JP2019537429A

JP2019537429A - 細胞によって発現される生物活性を調節する結合分子

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Publication number: JP2019537429A
Application number: JP2019515947A
Authority: JP
Inventors: セシリア・アンナ・ヴィルヘルミナ・ゲウイェン; マルク・スロスビー; コルネリス・アドリアーン・デ・クライフ; リンセ・クローステル; パウルス・ヨハンネス・タッケン; トン・ルテンベルグ
Original assignee: メルスナムローゼフェンノートシャップ
Priority date: 2016-09-23
Filing date: 2017-09-22
Publication date: 2019-12-26
Anticipated expiration: 2037-09-22
Also published as: NZ751956A; IL311603A; JP7305538B2; AU2021202085A1; CN117510643A; EP3515951A1; CN109983033A; AU2017332452B2; IL265541A; CN109983033B; UA127449C2; BR112019005895A2; IL265541B1; CA3038020A1; WO2018056821A1; MX2019003241A; JP2023116811A; KR20190065318A; US20200017595A1; TW201920653A

Abstract

本発明は、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する手段及び方法を提供する。本発明はまた、少なくとも２つの抗原結合部位を含む抗体などの結合分子を提供し、第１の抗原結合部位は、メンバーの細胞外部分に結合することができ、第２の抗原結合部位は、第２の（異なる）膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる。

Description

本発明は、結合分子の分野に関する。特に、本発明は、異常細胞が関与する疾患の治療のための治療用結合分子の分野に関する。より具体的には、本発明は、２つ以上の異なる膜結合タンパク質の細胞外部分に結合し、それにより細胞によって発現される生物活性を調節する結合分子に関する。

がんの治療は多大な進歩を遂げ、がんをもたらす分子事象の知識が増えたにもかかわらず、がんは依然として、世界での罹患及び死亡の主要な原因である。がんは、世界中で２番目に多い死因である。世界保健機関によれば、がんは、２０１５年に８８０万件の死亡に関与していた。世界的には、６件の死亡のうちのほぼ１件ががんに起因する。例えば、結腸直腸がん（colorectal cancer、ＣＲＣ）は、世界中で３番目に多いがんである。２００８年には、１２３万人の人々がこの疾患と診断されている。これは、欧州において２番目に多いがんであり、２０１２年には、およそ４４７，０００件の新たな症例が診断されている（合計の１３％）。結腸直腸がんは、４番目に多いがんの死亡原因であり、年間６０８，０００件（ＥＵでは１４８，０００件）の死亡に関与すると推定される。いくつかの新しい治療がＣＲＣにおいて進歩しているが、多くは臨床試験は失敗しており、転移性ＣＲＣは、依然として大部分は不治である。

従来、ほとんどのがん薬物の発見は、必須細胞機能をブロックし、分裂細胞を殺傷する薬剤に焦点を当ててきた。しかしながら、進行がんの場合、どんなに攻撃的に適用されても、患者が治療からの生命を脅かす副作用に苦しむ時点であっても、化学療法が完全な治癒をもたらすことは稀である。ほとんどの場合、患者内の腫瘍は、増殖を停止し、又は一時的に収縮（寛解と呼ばれる）するだけで、再度増殖を開始し、時にはより急速に増殖し（再発と呼ばれる）、治療がますます困難になる。最近では、がん薬物開発の焦点は、広範な細胞傷害性化学療法から離れて、毒性が少ない標的化細胞増殖抑制療法に向かっている。進行がんの治療は、白血病及びいくつかの他のがんにおいて臨床的に検証されている。しかしながら、癌腫の大部分において、標的化アプローチは、患者の大部分においてがんを完全に消滅させるのに十分な効果を依然としてもたらしていない。黒色腫は、非常に頻繁に発生するがんの別の例である。検出が十分に早期ではない場合、がんは転移する可能性があり、その段階では、治療が非常に困難である。免疫介入治療は、転移性黒色腫を有する患者の少なくとも一部に有効であることが示されている。非小細胞肺がんは、手術のための十分に早期の段階で稀に発見されるがん型である。また、これらの種類のがんは、免疫介入治療により成功裏に治療されてきた。

がんの標的化は、例えば、がんが生存及び／又は増殖に依存するシグナル伝達タンパク質に対して指向する小分子、腫瘍特異性タンパク質を有するワクチン、腫瘍細胞を能動的に殺傷する免疫細胞及び細胞傷害性分子を腫瘍に標的化する抗体を含む細胞療法、シグナル伝達の妨害及び／又は宿主の免疫系を腫瘍細胞に指向させる（向け直す）ことを含む様々な異なる方法を使用して達成されてきた。ＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１軸をブロックするモノクローナル抗体は、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、腎細胞癌、及び尿路上皮癌患者のサブセットにおいて持続性のある臨床応答を誘発することが示されている。

国際公開第２０１３／１５７９５４号

本発明は、免疫系成分を指向させる（向け直す）ための新規な手段及び方法を提供する。本発明はまた、細胞によって発現される生物活性を調節するための手段及び方法に関する。

本発明は、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第１及び第２の細胞を準備することを含み、第１の細胞が細胞膜上にメンバーを有し、第２の細胞が、細胞膜上に第２の膜タンパク質を有する、方法が、細胞を、２つの抗原結合部位を含む結合分子と接触させることを含み、第１の抗原結合部位が、メンバー（第１の膜タンパク質）の細胞外部分に結合することができ、第２の抗原結合部位が、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができ、それによって、第１の細胞上のメンバーの活性を刺激する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーは、ＣＤ１３７又はＯＸ４０であり、好ましくはＣＤ１３７である。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、Ｂ７ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１である。

好ましい実施形態では、方法は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む更なる結合分子（第２の結合分子）を準備することを更に含み、第１及び第２の結合分子は、
第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第１の細胞及び第２の細胞を、第１及び第２の結合分子と共にインキュベートすることによって、第１の細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激又は増強することを更に含む。

本発明はまた、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（第１の膜タンパク質）の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む結合分子も提供する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、好ましくはＣＤ１３７又はＯＸ４０であり、好ましくはＣＤ１３７である。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。第２の膜タンパク質は、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１である。

本発明は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（第１の膜タンパク質）の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む１つ以上の結合分子を含む部分の組成物又はキットオブパーツを更に提供する。好ましい実施形態では、本発明は、このような結合分子を２つ以上含む組成物又はキットオブパーツであって、少なくとも２つの結合分子が、
第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合することができる、組成物又はキットオブパーツを提供する。少なくとも２つの結合分子は、第１の膜タンパク質上の同じエピトープに結合し、第２の膜タンパク質上の異なるエピトープに結合することが好ましい。

本発明は、細胞上のＣＤ１３７又はＯＸ４０の活性を刺激する方法であって、第１の細胞及び第２の細胞を準備することであって、第１の細胞が細胞膜上にＣＤ１３７又はＯＸ４０を有し、第２の細胞が細胞膜上に第２の膜タンパク質を有することと、第１の細胞及び第２の細胞を、ＣＤ１３７又はＯＸ４０（第１の膜タンパク質）の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を含む結合分子（第１の結合分子）と第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む結合分子（第１の結合分子）と接触させることとを含み、方法が、第１の細胞及び第２の細胞を、第１の結合分子と共にインキュベートすることによって、第１の細胞上のＣＤ１３７又はＯＸ４０の活性を刺激することを更に含む方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。

好ましい実施形態では、方法は、第１の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む更なる結合分子（第２の結合分子）を準備することを更に含み、第１及び第２の結合分子は、
第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第１の細胞及び第２の細胞を、第１及び第２の結合分子と共にインキュベートすることによって、第１の細胞上のＣＤ１３７又はＯＸ４０の活性を刺激することを更に含む。

いくつかの実施形態では、本発明による結合分子は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子の抗原結合部位は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる１つの抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子は、ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子の抗原結合部位は、ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる１つの抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子は、ＣＤ１３７に結合することができる抗原結合部位と、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子の抗原結合部位は、ＣＤ１３７に結合することができる１つの抗原結合部位と、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる１つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子は、２つ以下の抗原結合部位を有する。

本明細書に記載される結合分子は、好ましくは抗体である。

本発明は、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第１の細胞及び第２の細胞を準備することを含み、第１の細胞が細胞膜上にメンバー（第１の膜タンパク質）を有し、第２の細胞が細胞膜上に第２の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、少なくとも２つの可変ドメインを含む本発明による抗体と接触させることを含み、１つの可変ドメインが、第１の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第１の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第２の抗原結合部位を含み、それによって、第１の細胞上のメンバーの活性を刺激する、方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。

本発明は、
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（第１の膜タンパク質）の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン、及び
第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメイン
を含む、抗体又は機能的部分、派生体及び／又はそれらの類似体を更に提供する。第１の膜タンパク質は、好ましくはＣＤ１３７又はＯＸ４０であり、好ましくはＣＤ１３７である。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。

結合分子は、好ましくは二重特異性抗体である。本発明は、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第１の細胞及び第２の細胞を準備することを含み、第１の細胞が細胞膜上にメンバー（第１の膜タンパク質）を有し、第２の細胞が細胞膜上に第２の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、２つの可変ドメインを含む二重特異性抗体と接触させることを含み、１つの可変ドメインが、第１の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第１の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第２の抗原結合部位を含み、それによって、第１の細胞上のメンバーの活性を刺激する、方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。また、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分（第１の膜タンパク質）に結合することができる抗原結合部位を有する可変ドメインと、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を有する可変ドメインとを含む二重特異性抗体も提供される。第１の膜タンパク質は、好ましくはＣＤ１３７又はＯＸ４０であり、好ましくはＣＤ１３７である。第２の膜タンパク質は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。

いくつかの実施形態では、本発明による抗体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明による抗体の抗原結合部位は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる１つの抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による抗体は、ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による抗体の抗原結合部位は、ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる１つの抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による抗体は、ＣＤ１３７に結合することができる抗原結合部位と、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による抗体の抗原結合部位は、ＣＤ１３７に結合することができる１つの抗原結合部位と、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる１つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による抗体は、２つ以下の抗原結合部位を有する。

本発明の１つ以上の結合分子、好ましくは抗体又はその変異体を含む医薬組成物が更に提供される。

また、本発明の抗体又はその変異体の重鎖（複数可）又は重鎖可変領域（複数可）をコードする核酸分子又は核酸分子の集合体も提供される。

また、本発明の抗体をコードする核酸分子又は核酸分子の集合体も提供される。

本発明の抗体は、好ましくは、図３に示されるようなＭＦのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。好ましい実施形態では、抗体は、図１に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を更に含む。好ましい実施形態では、軽鎖は、図１Ａに示されるようなアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ１抗体、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体の定常領域を含む。好ましい実施形態では、ＩｇＧ１定常領域のＣＨ２領域は、抗体のＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を低減するように遺伝子操作されている。好ましい実施形態では、ＣＨ２領域は、図２Ｅに示されるような配列を含む。好ましい実施形態では、抗体のＣＨ３領域は、重鎖のヘテロ二量体化を促進するように遺伝子操作されている。好ましい実施形態では、１つの重鎖は、図２Ｆに示されるような配列を含み、別の重鎖は、図２Ｇに示されるような配列を含む。

また、本発明の抗体又はその変異体を単独で又は一緒にコードする１つ以上の核酸分子を含む細胞も提供される。また、本発明の抗体又はその変異体を、記載されるような細胞を使用して、好ましくは細胞の培養物からの抗体又はその変異体の採取と一緒に産生する方法も提供される。

本発明の抗体又はその変異体を含む細胞系が更に提供される。

がんなどの異常細胞が関与する疾患を有する、又はウイルス若しくは寄生体による慢性感染症を有する個体の治療のための方法であって、それを必要とする個体に、本発明の結合分子、好ましくは抗体又はその変異体を投与することを含む方法も提供される。

本発明は、本発明の結合分子、好ましくは抗体又はその変異体、好ましくは、がんなどの異常細胞が関与する疾患、又はウイルス若しくは寄生体による慢性感染症を有する個体の治療に使用するための、本発明の二重特異性抗体又はその変異体を更に提供する。

好ましい実施形態では、寄生体は細胞内寄生体である。

個体における免疫応答を個体の異常細胞に対して刺激する方法であって、個体に、本発明の結合分子、好ましくは抗体又はその変異体、好ましくは二重特異性抗体又はその変異体を提供する（投与する）ことを含む方法が更に提供される。異常細胞は、好ましくはがん細胞、ウイルス感染細胞、寄生体又は寄生体感染細胞である。好ましい実施形態では、細胞は、がん細胞又は新生物性細胞である。

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（tumor necrosis factor receptor superfamily、ＴＮＦＲＳＦ）は、受容体の一群である。これらは、典型的には、細胞外システインリッチドメインを介して腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor、ＴＮＦ）に結合する能力によって特徴付けられる。神経成長因子（nerve growth factor、ＮＧＦ）を除いて、全てのＴＮＦは、原型のＴＮＦ−αに相同である。それらの活性形態では、ＴＮＦ受容体の大部分は、原形質膜中に三量体複合体を形成する。したがって、ほとんどのＴＮＦ受容体は、膜貫通ドメイン（transmembrane domain、ＴＭＤ）を含み、細胞膜上に位置する。しかしながら、一部は、可溶性形態（例えば、ＴＮＦＲ１）に切断することができ、ＴＭＤを完全に欠いている（例えばＤｃＲ３）。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合する本発明の抗体は、スーパーファミリーの膜結合メンバーに結合する。細胞膜に関連しない形態でのみ存在するメンバーは、本発明の範囲内ではない。

ＴＮＦ受容体は、受容体のリガンドの結合時に細胞の内側へのシグナル伝達に関与する。いくつかの受容体は、下流シグナル伝達のために、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ、ＲＩＰ、及びＦＡＤＤなどの特異的アダプタータンパク質を必要とする。本発明との関係においては、ＴＮＦスーパーファミリーの様々なメンバーが好ましい。これらには、腫瘍壊死因子受容体１、腫瘍壊死因子受容体２、リンホトキシンβ受容体、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３７、細胞死受容体３、細胞死受容体４、細胞死受容体５、細胞死受容体６、ＲＡＮＫ、ＴＲＯＹ、ＢＡＦＦ受容体、Ｂ細胞成熟抗原（B−cell maturation antigen、ＢＣＭＡ）及び膜貫通活性剤並びにカルシウム調節シクロフィリンリガンド相互作用タンパク質（trans−membrane activator and calcium−modulating cyclophilin ligand−interacting protein、ＴＡＣＩ）が挙げられる。

腫瘍壊死因子受容体１は、腫瘍壊死因子−αの主受容体のうちの１つである。この受容体は、多数の代替名を有し、これらのいくつかは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＡＲ、Ｐ６０、Ｐ５５、腫瘍壊死因子受容体１Ａアイソフォームβ、腫瘍壊死因子結合タンパク質１、腫瘍壊死因子受容体１型、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子−α受容体、腫瘍壊死因子受容体１、ＣＤ１２０ａ抗原、ＴＮＦＲ１−Ｄ２、ＴＮＦ−Ｒ−Ｉ、ＴＮＦ−Ｒ５５、ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲ５５、ＴＮＦＲ６０、ＴＮＦ−Ｒ、Ｐ５５−Ｒ、Ｔｂｐ１、ＦＰＦ、及びＭＳ５である。腫瘍壊死因子受容体１についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９１６、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：７１３２、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００６７１８２、ＯＭＩＭ：１９１１９０、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１９４３８である。

腫瘍壊死因子受容体２は、腫瘍壊死因子−α（tumor necrosis factor−alpha、ＴＮＦα）に結合する膜受容体である。この受容体は、多数の代替名を有し、これらのいくつかは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、腫瘍壊死因子受容体２、Ｐ８０ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦ−Ｒ２、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＢＲ、Ｐ７５、腫瘍壊死因子結合タンパク質２、腫瘍壊死因子β受容体、Ｐ７５ＴＮＦ受容体、ＣＤ１２０ｂ抗原、エタネルセプト、ＴＮＦ−Ｒ−ＩＩ、ＴＮＦ−Ｒ７５、Ｐ７５ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲ−ＩＩ、ＣＤ１２０ｂ、ＴＮＦＲ１Ｂ、ＴＮＦＲ８０、ＴＢＰＩＩである。腫瘍壊死因子受容体２についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９１７、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：７１３３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００２８１３７、ＯＭＩＭ：１９１１９１、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２０３３３である。

リンホトキシンβ受容体は、上皮及び骨髄系の細胞を含むほとんどの細胞型の表面上で発現されるが、通常は正常なＴリンパ球及びＢリンパ球では発現されない。このタンパク質は、リンホトキシン膜形態（リンホトキシン−α及びリンホトキシン−βの複合体）に結合する。コード化タンパク質及びそのリガンドは、リンパ系組織及び形質転換細胞の発生及び組織において役割を果たす。このタンパク質の活性化は、場合によってアポトーシスを誘発することができる。このタンパク質は、多数の別名で知られており、これらの中には、ＬＴＢＲ、腫瘍壊死因子受容体２関連タンパク質、腫瘍壊死因子受容体ＩＩＩ型、腫瘍壊死因子Ｃ受容体、Ｄ１２Ｓ３７０、ＴＮＦＲＳＦ３、ＴＮＦＣＲ、ＴＮＦＲ３、リンホトキシンβ受容体（ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー３）、リンホトキシンＢ受容体、ＬＴ−β−Ｒ、ＴＮＦ−Ｒ−ＩＩＩ、ＴＮＦＲ２−ＲＰ、ＴＮＦ−ＲＩＩＩ、ＴＮＦＲ−ＩＩＩ、ＴＮＦＲ−ＲＰ、及びＣＤ１８がある。リンホトキシンβ受容体の外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：６７１８、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：４０５５、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１１３２１、ＯＭＩＭ：６００９７９、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３６９４１である。

ＯＸ４０は、ＣＤ２８とは異なり、静止期のナイーブＴ細胞上では恒常的に発現されず、ＯＸ４０は、活性化から２４〜７２時間後に発現される、二次共刺激性免疫チェックポイント分子であり、そのリガンド、ＯＸ４０Ｌもまた、静止期の抗原提示細胞上では発現されないが、それらの活性化後に発現される。ＯＸ４０の発現は、Ｔ細胞の活性化に依存する。ＣＤ２８なしでは、ＯＸ４０の発現は、典型的には遅延され、より低いレベルで存在する。このタンパク質は、多数の別名で知られており、これらの中では、ＴＮＦＲＳＦ４、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４、ＴＡＸ転写活性化糖タンパク質１受容体、ＯＸ４０Ｌ受容体、ＡＣＴ３５抗原、ＣＤ１３４抗原、ＴＸＧＰ１Ｌ；Ｔａｘ転写活性化糖タンパク質１受容体、リンパ系活性化抗原ＡＣＴ３５、ＯＸ４０細胞表面抗原、ＡＴＣ３５抗原、ＯＸ４０抗原、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、及びＩＭＤ１６がある。ＯＸ４０についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９１８、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：７２９３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８６８２７、ＯＭＩＭ：６００３１５、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４３４８９である。

ＣＤ４０は、抗原提示細胞に見られる共刺激性タンパク質であり、それらの活性化に関与する。Ｔヘルパー細胞上のＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）ＣＤ４０への結合は、抗原提示細胞を活性化し、ＣＤ４０によって細胞内シグナル伝達を誘導し、様々な下流効果を誘導する。このタンパク質は、いくつもの異なる別名で知られており、これらの中には、ＣＤ４０分子、ＣＤ４０分子ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５、ＣＤ４０Ｌ受容体、ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤＷ４０、Ｂｐ５０、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー５、Ｂ細胞表面抗原ＣＤ４０、Ｂ細胞表面抗原ＣＤ４０、Ｂ細胞関連分子、ＣＤ４０抗原、及びＰ５０がある。ＣＤ４０についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９１９、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：９５８、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０１０１７、ＯＭＩＭ：１０９５３５、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２５９４２である。

Ｆａｓ受容体は、プログラムされた細胞死（アポトーシス）をもたらす、細胞の表面上の細胞死受容体である。これは、より顕著なアポトーシス経路のうちの１つの一部を形成する。これは、いくつもの代替名で知られており、例えば、Ｆａｓ細胞表面細胞死受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー６、アポトーシス媒介表面抗原ＦＡＳ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー６、ＦＡＳＬＧ受容体、ＣＤ９５抗原、ＴＮＦＲＳＦ６、ＡＰＴ１、ＦＡＳ１、ＡＰＯ−１細胞表面抗原、アポトーシス抗原１、Ａｐｏ−１抗原、ＦａｓＡＭＡ、ＡＬＰＳ１Ａ、ＡＰＯ−１、ＦＡＳＴＭ、及びＣＤ９５である。ＦＡＳについての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９２０、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：３５５、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００２６１０３、ＯＭＩＭ：１３４６３７、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２５４４５である。

ＣＤ２７は、Ｔ細胞免疫の発生及び長期維持に重要であると考えられている。これはリガンドＣＤ７０に結合し、Ｂ細胞活性化及び免疫グロブリン合成の調節において役割を果たす。ＣＤ２７は、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰＫ８／ＪＮＫの活性化をもたらすシグナルを伝達する。ＣＤ２７結合タンパク質（ＳＩＶＡ）、アポトーシスタンパク質は、この受容体に結合することができ、この受容体によって誘導されるアポトーシスにおいて役割を果たすと考えられている。このタンパク質の代替名は、とりわけ、ＣＤ２７分子、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー７、Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ２７、ＣＤ２７Ｌ受容体、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔ１４、Ｔ細胞活性化抗原Ｓ１５２、ＣＤ２７抗原、ｓ１５２、ＬＰＦＳ２、Ｓ１５２及びＴｐ５５である。ＣＤ２７についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９２２、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：９３９、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３９１９３、ＯＭＩＭ：１８６７１１、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２６８４２である。

ＣＤ３０は、活性化Ｔ及びＢ細胞によって発現される。ＴＲＡＦ２及びＴＲＡＦ５は、この受容体と相互作用し、ＮＦ−κＢの活性化をもたらすシグナル伝達を媒介すると考えられている。これはアポトーシスの正の調節因子であり、自己反応性ＣＤ８エフェクターＴ細胞の増殖可能性を制限し、自己免疫から身体を保護することも示されている。これは、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、ＴＮＦＲＳＦ８、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８、リンパ球活性化抗原ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ受容体、Ｋｉ−１抗原、Ｄ１Ｓ１６６Ｅ、ＣＤ３０、サイトカイン受容体ＣＤ３０、ＣＤ３０抗原、及びＫｉ−１である。ＣＤ３０についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９２３、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：９４３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２０９４９、ＯＭＩＭ：１５３２４３、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２８９０８である。

ＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞によって発現され得る。また、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球、及び炎症部位における血管壁の細胞などの他の細胞にも見出される。このタンパク質は、Ｔ細胞の活性化のための、その共刺激活性について知られている。ＣＤ１３７は、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９、Ｔ細胞抗原４−１ＢＢホモログ、４−１ＢＢリガンド受容体、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７抗原、ＣＤｗ１３７、ＩＬＡ、インターロイキン活性化受容体、マウスＬｙ６３のホモログ、誘導性リンパ球活性化（Induced By Lymphocyte Activation、ＩＬＡ）、マウス４−１ＢＢのホモログ、受容体タンパク質４−１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、及び４−１ＢＢである。ＣＤ１３７についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９２４、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：３６０４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００４９２４９、ＯＭＩＭ：６０２２５０、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０７０１１である。ＣＤ１３７は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞上で最も一般的にアップレギュレートされる誘導性受容体である。ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＮＦ−κＢを活性化することによってＴ細胞機能を増強する［Ａｒｃｈｅｔａｌ，１９９８］。ＣＤ４＋Ｔ細胞、単球、Ｂ細胞、樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）サブ集団、及び顆粒球並びにＮＫ細胞を含む他の細胞免疫細胞型は、様々なレベルでＣＤ１３７を発現することができる［Ｓｈａｏｅｔａｌ，２０１１］。単球において、ＣＤ１３７は、リポ多糖（lipopolysaccharide、ＬＰＳ）及びＩＬ−１βによる活性化によって誘導可能である。Ｂリンパ球において、ＣＤ１３７発現は、細胞表面免疫グロブリンに対する抗体によって、及びＥＢＶによる形質転換によって誘導される。ＤＣにおいて、ＣＤ１３７ライゲーションは、炎症性サイトカイン（ＩＬ−６及びＩＬ−１２）の産生及びそれらの生存率の向上に加えて、Ｂ７共刺激分子（ＣＤ８０及びＣＤ８６）のアップレギュレートを通してそれらの成熟を誘導する［Ｍａｋｋｏｕｋｅｔａｌ，２０１５］。好中球上のＣＤ１３７ライゲーションの自然な機能は、細菌及び寄生虫感染の食作用の増加である。加えて、ＣＤ１３７のライゲーションは、インビトロで好中球及び好酸球中のＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ−ＣＳＦ受容体によって媒介される抗アポトーシスシグナルをブロックし、それによって顆粒球蓄積を防止する［Ｓｉｍｏｎ，２００１；Ｖｉｎａｙｅｔａｌ，２０１１］。軟骨細胞、内皮細胞、及び腫瘍細胞などの非リンパ系細胞において、ＣＤ１３７発現は、軟骨細胞に対するＩＬ−１β、内皮細胞に対する炎症性サイトカインＴＮＦα／ＩＦＮγ／ＩＬ−１β、及び腫瘍細胞に対するＩＦＮγなどのサイトカイン刺激によって促進される。ＣＤ１３７（ＣＤ１３７Ｌ）を刺激するリガンドは、活性化抗原提示細胞上で発現される。ＣＤ１３７は、単量体及び二量体として膜中に存在する［Ｐｏｌｌｏｋｅｔａｌ，１９９３］。

細胞死受容体３は、活性化及び抗原経験Ｔリンパ球によって発現される。この受容体はまた、ＦｏｘＰ３正制御性Ｔリンパ球によっても発現される。受容体のリガンドはＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）であり、このＴＬ１Ａ（ＴＮＦＳＦ１５）は、トル様受容体又はＦｃ受容体の活性化後に、抗原提示細胞、及びいくつかの内皮細胞においてアップレギュレートされる。異なるアイソフォームをコードする様々な代替的にスプライシングされた転写変異体が報告されており、その大部分は、潜在的に分泌された分子である。この受容体は、Ｔ細胞活性化によって誘導されるリンパ球増殖の制御に関与すると考えられている。活性化は、Ｔ細胞受容体の以前の結合に依存すると考えられている。リガンドの結合は、ＩＬ−２受容体を介して内因性ＩＬ−２に対するＴ細胞の感受性を増加させ、Ｔ細胞増殖を増強させる。インビボ活性化は、同種抗原に遭遇するＴ細胞に対して特異的である可能性が高い。安静時、及び自己免疫下にない個体では、同族抗原に定期的に遭遇するＴ細胞の大部分は、ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞である。任意の他の外因性シグナルが存在しない場合の細胞死受容体３の刺激は、ＦｏｘＰ３＋制御性（ＣＤ４陽性）Ｔ細胞の重要かつ特異的増殖を刺激する。細胞死受容体３の治療的アゴニストは、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するために使用することができ、これは、喘息、同種異系固体臓器移植及び眼角膜炎の実験モデルにおける炎症を低減することができる。他方で、自己抗原又はワクチン抗原と一緒に受容体を共刺激することにより、免疫病理学の悪化又はワクチン刺激免疫の増強をそれぞれもたらし得る。受容体刺激は、Ｔ細胞媒介性免疫に対して特異的であり、これは、外来対自己抗原の利用能の時間コンテキスト及び質に応じて炎症を増強又は減衰させるために使用することができる。ヒトにおけるＴＮＦＲＳＦ２５の刺激は、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１などの分子を標的とする共刺激性遮断と同様であるが、より制御可能な効果をもたらし得る。細胞死受容体３は、いくつもの他の名称で知られており、例えばＴＮＦＲＳＦ２５、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２５、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１２（転位鎖会合性膜タンパク質）、細胞死のリンパ球関連受容体、アポトーシス媒介受容体ＴＲＡＭＰ、アポトーシス媒介受容体ＤＲ３、アポトーシス誘導性受容体ＡＩＲ、タンパク質ＷＳＬ−１、ＴＮＦＲＳＦ１２、ＡＰＯ−３、ＤＤＲ３、ＬＡＲＤ、ＤＲ３、アポトーシス誘導受容体、細胞死受容体β、タンパク質ＷＳＬ、ＷＳＬ−ＬＲ、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１、ＡＰＯ３、ＷＳＬ１、ＴＲ３、及びＷＳＬである。細胞死受容体３についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９１０、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：８７１８、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１５７８８、ＯＭＩＭ：６０３３６６、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９３０３８である。

細胞死受容体４は、ＴＲＡＩＬに結合し、細胞死シグナルを導入し細胞アポトーシスを誘導すると考えられるＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。これは、いくつもの名称で知られており、例えば、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ａ、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド受容体１、細胞死受容体４、ＴＲＡＩＬ受容体１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬＲ１、ＡＰＯ２、ＤＲ４、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ａ変異体２、細胞傷害性ＴＲＡＩＬ受容体、ＣＤ２６１抗原、ＴＲＡＩＬＲ−１、及びＣＤ２６１である。細胞死受容体４についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９０４、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：８７９７、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０４６８９、ＯＭＩＭ：６０３６１１、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ００２２０である。

細胞死受容体５は、ＴＲＡＩＬに結合し、アポトーシスを媒介するＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。この受容体は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＮＦＳＦ１０／ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ−２Ｌ）によって活性化され、アポトーシスシグナルを伝達することができる。この受容体は、いくつもの異なる名称で知られており、これらの中には、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド受容体２、細胞死受容体５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬＲ２、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ２、ＺＴＮＦＲ９、ＤＲ５、Ｐ５３制御ＤＮＡ損傷誘導性細胞死受容体（キラー）、腫瘍壊死因子受容体様タンパク質ＺＴＮＦＲ９、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ−２Ｌ用の受容体を含有する細胞死ドメイン、アポトーシス誘導タンパク質ＴＲＩＣＫ２Ａ／２Ｂ、アポトーシス誘導受容体ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ、細胞傷害性ＴＲＡＩＬ受容体−２、Ｆａｓ様タンパク質、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＣＤ２６２抗原、ＫＩＬＬＥＲ／ＤＲ５、ＴＲＩＣＫ２Ａ、ＴＲＩＣＫ２Ｂ、ＴＲＩＣＫＢ、及びＣＤ２６２がある。細胞死受容体５についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９０５、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：８７９５、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２０８８９、ＯＭＩＭ：６０３６１２、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ１４７６３である。

細胞死受容体６は、活性化時に細胞アポトーシスを誘導することができる。マウスにおけるノックアウト研究は、この受容体がＴヘルパー細胞活性化において役割を果たし、炎症及び免疫調節に関与し得ることを示唆している。この受容体はまた、アルツハイマー病、並びにストレス応答及び細胞生存におけるシグナル伝達を引き起こす脳における神経変性に関与すると考えられている。過剰発現は、発現細胞のアポトーシスを誘導する。ＡＰＰ（amyloid precursor protein、アミロイド前駆体タンパク質）は、この受容体の天然リガンドであり、最初にＡβ及びＮ−ＡＰＰに切断される。Ｎ−ＡＰＰは、ＤＲ６と相互作用してアルツハイマー患者における軸索分解を引き起こす断片である。細胞死受容体６は、いくつもの他の名称で知られており、例えばＴＮＦＲＳＦ２１、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２１、ＤＲ６、ＴＮＦＲ関連細胞死受容体６、ＣＤ３５８抗原、ＢＭ−０１８、及びＣＤ３５８である。細胞死受容体６についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１３４６９、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：２７２４２、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１４６０７２、ＯＭＩＭ：６０５７３２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ７５５０９である。

ＲＡＮＫは、ＲＡＮＫ−リガンド（ＲＡＮＫ−Ｌｉｇａｎｄ、ＲＡＮＫＬ）の受容体であり、破骨細胞の分化及び活性化を調節するＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧシグナル伝達経路の一部である。これは、骨リモデリング並びに修復、免疫細胞機能、リンパ節発生、熱調節、及び乳腺の発生に関連している。オステオプロテゲリン（Osteoprotegerin、ＯＰＧ）は、ＲＡＮＫのデコイ受容体であり、ＲＡＮＫＬに競合することによって、ＲＡＮＫシグナル伝達経路の刺激を調節する。ＲＡＮＫの細胞質ドメインは、ＮＦ−κＢ及びＪＮＫなどの下流標的にシグナルを伝達する。ＲＡＮＫは、骨格筋、胸腺、肝臓、結腸、小腸、副腎、破骨細胞、乳腺上皮細胞、前立腺、血管細胞、及び膵臓で発現される。ＮＦ−κＢの活性化は、ＲＡＮＫＬによって媒介されることが多いが、ＲＡＮＫ単独の過剰発現は、ＮＦ−κＢ経路を活性化させることもできる。ＲＡＮＫは、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１ａＮＦＫＢ活性化因子、ヘテロ接合性の喪失、１８、染色体領域１、破骨細胞分化因子受容体、ＮＦ−ＫＢの受容体活性化因子、骨ページェット病２、ＯＤＦＲ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１ａ、ＮＦＫＢの活性化因子、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１ａ、ＮＦＫＢ活性化因子、核因子−カッパＢの受容体活性化因子、ＣＤ２６５抗原、ＬＯＨ１８ＣＲ１、ＴＲＡＮＣＥＲ、ＣＤ２６５、ＯＰＴＢ７、ＯＳＴＳ、ＰＤＢ２、ＦＥＯ、及びＯＦＥである。ＲＡＮＫについての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９０８、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：８７９２、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１４１６５５、ＯＭＩＭ：６０３４９９、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｙ６Ｑ６である。

ＢＡＦＦ受容体は、ＢＡＦＦを認識するＴＮＦ受容体スーパーファミリーの膜タンパク質である。Ｂ細胞活性化因子（B−cell activating factor、ＢＡＦＦ）は、インビトロでＢ細胞の生存を増強させ、末梢Ｂ細胞集団の調節因子である。ＢＡＦＦ受容体は、ＢＡＦＦの受容体であり、単一細胞外フェニルアラニンリッチドメインを含有するＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。この受容体は、ＢＡＦＦ媒介成熟Ｂ細胞の生存に必要とされる主要な受容体であると考えられている。ＢＡＦＦはまた、ＴＮＦ受容体Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）及び膜貫通活性因子並びにカルシウム調節シクロフィリンリガンド相互作用タンパク質（ＴＡＣＩ）によって結合される。ＢＡＦＦ受容体は、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｃ、Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＡＦＦＲ、Ｂ細胞活性化因子受容体、ＣＤ２６８抗原、プロリキシン、ＢＲＯＭＩＸ、ＣＤ２６８、ＣＶＩＤ４、及びＢＲ３である。ＢＡＦＦ受容体の外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１７７５５、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：１１５６５０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１５９９５８、ＯＭＩＭ：６０６２６９、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＲＪ３である。

Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）を認識するＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。この受容体は、成熟Ｂリンパ球において優先的に発現され、Ｂ細胞の発生及び自己免疫応答にとって重要であると考えられている。この受容体は、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１３ｂ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ／ＴＡＬＬ−１／ＢＡＦＦ）に特異的に結合し、ＮＦ−カッパＢ及びＭＡＰＫ８／ＪＮＫの活性化につながることが示されている。Ｂ細胞成熟抗原は、いくつもの別名でも知られており、例えばＴＮＦＲＳＦ１７、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７、Ｂ細胞成熟タンパク質、ＢＣＭ、Ｂ細胞成熟因子、ＣＤ２６９抗原、ＴＮＦＲＳＦ１３Ａ、及びＣＤ２６９である。ＢＣＭＡについての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９１３、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：６０８、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００４８４６２、ＯＭＩＭ：１０９５４５、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０２２２３である。

膜貫通活性化因子及びカルシウム調節シクロフィリンリガンド相互作用タンパク質（ＴＡＣＩ）。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのリンパ球特異的メンバーである。これは、カルシウム調節因子及びシクロフィリンリガンド（calcium−modulator and cyclophilin ligand、ＣＡＭＬ）と相互作用する。このタンパク質はまた、ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ（ＴＮＳＦ１３又はＣＤ２５６）にも結合することができる。ＴＡＣＩは、転写因子ＮＦＡＴ、ＡＰ１、及びＮＦ−κ−Ｂの活性化を誘導し、ＴＮＦリガンドと相互作用することによって、体液性免疫で役割を果たす。ＴＡＣＩを欠損したマウスは、脾臓Ｂ細胞及び血清Ｉｇの増加を有し、これは、Ｂ細胞の生存におけるＴＡＣＩの潜在的な負の調節的役割を意味することを示唆した。しかしながら、より単純な説明は、ＴＡＣＩの欠如が、ＢＲ３に結合し、Ｂ細胞の数を増加させることができる、より循環するＢＡＦＦが利用可能となることであり得る。ＴＡＣＩに関連する疾患としては、分類不能型免疫不全症２、及び免疫グロブリンａ不全症２が挙げられる。ＴＡＣＩをコードする遺伝子は、１７番染色体上のスミス−マギニス症候群領域内に位置する。ＴＡＣＩは、多くの他の名称でも知られており、例えば、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｂ、膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬインターラクター、腫瘍壊死因子受容体１３Ｂ、ＣＤ２６７抗原、ＴＮＦＲＳＦ１４Ｂ、ＣＤ２６７、ＣＶＩＤ２、ＩＧＡＤ２、ＣＶＩＤ、及びＲＹＺＮ３である。ＴＡＣＩについての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１８１５３、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：２３４９５、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４０５０５、ＯＭＩＭ：６０４９０７、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ１４８３６である。

ＴＲＯＹは、胚発生中に発現される。これは、細胞中で過剰発現させたとき、ＪＮＫシグナル伝達経路を活性化することが示されている。この受容体の活性化は、アポトーシスを誘導することができる。この受容体は、胚発生において役割を果たすと考えられている。あるいは、異なるアイソフォームをコードするスプライシングされた転写変異体が記載されている。ＴＲＯＹは、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、ＴＮＦＲＳＦ１９、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１９、毒性及びＪＮＫ誘導因子、ＴＲＡＤＥ、ＴＡＪ、及びＴＡＪ−アルファである。ＴＲＯＹについての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１１９１５、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：５５５０４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２７８６３、ＯＭＩＭ：６０６１２２、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＳ６８である。

Ｂ７ファミリーは、免疫応答を調節するリンパ球上の受容体に結合する、多くの構造的に関連する細胞表面タンパク質を含む。リンパ球の活性化は、細胞表面、抗原特異的Ｔ細胞受容体、又はＢ細胞受容体の結合によって開始される。Ｂ７リガンドによって同時に送達される追加のシグナルは、これらの細胞の免疫応答を更に決定する。これらのいわゆる「共刺激性」又は「共抑制性」シグナルは、リンパ球上のＣＤ２８ファミリーの受容体を介してＢ７ファミリーメンバーによって送達される。共刺激性受容体とのＢ７ファミリーメンバーの結合は、免疫応答を増強し、共抑制性受容体との結合は、免疫応答が減衰させる。現在、以下のメンバーは、このファミリーの一部であると考えられている：Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、誘導性共刺激リガンド（inducible costimulator ligand、ＩＣＯＳ−Ｌ）、プログラム細胞死リガンド１（programmed death−1 ligand、ＰＤ−Ｌ１）、プログラム細胞死リガンド２（programmed death-2 ligand、ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６、及びＢ７−Ｈ７．Ｂ７ファミリーメンバーは、リンパ系組織及び非リンパ系組織で発現される。免疫応答の調節に及ぼすメンバーの効果は、Ｂ７ファミリー遺伝子における突然変異を有するマウスにおける免疫不全症及び自己免疫疾患の発症で示されている。Ｂ７リガンドによって送達されるシグナルの操作は、自己免疫、炎症性疾患、及びがんの治療における可能性を示している。

ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分及びＢ７ファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する、本発明による結合分子又は抗体若しくはその変異体は、Ｂ７ファミリーメンバーが、リンパ球に「共刺激性」又は「共抑制性」シグナルを送達し、それによって免疫応答を増強又は減衰させるために、所望の免疫応答が特に良好に促進され得るという利点を提供する。したがって、Ｂ７ファミリーのメンバーを標的化することによって、刺激性シグナルを増強すること、及び／又は抑制性シグナルを相殺することが可能であり、それによって、例えば異常細胞に対して所望の免疫応答を誘導又は増強することが可能である。

ＣＤ８０は、Ｔ細胞活性化及び生存に必要な共刺激性シグナルを提供する、活性化Ｂ細胞及び単球上に見出されるタンパク質である。これは、Ｔ細胞表面上の２つの異なるタンパク質：ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４のリガンドである。ＣＤ２８に結合されると、これが共刺激と関連付けられるのに対し、ＣＴＬＡ４への結合は、免疫応答の減衰と関連付けられる。ＣＤ８０は、Ｔ細胞を活性化するためにＣＤ８６と連携して機能する。ＣＤ８０は、ＰＤ−Ｌ１にも結合することが報告されている。ＣＤ８０は、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、ＣＤ８０分子、ＣＤ８０抗原、ＣＤ２８抗原リガンド１、Ｂ７−１抗原、Ｂリンパ球活性化抗原Ｂ７、ＣＴＬＡ−４カウンター受容体Ｂ７．１、活性化Ｂ７−１抗原、ＣＤ２８ＬＧ１、ＣＤ２８ＬＧ、ＬＡＢ７、ＢＢ１、Ｂ７、共刺激因子ＣＤ８０、ＣＤ８０抗原、及びＢ７−１である。ＣＤ８０についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１７００、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：９４１、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２１５９４、ＯＭＩＭ：１１２２０３、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ３３６８１である。

ＣＤ８６は、抗原提示細胞上で発現されるタンパク質である。これは、Ｔ細胞活性化及び生存のための共刺激性シグナルを提供することができる。これは、Ｔ細胞表面上の２つの異なるタンパク質：ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４のリガンドである。ＣＤ２８に結合されると、これが共刺激と関連付けられるのに対し、ＣＴＬＡ４への結合は、免疫応答の減衰と関連付けられる。ＣＤ８６は、Ｔ細胞を活性化するためにＣＤ８０と連携して機能する。これは、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、ＣＤ８６分子、ＣＤ８６抗原、ＣＤ２８抗原リガンド２、Ｂ７−２抗原、ＣＴＬＡ−４カウンター受容体Ｂ７．２、ＣＤ２８ＬＧ２、ＦＵＮ−１、ＢＵ６３、Ｂ７０、Ｂリンパ球活性化抗原Ｂ７−２、Ｂリンパ球抗原Ｂ７−２、活性化Ｂ７−２抗原、ＣＤ８６抗原、ＬＡＢ７２、及びＢ７−２である。ＣＤ８６についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１７０５、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：９４２、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１４０１３、ＯＭＩＭ：６０１０２０、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４２０８１である。

誘導性Ｔ細胞共刺激リガンド（ＩＣＯＳＬ又はＣＤ２７５）は、ＡＰＣ並びにいくつもの非血液組織によって構成的に発現される。発現は、進行中の炎症でダウンレギュレートされ得る。ＩＣＯＳＬは、ヒトにおけるＩＣＯＳ、ＣＤ２８、及びＣＴＬＡ−４と相互作用することが現在知られている。ＩＣＯＳＬ／ＣＤ２８相互作用は、ヒトＴ細胞の一次応答を同種異系抗原及びメモリリコール応答に共刺激するように見える。ＩＣＯＳＬ／ＣＴＬＡ−４は、共抑制性シグナルをもたらすと考えられている。ＩＣＯＳＬは、ＩＣＯＳＬＧ、Ｂ７関連タンパク質１、Ｂ７ホモログ２、Ｂ７様タンパク質ＧＩ５０、Ｂ７相同体２、Ｂ７ＲＰ−１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７Ｈ２、膜貫通タンパク質Ｂ７−Ｈ２ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２７５抗原、ＫＩＡＡ０６５３、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＬＩＣＯＳ、及びＧＬ５０としても知られている。ＩＣＯＳＬについての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１７０８７、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：２３３０８、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６０２２３、ＯＭＩＭ：６０５７１７、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ７５１４４である。

ＰＤ−Ｌ１は、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、及び肝炎などの他の疾患状態などの特定の事象中に免疫応答を抑制する役割を果たす、１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ−Ｌ１は、様々な種類のがん、特にＮＳＣＬＣ（Ｂｏｌａｎｄｅｔａｌ．，２０１３；Ｖｅｌｃｈｅｔｉｅｔａｌ．，２０１４）、黒色腫、腎細胞癌、胃がん、肝細胞並びに様々な白血病及び多発性骨髄腫（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，２０１４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．，２００５）で発現される。ＰＤ−Ｌ１は、がん細胞の細胞質及び原形質膜に存在するが、全てのがん又は腫瘍内の全ての細胞がＰＤ−Ｌ１を発現するわけではない（Ｄｏｎｇｅｔａｌ．，２００２）。複数の腫瘍微小環境細胞は、ＰＤ−Ｌ１発現をアップレギュレートすることによって免疫抑制に寄与する。この効果は、活性化Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ−γに応答してＰＤ−Ｌ１を誘導することによって、腫瘍がそれ自体を保護するために、「適応免疫抵抗」と呼ばれる（Ｓｈａｒｍａｅｔａｌ．，２０１７）。ＰＤ−Ｌ１はまた、癌遺伝子によって調節されることが可能であり、この機構は固有の免疫耐性として知られている（Ａｋｂａｙｅｔａｌ．，２０１３）。腫瘍微小環境内では、ＰＤ−Ｌ１はまた、骨髄細胞及び活性化Ｔ細胞上でも発現される（Ｔｕｍｅｈｅｔａｌ．，２０１４）。ＰＤ−Ｌ１の発現は、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＶＥＧＦ、並びにサイトカインＩＬ−１０及びＩＬ−４を含む複数の炎症誘発性分子によって誘導されＩＦＮ−γが、最も強力な誘導因子である（Ｋｏｎｄｏｅｔａｌ．，２０１０；ＳｚｎｏｌａｎｄＣｈｅｎ，２０１３）。

ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１又はＢ７．１（ＣＤ８０）への結合は、抑制性シグナルを伝達し、これは、Ｔ細胞を発現するＰＤ−１の増殖を低減する。ＰＤ−１は、アポトーシスを介した外来抗原特異的Ｔ細胞の蓄積を制御することができると考えられている。ＰＤ−Ｌ１は、様々ながん細胞によって発現され、その発現は、がん細胞に対して免疫応答を弱めることに少なくとも部分的に関与すると考えられている。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ７ファミリーのタンパク質のメンバーであり、様々な他の名称で知られており、例えば、ＣＤ２７４分子、ＣＤ２７４抗原、Ｂ７ホモログ１、ＰＤＣＤ１リガンド１、ＰＤＣＤ１ＬＧ１、ＰＤＣＤ１Ｌ１、Ｂ７Ｈ１、ＰＤＬ１、プログラム細胞死１リガンド１、プログラム細胞死リガンド１、Ｂ７−Ｈ１、及びＢ７−Ｈであり、ＣＤ２７４についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１７６３５、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：２９１２６、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２０２１７、ＯＭＩＭ：６０５４０２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＺＱ７である。

ＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１に対する第２のリガンドである。ＰＤ−Ｌ２によるＰＤ−１の結合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）媒介性増殖及びサイトカイン産生を阻害する。低抗原濃度では、ＰＤ−Ｌ２／ＰＤ−１結合は、Ｂ７−ＣＤ２８シグナルを阻害する。高抗原濃度では、ＰＤ−Ｌ２／ＰＤ−１結合は、サイトカイン産生を低減する。ＰＤ−Ｌ発現は、インターフェロンガンマ治療によって抗原提示細胞上でアップレギュレートされる。これは、いくつかの正常な組織及び様々な腫瘍で発現される。ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、重複する機能を有し、Ｔ細胞応答を調節すると考えられている。このタンパク質は、いくつもの他の名称で知られており、例えば、プログラム細胞死１リガンド２、Ｂ７樹状細胞分子、プログラム細胞死リガンド２、ブチロフィリンＢ７−ＤＣ、ＰＤＣＤ１リガンド２、ＰＤ−１リガンド２、ＰＤＣＤ１Ｌ２、Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３、Ｂ７ＤＣ、ＰＤＬ２、ＰＤ−１−リガンド２、ＣＤ２７３抗原、ＢＡ５７４Ｆ１１．２、及びＢｔｄｃである。ＰＤ−Ｌ２についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１８７３１、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：８０３８０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９７６４６、ＯＭＩＭ：６０５７２３、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＢＱ５１である。

Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）の発現は、様々な悪性疾患において増加し、正常細胞と腫瘍由来循環内皮細胞間を区別することができる（ＫｒａａｎｅｔａｌＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ（２０１４）１１１，１４９−１５６）。この受容体の刺激は、ヒト骨髄間質細胞の骨芽細胞への分化を誘導する（Ｘｕｅｔａｌ２０１１；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ２１６（２０１１）１３１１−１３１７）。このタンパク質は、ヒトにおいて４つのＩｇ様ドメインを含有するが、マウスタンパク質は、このようなドメインの２つを有するように見える。このタンパク質は、骨髄細胞発現トリガー受容体（triggering receptor expressed on myeloid cells、ＴＲＥＭ）様転写物２（ＴＬＴ−２又はＴＲＥＭＭＬ２）の最初に同定されたリガンドであると考えられている。後者のタンパク質は、Ｂ７−Ｈ３（４ｌｇ−Ｂ７−Ｈ３）に結合し、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化を共刺激する（Ｈｏｆｍｅｙｅｒｅｔａｌ２００９ＰＮＡＳ１０５；１０２７７−１０２７８）。ＣＤ２７６は、広範に発現される。これは、Ｔ細胞共刺激分子として作用する。ＣＤ２７６もまた、いくつもの他の名称で知られており、例えば、ＣＤ２７６分子、共刺激分子、ＣＤ２７６抗原、Ｂ７ホモログ３、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７Ｈ３、及びＢ７ＲＰ−２である。ＣＤ２７６についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：１９１３７、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：８０３８１、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０３８５５、ＯＭＩＭ：６０５７１５、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＺＰＲ３である。

Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）ｍＲＮＡは、広範発現されるように見えるが、いくつかの細胞のみが、膜上でタンパク質を能動的に発現する。Ｂ７−Ｈ４発現及び活性化Ｔ細胞への結合は、細胞周期停止、減少した増殖、及び低減されたＩＬ−２産生を介して、Ｔ細胞エフェクター機能を阻害する。Ｂ７−Ｈ４は、様々なヒトのがんにおけるがん細胞及び免疫抑制性の腫瘍随伴マクロファージ（tumor−associated macrophage、ＴＡＭ）の表面上でアップレギュレートされる。Ｂ７−Ｈ４経路によるシグナル伝達は、ＴＣＲ媒介ＣＤ４＋並びにＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、細胞周期の進行、及びＩＬ−２の産生の阻害をもたらす。Ｂ７−Ｈ４もまた、いくつもの他の名称で知られており、例えば、Ｖ−Ｓｅｔドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害剤１、免疫共刺激性タンパク質Ｂ７−Ｈ４、Ｔ−細胞共刺激性分子Ｂ７ｘ、Ｂ７スーパーファミリーメンバー１、Ｂ７ホモログ４、Ｂ７ｈ．５、Ｂ７Ｈ４、Ｔ細胞共刺激性分子Ｂ７ｘ、Ｂ７ファミリーメンバー、Ｈ４、タンパク質Ｂ７Ｓ１、ＰＲＯ１２９１、ＶＣＴＮ１、Ｂ７Ｓ１、Ｂ７Ｘ、及びＨ４２である。Ｂ７−Ｈ４についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：２８８７３、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：７９６７９、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３４２５８、ＯＭＩＭ：６０８１６２、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ７Ｚ７Ｄ３である。

Ｂ７−Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）は、Ｂ７ファミリーの５５〜６５ｋＤａのメンバーである。これは、骨内で、胚性幹細胞（embryonic stem cell、ＥＳＣ）上で、及び腫瘍細胞表面上で発現する膜貫通分子である。腫瘍細胞では、このタンパク質は、ＭＴ１−ＭＭＰ発現及び活性を促進し、ＭＴ１−ＭＭＰの基質として機能する。これにより、細胞運動性の可能性を増加させる。このタンパク質は、いくつもの他の名称で知られており、例えば、１０番染色体オープンリーディングフレーム５４、Ｖ−Ｓｅｔドメイン含有免疫調節受容体、Ｔ細胞活性化のＶ−ドメインＩｇ抑制因子、ストレス誘発性分泌タンパク質−１、Ｓｉｓｐ−１、ＳＩＳＰ１、ストレス誘発性分泌タンパク質１、血小板受容体ＧＩ２４、血小板受容体Ｇｉ２４、細胞死ドメイン１アルファ、ＤＤ１アルファ、Ｂ７Ｈ５、及びＧＩ２４である。このタンパク質についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：３００８５、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：６４１１５、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０７７３８、ＯＭＩＭ：６１５６０８、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９Ｈ７Ｍ９である。

Ｂ７−Ｈ６は、Ｂ７ファミリーに属し（ＭＩＭ６０５４０２を参照）、腫瘍細胞上で選択的に発現される。Ｂ７−Ｈ６のＮＫｐ３０（ＮＣＲ３；ＭＩＭ６１１５５０）との結合は、ナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞の活性化及び細胞傷害性をもたらす（Ｂｒａｎｄｔｅｔａｌ．２００９ＪＥｘｐＭｅｄ．２００９Ｊｕｌ６：２０６（７）：１４９５−５０３）。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍の排除に関与する自然免疫系のリンパ球である。Ｂ７−Ｈ６は、ＮＫｐ３０に結合する腫瘍細胞表面分子であり、抗腫瘍ＮＫ細胞の細胞傷害性及びサイトカイン分泌を引き起こすヒト受容体である。Ｂ７−Ｈ６についての他の名称は、ＮＣＲ３ＬＧ１、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性受容体３リガンド１、Ｂ７ホモログ６、Ｂ７Ｈ６、推定Ｉｇ様ドメイン含有タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｏ２４１６６／ＤＫＦＺｐ６８６Ｉ２１１６７、及びＤＫＦＺｐ６８６Ｏ２４１６６である。Ｂ７−Ｈ６についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：４２４００、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：３７４３８３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８８２１１、ＯＭＩＭ：６１３７１４、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ６８Ｄ８５である。

Ｂ７−Ｈ７（ＨＨＬＡ２）タンパク質は、胎盤の栄養芽球細胞、並びに腸、腎臓、胆嚢、及び乳房の上皮において検出されたが、ほとんどの他の器官では検出されなかった。ＨＨＬＡ２タンパク質は、乳房、肺、甲状腺、黒色腫、膵臓、卵巣、肝臓、膀胱、結腸、前立腺、腎臓、及び食道からのヒトのがんにおいて広範に発現される。高ＨＨＬＡ２発現は、局所リンパ節転移及びステージに関連している（Ｊａｎａｋｉｒａｍｅｔａｌ．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ；２１（１０）：２３５９−６６；Ｍａｙ１５，２０１５）。ＴＭＩＧＤ２は、ＨＨＬＡ２に対する受容体のうちの１つとして同定されている。Ｂ７−Ｈ７は、いくつもの異なる名称で知られており、例えば、ＨＥＲＶ−ＨＬＴＲ関連２、ヒト内因性レトロウイルス−Ｈ長い末端反復関連タンパク質２（Human Endogenous Retrovirus-H Long Terminal Repeat-Associating Protein 2）、Ｂ７Ｈ７、及びＢ７ｙである。Ｂ７−Ｈ７についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：４９０５、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：１１１４８、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１４４５５、ＯＭＩＭ：６０４３７１、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＵＭ４４である。

プログラム細胞死１タンパク質（Programmed Cell Death 1、ＰＤ−１）は、受容体のＣＤ２８ファミリーに属し、Ｔ細胞及びプロＢ細胞上で発現される細胞表面受容体である。ＰＤ−１は、現在、２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に結合することが知られている。免疫チェックポイントとして機能するＰＤ−１は、Ｔ細胞の活性化を阻害することによって免疫系をダウンレギュレートする上で重要な役割を果たし、これは、更に自己免疫を低減し、自己寛容を促進する。ＰＤ−１の阻害効果は、リンパ節中の抗原特異的Ｔ細胞におけるアポトーシス（プログラム細胞死）を促進する一方で、同時に制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）におけるアポトーシスを低減する二重機構によって達成されると考えられている。ＰＤ−１は、いくつもの異なる別名でも知られており、例えば、ＰＤＣＤ１、プログラム細胞死１、全身性エリテマトーデス感受性２、タンパク質ＰＤ−１、ＨＰＤ−１、ＰＤ１、プログラム細胞死１タンパク質、ＣＤ２７９抗原、ＣＤ２７９、ＨＰＤ−Ｌ、ＨＳＬＥ１、ＳＬＥＢ２、及びＰＤ−１である。ＰＤ−１についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：８７６０、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：５１３３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８８３８９、ＯＭＩＭ：６００２４４、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５１１６である。ＰＤ−１の活性をブロックする薬剤の新しい部類であるＰＤ−１阻害剤は、免疫系を活性化して腫瘍を攻撃し、したがっていくつかの種類のがんの治療に成功して使用されている。

ＣＬＥＣ１２Ａもまた、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２、メンバーＡ、Ｃ型レクチンタンパク質ＣＬＬ−１、ＭＩＣＬ、樹状細胞関連レクチン２、Ｃ型レクチンスーパーファミリー、骨髄阻害性Ｃ型レクチン様受容体、Ｃ型レクチン様分子−１、ＣＬＬ−１、ＤＣＡＬ２、ＣＬＬ１、Ｃ型レクチン様分子１、ＤＣＡＬ−２、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＬ、メンバー１（Killer cell lectin like receptor subfamily L，member 1、ＫＬＲＬ１）、ＣＤ３７１（ＢａｋｋｅｒＡ．ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００４，６４，ｐ８８４３５０；ＧｅｎＢａｎｋＴＭアクセス番号：ＡＹ５４７２９６；ＺｈａｎｇＷ．ｅｔａｌ．ＧｅｎＢａｎｋＴＭアクセス番号：ＡＦ２４７７８８；Ａ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００４，２７９．ｐ１４７９２−８０２；ＧｅｎＢａｎｋＴＭアクセス番号：ＡＹ４９８５５０；Ｙ．Ｈａｎｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ２００４，１０４、ｐ２８５８６６；Ｈ．Ｆｌｏｙｄ，ｅｔａｌ．ＧｅｎＢａｎｋＴＭアクセス番号：ＡＹ４２６７５９；Ｃ．Ｈ．Ｃｈｅｎ，ｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ２００６，１０７，ｐ１４５９６７）と称される。Ｉｄｓ；ＨＧＮＣ：３１７１３；ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：１６０３６４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１７２３２２、ＯＭＩＭ：６１２０８８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＱＧＺ９である。ＣＬＥＣ１２Ａは、白血病性芽球細胞及び急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）における白血病性幹細胞上で発現される抗原であり、ＣＤ３４陰性又はＣＤ３４低発現白血病性幹細胞（サイドポピュレーション）で発現される抗原である（Ａ．Ｂ．Ｂａｋｋｅｒｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００４，６４、ｐ８４４３５０；ＶａｎＲｈｅｎｅｎｅｔａｌ．２００７Ｂｌｏｏｄ１１０：２６５９；Ｍｏｓｈａｖｅｒｅｔａｌ．２００８ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２６：３０５９）。ＣＬＥＣ１２Ａの発現は、その他の点では、造血系に、特に末梢血及び骨髄中の骨髄細胞、すなわち顆粒球、単球、及び樹状細胞前駆体に制限されると考えられている。より重要なことに、ＣＬＥＣ１２Ａは、造血幹細胞には存在しない。この発現プロファイルは、ＣＬＥＣ１２ＡをＡＭＬにおいて、特に好ましい標的とする。ＣＬＥＣ１２Ａの全長形態は、他のアイソフォームではほとんど存在しない１０個のアミノ酸の更なる細胞内ストレッチを含む、２７５個のアミノ酸残基を含み、厳密な骨髄発現プロファイル（表面発現及びｍＲＮＡレベル）を示す。「ＣＬＥＣ１２Ａ又はその機能的等価物」という用語は、Ｂａｋｋｅｒｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００４，６４，ｐ８４４３−５０及びＭａｒｓｈａｌｌ２００４−ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７９（１５）、ｐ１４７９２−８０２に記載されているように、厳密な骨髄発現プロファイル（表面発現レベル及びｍＲＮＡレベルの両方）を保持する上記で言及される全ての（スプライス及び突然変異などの）変異体及びそのアイソフォームを意味する。本発明のＣＬＥＣ１２Ａ結合抗体は、ヒトＣＬＥＣ１２Ａに結合する。本明細書において、ＣＬＥＣ１２Ａに言及される場合、特に明記しない限り、ヒトＣＬＥＣ１２Ａを指す。

「ＥｒｂＢ１」又は「ＥＧＦＲ」は、Ｈｅｒ−又はｃＥｒｂＢ−１、−２、−３及び−４と命名された４つの受容体チロシンキナーゼ（receptor tyrosine kinase、ＲＴＫ）のファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲは、４つのサブドメインから構成される細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）を有し、これらのドメインのうちの２つは、リガンド結合に関与し、そのうちの１つは、ホモ二量体化及びヘテロ二量体化に関与する。この項で使用される参照番号は、「本明細書で引用された参照文献」との表題が付けられた列挙の番号付けを指す。ＥＧＦＲは、多様な細胞内応答を得るために、様々なリガンドからの細胞外シグナルを統合する。ＥＧＦＲにより活性化される主要シグナル伝達経路は、Ｒａｓマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（mitogen−activated protein kinase、ＭＡＰＫ）有糸分裂シグナル伝達カスケードから構成される。この経路の活性化は、Ｇｒｂ２のチロシンリン酸化ＥＧＦＲへの動員によって開始される。これは、Ｇｒｂ２結合Ｒａｓグアニンヌクレオチド交換因子ＳｏｎｏｆＳｅｖｅｎｌｅｓｓ（ＳＯＳ）を介してＲａｓの活性化をもたらす。加えて、ＰＩ３−キナーゼ−Ａｋｔシグナル伝達経路はまた、ＥＧＦＲによって活性化されるが、この活性化は、Ｈｅｒ３の共発現が存在する場合にははるかに強力である。ＥＧＦＲは、いくつかのヒト上皮悪性腫瘍、特に乳房、膀胱、非小細胞肺がん肺、結腸、卵巣、頭頸部、及び脳のがんに関与している。この遺伝子における活性化突然変異、並びに受容体及びそのリガンドの過剰発現が見出されており、自己分泌活性化ループが生じる。したがって、このＲＴＫは、がん療法の標的として広く使用されている。細胞外リガンド結合ドメインに指向されたＲＴＫ及びモノクローナル抗体（monoclonal antibody、ｍＡｂ）を標的とする小分子阻害剤の両方が開発されてきたが、これは、今までのところは、ほとんどが患者の選択群に関してだが、いくつかの臨床的成功を示している。ヒトＥＧＦＲタンパク質及びそれをコードする遺伝子についてのデータベース登録番号は、（ＧｅｎＢａｎｋＮＭ＿００５２２８．３）である。この登録番号は、主に、ＥＧＦＲタンパク質を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、抗体によって結合されたＥＧＦＲタンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。本明細書において、ＥＧＦＲに言及される場合、特に明記しない限り、ヒトＥＧＦＲを指す。ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、ＥＧＦＲ及びいくつかのＥＧＦＲ陽性腫瘍で発現されたものなどの様々な変異体に結合する。

本明細書で使用するとき、「ＥｒｂＢ−２」又は「ＨＥＲ２」は、ヒトにおいてＥＲＢＢ−２遺伝子によりコードされるタンパク質を指す。この遺伝子又はタンパク質の代替名としては、ＣＤ３４０、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＬＮ１９、ＮＥＵ、ＮＧＬ、ＴＫＲ１が挙げられる。ＥＲＢＢ−２遺伝子は、ＨＥＲ２（human epidermal growth factor receptor 2、ヒト表皮増殖因子受容体２）と呼ばれることが多い。本明細書においてＥｒｂＢ−２に言及する場合、この言及は、ヒトＥｒｂＢ−２を指す。ＥｒｂＢ−２に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒトＥｒｂＢ−２に結合する。ＥｒｂＢ−２抗原結合部位は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトＥｒｂＢ−２タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号の番号は、（ＮＰ＿００１００５８６２．１、ＮＰ＿００４４３９．２、ＮＣ＿００００１７．１０、ＮＴ＿０１０７８３．１５、ＮＣ＿０１８９２８．２）である。この登録番号は、主に、ＥｒｂＢ−２を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、抗体によって結合されたＥｒｂＢ−２タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。ＥｒｂＢ−２抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−２、及びいくつかのＥｒｂＢ−２陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。

本明細書で使用するとき、「ＥｒｂＢ−３」又は「ＨＥＲ３」は、ヒトにおいてＥＲＢＢ−３遺伝子によりコードされるタンパク質を指す。遺伝子又はタンパク質の代替名は、ＨＥＲ３、ＬＣＣＳ２、ＭＤＡ−ＢＦ−１、ｃ−ＥｒｂＢ−３、ｃ−ｅｒｂｂ−３、ｅｒｂｂ−３−Ｓ、ｐ１８０−Ｅｒｂｂ−３、ｐ４５−ｓＥｒｂｂ−３、及びｐ８５−ｓＥｒｂｂ−３である。本明細書においてＥｒｂＢ−３に言及する場合、この言及は、ヒトＥｒｂＢ−３を指す。ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒトＥｒｂＢ−３に結合する。ＥｒｂＢ−３抗原結合部位は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトＥｒｂＢ−３タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号は、（ＮＰ＿００１００５９１５．１、ＮＰ＿００１９７３．２、ＮＣ＿００００１２．１１、ＮＣ＿０１１８９２３．２、ＮＴ＿００２９４１９．１２）である。この登録番号は、主に、ＥｒｂＢ−３を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、抗体によって結合されたＥｒｂＢ−３タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。ＥｒｂＢ−３抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−３、及びいくつかのＥｒｂＢ−２陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。

ＬＧＲ４は、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４である。この遺伝子又はタンパク質の代替名は、ＧＰＲ４８、Ｇタンパク質共役受容体４８、ＢＮＭＤ１７、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４、Ｇタンパク質共役受容体４８である。

ＬＧＲ４に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトＬＧＲ４に結合する。本発明のＬＧＲ４結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトＬＧＲ４タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号の番号は、（ＮＣ＿００００００１１．１０、ＮＣ＿０１８９２２．２、ＮＴ＿００９２３７．１９、ＮＰ＿０６０９６０．２）である。この登録番号は、主に、ＬＧＲ４を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、結合されたＬＧＲ４タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。ＬＧＲ４抗原結合部位は、ＬＧＲ４及びいくつかのＬＧＲ４陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。

ＬＧＲ５は、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５である。この遺伝子又はタンパク質の代替名は、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５、Ｇタンパク質共役受容体ＨＧ３８、Ｇタンパク質共役受容体４９、Ｇタンパク質共役受容体６７、ＧＰＲ６７、ＧＰＲ４９、オーファンＧタンパク質共役受容体ＨＧ３８、Ｇタンパク質共役受容体４９、ＧＰＲ４９、Ｈｇ３８、及びＦＥＸである。

ＬＧＲ５に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトＬＧＲ５に結合する。本発明のＬＧＲ５結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトＬＧＲ５タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号の番号は、（ＮＣ＿００００１２．１２、ＮＴ＿０２９４１９．１３、ＮＣ＿０１８９２３．２、ＮＰ＿００１２６４１５５．１、ＮＰ＿００１２６４１５６．１、ＮＰ＿００３６５８．１）である。この登録番号は、主に、ＬＧＲ５を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、結合されたＬＧＲ５タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。ＬＧＲ５抗原結合部位は、ＬＧＲ５及びいくつかのＬＧＲ５陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。

ＺＮＲＦ３は、ジンク及びリングフィンガー３である。この遺伝子又はタンパク質についての代替名は、ジンク及びリングフィンガー３、ジンク／リングフィンガータンパク質３、リングフィンガータンパク質２０３、ＫＩＡＡ１１３３、ＲＮＦ２０３、新規なＣ３ＨＣ４型ジンクフィンガーフィンガー（リングフィンガー）、Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼＺＮＲＦ３、ＣＴＡ−２９２Ｅ１０．６、ＥＣ６．３．２．、及びＢＫ７４７Ｅ２．３３である。

ＺＮＲＦ３に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトＺＮＲＦ３に結合する。本発明のＺＮＲＦ３結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトＺＮＲＦ３タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号の番号は、（ＮＣ＿００００２２．１１、ＮＴ＿００１１５２０．１３、ＮＣ＿０１８９３３．２、ＮＰ＿００１１９３９２７．１、ＮＰ＿１１５５４９．２）である。この登録番号は、主に、ＺＮＲＦ３を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、結合されたＺＮＲＦ３タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。ＺＮＲＦ３抗原結合部位は、ＺＮＲＦ３及びいくつかのＺＮＲＦ３陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。

ＲＮＦ４３は、リングフィンガータンパク質４３である。この遺伝子又はタンパク質の代替名は、リングフィンガータンパク質４３、ＲＮＦ１２４、Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼＲＮＦ４３、リングフィンガータンパク質４３、ＥＣ６．３．２．、ＵＲＣＣである。

ＲＮＦ４３に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトＲＮＦ４３に結合する。本発明のＲＮＦ４３結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳類のオルソログとの間の配列及び三次構造類似性に起因して、そのようなオルソログにも結合するが、必ずしもそうではなくてもよい。ヒトＲＮＦ４３タンパク質及びそれをコードする遺伝子に対するデータベース登録番号の番号は、（ＮＣ＿００００１７．１１、ＮＴ＿０１０７８３．１６、ＮＣ＿０１８９２８．２、ＮＰ＿００１２９２４７３．１、ＮＰ＿００１２９２４７４．１、ＮＰ＿０６０２３３．３）である。この登録番号は、主に、ＲＮＦ４３を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、結合されたＲＮＦ４３タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。ＲＮＦ４３抗原結合部位は、ＲＮＦ４３及びいくつかのＲＮＦ４３陽性腫瘍細胞によって発現されるものなどの様々なその変異体に結合する。

配列識別子を参照して、どのタンパク質が標的化されているかを特定する。本発明の抗体などの結合分子はまた、抗体のそれぞれの可変ドメインによって認識されるエピトープが影響を受けていない限り、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、及びその突然変異体などの、少なくともいくつかの変異体も認識する。代替名のいくつかは、他のタンパク質を参照するために使用されてもよく、又は使用されなくてもよい。名称は、参照目的のためのみに与えられる。本発明の抗体などの結合分子は、細胞上で発現されるとき、タンパク質に結合する。これは、結合分子が結合するエピトープが利用可能である限り、タンパク質の変異体に結合することもできる。したがって、スプライス変異体又は突然変異体タンパク質（存在する場合）も、エピトープが利用可能である限り、結合される。結合分子が示されたタンパク質に結合するという事実は、これが特性としてタンパク質に結合することができることを意味し、結合分子がそうであっても、結合分子が実際に標的に結合していることを意味するものではない。また、抗体が他のタンパク質に結合しないことも意味しない。このような交差反応性は、本発明の抗体などの結合分子に関しては現時点では知られていない。しかしながら、このような交差反応性が存在し得ることは明示的に除外されない。

本発明は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分（第１の膜タンパク質）及び第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる結合分子を開示する。第２の膜タンパク質は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。このような結合分子は更に、「本発明の結合分子」とも称される。結合分子は、好ましくは結合タンパク質である。好ましい実施形態では、結合分子は、抗体又はその変異体、好ましくは二重特異性抗体又はその変異体である。本明細書に記載の結合分子を２つ以上含む組成物及びキットオブパーツも提供される。

本発明の結合分子は、好ましくは、抗体（又は、本願の他の箇所に記載されるようなその変異体）、抗体模倣体、ポリペプチド、アプタマー、又はこれらの組み合わせである。これらのタンパク質又はアプタマーは、典型的には、１つの標的に結合する。本発明の結合分子は、２つ以上の標的に結合する。結合分子は、好ましくは、２つの標的に結合する。抗体又は二重特異性抗体の変異体は、この態様を維持する。結合タンパク質又はアプタマーは、標的が結合している結合部位（抗原結合部位）を有する。結合タンパク質又はアプタマーは、好ましくは、標的（抗原）の結合部位、好ましくはドメイン当たり１つの結合部位を有する２つ以上のドメインを含む。このようなドメインは、好ましくは抗体可変ドメイン又はその変異体である。抗体可変ドメインは、多くの研究の対象であった。正常な可変ドメインの結合特異性を保持する可変ドメイン又はその部分に類似する多くの変異体が作製される。このような変異体の非限定的な例は、本明細書の他の箇所に記載されている。

これらの抗体、抗体模倣体、ポリペプチド及びアプタマーの任意の組み合わせは、当該技術分野において既知の方法によって一緒に連結され得ることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、コンジュゲート又は融合タンパク質である。抗体については、多重特異性抗体を作製する技術が、正常な単一特異性抗体と同じ全体構造を有する二重特異性抗体も含むように進行しているが、抗体の２つのアームはそれぞれ異なる標的に結合する。

抗体模倣体は、抗体と同様に、抗原に特異的に結合することができるが、抗体に構造的に関連しないポリペプチドである。抗体模倣体は、通常、約３〜２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチド又はタンパク質である。抗体に対する共通の利点は、より良好な溶解性、組織浸透、熱及び酵素に対する安定性、並びに比較的低い生産コストである。抗体模倣体の非限定的な例は、アフィボディ分子（典型的には、プロテインＡのＺドメインに基づく）、アフィリン（典型的には、ガンマ−Ｂ結晶質又はユビキチンに基づく）、アフィマー（典型的には、シスタチンに基づく）、アフィチン（典型的には、スルホロブス・アシドカルダリス（Sulfolobus acidocaldarius）からのＳａｃ７ｄに基づく）、アルファボディ（典型的には、三重螺旋コイルドコイルに基づく）、アンチカリン（典型的には、リポカリンに基づく）、アビマー（典型的には、様々な膜受容体のＡドメインに基づく）、ＤＡＲＰｉｎ（典型的にはアンキリン反復モチーフに基づく）、フィノマー（典型的にはＦｙｎ７のＳＨ３ドメインに基づく）、ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド（典型的には、様々なプロテアーゼ阻害剤のＫｕｎｉｔｚドメインに基づく）、及びモノボディ（典型的にはフィブロネクチンのＩＩＩ型ドメインに基づく）である。

モノボディは、分子スカフォールドとしてフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（fibronectin type III domain、ＦＮ３）を使用して構築される合成結合タンパク質である。モノボディは、標的結合タンパク質を作製するための抗体の単純かつロバストな代替物である。「モノボディ」という用語は、ヒトフィブロネクチンの第１０のＦｎ３ドメインを使用して、モノボディ概念を実証する最初の論文を公開したＫｏｉｄｅのグループによって、１９９８年に作り出された。

モノボディ及び他の抗体模倣体は、典型的には、スキャフォールドの部分が、分子ディスプレイ及びファージディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、及び酵母表面ディスプレイなどの指向進化技術を使用して多様化されるコンビナトリアルライブラリーから生成される。多数の抗体模倣体は、それらのそれぞれの標的に対して高い親和性及び高い特異性を有する。

アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチド又はペプチド分子である。アプタマーは、通常、大きなランダム配列プールから選択することによって作製されるが、天然アプタマーもリボスイッチ中に存在する。アプタマーは、巨大分子として基本研究及び臨床目的の両方に使用することができる。

本明細書で使用するとき、用語「コンジュゲート」は、任意選択的に連結領域によって共有結合された２つ以上の分子を指す。例えば、いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、連結領域によって第２のタンパク質又は非タンパク質部分に結合された第１のタンパク質又は非タンパク質部分である。例えば、本発明の結合分子のいくつかの実施形態では、これは、共有結合された２つ以上の抗体を含むか、又はそれからなる。コンジュゲートは、第１及び第２の部分に限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、更なる連結領域によって結合された第３、第４、又はそれ以上の部分を有してもよい。本出願の他の箇所に記載されるように、タンパク質部分の例としては、ポリペプチド、ペプチド模倣体、又は抗体（若しくは本出願の他の箇所に記載されるような、抗体部分、派生体、又は類似体）が挙げられるが、これらに限定されない。非タンパク質部分の例としては、アプタマーが挙げられるが、これに限定されない。多くの種類のリンカーを使用することができ、リンカーは、コンジュゲート中の分子型及びリンカーの所望の特性（長さ、可撓性、プロテアーゼ活性に対する耐性、及び他の類似の特性）に応じて適切であるように選択される。このようなリンカーは、ヌクレオチド、ポリペプチド、又は好適な合成材料を含み得る。例えば、リンカーは、可撓性ペプチドリンカーであってもよい。ある特定の実施形態では、リンカーは開裂可能なリンカーであってもよく、コンジュゲートの部分を互いに分離させることができる。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、螺旋状リンカーであってもよい。タンパク質及び他の分子を連結するための様々な例及びキットが、当該技術分野において既知である。本明細書で使用するとき、用語「融合タンパク質」は、組換えによってＤＮＡレベルで結合され、単一のポリペプチドとして一緒に発現される、２つ以上のポリペプチド又はタンパク質を含むタンパク質を指す。融合タンパク質はまた、ＤＮＡによりコードされ、融合タンパク質と共に発現されるペプチド連結領域も含み得る。融合タンパク質の一部であるペプチドリンカーは、可撓性、親水性、プロテアーゼ耐性、開裂性などの特定の特性を有するように設計され得る。これらの全ての特性は、ＤＮＡ配列内に設計することができ、リンカーを設計するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、抗体は、当該技術分野において周知の方法によって一緒に連結されることができ、本明細書に記載されるように、二重特異性又は多重標的化抗体を形成することができる。更に、二重特異性抗体は、例えば、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）などの技術を使用することによって、当該技術分野において既知の様々な方法によって構築することができる（例えば、国際公開第２０１３／１５７９５４号を参照されたい）。二重特異性モノクローナル抗体（bispecific monoclonal antibody、ＢｓＭＡｂ、ＢｓＡｂ）は、典型的には、２つの異なるモノクローナル抗体の結合ドメインを含み、その結果、２つの異なるエピトープに結合する。Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）分子だけでなく、他の全長ＩｇＧの二重特異性抗体はｓｃＦｖのＦａｂの全長ＩｇＧ分子の２つの異なる可変領域によってコードされる２つの異なる抗原結合特異性を有する。Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）は、本明細書の他の箇所に詳述されるように、２つの異なる共通軽鎖（common light chain、ｃＬＣ）抗体をコードする遺伝子構築物と個々の細胞との共トランスフェクションによって生成することができる。ＣＨ３工学は、本質的に純粋な二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量化及び形成を確実にする。

本発明の結合分子は、好ましくは、抗体又はその変異体である。本発明の結合分子は、好ましくは、二重特異性抗体又はその変異体である。

抗体は、典型的には、いわゆる抗原結合部位を介してそれらの標的に結合する。未修飾抗原結合部位は、典型的には、抗体の可変ドメインによって形成され、それに存在する。可変ドメインは、抗原結合部位を含有する。抗原に結合する可変ドメインは、抗原に結合する抗原結合部位を含む可変ドメインである。

一実施形態では、抗体可変ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。抗原結合部位は、組み合わされたＶＨ／ＶＬ可変ドメイン、又はＶＨ領域のみ、又はＶＬ領域のみに存在し得る。抗原結合部位が可変ドメインの２つの領域のうちの１つに存在する場合、対応する可変領域は、結合可変領域の折り畳み及び／又は安定性に寄与し得るが、抗原自体の結合にそれほど寄与しない。

本明細書で使用するとき、抗原結合は、抗体のその抗原に対する典型的な結合能力を指す。抗体の抗原に対する結合は、様々な方法で評価することができる。１つの方法は、抗体を抗原（好ましくは、抗原を発現する細胞）とインキュベートし、未結合の抗体を除去し（好ましくは、洗浄工程によって）、結合した抗体に結合する標識抗体によって結合抗体を検出することである。

抗体による抗原結合は、典型的には、抗体の相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）及び抗原及び可変ドメインの両方の特定の三次元構造を介して介在され、これらの２つの構造が、タンパク質のランダムで非特異的な粘着とは対照的に、正確に一緒に結合する（ロックとキーとに類似した相互作用）ことを可能にする。抗体は、典型的には、抗原のエピトープと呼ばれる抗原の一部を認識し、このようなエピトープは他の化合物中に同様に存在してもよく、本発明による抗体は、このような他の化合物が同じエピトープを含有する場合にも、他のタンパク質も同様に認識し得る。したがって、用語「結合」は、同じエピトープを含有する別の１つ又は複数のタンパク質に対する抗体の結合を排除するものではない。このような他のタンパク質（複数可）は、好ましくはヒトタンパク質ではない。

抗体などの本発明のタンパク質は、典型的には、出生後、好ましくは成人ヒトにおける細胞膜上の特定の標的タンパク質以外の他のタンパク質に結合しない。

本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、好ましくは、抗原上のエピトープに結合する１つ以上の可変ドメインを含有するタンパク質の免疫グロブリンクラスに属するタンパク質分子を意味し、このようなドメインは、抗体の可変ドメインに由来するか又は配列相同性を共有する。治療用の抗体は、好ましくは、可能な限り治療される対象の天然抗体（例えば、ヒト対象のヒト抗体）に近いものである。抗体結合は、特異性及び親和性の観点から表すことができる。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されているかを決定する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強度についての尺度である。好ましくは、本発明による抗体の別個のアームの親和性は、ナノモル範囲である。本発明の二重特異性抗体などの抗体は、典型的には、天然抗体の定常ドメイン（Ｆｃ部分）を含み、これは、例えば、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を低減するために、本明細書の他の箇所に記載されるように遺伝子操作され得る。本発明の抗体は、典型的には、二重特異性完全長抗体、好ましくはヒトＩｇＧサブクラスである。

「可変ドメイン」、「ＶＨ／ＶＬ対」、「ＶＨ／ＶＬ」という用語は、本明細書では互換的に使用される。可変ドメインは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域から構成される。重鎖の可変領域は、典型的には、再構成されたＶＤＪ領域によって形成される。軽鎖の可変領域は、典型的には、再構成されたＶＪ領域によって形成される。ＶＤＪ／ＶＪ領域は、ここで、例えば、機能的抗体の利用可能である多数の配列情報を使用して、人工的に生成され得る。

いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、ＣＤ１３７に結合することができる抗原結合部位と、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる抗原結合部位とを含む。

いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、２つ以下の抗原結合部位を有する。これは、このような結合分子又は抗体若しくは変異体の抗原結合部分が、追加の抗原結合部位の存在なしに、２つの抗原結合部位からなることを意味する。２つの抗原結合部位のそれぞれは、好ましくは、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対を含有する。好ましくは、本発明の結合分子又は抗体若しくは変異体の抗原結合部分は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインと、第２の膜タンパク質に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる。特定の好ましい実施形態は、ＩｇＧフォーマットを有する免疫グロブリンであり、本発明による二価結合分子／抗体／変異体の半減期が、典型的に多価化合物と比較して長いという利点を提供する。更に、本発明による二価結合分子の免疫原性は、典型的に多価化合物と比較して低い。これらの実施形態による分子／抗体／変異体は、好ましくは、天然ＩｇＧの構造を維持し、したがって天然ＩｇＧの構造に関連する全ての利益を維持する。

本明細書で使用するとき、用語「多価」は、３つ以上の特異性を包含し、これは、例えば、三価及び四価の結合分子内に存在する。

いくつかの実施形態は、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体を提供し、結合分子又は抗体若しくは変異体の抗原結合部位は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる１つの抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体の抗原結合部位は、ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる１つの抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位とからなる。いくつかの実施形態では、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体の抗原結合部位は、ＣＤ１３７に結合することができる１つの抗原結合部位と、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる１つの抗原結合部位とからなる。

本明細書で使用するとき、用語「抗原結合部位」は、抗原のエピトープに特異的に結合する結合分子又は抗体の部位を意味する。このような抗原結合部位は、好ましくは、抗体の可変ドメイン、特にそのＣＤＲ領域との配列相同性に由来するか、又はそれを共有する。いくつかの好ましい実施形態では、抗原結合部位は、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対によって形成される免疫グロブリン可変ドメインである。他の実施形態では、抗原結合部位は、例えば、本明細書で前に記載される、アフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（fynomer）、ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、又はモノボディなどの抗体模倣体に由来する。

本発明の抗体は、好ましくは「完全長」抗体である。本発明による用語「完全長」は、例えば、更なる抗原結合部位又は追加の活性化部位若しくは追加のリガンド又は追加のリガンド結合部分などの、２０個を超えるアミノ酸残基より大きいサイズを有する１つ以上の人工的に付加された部分を含まない、本質的に完全な抗体を含むものとして定義される。しかしながら、完全長抗体は、インタクトな抗体の全ての機能を必ずしも有さない。誤解を避けるために、完全長抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。各鎖は、定常（Ｃ）領域及び可変（Ｖ）領域を含有し、これは重鎖についてのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ及び軽鎖についてのＣＬ、ＶＬと表示されるドメインに分解することができる。重鎖のドメインは、好ましくは、天然抗体の順序で存在する（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；すなわち、ＶＨドメインがＣＨ１ドメインに隣接し、ＣＨ２ドメインが続き、その後ＣＨ３ドメインが続くことを意味する）。軽鎖のドメインもまた、好ましくは、天然抗体の順序で存在する（ＶＬ−ＣＬ；すなわち、ＶＬドメインがＣＬドメインに隣接することを意味する）。抗体は、Ｆａｂ断片部分に含まれる可変ドメインを介して抗原に結合する。抗体は、大部分がＦｃ部分を通って、定常ドメインを介して免疫系の分子及び細胞と相互作用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ,、好ましくは全長ＩｇＧである。完全長ＩｇＧ抗体は、それらの典型的には好ましい半減期、及び免疫原性の理由から完全な自家（ヒト）分子に近いままであるという要望のために好ましい。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、完全長ＩｇＧ１、完全長ＩｇＧ２、完全長ＩｇＧ３、又は完全長ＩｇＧ４抗体である。

本発明による完全長抗体は、所望の特性を提供するか、又は元の鎖内のものの代替物のみを提供する変異が存在し得る抗体を包含する。このような変異は、領域のうちのいずれかの実質的な部分の欠失であるべきではない。しかしながら、得られる抗体の抗原結合特性を本質的に変化させることなく、１つ又はいくつかのアミノ酸残基が酸挿入され、欠失され、置換され、又はこれらの組み合わせが行われている抗体は、用語「完全長抗体」内に包含される。例えば、ＩｇＧ抗体は、定常領域において、１〜２０個のアミノ酸残基挿入、置換、欠失、又はこれらの組み合わせを有することができる。

本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体である。好ましい実施形態では、これは、エフェクター機能が低減された二重特異性ＩｇＧ抗体である。本発明の好ましい実施形態では、抗体は、本発明の抗体は、二重特異性完全長抗体である。本発明の抗体は、好ましくは、エフェクター機能を低減するために、好ましくはＣＨ２／下部ヒンジ領域で変異した二重特異性完全長ＩｇＧ抗体である。エフェクター機能を低減するためにＣＨ２／下部ヒンジ領域で変異したＩｇＧ１は、人間でのその長い循環半減期に基づいて有利である。ヒトにおける任意の免疫原性を予防するために、本発明による二重特異性抗体は、ヒト抗体であることが好ましい。

用語「二重特異性」（bispecific、ｂｓ）は、抗体の１つの部分（上記で定義したような）が抗原上の１つのエピトープに結合する一方で、第２の部分は、同じ抗原、又は異なる抗原上のいずれかの異なるエピトープに結合することを意味する。異なるエピトープは、典型的には、異なる抗原上に存在する。しかしながら、異なるエピトープは、同じ抗原上に存在してもよい。本発明によれば、第１及び第２の抗原は、実際には２つの異なるタンパク質である。好ましい二重特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体の部分を含む抗体であり、その結果、２つの異なるエピトープ、好ましくは２つの異なる抗原に結合することができる。二重特異性抗体によって認識される２つの抗原の発現レベル、（サブ）細胞局在及び化学量論に依存して、抗体の両方のＦａｂアームは、それらのエピトープに同時に結合しても、又は結合しなくてもよい。二重特異性抗体の１つのアームは、典型的には、１つの抗体の可変ドメインを含有し、他方のアームは、別の抗体の可変ドメインを含有する（すなわち、二重特異性抗体の１つのアームは、１つの軽鎖と対をなす１つの重鎖によって形成されるのに対し、他方のアームは軽鎖と対になった異なる重鎖によって形成される）。本発明の二重特異性抗体の重鎖可変領域は、典型的には互いに異なるのに対し、軽鎖可変領域は、好ましくは、本発明の二重特異性抗体において同じである。異なる重鎖可変領域が同じ又は共通の軽鎖可変領域と関連付けられている二重特異性抗体は、共通軽鎖可変領域（common light chain variable region、ｃＬｃｖ）を有する二重特異性抗体とも称される。軽鎖定常領域も同じであることが好ましい。このような二重特異性抗体は、共通軽鎖（ｃＬｃ）を有するものと称される。したがって、両方のアームが共通軽鎖を含む、本発明による二重特異性抗体が更に提供される。

本明細書に記載される二重特異性抗体は、好ましくは、共通軽鎖可変ドメイン、好ましくは共通軽鎖を含む。本発明による用語「共通軽鎖」は、完全長抗体の結合特異性が影響を受けない一方で、同一であってもよく、又はいくつかのアミノ酸配列差を有し得る軽鎖を指す。例えば、保存的アミノ酸の変化、重鎖と対をなすときに結合特異性に寄与しないか、部分的にのみ寄与する領域におけるアミノ酸の変化などを導入し試験することによって、同一ではないが依然として機能的に同等である軽鎖を調製し又は見出すことが、本明細書に使用される共通軽鎖の定義の範囲内で可能である。用語「共通軽鎖」、「共通ＬＣ」、「ｃＬＣ」、「単一軽鎖」は、用語「再構成」が付加されて、又は付加されずに、全てが本明細書で互換的に使用される。用語「共通軽鎖可変領域」、「共通ＶＬ」、「共通ＬＣｖ」、「ｃＬＣｖ」、「単一ＶＬ」は、用語「再構成」が付加されて、又は付加されずに、全てが本明細書で互換的に使用される。二重特異性抗体が、少なくとも２つの、好ましくは異なる結合特異性の複数の重鎖（可変領域）に結合して、機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成することができる共通軽鎖（可変領域）を有することが、本発明の好ましい態様である（国際公開第２００４／００９６１８号、国際公開第２００９／１５７７７１号）。共通軽鎖（可変領域）は、ヒト軽鎖（可変領域）であることが好ましい。共通軽鎖（可変領域）は、好ましくは生殖細胞系列配列を有する。好ましい生殖細胞系列配列は、ヒトレパートリーで頻繁に使用され、良好な熱力学的安定性、収率、及び溶解度を有する軽鎖可変領域である。好ましい生殖細胞系列軽鎖は、Ｏ１２である。共通軽鎖は、好ましくは、再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１（図１Ａ）である。共通軽鎖可変領域は、好ましくは、再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１の可変領域である。共通軽鎖は、好ましくは、０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、図１Ｂ、又は１Ｄに示されるような軽鎖可変領域を含む。共通軽鎖は、好ましくは、軽鎖定常領域、好ましくはカッパ軽鎖定常領域を更に含む。共通軽鎖をコードする核酸は、共通軽鎖タンパク質を発現するために使用される細胞系に対してコドン最適化され得る。コード核酸は、生殖細胞系列核酸配列から逸脱し得る。

好ましい実施形態では、軽鎖は、０〜１０個の、好ましくは０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、図１Ａに示されるようなＯ１２／ＩｇＶκ１−３９^＊０１遺伝子セグメントのアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。語句「Ｏ１２軽鎖」は、０〜１０個の、好ましくは０〜５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、図１Ａに示されるようなＯ１２／ＩｇＶκ１−３９^＊０１遺伝子セグメントのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む軽鎖」についての短縮形として本明細書全体を通して使用されるであろう。ＩｇＶκ１−３９は、免疫グロブリン可変カッパ１−３９遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変１−３９、ＩＧＫＶ１３９、ＩＧＫＶ１−３９、Ｏ１２ａ又はＯ１２としても知られている。この遺伝因子についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：５７４０、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：２８９３０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４２３７１である。ＩｇＶκ１−３９の好ましいアミノ酸配列を図１Ｅに示す。これはＶ領域の配列を列挙している。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。図１Ｂ及び１Ｄは、Ｊ領域と組み合わせたＩｇＶκ１−３９についての２つの好ましい配列を記載している。結合された配列は、ＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ１及びＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ５として示され、代替名は、ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１又はＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ５^＊０１である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇでのＩＭＧＴデータベースの世界的なウェブによる命名法）。

軽鎖可変領域を含むＯ１２／ＩｇＶκ１−３９^＊０１は生殖細胞系列配列であることが好ましい。軽鎖可変領域を含むＩＧＪκ^＊０１又は／ＩＧＪκ５^＊０１は、生殖細胞系列配列であることが更に好ましい。好ましい実施形態では、ＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ１又はＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ５軽鎖可変領域は、生殖細胞系列配列である。

好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、生殖細胞系列Ｏ１２／ＩｇＶκ１−３９^＊０１を含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１又はＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ５^＊０１を含む。好ましい実施形態では、ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１である。軽鎖可変領域は、生殖細胞系列カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１又は生殖細胞系列カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ５^＊０１、好ましくは生殖細胞系列ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１を含む。

Ｏ１２軽鎖を有する抗体を産生する成熟Ｂ細胞は、多くの場合、生殖細胞系列配列に対して１つ以上の突然変異を受けた軽鎖、すなわち、生物の非リンパ系細胞における正常な配列を産生する。これらの変異に関与するプロセスは、体細胞（超）変異と呼ばれることが多い。得られた軽鎖は、親和性成熟した軽鎖と呼ばれる。このような軽鎖は、Ｏ１２生殖細胞系列配列に由来するとき、Ｏ１２由来の軽鎖である。本明細書では、語句「Ｏ１２軽鎖」は、Ｏ１２由来の軽鎖を含むであろう。体細胞超変異により導入される突然変異は、当然ながら、研究室でも人工的に導入され得る。研究室では、また量に関係なく、同種のやり方で軽鎖の特性に影響を及ぼすことなく他の変異も導入することができる。軽鎖は、これが０〜１０個の、好ましくは０〜５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する図１Ａ、図１Ｂ；図１Ｄ又は図１Ｅに示された配列を含む場合、少なくともＯ１２軽鎖である。好ましい実施形態では、Ｏ１２軽鎖は、０〜９個、０〜８個、０〜７個、０〜６個、０〜５個、０〜４個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する図１Ａ；図１Ｂ；図１Ｄ又は図１Ｅに示された配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、Ｏ１２軽鎖は、０〜５個、好ましくは０〜４個、より好ましくは０〜３個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する図１Ａ；図１Ｂ；図１Ｄ又は図１Ｅに示された配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、Ｏ１２軽鎖は、０〜２個、より好ましくは０〜１個、最も好ましくは０個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する図１Ａ；図１Ｂ；図１Ｄ又は図１Ｅに示された配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、Ｏ１２軽鎖は、前述のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する図１Ａ又は図１Ｂに示された配列を含む軽鎖である。好ましい実施形態では、軽鎖は、図１Ａの配列を含む。好ましい実施形態では、軽鎖可変領域は、図１Ｂの配列を含む。

共通軽鎖（可変領域）はラムダ軽鎖であってもよく、したがって、これは本発明の文脈でも提供されるが、カッパ軽鎖が好ましい。本発明の共通軽鎖の定常部分は、カッパ又はラムダ軽鎖の定常領域であり得る。これは、好ましくは、カッパ軽鎖の定常領域であり、好ましくは、共通軽鎖は生殖細胞系列軽鎖であり、好ましくは、ＩｇＶＫＩ−３９遺伝子断片を含む再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖であり、最も好ましくは、再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶＫＩ−３９^＊０１／ＩＧＪＫＩ^＊０１（図１）である。再構成された生殖細胞系ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１、ＩＧＫＶ１−３９／ＩＧＫＪ１、ｈｕＶκ１−３９軽鎖、又は短縮形のｈｕＶκ１−３９、又は単に１−３９という用語は、本願全体にわたって互換的に使用される。明らかに、当業者は、「共通」とは、アミノ酸配列が同一ではない軽鎖の機能的等価物を指すことを認識するであろう。軽鎖の多くの変異体が存在し、機能的結合領域の形成に影響を与えない変異（欠失、置換、付加）が存在する。

ＩｇＶκ１−３９は、免疫グロブリン可変カッパ１−３９遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変１−３９、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ１−３９、Ｏ１２ａ又はＯ１２としても知られている。この遺伝因子についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：５７４０、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ：２８９３０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４２３７１である。ＩｇＶκ１−３９の好ましいアミノ酸配列を図１に示す。これはＶ領域の配列を列挙している。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。図１は、Ｊ領域と組み合わせたＩｇＶκ１−３９についての２つの好ましい配列を記載している。結合された配列は、ＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ１及びＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ５として示され、代替名は、ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１又はＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ５^＊０１である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇでのＩＭＧＴデータベースの世界的なウェブによる命名法）。

共通軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖定常領域に結合することが好ましい。好ましい実施形態では、軽鎖は、カッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１又はＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ５^＊０１を含む。好ましい実施形態では、ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１である。

共通軽鎖を産生する細胞は、例えば、再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１及びラムダ定常領域に融合された前述の軽鎖の可変領域を含む軽鎖を産生することができる。

本明細書に記載される二重特異性抗体又はその変異体は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する１つの重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＶＨ／ＶＬ）の組み合わせ、及び第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合する第２のＶＨ／ＶＬの組み合わせを有し、第２の膜タンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。

本明細書に記載される二重特異性抗体又はその変異体は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する１つの重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＶＨ／ＶＬ）の組み合わせ、及びＢ７ファイミリーのメンバーの細胞外部分に結合する第２のＶＨ／ＶＬの組み合わせを有する。本明細書に記載されるように、これは、Ｂ７ファミリーメンバーがリンパ球に「共刺激」又は「共抑制」シグナルを送達し、それによって免疫応答を増強又は減衰させるので、所望の免疫応答が特に良好に促進され得るという利点を提供する。したがって、Ｂ７ファミリーのメンバーを標的化することによって、刺激性シグナルを増強すること、及び／又は抑制性シグナルを相殺することが可能であり、それによって、例えば異常細胞に対して所望の免疫応答を誘導又は増強することが可能である。

好ましい実施形態では、第１のＶＨ／ＶＬの組み合わせにおけるＶＬは、第２のＶＨ／ＶＬの組み合わせにおけるＶＬと類似している。より好ましい実施形態では、第１及び第２のＶＨ／ＶＬの組み合わせにおけるＶＬは同一である。好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する１つの重／軽（Ｈ／Ｌ）鎖の組み合わせと、Ｂ７ファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する１つのＨ／Ｌ鎖の組み合わせを有する完全長抗体である。好ましい実施形態では、第１のＨ／Ｌ鎖の組み合わせにおける軽鎖は、第２のＨ／Ｌ鎖の組み合わせにおける軽鎖と類似している。より好ましい実施形態では、第１及び第２のＨ／Ｌ鎖の組み合わせにおける軽鎖は同一である。

二重特異性抗体の産生、又はその逆に、単一特異性抗体の産生に有利であるいくつかの方法が公開されている。本発明において、細胞が、対応の単一特異性抗体の産生よりも、二重特異性抗体の産生を好むことが好ましい。このようなものは、典型的には、重鎖の定常領域を、これらがホモ二量体化よりもヘテロ二量体化（すなわち、他の重鎖／軽鎖の組み合わせの重鎖と二量体化）を好むように修飾することによって達成される。好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する２つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む。様々な適合性ヘテロ二量体化ドメインが、当該技術分野において記載されている。この適合性ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、適合性免疫グロブリン重鎖ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインである。野生型ＣＨ３ドメインが使用される場合、２つの異なる重鎖（Ａ及びＢ）と共通軽鎖との共発現は、３つの異なる抗体種、ＡＡ、ＡＢ及びＢＢをもたらすであろう。ＡＡ及びＢＢは、２つの単一特異性二価抗体の表記であり、ＡＢは二重特異性抗体の表記である。所望の二重特異性生成物（ＡＢ）の割合を増加させるために、ＣＨ３遺伝子操作を使用することができ、又は言い換えれば、以下に定義されるように、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する重鎖を使用することができる。当該技術分野では、重鎖のこのようなヘテロ二量体化が達成され得る様々な方法が記載されている。１つの方法は、二重特異性抗体に「ノブイントゥホール（knob into hole）」を生成することである。米国特許出願公開第２００３００７８３８５号（Ａｒａｔｈｏｏｎｅｔａｌ．）を参照されたい。

本明細書で使用するとき、用語「適合性ヘテロ二量体化ドメイン」は、遺伝子操作ドメインＡ’が遺伝子操作ドメインＢ’を有するヘテロ二量体を優先的に形成し、逆もまた同様であり、Ａ’−Ａ’とＢ’−Ｂ’との間のホモ二量体化が減少するように遺伝子操作を受けたタンパク質ドメインを指す。

米国特許出願第１３／８６６，７４７号（現在、米国特許第９，２４８，１８１号として発行）、米国特許出願第１４／０８１，８４８号（現在、米国特許第９，３５８，２８６号として発行）、及びＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９４（国際公開第２０１３／１５７９５４号として公開）；参照により本明細書に組み込まれる）において、適合性ヘテロ二量体化ドメインを使用して二重特異性抗体を産生するための方法及び手段が開示されている。本発明では、これらの手段及び方法を好適に採用することができる。具体的には、本発明の二重特異性抗体は、本質的に二重特異性完全長ＩｇＧ分子のみを産生するための突然変異を含むことが好ましい。好ましい突然変異は、第１のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ番号付け）（「ＫＫ−変異体」重鎖）、及び第２のドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（「ＤＥ−変異体」重鎖）、又はその逆である。ＤＥ−変異体及びＫＫ−変異体が優先的に対をなして、ヘテロ二量体（いわゆる「ＤＥＫＫ」二重特異性分子）を形成することが、本発明者らの米国特許第９，２４８，１８１号及び同第９，３５８，２８６号の特許、並びに国際公開第２０１３／１５７９５４号で以前に実証されている。ＤＥ−変異体重鎖のホモ二量体化（ＤＥＤＥホモ二量体）は、同一の重鎖間のＣＨ３−ＣＨ３界面における荷電残基間の反発力のために、ほとんど発生しない。

二重特異性抗体は、軽鎖をコードする１つ又は複数のプラスミドと、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量化及び形成を確実にするようにＣＨ３遺伝子操作された２つの異なる重鎖との（一過性）トランスフェクションによって生成することができる。単一細胞におけるこれらの鎖の産生は、単一特異性抗体の形成によりも二重特異性抗体の有利な形成をもたらす。二重特異性完全長ＩｇＧ１分子のみを本質的に生成するのに好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメイン中の３５１及び３６６位でのアミノ酸置換、例えばＬ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ番号付けに従っての番号付け）（「ＫＫ−変異体」重鎖）、及び第２のＣＨ３ドメイン中の３５１及び３６８位でのアミノ酸置換、例えばＬ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（「ＤＥ−変異体」重鎖）、又はその逆である。

一実施形態では、ＣＤ１３７に結合する可変ドメインを含む重鎖／軽鎖の組み合わせは、重鎖のＤＥ変異体を含む。この実施形態では、ＣＤ１３７以外の抗原に結合することができる可変ドメインを含む重鎖／軽鎖の組み合わせは、重鎖のＫＫ変異体を含む。本発明の一実施形態はまた、ＣＤ１３７に結合する可変ドメインを含んでもよく、重鎖のＫＫ変異体、並びにＣＤ１３７以外の抗原に結合することができる可変ドメインとのヘテロ二量体化を促進するために使用される当業者に既知の他の変形形態を含むことが認識されるであろう。

Ｆｃ領域は、補体依存性細胞傷害性（complement−dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害性（antibody−dependent cellular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）、及び抗体依存性細胞貪食作用（antibody−dependent cell phagocytosis、ＡＤＣＰ）などの抗体のエフェクター機能を媒介する。治療用抗体又はＦｃ融合タンパク質用途に応じて、エフェクター機能を低減又は増加させることのいずれかが望ましい場合がある。本発明では、低減されたエフェクター機能が好ましい。本発明のいくつかの実施形態のように、免疫応答が活性化、増強、又は刺激されるべき場合、エフェクター機能の低減が望まれ得る。エフェクター機能を低減した抗体を使用して、とりわけ免疫細胞の細胞表面分子を標的化することができる。

ＩｇＧのＦｃγＲｓ又はＣ１ｑへの結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン内に位置する残基を必要とすることが見出されている。ＣＨ２ドメインの２つの領域（図２Ｄ）は、ＦｃγＲｓ及びＣ１ｑ結合に関連する。ヒトＩｇＧ１中への２３３〜２３６位におけるＩｇＧ２残基及び３２７、３３０及び３３１位におけるＩｇＧ４残基の置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低減することが示されている（Ａｒｍｏｕｒｅｔａｌ．，１９９９．ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３−２４；Ｓｈｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，２００１．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６０４）。更に、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、Ｋ３２２を含む異なる位置でのアラニン置換が、補体活性化有意に低減させることを示した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅｅｔａｌ．，２０００．ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８−８４）。

それらのエフェクター機能の低減により、ＩｇＧ４抗体は、細胞枯渇なしの受容体ブロッキングのためのＩｇＧサブクラスを表す。ＩｇＧ４分子は、Ｆａｂアーム交換と称される動的プロセスで半分子を交換することができる。この現象は、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４との間で生じ得る。Ｓ２２８Ｐ変異は、Ｆａｂアーム交換に対する能力の低減を確実にする変異の例である。（Ｌａｂｒｉｊｎ．ｅｔａｌ．，２００９．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（８）：７６７−７１）。

エフェクター機能が低減された抗体は、好ましくは、修飾されたＣＨ２／下部ヒンジ領域を含むＩｇＧ抗体であり、例えば、Ｆｃ受容体相互作用を低減するか、又はＣ１ｑ結合を低減する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、二重特異性ＩｇＧ抗体とＦｃガンマ受容体との相互作用が低減されるように、変異体ＣＨ２及び／又は下部ヒンジドメインを有するＩｇＧ抗体である。変異体ＣＨ２領域を含む抗体は、好ましくはＩｇＧ１抗体である。このような変異体ＩｇＧ１ＣＨ２及び／又は下部ヒンジドメインは、好ましくは、２３５位及び／又は２３６位（ＥＵ番号付け）でのアミノ酸置換、好ましくはＬ２３５Ｇ置換及び／又はＧ２３６Ｒ置換を含む（図２Ｅ）。

本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗体の変異体は、抗体又は二重特異性抗体の機能的部分、派生体及び／又は類似体を含む。変異体は、（二重特異性）抗体の結合特異性を維持する。機能的部分、派生体及び／又は類似体は、（二重特異性）抗体の結合特異性を維持する。結合特異性は、本明細書に記載されるように、第１の膜タンパク質及び第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合する能力によって定義される。

本明細書に記載される抗体の機能的部分又は好ましくは二重特異性抗体の機能的部分は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインと、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合する可変ドメインとを含む部分である。好適な部分は、例えば、ペプシンによる二重特異性抗体の消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２断片である。可変ドメインを含む他の部分が、本発明に含まれる。

本明細書に記載される抗体の機能的派生体、又は好ましくは二重特異性抗体の機能的派生体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分と、リンカーによって連結された第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合する可変ドメインを含むタンパク質である。可変ドメインは、そのような可変ドメイン、又はＦａｂ断片若しくは、リンカーを介して一緒に連結されたＶＨ及びＶＬを含む単鎖Ｆｖ断片などの可変ドメイン様分子であってもよい。可変ドメイン様分子の他の例は、いわゆる単一ドメイン抗体断片である。単一ドメイン抗体断片（single−domain antibody fragment、ｓｄＡｂ）は、単一の単量体可変抗体領域を有する抗体断片である。抗体全体と同様に、これは特定の抗原に選択的に結合することができる。わずか１２〜１５ｋＤａの分子量を有する場合、単一ドメイン抗体断片は、２つの重鎖タンパク質及び２つの軽鎖で構成される共通抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、更にはＦａｂ断片（約５０ｋＤａ、１つの軽鎖と半分の重鎖）及び単鎖可変断片（約２５ｋＤａ、２つの可変領域、１つは軽鎖から、１つは重鎖から）よりも小さい。単一ドメイン抗体自体は、正常な抗体よりもはるかに小さいことはない（典型的には、９０〜１００ｋＤａである）。単一ドメイン抗体断片は、大部分が、ラクダに見られる重鎖抗体から遺伝子操作され、これらはＶＨＨ断片（ナノボディ（登録商標））と呼ばれる。一部の魚類もまた、ＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体断片を得ることができる重鎖のみの抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新抗原受容体」）も有する。別のアプローチは、ヒト又はマウスからの共通免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）からの二量体可変ドメインを単量体に分割することである。単一ドメイン抗体へのほとんどの研究は、現在、重鎖可変ドメインに基づくが、軽鎖に由来するナノボディも、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。可変ドメイン様分子の他の非限定的な例は、ＶＨＨ、ヒトドメイン抗体（Domain Antibody、ｄＡｂ）及びユニボディである。好ましい機能的部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む可変ドメインを含む部分である。このような可変ドメインの非限定的な例は、Ｆ（ａｂ）−断片及び単鎖Ｆｖ断片である。可変ドメイン（様）結合の二重特異性フォーマットは、例えば、２つの異なるｓｃＦｖに結合されたヒト血清アルブミン（Human Serum Albumine、ＨＳＡ）；二量体化モチーフを介して一緒に結合された２つの異なるｓｃＦｖ、又はｓｃＦｖ断片の二量体化をもたらすために、螺旋束又はコイル状コイルなどの自己会合二次構造を含む二重特異性ミニ抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２５：１２３３−３４）である。ｓｃＦｖをリンカーに結合するための好適なＨＳＡリンカー及び方法の例は、国際公開第第２００９／１２６９２０号に記載されている。

本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しく類似体、あるいは好ましくは二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、ヒトで使用されることが好ましい。この目的のために、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、ヒト又はヒト化抗体であることが好ましい。ポリペプチドに対するヒトの寛容は、多くの異なる態様によって管理される。免疫は、Ｔ細胞に媒介されるか、Ｂ細胞に媒介されるか、又は他のものに媒介されるものであり、ポリペプチドに対するヒトの寛容に包含される変数のうちの１つである。本発明の二重特異性抗体の定常領域は、好ましくは図２に示される配列を含む、ヒト重鎖定常領域と、好ましくは図１Ｃに示される配列を含むヒト軽鎖定常領域とを含むことが好ましい。この定常領域は、１つ以上の、好ましくは１０個以下の、好ましくは５個以下の、天然に存在するヒト抗体の定常領域とは異なるアミノ酸を含有することができる。定常部分は、天然に存在するヒト抗体から完全に由来することが好ましい。本明細書で産生される様々な抗体は、国際公開第２００９／１５７７１号に記載されているように、それぞれの標的で免疫化された共通軽鎖マウスに由来する。本明細書で産生される様々な抗体は、ヒト抗体可変ドメインライブラリーに由来する。したがって、これらの可変ドメインはヒトである。独自のＣＤＲ領域は、ヒトに由来してもよく、合成であってもよく、又は別の生物に由来してもよい。この可変領域は、これが、ＣＤＲ領域を除いて、天然に存在するヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する場合、少なくともヒト可変領域である。かかる実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー若しくはＢ７ファミリーの膜結合メンバーに結合する抗体の可変ドメインのＶＨ、又は本発明の抗体中の軽鎖は、１つ以上の、好ましくは、１０個以下、好ましくは５個以下の、天然に存在するヒト抗体の可変領域とは異なるアミノ酸を含有することができる（ＣＤＲ領域のアミノ酸配列における考えられる差異は数に入れない）。このような変異はまた、体細胞超変異という状況下では本質的に生じる。

抗体は、少なくとも重鎖可変領域に関して、様々な動物種に由来し得る。例えば、ネズミ重鎖可変領域をヒト化することが一般的なやり方である。これを達成することができる様々な方法が存在し、その中には、ネズミ重鎖可変領域の３Ｄ構造と一致する３Ｄ構造を有するヒト重鎖可変領域へのＣＤＲ移植；好ましくは、既知又は疑われるＴ細胞若しくはＢ細胞エピトープをネズミ重鎖可変領域から除去することによって行われる、ネズミ重鎖可変領域の脱免疫化がある。除去は、典型的には、エピトープの配列がもはやＴ細胞若しくはＢ細胞エピトープではないように、エピトープの配列が修飾されるように、エピトープ中の１つ以上のアミノ酸を別の（典型的には保存的な）アミノ酸に置換することによる。

脱免疫化ネズミ重鎖可変領域は、元のネズミ重鎖可変領域よりもヒトにおいて免疫原性が低い。好ましくは、本発明の可変領域又はドメインは、例えばベニヤ化など、更にヒト化される。ベニアリング技術を使用することにより、免疫系によって容易に遭遇する外部残基は、ヒト残基と選択的に置き換えられて、弱免疫原性又は実質的に非免疫原性のベニヤ化表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。本発明で使用される動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトである。

本発明による抗体若しくは二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、ヒト抗体の定常領域を含むことが好ましい。それらの重鎖定常ドメインの違いに従って、抗体は５つのクラス、又はアイソタイプ：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥに分類される。これらのクラス又はアイソタイプは、対応するギリシャ文字で命名される重鎖のうちの少なくとも１つを含む。好ましい実施形態では、本発明は、定常領域がＩｇＧ定常領域の群から選択される、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択される、本発明による抗体を提供する。好ましくは、定常領域は、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１定常領域（図２）であり、より好ましくは変異したＩｇＧ１定常領域である。ＩｇＧ１の定常領域におけるいくつかの変化は、性質的に生じ、及び／又は得られる抗体の免疫学的特性を変化させることなく許容される。典型的には、約１〜１０個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせが、定常領域で許容される。定常領域は、本明細書で示されるような効果的なヘテロ二量化を可能にするために、エフェクター機能を低減するために、又は半減期、安定性などを含む他の理由のために、変異されてもよい。

合理的な方法は、ヒト状況における非ヒト残基の含有量を最小化するように進化している。抗体の抗原結合特性を別の抗体にうまく移植するために、様々な方法が利用可能である。抗体の結合特性は、全体として可変ドメインの適切な構造と組み合わされた可変ドメイン内のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域の配列によって支持されることが多いＣＤＲ３領域の正確な配列に主として残り得る。ＣＤＲ領域を別の抗体の好適な可変ドメインに移植するために、様々な方法が現在利用可能である。これらの方法のいくつかは、Ｊ．Ｃ．Ａｌｍａｇｒｏ１ａｎｄＪ．Ｆｒａｎｓｓｏｎ（２００８）ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ１３，１６１９−１６３３（参照により本明細書に含まれる）で概説されている。

図３に示される可変重鎖配列を含む可変ドメインの軽鎖可変領域は、好ましくは、Ｏ１２の生殖細胞系列軽鎖であるか、又はＯ１２に基づくものであり、好ましくは、再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１又はその断片若しくは機能的派生体（ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおけるＩＭＧＴデータベースの世界的なウェブによる命名法）による）である。再構成された生殖細胞系ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１−３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１、ＩＧＫＶ１−３９／ＩＧＫＪ１、ｈｕＶκ１−３９軽鎖、又は短縮形のｈｕＶκ１−３９、という用語が使用される。軽鎖は、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有し得る。言及された１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせは、好ましくはＶＬ鎖のＣＤＲ３領域には存在しないことが好ましく、ＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３領域又はＦＲ４領域には存在しないことが好ましい。共通軽鎖の好ましい配列を図１に示す。

二重特異性抗体を産生するために、様々な方法が利用可能である。１つの方法は、細胞内の２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖の発現、及び細胞によって産生される抗体を収集することを伴う。このようにして産生される抗体は、典型的には、重鎖及び軽鎖の異なる組み合わせを有する抗体の集合体を含有し、そのうちのいくつかは、所望の二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、その後、集合体から精製することができる。細胞によって産生される他の抗体に対する二重特異性の比は、様々な方法で増加させることができる。本発明の好ましい実施形態では、この比は、２つの異なる軽鎖を発現しないが、細胞内の２つの本質的に同一の軽鎖を発現させることによって増加される。２つの本質的に同一の軽鎖は、本質的に同じ軽鎖可変領域及び異なる軽鎖定常領域、又は好ましくは２つの本質的に同一の軽鎖定常領域を有する軽鎖であり得る。この概念は、「共通軽鎖」法とも称される当該技術分野におけるものである。本質的に同一の軽鎖が２つの異なる重鎖と一緒に作用し、異なる抗原結合部位及び付随する異なる結合特性を有する可変ドメインの形成を可能にする場合、二重特異性抗体と、細胞によって産生される他の抗体との比は、２つの本質的に異なる軽鎖の発現よりも有意に改善される。細胞によって産生される二重特異性抗体の比は、２つの同一の重鎖のペアリングに対して２つの異なる重鎖の互いのペアリングを刺激することによって、更に改善することができる。当該技術分野では、重鎖のこのようなヘテロ二量体化が達成され得る様々な方法が記載されている。好ましい方法は、米国特許仮出願第６１／６３５，９３５号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許正規出願第１３／８６６，７４７号及びＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９４号（国際公開第２０１３／１５７９５４（Ａ１）号）によってフォローアップされている。二重特異性抗体（単一細胞から）を産生するための方法及び手段が開示され、これにより、単一特異性抗体の形成に対する二重特異性抗体の形成を有利にする手段が提供される。本発明では、これらの方法を好適に採用することができる。したがって、本発明は、本発明による二重特異性抗体を（単一細胞から）製造するための方法であって、二重特異性抗体が、界面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを含み、方法が、細胞中に、ａ）重鎖を含む第１のＣＨ３ドメインをコードする第１の核酸分子、ｂ）重鎖を含む第２のＣＨ３ドメインをコードする第２の核酸分子を提供することを含み、核酸分子は、重鎖を含む第１及び第２のＣＨ３ドメインの優先的なペアリングのための手段を備え、方法が、宿主細胞を培養する工程と、２つの核酸分子の発現を可能にする工程と、二重特異性抗体を培養物から採取する工程とを更に含む方法を提供する。第１及び第２の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクター、又は遺伝子送達ビヒクルの一部であってもよく、宿主細胞のゲノムの同一部位に組み込まれてもよい。あるいは、第１及び第２の核酸分子は、細胞に別々に提供される。宿主細胞は、少なくとも１つの軽鎖、好ましくは共通軽鎖を含む。

好ましい実施形態は、単一細胞から本発明による二重特異性抗体を産生するための方法であって、二重特異性抗体が、界面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを含み、方法が、
ａ）ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分に結合することができ、第１のＣＨ３ドメインを含有する抗原結合部位を含む重鎖をコードする第１の核酸分子と、ｂ）膜結合第２のタンパク質の細胞外部分に結合することができ、第２のＣＨ３ドメインを含有する抗原結合部位を含む重鎖をコードする第２の核酸分子とを有する細胞を準備することを含み、核酸分子は、第１及び第２のＣＨ３ドメインの優先的なペアリングのための手段を備え、
方法が、細胞を培養する工程と、２つの核酸分子によってコードされるタンパク質の発現を可能にする工程と、二重特異性ＩｇＧ抗体を培養物から採取する工程とを更に含む方法を提供する。特に好ましい実施形態では、細胞はまた、共通軽鎖をコードする第３の核酸分子を有する。第１、第２、及び第３の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクター、又は遺伝子送達ビヒクルの一部であってもよく、宿主細胞のゲノムの同一部位に組み込まれてもよい。あるいは、第１、第２、及び第３の核酸分子は、細胞に別々に提供される。好ましい共通軽鎖は、Ｏ１２に基づき、好ましくは、これは、上述したような再構成された生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１である。第１及び第２のＣＨ３ドメインの優先的なペアリングのための手段は、好ましくは、重鎖コード領域のＣＨ３ドメインにおける対応する変異である。二重特異性抗体のみを本質的に産生するのに好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ番号付けによる番号付け）、並びに第２のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅであり、又は逆もまた同様である（図２）。したがって、更に、二重特異性抗体を産生するための本発明による方法であって、第１のＣＨ３ドメインがアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ番号付けによる番号付け）を含み、第２のＣＨ３ドメインが、アミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含み、方法が、細胞を培養する工程と、核酸分子によってコードされるタンパク質の発現を可能にする工程と、二重特異性抗体を培養物から回収する工程とを更に含む方法が提供される。また、二重特異性抗体を産生するための本発明による方法であって、第１のＣＨ３ドメインがアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（ＥＵ番号付けによる番号付け）を含み、第２のＣＨ３ドメインが、アミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋを含み、方法が、細胞を培養する工程と、核酸分子の発現を可能にする工程と、二重特異性抗体を培養物から回収する工程とを更に含む方法も提供される。これらの方法によって産生され得る抗体もまた、本発明の一部である。ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくはＩｇＧ１ヘテロ二量体化ドメインである。ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインを含む重鎖定常領域は、好ましくはＩｇＧ１定常領域である。

ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（第１の膜タンパク質）は、好ましくはＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ４０、又はＣＤ３０である。好ましい実施形態では、第１の膜タンパク質は、ＣＤ１３７又はＯＸ４０であり、好ましくはＣＤ１３７である。本発明の結合分子は、好ましくは、第１の膜タンパク質に対する１つの（抗原）結合部位を含む。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、第１の膜タンパク質に対して一価である。結合分子は、好ましくは、第２の膜タンパク質に対する１つの（抗原）結合部位を含む。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、第２の膜タンパク質に対して一価である。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、第１の膜タンパク質に対して一価であり、第２の膜タンパク質に対して一価である。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに対して一価であり、Ｂ７ファミリーのメンバーに対して一価である。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、ＣＤ１３７に対して一価であり、Ｂ７ファミリーのメンバーに対して一価である。いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、ＣＤ１３７に対して一価であり、ＰＤ−Ｌ１に対して一価である。二価モノクローナル抗ＣＤ１３７抗体は、ＣＤ１３７を活性化することが当該技術分野において既知であるが、従来技術の一価のＣＤ１３７結合分子は、典型的には活性化しない。

本明細書に記載される第１の膜タンパク質は、細胞膜タンパク質であるＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。タンパク質は、それが上にある細胞の細胞膜中に存在する膜貫通領域を有する場合、細胞上の膜タンパク質であると言われる。これは、典型的には、本明細書に記載されるような第１の細胞である。タンパク質は、更なる膜貫通領域を有し得る。そのような場合、細胞膜内に存在する全ての膜貫通領域が、同じ細胞の細胞膜内に存在する。第１の膜タンパク質は、細胞膜上に存在する場合、細胞外部分を有する細胞膜タンパク質である。細胞膜は、細胞の内側を細胞の外側から分離する細胞の膜である。第１の膜タンパク質は、典型的には、本明細書に記載される第１の細胞の細胞膜上にある。本発明の結合分子という観点から、又は本発明の方法若しくは使用において、第１の膜タンパク質は、典型的には、本明細書に記載される第１の細胞の細胞膜上にある。第１の膜タンパク質は、第２の細胞上に存在し得るが、第１の膜タンパク質の発現は、第２の細胞上で無視できることが好ましい。典型的には、第２の細胞上の第１の膜タンパク質のレベルは、第１の細胞上の第１の膜タンパク質の発現と比較して、最大で１０％である。第２の細胞は、好ましくは、第１の膜タンパク質を有意に発現しない。発現は、第１の膜タンパク質に特異的な抗体を用いたＦＡＣＳアッセイにおける免疫蛍光によって、第１の膜タンパク質を検出できない場合（バックグラウンドを超えて）には、発現は少なくとも有意ではない。

第２の膜タンパク質は、同様に細胞膜タンパク質である。第２の膜タンパク質は、それが上にある細胞の細胞膜中に存在する膜貫通領域を有する。これは、典型的には、本明細書に記載される第２の細胞である。第２のタンパク質は、更なる膜貫通領域を有し得る。そのような場合、細胞膜内に存在する全ての膜貫通領域が、同じ細胞の細胞膜内に存在する。第２の膜タンパク質は、細胞膜上に存在する場合、細胞外部分を有する細胞膜タンパク質である。本発明の結合分子という観点から、又は本発明の方法若しくは使用において、第２の膜タンパク質は、典型的には、本明細書に記載される第２の細胞の細胞膜上にある。第２の膜タンパク質は、第１の細胞上に存在し得るが、第２の膜タンパク質の発現は、第１の細胞上で無視できることが好ましい。典型的には、第１の細胞上の第２の膜タンパク質のレベルは、第２の細胞上の第２の膜タンパク質の発現と比較して、最大で１０％である。第１の細胞は、好ましくは、第２の膜タンパク質を有意に発現しない。発現は、第２の膜タンパク質に特異的な抗体を用いたＦＡＣＳアッセイにおける免疫蛍光によって、第２の膜タンパク質を検出できない場合（バックグラウンドを超えて）には、発現は少なくとも有意ではない。

いくつかの実施形態によると、本発明による結合分子又は（二重特異性）抗体若しくは変異体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる１つの抗原結合部位と、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない第２の膜タンパク質に結合することができる第２の抗原結合部位とを有する。これにより、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのいくつかの異なるメンバーを発現しているＴ細胞などの（免疫）細胞のシス活性化が、少なくとも部分的に回避され、それによって非特異的Ｔ細胞活性化に起因する潜在的な有害な副作用及び毒性を低減するという利点がもたらされる。本発明のこれらの実施形態は、ＴＮＦスーパーファミリーの受容体に結合する結合剤、特に、ＴＮＦスーパーファミリーの少なくとも２つの異なる受容体に結合する結合剤に関連する従来技術のアプローチとは対照的である。このような従来技術のアプローチは、第２の標的が存在しないことを意味する、シスでのＴ細胞活性化につながり得、例えばサイトカインストームをもたらす過剰なＴ細胞応答のリスクを伴い得る。結果的に、かかる従来技術のアプローチは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる第１の抗原結合部位と、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない膜タンパク質に結合することができる第２の抗原結合部位とを有する、本発明による結合分子と比較して、副作用の潜在的な増加を有する。

また、ＣＤ１３７又はＯＸ４０の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供され、第２の膜タンパク質は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。また、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第１の細胞及び第２の細胞を準備することを含み、第１の細胞が、細胞膜上にＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーを有し、第２の細胞が、細胞膜上に第２の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、２つの可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と接触させることを含み、１つの可変ドメインが、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる第１の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第２の抗原結合部位を含み、それによって、第１の細胞上のメンバーの活性を刺激し、第２の膜タンパク質が、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない、方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。

いくつかの実施形態では、抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位と、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない第２の膜タンパク質に結合することができる１つの抗原結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインと、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない第２の膜タンパク質に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長ＩｇＧ、すなわち、完全長ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、好ましくは、完全長ＩｇＧ１又は完全長ＩｇＧ４である。

ＣＤ１３７又はＯＸ４０の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が更に提供され、第２の膜タンパク質は、Ｂ７ファミリーのメンバー、好ましくはＰＤ−Ｌ１である。また、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第１の細胞及び第２の細胞を準備することを含み、第１の細胞が細胞膜上にＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーを有し、第２の細胞が細胞膜上に第２の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、２つの可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と接触させることを含み、１つの可変ドメインが、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる第１の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第２の抗原結合部位を含み、それによって、第１の細胞上のメンバーの活性を刺激し、第２の膜タンパク質が、Ｂ７ファミリーのメンバー、好ましくはＰＤ−Ｌ１である、方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。

いくつかの実施形態では、抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位と、Ｂ７ファミリーのメンバー、好ましくはＰＤ−Ｌ１である第２の膜タンパク質に結合することができる１つの抗原結合部位とを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインと、Ｂ７ファミリーのメンバー、好ましくはＰＤ−Ｌ１である第２の膜タンパク質に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長ＩｇＧ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、好ましくは、完全長ＩｇＧ１又は完全長ＩｇＧ４である。

第１の膜タンパク質の、その結合パートナーへの結合を「ブロックする」可変ドメインは、第１の膜タンパク質の結合パートナーへの結合を干渉する。このような可変ドメインは、第１の膜タンパク質に結合することができる。このようなブロッキング可変ドメインは、第１の膜タンパク質上のエピトープに結合し、エピトープに結合するために、第１の膜タンパク質の結合パートナーと競合することができる。このようなブロッキング可変ドメイン及び第１の膜タンパク質の結合パートナーはまた、第１の膜タンパク質上の異なるエピトープにも結合することができる。そのような場合、ブロッキング活性は、例えば、結合パートナーの結合の低下、並びに／若しくは結合パートナーが第１の膜タンパク質に既に結合しているときの結合パートナーの変位に起因することがあり、及び／又はブロッキング可変ドメインは、立体障害による第１の膜タンパク質への結合パートナーの結合を防止することがある。これら及び他の機構は全て、少なくとも部分的に、結合パートナーが第１の膜タンパク質に結合することを防止することができる。

一実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗原結合部位を含むドメインは、メンバーの、メンバーのリガンドへの結合をブロックする。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー−リガンド相互作用は、当該技術分野において広く研究されている。一般に、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーは、典型的には、少なくとも１つのリガンドを有することが知られている。既知の受容体リガンド対の例は、ＴＮＦ受容体腫瘍壊死因子受容体１及び２並びにリガンドＴＮＦ−α、受容体ＯＸ４０及びリガンドＯＸ４０Ｌ、受容体ＣＤ４０及びリガンドＣＤ１５４、Ｆａｓ受容体及びリガンドＦａｓＬ、ＣＤ３０受容体及びリガンドＣＤ１５３、並びに受容体ＣＤ１３７及びリガンドＣＤ１３７Ｌである。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗原結合部位を含む可変ドメインは、メンバーの、メンバーのリガンドへの結合をブロックしない。

いくつかの実施形態では、このドメインは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに結合し、そのＴＮＦ受容体スーパーファミリー標的膜タンパク質の、その結合パートナーへの結合をブロックする抗原結合部位を含む。可変ドメインは、２つの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体として提供される場合、可変ドメインが、架橋することなく細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激しないように更に特徴付けられてもよい。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗原結合部位を含むドメインは、ＣＤ１３７のＣＤ１３７Ｌへの結合をブロックする可変ドメインを含み、可変ドメインは、２つの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体として提供される場合、細胞上のＣＤ１３７の活性を刺激しないという事実によって更に特徴付けられる。

用語「結合パートナー」、結合対、受容体リガンド対などは、互いに結合し、結合の結果として活性を発揮することができるタンパク質を指す。パートナー又は対のうちの少なくとも１つは、細胞の細胞膜上の膜タンパク質である。活性は、典型的には、細胞上にこの膜タンパク質を有する細胞に発揮される。

本明細書に記載されるような膜タンパク質の特定の結合対の結合をブロックする可変ドメインは、典型的には、可変ドメインの非存在下での結合と比較したとき、対の結合を低減する。これは、好ましくはインビトロアッセイで測定される。典型的には、これは、可変ドメインを膜タンパク質とインキュベートすることによって行われ、これは、混合物を対の他のメンバーに結合し、続いてインキュベートすることによって行われる。次いで、対の結合は、可変ドメインの非在下での対の結合と比較される。可変ドメインは、第１の膜タンパク質のその結合パートナーへの結合を完全に防止することができる。これは、結合対の結合を部分的に防止することもできる。膜タンパク質の特定の結合対の結合をブロックする可変ドメインは、可変ドメインの非存在下での結合と比較したときに、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％まで対の結合を低減することが好ましい。可変ドメインによる結合のブロッキングは、本明細書において、可変ドメインの同じものの２つを含む二価モノクローナル抗体を使用して得られるブロッキングとして定義される。当然のことながら、可変ドメインはまた、可変ドメインと第２の膜タンパク質に結合する可変ドメインとを含む抗体中に存在する場合も、結合をブロックする。

ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができ、ＣＤ１３７リガンドのＣＤ１３７への結合を少なくとも部分的にブロックする特定の可変ドメインは、ＭＦ６７８３、ＭＦ６８６１、ＭＦ６７９５、ＭＦ６８０８、ＭＦ６７９８、ＭＦ６７５４、ＭＦ６７６３、ＭＦ６７４４、ＭＦ６７８５、ＭＦ６８２５、ＭＦ６７３７、ＭＦ６７４９、ＭＦ６７８８、又はＭＦ６７９７のＶＨのアミノ酸配列を含む可変ドメインである。

ＰＤ−Ｌ１の細胞外部分に結合することができ、ＰＤ１のＰＤ−Ｌ１への結合をブロックする特定の可変ドメインは、ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５３５９、ＭＦ５３７７、ＭＦ５３８２、ＭＦ５４２４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５４３９、ＭＦ５４４２、ＭＦ５５５３、ＭＦ５５５７、ＭＦ５５６１、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５９４、又はＭＦ５７０８のＶＨのアミノ酸配列を含む可変ドメインである。アミノ酸配列を図３に示す。

ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合する可変ドメインは、好ましくは、ドメインのうちの２つを含む単一特異性二価抗体で提供される場合、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激しない可変ドメインである。二価単一特異性抗体という状況での可変ドメインは、可変ドメインの同じもののうちの２つを含み、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーを含む細胞の活性を刺激しない。

細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの刺激活性は、典型的には、細胞の生物活性を測定することによって測定される。活性の種類は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのどのメンバーが分析されるかに依存する。例えば、ＯＸ４０及びＣＤ１３７については、ＯＸ４０及び／又はＣＤ１３７陽性Ｔ細胞の活性化状態を測定することができる。ＯＸ４０及びＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞の活性を刺激するいわゆる共刺激性タンパク質である。Ｔ細胞の活性化を測定するための好適な方法が、実施例セクションに提供されている。１つの方法は、活性化Ｔ細胞又はＴ細胞を含む組成物によるＩＬ−２、ＩＦＮγ、及び／又はＴＮＦαの産生を測定することである。他のＴＮＦ受容体は、異なる生物活性を有する。例えば、ＣＤ３０は、活性化されたＴ細胞及びＢ細胞上で発現され、アポトーシスの正の調節因子である。ＣＤ３０の刺激は、本発明の結合分子に応答して、活性化Ｂ細胞又はＴ細胞のアポトーシスを測定することによって測定することができる。ＣＤ４０は、マクロファージなどの抗原提示細胞上に見出される共刺激性タンパク質であり、刺激は、抗原提示細胞の活性化を更に刺激する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性は、活性が本明細書で論議される結合分子の存在下で、好ましくは本発明による抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体の存在下で測定される場合に刺激され、結合分子、好ましくは本発明による抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体の非存在下で他の同一の条件下で測定される活性よりも高い。活性を刺激することは、活性の誘導及び既に存在する活性の増強を含む。

ＣＤ１３７又はＯＸ４０の活性の刺激は、好ましくは、細胞を含むＣＤ１３７又はＯＸ４０の生物活性を測定することによって測定される。生物活性は、好ましくは、ＣＤ１３７又はＯＸ４０発現細胞の活性化状態である。ＣＤ１３７及びＯＸ４０は、活性化Ｔ細胞を含む免疫細胞上で発現される共刺激分子である。ＣＤ１３７又はＯＸ４０の活性の刺激は、好ましくは、例えば活性化Ｔ細胞などの免疫細胞の活性化のレベルを決定することによって測定される。個体において、ＣＤ１３７又はＯＸ４０の活性の刺激は、個体の免疫細胞及び／又はＴ細胞の活性化を測定することによって測定される。あるいは、これはまた、適用可能な場合、個体における腫瘍応答、個体のウイルス負荷、又は個体の寄生体負荷を測定することによって決定することもできる。

本発明はまた、Ｔ細胞を関与させる及び／又はＴ細胞を活性化する方法であって、Ｔ細胞と、Ｔ細胞が関与する又は活性化される細胞（第２の細胞）とを含む系を準備することと、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる可変ドメインと、少なくとも１つの抗体、好ましくは、第２のタンパク質の細胞外部分に結合することができる可変ドメインとを含む、少なくとも１つの二重特異性抗体を系に提供することと、Ｔ細胞が関与及び／又は活性化されることを許容する条件下で系をインキュベートすることとを含む方法も提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、好ましくはＣＤ１３７又はＯＸ４０であり、最も好ましくはＣＤ１３７であり、第２の膜タンパク質は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。第２の膜タンパク質は、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーであり、最も好ましくはＰＤ−Ｌ１である。Ｔ細胞を関与又は活性化させる細胞は、好ましくは、免疫細胞、（例えば、抗原提示細胞、又はマクロファージ）、新生物性細胞、ウイルス感染細胞、又は細胞内寄生体感染細胞である。Ｔ細胞を関与及び／又は活性化させることにより、Ｔ細胞を特異的な標的に指向させる。Ｔ細胞を活性化することは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体を活性化する。Ｔ細胞を関与させることは、典型的にはＴ細胞を活性化する。関与はまた、既に活性化されたＴ細胞を抗体によって特定化された標的に指向させることもできる。Ｔ細胞が関与及び／又は活性化されることを許容する条件は、典型的には培養条件であるが、非ヒト動物においてもインキュベートすることができる。この条件は、Ｔ細胞を抗体の非存在下で関与させないような条件である。Ｔ細胞の集合体が測定される場合、これらのうちのいくつかは、その集合体が、関与していないか又は活性化されていない十分なＴ細胞を含有という条件で、既に関与又は活性化され得る。

本発明の抗体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー以外のタンパク質によって媒介される細胞と、本発明の抗体によって結合された第２の膜タンパク質との間の相互作用を可能にするように２つの細胞をごく近接して近づけ合うことができる。そのような相互作用の１つは、１つの細胞のＴ細胞受容体と他の細胞上のＭＨＣとの相互作用である。

第１及び第２の細胞は、好ましくは異なる細胞である。異なる細胞は、第１及び第２の膜タンパク質の両方を発現することができる。しかしながら、典型的には、第１の膜タンパク質は、第１の細胞上のみで発現され、第２の膜タンパク質は、第２の細胞上のみで発現される。生物活性は、典型的には、第１の細胞が第２の膜タンパク質を発現しない場合、第２の細胞が、第１の膜タンパク質を発現しない場合、又はより好ましくは、これらの組み合わせである場合に、より刺激される。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ３０、又はＣＤ４０である場合、第１の細胞が免疫細胞、好ましくはＴ細胞であることが好ましい。これらの場合、第２の細胞が異常細胞、腫瘍細胞、又は免疫細胞（例えば、マクロファージ又は抗原提示細胞）であることが好ましい。異常細胞は、健康な個体に通常存在しない細胞である。このような細胞の非限定的な好ましい例は、がん細胞、ウイルス感染細胞、寄生体感染細胞、又は第２の膜タンパク質を発現するよう誘導された細胞である。好適な第２の細胞も免疫細胞である。このような細胞の好ましい例は、樹状細胞、マクロファージ、骨髄系の他の細胞、又はＢ細胞である。場合によっては、細胞は、免疫細胞、線維芽細胞、又はがん細胞などの隣接細胞によって放出される抑制因子の結果として、第２の膜タンパク質を発現し得る。いくつかの実施形態では、第２の細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に関連して、例えばウイルス抗原又は寄生体抗原のような、腫瘍抗原又は病原性抗原を提示する抗原提示細胞である。ＭＨＣ複合体は、好ましくはヒト白血球抗原（human leukocyte antigen、ＨＬＡ）複合体である。これに関連して、本発明の抗体は、インビトロでの抗原ナイーブＴ細胞の増殖及び分化の両方を強化することができる。腫瘍抗原に対する新規なＴ細胞応答の誘導及び増強は、典型的には、より効果的な腫瘍免疫及びがん細胞の根絶をもたらす。

ＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞によって発現され得る。また、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球、及び炎症部位における血管壁の細胞などの他の細胞にも見出される。このタンパク質は、Ｔ細胞の活性化のための、その共刺激活性について知られている。リガンドＣＤ１３７Ｌは、単球、マクロファージ、及び他の細胞で発現される。ＣＤ１３７のＣＤ１３７リガンドへの結合は、受容体及びリガンド含有細胞の両方に効果を及ぼす。リガンド又は受容体の活性化は、様々な方法で達成することができる。一般的な方法は、組織培養プレート上のコーティング又は抗体による架橋である（レビューについては、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、２００４を参照されたい）。抗腫瘍応答を増強するその能力と結合された、先天性免疫細胞及び適応免疫細胞の両方におけるＣＤ１３７発現は、それを腫瘍免疫を増強する治療標的として確立している。様々なＣＤ１３７標的化免疫療法は、臨床開発に達している（レビューについては、Ｍａｋｋｏｕｋｅｔａｌ２０１６を参照されたい）。受容体又はリガンドの活性化は、それらの効果を及ぼすために、細胞膜におけるホモマー会合を必要とするように見える。ＣＤ１３７に対する２つの結合部位を有する抗体は、受容体又はリガンドを活性化することができる。したがって、かかる抗体は、ＣＤ１３７に対して二価である。ＣＤ１３７に対する１つの結合部位のみを有する分子も産生された。従来技術のこのような一価結合分子は、受容体を活性化できなかった（ＭｃＮａｍａｒａ２００８）。対照的に、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、ＣＤ１３７に対して一価である場合であっても、ＣＤ１３７を活性化することができる。

ＯＸ４０は、Ｔ細胞上で発現された二次共刺激性免疫チェックポイント分子である。ＯＸ４０発現は構成的ではなく、これは、典型的には、活性化から２４〜７２時間後に発現される。そのリガンド、ＯＸ４０Ｌもまた、静止期の抗原提示細胞上では発現されないが、それらの活性化後に発現される。

本発明では、結合分子が、第２の膜タンパク質がＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーのメンバーではないときを含む、別の細胞（第２の細胞）上の第２の膜タンパク質に対する結合部位も有する場合、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー（第１の膜タンパク質）に対する１つの結合部位のみを有する結合分子が活性化され得ることが見出された。第２の膜タンパク質は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの受容体に対するリガンドであり得る。しかしながら、典型的には、これは、第１の膜タンパク質であるＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーのリガンドではない。第２の膜タンパク質は、第１の膜タンパク質のリガンドではないＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーのリガンドであり得る。

細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性の刺激は、典型的には、２つ以上の受容体複合体を一緒に集めることを必要とする。細胞表面膜上に配列されたホモ三量体リガンドは、典型的には、隣接する細胞上の複数のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー複合体を結合することによって達成される。ＴＮＦ受容体スーパーファミリー複合体のクラスタリングは、細胞の活性の刺激を促進すると考えられる。これは、例えば、ＣＤ１３７受容体の細胞質部分のみを有する人工受容体からも明らかである。様々な人工受容体の細胞質部分の近接性もまた、人工受容体含有細胞を刺激する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに特異的な二価の単一特異性抗体は、リガンド効果を模倣し、活性を刺激することも可能である。抗体のアームは、受容体を一緒に集め又はクラスター化すると考えられる。このような活性は、受容体の架橋とも称される。活性は、時には抗抗体抗体を提供することによって更に刺激することができ、これは受容体の更なる架橋をもたらす。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーのための１つの結合部位のみを有する先行技術の結合分子は、典型的には、活性を刺激することができない。そのような分子は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーをクラスター化又は架橋することができない。しかしながら、本発明による結合分子又は抗体若しくは変異体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激することができ、これが、受容体スーパーファミリーメンバーに対して一価である場合を含む。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本発明による二重特異性抗体はまた、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー受容体複合体をクラスター化し、それによってＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性化を促進することができると考えられる。これは、本発明による抗体によって結合される第２の膜タンパク質が、ＰＤ−Ｌ１などのＢ７ファミリーのメンバーである場合に特に当てはまる。

本発明の一態様では、第２の膜タンパク質は、２つ以上の第２の膜タンパク質のインスタンス(instances)を含む多量体タンパク質の一部として細胞膜上に存在する。このような多量体タンパク質は、本発明の結合分子の抗原結合部位に２つ以上のエピトープを提供することができる。このような場合、他の細胞上の結合したＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、クラスター化され、ＴＮＦ受容体含有細胞の活性を刺激するようになるであろう。本発明の結合分子は、異なる細胞上の別のタンパク質への結合を通して、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの近接性を促すことができる。同じ細胞上の２つ以上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーのインスタンスに結合する結合分子によるシス架橋と対比して、トランス架橋とも称される特徴がある。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、ホモ二量体又はホモ三量体である。ホモ二量体は、２つの同一のポリペプチド単位から構成されるタンパク質である。ホモ三量体は、３つの同一のポリペプチド単位から構成されるタンパク質である。いかなる理論にも束縛されるものではないが、第２の膜タンパク質の抗原結合部位のエピトープは、いくつもの結合分子に集合的に結合すると考えられる。これにより、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーのうちの２つ以上の近接性を促すアンカーとしてこれらは機能する。近接性は、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激するのに十分に近い。

別の実施形態では、第２の膜タンパク質は、細胞膜上の１つ以上の別個の区域に存在するタンパク質である。細胞膜は、細胞膜の全ての構成成分の均質な分布を提供しない。現在、細胞膜は、細胞膜の１つ以上の構成成分が膜の他の部分よりも頻繁に存在する領域を有することが現在知られている（レビューについては、Ｖｅｒｅｂ，Ｇ．，ｅｔａｌ．，２００３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００．１４：８０５３−８０５８を参照されたい）。区域は、好ましくは、細胞膜上のタンパク質のクラスター、ドメイン、マイクロドメイン、又はコンパートメントであり、好ましくは免疫シナプスである。いかなる理論にも束縛されるものではないが、非ランダム分布は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが極めて近接することを促進すると考えられる。

他の実施形態では、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性の刺激は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの同じメンバー（第１の膜タンパク質）と、同じ第２の膜タンパク質とに結合する２つ以上の結合分子を提供することによって達成される。２つ以上の結合分子を伴う実施形態はまた、Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）実施形態とも称される。例えば、図１５及び１６に示されるように、Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）実施形態は、Ｔ細胞活性化をもたらし得る。このようなＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）産物を製造するための一般的な方法は、国際公開第２０１３／１５７９５３号及び同第２００４／００９６１８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。用語「Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ」は、登録商標であり、（登録商標）によって表示される。Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）実施形態では、結合分子のうちの少なくとも２つは、第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ、第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第２の膜タンパク質上の異なるエピトープに結合する。Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）実施形態は、２つ以上の結合分子の第１及び／又は第２の膜タンパク質の同一分子への結合を可能にし、それによって、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激する。結合分子のうちの少なくとも２つは、第２の膜タンパク質上の異なるエピトープに結合するか、又は第１の膜タンパク質上の異なるエピトープと第２の膜タンパク質上の異なるエピトープとに結合することが好ましい。特に好ましい実施形態では、結合分子のうちの少なくとも２つは、第１の膜タンパク質上の同じエピトープと第２の膜タンパク質上の異なるエピトープとに結合する。いくつかのＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）実施形態では、２つの結合分子は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー−リガンド相互作用をブロックする。他のＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）実施形態では、２つの結合分子は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー−リガンド相互作用をブロックしない。第１及び第２の膜タンパク質上の異なるエピトープは、エピトープのうちの１つに結合する結合分子と、異なるエピトープに結合する結合分子との同時結合が可能であることが好ましい。好ましい実施形態では、異なるエピトープは、非競合エピトープである。好ましい実施形態では、結合分子の第１及び第２のものは、ＣＤ１３７又はＯＸ４０の同じドメインに結合することができる。好ましい実施形態では、第１及び第２の結合分子は、ＣＤ１３７又はＯＸ４０の同じエピトープに結合する。

第２の膜タンパク質は、好ましくは、多量体サイトカイン受容体、Ｂ７ファミリーのメンバー、ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＡＴＰ結合カセット輸送体（ＡＢＣ輸送体）のメンバー、アクアポリン、セリン／スレオニンキナーゼ受容体ファミリーのメンバー、受容体型チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。好ましい実施形態では、第２の膜タンパク質は、Ｂ７ファミリーのメンバーである。好ましい実施形態では、Ｂ７ファミリーメンバーは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＣＯＳＬ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６、又はＢ７−Ｈ７である。第２の膜タンパク質は、Ｂ７−ファミリーの共抑制性タンパク質であることが好ましい。この好ましい実施形態では、第２の膜タンパク質に結合する可変ドメインは、Ｂ７ファミリーメンバーのＣＤ２８ファミリーのその結合パートナーへの結合をブロックすることが好ましい。このようにして、第２の膜タンパク質によって第１の細胞に提供される潜在的な共抑制シグナルが低減される。特に好ましい実施形態では、第２の膜タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２であり、好ましくはＰＤ−Ｌ１である。他の好ましい実施形態では、第２の膜タンパク質は、ＥＧＦ受容体ファミリー（ＥｒｂＢ）、インスリン受容体ファミリー、ＩＧＦ受容体ファミリー、ＦＧＦ受容体ファミリー、ＶＥＧＦ受容体ファミリー、ＨＧＦ受容体ファミリー、又はＡＸＬ受容体ファミリーのメンバーである。第２の膜タンパク質は、好ましくは、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバー（ＥｒｂＢ）、好ましくはＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ−２又はＥｒｂＢ−３であり、好ましくはＥｒｂＢ−２である。ＥＧＦＲ、ＥＧＦ受容体ファミリーのＥｒｂＢ−３又はＥｒｂＢ−４メンバーに結合する可変ドメインは、メンバーに対する増殖因子の結合をブロックすることが好ましい。この実施形態では、第２の細胞上のＥＧＦ受容体ファミリーメンバーの活性が低減される。

本発明の実施形態では、第２の膜タンパク質は、結合対のメンバーである。例えば、ＥＧＦ受容体（EGF receptor、ＥＧＦＲ）及びＥＧＦは、結合対を形成する。好適な結合対の他の非限定的な例は、ＨＥＲ３とヘレグリン、ＬＧＲ５−Ｒスポンジン、ＬＧＲ４−Ｒスポンジン、又はＢ７ファミリーメンバーリガンドとＣＤ２８ファミリーのその受容体である。本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載される結合分子は、結合対の相補的なメンバーに対する第２の膜タンパク質の結合をブロックする。このような結合分子は、典型的には、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激し、第２の膜タンパク質の活性をブロックする。このような結合分子は、第２の細胞が腫瘍細胞である状況、又はがんを有する個体の治療に特によく適している。好ましい実施形態では、第２の膜タンパク質は、Ｂ７ファミリーのメンバー、好ましくはＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２、好ましくはＰＤ−Ｌ１であり、少なくとも１つの結合分子は、好ましくは、Ｂ７ファミリーメンバーのＣＤ２８ファミリーのその正常な受容体への結合をブロックする。好ましい実施形態では、第２の膜タンパク質はＰＤ−Ｌ１であり、少なくとも１つの結合分子は、好ましくは、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合をブロックする。

本発明は、ＣＤ１３７発現細胞における生物学的効果を増強する方法であって、第１の細胞及び第２の細胞を有する系を準備することであって、第１の細胞が細胞膜上にＣＤ１３７を含み、第２の細胞がタンパク質の細胞外部分上の２つ以上の同じエピトープを有する細胞膜上のタンパク質を含む（すなわち、タンパク質の同一エピトープの２コピー以上が存在する）ことと、系にＣＤ１３７の細胞外部分に対する結合部位、及びエピトープに対する結合部位を含む結合分子を提供することとを含み、方法が、生物活性を強化できる条件下で系をインキュベートすることを更に含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１３７発現細胞は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞であり、第２の細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１３７発現細胞は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞であり、第２の細胞は、別の免疫細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１３７発現細胞は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞であり、第２の細胞は、骨髄細胞系列の細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１３７発現細胞は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞であり、第２の細胞は、抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、好ましくは、ＭＨＣの関連において、好ましくはＨＬＡの関連において腫瘍抗原又は病原性抗原を提示する。

細胞は、典型的には、メンバーが細胞によって発現される場合、膜上にＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーを有する。発現は、様々な方法で測定することができる。定量的ＲＮＡ特異的ＰＣＲを使用することが多い。免疫蛍光を用いた免疫組織化学分析又はＦＡＣＳ分析もまた、しばしば使用される。

第１の細胞及び第２の細胞が提供される好適な系は、細胞培養である。別の好適な系は、第１の細胞及び第２の細胞を含む非ヒト動物である。他の好適な系は、細胞が活性形態で維持されるが、細胞の増殖が必ずしも促進されないエクスビボ系である。第１及び第２の細胞は、例えば、増殖を必ずしも促進する必要はないが、生物活性を測定することを可能にするアッセイ条件下で、一緒にインキュベートすることができる。

第１の膜タンパク質と第２の膜タンパク質との結合によって介在される生物活性を発現する細胞に対して許容性である条件下で系をインキュベートすることは、第１及び第２の細胞が、結合パートナーの結果として生物活性を示すことができる条件下で、系が維持されることを意味する。インビボ又はインビトロでのインキュベーションは、生物活性が明らかになるのに十分な時間を超える経過を伴う必要はない。

本明細書に記載されるような膜タンパク質の特定の結合対の結合をブロックしない可変ドメインは、典型的には、可変ドメインの非存在下での結合と比較して、対の結合を低減しない。これは、好ましくはインビトロアッセイで測定される。典型的には、これは、可変ドメインを膜タンパク質とインキュベートすることによって行われ、これは、混合物を対の他のメンバーに結合し、続いてインキュベートすることによって行われる。次いで、対の結合は、可変ドメインの非存在下での対の結合と比較される。可変ドメインが、可変ドメインの非存在下での結合と比較して、５０％以下、好ましくは４０％以下、好ましくは３０％以下、好ましくは２０％以下、及びより好ましくは１０％以下まで対の結合を低減する場合、可変ドメインは、膜タンパク質の特定の結合対の結合をブロックしないと考えられる。可変ドメインによる結合、及び結合対の他のメンバーに対する結合のブロッキング又は非ブロッキングは、本明細書において、可変ドメインの２つの同じものを含む二価モノクローナル抗体を使用して得られるブロッキングとして定義される。ブロッキング又は非ブロッキングは、可変ドメインの２つの同じものを含む二価単一特異性抗体で得られたものとして定義される。

ＣＤ１３７の細胞外ドメインに結合することができ、ＣＤ１３７のＣＤ１３７Ｌへの結合をブロックしない特定の可変ドメインは、ＭＦ６８６０、ＭＦ６８４８、ＭＦ６８０５、ＭＦ６８３２、ＭＦ６８７０、ＭＦ６８６２、ＭＦ６８７５、又はＭＦ６８７３のＶＨのアミノ酸配列を含む可変ドメインである。

ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインに結合することができ、ＰＤ１のＰＤ−Ｌ１への結合をブロックしない特定の可変ドメインは、ＭＦ５３６１のＶＨのアミノ酸配列を含む可変ドメインである。

例えば、抗原への結合、受容体リガンド相互作用のブロック能力、可変ドメインの生物活性など、必ずしも量ではなく本質的な可変ドメインの機能的態様は、様々な方法で決定することができる。好適なフォーマットは、Ｆａｂ断片又は抗体である。好適な抗体フォーマットは、２つの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体である。別の好適なフォーマットは、例えば、試験対象の可変ドメイン及び別の可変ドメインを含む二重特異性抗体である。他の可変ドメインは、実施されるアッセイに対して中立的特異性を有する可変ドメインであることが好ましい。好適な中立的可変ドメインは、破傷風毒素に結合することができる可変ドメインである。

本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、そのＴＮＦ受容体スーパーファミリー標的膜タンパク質のその結合パートナーへの結合をブロックする可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、そのＴＮＦ受容体スーパーファミリー標的膜タンパク質のその結合パートナーへの結合をブロックする可変ドメインを含み、２つの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体として提供される場合、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激しない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、ＣＤ１３７のＣＤ１３７Ｌへの結合をブロックする可変ドメインを含み、２つの可変ドメインを含む単一特異性二価抗体として提供される場合、細胞上のＣＤ１３７の活性を刺激しない。

本発明はまた、がんを有する個体を治療するための方法であって、それを必要とする個体に、本発明の結合分子、好ましくは、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体、又は本発明の二重特異性抗体を投与することを含む方法も提供される。個体は、好ましくはがんを有する個体である。いくつかの実施形態では、がんは、第２の膜タンパク質を発現するがん細胞を含むがんである。いくつかの実施形態では、がんは、Ｂ７ファミリーのメンバーを発現するがん細胞を含むがんである。いくつかの実施形態では、個体の骨髄細胞系列の免疫細胞及び／又は細胞は、第２の膜タンパク質、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーを発現する。いくつかの実施形態では、個体の抗原提示細胞（antigen presenting cell、ＡＰＣ）細胞は、第２の膜タンパク質、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーを発現する。これらの実施形態によると、がん細胞は、第２の膜タンパク質を発現してもよく、又は発現しなくてもよい。ＡＰＣが第２の膜タンパク質を発現するとき、がんの抗原は、個体のこのようなＡＰＣによって提示され、免疫細胞（好ましくはＴ細胞）のトランス活性化は、免疫細胞及び個体の免疫細胞、ＡＰＣ、又は腫瘍細胞に結合することができる、本発明の抗体又は機能的部分、派生体、及び／若しくは類似体によって誘導され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ１３７及びＢ７ファミリーのメンバー、好ましくはＰＤ−Ｌ１に結合する、本発明の抗体又は機能的部分、本発明の派生体及び／若しくは類似体が使用される。本発明のかかる抗体又は機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、ＣＤ１３７発現免疫細胞（好ましくはＴ細胞）と、腫瘍細胞及び／又は免疫細胞、及び／又は骨髄細胞系列の細胞並びに／若しくはＢ７ファミリーのメンバーを発現するＡＰＣのいずれかに結合することにより、免疫細胞をトランス活性化することができる。

がんは、好ましくは腺癌である。好ましいがんは、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、黒色腫、精巣がん、尿路上皮がん、腎臓がん、胃がん、又はカロチノイドがんである。好ましい実施形態では、癌は、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、又は黒色腫である。特に好ましい実施形態では、癌は、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、又は肝臓がんである。特に好ましい実施形態では、がんは胃腸がんである。好ましい実施形態では、がんは結腸直腸がんである。この実施形態では、結合分子、好ましくは抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、ＣＤ１３７又はＯＸ４０に結合することができる可変ドメインと、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる可変ドメインとを有する抗体である。ＣＤ１３７又はＯＸ４０に結合する可変ドメインは、好ましくは、ＣＤ１３７のＣＤ１３７リガンドへの結合をブロックするか、又はＯＸ４０の場合、ＯＸ４０のＯＸ４０リガンドへの結合をブロックする。ＰＤ−Ｌ１に結合する可変ドメインは、好ましくは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合をブロックする。

更に、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体、あるいは二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体、並びに第１の細胞及び第２の細胞を含むエクスビボ系が提供される。第１及び第２の細胞は、好ましくは、細胞膜上にそれぞれ第１及び第２の膜タンパク質を発現する。この系は、好ましくは、第１の細胞の維持及び／又は増殖に好適な細胞系である。この細胞系は、好ましくは、第２の細胞の維持及び／又は増殖に好適な細胞系である。このような系は、例えば、異常細胞に向けられる免疫細胞を上昇及び／又は増殖させるのに好適である。このような免疫細胞は、その後、それを必要とする個体、例えばがん患者に投与することができる。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞を含む。免疫細胞は、好ましくは、それを必要とする個体の自家細胞である。

個体における免疫応答を個体の異常細胞に対して刺激する方法であって、本発明の抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体を個体に提供することを含む方法が更に提供される。異常細胞は、好ましくはがん細胞、ウイルス感染細胞、寄生体又は寄生体感染細胞である。好ましい実施形態では、細胞は、がん細胞又は新生物性細胞である。この実施形態では、抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、ＣＤ１３７又はＯＸ４０の細胞外部分に結合することができる可変ドメインと、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる可変ドメインとを有する抗体である。ＣＤ１３７又はＯＸ４０に結合する可変ドメインは、好ましくは、ＣＤ１３７のＣＤ１３７リガンドへの結合をブロックするか、又はＯＸ４０の場合、ＯＸ４０のＯＸリガンドへの結合をブロックする。ＰＤ−Ｌ１に結合する可変ドメインは、好ましくは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合をブロックする。

新生物は、組織の異常な増殖であり、これがまた塊も形成する場合、腫瘍と称される。本発明における新生物は、典型的には、塊を形成する。新生物性細胞は、塊を形成した新生物由来の細胞である。世界保健機関（World Health Organization、ＷＨＯ）は、新生物を４つの主群：良性新生物、上皮内（in situ）新生物、悪性新生物、及び性状不詳又は不明の新生物に分類する。悪性新生物はまた、がんとして単に知られている。

免疫応答を刺激することは、免疫応答を誘導し、既に存在する免疫応答を強化することを包含する。個体における免疫応答は、該当する場合、個体の腫瘍負荷、個体のウイルス負荷、個体の寄生体負荷を測定することによって測定することができる。

ウイルス感染細胞は、好ましくは、免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、好ましくは単純ヘルペスウイルス、ワセラ−ゾステリルウイルス、サイトメガロウイルス、又はエプスタイン−バーウイルス、パピローマウイルス、肝炎ウイルス、好ましくはＡ型、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、又はアデノウイルスに感染した細胞である。ウイルスは、個体において持続性であることが知られているウイルスであることが好ましい。持続性感染は、ウイルスが除去されないが感染した個体の特定の細胞内に留まるものとして特徴付けられる。持続性感染は、迅速に殺傷することなく、又は更に宿主細胞の過剰な損傷を生じさせることなく、無症状感染及び増殖性感染の両方の段階を伴い得る。持続性ウイルス−宿主相互作用は、潜伏感染、慢性感染及び／又は遅発性感染であってもよい。

寄生体感染細胞は、細胞内寄生体に感染している細胞である。このような寄生体は、宿主の細胞内で増殖及び再生することができる寄生微生物である。一部の細胞内寄生体はまた、細胞の外側で生存することができる。このような寄生体は、いわゆる通性細胞内寄生体である。非限定的な例は、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、レジオネラ、マイコバクテリウムの特定の種、及びクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）である。好ましい細胞内寄生体は、宿主細胞の外側で増殖できない寄生体であり、好ましい例は、クラミジア及び密接に関連する種、マイコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）などのマイコバクテリウムの特定種、特定の原生動物（アピコンプレクサ（マラリア原虫（Plasmodium spp．、トキソプラズマ・ドンディイ（Toxoplasma gondii）及びクリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）並びにトリパノソーマである。

本発明はまた、本発明による抗体重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。核酸分子（典型的には、インビトロ、単離された、又は組換え核酸分子）は、好ましくは、図３に示される重鎖可変領域、又は１、２、３、４、若しくは５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、図３に示される重鎖可変領域のいずれか１つをコード化する。好ましい実施形態では、核酸分子は、図３に示されるような配列を含む。核酸分子は、好ましくは、使用される抗体産生細胞における発現のために最適化されたコドンを使用する。好ましくは、図３に示される重鎖可変領域、又は１、２、３、４、若しくは５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、図３に示される重鎖可変領域をコードする核酸は、ヒト細胞、好ましくはＰｅｒ．Ｃ６ＴＭ、又はチャイニーズハムスター、好ましくはＣＨＯでの発現のために最適化されたコドンである。本発明は、図２の重鎖定常領域と共に、言及した重鎖可変領域をコードする核酸分子を更に提供する。

本発明で使用される核酸分子は、典型的には、但しこれに限定されずに、リボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）である。代替的な核酸は、当業者に利用可能である。本発明による核酸分子は、例えば、細胞内に含まれる。核酸分子が細胞内で発現されるとき、細胞は、本発明による抗体を産生することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、本発明による抗体及び／又は本発明による核酸分子を含む細胞を提供する。細胞が重鎖及び軽鎖を産生するとき、抗体が産生される。本発明の抗体を産生できる細胞が提供される。この細胞は、好ましくは、抗体重鎖可変領域を含む抗体重鎖をコード化する核酸分子を含み、この抗体重鎖可変領域は、共通軽鎖と組み合わされると、第１の膜タンパク質に結合することができる。この細胞は、好ましくは、抗体重鎖可変領域を含む抗体重鎖をコード化する核酸分子を更に含み、この抗体重鎖可変領域は、共通軽鎖と組み合わされると、第２の膜タンパク質に結合することができる。細胞は、好ましくは、共通軽鎖をコードする核酸分子を更に含む。細胞は、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の目的のために、好適な細胞は、本発明による抗体及び／又は本発明による核酸を含むことができ、好ましくは産生することができる任意の細胞である。

本発明は、本発明による抗体を含む細胞を更に提供する。また、本発明の抗体を単独で又は一緒にコード化する１つ以上の核酸分子を含む細胞も提供される。１つ以上の核酸分子は、発現可能な核酸分子であり、これは、それらがＲＮＡ転写及びタンパク質コードドメインの翻訳にシスでの必要なシグナルを含有することを意味する。好ましくは、細胞（典型的にはインビトロ、単離された、又は組換え細胞）は、抗体を産生する。好ましい実施形態では、細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、又はＰＥＲ−Ｃ６ＴＭ細胞である。特に好ましい実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。本発明による細胞を含む細胞培養が更に提供される。様々な機関及び企業は、例えば、臨床使用のために、抗体の大規模生産のための細胞株を開発してきた。このような細胞株の非限定的な例は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞である。これらの細胞はまた、タンパク質の産生などの他の目的にも使用される。タンパク質及び抗体の工業規模生産のために開発された細胞株は、本明細書では産業細胞株と更に称される。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、本発明の抗体の産生のための抗体の大規模生産のために開発された細胞株の使用を提供する。本発明は、図３、１及び２に示されるＶＨ、ＶＬ、及び／又は重鎖をコードする核酸分子を含む抗体を産生するための細胞を更に提供する。好ましくは、核酸分子は、図１及び２に示されるような配列を含む。

本発明は、本発明の細胞を培養することと、培養物から抗体を採取することとを含む、抗体を製造するための方法を更に提供する。好ましくは、細胞は、無血清培地中で培養される。好ましくは、細胞は懸濁増殖に適合される。更に、本発明による抗体を製造するための方法によって得ることができる抗体が提供される。抗体は、好ましくは、培養培地から精製される。好ましくは、抗体は、親和性精製される。

本発明の細胞は、例えば、ハイブリドーマ細胞株、ＣＨＯ細胞、２９３Ｆ細胞、ＮＳ０細胞、又は臨床目的のための抗体の産生に関して、特にヒトにおける投与に使用される抗体の産生に関して、その適性が当該技術分野において既知の任意の他の細胞型である。特に好ましい実施形態では、細胞は、ヒト細胞であり、好ましくはアデノウイルスＥ１領域又はその機能的等価物によって形質転換される細胞である。このような細胞株の好ましい例は、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞株又はその等価物である。特に好ましい実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞又はその変異体であり、好ましくは、抗体の発現のためのグルタミンシンターゼ（Glutamine synthetase、ＧＳ）ベクター系を使用する変異体である。

本発明は、本発明による１つ以上の抗体又はその変異体を含む医薬組成物を更に提供する。医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む。

本発明の抗体又はその変異体は、標識、好ましくはインビボ撮像用の標識を更に含んでもよい。このようなラベルは、典型的には、治療用途に必要ではない。例えば、診断設定では、標識が有用であり得る。例えば、身体内の標的細胞の可視化において有用であり得る。様々な標識が好適であり、多くは当該技術分野において周知である。好ましい実施形態では、標識は、検出用の放射性標識である。別の好ましい実施形態では、標識は、赤外標識である。好ましくは、赤外標識は、インビボ撮像に適している。様々な赤外標識が、当業者に利用可能である。好ましい赤外標識は、例えば、ＩＲＤｙｅ８００、ＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ、ＩＲＤｙｅ６８０ＬＴ、ＩＲＤｙｅ７５０、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳＩＲＤｙｅ６５０、ＩＲＤｙｅ７００ホスホルアミダイト、ＩＲＤｙｅ８００ホスホルアミダイト（ＬＩ−ＣＯＲＵＳＡ；４６４７ＳｕｐｅｒｉｏｒＳｔｒｅｅｔ；Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）である。

患者に投与されるべき本発明による抗体の量は、典型的には、治療用ウィンドウ内にあり、これは、治療効果を得るために十分な量が使用されるが、その量は、許容不可能な程度の副作用をもたらす閾値を超えないことを意味する。所望の治療効果を得るために必要とされる抗体の量が少なくなるほど、治療用ウィンドウは典型的にはより大きくなるであろう。したがって、低薬用量で十分な治療効果を発揮する本発明による抗体が好ましい。薬用量は、ニボルマブの投与レジメンの範囲であり得る。薬用量はまた、より低くてもよい。

腫瘍抑制環境では、周囲細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現は、実施例８に記載されるＴ細胞上のＣＤ１３７の活性化をもたらすことになる密度閾値に達することが予想される（図２８Ａ及び２８Ｂ）。したがって、二重特異性抗体は、腫瘍内のＴ細胞を活性化することができるか、又は低ＰＤ−Ｌ１細胞表面レベルを発現している細胞に対して、有意に少ない程度作用を及ぼすことができるであろう。ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体が、ＦａｂアームをブロックするＰＤ−Ｌ１を含有する場合、抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断を更に克服するであろう。「トランス」に作用することにより、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断を開放し、ＣＤ１３７を活性化することによってＴ細胞を同時に活性化する。結果として、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体は、サイトカインの過多の放出をもたらす局所的Ｔ細胞応答を増強することができ（実施例９）、次いで、腫瘍微小環境内の他の免疫細胞を活性化し、少なくとも部分的に腫瘍内の局所的な免疫抑制を克服することができる。本発明者らは、本発明による二重特異性抗体は、多くの場合、同じ種類の特異性を有する従来技術のベンチマーク抗体（例えば、ウレルマブに基づく抗体（抗ＣＤ１３７）又はアテゾリズマブに基づく抗体（抗ＰＤ−Ｌ１）など）と比較して、より良好なＴ細胞活性化特性を有することが示した。実施例では、本発明による二重特異性抗体を用いて、このようなベンチマーク系抗体の２つの混合物と比較して、より強いＴ細胞活性化活性が得られた。これは、例えば、本発明の実施例のＴ細胞トランス活性化アッセイ及びＳＥＢ刺激アッセイで示される。また、本発明による二重特異性抗体が、腫瘍随伴Ｍ２マクロファージによって誘発される免疫抑制を逆転させることができ、インビトロで患者腫瘍から単離された腫瘍特異的Ｔ細胞を（再）刺激することができることも実証されている。本発明による二重特異性抗体は、腫瘍特異的ＣＤ４＋エフェクターメモリＴ細胞、腫瘍特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリＴ細胞、及び腫瘍特異的ＣＤ８＋最終分化Ｔ細胞を（再）刺激することができ、一方で、アテゾリズマブに基づくベンチマーク抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、典型的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞のみを（再）刺激する。したがって、本発明による二重特異性抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むベンチマーク抗体と比較して、抗原特異的Ｔ細胞のより可変なサブセットを（再）刺激する効力を有する。

次に、抗原経験ＣＤ８Ｔ細胞を活性化することによって、腫瘍に対する既存の細胞傷害性Ｔ細胞応答を再活性化するために、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、デノボＣＤ８＋Ｔ細胞抗腫瘍応答を増強し得る。腫瘍細胞又は抗原提示細胞によって貪食された腫瘍細胞を染色することによって環境内に流出された腫瘍（新生）抗原は、腫瘍組織に見られる異所性リンパ様形成体である排出リンパ節又は三次リンパ様構造まで輸送される。局所腫瘍環境では、腫瘍抗原は、抗原認識時に増殖及び分化するナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に提示される。

実施例に示すように、本発明による抗体は、ウレルマブに基づく又はアテゾリズマブに基づくベンチマーク抗体と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミング後のＴ細胞の増殖をより高い程度に向上させることができる。実施例では、本発明による抗体は、ウレルマブに基づく又はアテゾリズマブに基づくベンチマーク抗体の混合物よりも高い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び分化の両方を誘導することができ、これは、腫瘍特異的メモリ及び最終分化キラーＴ細胞の大きな集団の生成を促進することになることを実証している。

本発明による抗体又はその変異体、特に二重特異性抗体又はその変異体は、可変ドメインを有する二価単一特異性抗体の組み合わせよりも副作用が少ない場合がある。阻害性及び／又は共刺激性分子をブロックする抗体の組み合わせは、既存の免疫療法に応答しない患者に利益をもたらす。しかしながら、免疫調節受容体（immuno−modulatory receptor、ｉＭＯＤ）の二重遮断が、免疫関連毒性を増加させることが示されている。本発明による抗体又はその変異体、特に二重特異性抗体又はその変異体は、これらがモノクローナル抗体の組み合わせによって再現することができない機能活性を及ぼすことができ、患者における安全性の障害を低減する特異的な細胞集団をより選択的に標的にすることができるため、ｉＭＯＤの二重遮断に対処するのに適している。いかなる理論にも束縛されるものではないが、単一特異性抗体（の組み合わせ）と比較した場合の、本発明の二重特異性抗体又は変異体の有害な副作用の可能性の低減は、少なくとも部分的には、本発明の二重特異性抗体又は変異体は、少なくとも部分的には、本発明の二重特異性抗体又は変異体が、典型的には、トランスにおいてＴ細胞活性化を呈するのに対し、シスにおいてはＴ細胞活性化活性は低いことに起因すると考えられる。本発明との関連において、シスＴ細胞活性化活性が低い抗体の使用は、これが潜在的な非特異的Ｔ細胞応答を減少させるため好ましい。本発明による抗体あるいは二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、可変ドメインを有する二価単一特異性抗体の組み合わせよりも少ない免疫関連毒性を有する。

上記を考慮すると、本発明による二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、治療用途に好ましい。

これらの抗体は、重鎖のヘテロ二量体化を促進するＣＨ３領域に突然変異を含有する相補的発現ベクターにそれらをクローニングすることによって、二重特異性抗体として産生された。多くの二重特異性抗体を小規模で産生し、がん細胞株に対する結合及び機能アッセイにおいて試験した。本発明の抗体、特に本発明の二重特異性抗体は、低毒性プロファイルに高効率を組み合わせることができる。本発明の抗体は、免疫標的療法の様々な種類及び系統において有用であり得る。本発明の抗体は、両方のアームと同じ抗原（複数可）に結合する抗体と比較して、治療用ウィンドウの増加を有することができる。

異常細胞、腫瘍及び／又は転移の形成の治療若しくは予防のための薬剤の調製のための、本発明による二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体の使用が更に提供される。転移が生じた腫瘍は、好ましくは、第２の細胞膜タンパク質に対して陽性であり、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーに対して陽性である腫瘍である。

本発明の抗体は、懸濁２９３Ｆ細胞における一過性トランスフェクションの後、＞５０ｍｇ／Ｌのレベルで産生することができる。二重特異性抗体は、＞７０％の収率で純度９８％超に精製することができる。分析特性評価研究は、二価単一特異性ＩｇＧ１に匹敵する二重特異性ＩｇＧ１抗体プロファイルを示す。

本発明はまた、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分と、膜結合第２の膜タンパク質、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーの細胞外部分とに結合することができる、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位と、第２のタンパク質、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位とを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体の抗原結合部分は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインと、Ｂ７ファミリーのメンバーに結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる。二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに対して一価であり、かつＢ７ファミリーのメンバーに対して一価である。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長ＩｇＧ、すなわち、完全長ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、好ましくは、完全長ＩｇＧ１又は完全長ＩｇＧ４である。

本発明はまた、ＣＤ１３７の細胞外部分と、ＰＤ−Ｌ１の細胞外部分とに結合することができる二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供する。二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体は、好ましくは、２つの抗原結合部位を含む。二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体は、好ましくは、ＣＤ１３７に結合することができる１つの抗原結合部位と、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる１つの抗原結合部位とを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体の抗原結合部分は、ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインと、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる。二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体は、好ましくは、ＣＤ１３７に対して一価であり、かつＰＤ−Ｌ１に対して一価である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１３７に結合することができる抗原結合部位は、ＣＤ１３７のＣＤ１３７Ｌへの結合をブロックすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１３７に結合することができる抗原結合部位は、ＣＤ１３７のＣＤ１３７Ｌへの結合をブロックすることができない。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる抗原結合部位は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合をブロックすることができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１に結合することができる抗原結合部位は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合をブロックすることができない。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長ＩｇＧ、すなわち、完全長ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、好ましくは、完全長ＩｇＧ１又は完全長ＩｇＧ４である。

本発明はまた、がんを有する個体を治療するための方法であって、それを必要とする個体に本発明の結合分子、あるいは本発明の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体を投与することを含む方法も提供される。

本発明は、がんを有する個体の治療に使用するための、本発明の結合分子、あるいは本発明の二重特異性抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体を更に提供する。

本発明の二重特異性抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体と、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの膜結合メンバーを発現する第１の細胞と、膜結合第２の膜タンパク質、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーを発現する第２の細胞とを含む細胞系を更に提供する。

本発明は、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第１の細胞及び第２の細胞を準備することを含み、第１の細胞が細胞膜上にメンバーを含み、第２の細胞が細胞膜上に第２の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、２つの可変ドメインを含む二重特異性抗体又はその変異体と接触させることを含み、１つの可変ドメインが、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる第１の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第２の抗原結合部位を含み、それによって、第１の細胞上のメンバーの活性を刺激する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーは、ＣＤ１３７又は好ましくはＯＸ４０である。第２の膜タンパク質は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。二重特異性抗体は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに対して一価であり、第２の膜タンパク質に対して一価であり、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーに対して一価である。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長ＩｇＧ、すなわち、完全長ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、好ましくは、完全長ＩｇＧ１又は完全長ＩｇＧ４である。

第１の細胞は、好ましくは、細胞膜上で第２の膜タンパク質を有意に発現しない。第２の膜タンパク質は、好ましくは、細胞膜上の１つ以上の区域に存在するタンパク質である。区域は、好ましくは、細胞膜上のクラスター、ドメイン、マイクロドメイン、又はコンパートメントであり、好ましくは免疫シナプスである。第２の膜タンパク質は、好ましくは、２つ以上の第２の膜タンパク質のインスタンスを含む多量体タンパク質の一部として細胞膜上に存在する。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、ホモ二量体又はホモ三量体の一部として細胞膜上に存在する。好ましい実施形態では、第２の膜タンパク質は、多量体サイトカイン受容体、Ｂ７ファミリーのメンバー、ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＡＴＰ結合カセット輸送体（ＡＢＣ輸送体）のメンバー、アクアポリン、セリン／スレオニンキナーゼ受容体ファミリーのメンバー、受容体型チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。第２の膜タンパク質は、好ましくはＢ７−ファミリーのメンバーであり、好ましくはＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２であり、好ましくはＰＤ−Ｌ１である。好ましい実施形態では、第２の膜タンパク質は、ＥＧＦ受容体ファミリー（ＥｒｂＢ）、ＩＧＦ受容体ファミリー、ＦＧＦ受容体ファミリー、ＶＥＧＦ受容体ファミリー、ＨＧＦ受容体ファミリー、又はＡＸＬ受容体ファミリーのメンバーである。第２の膜タンパク質は、好ましくは、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバー（ＥｒｂＢ）であり、好ましくはＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−２又はＥｒｂＢ−３であり、好ましくはＥｒｂＢ−２である。好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合する可変ドメインは、メンバーに対するリガンドの結合をブロックする。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインは、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合する２つの可変ドメインを含む二価の単一特異性抗体フォーマットである場合、細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激しない可変ドメインとして定義される。方法は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む更なる二重特異性抗体を準備することを更に含み、第１及び第２の二重特異性抗体は、
第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第１及び第２の細胞を第１及び第２の二重特異性抗体と共にインキュベートすることによって、第１の細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。好ましい実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、ＣＤ１３７又はＯＸ４０である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の二重特異性抗体は、それぞれ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに結合することができる１つの抗原結合部位を含む。第２の膜タンパク質は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。第１及び／又は第２の二重特異性抗体は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーに対して一価であり、第２の膜タンパク質に対して一価であり、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーに対して一価である。第１及び／又は第２の二重特異性抗体は、好ましくは完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の二重特異性抗体は、完全長ＩｇＧ、すなわち、完全長ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、好ましくは、完全長ＩｇＧ１又は完全長ＩｇＧ４である。

第２の膜タンパク質に結合することができる第１及び第２の二重特異性抗体の抗原結合部位は、好ましくは、第２の膜タンパク質の細胞外部分上の異なるエピトープに結合する。第２の膜タンパク質の細胞外部分上の異なるエピトープは、好ましくは非競合エピトープである。

また、ＣＤ１３７又はＯＸ４０の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む二重特異性抗体も提供される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１３７又はＯＸ４０に結合することができる１つの抗原結合部位を含む。第２の膜タンパク質は、好ましくは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない。第２の膜タンパク質は、好ましくはＴ細胞によって有意な程度では発現されない。第２の膜タンパク質は、好ましくは、免疫細胞、骨髄系の細胞、抗原提示細胞、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、又は寄生体感染細胞上で発現される。好ましくは、第２の膜タンパク質は、細胞膜上の１つ以上の区域に存在するタンパク質である。区域は、好ましくは、細胞膜上のクラスター、ドメイン、マイクロドメイン、又はコンパートメントであり、好ましくは免疫シナプスである。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、第２の膜タンパク質の２つ以上を含む多量体タンパク質の一部として細胞膜上に存在するタンパク質である。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、ホモ二量体又はホモ三量体の一部として細胞膜上に存在する。好ましくは、第２の膜タンパク質は、多量体サイトカイン受容体、Ｂ７ファミリーのメンバー、ＣＤ２８ファミリーのメンバー、ＡＴＰ結合カセット輸送体（ＡＢＣ輸送体）のメンバー、アクアポリン、セリン／スレオニンキナーゼ受容体ファミリーのメンバー、受容体型チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。第２の膜タンパク質は、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーであり、好ましくはＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２であり、好ましくはＰＤ−Ｌ１である。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、ＥＧＦ受容体ファミリー（ＥｒｂＢ）、インスリン受容体ファミリー、ＩＧＦ受容体ファミリー、ＦＧＦ受容体ファミリー、ＶＥＧＦ受容体ファミリー、ＨＧＦ受容体ファミリー、又はＡＸＬ受容体ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、第２の膜タンパク質は、ＥＧＦ受容体ファミリー（ＥｒｂＢ）のメンバーであり、好ましくは、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−２又はＥｒｂＢ−３であり、好ましくはＥｒｂＢ−２である。ＣＤ１３７又はＯＸ４０に結合する可変ドメインは、好ましくは、メンバーに対するリガンドの結合をブロックする。ＣＤ１３７又はＯＸ４０の細胞外部分に結合する可変ドメインは、好ましくは、ＣＤ１３７又はＯＸ４０に結合する２つの可変ドメインを含む二価の単一特異性抗体フォーマットである場合、細胞上のＣＤ１３７又はＯＸ４０の活性を刺激しない可変ドメインとして定義される。二重特異性抗体は、好ましくは、ＣＤ１３７又はＯＸ４０に対しては一価であり、第２の膜タンパク質に対して一価である。二重特異性抗体は、好ましくは、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、完全長ＩｇＧ、すなわち、完全長ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、好ましくは、完全長ＩｇＧ１又は完全長ＩｇＧ４である。

本発明はまた、本発明による二重特異性抗体を１つ以上含む組成物も提供する。また、本発明の二重特異性抗体を２つ以上含む組成物又はキットオブパーツであって、第１及び第２の二重特異性抗体のＣＤ１３７又はＯＸ４０に結合することができる抗原結合部位は、ＣＤ１３７又はＯＸ４０上の異なるエピトープに結合する、組成物又はキットオブパーツも提供される。また、細胞上のＣＤ１３７又はＯＸ４０の活性を刺激する方法であって、第１の細胞及び第２の細胞を準備することを含み、第１の細胞が細胞膜上にＣＤ１３７又はＯＸ４０（第１の膜タンパク質）を有し、第２の細胞が細胞膜上の第２の膜タンパク質を有し、方法が、細胞を、２つの可変ドメインを含む本発明による二重特異性抗体（第１の二重特異性抗体）と接触させることを含み、１つの可変ドメインが、第１の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第１の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第２の抗原結合部位を含み、それによって、第１の細胞上の第１の膜タンパク質の活性を刺激する、方法も提供される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、第１の膜タンパク質に結合することができる１つの抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。方法は、好ましくは、第１の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を有する可変ドメインと、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を有する可変ドメインとを含む更なる二重特異性抗体（第２の二重特異性抗体）を準備することを更に含み、第１及び第２の二重特異性抗体は、
第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
方法は、第１の細胞及び第２の細胞を、第１及び第２の二重特異性抗体と共にインキュベートすることによって、第１の細胞上のＣＤ１３７又はＯＸ４０の活性を刺激することを更に含む。第２の膜タンパク質は、好ましくはＢ７ファミリーのメンバーであり、より好ましくはＰＤ−Ｌ１である。

本明細書で以下に示されるようなＭＦ配列によって定義される抗体は、好ましくは、２つの異なる可変ドメインを有する二重特異性抗体であり、これらの可変ドメインのうちの１つは、示される配列を含む。

ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、ＭＦ６７５４、ＭＦ６７６３、ＭＦ６７８５、又はＭＦ６７９７（図３）の可変重鎖領域のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域を含む。

ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、ＭＦ６７５４、ＭＦ６７６３、ＭＦ６７８５、又はＭＦ６７９７（図３）に示されるＶＨのうちの１つの可変重鎖領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域を含む。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、好ましくは、同じＶＨ領域から選択される。

ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、示したＭＦのＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７５４、ＭＦ６７６３、ＭＦ６７８５、又はＭＦ６７９７の可変重鎖領域のアミノ酸配列を含む。アミノ酸挿入（複数可）、欠失（複数可）、置換（複数可）、又はこれらの組み合わせは、もしあれば、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列にはないことが好ましい。

ＰＤ−Ｌ１の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５４２４、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、ＭＦ５５５３、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５４４２、又はＭＦ５３６１（図３）の可変重鎖領域のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域を含む。

ＰＤ−Ｌ１の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５４２４、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、ＭＦ５５５３、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５４４２、又はＭＦ５３６１（図３）に示されるＶＨのうちの１つの可変重鎖領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域を含む。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、好ましくは、同じＶＨ領域から選択される。

ＰＤ−Ｌ１の細胞外部分に結合することができる可変ドメインを含む抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、示したＭＦのＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５４２４、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、ＭＦ５５５３、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５４４２、又はＭＦ５３６１の可変重鎖領域のアミノ酸配列を含む。アミノ酸挿入（複数可）、欠失（複数可）、置換（複数可）、又はこれらの組み合わせは、もしあれば、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列にはないことが好ましい。

抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、ＣＤ１３７のＣＤ１３７リガンドへの結合をブロックするＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる可変ドメインと、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合をブロックするＰＤ−Ｌ１の細胞外部分に結合することができる可変ドメインとを含む。この抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体におけるＰＤ−Ｌ１の細胞外部分に結合する可変ドメインは、好ましくは、ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５４２４、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、ＭＦ５５５３、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５４４２、又はＭＦ５３６１（図３）のＶＨのうちの１つのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む。好ましい実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の細胞外部分に結合する可変ドメインは、示したＭＦのＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５４２４、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、ＭＦ５５５３、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５４４２、又はＭＦ５３６１のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む。

この抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体におけるＣＤ１３７の細胞外部分に結合する可変ドメインは、好ましくは、ＭＦ６７５４、ＭＦ６７６３、ＭＦ６７８５、又はＭＦ６７９７（図３）のＶＨのうちの１つのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む。好ましい実施形態では、ＣＤ１３７の細胞外部分に結合する可変ドメインは、示したＭＦのＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７５４、ＭＦ６７６３、ＭＦ６７８５、又はＭＦ６７９７のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む。アミノ酸挿入（複数可）、欠失（複数可）、置換（複数可）、又はこれらの組み合わせは、もしあれば、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列にはないことが好ましい。この抗体又は機能的部分、派生体及び／若しくは類似体における特に好ましい組み合わせは、ＭＦ６７９７及びＭＦ７７０２、ＭＦ６７６３及びＭＦ７７０２、ＭＦ６７８５及びＭＦ７７０２、ＭＦ６７９７及びＭＦ５５５３、ＭＦ６７６３及びＭＦ５５５３、ＭＦ６７８５及びＭＦ５５５３、ＭＦ６７５４及びＭＦ５４２４、ＭＦ６７６３及びＭＦ５５６１、ＭＦ６７８５及びＭＦ５４３９、ＭＦ６７９７及びＭＦ５５５３、ＭＦ６７４４及びＭＦ５５９４、ＭＦ６７４４及びＭＦ５３６１、ＭＦ６７８３及びＭＦ５３６１、又はＭＦ６７８３及びＭＦ５５９４の示した配列又はその変異体を含む可変ドメインの組み合わせである。

本明細書に記載される抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、
ＭＦ６７５４のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５５５３、ＭＦ５４４２、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、又はＭＦ５３６１（図３）のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む。

抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、
ＭＦ６７５４のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７５４のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
示したＭＦのＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５５５３、ＭＦ５４４２、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、又はＭＦ５３６１（図３）のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む。

本明細書に記載される抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、
ＭＦ６７６３のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５５５３、ＭＦ５４４２、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、又はＭＦ５３６１（図３）のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む。

抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、
ＭＦ６７６３のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７６３のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
示したＭＦのＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５５５３、ＭＦ５４４２、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、又はＭＦ５３６１（図３）のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む。

本明細書に記載される抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、
ＭＦ６７８５のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５５５３、ＭＦ５４４２、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、又はＭＦ５３６１（図３）のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む。

抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、
ＭＦ６７８５のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７８５のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
示したＭＦのＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５５５３、ＭＦ５４４２、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、又はＭＦ５３６１（図３）のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む。

本明細書に記載される抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、
ＭＦ６７９７のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５５５３、ＭＦ５４４２、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、又はＭＦ５３６１（図３）のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む。

抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、
ＭＦ６７９７のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７９７のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
示したＭＦのＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５５４、ＭＦ５５７６、ＭＦ５５７８、ＭＦ９３７５、ＭＦ９３７６、ＭＦ７７０２、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５５５３、ＭＦ５４４２、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４３９、又はＭＦ５３６１（図３）のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む。

実施例に示すように、ＭＦ５５５３に基づくＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインを有する抗体は、特に良好なＴ細胞活性化を提供し、ＭＦ６７５４、ＭＦ６７６３、ＭＦ６７８５、及びＭＦ６７９７を含む異なるＣＤ１３７結合可変ドメインとの組み合わせをもたらす。

したがって、更に、
ＭＦ６７５４のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が更に提供される。

また、
ＭＦ６７５４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

また、
ＭＦ６７５４のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７５４のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５５３のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

更に、
ＭＦ６７６３のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が提供される。

また、
ＭＦ６７６３のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

また、
ＭＦ６７６３のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７６３のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５５３のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

更に、
ＭＦ６７８５のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が提供される。

また、
ＭＦ６７８５のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

また、
ＭＦ６７８５のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７８５のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５５３のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

更に、
ＭＦ６７９７のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が提供される。

また、
ＭＦ６７９７のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

また、
ＭＦ６７９７のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７９７のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５５３のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５５３のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

ＭＦ７７０２に基づくＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインを有する抗体が、特に良好なＴ細胞活性化を提供し、ＭＦ６７６３、ＭＦ６７８５、及びＭＦ６７９７を含む異なるＣＤ１３７結合可変ドメインとの組み合わせをもたらすことが、実施例に更に示されている。

したがって、更に、
ＭＦ６７９７のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ７７０２のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が提供される。

また、
ＭＦ６７９７のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ７７０２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

また、
ＭＦ６７９７のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７９７のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ７７０２のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ７７０２のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

更に、
ＭＦ６７６３のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ７７０２のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が提供される。

また、
ＭＦ６７６３のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ７７０２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

また、
ＭＦ６７６３のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７６３のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ７７０２のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ７７０２のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

更に、
ＭＦ６７８５のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ７７０２のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が提供される。

また、
ＭＦ６７８５のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ７７０２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

また、
ＭＦ６７８５のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７８５のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ７７０２のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ７７０２のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体、及び／若しくは類似体も提供される。

ＭＦ６７４４に基づくＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５５９４に基づくＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体が、特に良好なＴ細胞活性化を提供することが、実施例に更に示されおり、例えば、図１４〜１６を参照されたい。重要なことに、このような抗体は、抗体ウレルマブに基づく抗体と比較して、より強いＴ細胞活性化の可能性を有する。

したがって、更に
ＭＦ６７４４のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５９４のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が提供される。

また、
ＭＦ６７４４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５９４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

また、
ＭＦ６７４４のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７４４のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５９４のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５９４のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体、及び／若しくは類似体も提供される。

ＭＦ６７４４に基づくＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５３６１に基づくＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体が、特に良好なＴ細胞活性化を提供することが、実施例に更に示されおり、例えば、図１４〜１６を参照されたい。重要なことに、このような抗体は、抗体ウレルマブに基づく抗体と比較して、より強いＴ細胞活性化の可能性を有する。

したがって、更に、
ＭＦ６７４４のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５３６１のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が提供される。

また、
ＭＦ６７４４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５３６１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

また、
ＭＦ６７４４のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７４４のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５３６１のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５３６１のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

ＭＦ６７８３に基づくＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５３６１に基づくＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体が、特に良好なＴ細胞活性化を提供することが、実施例に更に示されおり、例えば、図１４〜１５を参照されたい。重要なことに、このような抗体は、抗体ウレルマブに基づく抗体と比較して、より強いＴ細胞活性化の可能性を有する。

したがって、更に、
ＭＦ６７８３のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５３６１のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が更に提供される。

また、
ＭＦ６７８３のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５３６１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

また、
ＭＦ６７８３のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７８３のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５３６１のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５３６１のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

ＭＦ６７８３に基づくＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５５９４に基づくＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体が、特に良好なＴ細胞活性化を提供することが、実施例に更に示されおり、例えば、図１４〜１５を参照されたい。

したがって、更に、
ＭＦ６７８３のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５９４のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体が更に提供される。

また、
ＭＦ６７８３のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５９４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

また、
ＭＦ６７８３のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７８３のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、
ＭＦ５５９４のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５９４のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体も提供される。

加えて、ＭＦ６７４４に基づくＣＤ１３７結合可変ドメイン及びＭＦ５３６１に基づくＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと共に、ＭＦ６７４４に基づくＣＤ１３７結合可変ドメイン及びＭＦ５５９４に基づくＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体の組み合わせ（デュアル二重特異性、例えば、Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）実施形態として適用される）は、優れたＴ細胞活性化（図１４〜１６を参照）を提供し、かつウレルマブに基づく抗体よりも優れていることが実施例に示されている。

したがって、
ＭＦ６７４４のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５５９４のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを含む、第１の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と、
ＭＦ６７４４のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５３６１のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを含む、第２の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツが更に提供される。

また、
ＭＦ６７４４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５５９４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを含む、第１の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と、
ＭＦ６７４４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５３６１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを含む、第２の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。

また、
ＭＦ６７４４のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７４４のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５５９４のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５９４のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと、を含む、第１の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と、
ＭＦ６７４４のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７４４のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５３６１のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５３６１のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを含む、第２の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。

加えて、ＭＦ６７４４に基づくＣＤ１３７結合可変ドメイン及びＭＦ５３６１に基づくＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと共に、ＭＦ６７８３に基づくＣＤ１３７結合可変ドメイン及びＭＦ５５９４に基づくＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを有する二重特異性抗体の組み合わせ（デュアル二重特異性、例えば、Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）実施形態として適用される）は、ウレルマブに基づく抗体と比べて、優れたＴ細胞活性化を提供することが実施例に示されている。

したがって、
ＭＦ６７８３のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５５９４のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを含む、第１の二重特異性抗体、又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と、
ＭＦ６７４４のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５３６１のＶＨのＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを含む、第２の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツが更に提供される。

また、
ＭＦ６７８３のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５５９４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを含む、第１の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と、
ＭＦ６７４４のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５３６１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを含む、第２の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。

また、
ＭＦ６７８３のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７８３のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５５９４のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５９４のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと、を含む、第１の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と、
ＭＦ６７４４のＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６７４４のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ５３６１のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５３６１のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを含む、第２の二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体と
を含む混合物又はキットオブパーツも提供される。

良好なＴ細胞活性化特性を有するＭＦ６７９７のＶＨのＣＤ１３７特異的結合は、図４２に示されるようなＣＤ１３７アミノ酸配列のＡｒｇ６６、Ｇｌｙ７０、及びＰｈｅ７２含むアミノ酸の存在に関連することもまた、実施例に示されている。

したがって、本発明はまた、ＣＤ１３７に結合することが可能である、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体を提供し、抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体のＣＤ１３７への結合は、図４２に示されるようなＣＤ１３７アミノ酸配列のＡｒｇ６６、Ｇｌｙ７０、及びＰｈｅ７２を含むアミノ酸の存在に関連する。ＣＤ１３７に対する抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体の結合は、好ましくは、図４２に示されるようなＣＤ１３７アミノ酸配列のＶａｌ７１を含むアミノ酸にも関連する。

用語「Ａｒｇ６６」は、図４２に示されるようなＣＤ１３７配列の６６位におけるアルギニン残基を指す。用語「Ｇｌｙ７０」は、図４２に示されるようなＣＤ１３７配列の７０位におけるグリシン残基を指す。用語「Ｖａｌ７１」は、図４２に示されるようなＣＤ１３７配列の７１位におけるバリン残基を指す。用語「Ｐｈｅ７２」は、図４２に示されるようなＣＤ１３７配列の７２位におけるフェニルアラニン残基を指す。

ＣＤ１３７に対する抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体の結合は、これらの残基のいずれか１つがアラニンによって置換されるとき、得られるＣＤ１３７タンパク質に対する抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体の結合が低減される場合、列挙されたアミノ酸残基の存在に関連する。

いくつかの実施形態は、ＣＤ１３７に結合することが可能である、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体を提供し、抗体、又は機能的部分、派生体若しくは類似体は、図４２に示されるようなＣＤ１３７アミノ酸配列のアミノ酸Ａｒｇ６６、Ｇｌｙ７０、及びＰｈｅ７２に特異的に結合する。抗体又は機能的部分、派生体若しくは類似体はまた、図４２に示されるようなＣＤ１３７アミノ酸配列のアミノ酸Ｖａｌ７１にも特異的に結合することが好ましい。

いくつかの好ましい実施形態は、ＣＤ１３７、及びＰＤ−Ｌ１に結合することが可能であり、ＭＦ６７９７に基づくＣＤ１３７結合可変ドメインと、ＭＦ７７０２に基づくＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインとを有する、二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体若しくは類似体を提供する。特に良好なＴ細胞活性化特性を有するこのような二重特異性抗体のＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１への結合は、上述のＣＤ１３７アミノ酸残基を含むアミノ酸に関連する。

ここで、上述のＣＤ１３７アミノ酸残基が同定されたことから、これらのアミノ酸残基に特異的に結合する抗体、又はその変異体を生成若しくは選択することが可能となる。特定のアミノ酸残基に特異的に結合する結合分子の生成及び／又は選択は、例えば、標的アミノ酸残基を含む特定のドメインを含有する抗原断片で抗体を生成することが可能なトランスジェニック非ヒト動物を免疫することなどによって、当該技術分野において周知の方法を用いて行うことができる。あるいは、抗体ファージディスプレイライブラリーを、同定されたアミノ酸残基に結合するファージについてスクリーニングすることによる。

ＣＤ１３７及び／又はＰＤ−Ｌ１に結合する抗体ＰＢ１７３１１と競合する、抗体又はその変異体が更に提供される。競合抗体又はその変異体は、例えば、ＣＤ１３７及び／又はＰＤ−Ｌ１を含む細胞が、ＰＢ１７３１１と共に、かつ候補抗体又はその変異体と共にインキュベートされる、競合アッセイを用いて同定される。ＣＤ１３７及び／又はＰＤ−Ｌ１を含む細胞が、候補抗体又はその変異体なしでＰＢ１７３１１とインキュベートされる対照と比較して、結合したＰＢ１７３１１の量を減少させることが可能な候補抗体又はその変異体は、競合抗体又は変異体である。

いくつかの実施形態は、ＣＤ１３７及び／又はＰＤ−Ｌ１への結合に関して抗体ＰＢ１７３１１と競合する、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体を提供する。

いくつかの実施形態は、図４２に示されるようなＣＤ１３７アミノ酸配列のアミノ酸Ａｒｇ６６、Ｇｌｙ７０、及びＰｈｅ７２への結合に関して、より好ましくは図４２に示されるようなＣＤ１３７アミノ酸配列のアミノ酸Ａｒｇ６６、Ｇｌｙ７０、Ｖａｌ７１、及びＰｈｅ７２への結合に関して、抗体ＰＢ１７３１１と競合する、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体を提供する。

いくつかの実施形態は、ＣＤ１３７及び／又はＰＤ−Ｌ１への結合に関して、抗体ＰＢ１７３０９と競合する、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体を提供する。

いくつかの実施形態は、ＣＤ１３７及び／又はＰＤ−Ｌ１への結合に関して抗体ＰＢ１７３１０と競合する、単離された合成若しくは組換え抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体を提供する。

ＣＤ１３７及び／又はＰＤ−Ｌ１への結合に関して、ＰＢ１７３０９又はＰＢ１７３１０と競合する抗体又はその変異体は、例えば、候補抗体又はその変異体の非存在下でのＰＢ１７３０９又はＰＢ１７３１０の、ＣＤ１３７及び／又はＰＤ−Ｌ１を含む細胞への結合が、候補抗体又はその変異体の存在下でのＰＢ１７３０９又はＰＢ１７３１０の、ＣＤ１３７及び／又はＰＤ−Ｌ１を含む細胞への結合と比較される、競合アッセイを用いて単離される。ＣＤ１３７及び／又はＰＤ−Ｌ１を含む細胞が、候補抗体又はその変異体なしでＰＢ１７３０９又はＰＢ１７３１０とインキュベートされる対照と比較して、結合したＰＢ１７３０９又はＰＢ１７３１０の量を減少させることが可能な候補抗体又はその変異体は、競合抗体又は変異体として同定される。

本明細書に記載されるＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、
ＭＦ６６２９、ＭＦ６６３０、ＭＦ６６３７、ＭＦ６６４３、ＭＦ６６４５、ＭＦ６６４８、ＭＦ６６５５、ＭＦ６６５８、ＭＦ６６６０、ＭＦ６６７５、ＭＦ６６８６、ＭＦ６６９０、ＭＦ６６９２、ＭＦ６７００、ＭＦ６７０６、ＭＦ６７１４、ＭＦ６７２１、ＭＦ６７２２、ＭＦ６７２４、ＭＦ６７２８、ＭＦ６７２９、ＭＦ６８２６、ＭＦ６９４０、ＭＦ６９４２、ＭＦ６９４３、ＭＦ６９４４、ＭＦ６９４７、ＭＦ６９４９、ＭＦ７３３１、ＭＦ７３３２、ＭＦ７３３４、ＭＦ７３４１、ＭＦ７３４５、ＭＦ７３５０、ＭＦ７３５１、ＭＦ７３５２、ＭＦ７３５３、ＭＦ７３５６、ＭＦ７３５８、ＭＦ７３６５、ＭＦ７３６６、ＭＦ７３７１、ＭＦ７３７２、ＭＦ７３７４、ＭＦ７３７８、ＭＦ７３８２、ＭＦ７３８３、ＭＦ７３９４、ＭＦ７３９５、又はＭＦ７３９７のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＯＸ４０結合可変ドメインと、
ＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む。ＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインは、好ましくは、図３に示されるようなＰＤ−Ｌ１特異的ＶＨのＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む。好ましい実施形態では、ＰＤ−Ｌ１特異的ＶＨは、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５５５３、ＭＦ５４４２、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４２６、又はＭＦ５４３９（図３）に関して示されている。

抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体は、好ましくは、
示したＭＦのＶＨのアミノ酸配列のアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ６６２９、ＭＦ６６３０、ＭＦ６６３７、ＭＦ６６４３、ＭＦ６６４５、ＭＦ６６４８、ＭＦ６６５５、ＭＦ６６５８、ＭＦ６６６０、ＭＦ６６７５、ＭＦ６６８６、ＭＦ６６９０、ＭＦ６６９２、ＭＦ６７００、ＭＦ６７０６、ＭＦ６７１４、ＭＦ６７２１、ＭＦ６７２２、ＭＦ６７２４、ＭＦ６７２８、ＭＦ６７２９、ＭＦ６８２６、ＭＦ６９４０、ＭＦ６９４２、ＭＦ６９４３、ＭＦ６９４４、ＭＦ６９４７、ＭＦ６９４９、ＭＦ７３３１、ＭＦ７３３２、ＭＦ７３３４、ＭＦ７３４１、ＭＦ７３４５、ＭＦ７３５０、ＭＦ７３５１、ＭＦ７３５２、ＭＦ７３５３、ＭＦ７３５６、ＭＦ７３５８、ＭＦ７３６５、ＭＦ７３６６、ＭＦ７３７１、ＭＦ７３７２、ＭＦ７３７４、ＭＦ７３７８、ＭＦ７３８２、ＭＦ７３８３、ＭＦ７３９４、ＭＦ７３９５、又はＭＦ７３９７のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含むＯＸ４０結合可変ドメインと、
ＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインと
を含む。ＰＤ−Ｌ１結合可変ドメインは、好ましくは、示したＭＦ（図３）のＶＨのアミノ酸配列に関して、最大１５個の、好ましくは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは０、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する、ＭＦ５５９４、ＭＦ５４２４、ＭＦ５４２６、ＭＦ５５５３、ＭＦ５４４２、ＭＦ５５６１、ＭＦ５４２６、又はＭＦ５４３９（図３）のＶＨのアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む。

言及されたＨ、ＶＬ、Ｌ、及びＶＬ領域における言及された最大１５個の、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の、好ましくは１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせは、好ましくは、Ｈ、ＶＬ、Ｌ、及びＶＬ鎖のＣＤＲ３領域には存在しないことが好ましく、ＶＨ又はＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３領域には存在しないことが好ましく、又はＦＲ４領域には存在しないことが好ましい。

明確さ及び簡潔な説明のために、特徴は本明細書では同じ又は別個の実施形態の一部として記載されているが、本発明の範囲は、記載される特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含んでもよいことが理解されよう。

本発明は、以下の実施例によっても更に説明される。これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではなく、本発明を単に明確にするために提供される。

単一特異性及び二重特異性ＩｇＧで使用される共通軽鎖である。図１Ａ：共通軽鎖アミノ酸配列である。図１Ｂ：共通軽鎖可変ドメインのＤＮＡ配列及び翻訳（ＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ１）である。図１Ｃ：共通軽鎖定常領域のＤＮＡ配列及び翻訳である。図１Ｄ：ＩＧＫＶ１−３９／ｊｋ５共通軽鎖可変ドメイン翻訳である。図１Ｅ：Ｖ領域のＩＧＫＶ１−３９Ａである。図２は、二重特異性分子の生成のためのＩｇＧ重鎖である。ＶＨは図３に示したＭＦについてのアミノ酸配列をコード化する核酸であることを示す。ＣＨ１領域である。ヒンジ領域である。ＣＨ２領域である。Ｌ２３５Ｇ及びＧ２３８Ｒ置換を含有するＣＨ２である。置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＫＫ）を含有するＣＨ３ドメインである。置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（ＤＥ）を含有するＣＨ３ドメインである。重鎖可変領域のアミノ酸配列である。図３Ａ：ＣＤ１３７特異的クローンのＶＨ配列である。図３Ｂ：ＰＤ−Ｌ１特異的クローンのＶＨ配列である。図３Ｃ：ＯＸ４０特異的クローンのＶＨ配列である。図３Ｄ：ＰＤ−Ｌ１特異的クローンのＶＨ配列である。表記ＭＦとは、示される重鎖可変領域及び共通軽鎖を含むｆａｂを指す。軽鎖のアミノ酸配列は、図１Ａに示されている。下線を付した配列は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って、それぞれアミノ酸配列毎に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を示す。ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３（ＭＶ１３６３）のベクターマップ及び特徴である。ｐＶＡＸ１のベクターマップ及び特徴である。「免疫」ファージディスプレイライブラリーを生成するために使用されるファージミドベクターＭＶ１４７３のベクターマップ及び特徴である。二重特異性ＩｇＧ生成のために、それぞれＫＫ変異体重鎖又はＤＥ変異体重鎖におけるＣＤ１３７、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＯＸ４０特異的Ｆａｂアームの発現に使用された、ＩｇＧ発現ベクターＭＶ１４５２又はＭＶ１４５３のベクターマップ及び特徴である。ＭＦ１３３７などの共通軽鎖と組み合わせるとき破傷風毒素特異的であり、ＰＤ−Ｌ１×ＴＴ二重特異性ＩｇＧ分子を生成するために使用されたＤＥ変異体重鎖中に存在するＶＨ遺伝子のアミノ酸配列である。下線を付した配列は、それぞれアミノ酸配列毎に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を示す。二重特異性ＩｇＧ生成のために、ＤＥ変異体重鎖におけるＴＴ特異的ＦａｂアームＭＦ１３３７の発現に使用された、ＩｇＧ発現ベクターＭＶ１３７７のベクターマップ及び特徴である。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ブロッキングアッセイである。１０μｇ／ｍｌの二重特異性ＩｇＧの濃度でＰＤ−１のコーティングされたＰＤ−Ｌ１に対する相互作用をブロックするための抗ＰＤ−Ｌ１抗体パネルの能力の評価である。データは、１０μｇ／ｍｌ（１００％のブロッキング）の濃度で、二価ベンチマークＰＤ−Ｌ１抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａで得られたデータに正規化する。ＰＤ−Ｌ１パネルの代表的な例が示されている。最大結合（０％のブロッキングに正規化）を、非ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１特異的ヒトアイソタイプ抗体とのインキュベーションによって確立した。図３に示すＭＦ配列を含む全てのＰＤ−Ｌ１可変ドメインは、ここでは表されないものが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を＞７０％ブロックする。二価ＣＤ１３７抗体によるジャーカットＣＤ１３７−ＮＦｋＢｌｕｃ細胞におけるＣＤ１３７の活性化である。ＩｇＧ架橋抗体の非存在下（左）又は存在下（右）でのＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体によるジャーカットＣＤ１３７−ＮＦｋＢｌｕｃ細胞におけるＣＤ１３７の活性化である。ＭＦ番号は、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体中に存在するＣＤ１３７のＦａＢを指す。ＩＬ−２放出によって測定される、ＰＤ−Ｌ１のＦａｂアーム（ＭＦ５５９４）と組み合わせた二価のＣＤ１３７抗体（上部）又は一価抗体（下部）による初代Ｔ細胞の活性化である。ＰＧ６７４４は、２つのＭＦ６７４４アームを含有する（６７４４×６７４４とも表記される）二価のＣＤ１３７抗体である。ＰＧ６７８３は、２つのＭＦ６７８３アームを含有する（６７８３×６７８３とも表記される）二価のＣＤ１３７抗体である。ＰＧ６８６０は、２つのＭＦ６８６０アームを含有する（６８６０×６８６０とも表記される）二価のＣＤ１３７抗体である。２０Ｈ４．９は、国際公開第２００５／０３５５８４号に基づく抗ＣＤ１３７参照抗体である。ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞又はＣＨＯ野生型細胞の存在下でのジャーカットＣＤ１３７−ｌｕｃ細胞上のＣＤ１３７の活性化である。ＣＤ１３７活性化を、ルシフェラーゼ発現により測定した。ＰＧ６７４４は、二価ＣＤ１３７抗体（６７４４×６７４４）である。ＰＢ１４６７１は、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体（６７４４×５３６１）である。ＰＢ１４５８０は、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体（６７４４×５５９４）である。ＰＢ１４８９０は、二重特異性ＣＤ１３７×ＴＴ抗体（６７４４×１３３７）である。ＰＧ６７８３は、二価ＣＤ１３７抗体（６７８３×６７８３）である。ＰＢ１４６８１は、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体（６７８３×５３６１）である。ＰＢ１４５９０は、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体（６７８３×５５９４）である。ＰＢ１５８５５は、二重特異性ＣＤ１３７×ＴＴ抗体（６７８３×１３３７）である。２０Ｈ４．９は、国際公開第２００５／０３５５８４号に基づく抗ＣＤ１３７参照抗体である。ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞又はＣＨＯ野生型細胞の存在下での二価ＣＤ１３７抗体、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体、又はＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）の組み合わせによる初代Ｔ細胞の活性化である。活性化を、ＩＬ−２放出によって測定した。ＰＧ６７４４は、二価ＣＤ１３７抗体（６７４４×６７４４）である。ＰＢ１４６７１は、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体（６７４４×５３６１）である。ＰＢ１４５８０は、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体（６７４４×５５９４）である。ＰＢ１４８９０は、二重特異性ＣＤ１３７×ＴＴ抗体（６７４４×１３３７）である。２０Ｈ４．９は、国際公開第２００５／０３５５８４号に基づく抗ＣＤ１３７参照抗体である。ＭＯＲ７４８０は、米国特許第８，３３７，８５０号に基づく抗ＣＤ１３７参照抗体である。ＩＬ−２産生のＳＥＢ刺激は、健康なドナー血液細胞中の抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体又は抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）により増強される。ＰＢ１４５８０は、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体（６７４４×５５９４）である。ＰＢ１４６７１は、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体（６７４４×５３６１）である。ＭＰＤＬ３２８０Ａは、国際公開第２０１０／０７７６３４号に基づく抗ＰＤ−Ｌ１参照抗体である。ＰＢ９４６９は、二重特異性ＰＤ−Ｌ１×ＴＴ抗体（５５９４×１３７７）である。ＰＢ１４８９０は、二重特異性ＣＤ１３７×ＴＴ抗体（６７４４×１３３７）である。２０Ｈ４．９は、国際公開第２００５／０３５５８４号に基づく抗ＣＤ１３７参照抗体である。ＣｔｒｌＡｂは、ＰＧ２７０８ｐ２１３、抗ＲＳＶ−Ｇである。健康なドナーの血液細胞におけるＩＬ−２産生のＳＥＢ刺激が、抗ＣＴＬＡ−４抗体１０Ｄ１（イピルムマブに基づく）と比較して、抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体によって劇的に増強されることを示す。ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞（左パネル）又はＣＨＯ野生型細胞（右パネル）の存在下でのジャーカットＯＸ−４０ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞上のＯＸ−４０の活性化である。活性化を、ルシフェラーゼ発現を測定することによって決定した。ＰＤ−Ｌ１ＦａｂアームＭＦ５５６１、ＰＤ−１ＦａｂアームＭＦ６２５６（図４３に示した配列）。Ｔ細胞活性化アッセイ（１２個のＣＤ１３７Ｆａｂアーム）におけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のスクリーニングである。単一ドナーからのＴ細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞（上部パネル）又はＣＨＯ野生型細胞（下部パネル）の存在下で、以下に示した抗体パネルの用量依存的漸増法を用いて、３７℃で７２時間刺激した。ＣＤ１３７活性化を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを用いてＩＬ−２の放出によって測定し、ＩＬ−２カウントで表した。陽性対照抗体は２０Ｈ４．９（この図ではＰＧ６６１９称される）であり、抗ＴＴ陰性対照抗体はＰＧ１３３７（ＮｅｇＣｔｒｌＡｂ）である。Ｔ細胞活性化アッセイ（１２個のＣＤ１３７Ｆａｂアーム）におけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のスクリーニングである。単一ドナーからのＴ細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞（上部パネル）又はＣＨＯ野生型細胞（下部パネル）の存在下で、以下に示した抗体パネルの用量依存的漸増法を用いて、３７℃で７２時間刺激した。ＣＤ１３７活性化を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを用いてＩＬ−２の放出によって測定し、ＩＬ−２カウントで表した。陽性対照抗体は２０Ｈ４．９（この図ではＰＧ６６１９称される）であり、抗ＴＴ陰性対照抗体はＰＧ１３３７（ＮｅｇＣｔｒｌＡｂ）である。Ｔ細胞活性化アッセイ（１２個のＣＤ１３７Ｆａｂアーム）におけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のスクリーニングである。単一ドナーからのＴ細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞（上部パネル）又はＣＨＯ野生型細胞（下部パネル）の存在下で、以下に示した抗体パネルの用量依存的漸増法を用いて、３７℃で７２時間刺激した。ＣＤ１３７活性化を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを用いてＩＬ−２の放出によって測定し、ＩＬ−２カウントで表した。陽性対照抗体は２０Ｈ４．９（この図ではＰＧ６６１９称される）であり、抗ＴＴ陰性対照抗体はＰＧ１３３７（ＮｅｇＣｔｒｌＡｂ）である。Ｔ細胞活性化アッセイ（１２個のＣＤ１３７Ｆａｂアーム）におけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のスクリーニングである。単一ドナーからのＴ細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞（上部パネル）又はＣＨＯ野生型細胞（下部パネル）の存在下で、以下に示した抗体パネルの用量依存的漸増法を用いて、３７℃で７２時間刺激した。ＣＤ１３７活性化を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを用いてＩＬ−２の放出によって測定し、ＩＬ−２カウントで表した。陽性対照抗体は２０Ｈ４．９（この図ではＰＧ６６１９称される）であり、抗ＴＴ陰性対照抗体はＰＧ１３３７（ＮｅｇＣｔｒｌＡｂ）である。Ｔ細胞活性化アッセイ（１２個のＣＤ１３７Ｆａｂアーム）におけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のスクリーニングである。単一ドナーからのＴ細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞（上部パネル）又はＣＨＯ野生型細胞（下部パネル）の存在下で、以下に示した抗体パネルの用量依存的漸増法を用いて、３７℃で７２時間刺激した。ＣＤ１３７活性化を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを用いてＩＬ−２の放出によって測定し、ＩＬ−２カウントで表した。陽性対照抗体は２０Ｈ４．９（この図ではＰＧ６６１９称される）であり、抗ＴＴ陰性対照抗体はＰＧ１３３７（ＮｅｇＣｔｒｌＡｂ）である。Ｔ細胞活性化アッセイ（１２個のＣＤ１３７Ｆａｂアーム）におけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のスクリーニングである。単一ドナーからのＴ細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞（上部パネル）又はＣＨＯ野生型細胞（下部パネル）の存在下で、以下に示した抗体パネルの用量依存的漸増法を用いて、３７℃で７２時間刺激した。ＣＤ１３７活性化を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを用いてＩＬ−２の放出によって測定し、ＩＬ−２カウントで表した。陽性対照抗体は２０Ｈ４．９（この図ではＰＧ６６１９称される）であり、抗ＴＴ陰性対照抗体はＰＧ１３３７（ＮｅｇＣｔｒｌＡｂ）である。Ｔ細胞活性化アッセイ（１２個のＣＤ１３７Ｆａｂアーム）におけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のスクリーニングである。単一ドナーからのＴ細胞を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞（上部パネル）又はＣＨＯ野生型細胞（下部パネル）の存在下で、以下に示した抗体パネルの用量依存的漸増法を用いて、３７℃で７２時間刺激した。ＣＤ１３７活性化を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを用いてＩＬ−２の放出によって測定し、ＩＬ−２カウントで表した。陽性対照抗体は２０Ｈ４．９（この図ではＰＧ６６１９称される）であり、抗ＴＴ陰性対照抗体はＰＧ１３３７（ＮｅｇＣｔｒｌＡｂ）である。ＳＥＢＰＢＭＣアッセイ（１２個のＣＤ１３７Ｆａｂアーム）におけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のスクリーニングである。ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体を、２μｇ／ｍｌのＳＥＢの存在下で、ＳＥＢＰＢＭＣアッセイにおいて試験した。ＣＤ１３７活性化を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを用いてＩＬ−２の放出によって測定し、ＩＬ−２カウントで表した。陽性対照抗体は、抗ＣＴＬＡ−４陽性対照抗体（イピリムマブに基づく、１０Ｄ１）であり、抗ＲＳＶ−Ｇ陰性対照抗体は、ＰＧ２７０８（ＮｅｇＣｔｒｌＡｂ）である。ＳＥＢＰＢＭＣアッセイ（１２個のＣＤ１３７Ｆａｂアーム）におけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のスクリーニングである。ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体を、２μｇ／ｍｌのＳＥＢの存在下で、ＳＥＢＰＢＭＣアッセイにおいて試験した。ＣＤ１３７活性化を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを用いてＩＬ−２の放出によって測定し、ＩＬ−２カウントで表した。陽性対照抗体は、抗ＣＴＬＡ−４陽性対照抗体（イピリムマブに基づく、１０Ｄ１）であり、抗ＲＳＶ−Ｇ陰性対照抗体は、ＰＧ２７０８（ＮｅｇＣｔｒｌＡｂ）である。ＳＥＢＰＢＭＣアッセイ（８個のＣＤ１３７Ｆａｂアーム）におけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のスクリーニングである。ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体を、２μｇ／ｍｌのＳＥＢの存在下で、ＳＥＢＰＢＭＣアッセイにおいて試験した。ＣＤ１３７活性化を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡを用いてＩＬ−２の放出によって測定し、ＩＬ−２カウントで表した。陽性対照抗体は、抗ＣＴＬＡ−４陽性対照抗体（イピリムマブに基づく、１０Ｄ１）であり、抗ＲＳＶ−Ｇ陰性対照抗体は、ＰＧ２７０８（ＮｅｇＣｔｒｌＡｂ）である。二重特異性抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体及びその親二価抗ＣＤ１３７抗体が、フローサイトメトリーによって決定されるように、ヒト及びカニクイザルのＣＤ１３７に結合することを示す。二重特異性抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体及びその親二価抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、フローサイトメトリーによって決定されるように、ヒト及びマカクザルのＰＤ−Ｌ１に結合することを示す。二重特異性抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体及びその親二価抗体が、フローサイトメトリーによって決定されるように、活性かＴ細胞に結合することを示す。二重特異性抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体及びその親二価抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＥＬＩＳＡによって決定されるように、ＰＤ−Ｌ１リガンド結合をブロックすることを示す。二重特異性抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体及びその親二価抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、フローサイトメトリーによって決定されるように、ＣＤ１３７リガンド結合をブロックすることを示す。二重特異性抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体及びその親二価抗体が、インビトロ遮断レポーターアッセイにおいて、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間の相互作用をブロックすることを示す。ＣＨＯ野生型細胞と比較した、細胞当たり異なるＰＤ−Ｌ１結合部位を発現するＣＨＯ細胞の存在下での、ジャーカットＣＤ１３７−ｌｕｃ細胞に対するＣＤ１３７のトランス活性化を示す。ＣＤ１３７活性化を、ルシフェラーゼ発現により測定した。細胞ＰＤ−Ｌ１当たり異なるＰＤ−Ｌ１結合部位を発現するヒト腫瘍細胞の存在下での、ジャーカットＣＤ１３７−ｌｕｃ細胞に対するＣＤ１３７のトランス活性化を示す。ＣＤ１３７活性化を、ルシフェラーゼ発現により測定した。ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１、ＥＳ−２、又はＣＨＯ野生型細胞の存在下で、ジャーカットＣＤ１３７−ｌｕｃ細胞に対するＣＤ１３７のトランス活性化を示す。ＩｇＧを、１０μｇ／ｍｌで三通りで試験した。ＣＤ１３７活性化を、ルシフェラーゼ発現により測定した。試験された抗体及びそれらの組成を下に示す。Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体の単一の参照対照及び参照対照の組み合わせとの比較を示す。ＣＤ１３７活性化を、ＩＬ−２及びＴＮＦαサイトカイン放出として測定し、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析により測定した。Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＢ１７３１１の活性の、単一の参照対照抗体及び参照対照抗体の組み合わせとの比較を示す。ＣＤ１３７活性化を、複数のサイトカイン放出として測定し、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析（２５ｐｌｅｘ）によって測定した。Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＢ１７３１１の活性の、単一の参照対照抗体及び参照対照抗体の組み合わせとの比較を示す。ＣＤ１３７活性化を、複数のサイトカイン放出として測定し、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析（２５ｐｌｅｘ）によって測定した。二重特異性抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＳＥＢ刺激アッセイ中のＰＢＭＣによるＩＬ−２放出を、ＰＢＭＣドナー又はＳＥＢ濃度とは無関係に一貫して増強することを示す。ＣＤ１３７活性化を、ＩＬ−２放出として測定し、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析により測定した。二重特異性抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＳＥＢ刺激アッセイ中のサイトカイン放出の増強において、抗ＣＤ１３７ベンチマーク抗体又は抗ＣＤ１３７及び抗ＰＤ−Ｌ１ベンチマーク抗体の等モル混合物よりも強力であることを示す。ＣＤ１３７活性化を、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、及びＴＮＦαサイトカイン放出として測定し、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析により測定した。ＰＢ１７３１１が、ＩＦＮγ放出の増強によって実証されるように、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＰＢＭＣのＭ２マクロファージ媒介抑制を阻害することを示す。ＰＢ１７３１１が、ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミング後のＴ細胞増殖を増強することを示す。ＰＢ１７３１１が、プライミング後のナイーブＴ細胞のセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターＴ細胞への分化を増強することを示す。Ｔ_{Ｎ／ＳＣＭ}は、ナイーブ／幹細胞メモリーであり、Ｔ_ＣＭは、セントラルメモリーであり、Ｔ_ＥＭは、エフェクターメモリーであり、Ｔ_Ｅは、ターミナルエフェクター細胞である。総Ｔ細胞集団におけるＣＤ１０７ａ及びサイトカインの発現に対するＰＢ１７３１１の効果を示す。Ｔ_ＥＭは、エフェクターメモリーであり、Ｔ_Ｅは、ターミナルエフェクター細胞である。総Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ１０７ａ及びサイトカインの発現に対するＰＢ１７３１１の効果を示す。結腸直腸がんにおける肝臓転移（ｌｉｖｅｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ、ＬＭ−ＣＲＣ）及び肝癌（ｈｅｐａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨＣＣ）に由来する腫瘍浸潤性ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖に対するＰＢ１７３１１の効果を示す。ＰＢ１７３１１のＣＤ１３７における重要な残基の同定及び可視化を示す。（Ａ）変異したクローンごとに、対照抗体の結合によって測定される、クローンの平均ＣＤ１３７発現値（灰色円）の関数として平均結合値をプロットする。結合は、ＷＴクローンで得られた割合として表される。点線は、重要なクローン（黒点）を同定するために使用される閾値を示す。（Ｂ）表は、同定された全ての重要な残基に対する平均結合反応性（及び範囲）を列挙する。ＰＢ１７３１１Ａｂ結合について重要な残基（黒色の輪郭線）は、ＰＢ１７３１１Ａｂ結合に対して陰性であった（ＷＴへの結合の＜２０％）が、対照抗体、５５５９５５ＭＡｂに対して陽性であった（ＷＴの＞７０％）。（Ｃ）重要な残基（輪郭線で囲まれた）を、ヒトＯＸ４０に結合したネズミＯＸ４０Ｌの構造に基づくＣＤ１３７モデル（ＰＤＢＩＤ＃２ＨＥＹ、Ｃｏｍｐａａｎｅｔａｌ．，２００６）上で可視化する。非検証残基、Ｃ１３３を、灰色で示す。異種移植片マウスモデルにおける１９日目の腫瘍体積中央値に対するＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体ＰＢ１７３１１の効果を示す。ＭＴＶは、腫瘍体積中央値であり、ＴＧＩは、腫瘍増殖阻害であり、群１と比較したとき、マン−ホイットニーの検定における統計的有意性は、^＊（０．０１＜Ｐ＜０．０５）及び^＊＊＊（Ｐ＜０．００１）によって示される。Ｔ細胞活性化によるｓＣＤ１３７の干渉を示す。二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体がヒト初代Ｔ細胞を活性化する能力に対する可溶性ＣＤ１３７の効果の評価を示す。ＣＤ１３７細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す。ＭＦ６２５６のアミノ酸配列を示す。

本明細書で使用するとき、「ＭＦＸＸＸＸ」（式中、Ｘは独立して、０〜９の数字である）は、可変ドメインを含むＦａｂを指し、ここでＶＨは、４桁で特定されたアミノ酸配列を有する。別途記載のない限り、可変ドメインの軽鎖可変領域は、典型的には、図１Ａの配列、典型的には１Ｂの配列を有する。「ＭＦＸＸＸＸＶＨ」は、４桁で同定されたＶＨのアミノ酸配列を指す。ＭＦは、軽鎖の定常領域と、軽鎖の定常領域と通常相互作用する重鎖の定常領域とを更に含む。ＰＧは、同一の重鎖及び軽鎖を含む単一特異性抗体を指す。ＰＢは、２つの異なる重鎖を有する二重特異性抗体を指す。重鎖（ＶＨ）の可変領域は、異なる、典型的にはＣＨ３領域であって、重鎖のうちの１つは、そのＣＨ３ドメインのＫＫ突然変異を有し、他方は、そのＣＨ３ドメインの相補的なＤＥ突然変異を有する（参考文献ＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９４号（国際公開第２０１３／１５７９５４号として公開）を参照されたい）。

実施例１
選択及びスクリーニングのための材料の生成
細胞株の培養
ヒトＥＳ−２細胞（カタログ番号ＣＲＬ−１９７８）を、ＡＴＣＣから購入し、１０％のＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を補充したＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ（Ｇｉｂｃｏ）中で日常的に維持した。フリースタイル２９３Ｆ細胞（カタログ番号ｐ／ｎ５１−００２９）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、２９３フリースタイル培地中で日常的に維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ（カタログ番号ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１１２６８）、及びＣＨＯ−Ｋ１（カタログ番号ＤＳＭＺＡＣＣ１１０）細胞株をＡＴＣＣから購入し、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及びＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中で日常的に維持した。

免疫化のためのＯＸ４０、ＣＤ１３７、及びＰＤ−Ｌ１発現ベクターの生成、及び安定した細胞株の生成
クローニングのための特有の制限部位及び効率的な翻訳のためのコザックコンセンサス配列を含む各標的の完全長ｃＤＮＡを、クローニングのための特有の制限部位及び効率的な翻訳のためのコザックコンセンサス配列を導入する特異的プライマーを用いて、合成するか、又は標的ｃＤＮＡを含有する市販の発現構築物上のＰＣＲ増幅を介して得た。各標的のｃＤＮＡを、Ｎｈｅｌ／ＥｃｏＲＩを介して、ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；図４）又はｐＶＡＸ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；図５）などの真核発現構築物中にクローンし、それぞれｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３＿［ＴＡＲＧＥＴ＿ＮＡＭＥ］及びｐＶＡＸ１＿［ＴＡＲＧＥＴ＿ＮＡＭＥ］をもたらした。インサート配列を、ＮＣＢＩ参照アミノ酸配列と比較して検証した。ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３構築物を、安定した細胞株の生成に使用した。ｐＶＡＸ１構築物を、免疫化の目的に使用した。得られた構築物の名称の概要については、表１を参照されたい。

細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長ｈｕＣＤ１３７インサート（ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３及びｐＶＡＸ１の両方）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００１５５２．２と同一）は、
ＭＧＮＳＣＹＮＩＶＡＴＬＬＬＶＬＮＦＥＲＴＲＳＬＱＤＰＣＳＮＣＰＡＧＴＦＣＤＮＮＲＮＱＩＣＳＰＣＰＰＮＳＦＳＳＡＧＧＱＲＴＣＤＩＣＲＱＣＫＧＶＦＲＴＲＫＥＣＳＳＴＳＮＡＥＣＤＣＴＰＧＦＨＣＬＧＡＧＣＳＭＣＥＱＤＣＫＱＧＱＥＬＴＫＫＧＣＫＤＣＣＦＧＴＦＮＤＱＫＲＧＩＣＲＰＷＴＮＣＳＬＤＧＫＳＶＬＶＮＧＴＫＥＲＤＶＶＣＧＰＳＰＡＤＬＳＰＧＡＳＳＶＴＰＰＡＰＡＲＥＰＧＨＳＰＱＩＩＳＦＦＬＡＬＴＳＴＡＬＬＦＬＬＦＦＬＴＬＲＦＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬである。

この中で、
ＭＧＮＳＣＹＮＩＶＡＴＬＬＬＶＬＮＦＥＲＴＲＳは、シグナルペプチドである。

ＬＱＤＰＣＳＮＣＰＡＧＴＦＣＤＮＮＲＮＱＩＣＳＰＣＰＰＮＳＦＳＳＡＧＧＱＲＴＣＤＩＣＲＱＣＫＧＶＦＲＴＲＫＥＣＳＳＴＳＮＡＥＣＤＣＴＰＧＦＨＣＬＧＡＧＣＳＭＣＥＱＤＣＫＱＧＱＥＬＴＫＫＧＣＫＤＣＣＦＧＴＦＮＤＱＫＲＧＩＣＲＰＷＴＮＣＳＬＤＧＫＳＶＬＶＮＧＴＫＥＲＤＶＶＣＧＰＳＰＡＤＬＳＰＧＡＳＳＶＴＰＰＡＰＡＲＥＰＧＨＳＰＱは、ｈｕＣＤ１３７のＥＣＤである。

ＩＩＳＦＦＬＡＬＴＳＴＡＬＬＦＬＬＦＦＬＴＬＲＦＳＶＶは、予測されるＴＭ領域である。

ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬは、細胞内テールである。

細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長マカクザル（カニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＣＤ１３７インサート（ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３及びｐＶＡＸ１の両方）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＹ４７５７５．１と同一）は、
ＭＧＮＳＣＹＮＩＶＡＴＬＬＬＶＬＮＦＥＲＴＲＳＬＱＤＬＣＳＮＣＰＡＧＴＦＣＤＮＮＲＳＱＩＣＳＰＣＰＰＮＳＦＳＳＡＧＧＱＲＴＣＤＩＣＲＱＣＫＧＶＦＫＴＲＫＥＣＳＳＴＳＮＡＥＣＤＣＩＳＧＹＨＣＬＧＡＥＣＳＭＣＥＱＤＣＫＱＧＱＥＬＴＫＫＧＣＫＤＣＣＦＧＴＦＮＤＱＫＲＧＩＣＲＰＷＴＮＣＳＬＤＧＫＳＶＬＶＮＧＴＫＥＲＤＶＶＣＧＰＳＰＡＤＬＳＰＧＡＳＳＡＴＰＰＡＰＡＲＥＰＧＨＳＰＱＩＩＦＦＬＡＬＴＳＴＶＶＬＦＬＬＦＦＬＶＬＲＦＳＶＶＫＲＳＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬである。

ＬＱＤＬＣＳＮＣＰＡＧＴＦＣＤＮＮＲＳＱＩＣＳＰＣＰＰＮＳＦＳＳＡＧＧＱＲＴＣＤＩＣＲＱＣＫＧＶＦＫＴＲＫＥＣＳＳＴＳＮＡＥＣＤＣＩＳＧＹＨＣＬＧＡＥＣＳＭＣＥＱＤＣＫＱＧＱＥＬＴＫＫＧＣＫＤＣＣＦＧＴＦＮＤＱＫＲＧＩＣＲＰＷＴＮＣＳＬＤＧＫＳＶＬＶＮＧＴＫＥＲＤＶＶＣＧＰＳＰＡＤＬＳＰＧＡＳＳＡＴＰＰＡＰＡＲＥＰＧＨＳＰＱは、ｍａＣＤ１３７のＥＣＤである。

ＩＩＦＦＬＡＬＴＳＴＶＶＬＦＬＬＦＦＬＶＬＲＦＳＶＶは、予測されるＴＭ領域である。

ＫＲＳＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬは、細胞内テールである。

細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長ラットＣＤ１３７インサート（ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３及びｐＶＡＸ１の両方）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＸＰ＿００８７６２５０５．１と同一）は、
ＭＧＳＳＣＹＮＭＶＶＴＶＬＬＶＶＧＴＥＥＶＲＡＴＲＮＰＣＤＳＣＥＡＧＴＦＣＳＫＹＰＰＶＣＴＳＣＰＰＳＴＹＳＳＴＧＧＱＰＮＣＤＩＣＲＶＣＱＧＹＦＲＦＫＫＰＣＳＳＴＨＮＡＥＣＥＣＶＥＧＦＨＣＬＧＰＫＣＴＲＣＥＫＤＣＲＰＧＱＥＬＴＥＱＧＣＫＮＣＧＬＧＴＦＮＤＱＤＧＡＧＶＣＲＰＷＴＮＣＳＬＤＧＲＳＶＬＫＮＧＴＫＥＫＤＶＶＣＧＰＰＶＶＳＬＳＰＳＴＴＰＳＡＶＴＴＰＥＲＥＳＧＥＲＰＬＱＶＬＴＬＦＬＡＬＴＬＡＬＬＬＦＬＩＦＩＩＬＷＦＳＶＰＫＷＬＲＫＫＦＰＨＩＦＫＱＰＦＫＫＡＶＲＴＡＱＥＥＤＡＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＧＧＳＹＥＬである。

この中で、
ＭＧＳＳＣＹＮＭＶＶＴＶＬＬＶＶＧＴＥＥＶＲＡはシグナルペプチドである。

ＴＲＮＰＣＤＳＣＥＡＧＴＦＣＳＫＹＰＰＶＣＴＳＣＰＰＳＴＹＳＳＴＧＧＱＰＮＣＤＩＣＲＶＣＱＧＹＦＲＦＫＫＰＣＳＳＴＨＮＡＥＣＥＣＶＥＧＦＨＣＬＧＰＫＣＴＲＣＥＫＤＣＲＰＧＱＥＬＴＥＱＧＣＫＮＣＧＬＧＴＦＮＤＱＤＧＡＧＶＣＲＰＷＴＮＣＳＬＤＧＲＳＶＬＫＮＧＴＫＥＫＤＶＶＣＧＰＰＶＶＳＬＳＰＳＴＴＰＳＡＶＴＴＰＥＲＥＳＧＥＲＰＬＱは、ｒａＣＤ１３７のＥＣＤである。

ＶＬＴＬＦＬＡＬＴＬＡＬＬＬＦＬＩＦＩＩＬＷＦは、予測されるＴＭ領域である。

ＳＶＰＫＷＬＲＫＫＦＰＨＩＦＫＱＰＦＫＫＡＶＲＴＡＱＥＥＤＡＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＧＧＳＹＥＬは、細胞内テールである。

細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長ｈｕＰＤ−Ｌ１インサート（ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３及びｐＶＡＸ１の両方）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＩ１３７３５．１と同一）は、
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴである。

この中で、
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡは、シグナルペプチドである。

ＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲは、ｈｕＰＤ−Ｌ１のＥＣＤである。

ＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦは、予測されるＴＭ領域である。

ＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴは、細胞内テールである。

細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長マカクザル（カニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＰＤ−Ｌ１インサート（ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３及びｐＶＡＸ１の両方）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＯ３３１６１．１と同一）は、
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＴＩＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＲＦＰＶＥＫＱＬＧＬＴＳＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＮＹＲＱＲＡＱＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＲＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＬＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＡＮＥＩＦＹＣＩＦＲＲＬＧＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＬＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＦＬＬＬＧＶＡＬＴＦＩＦＹＬＲＫＧＲＭＭＤＭＫＫＳＧＩＲＶＴＮＳＫＫＱＲＤＴＱＬＥＥＴである。

この中で、
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＴＩＹＷＨＬＬＮＡは、シグナルペプチドである。

ＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＲＦＰＶＥＫＱＬＧＬＴＳＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＮＹＲＱＲＡＱＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＲＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＬＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＡＮＥＩＦＹＣＩＦＲＲＬＧＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＬＰＰＮＥＲは、ｍａＰＤ−Ｌ１のＥＣＤである。

ＴＨＬＶＩＬＧＡＩＦＬＬＬＧＶＡＬＴＦＩＦは、予測されるＴＭ領域である。

ＹＬＲＫＧＲＭＭＤＭＫＫＳＧＩＲＶＴＮＳＫＫＱＲＤＴＱＬＥＥＴは、細胞内テールである。

細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長ヒトＯＸ４０インサート（ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３及びｐＶＡＸ１の両方）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００３３１８．１と同一）は、
ＭＣＶＧＡＲＲＬＧＲＧＰＣＡＡＬＬＬＬＧＬＧＬＳＴＶＴＧＬＨＣＶＧＤＴＹＰＳＮＤＲＣＣＨＥＣＲＰＧＮＧＭＶＳＲＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲＳＧＳＥＲＫＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲＣＲＡＧＴＱＰＬＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫＨＴＬＱＰＡＳＮＳＳＤＡＩＣＥＤＲＤＰＰＡＴＱＰＱＥＴＱＧＰＰＡＲＰＩＴＶＱＰＴＥＡＷＰＲＴＳＱＧＰＳＴＲＰＶＥＶＰＧＧＲＡＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩである。

この中で、
ＭＣＶＧＡＲＲＬＧＲＧＰＣＡＡＬＬＬＬＧＬＧＬＳＴＶＴＧは、シグナルペプチドである。

ＬＨＣＶＧＤＴＹＰＳＮＤＲＣＣＨＥＣＲＰＧＮＧＭＶＳＲＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲＳＧＳＥＲＫＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲＣＲＡＧＴＱＰＬＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫＨＴＬＱＰＡＳＮＳＳＤＡＩＣＥＤＲＤＰＰＡＴＱＰＱＥＴＱＧＰＰＡＲＰＩＴＶＱＰＴＥＡＷＰＲＴＳＱＧＰＳＴＲＰＶＥＶＰＧＧＲＡは、ＥＣＤである。

ＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬは、予測されるＴＭ領域である。

ＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩは、細胞内テールである。

細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ＯＸ４０インサート（ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３及びｐＶＡＸ１の両方）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿０３７１８１．１と同一）は、
ＭＹＶＷＶＱＱＰＴＡＦＬＬＬＧＬＳＬＧＶＴＶＫＬＮＣＶＫＤＴＹＰＳＧＨＫＣＣＲＥＣＱＰＧＨＧＭＶＳＲＣＤＨＴＲＤＴＶＣＨＰＣＥＰＧＦＹＮＥＡＶＮＹＤＴＣＫＱＣＴＱＣＮＨＲＳＧＳＥＬＫＱＮＣＴＰＴＥＤＴＶＣＱＣＲＰＧＴＱＰＲＱＤＳＳＨＫＬＧＶＤＣＶＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＳＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＳＧＫＱＩＲＨＰＡＳＮＳＬＤＴＶＣＥＤＲＳＬＬＡＴＬＬＷＥＴＱＲＴＴＦＲＰＴＴＶＰＳＴＴＶＷＰＲＴＳＱＬＰＳＴＰＴＬＶＡＰＥＧＰＡＦＡＶＩＬＧＬＧＬＧＬＬＡＰＬＴＶＬＬＡＬＹＬＬＲＫＡＷＲＳＰＮＴＰＫＰＣＷＧＮＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＴＤＴＨＦＴＬＡＫＩである。

この中で、
ＭＹＶＷＶＱＱＰＴＡＦＬＬＬＧＬＳＬＧは、シグナルペプチドである。

ＶＴＶＫＬＮＣＶＫＤＴＹＰＳＧＨＫＣＣＲＥＣＱＰＧＨＧＭＶＳＲＣＤＨＴＲＤＴＶＣＨＰＣＥＰＧＦＹＮＥＡＶＮＹＤＴＣＫＱＣＴＱＣＮＨＲＳＧＳＥＬＫＱＮＣＴＰＴＥＤＴＶＣＱＣＲＰＧＴＱＰＲＱＤＳＳＨＫＬＧＶＤＣＶＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＳＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＳＧＫＱＩＲＨＰＡＳＮＳＬＤＴＶＣＥＤＲＳＬＬＡＴＬＬＷＥＴＱＲＴＴＦＲＰＴＴＶＰＳＴＴＶＷＰＲＴＳＱＬＰＳＴＰＴＬＶＡＰＥＧＰは、ＥＣＤである。

ＡＦＡＶＩＬＧＬＧＬＧＬＬＡＰＬＴＶＬＬＡＬＹＬＬは、予測されるＴＭ領域である。

ＲＫＡＷＲＳＰＮＴＰＫＰＣＷＧＮＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＴＤＴＨＦＴＬＡＫＩは、細胞内テールである。

細胞表面での発現のためのアミノ酸配列完全長マカクザル（カニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＯＸ４０インサート（ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３及びｐＶＡＸ１の両方）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＸＰ＿００５５４５１７９．１と同一）は、
ＭＣＶＧＡＲＲＬＧＲＧＰＣＡＡＬＬＬＬＧＬＧＬＳＴＴＡＫＬＨＣＶＧＤＴＹＰＳＮＤＲＣＣＱＥＣＲＰＧＮＧＭＶＳＲＣＮＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＡＫＰＣＫＡＣＴＷＣＮＬＲＳＧＳＥＲＫＱＰＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲＣＲＡＧＴＱＰＬＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫＨＴＬＱＰＡＳＮＳＳＤＡＩＣＥＤＲＤＰＰＰＴＱＰＱＥＴＱＧＰＰＡＲＰＴＴＶＱＰＴＥＡＷＰＲＴＳＱＲＰＳＴＲＰＶＥＶＰＲＧＰＡＶＡＡＩＬＧＬＧＬＡＬＧＬＬＧＰＬＡＭＬＬＡＬＬＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＰＫＡＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＡＬＡＫＩである。

この中で、
ＭＣＶＧＡＲＲＬＧＲＧＰＣＡＡＬＬＬＬＧＬＧＬＳＴＴＡＫは、シグナルペプチドである。

ＬＨＣＶＧＤＴＹＰＳＮＤＲＣＣＱＥＣＲＰＧＮＧＭＶＳＲＣＮＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＡＫＰＣＫＡＣＴＷＣＮＬＲＳＧＳＥＲＫＱＰＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲＣＲＡＧＴＱＰＬＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫＨＴＬＱＰＡＳＮＳＳＤＡＩＣＥＤＲＤＰＰＰＴＱＰＱＥＴＱＧＰＰＡＲＰＴＴＶＱＰＴＥＡＷＰＲＴＳＱＲＰＳＴＲＰＶＥＶＰＲＧＰＡは、ＥＣＤである。

ＶＡＡＩＬＧＬＧＬＡＬＧＬＬＧＰＬＡＭＬＬは、予測されるＴＭ領域である。

ＡＬＬＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＰＫＡＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＡＬＡＫＩは、細胞内テールである。

ＣＤ１３７、ＯＸ４０、又はＰＤ−Ｌ１を発現する安定した細胞株の生成
ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３＿［ＴＡＲＧＥＴ＿ＮＡＭＥ］発現構築物（表１）を使用して、それぞれのタンパク質を安定的に発現するフリースタイル２９３Ｆ又はＣＨＯ−Ｋ１クローンを生成した。構築物を、リポフェクタフェタミントランスフェクションを使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞中に、又はフリースタイル２９３Ｆ細胞ではＰＥＩトランスフェクションを使用して、一過性にトランスフェクションし、それぞれのタンパク質と反応する抗体を用いてＦＡＣＳによりスクリーニングした。発現の確認後、一過性にトランスフェクションした細胞を制限希釈液中に播種し、使用した発現構築物に関連する選択圧力下で培養して、安定した細胞クローンを得た。選択から２〜３週間後に、クローンをＦＡＣＳによりスクリーニングした。選択されたクローンを連続継代で増殖させ、ＦＡＣＳで再試験し、−１５０℃に凍結した。異種タンパク質を安定的に発現するクローンの名称は、ＣＨＯ−Ｋ１＿［ＴＡＲＧＥＴ＿ＮＡＭＥ］細胞又はフリースタイル２９３Ｆ＿［ＴＡＲＧＥＴ＿ＮＡＭＥ］細胞である。安定した細胞株を生成するために使用された構築物及び得られた名称の概要については、表１を参照されたい。

実施例２
免疫化、選択、及びスクリーニング
免疫化に使用されるマウス
ｈｕＣＤ１３７、ｈｕＯＸ４０、及びｈｕＰＤ−Ｌ１に結合するヒト抗体の生成については、ヒトＶＫ１−３９軽鎖（共通軽鎖マウス、国際公開第２００９／１５７７７１号を参照されたい）に対する、及びヒト重鎖（ＨＣ）ミニ遺伝子座（ヒトＶ遺伝子断片、全てのヒトＤｓ及び全てのヒトＪｓの選択を含む）に対するトランスジェニックマウスを、以下に簡単に記載するように、組換えタンパク質又はこのタンパク質をコード化するＤＮＡのいずれかで免疫化した。これらのマウスは、「ＭｅＭｏ（登録商標）」マウスと称される。

タンパク質免疫化
「ＭｅＭｏ（登録商標）」マウスを、組換えタンパク質及びＧｅｒｂｕアジュバントＭＭ（ＧｅｒｂｕＢｉｏｔｅｃｈｎｉｋｃ＃３００１）を皮下注射することにより免疫化した。組換えｈｕＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１００８４−Ｈ０８Ｈ）、ｈｕＯＸ４０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号３３８８−ＯＸ）及びｈｕＯＸ４０−Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０４８１−Ｈ０８Ｈ）タンパク質を、免疫化に使用した。ＣＤ１３７抗体パネル生成については、タンパク質免疫は行わなかった。マウスを、４０μｌのアジュバントと混合したＰＢＳ中４０μｇの組換えタンパク質で、１００μｌの総容量で免疫化させた。続いて、１４及び２８日目に、マウスを、２０μｌのアジュバントと混合したＰＢＳ中２０μｇの組換えタンパク質で、５０μｌの総容量で追加免疫化させた。３５日目にマウス血清を採取し、血清力価を決定した。低血清力価を有するマウスは、ブースター免疫化及び血清分析の更なるサイクルを受けた。各サイクルは、５０μｌのＰＢＳ中２０μｇの組換えタンパク質を使用する週２回の免疫化、続いて１週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的に対して高い血清力価を示すマウスは、５０μｌのＰＢＳ中の２０μｇの組換えタンパク質を３日間連続して毎日注射することからなる最終的な追加免疫化を受けた。最終注射から１日後に、マウスリンパ系組織を採取した。

ＤＮＡ免疫化
ＭｅＭｏ（登録商標）のマウスを、マイクロピグメンテーション装置を用いて、ＤＮＡタトゥーによって免疫化させた。ＤＮＡタトゥー免疫化を、標的抗原をコード化する２０μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＶＡＸ１＿［ＴＡＲＧＥＴ＿ＮＡＭＥ］、表１）を用いて行った。マウスを、ヒト標的のみ（ＰＤ−Ｌ１）をコード化するＤＮＡで、又はヒト及びラット（ＣＤ１３７、ＯＸ４０）標的をコード化するＤＮＡでの交互免疫化によって免疫化して、種交差反応性抗体を得た。ＰＤ−Ｌ１の免疫化については、０．５ｍｇの抗ＣＤ２５抗体ＰＣ６１．５（Ｂｉｏｃｅｒｏｓ）をマウスに注射して寛容を破壊することによる免疫化の開始の４日前にＴｒｅｇ細胞を枯渇させた。マウスを、０、３、６、１４、１７、２８及び３１日目に免疫化させた。３５日目にマウス血清を採取し、血清力価を決定した。ヒト及び／又はマカクザル標的に対する血清反応性が低いマウスには、ヒト、ラット、又はマカクザルＤＮＡ抗原でブースター免疫化の更なるサイクルを受けさせて、血清分析を行った。各サイクルは、週２回のＤＮＡ免疫化、続いて１週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的を発現する細胞に対する強い血清反応性を示すマウスは、最終的な追加免疫化を受けた後、３日後にリンパ系組織を採取した。

タンパク質及びＤＮＡ免疫化の組み合わせ（ＯＸ４０のみ）
マウスを、組換えｈｕＯＸ４０−Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０４８１−Ｈ０８Ｈ）で免疫化させ、ＤＮＡ（ｐＶＡＸ１＿ｒａＯＸ４０）及びタンパク質（ｈｕＯＸ４０−Ｈｉｓ）免疫化の交互免疫化によって追加免疫し、種交差反応性抗体を得た。したがって、マウスを、４０μｌのアジュバントと混合したＰＢＳ中４０μｇの組換えタンパク質で、１００μｌの総容量で免疫化させた。続いて、１４及び１７日目に、マウスを、２０μｇのｐＶＡＸ１＿ｒａＯＸ４０でＤＮＡタトゥーにより追加免疫化し、続いて２８日目に、２０μｌのアジュバントと混合したＰＢＳ中２０μｇのｈｕＯＸ４０−Ｈｉｓタンパク質で、５０μｌの総容量でタンパク質免疫化させた。３５日目にマウス血清を採取し、血清力価を決定した。低ヒト及び／又はマカクザル血清力価を有するマウスは、ブースター免疫化及び血清分析の更なるサイクルを受けた。各サイクルは、２０μｇのｈｕＯＸ４０−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１＿ｒａＯＸ４０又はｐＶＡＸ１＿ｍａＯＸ４０による週２回のタンパク質若しくはＤＮＡ免疫化、続いて１週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的に対して高い血清力価を示すマウスは、５０μｌのＰＢＳ中の２０μｇの組換えタンパク質を３日間連続して毎日注射することからなる最終的な追加免疫化を受けた。最終注射から１日後に、マウスリンパ系組織を採取した。

血清力価の判定
血清力価は、ヒト及びマカクザル標的抗原を発現する細胞株を使用してＦＡＣＳ分析により決定した（表１）。

合成ファージＦａｂライブラリーの生成
合成ライブラリーを、天然レパートリー及び正準配列多様性における頻繁な使用のために選択された生殖細胞系列ヒトＶＨ遺伝子のレパートリーに基づいて構築した。ＰＣＲを用いて、合成ＨＣＤＲ３領域を、これらのＶＨ遺伝子に添加した。これは、ＶＨ遺伝子のフレームワーク１にアニーリングし、クローニングのためのＳｆｉｌ制限部位を含むフォワードプライマーを使用して行った。リバースプライマーは、ＶＨ遺伝子のフレームワーク３にアニーリングするための配列、続いて、ＨＣＤＲ３多様性をコード化するランダム化配列と、クローニングのためのＢｓｔＥＩＩ及びＸｈｏｌ制限部位も含有す配列をコード化するフレームワーク４とを含んだ。合成ＣＤＲ３領域は、完全にランダムであるか、又はＨＣＤＲ３内の特定の位置におけるアミノ酸残基の使用頻度に基づいて、より制限された多様性をコード化していた。ＶＨ遺伝子をコード化するＰＣＲ産物を、前述の制限酵素を使用し、かつ共通軽鎖コード化遺伝子も含めて、ファージＭ１３遺伝子３タンパク質と融合させてファージディスプレイベクター中にクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１の大規模ライゲーション及び形質転換は、抗原特異的Ｆａｂ断片を同定するために、抗原又は細胞上でパニングするために使用されたファージ上に表示された合成Ｆａｂ断片の大型ライブラリーをもたらした。

免疫化マウスの組織からのＲＴ−ＰＣＲによる「免疫」ファージＦａｂライブラリーの生成
脾臓及び排出リンパ節をマウスから除去することにより、対応する標的タンパク質に対して有意な体液性応答が観察された。

脾臓リンパ節及び鼠径リンパ節の両方から単一細胞懸濁液を生成し、続いてこれらの組織をＴｒｉｚｏｌＬＳ試薬（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｃ＃１０２９６０２８）中に溶解し、使用するまで−８０℃で保存した。

成功裏に免疫化されたマウスからの鼠径リンパ節を、「免疫」ファージ抗体レパートリーの構築に使用した。ＲＮＡをリンパ系組織の単一細胞懸濁液から抽出した。１μｇの全ＲＮＡを、ＩｇＧ−ＣＨ１特異的プライマーを用いるＲＴ反応で使用した。次いで、得られたｃＤＮＡを使用して、本質的にＭａｒｋｓら（ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１９９１Ｄｅｃ５；２２２（３）：５８１−９７）に記載されているように、インハウス適応ＶＨ特異的プライマーを使用して、ＶＨコード化ｃＤＮＡのポリクローナルプールを増幅した。次いで、得られたＰＣＲ産物を、軽鎖（図１Ａ及び１Ｂ）が全ての抗体に対して同じであり、ベクターによってコード化されたということを除いて、ｄｅＨａａｒｄら（ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９９Ｊｕｎ２５；２７４（２６）：１８２１８−３０）に記載されているように、ファージ上にＦａｂ断片を表示するためにファージミドベクター（図６）中にクローニングした。ライゲーション後、ファージミドを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細菌を形質転換し、形質転換細菌をアンピシリン及びグルコースを含有するＬＢ−寒天プレート上に播種した。全てのファージライブラリーは、＞４×１０^５個の形質転換体を含有し、＞９０％のインサート頻度を有した。一晩増殖後に細菌を採集し、確立されたプロトコル（ｄｅＨａａｒｄｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９９Ｊｕｎ２５；２７４（２６）：１８２１８−３０）に従ってファージを調製するために使用した。

組換えタンパク質を使用する、合成及び「免疫」ファージＦａｂライブラリーからのヒト標的タンパク質に特異的に結合するＦａｂ断片を保有するファージの選択
生成されたファージＦａｂライブラリーを使用して、直接コーティングされた組換えタンパク質上のファージディスプレイを使用して標的特異的Ｆａｂを選択した。ＰＤ−Ｌ１については、ｈｕＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１００８４−Ｈ０８Ｈ）、ｈｕＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号１５６−Ｂ７）、及びｍａＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号９０２５１−Ｃ０８Ｈ）、を使用した。ＣＤ１３７については、ｈｕＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号８３８−４Ｂ）、ｒａＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号７９６８−４Ｂ）、ｍｏＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号９３７−４Ｂ）、ｈｕＣＤ１３７−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１００４１−Ｈ０８Ｈ）、及びｈｕＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｅｎｚｏ、カタログ番号ＡＬＸ−５２２−０３１−Ｃ０５０）を使用し、ＯＸ４０については、ｈｕＯＸ４０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号３３８８−ＯＸ）、及びｈｕＯＸ４０−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０４８１−Ｈ０８Ｈ）を使用した。

組換えタンパク質を用いた選択については、タンパク質をＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）ＥＬＩＳＡプレートのウェルにコーティングした。ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中４％の乾燥した脱脂粉乳（Ｍａｒｖｅｌ）でブロックした。ファージＦａｂライブラリーはまた、４％のＭａｒｖｅｌでブロックされ、Ｆｃタグ付き組換えタンパク質を使用した場合、ファージライブラリーをコーティングされた抗原に添加する前に、Ｆｃ領域結合剤を枯渇させるために、ヒトＩｇＧを過剰に使用した。

コーティングされたタンパク質とのファージライブラリーのインキュベーションを、振盪条件下で室温にて１．５時間実施した。次いで、プレート又はチューブを、ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で１５回洗浄し、続いてＰＢＳで５回洗浄した。結合したファージをトリプシンを用いて２０分間溶出させ、その後、トリプシンをＡＥＢＳＦトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ）で中和した。

溶出液を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ−１に添加し、ファージ感染用に３７℃でインキュベートした。続いて、感染した細菌をアンピシリン及びグルコースを含有する寒天プレート上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。選択出力からの単一クローンを、標的に応じてＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳにおける標的結合についてスクリーニングした。

合成ファージＦａｂライブラリーを用いた選択については、第１ラウンド選択についての上記概要と同じプロトコルを使用して、第１ラウンド選択出力の救出後に、第２ラウンド選択を実施した。

標的タンパク質を安定して発現する細胞を使用する、「免疫」ファージＦａｂライブラリーからのヒト標的に特異的に結合するＦａｂ断片を保有するファージの選択
標的免疫化マウスから生成されたファージＦａｂライブラリーを、それぞれの標的を発現する細胞上のファージディスプレイを用いて選択した。ＣＤ１３７、ＯＸ４０、又はＰＤ−Ｌ１を発現する安定な細胞株（表１）を、第１ラウンドの選択に使用した。細胞を、ＰＢＳ中１０％のＦＢＳでブロックした。ブロッキング後、救出されたファージを、ブロックされた細胞と共にインキュベートした。細胞＋ファージを、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ中１０％のＦＢＳの１ｍｌを用いて、細胞の洗浄を行った（５回）。結合したファージをトリプシンを用いて２０分間溶出させ、その後、トリプシンをＡＥＢＳＦトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ）で中和した。溶出液を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ−１に添加し、ファージ感染用に３７℃でインキュベートした。続いて、ファージ感染した細菌をアンピシリン及びグルコースを含有する寒天プレート上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。

ＰＤ−Ｌ１については、ｈｕＰＤ−Ｌ１を内因的に発現するＥＳ−２細胞を用いた第２ラウンド選択を、第１ラウンド選択に使用したものと同じプロトコルで行った。選択後、単一のクローンを、ＦＡＣＳにおける標的結合についてスクリーニングした。

ＥＬＩＳＡにおける標的特異的Ｆａｂクローンのスクリーニング
単一クローンのうちの、可溶性Ｆａｂ又はファージを調製した（ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１９９１Ｄｅｃ５；２２２（３）：５８１−９７；ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９９Ｊｕｎ２５；２７４（２６）：１８２１８−３０）。得られた可溶性Ｆａｂ又はファージサンプルを、ＰＢＳ中４％の乾燥スキムミルク（Ｍａｒｖｅｌ）（ブロック緩衝液）中で希釈し（それぞれ１：５又は１：１０）、選択に使用したものと同じ抗原でコーティングされたウェルに対する、又はｒａＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号７９６８−４Ｂ）若しくはｍｏＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号９３７−４Ｂ）のいずれかを用いて実施された全ての選択出力についてはｈｕＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号８３８−４Ｂ）でコーティングされたウェルに対する結合をＥＬＩＳＡで試験した。

結合したＦａＢを、ブロック緩衝液中で１：１０００に希釈した抗ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１６６７２０３００１）で、続いてブロック緩衝液中で１：５０００に希釈したＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５−０３５−１５０）で染色することによって検出した。結合したファージを、ブロック緩衝液中で１：５０００に希釈したＨＲＰ結合モノクローナル抗Ｍ１３抗体（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２７−９４２１−０１）で染色することによって検出した。

各抗体染色後、ウェルをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。結合した二次抗体をＴＭＢ／Ｈ_２Ｏ_２染色により可視化し、ＯＤ_{４５０ｎｍ}測定により染色を定量化した。ＯＤ４５０ｎｍが陰性対照Ｆａｂで得られたバックグラウンドシグナルの少なくとも３倍以上であるとき、クローンは標的に結合すると考えられた。

全ての標的特異的クローンのＶＨコード化ｃＤＮＡを配列決定した。配列同一性及びクラスター解析に基づく特有のクローンの選択を、次いで、細胞選択出力から得られたクローンについて以下に記載されるように、細胞上の発現された標的への結合に対するＦＡＣＳで分析した。

ＦＡＣＳにおける標的特異的Ｆａｂクローンのスクリーニング
対応の標的を発現する細胞上で選択された単一クローンのうちの、可溶性Ｆａｂ又はファージを（ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１９９１Ｄｅｃ５；２２２（３）：５８１−９７；ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９９Ｊｕｎ２５；２７４（２６）：１８２１８−３０）に記載されるように調製した。Ｆａｂ試料を、ＦＡＣＳ緩衝液中の１：５に希釈したＦａｂ試料と１：１０００に希釈した抗ｍｙｃ抗体（Ｇｅｎｔａｕｒ、カタログ番号０４−ＣＭＹＣ−９Ｅ１０）との混合物（ＰＢＳ中、０．５％のＨｉ−ＦＢＳ）を用いたインキュベーションによって、ヒト及びマカクザル標的を発現する細胞への結合についてＦＡＣＳにおいて試験した（表１）。結合したＦａｂ／抗ｍｙｃ複合体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：５００に希釈したＡＰＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５０８２６）とインキュベーションすることによって検出した。

ファージ試料を、ブロック緩衝液中にファージ試料を１：３で希釈し、標的発現細胞と１時間インキュベートすることによって、ＦＡＣＳにおける結合について試験した。結合したファージを、ビオチン化抗Ｍ１３抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、カタログ番号６１Ｒ−Ｍ１０１ＡＢＴＢ６２−ＦＥＺ、ＦＡＣＳ緩衝液中１：１２５、氷上３０分間）及びＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＳＡ１００４−４、ＦＡＣＳ緩衝液中１：４００、氷上１５分間）で染色することによって検出した。各抗体とのインキュベーション後、ウェルをＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。染色した細胞を、ＦＡＣＳＡｃｃｕｒｉＣ６機器（ＢｅｃｔｏｎａｎｄＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。平均蛍光強度が陰性対照Ｆａｂで得られたバックグラウンドシグナルの少なくとも３倍以上であるとき、クローンは陽性であると考えられた。

結果
上述の方法によって得られた２４個のＣＤ１３７特異的クローン、１４個のＰＤ−Ｌ１特異的クローン、及び５０個のＯＸ４０特異的クローンのＶＨ配列を図３に示す。

実施例３
ＩｇＧフォーマットにおけるｈｕＣＤ１３７、ｈｕＯＸ４０及びｈｕＰＤ−Ｌ１特異的Ｆａｂクローンの特性評価
ヒトＣＤ１３７、ＯＸ４０、及びＰＤ−Ｌ１特異的ＦａｂのＩｇＧフォーマットへの再クローニング
細胞上で発現されたヒト及びマカクザル標的タンパク質に結合した、ＣＤＲ３配列とＶＨ生殖細胞系列との差異に基づく特有なクローンの選択を、次いで、標準化分子生物学的手法に従って、消化されたｃＤＮＡのプールのＳｆｉ１−ＢｓｔＥＩＩ消化及びライゲーションを用いて、共通軽鎖（図１）を含有する、ＭＶ１４５２（図７）などのＩｇＧ発現プラスミドに再クローニングした。

ヒトＣＤ１３７、ＯＸ４０又はＰＤ−Ｌ１特異的Ｆａｂ及び破傷風毒素特異的Ｆａｂを含有する二重特異性ＩｇＧの発現
二重特異性抗体を、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化及び形成を確実にするために、独自のＣＨ３工学技術を用いて、異なるＶＨドメインを有するＩｇＧをコード化する２つのプラスミドの一過性共トランスフェクションによって生成した。重鎖を含有する両方のプラスミド上に存在する共通軽鎖もまた、同じ細胞内で共トランスフェクションされる。本発明の同時係属出願（例えば、国際公開第２０１３／１５７９５４号及び国際公開第２０１３／１５７９５３号、参照により本明細書に組み込まれる）では、単一の細胞から二重特異性抗体を産生するための方法及び手段を開示しており、これにより、単一特異性抗体の形成よりも二重特異性抗体の形成を有利にする手段が提供される。本発明では、これらの方法を好適に採用することができる。具体的には、二重特異性完全長ＩｇＧ分子のみを本質的に生成するのに好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメイン中の３５１及び３６６位でのアミノ酸置換、例えばＬ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ番号付けに従っての番号付け）（「ＫＫ−変異体」重鎖）、及び第２のＣＨ３ドメイン中の３５１及び３６８位でのアミノ酸置換、例えばＬ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（「ＤＥ−変異体」重鎖）、又はその逆である。これは、負に帯電したＤＥ−変異体重鎖及び正に帯電したＫＫ−変異体重鎖が優先的に対をなし、ヘテロ二量体を形成する（いわゆる「ＤＥＫＫ」二重特異性分子）ことが、本発明の同時係属出願により以前に実証されている。ＤＥ−変異体重鎖のホモ二量体化（ＤＥ−ＤＥホモ二量体）又はＫＫ−変異体重鎖のホモ二量体化（ＫＫ−ＫＫホモ二量体）は、同一の重鎖間のＣＨ３−ＣＨ３界面における荷電残基間の強い反発力のために、ほとんど発生しない。

上記のヒトＣＤ１３７、ＯＸ４０、及びＰＤ−Ｌ１に結合する抗体をコード化するＶＨ遺伝子を、正に帯電したＣＨ３ドメインをコード化するＭＶ１４５２などのＩｇＧ発現ベクター中にクローニングした。破傷風毒素（ｔｅｔａｎｕｓｔｏｘｉｎ、ＴＴ）標的化抗体（図８）を、負に荷電したＣＨ３ドメインをコード化するＭＶ１３７７ＩｇＧ発現ベクター（図９）中にクローニングした。ＩｇＧフォーマットでＣＤ１３７抗体パネルを発現させるために、パネル全体もまた負に帯電したＣＨ３ドメインベクター中にクローンニングし、単一特異性ＣＤ１３７×ＣＤ１３７二価ＩｇＧを産生できる。

懸濁増殖に適合した２９３Ｆフリースタイル細胞を、３．０×１０^６個細胞／ｍｌの密度になるまで振盪プラトー上のＴ１２５フラスコ内で培養した。ディープ２４ウェルプレート（２４ウェルフォーマット）の各ウェルに、細胞を０．３〜０．５×１０^６個の生細胞／ｍｌの密度で播種した。細胞を、異なる抗体をコード化する２つのプラスミドの混合物で一過性にトランスフェクトし、独自のベクター系にクローニングした。トランスフェクションから７日後に、細胞上清を採取し、０．２２μＭのフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して濾過した。無菌上清を、抗体の精製まで４℃で保存した。

（二重特異性）ＩｇＧの精製
タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ＩｇＧの精製を小規模（＜５００μｇ）で行った。濾過を使用して、２４ウェルフィルタプレート中で、滅菌条件下で小規模の精製を行った。まず、培地のｐＨをｐＨ８．０に調整し、続いて、ＩｇＧ含有上清を、タンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（５０％ｖ／ｖ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、振盪プラットフォーム上で６００ｒｐｍで、２５℃にて２時間インキュベートした。次に、濾過によりビーズを採取した。ビーズをＰＢＳｐＨ７．４で２回洗浄した。次いで、結合したＩｇＧを、０．１Ｍクエン酸緩衝液で、ｐＨ３．０にて溶出させ、溶出液をトリスｐＨ８．０を用いて直ちに中和した。マルチスクリーンＵｌｔｒａｃｅｌ１０マルチプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、遠心分離により緩衝液交換を行った。試料を最後に、ＰＢＳｐＨ７．４中で採取した。ＩｇＧ濃度をＯｃｔｅｔを用いて測定した。タンパク質試料を４℃で保存した。

Ｏｃｔｅｔを使用したＩｇＧ定量化
精製したＩｇＧの量を決定するために、全ヒトＩｇＧ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｉ４５０６）を標準として使用して、タンパク質Ａバイオセンサ（Ｆｏｒｔｅ−Ｂｉｏ、供給元の推奨に従って）を用いてＯｃｔｅｔ分析により抗体の濃度を決定した。

ｈｕＣＤ１３７×ＣＤ１３７二価ＩｇＧ及びｈｕＯＸ４０×ＴＴ並びにｈｕＰＤ−Ｌ１×ＴＴ二重特異性ＩｇＧの特異性分析
ｈｕＣＤ１３７×ＣＤ１３７二価ＩｇＧ及びｈｕＯＸ４０×ＴＴ並びにｈｕＰＤ−Ｌ１×ＴＴ二重特異性ＩｇＧを、関連するヒト及びマカクザルオルソログ（表１）及び野生型細胞を発現する安定した細胞株への結合についてＦＡＣＳにおいて試験した。したがって、細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％のＢＳＡ／０．５ｍＭのＥＤＴＡ）中で１０^６個の細胞／ｍｌに希釈した。１〜２×１０^５個の細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート内の各ウェルに添加した。細胞を、４℃で３００ｇにて２分間遠心分離した。プレート（複数可）を反転させることにより、上清を廃棄した。５０μｌの各ＩｇＧ試料を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞を１回遠心分離し、上清を除去し、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。５０μｌの１：４００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、暗所で氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液の添加後、細胞を１回遠心分離し、上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメトリー（ＢｅｃｔｏｎａｎｄＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）でＨＴＳ設定で分析した。細胞への抗体の結合を、染色された細胞集団の平均蛍光強度（ｍｅａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）を測定することによって評価した。抗体は、ＭＦＩが（陰性対照）非結合抗体（破傷風毒素に向けられた）で染色された同じ細胞集団のものの少なくとも５倍である場合、それらの標的に結合すると考えられた。

ＣＤ１３７ＬとのＣＤ１３７相互作用をブロックする能力に対する、ＣＤ１３７×ＣＤ１３７二価ＩｇＧ中に存在するｈｕＣＤ１３７特異的Ｆａｂアームのビニング
二価ＩｇＧフォーマットにおけるｈｕＣＤ１３７結合クローンを、ＣＤ１３７のＣＤ１３７Ｌとの相互作用をブロックする能力について試験した。したがって、Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートのウェルを、ＰＢＳ中１．２５μｇ／ｍｌの組換えＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号８３８−４Ｂ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、続いてＰＢＳ（ブロック緩衝液）中２％のＢＳＡで室温にて１時間ブロックした。その後、ウェルを、２０μｇ／ｍｌのＩｇＧの存在下又は非存在下でブロック緩衝液中で希釈した０．２５μｇ／ｍｌのＣＤ１３７Ｌ−ｍｕＣＤ８ビオチン（Ａｎｃｅｌｌ、カタログ番号５０３−０３０）と共に室温で１時間インキュベートした。次に、洗浄工程を繰り返し、ウェルを、ブロック緩衝液中で１：２０００に希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号５５４０６６）と共に室温で３０分間インキュベートした。結合したストレプトアビジンの検出のために、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢ基質成分Ａ及びＢ１：１の比（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、それぞれカタログ番号５１−２６０６ＫＣ及び５１−２６０７ＫＣ）と共にインキュベートした。１０分後に、１ＭのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いてＯＤ_{４５０ｎｍ}を測定した。結果に基づいて、クローンを４つの異なる群においてビニングした：ＴＴ特異的競合抗体が添加された対照（０％のブロッキング）と比べて、２０μｇ／ｍｌのＩｇＧ（ＣＤ１３７×ＣＤ１３７）濃度においてＥＬＩＳＡシグナルが７０％超に減少させた場合、「ブロッキングクローン」は、ＣＤ１３７のＣＤ１３７Ｌとの相互作用を完全にブロックすると考えられ、「部分的ブロッキングクローン」は、２５〜７０％の間のシグナルを減少させ、「非ブロッキングクローン」は、最大で２５％減少させるか、又は最大２５％増強させるＥＬＩＳＡシグナルを示し、「エンハンシングクローン」は、２５％を超えるＥＬＩＳＡシグナルの増加を示した。ＣＤ１３７×ＣＤ１３７二重特異性分子として試験したＣＤ１３７抗体パネルの代表的な選択により得られた結果を表２に示す。

ドメイン特異性に対するＣＤ１３７×ＣＤ１３７二価ＩｇＧ中に存在するｈｕＣＤ１３７特異的Ｆａｂアームのビニング
二価ＩｇＧフォーマットにおける上述のｈｕＣＤ１３７結合クローンもまた、８つの異なるｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３マウス／ヒトＣＤ１３７ハイブリッド発現構築物、ＦＬマウスＣＤ１３７ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３発現構築物（以下のアミノ酸インサート配列を参照）、又はフリースタイル２９３Ｆ細胞を発現する安定なｈｕＣＤ１３７の生成に使用された（表１）ｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３ｈｕＣＤ１３７発現構築物で、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するドメイン特異性についてもＦＡＣＳで試験した。抗体パネルの特異性分析中に、同じＦＡＣＳプロトコルを上記のように使用した。ハイブリッド構築物の生成のために、マウス及びヒトＣＤ１３７の細胞外ドメインを５つのドメイン；Ｕｎｉｐｒｏｔ参照配列Ｑ０７０１１（ｈｕＣＤ１３７）及びＰ２０３３４（ｍｏＣＤ１３７）に基づく４つのシステインリッチドメインと、システインリッチドメイン４の末端から膜貫通ドメインまでの１つのヒンジドメインに分割した。以下のアミノ酸挿入配列を、Ｎｈｅｌ／ＥｃｏＲＩを介してｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３中にクローニングし（図４）、太字の文字はシグナルペプチドである。下線を引いた文字は、ヒトＣＤ１３７と同一の配列である。イタリック体の文字は、膜貫通ドメイン配列及び細胞内ドメイン配列を表す。

アミノ酸配列完全長マウスＣＤ１３７。
ＭＧＮＮＣＹＮＶＶＶＩＶＬＬＬＶＧＣＥＫＶＧＡＶＱＮＳＣＤＮＣＱＰＧＴＦＣＲＫＹＮＰＶＣＫＳＣＰＰＳＴＦＳＳＩＧＧＱＰＮＣＮＩＣＲＶＣＡＧＹＦＲＦＫＫＦＣＳＳＴＨＮＡＥＣＥＣＩＥＧＦＨＣＬＧＰＱＣＴＲＣＥＫＤＣＲＰＧＱＥＬＴＫＱＧＣＫＴＣＳＬＧＴＦＮＤＱＮＧＴＧＶＣＲＰＷＴＮＣＳＬＤＧＲＳＶＬＫＴＧＴＴＥＫＤＶＶＣＧＰＰＶＶＳＦＳＰＳＴＴＩＳＶＴＰＥＧＧＰＧＧＨＳＬＱＶＬＴＬＦＬＡＬＴＳＡＬＬＬＡＬＩＦＩＴＬＬＦＳＶＬＫＷＩＲＫＫＦＰＨＩＦＫＱＰＦＫＫＴＴＧＡＡＱＥＥＤＡＣＳＣＲＣＰＱＥＥＥＧＧＧＧＧＹＥＬ

アミノ酸配列ｍｏ／ｈｕＣＤ１３７キメラインサートＡ（ヒトシステインリッチドメイン１；システインリッチドメイン２から前方のマウス配列）。
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アミノ酸配列ｍｏ／ｈｕＣＤ１３７キメラインサートＢ（ヒトシステインリッチドメイン１及び２；システインリッチドメイン３から前方のマウス配列）。
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アミノ酸配列ｍｏ／ｈｕＣＤ１３７キメラインサートＣ（ヒトシステインリッチドメイン１〜３；システインリッチドメイン４から前方のマウス配列）。
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アミノ酸配列ｍｏ／ｈｕＣＤ１３７キメラインサートＤ（ヒトシステインリッチドメイン１〜４；ヒンジドメインから前方のマウス配列）。
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アミノ酸配列ｍｏ／ｈｕＣＤ１３７キメラインサートＥ（マウスシステインリッチドメイン１；システインリッチドメイン２から前方のヒト配列）。
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アミノ酸配列ｍｏ／ｈｕＣＤ１３７キメラインサートＦ（マウスシステインリッチドメイン１及び２；システインリッチドメイン３から前方のヒト配列）。
ＭＧＮＮＣＹＮＶＶＶＩＶＬＬＬＶＧＣＥＫＶＧＡＶＱＮＳＣＤＮＣＱＰＧＴＦＣＲＫＹＮＰＶＣＫＳＣＰＰＳＴＦＳＳＩＧＧＱＰＮＣＮＩＣＲＶＣＡＧＹＦＲＦＫＫＦＣＳＳＴＨＮＡＥＣＤＣＴＰＧＦＨＣＬＧＡＧＣＳＭＣＥＱＤＣＫＱＧＱＥＬＴＫＫＧＣＫＤＣＣＦＧＴＦＮＤＱＫＲＧＩＣＲＰＷＴＮＣＳＬＤＧＫＳＶＬＶＮＧＴＫＥＲＤＶＶＣＧＰＳＰＡＤＬＳＰＧＡＳＳＶＴＰＰＡＰＡＲＥＰＧＨＳＰＱＩＩＳＦＦＬＡＬＴＳＴＡＬＬＦＬＬＦＦＬＴＬＲＦＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ

アミノ酸配列ｍｏ／ｈｕＣＤ１３７キメラインサートＧ（マウスシステインリッチドメイン１〜３；システインリッチドメイン４から前方のヒト配列）。
ＭＧＮＮＣＹＮＶＶＶＩＶＬＬＬＶＧＣＥＫＶＧＡＶＱＮＳＣＤＮＣＱＰＧＴＦＣＲＫＹＮＰＶＣＫＳＣＰＰＳＴＦＳＳＩＧＧＱＰＮＣＮＩＣＲＶＣＡＧＹＦＲＦＫＫＦＣＳＳＴＨＮＡＥＣＥＣＩＥＧＦＨＣＬＧＰＱＣＴＲＣＥＫＤＣＲＰＧＱＥＬＴＫＱＧＣＫＤＣＣＦＧＴＦＮＤＱＫＲＧＩＣＲＰＷＴＮＣＳＬＤＧＫＳＶＬＶＮＧＴＫＥＲＤＶＶＣＧＰＳＰＡＤＬＳＰＧＡＳＳＶＴＰＰＡＰＡＲＥＰＧＨＳＰＱＩＩＳＦＦＬＡＬＴＳＴＡＬＬＦＬＬＦＦＬＴＬＲＦＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ

アミノ酸配列ｍｏ／ｈｕＣＤ１３７キメラインサートＨ（マウスシステインリッチドメイン１〜４；ヒンジドメインから前方のヒト配列）。
ＭＧＮＮＣＹＮＶＶＶＩＶＬＬＬＶＧＣＥＫＶＧＡＶＱＮＳＣＤＮＣＱＰＧＴＦＣＲＫＹＮＰＶＣＫＳＣＰＰＳＴＦＳＳＩＧＧＱＰＮＣＮＩＣＲＶＣＡＧＹＦＲＦＫＫＦＣＳＳＴＨＮＡＥＣＥＣＩＥＧＦＨＣＬＧＰＱＣＴＲＣＥＫＤＣＲＰＧＱＥＬＴＫＱＧＣＫＴＣＳＬＧＴＦＮＤＱＮＧＴＧＶＣＲＰＷＴＮＣＳＬＤＧＲＳＶＬＫＴＧＴＴＥＫＤＶＶＣＧＰＳＰＡＤＬＳＰＧＡＳＳＶＴＰＰＡＰＡＲＥＰＧＨＳＰＱＩＩＳＦＦＬＡＬＴＳＴＡＬＬＦＬＬＦＦＬＴＬＲＦＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ

キメラ及び完全長マウス並びにヒトＣＤ１３７構築物で得られたＦＡＣＳ結果に基づいて、観察された結合パターンに基づいてクローンをビニングした。抗体は、ＭＦＩが（陰性対照）非結合抗体（破傷風毒素に向けられた）で染色された同じ細胞集団のものの少なくとも３倍である場合、（キメラ）ＣＤ１３７に結合すると考えられた。

結果
ＣＤ１３７特異的Ｆａｂアームのドメイン特異性を表２に示す。

ＯＸ４０のＯＸ４０Ｌとの相互作用をブロックする能力に対する、ＯＸ４０×ＴＴ二重特異性ＩｇＧ中に存在するｈｕＯＸ４０特異的Ｆａｂアームのビニング
二重特異性ＩｇＧフォーマット（ＯＸ４０×ＴＴ）におけるｈｕＯＸ４０結合クローンを、ＯＸ４０のＯＸ４０Ｌとの相互作用をブロックする能力について試験した。したがって、Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートのウェルを、ＰＢＳ中０．１５６μｇ／ｍｌの組換えｈｕＯＸ４０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号３３８８−ＯＸ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、続いてＰＢＳ（ブロック緩衝液）中４％の乾燥した脱脂粉乳（ＥＬＫ）で室温にて１時間ブロックした。その後、ウェルを、２０μｇ／ｍｌの二重特異性ＯＸ４０×ＴＴＩｇＧの存在下又は非存在下でブロック緩衝液中で希釈した０．０１６μｇ／ｍｌのＯＸ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号１０５４−ＯＸ）と共に室温で１時間インキュベートした。次に、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、続いて、２％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で０．５μｇ／ｍｌに希釈したビオチン化抗ＯＸ４０Ｌ抗体（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＢＡＦ１０５４）と共に１時間インキュベートした。次に、洗浄工程を繰り返し、ウェルを、２％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：２０００に希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号５５４０６６）と共に室温で３０分間インキュベートした。結合したストレプトアビジンの検出のために、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＴＭＢ基質成分Ａ及びＢ１：１の比（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、それぞれカタログ番号５１−２６０６ＫＣ及び５１−２６０７ＫＣ）と共にインキュベートした。１０分後に、１ＭのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いてＯＤ_{４５０ｎｍ}を測定した。

結果に基づいて、クローンを２つの異なる群においてビニングした：「ブロッキングクローン」は、ＴＴ特異的競合抗体が添加された対照（０％のブロッキング）と比べて、２０μｇ／ｍｌのＩｇＧ（ＯＸ４０×ＴＴ）濃度においてＥＬＩＳＡシグナルが２４％超に減少させ、「非ブロッキングクローン」は、２４％未満減少させられるＥＬＩＳＡシグナルを示したか、又はＥＬＩＳＡシグナルを増強させた。この実験を、二重特異性ＩｇＧフォーマット（ＯＸ４０×ＴＴ）におけるｈｕＯＸ４０結合クローンの異なるサブセットを用いて２回実施した。ＯＸ４０×ＴＴ二重特異性分子として試験したＯＸ４０抗体パネルの結果を表５に提供する。

ドメイン特異性に対するＯＸ４０×ＴＴ二重特異性ＩｇＧ中に存在するｈｕＯＸ４０特異的Ｆａｂアームのビニング
二重特異性ＯＸ４０×ＴＴＩｇＧフォーマットにおけるｈｕＯＸ４０結合クローンを、８つの異なるｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３ラット／ヒトＯＸ４０ハイブリッド発現構築物（以下のアミノ酸インサート配列を参照）、フリースタイル２９３Ｆ細胞を発現する安定なｒａＯＸ４０及びｈｕＯＸ４０の生成に使用されたｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３＿ｒａＯＸ４０又はｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３＿ｈｕＯＸ４０発現構築物（表１）で、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するドメイン特異性についてもＦＡＣＳで試験した。抗体パネルの特異性分析中に、同じＦＡＣＳプロトコルを上記のように使用した。ハイブリッド構築物の生成のために、ラット及びヒトＯＸ４０の細胞外ドメインを５つのドメイン；Ｕｎｉｐｒｏｔ参照配列Ｐ４３４８９（ｈｕＯＸ４０）及びＰ１５７２５（ｒａＯＸ４０）に基づく４つのシステインリッチドメインと、システインリッチドメイン４の末端から膜貫通ドメインまでの１つのヒンジドメインに分割した。以下のアミノ酸挿入配列を、Ｎｈｅｌ／ＥｃｏＲＩを介してｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ３中にクローニングし（図４）、太字の文字はシグナルペプチドである。下線を引いた文字は、ヒトＯＸ４０と同一の配列である。イタリック体の文字は、膜貫通ドメイン配列及び細胞内ドメイン配列を表す。

アミノ酸配列ｒａ／ｈｕＯＸ４０キメラインサートＡ（ヒトシステインリッチドメイン１；システインリッチドメイン２から前方のラット配列）。
ＭＣＶＧＡＲＲＬＧＲＧＰＣＡＡＬＬＬＬＧＬＧＬＳＴＶＴＧＬＨＣＶＧＤＴＹＰＳＮＤＲＣＣＨＥＣＲＰＧＮＧＭＶＳＲＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＥＰＧＦＹＮＥＡＶＮＹＤＴＣＫＱＣＴＱＣＮＨＲＳＧＳＥＬＫＱＮＣＴＰＴＥＤＴＶＣＱＣＲＰＧＴＱＰＲＱＤＳＳＨＫＬＧＶＤＣＶＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＳＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＳＧＫＱＩＲＨＰＡＳＮＳＬＤＴＶＣＥＤＲＳＬＬＡＴＬＬＷＥＴＱＲＴＴＦＲＰＴＴＶＰＳＴＴＶＷＰＲＴＳＱＬＰＳＴＰＴＬＶＡＰＥＧＰＡＦＡＶＩＬＧＬＧＬＧＬＬＡＰＬＴＶＬＬＡＬＹＬＬＲＫＡＷＲＳＰＮＴＰＫＰＣＷＧＮＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＴＤＴＨＦＴＬＡＫＩ

アミノ酸配列ｒａ／ｈｕＯＸ４０キメラインサートＢ（ヒトシステインリッチドメイン１及び２；システインリッチドメイン３から前方のラット配列）。
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アミノ酸配列ｒａ／ｈｕＯＸ４０キメラインサートＣ（ヒトシステインリッチドメイン１〜３；システインリッチドメイン４から前方のラット配列）。
ＭＣＶＧＡＲＲＬＧＲＧＰＣＡＡＬＬＬＬＧＬＧＬＳＴＶＴＧＬＨＣＶＧＤＴＹＰＳＮＤＲＣＣＨＥＣＲＰＧＮＧＭＶＳＲＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲＳＧＳＥＲＫＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲＣＲＡＧＴＱＰＬＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＳＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＳＧＫＱＩＲＨＰＡＳＮＳＬＤＴＶＣＥＤＲＳＬＬＡＴＬＬＷＥＴＱＲＴＴＦＲＰＴＴＶＰＳＴＴＶＷＰＲＴＳＱＬＰＳＴＰＴＬＶＡＰＥＧＰＡＦＡＶＩＬＧＬＧＬＧＬＬＡＰＬＴＶＬＬＡＬＹＬＬＲＫＡＷＲＳＰＮＴＰＫＰＣＷＧＮＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＴＤＴＨＦＴＬＡＫＩ

アミノ酸配列ｒａ／ｈｕＯＸ４０キメラインサートＤ（ヒトシステインリッチドメイン１〜４；ヒンジドメインから前方のラット配列）。
ＭＣＶＧＡＲＲＬＧＲＧＰＣＡＡＬＬＬＬＧＬＧＬＳＴＶＴＧＬＨＣＶＧＤＴＹＰＳＮＤＲＣＣＨＥＣＲＰＧＮＧＭＶＳＲＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲＳＧＳＥＲＫＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲＣＲＡＧＴＱＰＬＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫＨＴＬＱＰＡＳＮＳＳＤＡＩＣＥＤＲＳＬＬＡＴＬＬＷＥＴＱＲＴＴＦＲＰＴＴＶＰＳＴＴＶＷＰＲＴＳＱＬＰＳＴＰＴＬＶＡＰＥＧＰＡＦＡＶＩＬＧＬＧＬＧＬＬＡＰＬＴＶＬＬＡＬＹＬＬＲＫＡＷＲＳＰＮＴＰＫＰＣＷＧＮＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＴＤＴＨＦＴＬＡＫＩ

アミノ酸配列ｒａ／ｈｕＯＸ４０キメラインサートＥ（ラットシステインリッチドメイン１；システインリッチドメイン２から前方のヒト配列）。
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アミノ酸配列ｒａ／ｈｕＯＸ４０キメラインサートＦ（ラットシステインリッチドメイン１及び２；システインリッチドメイン３から前方のヒト配列）。
ＭＹＶＷＶＱＱＰＴＡＦＬＬＬＧＬＳＬＧＶＴＶＫＬＮＣＶＫＤＴＹＰＳＧＨＫＣＣＲＥＣＱＰＧＨＧＭＶＳＲＣＤＨＴＲＤＴＶＣＨＰＣＥＰＧＦＹＮＥＡＶＮＹＤＴＣＫＱＣＴＱＣＮＨＲＳＧＳＥＬＫＱＮＣＴＰＴＥＤＴＶＣＲＣＲＡＧＴＱＰＬＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫＨＴＬＱＰＡＳＮＳＳＤＡＩＣＥＤＲＤＰＰＡＴＱＰＱＥＴＱＧＰＰＡＲＰＩＴＶＱＰＴＥＡＷＰＲＴＳＱＧＰＳＴＲＰＶＥＶＰＧＧＲＡＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ

アミノ酸配列ｒａ／ｈｕＯＸ４０キメラインサートＧ（ラットシステインリッチドメイン１〜３；システインリッチドメイン４から前方のヒト配列）。
ＭＹＶＷＶＱＱＰＴＡＦＬＬＬＧＬＳＬＧＶＴＶＫＬＮＣＶＫＤＴＹＰＳＧＨＫＣＣＲＥＣＱＰＧＨＧＭＶＳＲＣＤＨＴＲＤＴＶＣＨＰＣＥＰＧＦＹＮＥＡＶＮＹＤＴＣＫＱＣＴＱＣＮＨＲＳＧＳＥＬＫＱＮＣＴＰＴＥＤＴＶＣＱＣＲＰＧＴＱＰＲＱＤＳＳＨＫＬＧＶＤＣＶＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫＨＴＬＱＰＡＳＮＳＳＤＡＩＣＥＤＲＤＰＰＡＴＱＰＱＥＴＱＧＰＰＡＲＰＩＴＶＱＰＴＥＡＷＰＲＴＳＱＧＰＳＴＲＰＶＥＶＰＧＧＲＡＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ

アミノ酸配列ｒａ／ｈｕＯＸ４０キメラインサートＨ（ラットシステインリッチドメイン１〜４；ヒンジドメインから前方のヒト配列）。
ＭＹＶＷＶＱＱＰＴＡＦＬＬＬＧＬＳＬＧＶＴＶＫＬＮＣＶＫＤＴＹＰＳＧＨＫＣＣＲＥＣＱＰＧＨＧＭＶＳＲＣＤＨＴＲＤＴＶＣＨＰＣＥＰＧＦＹＮＥＡＶＮＹＤＴＣＫＱＣＴＱＣＮＨＲＳＧＳＥＬＫＱＮＣＴＰＴＥＤＴＶＣＱＣＲＰＧＴＱＰＲＱＤＳＳＨＫＬＧＶＤＣＶＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＳＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＳＧＫＱＩＲＨＰＡＳＮＳＬＤＴＶＣＥＤＲＤＰＰＡＴＱＰＱＥＴＱＧＰＰＡＲＰＩＴＶＱＰＴＥＡＷＰＲＴＳＱＧＰＳＴＲＰＶＥＶＰＧＧＲＡＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ

キメラ及び完全長ラット並びにヒトＯＸ４０構築物で得られたＦＡＣＳ結果に基づいて、観察された結合パターンに基づいてクローンをビニングした。抗体は、ＭＦＩが（陰性対照）非結合抗体（破傷風毒素に向けられた）で染色された同じ細胞集団のものの少なくとも３倍である場合、（キメラ）ＯＸ４０に結合すると考えられた。

二重特異性ＯＸ４０×ＴＴＩｇＧフォーマットにおけるｈｕＯＸ４０結合クローンの結果を、表５に提供する。

ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用をブロックする能力に対する、ＰＤ−Ｌ１×ＴＴ二重特異性ＩｇＧ中に存在するｈｕＰＤ−Ｌ１特異的Ｆａｂアームのビニング
１４個のｈｕＰＤ−Ｌ１結合クローン（図３に示すＶＨ配列）を、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１との相互作用をブロックするそれらの能力、並びにＰＤ−Ｌ１とＣＤ８０との間の相互作用をブロックするそれらの能力について試験した。したがって、ＰＤ１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１０８６−ＰＤ）又はＣＤ８０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１４０−Ｂ１）を、それぞれ１及び３μｇ／ｍｌでのマキシソーププレートにコーティングした。コーティングされたウェルを、ＰＢＳ中４％のＢＳＡでブロックした。その後、０．５５μｇ／ｍｌのビオチン化ＰＤ−Ｌ１（ＢＰＳｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号７１１０５）を、０．１５〜２０μｇ／ｍｌの範囲のｈｕＰＤ−Ｌ１×ＴＴ二重特異性ＩｇＧの存在下又は非存在下で添加した。結合したビオチン化ＰＤ−Ｌ１を、ブロック緩衝液中１：２０００で希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジン（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５４０６６）で検出した。各インキュベーション工程後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。結合したストレプトアビジンをＴＭＢ／Ｈ_２Ｏ_２染色により可視化し、ＯＤ_{４５０ｎｍ}測定により染色を定量化した。ＴＴ特異的競合抗体が添加された対照と比べて、１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ（ＰＤ−Ｌ１×ＴＴ）濃度においてＥＬＩＳＡシグナルが７０％超に減少させた場合、クローンは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用をブロックすると考えらえた。ＰＤ−Ｌ１×ＴＴ二重特異性分子として試験したＰＤ−Ｌ１抗体パネルの代表的な選択によって得られた結果については、図１０を参照されたい。ＭＦ５３６１を除いて、図１０に示されるＰＤ−Ｌ１特異的Ｆａｂアームは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を、７０％超でブロックする。加えて、図３に示されるＭＦ配列を含む全ての他のＰＤ−Ｌ１特異的Ｆａｂアームもまた、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を、７０％超でブロックする（データ図示せず）。

結論として、試験したｈｕＰＤ−Ｌ１特異的Ｆａｂアームは、ＭＦ５３６１を除いて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用をブロックする。

ＣＤ１３７×ＣＤ１３７、ＯＸ４０×ＴＴ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＴ二重特異性ＩｇＧ中に存在するｈｕＣＤ１３７、ｈｕＯＸ４０及びｈｕＰＤ−Ｌ１特異的Ｆａｂアームの親和性ランク付け
ＦＡＣＳにおいてそれぞれのヒト及びマカクザルオルソログに結合することが示された二重特異性抗体を、ＦＡＣＳにおいてオルソログの両方についての明らかな親和性に関してランク付けした。したがって、それぞれのオルソログを発現する安定な細胞株（表１）を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％のＢＳＡ／０．５ｍＭのＥＤＴＡ）中で１×１０^６個の細胞／ｍｌに希釈した。細胞を、４℃で３００ｇにて２分間遠心分離した。プレート（複数可）を反転させることにより、上清を廃棄した。５０μｌの各ＩｇＧ試料を、１１工程で、１０〜０．０１μｇ／ｍｌの範囲の２倍希釈系列で添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞を１回遠心分離し、上清を除去し、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。５０μｌの１：４００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、暗所で氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液の添加後、細胞を１回遠心分離し、上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメトリー（ＢｅｃｔｏｎａｎｄＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）でＨＴＳ設定で分析した。細胞への抗体の結合を、染色された細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって評価した。抗体は、ＭＦＩが（陰性対照）非結合抗体（破傷風毒素に向けられた）で染色された同じ細胞集団のものの少なくとも５倍である場合、それらの標的に結合すると考えられた。

参照抗体
ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１３７並びにＣＴＬＡ−４の機能を阻害する抗体は、当該技術分野において既知である。モノクローナル二価抗体を公開された情報に従って構築し、２９３Ｆフリースタイル又はＣＨＯ−Ｓ細胞中で発現させた。抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブに基づくサロゲート）は、国際公開第２０１００７７６３４（Ａ１）号に開示されている情報に基づいた。抗ＣＤ１３７抗体の２０Ｈ４．９（ウレルマブに基づくサロゲート）及びＰＦ−０５０８２５６６（ウトミルマブに基づくサロゲート）の情報は、それぞれ国際公開第２００５／０３５５８４号及び同第２０１５１１９９２３号から得られた。ＭＯＲ７４８０のＶＨ情報は、米国特許第８３３７８５０（Ｂ２）号から得られ、ＩｇＧ１骨格において再クローニングした。抗ＣＴＬＡ−４抗体１０Ｄ１（イピリムマブに基づくサロゲート）に関する情報は、ＰＣＴ国際公開第０１／１４４２４号から入手した。

実施例４
材料及び方法
ＰＢＭＣ単離
ヒト全血を軟膜（Sanquin）から入手し、ＰＢＳで１：１に希釈した。Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブ（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−Ｏｎｅ、カタログ番号２２７２９０）を、室温（room temperature、ＲＴ）で温めた１７．５ｍのＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰｌｕｓ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１７−１４４０−０２）で充填した。Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰｌｕｓを、ＲＴで１０００×ｇで３０秒間遠心沈殿させた。３０ｍｌの希釈した全血を、上部に注いだ。チューブを１０００×ｇで１０分間、ＲＴで遠心分離させ、単核ＰＢＭＣ界面を採取し、ＰＢＳで２回洗浄し、２５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。ＰＢＭＣを計数し、組織培養培地（１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ）中で１×１０６／ｍｌに再調整し、等量の氷冷凍結培地（８０％の培養培地／２０％のＤＭＳＯ）を添加することによって凍結させた。更なる使用まで、細胞を１ｍｌのアリコート中に−１５０℃で保存した。

Ｔ細胞活性化アッセイ
ＰＢＭＣを解凍し、９体積の培養培地（Ｌグルタミン及び１０％の熱不活性化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）を添加した。細胞を、ＲＴで１５０ｇにて１０分間遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍｌの培養培地に再懸濁し、３７℃、５％のＣＯ、９５％の相対湿度で、５０ｍｌのファルコンチューブ内で一晩インキュベートすることによって細胞を休止させた。翌日、ＥａｓｙＳｅｐＴ細胞富化（パンＣＤ３）精製手法を使用して、製造元（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１９０５１）に記載されているようにＴリンパ球を単離した。ＥａｓｙＳｅｐ手法は、負の選択を使用する。簡単に言うと、ＰＢＭＣを、ＲＴで１５０ｇにて１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、１ｍＭのＥＤＴＡを伴う２ｍｌのＰＢＳ＋２％のＦＢＳ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、３０μｍメッシュのナイロンストレーナを通して濾過した。細胞を計数し、１ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ＋２％のＦＢＳ中に５×１０７個細胞／ｍｌに再調整した。５０μｌのＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞富化カクテルを、各２ｍｌの細胞容積に添加し、混合して、ＲＴで１０分間インキュベートさせた。次に、５０μｌのＥａｓｙＳｅｐＤ磁気粒子を、各２ｍｌの細胞容積に添加し、ＲＴで５分間インキュベートさせた。総体積を、１ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ＋２％のＦＢＳで２．５ｍｌに持っていった。次に、このチューブを磁石内に配置し、望ましくない細胞画分を磁石にＲＴで５分間結合させた。次に、チューブを反転させ、精製Ｔ細胞画分を新しいチューブに注ぎ、ＲＴで１５０ｇにて１０分間遠心分離することによって細胞を採取し、続いて培養培地中で１×１０５個細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。Ｔ細胞活性化アッセイについては、９６ウェルプレート（９６ウェル平底プレート−Ｃｅｌｌｓｔａｒ、＃６５５１８０）の内側ウェルを、ＰＢＳ中３０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ＵＣＨＴ１で一晩コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄した。抗体希釈液（８０μｇ／ｍｌ）を調製し、クロスリンク抗体ａＨｕＩｇＧ−Ｆｃ（Ｂｅｔｈｙｌ、カタログ番号＃Ａ８０−１０４Ａ）と共に１：１の比で、ＲＴで１５分間インキュベートした。次に、混合物の系列希釈液を調製した。各ウェルに１００μＬのクロスリンク抗体を添加し、続いて１００μＬの精製Ｔ細胞懸濁液を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性（ＰＧ１３３７）及び陽性対照抗体（ウレルマブ）の系列希釈液を含有していた。Ｔ細胞培養物を、ＩＬ−２分泌及び／又は抗原の細胞表面発現について試験する前に、９５％の相対湿度において３７℃、５％のＣＯ２で３日間刺激した。放出されたＩＬ−２の濃度を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号＃ＡＬ２２１Ｃ）によって決定した。チェックポイント阻害に関連する細胞表面抗原又は共刺激抗原の発現を、フローサイトメトリーによって決定した。

ＳＥＢアッセイ
二重特異性抗体の機能活性を、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Staphylococcus enterotoxin B、ＳＥＢ）によって刺激されたＰＢＭＣを使用することによって決定した。ＳＥＢは、Ｖβ３及びＶβ８Ｔ細胞受容体鎖を発現するＴ細胞を特異的に活性化する。３人のドナーからのＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、計数し、培養培地（ＲＰＭＩ１６４０に１０％の熱不活性化ＦＢＳを加えたもの）中で、２×１０６個の細胞／ｍｌの濃度に再懸濁させた。ＳＥＢ（２０００又は１２５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、細胞を平底９６ウェルプレート（２×１０５個の細胞／ウェル）に播種した。２０μｇ／ｍｌで開始した抗体系列希釈液を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性（ＰＧ１３３７）及び陽性対照抗体（イピルムマブに基づく）の系列希釈液を含有した。細胞を、サイトカイン分泌及び／又は抗原の細胞表面発現について試験する前に、９５％の相対湿度において３７℃、５％のＣＯ２で３日間刺激した。

ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断レポーターアッセイ
使用されたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断レポーターアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａにより開発され、２つの細胞系；ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞、及びＰＤ−１を過剰発現するＴ細胞活性化因子並びにジャーカット／ＮＦＡＴ−ＲＥレポーター細胞株に基づく。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断レポーターアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａの解凍及び使用フォーマットを用いて実施した。ＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ細胞（カタログ番号Ｃ１８７１０３）を、１４．５ｍｌの細胞回収培地（１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で解凍した。次に、９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３６８８）の内側ウェルに、５０μｌの細胞懸濁液を添加した。プレートを、９５％の相対湿度において、３７℃、５％のＣＯで一晩インキュベートした。翌日、培養培地を除去し、アッセイ培地（４％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０）中の２０μｌの試験抗体を、系列希釈液（開始濃度１０μｇ／ｍｌ）で、各ウェルに添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性（ＰＧ１３３７）及び陽性対照抗体（ニボルマブ／ＭＰＤＬ３２８０Ａに基づく）の系列希釈液を含有した。ＰＤ−１エフェクター細胞（カタログ番号Ｃ１８７１０５）を５．９ｍｌのアッセイ培地で解凍し、２０μｌの細胞懸濁液を各ウェルに添加した。プレートを、９５％の相対湿度において、３７℃、５％のＣＯで６時間又は一晩インキュベートした。４０μｌのルシフェラーゼ（Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム、カタログ番号Ｇ７９４Ｌ）を翌日加え、ａＢｉｏＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙ２マルチモードマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性の量を測定した。陰性対照抗体と比較して、ルシフェラーゼ活性として効力を測定した。

ＰＤ−Ｌ１抗体パネルのスクリーニング
ＰＤ−Ｌ１抗体パネルからのＶＨを、荷電した遺伝子操作を受けたＦｃサイレンスベクターに再クローニングし、それにより、抗体重鎖の重鎖のこれに対する発現時に、重鎖の二量体化が強制され、その結果、トランスフェクション後に二重特異性抗体の生成をもたらす。ＰＤ−Ｌ１のＦａｂアームを、ＭＶ１６２４ベクター中に再クローニングした。ＰＤ−Ｌ１抗体を、ＭＦ１３３７、ＴＴ標的化Ｆａｂアームと組み合わせて、一価の様式でＰＤ−Ｌ１を標的化する二重特異性抗体を生成した。一価のフォーマットのＰＤ−Ｌ１抗体のパネルを、表３に示すように活性についてランク付けした。

サイトカインアッセイ
ＥＬＩＳＡ：Ｔ細胞又はＰＢＭＣの様々な時間での刺激の後に、プレートを遠心分離し、培地を除去した。サイトカインレベルを、製造業者（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の指示に従って、ＡｌｐｈａＬＩＳＡによって検出した。標準曲線に基づいて濃度を計算した。

Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ：インビトロでサイトカイン産生を決定するために使用される別の方法は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより開発された多重分析を使用するものである。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αのレベルを、製造元の指示に従って培養上清中で測定した。結果を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ分析ソフトウェアによって分析した。

ジャーカットＣＤ１３７−ＮＦκＢｌｕｃの生成
ジャーカットＣＤ１３７−ＮＦκＢｌｕｃ安定レポーター細胞株を、ジャーカットＥ６細胞において、完全長ＣＤ１３７構築物及びＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター構築物を安定して組み込むことによって生成した。したがって、完全長ＣＤ１３７ＭＶ１６０４［ｐＩＲＥＳｎｅｏ３］（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をトランスフェクトし、抗生物質選択後にＣＤ１３７を発現する安定したクローンを生成した。次に、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター構築物ｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦ−κＢ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ）を最高のＣＤ１３７発現を有するクローンにトランスフェクトし、ＣＤ１３７及びＮＦ−κＢルシフェラーゼの両方を発現する安定なクローンを、抗生物質選択後に選択した。プレート結合ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ−３）及びＰＭＡ／イオノマイシンによる初期活性化後に、クローンをＣＤ１３７Ｌに応答するそれらの能力について選択した。活性化の最高のウィンドウを示したクローンを、ＣＤ１３７レポーターアッセイにおける解凍及び使用フォーマットとして使用した。

ＣＤ１３７レポーターアッセイ
直接ＣＤ１３７活性化アッセイについては、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９１７）を、ＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で一晩コーティングした。クロスリンクによって媒介されるＣＤ１３７活性化アッセイについては、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９１７）を、ＰＢＳ＋１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ、カタログ番号Ａ８０−１０４Ａ）中の２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３で、一晩コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄した。上記ジャーカットＣＤ１３７−ＮＦκＢｌｕｃ細胞を解凍し、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（アッセイ培地）で洗浄した。細胞を２×１０６個の細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。２５μｌの細胞懸濁液を、コーティングされた９６ウェルアッセイプレートの内側ウェルに播種した。２５μｌの系列希釈液中の試験抗体を、各ウェルに添加し（開始濃度２０μｇ／ｍｌ）、続いて２５μｌのアッセイ培地を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性（ＰＧ１３３７）及び陽性対照抗体の連続希釈液を含有していた。プレートを、９５％の相対湿度において、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。５０μｌのルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）、カタログ番号Ｅ２６１０）を翌日添加し、ａＢｉｏＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙ２マルチモードマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性の量を測定した。

大規模二重特異性抗体の産生
ポリエチレンイミン（polyetyleneimine、ＰＥＩ）を２．５：１のＰＥＩ／ＤＮＡ質量比を有するトランスフェクション試薬として使用して、フリースタイル（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でタンパク質を生成した。二重特異性抗体を、０．４〜２Ｌのスケールで１：１のＤＮＡ質量比を用いてトランスフェクトした。細胞上清を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＬＸセファロース（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にバッチ式インキュベーションで精製した後、トリスを用いて酸性溶出及び中和を行った。その結果、タンパク質を脱塩し、遠心分離し、続いて、２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅｓＳ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを使用して、陽イオン交換精製を行った。１ＭのＮａＣｌへの勾配溶出を使用してタンパク質を溶出させ、タンパク質含有画分を回収し、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分析した。二重特異性抗体を含有する画分をプールし、ＰＢＳ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００２６／６００ゲル濾過カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。画分を回収し、ＮｕＰＡＧＥで分析した後、単量体抗体含有画分をプールし、滅菌濾過（０．２２μｍ）した。

結果
ＣＤ１３７レポーターアッセイ
ＣＤ１３７二価抗体のパネルを、上述したＣＤ１３７直接活性化レポーターアッセイにおいてスクリーニングした。抗体の選択の代表的な図を図１１に示す。抗体パネルの６０％は、ＣＤ１３７を様々な程度に直接活性化することができた。

ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体パネルのスクリーニング
抗がん剤開発におけるＣＤ１３７二価抗体の１つの制限は、ＣＤ１３７発現細胞の全身活性化である。これは、非特異的標的化のために、抗体の毒性をもたらし得る［Ｍｅｌｅｒｏ，２０１３］。二重特異性抗体は、２つの腫瘍抗原などの両方の標的を共発現する細胞を選択的に標的化することによって、又は標的のうちの１つをそれぞれ発現する２つの異なる細胞を標的化することによってのいずれかで、この制限を克服することができる。後者は、細胞が互いにごく近接しているときにのみ生じ得る。ＣＤ１３７の選択的活性化の可能性を検討するために、ＣＤ１３７を標的化する１つのＦａｂアーム及びＰＤ−Ｌ１を標的化する１つのＦａｂアームから構成される二重特異性抗体を生成した。ＰＤ−Ｌ１とは、腫瘍細胞上に高濃度で存在する抗原並びに腫瘍部位に存在する活性化Ｔ細胞上の高度に発現された抗原の両方を表す［Ｐｕｌｋｏｅｔａｌ．，２０１１］。したがって、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１を同じ細胞上で標的化するとき、ＣＤ１３７を「シス」で活性化することができるか、ＣＤ１３７を免疫細胞上でかつＰＤ−Ｌ１を隣接する細胞上で標的化することによって「トランス」で活性化することができるであろう。この機構の上に、ＰＤ−１ブロッキングＦａｂアームを含むことは、阻害シグナルを刺激シグナルに変換することができるであろう。

ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１抗体パネルからのＶＨを、荷電した遺伝子操作を受けたＦｃサイレンスベクターに再クローニングし、それにより、抗体重鎖の発現時に、重鎖のヘテロ二量体化が強制され、その結果、トランスフェクション後に二重特異性抗体の生成をもたらす。表３に示される４０個の異なるＣＤ１３７Ｆａｂアーム及び８つの異なるＰＤ−Ｌ１Ｆａｂアームを含む合計３２０個のＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体を、２４ウェルフォーマットで産生し、ＩｇＧを精製した。全ての抗体を、ＣＤ１３７−ｌｕｃレポーター系における用量依存性ルシフェラーゼ発現を直接、又は抗ヒトＩｇＧクロスリンク抗体の存在下で誘導する能力について試験した。サロゲート抗体２０Ｈ４．９及びＭＯＲ７４８０は、それぞれのアッセイにおいて参照抗体として含まれた。

抗ヒトＩｇＧクロスリンク抗体の非存在下又は存在下での、いくつかのＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体のＣＤ１３７−ｌｕｃレポーターアッセイにおける機能活性の一例を、図１２に示す。この図は、ＣＤ１３７誘導ルシフェラーゼ活性を活性化するためのＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の能力が、ルシフェラーゼ活性の大きさを２５％まで増加させるため、抗ヒトＩｇＧ抗体によるクロスリンクに非常に依存することを示す。ＣＤ１３７ライゲーション後のＩＦＮ−γ産生の有意な増強も２０Ｈ４．９として当該技術分野において既知の抗ＣＤ１３７抗体についても観察されている（国際公開第２００５／０３５５８４号）。二重特異性抗体パネルの上部２５％のＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１は、８個のＰＤ−Ｌ１Ｆａｂアームの全パネルの１〜７個のＰＤ−Ｌ１Ｆａｂアームと組み合わせた２２個のＣＤ１３７Ｆａｂアームから構成された。

次に、二価親ＣＤ１３７抗体及び破傷風毒素を標的とする無関係なＦａｂアームと組み合わせた親ＣＤ１３７Ｆａｂアームと比較して、初代Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＩＬ−２放出を誘導する能力について、上部２５％のＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体パネルを試験した。この実験の設定では、二価活性化に対する一価の活性化を監視することができた。図１３の上部パネルは、ＣＤ１３７×ＣＤ１３７二価フォーマットで２０Ｈ４．９参照抗体の範囲内に存在する場合の、ＣＤ１３７活性化の際にＩＬ−２分泌を誘導する３つの抗体のセットの例を示す。対照的に、図１３の底部パネルに示されるように、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体のいずれも、ＩＬ−２分泌を二価のＣＤ１３７親Ｆａｂのレベルまで誘導することができなかった。全てのＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＣＤ１３７シグナル伝達複合体が、同じ細胞表面でＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１に結合する（「シス」での結合）ことによって効果的に形成できなかったことを示すＣＤ１３７×ＴＴ変異体と同じ活性を示した。このＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体パネルのシスＴ細胞活性化の欠如は、非特異的Ｔ細胞活性化によるインビボ毒性の可能性を減少させるため、有利である。

トランス活性化アッセイ
二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体が「トランス」でＣＤ１３７を活性化できるかどうかを試験するために、二重特異性抗体を、免疫細胞内のＣＤ１３７シグナル伝達が、第２の細胞によるクロスリンクによって起こる、２つの細胞アッセイにおいて試験した。インビトロアッセイは、２つの異なる細胞株、すなわち、ＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞を模倣するＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞及び免疫細胞を表すジャーカットＣＤ１３７−ｌｕｃレポーター細胞から構成された。第１のＴ細胞活性化シグナルを提供する、コーティングされた抗ＣＤ３を有するＣＤ１３７−ｌｕｃレポーターの場合と同じアッセイ設定を使用した。使用したエフェクター標的細胞の、ＣＨＯ野生型又はＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞のいずれかである標的細胞との使用された比は、４：１であった。図１４は、同じＣＤ１３７Ｆａｂアーム（ＭＦ６７４４）及び２つの異なるＰＤ−Ｌ１Ｆａｂアーム（それぞれＭＦ５３６１又はＭＦ５５９４）から構成されているＣＤ１３７二重特異性抗体ＰＢ１４６７１及びＰＢ１４５８０の両方が、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞の存在下でＣＤ１３７レポーター細胞活性を誘導することができるが、一方ＣＤ１３７刺激が野生型ＣＨＯ野生型細胞の存在下で生じた例を示している。加えて、同じＣＤ１３７Ｆａｂアーム（ＭＦ６７８３）及び２つの異なるＰＤ−Ｌ１Ｆａｂアーム（それぞれＭＦ５３６１又はＭＦ５５９４）から構成されているＣＤ１３７二重特異性抗体ＰＢ１４６８１及びＰＢ１４５９０の両方が、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞の存在下でＣＤ１３７レポーター細胞活性を誘導することができるが、一方ＣＤ１３７刺激が野生型ＣＨＯ野生型細胞の存在下で生じた例を示している。更に、全てのＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、参照対照抗体２０Ｈ４．９と同じ程度に強力であった。ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体ＰＢ１４５８０及びＰＢ１４６７１の組み合わせ（Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）フォーマット）は、高いルシフェラーゼ活性を誘導した。

初代Ｔ細胞を用いたトランス活性化アッセイ
Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＣＨＯ野生型又はＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞を添加することにより、トランス活性化アッセイを初代細胞に再フォーマットした。ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１及びＣＨＯ野生型細胞に対する１：１．８のアッセイ開始時のエフェクター標的細胞比を使用した。Ｔ細胞活性化アッセイについては、９６ウェルプレート（９６ウェル平底プレート−Ｃｅｌｌｓｔａｒ、＃６５５１８０）の内側ウェルを、ＰＢＳ中３０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ＯＫＴ−３で一晩コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄した。５０μＬの抗体溶液を添加し、続いて、２５μＬの２×１０６個の細胞／ウェルの精製Ｔ細胞懸濁液、及び２５μＬの精製ＣＨＯ−Ｋ１又はＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１を、上に示した比で各ウェルに添加した。培養物を、ＩＬ−２分泌について試験する前に、９５％の相対湿度において３７℃、５％のＣＯ２で３日間刺激した。放出されたＩＬ−２の濃度を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号＃ＡＬ２２１Ｃ）によって決定した。

２つのＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（ＰＢ１４６７１及びＰＢ１４５８０）、並びにＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）フォーマット及びＣＤ１３７×ＴＴフォーマットを試験した。図１５に示される３日目のＩＬ−２放出は、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞の存在下で、Ｔ細胞におけるＩＬ−２産生を、対照抗体２０Ｈ４．９よりも高程度に誘導したことを示す。更に、ＣＤ１３７×ＴＴフォーマットは、ＩＬ−２放出を誘導できなかった。ＣＨＯ野生型細胞の存在下では、ＩＬ−２レベルは、対照抗体２０Ｈ４．９を除き、バックグラウンドレベルで産生される。２つのＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の組み合わせ（Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）フォーマット）は、高いルシフェラーゼ活性を誘導し、これによって、前の実験を確証した。Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）フォーマットは、同じＣＤ１３７エピトープ及び２つの異なるＰＤ−Ｌ１エピトープを標的化するか（図１４及び１５に示すように）、又は２つの異なるＣＤ１３７ドメイン及び２つの異なるＰＤ−Ｌ１ドメインを標的化するかのいずれかであり得る。

ＳＥＢアッセイ
ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体を、ＰＤ−Ｌ１を発現するＡＰＣが存在する場合の生理学的設定において試験するために、両方のＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＢ１４６７１及びＰＢ１４５８０）、ＣＤ１３７×ＴＴ抗体、及びＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）フォーマットをＳＥＢアッセイで試験した。ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体のうちの１つ（ＰＢ１４５８０）は、陰性対照抗体と比較してより高い活性化を示し、ＣＤ１３７（２０Ｈ４．９）又はＰＤ−Ｌ１（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）のいずれかを標的とする参照抗体と比較してはるかに強力であった（図１６を参照されたい）。ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１のＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）フォーマットによるＩＬ−２の誘導も強力であった。

追加の試験
１１個の異なるＣＤ１３７ビンＡ−Ｋを表す２４個の抗ＣＤ１３７Ｆａｂアームのパネル（表２）を、７つのＰＤ−Ｌ１に特異的な、ブロッキングＦａｂアーム及び１つのＰＤ−Ｌ１に特異的な非ブロッキングＦａｂアーム（表３）と組み合わせ、２４ウェルフォーマットで産生した。産生したＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体を、続いて、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞又はＣＨＯ野生型細胞の存在下でＣＤ１３７−ｌｕｃレポーター系における用量依存性ルシフェラーゼ発現を誘導するそれらの能力について、連続滴定で試験した。２０Ｈ４．９及び陰性対照抗体を参照抗体として含めた（図１９）。ルシフェラーゼの最も高い誘導を示した抗体（合計５６個）を選択し、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞又はＣＨＯ野生型細胞の存在下又は非存在下で活性化Ｔ細胞アッセイにおいて連続滴定で試験した。並行して、抗体をＳＥＢアッセイで試験した。ＣＤ１３７活性化の読み出しとして、ＩＬ−２放出を測定した。Ｔ細胞活性化アッセイで試験した２４個の二重特異性抗体の特性及び活性の概要を表７に示す。活性化Ｔ細胞アッセイ及びＳＥＢアッセイの両方においてＰＤ−Ｌ１アームの両方に対して活性であることが見出された１２個のＣＤ１３７Ｆａｂアームを、７つの異なるＰＤ−Ｌ１Ｆａｂアームと組み合わせて選択した。二価単一特異性ＩｇＧとして産生される場合と同じように、１２個のＣＤ１３７アームは、それぞれ７つの異なるＰＤ−Ｌ１アームのうちの１つと組み合わされた、二重特異性／一価ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体として産生された。したがって、合計８４個の二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体を、ＩＬ−２放出を読み出しとしてＳＥＢアッセイにおいて用量依存性滴定で試験した。図２０のデータは、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１フォーマットで存在する場合、１２個のＣＤ１３７Ｆａｂアームのうちの４つ（ＭＦ６７８３、ＭＦ６７４９、ＭＦ６７３７、及びＭＦ６７８８）が、他のＦａｂアームと比較してＳＥＢアッセイにおいてより低い効力を示したことを示している。したがって、これら４つのＣＤ１３７Ｆａｂアームを含むＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、更なる試験のために除外された。追加のＳＥＢ試験中に、ＭＦ６８０８、ＭＦ６７６３、ＭＦ６７５４、ＭＦ６７８５、及びＭＦ６７９７を含むＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１の組み合わせは、最高のＩＬ−２サイトカイン放出を誘導した。（図２１）。ＭＦ６８０５、ＭＦ６７４４、及びＭＦ６８２５を含むＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１の組み合わせは、より少量のＩＬ−２サイトカイン分泌を誘導した。ＭＦ６８０８、ＭＦ６７６３、ＭＦ６７５４、ＭＦ６７８５、及びＭＦ６７９７を含むＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１の組み合わせの効力を、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスにより決定されるＩＬ−２、ＩＦＮγ及びＴＮＦα放出の誘導を測定することによる連続滴定においてＳＥＢアッセイ中に更に分析した。次に、抗体をＩＬ−２放出のＥＣ５０値でランク付けした（表４）。４つの異なるＣＤ１３７Ｆａｂアームを含む２８個のＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体のパネル（表４）は、ＳＥＢアッセイにおいて最も高い活性を示した。これらの４つのＣＤ１３７Ｆａｂアームは、ＣＤ１３７内の同じ結合領域（結合ドメイン２）にマッピングすることができ、更に全てがＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌとの間の相互作用を完全にブロックした。これらのいずれも、ジャーカットＣＤ１３７レポータースクリーニングにおいて２価のモノクローナルとしてアゴニスト活性を示さなかった（図１７）。２８個のＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体のＣＩＥＸプロファイルは、ＭＦ７７０２などのＭＦ５５５３に基づくＰＤ−Ｌ１Ｆａｂアームを含むＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体が、製造のためのリード候補抗体として考慮する観点から、最適なＣＩＥＸプロファイルを有したことが実証された。

実施例５
抗ＣＤ１３７抗体パネルの親和性ランク付け
ＰＤーＬ１Ｆａｂアームをトランスで組み合わせてＴ細胞活性化を誘導した抗ＣＤ１３７Ｆａｂのパネルの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅによって決定した。

この目的のために、ヒト組換えＣＤ１３７タンパク質をチップに結合し、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００機器は、一価二重特異性フォーマット（一方のＦａｂアームは、ＣＤ１３７に特異的であり、他方は、無関係のリガンド、すなわち破傷風毒素（ＴＴ）に対して特異的であった）で異なる抗ＣＤ１３７抗体の親和性を分析した。

これらの実験では、二重特異性抗（ＣＤ１３７×ＴＴ）ＩｇＧを、小規模生産（２４ウェルフォーマット、実施例２を参照されたい）においてフリースタイル２９３Ｆ細胞中のコード化構築物の一過性トランスフェクションによって産生した。各トランスフェクションにおいて、選択された抗ＣＤ１３７配列のうちの１つをコード化する構築物を、抗ＴＴ配列をコード化するＭＦ１３３７と組み合わせた。

次いで、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００機器上の表面プラズモン共鳴（Surface plasmon resonance、ＳＰＲ）を使用して、抗体の親和性を決定した。この目的のために、ｈｕＣＤ１３７−Ｆｃタンパク質（ＲＮＤＳｙｓｔｅｍｓ＃８３８−４Ｂ）を、酢酸ナトリウムカップリング緩衝液（ｐＨ５．０）中に５μｇ／ｍｌに希釈し、ＣＭ５バイオセンサーチップのセル２の表面に、１５０共鳴単位（resonance unit、ＲＵ）のレベルまで結合させた。μフローセル１は、負の制御表面として機能した。動態解離速度定数（Ｋ_ｏｆｆ値）を決定するために、試験抗体をＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水ＨＢＳ中で１５μｇ／ｍｌ（１００ｎＭ）に希釈し、３０μｌ／分でＣＤ１３７でコーティングされたセンサチップのフローセル１及び２の両方の上を移動させた。１０μｌの１００ｍＭのＨＣｌのパルスを用いて再生を行った。得られたセンサーグラム（すなわち、時間に対する応答のグラフ）から、ＢＩＡ評価ソフトウェアにおける曲線当てはめを使用して解離速度定数を決定した。

抗体パネルの結合動態を測定し、ＣＤ１３７に結合する抗体の動態結合及び動態解離速度定数を得るために、異なる濃度の試験抗体のこのサブセットを、新たにコーティングされたチップのフローセル１及び２の表面上を移動させた。抗体をＨＢＳ中で２００ｎＭ（すなわち３０μｇ／ｍｌ）に希釈し、２倍に系列希釈し（４回希釈、１００ｎＭ〜５０ｎＭ〜２５ｎＭ〜１２．５ｎＭ）、次いで、高流量（３０μｌ／分）での動速度でチップへの結合について試験した。１０μｌの１００ｍＭのＨＣｌのパルスを用いて再生を行った。得られたセンサーグラムを、ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して分析し、動態結合速度定数（Ｋ_ａ）及び動態解離速度定数（Ｋ_ｄ）を決定し、それにより、異なる抗ＣＤ１３７Ｆａｂアームの親和性（Ｋ_Ｄ値）に関するデータを生成した。各抗体濃度について、オンレート及びオフレートを別々に決定し、次いで平均化した。

これらの結果を表６に示す。全ての試験した抗ＣＤ１３７Ｆａｂは、低いｎＭ範囲内の親和性を有した。

実施例６
ジャーカットＯＸ４０−ＮＦκＢｌｕｃの生成
ジャーカットＯＸ−４０−ＮＦκＢｌｕｃ安定レポーター細胞株を、ジャーカットＥ６細胞において、完全長ＯＸ−４０構築物及びＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター構築物を安定して組み込むことによって生成した。したがって、完全長ＯＸ−４０ＭＶ１６１６［ｐＩＲＥＳｎｅｏ３］（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をトランスフェクトし、抗生物質選択後にＯＸ−４０を発現する安定したクローンを生成した。次に、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター構築物ｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦ−κＢ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ）を最高のＯＸ−４０発現を有するクローンにトランスフェクトし、ＯＸ−４０及びＮＦ−κＢルシフェラーゼの両方を発現する安定なクローンを、抗生物質選択後に選択した。プレート結合ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ−３）及びＰＭＡ／イオノマイシンによる初期活性化後に、クローンをＯＸ−４０Ｌに応答するそれらの能力について選択した。活性化の最高のウィンドウを示したクローンを、ＯＸ−４０レポーターアッセイにおける解凍及び使用フォーマットとして使用した。

ＯＸ−４０レポーターアッセイ
直接ＯＸ−４０活性化アッセイ及びクロスリンクによって媒介されるＯＸ−４０活性化アッセイについては、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９１７）を、ＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で一晩コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄した。ジャーカットＯＸ−４０−ＮＦκＢｌｕｃを解凍し、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（アッセイ培地）で洗浄した。細胞を５×１０^５個の細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。２５μｌの細胞懸濁液を、コーティングされた９６ウェルアッセイプレートの内側ウェルに播種した。試験抗体を２．５倍のａＨｕＩｇＧ−Ｆｃ（Ｂｅｔｈｙｌ、カタログ番号Ａ８０−１０４Ａ）抗体と組み合わせて、系列希釈液を調製した（ＩｇＧの試験開始濃度、２０μｇ／ｍｌ）。抗体混合物を室温で１５分間インキュベートした。次に、５０μｌの抗体混合物を細胞に添加し、続いて２５μｌのアッセイ培地を添加した。各プレートは、参照対照として機能する陰性（ＰＧ１３３７）及び陽性対照抗体の連続希釈液を含有していた。プレートを、９５％の相対湿度において、３７℃、５％のＣＯで６時間インキュベートした。５０μｌのルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）、カタログ番号Ｅ２６１０）を添加し、ａＢｉｏＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙ２マルチモードマイクロプレートリーダーを使用してルシフェラーゼ活性の量を測定した。

ＯＸ−４０二価抗体のパネルを、ＯＸ−４０直接活性化レポーターアッセイ及びＴ細胞活性化アッセイでスクリーニングした。４つの異なるＯＸ−４０Ｆａｂアームを選択して、二重特異性ＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１又はＯＸ４０×ＰＤ−１抗体が、「シス」又は「トランス」においてＯＸ４０を活性化することができるかどうかを試験した。したがって、二重特異性抗体を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞及びジャーカットＯＸ−４０−ＮＦκＢｌｕｃを使用して、２つの細胞系で試験した。ＰＤ−Ｌ１を、ＣＨＯ細胞上で「トランス」で提供し、ＰＤ−１は、活性化ジャーカットＯＸ−４０−ＮＦκＢｌｕｃレポーター細胞上で「シス」で提供した。第１のＴ細胞活性化シグナルを提供する、コーティングされた抗ＣＤ３を用いたジャーカットＯＸ−４０−ＮＦκＢｌｕｃアッセイの場合と同じアッセイ設定を使用した。使用したエフェクター標的細胞の、ＣＨＯ野生型又はＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞のいずれかである標的細胞との使用された比は、４：１であった。図１８は、ＰＤ−Ｌ１（ＭＦ５５６１）又はＰＤ−１（ＭＦ６２５６）ブロッキングＦａｂアームのいずれかと組み合わされた４つの異なるＯＸ４０Ｆａｂアームの例を示す。ＯＸ４０×ＰＤ−１抗体は、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞の存在下で、ＯＸ４０レポーター細胞活性をイピルムマブに基づく抗ＣＴＬＡ４抗体と同じレベルまで誘導した。対照的に、ＯＸ４０×ＰＤ−１抗体は、基底の活性を示した。ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の非存在下では、ＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１抗体の活性は、ベースラインに戻った。

実施例７
実施例４では、５つのＣＤ１３７特異的Ｆａｂアームが、それらのＴ細胞トランス活性化能力の観点から好ましいと判定された。

この実施例では、３つの候補ＣＤ１３７アーム（６７６３、６７８５、及び６７９７）及び１つのＰＤ−Ｌ１アーム（７７０２）からなる３つの二重特異性抗体のパネルを使用した。二重特異性抗体を、２９３Ｆフリースタイル細胞で産生させて、ｐｒｏｔＡ、ＣＩＥＸ、及びゲル濾過により精製した。続いて、抗体をいくつかのアッセイで試験した。我々は、４つのＦａｂアームを、親二価単一特異性フォーマット（抗ＣＤ１３７又は抗ＰＤ−Ｌ１）及び二重特異性フォーマット（抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１）の両方で試験し、これら抗体を、ベンチマーク抗ＣＤ１３７抗体２０Ｈ４．９、ベンチマーク抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、及び陰性対照抗体（抗ＲＳＶ抗体ＰＧ２７０８）と比較した。

本実施例に記載のアッセイの材料及び方法についても、実施例４を参照する。

抗体を以下に列挙する。

ＦＡＣＳ分析
抗原特異性及び親和性
ヒト（ｈｕ）及びカニクイザル（ｃｙ）ＣＤ１３７への単一特異性及び二重特異性ＩｇＧの結合を、ｈｕＣＤ１３７又はｃｙＣＤ１３７のいずれかを発現する２９３ＦＦ安定細胞クローンを用いてＦＡＣＳ分析により検証した。この目的のために、細胞を、抗体の８段階連続滴定でインキュベートし、その後の蛍光染料フィコエリトリン（phycoerythrin、ＰＥ）に結合した二次抗体の抗ヒトＩｇＧの結合を通して結合強度を分析した。試験した抗体のそれぞれについて平均ＰＥ蛍光として表される結合強度を図２２に示す。単一特異性親抗ＣＤ１３７抗体のうち、ＰＧ６７８５は、最も高い親和性でヒトＣＤ１３７に結合し、ＰＧ６７９７、次いでＰＧ６７６３が続いた。二重特異性ＰＢ１７３１１（６７９７×７７０２）は、最も高い親和性でｈｕＣＤ１３７に結合し、ＰＢ１７３０９（６７６３×７７０２）、次いでＰＢ１７３１０（６７８５×７７０２）が続いた。親抗ＣＤ１３７抗体のうち、ＰＧ６７８５は、最も高い親和性でカニクイザルＣＤ１３７に再び結合し、この時点でＰＧ６７９７、次いでＰＧ６７６３が続いた。二重特異性ＰＢ１７３１１（６７９７×７７０２）は、最も高い親和性でｃｙＣＤ１３７に結合し、ＰＢ１７３０９（６７６３×７７０２）、次いでＰＢ１７３１０（６７８５×７７０２）が続いた。注目すべきことに、図２２に示されるように、３つのＣＤ１３７特異的Ｆａｂアームが二重特異性の一価抗体中に存在する場合、これらは、単一特異性二価親抗体についても観察されるように、ｈｕＣＤ１３７及びｃｙＣＤ１３７の両方にも同様に結合することができる。

ヒト（ｈｕ）及びアカゲザル（ｒｅ）ＰＤ−Ｌ１への単一特異性及び二重特異性ＩｇＧの結合を、ｈｕＰＤ−Ｌ１又はｒｅＰＤ−Ｌ１のいずれかを発現するＣＨＯ−Ｋ１安定細胞クローンを用いてＦＡＣＳ分析により検証した。この目的のために、細胞を、抗体の８段階連続滴定でインキュベートし、その後の二次抗体の抗ヒトＩｇＧ−ＰＥの結合を通して結合強度を分析した。試験した抗体のそれぞれについて平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される結合強度を図２３に示す。予想されるように、親抗ＣＤ１３７抗体は、ヒト又はアカゲザルＰＤ−Ｌ１に結合しなかったが、一方親抗ＰＤ−Ｌ１ＰＧ７７０２抗体は、結合した。重要なことに、全ての３つの二重特異性抗体は、ＰＤ−Ｌ１に強く結合し、全てが、陽性対照抗体よりも高い親和性を伴うことである。これは、一価の二重特異性抗体中に存在する場合であっても、ＭＦ７７０２アームが、二価対照抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０と比較して、ＰＤ−Ｌ１に対する親和性が高いことを意味する。

活性化されたＴ細胞に対する結合
我々は、活性化Ｔ細胞に対する抗体パネルの結合親和性を試験した。この目的のために、末梢血単核球細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）をドナーから採集し、一晩放置した。続いて、Ｔ細胞を単離し、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３でコーティングしたプレート上でそれらを３日間インキュベートすることによって活性化させた。活性化Ｔ細胞を採取し、抗体パネル内のＩｇＧの連続滴定で、及び対照ＩｇＧで染色した。抗体結合を、二次抗体、抗ヒトＩｇＧ−ＰＥのその後の結合を通してＦＡＣＳで測定した。試験した抗体のそれぞれについてＭＦＩとして表される結合強度を図２４に示しており、ここには二重特異性ＩｇＧの結合が左側に示され、単一特異性ＩｇＧの結合が右側に示されている。ＰＢ１７３１１（６７９７×７７０２）は、最も強力な結合を示した。重要なことに、陽性対照抗体の結合親和性は、二重特異性抗体の親和性よりも低かった。これは、本発明の二重特異性抗体が、ＰＤ−Ｌ１特異的ベンチマーク抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（アテゾリズマブに基づく）及びＣＤ１３７特異的ベンチマーク抗体２０Ｈ４．９（ウレエウマブに基づく）と比較して、活性化Ｔ細胞に対するより高い親和性を有することを意味する。

リガンドブロッキングアッセイ
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１競合アッセイ
二重特異性及び単一特異性ＩｇＧのＰＤ−Ｌ１リガンド結合をブロックする能力を、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１競合ＥＬＩＳＡにおいて試験し、これにより、抗ＰＤ−Ｌ１アームを含有する抗体の量を増加させることが、ＰＤ−１Ｆｃでコーティングされたプレートに結合することができるビオチン化ＰＤ−Ｌ１の量を低減させることが期待された。この目的のために、１μｇ／ｍｌのＰＤ−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、＃．１０８６−ＰＤ）をマキシソーププレートにコーティングし、ビオチン化ＰＤ−Ｌ１（ＢＰＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号７１１０５）を、１０μｇ／ｍｌの濃度で開始した各抗体の系列希釈液の存在下又は非存在下で溶液に添加した。μ結合したＰＤ−Ｌ１を、西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）に結合させたストレプトアビジンの後続の結合、及びＨＲＰが有色生成物に触媒作用する無色基質の添加を通して検出した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４５０ｎｍ測定した溶液の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ）は、結合したＰＤ−Ｌ１の指標である。結合曲線を図２５に示しており、ここには二重特異性ＩｇＧの結合が左側に示され、単一特異性ＩｇＧの結合が右側に示されている。予想されるように、陽性対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、高いレベルのブロッキング活性を示し、陰性対照抗体はいずれも示さなかった。単一特異性抗ＣＤ１３７抗体はまた、ＰＤ−Ｌ１ブロッキングに関して陰性であった。少なくとも１つの抗ＰＤ−Ｌ１アームを含有するＩｇＧについては、全てがＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合をブロックすることができた。親単一特異性抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＧ７７０２は、ＰＤ−Ｌ１結合のブロッキングにおいてベンチマーク抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０とほぼ同程度の有効性であることが判明した。二重特異性ＩｇＧは全て、良好な、同様のレベルのブロッキング活性を有した。

細胞ベースのｈｕＣＤ１３７リガンドブロッキングアッセイ
ＣＤ１３７リガンド結合をブロックするための二重特異性及び単一特異性ＩｇＧの能力も試験した。我々は、３つの候補ＣＤ１３７アーム（６７６３、６７８５、及び６７９７）及びＰＤ−Ｌ１アーム（７７０２）を、親二価単一特異性フォーマット（抗ＣＤ１３７又は抗ＰＤ−Ｌ１）及び二重特異性フォーマット（抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１）の両方で試験し、これら抗体を、ベンチマーク抗ＣＤ１３７抗体２０Ｈ４．９及びＰＦ−０５０８２５６６と、並びに陰性対照抗体（抗ＲＳＶ抗体ＰＧ２７０８）と比較した。

生理学的に関連する条件下でＣＤ１３７リガンドブロッキングを分析するために、二重特異性及び単一特異性ＩｇＧを、フローサイトメトリーを使用して細胞ベースのｈｕＣＤ１３７リガンドブロッキングアッセイで試験した。このアッセイでは、抗ＣＤ１３７アームを含有する抗体の量を増加させると、ｈｕＣＤ１３７を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合することができるｈｕＣＤ１３７Ｌ組換えタンパク質の量を減少させることが予想された。この目的のために、ＣＨＯ（ｈｕＣＤ１３７）細胞を、各抗体の系列希釈液と共にｈｕＣＤ１３７Ｌタンパク質と共インキュベートした。結合したｈｕＣＤ１３７Ｌを、二次ビオチン結合抗ｈｕＣＤ１３７Ｌ抗体で検出した後、フィコエリトリン（ＰＥ）に結合させたストレプトアビジンで染色した。

方法
ｈｕＣＤ１３７を安定的に発現するＣＨＯ細胞を採取し、計数し、ＦＡＣＳ緩衝液で５×１０^５個細胞／ｍｌに希釈し、２００μｌ（１×１０^５個細胞を含有する）を、Ｕ底９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。細胞を氷上に維持した。細胞を４℃で３００ｇにて３分間遠心分離させ、２００μｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液を添加することによって洗浄した。細胞を再び４℃で３００ｇにて３分間遠心分離させ、ペレットをＦＡＣＳ緩衝液中の２５μｌの抗体希釈液（２５から０．０３４μｇ／ｍｌまでの３倍の系列希釈液）に２５μｌのｈｕＣＤ１３７Ｌ−ＦＬＡＧタンパク質の溶液（Ａｄｉｐｏｇｅｎ、＃ＡＧ−４０Ａ−０１９８Ｔ、０．０６μｇ／ｍｌの最終濃度）を加えたものに再懸濁させた。プレートを暗所で氷上で６０分間インキュベートした。次いで、２００μｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液を添加し、４℃で３００ｇにて３分間遠心分離することによって、細胞を２回洗浄した。次いで、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中で１μｇ／ｍｌに希釈した５０μｌ／ウェルのビオチン化ポリクローナルヤギｈｕＣＤ１３７Ｌ抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ＃ＢＡＦ２２９５）を添加した。細胞を再懸濁させて、プレートを暗所で氷上で６０分間インキュベートした後、前述のように２回洗浄した。次いで、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中で１：２００で希釈したストレプトアビジン−ＰＥ希釈の５０μｌ／ウェルを添加した。細胞を再懸濁させて、プレートを暗所で氷上で３０分間インキュベートした後、前述のように２回洗浄した。細胞をウェル当たり１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させて、１００μｌの４％パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde、ＰＦＡ）溶液の添加によって固定した。ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターを使用して、ＢＤマニュアルの説明書に従って試料を測定した。ｈｕＣＤ１３７リガンドの結合度を、結合したストレプトアビジン−ＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。

結果
得られた結合曲線を図２６に示す。予想されたように、陰性対照は、ＣＤ１３７リガンド結合をブロックしなかった。陽性対照抗体によるリガンド結合のブロッキングは様々であって、すなわち、ベンチマーク抗体ＰＦ−０５０８２５６６は、強い遮断を示したが、２０Ｈ４．９は比較的弱くかつ不完全なブロッキングを示した。３つの単一特異性抗ＣＤ１３７抗体のうち、ＰＧ６７８５は最良のブロッカーであり、ＰＧ６７９７（ＰＢ１７３１１の親）は、２番目に良好であった。３つの対応する二重特異性抗ＣＤ１３７×抗ＰＤ−Ｌ１抗体もまた、ＣＤ１３７リガンド結合をブロックすることができた。これは細胞ベースのアッセイであるため、これらの結果は、生理学的に関連する条件に対する指標である。

ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１レポーターアッセイ
候補抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体の特性評価における別の工程は、これらがＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路をブロックすることができるかどうかを判定し、これをＰＤ−Ｌ１に特異的な対照抗体の活性と比較することであった。このブロッキング活性を、２つの細胞系（ＰＤ−Ｌ１並びにＴ細胞受容体活性化因子を発現するＣＨＯ細胞、及びＰＤ−１を過剰発現するジャーカット／ＮＦＡＴ−ＲＥレポーター細胞株）に基づいてＰｒｏｍｅｇａによって開発された生理学的に関連するＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断レポーターアッセイでインビトロにおいて試験した。ジャーカットＴ細胞は、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）経路を通して活性化され得るルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する。ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用は、この経路の活性化を阻害する。しかしながら、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対する抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用のブロッキングは、ＮＦＡＴ経路を活性化し得る。したがって、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断の程度が大きくなるほど、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化が大きくなる。この目的のために、各抗体の系列希釈液を、ＰＤ−１過剰発現するジャーカット／ＮＦＡＴ−ＲＥレポーター細胞を添加する前に、ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞に添加した。レポーター遺伝子の誘導倍率として表された２４時間後の遮断の程度を図２７に示しており、ここには二重特異性ＩｇＧの結合が左側に示され、単一特異性抗ＰＤ−Ｌ１ＩｇＧの結合が右側に示されている。ここでも、二価親抗体７７０２は、陽性対照ベンチマーク抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０よりも強力であった。二重特異性ＩｇＧは全て、良好な、同様のレベルのブロッキング活性を有した。

実施例８
ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性によるＣＤ１３７のトランス活性化に対するＰＤ−Ｌ１発現レベルの効果
細胞株の培養
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（カタログ番号ＣＲＭ−ＨＴＢ−２６）をＡＴＣＣから購入し、１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＧｉＢｃｏ）、１０％のＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ｇｉｂｃｏ）中で日常的に維持した。ＢｘＰＣ−３細胞（カタログ番号ＣＲＬ−１６８７）を、ＡＴＣＣから入手し、１０％のＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で日常的に維持した。

ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体の作用様式
ジャーカットＣＤ１３７−ｌｕｃレポータートランス活性化アッセイを使用して、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体媒介性トランス活性化が生理学的ＰＤ−Ｌ１発現レベルで生じるかどうか、及びそれがＰＤ−Ｌ１発現レベルに相関するかどうかを判定した。したがって、様々なＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞株及びヒト腫瘍細胞株上のＰＤ−Ｌ１結合部位の数を、ＱＩＦＩＫＩＴ分析（ＤＡＫＯ）によって決定した。比較的に高いレベル（ＥＳ−２細胞）、中間のレベル（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）、又は低いレベル（ＢｘＰＣ−３））のＰＤ−Ｌ１を発現するヒト腫瘍細胞株に対応するＰＤ−Ｌ１発現レベルを示す３つのＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞株を選択した。図２８Ａは、細胞当たり約６，０００〜約７２，０００個のＰＤ−Ｌ１結合部位を発現する３つの選択されたＣＨＯ細胞株を使用した３つのＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の例を示す。データは、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体が、３．８１０^４個を超えるＰＤ−Ｌ１コピーが細胞上に存在するときに、高活性化を示すことを示している。低ＰＤ−Ｌ１レベルにおいて、細胞当たり約６０００個のＰＤ−Ｌ１結合部位のみを発現するＣＨＯ細胞の存在下では、低レベルの活性化が観察される。したがって、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体によるトランス活性化は、免疫抑制性腫瘍微小環境において生じるような高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する細胞付近で生じ、したがって、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の最適な治療用ウィンドウを提供するであろう。

図２８Ａは、試験した全ての抗体についての、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体媒介性ＮＦ−κＢ活性化とＣＨＯ細胞上のＰＤ−Ｌ１発現レベルとの間の正の相関を示す。

図２８Ｂは、ジャーカットＣＤ１３７−ｌｕｃレポータートランス活性化アッセイの例を示しており、ここではＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞が、高い、中間の、及び低い表面ＰＤ−Ｌ１レベルを発現するヒト腫瘍細胞株に置き換えられた。この実験により、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体媒介性トランス活性化が、アクセサリー細胞ＰＤ−Ｌ１発現レベルに関連し、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞の存在下でトランス活性化することができることが確認された。

次に、ＰＤ−Ｌ１発現アクセサリー細胞の存在下でのＣＤ１３７トランス活性化が、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の特異的形質であるかどうかを評価した。図２８Ｃは、ＰＤ−Ｌ１発現アクセサリー細胞の存在下でのジャーカットＣＤ１３７−ｌｕｃレポーター細胞トランス活性化を、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体、それらの親単一特異性二価（ＣＤ１３７×ＣＤ１３７）、及び親単一特異性一価ＣＤ１３７（ＣＤ１３７×ＴＴ）並びにＰＤ−Ｌ１（ＴＴ×ＰＤ−Ｌ１）抗体について評価した例を示す。全てのＩｇＧを、１０μｇ／ｍｌで試験した。データは、ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ又はＥＳ−２細胞の存在下では、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体のみがトランス活性化を媒介したことを示す。予想されたように、参照対照抗体２０Ｈ４．９は、ジャーカットＣＤ１３７−ｌｕｃレポーター細胞を直接活性化し、アクセサリー細胞によるＰＤ−Ｌ１発現とは無関係であった。

実施例９
ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１×Ｔ細胞トランス活性化アッセイ
二重特異性ＩｇＧを使用する付加価値を決定するために、我々は、トランス活性化アッセイにおいてＴ細胞によるサイトカイン放出を誘導するためのいくつかの二重特異性抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体の能力を評価し、それらの活性を、ＰＤ−Ｌ１に対するベンチマーク二価抗体（ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）及びＣＤ１３７に対するベンチマーク二価抗体（２０Ｈ４．９）の活性化と比較した。これらのベンチマーク抗体を単独で、及び等モルの組み合わせで試験した。この目的のために、単一の健康なドナーからの精製かつ活性化されたＴ細胞を、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞及び試験抗体の系列希釈液と３日間共インキュベートした（このアッセイの詳細な説明については、実施例４も参照されたい）。続いて、未希釈培養上清中でＩＬ−２、ＩＦＮγ及びＴＮＦαのレベルを測定した。このトランス活性化アッセイで測定されたサイトカイン放出の程度を、図２９に示す。図２９に示されるように、３つの二重特異性抗体は全て、参照抗体のいずれか１つよりもサイトカイン放出の誘導においてより強力であった。重要なことに、３つの二重特異性抗体のそれぞれはまた、２つの参照抗体の組み合わせよりもサイトカイン放出の誘導においてより強力であって、それらの優れたＴ細胞活性化特性を実証した。

Ｔ細胞トランス活性化アッセイ中のサイトカイン放出
二重特異性ＩｇＧを使用する付加価値を決定するために、我々は、二重特異性抗体のうちの１つ（ＰＢ１７３１１、６７９７×７７０２）を、その親の単一特異性二価親ＩｇＧの混合物、及びＰＤ−Ｌ１並びにＣＤ１３７に対するベンチマーク二価抗体とに、トランス活性化アッセイにおけるＴ細胞によるサイトカイン放出を活性化するためのそれらの能力に関して比較した。これらのベンチマーク抗体は、クリニックで使用される治療用抗体に基づいており、抗ＰＤ−Ｌ１クローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０は、アテゾルズマブに基づくものであり、抗ＣＤ１３７クローン２０Ｈ４．９は、ウレルマブに基づくものであり、抗ＣＤ１３７クローンＰＦ−０５０８２５６６は、ウトミルマブに基づくものである。これらのベンチマーク抗体を単独で、及び等モルの組み合わせで試験した。

これらの実験では、抗体を２０μｇ／ｍｌで開始する６段階の１０倍滴定で試験した。μ２人のドナーからのＰＢＭＣを解凍し、９体積の培養培地（Ｌグルタミン及び１０％の熱不活性化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）を添加した。細胞を、ＲＴで１５０ｇにて１０分間遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍｌの培養培地に再懸濁し、３７℃、５％のＣＯで、９５％の相対湿度において、５０ｍｌのファルコンチューブ内で一晩インキュベートすることによって細胞を休止させた。トランス活性化アッセイの準備において、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５５１８０）の内側ウェルを、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３）で一晩コーティングした。

翌日、ＥａｓｙＳｅｐＴ細胞富化（パンＣＤ３）精製手法を使用して、製造元（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１９０５１）に記載されているようにＴリンパ球を単離した。ＥａｓｙＳｅｐ手法は、負の選択を使用する。簡単に言うと、ＰＢＭＣを、ＲＴで１５０ｇにて１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、１ｍＭのＥＤＴＡを伴う２ｍｌのＰＢＳ＋２％のＦＢＳ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、３０μｍメッシュのナイロンストレーナを通して濾過した。細胞を計数し、１ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ＋２％のＦＢＳ中に５×１０^７個細胞／ｍｌに再調整した。５０μｌのＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞富化カクテルを、各２ｍｌの細胞容積に添加し、混合して、ＲＴで１０分間インキュベートさせた。次に、５０μｌのＥａｓｙＳｅｐＤ磁気粒子を、各２ｍｌの細胞容積に添加し、ＲＴで５分間インキュベートさせた。総体積を、１ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ＋２％のＦＢＳで２．５ｍｌに持っていった。次に、このチューブを磁石内に配置し、望ましくない細胞画分を磁石にＲＴで５分間結合させた。次に、チューブを反転させ、精製Ｔ細胞画分を新しいチューブに注ぎ、ＲＴで１５０ｇにて１０分間遠心分離することによって細胞を採取し、続いて培養培地中で１×１０^６個細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。

同じ日に、予めコーティングされた９６ウェルプレートをＰＢＳで洗浄し、２５μｌの予め希釈した抗体を添加し、続いて５０μｌの精製Ｔ細胞（５０，０００個細胞／ウェル）及び２５μｌのＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞（３０，０００個細胞／ウェル）を添加した。細胞を３７℃で７２時間インキュベートさせた。次いで、上清を採集し、新鮮なうちに試験するか、又は−８０℃で保存した。サイトカインのレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスアッセイによって、製造元の指示に従って、未希釈培養上清中で測定した。結果を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ分析ソフトウェアによって分析した。

１６個のサイトカインのサブセットについて、トランス活性化アッセイにおいてＰＢ１７３１１によって誘導されたレベルは、ベンチマーク抗ＣＤ１３７抗体２０Ｈ４．９それ自体によって、又はベンチマーク抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０との組み合わせによって誘導されたレベルよりも高かった（図３０を参照されたい）。サブセットは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１３、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦα、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＩＬ−６、ＩＬ−５、ＩＬ−２１、及びＩＬ−９から構成された。ＰＢ１７３１１によって誘導されたサイトカインレベルの最大の増加は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、及びＩＬ−４について見られた。ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、又はＩＬ−２７については、顕著な抗体媒介性サイトカイン放出は観察されなかった。抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０のみ、又は抗ＣＤ１３７抗体ＰＦ−０５０８２５６６のみ、又は親６７９７（ＣＤ１３７）若しくはＰＤ−Ｌ１（７７０２）二価抗体と共に細胞をインキュベートしたときに、サイトカイン放出の増加は見られなかった。

結論として、本実験は、二重特異性抗体ＰＢ１７３１１が、ベンチマーク抗ＣＤ１３７抗体２０Ｈ４．９それ自体と比較して、又はベンチマーク抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０と組み合わせたものと比較して、改善されたＴ細胞活性化能力を有することを示す。

ＰＢ１７３１１の重要な利点は、この二重特異性抗体が、２つのベンチマーク抗体の混合物よりもＴ細胞の活性化においてより強力であることである。

実施例１０
ＳＥＢアッセイ
３つのＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体ＰＢ１７３０９、ＰＢ１７３１０、及びＰＢ１７３１１を更に特性化するために、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（staphylococcal enterotoxin B、ＳＥＢ）の存在下でのＰＢＭＣによるサイトカイン放出を強化するそれらの能力を決定した。この目的のために、３人のドナーからの精製ＰＢＭＣを、ＳＥＢ（２０００又は１２５ｎｇ／ｍｌ）及び３つの候補二重特異性抗体又は対照抗体の系列希釈液の存在下で３日間インキュベートした。この実験における参照対照抗体は、このアッセイにおいて強力なサイトカイン放出を誘導することが示されている抗ＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ１であった。

サイトカインレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスアッセイによって、培養上清中で測定した。２つの異なるＳＥＢ濃度での３つの異なるドナーからのＰＢＭＣＳによるＩＬ−２放出の結果を、図３１に示す。この比較は、３つのドナー間で、３つの二価ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体の全ての活性プロファイルが一貫していることを実証する。また、これらは、ＰＢ１７３０９及びＰＢ１７３１１が二重特異性抗体の最も有効なものであることも示す。ＰＢ１７３０９（６７６３×７７０２）、ＰＢ１７３１０（６７８５×７７０２）、及びＰＢ１７３１１（６７９７×７７０２）の３つ全てが、陽性対照抗体よりも強力であった。２０００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢ濃度での単一ドナー（番号１０３８）からＰＢＭＣによって放出されたＩＬ−２、ＩＦＮγ、及びＴＮＦαのレベルに関する結果を、図３２に示しており、それにより、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体によって誘導されたサイトカイン放出を、単独で又は等モル混合物で、ＣＤ１３７（２０Ｈ４．９）又はＰＤ−Ｌ１（ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）に対するベンチマーク二価抗体によって誘導されたものと比較した。この比較は、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体が、ベンチマーク二価抗体のそれぞれよりもＰＢＭＣの活性化において、明確により効率的であることを実証する。重要なことに、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体のそれぞれはまた、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０と２０Ｈ４．９との混合物よりも、ＰＢＭＣの活性化において更に効率的であって、二重特異性分子のトランスにおける活性化をもたらし得るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の存在下で、これらの二重特異性抗体の優れたＴ細胞活性化特性を再度実証した。

実施例１１
抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＰＢＭＣのＭ２マクロファージ媒介性抑制に対するＰＢ１７３０９、ＰＢ１７３１０、及びＰＢ１７３１１の効果
古典的に活性化されたマクロファージ（Ｍ１マクロファージ）は、発癌の初期工程中に腫瘍を死滅させることができる。しかしながら、進行性腫瘍ステージへの初期形質転換からの移行の間、腫瘍微小環境における動的変化は、Ｍ１マクロファージからＭ２マクロファージへの切り替えを徐々に促進する。腫瘍関連Ｍ２マクロファージは免疫抑制性サイトカインを分泌し、ＰＤ−１へのライゲーションによって免疫抑制を誘導する。したがって、Ｍ２マクロファージは、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生を阻害する。

ＡｑｕｉｌａＢｉｏｍｅｄｉｃａｌにより開発されたＭ２マクロファージ抑制アッセイは、抗ＰＤ−１抗体が、Ｔ細胞増殖に対するＭ２マクロファージの阻害効果を部分的に逆転させることができることを実証するために使用されている。我々は、このアッセイを使用して、Ｍ２マクロファージの再分極に対するＰＢ１７３０９、ＰＢ１７３１０、及びＰＢ１７３１１の効果を、ＩＦＮ−γ発現を読み出しとして用いて試験し、陰性アイソタイプ対照（抗ＲＳＶ−Ｇ抗体ＰＧ２７０８）及び２つの参照抗体（抗ＣＤ１３７ベンチマーク抗体２０Ｈ４．９及び抗ＰＤ−Ｌ１ベンチマーク抗体ＹＷ２４３．５５．５７０）によって媒介される効果と比較した。

Ｍ２抑制アッセイ
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、５人の健康なボランティアから採集した新鮮な血液から単離した。磁気細胞選別を使用して、単球を負の選択（ＣＤ１６枯渇なし）で単離した。５人のドナーのそれぞれからのＰＢＭＣのサブセットもまた、ＰＢＭＣ／Ｍ２共培養のアッセイにおいて後に使用するために凍結保存した。Ｍ２マクロファージは、８日間、９６ウェル丸底プレート中で、単離した単球をＲＰＭＩ−１０（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μＭのβ−メルカプトエタノール）中のＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）と共に培養することによって生成した。培養期間中、３日目及び６日目に、Ｍ−ＣＳＦを補足した新しいＲＰＭＩ−１０で細胞を補充した。８日目に培地を除去し、新鮮な培地（Ｍ−ＣＳＦなし）を添加し、細胞をＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ）で２時間活性化した。次にマクロファージを洗浄してＬＰＳを除去し、新鮮な培地（Ｍ−ＣＳＦなし）で補充した。Ｍ２マクロファージを、試験抗体又はアイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、自家ＰＢＭＣ（解凍し、洗浄した）と４：１の比（ＰＢＭＣ：Ｍ２）で共培養した（三通りで実施）。２４時間のクロストークの後、この培養物を抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍＬ）で３日間刺激して、ＴＣＲ受容体複合体を介してＴ細胞を活性化した。次いで、適切なＥＬＩＳＡ希釈液中で１：１０又は１：２０に希釈した上清を用いて、ＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによって培養上清中で測定し、キットの検出範囲内の値を得た。試験物質と適切な対照群との間で、事後比較ダネットの（post−hoc Dunnett）（対照と複数の群との間の比較用）又はＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ（全群間の比較用）多重比較検定のいずれかによる多重比較のために比対応のあるｔ検定、又は一元配置分散分析（one way−ANOVA）のいずれかを使用して、試験物質と適切な対照群との間に統計分析を行った。Ｐ＜０．０５場合、統計的有意性が想定された。

結果
これらの結果を図３３に示しており、データは、ＰＢＭＣの抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激後のＥＬＩＳＡによって検出された三通りのＩＦＮ−γの平均レベルとして提示されている。これらの結果から、Ｍ２マクロファージの非存在下で培養されたＰＢＭＣは、ＣＤ３及びＣＤ２８による刺激後により高いレベルのＩＦＮ−γを生成した（「ＰＢＭＣのみ」を「刺激されていない」状態とを比較する、^＊はＰ＜０．０５を示す）ことが明らかである。異なるドナーについて得られた結果の不均一性にもかかわらず、３つ全ての二重特異性抗体は、Ｍ２：ＰＢＭＣ共培養中でＩＦＮ−γの産生を増加させたと結論付けられる。統計的に有意ではないが、ＰＢ１７３０９及びＰＢ１７３１０は、ＰＧ２７０８アイソタイプ対照で処置したものと比較して、ＩＦＮ−γ産生の増加傾向を示す。重要なことに、ＰＢ１７３１１の添加は、ＰＧ２７０８アイソタイプ対照で処置したものと比べて、Ｍ２：ＰＢＭＣ共培養におけるＩＦＮ−γの産生を有意に増加させた（^＊＊は、Ｐ＜０．０１を示す）。ＰＢ１７３０９及びＰＢ１７３１０で得られたこれらの結果は、抗ＣＤ１３７ベンチマーク抗体２０Ｈ４．９及び抗ＰＤ−Ｌ１ベンチマーク抗体ＹＷ２４３．５５．５７０で得られた結果と同等である。ＰＢ１７３０９及びＰＢ１７３１０で得られた結果はまた、両方の参照抗体の組み合わせで得られた結果とも同等である。

実施例１２
ナイーブヒトＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングに対するＰＢ１７３１１の効果
本発明によるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、Ｔ細胞上のＣＤ１３７及びアクセサリー細胞上のＰＤ−Ｌ１を架橋することによってＴ細胞の活性化を誘導する。これは、ＣＤ１３７シグナル伝達をもたらし、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路をブロックすることによって抗原依存性ＴＣＲ活性化を向上させると考えられる。ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍の存在下で、本発明によるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、本実施例に示すように、抗原特異的Ｔ細胞の（再）活性化を容易にする。これは、ＣＤ１３７共刺激が、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン産生、及び生存を可能にすることが知られているという事実と一致する（Ｂｅｒｔｒａｍｅｔａｌ２００４）。しかしながら、我々はまた、本発明によるＣＤ１３７× ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体が、腫瘍新生抗原に対する新規の有効なＴ細胞応答を促進することを実証することも求めた。マウス感染モデルにおけるナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングは、ＣＤ１３７共刺激が、セントラルメモリ及びエフェクターＴ細胞集団の形成を促進することを示している（Ｚｈａｏｅｔａｌ２０１２）。したがって、我々は、ナイーブヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングに対する、本二重特異性抗体のうちの１つ（ＰＢ１７３１１、６７９７×７７０２）によって媒介される効果を評価した。

ナイーブＴ細胞前駆体細胞の数が少ないことから、ヒトＴ細胞の抗原特異的プライミングを評価することは困難である。しかしながら、黒色腫において過剰発現される抗原−腫瘍関連抗原メランＡは、ヒトＴ細胞におけるナイーブＴ細胞応答を評価するのに特に好適であることが見出されている。これは、このＨＬＡ−Ａ０２０１に制限されたメランＡの２７〜３５ペプチドエピトープに特異的なＴ細胞のレベルが、他の自己又は腫瘍関連抗原に対するＴ細胞のレベルよりも約１０倍高い（このエピトープは、１０００個のナイーブＴ細胞において約１個で認識される）ためである。このエピトープに基づいて、Ｗｏｌｆｌ及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ（２０１４）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するプライミング条件を確実に評価するインビトロプライミングシステムを開発した。この方法は、ヒトＣＤ８Ｔ細胞の抗原特異的活性化及びプライミング、又はＡＳＡＰ−Ｔ８として知られている。ＡＳＡＰ−Ｔ８アッセイでは、単離されたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を、ペプチド抗原負荷自家単球由来樹状細胞と１０日間共培養し、続いて抗原特異的Ｔ細胞の定量的及び定性的分析を行う。

この実施例では、２人の独立したドナーからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（番号１０６４及び１０６６）を使用して、Ｗｏｌｆｌ及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ（２０１４）に記載の詳細な方法に従ってＡＳＡＰ−Ｔ８アッセイを実施した。アッセイで試験した抗体及び対照は、抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＢ１７３１１、抗ＣＤ１３７ベンチマーク抗体の２０Ｈ４．９、抗ＰＤ−Ｌ１ベンチマーク抗体のＹＷ２４３．５５．５７０、両方のベンチマーク抗体の等モル混合物、及び陰性対照抗ＲＳＶ−Ｇ抗体のＰＧ２７０８であった。試験抗体をＤＣ：Ｔ細胞培養の開始から添加し、最初の供給中に再度添加した。

単球由来成熟樹状細胞（mature dendritic cell、ｍＤＣ）の生成
単球由来成熟樹状細胞を、Ｗｏｌｆｌ及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ（２０１４）に記載の詳細な方法に従うプロトコルを使用して生成した。この目的のために、ＡＳＡＰ−Ｔ８アッセイの開始４日前に、ＨＬＡ−Ａ２^＋ドナーからのＰＢＭＣを解凍し、ＲＴで３００ｇにて５分間遠心分離し、培養培地（ＣｅｌｌＧｒｏ樹状細胞培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、カタログ番号２００５）＋１％のヒト血清）中に、１×１０^７／ｍｌに再懸濁させた。次いで、この細胞懸濁液２ｍｌを６ウェルプレートの各ウェルに添加した。３７℃で２〜３時間インキュベートした後、プラスチックへ付着させ、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄することにより非接着性細胞を除去した。１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４及び１６００ＩＵ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦで補充した温かい培養培地３ｍｌを各ウェルに添加し、続いて３７℃で２日間インキュベートした。ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを補充した１．５ｍｌの新鮮な培養培地を更に添加した後、細胞を更に２４時間インキュベートした。

次いで、未成熟なＤＣを、３ｍｌの上清を除去した後、残りの培地中の細胞の激しい再懸濁、及び氷冷ＰＢＳで洗浄して、いかなる残りの細胞も除去した。細胞をプールし、計数し、ＲＴで３００ｇにて５分間遠心分離した。ペレットを、ＧＭ−ＣＳＦ（８００ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮγ（１００ＩＵ／ｍｌ）を補充した予熱した培養培地中に、１×１０^６個細胞／ｍで再懸濁させた。２ｍｌの細胞懸濁液（２×１０^６個細胞）を新しい６ウェルプレートのウェルに添加した。ＤＭＳＯ中に５μｇ／μｌに溶解したメランＡ抗原ペプチド（ＪＰＴ、カタログ番号ＳＰ−ＭＨＣＩー０００６）を、適切なウェルに２．５μｇ／ｍｌで添加し、細胞を３７℃で１６時間インキュベートした。

ＤＣの形態を確認した後、ピペットを用いて激しい再懸濁液を介してｍＤＣを採取し、空のウェルを氷冷ＰＢＳでフラッシングして、全ての接着細胞の除去を確実にした。ペプチドでパルスされたｍＤＣ及び別々にプールされなかったもので生きている細胞を計数した。ｍＤＣを含むチューブを、全ての時点で氷上に維持し、３０Ｇｙ（３０００Ｒａｄ）で照射して、細胞の後続の長期共培養中の汚染細胞の潜在的な増殖を防止した。次いで、細胞をＲＴで３００ｇにて５分間遠心分離し、ＣｅｌｌＧｒｏＤＣ培地＋５％のヒト血清（human serum、ＨＳ）中に５×１０^５個細胞／ｍｌで再懸濁させた。

ナイーブＣＤ８Ｔ細胞の生成
ＡＳＡＰ−Ｔ８アッセイの開始１日前に、ｍＤＣを生成するために使用したものと同じＨＬＡ−Ａ２^＋ドナーからのＰＢＭＣを解凍し、ＲＴで３００ｇにて５分間遠心分離し、冷ＰＢＳ／ＨＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（２％のＨＳ及び１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）中に５×１０^７個細胞／ｍｌで再懸濁させた。細胞を、ＥａｓｙＳＥＰヒトナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１９２５８）を使用するナイーブＣＤ８Ｔ細胞単離に使用した。

細胞試料１ｍｌ当たり、５０μｌのＥａｓｙＳｅｐ単離カクテルを添加し、続いて混合し、ＲＴで１０分間インキュベートした。次いで、ＥａｓｙＳｅｐ磁気粒子を３０秒間ボルテックスし、試料１ｍｌ当たり１００μｌの粒子を添加して、除去のために望ましくない細胞を標的とした。ＲＴで１０分間インキュベートした後、細胞懸濁液を、ＥａｓｙＳｅｐ緩衝液を添加することによって２．５ｍｌの総容積まで構成し、細胞を穏やかにピペット操作で混合し、続いて５ｍｌのファルコンチューブに移した。キャップを取り外し、チューブをＥａｓｙＳｅｐ磁石に配置した。ＲＴで５分置いた後、磁石及びチューブを１回の連続運動で反転させることにより、所望の画分を新しい５ｍｌのファルコンチューブに注ぎ、元のチューブの内側に結合した磁気的に標識された望ましくない細胞をそのまま残した。磁石及びチューブは、直立位置に戻る前に３秒間反転位置にされ、チューブの口から垂れ下がったままであったままのいかなる液滴も残した。望ましくない細胞を含む古いチューブを磁石から取り出し、消極的に濃縮された細胞画分を含む新しいチューブを、２番目の分離のために磁石に配置した。ＲＴで５分置いた後、所望の分画を同じ方法で注いだ。

消極的に選択された濃縮細胞を計数した後、ＲＴで３００ｇにて５分間遠心分離し、５％のＨＳを補充し、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を含有するＣｅｌｌＧｒｏＤＣ培養培地中で３×１０^６個細胞／ｍｌの最終細胞濃度で再懸濁させて、最適なＴ細胞プライミングを可能にした。細胞を２ｍｌ／ウェルで６ウェルプレートに移し、一晩インキュベートした。

ＡＳＡＰ−Ｔ８アッセイ
このアッセイは、Ｗｏｌｆｌ及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ（２０１４）に記載される詳細な方法に従って、各ドナーについて三通りで実施した。ＩＬ−７と共にプレインキュベートしたＴ細胞を採取し、プールし、計数した後、ＲＴで３００ｇにて５分間遠心分離した。ペレットを、培養培地中に２×１０^６個細胞／ｍｌで再懸濁させ、ＩＬ−２１を６０ｎｇ／ｍｌで添加して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞のプライミングを増強させた。２つのＤＣ／Ｔ細胞混合物を、ペプチドでパルスされたｍＤＣ又は非パルスＤＣをＴ細胞と１：１（ｖ／ｖ）に比で混合して、４：１のＴ細胞：ＤＣ比及び３０ｎｇ／ｍｌの最終ＩＬ−２１濃度をもたらすことによって調製した。試験抗体を１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。次いで、５００μｌの各細胞混合物を４８ウェルプレートの個々のウェルに移した。

細胞を３７℃で合計１０日間共培養し、これには２つの供給工程及び新しいプレートへの移動を伴った。細胞を、最初に、７２時間後に、２０μｇ／ｍｌの試験抗体（最終ＩｇＧ濃度１０μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、５％のＨＳ及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５並びに１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌの最終濃度のサイトカイン）を含有する追加の５００μｌの温めた培養培地と共に供給し、４８時間インキュベートした。増殖のためのより多くの余地を可能にし、かつＤＣ調製物から残留（プラスチック接着性）骨髄系細胞の数を減らすために、細胞及び培地を、５％のＨＳ及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５並びにＩＬ−７を含有する１ｍｌの培地が既に添加されている２４ウェルプレート内の新しいウェルに移した。更に１２０時間のインキュベーション後に、細胞は分析できる状態となった。

共培養１０日目に、個々のウェルからの細胞を採取し、計数して、ウェル当たりの絶対細胞数を決定した。次いで、Ｔ細胞を、蛍光標識されたメランＡ特異的デキストマー（Ｉｍｍｕｄｅｘカタログ番号ＷＢ２１６２−ＡＰＣ）で染色した。このデキストラマーでは、デキストランポリマー主鎖は、１０個超のＭＨＣ−ペプチド複合体及び蛍光色素分子（アロフィコシアニン）を担持し、それによって、ＦＡＣＳ分析によるメランＡペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の検出を可能にする。細胞を、特定のＴ細胞サブセット上のマーカーに対して、他の抗体でも染色した。この目的のために、個々のウェルから得られた細胞を、９６ウェルＦＡＣＳプレートのウェルに５０，０００個細胞／ウェルで移した。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、続いて４０μｌのデキストラマー（ＰＢＳ＋５％のＦＢＳ中で１：５０希釈）を添加し、暗所でＲＴで２０分間インキュベートした。次いで、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＣＲ７に対して特異的な追加の抗体（５倍濃縮物）を、１０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に添加した。細胞を暗所において４℃で２０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。４℃で１０分間インキュベートした後、細胞はＦＡＣＳによる分析ができる状態となった。

結果
Ｔ細胞増殖
デキストラマー陽性集団は、プライミング時に増殖し、全ＣＤ８Ｔ細胞集団の５〜２４％を構成した抗原特異的細胞を表す。デキストマー陽性、ＣＤ８陽性Ｔ細胞集団及び絶対細胞数の相対的なサイズを使用して、ウェル当たりの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を計算し、各ドナーからのデータを、抗体を含有しない試料に対する培養中の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数として表した（図３４を参照されたい）。示されるデータは、三通りで実施された実験からのものであり、エラーバーは標準偏差を表す。

これらの結果から、プライミング中にペプチド抗原が存在する場合には、デキストマー陽性抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団が増殖したことが明らかである（図３４の「ペプチドｃｔｒｌなし」及び「Ａｂなし」条件を比較して）。

抗ＣＤ１３７参照抗体２０Ｈ４．９は、陰性対照抗体と比較して抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増強させたが、１つのドナー（ＰＢＭＣ１０６４）においてのみであった。

抗ＰＤ−Ｌ１参照抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０は、増殖に影響を及ぼさなかった。

ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＢ１７３１１は、陰性対照抗体と比較して両方のドナーにおける抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を有意に増強させた。ＰＢ１７３１１は、抗ＣＤ１３７参照抗体２０Ｈ４．９よりも高い程度まで抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増強させた。ＰＢ１７３１１は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０と抗ＣＤ１３７参照抗体２０Ｈ４．９との組み合わせと比較して、より高いＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖活性を有した。これは、このＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体が、ＣＤ１３７特異的及びＰＤ−Ｌ１特異的ベンチマーク抗体よりもナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングにおいてより強力であることを意味する。

Ｔ細胞分化
抗原特異的プライミング時に、ナイーブＴ細胞は分化を開始する。この分化プロセス中に、細胞表面上のＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの発現はダウンレギュレートされ、ＣＤ４５ＲＡは、最終分化エフェクターＴ細胞上で再発現される。したがって、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡ発現のダウンレギュレートは、分化の指標である。分化マーカーＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの発現を、ＣＤ８＋デキストラマー＋細胞上でゲーティングし、次いで、異なるＴ細胞サブセット内の細胞の相対数を決定することによって分析した。サブセットは、Ｔナイーブ／メモリ幹細胞（Ｔ_Ｎ／Ｔ_ＳＣＭ）：ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋；セントラルメモリＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）：ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋；エフェクターメモリＴ細胞（Ｔ_ＥＭ）：ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−；及び最終分化エフェクターＴ細胞（Ｔ_ＴＥ）：ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−と定義された。各ドナーからのデータを、ＣＤ８＋デキストラマー＋Ｔ細胞集団内の各Ｔ細胞サブセットの割合として表した（図３５を参照）。

ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＢ１７３１１は、陰性対照抗体と比較して両方のドナーにおける抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化を増強させた。陰性対照抗体の存在下でプライミングされたＴ細胞及び抗体の存在下でプライミングされたＴ細胞と比較したとき、我々は、ＰＢ１７３１１がナイーブ細胞表現型（Ｔ_Ｎ／Ｔ_ＳＣＭ）を有する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の相対数を低減し、エフェクターメモリ及び最終分化エフェクター細胞集団（図３５のＴ_ＥＭ及びＴ_ＴＥ）の相対数を増加させたことを見出した。ＰＢ１７３１１は、２０Ｈ４．９とインキュベートされたＣＤ８＋Ｔ細胞集団と比較して、ＰＢ１７３１１とインキュベートされたＣＤ８＋Ｔ細胞集団内の、エフェクターメモリ及び最終分化エフェクター細胞集団の相対数の増加によって示されるように、抗体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化を参照抗体２０Ｈ４．９よりも高い程度まで増強させた。ＰＢ１７３１１は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０と抗ＣＤ１３７参照抗体２０Ｈ４．９との組み合わせと比較して、抗体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化をより高い程度まで更に増強させた。これは、このＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体が、ＣＤ１３７特異的及びＰＤ−Ｌ１特異的ベンチマーク抗体よりもプライミング時のナイーブＴ細胞の分化の増強においてより強力であることを意味する。

いかなる理論にも束縛されるものではないが、ＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングに対するＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＢ１７３１１の強力な効果は、主に、Ｔ細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達の誘導に依存すると考えられる。抗原認識後にＴ細胞表面上で発現されたＣＤ１３７と、成熟ＤＣ上のＰＤ−Ｌ１とを結合させることにより、ＰＢ１７３１１は、ＣＤ１３７シグナル伝達に必要なＣＤ１３７受容体のクラスター化を可能にする。

要約すると、これらの結果は、ＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体ＰＢ１７３１１が、インビトロでのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び分化の両方を増強することを実証する。

ＰＢ１７３１１は、抗ＰＤ−Ｌ１ベンチマーク抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０と抗ＣＤ１３７ベンチマーク抗体２０Ｈ４．９と（の組み合わせ）と比較して、増大した増殖及び分化能力を有する。これは、ＰＢ１７３１１が既存の腫瘍に対する新規なＴ細胞応答を誘導又は増強するのに有効であることを実証する。

実施例１３
ＣＤ１０７ａに対するＰＢ１７３１１の効果及びＴ細胞によるサイトカイン発現
実施例１０で実証されたように、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体は、ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣの上清中のＩＬ−２、ＴＮＦα、及びＩＦＮγの産生を増強させることができる。ここで、我々は、細胞内サイトカイン染色及びＦＡＣＳ分析を使用して、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体ＰＢ１７３１１による治療の際に増強させるサイトカイン産生に関与するＴ細胞サブセットを同定した。我々はまた、ＣＤ１０７ａ発現を、ＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性のマーカーとして評価した。我々は、ＰＢ１７３１１の効果を、抗ＣＤ１３７ベンチマーク抗体の２０Ｈ４．９、抗ＰＤ−Ｌ１ベンチマーク抗体のＹＷ２４３．５５．５７０、両方の参照抗体の等モル混合物、及び陰性対照抗ＲＳＶ−Ｇ抗体のＰＧ２７０８の効果と比較した。

この目的のために、ＰＢＭＣを抗体の存在下又は非存在下で、ＳＥＢ（３２０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激し、サイトカインＩＬ−２、ＴＮＦα、及びＩＦＮγに対し、及び生細胞染料を使用して、マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ１０７ａについて染色した。ＳＥＢ及び抗体の非存在下で培養したＰＢＭＣを、ＳＥＢ刺激についての対照（刺激なし）として含めた。総Ｔ細胞集団（ＣＤ３＋細胞）及び以下のＣＤ４並びにＣＤ８Ｔ細胞サブセット：ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋）、セントラルメモリＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−）、及び最終分化エフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７−）においてＣＤ１０７ａ及びサイトカインの発現を分析した。結果は、最も顕著な差異が観察されたサブセットについてのみ示されている：ＣＤ４エフェクターメモリ（effector memory、ＥＭ）細胞、ＣＤ８ＥＭ細胞、及びＣＤ８最終分化エフェクター（terminally differentiated effector、ＴＥ）細胞。

方法
ＦＡＣＳ分析における細胞内標的及び細胞外標的を検出するために使用された抗体のリスト。

単一の健康なドナーに由来する冷凍保存ＰＢＭＣを解凍し、一晩放置した。次いで、細胞を計数し、２００ｇで１２分間遠心分離して、ペレットをＰＢＭＣ培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％の熱不活性化ＦＢＳ及び１つのペニシリン−ストレプトマイシン）中で２×１０^６個細胞／ｍｌの濃度に再懸濁させた。１００μｌの細胞懸濁液を、ＳＥＢを含有する１００μｌのＰＢＭＣ培地及び試験抗体が既に添加された２つの９６ウェル丸底プレートのウェルに添加した。最終的なＳＥＢ濃度は３２０ｎｇ／ｍｌであった。各抗体を、（０．５＋０．５μｇ／ｍｌで試験したＹＷ２４３．５５．５７０及び２０Ｈ４．９の組み合わせを除いて）１μｇ／ｍｌの単一濃度で三通りで試験した。ＳＥＢ又は抗体を含まない対照ウェルも含まれた。刺激は、３７℃、５％のＣＯ_２、９５％の湿度で２４時間行った。抗ＣＤ１０７ａ及びブレフェルジンＡ（Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇ、ＢＤ）とモネンシン（Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ、ＢＤ）との混合物を、インキュベーションの最後の１２時間中に各ウェルに添加した。

次いで、複製プレートをプールし、ＰＢＭＣを関連するマーカー及びサイトカインに特異的な抗体で染色した（上記抗体のリストに概要を提供した）。ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８の検出は固定後に損なわれないため、これらの標的に対する抗体を細胞内サイトカインに対する抗体と共に細胞内染色工程で添加した。細胞外標的ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯは、それらの固定に対する感受性が知られているため、固定工程の前に染色された。この目的のため、プレートを３５０ｇで３分間遠心分離し、細胞をウェル当たり１００μｌのＰＢＳに再懸濁し、複製プレートからの細胞をプールした。プレートを前と同様に遠心分離し、細胞を、１：１０００に希釈したＦｉｘａｂｌｅ生体染料（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６６）のウェル当たり１００μｌに再懸濁させた。暗所でＲＴで１０分間インキュベートした後、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％のＢＳＡ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）を各ウェルに添加した。プレートを遠心分離し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で希釈した、２５μｌの抗ＣＣＲ７抗体中に再懸濁させた。３７℃、５％のＣＯ_２、９５％の湿度で１５分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した、２５μｌの抗ＣＤ４５ＲＯ抗体を添加した。暗所でＲＴで３０分間インキュベートした後、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各ウェルに添加した。プレートを前のように遠心分離し、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。プレートを遠心分離し、細胞を１００μｌのＢＤ固定／透過処理溶液（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４７１４）中に再懸濁させた。暗所でＲＴで１０分間インキュベートした後、１００μｌのＢＤ透過処理／洗浄緩衝液（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４７１４）を添加した。次いで、プレートを３５０ｇで３分間遠心分離し、細胞を２００μｌのＢＤ透過処理／洗浄緩衝液中に再懸濁させた。

この固定及び透過処理工程の後、プレートを５００ｇで３分間遠心分離し、細胞を細胞内標的に特異的な抗体を含有するＢＤ透過処理／洗浄緩衝液の５０μｌ溶液に再懸濁させた。この溶液は、細胞内標的ＩＦＮγ、ＩＬ−２、及びＴＮＦαに対する、並びにＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８に対する抗体を含有した。プレートを暗所でＲＴで１時間インキュベートし、次いで、１５０μｌのＢＤ透過処理／洗浄緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、プレートを３５０ｇで３分間遠心分離し、細胞を２００μｌのＢＤ透過処理／洗浄緩衝液中に再懸濁させた。プレートを再び３５０ｇで３分間遠心分離し、細胞を１００μｌの固定液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％のＢＳＡ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のホルムアルデヒド）に再懸濁させ、翌日収集するまで４℃で保存した。

ＢＤＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して試料を測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０を用いてデータを分析した。細胞集団を以下のように分析した：ＦＳＣ−Ａ対ＦＳＣ−Ｈをプロットすることによって、一重項を二重項から区別した。死細胞は、生細胞染色のために陰性集団をゲーティングすることによって除外した。Ｔ細胞をＣＤ３＋として同定し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットに分割した。これらのＴ細胞サブセットを、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯの発現に基づいて、ナイーブ、セントラルメモリ、エフェクターメモリ、及び最終分化エフェクター細胞に更に分割した。サイトカイン及びＣＤ１０７ａの発現を、総Ｔ細胞集団内及びサブ集団内で評価し、Ｔ細胞の総集団の割合として表した。

結果
総Ｔ細胞集団におけるＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、及びＴＮＦαの細胞内レベルを図３６に示しており、３つの個々のＴ細胞サブセット（ＣＤ４Ｔ_ＥＭ、ＣＤ８Ｔ_ＥＭ、及びＣＤ８Ｔ_ＴＥ）によって発現されるレベルを図３７に示している。これらの図では、点線は、ＳＥＢ及び陰性対照抗体ＰＧ２７０８で刺激された場合に示されるマーカーに対する陽性の細胞の平均割合を表す。バーは、単一のドナーに由来する細胞を使用して三通りで実施された実験の平均値±ＳＤを表す。有意差を試験するために、各条件を、一元配置分散分析（one−way ANOVA）による陰性対照抗体ＰＧ２７０８（ＮｅｇＣｔｒｌＡｂ）と比較し、続いてダネットの多重比較検定を行った。Ｐ値は、次のようにアスタリスクで示される：^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

陰性対照抗体と比較して、ＰＢ１７３１１は、総Ｔ細胞集団におけるＣＤ１０７ａ、ＩＬ−２、及びＩＦＮγ産生を増強させた（図３６）。注目すべきことに、ＣＤ１０７ａ産生は、抗ＣＤ１３７ベンチマーク抗体２０Ｈ４．９、抗ＰＤ−Ｌ１ベンチマーク抗体ＹＷ２４３．５５．５７０と比較して、また参照抗体の両方の等モル混合物とも比較して、ＰＢ１７３１１によってより増強された。このことから、２０Ｈ４．９、ＹＷ２４３．５５．５７０又はこれらの混合物と比較して、ＰＢ１７３１１とのインキュベーション後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性がより増強されると結論付けられる。ＩＬ−２及びＩＦＮγの産生はまた、２０Ｈ４．９及びＹＷ２４３．５５．５７０と比較して、ＰＢ１７３１１とのインキュベーション後に高くなるように見える。

我々が個々のＴ細胞サブセットにおいてより詳細に調べると、ＰＢ１７３１１は、ＣＤ４Ｔ_ＥＭ細胞内の３つのサイトカイン全ての発現を増強させることを見出した。ＰＢ１７３１１はまた、ＣＤ８Ｔ_ＥＭ及びＴ_ＴＥ集団中のＣＤ１０７ａの発現を、ベンチマーク抗体２０Ｈ４．９、ＹＷ２４３．５５．５７０及びその混合物よりも高い程度に押し上げ、これが、これらのベンチマーク抗体の混合物よりも良好にＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害性を増強させることを示す。

結論
これらの結果は、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体が、ＳＥＢ刺激時にＰＢＭＣによるＩＬ−２、ＴＮＦα、及びＩＦＮγ産生を増強させるという以前の観察と一致している。これらは、ＰＢ１７３１１がサイトカインを発現するＴ細胞数の有意な増加を引き起こすこと、及びＰＢ１７３１１が、２０Ｈ４．９及びＹＷ２４３．５５．Ｓ７０ベンチマーク抗体よりもＣＤ８Ｔ_ＥＭ及びＴ_ＴＥサブセット上の細胞傷害性マーカーＣＤ１０７ａの発現をよりも強力に誘導することを示す。注目すべきことに、ＣＤ８Ｔ_ＥＭ及びＴ_ＴＥ集団のＩＦＮγ及びＴＮＦα産生もまた、２０Ｈ４．９、ＹＷ２４３．５５．５７０又はこれらの混合物とのインキュベーション後のＩＦＮγ及びＴＮＦα産生と比較して、ＰＢ１７３１１とのインキュベーション後にも高く、これは、ＰＢ１７３１１が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する可能性が高いことを示す。ＣＤ４Ｔ_ＥＭ集団のＩＬ−２の産生はまた、２０Ｈ４．９とのインキュベーションと比較して、ＰＢ１７３１１とのインキュベーション後により高く、及びＹＷ２４３．５５．５７０と比較して、それほど高くなるように見える。

実施例１４
腫瘍浸潤性Ｔ細胞の増殖に対するＰＢ１７３１１の効果
抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の初期スクリーニングは、初代Ｔ細胞に基づくアッセイを使用した。しかしながら、このようなアッセイは、腫瘍及びその微小環境の共進化を促進する細胞相互作用の複雑性を欠く。腫瘍関連設定において我々の二重特異性抗体を試験するために、患者腫瘍材料から単離されたＴ細胞に基づく最近開発されたアッセイを使用した。Ｚｈｏｕらは、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma、ＨＣＣ）又は結腸直腸がん（ＣＲＣ）を有する患者から新鮮な腫瘍材料を得て、腫瘍浸潤性細胞（骨髄系細胞及びリンパ球性細胞）を単離して、腫瘍浸潤性Ｔ細胞の機能上の免疫チェックポイント阻害剤を標的とする抗体の効果を試験する方法を開発している（Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，２０１７）。ここで、抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体ＰＢ１７３１１が、これらの患者に由来する腫瘍浸潤性ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を再活性化し得るかどうかを試験するために、我々はＨＣＣ又はＣＲＣの肝転位（ＬＭ−ＣＲＣ）を有する患者から材料を得た。

［方法］
この目的のため、新しい腫瘍材料を、ＬＭ−ＣＲＣを有する４人の患者から、及び腫瘍の外科的切除のために適格なＨＣＣを有する３人の患者から得た。患者のいずれも、手術前少なくとも３ヶ月間、化学療法又は免疫抑制治療を受けなかった。Ｚｈｏｕｅｔａｌ．（２０１７）によって記載される方法は以下の通りであった：腫瘍浸潤性骨髄系細胞及びリンパ球性細胞を、小片に切断し、続いて３７℃で０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び０．２ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中で、３７℃で２０〜３０分間消化させることによって、新鮮な組織から単離した。得られた細胞懸濁液を１００μｍの細孔セルストレーナー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を通して濾過し、フィコール密度勾配遠心分離によって単核白血球を得た。生存率を、トリパンブルー排除によって決定した。次いで、細胞を、０．１μＭの蛍光染料カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester、ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、１０％のヒトＡＢ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１％の最小必須培地非必須アミノ酸（minimum essential medium non-essential amino acid、ＭＥＭＮＥＡＡ）で補充したＲＰＭＩ培地に懸濁させた。次いで、ＨＣＣの１×１０^５個細胞について、及びＬＭ−ＣＲＣの１〜２×１０^５個細胞について、１００μｌで、９６ウェル丸底プレートの各ウェルに移した。次いで、腫瘍浸潤性リンパ球（tumor−infiltrating lymphocyte、ＴＩＬ）を刺激して、以下のように試験抗体の非存在下又は存在下で活性化を誘導した：ＨＣＣ患者に由来するＴＩＬを含有するウェルに、試験抗体、及び増殖した１×１０^５個の自家ＣＤ４０活性化Ｂ細胞芽球を含有する１００μｌの同じ培地を添加し、続いて完全長腫瘍抗原グリピカン−３（glypican−3、ＧＰＣ３）又は黒色腫関連抗原Ｃ２（melanoma−associated antigen C2、ＭＡＧＥＣ２）をコード化するｍＲＮＡでトランスフェクトした。これらの細胞を、６日間共インキュベートした。ＬＭ−ＣＲＣ患者に由来するＴＩＬを含有するウェルに、試験抗体及び抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ−ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＡＳ，Ｎｏｒｗａｙ）でコーティングされたダイナビーズを含有する１００μｌの同じ培地を添加し、４日間置いた。インキュベーション後、ＣＦＳＥで標識された細胞を採取し、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３抗体で染色した。死滅細胞を、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎＤ、７ＡＡＤ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰａｉｓｌｅｙＵＫ）を使用して除外し、Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリー分析によるＣＦＳＥ希釈に基づいて決定した。細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＵＳＡ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体ＰＢ１７３１１を、その単一特異性二価親抗体ＰＧ６７９７並びにＰＧ７７０２、及び抗ＣＤ１３７参照抗体２０Ｈ４．９、抗ＰＤ−Ｌ１参照抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、並びに無関係のＲＳＶ−Ｇ抗原に対する陰性対照抗体ＰＧ２７０８と比較した。抗体を含まない試料を対照として含め、全ての条件を、１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度でデュプロで試験した。

ＬＭ−ＣＲＣに由来する試料については、抗体の存在下でのＣＤ４Ｔ細胞増殖は、４人のドナーのうちの３人においてのみ決定され得るが、これは、ＣＤ４Ｔ細胞増殖の第４のドナーのベースラインレベルが、既に例外的に高かった（６０％超の増殖細胞）ためである。ＣＤ８Ｔ細胞増殖は、４人の全てのＬＭ−ＣＲＣドナーからの試料において決定することができる。ＨＣＣに由来する試料に関しては、３人の全てのドナーについてＧＰＣ３を発現している自家Ｂ細胞を生成したが、３つのうちの２つについては、ＭＡＧＥＣ２発現のみ可能であった。これにより、３人のＨＣＣドナーからの細胞を使用して、合計５つの増殖実験をもたらした。

結果を平均±ＳＥＭとして示した。

結果
これらの結果を図３８に示す。ＣＤ４ＴＩＬのベースライン増殖（右上パネル）及びＣＤ８ＴＩＬのベースライン増殖（右下パネル）を、陰性対照抗体の存在下で増殖するＴ細胞（低レベルのＣＦＳＥ）の割合を測定することによって決定した。試料のＣＤ４増殖（左上）及びＣＤ８増殖（左下）を、ベースラインを超える増殖の増加率として計算した。値は、平均±ＳＥＭ（ＬＭ−ＣＲＣ：ＣＤ４ｎ＝３、ＣＤ８ｎ＝４；ＨＣＣ：ＣＤ４及びＣＤ８ｎ＝５）である。

ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体ＰＢ１７３１１は、両方の腫瘍型におけるＣＤ４及びＣＤ８ＴＩＬの両方の増殖を明確に増強させ、これらの結果は、これがその親抗体ＰＧ６７９７及びＰＧ７７０２よりも優れていることを示す。これらの結果はまた、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０が、同じレベルへのＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞増殖を刺激したことも示す。ＰＢ１７３１１及び２０Ｈ４．９はまた、ＣＤ４Ｔ細胞の増殖を増強させたが、ＣＤ８Ｔ細胞の増殖をより強力に増強させた。

これらの実験は、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体を使用する付加価値を示し、ＰＢ１７３１１は、ＨＣＣ及びＬＭ−ＣＲＣを有する患者に由来するＣＤ４及びＣＤ８ＴＩＬの増殖を増強させることを実証する。重要なことに、これは、本発明による二重特異性抗体が、がん患者の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及び抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を再刺激することができること、及びこれが、ＣＤ８＋ＴＩＬの増殖を、ベンチマーク抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０よりも強力に刺激することができることを意味する。

実施例１５
アラニンスキャニングによるＰＢ１７３１１エピトープ分析
エピトープ分析を実施して、ＰＢ１７３１１中に存在する抗ＣＤ１３７Ｆａｂアーム（ＭＦ６７９７）によって認識されるエピトープの一部を含むか、又はその一部である残基のセットを同定した。

ＰＢ１７３１１が結合するＣＤ１３７抗原の潜在的に非直鎖エピトープの分析には、ＣＤ１３７の三次元タンパク質構造の知識が必要である。ＣＤ１３７は、明確に異なるドメインを有さない、２５．４ｋＤａ（１７．３ｋＤａの細胞外）の比較的小さいタンパク質である。しかしながら、定義された「反復領域」又はシステインリッチドメイン（cysteine-rich domain、ＣＲＤ）は、ＣＤ１３７について記載されている。ＣＤ１３７のタンパク質構造に関する文献の報告は限定されている。Ｙｉｅｔａｌ．（２０１４）は、ＣＤ１３７のリガンド結合部位を、切断型発現構築物との結合研究に基づいてＣＤ１３７の領域３内に配置することが記載している。ＣＤ１３７では結晶構造が利用可能ではないが、相同性モデルが、ＴＮＦＲ１に基づいて公表されている（Ｗｏｎｅｔａｌ．，２０１０）。ＴＮＦＲ１は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー中の膜結合タンパク質であり、ＣＤ１３７もまたそのメンバーである。ヒト／マウスＣＤ１３７キメラ構築物を含むドメイン／スワップ実験の結果は、抗ＣＤ１３７Ｆａｂアーム（ＭＦ６７９７）がＣＲＤ１及び／又はＣＤＲ２に結合することを示唆している。ＣＤ１３７Ｌのブロッキングデータはまた、ＭＦ６７９７エピトープがＣＤ１３７リガンド結合部位の近くにあるか、又はＣＤ１３７リガンド結合部位と重なることも示唆している。

ＰＤ−Ｌ１はまた、異なる領域又はドメインが定義されていない、３１．１ｋＤａ（２５．２ｋＤａの細胞外）の比較的小さいタンパク質である。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１の結晶構造は、ＰＤ−Ｌ１とのその複合体の結晶構造と同様に知られている。

これらの実験では、ショットガン変異誘発を使用して、アラニン残基による置換により単一残基が変異した一連の突然変異タンパク質を生成した。次いで、変異体ＣＤ１３７タンパク質をヒト細胞で発現させ、複合タンパク質、又はヒト細胞においてのみ発現され、かつ適切に折り畳まれ得るタンパク質の分析を可能にした。抗体への機能的結合を、蛍光染色によって測定し、結合マップ及び抗体結合にとって重要な残基の同定をもたらした。ショットガン突然変異誘発実験及び分析を、ＤａｖｉｄｓｏｎａｎｄＤｏｒａｎｚ（２０１４）に記載の方法を使用して、ＩｎｔｅｇｒａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒにより分析が行われた。

まず、野生型ＣＤ１３７ｃＤＮＡを保有するプラスミドに基づいて、標的タンパク質について変異ライブラリ（Ｘｘｘ〜Ａｌａ、Ａｌａ〜Ｓｅｒ）を生成した。これにより、ＣＤ１３７についての１６３個の変異体ｃＤＮＡクローンが得られ、これらのクローンの全てを配列決定して変異を確認した。それに応じて、これらの変異体ｃＤＮＡクローンを、比較のために野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ、ＷＴ）構築物と共に、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。続いて、各々の変異体クローンを発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析し、それにより、各変異体タンパク質のＰＢ１７３１１への結合を、ＣＤ１３７に特異的な対照抗体（マウスＩｇＧ１、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５９５５）への結合と比較した。この対照抗体は、結合のためにＰＢ１７３１１と競合しない。ヒト又はマウスＩｇＧに対する蛍光標識二次抗体を使用して、ＰＢ１７３１１又はコントロール抗体の結合を検出した。

高いＣＤ１３７発現を有するが、ＰＢ１７３１１との低結合をもたらしたクローンを同定するために、我々は、ＰＢ１７３１１の結合を関連する対照抗体の結合と比較した（図３９Ａを参照されたい）。各クローンごとに、対照抗体の結合によって測定される、クローンの平均発現値の関数として平均結合値をプロットした。予備的な重要なクローンを同定するために、我々は、対照抗体に対する７０％超のＷＴ結合及びＰＢ１７３１１のＡｂに対する２０％未満のＷＴ反応性の閾値を適用した。これらの閾値を使用して同定された予備的な重要なクローンを、図３９Ａに黒丸として示している。

結果は、ＰＢ１７３１１の結合のためのＣＤ１３７における重要な残基が、Ａｒｇ６６、Ｇｌｙ７０、及びＰｈｅ７２であることを示す。Ｖａｌ７１もまた、ＰＢ１７３１１の結合に関与するように見える（図３９Ｂを参照されたい）。Ｃｙｓ１３３は、結合閾値に基づいて重要な残基として最初に同定されたが、他の重要な残基から比較的離れており、システイン変異は、ジスルフィド結合の破壊に起因してタンパク質立体配座におけるわずかな異常を引き起こす傾向がある。したがって、Ｃｙｓ１３３は、ＰＢ１７３１１エピトープの一部とは見なされなかった。Ａｒｇ６６、Ｇｌｙ７０、及びＰｈｅ７２で変異したタンパク質のＰＢ１７３１１との低い反応性は、これらの残基が、Ｖａｌ７１による寄与が小さい状態の、ＰＢ１７３１１結合に対する主要なエネルギー寄与因子であることを示す。

実施例１６
異種移植片マウスモデルにおけるＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の抗腫瘍効果
クローンの例示的な１つのＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体ＰＢ１７３１１の抗腫瘍有効性を実験動物において試験し、それを参照抗体と比較するために、抗体ＰＢ１７３１１を異種移植腫瘍を保有するマウスに投与した。選択されたマウスモデルは、ヒトがん細胞株で注射する前に、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を移植することによって免疫不全マウスがヒト化されるものである。次いで、皮下固形腫瘍増殖を、３週間にわたって評価する。

ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の抗ＣＤ１３７及び抗ＰＤ−Ｌ１Ｆａｂは、ヒト及びカニクイザルと交差反応するが、マウスタンパク質とは交差反応しない。上記モデルは、これが抗体のインビボ活性がヒト化系で試験されることを可能にし、それにより、抗体の抗腫瘍応答が、ヒトＴ細胞によって媒介され、マウスＴ細胞によって媒介されないために選択された。この種のモデルは、いくつかの抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体を含む様々な免疫調節標的療法を評価するために成功裏に使用されてきた。例えば、２０Ｈ４．９の有効性は、ＨＴ２９細胞を保有するＰＢＭＣヒト化Ｒａｇ２−／−ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌマウスで評価され（Ｓａｎｍａｍｅｄｅｔａｌ２０１５）、ウトミルマブの有効性は、ＰＢＭＣとヒト腫瘍細胞ＰＣ３、ＬｏＶｏ又はＷＭ−２６６との混合物で異種移植されたＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスにおいて評価されている（Ｆｉｓｈｅｒｅｔａｌ．，２０１２）。両方のモデルにおいて、抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体は、対照ＩｇＧ処置動物と比較して、有意なＴ細胞媒介性抗腫瘍活性を示した。

本明細書で使用される異種移植マウスモデルでは、ＰＢＭＣ−ヒト化マウスに注入されたがん細胞が、ＲＫＯ細胞であって、比較的高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現するが、ＣＤ１３７を発現しない十分に確立されたヒト結腸癌細胞株であった。免疫不全マウスに注入されたＰＢＭＣが、移植後５日目の早期にＣＤ１３７を発現し、それが少なくとも２２日目まで継続することが示された（Ｓａｎｍａｍｅｄｅｔａｌ２０１５）という事実は、ＲＫＯ細胞を保有するＰＢＭＣ−ヒト化マウスが、「トランス」構成（ＲＫＯ細胞上のＰＤ−Ｌ１及びＴ細胞上のＣＤ１３７）でＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体の標的を発現するための理想的なモデルであることを示す。加えて、ＰＢＭＣドナーは、移植後少なくとも４０日間、移植片対宿主疾患につながることはない。したがって、このモデルは、免疫調節剤の有効性を評価するためにロバストである。

方法
９週齢の雌ＮＯＤＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスに、尾静脈注射によって、３×１０^７個のヒトＰＢＭＣを移植した。７日後、各試験マウスは、右脇腹に０．１ｍＬの５０％マトリゲル中の５×１０^６個のＲＫＯ腫瘍細胞の皮下注射を受けた。５０〜８０ｍｍ^３の標的範囲に近い平均腫瘍体積として、キャリパーによって腫瘍増殖を監視した。試験の１日目と表示される腫瘍細胞移植後から４日目に、４０〜６３ｍｍ^３の個々の腫瘍体積を有する動物を、８匹の動物の４つの群に分類した。各群の腫瘍保有動物は、１、４、８、１１、１５及び１８日目に１００μＬのＰＢＳ中１００μｇの用量で、抗体の６回腹腔内注射を受けた。４つの異なる群は、陰性対照（ＩｇＧ）、又はベンチマーク抗体２０Ｈ４．９（抗ＣＤ１３７）若しくはＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（抗ＰＤ−Ｌ１）、又はＰＢ１７３１１（抗ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１）を受けた。腫瘍増殖の阻害を評価したときの１９日目の試験の終了までに、キャリパーを使用して腫瘍体積を週３回測定した。

腫瘍増殖阻害（Tumor growth inhibition、ＴＧＩ）は、処置されたマウス及び対照マウスの１９日目の腫瘍体積中央値（median tumor volume、ＭＴＶ）の間のパーセント差として定義し、グループ間の差は、マン・ホイットニー検定を使用してＰ≦０．０５において統計的に有意であるとみなされる群間の差として定義した。治療忍容性を、体重測定及び治療関連有害事象の臨床的徴候について頻繁に観察することによって評価した。図４０は、群による腫瘍体積分布の箱ひげ図を提供する。１９日目に、ＩｇＧ対照中のマウスの腫瘍体積中央値（ＭＴＶ）は５１７ｍｍ^３であって、個々の腫瘍体積範囲は、４２９〜８０７ｍｍ^３であった。３つの処理群のうち、ＰＢ１７３１１（２６４ｍｍ^３のＭＴＶ、ＴＧＩ４９％を伴う）は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（２８３ｍｍ^３のＭＴＶ、ＴＧＩ４５％を伴う）並びに２０Ｈ４．９（３３９ｍｍ^３のＭＴＶ及びＴＧＩ３４％を伴う）と同様に有効であった。全ての処置は、対照群のＭＴＶよりも有意に低いＭＴＶをもたらした（２０Ｈ４．９についてはＰ＜０．０５、ＰＢ１７３１１及びＹＷ２４３．５５．Ｓ７０についてはＰ＜０．００１）。２０Ｈ４．９を受けた１匹の動物は８日目に死亡し、剖検により、ピンク色の肺及び斑状の肝臓が明らかになった。この群の動物はまた、最大平均ＢＷ損失（１５日目に最低点で−８．０％）を経験した。その他のものでは、治療は十分に忍容された。

要約すると、ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体ＰＢ１７３１１は、ヒトＰＢＭＣを移植したＮＳＧマウスにおけるヒトＲＫＯ結腸癌の治療として統計的に有意な生存効果を提供した。ＰＢ１７３１１による治療結果はより良好であり、２０Ｈ４．９と比較して副作用が少なかった。

実施例１７
ＣＤ１３７標的化抗体のアゴニスト活性を有するｓＣＤ１３７の干渉
可溶性ＣＤ１３７は、二価のＣＤ１３７抗体よりも二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体のアゴニスト活性とあまり干渉しない。
ＣＤ１３７発現は、細胞表面から排出される抗原によって調節される。ｓｈｅｄ抗原（ｓＣＤ１３７）は、血液並びに細胞外空間内に見出され、したがって、ＣＤ１３７標的化抗体のクリアランスの競合シンクとして機能することができる。

研究は、ｓＣＤ１３７が、調節性Ｔ細胞などの高レベルのＣＤ１３７を発現している免疫細胞から排出されること（Ｒｉｄｇｗａｙｅｔａｌ．，２０１４）、及びｓＣＤ１３７及びｓＣＤ１３７Ｌの両方が、結腸直腸患者のがん細胞によって産生されること（Ｄｉｍｂｅｒｇｅｔａｌ．，２００６）が示している。加えて、腫瘍細胞株の低酸素状態への曝露は、ＣＤ１３７発現を促進し、最も優勢な形態は可溶性変異体である（Ｌａｂｉａｎｏｅｔａｌ，２０１６）。健康なドナーにおけるｓＣＤ１３７の平均血清レベルは、０．０２〜０．２ｎｇ／ｍｌの範囲であるが、様々な疾患状態におけるレベルがより高いことが知られており、０．２〜３．６ｎｇ／ｍｌの範囲に及ぶ（Ｍｉｃｈｅｌｅｔａｌ，１９９８、Ｓｈａｏｅｔａｌ，２０１２）。ｓＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞を調節するように見える（腫瘍微小環境に排出されると、これは免疫系の活性を弱め、それによって免疫回避を媒介する）。ｓＣＤ１３７は、ＣＤ１３７Ｌへの結合のために膜結合ＣＤ１３７と競合し、それによってＴ細胞上で発現されたＣＤ１３７を介したシグナル伝達をブロックすると考えられる。

上記のメカニズムを考慮して、ｓＣＤ１３７が、インビトロでヒト初代Ｔ細胞を活性化する二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＢ１７３１１及び参照抗体の能力に影響を及ぼすかどうかを判定した。このような活性化を、過剰量のｓＣＤ１３７の非存在下又は存在下で、ジャーカットレポーター／ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１トランス活性化アッセイで測定した。このアッセイでは、ジャーカットレポーターＴ細胞株はＣＤ１３７を発現し、レポーター遺伝子はＣＤ１３７に特異的な抗体によって活性化される。Ｔ細胞を、ＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞を模倣し、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体によるＴ細胞の活性化に必要とされる、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞と共培養した。

この目的のために、平底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９１７）を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ−３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６−００３７−８５）で一晩コーティングした。翌日、ジャーカットＣＤ１３７−ＮＦκＢｌｕｃレポーター細胞を解凍し、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（アッセイ培地）で洗浄した。細胞を２×１０^６個細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。プレコーティングされた９６ウェルプレートをＰＢＳで２回洗浄した後、２５μＬの試験抗体（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、続いて２５μＬのｓＣＤ１３７の混合物（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号９２２０−４Ｂ）２０μｇ／ｍＬで開始して、５段階の３倍希釈で（最終濃度）で添加した。次いで、２５μＬのジャーカットＮＦκＢｌｕｃ（５００００個細胞／ウェル、２×１０^６個細胞／ｍｌ）を添加し、続いて、２５μＬのＣＨＯ−Ｋ１／ＣＨＯ．ｈｕＰＤ−Ｌ１細胞（１２５００個細胞／ウェル、５×１０^５個細胞／ｍｌ）を添加した。翌日、プレートを室温に平衡化し、１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ／ウェル（室温）を添加し（一回に最大４プレート）、続いて室温で５分間インキュベートした。ＢｉｏｔｅｋＳｙｎｅｒｇｙ２マルチモードマイクロプレートリーダー（発光モード）でプレートを測定した。ルシフェラーゼ活性に関する活性化は、組換えタンパク質を添加せずに得られた割合として表した。

これらの結果を図４１に示しており、高濃度の可溶性ＣＤ１３７が、両方の試験抗体のアゴニスト活性を実際に干渉し得ることを示す。しかしながら、重要なことに、ｓＣＤ１３７競合は、二重特異性ＣＤ１３７×ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＢ１７３１１よりも抗ＣＤ１３７参照抗体（クローン２０Ｈ４．９）に対してはるかに大きな効果を有するように見える。このことから、ＰＢ１７３１１のインビボ効果は、ベンチマーク抗体２０Ｈ４．９と比較して免疫抑制機構に対して感受性が低くなると結論付けられる。

表

ＭＦ、Ｆａｂの固有ＩＤ、ＣＤＲ３、ＣＤＲ３の配列、ＶＨ生殖細胞系列、ＶＨに由来、ビン、ビンへの特異的分類（Ｐ１３０６−Ｓ３３）、ドメイン、マウスヒトスワップドメイン構築物を用いて抗体がマッピングされたＣＤ１３７ドメイン（１又は２は、抗体が２つのドメインのうちの１つに明確にマッピングされ得ないことを意味する）、アゴニスト二価、ジャーカット−ＮＦκＢ−ｌｕｃ−ＣＤ１３７を活性化するための二価抗体の能力、ＣＤ１３７のブロック％、ＦａｂアームがＣＤ１３７との相互作用をブロックするための能力、レポーター、レポーターアッセイからのデータ、Ｔ細胞、Ｔ細胞アッセイからのデータ、ＰＤ−Ｌ１ＮＢ、ＰＤ−Ｌ１非ブロッキングＦａｂアームと組み合わされたＣＤ１３７Ｆａｂ、ＰＤ−Ｌ１Ｂ、ＰＤ−Ｌ１ブロッキングＦａｂアームと組み合わされたＣＤ１３７Ｆａｂ。

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Ｗｏｎ，Ｅ．Ｙ．，Ｃｈａ，Ｋ．，Ｂｙｕｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｄ．Ｕ．，Ｓｈｉｎ，Ｓ．，Ａｈｎ，Ｂ．，・・・Ｃｈｏ，Ｈ．Ｓ．（２０１０）．Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｔｒｉｍｅｒｏｆｈｕｍａｎ４−１ＢＢｌｉｇａｎｄｉｓｕｎｉｑｕｅａｍｏｎｇｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８５（１２），９２０２−９２１０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１０９．０８４４４２
Ｙｉ，Ｌ．，Ｚｈａｏ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｄａｉ，Ｍ．，Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ｅ．，Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｈ．（２０１４）．ＨｕｍａｎａｎｄｍｏｕｓｅＣＤ１３７ｈａｖｅｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇＣＲＤｓｔｏｔｈｅｉｒｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｉｇａｎｄｓ．ＰＬｏＳＯＮＥ，９（１）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８６３３７
Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｗｅｉ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｂａｉ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｐ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｊｉａｎｇ，Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｃａｉ，Ｈ．，Ｘｕ，Ｔ．，Ｚｈｏu，Ａ．（２０１７）．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｏｆａｎｏｖｅｌＰＤ−Ｌ１ｎａｎｏｂｏｄｙｆｏｒｉｍｍｕｎｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｂｌｏｃｋａｄｅ．ＣｅｌｌＤｉｓｃｏｖｅｒｙ３，１７００４．Ｚｈａｏｅｔａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）ｔｏｅｎｈａｎｃｅＣＤ８Ｔｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｗｉｔｈｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｖｉｒａｌａｎｔｉｇｅｎｓ．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３，２０１２
Ｚｈｏｕｅｔａｌ．ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡｇａｉｎｓｔＩｍｍｕｎｅＣｈｅｃｋｐｏｉｎｔＭｏｌｅｃｕｌｅｓＲｅｓｔｏｒｅＦｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＴｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇＴｃｅｌｌｓｉｎＨｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒＣａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ２０１７ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１７．０６．０１７．

Claims

細胞上のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの活性を刺激する方法であって、第１の細胞及び第２の細胞を準備することを含み、前記第１の細胞が細胞膜上に前記メンバーを有し、前記第２の細胞が細胞膜上に第２の膜タンパク質を有し、前記方法が、前記細胞を、２つの可変ドメインを含む二重特異性抗体と接触させることを含み、１つの可変ドメインが、前記メンバーの細胞外部分に結合することができる第１の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、前記第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第２の抗原結合部位を含み、それによって、前記第１の細胞上の前記メンバーの活性を刺激する、方法。
前記第２の膜タンパク質が、前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない、請求項１に記載の方法。
前記二重特異性抗体が、２つの抗原結合部位を含む、請求項１又は２に記載の方法。
前記二重特異性抗体の前記抗原結合部位が、前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの前記メンバーの細胞外部分に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインと、前記第２の膜タンパク質に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記二重特異性抗体が、完全長抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記二重特異性抗体がＩｇＧである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記第１の細胞が、細胞膜上で前記第２の膜タンパク質を有意に発現しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の膜タンパク質が、細胞膜上の１つ以上の区域に存在する膜タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記区域が、細胞膜上のクラスター、ドメイン、マイクロドメイン又はコンパートメント、好ましくは免疫シナプスである、請求項８に記載の方法。
前記第２の膜タンパク質が、２つ以上の前記第２の膜タンパク質のインスタンスを含む多量体膜タンパク質の一部として細胞膜上に存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の膜タンパク質が、ホモ二量体又はホモ三量体の一部として細胞膜上に存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の膜タンパク質が、Ｂ７ファミリーのメンバーである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の膜タンパク質が、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２であり、好ましくはＰＤ−Ｌ１である、請求項１２に記載の方法。
前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの前記メンバーに結合する前記可変ドメインが、前記メンバーに対するリガンドの結合をブロックする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの前記メンバーの細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの前記メンバーに結合する２つの前記可変ドメインを含む二価の単一特異性抗体フォーマットである場合、細胞上の前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性を刺激しない可変ドメインとして定義される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの前記メンバーの細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、前記第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む更なる二重特異性抗体を準備することを更に含み、前記第１及び第２の二重特異性抗体が、
前記第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
前記第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
前記第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び前記第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
前記方法が、前記第１の細胞及び第２の細胞を前記第１及び第２の二重特異性抗体と共にインキュベートすることによって、前記第１の細胞上の前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの前記メンバーの活性を刺激することを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
前記第１及び前記第２の二重特異性抗体がそれぞれ、前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの前記メンバーに結合することができる１つの抗原結合部位を含む、請求項１６に記載の方法。
前記第２の膜タンパク質に結合することができる前記第１及び第２の二重特異性抗体の前記抗原結合部位が、膜第２の膜タンパク質の前記細胞外部分上の異なるエピトープに結合する、請求項１６又は１７に記載の方法。
前記第２の膜タンパク質の前記細胞外部分上の前記異なるエピトープが、非競合エピトープである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＣＤ１３７又はＯＸ４０である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
ＣＤ１３７の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位と、第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位とを含む二重特異性抗体。
前記第２の膜タンパク質が、前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーではない、請求項２１に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体が、２つの抗原結合部位を含む、請求項２１又は２２に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体の前記抗原結合部位が、前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの前記メンバーの細胞外部分に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインと、前記第２の膜タンパク質に結合することができる１つの免疫グロブリン可変ドメインとからなる、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体が、完全長抗体である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体がＩｇＧである、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記ＣＤ１３７に結合することができる１つの抗原結合部位を含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記第２の膜タンパク質が、Ｔ細胞によって有意な程度では発現されない、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記第２の膜タンパク質が、抗原提示細胞、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、又は寄生体感染細胞上で発現される、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記第２の膜タンパク質が、細胞膜上の１つ以上の区域に存在する膜タンパク質である、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記区域が、細胞膜上のクラスター、ドメイン、マイクロドメイン又はコンパートメント、好ましくは免疫シナプスである、請求項３０に記載の二重特異性抗体。
前記第２の膜タンパク質が、２つ以上の前記第２の膜タンパク質を含む多量体膜タンパク質の一部として細胞膜上に存在する、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記第２の膜タンパク質が、ホモ二量体又はホモ三量体の一部として細胞膜上に存在する、請求項２１〜３２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記第２の膜タンパク質が、Ｂ７ファミリーのメンバーである、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
前記第２の膜タンパク質が、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２であり、好ましくはＰＤ−Ｌ１である、請求項２１〜３４に記載の二重特異性抗体。
ＣＤ１３７に結合する前記可変ドメインが、前記ＣＤ１３７に対するリガンドの結合をブロックする、請求項２１〜３５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
ＣＤ１３７の細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＣＤ１３７に結合する２つの前記可変ドメインを含む二価の単一特異性抗体フォーマットである場合、細胞上のＣＤ１３７の活性を刺激しない可変ドメインとして定義される、請求項２１〜３６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
請求項２１〜３７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を１つ以上含む組成物又はキットオブパーツ。
請求項２１〜３７のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体を２つ以上含む組成物又はキットオブパーツであって、第１及び第２の二重特異性抗体のＣＤ１３７又はＯＸ４０に結合することができる前記抗原結合部位が、前記ＣＤ１３７又はＯＸ４０上の異なるエピトープに結合する、組成物又はキットオブパーツ。
細胞上のＣＤ１３７の活性を刺激する方法であって、第１の細胞及び第２の細胞を準備することを含み、前記第１の細胞が細胞膜上に前記ＣＤ１３７（第１の膜タンパク質）を有し、前記第２の細胞が細胞膜上に第２の膜タンパク質を有し、前記方法が、前記細胞を、２つの可変ドメインを含む二重特異性抗体（第１の二重特異性抗体）と接触させることを含み、１つの可変ドメインが、前記第１の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第１の抗原結合部位を含み、別の可変ドメインが、前記第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる第２の抗原結合部位を含み、それによって、前記第１の細胞上の前記第１の膜タンパク質の活性を刺激する、方法。
前記第１の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を含む可変ドメインと、前記第２の膜タンパク質の細胞外部分に結合することができる抗原結合部位を含む可変ドメインとを含む更なる二重特異性抗体（第２の二重特異性抗体）を準備することを更に含み、前記第１及び第２の二重特異性抗体が、
前記第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ、
前記第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ、又は
前記第１の膜タンパク質上の異なるエピトープ及び前記第２の膜タンパク質上の異なるエピトープ
に結合し、
前記方法が、前記第１の細胞及び第２の細胞を、前記第１及び第２の二重特異性抗体と共にインキュベートすることによって、前記第１の細胞上のＣＤ１３７の活性を刺激することを更に含む、請求項４０に記載の方法。
前記第２の膜タンパク質が、Ｂ７ファミリーのメンバーである、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
ＣＤ１３７及びＰＤ−Ｌ１に結合することができる抗体又はその機能的部分、派生体及び／若しくは類似体。
二重特異性抗体である、請求項４３に記載の抗体又は機能的部分若しくは派生体若しくは類似体。