ По УСВА ТМ СКУ КЕКВ У СР УВЕБВОТТУ
ТЕКС РОСНО СТЕ НА ОТ ЕСЕ КА КК КО ЕКО ОХ
ПАСОК ОК НТ ЕЕ,
Амінокислотна послідовність химерної вставки Ю то/пиСО137 (багатий на цистеїн домен від 1 до 4 людини; послідовність миші від шарнірного домену й далі).
МоеБ АТХ ВЕК ВО БО КЕ ЕЕ РЕК ВКА
РЕОСТАТ БАНЯ НМ У КЕ КВК КК ЕН КОВКА ТО НЕК
МЕС ПЕВНУ КЕ,
Амінокислотна послідовність химерної вставки Е то/лиСО137 (багатий на цистеїн домен 1 миші; послідовність людини від багатого на цистеїн домену 2 і далі).
МОСТУ УСЕ УА УСЧЕСВКСОВОТ СВК МВУСЕ РСРИМЕ ВКА
КСО ТЕМОЮ КО КРУ СОС УМО КЕКСИ,
Амінокислотна послідовність химерної вставки Е то/лиС0О137 (багатий на цистеїн домен 1 і 2 миші; послідовність людини від багатого на цистеїн домену З і далі).
МОММСУМУУУ ТУ УВСЕКУСА ВОНО МКУ СКВСЕВУ ТЕО
УИЧСМСКУСАСТУ ЕКС НМА КСОСТРОЕНСЬССЬСИК В МЕ О СОЦ ТЬ
СБС ЕК ОВО ЕК С СУ КО ЕОМ УСЕ НИЯВУХ
Амінокислотна послідовність химерної вставки Сх то/лиС0137 (багатий на цистеїн домен від 1 до З миші; послідовність людини від багатого на цистеїн домену 4 і далі). маму УК АУСМОСМС ОРОС МВУСКСВРКТКВНИХ
ОРОС УСАСТЕКЕКЕСУТНМАКСЕСТСИСВОСТОРОСТЕСВЕК РЕК ЕТ КОЮ
КОССТО ГМООКВ ОКР ТС ОС УМО ТЕКУ УСТ АВЕЗРОАВВУ ТЕ
Амінокислотна послідовність химерної вставки Н то/пиСО137 (багатий на цистеїн домен від 1 до 4 миші; послідовність людини від шарнірного домену й далі).
МОМ ТЕКУ САС СТИСК УМВС СЕР ТРЕК
ОВС СКУСАСУВКТЕКЕСВУТ НМА СЕС НСЬСР ОС ЗТ КСЕК ОС РОК ТК ОК ктвБ Емо СУС РЖТМОВроКиУКС ПЕК ОВУ КРАСІ ЗРОаЕУТВ
ГАРАКЕВО ІРОН М У КН АК ЛО КОН ОО
На основі результатів ЕАС5, отриманих для химерних і повнорозмірних конструкцій 20137 миші й людини, проводили сортування клонів на основі характеристик зв'язування, які спостерігалися. Антитіла вважалися такими, що зв'язуються з (химерним) СО137, коли кількість
СІФ була принаймні втричі більшою, ніж у популяції однієї й тієї ж клітини, зафарбованої (негативний контроль) незв'язувальним антитілом (до правцевого анатоксину).
Результати
Особливості домену РГар-фрагментів, специфічних до СО137, показані в таблиці 2.
Сортування Рар-фрагментів, специфічних до пиОХ40, присутніх у біспецифічному да
ОХ4ОХТТ, за здатністю до блокування взаємодії ОХ40 із ОХАОЇІ.
Клони, що зв'язують пиОХ40, у формі біспецифічного Ід (ОХ40ОХхТТ) досліджували щодо їхньої здатності блокувати взаємодію ОХ40 і ОХ40Ї. Отже, лунки в 96-лунковому планшеті
Махізогр покривали рекомбінантним пиОХ40-Ес (На; кат. Мо 3388-ОХ) за 0,156 мг/мл у ФБР та інкубували протягом ночі за температури 4 "С. Лунки двічі промивали ФБРТ (0,05 95 об./об.
Тмжеепг0 у ФБР), а потім блокували за допомогою 4 95 сухого знежиреного молока (ЕК) у ФБР (блокувальному буфері) протягом однієї години за кімнатної температури. Потім планшети інкубували протягом однієї години за кімнатної температури з 0,016 мкг/л ОХ4А0І (На; кат. Мо 1054-ОХ), розведеного в блокувальному буфері в присутності або за відсутності 20 мкг/мл біспецифічного їдс ОХ40хХТТ. Потім лунки промивали З рази ФБРТ і далі інкубували протягом однієї години з біотинільованим антитілом до ОХ40І (На; кат. Мо ВАЕ1054), розведеним у 2 95
ВБА/ФБР до 0,5 мкг/мл. Далі повторювали етапи промивання й лунки інкубували зі стрептавідином, кон'югованим з НАР (Весіоп ОісКіпзоп; кат. Мо 554066), розведеним до 1:2000 у 2 Уо-му ВБА/ФБР протягом 30 хвилин за кімнатної температури. Для виявлення зв'язаного
Зо стрептавідину лунки тричі промивали ФБРТ та інкубували з компонентами А і В субстрату тетраметилбензидину (ТМВ) (співвідношення 1:1) (Весіоп ОісКкіпвоп; кат. Мо 51-2606КС і 51- 2607КС відповідно). Через 10 хвилин реакцію зупиняли за допомогою 1М Небо і вимірювали
ОЮхл5о нм з використанням зчитувача планшетів для ЕГ І5БА. На основі результатів проводили розподіл клонів на 2 різні групи: "Блокувальні клони" зменшували сигнал ІФА » 2495 за концентрації Ідеї (ОХ4ОХТТ) 20 мкг/мл порівняно з контролем, у якому додавали специфічне до
ТТ конкурентне антитіло (095 блокування); "неблокувальні клони" продемонстрували сигнал
ЕПІЗА, який був менш ніж на 24 95 зменшений або посилений. Цей експеримент проводили двічі з різними підгрупами клонів, що зв'язують пиОХ40, у формі біспецифічного се (ОХ40Ох17).
Результати панелі антитіл ОХ40 досліджували як біспецифічні молекули ОХ4ОХТТ, як подано в таблиці 5.
Сортування Рар-фрагментів, специфічних до пиОХ40, присутніх у біспецифічному да
ОХ4ОХТТ, за доменною специфічністю
Клони у формі біспецифічного дСсСь ОХ4ОхХТТ, що зв'язують пиОХ40, досліджували на доменну специфічність за допомогою ЕАС5 на клітинах НЕК293Т, які транзієнтно трансфікували вісьмома різними гібридними експресійними конструкціями (див. послідовності амінокислотної вставки нижче) рівВЕб-Мео3 з ОХ40 щура/людини, експресійною конструкцією ріВЕ5-
МеоЗ3З гаохХ40 або рІВЕ5-Мео3 пиОХ40, що використовували для створення стабільних клітин
Егеезіуіїє 293Е, які експресують гаОхХ40 і пиОХ40 (таблиця 1). Під час аналізу специфічності панелі антитіл використовували той самий протокол ЕАС5. Для створення гібридних конструкцій позаклітинний домен ОХ40 щура й людини ділили на 5 доменів: 4 багатих на цистеїн домени на основі еталонних послідовностей Опіргої РА3489 (пиОХ40) і Р1І5725 (гтаоха40) і 1 шарнірний домен із кінця багатого на цистеїн домену 4 до трансмембранного домену. Указані далі послідовності амінокислотної вставки клонували в рІВЕ5-МеозЗ (Фіг. 4) за допомогою МНеї/ЕЄсоВІ; текст, виділений жирним шрифтом, позначає сигнальний пептид. Підкреслений текст позначає послідовність, ідентичну до ОХ40 людини. Текст курсивом позначає послідовності трансмембранних і внутріклітинних доменів.
Амінокислотна послідовність химерної вставки А га/плиОхХ40 (багатий на цистеїн домен 1 людини; послідовність щура від багатого на цистеїн домену 2 і далі).
Меса АС БУТИ М СКК ВАКЕ НЕК ВОВК
СУК МТУСЕРСЕРОКУ МАМУ ТИ КОС ТОЧНА КУЄ ТТ КТ УСВА
ОРКОЛЕНКОСУЮВСУВСВРОНКЕРОЕМОАСКРАУ ТВП ОКУ НРА МО ГУСЄВ
МАТЕР ТУВКЕТУ ВВ ВЕР ТЕ У АВС НВН А Я ВЕХ
Я АЕКА МЕРА ТРЕСТ УА ОО ОТАК
Амінокислотна послідовність химерної вставки В га/пиОхХ40 (багатий на цистеїн домен 1 і 2 людини; послідовність щура від багатого на цистеїн домену З і далі). кожна ОН СУ ОТ КСО САМОМУ
С УСКРОЦЕ У КОУУЧК СЕТ Ж СК ЕКО СТАТОВТУСОСКРОТ
ПРЕС КУ ПВСУ ВС НЕО КОАСКиУ ТОК НАМ У УКВ
ЗБОКУ КСО ТЕКУ РЕТТ УЖЕ ЕУТЕТ МАРЕСРВЯ НЯ Км
КН ОЖКА АДАМА КЕ ОВО ЯК
Амінокислотна послідовність химерної вставки С галлиоха40 (багатий на цистеїн домен від 1 до З людини; послідовність щура від багатого на цистеїн домену 4 і далі). мехраввсвесгсла сь УСБУ ува ОККО МУВе
СВО УСРР МОУ УКВ КО БЕАКС АЛО УСВА
ОР УКТО УКСАРСОВРОНЕХРОЗ МОЛОКО ВЕ НРАВМВ ОТ УСІ
АТС ТОВТТЕВВГТТУВУГЕ УКВ ОРЕГАНО ЕТ КІ,
АБУ ЕКА АХА ТРАКРО ВСАА НЕО ОТАК
Амінокислотна послідовність химерної вставки О галшоха40 (багатий на цистеїн домен від 1 до 4 людини; послідовність щура від шарнірного домену й далі). мсувавв ев оС Не УКО ГУ гУМОоКСС ЕКС МУ
СОВА УМ У КЕР ПУСК ВК А ТУКА
Ор У ро Хо АРСТВИ НЕЗВРОО КО АСК ВК СТ СОВА ВОНО
САБО К ТРЕК ТУТ ГУ КРЕТЧ РУ ТВ ТУ АВРЕСВЯ Я ООН ОАЕ, зо АД РЛККА ВКМ НА АК РОН МЕ ТАКІ
Амінокислотна послідовність химерної вставки Е га/лиОхХ40 (багатий на цистеїн домен 1 щура; послідовність людини від багатого на цистеїн домену 2 і далі).
Ме ТАТ ЛДУ ГУК Ура НВО ВЕС ОРО НИМ УСТ
БУКРОУОСАРСЕРОНЕВО ОВО АСК ЕС АСК ОогАСМОВ ОА СКОВОСРАТО
ОЗ ОО АВР УМ КА ЖЕК БСК СТУ ТВРУКУ ОСА БО ОС ЛНУ
АН ПИ а КОН
Амінокислотна послідовність химерної вставки Е галлиОха40 (багатий на цистеїн домен 1 і 2 щура; послідовність людини від багатого на цистеїн домену З і далі). ума НЯ У ТУЮ УКОПТУРАЕНКОССВЕСОваНОМмУКАСТИТВ
ІУСНРСЕРОРУчЕАУМУЮТСКОСТ ЮНА НОВОМУ КСВАСНВ зхкгоХасарсеео промо мтс АСК ОО ОО ОТАТО
РОЄТОСЕР А ТУ ВЕ ТАЖРЕТОСВЕТВРУБУВОСВА КА ЛООЕЕАННЧУННЕ
Амінокислотна послідовність химерної вставки С га/плиОх40 (багатий на цистеїн домен від 1 до З щура; послідовність людини від багатого на цистеїн домену 4 і далі).
МУФТУ ОоОоггам се УТУК СУК УСНЕ НОМ УБАСОНТЕ
БРУСНРСЕРЕКУКМЕА УК ПТСКОСТОСМНАОВЕ ЕЛМСТИТ В ОТ УСС КРТ ОРКО охо УВС СВО цер охо СКАТ п ОО КНТ Оп а ВО МО ВЕе,
МВТ ОСеРАКЕ ПУ АЖ СОУ КУРКА НН ВН А
Амінокислотна послідовність химерної вставки Н га/лиОха40 (багатий на цистеїн домен від 1 до 4 щура; послідовність людини від шарнірного домену й далі). муку и тТАКЛЛ НИЗУ ГУК чСУКІГУРЖЕСНКОСВЕССВНОМУКНСТИТВЕ. пРУСсНРОКЕСОВУМКА УВУ М СКОСТОСМНЕИпВ КТ ТЕ У ОСИ РО ТОР
ПЕК ОМС УВСРРО МЕРОМ АСК ТМ АСК ЦВАХВАВТУЄК ТИТА
ТОоРОоКтОовеАВЕОУВИ АВЕНЮ КУ КУ ИВАКН ЕЕ КНН С НХ
На основі результатів ЕАС5, отриманих для химерних і повнорозмірних конструкцій ОХ40 щура й людини, клони сортували на основі зв'язувальних характеристик, що спостерігалися.
Антитіла вважалися такими, що зв'язуються з (химерним) ОХ40, коли кількість СІФ була принаймні втричі більшою, ніж у популяції однієї й тієї ж клітини, зафарбованої (негативний контроль) незв'язувальним антитілом (до правцевого анатоксину).
Результати клонів, що зв'язують пиОХ40, у формі біспецифічного Її ОХ40ОхХТТ подано в таблиці 5.
Сортування Рар-фрагментів, специфічних до пиРО-11, присутніх у біспецифічному ІДС РО-
Їх, за здатністю до блокування взаємодії РО-1/РО-ІЇ 1 14 Клонів (послідовності МН, показані на Фіг. 3), що зв'язують пПиРО-І1, аналізували щодо їхньої здатності блокувати взаємодію РО-11 із РО-1 і їхньої здатності блокувати взаємодію між
РО-І1 ї СО80. Отже, РО1-Ес (НО 5увієтв; кат. Мо 1086-РО) або СО80-ЕС (НО 5увієтв; кат. Мо 140-811) наносили на планшет тахізогр за 1 і З мкг/мл відповідно. Лунки з нанесеним покриттям блокували за допомогою 4 95 В5А у ФБР. Після цього додавали 0,55 мкг/мл біотинільованого
РО-І1 (ВРБ Біозсієпсе; кат. Мо 71105) у присутності або за відсутності біспецифічного Їдс пиРО-
Їх у діапазоні концентрацій від 0,15 до 20 мкг/мл. Біотинільований РО-11, який зв'язався, виявляли стрептавідином, кон'югованим із НАР (ВО бБіозсієпсе: кат. Ме 554066), розведеним 122000 у блокувальному буфері. Після кожного етапу інкубування планшет для ЕГІ5БА
Зо промивали ФБР-Т (ФБР-0,05 95 об./0б. Тмеєп 20). Зв'язаний стрептавідин візуалізували фарбуванням ТМВ/НгО» і зафарбовування кількісно оцінювали за допомогою вимірювання оптичної густини (00) 450 нм. Клони вважали такими, що блокують взаємодію РО-1 із РО-І 1, коли сигнал ЕГІЗБА за концентрації дсп (РО-Ї1ХхТТ) 10 мкг/мл знижувався більше ніж на 70 95 порівняно з контролем, у якому додавали специфічне до ТТ конкурентне антитіло; На Фіг. 10 представлені результати, отримані від репрезентативного відбору панелі антитіл до РО-11,
дослідження яких проводили в ролі біспецифічних молекул РО-Ї1ХхТТ. За винятком МЕ5З361 специфічні до РО-Ї1 Рар-фрагменти, зображені на Фіг. 10, блокують взаємодію РО-1/РО-11 » 70 95. На додаток, усі інші специфічні до РО-І 1 Раб-фрагменти, що містять послідовність МЕ, показані на Фіг. 3, також блокують взаємодію РО-1/РО-11 » 70 95 (дані не показано).
Як висновок, проаналізовані Габ-фрагменти, специфічні до пШРО-І 1, блокують взаємодію
РО-1/РО-11 за винятком МЕ5З61.
Категоризація афінності плечей Раб, специфічних до пиСО137, пиОХ40 і пиРО-І1 1, присутніх у біспецифічних де СО137хС0137, ОХ4ОХТ і РО-І1Х ТТ
Категоризацію біспецифічних антитіл, які у РАС5 продемонстрували зв'язування відповідних ортологів людини й макаки, проводили за видимою афінністю до обох ортологів у ЕАС5. Отже, стабільні клітинні лінії, що експресують відповідні ортологи (таблиця 1) збирали й розводили до 1х106 клітин/мл у буфері БАС (ФБР/0,595 ВБА/),5 мМ ЕДТК). Клітини центрифугували протягом 2 хвилин за 300 Яд за температури 4 "С. Надосадову рідину видаляли шляхом перевертання планшета (-ів). 50 мкл кожного зразка ДС; додавали з 11-етапним 2-кратним серійним розведенням у діапазоні від 10 до 0,01 мкг/мл та інкубували протягом 1 год. на льоду.
Клітини центрифугували один раз, надосадову рідину видаляли, а клітини двічі промивали 150 мкл буфера ЕРАС5. Додавали 50 мкл розведених 1:400 козячих антитіл до Ст людини з фікоеритрином (РЕ) (Іпийтодеп) та інкубували протягом 30 хвилин на льоду в темряві. Після додавання буфера ГАС5 клітини центрифугували один раз, надосадову рідину видаляли, а клітини двічі промивали буфером ЕАС5. Клітини аналізували в проточному цитометрі
ЕАСбЗсСапіо (Весіоп ОРісКіпвоп) у режимі НТ5. Зв'язування антитіл із клітинами оцінювали за допомогою вимірювання середньої інтенсивності флуоресценції (СІФ) популяції зафарбованих клітин. Антитіла вважалися такими, що зв'язуються зі своєю мішенню, коли кількість СІФ була принаймні вп'ятеро більшою, ніж у популяції однієї й тієї ж клітини, зафарбованої (негативний контроль) незв'язувальним антитілом (до правцевого анатоксину).
Еталонні антитіла
Антитіла, які інгібують функцію РО-11 ії СО137, і СТІ А-4, відомі в цій галузі. Моноклональні бівалентні антитіла створювали відповідно до опублікованої інформації й експресували у клітинах 293 Ртгеезіуе або СНО-5. Антитіло до РО-Ї1 МРОІЇЗ280А (сурогат на основі
Зо атезолізумабу) грунтувалося на інформації, розкритій у М/О2010077634А1. Інформацію про антитіла 20Н4.9 до СО137 (сурогат на основі урелумабу) і РЕ-05082566 (сурогат на основі утомілумабу) отримували з УУО 2005/035584 і М/О2015119923 відповідно. Інформацію про МН із
МОНВ7480 отримували з 58337850 В2 і переклоновували в каркас дат. Інформацію стосовно антитіла 1001 до СТІ А-4 (сурогат на основі іпілімумабу) отримували з публікації РСТ Мо М/О 01/14424.
Приклад 4
Матеріали й способи
Виділення МКПК
Цільну кров людини отримували зі світлого шару кров'яного згустку (Запдціп) і розводили 1:1 з ФБР. Пробірки І еисозер (Стєїпег Віо-Опе кат. Мо 227 290) заповнювали 17,5 мл РісоіІ-Радиє
Різ (Атетепат Віозсієпсев кат. Мо 17-1440-02), підігрітого за кімнатної температури (КТ). РісоїЇ
Радие Ріних центрифугували протягом 30 секунд за 1000 хд за кімнатної температури. Зверху заливали 30 мл розбавленої цільної крові. Пробірки центрифугували за 1000 х у протягом 10 хвилин за кімнатної температури та збирали шар мононуклеарних МКПК, двічі промивали у ФБР і ресуспендували в 250 мкл ФБР. Клітини МКПК підраховували й повторно доводили до концентрації 1х1Об/мл у тканинному культуральному середовищі (середовище Ігла, модифіковане Дульбекко (ОМЕМ) із 1095 ЕС5) і заморожували додаванням рівного об'єму льодового середовища для заморожування (8095 культурального середовища/20 956 ДМСО).
Клітини зберігали в аліквотах по 1 мл за -150 "С до подальшого використання.
Аналіз активації Т-клітин
МКПК розморожували й додавали 9 об'ємів культурального середовища (АРМІ1640 з 1- глутаміном і 10 95 термічно інактивованої ЕВ5). Клітини центрифугували протягом 10 хвилин за 150 д за кімнатної температури. Клітинний залишок ресуспендували в 10 мл культурального середовища й залишали клітини на ніч для інкубування і пробірці Раісоп на 50 мл за температури 37 "С у атмосфері з 5 95 СО у відносній вологості 95 95. Наступного дня виділяли
Т-лімфоцити з використанням процедури очищення за допомогою набору для збагачення Т- клітин Еазузер (пеннінг на СОЗ) згідно з інструкціями виробника (5іет сеї! Тесппоіодіев, кат. Мо 19051). У процедурі Еазубер застосовується негативна селекція. Коротко, МКПК центрифугували протягом 10 хвилин за 150 9 за кімнатної температури. Клітинний залишок бо ресуспендували в 2 мл ФБР - 295 ЕВ5 із 1 мМ ЕДТК. Суспензію клітин фільтрували через сітчастий нейлоновий фільтр ЗО мкм. Підраховували кількість клітин і доводили її до 5х107 клітин/імл у ФБР я 295 ЕВ5 із 1 мМ ЕДТК. Додавали 50 мкл суміші для збагачення Т-клітин людини Еазубер на кожні 2 мл клітинного розчину, перемішували й залишали інкубуватися протягом 10 хвилин за кімнатної температури. Після цього додавали 50 мкл магнітних частинок
Еазузер О на кожні 2 мл клітинного розчину й залишали інкубуватися протягом 5 хвилин за кімнатної температури. Загальний об'єм доводили до 2,5 мл ФБР -- 2 95 ЕВ5 із 1 мМ ЕДТК.
Потім пробірку поміщали в магнітне поле, що дозволяло зв'язати небажану фракцію клітин магнітом, на 5 хвилин за кімнатної температури. Після цього пробірку перевертали й очищену фракцію Т-клітин переливали в нову пробірку; клітини збирали шляхом 10-хвилинного центрифугування за 150 49 і кімнатної температури, а потім ресуспендували за концентрації 1х105 клітин/мл у культуральному середовищі. Для аналізу активації Т-клітин на внутрішні лунки 96-лункових планшетів (96-лункові планшети з плоским дном СеїЇвіаг Мо 655180) наносили 30 мкг/мл антитіла до СОЗ ОСНТІ у ФБР і витримували протягом ночі. Наступного дня планшети промивали ФБР. Готували розведення антитіл (80 мкг/мл) та інкубували у співвідношенні 1:11 із перехреснозшиваючим антитілом аНиїдсас-кс (Веїшу! кат. Мо А80-104А) протягом 15 хвилин за кімнатної температури. Далі готували серійні розведення суміші. У кожну лунку додавали по 100 мкл перехреснозшитих антитіл із наступним додаванням 100 мкл очищеної суспензії Т-клітин. Кожен планшет містив антитіло негативного (РЕ1337) і позитивного (урелумаб) контролю в серійному розведенні, що служило в ролі еталонного контролю. Перед дослідженням секреції ІЇ-2 і/або експресії антигенів на клітинній поверхні культури Т-клітин стимулювали протягом З діб за температури 37 "С у атмосфері з 5 95 СО2 і відносною вологістю 95 95. Концентрацію вивільненого ІЇ-2 визначали за допомогою АЇІрнаг ІзА (Мо за кат. Регкіп
ЕІтег АГ 2210). Експресію антигенів клітинної поверхні стосовно інгібування контрольної точки або костимуляторних антигенів визначали за допомогою проточної цитометрії.
Аналіз 5ЕВ
Функціональну активність біспецифічних антитіл визначали з використанням МКПК, стимульованих стафілококовим ентеротоксином В (ЗЕВ). ЕВ специфічно активує Т-клітини, які експресують Т-клітинний рецепторний ланцюг МВЗ и МВ8. МКПК від З донорів розморожували, промивали підраховували й ресуспендували в культуральному середовищі (АРМІ1640 із 10 95
Зо інактивованою нагріванням ЕВ5) до концентрації 2х106 клітин/мл. Клітини висівали на плоскодонних 96-лункових планшетах (2х105 клітин/лунку) в присутності 5ЕВ (2000 або 125 нг/мл). Додавали антитіла в серійних розведеннях, починаючи з 20 мкг/мл. Кожен планшет містив антитіло негативного (РІТ337) і позитивного (на основі іпілімумабу) контролю в серійному розведенні, які служили в ролі еталонного контролю. Перед дослідженням секреції цитокінів і/або експресії антигенів на клітинній поверхні клітини стимулювали протягом З діб за температури 37 "С у атмосфері з 5 95 СО2 і відносною вологістю 95 95.
Репортерний аналіз блокади РО-1/РО-І 1
Використані репортерні аналізи блокади РО-1/РО-11 розроблені Рготеда та грунтуються на двоклітинній системі: клітини СНО, що експресують РО-11, і активатор Т-клітин і репортерна клітинна лінія уикациМЕАТ-НЕ, яка надмірно експресує РО-1. Репортерні аналізи блокади РО- 1/Р0-І1 проводили з використанням формату "розморожуй і використовуй" від Рготеда. Клітини
СНО (кат. Мо С187103), що експресують РО-Ї1, розморожували в 14,5 мл середовища для відновлення клітин (ОМЕМ/Е12, що містить 1095 ЕВ5). Далі по 50 мкл клітинної суспензії додавали до внутрішніх лунок 9б-лункового планшета з половинною площею (Согпіпд, кат. Мо 3688). Планшети інкубували протягом ночі за температури 37 "С у атмосфері з 595 СО й відносною вологістю 95 95. Наступного дня культуральне середовище видаляли й до кожної лунки додавали по 20 мкл досліджуваного антитіла в середовищі для аналізу (АРМІ 1640, що містить 4 95 ЕВ5) у серійному розведенні (початкова концентрація 10 мкг/мл). Кожен планшет містив антитіло негативного (РС1337) і позитивного (на основі ніволумабу/МРОЇ 3280А) контролю в серійному розведенні, які служили в ролі еталонних контролів. Ефекторні клітини
РО-1 (кат. Ме С187105) розморожували в 5,9 мл середовища для аналізу й у кожну лунку додавали по 20 мкл клітинної суспензії. Планшети інкубували протягом 6 год. або протягом ночі за температури 37 "С у атмосфері з 595 СО й відносною вологістю 95 905. Наступного дня додавали 40 мкл люциферази (система для аналізу люциферази Віо-Ссіо, кат. Мо С17941) і вимірювали рівень активності люциферази з використанням багаторежимного зчитувача мікропланшета аВіоТек бЗупегау 2. Ефективність вимірювали як активність люциферази порівняно з антитілом негативного контролю.
Скринінг панелі антитіл до РО-Ї 1
МН із панелі антитіл до РО-Ї1 повторно клонували в навантажених сконструйованих бо векторах з вимкненим Ес, так що після експресії важких ланцюгів антитіла відбувається примусова гетеродимеризація важких ланцюгів, яка призводить до утворення біспецифічних антитіл після трансфекції. РО-І1-специфічні Гар-фрагменти переклоновували у вектор ММ1624.
Антитіла до РО-11 комбінували з МЕ1337, Гар-фрагментом, мішенню якого є ТТ, для утворення біспецифічних антитіл, спрямованих на РО-І 1 моновалентним чином. Панель антитіл до РО-Ї 1 у моновалентному форматі класифікували за активністю, як показано в таблиці 3.
Аналізи на цитокіни
ЕПІЗА: Після стимулювання Т-клітин або МКПК у різний час планшети центрифугували й видаляли середовище. Рівні цитокінів виявляли за допомогою АїЇрнаг! І5А відповідно до інструкцій виробника (РеїКкіп ЕІтег). Концентрації розраховували на основі калібрувальної кривої.
Аналіз І штіпех: Інший спосіб, який використовували для визначення продукції цитокінів іп міїго, був представлений мультиплексним аналізом, розробленим евВіозсіепсе. Рівні ІЕМ-у, ІІ -2 і
ФНІП-а вимірювали в культуральній надосадовій рідині з дотриманням інструкцій виробника.
Результати аналізували за допомогою програмного забезпечення для аналізу еВіозсіепсе.
Створення клітин диїкаї СОТ 37-МЕКВІисС
Стабільну клітинну лінію з репортерними генами дигкаї СО137-МЕКВІінс створювали шляхом стабільного вбудовування повнорозмірної конструкції СО137 і конструкції репортерного гена люциферази МЕ-кВ у клітини Уїцшаї Еб. Отже, повнорозмірний СО137 МУМ1604
ІРІВЕ5зпеоЗ|(Сіопіесі) трансфікували, а стабільні клони, що експресують СО137, отримували після відбору антибіотиками. Далі, після відбору антибіотиками, в клон із найбільшою експресією СО0137 трансфікували репортерну конструкцію раї4.32(Писе2Р/МЕ- кВ-ВЕ/Нудго (Рготеда) люциферази МЕ-кВ і вибирали стабільні клони, які експресували як СО137, так і люциферазу МЕ-кВ. Клони відбирали за їхньою здатністю відповідати на СО1371 після первинної активації антитілами СОЗ, зв'язаними на планшеті (клон ОКТ-3), і РМАЛономіцином.
Клон, що демонстрував найбільше вікно активації, використовували в репортерному аналізі
СО137 у форматі "розморожуй і використовуй".
Аналіз репортерного гена СО137
Для аналізу прямої активації СО137 на9б-лункові планшети (Совзіаг, кат. Мо 3917) наносили 2 мкг/мл антитіла до СОЗ (ОКТЗ3) у ФБР і витримували протягом ночі. Для аналізу активації
Зо СО0137, опосередкованого перехресним зшиванням, у лунки 96-лункових планшетів (Совіаг, кат.
Мо 3917) протягом ночі нашаровували 2 мкг/мл антитіла до СОЗ у ФБР - 10 мкг/мл антитіла до
Ід людини (ВеїнНуї, кат. Мо. А80-104А). Наступного дня планшети промивали ФБР. Указані вище клітини УшКаї СО137-МЕКВІнс розморожували та промивали середовищем ОМЕМ/Е12, яке містить 10 95 термічно інактивованої фетальної бичачої сироватки (середовище для аналізу).
Клітини ресуспендували за щільності 2х106 клітин/мл. У внутрішні лунки 96-лункового планшету з нанесеним покриттям висівали по 25 мкл клітинної суспензії. У кожну лунку додавали по 25 мкл досліджуваного антитіла в серійному розведенні (вихідна концентрація 20 мкг/мл), а потім по 25 мкл середовища для аналізу. Кожен планшет містив антитіло негативного (РЕ1337) і позитивного контролю в серійному розведенні, що служило в ролі еталонного контролю.
Планшети інкубували протягом ночі за температури 37 "С у атмосфері з 5 95 СО2 і відносною вологістю 95 95. Наступного дня додавали 50 мкл люциферази (Рготеда, Вгідні-сіо "М, кат. Мо
Е2610) і вимірювали рівень активності люциферази з використанням багаторежимного зчитувача мікропланшета аВіотТек Зупегаду 2.
Вироблення біспецифічного антитіла у великому об'ємі
Вироблення білків здійснювали в клітинах Егеесіуіе"М 293-Е (Іпм/йгодеп) із використанням поліетиленіміну (ПЕЇ) як реагенту для трансфекції, з масовим співвідношенням ПЕЇ/ДНК 2,5:1.
Біспецифічні антитіла трансфікували з використанням масового співвідношення з ДНК 1:71 у об'ємі 0,4-2 л. Клітинні надосадові рідини очищали шляхом порційного інкубування із сефарозою Марбеїєсї 5!ийе ЇХ (СЕ Неайнсагє) із подальшим кислотним елююванням і нейтралізацією трис-буфером. Далі білки знесолювали й центрифугували, а потім очищали шляхом катіонного обміну на колонці НКезоцшсе 5 (СЕ НеайНсагє), урівноваженій 25 мМ фосфатним буфером із рН 6,0. Для елюювання білків використовували градієнтне елюювання до 1 М Масі; збирали фракції, що містять білки, і аналізували їх із використанням біс-трис-гелів із градієнтом 4-1295 для розділення білків МиРАСЕ (Іпийгодеп). Фракції, що містять біспецифічне антитіло, об'єднували та вносили в гель-фільтраційну колонку Зирегаєх200 26/600 (СЕ Неайнсаге), урівноважену ФБР. Фракції збирали й аналізували з використанням гелів
МиИРАСЕ, після чого фракції, що містять мономерне антитіло, об'єднували й піддавали стерилізаційному фільтруванню (0,22 мкм).
Результати 60 Аналіз репортерного гена СО137
Проводили скринінг панелі бівалентних антитіл до СО137 у вищезгаданому аналізі репортерного гена прямої активації СО137. На Фіг. 11 представлений характерний графік для вибірки антитіл. 60 95 панелі антитіл були здатні різною мірою прямо активувати СО137.
Скринінг панелі антитіл до СО137хРО-Ї 1
Одним із обмежень використання бівалентних антитіл до СО137 у розробці лікарських засобів для лікування раку є системна активація клітин, що експресують СО137. Вона може призводити до того, що антитіло стане токсичним через неспецифічну спрямованість |Меї!его, 2013). Це обмеження можна подолати за допомогою біспецифічних антитіл шляхом селективного спрямування на клітини: або шляхом спрямованої дії на клітини, що одночасно експресують обидві мішені, наприклад два пухлинні антигени, або шляхом спрямованої дії на дві різні клітини, кожна з яких експресує одну з мішеней. Останнє може відбуватися, коли клітини знаходяться в безпосередній близькості одна до одної. Для дослідження можливості селективної активації СО137 створювали біспецифічні антитіла, які складаються з одного
Ср137-специфічного РГар-фрагмента й одного РО-Ї 1-специфічного Гар-фрагмента. Де РО-Ї1 представляє як антиген, наявний у високій концентрації на пухлинних клітинах, так і антиген, що на високому рівні експресується на активованих Т-клітинах, наявних у місці локалізації пухлини
ІРиїКо еї аї, 2011). Як таке, антитіло до СО137ХхРО-Ї 1 могло б активувати СО137 у цис-положенні у випадку спрямування антитіла на СО137 ії РО-11 однієї й тієї самої клітини, або в транс- положенні у випадку спрямування антитіла на СО137 імунної клітини і РО-І 1 суміжних клітин. На додаток до цього механізму, включення РО-1-блокувального Рар-фрагмента дозволило б перетворити інгібувальний сигнал на стимулювальний сигнал. УН із панелі антитіл до СО137 і
РО-І1 повторно клонували в навантажених сконструйованих векторах з вимкненим Ес, так що після експресії важких ланцюгів антитіла відбувається примусова гетеродимеризація важких ланцюгів, яка призводить до утворення біспецифічних антитіл після трансфекції. Загалом 320 біспецифічних антитіл до СО137ХхРО-1 які містять 40 різних СО137-специфічних Габ-фрагментів і 8 різних РО-І 1-специфічних Рар-фрагментів, зазначених у таблиці 3, були вироблені у форматі 24-пункового планшета, і (ДС були очищені. Усі антитіла перевіряли на здатність індукувати дозозалежну експресію люциферази в системі репортерного гена СО137-люциферази напряму або за присутності антитіла до Їдсї людини - агента перехресного зшивання. Антитіла-імітатори 20Н4.9 і МОВ7480 були включені до відповідних аналізів як еталонні антитіла.
На Фіг. 12 показаний приклад функціональної активності декількох біспецифічних антитіл до
СО137хРО-І 1, визначеної в аналізі репортерного гена СО137-люциферази, за відсутності або за присутності антитіла до ЇДС людини - агента перехресного зшивання. На графіку показано, що здатність біспецифічного антитіла до СО13З7ХРО-І 1 активувати СО137-індуковану люциферазу сильно залежить від перехресного зшивання антитілом до дСї людини, оскільки це збільшує величину активності люциферази на 25 95. Значне підсилення вироблення ІЕМ-у після зшивання
СО137 також спостерігалося для антитіла до СО137, відомого в галузі як 20Н4.9 (МО 2005/035584). У верхні 25 95 панелі біспецифічних антитіл до СО137ХРО-І 1 входили 22 СО137- специфічних Рар-фрагментів у комбінації з одним до семи РО-Ї 1-специфічних Раб-фрагментів усієї панелі, яка складалася з восьми РО-ЇІ 1-специфічних Гар-фрагментів.
Потім верхні 25 95 панелі біспецифічних антитіл до СО137ХхРО-11 перевіряли на здатність індукувати вивільнення 1-2 у первинному аналізі активації Т-клітин порівняно з бівалентними батьківськими антитілами до СО137 і батьківським СО137-специфічним Рар-фрагментом, об'єднаним із нерелевантним Рар-фрагментом, специфічним для правцевого анатоксину. У цій експериментальній моделі можна відстежувати моновалентну активацію порівняно з бівалентною активацією. У верхній частині Фіг. 13 показано набір із трьох антитіл, що індукують секрецію ІІ--2 після активації СО137, якщо вони наявні у бівалентному форматі СО137хС0137, у діапазоні, характерному для еталонного антитіла 20Н4.9. Навпаки, як показано в нижній частині
Фіг. 13, жодне з біспецифічних антитіл до СО1З37ХхРО-І1 не було здатне індукувати секрецію ІІ -2 до рівня, характерного для бівалентного СО137-специфічного батьківського Габ-фрагмента. Усі біспецифічні антитіла до СО1З37ХРО-11 показали таку саму активність, як варіанти СО137Х1Т, що вказує на неможливість ефективного формування сигнальних комплексів СО137 шляхом зв'язування СО137 і РО-І 1 на поверхні однієї й тієї самої клітини (зв'язування в цис-положенні).
Відсутність активації Т-клітин у цис-положенні, характерна для цієї панелі біспецифічних антитіл до СО137хХРО-11, є перевагою, оскільки це зменшує можливість прояву токсичності іп мімо через неспецифічну активацію Т-клітин.
Аналіз трансактивагпії
Біспецифічні антитіла досліджували у двох клітинних аналізах, щоб визначити, чи можуть біспецифічні антитіла до СО137ХхРО-І 1 активувати СО137 у транс-положенні, коли передавання бо сигналів за допомогою 20137 в імунних клітинах відбувається шляхом перехресного зшивання другою клітиною. Аналіз іп міо проводили з використанням двох різних клітинних ліній, тобто клітин СНО-РО-Ї1, які імітують пухлинні клітини, що експресують РО-Ї1, і клітин із репортерними генами СО137-люциферази дигКаї, які представляють імунні клітини. У цьому аналізі використовували таку саму модель, як у аналізі репортерного гена СО137-люциферази, навантажену антитілом до СОЗ, що забезпечує перший сигнал активації Т-клітин.
Використовували співвідношення клітин-ефекторів і клітин-мішеней 4:1, причому клітинами- мішенями були клітини СНО дикого типу або клітини СНО-РО-І| 1. На Фіг. 14 показаний приклад, у якому обидва біспецифічні антитіла до СО137, РВІ14671 і РВІ14580, які складаються з однакового СО137-специфічного Гар-фрагмента (МЕ6744) і двох різних РО-І 1-специфічних Рар- фрагментів (МЕ5361 або МЕ5594 відповідно), були здатні індукувати активність клітин із репортерним геном СО137 за присутності клітин СНО-РО-І 1, тоді як за присутності клітин СНО дикого типу жодного стимулювання СО137 не відбувалося. На додаток, обидва біспецифічні антитіла до СО137, РВ14681 і РВ14590, які складаються з однакового СО137-специфічного Еар- фрагмента (МЕ6783) і двох різних РО-Ї 1-специфічних Рар-фрагментів (МЕ5361 або МЕ5594 відповідно), були здатні індукувати активність клітин із репортерним геном СО137 за присутності клітин СНО-РО-1І 1, тоді як за присутності клітин СНО дикого типу жодного стимулювання СО137 не відбувалося. Більше того, усі біспецифічні антитіла до СО137ХхРО-І1 були такими ж активними, як еталонне контрольне антитіло 20Н4.9. Комбінація біспецифічних антитіл до
СО137хРО-І1 РВІ4580 ії РВІ14671 (формат Оіїдосіопіс5?) індукувала високу активність люциферази.
Аналіз трансактивації з використанням первинних Т-клітин
Для первинних клітин змінили формат аналізу трансактивації, додавши клітини СНО дикого типу або клітини СНО-РО-І 1 до аналізу активації Т-клітин. На початку аналізу використовували співвідношення клітин-ефекторів і клітин-мішеней 1:1,8 для клітин СНО-РО-І1 і клітин СНО дикого типу. Для аналізу активації Т-клітин на внутрішні лунки 96-лункових планшетів (96- лункові планшети з плоским дном СеїЇвіаг Мо 655180) наносили 30 мкг/мл антитіла до СОЗ ОКТ-
З у ФБР і витримували протягом ночі. Наступного дня планшети промивали ФБР. Додавали 50 мкл розчину антитіла, а потім 25 мкл очищеної суспензії з Т-клітин у кількості 2х106 клітин/лунку, і в кожну лунку додавали 25 мкл очищених клітин СНО-КІ або СНО-РБО-І1 у
Зо зазначеному вище співвідношенні. Перед дослідженням секреції ІЇ-2 культури стимулювали протягом З діб за температури 37 "С у атмосфері з 595 С02 і відносною вологістю 95 95.
Концентрацію вивільненого ІЇ-2 визначали за допомогою АІрна! І5А (Мо за кат. Режіп ЕІтег
АІ 2215).
Досліджували два біспецифічні антитіла до СО137ХхРО-І1 (РВ14671 і РВ14580), а також формат Оіїдосіопіс5? і формат СО137хХТТ. Вивільнення ІІ -2 на день 3, зображене на фіг. 15, показує, що антитіла до СО137ХхРО-І 1 індукували вироблення 1-2 у Т-клітинах за присутності клітин СНО-РО-Ї1 більшою мірою, ніж контрольне антитіло 20Н4.9. Більше того, формат
СО137ХТТ не показав індукування вивільнення ІІ -2. За присутності клітин СНО дикого типу ІІ -2 виробляється на фоновому рівні за винятком контрольного антитіла 20Н4.9. Комбінація біспецифічних антитіл до СО137хХРО-1І1 (формат Оіїдосіопіс5У) індукувала високу активність люциферази, що підтверджує результати попереднього експерименту. Формат Оіїдосіопісв? може бути націленим на один і той самий епітоп СО137 і два різні епітопи РО-І 1 (як показано на
Фіг. 14 і 15) або націленим на два різні домени СО137 і два різні домени РО-1 1.
Аналіз 5ЕВ
Для дослідження біспецифічних антитіл до СО137хРО-І 1 у фізіологічних умовах, де присутні
АПК, які експресують РО-11, обидва антитіла до СО137ХхРО-І 1 (РВ14671 і РВ14580), антитіла до
СО137Хт1 і формат Оіідосіопісв? досліджували в аналізі ФЕВ. Одне з біспецифічних антитіл до
СО137хРО-І1 (РВ14580) показало більшу активацію порівняно з негативними контрольними антитілами і було набагато активнішим порівняно з еталонними антитілами, націленими на
СОр137 (20Н4.9) або РО-І1 (МРОЇ 3280А); див. Фіг. 16. Індукування І -2 форматом СО137хРО-Ї 1
Оіїдосіопісв? також було сильним.
Додаткові дослідження
Панель із 24 СО137-специфічних Рар-фрагментів, які представляють одинадцять різних
СО137-епітопних груп А-К (таблиця 2), комбінували з сімома РО-І1 - специфічними блокувальними Раб-фрагментами й одним РО-Ї1-специфічним неблокувальним Еар- фрагментом (таблиця 3) і здійснювали їхнє вироблення у форматі 24-лункового планшета.
Після цього вироблені біспецифічні антитіла СО137хХРО-1І1 шляхом серійного титрування перевіряли на здатність індукувати дозозалежну експресію люциферази в системі репортерного гена СО137-люциферази за присутності клітин СНО-РО-І/1 або клітин СНО дикого типу. бо Антитіло 20НА4.9 і антитіло негативного контролю були включені як еталонні антитіла (Фіг. 19).
Вибирали антитіла (загалом 56), які показали найвище індукування люциферази, і шляхом серійного титрування досліджували їх у аналізі активації Т-клітин за присутності або за відсутності клітин СНО-РО-1 1 або клітин СНО дикого типу. Паралельно антитіла досліджували в аналізі ЕВ. Як кількісний показник активації СО137 вимірювали рівень вивільнення 1-2. Огляд характеристик і активності 24 біспецифічних антитіл, досліджуваних у аналізі активації Т-клітин, поданий у таблиці 7. Дванадцять СЮО137-специфічних Раб-фрагментів, для яких була виявлена активність обох РО-І 1-специфічних фрагментів як у аналізі активації Т-клітин, так ії в аналізі
ЗЕВ, були вибрані для створення комбінацій із 7 різними РО-Ї1-специфічними Еар- фрагментами. Здійснювали вироблення цих 12 СО137-специфічних фрагментів у формі бівалентних/моноспецифічних ІДС, а також у формі біспецифічних/моновалентних антитіл до
СО137хРО-І1, кожне з яких комбіноване з одним із 7 різних РО-Ї 1-специфічних фрагментів.
Таким чином, досліджували загалом 84 біспецифічні антитіла до СО137хРО-І1 шляхом дозозалежного титрування в аналізі ФЕВ з вимірюванням рівня вивільнення ІЇ-2 як кількісним показником. З даних на Фіг. 20 видно, що у випадку перебування у форматі СО137хРО-Ї 1 чотири з дванадцяти СО137-специфічних Гар-фрагментів (МЕ6783, МЕ6749, МЕ6737 і МЕ6788) показали нижчу активність у аналізі 5ЕВ порівняно з іншими Рар-фрагментами. Отже, біспецифічні антитіла до СО1З37ХхРО-І 1, які містять ці чотири СО137-специфічні ГЕар-фрагменти, були виключені з подальшого дослідження. Протягом додаткового аналізу 5ЕВ комбінації
СО137хРО-Ї1 які містять МЕ6808, МЕ6763, МЕ6754, МЕ6785 і МЕ6797, індукували найбільше вивільнення цитокіну ІЇ/-2 (Фіг. 21). Комбінації СО137хРО-І11, які містять МЕ6805, МЕ6744 і
МЕ6825, індукували секрецію цитокіну ІЇ-2 у меншій кількості. Активність комбінацій СО137хРО-
І1, які містять МЕ6808, МЕ6763, МЕ6754, МЕ6785 і МЕ6797, додатково визначали в аналізі ХЕВ шляхом серійного титрування, вимірюючи рівні індукування вивільнення 1-2, ІЕМу і ФНПа, які визначаються аналізом І итіпех у багатократних повторах. Після цього антитіла ранжували за значеннями ЕС5О для вивільнення 1-2 (таблиця 4). Панель із 28 біспецифічних антитіл до
СО137хХРО-І 1 (таблиця 4), які містять чотири різні СО137-специфічні Рар-фрагменти, показала найвищу активність у аналізі ЕВ. Ці чотири СО137-специфічні Гар-фрагменти можна віднести до тієї самої області зв'язування в СО137 (зв'язувальний домен 2), і, більше того, усі вони повністю блокували взаємодію між СО137 і СО1371. У формі бівалентного моноклонального
Зо антитіла жоден із них не показав агоністичної активності під час скринінгу з використанням клітин із репортерними генами СО137 ЧитКаї (Фіг. 17). Катіонообмінні (СІЕХ) профілі 28 біспецифічних антитіл до СЮО13З7ХхРО-11 показали, що антитіла до СО1З7хРО-11, які містять РО-
І 1-специфічний Рар-фрагмент на основі МЕ5553, такі як МЕ7702, мають оптимальні профілі
СІЕХ з точки зору розгляду як провідного кандидата антитіла для виробництва.
Приклад 5
Ранжування панелі антитіл до СО137 за афінністю
Афінність панелі СО137-специфічних Рар-фрагментів, які індукували активацію Т-клітин у комбінації з РО-Ї 1-специфічними Рар-фрагментами у транс-положенні, визначали за допомогою приладу Віасоге.
Для цього рекомбінантний білок СО137 людини з'єднували з чипом і за допомогою приладу
Віасоге Т100 вимірювали афінність різних антитіл до СО137 у моновалентному біспецифічному форматі: один ЕРаб-фрагмент був специфічним для СО137, а інший - для нерелевантного ліганду, а саме правцевого анатоксину (ТТ).
У цих експериментах вироблення біспецифічного Ід до (СО137хТТ) здійснювали засобами транзієнтної трансфекції кодуючих конструкцій у клітинах Егеевзіуіїє 293Е у невеликому об'ємі (у форматі 24-лункового планшета, див. приклад 2). Під час кожної трансфекції конструкцію, що кодує одну з вибраних послідовностей антитіла до СО137, комбінували з МЕ1337, що кодує послідовність антитіла до ТТ.
Після цього методом поверхневого плазмонного резонансу за допомогою приладу Віасоге
Т100 визначали величини афінності антитіл. Для цього білок пПиИСО137-Рс (ВМО Зувієт5 й 838- 48) розводили до концентрації 5 мкг/мл у натрійацетатному буфері для зв'язування, рН 5,0 і з'єднували з поверхнею комірки 2 біосенсорного чипа СМ5 до рівня 150 резонансних одиниць.
Проточна комірка 1 слугувала як поверхня негативного контролю. Для визначення кінетичних констант швидкості дисоціації (значень Кок) досліджувані антитіла розводили в сольовому буфері НЕРЕ5 (НВБ) до концентрації 15 мкг/мл (100 нМ) і пропускали через обидві проточні комірки 1 і 2 сенсорного чипа, вкритого СО137 за швидкості 30 мкл/хв. Регенерацію виконували шляхом імпульсного введення 10 мкл 100 мМ НС1. Константу швидкості дисоціації визначали на основі отриманих сенсограм (тобто графіків залежності відповіді від часу) методом апроксимації кривої за допомогою програмного забезпечення ВіАеємаїчаїоп.
Для вимірювання кінетичних параметрів зв'язування панелі антитіл і визначення констант швидкості асоціації й дисоціації для антитіл, що зв'язуються з СО137, цю підгрупу досліджуваних антитіл у різних концентраціях пропускали через проточні комірки 1 і 2 заново вкритого чипа. Антитіла розводили в НВ5 до концентрації 200 нМ (тобто 30 мкг/мл), виконували серію двократних розведень (4 розведення: 100 НМ - 50 нМ - 25 нМ - 12,5 нМ), а потім перевіряли на зв'язування з чипом у кінетичному аналізі за високої швидкості потоку (30 мкл/хв).
Регенерацію виконували шляхом імпульсного введення 10 мкл 100 мМ НС. Отримані сенсограми аналізували за допомогою програмного забезпечення ВіАемаїЇцайоп і визначали кінетичні константи швидкості асоціації (Ка) і дисоціації (Ка), таким чином отримуючи дані щодо афінності (значення Ко) різних СО137-специфічних Раб-фрагментів. Для кожної концентрації антитіла окремо визначали швидкості асоціації та швидкості дисоціації, а потім їх усереднювали.
Результати показано в Таблиці 6. Усі досліджувані СЮО137-специфічні Гар-фрагменти мали афінність у діапазоні низьких концентрацій (НМ).
Приклад 6
Створення клітин диїкаї ОХ40-МЕКВІнсС
Стабільну клітинну лінію з репортерними генами ДЩигКаї ОХ-40-МЕКВІнс створювали шляхом стабільного вбудовування повнорозмірної конструкції ОХ-40 і конструкції репортерного гена люциферази МЕ-кВ у клітини УшЖаї Еб. Отже, оповнорозмірний ОХ-40 ММ1616
ІРІВЕ5зпеоЗ|(Сіопіесп) трансфікували, а стабільні клони, що експресують ОХ-40, отримували після відбору антибіотиками. Далі, після відбору антибіотиками, в клон із найбільшою експресією 0Х-40 трансфікували репортерну конструкцію раї 4.32(Пис2Р/МЕ-кКВ-ВЕ/Нуаго (Рготеда) люциферази МЕ-кВ і вибирали стабільні клони, які експресували як ОХ-40, так і люциферазу МЕ-кВ. Клони відбирали за їхньою здатністю відповідати на ОХ-401| після первинної активації антитілами СОЗ, зв'язаними на планшеті (клон ОКТ-3), і РМАЛономіцином.
Клон, що демонстрував найбільше вікно активації, використовували в репортерному аналізі ОХ- 40 у форматі "розморожуй і використовуй".
Аналіз репортерного гена ОХ-40
Для аналізу прямої активації ОХ-40 і аналізу активації ОХ-40, опосередкованої перехресним
Зо зшиванням, на 96-лункові планшети (Совіаг, кат. Мо 3917) наносили 2 мкг/мл антитіла до СОЗ (ОКТЗ) у ФБР і витримували протягом ночі. Наступного дня планшети промивали ФБР. Клітини
Уижкаї ОХ-40-МЕКВІйс розморожували та промивали середовищем ОМЕМ/Е12, яке містить 10 95 термічно інактивованої фетальної бичачої сироватки (середовище для аналізу). Клітини ресуспендували за щільності 5х105 клітин/імл. У внутрішні лунки 96-лункового планшету з нанесеним покриттям висівали по 25 мкл клітинної суспензії. Досліджуване антитіло комбінували з 2,5-кратно розведеним антитілом анНиідс-Ес (Веїйу!, кат. МеАв80-104А) і виконували серію розведень (початкова концентрація досліджуваного Ідсї становила 20 мкг/мл).
Суміші антитіл інкубували протягом 15 хвилин за кімнатної температури. Після цього 50 мкл суміші антитіл вносили в комірки з подальшим додаванням 25 мкл середовища для аналізу.
Кожен планшет містив антитіло негативного (РЕ1337) і позитивного контролю в серійному розведенні, що служило в ролі еталонного контролю. Планшети інкубували протягом 6 год. за температури 37 "С у атмосфері з 595 СО й відносною вологістю 95905. Додавали 50 мкл люциферази (Рготеда, Вгіднпі-Спіо М, кат. Мо Е2610) і вимірювали рівень активності люциферази з використанням багаторежимного зчитувача мікропланшета авВіоТек бупегду 2.
Проводили скринінг панелі бівалентних антитіл до ОХ-40 у вищезгаданому аналізі репортерного гена прямої активації ОХ-40 і аналізі активації Т-клітин. Вибрали чотири різні ОХ- 40-специфічні Рар-фрагменти, щоб визначити, чи можуть біспецифічні антитіла до ОХАОХхРО-Ї 1 або до ОХ40хХРО-1 активувати ОХ40 у цис- або трансо-положенні. Отже, дослідження біспецифічних антитіл проводили у двох клітинних системах із використанням клітин СНО з надмірною експресією РО-Ї1 і клітин ЧУиїкаї ОХ-40-МЕКВІйс. РО-Ї1 у транс-положенні забезпечували на клітинах СНО, а РО-1 у цис-положенні - на клітинах із репортерними генами
Уижаї ОХ-40-МЕКВІінс. У цьому аналізі використовували таку саму модель, як у аналізі дикаї
ОХ-40-МЕКВІійс, навантажену антитілом до СОЗ, що забезпечує перший сигнал активації Т- клітин. Використовували співвідношення клітин-ефекторів і клітин-мішеней 4:1, причому клітинами-мішенями були клітини СНО дикого типу або клітини СНО-РО-1 1. На фіг. 18 показані приклади чотирьох різних ОХ40-специфічних Рар-фрагментів, скомбінованих із РО-Ї1- специфічним (МЕ5561) або РО-1-специфічним (МЕб256) блокувальним Рар-фрагментом.
Антитіла до ОХ40ОхХРО-11 індукували активність клітин із репортерним геном ОХ40 за присутності клітин СНО-РО-Ї1 на тому самому рівні, що антитіло до СТІ А4 на основі бо іпілімумабу. Натомість антитіла до ОХ4ОХхРО-1 показували активність на фоновому рівні. За відсутності клітин, що експресують РО-11, активність антитіл до ОХАОХРО-11 поверталася до вихідного рівня.
Приклад 7
У прикладі 4 було визначено, що п'ять СО137-специфічних РГар-фрагментів є переважними з огляду на їхню здатність до трансактивації Т-клітин.
У цьому прикладі використовували панель із трьох біспецифічних антитіл, які складаються з трьох кандидатів СО137-специфічних фрагментів (6763, 6785 і 6797) і одного РО-Ї1- специфічного фрагмента (7702). Вироблення біспецифічних антитіл здійснювали в клітинах 293Е Егеезіуве і очищали їх за допомогою білка А, шляхом катіонного обміну й гель-фільтрації.
Після цього ці антитіла досліджували в декількох аналізах Автори цього винаходу досліджували Рар-фрагменти як у батьківському моноспецифічному бівалентному форматі (антитіло до СО137 або до РО-І 1), так і в біспецифічному форматі (антитіло до СО1З37ХхРО-І 1) і порівнювали ці антитіла з еталонним антитілом до СО137 (20Н4.9), еталонним антитілом до РО-
Ї1 (ММ243.55.570) і з негативним контрольним антитілом (антитіло до А5М |РО27081).
Щодо матеріалів і методів, використовуваних у аналізах, описаних у цьому прикладі, також дається посилання на приклад 4.
Антитіла перелічені нижче.
Аналіз методом сортування клітин з активацією флуоресценції (ГАС)
Афінність і специфічність до антигена
Зв'язування моноспецифічних і біспецифічних ДС з СО137 людини (пи) і яванського макака (су) перевіряли за допомогою аналізу ЕАС5 із використанням стабільних клонів клітин 293ЕЕ, які експресують або пиСО137, або суСор137. Для цього клітини інкубували з 8-етапним серійним титруванням антитіла й визначали інтенсивність зв'язування через подальше зв'язування вторинного антитіла, антитіла до Ідсб;їі людини, зв'язаного із флуоресцентним барвником фікоеритрином (РЕ). На Фіг. 22 показана інтенсивність зв'язування, виражена як середнє значення флуоресценції РЕ, для кожного з досліджуваних антитіл. З батьківських моноспецифічних антитіл до СО137 РОб785 зв'язувалося з СО137 людини з найвищою
Зо афінністю, на другому місці було РОІбЄ797, на третьому - Раб763. Біспецифічне антитіло
РВ17311 (6797 х 7702) зв'язувалося з пиИСО137 з найвищою афінністю, на другому місці було
РВ17309 (6763 х 7702), на третьому - РВ17310 (6785 х 7702). З батьківських антитіл до СО137 знову ж Раб785 зв'язувалося з СЮО137 яванського макака з найвищою афінністю, на другому місці було Рб797, на третьому - РОаб6763. Біспецифічне антитіло РВ17311 (6797 х 7702) зв'язувалося з суСО137 з найвищою афінністю, на другому місці було РВ 17309 (6763 х 7702), на третьому - РВ17310 (6785 х 7702). Слід відзначити, що, як показано на Фіг. 22, коли ці три
СО0137-специфічні Раб-фрагменти наявні в біспецифічному моновалентному антитілі, вони можуть однаково добре зв'язувати як пиСО137, так і суСО137; це також спостерігалося для батьківських моноспецифічних бівалентних антитіл.
Зв'язування моноспецифічних і біспецифічних Ідс з РО-Ї1 людини (пи) і макака-резус (ге) перевіряли за допомогою аналізу ЕАС5 із використанням стабільних клонів клітин СНО-КІ, які експресують пПиРО-Ї1 або теРО-І1. Для цього клітини інкубували з 8-етапним серійним титруванням антитіла й визначали інтенсивність зв'язування через подальше зв'язування вторинного антитіла, антитіла до ЇдС людини. На фіг. 23 показана інтенсивність зв'язування, виражена як середня інтенсивність флуоресценції (СІФ), для кожного з досліджуваних антитіл.
Як і очікувалося, батьківські антитіла до СО137 не зв'язувалися з РО-І1 людини або макака- резус, тоді як батьківське антитіло до РО-Ї1 Р(7702 зв'язувалося. Важливо, що всі три біспецифічні антитіла зв'язуються виключно з РО-11, усі з вищою афінністю, ніж антитіло позитивного контролю. Це означає, що фрагмент МЕ7702, навіть перебуваючи в складі моновалентного біспецифічного антитіла, має вищу афінність відносно РО-І1 порівняно з бівалентним контрольним антитілом УМУ243.55.570.
Зв'язування з активованими Т-клітинами
Автори цього винаходу досліджували афінність зв'язування панелі антитіл з активованими
Т-клітинами. Для цього в донора брали мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК) і залишали їх на ніч. Після цього виділяли Т-клітини й активували їх шляхом інкубування протягом З діб на планшетах, укритих антитілом до СОЗ ОКТЗ. Активовані Т-клітини збирали й забарвлювали шляхом серійного титрування ІдсСро у панелі антитіл і контрольними да.
Зв'язування антитіл вимірювали методом ЕБАСе через подальше зв'язування вторинного антитіла, антитіла до (ДС людини, міченого РЕ. На Фіг. 24 показана інтенсивність зв'язування, виражена як СІФ, для кожного з досліджуваних антитіл; зв'язування біспецифічних Ідсї показане зліва, а зв'язування моноспецифічних Ідсї - справа. РВ17311 (6797 х 7702) показало найбільш сильне зв'язування. Важливо, що величини афінності зв'язування позитивних контрольних антитіл були нижчими, ніж у біспецифічних антитіл. Це означає, що біспецифічні антитіла за цим винаходом мають вищу афінність відносно активованих Т-клітин порівняно з РО-Ї1- специфічним еталонним антитілом УМу/243.55.570 (на основі атезолізумабу) і СО137- специфічним еталонним антитілом 20НА4.9 (на основі урелумабу).
Аналізи блокування ліганду
Конкурентний аналіз РО-1/РО-І 1
Здатність біспецифічних і моноспецифічних ІдС:ї блокувати зв'язування ліганду РО-І1 досліджували в порівняльному аналізі РО-1/РО-І 1 методом ЕГІ5ЗА; при цьому очікувалося, що збільшення кількості антитіл, що містять РО-І 1-специфічний фрагмент, призведе до зменшення кількості біотинільованого РО-Ї1, що може зв'язуватися з планшетом, вкритим РО-1- специфічним Ес-фрагментом. Для цього 1 мкг/мл РО-1-Рс (НО; Мо 1086-РО) наносили на планшети Махізогр і додавали біотинільований РО-І 1 (ВРБ5 Віозсієпсе; кат. Мо 71105) у розчин за присутності або відсутності кожного антитіла, серійно розведеного, починаючи з концентрації 10 мкг/мл. Зв'язування РО-Ї17 виявляли через подальше зв'язування стрептавідину, кон'югованого з пероксидазою хрону (НЕРР), і додавання безбарвного субстрату, забарвлення якого каталізує НАР. Показником зв'язування РО-Ї1 є оптична густина (00) розчину, яка вимірюється на довжині хвилі 450 нм з використанням зчитувача планшета для ЕЇ І5А. На фіг. 25 показані криві зв'язування, де зв'язування біспецифічних ІдСсї показане зліва, а зв'язування моноспецифічних ІдС: - справа. Як і очікувалося, антитіло позитивного контролю до РО-Ї1
Зо показало високий рівень блокувальної активності, тоді як антитіло негативного контролю не показало жодної. Також моноспецифічні антитіла до СО137 показали відсутність блокування
РО-І1. Усі да, які містять принаймні один РО-Ї 1-специфічний фрагмент, були здатні блокувати зв'язування РО-1/РО-І1. Було виявлено, що батьківське моноспецифічне антитіло до РО-Ї1
РО7702 таке ж ефективне, як еталонне антитіло до РО-Ї1 ММ/243.55.570, що стосується блокування зв'язування РО-І1. Усі біспецифічні ІДС мали схожі високі рівні блокувальної активності.
Клітинний аналіз блокування ліганду пиИСО137
Також досліджували здатність біспецифічних і моноспецифічних ІдСї блокувати зв'язування ліганду СО137. Автори цього винаходу досліджували три кандидати СО137-специфічних фрагментів (6763, 6785 і 6797) і РО-І 1-специфічний фрагмент (7702) як у батьківському бівалентному моноспецифічному форматі (антитіло до СО 137 або до РБО-І1), так і в біспецифічному форматі (антитіло до СО1З7хХРО-І1), і порівнювали ці антитіла з еталонним антитілом до СО137 (20Н4.9 і РЕ-05082566) і з антитілом негативного контролю (антитіло до
ВМ ІРа27081).
Для аналізу блокування ліганду СО137 в умовах, наближених до фізіологічних, біспецифічні й моноспецифічні ІДС досліджували в клітинному аналізі блокування ліганду пиСО137 з використанням проточної цитометрії. У цьому аналізі очікувалося, що збільшення кількості антитіл, що містять СО137-специфічний фрагмент, призведе до зменшення кількості рекомбінантного білка пиСО137Ї, який може зв'язуватися з клітинами СНО-КІ, які стабільно експресують пиИСО137. Для цього клітини СНО(пиСО137) сумісно інкубували з білком пиСО1371. разом із кожним серійно розведеним антитілом. Зв'язування пиИСО137Ї виявляли за допомогою вторинного біотин-кон'югованого антитіла до ПйпиСО137Ї з подальшим забарвленням стрептавідину, кон'югованого з фікоеритрином (РЕ).
Способи
Клітини СНО зі стабільною експресією пиСО137 збирали, підраховували й розводили в буфері для ГАС5 до концентрації 5х105 клітин/мл і додавали 200 мкл (тобто 1х105 клітин) до кожної лунки 9б-лункового мікротитрувального планшета з О-подібним дном. Клітини тримали на льоду. Клітини центрифугували протягом З хв. за 300 49 і 4 "С, потім промивали 200 мкл крижаного буферу для ЕАС5. Клітини повторно центрифугували протягом З хв. за ЗО ді 4 с, бо клітинний залишок ресуспендували у 25 мкл розчину антитіла в буфері для ЕАС5 (серійні 3-
кратні розведення від 25 до 0,034 мкг/мл) плюс 25 мкл розчину білка пиСО1371 -РІ АС (Адіродеп
Ж дОа-40А-0198Т; кінцева концентрація 0,06 мкг/мл). Планшети інкубували протягом 60 хв. на льоду в темному місці. Після цього клітини промивали двічі шляхом додавання 200 мкл крижаного буферу для ГАС і центрифугували протягом З хв. за 300 д і 4 "С. Після цього додавали 50 мкл/лунку біотинільованого поліклонального козячого антитіла до пиИСО1371 (нар
Зузієте Мо ВАЕ2295), розведеного до концентрації 1 мкг/мл у крижаному буфері для ЕАС5.
Клітини ресуспендували, планшети інкубували протягом 60 хв. на льоду в темному місці, потім промивали двічі таким самим способом, що й перед цим. Після цього додавали 50 мкл/лунку стрептавідину-РЕ, розведеного 1:200 у крижаному буфері для ЕАС5. Клітини ресуспендували, планшети інкубували протягом 60 хв. на льоду в темному місці, потім промивали двічі таким самим способом, що й перед цим. Клітини ресуспендували у 100 мкл буферу для ЕАС5 на лунку й фіксували шляхом додавання 100 мкл 4 95-го розчину параформальдегіду (РЕА).
Вимірювання зразків здійснювали з використанням проточного цитометра ВО ЕАСбЗсСапіо відповідно до інструкцій, поданих у посібниках ВО. Ступінь зв'язування ліганду пиИСО137 виражали як середню інтенсивність флуоресценції (СІФ) зв'язаного стрептавідину-РЕ.
Результати
Отримані криві зв'язування показані на Фіг. 26. Як і очікувалося, антитіло негативного контролю не блокувало зв'язування ліганду СО137. Блокування зв'язування ліганду антитілами позитивного контролю різнилося: у випадку еталонного антитіла РЕ-05082566 спостерігалося сильне блокування, тоді як у випадку 20НА4.9 зв'язування було відносно слабким і неповним. Із трьох моноспецифічних антитіл до СО137 найкращим блокатором було РОб785, а другому місці було РОаб797 (батьківське для РВ17311). Відповідні три біспецифічні антитіла до СО137хРО-Ї 1 також були здатні блокувати зв'язування ліганду СО137. Оскільки це клітинний аналіз, його результати є показовими для умов, наближених до фізіологічних.
Аналіз репортерного гена РО-1/Р 0-11
Іншим етапом визначення характеристик кандидатів антитіл до СО137хРО-11 було визначення того, чи можуть вони блокувати сигнальний шлях РО-1/РО-11, ії порівняння цієї їхньої активності з відповідною активністю контрольного антитіла, специфічного для РО-І 1. Цю блокувальну активність досліджували іп міо в аналізі репортерного гена блокування РО-1/РО-
Зо ЇЇ в умовах, наближених до фізіологічних; цей аналіз розроблений компанією Рготеда на основі двоклітинної системи: клітин СНО, що експресують РО-1 1 і активатор рецептора Т-клітин, і клітинної лінії з репортерними генами УишкамиМЕАТ-НЕ з надмірною експресією РО-1. Т-клітини
Уимжаї містять репортерний ген люциферази, який може бути активований через сигнальний шлях МЕАТ (ядерного фактора активованих Т-клітин). Взаємодія РО-1 із РО-І 1 інгібує активацію цього сигнального шляху. Однак блокування взаємодії РО-1/РО-І 1 антитілами проти РО-1 або
РО-Ї1 може призвести до активації сигнального шляху МЕАТ. Тому що вищий ступінь блокування РО-1/РО-І1, то сильніша активація репортерного гена люциферази. Для цього, перед додаванням клітин із репортерним геном дикаумМЕАТ-НЕ з надмірною експресією РО-1 до РО-ІЇ 1-експресуючих клітин СНО додавали кожне серійно розведене антитіло. На Фіг. 27 показаний ступінь блокування через 24 години, виражений як кратність індукування репортерного гена; де зв'язування біспецифічних ІдСсСьс показане зліва, а зв'язування моноспецифічних ІдсСї до РО-І1 - справа. Знову ж, бівалентне батьківське антитіло 7702 було активнішим, ніж еталонне антитіло позитивного контролю УМ/243.55.570. Усі біспецифічні Іс мали схожі високі рівні блокувальної активності.
Приклад 8
Вплив рівня експресії РО-Ї1 на трансактивацію СО137 біспецифічними антитілами до
СО137хРО-І 1
Культивування клітинних ліній
Клітини МОА-МВ231 (кат. Ме СА!АМ-НТВ-26) купували в АТСС і весь час тримали їх у середовищі ОМЕМ із високим умістом глюкози (Сірсо), збагаченому 100 мМ пірувату натрію (сірсо), замінними амінокислотами для мінімально поживного середовища (сзібсо) і 10 95 ЕВ5 (опа). Клітини ВхРС-3 (кат. Мо СВІ -1687) купували в АТСС і весь час тримали їх у середовищі
АРМІ-1640 (Сіірсо), збагаченому 10 95 ЕВ5 (І опга).
Механізм дії антитіл до СО137хРО-ІЇ 1
За допомогою аналізу трансактивації репортерного гена диїаї СО137-Іс визначали, чи трансактивація, опосередкована антитілом до СО137хРО-І11, відбуватиметься на фізіологічних рівнях експресії РО-І1, і чи корелює вона з рівнями експресії РО-І1. Отже, кількість сайтів зв'язування РО-І 1 на різноманітних клітинних лініях СНО-РО-11 і пухлинних клітинних лініях людини визначали за допомогою аналізу ОІРІКІТ (САКО). Були вибрані три клітинні лінії СНО- 60 РО-І1 із рівнями експресії РО-Ї1, що відповідають пухлинним клітинним лініям людини з відносно високим (клітини Е5-2), середнім (МОА-МВ231) або низьким (ВхРС-3) рівнем експресії
РО-І1. На Фіг. 28А показаний приклад трьох біспецифічних антитіл до СО137ХхРО-І1 при використанні трьох вибраних клітинних ліній СНО, які експресують від -«- 6000 до -- 72 000 сайтів зв'язування РО-Ї1 на клітину. Дані показують, що біспецифічні антитіла до СО137хРО-І1 демонструють високий рівень активації, коли на клітині наявні більш ніж 3,8 х 107 копій РО-1 1.
За низьких рівнів РО-І1, за присутності клітин СНО, що експресують лише - 6000 сайтів зв'язування РО-11 на клітину, спостерігається низький рівень активації. Отже, трансактивація біспецифічними антитілами до СО137хРО-І 1 відбуватиметься поблизу клітин, що експресують високі рівні РО-І1, як це відбувається в імуносупресивному пухлинному мікросередовицщі, і таким чином забезпечуватиме оптимальний терапевтичний діапазон для біспецифічного антитіла до СО1З7ХРО-І 1.
На Фіг. 28А показана позитивна кореляція між активацією МЕ-КВ, опосередковану біспецифічним антитілом до СО1З37хРО-11, і рівнями експресії РО-І 1 на клітинах СНО для всіх досліджуваних антитіл.
На Фіг. 288 показаний приклад аналізу трансактивації репортерного гена УХижаї СО137-Іис, коли клітини СНО-РО-І11 використовували замість пухлинних клітинних ліній людини з високим, середнім і низьким рівнями експресії поверхневого РО-І1. Цей експеримент підтвердив, що трансактивація, опосередкована біспецифічним антитілом до СО137хРО-11, пов'язана з рівнями експресії РО-І 1 на антигенпрезентуючих клітинах і що біспецифічні антитіла до СО137хХРО-Ї 1 здатні до трансактивації за присутності пухлинних клітин з високими рівнями експресії РО-Ї 1.
Після цього оцінювали, чи була трансактивація СО137 за присутності антигенпрезентуючих клітин, що експресують РО-І1, специфічною ознакою біспецифічних антитіл до СО137хХРО-11.
На Фіг. 28С показаний приклад, у якому оцінювали трансактивацію клітин репортерного гена
УижЖаї СО0137-с за присутності антигенпрезентуючих клітин, що експресують РБО-І1, здійснювану біспецифічними антитілами до СО137хХРО-Ї1, їхніми батьківськими моноспецифічними бівалентними антитілами (Сб0137х00137) і батьківськими моноспецифічними моновалентними антитілами до СО137 (СО137х1) і до РО-Ї1 (ТТХРО-І 1).
Усі (Ід досліджували в концентрації 10 мг/мл. Дані показують, що лише біспецифічні антитіла до СО137ХхРО-І1 опосередковували трансактивацію за присутності клітин СНО або Е5-2, що
Зо експресують РО-ЇІ 1. Як і очікувалося, еталонне контрольне антитіло 20Н4.9 напряму активувало клітини з репортерним геном УїшжЖаї СО137-с незалежно від експресії РО-/1 антигенпрезентуючими клітинами.
Приклад 9
Аналіз транс активації СНО-РО-1 1 і Т-клітин
Для визначення додаткових переваг використання біспецифічного ІдСь автори цього винаходу оцінювали здатність декількох біспецифічних антитіл до СО137ХхРО-І1 індукувати вивільнення цитокінів Т-клітинами в аналізі трансактивації, а також порівнювали силу активації в цих антитіл і в еталонних бівалентних антитіл проти РО-Ї 1 (УМ/243.55.570) і проти СО137 (20Н4.9). Ці еталонні антитіла досліджували поодинці та в еквімолярній комбінації. Для цього очищені й активовані Т-клітини від одного здорового донора протягом З діб сумісно інкубували з клітинами СНО-РО-Ї1 і серійно розведеними досліджуваними антитілами (докладний опис цього аналізу див. також у прикладі 4). Після цього вимірювали рівні ІЇ-2, ІЕМу ії ФНПа у нерозведених надосадових рідинах клітинних культур. Ступінь вивільнення цитокіну, виміряний у цьому аналізі трансактивації, показаний на Фіг. 29. Як показано на Фіг. 29, усі три біспецифічні антитіла були активнішими в індукуванні вивільнення цитокінів, ніж будь-яке одне з еталонних антитіл. Важливо, що кожне з цих трьох біспецифічних антитіл також було активнішим в індукуванні вивільнення цитокінів, ніж комбінація з двох еталонних антитіл; це демонструє вищі характеристики цих біспецифічних антитіл стосовно активації Т-клітин.
Вивільнення цитокінів під час аналізу трансактивації Т-клітин
Для визначення додаткових переваг використання біспецифічного ІдСь автори цього винаходу порівнювали одне з біспецифічних антитіл (РВ17311; 6797 х 7702) із сумішшю його батьківських моноспецифічних бівалентних Ідс і з еталонними бівалентними антитілами проти
РО-І1 ї СО0О137 на предмет їхньої здатності активувати вивільнення цитокінів Т-клітинами в аналізі трансактивації. Ці еталонні антитіла базуються на терапевтичних антитілах, застосовуваних у клінічній практиці: клон антитіла до РО-Ї1 УМ/243.55.570 базується на атезолізумабі, клон антитіла до СО137 20НА4.9 базується на урелумабі, клон антитіла до СО137
РЕ-05082566 базується на утомілумабі. Ці еталонні антитіла досліджували поодинці та в еквімолярній комбінації.
У цих експериментах антитіла досліджували з використанням б-етапного 10-кратного бо титрування, починаючи з концентрації 20 мкг/мл. МКПК від 2 донорів розморожували й додавали 9 об'ємів культурального середовища (АРМІ1640 з І-глутаміном і 10 95 термічно інактивованої ЕВ5). Клітини центрифугували протягом 10 хвилин за 150 4 за кімнатної температури. Клітинний залишок ресуспендували в 10 мл культурального середовища й залишали клітини на ніч для інкубування і пробірці Раісоп на 50 мл за температури 37 "С у атмосфері з 5 96 СО й відносною вологістю 95 95. Під час підготовки до аналізу трансактивації на внутрішні лунки 96-лункового планшета (СеїІвїаг, кат. Мо 655180) наносили 5 мкг/мл антитіла до СОЗ (клон ОКТ3З) у ФБР і витримували протягом ночі.
Наступного дня виділяли Т-лімфоцити з використанням процедури очищення за допомогою набору для збагачення Т-клітин Еазузер (пеннінг на СОЗ) згідно з інструкціями виробника (біт сеї! Тесппоодіез5, кат. Ме19051). У процедурі Еазубер застосовується негативна селекція.
Коротко, МКПК центрифугували протягом 10 хвилин за 150 9 за кімнатної температури.
Клітинний залишок ресуспендували в 2 мл ФБР - 295 ЕВ5 із 1 мМ ЕДТК. Суспензію клітин фільтрували через сітчастий нейлоновий фільтр 30 мкм. Підраховували кількість клітин і доводили її до 5 х 107 клітин/мл у ФБР -- 2 95 ЕВ5 із 1 мМ ЕДТК. Додавали 50 мкл суміші для збагачення Т-клітин людини Еазубер на кожні 2 мл клітинного розчину, перемішували й залишали інкубуватися протягом 10 хвилин за кімнатної температури. Після цього додавали 50 мкл магнітних частинок Еазубер О на кожні 2 мл клітинного розчину й залишали інкубуватися протягом 5 хвилин за кімнатної температури. Загальний об'єм доводили до 2,5 мл ФБР 4-4 2 95
ЕВ5 із 1 мМ ЕДТК. Потім пробірку поміщали в магнітне поле, що дозволяло зв'язати небажану фракцію клітин магнітом, на 5 хвилин за кімнатної температури. Після цього пробірку перевертали й очищену фракцію Т-клітин переливали в нову пробірку; клітини збирали шляхом 10-хвилинного центрифугування за 150 49 і кімнатної температури, а потім ресуспендували за концентрації 105 клітин/мл у культуральному середовицщі.
Того самого дня попередньо вкриті 96-лункові планшети промивали ФБР і додавали 25 мкл попередньо розведеного антитіла, а потім - 50 мкл очищених Т-клітин (50 000 клітин/лунку) і 25 мкл клітин СНО-РО-І 1 (30 000 клітин/лунку). Клітини залишали інкубуватися протягом 72 год. за 37 "С. Після цього збирали надосадову рідину й досліджували його у свіжому вигляді або сортували за -80 "С. Рівні цитокінів вимірювали в нерозведених надосадових рідинах клітинних культур за допомогою аналізу ІШтіпех у багатократних повторах згідно з інструкціями
Зо виробника. Результати аналізували за допомогою програмного забезпечення для аналізу еВіозсієпсе.
Для підгрупи з 16 цитокінів рівні, індуковані РВ17311 у аналізі трансактивації, були вищими, ніж індуковані еталонним антитілом до СО137 20Н4.9 самостійно або в комбінації з антитілом до
РО-І1 УМ/243.55.570 (див. Фіг. 30). До складу підгрупи входили СМ-С5БЕ, ІІ -2, 11-13, ІЕМУу, ФНПВ,
І--17А, ФНПа, ІІ -18, І-І, 22, 1-4, 11-31, 1-6, 11 -5, 11-21 ї І -9. Найбільше зростання рівня вивільнення цитокінів, індукованого РВ17311, спостерігалося для ЯМ-С5БЕ, 1-2, 11-13, 11 -17А,
ІЕМУу, ФНІ-а, ФНП-В, 1-18, 1-22, ї 1-4. Помітного вивільнення цитокінів, опосередкованого антитілом, не спостерігалося для 1І1/-18, І -1ВА, 1-7, 11-10, П/-12р70, 11-15, 1-23 або ІІ -27.
Зростання вивільнення цитокінів не спостерігалося, коли клітини інкубували лише з антитілом до РО-Ї1 УМ/243.55.570, або лише з антитілом до СО137 РЕ-05082566, або з батьківськими бівалентними антитілами до СО137 (6797) або до РО-І 1 (7702).
Висновок: цей експеримент показує, що біспецифічне антитіло РВ17311 має кращу здатність до активації Т-клітин порівняно з еталонним антитілом до СО137 20НА4.9, яке діє самостійно або в комбінації з еталонним антитілом до РО-Ї1 ММ/243.55.570. Важливою перевагою РВ17311 є те, що це біспецифічне антитіло є сильнішим у активації Т-клітин, ніж суміш двох еталонних антитіл.
Приклад 10
Аналіз 5ЕВ
Для додаткового визначення характеристик трьох біспецифічних антитіл до СО137хРО-Ї 1 (РВ17309, РВ17310 і РВ17311) досліджували їхню здатність підсилювати вивільнення цитокінів клітинами МКПК за присутності стафілококового ентеротоксину В (ЗЕВ). Для цього МКПК від З донорів інкубували протягом З діб за присутності ЕВ (2000 або 125 нг/мл) і трьох кандидатів біспецифічних антитіл або серійно розведених контрольних антитіл. Еталонним контрольним антитілом у цьому експерименті було антитіло до СТІ А4 1001, яке в цьому аналізі показало індукування сильного вивільнення цитокінів. Рівні цитокінів вимірювали в супернатантах клітинних культур за допомогою аналізу І итіпех у багатократних повторах. На Фіг. 31 показані результати вивільнення //-2 клітинами МКІПК від трьох різних донорів за двох різних концентрацій 5ЕВ. Це порівняння демонструє, що профілі активності всіх З бівалентних антитіл до СО137хХРО-11 були однаковими для цих трьох донорів. Воно також показує, що серед цих бо біспецифічних антитіл найефективнішими були РВ17309 і РВ17311. Усі три антитіла РВ17309
(6763 х 7702), РВ17310 (6785 х 7702) і РВ17311 (6797 х 7702) були активнішими, ніж антитіла позитивного контролю. На Фіг. 32 показані результати для рівнів вивільнення ІІ -2, ІЕМу ії ФНПа клітинами МКІПК від одного донора (Мо 1038) за концентрації 5ЕВ 2000 нг/мл, причому вивільнення цитокінів, індуковане біспецифічними антитілами до СО137хХРО-11, порівнювали з вивільненням цитокінів, індукованим еталонними бівалентними антитілами проти С0О137 (20Н4.93у або проти РО-/1 (ММ/243.55.570), як поодинці, так і в еквімолярній суміші. Це порівняння демонструє, що біспецифічні антитіла до СО137хХРО-11 є безсумнівно ефективнішими в активації МКПК, ніж кожне з еталонних бівалентних антитіл. Важливо, що кожне з біспецифічних антитіл до СО137ХхРО-11 було ефективнішим у активації МКПК, ніж суміш
УМ243.55.570 і 20Н4.9; це ще раз демонструє вищі характеристики цих біспецифічних антитіл стосовно активації Т-клітин за присутності клітин, які експресують РО-ЇІ1, що може забезпечувати активацію в транс-положенні цих біспецифічних антитіл.
Приклад 11
Вплив РВ17309, РВ17310 і РВ17311 на опосередковане макрофагами Ма2 пригнічення клітин
МКПК. стимульованих антитілом до СОЗ/С028
Класично активовані макрофаги (макрофаги МІ!) можуть знищувати пухлини на ранніх стадіях канцерогенезу. Однак протягом переходу з ранньої стадії трансформації до пізніх стадій пухлини динамічні зміни в мікросередовищі пухлини поступово скеровують перехід від макрофагів М' до макрофагів М2. Пов'язані з пухлиною макрофаги М2 секретують імуносупресивні цитокіни й індукують імунну супресію шляхом зшивання з РО-1. Як такі, макрофаги М2 інгібують проліферацію Т-клітин і вироблення цитокінів. Для демонстрації того, що антитіло до РО-1ї може частково скасовувати інгібіторний вплив макрофагів М2 на проліферацію Т-клітин, проводили аналіз супресії макрофагів М2, розроблений компанією
Адцшійа Віотеаіса!. За допомогою цього аналізу автори винаходу досліджували вплив РВ17309,
РВІ17310 ії РВІ17311 на реполяризацію макрофагів М2 з використанням експресії ІЕМ-у як кількісного показника й порівнювали його із впливами, обумовленими негативним ізотипним контролем (антитілом до НОМ-сй РОаг2708) і двома еталонними антитілами (еталонним антитілом до СО137 20Н4.9 та еталонним антитілом до РО-І 1 УМуУ243.55.570).
Аналіз супресії М2
Зо Зі свіжої крові, взятої у п'яти здорових донорів, виділяли мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК). Для виділення моноцитів шляхом негативної селекції використовували магнітне сортування клітин (без виснаження СО16). Субпопуляцію МКПК від кожного з 5 донорів також зберігали методом кріоконсервування для подальшого використання в аналізі для сумісної культури МКПК/М2. Макрофаги М2 отримували шляхом культивування виділених моноцитів із М-СОЕ (50 нг/мл) у середовищі АРМІ-10 (АРМІ-1640, 10 95 термічно інактивованої ЕВ5, 100 од/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину, 2 мМ І-глутаміну, 50 мкМ Д- меркаптоетанолу) протягом 8 діб у 96-лункових планшетах із круглим дном. Протягом періоду культивування середовище клітин поповнювали свіжим АРМІ-10, збагаченим М-С5Е, у дні З і 6.
У день 8 середовище видаляли, додавали свіже середовище (без М-С5БЕ) і активували клітини з
ІРБ (0,1 мкг/мл) протягом 2 годин. Після цього макрофаги промивали для видалення І РЗ і поповнювали свіжим середовищем (без М-С5Е). Макрофаги М2 культивували спільно з аутологічними МКПК (розмороженими та промитими) у співвідношенні 4: 1 (МКПК: М2) за присутності або відсутності досліджуваних антитіл або ізотипних контролів (10 мкг/мл) у трьох повторах. Після 24 годин сумісного культивування культури стимулювали антитілом до СОЗ (1 мкг/мл) антитілом до СО28 (2 мкг/мл) протягом трьох діб для активації Т-клітин через ТСВ- рецепторний комплекс. Після цього вимірювали рівень ІЕМ-у у надосадовій рідині клітинної культури методом ЕГІЗА, при цьому супернатанти розводили 1:10 або 1: 20 у відповідному розчиннику для ЕГІЗА, щоб отримувати значення в межах діапазону виявлення цих наборів.
Проводили порівняльні статистичні аналізи для досліджуваної речовини й відповідних контрольних груп із використанням або і-критерію для попарного порівняння відношень, або однофакторного дисперсійного аналізу (АМОМА) для множинних порівнянь за допомогою апостеріорного критерію Даннета (для порівнянь між контролем і декількома групами) або критерію Голма - Сідака (для порівнянь між усіма групами). Статистичну значущість приймали на рівні Р « 0,05.
Результати
Результати показані на Фіг. 33; дані представлені як середні (для трьох повторів) рівні ТЕМ-у, виміряні за допомогою ЕГ І5А після стимулювання МКПК антитілом до СОЗ/С028. Ці результати чітко показують, що МКПК, культивовані за відсутності макрофагів М2, виробляли вищі рівні
ІЕМ-у після стимулювання СОЗ і СО28 (порівняйте "лише МКПК" з умовами "не стимульовані"; бо «7» вказує на Р « 0,05). Незважаючи на неоднорідність результатів, отриманих для різних донорів, було зроблено висновок, що всі три біспецифічні антитіла підвищували вироблення
ІЕМ-у у сумісних культурах М2/МКПК. РВ17309 ії РВ17310 показують тенденцію, хоча й не статистично значущу, до підвищення вироблення ІЕМ-у порівняно з культурами, обробленими ізотипним контролем Р(іа2708. Важливо, що додавання РВІ17311 значно підвищувало вироблення ІРМ-у в сумісних культурах М2/МКПК порівняно з культурами, обробленими ізотипним контролем Раг2708 («""» вказує на Р « 0,01). Результати, отримані з використанням
РВ17309 і РВ17310, є порівнянними з результатами, отриманими з використанням еталонного антитіла до СО 137 20Н4.9 ії з використанням еталонного антитіла до РО-І1 ММ/243.55.570.
Результати, отримані з використанням РВ17309 і РВ17310, також є порівнянними з результатами, отриманими з використанням комбінації обох еталонних антитіл.
Приклад 12
Вплив РВ17311 на примування наївних людських Т-клітин СОВ--
Біспецифічні антитіла до СО137хХРО-1 1 відповідно до цього винаходу індукують активацію Т- клітин шляхом створення містка між СО137 на Т-клітині й РО-Ї1 на антигенпрезентуючих клітинах. Вважається, що це призводить до сигналізації СО 137 і стимулювання антигензалежної активації ТОВ через блокування сигнального шляху РО-1/РО-І1. За присутності пухлин, що експресують РО-11, біспецифічні антитіла до СО1З7ХхРО-11 відповідно до цього винаходу сприяють (повторній) активації антигенспецифічних Т-клітин, як показано в цих прикладах. Це узгоджується з тим відомим фактом, що костимулювання СО137 забезпечує розмноження, вироблення цитокінів і виживання Т-клітин (Вепгат еї аІ 2004). Однак автори цього винаходу також хотіли продемонструвати, що біспецифічні антитіла до СО137хРО-І 1 відповідно до цього винаходу сприяють ефективній відповіді Т-клітин де помо на пухлинні неоантигени. Примування наївних Т-клітин СО8ж- у мишачих моделях інфекції показав, що костимулювання СО 137 сприяє формуванню популяцій центральних Т-клітин пам'яті й ефекторних Т-клітин (7йао еї а! 2012). Отже, автори цього винаходу оцінювали впливи, опосередковані одним із досліджуваних біспецифічних антитіл (РВ17311; 6797 х 7702) на примування наївних людських Т-клітин СОВ в.
Антигенспецифічне примування Т-клітин людини важко оцінювати через низьку кількість клітин-попередників наївних Т-клітин. Однак було виявлено, що антиген, який надмірно
Зо експресується в клітинах меланоми, - пухлиноасоційований антиген мелан-А - особливо підходить для оцінювання відповіді наївних Т-клітин у людських Т-клітинах. Це пояснюється тим, що рівні Т-клітин, специфічних до епітопа пептиду 27-35 цього НІ А-А0201-обмеженого антигена мелан-А, у 10 разів вищі, ніж рівні Т-клітин проти інших власних або пухлиноасоційованих антигенів; цей епітоп розпізнається приблизно 1 з 1000 наївних Т-клітин.
На основі цього епітопа МО ї Стеєпрега (2014) розробили систему примування іп міїго, яка дозволяє достовірно оцінити умови примування для Т-клітин СО8вж. Цей спосіб відомий як антигенспецифічна активація й примування людських Т-клітин СО8, або АБАР-Т8. В аналізі
АБАР-Т8 виділені наївні Т-клітини СО8ж- культивують спільно з аутологічними моноцитарними дендритними клітинами, навантаженими пептидним антигеном, протягом 10 діб, після чого проводили кількісний і якісній аналізи антигенспецифічних Т-клітин.
У цьому прикладі аналіз АБАР-Т8 проводили згідно з методами, докладно описаними у Мб! і Сстеепрегу (2014) із використанням мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК) від двох незалежних донорів (Мо 1064 і 1066). У цьому аналізі досліджували такі антитіла й контролі: антитіло до СО137ХРО-І 1 РВ17311, еталонне антитіло до СО137 20НА4.9, еталонне антитіло до
РО-Ї1 мМу/243.55.570, еквімолярну суміш обох еталонних антитіл і антитіло негативного контролю до НБМУ-й РО2708. Досліджувані антитіла додавали на початку культивування дендритних клітин (ОС) з Т-клітинами й повторно під час першого підживлення.
Отримання зрілих моноцитарних дендритних клітин (тРС)
Зрілі моноцитарні дендритні клітини отримували з використанням протоколу згідно з методами, докладно описаними у УМО ї Стеєпрегу (2014). Для цього за чотири доби до початку аналізу АБАР-Т8 МКПК від донорів НІ А-А2" розморожували, центрифугували за 300 д протягом 5 хв за кімнатної температури й ресуспендували в культуральному середовищі (середовище для дендритних клітин СеїСто (|СеїЇСепіх, кат. Ме 2005) жї- 195 людської сироватки) до концентрації 1 х 10"/мл. Після цього по 2 мл цієї клітинної суспензії додавали в кожну лунку 6- лункового планшета. Після інкубування протягом 2-3 год. за 37"С (для забезпечення прилипання до пластикової поверхні планшета) середовище видаляли й неприлиплі клітини видаляли шляхом промивання за допомогою ФБР. У кожну лунку додавали З мл теплого культурального середовища, збагаченого 10 нг/мл ЇЇ -4 і 1600 МО/мл СМ-С5Е, потім інкубували протягом 2 діб за 37 "С. Після додаткового додавання 1,5 мл свіжого культурального 60 середовища, збагаченого ІІ -4 і 4М-С5Е, клітини інкубували протягом додаткових 24 год.
Після цього збирали незрілі ОС шляхом вилучення З мл надосадової рідини з подальшим енергійним ресуспендуванням клітин у решті середовища й промиванням крижаним ФБР для видалення решти клітин. Клітини об'єднували, підраховували й центрифугували за 300 49 протягом 5 хв за кімнатної температури. Клітинний залишок ресуспендували за концентрації 1 х 106 клітин/мл у попередньо нагрітому культуральному середовищі, збагаченому СМ-С5Е (800
МО/мл), 1І--4 (10 нг/мл), І РБ5 (10 нг/мл) і ІЕМу (100 МО/мл). У лунки нового б-лункового планшета додавали 2 мл клітинної суспензії (2 х 105 клітин). Пептид антигена мелан-А (РТ, кат. Мо 5Р-
МНОІ-0006), розчиненого в ДМСО до концентрації 5 мкг/мкл, додавали до відповідних лунок у концентрації 2,5 мкг/мл і клітини інкубували за 37 "С протягом 16 год. Після перевірки на морфологію ОС клітини тОС збирали шляхом енергійного ресуспендування піпеткою та промивання порожніх лунок крижаним ФБР, щоб забезпечити видалення всіх прилиплих клітин.
Підраховували кількість тОС, у які був уведений пептид, і тих, які не були зібрані окремо, а також живих клітин. Пробірки з тОС увесь час тримали на льоду й опромінювали в дозі 30 Гр (3000 рад) для попередження потенційної проліферації забруднюючих клітин протягом подальшого тривалого сумісного культивування клітин. Після цього клітини центрифугували за
З00 д протягом 5 хв за кімнатної температури, ресуспендували в середовищі для ОС
СеїІСтго--5 95 людської сироватки (ЛС) за концентрації 5 х 105 клітин/мл.
Отримання наївних Т-клітин СОВ
За одну добу до початку аналізу АБАР-Т8 МКПК від тих самих донорів НІ А-А27, що й для отримання торс, розморожували, центрифугували за 300 д протягом 5 хв за кімнатної температури й ресуспендували в холодному буфері ФБР/ЛС/ЕДТК (ФБР, що містить 2 95 ЛС і 1
ММ ЕДТК) за концентрації 5 х 107 клітин/мл. Для виділення наївних Т-клітин СО8 використовували набір для виділення людських наївних Т-клітин СО8-ЕазубЕР (ЗТЕМСЕ, кат. Мо 19258).
На мл зразка клітин додавали 50 мкл розчину для виділення Еазубер, потім змішували й інкубували за кімнатної температури протягом 10 хвилин. Після цього магнітні частинки Еазубер перемішували у вихровий спосіб протягом 30 с і додавали 100 мкл частинок на мл зразка для видалення непотрібних клітин. Після інкубування за кімнатної температури протягом 10 хв загальний об'єм клітинної суспензії доводили до 2,5 мл шляхом додавання буферу Еазузер і
Зо обережно перемішували клітини піпеткою, а потім переносили до пробірки Раісоп на 5 мл.
Кришку знімали й поміщали пробірку в магнітний пристрій Еазузер. Після 5 хвилин перебування за кімнатної температури потрібну фракцію переливали до нової пробірки Раісоп на 5 мл шляхом перевертання магнітного пристрою з пробіркою одним безперервним рухом, залишаючи непотрібні клітини з магнітною міткою всередині первинної пробірки. Магнітний пристрій із пробіркою тримали перевернутими протягом З секунд, перш ніж вернути у вертикальне положення, щоб стекли всі краплі, що звисали з шийки пробірки. Стару пробірку з непотрібними клітинами виймали з магнітного пристрою, натомість поміщали в нього нову пробірку з фракцією, збагаченою клітинами без магнітної мітки, для повторного сортування.
Після 5 хвилин перебування за кімнатної температури потрібну фракцію переливали в той самий спосіб.
Збагачені в результаті негативної селекції клітини підраховували, а потім центрифугували за
З00 9 протягом 5 хв за кімнатної температури й ресуспендували за кінцевої концентрації клітин
З х 105 клітин/мл у культуральному середовищі для ОС СеїЇСто, яке було збагачене 5 95 ЛС і містило 5 нг/мл 1ІІ-7, щоб забезпечити оптимальне примування Т-клітин. Клітини переносили до б-лункових планшетів по 2 мл/лунку й інкубували протягом ночі.
Аналіз АБАР-Т8
Цей аналіз виконували в трьох повторах для кожного донора згідно з методами, докладно описаними у МУбІШ ї Стеепрегу (2014). Т-клітини, попередньо інкубовані з 1І/-7, збирали, об'єднували й підраховували, а потім центрифугували за 300 д протягом 5 хв за кімнатної температури. Клітинний залишок ресуспендували в культуральному середовищі за концентрації 2 х 105 клітин/мл і додавали ІІ -21 за концентрації 60 нг/мл для стимулювання примування Т- клітин СО8". Отримували дві суміші ОС/Т-клітин шляхом змішування тос, у які був уведений пептид, або ЮС без пептиду, з Т-клітинами у співвідношенні 1: 1 об./0б., у результаті чого співвідношення Т-клітини: ОС становило 4: 1, а кінцева концентрація ІЇ-21 становила 30 нг/мл.
Досліджувані антитіла додавали за кінцевої концентрації 10 мкг/мл. Після цього по 500 мкл кожної клітинної суміші переносили до окремих лунок 48-лункових планшетів.
Клітини спільно культивували за 37 "С загалом протягом 10 діб, з урахуванням двох етапів підживлення й перенесення до свіжих планшетів. Перший раз клітини підживлювали через 72 год. додатковими 500 мкл теплого культурального середовища, яке містило 5 95 ЛС, 10 нг/мл ІІ - бо 15 ї 10 нг/мл 1-7 (кінцева концентрація цитокінів становила 5 нг/мл), за присутності або відсутності 20 мкг/мл досліджуваного антитіла (кінцева концентрація ІДС становила 10 мкг/мл), та інкубували протягом 48 год. Щоб забезпечити більше простору для розмноження та зменшити кількість залишкових (прилиплих до пластикової поверхні планшета) мієлоїдних клітин з розчину ОС, клітини й середовище згодом переносили до свіжих лунок 24-лункового планшета, у які попередньо вносили по 1 мл середовища, що містило 5 95 Ле і 10 нг/мл 1І-15 і
І--7. Після додаткового 120-годинного інкубування клітини були готові до аналізу.
На 10-й день спільного культивування клітини з окремих лунок збирали й підраховували, щоб визначити абсолютну кількість клітин на лунку. Після цього Т-клітини обробляли флуоресцентно-міченим мелан-А-специфічним декстрамером (Іттиадех, кат. Ме М/В2162-АРС).
У цьому декстрамері основний ланцюг полімеру декстрану несе » 10 МНС-пептидних комплексів і молекул флуорохрому (алофікоціаніну), що дозволяє виявляти мелан-А-пептид- специфічні Т-клітини СО8: за допомогою аналізу ГАС5. Клітини також обробляли іншими антитілами проти маркерів специфічних субпопуляцій Т-клітин. Для цього клітини, взяті з окремих лунок, переносили до лунок 9б-лункового планшета для РГАС5 у кількості 50 000 клітин/лунку. Клітини центрифугували протягом 5 хв за 300 9, надосадову рідину видаляли, потім додавали 40 мкл декстрамеру (розводили 1: 50 у ФБР -- 5 95 ЕВ5) та інкубували в темному місці протягом 20 хв за кімнатної температури. Після цього до 10 мкл буферу для ЕАС5 додавали додаткові СО8-специфічні антитіла, СО45ВА і ССВ?7 (5-кратно концентровані). Клітині інкубували в темному місці протягом 20 хв за 4 "С, потім двічі промивали буфером для ЕАС5.
Через 10 хв інкубування за 4 "С клітини були готовими для аналізу методом ЕАС5.
Результати
Розмноження Т-клітин
Декстрамер-позитивна популяція представляє антигенспецифічні клітини, які розмножилися після примування й складали 5-24 95 від загальної популяції Т-клітин СО8. На основі відносного розміру декстрамер-позитивної, СОв-позитивної популяції Т-клітин і абсолютних кількостей клітин обчислювали кількість антигенспецифічних Т-клітин СО8-- на лунку, і дані для кожного донора виражали як кількість антигенспецифічних Т-клітин СО8- у культурі порівняно зі зразком, який не містив антитіл (див. Фіг. 34).
Показані дані взяті з експерименту, проведеного в трьох повторах, а смуги похибок
Зо представляють стандартне відхилення.
Ці результати чітко показують, що популяція декстрамер-позитивних антигенспецифічних Т- клітин СО8-- зростала, коли під час примування був присутній пептидний антиген (порівняйте результати за умов "Без пептидного контролю" і "Без антитіл" на Фіг. 34).
Еталонне антитіло до СО137 20Н4.9 стимулювало розмноження антигенспецифічних Т- клітин СОВ8-- порівняно з антитілом негативного контролю, але лише у випадку одного донора (РВМС1064).
Еталонне антитіло до РО-І1 УМ/243.55.570 не впливало на розмноження клітин.
Антитіло до СО137ХхРО-І1 РВ17311 значно стимулювало розмноження антигенспецифічних
Т-клітин СОВ8-- у випадку обох донорів порівняно з антитілом негативного контролю. РВ17311 стимулювало розмноження антигенспецифічних Т-клітин СО8- більшою мірою, ніж еталонне антитіло до СО137 20Н4.9. РВ17311 мало вищу активність щодо розмноження Т-клітин СО8-- порівняно з комбінацією антитіла до РО-Ї1 ММ/243.55.570 і еталонного антитіла до СО 137 20Н4.9. Це означає, що це біспецифічне антитіло до СО137ХРО-І 1 є активнішим у примуванні наївних Т-клітин СОв'ї, ніж СО137-специфічне й РО-ІЇ 1-специфічне еталонні антитіла.
Диференціація Т-клітин
Після антигенспецифічного примування наївні Т-клітини починають диференціюватися. Під час цього процесу диференціації експресія ССВ7 і СО45ВА на поверхні клітин пригнічується, при цьому експресія СО45ВА відновлюється на остаточно диференційованих ефекторних Т- клітинах. Таким чином, пригнічення експресії СОВА і СО45ВА є ознакою диференціації.
Експресію маркерів диференціації ССВ7 ії СО45ВА аналізували шляхом виділення клітин
СОвждекстрамер- методом гейтингу й подальшого визначення відносної кількості клітин у різних субпопуляціях Т-клітин. Субпопуляції визначали таким чином: наївні Т-клітини / стовбурові клітини пам'яті (Т/Гесм) - С0О45ВА-ССВА7ж; центральні Т-клітини пам'яті (Тем)-
СО45АА-ССА7; ефекторні Т-клітини пам'яті (Тем). С0О45ВА-ССМВ7-; та остаточно диференційовані ефекторні Т-клітини (Тт) - СО45АА-ССВ7-. Дані для кожного донора виражали як відсоток кожної субпопуляції Т-клітин у популяції Т-клітин СОв-декстрамер-я- (див.
Фіг. 35).
Антитіло до СО137ХхРО-Ї1 РВ17311 стимулювало диференціацію антигенспецифічних Т- клітин СО8-- у випадку обох донорів порівняно з антитілом негативного контролю. Коли автори бо цього винаходу порівнювали Т-клітини, примовані за присутності антитіла негативного контролю, і Т-клітини, примовані за присутності досліджуваного антитіла, вони виявили, що
РВ17311 зменшувало відносні кількості антигенспецифічних Т-клітин СОвж із наївним фенотипом клітин (Тм/Теєсм) і збільшувало відносні кількості популяцій ефекторних Т-клітин пам'яті й остаточно диференційованих ефекторних Т-клітин (Тем і Ттє на Фіг. 35). РВ17311 стимулювало диференціацію антигенспецифічних Т-клітин СОвж більшою мірою, ніж еталонне антитіло 20НА4.9, як це видно зі збільшення відносних кількостей популяцій ефекторних Т-клітин пам'яті й остаточно диференційованих ефекторних Т-клітин у межах популяції Т-клітин СОв-, інкубованої з РВ17311, порівняно з популяцією Т-клітин СОв8», інкубованою з 20Н4.9. РВ17311 навіть стимулювало диференціацію антигенспецифічних Т-клітин СОдж більшою мірою, ніж комбінація антитіла до РО-Ї1 ММ/243.55.570 і еталонного антитіла до СО137 20Н4.9. Це означає, що це біспецифічне антитіло до СО137хХРО-І1 є активнішим у стимулюванні диференціації наївних Т-клітин після примування, ніж СО137-специфічне й РО-І 1 - специфічне еталонні антитіла.
Без обмеження будь-якою теорією вважається, що сильний вплив антитіла до СО137хРО-Ї 1
РВ17311 на примування Т-клітин СОвж напряму залежить від індукування сигналізації СО 137 у
Т-клітинах. Шляхом зв'язування СО 137, експресованого на поверхні Т-клітин після розпізнавання антигена, і РО-Ї1 на зрілих клітинах ОС РВ17311 забезпечує кластеризацию рецептора СО137, яка необхідна для сигналізації СО 137.
Висновок: ці результати демонструють, що біспецифічне антитіло до СО137хХРО-І 1 РВ17311 стимулює як розмноження, так і диференціацію наївних Т-клітин СОбв-іп міт. РВ17311 підвищувало потенціал розмноження й диференціації порівняно з еталонним антитілом до РО-
ІТ ммМу243.55.570 і еталонним антитілом до СО137 20Н4.9 (у комбінації). Це демонструє, що
РВІ17311 є ефективнішим у індукуванні або підсиленні відповідей нових Т-клітин на наявні пухлини.
Приклад 13
Вплив РВ17311 на експресію СО 107а і цитокінів у Т-клітинах
Як продемонстровано в прикладі 10, біспецифічні антитіла до СО137хРО-І1 можуть підсилювати вироблення І/-2, ФНПа і ІЕМу в надосадових рідинах 5ЕВ-активованих МКПК.
Автори цього винаходу використовували внутрішньоклітинне забарвлення цитокінів і аналіз
Зо ЕАС5, щоб ідентифікувати субпопуляції Т-клітин, які відповідають за підсилене вироблення цитокінів після обробки біспецифічним антитілом до СО137ХхРО-І1 РВІ17311. Автори цього винаходу також оцінювали експресію СО107а як маркер цитотоксичності Т-клітин СО8-к. Автори цього винаходу порівнювали вплив РВ17311 із впливом еталонного антитіла до СО137 20Н4.9, еталонного антитіла до РО-Ї1 УМ/243.55.570, еквімолярної суміші обох еталонних антитіл і антитіла негативного контролю до НОМ-с РО2708.
Для цього МКПК стимулювали за допомогою 5ЕВ (320 нг/мл) за присутності або відсутності антитіл протягом 24 год., обробляли барвником для маркерів СОЗ, СО4, СО8, ССВ7, САБО їі
СОр107а, для цитокінів ІІ -2, ІРМу і ФНПа, а також барвником для оцінки життєздатності. МКПК, культивовані за відсутності ЕВ і антитіл, були включені як контроль для стимулювання 5ЕВ ("не стимульовані"). Експресію СО107а та цитокінів визначали в загальній популяції Т-клітин (клітини СОЮЗ) і в таких субпопуляціях Т-клітин СО4 і СО8: наївні Т-клітини (С04580-ССН7 в), центральні Т-клітини пам'яті (Ф04580-СС87 5), ефекторні Т-клітини пам'яті (С04580-ССН87-) і остаточно диференційовані ефекторні Т-клітини (С04580-ССВ7-). Показані лише результати субпопуляцій, для яких спостерігали найбільш виражені зміни: ефекторні Т-клітини пам'яті (ЕМ)
С04, клітини ЕМ СО8 і остаточно диференційовані ефекторні Т-клітини (ТЕ) СОВ8.
Способи
Нижче наведено перелік антитіл, використовуваних для виявлення внутрішньоклітинних і позаклітинних мішеней у аналізі ЕАС5.
со3 77777771 ФАРСНУ 7 ІВ | 560176.ЙШЧ: ср4 7 |РеєР/Сув5 ІВ 77777777 | 5606501 со8 77777777 ф6тЄ 77777777 Іво |111115556340ШГ
Ему 77777771 |вМа2!7777777777777 ВО 171111 562988..ШЧ » додавали до клітин під час стимулювання 5ЕВ
МКІК від одного здорового донора, які зберігали методом кріоконсервування, розморожували й залишали на ніч. Після цього клітини підраховували, центрифугували за 200 а протягом 12 хв, а клітинний залишок ресуспендували до концентрації 2 х 105 клітин/мл у середовищі для МКПК (АРМІТ640, 1095 термічно інактивованої ЕВ5 і 1 пеніциліну- стрептоміцину). 100 мкл клітинної суспензії додавали в лунки 96-лункових планшетів із круглим дном, у які попередньо було внесено 100 мкл середовища для МКПК, що містило 5ЕВ і досліджуване антитіло. Кінцева концентрація 5ЕВ становила 320 нг/мл. Кожне антитіло досліджували в трьох повторах за єдиної концентрації 1 мкг/мл (за винятком комбінації
УМ243.55.570 і 20Н4.9, яку досліджували за концентрації 0,5--0,5 мкг/мл). Також були включені контрольні лунки, які не містили ані ФЕВ, ані антитіла. Стимулювання здійснювали протягом 24 годин за температури 37 "С у атмосфері з 5 956 СО» і вологістю 95 95. Під час останніх 12 годин інкубування до кожної лунки додавали антитіло до СО 107а, а також суміш Вгеїейадіп А (СоіІдіріна,
ВО) і Мопепзіп (Со/ідівіор, ВО).
Після цього дубльовані планшети об'єднували й МКПК обробляли антитілами, специфічними до відповідних маркерів і цитокінів (інформація про них наведена вище у переліку антитіл). Оскільки фіксація не впливає на результати виявлення СОЗ, С04 і СОВ8, антитіла проти цих мішеней додавали на стадії внутрішньоклітинного забарвлення разом із антитілами проти внутрішньоклітинних цитокінів. Позаклітинні мішені СОВА і СО458О забарвлювали до стадії фіксації з огляду на відому їхню чутливість до фіксації. Для цього планшети центрифугували за 350 9 протягом З хвилин, клітини ресуспендували в 100 мкл ФБР на лунку й об'єднували клітини з продубльованих планшетів. Планшети центрифугували у той самий спосіб, що й перед цим, клітини ресуспендували і 100 мкл на лунку розведеного у співвідношенні 1: 1000 барвника для оцінки життєздатності Ріхабіє Міарішу Оуе (еВіозсієпсе, кат. Мо 65-0866). Після 10-хвилинного інкубування за кімнатної температури в темному місці до кожної лунки додавали 150 мкл буферу для ЕАС5 (ФБР за рн 7,4, 0,5 95 В5А, 0,5 мМ ЕДТК). Планшети центрифугували, клітини ресуспендували в 25 мкл антитіла до ССВ7, розведеного в буфері для БАС. Після 15- хвилинного інкубування за температури 37 "С в атмосфері з 5 95 СО» і вологістю 95 95 додавали
Зо 25 мкл антитіла до СО45ВО, розведеного в буфері для ЕАС5. Після 30-хвилинного інкубування за кімнатної температури в темному місці до кожної лунки додавали 150 мкл буферу для ЕАС5.
Планшети центрифугували в той самий спосіб, що й перед цим, а клітини ресуспендували в 200 мкл буферу для ЕАС5. Планшети центрифугували й клітини ресуспендували в 100 мкл розчину для фіксації/пермеабілізації ВО Ріхайоп/Рептвєабрбіїїгайоп (ВО Віозсіепсев, кат. Мо 554714). Після 10-хвилинного інкубування за кімнатної температури в темному місці додавали 100 мкл буферу для пермеабілізації/промивання ВО Репт//Мази (ВО Віозсієпсе5, кат. Мо 554714). Після цього планшети центрифугували за 350 4 протягом З хв і клітини ресуспендували в 200 мкл буферу
ВО Репгт/Мави.
Після цієї стадії фіксації й пермеабілізації планшети центрифугували за 500 у протягом З хв, клітини ресуспендували в 50 мкл буферного розчину ВО Репт///авзи, що містив антитіла, специфічні до внутрішньоклітинних мішеней. Цей розчин містив антитіла проти внутрішньоклітинних мішеней ІЄМу, І/-2 і ФНПа, а також проти СОЗ3, 204 і СО08. Планшети інкубували протягом 1 години за кімнатної температури в темному місці й після цього до кожної лунки додавали 150 мкл буферу ВО Репт//Мавп. Після цього планшети центрифугували за 350 9 протягом З хв і клітини ресуспендували в 200 мкл буферу ВО Репт///ази. Планшети знову центрифугували за 350 д протягом З хв, клітини ресуспендували в 100 мкл розчину для фіксації
(ФБР за рН 7,4, 0,5 95 В5А, 0,5 мМ ЕДТК, 1 95 формальдегіду) і зберігали за 4 "С до збирання даних наступного дня.
Вимірювання зразків здійснювали з використанням проточного цитометра ВО Ропевзза Пому, аналіз даних здійснювали з використанням програмного забезпечення Ріомо версії 10.
Популяції клітин аналізували таким чином: синглети відрізняли від дублетів шляхом побудови графіку залежності площі прямого розсіювання (Е5С-А) від висоти прямого розсіювання (Е50-
Н). Мертві клітини виключали шляхом гейтингу популяції з негативним результатом забарвлення для оцінки життєздатності. Т-клітини ідентифікували як СОЗ- і ділили на субпопуляції СО4- і СО8--. Субпопуляції Т-клітин додатково ділили на наївні, центральні Т- клітини пам'яті, ефекторні Т-клітини пам'яті й остаточно диференційовані ефекторні Т-клітини на основі експресії СОВА? і 204580. Експресію цитокінів ії СО 107а оцінювали в межах загальної популяції Т-клітин і в межах субпопуляцій і виражали як відсоток від загальної популяції Т- клітин.
Результати
Внутрішньоклітинні рівні СО 107а, ІЄМУ, ІІ -2 ії ФНПа в загальній популяції Т-клітин показані на Фіг. 36, а рівні експресії в трьох окремих субпопуляціях Т-клітин (С04 Тєм, СО8 Тем і СОВ8 Ттє) показані на Фіг. 37. На цих фігурах пунктирними лініями представлений середній відсоток клітин, які показали позитивний результат на вказаний маркер у випадку стимулювання 5ЕВ і антитілом негативного контролю РІ2708. Смуги представляють середні значення х стандартне відхилення (СВ) для експерименту, виконаного в трьох повторах з використанням клітин, отриманих від одного донора. Для дослідження значущих відмінностей результати кожних умов порівнювали з антитілом негативного контролю Р(із2708 (ант. нег. контр.») за допомогою однофакторного АМОМА з подальшим використанням критерію Даннета для множинних порівнянь. Р-значення відповідним чином позначені зірочками: "Р-0,05; Р «0,01; и7Р-0,001.
Порівняно з антитілом негативного контролю РВ17311 підсилювало вироблення СО 107а, ІІ -2 і
ІЕРМу у загальній популяції Т-клітин (Фіг. 36). Слід відзначити, що РВ17311 більшою мірою підсилювало вироблення СО107а, ніж еталонне антитіло до СО137 20Н4.9, еталонне антитіло до РО-Ї1 ММ/243.55.570, а також ніж еквімолярна суміш обох еталонних антитіл. Із цього було зроблено висновок, що цитотоксичність Т-клітин СОвж більшою мірою підсилюється після
Зо інкубування з РВ17311, ніж із 20Н4.9, ММуУ243.55.570 або їхньою сумішшю. Рівень вироблення ЇЇ - 2 і Ему очевидно також вищий після інкубування з РВ 17311, ніж із 20Н4.9 ії УМу243.55.570.
При більш детальному розгляді окремих субпопуляцій Т-клітин автори цього винаходу виявили, що РВ17311 підсилювало експресію всіх трьох цитокінів у клітинах Тем С04. РВ17311 також підвищувало експресію СО 107а у популяціях клітин Тем ії Ттє СО8 більшою мірою, ніж еталонні антитіла 20Н4.9, УМуУ243.55.570 і їхня суміш; це вказує на те, що воно підвищує цитотоксичність Т-клітин СО8 краще, ніж суміш цих еталонних антитіл.
Висновки
Ці результати узгоджуються з попередніми спостереженнями стосовно того, що біспецифічні антитіла до СО137хХРО-11 підсилюють вироблення І/-2, ФНПа та ІРМу в МКПК після стимулювання 5ЕВ. Вони демонструють, що РВ17311 викликає значне зростання кількості Т- клітин, що експресують цитокіни, і що РВ17311 індукує експресію маркера цитотоксичності
СОр107а в субпопуляціях Тем і Ттє СО8 активніше, ніж еталонні антитіла 20Н4.9 і Му/243.55.570.
Слід відзначити, що рівень вироблення ІЄМу і ФНПа популяціями Тем і Тт СО8 був також вищим після інкубування з РВ17311 порівняно з рівнем вироблення ІЄМу і ФНПа після інкубування з 20Нн4.9, ММу243.55.570 або їхньою сумішшю; це вказує на те, що РВ17311 має вищий потенціал активації Т-клітин СО8вж. Рівень вироблення ІЇ-2 популяцією Тем СО4 очевидно також був вищим після інкубування з РВ17311 порівняно з інкубуванням з 20Н4.9 і меншою мірою - з
УМ243.55.570.
Приклад 14
Вплив РВ17311 на проліферацію пухлино-інфільтруючих Т-клітин
У початковому скринінгу біспецифічних антитіл до СО137ХРО-11 використовували аналізи, які базуються на первинних Т-клітинах. Проте такі аналізи не охоплюють складні клітинні взаємодії, які стимулюють спільний розвиток пухлини та її мікросередовища. Для дослідження біспецифічних антитіл в умовах, наближених до пухлини, автори цього винаходу використовували нещодавно розроблені аналізи на основі Т-клітин, виділених із пухлинного матеріалу пацієнта. 7пои єї а). розробили спосіб отримання свіжого пухлинного матеріалу від пацієнтів із гепатоцелюлярною карциномою (ГЦК) або колоректальним раком (КРР) і виділення пухлино-інфільтруючих клітин (мієлоїдних і лімфоцитарних клітин) для дослідження впливу антитіл, мішенню яких є інгібітори імунної контрольної точки, на функції пухлино-інфільтруючих бо Т-клітин (2пои еї аї., 2017). У цьому дослідженні автори цього винаходу отримали матеріал від пацієнтів із ГЦК або метастазом у печінці при КРР (МП-КРР), щоб визначити, чи може біспецифічне антитіло до СО137ХхРО-І1 РВ17311 реактивувати пухлино-інфільтруючі Т-клітини
Сбр4 і СО8, отримані від цих пацієнтів.
ІСпособи
Для цього отримували свіжий пухлинний матеріал від чотирьох пацієнтів із МП-КРР і від трьох пацієнтів із ГЦК, яким показана хірургічна резекція пухлини. Жоден із цих пацієнтів не отримував хіміотерапії або імуносупресивної терапії протягом принаймні трьох місяців до операції. Спосіб, описаний у 7пои еї аї. (2017), був таким: зі свіжої тканини виділяли пухлино- інфільтруючі мієлоїдні та лімфоцитарні клітини шляхом нарізання на маленькі шматочки й подальшого розщеплення протягом 20-30 хвилин за 37 "С у 0,5 мг/мл колагенази ІМ (Зідта-
Аагісн, м. Сент-Луїс, штат Міссурі, США) і 0,2 мг/мл ДНКази І (Росте, м. Індіанаполіс, штат
Індіана, США). Отриману клітинну суспензію фільтрували через клітинні фільтри з розміром пор 100 мкм (ВО Віозсієпсе5, Ерембодегем, Бельгія), а мононуклеарні лейкоцити отримували за допомогою центрифугування з градієнтом щільності фіколу. Життєздатність клітин визначали методом виключення трипанового синього. Після цього клітини мітили 0,1 мкм флуоресцентного барвника складного сукцинімідилового ефіру діацетату карбоксифлуоресцеїну (СЕБЕ, Іпуиітодеп) і суспендували в середовищі АРМІ, збагаченому 10 95 людської сироватки АВ, 2 мМ І -глутаміну, 50 мМ буферу НЕРЕЗ, 1 95 пеніциліну-стрептоміцину, 5 ММ пірувату натрію й 1 95 замінних амінокислот для мінімально поживного середовища. Потім до кожної лунки 96-лункових планшетів із круглим дном переносили 1 х 105 клітин (для ГЦК) і 1- 2 х 105 клітин (для МП-КРР) у 100 мкл. Після цього здійснювали стимулювання пухлино- інфільтруючих лімфоцитів (ПІЛ)У для індукування активації за відсутності або присутності досліджуваного антитіла в такий спосіб: до лунок, що містили ПІЛ, отримані від пацієнтів із ГЦК, додавали 100 мкл того самого середовища, що містило досліджувані антитіла, і 1 х 105 аутологічних СО40-активованих В-клітинних бластів, попередньо вирощених і потім трансфікованих мРНК, що кодує повнорозмірні пухлинні антигени діурісап-3 (40РСЗ) або асоційований із меланомою антиген С2 (МАСЕС2). Ці клітини сумісно інкубували протягом шести діб. До лунок, що містили ПІЛ, отримані від пацієнтів із МП-КРР, додавали 100 мкл того самого середовища, що містило досліджувані антитіла, і магнітні мікрочастинки Юупареадв,
Зо вкриті антитілом до СОЗ/С028 людини (сіірсо-Ї їе Тесппоіодієз А5, Норвегія), на чотири доби.
Після інкубування СЕ5Е-забарвлені клітини збирали та обробляли антитілами до СО8, 204,
СО3. Мертві клітини виключали з використанням 7-аміноактиноміцину О (7ААО; Іпмйгодеп, м.
Пейслі, Великобританія), а проліферацію Т-клітин визначали з урахуванням розведення СЕБЕ за допомогою проточної цитометрії. Клітини вимірювали за допомогою проточного цитометра
ЕАСбСапіо І (ВО Віозсіепсе5, м. Сан-Дієго, штат Каліфорнія, США) і аналізували з використанням програмного забезпечення БРіом/уо.
Біспецифічне антитіло до СО137ХРО-І1 РВ17311 порівнювали з його моноспецифічними бівалентними батьківськими антитілами РЕб6797 і РЕ7702, а також з еталонним антитілом до
Ср137 20Н4.9, еталонним антитілом до РО-І 1 МУу243.55.570 і антитілом негативного контролю
Раг708 проти нерелевантного антигена НБУ-а. Зразки без антитіла були включені як контролі, і всі умови досліджували у двох повторах за концентрації Ідс 10 мкг/мл. Для зразків, отриманих із МП-КРР, визначення проліферації Т-клітин СО4 за присутності антитіл було можливим лише для трьох із чотирьох донорів, оскільки в четвертого донора вихідний рівень проліферації Т- клітин СО4 вже був надзвичайно високим (» 6095 проліферуючих клітин). Визначення проліферації Т-клітин СО8 було можливим для зразків від усіх чотирьох донорів із МП-КРР. Що стосується зразків, отриманих від донорів із ГЦК, аутологічні В-клітини, що експресують СРСЗ, були отримані для всіх трьох донорів, але експресія МАСЕС2 була можлива лише у випадку двох донорів із трьох. Тому було проведено загалом 5 експериментів із дослідження проліферації з використанням клітин від цих трьох донорів із ГЦК. Результати представлені як середні значення х стандартна похибка середнього.
Результати
Результати показано на Фіг. 38. Вихідний рівень проліферації ПІЛ СО4 (верхня права панель) і ПІЛ СО8 (нижня права панель) визначали шляхом визначення відсотка проліферуючих
Т-клітин (низькі рівні СЕБЕ) за присутності антитіла негативного контролю. Проліферацію СО4 (зверху зліва) і СО8 (знизу зліва) у зразках обчислювали як відсоткове збільшення рівня проліферації відносно вихідного рівня. Значення представлені як середнє х стандартна похибка середнього (МП-КРР: С04 п-3, СО8 п-4; ГЦК: 004 і 208 п-5).
Біспецифічне антитіло до СО 137хРО-Ї1 РВ17311 очевидно підсилювало проліферацію як
ПІЛ СО4, так і ПІЛ СО8 у обох типах пухлин; і результати вказують на те, що воно перевершило 60 свої батьківські антитіла РЕ6797 і РЕ7702. Результати також свідчать про те, що УМуУ243.55.570 стимулювало проліферацію Т-клітин СО4 ії СО8 такою самою мірою. РВ17311 їі 20Н4.9 також підсилювали проліферацію Т-клітин СО4, але сильніше підсилювали проліферацію Т-клітин сов.
Ці експерименти демонструють додаткові переваги використання біспецифічного антитіла до СО137ХРО-І1 і свідчать про те, що РВ17311 підсилює проліферацію ПІЛ С0О4 і СОВ8, отриманих від пацієнтів із ГЦК ї МП-КРР. Важливо, що це означає, що біспецифічне антитіло відповідно до цього винаходу може повторно стимулювати як антиген-специфічні Т-клітини бра, так і антиген-специфічні Т-клітини СО8-- у пацієнта зі злоякісним новоутворенням, і що воно може стимулювати проліферацію ПІЛ СО8вж- сильніше, ніж еталонне антитіло мМ/243.55.570.
Приклад 15
Аналіз епітопів для РВ17311 методом аланінового сканування
Проводили аналіз епітопів для виявлення набору залишків, які утворюють або являють собою частину епітопів, які розпізнаються СО137-специфічним Рарб-фрагментом (МЕб6797), наявним у РВ17311.
Аналіз потенційно нелінійного епітопа антигена СО 137, із яким зв'язується РВ17311, вимагає знання тримірної структури білка СО137. СО0О137 являє собою відносно малий білок із масою 25,4 кДа (маса позаклітинної частини 17,3 кДа) без чітко виражених доменів. Однак для
СО137 були визначені "повторювані області" та багаті цистеїном домени (СВО). У науковій літературі відомості щодо білкової структури СО137 обмежені. У У єї а). (2014) описано сайт зв'язування ліганду в СО137, розташований у області З СО137, визначений у дослідженнях зв'язування з використанням усічених експресійних конструкцій. Хоча жодних даних щодо кристалічної структури СО 137 немає, була опублікована гомологічна модель на основі ТМЕВ1 (Ууоп єї аї., 2010). ТМЕВІ - це зв'язаний із мембраною білок із надродини рецепторів фактора некрозу пухлини, до якого також належить СО 137. Результати експериментів із обміну доменами з використанням химерних конструкцій людського/у мишачого СО 137 свідчать про те, що СО 137-специфічний ЕРаб-фрагмент (МЕб6797) зв'язується з СВО 1 і/або 2. Дані по блокуванню СО137Ї також свідчать про те, що епітоп МЕ6797 знаходиться поблизу сайту зв'язування ліганду в СО137 або перекривається з ним.
РО-І1 також являє собою відносно малий білок із масою 31,1 кДа (маса позаклітинної частини 25,2 кДа), у якого також не виявлено чітко виражених областей або доменів. Проте кристалічна структура РО-І 1 відома, як і структура комплексу з РО-ІЇ 1.
У цих експериментах використовували мутагенез "методом дробовика" для створення серії мутантних білків, у яких один залишок мутований шляхом його заміщення на аланіновий залишок. Після цього здійснювали експресію цих мутантних білків 60137 у клітинах людини, що дозволяло проводити аналіз складних білків або білків, які можуть експресуватися й належним чином згортатися лише в клітинах людини. Функціональне зв'язування з антитілом визначали за допомогою флуоресцентного забарвлення, у результаті чого отримували карти зв'язування й ідентифікували залишки, критичні для зв'язування з антитілом. Експерименти з мутагенезу "методом дробовика" проводила компанія Іпієднка! Моїесціаг із використанням способів, описаних у ЮОамідзоп апа Рогапг (2014).
Спочатку на основі плазміди з КДНК СО137 дикого типу створювали бібліотеки мутацій (від
Ххх до Аа, від Аа до 56єї) для білків-мішеней. Результатом цього стали 163 мутантні клони
КДНК для СО 137, усі вони були секвеновані для підтвердження мутації. Після цього ці мутантні клони КДНК трансфікували в клітини НЕК-293Т разом із конструкціями дикого типу (М/Т) для порівняння. Потім клітини НЕК-293Т, що експресують кожен із мутантних клонів, аналізували методом проточної цитометрії, причому зв'язування кожного мутантного білка з РВІ17311 порівнювали зі зв'язуванням із контрольним антитілом, специфічним до СО137 (мишаче ІДС,
ВО Віозсіепсев, кат. Мо 555955). Це контрольне антитіло не конкурує з РВ17311 за зв'язування.
Для виявлення зв'язування РВІ17311 або контрольного антитіла використовували флуоресцентно-мічені вторинні антитіла проти людського або мишачого Іда.
Для визначення клонів, які мали високий рівень експресії СО137, але низький рівень зв'язування з РВІ17311, автори цього винаходу порівнювали зв'язування РВІ17311 зі зв'язуванням із відповідним контрольним антитілом (див. Фіг. З9А). Для кожного клону будували графік залежності середнього значення зв'язування від середнього значення експресії клону за результатами вимірювань зв'язування контрольного антитіла. Щоб попередньо ідентифікувати критично важливі клони, автори цього винаходу застосовували порогові значення: »70 95 від величини зв'язування М/Т з контрольним антитілом і «20 956 від величини реактивності МТ до антитіла РВ17311. Критично важливі клони, попередньо ідентифіковані з використанням цих бо порогових значень, показані на Фіг. З9А чорними колами.
Результати вказують на те, що залишками в СО137, важливими для зв'язування РВ17311, є
Агабб, СПу70 і Рне72. МаІ/71 очевидно також задіяний у зв'язуванні РВ17311 (див. Фіг. 398). Хоча
Субз133 початково був ідентифікований як критично важливий залишок на основі порогових значень зв'язування, він відносно віддалений від інших критичних залишків, і мутації цистеїну мають тенденцію спричиняти незначні зміни в конформації білка через руйнування дисульфідних зв'язків. Отже, Суб133 не вважався частиною епітопа РВ17311. Низькі рівні реактивності до РВ17З3И у білків із мутаціями в Аг96б, СІу70 ії Рнпе72 вказують на те, що ці залишки роблять найбільший енергетичний внесок у зв'язування з РВ17311, а Ма/71 вносить менший внесок.
Приклад 16
Протипухлинна ефективність біспецифічного антитіла до СО1З37ХхРО-І1 у мишачій моделі ксенотрансплантату
Для дослідження протипухлинної ефективності одного прикладу клонів, біспецифічного антитіла до СО137ХхРО-І1 РВІ17311, в експериментальних тварин і порівняння його з еталонними антитілами антитіло РВ17311 вводили мишам із ксенотрансплантатами пухлин.
Була вибрана мишача модель, у якій мишей з імунною недостатністю гуманізують шляхом щеплення мононуклеарними клітинами периферичної крові (МКПК) людини, а потім роблять ін'єкцію лінії ракових клітин людини. Після цього оцінюють зростання підшкірної солідної пухлини протягом З тижнів.
СО137-специфічні й РО-Ї1-специфічні Раб-фрагменти біспецифічного антитіла до
СО137ХхРО-І1 перехресно реагують із ортологами людини та яванського макака, але не з мишачими білками. Описана вище модель була вибрана через те, що вона дозволяє досліджувати активність антитіла іп мімо в гуманізованих системах, де протипухлинна відповідь антитіла опосередковується людськими Т-клітинами, а не мишачими Т-клітинами. Цей тип моделі успішно використовували для оцінювання різноманітних методів імуномодулюючої прицільної терапії включаючи декілька моноклональних антитіл до СО137. Наприклад, ефективність 20Н4.9 оцінювали в гуманізованих МКПК мишей Надг-/-ІЇ 2Напиї, які є носіями клітин НТ29 (Заптатеай єї а! 2015), ефективність утомілумабу оцінювали в мишей 5СІЮ із вродженою відсутністю клітин-кілерів, яким було ксенотрансплантовано суміш МКПК і людських пухлинних клітин РСЗ, ГоМо або М/М-266 (РізНег єї аї!., 2012). В обох моделях моноклональні антитіла до СО137 показали значну протипухлинну активність, опосередковану Т-клітинами, порівняно з тваринами, лікованими контрольними Їда.
У мишачій моделі ксенотрансплантату, використовуваній у цьому дослідженні, раковими клітинами, які вводили гуманізованим МКПК мишам, були клітини АКО - добре вивчена клітинна лінія карциноми товстої кишки людини, яка експресує високі рівні РО-І1, але не СО 137. Той факт, що МКПК, уведені мишам з імунною недостатністю, почали експресувати СО137 усього через 5 днів після імплантації й продовжували принаймні до дня 22 (Заптатеєа еї а! 2015), вказує на те, що гуманізовані МКПК миші, які є носіями клітин АКО, являють собою ідеальну модель для експресії мішеней біспецифічного антитіла до СО137ХхРО-І1 у транс-конфігурації (РО-Ї1 на клітинах АКО і СО137 на Т-клітинах). На додаток, донор МКПК не викликає захворювання "трансплантат проти хазяїна" протягом принаймні 40 днів після щеплення. Отже, ця модель є надійною для оцінювання ефективності імуномодулюючих агентів.
Способи
Дев'ятимісячним самицям мишей МОЮ 5СІО гамма (М5С) прищеплювали З х 107 МКПК людини шляхом ін'єкції у хвостову вену. Через 7 днів кожна досліджувана миша отримувала підшкірну ін'єкцію 5 х 106 пухлинних клітин ВКО в 0,1 мл 50 95 суміші Маїгіде! у правий бік. Ріст пухлини відстежували за допомогою штангенциркуля, коли середній об'єм пухлини наближався до цільового діапазону 50-80 мм. Через чотири дні після імплантації пухлинних клітин, позначеної як день 1 дослідження, тварин з окремими об'ємами пухлин 40-63 мм3 розподіляли в чотири групи по вісім тварин. Тварини-носії пухлин у кожній групі отримували шість внутрішньоочеревинних ін'єкцій антитіла в дозі 100 мкг у 100 мкл ФБР у дні 1, 4, 8, 11, 151 18.
Чотири різні групи отримували антитіло негативного контролю (ІДС) або еталонне антитіло 20нН4.9 (до СО137) або мММуУ243.55.570 (до РО-І1), або РВ17311 (до СО137хРО-І1). За допомогою штангенциркуля вимірювали об'єми пухлин тричі на тиждень аж до кінця дослідження в день 19, коли оцінювали інгібування росту пухлини.
Інгібування росту пухлини (ІРП) визначали як різницю у відсотках між медіанами об'ємів пухлин (МОП) станом на день 19 у лікованих і контрольних мишей, причому відмінності між групами вважалися статистично значущими за Р х 0,05 для значень, обчислених із використанням критерію Манна - Уїтні. Переносимість лікування оцінювали за вимірюваннями маси тіла й частими спостереженнями на наявність клінічних ознак небажаних явищ, пов'язаних із лікуванням.
На фіг. 40 показана діаграма розмаху для розподілу об'ємів пухлин по групах. Станом на день 19 медіана об'ємів пухлин (МОП) у мишей, які отримували контрольний Ідсї, становила 517 мм, а окремі об'єми пухлин варіювалися в діапазоні 429-807 мм3. Серед трьох груп лікування
РВІ17311 було настільки ж ефективним (МОП 264 мм3, ІРП 49 95), наскільки УМ/243.55.570 (МОП 283 мм, ІРП 45 95) і 204.9 (МОП 339 мм3, ІРП 34 95). У всіх групах лікування МОП були значно нижчі, ніж у контрольній групі (Р « 0,05 для 20Н4.9; Р « 0,001 для РВ17311 і ММу/243.55.570).
Одна тварина, яка отримувала 20Н4.9, померла в день 8; розтин показав рожеві легені та печінку з плямистими ураженнями. У тварин цієї групи також спостерігалося найбільше середнє зниження маси тіла (-8,0 956 у найнижчій точці в день 15). В іншому лікування переносилося добре.
Висновок: біспецифічне антитіло до СО137ХхРО-І1 РВ17311 забезпечувало статистично значущу перевагу стосовно виживаності, коли використовувалося для лікування карциноми товстої кишки людини АКО у мишей М5а із прищепленими МКПК людини. Результати лікування за допомогою РВ17311 були кращими й супроводжувалися меншими побічними ефектами порівняно з 20НА4.9.
Приклад 17
Перешкоджання 520137 агоністичній активності антитіл, мішенню яких є СО137
Розчинний СО137 менше перешкоджає агоністичній активності біспецифічного антитіла до (1)137 х 14)1,1, ніж агоністичній активності бівалентного антитіла до СО137
Експресія СО137 регулюється відокремленням антигена від клітинної поверхні.
Відокремлений антиген (520137) зустрічається в крові, а також у позаклітинному просторі й, таким чином, може діяти як конкуруючий поглинач для кліренсу антитіл, мішенню яких еСО137.
Дослідження показали, що 520137 відокремлюється від імунних клітин, які експресують високі рівні СО137, таких як регуляторні Т-клітини (Відауау єї аї., 2014), і що в пацієнтів із колоректальним раком пухлинні клітини виробляють як 5200137, так і 5001371 (Оітьего еї аї., 2006). На додаток, піддавання пухлинних клітинних ліній впливу гіпоксичних умов стимулює експресію СО 137, при цьому домінантною формою є розчинний різновид (І аріапо еї аї, 2016). У
Зо здорових донорів середні рівні 5250137 у сироватці крові перебувають у діапазоні 0,02-0,2 нг/мл, тоді як відомо, що за різних станів захворювання рівні є вищими й перебувають у діапазоні 0,2- 3,6 нг/мл (Міснеї єї аїЇ, 1998; 5пао єї аї, 2012). Імовірно, 500137 регулює активовані Т-клітини: після відокремлення в мікросередовище пухлини він пригнічує активність імунної системи, таким чином опосередковуючи оминання імунної відповіді. Вважається, що 520137 конкурує зі зв'язаним із мембраною СО137 за зв'язування з СО137Ї, таким чином блокуючи сигналізацію через СО137, експресований на Т-клітинах. Беручи до уваги описані вище механізми, визначали, чи впливатиме 520137 на здатність біспецифічного антитіла до СО137хРО-Ї 1
РВ17311 і еталонних антитіл активувати первинні Т-клітини людини іп міо. Таку активацію вимірювали в аналізі трансактивації з використанням клітин із репортерним геном дигкаї і клітин
СНО-РБ-11 за відсутності або присутності надлишкових кількостей 500137. У цьому аналізі лінія Т-клітин із репортерним геном дЩигКаї експресує СО 137, і репортерний ген активується антитілами, специфічними до СО137. Т-клітини культивують спільно з клітинами СНО з надмірною експресією РО-І 1, які імітують пухлинні клітини, що експресують РО-1 1, і потрібні для активації Т-клітин біспецифічним антитілом до СО137хРО-1 1.
Для цього на 96-лункові планшети з плоским дном (Совіаг, кат. Ме3917) наносили 2 мкг/мл антитіла до СОЗ ОКТ-3 (еВіозсіепсе, кат. Мо 16-0037-85) у ФБР і витримували протягом ночі.
Наступного дня клітини з репортерним геном УшЖаї СО137-МЕКВІнс розморожували та промивали середовищем ЮМЕМ/РЕ12, яке містить 10905 термічно інактивованої фетальної бичачої сироватки (середовище для аналізу). Клітини ресуспендували за щільності 2 х 105 клітин/мл. Попередньо вкриті антитілом 96-лункові планшети двічі промивали ФБР з подальшим додаванням 25 мкл досліджуваного антитіла (кінцева концентрація 200 нг/мл), а потім додавали 25 мкл суміші 500137 (На, кат. Мо 9220-48) шляхом п'ятиетапного трикратного розведення, починаючи з концентрації 20 мкг/мл (кінцева концентрація). Після цього додавали 25 мкл Уиткаї
МЕКВІШис (50 000 клітин/лунку, 2 х 105 клітин/мл) із подальшим додаванням 25 мкл клітин СНО-
КІ/СНО.пиРО-Ї1 (12 500 клітин/лунку, 5 х 105 клітин/мл). Наступного дня планшети врівноважували до кімнатної температури й додавали 100 мкл розчину Віідні-Спіо/лунку (кімнатної температури) (максимум 4 планшети за один раз) із подальшим 5-хвилинним інкубуванням за кімнатної температури. Вимірювання планшетів проводили з використанням багаторежимного зчитувача мікропланшета ВіоїеК БЗупегду 2 (у режимі люмінесценції).
Активацію визначали за активністю люциферази й виражали як відсоток активації, досягнутий без додавання рекомбінантного білка.
Результати показані на Фіг. 41, і вони вказують на те, що високі концентрації розчинного
СОр137 дійсно можуть перешкоджати агоністичній активності обох досліджуваних антитіл. Однак важливо, що конкурування 520137, імовірно, значно більше впливає на еталонне антитіло до
СО137 (клон 20НА4.9), ніж на біспецифічне антитіло до СО137ХхРО-І1 РВ17311. Із цього було зроблено висновок, що вплив РВ17311 іп мімо буде менш чутливим до імуносупресивних механізмів порівняно з еталонним антитілом 20НА.9.
Таблиці
Таблиця 1
Експресійні конструкції для кожної мішені, які використовували для ДНК-імунізації (на основі вектора рМАХ 1) і для створення стабільних клітинних ліній
Егеевіуїє 293Е або СНО-К!І (на основі вектора рІВЕ5-пеоЗ або подібного) сО137
Охао
РО-І1
Пи - людини, та - макака, НЗ - не застосовно
Таблиця 2
Панель СО137-специфічних Рар-фрагментів, яка описує сортування на основі профілів
ЕАС5Б, зв'язування з доменом, агоністичну активність у формі бівалентного антитіла й активність щодо блокування СО137
Агоністичне до блокування омеме|Трив|Ддомен бваленте | СБУ 000повнеченя
МЕбВбОГА | 1/2 ЇХ 77777771 17777116 |Неблокувальна./:477777/7/7/:УЗО мебвавІВ | 1/2 | 77771711 126 |Посилювальна.//7777/7/:СУ(О мебв5бІВ | 2 | (Кк.707070177111110024 0 |Неблокувальна./77777/7/7/:УЗО мебввлІВ | 1/2 | 777/7Ю7Ю71711771111111050 | Частковоблокувальна./З/З мебва7|ЇЄ | 4 | .7Ю7Ю7Ю7Д17771717171111024 0 |Неблокувальна./77777/7/7/ГУЗО мЕб7951о Інв ОЇ 7777717171717117717111111092 | Частковоблокувальна.//7/З мебвоВІо Інв ОЇ 7777717171717117171711111177 0 |Блокувальна.:.4:77/7/:/(/|Н(К«
МЕб7ОВІЕ | 1 7 ЮК 7777771171144 | Частковоблокувальна./З мМЕбвобІЕЇ | 1 7 .ЮЙ/7/7Ю7Ю7Ю17771111112 |Неблокувальна.7/7.7:/К/:/).О мебвз3аЕ | 1 ЇХ 77/7/777717171717177777111118 |Неблокувальна.:4.:7/:/УУ3/У мЕб75Я4ЇЕ | 2 | .77Ю7ЮЙї72111117711111117101 1 |Блокувальна.:4.:7С7/С:/(У//.У:- мЕб763Іє | 2 | .Ю7Ю7Ю7Ю7Д717117717171711117101 0 |Блокувальна.:.:7/:/(///.У:У- мЕбувбІа | 2 | Кк 77Ю7Ю7Ю7Д1777711110199 |Блокувальна.:.:72С:"/С//:'/. мЕбвабіа | 2 ЇХ //7/7/7/7/7/7/7/7/7/7/0/7177777111189 |Блокувальна.:.:7:727С2С:/(/(/ З мМЕб8701 | 4, 77Ю7Ю7Д7Д7Д17717171711110-16 0 |Неблокувальна./:-47777/7/7/7/ГЗ мЕб8б2їю Інв о ЇХ 77777771 177111111-80 0 |Посилювальна.:-4777/7/7/ЗГЗУ/ мЕб87513У | 1 71 77717171771711111-22 0 |Неблокувальна./:-4777/7/:З/ГУГ мЕ6797їК | 12 | 77/7/7ЮД1771111111102 |Блокувальна.:.:72С-СУ/-(;-4-: мЕб873|К | ма 1 7777777171717171717171717111|7111111-100 1 |Посилювальна./:-77777/7/:ЗГЗО1
Ффункцівнальна активність РОН І-спецькффічних Баб-фрагтентів у формі моновалентного антитіпя, виміряна в анапі: репортерного гена блокування БЛНЛІРТЬІ З і виражена ях преяца під кривою СПК Афінніть антитіл визначали в знапізі з вихористанням припаду Нідсогта. МЕЗО являє собою неблохувальнимМ Гаї-фрагмент, тому величина МІК: не застосовувалася НАХ її
МЕЗО ні За
Таблиця 4
Функціональна активність (ІСзо для вивільнення ІЇ -2 в аналізі ФЕВ) панелі провідних антитіл до
СО137хХРО-І 1 (позначені префіксом РВ; кожне антитіло РВ містить СО137-специфічний і РО-І 1-специфічний РГар-фрагменти, як указано в таблиці) порівняно з іпілімумабом.
На основі профілів зв'язування з використанням химерних конструкцій СО137 їх можна розподілити на різні доменні групи
Ідентифіка- СО 137-специфічний РО-І1-специфічний Домен
Ппілімумаб | 777771717171717171717777717217117771717171717171711111111111171171111171171117119388
Таблиця 5
Здатність до блокування ліганду й доменна специфічність клонів ОХ40.
Здатність до блокування визначали у двох окремих експериментах.
НА - не аналізувалося; НВ - не визначено (доменну специфічність неможливо було визначити через зв'язування як зі щурячим, так і з лодським ОХ40
Генера- 1 кін. 1 Експ. 2
МЕМе сов тивна щодо щодо Блокування Доменна с. блокування блокування! ОХ401 |специфічн. лінія УН о/, о/; мЕбб29|ЇаМОє 77771111 фУНв-! | -ї нз7777 ні |нз/0 мЕббзо|сстМУВаУЮрУРОР 0 |УнтЯ46Ї 4 нз7777 ні | 2
МЕбб637|УссівОАМУУРОЇ 0 |УнІ-69| 9 внз нг |нз мЕббазІссМуЕЕМУРОЮ 0 |УнЯЯЯІ лінз їн | з
МЕбб45І5РРУУМОМ 777777 |Уна5У| 20 нз7777 ні | з мМЕббав|ІсХМуУсУЗОУСРЕСРОЇ 0 |УнНзЗ5! 22 днз ін | 2
МЕбб55Исстаттомууєо! 00 фУні-69|нз 17110 н///// | ле
МЕбб58ІУссУТЗЗЗУУРРОЇ 0 |УНІ-69| 9 внз ні | 2 мЕбббО|Уросм5оМУУРО 00 |УнІ-69| 714 нз ні |нз/0
МЕ6675|ІМрове5СООММУНЕоІ 00 |Уні-69| 5 внз сн | 2 мМЕббОО|сМОРРОВ 77111111 |УнНЯЯІ 7 нз777 ні |нз/ мМЕбб92г|УссістТТРНУУУРО 0 |Уні-69|нз 171116 ні | ле міб700|РБУММУМНІ МУУУМОМ 0 |УнІ-69| 7 нз їн | з
МЕ67О6|І5ОРМОРМУБаУНЕОМ 0 |УНн2-5 | 99 | 97 так |нз' бФ
МЕ6721|сМаВа 7777 фУнзл|Їнз/// 1777179 їн | 4
МЕб722|уссусММУМЕОМ 00 |УНІ-69| 24 нНз ні |нз/
МЕ6729|асМУсі ЕМО 0 |УнЯЯя| 66 | 74 (так |нз/0 мЕб8гбІіНтТанУВОРОМ 0 |УнзЗзоЇ 1 нз 7777 ні |нз0
МЕб94ЗІОМОММУМУєсСТУУУМ ОМ 0 |УнЯЯя| 90 | 87 так | 2
МЕбО44| МЕСМУСЗОМУУРО 0 |УНнІ-69| 18 нз 7777 ні/// | ле мЕб949ІррстоатеруумснувУтонУНЯЯЯ|НЗ 171190 так | з
МЕ7З31|раУКІМААрОРОУ 00 фУніл8|нз 17718 їн//// | 1
МЕ7332ЇОМО5УРЕУВОРОМ 0 фУні-л8|нз 177773 ні (Нв
МЕ7З334|ООМТМУУУЗАРУАРОУ |УнзЗЗОЇ 4 нЗ 7777 ні///// | ле
МЕ7За1|О5РУМУВІРОСЕОМ 0 |УНТл18| 15 нз ні | ле
МЕ7З45ІРОВМУМУМОРОАСРОУ |УнЗЗОЇ 5 нНЗз ні | ле
МЕ7З5о|руБУЗатовЗЗАРОУ 0 фУНІ18! -8 днз 77 ні/// | 23
МЕ7З51|ОМіНнавУуваЗАРОУ 0 |Унз-азо|нНЗ 17711 ні | 23
МЕ7З5З|рацсмрРОУОРОМ 0 ф|УнзЗзоО| 19 нз 77 ні | г
МЕ7З56бІірмУуссмМУУРСТОРОМ |УнзЗзоОЇ з днз 77 ні | 23
МЕ7З58ІОМНУУЗРРТУМСЕОМ |УнЗЗОЇ 2 нЗз ні | ее
Продовження Таблиця 5
МЕ7371|0ОМоУУрОМУУЗАРОМ 0 фУнз-азоЇнНЗ 1777771 їн | 1
МЕ7372|ОУУОСЗНУРОРАРОМ |Унз-азоЇНнЗ 1777114 ні//// | 23
МЕ7374|срОМАМУ5ЗМРКСРОУ |УнЗЗОЇ 21 нЗз он | г мЕ7378ЇрМмтТОсМмУУвеВОРОМ 0 |УнзЗоОЇ 2 нні | 23 мЕ7Зз8вгТрацосемуУнісеРоМ 0 фУнз-азо|нЗ 17771175 ні | 23
МЕ7З83|сУОМУСОМУСАМУСЕОМ |УнЗзеЗз| 6 нз 777 ін | 2
МЕ7395ІОУМУМІВЗрАРОМ 0 фУнз-зо|нНЗ 17778 ні | 2 лмЕ7397|ОНУУеВЕУсрРрУ 0 ф|Унзез|інз 1770 ін | 2
Таблиця 6 ідентифікатор МЕ| 0 ОбнМантитлаї ЇЇ кобМ) 01111110 Щ0коп 0 кої КО ЇЇ
МЕ6Т97 | 249Е:505 / 7,76204 | 3ПЕ09 | | зо оЗзнМ
ОМЕЄ?5А4 | 145Е:06 0001856 1286-09 | | 21 линмМ
МЕЄТ6З | 354505 0001033 2922-09 | | 5Бб5нгЗнМ
МЕЄТ49 | 82бЕнО5 0002419 29309 | | 27 линМ
ОМЕ6Ї37 | 1,56ЕнО6 0008839 5686-09, | | 3,74/-18нМ
МмЕб8О5 | 3АїЕМО5 629204 | 1842-09 | | 2гено5нМ
МЕЄТ85 | 348ЕнО6 0 001575 4522-09 | | 40 н-бонМ
МмЕб8О8 | 2511505 398204 / 1,595-09,. | - | Т4бБ5нМ мМЕ6744 (НВ 1111717ї111111111111111111111г мМЕ6788 (НВ ї111717ї1111111111111111Ї11111с1 мЕбва5ї (НВ її ї1211111111Ї11111Г
Таблиця 7
Активність біспецифічних антитілдо СО1З37хРО-І 1, що складалися з 24 СО0137-специфічних Рар-фрагментів і 2 РО-І 1-специфічних Рар-фрагментів
Гене- о
МЕ Ме совЗ ра Гру- вісти чне блоку- терний РО- Мвт. п с пінія ла бівалент- вання | РО-ІЛ 11 1в клітин В не б0р137Ц МВ
УН
МН?7-4- ,
МЕ6783І ОМамМмІаСЕНУМОМ 4 А 1/2|хХ 44 щ ж щ щ мЕбвбо сі мУсктрУууВагруУ 0УНБе-БЧА |1/2|ЇХ 7/1 6 | || -
МЕ6861, ОЗрахаРКАРОУ мнілеав |17/2| | 50 | - | |нв (Нв
МЕб856 рМуЗаБМУрУаЗВАРОУ С УНЗазВв |1/2| | 24 | - |- Інв (Нв.
МЕ6848| ОМУ5СМОЗРУАРОУ мнілеав 7/2, - | -ж72б | - |- Інв (нв/
МЕ6847| ОЗаУОАМІАРОУ УнІілВІС | 4| щ ЛЗ 24 | - |-|нв (нв/
МЕ6795| РУТОІМСАТСОАРОМ мн5-ело |нв| 32 | - |- Інв (Нв
МЕ6832| СУУМАРМЕСУ УнзазЕ | 1|ЇХ Й. 8 | км || -
МЕб754 ЕСРОМУсЗсІВОМУУРОР УНІ2ЯЕ | 2 юр, я ж Твою
МЕ6763| ЕСМОМІВОММУ ОР МнігЯЕ | 2 ..ЮюЮюЮю1р7рл01 | я ЇЇ ж Тен
МЕб6785 ПІВ сАБУУ УЗ МОМ УНІгЯа 2/3, 199 | я || ж
МЕб825| ТІММО5ОУРОМ Ммна5Іа | 2|Х («89 | я |-ї|Ї х
МЕ6744 | БОУЗОМАЕОРМОГ Уно-еа | 2|Х (3 67 | я |-ї|Ї х
МЕ6749| НАСРПТЗОМІОрУ Уне-влн о | зх 77717781 ЇЇ я | ж Тв мЕб870сЗаНАРУОУВЗаРОУ УнЗаЗ3І | 4 щ 6 | - |-|нв (нв/
МЕ6875 СВМЛМУЕТравру мнз-аезу Інв! 01-22 | я || -
МЕбвбг свсМУвМУєОМлЛУсЕоУ (УНЗ-303 |нВ|Х 1-80 | я || - | -
МЕ6797| ЕСПОРІ-СОМУЕОР мна-5ІК |2| 17102 | я || ж | нн
Ммеб873ІОвМУЗМУУОсС ве ОРоУ УНнІлВІК |17/2| 71 -лоо | - |- |нв (нв/у
МЕ - унікальний ідентифікатор ГЕаб-фрагмента; СОВЗ - послідовність СОВЗ; МН генеративної лінії - похідна МН; група - специфічна класифікація за групами (Р1Т306-533); домен - домен
СО137, до якого було віднесено антитіло за результатами експериментів із обміну доменами з використанням людських/мишачих конструкцій ("1 або 2" означає, що антитіло неможливо було однозначно віднести до одного з двох доменів); агоністичне бівалентне - здатність бівалентного антитіла активувати дигїКаї-МЕкВ-Ішс-СО137; ую блокування СО1 371. - здатність
Еар-фрагмента блокувати взаємодію з СО137; репортерний ген - дані з аналізу репортерного гена; Т-клітини - дані з аналізу Т-клітин; РО-І 1 МВ - СО137-специфічний Гар-фрагмент у комбінації з РО-Ї 1-специфічним неблокувальним Рар-фрагментом; РО-І 1 В - СО137- специфічний Раб-фрагмент у комбінації з РО-І 1 - специфічним блокувальним Еабр- фрагментом.
Посилання
АКвау, Е. А., Коуата, 5., Сатеїего, у., Апабреї, А., ТеНаісна, 4). Н., СНгівієпзеп, С І., Мікзе, 0.
ВА., Спетіаск, А. 0., Веаиспатр, Е. М., Риди, Т. 5., еї аї. (2013). Асіїмайоп ої Ше РО-1 Раїйжау
Сопігіршев ю Іттипе Езсаре іп ЕСЕВ-Огімеп Гипд Титогв. Сапсег Оібвсом 3, 1355-1363
Аген, В. Н., « Тпотрзоп, С. В. (1998). 4-188 апа Ох40 аге тетрегз ої а Шштог песговів Тасіог (ТІМЕ)-пегге агоулй Тасюг тесеріог зибіатіу ЩШТаї ріпа ТМЕ гесеріог-аззосіаїейд Тасюгв5 апа асіїмаїе писієаг Тасіог КарравВ. Мої! Сеї! Віої, 18(1), 558-65. пЕр://доїі.огд/10.1016/).риїсап.2015.03.022
Вегпвієїп, М. В., Сатей, С. Т., 7Напа, Н., Меїсісн, А., ММайепрег9д, М. М., Сатвеєіко, 5. В.,
Каїпіскі, 5., Нодде, у. МУ., апа Сина, С (2014). Вадіаноп-іпдисед тоашіайоп ої совіїтшціагу апа соіїппірйогу Т-сеї! відпаїйпу тоІесшеб5 оп питап ргобіаїє сагсіпота сеїє рготоїе5 ргодисіїме апішитог іттипе іпіегасіїоп5. Сапсег Віоштег Вадіорнатт 29, 153-161
Вепгат 6вї аї. Роїє ої Т сеї! совіїтиїайоп іп апії-міга! іттипйу. бетіпагв іп Іттипоіоду, 16(3), 2004
Воїапа, 9. М., Кмоп, Е. 0., Натпіпдюп, 5. М, УУатріег, 9. А., Тапо, Н., Мапо, Р., апа А!цбгу, М. б. (2013). Титог В7-НІ апа В7-НЗ ехргеззіоп іп здапатоив сеї! сагсіпота ої Ше Ішпд. Сіїп Гипа
Сапсег 14, 157-163.
Сотраап, О.М., Нутомуй», 5.21. (2006). Те стувіа! вігисіште ої Ше совіїтиціаїту ОХ40-ОХ40І сотріех. Зінисішге 14, 1321-1330.
ОРамідбзоп, Е. апа Рогап:, В.У. (2014) А підп-Іпгоцаприї в5поїдип тшиадепевзів арргоаси тарріпа В-сеї!Ї апіїроду еріоре. Іттипоіоду 143, 13-20. опо, Н., Біготе, 5. Е., Заіотао, 0. В., Татига, Н., Нігапо, Р., Рііев, 0. В., Воспе, Р. С, Ти, у. 7пи, а., Татада, К., єї аї. (2002). Титог-аззосіаїед В7-НІ рготоїез Т-сеїЇ ароріовів: а роїепііа! теспапібзт ої іттипе емавіоп. Маї Меа 8, 793-800.
МакКкКоик А, СНезієг С, Коні Н. Ваїіопаїє їог апіі-СО137 сапсег іттипоїНегару. Єиг у ої Сапсег 54 (2016): 112-119
МеМатага У, КоІопіаз О, Равіог Е, МішШег В, Снеп І, Сіапагападє Р, ЗйШепадег В, Сіїроа Е.
Мийімаїепі 4-1 ВВ ріпаїпуд аріатегв совіїтціаїє СОВ8-- Т сеї апа іппірії Ттог дгоУли іп тісе.
Меїего І, Нігтвсппогп-Сутетптап О, МогаІе5-Казігтезапа А, Заптатей МЕ, Уоіснок 90. Адопіві апійродієв то ТМЕВ тоїіесшціез їйаї совіїтиіане Т апа МК сеїІв. Сіїп Сапсег Не 2013.
Міснеї, 9., еї а!., А зоЇшріє тогт ої СО137 (І А/4-188), а тетрбег ої Ше ТМЕ гесерюг Татіу, і5 геІєазей Бу асіїмаїєд Іутрпосуїез апа ів аеїестаріє іп зега ої райепів м/йй "пештаїйсід апнпгйів.
Емгореап доишгпаї ої Іттипо!оду, 1998. 28(1): р. 290-295.
ЕівНег еї аї. Тагдеїїпа ої 4-188 ру топосіопа! апібоду РЕ-05082566 еппапсез Т-сеї! Типсіоп апа рготоїез апіі-шШштог асіїмпу. Сапсег Іттипоіоду ІттипоїНегару, 61, 2012.
Рок, К. Е., Кіт, У. у., 2пои, 2., Нипадо, .., Кіт, К. К., РісКага, В. Т., Кмоп, В. 5. (1993).
Іпаисірбіе Т сеїЇ апідеп 4-188. Апаїувзіє ої ехргезбвіоп апа їшпсіп. дошта! ої Іттипоіоду (Вайтотге, Ма.: 1950, 150(3), 7771-81). Взято з пирУЛлумли. порі. піт.піпй-.дом/риртеа/7678621
РиїКо У, Наїтів КУ, Пи Х, Ссіброп5 ВМ, Нагтіпдіоп 5М, Ктсо СУ, Кмоп ЕО, бопд Н у. В7-НІ1 ехргеззей Бу асіїмаїєд СО8 Т сеї5 із еззепійа! ог ІНеїг вигуїмаї!. Іттипої. 2011.
Заптатеай еї аї. Мімоїштар апа 20Н4.9 епнапсе апійштог асімпу ої питап Т ІутрНіосуїєв5 епагайеа іп Надг-/-І/.2 Кугчі! іттипоадеїйсієпі тісе. Сапсег Незвеагси, 75(17), 2015.
Зспулаг? Н. Віоіодіса! асіїмцієв ої гемегзе зідпа! (апзаисіоп Шгоцди СО137 Ідапа. ) І еикос
Віо! 77 (2005): 281-286
Зпао, 7., еї аї., Адтіввіоп Іємеі5 ої взоЇШбіє СО137 аге іпстєазей іп раїєпібв м/ййп асше рапстеаїйів апа аге авзосіаїєй мйй з!Иирзедиепі сотріїсайоп5. Ехрегпітепіачй апа Моїесшіаг
Раїпоіоду, 2012. 92(1): р. 1-6. зпао, 27., й Зсепмаг, Н. (2011). СО137 Ндапа, а тетрег ої (Ше їштог песговів Тасіог Ттатійу, гедшаїев5 іттипе гезропзез міа гемегзе зідпа! ігапзаисіоп. Уситаї ої І еикосуїе Віоіоду, 89(1), 21- 29. пир/дої.огд/10.1189/16.0510315
ЗПпапта, Р., Ни-ГіезКомап, 5., ММагодо, 9. А., апа Віра, А. (2017). Ріїтагу, Адаріїме, апа
Асадцігей Невзівіапсе (о Сапсег ІттипоїНегару. Сеї! 168, 707-723.
Зітоп, Н. ШО. (2001). Емідепсе ог а рго-ароріоїіс Тпсіп ої СО 137 іп дгапиціосуїе5. бу/із5
Меадіса! У/еекіу, 131(31-32), 455-458. пИр/дої.ога/2001/31/5тм/-09668
З7пої, М., апа Спеп, І. (2013). Апіадопівії апіїбодієв 10 РО-1 апа В7-НІ1 (РО-І 1) іп ІПТїе ігеаїйтепі ої адмапсед питап сапсег. Сіїп Сапсег Нез 19, 1021-1034.
Тпотрзоп, В. Н., СсШейн, М. 0., СпеміїІе, у. С, Гонзе, С М., Бопа, Н., УУебзіег, МУ. 5., Спеп, Ї.., 7іпеКе, Н., Віше, М. І.., І еіромісн, В. С, апа Кмоп, Е. 0. (2005). Совіїтшаюгу тоіІесше В7-НІ іп ріітагу апа теїавіаїйс сієаг сеї! тепаї сеїЇ сагсіпота. Сапсег 104, 2084-2091.
Титен, Р. С, Наг/ем, С ї., Меапєу, 9. Н., Зпіпіаки, І. Р., Тауїог, Е. У. М., Вобен, І1.,
Сптівіомувкі, В., Зравзіс, М., Непгу, С, Сіорапи, У., еї а). (2014). РО-1 ріоскаде іпдисез гезропзев5
Бу іппібіййпу адаріїме іттипе гезізіїапсе. Маїшге 515, 568-571.
Меїснеїї, М., ЗсНаї!рег, К. А., Сагуайаї, О. Е., Ападповіои, М. К., Зугідов, К. М., 52п01, М., Негбві,
А. 5., сеціподег, 5. М., Спеп, І.., апа Вітт, 0. І. (2014). Ргодгаттеєа аваїйй Іїдапа-1 ехргеввіоп іп 60 поп-5таї сеї Ішпод сапсег. І ар Іпмеві 94, 107-116.
Міпау, 0. 5., б Кмоп, В. 5. (2011). 4-188 зідпаійпу Беуопа Т сеїїв. СешШаг є Моіесшіаг
Іттипо!іоду, 8(4), 281-4. пИр://доїі.огд/10.1038/сті.2010.82
МОЇ В., Могдап Н., Ктїєд 9., еї аіІ. А м/поїє ріосс іп міо суїюкКіпе геієазе аззау мйй адиеоив топосіопа! апіїбоду ргезепіайоп ог їйе ргедісійоп ої ІНегарешіс ргоївіп іпдисей суїоКіпе геІєазе вупаюоте іп питапв. СуїокКіпе 60:828-831, 2012.
МБ апа Сгеепрегуд. Апіїдеп-5ресіїїс асіїмайоп апа суюКіпе-Тасіїйаїєд ехрапвіоп ої паїме, питап СОВ8-- Т сеїІв. Маїшге ргоїосої!в 9(4), 2014
Муоп, Е. У., Спа, К., Вушп, 9. 5., Кіт, 0. О., 5Ніп, 5., АНп, В.,... Спо, Н. 5. (2010). Те вігисіште ої Ше Шітег ої питап 4-188 Іїдапа іє ипідие атопод тетбеї5 ої Ше їШштог песговів Тасіог вурепйатйу. доцйтаї! ої Віоіодісаї Спетівігу, 285(12), 9202-9210. пирз//доїі.огу/10.1074/рс.М 109.084442
У, ., 2пао, У., Мапа, Х., Оаї, М., НеїІзігот, К. Е., НеїІ5ігот, І., « 2Напо, Н. (2014). Нитап апа тоизе СО137 Наме ргедотіпапіу айегепі Біпаїпд САО» Юю ІНеїг гтезресіїме Ідапав. Р о5 ОМЕ, 9(1). пбрз //дої.ого/10.1371/Лоштаї!.Юопе.0086337 "папа, Е., Меї, Н., Мапа, Х., Ваї, У., ММапо, Р., Ми, у., діапа, Х., Мапо, У., Саї, Н., Хи, Т., 2пои,
А. (2017). Зщтписіцга! разі ої а поме! РО-ІЇ1 папороду їТог іттипе спесКроїпі ріосКаде. Сеї рівсомегу З, 17004. 7Нао еї а. Тагоаєїїпа 4-1 ВВ (С0О137) 1 епнапсе СОВ8 Т сеї! тезропзев м/йй рохмігизез апа мігаї апіїдеп5. Егопіїег5 іп Іттипоїіоду З, 2012 7пои еї аї. Апіїбодіез Адаїп5зі Іттипе СПесКроїпі Моіесцев Вевіоге Еипсіопб5 ої Титог- іптійгайпу То сеїйб іп Нераїйосеїїшаг Сагсіпотав5. (завзігоепівгоїюоду 2017 аоі: 10.1053/ )-да5іто.2017.06.017.

Claims (24)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб стимулювання активності СО137 або ОХ40 на клітині, який включає забезпечення першої клітини та другої клітини, де вказана перша клітина має СО137 або ОХ40, відповідно, на клітинній мембрані та вказана друга клітина має РО-11 на клітинній мембрані, причому спосіб включає контактування вказаних клітин із біспецифічним антитілом, яке містить два варіабельні домени, де один варіабельний домен містить перший антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину СО137 або ОХ40, відповідно, і де інший варіабельний домен містить другий антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину РО-І 1, таким чином стимулюючи активність СО137 або ОХ40, відповідно, на вказаній першій клітині.
2. Біспецифічне антитіло для застосування як лікарського засобу, де біспецифічне антитіло містить два варіабельні домени, при цьому один варіабельний домен містить перший сайт зв'язування антигену, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137 або ОХ40 на першій клітині, а інший варіабельний домен містить другий сайт зв'язування антигену, який може зв'язувати позаклітинну частину РО-11 на другій клітині, тим самим стимулюючи активність СО0137 або ОХ40, відповідно, на вказаній першій клітині.
З. Біспецифічне антитіло для застосування за п. 2, яке відрізняється тим, що вказаний лікарський засіб призначений для лікування раку.
4. Біспецифічне антитіло для застосування за п. 2, яке відрізняється тим, що зазначений лікарський засіб призначений для стимуляції імунної відповіді в індивідуума проти аберантної клітини в зазначеного індивідуума.
5. Біспецифічне антитіло для застосування за будь-яким із пп. 2-4, яке відрізняється тим, що антигензв'язувальні сайти вказаного біспецифічного антитіла складаються 3 одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137 або ОХ40, й одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати РО-ЇІ 1.
6. Біспецифічне антитіло для застосування за будь-яким із пп. 2-5, яке відрізняється тим, що сайти зв'язування антигену зазначеного біспецифічного антитіла складаються з одного сайта зв'язування антигену, який може зв'язувати позаклітинну частину ОХ40 або СО137, й одного сайта зв'язування антигену, який може зв'язувати позаклітинну частину РО-Ї 1.
7. Біспецифічне антитіло для застосування за будь-яким із пп. 2-6, яке відрізняється тим, що вказане біспецифічне антитіло являє собою повнорозмірне антитіло.
8. Біспецифічне антитіло для застосування за будь-яким із пп. 2-7, яке відрізняється тим, що вказане біспецифічне антитіло являє собою Ідс.
9. Біспецифічне антитіло для застосування за будь-яким із пп. 2-8, яке відрізняється тим, що варіабельний домен, який зв'язує СО137 або ОХ40, блокує зв'язування ліганду із зазначеним СО137 або ОХ40, відповідно.
10. Біспецифічне антитіло для застосування за будь-яким із пп. 2-9, яке відрізняється тим, що варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину СО137 або ОХ40, визначають як варіабельний домен, який, коли він у формі бівалентного моноспецифічного антитіла, що містить два вказані варіабельні домени, які зв'язують вказаний СО137 або ОХ40, відповідно, не стимулює активність вказаного СО137 або ОХ40, відповідно, на клітині.
11. Біспецифічне антитіло для застосування за будь-яким із пп. 2-10, яке відрізняється тим, що варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину СО137, містить варіабельну область важкого ланцюга з ділянкою СОКЗ, що має послідовності ЕСЕОМУО5БОІКОМУМЕОР, ЕСМОМІКОМУУЕОР, ОЇ КІ ОАЗУМУЗУМОМ або ЕСІОРІ ССМУМЕОР; СОКІ, СО? ії СОКЗ, що мають послідовності ЕЇ5ЗІН, СЕМРЕЮОМЕРІМАККРОСЄ ( ЕСРОМУО5СІКОСММУЕОР, відповідно; СОМКІ, СОК? ії СОКЗ, що мають послідовності ЕЇ5МН, ЗЕМРЕЮОСЕТІМАОКРОСЄ (Зі ЕСМОМІСМУМУЕОР, відповідно; СОКІ, СОК2 і СОКЗ3, що мають послідовності КІЗМН, СЕЕРЕОСЕТІМАОКРОСЄ і ПІ АГ аАБУМУ5ММОМ, відповідно; або СОМКІ, СОК? і СОКЗ, що мають послідовності ТТОМСМУМ, ПММ/МООТУМЗРБЗІК і ЕСІСРІ ССОМУМЕОР, відповідно, згідно з нумерацією Кабат.
12. Спосіб за п. 1, що додатково включає забезпечення додаткового біспецифічного антитіла, яке містить антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину СЮО137 або ОХ40, й антигензв'язувальний сайт, що може зв'язувати позаклітинну частину РО-І111, де вказане перше та друге біспецифічні антитіла зв'язують: - різні епітопи на вказаному РО-1 1; або - різні епітопи на вказаному СО137 або ОХ40, відповідно, або - різні епітопи на СЮО137 або ОХ40, відповідно, та різні епітопи на РО-Ї 1; причому спосіб додатково включає інкубування вказаних першої та другої клітин з указаним першим і другим біспецифічними антитілами, таким чином стимулюючи активність вказаного СО0137 або ОХ40, відповідно, на вказаній першій клітині.
13. Біспецифічне антитіло, що містить антигензв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137 або позаклітинну частину ОХ40 на першій клітині, та другий Зо антигензв'язувальний сайт, який може зв'язувати позаклітинну частину РО-І1 на другій клітині, тим самим стимулюючи активність СО137 або ОХ40, відповідно.
14. Біспецифічне антитіло за п. 13, яке відрізняється тим, що антигензв'язувальні сайти вказаного біспецифічного антитіла складаються з одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137 або ОХ40, відповідно, й одного варіабельного домену імуноглобуліну, який може зв'язувати вказаний РО-1 1.
15. Біспецифічне антитіло за п. 13 або 14, яке відрізняється тим, що сайти зв'язування антигену зазначеного біспецифічного антитіла складаються з одного сайта зв'язування антигену, який може зв'язувати позаклітинну частину ОХ40 або СО137, й одного сайта зв'язування антигену, який може зв'язувати позаклітинну частину РО-І1 1.
16. Біспецифічне антитіло за будь-яким із пп. 13-15, яке відрізняється тим, що вказане біспецифічне антитіло є повнорозмірним антитілом.
17. Біспецифічне антитіло за будь-яким із пп. 13-16, яке відрізняється тим, що вказане біспецифічне антитіло є до.
18. Біспецифічне антитіло за будь-яким із пп. 13-17, яке відрізняється тим, що варіабельний домен, який зв'язує СО137 або ОХ40, блокує зв'язування ліганду з вказаним СО137 або ОХ40, відповідно.
19. Біспецифічне антитіло за будь-яким із пп. 13-18, яке відрізняється тим, що варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину СО137 або ОХ40, визначають як варіабельний домен, який, коли він у формі бівалентного моноспецифічного антитіла, що містить два з вказаних БО варіабельних доменів, які зв'язують СЮО137 або ОХ40, не стимулює активність СО137 або ОХ40, відповідно, на клітині.
20. Біспецифічне антитіло за будь-яким із пп. 13-19, яке відрізняється тим, що варіабельний домен, який зв'язує позаклітинну частину СО137, містить варіабельну область важкого ланцюга з ділянкою СОКЗ, що має послідовності ЕСЕОМУСЗСІКОММУРОР, ЕСМОМІКОММУУБОР, РІКГОАБУУУЗУМОМ або ЕСПОРІ ЄОМУУБОР; СОКІ, СО? ії СОКЗ, що мають послідовності ЕЇ5ІН, СЕМРЕОМЕРІМАККЕРОСЄ, (і ЕСРОММО5ОІКСМУМЕОР, відповідно; СОМКІ, СОК? ії СОКЗ, що мають послідовності ЕЇ5МН, ЗЕМРЕЮОСЕТІМАОКРОСЄ (Зі ЕСМОМІСМУМУЕОР, відповідно;
СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, що мають послідовності КІ5МН, СРБЕРЕОСЕТІМАОКРОС «(і ОГАГОАБУУУЗУМОМ, відповідно; або СОКІ, СОК2 і СОКЗ, що мають послідовності ТТОМОММ, ГПИМ/МООСТУУЗРБІК. і ЕСІСРІ ССОМУМЕОР, відповідно, згідно з нумерацією Кабат.
21. Біспецифічне антитіло, що містить перший варіабельний домен, який може зв'язувати позаклітинну частину СО137, і другий варіабельний домен, який може зв'язувати позаклітинну частину РО-11, де перший варіабельний домен містить варіабельну область важкого ланцюга з СОКІ, СОК?2 її СОКЗ, що мають послідовності ЕБЕЇ5ІН, СЕУРЕЮОМЕРІМАККРОС, «(і ЕСРОМУСЗСОІКОМУМЕОР, відповідно; СОКІ, СОК?2 ії СОКЗ, що мають оппослідовності ЕЇ5МН, 5ЕМРЕОСЕТІХАОКРОЄ, («і ЕСМОМІСМУМУЕОР, відповідно; СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, що мають послідовності КІ5МН, СРБЕРЕОСЕТІМАОКРОС «(і ОГАГОАБУУУЗУМОМ, відповідно; або СОКІ, СОК2 і СОКЗ, що мають послідовності ТТОМОММ, ГІМУУМООТУУ5РБІК і ЕСІСРІ ССММУМЕОР, відповідно, згідно з нумерацією Кабат; і де другий варіабельний домен містить варіабельну область важкого ланцюга з СОКІ, СОК2 ії СОКЗ, що мають послідовності МУАЇМ, УМІМРМТОМРТМАОСЕТО і ОЕКУУТМУУУЕАЕОРЕОН, відповідно; або СОКІ, СОК2 і СОКЗ, що мають послідовності З'ЄЗІ М, УМІМТ МТ ОМРТУАОСЕТО і ОНОЕККОК5БІ БУ, відповідно; згідно з нумерацією Кабат.
22. Біспецифічне антитіло за п. 21, яке відрізняється тим, що перший та другий варіабельні домени містять варіабельну область легкого ланцюга, що має послідовність РІОМТО5РБОБІ БАМИ ВМТ СВАБОБІЗЗМІ МУ УООКРОКАРКІ ІМААБЗБІ ОБИУРЗОНЕЗОВИОаБОИ ТОРТІ ТІ ОРЕОРАТУУСОО5БУЗТРРТРСОСТКМЕЇК.
23. Біспецифічне антитіло за п. 21 або 22 для застосування як лікарського засобу для лікування раку.
24. Композиція для лікування раку, що містить два або більше біспецифічних антитіл за будь- яким із пп. 13-22, де антигензв'язувальні сайти, які можуть зв'язувати СО137 або ОХ40 першого та другого біспецифічних антитіл, зв'язують різні епітопи на вказаних СО137 або ОХ40. ГРОМОВ Ж АВУСЮВУ СКАН ОИВОКІ ВЖИ РИКАРКІДІК ААУ МЕТ ВЕЛИ ОРЕ АТУ УК ТЕРНУ КЕ, ЕТУААРЕУ КРИВІ КАЖУ ВКЕ АКТУ ОМВК УТКООВЕ ПЕК а ПК АНТ ЕКНЕХУАСКУ ТИНИ УТ КЕКВ Фіг ЛА чесати водвсосоаехк оса ува Ева вх З в т о їх 5 я я Б Б В В У б В яхт зкеаштпосизеан ванн лашта аа м ад оаимия ро в хх В 5 її А 5 кВт ак дерну КВ с КДК В Таж Крим а иВ А КЛ Мя КН ОК МК Ма зчихкса а таррус прукІах Мане ово и о я ВХ, паза осв касова міс пе стома ж В Р А т ХХ Я с боб вт зт В вто Ж КМ КК Фіг. 18В сшазлсхз осі зсвес міфи ксаксріс мала пасіках Ж М 5 тя хх КІ вип ж Ка чЧвсхуЧчис типи все левквансс иа надавача ви Ж а я хх дв пово во косе вит в ау шо вімап нави Ж в хх В Б А хе ЕЕ Б 5 5 тк ве зипсазвсавоснапівлаіпладсласалечи зали сват ж Кк в ж т У Б оп в їх Жах ВИМ т Тк ТЗ СЕТ, их ЗА Ша СІАОШХ З МД Б ус Ем ПТК У ЕВ мае З кв Е х ж я кш Б КК т В 5 вт. десжкмсвасачнлочаляи комах ж Кк Я 5 Фіг 1С ПпІШНТСЖРвиВЬВАЙМОВВУХ АНОНІМНІ ААУ ТПЕКІЛІБВВІ ВОК ТУ КИШОК
Фіг. 10 ПІХВА ХО ВУ МКК КАК ВЬІ УААН ТТ ВЕБОККиКАТХ АЮ
Чи. ЛЕ МН; звлюжаетв віх ВК (нави МИ З.
Фіг. 2А СН чигаздсансазчзкссерово в сви соскатовоси вовка асравеаеи КОЮ 5 8 5 Кк Б в 5 хх ЕВ я в В В хх какайцоочссикссс кс каско ци шт а а В в см Кп ВЕ вм созказемрмхстоовс ніна ис Вп Кая Б В 5 5 8 Я вка засно тусафса их кп силоси свои пером осивуеох ш Б Ох В в ОБ Б У Ж т У В 5 БОБ Мт хх ж «ск я У М В хв Ек хв хх
Фіг. 28 Шевеа зазсмозвакио касами х Ж Ж й її Б Ж Ж НВ в Еш
Фіг. 20
КН зсбалетзавсороа отак чесати ами ОВО моє КК ВОВКОМ КВ лк милих сви ах МОМ в Божою БОЖЕ В пеЕДЕОН Ван тва в ак сопе ото и ка Стуса ож ж ж Ж В В я М В В У Ж У В Ж В Кк пспосипданоаоєхнсаняаснсоп анонс нксао ему ов В ВО щОоЖ В до ж ох вом ВОМ Нм ООВ пасток чачходо авто нц г ечнци есе ави Юм ш во Бо Коко хх кою Ко В ВК А вок ТНТУ В а КК КИМ ККД ОТ ВЕ КОЖ 5 КЕ сво
Фіг. 20 Домен СТБ, поз мість пев нічуватьні звеплення КУ ВК: динсстоннвтх сором лавки Коко тю аа фон БК В в А КК В я ж в вк Кв яхксахцатининими ие са ол раці иа а воа В м ЮК Б В хв ВУ жо сокдпедух свт савох учора ун уєя стае КБ Ж КЕ КМ В м ше в кА КК сечо миавозалсзівовасвовоз козою Ж Ж ЕЕ ЕЄБ З ж В Б Ж хх В хв ЖЕН дБ я її в 5 хх Ж хх ск: КЕ кА МА сусаусоадаватслякстссвазачссияа я КК хв Кк АХ
Фіг. 2Е зЗаісасскспидаксс свв вепоса опор ува висо м В В й Кк ФУ її т Ж гг БВ Б В х висазрсазові дак именно сва митна са вину код о ж 0 Ж п Мою я В Ж вх зо азассзакоансаосоов аванс ваосино вок ос ах к БЕ В Кк 5 б я Ж щ кох ЖК хх Рв хх завод скшокких тс ую вки порвав у пс коки ож В Кк ОК Ох КК ях Ж КЕ поспіль пяв чо поса ву ВИ Ву ЕВ ш Ж Ж 5 хх 3 Ж М ножа вв вв охко ШИК Кок КЕ ОБОВ Кошо-
Фіг. 2Е у. У о» МК СН ЕЕ зорсацепесявтавомасае ово сспвсеосеса хаос оаюу а в я Б 5 0 У Ж Тов 5 Ек МЕ звссвадесвалте асо ква ча тес сховав ка ук кВ й вх п Ек а їх вв кзпсацваскас асан вовни Мам в Б а хв ЕК Кк Кв В пиво ккипу сих сссІ сів осаостнае онов ау осами шоб ЕЕ КО Ох поко ж хх шк хх В шо ВАСЬКО І в шК В п Б М жЕЄ 5 КВ Ж М МЕ в МБ Вт Кк ЕЕ хрскюоовус кох ОБОВ В ОО ОоОФох МАЇЖУКУ? БУС ОВО ЕУККВИ СУХО ОМВО УМО ВО КМ Те МК КУТ УЄВСАКТЕКРОВН КІСКИ УНІ УКОМЕ Ж УМОВ о вее ЕС ХАМКТАУ ВЕК АМТУУСКі І ЕКУуКК М ТУЕ заказ КУБ УСВСАКУВЕРОВВ КВК ОСТ Гру УКОомеОоКОоЕ мороку Ве РОГУ ПАПКУ У ОК КАТ АМУТСАВНАСРИ ТНТУ ВХ МЕТУ СУДУ ВОАКУ КК ВЛ У КУСОК УКАРОКО УВУ А Матея ЕУСМЛЯМОАКУККВОСАКУКУВ КУКИ ПИЛОМ АУВ ЮВОКО ЕМО ВЕУРЕООЕ ХА СКС ВІТМІ КИ хАСТАТМКІ І ВБЕОГАУХКАТЕЦУ УТОМИ ВУ ТУ СОУСУ ККРОАХУК У КАМІН У ВАВ ЖАВ З ЕОМРЕХ ДЕК ІОЕКУКОТХУКТАУ АНІ КАПОТ АЖУ ТАКИ КОУВ НУ М С ТУ ТУах
Фіг. ЗА
КАСИ ОВО АКУККВОАХУЮВК У ВІК ТТ КОМУ КОРОК ЕКО КРЕМИ АОКЕОСЦВУТМТКОТ КТ АЖМК І КОТА АПВ ОА МОВУ ЖОВОТМУ БУС ОВО ККРОАКУК У КАВУ ПТК УВО АКНЕ МОВІ ОХ АСОГЕЦЕРУКЧ ОМА МКК АКТА УАНМ УВУ РІК ЖИТЬ ТУ ВЕ ЗЕОЦО ТІ АЗЖК ОБУ ТАТВКИСВКІ КАХОТАМУУ САКЕ УААН У КТ ТУ ТУ ОАЕ ЖК МЕТЕЛИКИ ТЕ Я КОХ МАН КО У КА ВИМОВУ ЕЬ КОТ КО ТК МОУ ТМ ТМОВУОТАТУ САВКА ОКК ОКОМ У ТУЯ ПСО К К КАВУ УСВА ТІ МЕМ І ЖУ ВАХТУ МО КТЦВЕУРИ У ХУ МТА НІ КАПОТ САН МАУ МУ ВОИЦВОУТОССТТУВ МЕеВОХ СВУ ККРСАВУКЮ СКК ТЕКА У ЕЛ АРОСЮВ Я ВОІВ МЕМ АСКІК ОВ УРЕ ВУ ТАТУ ОКР АУТТСУЮ ТЕКУ КОХ РКК ТОЮСТЬУ ТУ ВХ ОО УС АВУККЕРОВЕУК УБОК АВС АТМ В УВОАРОСЮИ АЮ МОСТА ОКУПАНТА ТМЕ В ВВОТАУУ СУ АТХ ОККО УКОСИ,
МІКБКІХ ОП КЕВОВТ УК М ТТ ЕМО КЕ КУКА АК МОМ ІЖЕВЕЛТЕКОТЕКМОУУТЛЕ ТММ ОРУ ТАТУ УСАНТ ОКО КВУ НКИ МУ ТУ БАС УК ОРОС ВІ ХСААНТ ТЕ КАМ УВО АВ ЕТ УХА ОО КА ЗУКОВКТЕНОМЕК МТ ОМ Ма ВАК АУУУСАНОЖМАКЖЕНУ ЖОЮТТУ ВЕ ПУБ АКУКЕРВОАУКУМ КАЖУ ТКУ, ТУ ВОАРОККТ КУМ ИУАМИМЕУ, АОКІОПВУТМТ УГТ АУ МК ВА НОТА САВА ОККО УТУ ПУБ АУРА КАК ВЕУ АК ККУ АУМОМІМУ ВОК ТМ ТУГУ УТА МІЯ КЕН МЕГ АСУ САВЕЖВИУЦВВУ МУЮ КУЦ УСНІ КЕН УМ НЕ ВІКО АШОЕТЕН УА МЕМ У ВОАС КУКА КУ КІЗ з Кевей ВУДКУ ВУБКВОБМ АК БСКОУТ УК ККУ УВОМЕСКО МО ОТ РОСТУ АПК АК МНЕ КАЧА АКОТ КУ ВОК ТОЮ У ТУ БОКИ ПК УС ХОАКУККВОАКУК СК АВІУ КТК ВО АКАНИ МК УМОВІАУМИМІМХ ОКУ МТП ТАХМЕВ КВОТ А АВС КАТ СОЮ ТАТУ Х
ОІД Ком я ві ак АРСКО У АУ УВО ТУ АИБУКОВЕ ТІВ МеКМТЕ У СЯ М ВАТА УУСАВЦВОМВКУ ПОБУ КМУ, ЕММА МНН ОРОС ААБИКТРОВХАМОЖУВЛАВОКО ЕМ АВИКОС ТКА УКОСІВ ЕКМТ КОМИ ВАКОТАУчУСАКОВМВР СВО ВОЮ ТУХ ве Мета ВМД ВКМ УК НЕХСААХОРТТВЕКАМВВУВОАВОКО ВУАН ВКА МЕ53ІЗ БОМ ОБОАВУКК ОВУ КАТЕТ У КУ ВАС ВМ МОБ УВК КЕОПЕВІПАПКЗАМТАУМК АН ВКА УСАВИКІМУСУ УМ ОКО ТМУТ мами ЗУ УОКККВОАВУК УМСА ТРТВ УК КУ ВОАРОССК УМ ЕЕГ 8 ок фіг. ЗВ
ПУ ЛОХОАКУКЮК РОХЗУКУХСК АЗОСНЕВ ТУ АВК УВО АРОЦЄ ЕК МОСЦВВЕОТ АК БОСВУПТАНВКЕТЕТАУМІ І ЗЕ НІСПТАУТУСАЕМУВИУ ВАХ УВО УТУЮЕ ОКЕОСВУ ТТ АЮКЕТТТАТМЕУ ВИ ВОКУТАУ УС АВОСАН НТ ВУ ЖОВТІЄ ТУ КУ РОК ТТАНКХТМТУУМЕ акта ЖУТАВЕОСМН СУКИ ООЄТ У ТУКО меха ОО УОВСАБУКЕРОЗЗУК УДК АБООТЕВЕКЦП АК УВО МИ КЖМОСЦРОТЕМХАЮ ОУСЇУОСАБУКК ІК УК УВС АВТО ЛУУВОАВИКН КУ МОСЦЕЕСТАМУ АЮ КІОСКУ ПТАЦІЯТУТАТМКІ ЯКІ ЯКО АУУУСАВОЦОКУУВЕУ УФО У ТУЮ ЕН УСОВОАКУККРОХУВУМКАНКИ КМУ МУКА НКИ КВУ СВНККОТАМИАЮ ОЧИ УКВ ККРОАЧУКУВСКАХОУТЕТ МУДІ КУВОАТИКНІУМОМІЧЕНТМИТЕ АОЦЕТОВЕУРВ ОТЧУЧТАТНЕМКАВПТАУТУСАНОВКХУ ТК УКАВОВОНУЄЮЮТЬУ
МЕТІ ПНО АВУКИРОКВУК УМ КАК ЕМ ГЕ ВОМ ИН КУМ КУ ЕКОПНУ АНКЕТ МІАУМЕ ОМ ЕЗЕОТАУУ У САКЕ КОТ УНК УТ УКВ МБ ПУСКУ ККРОАХУК УЗСКАВСУ ТЕТ ОНАМУ УВО КРОС МС ЧМТ МЕКХ АМОЦЕТОВЕУЕК І УУВТА ТЕН КАБИТАУХУСАНВОУ МОНУ АКЕХЕВИ КІНА хх МКК БУС УВО ККРОВУУКУБСКАВОСТЕК КВ Ж УВОАРОВО ЕМО ЦИНК ККУ ПТАЮКВІХТАЖМЕ ІК ВХЕОТАУТУСАВНТ ТМ УПАК ЕМ МТ Кя МЕ ПУ УСВСАБУККРОЗНТУК УК АН КНЕКОП КУКОАРИМИ ЖЕН УТ МА, МЕ СНЕБУОКОАЕЄК КРОН КВК ОКУ НЕК У Ж КИ УВОМЕОК С УМОВ ВООБКК ВЕОПОРТАЮКВВТ АХ СВУ ВАБІТАМУ УСАТОВОК АС ОТУТУВІ МКК БУЦУАКУКАЕРОАХУК УКСКАО ТТ ТЕ У УМ УВОАРОЄКИ КІ УМОНКРЕООЯ ТКА ОТО У ТМ ТТ У У МЕ ВВЕ АУЖУСАВОСТМУ ВУЦВК УЄОСТЬКХ Уа
Фіг. З3С
ПУ СМУСАКУККРОУК УВК АКТ КУ ВІ УВПАРОСКЦЕК МКК НК, ПАСМ АНІ КК РОАКЕКУ В КАВСУТКІК ЕМ УВА КАТКИ РТУя, СУВОРУ КВК ТОН ТОВ У БОС МЕ У Я ВОРОН ЕК ЮУТУ УМ ЕМУ МЕМ.
ЕЖЕУТУЮІ ЗЕ УМА АНТАУ У ААУ ТУГУ
БУС УКВ КЕР ХК ВСАА АОКТ МАМУ ВОАВМИЮЮВ УНК ТО КА У КК У КРОВ ЖЕО ЛАД ТОМУ У ТВО УРОКОВ ГУСТО ТО САУ УСС АБУККРОВУК УВС АМНКЕМУ МУЛ АРОСКН ЕМО АНІМО ОН УСЦКИАЕУККІЛВХУК УСЕ АВОСТРЕМУ АВОЖ УВО АЮ ЖЕРТВА СВУ ТАКТУ ЖИ М Ер ТАТУСАКУЄН В УСТ УТ Ва
БУСЙ УОХОАКУККРВО МУКУ КАМНІ КВУ УВА ИЮ КУМИР АМКУВ КЕСОСВУТТАПКХТЯТАУМЕЕ ХВ УТА УСТАВ МОХ КО ВС У ТУ СУС КУОБОАБУКК РОЗІ УКУВСК АВС ТЕЗУ РІВ УКОАРОВОС ВКМ ЕК А АК СЕУ ТТАВКВТМТУКМ ВВ ВАК АТС УВУ ВІСН ОО ВО Те БУС УС АКЕУККРОВУК УЮОКАВОСТЕЯУХ ПКУ ВОАРОССЕК КУ ОСІВ ОТ АС ТОПКУНТАВКУТМТАХМЕ ОК ЛВ ТАУУУСАВНКУХЕИ ЧСВВ У ТУ ПОБУ КК РОЛУ КАВОВУ АМКУ ВОАВОМЄСС УМОВИ ТОМУ АССКТЦВРУК ОТУТ А ОВ КАТ АУУКСАВО МОВНЕ ЖИТ УКУВУ ОУН УОБИАЕУККРОДУ УВС АБО ТОБ А УВУ АРТЕМЕНКА, ОБКОПКУТТАЮКЕТЕТУММИ ВЕ НЕО ТАКУ УСТАВ УК ТТН УК ОВО УТУХ
Ме Ом УОБОАвУККРОВА УКУСІ ОТ КВТ МАВ УВО ЖУК УМ.
ОМ ВУТЕ АВВАТЕТАУМЕКІМЕ ВВА УА КУМ У МОЖ ОКОКТУТ МЕМ ОПЕжЕКВОР УВО ПСО км ІА ОКО кави АУЖЗОВК КУ еВ КД КОКО У ЕМ УМОВУ ТАТУ САВВИЧ У еВ
КУСЛОБОАВУКККОВ УКВ КАВОВЕ ПТ МАЛАНКИ КА МК АК ХЕОЦЕУТТАНВЕЯТМТАХМЕ Я ЕВ ТАУТУСАВОВЕКУ ВВР КУТУ ТУЯ КУ УККИКИ УКВ ВІВСА ТВА МО УУНОАВОКСИ КУН КОК ТЕКС ХААВУКОХРТІЗВ ВОК ОК ТВОТАУУ СТВ ЖОВ КТТЬ УТУВВ МЕТ УСС УЮВОАСУКЕВОВ УЮ УВСК ТВОЮ ТТ У ЦК ОАРООСЬК У МО ОЦЕТ КООНУТТАПНяТМТУУМНІ ПОТ АУУСАВУЄЮ ІМ УЧЕ У КСЮТТ ТУ ВЕ БУС У БІОС РОСИ КО САДОК РЕВЕ МУ КО АРОК АК УДК КК ПЕАДЕУКОКРНЕВОВОВКМИ НЕК У УСТ Тео УМ ОКО ТУБа ЕКОН УК ВТО ТОТСТ КОР ТАЖ ВОВК АК В ОО КР ЕКВВІЛІТКТОКМОУУ ВМІВ АТУ С АНЕВЕМ КПКУ ВУХ ЮТЬ ТУВ КК ОВЕС АКОУ ТТН ММК ВОАС БУМ КИМ АС ТОВЕУРЦІМІУВТ А ОН КВАС КЕУК ОСТ ТУ БАКИ АЛЕКИЕНСТ УС В Я КА АВК О МУНВОАКИ НИ ВУ УВОМЕКУ ПеУКОВЕНеДОМЕККТЬУ Ма КАН АК УСАТНІ НУМО ОКА УВІ
ЕН ОЦЕНКА ТУ УМ Я БЕОЗКАТ САС ТЯ КО УКОСУ ТУ мкБогІ КУ УОВОАКУККРОВВУЮТЬСИ АВОСТЕВ КУ АМЯУ НОММОЮСІ НУМО ЖЕ ТОМРІХ АОСЕТК КУРКУ УТ АТО ЖАКОТАЄУЖРСТ ОУН КИСЕНЬ УТУХВ мере ПУСК ККРО АВК УВК АВ ТЕ ТО АЛ УКОАРОДЮК КУ ВМ ТОКЕТУ АСОБТОВГ УВУ НІВУВТ АТ ВО КАКЕТАУХ САМІ ВМ УМО ЖК ТУЧА БУС УОВОАЕУККРОБВУК УБСВАВОСТЕ МУ АНЯ УВОАРОСВІ Ж МОСЦРОВТАНВАЮ ТРОБК УТ АТ ТКУ МЕ ЕХ АЄЖУСАНУКО КОВО УМ ОВС ТУ ТУВя МІУ ФСП ОВСАЕУККРИХКУК УВСКАЗОСТЕМ МУ МІК УВО АРОЄЮВ М ПРЕ ОТКВКАЮЮ ОЦЕ УТ АВЕЖКМТУЮМЕК ВНАУ САНУ ОВ НЕТ УХВ МЕБОДО ФУ УМВБ ККРОАВУК УВК АВОУ ТКУ АМКУ ВОАС ВУМО М ТООМЕТХ МК ІПВЕУКВ ЗУ МТАТИ НМ КВЕОВТАУУСАВООИОКІ НУЄ У ВОВНУ ТОВ ТУ МРЕМИ ПО ЧОЖСАВУККРОАХУК УВС АБО КТ ОК УВОАРОССС КУМ ВАМ АСК УТМТТОТУТУТАТУМЕМЯВВІЮОТАТУ САЛА АЛОЕ ОСТ
МЕТ СУКИ УОЗСАКУККРОЗКУКУВСКАВОУТЕТ ВУСІВ УВОАРОССІ КУМОЖВАУМОМІМУ АОКІОСНУТМТТОТТУТАТМЕ ВЕ ЛХООТАУ ТУ САМОК УВК ВООСТЕУТУ Кт САН А ВВООСУУОВОВИ ВІДС ААЗОК ТРІО УВОАРОКО ЕК УАМІВУВОХМКТХ МЕЖ УС АБУККВОАВУКУСКАВОУ ТК ВАМИ У ММ я : АКТАХ СУЯ ТРОС У ОВО ВІСЛА ТРІО МІУ У ВОАС КО КУ АУВУОІЧКУХ АЕЕУКОВЕ ТЕ ВОВК І ОММЕ ВАКЛТАУТУСАВВОВ В УМОВ АСЕВ КВОТ.
МЕРЕ ПУЕ ОАНУККВОАЕУК УВСКАВСУТРТЗ УСІ ЖТУВОДМТ НИМИ БЖМОЗАТМОМІМУ АОКОЦИСТМТ ТОК ВТАУМЕ ВИ КУПОТАУУТУСАКО УВУ ВО ТОБАГО СТЬТ Мі МІКУКОЕНТЕКОМЕК МТУ ОМ нАКОТАУ У АНІ НОВУ ХВО АТПУ ЧТ МКУ ОВ УК ЮК УЄРТВІ КІ С ААХПЕТТКОУОМН У ВОАРОКСЕ КОС АУЩУОВСЯНКТХ АПЕККСЕРТІЧВОМЯК МТ ТОМІ КАКВТАУТТСАКОКУНООУ УК ВУ КОЮКТХ ТУ
СУА ВМ КОРОВА САНОК КОКО МН У ВОЛРОКОСИ У АВТО НКХ ВЕБУКОКР ПКС УКК ТП МКК АКОУТАУ У УСАКОЦЕ КЕКВ У КУЮЮТЬУТУ як ОМ ЕВ У КОРОН ВСАА ТВ КОМУ УВОАРОКОЕЖУАУВУ ВОВК АОЧУКОВЕ НВК КЮМ ТОМ ВАКОТАУ У УСАНОВ КОМ КУ ОДОРО ЮК ЄЮЄТЬХ ОУН У ОВ ВЬВСААКОК ТРК УКВ ВО АРОКОМИУ АВ ОВККХ АВЕУКОКРОЯКОКУКК НИ ОМ КАКОТАУЄ УСАКОМНУ УВУ КОВІ ОДУ ТУВЕ ЕУСЛИВСЄКУ ОРОСВЕ КІ ЯСААВОКТРВЕ У УМ УК ОАВОККИ КЖУВАОВОСЕТ УХА ВУКОМУНВАВКУКАТІ У СОМ НАВОТАУ ТУСАКЦО ОУН КВОТ КСО ТУ ЗЕ ОУН ЕВ КО УСНО ЦНС АБОКТКВК КОМУ ВАРОКО КАК ОКХ АМОЖУКОЦВЕ ТІВ ОМ ТЛОМ ВАКВТАУТ У ТАВВ ЖИ ОНЖХВОВКО КТ.
ОО УВО У ОВО САЛО ККУ ОМ УКОАВОКО КУА КОСНКУХ АОБУКЦЕКТВКОМЕЮЧ НУ ТОМ ВАБВТАУТУСАВЦОМОХ ОН ЖУВАВОУ СМТ.
УТУВЕ ОХОЛЕВЮУ УОИНОВН І ЗСААВОКТУВЕ КОМУ УНОАРОКОС ЕРА У КОВКИ АЕБУКОКУ ПЕК УЧЕКМ ТЛ ОМВК БАКОТА УСАВВК КОН ОТРАКОЄУЄОСТЬУ Ук
ОУН УВІ ВІ СААЗОКТУВІХ МН УВОАРОКО ЖАХ
АОЖУКОВН ПЕВНЕ ТЛО ММ ВАБОТАУУ УСАВООВОМОМУ КРОС ККУ
УЖЕ
ОЦІ УВО У У ОВ ОВК КІ СААЗОКТЕВВУ МНН АРОКО КУ АУВУ ККУ
АОБУКОКРТКВИМКМ ТОМИ КАКОТАУХУ АВК УВО КАТ Х
ТК
МЕТКИ
ОЦТУ ВК У РОК КІ САНОК ТЕКСТУ АРОК УА МКС
АВЕУКОКРИБАВМІЮК ТУ СОМ ВАТА ТУ САНОК У ОЦЕ ВУ ЧККЮТЬУ
ЖЖ
БУС КВОТ УКВООВЕК ВСАА АКОК ТЕ КАМИ У КОРОК ВО УКа ОК ТЮКАВ
ЗУКОВКТЩАОМКМ І ТОМ КАБОТАКТУСАКТКОВ УОА ВО ЦЮ
СУОБАУКАКУЮКРОАВУК ВСЮ АВОХТІХОВУ КОНИК МОМ КАУМОВІЩХ
АОООЦВУ ПМ ТВА ВІ В ТАУ КУ САВА КАТА УТ УТУВ
МЕТ
СУС УКОСУ У СВІ ВІ САЖА УПМ ВОАРОК С КЖУАУВИННКУХ
МЕТ
ВЕУСИЛ.
ВЕС.
СИЧ КИ ВЕС ААЖОКТЕ КАМНІ УВОАРОКОЇ КУ МВООСВТКЖАО
ЗУКОВЕТОВОМаЮ ТУ СОМ АВТ АМТ УСАВІН ВОВК ОВИ КОТ КУ КВ
МЕЗаНЯ АНА КЕКВ АКУ КУКА ТЦ УКОЛ ЕМО КІМЕКТИКЕУ АСОКЕТОВКУРВ ПОТУ ВТАХ ВЕБ КАВА УТА ВЕУ ТМ УА ОНМССТТУ ТУ Ммухуте ПСИ ОВО ККВОЗХУКУХСКАВО УТ ЕНАММУУВОАРООСЬВ УМОВ МІОМЕХ АСКЦКТСККУЄВ ОТЕУВТА КІН КАКНТАУХ САНУ и КАК КЕР СЦОЮТХТ ПУЕ УСІ КЕ КРОАХУК УЮ КАВУ ТУ АММУЖУВОАРВООССІ УМО КТС АООБІСВЕУЕ ОТУТ АХ КАВА АТО ОКХ ОНТЬХІ МЕН ПУСК УСМОЗВІ ККРОАЛУК УВК АЗОТ ТІ МУ ВУЮЗАРИНИ БЖМОВІВН ТОМУ АСЦЕТОКЕТЕН ОТУТ ПО КАКОТАУЖТУЄСАКОВКУ МТМ АКОКОВ АСИСТ х МЕТ САН УСИК ККРОСАВУК УСТАВ ЖТРТКЕ АМКУ ВАТИ ЕМ АСУМИМІВРТУ, МООБТОВЕУУВЦ ОТ ЕУ ТАТОВІ КАКОТАТУ С АНОВК ТУТ КУ АВВКОНЖОНОТУ ТУ УМХ УОВОМИ КЕРОАВУК УЗ АХОХ ПТМУАММ У УКОАРО МИ ВУХ МУВМІОМеІ ХАСКІ ИВЕУ УВО ТЗУЄТА ТСН КАВТАУТУСАКОВК УТ ВУАН СВОИ.
Фіг. 30 рЯшЯ Енквнсер ой ня «(ьо о вонеюв щ СН ар олеентннсь Ку "би я «Веожетві? г У Овен її з вне е дет у і ши о війЕ5-МеоЗ |. Дива нн ! ї і Ж "вв Зверотк. врайнер ВС сив, т оку, « Тюх з пес Й сс дюовотний прайнео ВИХ. й і шо Я Заворети. пежднев БАКУ і Завжая Тармічатор ВУОБА
Фіг. 4 Почаекреннй «в зе : Й Вр олнтьсну ЗО я я сич ) ; : ак вражена Її? : вужа кВ, ьо Ковйу зверотніне примування ВІН Конежіцни
Фіг. 5
Диерене ГІ шк що Тевенаетене Ві в ку. - "Ох Біентна . ща 5. де Зпбечтетвевн і у і ЗЕ щ Б СКУ МЕН о. з ке х ан нн МУЗ473 : Кене . І. сто Шо .
ше . - ОО, и і.
я Ж. : їх пит жо . Ех рагмвнт заканинаич ТА я: вен. сз Он Преветвваох Шо ТІ. У Де нн Ах Меч . я сені 222 х з 0 Шрерді Янв еВ х панки рибосовозн язковлиний хх щеетр (твоє)
Фіг. 5 Взазх Уа м ; й Ко аква й як янв хо дв ще Ко песевювнють Как сек ЗЕ щи ой венійно зе іван НЕ РЕЖ М в. ЗЕ ЗІЗ к о я хо БО ення т» ВВ НК ВВ ВВ НВЕОМНОроНЛИВК НН КО бра . Й 7 х Зоо З ще ї КО ВІН іх мучеві ЩО 00 БМК за; дае М МУ Ше ВО пливе фран й ч СН ня ва кевнх - шк рон конк Ще о фитальннй вена Щ Ще см донн ше. СТев ть. ВВ ов Веб ук:
Фіг. 7 ІеТЕХНКВОВ НАУ КТК УКВ
Фіг. В чаоя бСегнальний лептня КЕ сту їі пе Б й «т У ще зв и СУ давеий я КЕ я інтров - у тек р». СВ я що 5 ес «а Я -
ие. сн г КД вон Кав . тя тече - пав о о вує в «реве Ф о ЩЕ шк з | і о Й Свв т шо іх В Ф Фен ТО вою інтрев ї | х Я 7 о о
МЮУ. БУ ДОБИКН
Фіг. З Клони РОЗІ їв ї я 5 5 5 5 85 5 5 85 5 88 5 | : КУ : шк ж ж ШЕ ші й 5 що Кк , о ки а : З ак на Кк : а М Ко ' (Віг. ТО
ЖЕ КК - щестухтя хх ! ко МКК г оо ккусют же : : Оки є ЗБЕ Ї ТІМ З ; як МКУ Ї це. МК за. і? я МЕС : З ЗК 2 і жк МЕТ зе : х а ВЖК пр і «к МЕВТАВ х 7 то фас и та і З же ї ; о Ух БО їж С З Її "8
КК. 5 ще
Ва. Я ї : г КУ самі ї ж В г шостою кое Як ее КЕНЕ. ЕК . Ку КО У З Я т г й Я.О КІ я КО. орні сс се и як я В Е сш оси сх со я МИ В онов Дон вон В ННЯ УК Ер сте ють т ж точи ут со в чере, ка Зах яд зе що Я Кене унесення щу сх вка а їх: МЕТОД ї -е УДК че ж БИ ї - ЕВ ще зи МЕН і ке МЕКТЯЯ щі я МЕЖаХ і я ККЯХ с е у щі я МЕ А п ДЕНВТАХ Я 7 ях мя В хе ВЕЩІ МВ У і ї. 2 МУ: Ж х я МЕЕУХУ ЖІ г ло 7 Ж М що А ш Я ЗУ ХУ ї й Ох не ї ЗЕ пн А Не Б се Кумуровще х з ско Жуето. ВК і Кс З Ж ї вся . м де п 1 «ий з оф : оф я в: Вик : КО ; Я Мт жеох п ин з я ще як «Е Ех її З де Ук кун МО ід конку Кр рем Фиго2 х І ще ще - КО дм Ж ун СХ ЯК ТМ ВВ І с ЕЕ ще сих. ВІК ЩО МУКК КК ВВ ОВ І с: ВМ 2 АВ р ВИК КЗ І КК БАН ОО КОЯВ С В КОЖ ОБ ОВ БГАММСЕ у щук КН КВН Уе сс КО ТКУ. В ЕЕ АХО ВЕК ЕКОН КО ж ВЕ ПК С КО ВВ ХХ мер І КК я. ТКА КЕПККВИВНн КВ БОННІ 0 КОТ ни хо ОщАкК ТК КК НК о ДОЗ КО КО КК І ЖМННК 0 ІА ІБН ЕК ЕН 1 СПОКЖНВ: ху а ОКОМ СН СО. СЕН СО НО НК хх хо 155 як БУ По коктю ке Кохана а інки Ж кю нн й Її 3 я ОН Ох ї о х к В: З їх ж прищ що В Не: Я ях ях жав ОВК аю нм В жду ВК т ВО я З ВИК к У ІЕЕ я ОСККХ о ща ОБОХ ну я : На Я КК В ККУ КО КУ щ- БЕ Ще ме --- СМ шк ск. т ям В і як Кох З -В о ж Во ВОВИХ ОКОМ ЖІ КН ВО С ВІ КЕ : в. ОС : о ПЛАНИ ЯКІ ях ВКОСОпКМ ОКУ як ОО я шККЕ БУК У З щи ЗЕ Щ арте й пон Що яна канИОНтННя БК СКК ІІ бинтом яка
Фіг. 13
ЗА с щвяе ПИШКІККХ ЩІ ниММмі ; в вкж с ща ще х ! З її - де Кг роя ЩНх т ся НК а ЗД: звзе Е ВА дня пило не я гос В ЕЕ я ожою Ян ПИ Бек: ПИ Ж ПО вве жк же Ж. т що . х 17 щкк ЗЕ ще г зва Я ще ї шах 1-4 БК. КО -А ЩЕ... Е - х3 ЕВ ще ще Я : ЩЕ же КОС дк Тх В ой їх ще Ух ще: : Як Яке Кк КОС їх Бе я НЕ не ЩІ ТІ : як в я : ВЕ тен і ВЕ ТО ВЕ. ща: : ЩЕ я ВЕ я х В ТЕ БО ССО Б Б 5 5 еВ ЕП ВЕУ КЕЕЖНМ ТБ ЯВНО ББІНХ КМ. КВУ ВНІМЖ ВВІЖИИ ЗОМ хлор, т ЗБЕ Х МЕІАКТЕ каже Здав ах о Вена жде о Вінкавне Я фдкжия. дже ке дво Я "о ря их че ОЕМ им ВІТ М Я кре ит Ма І Ма М кат ща ЩЕ ОМ УК КХ я НИ ка ката Мі мк МІУ пух Ма -а ка Му ке кНа КЛ, ЕМ КБУ їх ВІ ЯКЕ ЇХ. ка МЕ ТЕ уЗЯХ СМ КУлЖ І м ще Кх КТ МИХ: БУ СЕМ КІН вк МУ на Мо ВЕЖ щі ЗЕ КЗІЗУ ВУХ ка а ха хх за ща Ки КА НУ МЕ ВХ Ах У ВЕД УКВ я. п ВІЗУ В вач ЗА МЕНЯХ КК ВЕР ЧЕ За: ХМ ЗМ Мк ща ха КЕ ЗНА МИХ ща щи М Мк му а МЕ Кр их. т У ТР ЩЕ МЕ У Мах Мх
Фіг. 14 ПІВ У : Осо ШВУ я . ї ЗХ АВ БЛЯ Е як Коко КК ; вся : Ж нн вжонся; т : 5 КН явне хх кт МЕ МНН Коля Я Ж : о ТТ ОН х пд МОХ НН М прлнтти у М КК ВН тт, їв КОМИ "Ве се : :ОО БМК Кн х рухати 7 : БО КЕ. ХУ оон рих й. НИК ЕКЗ ие ПК З ВО, зем жк прое КОМ МАК В пня тили ОНКО ЯНВ ТУ зтв.оВкх. СМОКО-І КНИЖКИ пемнтнох іденти феканх цізковий інетщий ідльсема прнковкх Фиаумені МК фуролакце ех бряскет ВУ 00 сфоауени Ве Я РАІ меси ех ФВАВКІЇ КК ВА ТАК ВІН У кі КАТЯ ана СЯ Мах ТАХІ МЛІВУ вВТаЕ ТЯ ТЕ мкл СЕ СХ МАЗКИ ит КУ Муютошль. т її
Фіг. 15
З ре ЗН клю і роя жк ВЕЗЯВВРЕаЕХ Н я й ! є Кк 85 - Як У вище ї і єї я ВВА КЗ 7 : -е Я Х ДИ ц с і і Ко що ВЕБ. щ Н ї Ки . о вза її е що ОВВіяВЯО З ї з К я: й е щі МОЖ он ЗНО їж Н ще ки Ше Бод Б онук о КЕН З кВ в вий : ЕЕ ож х Я їх о ле кох Бе ол пошани 7 Ж рооонвстннннНН «і | 5 7 /- Абмкоо км оав іпотек ого типі нн ном ісотіхккх аж ВЕ ЗА я же ще вну еНеЦ НХ ГеЕ
Фіг. 16 і ак БУВ ван еантне 5 Вр шт ті ек ПИЙОКОЧЕ ! осі» КРАЗЮМОТЬ : я чути теж ї я че пули Й дж т» Втавхвкоя я г Ще я ке 5 й й ох ВУВОХОЛОЯ : дея зо КІ . Я он 00 МВОКОЕ ех. ї ЯКО т о. до фетр укот ов Мих ЗІ лив Я шк ке ВУХО Ж ї шк НВ рн сн че Ж КЗ ми А
5. ой ж
Х. ї ВЕ В о фостнннєннтх - ї де Ж :ї Ж С Бук ї р й ТІ се: пон С Ялге т 3 Нр Ж є Й х я ее " І ї Ж хна окоентр. ан 3 ли лю Щ ЖШдзвльне ї ие Ух ох ш- щмцазяльне 4 осн ух ж рання т дя КИ я й нн що іх Шу ВО як деле во дтееоооуттАТОТТ т т ет о в алтфккткквюккки за ще ЕЕ 18 Бе че ДОК девучйк хх, За гне
Фіг. 7 в м -з МефувВОК: Ї ї я МЕНЕ ЕО : : с ях МЕНЕ ІВОМІ і ї Ки ме МЕВТКОИИМЯ ї ї дих «В. ЕЕ С " С о ке МРЕВ ТЯ КЕ 8 що у ж ЯКО ВАВВМКВКЕК жі жк Я ит і є я ЖІ ой щі се к Женя ВІ с дв ЖІ х пк поки х я Кн УС, у хвня З дя т Ж с У з БЕ нний я Вонтровех. жі нер ЖІ зо Вище т ВЕХаИЬНЕ : х х ж і х - : ї : ї ї ї я ння . зі о в на АМКУ УКХ МАК У МУК Ж УКАКЕ Я КАК ТК КК ЖК КК т и ЖК, я ще о зве Коко Зо ХО Во «юс коз кенцвнтуранів ПИ (му Вамі кни ектмацію М Мехтані
Фіг. 18 дазлі акта кит кедтккоюх дк сих его І ння НО лечнЬ пи оківих т : Ж НЕ п Ж Ти х ї її М кі ради тенти Я ще щ- що х іще Яке її м їх ЕВ ЩЕ ЩО ОВК в В. В ЗО ХМ Б З Б С В о, хЕЇІВХ БУ УМ ОО ХЕРИМ: КЕІМЖ НМ ЖЕКу ВВА ШУМ дих кх КОБІЖЕ дваніз ватної Текитию дит соках сно кі мурах х ! хпщ ш : пек рин не о. не ща В Ж з з дехоякх ами сухо ве мох ох панна ЖЖ. фо Н вів ке ВВ БО зе: Ба з ь М ХІМ У УЖЕ ЮщИМІ ЖБЕХИИЬ ВМТ ЖИХ УКІМХ ВИЛА ПОЕМІ щи ВОММУХ ех оюмхи ТИМ тіг. 12 Аналіз вкуемації С клітхн пвкгпани щі пи ВНОДНВОЯ Св хижк рин Ж 00 со сови є г : ОО Ки жк ж оо: Я КК: ГЕ же - бах, : сг о о ОВО КОХ АХ ще Що жа ВЗ ЖАХ ОСЖКМКККХ ККХ ЕХ М. КОХ с ЕХ ЗХ «Ж с ЩА ЗА вам 2МОЖОМ БМНЯК о УВИЩМІ СВУМЕХ ОРВОМУМЖ БИТВ. ЖОЕФІХ схклисхухх о МВВ нати зктввації Титнн смотюмвий ва. Кі ів ом - 1 ЕБлі МДЖ ення но Б 'щ хх : З -Х Б х Мои ЗО: зав М: ВВЕ х КОХ «НВ з о: з і тет КАТ ІМ ЗІ ММА БІК: ЖЕК ОРЗІТІЛЕ НМЖИМХ жилок шин ЖОІЖКИ
ЖНЕх ВкТИНИї Сян сполох щк сани дю ШЕЙК птн ша ОТИТ дБ яке З ; я р ї З 5 ше ЖК а ВК В Ми В МО В ВЕК ВК х х КЕ ех МОЖ х к | ГО Х кк « шо. ВОМ БОМ ї о ї З й. Ко. А ЕД: ЖВНОХ БА Бан НУ СКАЖИ» ХВРМАХ ЖАХ МОЕАДЕ схе кох Декан акти ції Т-клітма у семи сно КЗ ІВКр ік х : тяж ще : хх кох Ома В В і ех шк шо ї Ех Е щЩ й ж ж ж в ж ж й й й РВІЖЕУ БФІХНІЕ лу ЗБІМУУ ФБЖИМХ ФЖІЗНХХ МВІМЖУ ОББІМОУ СОБООХ сбоухеєунюх аналіз активації кни кайтивнях . Се ал СИ : з е ! Є - Зх В «В Бак ЦО вах р . і п, о. Іона: ОМА ЗАКОНАХ ЗО ЗВ ВВА СКК ЕЕ сх я ше о і ша, в я її ТІКЯХ ЗЕОАа ФВБІЩНИХ 0 КТУММЮ хи ме сБКМах 0 БЕУМЖЕ ЕМО ЕФЕЖИВ догм михк. Ана акта ТУКА ПЕ ЧЯ що Св. КІ ік « : ЖИЛІ дО ЗК З п щі й : Н «В. Ко : ох х Ум. же ме МК. МК: х я я З БЕІНЯХ фБІЖЩщя ВБЕБНЯ БВІЯВКХ РБК СККНЖК СаКНЩЯ БК ЗООКУВ дих див
Аввнія кума Текиіснн ще . : БУКЛЕТ КВІТКИ я : щ но як ЖЕК дет ОКХ МК КК ЗК ВКА КЕ ЗХ СЕК г, о ВОК ОХ о ОК ВХ що . з ще « ше З ВМ ЕЕ. І з 5 во «ВІДІ. ХЕ ЗМК РК Бе ОЩІЯ БІЛЕ БІТ МОНИЯ осхохкоюи ЛанЕх зтвкані ТИВНЕ ши
НО. Кк ІІТ е : й хх : пл х : Кох тт : ; х їз ко х си 2 Кн МУК мех Ж с кі с МОЖ сом ТЖЧМ ЕХ З 0ОЗВАжЦХ пах кат же тет МОМКОЯЙ дхохях му аналіз зиуиниці кан певен шле МРкрктв: 8 : . Я й ле ДИ т Ах ; 1 ко КЗ з ї : я : жк ши х. М Ж. ВК: ї : З : М Ж ЯК МОЯ . 5 . ПО Ок жо ШОН. ТА ПК І ЖК х хх : т х ЖЖ жо х ши и Е - В в в сві Жах ТЕЖ еБЯМІ ВЕБІМІЗЖ ОО БЕАТНКо ВУЖ ЗКУ ФК МУ. оВіУМ. ПСУММУХЄ йхкожожю Анмапіж актванці текинумя шк Що сно кі ІРЖІ ік я : жа г І. й й и ж и ма зо ТтМХ:. Ба» ги ОРУМЩІ БЛЗАЮЮ МОЯ БИЯММИй РЕМ БІЖИ дод туюх
Ав хе нваци тами вкл пан шк сновнеомя шк ше Вже ся вк « : пили Х : сх хх: ЖЕ сонне В В В 5 В БО Я я ОКХ Я їх ХУ М І ще 5 ще ї МО з ЗХ М ВЕ КМ: ВМ ВВ ОХ ВН ОК, ТОК БЖЯНУ: БОЖЕ РІ ЯМИ ББЖ. ЖБІЖНЕ БОЛЯХ ОЗ осжехохоке днаві: вки Тени дж дику ж ІКЙІІМАКАМХ маже: шлла
Я. віх х : сппккк : жк жк ах шен СВ З с Х сок Ох КК що хх Х мох х- ВО ВО ВОМ ЗБ ЗБ І ОО о С БВ «ВУНІЖЕ. ВВ ЩІ5МКУ РКІУМУ В СО ЯМИ ОБВЛЖИ ВфІАН ОВНА. дже лива активи теки кою й МЕЦЕТиКИМ : БЖ - 1 АХ 5 : а с х хх: : ШИ 0 В щі й і Зах В. АХ п хх М КН ЕЕ У .-. 8 і В В ЕЕ а: ве г жі ща ; КК ВКМ КОМ ВК і МНК Ок, КІЗ ЕИЗЯВКХ ВЕК ВЕЖ ХВ: ВИХ ВУХ ЖУКИ МХЖНИХ смт мо. днавіз активації Текани вісн сккоуцх Ко. КА ІЗ ТИ Ю я " ХХ : З МЕ ! ккд У : 7 : ХК
- . й. . й б її й й ТВО саяжкнє ФЗБМЖІ БО ММ БО ЖОВ БНО СВО БМ засво
Зкнамез яктввації т киян ПИ сно іннова нн пе й пн за - : а ВОК ЖУК З Як. до : ких сї : КЕ с Ж Щ 5 Б-х Ж киш 2 : 55 ШЕ з АХ я Пп ТАЖ Ж ДЕ хх ва: 5 ЩО Ма ВВ ВО ХХ ЕІ ВИМИ вище ММК КИВМІХХ хМлмх пл ТЛ доми, Аваліх активації Тела нв о й Спека ПИВО ТАКИМ т : щ.Х Жов : х х о Ах Х з ОО ОО : их ЕЕ Ж вх с
- . й її Є її й ж її їз ВЕНА ОрЕХ. ВЕК СЕУ КЕ МОЖ ВІКІ КХ МІУ МИТУТЕХ ТЕМАХ шик сх. Анапіз нитанаці тевннеи деки й СНО Вврінком хх : х я КОД нин но ш. би жило х : ІЗ Ж т х : х Ж Ж х з Щі я . и. її . ч. -
ВАК. бос ВО ВО ОС ВОМ ВО ВУ ВЕ ВВС ВЕ со ке: з ва хх ї В В і . в. «3 ню «ВВ І о» і. «В пада МАК ВАХ МИ ЕХ ОКУ ВЕНУ БІК, Тан пхтожкчх Ана» зкумеації їчелетня пило о нс кі ІК МЖИАЮХ е : від їх : в : о чи сх х се Ж дхоховх ча М ки ХО Я о хо х «НМ ОМ ЗОВ ЗО вах ВЗ Во зе БО ЗБ СІЯ А АЖ ВІЇ ВБІК ЖЕ ІІТ ТК ТК БАКИ дя ик мих фіналі витки ЕеБАЕУ ши зе сналеваяя ее г ЗХ Я. ЗВ КИ щХ КВ ОХ ям ЕЙ а ОО І В В НН КОХ ЗК ЕКО ОКО : ВК ВК : ЗУ «УдЕ о. : о. о : А З : 5 ОО ВУХ 7 ев ПО І ех МАТ: РВЮХЮ ЗК РАНУ УМХ ХВУМЯ) ВВЕННХ СБЩОМИУ ОЗНА хе кю днавіз вктуневц З-китии шк Й НО Кі ІК (кину т сх ХЕ ЗО ВЖЕ иннннннннннннннннннннннннннннннннннннннннннннннннинннннннннннння ве В А Ж Е ЕеБеЯ - с и х с «НМ щі: ЖІ: З зо: б: Б: я З ШЕ КЕЗКІщ вазах ХК ВІ ЕМВ КаМмОна БВ ЖКХ ВВА В ДЖ ох хх же дюонвтна акваааія ТКА па щ шНО ВЕ Мт хжук хи м тку Х здо: ЖК... даю КОС хе КЕН Ще З й З Я Ес . ; яко 5 її . »х о. Ему ЖЕК виЗМЖ ви вніджке МЕМ я ЕІ пахах крем УМО Акту затим Бекон с
«МО. КІ ЗМЕН КО ЖЖ сення не п ма ех Ал ї шо: ня ня - ШО: з: ше: ЗО зе: ше: ЗМ я б ММЗ ВИДАХ РІК УЖІлЖА МУК КЕ ЯМУ ЕЕ РЕУІМе ТХАМЕХ же му
КЕН «Мн ЖЕО. хх ВЕНАХ ; уже: коусюмх СХ : . ВЕТО ї Й В х : х - МЕМ Ї т п Кк ще І є с Тра й соя ВВОДИВ у заЖхи та КМУ ОН п змуаи а ОТ пу імла срохянУМ ох КАМ В і ШяКХ ох ЗМК ї ГУ МАМ хх ї ХИТ у пу нії Е и КУ зим шк: ї СХ «ММА ще ; Я еРЕМНЯВО Я нині Б я КЕН одини Я оеКВІМЕВОЮ ХАКІ Ка - ВЕТИВЕ Хомик ОВ пол, МО, ї «ЖК и іжекумит ВО ЯК жо КЕ ТИЩУ : СЕ я ВЕК х ї СОЯ х ЗК: ї я ЖЕ ї ХК сне гих Т Що КУ 2 х МДЖ З ї «сот С ЕВТ НВ ЗЕМ: х жо г Ж кож ОХ та а. х А ща ах, . ОК конк Мвт дних ее уцх іа сни М ТНК; Де щі Б ! КООСВ ке ее Дещии ВЖИ У дну. МЕ НТУ. 5 13 х х я вит: ВЕК КОИЗЕ УСЕ ти уки ТЕ КЕ М а ши щи ЦЕ МИ ОБ ах лен НИ ОО КЕ пам АЮ КЕ МО тх о) ВН км иВ ВЗ с ре вени КіВ і сих іван КАММАК ТАМ ЗДО АНТИ М ; Іа пк ша ; ОСЕЛІ КИХ КК о УК см пил ї соуси. ЗХ ох ВІК ї -й 5 ВИЗ Е В хек ї МОЖ о : дО Ж КВН ох : . ка в РЕННЯ Х пеоосоолтдииї З г: КВК, у ї ах си ск ДаВЖИ ЩЕ хо МЕ АМУ СЕ ще х КК - БЕЛУЩХ г ї ї Ко от б одею МО с пе - й ї З жо ж БА ЩОВ х ї х ке а й я БЕИККХ й. ї ЕЖ кексу ккх ш ї ШК же авх їх зопі дж БЕІНМХ 5 ї я Ж ож КЕТЕТВУ ООН Е ЖК зхі од Ж ї ОО ІмпЗидХ х Е . щ - БІТ я Е ки а шк МЕТ ї х КУ х ода шк Ки Ме ккал Куплжуцї о Ж БІТ ІМК юки о ККУ У З МНИХ осот ня ІМК злж т 5 НК ОВ хх ЕВ КЕН У - и БОМ х ї : Х ТЕ їж ря дю дяка ї же ме си дим ОВЕК. ВОК рн Можно нг, Кох ЗК моги кують ДЕК Ух ут мури уч мук ую щи ше зе ще ме Ко ке крони сну щу ще БИ Ое ханНент шення ЗСУ моху ХеНиЖне Р ТЦЯ ЗО ТЕМНІ сомеряї х ТТ : екв ІОН скіни х сичехі ж екз ЗЕ дю є ВОВНА ХЕХХИ уко з ВВЕ : и сикіж м с ї. Її ши еп ва нов ее БЕ Оу : де се ВЕН ЗБІКУХ КАШ ес ки М еф туя в Не я ЖК сх ЕІ щ-8 ШК КЕ ок ОТИХ ШК оди КО пихи А. 1 я А дк. ПЕСИК кі ода х ще я Ж РЕМБАЛЖВ - 1 ї а шен Ж СКМ до ТУ миша ве Мпа СЯ подрж ммс й і док як БЕБІ ОК КК яю ж БАРТКВЮ : КК Ки уми. СУ Ї ЖЕЛЕ ШК повююові У Що о ВН : Еш У КЕМ и сеотеести ху жа Ж стмиеКМ СТУК КИ ха КЕ Кн ж ВВЕ ЖЖЖВИ дж хв тНія Ж дині ЗК ВЕК Ке дкозежх БК як кА чн Я корм : ВВ Ше їх у си МЕД алко Й ки Мом т нує. кити. БЕК" т ДОМУ. МЕР. кОитЕх. Й че снмрі йо ядл мм оз діт, по ян и од ше че в озе ще Бе Оле Зат ух з же зе дк ому ВИНИК УЕН КВХ СТИ КОМЕТ КН В ОКХ АКА що
ЕЕ . тах К «ущіав : з ВЕвЕ хіт Може чив здох зе т я ТЕКА «МЖК кое БІК ЕКИ АКА тот им : 4 іга 3 нан по: семи . с -тх ВВ ї ї Ж. вія тро нер ле ка ;
«й. 1 ко й ще " хх «ЕМИМІ В. шани з; ЗВМХЮ М КО ВВЕ : лу З БТ а і і РОК. рівнем пе І би се ПМЖ Кк - і Гола КМ Мя о сих КК щиХ вини що КК Ти 0 еВ КИ с пт хи ами х І У укрити х 3 Пк ВДЕ З : же ож КІМ Фо дкА ЛО т МУК Мо осади Же нев ЩО ша ЖИ де ку КМУ хи кВА ЕОМ я щ хи УЮ 1 ОО тик - ї й ие ку ї ик Ух ї ДИ дн ЖОМУ зве сен ж хнкщи закахеНи кочях Ї Зх ХОМ УЗ г ТИ и ях УОНВИ М ХМК ія ОВК Жир ОКХ, КИМ я 5 я Ам и усе Е АХ. пеню ЗВІДВМУ Меч дналтнндижжняюх че Метт ТУу ЕІ У таза де по Не че и и кю хомивнтвацн іже ми КУН КЮя КВ МКК : І с ФМ, з туї ще : о ЖЕК а с 345 зеиКі ХХ мен КБККК ОО ЕВ Я ТК Еш: 5 «ВИМ аВ : во ВЕБ : Я Аня и ї не : С «вени хе «В ї ї Оп Ми и соми с -ї Є ЖИМУ Е : 5 «ВЕНИ ту ЗВ Ж БІК хо дної ї ше ВОІще ща : У ПЕК КХ у КК ви КН яд Ж 0 зрачадую Код пеле РАВА ОО ВИКК Жах пох Мо зи Ки ПАХ т і о МЩКТ КИ о СО ВК КЕ жи КІКУ Бо ! а Ж хи ю х Н ЯК ЗМК Е ще з «іти -3 З Сх о Хо сем «8 ММА Ш кави «ТУ КВТ ШОК тей Те ВК У мем 5 : кВ хратятів " ту Х я ері х іст ХХ КИТ Ше ошжу х ТК Е пк М джем СКУ ЗНО Бокові шт НЯМ о о сни че дя им . їх їх дах УМ, одпдц і ре м одкущУнН: ЖИ КТ яОНте запНВІ я ДОН: зам ще де за ще ла цу зро це промо щу . щ куме миску У свахи дат кеВ МР ВВС ПиЖКУМНИЙ НКТ уКНЯ КЕ ТЯХННАКЮ ЖК кам к САМКУ «хх аг ВКА г заці ЖК: «ВЛА м я им : МОХ МЕЖ йо ев кали КЕКВ ее Я еВ ж «ВЕЖА МЕККА ! стмхк км Фо щи тео ВИН З ВУ М т щи е НО УМ Це Е сходу ші МАМ ї салх ше ТОМУ щей о зРБИаММ 0 : Ж о «ВБЕВеВ т ЕХ ших МОМОТ а , ще п нн их ДУМИ ж одкв мух НЯ «5 пед ту ях во ЖиЖКе я МТВ МОХИ фе СТ НЛНя М жа: ще 00 ББІРИВа я ї Я ОЗ КВ ОВ ЩО ЕМ ОК . куки Шо магишу ту УК Х ОМ Я щи МЕДІ В АК ще КЕТІ М КИ КО Ки Ж х ї с сю А Мо ДЯК а днях Ор ; ща, я ОС ЛКУК х ЖОВ о НИК Бета є ух же ин ЖЕКи пов Ме дивак КК фесфннфе Ж око САНД ЖИНТ. с х гук Є юю ки х пи ШМК КН хе КАК, З сук х ТК и т кет, ЗМК ентерит пит ктт тет щи ни Беж и що то ню Ку Ин сек мріють с с йде, пах КОЖНУ МК ТКА конем НК Х памеми
: х ВБІДАКВИВ КУкМ: мяхке з ува ощнх КК « КВН тт, дент У БОЙКО ї нем і тк Є КК ЩЕ 7 ВИМ ТОМИ, шелнохий тку ам ОК Ж ох ВІНЕДІКОВ хе иКНХ доожшнещ Ох ЕХНУЮНКОЯ 7 що Кною са і ЖИ аршином -х : ай» 7 ОБхМКИ К й АЖ ОВУ кі КЕ КЕ оз Он друці Ж 7 є 5 ї Ж ШО ЗВО а я БОКИ е Е ї ТЕ х НМ хх Е ШУ х завд п оку : кож ВОК й Е пив щи - ОВК ЕЕ АЖ ох ВОВКА й Ам пр є КК х : ї ох ЖК ЖЕК с Бо В : С 7 од рфоеинттннях ох вро хоютю. "7 жжжщи х ке йо ля ; ТАН коня ЗОДИУИОКМУВ МО нич ЗВ це КК нету и киш вині знак мцимх Мер дек дію МЕ І КИ пов ВИХ КТК ким. пепако. пре З копита ВИХ пами 3 е ВІК ЗКТКЗ. . сит ї се ВУВАХОВВХ : ко ВсНевим шк що ох НуВеВюВ 5 бос ЕкюУиК Ко ї ВЖК жене ДІЦНХХ бу ЕММА ще Н ДЕ кое во м : ий. жду вци к і ОН х : «ша ВрЯююВ Е : ВЗН з ВІВЗХК НВ хо : ЕЕ ТВаюЮЬ х Ах сани т і я диваки З зак «КО я ВІаЗк Клин Яви 00 ин Кух що ООН з ХМК МОМЖКЖИ ше хе РКК х юю и Му Ж : шк є ВИЛА Ко хоуц як Х нн Ву я ЗКУ в а нти шт Ким КО деку, НИХ ї т : З ЖД му по ЖАН МВ КИМЛЕ НІВ осот парі БО ше у кети МІК ЕЗВл Уа ВІН М удутюттуют нажите ек МНК МК т це яИМИЕН НАМ КЗ пу ор М ям ВЗ жк КВ конання Ку пекти пуд : сих зві оо врвхдуке ЯЕККЕ « зим У ВО Я май НО БУВИХЖМ і Ро Веамив ЛІКВЖЕ КВК є ВУВИХВНОВ Мову Є ві і «Вас к с і ДУЖЕ ох ВуЩМИВУХ м МЖК 7 оди ом ФК лумумь СТЕ дж в й оохвівакикю З АщИХ ТК М КЕ Ї . -Кї З ВІКХВМ ща : Ки Є и рн ик БІД ХАКЯ Шо доню Ки ак ЖК ох ше Ж т ВРХ ЩО Ю КК Оу БІВХ Е І п ема У : км БУВ КОВИ х Коня ЖК ою ї коой Й Ж, ЛВУВНЮКУИ є ОН дня КН З кю КО жу ск КМ М не деко М вищу кт те тної БОКС» я Ко є Аме пек усу. НН ЖЕК дет дит мРНК НЕ З пи Мр х аа цк а ще меужохохмим дух уки НН зад о нектвак МВ Цожку ТЖЕв секодан хоховкТра АХ СМОММ т і КВЛІЖКУВИХ ЗК нгедтние : п кВЕОаКУКИ : ТЕКУ си дошк КАК : - ЖЕН ІБ; ях БЕЛеКМОЮ заці од щне хх ! Ки ох ЕВ ВиЖю око хе юКВ й ї ни ви З пед « : дае У МЕККА даУЖи 080 ит ЗОЯЕВЖКЕ кінцях ЖК 0 ШЕБвкННе ХЕ КЕ КИ ЗАЕККХ Е й «НЕ ХхаКка й ад т ВНЕВКЯ Е ї скін оо» 00 ВОТЖВНе З дар У ой се Ж дих дм г хг ект В НК ОК ння їм ШКО корон БЕК 1 З хх мех ковтух, х ї ВУЖ, Е Ме НЕ щуки Жак КК. МІ Ки Зк тт . боях пев чек в їх конання ВХ метмих . МИЛИ мин 7 . о М Ом
Фіг. 21 сер зала пор нику кКЖ о що ЗКУ ЧЕ кун ахмух ОККО ММК ВЕК Б : ! х З песо Кк вионці гі ко : Ки ОВУ НКИ КУ ці вм Сх МОУ У є ! в К. ЩО я ЕТ хо ї з Ф ! ІЩУ дика ЖК «ее оОНИКК у яви КУ ку я роту ТА ку я они Я Е ! щеК ЗЕ полю Ба ! г У «УЯВИ я я опоап а "ЕЛЬ ве дей ЕК 7 зі й дмтлию ВНУ. Одна ккжкхняя п ик. вені а Мов деко яння ПИВ МИ ОМ СНЮ ПЛЕКЯМЕНОЯКОМХ Б ов ОМе Хе ему ях; Я кім ВИКЖВН раці ННх пеЖИЙ комою ВН мкл МАМ ТЕФАН НІХ МЖК МОМОТ Б МИТ тай гечузич о ря ТХЗКМ я Тени ву рі а ЧИ Ухтрхжиских су и МК ТЕЧЕ - МЕТУ ЖККИ х й ЕК Же ще Теза ! я па сяей 0 ЖРЕКИО меш Косик Мт їй ек МЖК у ух си же ї ще ї Ж кое ї К пиши ї є НО сно зах ВІ КЗ МТ с ях УЖ шу ї Ка сухехюмиих Ко і де х в ї Ж дути З С ї ЖЖ х Х ий Кв хіх Епохи 7 я миши 4 ох іч
М. Зах - їх ЧАК ше ях ер ХЕ то: КЕ : з Н ї в я КУКА ВБІК ЕН й с Ой дме и КЕ Кз КІ ї ХЕ я ВТ МЕ. КОМ, ї Ди т : БУ дореумї хі сер СИ НЕК Ой а «й ді а Ро Время щі МЖК ке
ІКЦ. й до у МАЯ ТОМУ ЛІТОМ Мишко ми ЕХ їмо ця пав Чак хі ї М тоц сп мист МА КАХ уд іде : тт ВКМ Ма ХВ КОКОН Ж ЕМО
И ж Е ТТ я Е ; МКК ї ЗЕНИК пе в ЕВ ОВ ж МВА яке В омшиоя Ї пани ! ях дм н | те ВОВНУ ї Ж к -- жИЗМаАй ЯЖ феї п кминк Ми Я си дачі моде 2 М я Ж ВУ я ЖК ТУ ВЕН ї М ж вах ее же зу ї й ах ж пе ї маки МОЖ НТаНМ кате х : оо РУК, В КЕН, дан М ожжі Ж х ЕБ ї ше ВК КИМ ї КЗ, С ееютеєттюи ї яки а : ЖЕК : ший дк ї Й 1 Е є Ж КИ ші шу За дееднийн КН ж! вих СОЯ у тя : М ож Є ке Ве жо ВоВ в в диким г Кри КВК КК КЕ ню У хоч КЕ Во «яр ер Ме ДЯ У зи зх «ЕХ я: ОХ. 1 ТУ БЕ о 7 І - гозок у Н концерни НМ ПжяКхиХ ВІННІ ВИЗ КМУ т « ВІВ 14 У во ВХ я ЕЕ : т ВЕК : КСО : . Й нен що ек Хеіхжже тю к ВНТУ ехо кан жххкукоюх о ЕМВ по ЗА рВквх су ВВ БОЗХККК й - Оу -ї ї а УУФЕКЕУВВЯТО Е : Ж я КМ ще 3 Ж С сек с : х злив «Що ВУ Ж 1 х СОЖНдшЕ ОН. що І ї о ЖЕД КВИ КИ жов х У Оп х ск Ме КВК ЛАКУ 5 ЗЕ 5
1 т. КЕ м : хх 1 хо Ж пі хх пи ПЕ тя ПАКуУ я МІЩежММКМиММВ ВДВ донна ВВ. мине зони їх яп - кі МИ ії У : с хаицент и махи хек ма ще З ЗМНМИ й з оо мое хемх ж ж | я КОКО у сохне екон Еф ке ккк свежокукх з ск ВИ Ск інінінтя я кн Кл іі ККД дак. МЕМ рен о кни се нення гдЕх с - КЕ Тл ОК Ох пен вве Я я ех со «ке ПЕВ УЩУ хх : СЯ х і з що А : КО с я ЖУК Б 5 ж Як ох І Щ Кох я - М жк о пкт кх КУ о х Зв Як МТ ЩО ях ЗА ; х ж й ех ха ку я ; же я КИ х Ж У их " ї ; З х С се укр : ї х х Хе ж ве ОК МК ТІК цої їх з вх, сь Я у Тксоя ще їх МОХ хх . щу які х У з тех Я г хо им їх за ДЕ У З лі к. О.І хе А М. хх що шо «Фолонлоисивх ; я КОМ
3. х ж Килими нення о Коня х з З КУ ит, ОЗ х з х х х МЕ КИ - ; . х вч х Б я РОТ Е х х. Ух : ї 5 х А Ж АН МЕМ ЖОВ, ВЕК х КЕ ; кох ї ку хх КВ ї хх У ; ск чи о : КАК ож х о, З х Ех х Ьх зані й про я зх В ТЕ х Зк в К з я х ОМ ; Мк їх пк ща ко мая ее з дея со Ко до он ї Пе де м Ж т ох сини Ве то ЩЕ офдуосетюсеосооок ко ровоооеоссоооолсс КВВВКлИомлотоиотох хх ї Ко ах ХК. Ек ще це зе зо пуер лу баси вали КОМ НК АХ НКИ
Фіг. 26 з; ї т ї кт ВХ пе Б реююснн ЖОВ яд Ж Жос кВ ВО Ше щЯ рат Що Ж я Ж КЕВВКУВНЕ ї Мі Ж ІЙ «вату що 1 шт ке х що Ва Т7 МЕ хо ЖІ ї я мм КСВ я 7 я УКВ ЕХ ї ХЕ ще «ЕТ акоОЖ г я з ваш шо щі й щ СЕ ФО КО т ВНТ НМ КОНУК. Б в ОВК ЖИВ 8 ох ОО ща ХТНТ НЕ КОМЕМ. НЕ Ше Ж я со ЩЕ ї по я Ж Хек сумі У хі я КЗ х я ї ті жиє «Жено кляллууюти кт Ки или ил : ДЕ бем рин тн, щі КО 1 т БУ Клапан т попит данних кеАдіт ки зт пи т т КОКОН МОХ ПЕКТИ я їх. щі КОНОНКО ІТИ МАУ Кущ що ВК пк х ті УЖ КХУ вчать хр ; АК ВІКИ ВОНО ї ї ох й і Ж 5 : і ЛЮ вожиим як Ж плюща ; ШЕ ї с УК її ДОЗМЕКМВ с 5 МКМ Жито УДК ИУ Х ї В Ж 1 хх 5 1 Кк пах Ех 1 ї КЗ ї с : Я Н К ж уки х 3 Ж мя З ї пеню Бл і МН ОК Що яжеко! ї С їх ї ви Вр НМ ще ге. ж мах ВО Я : ВЕ БУ з ІЗ ОО С В і її Е Ко З ОА я Медшх В - й х їй ЖИ дя щини хх І : У - ща К-й шо ФМ 5 МОЖНА й ож Ку КК З Кит ш НОМ У у м і . ЕЙ дкенжсе ЕЕ. й в хх т, тм з ДІ ЛК ккахким Га КЕ
ТР. вдоско, ФК кох увокуюкх Перм вав ло щи о пика я В каное Кая ПУ ТЕН дном ки і ВАВ : дк кцемик си дае Тс дна ПУХ ІВ КуНЦЕ ВН МУХ МНМА ХЕМКДЕН? МНЕ КОХ КЖККНАК
Фіг. 25А КУМ НКУ ВЕ пу сх, заоповт МЖКюВ, й РЕиКН: ї і ам; Ж Ї Флжтя Бош г - ШИ В капови: З х ані Же я ! штифт ет кам М ї Її ще Е Її ке З ки : с ВІКИ ПОТ ЖЛІ х ї їз Ж : В 0 ШК М шви КМ т Бхя Н ех ЖЕ задлкії Її ж От холу ОМА МІК ГДК Ж сх їх ЖЖ с 7 Зх і Е ж «ел р ІПОЖММКМ ї; у : їж 5 : Ї ШК ПВХ МУ оту її У ї її Мо каси й ! 7 ТЯ ї ЗУ й ї РУШ ОККО г 5 НКУ Х вюею! 53 КОСТІ фетою М якої й З і; З ра - їх - і ї ТТ самою і Ж ж Р суку 0000 ВКА у шо З Тан іх Ви сучка, Ії: з Ве ЖК уд кни ж петанк, з Ж леж мих Мету В ВМ СХ уодечютвнисяя щі п їй ЗИМ Кл їв ц ях душ, ХОРИ КЕ; МОм кмвнкна Во сессоя БОМ М х ВКХМЕОКЕКЕТ ККУ МОХ ТМКЕТАМІ КЕКВ МИХ павуки
Фіг. 28 ВЕК: Н 3 Я мама ї ва сне -к и к З. шк - : 5 3 ще ж х 5 щі я ще ЖЖ ки их ; явовев : й З ї СОУ НК гу В бе ї х В ші - 5 дО КЕН В я Зк вк а ВЕ що ОК Е я - о ще я З ш 5 В ще З. «клинок щ ще Вк З ЗНКНК У ще: З З. і З ях У Б ВХ ЯЗ У КО о В щ-х як ВЗ її ЗХ звонок в МУ знах КЗ с Зк і т У в в Ох жк ж ж 50 х х КВН КН М овкинь аю «Же де» ай фе 0 ко щк : ще ЯК Ко о Шо ШК Ж ща а а а КК ее и т ЖК КО мих ше Ж ж х Ж Кк «ше ще КУОШУх Ще Оу Кох ке ща о СО їх у я о ОК в Ж с КЗ» 53 їх Ж Я Ж З що К с НЕ - «ОХ щи Ж Може Ах М ду х КУ ФК п го ОК Ж З Ко а щ Ж ко Ж ШАХ о ж ще ак в М оо «Мо я а Б НК « ки ши ши жи я ще я ще я т сх в х : У т КО
КЕ ЕКО. КЕ МЖК ХО ЩЕ: 3 : : ВЗ ж ж зи ит ХА дюн дукщрю у не МАКЖКК ши лю де Щи Квх Зк: их еру т 1 м г Ї я - ї ги СЕ я З Ї бот М і Кт ш : оон В ЕК "о сдом ШОМУ ул ї йог ДЕ Жодні нене сл х. ШОВК Шо ЕК й МАК х ЯНВ т Ї М о : ТИ ЖИ Я : КН ЖУК ВО г дише ЩО т и Мих ж : Ох пи, дж пом кити с ми о . Ж ОоЩщиУМ НК Ж С вити ЗДУ КО, ТЕХ У МАМИ шо кдд ХО ЕК, оо о ІА ЛОЗУ 2 Му ее Ми Х АХ х ! хом ник си З ВКМ юю зх шаснй о «ОПН 5 7 І Кт, т ї Її шт КИ ЖАТИ» пов нт Во се я МІНОР ЖЕНЯ. Ме ЖО ших Ок шк Фдже лимм пом т СО о пе ММ ШМИ и Мт ої ОС . МКК М МК їх - пливи, ФУ укжет лк ПО мМ 2 х ХЕ ВХ ММК конт ваЦія и ХХ конц ИН ОС ПЯКЕИ ско КВК: : й Борщ шота мих Мп Мо ди, п ЖЖ сле ЖИ г Б ке У а ш : с оОоощщі й Жди і х ки пе Ж ве Ше ЖЖ: ; З з ї я, Ок ; х Ще оз Од ЛЕ п Ж т ЩО у - М З йо їх я х од г З ді о Тож й жом Дим, є КК Ой ща й б. м Хоєкує Роше й Мк : Х я Кох КОВО оожоюох - ІІ й сх Ж. щі СН У -е Ту омфеоу : ї у ХлежА пе а Фен СК кн нан М тах В ев ХК В КК ХА Рай ня ПЕ ОУеВКкевяК - МУК хх В шахи ВМ ї їх Кене рн Ву кути КЕКВ ЮНЕ СУ Ка АН КЕКВ туя КО (МАКЕНАН
-- . 1 Ж М я ЖИ а хи Сея ро : х ї кеш т й тА дрож: г ЗИ ої х х Ки : Кк тю Х : ши, З З у я ї ї Крит ах че Ж ї х Хо 7 МОЖЕ: й 7 ої ї КУ Е Ж оипІЖ тю ДОМ шт ДИ тою што ДВІ ще І: : г КИ 7 М : Я отож Я й де вже ко ШО ою одне ОМ с БО дж к- : до КК еВ вон Кк Я Тан се ВК ш ДКС Ве Не ІК порок м Й Бе Ви М КО МОЗх п лили или ти ФМоггиат ин КК ЖК х Мом Ж Ми: І ЩА Ол ЖЖ МЕМ МИ У у юс их Кк у й ХНН ТІ ЕК тик - У х с Ж ВИ буки г БОЗВКН ПЕНКН Тр МЕЖІ еВ ре ВІК пмКеля концент ЕХ МИ Же : о її ж сх Ж а Ко ее ОО: МО що МАКИ Х т Ж ї 7 ке с ї иосмаМ « - ой є ОО « ОЙ кож И «У : М ко. ї 7 дл : г Ко пов Кс Ж и ї : што ЖЕК ФОМЖТ Акохх ЗХ ше дою хе. ЖК Бек ЗК фо оофккй под в, Я стекти ик ж тттнян ня т ВО Ол ме ЖІ ММ Ж ОО Сх кОнненток ВІЗА У омри ОКНМ уеч ЕЕ о ; МУКУ Я БВ ее РОБИ «й КБ ОХ ХЕ вах ТУ Шо 3: є жк. «МА хх с кни Ми БК Я РОБІН РОМ ек МОЯ че ОР ББ ю у ую я ки КЕКВ вуж МЕ ШУХИЮ К. сяє че БЕ ОБОВ є ХУ БМ ее АМмЕ НЕК КОМ,
Фіг. З
І чи ПІ р : сек МІ т пк м ми : ях ї. т ХХ Н є ОО ш х, Ку 1 д 7 «Ж КУ шт їх : хх х ХУ -- Ку хх Зі в де тйкткяк лето МТА й пе ще Ка нт т - ї є; Тих як : їх хо. кт кт Хотин - Ко ШО Ж щі х «ХУ : ш Ж же їх шк мо МИХ -Ї Є кот у ха я Б ї : с же БІ ж ся т Кв кт з: : ще Фсикя т Тож Я 0 ІВ еко хо ово й кош Х сої я ЗЕ 87 а Й 7 Ол фокус океан : І о ВК Ми КДКА я АС НЕ ВМ МІ АК А КА ОМ «НВ що КО поемами Б ках т й ти М А, п секс пики КВ Кк МІ и Мо у митту хОМиЕНІИ МИХ КО МНІ: ВОомНемтуев МКУ пев ані Її : ск ше СЕ оч Ж ок ше що Ж Ко: Се УМО Ка ту ЩЕ ї у : ї т з І п Ж ї х х З щ : Ї Ж КУ ї СОУ їй г х. Хо ї ЧУ ї дети же т ж й Ж МИ в То що М ХУ ї хх хо -- : ї ОМ Ї х. чн Кох м ї г п : в х моло о, ОО х м : Ї х ЖЖ і Коди ее : п Х, Є х к їх Но Кох . Ж ож: п шия у я КО Ж ТЕ. БІ шк 7 ту? КН Щі : ших ОК Що ГІ Шити им, пе й ОЙ тк УВК, теп НМ ОКО Кн ОВК ВХ ПМК же ЗК АИ ВАК ВО С СвроОК МАН ЖЕ Ж МЕ ЗК МОЖ ТИ уче кутових из вк К сх шт сипких м БЕ самку сек лн інки, Ж і сх теки ВОММЕНУМИВ МО ЗМК ХОМИН ИМ Ко ЯКІМ ОКОуВТИВуММ вах КЕ ще вщя а Ко 5 ї Кая Мо ще Ж ких Жах Ок БУ Ї як ХЕ Ї 7 х ви МЕ Е т - ях х т ти М : - я ОС ї ї щ ї Є Ж жк ї ї т ей КУ е Моск ї ч ОЗ 2 х ов ї ї 0 й т ше дЕ Ї їх ФОН х х, зу ОнЕ х У їж Ж х щей : х у - Ел кох я не Ух ТЕ Зодчих т «7 Я чеж ск тже и Ки. свв КУН я ПІКНХ ВІВК ОКО ЕВ пе ХЕ ще ШЛЕМНІМИ ТИХ ПО хо плею: ДЖ м: кимлих ем Фа сину поклик іо Да г х КОМІР ЕМИК НО КМИН конц НИХ МК є ккд Фе и 5. дих жу к їй к. з СІ й К се жи У Я БВ 0о-е ВОБУВ) як ВОЮ : ТЗ дае Ех тва ще ОДНА В ее чеки и КИ «й ТЕН хв Я Я з чи цк Я РОТІ РТМ че ВОНО Я че УЦНЯ Я МВ ВТО с у. ОБДВО З кої кА и. с - я ЖК МАО ОТО я Внмт него весь ще
Фіг. 30 продовження
ІНН: КУ ї зі Ким МАК; ке посол СНИ Ф вит "Зава щКВ - ЗУ За ІН Е КЕВНН КВ у УЕВЕ СУ 7 МАУ хх шення куми тка грі о ек у ко зиие АКЛК Я в ту кі О МК ВН чення « ВЕК т рі з о ях рухах кої и дотику д 2 ТЗ т з ди ери . Ми ях . У С ї що : І й а Харк Ух т ХХ ши Ж. корка д : ЗЕ данних З х Н ; нт Ки - ї Мои щ ї й ОО с сек Си за ізвау. кучКире я : г У . тітки сито в ак Я ФТНЗКЖЮМЯМ осн ож ВМ нг хх ФК ФЕО ї пет Хо З й ї КЕ 35 ЕН Ж деяется ш і сек х ХЕ ооо 7 Ж ! м з В тод : МКМ У ш Хот рОжЖя у і я, Ж ж ОВК 5 я Н ж х Б я с ШК ОВ же Робоюреие А х шт Сюди : «ФК ення Коди тнчтнккжккюкту де Ї в КУ пох жох них МІК Контент п ОЗМе ж Цх ее Ти еееееетттвосня тут, це жере сяОНеКОСНе зони МИЗ СКЕЛМН ; пк КщЩЯ ЗЕКЕЕВМЯ НИХ СУБТИНТЮ хеваде чма Ж КаЕ НКТ «епох МЕ ВЕКНЕ. ИНА БЕ у
КК . хе ю іа ух т ТАТУ: ПЕК: ЗМК ОВ ня е БЕЗ ЩА « ЕКЕКаЦВ що 1 щею ПЕК щі ї . ЖЕО ще ї вел ЕХ ж МК И іезкорноци БЕЖ Жов жти ти І товари ТТДОЕКІМИ ХМ нн - БУХ - Ки СНД ко БМВ пкаКтух я пики шХ МЖК Одес я х ех КТ Я и жжшитуУлі ій ; МЕТ ха с МЖКЕ Я ов У ВЕН її : й Х дич ; тх і ит, ОК Оу ї М ї ДМ ВИ КИ. : ОН дотик Ж хости "З Я м шк ї КГ ТЕ хи КК ВОВК еко Вод ей питне З Божик КЗ ТОЖ ик в : дих Ж ї сей ОК ж ї Бе : ке Жде 5 и хо си: М 7. Ку ок що Х М: «ШЕ ою ї ї Б шк шк І : ду де ЖК лях с 35 «Бодя ти и ДУ Ко ЕК. Км ик. с. ЯКИХ сивини им екю Мво нео ще ОО не Ми дув кошстімлавм м Мт п кон оте В КК хенденувеия З МИ ВНУ ННВИ ІК ТЕН ве : х ПВЖХЗОВ : : 4 МЕМ шк окт іздхоуу ух Зх коту пеМУх кана КК КУТКУ пен МЕ ше ВЕ ВОХКІ РЕВЕ НА ВК 5 да в: х пами чу СИ т ікри Маму бро Я а МІ хім тво МК ОВ одер ЕЕ Та КС ких та І жа ори Й ї вт МТА й : їР В тв. Ї одини ОЗ ї с нт дае ду жежМИ КО З кум Ж а МБТІ НУ. ху ВЖК я датами ЖК НЯ я К КК НЯ ХІУМУКИ УКеМУМ М ; кН щ і 1 5 ї ЇХ Ї дк ї ЗЕ ЩОКИ - Ї Іа ї Одже ЖОЖЖКМ оо с МИ БИ ПН о їж ЯКЕНК соки ! т У? «й СХ «Ж за плтлт кю юки ду З цю ке ВУ зеш З Е х ху 1 З це НКУ З як кенук по ацея ВЕСЬ ТАН Я са п км ДВУТЮКЕА ВЕ СВЕОВНХ хонцкнувація КЗ ЖЕН; ях
Фіг. 1 вон і ой : ва пф, М Ж а щої ЯКЕ ря В хе ВВ я й З Е я ї дено о Ко і ї ї Я х че В Я жов Ж Кв и ши І Я Ей Ж ДЕК ння ! и а в Їх В нннтутіуттттссіуооооттотттреттссптторооттсотетртессттн, ВІВ Клоун ул тА КАК ААА тА тнто, ЗНЗ еа ДЕК В КН зовкентвонія Вб учений я; я: вн КОВО дну. дж ЗЕ Ану ЖЖ х З Ко хлор Б ща в Я боже м Я ВЕ Бо зе Дня яке каеух ЩО Й одн ів а ав вв Ек ої во В Ха ВИНА В ПКТ Нема
Фіг. 32 МНН і " як ш : о і ! що 1 ї в
Є. я ТОЖ їх ; сх ПО зх КІ НН С й . Ж 0 їж ж ВВ . . в а й бо свв М а ев А ж а ой с МК, -Е є м и я с ж са є 5 ж макрофаги МУ
Фіг. 33
ЩЕ ско мк ючклутя Кт | шщ вм ОВ ее ВІН Я е я шко З ! а ЕМВ ОКО 4 ; ж ях З ще СТА й з 5 з Щ Б З т 5 300 т. Бк : чу хт ї 0 Б З г Ц - ву о 5 3 С й у сьуюве ЗК лики. КН ко хх осо ВВНКХ со пос КН со кни ше шк шк шу ши ах що ах ях «Х -е аа ж У о В в я й А е є КИ КС: А і ну КЕ є Ся ох Б «я
Фіг. 348 кавомая й і в й і т ет Е Ко
: х. | ей ! с й ша ше 1 ОО ЩЕ Б СЕК Ч ще. УААН Ва. не вен Бар ану: з пожае ав: жк вій Ек Я Е | Ве і Я й З я о ї ТЯ / Е: Є Ї ї і че Ох кох й о І сш Кя м щи РЮМСННЕ ЗЕ З сові оват шко ден а ; х БЕ | ЩЕ х і іще с !
! . Ве БО !
У.) СС,
и і. я Ж в ж ся М нн ях, а» Я С, ка у ши ще ж і. й о І Я У в; ки о т КЗ йо я й С доддннни ве ше хо Ба ба б ох
Фіг. 35
Загальна популяція Т-клітин оотв вх Бо Зх і З -- ' -х У
Ж. Хі х | ххх А Бо зе щОБ 8. ще ЖЕ і і
ВК. в хх й не А вв з: с їх КО ВК В. ЗВ ЗНО є зе Б 1 у - ЩЕ БУК З Ж ЖК ни ни их ек Е У : ЖК Оу» Н зх хх. ще Б Б З Б 5 Кі... В В Б су. КУ х Ж ЗЕ ЕЕ 5 ЕЕ Ж Б т ЕЕ Б ОХ я 55 зо БЕ іще Ж ББЖ ж З З З їх ї оо и ее Ж рю фе Ж ЖБББО Хмнни: ее фс ех Бе фе й «ве. Зк З доме ие ек Зою не ЇЇ В М Б Б Б В "ве 5 1 Ж же шк жк Зк ек ех І ЕЕ 5 В В НК ВК НН КН ЯК в МАЯ Внх КН ВВ. КО хе око уж " фЕ ; з ух ок шо ув ШК; о 0 Я а Ка кишка шк. я Кк а КК ОО у ИН КО ож ШИ ОО ак кс Ж я Ж кН ки с: ех 1 хо ее ГА щ Би Ше як ще я в «У Б я в-з вних 18 я їх є і т 5 і як - Х : ж ЖЕ А ! Я ов СВ «хо й че МО у и В В В ою ОТ в. Вяах шк Кк НК. Ж В ее ни ех Бо ї В зе В БК ше ов і Но Зм ек о Се их хи Дх ж хх В ее У У я вооває х звобоя Зх 3 М ЖК ек жи з ше Ж з нн Зни Зее н х 5 3 и Ши Хек Мих КМ КК Ж Я 0. ВК ЕХ 5 ВО Б 5 Мі ве В ОК ще ЩО ЗК В У їх 5 ЩО БО щ В» щи Зх 5 58 85 5 З Б ше 5 ж їі Б ЖЖ ХК Я Не ек же т х й Пе и них Зх ех шен рек МЕ 7 Б шк ек бю меш вне шк Кк ж Ж пк ех Бохю омек ше ою ее и Іп185 55585 55 5 ще х- | Зк З В ЩО ЗК КЕ 7 ЖЖ ж БК Я Б ен І ЖЖ ШЕ З ОК ше ох 1 Б ж 5 5 Б З ва др НН. ЯН ВЩИН-- ЯН ЯК А ЯВИ ВІ -ЯЕК ЯК -- Я НК Я-- х Ж ще х з щг ку Я т - 5 Мов СЕ сх «3 жк ж хв жк о в С Ж как ОВ я К-Я ЩЕ и Я Я ще й й а я з че «оо ОК ай я Я Є т Ян ЖЖ а Як зей Же и ще СО « я ж х Ж Х хх ня х я «х Б ек Е - «і ; я
Чиг. 6
З СЯ е ще Б « вшої ЗИ шЖІ : Жох я 5. вису ЕІ т Вк. хх 5 " ж і х СУК с-ео ХХ хх МА хе « хо сх мін; Ж : КУ зх Жті те х З хх Во 5. 5 ; КА ЕІ хе их г ЩО Я ех ХХ я тя Хі Ск ша ше Я жі ЩЕ ЯК у уко рот Ша ЗО ж Кл В В З - Ин зво У г ек ЯК ВН. осв, ЖІ В НН З судну ХЯВ Же ВЕ ек сонна Б ше Я Зо зак ак І я М 5 З УК І Я У ЯЗ ЗНО шщ Я де не ж їж 5 З 5 І Я З й ЯКО ЖК з Яни Ян З ГЕ ї ше Ме З вк Я З ха НН В Як; Я :с Янв п Як: ЗК Яке З ЗК Зх 18 Б о а З З ках ОН ЯК -Е ШК ЕЕ: З З З х х І ВЕ З а з у ЗКУ ах сх У з З яв Янне ЗЕ ЗК хі ЩЕ ще Ве З В З ак в ай її Ж З жк ПИВО Хо ТВ ще Я що и З КОНЯ я. КК КВК ВК ЯК де зн ак РІ ВЕ В «я ОО й Шок само Ж ООН ще З ще З а В е - шою КОНЯ с ів в б а У М а Я ВК ЗЕ Я ЗВ ще р: ее КОМ КУН В Ко що х си Ну ж я ОО Ж СК ва ся ха їх г х МА ще - я Ка ще Ж ШК ше ох Й з 7 о СНИ ка ще «Ка що СІЙ А ще ОДН КоЯ Ме хе я Са ям з Ки кюч СОТ беж кі ї їх я сх їх к ! жі ж Жкх ше: зах з й . зне АВК, . ї зних Ж Х й ВК рдок ВК -ЯВВ в шо ї х х ях Же ї Як Як ек ЖН ЖОВ ах ЩІ Я х ї Ж Ж Зк В Зк НК ЖЕ НУ Кк х Ї шої я ОЇ Як ж Я Ве Знак У І ве; іде Ж: ох ЖЖ: хх ЩЕ ВВЕ З С у Мк і Я ко йо З 1.0 хх МВ ви ше з Я Я. и: о ВОНО кох КК ї З ЕВ С ях Вк Во йо о - ВВ де ще З ен У М Не Ше я: МІ ЩЕ: Не Щек З ЗХ і Вк дк В вк ЗА -- КІВ Я ЩЕ Я як ЖЖ 3 ек. ЗВ Як ак З Зх Б ях Б ОХ ЗК ЗХ У ДЯН НИ НН Ж І Ж зе ЗО ЗЕ Х ж Зі ЗЕ Ян ЗХ де и зо «Б мок я КВ ООВКОВК 5 1 ех З не я са «а АК ОО щ «й я Же Я З хх Ж ще не ДАК Вк и я я ЗИ КЗ ЗАВ НИ Я ЯК Н.Е - БЕ ВЕ В З В В Е ОК КО З що х ще ЯК ОВК ЗК кк 01 З ЗЕ В ЯК ях я я ОО в Я ФК ш з Я Я ЯК З я же ах КОСИ КИ ко ЯК СУКА УНК ЯКА. Ем Я КШНй У КО КО хх КЕ их 7 я я Ж я ЗИ се м НЕ У Я У о ОК Кей У Со МО вза Я Ж я я Ка ою шо ще а Я ду І ки ша те ТЕ се КЕ х «Б сх хх ; з. же Ж І а хх ЖЕ що х т ях Зі я Ї й хх 7 ЖЕ - ї я Зоо ї ЖЖ 1 В як ж «хх ВК ВЕ ВЕ Ме о ЖЕ а і: жи і МН НЕ ВН ЯК зб ЗК хх - з МЕ і Є їх не не В а а Б ВЕ | ї ЕХ | І - т Ки Я фек Зк ве Зк НЕ хе ХХ хдя В ох х Ж Ж с ЗЕ ЗЕ ЗК В ЯК НН ЗК ГУ і з» я Що Ба як Х 3 ї хв Я я ще Зв я Ж Ж Я хо Жах 0 Бест с: МК ко соб» Ей В В ЗБЕ Зк що ще їщжа М зом З че Б с ЗН шо М В В ЗХ о ВН УНК ЗК Як нх к їх сю Нв о: Ви: х Ж. 1 шк о же МКЯХ уки ЗКУ МАК ТНК А ЯК Я Зк Ве КЕ І ОВ В ВН и, ВЕ ХЕ шо 5 ще о ек З Зо СС уж вкх. ко Ве яви з ВК хх 15 я ВО ах В ЗХ Ох о й я а зх. НЕ ВНУ ЗНЗ де Зх ж 15 5 в дк КУ ОА З Ох зі В ВЕ В НИ ЗЕ т 1 В Ве З З З Ка МО Я я хх Ку тиконя Я ІК Б В В ЗХ Я ЗНА З ОБ ах Од ох х о па до Кк Ки СХ як. я КИ ЗНЗ о ВК Я ЯК я ОО КОКОС а Ж ех ех аа 5 їх Ж о т я КК СЯ Ся - Я КУЩ Ж ЗШ КОН а х во З КЗ Ж МО У х ОА Кк ик з ЕЕ с Кх де ох ФО З Ка ще - КЗ их С (2 х а КУ - я см ролів ЄВА на миківнаму пінні Тнонреаоів Ома хоакужмему зів ЩО з ши вк НОС оон ї ЕК веб іМЬОВе ОО !
З. ж і В. ! С КЕ я ож з Кв К ТЕ ях уововово В т Ц 11 га. КУ ЕТ у ще Як 5 ВЕК ЩА ЗО ФО ВВ схову БІБ. о ді ВО но СИ у |! ЕЕ Осн хх е З ооо ооо ооо Бій х М «ую кексу ик укл рт тт ж й ЕНН УНК йо фо в щех х х у ух х У Я ЖЕ ах Кая й нм НК Кв ЇХ Ж Як С я СО ; ЕЖ готи ; с зе Превнрераців СОЯ навзакідному сіні а як во Щі «Ко ! ! Я МЕС шо, з ееодох т ій - зВоВ ОВ З ях М ххх х В я Ж в 3 Зв З Щи З вав ВЕ ов З зак. я. Я М пи, ш. їх -щ. ТХ ож 1-Х К жк 5 с Кт ОХ щен за і беж З т вав 0 НЯ обо Він Ве їх І шен МН " Ж є НН пуер юхрєкютюєкю усна я кн дрантя БУ дісннн ЮА яко В ХЕ х І : А а ам ге дби с ШК ще ох ДОЩ їх 7 У Кох я я Ко в щи К Ку а ее «ак м
Фіг. За
Є х « г Ж 0000 РВИЗІАВ у, во б'нююни -х | ТО Бе кремом рено г х ї : п Гук екиміят Зк яЗужКки ГК ще КІ ї ве КУ : - детеци 3 КВУ ек іа й Но і ВК ім ни
Ба . В. Божко фа; Но Б ою е ожина рН: ЗОВ Ж Ж що фран НЕ, КО фр дувтрннннттня сіва ев щої З Віда пан Ка онанаанння потіти інн хниН А Хто АкрівоавкдвовакнккАТТККЯ Ж ; ; ; т Ковтреь: МАВ ЗБ5ОВ із вів сни дме онаний да КІ ВНТУ ех св я Й я С т я і з ке що зов н іш шен сени ден Я ше Це ке ее вв ТИ 7 Хо 8 ОКО НИ дяки ху ЯН З де В У "в ках де В ней й НН ОС ск М КТЕ Є "В З а оо В ни
Фіг. 38 бе ша: шиє феййНВ ; кі с фену З к КЗ що зе. Кей ж ее й З : щік є й
Фіг. 40
ЗЕ нн нн ннтнннннненннн кет се с ! ща кВІмиЗ Фе : : яр Є див: ї Ж ОН . З ВЕ 5 :
ВВ . ш ОВ і ші и щі що : І и щ є. ща ! ще ІК ЯК Є що : р : ВВ Б КІТИПИМИ ШИ ТИ : ф ОМВО. «н- НВК ВО... я «В ов ве Фо в г х с Є вх с ре « й «Й І «
Чит. А і МОм МмІУД ТО ЗІМЕЖВ ТВО М ПЕК сОМЕ ВМОТСЕВОВЕ Зі мжкоивоюоМ ТоВІсВОосСко ШеАзБМБОуно темажсосте ОКНСроАТСВ ТЗІ МОЕСТСКОО ШеТЕЖОСКОС СуОТянООКА ЗІСВІЖТМВ ЗощЕнУ УЮ ТІКЖВІБЛАКХУК ЗРАГНОЖВОАВ ЗУТРКАВАНЕ ШОБЖеОТІВЕ КОЛМТаТАВ. ПІ БЕМТЕТТЬЕЖ БУЧЕЩОВККІ ЗТІРКОБЕШЕ БУК ІНХ СООВЕВЖБЕЖ
Фіг. 42 Мед ще У УС АКУКК РОМА КУ У АВК Ж МОР УВУ ЕК ЖОВТЕ АХ ВІКУ КІМ ЕХКОаАТ САМО УКА ПІ ВОБУНІМвХ
Фіг. 45
UAA201902889A 2016-09-23 2017-09-22 Зв'язувальна молекула, яка модулює біологічну активність, що експресується клітиною UA127449C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16190499 2016-09-23
PCT/NL2017/050634 WO2018056821A1 (en) 2016-09-23 2017-09-22 Binding molecules that modulate a biological activity expressed by a cell

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA127449C2 true UA127449C2 (uk) 2023-08-30

Family

ID=57132987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201902889A UA127449C2 (uk) 2016-09-23 2017-09-22 Зв'язувальна молекула, яка модулює біологічну активність, що експресується клітиною

Country Status (19)

Country Link
US (2) US11685786B2 (uk)
EP (2) EP3515951B1 (uk)
JP (2) JP7305538B2 (uk)
KR (1) KR20190065318A (uk)
CN (2) CN109983033B (uk)
AU (3) AU2017332452B2 (uk)
BR (1) BR112019005895A2 (uk)
CA (1) CA3038020A1 (uk)
EA (1) EA201990578A1 (uk)
ES (1) ES2981272T3 (uk)
IL (2) IL311603A (uk)
MA (1) MA46278A (uk)
MX (1) MX2019003241A (uk)
NZ (1) NZ751956A (uk)
PH (1) PH12019550044A1 (uk)
TW (1) TW201920653A (uk)
UA (1) UA127449C2 (uk)
WO (1) WO2018056821A1 (uk)
ZA (1) ZA201902146B (uk)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102435324B1 (ko) 2015-01-20 2022-08-23 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 종양 괴사 인자(ｔｎｆ) 수퍼패밀리 수용체 결합 분자 및 그의 용도
ES2858091T3 (es) 2016-06-20 2021-09-29 F Star Therapeutics Ltd Moléculas de unión que se unen a PD-L1 y LAG-3
TW201831513A (zh) 2016-06-20 2018-09-01 Ｆ星貝塔有限公司 結合物件(一)
KR102632202B1 (ko) 2016-07-14 2024-02-02 젠맵 에이/에스 Cd40 및 cd137에 대한 다중특이적 항체
GB201612520D0 (en) 2016-07-19 2016-08-31 F-Star Beta Ltd Binding molecules
EA201990578A1 (ru) 2016-09-23 2019-10-31 Связывающие молекулы, которые модулируют биологическую активность, проявляемую клеткой
BR112019017628A2 (pt) 2017-02-24 2020-07-07 Macrogenics, Inc. molécula de ligação a cd137 x ta, composições farmacêuticas, uso da molécula de ligação a cd137 x ta, molécula de ligação a cd137, uso da molécula de ligação a cd137, molécula de ligação a her2/neu, uso da molécula de ligação a her2/neu, e uso de uma composição
KR102629972B1 (ko) 2017-04-13 2024-01-29 아게누스 인코포레이티드 항-cd137 항체 및 이의 사용 방법
EP3649156A1 (en) 2017-07-06 2020-05-13 Merus N.V. Antibodies that modulate a biological activity expressed by a cell
CA3071211A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S Binding agents binding to pd-l1 and cd137 and use thereof
WO2019121906A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 F-Star Beta Limited Specific pd-l1 binding sequences inserted in a ch3 domain
JP2021519610A (ja) 2018-03-30 2021-08-12 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ 多価抗体
SG11202009525VA (en) * 2018-03-30 2020-10-29 Eureka Therapeutics Inc Constructs targeting cd22 and uses thereof
EA202092420A1 (ru) 2018-04-09 2021-01-28 Ориджинселл Терапьютикс Ко., Лтд. Антитело против pd-l1 и его применение
JP7332194B2 (ja) * 2018-06-29 2023-08-23 スーチョウ スマートヌクライド バイオファーマシューティカル カンパニー リミテッド Ｐｄ－ｌ１結合ポリペプチドおよびそれらの使用
JP7360440B2 (ja) 2018-07-12 2023-10-12 エフ－スター セラピューティクス リミテッド Ｐｄ－ｌ１及びｃｄ１３７に結合する抗体分子
GB201811404D0 (en) * 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd Anti-CD137 Antibodies
GB201811408D0 (en) 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd CD137 Binding Molecules
EP3636320A1 (en) * 2018-10-09 2020-04-15 Numab Therapeutics AG Antibodies targeting cd137 and methods of use thereof
TWI839395B (zh) * 2018-10-09 2024-04-21 瑞士商Ｎｕｍａｂ治療公司 靶向cd137的抗體及其使用方法
MX2021005085A (es) * 2018-11-06 2021-11-04 Genmab As Formulacion de anticuerpo.
AU2020276500A1 (en) * 2019-05-10 2021-12-16 Lyvgen Biopharma Holdings Limited Humanized anti-CD137 antibodies and uses thereof
CN118791614A (zh) * 2019-06-26 2024-10-18 圆祥生技股份有限公司 T细胞活化抗体
EP4041772A4 (en) * 2019-10-11 2024-04-24 Nanjing Leads Biolabs Co., Ltd. 4-1BB-BINDING ANTIBODIES AND USES THEREOF
JP2023513896A (ja) * 2020-02-04 2023-04-04 ジェンマブ エー／エス 療法において使用するための抗体
EP4106813A4 (en) * 2020-02-21 2024-03-27 MacroGenics, Inc. CD137-BINDING MOLECULES AND USES THEREOF
US20230172189A1 (en) * 2020-04-28 2023-06-08 Ohio University Methods for Extending the Shelf-life of Stored Donor Blood and/or Red Blood Cells and Treated Red Blood Cell Compositions Produced Thereby
AR122132A1 (es) 2020-05-21 2022-08-17 Merus Nv Métodos y medios para producción de moléculas tipo ig
IL300225A (en) * 2020-07-31 2023-03-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A pharmaceutical composition including chimeric receptor expressing cells
CN112225813B (zh) * 2020-10-21 2021-12-21 北京智仁美博生物科技有限公司 针对破伤风毒素的抗体及其用途
EP4262853A1 (en) 2020-12-16 2023-10-25 Merus N.V. Multispecific antibodies for the treatment of cancer
US20240309115A1 (en) 2021-03-31 2024-09-19 Merus N.V. Novel multispecific antibodies
WO2023146394A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Merus N.V. Combination therapy for the treatment of cancer
WO2023225098A1 (en) * 2022-05-18 2023-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen binding molecules that bind cd38 and 4-1bb, and uses thereof

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6984720B1 (en) 1999-08-24 2006-01-10 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies
BR0108001A (pt) * 2000-02-01 2004-01-06 Tanox Inc Moléculas ativadoras de apc com ligação para cd-40
SI1523496T1 (sl) 2002-07-18 2011-11-30 Merus B V Rekombinantno proizvajanje zmesi protiteles
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
AU2005327973A1 (en) * 2005-02-23 2006-08-31 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents for modulating biological activity
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
EP2860260A1 (en) 2008-04-11 2015-04-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
PT2147594E (pt) 2008-06-27 2014-02-17 Merus B V Mamíferos não humanos que produzem anticorpos
CN102245640B (zh) 2008-12-09 2014-12-31 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
MX2011009729A (es) 2009-03-20 2011-10-14 Genentech Inc Anticuerpos anti-her.
KR20130087517A (ko) 2010-06-25 2013-08-06 백시바디 에이에스 동종이합체 단백질 구조물
NZ714128A (en) 2010-09-09 2017-10-27 Pfizer 4-1bb binding molecules
EA035344B1 (ru) 2012-04-20 2020-05-29 Мерюс Н.В. Способ получения двух антител из одной клетки-хозяина
WO2014116846A2 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
CA2899577C (en) * 2013-04-03 2023-10-17 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
AU2014343636A1 (en) * 2013-11-04 2016-06-02 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Production of T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
WO2015095423A2 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
EP3686219A1 (en) 2014-02-04 2020-07-29 Pfizer Inc Combination of a pd-1 antagonist and a 4-1bb agonist for treating cancer
JP6629187B2 (ja) 2014-04-07 2020-01-15 中外製薬株式会社 免疫活性化抗原結合分子
US20150307620A1 (en) * 2014-04-16 2015-10-29 University Of Connecticut Linked immunotherapeutic agonists that costimulate multiple pathways
EP3623386B1 (en) 2015-01-08 2022-04-13 BioNTech SE Agonistic tnf receptor binding agents
GB201500319D0 (en) 2015-01-09 2015-02-25 Agency Science Tech & Res Anti-PD-L1 antibodies
JP2018503399A (ja) * 2015-01-14 2018-02-08 コンパス セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー 多特異性免疫調節抗原結合構築物
US20180044429A1 (en) * 2015-03-09 2018-02-15 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
JP6955445B2 (ja) * 2015-04-07 2021-10-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド アゴニスト性の活性を有する抗原結合複合体及びその使用方法
US11008396B2 (en) * 2015-05-21 2021-05-18 Alligator Bioscience Ab Polypeptides
SI3303396T1 (sl) 2015-05-29 2023-01-31 Bristol-Myers Squibb Company Protitelesa proti OX40 in njihova uporaba
MA43017A (fr) * 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Anticorps bispécifiques spécifiques d'un récepteur de co-stimulation du tnf
CN108271377B (zh) 2015-10-07 2021-11-19 豪夫迈·罗氏有限公司 具有针对共刺激性tnf受体的四价的双特异性抗体
US11447557B2 (en) 2015-12-02 2022-09-20 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
US20200048345A1 (en) * 2015-12-28 2020-02-13 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
AU2017207318B2 (en) * 2016-01-11 2023-12-07 Inhibrx Biosciences, Inc. Multivalent and multispecific OX40-binding fusion proteins
MX2018008308A (es) * 2016-01-11 2019-05-15 Inhibrx Inc Proteinas de fusion de union a 41bb multivalentes y multiespecificas.
EP3445788B1 (en) * 2016-04-22 2022-01-19 Alligator Bioscience AB Novel bispecific polypeptides against cd137
AR108377A1 (es) * 2016-05-06 2018-08-15 Medimmune Llc Proteínas de unión biespecíficas y sus usos
TW201806972A (zh) 2016-05-27 2018-03-01 美商艾伯維生物醫療股份有限公司 雙特異性結合蛋白
WO2018045110A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EA201990578A1 (ru) 2016-09-23 2019-10-31 Связывающие молекулы, которые модулируют биологическую активность, проявляемую клеткой
CN110305210B (zh) 2018-03-27 2023-02-28 信达生物制药(苏州)有限公司 新型抗体分子、其制备方法及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
MX2019003241A (es) 2019-11-12
IL265541A (en) 2019-05-30
BR112019005895A2 (pt) 2019-06-11
EP4342912A3 (en) 2024-05-22
US11685786B2 (en) 2023-06-27
JP2019537429A (ja) 2019-12-26
US20200017595A1 (en) 2020-01-16
CN117510643A (zh) 2024-02-06
US20240209105A1 (en) 2024-06-27
EA201990578A1 (ru) 2019-10-31
JP7305538B2 (ja) 2023-07-10
IL265541B2 (en) 2024-08-01
TW201920653A (zh) 2019-06-01
EP3515951B1 (en) 2024-02-28
AU2017332452B2 (en) 2021-01-07
IL311603A (en) 2024-05-01
AU2024220074A1 (en) 2024-10-17
WO2018056821A8 (en) 2019-05-02
IL265541B1 (en) 2024-04-01
CA3038020A1 (en) 2018-03-29
AU2017332452A1 (en) 2019-04-11
AU2021202085A1 (en) 2021-04-29
AU2021202085B2 (en) 2024-07-11
MA46278A (fr) 2019-07-31
CN109983033B (zh) 2023-10-31
EP3515951A1 (en) 2019-07-31
EP4342912A2 (en) 2024-03-27
ZA201902146B (en) 2024-08-28
ES2981272T3 (es) 2024-10-08
CN109983033A (zh) 2019-07-05
NZ751956A (en) 2022-01-28
PH12019550044A1 (en) 2019-11-11
JP2023116811A (ja) 2023-08-22
KR20190065318A (ko) 2019-06-11
WO2018056821A1 (en) 2018-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA127449C2 (uk) Зв'язувальна молекула, яка модулює біологічну активність, що експресується клітиною
KR102564097B1 (ko) 항 gpc3 항체
US20240034794A1 (en) Binding molecules that modulate a biological activity expressed by a cell
CN110950953B (zh) 抗b7-h3的单克隆抗体及其在细胞治疗中的应用
CN108373504B (zh) Cd24特异性抗体和抗cd24-car-t细胞
CN106574272B (zh) 靶向多样的多种抗原的通用嵌合抗原受体表达性免疫细胞及其制造方法及其在癌症、感染和自身免疫病的治疗中的应用
CA3123303A1 (en) Antibodies and chimeric antigen receptors specific for receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1 (ror1)
WO2020083406A1 (zh) 靶向cll1的抗体及其应用
TW201920275A (zh) 藉由細胞表現之調控生物活性的抗體
US20230071098A1 (en) Anti-gpc3 single-chain antibody-containing car
JP2021519289A (ja) ガイダンス及びナビゲーションコントロール蛋白質の生産及び使用方法
TW201920657A (zh) 藉由細胞表現之調控生物活性的抗體
JP2020506697A (ja) 改善された抗体結合ｔ細胞受容体構築物およびその治療用途
US20240141038A1 (en) Antibody against nkp46 and application thereof
WO2023138661A1 (zh) Nkg2a抗体及其应用
US20240034790A1 (en) Antibody specific for cd47 and uses thereof
US20240018262A1 (en) Antibody specific for gpc3 and uses thereof