BR112019017628A2 - molécula de ligação a cd137 x ta, composições farmacêuticas, uso da molécula de ligação a cd137 x ta, molécula de ligação a cd137, uso da molécula de ligação a cd137, molécula de ligação a her2/neu, uso da molécula de ligação a her2/neu, e uso de uma composição - Google Patents

molécula de ligação a cd137 x ta, composições farmacêuticas, uso da molécula de ligação a cd137 x ta, molécula de ligação a cd137, uso da molécula de ligação a cd137, molécula de ligação a her2/neu, uso da molécula de ligação a her2/neu, e uso de uma composição Download PDF

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Liqin Liu
Chia-Ying Kao Lam
Gundo Diedrich
Leslie S. Johnson
Paul A. Moore
Ezio Bonvini
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Abstract

A presente invenção refere-se a moléculas de ligação que possuem um ou mais sítios de ligação a epitopo específicos para um epitopo de cd137 e um ou mais sítios de ligação a epitopo específicos para um epitopo de um antígeno tumoral (ta) (ou seja, uma molécula de ligação a cd137 x ta). Em uma realização, essas moléculas de ligação a cd137 x ta serão moléculas biespecíficas, especialmente diacorpos tetravalentes biespecíficos, que são compostas de duas, três, quatro ou mais que quatro cadeias polipeptídicas e que possuem dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de cd137 e dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de um ta. Alternativamente, essas moléculas de ligação a cd137 x ta serão moléculas biespecíficas, especialmente moléculas de ligação trivalentes biespecíficas compostas de três ou mais cadeias polipeptídicas e que possuem um ou dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de cd137 e um ou dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de um TA. As Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são capazes de se ligar simultaneamente a CD137 e a um TA. A invenção refere-se a composições farmacêuticas que contêm quaisquer dessas Moléculas de Ligação a CD137 x TA. A invenção refere-se, adicionalmente, a métodos para o uso dessas moléculas no tratamento de câncer e de outras doenças e condições. A invenção também provê novas moléculas de ligação a CD137, e moléculas de ligação HER2/neu, bem como a derivados destas e aos usos destas.

Description

MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A CD137 X TA, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, USO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A CD137 X TA, MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A CD137, USO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A CD137, MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A HER2/NEU, USO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A HER2/NEU, E USO DE UMA COMPOSIÇÃO
REFERÊNCIA CRUZADA COM OS PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente norte-americano Nos de Série 62/463.353 (depositado em 24 de fevereiro de 2017; pendente) e 62/597.594 (depositado em 12 de dezembro de 2017; pendente), cujos pedidos são pelo presente incorporados por referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA COM A LISTA DE SEQUÊNCIAS
[002] Este pedido inclui uma ou mais Listas de Sequências referentes à 37 C.F.R. 1.821 et seq., as quais são reveladas na mídia de leitura por computador (nome do arquivo: 1301_0149PCT_ST25.txt, criado em 11 de fevereiro de 2018, e que possui tamanho de 309.094 bytes), cujo arquivo é pelo presente incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação que possuem um ou mais sítios de ligação a epitopo específicos para um epitopo de CD137 e um ou mais sítios de ligação a epitopo específicos para um epitopo de um antígeno tumoral (“TA”) (ou seja, uma “Molécula de Ligação a CD137 x TA”). Em uma realização, essas Moléculas de Ligação a CD137 x TA serão moléculas biespecíficas, especialmente diacorpos tetravalentes biespecíficos, que são compostas de duas, três, quatro ou mais que quatro cadeias polipeptídicas e que possuem dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de CD137 e dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de um TA. Alternativamente, essas Moléculas de Ligação a CD137 x TA serão moléculas biespecíficas, especialmente moléculas de ligação trivalentes biespecíficas compostas de três ou mais cadeias polipeptídicas e que possuem um ou dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de CD137 e um ou dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de um TA. As Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são capazes de se ligar simultaneamente a CD137 e a um TA. A invenção refere-se a composições farmacêuticas que contêm quaisquer dessas Moléculas de Ligação a CD137 x TA. A invenção refere- se, adicionalmente, a métodos para o uso dessas moléculas no tratamento de câncer e de outras doenças e condições. A invenção também provê novas moléculas de ligação a CD137, e moléculas de ligação HER2/neu, bem como a derivados destas e aos usos destas.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO
[004] CD137 (também conhecido como 4-1BB e “membro 9 da superfamília do receptor de TNF” (“TNFRSF9”)) é um membro do receptor coestimulador da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, que faz a mediação da coestimulação de células T CD28-dependentes e independentes (Vinay, D.S. and Kwon, B.S. (1998) “Role of 4-1BB in immune responses,” Semin Immunol. 10:481–489; Bartkowiak, T. et al. (2015) “4-1BB Agonists: Multi-Potent Potentiators Of Tumor Immunity,” Frontiers Oncol. 5:117; pp. 1-16; So, T., et al. (2008) “Immune Regulation And Control Of Regulatory T Cells By OX40 And 4-1BB,” Cytokine & Growth Factor Rev. 19:253-262; Croft, M. (2009) “The Role Of TNF Superfamily Members In T-
Cell Function And Diseases,” Nat. Rev. Immunol. 9:271-285; Yonezawa, A. et al. (2015) “Boosting cancer immunotherapy with Anti-CD137 antibody therapy,” Clin. Cancer Res. 21(14):3113- 3120; Li, S.Y. et al. (2013) “Immunotherapy Of Melanoma With The Immunecostimulatory Monoclonal Antibodies Targeting CD137,” Clin. Pharmacol. 5:47-53; Vinay, D.S. et al. (2012) “Immunotherapy Of Cancer With 4-1BB,” Mol. Cancer Ther. 11:1062-1070; Houot, R. et al. (2012) “Boosting Antibody- Dependent Cellular Cytotoxicity Against Tumor Cells With A CD137 Stimulatory Antibody,” Oncoimmunology. 1:957-958; Kwon, B.S. et al. (1989) “cDNA Sequences Of Two Inducible T-Cell Genes,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:1963-1967; Chen, L. et al. (2013) “Molecular Mechanisms Of T Cell Co-Stimulation And Coinhibition,” Nat. Rev. Immunol. 13:227-242; Yao S. et al. “Advances In Targeting Cell Surface Signaling Molecules For Immune Modulation,” Nat. Rev. Drug Discov. 12:130-146).
[005] CD137 is inducibly expressed by T cells, natural killer (NK) cells, dendritic cells (DC), B cells, and other cells of the immune system (Vinay, D.S. et al. (2015) “Therapeutic Potential Of Anti-CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibodies, Expert Opinion On Therapeutic Targets,” DOI:10.1517/14728222.2016.1091448; pp.1-14; Wang, C. et al. (2009) “Immune Regulation By 4-1BB And 4-1BBL: Complexities And Challenges,” Immunol. Rev. 229:192-215; Sallin, M.A. et al. (2014) “The Anti-Lymphoma Activities Of Anti-CD137 Monoclonal Antibodies Are Enhanced In FcγRIII−/− Mice,” Cancer Immunol. Immunother. 63:947-958; Melero, I. et al. (2008) “Multilayered Action Mechanisms Of CD137 (4-1BB)-Targeted Immunotherapies,” Trends Pharmacol Sci. 29:383-390; Ramakrishna, V. et al. (2015) “Characterization Of The Human
T Cell Response To In Vitro CD27 Costimulation With Varlilumab,” J. Immunother. Canc. 2:37; pp.1-13). A proteína é composta de uma proteína de 255 aminoácidos que possui uma porção citoplasmática de N-terminal curta, uma região de transmembrana e um domínio extracelular que possui 3 motivos ricos em cisteína (Schwarz, H. et al. (1993) “A Receptor Induced By Lymphocyte Activation (ILA): A New Member Of The Human Nerve-Growth-Factor/Tumor-Necrosis-Factor Receptor Family,” Gene 134:295-298).
[006] A ligação de CD137 por seu ligante CD137L (4-1BBL; TNFSF9), que é principalmente, embora não exclusivamente, expressa em Células que Apresentam Antígeno (APCs), evoca diversas respostas de células T como expansão celular, aumento da secreção de citocina e a prevenção de morte celular induzida por ativação (Qian, Y. et al. (2015) “CD137 Ligand-Mediated Reverse Signaling Inhibits Proliferation And Induces Apoptosis In Non-Small Cell Lung Cancer,” Med. Oncol. 32:44; pp.1-10); Sallin, M.A. et al. (2014) “The Anti-Lymphoma Activities Of Anti-CD137 Monoclonal Antibodies Are Enhanced In FcγRIII−/− Mice,” Cancer Immunol. Immunother. 63:947-958; Lee, S.W. et al. (2009) “4-1BB As A Therapeutic Target For Human Disease,” Adv. Exp. Med. Biol. 647:120-129; Thum, E. et al. (2009) “CD137, Implications In Immunity And Potential For Therapy,” Front. Biosci. (Landmark Ed). 14:4173-4188; Wang, C. et al. (2009) “Immune Regulation By 4-1BB And 4-1BBL: Complexities And Challenges,” Immunol. Rev. 229(1):192-215; Long, A.H. et al. (2015) “4-1BB Costimulation Ameliorates T Cell Exhaustion Induced By Tonic Signaling Of Chimeric Antigen Receptors,” Nature Med. 21(6):581; pp. 1-13). Portanto, esta ligação serve para ativar o sistema imunológico. No entanto,
as cis-interações entre CD137 e CD137L também potencialmente regulam negativamente a expressão de CD137L (Kwon, B. (2015) “Is CD137 Ligand (CD137L) Signaling a Fine Tuner of Immune Responses?,” Immune Network. 15(3): 121-124). Portanto, o ligante CD137 funciona para controlar a extensão e a cinética da ativação do sistema imunológico mediada por CD137 (Kwon, B. (2015) “Is CD137 Ligand (CD137L) Signaling a Fine Tuner of Immune Responses?,” Immune Network. 15(3): 121-124; Shuford WW et al. (1997) “4-1BB Costimulatory Signals Preferentially Induce CD8+ T Cell Proliferation And Lead To The Amplification In Vivo Of Cytotoxic T Cell Responses,” J. Exp. Med. 186:47- 55).
[007] De forma significativa, CD137 expresso em células NK humanas se tornar regulado positivamente mediante ligação com anticorpos antitumorais (ou seja, anticorpos que se ligam a um antígeno tumoral (“TA”)) que se ligaram às células tumorais (Houot, R. et al. (2012) “Boosting Antibody- Dependent Cellular Cytotoxicity Against Tumor Cells With A CD137 Stimulatory Antibody,” Oncoimmunology. 1:957-958; Kohrt, H.E. et al. (2014) “Targeting CD137 Enhances The Efficacy Of Cetuximab,” J. Clin. Invest. 124(4):2668-2682; Lin, W. et al. (2008) “Fc-Dependent Expression Of CD137 On Human NK Cells: Insights Into “Agonistic” Effects Of Anti-CD137 Monoclonal Antibodies,” Blood 112(3):699-707; Mittal, P. et al. (2015) “Tumor-Unrelated CD4 T Cell Help Augments CD134 Plus CD137 Dual Costimulation Tumor Therapy,” J. Immunol. Nov 11. pii: 1502032; pp.1-14; Sánchez-Paulete, A.R. et al. (2015) “Cancer Immunotherapy With Immunomodulatory Anti-CD137 And Anti-PD-1 Monoclonal Antibodies Requires Batf3-Dependent Dendritic Cells,” Cancer Discov. Oct 22. pii: CD-15-0510; pp. 1-28; Wei,
H. et al. (2014) “Dual Targeting Of CD137 Co-Stimulatory And PD-1 Co-Inhibitory Molecules For Ovarian Cancer Immunotherapy,” OncoImmunology 3:e28248; pp. 1-3; Seo, S.K. et al. (2004) “4-1BB-Mediated Immunotherapy Of Rheumatoid Arthritis,” Nat. Med. 10:1088-1094).
[008] Estes reconhecimentos levaram à proposta de que os anticorpos que são imunoespecíficos para CD137 poderiam ser usados para ativar o sistema imunológico e, assim, prover uma terapia para o câncer (Melero I. et al. (1997) “Monoclonal Antibodies Against The 4-1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors,” Nat Med. 3:682-385; Sun, Y. et al. (2002) “Costimulatory Molecule-Targeted Antibody Therapy Of A Spontaneous Autoimmune Disease,” Nature Med. 8:1405-1413; Kammer, G.M. et al. (2002) “Immunotherapy Tackles Lupus,” Nat. Med. 8(12):1356-1358; Foell, J. et al. (2003) “CD137 Costimulatory T Cell Receptor Engagement Reverses Acute Disease In Lupus-Prone NZB x NZW F1 Mice,” J. Clin. Invest. 111(10):1505-1518; Mittler, R.S. et al. (2004) “Anti-CD137 Antibodies In The Treatment Of Autoimmune Disease And Cancer,” Immunol. Res. 29(1-3):197-208; Foell, J.L. et al. (2004) “Engagement of The CD137 (4-1BB) Costimulatory Molecule Inhibits And Reverses The Autoimmune Process In Collagen- Induced Arthritis And Establishes Lasting Disease Resistance,” Immunology 113(1):89-98; Sytwu, H.K. et al. (2003) “Anti-4- 1BB-Based Immunotherapy For Autoimmune Diabetes: Lessons From A Transgenic Non-Obese Diabetic (NOD) Model,” J. Autoimmun. 21(3):247-254; Hernandez-Chacon JA et al. (2011) “Costimulation Through The CD137/4-1BB Pathway Protects Human Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes From Activation Induced Cell Death And Enhances Antitumor Effector Function,”
J. Immunother. 34:236-250; Morales-Kastresana, A. et al. (2014) “Combinations Of Immunostimulatory Antibodies With Synergistic Effects Against Spontaneous Cancer,” OncoImmunology 3:2, e27812, pp.1-4; Sanmamed, M.F. et al. (2015) “Agonists of Co-stimulation in Cancer Immunotherapy Directed Against CD137, OX40, GITR, CD27, CD28, and ICOS,” Seminars Oncol. 42(4):640-655; Tongu, M. et al. (2015) “Intermittent Chemotherapy Can Retain The Therapeutic Potential Of Anti-CD137 Antibody During The Late Tumor-Bearing State,” Cancer Sci. 106(1):9-17; Takeda, K. et al. (2007) “Combination Antibody-Based Cancer Immunotherapy,” Cancer Sci. 98(9):1297-1302). Os anticorpos anti-CD137 são revelados nas Patentes Norte-americanas Nos. 2014/0274909; 2013/0280265; 2013/0273078; 2013/0071403; 2012/0058047; 2011/0104049; 2011/0097313; 2008/0166336; 2008/0019905; 2006/0188439; 2006/0182744; 2006/0121030; e 2003/0223989.
[009] No entanto, apesar de todos estes avanços anteriores, permanece a necessidade de composições aperfeiçoadas capaz de direcionar mais vigorosamente o sistema imunológico do corpo para atacar células cancerosas ou células infectadas por patógenos, especialmente em baixas concentrações terapêuticas. Pois, embora o sistema imunológico adaptativo possa ser um potente mecanismo de defesa contra o câncer e a doença, muitas é dificultado por mecanismos imunossupressores/de evasão no microambiente tumoral, mediado pela atividade coestimuladora reduzida/ausente de CD137. Além disso, as moléculas coinibitórias expressas por células tumorais, células imunológicas e células estromais no ambiente tumoral pode atenuar de forma dominante as respostas de células T contra as células cancerosas.
[010] Conforme descrito detalhadamente abaixo, a presente invenção trata desta necessidade ao prover Moléculas de Ligação a CD137 x TA. Estas moléculas biespecíficas são capazes de se ligar a antígenos tumorais que são expressos nas superfícies das células tumorais, e de co-localizar as células NK que expressam CD137 para tais células tumorais. Esta co- localização regula positivamente as células NK de modo a promover a ativação ou ativação contínua do sistema imunológico (por exemplo, estimulando uma resposta citotóxica das células T contra as células tumorais). Estes atributos permitem que tais moléculas biespecíficas tenham utilidade na estimulação do sistema imunológico e, particularmente, no tratamento do câncer e doenças e condições associadas ao patógeno. A presente invenção se refere a estes e demais objetivos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[011] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação que possuem um ou mais sítios de ligação a epitopo específicos para um epitopo de CD137 e um ou mais sítios de ligação a epitopo específicos para um epitopo de um antígeno tumoral (“TA”) (ou seja, uma “Molécula de Ligação a CD137 x TA”). Em uma realização, essas Moléculas de Ligação a CD137 x TA serão moléculas biespecíficas, especialmente diacorpos tetravalentes biespecíficos, que são compostas de duas, três, quatro ou mais que quatro cadeias polipeptídicas e que possuem dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de CD137 e dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de um TA. Alternativamente, essas Moléculas de Ligação a CD137 x TA serão moléculas biespecíficas, especialmente moléculas de ligação trivalentes biespecíficas compostas de três ou mais cadeias polipeptídicas e que possuem um ou dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de CD137 e um ou dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de um TA. As Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são capazes de se ligar simultaneamente a CD137 e a um TA. A invenção refere-se a composições farmacêuticas que contêm quaisquer dessas Moléculas de Ligação a CD137 x TA. A invenção refere- se, adicionalmente, a métodos para o uso dessas moléculas no tratamento de câncer e de outras doenças e condições. A invenção também provê novas moléculas de ligação a CD137, e moléculas de ligação HER2/neu, bem como a derivados destas e aos usos destas.
[012] A presente invenção provê Moléculas de Ligação a CD137 x TA que são monovalentes na medida em que são capazes de se ligar a apenas uma cópia de um epitopo de CD137 e a apenas uma cópia de um epitopo de um TA, mas são biespecíficas na medida em que tal diacorpo é capaz de se ligar simultaneamente ao epitopo de CD137 e ao epitopo de um TA. No entanto, a presente invenção é particularmente direcionada a Moléculas de Ligação a CD137 x TA que são compostas de cadeias polipeptídicas que se associam a outra heterodimericamente para formar dois sítios de ligação, cada um específico para um epitopo de CD137, e dois sítios de ligação, cada um específico para um epitopo de um TA. Estas Moléculas de Ligação a CD137 x TA preferidas da invenção são denominadas “biespecíficas e tetravalentes”. A presente invenção também é particularmente direcionada a Moléculas de Ligação a CD137 x TA que são compostas de cadeias polipeptídicas que se associam entre si heterodimericamente para formar dois sítios de ligação, cada um específico para um epitopo de CD137, um local de ligação específico para um epitopo de um TA. Estas Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são denominadas “trivalentes biespecíficas”.
[013] A presente invenção provê Moléculas de Ligação a CD137 x TA que compreendem três cadeias polipeptídicas (uma “primeira”, “segunda” e “terceira” cadeia polipeptídica), em que a primeira e a segunda cadeias polipeptídicas são covalentemente ligadas entre si e a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas são covalentemente ligadas entre si. As Moléculas de Ligação a CD137 x TA preferidas da invenção compreendem quatro cadeias polipeptídicas (uma “primeira”, “segunda”, “terceira” e “quarta” cadeia polipeptídica), em que a primeira e a segunda cadeias polipeptídicas são covalentemente ligadas entre si, a terceira e a quarta cadeias polipeptídicas são covalentemente ligadas entre si, e a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas são covalentemente ligadas entre si. Também são preferidas as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção que compreendem cinco cadeias polipeptídicas (uma “primeira”, “segunda”, “terceira”, “quarta” e “quinta” cadeia polipeptídica), em que a primeira e a segunda cadeias polipeptídicas são covalentemente ligadas entre si, a terceira e a quarta cadeias polipeptídicas são covalentemente ligadas entre si, a terceira e a quinta cadeias polipeptídicas são covalentemente ligadas entre si, e a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas são covalentemente ligadas entre si.
[014] Detalhadamente, a invenção provê uma Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que a dita Molécula de Ligação é capaz de ligação específica a um epitopo de CD137 e a um epitopo de um antígeno tumoral (TA), e em que a dita
Molécula de Ligação a CD137 x TA compreende um primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; e em que: (A) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (B) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (C) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (D) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84);
(E) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (F) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (G) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74); (H) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90); (I) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-5 VL (SEQ ID NO:97); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96);
(J) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); (K) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (L) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); ou (M) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86).
[015] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA em que o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77); ou (B) hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:92);
e/ou em que o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82); ou (B) hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:93).
[016] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA em que o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208); (B) hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (C) hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); (D) hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76); (E) hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); (F) hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86); (G) hCD137 MAB-3 VH1F (SEQ ID NO:209); (H) hCD137 MAB-3 VH1G (SEQ ID NO:210); or (I) hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92).
[017] A invenção refere-se ainda a essas Moléculas de Ligação a CD137 x TA, em que o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); (B) hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); (C) hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87); (D) hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88); (E) hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89); (F) hCD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211); (G) hCD137 MAB-3 VL5 (SEQ ID NO:212); (H) hCD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213); (I) hCD137 MAB-3 VL7 (SEQ ID NO:214); (J) hCD137 MAB-3 VL8 (SEQ ID NO:215);
(K) hCD137 MAB-3 VL9 (SEQ ID NO:216); (L) hCD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217); (M) hCD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218); (N) hCD137 MAB-3 VL12 (SEQ ID NO:219); (O) hCD137 MAB-3 VL13 (SEQ ID NO:220); (P) hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94); ou (Q) hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95).
[018] A invenção se refere ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA, em o antígeno tumoral (TA) é selecionado a partir do grupo de antígenos tumorais que consiste em: 19.9; proteína oncofetal 5T4; antígeno 4.2; A33; AFP; ALCAM; BAGE; beta-catenina; CA125; Carboxipeptidase M; B1; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD30; CD33; CD36; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD123; CD317; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CO-43; CO-514; CTLA-1; CTLA-4; Citoqueratina 8; Série E1; EGF- R; um Receptor de Efrina; Erb; F3; FC10.2; um GAGE GD2; GD3; GD49; GM2; GM3; GICA 19-9; gp37; gp75; gp100; HER-2/neu; antígeno-CD20 de linfoma B humano; antígeno de glóbulo de gordura de leite humano; papilomavírus-E6 humano/papilomavírus-E7 humano; HMW-MAA; antígeno I; ITGB6; IL13Rα2; JAM-3; KID3; KID31; antígeno pan-carcinoma KS 1/4; KS 1/4; KSA; L6; L20; LEA; LUCA-2; M1:22:25:8; M18; M39; um MAGE; MART; Myl; MUC-1; MUM-1; N-acetilglicosaminiltransferase; neoglicoproteína; NS-10; OFA-1; OFA-2; Oncostatina M; p15; PSA; PSMA; PEMA; PIPA; fosfato de ácido prostático; R24; ROR1; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn; peptídeo derivado de receptor de células T; TAG-72; TL5; receptor de TNF-α; receptor de TNF-ß; receptor de TNF-γ; TRA-1-85; Receptor de Transferrina; TSTA; e VEGF-R.
[019] A invenção se refere ainda a tal Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que o antígeno tumoral (TA) é selecionada a partir dos antígenos tumorais da Tabela 1, e particularmente em que o antígeno tumoral (TA) é: HER2/neu, EphA2 ou5T4.
[020] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que o antígeno tumoral (TA) é HER2/neu e em que a Molécula de Ligação a CD137 x TA é caracterizada por compreender um segundo Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; e em que: (A) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63); e (B) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de HER2 MAB- 1 VH (SEQ ID NO:62).
[021] A invenção se refere ainda a tal Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que: (A) (1) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB- 1 VL1 (SEQ ID NO:67); (2) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou (3) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69); e
(B) (1) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); (2) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou (3) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66).
[022] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA em que o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: (A) hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); (B) hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou (C) hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66).
[023] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA em que o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: (A) hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67); (B) hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou (C) hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69).
[024] A invenção se refere ainda a tal Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que o antígeno tumoral (TA) é 5T4 e em que a Molécula de Ligação a CD137 x TA compreende um segundo Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; e em que: (I) (A) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de 5T4 MAB-1 VL (SEQ ID NO:135); e
(B) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de 5T4 MAB- 1 VH (SEQ ID NO:134); ou (II) (A) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de 5T4 MAB-2 VL (SEQ ID NO:137); e (B) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de 5T4 MAB- 2 VH (SEQ ID NO:136).
[025] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA em que o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:135).
[026] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA em que o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:136).
[027] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que a molécula é um diacorpo contendo Fc tetravalente biespecífico compreendendo uma primeira, uma segunda, uma terceira e uma quarta cadeias polipeptídicas, em que as cadeias polipeptídicas formam um complexo ligado covalentemente.
[028] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que o antígeno tumoral (TA) é HER2/neu e em que: (I) (A) a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:100; e
(B) a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:101; ou (II) (A) a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:102; e (B) a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:103.
[029] A invenção refere-se ainda a Moléculas de Ligação a CD137 x TA, em que a molécula é biespecífica e tetravalente, e compreende uma primeira, uma segunda, uma terceira, uma quarta e uma quinta cadeias polipeptídicas, em que as cadeias polipeptídicas formam um complexo ligado covalentemente.
[030] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que o antígeno tumoral (TA) é HER2/neu e em que: (I) (A) a primeira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:104; (B) a segunda e a quinta cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105; (C) a terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:106; e (D) a quarta cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:107. ou (II) (A) a primeira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:104; (B) a segunda e a quinta cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105;
(C) a terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, ou SEQ ID NO:230; e (D) a quarta cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, ou SEQ ID NO:123.
[031] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que a molécula é biespecífica e trivalente, e compreende uma primeira, uma segunda, uma terceira e uma quarta cadeias polipeptídicas, em que as ditas cadeias polipeptídicas formam um complexo ligado covalentemente.
[032] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que o dito antígeno tumoral (TA) é HER2/neu e em que: (A) a dita primeira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, ou SEQ ID NO:196; (B) a dita segunda cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, ou SEQ ID NO:201; (C) a dita terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:104; e (D) a dita quarta cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105.
[033] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que o dito antígeno tumoral (TA) é 5T4 e em que:
(A) a dita primeira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, ou SEQ ID NO:229; (B) a dita segunda cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, ou SEQ ID NO:230; (C) a dita terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:231; e (D) a dita quarta cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:232.
[034] A invenção se refere ainda a uma composição farmacêutica que compreende quaisquer das Moléculas de Ligação a CD137 x TA descritas acima e um veículo fisiologicamente aceitável.
[035] A invenção se refere ainda ao uso de quaisquer das Moléculas de Ligação a CD137 x TA descritas acima ou a tal composição farmacêutica no tratamento de uma doença ou condição associada ou caracterizada pela expressão do antígeno tumoral (TA), e particularmente em que a doença ou condição associada ou caracterizada pela expressão do antígeno tumoral (TA) é câncer.
[036] A invenção refere-se ainda a uma molécula de ligação a CD137 que compreende um Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; em que: (A) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); e
(2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (B) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (C) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (D) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (E) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (F) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211); e
(2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (G) (1) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74); (H) (1) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91); e (2) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90); (I) (1) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-5 VL (SEQ ID NO:97); e (2) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96); (J) (1) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); (K) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB- 3 VL (SEQ ID NO:75); e
(2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (L) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB- 3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); ou (M) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB- 3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86).
[037] A invenção refere-se ainda à realização dessa molécula de ligação a CD137, em que o Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77); ou (B) hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:92).
[038] A invenção refere-se ainda à realização dessa molécula de ligação a CD137, em que o Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82); ou (B) hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:93).
[039] A invenção refere-se ainda à realização dessas moléculas de ligação a CD137, em que o Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76);
(B) hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); (C) hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (D) hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); (E) hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86); (F) hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208); (G) hCD137 MAB-3 VH1F (SEQ ID NO:209); (H) hCD137 MAB-3 VH1G (SEQ ID NO:210); or (I) hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92).
[040] A invenção refere-se ainda à realização dessas moléculas de ligação a CD137, em que o Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); (B) hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); (C) hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87); (D) hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88); (E) hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89); (F) hCD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211); (G) hCD137 MAB-3 VL5 (SEQ ID NO:212); (H) hCD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213); (I) hCD137 MAB-3 VL7 (SEQ ID NO:214); (J) hCD137 MAB-3 VL8 (SEQ ID NO:215); (K) hCD137 MAB-3 VL9 (SEQ ID NO:216); (L) hCD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217); (M) hCD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218); (N) hCD137 MAB-3 VL12 (SEQ ID NO:219); (O) hCD137 MAB-3 VL13 (SEQ ID NO:220); (P) hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94); ou (Q) hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95).
[041] A invenção se refere ainda à realização de tais Moléculas de Ligação a CD137, em que a molécula é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
[042] A invenção se refere ainda a uma composição farmacêutica que compreende quaisquer das Moléculas de Ligação a CD137 descritas acima e a um veículo fisiologicamente aceitável.
[043] A invenção se refere ainda ao uso de quaisquer Moléculas de Ligação a CD137 descritas acima, ou tal composição farmacêutica, no tratamento de uma doença ou condição associada a um sistema imunológico suprimido ou caracterizada pela expressão de um antígeno tumoral (TA).
[044] A invenção refere-se ainda ao uso em que a condição associada a um sistema imunossuprimido ou caracterizada pela expressão do antígeno tumoral (TA) é câncer.
[045] A invenção refere-se ainda a uma Molécula de Ligação a HER2/neu que compreende um Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; em que: (A) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63); e (B) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62).
[046] A invenção se refere ainda à realização de tais Moléculas de Ligação a HER2/neu, em que:
(A) (1) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67); (2) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou (2) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69); ou e (B) (1) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); (2) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou (3) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66).
[047] A invenção refere-se ainda à realização dessas Moléculas de Ligação a HER2/neu, em que o Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: (A) hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); (B) hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou (C) hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66).
[048] A invenção refere-se ainda à realização dessas Moléculas de Ligação a HER2/neu, em que o Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de:
(A) hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67); (B) hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou (C) hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69).
[049] A invenção se refere ainda à realização de tais Moléculas de Ligação a HER2/neu, em que a molécula é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
[050] A invenção se refere ainda a uma composição farmacêutica que compreende quaisquer das Moléculas de Ligação a HER2/neu descritas acima e um veículo fisiologicamente aceitável
[051] A invenção se refere ainda ao uso de quaisquer das Moléculas de Ligação a HER2/neu descritas acima, ou tal composição farmacêutica, no tratamento de uma doença ou condição associada a ou caracterizada pela expressão de HER2/neu, e particularmente em que a condição associada ou caracterizada pela expressão de HER2/neu é câncer.
[052] A invenção se refere ainda a métodos de potencialização da atividade de um agente de alvo tumoral que compreende a administração de tal agente de alvo tumoral em combinação com quaisquer das Moléculas de Ligação a CD137 x TA descritas acima, ou uma composição farmacêutica que a compreende. A invenção se refere ainda a tais métodos que compreendem ainda a administração de um inibidor de checkpoint de PD-1/PD-L1 e particularmente em que tal inibidor de checkpoint é um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD- L1. A invenção refere-se particularmente a métodos em que o agente-alvo tumoral é um anticorpo, um fragmento de ligação a epitopo de um anticorpo, ou um agente que faz a mediação da eliminação redirecionada de células T de uma célula-alvo.
[053] A invenção se refere ainda a métodos de tratamento de uma doença ou condição associada a uma sistema imunológico suprimido ou caracterizada pela expressão de um antígeno tumoral (TA) que compreende a administração a um indivíduo que necessita deste de quaisquer das Moléculas de Ligação a CD137 x TA descritas acima, ou uma composição farmacêutica que a compreende. A invenção refere-se particularmente a métodos em que a condição associada a um sistema imunossuprimido ou caracterizada pela expressão do antígeno tumoral (TA) é câncer. A invenção também se refere a métodos que compreendem ainda a administração de um agente de alvo tumoral e, particularmente, em que o agente-alvo tumoral é um anticorpo, um fragmento de ligação a epitopo de um anticorpo, ou um agente que faz a mediação da eliminação redirecionada de células T de uma célula-alvo. A invenção se refere ainda a tais métodos que compreendem ainda a administração de um inibidor de checkpoint de PD-1/PD-L1, e particularmente em que tal inibidor de checkpoint é um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1.
[054] A invenção se refere ainda aos usos e métodos acima, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: leucemia mieloide aguda, tumor da glândula suprarrenal, câncer associado à AIDS, sarcoma alveolar das partes moles, tumor astrocítico, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral e da medula vertebral, tumor cerebral metastático, câncer de mama, tumores do corpo carótido, câncer cervical, condrossarcoma, cordoma, carcinoma de células renais cromófobas, carcinoma de células claras, câncer de cólon, câncer colorretal, histiocitoma fibroso cutâneo benigno, tumor de células pequenas redondas desmoplásico, ependimoma, tumor de Ewing, condrossarcoma mixoide extra esquelético, fibrogênese óssea imperfeita, displasia fibrosa óssea, câncer da vesícula biliar ou duto biliar, câncer gástrico, doença trofoblástica gestacional, tumor de células germinativas, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, tumor de células de ilhota, sarcoma de Kaposi, câncer renal, leucemia, lipoma/tumor lipomatoso benigno, lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, câncer hepático, linfoma, câncer de pulmão, meduloblastoma, melanoma, meningioma, mesotelioma maligno, neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, câncer pulmonar de células não pequenas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de faringe, carcinoma tireoide papilar, tumor da paratireoide, câncer pediátrico, tumor da bainha nervosa periférica, feocromocitoma, tumor hipofisário, câncer da próstata, melanoma uveal posterior, distúrbio hematológico raro, carcinoma de células renais, câncer renal metastático, tumor rabdoide, rabdomiossarcoma, sarcoma, câncer cutâneo, sarcoma de tecidos moles, câncer espinocelular, câncer de estômago, sarcoma sinovial, câncer de testículo, carcinoma tímico, timoma, câncer metastático de tireoide e câncer de útero.
[055] A invenção refere-se particularmente aos usos e métodos acima em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em: câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer gástrico, glioblastoma, câncer renal, câncer de pulmão, melanoma, neuroblastoma, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de faringe, câncer de próstata, carcinoma de célula renal, rabdomiossarcoma e câncer espinocelular de cabeça e pescoço (SCCHN).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[056] As Figuras 1A-1B proveem diagramas de um diacorpos representativo ligado covalentemente que possui dois sítios de ligação a epitopo compostos de duas cadeias polipeptídicas, cada um tendo um Domínio de Promoção de Heterodímero de espiral E ou espiral K (os Domínios de Promoção de Heterodímero alternativos são providos abaixo). Um resíduo de cisteína pode estar presentes em um ligante (Figura 1A) e/ou no Domínio de Promoção de Heterodímero (Figura 1B). Os Domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epitopo são mostrados utilizando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento. A linha ondulada (WWW) nesta e todas as Figuras que proveem apresentações esquemáticas de domínios de Molécula de Ligação representa um ou mais Domínio de Promoção de Heterodímero opcional, que estão preferivelmente presentes.
[057] A Figura 2 provê um diagrama de uma molécula de diacorpo representativo ligado covalentemente que possui dois sítios de ligação a epitopo compostos de duas cadeias polipeptídicas, cada uma tendo um Domínio CH2 e CH3, de modo que estas cadeias associadas forem toda ou parte de uma Região Fc. Os Domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epitopo são mostrados utilizando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.
[058] As Figuras 3A-3E proveem diagramas que mostram os diacorpos tetravalentes representativos ligados covalentemente que possuem quatro sítios de ligação a epitopo compostos de dois pares de cadeias polipeptídicas (ou seja, quatro cadeias polipeptídicas ao todo). Uma cadeia polipeptídica de cada par possui um Domínio CH2 e CH3, de modo que as cadeias associadas formem todo ou parte de uma região
Fc.
Os Domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epitopo são mostrados utilizando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.
Os dois pares de cadeias polipeptídicas podem ser iguais.
Nestas realizações, em que os dois pares de cadeias polipeptídicas são iguais e os Domínios VL e VH reconhecem diferentes epitopos (como mostrado nas Figuras 3A-3B), a molécula resultante possui quatro sítios de ligação a epitopo e é biespecífica e bivalente em relação a cada epitopo ligado.
Nestas realizações, em que os Domínios VL e VH reconhecem o mesmo epitopo (por exemplo, os mesmos CDRs de Domínio VL e os mesmos CDRs de Domínio VH são usados em ambas as cadeias), a molécula resultante possui quatro sítios de ligação a epitopo e é monoespecífica e tetravalente em relação a único epitopo.
Alternativamente, os dois pares de polipeptídeos podem ser diferentes.
Nestas realizações, em que os dois pares de cadeias polipeptídicas são diferentes e os Domínios VL e VH de cada par de polipeptídeos reconhecem diferentes epitopos (como mostrado pelos diferentes sombreamentos e padrões na Figura 3C), a molécula resultante possui quatro sítios de ligação a epitopo e é tetraespecífica e monovalente em relação a cada epitopo ligado.
A Figura 3A mostra um diacorpo contendo uma Região Fc que contém um Domínio de Promoção de Heterodímero de peptídeo compreendendo um resíduo de cisteína.
A Figura 3B mostra um diacorpo contendo Região Fc, que contém Domínio de Promoção de Heterodímero de espiral E e espiral K compreendendo um resíduo de cisteína e um ligante (com um resíduo de cisteína opcional). A Figura 3C, mostra um diacorpo contendo Região Fc, que contém os domínios CH1 e CL de anticorpo.
As Figuras 3D- 3E ilustram como a seleção dos domínios de ligação mostrados na Figura 3B podem resultar em uma Molécula de Ligação a CD137 x TA tendo dois sítios de ligação específicos para um epitopo de CD137 e dois sítios de ligação específicos para um epitopo de um TA. As Figuras 3D-3E ilustram como os domínios podem ser selecionados para produzir Moléculas de Ligação a CD137 x TA tendo diferentes orientações (ou seja, a Figura 3D emprega um Domínio VL CD137 como o Domínio VL1 da Molécula de Ligação, um Domínio VH CD137 como o Domínio VH1 da Molécula de Ligação, um Domínio VL TA como o Domínio VL2 da Molécula de Ligação e um Domínio VH TA como o Domínio VH2 da Molécula de Ligação. Em contraste, a Figura 3E emprega um Domínio VL TA como o Domínio VL1 da Molécula de Ligação, um Domínio VH TA como o Domínio VH1 da Molécula de Ligação, um Domínio VL CD137 como o Domínio VL2 da Molécula de Ligação e um Domínio VH CD137 como o Domínio VH2 da Molécula de Ligação). Conforme mostrado abaixo, os sítios de ligação VL/VH formados pela associação das cadeias polipeptídicas podem ser iguais ou diferentes, de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica.
[059] As Figuras 4A e 4B proveem diagramas de uma molécula de diacorpo representativa ligada covalentemente que possui dois sítios de ligação a epitopo compostos de três cadeias polipeptídicas. Duas das cadeias polipeptídicas possuem um Domínio CH2 e CH3, de modo que as cadeias associadas formam toda ou parte de uma Região Fc. As cadeias polipeptídicas que compreendem o Domínio VL e VH compreendem ainda um Domínio de Promoção de Heterodímero. Os Domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epitopo são mostrados utilizando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.
[060] As Figuras 5A-5D proveem diagramas de uma Molécula de Ligação representativa ligada covalentemente que possui quatro sítios de ligação a epitopo compostos de cinco cadeias polipeptídicas.
A Figura 5A mostra a estrutura geral de tal Molécula de Ligação a CD137 x TA.
Duas das cadeias polipeptídicas possuem um Domínio CH2 e CH3, de modo que as cadeias associadas formam uma Região Fc que compreende toda ou parte de uma Região Fc.
As cadeias polipeptídicas que compreendem os Domínio VL e VH ligados, compreendem ainda um Domínio de Promoção de Heterodímero.
Os Domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epitopo são mostrados utilizando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.
A Figura 5B mostra a estrutura de uma Molécula de Ligação a CD137 x TA alternativa preferida, na qual os Domínios Variáveis mostrados na Figura 5A foram selecionados para produzir uma Molécula de Ligação a CD137 x TA resultante que possui dois domínios de ligação do tipo não diacorpo específicos para um TA ilustrativo, HER2/neu, e dois domínios de ligação do tipo diacorpo específico para CD137. A Figura 5C mostra a estrutura de uma Molécula de Ligação a CD137 x TA alternativa preferida na qual os Domínios Variáveis mostrados na Figura 5A foram selecionados para produzir uma Molécula de Ligação a CD137 x TA resultante que possui dois domínios de ligação do tipo não diacorpo específicos para CD137 e dois domínio de ligação do tipo diacorpo específicos para HER2/neu.
A Figura 5D mostra a estrutura geral de uma Molécula de Ligação a CD137 x TA alternativa preferida na qual os Domínios Variáveis mostrados na Figura 5A foram selecionados para produzir uma Molécula de Ligação a CD137 x TA resultante que possui dois domínios de ligação do tipo não diacorpo específicos para um epitopo de CD137, um domínio de ligação do tipo diacorpo específicos para um epitopo de HER2/neu e um segundo domínio de ligação do tipo diacorpo específico para um epitopo de CD137. Estes epitopos de CD137 podem ser iguais ou diferentes. Conforme será reconhecido, por meio de seleção apropriada dos domínios de ligação mostrados na Figura 5A, quaisquer dos três domínios de ligação poderia ter sido selecionados para ligar um epitopo de CD137. Da mesma forma, quaisquer dos três domínios de ligação poderiam ter sido selecionados para ligar um epitopo de HER2/neu. Conforme mostrado abaixo, os sítios de ligação VL/VH formados pela associação das cadeias polipeptídicas podem ser iguais ou diferentes, de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica.
[061] As Figuras 6A-6F proveem diagramas de Moléculas de Ligação trivalentes representativas contendo Região Fc tendo três sítios de ligação a epitopo. As Figuras 6A ilustram esquematicamente os domínios de Moléculas de Ligação trivalentes que compreendem dois domínios de ligação do tipo diacorpo e um domínio de ligação do tipo Fab que possui diferentes orientações de domínio nas quais o domínio de ligação do tipo diacorpo são C-terminal para uma Região Fc. As Figuras 6B-6C mostram a estrutura da Molécula de Ligação a CD137 x TA ilustrativa preferida na qual os Domínios Variáveis mostrados nas Figuras 6A foram selecionados para produzir uma Molécula de Ligação a CD137 x TA resultante que possui um domínio de ligação do tipo não diacorpo específico para CD137, um domínio de ligação do tipo diacorpo específico para um TA ilustrativo, HER2/neu, e um segundo domínio de ligação do tipo diacorpo específico para CD137. A Figura 6D ilustra esquematicamente os domínios das Moléculas de Ligação trivalentes que compreendem dois do domínio de ligação do tipo diacorpo e domínio de ligação do tipo Fab tendo diferentes orientações de domínio nas quais o domínio de ligação do tipo diacorpo são C-terminal para uma Região Fc. As moléculas nas Figuras 6A-6D compreendem quatro cadeias. As Figuras 6E e 6F, respectivamente, ilustram esquematicamente os domínios de Moléculas de Ligação trivalente que compreendem dois domínios de ligação do tipo diacorpo N-terminal para uma Região Fc, e um domínio de ligação do tipo Fab no qual a Cadeia Leve e a Cadeia Pesada são ligadas por meio de um espaçador polipeptídico, ou um domínio de ligação do tipo scFv. As Moléculas de Ligação trivalente nas Figuras 6G e 6H, respectivamente, ilustram esquematicamente os domínios de Moléculas de Ligação trivalente que compreendem dois domínios de ligação do tipo diacorpo C-terminal para uma Região Fc e um domínio de ligação do tipo Fab no qual a Cadeia Leve e Cadeia Pesada são ligadas por meio de um espaçador polipeptídico, ou um domínio de ligação do tipo scFv. As Moléculas de Ligação trivalente nas Figuras 6E-6H compreendem três cadeias. Os Domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epitopo são mostrados utilizando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.
[062] A Figura 7 mostra as curvas de ligação dos anticorpos anti-CD137 urelumabe e utomilumabe (CD137 MAB-1 e CD137 MAB-2, respectivamente) e diversos novos CD137 mAbs quiméricos (chCD137 MAB-3; chCD137 MAB-4 e chCD137 MAB-5) para células T CD8+ ativadas.
[063] A Figura 8 mostra a indução após 72 horas de secreção de IL-2 por células T pan mediante estímulo com anticorpos anti-CD3 de cobertura seca (3 µg/mL a 50 µg/mL) na presença dos anticorpos anti-CD137 urelumabe ou utomilumabe (CD137 MAB-1 ou CD137 MAB-2, respectivamente) ou os novos anticorpos anti-CD137 quiméricos (chCD137 MAB-3, chCD137 MAB- 4 ou chCD137 MAB-5) que foram reticulados com 4x hFc F(ab)’2. Os anticorpos reticulados (Ab + αhFc) foram usados a 0,1, 1,0 ou 10 μg/mL. Os seguintes controles também são representados: células T pan estimuladas tratadas com anticorpo de controle de isótipo, hFc F(ab)’2 isoladamente, ou células não tratadas.
[064] A Figura 9 mostra a indução após 72 horas de secreção de IFN-γ pelas células T pan mediante estímulo com grânulos anti-CD3 na presença de anticorpos anti-CD137 quiméricos reticulados (chCD137 MAB-3 ou chCD137 MAB-5) (1 µg/mL de anticorpo CD-137 + 4 µg/mL de hFc F(ab)’2) ± células alvo JIMT-1(HER2/neu++), na presença ou ausência de ligante (1 µg/mL de CD-137L-His). As seguintes amostras de controle também são representadas: células T pan estimuladas ± células JIMT- 1, ± hFc F(ab)’2, e células T pan não tratadas/não estimuladas e células JIMT-1.
[065] As Figuras 10A-10B mostram a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA se ligarem a CD137 de células T CD8+ ativadas, conforme medido por FACS usando CD8 rotuladas com FITC e αhFc APC. Figura 10A: DART-B e DART-C (compreendendo os domínios hCD137 MAB-3 e hHER2 MAB-1), DART- D e DART-E (compreendendo os domínios CD137 MAB-3 e hHER2 MAB- 1), e as moléculas de controle, DART-3 (compreendendo os domínios hHER2 MAB-1 e palivizumabe variante) e DART-6 (compreendendo os domínios de palivizumabe variante e CD137 MAB-3). Figura 10B: DART-D (compreendendo os domínios CD137 MAB-3 e hHER2 MAB-1), DART-F (compreendendo os domínios CD137 MAB-4 e hHER2 MAB-1), DART-1, e DART-4 (compreendendo os domínios CD137 MAB-1 e hHER2 MAB-1), DART-2 e DART-5 (compreendendo os domínios CD137 MAB-2 e hHER2 MAB-1) e
Molécula de Ligação controle DART-6 (compreendendo os domínios CD137 MAB-3 e palivizumabe variante).
[066] As Figuras 11A-11B mostram a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA se ligarem a um TA ilustrativo, HER2/neu, na superfície de células-alvo cancerosas gástricas N87 (HER2+++), conforme medido pela intensidade de fluorescência média (MFI). Figura 11A: DART-B, DART-C, DART-D, DART-E, e as Moléculas de Ligação controle DART-3 e DART-6. Figura 11B: DART-D, DART-F, DART-1, DART-2, DART-4, DART-5, e DART-6.
[067] As Figuras 12A-12B mostram a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA DART-B, DART-D e DART-G, e as moléculas controle DART-3 e DART-6 de se ligar a CD137 expresso por células CHO projetadas (Figura 12A) e CD137 expresso por células T CD8+ ativadas (Figura 12B).
[068] As Figuras 13A-13B mostram a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA DART-B, DART-D e DART-G, e moléculas de controle DART-3 e DART-6 se ligarem a um TA ilustrativo, HER2/neu, expresso por células-alvo cancerosas gástricas N87 (HER2+++) (Figura 13A) e células-alvo JIMT-1 (HER2++) (Figura 13B).
[069] As Figuras 14A-14B proveem os resultados de um primeiro ensaio representativo da capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA mediarem uma atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocina em células T (exemplificado pela liberação de IFN-γ). As Figuras mostram os resultados para DART-1, DART-2, DART-4, DART-5, DART-A, DART-D, DART-E e DART-F, e as moléculas controle, DART- 3 e DART-6, testadas na presença de HER2/N87 com expressão de neu (HER2+++) (Figura 14A) ou células-alvo JIMT-1 (HER2++)
(Figura 14B), não foi observada atividade coestimulatória usando células-alvo Hs700T negativas para HER2/neu, nem células-alvo.
[070] As Figuras 15A-15B proveem os resultados de um segundo ensaio representativo da capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA mediarem a atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocinas em células T (exemplificado pela liberação de IFN-γ). As Figuras mostram resultados para DART-1, DART-2, DART-4, DART-5, DART- B, DART-D e DART-G, e as moléculas controle DART-3 e DART-6, testadas na presença de HER2/N87 com expressão de neu (HER2+++) (Figura 15A) ou células-alvo JIMT-1 (HER2++) (Figura 15B), não foi observada atividade coestimulatória usando as células-alvo Hs700T HER2/neu-negativas, nem na ausência de células-alvo.
[071] As Figuras 16A e 16B mostram a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA mediarem a transdução de sinal dependente de dose e alvo da via de NF/kB na linhagem celular relatora que expressa CD137 (Jurkat-NF-κB-Luc), como demonstrado pelo aumento da expressão de luciferase. As Figuras mostram resultados para DART-G, e as Moléculas de Ligação controle DART-3 e DART-6 em CD137 que expressa células Jurkat- NF-κB-Luc co-cultivadas com células JIMT-1 que expressam HER2/neu (Figura 16A) ou células KG-1 HER2/neu-negativas (Figura 16B).
[072] As Figura 17, Painéis A-O mostram a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA potencializarem a proliferação de células T na co-cultura com células-alvo que expressam TA. As células T humanas rotuladas com CFSE ± estímulo subideal de αCD3/αCD28 co-cultivadas com células-alvo N87 HER2/neu-elevadas (Figura 17, Painéis A-C e
J-K), células-alvo MCF-7 HER2/neu-baixas (Figura 17, Painéis D-F e L-M), ou sem células-alvo (Figura 17, Painéis G-I e N- O) na presença de DART-A (Figura 17, Painéis A, D e G), DART- 3 (Figura 17, Painéis B, E e H), DART-6 (Figura 17, Painéis C, F e I), ou sem molécula (Figura 17, Painéis J, L e N) e monitoradas quanto a proliferação de células T.
[073] As Figuras 18A-18B mostram a capacidade de a Molécula de Ligação a CD137 x TA DART-1 potencializar a ADCC mediada por anticorpo anti-TA margetuximabe que extermina as células-alvo N87, conforme medido pela atividade de luciferase associada às células (Figura 18A) e potencializar a ativação de células NK mediada por margituximabe, conforme medido pela expressão de CD69 (Figura 18B).
[074] As Figuras 19A-19B mostram os resultados de um ensaio representativo da capacidade de a Molécula de Ligação a CD137 x TA DART-7 e de a molécula controle DART-8 mediarem a atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocinas em células T (exemplificado pela liberação de IFN-γ). A liberação de citocina foi medida na presença de células-alvo Hs700T que expressam EphA2 (Figura 19A), ou células-alvo Hs700T EphA2-negativas (EphA2.KO) (Figura 19B), ou ausência de células-alvo. As seguintes amostras controle também são representadas: células T pan estimuladas + células- alvo, e células T pan não tratadas/não estimuladas.
[075] As Figuras 20A-20B mostram a capacidade de os derivados de DART-G tendo CDRH3s otimizado se ligar a CD137 expresso na superfície de células CHO de engenharia (Figura 20A) ou células T CD8+ (Figura 20B).
[076] As Figuras 21A-21C mostram os resultados de um ensaio representativo da capacidade de as Moléculas de
Ligação a CD137 x TA DART-B, DART-D, DART-G, DART-G2, DART-G3 e DART-G4, e as moléculas controle DART-3, DART-6, mediarem a atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocinas em células T (exemplificado pela liberação de IFN- γ). A liberação de citocina foi medida na presença de células- alvo N87 que expressam HER2/neu (Figura 21A), células-alvo JIMT-1 (Figura 21B) ou células-alvo MDA-231 (Figura 21C), ou ausência de células-alvo.
[077] A Figura 22 mostra os resultados de um ensaio representativo da capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA DART-B, DART-G, DART-G1, DART-G2, DART-G3 e DART- G4, e as moléculas controle DART-3, DART-6, mediarem a aniquilação de células redirecionadas de células-alvo N87 (HER2+++), conforme medido pela atividade de luciferase associada à célula.
[078] As Figuras 23A-23C mostram a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA se ligarem a diferentes células que expressam o TA ilustrativo, HER2/neu, conforme medido pela intensidade de fluorescência média (MFI). Figura 23A: ligação a células cancerosas gástricas N87 (HER2+++). Figura 23B: ligação a células de carcinoma mamário JIMT-1 (HER2++). Figura 23C: ligação a células de câncer de mama MCF- 7 (HER2+). A ligação para TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3, TRIDENT-A4, DART-G, DART-G2, DART-G3, DART-G4, e as Moléculas de Ligação controle TRIDENT-1 e TRIDENT-2 é mostrada em ambos os painéis.
[079] As Figuras 24A-24B mostram a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA se ligarem a CD137 expresso por células T CD8+ ativadas. Figura 24A: TRIDENT-A, TRIDENT- A2, TRIDENT-A3, TRIDENT-A4, e as Moléculas de Ligação controle
TRIDENT-1 e TRIDENT-2. Figura 24B: DART-G, DART-G2, DART-G3, DART-G4, e as Moléculas de Ligação controle TRIDENT-1 e TRIDENT-2.
[080] As Figuras 25A-25C mostram a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA mediarem a conjunção de célula para célula entre as células CHO que expressam CD137 e células que expressam o TA ilustrativo, HER2/neu, FACS. Figura 25A: A conjunção de célula para célula com as células cancerosas gástricas N87 (HER2+++). Figura 25B: A conjugação de célula para célula com as células de carcinoma mamário JIMT-1 (HER2++). Figura 25C: Conjugação de célula para célula com células de câncer de mama MCF-7 (HER2+). A atividade de TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3, TRIDENT-A4, DART-G4, e da Molécula de Ligação controle TRIDENT-2 é mostrada em ambos os painéis.
[081] As Figuras 26A-26C mostram os resultados de um ensaio representativo da capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3, TRIDENT-A4, DART-G, DART-G2, DART-G3, DART-G4, e as Moléculas de Ligação controle TRIDENT-1 e TRIDENT-2 mediarem a atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocinas em células T (exemplificado pela liberação de IFN-γ). A liberação de citocina foi medida na presença de células-alvo N87 que expressam HER2/neu (Figura 26A), células-alvo JIMT-1 (Figura 26B) ou ausência de células-alvo (Figura 26C).
[082] A Figura 27 mostra a capacidade de uma Molécula de Ligação a CD137 x TA exemplificadora (TRIDENT-A2) potencializar a aniquilação de células T redirecionadas mediadas por diacorpo TA x CD3 de células-alvo Colo205/Luc,
conforme medido pela luciferase associada à célula em comparação a molécula controle (TRIDENT-1).
[083] As Figuras 28A-28C mostram a expressão de marcadores de células T presentes em 1 mg de amostra de tumor após tratamento com veículo controle (●); TRIDENT-A2 (▼); diacorpo TA x CD3 (■); combinação de TRIDENT-A2 e diacorpo TA x CD3 (♦); anti-PD-1 mAb (▼); ou a combinação de TRIDENT-A2, diacorpo TA x CD3 e anti-PD-1 mAb. Figura 28A: Expressão de CD4, Figura 28B: Expressão de CD8, Figura 28B: Expressão de CD69, Figura 28D: Expressão de PD-1.
[084] A Figura 29 mostra a capacidade do veículo controle (●); TRIDENT-A2 (▼); diacorpo TA x CD3 (■); a combinação de TRIDENT-A2 e diacorpo TA x CD3 (♦); anti-PD-1 mAb (▼); e a combinação de TRIDENT-A2, diacorpo TA x CD3 e anti-PD-1 mAb para inibir o crescimento tumoral ou desenvolvimento de células de carcinoma ovariano em um modelo de xenoenxerto murino reconstituído em PBMC.
[085] A Figura 30 mostra a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA TRIDENT-A2, TRIDENT-B2, e as Moléculas de Ligação controle TRIDENT-1 e TRIDENT-2 mediarem a atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocinas em células T de macacos Cynomolgus (exemplificado pela liberação de IFN-γ). A liberação de citocina foi medida na presença de células-alvo JIMT-1 que expressam 5T4 e HER2/neu.
[086] As Figuras 31A-31B representam as sequências de aminoácidos de hCD137 MAB-3 VH1B (Figura 30A, SEQ ID NO:84) e hCD137 MAB-3 VL3 (Figura 30B, SEQ ID NO:89). sublinhadas indicam os resíduos de CDR. As posições de substituições estão entre parênteses e os números Kabat são indicados com setas; a numeração do resíduo de aminoácido sequencial é indicada acima das sequências.
[087] As Figuras 32A-32B mostram a capacidade de os anticorpos anti-CD137 compreendendo os Domínios de VH e VL desimunizados se ligarem a CD137 de células T CD4+ ou células T CD8+ ativadas, conforme medido por FACS usando CD4+ rotulada com V510 e αhFc APC (Figura 32A) ou CD8 rotulada com FITC e αhFc APC (Figura 32A).
[088] As Figuras 33A-33B mostram a indução após 72 horas de IFN-γ por células T pan mediante estímulo com anticorpo anti-CD3 revestido a seco (3 µg/mL a 50 µg/mL) na presença dos anticorpos anti-CD137 otimizados/desimunizados CD137 MAB-3 (1b.3), CD137 MAB-3 (1E.15) e CD137 MAB-3 (1G.15) na ausência de reticulação (Figura 33A) ou reticulados com 4x hFc F(ab)’2 (Figura 33B).
[089] As Figuras 34A-34C mostram a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA TRIDENT-B2, TRIDENT-B5, e as moléculas controle TRIDENT-1, TRIDENT-3 e TRIDENT-4 se ligarem a CD137 na superfície de células T CD8+ ativadas, conforme medido por FACS usando CD8 rotulada com FITC e αhFc APC (Figura 34A), e o TA ilustrativo, 5T4, na superfície de JIMT-1 (5T4hi) (Figura 34B) ou células-alvo SKOV-3 (5T4lo) (Figura 34C).
[090] As Figuras 35A-35C mostram a capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA mediarem a atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocinas em células T (exemplificado pela liberação de IFN-γ). As Figuras mostram os resultados para TRIDENT-B2, TRIDENT-B5, e as moléculas controle TRIDENT-1, TRIDENT-3 e TRIDENT-4, testadas na presença de JIMT-1 que expressa 5T4 (5T4hi) (Figura 35A) ou células-alvo SKOV-3 (5T4lo) (Figura 35B), não foi observada atividade coestimulatória na ausência de células-alvo (Figura 35C).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[091] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação que possuem um ou mais sítios de ligação a epitopo específicos para um epitopo de CD137 e um ou mais sítios de ligação a epitopo específicos para um epitopo de um antígeno tumoral (“TA”) (ou seja, uma “Molécula de Ligação a CD137 x TA”). Em uma realização, essas Moléculas de Ligação a CD137 x TA serão moléculas biespecíficas, especialmente diacorpos tetravalentes biespecíficos, que são compostas de duas, três, quatro ou mais que quatro cadeias polipeptídicas e que possuem dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de CD137 e dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de um TA. Alternativamente, essas Moléculas de Ligação a CD137 x TA serão moléculas biespecíficas, especialmente moléculas de ligação trivalentes biespecíficas compostas de três ou mais cadeias polipeptídicas e que possuem um ou dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de CD137 e um ou dois sítios de ligação a epitopo cada específicos para um epitopo de um TA. As Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são capazes de se ligar simultaneamente a CD137 e a um TA. A invenção refere-se a composições farmacêuticas que contêm quaisquer dessas Moléculas de Ligação a CD137 x TA. A invenção refere- se, adicionalmente, a métodos para o uso dessas moléculas no tratamento de câncer e de outras doenças e condições. A invenção também provê novas moléculas de ligação a CD137, e moléculas de ligação HER2/neu, bem como a derivados destas e aos usos destas. Anticorpos e Outras Moléculas de Ligação
[092] Anticorpos são moléculas de imunoglobulina capazes de ligação específica a uma região alvo (“epitopo”) de uma molécula, como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo etc. (“antígeno”), através de pelo menos um “sítio de ligação a epitopo” localizado na Região Variável da molécula de imunoglobulina. Conforme aqui usado, os termos “anticorpo” e “anticorpos” se referem a anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos sintético, anticorpos quiméricos, anticorpos policlonais, anticorpos camelizados, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab’), Fvs biespecíficos ligados a dissulfeto (sdFv), intracorpos e fragmentos de ligação a epitopo de quaisquer dos descritos acima. Em particular, o termo “anticorpo” inclui moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina, ou seja, moléculas que contêm um sítio de ligação a epitopo. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse. Os anticorpos são capazes de “ligação imunoespecífica” a um polipeptídeo ou proteína ou uma molécula não proteína devido à presença de tal molécula de um domínio ou parcela ou conformação particular (um “epitopo”). Conforme aqui usado, um “fragmento de ligação a epitopo de um anticorpo” pretende indicar uma porção de um anticorpo capaz de ligação imunoespecífica a um epitopo. Conforme aqui usado, este termo abrange fragmentos (como Fab,
Fab', F(ab')2 Fv), e cadeia única (scFv), bem como o domínio de ligação a epitopo de um diacorpo. Conforme aqui usado, um anticorpo ou um fragmento de ligação a epitopo deste é dito por ligar “imunoespecificamente” uma região de outra molécula (ou seja, um epítopo) caso reaja ou se associe mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade ou avidez àquele epitopo em relação aos epitopos alternativos. Também é compreendido pela leitura desta definição que, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de ligação a epitopo deste que se liga imunoespecificamente a um primeiro alvo pode ou não se ligar de forma específica ou preferencial a um segundo alvo. Uma molécula contendo epitopo pode ter atividade imunogênica, de modo que obtenha uma resposta de produção de anticorpo em um animal; estas moléculas são denominadas “antígenos”. Os anticorpos naturais são capazes de ligação a apenas uma espécie de epitopo (ou seja, são “monoespecíficos”), embora possam se ligar a diversas cópias daquela espécie (ou seja, apresentando “bivalência” ou “multivalência”).
[093] O termo “anticorpo monoclonal” se refere a uma população de anticorpo homogênea em que o anticorpo monoclonal é compreendido de aminoácidos (de ocorrência natural ou ocorrência não natural) que estão envolvidos na ligação seletiva de um antígeno. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único epitopo (ou sítio antigênico). O termo “anticorpo monoclonal” abrange não apenas anticorpos monoclonais intacto e anticorpos monoclonais de comprimento total, mas também fragmentos destes (como Fab, Fab', F(ab')2 Fv), de cadeia única (scFv), mutantes destes, proteínas de fusão que compreendem uma porção de anticorpo, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno da especificidade exigida e a capacidade de se ligar a um antígeno.
Não se destina a se limitar quanto à fonte de anticorpo ou a forma na qual é feito (por exemplo, por hibridoma, seleção de fago, expressão recombinante, animais transgênicos etc.). O termo inclui imunoglobulinas totais, bem como os fragmentos etc., descritos acima sob a definição de “anticorpo”. Os métodos de fabricação de anticorpos monoclonais são conhecidos na técnica.
Um método que pode ser empregado é o método de Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497 or a modification thereof.
Normalmente, os anticorpos monoclonais são desenvolvidos em camundongos, ratos ou coelhos.
Os anticorpos são produzidos pela imunização de um animal com uma quantidade de células imunogênicas, extratos de células ou preparações proteicas que contêm o epitopo desejado.
O imunogênio pode ser, entre outros, células primárias, linhagens celulares cultivadas, células cancerosas, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos ou tecidos.
As células usadas para imunização podem ser cultivadas por um período de tempo (por exemplo, pelo menos 24 horas) antes de seu uso como um imunogênio.
As células podem ser usadas como imunogênios por si só ou em combinação com um adjuvante sem desnaturação, como Ribi (vide, por exemplo, Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125). No geral, as células devem ser mantidas intactas e preferivelmente viáveis quando usadas como imunogênios.
As células intactas podem permitir que os antígenos sejam mais bem detectados que células rompidas pelo animal imunizado.
O uso de adjuvantes de desnaturação ou extremos, por exemplo, adjuvante de Freund, pode romper as células e, portanto, é desencorajado.
O imunogênio pode ser administrado diversas vezes em intervalos periódicos como, duas vezes por semana ou semanalmente, ou pode ser administrado de modo a manter a viabilidade no animal (por exemplo, em um recombinante tecidual). Alternativamente, os anticorpos monoclonais existentes e quaisquer outros anticorpos equivalentes que sejam imunoespecíficos para um epitopo patogênico desejado pode ser sequenciado ou produzido recombinantemente por quaisquer meios conhecidos na técnica.
Em uma realização, tal anticorpo é sequenciado, e a sequência de polinucleotídeo é então clonada em um vetor para expressão ou propagação.
A sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelado para uso futuro.
A sequência de polinucleotídeo de tais anticorpos pode ser usada para manipulação genética para gerar as moléculas monoespecíficas ou multiespecíficas (por exemplo, biespecíficas, triespecíficas e tetraespecíficas) da invenção, bem como um anticorpo de afinidade otimizada, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e/ou anticorpo caninizado, para melhorar a afinidade ou outras características do anticorpo.
O princípio geral na humanização de um anticorpo envolve a retenção da sequência básica da porção de ligação a epítopo do anticorpo, enquanto ocorre a troca do remanescente não humano do anticorpo com sequências de anticorpo humano.
Há quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclonal.
São elas: (1) determinação do nucleotídeo e/ou sequência de aminoácidos prevista dos Domínios Variáveis de Cadeia Pesada e Leve do anticorpo inicial; (2) concepção do anticorpo humanizado ou anticorpo caninizado, ou seja, decisão de qual (is) região(ões) estrutura(is) do anticorpo usar durante o processo de humanização ou caninização; (3) aplicação das metodologias/técnicas de humanização ou caninização atuais; e (4) a transfecção e expressão do anticorpo humanizado ou caninizado (vide, por exemplo, Patentes norte-americanas Nos
4.816.567; 5.807.715; 5.866.692 e 6.331.415).
[094] As últimas décadas testemunharam um ressurgimento de interesse no potencial terapêutico de anticorpos, e os anticorpos se tornaram uma das principais classes de drogas derivadas da biotecnologia (Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666). Mais de 200 drogas baseadas em anticorpo foram aprovadas para uso ou estão em desenvolvimento. Atributos da estrutura geral dos anticorpos
[095] A unidade estrutural básica de imunoglobulinas de ocorrência natural (por exemplo, IgG) é um tetrâmero composto de duas “Cadeia Leves” mais curtas complexadas com duas “Cadeias Pesadas” mais longas e é expresso naturalmente como um glicoproteína de aproximadamente 150.000 Da. Cada cadeia é composta de uma porção de terminal amino (“N-terminal”) que compreende um “Domínio Variável” e uma porção de terminal carboxi (“C-terminal”) que compreende pelo menos um “Domínio Constante”. Uma Cadeia Leve de IgG é composta de um único “Domínio Variável de Cadeia Leve” (“VL”) e um único “Domínio Constante de Cadeia Leve” (“CL”). Portanto, a estrutura das cadeias leves de uma molécula de IgG é n-VL-CL-
c (onde n e c representam, respectivamente, o N-terminal e o C-terminal do polipeptídeo). Uma Cadeia Pesada de IgG é composta de um único “Domínio Variável de Cadeia Pesada” (“VH”), três “Domínios Constantes de Cadeia Pesada” (“CH1,” “CH2” e “CH3”), e uma região de “Articulação” (“H”) localizada entre os Domínios CH1 e CH2. Portanto, a estrutura de uma Cadeia Pesada de IgG é n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (onde n e c representam, respectivamente, o N-terminal e o C-terminal do polipeptídeo). A capacidade de um anticorpo intacto e não modificado (por exemplo, um anticorpo IgG) se ligar a um epitopo de um antígeno depende da presença e das sequências dos Domínios Variáveis. Domínios Constantes Domínio Constante de Cadeia Leve
[096] Um Domínio CL preferido é um Domínio Kappa CL IgG humano. A sequência de aminoácidos de um Domínio CL Kappa humano exemplificador é (SEQ ID NO:1):
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
[097] Alternativamente, um Domínio CL exemplificador é um Domínio Lambda CL IgG humano. A sequência de aminoácidos de um Domínio CL Lambda humano exemplificador é (SEQ ID NO:2):
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS Domínios CH1 de Cadeia Pesada
[098] Um Domínio CH1 exemplificador é um Domínio CH1 de IgG1 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG1 humana exemplificador é (SEQ ID NO:3):
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
[099] Um Domínio CH1 exemplificador é um Domínio CH1 de IgG2 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG2 humana exemplificador é (SEQ ID NO:4):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
[100] Um Domínio CH1 exemplificador é um Domínio CH1 de IgG3 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG3 humana exemplificador é (SEQ ID NO:5):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
[101] Um Domínio CH1 exemplificador é um Domínio CH1 de IgG4 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG4 humana exemplificador é (SEQ ID NO:6):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS
NTKVDKRV Regiões de Articulação de Cadeia Pesada
[102] Uma Região de Dobradiça exemplificadora é uma Região de Dobradiça de IgG1 humana. A sequência de aminoácidos de uma Região de Dobradiça de IgG1 humana exemplificadora é (SEQ ID NO:7):
EPKSCDKTHT CPPCP
[103] Uma outra Região de Dobradiça exemplificadora é uma Região de Dobradiça de IgG2 humana. A sequência de aminoácidos de uma Região de Dobradiça de IgG2 humana exemplificadora é (SEQ ID NO:8):
ERKCCVECPP CP
[104] Uma outra Região de Dobradiça exemplificadora é uma Região de Dobradiça de IgG3 humana. A sequência de aminoácidos de uma Região de Dobradiça de IgG3 humana exemplificadora é (SEQ ID NO:9):
ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK SCDTPPPCPR CP
[105] Uma outra Região de Dobradiça exemplificadora é uma Região de Dobradiça de IgG4 humana. A sequência de aminoácidos de uma Região de Dobradiça de IgG4 humana exemplificadora é (SEQ ID NO:10):
ESKYGPPCPS CP
[106] Conforme aqui descrito, uma Região de Articulação IgG4 pode compreender uma mutação estabilizadora como a substituição de S228P (conforme numerado pelo índice da UE conforme estabelecido em Kabat). A sequência de aminoácidos de uma Região de Dobradiça de IgG4 estabilizada exemplificadora é (SEQ ID NO:11):
ESKYGPPCPP CP Domínios CH2 e CH3 de Cadeia Pesada
[107] Os Domínios CH2 e CH3 das duas Cadeia Pesadas interagem para formar a “Região Fc” de anticorpos IgG que é reconhecida pelos Receptores Fc celular, inclusive, entre outros, Receptores gama Fc (FcγRs). Conforme aqui usado, o termo “Região Fc” é usado para definir uma região C-terminal de uma Cadeia Pesada de IgG. Uma porção de uma Região Fc (incluindo uma porção que abrange toda uma Região Fc) é denominada aqui como “Domínio Fc”. Diz-se que uma Região Fc por ser de um isótipo de IgG particular, classe ou subclasse caso sua sequência de aminoácidos seja mais homóloga do que o isótipo em relação a outros isótipos IgG. Além de seus usos conhecidos no diagnóstico, descobriu-se que os anticorpos são úteis como agentes terapêuticos.
[108] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2- CH3 de uma IgG1 humana exemplificadora é (SEQ ID NO:12): 231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVKFNWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA 340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK
GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE 440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX conforme numerado pelo índice EU conforme definido em Kabat, em que X é uma lisina (K) ou está ausente.
[109] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2- CH3 de uma IgG2 humana exemplificadora é (SEQ ID NO:13): 231 240 250 260 270 280 APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK
CKVSNKGLPA 340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK
GFYPSDISVE 390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE 440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX conforme numerado pelo índice EU conforme definido em Kabat, em que X é uma lisina (K) ou está ausente.
[110] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2- CH3 de uma IgG3 humana exemplificadora é (SEQ ID NO:14): 231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
PEVQFKWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA 340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK
GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
NIFSCSVMHE 440 447
ALHNRFTQKS LSLSPGX conforme numerado pelo índice EU conforme definido em Kabat, em que X é uma lisina (K) ou está ausente.
[111] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2- CH3 de uma IgG4 humana exemplificadora é (SEQ ID NO:15): 231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED
PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKGLPS 340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK
GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHE 440 447
ALHNHYTQKS LSLSLGX conforme numerado pelo índice EU conforme definido em Kabat, em que X é uma lisina (K) ou está ausente.
[112] Durante toda o presente relatório descritivo, a numeração dos resíduos na região constante de uma Cadeia Pesada de IgG é aquela do índice UE, como em Kabat et al., SEQUÊNCIAS OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) (“Kabat”), expressamente aqui incorporado por referência. O termo “índice UE como em Kabat” se refere à numeração dos Domínios Constantes do anticorpo UE IgG1 humano.
[113] Foram observados polimorfismos em inúmeras diferentes posições dentre das regiões constantes do anticorpo (por exemplo, posições Fc, inclusive, entre outras, posições 270, 272, 312, 315, 356 e 358, conforme numerado pelo índice UE estabelecido em Kabat) e, assim, podem existir diferenças discretas entre a sequência apresentada e as sequências na técnica anterior. As formas polimórficas das imunoglobulinas humanas foram bem caracterizadas. No momento, 18 alótipos de Gm são conhecidos: G1m (1, 2, 3, 17) ou G1m (a, x, f, z), G2m (23) or G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) ou G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., “The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation.” Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Contempla-se especificamente que os anticorpos da presente invenção podem incorporar qualquer alótipo, isoalótipo ou haplótipo de qualquer gene de imunoglobulina, e não estão limitados aos alótipos, isoalótipos ou haplótipos das sequências aqui providas. Além disso, em alguns sistemas de expressão, o resíduo do aminoácido do C-terminal (em negrito acima) do Domínio CH3 pode ser removido de forma pós-translacional. Da mesma forma, o resíduo do C terminal do Domínio CH3 é um resíduo de aminoácido opcional nas Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção. Especificamente abrangidos pela imediata invenção estão as Moléculas de Ligação a CD137 x TA que carecem do resíduo do C- terminal do Domínio CH3. Também especificamente abrangidos pela imediata invenção estão estes constructos que compreendem o resíduo de lisina do C-terminal do Domínio CH3. Domínios Variáveis
[114] Os Domínios Variáveis de uma molécula IgG consistem em três “regiões de determinação de complementaridade” (“CDRs”), as quais contêm resíduos de aminoácidos do anticorpo que estará em contato com o epitopo, bem como intervenção de segmentos não CDR, denominados “regiões estruturais” (“FR”), que, no geral, mantêm a estrutura e determinam o posicionamento dos ciclos de CDR de modo a permitir tal contato (embora determinados resíduos de estrutura também possam entrar em contato com o epitopo). Portanto, os Domínios VL e VH possuem a estrutura n-FR1-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c. As sequências de aminoácidos das CDRs determinam se um anticorpo será capaz de se ligar a um epitopo particular. A interação de uma Cadeia Leve do anticorpo com uma Cadeia Pesada do anticorpo e, em particular, interação de seus Domínios VL e VH, formam um sítio de ligação a epitopo do anticorpo.
[115] Os aminoácidos dos Domínios Variáveis das cadeias pesadas e leves maduras de imunoglobulinas são designados pela posição de um aminoácido na cadeia. Kabat (SEQUÊNCIAS OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)) descreveu diversas sequências de aminoácidos para anticorpos, identificou uma sequência consensual de aminoácido para cada subgrupo, e designou um número de resíduo a cada aminoácido, e as CDRs e FRs são identificadas conforme definido por Kabat (será compreendido que que CDRH1 conforme definido por Chothia, C. & Lesk, A. M. ((1987) “Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins,” J. Mol. Biol. 196:901-917) se inicia cinco resíduos depois). O esquema de numeração de Kabat é extensível a anticorpos não incluídos em seu compêndio ao alinhar o anticorpo em questão com uma das sequências consensuais em Kabat por referência aos aminoácidos conservados. Este método para designer números de resíduo se tornou padrão na área e facilmente identifica os aminoácidos em posições equivalentes em diferentes anticorpos, inclusive variantes quiméricas ou humanizadas. Por exemplo, um aminoácido na posição 50 de uma Cadeia Leve de anticorpo humano ocupa a posição equivalente a um aminoácido na posição 50 de uma Cadeia Leve de anticorpo de camundongo.
[116] Os polipeptídeos que são (ou podem servir como) a primeira, segunda e terceira CDR da Cadeia Leve de um anticorpo são, respectivamente, aqui designados como: Domínio CDRL1, Domínio CDRL2 e Domínio CDRL3. Da mesma forma, os polipeptídeos que são (ou podem servir como) a primeira, segunda e terceira CDR da Cadeia Pesada de um anticorpo são, respectivamente, aqui designados como: Domínio CDRH1, Domínio
CDRH2 e Domínio CDRH3. Portanto, os termos Domínio CDRL1, Domínio CDRL2, Domínio CDRL3, Domínio CDRH1, Domínio CDRH2 e Domínio CDRH3 são direcionados a polipeptídeos que, quando incorporados em uma proteína, faz com que a proteína seja capaz de se ligar a um epitopo específico independente de se tal proteína é um anticorpo que possui Cadeia Leves e Pesadas ou é um diacorpo ou uma Molécula de Ligação de cadeia única (por exemplo, um scFv, um BiTe etc.), ou se outro tipo de proteína. De forma adequada, como aqui usado, o termo “Fragmento de Ligação ao Epitopo” indica um fragmento de uma molécula capaz de se ligar imunoespecificamente a um epitopo. Um fragmento de ligação a epitopo pode conter quaisquer 1, 2, 3, 4 ou 5 dos Domínios CDR de um anticorpo, ou pode conter todos os 6 dos Domínios CDR de um anticorpo e, embora capaz de se ligar imunoespecificamente a tal epitopo, pode apresentar uma imunoespecificidade, afinidade ou seletividade para tal epitopo que difere daquela do anticorpo. Preferivelmente, no entanto, um fragmento de ligação a epitopo conterá todos os 6 dos Domínios CDR deste anticorpo. Um fragmento de ligação a epitopo de um anticorpo pode ser uma cadeia polipeptídica única (por exemplo, um scFv), ou pode compreender duas ou mais cadeias polipeptídicas, cada um tendo um terminal amino e um terminal carboxi (por exemplo, um diacorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab2 etc.). exceto observado especificamente, a ordem dos domínios das moléculas de proteína aqui descritas está na direção do “N-Terminal para C-Terminal”.
[117] O sítio de ligação a epitopo pode compreender tanto um Domínio Variável completo fundido nos Domínios Constantes quanto apenas as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) deste Domínio Variável enxertado às regiões estruturais apropriadas.
Os sítios de ligação a epitopo podem ser tipo selvagem ou modificadas por uma ou mais substituições de aminoácido.
Isto elimina a região constante como um imunogênio em seres humanos, mas permanece a possibilidade de uma resposta imunológica ao Domínio Variável estranho (LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Outra abordagem foca não apenas em prover regiões constantes derivadas humanas, mas modificar os Domínios Variáveis, bem como as remodela o mais próximo possível à forma humana.
Sabe-se que os Domínios Variáveis das Cadeia Pesadas e Leves contêm três Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs) que variam em resposta aos antígenos em questão e determinam a capacidade de ligação, margeados por quatros regiões estruturais (FRs) que são relativamente conservadas em uma determinada espécie e que supostamente proveem um andaime para as CDRs.
Quando os anticorpos não humanos são preparados em relação a um antígeno em particular, os Domínios Variáveis podem ser “remodelados” ou “humanizados” ao enxertar as CDRs derivadas do anticorpo não humano nas FRs presentes no anticorpo humano a ser modificado.
A aplicação desta abordagem a diversos anticorpos foi relatada por Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; Kettleborough, C.
A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR- Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124- 134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; and Co, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-
1154. Em algumas realizações, os anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado que contém todas as seis CDRs dos anticorpos de camundongo). Em outras realizações, os anticorpos humanizados possuem uma ou mais CDRs (um, duas, três, quatro, cinco ou seis) que diferente em sequência quanto ao anticorpo original.
Humanização de Anticorpos
[118] A invenção abrange particularmente Moléculas de Ligação (inclusive anticorpos e diacorpos) que compreendem um Domínio VL e/ou VH de um anticorpo humanizado. O termo anticorpo “humanizado” se refere a uma molécula quimérica, geralmente preparada usando técnicas recombinantes, que possui um sítio de ligação a epitopo de uma imunoglobulina oriunda de uma espécie não humana e uma estrutura de imunoglobulina restante da molécula que é baseada na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. A sequência de polinucleotídeo dos Domínios Variáveis destes anticorpos pode ser usada para manipulação genética para gerar tais derivados e melhorar a afinidade, ou outras características, destes anticorpos. O princípio geral na humanização de um anticorpo envolve a retenção da sequência básica da porção de ligação a epítopo do anticorpo, enquanto ocorre a troca do remanescente não humano do anticorpo com sequências de anticorpo humano. Há quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclonal. São elas: (1) determinação do nucleotídeo e sequência de aminoácidos prevista dos Domínios Variáveis leves e pesados do anticorpo inicial (2) concepção do anticorpo humanizado ou anticorpo caninizado, ou seja, decisão de qual região estrutural do anticorpo usar durante o processo de humanização ou caninização (3) as metodologias/técnicas de humanização ou caninização e (4) a transfecção e expressão do anticorpo humanizado. Vide, por exemplo, as Patentes Norte-americanas Nos. 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; e 6.331.415.
[119] Diversas moléculas do anticorpo humanizado que compreendem um sítio de ligação a epitopo derivado de uma imunoglobulina não humana foram descritas, inclusive anticorpos quiméricos que possuem Domínio Variável de roedor ou modificado de roedor e suas regiões de determinação de complementaridade (CDRs) associadas fundidas aos Domínios Constantes humanos (vide, por exemplo, Winter et al. (1991) “Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon
Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538, and Brown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583). Outras referências descrevem as CDRs de roedores enxertadas em uma região estrutural (FR) humana de suporte antes da fusão com um Domínio Constante do anticorpo humano apropriado (vide, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; and Jones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525). Outra referência descreve as CDRs de roedores apoiadas por regiões estruturais de roedores recombinantemente revestidas. Vide, por exemplo, a Publicação de Patente Europeia No. 519.596. Estas moléculas “humanizadas” são concebidas para minimizar a resposta imunológica indesejada para as moléculas de anticorpo de roedor anti-humanas, que limita a duração e eficácia das aplicações terapêuticas destas parcelas nos recipientes humanos. Outros métodos de humanização de anticorpos que também podem ser utilizados são revelados por Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR- Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 e nas Patentes Norte-americanas
6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; e 5.866.692.
[120] Sem prejuízo destas conquistas, a produção de diacorpos estáveis, heterodiméricos funcionais e não monoespecíficos otimizados para uso terapêutico pode ser aperfeiçoada ainda pela consideração cuidadosa e inserção dos domínios empregados nas cadeias polipeptídicas. Portanto, a presente invenção é direcionada à provisão de polipeptídeos específicos que são particularmente concebidos para formar, por meio de ligação covalente, diacorpos heterodiméricos e diacorpos Fc heterodiméricos estáveis e terapeuticamente úteis que são capazes de se ligar simultaneamente a CD137 e a um TA. Anticorpos biespecíficos, Diacorpos multiespecíficos e Diacorpos DART®
[121] Conforme indicado cima, os anticorpos naturais são capazes de se ligar a apenas uma espécie de epitopo, embora possam se ligar a diversas cópias desta espécie. A técnica reconheceu a conveniência de produzir anticorpos biespecíficos, e desenvolveu-se uma ampla variedade de formatos de anticorpo biespecífico recombinante para produzir tais anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Publicação PCT Nos WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565). A maioria destas abordagens usam peptídeos ligantes para fundir um domínio de ligação adicional (por exemplo, um scFv, VL, VH etc.) a ou dentro do núcleo do anticorpo (IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM), ou para fundir diversas porções de ligação de anticorpo a outras (por exemplo, dois fragmentos Fab scFv). Os formatos alternativos usam peptídeos ligantes para fundir uma proteína de ligação (por exemplo, um scFv, VL, VH etc.) a um domínio de dimerização, como o Domínio CH2-CH3 ou polipeptídeos alternativos (WO 2005/070966, WO 2006/107786A WO 2006/107617A, WO 2007/046893). Normalmente, estas abordagens envolvem compromisso e compensações. Por exemplo, as Publicações PCT No. WO 2013/174873, WO 2011/133886 e WO 2010/136172 revelam que o uso de ligantes podem causar problemas nas condições terapêuticas, e ensina um anticorpo triespecífico no qual os Domínios CL e CH1 são trocados de suas respectivas posições naturais e os Domínios VL e VH foram diversificados (WO 2008/027236; WO 2010/108127) para permitir- lhes se ligar a mais de um antígeno.
Portanto, as moléculas reveladas nestes documentos cambiam a especificidade de ligação pela capacidade de ligar espécie de antígeno adicional.
As Publicações PCT No.
WO 2013/163427 e WO 2013/119903 revelam modificação do Domínio CH2 para conter um aduto da proteína de fusão que compreendem um domínio de ligação.
O documento observa que o Domínio CH2 provavelmente desempenha apenas um papel mínimo na mediação da função efetora.
As Publicações PCT Nos WO 2010/028797, WO2010028796 e WO 2010/028795 revelam anticorpos recombinantes cujas Regiões Fc foram substituídas por Domínios VL e VH adicionais, de modo a formar Moléculas de Ligação trivalentes.
As Publicações PCT No.
WO 2003/025018 e WO2003012069 revelam diacorpos recombinantes cujas cadeias individuais contêm domínios scFv.
A Publicação PCT No.
WO 2013/006544 revela moléculas Fab multivalentes que são sintetizadas como uma cadeia polipeptídica única e então sujeita a proteólise para produzir estruturas heterodiméricas.
Assim, as moléculas reveladas nestes documentos negociam toda ou alguma da capacidade de mediação da função efetora pela capacidade de ligação a espécie de antígeno adicional.
As Publicações PCT Nos WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 e WO 1991/003493 revelam a adição de Domínios de ligação ou grupos funcionais adicionais a um anticorpo ou uma porção do anticorpo (por exemplo, adição de um diacorpo à Cadeia Leve do anticorpo, ou adição de Domínios VL e VH adicionais às Cadeia Leves e Pesadas do anticorpo, ou adição de uma proteína de fusão heteróloga ou encadeamento de diversos Domínios Fab entre si). Portanto, as moléculas reveladas nestes documentos cambiam a estrutura natural do anticorpo pela capacidade de ligação a espécie de antígeno adicional.
[122] A técnica observou adicionalmente a capacidade de produzir diacorpos que diferem dos anticorpos naturais ao serem capazes de se ligar a duas ou mais diferentes espécies de epitopo (ou seja, apresentação de biespecificidade ou multiespecificidade além da bivalência ou multivalência) (vide, por exemplo, Holliger et al. (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000)
“Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583- 588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944).
[123] A provisão de “diacorpos” não monoespecíficos provê uma vantagem significativa sobre os anticorpos: a capacidade de se coligar e co-localizar células que expressam diferentes epitopos. Portanto, os diacorpos biespecíficos possuem aplicações de ampla variação, inclusive terapia e imunodiagnóstico. A bioespecificidade permite melhor flexibilidade na concepção e engenharia do diacorpo em diversas aplicações, provendo avidez potencializada para antígenos multiméricos, a reticulação de diferentes antígenos e direcionamento destinado a tipos específicos de célula que dependem da presença de ambos os antígenos alvo. Devido à sua bivalência, taxas baixas de dissociação e rápida liberação da circulação (para diacorpos de pequeno tamanho, a ~50 kDa ou menos), moléculas de diacorpo conhecidas na técnica também demonstraram uso particular na área de exame por imagem do tumor (Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221). De importância particular encontra-se a coligação de diferentes células, por exemplo, a reticulação de células T citotóxicas a células tumorais (Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305) para dessa forma co-localizar células T aos sítios de células tumoras.
[124] Alternativamente ao direcionamento, estes diacorpos se ligam às células T, os domínios de ligação do epitopo do diacorpo podem ser direcionados para um determinante de superfície de uma célula B, como CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD40 e CD74 (Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma,” N.
Engl.
J.
Med. 359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) “Newer Monoclonal Antibodies For Hematological Malignancies,” Exp.
Hematol. 36(7):755-768). Em muitos estudos, também sdescobriu que a ligação do diacorpo a determinantes de célula efetora, por exemplo, receptores de Fcγ (FcγR), ativa a célula efetora (Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909- 2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Normalmente, a ativação da célula efetora é acionada pela ligação de um anticorpo ligado a antígeno a uma célula efetora por meio de uma interação do Domínio Fc - FcγR; assim, quanto a isto, as moléculas de diacorpo podem apresentar funcionalidade semelhante a Ig independente de se compreendem um Domínio Fc (por exemplo, conforme avaliado em qualquer ensaio da função efetora conhecido na técnica ou aqui exemplificado (por exemplo, ensaio ADCC)). Ao reticular células tumorais e efetoras, o diacorpo não apenas traz a célula efetora próxima a uma célula tumoral, mas leva à aniquilação tumoral eficaz (vide, por exemplo, Cao et al. (2003) “Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).
[125] No entanto, as vantagens descritas acima vêm a um custo relevante. A formação de tais diacorpos não monoespecíficos exige a fabricação bem sucedida de dois ou mais polipeptídeos distintos e diferentes (ou seja, esta formação exige que os diacorpos sejam formados através de heterodimerização de diferentes espécies de cadeia polipeptídica). Este fato encontra-se em contraste aos diacorpos monoespecíficos, que são formados através da homodimerização de cadeias polipeptídicas idênticas. Devido ao fato de pelo menos dois polipeptídeos diferentes (ou seja, duas espécies de polipeptídeo) deverem ser providos a fim de formar um diacorpo não monoespecífico, e devido à homodimerização de tais polipeptídeos levar a moléculas inativas (Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588), a produção destes polipeptídeos deve ser realizada de modo a abordar com a ligação covalente entre polipeptídeos da mesma espécie (ou seja, de modo a minimizar sua homodimerização) (Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588). Portanto, a técnica ensinou a associação não covalente destes polipeptídeos (vide, por exemplo, Olafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583- 588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665- 19672).
[126] No entanto, a técnica reconheceu que os diacorpos biespecíficos compostos de polipeptídeos não covalentemente associados são instáveis e se dissocial rapidamente em monômeros não funcionais de cadeia polipeptídica única (vide, por exemplo, Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672).
[127] Diante deste desafio, a técnica conseguiu desenvolver diacorpos heterodiméricos não monoespecíficos estáveis ligados covalentemente, denominados diacorpos DART®, vide, por exemplo, Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual- Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell
Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Patentes Norte-americanas Nos. 8.044.180; 8.133.982; 8.187.593; 8.193.318; 8.530.627;
8.669.349; 8.778.339; 8.784.808; 8.795.667; 8.802.091;
8.802.093; 8.946.387; 8.968.730; e 8.993.730; Publicação de Patentes Norte-americanas Nos. 2009/0060910; 2010/0174053; 2011/0081347; 2011/0097323; 2011/0117089; 2012/0009186; 2012/0034221; 2012/0141476; 2012/0294796; 2013/0149236; 2013/0295121; 2014/0017237; e 2014/0099318; Documentos de Patente Europeia Nos. EP 1868650; EP 2158221; EP 2247304; EP 2252631; EP 2282770; EP 2328934; EP 2376109; EP 2542256; EP 2601216; EP 2714079; EP 2714733; EP 2786762; EP 2839842; EP 2840091; e Publicações PCT Nos. WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/027797; WO 2010/033279; WO 2010/080538; WO 2011/109400; WO 2012/018687; WO 2012/162067; WO 2012/162068; WO 2014/159940; WO 2015/021089; WO 2015/026892; e WO 2015/026894). Estes diacorpos compreendem dois ou mais polipeptídeos covalentemente complexados e envolvem a engenharia de um ou mais resíduos de cisteína em cada uma das espécies de polipeptídeo empregadas. Por exemplo, a adição de um resíduo de cisteína ao C-terminal destes constructos mostrou permitir a ligação de dissulfeto entre as cadeias polipeptídicas, estabilizando o heterodímero resultante sem interferir nas características de ligação da molécula bivalente.
[128] O diacorpos DART® mais simples compreende duas cadeias polipeptídicas, cada uma compreendendo três Domínios (Figura 1). A primeira cadeia polipeptídica compreende: (i) um primeiro Domínio que compreende uma região de ligação de um Domínio Variável de Cadeia Leve de uma primeira imunoglobulina (VL1), (ii) um segundo Domínio que compreende uma região de ligação de um Domínio Variável de Cadeia Pesada de um segunda imunoglobulina (VH2), e (iii) um terceiro Domínio que serve para promover heterodimerização (um “Domínio de Promoção de Heterodímero”) com a segunda cadeia polipeptídica e ligar covalentemente o primeiro polipeptídeo à segunda cadeia polipeptídica do diacorpo.
A segunda cadeia polipeptídica contém um primeiro Domínio complementar (um Domínio VL2), um segundo Domínio complementar (um Domínio VH1) e um terceiro Domínio que complexa com o terceiro Domínio da primeira cadeia polipeptídica a fim de promover a heterodimerização (um “Domínio de Promoção de Heterodímero”) e ligação covalente com a primeira cadeia polipeptídica.
Estas moléculas são estáveis, potentes e possuem a capacidade de ligar simultaneamente dois ou mais antígenos.
Em uma realização, os terceiros Domínios da primeira e segunda cadeias polipeptídicas contêm, cada, um resíduo de cisteína (“©”), que serve para ligar os polipeptídeos por meio de uma ligação de dissulfeto.
O terceiro Domínio de uma ou ambas as cadeias polipeptídicas pode possuir adicionalmente a sequência de um Domínio CH2-CH3, de modo que a complexação dos polipeptídeos do diacorpo formam um Domínio Fc que seja capaz de ligação ao receptor Fc das células (tais linfócitos B, células dendríticas, células aniquiladoras naturais, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos e mastócitos). Foram descritas muitas variações destas moléculas (vide, por exemplo, Publicações da Patentes norte-americanas Nos 2013- 0295121; 2010-0174053; 2007-0004909; 2009-0060910; Publicação de Patentes Europeias Nos EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 e Publicações PCT Nos WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665) e são aqui providas. Componentes das Moléculas de Ligação a CD137 x TA Preferidas da Presente invenção
[129] As Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção são compostas de polipeptídeos e podem ser compostas de duas, três, quatro ou mais de quatro cadeias polipeptídicas. Conforme aqui usado, o termo “composto de” pretende ser aberto, de modo que as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção, compostas de duas cadeias polipeptídicas, podem possuir cadeias polipeptídicas adicionais. Estas cadeias podem ter a mesma sequência à da outra cadeia polipeptídica da Molécula de Ligação, ou podem ser diferentes em sequência de qualquer outra cadeia polipeptídica da Molécula de Ligação. Peptídeos “Ligantes” Preferidos
[130] Os polipeptídeos das Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção compreendem domínios que são precedidos de, seguidos de e/ou ligados a um outro por peptídeos “ligantes”, como Ligante 1, Ligante 2, Ligante 3 etc. Embora a invenção utilize determinados peptídeos “ligantes” preferidos, em vista dos ensinamentos aqui providos, ligantes alternativos poderiam ser facilmente identificados e empregados para se atingir as Moléculas de Ligação a CD137 x TA.
[131] Mais preferivelmente, o comprimento do Ligante 1, o qual separa estes Domínios VL e VH de uma cadeia polipeptídica, é selecionado para evitar substancial ou completamente que estes Domínios VL e VH se liguem (por exemplo, 12 ou menos resíduos de aminoácidos de comprimento). Portanto, os domínios VL1 e VH2 da primeira cadeia polipeptídica são substancial ou completamente incapazes de se ligar, e não formam um sítio de ligação a epitopo capaz de se ligar substancialmente ao primeiro ou segundo antígeno. Da mesma forma, os domínios VL2 e VH1 da segunda cadeia polipeptídica são substancial ou completamente incapazes de se ligar, e não formam um sítio de ligação a epitopo capaz de se ligar substancialmente ao primeiro ou segundo antígeno. Um peptídeo espaçador de intervenção preferido (Ligante 1) possui a sequência (SEQ ID NO:16): GGGSGGGG, a qual é muito curta para permitir que os Domínios VL e VH da mesma cadeia polipeptídica se complexem (em contraste ao peptídeo espaçador de intervenção mais longo empregado pra produzir moléculas scFv (por exemplo, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:17)).
[132] O objetivo do Ligante 2 é separar o Domínio VH de uma cadeia polipeptídica do Domínio de Promoção de Heterodímero opcionalmente presente daquela cadeia polipeptídica. Qualquer de uma variedade de ligantes pode ser utilizada para a finalidade do Ligante 2. Uma sequência preferida para esse Ligante 2 tem a sequência de aminoácidos: GGCGGG (SEQ ID NO:18), que possui um resíduo de cisteína que pode ser usado para ligar covalentemente a primeira e a segunda cadeias polipeptídicas entre si por meio de uma ligação de dissulfeto, ou ASTKG (SEQ ID NO:19), que é derivada do domínio CH1 de IgG. Como o Ligante 2, ASTKG (SEQ ID NO:19) não possui esta cisteína, o uso deste Ligante 2 é preferivelmente associado ao uso de um Domínio de Promoção de Heterodímero contendo cisteína, como a espiral E de SEQ ID NO:38 ou a espiral K de SEQ ID NO:39 (vide abaixo).
[133] Um objetivo do Ligante 3 é separar o Domínio de Promoção de Heterodímero de uma cadeia polipeptídica do Domínio Fc daquela cadeia polipeptídica. Um segundo objetivo é prover um domínio de polipeptídeo contendo cisteína. Qualquer de uma variedade de ligantes pode ser utilizada para a finalidade do Ligante 3. Uma sequência preferida para esse Ligante 3 tem a sequência de aminoácidos: DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:20). Uma outra sequência preferida para o Ligante 3 tem a sequência de aminoácidos: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:21).
[134] O objetivo do Ligante 4 é separar o C- terminal dos domínios CH2-CH3 de uma Região Fc (“Domínio Fc”) do N-terminal de um Domínio VL. Qualquer de uma variedade de ligantes pode ser utilizada para a finalidade do Ligante 4. Uma sequência preferida para esse Ligante 4 tem a sequência de aminoácidos: APSSS (SEQ ID NO:22) or the amino acid sequence APSSSPME (SEQ ID NO:23) or the amino acid sequence GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24),
[135] As moléculas contendo Região Fc da presente invenção podem incluir peptídeos espaçadores de intervenção adicionais (Ligantes), geralmente estes Ligantes serão incorporados entre um Domínio de Promoção de Heterodímero (por exemplo, um espiral E ou espiral K) e um Domínio CH2-CH3 e/ou entre um Domínio CH2-CH3 e um Domínio Variável (ou seja, VH ou VL). Normalmente, os Ligantes adicionais compreenderão 3 a 20 resíduos de aminoácidos e podem, opcionalmente, conter toda ou uma porção de uma Região de Articulação de IgG
(preferivelmente uma porção contendo cisteína de uma Região de Articulação de IgG). Os Ligantes que podem ser empregados nas moléculas de diacorpos contendo Região Fc biespecífica da presente invenção incluem: GGC, GGG, ASTKG (SEQ ID NO:19), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:20), APSSS (SEQ ID NO:22), APSSSPME (SEQ ID NO:23), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24), LGGGSG (SEQ ID NO:25), GGGS (SEQ ID NO:26), LEPKSS (SEQ ID NO:27), VEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:28), LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:29). LEPKSS (SEQ ID NO:27) may be used in lieu of GGG or GGC for ease of cloning. Adicionalmente, os aminoácidos GGG, ou LEPKSS (SEQ ID NO:27) podem ser imediatamente seguidos de DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:20) para formar os ligantes alternativos: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:21); e LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:30). Moléculas contendo Região Fc Biespecífica da presente invenção podem incorporar uma Região de Articulação de IgG, como a Região de Articulação de IgG de um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano, ou uma porção desta. Domínio de Promoção de Heterodímero Preferido
[136] Conforme indicado acima, a formação das Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção envolve o fabrico de duas ou mais cadeias polipeptídicas diferentes (ou seja, heterodimerização). A formação de heterodímeros da primeira e segunda cadeias polipeptídicas pode ser acionada pela inclusão do “Domínio de Promoção de Heterodímero”. O Domínio de Promoção de Heterodímero pode ser um domínio de uma Região de Articulação de um IgG (ou um polipeptídeo derivado de uma Região de Articulação, como, por exemplo, GVEPKSC (SEQ ID NO:31), VEPKSC (SEQ ID NO:32)) ou AEPKSC (SEQ ID NO:33)) em uma cadeia polipeptídica, e um Domínio CL (ou um polipeptídeo derivado do Domínio CL, como, por exemplo, GFNRGEC (SEQ ID
NO:34) ou FNRGEC (SEQ ID NO:35)) na outra cadeia polipeptídica (US2007/0004909).
[137] Mais preferivelmente, no entanto, o Domínio de Promoção de Heterodímero da presente invenção compreenderá domínios de espiral repetido em modo tandem de carga oposta, por exemplo, domínios helicoidais de “espiral E” (SEQ ID NO:36: EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK), cujos resíduos de glutamato formarão uma carga negativa a pH 7, enquanto o outro do Domínio de Promoção de Heterodímero compreenderá quatro domínios de “espiral K” tandem (SEQ ID NO:37: KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE), cujos resíduos de lisina formarão uma carga positiva a pH 7. A presença destes domínios carregados promove a associação entre o primeiro e segundo polipeptídeos e, assim, propicia a heterodimerização. Em outra realização preferida, um Domínio de Promoção de Heterodímero no qual um dos quatro domínios helicoidais de “espiral E” em tandem de SEQ ID NO:36 foi modificado para conter um resíduo de cisteína: EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:38) é utilizado. Da mesma forma, em outra realização preferida, um Domínio de Promoção de Heterodímero no qual um dos quatro domínios helicoidais de “espiral K” em tandem de SEQ ID NO:37 foi modificado para conter um resíduo de cisteína: KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:39) é utilizado. Ligação covalente das cadeias polipeptídicas
[138] As Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção são projetadas de modo que os pares de suas cadeias polipeptídicas se liguem covalentemente por meio de um ou mais resíduos de cisteína posicionados ao longo de seu comprimento para produzir um complexo molecular covalentemente associado. Estes resíduos de cisteína podem ser introduzidos no ligante de intervenção que separa os Domínios VL e VH dos polipeptídeos. Alternativamente, o Ligante 2 ou Ligante 3, ou um ligante alternativo pode conter um resíduo de cisteína. Mais preferivelmente, um ou mais domínios de espiral de um Domínio de Promoção de Heterodímero contendo espiral compreenderão uma substituição de aminoácido que incorpora um resíduo de cisteína como na SEQ ID NO:38 ou SEQ ID NO:39.
Domínios Fc Preferidos
[139] O Domínio Fc de uma Molécula de Ligação a CD137 x TA portando Fc da presente invenção podem compreender uma Região Fc completa (por exemplo, uma Região Fc de IgG completa) ou apenas um fragmento de uma Região Fc completa. O Domínio Fc das Moléculas de Ligação a CD137 x TA portando Fc da presente invenção pode, portanto, incluir alguns ou todos do Domínio CH2 e/ou alguns ou todos do Domínio CH3 de uma Região Fc completa, ou pode compreender uma sequência CH2 variante e/ou CH3 variante (que pode incluir, por exemplo, uma ou mais inserções e/ou uma ou mais exclusões em relação aos domínios CH2 ou CH3 de uma Região Fc completa). O Domínio Fc dos diacorpos Fc biespecífico da presente invenção pode compreender porções de polipeptídeo não Fc, ou pode compreender porções de Regiões Fc não naturalmente completas, ou pode compreender orientações de ocorrência não natural de domínios CH2 e/ou CH3 (como, por exemplo, dois domínios CH2 ou dois domínios CH3, ou na direção do N-terminal para C-terminal, um Domínio CH3 ligado a um Domínio CH2 etc.).
[140] Embora o Domínio Fc de uma Molécula de Ligação a CD137 x TA portando Fc da presente invenção possa compreender a sequência de aminoácidos de um Domínio FC de ocorrência natural, prefere-se para os Domínios CH2-CH3 que formam tal Domínio Fc para compreender uma ou mais substituições de modo que o Domínio FC resultante apresente redução (por exemplo, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20% ou menos de 10%, da ligação apresentada pela molécula caso tenha um Domínio Fc que possui a sequência de aminoácidos de uma Região Fc de ocorrência natural), ou substancialmente indetectável, ligando-se a FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) ou FcγRIIIB (CD16b) (em relação à ligação apresentada pela Região Fc do tipo selvagem). As variantes Fc e formas mutantes capazes de mediar esta ligação alterada são bem conhecidas na técnica e incluem substituições de aminoácido em uma ou mais posições eleitas a partir do grupo que consiste em: 234, 235, 265 e 297, em que a dita numeração é aquela do índice UE conforme em Kabat (vide, por exemplo, Patente norte-americana No.
5.624.821, incorporada pelo presente por referência). Em uma realização, o Domínio CH2-CH3 da primeira e/ou Terceira cadeias polipeptídicas das moléculas portando Fc da invenção incluem quaisquer 1, 2, 3 ou 4 das substituições: L234A, L235A, D265A, N297Q, e N297G. Alternativamente, utiliza-se um Domínio CH2- CH3 de uma Região Fc de ocorrência natural que apresenta inerentemente redução (ou substancialmente ausência) de ligação a FcγRIIIA (CD16a) e/ou redução de função efetora (em relação à ligação e função efetora apresentada pela Região Fc do IgG1 do tipo selvagem (SEQ ID NO:12)). Em uma realização específica, as moléculas portando Fc da presente invenção compreendem uma Região Fc do IgG2 (SEQ ID NO:13) ou uma Região Fc IgG4 (SEQ ID:NO:15). Quando se utiliza uma Região Fc do IgG4, a presente invenção também abrange a introdução de uma mutação estabilizante, como a substituição da Região de Articulação S228P descrita acima (vide, por exemplo, SEQ ID NO:11).
[141] Em uma realização preferida, o Domínio CH2-CH3 empregado de Moléculas de Ligação a CD137 x TA portando Fc da presente invenção inclui uma substituição na posição 234 com alanina e 235 com alanina, em que a dita numeração é aquela do índice UE como em Kabat (SEQ ID NO:40):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX em que X é uma lisina (K) ou está ausente.
[142] A meia-vida sérica das proteínas que compreendem as Regiões Fc pode ser elevada ao aumentar a afinidade de ligação da Região Fc para FcRn. O termo “meia- vida”, como aqui usado, significa uma propriedade farmacocinética de uma molécula que é uma medida do tempo médio de sobrevida das moléculas após sua administração. Meia-vida pode ser expressa como o tempo necessário para se eliminar cinquenta porcento (50%) de uma quantidade conhecida da molécula do organismo de um indivíduo (por exemplo, um paciente humano ou outro mamífero) ou um compartimento específico deste, por exemplo, como medido no soro, ou seja, meia-vida circulante, ou em outros tecidos. No geral, um aumento na meia- vida resulta em um aumento no tempo médio de residência (MRT) na circulação para a molécula administrada.
[143] Em algumas realizações, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA portando Fc da presente invenção compreendem uma Região Fc variante, em que a dita Região Fc variante compreende pelo menos a modificação de um aminoácido em relação a uma Região Fc do tipo selvagem, de modo que a dita molécula possua uma meia-vida aumentada (em relação a uma molécula que compreende uma Região Fc do tipo selvagem). Em algumas realizações, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA portando Fc da presente invenção compreendem uma Região Fc do IgG variante, em que a dita Região Fc variante compreende uma meia-vida que estende a substituição de aminoácido. Diversas substituições de aminoácido capazes de aumentar a meia-vida de uma molécula portando Fc são conhecidas na técnica, vide, por exemplo, as substituições de aminoácido descritas nas patentes norte-americanas Nos 6.277.375, 7.083.784, 7.217.797,
8.088.376; publicações norte-americanas Nos 2002/0147311; 2007/0148164; e publicações PCT Nos WO 98/23289; WO 2009/058492 e WO 2010/033279, as quais são pelo presente incorporadas por referência em sua totalidade. Uma Molécula de Ligação a CD137 x TA portando Fc que possui uma meia-vida aumentada pode compreender duas ou mais substituições selecionadas entre: T250Q, M252Y, S254T, T256E, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K e Y436I, em que a dita numeração é aquela do índice UE como em Kabat.
[144] Em particular, o Domínio CH2-CH3 empregado pode compreender as substituições: (A) M252Y, S254T e T256E; (B) M252Y e S254T; (C) M252Y e T256E; (D) T250Q e M428L; (E) T307Q e N434A; (F) A378V e N434A;
(G) N434A e Y436I; (H) V308P e N434A; or (I) K288D e H435K, em que a dita numeração é aquela do índice UE como em Kabat.
[145] Uma sequência preferida para os Domínios CH2 e CH3 compreende a substituição tripla de aminoácidos: M252Y/S254T/T256E (YTE), que aumenta significativamente a meia-vida sérica (Dall’Acqua, W.F. et al. (2006) “Properties of Human IgGs Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn),” J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524), como na SEQ ID NO:41 ou SEQ ID NO:42, as quais são variantes do Domínio CH2-CH3 de IgG1, ou como na SEQ ID NO:43, que é uma variante do Domínio CH2-CH3 de IgG4: SEQ ID NO:41:
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX em que X é uma lisina (K) ou está ausente. SEQ ID NO:42:
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX em que X é uma lisina (K) ou está ausente. SEQ ID NO:43:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX em que X é uma lisina (K) ou está ausente.
[146] A invenção também abrange Moléculas de Ligação a CD137 x TA portando Fc que compreendem Domínios Fc variantes que apresentam função efetora alterada, meia-vida sérica alterada, estabilidade alterada, susceptibilidade alterada a enzimas celulares ou função efetora alterada, como testado em um ensaio dependente de NK ou dependente de macrófago etc. As modificações de Domínio Fc identificadas como alteração da função efetora são conhecidas na técnica, inclusive modificações que aumentam a ligação a receptores de ativação (por exemplo, FcγRIIA (CD16A) e reduzem a ligação a receptores inibitórios (por exemplo, FcγRIIB (CD32B) (vide, por exemplo, Stavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low- Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890). As variantes exemplificadoras de Domínios Fc de IgG1 humano com ligação reduzida a CD32B e/ou ligação aumentada a CD16A contêm substituições de F243L, R292P, Y300L, V305I ou P296L. Estas substituições de aminoácido podem estar presentes em um Domínio Fc de IgG1 em qualquer combinação. Em uma realização, o Domínio Fc de IgG1 humano variante contém uma substituição de F243L, R292P e Y300L, em que a dita numeração é aquela do índice UE como em Kabat. Em outra realização, o Domínio Fc de IgG1 humano variante contém uma substituição de F243L, R292P, Y300L, V305I e P296L, em que a dita numeração é aquela do índice UE como em Kabat.
[147] Os Domínios CH2 e/ou CH3 das Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção não precisam ser de sequência idêntica e, vantajosamente, são modificados para promover a heterodimerização entre as duas cadeias polipeptídicas que portam CH2-CH3. Por exemplo, uma substituição de aminoácido (de preferência, uma substituição com um aminoácido compreendem um grupo lateral volumoso formando um “saliência”, por exemplo, triptofano) pode ser introduzida no Domínio CH2 ou CH3 de modo que a interferência estérica evitará a interação com um Domínio similarmente mutado e obrigará o Domínio mutado a parear com um Domínio em que uma mutação complementar ou de acomodação foi projetada, ou seja, uma “lacuna” (por exemplo, uma substituição com glicina). Estes conjuntos de mutações podem ser projetados em qualquer par de polipeptídeos que compreendem a molécula de diacorpo biespecíficos portando Fc, e ainda, projetados em qualquer porção das cadeias polipeptídicas do dito par. Os métodos de projeção de proteína para favorecer a heterodimerização sobre a homodimerização são bem conhecidos na técnica, em particular em relação à projeção de moléculas semelhantes à imunoglobulina, e são abrangidos aqui (vide, por exemplo, Ridgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35, e Xie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And
Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101; cada um destes documentos é pelo presente incorporado por referência em sua totalidade). Em uma realização, a saliência é projetada nos Domínios CH2-CH3 da primeira cadeia polipeptídica e a lacuna é projetada nos Domínios CH2-CH3 da terceira cadeia polipeptídica. Assim, a saliência ajudará a evitar que duas moléculas da primeira cadeia polipeptídica se homodimerizem por meio de seus Domínios CH2 e/ou CH3. Como a terceira cadeia polipeptídica desta realização contém preferivelmente a substituição de lacuna, ela terá a capacidade de se heterodimerizar com a primeira cadeia polipeptídica, bem como se homodimerizar (no entanto, esta homodimerização não forma uma molécula que possui sítios de ligação a epitopo). Uma saliência preferida é criada pela modificação de um Domínio Fc de IgG natural para conter a modificação T366W. Uma lacuna preferida é criada ao modificar um Domínio Fc de IgG natural para conter as modificações T366S, L368A e Y407V. Para ajudar na purificação da terceira cadeia polipeptídica, o homodímero do diacorpo biespecífico final portando Fc que compreende heterodímeros da primeira e terceira cadeias polipeptídicas, o sítio de ligação à proteína A dos Domínios CH2 e CH3 da terceira cadeia polipeptídica é preferivelmente submetido à mutação pela substituição de aminoácido na posição 435 (H435R). Portanto, o homodímero da terceira cadeia polipeptídica não se ligará à proteína A, ao passo que o diacorpo biespecífico portando Fc adequadamente montado manterá sua capacidade de se ligar à proteína A por meio do sítio de ligação à proteína A na primeira cadeia polipeptídica.
[148] SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46 proveem sequências exemplificadoras preferidas para Domínios
CH2 e CH3 “portando saliência” que podem ser usadas nas Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção: SEQ ID NO:44:
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX em que X é uma lisina (K) ou está ausente, SEQ ID NO:45:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX em que X é uma lisina (K) ou está ausente, SEQ ID NO:46:
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX em que X é uma lisina (K) ou está ausente,
[149] SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:49 proveem as sequências exemplificadoras preferidas para Domínios CH2 e CH3 “portando lacuna” que podem ser usadas nas Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção: SEQ ID NO:47:
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGX em que X é uma lisina (K) ou está ausente, SEQ ID NO:48:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSRL TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSLGX em que X é uma lisina (K) ou está ausente, SEQ ID NO:49:
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGX em que X é uma lisina (K) ou está ausente,
[150] Como será observado, os Domínios CH2-CH3 das SEQ ID NOs:45 e 48 são Domínios de IgG4, enquanto os Domínios CH2-CH3 das SEQ ID NOs:44, 46 47 e 49 são Domínios de IgG1. As SEQ ID NOs:44, 46 47 e 49 incluem uma substituição na posição 234 com alanina e 235 com alanina e, assim, formam um Domínio Fc que apresenta redução (ou substancialmente ausência) de ligação a FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) ou FcγRIIIB (CD16b) (em relação à ligação apresentada pela Região Fc do tipo selvagem (SEQ ID NO:12). Além disso, especificamente abrangido pela presente encontram-se os constructos de Molécula de Ligação a CD137 x
TA que carecem do resíduo de lisina do C-terminal indicado acima.
[151] Na realização descrita acima, a primeira cadeia polipeptídica terá uma sequência de CH2-CH3 “portando saliência”, como aquela da SEQ ID NO:44. No entanto, como será reconhecido, um Domínio CH2-CH3 “portando lacuna” (por exemplo, SEQ ID NO:47) poderia ser empregado na primeira cadeia polipeptídica, caso no qual um Domínio CH2-CH3 “portando saliência” (por exemplo, SEQ ID NO:44) seria empregado na terceira cadeia polipeptídica. Domínio de Ligação a Albumina
[152] Como revelado no documento de patente WO 2012/018687, para melhorar as propriedades farmacocinéticas in vivo dos diacorpos, um diacorpo pode ser modificado para conter uma porção polipeptídica de uma proteína de ligação sérica a um ou mais dos terminais do diacorpo. Estas considerações também são aplicáveis a Moléculas de Ligação Triespecíficas da presente invenção. Mais preferivelmente, quando se deseja que uma porção polipeptídica de uma proteína de ligação sérica seja incorporada nas Moléculas de Ligação Triespecíficas da presente invenção, tal porção polipeptídica será instalada no C-terminal de uma das cadeias polipeptídicas da Molécula de Ligação Triespecífica.
[153] A albumina é a proteína mais abundante no plasma e possui uma meia-vida de 19 dias nos seres humanos. A albumina possui diversos pequenos sítios de ligação a molécula que permite que eles se liguem de modo não covalente a outras proteínas e, assim, estendam suas meia-vidas séricas. O Domínio 3 de Ligação a Albumina (ABD3) da proteína G da cepa de Streptococcus G148 consiste em 46 resíduos de aminoácidos que formam um feixe de hélice tripla estável e possui ampla especificidade de ligação a albumina (Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120. Portanto, uma porção polipeptídica particularmente preferida de uma proteína de ligação sérica para melhorar as propriedades farmacocinéticas in vivo de um diacorpo é o Domínio de Ligação a Albumina (ABD) a partir da proteína G estreptocócica, e mais preferivelmente, o Domínio de Ligação a Albumina 3 (ABD3) da proteína G da cepa de Streptococcus G148 (SEQ ID NO:50): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP.
[154] Conforme revelado no documento de patente WO 2012/162068 (pelo presente incorporado por referência), variantes “desimunizadas” da SEQ ID NO:50 possuem a capacidade de atenuar ou eliminar a ligação a MHC classe II. Com base nos resultados de mutação de combinação, as seguintes combinações de substituições são consideradas substituições preferidas para a formação de um Domínio de Ligação a Albumina desimunizado: 66S/70S +71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. Variante ABDs tendo as modificações L64A, I65A e D79A ou as modificações N66S, T70S e D79A. Variante ABD desimunizada tendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs:51, 52 ou 53 são particularmente preferidas uma vez eu os Domínios de ligação a Albumina desimunizada apresentam ligação substancialmente tipo selvagem enquanto proveem atenuação da ligação a MHC classe II: SEQ ID NO: NO:51:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70 A71EGVKALIDE
ILAALP SEQ ID NO: NO:52: LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E
ILAALP SEQ ID NO: NO:53: LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E
ILAALP
[155] Embora tais Domínios de Ligação a Albumina possam ser incorporados em quaisquer das cadeias polipeptídicas das Moléculas de Ligação Triespecíficas da presente invenção, preferiu-se posicionar este Domínio C- terminal ao Domínio de espiral E (ou espiral K) da primeira ou terceira cadeia polipeptídica (por meio de um ligante que interfere entre o Domínio de espiral E (ou espiral K) e o Domínio de Ligação a Albumina (o qual é preferivelmente um Domínio de Ligação a Albumina desimunizado)). Uma sequência preferida para tal ligante é SEQ ID NO:26: GGGS. GGGS. Antígenos Tumorais (TA) Preferidos e Domínios Variáveis Exemplificadores
[156] As Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção compreendem pelo um sítio de ligação a epitopo específico para um epitopo de um antígeno tumoral. Os Antígenos Tumorais (“TAs”) preferidos, que podem ser ligados pelas Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção, incluem, entre outros: antígeno do câncer de cólon 19.9; proteína oncofetal 5T4; antígeno mucina de câncer gástrico antígeno 4.2; antígeno de carcinoma colorretal A33 (Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8):991-998); ADAM-9 (Publicação de Patente norte-americana No. 2006/0172350; Publicação PCT
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WO 03/093443); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); beta-catenina (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); CA125 (Bast, R.C.
Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81); Carboxipeptidase M (Publicação de Patente Norte-americana No. 2006/0166291); B1 (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(1):6-9); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2):167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD20 (Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36); CD20 (Cang, S. et al. (2012) “Novel CD20 Monoclonal Antibodies For Lymphoma Therapy,” J.
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[157] Os anticorpos que reconhecem estes Antígenos Tumorais são conhecidos na técnica ou podem ser gerado usando-se métodos bem conhecidos, inclusive aqueles descritos no documento de patente WO 2002/014870. Os anticorpos exemplificadores que compreendem Domínios VL e VH capazes de ligação a um Antígeno Tumoral, e cujas sequências ou cadeias polipeptídicas podem, portanto, ser empregadas na construção das Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção, estão listados na Tabela 1. Os Domínios VH e VL exemplificadores para ligação de anticorpos a diversos Antígenos Tumorais são apresentados abaixo. Tabela 1 Nome do Antígeno(s) Aplicação Alvo Terapêutica Anticorpo Tumoral(is) 3F8 Gd2 Neuroblastoma Neuroblastoma, sarcoma, 8H9 B7-H3 cânceres cerebrais metastáticos Abagovomabe CA-125 Câncer de ovário Adecatumumabe Epcam Câncer de próstata e mama Afutuzumabe CD20 Linfoma Alacizumabe VEGFR2 Câncer Altumomabe CEA Câncer colorretal Amatuximabe Mesotelina Câncer Anatumomabe Carcinoma de pulmão de TAG-72 Mafenatox células não pequenas Receptor de Anifrolumabe Lúpus Eritematoso Sistêmico Interferon Α/Β Anruquinzumabe IL-13 Câncer
Tabela 1 Nome do Antígeno(s) Aplicação Alvo Terapêutica Anticorpo Tumoral(is) Apolizumabe HLA-DR Cânceres hematológicos Arcitumomabe CEA Câncer gastrointestinal Atinumabe RTN4 Câncer Linfoma não Hodgkin Bectumomabe CD22 (Detecção) Belimumabe BAFF Linfoma não Hodgkin Câncer metastático, Bevacizumabe VEGF-A retinopatia de prematuridade Bivatuzumabe CD44 V6 Carcinoma espinocelular Blinatumomabe CD19 Câncer Brentuximabe CD30 (TNFRSF8) Cânceres hematológicos Cantuzumabe MUC1 Cânceres Cantuzumabe Mucin Canag Câncer colorretal Mertansina Caplacizumabe VWF Cânceres Células de Câncer de próstata Capromabe carcinoma (Detecção) prostático Indicações Carlumabe MCP-1 oncológicas/imunológicas Câncer de ovário, ascite Catumaxomabe Epcam, CD3 maligna, câncer gástrico Cc49 Tag-72 Detecção de tumor Câncer colorretal Cetuximabe EGFR metastático e câncer de cabeça e pescoço Ch.14.18 Não determinado Neuroblastoma Câncer de ovário e outros Citatuzumabe Epcam tumores sólidos Cixutumumabe Receptor de IGF-1 Tumores sólidos Clivatuzumabe MUC1 Câncer pancreático Conatumumabe TRAIL-R2 Câncer Dacetuzumabe CD40 Cânceres hematológicos Receptor do fator Dalotuzumabe de crescimento I Câncer similar à insulina Daratumumabe CD38 Câncer Demcizumabe DLL4 Câncer
Tabela 1 Nome do Antígeno(s) Aplicação Alvo Terapêutica Anticorpo Tumoral(is) Linfomas de células Detumomabe Linfoma b Drozitumabe DR5 Câncer Duligotumabe HER3 Câncer Dusigitumabe ILGF2 Câncer Ecromeximabe Gangliosídeo GD3 Melanoma maligno Hemoglobinúria paroxística Eculizumabe C5 noturna Edrecolomabe Epcam Carcinoma colorretal Elotuzumabe SLAMF7 Mieloma múltiplo Elsilimomabe IL-6 Câncer Enavatuzumabe Receptor TWEAK Câncer Enlimomabe ICAM-1 (CD54) Câncer Enoquizumabe IL9 Asma Enoticumabe DLL4 Câncer Ensituximabe 5AC Câncer Epitumomabe Episialina Câncer Cituxetan Epratuzumabe CD22 Câncer, SLE Ertumaxomabe HER2/Neu, CD3 Câncer de mama Melanoma, câncer de Etaracizumabe Integrina Αvβ3 próstata, câncer de ovário Receptor de Faralimomabe Câncer Interferon Receptor de folato Farletuzumabe Câncer de ovário 1 Fasinumabe HNGF Câncer Leucemia linfocítica Fbta05 CD20 crônica Ficlatuzumabe HGF Câncer Carcinoma adrenocortical, Figitumumabe Receptor de IGF-1 carcinoma pulmonar de células não pequenas TYRP1 Flanvotumabe Melanoma (Glicoproteína 75) Fontolizumabe IFN-γ Doença de Crohn Fibrose pulmonar Fresolimumabe TGF-Β idiopática,
Tabela 1 Nome do Antígeno(s) Aplicação Alvo Terapêutica Anticorpo Tumoral(is) glomeruloesclerose segmental focal, câncer Futuximabe EGFR Câncer Galiximabe CD80 Linfoma de células B Ganitumabe IGF-I Câncer Gemtuzumabe CD33 Leucemia mielogênica aguda Ozogamicina Gevokizumabe IL-1β Diabetes Anidrase carbônica Carcinoma renal de células Girentuximabe 9 (CA-IX) claras Glembatumumabe GPNMB Melanoma, câncer de mama Vedotina Artrite reumatoide, artrite Golimumabe TNF-Α psoriática, espondilite anquilosante Ibritumomabe CD20 Linfoma não Hodgkin Tiuxetano Icrucumabe VEGFR-1 Câncer Câncer de ovário Igovomabe CA-125 (Diagnóstico) Adenocarcinomas Imab362 Cldn18.2 gastrointestinais e tumor pancreático Imgatuzumabe EGFR Câncer Inclacumabe Selectina P Câncer Indatuximabe SDC1 Câncer Ravtansina Inotuzumabe CD22 Câncer Ozogamicina Tumores sólidos (câncer de Intetumumabe CD51 próstata, melanoma) Ipilimumabe CD152 Melanoma Iratumumabe CD30 (TNFRSF8) Linfoma de Hodgkin Itolizumabe CD6 Câncer Labetuzumabe CEA Câncer colorretal Lambrolizumabe PDCD1 Agente antineoplásico Lampalizumabe CFD Câncer Lexatumumabe TRAIL-R2 Câncer
Tabela 1 Nome do Antígeno(s) Aplicação Alvo Terapêutica Anticorpo Tumoral(is) Antígeno de Libivirumabe superfície da Hepatite B hepatite B Ligelizumabe IGHE Câncer Lintuzumabe CD33 Câncer Lirilumabe KIR2D Câncer Lorvotuzumabe CD56 Câncer Mieloma múltiplo, linfoma Lucatumumabe CD40 não hodgkin, linfoma de hodgkin Leucemia linfocítica Lumiliximabe CD23 crônica Mapatumumabe TRAIL-R1 Câncer Margetuximabe Ch4d5 Câncer Câncer colorretal, pulmonar Matuzumabe EGFR e estomacal Mieloma múltiplo e outras Milatuzumabe CD74 malignidades hematológicas Minretumomabe TAG-72 Câncer Carcinoma de pulmão de Mitumomabe Gangliosídeo GD3 células pequenas Mogamulizumabe CCR4 Câncer Morolimumabe Fator Rhesus Câncer Moxetumomabe CD22 Câncer Pasudotox Nacolomabe Antígeno C242 Câncer colorretal Tafenatox Namilumabe CSF2 Câncer Carcinoma pulmonar de Naptumomabe 5T4 células não pequenas, Estafenatox carcinoma de células renais Narnatumabe RON Câncer Nebacumabe Endotoxina Sepse Carcinoma de pulmão de Necitumumabe EGFR células não pequenas Nerelimomabe TNF-Α Câncer Nesvacumabe Angiopoietina 2 Câncer Carcinoma espinocelular, Nimotuzumabe EGFR câncer de cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo, glioma
Tabela 1 Nome do Antígeno(s) Aplicação Alvo Terapêutica Anticorpo Tumoral(is) Nivolumabe PD-1 Câncer Nofetumomabe Não determinado Câncer Merpentano Ocaratuzumabe CD20 Câncer Leucemia linfocítica Ofatumumabe CD20 crônica Olaratumabe PDGF-R Α Câncer Oloquizumabe IL6 Câncer Quinase do receptor Onartuzumabe do fator de Câncer dispersão humano Ontuxizumabe TEM1 Câncer Oportuzumabe Epcam Câncer Monatox Oregovomabe CA-125 Câncer de ovário Orticumabe Oxldl Câncer Otlertuzumabe CD37 Câncer Panitumumabe EGFR Câncer colorretal Glicosilação Pancomabe tumoral específica Câncer de ovário de MUC1 Parsatuzumabe EGFL7 Câncer Patritumabe HER3 Câncer Pembrolizumabe PD-1 Câncer Pemtumomabe MUC1 Câncer Peraquizumabe IL17A Artrite Pertuzumabe HER2/Neu Câncer Câncer e doenças Pidilizumabe PD-1 infecciosas Pinatuzumabe CD22 Câncer Vedotina Antígeno de Pintumomabe Adenocarcinoma adenocarcinoma Placulumabe TNF humano Câncer Polatuzumabe CD79B Câncer Vedotina Toxina E.
Coli Pritoxaximabe Câncer Shiga Tipo 1 Pritumumabe Vimentina Câncer cerebral
Tabela 1 Nome do Antígeno(s) Aplicação Alvo Terapêutica Anticorpo Tumoral(is) Quilizumabe IGHE Câncer Ácido N- Racotumomabe Câncer glicolilneuramínico Domínio-B extra Radretumabe Câncer fibronectina Ramucirumabe VEGFR2 Tumores sólidos Rilotumumabe HGF Tumores sólidos Linfomas, leucemias, alguns Rituximabe CD20 distúrbios autoimunes Robatumumabe Receptor de IGF-1 Câncer Roledumabe RHD Câncer Samalizumabe CD200 Câncer Satumomabe TAG-72 Câncer Pendetida Seribantumabe ERBB3 Câncer Toxina E.
Coli Setoxaximabe Câncer Shiga Tipo 1 Leucemia linfoblástica Sgn-CD19a CD19 aguda e linfoma não Hodgkin de células B Sgn-CD33a CD33 Leucemia mieloide aguda Sibrotuzumabe FAP Câncer Siltuximabe IL-6 Câncer Solitomabe Epcam Câncer Sontuzumabe Episialina Câncer Tabalumabe BAFF Cânceres de células B Tacatuzumabe Alfa-fetoproteína Câncer Tetraxetano Taplitumomabe CD19 Câncer Paptox Telimomabe Não determinado Câncer Tenatumomabe TenascinaC Câncer Teneliximabe CD40 Câncer Teprotumumabe CD221 Tumores hematológicos Ticilimumabe CTLA-4 Câncer Tigatuzumabe TRAIL-R2 Câncer Tnx-650 Il-13 Linfoma de Hodgkin Tositumomabe CD20 Linfoma folicular
Tabela 1 Nome do Antígeno(s) Aplicação Alvo Terapêutica Anticorpo Tumoral(is) Tovetumabe CD140a Câncer Trastuzumabe HER2/Neu Câncer de mama Trbs07 Gd2 Melanoma Tremelimumabe CTLA-4 Câncer Tucotuzumabe Epcam Câncer Celmoleucimna Ublituximabe MS4A1 Câncer Urelumabe 4-1BB Câncer Vantictumabe Receptor encrespado Câncer Vapaliximabe AOC3 (VAP-1) Câncer Vatelizumabe ITGA2 Câncer Veltuzumabe CD20 Linfoma não Hodgkin Vesencumabe NRP1 Câncer Volociximabe Integrina Α5β1 Tumores sólidos Vorsetuzumabe CD70 Câncer Antígeno tumoral Votumumabe Tumores colorretais CTAA16.88 Carcinomas espinocelulares Zalutumumabe EGFR de cabeça e pescoço Zatuximabe HER1 Câncer Ziralimumabe CD147 Câncer Anticorpos que se ligam a HER2/neu
[158] HER2/neu é uma proteína do receptor 185 kDa que foi originalmente identificada como o produto do gene de transformação de neuroblastomas de ratos quimicamente tratados. HER2/neu foi extensivamente investigado devido ao seu papel em diversos carcinomas humanos e no desenvolvimento de mamíferos (Hynes et al. (1994) “The Biology of erbB- 2/neu/HER-2 and its Role in Cancer,” Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184; Dougall et al. (1994) “The neu-Oncogene: Signal Transduction Pathways, Transformation Mechanisms and Evolving Therapies,” Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) “Requirement for Neuregulin Receptor erbB2 in Neural and Cardiac Development,” Nature 378:394-398).
[159] O sítio de ligação a epitopo de qualquer anticorpo anti-HER2/neu pode ser usado em conformidade com a presente invenção, os princípios da presente invenção sendo ilustrados em relação ao antígeno tumoral HER2/neu. Os anticorpos exemplificadores que se ligam a HER2/neu humano incluem “Margetuximabe”, “Trastuzumabe” e “Pertuzumabe”. Margetuximabe (também conhecido como MGAH22; CAS Reg. No. 1350624-75-7, vide, por exemplo, patente norte-americana No.
8.802.093) é um anticorpo monoclonal otimizado para Fc que se liga a HER2/neu e faz a mediação da atividade potencializada de ADCC. Trastuzumabe (também conhecido como rhuMAB4D5 e comercializado como HERCEPTIN®; CAS Reg. No. 180288-69-1; vide, patente norte-americana No. 5.821.337) é a versão humanizada do anticorpo 4D5, tendo as regiões constantes de IgG1/kappa. Pertuzumabe (também conhecido como rhuMAB2C4 e comercializado como PERJETA™; CAS Reg. No. 380610-27-5; vide, por exemplo, WO2001/000245) é uma versão humanizada do anticorpo 2C4 que possui regiões constantes de IgG1/kappa. Os anticorpos anti-HER2/neu adicionais também são providos. Margetuximabe
[160] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de Margetuximabe é (SEQ ID NO:54) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGR IYPTNGYTRY DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGASVTVSS
[161] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de Margetuximabe é (SEQ ID NO:55) (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIK
[162] As sequências de aminoácidos das Cadeias Pesadas e Leves completas de Margetuximabe são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Informação sobre Medicamento da OMS, 2014, Recommended INN: List 71, 28(1):93-94). Trastuzumabe
[163] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de Trastuzumabe é (SEQ ID NO:56) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS
[164] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de Trastuzumabe é (SEQ ID NO:57) (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ
GTKVEIK Pertuzumabe
[165] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de Pertuzumabe é (SEQ ID NO:58) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYTMDWVRQA PGKGLEWVAD VNPNSGGSIY NQRFKGRFTL SVDRSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARNL GPSFYFDYWG QGTLVTVSS
[166] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de Pertuzumabe é (SEQ ID NO:59) (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVS IGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ
YYIYPYTFGQ GTKVEIK HER2-MAB-1
[167] O anticorpo HER2-MAB-1 é um anticorpo monoclonal anti-HER2/neu murino que se liga a um epitopo de HER2/neu distinto do epitopo reconhecido por Margetuximabe, Trastuzumabe e Pertuzumabe. A sequência de aminoácidos do Domínio VH de HER2-MAB-1 (aqui referida como HER2 MAB-1 VH) é (SEQ ID NO:60) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLQESGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRFAF SLGTSASTAF LQINNLKNED TATYFCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSA
[168] As sequências de aminoácidos dos CDRHs de HER2 MAB-1 VH são: CDRH1 (SEQ ID NO:177): NYGMN CDRH2 (SEQ ID NO:178): WINTNIGEPTYTEEFKG CDRH3 (SEQ ID NO:179): DDGYGNRVSY
[169] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de HER2-MAB-1 (aqui referida como HER2 MAB-1 VH) é (SEQ ID NO:61) (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DILMTQSPLS MYTSLGERVT ITCKASQDIN SYLSWFQQKP GKSPKTLIYR ANRLVDGVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLEY EDMGIYYCLQ HDEFPWTFGG GTKLEIK
[170] As sequências de aminoácidos dos CDRLs de HER2 MAB-1 VL são: CDRL1 (SEQ ID NO:180): KASQDINSYLS
CDRL2 (SEQ ID NO:181): RANRLVD CDRL3 (SEQ ID NO:182): LQHDEFPWT HER2-MAB-1 Humanizado
[171] O anticorpo HER2-MAB-1 foi humanizado para formar o anticorpo hHER2-MAB-1. A sequência de aminoácidos do Domínio VH desse anticorpo humanizado (hHER2-MAB-1 VH) é (SEQ ID NO:62) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA
PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDX1 X2YGNRVSYWG QGTLVTVSS
[172] em que: X1 é D ou E e X2 é G ou I
[173] A sequência de aminoácidos do Domínio VL desse anticorpo humanizado (hHER2 MAB-1 VL) é (SEQ ID NO:63) (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIX3 X4YLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLX5X6GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ
HDEFPWTFGQ GTKLEIK em que: X3 é N ou S; X4 é S, T ou N; X5 é V ou Q e X6 é D, E ou S
[174] Três Domínios hHER2-MAB-1 VH variantes foram isolados: hHER2 MAB-1 VH1, hHER2 MAB-1 VH2, e hHER2 MAB- 1 VH3. As sequências de aminoácidos desses Domínios hHER2 MAB- 1 VH variantes são apresentadas abaixo.
[175] A sequência de aminoácidos de hHER2 MAB-1 VH1 é (SEQ ID NO:64) (resíduos CDRH são mostrados sublinhados; observe que o segundo e terceiro resíduos de CDRH3 são D e G, respectivamente):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSS
[176] A sequência de aminoácidos de hHER2 MAB-1 VH2 é (SEQ ID NO:65) (resíduos CDRH são mostrados sublinhados; observe que o segundo e terceiro resíduos de CDRH3 são E e G, respectivamente):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDE GYGNRVSYWG QGTLVTVSS
[177] A sequência de aminoácidos de hHER2 MAB-1 VH3 é (SEQ ID NO:66) (resíduos CDRH são mostrados sublinhados; observe que o segundo e terceiro resíduos de CDRH3 são D e I, respectivamente):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD IYGNRVSYWG QGTLVTVSS
[178] Portanto, a sequência de aminoácidos de CDRH1 de hHER2 MAB-1 VH1, hHER2 MAB-1 VH2 e hHER2 MAB-1 VH3 é igual (NYGMN; SEQ ID NO:177) e a sequência de aminoácidos de CDRH2 de hHER2 MAB-1 VH1, hHER2 MAB-1 VH2 e hHER2 MAB-1 VH3 é igual (SEQ ID NO:178). No entanto, as sequências de aminoácidos de CDRH3 de hHER2 MAB-1 VH1, hHER2 MAB-1 VH2 e hHER2 MAB-1 VH3 diferem: hHER2 MAB-1 VH1 CDRH3 (SEQ ID NO:183): DDGYGNRVSY hHER2 MAB-1 VH2 CDRH3 (SEQ ID NO:184): DEGYGNRVSY hHER2 MAB-1 VH3 CDRH3 (SEQ ID NO:185): DDIYGNRVSY
[179] Três Domínios hHER2-MAB-1 VL variantes foram isolados: hHER2 MAB-1 VL1, hHER2 MAB-1 VL2, e hHER2 MAB- 1 VL3. As sequências de aminoácidos desses Domínios hHER2 MAB- 1 VH variantes são apresentadas abaixo.
[180] A sequência de aminoácidos de hHER2 MAB-1 VL1 é (SEQ ID NO:67) (resíduos CDRL são mostrados sublinhados;
observe que o sétimo e oitavo resíduos de CDRL1 são N e S, respectivamente, e eu o sexto e sétimo resíduos de CDRL2 são V e D, respectivamente):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIN SYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLVDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIK
[181] A sequência de aminoácidos de hHER2 MAB-1 VL2 é (SEQ ID NO:68) (resíduos CDRL são mostrados sublinhados; observe que o sétimo e oitavo resíduos de CDRL1 são N e T, respectivamente, e que o sexto e sétimo resíduos de CDRL2 são V e E, respectivamente):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIN TYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLVEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIK
[182] A sequência de aminoácidos de hHER2 MAB-1 VL3 é (SEQ ID NO:69) (resíduos CDRL são mostrados sublinhados; observe que o sétimo e oitavo resíduos de CDRL1 são S e N, respectivamente, e que o sexto e sétimo resíduos de CDRL2 são Q e S, respectivamente):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIK
[183] Portanto, a sequência de aminoácidos de CDRL3 de hHER2 MAB-1 VL1, hHER2 MAB-1 VL2 e hHER2 MAB-1 VL3 é igual (LQHDEFPWT; SEQ ID NO:182). No entanto, as sequências de aminoácidos de CDRL1 e CDRL2 de hHER2 MAB-1 VL1, hHER2 MAB-1 VL2 e hHER2 MAB-1 VL3 diferem: hHER2 MAB-1 VL1 CDRL1 (SEQ ID NO:186): KASQDINSYLS hHER2 MAB-1 VL2 CDRL1 (SEQ ID NO:187): KASQDINTYLS hHER2 MAB-1 VL3 CDRL1 (SEQ ID NO:188): KASQDISNYLS hHER2 MAB-1 VL1 CDRL2 (SEQ ID NO:189): RANRLVD hHER2 MAB-1 VL2 CDRL2 (SEQ ID NO:190): RANRLVE hHER2 MAB-1 VL3 CDRL2 (SEQ ID NO:191): RANRLQS Quaisquer dos Domínios VH e VL humanizados hHER2- MAB-1, inclusive qualquer um incorporado na(s) sequência(s) genérica(s) dos Domínios VH e/ou VL hHER2-MAB-1 apresentados acima podem ser usados para formar um anticorpo, diacorpo ou Molécula de Ligação capaz de ligação a Her2/neu. Outros Anticorpos Anti-HER2/neu
[184] Além das Moléculas de Ligação anti- HER2/neu preferidas identificadas acima, a invenção contempla o uso de quaisquer das seguintes Moléculas de Ligação anti- Her-2: 1.44.1; 1.140; 1.43; 1.14.1; 1.100.1; 1.96; 1.18.1;
1.20; 1.39; 1.24 e 1.71.3 (Patentes norte-americanas Nos.
8.350.011, 8.858.942, e Publicação de Patente PCT WO 2008/019290); F5 e C1 (Patentes norte-americanas Nos.
7.892.554, 8.173.424, 8.974.792; e Publicação de Patente PCT WO 99/55367); e também as Moléculas de Ligação anti-Her-2 das Publicações de Patentes norte-americanas 2011/0097323, 2013/017114, 2014/0328836, 2016/0130360 e 2016/0257761, e Publicação de Patentes PCT WO2011/147986), todas as publicações as quais são pelo presente incorporadas por referência quanto à suas revelações de Moléculas de Ligação anti-HER2/neu.
[185] A presente invenção inclui e abrange especificamente Moléculas de Ligação a CD137 x HER2/neu que compreendem o Domínio VL e/ou VH, e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH de qualquer um entre Margetuximabe, Trastuzumabe,
Pertuzumabe, hHER2-MAB-1, ou qualquer um dos demais anticorpos anti-HER2/neu aqui providos; e mais preferivelmente possuem 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH destes anticorpos monoclonais anti- HER2/neu. Anticorpos que se ligam a EphA2
[186] A tirosina quinase receptora, receptor 2 de efrina tipo A (EphA2) normalmente é expressa nos locais de contato entre as células em tecidos epiteliais adultos, no entanto, estudos recentes mostraram que também é superexpressa em diversos tipos de carcinomas epiteliais, com o maior nível de expressão de EphA2 observado em lesões metastáticas. Descobriram-se altos níveis de expressão de EphA2 em uma ampla gama de cânceres e em diversas linhagens de células tumorais, inclusive câncer de próstata, câncer de mama, câncer pulmonar de células não pequenas e melanoma (Xu, J. et al. (2014) “High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome,” Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687-692; Miao, B. et al. (2014) “EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma,” Cancer Discov. pii: CD-14-0295. EphA2 não parece ser meramente um marcador para câncer, mas sim parece ser persistentemente superexpressão e funcionalmente alterado em diversos cânceres humanos (Chen, P. et al. (2014) “EphA2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate Cancer Cells,” Oncol. Lett. 8(1):41-46). O sítio de ligação a epítopo de qualquer anticorpo anti-EphA2 pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. São apresentados abaixo diversos anticorpos anti-EphA2 murinos, cujos derivados humanizados destes anticorpos são particularmente preferidos.
EphA2 MAB-1
[187] O anticorpo EphA2 MAB-1 é um anticorpo monoclonal anti-EphA2 de murino. A sequência de aminoácidos do Domínio VH de EphA2 MAB-1 é (SEQ ID NO:128) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM IWGGGSTDYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG NYYTMDYWGQ GTSVTVSS
[188] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de EphA2 MAB-1 é (SEQ ID NO:129) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ
GYTLYTFGGG TKLEIK EphA2 MAB-2
[189] O anticorpo EphA2 MAB-2 é um anticorpo monoclonal anti-EphA2 de murino. A sequência de aminoácidos do Domínio VH de EphA2 MAB-2 é (SEQ ID NO:130) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW INTYIGEPTY ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL GPYYFDYWGQ GTTLTVSS
[190] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de EphA2 MAB-2 é (SEQ ID NO:131) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV
YFCSQSTHVP TFGSGTKLEI K EphA2 MAB-3
[191] O anticorpo EphA2 MAB-3 é um anticorpo monoclonal anti-EphA2 de murino. A sequência de aminoácidos do Domínio VH de EphA2 MAB-3 é (SEQ ID NO:132) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT ISDGGSFTSY PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE SDRPFPYWGQ GTLVTVSS
[192] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de EphA2 MAB-3 é (SEQ ID NO:133) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ
HYSTPYTFGG GTKLEIK Outros Anticorpos EphA2
[193] Além dos anticorpos anti-EphA2 acima identificados, a invenção contempla o uso de quaisquer dos seguintes anticorpos anti-EphA2: SPL1, LUCA19, SG5 ou LUCA40 (vide, Publicação de Patente PCT WO 2006/084226); B13 (vide, patente norte-americana No. 7.101.976); D7 (vide, patente norte-americana No. 7.192.698); B-233 e EA2 (vide, Publicação de Patente PCT WO 2003/094859).
[194] A presente invenção inclui e abrange especificamente Moléculas de Ligação a CD137 x EphA2 que compreendem o Domínio VL e/ou VH, e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRHs do Domínio VH de anticorpos monoclonais anti-EphA2 EphA2 MAB-1, EphA2 MAB-2 e EphA2 MAB-3. Anticorpos que se ligam a 5T4
[195] A proteína oncofetal, 5T4, é uma proteína associada ao tumor exibida na membrana celular de muitos carcinomas, inclusive carcinoma renal, de cólon, de próstata e pulmonar e em leucemia linfoblástica aguda (vide, Boghaert, E.R. et al. (2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin,” Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6). O sítio de ligação a epítopo de qualquer anticorpo anti-5T4 pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Abaixo são apresentados dois anticorpos anti-5T4 exemplificadores, “5T4 MAB-1” e “5T4 MAB-2”. Os anticorpos anti-5T4 adicionais são descritos na técnica (vide, por exemplo, Patentes norte- americanas Nos.: 8.084.249, 8.409.577, 8.759.495, 8.409.577; Publicações PCT Nos.: WO 2013/041687; WO 2014/137931; WO 2016/022939) 5T4 MAB-1
[196] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de 5T4 MAB-1 é (SEQ ID NO:134) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR IDPNRGGTEY NEKAKSRVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAGGN PYYPMDYWGQ GTTVTVSS
[197] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de 5T4 MAB-1 é (SEQ ID NO:135) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ
YDDFPWTFGQ GTKLEIK 5T4 MAB-2
[198] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de 5T4 MAB-2 é (SEQ ID NO:136) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYWITWVKQR PGQGLEWIGD IYPGSGRANY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCARYG PLFTTVVDPN SYAMDYWGQG TSVTVSS
[199] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de 5T4 MAB-2 é (SEQ ID NO:137) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP FTFGSGTKLE IK
[200] A presente invenção inclui e abrange especificamente Moléculas de Ligação a CD137 x 5T4 que compreendem o Domínio VL e/ou VH, e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRHs do Domínio VH dos anticorpos monoclonais anti-5T4, 5T4 MAB-1 ou 5T4 MAB-2, ou de quaisquer dos anticorpos anti-5T4 providos em WO 2007/106744; WO 2013/041687 ou WO 2015/184203. Anticorpos que se ligam a B7-H3
[201] B7-H3 é um Antígeno Tumoral superexpresso em uma ampla variedade de tipos de tumores sólidos e é um membro da família B7 de moléculas que estão envolvidas na regulação imunológica (vide, Patente norte-americana No.
8.802.091; Patente norte-americana No. 2014/0328750; Patente norte-americana No. 2013/0149236; Loo, D. et al. (2012) “Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody With Potent Antitumor Activity,” Clin. Cancer Res. 18(14):3834-3845). Em particular, diversos estudos independentes mostraram que as células tumorais malignas humanas (por exemplo, células tumorais de neuroblastomas e cânceres gástrico, ovariano e pulmonar de células não pequenas) apresentam um aumento acentuado na expressão de proteína B7- H3 e que este aumento de expressão foi associado ao aumento de gravidade da doença (Zang, X. et al. (2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition,” Clin. Cancer Res. 13:5271-5279), sugerindo que B7-H3 é explorada pelos tumores como uma via de evasão imunológica (Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).
[202] O sítio de ligação a epítopo de qualquer anticorpo anti-B7-H3 pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Um anticorpo exemplificador que se liga a B7-H3 humana é “Enoblituzumabe”. Enoblituzumabe (também conhecido como MGA271; CAS Reg. No. 1353485-38-7; vide, por exemplo, Patente norte-americana No. 8.802.091) é um anticorpo monoclonal otimizado para Fc que se liga a B7-H3 e faz a mediação da atividade de ADCC aumentada. Os anticorpos anti- B7-H3 adicionais exemplificadores também são apresentados. Enoblituzumabe
[203] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de Enoblituzumabe é (SEQ ID NO:138) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
[204] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de Enoblituzumabe é (SEQ ID NO:139) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ
YNNYPFTFGQ GTKLEIK BRCA69D
[205] O anticorpo BRCA69D é um anticorpo monoclonal anti-B7-H3 de murino. A sequência de aminoácidos do Domínio VH de BRCA69D (SEQ ID NO:140) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQWVKQR PGQGLEWIGT IYPGDGDTRY TQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARRG IPRLWYFDVW GAGTTVTVSS
[206] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de BRCA69D (SEQ ID NO:141) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFCQQ
GNTLPPTFGG GTKLEIK BRCA69D Humanizado
[207] O anticorpo BRCA69D foi humanizado, produzindo dois Domínios VH variantes, hBRCA69D VH1 e hBRCA69D VH2; e dois Domínios VL variantes, hBRCA69D VL1 e hBRCA69D VL2, que podem ser usados em qualquer combinação de VH/VL para produzir um Domínio de ligação funcional humanizado. As sequências de amino destas variantes são providas abaixo.
[208] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de hBRCA69D VH1 é (SEQ ID NO:142) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
[209] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de hBRCA69D VH2 é (SEQ ID NO:143) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT IYPGGGDTRY TQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
[210] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de hBRCA69D VL1 é (SEQ ID NO:144) (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIK
[211] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de hBRCA69D VL2 é (SEQ ID NO:145) (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ
GNTLPPTFGG GTKLEIK PRCA157
[212] O anticorpo PRCA157 é um anticorpo monoclonal anti-B7-H3 de murino. A sequência de aminoácidos do Domínio VH de PRCA157 é (SEQ ID NO:146) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PDKRLEWVAT INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD GGAMDYWGQG TSVTVSS
[213] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de PRCA157 é (SEQ ID NO:147) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITCRASESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH
HYGTPPWTFG GGTNLEIK PRCA157 Humanizado
[214] O anticorpo PRCA157 foi humanizado, produzindo um Domínio VH humanizado, hPRCA157 VH1, e um Domínio VL humanizado, hPRCA157 VL1, para produzir um Domínio de ligação funcional humanizado. As sequências de amino de PRCA157 humanizado são providas abaixo.
[215] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de hPRCA157 VH1 é (SEQ ID NO:202) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMSWVRQA PGKGLEWVAT INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHD GGAMDYWGQG TTVTVSS
[216] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de hPRCA157 VL1 é (SEQ ID NO:203) (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESIY SYLAWYQQKP GKAPKLLVYN TKTLPEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH
HYGTPPWTFG QGTRLEIK Outros anticorpos anti-B7-H3
[217] Além das Moléculas de Ligação a anti-B7- H3 preferidas identificadas acima, a invenção contempla o uso de quaisquer das seguintes Moléculas de Ligação a anti-B7-H3: LUCA1; BLA8; PA20 ou SKN2 (vide, Patentes norte-americanas No.
7.527.969, 8.779.098 e Publicação de Patente PCT WO 2004/001381); M30; cM30; M30-H1-L1; M30-H1-L2; M30-H1-L3; M30- H1-L4; M30-H1-L5; M30-H1-L6; M30-H1-L7; M30-H4-L1; M30-H4-L2; M30-H4-L3 e M30-H4-L4 (vide, Publicação de Patente norte-
americana 2013/0078234 e Publicação de Patente PCT WO 2012/147713; e 8H9 (vide, Patentes norte-americanas Nos.
7.666.424, 7.737.258, 7.740.845, 8.148.154, 8.414.892,
8.501.471, 9.062.110; Publicação de Patente norte-americana 2010/0143245 e Publicação de Patente PCT WO 2008/116219).
[218] A presente invenção inclui e abrange especificamente Moléculas de Ligação a CD137 x B7-H3 que compreendem o Domínio VL e/ou VH, e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRHs do Domínio VH de qualquer um entre BRCA69D, BRCA69D humanizado, PRCA157, PRCA157 humanizado ou Enoblituzumabe, ou quaisquer dos demais anticorpos anti-B7-H3 aqui providos; e mais preferivelmente, possuem 1, 2 ou todas as 3 CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRHs do Domínio VH destes anticorpos monoclonais anti-B7-H3. Anticorpos que se ligam a GpA33
[219] A glicoproteína transmembrana 43kD A33 (gpA33) é expressa em >95% de todos os carcinomas colorretais (Heath, J.K. et al. (1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263). O sítio de ligação a epítopo de qualquer anticorpo anti-gpA33 pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Um anticorpo anti-gpA33 exemplificador (“gpA33 MAB-1”) é apresentado abaixo.
[220] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de gpA33 MAB-1 é (SEQ ID NO:148) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY GNNVYFDVWG QGTTVTVSS
[221] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de gpA33 MAB-1 é (SEQ ID NO:149) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIK
[222] A presente invenção inclui e abrange especificamente Moléculas de Ligação a CD137 x gpA33 que compreendem o Domínio VL e/ou VH, e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRHs do Domínio VH de anticorpos monoclonais anti-gpA33, gpA33 MAB-1, ou de quaisquer dos anticorpos monoclonais anti-gpA33 providos em WO 2015/026894. Anticorpos que se ligam a CEACAM5 e CEACAM6
[223] Descobriu-se que as Moléculas de Adesão Celular Relacionada ao Antígeno Carcinoembriônico 5 (CEACAM5) e 6 (CEACAM6) estão associadas a diversos tipos de cânceres, inclusive câncer tireoidiano medular, câncer colorretal, câncer pancreático, carcinoma hepatocelular, câncer gástrico, câncer pulmonar, cânceres de cabeça e pescoço, câncer da bexiga urinária, câncer da próstata, câncer uterino, câncer endometrial, câncer de mama, câncer hematopoiético, leucemia e câncer ovariano (Publicação PCT No.
WO 2011/034660), e particularmente câncer colorretal, gastrointestinal, pancreático, pulmonar de células não pequenas (NSCL), de mama, da tireoide, estomacal, ovariano e carcinomas uterinos (Zheng, C. et al. (2011) “A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells- Mediated Tumor Immunity,” PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11). Descobriu-se que CEACAM5 é superexpressão em 90% dos cânceres gastrointestinais, colorretais e pancreáticos, 70% das células de câncer pulmonar de células não pequenas e 50% dos cânceres de mama (Thompson, J.A. et al. (1991) “Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives,” J.
Clin.
Lab.
Anal. 5:344-366). A molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembriônico 6 (CEACAM6) superexpressa desempenha importantes papeis na invasão e metástase de uma variedade de cânceres humanos, inclusive câncer tireoidiano medular, câncer colorretal, câncer pancreático, carcinoma hepatocelular, câncer gástrico, câncer pulmonar, cânceres de cabeça e pescoço, câncer da bexiga urinária, câncer da próstata, câncer uterino, câncer endometrial, câncer de mama, câncer hematopoiético, leucemia e câncer de ovário (Publicação PCT No.
WO 2011/034660; Deng, X., et al. (2014) “Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma,” Genet.
Mol.
Res. 13(3):7686-7697; Cameron, S. et al. (2012) “Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis,” Mol.
Cancer 11:74, pp. 1-11; Chapin, C. et al. (2012) “Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung,” Amer.
J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25; Riley, C.J. et al. (2009) “Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer,” Cancer Res. 69(5):1933-1940; Lewis-Wambi, J.S. et al. (2008) “Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells,” Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779; Blumenthal, R.D. et al. (2007) “Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers,” BMC Cancer. 7:2, pp. 1- 15). O sítio de ligação a epítopo de qualquer anticorpo anti- CEACAM5 / CEACAM6 pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Os anticorpos anti-CEACAM5/CEACAM6 exemplificadores são providos abaixo. 16C3
[224] A sequência de aminoácidos do Domínio VH do anticorpo anti-CEACAM5 / CEACAM6 humanizado 16C3 (EP 2585476) é (SEQ ID NO:150) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGSGYTFT DYAMHWVKQS HAKSLEWIGL ISTYSGDTKY NQNFKGKATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARGD YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S
[225] A sequência de aminoácidos do Domínio VL do anticorpo anti-CEACAM5 / CEACAM6 humanizado 16C3 (EP 2585476) é (SEQ ID NO:151) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQRKP GKSPKLLIWG ASNLADGMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYYCQN
VLSSPYTFGG GTKLEIK hMN15
[226] A sequência de aminoácidos do Domínio VH do anticorpo anti-CEACAM5 / CEACAM6 humanizado hMN15 (WO 2011/034660) é (SEQ ID NO:152) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSGFALT DYYMSWVRQA PGKGLEWLGF IANKANGHTT DYSPSVKGRF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S
[227] A sequência de aminoácidos do Domínio VL do anticorpo anti-CEACAM5 / CEACAM6 humanizado hMN15 (WO 2011/034660) é (SEQ ID NO:153) (os resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTCSASSRVS YIHWYQQKPG KAPKRWIYGT STLASGVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYCQQW SYNPPTFGQG TKVEIKR
[228] A presente invenção inclui e abrange especificamente Moléculas de Ligação a CD137 x CEACAM5/CEACAM6 que compreendem o Domínio VL e/ou VH, e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRHs do Domínio VH dos anticorpos monoclonais anti-CEACAM5/CEACAM6 16C3 ou hMN15. Anticorpos que se ligam a CD19
[229] CD19 (antígeno de superfície de linfócitos B B4, número de registro Genbank M28170) é um componente do complexo do receptor de células B (BCR), e é um regulador positivo de sinalização de células B que modula o limiar para ativação de células B e imunidade humoral. CD19 é um dos antígenos mais onipresentemente expresso na linhagem de células B e é expresso em >95% das malignidades de células B, inclusive leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL) e Linfoma não Hodgkin (NHL). Particularmente, a expressão de CD19 é mantida em linfomas de células B que se tornam resistentes à terapia anti-CD20 (Davis et al. (1999) “Therapy of B-cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression.” Clin Cancer Res, 5:611-615, 1999). CD19 has also been suggested as a target to treat autoimmune diseases (Tedder (2009) “CD19: A Promising B Cell Target For Rheumatoid Arthritis,” Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577).
[230] Um anticorpo exemplificador que se liga a CD19 humano, e que pode ser empregado na presente invenção, é o anticorpo anti-CD19 revelado em WO 2016/048938 (mencionado aqui como “CD19 MAB-1”).
[231] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de CD19 MAB-1 (SEQ ID NO:204) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV FLTMTNMDPV DTATYYCARM ELWSYYFDYW GQGTTVTVSS
[232] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de CD19 MAB-1 (SEQ ID NO:205) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA SNRASGVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIK
[233] A presente invenção inclui e abrange especificamente Moléculas de Ligação a CD137 x CD19 que compreendem o Domínio VL e/ou VH, e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRHs do Domínio VH do anticorpo monoclonal anti-CD19 CD19 MAB-1, ou quaisquer dos anticorpos anti-CD19 revelados na Patente norte-americana US
7.112.324, ou presentes em blinatumomabe (BLINCYTO®; sequência de aminoácidos encontrada nas Informações sobre Medicamento da OMS, 2009, INN Recomendado: List 62, 23(3):240-241) e duvortuxizumabe (aka MGD011; sequência de aminoácidos encontrada nas Informações sobre Medicamento da OMS, 2016, INN Proposto: List 116, 30(4):627-629). Anticorpos que se ligam a CD123
[234] CD123 (receptor alfa de interleucina 3, IL-3Ra) é uma molécula 40 kDa e é parte do complexo do receptor de interleucina 3 (Stomski, F.C. et al. (1996) “Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding,” Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046). A interleucina 3 (IL-3) aciona a diferenciação precoce de células-tronco multipotentes nas células dos progenitores eritroides, mieloides e linfoides. CD123 foi relatado como sendo superexpressão em células malignas em uma ampla gama de malignidades hematológicas, inclusive leucemia mieloide aguda (AML) e síndrome mielodisplásica (MDS) (Muñoz, L. et al. (2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86(12):1261-1269). A superexpressão de CD123 está associada a prognóstico piores em AML (Tettamanti, M.S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401).
[235] Um anticorpo exemplificador que se liga a CD123 humano, e que pode ser empregado na presente invenção, é “CD123 MAB-1” (vide, por exemplo, Publicação de Patente PCT WO 2015/026892).
[236] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de CD123 MAB-1 (SEQ ID NO:206) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMKWVRQA PGQGLEWIGD IIPSNGATFY NQKFKGRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSH LLRASWFAYW GQGTLVTVSS
[237] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de CD123 MAB-1 (SEQ ID NO:207) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIK
[238] A presente invenção inclui e abrange especificamente Moléculas de Ligação a CD137 x CD123 que compreendem o Domínio VL e/ou VH, e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 CDRHs do Domínio VH do anticorpo monoclonal anti-CD123 CD123 MAB-1, ou quaisquer dos anticorpos anti-CD123 revelados em US 2017/081424 e WO 2016/036937, ou presentes em JNJ-63709178 (Johnson & Johnson, vide também WO 2016/036937) e XmAb14045 (Xencor, vide também US 2017/081424). Domínios Variáveis CD137 Preferidos
[239] O sítio de ligação a epítopo de qualquer anticorpo anti-CD137 pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Os anticorpos exemplificadores que se ligam a CD137 humano incluem “urelumabe” e “utomilumabe”, atualmente sendo avaliados em estudos clínicos em seres humanos. Urelumabe (também conhecido como BMS-663513, designado aqui “CD137 MAB- 1”) é um anticorpo monoclonal totalmente humano que possui regiões constantes de IgG4/kappa (vide, Patente norte-
americana No. 8.137.667). Utomilumabe (também conhecido como PF-05082566, designado aqui “CD137 MAB-2”) é um anticorpo monoclonal totalmente humano que possui regiões constantes de IgG2/lambda (vide, Patente norte-americana No. 8.337.850). Os anticorpos adicionais exemplificadores que são imunoespecíficos para CD137 humano (designados “CD137 MAB-3”, “CD137 MAB-4” e “CD137 MAB-5”) são providos abaixo. CD137 MAB-1
[240] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de CD137 MAB-1 (CD137 MAB-1 VH) é (SEQ ID NO:70) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWSWIRQS PEKGLEWIGE INHGGYVTYN PSLESRVTIS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDYG PGNYDWYFDL WGRGTLVTVS S
[241] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de CD137 MAB-1 (CD137 MAB-1 VL) é (SEQ ID NO:71) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ
RSNWPPALTF GGGTKVEIK CD137 MAB-2
[242] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de CD137 MAB-2 (CD137 MAB-2 VH) é (SEQ ID NO:72) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVQSGAE VKKPGESLRI SCKGSGYSFS TYWISWVRQM PGKGLEWMGK IYPGDSYTNY SPSFQGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCARGY GIFDYWGQGT LVTVSS
[243] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de CD137 MAB-2 (CD137 MAB-2 VL) é (SEQ ID NO:73) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
SYELTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDNIGDQ YAHWYQQKPG QSPVLVIYQD KNRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCATY
TGFGSLAVFG GGTKLTVL CD137 MAB-3
[244] CD137 MAB-3 é um novo anticorpo monoclonal de murino. A sequência de aminoácidos do Domínio VH de CD137 MAB-3 (CD137 MAB-3 VH) é (SEQ ID NO:74) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWINWVKQR PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTRDY GSSYSFDYWG QGTTLTVSS
[245] As sequências de aminoácidos dos CDRHs de CD137 MAB-3 VH são: CDRH1 (SEQ ID NO:154): SYWIN CDRH2 (SEQ ID NO:155): NIYPSDSYTNYNQKFKD CDRH3 (SEQ ID NO:156): DYGSSYSFDY
[246] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de CD137 MAB-3 (CD137 MAB-3 VL) é (SEQ ID NO:75) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRPSQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIK
[247] As sequências de aminoácidos dos CDRLs de CD137 MAB-3 VL são: CDRL1 (SEQ ID NO:157): RPSQDISNYLN CDRL2 (SEQ ID NO:158): YTSRLRS CDRL3 (SEQ ID NO:159): QQGDTLPYT hCD137 MAB-3
[248] O anticorpo CD137 MAB-3 foi humanizado para formar o anticorpo hCD137 MAB-3. A sequência de aminoácidos do Domínio VH desse anticorpo humanizado (hCD137 MAB-3 VH1) é (SEQ ID NO:76) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVKQA PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSSYSFDYWG QGTTVTVSS
[249] O Domínio VH do anticorpo humanizado hCD137 MAB-3 (hCD137 MAB-3 VH1) foi otimizado para produzir um Domínio VH que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:77:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVKQA
PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSX10X11X12X13X14X15WG QGTTVTVSS em que: X10X11X12X13X14X15 são: AYSFHP (1A; SEQ ID NO:78), ou AYSMST (1B; SEQ ID NO:79), ou AYSYSL (1C; SEQ ID NO:80), ou SYSYNV (1D; SEQ ID NO:81).
[250] Conforme indicado acima, a sequência parental correspondente (presente na SEQ ID NO:74) é SYSFDY (SEQ ID NO:160).
[251] O Domínio VL de anticorpo humanizado hCD137 MAB-3 (hCD137 MAB-3 VL) foi otimizado para produzir um Domínio VL que possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:82:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP X7X8TVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ
GDTLPYTFGQ GTKLEIK em que: X7 é D ou G; X8 é G ou K.
[252] Quatro Domínios hCD137 MAB-3 VH1 variantes foram isolados: hCD137 MAB-3 VH1A, hCD137 MAB-3 VH1B, hCD137 MAB-3 VH1C e hCD137 MAB-3 VH1D. As sequências de aminoácidos desses Domínios hCD137 MAB-3 VH1 variantes são apresentadas abaixo.
[253] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VH1A é (SEQ ID NO:83) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; observar que os resíduos 5-10 de CDR3H são AYSFHP (SEQ ID NO:78):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVKQA PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSAYSFHPWG QGTTVTVSS
[254] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VH1B é (SEQ ID NO:84) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; observar que os resíduos 5-10 de CDR3H são AYSMST (SEQ ID NO:79):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVKQA PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSAYSMSTWG QGTTVTVSS
[255] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VH1C é (SEQ ID NO:85) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; observar que os resíduos 5-10 de CDR3H são AYSYSL (SEQ ID NO:80):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVKQA PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSAYSYSLWG QGTTVTVSS
[256] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VH1D é (SEQ ID NO:86) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; observar que os resíduos 5-10 de CDR3H são SYSYNV (1D; SEQ ID NO:81):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVKQA PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSSYSYNVWG QGTTVTVSS
[257] Portanto, a sequência de aminoácidos de CDRH1 de hCD137 MAB-3 VH1A, hCD137 MAB-3 VH1B, hCD137 MAB-3 VH1C e hCD137 MAB-3 VH1D é igual (SEQ ID NO:154) e a sequência de aminoácidos de CDRH2 de hCD137 MAB-3 VH1A, hCD137 MAB-3 VH1B, hCD137 MAB-3 VH1C e hCD137 MAB-3 VH1D é igual (SEQ ID NO:155). No entanto, as sequências de aminoácidos de CDRH3 de hCD137 MAB-3 VH1A, hCD137 MAB-3 VH1B, hCD137 MAB-3 VH1C e hCD137 MAB-3 VH1D diferem: hCD137 MAB-3 VH1A CDRH3 (SEQ ID NO:161): DYGSAYSFHP hCD137 MAB-3 VH1B CDRH3 (SEQ ID NO:162): DYGSAYSMST hCD137 MAB-3 VH1C CDRH3 (SEQ ID NO:163): DYGSAYSYSL hCD137 MAB-3 VH1D CDRH3 (SEQ ID NO:164): DYGSSYSYNV
[258] Três Domínios hCD137 MAB-3 VL variantes foram isolados: hCD137 MAB-3 VL1, hCD137 MAB-3 VL2 e hCD137 MAB-3 VL3. As sequências de aminoácidos desses Domínios hCD137 MAB-3 VL variantes são apresentadas abaixo.
[259] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL1 é (SEQ ID NO:87) (resíduos CDRL são mostrado sublinhados; observe que os resíduos 41 e 42 são D e G, respectivamente):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[260] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL2 é (SEQ ID NO:88) (resíduos CDRL são mostrados sublinhados; observe que os resíduos 41 e 42 são ambos G):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP GGTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[261] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL3 é (SEQ ID NO:89) (resíduos CDRL são mostrado sublinhados; observe que os resíduos 41 e 42 são D e K, respectivamente):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[262] O Domínio VH hCD137 MAB-3 VH1B foi desimunizado conforme descrito nos Exemplos abaixo. As sequências de aminoácidos de três dos Domínios VH desimunizados resultantes designados hCD137 MAB-3 VH1E, hCD137 MAB-3 VH1F e hCD137 MAB-3 VH1G, tendo uma substituição de aminoácido no resíduo Kabat 38 e/ou 48 são providas abaixo. Contemplou-se especificamente que as substituições identificadas, R38K e/ou I48A, podem ser incorporadas em quaisquer Domínios VH hCD137 MAB-3 revelados. Em uma realização específica, a substituição de aminoácido K38R é incorporada na SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85 ou SEQ ID NO:86.
[263] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VH1E compreendendo K38R é (SEQ ID NO:208) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; a substituição tem sublinhado duplo):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVRQA PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSAYSMSTWG QGTTVTVSS
[264] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VH1F compreendendo I48A é (SEQ ID NO:209) (os resíduos de
CDRH são mostrados sublinhados; as substituições têm sublinhado duplo):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVKQA PGQGLEWAGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSAYSMSTWG QGTTVTVSS
[265] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VH1G compreendendo K38R/I48A (SEQ ID NO:210) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; as substituições têm sublinhado duplo):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVRQA PGQGLEWAGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSAYSMSTWG QGTTVTVSS
[266] O Domínio VL hCD137 MAB-3 VL3 foi desimunizado conforme descrito nos Exemplos abaixo. As sequências de aminoácidos de doze dos Domínios VL desimunizados resultantes designados hCD137 MAB-3 VL4-VL15, tendo uma substituição de aminoácido nos resíduos Kabat 24, 25, 44, 48, 52 e/ou 54 são providas abaixo. Contemplou-se especificamente que as substituições identificadas, R24Q, P25A, V44A, I48A, S52T, S52G e/ou L54A, podem ser incorporadas em quaisquer Domínios VL hCD137 MAB-3 revelados providos acima para produzir um Domínio VL desimunizado. Em uma realização específica, as substituições de aminoácidos R24Q, P25A, I48A, S52G e L54A são incorporadas na SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 89. Em outra realização específica, as substituições de aminoácidos R24Q, P25A, I48A, S52T e L54A são incorporadas na SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO:
89.
[267] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL4 compreendendo R24Q/P25A é (SEQ ID NO:211) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; as substituições têm (sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[268] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL5 compreendendo V44A é (SEQ ID NO:212) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; a substituição tem sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTAKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[269] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL6 compreendendo L54A é (SEQ ID NO:213) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; a substituição tem sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRARSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[270] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL7 compreendendo R24Q/P25A/V44A é (SEQ ID NO:214) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; as substituições têm sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP DKTAKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[271] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL8 compreendendo R24Q/P25A/V44A/L54A é (SEQ ID NO:215) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; as substituições têm sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP DKTAKLLIYY TSRARSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[272] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL9 compreendendo R24Q/P25A/L54A é (SEQ ID NO:216) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; as substituições têm sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRARSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[273] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL10 compreendendo S52T é (SEQ ID NO:217) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; a substituição tem sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TTRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[274] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL11 compreendendo S52G é (SEQ ID NO:218) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; a substituição tem sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TGRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[275] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL12 compreendendo I48A/S52T é (SEQ ID NO:219) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; as substituições têm sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLAYY TTRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[276] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL13 compreendendo I48A/S52G é (SEQ ID NO:220) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; as substituições têm sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLAYY TGRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[277] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL14 compreendendo R24Q/P25A/S52T/L54A é (SEQ ID NO:221) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; as substituições têm sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TTRARSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[278] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 3 VL15 compreendendo R24Q/P25A/S52G/L54A é (SEQ ID NO:222) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados; as substituições têm sublinhado duplo):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TGRARSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
[279] Portanto, a sequência de aminoácidos de CDRL3 de hCD137 MAB-3 VL3-VL15 é igual (QQGDTLPYT; SEQ ID NO:159). No entanto, as sequências de aminoácidos de CDRL1 e/ou CDRL2 de hCD137 MAB-3 VL4 e hCD137 MAB-3 VL6-VL15 diferem:
[280] hCD137 MAB-3 VL4, VL7, VL8, VL9, VL14, e VL15 CDRL1 (SEQ ID NO:223): QASQDISNYLN hCD137 MAB-3 VL6, VL8, e VL9 CDRL2 (SEQ ID NO:224):
YTSRARS hCD137 MAB-3 VL10, e VL12 CDRL2 (SEQ ID NO:225):
YTTRLRS hCD137 MAB-3 VL11, e VL13 CDRL2 (SEQ ID NO:226):
YTGRLRS hCD137 MAB-3 VL14 CDRL2 (SEQ ID NO:227): YTTRARS hCD137 MAB-3 VL15 CDRL2 (SEQ ID NO:228): YTGRARS
[281] As CDRs, Domínio VL e/ou Domínio VH de quaisquer destes Domínios VH e VL hCD137 MAB-3 humanizados, otimizados e/ou desimunizados, inclusive qualquer um incorporado na(s) sequência(s) genérica(s) dos Domínios VH e/ou VL hCD137 MAB-3 apresentados acima podem ser usados para formar um anticorpo, diacorpo ou Molécula de Ligação capaz de ligação a CD137. CD137 MAB-4
[282] CD137 MAB-4 é um novo anticorpo monoclonal de murino. A sequência de aminoácidos do Domínio VH de CD137 MAB-4 (CD137 MAB-4 VH) é (SEQ ID NO:90) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWINWVKQR PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY DQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTKSG EYGKIGYYAM DYWGQGTSVT VSS
[283] As sequências de aminoácidos dos CDRHs de CD137 MAB-4 VH são: CDRH1 (SEQ ID NO:165): SYWIN CDRH2 (SEQ ID NO:166): NIYPSDSYTNYDQKFKD CDRH3 (SEQ ID NO:167): SGEYGKIGYYAMDY
[284] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de CD137 MAB-4 (CD137 MAB-4 VL) é (SEQ ID NO:91) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPYTFGG GTKLEIK
[285] As sequências de aminoácidos dos CDRLs de CD137 MAB-4 VL são: CDRL1 (SEQ ID NO:168): RASQDISNYLN CDRL2 (SEQ ID NO:169): YTSRLHS CDRL3 (SEQ ID NO:170): QQGNTLPYT hCD137 MAB-4
[286] O anticorpo CD137 MAB-4 foi humanizado para formar o anticorpo hCD137 MAB-4. A sequência de aminoácidos do Domínio VH de anticorpo humanizado hCD137 MAB- 4 (hCD137 MAB-4 VH1) é (SEQ ID NO:92) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVRQA PGQGLEWMGN IYPSDSYTNY DQKFKDRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCTKSG EYGKIGYYAM DYWGQGTTVT VSS
[287] O Domínio VL do anticorpo humanizado hCD137 MAB-4 foi humanizado e otimizado para produzir um Domínio VL (hCD137 MAB-3 VL) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:93 (resíduos CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP
DKTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDIATYX9CQQ
GNTLPYTFGQ
GTKLEIK em que X9 é F ouY
[288] Dois Domínios hCD137 MAB-4 VL variantes foram isolados: hCD137 MAB-4 VL1 e hCD137 MAB-4 VL2. As sequências de aminoácidos desses Domínios hCD137 MAB-4 VL variantes são apresentadas abaixo.
[289] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 4 VL1 é (SEQ ID NO:94) (resíduos CDRL são mostrados sublinhados; observe que o resíduo 87 é F):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDIATYFCQQ GNTLPYTFGQ GTKLEIK
[290] A sequência de aminoácidos de hCD137 MAB- 4 VL2 é (SEQ ID NO:95) (resíduos CDRL são mostrados sublinhados; observe que o resíduo 87 é Y):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDIATYYCQQ
GNTLPYTFGQ GTKLEIK CD137 MAB-5
[291] CD137 MAB-5 é um novo anticorpo monoclonal de murino. A sequência de aminoácidos do Domínio VH de CD137 MAB-5 (CD137 MAB-5 VH) é (SEQ ID NO:96) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLT SYDISWIRQP PGKGLEWLGV VWTGGGTNYN SAFMSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AIYYCERVDY WGQGTSVTVS S
[292] As sequências de aminoácidos dos CDRHs de CD137 MAB-5 VH são: CDRH1 (SEQ ID NO:171): SYDIS CDRH2 (SEQ ID NO:172): VVWTGGGTNYNSAFMS CDRH3 (SEQ ID NO:173): VDY
[293] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de CD137 MAB-5 (CD137 MAB-5 VL) é (SEQ ID NO:97) (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP WTFGGGTKLE IK
[294] As sequências de aminoácidos dos CDRLs de CD137 MAB-5 VL são: CDRL1 (SEQ ID NO:174): RSSQSLVHSNGNTYLH CDRL2 (SEQ ID NO:175): KVSNRFS CDRL3 (SEQ ID NO:176): SQSTHVPWT Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção
[295] A presente invenção é particularmente direcionada a Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes que compreendem um Domínio Fc, diacorpos DART® CD137 x TA portando Fc capazes de ligação simultânea a CD137 e a um TA, e outras Moléculas de Ligação a CD137 x TA portando Fc capazes de ligação simultânea a CD137 e a um TA. A presente invenção refere-se ainda ao uso dessas moléculas no tratamento de câncer e de outras doenças e condições. Embora as Moléculas de Ligação a CD137 x TA não otimizadas sejam totalmente funcionais, análogas às melhorias obtidas na expressão de gene através da otimização de códon (vide, por exemplo, Grosjean, H. et al. (1982) “Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes” Gene 18(3):199- 209), é possível potencializar ainda a estabilidade e/ou função das Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção ao modificar ou refinar suas sequências.
Diacorpos DART® CD137 x TA Portando Fc
[296] A presente invenção abrange particularmente uma ampla variedade de diacorpos DART® portando Fc capazes de ligação simultânea a CD137 e a um TA. Os diacorpos DART® CD137 x TA portando Fc exemplificadores são descritos abaixo.
[297] Em uma realização, estes diacorpos portando Fc compreenderão duas cadeias polipeptídicas. Como mostrado na Figura 2, a primeira destas cadeias polipeptídicas pode conter, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio Variável de Cadeia Leve (VL) capaz de ligação a um epitopo de um “primeiro” antígeno (VL1) (tanto CD137 quanto TA), um Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH) capaz de ligação a um epitopo de um “segundo” antígeno (VH2) (TA, caso VL1 fosse selecionado para se ligar a um epitopo de CD137; CD137 caso VL1 fosse selecionados para se ligar a um epitopo de TA), um ligante contendo cisteína, um Domínio CH2- CH3 e um C-terminal. A segunda destas cadeias polipeptídicas pode conter, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio Variável de Cadeia Leve (VL) capaz de ligação a um epitopo do “segundo” antígeno (VL2) (TA, caso o primeiro antígeno fosse CD137; CD137, caso o primeiro antígeno fosse TA)), um Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH) capaz de ligação a um epitopo do “segundo” antígeno (VH2) (TA, caso VL2 fosse selecionado para se ligar a um epitopo de CD137; CD137 caso VL2 fosse selecionado para se ligar a um epitopo de TA, um ligante contendo cisteína, um Domínio CH2-CH3 e um C- terminal. Um peptídeo ligante interventor (Ligante 1) separa o Domínio Variável de Cadeia Leve (VL1 ou VL2) do Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH1 ou VH2).
[298] Em outra realização, diacorpos portando Fc da presente invenção compreendem três cadeias polipeptídicas, e são representados nas Figuras 4A-4B.
A primeira cadeia polipeptídica de tal diacorpo contém quatro Domínios: (i) um Domínio contendo VL1, (ii) um Domínio contendo VH2, (iii) um Domínio que promove heterodimerização (“Domínio de Promoção de Heterodímero”) e ligação covalente com a segunda cadeia polipeptídica do diacorpo, e (iv) um Domínio contendo uma sequência CH2-CH3. A segunda cadeia polipeptídica de tais diacorpos portando Fc contém: (i) um Domínio contendo VL2, (ii) um Domínio contendo VH1 e (iii) um Domínio que promove heterodimerização (“Domínio de Promoção de Heterodímero”) e ligação covalente com a primeira cadeia polipeptídica do diacorpo.
A terceira cadeia polipeptídica de tais diacorpos portando Fc compreende uma sequência CH2-CH3. Assim, a primeira e segunda cadeias polipeptídicas de tais diacorpos portando Fc se associam para formar um sítio de ligação a VL1/VH1 capaz de se ligar a um primeiro epitopo (1), bem como um sítio de ligação a VL2/VH2 capaz de ligação a um segundo epitopo (2). Os diacorpos portando Fc preferidos da presente invenção são diacorpos biespecíficos CD137 x TA capazes de ligação ao “primeiro epitopo”, que pode ser CD137 ou TA, e ao “segundo epitopo”, que é TA quando o primeiro epitopo é CD137, e é CD137 quando o primeiro epitopo é TA.
O primeiro e o Segundo polipeptídeos são ligados entre si através de uma ou mais ligações de dissulfeto que envolvem resíduos de cisteína em seus respectivos ligantes e/ou terceiros Domínios.
Particularmente, a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas complexam entre si para formar um Domínio Fc que é estabilizado por meio de uma ligação de dissulfeto.
Estes diacorpos possuem potência aumentada. Os diacorpos portando Fc preferidos da presente invenção podem ter quaisquer das duas orientações (Tabela 2): Tabela 2 3a NH2 – © – CH2 – CH3 cadeia – COOH Primeira 1a NH2 – VL2 – VH1 – © orientação cadeia – HPD – © – CH2 – CH3 – COOH 2a NH2 – VL1 – VH2 – © cadeia – HPD – COOH 3a NH2 – © – CH2 – CH3 cadeia – COOH Segunda 1a NH2 – © – CH2 – CH3 orientação cadeia – VL2 – VH1 – © – HPD – COOH 2a NH2 – VL1 – VH2 – © cadeia – HPD – COOH ( – © – denota um domínio polipeptídico contendo cisteína que possui um, dois ou mais que dois resíduos de cisteína. A representação tem como objetivo ser ilustrativa e não limitativa. Os resíduos de cisteína podem estar presentes em domínios adicionais ou alternativos, por exemplo, dentro do Domínio Promotor de Heterodímero (HPD)).
[299] Como mostrado na Figura 4A, em uma primeira realização, a primeira destas três cadeias polipeptídicas pode conter, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio Variável de Cadeia Leve (VL) capaz de ligação a um epitopo de um “primeiro” antígeno (VL1) (tanto CD137 quanto TA), um Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH) capaz de ligação a um epitopo de um “segundo” antígeno (VH2)
(TA, caso o primeiro antígeno fosse CD137; CD137, caso o segundo antígeno fosse TA), um Domínio contendo cisteína, um Domínio de Promoção de Heterodímero, um segundo Domínio contendo cisteína, um Domínio CH2-CH3 e um C-terminal. Um peptídeo ligante interventor (Ligante 1) separa o Domínio Variável de Cadeia Leve (VL1) do Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH2). Preferivelmente, o Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH1) é ligado a um Domínio Promotor de Heterodímero by an peptídeo ligante interventor (Ligante 2). Em uma realização preferido do diacorpo CD137 x TA biespecífico portando Fc, o C-terminal do Domínio de Promoção de Heterodímero está ligado ao Domínios CH2-CH3 de uma Região Fc (“Domínio Fc”) por um peptídeo ligante de interferência (Ligante 3) ou por um peptídeo espaçador de interferência (Ligante 3). Mais preferivelmente, a primeira das três cadeias polipeptídicas conterão assim, na direção do N-terminal para o C-terminal: VL1 – Ligante 1 – VH2 – Ligante 2 – Domínio de Promoção de Heterodímero – Ligante 3 – Domínio Fc.
[300] A segunda destas três cadeias polipeptídicas conterão, na direção do N-terminal para o C- terminal, um N-terminal, um Domínio Variável de Cadeia Leve (VL) capaz de ligação ao epitopo do “segundo” antígeno (VL2), um Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH) capaz de ligação ao epitopo do “primeiro” antígeno (VH1), um Domínio contendo cisteína, um Domínio de Promoção de Heterodímero e um C- terminal. Um peptídeo ligante interventor (Ligante 1) separa o Domínio Variável de Cadeia Leve (VL2) do Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH1). Preferivelmente, o Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH1) é ligado ao Domínio Promotor de Heterodímero by an peptídeo ligante interventor (Ligante 2).
Mais preferivelmente, a segunda das três cadeias polipeptídicas conterão assim, na direção do N-terminal para o C-terminal: VL2 – Ligante 1 – VH1 – Ligante 2 – Domínio de Promoção de Heterodímero.
[301] A terceira destas três cadeias polipeptídicas conterão, na direção do N-terminal para o C- terminal, um peptídeo contendo cisteína (como o Ligante 3) e os Domínios CH2-CH3 de uma Região Fc (“Domínio Fc”). Como a terceira cadeia polipeptídica não compreende um Domínio VL nem um Domínio VH, a terceira cadeia polipeptídica pode ser idêntica entre dois ou mais diferentes diacorpos CD137 x TA biespecífico portando Fc da presente invenção.
[302] Alternativamente, como mostrado na Figura 4B, em uma segunda realização, a primeira destas três cadeias polipeptídicas conterão, na direção do N-terminal para o C- terminal, um N-terminal, um peptídeo contendo cisteína (como o Ligante 3), os Domínios CH2-CH3 de uma Região Fc (“Domínio Fc”), um peptídeo espaçador de interferência (Ligante 4), um Domínio Variável de Cadeia Leve (VL) capaz de ligação a um epitopo do “primeiro” antígeno (VL1) (tanto CD137 quanto TA), um Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH) capaz de ligação a um epitopo do “segundo” antígeno (VH2) (TA, caso o primeiro antígeno fosse CD137; CD137, caso o primeiro antígeno fosse TA), um ligante contendo cisteína, um Domínio de Promoção de Heterodímero e um C-terminal. Um peptídeo ligante interventor (Ligante 1) separa o Domínio Variável de Cadeia Leve (VL1) do Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH2). Preferivelmente, o Domínio Variável de Cadeia Pesada (VH1) é ligado a um Domínio Promotor de Heterodímero by an peptídeo ligante interventor (Ligante 2). Mais preferivelmente, nesta orientação alternativa, a primeira das três cadeias polipeptídicas conterão assim, na direção do N-terminal para o C-terminal: Ligante 3 – Domínio Fc – Ligante 4 – VL1 – Ligante 1 – VH2 – Ligante 2 – Domínio de Promoção de Heterodímero. A segunda e terceira cadeias polipeptídicas deste diacorpo alternativo podem ser iguais às segunda e terceira cadeias polipeptídicas da primeira realização.
[303] Em cada uma das realizações acima, o Domínio Variável de Cadeia Leve da primeira cadeia polipeptídica (VL1) é selecionada de forma coordenada de modo a permitir a interação com Domínio Variável de Cadeia Pesada da segunda cadeia polipeptídica (VH1) para, assim, formar um sítio de ligação a epitopo funcional capaz de ligação imunoespecífica a um epitopo do primeiro antígeno (ou seja, tanto TA quanto CD137). Da mesma forma, o Domínio Variável de Cadeia Leve da segunda cadeia polipeptídica (VL2) é selecionado de forma coordenada de modo a permitir a interação com o Domínio Variável de Cadeia Pesada da primeira cadeia polipeptídica (VH2) para, assim, formar um sítio de ligação a epitopo funcional capaz de ligação imunoespecífica a um epitopo do segundo antígeno (ou seja, tanto TA quanto CD137). Portanto, a seleção dos Domínios Variáveis de Cadeia Leve e Domínios Variáveis de Cadeia Pesada é coordenada, de modo que as duas cadeias polipeptídicas compreendam coletivamente sítios de ligação a epitopo capazes de ligação a CD137 e a um TA.
[304] Os diacorpos portando Fc preferidos da presente invenção são ligados covalentemente a diacorpos tetravalentes que possuem quatro sítios de ligação a epitopo que compreendem quatro cadeias polipeptídicas, e são representados nas Figuras 3A-3C. A primeira e terceira cadeias polipeptídicas de tal diacorpo contêm: (i) um Domínio contendo VL1, (ii) um Domínio contendo VH2, (iii) Domínio de Promoção de Heterodímero e (iv) um Domínio contendo uma sequência de CH2-CH3. A segunda e quarta cadeias polipeptídicas contêm: (i) um Domínio contendo VL2, (ii) um Domínio contendo VH1 e (iii) um Domínio de Promoção de Heterodímero, onde o Domínio de Promoção de Heterodímero promove a dimerização e a ligação covalente da primeira/terceira cadeias polipeptídicas com as segunda/quarta cadeias polipeptídicas.
De preferência, os Domínios VH são ligados ao Domínio de Promoção de Heterodímero por peptídeos ligantes de interferência (Ligante 2). Em uma realização preferida do diacorpo CD137 x TA biespecífico portando Fc, o C-terminal do Domínio de Promoção de Heterodímero da primeira cadeia polipeptídica está ligado aos Domínios CH2-CH3 por um peptídeo ligante de interferência (Ligante 3) ou por um peptídeo espaçador de interferência (Ligante 3). Os Domínios VL e/ou VH da terceira e quarta cadeias polipeptídicas, e os Domínios VL e/ou VH da primeira e segunda cadeias polipeptídicas podem ser iguais ou diferentes, de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica ou tetraespecífica.
As notações “VL3” e “VH3” indicam, respectivamente, o Domínio Variável de Cadeia Leve e Domínio Variável de Cadeia Pesada que liga um “terceiro” epitopo de tal diacorpo.
Similarmente, as notações “VL4” e “VH4” indicam, respectivamente, o Domínio Variável de Cadeia Leve e o Domínio Variável de Cadeia Pesada que se liga a um “quarto” epitopo de tal diacorpo.
A estrutura geral das cadeias polipeptídicas de diacorpos biespecíficos contendo Região Fc de quatro cadeias representativas da invenção é provida na Tabela 3:
Tabela 3 2a NH2-VL2-VH1-©- cadeia HPD-COOH 1a NH2-VL1-VH2-©- cadeia HPD-©-CH2-CH3-COOH Biespecífico 1a NH2-VL1-VH2-©- cadeia HPD-©-CH2-CH3-COOH 2a NH2-VL2-VH1-©- cadeia HPD-COOH 2a NH2-VL2-VH1-©- cadeia HPD-COOH 1a NH2-VL1-VH2-©- cadeia HPD-©-CH2-CH3-COOH Tetraespecífico 3a NH2-VL3-VH4-©- cadeia HPD-©-CH2-CH3-COOH 4a NH2-VL4-VH3-©- cadeia HPD-COOH ( – © – denota um domínio polipeptídico contendo cisteína que possui um, dois ou mais que dois resíduos de cisteína. A representação tem como objetivo ser ilustrativa e não limitativa. Os resíduos de cisteína podem estar presentes em domínios adicionais ou alternativos, por exemplo, dentro do Domínio Promotor de Heterodímero (HPD)).
[305] Em realizações preferidas, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção são diacorpos portando Fc biespecíficos e tetravalentes (ou seja, possuem quatro sítios de ligação a epitopo) que são compostos de quatro cadeias polipeptídicas totais (Figuras 3A-3C). As Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são diacorpos portando Fc biespecíficos e tetravalentes que compreendem dois sítios de ligação a epitopo imunoespecífico para CD137 (que podem ser capazes de ligação ao mesmo epitopo de CD137 ou a diferentes epitopos de CD137), e dois sítios de ligação a epitopo imunoespecífico para um antígeno tumoral (que pode ser capaz de ligação ao mesmo epitopo de um TA ou a diferentes epitopos de um TA ou diferentes epitopos de diferentes TAs).
[306] Os diacorpos portando FC adicionais preferidos da presente invenção compreendem cinco cadeias polipeptídicas, e são representados nas Figuras 5A-5D. A primeira cadeia polipeptídica de tal diacorpo contém: (i) um Domínio contendo VH1, (ii) um Domínio contendo CH1 e (iii) um Domínio contendo uma sequência de CH2-CH3. A primeira cadeia polipeptídica pode ser a Cadeia Pesada de um anticorpo que contém VH1 e uma região constante de Cadeia Pesada. A segunda e quintas cadeias polipeptídicas deste diacorpo contém: (i) um Domínio contendo VL1 e (ii) um Domínio contendo CL. A segunda e/ou quinta cadeias polipeptídicas deste diacorpo pode as Cadeias Leves de um anticorpo que contém um VL1 complementar ao VH1 da primeira/terceira cadeia polipeptídica. A primeira, segunda e/ou quinta cadeias polipeptídicas podem se isoladas de um anticorpo de ocorrência natural. Alternativamente, elas podem ser construídas de forma recombinante. Em uma realização preferida, a segunda e quinta cadeias polipeptídicas possuem a mesma sequência de aminoácidos. A terceira cadeia polipeptídica deste diacorpo contém: (i) um Domínio contendo VH1, (ii) um Domínio contendo CH1, (iii) um Domínio contendo uma sequência de CH2-CH3, (iv) um Domínio contendo VL2, (v) um Domínio contendo VH3 e (vi) um Domínio de Promoção de Heterodímero, onde o Domínio de Promoção de Heterodímero promove a dimerização da terceira cadeia com a quarta cadeia. O quarto polipeptídeo destes diacorpos contém: (i) um Domínio contendo VL3, (ii) um Domínio contendo VH2 e (iii) um Domínio que promove a heterodimerização e a ligação covalente com a terceira cadeia polipeptídica do diacorpo. De preferência, o C-terminal dos Domínios contendo VH2 e VH3 da terceira e quarta cadeias polipeptídicas está ligado a um Domínio de Promoção de Heterodímero por um peptídeo ligante de interferência (Ligante 2), e o C-terminal dos Domínios CH2-CH3 da terceira cadeia polipeptídica está ligado ao Domínio contendo VL2 por um peptídeo ligante de interferência (Ligante 4).
[307] Portanto, a primeira e segunda, e a terceira e quinta cadeias polipeptídicas destes diacorpos se associam para formar dois sítios de ligação a VL1/VH1 capazes de ligação ao primeiro epitopo. A terceira e quarta cadeias polipeptídicas destes diacorpos se associam para formar um sítio de ligação a VL2/VH2 capaz de ligação ao segundo epitopo, bem como um sítio de ligação a VL3/VH3 capaz de ligação a um terceiro epitopo. O primeiro e terceiro polipeptídeos são ligados entre si através de uma ligação de dissulfeto envolvendo resíduos de cisteína em suas respectivas regiões constantes. Particularmente, a primeira e terceira cadeias polipeptídicas complexam entre si para formar uma Região Fc. Estes diacorpos biespecíficos possuem potência aumentada. As Figuras 5A-5D ilustram a estrutura destes diacorpos. Será compreendido que os Domínios VL1/VH1, VL2/VH2 e VL3/VH3 podem ser iguais ou diferentes, de modo a permitir que a ligação seja monoespecífica, biespecífica ou triespecífica. No entanto, como aqui provido, estes Domínios são selecionados preferivelmente de modo a se ligarem a CD137 e um TA.
[308] Os Domínios VL e VH das cadeias polipeptídicas são selecionados de modo a formar sítios de ligação a VL/VH específicos a um epitopo desejado. Os sítios de ligação VL/VH formados pela associação das cadeias polipeptídicas podem ser iguais ou diferentes, de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica. Em particular, os Domínios VL e VH podem ser selecionados de modo que um diacorpo biespecífico possa compreender dois sítios de ligação para um primeiro epitopo e dois sítios de ligação para um segundo epitopo, ou três sítios de ligação para um primeiro epitopo e um sítio de ligação para um segundo epitopo, ou dois sítios de ligação para um primeiro epitopo, um sítio de ligação para um segundo epitopo e um sítio de ligação para um terceiro epitopo (como representado nas Figuras 5A-5D). A estrutura geral das cadeias polipeptídicas de diacorpos contendo Região Fc de cinco cadeias representativas da invenção é provida na Tabela 4: Tabela 4 2a NH2-VL1—CL-©- cadeia COOH 1a NH2-VH1-CH1-©- cadeia ©-CH2-CH3-COOH Biespecífico NH2-VH1-CH1-©- (2x2) 3a ©-CH2-CH3-VL2-VH2-©-HPD- cadeia
COOH 5a NH2-VL1—CL-©- cadeia COOH
Tabela 4 4a NH2-VL2-VH2-©- cadeia HPD-COOH 2a NH2-VL1—CL-©- cadeia COOH 1a NH2-VH1-CH1-©- cadeia ©-CH2-CH3-COOH NH2-VH1-CH1-©- Biespecífico 3a ©-CH2-CH3-VL1-VH2-©-HPD- (3x1) cadeia
COOH 5a NH2-VL1—CL-©- cadeia COOH 4a NH2-VL2-VH1-©- cadeia HPD-COOH 2a NH2-VL1—CL-©- cadeia COOH 1a NH2-VH1-CH1-©- cadeia ©-CH2-CH3-COOH NH2-VH1-CH1-©- Triespecífico 3a ©-CH2-CH3-VL2-VH3-©-HPD- (2x1x1) cadeia
COOH 5a NH2-VL1—CL-©- cadeia COOH 4a NH2-VL3-VH2-©- cadeia HPD-COOH ( – © – denota um domínio polipeptídico contendo cisteína que possui um, dois ou mais que dois resíduos de cisteína. A representação tem como objetivo ser ilustrativa e não limitativa. Os resíduos de cisteína podem estar presentes em domínios adicionais ou alternativos, por exemplo, dentro do Domínio Promotor de Heterodímero (HPD)).
[309] Em uma realização preferida, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção são diacorpos portanto Fc biespecíficos e tetravalentes (ou seja, possuem quatro sítios de ligação a epitopo) que são compostos de cinco cadeias polipeptídicas totais tendo dois sítios de ligação a epitopo imunoespecíficos para CD137 (que pode ser capaz de ligação ao mesmo epitopo de CD137 ou a diferentes epitopos de CD137), e dois sítios de ligação a epitopo imunoespecíficos para um TA (que pode ser capaz de ligação ao mesmo epitopo de um TA ou a diferentes epitopos de um TA ou diferentes epitopos de diferentes TAs). Em outra realização, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são diacorpos portado Fc biespecíficos e tetravalentes que compreendem três sítios de ligação a epitopo imunoespecíficos para CD137 (que pode ser capaz de ligação ao mesmo epitopo de CD137 ou a dois ou três diferentes epitopos de CD137), e um sítio de ligação a epitopo específico para um TA. Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes
[310] Em uma realização, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção são trivalentes e compreenderão um primeiro sítio de ligação a epitopo (por exemplo, um VL1 e VH1), um segundo sítio de ligação a epitopo (por exemplo, um VL2 e VH2) e um terceiro sítio de ligação a epitopo (por exemplo, um VL3 e VH3) e, assim, serão capazes de se ligar a um epitopo de TA, um epitopo de CD137 e um terceiro epitopo, o qual terceiro epitopo pode ser: (a) o mesmo ou um diferente epitopo do TA;
(b) o mesmo ou um diferente epitopo de CD137; ou (c) um epitopo de um TA diferente.
[311] Preferencialmente, estas “Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes” da presente invenção compreenderão dois sítios de ligação a epitopo para um epitopo de CD137 (cujos epitopos podem ser iguais ou diferentes) e um sítio de ligação a epitopo para um epitopo de um TA.
[312] No geral, estas Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes da presente invenção são compostas de três, quatro, cinco ou mais de cinco cadeias polipeptídicas que, em virtude de uma ou mais ligações de dissulfeto entre os pares destes polipeptídeos, formam um complexo molecular ligado covalentemente que compreende um “Domínio de ligação do tipo diacorpo” e um “Domínio de ligação do tipo não diacorpo.”
[313] Um “Domínio de ligação do tipo diacorpo” é o Domínio de Ligação a Epitopo de um diacorpo e, especialmente, um diacorpo DART®. Os termos “diacorpo” e “diacorpo DART®” foram discutidos acima. Um Domínio de Ligação “Tipo não Diacorpo” pretende indicar um Domínio de Ligação que não possui a estrutura de um Domínio de ligação do tipo diacorpo. De preferência, um Domínio de ligação do tipo não diacorpo é um Domínio de Ligação Tipo Fab ou um Domínio de Ligação Tipo ScFv. Como aqui usado, o termo “Domínio de Ligação Tipo Fab” se refere a um Domínio de Ligação a um Epitopo que é formado pela interação do Domínio VL de uma Cadeia Leve de imunoglobulina e um Domínio VH complementar de uma Cadeia Pesada de imunoglobulina. Os Domínios de ligação tipo Fab diferente do Domínio de ligação do tipo diacorpo em que as duas cadeias polipeptídicas que formam um Domínio de Ligação Tipo Fab compreende apenas um único Domínio de Ligação a Epitopo, ao passo que as duas cadeias polipeptídicas que formam um Domínio de ligação do tipo diacorpo compreende pelo menos dois Domínios de ligação ao Epitopo. Os Domínios de ligação do tipo ScFv diferem do Domínio de ligação do tipo diacorpo em que os Domínios VL e VH da mesma cadeia polipeptídica interagem para formar um Domínio de Ligação a Epitopo. Assim, como aqui usado, os Domínios de ligação tipo Fab e Domínios de ligação tipo ScFv são diferentes do Domínio de ligação do tipo diacorpo.
[314] Portanto, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes da presente invenção compreendem preferencialmente: (I) um “primeiro” Domínio de Ligação a Epitopo capaz de se ligar imunoespecificamente a um “primeiro” epitopo; (II) um “segundo” Domínio de Ligação a Epitopo capaz de se ligar imunoespecificamente a um “segundo” epitopo; (III) um “terceiro” Domínio de Ligação a Epitopo capaz de se ligar imunoespecificamente a um “terceiro” epitopo; e (IV) um Domínio Fc que é formado pela associação de dois Domínios CH2-CH3 entre si; em que: (A) o “primeiro” Domínio de Ligação a Epitopo e o “segundo” Domínio de Ligação a Epitopo são ambos “Domínio de ligação do tipo diacorpo; (B) o “terceiro” Domínio de Ligação a Epitopo é um Domínio de ligação do tipo não diacorpo; e (C) um destes “primeiro”, “segundo” ou “terceiro” Domínios de ligação a Epitopo se liga a um epitopo de TA, e outro destes “primeiro”, “segundo” ou “terceiro” Domínios de ligação Epitopo se liga a um epitopo de CD137;
[315] O epitopo que é ligado pelo Domínio de Ligação a Epitopo restante pode ser qualquer epitopo desejado, preferencialmente um epitopo de CD137. Este epitopo pode ser igual ou diferente do epitopo CD137 ligado que é ligado por outros Domínios de ligação a Epitopo da molécula.
[316] As Figuras 6A-6H proveem uma representação diagramática dos Domínios de Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes preferidas. As Figuras 6A-6D ilustram esquematicamente os Domínios de Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes preferidas que são compostas da complexação covalente de quatro cadeias polipeptídicas e possuem um Sítio de Ligação do Tipo não Diacorpo (VL3/VH3 e, assim, são monovalentes para tal epitopo), e dois Sítios de ligação do tipo Diacorpo (VL1/VH1 e VL2/VH2 e, assim, são monovalentes para cada um destes epitopos). As Figuras 6E-6H ilustram esquematicamente os Domínios de Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes preferidas que são compostas da complexação covalente de três cadeias polipeptídicas e possuem um Sítio de Ligação do Tipo não Diacorpo (VL3/VH3 e, assim, são monovalentes para este epitopo), e dois Sítios de ligação do tipo Diacorpo (VL1/VH1 e VL2/VH2 e, assim, são monovalentes para cada um destes epitopos). O Sítio de Ligação do Tipo não Diacorpo mostrado nas Figuras 6A-6H é um Domínio de Ligação do Tipo Fab nas Figuras 6A-6D e é um Domínio de Ligação do Tipo scFv nas Figuras 6E-6H. Conforme mostrado abaixo, os sítios de ligação VL/VH formados pela associação das cadeias polipeptídicas podem ser iguais ou diferentes, de modo a permitir a ligação trivalente que é monoespecífica, biespecífica ou triespecífica. Moléculas de Ligação a CD137 x TA exemplificadoras
[317] A invenção provê uma Molécula de Ligação a CD137 x TA que são diacorpos Fc biespecíficos e tetravalentes capazes de ligação simultânea e específica a CD137 e a um TA. Conforme indicado acima, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção pode compreender quatro ou cinco cadeias polipeptídicas. As cadeias polipeptídicas de sete Moléculas de Ligação a CD137 x TA exemplificadoras capazes de ligação a CD137 e ao TA, HER2/neu, são providas abaixo (designadas “DART- A”, “DART-B”, “DART-C”, “DART-D”, “DART-E”, “DART-F”, “DART- G”, “DART-G1”, “DART-G2”, “DART-G3” e “DART-G4”, respectivamente). A invenção provê ainda Molécula de Ligação a CD137 x TA que são moléculas de ligação trivalentes biespecíficas capazes de se ligar simultânea e especificamente a CD137 e a um TA. Como indicado acima, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes da presente invenção podem compreender quatro cadeias polipeptídicas. As cadeias polipeptídicas de uma Molécula de Ligação a CD137 x TA Triespecífica capazes de ligação a CD137 e ao TA, HER2/neu, e variantes otimizadas destas são providas abaixo (designadas “TRIDENT-A”, “TRIDENT- A1”, “TRIDENT-A2”, “TRIDENT-A3”, “TRIDENT-A5”, “TRIDENT-B”, “TRIDENT-B2” e “TRIDENT-B5”, respectivamente). DART-A
[318] DART-A é composto de quatro cadeias polipeptídicas, nas quais a primeira e terceira cadeias polipeptídicas são iguais e a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas são iguais (vide Figura 3B).
[319] A primeira e a terceira cadeias polipeptídicas de DART-A compreendem, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VLHER2/neu) (hHER2 MAB-1
VL2 (SEQ ID NO:68)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral E) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:38)), um ligante (LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:30)), o Domínio CH2-CH3 de um IgG1 humano exemplificador que substancialmente carece da função efetora (SEQ ID NO:40) e um C-terminal:
[320] A sequência de aminoácidos da primeira e terceira cadeias polipeptídicas de DART-A é (SEQ ID NO:98):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIN TYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLVEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKLE PKSADKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG
[321] Assim, a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas de DART-A são compostas de: SEQ ID NO:68 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:40.
[322] A segunda e a quarta cadeia polipeptídica de DART-A compreendem, na direção do N-terminal para o C- terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137 (hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VHHER2/neu (hHER2 MAB-1 VH1, SEQ ID NO:64)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral K) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:39) e um C-terminal.
[323] Assim, a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas de DART-A são compostas de: SEQ ID NO:87 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39.
[324] A sequência de aminoácidos da segunda e quarta cadeia polipeptídica de DART-A é (SEQ ID NO:99):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTNYGMN WVRQAPGQGL EWMGWINTNI GEPTYTEEFK GRVTMTRDTS ISTAYMELSR LRSDDTAVYY CARDDGYGNR VSYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE DART-B
[325] DART-B é composto de quatro cadeias polipeptídicas, nas quais a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas são iguais e a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas são iguais (vide Figura 3B).
[326] A primeira e a terceira cadeias polipeptídicas de DART-B compreendem, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VLHER2/neu) (hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral E) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:38)), um ligante (LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:30)), o Domínio CH2-CH3 de um IgG1 humano exemplificador que substancialmente carece da função efetora (SEQ ID NO:40) e um C-terminal:
[327] Assim, a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas de DART-B são compostas de: SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:40.
[328] A sequência de aminoácidos da primeira e terceira cadeias polipeptídicas de DART-B é (SEQ ID NO:100):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKLE PKSADKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG
[329] A segunda e a quarta cadeia polipeptídica de DART-B compreendem, na direção do N-terminal para o C- terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137 (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante
1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VHHER2/neu (hHER2 MAB-1 VH1, SEQ ID NO:64)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral K) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:39) e um C-terminal.
[330] Assim, a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas de DART-B são compostas de: SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39.
[331] A sequência de aminoácidos da segunda e quarta cadeia polipeptídica de DART-B é (SEQ ID NO:101):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTNYGMN WVRQAPGQGL EWMGWINTNI GEPTYTEEFK GRVTMTRDTS ISTAYMELSR LRSDDTAVYY CARDDGYGNR VSYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE DART-C
[332] DART-C é composto de quatro cadeias polipeptídicas, nas quais a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas são iguais e a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas são iguais (vide Figura 3B).
[333] A primeira e a terceira cadeias polipeptídicas de DART-C compreendem, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VHHER2/neu) (hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64)), um peptídeo ligante de intervenção
(Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral E) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:38)), um ligante (LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:30)), o Domínio CH2-CH3 de um IgG1 humano exemplificador que substancialmente carece da função efetora (SEQ ID NO:40) e um C-terminal:
[334] Assim, a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas de DART-C são compostas de: SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:40.
[335] A sequência de aminoácidos da primeira e terceira cadeias polipeptídicas de DART-C é (SEQ ID NO:102):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTNYGMN WVRQAPGQGL EWMGWINTNI GEPTYTEEFK GRVTMTRDTS ISTAYMELSR LRSDDTAVYY CARDDGYGNR VSYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKLE PKSADKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG
[336] A segunda e a quarta cadeia polipeptídica de DART-C compreendem, na direção do N-terminal para o C- terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VLHER2/neu (hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137 (hCD137
MAB-3 VH1, SEQ ID NO:76)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral K) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:39) e um C-terminal.
[337] Assim, a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas de DART-C são compostas de: SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39.
[338] A sequência de aminoácidos da segunda e quarta cadeia polipeptídica de DART-C é (SEQ ID NO:103):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE DART-D
[339] DART-D é composto de cinco cadeias polipeptídicas, das quais a segunda e quinta são idênticas (vide, Figura 5A, onde VL2/VH2 são iguais a VL3/VH3, e Figura 5B).
[340] A primeira cadeia polipeptídica de DART-D compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VHHER2/neu) (hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64)), um Domínio CH1 de IgG1 humano (SEQ ID NO:3), uma Região de Articulação de IgG1 humano (SEQ ID NO:7) e um Domínio CH2 e CH3 “portando lacuna” (SEQ ID NO:47).
[341] Assim, a primeira cadeia polipeptídica de DART-D é composta de: SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:47.
[342] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de DART-D é (SEQ ID NO:104):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
[343] A segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-D compreendem, na direção do N-terminal para o C- terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VLHER2/neu) (hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69)), um Domínio Kappa CL de IgG humano (SEQ ID NO:1) e um C-terminal.
[344] Assim, a segunda e a quinta cadeias polipeptídicas de DART-D são compostas de: SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:1.
[345] A sequência de aminoácidos da segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-D é (SEQ ID NO:105):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
[346] A terceira cadeia polipeptídica de DART-D compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N-
terminal, um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VHHER2/neu) (hHER2 MAB-1 VH1, SEQ ID NO:64)), um Domínio CH1 de IgG1 humano (SEQ ID NO:3), uma Região de Articulação de IgG1 humano (SEQ ID NO:7), um Domínio CH2 e CH3 “portando saliência” (SEQ ID NO:44), um peptídeo ligante de intervenção (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24)), um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137) (CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral E) (EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:36) e um C-terminal.
[347] Assim, a terceira cadeia polipeptídica de DART-D é composta de: SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:44─ SEQ ID NO:24 ─ SEQ ID NO:75 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:74─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:36.
[348] A sequência de aminoácidos das terceiras cadeias polipeptídicas de DART-D é (SEQ ID NO:106):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQTTSSL SASLGDRVTI SCRPSQDISN YLNWYQQKPD GTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDY SLTISNLEQE DIATYFCQQG DTLPYTFGGG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ PGAELVRPGA SVKLSCKASG YTFTSYWINW VKQRPGQGLE WIGNIYPSDS YTNYNQKFKD KATLTVDKSS STAYMQLSSP TSEDSAVYYC TRDYGSSYSF DYWGQGTTLT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK
[349] A quarta cadeia polipeptídica de DART-D compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137) (CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral K) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE) (SEQ ID NO:37) e um C- terminal.
[350] Assim, a quarta cadeia polipeptídica de DART-D é composta de: SEQ ID NO:75 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:74 ─ SEQ ID NO:18─ SEQ ID NO:37.
[351] A sequência de aminoácidos da quarta cadeia polipeptídica de DART-D é (SEQ ID NO:107):
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRPSQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWIN WVKQRPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS PTSEDSAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTL TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE DART-E
[352] DART-E é composto de cinco cadeias polipeptídicas, das quais a segunda e quinta são idênticas
(vide, Figura 5A, onde VL2/VH2 são iguais a VL3/VH3, e Figura 5C).
[353] A primeira cadeia polipeptídica de DART-E compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74)), um Domínio CH1 de IgG1 (SEQ ID NO:3), um Domínio de Articulação de IgG1 (SEQ ID NO:7), um Domínio CH2 e CH3 “portando lacuna” (SEQ ID NO:47) e um C-terminal.
[354] Assim, a primeira cadeia polipeptídica de DART-E é composta de: SEQ ID NO:74 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:47.
[355] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de DART-E é (SEQ ID NO:108):
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWINWVKQR PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTRDY GSSYSFDYWG QGTTLTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
[356] A segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-E compreendem, na direção do N-terminal para o C- terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137u) (CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75)), um Domínio Kappa CL de IgG humano (SEQ ID NO:1) e um C-terminal.
[357] Assim, a segunda e a quinta cadeias polipeptídicas de DART-E são compostas de: SEQ ID NO:75 ─ SEQ ID NO:1.
[358] A sequência de aminoácidos da segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-E é (SEQ ID NO:109):
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRPSQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
[359] A terceira cadeia polipeptídica de DART-E compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (CD137 MAB-3 VH, SEQ ID NO:74)), um Domínio CH1 de IgG1 humano (SEQ ID NO:3), uma Região de Articulação de IgG1 humano (SEQ ID NO:7), um Domínio CH2 e CH3 “portando saliência” (SEQ ID NO:44), um peptídeo ligante de intervenção (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24)), um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VLHER2/neu) (hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VHHER2/neu) (hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), a Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral E) (EVAALEK- EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:36) e um C-terminal.
[360] Assim, a terceira cadeia polipeptídica de DART-E é composta de: SEQ ID NO:74 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:44─ SEQ ID NO:24 ─ SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:64─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:36.
[361] A sequência de aminoácidos das terceiras cadeias polipeptídicas de DART-E é (SEQ ID NO:110):
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWINWVKQR PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTRDY GSSYSFDYWG QGTTLTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCKASQDISN YLSWFQQKPG KAPKTLIYRA NRLQSGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCLQH DEFPWTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLVQ SGAEVKKPGA SVKVSCKASG YTFTNYGMNW VRQAPGQGLE WMGWINTNIG EPTYTEEFKG RVTMTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC ARDDGYGNRV SYWGQGTLVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK
[362] A quarta cadeia polipeptídica de DART-E compreendem, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VLHER2/neu (hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VHHER2/neu (hHER2 MAB-1 VH1, SEQ ID NO:64)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral K) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE) (SEQ ID NO:37) e um C- terminal.
[363] Assim, a quarta cadeia polipeptídica de DART-E é composta de: SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:18─ SEQ ID NO:37.
[364] A sequência de aminoácidos da quarta cadeia polipeptídica de DART-E é (SEQ ID NO:111):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTNYGMN WVRQAPGQGL EWMGWINTNI GEPTYTEEFK GRVTMTRDTS ISTAYMELSR LRSDDTAVYY CARDDGYGNR VSYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE DART-F
[365] DART-F é composto de cinco cadeias polipeptídicas, das quais a segunda e quinta são idênticas (vide, Figura 5A, onde VL2/VH2 são iguais a VL3/VH3, e Figura 5B).
[366] A primeira cadeia polipeptídica de DART-F é igual à primeira cadeia polipeptídica de DART-D (SEQ ID NO:104).
[367] A segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-F são iguais às segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-D (SEQ ID NO:105).
[368] A terceira cadeia polipeptídica de DART-F compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VHHER2/neu) (hHER2 MAB-1 VH1, SEQ ID NO:64)), um Domínio CH1 de IgG1 (SEQ ID NO:3), um Domínio de Articulação de IgG1 (SEQ ID NO:7), um Domínio CH2 e CH3 “portando saliência” (SEQ ID NO:44), um peptídeo ligante de intervenção (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24)), um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137) (CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral E) (EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:36) e um C-terminal.
[369] Assim, a terceira cadeia polipeptídica de DART-F é composta de: SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:44 ─ SEQ ID NO:24 ─ SEQ ID NO:91 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:90 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:36.
[370] A sequência de aminoácidos da terceira cadeia polipeptídica de DART-F é (SEQ ID NO:112):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQTTSSL SASLGDRVTI SCRASQDISN YLNWYQQKPD GTVKLLIYYT SRLHSGVPSR FSGSGSGTDY SLTISNLEQE DIATYFCQQG NTLPYTFGGG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ PGAELVRPGA SVKLSCKASG YTFTSYWINW VKQRPGQGLE WIGNIYPSDS YTNYDQKFKD KATLTVDKSS STAYMQLSSP TSEDSAVYYC TKSGEYGKIG YYAMDYWGQG TSVTVSSGGC GGGEVAALEK EVAALEKEVA ALEKEVAALE K
[371] A quarta cadeia polipeptídica de DART-F compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137) (CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral K) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE) (SEQ ID NO:37) e um C- terminal.
[372] Assim, a quarta cadeia polipeptídica de DART-F é composta de: SEQ ID NO:91 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:90─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37.
[373] A sequência de aminoácidos da quarta cadeia polipeptídica de DART-F é (SEQ ID NO:113):
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPYTFGG GTKLEIKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWIN WVKQRPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYDQKFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS PTSEDSAVYY CTKSGEYGKI GYYAMDYWGQ GTSVTVSSGG CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE DART-G
[374] DART-G é composto de cinco cadeias polipeptídicas, das quais a segunda e quinta são idênticas (vide, Figura 5A, onde VL2/VH2 são iguais a VL3/VH3, e Figura 5B).
[375] A primeira cadeia polipeptídica de DART-G é igual à primeira cadeia polipeptídica de DART-D (SEQ ID NO:104).
[376] A segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-G são iguais às segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-D (SEQ ID NO:105).
[377] A terceira cadeia polipeptídica de DART-G compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VHHER2/neu) (hHER2 MAB-1 VH1, SEQ ID NO:64)), um Domínio CH1 de IgG1 (SEQ ID NO:3), um Domínio de Articulação de IgG1 (SEQ ID NO:7), um Domínio CH2 e CH3 “portando saliência” (SEQ ID NO:44), um peptídeo ligante de intervenção (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24)), um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de Heterodímero (espiral E) (EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:36) e um C-terminal.
[378] Assim, a terceira cadeia polipeptídica de DART-G é composta de: SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:44 ─ SEQ ID NO:24 ─ SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:36.
[379] A sequência de aminoácidos da terceira cadeia polipeptídica de DART-G é (SEQ ID NO:114):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRPSQDISN YLNWYQQKPD KTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYFCQQG DTLPYTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLVQ SGAEVKKPGA SVKVSCKASG YTFTSYWINW VKQAPGQGLE WIGNIYPSDS YTNYNQKFKD KATITADKST STAYMELSSL RSEDTAVYYC TRDYGSSYSF DYWGQGTTVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK
[380] Podem ser empregadas terceiras cadeias polipeptídicas de DART-G alternativas, nas quais os resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:76 (o Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137)) são substituídos pelos resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A), SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B), SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C) ou SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D). As moléculas otimizadas compreendendo essas cadeias polipeptídicas são descritas abaixo. A quarta cadeia polipeptídica de DART-G compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N- terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; GGCGGG (SEQ ID NO:18)), um Domínio de Promoção de
Heterodímero (espiral K) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE- KVAALKE) (SEQ ID NO:37) e um C-terminal.
[381] Assim, a quarta cadeia polipeptídica de DART-G é composta de: SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37.
[382] A sequência de aminoácidos da quarta cadeia polipeptídica de DART-G é (SEQ ID NO:119):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
[383] Podem ser empregadas quartas cadeias polipeptídicas de DART-G alternativas, nas quais os resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:76 (o Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137)) são substituídos pelos resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A), SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B), SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C) ou SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D). As moléculas otimizadas compreendendo essas cadeias polipeptídicas são descritas abaixo. DART-G Otimizado
[384] As variantes otimizadas de DART-G designadas “DART-G1”, “DART-G2”, “DART-G3” e “DART-G4” são compostas de cinco cadeias polipeptídicas, e contêm os domínios de ligação a HER2/neu de anticorpo hHER2 MAB-1 (1.3) e os domínios de ligação a CD137 de qualquer anticorpo hCD137 MAB- 3 (1A.3)-(1D.3).
[385] A primeira cadeia polipeptídica destas variantes otimizadas de DART-G possui a mesma sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de DART-G (SEQ ID NO:104).
[386] A segunda e quinta cadeias polipeptídicas destas variantes otimizadas de DART-G possuem a mesma sequência de aminoácidos da segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-G (SEQ ID NO:105).
[387] A terceira e quarta cadeias polipeptídicas destas variantes otimizadas de DART-G possuem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:115 e SEQ ID NO:120 (DART-G1); de SEQ ID NO:116 e SEQ ID NO:121 (DART-G2); de SEQ ID NO:117 e SEQ ID NO:122 (DART-G3); ou de SEQ ID NO:118 e SEQ ID NO:123 (DART- G4), conforme provido abaixo.
[388] A sequência de aminoácidos da terceira cadeia polipeptídica de DART-G1 otimizado, compreendendo SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A), é SEQ ID NO:115:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRPSQDISN YLNWYQQKPD KTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYFCQQG DTLPYTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTSYWI NWVKQAPGQG LEWIGNIYPS DSYTNYNQKF KDKATITADK STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCTRDYGSAY SFHPWGQGTT VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK
[389] A sequência de aminoácidos da terceira cadeia polipeptídica de DART-G2 otimizado, compreendendo SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B), é SEQ ID NO:116:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRPSQDISN YLNWYQQKPD KTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYFCQQG DTLPYTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTSYWI NWVKQAPGQG LEWIGNIYPS DSYTNYNQKF KDKATITADK STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCTRDYGSAY SMSTWGQGTT VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK
[390] A sequência de aminoácidos da terceira cadeia polipeptídica de DART-G3 otimizado, compreendendo SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C), é SEQ ID NO:117:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRPSQDISN YLNWYQQKPD KTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYFCQQG DTLPYTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTSYWI NWVKQAPGQG LEWIGNIYPS DSYTNYNQKF KDKATITADK STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCTRDYGSAY SYSLWGQGTT VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK
[391] A sequência de aminoácidos da terceira cadeia polipeptídica de DART-G4 otimizado, compreendendo SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D), é SEQ ID NO:118:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRPSQDISN YLNWYQQKPD KTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYFCQQG DTLPYTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTSYWI NWVKQAPGQG LEWIGNIYPS DSYTNYNQKF KDKATITADK STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCTRDYGSSY SYNVWGQGTT VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK
[392] A sequência de aminoácidos da quarta cadeia polipeptídica de DART-G1 otimizado, compreendendo SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A), é SEQ ID NO:120:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS FHPWGQGTTV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
[393] A sequência de aminoácidos da quarta cadeia polipeptídica de DART-G2 otimizado, compreendendo SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B), é SEQ ID NO:121:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS MSTWGQGTTV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
[394] A sequência de aminoácidos da quarta cadeia polipeptídica de DART-G3 otimizado, compreendendo SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C), SEQ ID NO:122:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS YSLWGQGTTV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
[395] A sequência de aminoácidos da quarta cadeia polipeptídica de DART-G4 otimizado, compreendendo SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D), é SEQ ID NO:123:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS YNVWGQGTTV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE TRIDENT-A
[396] TRIDENT-A é uma Molécula de Ligação a CD137 x CD137 x TA Trivalente que possui dois sítios de ligação a CD137 e um sítio de ligação para o TA exemplificador, HER2/neu. TRIDENT-A é composto de quatro cadeias polipeptídicas (vide, Figura 6A, em que VL1/VH1 (Sítio A) é igual a VL2/VH2 (Sítio B) e ligação a CD137, e VL3/VH3 (Sítio C) de ligação a HER2/neu).
[397] A primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A compreende, na direção do N-terminal para o C- terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; ASTKG (SEQ ID NO:19)), um Domínio de Promoção de Heterodímero contendo cisteína (espiral E) (EVAACEK-EVAALEK- EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:38)), um peptídeo ligante de intervenção (GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:21)), um Domínio CH2 e CH3 “portando saliência” (SEQ ID NO:44) e um C-terminal.
[398] Assim, a primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A é composta de: SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:19 ─ SEQ ID NO:38 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:44.
[399] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A é (SEQ ID NO:192):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
[400] A segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT- A compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; ASTKG (SEQ ID NO:19)), um Domínio de Promoção de Heterodímero contendo cisteína (espiral K) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:39)), e um C-terminal.
[401] Assim, a segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-A é composta de: SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:19 ─ SEQ ID NO:39.
[402] A sequência de aminoácidos da segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-A é (SEQ ID NO:197):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTV TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
[403] Podem ser empregadas a primeira e segunda cadeias polipeptídicas TRIDENT-A alternativas, nas quais os resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:76 (o Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137)) são substituídos pelos resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A), SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B), SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C), SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D), SEQ ID NO:208 (hCD137 MAB-3 VH1E), SEQ ID NO:209 (hCD137 MAB- 3 VH1F) ou SEQ ID NO:210 (hCD137 MAB-3 VH1G) e/ou os resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:89 (o Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137)) são substituídos pelos resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:211 (hCD137 MAB-3 VL4), SEQ ID NO:212 (hCD137 MAB-3 VL5), SEQ ID NO:213 (hCD137 MAB-3 VL6), SEQ ID NO:214 (hCD137 MAB-3 VL7), SEQ ID NO:215 (hCD137 MAB-3 VL8), SEQ ID NO:216 (hCD137 MAB-3 VL9), SEQ ID NO:217 (hCD137 MAB-3 VL10), SEQ ID NO:218 (hCD137 MAB-3 VL11), SEQ ID NO:219 (hCD137 MAB-3 VL12), SEQ ID NO:220 (hCD137 MAB- 3 VL13), SEQ ID NO:221 (hCD137 MAB-3 VL14) ou SEQ ID NO:222 (hCD137 MAB-3 VL15). As moléculas otimizadas/desimunizadas compreendendo muitas dessas cadeias polipeptídicas são descritas abaixo.
[404] A terceira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A compreende, na direção do N-terminal para o C- terminal, um N-terminal, um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VHHER2/neu) (hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64)), um Domínio CH1 de IgG1 humano (SEQ ID NO:3), uma Região de Articulação de IgG1 humano (SEQ ID NO:7) e um Domínio CH2 e CH3 “portando lacuna” (SEQ ID NO:47). Assim,
a terceira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A é composta de: SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:47, e possui a mesma sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de DART-D (SEQ ID NO:104) provida acima.
[405] A quarta cadeia polipeptídica de TRIDENT- A compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a HER2/neu (VLHER2/neu) (hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69)), um Domínio Kappa CL de IgG humano (SEQ ID NO:1) e um C-terminal. Assim, a quarta cadeia polipeptídica de TRIDENT-A é composta de: SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:1, e possui a mesma sequência de aminoácidos das segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-D (SEQ ID NO: 105) providas acima. Variantes Otimizadas de TRIDENT-A
[406] As variantes otimizadas de TRIDENT-A designadas “TRIDENT-A1”, “TRIDENT-A2”, “TRIDENT-A3” e “TRIDENT-A4” são compostas de quatro cadeias polipeptídicas, e contêm os domínios de ligação a HER2/neu de anticorpo hHER2 MAB-1 (1.3) e os domínios de ligação a CD137 de qualquer anticorpo hCD137 MAB-3 (1A.3)-(1D.3).
[407] A terceira cadeia polipeptídica desta TRIDENT-A otimizada possui a mesma sequência de aminoácidos da terceira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A, a qual, conforme observado, é igual à primeira cadeia polipeptídica de DART-D (SEQ ID NO:104).
[408] A quarta cadeia polipeptídica desta TRIDENT-A otimizada possui a mesma sequência de aminoácidos da quarta cadeia polipeptídica de TRIDENT-A, a qual, conforme observado, é igual à da segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-D (SEQ ID NO:105).
[409] A primeira e segunda cadeias polipeptídicas destas variantes otimizadas de TRIDENT-A possuem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:193 e SEQ ID NO:198 (TRIDENT-A1); de SEQ ID NO:194 e SEQ ID NO:199 (TRIDENT- A2); de SEQ ID NO:195 e SEQ ID NO:200 (TRIDENT-A3); ou de SEQ ID NO:196 e SEQ ID NO:201 (TRIDENT-A4), conforme provido abaixo.
[410] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A1, compreendendo SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A), é SEQ ID NO:193:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS FHPWGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
[411] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A2, compreendendo SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B), é SEQ ID NO:194:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS MSTWGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
[412] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A3, compreendendo SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C), é SEQ ID NO:195:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS YSLWGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
[413] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A4, compreendendo SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D), é SEQ ID NO:196:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS YNVWGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
[414] A sequência de aminoácidos da segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-A1, compreendendo SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A), é SEQ ID NO:198:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS FHPWGQGTTV TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
[415] A sequência de aminoácidos da segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-A2, compreendendo SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B), é SEQ ID NO:199:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS MSTWGQGTTV TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
[416] A sequência de aminoácidos da segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-A3, compreendendo SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C), é SEQ ID NO:200:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS YSLWGQGTTV TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
[417] A sequência de aminoácidos da segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-A4, compreendendo SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D), é SEQ ID NO:201:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS YNVWGQGTTV TVSSASTKGK
VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE Variantes Desimunizadas de TRIDENT-A
[418] As variantes desimunizadas de TRIDENT-A são compostas de quatro cadeias polipeptídicas e contêm os domínios de ligação a HER2/neu de anticorpo hHER2 MAB-1 (1.3) e o Domínio VH de CD137 de qualquer hCD137 MAB-3 VH1E-VH1G e o Domínio VL de CD137 de qualquer hCD137 MAB-3 VL4-VL15.
[419] Uma variante desimunizada exemplificadora de TRIDENT-A designada “TRIDENT-A5” é composta de quatro cadeias polipeptídicas e contém os domínios de ligação a HER2/neu de anticorpo hHER2 MAB-1 (1.3) e os domínios de ligação a CD137 de qualquer anticorpo hCD137 MAB-3 (1E.15).
[420] A sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A5 (compreendendo hCD137 MAB- 3 VH1E e hCD137 MAB-3 VL15), é (SEQ ID NO:229):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TGRARSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVRQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS MSTWGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
[421] A sequência de aminoácidos da segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-A5 (compreendendo hCD137 MAB- 3 VH1E e hCD137 MAB-3 VL15), é (SEQ ID NO:230):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TGRARSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVRQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS MSTWGQGTTV TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
[422] A terceira cadeia polipeptídica desta TRIDENT-A5 desimunizada possui a mesma sequência de aminoácidos da terceira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A, a qual, conforme observado acima, é igual à primeira cadeia polipeptídica de DART-D (SEQ ID NO:104).
[423] A quarta cadeia polipeptídica desta TRIDENT-A5 desimunizada possui a sequência de aminoácidos das quartas cadeias polipeptídicas de TRIDENT-A, a qual, conforme observado acima, é igual às segunda e quinta cadeias polipeptídicas de DART-D (SEQ ID NO:105). TRIDENT-B
[424] TRIDENT-B é uma Molécula de Ligação a CD137 x CD137 x TA Trivalente que possui dois sítios de ligação a CD137 e um sítio de ligação para o TA exemplificador, 5T4. TRIDENT-B é composto de quatro cadeias polipeptídicas (vide, Figura 6A, em que VL1/VH1 (Sítio A) é igual a VL2/VH2 (Sítio B) e ligação a CD137, e VL3/VH3 (Sítio C) de ligação a 5T4).
[425] A primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-B compreende, na direção do N-terminal para o C- terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137) (hCD137 MAB-3 VL3
(SEQ ID NO:89)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; ASTKG (SEQ ID NO:19)), um Domínio de Promoção de Heterodímero contendo cisteína (espiral E) (EVAACEK-EVAALEK- EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:38)), um peptídeo ligante de intervenção (GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:21)), um Domínio CH2 e CH3 “portando saliência” (SEQ ID NO:44) e um C-terminal. Assim, a primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-B é composta de: SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:19 ─ SEQ ID NO:38 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:44, e possui a mesma sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A (SEQ ID NO: 192) providas acima.
[426] A segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT- B compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VLCD137) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO:16)), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76)), um peptídeo ligante de intervenção (Ligante 2; ASTKG (SEQ ID NO:19)), um Domínio de Promoção de Heterodímero contendo cisteína (espiral K) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:39)), e um C-terminal. Assim, a segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-B é composta de: SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:19 ─ SEQ ID NO:39, e possui a mesma sequência de aminoácidos da segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-A (SEQ ID NO: 197) providas acima.
[427] Podem ser empregadas a primeira e segunda cadeias polipeptídicas TRIDENT-B alternativas, nas quais os resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:76 (o Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137)) são substituídos pelos resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A), SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B), SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C), SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D), SEQ ID NO:208 (hCD137 MAB-3 VH1E), SEQ ID NO:209 (hCD137 MAB- 3 VH1F) ou SEQ ID NO:210 (hCD137 MAB-3 VH1G) e/ou os resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:89 (o Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a CD137 (VHCD137)) são substituídos pelos resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO:211 (hCD137 MAB-3 VL4), SEQ ID NO:212 (hCD137 MAB-3 VL5), SEQ ID NO:213 (hCD137 MAB-3 VL6), SEQ ID NO:214 (hCD137 MAB-3 VL7), SEQ ID NO:215 (hCD137 MAB-3 VL8), SEQ ID NO:216 (hCD137 MAB-3 VL9), SEQ ID NO:217 (hCD137 MAB-3 VL10), SEQ ID NO:218 (hCD137 MAB-3 VL11), SEQ ID NO:219 (hCD137 MAB-3 VL12), SEQ ID NO:220 (hCD137 MAB- 3 VL13), SEQ ID NO:221 (hCD137 MAB-3 VL14) ou SEQ ID NO:222 (hCD137 MAB-3 VL15). As moléculas otimizadas/desimunizadas que compreendem muitas destas cadeias polipeptídicas são descritas aqui e possuem as mesmas sequências de aminoácidos da primeira e segunda cadeias polipeptídicas de moléculas TRIDENT-A otimizadas/desimunizadas (por exemplo, TRIDENT-A1 – TRIDENT- A5).
[428] A terceira cadeia polipeptídica de TRIDENT-B compreende, na direção do N-terminal para o C- terminal, um N-terminal, um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a 5T4 (VH5T4) (h5T4 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:134)), um Domínio CH1 de IgG1 humano (SEQ ID NO:3), uma Região de Articulação de IgG1 humano (SEQ ID NO:7) e um Domínio
CH2 e CH3 “portando lacuna” (SEQ ID NO:47). Assim, a primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-B é composta de: SEQ ID NO:134 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:47.
[429] A sequência de aminoácidos da terceira cadeia polipeptídica de TRIDENT-B é (SEQ ID NO:231):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR IDPNRGGTEY NEKAKSRVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAGGN PYYPMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
[430] A quarta cadeia polipeptídica de TRIDENT- B compreende, na direção do N-terminal para o C-terminal, um N-terminal, um Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de ligação a 5T4 (VL5T4) (h5T4 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:135)), um Domínio Kappa CL de IgG humano (SEQ ID NO:1) e um C-terminal. Assim, a quarta cadeia polipeptídica de TRIDENT-B é composta de: SEQ ID NO:135 ─ SEQ ID NO:1.
[431] A sequência de aminoácidos das quartas cadeias polipeptídicas de TRIDENT-B é (SEQ ID NO:232):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC Variantes Otimizadas e Desimunizadas TRIDENT-B
[432] As variantes otimizadas e desimunizadas de TRIDENT-B são compostas de quatro cadeias polipeptídicas e contêm os domínios de ligação a 5T4 de anticorpo h5T4 MAB-1 e o Domínio VH de CD137 de qualquer hCD137 MAB-3 VH1A-VH1G e o Domínio VL de CD137 de qualquer hCD137 MAB-3 VL3-VL15.
[433] As variantes otimizadas e desimunizadas exemplificadoras de TRIDENT-B designadas “TRIDENT-B2” e “TRIDENT-B5” são compostas de quatro cadeias polipeptídicas e contêm os domínios de ligação a 5T4 de anticorpo h5T4 MAB-1 e os domínios de ligação a CD137 de anticorpo hCD137 MAB-3 (1B.3) e hCD137 MAB-3 (1E.15), respectivamente.
[434] A primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-B2 tem a mesma sequência de aminoácidos que a primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A2 (SEQ ID NO:194), conforme provido acima.
[435] A segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT- B2 tem a mesma sequência de aminoácidos que a segunda cadeia de polipeptídeo de TRIDENT-A2 (SEQ ID NO:199), conforme provido acima.
[436] A primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-B5 tem a mesma sequência de aminoácidos que a primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A5 (SEQ ID NO:229), conforme provido acima.
[437] A segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT- B5 tem a mesma sequência de aminoácidos que o segundo polipeptídeo de TRIDENT-A5 (SEQ ID NO:230), conforme provido acima.
[438] As terceiras cadeias polipeptídicas de ambas as variantes otimizadas e desimunizadas de TRIDENT-B possuem a mesma sequência de aminoácidos da terceira cadeia polipeptídica de TRIDENT-B (SEQ ID NO:231).
[439] A quarta cadeia polipeptídica de ambas as variantes otimizadas e desimunizadas de TRIDENT-B possuem a mesma sequência de aminoácidos das quartas cadeias polipeptídicas de TRIDENT-B (SEQ ID NO:232). Moléculas de Ligação a CD137 x TA Alternativas
[440] Como será reconhecido em vista da presente revelação, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA adicionais tendo a estrutura geral de quaisquer das moléculas exemplificadoras acima e compreendendo um sítio de ligação para um Antígeno Tumoral alternativo e/ou tendo um sítio de ligação a CD137 otimizado/desimunizados podem ser construídas ao empregar os Domínios VL e VH de anticorpos de Antígeno Tumoral alternativo no lugar dos Domínios VL e VH dos anticorpos anti-HER2/neu ou anti-5T4, e/ou os Domínios VL e VH de quaisquer anticorpos CD137 otimizados/desimunizados aqui revelados. Da mesma forma, conforme provido pelo presente, as
Moléculas de Ligação a CD137 x TA alternativas podem ser construídas da mesma forma incorporando ligantes alternativos e/ou domínio de promoção de heterodímero. Moléculas Controle
[441] A fim de demonstrar de forma mais significativa as propriedades das Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção, os anticorpos controle, cujos Domínios VL e VH podem ser usados para produzir diacorpos controle portando Fc e demais Moléculas de Ligação controle, são apresentadas abaixo.
[442] O anticorpo antifluoresceína 4-4-20 (Gruber, M. et al. (1994) “Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli,” J. Immunol. 152(11):5368-5374; Bedzyk, W.D. et al. (1989) “Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family,” J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569) é um anticorpo controle adequado, diacorpos. As sequências de aminoácidos dos Domínios variáveis leves e variáveis pesados do anticorpo antifluoresceína 4-4- 20 são as seguintes:
[443] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de anticorpo anti-fluoresceína 4-4-20 (SEQ ID NO:124) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWMNWVRQS PEKGLEWVAQ IRNKPYNYET YYSDSVKGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG SYYGMDYWGQ GTSVTVSS
[444] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de anticorpo anti-fluoresceína 4-4-20 (SEQ ID NO:125) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP WTFGGGTKLE IK
[445] Palivizumabe (vide, por exemplo, Banco de Dados de Proteína (PDB) ID No 2HWZ) é um anticorpo humanizado monoclonal (IgG) direcionado contra um epitopo no sítio antigênico da proteína F de RSV e é um anticorpo controle adequado, cujos Domínios VL e VH podem ser usados para produzir diacorpos controle e demais Moléculas de Ligação controle. Os anticorpos F alternativos da glicoproteína anti-RSV incluem motavizumabe (vide, por exemplo, PDB ID No 3IXT) e uma variante de palivizumabe projetada para remover resíduos de cisteína da CDR 1 da cadeia leve. A variante de palivizumabe foi usada para geração das moléculas controle abaixo.
[446] A sequência de aminoácidos do Domínio VH variante de palivizumabe (SEQ ID NO:126) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVGWIR QPPGKALEWL ADIWWDDKKD YNPSLKSRLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCARS MITNWYFDVW GAGTTVTVSS
[447] A sequência de aminoácidos do Domínio VL da variante de palivizumabe (SEQ ID NO:127) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSVG YMHWYQQKPG KAPKLLIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYCFQG
SGYPFTFGGG TKLEIK Sumário das Moléculas de Ligação a CD137 x TA e Controle
[448] A Tabela 5 resume os atributos do Domínio de DART-A – DART-G, TRIDENT-A-A5: Tabela 5 Nome mAbs Cadeia SEQ ID Outros (No. de Domínio Fc Parental No.
NOs. componentes cadeias) hHER2 1 98 MAB-1 2 99 DART-A (1.2) 3 98 IgG1 (AA) Novelos E/K (4 cadeias) hCD137 4 MAB-3 99 (1.1) hHER2 1 100 MAB-1 2 101 DART-B (1.3) 3 100 IgG1 (AA) Novelos E/K (4 cadeias) hCD137 4 MAB-3 101 (1.3) hCD137 1 102 MAB-3 2 103 DART-C (1.3) 3 102 IgG1 (AA) Novelos E/K (4 cadeias) hHER2 4 MAB-1 103 (1.3) hHER2 1 104 MAB-1 2 105 DART-D IgG1 (AA) CL/CH1 e (1.3) 3 106 (5 cadeias) (saliência/lacuna) novelos E/K CD137 4 107 MAB-3 5 105 CD137 1 108 MAB-3 2 109 DART-E IgG1 (AA) CL/CH1 e hHER2 3 110 (5 cadeias) (saliência/lacuna) novelos E/K MAB-1 4 111 (1.3) 5 109 hHER2 1 104 MAB-1 2 105 DART-F IgG1 (AA) CL/CH1 e (1.3) 3 112 (5 cadeias) (saliência/lacuna) novelos E/K CD137 4 113 MAB-4 5 105 hHER2 1 104 MAB-1 2 105 DART-G (1.3) IgG1 (AA) 3 114 CL/CH1 e (5 cadeias) hCD137 (saliência/lacuna) 4 119 novelos E/K MAB-3 5 (1.3) 105
1 104
Tabela 5 Nome mAbs Cadeia SEQ ID Outros (No. de Domínio Fc Parental No. NOs. componentes cadeias) hHER2 IgG1 (AA) 2 105 MAB-1 (saliência/lacuna) 3/4 115/120 DART-G1-G4 (1.3) 3/4 116/121 CL/CH1 e otimizado hCD137 3/4 117/122 novelos E/K (5 cadeias) MAB-3 3/4 118/123 (1A.3)- 5 (1D.3) 105 hHER2 1 192 MAB-1 2 197 TRIDENT-A (1.3) IgG1 (AA) 3 104 CL/CH1 e (4 cadeias) hCD137 (saliência/lacuna) novelos E/K MAB-3 4 105 (1.3) hHER2 1/2 193/198 MAB-1 1/2 194/199 TRIDENT-A1- (1.3) IgG1 (AA) 1/2 195/200 CL/CH1 e A4 otimizado hCD137 (saliência/lacuna) 1/2 196/201 novelos E/K (4 cadeias) MAB-3 3 104 (1A.3)- (1D.3) 4 105 hHER2 1 229 MAB-1 2 230 TRIDENT A5 (1.3) IgG1 (AA) 3 104 CL/CH1 e Desimunizada hCD137 (saliência/lacuna) novelos E/K (4 cadeias) MAB-3 4 105 (1E.15) h5T4 1 192 MAB-1 2 197 IgG1 (AA) CL/CH1 e TRIDENT-B hCD137 (saliência/lacuna) 3 231 novelos E/K MAB-3 (1.3) 4 232 h5T4 1 194 MAB-1 2 199 TRIDENT-B2 IgG1 (AA) CL/CH1 e hCD137 otimizado (saliência/lacuna) 3 231 novelos E/K MAB-3 (1B.3) 4 232 h5T4 1 229 MAB-1 2 230 TRIDENT-B5 IgG1 (AA) CL/CH1 e hCD137 Desimunizada (saliência/lacuna) 3 231 novelos E/K MAB-3 (1E.15) 4 232
[449] A Tabela 6 mostra os atributos de moléculas DART e TRIDENT adicionais que foram preparadas:
Tabela 6 Nome (No. de mAbs Parental Domínio Fc Outros componentes cadeias) Idem a DART-A, exceto hHER2 MAB-1 por compreender DART-1 (1.2) IgG1 (AA) VH/VL de CD137 MAB-1 (4 cadeias) CD137 MAB-1 no lugar do VH/VL de hCD137 MAB-3(1.1) Idem a DART-A, exceto hHER2 MAB-1 por compreender DART-2 (1.2) IgG1 (AA) VH/VL de CD137 MAB-2 (4 cadeias) CD137 MAB-2 no lugar do VH/VL de hCD137 MAB-3(1.1) Idem a DART-A, exceto por compreender hHER2 MAB-1 VH/VL de DART-3 (1.2) IgG1 (AA) palivizumabe (4 cadeias) palivizumabe variante no lugar do variante VH/VL de hCD137 MAB- 3(1.1) Idem a DART-D, exceto hHER2 MAB-1 por compreender DART-4 IgG1 (AA) (1.3) VH/VL de CD137 MAB-1 (5 cadeias) (saliência/lacuna) CD137 MAB-1 no lugar do VH/VL de CD137 MAB-3. Idem a DART-D, exceto hHER2 MAB-1 por compreender DART-5 IgG1 (AA) (1.3) VH/VL de CD137 MAB-2 (5 cadeias) (saliência/lacuna) CD137 MAB-2 no lugar do VH/VL de CD137 MAB-3. Idem a DART-D, exceto por compreender palivizumabe VH/VL de DART-6 IgG1 (AA) variante palivizumabe (5 cadeias) (saliência/lacuna) CD137 MAB-3 variante no lugar do VH/VL de hHER2 MAB- 1(1.3) Idem a DART-1, exceto por compreender EphA2 MAB-3 DART-7 VH/VL de uma variante humanizado IgG1 (AA) (4 cadeias) humanizada de EphA2 CD137 MAB-1 MAB-3 no lugar de hHER2 MAB-1 (1.2) EphA2 MAB-3 Idem a DART-3, exceto DART-8 humanizado por compreender IgG1 (AA) (4 cadeias) palivizumabe VH/VL de uma variante variante humanizada de EphA2
Tabela 6 Nome (No. de mAbs Parental Domínio Fc Outros componentes cadeias) MAB-3 no lugar de hHER2 MAB-1 (1.2) Idem a TRIDENT A2, exceto por palivizumabe compreender VH/VL de TRIDENT-1 variante IgG1 (AA) palivizumabe (4 cadeias) CD137 MAB-3 (saliência/lacuna) variante no lugar do (1B.3) VH/VL de hHER2 MAB-1 (1.3) Igual a TRIDENT-A, exceto os Domínios VH hHER2 MAB-1 e VL de CD137 MAB-3 (1.3) (1.3) são TRIDENT-2 IgG1 (AA) 4-4-20 substituídos por (4 cadeias) (saliência/lacuna) palivizumabe VH/VL de variante palivizumabe variante, e VH/VL de 4-4-20 Igual a TRIDENT-2, exceto os Domínio VH 5T4 MAB-1 TRIDENT-3 IgG1 (AA) e VL de hHER2 MAB-1 4-4-20 (4 cadeias) (saliência/lacuna) (1.3) são Palivizumabe substituídos por VH/VL de 5T4 MAB-1 Idem a TRIDENT A5, exceto por Palivizumabe compreender VH/VL de TRIDENT-4 IgG1 (AA) CD137 MAB-3 palivizumabe (4 cadeias) (saliência/lacuna) (1E.15) variante no lugar do VH/VL de hHER2 MAB-1 (1.3) Composições farmacêuticas
[450] As composições da invenção incluem composições medicamentosas a granel úteis na fabricação de composições farmacêuticas (por exemplo, composições impuras ou não estéreis) e composições farmacêuticas (ou seja, composições adequadas para administração a um indivíduo ou paciente) que podem ser usadas na preparação de formas de dosagem unitária. Estas composições compreendem uma Molécula de Ligação a CD137 x TA da presente invenção, ou uma combinação de tais agentes e um veículo farmaceuticamente aceitável. De preferência, as composições da invenção compreendem uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz do diacorpo biespecífico portando Fc CD137 x TA da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[451] A invenção também abrange composições farmacêuticas que compreendem Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção e um ou mais moléculas adicionais que são eficazes no estímulo de uma resposta imune (por exemplo, um inibidor de checkpoint imunológico) e/ou em combinação com uma ou mais moléculas adicionais que se ligam especificamente a um antígeno tumoral (por exemplo, um anticorpo monoclonal ou diacorpo específico ao tumor) que é específico para pelo menos antígeno tumoral em particular (TA, conforme descrito acima), e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[452] Em uma realização específica, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência regulatória do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia norte-americana ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em humanos. O termo “veículo” se refere a um diluente, adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente, ou veículo com o qual o produto terapêutico é administrado. Estes veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis. Os veículos aquosos, como soluções salina, dextrose aquosa e soluções de glicerol, são preferidos quando a composição farmacêutica é administrada via intravenosa.
[453] No geral, os ingredientes das composições da invenção são fornecidos tanto separadamente quanto misturados em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado a seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente vedado, como uma ampola ou sachê, indicando a quantidade do agente ativo. Quando a composição deve ser administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água de grau farmacêutico estéril ou solução salina. Quando a composição é administrada por injeção, pode ser provida uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina de modo que os ingredientes podem ser misturados antes da administração.
[454] A invenção também provê um pacote ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes contendo uma Molécula de Ligação a CD137 x TA da presente invenção isoladamente ou com outros agentes, de preferência com um veículo farmaceuticamente aceitável. Além disso, um ou mais outros agentes profiláticos ou terapêuticos úteis para o tratamento de uma doença também podem ser incluídos no pacote ou kit farmacêutico. A invenção também provê um pacote ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Opcionalmente associado a este(s) recipiente(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou comercialização de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência sobre a fabricação, uso ou comercialização para administração em seres humanos.
[455] Um kit pode compreender uma Molécula de Ligação a CD137 x TA da invenção. O kit pode compreender ainda um ou mais outros agentes profiláticos e/ou terapêuticos úteis para o tratamento de câncer em um ou mais recipientes; e/ou o kit pode compreender ainda um ou mais anticorpos citotóxicos que se ligam a um ou mais antígenos tumorais (TAs). Em determinadas realizações, o outro agente profilático ou terapêutico é um agente quimioterápico. Em outras realizações, o agente profilático ou terapêutico é um agente terapêutico biológico ou hormonal. Métodos de administração
[456] As composições da presente invenção podem ser providas para o tratamento, profilaxia e melhora de um ou mais sintomas associados ao câncer ou outra doença ou distúrbio pela administração de uma quantidade eficaz de uma molécula da invenção a um indivíduo, ou uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula da invenção. Em um aspecto preferido, estas composições são substancialmente purificadas (ou seja, substancialmente livres de substâncias que limitam seu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejados). Em uma realização específica, o indivíduo é um animal, de preferência um mamífero como um não primata (por exemplo, bovino, equino, felino, canino, roedor etc.) ou um primata (por exemplo, macaco, como um macaco Cynomolgus, ser humano etc.). Em uma realização preferida, o indivíduo é um ser humano.
[457] Diversos sistemas de fornecimento são conhecidos e podem ser usados para administrar as moléculas e composições da invenção, por exemplo, encapsulamento em lipossomos, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o anticorpo ou proteína de fusão, endocitose mediada por receptor (Vide, por exemplo, Wu et al. (1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-
4432), construção de um ácido nucleico como parte de um retroviral ou outro vetor etc.
[458] Os métodos de administração de uma molécula da invenção incluem, entre outros, administração parenteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea), epidural e mucosal (por exemplo, intranasal e vias orais). Em uma realização específica, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são administradas via intramuscular, intravenosa ou subcutânea. As composições podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção por bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal etc.) e podem ser administradas junto a outros ativos biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.
[459] A invenção também provê que as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção sejam embaladas em um recipiente hermeticamente vedado, como uma ampola ou sachê, indicando a quantidade da molécula. Em uma realização, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são fornecidas na forma de um pó liofilizado a seco esterilizado ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente vedado e podem ser reconstituídas, por exemplo, com água ou solução salina à concentração apropriada para administração a um indivíduo. De preferência, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são fornecidas na forma de um pó liofilizado a seco estéril em um recipiente hermeticamente vedado.
[460] As Moléculas de Ligação a CD137 x TA liofilizadas da presente invenção devem ser armazenadas entre
2 e 8 °C em seu recipiente original e as moléculas devem ser administradas no período de 12 horas, de preferência no período de 6 horas, período de 5 horas, período de 3 horas ou período de 1 hora após ser reconstituídas. Em uma realização alternativa, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são fornecidas em forma líquida em um recipiente hermeticamente vedado indicando a quantidade e concentração da molécula, proteína de fusão ou molécula conjugada. De preferência, a forma líquida das Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são fornecidas em um recipiente hermeticamente vedado.
[461] A quantidade da composição da invenção que será eficaz no tratamento, prevenção ou melhora de um ou mais sintomas associados a um distúrbio pode ser determinada pelas técnicas clínicas padrão. A dose precisa a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da seriedade da condição, e deve ser decidida de acordo com a decisão do profissional da saúde e das circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir das curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.
[462] Conforme aqui usado, uma “quantidade eficaz” de uma composição farmacêutica, em uma realização, é uma quantidade suficiente para produzir resultados benéficos ou desejado, inclusive, sem limitação, resultados clínicos como diminuição de sintomas resultantes da doença, atenuação de um sintoma da doença (por exemplo, a proliferação de células cancerosas, presença de tumor, metástases tumorais etc.), aumentando assim a qualidade de vida daqueles acometidos pela doença, reduzindo a dose de outras medicações necessária para tratar a doença, potencializando o efeito de outra medicação como direcionamento de via e/ou internação, atraso da progressão da doença e/ou prolongamento da sobrevida de indivíduos.
[463] Esta quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para as finalidades desta invenção, uma quantidade eficaz da droga, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade eficaz para reduzir a proliferação de (ou o efeito de) presença viral e reduzir e/ou atrasar o desenvolvimento da doença (por exemplo, câncer) tanto direta quanto indiretamente. Em algumas realizações, uma quantidade eficaz de uma droga, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser atingida em conexão com outra droga, composto ou composição farmacêutica. Portanto, uma “quantidade eficaz” pode ser considerada no contexto de administração de um ou mais agentes quimioterápicos, e um único agente pode ser considerado para ser fornecido em uma quantidade eficaz caso, em conexão com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou é atingido. Apesar de as necessidades individuais variarem, a determinação de variações ideais de quantidades eficazes de cada componente encontra-se na perícia da técnica.
[464] Para as Moléculas de Ligação a CD137 x TA abrangidas pela invenção, a dosagem administrada a um paciente é de preferência determinada com base no peso corporal (kg) do indivíduo receptor. A dosagem administrada normalmente é de aproximadamente 0,01 μg/kg a aproximadamente 150 mg/kg, ou mais, do peso corporal do indivíduo.
[465] A dosagem e frequência de administração das Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção podem ser reduzidas ou alteradas ao potencializar a captação e penetração tecidual das Moléculas de Ligação a CD137 x TA por modificações como, por exemplo, lipidação.
[466] A dosagem da Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção administrada a um paciente pode ser calculada para uso como uma terapia de agente único. Alternativamente, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são usadas em combinação com outras composições terapêuticas, de modo que a dosagem administrada a um paciente seja menor que quando as ditas moléculas são usadas como uma terapia de agente único.
[467] O tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção pode incluir um único tratamento ou, de preferência, pode incluir uma séria de tratamentos. Em um exemplo preferido, um indivíduo é tratado com tal diacorpo uma vez por semana, uma vez a cada quinze dias (ou seja, uma vez a cada duas semanas), ou uma vez a cada três semanas, entre aproximadamente 1 a 52 semanas. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas uma vez ao dia, duas vezes ao dia ou três vezes ao dia. Alternativamente, as composições farmacêuticas podem ser administradas uma vez por semanas, duas vezes por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez ao mês, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada dois meses, duas vezes ao ano ou uma vez ao ano. Também será reconhecido que a dosagem eficaz das moléculas usadas para tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo do ciclo de um tratamento em particular. Usos das composições da invenção
[468] As Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção possuem a capacidade de se ligar a células T (APCs) (por exemplo, ao se ligar a CD137 expresso nas superfícies destas células T) e a capacidade de se ligar a células tumorais que expressão TA (por exemplo, ao se ligar a um TA expresso nas superfície destas células tumorais). Portanto, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção possuem a capacidade de co-localizar as células T para as células tumorais que expressam TA e, assim, podem ser usadas para tratar qualquer doença ou condição associada a ou caracterizada pela expressão de um TA.
Assim, sem limitação, composições farmacêuticas que compreendem essas moléculas podem ser empregadas no diagnóstico ou no tratamento de cânceres que expressam um TA, incluindo os cânceres caracterizados pela presença de uma célula cancerosa, incluindo, entre outros, uma célula cancerosa de leucemia mieloide aguda, tumor da glândula suprarrenal, câncer associado à AIDS, sarcoma alveolar das partes moles, tumor astrocítico, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral e da medula vertebral, tumor cerebral metastático, câncer de mama, tumores do corpo carótido, câncer cervical, condrossarcoma, cordoma, carcinoma de células renais cromófobas, carcinoma de células claras, câncer de cólon, câncer colorretal, histiocitoma fibroso cutâneo benigno, tumor de células pequenas redondas desmoplásico, ependimoma, tumor de Ewing, condrossarcoma mixoide extra esquelético, fibrogênese óssea imperfeita, displasia fibrosa óssea, câncer da vesícula biliar ou duto biliar, câncer gástrico, doença trofoblástica gestacional, tumor de células germinativas, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, tumor de células de ilhota, sarcoma de Kaposi, câncer renal, leucemia, lipoma/tumor lipomatoso benigno, lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, câncer hepático,
linfoma, câncer de pulmão, meduloblastoma, melanoma, meningioma, mesotelioma maligno, neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, câncer pulmonar de células não pequenas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de faringe, carcinoma tireoide papilar, tumor da paratireoide, câncer pediátrico, tumor da bainha nervosa periférica, feocromocitoma, tumor hipofisário, câncer da próstata, melanoma uveal posterior, distúrbio hematológico raro, carcinoma de células renais, câncer renal metastático, tumor rabdoide, rabdomiossarcoma, sarcoma, câncer cutâneo, sarcoma de tecidos moles, câncer espinocelular, câncer de estômago, sarcoma sinovial, câncer de testículo, carcinoma tímico, timoma, câncer metastático de tireoide ou câncer de útero.
[469] Em particular, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção são úteis para o tratamento de cânceres espinocelulares de cabeça e pescoço (SCCHN), cânceres da bexiga, cânceres de mama, cânceres colorretais, cânceres gástricos, glioblastomas, cânceres renais, cânceres pulmonares, inclusive cânceres pulmonares de células não pequenas (NSCLC), melanomas, cânceres ovarianos, cânceres pancreáticos, cânceres faríngeos, cânceres prostáticos, carcinomas de células renais e tumores de pequenas células redondas e azuis da infância, inclusive neuroblastomas e rabdomiossarcomas, cada um dos quais expressam fortemente TAs.
[470] As Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção pode ser usadas adicionalmente na fabricação de medicamentos para o tratamento das condições descritas acima.
[471] Conforme demonstrado pelo presente, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção potencializam a atividade de agentes de alvo tumoral. De forma adequada, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção podem ser usadas adicionalmente em combinação com outros agentes de alvo tumoral, inclusive, entre outros, um anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo (por exemplo, um scFv, um Fab, um F(ab)2 etc.), um TandAb etc.), uma Molécula de Ligação multiespecífica (por exemplo, um diacorpo, um anticorpo biespecífico, uma Molécula de Ligação trivalente etc.), capaz de ligação a um TA desejado. Contempla- se especificamente que o agente de alvo tumoral pode se ligar ao mesmo TA ou a um TA diferente da Molécula de Ligação a CD137 x TA usada em tais combinações. Em realizações particulares, o agente de alvo tumoral é uma molécula multiespecífica que se liga a um TA e a um epitopo expresso nas células T incluindo, por exemplo, CD3 e/ou CD8. Os agentes de alvo tumoral exemplificadores incluem, entre outros, moléculas que se ligam a um TA e CD3 (“TA x CD3”). As Moléculas de Ligação a TA x CD3 exemplificadores (por exemplo, anticorpos biespecíficos, moléculas DART®, moléculas BiTe®, TandAbs etc.), e métodos para a fabricação destes, os quais podem ser usados nestas combinações, são bem conhecidos na técnica. (vide, por exemplo, WO2013026835, WO2013158856, WO2014047231; WO2014110601; WO2014131711; WO 2015/026894; WO2015026892; WO 2015/184203; WO 2016/036937; WO2016182751; WO2017091656; WO2017/142928; WO2017118675).
[472] Conforme provido pelo presente, o uso das Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção em combinação com um agente de alvo tumoral (por exemplo, uma
Molécula de Ligação a TA x CD3) pode levar a uma supraregulação do modulador inibitório imunológico de Morte Programada-1 (“PD-1”, também conhecido como “CD279”). PD-1 faz a mediação da sua inibição do sistema imunológico ao se ligar a PD-L1 e PD-L2 (também conhecidos como B7-H1 e B7-DC) (Flies, D.B. et al. (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity,” J. Immunother. 30(3):251-260; Patentes Norte- americanas Nos. 6.803.192; 7.794.710; Publicações de Pedidos de Patentes Norte-americanas Nos. 2005/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; Publicacções PCT Nos. WO 01/39722; WO 02/086083). No entanto, como aqui demonstrado, a adição posterior de um agente que inibe a atividade inibitória de PD- 1 (“Inibidor de checkpoint de PD-1/PD-L1”) subrregula a expressão de PD-1 e potencializa ainda a atividade de CD137 x TA e de agentes de alvo tumoral como Moléculas de Ligação a TA x CD3. A invenção abrange particularmente os Inibidores de checkpoint de PD-1/PD-L1 que compreendem um sítio de ligação a epitopo de um anticorpo que se liga a PD-1.
[473] De forma adequada, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção podem ser usadas adicionalmente em combinação com outros agentes de alvo tumoral, em combinação posterior com um inibidor de checkpoint de PD-1/PD-L1. Os Inibidores de checkpoint de PD-1/PD-L1 incluem, entre outros, um anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo (por exemplo, um scFv, um Fab, um F(ab)2 etc.), um TandAb etc.), uma Molécula de Ligação multiespecífica (por exemplo, um diacorpo, um anticorpo biespecífico, uma Molécula de Ligação trivalente etc.), capaz de ligação a PD-1 e/ou PD-L1. Os Inibidores de checkpoint de PD-1/PD-L1 exemplificadores e métodos de fabricação destes, os quais podem ser usados nestas combinações, são bem conhecidos na técnica. (vide, por exemplo, as Patentes Norte-americanas Nos. 9.617.338; 9.273.135, 9.062.112, 8.981.063, 8.779.108,
8.609.089; 8.552.154; 8.460.927; 8.008.449; Publicações de Patentes Norte-americanas Nos: 2015/0197571; 2016/0075782; 2016/0159905; 2016/0319019; 2017/0044259; Publicações de Patente PCT Nos. WO 2004/056875; WO 2006/121168; WO 2008/156712; WO 2012/135408; WO 2012/145549; WO 2013/014668; WO 2014/055897; WO 2013/079174; WO 2014/179664; WO 2014/194302; WO 2015/109124; WO 2015/112800; WO 2015/112805; WO 2016/000619; WO 2016007235; WO 2016/061142; WO 2016/111645; WO 2016/210262; WO 2016/014688; WO 2016/077397; WO 2017/019846; WO 2017/079112; WO 2017/087547; e WO 2017/106656).
[474] Onde empregam-se estas combinações, contempla-se especificamente que uma ou mais das moléculas podem ser administradas “concomitantemente” a um indivíduo (por exemplo, uma Molécula de Ligação a CD137 x TA pode ser administrada ao mesmo tempo que uma Molécula de Ligação a TA x CD3 e/ou um Inibidor de checkpoint de PD-1/PD-L1 é administrada) e/ou que uma ou mais das moléculas podem ser administradas “sequencialmente” (por exemplo, uma Molécula de Ligação a CD137 x TA é administrada e, em um momento posterior, uma Molécula de Ligação a TA x CD3 e/ou um Inibidor de checkpoint de PD-1/PD-L1 é administrado, ou vice-versa). Realizações Particulares da Invenção
[475] Tendo descrito agora a invenção de modo geral, esta será facilmente compreendida através da referência às seguintes Realizações numeradas (“E”), as quais são providas por meio de ilustração e não pretendem ser limitantes da presente invenção, exceto especificado: E1. Uma Molécula de Ligação a CD137 x TA, em que essa Molécula de Ligação é capaz de ligação específica a um epitopo de CD137 e a um epitopo de um antígeno tumoral (TA), e em que essa Molécula de Ligação a CD137 x TA compreende um primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; e em que, (A) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (B) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (C) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84);
(D) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (E) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (F) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (G) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74); (H) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91); e (2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90);
(I) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-5 VL (SEQ ID NO:97); e (2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96); (J) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); (K) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (L) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); ou (M) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e
(2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86). E2. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E1, em que o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77); ou hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:92). E3. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E1 ou E2, em que o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82); ou hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:93). E4. A Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E3, em que o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208); hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76); hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86); hCD137 MAB-3 VH1F (SEQ ID NO:209); hCD137 MAB-3 VH1G (SEQ ID NO:210); or hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92). E5. A Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E4, em que o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de:
hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87); hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88); hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89); hCD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211); hCD137 MAB-3 VL5 (SEQ ID NO:212); hCD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213); hCD137 MAB-3 VL7 (SEQ ID NO:214); hCD137 MAB-3 VL8 (SEQ ID NO:215); hCD137 MAB-3 VL9 (SEQ ID NO:216); hCD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217); hCD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218); hCD137 MAB-3 VL12 (SEQ ID NO:219); hCD137 MAB-3 VL13 (SEQ ID NO:220); hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94); ou hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95). E6. A Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E5, em que o antígeno tumoral (TA) é selecionado do grupo de antígenos tumorais que consiste em: 19.9; proteína oncofetal 5T4; antígeno
4.2; A33; AFP; ALCAM; BAGE; beta-catenina; CA125; Carboxipeptidase M; B1; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD30; CD33; CD36; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD123; CD317; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CO-43; CO-514; CTLA-1; CTLA-4; Citoqueratina 8; Série E1; EGF-R; um Receptor de Efrina; Erb; F3; FC10.2; um GAGE GD2; GD3; GD49; GM2; GM3; GICA 19- 9; gp37; gp75; gp100; HER-2/neu; antígeno-CD20 de linfoma B humano; antígeno de glóbulo de gordura de leite humano; papilomavírus-E6 humano/papilomavírus-E7 humano; HMW-MAA; antígeno I; ITGB6; IL13Rα2; JAM-3; KID3; KID31; antígeno pan- carcinoma KS 1/4; KS 1/4; KSA; L6; L20; LEA; LUCA- 2; M1:22:25:8; M18; M39; um MAGE; MART; Myl; MUC-1; MUM-1; N-acetilglicosaminiltransferase; neoglicoproteína; NS-10; OFA-1; OFA-2; Oncostatina M; p15; PSA; PSMA; PEMA; PIPA; fosfato de ácido prostático; R24; ROR1; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn; peptídeo derivado de receptor de células T; TAG-72; TL5; receptor de TNF-α; receptor de TNF-ß; receptor de TNF-γ; TRA-1-85; Receptor de Transferrina; TSTA; e VEGF-R. E7. A Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E5, em que o antígeno tumoral (TA) é selecionado do grupo de antígenos tumorais da Tabela
1. E8. A Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E7, em que o antígeno tumoral (TA) é: HER2/neu, EphA2 ou5T4. E9. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E8, em que o antígeno tumoral (TA) é HER2/neu e em que a Molécula de Ligação a CD137 x TA compreende um segundo Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; e em que: o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63); e o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62). E10. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E9, em que: (A) (1) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67); (2) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou (3) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69); e (B) (1) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); (2) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou (3) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66). E11. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E10, em que o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66).
E12. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E10 ou E11, em que o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67); hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69). E13. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E8, em que o antígeno tumoral (TA) é 5T4 e em que a Molécula de Ligação a CD137 x TA compreende um segundo Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; e em que: (I) (A) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de 5T4 MAB-1 VL (SEQ ID NO:135); e (B) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de 5T4 MAB-1 VH (SEQ ID NO:134); ou (II) (A) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de 5T4 MAB-2 VL (SEQ ID NO:137); e (B) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de 5T4 MAB-2 VH (SEQ ID NO:136). E14. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E13, em que o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:135).
E15. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E13 ou E14, em que o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: MAB- 1 VH1 (SEQ ID NO:136). E16. A Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E15, em que a molécula é um diacorpo contendo Fc tetravalente biespecífico compreendendo uma primeira, uma segunda, uma terceira e uma quarta cadeias polipeptídicas, em que as cadeias polipeptídicas formam um complexo ligado covalentemente.
E17. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E16, em que o antígeno tumoral (TA) é HER2/neu e em que: (I) (A) a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:100; e (B) a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:101; ou (II) (A) a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:102; e (B) a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:103. E18. A Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E15, em que a molécula é biespecífica e tetravalente, e compreende uma primeira, uma segunda, uma terceira, uma quarta e uma quinta cadeias polipeptídicas, em que as cadeias polipeptídicas formam um complexo ligado covalentemente.
E19. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E15, em que o antígeno tumoral (TA) é HER2/neu e em que: (I) (A) a primeira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:104; (B) a segunda e a quinta cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105; (C) a terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:106; e (D) a quarta cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:107. ou (II) (A) a primeira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:104; (B) a segunda e a quinta cadeias polipeptídicas têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105; (C) a terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, ou SEQ ID NO:230; e (D) a quarta cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122, ou SEQ ID NO:123. E20. A Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E15, em que a dita molécula é biespecífica e trivalente, e compreende uma primeira, uma segunda, uma terceira e uma quarta cadeias polipeptídicas, em que as ditas cadeias polipeptídicas formam um complexo ligado covalentemente.
E21. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E20, em que o dito antígeno tumoral (TA) é HER2/neu e em que: a dita primeira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, ou SEQ ID NO:229; a dita segunda cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, ou SEQ ID NO:230; a dita terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:104; e a dita quarta cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105. E23. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E20, em que o dito antígeno tumoral (TA) é 5T4 e em que: a dita primeira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, ou SEQ ID NO:229; a dita segunda cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, ou SEQ ID NO:230; a dita terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:231; e a dita quarta cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:232. E24. Uma composição farmacêutica que compreende a Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E23, e um veículo fisiologicamente aceitável.
E25. Uso da Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E23, ou da composição farmacêutica da E24, no tratamento de uma doença ou condição associada a ou caracterizada pela expressão do antígeno tumoral (TA). E26. O uso da E25, em que a dita doença ou condição associada a ou caracterizada pela expressão do dito antígeno tumoral (TA) é câncer.
E27. Uma molécula de ligação a CD137 que compreende um Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; em que: (A) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (B) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84);
(C) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (D) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (E) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (F) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (G) (1) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74);
(H) (1) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91); e (2) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90); (I) (1) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-5 VL (SEQ ID NO:97); e (2) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96); (J) (1) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); (K) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (L) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); ou
(M) (1) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86). E28. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E27, em que o Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77); ou hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:92). E29. A Molécula de Ligação a CD137 x TA da E27 ou E28, em que o Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82); ou hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:93). E30. A Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E27-E29, em que o Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76); hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86); hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208); hCD137 MAB-3 VH1F (SEQ ID NO:209); hCD137 MAB-3 VH1G (SEQ ID NO:210); or hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92).
E31. A Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E27-E30, em que o Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87); hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88); hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89); hCD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211); hCD137 MAB-3 VL5 (SEQ ID NO:212); hCD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213); hCD137 MAB-3 VL7 (SEQ ID NO:214); hCD137 MAB-3 VL8 (SEQ ID NO:215); hCD137 MAB-3 VL9 (SEQ ID NO:216); hCD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217); hCD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218); hCD137 MAB-3 VL12 (SEQ ID NO:219); hCD137 MAB-3 VL13 (SEQ ID NO:220); hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94); ou hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95). E32. A Molécula de Ligação a CD137 de qualquer uma das E27-31, em que a molécula é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno deste.
E33. Uma composição farmacêutica que compreende a Molécula de Ligação a CD137 de qualquer um E27-E32, e um veículo fisiologicamente aceitável.
E34. Uso da Molécula de Ligação a CD137 de qualquer uma das E27-E31, ou da composição farmacêutica da E33, no tratamento de uma doença ou condição associada a um sistema imunossuprimido ou caracterizada pela expressão do dito antígeno tumoral (TA). E35. O uso da E34, em que a condição associada a um sistema imunossuprimido ou caracterizada pela expressão do antígeno tumoral (TA) é câncer.
E36. Uma Molécula de Ligação a anti-HER2/neu que compreende um Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; em que: o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63); e o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62). E37. A Molécula de Ligação a anti-HER2/neu da E36, em que: (A) (1) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67); (2) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou (2) o Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69); ou e
(B) (1) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); (2) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou (3) o Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66). E38. A Molécula de Ligação a HER2/neu da E337, em que o Domínio Variável de Cadeia Pesada compreende a sequência de aminoácidos de: hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66). E39. A Molécula de Ligação a anti-HER2/neu das E37- E38, em que o Domínio Variável de Cadeia Leve compreende a sequência de aminoácidos de: hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67); hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69). E40. A Molécula de Ligação a anti-HER2/neu de qualquer uma das E36-E39, em que a molécula é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno deste.
E41. Uma composição farmacêutica que compreende a Molécula de Ligação a HER2/neu de qualquer um E36- E40, e um veículo fisiologicamente aceitável.
E42. Uso da Molécula de Ligação a anti-HER2/neu de qualquer uma das E33-E37, ou da composição farmacêutica da E41, no tratamento de uma doença ou condição associada a ou caracterizada pela expressão de HER2/neu.
E43. O uso da E42, em que a condição associada a ou caracterizada pela expressão de HER2/neu é câncer.
E44. Um método de intensificação da atividade de um agente de alvo tumoral compreendendo a administração do dito agente de alvo tumoral em combinação com a Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E23, ou da composição farmacêutica da realização E24. E45. Um método de tratamento de uma doença ou condição associada a um sistema imunossuprimido ou caracterizada pela expressão de um antígeno tumoral (TA) compreendendo a administração, a um indivíduo que necessita da Molécula de Ligação a CD137 x TA de qualquer uma das E1-E23, ou da composição farmacêutica da E24. E46. O método da E45, em que a condição associada a um sistema imunossuprimido ou caracterizada pela expressão do antígeno tumoral (TA) é câncer.
E47. O método da E45 ou E46, compreendendo adicionalmente a administração de um agente de alvo tumoral.
E48. O método de qualquer uma das E44-E47, compreendendo adicionalmente a administração de um inibidor de checkpoint de PD-1/PD-L1. E49. O método da E44 ou E47, em que o dito agente de alvo tumoral é um anticorpo, um fragmento de ligação a epitopo de um anticorpo, ou um agente que faz a mediação da eliminação redirecionada de células T de uma célula-alvo.
E50. O método da E48 ou E49, em que o dito inibidor de checkpoint de PD-1/PD-L1 é um anticorpo anti-PD- 1 ou um anticorpo anti-PD-L1. E51. O método de quaisquer entre E48-E50, em que o dito inibidor de checkpoint de PD-1/PD-L1 compreende os Domínios VH e VL de um anticorpo selecionados a partir daqueles listados na Tabela 7: Tabela 7 Anticorpos PD-1 e PD- Referência/Fonte L1 CAS Reg.
No.:946414-94-4; WHO Drug Information, nivolumabe 2013, Recommended INN: List 69, 27(1):68-69 CAS Reg.
No.:1374853-91- 4; WHO Drug Information, pembrolizumabe 2014, Recommended INN: List 75, 28(3):407
Tabela 7 Anticorpos PD-1 e PD- Referência/Fonte L1 PD1-17; PD1-28; PD1- Patentes Norte- 33; PD1-35; e PD1-F2 americanas Nos.
7.488.802;
7.521.051 e
8.088.905; Publicação de Patente PCT WO 2004/056875 17D8; 2D3; 4H1; 5C4; Patentes Norte- 4A11; 7D3; e 5F4 americanas Nos.
8.008.449;
8.779.105 e
9.084.776; Publicação de Patente PCT WO 2006/121168 hPD-1.08A; hPD-1.09A; Patentes Norte- 109A; K09A; 409A; americanas Nos. h409A11; h409A16; 8.354.509; h409A17; Códon 8.900.587 e otimizado 109A; e 5.952.136; Códon otimizado 409A Publicação de Patente PCT WO 2008/156712
Tabela 7 Anticorpos PD-1 e PD- Referência/Fonte L1 1E3; 1E8; e 1H3 Publicação de Patente Norte- americana 2014/0044738; Publicação de Patente PCT WO 2012/145493 9A2; 10B11; 6E9; Publicação de APE1922; APE1923; Patente PCT WO APE1924; APE1950; 2014/179664 APE1963; e APE2058 GA1; GA2; GB1; GB6; Publicação de GH1; A2; C7; H7; SH-A4; Patente Norte- SH-A9; RG1H10; RG1H11; americana RG2H7; RG2H10; RG3E12; 2014/0356363; RG4A6; RG5D9; RG1H10- Publicação de H2A-22-1S; RG1H10-H2A- Patente PCT WO 27-2S; RG1H10-3C; 2014/194302 RG1H10-16C; RG1H10- 17C; RG1H10-19C; RG1H10-21C; e RG1H10- 23C2
Tabela 7 Anticorpos PD-1 e PD- Referência/Fonte L1 H1M7789N; H1M7799N; Publicação de H1M7800N; H2M7780N; Patente Norte- H2M7788N; H2M7790N; americana H2M7791N; H2M7794N; 2015/0203579; H2M7795N; H2M7796N; Publicação de H2M7798N; H4H9019P; Patente PCT WO H4xH9034P2; 2015/112800 H4xH9035P2; H4xH9037P2; H4xH9045P2; H4xH9048P2; H4H9057P2; H4H9068P2; H4xH9119P2; H4xH9120P2; H4Xh9128p2; H4Xh9135p2; H4Xh9145p2; H4Xh8992p; H4Xh8999p; e H4Xh9008p; mAb1; mAb2; mAb3; Publicação de mAb4; mAb7; mAb8; Patente Norte- mAb9; mAb10; mAb11; americana WO mAb12; mAb13; mAb14; 2016/0159905 mAb15; e mAb16
Tabela 7 Anticorpos PD-1 e PD- Referência/Fonte L1 246A10; 244C8; 413D2; Publicação de 393C5; 388D4; 413E1; Patente Norte- 244C8-1; 244C8-2; americana WO 244C8-3; 388D4-1; 2016/0319019 388D4-2; e 388D4-3 22A5; 6El; lODl, 4C1; Publicação PCT 7D3; 13Fl; 14A6; 15H5; No.
WO 5A8; 7A4; e versões 2016/014688 humanizadas destes 1E9; hlE9-l; hlE9-2; Publicação PCT hlE9-4; hlE9-5; 4B10; No.
WO h4Β10-1; h4Β10-2; 2016/077397 h4Β10-3; 1B10; 10B4; A09; C07; F09; G08; G10; H08; e H09 M136-M13-MHC723; m136- Publicação de M14-MHC724; m136-M19- Patente Norte- MHC725; m245-M3- americana WO MHC728; m245-M5- 2017/0044259 MHC729; A1.0; A1.6; Ba2; Bb2/C1.1; e D4
Tabela 7 Anticorpos PD-1 e PD- Referência/Fonte L1 PD-1 mAb 1; PD-1 mAb 2; Publicação PCT hPD-1 mAb 2; PD-1 mAb No.
WO 3; PD-1 mAb 4; PD-1 mAb 2017/019846 5; PD-1 mAb 6; PD-1 mAb (Particularmente 7; hPD-1 mAb 7; PD-1 as SEQ ID NOs: mAb 8; PD-1 mAb 9; hPD- 264 e 266) 1 mAb 9; PD-1 mAb 10; PD-1 mAb 11; PD-1 mAb 12; PD-1 mAb 13; PD-1 mAb 14; PD-1 mAb 15; hPD-1 mAb 15; e versões humanizadas destes; particularmente anti- PD-1 mAb (hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (Ρ) atezolizumabe CAS Reg No. 1380723-44-3; (WHO Drug Information, 2015, Recommended INN: List 74, 29(3):387
Tabela 7 Anticorpos PD-1 e PD- Referência/Fonte L1 durvalumabe CAS Reg No. 1428935-60-7; WHO Drug Information, 2015, Recommended INN: List 74, 29(3):393-394 avelumabe, MDX1105 CAS Reg No. 1537032-82-8; WHO Drug Information, 2016, Recommended INN: List 74, 30(1):100-101
Tabela 7 Anticorpos PD-1 e PD- Referência/Fonte L1 A09-188-1, e afinidade Publicação de maturada e variantes Patente PCT WO otimizadas: A09-204-1, 2013/079174 A09-211-1, A09-212-1, A09-213-1, A09-214-1, A09-215-1, A09-216-1 A09-219-1, A09-220-1, A09-221-1, A09-222-1 A09-223-1, A09-202-1, A09-248-2, A09-239-2, A09-240-2, A09-241-2, A09-242-2, A09-243-2, A09-244-2, A09-245-2, A09-246-2, e A09-247-2 1B9.2E11.2, Publicação de 4H1.G10.15, 1Α8, 1Ε4, Patente Norte- 8G2, 1D11, 3Α2, 3Β11, americana 3F4, 3Η6, 4C1, 4Ε1, US2015/0197571 5Α6, 9C12, 1Β4, 1Β11, 1F6, 1Η8, 1Η12, 2D5, 2Η11, 3D12, 4C8, 4C9, 5Ε10, 5Η4, 5Η5, 8Α1, 9G9, 10Α7, e 10Η6
Tabela 7 Anticorpos PD-1 e PD- Referência/Fonte L1 1D05, 84G09, 411Β08, Patente Norte- 411C04, 411D07, americana 386Η03, 386Α03, 9.617.338 385F01, 413D08, 413G05, 413F09, 414Β06 3G10,12Α4,10Α5, Publicação 5F8,10Η10, 1Β12, 7Η1, Norte-americana 11Ε6, 12Β7, e 13G4 2016/0075782 A1, C2, C4, H12, e H12- Publicação GL Norte-americana 2017/0319690; Publicação de Patente PCT WO 2016/111645 Ab- 14, Ab-16, Ab-22, Publicação de Ab-30, Ab-31, Ab-32, Patente PCT WO Ab-38, Ab-42, Ab-46, 2014/055897 Ab-50, Ab-52, Ab-55, Ab-56, e Ab-65.
Tabela 7 Anticorpos PD-1 e PD- Referência/Fonte L1 R2κA3, R2κA4, R2κA6, Publicação de R2κF4, R2κH5, R2κH6, Patente PCT WO R2κH3, sR3κA8, sR3κA9, 2015/109124 sR3κB2, sR3κB5, tccR3ΚA8, tccR3ΚAl1, tccR3ΚB7, tccR3ΚD9, tccΚF10, tctR3ΚA4, tctR3ΚF8, R2λΑ7, R2λΒ12, R2λ12, sR3λD7, sR3λE1, tccAF8, tccAD7, tctR3λH4, e outros Η2Μ8306Ν, Η2Μ8307Ν, Publicação de Η2Μ8309Ν, Η2Μ8310Ν, Patente PCT WO Η2Μ8312Ν, Η2Μ8314Ν, 2015/112805 Η2Μ8316Ν, Η2Μ8317Ν, Η2Μ8321Ν, Η2Μ8323Ν, Η2Μ8718Ν, Η2Μ8718Ν2, and Η2Μ8719Ν, Η1Η9323Ρ, Η1 Η9327Ρ, Η1 Η9329Ρ, Η1Η9336Ρ, Η1Η9344Ρ2, 1Η9345Ρ2, Η1Η9351Ρ2, Η1Η9354Ρ2, Η1 Η9364Ρ2, Η1Η9373Ρ2, Η1Η9382Ρ2, Η1Η9387Ρ2, e Η1Η9396Ρ2
Tabela 7 Anticorpos PD-1 e PD- Referência/Fonte L1 Mu333, Mu277, e Publicação de variantes humanizadas Patente PCT WO destes, inclusive: 2016/000619 hu333-2B, hu333-3A2, hu333-3C2 e hu333-3H2 ΒΑΡ058 e variantes Publicação de humanizadas destes, Patente PCT WO incluindo: ΒΑΡ058- 2016/061142 hum01, ΒΑΡ058-hum02, ΒΑΡ058-hum03, ΒΑΡ058- hum04, ΒΑΡ058-hum05, ΒΑΡ058-hum06, ΒΑΡ058- hum07, ΒΑΡ058-hum08, ΒΑΡ058-hum09, ΒΑΡ058- hum10, ΒΑΡ058-hum11, ΒΑΡ058-hum12, ΒΑΡ058- hum13, ΒΑΡ058-hum14, ΒΑΡ058-hum15, ΒΑΡ058- hum16, e ΒΑΡ058-hum17 332Μ1 e variantes Publicação de humanizadas destes, Patente PCT WO incluindo: 332Μ7, 2017/087547 332Μ72, e 332M8
E52. O uso de E26, E35, E42 ou o método de qualquer um dos E46-E51, em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em: leucemia mieloide aguda, tumor da glândula suprarrenal, câncer associado à
AIDS, sarcoma alveolar das partes moles, tumor astrocítico, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral e da medula vertebral, tumor cerebral metastático, câncer de mama, tumores do corpo carótido, câncer cervical, condrossarcoma, cordoma, carcinoma de células renais cromófobas, carcinoma de células claras, câncer de cólon, câncer colorretal, histiocitoma fibroso cutâneo benigno, tumor de células pequenas redondas desmoplásico, ependimoma, tumor de Ewing, condrossarcoma mixoide extra esquelético, fibrogênese óssea imperfeita, displasia fibrosa óssea, câncer da vesícula biliar ou duto biliar, câncer gástrico, doença trofoblástica gestacional, tumor de células germinativas, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, glioblastoma, tumor de células de ilhota, sarcoma de Kaposi, câncer renal, leucemia, lipoma/tumor lipomatoso benigno, lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, câncer hepático, linfoma, câncer de pulmão, meduloblastoma, melanoma, meningioma, mesotelioma maligno, neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, câncer pulmonar de células não pequenas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de faringe, carcinoma tireoide papilar, tumor da paratireoide, câncer pediátrico, tumor da bainha nervosa periférica, feocromocitoma, tumor hipofisário, câncer da próstata, melanoma uveal posterior, distúrbio hematológico raro, carcinoma de células renais, câncer renal metastático, tumor rabdoide, rabdomiossarcoma, sarcoma, câncer cutâneo, sarcoma de tecidos moles, câncer espinocelular, câncer de estômago, sarcoma sinovial, câncer de testículo, carcinoma tímico, timoma, câncer metastático de tireoide e câncer de útero. E53. O uso de E26, E35, E42 ou o método de qualquer uma das E46-E51, em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em: câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer gástrico, glioblastoma, câncer renal, câncer de pulmão, melanoma, neuroblastoma, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de faringe, câncer de próstata, carcinoma de célula renal, rabdomiossarcoma e câncer espinocelular de cabeça e pescoço (SCCHN).
EXEMPLOS
[476] Os exemplos a seguir ilustram os diversos métodos para composições nos métodos diagnósticos ou de tratamento da invenção. Os exemplos pretendem ser ilustrativos, porém não limitar, o escopo da invenção. Exemplo 1 A Humanização de HER2 MAB-1
[477] A Publicação PCT WO 2001/036005 revela um anticorpo anti-HER2/neu, ali designado como “8H11”, no entanto, as sequências dos Domínios VL e VH ali providas são imprecisas. O anticorpo 8H11 se liga a um epitopo de HER2/neu que é diferente do epitopo ligado por trastuzumabe, margetuximabe e pertuzumabe.
[478] As sequências corretas para os Domínios VH e VL do anticorpo anti-HER2/neu 8H11 foram deduzidas (para assim prover HER2-MAB-1 VH (SEQ ID NO:60) e HER2-MAB-1 VL (SEQ
ID NO:61)), e diversos ciclos de humanização foram então realizados a fim de se obter o Domínio VH humanizado descrito acima “hHER2 MAB-1 VH1” (SEQ ID NO:64) e o Domínio VL humanizado “hHER2 MAB-1 VL1” (SEQ ID NO:67). No decorrer destes esforços, diversas potenciais obrigações da sequência foram identificadas nos Domínio hHER2 MAB-1 VH1 e hHER2 MAB-1 VL1, e foram realizadas substituições que removeram estas obrigações enquanto mantinha a afinidade de ligação. Especificamente: (1) um sítio de isomerização de ácido aspártico foi identificado na posição Kabat 96 do Domínio hHER2 MAB-1 VH1, sendo corrigido tanto pela substituição de D96E quanto pela substituição de G97I, como em hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65) e hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66), respectivamente; (2) um potencial sítio de deamidação de asparagina foi identificado na posição Kabat 30 do Domínio hHER2 MAB-1 VL1 e foi corrigido tanto por substituição de N30S quanto pela substituição de S31T, como em hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69) e hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68), respectivamente; (3) potencial sítio de isomerização de ácido aspártico foi identificado na posição Kabat D56 do Domínio hHER2 MAB-1 VL1 e foi corrigido por uma substituição: V55Q, D56E ou D56S, como em hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69) e hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68).
[479] Os domínios variáveis de cadeia leve e pesada humanizados de hHER2 MAB-1 podem ser usados em qualquer combinação e as combinações particulares de cadeias humanizadas são indicadas por referência aos Domínios VH/VL específicos. Por exemplo, um anticorpo humanizado que compreende hHER2 MAB-1 VH1 e hHER2 MAB-1 VL3 é indicado aqui como “hHER2 MAB-1 (1.3)”.
[480] As variantes humanizadas foram selecionadas por apresentarem afinidade de ligação melhorada em comparação ao anticorpo parental murino e, como descrito, podem ser projetadas ainda para eliminar as obrigações de sequência (por exemplo, sítios de isomerização e deamidação) como descrito acima. A afinidade de ligação de diversas combinações de Domínios VH e VL humanizados foi examinada por BIACORE®. Assim, uma porção extracelular de HER2 humana fundida a um peptídeo contendo histidina (“huHER2”) foi passada sobre uma superfície revestida com anticorpo imobilizado. Resumidamente, cada molécula teste foi capturada em uma superfície revestida com FC anti-humana carpina F(ab)2 e então incubadas na presença de diferentes concentrações (6,25 nM - 50 nM) de huHER2. A cinética de ligação foi determinada por ligação de análise BIACORE® (modelo de ligação Langmuir 1:1 normalizado). Os valores calculados de ka, kd e KD a partir desses estudos são apresentados na Tabela 8. Tabela 8 A V V k k K nticorpo H L a (M-1s-1) d (s-1) D (nM) H m m 5 6 1 ER2 MAB-1 urino urino ,1 x 105 ,54 x 10- ,27 4 h 1 2 6 2 0 HER2 MAB-1 ,2 x 105 ,80 x 10- ,45 (1.2) 4 h 1 3 6 2 0 HER2 MAB-1 ,18 x 105 ,23 x 10- ,36 4 (1.3)
[481] Em um estudo separado, as cinéticas de ligação do diacorpo biespecífico de CD137 x TA, DART-B (descrito acima), foram determinadas quanto a ligação a HER2 humano e HER2 de macaco Cynomolgus, essencialmente como descrito acima. Os valores calculados de ka, kd e KD a partir desses estudos são apresentados na Tabela 9. Tabela 9 HER2/ne ka kd KD u (M-1s-1) (s-1) (nM) Humana 4,8 1,8 0,3 x 105 2 x 10-4 8 Macaco 4,4 2,9 0,6 Cynomolgus 4 x 105 4 x 10-4 6 Exemplo 2 O Isolamento e caracterização de anti-CD137 murino mAbs
[482] Um painel de anticorpos monoclonais murinos específicos para CD137 humano foi testado quanto a anticorpos que apresentam alta afinidade de ligação. Três anticorpos foram selecionados para estudo adicional. Para estas avaliações, células T pan purificadas (vide acima) foram estimuladas com grânulos anti-CD3/CD28 (células : grânulos=1:1) por 72 horas na presença de IL-2 (100 U/mL). Adicionaram-se 100 μL de células T ativadas (1,0 x 106 células/mL) e 100 μL de artigo teste (anticorpo ou diacorpo biespecífico) serialmente diluído (diluições de 5 ou 10 vezes) a cada poço da(s) lâmina(s) de ensaio de microtitulação,
misturados e incubados em temperatura ambiente por 45 min. As células foram enxaguadas com Tampão FACS e o anticorpo secundário (APC de Região Fc anti-humana) foi então adicionado a cada poço, misturado e incubado em temperatura ambiente por 30 min. As células foram então enxaguadas com Tampão FACS e os anticorpos de marcador de superfície de células T (anti-CD4 rotulado com V510, e anti-CD8 rotulado com FITC) foram então adicionados a cada poço, misturados e incubados em temperatura ambiente por 30 min. As células foram então enxaguadas e novamente suspensas em 100 μL de Tampão FACS e analisadas por citometria de fluxo (BD LSR Fortessa ou FACSCanto ll) para coleção de evento celular. A análise dos dados foi realizada por FloJo v10.
[483] Descobriu-se que dois destes anticorpos selecionados, CD137 MAB-3 e CD137 MAB-4, apresentavam forte ligação a CD137 humano e eram capazes de bloquear a ligação entre CD137 e seus ligantes naturais. O terceiro destes anticorpos selecionados, CD137 MAB-5, apresentou menor ligação a CD137 humano e não foi capaz de bloquear a ligação entre CD137 e seus ligantes naturais.
[484] Os anticorpos quiméricos que apresentam Regiões Fc de IgG1 humano e Domínios VH/VL murinos foram gerados (designados: chCD137 MAB-1, chCD137 MAB-2, chCD137 MAB-3, chCD137 MAB-4 e chCD137 MAB-5, respectivamente), e foram testados quanto à sua capacidade de se ligar a células T CD8+ ativadas. Como mostrado na Figura 7, os anticorpos selecionados apresentaram uma variação de afinidade de ligação.
[485] A seleção de epitopo foi realizada por estudos de competição cruzada. Os resultados destes e dos estudos de competição de ligação a ligante indicam que:
(1) CD137 MAB-2, CD137 MAB-3 e CD137 MAB-4 competem com CD137L pela ligação a CD137, mas que CD137 MAB-2 reconhece um epitopo de CD137 diferente do epitopo reconhecido por CD137 MAB-1, CD137 MAB-3, CD137 MAB-4 e CD137 MAB-5; (2) CD137 MAB-1 e CD137 MAB-5 não compete com CD137L pela ligação a CD137; (3) CD137 MAB-3 e CD137 MAB-4 apresentam competição com CD137 MAB-1, mas se ligam a um epitopo diferente, conforme demonstrado por sua capacidade de competir pela ligação a ligante; (4) CD137 MAB-5 reconhece um epitopo diferente dos epitopos reconhecidos por CD137 MAB-1, CD137 MAB-2, CD137 MAB- 3 ou CD137 MAB-4.
[486] Os anticorpos quiméricos também foram testados quanto à sua capacidade de induzir liberação de citocina (por exemplo, IFN-γ, TNF-α) a partir das células T (ou seja, sua atividade agonista) na ausência de ligante. Para estas avaliações, as células T pan purificadas (vide acima) foram novamente suspensas em meio de ensaio e colocadas em uma incubadora de cultura tecidual de um dia para o outro. As células-alvo tumorais (inclusive JIMT-1, N87) foram obtidas a partir da cultura. Após enxague, os grânulos de células foram novamente suspensos em meio de cultura à densidade celular de 1,0 x 105 células/mL. Adicionaram-se então 104 células a cada poços de lâmina de ensaio de fundo plano branco colocada em uma incubadora de cultura tecidual de um dia para o outro. No dia seguinte as células T pan humanas repousadas foram medidas quanto a densidade e viabilidade de exclusão de azul tripano usando um contador de Células Beckman Coulter Vi e ajustadas para uma densidade de 2 x 106 células/mL. As células-alvo tumorais pré-cultivadas na lâmina foram enxaguadas uma vez com um meio de ensaio.
[487] Para os ensaios de liberação de citocina: 50 µL do artigo teste serialmente diluído (anticorpos (+/- reticulação com Fc anti-humano (Fab)’2), diacorpos, moléculas trivalentes etc.), 50 µL de Dynabead αCD3 pré-enxaguada (REF 11151D; Invitrogen por Thermo Fisher Scientific) a 2 x 106 grânulos/mL, 50 µL/poço de células T pan humanas a 2 x 106 células/mL, e 50 µL do meio de ensaio isoladamente ou contendo 1,6 µg/mL de αCD28 (Cat.: 555725; BD Pharmigen) foram adicionados a cada poço da lâmina de ensaio. O volume final de cada poço na lâmina foi de 200 µL. Para aqueles poços controle que não continham o artigo teste ou grânulos αCD3, o meio de ensaio foi adicionado criar o volume total de 200 µL e as lâminas foram incubadas por 72 horas em uma incubadora de cultura tecidual. Os sobrenadantes foram então coletados de cada poço e as citocinas liberadas de IFN-γ, TNF-α e IL-2R foram medidas usando um Kit de Citocina ELISA da R&D System (IL-2 Humano DuoSet ELISA (Cat.: DY202), IFN-gama Humano DuoSet ELISA (Cat.: DY285) e TNF-alfa humano DuoSet ELISA (Cat.: DY210) ou reagentes comerciais similares. Os métodos ELISA foram providos com os kits. O Microsoft Excel e SoftMax Pro foram usados para análise de dados para extrapolar os níveis de citocina, os quais foram representados com Prism.
[488] Como mostrado na Figura 8, CD137 MAB-1, chCD137 MAB-3 e chCD137 MAB-4 apresentaram, cada um, forte atividade agonista, CD137 MAB-2 apresentou menos atividade agonista e CD137 MAB-5 não apresentou atividade agonista na ausência de ligante.
[489] Os anticorpos quiméricos chCD137 MAB-3 e chCD137 MAB-4 também foram testados quanto à sua capacidade de induzir liberação de citocina (por exemplo, IFN-γ, TNF-α) a partir de células T pan na ausência e presença de ligante e/ou células-alvo. As células T pan humanas foram purificadas a partir de PBMC de doador usando Kit de Células T Humanas Dynabeads Untouched (Invitrogen Cat. No. 11344D) conforme protocolo do fabricante. Os resultados para liberação de IFN- γ são mostrados na Figura 9. A Figura 9 mostra a indução de IFN-γ por células T pan 72 horas após estimulação com grânulos revestidos com CD3 na presença ou ausência de 1 µg/mL de anticorpos quiméricos anti-CD137 (chCD137 MAB-3 ou chCD137 MAB-5), e na presença ou ausência de 1 µg/mL de CD-137L-His e 4 µg/mL de hFc F(ab)’2. A figura mostra que IFN-γ foi induzido na presença ou ausência de CD137-His e que observou-se maior indução com JIMT-1/células T pan em relação àquela observada com células T pan isoladamente. Foram observados resultados similares para TNF-α.
[490] Na presença de células T e células-alvo, ou células T isoladamente, chCD137 MAB-3 apresentou forte atividade agonista, que foi similar na presença ou ausência de ligante. Em contraste, chCD137 MAB-5 apresentou atividade agonista mínima na ausência de ligante e uma atividade agonista fortemente potencializada na presença de ligante. Exemplo 3 A Humanização de Anti-CD137 mAbs Murino
[491] Os anticorpos CD137 MAB-3 e CD137 MAB-4 foram selecionados para humanização. Foram realizados quatro ciclos de humanização para CD137 MAB-3, os quais produziram um Domínio VH humanizado, designado como “hCD137 MAB-3 VH1” (SEQ
ID NO:76), e três Domínios VL humanizados, designados como “hCD137 MAB-3 VL1” (SEQ ID NO:87), “hCD137 MAB-3 VL2” (SEQ ID NO:88) e “hCD137 MAB-3 VL3” (SEQ ID NO:89).
[492] Foram realizados três ciclos de humanização para CD137 MAB-4, os quais produziram um Domínio VH humanizado, designado como “hCD137 MAB-4 VH1” (SEQ ID NO:92), e dois Domínios VL humanizados, designados como “hCD137 MAB-4 VL1” (SEQ ID NO:94) e “hCD137 MAB-4 VL2” (SEQ ID NO:95).
[493] Os Domínios Variáveis de Cadeia Leve e Pesada humanizados de um anticorpo anti-CD137 em particular (por exemplo, CD137 MAB-3) podem ser usados em qualquer combinação e as combinações particulares de cadeias humanizadas são indicadas por referência aos Domínios VH/VL específicos, por exemplo, um anticorpo humanizado que compreende hCD137 MAB-3 VH1 e hCD137 MAB-3 VL3 é indicado aqui como “hCD137 MAB-3 (1.3)”.
[494] As afinidades de ligação dos anticorpos quiméricos possuem Domínios Variáveis murinos e os anticorpos totalmente humanizados foram examinados por Biacore.
[495] Assim, uma porção extracelular de CD137 humana fundida a um peptídeo contendo histidina (“huCD137”) foi passada sobre uma superfície revestida com anticorpo imobilizado. Resumidamente, cada molécula teste foi capturada na superfície revestida com Fc anti-humano caprino F(ab)2 e então incubada na presença de diferentes concentrações (25 nM e 100 nM) de huCD137. A cinética de ligação foi determinada por ligação de análise BIACORE® (modelo de ligação Langmuir 1:1 normalizado). Os ka, kd e KD calculados a partir destes estudos são apresentados na Tabela 10 e mostram que os mAbs humanizados apresentaram aproximadamente uma redução de 2 vezes na afinidade de ligação em relação aos anticorpos murinos. Tabela 10 Anticorpo VH VL ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (nM) chCD137 MAB-3 murino murino 8,9 x 105 0,020 23 chCD137 MAB-3 1 1 6,7 x 105 0,031 46 (1.1) chCD137 MAB-3 1 2 6,1 x 105 0,030 49 (1.2) chCD137 MAB-3 (1.3 1 3 6,6 x 105 0,033 50 5 -4 chCD137 MAB-4 murino murino 1,5 x 10 9,2 x 10 6,1 chCD137 MAB-4 1 1 1,3 x 105 2,1 x 10-3 16,2 (1.1) chCD137 MAB-4 1 2 1,4 x 105 1,9 x 10-3 13,6 (1.2) Exemplo 4 Caracterização de Moléculas de Ligação a CD137 x TA
[496] Conforme descrito acima, foram geradas diversas Moléculas de Ligação a CD137 x TA exemplificadoras capazes de ligação a CD137 e ao TA exemplificador, HER2/neu. Em particular, foram gerados seis diacorpos biespecíficos (designados “DART-A”, “DART-B”, “DART-C”, “DART-D”, “DART-E” e “DART-G”) compreendendo Domínios CD137 MAB-3 ou hCD137 MAB- 3, um diacorpo biespecífico (designado “DART-F”) compreendendo Domínios CD137 MAB-4, dois diacorpos biespecíficos (designados “DART-1” e “DART-4”) compreendendo Domínios CD137 MAB-1, e dois diacorpos biespecíficos (designados “DART-2” e “DART-5”) compreendendo Domínios CD137 MAB-2, cada um compreendendo Domínios hHER2 MAB-1. DART-A, DART-B, DART-C, DART-1 e DART-2 apresentam a estrutura geral mostrada na Figura 3B (DART-A, DART-B, DART-1 e DART-2 apresentam a estrutura geral mostrada na Figura 3E; DART-C possui a estrutura mostrada na Figura 3D). DART-D, DART-E, DART-F, DART-G, DART-4 e DART-5 possuem a estrutura geral mostrada na Figura 5A (DART-D, DART-F, DART-
G, DART-4 e DART-5 possuem a estrutura mostrada na Figura 5B; DART-E possui a estrutura mostrada na Figura 5C).
[497] Outra Molécula de Ligação a CD137 x TA exemplificador capaz de ligação a CD137 e ao TA exemplificador, EphA2 (designado “DART-7”) foi gerada. DART-7 é um diacorpo biespecífico que possui a estrutura apresentada na Figura 3B, compreendendo os Domínios humanizados de CD137 MAB-1, EphA2 MAB-3.
[498] Além disso, foram geradas três moléculas controle, “DART-3”, que compreendem hHER2 MAB-1 e Domínios de palivizumabe variante (HER2 x RSV), “DART-6”, compreendendo palivizumabe variante e domínios de CD137 MAB-3 (RSV x CD137), e “DART-8”, compreendendo os Domínios de EphA2 MAB-3 humanizado e palivizumabe variante (EphA2 x RSV).
[499] As Moléculas de Ligação a CD137 x TA que possuem dois sítios de ligação a CD137 e 2 sítios de ligação a HER2/neu, e a molécula controle CD137 x RSV (DART-6) ligada a CD137 apresentam-se na superfície de células T ativadas. Em contraste, a molécula controle HER2/neu x RSV (DART-3) não apresenta qualquer ligação. DART-1 apresentou a maior ligação e DART-5 apresentou a menor ligação neste ensaio, com as moléculas restantes testadas (DART-B, DART-C, DART-D, DART-E, DART-F, DART-2, DART-4 e DART-6) apresentando ligação comparável (Figura 10). As posições relativas dos domínios de ligação a HER2/neu e CD137 apresentaram impacto mínimo ou ausente na ligação a CD137 neste ensaio para moléculas que possuem a estrutura apresentada na Figura 3B (comparar DART- B/DART-C) ou a estrutura apresentada nas Figuras 5B-5C (comparar DART-D/DART-E).
[500] Do mesmo modo, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA foram avaliadas quanto à sua capacidade de se ligar a HER2/neu presente na superfície de células-alvo de câncer gástrico N87 (Figuras 11A-11B). A molécula controle RSV x CD137 (DART-6) não apresentou nenhuma ligação. As posições relativas dos domínios de ligação a HER2/neu e CD137 apresentaram impacto mínimo a ausente sobre a ligação a HER2/neu neste ensaio para moléculas que possuem a estrutura apresentada na Figura 3B (comparar DART-B/DART-C). Em contraste, DART-E apresentou ligação a HER2/neu em comparação a DART-D, sugerindo que pode haver uma efeito posicional na ligação a HER2/neu para moléculas que apresentam a estrutura apresentada nas Figuras 5B-5C, ou que a ligação mediada por domínios de ligação a HER2/neu de hHER2 MAB-1 (1.3) em particular apresenta um efeito posicional.
[501] As Moléculas de Ligação a CD137 x TA, DART- B, DART-D, DART-G e as moléculas controle DART-3 e DART-6 foram avaliadas adicionalmente quanto à sua ligação a CD137 expresso por células CHO (Figura 12A) e células T ativadas (Figura 12B).
[502] As Moléculas de Ligação a CD137 x TA, DART- B, DART-D, DART-G e as moléculas controle DART-3 e DART-6 foram avaliadas adicionalmente quanto à sua ligação a HER2/neu expresso nas células N87 (Figura 13A) e células JIMT-1 (Figura 13B). Para esta avaliação, foram adicionados 100 μL de células- alvo que expressam HER2/neu (1,0 x 106 células/mL) e 100 μL do artigo teste (diacorpo biespecífico) serialmente diluído (diluições de 5 ou 10 vezes) a cada poço de lâmina(s) de ensaio microtitulação, misturados e incubados em temperatura ambiente durante 45 min. As células foram enxaguadas com Tampão FACS e o anticorpo secundário (APC de Região Fc anti-humana) foi então adicionado a cada poço, misturado e incubado em temperatura ambiente por 30 min. As células foram então enxaguadas e novamente suspensas em 100 μL de Tampão FACS e analisadas por citometria de fluxo (BD LSR Fortessa ou FACSCanto ll) para coleção de evento celular. A análise dos dados foi realizada por FloJo v10. As Moléculas de Ligação a HER2 x CD137 que possuem a estrutura apresentada na Figura 3B apresentaram ligação discretamente melhor a HER2/neu que aquelas que possuem a estrutura apresentada nas Figuras 5A-5C (comparar DART- B/DART-D). A molécula controle RSV x CD137 (DART-6) não apresentou nenhuma ligação. Os diacorpos biespecíficos CD137 x TA que possuem um sítio de ligação a CD137 humanizado ou murino apresentaram ligação similar a HER2/neu (comparar DART- D/DART-G).
[503] As Figuras 14A-14B proveem os resultados de um primeiro ensaio representativo da capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA mediarem uma atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocinas em células T (realizado essencialmente conforme descrito no Exemplo 2 acima, e exemplificado pela liberação de IFN-γ) na presença ou ausência de células-alvo que expressam o TA exemplificador, HER2/neu. As Figuras mostram os resultados para DART-1, DART-2, DART-3, DART-4, DART-5, DART-6, DART-A, DART-D, DART-E e DART-F testados (usando os protocolos descritos acima) na presença de N87 (3+) que expressam HER2/neu (Figura 14A) ou células-alvo JIMT-1 (2+) (Figura 14B), células- alvo Hs700T HER2/neu-negativas ou ausência de células-alvo. Os resultados mostram que as moléculas de controle, DART-3 e DART- 6, não apresentaram atividade coestimulatória. As Moléculas de Ligação a CD137 x TA não apresentaram nenhuma atividade coestimulatória observável na ausência de células-alvo ou com células-alvo HER2/neu-negativas. DART-D e DART-F, que compreendem novos anticorpos anti-CD137 (CD137 MAB-3 e MAB-4, respectivamente), apresentaram a mais elevada atividade coestimulatória na presença de linhagem de células-alvo. DART- E (que compreende domínios de HER2/neu e CD137 invertidos) apresentou a menor atividade coestimulatória, particularmente na presença de células-alvo N87. Foram observados padrões similares com IL-2 e TNF-α.
[504] As Figuras 15A-15B proveem os resultados de um segundo ensaio representativo da capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA mediarem a atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocinas em células T (realizado essencialmente conforme descrito no Exemplo 2 acima e exemplificado pela liberação de IFN-γ). As Figuras mostram resultados para DART-1, DART-2, DART-3, DART- 4, DART-5, DART-6, DART-B, DART-D e DART-G testados (usando os protocolos acima descritos) na presença de células-alvo N87 que expressam HER2/neu (Figura 15A) ou JIMT-1 (Figura 15B), células-alvo Hs700 T HER2/neu-negativas ou ausência de células-alvo.
[505] Os resultados mostram que as moléculas de controle, DART-3 e DART-6, não apresentaram atividade coestimulatória. As Moléculas de Ligação a CD137 x TA não apresentaram nenhuma atividade coestimulatória observável na ausência de células-alvo ou com células-alvo HER2/neu- negativas. DART-D e DART-G, que compreendem o novo anticorpo anti-CD137, CD137 MAB-3 (murino e humanizado, respectivamente) apresentaram a mais elevada atividade coestimulatória na presença de linhagem de células-alvo. DART-G apresentou a mais elevada atividade coestimulatória, apesar de apresentar ligação discretamente menor para CD137 expresso na superfície celular. Como detalhado acima, DART-B e DART-G compreendem os mesmos sítios de ligação a HER2 e CD137, porém possuem as estruturas mostradas nas Figura 3B e Figura 5B, respectivamente. DART-G apresentou atividade coestimulatória mais elevada que DART-B na presença de linhagem de células- alvo.
[506] A Molécula de Ligação a CD137 x TA, DART- G, e as moléculas controle, DART-3 e DART-6, foram avaliadas adicionalmente quanto à sua capacidade de mediarem a transdução de sinal de células T dependente da dose da via NF/κB em uma linhagem celular relatora que expressa CD137 (Jurkat-NF-κB- Luc) na presença de células-alvo positivas ou negativas para o TA exemplificador, HER2/neu. Resumidamente, as células relatoras Jurkat-NF-κB-Luc que superexpressam CD137 foram co- cultivadas com células JIMT-1 que expressam HER2/neu (Figura 16A) ou células KG-1 HER2/neu-negativas (Figura 16B) na presença de concentrações crescentes de DART-G, DART-3 ou DART-
6. Após a incubação, mediu-se a transdução de sinal por unidade de luz relativa (RLU) de luminescência conforme a leitura. Os resultados mostram que as Moléculas de Ligação a CD137 x TA, como DART-G, fazem a mediação da transdução de sinal de células T dependente de dose que é dependente da presença de células- alvo que expressam TA.
[507] A Molécula de Ligação a CD137 x TA, DART- A, e as moléculas controle, DART-3 e DART-6, foram adicionalmente avaliadas quanto à sua capacidade de mediarem a proliferação potencializada de células T na presença de células que expressam diferentes níveis do TA exemplificador,
HER2/neu. Resumidamente, as células T humanas rotuladas para CFSE ± estimulação subideal de αCD3/αCD28 foram co-cultivadas com células-alvo N87 com HER2/neu elevado (Figura 17, Painéis A-C e J-K), células-alvo MCF-7 com HER2/neu baixo (Figura 17, Painéis D-F e L-M), ou foram cultivadas isoladamente (Figura 17, Painéis G-I e N-O) na presença de DART-A (Figura 17, Painéis A, D e G), DART-3 (Figura 17, B, E e H), DART-6 (Figura 17, Painéis C, F e I), ou nenhuma molécula (Figura 17, Painéis J, L e N) e monitoradas quanto à proliferação de células T. Os resultados mostram que as Moléculas de Ligação a CD137 x TA, como DART-A, potencializam a proliferação do sinal de células T. Estas proliferações potencializadas de células T é dependente de expressão de TA e se correlaciona aos níveis de expressão de TA.
[508] Margetuximabe é um anticorpo monoclonal anti-HER2/neu otimizado para Fc que pode induzir a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo potencializado após ligação à célula alvo tumoral. Como observado acima, HER2 MAB-1 se liga a um epitopo de HER2/neu que é diferente daquele ligado por margetuximabe. A atividade de aniquilação de célula-alvo do anticorpo anti-TA margetuximabe foi examinada em combinação com a Molécula de Ligação a CD137 x TA DART-1 ou a molécula controle DART-3 (HER2 x RSV). Resumidamente, as células-alvo N87 que foram projetadas para expressarem o gene relator de luciferase (luc) (N87/GFP/células Luc) foram incubadas com células efetoras NK purificadas (a uma proporção de efetora:alvo (E:T) de 2:1, concentrações crescentes de margetuximabe em combinação com uma concentração fixa (0,1 μg/mL) de DART-1 ou DART-3 durante 72 horas, e a citotoxicidade foi determinada por ensaio de luminescência (LUM) que mede a atividade de luciferase celular das células-alvo com unidade de lux relativa (RLU) de luminescência, conforme leitura (Figura 18A). Além disso, as células NK (CD3-/CD56+) deste ensaio foram avaliadas quanto à expressão do marcador de ativação, CD69 (Figura 18B). Os resultados deste estudo demonstraram que a Molécula de Ligação a CD137 x TA DART-1 potencializaram a atividade de ADCC mediada por margituximabe contra células-alvo N87/Luc, e supraregulação de CD69 mediada por margituximabe nas células NK em comparação à molécula controle que possui apenas ligação a HER2/neu.
[509] A capacidade de uma Molécula de Ligação a CD137 x TA designada “DART-7”, a qual se lista ao TA ilustrativo EphA2 para mediar uma atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocinas em células T (realizado essencialmente conforme descrito no Exemplo 2 acima e exemplificado pela liberação de IFN-γ) foi medida. A Molécula de Ligação a CD137 x TA DART-7 e a molécula controle DART-8 foram testadas (usando os protocolos descritos acima) na presença de células-alvo Hs700T que expressam EphA2 (Figura 19A) ou células-alvo Hs700T EphA2-negativas (EphA2.KO) (Figura 19B) ou nenhuma célula-alvo. Os resultados mostram que a Molécula de Ligação a CD137 x TA DART-7 apresentou atividade coestimulatória na presença de células que expressam EphA2, mas não apresentou nenhuma atividade coestimulatória observável na ausência de células-alvo ou com células-alvo EphA2-negativas. A molécula controle, DART-8, não apresentou nenhuma atividade coestimulatória.
[510] A atividade coestimulatória de Moléculas de Ligação a CD137 x TA nas populações de células T foi examinada pela avaliação da fração de células T da Memória Central (Tcm) e Células T da Memória Efetora (Tem). Resumidamente, as células T humanas foram co-cultivadas com células-alvo Colo205 de adenocarcinoma do cólon positivas para EphA2 durante 5 dias em condições de estimulação subideais na presença da Molécula de Ligação a CD137 x TA DART-7 ou de moléculas controle DART-8 ou DART-6. Após co-cultura, a porcentagem de células Tcm (CCR7+CD45RA-) e Tem (CCR7-CD45RA-) foi determinada nos subconjuntos de fechados de CD4+ e CD8+. Os resultados, resumidos na Tabela 11, mostram que há um aumento substancial na fração dos tipos de células CD8+ Tcm e Tem e que este aumento exige a ligação tanto a CD137, quanto ao TA (por exemplo, EphA2). Estes resultados indicam que as Moléculas de Ligação a CD137 x TA induzem um aumento substancial na fração de células CD8+ Tcm e Tem na presença das células apropriadas que expressam antígeno tumoral. O agonismo de células T direcionadas apresentado pelas Moléculas de Ligação a CD137 x TA pode oferecer uma oportunidade de induzir a ativação de CD137 ancorado em células tumorais, limitando a ativação de células imunológicas sistêmicas e efeitos colaterais relacionados. Tabela 11 CD4+ Classificado CD8+ Classificado Tratamento Tcm (%) Tem (%) Tcm (%) Tem (%) (CCR7+CD45RA-) (CCR7-CD45RA-) (CCR7+CD45RA-) (CCR7-CD45RA-) DART-7 50,1 17,7 20,5 38,6 DART-8 44,8 10,4 6,10 23,5 DART-6 44,4 9,95 6,67 25,2
[511] Além disso, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA que possuem um sítio de ligação para CD137 e um ou mais sítios de ligação para HER2/neu (vide, por exemplo, Figuras
4A, 5A e 6A) foram construídas e testadas. Estas moléculas são monovalentes para CD137 e apresentaram ligação reduzida às células T ativadas, conforme esperado em vista de sua avidez reduzida. Estas moléculas apresentaram uma variação de ligação às células-alvo N87. No entanto, nenhuma das moléculas monovalente para CD137 apresentaram qualquer atividade coestimulatória no ensaio de liberação de citocinas em células T. Esta observação sugere que pelo menos dois sítios de ligação a CD137 podem ser necessários para a atividade coestimulatória nestes ensaios. Exemplo 5 Otimização de CD137 MAB-3 Humanizado
[512] Como observado acima, a humanização de CD137 MAB-3 resultou em aproximadamente uma perda de duas vezes na afinidade de ligação (vide, por exemplo, Tabela 9 acima). Utilizou-se otimização para identificar clones de CD137 MAB-3 humanizado que possuem afinidade de ligação similar ou melhor que o anticorpo parental murino. Resumidamente, usou-se mutagênese randômica para introduzir substituições nos Domínios de Cadeia Pesada CDRH3 (posições Kabat 99 a 102) de hCD137 MAB-3 (1.3). Três ciclos de triagem de seleção que usam rigor crescente foram usados para identificar clones que possuem ligação potencializada a CD137. Foram selecionados 48 clones a partir dos ciclos 2 e 3, e foram avaliados como diacorpos (tendo a estrutura mostrada na Figura 5B) para afinidade. A Tabela 12 provê um alinhamento da sequência de aminoácidos de resíduos de CDRH3 Kabat 99 a 102 a partir dos quatro clones selecionados para ligação potencializada a hCD137. Tabela 12
ID do SEQ CDRH3 CDRH3 Clone ID NO. (Kabat 99-102) SEQ ID NO. do Clone hCD137 76 SYSFDY 160 MAB-3 VH1 hCD137 83 AYSFHP 78 MAB-3 VH1A hCD137 84 AYSMST 79 MAB-3 VH1B hCD137 85 AYSYSL 80 MAB-3 VH1C hCD137 86 SYSYNV 81 MAB-3 VH1D
[513] As sequências de aminoácidos destes clones foram incorporadas no diacorpo de cinco cadeias DART-G para produzir as moléculas otimizadas de DART-G (designadas como DART-G1, DART-G2, DART-G3 e DART-G4). A afinidade de ligação de DART-G2, DART-G3 e DART-G4 foi avaliada por meio de BIAcore (Tabela 11). Para esta avaliação, CD137 humano solúvel marcado para His (huCD137) ou CD137 de macaco Cynomolgus (cynoCD137) (contendo uma porção extracelular de CD137 humano ou de macaco Cynomolgus CD137 fundida a um peptídeo contendo histidina) foi passado sobre uma superfície revestida com anticorpo imobilizado. Resumidamente, cada molécula teste foi capturada em uma superfície revestida por Fc anti-humano caprino F(ab)2 e então incubada na presença de diferentes concentrações (6,25 a 100 nM) de huCD137 ou cynoCD137. A cinética de ligação foi determinada por ligação de análise BIACORE® (modelo de ligação Langmuir 1:1 normalizado). Os valores calculados de ka, kd e KD a partir desses estudos são apresentados na Tabela 13. Tabela 13 hCD137 huCD137 cynoCD137 MAB-3 ka kd ka kd Molécula KD KD Domínio (x105) (x10-3) (x10 )5 (x10-4) (nM) (nM) VH (M-1s-1) (s-1) (M s ) (s-1) -1 -1 DART-D murino 4,7 25 53 4,6 31 67 DART-G VH1 3,7 42 114 3,9 45 115 DART-G2 VH1B 3,5 21 60 3,9 25 64 DART-G3 VH1C 2,2 14 64 2,3 18 78 DART-G4 VH1D 3,1 8,7 28 3,5 14 40
[514] Os diacorpos foram avaliados quanto à sua capacidade de se ligar a CD137 da mesma forma à descrita acima. Os resultados deste estudo são mostrados nas Figuras 20A-20B. Conforme observado acima, DART-G, que possui sítios de ligação a hCD137 MAB-3 (1.3) para CD137, apresentou ligação discretamente menor em comparação aos constructos que possuem a mesma estrutura, mas que compreendem os sítios de ligação a CD137 de CD137 MAB-3 murino (DART-6). Os diacorpos HER2 x CD137 que compreendem os Domínios hCD137 MAB-3 VH otimizados apresentaram maior ligação, e a atividade de ligação relativa das moléculas a CD137 foi: DART-G4 > DART-G3 > DART-G2 ≈ DART- 6 > DART-G. DART-G e as variantes otimizadas todas apresentarão ligação quase idêntica a HER2 na superfície de diversos tipos de células-alvo, inclusive: células N87, JIMT-1 e MDA-MB231.
[515] As Figuras 21A-21C mostram os resultados de um ensaio representativo da capacidade de DART-3, DART-6, DART-B, DART-D, DART-G, DART-G2, DART-G3 e DART-G4 de mediar a atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocinas em células T (realizado essencialmente como descrito no Exemplo 2 acima e exemplificado pela liberação de IFN-γ). A liberação de citocina foi medida conforme descrito acima na presença de células-alvo N87 que expressam HER2/neu (Figura 21A), células-alvo JIMT-1 (Figura 21B), ou células-alvo MDA- 231 (Figura 21C) ou sem presença de células-alvo.
[516] Os resultados mostram que os diacorpos de controle, DART-3 e DART-6, não apresentaram atividade coestimulatória. As Moléculas de Ligação a CD137 x TA não apresentaram nenhuma atividade coestimulatória observável na ausência de células-alvo ou com células-alvo HER2/neu- negativas. DART-G, que compreende o novo anticorpo anti-CD137 humanizado, hCD137 MAB-3, apresentou a mais elevada atividade coestimulatória na presença de da linhagem de células-alvo. TNF-α e IL-2 mostram padrões de liberação similares.
[517] Descobriu-se que a atividade coestimulatória das variantes otimizadas DART-G2, DART-G3 e DART-G4 era inversamente relacionada à ligação a CD137 expresso em superfície celular, indicando que a maior afinidade de ligação não parece diretamente correlacionada à atividade coestimulatória neste ensaio. No entanto, como mostrado abaixo, as variantes otimizadas realizam-se comparavelmente em outros ensaios funcionais. Estes atributos tornam as variantes otimizadas de afinidade particularmente úteis para a detecção da expressão de CD137 e para os ensaios diagnósticos que medem a expressão de CD137 em adição ao seu uso como agentes coestimulatórios.
[518] A capacidade de as Moléculas de Ligação a CD137 x TA medirem a aniquilação celular redirecionada de células-alvo tumorais foi examinada. Resumidamente, células- alvo N87/GFP/Luc (projetadas para expressar o gene relator de luciferase (luc)) foram incubadas com células T pan em condições de estimulação subideiais durante 72 horas na ausência ou presença de DART-B, DART-G, DART-G1, DART-G2, DART- G3, DART-G4 ou de moléculas controle DART-3 ou DART-6 (cada uma a 0,001; 0,01; 0,1, e 1 μg/mL), essencialmente como descrito acima para os ensaios de coestimulação. No término da incubação, a citotoxicidade foi determinada pelo ensaio de luminescência (LUM) que mede a atividade de luciferase celular das células-alvo com unidade de luz relativa (RLU) de luminescência, conforme leitura (Figura 22). Cada uma das Moléculas de Ligação a CD137 x TA examinadas apresentou alguma atividade de aniquilação celular redirecionada, com DART-G apresentando a atividade mais elevada e DART-B apresentando a menor atividade. Em contraste, as moléculas controle apresentaram ausência de atividade de aniquilação celular redirecionada detectáveis. Os resultados deste estudo demonstram que as Moléculas de Ligação a CD137 x TA são capazes de mediar a aniquilação celular redirecionada de células tumorais. Exemplo 6 Caracterização de Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes
[519] Como observado acima, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA que possuem um sítio de ligação para CD137 e um ou mais sítios de ligação para HER2/neu não apresentaram qualquer atividade coestimulatória no ensaio de liberação de citocinas em células T. Esta observação sugere que pelo menos dois sítios de ligação a CD137 podem ser necessários para a atividade coestimulatória. Para tratar desta questão, foi gerado um conjunto de Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes exemplificador que é capaz de ligação a CD137 e ao TA exemplificador, HER2/neu. Estas moléculas incluíram quatro Moléculas de Ligação trivalentes biespecíficas “TRIDENT-A”, “TRIDENT-A2”, “TRIDENT-A3” e “TRIDENT-A4”, respectivamente, cada uma da qual compreende dois Domínios hCD137 MAB-3 e um
Domínio hHER2 MAB-1 (CD137 x CD137 x HER2). A estrutura e as sequências dessas Moléculas de Ligação a CD137 x TA exemplificadoras são mostradas detalhadamente acima. Além disso, foram geradas duas moléculas controle, “TRIDENT-1”, cada uma compreendem um domínio de palivizumabe variante e dois domínios hCD137 MAB-3 otimizados (CD137 x CD137 x RSV), e “TRIDENT-2” compreendendo um domínio hHER2 MAB-1, um domínio 4-4-20 e um domínio de palivizumabe variante (RSV x FITC x HER2). As moléculas trivalentes possuem a estrutura geral mostrada na Figura 6A, e foram geradas e caracterizadas conforme detalhado abaixo quanto à sua capacidade de se ligar a HER2/neu presente na superfície de N87(3+) alvo, JIMT-1(2+) e MCF-7(1+) através de análise por FACS, essencialmente como descrito acima. As Moléculas de Ligação a CD137 x TA que possuem dois sítios de ligação para CD137 e dois sítios de ligação para HER2/neu (DART-G, DART-G2, DART-G3 e DART-G4) também foram avaliadas.
[520] Como mostrado nas Figuras 23A-23C, as moléculas compreenderam um ou dois domínios de ligação a HER2/neu ligados a todos os três tipos de células-alvo. Será observado que as curvas de ligação de moléculas que possuem dois sítios de ligação a HER2/neu (DART-G, DART-G2, DART-G3 e DART-G4) atingiram saturação particularmente mais cedo em células que possuem altos níveis de HER2/neu em sua superfície celular. Isto indica que algumas moléculas estão apresentando ligação bivalente (ou seja, ligação a duas moléculas HER2/neu na superfície). A ligação bivalente é mais provável na presença de altas concentrações do ligante alvo.
[521] As Moléculas de Ligação a CD137 x TA que possuem dois sítios de ligação para CD137 e um sítio de ligação para HER2/neu (TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 e TRIDENT- A4), as moléculas controle CD137 x CD137 x RSV e TA x FITC x RSV (TRIDENT-1 e TRIDENT-2) e as Moléculas de Ligação a CD137 x TA que possuem dois sítios de ligação para CD137 e 2 sítios de ligação para HER2/neu (DART-G, DART-G2, DART-G3 e DART-G4), também foram avaliadas através de análise por FACS, essencialmente como descrito no Exemplo 2 acima, quanto à sua capacidade de se ligar a CD137 presente na surface de células T CD4+ (Figura 24A) e CD8+ (Figura 24B) ativadas. As moléculas que compreenderam dois domínios de ligação a CD137 apresentaram ligação mais forte a células T ativadas. A ligação melhorada foi observada para os diacorpos exemplificadores HER2 x CD137 que compreendem os Domínio hCD137 MAB-3 VH descritos acima. A molécula controle TA x FITC x RSV (TRIDENT-2) não apresentou qualquer ligação a células T ativadas, como esperado.
[522] Em outro estudo, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA que possuem dois sítios de ligação for CD137 e um sítio de ligação para HER2/neu (TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 e TRIDENT-A4), uma Molécula de Ligação a CD137 x TA que possui dois sítios de ligação para CD137 e dois sítios de ligação para HER2/neu (DART-G4) e a molécula controle TA x FITC x RSV (TRIDENT-2), foram avaliadas quanto à sua capacidade de mediar a conjugação entre células entre as células que expressam CD137 e células-alvo que expressam HER2/neu. Para tal avaliação, 1,5 x 104 de células CHO que expressa CD137 rotuladas com PKH26 foram co-incubadas com 1,5 x 104 de células-alvo que expressam HER2/neu (N87(nível de expressão de HER2: 3+), JIMT-1 (nível de expressão de HER2: 2+) ou MCF- 7(nível de expressão de HER2: 1+)), rotuladas com CFSE a uma proporção de 1:1 na presença do artigo teste serialmente diluído (diluições de 10 vezes) durante 30 min em temperatura ambiente. As amostras foram então analisadas por citometria de fluxo para determinar a porcentagem de células conjugadas (CFSE+/PKH26+), conforme leitura para a conjugação entre células. Como mostrado nas Figuras 25A-25C, as moléculas que compreenderam pelo menos um Domínio de ligação a HER2/neu e dois domínios de ligação a CD137 foram capazes de mediar a conjugação entre células enquanto a molécula controle estava inativa. Para todas as moléculas ativas, a atividade de conjugação entre células se correlacionou com o nível de expressão de HER2/neu.
[523] Em outro estudo, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA que possuem dois sítios de ligação para CD137 e um sítio de ligação para HER2/neu (TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 e TRIDENT-A4), as moléculas controle CD137 x RSV e TA x FITC x RSV (TRIDENT-1 e TRIDENT-2), e as Moléculas de Ligação a CD137 x TA que possuem dois sítios de ligação para CD137 e dois sítios de ligação para HER2/neu (DART-G, DART-G2, DART-G3 e DART-G4), foram avaliadas quanto à sua capacidade de mediar a atividade coestimulatória em um a ensaio de liberação de citocinas em células T (realizado essencialmente conforme descrito no Exemplo 2 acima e exemplificado pela liberação de IFN-γ) na presença ou ausência de células-alvo que expressam o TA exemplificador, HER2/neu. A liberação de citocina foi medida conforme descrito acima, na presença de células-alvo N87 que expressam HER2/neu (Figura 26A), células-alvo JIMT-1 (Figura 26B) ou sem presença de células-alvo (Figura 26C).
[524] Os resultados mostram que as Moléculas de Ligação a CD137 x TA exemplificadores apresentaram atividade coestimulatória na presença de linhagem de células-alvo, com atividade correlacionada ao nível de expressão de HER2/neu. TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 e TRIDENT-A4 (cada uma tendo dois sítios de ligação para CD137 e um sítio de ligação para HER2/neu) apresentaram maior atividade coestimulatória em células JIMT-1 (HER2++) que DART-G, DART-G2, DART-G3 ou DART- G4 (tendo dois sítios de ligação para CD137 e 2 sítios de ligação para HER2/neu). As Moléculas de Ligação a CD137 x TA não apresentaram nenhuma atividade coestimulatória observável na ausência de células-alvo ou com células-alvo HER2/neu- negativas. As moléculas controle, TRIDENT-1 e TRIDENT-2, não apresentaram atividade coestimulatória. Exemplo 7 Moléculas de Ligação a CD137 x TA Potencializam a Ativação de Células T
[525] Como descrito acima, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da presente invenção podem potencializar a expansão e ativação de células T (vide, por exemplo, Figuras 17A-17O) e a função efetora NK mediada por agente de alvo tumoral (ADCC) (vide, por exemplo, potencialização de ADCC mediada por Margetuximabe, Figuras 18A-18B). As moléculas biespecíficas TA x CD3 (por exemplo, diacorpos DART, moléculas BiTE® etc.) que se ligam a um TA e a CD3 são conhecidas por mediar a aniquilação redirecionada de células T de células- alvo que expressam o TA, e estimulam a expansão e ativação de células T (vide, por exemplo, Publicação PCT Nos WO 2017/030926, WO 2016/048938 e WO 2015/026892). A capacidade das Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção de potencializar a ativação de células T e a aniquilação redirecionada de células T mediada por tais agentes de alvo tumoral foi avaliada em diversos estudos usando moléculas biespecíficas TA x CD3 exemplificadoras.
[526] Em tal estudo, a capacidade da Molécula de Ligação a CD137 x TA exemplificador TRIDENT-A4 de potencializar a aniquilação celular redirecionada a células T mediada por um diacorpo TA x CD3 que se liga ao TA ilustrativo gpA33 foi avaliada usando um ensaio de luciferase baseada em linfócitos T citotóxicos (CTL). Resumidamente, as células T pan foram incubadas com células Colo205 projetadas para expressar as células-alvo do gene relator de luciferase (luc) (Colo205/luc) a uma proporção de efetora:alvo (E:T) de 3:1 na presença de TRIDENT-A4 ou TRIDENT-1 controle em combinação com um diacorpo TA x CD3 ou um diacorpo biespecífico controle Irrel x CD3 (que compreende um Domínio de ligação irrelevante (4-4-20 para fluoresceína) no lugar de gpA33). No término da incubação, a citotoxicidade foi determinada por ensaio de luminescência (LUM) que mede a atividade de luciferase celular das células- alvo com unidade luz relativa (RLU) de luminescência, conforme leitura (Figura 27). Os resultados deste estudo demonstram que as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção são capazes de potencializar a aniquilação redirecionada de células T mediada por moléculas biespecíficas TA x CD3.
[527] Em outro estudo, a capacidade da Molécula de Ligação a CD137 x TA exemplificador TRIDENT-A2 de potencializar a expansão de células T e a atividade antitumoral em combinação in vivo foi avaliada em um modelo de carcinoma ovariano SK-OV3 (que expressa os TAs HER2/neu e 5T4). Neste estudo, a atividade de TRIDENT-A2 foi avaliada isoladamente ou em combinação com um diacorpo TA x CD3 que se liga ao TA ilustrativo 5T4 (5T4 x CD3), e opcionalmente em combinação adicional com um anti-PD-1 mAb (hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (Ρ), vide, por exemplo, SEQ ID NOs:264 e 266 da Publicação PCT WO 2017/019846).
[528] Resumidamente, as PBMCs recém-isoladas foram injetadas via retro-orbital em camundongos NSG.MHCI-/- (fêmeas de camundongo, 7 por grupo para monitoramento tumoral; 3 por grupo para perfil de células T e tumorais) no dia 0 do estudo. As células SK-OV3 (5 x 106) foram misturadas 1:1 com Matrigel e injetadas via subcutânea no dia 0 do estudo. No dia 7 do estudo, os camundongos foram tratados com o anticorpo anti-CD4 OKT4 (dose inicial de 10 mg/kg via subcutânea, 5 mg/kg duas vezes por semana IP e assim por diante) para eliminar as células T CD4+. Com início no dia 22, os camundongos foram tratados por injeção intravenosa (IV) com: veículo controle; TRIDENT-A2 (2,5 mg/kg, uma vez por semana); diacorpo TA x CD3 (0,01 mg/kg, duas vezes por semana); combinação de TRIDENT-A2 (2,5 mg/kg, uma vez por semana) e diacorpo TA x CD3 (0,01 mg/kg, duas vezes por semana); anti-PD-1 mAb (5 mg/kg, uma vez por semana); ou a combinação de TRIDENT-A2 (2,5 mg/kg; uma vez por semana), diacorpo TA x CD3 (0,01 mg/kg, duas vezes por semana) e anti-PD-1 mAb (5 mg/kg, uma vez por semana).
[529] Os marcadores de células T foram avaliados através de análise por FACS 7 dias após a administração dos artigos teste e o crescimento tumoral foi monitorado no decorrer do estudo. A expressão dos marcadores de células T CD4, CD8, CD69, e PD-1, presentes em 1 mg de tumor amostrado no dia 7 após tratamento foi representada nas Figura 28A, Figura 28B, Figura 28C e Figura 28D, respectivamente. Estes dados mostram que a Molécula de Ligação a CD137 x TA TRIDENT- A2 potencializa a ativação e expansão de células T (conforme exemplificado pela expressão aumentada de CD4, CD8 e CD69) mediadas pelo diacorpo TA x CD3. A expressão da molécula de checkpoint imunológico PD-1 foi suprarregulada no tratamento com o diacorpo TA x CD3 isoladamente. O tratamento com a combinação da Molécula de Ligação a CD137 x TA TRIDENT-A2 e o diacorpo TA x CD3 potencializou mais a expressão da molécula de checkpoint PD-1 observada no tratamento com diacorpo TA x CD3 isoladamente e sugeriu que a atividade da combinação poderia ser potencializada pela adição de um inibidor de checkpoint. Na verdade, a adição do anti-PD-1 mAb, um inibidor de checkpoint PD-1/PD-L1 exemplificador, à combinação de diacorpo TRIDENT-A2/TA x CD3 inibiu a supraregulação da expressão de PD-1 e potencializou ainda a ativação e proliferação de células T.
[530] O crescimento tumoral no decorrer do estudo está representado na Figura 29, que mostra que a Molécula de Ligação a CD137 x TA TRIDENT-A2 potencializou a atividade antitumoral do diacorpo TA x CD3. Além disso, a adição do inibidor de checkpoint de PD-1/PD-L1, anti-PD-1 mAb, à combinação potencializou mais a atividade antitumoral da combinação. Os resultados deste estudo demonstram que a Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção, particularmente aquelas que possuem dois sítios de ligação para CD137 e um sítio de ligação para um TA, potencializam a ativação e proliferação de células T e aniquilação de células-alvo em combinação com um agente de alvo tumoral. Portanto, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA da invenção podem ser vantajosamente usadas em combinação com agentes de alvo tumoral, particularmente aqueles que fazem a mediação da ativação de células T, ativação de células NK e/ou estimulam a expressão de CD137 nestas células. Além disso, estes estudos demonstram que a adição de um inibidor de checkpoint de PD- 1/PD-L1, como um anti-PD-1 ou anticorpo anti-PD-L1, pode aumentar ainda a ativação de células T, proliferação e aniquilação de células-alvo. Exemplo 8 Estudos de estabilidade
[531] A temperatura de fusão (Tm) e outros parâmetros de estabilidade das Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes exemplificadoras TRIDENT-A (que compreendem hCD137 MAB-3 (1.3)), e as variantes otimizadas TRIDENT-A1 (que compreende hCD137 MAB-3 (1A.3)), TRIDENT-A2 (que compreende hCD137 MAB-3 (1B.3)), TRIDENT-A3 (que compreende hCD137 MAB-3 (1C.3)) e TRIDENT-A4 (que compreende hCD137 MAB-3 (1D.3)) foram avaliados. A Tm do material purificado (>95%, conforme determinado por Cromatografia de Exclusão de Tamanho por Alta Pressão (HP-SEC)) foi avaliada por calorimetria de digitalização diferencial (DSC). Resumidamente, os níveis de pureza foram medidos por HPLC-SEC usando um Agilent 1260 Infinity II HPLC conectado a um Waters Acquity UPLC BEH Column (200 Å 1,7 µm 4,6 x 150 mm). O tampão de execução foi fosfato de sódio 20 mM, 0,5 M NaCl, 0,02% azida de sódio, pH 7,2. A faixa de vazão foi 0,4 mL/minuto durante 5 minutos. A % de pureza é determinada a partir da % de área do traçado de absorção a 280 nm do monômero máximo. As medições de estabilidade térmica foram realizadas em um MicroCal VP- Capillary DSC (Malvern Instruments, Inc.) entre 15 e 95 ºC e forçadas a 1 ºC/minuto.
[532] Para avaliar outros parâmetros de estabilidade, as Moléculas de Ligação a CD137 x TA purificadas
(1 mg/mL em PBS, pH 7,2, exceto observado) foram estressadas e reavaliadas por HP-SEC, sendo os valores comparados àqueles obtidos da molécula não estressada. As condições de estresse a seguir foram utilizadas: três ciclos de congelamento (1 h a -80 °C) seguidos de descongelamento; após 2 e 7 dias de armazenamento a 25 °C ou 40 °C; após 0, 2, 7 dias de armazenamento a 25 °C em 20 mM Acetato de Sódio, pH 5,5; a 0, 2, 7 dias de armazenamento a 25 °C em 10 mM Cloridrato de Histidina, pH 6,5. Os resultados destes estudos estão resumidos na Tabela 14. Tabela 14 TRIDENT-
T E Val A A A ipo de A nsaio or ideal 2 3 4 estresse n enhum
H (armaze- > 9 9 9 9 P-SEC n 95% † 9,4 6,6 7,1 9,6 puro amento a 4 °C) n Iní 6 5 4 4 enhum D cio Tm > 50 °C 2,19 4,72 8,57 8,35 SC n Tm1 6 6 5 5 enhum > 60 °C 8,19 1,75 4,72 6,61
E C s s s s stabili ongela- sem em em em em dade m alterações altera altera altera altera avaliad ento e ções ções ções ções a degelo 3x s s s s 2 sem em em em em 5 °C alterações altera altera altera altera ções ções ções ções s m s s 4 sem em uito ensíve ensíve 0 °C alterações altera sensív l l ções el s s A s s sem em em cetato pH ensíve ensíve alterações altera altera 5,5 l l ções ções s s s s
H sem em em em em istidina alterações altera altera altera altera pH 6,5 ções ções ções ções † indica a porcentagem de pureza da amostra, conforme medido por HP-SEC sensível: < 95% do produto desejado permanece conforme medido por HP-SEC muito sensível: < 90% do produto desejado permanece conforme medido por HP-SEC
[533] O início da Tm e a Tm das regiões de ligação a CD137 (Tm1) estão na faixa ideal para TRIDENT-A e TRIDENT-A2. No entanto, o início da Tm e Tm1 são menores para ambas TRIDENT-A3 e TRIDENT-A4. Apenas TRIDENT-A2 estava estável a 40 °C (Dia 2 e Dia 7) em PBS, as moléculas restantes foram sensíveis a esta condição de armazenamento. Tanto TRIDENT-A, quanto TRIDENT-A2 foram estáveis em Acetato, pH 5,5, enquanto TRIDENT-A3 e TRIDENT-A4 foram sensíveis a incubação com Acetato, pH 5,5. Todas as moléculas testadas foram estáveis em Histidina a pH 6,5. Com base nos resultados destes estudos, a classificação para estabilidade nos tampões testados é a seguinte TRIDENT-A2 > TRIDENT-A > TRIDENT-A3 > TRIDENT-A4. Exemplo 9 Atividade coestimulatória com células T de Cynomolgus
[534] Como observado acima, as moléculas que compreendem os domínios de ligação de CD137 MAB-3 (ou variantes humanizadas e otimizadas destas) se ligam a CD137 humanas e de macaco Cynomolgus. As Moléculas de Ligação a CD137 x TA representativas TRIDENT-A2 e TRIDENT-B2 que possuem dois sítios de ligação para CD137 e um sítio de ligação para HER2/neu ou 5T4 foram avaliadas quanto à sua capacidade de mediar a atividade coestimulatória em um ensaio de liberação de citocinas em células T de Cynomolgus. A estrutura e as sequências dessas Moléculas de Ligação a CD137 x TA exemplificadoras são mostradas detalhadamente acima. As moléculas controle, TRIDENT-1 e TRIDENT-2, também foram incluídas. O ensaio de liberação de citocina foi realizado (essencialmente conforme descrito no Exemplo 2 acima e exemplificado por liberação de IFN-γ) na presença ou ausência de células-alvo, exceto as células T pan de macaco Cynomolgus foram utilizadas. Para estes estudos, as células-alvo JIMT-1 que expressam HER2/neu e 5T4 foram utilizadas.
[535] Os resultados são representados na Figura 30 e mostram que as moléculas controle, TRIDENT-1 e TRIDENT- 2, não apresentaram atividade coestimulatória. Enquanto as Moléculas de Ligação a CD137 x TA TRIDENT-A2 e TRIDENT-B2 (que compreendem o anticorpo anti-CD137 humanizado/otimizado hCD137
MAB-3 (1B.3)) apresentaram uma atividade coestimulatória dependente de dose. Exemplo 10 Desimunização de CD137
[536] A análise in silico de hCD137 MAB-3 (1B.3) identificou dois possíveis peptídeos de ligação a MHC classe II (epitopos de células T) no Domínio VH e três possíveis peptídeos de ligação a MHC classe II no Domínio VL. Um painel de substituições de aminoácido a hCD137 MAB-3 (1B.3) foi examinado para identificar substituições (o que pode ser substituições únicas de aminoácidos ou conjuntos de substituições) para eliminar/reduzir a potencial imunogenicidade dos epitopos identificados de células T. Especificamente, as substituições de aminoácido foram introduzidas em até duas posições (resíduos Kabat 38 e 48) para desimunização de hCD137 MAB-3 VH1B e até seis posições (resíduos Kabat 24, 25, 44, 48, 52 e 54) para a desimunização de hCD137 MAB-3 VL3. Os resíduos de aminoácidos substituídos nos Domínios VH e VL estão em colchetes e a numeração Kabat é indicada por setas nas Figuras 31A e 31B, respectivamente. Os anticorpos IgG1 (que possuem Domínio Fc 234A/235A (SEQ ID NO:40)) compreendendo as variantes VH e/ou VL de hCD137 MAB-3 (1B.3) tendo diversas substituições nestas posições, separadamente e/ou em combinação, foram gerados e caracterizados quanto à sua capacidade de se ligar a CD137 por Attana Cell A200 QCM. Resumidamente, hCD137 MAB-3 (1B.3) e as variantes desimunizadas foram capturadas independentemente em um chip detector Attana revestido com um anticorpo policlonal Fc de IgG anti-humano de coelhos e a proteína de fusão marcada com His de CD137 humana solúvel foi passada no chip a 11,1;
33,3; 100 e 300 mM.
Os sensogramas das variantes desimunizadas foram comparados àqueles de hCD137 MAB-3 (1B.3) e pontuados.
Os anticorpos também foram caracterizados quanto à sua estabilidade térmica por DSC, realizado essencialmente conforme descrito acima no Exemplo 8. Os resultados para estas diversas variantes estão resumidos na Tabela 15, as sequências de aminoácidos destas variantes são providas acima.
Tabela 15 h Su L CD137 Subst D bstituições igação a MAB-3 ituições VL3^ SC‡ VH1B^ CD137* Ref. ( ne nenhu + 6 1B.3) nhuma ma ++ 4,7 ( K3 nenhu + 6 1E.3) 8R (VH1E) ma ++ 5 ( I4 nenhu + 5 1F.3) 8A (VH1F) ma + 5,0 ( ne R24Q/ + 6 1B.4) nhuma P25A (VL4) ++ 5,5 ( ne V44A + 6 1B.5) nhuma (VL5) ++ 2,6 ( ne L54A + 6 1B.6) nhuma (VL6) ++ 4,7 ( K3 R24Q/ 4 1G.7) 8R/I48A P25A/V44A (VL7) + 5,2 (VH1G)
Tabela 15 h Su L CD137 Subst D bstituições igação a MAB-3 ituições VL3^ SC‡ VH1B^ CD137* Ref. ( K3 R24Q/ n 1G.8) 8R/I48A P25A/V44A/L54A + .d. (VH1G) (VL8) ( K3 R24Q/ + 6 1E.4) 8R (VH1E) P25A (VL4) ++ 4,5 ( K3 R24Q/ + 5 1G.4) 8R/I48A P25A (VL4) ++ 5,1 (VH1G) ( ne S52T + 6 1B.10) nhuma (VL10) ++ 5,2 ( ne S52G + 6 1B.11) nhuma (VL11) ++ 4,4 ( ne I48A/ + n 1B.11) nhuma S52T (VL12) ++ .d. ( ne I48A/ + n 1B.13) nhuma S52G (VL13) +- .d. ( K3 R24Q/ + 6 1E.9) 8R (VH1E) P25A/L54A (VL9) ++ 4 ( K3 R24Q/ + 6 1E.14) 8R (VH1E) P25A/S52T/L54A ++ 4 (VL14) ( K3 R24Q/ + 6 1E.15) 8R (VH1E) P25A/S52G/L54A ++ 2,9 (VL15)
Tabela 15 h Su L CD137 Subst D bstituições igação a MAB-3 ituições VL3^ SC‡ VH1B^ CD137* Ref. ( K3 R24Q/ + 5 1G.14) 8R/I48A P25A/S52T/L54A + 1,9 (VH1G) (VL14) ( K3 R24Q/ 5 1G.15) 8R/I48A P25A/S52G/L54A + 0 (VH1G) (VL15) ^ substituição(ões) em relação a VH1B ou VL3 estão listadas, a designação da região variável resultante compreendendo as substituições indicadas é provida entre parênteses * ligação relativa em comparação a hCD137 MAB-3 (1B.3) (estabelecida em +++) determinada pela comparação de sensogramas de ligação ‡ Início de Tm; “nenhum” indica que não há mutações presentes; n.d. não determinado
[537] Um grande número de variantes desimunizadas foi identificado, as quais retêm tanto atividade de ligação a CD137, quanto estabilidade térmica. A maioria das variantes desimunizadas que compreende a substituição I48A do Domínio VH apresentou alguma redução tanto na ligação a CD137, quanto no início de Tm.
[538] hCD137 MAB-3 (1E.15) e hCD137 MAB-3 (1G.15) desimunizadas, e hCD137 MAB-3 (1B.3) parenteral imunizada foram testadas quanto à sua capacidade de se ligar às células T CD4+ e CD8+ ativadas essencialmente conforme descrito acima. Como mostrado nas Figuras 32A-32B, a curva de ligação do anticorpo desimunizado hCD137 MAB-3 (1E.15) não foi alterada, enquanto hCD137 MAB-3 (1G.15) apresentou ligação discretamente reduzida ambas as células T CD4+ e CD8+.
[539] A atividade agonista in vitro de hCD137 MAB-3 (1E.15) e hCD137 MAB-3 (1G.15) foi avaliada em um ensaio de liberação de citocinas em células T (realizado essencialmente conforme descrito no Exemplo 2 acima e exemplificado pela liberação de IFN-γ) na ausência de ou com reticulação. Nenhum dos anticorpos baseados em hCD137 MAB-3 apresentou atividade observada na ausência de reticulação (Figura 33A), com reticulação hCD137 MAB-3 (1E.15) apresentou atividade agonista similar a hCD137 MAB-3 (1B.3), enquanto hCD137 MAB-3 (1G.15) apresentou uma discreta redução na atividade agonista provavelmente devido à redução de ligação para CD137 (Figura 33B). Conforme relatado acima, CD137 MAB-1 apresentou atividade agonista na presença e ausência de reticulação. Exemplo 11 Moléculas de Ligação a CD137 x TA Trivalentes que Possuem Domínios de Ligação a CD137 Desimunizados
[540] Conforme descrito acima, os Domínios VH e VL de hCD137 MAB-3 foram humanizados, otimizados e desimunizados. As Moléculas de Ligação a CD137 x TA biespecíficas e tetravalentes e/ou trivalentes são geradas ao incorporar estes Domínios VH e VL. Uma destas Moléculas de Ligação trivalentes biespecíficas “TRIDENT-B5” que compreende os domínios de ligação a CD137 de hCD137 MAB-3 (1E.15) foi gerada e avaliada em diversos ensaios. A estrutura e a sequência dessa Molécula de Ligação a CD137 x TA exemplificador são mostradas detalhadamente acima. TRIDENT-B2 e uma ou mais moléculas controle: TRIDENT-1, TRIDENT-2, TRIDENT-3, TRIDENT- 4, foram incluídas nestes estudos.
[541] TRIDENT-B2, TRIDENT-B5 e as moléculas controle TRIDENT-1, TRIDENT-3 e TRIDENT-4, foram avaliadas quanto à sua capacidade de se ligar a células T CD8+ ativadas, e/ou 5T4 presentes na superfície de células-alvo (células de carcinoma de mama JIMT-1 com alta expressão e células de carcinoma ovariano SKOV-3 de baixa expressão) essencialmente conforme descrito acima. Como mostrado na Figura 34A, todas as moléculas que compreendem dois domínios de ligação a CD137 (TRIDENT-B2, TRIDENT-B5, e as moléculas controle TRIDENT-1 e TRIDENT-4) apresentaram ligação similar a células T CD8+ ativadas, enquanto a molécula controle que carece de domínios de ligação a CD137 (TRIDENT-3) não se ligou. Da mesma forma, todas as moléculas que possuem domínio de ligação a 5T4 (TRIDENT-B2, TRIDENT-B5, e a molécula controle TRIDENT-3) apresentaram forte ligação similar às células-alvo que expressam altos níveis de 5T4 (JIMT-1, Figura 34B), e ligação mais fraca a células-alvo que expressam baixos níveis de 5T4 (SKOV-3, Figura 34C), enquanto as moléculas controle que carecem de Domínio de ligação a 5T4 (TRIDENT-1 e TRIDENT-4) não se ligaram à célula-alvo que expressa 5T4.
[542] A atividade agonista in vitro de TRIDENT- B2, TRIDENT-B5, e as moléculas controle TRIDENT-1, TRIDENT-3 e TRIDENT-4, foi avaliada em um ensaio de liberação de citocinas em células T (realizado essencialmente conforme descrito no Exemplo 2 acima e exemplificado pela liberação de IFN-γ) na presença ou ausência de células-alvo que expressam diferentes níveis de TA exemplificador, células 5T4 (JIMT-1 (5T4hi) ou células SKOV-3 (5T4lo)).
[543] Conforme mostrado nas Figuras 35A-35C, TRIDENT-1, TRIDENT-4 (que carecem de um Domínio de ligação a 5T4) apresentaram ausência de atividade coestimulatória. Também se descobriu que TRIDENT-3 (que carece de domínios de ligação a CD137) carece de qualquer atividade coestimulatória. TRIDENT-B2 e TRIDENT-B5 apresentaram atividade coestimulatória dependente de dose similar na presença de células-alvo JIMT-1 com alta expressão de 5T4 (Figura 35A), mas pouca ou nenhuma atividade coestimulatória na presença de células-alvo SKOV-3 com baixa expressão de 5T4 (Figura 35B), ou nenhuma célula- alvo (Figura 35C).
[544] Os resultados destes estudos indicam que as Moléculas de Ligação a CD137 x TA compreendendo Domínios VH e VL desimunizados de hCD137 MAB-3 (1E.15) apresentam perfis comparáveis de ligação e atividade coestimulatória às Moléculas de Ligação a CD137 x TA que compreendem os Domínios VH e VL otimizados de hCD137 MAB-3 (1B.3).
[545] Todas as publicações e patentes mencionadas nesta especificação são pelo presente incorporadas por referência na mesma medida, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporadas por referência em sua totalidade. Apesar de a invenção ter sido descrita em conexão a realizações específicas desta, será compreendido que é capaz de outras modificações, sendo este pedido pretendido para abranger quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção seguindo, no geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente revelação como sendo da prática comum na técnica à qual a invenção pertence conforme pode ser aplicada às características essenciais anteriormente estabelecidas neste instrumento.

Claims (38)

REIVINDICAÇÕES
1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A CD137 x TA, em que a dita Molécula de Ligação é capaz de ligação específica a um epitopo de CD137 e a um epitopo de um antígeno tumoral (TA), e em que a dita Molécula de Ligação a CD137 x TA é caracterizada por compreender um primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; e em que, (A) (1) o primeiro Domínio Variável da Cadeia leve CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são as CDR de cadeia leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO: 75); e (2) dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são as CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO: 84); (B) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (C) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (D) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218); e
(2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (E) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (F) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (G) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (H) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74); (I) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91); e
(2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90); (J) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-5 VL (SEQ ID NO:97); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96); (K) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); (L) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); ou (M) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86).
2. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada é caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77); (B) hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208); (C) hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (D) hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); (E) hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76); (F) hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); (G) hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86); ou (H) hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92).
3. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em que o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve é caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82); (B) hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); (C) hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); (D) hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87); (E) hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88); (F) hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89); (G) hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94); ou (H) hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95).
4. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo dito antígeno tumoral (TA) ser selecionado do grupo de antígenos tumorais que consiste em: 19.9; proteína oncofetal 5T4; antígeno 4.2; A33; AFP; ALCAM; BAGE; beta-catenina; CA125; Carboxipeptidase M; B1; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD30; CD33; CD36; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD123; CD317; CEA; CEACAM5; CEACAM6;
CO-43; CO-514; CTLA-1; CTLA-4; Citoqueratina 8; Série E1; EGF- R; um Receptor de Efrina; Erb; F3; FC10.2; um GAGE GD2; GD3; GD49; GM2; GM3; GICA 19-9; gp37; gp75; gp100; HER-2/neu; antígeno-CD20 de linfoma B humano; antígeno de glóbulo de gordura de leite humano; papilomavírus-E6 humano/papilomavírus-E7 humano; HMW-MAA; antígeno I; ITGB6; IL13Rα2; JAM-3; KID3; KID31; antígeno pan-carcinoma KS 1/4; KS 1/4; KSA; L6; L20; LEA; LUCA-2; M1:22:25:8; M18; M39; um MAGE; MART; Myl; MUC-1; MUM-1; N-acetilglicosaminiltransferase; neoglicoproteína; NS-10; OFA-1; OFA-2; Oncostatina M; p15; PSA; PSMA; PEMA; PIPA; fosfato de ácido prostático; R24; ROR1; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn; peptídeo derivado de receptor de células T; TAG-72; TL5; receptor de TNF-α; receptor de TNF-ß; receptor de TNF-γ; TRA-1-85; Receptor de Transferrina; TSTA; e VEGF-R.
5. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 4, em que o dito antígeno tumoral (TA) é HER2/neu e em que a dita Molécula de Ligação a CD137 x TA é caracterizada por compreender um segundo Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; e em que (A) o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63); e (B) o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62).
6. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por:
(A) (1) o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67); (2) o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB- 1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou (3) o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB- 1 VL3 (SEQ ID NO:69); e (B) (1) o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); (2) o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou (3) o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66).
7. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 6, em que o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada é caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de: (A) hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); (B) hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou (C) hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66).
8. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Leve é caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de: (A) hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67); (B) hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou
(C) hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69).
9. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 4, em que o antígeno tumoral (TA) é 5T4 e em que a Molécula de Ligação a CD137 x TA é caracterizada por compreender um segundo Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; e em que: (I) (A) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de 5T4 MAB-1 VL (SEQ ID NO:135); e (B) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de 5T4 MAB- 1 VH (SEQ ID NO:134); ou (II) (A) o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de 5T4 MAB-2 VL (SEQ ID NO:137); e (B) o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de 5T4 MAB- 2 VH (SEQ ID NO:136).
10. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 9, em que o segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada é caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de: MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:135).
11. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que o segundo Domínio Variável de Cadeia Leve é caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de: MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:136).
12. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a dita molécula é um diacorpo contendo Fc tetravalente biespecífico caracterizado por compreender uma primeira, uma segunda, uma terceira e uma quarta cadeias polipeptídicas, em que as ditas cadeias polipeptídicas formam um complexo ligado covalentemente.
13. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a dita molécula é biespecífica e tetravalente, e caracterizada por compreender uma primeira, uma segunda, uma terceira, uma quarta e uma quinta cadeias polipeptídicas, em que as ditas cadeias polipeptídicas formam um complexo ligado covalentemente.
14. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a dita molécula é biespecífica e trivalente, e caracterizada por compreender uma primeira, uma segunda, uma terceira e uma quarta cadeias polipeptídicas, em que as ditas cadeias polipeptídicas formam um complexo ligado covalentemente.
15. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo dito antígeno tumoral (TA) ser HER2/neu e em que: (A) a dita primeira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, ou SEQ ID NO:229; (B) a dita segunda cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:163, ou SEQ ID NO:230; (C) a dita terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:104; e (D) a dita quarta cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105.
16. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo dito antígeno tumoral (TA) ser 5T4 e em que: (A) a dita primeira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, ou SEQ ID NO:229; (B) a dita segunda cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, ou SEQ ID NO:230; (C) a dita terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:231; e (D) a dita quarta cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:232.
17. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a Molécula de Ligação a CD137 x TA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, e um veículo fisiologicamente aceitável.
18. USO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A CD137 x TA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 17, na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição associada a ou caracterizada pela expressão do dito antígeno tumoral (TA).
19. USO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela dita doença ou condição associada a expressão do dito antígeno tumoral (TA) ser câncer.
20. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A CD137, caracterizada por compreender um Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; em que:
(A) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia leve CDRL1, CDRL2 e CDRL3 são as CDR de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO: 75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2 e CDRH3 são as CDR de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO: 84); (B) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (C) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (D) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3VH1B (SEQ ID NO:84); (E) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84);
(F) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (G) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (H) (1) o dito Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB- 3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74); (I) (1) o dito Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB- 4 VL (SEQ ID NO:91); e (2) o dito Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90); (J) (1) o dito Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB- 5 VL (SEQ ID NO:97); e (2) o dito Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96);
(K) (1) o dito Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB- 3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); (L) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); (M) (1) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75); e (2) o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86).
21. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 20, em que o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada é caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77); (B) hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208); (C) hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84); (D) hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83); (E) hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76); (F) hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85); (G) hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86); ou (H) hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92).
22. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 21, em que o dito primeiro Domínio Variável de Cadeia Leve é caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de: (A) hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82); (B) hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222); (C) hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221); (D) hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87); (E) hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88); (F) hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89); (G) hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94); ou (H) hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95).
23. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizada pela dita molécula ser um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno deste.
24. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a Molécula de Ligação a CD137, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 23, e um veículo fisiologicamente aceitável.
25. USO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A CD137, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 23, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 24, na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição associada a um sistema imunossuprimido ou caracterizada pela expressão do dito antígeno tumoral (TA).
26. USO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pela condição associada a um sistema imunossuprimido ou pela expressão do dito antígeno tumoral (TA) ser câncer.
27. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A HER2/NEU, caracterizada por compreender um Domínio Variável de Cadeia Leve que compreende um CDRL1, CDRL2 e CDRL3, e um Domínio Variável de Cadeia Pesada que compreende um CDRH1, CDRH2 e CDRH3; em que: (A) (1) o dito Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63); (2) o dito Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67); (3) o dito Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou (4) o dito Domínio Variável de Cadeia Leve CDRL1, CDRL2, e CDRL3 são os CDRs de Cadeia Leve de hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69); e (B) (1) o dito Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de HER2 MAB- 1 VH (SEQ ID NO:62); (2) o dito Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); (3) o dito Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou (4) o dito Domínio Variável de Cadeia Pesada CDRH1, CDRH2, e CDRH3 são os CDRs de Cadeia Pesada de hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66).
28. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 27, em que o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Pesada é caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de: (A) HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62) (B) hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64); (C) hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65); ou (D) hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66).
29. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, em que o dito segundo Domínio Variável de Cadeia Leve é caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de: (A) HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63); (B) hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67); (C) hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68); ou (D) hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69).
30. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizada pela dita molécula ser um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno deste.
31. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a Molécula de Ligação HER2/neu, conforme definica em qualquer uma das reivindicações 27 a 30, e um veículo fisiologicamente aceitável.
32. USO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A HER2/NEU, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 27 a 30, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 31, na preparação de uma medicação para o tratamento de uma doença ou condição associada a ou caracterizada pela expressão de HER2/neu.
33. USO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela dita condição associada a expressão de HER2/neu ser câncer.
34. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, em que um agente de alvo tumoral e/ou um PD-1/PD-L1 inibidor de checkpoint em combinação com a Molécula de Ligação a CD137 x TA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 17, na preparação de um medicamento para o tratamento de um doença ou condição associada a um sistema imunológico suprimido ou caracterizada pela expressão de um antígeno tumoral(TA)
35. USO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo dito agente de alvo tumoral ser um anticorpo, um fragmento de ligação a epitopo de um anticorpo, ou um agente que faz a mediação da eliminação redirecionada de células T de uma célula-alvo.
36. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 ou 35, caracterizado pelo dito inibidor de checkpoint de PD-1/PD-L1 ser um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1.
37. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pela doença ou condição ser câncer.
38. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 26,33 e 37, em que o referido cancro é selecionado o grupo caracterizado por: câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer gástrico, glioblastoma, câncer renal, câncer de pulmão, melanoma, neuroblastoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de faringe, próstata câncer, carcinoma de células renais, rabdomiossarcoma e câncer de células escamosas da cabeça e pescoço (SCCHN).
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