JP2023116811A - 細胞によって発現される生物活性を調節する結合分子 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する手段及び方法を提供する。本発明はまた、少なくとも2つの抗原結合部位を含む抗体などの結合分子を提供し、第1の抗原結合部位は、メンバーの細胞外部分に結合することができ、第2の抗原結合部位は、第2の(異なる)膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる。【解決手段】細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第1の細胞及び第2の細胞を準備することを含み、前記第1の細胞が細胞膜上に前記メンバーを有し、前記第2の細胞が細胞膜上に第2の膜タンパク質を有し、前記方法が、前記細胞を、2つの可変ドメインを含む二重特異性抗体と接触させることを含み、1つの可変ドメインが、前記メンバーの細胞外部分に結合することができる第1の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、前記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第2の抗原結合部位を含み、それによって、前記第1の細胞上の前記メンバーの活性を刺激する、方法の提供。【選択図】なし
Description
本発明は、結合分子の分野に関する。特に、本発明は、異常細胞が関与する疾患の治療のための治療用結合分子の分野に関する。より具体的には、本発明は、2つ以上の異なる膜結合タンパク質の細胞外部分に結合し、それにより細胞によって発現される生物活性を調節する結合分子に関する。
がんの治療は多大な進歩を遂げ、がんをもたらす分子事象の知識が増えたにもかかわらず、がんは依然として、世界での罹患及び死亡の主要な原因である。がんは、世界中で2番目に多い死因である。世界保健機関によれば、がんは、2015年に880万件の死亡に関与していた。世界的には、6件の死亡のうちのほぼ1件ががんに起因する。例えば、結腸直腸がん(colorectal cancer、CRC)は、世界中で3番目に多いがんである。2008年には、123万人の人々がこの疾患と診断されている。これは、欧州において2番目に多いがんであり、2012年には、およそ447,000件の新たな症例が診断されている(合計の13%)。結腸直腸がんは、4番目に多いがんの死亡原因であり、年間608,000件(EUでは148,000件)の死亡に関与すると推定される。いくつかの新しい治療がCRCにおいて進歩しているが、多くは臨床試験は失敗しており、転移性CRCは、依然として大部分は不治である。
従来、ほとんどのがん薬物の発見は、必須細胞機能をブロックし、分裂細胞を殺傷する薬剤に焦点を当ててきた。しかしながら、進行がんの場合、どんなに攻撃的に適用されても、患者が治療からの生命を脅かす副作用に苦しむ時点であっても、化学療法が完全な治癒をもたらすことは稀である。ほとんどの場合、患者内の腫瘍は、増殖を停止し、又は一時的に収縮(寛解と呼ばれる)するだけで、再度増殖を開始し、時にはより急速に増殖し(再発と呼ばれる)、治療がますます困難になる。最近では、がん薬物開発の焦点は、広範な細胞傷害性化学療法から離れて、毒性が少ない標的化細胞増殖抑制療法に向かっている。進行がんの治療は、白血病及びいくつかの他のがんにおいて臨床的に検証されている。しかしながら、癌腫の大部分において、標的化アプローチは、患者の大部分においてがんを完全に消滅させるのに十分な効果を依然としてもたらしていない。黒色腫は、非常に頻繁に発生するがんの別の例である。検出が十分に早期ではない場合、がんは転移する可能性があり、その段階では、治療が非常に困難である。免疫介入治療は、転移性黒色腫を有する患者の少なくとも一部に有効であることが示されている。非小細胞肺がんは、手術のための十分に早期の段階で稀に発見されるがん型である。また、これらの種類のがんは、免疫介入治療により成功裏に治療されてきた。
がんの標的化は、例えば、がんが生存及び/又は増殖に依存するシグナル伝達タンパク質に対して指向する小分子、腫瘍特異性タンパク質を有するワクチン、腫瘍細胞を能動的に殺傷する免疫細胞及び細胞傷害性分子を腫瘍に標的化する抗体を含む細胞療法、シグナル伝達の妨害及び/又は宿主の免疫系を腫瘍細胞に指向させる(向け直す)ことを含む様々な異なる方法を使用して達成されてきた。CTLA-4又はPD-1軸をブロックするモノクローナル抗体は、黒色腫、NSCLC、腎細胞癌、及び尿路上皮癌患者のサブセットにおいて持続性のある臨床応答を誘発することが示されている。
本発明は、免疫系成分を指向させる(向け直す)ための新規な手段及び方法を提供する。本発明はまた、細胞によって発現される生物活性を調節するための手段及び方法に関する。
本発明は、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第1及び第2の細胞を準備することを含み、第1の細胞が細胞膜上にメンバーを有し、第2の細胞が、細胞膜上に第2の膜タンパク質を有する、方法が、細胞を、2つの抗原結合部位を含む結合分子と接触させることを含み、第1の抗原結合部位が、メンバー(第1の膜タンパク質)の細胞外部分に結合することができ、第2の抗原結合部位が、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができ、それによって、第1の細胞上のメンバーの活性を刺激する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。いくつかの実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーは、CD137又はOX40であり、好ましくはCD137である。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、B7ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、PD-L1である。
好ましい実施形態では、方法は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む更なる結合分子(第2の結合分子)を準備することを更に含み、第1及び第2の結合分子は、
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第1の細胞及び第2の細胞を、第1及び第2の結合分子と共にインキュベートすることによって、第1の細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激又は増強することを更に含む。
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第1の細胞及び第2の細胞を、第1及び第2の結合分子と共にインキュベートすることによって、第1の細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激又は増強することを更に含む。
本発明はまた、TNF受容体スーパーファミリーのメンバー(第1の膜タンパク質)の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む結合分子も提供する。TNF受容体スーパーファミリーメンバーは、好ましくはCD137又はOX40であり、好ましくはCD137である。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。第2の膜タンパク質は、好ましくはB7ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、PD-L1である。
本発明は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバー(第1の膜タンパク質)の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む1つ以上の結合分子を含む部分の組成物又はキットオブパーツを更に提供する。好ましい実施形態では、本発明は、このような結合分子を2つ以上含む組成物又はキットオブパーツであって、少なくとも2つの結合分子が、
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合することができる、組成物又はキットオブパーツを提供する。少なくとも2つの結合分子は、第1の膜タンパク質上の同じエピトープに結合し、第2の膜タンパク質上の異なるエピトープに結合することが好ましい。
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合することができる、組成物又はキットオブパーツを提供する。少なくとも2つの結合分子は、第1の膜タンパク質上の同じエピトープに結合し、第2の膜タンパク質上の異なるエピトープに結合することが好ましい。
本発明は、細胞上のCD137又はOX40の活性を刺激する方法であって、第1の細胞及び第2の細胞を準備することであって、第1の細胞が細胞膜上にCD137又はOX40を有し、第2の細胞が細胞膜上に第2の膜タンパク質を有することと、第1の細胞及び第2の細胞を、CD137又はOX40(第1の膜タンパク質)の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を含む結合分子(第1の結合分子)と第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む結合分子(第1の結合分子)と接触させることとを含み、方法が、第1の細胞及び第2の細胞を、第1の結合分子と共にインキュベートすることによって、第1の細胞上のCD137又はOX40の活性を刺激することを更に含む方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。
好ましい実施形態では、方法は、第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む更なる結合分子(第2の結合分子)を準備することを更に含み、第1及び第2の結合分子は、
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第1の細胞及び第2の細胞を、第1及び第2の結合分子と共にインキュベートすることによって、第1の細胞上のCD137又はOX40の活性を刺激することを更に含む。
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第1の細胞及び第2の細胞を、第1及び第2の結合分子と共にインキュベートすることによって、第1の細胞上のCD137又はOX40の活性を刺激することを更に含む。
いくつかの実施形態では、本発明による結合分子は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子の抗原結合部位は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる1つの抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子は、CD137の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子の抗原結合部位は、CD137の細胞外部分に結合することができる1つの抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子は、CD137に結合することができる抗原結合部位と、PD-L1に結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子の抗原結合部位は、CD137に結合することができる1つの抗原結合部位と、PD-L1に結合することができる1つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子は、2つ以下の抗原結合部位を有する。
本明細書に記載される結合分子は、好ましくは抗体である。
本発明は、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第1の細胞及び第2の細胞を準備することを含み、第1の細胞が細胞膜上にメンバー(第1の膜タンパク質)を有し、第2の細胞が細胞膜上に第2の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、少なくとも2つの可変ドメインを含む本発明による抗体と接触させることを含み、1つの可変ドメインが、第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第1の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第2の抗原結合部位を含み、それによって、第1の細胞上のメンバーの活性を刺激する、方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。
本発明は、
TNF受容体スーパーファミリーのメンバー(第1の膜タンパク質)の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン、及び
第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン
を含む、抗体又は機能的部分、派生体及び/又はそれらの類似体を更に提供する。第1の膜タンパク質は、好ましくはCD137又はOX40であり、好ましくはCD137である。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。
TNF受容体スーパーファミリーのメンバー(第1の膜タンパク質)の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン、及び
第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン
を含む、抗体又は機能的部分、派生体及び/又はそれらの類似体を更に提供する。第1の膜タンパク質は、好ましくはCD137又はOX40であり、好ましくはCD137である。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。
結合分子は、好ましくは二重特異性抗体である。本発明は、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第1の細胞及び第2の細胞を準備することを含み、第1の細胞が細胞膜上にメンバー(第1の膜タンパク質)を有し、第2の細胞が細胞膜上に第2の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、2つの可変ドメインを含む二重特異性抗体と接触させることを含み、1つの可変ドメインが、第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第1の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第2の抗原結合部位を含み、それによって、第1の細胞上のメンバーの活性を刺激する、方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。また、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分(第1の膜タンパク質)に結合することができる抗原結合部位を有する可変ドメインと、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を有する可変ドメインとを含む二重特異性抗体も提供される。第1の膜タンパク質は、好ましくはCD137又はOX40であり、好ましくはCD137である。第2の膜タンパク質は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。
いくつかの実施形態では、本発明による抗体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明による抗体の抗原結合部位は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる1つの抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による抗体は、CD137の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による抗体の抗原結合部位は、CD137の細胞外部分に結合することができる1つの抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による抗体は、CD137に結合することができる抗原結合部位と、PD-L1に結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による抗体の抗原結合部位は、CD137に結合することができる1つの抗原結合部位と、PD-L1に結合することができる1つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による抗体は、2つ以下の抗原結合部位を有する。
本発明の1つ以上の結合分子、好ましくは抗体又はその変異体を含む医薬組成物が更に提供される。
また、本発明の抗体又はその変異体の重鎖(複数可)又は重鎖可変領域(複数可)をコードする核酸分子又は核酸分子の集合体も提供される。
また、本発明の抗体をコードする核酸分子又は核酸分子の集合体も提供される。
本発明の抗体は、好ましくは、図3に示されるようなMFのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。好ましい実施形態では、抗体は、図1に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を更に含む。好ましい実施形態では、軽鎖は、図1Aに示されるようなアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、重鎖は、IgG1抗体、好ましくはヒトIgG1抗体の定常領域を含む。好ましい実施形態では、IgG1定常領域のCH2領域は、抗体のADCC及び/又はCDC活性を低減するように遺伝子操作されている。好ましい実施形態では、CH2領域は、図2Eに示されるような配列を含む。好ましい実施形態では、抗体のCH3領域は、重鎖のヘテロ二量体化を促進するように遺伝子操作されている。好ましい実施形態では、1つの重鎖は、図2Fに示されるような配列を含み、別の重鎖は、図2Gに示されるような配列を含む。
また、本発明の抗体又はその変異体を単独で又は一緒にコードする1つ以上の核酸分子を含む細胞も提供される。また、本発明の抗体又はその変異体を、記載されるような細胞を使用して、好ましくは細胞の培養物からの抗体又はその変異体の採取と一緒に産生する方法も提供される。
本発明の抗体又はその変異体を含む細胞系が更に提供される。
がんなどの異常細胞が関与する疾患を有する、又はウイルス若しくは寄生体による慢性感染症を有する個体の治療のための方法であって、それを必要とする個体に、本発明の結合分子、好ましくは抗体又はその変異体を投与することを含む方法も提供される。
本発明は、本発明の結合分子、好ましくは抗体又はその変異体、好ましくは、がんなどの異常細胞が関与する疾患、又はウイルス若しくは寄生体による慢性感染症を有する個体の治療に使用するための、本発明の二重特異性抗体又はその変異体を更に提供する。
好ましい実施形態では、寄生体は細胞内寄生体である。
個体における免疫応答を個体の異常細胞に対して刺激する方法であって、個体に、本発明の結合分子、好ましくは抗体又はその変異体、好ましくは二重特異性抗体又はその変異体を提供する(投与する)ことを含む方法が更に提供される。異常細胞は、好ましくはがん細胞、ウイルス感染細胞、寄生体又は寄生体感染細胞である。好ましい実施形態では、細胞は、がん細胞又は新生物性細胞である。
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(tumor necrosis factor receptor superfamily、TNFRSF)は、受容体の一群である。これらは、典型的には、細胞外システインリッチドメインを介して腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor、TNF)に結合する能力によって特徴付けられる。神経成長因子(nerve growth factor、NGF)を除いて、全てのTNFは、原型のTNF-αに相同である。それらの活性形態では、TNF受容体の大部分は、原形質膜中に三量体複合体を形成する。したがって、ほとんどのTNF受容体は、膜貫通ドメイン(transmembrane domain、TMD)を含み、細胞膜上に位置する。しかしながら、一部は、可溶性形態(例えば、TNFR1)に切断することができ、TMDを完全に欠いている(例えばDcR3)。TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合する本発明の抗体は、スーパーファミリーの膜結合メンバーに結合する。細胞膜に関連しない形態でのみ存在するメンバーは、本発明の範囲内ではない。
TNF受容体は、受容体のリガンドの結合時に細胞の内側へのシグナル伝達に関与する。いくつかの受容体は、下流シグナル伝達のために、TRADD、TRAF、RIP、及びFADDなどの特異的アダプタータンパク質を必要とする。本発明との関係においては、TNFスーパーファミリーの様々なメンバーが好ましい。これらには、腫瘍壊死因子受容体1、腫瘍壊死因子受容体2、リンホトキシンβ受容体、OX40、CD40、Fas受容体、CD27、CD30、CD137、細胞死受容体3、細胞死受容体4、細胞死受容体5、細胞死受容体6、RANK、TROY、BAFF受容体、B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen、BCMA)及び膜貫通活性剤並びにカルシウム調節シクロフィリンリガンド相互作用タンパク質(trans-membrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand-interacting protein、TACI)が挙げられる。
腫瘍壊死因子受容体1は、腫瘍壊死因子-αの主受容体のうちの1つである。この受容体は、多数の代替名を有し、これらのいくつかは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー1A、TNFRSF1A、TNF-R1、TNF-RI、TNFR-I、TNFR1、TNFAR、P60、P55、腫瘍壊死因子受容体1Aアイソフォームβ、腫瘍壊死因子結合タンパク質1、腫瘍壊死因子受容体1型、腫瘍壊死因子受容体I型、腫瘍壊死因子-α受容体、腫瘍壊死因子受容体1、CD120a抗原、TNFR1-D2、TNF-R-I、TNF-R55、CD120a、TNFR55、TNFR60、TNF-R、P55-R、Tbp1、FPF、及びMS5である。腫瘍壊死因子受容体1についての外部Idsは、HGNC:11916、Entrez Gene:7132、Ensembl:ENSG00000067182、OMIM:191190、及びUniProtKB:P19438である。
腫瘍壊死因子受容体2は、腫瘍壊死因子-α(tumor necrosis factor-alpha、TNFα)に結合する膜受容体である。この受容体は、多数の代替名を有し、これらのいくつかは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー1B、TNFRSF1B、腫瘍壊死因子受容体II型、腫瘍壊死因子受容体2、P80 TNF-α受容体、TNF-RII、TNF-R2、TNFR2、TNFBR、P75、腫瘍壊死因子結合タンパク質2、腫瘍壊死因子β受容体、P75 TNF受容体、CD120b抗原、エタネルセプト、TNF-R-II、TNF-R75、P75TNFR、TNFR-II、CD120b、TNFR1B、TNFR80、TBPIIである。腫瘍壊死因子受容体2についての外部Idsは、HGNC:11917、Entrez Gene:7133、Ensembl:ENSG00000028137、OMIM:191191、及びUniProtKB:P20333である。
リンホトキシンβ受容体は、上皮及び骨髄系の細胞を含むほとんどの細胞型の表面上で発現されるが、通常は正常なTリンパ球及びBリンパ球では発現されない。このタンパク質は、リンホトキシン膜形態(リンホトキシン-α及びリンホトキシン-βの複合体)に結合する。コード化タンパク質及びそのリガンドは、リンパ系組織及び形質転換細胞の発生及び組織において役割を果たす。このタンパク質の活性化は、場合によってアポトーシスを誘発することができる。このタンパク質は、多数の別名で知られており、これらの中には、LTBR、腫瘍壊死因子受容体2関連タンパク質、腫瘍壊死因子受容体III型、腫瘍壊死因子C受容体、D12S370、TNFRSF3、TNFCR、TNFR3、リンホトキシンβ受容体(TNFRスーパーファミリー、メンバー3)、リンホトキシンB受容体、LT-β-R、TNF-R-III、TNFR2-RP、TNF-RIII、TNFR-III、TNFR-RP、及びCD18がある。リンホトキシンβ受容体の外部Idsは、HGNC:6718、Entrez Gene:4055、Ensembl:ENSG00000111321、OMIM:600979、及びUniProtKB:P36941である。
OX40は、CD28とは異なり、静止期のナイーブT細胞上では恒常的に発現されず、OX40は、活性化から24~72時間後に発現される、二次共刺激性免疫チェックポイント分子であり、そのリガンド、OX40Lもまた、静止期の抗原提示細胞上では発現されないが、それらの活性化後に発現される。OX40の発現は、T細胞の活性化に依存する。CD28なしでは、OX40の発現は、典型的には遅延され、より低いレベルで存在する。このタンパク質は、多数の別名で知られており、これらの中では、TNFRSF4、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4、TAX転写活性化糖タンパク質1受容体、OX40L受容体、ACT35抗原、CD134抗原、TXGP1L;Tax転写活性化糖タンパク質1受容体、リンパ系活性化抗原ACT35、OX40細胞表面抗原、ATC35抗原、OX40抗原、ACT35、CD134、及びIMD16がある。OX40についての外部Idsは、HGNC:11918、Entrez Gene:7293、Ensembl:ENSG00000186827、OMIM:600315、及びUniProtKB:P43489である。
CD40は、抗原提示細胞に見られる共刺激性タンパク質であり、それらの活性化に関与する。Tヘルパー細胞上のCD154(CD40L)CD40への結合は、抗原提示細胞を活性化し、CD40によって細胞内シグナル伝達を誘導し、様々な下流効果を誘導する。このタンパク質は、いくつもの異なる別名で知られており、これらの中には、CD40分子、CD40分子TNF受容体スーパーファミリーメンバー5、CD40L受容体、TNFRSF5、CDW40、Bp50、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー5、B細胞表面抗原CD40、B細胞表面抗原CD40、B細胞関連分子、CD40抗原、及びP50がある。CD40についての外部Idsは、HGNC:11919、Entrez Gene:958、Ensembl:ENSG00000101017、OMIM:109535、及びUniProtKB:P25942である。
Fas受容体は、プログラムされた細胞死(アポトーシス)をもたらす、細胞の表面上の細胞死受容体である。これは、より顕著なアポトーシス経路のうちの1つの一部を形成する。これは、いくつもの代替名で知られており、例えば、Fas細胞表面細胞死受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー6、アポトーシス媒介表面抗原FAS、TNF受容体スーパーファミリーメンバー6、FASLG受容体、CD95抗原、TNFRSF6、APT1、FAS1、APO-1細胞表面抗原、アポトーシス抗原1、Apo-1抗原、Fas AMA、ALPS1A、APO-1、FASTM、及びCD95である。FASについての外部Idsは、HGNC:11920、Entrez Gene:355、Ensembl:ENSG00000026103、OMIM:134637、及びUniProtKB:P25445である。
CD27は、T細胞免疫の発生及び長期維持に重要であると考えられている。これはリガンドCD70に結合し、B細胞活性化及び免疫グロブリン合成の調節において役割を果たす。CD27は、NF-κB及びMAPK8/JNKの活性化をもたらすシグナルを伝達する。CD27結合タンパク質(SIVA)、アポトーシスタンパク質は、この受容体に結合することができ、この受容体によって誘導されるアポトーシスにおいて役割を果たすと考えられている。このタンパク質の代替名は、とりわけ、CD27分子、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー7、T細胞活性化抗原CD27、CD27L受容体、TNFRSF7、T14、T細胞活性化抗原S152、CD27抗原、s152、LPFS2、S152及びTp55である。CD27についての外部Idsは、HGNC:11922、Entrez Gene:939、Ensembl:ENSG00000139193、OMIM:186711、及びUniProtKB:P26842である。
CD30は、活性化T及びB細胞によって発現される。TRAF2及びTRAF5は、この受容体と相互作用し、NF-κBの活性化をもたらすシグナル伝達を媒介すると考えられている。これはアポトーシスの正の調節因子であり、自己反応性CD8エフェクターT細胞の増殖可能性を制限し、自己免疫から身体を保護することも示されている。これは、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、TNFRSF8、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー8、リンパ球活性化抗原CD30、CD30L受容体、Ki-1抗原、D1S166E、CD30、サイトカイン受容体CD30、CD30抗原、及びKi-1である。CD30についての外部Idsは、HGNC:11923、Entrez Gene:943、Ensembl:ENSG00000120949、OMIM:153243、及びUniProtKB:P28908である。
CD137は、活性化T細胞によって発現され得る。また、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球、及び炎症部位における血管壁の細胞などの他の細胞にも見出される。このタンパク質は、T細胞の活性化のための、その共刺激活性について知られている。CD137は、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、TNFRSF9、TNF受容体スーパーファミリーメンバー9、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9、T細胞抗原4-1BBホモログ、4-1BBリガンド受容体、T細胞抗原ILA、CD137抗原、CDw137、ILA、インターロイキン活性化受容体、マウスLy63のホモログ、誘導性リンパ球活性化(Induced By Lymphocyte Activation、ILA)、マウス4-1BBのホモログ、受容体タンパク質4-1BB、T細胞抗原ILA、及び4-1BBである。CD137についての外部Idsは、HGNC:11924、Entrez Gene:3604、Ensembl:ENSG00000049249、OMIM:602250、及びUniProtKB:Q07011である。CD137は、活性化CD8+T細胞上で最も一般的にアップレギュレートされる誘導性受容体である。CD137シグナル伝達は、NF-κBを活性化することによってT細胞機能を増強する[Arch et al,1998]。CD4+T細胞、単球、B細胞、樹状細胞(dendritic cell、DC)サブ集団、及び顆粒球並びにNK細胞を含む他の細胞免疫細胞型は、様々なレベルでCD137を発現することができる[Shao et al,2011]。単球において、CD137は、リポ多糖(lipopolysaccharide、LPS)及びIL-1βによる活性化によって誘導可能である。Bリンパ球において、CD137発現は、細胞表面免疫グロブリンに対する抗体によって、及びEBVによる形質転換によって誘導される。DCにおいて、CD137ライゲーションは、炎症性サイトカイン(IL-6及びIL-12)の産生及びそれらの生存率の向上に加えて、B7共刺激分子(CD80及びCD86)のアップレギュレートを通してそれらの成熟を誘導する[Makkouk et al,2015]。好中球上のCD137ライゲーションの自然な機能は、細菌及び寄生虫感染の食作用の増加である。加えて、CD137のライゲーションは、インビトロで好中球及び好酸球中のIL-3/IL-5/GM-CSF受容体によって媒介される抗アポトーシスシグナルをブロックし、それによって顆粒球蓄積を防止する[Simon,2001;Vinay et al,2011]。軟骨細胞、内皮細胞、及び腫瘍細胞などの非リンパ系細胞において、CD137発現は、軟骨細胞に対するIL-1β、内皮細胞に対する炎症性サイトカインTNFα/IFNγ/IL-1β、及び腫瘍細胞に対するIFNγなどのサイトカイン刺激によって促進される。CD137(CD137L)を刺激するリガンドは、活性化抗原提示細胞上で発現される。CD137は、単量体及び二量体として膜中に存在する[Pollok et al,1993]。
細胞死受容体3は、活性化及び抗原経験Tリンパ球によって発現される。この受容体はまた、FoxP3正制御性Tリンパ球によっても発現される。受容体のリガンドはTL1A(TNFSF15)であり、このTL1A(TNFSF15)は、トル様受容体又はFc受容体の活性化後に、抗原提示細胞、及びいくつかの内皮細胞においてアップレギュレートされる。異なるアイソフォームをコードする様々な代替的にスプライシングされた転写変異体が報告されており、その大部分は、潜在的に分泌された分子である。この受容体は、T細胞活性化によって誘導されるリンパ球増殖の制御に関与すると考えられている。活性化は、T細胞受容体の以前の結合に依存すると考えられている。リガンドの結合は、IL-2受容体を介して内因性IL-2に対するT細胞の感受性を増加させ、T細胞増殖を増強させる。インビボ活性化は、同種抗原に遭遇するT細胞に対して特異的である可能性が高い。安静時、及び自己免疫下にない個体では、同族抗原に定期的に遭遇するT細胞の大部分は、FoxP3+制御性T細胞である。任意の他の外因性シグナルが存在しない場合の細胞死受容体3の刺激は、FoxP3+制御性(CD4陽性)T細胞の重要かつ特異的増殖を刺激する。細胞死受容体3の治療的アゴニストは、Treg細胞の増殖を刺激するために使用することができ、これは、喘息、同種異系固体臓器移植及び眼角膜炎の実験モデルにおける炎症を低減することができる。他方で、自己抗原又はワクチン抗原と一緒に受容体を共刺激することにより、免疫病理学の悪化又はワクチン刺激免疫の増強をそれぞれもたらし得る。受容体刺激は、T細胞媒介性免疫に対して特異的であり、これは、外来対自己抗原の利用能の時間コンテキスト及び質に応じて炎症を増強又は減衰させるために使用することができる。ヒトにおけるTNFRSF25の刺激は、CTLA-4及びPD-1などの分子を標的とする共刺激性遮断と同様であるが、より制御可能な効果をもたらし得る。細胞死受容体3は、いくつもの他の名称で知られており、例えばTNFRSF25、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー25、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー12(転位鎖会合性膜タンパク質)、細胞死のリンパ球関連受容体、アポトーシス媒介受容体TRAMP、アポトーシス媒介受容体DR3、アポトーシス誘導性受容体AIR、タンパク質WSL-1、TNFRSF12、APO-3、DDR3、LARD、DR3、アポトーシス誘導受容体、細胞死受容体β、タンパク質WSL、WSL-LR、TRAMP、WSL-1、APO3、WSL1、TR3、及びWSLである。細胞死受容体3についての外部Idsは、HGNC:11910、Entrez Gene:8718、Ensembl:ENSG00000215788、OMIM:603366、及びUniProtKB:Q93038である。
細胞死受容体4は、TRAILに結合し、細胞死シグナルを導入し細胞アポトーシスを誘導すると考えられるTNF受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。これは、いくつもの名称で知られており、例えば、TNFRSF10A、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10a、TNF関連アポトーシス誘導性リガンド受容体1、細胞死受容体4、TRAIL受容体1、TRAIL-R1、TRAILR1、APO2、DR4、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10a変異体2、細胞傷害性TRAIL受容体、CD261抗原、TRAILR-1、及びCD261である。細胞死受容体4についての外部Idsは、HGNC:11904、Entrez Gene:8797、Ensembl:ENSG00000104689、OMIM:603611、及びUniProtKB:O00220である。
細胞死受容体5は、TRAILに結合し、アポトーシスを媒介するTNF受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。この受容体は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド(TNFSF10/TRAIL/APO-2L)によって活性化され、アポトーシスシグナルを伝達することができる。この受容体は、いくつもの異なる名称で知られており、これらの中には、TNFRSF10B、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10b、TNF関連アポトーシス誘導性リガンド受容体2、細胞死受容体5、TRAIL-R2、TRAILR2、KILLER、TRICK2、ZTNFR9、DR5、P53制御DNA損傷誘導性細胞死受容体(キラー)、腫瘍壊死因子受容体様タンパク質ZTNFR9、TRAIL/Apo-2L用の受容体を含有する細胞死ドメイン、アポトーシス誘導タンパク質TRICK2A/2B、アポトーシス誘導受容体TRAIL-R2、TNF受容体スーパーファミリーメンバー10b、細胞傷害性TRAIL受容体-2、Fas様タンパク質、TRAIL受容体2、CD262抗原、KILLER/DR5、TRICK2A、TRICK2B、TRICKB、及びCD262がある。細胞死受容体5についての外部Idsは、HGNC:11905、Entrez Gene:8795、Ensembl:ENSG00000120889、OMIM:603612、及びUniProtKB:O14763である。
細胞死受容体6は、活性化時に細胞アポトーシスを誘導することができる。マウスにおけるノックアウト研究は、この受容体がTヘルパー細胞活性化において役割を果たし、炎症及び免疫調節に関与し得ることを示唆している。この受容体はまた、アルツハイマー病、並びにストレス応答及び細胞生存におけるシグナル伝達を引き起こす脳における神経変性に関与すると考えられている。過剰発現は、発現細胞のアポトーシスを誘導する。APP(amyloid precursor protein、アミロイド前駆体タンパク質)は、この受容体の天然リガンドであり、最初にAβ及びN-APPに切断される。N-APPは、DR6と相互作用してアルツハイマー患者における軸索分解を引き起こす断片である。細胞死受容体6は、いくつもの他の名称で知られており、例えばTNFRSF21、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー21、DR6、TNFR関連細胞死受容体6、CD358抗原、BM-018、及びCD358である。細胞死受容体6についての外部Idsは、HGNC:13469、Entrez Gene:27242、Ensembl:ENSG00000146072、OMIM:605732、UniProtKB:O75509である。
RANKは、RANK-リガンド(RANK-Ligand、RANKL)の受容体であり、破骨細胞の分化及び活性化を調節するRANK/RANKL/OPGシグナル伝達経路の一部である。これは、骨リモデリング並びに修復、免疫細胞機能、リンパ節発生、熱調節、及び乳腺の発生に関連している。オステオプロテゲリン(Osteoprotegerin、OPG)は、RANKのデコイ受容体であり、RANKLに競合することによって、RANKシグナル伝達経路の刺激を調節する。RANKの細胞質ドメインは、NF-κB及びJNKなどの下流標的にシグナルを伝達する。RANKは、骨格筋、胸腺、肝臓、結腸、小腸、副腎、破骨細胞、乳腺上皮細胞、前立腺、血管細胞、及び膵臓で発現される。NF-κBの活性化は、RANKLによって媒介されることが多いが、RANK単独の過剰発現は、NF-κB経路を活性化させることもできる。RANKは、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、TNFRSF11A、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー11aNFKB活性化因子、ヘテロ接合性の喪失、18、染色体領域1、破骨細胞分化因子受容体、NF-KBの受容体活性化因子、骨ページェット病2、ODFR、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー11a、NFKBの活性化因子、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー11a、NFKB活性化因子、核因子-カッパBの受容体活性化因子、CD265抗原、LOH18CR1、TRANCER、CD265、OPTB7、OSTS、PDB2、FEO、及びOFEである。RANKについての外部Idsは、HGNC:11908、Entrez Gene:8792、Ensembl:ENSG00000141655、OMIM:603499、及びUniProtKB:Q9Y6Q6である。
BAFF受容体は、BAFFを認識するTNF受容体スーパーファミリーの膜タンパク質である。B細胞活性化因子(B-cell activating factor、BAFF)は、インビトロでB細胞の生存を増強させ、末梢B細胞集団の調節因子である。BAFF受容体は、BAFFの受容体であり、単一細胞外フェニルアラニンリッチドメインを含有するIII型膜貫通タンパク質である。この受容体は、BAFF媒介成熟B細胞の生存に必要とされる主要な受容体であると考えられている。BAFFはまた、TNF受容体B細胞成熟抗原(BCMA)及び膜貫通活性因子並びにカルシウム調節シクロフィリンリガンド相互作用タンパク質(TACI)によって結合される。BAFF受容体は、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、TNFRSF13C、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー13C、B細胞活性化因子受容体、BLyS受容体3、BAFF-R、BAFFR、B細胞活性化因子受容体、CD268抗原、プロリキシン、BROMIX、CD268、CVID4、及びBR3である。BAFF受容体の外部Idsは、HGNC:17755、Entrez Gene:115650、Ensembl:ENSG00000159958、OMIM:606269、及びUniProtKB:Q96RJ3である。
B細胞成熟抗原(BCMA)は、B細胞活性化因子(BAFF)を認識するTNF受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。この受容体は、成熟Bリンパ球において優先的に発現され、B細胞の発生及び自己免疫応答にとって重要であると考えられている。この受容体は、腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー13b(TNFSF13B/TALL-1/BAFF)に特異的に結合し、NF-カッパB及びMAPK8/JNKの活性化につながることが示されている。B細胞成熟抗原は、いくつもの別名でも知られており、例えばTNFRSF17、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17、B細胞成熟タンパク質、BCM、B細胞成熟因子、CD269抗原、TNFRSF13A、及びCD269である。BCMAについての外部Idsは、HGNC:11913、Entrez Gene:608、Ensembl:ENSG00000048462、OMIM:109545、及びUniProtKB:Q02223である。
膜貫通活性化因子及びカルシウム調節シクロフィリンリガンド相互作用タンパク質(TACI)。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリーのリンパ球特異的メンバーである。これは、カルシウム調節因子及びシクロフィリンリガンド(calcium-modulator and cyclophilin ligand、CAML)と相互作用する。このタンパク質はまた、BAFF及びAPRIL(TNSF13又はCD256)にも結合することができる。TACIは、転写因子NFAT、AP1、及びNF-κ-Bの活性化を誘導し、TNFリガンドと相互作用することによって、体液性免疫で役割を果たす。TACIを欠損したマウスは、脾臓B細胞及び血清Igの増加を有し、これは、B細胞の生存におけるTACIの潜在的な負の調節的役割を意味することを示唆した。しかしながら、より単純な説明は、TACIの欠如が、BR3に結合し、B細胞の数を増加させることができる、より循環するBAFFが利用可能となることであり得る。TACIに関連する疾患としては、分類不能型免疫不全症2、及び免疫グロブリンa不全症2が挙げられる。TACIをコードする遺伝子は、17番染色体上のスミス-マギニス症候群領域内に位置する。TACIは、多くの他の名称でも知られており、例えば、TNFRSF13B、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー13B、膜貫通活性化因子及びCAMLインターラクター、腫瘍壊死因子受容体13B、CD267抗原、TNFRSF14B、CD267、CVID2、IGAD2、CVID、及びRYZN3である。TACIについての外部Idsは、HGNC:18153、Entrez Gene:23495、Ensembl:ENSG00000240505、OMIM:604907、及びUniProtKB:O14836である。
TROYは、胚発生中に発現される。これは、細胞中で過剰発現させたとき、JNKシグナル伝達経路を活性化することが示されている。この受容体の活性化は、アポトーシスを誘導することができる。この受容体は、胚発生において役割を果たすと考えられている。あるいは、異なるアイソフォームをコードするスプライシングされた転写変異体が記載されている。TROYは、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、TNFRSF19、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー19、毒性及びJNK誘導因子、TRADE、TAJ、及びTAJ-アルファである。TROYについての外部Idsは、HGNC:11915、Entrez Gene:55504、Ensembl:ENSG00000127863、OMIM:606122、及びUniProtKB:Q9NS68である。
B7ファミリーは、免疫応答を調節するリンパ球上の受容体に結合する、多くの構造的に関連する細胞表面タンパク質を含む。リンパ球の活性化は、細胞表面、抗原特異的T細胞受容体、又はB細胞受容体の結合によって開始される。B7リガンドによって同時に送達される追加のシグナルは、これらの細胞の免疫応答を更に決定する。これらのいわゆる「共刺激性」又は「共抑制性」シグナルは、リンパ球上のCD28ファミリーの受容体を介してB7ファミリーメンバーによって送達される。共刺激性受容体とのB7ファミリーメンバーの結合は、免疫応答を増強し、共抑制性受容体との結合は、免疫応答が減衰させる。現在、以下のメンバーは、このファミリーの一部であると考えられている:B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、誘導性共刺激リガンド(inducible costimulator ligand、ICOS-L)、プログラム細胞死リガンド1(programmed death-1 ligand、PD-L1)、プログラム細胞死リガンド2(programmed death-2 ligand、PD-L2)、B7-H3(CD276)、B7-H4、B7-H5、B7-H6、及びB7-H7.B7ファミリーメンバーは、リンパ系組織及び非リンパ系組織で発現される。免疫応答の調節に及ぼすメンバーの効果は、B7ファミリー遺伝子における突然変異を有するマウスにおける免疫不全症及び自己免疫疾患の発症で示されている。B7リガンドによって送達されるシグナルの操作は、自己免疫、炎症性疾患、及びがんの治療における可能性を示している。
TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分及びB7ファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する、本発明による結合分子又は抗体若しくはその変異体は、B7ファミリーメンバーが、リンパ球に「共刺激性」又は「共抑制性」シグナルを送達し、それによって免疫応答を増強又は減衰させるために、所望の免疫応答が特に良好に促進され得るという利点を提供する。したがって、B7ファミリーのメンバーを標的化することによって、刺激性シグナルを増強すること、及び/又は抑制性シグナルを相殺することが可能であり、それによって、例えば異常細胞に対して所望の免疫応答を誘導又は増強することが可能である。
CD80は、T細胞活性化及び生存に必要な共刺激性シグナルを提供する、活性化B細胞及び単球上に見出されるタンパク質である。これは、T細胞表面上の2つの異なるタンパク質:CD28及びCTLA-4のリガンドである。CD28に結合されると、これが共刺激と関連付けられるのに対し、CTLA4への結合は、免疫応答の減衰と関連付けられる。CD80は、T細胞を活性化するためにCD86と連携して機能する。CD80は、PD-L1にも結合することが報告されている。CD80は、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、CD80分子、CD80抗原、CD28抗原リガンド1、B7-1抗原、Bリンパ球活性化抗原B7、CTLA-4カウンター受容体B7.1、活性化B7-1抗原、CD28LG1、CD28LG、LAB7、BB1、B7、共刺激因子CD80、CD80抗原、及びB7-1である。CD80についての外部Idsは、HGNC:1700、Entrez Gene:941、Ensembl:ENSG00000121594、OMIM:112203、及びUniProtKB:P33681である。
CD86は、抗原提示細胞上で発現されるタンパク質である。これは、T細胞活性化及び生存のための共刺激性シグナルを提供することができる。これは、T細胞表面上の2つの異なるタンパク質:CD28及びCTLA-4のリガンドである。CD28に結合されると、これが共刺激と関連付けられるのに対し、CTLA4への結合は、免疫応答の減衰と関連付けられる。CD86は、T細胞を活性化するためにCD80と連携して機能する。これは、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、CD86分子、CD86抗原、CD28抗原リガンド2、B7-2抗原、CTLA-4カウンター受容体B7.2、CD28LG2、FUN-1、BU63、B70、Bリンパ球活性化抗原B7-2、Bリンパ球抗原B7-2、活性化B7-2抗原、CD86抗原、LAB72、及びB7-2である。CD86についての外部Idsは、HGNC:1705、Entrez Gene:942、Ensembl:ENSG00000114013、OMIM:601020、及びUniProtKB:P42081である。
誘導性T細胞共刺激リガンド(ICOSL又はCD275)は、APC並びにいくつもの非血液組織によって構成的に発現される。発現は、進行中の炎症でダウンレギュレートされ得る。ICOSLは、ヒトにおけるICOS、CD28、及びCTLA-4と相互作用することが現在知られている。ICOSL/CD28相互作用は、ヒトT細胞の一次応答を同種異系抗原及びメモリリコール応答に共刺激するように見える。ICOSL/CTLA-4は、共抑制性シグナルをもたらすと考えられている。ICOSLは、ICOSLG、B7関連タンパク質1、B7ホモログ2、B7様タンパク質GI50、B7相同体2、B7RP-1、B7-H2、B7RP1、B7H2、膜貫通タンパク質B7-H2 ICOSリガンド、CD275抗原、KIAA0653、ICOS-L、LICOS、及びGL50としても知られている。ICOSLについての外部Idsは、HGNC:17087、Entrez Gene:23308、Ensembl:ENSG00000160223、OMIM:605717、及びUniProtKB:O75144である。
PD-L1は、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、及び肝炎などの他の疾患状態などの特定の事象中に免疫応答を抑制する役割を果たす、1型膜貫通タンパク質である。PD-L1は、様々な種類のがん、特にNSCLC(Boland et al.,2013;Velcheti et al.,2014)、黒色腫、腎細胞癌、胃がん、肝細胞並びに様々な白血病及び多発性骨髄腫(Bernstein et al.,2014;Thompson et al.,2005)で発現される。PD-L1は、がん細胞の細胞質及び原形質膜に存在するが、全てのがん又は腫瘍内の全ての細胞がPD-L1を発現するわけではない(Dong et al.,2002)。複数の腫瘍微小環境細胞は、PD-L1発現をアップレギュレートすることによって免疫抑制に寄与する。この効果は、活性化T細胞によって産生されたIFN-γに応答してPD-L1を誘導することによって、腫瘍がそれ自体を保護するために、「適応免疫抵抗」と呼ばれる(Sharma et al.,2017)。PD-L1はまた、癌遺伝子によって調節されることが可能であり、この機構は固有の免疫耐性として知られている(Akbay et al.,2013)。腫瘍微小環境内では、PD-L1はまた、骨髄細胞及び活性化T細胞上でも発現される(Tumeh et al.,2014)。PD-L1の発現は、I型及びII型IFN-γ、TNF-α、LPS、GM-CSF、及びVEGF、並びにサイトカインIL-10及びIL-4を含む複数の炎症誘発性分子によって誘導されIFN-γが、最も強力な誘導因子である(Kondo et al.,2010;Sznol and Chen,2013)。
PD-L1のPD-1又はB7.1(CD80)への結合は、抑制性シグナルを伝達し、これは、T細胞を発現するPD-1の増殖を低減する。PD-1は、アポトーシスを介した外来抗原特異的T細胞の蓄積を制御することができると考えられている。PD-L1は、様々ながん細胞によって発現され、その発現は、がん細胞に対して免疫応答を弱めることに少なくとも部分的に関与すると考えられている。PD-L1は、B7ファミリーのタンパク質のメンバーであり、様々な他の名称で知られており、例えば、CD274分子、CD274抗原、B7ホモログ1、PDCD1リガンド1、PDCD1LG1、PDCD1L1、B7H1、PDL1、プログラム細胞死1リガンド1、プログラム細胞死リガンド1、B7-H1、及びB7-Hであり、CD274についての外部Idsは、HGNC:17635、Entrez Gene:29126、Ensembl:ENSG00000120217、OMIM:605402、UniProtKB:Q9NZQ7である。
PD-L2は、PD-1に対する第2のリガンドである。PD-L2によるPD-1の結合は、CD4+T細胞によるT細胞受容体(T cell receptor、TCR)媒介性増殖及びサイトカイン産生を阻害する。低抗原濃度では、PD-L2/PD-1結合は、B7-CD28シグナルを阻害する。高抗原濃度では、PD-L2/PD-1結合は、サイトカイン産生を低減する。PD-L発現は、インターフェロンガンマ治療によって抗原提示細胞上でアップレギュレートされる。これは、いくつかの正常な組織及び様々な腫瘍で発現される。PD-L1及びPD-L2は、重複する機能を有し、T細胞応答を調節すると考えられている。このタンパク質は、いくつもの他の名称で知られており、例えば、プログラム細胞死1リガンド2、B7樹状細胞分子、プログラム細胞死リガンド2、ブチロフィリンB7-DC、PDCD1リガンド2、PD-1リガンド2、PDCD1L2、B7-DC、CD273、B7DC、PDL2、PD-1-リガンド2、CD273抗原、BA574F11.2、及びBtdcである。PD-L2についての外部Idsは、HGNC:18731、Entrez Gene:80380、Ensembl:ENSG00000197646、OMIM:605723、及びUniProtKB:Q9BQ51である。
B7-H3(CD276)の発現は、様々な悪性疾患において増加し、正常細胞と腫瘍由来循環内皮細胞間を区別することができる(Kraan et al British Journal of Cancer(2014)111,149-156)。この受容体の刺激は、ヒト骨髄間質細胞の骨芽細胞への分化を誘導する(Xu et al 2011;Immunobiology 216(2011)1311-1317)。このタンパク質は、ヒトにおいて4つのIg様ドメインを含有するが、マウスタンパク質は、このようなドメインの2つを有するように見える。このタンパク質は、骨髄細胞発現トリガー受容体(triggering receptor expressed on myeloid cells、TREM)様転写物2(TLT-2又はTREMML2)の最初に同定されたリガンドであると考えられている。後者のタンパク質は、B7-H3(4lg-B7-H3)に結合し、CD8 T細胞の活性化を共刺激する(Hofmeyer et al 2009 PNAS 105;10277-10278)。CD276は、広範に発現される。これは、T細胞共刺激分子として作用する。CD276もまた、いくつもの他の名称で知られており、例えば、CD276分子、共刺激分子、CD276抗原、B7ホモログ3、4Ig-B7-H3、B7-H3、B7H3、及びB7RP-2である。CD276についての外部Idsは、HGNC:19137、Entrez Gene:80381、Ensembl:ENSG00000103855、OMIM:605715、及びUniProtKB:Q5ZPR3である。
B7-H4(VTCN1)mRNAは、広範発現されるように見えるが、いくつかの細胞のみが、膜上でタンパク質を能動的に発現する。B7-H4発現及び活性化T細胞への結合は、細胞周期停止、減少した増殖、及び低減されたIL-2産生を介して、T細胞エフェクター機能を阻害する。B7-H4は、様々なヒトのがんにおけるがん細胞及び免疫抑制性の腫瘍随伴マクロファージ(tumor-associated macrophage、TAM)の表面上でアップレギュレートされる。B7-H4経路によるシグナル伝達は、TCR媒介CD4+並びにCD8+T細胞増殖、細胞周期の進行、及びIL-2の産生の阻害をもたらす。B7-H4もまた、いくつもの他の名称で知られており、例えば、V-Setドメイン含有T細胞活性化阻害剤1、免疫共刺激性タンパク質B7-H4、T-細胞共刺激性分子B7x、B7スーパーファミリーメンバー1、B7ホモログ4、B7h.5、B7H4、T細胞共刺激性分子B7x、B7ファミリーメンバー、H4、タンパク質B7S1、PRO1291、VCTN1、B7S1、B7X、及びH4 2である。B7-H4についての外部Idsは、HGNC:28873、Entrez Gene:79679、Ensembl:ENSG00000134258、OMIM:608162、及びUniProtKB:Q7Z7D3である。
B7-H5(VISTA)は、B7ファミリーの55~65kDaのメンバーである。これは、骨内で、胚性幹細胞(embryonic stem cell、ESC)上で、及び腫瘍細胞表面上で発現する膜貫通分子である。腫瘍細胞では、このタンパク質は、MT1-MMP発現及び活性を促進し、MT1-MMPの基質として機能する。これにより、細胞運動性の可能性を増加させる。このタンパク質は、いくつもの他の名称で知られており、例えば、10番染色体オープンリーディングフレーム54、V-Setドメイン含有免疫調節受容体、T細胞活性化のV-ドメインIg抑制因子、ストレス誘発性分泌タンパク質-1、Sisp-1、SISP1、ストレス誘発性分泌タンパク質1、血小板受容体GI24、血小板受容体Gi24、細胞死ドメイン1アルファ、DD1アルファ、B7H5、及びGI24である。このタンパク質についての外部Idsは、HGNC:30085、Entrez Gene:64115、Ensembl:ENSG00000107738、OMIM:615608、及びUniProtKB:Q9H7M9である。
B7-H6は、B7ファミリーに属し(MIM 605402を参照)、腫瘍細胞上で選択的に発現される。B7-H6のNKp30(NCR3;MIM611550)との結合は、ナチュラルキラー(natural killer、NK)細胞の活性化及び細胞傷害性をもたらす(Brandt et al.2009 J Exp Med.2009 Jul 6:206(7):1495-503)。ナチュラルキラー(NK)細胞は、腫瘍の排除に関与する自然免疫系のリンパ球である。B7-H6は、NKp30に結合する腫瘍細胞表面分子であり、抗腫瘍NK細胞の細胞傷害性及びサイトカイン分泌を引き起こすヒト受容体である。B7-H6についての他の名称は、NCR3LG1、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性受容体3リガンド1、B7ホモログ6、B7H6、推定Ig様ドメイン含有タンパク質DKFZp686O24166/DKFZp686I21167、及びDKFZp686O24166である。B7-H6についての外部Idsは、HGNC:42400、Entrez Gene:374383、Ensembl:ENSG00000188211、OMIM:613714、及びUniProtKB:Q68D85である。
B7-H7(HHLA2)タンパク質は、胎盤の栄養芽球細胞、並びに腸、腎臓、胆嚢、及び乳房の上皮において検出されたが、ほとんどの他の器官では検出されなかった。HHLA2タンパク質は、乳房、肺、甲状腺、黒色腫、膵臓、卵巣、肝臓、膀胱、結腸、前立腺、腎臓、及び食道からのヒトのがんにおいて広範に発現される。高HHLA2発現は、局所リンパ節転移及びステージに関連している(Janakiram et al.Clin Cancer Res;21(10):2359-66;May 15,2015)。TMIGD2は、HHLA2に対する受容体のうちの1つとして同定されている。B7-H7は、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、HERV-H LTR関連2、ヒト内因性レトロウイルス-H長い末端反復関連タンパク質2(Human Endogenous Retrovirus-H Long Terminal Repeat-Associating Protein 2)、B7H7、及びB7yである。B7-H7についての外部Idsは、HGNC:4905、Entrez Gene:11148、Ensembl:ENSG00000114455、OMIM:604371、及びUniProtKB:Q9UM44である。
プログラム細胞死1タンパク質(Programmed Cell Death 1、PD-1)は、受容体のCD28ファミリーに属し、T細胞及びプロB細胞上で発現される細胞表面受容体である。PD-1は、現在、2つのリガンド、PD-L1及びPD-L2に結合することが知られている。免疫チェックポイントとして機能するPD-1は、T細胞の活性化を阻害することによって免疫系をダウンレギュレートする上で重要な役割を果たし、これは、更に自己免疫を低減し、自己寛容を促進する。PD-1の阻害効果は、リンパ節中の抗原特異的T細胞におけるアポトーシス(プログラム細胞死)を促進する一方で、同時に制御性T細胞(サプレッサーT細胞)におけるアポトーシスを低減する二重機構によって達成されると考えられている。PD-1は、いくつもの異なる別名でも知られており、例えば、PDCD1、プログラム細胞死1、全身性エリテマトーデス感受性2、タンパク質PD-1、HPD-1、PD1、プログラム細胞死1タンパク質、CD279抗原、CD279、HPD-L、HSLE1、SLEB2、及びPD-1である。PD-1についての外部Idsは、HGNC:8760、Entrez Gene:5133、Ensembl:ENSG00000188389、OMIM:600244、及びUniProtKB:Q15116である。PD-1の活性をブロックする薬剤の新しい部類であるPD-1阻害剤は、免疫系を活性化して腫瘍を攻撃し、したがっていくつかの種類のがんの治療に成功して使用されている。
CLEC12Aもまた、C型レクチンドメインファミリー12、メンバーA、C型レクチンタンパク質CLL-1、MICL、樹状細胞関連レクチン2、C型レクチンスーパーファミリー、骨髄阻害性C型レクチン様受容体、C型レクチン様分子-1、CLL-1、DCAL2、CLL1、C型レクチン様分子1、DCAL-2、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーL、メンバー1(Killer cell lectin like receptor subfamily L,member 1、KLRL1)、CD371(Bakker A.et al.Cancer Res.2004,64,p8843 50;GenBankTMアクセス番号:AY547296;Zhang W.et al.GenBankTMアクセス番号:AF247788;A.S.Marshall,et al.J Biol Chem 2004,279.p14792-802;GenBankTMアクセス番号:AY498550;Y.Han et al.Blood 2004,104、p2858 66;H.Floyd,et al.GenBankTMアクセス番号:AY426759;C.H.Chen,et al.Blood 2006,107,p1459 67)と称される。Ids;HGNC:31713;Entrez Gene:160364、Ensembl:ENSG00000172322、OMIM:612088、UniProtKB:Q5QGZ9である。CLEC12Aは、白血病性芽球細胞及び急性骨髄性白血病(acute myeloid leukemia、AML)における白血病性幹細胞上で発現される抗原であり、CD34陰性又はCD34低発現白血病性幹細胞(サイドポピュレーション)で発現される抗原である(A.B.Bakker et al.Cancer Res 2004,64、p8443 50;Van Rhenen et al.2007 Blood 110:2659;Moshaver et al.2008 Stem Cells 26:3059)。CLEC12Aの発現は、その他の点では、造血系に、特に末梢血及び骨髄中の骨髄細胞、すなわち顆粒球、単球、及び樹状細胞前駆体に制限されると考えられている。より重要なことに、CLEC12Aは、造血幹細胞には存在しない。この発現プロファイルは、CLEC12AをAMLにおいて、特に好ましい標的とする。CLEC12Aの全長形態は、他のアイソフォームではほとんど存在しない10個のアミノ酸の更なる細胞内ストレッチを含む、275個のアミノ酸残基を含み、厳密な骨髄発現プロファイル(表面発現及びmRNAレベル)を示す。「CLEC12A又はその機能的等価物」という用語は、Bakker et al.Cancer Res 2004,64,p8443-50及びMarshall 2004-J Biol Chem 279(15)、p14792-802に記載されているように、厳密な骨髄発現プロファイル(表面発現レベル及びmRNAレベルの両方)を保持する上記で言及される全ての(スプライス及び突然変異などの)変異体及びそのアイソフォームを意味する。本発明のCLEC12A結合抗体は、ヒトCLEC12Aに結合する。本明細書において、CLEC12Aに言及される場合、特に明記しない限り、ヒトCLEC12Aを指す。
「ErbB1」又は「EGFR」は、Her-又はcErbB-1、-2、-3及び-4と命名された4つの受容体チロシンキナーゼ(receptor tyrosine kinase、RTK)のファミリーのメンバーである。EGFRは、4つのサブドメインから構成される細胞外ドメイン(extracellular domain、ECD)を有し、これらのドメインのうちの2つは、リガンド結合に関与し、そのうちの1つは、ホモ二量体化及びヘテロ二量体化に関与する。この項で使用される参照番号は、「本明細書で引用された参照文献」との表題が付けられた列挙の番号付けを指す。EGFRは、多様な細胞内応答を得るために、様々なリガンドからの細胞外シグナルを統合する。EGFRにより活性化される主要シグナル伝達経路は、Rasマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(mitogen-activated protein kinase、MAPK)有糸分裂シグナル伝達カスケードから構成される。この経路の活性化は、Grb2のチロシンリン酸化EGFRへの動員によって開始される。これは、Grb2結合Rasグアニンヌクレオチド交換因子Son of Sevenless(SOS)を介してRasの活性化をもたらす。加えて、PI3-キナーゼ-Aktシグナル伝達経路はまた、EGFRによって活性化されるが、この活性化は、Her3の共発現が存在する場合にははるかに強力である。EGFRは、いくつかのヒト上皮悪性腫瘍、特に乳房、膀胱、非小細胞肺がん肺、結腸、卵巣、頭頸部、及び脳のがんに関与している。この遺伝子における活性化突然変異、並びに受容体及びそのリガンドの過剰発現が見出されており、自己分泌活性化ループが生じる。したがって、このRTKは、がん療法の標的として広く使用されている。細胞外リガンド結合ドメインに指向されたRTK及びモノクローナル抗体(monoclonal antibody、mAb)を標的とする小分子阻害剤の両方が開発されてきたが、これは、今までのところは、ほとんどが患者の選択群に関してだが、いくつかの臨床的成功を示している。ヒトEGFRタンパク質及びそれをコードする遺伝子についてのデータベース登録番号は、(GenBank NM_005228.3)である。この登録番号は、主に、EGFRタンパク質を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、抗体によって結合されたEGFRタンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。本明細書において、EGFRに言及される場合、特に明記しない限り、ヒトEGFRを指す。EGFRに結合する抗原結合部位は、EGFR及びいくつかのEGFR陽性腫瘍で発現されたものなどの様々な変異体に結合する。
本明細書で使用するとき、「ErbB-2」又は「HER2」は、ヒトにおいてERBB-2遺伝子によりコードされるタンパク質を指す。この遺伝子又はタンパク質の代替名としては、CD340、HER-2、HER-2/neu、MLN 19、NEU、NGL、TKR1が挙げられる。ERBB-2遺伝子は、HER2(human epidermal growth factor receptor 2、ヒト表皮増殖因子受容体2)と呼ばれることが多い。本明細書においてErbB-2に言及する場合、この言及は、ヒトErbB-2を指す。ErbB-2に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒトErbB-2に結合する。ErbB-2抗原結合部位は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトErbB-2タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号の番号は、(NP_001005862.1、NP_004439.2、NC_000017.10、NT_010783.15、NC_018928.2)である。この登録番号は、主に、ErbB-2を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、抗体によって結合されたErbB-2タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。ErbB-2抗原結合部位は、ErbB-2、及びいくつかのErbB-2陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。
本明細書で使用するとき、「ErbB-3」又は「HER3」は、ヒトにおいてERBB-3遺伝子によりコードされるタンパク質を指す。遺伝子又はタンパク質の代替名は、HER3、LCCS2、MDA-BF-1、c-ErbB-3、c-erbb-3、erbb-3-S、p180-Erbb-3、p45-sErbb-3、及びp85-sErbb-3である。本明細書においてErbB-3に言及する場合、この言及は、ヒトErbB-3を指す。ErbB-3に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒトErbB-3に結合する。ErbB-3抗原結合部位は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトErbB-3タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号は、(NP_001005915.1、NP_001973.2、NC_000012.11、NC_0118923.2、NT_0029419.12)である。この登録番号は、主に、ErbB-3を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、抗体によって結合されたErbB-3タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。ErbB-3抗原結合部位は、ErbB-3、及びいくつかのErbB-2陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。
LGR4は、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体4である。この遺伝子又はタンパク質の代替名は、GPR48、Gタンパク質共役受容体48、BNMD17、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体4、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体4、Gタンパク質共役受容体48である。
LGR4に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトLGR4に結合する。本発明のLGR4結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトLGR4タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号の番号は、(NC_00000011.10、NC_018922.2、NT_009237.19、NP_060960.2)である。この登録番号は、主に、LGR4を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、結合されたLGR4タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。LGR4抗原結合部位は、LGR4及びいくつかのLGR4陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。
LGR5は、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体5である。この遺伝子又はタンパク質の代替名は、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体5、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体5、Gタンパク質共役受容体HG38、Gタンパク質共役受容体49、Gタンパク質共役受容体67、GPR67、GPR49、オーファンGタンパク質共役受容体HG38、Gタンパク質共役受容体49、GPR49、Hg38、及びFEXである。
LGR5に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトLGR5に結合する。本発明のLGR5結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトLGR5タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号の番号は、(NC_000012.12、NT_029419.13、NC_018923.2、NP_001264155.1、NP_001264156.1、NP_003658.1)である。この登録番号は、主に、LGR5を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、結合されたLGR5タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。LGR5抗原結合部位は、LGR5及びいくつかのLGR5陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。
ZNRF3は、ジンク及びリングフィンガー3である。この遺伝子又はタンパク質についての代替名は、ジンク及びリングフィンガー3、ジンク/リングフィンガータンパク質3、リングフィンガータンパク質203、KIAA1133、RNF203、新規なC3HC4型ジンクフィンガーフィンガー(リングフィンガー)、E3ユビキチン-タンパク質リガーゼZNRF3、CTA-292E10.6、EC 6.3.2.、及びBK747E2.3 3である。
ZNRF3に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトZNRF3に結合する。本発明のZNRF3結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトZNRF3タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号の番号は、(NC_000022.11、NT_0011520.13、NC_018933.2、NP_001193927.1、NP_115549.2)である。この登録番号は、主に、ZNRF3を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、結合されたZNRF3タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。ZNRF3抗原結合部位は、ZNRF3及びいくつかのZNRF3陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。
RNF43は、リングフィンガータンパク質43である。この遺伝子又はタンパク質の代替名は、リングフィンガータンパク質43、RNF124、E3ユビキチン-タンパク質リガーゼRNF43、リングフィンガータンパク質43、EC6.3.2.、URCCである。
RNF43に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトRNF43に結合する。本発明のRNF43結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトRNF43タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号の番号は、(NC_000017.11、NT_010783.16、NC_018928.2、NP_001292473.1、NP_001292474.1、NP_060233.3)である。この登録番号は、主に、RNF43を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、結合されたRNF43タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。RNF43抗原結合部位は、RNF43及びいくつかのRNF43陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。
配列識別子を参照して、どのタンパク質が標的化されているかを特定する。本発明の抗体などの結合分子はまた、抗体のそれぞれの可変ドメインによって認識されるエピトープが影響を受けていない限り、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、及びその突然変異体などの、少なくともいくつかの変異体も認識する。代替名のいくつかは、他のタンパク質を参照するために使用されてもよく、又は使用されなくてもよい。名称は、参照目的のためのみに与えられる。本発明の抗体などの結合分子は、細胞上で発現されるとき、タンパク質に結合する。これは、結合分子が結合するエピトープが利用可能である限り、タンパク質の変異体に結合することもできる。したがって、スプライス変異体又は突然変異体タンパク質(存在する場合)も、エピトープが利用可能である限り、結合される。結合分子が示されたタンパク質に結合するという事実は、これが特性としてタンパク質に結合することができることを意味し、結合分子がそうであっても、結合分子が実際に標的に結合していることを意味するものではない。また、抗体が他のタンパク質に結合しないことも意味しない。このような交差反応性は、本発明の抗体などの結合分子に関しては現時点では知られていない。しかしながら、このような交差反応性が存在し得ることは明示的に除外されない。
本発明は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分(第1の膜タンパク質)及び第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる結合分子を開示する。第2の膜タンパク質は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。このような結合分子は更に、「本発明の結合分子」とも称される。結合分子は、好ましくは結合タンパク質である。好ましい実施形態では、結合分子は、抗体又はその変異体、好ましくは二重特異性抗体又はその変異体である。本明細書に記載の結合分子を2つ以上含む組成物及びキットオブパーツも提供される。
本発明の結合分子は、好ましくは、抗体(又は、本願の他の箇所に記載されるようなその変異体)、抗体模倣体、ポリペプチド、アプタマー、又はこれらの組み合わせである。これらのタンパク質又はアプタマーは、典型的には、1つの標的に結合する。本発明の結合分子は、2つ以上の標的に結合する。結合分子は、好ましくは、2つの標的に結合する。抗体又は二重特異性抗体の変異体は、この態様を維持する。結合タンパク質又はアプタマーは、標的が結合している結合部位(抗原結合部位)を有する。結合タンパク質又はアプタマーは、好ましくは、標的(抗原)の結合部位、好ましくはドメイン当たり1つの結合部位を有する2つ以上のドメインを含む。このようなドメインは、好ましくは抗体可変ドメイン又はその変異体である。抗体可変ドメインは、多くの研究の対象であった。正常な可変ドメインの結合特異性を保持する可変ドメイン又はその部分に類似する多くの変異体が作製される。このような変異体の非限定的な例は、本明細書の他の箇所に記載されている。
これらの抗体、抗体模倣体、ポリペプチド及びアプタマーの任意の組み合わせは、当該技術分野において既知の方法によって一緒に連結され得ることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、コンジュゲート又は融合タンパク質である。抗体については、多重特異性抗体を作製する技術が、正常な単一特異性抗体と同じ全体構造を有する二重特異性抗体も含むように進行しているが、抗体の2つのアームはそれぞれ異なる標的に結合する。
抗体模倣体は、抗体と同様に、抗原に特異的に結合することができるが、抗体に構造的に関連しないポリペプチドである。抗体模倣体は、通常、約3~20kDaのモル質量を有する人工ペプチド又はタンパク質である。抗体に対する共通の利点は、より良好な溶解性、組織浸透、熱及び酵素に対する安定性、並びに比較的低い生産コストである。抗体模倣体の非限定的な例は、アフィボディ分子(典型的には、プロテインAのZドメインに基づく)、アフィリン(典型的には、ガンマ-B結晶質又はユビキチンに基づく)、アフィマー(典型的には、シスタチンに基づく)、アフィチン(典型的には、スルホロブス・アシドカルダリス(Sulfolobus acidocaldarius)からのSac7dに基づく)、アルファボディ(典型的には、三重螺旋コイルドコイルに基づく)、アンチカリン(典型的には、リポカリンに基づく)、アビマー(典型的には、様々な膜受容体のAドメインに基づく)、DARPin(典型的にはアンキリン反復モチーフに基づく)、フィノマー(典型的にはFyn7のSH3ドメインに基づく)、kunitzドメインペプチド(典型的には、様々なプロテアーゼ阻害剤のKunitzドメインに基づく)、及びモノボディ(典型的にはフィブロネクチンのIII型ドメインに基づく)である。
モノボディは、分子スカフォールドとしてフィブロネクチンIII型ドメイン(fibronectin type III domain、FN3)を使用して構築される合成結合タンパク質である。モノボディは、標的結合タンパク質を作製するための抗体の単純かつロバストな代替物である。「モノボディ」という用語は、ヒトフィブロネクチンの第10のFn3ドメインを使用して、モノボディ概念を実証する最初の論文を公開したKoideのグループによって、1998年に作り出された。
モノボディ及び他の抗体模倣体は、典型的には、スキャフォールドの部分が、分子ディスプレイ及びファージディスプレイ、mRNAディスプレイ、及び酵母表面ディスプレイなどの指向進化技術を使用して多様化されるコンビナトリアルライブラリーから生成される。多数の抗体模倣体は、それらのそれぞれの標的に対して高い親和性及び高い特異性を有する。
アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチド又はペプチド分子である。アプタマーは、通常、大きなランダム配列プールから選択することによって作製されるが、天然アプタマーもリボスイッチ中に存在する。アプタマーは、巨大分子として基本研究及び臨床目的の両方に使用することができる。
本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲート」は、任意選択的に連結領域によって共有結合された2つ以上の分子を指す。例えば、いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、連結領域によって第2のタンパク質又は非タンパク質部分に結合された第1のタンパク質又は非タンパク質部分である。例えば、本発明の結合分子のいくつかの実施形態では、これは、共有結合された2つ以上の抗体を含むか、又はそれからなる。コンジュゲートは、第1及び第2の部分に限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、更なる連結領域によって結合された第3、第4、又はそれ以上の部分を有してもよい。本出願の他の箇所に記載されるように、タンパク質部分の例としては、ポリペプチド、ペプチド模倣体、又は抗体(若しくは本出願の他の箇所に記載されるような、抗体部分、派生体、又は類似体)が挙げられるが、これらに限定されない。非タンパク質部分の例としては、アプタマーが挙げられるが、これに限定されない。多くの種類のリンカーを使用することができ、リンカーは、コンジュゲート中の分子型及びリンカーの所望の特性(長さ、可撓性、プロテアーゼ活性に対する耐性、及び他の類似の特性)に応じて適切であるように選択される。このようなリンカーは、ヌクレオチド、ポリペプチド、又は好適な合成材料を含み得る。例えば、リンカーは、可撓性ペプチドリンカーであってもよい。ある特定の実施形態では、リンカーは開裂可能なリンカーであってもよく、コンジュゲートの部分を互いに分離させることができる。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、螺旋状リンカーであってもよい。タンパク質及び他の分子を連結するための様々な例及びキットが、当該技術分野において既知である。本明細書で使用するとき、用語「融合タンパク質」は、組換えによってDNAレベルで結合され、単一のポリペプチドとして一緒に発現される、2つ以上のポリペプチド又はタンパク質を含むタンパク質を指す。融合タンパク質はまた、DNAによりコードされ、融合タンパク質と共に発現されるペプチド連結領域も含み得る。融合タンパク質の一部であるペプチドリンカーは、可撓性、親水性、プロテアーゼ耐性、開裂性などの特定の特性を有するように設計され得る。これらの全ての特性は、DNA配列内に設計することができ、リンカーを設計するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、抗体は、当該技術分野において周知の方法によって一緒に連結されることができ、本明細書に記載されるように、二重特異性又は多重標的化抗体を形成することができる。更に、二重特異性抗体は、例えば、Biclonics(登録商標)などの技術を使用することによって、当該技術分野において既知の様々な方法によって構築することができる(例えば、国際公開第2013/157954号を参照されたい)。二重特異性モノクローナル抗体(bispecific monoclonal antibody、BsMAb、BsAb)は、典型的には、2つの異なるモノクローナル抗体の結合ドメインを含み、その結果、2つの異なるエピトープに結合する。Biclonics(登録商標)分子だけでなく、他の全長IgGの二重特異性抗体はscFvのFabの全長IgG分子の2つの異なる可変領域によってコードされる2つの異なる抗原結合特異性を有する。Biclonics(登録商標)は、本明細書の他の箇所に詳述されるように、2つの異なる共通軽鎖(common light chain、cLC)抗体をコードする遺伝子構築物と個々の細胞との共トランスフェクションによって生成することができる。CH3工学は、本質的に純粋な二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量化及び形成を確実にする。
本発明の結合分子は、好ましくは、抗体又はその変異体である。本発明の結合分子は、好ましくは、二重特異性抗体又はその変異体である。
抗体は、典型的には、いわゆる抗原結合部位を介してそれらの標的に結合する。未修飾抗原結合部位は、典型的には、抗体の可変ドメインによって形成され、それに存在する。可変ドメインは、抗原結合部位を含有する。抗原に結合する可変ドメインは、抗原に結合する抗原結合部位を含む可変ドメインである。
一実施形態では、抗体可変ドメインは、重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む。抗原結合部位は、組み合わされたVH/VL可変ドメイン、又はVH領域のみ、又はVL領域のみに存在し得る。抗原結合部位が可変ドメインの2つの領域のうちの1つに存在する場合、対応する可変領域は、結合可変領域の折り畳み及び/又は安定性に寄与し得るが、抗原自体の結合にそれほど寄与しない。
本明細書で使用するとき、抗原結合は、抗体のその抗原に対する典型的な結合能力を指す。抗体の抗原に対する結合は、様々な方法で評価することができる。1つの方法は、抗体を抗原(好ましくは、抗原を発現する細胞)とインキュベートし、未結合の抗体を除去し(好ましくは、洗浄工程によって)、結合した抗体に結合する標識抗体によって結合抗体を検出することである。
抗体による抗原結合は、典型的には、抗体の相補性決定領域(complementarity determining region、CDR)及び抗原及び可変ドメインの両方の特定の三次元構造を介して介在され、これらの2つの構造が、タンパク質のランダムで非特異的な粘着とは対照的に、正確に一緒に結合する(ロックとキーとに類似した相互作用)ことを可能にする。抗体は、典型的には、抗原のエピトープと呼ばれる抗原の一部を認識し、このようなエピトープは他の化合物中に同様に存在してもよく、本発明による抗体は、このような他の化合物が同じエピトープを含有する場合にも、他のタンパク質も同様に認識し得る。したがって、用語「結合」は、同じエピトープを含有する別の1つ又は複数のタンパク質に対する抗体の結合を排除するものではない。このような他のタンパク質(複数可)は、好ましくはヒトタンパク質ではない。
抗体などの本発明のタンパク質は、典型的には、出生後、好ましくは成人ヒトにおける細胞膜上の特定の標的タンパク質以外の他のタンパク質に結合しない。
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、好ましくは、抗原上のエピトープに結合する1つ以上の可変ドメインを含有するタンパク質の免疫グロブリンクラスに属するタンパク質分子を意味し、このようなドメインは、抗体の可変ドメインに由来するか又は配列相同性を共有する。治療用の抗体は、好ましくは、可能な限り治療される対象の天然抗体(例えば、ヒト対象のヒト抗体)に近いものである。抗体結合は、特異性及び親和性の観点から表すことができる。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されているかを決定する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強度についての尺度である。好ましくは、本発明による抗体の別個のアームの親和性は、ナノモル範囲である。本発明の二重特異性抗体などの抗体は、典型的には、天然抗体の定常ドメイン(Fc部分)を含み、これは、例えば、ADCC及び/又はCDC活性を低減するために、本明細書の他の箇所に記載されるように遺伝子操作され得る。本発明の抗体は、典型的には、二重特異性完全長抗体、好ましくはヒトIgGサブクラスである。
「可変ドメイン」、「VH/VL対」、「VH/VL」という用語は、本明細書では互換的に使用される。可変ドメインは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域から構成される。重鎖の可変領域は、典型的には、再構成されたVDJ領域によって形成される。軽鎖の可変領域は、典型的には、再構成されたVJ領域によって形成される。VDJ/VJ領域は、ここで、例えば、機能的抗体の利用可能である多数の配列情報を使用して、人工的に生成され得る。
いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、CD137の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、CD137に結合することができる抗原結合部位と、PD-L1に結合することができる抗原結合部位とを含む。
いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、2つ以下の抗原結合部位を有する。これは、このような結合分子又は抗体若しくは変異体の抗原結合部分が、追加の抗原結合部位の存在なしに、2つの抗原結合部位からなることを意味する。2つの抗原結合部位のそれぞれは、好ましくは、免疫グロブリンVH/VL対を含有する。好ましくは、本発明の結合分子又は抗体若しくは変異体の抗原結合部分は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインと、第2の膜タンパク質に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる。特定の好ましい実施形態は、IgGフォーマットを有する免疫グロブリンであり、本発明による二価結合分子/抗体/変異体の半減期が、典型的に多価化合物と比較して長いという利点を提供する。更に、本発明による二価結合分子の免疫原性は、典型的に多価化合物と比較して低い。これらの実施形態による分子/抗体/変異体は、好ましくは、天然IgGの構造を維持し、したがって天然IgGの構造に関連する全ての利益を維持する。
本明細書で使用するとき、用語「多価」は、3つ以上の特異性を包含し、これは、例えば、三価及び四価の結合分子内に存在する。
いくつかの実施形態は、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体を提供し、結合分子又は抗体若しくは変異体の抗原結合部位は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる1つの抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体の抗原結合部位は、CD137の細胞外部分に結合することができる1つの抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体の抗原結合部位は、CD137に結合することができる1つの抗原結合部位と、PD-L1に結合することができる1つの抗原結合部位とからなる。
本明細書で使用するとき、用語「抗原結合部位」は、抗原のエピトープに特異的に結合する結合分子又は抗体の部位を意味する。このような抗原結合部位は、好ましくは、抗体の可変ドメイン、特にそのCDR領域との配列相同性に由来するか、又はそれを共有する。いくつかの好ましい実施形態では、抗原結合部位は、免疫グロブリンVH/VL対によって形成される免疫グロブリン可変ドメインである。他の実施形態では、抗原結合部位は、例えば、本明細書で前に記載される、アフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、DARPin、フィノマー(fynomer)、kunitzドメインペプチド、又はモノボディなどの抗体模倣体に由来する。
本発明の抗体は、好ましくは「完全長」抗体である。本発明による用語「完全長」は、例えば、更なる抗原結合部位又は追加の活性化部位若しくは追加のリガンド又は追加のリガンド結合部分などの、20個を超えるアミノ酸残基より大きいサイズを有する1つ以上の人工的に付加された部分を含まない、本質的に完全な抗体を含むものとして定義される。しかしながら、完全長抗体は、インタクトな抗体の全ての機能を必ずしも有さない。誤解を避けるために、完全長抗体は、2つの重鎖及び2つの軽鎖を含む。各鎖は、定常(C)領域及び可変(V)領域を含有し、これは重鎖についてのCH1、CH2、CH3、VH及び軽鎖についてのCL、VLと表示されるドメインに分解することができる。重鎖のドメインは、好ましくは、天然抗体の順序で存在する(VH-CH1-CH2-CH3;すなわち、VHドメインがCH1ドメインに隣接し、CH2ドメインが続き、その後CH3ドメインが続くことを意味する)。軽鎖のドメインもまた、好ましくは、天然抗体の順序で存在する(VL-CL;すなわち、VLドメインがCLドメインに隣接することを意味する)。抗体は、Fab断片部分に含まれる可変ドメインを介して抗原に結合する。抗体は、大部分がFc部分を通って、定常ドメインを介して免疫系の分子及び細胞と相互作用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、IgG,、好ましくは全長IgGである。完全長IgG抗体は、それらの典型的には好ましい半減期、及び免疫原性の理由から完全な自家(ヒト)分子に近いままであるという要望のために好ましい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、完全長IgG1、完全長IgG2、完全長IgG3、又は完全長IgG4抗体である。
本発明による完全長抗体は、所望の特性を提供するか、又は元の鎖内のものの代替物のみを提供する変異が存在し得る抗体を包含する。このような変異は、領域のうちのいずれかの実質的な部分の欠失であるべきではない。しかしながら、得られる抗体の抗原結合特性を本質的に変化させることなく、1つ又はいくつかのアミノ酸残基が酸挿入され、欠失され、置換され、又はこれらの組み合わせが行われている抗体は、用語「完全長抗体」内に包含される。例えば、IgG抗体は、定常領域において、1~20個のアミノ酸残基挿入、置換、欠失、又はこれらの組み合わせを有することができる。
本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体である。好ましい実施形態では、これは、エフェクター機能が低減された二重特異性IgG抗体である。本発明の好ましい実施形態では、抗体は、本発明の抗体は、二重特異性完全長抗体である。本発明の抗体は、好ましくは、エフェクター機能を低減するために、好ましくはCH2/下部ヒンジ領域で変異した二重特異性完全長IgG抗体である。エフェクター機能を低減するためにCH2/下部ヒンジ領域で変異したIgG1は、人間でのその長い循環半減期に基づいて有利である。ヒトにおける任意の免疫原性を予防するために、本発明による二重特異性抗体は、ヒト抗体であることが好ましい。
用語「二重特異性」(bispecific、bs)は、抗体の1つの部分(上記で定義したような)が抗原上の1つのエピトープに結合する一方で、第2の部分は、同じ抗原、又は異なる抗原上のいずれかの異なるエピトープに結合することを意味する。異なるエピトープは、典型的には、異なる抗原上に存在する。しかしながら、異なるエピトープは、同じ抗原上に存在してもよい。本発明によれば、第1及び第2の抗原は、実際には2つの異なるタンパク質である。好ましい二重特異性抗体は、2つの異なるモノクローナル抗体の部分を含む抗体であり、その結果、2つの異なるエピトープ、好ましくは2つの異なる抗原に結合することができる。二重特異性抗体によって認識される2つの抗原の発現レベル、(サブ)細胞局在及び化学量論に依存して、抗体の両方のFabアームは、それらのエピトープに同時に結合しても、又は結合しなくてもよい。二重特異性抗体の1つのアームは、典型的には、1つの抗体の可変ドメインを含有し、他方のアームは、別の抗体の可変ドメインを含有する(すなわち、二重特異性抗体の1つのアームは、1つの軽鎖と対をなす1つの重鎖によって形成されるのに対し、他方のアームは軽鎖と対になった異なる重鎖によって形成される)。本発明の二重特異性抗体の重鎖可変領域は、典型的には互いに異なるのに対し、軽鎖可変領域は、好ましくは、本発明の二重特異性抗体において同じである。異なる重鎖可変領域が同じ又は共通の軽鎖可変領域と関連付けられている二重特異性抗体は、共通軽鎖可変領域(common light chain variable region、cLcv)を有する二重特異性抗体とも称される。軽鎖定常領域も同じであることが好ましい。このような二重特異性抗体は、共通軽鎖(cLc)を有するものと称される。したがって、両方のアームが共通軽鎖を含む、本発明による二重特異性抗体が更に提供される。
本明細書に記載される二重特異性抗体は、好ましくは、共通軽鎖可変ドメイン、好ましくは共通軽鎖を含む。本発明による用語「共通軽鎖」は、完全長抗体の結合特異性が影響を受けない一方で、同一であってもよく、又はいくつかのアミノ酸配列差を有し得る軽鎖を指す。例えば、保存的アミノ酸の変化、重鎖と対をなすときに結合特異性に寄与しないか、部分的にのみ寄与する領域におけるアミノ酸の変化などを導入し試験することによって、同一ではないが依然として機能的に同等である軽鎖を調製し又は見出すことが、本明細書に使用される共通軽鎖の定義の範囲内で可能である。用語「共通軽鎖」、「共通LC」、「cLC」、「単一軽鎖」は、用語「再構成」が付加されて、又は付加されずに、全てが本明細書で互換的に使用される。用語「共通軽鎖可変領域」、「共通VL」、「共通LCv」、「cLCv」、「単一VL」は、用語「再構成」が付加されて、又は付加されずに、全てが本明細書で互換的に使用される。二重特異性抗体が、少なくとも2つの、好ましくは異なる結合特異性の複数の重鎖(可変領域)に結合して、機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成することができる共通軽鎖(可変領域)を有することが、本発明の好ましい態様である(国際公開第2004/009618号、国際公開第2009/157771号)。共通軽鎖(可変領域)は、ヒト軽鎖(可変領域)であることが好ましい。共通軽鎖(可変領域)は、好ましくは生殖細胞系列配列を有する。好ましい生殖細胞系列配列は、ヒトレパートリーで頻繁に使用され、良好な熱力学的安定性、収率、及び溶解度を有する軽鎖可変領域である。好ましい生殖細胞系列軽鎖は、O12である。共通軽鎖は、好ましくは、再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(図1A)である。共通軽鎖可変領域は、好ましくは、再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01の可変領域である。共通軽鎖は、好ましくは、0~5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、図1B、又は1Dに示されるような軽鎖可変領域を含む。共通軽鎖は、好ましくは、軽鎖定常領域、好ましくはカッパ軽鎖定常領域を更に含む。共通軽鎖をコードする核酸は、共通軽鎖タンパク質を発現するために使用される細胞系に対してコドン最適化され得る。コード核酸は、生殖細胞系列核酸配列から逸脱し得る。
好ましい実施形態では、軽鎖は、0~10個の、好ましくは0~5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、図1Aに示されるようなO12/IgVκ1-39*01遺伝子セグメントのアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。語句「O12軽鎖」は、0~10個の、好ましくは0~5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、図1Aに示されるようなO12/IgVκ1-39*01遺伝子セグメントのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む軽鎖」についての短縮形として本明細書全体を通して使用されるであろう。IgVκ1-39は、免疫グロブリン可変カッパ1-39遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変1-39、IGKV139、IGKV1-39、O12a又はO12としても知られている。この遺伝因子についての外部Idsは、HGNC:5740、Entrez Gene:28930、Ensembl:ENSG00000242371である。IgVκ1-39の好ましいアミノ酸配列を図1Eに示す。これはV領域の配列を列挙している。V領域は、5つのJ領域のうちの1つと組み合わせることができる。図1B及び1Dは、J領域と組み合わせたIgVκ1-39についての2つの好ましい配列を記載している。結合された配列は、IGKV1-39/jk1及びIGKV1-39/jk5として示され、代替名は、IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01である(imgt.orgでのIMGTデータベースの世界的なウェブによる命名法)。
軽鎖可変領域を含むO12/IgVκ1-39*01は生殖細胞系列配列であることが好ましい。軽鎖可変領域を含むIGJκ*01又は/IGJκ5*01は、生殖細胞系列配列であることが更に好ましい。好ましい実施形態では、IGKV1-39/jk1又はIGKV1-39/jk5軽鎖可変領域は、生殖細胞系列配列である。
好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、生殖細胞系列O12/IgVκ1-39*01を含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01を含む。好ましい実施形態では、IgVκ1-39*01/IGJκ1*01である。軽鎖可変領域は、生殖細胞系列カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又は生殖細胞系列カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ5*01、好ましくは生殖細胞系列IgVκ1-39*01/IGJκ1*01を含む。
O12軽鎖を有する抗体を産生する成熟B細胞は、多くの場合、生殖細胞系列配列に対して1つ以上の突然変異を受けた軽鎖、すなわち、生物の非リンパ系細胞における正常な配列を産生する。これらの変異に関与するプロセスは、体細胞(超)変異と呼ばれることが多い。得られた軽鎖は、親和性成熟した軽鎖と呼ばれる。このような軽鎖は、O12生殖細胞系列配列に由来するとき、O12由来の軽鎖である。本明細書では、語句「O12軽鎖」は、O12由来の軽鎖を含むであろう。体細胞超変異により導入される突然変異は、当然ながら、研究室でも人工的に導入され得る。研究室では、また量に関係なく、同種のやり方で軽鎖の特性に影響を及ぼすことなく他の変異も導入することができる。軽鎖は、これが0~10個の、好ましくは0~5個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する図1A、図1B;図1D又は図1Eに示された配列を含む場合、少なくともO12軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、0~9個、0~8個、0~7個、0~6個、0~5個、0~4個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する図1A;図1B;図1D又は図1Eに示された配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、0~5個、好ましくは0~4個、より好ましくは0~3個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する図1A;図1B;図1D又は図1Eに示された配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、0~2個、より好ましくは0~1個、最も好ましくは0個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する図1A;図1B;図1D又は図1Eに示された配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、O12軽鎖は、前述のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する図1A又は図1Bに示された配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、軽鎖は、図1Aの配列を含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、図1Bの配列を含む。
共通軽鎖(可変領域)はラムダ軽鎖であってもよく、したがって、これは本発明の文脈でも提供されるが、カッパ軽鎖が好ましい。本発明の共通軽鎖の定常部分は、カッパ又はラムダ軽鎖の定常領域であり得る。これは、好ましくは、カッパ軽鎖の定常領域であり、好ましくは、共通軽鎖は生殖細胞系列軽鎖であり、好ましくは、IgVKI-39遺伝子断片を含む再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖であり、最も好ましくは、再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖IgVKI-39*01/IGJKI*01(図1)である。再構成された生殖細胞系ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39軽鎖、又は短縮形のhuVκ1-39、又は単に1-39という用語は、本願全体にわたって互換的に使用される。明らかに、当業者は、「共通」とは、アミノ酸配列が同一ではない軽鎖の機能的等価物を指すことを認識するであろう。軽鎖の多くの変異体が存在し、機能的結合領域の形成に影響を与えない変異(欠失、置換、付加)が存在する。
IgVκ1-39は、免疫グロブリン可変カッパ1-39遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変1-39、IGKV1-39、IGKV1-39、O12a又はO12としても知られている。この遺伝因子についての外部Idsは、HGNC:5740、Entrez Gene:28930、Ensembl:ENSG00000242371である。IgVκ1-39の好ましいアミノ酸配列を図1に示す。これはV領域の配列を列挙している。V領域は、5つのJ領域のうちの1つと組み合わせることができる。図1は、J領域と組み合わせたIgVκ1-39についての2つの好ましい配列を記載している。結合された配列は、IGKV1-39/jk1及びIGKV1-39/jk5として示され、代替名は、IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01である(imgt.orgでのIMGTデータベースの世界的なウェブによる命名法)。
共通軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖定常領域に結合することが好ましい。好ましい実施形態では、軽鎖は、カッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はIgVκ1-39*01/IGJκ5*01を含む。好ましい実施形態では、IgVκ1-39*01/IGJκ1*01である。
共通軽鎖を産生する細胞は、例えば、再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01及びラムダ定常領域に融合された前述の軽鎖の可変領域を含む軽鎖を産生することができる。
本明細書に記載される二重特異性抗体又はその変異体は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する1つの重鎖可変領域/軽鎖可変領域(VH/VL)の組み合わせ、及び第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合する第2のVH/VLの組み合わせを有し、第2の膜タンパク質は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。
本明細書に記載される二重特異性抗体又はその変異体は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する1つの重鎖可変領域/軽鎖可変領域(VH/VL)の組み合わせ、及びB7ファイミリーのメンバーの細胞外部分に結合する第2のVH/VLの組み合わせを有する。本明細書に記載されるように、これは、B7ファミリーメンバーがリンパ球に「共刺激」又は「共抑制」シグナルを送達し、それによって免疫応答を増強又は減衰させるので、所望の免疫応答が特に良好に促進され得るという利点を提供する。したがって、B7ファミリーのメンバーを標的化することによって、刺激性シグナルを増強すること、及び/又は抑制性シグナルを相殺することが可能であり、それによって、例えば異常細胞に対して所望の免疫応答を誘導又は増強することが可能である。
好ましい実施形態では、第1のVH/VLの組み合わせにおけるVLは、第2のVH/VLの組み合わせにおけるVLと類似している。より好ましい実施形態では、第1及び第2のVH/VLの組み合わせにおけるVLは同一である。好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する1つの重/軽(H/L)鎖の組み合わせと、B7ファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する1つのH/L鎖の組み合わせを有する完全長抗体である。好ましい実施形態では、第1のH/L鎖の組み合わせにおける軽鎖は、第2のH/L鎖の組み合わせにおける軽鎖と類似している。より好ましい実施形態では、第1及び第2のH/L鎖の組み合わせにおける軽鎖は同一である。
二重特異性抗体の産生、又はその逆に、単一特異性抗体の産生に有利であるいくつかの方法が公開されている。本発明において、細胞が、対応の単一特異性抗体の産生よりも、二重特異性抗体の産生を好むことが好ましい。このようなものは、典型的には、重鎖の定常領域を、これらがホモ二量体化よりもヘテロ二量体化(すなわち、他の重鎖/軽鎖の組み合わせの重鎖と二量体化)を好むように修飾することによって達成される。好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する2つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む。様々な適合性ヘテロ二量体化ドメインが、当該技術分野において記載されている。この適合性ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、適合性免疫グロブリン重鎖CH3ヘテロ二量体化ドメインである。野生型CH3ドメインが使用される場合、2つの異なる重鎖(A及びB)と共通軽鎖との共発現は、3つの異なる抗体種、AA、AB及びBBをもたらすであろう。AA及びBBは、2つの単一特異性二価抗体の表記であり、ABは二重特異性抗体の表記である。所望の二重特異性生成物(AB)の割合を増加させるために、CH3遺伝子操作を使用することができ、又は言い換えれば、以下に定義されるように、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する重鎖を使用することができる。当該技術分野では、重鎖のこのようなヘテロ二量体化が達成され得る様々な方法が記載されている。1つの方法は、二重特異性抗体に「ノブイントゥホール(knob into hole)」を生成することである。米国特許出願公開第20030078385号(Arathoon et al.)を参照されたい。
本明細書で使用するとき、用語「適合性ヘテロ二量体化ドメイン」は、遺伝子操作ドメインA’が遺伝子操作ドメインB’を有するヘテロ二量体を優先的に形成し、逆もまた同様であり、A’-A’とB’-B’との間のホモ二量体化が減少するように遺伝子操作を受けたタンパク質ドメインを指す。
米国特許出願第13/866,747号(現在、米国特許第9,248,181号として発行)、米国特許出願第14/081,848号(現在、米国特許第9,358,286号として発行)、及びPCT/NL2013/050294(国際公開第2013/157954号として公開);参照により本明細書に組み込まれる)において、適合性ヘテロ二量体化ドメインを使用して二重特異性抗体を産生するための方法及び手段が開示されている。本発明では、これらの手段及び方法を好適に採用することができる。具体的には、本発明の二重特異性抗体は、本質的に二重特異性完全長IgG分子のみを産生するための突然変異を含むことが好ましい。好ましい突然変異は、第1のCH3ドメイン中のアミノ酸置換L351K及びT366K(EU番号付け)(「KK-変異体」重鎖)、及び第2のドメイン中のアミノ酸置換L351D及びL368E(「DE-変異体」重鎖)、又はその逆である。DE-変異体及びKK-変異体が優先的に対をなして、ヘテロ二量体(いわゆる「DEKK」二重特異性分子)を形成することが、本発明者らの米国特許第9,248,181号及び同第9,358,286号の特許、並びに国際公開第2013/157954号で以前に実証されている。DE-変異体重鎖のホモ二量体化(DEDEホモ二量体)は、同一の重鎖間のCH3-CH3界面における荷電残基間の反発力のために、ほとんど発生しない。
二重特異性抗体は、軽鎖をコードする1つ又は複数のプラスミドと、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量化及び形成を確実にするようにCH3遺伝子操作された2つの異なる重鎖との(一過性)トランスフェクションによって生成することができる。単一細胞におけるこれらの鎖の産生は、単一特異性抗体の形成によりも二重特異性抗体の有利な形成をもたらす。二重特異性完全長IgG1分子のみを本質的に生成するのに好ましい変異は、第1のCH3ドメイン中の351及び366位でのアミノ酸置換、例えばL351K及びT366K(EU番号付けに従っての番号付け)(「KK-変異体」重鎖)、及び第2のCH3ドメイン中の351及び368位でのアミノ酸置換、例えばL351D及びL368E(「DE-変異体」重鎖)、又はその逆である。
一実施形態では、CD137に結合する可変ドメインを含む重鎖/軽鎖の組み合わせは、重鎖のDE変異体を含む。この実施形態では、CD137以外の抗原に結合することができる可変ドメインを含む重鎖/軽鎖の組み合わせは、重鎖のKK変異体を含む。本発明の一実施形態はまた、CD137に結合する可変ドメインを含んでもよく、重鎖のKK変異体、並びにCD137以外の抗原に結合することができる可変ドメインとのヘテロ二量体化を促進するために使用される当業者に既知の他の変形形態を含むことが認識されるであろう。
Fc領域は、補体依存性細胞傷害性(complement-dependent cytotoxicity、CDC)、抗体依存性細胞傷害性(antibody-dependent cellular cytotoxicity、ADCC)、及び抗体依存性細胞貪食作用(antibody-dependent cell phagocytosis、ADCP)などの抗体のエフェクター機能を媒介する。治療用抗体又はFc融合タンパク質用途に応じて、エフェクター機能を低減又は増加させることのいずれかが望ましい場合がある。本発明では、低減されたエフェクター機能が好ましい。本発明のいくつかの実施形態のように、免疫応答が活性化、増強、又は刺激されるべき場合、エフェクター機能の低減が望まれ得る。エフェクター機能を低減した抗体を使用して、とりわけ免疫細胞の細胞表面分子を標的化することができる。
IgGのFcγRs又はC1qへの結合は、ヒンジ領域及びCH2ドメイン内に位置する残基を必要とすることが見出されている。CH2ドメインの2つの領域(図2D)は、FcγRs及びC1q結合に関連する。ヒトIgG1中への233~236位におけるIgG2残基及び327、330及び331位におけるIgG4残基の置換は、ADCC及びCDCを大幅に低減することが示されている(Armour et al.,1999.Eur J Immunol.29(8):2613-24;Shields et al.,2001.J Biol Chem.276(9):6591-604)。更に、Idusogieらは、K322を含む異なる位置でのアラニン置換が、補体活性化有意に低減させることを示した(Idusogie et al.,2000.J Immunol.164(8):4178-84)。
それらのエフェクター機能の低減により、IgG4抗体は、細胞枯渇なしの受容体ブロッキングのためのIgGサブクラスを表す。IgG4分子は、Fabアーム交換と称される動的プロセスで半分子を交換することができる。この現象は、治療用抗体と内因性IgG4との間で生じ得る。S228P変異は、Fabアーム交換に対する能力の低減を確実にする変異の例である。(Labrijn.et al.,2009.Nat Biotechnol.27(8):767-71)。
エフェクター機能が低減された抗体は、好ましくは、修飾されたCH2/下部ヒンジ領域を含むIgG抗体であり、例えば、Fc受容体相互作用を低減するか、又はC1q結合を低減する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、二重特異性IgG抗体とFcガンマ受容体との相互作用が低減されるように、変異体CH2及び/又は下部ヒンジドメインを有するIgG抗体である。変異体CH2領域を含む抗体は、好ましくはIgG1抗体である。このような変異体IgG1 CH2及び/又は下部ヒンジドメインは、好ましくは、235位及び/又は236位(EU番号付け)でのアミノ酸置換、好ましくはL235G置換及び/又はG236R置換を含む(図2E)。
本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗体の変異体は、抗体又は二重特異性抗体の機能的部分、派生体及び/又は類似体を含む。変異体は、(二重特異性)抗体の結合特異性を維持する。機能的部分、派生体及び/又は類似体は、(二重特異性)抗体の結合特異性を維持する。結合特異性は、本明細書に記載されるように、第1の膜タンパク質及び第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合する能力によって定義される。
本明細書に記載される抗体の機能的部分又は好ましくは二重特異性抗体の機能的部分は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインと、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合する可変ドメインとを含む部分である。好適な部分は、例えば、ペプシンによる二重特異性抗体の消化によって作製されるF(ab’)2断片である。可変ドメインを含む他の部分が、本発明に含まれる。
本明細書に記載される抗体の機能的派生体、又は好ましくは二重特異性抗体の機能的派生体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分と、リンカーによって連結された第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合する可変ドメインを含むタンパク質である。可変ドメインは、そのような可変ドメイン、又はFab断片若しくは、リンカーを介して一緒に連結されたVH及びVLを含む単鎖Fv断片などの可変ドメイン様分子であってもよい。可変ドメイン様分子の他の例は、いわゆる単一ドメイン抗体断片である。単一ドメイン抗体断片(single-domain antibody fragment、sdAb)は、単一の単量体可変抗体領域を有する抗体断片である。抗体全体と同様に、これは特定の抗原に選択的に結合することができる。わずか12~15kDaの分子量を有する場合、単一ドメイン抗体断片は、2つの重鎖タンパク質及び2つの軽鎖で構成される共通抗体(150~160kDa)よりもはるかに小さく、更にはFab断片(約50kDa、1つの軽鎖と半分の重鎖)及び単鎖可変断片(約25kDa、2つの可変領域、1つは軽鎖から、1つは重鎖から)よりも小さい。単一ドメイン抗体自体は、正常な抗体よりもはるかに小さいことはない(典型的には、90~100kDaである)。単一ドメイン抗体断片は、大部分が、ラクダに見られる重鎖抗体から遺伝子操作され、これらはVHH断片(ナノボディ(登録商標))と呼ばれる。一部の魚類もまた、VNAR断片と呼ばれる単一ドメイン抗体断片を得ることができる重鎖のみの抗体(IgNAR、「免疫グロブリン新抗原受容体」)も有する。別のアプローチは、ヒト又はマウスからの共通免疫グロブリンG(IgG)からの二量体可変ドメインを単量体に分割することである。単一ドメイン抗体へのほとんどの研究は、現在、重鎖可変ドメインに基づくが、軽鎖に由来するナノボディも、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。可変ドメイン様分子の他の非限定的な例は、VHH、ヒトドメイン抗体(Domain Antibody、dAb)及びユニボディである。好ましい機能的部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む可変ドメインを含む部分である。このような可変ドメインの非限定的な例は、F(ab)-断片及び単鎖Fv断片である。可変ドメイン(様)結合の二重特異性フォーマットは、例えば、2つの異なるscFvに結合されたヒト血清アルブミン(Human Serum Albumine、HSA);二量体化モチーフを介して一緒に結合された2つの異なるscFv、又はscFv断片の二量体化をもたらすために、螺旋束又はコイル状コイルなどの自己会合二次構造を含む二重特異性ミニ抗体(Morrison(2007)Nat.Biotechnol 25:1233-34)である。scFvをリンカーに結合するための好適なHSAリンカー及び方法の例は、国際公開第第2009/126920号に記載されている。
本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しく類似体、あるいは好ましくは二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、ヒトで使用されることが好ましい。この目的のために、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、ヒト又はヒト化抗体であることが好ましい。ポリペプチドに対するヒトの寛容は、多くの異なる態様によって管理される。免疫は、T細胞に媒介されるか、B細胞に媒介されるか、又は他のものに媒介されるものであり、ポリペプチドに対するヒトの寛容に包含される変数のうちの1つである。本発明の二重特異性抗体の定常領域は、好ましくは図2に示される配列を含む、ヒト重鎖定常領域と、好ましくは図1Cに示される配列を含むヒト軽鎖定常領域とを含むことが好ましい。この定常領域は、1つ以上の、好ましくは10個以下の、好ましくは5個以下の、天然に存在するヒト抗体の定常領域とは異なるアミノ酸を含有することができる。定常部分は、天然に存在するヒト抗体から完全に由来することが好ましい。本明細書で産生される様々な抗体は、国際公開第2009/15771号に記載されているように、それぞれの標的で免疫化された共通軽鎖マウスに由来する。本明細書で産生される様々な抗体は、ヒト抗体可変ドメインライブラリーに由来する。したがって、これらの可変ドメインはヒトである。独自のCDR領域は、ヒトに由来してもよく、合成であってもよく、又は別の生物に由来してもよい。この可変領域は、これが、CDR領域を除いて、天然に存在するヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する場合、少なくともヒト可変領域である。かかる実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーのメンバー若しくはB7ファミリーの膜結合メンバーに結合する抗体の可変ドメインのVH、又は本発明の抗体中の軽鎖は、1つ以上の、好ましくは、10個以下、好ましくは5個以下の、天然に存在するヒト抗体の可変領域とは異なるアミノ酸を含有することができる(CDR領域のアミノ酸配列における考えられる差異は数に入れない)。このような変異はまた、体細胞超変異という状況下では本質的に生じる。
抗体は、少なくとも重鎖可変領域に関して、様々な動物種に由来し得る。例えば、ネズミ重鎖可変領域をヒト化することが一般的なやり方である。これを達成することができる様々な方法が存在し、その中には、ネズミ重鎖可変領域の3D構造と一致する3D構造を有するヒト重鎖可変領域へのCDR移植;好ましくは、既知又は疑われるT細胞若しくはB細胞エピトープをネズミ重鎖可変領域から除去することによって行われる、ネズミ重鎖可変領域の脱免疫化がある。除去は、典型的には、エピトープの配列がもはやT細胞若しくはB細胞エピトープではないように、エピトープの配列が修飾されるように、エピトープ中の1つ以上のアミノ酸を別の(典型的には保存的な)アミノ酸に置換することによる。
脱免疫化ネズミ重鎖可変領域は、元のネズミ重鎖可変領域よりもヒトにおいて免疫原性が低い。好ましくは、本発明の可変領域又はドメインは、例えばベニヤ化など、更にヒト化される。ベニアリング技術を使用することにより、免疫系によって容易に遭遇する外部残基は、ヒト残基と選択的に置き換えられて、弱免疫原性又は実質的に非免疫原性のベニヤ化表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。本発明で使用される動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトである。
本発明による抗体若しくは二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、ヒト抗体の定常領域を含むことが好ましい。それらの重鎖定常ドメインの違いに従って、抗体は5つのクラス、又はアイソタイプ:IgG、IgA、IgM、IgD、及びIgEに分類される。これらのクラス又はアイソタイプは、対応するギリシャ文字で命名される重鎖のうちの少なくとも1つを含む。好ましい実施形態では、本発明は、定常領域がIgG定常領域の群から選択される、すなわち、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4からなる群から選択される、本発明による抗体を提供する。好ましくは、定常領域は、IgG4又はIgG1定常領域(図2)であり、より好ましくは変異したIgG1定常領域である。IgG1の定常領域におけるいくつかの変化は、性質的に生じ、及び/又は得られる抗体の免疫学的特性を変化させることなく許容される。典型的には、約1~10個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせが、定常領域で許容される。定常領域は、本明細書で示されるような効果的なヘテロ二量化を可能にするために、エフェクター機能を低減するために、又は半減期、安定性などを含む他の理由のために、変異されてもよい。
合理的な方法は、ヒト状況における非ヒト残基の含有量を最小化するように進化している。抗体の抗原結合特性を別の抗体にうまく移植するために、様々な方法が利用可能である。抗体の結合特性は、全体として可変ドメインの適切な構造と組み合わされた可変ドメイン内のCDR1及びCDR2領域の配列によって支持されることが多いCDR3領域の正確な配列に主として残り得る。CDR領域を別の抗体の好適な可変ドメインに移植するために、様々な方法が現在利用可能である。これらの方法のいくつかは、J.C.Almagro1 and J.Fransson(2008)Frontiers in Bioscience 13,1619-1633(参照により本明細書に含まれる)で概説されている。
図3に示される可変重鎖配列を含む可変ドメインの軽鎖可変領域は、好ましくは、O12の生殖細胞系列軽鎖であるか、又はO12に基づくものであり、好ましくは、再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01又はその断片若しくは機能的派生体(imgt.orgにおけるIMGTデータベースの世界的なウェブによる命名法)による)である。再構成された生殖細胞系ヒトカッパ軽鎖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39軽鎖、又は短縮形のhuVκ1-39、という用語が使用される。軽鎖は、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有し得る。言及された1、2、3、4、又は5個のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせは、好ましくはVL鎖のCDR3領域には存在しないことが好ましく、VL鎖のCDR1、CDR2、若しくはCDR3領域又はFR4領域には存在しないことが好ましい。共通軽鎖の好ましい配列を図1に示す。
二重特異性抗体を産生するために、様々な方法が利用可能である。1つの方法は、細胞内の2つの異なる重鎖及び2つの異なる軽鎖の発現、及び細胞によって産生される抗体を収集することを伴う。このようにして産生される抗体は、典型的には、重鎖及び軽鎖の異なる組み合わせを有する抗体の集合体を含有し、そのうちのいくつかは、所望の二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、その後、集合体から精製することができる。細胞によって産生される他の抗体に対する二重特異性の比は、様々な方法で増加させることができる。本発明の好ましい実施形態では、この比は、2つの異なる軽鎖を発現しないが、細胞内の2つの本質的に同一の軽鎖を発現させることによって増加される。2つの本質的に同一の軽鎖は、本質的に同じ軽鎖可変領域及び異なる軽鎖定常領域、又は好ましくは2つの本質的に同一の軽鎖定常領域を有する軽鎖であり得る。この概念は、「共通軽鎖」法とも称される当該技術分野におけるものである。本質的に同一の軽鎖が2つの異なる重鎖と一緒に作用し、異なる抗原結合部位及び付随する異なる結合特性を有する可変ドメインの形成を可能にする場合、二重特異性抗体と、細胞によって産生される他の抗体との比は、2つの本質的に異なる軽鎖の発現よりも有意に改善される。細胞によって産生される二重特異性抗体の比は、2つの同一の重鎖のペアリングに対して2つの異なる重鎖の互いのペアリングを刺激することによって、更に改善することができる。当該技術分野では、重鎖のこのようなヘテロ二量体化が達成され得る様々な方法が記載されている。好ましい方法は、米国特許仮出願第61/635,935号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許正規出願第13/866,747号及びPCT/NL2013/050294号(国際公開第2013/157954(A1)号)によってフォローアップされている。二重特異性抗体(単一細胞から)を産生するための方法及び手段が開示され、これにより、単一特異性抗体の形成に対する二重特異性抗体の形成を有利にする手段が提供される。本発明では、これらの方法を好適に採用することができる。したがって、本発明は、本発明による二重特異性抗体を(単一細胞から)製造するための方法であって、二重特異性抗体が、界面を形成することができる2つのCH3ドメインを含み、方法が、細胞中に、a)重鎖を含む第1のCH3ドメインをコードする第1の核酸分子、b)重鎖を含む第2のCH3ドメインをコードする第2の核酸分子を提供することを含み、核酸分子は、重鎖を含む第1及び第2のCH3ドメインの優先的なペアリングのための手段を備え、方法が、宿主細胞を培養する工程と、2つの核酸分子の発現を可能にする工程と、二重特異性抗体を培養物から採取する工程とを更に含む方法を提供する。第1及び第2の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクター、又は遺伝子送達ビヒクルの一部であってもよく、宿主細胞のゲノムの同一部位に組み込まれてもよい。あるいは、第1及び第2の核酸分子は、細胞に別々に提供される。宿主細胞は、少なくとも1つの軽鎖、好ましくは共通軽鎖を含む。
好ましい実施形態は、単一細胞から本発明による二重特異性抗体を産生するための方法であって、二重特異性抗体が、界面を形成することができる2つのCH3ドメインを含み、方法が、
a)TNF受容体スーパーファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分に結合することができ、第1のCH3ドメインを含有する抗原結合部位を含む重鎖をコードする第1の核酸分子と、b)膜結合第2のタンパク質の細胞外部分に結合することができ、第2のCH3ドメインを含有する抗原結合部位を含む重鎖をコードする第2の核酸分子とを有する細胞を準備することを含み、核酸分子は、第1及び第2のCH3ドメインの優先的なペアリングのための手段を備え、
方法が、細胞を培養する工程と、2つの核酸分子によってコードされるタンパク質の発現を可能にする工程と、二重特異性IgG抗体を培養物から採取する工程とを更に含む方法を提供する。特に好ましい実施形態では、細胞はまた、共通軽鎖をコードする第3の核酸分子を有する。第1、第2、及び第3の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクター、又は遺伝子送達ビヒクルの一部であってもよく、宿主細胞のゲノムの同一部位に組み込まれてもよい。あるいは、第1、第2、及び第3の核酸分子は、細胞に別々に提供される。好ましい共通軽鎖は、O12に基づき、好ましくは、これは、上述したような再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1 39*01/IGJκ1*01である。第1及び第2のCH3ドメインの優先的なペアリングのための手段は、好ましくは、重鎖コード領域のCH3ドメインにおける対応する変異である。二重特異性抗体のみを本質的に産生するのに好ましい変異は、第1のCH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351K及びT366K(EU番号付けによる番号付け)、並びに第2のCH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351D及びL368Eであり、又は逆もまた同様である(図2)。したがって、更に、二重特異性抗体を産生するための本発明による方法であって、第1のCH3ドメインがアミノ酸置換L351K及びT366K(EU番号付けによる番号付け)を含み、第2のCH3ドメインが、アミノ酸置換L351D及びL368Eを含み、方法が、細胞を培養する工程と、核酸分子によってコードされるタンパク質の発現を可能にする工程と、二重特異性抗体を培養物から回収する工程とを更に含む方法が提供される。また、二重特異性抗体を産生するための本発明による方法であって、第1のCH3ドメインがアミノ酸置換L351D及びL368E(EU番号付けによる番号付け)を含み、第2のCH3ドメインが、アミノ酸置換L351K及びT366Kを含み、方法が、細胞を培養する工程と、核酸分子の発現を可能にする工程と、二重特異性抗体を培養物から回収する工程とを更に含む方法も提供される。これらの方法によって産生され得る抗体もまた、本発明の一部である。CH3ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくはIgG1ヘテロ二量体化ドメインである。CH3ヘテロ二量体化ドメインを含む重鎖定常領域は、好ましくはIgG1定常領域である。
a)TNF受容体スーパーファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分に結合することができ、第1のCH3ドメインを含有する抗原結合部位を含む重鎖をコードする第1の核酸分子と、b)膜結合第2のタンパク質の細胞外部分に結合することができ、第2のCH3ドメインを含有する抗原結合部位を含む重鎖をコードする第2の核酸分子とを有する細胞を準備することを含み、核酸分子は、第1及び第2のCH3ドメインの優先的なペアリングのための手段を備え、
方法が、細胞を培養する工程と、2つの核酸分子によってコードされるタンパク質の発現を可能にする工程と、二重特異性IgG抗体を培養物から採取する工程とを更に含む方法を提供する。特に好ましい実施形態では、細胞はまた、共通軽鎖をコードする第3の核酸分子を有する。第1、第2、及び第3の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクター、又は遺伝子送達ビヒクルの一部であってもよく、宿主細胞のゲノムの同一部位に組み込まれてもよい。あるいは、第1、第2、及び第3の核酸分子は、細胞に別々に提供される。好ましい共通軽鎖は、O12に基づき、好ましくは、これは、上述したような再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖IgVκ1 39*01/IGJκ1*01である。第1及び第2のCH3ドメインの優先的なペアリングのための手段は、好ましくは、重鎖コード領域のCH3ドメインにおける対応する変異である。二重特異性抗体のみを本質的に産生するのに好ましい変異は、第1のCH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351K及びT366K(EU番号付けによる番号付け)、並びに第2のCH3ドメインにおけるアミノ酸置換L351D及びL368Eであり、又は逆もまた同様である(図2)。したがって、更に、二重特異性抗体を産生するための本発明による方法であって、第1のCH3ドメインがアミノ酸置換L351K及びT366K(EU番号付けによる番号付け)を含み、第2のCH3ドメインが、アミノ酸置換L351D及びL368Eを含み、方法が、細胞を培養する工程と、核酸分子によってコードされるタンパク質の発現を可能にする工程と、二重特異性抗体を培養物から回収する工程とを更に含む方法が提供される。また、二重特異性抗体を産生するための本発明による方法であって、第1のCH3ドメインがアミノ酸置換L351D及びL368E(EU番号付けによる番号付け)を含み、第2のCH3ドメインが、アミノ酸置換L351K及びT366Kを含み、方法が、細胞を培養する工程と、核酸分子の発現を可能にする工程と、二重特異性抗体を培養物から回収する工程とを更に含む方法も提供される。これらの方法によって産生され得る抗体もまた、本発明の一部である。CH3ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくはIgG1ヘテロ二量体化ドメインである。CH3ヘテロ二量体化ドメインを含む重鎖定常領域は、好ましくはIgG1定常領域である。
TNF受容体スーパーファミリーのメンバー(第1の膜タンパク質)は、好ましくはCD137、OX40、CD40、又はCD30である。好ましい実施形態では、第1の膜タンパク質は、CD137又はOX40であり、好ましくはCD137である。本発明の結合分子は、好ましくは、第1の膜タンパク質に対する1つの(抗原)結合部位を含む。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、第1の膜タンパク質に対して一価である。結合分子は、好ましくは、第2の膜タンパク質に対する1つの(抗原)結合部位を含む。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、第2の膜タンパク質に対して一価である。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、第1の膜タンパク質に対して一価であり、第2の膜タンパク質に対して一価である。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに対して一価であり、B7ファミリーのメンバーに対して一価である。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、CD137に対して一価であり、B7ファミリーのメンバーに対して一価である。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、CD137に対して一価であり、PD-L1に対して一価である。二価モノクローナル抗CD137抗体は、CD137を活性化することが当該技術分野において既知であるが、従来技術の一価のCD137結合分子は、典型的には活性化しない。
本明細書に記載される第1の膜タンパク質は、細胞膜タンパク質であるTNF受容体スーパーファミリーのメンバーである。タンパク質は、それが上にある細胞の細胞膜中に存在する膜貫通領域を有する場合、細胞上の膜タンパク質であると言われる。これは、典型的には、本明細書に記載されるような第1の細胞である。タンパク質は、更なる膜貫通領域を有し得る。そのような場合、細胞膜内に存在する全ての膜貫通領域が、同じ細胞の細胞膜内に存在する。第1の膜タンパク質は、細胞膜上に存在する場合、細胞外部分を有する細胞膜タンパク質である。細胞膜は、細胞の内側を細胞の外側から分離する細胞の膜である。第1の膜タンパク質は、典型的には、本明細書に記載される第1の細胞の細胞膜上にある。本発明の結合分子という観点から、又は本発明の方法若しくは使用において、第1の膜タンパク質は、典型的には、本明細書に記載される第1の細胞の細胞膜上にある。第1の膜タンパク質は、第2の細胞上に存在し得るが、第1の膜タンパク質の発現は、第2の細胞上で無視できることが好ましい。典型的には、第2の細胞上の第1の膜タンパク質のレベルは、第1の細胞上の第1の膜タンパク質の発現と比較して、最大で10%である。第2の細胞は、好ましくは、第1の膜タンパク質を有意に発現しない。発現は、第1の膜タンパク質に特異的な抗体を用いたFACSアッセイにおける免疫蛍光によって、第1の膜タンパク質を検出できない場合(バックグラウンドを超えて)には、発現は少なくとも有意ではない。
第2の膜タンパク質は、同様に細胞膜タンパク質である。第2の膜タンパク質は、それが上にある細胞の細胞膜中に存在する膜貫通領域を有する。これは、典型的には、本明細書に記載される第2の細胞である。第2のタンパク質は、更なる膜貫通領域を有し得る。そのような場合、細胞膜内に存在する全ての膜貫通領域が、同じ細胞の細胞膜内に存在する。第2の膜タンパク質は、細胞膜上に存在する場合、細胞外部分を有する細胞膜タンパク質である。本発明の結合分子という観点から、又は本発明の方法若しくは使用において、第2の膜タンパク質は、典型的には、本明細書に記載される第2の細胞の細胞膜上にある。第2の膜タンパク質は、第1の細胞上に存在し得るが、第2の膜タンパク質の発現は、第1の細胞上で無視できることが好ましい。典型的には、第1の細胞上の第2の膜タンパク質のレベルは、第2の細胞上の第2の膜タンパク質の発現と比較して、最大で10%である。第1の細胞は、好ましくは、第2の膜タンパク質を有意に発現しない。発現は、第2の膜タンパク質に特異的な抗体を用いたFACSアッセイにおける免疫蛍光によって、第2の膜タンパク質を検出できない場合(バックグラウンドを超えて)には、発現は少なくとも有意ではない。
いくつかの実施形態によると、本発明による結合分子又は(二重特異性)抗体若しくは変異体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる1つの抗原結合部位と、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない第2の膜タンパク質に結合することができる第2の抗原結合部位とを有する。これにより、TNF受容体スーパーファミリーのいくつかの異なるメンバーを発現しているT細胞などの(免疫)細胞のシス活性化が、少なくとも部分的に回避され、それによって非特異的T細胞活性化に起因する潜在的な有害な副作用及び毒性を低減するという利点がもたらされる。本発明のこれらの実施形態は、TNFスーパーファミリーの受容体に結合する結合剤、特に、TNFスーパーファミリーの少なくとも2つの異なる受容体に結合する結合剤に関連する従来技術のアプローチとは対照的である。このような従来技術のアプローチは、第2の標的が存在しないことを意味する、シスでのT細胞活性化につながり得、例えばサイトカインストームをもたらす過剰なT細胞応答のリスクを伴い得る。結果的に、かかる従来技術のアプローチは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる第1の抗原結合部位と、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない膜タンパク質に結合することができる第2の抗原結合部位とを有する、本発明による結合分子と比較して、副作用の潜在的な増加を有する。
また、CD137又はOX40の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供され、第2の膜タンパク質は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。また、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第1の細胞及び第2の細胞を準備することを含み、第1の細胞が、細胞膜上にTNF受容体スーパーファミリーのメンバーを有し、第2の細胞が、細胞膜上に第2の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、2つの可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と接触させることを含み、1つの可変ドメインが、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる第1の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第2の抗原結合部位を含み、それによって、第1の細胞上のメンバーの活性を刺激し、第2の膜タンパク質が、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない、方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。
いくつかの実施形態では、抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位と、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない第2の膜タンパク質に結合することができる1つの抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインと、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない第2の膜タンパク質に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長IgG、すなわち、完全長IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4であり、好ましくは、完全長IgG1又は完全長IgG4である。
CD137又はOX40の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が更に提供され、第2の膜タンパク質は、B7ファミリーのメンバー、好ましくはPD-L1である。また、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第1の細胞及び第2の細胞を準備することを含み、第1の細胞が細胞膜上にTNF受容体スーパーファミリーのメンバーを有し、第2の細胞が細胞膜上に第2の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、2つの可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と接触させることを含み、1つの可変ドメインが、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる第1の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第2の抗原結合部位を含み、それによって、第1の細胞上のメンバーの活性を刺激し、第2の膜タンパク質が、B7ファミリーのメンバー、好ましくはPD-L1である、方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。
いくつかの実施形態では、抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位と、B7ファミリーのメンバー、好ましくはPD-L1である第2の膜タンパク質に結合することができる1つの抗原結合部位とを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインと、B7ファミリーのメンバー、好ましくはPD-L1である第2の膜タンパク質に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長IgG、すなわち、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4であり、好ましくは、完全長IgG1又は完全長IgG4である。
第1の膜タンパク質の、その結合パートナーへの結合を「ブロックする」可変ドメインは、第1の膜タンパク質の結合パートナーへの結合を干渉する。このような可変ドメインは、第1の膜タンパク質に結合することができる。このようなブロッキング可変ドメインは、第1の膜タンパク質上のエピトープに結合し、エピトープに結合するために、第1の膜タンパク質の結合パートナーと競合することができる。このようなブロッキング可変ドメイン及び第1の膜タンパク質の結合パートナーはまた、第1の膜タンパク質上の異なるエピトープにも結合することができる。そのような場合、ブロッキング活性は、例えば、結合パートナーの結合の低下、並びに/若しくは結合パートナーが第1の膜タンパク質に既に結合しているときの結合パートナーの変位に起因することがあり、及び/又はブロッキング可変ドメインは、立体障害による第1の膜タンパク質への結合パートナーの結合を防止することがある。これら及び他の機構は全て、少なくとも部分的に、結合パートナーが第1の膜タンパク質に結合することを防止することができる。
一実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗原結合部位を含むドメインは、メンバーの、メンバーのリガンドへの結合をブロックする。TNF受容体スーパーファミリーメンバー-リガンド相互作用は、当該技術分野において広く研究されている。一般に、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーは、典型的には、少なくとも1つのリガンドを有することが知られている。既知の受容体リガンド対の例は、TNF受容体腫瘍壊死因子受容体1及び2並びにリガンドTNF-α、受容体OX40及びリガンドOX40L、受容体CD40及びリガンドCD154、Fas受容体及びリガンドFasL、CD30受容体及びリガンドCD153、並びに受容体CD137及びリガンドCD137Lである。いくつかの実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗原結合部位を含む可変ドメインは、メンバーの、メンバーのリガンドへの結合をブロックしない。
いくつかの実施形態では、このドメインは、TNF受容体スーパーファミリーメンバーに結合し、そのTNF受容体スーパーファミリー標的膜タンパク質の、その結合パートナーへの結合をブロックする抗原結合部位を含む。可変ドメインは、2つの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体として提供される場合、可変ドメインが、架橋することなく細胞上のTNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激しないように更に特徴付けられてもよい。いくつかの実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗原結合部位を含むドメインは、CD137のCD137Lへの結合をブロックする可変ドメインを含み、可変ドメインは、2つの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体として提供される場合、細胞上のCD137の活性を刺激しないという事実によって更に特徴付けられる。
用語「結合パートナー」、結合対、受容体リガンド対などは、互いに結合し、結合の結果として活性を発揮することができるタンパク質を指す。パートナー又は対のうちの少なくとも1つは、細胞の細胞膜上の膜タンパク質である。活性は、典型的には、細胞上にこの膜タンパク質を有する細胞に発揮される。
本明細書に記載されるような膜タンパク質の特定の結合対の結合をブロックする可変ドメインは、典型的には、可変ドメインの非存在下での結合と比較したとき、対の結合を低減する。これは、好ましくはインビトロアッセイで測定される。典型的には、これは、可変ドメインを膜タンパク質とインキュベートすることによって行われ、これは、混合物を対の他のメンバーに結合し、続いてインキュベートすることによって行われる。次いで、対の結合は、可変ドメインの非在下での対の結合と比較される。可変ドメインは、第1の膜タンパク質のその結合パートナーへの結合を完全に防止することができる。これは、結合対の結合を部分的に防止することもできる。膜タンパク質の特定の結合対の結合をブロックする可変ドメインは、可変ドメインの非存在下での結合と比較したときに、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%まで対の結合を低減することが好ましい。可変ドメインによる結合のブロッキングは、本明細書において、可変ドメインの同じものの2つを含む二価モノクローナル抗体を使用して得られるブロッキングとして定義される。当然のことながら、可変ドメインはまた、可変ドメインと第2の膜タンパク質に結合する可変ドメインとを含む抗体中に存在する場合も、結合をブロックする。
CD137の細胞外部分に結合することができ、CD137リガンドのCD137への結合を少なくとも部分的にブロックする特定の可変ドメインは、MF6783、MF6861、MF6795、MF6808、MF6798、MF6754、MF6763、MF6744、MF6785、MF6825、MF6737、MF6749、MF6788、又はMF6797のVHのアミノ酸配列を含む可変ドメインである。
PD-L1の細胞外部分に結合することができ、PD1のPD-L1への結合をブロックする特定の可変ドメインは、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5359、MF5377、MF5382、MF5424、MF5426、MF5439、MF5442、MF5553、MF5557、MF5561、MF5576、MF5594、又はMF5708のVHのアミノ酸配列を含む可変ドメインである。アミノ酸配列を図3に示す。
TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合する可変ドメインは、好ましくは、ドメインのうちの2つを含む単一特異性二価抗体で提供される場合、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激しない可変ドメインである。二価単一特異性抗体という状況での可変ドメインは、可変ドメインの同じもののうちの2つを含み、TNF受容体スーパーファミリーメンバーを含む細胞の活性を刺激しない。
細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの刺激活性は、典型的には、細胞の生物活性を測定することによって測定される。活性の種類は、TNF受容体スーパーファミリーのどのメンバーが分析されるかに依存する。例えば、OX40及びCD137については、OX40及び/又はCD137陽性T細胞の活性化状態を測定することができる。OX40及びCD137は、活性化T細胞の活性を刺激するいわゆる共刺激性タンパク質である。T細胞の活性化を測定するための好適な方法が、実施例セクションに提供されている。1つの方法は、活性化T細胞又はT細胞を含む組成物によるIL-2、IFNγ、及び/又はTNFαの産生を測定することである。他のTNF受容体は、異なる生物活性を有する。例えば、CD30は、活性化されたT細胞及びB細胞上で発現され、アポトーシスの正の調節因子である。CD30の刺激は、本発明の結合分子に応答して、活性化B細胞又はT細胞のアポトーシスを測定することによって測定することができる。CD40は、マクロファージなどの抗原提示細胞上に見出される共刺激性タンパク質であり、刺激は、抗原提示細胞の活性化を更に刺激する。TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性は、活性が本明細書で論議される結合分子の存在下で、好ましくは本発明による抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体の存在下で測定される場合に刺激され、結合分子、好ましくは本発明による抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体の非存在下で他の同一の条件下で測定される活性よりも高い。活性を刺激することは、活性の誘導及び既に存在する活性の増強を含む。
CD137又はOX40の活性の刺激は、好ましくは、細胞を含むCD137又はOX40の生物活性を測定することによって測定される。生物活性は、好ましくは、CD137又はOX40発現細胞の活性化状態である。CD137及びOX40は、活性化T細胞を含む免疫細胞上で発現される共刺激分子である。CD137又はOX40の活性の刺激は、好ましくは、例えば活性化T細胞などの免疫細胞の活性化のレベルを決定することによって測定される。個体において、CD137又はOX40の活性の刺激は、個体の免疫細胞及び/又はT細胞の活性化を測定することによって測定される。あるいは、これはまた、適用可能な場合、個体における腫瘍応答、個体のウイルス負荷、又は個体の寄生体負荷を測定することによって決定することもできる。
本発明はまた、T細胞を関与させる及び/又はT細胞を活性化する方法であって、T細胞と、T細胞が関与する又は活性化される細胞(第2の細胞)とを含む系を準備することと、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる可変ドメインと、少なくとも1つの抗体、好ましくは、第2のタンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインとを含む、少なくとも1つの二重特異性抗体を系に提供することと、T細胞が関与及び/又は活性化されることを許容する条件下で系をインキュベートすることとを含む方法も提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。TNF受容体スーパーファミリーメンバーは、好ましくはCD137又はOX40であり、最も好ましくはCD137であり、第2の膜タンパク質は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。第2の膜タンパク質は、好ましくはB7ファミリーのメンバーであり、最も好ましくはPD-L1である。T細胞を関与又は活性化させる細胞は、好ましくは、免疫細胞、(例えば、抗原提示細胞、又はマクロファージ)、新生物性細胞、ウイルス感染細胞、又は細胞内寄生体感染細胞である。T細胞を関与及び/又は活性化させることにより、T細胞を特異的な標的に指向させる。T細胞を活性化することは、T細胞のT細胞受容体を活性化する。T細胞を関与させることは、典型的にはT細胞を活性化する。関与はまた、既に活性化されたT細胞を抗体によって特定化された標的に指向させることもできる。T細胞が関与及び/又は活性化されることを許容する条件は、典型的には培養条件であるが、非ヒト動物においてもインキュベートすることができる。この条件は、T細胞を抗体の非存在下で関与させないような条件である。T細胞の集合体が測定される場合、これらのうちのいくつかは、その集合体が、関与していないか又は活性化されていない十分なT細胞を含有という条件で、既に関与又は活性化され得る。
本発明の抗体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバー以外のタンパク質によって媒介される細胞と、本発明の抗体によって結合された第2の膜タンパク質との間の相互作用を可能にするように2つの細胞をごく近接して近づけ合うことができる。そのような相互作用の1つは、1つの細胞のT細胞受容体と他の細胞上のMHCとの相互作用である。
第1及び第2の細胞は、好ましくは異なる細胞である。異なる細胞は、第1及び第2の膜タンパク質の両方を発現することができる。しかしながら、典型的には、第1の膜タンパク質は、第1の細胞上のみで発現され、第2の膜タンパク質は、第2の細胞上のみで発現される。生物活性は、典型的には、第1の細胞が第2の膜タンパク質を発現しない場合、第2の細胞が、第1の膜タンパク質を発現しない場合、又はより好ましくは、これらの組み合わせである場合に、より刺激される。TNF受容体スーパーファミリーメンバーが、OX40、CD137、CD30、又はCD40である場合、第1の細胞が免疫細胞、好ましくはT細胞であることが好ましい。これらの場合、第2の細胞が異常細胞、腫瘍細胞、又は免疫細胞(例えば、マクロファージ又は抗原提示細胞)であることが好ましい。異常細胞は、健康な個体に通常存在しない細胞である。このような細胞の非限定的な好ましい例は、がん細胞、ウイルス感染細胞、寄生体感染細胞、又は第2の膜タンパク質を発現するよう誘導された細胞である。好適な第2の細胞も免疫細胞である。このような細胞の好ましい例は、樹状細胞、マクロファージ、骨髄系の他の細胞、又はB細胞である。場合によっては、細胞は、免疫細胞、線維芽細胞、又はがん細胞などの隣接細胞によって放出される抑制因子の結果として、第2の膜タンパク質を発現し得る。いくつかの実施形態では、第2の細胞は、主要組織適合複合体(MHC)に関連して、例えばウイルス抗原又は寄生体抗原のような、腫瘍抗原又は病原性抗原を提示する抗原提示細胞である。MHC複合体は、好ましくはヒト白血球抗原(human leukocyte antigen、HLA)複合体である。これに関連して、本発明の抗体は、インビトロでの抗原ナイーブT細胞の増殖及び分化の両方を強化することができる。腫瘍抗原に対する新規なT細胞応答の誘導及び増強は、典型的には、より効果的な腫瘍免疫及びがん細胞の根絶をもたらす。
CD137は、活性化T細胞によって発現され得る。また、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球、及び炎症部位における血管壁の細胞などの他の細胞にも見出される。このタンパク質は、T細胞の活性化のための、その共刺激活性について知られている。リガンドCD137Lは、単球、マクロファージ、及び他の細胞で発現される。CD137のCD137リガンドへの結合は、受容体及びリガンド含有細胞の両方に効果を及ぼす。リガンド又は受容体の活性化は、様々な方法で達成することができる。一般的な方法は、組織培養プレート上のコーティング又は抗体による架橋である(レビューについては、Schwartz、2004を参照されたい)。抗腫瘍応答を増強するその能力と結合された、先天性免疫細胞及び適応免疫細胞の両方におけるCD137発現は、それを腫瘍免疫を増強する治療標的として確立している。様々なCD137標的化免疫療法は、臨床開発に達している(レビューについては、Makkouk et al 2016を参照されたい)。受容体又はリガンドの活性化は、それらの効果を及ぼすために、細胞膜におけるホモマー会合を必要とするように見える。CD137に対する2つの結合部位を有する抗体は、受容体又はリガンドを活性化することができる。したがって、かかる抗体は、CD137に対して二価である。CD137に対する1つの結合部位のみを有する分子も産生された。従来技術のこのような一価結合分子は、受容体を活性化できなかった(McNamara 2008)。対照的に、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、CD137に対して一価である場合であっても、CD137を活性化することができる。
OX40は、T細胞上で発現された二次共刺激性免疫チェックポイント分子である。OX40発現は構成的ではなく、これは、典型的には、活性化から24~72時間後に発現される。そのリガンド、OX40Lもまた、静止期の抗原提示細胞上では発現されないが、それらの活性化後に発現される。
本発明では、結合分子が、第2の膜タンパク質がTNF受容体スーパーファミリーメンバーのメンバーではないときを含む、別の細胞(第2の細胞)上の第2の膜タンパク質に対する結合部位も有する場合、TNF受容体スーパーファミリーメンバー(第1の膜タンパク質)に対する1つの結合部位のみを有する結合分子が活性化され得ることが見出された。第2の膜タンパク質は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーの受容体に対するリガンドであり得る。しかしながら、典型的には、これは、第1の膜タンパク質であるTNF受容体スーパーファミリーメンバーのリガンドではない。第2の膜タンパク質は、第1の膜タンパク質のリガンドではないTNF受容体スーパーファミリーメンバーのリガンドであり得る。
細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性の刺激は、典型的には、2つ以上の受容体複合体を一緒に集めることを必要とする。細胞表面膜上に配列されたホモ三量体リガンドは、典型的には、隣接する細胞上の複数のTNF受容体スーパーファミリーメンバー複合体を結合することによって達成される。TNF受容体スーパーファミリー複合体のクラスタリングは、細胞の活性の刺激を促進すると考えられる。これは、例えば、CD137受容体の細胞質部分のみを有する人工受容体からも明らかである。様々な人工受容体の細胞質部分の近接性もまた、人工受容体含有細胞を刺激する。TNF受容体スーパーファミリーメンバーに特異的な二価の単一特異性抗体は、リガンド効果を模倣し、活性を刺激することも可能である。抗体のアームは、受容体を一緒に集め又はクラスター化すると考えられる。このような活性は、受容体の架橋とも称される。活性は、時には抗抗体抗体を提供することによって更に刺激することができ、これは受容体の更なる架橋をもたらす。TNF受容体スーパーファミリーメンバーのための1つの結合部位のみを有する先行技術の結合分子は、典型的には、活性を刺激することができない。そのような分子は、TNF受容体スーパーファミリーメンバーをクラスター化又は架橋することができない。しかしながら、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、TNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激することができ、これが、受容体スーパーファミリーメンバーに対して一価である場合を含む。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本発明による二重特異性抗体はまた、TNF受容体スーパーファミリー受容体複合体をクラスター化し、それによってTNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性化を促進することができると考えられる。これは、本発明による抗体によって結合される第2の膜タンパク質が、PD-L1などのB7ファミリーのメンバーである場合に特に当てはまる。
本発明の一態様では、第2の膜タンパク質は、2つ以上の第2の膜タンパク質のインスタンス(instances)を含む多量体タンパク質の一部として細胞膜上に存在する。このような多量体タンパク質は、本発明の結合分子の抗原結合部位に2つ以上のエピトープを提供することができる。このような場合、他の細胞上の結合したTNF受容体スーパーファミリーメンバーは、クラスター化され、TNF受容体含有細胞の活性を刺激するようになるであろう。本発明の結合分子は、異なる細胞上の別のタンパク質への結合を通して、TNF受容体スーパーファミリーメンバーの近接性を促すことができる。同じ細胞上の2つ以上のTNF受容体スーパーファミリーメンバーのインスタンスに結合する結合分子によるシス架橋と対比して、トランス架橋とも称される特徴がある。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、ホモ二量体又はホモ三量体である。ホモ二量体は、2つの同一のポリペプチド単位から構成されるタンパク質である。ホモ三量体は、3つの同一のポリペプチド単位から構成されるタンパク質である。いかなる理論にも束縛されるものではないが、第2の膜タンパク質の抗原結合部位のエピトープは、いくつもの結合分子に集合的に結合すると考えられる。これにより、TNF受容体スーパーファミリーメンバーのうちの2つ以上の近接性を促すアンカーとしてこれらは機能する。近接性は、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激するのに十分に近い。
別の実施形態では、第2の膜タンパク質は、細胞膜上の1つ以上の別個の区域に存在するタンパク質である。細胞膜は、細胞膜の全ての構成成分の均質な分布を提供しない。現在、細胞膜は、細胞膜の1つ以上の構成成分が膜の他の部分よりも頻繁に存在する領域を有することが現在知られている(レビューについては、Vereb,G.,et al.,2003 Proc.Natl.Acad.Sci.100.14:8053-8058を参照されたい)。区域は、好ましくは、細胞膜上のタンパク質のクラスター、ドメイン、マイクロドメイン、又はコンパートメントであり、好ましくは免疫シナプスである。いかなる理論にも束縛されるものではないが、非ランダム分布は、TNF受容体スーパーファミリーメンバーが極めて近接することを促進すると考えられる。
他の実施形態では、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性の刺激は、TNF受容体スーパーファミリーの同じメンバー(第1の膜タンパク質)と、同じ第2の膜タンパク質とに結合する2つ以上の結合分子を提供することによって達成される。2つ以上の結合分子を伴う実施形態はまた、Oligoclonics(登録商標)実施形態とも称される。例えば、図15及び16に示されるように、Oligoclonics(登録商標)実施形態は、T細胞活性化をもたらし得る。このようなOligoclonics(登録商標)産物を製造するための一般的な方法は、国際公開第2013/157953号及び同第2004/009618号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。用語「Oligoclonics」は、登録商標であり、(登録商標)によって表示される。Oligoclonics(登録商標)実施形態では、結合分子のうちの少なくとも2つは、第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープに結合する。Oligoclonics(登録商標)実施形態は、2つ以上の結合分子の第1及び/又は第2の膜タンパク質の同一分子への結合を可能にし、それによって、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激する。結合分子のうちの少なくとも2つは、第2の膜タンパク質上の異なるエピトープに結合するか、又は第1の膜タンパク質上の異なるエピトープと第2の膜タンパク質上の異なるエピトープとに結合することが好ましい。特に好ましい実施形態では、結合分子のうちの少なくとも2つは、第1の膜タンパク質上の同じエピトープと第2の膜タンパク質上の異なるエピトープとに結合する。いくつかのOligoclonics(登録商標)実施形態では、2つの結合分子は、TNF受容体スーパーファミリーメンバー-リガンド相互作用をブロックする。他のOligoclonics(登録商標)実施形態では、2つの結合分子は、TNF受容体スーパーファミリーメンバー-リガンド相互作用をブロックしない。第1及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープは、エピトープのうちの1つに結合する結合分子と、異なるエピトープに結合する結合分子との同時結合が可能であることが好ましい。好ましい実施形態では、異なるエピトープは、非競合エピトープである。好ましい実施形態では、結合分子の第1及び第2のものは、CD137又はOX40の同じドメインに結合することができる。好ましい実施形態では、第1及び第2の結合分子は、CD137又はOX40の同じエピトープに結合する。
第2の膜タンパク質は、好ましくは、多量体サイトカイン受容体、B7ファミリーのメンバー、CD28ファミリーのメンバー、ATP結合カセット輸送体(ABC輸送体)のメンバー、アクアポリン、セリン/スレオニンキナーゼ受容体ファミリーのメンバー、受容体型チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。好ましい実施形態では、第2の膜タンパク質は、B7ファミリーのメンバーである。好ましい実施形態では、B7ファミリーメンバーは、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6、又はB7-H7である。第2の膜タンパク質は、B7-ファミリーの共抑制性タンパク質であることが好ましい。この好ましい実施形態では、第2の膜タンパク質に結合する可変ドメインは、B7ファミリーメンバーのCD28ファミリーのその結合パートナーへの結合をブロックすることが好ましい。このようにして、第2の膜タンパク質によって第1の細胞に提供される潜在的な共抑制シグナルが低減される。特に好ましい実施形態では、第2の膜タンパク質は、PD-L1又はPD-L2であり、好ましくはPD-L1である。他の好ましい実施形態では、第2の膜タンパク質は、EGF受容体ファミリー(ErbB)、インスリン受容体ファミリー、IGF受容体ファミリー、FGF受容体ファミリー、VEGF受容体ファミリー、HGF受容体ファミリー、又はAXL受容体ファミリーのメンバーである。第2の膜タンパク質は、好ましくは、EGF受容体ファミリーのメンバー(ErbB)、好ましくはEGFR;ErbB-2又はErbB-3であり、好ましくはErbB-2である。EGFR、EGF受容体ファミリーのErbB-3又はErbB-4メンバーに結合する可変ドメインは、メンバーに対する増殖因子の結合をブロックすることが好ましい。この実施形態では、第2の細胞上のEGF受容体ファミリーメンバーの活性が低減される。
本発明の実施形態では、第2の膜タンパク質は、結合対のメンバーである。例えば、EGF受容体(EGF receptor、EGFR)及びEGFは、結合対を形成する。好適な結合対の他の非限定的な例は、HER3とヘレグリン、LGR5-Rスポンジン、LGR4-Rスポンジン、又はB7ファミリーメンバーリガンドとCD28ファミリーのその受容体である。本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載される結合分子は、結合対の相補的なメンバーに対する第2の膜タンパク質の結合をブロックする。このような結合分子は、典型的には、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激し、第2の膜タンパク質の活性をブロックする。このような結合分子は、第2の細胞が腫瘍細胞である状況、又はがんを有する個体の治療に特によく適している。好ましい実施形態では、第2の膜タンパク質は、B7ファミリーのメンバー、好ましくはPD-L1又はPD-L2、好ましくはPD-L1であり、少なくとも1つの結合分子は、好ましくは、B7ファミリーメンバーのCD28ファミリーのその正常な受容体への結合をブロックする。好ましい実施形態では、第2の膜タンパク質はPD-L1であり、少なくとも1つの結合分子は、好ましくは、PD-L1のPD-1への結合をブロックする。
本発明は、CD137発現細胞における生物学的効果を増強する方法であって、第1の細胞及び第2の細胞を有する系を準備することであって、第1の細胞が細胞膜上にCD137を含み、第2の細胞がタンパク質の細胞外部分上の2つ以上の同じエピトープを有する細胞膜上のタンパク質を含む(すなわち、タンパク質の同一エピトープの2コピー以上が存在する)ことと、系にCD137の細胞外部分に対する結合部位、及びエピトープに対する結合部位を含む結合分子を提供することとを含み、方法が、生物活性を強化できる条件下で系をインキュベートすることを更に含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。いくつかの実施形態では、CD137発現細胞は、免疫細胞、好ましくはT細胞であり、第2の細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、CD137発現細胞は、免疫細胞、好ましくはT細胞であり、第2の細胞は、別の免疫細胞である。いくつかの実施形態では、CD137発現細胞は、免疫細胞、好ましくはT細胞であり、第2の細胞は、骨髄細胞系列の細胞である。いくつかの実施形態では、CD137発現細胞は、免疫細胞、好ましくはT細胞であり、第2の細胞は、抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、好ましくは、MHCの関連において、好ましくはHLAの関連において腫瘍抗原又は病原性抗原を提示する。
細胞は、典型的には、メンバーが細胞によって発現される場合、膜上にTNF受容体スーパーファミリーのメンバーを有する。発現は、様々な方法で測定することができる。定量的RNA特異的PCRを使用することが多い。免疫蛍光を用いた免疫組織化学分析又はFACS分析もまた、しばしば使用される。
第1の細胞及び第2の細胞が提供される好適な系は、細胞培養である。別の好適な系は、第1の細胞及び第2の細胞を含む非ヒト動物である。他の好適な系は、細胞が活性形態で維持されるが、細胞の増殖が必ずしも促進されないエクスビボ系である。第1及び第2の細胞は、例えば、増殖を必ずしも促進する必要はないが、生物活性を測定することを可能にするアッセイ条件下で、一緒にインキュベートすることができる。
第1の膜タンパク質と第2の膜タンパク質との結合によって介在される生物活性を発現する細胞に対して許容性である条件下で系をインキュベートすることは、第1及び第2の細胞が、結合パートナーの結果として生物活性を示すことができる条件下で、系が維持されることを意味する。インビボ又はインビトロでのインキュベーションは、生物活性が明らかになるのに十分な時間を超える経過を伴う必要はない。
本明細書に記載されるような膜タンパク質の特定の結合対の結合をブロックしない可変ドメインは、典型的には、可変ドメインの非存在下での結合と比較して、対の結合を低減しない。これは、好ましくはインビトロアッセイで測定される。典型的には、これは、可変ドメインを膜タンパク質とインキュベートすることによって行われ、これは、混合物を対の他のメンバーに結合し、続いてインキュベートすることによって行われる。次いで、対の結合は、可変ドメインの非存在下での対の結合と比較される。可変ドメインが、可変ドメインの非存在下での結合と比較して、50%以下、好ましくは40%以下、好ましくは30%以下、好ましくは20%以下、及びより好ましくは10%以下まで対の結合を低減する場合、可変ドメインは、膜タンパク質の特定の結合対の結合をブロックしないと考えられる。可変ドメインによる結合、及び結合対の他のメンバーに対する結合のブロッキング又は非ブロッキングは、本明細書において、可変ドメインの2つの同じものを含む二価モノクローナル抗体を使用して得られるブロッキングとして定義される。ブロッキング又は非ブロッキングは、可変ドメインの2つの同じものを含む二価単一特異性抗体で得られたものとして定義される。
CD137の細胞外ドメインに結合することができ、CD137のCD137Lへの結合をブロックしない特定の可変ドメインは、MF6860、MF6848、MF6805、MF6832、MF6870、MF6862、MF6875、又はMF6873のVHのアミノ酸配列を含む可変ドメインである。
PD-L1の細胞外ドメインに結合することができ、PD1のPD-L1への結合をブロックしない特定の可変ドメインは、MF5361のVHのアミノ酸配列を含む可変ドメインである。
例えば、抗原への結合、受容体リガンド相互作用のブロック能力、可変ドメインの生物活性など、必ずしも量ではなく本質的な可変ドメインの機能的態様は、様々な方法で決定することができる。好適なフォーマットは、Fab断片又は抗体である。好適な抗体フォーマットは、2つの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体である。別の好適なフォーマットは、例えば、試験対象の可変ドメイン及び別の可変ドメインを含む二重特異性抗体である。他の可変ドメインは、実施されるアッセイに対して中立的特異性を有する可変ドメインであることが好ましい。好適な中立的可変ドメインは、破傷風毒素に結合することができる可変ドメインである。
本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、そのTNF受容体スーパーファミリー標的膜タンパク質のその結合パートナーへの結合をブロックする可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、そのTNF受容体スーパーファミリー標的膜タンパク質のその結合パートナーへの結合をブロックする可変ドメインを含み、2つの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体として提供される場合、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激しない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、CD137のCD137Lへの結合をブロックする可変ドメインを含み、2つの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体として提供される場合、細胞上のCD137の活性を刺激しない。
本発明はまた、がんを有する個体を治療するための方法であって、それを必要とする個体に、本発明の結合分子、好ましくは、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体、又は本発明の二重特異性抗体を投与することを含む方法も提供される。個体は、好ましくはがんを有する個体である。いくつかの実施形態では、がんは、第2の膜タンパク質を発現するがん細胞を含むがんである。いくつかの実施形態では、がんは、B7ファミリーのメンバーを発現するがん細胞を含むがんである。いくつかの実施形態では、個体の骨髄細胞系列の免疫細胞及び/又は細胞は、第2の膜タンパク質、好ましくはB7ファミリーのメンバーを発現する。いくつかの実施形態では、個体の抗原提示細胞(antigen presenting cell、APC)細胞は、第2の膜タンパク質、好ましくはB7ファミリーのメンバーを発現する。これらの実施形態によると、がん細胞は、第2の膜タンパク質を発現してもよく、又は発現しなくてもよい。APCが第2の膜タンパク質を発現するとき、がんの抗原は、個体のこのようなAPCによって提示され、免疫細胞(好ましくはT細胞)のトランス活性化は、免疫細胞及び個体の免疫細胞、APC、又は腫瘍細胞に結合することができる、本発明の抗体又は機能的部分、派生体、及び/若しくは類似体によって誘導され得る。いくつかの実施形態では、CD137及びB7ファミリーのメンバー、好ましくはPD-L1に結合する、本発明の抗体又は機能的部分、本発明の派生体及び/若しくは類似体が使用される。本発明のかかる抗体又は機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、CD137発現免疫細胞(好ましくはT細胞)と、腫瘍細胞及び/又は免疫細胞、及び/又は骨髄細胞系列の細胞並びに/若しくはB7ファミリーのメンバーを発現するAPCのいずれかに結合することにより、免疫細胞をトランス活性化することができる。
がんは、好ましくは腺癌である。好ましいがんは、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、黒色腫、精巣がん、尿路上皮がん、腎臓がん、胃がん、又はカロチノイドがんである。好ましい実施形態では、癌は、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、又は黒色腫である。特に好ましい実施形態では、癌は、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、又は肝臓がんである。特に好ましい実施形態では、がんは胃腸がんである。好ましい実施形態では、がんは結腸直腸がんである。この実施形態では、結合分子、好ましくは抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、CD137又はOX40に結合することができる可変ドメインと、PD-L1に結合することができる可変ドメインとを有する抗体である。CD137又はOX40に結合する可変ドメインは、好ましくは、CD137のCD137リガンドへの結合をブロックするか、又はOX40の場合、OX40のOX40リガンドへの結合をブロックする。PD-L1に結合する可変ドメインは、好ましくは、PD-1のPD-L1への結合をブロックする。
更に、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体、あるいは二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体、並びに第1の細胞及び第2の細胞を含むエクスビボ系が提供される。第1及び第2の細胞は、好ましくは、細胞膜上にそれぞれ第1及び第2の膜タンパク質を発現する。この系は、好ましくは、第1の細胞の維持及び/又は増殖に好適な細胞系である。この細胞系は、好ましくは、第2の細胞の維持及び/又は増殖に好適な細胞系である。このような系は、例えば、異常細胞に向けられる免疫細胞を上昇及び/又は増殖させるのに好適である。このような免疫細胞は、その後、それを必要とする個体、例えばがん患者に投与することができる。免疫細胞は、好ましくはT細胞又はNK細胞、好ましくは細胞傷害性T細胞を含む。免疫細胞は、好ましくは、それを必要とする個体の自家細胞である。
個体における免疫応答を個体の異常細胞に対して刺激する方法であって、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体を個体に提供することを含む方法が更に提供される。異常細胞は、好ましくはがん細胞、ウイルス感染細胞、寄生体又は寄生体感染細胞である。好ましい実施形態では、細胞は、がん細胞又は新生物性細胞である。この実施形態では、抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、CD137又はOX40の細胞外部分に結合することができる可変ドメインと、PD-L1に結合することができる可変ドメインとを有する抗体である。CD137又はOX40に結合する可変ドメインは、好ましくは、CD137のCD137リガンドへの結合をブロックするか、又はOX40の場合、OX40のOXリガンドへの結合をブロックする。PD-L1に結合する可変ドメインは、好ましくは、PD-1のPD-L1への結合をブロックする。
新生物は、組織の異常な増殖であり、これがまた塊も形成する場合、腫瘍と称される。本発明における新生物は、典型的には、塊を形成する。新生物性細胞は、塊を形成した新生物由来の細胞である。世界保健機関(World Health Organization、WHO)は、新生物を4つの主群:良性新生物、上皮内(in situ)新生物、悪性新生物、及び性状不詳又は不明の新生物に分類する。悪性新生物はまた、がんとして単に知られている。
免疫応答を刺激することは、免疫応答を誘導し、既に存在する免疫応答を強化することを包含する。個体における免疫応答は、該当する場合、個体の腫瘍負荷、個体のウイルス負荷、個体の寄生体負荷を測定することによって測定することができる。
ウイルス感染細胞は、好ましくは、免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、好ましくは単純ヘルペスウイルス、ワセラ-ゾステリルウイルス、サイトメガロウイルス、又はエプスタイン-バーウイルス、パピローマウイルス、肝炎ウイルス、好ましくはA型、B型若しくはC型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、又はアデノウイルスに感染した細胞である。ウイルスは、個体において持続性であることが知られているウイルスであることが好ましい。持続性感染は、ウイルスが除去されないが感染した個体の特定の細胞内に留まるものとして特徴付けられる。持続性感染は、迅速に殺傷することなく、又は更に宿主細胞の過剰な損傷を生じさせることなく、無症状感染及び増殖性感染の両方の段階を伴い得る。持続性ウイルス-宿主相互作用は、潜伏感染、慢性感染及び/又は遅発性感染であってもよい。
寄生体感染細胞は、細胞内寄生体に感染している細胞である。このような寄生体は、宿主の細胞内で増殖及び再生することができる寄生微生物である。一部の細胞内寄生体はまた、細胞の外側で生存することができる。このような寄生体は、いわゆる通性細胞内寄生体である。非限定的な例は、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、レジオネラ、マイコバクテリウムの特定の種、及びクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)である。好ましい細胞内寄生体は、宿主細胞の外側で増殖できない寄生体であり、好ましい例は、クラミジア及び密接に関連する種、マイコバクテリウム・レプレ(Mycobacterium leprae)などのマイコバクテリウムの特定種、特定の原生動物(アピコンプレクサ(マラリア原虫(Plasmodium spp.、トキソプラズマ・ドンディイ(Toxoplasma gondii)及びクリプトスポリジウム・パルブム(Cryptosporidium parvum)並びにトリパノソーマである。
本発明はまた、本発明による抗体重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。核酸分子(典型的には、インビトロ、単離された、又は組換え核酸分子)は、好ましくは、図3に示される重鎖可変領域、又は1、2、3、4、若しくは5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、図3に示される重鎖可変領域のいずれか1つをコード化する。好ましい実施形態では、核酸分子は、図3に示されるような配列を含む。核酸分子は、好ましくは、使用される抗体産生細胞における発現のために最適化されたコドンを使用する。好ましくは、図3に示される重鎖可変領域、又は1、2、3、4、若しくは5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、図3に示される重鎖可変領域をコードする核酸は、ヒト細胞、好ましくはPer.C6TM、又はチャイニーズハムスター、好ましくはCHOでの発現のために最適化されたコドンである。本発明は、図2の重鎖定常領域と共に、言及した重鎖可変領域をコードする核酸分子を更に提供する。
本発明で使用される核酸分子は、典型的には、但しこれに限定されずに、リボ核酸(ribonucleic acid、RNA)又はデオキシリボ核酸(deoxyribonucleic acid、DNA)である。代替的な核酸は、当業者に利用可能である。本発明による核酸分子は、例えば、細胞内に含まれる。核酸分子が細胞内で発現されるとき、細胞は、本発明による抗体を産生することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、本発明による抗体及び/又は本発明による核酸分子を含む細胞を提供する。細胞が重鎖及び軽鎖を産生するとき、抗体が産生される。本発明の抗体を産生できる細胞が提供される。この細胞は、好ましくは、抗体重鎖可変領域を含む抗体重鎖をコード化する核酸分子を含み、この抗体重鎖可変領域は、共通軽鎖と組み合わされると、第1の膜タンパク質に結合することができる。この細胞は、好ましくは、抗体重鎖可変領域を含む抗体重鎖をコード化する核酸分子を更に含み、この抗体重鎖可変領域は、共通軽鎖と組み合わされると、第2の膜タンパク質に結合することができる。細胞は、好ましくは、共通軽鎖をコードする核酸分子を更に含む。細胞は、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の目的のために、好適な細胞は、本発明による抗体及び/又は本発明による核酸を含むことができ、好ましくは産生することができる任意の細胞である。
本発明は、本発明による抗体を含む細胞を更に提供する。また、本発明の抗体を単独で又は一緒にコード化する1つ以上の核酸分子を含む細胞も提供される。1つ以上の核酸分子は、発現可能な核酸分子であり、これは、それらがRNA転写及びタンパク質コードドメインの翻訳にシスでの必要なシグナルを含有することを意味する。好ましくは、細胞(典型的にはインビトロ、単離された、又は組換え細胞)は、抗体を産生する。好ましい実施形態では、細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(Chinese hamster ovary、CHO)細胞、NS0細胞、又はPER-C6TM細胞である。特に好ましい実施形態では、細胞は、CHO細胞である。本発明による細胞を含む細胞培養が更に提供される。様々な機関及び企業は、例えば、臨床使用のために、抗体の大規模生産のための細胞株を開発してきた。このような細胞株の非限定的な例は、CHO細胞、NS0細胞、又はPER.C6TM細胞である。これらの細胞はまた、タンパク質の産生などの他の目的にも使用される。タンパク質及び抗体の工業規模生産のために開発された細胞株は、本明細書では産業細胞株と更に称される。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、本発明の抗体の産生のための抗体の大規模生産のために開発された細胞株の使用を提供する。本発明は、図3、1及び2に示されるVH、VL、及び/又は重鎖をコードする核酸分子を含む抗体を産生するための細胞を更に提供する。好ましくは、核酸分子は、図1及び2に示されるような配列を含む。
本発明は、本発明の細胞を培養することと、培養物から抗体を採取することとを含む、抗体を製造するための方法を更に提供する。好ましくは、細胞は、無血清培地中で培養される。好ましくは、細胞は懸濁増殖に適合される。更に、本発明による抗体を製造するための方法によって得ることができる抗体が提供される。抗体は、好ましくは、培養培地から精製される。好ましくは、抗体は、親和性精製される。
本発明の細胞は、例えば、ハイブリドーマ細胞株、CHO細胞、293F細胞、NS0細胞、又は臨床目的のための抗体の産生に関して、特にヒトにおける投与に使用される抗体の産生に関して、その適性が当該技術分野において既知の任意の他の細胞型である。特に好ましい実施形態では、細胞は、ヒト細胞であり、好ましくはアデノウイルスE1領域又はその機能的等価物によって形質転換される細胞である。このような細胞株の好ましい例は、PER.C6TM細胞株又はその等価物である。特に好ましい実施形態では、細胞は、CHO細胞又はその変異体であり、好ましくは、抗体の発現のためのグルタミンシンターゼ(Glutamine synthetase、GS)ベクター系を使用する変異体である。
本発明は、本発明による1つ以上の抗体又はその変異体を含む医薬組成物を更に提供する。医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む。
本発明の抗体又はその変異体は、標識、好ましくはインビボ撮像用の標識を更に含んでもよい。このようなラベルは、典型的には、治療用途に必要ではない。例えば、診断設定では、標識が有用であり得る。例えば、身体内の標的細胞の可視化において有用であり得る。様々な標識が好適であり、多くは当該技術分野において周知である。好ましい実施形態では、標識は、検出用の放射性標識である。別の好ましい実施形態では、標識は、赤外標識である。好ましくは、赤外標識は、インビボ撮像に適している。様々な赤外標識が、当業者に利用可能である。好ましい赤外標識は、例えば、IRDye800、IRDye 680RD、IRDye 680LT、IRDye 750、IRDye 700DX、IRDye 800RS IRDye 650、IRDye 700ホスホルアミダイト、IRDye 800 ホスホルアミダイト(LI-COR USA;4647 Superior Street;Lincoln,Nebraska)である。
患者に投与されるべき本発明による抗体の量は、典型的には、治療用ウィンドウ内にあり、これは、治療効果を得るために十分な量が使用されるが、その量は、許容不可能な程度の副作用をもたらす閾値を超えないことを意味する。所望の治療効果を得るために必要とされる抗体の量が少なくなるほど、治療用ウィンドウは典型的にはより大きくなるであろう。したがって、低薬用量で十分な治療効果を発揮する本発明による抗体が好ましい。薬用量は、ニボルマブの投与レジメンの範囲であり得る。薬用量はまた、より低くてもよい。
腫瘍抑制環境では、周囲細胞上のPD-L1の発現は、実施例8に記載されるT細胞上のCD137の活性化をもたらすことになる密度閾値に達することが予想される(図28A及び28B)。したがって、二重特異性抗体は、腫瘍内のT細胞を活性化することができるか、又は低PD-L1細胞表面レベルを発現している細胞に対して、有意に少ない程度作用を及ぼすことができるであろう。CD137×PD-L1二重特異性抗体が、FabアームをブロックするPD-L1を含有する場合、抗体は、PD-1/PD-L1遮断を更に克服するであろう。「トランス」に作用することにより、CD137×PD-L1抗体は、PD-1/PD-L1遮断を開放し、CD137を活性化することによってT細胞を同時に活性化する。結果として、CD137×PD-L1抗体は、サイトカインの過多の放出をもたらす局所的T細胞応答を増強することができ(実施例9)、次いで、腫瘍微小環境内の他の免疫細胞を活性化し、少なくとも部分的に腫瘍内の局所的な免疫抑制を克服することができる。本発明者らは、本発明による二重特異性抗体は、多くの場合、同じ種類の特異性を有する従来技術のベンチマーク抗体(例えば、ウレルマブに基づく抗体(抗CD137)又はアテゾリズマブに基づく抗体(抗PD-L1)など)と比較して、より良好なT細胞活性化特性を有することが示した。実施例では、本発明による二重特異性抗体を用いて、このようなベンチマーク系抗体の2つの混合物と比較して、より強いT細胞活性化活性が得られた。これは、例えば、本発明の実施例のT細胞トランス活性化アッセイ及びSEB刺激アッセイで示される。また、本発明による二重特異性抗体が、腫瘍随伴M2マクロファージによって誘発される免疫抑制を逆転させることができ、インビトロで患者腫瘍から単離された腫瘍特異的T細胞を(再)刺激することができることも実証されている。本発明による二重特異性抗体は、腫瘍特異的CD4+エフェクターメモリT細胞、腫瘍特異的CD8+エフェクターメモリT細胞、及び腫瘍特異的CD8+最終分化T細胞を(再)刺激することができ、一方で、アテゾリズマブに基づくベンチマーク抗PD-L1抗体は、典型的には、CD4+T細胞のみを(再)刺激する。したがって、本発明による二重特異性抗体は、CD8+T細胞を含むベンチマーク抗体と比較して、抗原特異的T細胞のより可変なサブセットを(再)刺激する効力を有する。
次に、抗原経験CD8 T細胞を活性化することによって、腫瘍に対する既存の細胞傷害性T細胞応答を再活性化するために、CD137×PD-L1二重特異性抗体は、デノボCD8+T細胞抗腫瘍応答を増強し得る。腫瘍細胞又は抗原提示細胞によって貪食された腫瘍細胞を染色することによって環境内に流出された腫瘍(新生)抗原は、腫瘍組織に見られる異所性リンパ様形成体である排出リンパ節又は三次リンパ様構造まで輸送される。局所腫瘍環境では、腫瘍抗原は、抗原認識時に増殖及び分化するナイーブCD8+T細胞に提示される。
実施例に示すように、本発明による抗体は、ウレルマブに基づく又はアテゾリズマブに基づくベンチマーク抗体と比較して、CD8+T細胞プライミング後のT細胞の増殖をより高い程度に向上させることができる。実施例では、本発明による抗体は、ウレルマブに基づく又はアテゾリズマブに基づくベンチマーク抗体の混合物よりも高い抗原特異的CD8+T細胞の増殖及び分化の両方を誘導することができ、これは、腫瘍特異的メモリ及び最終分化キラーT細胞の大きな集団の生成を促進することになることを実証している。
本発明による抗体又はその変異体、特に二重特異性抗体又はその変異体は、可変ドメインを有する二価単一特異性抗体の組み合わせよりも副作用が少ない場合がある。阻害性及び/又は共刺激性分子をブロックする抗体の組み合わせは、既存の免疫療法に応答しない患者に利益をもたらす。しかしながら、免疫調節受容体(immuno-modulatory receptor、iMOD)の二重遮断が、免疫関連毒性を増加させることが示されている。本発明による抗体又はその変異体、特に二重特異性抗体又はその変異体は、これらがモノクローナル抗体の組み合わせによって再現することができない機能活性を及ぼすことができ、患者における安全性の障害を低減する特異的な細胞集団をより選択的に標的にすることができるため、iMODの二重遮断に対処するのに適している。いかなる理論にも束縛されるものではないが、単一特異性抗体(の組み合わせ)と比較した場合の、本発明の二重特異性抗体又は変異体の有害な副作用の可能性の低減は、少なくとも部分的には、本発明の二重特異性抗体又は変異体は、少なくとも部分的には、本発明の二重特異性抗体又は変異体が、典型的には、トランスにおいてT細胞活性化を呈するのに対し、シスにおいてはT細胞活性化活性は低いことに起因すると考えられる。本発明との関連において、シスT細胞活性化活性が低い抗体の使用は、これが潜在的な非特異的T細胞応答を減少させるため好ましい。本発明による抗体あるいは二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、可変ドメインを有する二価単一特異性抗体の組み合わせよりも少ない免疫関連毒性を有する。
上記を考慮すると、本発明による二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、治療用途に好ましい。
これらの抗体は、重鎖のヘテロ二量体化を促進するCH3領域に突然変異を含有する相補的発現ベクターにそれらをクローニングすることによって、二重特異性抗体として産生された。多くの二重特異性抗体を小規模で産生し、がん細胞株に対する結合及び機能アッセイにおいて試験した。本発明の抗体、特に本発明の二重特異性抗体は、低毒性プロファイルに高効率を組み合わせることができる。本発明の抗体は、免疫標的療法の様々な種類及び系統において有用であり得る。本発明の抗体は、両方のアームと同じ抗原(複数可)に結合する抗体と比較して、治療用ウィンドウの増加を有することができる。
異常細胞、腫瘍及び/又は転移の形成の治療若しくは予防のための薬剤の調製のための、本発明による二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体の使用が更に提供される。転移が生じた腫瘍は、好ましくは、第2の細胞膜タンパク質に対して陽性であり、好ましくはB7ファミリーのメンバーに対して陽性である腫瘍である。
本発明の抗体は、懸濁293F細胞における一過性トランスフェクションの後、>50mg/Lのレベルで産生することができる。二重特異性抗体は、>70%の収率で純度98%超に精製することができる。分析特性評価研究は、二価単一特異性IgG1に匹敵する二重特異性IgG1抗体プロファイルを示す。
本発明はまた、TNF受容体スーパーファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分と、膜結合第2の膜タンパク質、好ましくはB7ファミリーのメンバーの細胞外部分とに結合することができる、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位と、第2のタンパク質、好ましくはB7ファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位とを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体の抗原結合部分は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインと、B7ファミリーのメンバーに結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる。二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに対して一価であり、かつB7ファミリーのメンバーに対して一価である。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長IgG、すなわち、完全長IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4であり、好ましくは、完全長IgG1又は完全長IgG4である。
本発明はまた、CD137の細胞外部分と、PD-L1の細胞外部分とに結合することができる二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供する。二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体は、好ましくは、2つの抗原結合部位を含む。二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体は、好ましくは、CD137に結合することができる1つの抗原結合部位と、PD-L1に結合することができる1つの抗原結合部位とを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体の抗原結合部分は、CD137の細胞外部分に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインと、PD-L1に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる。二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体は、好ましくは、CD137に対して一価であり、かつPD-L1に対して一価である。いくつかの実施形態では、CD137に結合することができる抗原結合部位は、CD137のCD137Lへの結合をブロックすることができる。いくつかの実施形態では、CD137に結合することができる抗原結合部位は、CD137のCD137Lへの結合をブロックすることができない。いくつかの実施形態では、PD-L1に結合することができる抗原結合部位は、PD-L1のPD-1への結合をブロックすることができる。いくつかの実施形態では、PD-L1に結合することができる抗原結合部位は、PD-L1のPD-1への結合をブロックすることができない。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長IgG、すなわち、完全長IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4であり、好ましくは、完全長IgG1又は完全長IgG4である。
本発明はまた、がんを有する個体を治療するための方法であって、それを必要とする個体に本発明の結合分子、あるいは本発明の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体を投与することを含む方法も提供される。
本発明は、がんを有する個体の治療に使用するための、本発明の結合分子、あるいは本発明の二重特異性抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体を更に提供する。
本発明の二重特異性抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体と、TNF受容体スーパーファミリーの膜結合メンバーを発現する第1の細胞と、膜結合第2の膜タンパク質、好ましくはB7ファミリーのメンバーを発現する第2の細胞とを含む細胞系を更に提供する。
本発明は、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第1の細胞及び第2の細胞を準備することを含み、第1の細胞が細胞膜上にメンバーを含み、第2の細胞が細胞膜上に第2の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、2つの可変ドメインを含む二重特異性抗体又はその変異体と接触させることを含み、1つの可変ドメインが、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる第1の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第2の抗原結合部位を含み、それによって、第1の細胞上のメンバーの活性を刺激する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。いくつかの実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーは、CD137又は好ましくはOX40である。第2の膜タンパク質は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。二重特異性抗体は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに対して一価であり、第2の膜タンパク質に対して一価であり、好ましくはB7ファミリーのメンバーに対して一価である。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長IgG、すなわち、完全長IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4であり、好ましくは、完全長IgG1又は完全長IgG4である。
第1の細胞は、好ましくは、細胞膜上で第2の膜タンパク質を有意に発現しない。第2の膜タンパク質は、好ましくは、細胞膜上の1つ以上の区域に存在するタンパク質である。区域は、好ましくは、細胞膜上のクラスター、ドメイン、マイクロドメイン、又はコンパートメントであり、好ましくは免疫シナプスである。第2の膜タンパク質は、好ましくは、2つ以上の第2の膜タンパク質のインスタンスを含む多量体タンパク質の一部として細胞膜上に存在する。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、ホモ二量体又はホモ三量体の一部として細胞膜上に存在する。好ましい実施形態では、第2の膜タンパク質は、多量体サイトカイン受容体、B7ファミリーのメンバー、CD28ファミリーのメンバー、ATP結合カセット輸送体(ABC輸送体)のメンバー、アクアポリン、セリン/スレオニンキナーゼ受容体ファミリーのメンバー、受容体型チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。第2の膜タンパク質は、好ましくはB7-ファミリーのメンバーであり、好ましくはPD-L1又はPD-L2であり、好ましくはPD-L1である。好ましい実施形態では、第2の膜タンパク質は、EGF受容体ファミリー(ErbB)、IGF受容体ファミリー、FGF受容体ファミリー、VEGF受容体ファミリー、HGF受容体ファミリー、又はAXL受容体ファミリーのメンバーである。第2の膜タンパク質は、好ましくは、EGF受容体ファミリーのメンバー(ErbB)であり、好ましくはEGFR、ErbB-2又はErbB-3であり、好ましくはErbB-2である。好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合する可変ドメインは、メンバーに対するリガンドの結合をブロックする。TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインは、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合する2つの可変ドメインを含む二価の単一特異性抗体フォーマットである場合、細胞上のTNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激しない可変ドメインとして定義される。方法は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む更なる二重特異性抗体を準備することを更に含み、第1及び第2の二重特異性抗体は、
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第1及び第2の細胞を第1及び第2の二重特異性抗体と共にインキュベートすることによって、第1の細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。好ましい実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーメンバーは、CD137又はOX40である。いくつかの実施形態では、第1及び第2の二重特異性抗体は、それぞれ、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位を含む。第2の膜タンパク質は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。第1及び/又は第2の二重特異性抗体は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに対して一価であり、第2の膜タンパク質に対して一価であり、好ましくはB7ファミリーのメンバーに対して一価である。第1及び/又は第2の二重特異性抗体は、好ましくは完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第1及び/又は第2の二重特異性抗体は、完全長IgG、すなわち、完全長IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4であり、好ましくは、完全長IgG1又は完全長IgG4である。
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第1及び第2の細胞を第1及び第2の二重特異性抗体と共にインキュベートすることによって、第1の細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。好ましい実施形態では、TNF受容体スーパーファミリーメンバーは、CD137又はOX40である。いくつかの実施形態では、第1及び第2の二重特異性抗体は、それぞれ、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる1つの抗原結合部位を含む。第2の膜タンパク質は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。第1及び/又は第2の二重特異性抗体は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに対して一価であり、第2の膜タンパク質に対して一価であり、好ましくはB7ファミリーのメンバーに対して一価である。第1及び/又は第2の二重特異性抗体は、好ましくは完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第1及び/又は第2の二重特異性抗体は、完全長IgG、すなわち、完全長IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4であり、好ましくは、完全長IgG1又は完全長IgG4である。
第2の膜タンパク質に結合することができる第1及び第2の二重特異性抗体の抗原結合部位は、好ましくは、第2の膜タンパク質の細胞外部分上の異なるエピトープに結合する。第2の膜タンパク質の細胞外部分上の異なるエピトープは、好ましくは非競合エピトープである。
また、CD137又はOX40の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む二重特異性抗体も提供される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、CD137又はOX40に結合することができる1つの抗原結合部位を含む。第2の膜タンパク質は、好ましくは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない。第2の膜タンパク質は、好ましくはT細胞によって有意な程度では発現されない。第2の膜タンパク質は、好ましくは、免疫細胞、骨髄系の細胞、抗原提示細胞、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、又は寄生体感染細胞上で発現される。好ましくは、第2の膜タンパク質は、細胞膜上の1つ以上の区域に存在するタンパク質である。区域は、好ましくは、細胞膜上のクラスター、ドメイン、マイクロドメイン、又はコンパートメントであり、好ましくは免疫シナプスである。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、第2の膜タンパク質の2つ以上を含む多量体タンパク質の一部として細胞膜上に存在するタンパク質である。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、ホモ二量体又はホモ三量体の一部として細胞膜上に存在する。好ましくは、第2の膜タンパク質は、多量体サイトカイン受容体、B7ファミリーのメンバー、CD28ファミリーのメンバー、ATP結合カセット輸送体(ABC輸送体)のメンバー、アクアポリン、セリン/スレオニンキナーゼ受容体ファミリーのメンバー、受容体型チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。第2の膜タンパク質は、好ましくはB7ファミリーのメンバーであり、好ましくはPD-L1又はPD-L2であり、好ましくはPD-L1である。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、EGF受容体ファミリー(ErbB)、インスリン受容体ファミリー、IGF受容体ファミリー、FGF受容体ファミリー、VEGF受容体ファミリー、HGF受容体ファミリー、又はAXL受容体ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、第2の膜タンパク質は、EGF受容体ファミリー(ErbB)のメンバーであり、好ましくは、EGFR、ErbB-2又はErbB-3であり、好ましくはErbB-2である。CD137又はOX40に結合する可変ドメインは、好ましくは、メンバーに対するリガンドの結合をブロックする。CD137又はOX40の細胞外部分に結合する可変ドメインは、好ましくは、CD137又はOX40に結合する2つの可変ドメインを含む二価の単一特異性抗体フォーマットである場合、細胞上のCD137又はOX40の活性を刺激しない可変ドメインとして定義される。二重特異性抗体は、好ましくは、CD137又はOX40に対しては一価であり、第2の膜タンパク質に対して一価である。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長IgG、すなわち、完全長IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4であり、好ましくは、完全長IgG1又は完全長IgG4である。
本発明はまた、本発明による二重特異性抗体を1つ以上含む組成物も提供する。また、本発明の二重特異性抗体を2つ以上含む組成物又はキットオブパーツであって、第1及び第2の二重特異性抗体のCD137又はOX40に結合することができる抗原結合部位は、CD137又はOX40上の異なるエピトープに結合する、組成物又はキットオブパーツも提供される。また、細胞上のCD137又はOX40の活性を刺激する方法であって、第1の細胞及び第2の細胞を準備することを含み、第1の細胞が細胞膜上にCD137又はOX40(第1の膜タンパク質)を有し、第2の細胞が細胞膜上の第2の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、2つの可変ドメインを含む本発明による二重特異性抗体(第1の二重特異性抗体)と接触させることを含み、1つの可変ドメインが、第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第1の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第2の抗原結合部位を含み、それによって、第1の細胞上の第1の膜タンパク質の活性を刺激する、方法も提供される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、第1の膜タンパク質に結合することができる1つの抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。方法は、好ましくは、第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を有する可変ドメインと、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を有する可変ドメインとを含む更なる二重特異性抗体(第2の二重特異性抗体)を準備することを更に含み、第1及び第2の二重特異性抗体は、
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第1の細胞及び第2の細胞を、第1及び第2の二重特異性抗体と共にインキュベートすることによって、第1の細胞上のCD137又はOX40の活性を刺激することを更に含む。第2の膜タンパク質は、好ましくはB7ファミリーのメンバーであり、より好ましくはPD-L1である。
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第1の細胞及び第2の細胞を、第1及び第2の二重特異性抗体と共にインキュベートすることによって、第1の細胞上のCD137又はOX40の活性を刺激することを更に含む。第2の膜タンパク質は、好ましくはB7ファミリーのメンバーであり、より好ましくはPD-L1である。
本明細書で以下に示されるようなMF配列によって定義される抗体は、好ましくは、2つの異なる可変ドメインを有する二重特異性抗体であり、これらの可変ドメインのうちの1つは、示される配列を含む。
CD137の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、MF6754、MF6763、MF6785、又はMF6797(図3)の可変重鎖領域のCDR3領域のアミノ酸配列を含むCDR3領域を有する重鎖可変領域を含む。
CD137の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、MF6754、MF6763、MF6785、又はMF6797(図3)に示されるVHのうちの1つの可変重鎖領域のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を含むCDR1、CDR2、及びCDR3領域を有する重鎖可変領域を含む。CDR1、CDR2、及びCDR3配列は、好ましくは、同じVH領域から選択される。
CD137の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6754、MF6763、MF6785、又はMF6797の可変重鎖領域のアミノ酸配列を含む。アミノ酸挿入(複数可)、欠失(複数可)、置換(複数可)、又はこれらの組み合わせは、もしあれば、CDR領域のアミノ酸配列にはないことが好ましい。
PD-L1の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5424、MF5561、MF5439、MF5553、MF5594、MF5426、MF5442、又はMF5361(図3)の可変重鎖領域のCDR3領域のアミノ酸配列を含むCDR3領域を有する重鎖可変領域を含む。
PD-L1の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5424、MF5561、MF5439、MF5553、MF5594、MF5426、MF5442、又はMF5361(図3)に示されるVHのうちの1つの可変重鎖領域のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を含むCDR1、CDR2、及びCDR3領域を有する重鎖可変領域を含む。CDR1、CDR2、及びCDR3配列は、好ましくは、同じVH領域から選択される。
PD-L1の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5424、MF5561、MF5439、MF5553、MF5594、MF5426、MF5442、又はMF5361の可変重鎖領域のアミノ酸配列を含む。アミノ酸挿入(複数可)、欠失(複数可)、置換(複数可)、又はこれらの組み合わせは、もしあれば、CDR領域のアミノ酸配列にはないことが好ましい。
抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、CD137のCD137リガンドへの結合をブロックするCD137の細胞外部分に結合することができる可変ドメインと、PD-1のPD-L1への結合をブロックするPD-L1の細胞外部分に結合することができる可変ドメインとを含む。この抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体におけるPD-L1の細胞外部分に結合する可変ドメインは、好ましくは、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5424、MF5561、MF5439、MF5553、MF5594、MF5426、MF5442、又はMF5361(図3)のVHのうちの1つのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含む。好ましい実施形態では、PD-L1の細胞外部分に結合する可変ドメインは、示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5424、MF5561、MF5439、MF5553、MF5594、MF5426、MF5442、又はMF5361のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含む。
この抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体におけるCD137の細胞外部分に結合する可変ドメインは、好ましくは、MF6754、MF6763、MF6785、又はMF6797(図3)のVHのうちの1つのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含む。好ましい実施形態では、CD137の細胞外部分に結合する可変ドメインは、示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6754、MF6763、MF6785、又はMF6797のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含む。アミノ酸挿入(複数可)、欠失(複数可)、置換(複数可)、又はこれらの組み合わせは、もしあれば、CDR領域のアミノ酸配列にはないことが好ましい。この抗体又は機能的部分、派生体及び/若しくは類似体における特に好ましい組み合わせは、MF6797及びMF7702、MF6763及びMF7702、MF6785及びMF7702、MF6797及びMF5553、MF6763及びMF5553、MF6785及びMF5553、MF6754及びMF5424、MF6763及びMF5561、MF6785及びMF5439、MF6797及びMF5553、MF6744及びMF5594、MF6744及びMF5361、MF6783及びMF5361、又はMF6783及びMF5594の示した配列又はその変異体を含む可変ドメインの組み合わせである。
本明細書に記載される抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、
MF6754のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
MF6754のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、
MF6754のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6754のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
MF6754のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6754のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
本明細書に記載される抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、
MF6763のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
MF6763のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、
MF6763のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6763のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
MF6763のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6763のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
本明細書に記載される抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、
MF6785のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
MF6785のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、
MF6785のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6785のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
MF6785のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6785のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
本明細書に記載される抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、
MF6797のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
MF6797のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、
MF6797のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6797のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
MF6797のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6797のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
示したMFのVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5554、MF5576、MF5578、MF9375、MF9376、MF7702、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5439、又はMF5361(図3)のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む。
実施例に示すように、MF5553に基づくPD-L1結合可変ドメインを有する抗体は、特に良好なT細胞活性化を提供し、MF6754、MF6763、MF6785、及びMF6797を含む異なるCD137結合可変ドメインとの組み合わせをもたらす。
したがって、更に、
MF6754のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が更に提供される。
MF6754のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が更に提供される。
また、
MF6754のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6754のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
また、
MF6754のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6754のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5553のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6754のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6754のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5553のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
更に、
MF6763のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
MF6763のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
また、
MF6763のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6763のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
また、
MF6763のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6763のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5553のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6763のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6763のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5553のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
更に、
MF6785のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
MF6785のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
また、
MF6785のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6785のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
また、
MF6785のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6785のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5553のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6785のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6785のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5553のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
更に、
MF6797のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
MF6797のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
また、
MF6797のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6797のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
また、
MF6797のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6797のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5553のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6797のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6797のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5553のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5553のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF7702に基づくPD-L1結合可変ドメインを有する抗体が、特に良好なT細胞活性化を提供し、MF6763、MF6785、及びMF6797を含む異なるCD137結合可変ドメインとの組み合わせをもたらすことが、実施例に更に示されている。
したがって、更に、
MF6797のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
MF6797のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
また、
MF6797のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6797のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
また、
MF6797のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6797のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF7702のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6797のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6797のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF7702のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
更に、
MF6763のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
MF6763のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
また、
MF6763のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6763のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
また、
MF6763のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6763のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF7702のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6763のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6763のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF7702のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
更に、
MF6785のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
MF6785のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
また、
MF6785のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6785のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
また、
MF6785のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6785のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF7702のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体、及び/若しくは類似体も提供される。
MF6785のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6785のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF7702のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF7702のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体、及び/若しくは類似体も提供される。
MF6744に基づくCD137結合可変ドメインと、MF5594に基づくPD-L1結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体が、特に良好なT細胞活性化を提供することが、実施例に更に示されおり、例えば、図14~16を参照されたい。重要なことに、このような抗体は、抗体ウレルマブに基づく抗体と比較して、より強いT細胞活性化の可能性を有する。
したがって、更に
MF6744のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
MF6744のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
また、
MF6744のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6744のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
また、
MF6744のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6744のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5594のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体、及び/若しくは類似体も提供される。
MF6744のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6744のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5594のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体、及び/若しくは類似体も提供される。
MF6744に基づくCD137結合可変ドメインと、MF5361に基づくPD-L1結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体が、特に良好なT細胞活性化を提供することが、実施例に更に示されおり、例えば、図14~16を参照されたい。重要なことに、このような抗体は、抗体ウレルマブに基づく抗体と比較して、より強いT細胞活性化の可能性を有する。
したがって、更に、
MF6744のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
MF6744のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が提供される。
また、
MF6744のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6744のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
また、
MF6744のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6744のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5361のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6744のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6744のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5361のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6783に基づくCD137結合可変ドメインと、MF5361に基づくPD-L1結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体が、特に良好なT細胞活性化を提供することが、実施例に更に示されおり、例えば、図14~15を参照されたい。重要なことに、このような抗体は、抗体ウレルマブに基づく抗体と比較して、より強いT細胞活性化の可能性を有する。
したがって、更に、
MF6783のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が更に提供される。
MF6783のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が更に提供される。
また、
MF6783のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6783のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
また、
MF6783のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6783のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5361のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6783のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6783のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5361のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5361のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6783に基づくCD137結合可変ドメインと、MF5594に基づくPD-L1結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体が、特に良好なT細胞活性化を提供することが、実施例に更に示されおり、例えば、図14~15を参照されたい。
したがって、更に、
MF6783のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が更に提供される。
MF6783のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体が更に提供される。
また、
MF6783のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6783のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
また、
MF6783のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6783のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5594のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
MF6783のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6783のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、
MF5594のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5594のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体も提供される。
加えて、MF6744に基づくCD137結合可変ドメイン及びMF5361に基づくPD-L1結合可変ドメインと共に、MF6744に基づくCD137結合可変ドメイン及びMF5594に基づくPD-L1結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体の組み合わせ(デュアル二重特異性、例えば、Oligoclonics(登録商標)実施形態として適用される)は、優れたT細胞活性化(図14~16を参照)を提供し、かつウレルマブに基づく抗体よりも優れていることが実施例に示されている。
したがって、
MF6744のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第1の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツが更に提供される。
MF6744のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第1の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツが更に提供される。
また、
MF6744のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第1の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。
MF6744のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第1の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。
また、
MF6744のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6744のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5594のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと、を含む、第1の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6744のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5361のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。
MF6744のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6744のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5594のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと、を含む、第1の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6744のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5361のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。
加えて、MF6744に基づくCD137結合可変ドメイン及びMF5361に基づくPD-L1結合可変ドメインと共に、MF6783に基づくCD137結合可変ドメイン及びMF5594に基づくPD-L1結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体の組み合わせ(デュアル二重特異性、例えば、Oligoclonics(登録商標)実施形態として適用される)は、ウレルマブに基づく抗体と比べて、優れたT細胞活性化を提供することが実施例に示されている。
したがって、
MF6783のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第1の二重特異性抗体、又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツが更に提供される。
MF6783のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第1の二重特異性抗体、又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツが更に提供される。
また、
MF6783のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第1の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。
MF6783のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第1の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。
また、
MF6783のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6783のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5594のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと、を含む、第1の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6744のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5361のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。
MF6783のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6783のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5594のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5594のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインと、を含む、第1の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と、
MF6744のVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6744のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むCD137結合可変ドメインと、MF5361のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5361のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むPD-L1結合可変ドメインとを含む、第2の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。
良好なT細胞活性化特性を有するMF6797のVHのCD137特異的結合は、図42に示されるようなCD137アミノ酸配列のArg66、Gly70、及びPhe72含むアミノ酸の存在に関連することもまた、実施例に示されている。
したがって、本発明はまた、CD137に結合することが可能である、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体を提供し、抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体のCD137への結合は、図42に示されるようなCD137アミノ酸配列のArg66、Gly70、及びPhe72を含むアミノ酸の存在に関連する。CD137に対する抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体の結合は、好ましくは、図42に示されるようなCD137アミノ酸配列のVal71を含むアミノ酸にも関連する。
用語「Arg66」は、図42に示されるようなCD137配列の66位におけるアルギニン残基を指す。用語「Gly70」は、図42に示されるようなCD137配列の70位におけるグリシン残基を指す。用語「Val71」は、図42に示されるようなCD137配列の71位におけるバリン残基を指す。用語「Phe72」は、図42に示されるようなCD137配列の72位におけるフェニルアラニン残基を指す。
CD137に対する抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体の結合は、これらの残基のいずれか1つがアラニンによって置換されるとき、得られるCD137タンパク質に対する抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体の結合が低減される場合、列挙されたアミノ酸残基の存在に関連する。
いくつかの実施形態は、CD137に結合することが可能である、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体を提供し、抗体、又は機能的部分、派生体若しくは類似体は、図42に示されるようなCD137アミノ酸配列のアミノ酸Arg66、Gly70、及びPhe72に特異的に結合する。抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体はまた、図42に示されるようなCD137アミノ酸配列のアミノ酸Val71にも特異的に結合することが好ましい。
いくつかの好ましい実施形態は、CD137、及びPD-L1に結合することが可能であり、MF6797に基づくCD137結合可変ドメインと、MF7702に基づくPD-L1結合可変ドメインとを有する、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体を提供する。特に良好なT細胞活性化特性を有するこのような二重特異性抗体のCD137及びPD-L1への結合は、上述のCD137アミノ酸残基を含むアミノ酸に関連する。
ここで、上述のCD137アミノ酸残基が同定されたことから、これらのアミノ酸残基に特異的に結合する抗体、又はその変異体を生成若しくは選択することが可能となる。特定のアミノ酸残基に特異的に結合する結合分子の生成及び/又は選択は、例えば、標的アミノ酸残基を含む特定のドメインを含有する抗原断片で抗体を生成することが可能なトランスジェニック非ヒト動物を免疫することなどによって、当該技術分野において周知の方法を用いて行うことができる。あるいは、抗体ファージディスプレイライブラリーを、同定されたアミノ酸残基に結合するファージについてスクリーニングすることによる。
CD137及び/又はPD-L1に結合する抗体PB17311と競合する、抗体又はその変異体が更に提供される。競合抗体又はその変異体は、例えば、CD137及び/又はPD-L1を含む細胞が、PB17311と共に、かつ候補抗体又はその変異体と共にインキュベートされる、競合アッセイを用いて同定される。CD137及び/又はPD-L1を含む細胞が、候補抗体又はその変異体なしでPB17311とインキュベートされる対照と比較して、結合したPB17311の量を減少させることが可能な候補抗体又はその変異体は、競合抗体又は変異体である。
いくつかの実施形態は、CD137及び/又はPD-L1への結合に関して抗体PB17311と競合する、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体を提供する。
いくつかの実施形態は、図42に示されるようなCD137アミノ酸配列のアミノ酸Arg66、Gly70、及びPhe72への結合に関して、より好ましくは図42に示されるようなCD137アミノ酸配列のアミノ酸Arg66、Gly70、Val71、及びPhe72への結合に関して、抗体PB17311と競合する、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体を提供する。
いくつかの実施形態は、CD137及び/又はPD-L1への結合に関して、抗体PB17309と競合する、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体を提供する。
いくつかの実施形態は、CD137及び/又はPD-L1への結合に関して抗体PB17310と競合する、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体を提供する。
CD137及び/又はPD-L1への結合に関して、PB17309又はPB17310と競合する抗体又はその変異体は、例えば、候補抗体又はその変異体の非存在下でのPB17309又はPB17310の、CD137及び/又はPD-L1を含む細胞への結合が、候補抗体又はその変異体の存在下でのPB17309又はPB17310の、CD137及び/又はPD-L1を含む細胞への結合と比較される、競合アッセイを用いて単離される。CD137及び/又はPD-L1を含む細胞が、候補抗体又はその変異体なしでPB17309又はPB17310とインキュベートされる対照と比較して、結合したPB17309又はPB17310の量を減少させることが可能な候補抗体又はその変異体は、競合抗体又は変異体として同定される。
本明細書に記載されるOX40×PD-L1二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、
MF6629、MF6630、MF6637、MF6643、MF6645、MF6648、MF6655、MF6658、MF6660、MF6675、MF6686、MF6690、MF6692、MF6700、MF6706、MF6714、MF6721、MF6722、MF6724、MF6728、MF6729、MF6826、MF6940、MF6942、MF6943、MF6944、MF6947、MF6949、MF7331、MF7332、MF7334、MF7341、MF7345、MF7350、MF7351、MF7352、MF7353、MF7356、MF7358、MF7365、MF7366、MF7371、MF7372、MF7374、MF7378、MF7382、MF7383、MF7394、MF7395、又はMF7397のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むOX40結合可変ドメインと、
PD-L1結合可変ドメインと
を含む。PD-L1結合可変ドメインは、好ましくは、図3に示されるようなPD-L1特異的VHのVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含む。好ましい実施形態では、PD-L1特異的VHは、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5426、又はMF5439(図3)に関して示されている。
MF6629、MF6630、MF6637、MF6643、MF6645、MF6648、MF6655、MF6658、MF6660、MF6675、MF6686、MF6690、MF6692、MF6700、MF6706、MF6714、MF6721、MF6722、MF6724、MF6728、MF6729、MF6826、MF6940、MF6942、MF6943、MF6944、MF6947、MF6949、MF7331、MF7332、MF7334、MF7341、MF7345、MF7350、MF7351、MF7352、MF7353、MF7356、MF7358、MF7365、MF7366、MF7371、MF7372、MF7374、MF7378、MF7382、MF7383、MF7394、MF7395、又はMF7397のVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含むOX40結合可変ドメインと、
PD-L1結合可変ドメインと
を含む。PD-L1結合可変ドメインは、好ましくは、図3に示されるようなPD-L1特異的VHのVHのCDR3のアミノ酸配列、又はCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するVH領域を含む。好ましい実施形態では、PD-L1特異的VHは、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5426、又はMF5439(図3)に関して示されている。
抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体は、好ましくは、
示したMFのVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6629、MF6630、MF6637、MF6643、MF6645、MF6648、MF6655、MF6658、MF6660、MF6675、MF6686、MF6690、MF6692、MF6700、MF6706、MF6714、MF6721、MF6722、MF6724、MF6728、MF6729、MF6826、MF6940、MF6942、MF6943、MF6944、MF6947、MF6949、MF7331、MF7332、MF7334、MF7341、MF7345、MF7350、MF7351、MF7352、MF7353、MF7356、MF7358、MF7365、MF7366、MF7371、MF7372、MF7374、MF7378、MF7382、MF7383、MF7394、MF7395、又はMF7397のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むOX40結合可変ドメインと、
PD-L1結合可変ドメインと
を含む。PD-L1結合可変ドメインは、好ましくは、示したMF(図3)のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5426、又はMF5439(図3)のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含む。
示したMFのVHのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF6629、MF6630、MF6637、MF6643、MF6645、MF6648、MF6655、MF6658、MF6660、MF6675、MF6686、MF6690、MF6692、MF6700、MF6706、MF6714、MF6721、MF6722、MF6724、MF6728、MF6729、MF6826、MF6940、MF6942、MF6943、MF6944、MF6947、MF6949、MF7331、MF7332、MF7334、MF7341、MF7345、MF7350、MF7351、MF7352、MF7353、MF7356、MF7358、MF7365、MF7366、MF7371、MF7372、MF7374、MF7378、MF7382、MF7383、MF7394、MF7395、又はMF7397のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含むOX40結合可変ドメインと、
PD-L1結合可変ドメインと
を含む。PD-L1結合可変ドメインは、好ましくは、示したMF(図3)のVHのアミノ酸配列に関して、最大15個の、好ましくは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは0、1、2、3、4、又は5個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、MF5594、MF5424、MF5426、MF5553、MF5442、MF5561、MF5426、又はMF5439(図3)のVHのアミノ酸配列を有するVH領域を含む。
言及されたH、VL、L、及びVL領域における言及された最大15個の、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の、好ましくは1、2、3、4、又は5個のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせは、好ましくは、H、VL、L、及びVL鎖のCDR3領域には存在しないことが好ましく、VH又はVL鎖のCDR1、CDR2、若しくはCDR3領域には存在しないことが好ましく、又はFR4領域には存在しないことが好ましい。
明確さ及び簡潔な説明のために、特徴は本明細書では同じ又は別個の実施形態の一部として記載されているが、本発明の範囲は、記載される特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含んでもよいことが理解されよう。
本発明は、以下の実施例によっても更に説明される。これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではなく、本発明を単に明確にするために提供される。
本明細書で使用するとき、「MFXXXX」(式中、Xは独立して、0~9の数字である)は、可変ドメインを含むFabを指し、ここでVHは、4桁で特定されたアミノ酸配列を有する。別途記載のない限り、可変ドメインの軽鎖可変領域は、典型的には、図1Aの配列、典型的には1Bの配列を有する。「MFXXXX VH」は、4桁で同定されたVHのアミノ酸配列を指す。MFは、軽鎖の定常領域と、軽鎖の定常領域と通常相互作用する重鎖の定常領域とを更に含む。PGは、同一の重鎖及び軽鎖を含む単一特異性抗体を指す。PBは、2つの異なる重鎖を有する二重特異性抗体を指す。重鎖(VH)の可変領域は、異なる、典型的にはCH3領域であって、重鎖のうちの1つは、そのCH3ドメインのKK突然変異を有し、他方は、そのCH3ドメインの相補的なDE突然変異を有する(参考文献PCT/NL2013/050294号(国際公開第2013/157954号として公開)を参照されたい)。
実施例1
選択及びスクリーニングのための材料の生成
細胞株の培養
ヒトES-2細胞(カタログ番号CRL-1978)を、ATCCから購入し、10%のFBS(Lonza)を補充したMcCoy’s 5A(Gibco)中で日常的に維持した。フリースタイル293F細胞(カタログ番号p/n51-0029)をInvitrogenから入手し、293フリースタイル培地中で日常的に維持した。HEK293T(カタログ番号ATCC-CRL-11268)、及びCHO-K1(カタログ番号DSMZ ACC110)細胞株をATCCから購入し、L-グルタミン(Gibco)及びFBS(Lonza)を補充したDMEM/F12(Gibco)中で日常的に維持した。
選択及びスクリーニングのための材料の生成
細胞株の培養
ヒトES-2細胞(カタログ番号CRL-1978)を、ATCCから購入し、10%のFBS(Lonza)を補充したMcCoy’s 5A(Gibco)中で日常的に維持した。フリースタイル293F細胞(カタログ番号p/n51-0029)をInvitrogenから入手し、293フリースタイル培地中で日常的に維持した。HEK293T(カタログ番号ATCC-CRL-11268)、及びCHO-K1(カタログ番号DSMZ ACC110)細胞株をATCCから購入し、L-グルタミン(Gibco)及びFBS(Lonza)を補充したDMEM/F12(Gibco)中で日常的に維持した。
免疫化のためのOX40、CD137、及びPD-L1発現ベクターの生成、及び安定した細胞株の生成
クローニングのための特有の制限部位及び効率的な翻訳のためのコザックコンセンサス配列を含む各標的の完全長cDNAを、クローニングのための特有の制限部位及び効率的な翻訳のためのコザックコンセンサス配列を導入する特異的プライマーを用いて、合成するか、又は標的cDNAを含有する市販の発現構築物上のPCR増幅を介して得た。各標的のcDNAを、Nhel/EcoRIを介して、pIRES-Neo3(Clontech;図4)又はpVAX1(Thermo Fisher Scientific;図5)などの真核発現構築物中にクローンし、それぞれpIRES-Neo3_[TARGET_NAME]及びpVAX1_[TARGET_NAME]をもたらした。インサート配列を、NCBI参照アミノ酸配列と比較して検証した。pIRES-Neo3構築物を、安定した細胞株の生成に使用した。pVAX1構築物を、免疫化の目的に使用した。得られた構築物の名称の概要については、表1を参照されたい。
クローニングのための特有の制限部位及び効率的な翻訳のためのコザックコンセンサス配列を含む各標的の完全長cDNAを、クローニングのための特有の制限部位及び効率的な翻訳のためのコザックコンセンサス配列を導入する特異的プライマーを用いて、合成するか、又は標的cDNAを含有する市販の発現構築物上のPCR増幅を介して得た。各標的のcDNAを、Nhel/EcoRIを介して、pIRES-Neo3(Clontech;図4)又はpVAX1(Thermo Fisher Scientific;図5)などの真核発現構築物中にクローンし、それぞれpIRES-Neo3_[TARGET_NAME]及びpVAX1_[TARGET_NAME]をもたらした。インサート配列を、NCBI参照アミノ酸配列と比較して検証した。pIRES-Neo3構築物を、安定した細胞株の生成に使用した。pVAX1構築物を、免疫化の目的に使用した。得られた構築物の名称の概要については、表1を参照されたい。
細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長huCD137インサート(pIRES-Neo3及びpVAX1の両方)(GenBank:NP_001552.2と同一)は、
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELである。
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELである。
この中で、
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSは、シグナルペプチドである。
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSは、シグナルペプチドである。
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQは、huCD137のECDである。
IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVは、予測されるTM領域である。
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELは、細胞内テールである。
細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長マカクザル(カニクイザル(Macaca fascicularis))CD137インサート(pIRES-Neo3及びpVAX1の両方)(GenBank:ABY47575.1と同一)は、
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQIIFFLALTSTVVLFLLFFLVLRFSVVKRSRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELである。
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQIIFFLALTSTVVLFLLFFLVLRFSVVKRSRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELである。
この中で、
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSは、シグナルペプチドである。
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSは、シグナルペプチドである。
LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQは、maCD137のECDである。
IIFFLALTSTVVLFLLFFLVLRFSVVは、予測されるTM領域である。
KRSRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELは、細胞内テールである。
細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長ラットCD137インサート(pIRES-Neo3及びpVAX1の両方)(GenBank:XP_008762505.1と同一)は、
MGSSCYNMVVTVLLVVGTEEVRATRNPCDSCEAGTFCSKYPPVCTSCPPSTYSSTGGQPNCDICRVCQGYFRFKKPCSSTHNAECECVEGFHCLGPKCTRCEKDCRPGQELTEQGCKNCGLGTFNDQDGAGVCRPWTNCSLDGRSVLKNGTKEKDVVCGPPVVSLSPSTTPSAVTTPERESGERPLQVLTLFLALTLALLLFLIFIILWFSVPKWLRKKFPHIFKQPFKKAVRTAQEEDACSCRFPEEEEGGGGSYELである。
MGSSCYNMVVTVLLVVGTEEVRATRNPCDSCEAGTFCSKYPPVCTSCPPSTYSSTGGQPNCDICRVCQGYFRFKKPCSSTHNAECECVEGFHCLGPKCTRCEKDCRPGQELTEQGCKNCGLGTFNDQDGAGVCRPWTNCSLDGRSVLKNGTKEKDVVCGPPVVSLSPSTTPSAVTTPERESGERPLQVLTLFLALTLALLLFLIFIILWFSVPKWLRKKFPHIFKQPFKKAVRTAQEEDACSCRFPEEEEGGGGSYELである。
この中で、
MGSSCYNMVVTVLLVVGTEEVRAはシグナルペプチドである。
MGSSCYNMVVTVLLVVGTEEVRAはシグナルペプチドである。
TRNPCDSCEAGTFCSKYPPVCTSCPPSTYSSTGGQPNCDICRVCQGYFRFKKPCSSTHNAECECVEGFHCLGPKCTRCEKDCRPGQELTEQGCKNCGLGTFNDQDGAGVCRPWTNCSLDGRSVLKNGTKEKDVVCGPPVVSLSPSTTPSAVTTPERESGERPLQは、raCD137のECDである。
VLTLFLALTLALLLFLIFIILWFは、予測されるTM領域である。
SVPKWLRKKFPHIFKQPFKKAVRTAQEEDACSCRFPEEEEGGGGSYELは、細胞内テールである。
細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長huPD-L1インサート(pIRES-Neo3及びpVAX1の両方)(GenBank:AAI13735.1と同一)は、
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEETである。
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEETである。
この中で、
MRIFAVFIFMTYWHLLNAは、シグナルペプチドである。
MRIFAVFIFMTYWHLLNAは、シグナルペプチドである。
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERは、huPD-L1のECDである。
THLVILGAILLCLGVALTFIFは、予測されるTM領域である。
RLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEETは、細胞内テールである。
細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長マカクザル(カニクイザル(Macaca fascicularis))PD-L1インサート(pIRES-Neo3及びpVAX1の両方)(GenBank:ABO33161.1と同一)は、
MRIFAVFIFTIYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECRFPVEKQLGLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLGPEENHTAELVIPELPLALPPNERTHLVILGAIFLLLGVALTFIFYLRKGRMMDMKKSGIRVTNSKKQRDTQLEETである。
MRIFAVFIFTIYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECRFPVEKQLGLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLGPEENHTAELVIPELPLALPPNERTHLVILGAIFLLLGVALTFIFYLRKGRMMDMKKSGIRVTNSKKQRDTQLEETである。
この中で、
MRIFAVFIFTIYWHLLNAは、シグナルペプチドである。
MRIFAVFIFTIYWHLLNAは、シグナルペプチドである。
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECRFPVEKQLGLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLGPEENHTAELVIPELPLALPPNERは、maPD-L1のECDである。
THLVILGAIFLLLGVALTFIFは、予測されるTM領域である。
YLRKGRMMDMKKSGIRVTNSKKQRDTQLEETは、細胞内テールである。
細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長ヒトOX40インサート(pIRES-Neo3及びpVAX1の両方)(GenBank:NP_003318.1と同一)は、
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIである。
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIである。
この中で、
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGは、シグナルペプチドである。
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGは、シグナルペプチドである。
LHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAは、ECDである。
VAAILGLGLVLGLLGPLAILLは、予測されるTM領域である。
ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIは、細胞内テールである。
細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長ラット(ドブネズミ(Rattus norvegicus))OX40インサート(pIRES-Neo3及びpVAX1の両方)(GenBank:NP_037181.1と同一)は、
MYVWVQQPTAFLLLGLSLGVTVKLNCVKDTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDTVCHPCEPGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTEDTVCQCRPGTQPRQDSSHKLGVDCVPCPPGHFSPGSNQACKPWTNCTLSGKQIRHPASNSLDTVCEDRSLLATLLWETQRTTFRPTTVPSTTVWPRTSQLPSTPTLVAPEGPAFAVILGLGLGLLAPLTVLLALYLLRKAWRSPNTPKPCWGNSFRTPIQEEQTDTHFTLAKIである。
MYVWVQQPTAFLLLGLSLGVTVKLNCVKDTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDTVCHPCEPGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTEDTVCQCRPGTQPRQDSSHKLGVDCVPCPPGHFSPGSNQACKPWTNCTLSGKQIRHPASNSLDTVCEDRSLLATLLWETQRTTFRPTTVPSTTVWPRTSQLPSTPTLVAPEGPAFAVILGLGLGLLAPLTVLLALYLLRKAWRSPNTPKPCWGNSFRTPIQEEQTDTHFTLAKIである。
この中で、
MYVWVQQPTAFLLLGLSLGは、シグナルペプチドである。
MYVWVQQPTAFLLLGLSLGは、シグナルペプチドである。
VTVKLNCVKDTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDTVCHPCEPGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTEDTVCQCRPGTQPRQDSSHKLGVDCVPCPPGHFSPGSNQACKPWTNCTLSGKQIRHPASNSLDTVCEDRSLLATLLWETQRTTFRPTTVPSTTVWPRTSQLPSTPTLVAPEGPは、ECDである。
AFAVILGLGLGLLAPLTVLLALYLLは、予測されるTM領域である。
RKAWRSPNTPKPCWGNSFRTPIQEEQTDTHFTLAKIは、細胞内テールである。
細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長マカクザル(カニクイザル(Macaca fascicularis))OX40インサート(pIRES-Neo3及びpVAX1の両方)(GenBank:XP_005545179.1と同一)は、
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTTAKLHCVGDTYPSNDRCCQECRPGNGMVSRCNRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSAKPCKACTWCNLRSGSERKQPCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPPTQPQETQGPPARPTTVQPTEAWPRTSQRPSTRPVEVPRGPAVAAILGLGLALGLLGPLAMLLALLLLRRDQRLPPDAPKAPGGGSFRTPIQEEQADAHSALAKIである。
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTTAKLHCVGDTYPSNDRCCQECRPGNGMVSRCNRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSAKPCKACTWCNLRSGSERKQPCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPPTQPQETQGPPARPTTVQPTEAWPRTSQRPSTRPVEVPRGPAVAAILGLGLALGLLGPLAMLLALLLLRRDQRLPPDAPKAPGGGSFRTPIQEEQADAHSALAKIである。
この中で、
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTTAKは、シグナルペプチドである。
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTTAKは、シグナルペプチドである。
LHCVGDTYPSNDRCCQECRPGNGMVSRCNRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSAKPCKACTWCNLRSGSERKQPCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPPTQPQETQGPPARPTTVQPTEAWPRTSQRPSTRPVEVPRGPAは、ECDである。
VAAILGLGLALGLLGPLAMLLは、予測されるTM領域である。
ALLLLRRDQRLPPDAPKAPGGGSFRTPIQEEQADAHSALAKIは、細胞内テールである。
CD137、OX40、又はPD-L1を発現する安定した細胞株の生成
pIRES-Neo3_[TARGET_NAME]発現構築物(表1)を使用して、それぞれのタンパク質を安定的に発現するフリースタイル293F又はCHO-K1クローンを生成した。構築物を、リポフェクタフェタミントランスフェクションを使用してCHO-K1細胞中に、又はフリースタイル293F細胞ではPEIトランスフェクションを使用して、一過性にトランスフェクションし、それぞれのタンパク質と反応する抗体を用いてFACSによりスクリーニングした。発現の確認後、一過性にトランスフェクションした細胞を制限希釈液中に播種し、使用した発現構築物に関連する選択圧力下で培養して、安定した細胞クローンを得た。選択から2~3週間後に、クローンをFACSによりスクリーニングした。選択されたクローンを連続継代で増殖させ、FACSで再試験し、-150℃に凍結した。異種タンパク質を安定的に発現するクローンの名称は、CHO-K1_[TARGET_NAME]細胞又はフリースタイル293F_[TARGET_NAME]細胞である。安定した細胞株を生成するために使用された構築物及び得られた名称の概要については、表1を参照されたい。
pIRES-Neo3_[TARGET_NAME]発現構築物(表1)を使用して、それぞれのタンパク質を安定的に発現するフリースタイル293F又はCHO-K1クローンを生成した。構築物を、リポフェクタフェタミントランスフェクションを使用してCHO-K1細胞中に、又はフリースタイル293F細胞ではPEIトランスフェクションを使用して、一過性にトランスフェクションし、それぞれのタンパク質と反応する抗体を用いてFACSによりスクリーニングした。発現の確認後、一過性にトランスフェクションした細胞を制限希釈液中に播種し、使用した発現構築物に関連する選択圧力下で培養して、安定した細胞クローンを得た。選択から2~3週間後に、クローンをFACSによりスクリーニングした。選択されたクローンを連続継代で増殖させ、FACSで再試験し、-150℃に凍結した。異種タンパク質を安定的に発現するクローンの名称は、CHO-K1_[TARGET_NAME]細胞又はフリースタイル293F_[TARGET_NAME]細胞である。安定した細胞株を生成するために使用された構築物及び得られた名称の概要については、表1を参照されたい。
実施例2
免疫化、選択、及びスクリーニング
免疫化に使用されるマウス
huCD137、huOX40、及びhuPD-L1に結合するヒト抗体の生成については、ヒトVK1-39軽鎖(共通軽鎖マウス、国際公開第2009/157771号を参照されたい)に対する、及びヒト重鎖(HC)ミニ遺伝子座(ヒトV遺伝子断片、全てのヒトDs及び全てのヒトJsの選択を含む)に対するトランスジェニックマウスを、以下に簡単に記載するように、組換えタンパク質又はこのタンパク質をコード化するDNAのいずれかで免疫化した。これらのマウスは、「MeMo(登録商標)」マウスと称される。
免疫化、選択、及びスクリーニング
免疫化に使用されるマウス
huCD137、huOX40、及びhuPD-L1に結合するヒト抗体の生成については、ヒトVK1-39軽鎖(共通軽鎖マウス、国際公開第2009/157771号を参照されたい)に対する、及びヒト重鎖(HC)ミニ遺伝子座(ヒトV遺伝子断片、全てのヒトDs及び全てのヒトJsの選択を含む)に対するトランスジェニックマウスを、以下に簡単に記載するように、組換えタンパク質又はこのタンパク質をコード化するDNAのいずれかで免疫化した。これらのマウスは、「MeMo(登録商標)」マウスと称される。
タンパク質免疫化
「MeMo(登録商標)」マウスを、組換えタンパク質及びGerbuアジュバントMM(Gerbu Biotechnik c#3001)を皮下注射することにより免疫化した。組換えhuPD-L1-His(SinoBiological、カタログ番号10084-H08H)、huOX40-Fc(R&D、カタログ番号3388-OX)及びhuOX40-His(SinoBiological、カタログ番号10481-H08H)タンパク質を、免疫化に使用した。CD137抗体パネル生成については、タンパク質免疫は行わなかった。マウスを、40μlのアジュバントと混合したPBS中40μgの組換えタンパク質で、100μlの総容量で免疫化させた。続いて、14及び28日目に、マウスを、20μlのアジュバントと混合したPBS中20μgの組換えタンパク質で、50μlの総容量で追加免疫化させた。35日目にマウス血清を採取し、血清力価を決定した。低血清力価を有するマウスは、ブースター免疫化及び血清分析の更なるサイクルを受けた。各サイクルは、50μlのPBS中20μgの組換えタンパク質を使用する週2回の免疫化、続いて1週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的に対して高い血清力価を示すマウスは、50μlのPBS中の20μgの組換えタンパク質を3日間連続して毎日注射することからなる最終的な追加免疫化を受けた。最終注射から1日後に、マウスリンパ系組織を採取した。
「MeMo(登録商標)」マウスを、組換えタンパク質及びGerbuアジュバントMM(Gerbu Biotechnik c#3001)を皮下注射することにより免疫化した。組換えhuPD-L1-His(SinoBiological、カタログ番号10084-H08H)、huOX40-Fc(R&D、カタログ番号3388-OX)及びhuOX40-His(SinoBiological、カタログ番号10481-H08H)タンパク質を、免疫化に使用した。CD137抗体パネル生成については、タンパク質免疫は行わなかった。マウスを、40μlのアジュバントと混合したPBS中40μgの組換えタンパク質で、100μlの総容量で免疫化させた。続いて、14及び28日目に、マウスを、20μlのアジュバントと混合したPBS中20μgの組換えタンパク質で、50μlの総容量で追加免疫化させた。35日目にマウス血清を採取し、血清力価を決定した。低血清力価を有するマウスは、ブースター免疫化及び血清分析の更なるサイクルを受けた。各サイクルは、50μlのPBS中20μgの組換えタンパク質を使用する週2回の免疫化、続いて1週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的に対して高い血清力価を示すマウスは、50μlのPBS中の20μgの組換えタンパク質を3日間連続して毎日注射することからなる最終的な追加免疫化を受けた。最終注射から1日後に、マウスリンパ系組織を採取した。
DNA免疫化
MeMo(登録商標)のマウスを、マイクロピグメンテーション装置を用いて、DNAタトゥーによって免疫化させた。DNAタトゥー免疫化を、標的抗原をコード化する20μgのプラスミドDNA(pVAX1_[TARGET_NAME]、表1)を用いて行った。マウスを、ヒト標的のみ(PD-L1)をコード化するDNAで、又はヒト及びラット(CD137、OX40)標的をコード化するDNAでの交互免疫化によって免疫化して、種交差反応性抗体を得た。PD-L1の免疫化については、0.5mgの抗CD25抗体PC61.5(Bioceros)をマウスに注射して寛容を破壊することによる免疫化の開始の4日前にTreg細胞を枯渇させた。マウスを、0、3、6、14、17、28及び31日目に免疫化させた。35日目にマウス血清を採取し、血清力価を決定した。ヒト及び/又はマカクザル標的に対する血清反応性が低いマウスには、ヒト、ラット、又はマカクザルDNA抗原でブースター免疫化の更なるサイクルを受けさせて、血清分析を行った。各サイクルは、週2回のDNA免疫化、続いて1週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的を発現する細胞に対する強い血清反応性を示すマウスは、最終的な追加免疫化を受けた後、3日後にリンパ系組織を採取した。
MeMo(登録商標)のマウスを、マイクロピグメンテーション装置を用いて、DNAタトゥーによって免疫化させた。DNAタトゥー免疫化を、標的抗原をコード化する20μgのプラスミドDNA(pVAX1_[TARGET_NAME]、表1)を用いて行った。マウスを、ヒト標的のみ(PD-L1)をコード化するDNAで、又はヒト及びラット(CD137、OX40)標的をコード化するDNAでの交互免疫化によって免疫化して、種交差反応性抗体を得た。PD-L1の免疫化については、0.5mgの抗CD25抗体PC61.5(Bioceros)をマウスに注射して寛容を破壊することによる免疫化の開始の4日前にTreg細胞を枯渇させた。マウスを、0、3、6、14、17、28及び31日目に免疫化させた。35日目にマウス血清を採取し、血清力価を決定した。ヒト及び/又はマカクザル標的に対する血清反応性が低いマウスには、ヒト、ラット、又はマカクザルDNA抗原でブースター免疫化の更なるサイクルを受けさせて、血清分析を行った。各サイクルは、週2回のDNA免疫化、続いて1週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的を発現する細胞に対する強い血清反応性を示すマウスは、最終的な追加免疫化を受けた後、3日後にリンパ系組織を採取した。
タンパク質及びDNA免疫化の組み合わせ(OX40のみ)
マウスを、組換えhuOX40-His(SinoBiological、カタログ番号10481-H08H)で免疫化させ、DNA(pVAX1_raOX40)及びタンパク質(huOX40-His)免疫化の交互免疫化によって追加免疫し、種交差反応性抗体を得た。したがって、マウスを、40μlのアジュバントと混合したPBS中40μgの組換えタンパク質で、100μlの総容量で免疫化させた。続いて、14及び17日目に、マウスを、20μgのpVAX1_raOX40でDNAタトゥーにより追加免疫化し、続いて28日目に、20μlのアジュバントと混合したPBS中20μgのhuOX40-Hisタンパク質で、50μlの総容量でタンパク質免疫化させた。35日目にマウス血清を採取し、血清力価を決定した。低ヒト及び/又はマカクザル血清力価を有するマウスは、ブースター免疫化及び血清分析の更なるサイクルを受けた。各サイクルは、20μgのhuOX40-His、pVAX1_raOX40又はpVAX1_maOX40による週2回のタンパク質若しくはDNA免疫化、続いて1週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的に対して高い血清力価を示すマウスは、50μlのPBS中の20μgの組換えタンパク質を3日間連続して毎日注射することからなる最終的な追加免疫化を受けた。最終注射から1日後に、マウスリンパ系組織を採取した。
マウスを、組換えhuOX40-His(SinoBiological、カタログ番号10481-H08H)で免疫化させ、DNA(pVAX1_raOX40)及びタンパク質(huOX40-His)免疫化の交互免疫化によって追加免疫し、種交差反応性抗体を得た。したがって、マウスを、40μlのアジュバントと混合したPBS中40μgの組換えタンパク質で、100μlの総容量で免疫化させた。続いて、14及び17日目に、マウスを、20μgのpVAX1_raOX40でDNAタトゥーにより追加免疫化し、続いて28日目に、20μlのアジュバントと混合したPBS中20μgのhuOX40-Hisタンパク質で、50μlの総容量でタンパク質免疫化させた。35日目にマウス血清を採取し、血清力価を決定した。低ヒト及び/又はマカクザル血清力価を有するマウスは、ブースター免疫化及び血清分析の更なるサイクルを受けた。各サイクルは、20μgのhuOX40-His、pVAX1_raOX40又はpVAX1_maOX40による週2回のタンパク質若しくはDNA免疫化、続いて1週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的に対して高い血清力価を示すマウスは、50μlのPBS中の20μgの組換えタンパク質を3日間連続して毎日注射することからなる最終的な追加免疫化を受けた。最終注射から1日後に、マウスリンパ系組織を採取した。
血清力価の判定
血清力価は、ヒト及びマカクザル標的抗原を発現する細胞株を使用してFACS分析により決定した(表1)。
血清力価は、ヒト及びマカクザル標的抗原を発現する細胞株を使用してFACS分析により決定した(表1)。
合成ファージFabライブラリーの生成
合成ライブラリーを、天然レパートリー及び正準配列多様性における頻繁な使用のために選択された生殖細胞系列ヒトVH遺伝子のレパートリーに基づいて構築した。PCRを用いて、合成HCDR3領域を、これらのVH遺伝子に添加した。これは、VH遺伝子のフレームワーク1にアニーリングし、クローニングのためのSfil制限部位を含むフォワードプライマーを使用して行った。リバースプライマーは、VH遺伝子のフレームワーク3にアニーリングするための配列、続いて、HCDR3多様性をコード化するランダム化配列と、クローニングのためのBstEII及びXhol制限部位も含有す配列をコード化するフレームワーク4とを含んだ。合成CDR3領域は、完全にランダムであるか、又はHCDR3内の特定の位置におけるアミノ酸残基の使用頻度に基づいて、より制限された多様性をコード化していた。VH遺伝子をコード化するPCR産物を、前述の制限酵素を使用し、かつ共通軽鎖コード化遺伝子も含めて、ファージM13遺伝子3タンパク質と融合させてファージディスプレイベクター中にクローニングした。大腸菌(E.coli)TG1の大規模ライゲーション及び形質転換は、抗原特異的Fab断片を同定するために、抗原又は細胞上でパニングするために使用されたファージ上に表示された合成Fab断片の大型ライブラリーをもたらした。
合成ライブラリーを、天然レパートリー及び正準配列多様性における頻繁な使用のために選択された生殖細胞系列ヒトVH遺伝子のレパートリーに基づいて構築した。PCRを用いて、合成HCDR3領域を、これらのVH遺伝子に添加した。これは、VH遺伝子のフレームワーク1にアニーリングし、クローニングのためのSfil制限部位を含むフォワードプライマーを使用して行った。リバースプライマーは、VH遺伝子のフレームワーク3にアニーリングするための配列、続いて、HCDR3多様性をコード化するランダム化配列と、クローニングのためのBstEII及びXhol制限部位も含有す配列をコード化するフレームワーク4とを含んだ。合成CDR3領域は、完全にランダムであるか、又はHCDR3内の特定の位置におけるアミノ酸残基の使用頻度に基づいて、より制限された多様性をコード化していた。VH遺伝子をコード化するPCR産物を、前述の制限酵素を使用し、かつ共通軽鎖コード化遺伝子も含めて、ファージM13遺伝子3タンパク質と融合させてファージディスプレイベクター中にクローニングした。大腸菌(E.coli)TG1の大規模ライゲーション及び形質転換は、抗原特異的Fab断片を同定するために、抗原又は細胞上でパニングするために使用されたファージ上に表示された合成Fab断片の大型ライブラリーをもたらした。
免疫化マウスの組織からのRT-PCRによる「免疫」ファージFabライブラリーの生成
脾臓及び排出リンパ節をマウスから除去することにより、対応する標的タンパク質に対して有意な体液性応答が観察された。
脾臓及び排出リンパ節をマウスから除去することにより、対応する標的タンパク質に対して有意な体液性応答が観察された。
脾臓リンパ節及び鼠径リンパ節の両方から単一細胞懸濁液を生成し、続いてこれらの組織をTrizol LS試薬(Thermo Scientific c#10296028)中に溶解し、使用するまで-80℃で保存した。
成功裏に免疫化されたマウスからの鼠径リンパ節を、「免疫」ファージ抗体レパートリーの構築に使用した。RNAをリンパ系組織の単一細胞懸濁液から抽出した。1μgの全RNAを、IgG-CH1特異的プライマーを用いるRT反応で使用した。次いで、得られたcDNAを使用して、本質的にMarksら(J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581-97)に記載されているように、インハウス適応VH特異的プライマーを使用して、VHコード化cDNAのポリクローナルプールを増幅した。次いで、得られたPCR産物を、軽鎖(図1A及び1B)が全ての抗体に対して同じであり、ベクターによってコード化されたということを除いて、de Haardら(J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218-30)に記載されているように、ファージ上にFab断片を表示するためにファージミドベクター(図6)中にクローニングした。ライゲーション後、ファージミドを使用して大腸菌(E.coli)TG1細菌を形質転換し、形質転換細菌をアンピシリン及びグルコースを含有するLB-寒天プレート上に播種した。全てのファージライブラリーは、>4×105個の形質転換体を含有し、>90%のインサート頻度を有した。一晩増殖後に細菌を採集し、確立されたプロトコル(de Haard et al.,J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218-30)に従ってファージを調製するために使用した。
組換えタンパク質を使用する、合成及び「免疫」ファージFabライブラリーからのヒト標的タンパク質に特異的に結合するFab断片を保有するファージの選択
生成されたファージFabライブラリーを使用して、直接コーティングされた組換えタンパク質上のファージディスプレイを使用して標的特異的Fabを選択した。PD-L1については、huPD-L1-His(Sinobiological、カタログ番号10084-H08H)、huPD-L1-Fc(R&D、カタログ番号156-B7)、及びmaPD-L1-His(Sinobiological、カタログ番号90251-C08H)、を使用した。CD137については、huCD137-Fc(R&D、カタログ番号838-4B)、raCD137-Fc(R&D、カタログ番号7968-4B)、moCD137-Fc(R&D、カタログ番号937-4B)、huCD137-His(Sinobiological、カタログ番号10041-H08H)、及びhuCD137-Fc(Enzo、カタログ番号ALX-522-031-C050)を使用し、OX40については、huOX40-Fc(R&D、カタログ番号3388-OX)、及びhuOX40-His(Sinobiological、カタログ番号10481-H08H)を使用した。
生成されたファージFabライブラリーを使用して、直接コーティングされた組換えタンパク質上のファージディスプレイを使用して標的特異的Fabを選択した。PD-L1については、huPD-L1-His(Sinobiological、カタログ番号10084-H08H)、huPD-L1-Fc(R&D、カタログ番号156-B7)、及びmaPD-L1-His(Sinobiological、カタログ番号90251-C08H)、を使用した。CD137については、huCD137-Fc(R&D、カタログ番号838-4B)、raCD137-Fc(R&D、カタログ番号7968-4B)、moCD137-Fc(R&D、カタログ番号937-4B)、huCD137-His(Sinobiological、カタログ番号10041-H08H)、及びhuCD137-Fc(Enzo、カタログ番号ALX-522-031-C050)を使用し、OX40については、huOX40-Fc(R&D、カタログ番号3388-OX)、及びhuOX40-His(Sinobiological、カタログ番号10481-H08H)を使用した。
組換えタンパク質を用いた選択については、タンパク質をMAXISORP(商標)ELISAプレートのウェルにコーティングした。MAXISORP(商標)ELISAプレートを、PBS中4%の乾燥した脱脂粉乳(Marvel)でブロックした。ファージFabライブラリーはまた、4%のMarvelでブロックされ、Fcタグ付き組換えタンパク質を使用した場合、ファージライブラリーをコーティングされた抗原に添加する前に、Fc領域結合剤を枯渇させるために、ヒトIgGを過剰に使用した。
コーティングされたタンパク質とのファージライブラリーのインキュベーションを、振盪条件下で室温にて1.5時間実施した。次いで、プレート又はチューブを、PBS中0.05%のTween-20で15回洗浄し、続いてPBSで5回洗浄した。結合したファージをトリプシンを用いて20分間溶出させ、その後、トリプシンをAEBSFトリプシン阻害剤(Sigma)で中和した。
溶出液を大腸菌(E.coli)TG-1に添加し、ファージ感染用に37℃でインキュベートした。続いて、感染した細菌をアンピシリン及びグルコースを含有する寒天プレート上に播種し、37℃で一晩インキュベートした。選択出力からの単一クローンを、標的に応じてELISA又はFACSにおける標的結合についてスクリーニングした。
合成ファージFabライブラリーを用いた選択については、第1ラウンド選択についての上記概要と同じプロトコルを使用して、第1ラウンド選択出力の救出後に、第2ラウンド選択を実施した。
標的タンパク質を安定して発現する細胞を使用する、「免疫」ファージFabライブラリーからのヒト標的に特異的に結合するFab断片を保有するファージの選択
標的免疫化マウスから生成されたファージFabライブラリーを、それぞれの標的を発現する細胞上のファージディスプレイを用いて選択した。CD137、OX40、又はPD-L1を発現する安定な細胞株(表1)を、第1ラウンドの選択に使用した。細胞を、PBS中10%のFBSでブロックした。ブロッキング後、救出されたファージを、ブロックされた細胞と共にインキュベートした。細胞+ファージを、4℃で1時間インキュベートした。PBS中10%のFBSの1mlを用いて、細胞の洗浄を行った(5回)。結合したファージをトリプシンを用いて20分間溶出させ、その後、トリプシンをAEBSFトリプシン阻害剤(Sigma)で中和した。溶出液を大腸菌(E.coli)TG-1に添加し、ファージ感染用に37℃でインキュベートした。続いて、ファージ感染した細菌をアンピシリン及びグルコースを含有する寒天プレート上に播種し、37℃で一晩インキュベートした。
標的免疫化マウスから生成されたファージFabライブラリーを、それぞれの標的を発現する細胞上のファージディスプレイを用いて選択した。CD137、OX40、又はPD-L1を発現する安定な細胞株(表1)を、第1ラウンドの選択に使用した。細胞を、PBS中10%のFBSでブロックした。ブロッキング後、救出されたファージを、ブロックされた細胞と共にインキュベートした。細胞+ファージを、4℃で1時間インキュベートした。PBS中10%のFBSの1mlを用いて、細胞の洗浄を行った(5回)。結合したファージをトリプシンを用いて20分間溶出させ、その後、トリプシンをAEBSFトリプシン阻害剤(Sigma)で中和した。溶出液を大腸菌(E.coli)TG-1に添加し、ファージ感染用に37℃でインキュベートした。続いて、ファージ感染した細菌をアンピシリン及びグルコースを含有する寒天プレート上に播種し、37℃で一晩インキュベートした。
PD-L1については、huPD-L1を内因的に発現するES-2細胞を用いた第2ラウンド選択を、第1ラウンド選択に使用したものと同じプロトコルで行った。選択後、単一のクローンを、FACSにおける標的結合についてスクリーニングした。
ELISAにおける標的特異的Fabクローンのスクリーニング
単一クローンのうちの、可溶性Fab又はファージを調製した(J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581-97;J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218-30)。得られた可溶性Fab又はファージサンプルを、PBS中4%の乾燥スキムミルク(Marvel)(ブロック緩衝液)中で希釈し(それぞれ1:5又は1:10)、選択に使用したものと同じ抗原でコーティングされたウェルに対する、又はraCD137-Fc(R&D、カタログ番号7968-4B)若しくはmoCD137-Fc(R&D、カタログ番号937-4B)のいずれかを用いて実施された全ての選択出力についてはhuCD137-Fc(R&D、カタログ番号838-4B)でコーティングされたウェルに対する結合をELISAで試験した。
単一クローンのうちの、可溶性Fab又はファージを調製した(J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581-97;J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218-30)。得られた可溶性Fab又はファージサンプルを、PBS中4%の乾燥スキムミルク(Marvel)(ブロック緩衝液)中で希釈し(それぞれ1:5又は1:10)、選択に使用したものと同じ抗原でコーティングされたウェルに対する、又はraCD137-Fc(R&D、カタログ番号7968-4B)若しくはmoCD137-Fc(R&D、カタログ番号937-4B)のいずれかを用いて実施された全ての選択出力についてはhuCD137-Fc(R&D、カタログ番号838-4B)でコーティングされたウェルに対する結合をELISAで試験した。
結合したFaBを、ブロック緩衝液中で1:1000に希釈した抗myc抗体(Roche、カタログ番号11667203001)で、続いてブロック緩衝液中で1:5000に希釈したHRP結合抗マウスIgG抗体(Jackson Immunoresearch、カタログ番号715-035-150)で染色することによって検出した。結合したファージを、ブロック緩衝液中で1:5000に希釈したHRP結合モノクローナル抗M13抗体(GE healthcare、カタログ番号27-9421-01)で染色することによって検出した。
各抗体染色後、ウェルをPBS-T(PBS-0.05%(v/v)Tween 20)で洗浄した。結合した二次抗体をTMB/H2O2染色により可視化し、OD450nm測定により染色を定量化した。OD450nmが陰性対照Fabで得られたバックグラウンドシグナルの少なくとも3倍以上であるとき、クローンは標的に結合すると考えられた。
全ての標的特異的クローンのVHコード化cDNAを配列決定した。配列同一性及びクラスター解析に基づく特有のクローンの選択を、次いで、細胞選択出力から得られたクローンについて以下に記載されるように、細胞上の発現された標的への結合に対するFACSで分析した。
FACSにおける標的特異的Fabクローンのスクリーニング
対応の標的を発現する細胞上で選択された単一クローンのうちの、可溶性Fab又はファージを(J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581-97;J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218-30)に記載されるように調製した。Fab試料を、FACS緩衝液中の1:5に希釈したFab試料と1:1000に希釈した抗myc抗体(Gentaur、カタログ番号04-CMYC-9E10)との混合物(PBS中、0.5%のHi-FBS)を用いたインキュベーションによって、ヒト及びマカクザル標的を発現する細胞への結合についてFACSにおいて試験した(表1)。結合したFab/抗myc複合体を、FACS緩衝液中で1:500に希釈したAPCコンジュゲートヤギ抗マウスIgG抗体(BD Bioscience、カタログ番号550826)とインキュベーションすることによって検出した。
対応の標的を発現する細胞上で選択された単一クローンのうちの、可溶性Fab又はファージを(J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581-97;J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218-30)に記載されるように調製した。Fab試料を、FACS緩衝液中の1:5に希釈したFab試料と1:1000に希釈した抗myc抗体(Gentaur、カタログ番号04-CMYC-9E10)との混合物(PBS中、0.5%のHi-FBS)を用いたインキュベーションによって、ヒト及びマカクザル標的を発現する細胞への結合についてFACSにおいて試験した(表1)。結合したFab/抗myc複合体を、FACS緩衝液中で1:500に希釈したAPCコンジュゲートヤギ抗マウスIgG抗体(BD Bioscience、カタログ番号550826)とインキュベーションすることによって検出した。
ファージ試料を、ブロック緩衝液中にファージ試料を1:3で希釈し、標的発現細胞と1時間インキュベートすることによって、FACSにおける結合について試験した。結合したファージを、ビオチン化抗M13抗体(Fitzgerald、カタログ番号61R-M101ABTB62-FEZ、FACS緩衝液中1:125、氷上30分間)及びPE標識ストレプトアビジン(Invitrogen、カタログ番号SA1004-4、FACS緩衝液中1:400、氷上15分間)で染色することによって検出した。各抗体とのインキュベーション後、ウェルをFACS緩衝液で3回洗浄した。染色した細胞を、FACS Accuri C6機器(Becton and Dickinson)を用いて分析した。平均蛍光強度が陰性対照Fabで得られたバックグラウンドシグナルの少なくとも3倍以上であるとき、クローンは陽性であると考えられた。
結果
上述の方法によって得られた24個のCD137特異的クローン、14個のPD-L1特異的クローン、及び50個のOX40特異的クローンのVH配列を図3に示す。
上述の方法によって得られた24個のCD137特異的クローン、14個のPD-L1特異的クローン、及び50個のOX40特異的クローンのVH配列を図3に示す。
実施例3
IgGフォーマットにおけるhuCD137、huOX40及びhuPD-L1特異的Fabクローンの特性評価
ヒトCD137、OX40、及びPD-L1特異的FabのIgGフォーマットへの再クローニング
細胞上で発現されたヒト及びマカクザル標的タンパク質に結合した、CDR3配列とVH生殖細胞系列との差異に基づく特有なクローンの選択を、次いで、標準化分子生物学的手法に従って、消化されたcDNAのプールのSfi1-BstEII消化及びライゲーションを用いて、共通軽鎖(図1)を含有する、MV1452(図7)などのIgG発現プラスミドに再クローニングした。
IgGフォーマットにおけるhuCD137、huOX40及びhuPD-L1特異的Fabクローンの特性評価
ヒトCD137、OX40、及びPD-L1特異的FabのIgGフォーマットへの再クローニング
細胞上で発現されたヒト及びマカクザル標的タンパク質に結合した、CDR3配列とVH生殖細胞系列との差異に基づく特有なクローンの選択を、次いで、標準化分子生物学的手法に従って、消化されたcDNAのプールのSfi1-BstEII消化及びライゲーションを用いて、共通軽鎖(図1)を含有する、MV1452(図7)などのIgG発現プラスミドに再クローニングした。
ヒトCD137、OX40又はPD-L1特異的Fab及び破傷風毒素特異的Fabを含有する二重特異性IgGの発現
二重特異性抗体を、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化及び形成を確実にするために、独自のCH3工学技術を用いて、異なるVHドメインを有するIgGをコード化する2つのプラスミドの一過性共トランスフェクションによって生成した。重鎖を含有する両方のプラスミド上に存在する共通軽鎖もまた、同じ細胞内で共トランスフェクションされる。本発明の同時係属出願(例えば、国際公開第2013/157954号及び国際公開第2013/157953号、参照により本明細書に組み込まれる)では、単一の細胞から二重特異性抗体を産生するための方法及び手段を開示しており、これにより、単一特異性抗体の形成よりも二重特異性抗体の形成を有利にする手段が提供される。本発明では、これらの方法を好適に採用することができる。具体的には、二重特異性完全長IgG分子のみを本質的に生成するのに好ましい変異は、第1のCH3ドメイン中の351及び366位でのアミノ酸置換、例えばL351K及びT366K(EU番号付けに従っての番号付け)(「KK-変異体」重鎖)、及び第2のCH3ドメイン中の351及び368位でのアミノ酸置換、例えばL351D及びL368E(「DE-変異体」重鎖)、又はその逆である。これは、負に帯電したDE-変異体重鎖及び正に帯電したKK-変異体重鎖が優先的に対をなし、ヘテロ二量体を形成する(いわゆる「DEKK」二重特異性分子)ことが、本発明の同時係属出願により以前に実証されている。DE-変異体重鎖のホモ二量体化(DE-DEホモ二量体)又はKK-変異体重鎖のホモ二量体化(KK-KKホモ二量体)は、同一の重鎖間のCH3-CH3界面における荷電残基間の強い反発力のために、ほとんど発生しない。
二重特異性抗体を、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化及び形成を確実にするために、独自のCH3工学技術を用いて、異なるVHドメインを有するIgGをコード化する2つのプラスミドの一過性共トランスフェクションによって生成した。重鎖を含有する両方のプラスミド上に存在する共通軽鎖もまた、同じ細胞内で共トランスフェクションされる。本発明の同時係属出願(例えば、国際公開第2013/157954号及び国際公開第2013/157953号、参照により本明細書に組み込まれる)では、単一の細胞から二重特異性抗体を産生するための方法及び手段を開示しており、これにより、単一特異性抗体の形成よりも二重特異性抗体の形成を有利にする手段が提供される。本発明では、これらの方法を好適に採用することができる。具体的には、二重特異性完全長IgG分子のみを本質的に生成するのに好ましい変異は、第1のCH3ドメイン中の351及び366位でのアミノ酸置換、例えばL351K及びT366K(EU番号付けに従っての番号付け)(「KK-変異体」重鎖)、及び第2のCH3ドメイン中の351及び368位でのアミノ酸置換、例えばL351D及びL368E(「DE-変異体」重鎖)、又はその逆である。これは、負に帯電したDE-変異体重鎖及び正に帯電したKK-変異体重鎖が優先的に対をなし、ヘテロ二量体を形成する(いわゆる「DEKK」二重特異性分子)ことが、本発明の同時係属出願により以前に実証されている。DE-変異体重鎖のホモ二量体化(DE-DEホモ二量体)又はKK-変異体重鎖のホモ二量体化(KK-KKホモ二量体)は、同一の重鎖間のCH3-CH3界面における荷電残基間の強い反発力のために、ほとんど発生しない。
上記のヒトCD137、OX40、及びPD-L1に結合する抗体をコード化するVH遺伝子を、正に帯電したCH3ドメインをコード化するMV1452などのIgG発現ベクター中にクローニングした。破傷風毒素(tetanus toxin、TT)標的化抗体(図8)を、負に荷電したCH3ドメインをコード化するMV1377 IgG発現ベクター(図9)中にクローニングした。IgGフォーマットでCD137抗体パネルを発現させるために、パネル全体もまた負に帯電したCH3ドメインベクター中にクローンニングし、単一特異性CD137×CD137二価IgGを産生できる。
懸濁増殖に適合した293Fフリースタイル細胞を、3.0×106個細胞/mlの密度になるまで振盪プラトー上のT125フラスコ内で培養した。ディープ24ウェルプレート(24ウェルフォーマット)の各ウェルに、細胞を0.3~0.5×106個の生細胞/mlの密度で播種した。細胞を、異なる抗体をコード化する2つのプラスミドの混合物で一過性にトランスフェクトし、独自のベクター系にクローニングした。トランスフェクションから7日後に、細胞上清を採取し、0.22μMのフィルター(Sartorius)を通して濾過した。無菌上清を、抗体の精製まで4℃で保存した。
(二重特異性)IgGの精製
タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィーを用いて、IgGの精製を小規模(<500μg)で行った。濾過を使用して、24ウェルフィルタプレート中で、滅菌条件下で小規模の精製を行った。まず、培地のpHをpH8.0に調整し、続いて、IgG含有上清を、タンパク質AセファロースCL-4Bビーズ(50%v/v)(Pierce)と共に、振盪プラットフォーム上で600rpmで、25℃にて2時間インキュベートした。次に、濾過によりビーズを採取した。ビーズをPBS pH7.4で2回洗浄した。次いで、結合したIgGを、0.1Mクエン酸緩衝液で、pH3.0にて溶出させ、溶出液をトリスpH8.0を用いて直ちに中和した。マルチスクリーンUltracel 10マルチプレート(Millipore)を使用して、遠心分離により緩衝液交換を行った。試料を最後に、PBS pH7.4中で採取した。IgG濃度をOctetを用いて測定した。タンパク質試料を4℃で保存した。
タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィーを用いて、IgGの精製を小規模(<500μg)で行った。濾過を使用して、24ウェルフィルタプレート中で、滅菌条件下で小規模の精製を行った。まず、培地のpHをpH8.0に調整し、続いて、IgG含有上清を、タンパク質AセファロースCL-4Bビーズ(50%v/v)(Pierce)と共に、振盪プラットフォーム上で600rpmで、25℃にて2時間インキュベートした。次に、濾過によりビーズを採取した。ビーズをPBS pH7.4で2回洗浄した。次いで、結合したIgGを、0.1Mクエン酸緩衝液で、pH3.0にて溶出させ、溶出液をトリスpH8.0を用いて直ちに中和した。マルチスクリーンUltracel 10マルチプレート(Millipore)を使用して、遠心分離により緩衝液交換を行った。試料を最後に、PBS pH7.4中で採取した。IgG濃度をOctetを用いて測定した。タンパク質試料を4℃で保存した。
Octetを使用したIgG定量化
精製したIgGの量を決定するために、全ヒトIgG(Sigma Aldrich、カタログ番号I4506)を標準として使用して、タンパク質Aバイオセンサ(Forte-Bio、供給元の推奨に従って)を用いてOctet分析により抗体の濃度を決定した。
精製したIgGの量を決定するために、全ヒトIgG(Sigma Aldrich、カタログ番号I4506)を標準として使用して、タンパク質Aバイオセンサ(Forte-Bio、供給元の推奨に従って)を用いてOctet分析により抗体の濃度を決定した。
huCD137×CD137二価IgG及びhuOX40×TT並びにhuPD-L1×TT二重特異性IgGの特異性分析
huCD137×CD137二価IgG及びhuOX40×TT並びにhuPD-L1×TT二重特異性IgGを、関連するヒト及びマカクザルオルソログ(表1)及び野生型細胞を発現する安定した細胞株への結合についてFACSにおいて試験した。したがって、細胞を採取し、FACS緩衝液(PBS/0.5%のBSA/0.5mMのEDTA)中で106個の細胞/mlに希釈した。1~2×105個の細胞を、U底96ウェルプレート内の各ウェルに添加した。細胞を、4℃で300gにて2分間遠心分離した。プレート(複数可)を反転させることにより、上清を廃棄した。50μlの各IgG試料を10μg/mlの濃度で添加し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を150μlのFACS緩衝液で2回洗浄した。50μlの1:400に希釈したヤギ抗ヒトIgG PE(Invitrogen)を添加し、暗所で氷上で30分間インキュベートした。FACS緩衝液の添加後、細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、FACSCantoフローサイトメトリー(Becton and Dickinson)でHTS設定で分析した。細胞への抗体の結合を、染色された細胞集団の平均蛍光強度(mean fluorescence intensity、MFI)を測定することによって評価した。抗体は、MFIが(陰性対照)非結合抗体(破傷風毒素に向けられた)で染色された同じ細胞集団のものの少なくとも5倍である場合、それらの標的に結合すると考えられた。
huCD137×CD137二価IgG及びhuOX40×TT並びにhuPD-L1×TT二重特異性IgGを、関連するヒト及びマカクザルオルソログ(表1)及び野生型細胞を発現する安定した細胞株への結合についてFACSにおいて試験した。したがって、細胞を採取し、FACS緩衝液(PBS/0.5%のBSA/0.5mMのEDTA)中で106個の細胞/mlに希釈した。1~2×105個の細胞を、U底96ウェルプレート内の各ウェルに添加した。細胞を、4℃で300gにて2分間遠心分離した。プレート(複数可)を反転させることにより、上清を廃棄した。50μlの各IgG試料を10μg/mlの濃度で添加し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を150μlのFACS緩衝液で2回洗浄した。50μlの1:400に希釈したヤギ抗ヒトIgG PE(Invitrogen)を添加し、暗所で氷上で30分間インキュベートした。FACS緩衝液の添加後、細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、FACSCantoフローサイトメトリー(Becton and Dickinson)でHTS設定で分析した。細胞への抗体の結合を、染色された細胞集団の平均蛍光強度(mean fluorescence intensity、MFI)を測定することによって評価した。抗体は、MFIが(陰性対照)非結合抗体(破傷風毒素に向けられた)で染色された同じ細胞集団のものの少なくとも5倍である場合、それらの標的に結合すると考えられた。
CD137LとのCD137相互作用をブロックする能力に対する、CD137×CD137二価IgG中に存在するhuCD137特異的Fabアームのビニング
二価IgGフォーマットにおけるhuCD137結合クローンを、CD137のCD137Lとの相互作用をブロックする能力について試験した。したがって、Maxisorp 96ウェルプレートのウェルを、PBS中1.25μg/mlの組換えCD137-Fc(R&D、カタログ番号838-4B)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ウェルをPBST(PBS中0.05%v/vのTween 20)で2回洗浄し、続いてPBS(ブロック緩衝液)中2%のBSAで室温にて1時間ブロックした。その後、ウェルを、20μg/mlのIgGの存在下又は非存在下でブロック緩衝液中で希釈した0.25μg/mlのCD137L-muCD8ビオチン(Ancell、カタログ番号503-030)と共に室温で1時間インキュベートした。次に、洗浄工程を繰り返し、ウェルを、ブロック緩衝液中で1:2000に希釈したHRP結合ストレプトアビジン(Becton Dickinson、カタログ番号554066)と共に室温で30分間インキュベートした。結合したストレプトアビジンの検出のために、ウェルをPBSTで3回洗浄し、TMB基質成分A及びB1:1の比(Becton Dickinson、それぞれカタログ番号51-2606KC及び51-2607KC)と共にインキュベートした。10分後に、1MのH2SO4で反応を停止させ、ELISAプレートリーダーを用いてOD450nmを測定した。結果に基づいて、クローンを4つの異なる群においてビニングした:TT特異的競合抗体が添加された対照(0%のブロッキング)と比べて、20μg/mlのIgG(CD137×CD137)濃度においてELISAシグナルが70%超に減少させた場合、「ブロッキングクローン」は、CD137のCD137Lとの相互作用を完全にブロックすると考えられ、「部分的ブロッキングクローン」は、25~70%の間のシグナルを減少させ、「非ブロッキングクローン」は、最大で25%減少させるか、又は最大25%増強させるELISAシグナルを示し、「エンハンシングクローン」は、25%を超えるELISAシグナルの増加を示した。CD137×CD137二重特異性分子として試験したCD137抗体パネルの代表的な選択により得られた結果を表2に示す。
二価IgGフォーマットにおけるhuCD137結合クローンを、CD137のCD137Lとの相互作用をブロックする能力について試験した。したがって、Maxisorp 96ウェルプレートのウェルを、PBS中1.25μg/mlの組換えCD137-Fc(R&D、カタログ番号838-4B)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ウェルをPBST(PBS中0.05%v/vのTween 20)で2回洗浄し、続いてPBS(ブロック緩衝液)中2%のBSAで室温にて1時間ブロックした。その後、ウェルを、20μg/mlのIgGの存在下又は非存在下でブロック緩衝液中で希釈した0.25μg/mlのCD137L-muCD8ビオチン(Ancell、カタログ番号503-030)と共に室温で1時間インキュベートした。次に、洗浄工程を繰り返し、ウェルを、ブロック緩衝液中で1:2000に希釈したHRP結合ストレプトアビジン(Becton Dickinson、カタログ番号554066)と共に室温で30分間インキュベートした。結合したストレプトアビジンの検出のために、ウェルをPBSTで3回洗浄し、TMB基質成分A及びB1:1の比(Becton Dickinson、それぞれカタログ番号51-2606KC及び51-2607KC)と共にインキュベートした。10分後に、1MのH2SO4で反応を停止させ、ELISAプレートリーダーを用いてOD450nmを測定した。結果に基づいて、クローンを4つの異なる群においてビニングした:TT特異的競合抗体が添加された対照(0%のブロッキング)と比べて、20μg/mlのIgG(CD137×CD137)濃度においてELISAシグナルが70%超に減少させた場合、「ブロッキングクローン」は、CD137のCD137Lとの相互作用を完全にブロックすると考えられ、「部分的ブロッキングクローン」は、25~70%の間のシグナルを減少させ、「非ブロッキングクローン」は、最大で25%減少させるか、又は最大25%増強させるELISAシグナルを示し、「エンハンシングクローン」は、25%を超えるELISAシグナルの増加を示した。CD137×CD137二重特異性分子として試験したCD137抗体パネルの代表的な選択により得られた結果を表2に示す。
ドメイン特異性に対するCD137×CD137二価IgG中に存在するhuCD137特異的Fabアームのビニング
二価IgGフォーマットにおける上述のhuCD137結合クローンもまた、8つの異なるpIRES-Neo3マウス/ヒトCD137ハイブリッド発現構築物、FLマウスCD137 pIRES-Neo3発現構築物(以下のアミノ酸インサート配列を参照)、又はフリースタイル293F細胞を発現する安定なhuCD137の生成に使用された(表1)pIRES-Neo3 huCD137発現構築物で、一過性にトランスフェクトされたHEK293T細胞に対するドメイン特異性についてもFACSで試験した。抗体パネルの特異性分析中に、同じFACSプロトコルを上記のように使用した。ハイブリッド構築物の生成のために、マウス及びヒトCD137の細胞外ドメインを5つのドメイン;Uniprot参照配列Q07011(huCD137)及びP20334(moCD137)に基づく4つのシステインリッチドメインと、システインリッチドメイン4の末端から膜貫通ドメインまでの1つのヒンジドメインに分割した。以下のアミノ酸挿入配列を、Nhel/EcoRIを介してpIRES-Neo3中にクローニングし(図4)、太字の文字はシグナルペプチドである。下線を引いた文字は、ヒトCD137と同一の配列である。イタリック体の文字は、膜貫通ドメイン配列及び細胞内ドメイン配列を表す。
二価IgGフォーマットにおける上述のhuCD137結合クローンもまた、8つの異なるpIRES-Neo3マウス/ヒトCD137ハイブリッド発現構築物、FLマウスCD137 pIRES-Neo3発現構築物(以下のアミノ酸インサート配列を参照)、又はフリースタイル293F細胞を発現する安定なhuCD137の生成に使用された(表1)pIRES-Neo3 huCD137発現構築物で、一過性にトランスフェクトされたHEK293T細胞に対するドメイン特異性についてもFACSで試験した。抗体パネルの特異性分析中に、同じFACSプロトコルを上記のように使用した。ハイブリッド構築物の生成のために、マウス及びヒトCD137の細胞外ドメインを5つのドメイン;Uniprot参照配列Q07011(huCD137)及びP20334(moCD137)に基づく4つのシステインリッチドメインと、システインリッチドメイン4の末端から膜貫通ドメインまでの1つのヒンジドメインに分割した。以下のアミノ酸挿入配列を、Nhel/EcoRIを介してpIRES-Neo3中にクローニングし(図4)、太字の文字はシグナルペプチドである。下線を引いた文字は、ヒトCD137と同一の配列である。イタリック体の文字は、膜貫通ドメイン配列及び細胞内ドメイン配列を表す。
アミノ酸配列完全長マウスCD137。
MGNNCYNVVVIVLLLVGCEKVGAVQNSCDNCQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPNCNICRVCAGYFRFKKFCSSTHNAECECIEGFHCLGPQCTRCEKDCRPGQELTKQGCKTCSLGTFNDQNGTGVCRPWTNCSLDGRSVLKTGTTEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGPGGHSLQVLTLFLALTSALLLALIFITLLFSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYEL
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アミノ酸配列mo/huCD137キメラインサートA(ヒトシステインリッチドメイン1;システインリッチドメイン2から前方のマウス配列)。
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アミノ酸配列mo/huCD137キメラインサートB(ヒトシステインリッチドメイン1及び2;システインリッチドメイン3から前方のマウス配列)。
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アミノ酸配列mo/huCD137キメラインサートC(ヒトシステインリッチドメイン1~3;システインリッチドメイン4から前方のマウス配列)。
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アミノ酸配列mo/huCD137キメラインサートD(ヒトシステインリッチドメイン1~4;ヒンジドメインから前方のマウス配列)。
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アミノ酸配列mo/huCD137キメラインサートE(マウスシステインリッチドメイン1;システインリッチドメイン2から前方のヒト配列)。
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アミノ酸配列mo/huCD137キメラインサートF(マウスシステインリッチドメイン1及び2;システインリッチドメイン3から前方のヒト配列)。
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アミノ酸配列mo/huCD137キメラインサートG(マウスシステインリッチドメイン1~3;システインリッチドメイン4から前方のヒト配列)。
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アミノ酸配列mo/huCD137キメラインサートH(マウスシステインリッチドメイン1~4;ヒンジドメインから前方のヒト配列)。
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キメラ及び完全長マウス並びにヒトCD137構築物で得られたFACS結果に基づいて、観察された結合パターンに基づいてクローンをビニングした。抗体は、MFIが(陰性対照)非結合抗体(破傷風毒素に向けられた)で染色された同じ細胞集団のものの少なくとも3倍である場合、(キメラ)CD137に結合すると考えられた。
結果
CD137特異的Fabアームのドメイン特異性を表2に示す。
CD137特異的Fabアームのドメイン特異性を表2に示す。
OX40のOX40Lとの相互作用をブロックする能力に対する、OX40×TT二重特異性IgG中に存在するhuOX40特異的Fabアームのビニング
二重特異性IgGフォーマット(OX40×TT)におけるhuOX40結合クローンを、OX40のOX40Lとの相互作用をブロックする能力について試験した。したがって、Maxisorp 96ウェルプレートのウェルを、PBS中0.156μg/mlの組換えhuOX40-Fc(R&D、カタログ番号3388-OX)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ウェルをPBST(PBS中0.05%v/vのTween 20)で2回洗浄し、続いてPBS(ブロック緩衝液)中4%の乾燥した脱脂粉乳(ELK)で室温にて1時間ブロックした。その後、ウェルを、20μg/mlの二重特異性OX40×TT IgGの存在下又は非存在下でブロック緩衝液中で希釈した0.016μg/mlのOX40L(R&D、カタログ番号1054-OX)と共に室温で1時間インキュベートした。次に、ウェルをPBSTで3回洗浄し、続いて、2%のBSA/PBS中で0.5μg/mlに希釈したビオチン化抗OX40L抗体(R&D、カタログ番号BAF1054)と共に1時間インキュベートした。次に、洗浄工程を繰り返し、ウェルを、2%のBSA/PBS中で1:2000に希釈したHRP結合ストレプトアビジン(Becton Dickinson、カタログ番号554066)と共に室温で30分間インキュベートした。結合したストレプトアビジンの検出のために、ウェルをPBSTで3回洗浄し、TMB基質成分A及びB1:1の比(Becton Dickinson、それぞれカタログ番号51-2606KC及び51-2607KC)と共にインキュベートした。10分後に、1MのH2SO4で反応を停止させ、ELISAプレートリーダーを用いてOD450nmを測定した。
二重特異性IgGフォーマット(OX40×TT)におけるhuOX40結合クローンを、OX40のOX40Lとの相互作用をブロックする能力について試験した。したがって、Maxisorp 96ウェルプレートのウェルを、PBS中0.156μg/mlの組換えhuOX40-Fc(R&D、カタログ番号3388-OX)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ウェルをPBST(PBS中0.05%v/vのTween 20)で2回洗浄し、続いてPBS(ブロック緩衝液)中4%の乾燥した脱脂粉乳(ELK)で室温にて1時間ブロックした。その後、ウェルを、20μg/mlの二重特異性OX40×TT IgGの存在下又は非存在下でブロック緩衝液中で希釈した0.016μg/mlのOX40L(R&D、カタログ番号1054-OX)と共に室温で1時間インキュベートした。次に、ウェルをPBSTで3回洗浄し、続いて、2%のBSA/PBS中で0.5μg/mlに希釈したビオチン化抗OX40L抗体(R&D、カタログ番号BAF1054)と共に1時間インキュベートした。次に、洗浄工程を繰り返し、ウェルを、2%のBSA/PBS中で1:2000に希釈したHRP結合ストレプトアビジン(Becton Dickinson、カタログ番号554066)と共に室温で30分間インキュベートした。結合したストレプトアビジンの検出のために、ウェルをPBSTで3回洗浄し、TMB基質成分A及びB1:1の比(Becton Dickinson、それぞれカタログ番号51-2606KC及び51-2607KC)と共にインキュベートした。10分後に、1MのH2SO4で反応を停止させ、ELISAプレートリーダーを用いてOD450nmを測定した。
結果に基づいて、クローンを2つの異なる群においてビニングした:「ブロッキングクローン」は、TT特異的競合抗体が添加された対照(0%のブロッキング)と比べて、20μg/mlのIgG(OX40×TT)濃度においてELISAシグナルが24%超に減少させ、「非ブロッキングクローン」は、24%未満減少させられるELISAシグナルを示したか、又はELISAシグナルを増強させた。この実験を、二重特異性IgGフォーマット(OX40×TT)におけるhuOX40結合クローンの異なるサブセットを用いて2回実施した。OX40×TT二重特異性分子として試験したOX40抗体パネルの結果を表5に提供する。
ドメイン特異性に対するOX40×TT二重特異性IgG中に存在するhuOX40特異的Fabアームのビニング
二重特異性OX40×TT IgGフォーマットにおけるhuOX40結合クローンを、8つの異なるpIRES-Neo3ラット/ヒトOX40ハイブリッド発現構築物(以下のアミノ酸インサート配列を参照)、フリースタイル293F細胞を発現する安定なraOX40及びhuOX40の生成に使用されたpIRES-Neo3_raOX40又はpIRES-Neo3_huOX40発現構築物(表1)で、一過性にトランスフェクトされたHEK293T細胞に対するドメイン特異性についてもFACSで試験した。抗体パネルの特異性分析中に、同じFACSプロトコルを上記のように使用した。ハイブリッド構築物の生成のために、ラット及びヒトOX40の細胞外ドメインを5つのドメイン;Uniprot参照配列P43489(huOX40)及びP15725(raOX40)に基づく4つのシステインリッチドメインと、システインリッチドメイン4の末端から膜貫通ドメインまでの1つのヒンジドメインに分割した。以下のアミノ酸挿入配列を、Nhel/EcoRIを介してpIRES-Neo3中にクローニングし(図4)、太字の文字はシグナルペプチドである。下線を引いた文字は、ヒトOX40と同一の配列である。イタリック体の文字は、膜貫通ドメイン配列及び細胞内ドメイン配列を表す。
二重特異性OX40×TT IgGフォーマットにおけるhuOX40結合クローンを、8つの異なるpIRES-Neo3ラット/ヒトOX40ハイブリッド発現構築物(以下のアミノ酸インサート配列を参照)、フリースタイル293F細胞を発現する安定なraOX40及びhuOX40の生成に使用されたpIRES-Neo3_raOX40又はpIRES-Neo3_huOX40発現構築物(表1)で、一過性にトランスフェクトされたHEK293T細胞に対するドメイン特異性についてもFACSで試験した。抗体パネルの特異性分析中に、同じFACSプロトコルを上記のように使用した。ハイブリッド構築物の生成のために、ラット及びヒトOX40の細胞外ドメインを5つのドメイン;Uniprot参照配列P43489(huOX40)及びP15725(raOX40)に基づく4つのシステインリッチドメインと、システインリッチドメイン4の末端から膜貫通ドメインまでの1つのヒンジドメインに分割した。以下のアミノ酸挿入配列を、Nhel/EcoRIを介してpIRES-Neo3中にクローニングし(図4)、太字の文字はシグナルペプチドである。下線を引いた文字は、ヒトOX40と同一の配列である。イタリック体の文字は、膜貫通ドメイン配列及び細胞内ドメイン配列を表す。
アミノ酸配列ra/huOX40キメラインサートA(ヒトシステインリッチドメイン1;システインリッチドメイン2から前方のラット配列)。
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アミノ酸配列ra/huOX40キメラインサートB(ヒトシステインリッチドメイン1及び2;システインリッチドメイン3から前方のラット配列)。
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アミノ酸配列ra/huOX40キメラインサートC(ヒトシステインリッチドメイン1~3;システインリッチドメイン4から前方のラット配列)。
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アミノ酸配列ra/huOX40キメラインサートD(ヒトシステインリッチドメイン1~4;ヒンジドメインから前方のラット配列)。
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アミノ酸配列ra/huOX40キメラインサートE(ラットシステインリッチドメイン1;システインリッチドメイン2から前方のヒト配列)。
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アミノ酸配列ra/huOX40キメラインサートF(ラットシステインリッチドメイン1及び2;システインリッチドメイン3から前方のヒト配列)。
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アミノ酸配列ra/huOX40キメラインサートG(ラットシステインリッチドメイン1~3;システインリッチドメイン4から前方のヒト配列)。
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アミノ酸配列ra/huOX40キメラインサートH(ラットシステインリッチドメイン1~4;ヒンジドメインから前方のヒト配列)。
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キメラ及び完全長ラット並びにヒトOX40構築物で得られたFACS結果に基づいて、観察された結合パターンに基づいてクローンをビニングした。抗体は、MFIが(陰性対照)非結合抗体(破傷風毒素に向けられた)で染色された同じ細胞集団のものの少なくとも3倍である場合、(キメラ)OX40に結合すると考えられた。
二重特異性OX40×TT IgGフォーマットにおけるhuOX40結合クローンの結果を、表5に提供する。
PD-1/PD-L1の相互作用をブロックする能力に対する、PD-L1×TT二重特異性IgG中に存在するhuPD-L1特異的Fabアームのビニング
14個のhuPD-L1結合クローン(図3に示すVH配列)を、PD-L1のPD-1との相互作用をブロックするそれらの能力、並びにPD-L1とCD80との間の相互作用をブロックするそれらの能力について試験した。したがって、PD1-Fc(R&D systems、カタログ番号1086-PD)又はCD80-Fc(R&D systems、カタログ番号140-B1)を、それぞれ1及び3μg/mlでのマキシソーププレートにコーティングした。コーティングされたウェルを、PBS中4%のBSAでブロックした。その後、0.55μg/mlのビオチン化PD-L1(BPS bioscience、カタログ番号71105)を、0.15~20μg/mlの範囲のhuPD-L1×TT二重特異性IgGの存在下又は非存在下で添加した。結合したビオチン化PD-L1を、ブロック緩衝液中1:2000で希釈したHRP結合ストレプトアビジン(BD bioscience、カタログ番号554066)で検出した。各インキュベーション工程後、ELISAプレートをPBS-T(PBS-0.05%(v/v)Tween 20)で3回洗浄した。結合したストレプトアビジンをTMB/H2O2染色により可視化し、OD450nm測定により染色を定量化した。TT特異的競合抗体が添加された対照と比べて、10μg/mlのIgG(PD-L1×TT)濃度においてELISAシグナルが70%超に減少させた場合、クローンは、PD-1のPD-L1との相互作用をブロックすると考えらえた。PD-L1×TT二重特異性分子として試験したPD-L1抗体パネルの代表的な選択によって得られた結果については、図10を参照されたい。MF5361を除いて、図10に示されるPD-L1特異的Fabアームは、PD-1/PD-L1相互作用を、70%超でブロックする。加えて、図3に示されるMF配列を含む全ての他のPD-L1特異的Fabアームもまた、PD-1/PD-L1相互作用を、70%超でブロックする(データ図示せず)。
14個のhuPD-L1結合クローン(図3に示すVH配列)を、PD-L1のPD-1との相互作用をブロックするそれらの能力、並びにPD-L1とCD80との間の相互作用をブロックするそれらの能力について試験した。したがって、PD1-Fc(R&D systems、カタログ番号1086-PD)又はCD80-Fc(R&D systems、カタログ番号140-B1)を、それぞれ1及び3μg/mlでのマキシソーププレートにコーティングした。コーティングされたウェルを、PBS中4%のBSAでブロックした。その後、0.55μg/mlのビオチン化PD-L1(BPS bioscience、カタログ番号71105)を、0.15~20μg/mlの範囲のhuPD-L1×TT二重特異性IgGの存在下又は非存在下で添加した。結合したビオチン化PD-L1を、ブロック緩衝液中1:2000で希釈したHRP結合ストレプトアビジン(BD bioscience、カタログ番号554066)で検出した。各インキュベーション工程後、ELISAプレートをPBS-T(PBS-0.05%(v/v)Tween 20)で3回洗浄した。結合したストレプトアビジンをTMB/H2O2染色により可視化し、OD450nm測定により染色を定量化した。TT特異的競合抗体が添加された対照と比べて、10μg/mlのIgG(PD-L1×TT)濃度においてELISAシグナルが70%超に減少させた場合、クローンは、PD-1のPD-L1との相互作用をブロックすると考えらえた。PD-L1×TT二重特異性分子として試験したPD-L1抗体パネルの代表的な選択によって得られた結果については、図10を参照されたい。MF5361を除いて、図10に示されるPD-L1特異的Fabアームは、PD-1/PD-L1相互作用を、70%超でブロックする。加えて、図3に示されるMF配列を含む全ての他のPD-L1特異的Fabアームもまた、PD-1/PD-L1相互作用を、70%超でブロックする(データ図示せず)。
結論として、試験したhuPD-L1特異的Fabアームは、MF5361を除いて、PD-1/PD-L1相互作用をブロックする。
CD137×CD137、OX40×TT及びPD-L1×TT二重特異性IgG中に存在するhuCD137、huOX40及びhuPD-L1特異的Fabアームの親和性ランク付け
FACSにおいてそれぞれのヒト及びマカクザルオルソログに結合することが示された二重特異性抗体を、FACSにおいてオルソログの両方についての明らかな親和性に関してランク付けした。したがって、それぞれのオルソログを発現する安定な細胞株(表1)を採取し、FACS緩衝液(PBS/0.5%のBSA/0.5mMのEDTA)中で1×106個の細胞/mlに希釈した。細胞を、4℃で300gにて2分間遠心分離した。プレート(複数可)を反転させることにより、上清を廃棄した。50μlの各IgG試料を、11工程で、10~0.01μg/mlの範囲の2倍希釈系列で添加し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を150μlのFACS緩衝液で2回洗浄した。50μlの1:400に希釈したヤギ抗ヒトIgG PE(Invitrogen)を添加し、暗所で氷上で30分間インキュベートした。FACS緩衝液の添加後、細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、FACSCantoフローサイトメトリー(Becton and Dickinson)でHTS設定で分析した。細胞への抗体の結合を、染色された細胞集団の平均蛍光強度(MFI)を測定することによって評価した。抗体は、MFIが(陰性対照)非結合抗体(破傷風毒素に向けられた)で染色された同じ細胞集団のものの少なくとも5倍である場合、それらの標的に結合すると考えられた。
FACSにおいてそれぞれのヒト及びマカクザルオルソログに結合することが示された二重特異性抗体を、FACSにおいてオルソログの両方についての明らかな親和性に関してランク付けした。したがって、それぞれのオルソログを発現する安定な細胞株(表1)を採取し、FACS緩衝液(PBS/0.5%のBSA/0.5mMのEDTA)中で1×106個の細胞/mlに希釈した。細胞を、4℃で300gにて2分間遠心分離した。プレート(複数可)を反転させることにより、上清を廃棄した。50μlの各IgG試料を、11工程で、10~0.01μg/mlの範囲の2倍希釈系列で添加し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を150μlのFACS緩衝液で2回洗浄した。50μlの1:400に希釈したヤギ抗ヒトIgG PE(Invitrogen)を添加し、暗所で氷上で30分間インキュベートした。FACS緩衝液の添加後、細胞を1回遠心分離し、上清を除去し、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、FACSCantoフローサイトメトリー(Becton and Dickinson)でHTS設定で分析した。細胞への抗体の結合を、染色された細胞集団の平均蛍光強度(MFI)を測定することによって評価した。抗体は、MFIが(陰性対照)非結合抗体(破傷風毒素に向けられた)で染色された同じ細胞集団のものの少なくとも5倍である場合、それらの標的に結合すると考えられた。
参照抗体
PD-L1及びCD137並びにCTLA-4の機能を阻害する抗体は、当該技術分野において既知である。モノクローナル二価抗体を公開された情報に従って構築し、293Fフリースタイル又はCHO-S細胞中で発現させた。抗PD-L1抗体のMPDL3280A(アテゾリズマブに基づくサロゲート)は、国際公開第2010077634(A1)号に開示されている情報に基づいた。抗CD137抗体の20H4.9(ウレルマブに基づくサロゲート)及びPF-05082566(ウトミルマブに基づくサロゲート)の情報は、それぞれ国際公開第2005/035584号及び同第2015119923号から得られた。MOR7480のVH情報は、米国特許第8337850(B2)号から得られ、IgG1骨格において再クローニングした。抗CTLA-4抗体10D1(イピリムマブに基づくサロゲート)に関する情報は、PCT国際公開第01/14424号から入手した。
PD-L1及びCD137並びにCTLA-4の機能を阻害する抗体は、当該技術分野において既知である。モノクローナル二価抗体を公開された情報に従って構築し、293Fフリースタイル又はCHO-S細胞中で発現させた。抗PD-L1抗体のMPDL3280A(アテゾリズマブに基づくサロゲート)は、国際公開第2010077634(A1)号に開示されている情報に基づいた。抗CD137抗体の20H4.9(ウレルマブに基づくサロゲート)及びPF-05082566(ウトミルマブに基づくサロゲート)の情報は、それぞれ国際公開第2005/035584号及び同第2015119923号から得られた。MOR7480のVH情報は、米国特許第8337850(B2)号から得られ、IgG1骨格において再クローニングした。抗CTLA-4抗体10D1(イピリムマブに基づくサロゲート)に関する情報は、PCT国際公開第01/14424号から入手した。
実施例4
材料及び方法
PBMC単離
ヒト全血を軟膜(Sanquin)から入手し、PBSで1:1に希釈した。Leucosepチューブ(Greiner Bio-One、カタログ番号227 290)を、室温(room temperature、RT)で温めた17.5mのFicoll-Paque Plus(Amersham Biosciences、カタログ番号17-1440-02)で充填した。Ficoll-Paque Plusを、RTで1000×gで30秒間遠心沈殿させた。30mlの希釈した全血を、上部に注いだ。チューブを1000×gで10分間、RTで遠心分離させ、単核PBMC界面を採取し、PBSで2回洗浄し、250μlのPBS中に再懸濁した。PBMCを計数し、組織培養培地(10%のFCSを含むDMEM)中で1×106/mlに再調整し、等量の氷冷凍結培地(80%の培養培地/20%のDMSO)を添加することによって凍結させた。更なる使用まで、細胞を1mlのアリコート中に-150℃で保存した。
材料及び方法
PBMC単離
ヒト全血を軟膜(Sanquin)から入手し、PBSで1:1に希釈した。Leucosepチューブ(Greiner Bio-One、カタログ番号227 290)を、室温(room temperature、RT)で温めた17.5mのFicoll-Paque Plus(Amersham Biosciences、カタログ番号17-1440-02)で充填した。Ficoll-Paque Plusを、RTで1000×gで30秒間遠心沈殿させた。30mlの希釈した全血を、上部に注いだ。チューブを1000×gで10分間、RTで遠心分離させ、単核PBMC界面を採取し、PBSで2回洗浄し、250μlのPBS中に再懸濁した。PBMCを計数し、組織培養培地(10%のFCSを含むDMEM)中で1×106/mlに再調整し、等量の氷冷凍結培地(80%の培養培地/20%のDMSO)を添加することによって凍結させた。更なる使用まで、細胞を1mlのアリコート中に-150℃で保存した。
T細胞活性化アッセイ
PBMCを解凍し、9体積の培養培地(Lグルタミン及び10%の熱不活性化FBSを含むRPMI1640)を添加した。細胞を、RTで150gにて10分間遠心分離した。細胞ペレットを10mlの培養培地に再懸濁し、37℃、5%のCO、95%の相対湿度で、50mlのファルコンチューブ内で一晩インキュベートすることによって細胞を休止させた。翌日、EasySep T細胞富化(パンCD3)精製手法を使用して、製造元(Stem cell Technologies、カタログ#19051)に記載されているようにTリンパ球を単離した。EasySep手法は、負の選択を使用する。簡単に言うと、PBMCを、RTで150gにて10分間遠心分離した。細胞ペレットを、1mMのEDTAを伴う2mlのPBS+2%のFBS中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、30μmメッシュのナイロンストレーナを通して濾過した。細胞を計数し、1mMのEDTAを伴うPBS+2%のFBS中に5×107個細胞/mlに再調整した。50μlのEasySepヒトT細胞富化カクテルを、各2mlの細胞容積に添加し、混合して、RTで10分間インキュベートさせた。次に、50μlのEasySep D磁気粒子を、各2mlの細胞容積に添加し、RTで5分間インキュベートさせた。総体積を、1mMのEDTAを伴うPBS+2%のFBSで2.5mlに持っていった。次に、このチューブを磁石内に配置し、望ましくない細胞画分を磁石にRTで5分間結合させた。次に、チューブを反転させ、精製T細胞画分を新しいチューブに注ぎ、RTで150gにて10分間遠心分離することによって細胞を採取し、続いて培養培地中で1×105個細胞/mlの濃度で再懸濁させた。T細胞活性化アッセイについては、96ウェルプレート(96ウェル平底プレート-Cellstar、#655180)の内側ウェルを、PBS中30μg/mLの抗CD3 UCHT1で一晩コーティングした。翌日、プレートをPBSで洗浄した。抗体希釈液(80μg/ml)を調製し、クロスリンク抗体aHuIgG-Fc(Bethyl、カタログ番号#A80-104A)と共に1:1の比で、RTで15分間インキュベートした。次に、混合物の系列希釈液を調製した。各ウェルに100μLのクロスリンク抗体を添加し、続いて100μLの精製T細胞懸濁液を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性(PG1337)及び陽性対照抗体(ウレルマブ)の系列希釈液を含有していた。T細胞培養物を、IL-2分泌及び/又は抗原の細胞表面発現について試験する前に、95%の相対湿度において37℃、5%のCO2で3日間刺激した。放出されたIL-2の濃度を、AlphaLISA(Perkin Elmer、カタログ番号#AL221C)によって決定した。チェックポイント阻害に関連する細胞表面抗原又は共刺激抗原の発現を、フローサイトメトリーによって決定した。
PBMCを解凍し、9体積の培養培地(Lグルタミン及び10%の熱不活性化FBSを含むRPMI1640)を添加した。細胞を、RTで150gにて10分間遠心分離した。細胞ペレットを10mlの培養培地に再懸濁し、37℃、5%のCO、95%の相対湿度で、50mlのファルコンチューブ内で一晩インキュベートすることによって細胞を休止させた。翌日、EasySep T細胞富化(パンCD3)精製手法を使用して、製造元(Stem cell Technologies、カタログ#19051)に記載されているようにTリンパ球を単離した。EasySep手法は、負の選択を使用する。簡単に言うと、PBMCを、RTで150gにて10分間遠心分離した。細胞ペレットを、1mMのEDTAを伴う2mlのPBS+2%のFBS中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、30μmメッシュのナイロンストレーナを通して濾過した。細胞を計数し、1mMのEDTAを伴うPBS+2%のFBS中に5×107個細胞/mlに再調整した。50μlのEasySepヒトT細胞富化カクテルを、各2mlの細胞容積に添加し、混合して、RTで10分間インキュベートさせた。次に、50μlのEasySep D磁気粒子を、各2mlの細胞容積に添加し、RTで5分間インキュベートさせた。総体積を、1mMのEDTAを伴うPBS+2%のFBSで2.5mlに持っていった。次に、このチューブを磁石内に配置し、望ましくない細胞画分を磁石にRTで5分間結合させた。次に、チューブを反転させ、精製T細胞画分を新しいチューブに注ぎ、RTで150gにて10分間遠心分離することによって細胞を採取し、続いて培養培地中で1×105個細胞/mlの濃度で再懸濁させた。T細胞活性化アッセイについては、96ウェルプレート(96ウェル平底プレート-Cellstar、#655180)の内側ウェルを、PBS中30μg/mLの抗CD3 UCHT1で一晩コーティングした。翌日、プレートをPBSで洗浄した。抗体希釈液(80μg/ml)を調製し、クロスリンク抗体aHuIgG-Fc(Bethyl、カタログ番号#A80-104A)と共に1:1の比で、RTで15分間インキュベートした。次に、混合物の系列希釈液を調製した。各ウェルに100μLのクロスリンク抗体を添加し、続いて100μLの精製T細胞懸濁液を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性(PG1337)及び陽性対照抗体(ウレルマブ)の系列希釈液を含有していた。T細胞培養物を、IL-2分泌及び/又は抗原の細胞表面発現について試験する前に、95%の相対湿度において37℃、5%のCO2で3日間刺激した。放出されたIL-2の濃度を、AlphaLISA(Perkin Elmer、カタログ番号#AL221C)によって決定した。チェックポイント阻害に関連する細胞表面抗原又は共刺激抗原の発現を、フローサイトメトリーによって決定した。
SEBアッセイ
二重特異性抗体の機能活性を、ブドウ球菌エンテロトキシンB(Staphylococcus enterotoxin B、SEB)によって刺激されたPBMCを使用することによって決定した。SEBは、Vβ3及びVβ8T細胞受容体鎖を発現するT細胞を特異的に活性化する。3人のドナーからのPBMCを解凍し、洗浄し、計数し、培養培地(RPMI1640に10%の熱不活性化FBSを加えたもの)中で、2×106個の細胞/mlの濃度に再懸濁させた。SEB(2000又は125ng/ml)の存在下で、細胞を平底96ウェルプレート(2×105個の細胞/ウェル)に播種した。20μg/mlで開始した抗体系列希釈液を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性(PG1337)及び陽性対照抗体(イピルムマブに基づく)の系列希釈液を含有した。細胞を、サイトカイン分泌及び/又は抗原の細胞表面発現について試験する前に、95%の相対湿度において37℃、5%のCO2で3日間刺激した。
二重特異性抗体の機能活性を、ブドウ球菌エンテロトキシンB(Staphylococcus enterotoxin B、SEB)によって刺激されたPBMCを使用することによって決定した。SEBは、Vβ3及びVβ8T細胞受容体鎖を発現するT細胞を特異的に活性化する。3人のドナーからのPBMCを解凍し、洗浄し、計数し、培養培地(RPMI1640に10%の熱不活性化FBSを加えたもの)中で、2×106個の細胞/mlの濃度に再懸濁させた。SEB(2000又は125ng/ml)の存在下で、細胞を平底96ウェルプレート(2×105個の細胞/ウェル)に播種した。20μg/mlで開始した抗体系列希釈液を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性(PG1337)及び陽性対照抗体(イピルムマブに基づく)の系列希釈液を含有した。細胞を、サイトカイン分泌及び/又は抗原の細胞表面発現について試験する前に、95%の相対湿度において37℃、5%のCO2で3日間刺激した。
PD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイ
使用されたPD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイは、Promegaにより開発され、2つの細胞系;PD-L1を発現するCHO細胞、及びPD-1を過剰発現するT細胞活性化因子並びにジャーカット/NFAT-REレポーター細胞株に基づく。PD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイは、Promegaの解凍及び使用フォーマットを用いて実施した。PD-L1発現CHO細胞(カタログ番号C187103)を、14.5mlの細胞回収培地(10%のFBSを含有するDMEM/F12)中で解凍した。次に、96ウェルハーフエリアプレート(Corning、カタログ番号3688)の内側ウェルに、50μlの細胞懸濁液を添加した。プレートを、95%の相対湿度において、37℃、5%のCOで一晩インキュベートした。翌日、培養培地を除去し、アッセイ培地(4%のFBSを含有するRPMI 1640)中の20μlの試験抗体を、系列希釈液(開始濃度10μg/ml)で、各ウェルに添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性(PG1337)及び陽性対照抗体(ニボルマブ/MPDL3280Aに基づく)の系列希釈液を含有した。PD-1エフェクター細胞(カタログ番号C187105)を5.9mlのアッセイ培地で解凍し、20μlの細胞懸濁液を各ウェルに添加した。プレートを、95%の相対湿度において、37℃、5%のCOで6時間又は一晩インキュベートした。40μlのルシフェラーゼ(Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム、カタログ番号G794L)を翌日加え、aBio Tek Synergy2マルチモードマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性の量を測定した。陰性対照抗体と比較して、ルシフェラーゼ活性として効力を測定した。
使用されたPD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイは、Promegaにより開発され、2つの細胞系;PD-L1を発現するCHO細胞、及びPD-1を過剰発現するT細胞活性化因子並びにジャーカット/NFAT-REレポーター細胞株に基づく。PD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイは、Promegaの解凍及び使用フォーマットを用いて実施した。PD-L1発現CHO細胞(カタログ番号C187103)を、14.5mlの細胞回収培地(10%のFBSを含有するDMEM/F12)中で解凍した。次に、96ウェルハーフエリアプレート(Corning、カタログ番号3688)の内側ウェルに、50μlの細胞懸濁液を添加した。プレートを、95%の相対湿度において、37℃、5%のCOで一晩インキュベートした。翌日、培養培地を除去し、アッセイ培地(4%のFBSを含有するRPMI 1640)中の20μlの試験抗体を、系列希釈液(開始濃度10μg/ml)で、各ウェルに添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性(PG1337)及び陽性対照抗体(ニボルマブ/MPDL3280Aに基づく)の系列希釈液を含有した。PD-1エフェクター細胞(カタログ番号C187105)を5.9mlのアッセイ培地で解凍し、20μlの細胞懸濁液を各ウェルに添加した。プレートを、95%の相対湿度において、37℃、5%のCOで6時間又は一晩インキュベートした。40μlのルシフェラーゼ(Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム、カタログ番号G794L)を翌日加え、aBio Tek Synergy2マルチモードマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性の量を測定した。陰性対照抗体と比較して、ルシフェラーゼ活性として効力を測定した。
PD-L1抗体パネルのスクリーニング
PD-L1抗体パネルからのVHを、荷電した遺伝子操作を受けたFcサイレンスベクターに再クローニングし、それにより、抗体重鎖の重鎖のこれに対する発現時に、重鎖の二量体化が強制され、その結果、トランスフェクション後に二重特異性抗体の生成をもたらす。PD-L1のFabアームを、MV1624ベクター中に再クローニングした。PD-L1抗体を、MF1337、TT標的化Fabアームと組み合わせて、一価の様式でPD-L1を標的化する二重特異性抗体を生成した。一価のフォーマットのPD-L1抗体のパネルを、表3に示すように活性についてランク付けした。
PD-L1抗体パネルからのVHを、荷電した遺伝子操作を受けたFcサイレンスベクターに再クローニングし、それにより、抗体重鎖の重鎖のこれに対する発現時に、重鎖の二量体化が強制され、その結果、トランスフェクション後に二重特異性抗体の生成をもたらす。PD-L1のFabアームを、MV1624ベクター中に再クローニングした。PD-L1抗体を、MF1337、TT標的化Fabアームと組み合わせて、一価の様式でPD-L1を標的化する二重特異性抗体を生成した。一価のフォーマットのPD-L1抗体のパネルを、表3に示すように活性についてランク付けした。
サイトカインアッセイ
ELISA:T細胞又はPBMCの様々な時間での刺激の後に、プレートを遠心分離し、培地を除去した。サイトカインレベルを、製造業者(Perkin Elmer)の指示に従って、AlphaLISAによって検出した。標準曲線に基づいて濃度を計算した。
ELISA:T細胞又はPBMCの様々な時間での刺激の後に、プレートを遠心分離し、培地を除去した。サイトカインレベルを、製造業者(Perkin Elmer)の指示に従って、AlphaLISAによって検出した。標準曲線に基づいて濃度を計算した。
Luminexアッセイ:インビトロでサイトカイン産生を決定するために使用される別の方法は、eBioscienceにより開発された多重分析を使用するものである。IFN-γ、IL-2、及びTNF-αのレベルを、製造元の指示に従って培養上清中で測定した。結果を、eBioscience分析ソフトウェアによって分析した。
ジャーカットCD137-NFκBlucの生成
ジャーカットCD137-NFκBluc安定レポーター細胞株を、ジャーカットE6細胞において、完全長CD137構築物及びNF-κBルシフェラーゼレポーター構築物を安定して組み込むことによって生成した。したがって、完全長CD137 MV1604[pIRESneo3](Clontech)をトランスフェクトし、抗生物質選択後にCD137を発現する安定したクローンを生成した。次に、NF-κBルシフェラーゼレポーター構築物pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega)を最高のCD137発現を有するクローンにトランスフェクトし、CD137及びNF-κBルシフェラーゼの両方を発現する安定なクローンを、抗生物質選択後に選択した。プレート結合CD3抗体(クローンOKT-3)及びPMA/イオノマイシンによる初期活性化後に、クローンをCD137Lに応答するそれらの能力について選択した。活性化の最高のウィンドウを示したクローンを、CD137レポーターアッセイにおける解凍及び使用フォーマットとして使用した。
ジャーカットCD137-NFκBluc安定レポーター細胞株を、ジャーカットE6細胞において、完全長CD137構築物及びNF-κBルシフェラーゼレポーター構築物を安定して組み込むことによって生成した。したがって、完全長CD137 MV1604[pIRESneo3](Clontech)をトランスフェクトし、抗生物質選択後にCD137を発現する安定したクローンを生成した。次に、NF-κBルシフェラーゼレポーター構築物pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega)を最高のCD137発現を有するクローンにトランスフェクトし、CD137及びNF-κBルシフェラーゼの両方を発現する安定なクローンを、抗生物質選択後に選択した。プレート結合CD3抗体(クローンOKT-3)及びPMA/イオノマイシンによる初期活性化後に、クローンをCD137Lに応答するそれらの能力について選択した。活性化の最高のウィンドウを示したクローンを、CD137レポーターアッセイにおける解凍及び使用フォーマットとして使用した。
CD137レポーターアッセイ
直接CD137活性化アッセイについては、96ウェルプレート(Costar、カタログ番号3917)を、PBS中で2μg/mlの抗CD3(OKT3)で一晩コーティングした。クロスリンクによって媒介されるCD137活性化アッセイについては、96ウェルプレート(Costar、カタログ番号3917)を、PBS+10μg/mlの抗ヒトIgG(Bethyl、カタログ番号A80-104A)中の2μg/mlの抗CD3で、一晩コーティングした。翌日、プレートをPBSで洗浄した。上記ジャーカットCD137-NFκBluc細胞を解凍し、10%の熱不活性化ウシ胎児血清を含有するDMEM/F12培地(アッセイ培地)で洗浄した。細胞を2×106個の細胞/mlの密度で再懸濁させた。25μlの細胞懸濁液を、コーティングされた96ウェルアッセイプレートの内側ウェルに播種した。25μlの系列希釈液中の試験抗体を、各ウェルに添加し(開始濃度20μg/ml)、続いて25μlのアッセイ培地を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性(PG1337)及び陽性対照抗体の連続希釈液を含有していた。プレートを、95%の相対湿度において、37℃、5%のCO2で一晩インキュベートした。50μlのルシフェラーゼ(Promega、Bright-Glo(商標)、カタログ番号E2610)を翌日添加し、aBio Tek Synergy2マルチモードマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性の量を測定した。
直接CD137活性化アッセイについては、96ウェルプレート(Costar、カタログ番号3917)を、PBS中で2μg/mlの抗CD3(OKT3)で一晩コーティングした。クロスリンクによって媒介されるCD137活性化アッセイについては、96ウェルプレート(Costar、カタログ番号3917)を、PBS+10μg/mlの抗ヒトIgG(Bethyl、カタログ番号A80-104A)中の2μg/mlの抗CD3で、一晩コーティングした。翌日、プレートをPBSで洗浄した。上記ジャーカットCD137-NFκBluc細胞を解凍し、10%の熱不活性化ウシ胎児血清を含有するDMEM/F12培地(アッセイ培地)で洗浄した。細胞を2×106個の細胞/mlの密度で再懸濁させた。25μlの細胞懸濁液を、コーティングされた96ウェルアッセイプレートの内側ウェルに播種した。25μlの系列希釈液中の試験抗体を、各ウェルに添加し(開始濃度20μg/ml)、続いて25μlのアッセイ培地を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性(PG1337)及び陽性対照抗体の連続希釈液を含有していた。プレートを、95%の相対湿度において、37℃、5%のCO2で一晩インキュベートした。50μlのルシフェラーゼ(Promega、Bright-Glo(商標)、カタログ番号E2610)を翌日添加し、aBio Tek Synergy2マルチモードマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性の量を測定した。
大規模二重特異性抗体の産生
ポリエチレンイミン(polyetyleneimine、PEI)を2.5:1のPEI/DNA質量比を有するトランスフェクション試薬として使用して、フリースタイル(商標)293-F細胞(Invitrogen)中でタンパク質を生成した。二重特異性抗体を、0.4~2Lのスケールで1:1のDNA質量比を用いてトランスフェクトした。細胞上清を、MabSelect SuReLXセファロース(GE Healthcare)と共にバッチ式インキュベーションで精製した後、トリスを用いて酸性溶出及び中和を行った。その結果、タンパク質を脱塩し、遠心分離し、続いて、25mMのリン酸緩衝液(pH6.0)中で平衡化したResources S(GE Healthcare)カラムを使用して、陽イオン交換精製を行った。1MのNaClへの勾配溶出を使用してタンパク質を溶出させ、タンパク質含有画分を回収し、NuPAGE 4~12% Bis-Trisタンパク質ゲル(Invitrogen)を使用して分析した。二重特異性抗体を含有する画分をプールし、PBS中で平衡化したSuperdex200 26/600ゲル濾過カラム(GE Healthcare)に適用した。画分を回収し、NuPAGEで分析した後、単量体抗体含有画分をプールし、滅菌濾過(0.22μm)した。
ポリエチレンイミン(polyetyleneimine、PEI)を2.5:1のPEI/DNA質量比を有するトランスフェクション試薬として使用して、フリースタイル(商標)293-F細胞(Invitrogen)中でタンパク質を生成した。二重特異性抗体を、0.4~2Lのスケールで1:1のDNA質量比を用いてトランスフェクトした。細胞上清を、MabSelect SuReLXセファロース(GE Healthcare)と共にバッチ式インキュベーションで精製した後、トリスを用いて酸性溶出及び中和を行った。その結果、タンパク質を脱塩し、遠心分離し、続いて、25mMのリン酸緩衝液(pH6.0)中で平衡化したResources S(GE Healthcare)カラムを使用して、陽イオン交換精製を行った。1MのNaClへの勾配溶出を使用してタンパク質を溶出させ、タンパク質含有画分を回収し、NuPAGE 4~12% Bis-Trisタンパク質ゲル(Invitrogen)を使用して分析した。二重特異性抗体を含有する画分をプールし、PBS中で平衡化したSuperdex200 26/600ゲル濾過カラム(GE Healthcare)に適用した。画分を回収し、NuPAGEで分析した後、単量体抗体含有画分をプールし、滅菌濾過(0.22μm)した。
結果
CD137レポーターアッセイ
CD137二価抗体のパネルを、上述したCD137直接活性化レポーターアッセイにおいてスクリーニングした。抗体の選択の代表的な図を図11に示す。抗体パネルの60%は、CD137を様々な程度に直接活性化することができた。
CD137レポーターアッセイ
CD137二価抗体のパネルを、上述したCD137直接活性化レポーターアッセイにおいてスクリーニングした。抗体の選択の代表的な図を図11に示す。抗体パネルの60%は、CD137を様々な程度に直接活性化することができた。
CD137×PD-L1抗体パネルのスクリーニング
抗がん剤開発におけるCD137二価抗体の1つの制限は、CD137発現細胞の全身活性化である。これは、非特異的標的化のために、抗体の毒性をもたらし得る[Melero,2013]。二重特異性抗体は、2つの腫瘍抗原などの両方の標的を共発現する細胞を選択的に標的化することによって、又は標的のうちの1つをそれぞれ発現する2つの異なる細胞を標的化することによってのいずれかで、この制限を克服することができる。後者は、細胞が互いにごく近接しているときにのみ生じ得る。CD137の選択的活性化の可能性を検討するために、CD137を標的化する1つのFabアーム及びPD-L1を標的化する1つのFabアームから構成される二重特異性抗体を生成した。PD-L1とは、腫瘍細胞上に高濃度で存在する抗原並びに腫瘍部位に存在する活性化T細胞上の高度に発現された抗原の両方を表す[Pulko et al.,2011]。したがって、二重特異性CD137×PD-L1抗体は、CD137及びPD-L1を同じ細胞上で標的化するとき、CD137を「シス」で活性化することができるか、CD137を免疫細胞上でかつPD-L1を隣接する細胞上で標的化することによって「トランス」で活性化することができるであろう。この機構の上に、PD-1ブロッキングFabアームを含むことは、阻害シグナルを刺激シグナルに変換することができるであろう。
抗がん剤開発におけるCD137二価抗体の1つの制限は、CD137発現細胞の全身活性化である。これは、非特異的標的化のために、抗体の毒性をもたらし得る[Melero,2013]。二重特異性抗体は、2つの腫瘍抗原などの両方の標的を共発現する細胞を選択的に標的化することによって、又は標的のうちの1つをそれぞれ発現する2つの異なる細胞を標的化することによってのいずれかで、この制限を克服することができる。後者は、細胞が互いにごく近接しているときにのみ生じ得る。CD137の選択的活性化の可能性を検討するために、CD137を標的化する1つのFabアーム及びPD-L1を標的化する1つのFabアームから構成される二重特異性抗体を生成した。PD-L1とは、腫瘍細胞上に高濃度で存在する抗原並びに腫瘍部位に存在する活性化T細胞上の高度に発現された抗原の両方を表す[Pulko et al.,2011]。したがって、二重特異性CD137×PD-L1抗体は、CD137及びPD-L1を同じ細胞上で標的化するとき、CD137を「シス」で活性化することができるか、CD137を免疫細胞上でかつPD-L1を隣接する細胞上で標的化することによって「トランス」で活性化することができるであろう。この機構の上に、PD-1ブロッキングFabアームを含むことは、阻害シグナルを刺激シグナルに変換することができるであろう。
CD137及びPD-L1抗体パネルからのVHを、荷電した遺伝子操作を受けたFcサイレンスベクターに再クローニングし、それにより、抗体重鎖の発現時に、重鎖のヘテロ二量体化が強制され、その結果、トランスフェクション後に二重特異性抗体の生成をもたらす。表3に示される40個の異なるCD137 Fabアーム及び8つの異なるPD-L1 Fabアームを含む合計320個のCD137×PD-L1二重特異性抗体を、24ウェルフォーマットで産生し、IgGを精製した。全ての抗体を、CD137-lucレポーター系における用量依存性ルシフェラーゼ発現を直接、又は抗ヒトIgGクロスリンク抗体の存在下で誘導する能力について試験した。サロゲート抗体20H4.9及びMOR7480は、それぞれのアッセイにおいて参照抗体として含まれた。
抗ヒトIgGクロスリンク抗体の非存在下又は存在下での、いくつかのCD137×PD-L1二重特異性抗体のCD137-lucレポーターアッセイにおける機能活性の一例を、図12に示す。この図は、CD137誘導ルシフェラーゼ活性を活性化するためのCD137×PD-L1二重特異性抗体の能力が、ルシフェラーゼ活性の大きさを25%まで増加させるため、抗ヒトIgG抗体によるクロスリンクに非常に依存することを示す。CD137ライゲーション後のIFN-γ産生の有意な増強も20H4.9として当該技術分野において既知の抗CD137抗体についても観察されている(国際公開第2005/035584号)。二重特異性抗体パネルの上部25%のCD137×PD-L1は、8個のPD-L1 Fabアームの全パネルの1~7個のPD-L1 Fabアームと組み合わせた22個のCD137 Fabアームから構成された。
次に、二価親CD137抗体及び破傷風毒素を標的とする無関係なFabアームと組み合わせた親CD137 Fabアームと比較して、初代T細胞活性化アッセイにおいてIL-2放出を誘導する能力について、上部25%のCD137×PD-L1二重特異性抗体パネルを試験した。この実験の設定では、二価活性化に対する一価の活性化を監視することができた。図13の上部パネルは、CD137×CD137二価フォーマットで20H4.9参照抗体の範囲内に存在する場合の、CD137活性化の際にIL-2分泌を誘導する3つの抗体のセットの例を示す。対照的に、図13の底部パネルに示されるように、CD137×PD-L1二重特異性抗体のいずれも、IL-2分泌を二価のCD137親Fabのレベルまで誘導することができなかった。全てのCD137×PD-L1二重特異性抗体は、CD137シグナル伝達複合体が、同じ細胞表面でCD137及びPD-L1に結合する(「シス」での結合)ことによって効果的に形成できなかったことを示すCD137×TT変異体と同じ活性を示した。このCD137×PD-L1二重特異性抗体パネルのシスT細胞活性化の欠如は、非特異的T細胞活性化によるインビボ毒性の可能性を減少させるため、有利である。
トランス活性化アッセイ
二重特異性CD137×PD-L1抗体が「トランス」でCD137を活性化できるかどうかを試験するために、二重特異性抗体を、免疫細胞内のCD137シグナル伝達が、第2の細胞によるクロスリンクによって起こる、2つの細胞アッセイにおいて試験した。インビトロアッセイは、2つの異なる細胞株、すなわち、PD-L1を発現する腫瘍細胞を模倣するCHO-PD-L1細胞及び免疫細胞を表すジャーカットCD137-lucレポーター細胞から構成された。第1のT細胞活性化シグナルを提供する、コーティングされた抗CD3を有するCD137-lucレポーターの場合と同じアッセイ設定を使用した。使用したエフェクター標的細胞の、CHO野生型又はCHO-PD-L1細胞のいずれかである標的細胞との使用された比は、4:1であった。図14は、同じCD137 Fabアーム(MF6744)及び2つの異なるPD-L1 Fabアーム(それぞれMF5361又はMF5594)から構成されているCD137二重特異性抗体PB14671及びPB14580の両方が、CHO-PD-L1細胞の存在下でCD137レポーター細胞活性を誘導することができるが、一方CD137刺激が野生型CHO野生型細胞の存在下で生じた例を示している。加えて、同じCD137 Fabアーム(MF6783)及び2つの異なるPD-L1 Fabアーム(それぞれMF5361又はMF5594)から構成されているCD137二重特異性抗体PB14681及びPB14590の両方が、CHO-PD-L1細胞の存在下でCD137レポーター細胞活性を誘導することができるが、一方CD137刺激が野生型CHO野生型細胞の存在下で生じた例を示している。更に、全てのCD137×PD-L1二重特異性抗体は、参照対照抗体20H4.9と同じ程度に強力であった。CD137×PD-L1二重特異性抗体PB14580及びPB14671の組み合わせ(Oligoclonics(登録商標)フォーマット)は、高いルシフェラーゼ活性を誘導した。
二重特異性CD137×PD-L1抗体が「トランス」でCD137を活性化できるかどうかを試験するために、二重特異性抗体を、免疫細胞内のCD137シグナル伝達が、第2の細胞によるクロスリンクによって起こる、2つの細胞アッセイにおいて試験した。インビトロアッセイは、2つの異なる細胞株、すなわち、PD-L1を発現する腫瘍細胞を模倣するCHO-PD-L1細胞及び免疫細胞を表すジャーカットCD137-lucレポーター細胞から構成された。第1のT細胞活性化シグナルを提供する、コーティングされた抗CD3を有するCD137-lucレポーターの場合と同じアッセイ設定を使用した。使用したエフェクター標的細胞の、CHO野生型又はCHO-PD-L1細胞のいずれかである標的細胞との使用された比は、4:1であった。図14は、同じCD137 Fabアーム(MF6744)及び2つの異なるPD-L1 Fabアーム(それぞれMF5361又はMF5594)から構成されているCD137二重特異性抗体PB14671及びPB14580の両方が、CHO-PD-L1細胞の存在下でCD137レポーター細胞活性を誘導することができるが、一方CD137刺激が野生型CHO野生型細胞の存在下で生じた例を示している。加えて、同じCD137 Fabアーム(MF6783)及び2つの異なるPD-L1 Fabアーム(それぞれMF5361又はMF5594)から構成されているCD137二重特異性抗体PB14681及びPB14590の両方が、CHO-PD-L1細胞の存在下でCD137レポーター細胞活性を誘導することができるが、一方CD137刺激が野生型CHO野生型細胞の存在下で生じた例を示している。更に、全てのCD137×PD-L1二重特異性抗体は、参照対照抗体20H4.9と同じ程度に強力であった。CD137×PD-L1二重特異性抗体PB14580及びPB14671の組み合わせ(Oligoclonics(登録商標)フォーマット)は、高いルシフェラーゼ活性を誘導した。
初代T細胞を用いたトランス活性化アッセイ
T細胞活性化アッセイにおいてCHO野生型又はCHO-PD-L1細胞を添加することにより、トランス活性化アッセイを初代細胞に再フォーマットした。CHO-PD-L1及びCHO野生型細胞に対する1:1.8のアッセイ開始時のエフェクター標的細胞比を使用した。T細胞活性化アッセイについては、96ウェルプレート(96ウェル平底プレート-Cellstar、#655180)の内側ウェルを、PBS中30μg/mLの抗CD3 OKT-3で一晩コーティングした。翌日、プレートをPBSで洗浄した。50μLの抗体溶液を添加し、続いて、25μLの2×106個の細胞/ウェルの精製T細胞懸濁液、及び25μLの精製CHO-K1又はCHO-PD-L1を、上に示した比で各ウェルに添加した。培養物を、IL-2分泌について試験する前に、95%の相対湿度において37℃、5%のCO2で3日間刺激した。放出されたIL-2の濃度を、AlphaLISA(Perkin Elmer、カタログ番号#AL221C)によって決定した。
T細胞活性化アッセイにおいてCHO野生型又はCHO-PD-L1細胞を添加することにより、トランス活性化アッセイを初代細胞に再フォーマットした。CHO-PD-L1及びCHO野生型細胞に対する1:1.8のアッセイ開始時のエフェクター標的細胞比を使用した。T細胞活性化アッセイについては、96ウェルプレート(96ウェル平底プレート-Cellstar、#655180)の内側ウェルを、PBS中30μg/mLの抗CD3 OKT-3で一晩コーティングした。翌日、プレートをPBSで洗浄した。50μLの抗体溶液を添加し、続いて、25μLの2×106個の細胞/ウェルの精製T細胞懸濁液、及び25μLの精製CHO-K1又はCHO-PD-L1を、上に示した比で各ウェルに添加した。培養物を、IL-2分泌について試験する前に、95%の相対湿度において37℃、5%のCO2で3日間刺激した。放出されたIL-2の濃度を、AlphaLISA(Perkin Elmer、カタログ番号#AL221C)によって決定した。
2つのCD137×PD-L1二重特異性抗体(PB14671及びPB14580)、並びにOligoclonics(登録商標)フォーマット及びCD137×TTフォーマットを試験した。図15に示される3日目のIL-2放出は、CD137×PD-L1抗体が、CHO-PD-L1細胞の存在下で、T細胞におけるIL-2産生を、対照抗体20H4.9よりも高程度に誘導したことを示す。更に、CD137×TTフォーマットは、IL-2放出を誘導できなかった。CHO野生型細胞の存在下では、IL-2レベルは、対照抗体20H4.9を除き、バックグラウンドレベルで産生される。2つのCD137×PD-L1二重特異性抗体の組み合わせ(Oligoclonics(登録商標)フォーマット)は、高いルシフェラーゼ活性を誘導し、これによって、前の実験を確証した。Oligoclonics(登録商標)フォーマットは、同じCD137エピトープ及び2つの異なるPD-L1エピトープを標的化するか(図14及び15に示すように)、又は2つの異なるCD137ドメイン及び2つの異なるPD-L1ドメインを標的化するかのいずれかであり得る。
SEBアッセイ
CD137×PD-L1二重特異性抗体を、PD-L1を発現するAPCが存在する場合の生理学的設定において試験するために、両方のCD137×PD-L1抗体(PB14671及びPB14580)、CD137×TT抗体、及びOligoclonics(登録商標)フォーマットをSEBアッセイで試験した。CD137×PD-L1二重特異性抗体のうちの1つ(PB14580)は、陰性対照抗体と比較してより高い活性化を示し、CD137(20H4.9)又はPD-L1(MPDL3280A)のいずれかを標的とする参照抗体と比較してはるかに強力であった(図16を参照されたい)。CD137×PD-L1のOligoclonics(登録商標)フォーマットによるIL-2の誘導も強力であった。
CD137×PD-L1二重特異性抗体を、PD-L1を発現するAPCが存在する場合の生理学的設定において試験するために、両方のCD137×PD-L1抗体(PB14671及びPB14580)、CD137×TT抗体、及びOligoclonics(登録商標)フォーマットをSEBアッセイで試験した。CD137×PD-L1二重特異性抗体のうちの1つ(PB14580)は、陰性対照抗体と比較してより高い活性化を示し、CD137(20H4.9)又はPD-L1(MPDL3280A)のいずれかを標的とする参照抗体と比較してはるかに強力であった(図16を参照されたい)。CD137×PD-L1のOligoclonics(登録商標)フォーマットによるIL-2の誘導も強力であった。
追加の試験
11個の異なるCD137ビンA-Kを表す24個の抗CD137 Fabアームのパネル(表2)を、7つのPD-L1に特異的な、ブロッキングFabアーム及び1つのPD-L1に特異的な非ブロッキングFabアーム(表3)と組み合わせ、24ウェルフォーマットで産生した。産生したCD137×PD-L1二重特異性抗体を、続いて、CHO-PD-L1細胞又はCHO野生型細胞の存在下でCD137-lucレポーター系における用量依存性ルシフェラーゼ発現を誘導するそれらの能力について、連続滴定で試験した。20H4.9及び陰性対照抗体を参照抗体として含めた(図19)。ルシフェラーゼの最も高い誘導を示した抗体(合計56個)を選択し、CHO-PD-L1細胞又はCHO野生型細胞の存在下又は非存在下で活性化T細胞アッセイにおいて連続滴定で試験した。並行して、抗体をSEBアッセイで試験した。CD137活性化の読み出しとして、IL-2放出を測定した。T細胞活性化アッセイで試験した24個の二重特異性抗体の特性及び活性の概要を表7に示す。活性化T細胞アッセイ及びSEBアッセイの両方においてPD-L1アームの両方に対して活性であることが見出された12個のCD137 Fabアームを、7つの異なるPD-L1 Fabアームと組み合わせて選択した。二価単一特異性IgGとして産生される場合と同じように、12個のCD137アームは、それぞれ7つの異なるPD-L1アームのうちの1つと組み合わされた、二重特異性/一価CD137×PD-L1抗体として産生された。したがって、合計84個の二重特異性CD137×PD-L1抗体を、IL-2放出を読み出しとしてSEBアッセイにおいて用量依存性滴定で試験した。図20のデータは、CD137×PD-L1フォーマットで存在する場合、12個のCD137 Fabアームのうちの4つ(MF6783、MF6749、MF6737、及びMF6788)が、他のFabアームと比較してSEBアッセイにおいてより低い効力を示したことを示している。したがって、これら4つのCD137 Fabアームを含むCD137×PD-L1二重特異性抗体は、更なる試験のために除外された。追加のSEB試験中に、MF6808、MF6763、MF6754、MF6785、及びMF6797を含むCD137×PD-L1の組み合わせは、最高のIL-2サイトカイン放出を誘導した。(図21)。MF6805、MF6744、及びMF6825を含むCD137×PD-L1の組み合わせは、より少量のIL-2サイトカイン分泌を誘導した。MF6808、MF6763、MF6754、MF6785、及びMF6797を含むCD137×PD-L1の組み合わせの効力を、Luminexマルチプレックスにより決定されるIL-2、IFNγ及びTNFα放出の誘導を測定することによる連続滴定においてSEBアッセイ中に更に分析した。次に、抗体をIL-2放出のEC50値でランク付けした(表4)。4つの異なるCD137 Fabアームを含む28個のCD137×PD-L1二重特異性抗体のパネル(表4)は、SEBアッセイにおいて最も高い活性を示した。これらの4つのCD137 Fabアームは、CD137内の同じ結合領域(結合ドメイン2)にマッピングすることができ、更に全てがCD137とCD137Lとの間の相互作用を完全にブロックした。これらのいずれも、ジャーカットCD137レポータースクリーニングにおいて2価のモノクローナルとしてアゴニスト活性を示さなかった(図17)。28個のCD137×PD-L1二重特異性抗体のCIEXプロファイルは、MF7702などのMF5553に基づくPD-L1 Fabアームを含むCD137×PD-L1抗体が、製造のためのリード候補抗体として考慮する観点から、最適なCIEXプロファイルを有したことが実証された。
11個の異なるCD137ビンA-Kを表す24個の抗CD137 Fabアームのパネル(表2)を、7つのPD-L1に特異的な、ブロッキングFabアーム及び1つのPD-L1に特異的な非ブロッキングFabアーム(表3)と組み合わせ、24ウェルフォーマットで産生した。産生したCD137×PD-L1二重特異性抗体を、続いて、CHO-PD-L1細胞又はCHO野生型細胞の存在下でCD137-lucレポーター系における用量依存性ルシフェラーゼ発現を誘導するそれらの能力について、連続滴定で試験した。20H4.9及び陰性対照抗体を参照抗体として含めた(図19)。ルシフェラーゼの最も高い誘導を示した抗体(合計56個)を選択し、CHO-PD-L1細胞又はCHO野生型細胞の存在下又は非存在下で活性化T細胞アッセイにおいて連続滴定で試験した。並行して、抗体をSEBアッセイで試験した。CD137活性化の読み出しとして、IL-2放出を測定した。T細胞活性化アッセイで試験した24個の二重特異性抗体の特性及び活性の概要を表7に示す。活性化T細胞アッセイ及びSEBアッセイの両方においてPD-L1アームの両方に対して活性であることが見出された12個のCD137 Fabアームを、7つの異なるPD-L1 Fabアームと組み合わせて選択した。二価単一特異性IgGとして産生される場合と同じように、12個のCD137アームは、それぞれ7つの異なるPD-L1アームのうちの1つと組み合わされた、二重特異性/一価CD137×PD-L1抗体として産生された。したがって、合計84個の二重特異性CD137×PD-L1抗体を、IL-2放出を読み出しとしてSEBアッセイにおいて用量依存性滴定で試験した。図20のデータは、CD137×PD-L1フォーマットで存在する場合、12個のCD137 Fabアームのうちの4つ(MF6783、MF6749、MF6737、及びMF6788)が、他のFabアームと比較してSEBアッセイにおいてより低い効力を示したことを示している。したがって、これら4つのCD137 Fabアームを含むCD137×PD-L1二重特異性抗体は、更なる試験のために除外された。追加のSEB試験中に、MF6808、MF6763、MF6754、MF6785、及びMF6797を含むCD137×PD-L1の組み合わせは、最高のIL-2サイトカイン放出を誘導した。(図21)。MF6805、MF6744、及びMF6825を含むCD137×PD-L1の組み合わせは、より少量のIL-2サイトカイン分泌を誘導した。MF6808、MF6763、MF6754、MF6785、及びMF6797を含むCD137×PD-L1の組み合わせの効力を、Luminexマルチプレックスにより決定されるIL-2、IFNγ及びTNFα放出の誘導を測定することによる連続滴定においてSEBアッセイ中に更に分析した。次に、抗体をIL-2放出のEC50値でランク付けした(表4)。4つの異なるCD137 Fabアームを含む28個のCD137×PD-L1二重特異性抗体のパネル(表4)は、SEBアッセイにおいて最も高い活性を示した。これらの4つのCD137 Fabアームは、CD137内の同じ結合領域(結合ドメイン2)にマッピングすることができ、更に全てがCD137とCD137Lとの間の相互作用を完全にブロックした。これらのいずれも、ジャーカットCD137レポータースクリーニングにおいて2価のモノクローナルとしてアゴニスト活性を示さなかった(図17)。28個のCD137×PD-L1二重特異性抗体のCIEXプロファイルは、MF7702などのMF5553に基づくPD-L1 Fabアームを含むCD137×PD-L1抗体が、製造のためのリード候補抗体として考慮する観点から、最適なCIEXプロファイルを有したことが実証された。
実施例5
抗CD137抗体パネルの親和性ランク付け
PDーL1 Fabアームをトランスで組み合わせてT細胞活性化を誘導した抗CD137 Fabのパネルの親和性を、Biacoreによって決定した。
抗CD137抗体パネルの親和性ランク付け
PDーL1 Fabアームをトランスで組み合わせてT細胞活性化を誘導した抗CD137 Fabのパネルの親和性を、Biacoreによって決定した。
この目的のために、ヒト組換えCD137タンパク質をチップに結合し、Biacore T100機器は、一価二重特異性フォーマット(一方のFabアームは、CD137に特異的であり、他方は、無関係のリガンド、すなわち破傷風毒素(TT)に対して特異的であった)で異なる抗CD137抗体の親和性を分析した。
これらの実験では、二重特異性抗(CD137×TT)IgGを、小規模生産(24ウェルフォーマット、実施例2を参照されたい)においてフリースタイル293F細胞中のコード化構築物の一過性トランスフェクションによって産生した。各トランスフェクションにおいて、選択された抗CD137配列のうちの1つをコード化する構築物を、抗TT配列をコード化するMF1337と組み合わせた。
次いで、Biacore T100機器上の表面プラズモン共鳴(Surface plasmon resonance、SPR)を使用して、抗体の親和性を決定した。この目的のために、huCD137-Fcタンパク質(RND Systems#838-4B)を、酢酸ナトリウムカップリング緩衝液(pH5.0)中に5μg/mlに希釈し、CM5バイオセンサーチップのセル2の表面に、150共鳴単位(resonance unit、RU)のレベルまで結合させた。μフローセル1は、負の制御表面として機能した。動態解離速度定数(Koff値)を決定するために、試験抗体をHEPES緩衝生理食塩水HBS中で15μg/ml(100nM)に希釈し、30μl/分でCD137でコーティングされたセンサチップのフローセル1及び2の両方の上を移動させた。10μlの100mMのHClのパルスを用いて再生を行った。得られたセンサーグラム(すなわち、時間に対する応答のグラフ)から、BIA評価ソフトウェアにおける曲線当てはめを使用して解離速度定数を決定した。
抗体パネルの結合動態を測定し、CD137に結合する抗体の動態結合及び動態解離速度定数を得るために、異なる濃度の試験抗体のこのサブセットを、新たにコーティングされたチップのフローセル1及び2の表面上を移動させた。抗体をHBS中で200nM(すなわち30μg/ml)に希釈し、2倍に系列希釈し(4回希釈、100nM~50nM~25nM~12.5nM)、次いで、高流量(30μl/分)での動速度でチップへの結合について試験した。10μlの100mMのHClのパルスを用いて再生を行った。得られたセンサーグラムを、BIA評価ソフトウェアを使用して分析し、動態結合速度定数(Ka)及び動態解離速度定数(Kd)を決定し、それにより、異なる抗CD137 Fabアームの親和性(KD値)に関するデータを生成した。各抗体濃度について、オンレート及びオフレートを別々に決定し、次いで平均化した。
これらの結果を表6に示す。全ての試験した抗CD137 Fabは、低いnM範囲内の親和性を有した。
実施例6
ジャーカットOX40-NFκBlucの生成
ジャーカットOX-40-NFκBluc安定レポーター細胞株を、ジャーカットE6細胞において、完全長OX-40構築物及びNF-κBルシフェラーゼレポーター構築物を安定して組み込むことによって生成した。したがって、完全長OX-40 MV1616[pIRESneo3](Clontech)をトランスフェクトし、抗生物質選択後にOX-40を発現する安定したクローンを生成した。次に、NF-κBルシフェラーゼレポーター構築物pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega)を最高のOX-40発現を有するクローンにトランスフェクトし、OX-40及びNF-κBルシフェラーゼの両方を発現する安定なクローンを、抗生物質選択後に選択した。プレート結合CD3抗体(クローンOKT-3)及びPMA/イオノマイシンによる初期活性化後に、クローンをOX-40Lに応答するそれらの能力について選択した。活性化の最高のウィンドウを示したクローンを、OX-40レポーターアッセイにおける解凍及び使用フォーマットとして使用した。
ジャーカットOX40-NFκBlucの生成
ジャーカットOX-40-NFκBluc安定レポーター細胞株を、ジャーカットE6細胞において、完全長OX-40構築物及びNF-κBルシフェラーゼレポーター構築物を安定して組み込むことによって生成した。したがって、完全長OX-40 MV1616[pIRESneo3](Clontech)をトランスフェクトし、抗生物質選択後にOX-40を発現する安定したクローンを生成した。次に、NF-κBルシフェラーゼレポーター構築物pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega)を最高のOX-40発現を有するクローンにトランスフェクトし、OX-40及びNF-κBルシフェラーゼの両方を発現する安定なクローンを、抗生物質選択後に選択した。プレート結合CD3抗体(クローンOKT-3)及びPMA/イオノマイシンによる初期活性化後に、クローンをOX-40Lに応答するそれらの能力について選択した。活性化の最高のウィンドウを示したクローンを、OX-40レポーターアッセイにおける解凍及び使用フォーマットとして使用した。
OX-40レポーターアッセイ
直接OX-40活性化アッセイ及びクロスリンクによって媒介されるOX-40活性化アッセイについては、96ウェルプレート(Costar、カタログ番号3917)を、PBS中で2μg/mlの抗CD3(OKT3)で一晩コーティングした。翌日、プレートをPBSで洗浄した。ジャーカットOX-40-NFκBlucを解凍し、10%の熱不活性化ウシ胎児血清を含有するDMEM/F12培地(アッセイ培地)で洗浄した。細胞を5×105個の細胞/mlの密度で再懸濁させた。25μlの細胞懸濁液を、コーティングされた96ウェルアッセイプレートの内側ウェルに播種した。試験抗体を2.5倍のaHuIgG-Fc(Bethyl、カタログ番号A80-104A)抗体と組み合わせて、系列希釈液を調製した(IgGの試験開始濃度、20μg/ml)。抗体混合物を室温で15分間インキュベートした。次に、50μlの抗体混合物を細胞に添加し、続いて25μlのアッセイ培地を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性(PG1337)及び陽性対照抗体の連続希釈液を含有していた。プレートを、95%の相対湿度において、37℃、5%のCOで6時間インキュベートした。50μlのルシフェラーゼ(Promega、Bright-Glo(商標)、カタログ番号E2610)を添加し、aBio Tek Synergy2マルチモードマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性の量を測定した。
直接OX-40活性化アッセイ及びクロスリンクによって媒介されるOX-40活性化アッセイについては、96ウェルプレート(Costar、カタログ番号3917)を、PBS中で2μg/mlの抗CD3(OKT3)で一晩コーティングした。翌日、プレートをPBSで洗浄した。ジャーカットOX-40-NFκBlucを解凍し、10%の熱不活性化ウシ胎児血清を含有するDMEM/F12培地(アッセイ培地)で洗浄した。細胞を5×105個の細胞/mlの密度で再懸濁させた。25μlの細胞懸濁液を、コーティングされた96ウェルアッセイプレートの内側ウェルに播種した。試験抗体を2.5倍のaHuIgG-Fc(Bethyl、カタログ番号A80-104A)抗体と組み合わせて、系列希釈液を調製した(IgGの試験開始濃度、20μg/ml)。抗体混合物を室温で15分間インキュベートした。次に、50μlの抗体混合物を細胞に添加し、続いて25μlのアッセイ培地を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性(PG1337)及び陽性対照抗体の連続希釈液を含有していた。プレートを、95%の相対湿度において、37℃、5%のCOで6時間インキュベートした。50μlのルシフェラーゼ(Promega、Bright-Glo(商標)、カタログ番号E2610)を添加し、aBio Tek Synergy2マルチモードマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性の量を測定した。
OX-40二価抗体のパネルを、OX-40直接活性化レポーターアッセイ及びT細胞活性化アッセイでスクリーニングした。4つの異なるOX-40 Fabアームを選択して、二重特異性OX40×PD-L1又はOX40×PD-1抗体が、「シス」又は「トランス」においてOX40を活性化することができるかどうかを試験した。したがって、二重特異性抗体を、PD-L1を過剰発現するCHO細胞及びジャーカットOX-40-NFκBlucを使用して、2つの細胞系で試験した。PD-L1を、CHO細胞上で「トランス」で提供し、PD-1は、活性化ジャーカットOX-40-NFκBlucレポーター細胞上で「シス」で提供した。第1のT細胞活性化シグナルを提供する、コーティングされた抗CD3を用いたジャーカットOX-40-NFκBlucアッセイの場合と同じアッセイ設定を使用した。使用したエフェクター標的細胞の、CHO野生型又はCHO-PD-L1細胞のいずれかである標的細胞との使用された比は、4:1であった。図18は、PD-L1(MF5561)又はPD-1(MF6256)ブロッキングFabアームのいずれかと組み合わされた4つの異なるOX40 Fabアームの例を示す。OX40×PD-1抗体は、CHO-PD-L1細胞の存在下で、OX40レポーター細胞活性をイピルムマブに基づく抗CTLA4抗体と同じレベルまで誘導した。対照的に、OX40×PD-1抗体は、基底の活性を示した。PD-L1を発現する細胞の非存在下では、OX40×PD-L1抗体の活性は、ベースラインに戻った。
実施例7
実施例4では、5つのCD137特異的Fabアームが、それらのT細胞トランス活性化能力の観点から好ましいと判定された。
実施例4では、5つのCD137特異的Fabアームが、それらのT細胞トランス活性化能力の観点から好ましいと判定された。
この実施例では、3つの候補CD137アーム(6763、6785、及び6797)及び1つのPD-L1アーム(7702)からなる3つの二重特異性抗体のパネルを使用した。二重特異性抗体を、293Fフリースタイル細胞で産生させて、protA、CIEX、及びゲル濾過により精製した。続いて、抗体をいくつかのアッセイで試験した。我々は、4つのFabアームを、親二価単一特異性フォーマット(抗CD137又は抗PD-L1)及び二重特異性フォーマット(抗CD137×PD-L1)の両方で試験し、これら抗体を、ベンチマーク抗CD137抗体20H4.9、ベンチマーク抗PD-L1抗体YW243.55.S70、及び陰性対照抗体(抗RSV抗体PG2708)と比較した。
本実施例に記載のアッセイの材料及び方法についても、実施例4を参照する。
抗体を以下に列挙する。
FACS分析
抗原特異性及び親和性
ヒト(hu)及びカニクイザル(cy)CD137への単一特異性及び二重特異性IgGの結合を、huCD137又はcyCD137のいずれかを発現する293FF安定細胞クローンを用いてFACS分析により検証した。この目的のために、細胞を、抗体の8段階連続滴定でインキュベートし、その後の蛍光染料フィコエリトリン(phycoerythrin、PE)に結合した二次抗体の抗ヒトIgGの結合を通して結合強度を分析した。試験した抗体のそれぞれについて平均PE蛍光として表される結合強度を図22に示す。単一特異性親抗CD137抗体のうち、PG6785は、最も高い親和性でヒトCD137に結合し、PG6797、次いでPG6763が続いた。二重特異性PB17311(6797×7702)は、最も高い親和性でhuCD137に結合し、PB17309(6763×7702)、次いでPB17310(6785×7702)が続いた。親抗CD137抗体のうち、PG6785は、最も高い親和性でカニクイザルCD137に再び結合し、この時点でPG6797、次いでPG6763が続いた。二重特異性PB17311(6797×7702)は、最も高い親和性でcyCD137に結合し、PB17309(6763×7702)、次いでPB17310(6785×7702)が続いた。注目すべきことに、図22に示されるように、3つのCD137特異的Fabアームが二重特異性の一価抗体中に存在する場合、これらは、単一特異性二価親抗体についても観察されるように、huCD137及びcyCD137の両方にも同様に結合することができる。
抗原特異性及び親和性
ヒト(hu)及びカニクイザル(cy)CD137への単一特異性及び二重特異性IgGの結合を、huCD137又はcyCD137のいずれかを発現する293FF安定細胞クローンを用いてFACS分析により検証した。この目的のために、細胞を、抗体の8段階連続滴定でインキュベートし、その後の蛍光染料フィコエリトリン(phycoerythrin、PE)に結合した二次抗体の抗ヒトIgGの結合を通して結合強度を分析した。試験した抗体のそれぞれについて平均PE蛍光として表される結合強度を図22に示す。単一特異性親抗CD137抗体のうち、PG6785は、最も高い親和性でヒトCD137に結合し、PG6797、次いでPG6763が続いた。二重特異性PB17311(6797×7702)は、最も高い親和性でhuCD137に結合し、PB17309(6763×7702)、次いでPB17310(6785×7702)が続いた。親抗CD137抗体のうち、PG6785は、最も高い親和性でカニクイザルCD137に再び結合し、この時点でPG6797、次いでPG6763が続いた。二重特異性PB17311(6797×7702)は、最も高い親和性でcyCD137に結合し、PB17309(6763×7702)、次いでPB17310(6785×7702)が続いた。注目すべきことに、図22に示されるように、3つのCD137特異的Fabアームが二重特異性の一価抗体中に存在する場合、これらは、単一特異性二価親抗体についても観察されるように、huCD137及びcyCD137の両方にも同様に結合することができる。
ヒト(hu)及びアカゲザル(re)PD-L1への単一特異性及び二重特異性IgGの結合を、huPD-L1又はrePD-L1のいずれかを発現するCHO-K1安定細胞クローンを用いてFACS分析により検証した。この目的のために、細胞を、抗体の8段階連続滴定でインキュベートし、その後の二次抗体の抗ヒトIgG-PEの結合を通して結合強度を分析した。試験した抗体のそれぞれについて平均蛍光強度(MFI)として表される結合強度を図23に示す。予想されるように、親抗CD137抗体は、ヒト又はアカゲザルPD-L1に結合しなかったが、一方親抗PD-L1 PG7702抗体は、結合した。重要なことに、全ての3つの二重特異性抗体は、PD-L1に強く結合し、全てが、陽性対照抗体よりも高い親和性を伴うことである。これは、一価の二重特異性抗体中に存在する場合であっても、MF7702アームが、二価対照抗体YW243.55.S70と比較して、PD-L1に対する親和性が高いことを意味する。
活性化されたT細胞に対する結合
我々は、活性化T細胞に対する抗体パネルの結合親和性を試験した。この目的のために、末梢血単核球細胞(peripheral blood mononuclear cell、PBMC)をドナーから採集し、一晩放置した。続いて、T細胞を単離し、抗CD3抗体OKT3でコーティングしたプレート上でそれらを3日間インキュベートすることによって活性化させた。活性化T細胞を採取し、抗体パネル内のIgGの連続滴定で、及び対照IgGで染色した。抗体結合を、二次抗体、抗ヒトIgG-PEのその後の結合を通してFACSで測定した。試験した抗体のそれぞれについてMFIとして表される結合強度を図24に示しており、ここには二重特異性IgGの結合が左側に示され、単一特異性IgGの結合が右側に示されている。PB17311(6797×7702)は、最も強力な結合を示した。重要なことに、陽性対照抗体の結合親和性は、二重特異性抗体の親和性よりも低かった。これは、本発明の二重特異性抗体が、PD-L1特異的ベンチマーク抗体YW243.55.S70(アテゾリズマブに基づく)及びCD137特異的ベンチマーク抗体20H4.9(ウレエウマブに基づく)と比較して、活性化T細胞に対するより高い親和性を有することを意味する。
我々は、活性化T細胞に対する抗体パネルの結合親和性を試験した。この目的のために、末梢血単核球細胞(peripheral blood mononuclear cell、PBMC)をドナーから採集し、一晩放置した。続いて、T細胞を単離し、抗CD3抗体OKT3でコーティングしたプレート上でそれらを3日間インキュベートすることによって活性化させた。活性化T細胞を採取し、抗体パネル内のIgGの連続滴定で、及び対照IgGで染色した。抗体結合を、二次抗体、抗ヒトIgG-PEのその後の結合を通してFACSで測定した。試験した抗体のそれぞれについてMFIとして表される結合強度を図24に示しており、ここには二重特異性IgGの結合が左側に示され、単一特異性IgGの結合が右側に示されている。PB17311(6797×7702)は、最も強力な結合を示した。重要なことに、陽性対照抗体の結合親和性は、二重特異性抗体の親和性よりも低かった。これは、本発明の二重特異性抗体が、PD-L1特異的ベンチマーク抗体YW243.55.S70(アテゾリズマブに基づく)及びCD137特異的ベンチマーク抗体20H4.9(ウレエウマブに基づく)と比較して、活性化T細胞に対するより高い親和性を有することを意味する。
リガンドブロッキングアッセイ
PD-1/PD-L1競合アッセイ
二重特異性及び単一特異性IgGのPD-L1リガンド結合をブロックする能力を、PD-1/PD-L1競合ELISAにおいて試験し、これにより、抗PD-L1アームを含有する抗体の量を増加させることが、PD-1 Fcでコーティングされたプレートに結合することができるビオチン化PD-L1の量を低減させることが期待された。この目的のために、1μg/mlのPD-1-Fc(R&D、#.1086-PD)をマキシソーププレートにコーティングし、ビオチン化PD-L1(BPS Bioscience、カタログ番号71105)を、10μg/mlの濃度で開始した各抗体の系列希釈液の存在下又は非存在下で溶液に添加した。μ結合したPD-L1を、西洋わさびペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase、HRP)に結合させたストレプトアビジンの後続の結合、及びHRPが有色生成物に触媒作用する無色基質の添加を通して検出した。ELISAプレートリーダーを使用して450nm測定した溶液の光学密度(optical density、OD)は、結合したPD-L1の指標である。結合曲線を図25に示しており、ここには二重特異性IgGの結合が左側に示され、単一特異性IgGの結合が右側に示されている。予想されるように、陽性対照抗PD-L1抗体は、高いレベルのブロッキング活性を示し、陰性対照抗体はいずれも示さなかった。単一特異性抗CD137抗体はまた、PD-L1ブロッキングに関して陰性であった。少なくとも1つの抗PD-L1アームを含有するIgGについては、全てがPD-1/PD-L1結合をブロックすることができた。親単一特異性抗PD-L1抗体PG7702は、PD-L1結合のブロッキングにおいてベンチマーク抗PD-L1抗体YW243.55.S70とほぼ同程度の有効性であることが判明した。二重特異性IgGは全て、良好な、同様のレベルのブロッキング活性を有した。
PD-1/PD-L1競合アッセイ
二重特異性及び単一特異性IgGのPD-L1リガンド結合をブロックする能力を、PD-1/PD-L1競合ELISAにおいて試験し、これにより、抗PD-L1アームを含有する抗体の量を増加させることが、PD-1 Fcでコーティングされたプレートに結合することができるビオチン化PD-L1の量を低減させることが期待された。この目的のために、1μg/mlのPD-1-Fc(R&D、#.1086-PD)をマキシソーププレートにコーティングし、ビオチン化PD-L1(BPS Bioscience、カタログ番号71105)を、10μg/mlの濃度で開始した各抗体の系列希釈液の存在下又は非存在下で溶液に添加した。μ結合したPD-L1を、西洋わさびペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase、HRP)に結合させたストレプトアビジンの後続の結合、及びHRPが有色生成物に触媒作用する無色基質の添加を通して検出した。ELISAプレートリーダーを使用して450nm測定した溶液の光学密度(optical density、OD)は、結合したPD-L1の指標である。結合曲線を図25に示しており、ここには二重特異性IgGの結合が左側に示され、単一特異性IgGの結合が右側に示されている。予想されるように、陽性対照抗PD-L1抗体は、高いレベルのブロッキング活性を示し、陰性対照抗体はいずれも示さなかった。単一特異性抗CD137抗体はまた、PD-L1ブロッキングに関して陰性であった。少なくとも1つの抗PD-L1アームを含有するIgGについては、全てがPD-1/PD-L1結合をブロックすることができた。親単一特異性抗PD-L1抗体PG7702は、PD-L1結合のブロッキングにおいてベンチマーク抗PD-L1抗体YW243.55.S70とほぼ同程度の有効性であることが判明した。二重特異性IgGは全て、良好な、同様のレベルのブロッキング活性を有した。
細胞ベースのhuCD137リガンドブロッキングアッセイ
CD137リガンド結合をブロックするための二重特異性及び単一特異性IgGの能力も試験した。我々は、3つの候補CD137アーム(6763、6785、及び6797)及びPD-L1アーム(7702)を、親二価単一特異性フォーマット(抗CD137又は抗PD-L1)及び二重特異性フォーマット(抗CD137×PD-L1)の両方で試験し、これら抗体を、ベンチマーク抗CD137抗体20H4.9及びPF-05082566と、並びに陰性対照抗体(抗RSV抗体PG2708)と比較した。
CD137リガンド結合をブロックするための二重特異性及び単一特異性IgGの能力も試験した。我々は、3つの候補CD137アーム(6763、6785、及び6797)及びPD-L1アーム(7702)を、親二価単一特異性フォーマット(抗CD137又は抗PD-L1)及び二重特異性フォーマット(抗CD137×PD-L1)の両方で試験し、これら抗体を、ベンチマーク抗CD137抗体20H4.9及びPF-05082566と、並びに陰性対照抗体(抗RSV抗体PG2708)と比較した。
生理学的に関連する条件下でCD137リガンドブロッキングを分析するために、二重特異性及び単一特異性IgGを、フローサイトメトリーを使用して細胞ベースのhuCD137リガンドブロッキングアッセイで試験した。このアッセイでは、抗CD137アームを含有する抗体の量を増加させると、huCD137を安定的に発現するCHO-K1細胞に結合することができるhuCD137L組換えタンパク質の量を減少させることが予想された。この目的のために、CHO(huCD137)細胞を、各抗体の系列希釈液と共にhuCD137Lタンパク質と共インキュベートした。結合したhuCD137Lを、二次ビオチン結合抗huCD137L抗体で検出した後、フィコエリトリン(PE)に結合させたストレプトアビジンで染色した。
方法
huCD137を安定的に発現するCHO細胞を採取し、計数し、FACS緩衝液で5×105個細胞/mlに希釈し、200μl(1×105個細胞を含有する)を、U底96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。細胞を氷上に維持した。細胞を4℃で300gにて3分間遠心分離させ、200μlの氷冷FACS緩衝液を添加することによって洗浄した。細胞を再び4℃で300gにて3分間遠心分離させ、ペレットをFACS緩衝液中の25μlの抗体希釈液(25から0.034μg/mlまでの3倍の系列希釈液)に25μlのhuCD137L-FLAGタンパク質の溶液(Adipogen、#AG-40A-0198T、0.06μg/mlの最終濃度)を加えたものに再懸濁させた。プレートを暗所で氷上で60分間インキュベートした。次いで、200μlの氷冷FACS緩衝液を添加し、4℃で300gにて3分間遠心分離することによって、細胞を2回洗浄した。次いで、氷冷FACS緩衝液中で1μg/mlに希釈した50μl/ウェルのビオチン化ポリクローナルヤギhuCD137L抗体(R&D Systems#BAF2295)を添加した。細胞を再懸濁させて、プレートを暗所で氷上で60分間インキュベートした後、前述のように2回洗浄した。次いで、氷冷FACS緩衝液中で1:200で希釈したストレプトアビジン-PE希釈の50μl/ウェルを添加した。細胞を再懸濁させて、プレートを暗所で氷上で30分間インキュベートした後、前述のように2回洗浄した。細胞をウェル当たり100μlのFACS緩衝液中に再懸濁させて、100μlの4%パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde、PFA)溶液の添加によって固定した。BD FACSCantoフローサイトメーターを使用して、BDマニュアルの説明書に従って試料を測定した。huCD137リガンドの結合度を、結合したストレプトアビジン-PEの平均蛍光強度(MFI)として表した。
huCD137を安定的に発現するCHO細胞を採取し、計数し、FACS緩衝液で5×105個細胞/mlに希釈し、200μl(1×105個細胞を含有する)を、U底96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。細胞を氷上に維持した。細胞を4℃で300gにて3分間遠心分離させ、200μlの氷冷FACS緩衝液を添加することによって洗浄した。細胞を再び4℃で300gにて3分間遠心分離させ、ペレットをFACS緩衝液中の25μlの抗体希釈液(25から0.034μg/mlまでの3倍の系列希釈液)に25μlのhuCD137L-FLAGタンパク質の溶液(Adipogen、#AG-40A-0198T、0.06μg/mlの最終濃度)を加えたものに再懸濁させた。プレートを暗所で氷上で60分間インキュベートした。次いで、200μlの氷冷FACS緩衝液を添加し、4℃で300gにて3分間遠心分離することによって、細胞を2回洗浄した。次いで、氷冷FACS緩衝液中で1μg/mlに希釈した50μl/ウェルのビオチン化ポリクローナルヤギhuCD137L抗体(R&D Systems#BAF2295)を添加した。細胞を再懸濁させて、プレートを暗所で氷上で60分間インキュベートした後、前述のように2回洗浄した。次いで、氷冷FACS緩衝液中で1:200で希釈したストレプトアビジン-PE希釈の50μl/ウェルを添加した。細胞を再懸濁させて、プレートを暗所で氷上で30分間インキュベートした後、前述のように2回洗浄した。細胞をウェル当たり100μlのFACS緩衝液中に再懸濁させて、100μlの4%パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde、PFA)溶液の添加によって固定した。BD FACSCantoフローサイトメーターを使用して、BDマニュアルの説明書に従って試料を測定した。huCD137リガンドの結合度を、結合したストレプトアビジン-PEの平均蛍光強度(MFI)として表した。
結果
得られた結合曲線を図26に示す。予想されたように、陰性対照は、CD137リガンド結合をブロックしなかった。陽性対照抗体によるリガンド結合のブロッキングは様々であって、すなわち、ベンチマーク抗体PF-05082566は、強い遮断を示したが、20H4.9は比較的弱くかつ不完全なブロッキングを示した。3つの単一特異性抗CD137抗体のうち、PG6785は最良のブロッカーであり、PG6797(PB17311の親)は、2番目に良好であった。3つの対応する二重特異性抗CD137×抗PD-L1抗体もまた、CD137リガンド結合をブロックすることができた。これは細胞ベースのアッセイであるため、これらの結果は、生理学的に関連する条件に対する指標である。
得られた結合曲線を図26に示す。予想されたように、陰性対照は、CD137リガンド結合をブロックしなかった。陽性対照抗体によるリガンド結合のブロッキングは様々であって、すなわち、ベンチマーク抗体PF-05082566は、強い遮断を示したが、20H4.9は比較的弱くかつ不完全なブロッキングを示した。3つの単一特異性抗CD137抗体のうち、PG6785は最良のブロッカーであり、PG6797(PB17311の親)は、2番目に良好であった。3つの対応する二重特異性抗CD137×抗PD-L1抗体もまた、CD137リガンド結合をブロックすることができた。これは細胞ベースのアッセイであるため、これらの結果は、生理学的に関連する条件に対する指標である。
PD-1/PD-L1レポーターアッセイ
候補抗CD137×PD-L1抗体の特性評価における別の工程は、これらがPD-1/PD-L1経路をブロックすることができるかどうかを判定し、これをPD-L1に特異的な対照抗体の活性と比較することであった。このブロッキング活性を、2つの細胞系(PD-L1並びにT細胞受容体活性化因子を発現するCHO細胞、及びPD-1を過剰発現するジャーカット/NFAT-REレポーター細胞株)に基づいてPromegaによって開発された生理学的に関連するPD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイでインビトロにおいて試験した。ジャーカットT細胞は、NFAT(活性化T細胞の核因子)経路を通して活性化され得るルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する。PD-1のPD-L1との相互作用は、この経路の活性化を阻害する。しかしながら、PD-1又はPD-L1に対する抗体によるPD-1/PD-L1相互作用のブロッキングは、NFAT経路を活性化し得る。したがって、PD-1/PD-L1の遮断の程度が大きくなるほど、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化が大きくなる。この目的のために、各抗体の系列希釈液を、PD-1過剰発現するジャーカット/NFAT-REレポーター細胞を添加する前に、PD-L1を発現するCHO細胞に添加した。レポーター遺伝子の誘導倍率として表された24時間後の遮断の程度を図27に示しており、ここには二重特異性IgGの結合が左側に示され、単一特異性抗PD-L1 IgGの結合が右側に示されている。ここでも、二価親抗体7702は、陽性対照ベンチマーク抗体YW243.55.S70よりも強力であった。二重特異性IgGは全て、良好な、同様のレベルのブロッキング活性を有した。
候補抗CD137×PD-L1抗体の特性評価における別の工程は、これらがPD-1/PD-L1経路をブロックすることができるかどうかを判定し、これをPD-L1に特異的な対照抗体の活性と比較することであった。このブロッキング活性を、2つの細胞系(PD-L1並びにT細胞受容体活性化因子を発現するCHO細胞、及びPD-1を過剰発現するジャーカット/NFAT-REレポーター細胞株)に基づいてPromegaによって開発された生理学的に関連するPD-1/PD-L1遮断レポーターアッセイでインビトロにおいて試験した。ジャーカットT細胞は、NFAT(活性化T細胞の核因子)経路を通して活性化され得るルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する。PD-1のPD-L1との相互作用は、この経路の活性化を阻害する。しかしながら、PD-1又はPD-L1に対する抗体によるPD-1/PD-L1相互作用のブロッキングは、NFAT経路を活性化し得る。したがって、PD-1/PD-L1の遮断の程度が大きくなるほど、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化が大きくなる。この目的のために、各抗体の系列希釈液を、PD-1過剰発現するジャーカット/NFAT-REレポーター細胞を添加する前に、PD-L1を発現するCHO細胞に添加した。レポーター遺伝子の誘導倍率として表された24時間後の遮断の程度を図27に示しており、ここには二重特異性IgGの結合が左側に示され、単一特異性抗PD-L1 IgGの結合が右側に示されている。ここでも、二価親抗体7702は、陽性対照ベンチマーク抗体YW243.55.S70よりも強力であった。二重特異性IgGは全て、良好な、同様のレベルのブロッキング活性を有した。
実施例8
CD137×PD-L1二重特異性によるCD137のトランス活性化に対するPD-L1発現レベルの効果
細胞株の培養
MDA-MB231細胞(カタログ番号CRM-HTB-26)をATCCから購入し、100mMのピルビン酸ナトリウム(Gibco)、MEM非必須アミノ酸(GiBco)、10%のFBS(Lonza)を補充したDMEM高グルコース(Gibco)中で日常的に維持した。BxPC-3細胞(カタログ番号CRL-1687)を、ATCCから入手し、10%のFBS(Lonza)を補充したRPMI-1640(Gibco)中で日常的に維持した。
CD137×PD-L1二重特異性によるCD137のトランス活性化に対するPD-L1発現レベルの効果
細胞株の培養
MDA-MB231細胞(カタログ番号CRM-HTB-26)をATCCから購入し、100mMのピルビン酸ナトリウム(Gibco)、MEM非必須アミノ酸(GiBco)、10%のFBS(Lonza)を補充したDMEM高グルコース(Gibco)中で日常的に維持した。BxPC-3細胞(カタログ番号CRL-1687)を、ATCCから入手し、10%のFBS(Lonza)を補充したRPMI-1640(Gibco)中で日常的に維持した。
CD137×PD-L1抗体の作用様式
ジャーカットCD137-lucレポータートランス活性化アッセイを使用して、CD137×PD-L1抗体媒介性トランス活性化が生理学的PD-L1発現レベルで生じるかどうか、及びそれがPD-L1発現レベルに相関するかどうかを判定した。したがって、様々なCHO-PD-L1細胞株及びヒト腫瘍細胞株上のPD-L1結合部位の数を、QIFIKIT分析(DAKO)によって決定した。比較的に高いレベル(ES-2細胞)、中間のレベル(MDA-MB231)、又は低いレベル(BxPC-3))のPD-L1を発現するヒト腫瘍細胞株に対応するPD-L1発現レベルを示す3つのCHO-PD-L1細胞株を選択した。図28Aは、細胞当たり約6,000~約72,000個のPD-L1結合部位を発現する3つの選択されたCHO細胞株を使用した3つのCD137×PD-L1二重特異性抗体の例を示す。データは、CD137×PD-L1二重特異性抗体が、3.8 104個を超えるPD-L1コピーが細胞上に存在するときに、高活性化を示すことを示している。低PD-L1レベルにおいて、細胞当たり約6000個のPD-L1結合部位のみを発現するCHO細胞の存在下では、低レベルの活性化が観察される。したがって、CD137×PD-L1二重特異性抗体によるトランス活性化は、免疫抑制性腫瘍微小環境において生じるような高レベルのPD-L1を発現する細胞付近で生じ、したがって、CD137×PD-L1二重特異性抗体の最適な治療用ウィンドウを提供するであろう。
ジャーカットCD137-lucレポータートランス活性化アッセイを使用して、CD137×PD-L1抗体媒介性トランス活性化が生理学的PD-L1発現レベルで生じるかどうか、及びそれがPD-L1発現レベルに相関するかどうかを判定した。したがって、様々なCHO-PD-L1細胞株及びヒト腫瘍細胞株上のPD-L1結合部位の数を、QIFIKIT分析(DAKO)によって決定した。比較的に高いレベル(ES-2細胞)、中間のレベル(MDA-MB231)、又は低いレベル(BxPC-3))のPD-L1を発現するヒト腫瘍細胞株に対応するPD-L1発現レベルを示す3つのCHO-PD-L1細胞株を選択した。図28Aは、細胞当たり約6,000~約72,000個のPD-L1結合部位を発現する3つの選択されたCHO細胞株を使用した3つのCD137×PD-L1二重特異性抗体の例を示す。データは、CD137×PD-L1二重特異性抗体が、3.8 104個を超えるPD-L1コピーが細胞上に存在するときに、高活性化を示すことを示している。低PD-L1レベルにおいて、細胞当たり約6000個のPD-L1結合部位のみを発現するCHO細胞の存在下では、低レベルの活性化が観察される。したがって、CD137×PD-L1二重特異性抗体によるトランス活性化は、免疫抑制性腫瘍微小環境において生じるような高レベルのPD-L1を発現する細胞付近で生じ、したがって、CD137×PD-L1二重特異性抗体の最適な治療用ウィンドウを提供するであろう。
図28Aは、試験した全ての抗体についての、CD137×PD-L1二重特異性抗体媒介性NF-κB活性化とCHO細胞上のPD-L1発現レベルとの間の正の相関を示す。
図28Bは、ジャーカットCD137-lucレポータートランス活性化アッセイの例を示しており、ここではCHO-PD-L1細胞が、高い、中間の、及び低い表面PD-L1レベルを発現するヒト腫瘍細胞株に置き換えられた。この実験により、CD137×PD-L1二重特異性抗体媒介性トランス活性化が、アクセサリー細胞PD-L1発現レベルに関連し、CD137×PD-L1二重特異性抗体は、高レベルのPD-L1を発現する腫瘍細胞の存在下でトランス活性化することができることが確認された。
次に、PD-L1発現アクセサリー細胞の存在下でのCD137トランス活性化が、CD137×PD-L1二重特異性抗体の特異的形質であるかどうかを評価した。図28Cは、PD-L1発現アクセサリー細胞の存在下でのジャーカットCD137-lucレポーター細胞トランス活性化を、CD137×PD-L1二重特異性抗体、それらの親単一特異性二価(CD137×CD137)、及び親単一特異性一価CD137(CD137×TT)並びにPD-L1(TT×PD-L1)抗体について評価した例を示す。全てのIgGを、10μg/mlで試験した。データは、PD-L1を発現するCHO又はES-2細胞の存在下では、CD137×PD-L1二重特異性抗体のみがトランス活性化を媒介したことを示す。予想されたように、参照対照抗体20H4.9は、ジャーカット CD137-lucレポーター細胞を直接活性化し、アクセサリー細胞によるPD-L1発現とは無関係であった。
実施例9
CHO-PD-L1×T細胞トランス活性化アッセイ
二重特異性IgGを使用する付加価値を決定するために、我々は、トランス活性化アッセイにおいてT細胞によるサイトカイン放出を誘導するためのいくつかの二重特異性抗CD137×PD-L1抗体の能力を評価し、それらの活性を、PD-L1に対するベンチマーク二価抗体(YW243.55.S70)及びCD137に対するベンチマーク二価抗体(20H4.9)の活性化と比較した。これらのベンチマーク抗体を単独で、及び等モルの組み合わせで試験した。この目的のために、単一の健康なドナーからの精製かつ活性化されたT細胞を、CHO-PD-L1細胞及び試験抗体の系列希釈液と3日間共インキュベートした(このアッセイの詳細な説明については、実施例4も参照されたい)。続いて、未希釈培養上清中でIL-2、IFNγ及びTNFαのレベルを測定した。このトランス活性化アッセイで測定されたサイトカイン放出の程度を、図29に示す。図29に示されるように、3つの二重特異性抗体は全て、参照抗体のいずれか1つよりもサイトカイン放出の誘導においてより強力であった。重要なことに、3つの二重特異性抗体のそれぞれはまた、2つの参照抗体の組み合わせよりもサイトカイン放出の誘導においてより強力であって、それらの優れたT細胞活性化特性を実証した。
CHO-PD-L1×T細胞トランス活性化アッセイ
二重特異性IgGを使用する付加価値を決定するために、我々は、トランス活性化アッセイにおいてT細胞によるサイトカイン放出を誘導するためのいくつかの二重特異性抗CD137×PD-L1抗体の能力を評価し、それらの活性を、PD-L1に対するベンチマーク二価抗体(YW243.55.S70)及びCD137に対するベンチマーク二価抗体(20H4.9)の活性化と比較した。これらのベンチマーク抗体を単独で、及び等モルの組み合わせで試験した。この目的のために、単一の健康なドナーからの精製かつ活性化されたT細胞を、CHO-PD-L1細胞及び試験抗体の系列希釈液と3日間共インキュベートした(このアッセイの詳細な説明については、実施例4も参照されたい)。続いて、未希釈培養上清中でIL-2、IFNγ及びTNFαのレベルを測定した。このトランス活性化アッセイで測定されたサイトカイン放出の程度を、図29に示す。図29に示されるように、3つの二重特異性抗体は全て、参照抗体のいずれか1つよりもサイトカイン放出の誘導においてより強力であった。重要なことに、3つの二重特異性抗体のそれぞれはまた、2つの参照抗体の組み合わせよりもサイトカイン放出の誘導においてより強力であって、それらの優れたT細胞活性化特性を実証した。
T細胞トランス活性化アッセイ中のサイトカイン放出
二重特異性IgGを使用する付加価値を決定するために、我々は、二重特異性抗体のうちの1つ(PB17311、6797×7702)を、その親の単一特異性二価親IgGの混合物、及びPD-L1並びにCD137に対するベンチマーク二価抗体とに、トランス活性化アッセイにおけるT細胞によるサイトカイン放出を活性化するためのそれらの能力に関して比較した。これらのベンチマーク抗体は、クリニックで使用される治療用抗体に基づいており、抗PD-L1クローンYW243.55.S70は、アテゾルズマブに基づくものであり、抗CD137クローン20H4.9は、ウレルマブに基づくものであり、抗CD137クローンPF-05082566は、ウトミルマブに基づくものである。これらのベンチマーク抗体を単独で、及び等モルの組み合わせで試験した。
二重特異性IgGを使用する付加価値を決定するために、我々は、二重特異性抗体のうちの1つ(PB17311、6797×7702)を、その親の単一特異性二価親IgGの混合物、及びPD-L1並びにCD137に対するベンチマーク二価抗体とに、トランス活性化アッセイにおけるT細胞によるサイトカイン放出を活性化するためのそれらの能力に関して比較した。これらのベンチマーク抗体は、クリニックで使用される治療用抗体に基づいており、抗PD-L1クローンYW243.55.S70は、アテゾルズマブに基づくものであり、抗CD137クローン20H4.9は、ウレルマブに基づくものであり、抗CD137クローンPF-05082566は、ウトミルマブに基づくものである。これらのベンチマーク抗体を単独で、及び等モルの組み合わせで試験した。
これらの実験では、抗体を20μg/mlで開始する6段階の10倍滴定で試験した。μ2人のドナーからのPBMCを解凍し、9体積の培養培地(Lグルタミン及び10%の熱不活性化FBSを含むRPMI1640)を添加した。細胞を、RTで150gにて10分間遠心分離した。細胞ペレットを10mlの培養培地に再懸濁し、37℃、5%のCOで、95%の相対湿度において、50mlのファルコンチューブ内で一晩インキュベートすることによって細胞を休止させた。トランス活性化アッセイの準備において、96ウェルプレート(Cellstar、カタログ番号655180)の内側ウェルを、PBS中の5μg/mLの抗CD3抗体(クローンOKT3)で一晩コーティングした。
翌日、EasySep T細胞富化(パンCD3)精製手法を使用して、製造元(Stem cell Technologies、カタログ番号19051)に記載されているようにTリンパ球を単離した。EasySep手法は、負の選択を使用する。簡単に言うと、PBMCを、RTで150gにて10分間遠心分離した。細胞ペレットを、1mMのEDTAを伴う2mlのPBS+2%のFBS中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、30μmメッシュのナイロンストレーナを通して濾過した。細胞を計数し、1mMのEDTAを伴うPBS+2%のFBS中に5×107個細胞/mlに再調整した。50μlのEasySepヒトT細胞富化カクテルを、各2mlの細胞容積に添加し、混合して、RTで10分間インキュベートさせた。次に、50μlのEasySep D磁気粒子を、各2mlの細胞容積に添加し、RTで5分間インキュベートさせた。総体積を、1mMのEDTAを伴うPBS+2%のFBSで2.5mlに持っていった。次に、このチューブを磁石内に配置し、望ましくない細胞画分を磁石にRTで5分間結合させた。次に、チューブを反転させ、精製T細胞画分を新しいチューブに注ぎ、RTで150gにて10分間遠心分離することによって細胞を採取し、続いて培養培地中で1×106個細胞/mlの濃度で再懸濁させた。
同じ日に、予めコーティングされた96ウェルプレートをPBSで洗浄し、25μlの予め希釈した抗体を添加し、続いて50μlの精製T細胞(50,000個細胞/ウェル)及び25μlのCHO-PD-L1細胞(30,000個細胞/ウェル)を添加した。細胞を37℃で72時間インキュベートさせた。次いで、上清を採集し、新鮮なうちに試験するか、又は-80℃で保存した。サイトカインのレベルを、Luminexマルチプレックスアッセイによって、製造元の指示に従って、未希釈培養上清中で測定した。結果を、eBioscience分析ソフトウェアによって分析した。
16個のサイトカインのサブセットについて、トランス活性化アッセイにおいてPB17311によって誘導されたレベルは、ベンチマーク抗CD137抗体20H4.9それ自体によって、又はベンチマーク抗PD-L1抗体YW243.55.S70との組み合わせによって誘導されたレベルよりも高かった(図30を参照されたい)。サブセットは、GM-CSF、IL-2、IL-13、IFNγ、TNFβ、IL-17A、TNFα、IL-18、IL-1α、IL-22、IL-4、IL-31、IL-6、IL-5、IL-21、及びIL-9から構成された。PB17311によって誘導されたサイトカインレベルの最大の増加は、GM-CSF、IL-2、IL-13、IL-17A、IFNγ、TNF-α、TNF-β、IL-18、IL-22、及びIL-4について見られた。IL-1β、IL-1RA、IL-7、IL-10、IL-12p70、IL-15、IL-23、又はIL-27については、顕著な抗体媒介性サイトカイン放出は観察されなかった。抗PD-L1抗体YW243.55.S70のみ、又は抗CD137抗体PF-05082566のみ、又は親6797(CD137)若しくはPD-L1(7702)二価抗体と共に細胞をインキュベートしたときに、サイトカイン放出の増加は見られなかった。
結論として、本実験は、二重特異性抗体PB17311が、ベンチマーク抗CD137抗体20H4.9それ自体と比較して、又はベンチマーク抗PD-L1抗体YW243.55.S70と組み合わせたものと比較して、改善されたT細胞活性化能力を有することを示す。
PB17311の重要な利点は、この二重特異性抗体が、2つのベンチマーク抗体の混合物よりもT細胞の活性化においてより強力であることである。
実施例10
SEBアッセイ
3つのCD137×PD-L1二重特異性抗体PB17309、PB17310、及びPB17311を更に特性化するために、ブドウ球菌エンテロトキシンB(staphylococcal enterotoxin B、SEB)の存在下でのPBMCによるサイトカイン放出を強化するそれらの能力を決定した。この目的のために、3人のドナーからの精製PBMCを、SEB(2000又は125ng/ml)及び3つの候補二重特異性抗体又は対照抗体の系列希釈液の存在下で3日間インキュベートした。この実験における参照対照抗体は、このアッセイにおいて強力なサイトカイン放出を誘導することが示されている抗CTLA4抗体10D1であった。
SEBアッセイ
3つのCD137×PD-L1二重特異性抗体PB17309、PB17310、及びPB17311を更に特性化するために、ブドウ球菌エンテロトキシンB(staphylococcal enterotoxin B、SEB)の存在下でのPBMCによるサイトカイン放出を強化するそれらの能力を決定した。この目的のために、3人のドナーからの精製PBMCを、SEB(2000又は125ng/ml)及び3つの候補二重特異性抗体又は対照抗体の系列希釈液の存在下で3日間インキュベートした。この実験における参照対照抗体は、このアッセイにおいて強力なサイトカイン放出を誘導することが示されている抗CTLA4抗体10D1であった。
サイトカインレベルを、Luminexマルチプレックスアッセイによって、培養上清中で測定した。2つの異なるSEB濃度での3つの異なるドナーからのPBMCSによるIL-2放出の結果を、図31に示す。この比較は、3つのドナー間で、3つの二価CD137×PD-L1抗体の全ての活性プロファイルが一貫していることを実証する。また、これらは、PB17309及びPB17311が二重特異性抗体の最も有効なものであることも示す。PB17309(6763×7702)、PB17310(6785×7702)、及びPB17311(6797×7702)の3つ全てが、陽性対照抗体よりも強力であった。2000ng/mlのSEB濃度での単一ドナー(番号1038)からPBMCによって放出されたIL-2、IFNγ、及びTNFαのレベルに関する結果を、図32に示しており、それにより、CD137×PD-L1二重特異性抗体によって誘導されたサイトカイン放出を、単独で又は等モル混合物で、CD137(20H4.9)又はPD-L1(YW243.55.S70)に対するベンチマーク二価抗体によって誘導されたものと比較した。この比較は、CD137×PD-L1二重特異性抗体が、ベンチマーク二価抗体のそれぞれよりもPBMCの活性化において、明確により効率的であることを実証する。重要なことに、CD137×PD-L1二重特異性抗体のそれぞれはまた、YW243.55.S70と20H4.9との混合物よりも、PBMCの活性化において更に効率的であって、二重特異性分子のトランスにおける活性化をもたらし得るPD-L1を発現する細胞の存在下で、これらの二重特異性抗体の優れたT細胞活性化特性を再度実証した。
実施例11
抗CD3/CD28刺激PBMCのM2マクロファージ媒介性抑制に対するPB17309、PB17310、及びPB17311の効果
古典的に活性化されたマクロファージ(M1マクロファージ)は、発癌の初期工程中に腫瘍を死滅させることができる。しかしながら、進行性腫瘍ステージへの初期形質転換からの移行の間、腫瘍微小環境における動的変化は、M1マクロファージからM2マクロファージへの切り替えを徐々に促進する。腫瘍関連M2マクロファージは免疫抑制性サイトカインを分泌し、PD-1へのライゲーションによって免疫抑制を誘導する。したがって、M2マクロファージは、T細胞増殖及びサイトカイン産生を阻害する。
抗CD3/CD28刺激PBMCのM2マクロファージ媒介性抑制に対するPB17309、PB17310、及びPB17311の効果
古典的に活性化されたマクロファージ(M1マクロファージ)は、発癌の初期工程中に腫瘍を死滅させることができる。しかしながら、進行性腫瘍ステージへの初期形質転換からの移行の間、腫瘍微小環境における動的変化は、M1マクロファージからM2マクロファージへの切り替えを徐々に促進する。腫瘍関連M2マクロファージは免疫抑制性サイトカインを分泌し、PD-1へのライゲーションによって免疫抑制を誘導する。したがって、M2マクロファージは、T細胞増殖及びサイトカイン産生を阻害する。
Aquila Biomedicalにより開発されたM2マクロファージ抑制アッセイは、抗PD-1抗体が、T細胞増殖に対するM2マクロファージの阻害効果を部分的に逆転させることができることを実証するために使用されている。我々は、このアッセイを使用して、M2マクロファージの再分極に対するPB17309、PB17310、及びPB17311の効果を、IFN-γ発現を読み出しとして用いて試験し、陰性アイソタイプ対照(抗RSV-G抗体PG2708)及び2つの参照抗体(抗CD137ベンチマーク抗体20H4.9及び抗PD-L1ベンチマーク抗体YW243.55.570)によって媒介される効果と比較した。
M2抑制アッセイ
末梢血単核球(PBMC)を、5人の健康なボランティアから採集した新鮮な血液から単離した。磁気細胞選別を使用して、単球を負の選択(CD16枯渇なし)で単離した。5人のドナーのそれぞれからのPBMCのサブセットもまた、PBMC/M2共培養のアッセイにおいて後に使用するために凍結保存した。M2マクロファージは、8日間、96ウェル丸底プレート中で、単離した単球をRPMI-10(RPMI-1640、10%の熱不活性化FBS、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン及び2mMのL-グルタミン、50μMのβ-メルカプトエタノール)中のM-CSF(50ng/mL)と共に培養することによって生成した。培養期間中、3日目及び6日目に、M-CSFを補足した新しいRPMI-10で細胞を補充した。8日目に培地を除去し、新鮮な培地(M-CSFなし)を添加し、細胞をLPS(0.1μg/mL)で2時間活性化した。次にマクロファージを洗浄してLPSを除去し、新鮮な培地(M-CSFなし)で補充した。M2マクロファージを、試験抗体又はアイソタイプ対照(10μg/ml)の存在下又は非存在下で、自家PBMC(解凍し、洗浄した)と4:1の比(PBMC:M2)で共培養した(三通りで実施)。24時間のクロストークの後、この培養物を抗CD3(1μg/mL)及び抗CD28(2μg/mL)で3日間刺激して、TCR受容体複合体を介してT細胞を活性化した。次いで、適切なELISA希釈液中で1:10又は1:20に希釈した上清を用いて、IFN-γをELISAによって培養上清中で測定し、キットの検出範囲内の値を得た。試験物質と適切な対照群との間で、事後比較ダネットの(post-hoc Dunnett)(対照と複数の群との間の比較用)又はHolm-Sidak(全群間の比較用)多重比較検定のいずれかによる多重比較のために比対応のあるt検定、又は一元配置分散分析(one way-ANOVA)のいずれかを使用して、試験物質と適切な対照群との間に統計分析を行った。P<0.05場合、統計的有意性が想定された。
末梢血単核球(PBMC)を、5人の健康なボランティアから採集した新鮮な血液から単離した。磁気細胞選別を使用して、単球を負の選択(CD16枯渇なし)で単離した。5人のドナーのそれぞれからのPBMCのサブセットもまた、PBMC/M2共培養のアッセイにおいて後に使用するために凍結保存した。M2マクロファージは、8日間、96ウェル丸底プレート中で、単離した単球をRPMI-10(RPMI-1640、10%の熱不活性化FBS、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン及び2mMのL-グルタミン、50μMのβ-メルカプトエタノール)中のM-CSF(50ng/mL)と共に培養することによって生成した。培養期間中、3日目及び6日目に、M-CSFを補足した新しいRPMI-10で細胞を補充した。8日目に培地を除去し、新鮮な培地(M-CSFなし)を添加し、細胞をLPS(0.1μg/mL)で2時間活性化した。次にマクロファージを洗浄してLPSを除去し、新鮮な培地(M-CSFなし)で補充した。M2マクロファージを、試験抗体又はアイソタイプ対照(10μg/ml)の存在下又は非存在下で、自家PBMC(解凍し、洗浄した)と4:1の比(PBMC:M2)で共培養した(三通りで実施)。24時間のクロストークの後、この培養物を抗CD3(1μg/mL)及び抗CD28(2μg/mL)で3日間刺激して、TCR受容体複合体を介してT細胞を活性化した。次いで、適切なELISA希釈液中で1:10又は1:20に希釈した上清を用いて、IFN-γをELISAによって培養上清中で測定し、キットの検出範囲内の値を得た。試験物質と適切な対照群との間で、事後比較ダネットの(post-hoc Dunnett)(対照と複数の群との間の比較用)又はHolm-Sidak(全群間の比較用)多重比較検定のいずれかによる多重比較のために比対応のあるt検定、又は一元配置分散分析(one way-ANOVA)のいずれかを使用して、試験物質と適切な対照群との間に統計分析を行った。P<0.05場合、統計的有意性が想定された。
結果
これらの結果を図33に示しており、データは、PBMCの抗CD3/CD28刺激後のELISAによって検出された三通りのIFN-γの平均レベルとして提示されている。これらの結果から、M2マクロファージの非存在下で培養されたPBMCは、CD3及びCD28による刺激後により高いレベルのIFN-γを生成した(「PBMCのみ」を「刺激されていない」状態とを比較する、*はP<0.05を示す)ことが明らかである。異なるドナーについて得られた結果の不均一性にもかかわらず、3つ全ての二重特異性抗体は、M2:PBMC共培養中でIFN-γの産生を増加させたと結論付けられる。統計的に有意ではないが、PB17309及びPB17310は、PG2708アイソタイプ対照で処置したものと比較して、IFN-γ産生の増加傾向を示す。重要なことに、PB17311の添加は、PG2708アイソタイプ対照で処置したものと比べて、M2:PBMC共培養におけるIFN-γの産生を有意に増加させた(**は、P<0.01を示す)。PB17309及びPB17310で得られたこれらの結果は、抗CD137ベンチマーク抗体20H4.9及び抗PD-L1ベンチマーク抗体YW243.55.570で得られた結果と同等である。PB17309及びPB17310で得られた結果はまた、両方の参照抗体の組み合わせで得られた結果とも同等である。
これらの結果を図33に示しており、データは、PBMCの抗CD3/CD28刺激後のELISAによって検出された三通りのIFN-γの平均レベルとして提示されている。これらの結果から、M2マクロファージの非存在下で培養されたPBMCは、CD3及びCD28による刺激後により高いレベルのIFN-γを生成した(「PBMCのみ」を「刺激されていない」状態とを比較する、*はP<0.05を示す)ことが明らかである。異なるドナーについて得られた結果の不均一性にもかかわらず、3つ全ての二重特異性抗体は、M2:PBMC共培養中でIFN-γの産生を増加させたと結論付けられる。統計的に有意ではないが、PB17309及びPB17310は、PG2708アイソタイプ対照で処置したものと比較して、IFN-γ産生の増加傾向を示す。重要なことに、PB17311の添加は、PG2708アイソタイプ対照で処置したものと比べて、M2:PBMC共培養におけるIFN-γの産生を有意に増加させた(**は、P<0.01を示す)。PB17309及びPB17310で得られたこれらの結果は、抗CD137ベンチマーク抗体20H4.9及び抗PD-L1ベンチマーク抗体YW243.55.570で得られた結果と同等である。PB17309及びPB17310で得られた結果はまた、両方の参照抗体の組み合わせで得られた結果とも同等である。
実施例12
ナイーブヒトCD8+T細胞プライミングに対するPB17311の効果
本発明によるCD137×PD-L1二重特異性抗体は、T細胞上のCD137及びアクセサリー細胞上のPD-L1を架橋することによってT細胞の活性化を誘導する。これは、CD137シグナル伝達をもたらし、PD-1/PD-L1経路をブロックすることによって抗原依存性TCR活性化を向上させると考えられる。PD-L1発現腫瘍の存在下で、本発明によるCD137×PD-L1二重特異性抗体は、本実施例に示すように、抗原特異的T細胞の(再)活性化を容易にする。これは、CD137共刺激が、T細胞の増殖、サイトカイン産生、及び生存を可能にすることが知られているという事実と一致する(Bertram et al 2004)。しかしながら、我々はまた、本発明によるCD137× PD-L1二重特異性抗体が、腫瘍新生抗原に対する新規の有効なT細胞応答を促進することを実証することも求めた。マウス感染モデルにおけるナイーブCD8+T細胞のプライミングは、CD137共刺激が、セントラルメモリ及びエフェクターT細胞集団の形成を促進することを示している(Zhao et al 2012)。したがって、我々は、ナイーブヒトCD8+T細胞のプライミングに対する、本二重特異性抗体のうちの1つ(PB17311、6797×7702)によって媒介される効果を評価した。
ナイーブヒトCD8+T細胞プライミングに対するPB17311の効果
本発明によるCD137×PD-L1二重特異性抗体は、T細胞上のCD137及びアクセサリー細胞上のPD-L1を架橋することによってT細胞の活性化を誘導する。これは、CD137シグナル伝達をもたらし、PD-1/PD-L1経路をブロックすることによって抗原依存性TCR活性化を向上させると考えられる。PD-L1発現腫瘍の存在下で、本発明によるCD137×PD-L1二重特異性抗体は、本実施例に示すように、抗原特異的T細胞の(再)活性化を容易にする。これは、CD137共刺激が、T細胞の増殖、サイトカイン産生、及び生存を可能にすることが知られているという事実と一致する(Bertram et al 2004)。しかしながら、我々はまた、本発明によるCD137× PD-L1二重特異性抗体が、腫瘍新生抗原に対する新規の有効なT細胞応答を促進することを実証することも求めた。マウス感染モデルにおけるナイーブCD8+T細胞のプライミングは、CD137共刺激が、セントラルメモリ及びエフェクターT細胞集団の形成を促進することを示している(Zhao et al 2012)。したがって、我々は、ナイーブヒトCD8+T細胞のプライミングに対する、本二重特異性抗体のうちの1つ(PB17311、6797×7702)によって媒介される効果を評価した。
ナイーブT細胞前駆体細胞の数が少ないことから、ヒトT細胞の抗原特異的プライミングを評価することは困難である。しかしながら、黒色腫において過剰発現される抗原-腫瘍関連抗原メランAは、ヒトT細胞におけるナイーブT細胞応答を評価するのに特に好適であることが見出されている。これは、このHLA-A0201に制限されたメランAの27~35ペプチドエピトープに特異的なT細胞のレベルが、他の自己又は腫瘍関連抗原に対するT細胞のレベルよりも約10倍高い(このエピトープは、1000個のナイーブT細胞において約1個で認識される)ためである。このエピトープに基づいて、Wolfl及びGreenberg(2014)は、CD8+T細胞に対するプライミング条件を確実に評価するインビトロプライミングシステムを開発した。この方法は、ヒトCD8 T細胞の抗原特異的活性化及びプライミング、又はASAP-T8として知られている。ASAP-T8アッセイでは、単離されたナイーブCD8+T細胞を、ペプチド抗原負荷自家単球由来樹状細胞と10日間共培養し、続いて抗原特異的T細胞の定量的及び定性的分析を行う。
この実施例では、2人の独立したドナーからの末梢血単核球(PBMC)(番号1064及び1066)を使用して、Wolfl及びGreenberg(2014)に記載の詳細な方法に従ってASAP-T8アッセイを実施した。アッセイで試験した抗体及び対照は、抗CD137×PD-L1抗体のPB17311、抗CD137ベンチマーク抗体の20H4.9、抗PD-L1ベンチマーク抗体のYW243.55.570、両方のベンチマーク抗体の等モル混合物、及び陰性対照抗RSV-G抗体のPG2708であった。試験抗体をDC:T細胞培養の開始から添加し、最初の供給中に再度添加した。
単球由来成熟樹状細胞(mature dendritic cell、mDC)の生成
単球由来成熟樹状細胞を、Wolfl及びGreenberg(2014)に記載の詳細な方法に従うプロトコルを使用して生成した。この目的のために、ASAP-T8アッセイの開始4日前に、HLA-A2+ドナーからのPBMCを解凍し、RTで300gにて5分間遠心分離し、培養培地(CellGro樹状細胞培地(CellGenix、カタログ番号2005)+1%のヒト血清)中に、1×107/mlに再懸濁させた。次いで、この細胞懸濁液2mlを6ウェルプレートの各ウェルに添加した。37℃で2~3時間インキュベートした後、プラスチックへ付着させ、培地を除去し、PBSで洗浄することにより非接着性細胞を除去した。10ng/mlのIL-4及び1600IU/mlのGM-CSFで補充した温かい培養培地3mlを各ウェルに添加し、続いて37℃で2日間インキュベートした。IL-4及びGM-CSFを補充した1.5mlの新鮮な培養培地を更に添加した後、細胞を更に24時間インキュベートした。
単球由来成熟樹状細胞を、Wolfl及びGreenberg(2014)に記載の詳細な方法に従うプロトコルを使用して生成した。この目的のために、ASAP-T8アッセイの開始4日前に、HLA-A2+ドナーからのPBMCを解凍し、RTで300gにて5分間遠心分離し、培養培地(CellGro樹状細胞培地(CellGenix、カタログ番号2005)+1%のヒト血清)中に、1×107/mlに再懸濁させた。次いで、この細胞懸濁液2mlを6ウェルプレートの各ウェルに添加した。37℃で2~3時間インキュベートした後、プラスチックへ付着させ、培地を除去し、PBSで洗浄することにより非接着性細胞を除去した。10ng/mlのIL-4及び1600IU/mlのGM-CSFで補充した温かい培養培地3mlを各ウェルに添加し、続いて37℃で2日間インキュベートした。IL-4及びGM-CSFを補充した1.5mlの新鮮な培養培地を更に添加した後、細胞を更に24時間インキュベートした。
次いで、未成熟なDCを、3mlの上清を除去した後、残りの培地中の細胞の激しい再懸濁、及び氷冷PBSで洗浄して、いかなる残りの細胞も除去した。細胞をプールし、計数し、RTで300gにて5分間遠心分離した。ペレットを、GM-CSF(800IU/ml)、IL-4(10ng/ml)、LPS(10ng/ml)及びIFNγ(100IU/ml)を補充した予熱した培養培地中に、1×106個細胞/mで再懸濁させた。2mlの細胞懸濁液(2×106個細胞)を新しい6ウェルプレートのウェルに添加した。DMSO中に5μg/μlに溶解したメランA抗原ペプチド(JPT、カタログ番号SP-MHCIー0006)を、適切なウェルに2.5μg/mlで添加し、細胞を37℃で16時間インキュベートした。
DCの形態を確認した後、ピペットを用いて激しい再懸濁液を介してmDCを採取し、空のウェルを氷冷PBSでフラッシングして、全ての接着細胞の除去を確実にした。ペプチドでパルスされたmDC及び別々にプールされなかったもので生きている細胞を計数した。mDCを含むチューブを、全ての時点で氷上に維持し、30Gy(3000Rad)で照射して、細胞の後続の長期共培養中の汚染細胞の潜在的な増殖を防止した。次いで、細胞をRTで300gにて5分間遠心分離し、CellGro DC培地+5%のヒト血清(human serum、HS)中に5×105個細胞/mlで再懸濁させた。
ナイーブCD8 T細胞の生成
ASAP-T8アッセイの開始1日前に、mDCを生成するために使用したものと同じHLA-A2+ドナーからのPBMCを解凍し、RTで300gにて5分間遠心分離し、冷PBS/HS/EDTA緩衝液(2%のHS及び1mMのEDTA を含有するPBS)中に5×107個細胞/mlで再懸濁させた。細胞を、EasySEPヒトナイーブCD8+T細胞単離キット(STEMCELL、カタログ番号19258)を使用するナイーブCD8 T細胞単離に使用した。
ASAP-T8アッセイの開始1日前に、mDCを生成するために使用したものと同じHLA-A2+ドナーからのPBMCを解凍し、RTで300gにて5分間遠心分離し、冷PBS/HS/EDTA緩衝液(2%のHS及び1mMのEDTA を含有するPBS)中に5×107個細胞/mlで再懸濁させた。細胞を、EasySEPヒトナイーブCD8+T細胞単離キット(STEMCELL、カタログ番号19258)を使用するナイーブCD8 T細胞単離に使用した。
細胞試料1ml当たり、50μlのEasySep単離カクテルを添加し、続いて混合し、RTで10分間インキュベートした。次いで、EasySep磁気粒子を30秒間ボルテックスし、試料1ml当たり100μlの粒子を添加して、除去のために望ましくない細胞を標的とした。RTで10分間インキュベートした後、細胞懸濁液を、EasySep緩衝液を添加することによって2.5mlの総容積まで構成し、細胞を穏やかにピペット操作で混合し、続いて5mlのファルコンチューブに移した。キャップを取り外し、チューブをEasySep磁石に配置した。RTで5分置いた後、磁石及びチューブを1回の連続運動で反転させることにより、所望の画分を新しい5mlのファルコンチューブに注ぎ、元のチューブの内側に結合した磁気的に標識された望ましくない細胞をそのまま残した。磁石及びチューブは、直立位置に戻る前に3秒間反転位置にされ、チューブの口から垂れ下がったままであったままのいかなる液滴も残した。望ましくない細胞を含む古いチューブを磁石から取り出し、消極的に濃縮された細胞画分を含む新しいチューブを、2番目の分離のために磁石に配置した。RTで5分置いた後、所望の分画を同じ方法で注いだ。
消極的に選択された濃縮細胞を計数した後、RTで300gにて5分間遠心分離し、5%のHSを補充し、5ng/mlのIL-7を含有するCellGro DC培養培地中で3×106個細胞/mlの最終細胞濃度で再懸濁させて、最適なT細胞プライミングを可能にした。細胞を2ml/ウェルで6ウェルプレートに移し、一晩インキュベートした。
ASAP-T8アッセイ
このアッセイは、Wolfl及びGreenberg(2014)に記載される詳細な方法に従って、各ドナーについて三通りで実施した。IL-7と共にプレインキュベートしたT細胞を採取し、プールし、計数した後、RTで300gにて5分間遠心分離した。ペレットを、培養培地中に2×106個細胞/mlで再懸濁させ、IL-21を60ng/mlで添加して、CD8+T細胞のプライミングを増強させた。2つのDC/T細胞混合物を、ペプチドでパルスされたmDC又は非パルスDCをT細胞と1:1(v/v)に比で混合して、4:1のT細胞:DC比及び30ng/mlの最終IL-21濃度をもたらすことによって調製した。試験抗体を10μg/mlの最終濃度で添加した。次いで、500μlの各細胞混合物を48ウェルプレートの個々のウェルに移した。
このアッセイは、Wolfl及びGreenberg(2014)に記載される詳細な方法に従って、各ドナーについて三通りで実施した。IL-7と共にプレインキュベートしたT細胞を採取し、プールし、計数した後、RTで300gにて5分間遠心分離した。ペレットを、培養培地中に2×106個細胞/mlで再懸濁させ、IL-21を60ng/mlで添加して、CD8+T細胞のプライミングを増強させた。2つのDC/T細胞混合物を、ペプチドでパルスされたmDC又は非パルスDCをT細胞と1:1(v/v)に比で混合して、4:1のT細胞:DC比及び30ng/mlの最終IL-21濃度をもたらすことによって調製した。試験抗体を10μg/mlの最終濃度で添加した。次いで、500μlの各細胞混合物を48ウェルプレートの個々のウェルに移した。
細胞を37℃で合計10日間共培養し、これには2つの供給工程及び新しいプレートへの移動を伴った。細胞を、最初に、72時間後に、20μg/mlの試験抗体(最終IgG濃度10μg/ml)の存在下又は非存在下で、5%のHS及び10ng/mlのIL-15並びに10ng/mlのIL-7(5ng/mlの最終濃度のサイトカイン)を含有する追加の500μlの温めた培養培地と共に供給し、48時間インキュベートした。増殖のためのより多くの余地を可能にし、かつDC調製物から残留(プラスチック接着性)骨髄系細胞の数を減らすために、細胞及び培地を、5%のHS及び10ng/mlのIL-15並びにIL-7を含有する1mlの培地が既に添加されている24ウェルプレート内の新しいウェルに移した。更に120時間のインキュベーション後に、細胞は分析できる状態となった。
共培養10日目に、個々のウェルからの細胞を採取し、計数して、ウェル当たりの絶対細胞数を決定した。次いで、T細胞を、蛍光標識されたメランA特異的デキストマー(Immudexカタログ番号WB2162-APC)で染色した。このデキストラマーでは、デキストランポリマー主鎖は、10個超のMHC-ペプチド複合体及び蛍光色素分子(アロフィコシアニン)を担持し、それによって、FACS分析によるメランAペプチド特異的CD8+T細胞の検出を可能にする。細胞を、特定のT細胞サブセット上のマーカーに対して、他の抗体でも染色した。この目的のために、個々のウェルから得られた細胞を、96ウェルFACSプレートのウェルに50,000個細胞/ウェルで移した。細胞を300gで5分間遠心分離し、上清を除去し、続いて40μlのデキストラマー(PBS+5%のFBS中で1:50希釈)を添加し、暗所でRTで20分間インキュベートした。次いで、CD8、CD45RA、及びCCR7に対して特異的な追加の抗体(5倍濃縮物)を、10μlのFACS緩衝液中に添加した。細胞を暗所において4℃で20分間インキュベートした後、FACS緩衝液で2回洗浄した。4℃で10分間インキュベートした後、細胞はFACSによる分析ができる状態となった。
結果
T細胞増殖
デキストラマー陽性集団は、プライミング時に増殖し、全CD8T細胞集団の5~24%を構成した抗原特異的細胞を表す。デキストマー陽性、CD8陽性T細胞集団及び絶対細胞数の相対的なサイズを使用して、ウェル当たりの抗原特異的CD8+T細胞の数を計算し、各ドナーからのデータを、抗体を含有しない試料に対する培養中の抗原特異的CD8+T細胞の数として表した(図34を参照されたい)。示されるデータは、三通りで実施された実験からのものであり、エラーバーは標準偏差を表す。
T細胞増殖
デキストラマー陽性集団は、プライミング時に増殖し、全CD8T細胞集団の5~24%を構成した抗原特異的細胞を表す。デキストマー陽性、CD8陽性T細胞集団及び絶対細胞数の相対的なサイズを使用して、ウェル当たりの抗原特異的CD8+T細胞の数を計算し、各ドナーからのデータを、抗体を含有しない試料に対する培養中の抗原特異的CD8+T細胞の数として表した(図34を参照されたい)。示されるデータは、三通りで実施された実験からのものであり、エラーバーは標準偏差を表す。
これらの結果から、プライミング中にペプチド抗原が存在する場合には、デキストマー陽性抗原特異的CD8+T細胞の集団が増殖したことが明らかである(図34の「ペプチドctrlなし」及び「Abなし」条件を比較して)。
抗CD137参照抗体20H4.9は、陰性対照抗体と比較して抗原特異的CD8+T細胞の増殖を増強させたが、1つのドナー(PBMC1064)においてのみであった。
抗PD-L1参照抗体YW243.55.S70は、増殖に影響を及ぼさなかった。
CD137×PD-L1抗体PB17311は、陰性対照抗体と比較して両方のドナーにおける抗原特異的CD8+T細胞の増殖を有意に増強させた。PB17311は、抗CD137参照抗体20H4.9よりも高い程度まで抗原特異的CD8+T細胞の増殖を増強させた。PB17311は、抗PD-L1抗体YW243.55.S70と抗CD137参照抗体20H4.9との組み合わせと比較して、より高いCD8+T細胞の増殖活性を有した。これは、このCD137×PD-L1二重特異性抗体が、CD137特異的及びPD-L1特異的ベンチマーク抗体よりもナイーブCD8+T細胞のプライミングにおいてより強力であることを意味する。
T細胞分化
抗原特異的プライミング時に、ナイーブT細胞は分化を開始する。この分化プロセス中に、細胞表面上のCCR7及びCD45RAの発現はダウンレギュレートされ、CD45RAは、最終分化エフェクターT細胞上で再発現される。したがって、CCR7及びCD45RA発現のダウンレギュレートは、分化の指標である。分化マーカーCCR7及びCD45RAの発現を、CD8+デキストラマー+細胞上でゲーティングし、次いで、異なるT細胞サブセット内の細胞の相対数を決定することによって分析した。サブセットは、Tナイーブ/メモリ幹細胞(TN/TSCM):CD45RA+CCR7+;セントラルメモリT細胞(TCM):CD45RA-CCR7+;エフェクターメモリT細胞(TEM):CD45RA-CCR7-;及び最終分化エフェクターT細胞(TTE):CD45RA+CCR7-と定義された。各ドナーからのデータを、CD8+デキストラマー+T細胞集団内の各T細胞サブセットの割合として表した(図35を参照)。
抗原特異的プライミング時に、ナイーブT細胞は分化を開始する。この分化プロセス中に、細胞表面上のCCR7及びCD45RAの発現はダウンレギュレートされ、CD45RAは、最終分化エフェクターT細胞上で再発現される。したがって、CCR7及びCD45RA発現のダウンレギュレートは、分化の指標である。分化マーカーCCR7及びCD45RAの発現を、CD8+デキストラマー+細胞上でゲーティングし、次いで、異なるT細胞サブセット内の細胞の相対数を決定することによって分析した。サブセットは、Tナイーブ/メモリ幹細胞(TN/TSCM):CD45RA+CCR7+;セントラルメモリT細胞(TCM):CD45RA-CCR7+;エフェクターメモリT細胞(TEM):CD45RA-CCR7-;及び最終分化エフェクターT細胞(TTE):CD45RA+CCR7-と定義された。各ドナーからのデータを、CD8+デキストラマー+T細胞集団内の各T細胞サブセットの割合として表した(図35を参照)。
CD137×PD-L1抗体PB17311は、陰性対照抗体と比較して両方のドナーにおける抗原特異的CD8+T細胞の分化を増強させた。陰性対照抗体の存在下でプライミングされたT細胞及び抗体の存在下でプライミングされたT細胞と比較したとき、我々は、PB17311がナイーブ細胞表現型(TN/TSCM)を有する抗原特異的CD8+T細胞の相対数を低減し、エフェクターメモリ及び最終分化エフェクター細胞集団(図35のTEM及びTTE)の相対数を増加させたことを見出した。PB17311は、20H4.9とインキュベートされたCD8+T細胞集団と比較して、PB17311とインキュベートされたCD8+T細胞集団内の、エフェクターメモリ及び最終分化エフェクター細胞集団の相対数の増加によって示されるように、抗体特異的CD8+T細胞の分化を参照抗体20H4.9よりも高い程度まで増強させた。PB17311は、抗PD-L1抗体YW243.55.S70と抗CD137参照抗体20H4.9との組み合わせと比較して、抗体特異的CD8+T細胞の分化をより高い程度まで更に増強させた。これは、このCD137×PD-L1二重特異性抗体が、CD137特異的及びPD-L1特異的ベンチマーク抗体よりもプライミング時のナイーブT細胞の分化の増強においてより強力であることを意味する。
いかなる理論にも束縛されるものではないが、CD8+T細胞プライミングに対するCD137×PD-L1抗体PB17311の強力な効果は、主に、T細胞におけるCD137シグナル伝達の誘導に依存すると考えられる。抗原認識後にT細胞表面上で発現されたCD137と、成熟DC上のPD-L1とを結合させることにより、PB17311は、CD137シグナル伝達に必要なCD137受容体のクラスター化を可能にする。
要約すると、これらの結果は、CD137/PD-L1二重特異性抗体PB17311が、インビトロでのナイーブCD8+T細胞の増殖及び分化の両方を増強することを実証する。
PB17311は、抗PD-L1ベンチマーク抗体YW243.55.S70と抗CD137ベンチマーク抗体20H4.9と(の組み合わせ)と比較して、増大した増殖及び分化能力を有する。これは、PB17311が既存の腫瘍に対する新規なT細胞応答を誘導又は増強するのに有効であることを実証する。
実施例13
CD107aに対するPB17311の効果及びT細胞によるサイトカイン発現
実施例10で実証されたように、CD137×PD-L1二重特異性抗体は、SEB活性化PBMCの上清中のIL-2、TNFα、及びIFNγの産生を増強させることができる。ここで、我々は、細胞内サイトカイン染色及びFACS分析を使用して、CD137×PD-L1二重特異性抗体PB17311による治療の際に増強させるサイトカイン産生に関与するT細胞サブセットを同定した。我々はまた、CD107a発現を、CD8+T細胞傷害性のマーカーとして評価した。我々は、PB17311の効果を、抗CD137ベンチマーク抗体の20H4.9、抗PD-L1ベンチマーク抗体のYW243.55.570、両方の参照抗体の等モル混合物、及び陰性対照抗RSV-G抗体のPG2708の効果と比較した。
CD107aに対するPB17311の効果及びT細胞によるサイトカイン発現
実施例10で実証されたように、CD137×PD-L1二重特異性抗体は、SEB活性化PBMCの上清中のIL-2、TNFα、及びIFNγの産生を増強させることができる。ここで、我々は、細胞内サイトカイン染色及びFACS分析を使用して、CD137×PD-L1二重特異性抗体PB17311による治療の際に増強させるサイトカイン産生に関与するT細胞サブセットを同定した。我々はまた、CD107a発現を、CD8+T細胞傷害性のマーカーとして評価した。我々は、PB17311の効果を、抗CD137ベンチマーク抗体の20H4.9、抗PD-L1ベンチマーク抗体のYW243.55.570、両方の参照抗体の等モル混合物、及び陰性対照抗RSV-G抗体のPG2708の効果と比較した。
この目的のために、PBMCを抗体の存在下又は非存在下で、SEB(320ng/ml)で24時間刺激し、サイトカインIL-2、TNFα、及びIFNγに対し、及び生細胞染料を使用して、マーカーCD3、CD4、CD8、CCR7、CD45RO及びCD107aについて染色した。SEB及び抗体の非存在下で培養したPBMCを、SEB刺激についての対照(刺激なし)として含めた。総T細胞集団(CD3+細胞)及び以下のCD4並びにCD8T細胞サブセット:ナイーブT細胞(CD45RO-CCR7+)、セントラルメモリT細胞(CD45RO+CCR7+)、エフェクターメモリT細胞(CD45RO+CCR7-)、及び最終分化エフェクターT細胞(CD45RO-CCR7-)においてCD107a及びサイトカインの発現を分析した。結果は、最も顕著な差異が観察されたサブセットについてのみ示されている:CD4エフェクターメモリ(effector memory、EM)細胞、CD8 EM細胞、及びCD8最終分化エフェクター(terminally differentiated effector、TE)細胞。
方法
FACS分析における細胞内標的及び細胞外標的を検出するために使用された抗体のリスト。
FACS分析における細胞内標的及び細胞外標的を検出するために使用された抗体のリスト。
単一の健康なドナーに由来する冷凍保存PBMCを解凍し、一晩放置した。次いで、細胞を計数し、200gで12分間遠心分離して、ペレットをPBMC培地(RPMI1640、10%の熱不活性化FBS及び1つのペニシリン-ストレプトマイシン)中で2×106個細胞/mlの濃度に再懸濁させた。100μlの細胞懸濁液を、SEBを含有する100μlのPBMC培地及び試験抗体が既に添加された2つの96ウェル丸底プレートのウェルに添加した。最終的なSEB濃度は320 ng/mlであった。各抗体を、(0.5+0.5μg/mlで試験したYW243.55.570及び20H4.9の組み合わせを除いて)1μg/mlの単一濃度で三通りで試験した。SEB又は抗体を含まない対照ウェルも含まれた。刺激は、37℃、5%のCO2、95%の湿度で24時間行った。抗CD107a及びブレフェルジンA(Golgiplug、BD)とモネンシン(Golgistop、BD)との混合物を、インキュベーションの最後の12時間中に各ウェルに添加した。
次いで、複製プレートをプールし、PBMCを関連するマーカー及びサイトカインに特異的な抗体で染色した(上記抗体のリストに概要を提供した)。CD3、CD4、及びCD8の検出は固定後に損なわれないため、これらの標的に対する抗体を細胞内サイトカインに対する抗体と共に細胞内染色工程で添加した。細胞外標的CCR7及びCD45ROは、それらの固定に対する感受性が知られているため、固定工程の前に染色された。この目的のため、プレートを350gで3分間遠心分離し、細胞をウェル当たり100μlのPBSに再懸濁し、複製プレートからの細胞をプールした。プレートを前と同様に遠心分離し、細胞を、1:1000に希釈したFixable生体染料(eBioscience、カタログ番号65-0866)のウェル当たり100μlに再懸濁させた。暗所でRTで10分間インキュベートした後、150μlのFACS緩衝液(PBS(pH7.4)、0.5%のBSA、0.5mMのEDTA)を各ウェルに添加した。プレートを遠心分離し、細胞をFACS緩衝液で希釈した、25μlの抗CCR7抗体中に再懸濁させた。37℃、5%のCO2、95%の湿度で15分間インキュベートした後、FACS緩衝液で希釈した、25μlの抗CD45RO抗体を添加した。暗所でRTで30分間インキュベートした後、150μlのFACS緩衝液を各ウェルに添加した。プレートを前のように遠心分離し、細胞を200μlのFACS緩衝液に再懸濁させた。プレートを遠心分離し、細胞を100μlのBD固定/透過処理溶液(BD Biosciences、カタログ番号554714)中に再懸濁させた。暗所でRTで10分間インキュベートした後、100μlのBD透過処理/洗浄緩衝液(BD Biosciences、カタログ番号554714)を添加した。次いで、プレートを350gで3分間遠心分離し、細胞を200μlのBD透過処理/洗浄緩衝液中に再懸濁させた。
この固定及び透過処理工程の後、プレートを500gで3分間遠心分離し、細胞を細胞内標的に特異的な抗体を含有するBD透過処理/洗浄緩衝液の50μl溶液に再懸濁させた。この溶液は、細胞内標的IFNγ、IL-2、及びTNFαに対する、並びにCD3、CD4、及びCD8に対する抗体を含有した。プレートを暗所でRTで1時間インキュベートし、次いで、150μlのBD透過処理/洗浄緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、プレートを350gで3分間遠心分離し、細胞を200μlのBD透過処理/洗浄緩衝液中に再懸濁させた。プレートを再び350gで3分間遠心分離し、細胞を100μlの固定液(PBS(pH7.4)、0.5%のBSA、0.5mMのEDTA、1%のホルムアルデヒド)に再懸濁させ、翌日収集するまで4℃で保存した。
BD Fortessaフローサイトメーターを使用して試料を測定し、FlowJoソフトウェアバージョン10を用いてデータを分析した。細胞集団を以下のように分析した:FSC-A対FSC-Hをプロットすることによって、一重項を二重項から区別した。死細胞は、生細胞染色のために陰性集団をゲーティングすることによって除外した。T細胞をCD3+として同定し、CD4+及びCD8+サブセットに分割した。これらのT細胞サブセットを、CCR7及びCD45ROの発現に基づいて、ナイーブ、セントラルメモリ、エフェクターメモリ、及び最終分化エフェクター細胞に更に分割した。サイトカイン及びCD107aの発現を、総T細胞集団内及びサブ集団内で評価し、T細胞の総集団の割合として表した。
結果
総T細胞集団におけるCD107a、IFNγ、IL-2、及びTNFαの細胞内レベルを図36に示しており、3つの個々のT細胞サブセット(CD4 TEM、CD8 TEM、及びCD8 TTE)によって発現されるレベルを図37に示している。これらの図では、点線は、SEB及び陰性対照抗体PG2708で刺激された場合に示されるマーカーに対する陽性の細胞の平均割合を表す。バーは、単一のドナーに由来する細胞を使用して三通りで実施された実験の平均値±SDを表す。有意差を試験するために、各条件を、一元配置分散分析(one-way ANOVA)による陰性対照抗体PG2708(Neg Ctrl Ab)と比較し、続いてダネットの多重比較検定を行った。P値は、次のようにアスタリスクで示される:*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
総T細胞集団におけるCD107a、IFNγ、IL-2、及びTNFαの細胞内レベルを図36に示しており、3つの個々のT細胞サブセット(CD4 TEM、CD8 TEM、及びCD8 TTE)によって発現されるレベルを図37に示している。これらの図では、点線は、SEB及び陰性対照抗体PG2708で刺激された場合に示されるマーカーに対する陽性の細胞の平均割合を表す。バーは、単一のドナーに由来する細胞を使用して三通りで実施された実験の平均値±SDを表す。有意差を試験するために、各条件を、一元配置分散分析(one-way ANOVA)による陰性対照抗体PG2708(Neg Ctrl Ab)と比較し、続いてダネットの多重比較検定を行った。P値は、次のようにアスタリスクで示される:*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
陰性対照抗体と比較して、PB17311は、総T細胞集団におけるCD107a、IL-2、及びIFNγ産生を増強させた(図36)。注目すべきことに、CD107a産生は、抗CD137ベンチマーク抗体20H4.9、抗PD-L1ベンチマーク抗体YW243.55.570と比較して、また参照抗体の両方の等モル混合物とも比較して、PB17311によってより増強された。このことから、20H4.9、YW243.55.570又はこれらの混合物と比較して、PB17311とのインキュベーション後に、CD8+T細胞傷害性がより増強されると結論付けられる。IL-2及びIFNγの産生はまた、20H4.9及びYW243.55.570と比較して、PB17311とのインキュベーション後に高くなるように見える。
我々が個々のT細胞サブセットにおいてより詳細に調べると、PB17311は、CD4 TEM細胞内の3つのサイトカイン全ての発現を増強させることを見出した。PB17311はまた、CD8 TEM及びTTE集団中のCD107aの発現を、ベンチマーク抗体20H4.9、YW243.55.570及びその混合物よりも高い程度に押し上げ、これが、これらのベンチマーク抗体の混合物よりも良好にCD8 T細胞の細胞傷害性を増強させることを示す。
結論
これらの結果は、CD137×PD-L1二重特異性抗体が、SEB刺激時にPBMCによるIL-2、TNFα、及びIFNγ産生を増強させるという以前の観察と一致している。これらは、PB17311がサイトカインを発現するT細胞数の有意な増加を引き起こすこと、及びPB17311が、20H4.9及びYW243.55.S70ベンチマーク抗体よりもCD8 TEM及びTTEサブセット上の細胞傷害性マーカーCD107aの発現をよりも強力に誘導することを示す。注目すべきことに、CD8 TEM及びTTE集団のIFNγ及びTNFα産生もまた、20H4.9、YW243.55.570又はこれらの混合物とのインキュベーション後のIFNγ及びTNFα産生と比較して、PB17311とのインキュベーション後にも高く、これは、PB17311が、CD8+T細胞を活性化する可能性が高いことを示す。CD4 TEM集団のIL-2の産生はまた、20H4.9とのインキュベーションと比較して、PB17311とのインキュベーション後により高く、及びYW243.55.570と比較して、それほど高くなるように見える。
これらの結果は、CD137×PD-L1二重特異性抗体が、SEB刺激時にPBMCによるIL-2、TNFα、及びIFNγ産生を増強させるという以前の観察と一致している。これらは、PB17311がサイトカインを発現するT細胞数の有意な増加を引き起こすこと、及びPB17311が、20H4.9及びYW243.55.S70ベンチマーク抗体よりもCD8 TEM及びTTEサブセット上の細胞傷害性マーカーCD107aの発現をよりも強力に誘導することを示す。注目すべきことに、CD8 TEM及びTTE集団のIFNγ及びTNFα産生もまた、20H4.9、YW243.55.570又はこれらの混合物とのインキュベーション後のIFNγ及びTNFα産生と比較して、PB17311とのインキュベーション後にも高く、これは、PB17311が、CD8+T細胞を活性化する可能性が高いことを示す。CD4 TEM集団のIL-2の産生はまた、20H4.9とのインキュベーションと比較して、PB17311とのインキュベーション後により高く、及びYW243.55.570と比較して、それほど高くなるように見える。
実施例14
腫瘍浸潤性T細胞の増殖に対するPB17311の効果
抗CD137×PD-L1二重特異性抗体の初期スクリーニングは、初代T細胞に基づくアッセイを使用した。しかしながら、このようなアッセイは、腫瘍及びその微小環境の共進化を促進する細胞相互作用の複雑性を欠く。腫瘍関連設定において我々の二重特異性抗体を試験するために、患者腫瘍材料から単離されたT細胞に基づく最近開発されたアッセイを使用した。Zhouらは、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma、HCC)又は結腸直腸がん(CRC)を有する患者から新鮮な腫瘍材料を得て、腫瘍浸潤性細胞(骨髄系細胞及びリンパ球性細胞)を単離して、腫瘍浸潤性T細胞の機能上の免疫チェックポイント阻害剤を標的とする抗体の効果を試験する方法を開発している(Zhou et al.,2017)。ここで、抗CD137×PD-L1二重特異性抗体PB17311が、これらの患者に由来する腫瘍浸潤性CD4及びCD8 T細胞を再活性化し得るかどうかを試験するために、我々はHCC又はCRCの肝転位(LM-CRC)を有する患者から材料を得た。
腫瘍浸潤性T細胞の増殖に対するPB17311の効果
抗CD137×PD-L1二重特異性抗体の初期スクリーニングは、初代T細胞に基づくアッセイを使用した。しかしながら、このようなアッセイは、腫瘍及びその微小環境の共進化を促進する細胞相互作用の複雑性を欠く。腫瘍関連設定において我々の二重特異性抗体を試験するために、患者腫瘍材料から単離されたT細胞に基づく最近開発されたアッセイを使用した。Zhouらは、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma、HCC)又は結腸直腸がん(CRC)を有する患者から新鮮な腫瘍材料を得て、腫瘍浸潤性細胞(骨髄系細胞及びリンパ球性細胞)を単離して、腫瘍浸潤性T細胞の機能上の免疫チェックポイント阻害剤を標的とする抗体の効果を試験する方法を開発している(Zhou et al.,2017)。ここで、抗CD137×PD-L1二重特異性抗体PB17311が、これらの患者に由来する腫瘍浸潤性CD4及びCD8 T細胞を再活性化し得るかどうかを試験するために、我々はHCC又はCRCの肝転位(LM-CRC)を有する患者から材料を得た。
[方法]
この目的のため、新しい腫瘍材料を、LM-CRCを有する4人の患者から、及び腫瘍の外科的切除のために適格なHCCを有する3人の患者から得た。患者のいずれも、手術前少なくとも3ヶ月間、化学療法又は免疫抑制治療を受けなかった。Zhou et al.(2017)によって記載される方法は以下の通りであった:腫瘍浸潤性骨髄系細胞及びリンパ球性細胞を、小片に切断し、続いて37℃で0.5mg/mlのコラゲナーゼIV(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)及び0.2mg/mlのDNAse I(Roche,Indianapolis,IN)中で、37℃で20~30分間消化させることによって、新鮮な組織から単離した。得られた細胞懸濁液を100μmの細孔セルストレーナー(BD Biosciences,Erembodegem,Belgium)を通して濾過し、フィコール密度勾配遠心分離によって単核白血球を得た。生存率を、トリパンブルー排除によって決定した。次いで、細胞を、0.1μMの蛍光染料カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester、CFSE、Invitrogen)で標識し、10%のヒトAB血清、2mMのL-グルタミン、50mMのHEPES緩衝液、1%のペニシリン-ストレプトマイシン、5mMのピルビン酸ナトリウム、及び1%の最小必須培地非必須アミノ酸(minimum essential medium non-essential amino acid、MEM NEAA)で補充したRPMI培地に懸濁させた。次いで、HCCの1×105個細胞について、及びLM-CRCの1~2×105個細胞について、100μlで、96ウェル丸底プレートの各ウェルに移した。次いで、腫瘍浸潤性リンパ球(tumor-infiltrating lymphocyte、TIL)を刺激して、以下のように試験抗体の非存在下又は存在下で活性化を誘導した:HCC患者に由来するTILを含有するウェルに、試験抗体、及び増殖した1×105個の自家CD40活性化B細胞芽球を含有する100μlの同じ培地を添加し、続いて完全長腫瘍抗原グリピカン-3(glypican-3、GPC3)又は黒色腫関連抗原C2(melanoma-associated antigen C2、MAGEC2)をコード化するmRNAでトランスフェクトした。これらの細胞を、6日間共インキュベートした。LM-CRC患者に由来するTILを含有するウェルに、試験抗体及び抗ヒトCD3/CD28(Gibco-Life Technologies AS,Norway)でコーティングされたダイナビーズを含有する100μlの同じ培地を添加し、4日間置いた。インキュベーション後、CFSEで標識された細胞を採取し、CD8、CD4、CD3抗体で染色した。死滅細胞を、7-アミノアクチノマイシンD(7-Aminoactinomycin D、7AAD;Invitrogen,Paisley UK)を使用して除外し、T細胞増殖を、フローサイトメトリー分析によるCFSE希釈に基づいて決定した。細胞をFACSCanto IIフローサイトメーター(BD Biosciences,San Diego,USA)によって測定し、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
この目的のため、新しい腫瘍材料を、LM-CRCを有する4人の患者から、及び腫瘍の外科的切除のために適格なHCCを有する3人の患者から得た。患者のいずれも、手術前少なくとも3ヶ月間、化学療法又は免疫抑制治療を受けなかった。Zhou et al.(2017)によって記載される方法は以下の通りであった:腫瘍浸潤性骨髄系細胞及びリンパ球性細胞を、小片に切断し、続いて37℃で0.5mg/mlのコラゲナーゼIV(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)及び0.2mg/mlのDNAse I(Roche,Indianapolis,IN)中で、37℃で20~30分間消化させることによって、新鮮な組織から単離した。得られた細胞懸濁液を100μmの細孔セルストレーナー(BD Biosciences,Erembodegem,Belgium)を通して濾過し、フィコール密度勾配遠心分離によって単核白血球を得た。生存率を、トリパンブルー排除によって決定した。次いで、細胞を、0.1μMの蛍光染料カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester、CFSE、Invitrogen)で標識し、10%のヒトAB血清、2mMのL-グルタミン、50mMのHEPES緩衝液、1%のペニシリン-ストレプトマイシン、5mMのピルビン酸ナトリウム、及び1%の最小必須培地非必須アミノ酸(minimum essential medium non-essential amino acid、MEM NEAA)で補充したRPMI培地に懸濁させた。次いで、HCCの1×105個細胞について、及びLM-CRCの1~2×105個細胞について、100μlで、96ウェル丸底プレートの各ウェルに移した。次いで、腫瘍浸潤性リンパ球(tumor-infiltrating lymphocyte、TIL)を刺激して、以下のように試験抗体の非存在下又は存在下で活性化を誘導した:HCC患者に由来するTILを含有するウェルに、試験抗体、及び増殖した1×105個の自家CD40活性化B細胞芽球を含有する100μlの同じ培地を添加し、続いて完全長腫瘍抗原グリピカン-3(glypican-3、GPC3)又は黒色腫関連抗原C2(melanoma-associated antigen C2、MAGEC2)をコード化するmRNAでトランスフェクトした。これらの細胞を、6日間共インキュベートした。LM-CRC患者に由来するTILを含有するウェルに、試験抗体及び抗ヒトCD3/CD28(Gibco-Life Technologies AS,Norway)でコーティングされたダイナビーズを含有する100μlの同じ培地を添加し、4日間置いた。インキュベーション後、CFSEで標識された細胞を採取し、CD8、CD4、CD3抗体で染色した。死滅細胞を、7-アミノアクチノマイシンD(7-Aminoactinomycin D、7AAD;Invitrogen,Paisley UK)を使用して除外し、T細胞増殖を、フローサイトメトリー分析によるCFSE希釈に基づいて決定した。細胞をFACSCanto IIフローサイトメーター(BD Biosciences,San Diego,USA)によって測定し、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
CD137×PD-L1二重特異性抗体PB17311を、その単一特異性二価親抗体PG6797並びにPG7702、及び抗CD137参照抗体20H4.9、抗PD-L1参照抗体YW243.55.S70、並びに無関係のRSV-G抗原に対する陰性対照抗体PG2708と比較した。抗体を含まない試料を対照として含め、全ての条件を、10μg/mlのIgG濃度でデュプロで試験した。
LM-CRCに由来する試料については、抗体の存在下でのCD4 T細胞増殖は、4人のドナーのうちの3人においてのみ決定され得るが、これは、CD4 T細胞増殖の第4のドナーのベースラインレベルが、既に例外的に高かった(60%超の増殖細胞)ためである。CD8 T細胞増殖は、4人の全てのLM-CRCドナーからの試料において決定することができる。HCCに由来する試料に関しては、3人の全てのドナーについてGPC3を発現している自家B細胞を生成したが、3つのうちの2つについては、MAGEC2発現のみ可能であった。これにより、3人のHCCドナーからの細胞を使用して、合計5つの増殖実験をもたらした。
結果を平均±SEMとして示した。
結果
これらの結果を図38に示す。CD4 TILのベースライン増殖(右上パネル)及びCD8 TILのベースライン増殖(右下パネル)を、陰性対照抗体の存在下で増殖するT細胞(低レベルのCFSE)の割合を測定することによって決定した。試料のCD4増殖(左上)及びCD8増殖(左下)を、ベースラインを超える増殖の増加率として計算した。値は、平均±SEM(LM-CRC:CD4 n=3、CD8 n=4;HCC:CD4及びCD8 n=5)である。
これらの結果を図38に示す。CD4 TILのベースライン増殖(右上パネル)及びCD8 TILのベースライン増殖(右下パネル)を、陰性対照抗体の存在下で増殖するT細胞(低レベルのCFSE)の割合を測定することによって決定した。試料のCD4増殖(左上)及びCD8増殖(左下)を、ベースラインを超える増殖の増加率として計算した。値は、平均±SEM(LM-CRC:CD4 n=3、CD8 n=4;HCC:CD4及びCD8 n=5)である。
CD137×PD-L1二重特異性抗体PB17311は、両方の腫瘍型におけるCD4及びCD8 TILの両方の増殖を明確に増強させ、これらの結果は、これがその親抗体PG6797及びPG7702よりも優れていることを示す。これらの結果はまた、YW243.55.S70が、同じレベルへのCD4及びCD8 T細胞増殖を刺激したことも示す。PB17311及び20H4.9はまた、CD4 T細胞の増殖を増強させたが、CD8 T細胞の増殖をより強力に増強させた。
これらの実験は、二重特異性CD137×PD-L1抗体を使用する付加価値を示し、PB17311は、HCC及びLM-CRCを有する患者に由来するCD4及びCD8 TILの増殖を増強させることを実証する。重要なことに、これは、本発明による二重特異性抗体が、がん患者の抗原特異的CD4+T細胞及び抗原特異的CD8+T細胞の両方を再刺激することができること、及びこれが、CD8+TILの増殖を、ベンチマーク抗体YW243.55.S70よりも強力に刺激することができることを意味する。
実施例15
アラニンスキャニングによるPB17311エピトープ分析
エピトープ分析を実施して、PB17311中に存在する抗CD137 Fabアーム(MF6797)によって認識されるエピトープの一部を含むか、又はその一部である残基のセットを同定した。
アラニンスキャニングによるPB17311エピトープ分析
エピトープ分析を実施して、PB17311中に存在する抗CD137 Fabアーム(MF6797)によって認識されるエピトープの一部を含むか、又はその一部である残基のセットを同定した。
PB17311が結合するCD137抗原の潜在的に非直鎖エピトープの分析には、CD137の三次元タンパク質構造の知識が必要である。CD137は、明確に異なるドメインを有さない、25.4kDa(17.3kDaの細胞外)の比較的小さいタンパク質である。しかしながら、定義された「反復領域」又はシステインリッチドメイン(cysteine-rich domain、CRD)は、CD137について記載されている。CD137のタンパク質構造に関する文献の報告は限定されている。Yi et al.(2014)は、CD137のリガンド結合部位を、切断型発現構築物との結合研究に基づいてCD137の領域3内に配置することが記載している。CD137では結晶構造が利用可能ではないが、相同性モデルが、TNFR1に基づいて公表されている(Won et al.,2010)。TNFR1は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー中の膜結合タンパク質であり、CD137もまたそのメンバーである。ヒト/マウスCD137キメラ構築物を含むドメイン/スワップ実験の結果は、抗CD137 Fabアーム(MF6797)がCRD1及び/又はCDR2に結合することを示唆している。CD137Lのブロッキングデータはまた、MF6797エピトープがCD137リガンド結合部位の近くにあるか、又はCD137リガンド結合部位と重なることも示唆している。
PD-L1はまた、異なる領域又はドメインが定義されていない、31.1kDa(25.2kDaの細胞外)の比較的小さいタンパク質である。しかしながら、PD-L1の結晶構造は、PD-L1とのその複合体の結晶構造と同様に知られている。
これらの実験では、ショットガン変異誘発を使用して、アラニン残基による置換により単一残基が変異した一連の突然変異タンパク質を生成した。次いで、変異体CD137タンパク質をヒト細胞で発現させ、複合タンパク質、又はヒト細胞においてのみ発現され、かつ適切に折り畳まれ得るタンパク質の分析を可能にした。抗体への機能的結合を、蛍光染色によって測定し、結合マップ及び抗体結合にとって重要な残基の同定をもたらした。ショットガン突然変異誘発実験及び分析を、Davidson and Doranz(2014)に記載の方法を使用して、Integral Molecularにより分析が行われた。
まず、野生型CD137 cDNAを保有するプラスミドに基づいて、標的タンパク質について変異ライブラリ(Xxx~Ala、Ala~Ser)を生成した。これにより、CD137についての163個の変異体cDNAクローンが得られ、これらのクローンの全てを配列決定して変異を確認した。それに応じて、これらの変異体cDNAクローンを、比較のために野生型(wild-type、WT)構築物と共に、HEK-293T細胞中にトランスフェクトした。続いて、各々の変異体クローンを発現しているHEK-293T細胞をフローサイトメトリーによって分析し、それにより、各変異体タンパク質のPB17311への結合を、CD137に特異的な対照抗体(マウスIgG1、BD Biosciences、カタログ番号555955)への結合と比較した。この対照抗体は、結合のためにPB17311と競合しない。ヒト又はマウスIgGに対する蛍光標識二次抗体を使用して、PB17311又はコントロール抗体の結合を検出した。
高いCD137発現を有するが、PB17311との低結合をもたらしたクローンを同定するために、我々は、PB17311の結合を関連する対照抗体の結合と比較した(図39Aを参照されたい)。各クローンごとに、対照抗体の結合によって測定される、クローンの平均発現値の関数として平均結合値をプロットした。予備的な重要なクローンを同定するために、我々は、対照抗体に対する70%超のWT結合及びPB17311のAbに対する20%未満のWT反応性の閾値を適用した。これらの閾値を使用して同定された予備的な重要なクローンを、図39Aに黒丸として示している。
結果は、PB17311の結合のためのCD137における重要な残基が、Arg66、Gly70、及びPhe72であることを示す。Val71もまた、PB17311の結合に関与するように見える(図39Bを参照されたい)。Cys133は、結合閾値に基づいて重要な残基として最初に同定されたが、他の重要な残基から比較的離れており、システイン変異は、ジスルフィド結合の破壊に起因してタンパク質立体配座におけるわずかな異常を引き起こす傾向がある。したがって、Cys133は、PB17311エピトープの一部とは見なされなかった。Arg66、Gly70、及びPhe72で変異したタンパク質のPB17311との低い反応性は、これらの残基が、Val71による寄与が小さい状態の、PB17311結合に対する主要なエネルギー寄与因子であることを示す。
実施例16
異種移植片マウスモデルにおけるCD137×PD-L1二重特異性抗体の抗腫瘍効果
クローンの例示的な1つのCD137×PD-L1二重特異性抗体PB17311の抗腫瘍有効性を実験動物において試験し、それを参照抗体と比較するために、抗体PB17311を異種移植腫瘍を保有するマウスに投与した。選択されたマウスモデルは、ヒトがん細胞株で注射する前に、ヒト末梢血単核球(PBMC)を移植することによって免疫不全マウスがヒト化されるものである。次いで、皮下固形腫瘍増殖を、3週間にわたって評価する。
異種移植片マウスモデルにおけるCD137×PD-L1二重特異性抗体の抗腫瘍効果
クローンの例示的な1つのCD137×PD-L1二重特異性抗体PB17311の抗腫瘍有効性を実験動物において試験し、それを参照抗体と比較するために、抗体PB17311を異種移植腫瘍を保有するマウスに投与した。選択されたマウスモデルは、ヒトがん細胞株で注射する前に、ヒト末梢血単核球(PBMC)を移植することによって免疫不全マウスがヒト化されるものである。次いで、皮下固形腫瘍増殖を、3週間にわたって評価する。
CD137×PD-L1二重特異性抗体の抗CD137及び抗PD-L1 Fabは、ヒト及びカニクイザルと交差反応するが、マウスタンパク質とは交差反応しない。上記モデルは、これが抗体のインビボ活性がヒト化系で試験されることを可能にし、それにより、抗体の抗腫瘍応答が、ヒトT細胞によって媒介され、マウスT細胞によって媒介されないために選択された。この種のモデルは、いくつかの抗CD137モノクローナル抗体を含む様々な免疫調節標的療法を評価するために成功裏に使用されてきた。例えば、20H4.9の有効性は、HT29細胞を保有するPBMCヒト化Rag2-/-IL2Rgnullマウスで評価され(Sanmamed et al 2015)、ウトミルマブの有効性は、PBMCとヒト腫瘍細胞PC3、LoVo又はWM-266との混合物で異種移植されたSCID-beigeマウスにおいて評価されている(Fisher et al.,2012)。両方のモデルにおいて、抗CD137モノクローナル抗体は、対照IgG処置動物と比較して、有意なT細胞媒介性抗腫瘍活性を示した。
本明細書で使用される異種移植マウスモデルでは、PBMC-ヒト化マウスに注入されたがん細胞が、RKO細胞であって、比較的高レベルのPD-L1を発現するが、CD137を発現しない十分に確立されたヒト結腸癌細胞株であった。免疫不全マウスに注入されたPBMCが、移植後5日目の早期にCD137を発現し、それが少なくとも22日目まで継続することが示された(Sanmamed et al 2015)という事実は、RKO細胞を保有するPBMC-ヒト化マウスが、「トランス」構成(RKO細胞上のPD-L1及びT細胞上のCD137)でCD137×PD-L1二重特異性抗体の標的を発現するための理想的なモデルであることを示す。加えて、PBMCドナーは、移植後少なくとも40日間、移植片対宿主疾患につながることはない。したがって、このモデルは、免疫調節剤の有効性を評価するためにロバストである。
方法
9週齢の雌NOD SCIDガンマ(NSG)マウスに、尾静脈注射によって、3×107個のヒトPBMCを移植した。7日後、各試験マウスは、右脇腹に0.1mLの50%マトリゲル中の5×106個のRKO腫瘍細胞の皮下注射を受けた。50~80mm3の標的範囲に近い平均腫瘍体積として、キャリパーによって腫瘍増殖を監視した。試験の1日目と表示される腫瘍細胞移植後から4日目に、40~63mm3の個々の腫瘍体積を有する動物を、8匹の動物の4つの群に分類した。各群の腫瘍保有動物は、1、4、8、11、15及び18日目に100μLのPBS中100μgの用量で、抗体の6回腹腔内注射を受けた。4つの異なる群は、陰性対照(IgG)、又はベンチマーク抗体20H4.9(抗CD137)若しくはYW243.55.S70(抗PD-L1)、又はPB17311(抗CD137×PD-L1)を受けた。腫瘍増殖の阻害を評価したときの19日目の試験の終了までに、キャリパーを使用して腫瘍体積を週3回測定した。
9週齢の雌NOD SCIDガンマ(NSG)マウスに、尾静脈注射によって、3×107個のヒトPBMCを移植した。7日後、各試験マウスは、右脇腹に0.1mLの50%マトリゲル中の5×106個のRKO腫瘍細胞の皮下注射を受けた。50~80mm3の標的範囲に近い平均腫瘍体積として、キャリパーによって腫瘍増殖を監視した。試験の1日目と表示される腫瘍細胞移植後から4日目に、40~63mm3の個々の腫瘍体積を有する動物を、8匹の動物の4つの群に分類した。各群の腫瘍保有動物は、1、4、8、11、15及び18日目に100μLのPBS中100μgの用量で、抗体の6回腹腔内注射を受けた。4つの異なる群は、陰性対照(IgG)、又はベンチマーク抗体20H4.9(抗CD137)若しくはYW243.55.S70(抗PD-L1)、又はPB17311(抗CD137×PD-L1)を受けた。腫瘍増殖の阻害を評価したときの19日目の試験の終了までに、キャリパーを使用して腫瘍体積を週3回測定した。
腫瘍増殖阻害(Tumor growth inhibition、TGI)は、処置されたマウス及び対照マウスの19日目の腫瘍体積中央値(median tumor volume、MTV)の間のパーセント差として定義し、グループ間の差は、マン・ホイットニー検定を使用してP≦0.05において統計的に有意であるとみなされる群間の差として定義した。治療忍容性を、体重測定及び治療関連有害事象の臨床的徴候について頻繁に観察することによって評価した。図40は、群による腫瘍体積分布の箱ひげ図を提供する。19日目に、IgG対照中のマウスの腫瘍体積中央値(MTV)は517mm3であって、個々の腫瘍体積範囲は、429~807mm3であった。3つの処理群のうち、PB17311(264mm3のMTV、TGI 49%を伴う)は、YW243.55.S70(283mm3のMTV、TGI 45%を伴う)並びに20H4.9(339mm3のMTV及びTGI 34%を伴う)と同様に有効であった。全ての処置は、対照群のMTVよりも有意に低いMTVをもたらした(20H4.9についてはP<0.05、PB17311及びYW243.55.S70についてはP<0.001)。20H4.9を受けた1匹の動物は8日目に死亡し、剖検により、ピンク色の肺及び斑状の肝臓が明らかになった。この群の動物はまた、最大平均BW損失(15日目に最低点で-8.0%)を経験した。その他のものでは、治療は十分に忍容された。
要約すると、CD137×PD-L1二重特異性抗体PB17311は、ヒトPBMCを移植したNSGマウスにおけるヒトRKO結腸癌の治療として統計的に有意な生存効果を提供した。PB17311による治療結果はより良好であり、20H4.9と比較して副作用が少なかった。
実施例17
CD137標的化抗体のアゴニスト活性を有するsCD137の干渉
可溶性CD137は、二価のCD137抗体よりも二重特異性CD137×PD-L1抗体のアゴニスト活性とあまり干渉しない。
CD137発現は、細胞表面から排出される抗原によって調節される。shed抗原(sCD137)は、血液並びに細胞外空間内に見出され、したがって、CD137標的化抗体のクリアランスの競合シンクとして機能することができる。
CD137標的化抗体のアゴニスト活性を有するsCD137の干渉
可溶性CD137は、二価のCD137抗体よりも二重特異性CD137×PD-L1抗体のアゴニスト活性とあまり干渉しない。
CD137発現は、細胞表面から排出される抗原によって調節される。shed抗原(sCD137)は、血液並びに細胞外空間内に見出され、したがって、CD137標的化抗体のクリアランスの競合シンクとして機能することができる。
研究は、sCD137が、調節性T細胞などの高レベルのCD137を発現している免疫細胞から排出されること(Ridgway et al.,2014)、及びsCD137及びsCD137Lの両方が、結腸直腸患者のがん細胞によって産生されること(Dimberg et al.,2006)が示している。加えて、腫瘍細胞株の低酸素状態への曝露は、CD137発現を促進し、最も優勢な形態は可溶性変異体である(Labiano et al,2016)。健康なドナーにおけるsCD137の平均血清レベルは、0.02~0.2ng/mlの範囲であるが、様々な疾患状態におけるレベルがより高いことが知られており、0.2~3.6ng/mlの範囲に及ぶ(Michel et al,1998、Shao et al,2012)。sCD137は、活性化T細胞を調節するように見える(腫瘍微小環境に排出されると、これは免疫系の活性を弱め、それによって免疫回避を媒介する)。sCD137は、CD137Lへの結合のために膜結合CD137と競合し、それによってT細胞上で発現されたCD137を介したシグナル伝達をブロックすると考えられる。
上記のメカニズムを考慮して、sCD137が、インビトロでヒト初代T細胞を活性化する二重特異性CD137×PD-L1抗体PB17311及び参照抗体の能力に影響を及ぼすかどうかを判定した。このような活性化を、過剰量のsCD137の非存在下又は存在下で、ジャーカットレポーター/CHO-PD-L1トランス活性化アッセイで測定した。このアッセイでは、ジャーカットレポーターT細胞株はCD137を発現し、レポーター遺伝子はCD137に特異的な抗体によって活性化される。T細胞を、PD-L1を発現する腫瘍細胞を模倣し、二重特異性CD137×PD-L1抗体によるT細胞の活性化に必要とされる、PD-L1を過剰発現するCHO細胞と共培養した。
この目的のために、平底96ウェルプレート(Costar、カタログ番号3917)を、PBS中の2μg/mLの抗CD3抗体OKT-3(eBioscience、カタログ番号16-0037-85)で一晩コーティングした。翌日、ジャーカットCD137-NFκBlucレポーター細胞を解凍し、10%の熱不活性化ウシ胎児血清を含有するDMEM/F12培地(アッセイ培地)で洗浄した。細胞を2×106個細胞/mlの密度で再懸濁させた。プレコーティングされた96ウェルプレートをPBSで2回洗浄した後、25μLの試験抗体(最終濃度200ng/ml)を添加し、続いて25μLのsCD137の混合物(R&D、カタログ番号9220-4B)20μg/mLで開始して、5段階の3倍希釈で(最終濃度)で添加した。次いで、25μLのジャーカットNFκBluc(50000個細胞/ウェル、2×106個細胞/ml)を添加し、続いて、25μLのCHO-K1/CHO.huPD-L1細胞(12500個細胞/ウェル、5×105個細胞/ml)を添加した。翌日、プレートを室温に平衡化し、100μlのBright-Glo/ウェル(室温)を添加し(一回に最大4プレート)、続いて室温で5分間インキュベートした。Biotek Synergy 2マルチモードマイクロプレートリーダー(発光モード)でプレートを測定した。ルシフェラーゼ活性に関する活性化は、組換えタンパク質を添加せずに得られた割合として表した。
これらの結果を図41に示しており、高濃度の可溶性CD137が、両方の試験抗体のアゴニスト活性を実際に干渉し得ることを示す。しかしながら、重要なことに、sCD137競合は、二重特異性CD137×PD-L1抗体PB17311よりも抗CD137参照抗体(クローン20H4.9)に対してはるかに大きな効果を有するように見える。このことから、PB17311のインビボ効果は、ベンチマーク抗体20H4.9と比較して免疫抑制機構に対して感受性が低くなると結論付けられる。
表
MF、Fabの固有ID、CDR3、CDR3の配列、VH生殖細胞系列、VHに由来、ビン、ビンへの特異的分類(P1306-S33)、ドメイン、マウスヒトスワップドメイン構築物を用いて抗体がマッピングされたCD137ドメイン(1又は2は、抗体が2つのドメインのうちの1つに明確にマッピングされ得ないことを意味する)、アゴニスト二価、ジャーカット-NFκB-luc-CD137を活性化するための二価抗体の能力、CD137のブロック%、FabアームがCD137との相互作用をブロックするための能力、レポーター、レポーターアッセイからのデータ、T細胞、T細胞アッセイからのデータ、PD-L1 NB、PD-L1非ブロッキングFabアームと組み合わされたCD137 Fab、PD-L1 B、PD-L1ブロッキングFabアームと組み合わされたCD137 Fab。
参照文献
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Claims (44)
- 細胞上のTNF受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第1の細胞及び第2の細胞を準備することを含み、前記第1の細胞が細胞膜上に前記メンバーを有し、前記第2の細胞が細胞膜上に第2の膜タンパク質を有し、前記方法が、前記細胞を、2つの可変ドメインを含む二重特異性抗体と接触させることを含み、1つの可変ドメインが、前記メンバーの細胞外部分に結合することができる第1の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、前記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第2の抗原結合部位を含み、それによって、前記第1の細胞上の前記メンバーの活性を刺激する、方法。
- 前記第2の膜タンパク質が、前記TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない、請求項1に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、2つの抗原結合部位を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体の前記抗原結合部位が、前記TNF受容体スーパーファミリーの前記メンバーの細胞外部分に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインと、前記第2の膜タンパク質に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、完全長抗体である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体がIgGである、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の細胞が、細胞膜上で前記第2の膜タンパク質を有意に発現しない、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の膜タンパク質が、細胞膜上の1つ以上の区域に存在する膜タンパク質である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記区域が、細胞膜上のクラスター、ドメイン、マイクロドメイン又はコンパートメント、好ましくは免疫シナプスである、請求項8に記載の方法。
- 前記第2の膜タンパク質が、2つ以上の前記第2の膜タンパク質のインスタンスを含む多量体膜タンパク質の一部として細胞膜上に存在する、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の膜タンパク質が、ホモ二量体又はホモ三量体の一部として細胞膜上に存在する、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の膜タンパク質が、B7ファミリーのメンバーである、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の膜タンパク質が、PD-L1又はPD-L2であり、好ましくはPD-L1である、請求項12に記載の方法。
- 前記TNF受容体スーパーファミリーの前記メンバーに結合する前記可変ドメインが、前記メンバーに対するリガンドの結合をブロックする、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TNF受容体スーパーファミリーの前記メンバーの細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、前記TNF受容体スーパーファミリーの前記メンバーに結合する2つの前記可変ドメインを含む二価の単一特異性抗体フォーマットである場合、細胞上の前記TNF受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激しない可変ドメインとして定義される、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TNF受容体スーパーファミリーの前記メンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、前記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む更なる二重特異性抗体を準備することを更に含み、前記第1及び第2の二重特異性抗体が、
前記第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
前記第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
前記第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び前記第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
前記方法が、前記第1の細胞及び第2の細胞を前記第1及び第2の二重特異性抗体と共にインキュベートすることによって、前記第1の細胞上の前記TNF受容体スーパーファミリーの前記メンバーの活性を刺激することを更に含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1及び前記第2の二重特異性抗体がそれぞれ、前記TNF受容体スーパーファミリーの前記メンバーに結合することができる1つの抗原結合部位を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記第2の膜タンパク質に結合することができる前記第1及び第2の二重特異性抗体の前記抗原結合部位が、膜第2の膜タンパク質の前記細胞外部分上の異なるエピトープに結合する、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記第2の膜タンパク質の前記細胞外部分上の前記異なるエピトープが、非競合エピトープである、請求項16~18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TNF受容体スーパーファミリーメンバーが、CD137又はOX40である、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- CD137の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む二重特異性抗体。
- 前記第2の膜タンパク質が、前記TNF受容体スーパーファミリーのメンバーではない、請求項21に記載の二重特異性抗体。
- 前記二重特異性抗体が、2つの抗原結合部位を含む、請求項21又は22に記載の二重特異性抗体。
- 前記二重特異性抗体の前記抗原結合部位が、前記TNF受容体スーパーファミリーの前記メンバーの細胞外部分に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインと、前記第2の膜タンパク質に結合することができる1つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる、請求項21~23のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記二重特異性抗体が、完全長抗体である、請求項21~24のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記二重特異性抗体がIgGである、請求項21~25のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記CD137に結合することができる1つの抗原結合部位を含む、請求項21~26のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第2の膜タンパク質が、T細胞によって有意な程度では発現されない、請求項21~27のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第2の膜タンパク質が、抗原提示細胞、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、又は寄生体感染細胞上で発現される、請求項21~28のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第2の膜タンパク質が、細胞膜上の1つ以上の区域に存在する膜タンパク質である、請求項21~29のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記区域が、細胞膜上のクラスター、ドメイン、マイクロドメイン又はコンパートメント、好ましくは免疫シナプスである、請求項30に記載の二重特異性抗体。
- 前記第2の膜タンパク質が、2つ以上の前記第2の膜タンパク質を含む多量体膜タンパク質の一部として細胞膜上に存在する、請求項21~31のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第2の膜タンパク質が、ホモ二量体又はホモ三量体の一部として細胞膜上に存在する、請求項21~32のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第2の膜タンパク質が、B7ファミリーのメンバーである、請求項21~33のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第2の膜タンパク質が、PD-L1又はPD-L2であり、好ましくはPD-L1である、請求項21~34に記載の二重特異性抗体。
- CD137に結合する前記可変ドメインが、前記CD137に対するリガンドの結合をブロックする、請求項21~35のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- CD137の細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、CD137に結合する2つの前記可変ドメインを含む二価の単一特異性抗体フォーマットである場合、細胞上のCD137の活性を刺激しない可変ドメインとして定義される、請求項21~36のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
- 請求項21~37のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を1つ以上含む組成物又はキットオブパーツ。
- 請求項21~37のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体を2つ以上含む組成物又はキットオブパーツであって、第1及び第2の二重特異性抗体のCD137又はOX40に結合することができる前記抗原結合部位が、前記CD137又はOX40上の異なるエピトープに結合する、組成物又はキットオブパーツ。
- 細胞上のCD137の活性を刺激する方法であって、第1の細胞及び第2の細胞を準備することを含み、前記第1の細胞が細胞膜上に前記CD137(第1の膜タンパク質)を有し、前記第2の細胞が細胞膜上に第2の膜タンパク質を有し、前記方法が、前記細胞を、2つの可変ドメインを含む二重特異性抗体(第1の二重特異性抗体)と接触させることを含み、1つの可変ドメインが、前記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第1の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、前記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第2の抗原結合部位を含み、それによって、前記第1の細胞上の前記第1の膜タンパク質の活性を刺激する、方法。
- 前記第1の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を含む可変ドメインと、前記第2の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を含む可変ドメインとを含む更なる二重特異性抗体(第2の二重特異性抗体)を準備することを更に含み、前記第1及び第2の二重特異性抗体が、
前記第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
前記第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
前記第1の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び前記第2の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
前記方法が、前記第1の細胞及び第2の細胞を、前記第1及び第2の二重特異性抗体と共にインキュベートすることによって、前記第1の細胞上のCD137の活性を刺激することを更に含む、請求項40に記載の方法。 - 前記第2の膜タンパク質が、B7ファミリーのメンバーである、請求項40又は請求項41に記載の方法。
- CD137及びPD-L1に結合することができる抗体又はその機能的部分、派生体及び/若しくは類似体。
- 二重特異性抗体である、請求項43に記載の抗体又は機能的部分若しくは派生体若しくは類似体。
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