TW201930355A - 結合物件(三) - Google Patents

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萊恩 費赫勒
穆斯塔法 法洛迪
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Abstract

本申請案係有關於結合程式性死亡配體1(PD-L1)的專一性結合物件。該專一性結合物件較佳包含座落於該專一性結合物件的一恆定域之結構環內的一PD-L1抗原結合位址。該專一性結合物件於舉例而言，癌症治療以及感染性疾病、發炎、與發炎相關的疾病及病況、及發炎疾病方面獲得應用。

Description

結合物件(三)
發明領域
本發明係有關於結合程式性死亡配體1(PD-L1)的專一性結合物件。該專一性結合物件較佳包含座落於該專一性結合物件的一恆定域之結構環內的一PD-L1抗原結合位址。本發明之專一性結合物件於舉例而言，癌症治療以及感染性疾病與發炎方面獲得應用。
發明背景
程式性細胞死亡1(PD-1)及其之配體PD-L1(CD274，B7-H1)與PD-L2(B7-DC)遞送抑制訊息以調節T細胞活化、耐受性及免疫病理學之間的平衡。PD-L1持續或暫時地表現於多種免疫細胞類型及某些腫瘤細胞上。
PD-L1為第I型跨膜蛋白具有二個似Ig域於細胞外區域、一個跨膜域及一個短的細胞質域。可以於UniProt登錄號Q9NZQ7找到完整的人類PD-L1的序列。細胞質域沒有已知的訊息傳遞部分，暗示關於PD-L1沒有透過配體及其受體之交互作用發送訊息。人類PD-L1的分子量為40 kDa(290個胺基酸)且其分別與鼠類及食蟹獼猴(cynomolgus)之PD-L1異種同源物共享70 %及93 %的胺基酸同一性。
人類PD-L1係以770 nM之親和力(KD )與其之受體PD-1結合。PD-1係表現於活化的T細胞、B細胞及骨髓細胞上，以及調控細胞免疫反應的活化或抑制。PD-L1與PD-1之結合遞送了抑制訊息，減少細胞介素生產及T細胞增殖。結果，細胞之PD-L1表現能媒介防範胞毒型T淋巴細胞(CTL)毒殺作用且為病毒感染期間減輕慢性免疫反應的調控機轉。癌症，如同慢性及促進發炎性(pro-inflammatory)疾病，通過上調PD-L1表現而破壞此免疫保護途徑以躲避宿主的免疫反應。於主動免疫反應的情況中，IFNγ亦會上調PD-L1的表現。
PD-L1亦會通過與另一種蛋白B7.1(也稱為CD80)之交互作用來媒介免疫抑制作用，阻斷其通過CD28遞送T細胞活化的第二信號之一的能力。
種類繁多的實性腫瘤業已顯示出PD-L1的表現。於一項研究中檢查的654個樣本中，包括來自不同位址的19種腫瘤，14%為PD-L1陽性。最高的PD-L1陽性頻率見於頭頸部(31%)、子宮頸(29%)、不明原始來源的癌症(CUP；28%)、多形性神經膠質母細胞瘤(GBM；25%)、膀胱癌(21%)、食道癌(20%)、三重陰性(TN)乳癌(18%)及肝癌(15%) (Grosso等人，2013)。PD-L1之腫瘤關聯性表現已經顯示出會賦予免疫抗性及可能保護腫瘤細胞免受T細胞媒介的細胞凋亡。
靶定PD-L1的療法已經於鼠類活體內 研究中顯示出傑出的結果。於黑色素瘤之B16鼠類模式中，抗-PD-L1組合以GVAX或FVAX疫苗接種策略的治療，對於研究結束後之存活(對照為30天vsPD-L1-治療為52天)及無腫瘤動物百分率(5%)二者均導致顯著效應(Curran等人，2010)。抗-PD-L1療法也已經用來研究P815鼠類乳腺瘤(mastoma)模式內免疫抑制作用的機轉。注射至小鼠內的P815細胞通常會觸發強大的免疫反應，其導致其等之排斥作用。當PD-L1表現於P815細胞上時，此等細胞逃避免疫的攻擊，此又能通過投予抗-PD-L1抗體而失效(Iwai等人，2002)。很明顯地靶定免疫性人類癌症的PD-1/PD-L1中心(Herbst等人，2014)會通過刺激抗癌的免疫反應而導致存活優勢(Wolchok等人，2013；Larkin等人，2015)。
臨床試驗業已顯示靶定患者的PD-L1之臨床獲益，其迄今導致三種抗-PD-L1靶定單株抗體的許可。
阿替珠單抗(Atezolizumab) ((癌自禦™ (Tecentriq™))為一種結合PD-L1的人化IgG1抗體。其於臨床試驗作為單方療法並且也與其他治療實性癌症，包括結腸直腸癌、乳癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌及腎細胞癌的生物製品及/或小分子療法組合。
阿維魯單抗(Avelumab) (Bavencio™)為一種結合PD-L1之完全的人類IgG1抗體且正進行一些癌症的臨床試驗，包括膀胱癌、胃癌、頭頸部癌症、間皮瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、腎癌、默克細胞癌(Merkel-cell carcinoma)及轉移的泌尿上皮癌(UC)。
德瓦魯單抗(Durvalumab) (Imfinzi™)為一種結合PD-L1之人類IgG1抗體且於頭頸部鱗狀細胞癌、膀胱癌、胰臟癌之臨床試驗中單獨測試或與摧麥拉單抗(tremelimumab)組合測試，以及於額外的實性癌症例如胃癌、黑色素瘤及不可切除的肝細胞癌之試驗中與其他的生物製品及小分子組合測試。
業已許可德瓦魯單抗用於治療有局部晚期或轉移的泌尿上皮癌及不可切除的第三期NSCLC的患者。
另外的抗-PD-L1抗體，包括BMS-936559(NCT00729664)，業已在臨床試驗中測試，且其餘者係於臨床前試驗中。
感染性疾病與腫瘤學顯示出許多相似之處。一般認為可以利用PD-L1於免疫調節的角色來使對抗病原體的免疫反應達到最大。感染性疾病之免疫調控為醫學新興的領域且早期評論暗示PD-L1阻斷可改善感染的生物反應，特別地，幫助抵消T細胞衰竭、管理免疫媒介的廓清作用(clearance)及產生長期的免疫性(Wykes, M. N. and Lewin, S. R., 2018)。
再者，近來的研究也暗示PD-1/PD-L1途徑可以為治療發炎、與發炎相關的疾病及病況、及發炎疾病之治療標靶，例如中風及中風相關的發炎(Bodhankar等人，2015)，及血管發炎或血管炎，諸如，中及大血管血管炎，或中樞及/或周邊神經系統血管炎(Hid Cadena等人，2018及Daxini等人，2018)。
雖然有各種抗-PD-L1療法在發展中，但目前的數據顯示用現存的抗-PD-L1單方療法之整體治療導致低於50%的癌症患者有反應。於臨床試驗中報導的不良反應範圍和嚴重程度於抗體之間有差異。為了增加客觀緩解率(ORR)及/或降低不良效應，抗-PD-L1抗體可組合以其他的生物製品，例如對其他檢查點調節劑的抗體，以及小分子療法及其他免疫系統活化方法，例如腫瘤疫苗。
因而，本技藝仍然需要能靶定PD-L1且於癌症療法方面獲得應用之額外的分子。
此外，本技藝也仍然需要能靶定PD-L1且於治療感染性疾病方面獲得應用之額外的分子。
再者，本技藝也仍然需要能靶定PD-L1且於治療發炎、與發炎相關的疾病及病況、及發炎疾病方面獲得應用之額外的分子。
發明概要
本發明人已製備一些專一性結合物件，其包含PD-L1的非天然結合位址於該專一性結合物件的CH3域內。單離此等專一性結合物件係通過天然CH3域噬菌體庫的初始篩選，接著複雜的疊代輪次的突變誘發、篩選及選擇程序以單離出對於PD-L1有改良的活性及親和力之初始篩選的專一性結合物件之變異體。
本發明人發現從初始的親和力成熟程序接著天然CH3域噬菌體庫的初始篩選所辨識出的專一性結合物件，對於PD-L1顯示出增高的親和力，以及PD-L1及其配體PD-1之間的交互作用之阻斷增高。然而，擇出的專一性結合物件意外地於T細胞活化分析中具有非常弱的活性。
於額外輪次的突變誘發、篩選及選擇之後，本發明人辨識出專一性結合物件，其不止對於PD-L1有高親和力且亦於T細胞活化分析中具有優異的活性。此等專一性結合物件意外地包含AB結構環序列中有一缺失(座落於該AB結構環之殘基14、15或16)的CH3域。認為該缺失係源自於意外截斷的突變誘發引子之人工製品。結構環包含此等缺失之該等專一性結合物件通常會於選擇方法期間移除，因缺失很少會導致保留抗原結合活性的專一性結合物件。然而，由於本發明人使用的突變誘發方法之特定序列，一般認為於AB環突變誘發後未辨識出的此截斷的AB環序列，已經如罕見的殖株或親和力較低的結合物存在於選擇的產品池內。當此截斷的AB結構環序列與另一結構環混洗時，其變成占優勢的AB結構環序列，暗示著此缺失於結構環序列混洗後對專一性結合物件的抗原結合活性及/或結構貢獻很大。設若本發明人使用更直接的混洗方法，其中AB結構環選擇辨識出最有希望的序列係與來自CD結構環選擇最有希望的序列組合，則AB結構環包含此缺失之該等專一性結合物件不會被辨識出。本發明人發現復原AB結構環缺失的殘基出乎意料地導致所生成供用於PD-L1之專一性結合物件親和力顯著降低，證明AB環的缺失對於PD-L1結合是重要的。
本發明人執行進一步輪次的突變誘發、篩選及選擇俾以移除潛在的製造序列責任(sequence liabilities)並且改良擇出的專一性結合物件之生物物理性質。
以上的方法允許本發明人辨識出大量的專一性結合物件，其包含一PD-L1結合位址於其等之CH3域，且其與PD-L1顯示出優異的結合作用，以及於T細胞活化分析中顯示出或是預期會具有高活性。基於此等特徵，預期本發明的專一性結合物件經由抑制PD-L1，會於治療人類癌症，以及感染性疾病、發炎、與發炎相關的疾病及病況、及發炎疾病方面獲得應用。
該專一性結合物件亦顯示出對於食蟹獼猴(cynomolgus)PD-L1具有高親和力，其比得上對於人類PD-L1之親和力且預期可用於食蟹獼猴疾病模式內評估該專一性結合物件的性質。原因是，比起以一種對於人類及食蟹獼猴PD-L1之親和力有較高變異性的專一性結合物件於食蟹獼猴模式內測試時，該等獲得的結果更有可能預測該專一性結合物件於人類患者的效應。
因而，於第一個態樣中本發明提供一種專一性結合物件，其與PD-L1結合以及包含一PD-L1抗原結合位址座落於該專一性結合物件的一恆定域，例如CL、CH1、CH2或CH3域，較佳為CH1、CH2或CH3域，最佳為CH3域。
本發明的專一性結合物件之PD-L1結合位址較佳包含：
(i) 一第一序列座落於該CH3域的該AB結構環之位置14至18處，其中該專一性結合物件於該CH3域的位置14、15或16處包含一胺基酸缺失，且其中該第一序列係由下列組成：
(a) 胺基酸序列SGYW(序列辨識編號：23)，或
(b)序列辨識編號：23之一變異體，其中
該絲胺酸(S)係用胺基酸A、E、F、G、H、I、L、P、R、T、V、或Y予以取代，及/或
該甘胺酸(G)係用胺基酸A、D、E、F、H、K、L、N、P、R、T、V、或Y予以取代；
(ii) 一第二序列座落於該CH3域的該CD結構環之位置45.1至78處，其中該第二序列係由下列組成：
(a) 胺基酸序列EPQYWA(序列辨識編號：11)，或
(b)序列辨識編號：11之一變異體，其中
該麩胺酸(E)係用胺基酸A、G、H、I、L、N、Q、R、S、或W予以取代，及/或
該脯胺酸(P)係用胺基酸A、D、E、G、H、N、Q、W、或Y予以取代，及/或
該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸H、或N予以取代，及/或
該酪胺酸(Y)係用胺基酸A、D、H、T、或V予以取代，及/或
該丙胺酸(A)係用胺基酸D、E、G、L、R、S、或W予以取代；及
(iii) 一第三序列座落於該CH3域的該EF結構環之位置92至100處，其中該第三序列係由下列組成：
(a) 胺基酸序列SNWRWQMDD(序列辨識編號：19)，或
(b)序列辨識編號：19之一變異體，其中
於位置92處的該絲胺酸(S)係用胺基酸A、或G予以取代，及/或
於位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸A、E、F、G、H、I、K、L、Q、R、S、T、或Y予以取代，及/或
於位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸A、D、E、F、G、H、K、L、N、R、S、或V予以取代，及/或
於位置98處的該甲硫胺酸(M)係用胺基酸F、I、L、V、W、或Y予以取代，及/或
於位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸E、A、I、L、R、S、T、V、W、或Y予以取代，及/或
於位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸A、E、F、I、K、L、N、R、V、W、或Y予以取代；以及
其中於該CH3域的位置101處的該胺基酸為纈胺酸(V)或不存在；
其中該胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics(IMGT)編號方式。
本發明因而提供：
[1]一種專一性結合物件，其與PD-L1結合以及包含一PD-L1抗原結合位址座落於該專一性結合物件的一CH3域，其中該PD-L1結合位址包含：
(i) 一第一序列座落於該CH3域的該AB結構環之位置14至18處，其中該專一性結合物件於該CH3域的位置14、15或16處包含一胺基酸缺失，
(ii) 一第二序列座落於該CH3域的該CD結構環之位置45.1至78處，以及
(iii) 一第三序列座落於該CH3域的該EF結構環之位置92至100處。
[2]如[1]之專一性結合物件，其中該第一序列係由胺基酸序列SGYW(序列辨識編號：23)或其之一變異體組成。
[3]如[1]或[2]之專一性結合物件，其中該第二序列係由胺基酸序列EPQYWA(序列辨識編號：11)或其之一變異體組成。
[4]如[1]至[3]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由胺基酸序列SNWRWQMDD(序列辨識編號：19)或其之一變異體組成。
[5]如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸A予以取代。
[6] 如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸E予以取代。
[7] 如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸F予以取代。
[8] 如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸G予以取代。
[9] 如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸H予以取代。
[10] 如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸I予以取代。
[11] 如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸L予以取代。
[12] 如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸P予以取代。
[13] 如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸R予以取代。
[14] 如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸T予以取代。
[15] 如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸V予以取代。
[16] 如[1]至[4]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸Y予以取代。
[17] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸A予以取代。
[18] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸D予以取代。
[19] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸E予以取代。
[20] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸F予以取代。
[21] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸H予以取代。
[22] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸K予以取代。
[23] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸L予以取代。
[24] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸N予以取代。
[25] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸P予以取代。
[26] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸R予以取代。
[27] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸T予以取代。
[28] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸V予以取代。
[29] 如[1]至[16]中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列係由序列辨識編號：23之一變異體組成，其中該甘胺酸(G)係用胺基酸Y予以取代。
[30] 如[1]至[29]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩胺酸(E)係用胺基酸A予以取代。
[31] 如[1]至[29]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩胺酸(E)係用胺基酸G予以取代。
[32] 如[1]至[29]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩胺酸(E)係用胺基酸H予以取代。
[33] 如[1]至[29]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩胺酸(E)係用胺基酸I予以取代。
[34] 如[1]至[29]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩胺酸(E)係用胺基酸L予以取代。
[35] 如[1]至[29]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩胺酸(E)係用胺基酸N予以取代。
[36] 如[1]至[29]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩胺酸(E)係用胺基酸Q予以取代。
[37] 如[1]至[29]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩胺酸(E)係用胺基酸R予以取代。
[38] 如[1]至[29]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩胺酸(E)係用胺基酸S予以取代。
[39] 如[1]至[29]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩胺酸(E)係用胺基酸W予以取代。
[40] 如[1]至[39]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該脯胺酸(P)係用胺基酸A予以取代。
[41] 如[1]至[39]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該脯胺酸(P)係用胺基酸D予以取代。
[42] 如[1]至[39]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該脯胺酸(P)係用胺基酸E予以取代。
[43] 如[1]至[39]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該脯胺酸(P)係用胺基酸G予以取代。
[44] 如[1]至[39]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該脯胺酸(P)係用胺基酸H予以取代。
[45] 如[1]至[39]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該脯胺酸(P)係用胺基酸N予以取代。
[46] 如[1]至[39]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該脯胺酸(P)係用胺基酸Q予以取代。
[47] 如[1]至[39]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該脯胺酸(P)係用胺基酸W予以取代。
[48] 如[1]至[39]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該脯胺酸(P)係用胺基酸Y予以取代。
[49] 如[1]至[48]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸H予以取代。
[50] 如[1]至[48]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸N予以取代。
[51] 如[1]至[50]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該酪胺酸(Y)係用胺基酸A予以取代。
[52] 如[1]至[50]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該酪胺酸(Y)係用胺基酸D予以取代。
[53] 如[1]至[50]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該酪胺酸(Y)係用胺基酸H予以取代。
[54] 如[1]至[50]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該酪胺酸(Y)係用胺基酸T予以取代。
[55] 如[1]至[50]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該酪胺酸(Y)係用胺基酸V予以取代。
[56] 如[1]至[55]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該丙胺酸(A)係用胺基酸D予以取代。
[57] 如[1]至[55]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該丙胺酸(A)係用胺基酸E予以取代。
[58] 如[1]至[55]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該丙胺酸(A)係用胺基酸G予以取代。
[59] 如[1]至[55]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該丙胺酸(A)係用胺基酸L予以取代。
[60] 如[1]至[55]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該丙胺酸(A)係用胺基酸R予以取代。
[61] 如[1]至[55]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該丙胺酸(A)係用胺基酸S予以取代。
[62] 如[1]至[55]中任一項之專一性結合物件，其中該第二序列係由序列辨識編號：11之一變異體組成，其中該丙胺酸(A)係用胺基酸W予以取代。
[63] 如[1]至[62]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置92處的該絲胺酸(S)係用胺基酸A予以取代。
[64] 如[1]至[62]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置92處的該絲胺酸(S)係用胺基酸G予以取代。
[65] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸A予以取代。
[66] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸E予以取代。
[67] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸F予以取代。
[68] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸G予以取代。
[69] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸H予以取代。
[70] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸I予以取代。
[71] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸K予以取代。
[72] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸L予以取代。
[73] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸Q予以取代。
[74] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸R予以取代。
[75] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸S予以取代。
[76] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸T予以取代。
[77] 如[1]至[64]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸Y予以取代。
[78] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸A予以取代。
[79] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸D予以取代。
[80] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸E予以取代。
[81] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸F予以取代。
[82] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸G予以取代。
[83] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸H予以取代。
[84] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸K予以取代。
[85] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸L予以取代。
[86] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸N予以取代。
[87] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸R予以取代。
[88] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸S予以取代。
[89] 如[1]至[77]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸V予以取代。
[90] 如[1]至[89]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置98處的該甲硫胺酸(M)係用胺基酸F予以取代。
[91] 如[1]至[89]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置98處的該甲硫胺酸(M)係用胺基酸I予以取代。
[92] 如[1]至[89]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置98處的該甲硫胺酸(M)係用胺基酸L予以取代。
[93] 如[1]至[89]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置98處的該甲硫胺酸(M)係用胺基酸V予以取代。
[94] 如[1]至[89]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置98處的該甲硫胺酸(M)係用胺基酸W予以取代。
[95] 如[1]至[89]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置98處的該甲硫胺酸(M)係用胺基酸Y予以取代。
[96] 如[1]至[95]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸E予以取代。
[97] 如[1]至[95]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸A予以取代。
[98] 如[1]至[95]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸I予以取代。
[99] 如[1]至[95]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸L予以取代。
[100] 如[1]至[95]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸R予以取代。
[101] 如[1]至[95]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸S予以取代。
[102] 如[1]至[95]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸T予以取代。
[103] 如[1]至[95]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸V予以取代。
[104] 如[1]至[95]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸W予以取代。
[105] 如[1]至[95]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸Y予以取代。
[106] 如[1]至[105]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸A予以取代。
[107] 如[1]至[105]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸E予以取代。
[108] 如[1]至[105]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸F予以取代。
[109] 如[1]至[105]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸I予以取代。
[110] 如[1]至[105]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸K予以取代。
[111] 如[1]至[105]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸L予以取代。
[112] 如[1]至[105]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸N予以取代。
[113] 如[1]至[105]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸R予以取代。
[114] 如[1]至[105]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸V予以取代。
[115] 如[1]至[105]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸W予以取代。
[116] 如[1]至[105]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸Y予以取代。
[117]如[1]至[116]中任一項之專一性結合物件，其中於該CH3域的位置101處的該胺基酸為纈胺酸(V)。
[118] 如[1]至[116]中任一項之專一性結合物件，其中於該CH3域的位置101處的該胺基酸不存在。
[119] 如[1]至[118]中任一項之專一性結合物件，其中於該CH3域的位置38處的該胺基酸為纈胺酸(V)。
[120] 如[1]至[118]中任一項之專一性結合物件，其中於該CH3域的位置38處的該胺基酸為丙胺酸(A)。
可以用胺基酸的一字母或三字母密碼或其等之全名來提及其等。二十個標準胺基酸各者的一及三字母密碼以及全名列出如下。
本發明的專一性結合物件之PD-L1結合位址較佳包含一第一序列、第二序列及第三序列，其中：
該第一序列係由下列組成：
(a)胺基酸序列SGYW(序列辨識編號：23)，或
(b)序列辨識編號：23之一變異體，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸E或T予以取代；
該第二序列係由胺基酸序列EPQYWA(序列辨識編號：11)組成；以及
該第三序列係由下列組成：
(a)胺基酸序列SNWRWQMDD(序列辨識編號：19)，或
(b)序列辨識編號：19之一變異體，其中於位置98處的該甲硫胺酸(M)係用胺基酸I、L、或V予以取代；及/或
其中於該CH3域的位置101處的該胺基酸為纈胺酸(V)或不存在。
於優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之結合位址包含Fcab FS17-33-116之該第一序列、第二序列及第三序列，其中該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：19內列出的該序列。
於另一優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之結合位址包含Fcab FS17-33-288之該第一序列、第二序列及第三序列，其中該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：27內列出的該序列。
於另一優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之結合位址包含Fcab FS17-33-289及Fcab FS17-33-334之該第一序列、第二序列及第三序列，其中該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：31內列出的該序列。
於另一優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之結合位址包含Fcab FS17-33-296之該第一序列、第二序列及第三序列，其中該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：35內列出的該序列。
於另一優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之結合位址包含FS17-33-449之該第一序列、第二序列及第三序列，其中該第一序列具有序列辨識編號：42內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：43內列出的該序列。
於另一優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之結合位址包含Fcab FS17-33-451之該第一序列、第二序列及第三序列，其中該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：43內列出的該序列。
除了以上所述的實驗工作，本發明人還執行進一步的突變誘發程式俾以辨識專一性結合物件其包含PD-L1的非天然結合位址於該專一性結合物件的CH3域內，其具有提高的熔化溫度且因而預期是更穩定的。料想此提升的穩定性於該專一性結合物件之製造及儲存是有助益的。
具體而言，本發明人意外地發現本發明之專一性結合物件之CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)殘基回復成為野生型甘胺酸(G)會增加該專一性結合物件的熔化溫度。除了增加熔化溫度，此胺基酸回復還有降低生成的專一性結合物件的突變負荷之額外的優勢。本發明人進一步發現除了回復位置99處，用精胺酸(R)殘基取代該專一性結合物件之CH3域的位置113處的該組胺酸(H)殘基，也會導致專一性結合物件熔化溫度增加之專一性結合物件。此等突變二者均獨立出現二次，表示此等胺基酸改變對於該專一性結合物件的熔化溫度增加可能是重要的。
因而於一優選的具體例中，本發明之專一性結合物件包含一PD-L1結合位址，其包含如本文揭示的一第一、第二及第三序列，其中該第三序列係座落於該CH3域的該EF結構環，較佳於位置92至100處，以及係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於位置99處的該天冬胺酸(D)係用甘胺酸(G)予以取代，更佳地，於位置99處的該天冬胺酸(D)係用甘胺酸(G)予以取代且於位置98處的該甲硫胺酸(M)係用白胺酸(L)予以取代。此外，本發明之專一性結合物件之該CH3域的位置113處的該組胺酸(H)可以用精胺酸(R)予以取代。該專一性結合物件可進一步包含下列額外的突變於該CH3域：
(i) 於位置84.1處的該白胺酸(L)可以用脯胺酸(P)予以取代；及/或
(ii) 於位置85.3處的該絲胺酸(S)可以用蘇胺酸(T)予以取代；及/或
(iii) 於位置101處的該胺基酸可以為丙胺酸(A)。
本發明因而進一步提供：
[121] 如上之[1]至[95]或[106]至[120]中任一項之專一性結合物件，其中該第三序列係由序列辨識編號：19之一變異體組成，其中於該CH3域的位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸G予以取代。
[122]如上之[1]至[116]或[119]至[121]中任一項之專一性結合物件，其中於該CH3域的位置101處的該胺基酸為丙胺酸(A)。
[123] 如上之[1]至[122]中任一項之專一性結合物件，其中於該CH3域的位置113處的該胺基酸為精胺酸(R)。
[124] 如上之[1]至[123]中任一項之專一性結合物件，其中於該CH3域的位置84.1處的該胺基酸為脯胺酸(P)。
[125] 如上之[1]至[124]中任一項之專一性結合物件，其中於該CH3域的位置85.3處的該胺基酸為蘇胺酸(T)。
於優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之PD-L1結合位址包含Fcab FS17-33-488之第一序列、第二序列及第三序列，其中該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：70內列出的該序列，其中於該專一性結合物件的該CH3域的位置84.1、85.3、101及113處的該等殘基分別為脯胺酸(P)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)及精胺酸(R)。
於另外的優選具體例中，本發明的專一性結合物件之PD-L1結合位址包含Fcab FS17-33-539之第一序列、第二序列及第三序列，其中該第一序列具有序列辨識編號：42內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：74內列出的該序列且於該專一性結合物件的該CH3域的位置113處的該殘基為精胺酸(R)。
於更進一步優選的具體例中，該專一性結合物件包含Fcab FS17-33-548之該第一序列、第二序列及第三序列，其中該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：78內列出的該序列。
本發明的專一性結合物件之結合位址可包含總共高達十二個、高達十一個、高達十個、高達九個、高達八個、高達七個、高達六個、高達五個、高達四個、高達三個、高達二個或一個(另外的)胺基酸修飾於一第一、第二及第三序列內，如本文所揭示。於優選的具體例中，該專一性結合物件可包含總共高達三個、高達二個或一個(另外的)胺基酸修飾於一第一、第二及第三序列內，如本文所揭示。於一更優選的具體例中，該專一性結合物件可包含總共高達二個或一個(另外的)胺基酸修飾於一第一、第二及第三序列內，如本文所揭示。於一第一、第二及第三序列內的修飾總數係指組合此等序列導致的修飾總數。
本發明的專一性結合物件之結合位址可包含高達二個或一個(另外的)胺基酸修飾於一第一序列內，如本文所揭示。此外或任擇地，該專一性結合物件可包含高達五個、高達四個、高達三個、高達二個或一個(另外的)胺基酸修飾於一第二序列內，如本文所揭示。此外或任擇地，本發明的專一性結合物件之結合位址可包含高達六個、高達五個、高達四個、高達三個、高達二個或一個(另外的)胺基酸修飾於一第三序列內，如本文所揭示。
於優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之結合位址可包含高達二個或一個(另外的)胺基酸修飾於一第一序列內及/或高達二個或一個(另外的)胺基酸修飾於一第三序列內，如本文所揭示。於一更優選的具體例中，該結合位址可包含一個(另外的)胺基酸修飾於一第一序列內及/或一個(另外的)胺基酸修飾於一第三序列內，如本文所揭示。
於優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之結合位址包含一個(另外的)胺基酸修飾於一第一、第二及第三序列內，如本文所揭示。
本發明的專一性結合物件之結合位址可包含一第三序列，其中於位置98處的該甲硫胺酸(M)係用胺基酸L予以取代。此外，本發明的專一性結合物件之結合位址可包含一、二或三，較佳為一或二，更佳為一個，另外的胺基酸修飾於該第一、第二及第三序列內。
於本發明的專一性結合物件包含一或更多額外的修飾於一第一序列內的情況下，與親代序列相比之下，較佳維持該CH3域的位置14、15或16處之胺基酸缺失及/或該CH3域的位置17、18處之胺基酸較佳為未經修飾的。
於本發明的專一性結合物件包含一或更多額外的修飾於一第二序列內情況下，與親代序列相比之下，該CH3域的位置77處之胺基酸及選擇性地位置45.3處之胺基酸較佳為未經修飾的。
於本發明的專一性結合物件包含一或更多額外的修飾於一第三序列內情況下，與親代序列相比，該CH3域的位置94處之胺基酸及選擇性地位置92處之胺基酸較佳為未經修飾的。
修飾可以為一胺基酸取代、缺失或插入。較佳地，該修飾為一取代。
於優選的具體例中，該專一性結合物件的CH3域的位置101處的該胺基酸為纈胺酸(V)。
於任擇優選的具體例中，該專一性結合物件的CH3域的位置101處的該胺基酸為丙胺酸(A)。
本發明人展現出AB及EF環以及框架區域的某些殘基能轉換回野生型(WT)殘基(參見圖1)且與PD-L1結合時對於該專一性結合物件之解離速率(k解離 )的效應最小，同時降低該專一性結合物件的突變負荷。
因而，於優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之結合位址包含一第一序列，其帶有：
以胺基酸T取代該絲胺酸(S)及/或
以胺基酸K取代甘胺酸(G)。
於另一優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之結合位址包含一第三序列，其帶有：
以胺基酸K取代位置93處的天冬醯胺酸(N)，及/或
以胺基酸N取代位置100處的天冬胺酸(D)。
於該專一性結合物件的該CH3域的位置38處的胺基酸可為纈胺酸或丙胺酸殘基，較佳為丙胺酸殘基。
除了該PD-L1抗原結合位址的序列外，該專一性結合物件的該CH3域之序列，不特別限制。較佳地，CH3域為一種人類免疫球蛋白G域，例如一種人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3域，最佳為一種人類IgG1 CH3域。人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3域的序列為本技藝已知的。
於優選的具體例中，該專一性結合物件包含序列辨識編號：24、28、32、36、39、44或48內列出的該CH3域，更佳為序列辨識編號：28、32、36、39、44或48內列出的該CH3域，最佳為序列辨識編號：32、44或48內列出的該CH3域。
於進一步最優選的具體例中，該專一性結合物件包含序列辨識編號：71、75或79內列出的該CH3域。
任擇地，該專一性結合物件可包含帶有一胺基酸序列之一CH3域，該胺基酸序列與序列辨識編號：24、28、32、36、39、44或48內列出的序列，較佳為序列辨識編號：28、32、36、39、44或48內列出的序列，最佳為序列辨識編號：32、44或48內列出的該CH3域，有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。
依據進一步最優選的具體例，該專一性結合物件包含帶有一胺基酸序列之一CH3域，該胺基酸序列與序列辨識編號：71、75或79內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。
該專一性結合物件可進一步包含一CH2域。該CH2域較佳座落於該CH3域的N端，於人類IgG分子的情況下。該專一性結合物件的CH2域較佳為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2域，更佳為人類IgG1的CH2域。人類IgG域的序列為本技藝已知的。於優選的具體例中，該專一性結合物件包含帶有序列辨識編號：5或6內列出的序列之IgG CH2域，或帶有與序列辨識編號：5或6內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之胺基酸序列的CH2域。任擇地，該專一性結合物件包含帶有序列辨識編號：82內列出的序列之IgG CH2域，或帶有與序列辨識編號：82內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之胺基酸序列的CH2域。
於優選的具體例中，該專一性結合物件包含(i)序列辨識編號：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的CH3域，更佳為序列辨識編號：28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的CH3域，最佳為序列辨識編號：32、44、48、71、75或79內列出的CH3域，以及(ii)序列辨識編號：5內列出的CH2域。
於任擇優選的具體例中，該專一性結合物件包含(i)序列辨識編號：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的CH3域，更佳為序列辨識編號：28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的CH3域，最佳為序列辨識編號：32、44、48、71、75或79內列出的CH3域，以及(ii)序列辨識編號：6內列出的CH2域。
較佳地，該專一性結合物件包含一免疫球蛋白鉸鏈區或其部分於該CH2域的N端。該免疫球蛋白鉸鏈區讓二個CH2-CH3域締合且形成二聚體。較佳地，該鉸鏈區或其部分為一人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4鉸鏈區或其部分。更佳地，該鉸鏈區或其部分為一種IgG1鉸鏈區或其部分。人類IgG1鉸鏈區的序列係顯示於序列辨識編號：69內。一種可形成專一性結合物件的一部分之合適的截斷的鉸鏈區係顯示於序列辨識編號：7內。此鉸鏈區係存在於實施例測試的Fcab分子內，而全長的鉸鏈區係呈假(mock)mAb2 格式存在。因而，該專一性結合物件較佳包含一免疫球蛋白鉸鏈區或其部分於該CH2域的N端，其中該鉸鏈區具有序列辨識編號：69或序列辨識編號：7內列出的序列，或其中該鉸鏈區具有一胺基酸序列，其與序列辨識編號：69或7內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。任擇地，該專一性結合物件可包含一免疫球蛋白鉸鏈區或其部分於該CH2域的N端，其中該鉸鏈區包含序列辨識編號：69內列出的序列或其片段，其中該片段包含至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或更多、至少十個、至少十一個、至少十二個、至少十三個或至少十四個序列辨識編號：69的胺基酸序列。
於優選的具體例中，該專一性結合物件包含(i)序列辨識編號：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的CH3域，更佳為序列辨識編號：28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的CH3域，最佳為序列辨識編號：32、44、48、71、75或79內列出的CH3域，(ii)序列辨識編號：5內列出的CH2域，以及(ii)一免疫球蛋白鉸鏈區或其部分於該CH2域的N端，其中該免疫球蛋白鉸鏈區具有序列辨識編號：69內列出的序列。
於任擇優選的具體例中，該專一性結合物件包含(i)序列辨識編號：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的CH3域，更佳為序列辨識編號：28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的CH3域，最佳為序列辨識編號：32、44、48、71、75或79內列出的CH3域，(ii)序列辨識編號：6內列出的CH2域，以及(iii) 一免疫球蛋白鉸鏈區或其部分於該CH2域的N端，其中該免疫球蛋白鉸鏈區具有序列辨識編號：69內列出的序列。
於優選的具體例中，該專一性結合物件包含序列辨識編號：25、26、29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49或50內列出的序列，或與序列辨識編號：25、26、29、33、34、30、37、38、40、41、45、46、49或50內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之序列。更佳地，該專一性結合物件包含序列辨識編號：29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49或50內列出的序列，或與序列辨識編號：29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49或50內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之序列。最佳地，該專一性結合物件包含序列辨識編號：45、46、49或50內列出的序列，或與序列辨識編號：45、46、49或50內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之序列。於任擇最優選的具體例中，該專一性結合物件包含序列辨識編號：33或34內列出的序列，或與序列辨識編號：33或34內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之序列。
於進一步最優選的具體例中，該專一性結合物件包含序列辨識編號：72、73、76、77、80或81內列出的序列，或與序列辨識編號：72、73、76、77、80或81內列出的序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性之序列。
近年來單株抗體為基的癌症免疫療法，例如抗-CTLA-4或抗-PD-1/PD-L1抗體，對於癌症患者之治療產生了重大影響。然而，儘管此等單方療法於一些惡性腫瘤方面非凡的臨床功效，但是只有很小子集的癌症患者對此等治療起反應。近來，PD-1及CTLA-4於黑色素瘤及非小細胞肺癌之組合抑制作用使得注意到此單方療法藉由組合其等與有互補作用機轉的其他製劑，而進一步提升臨床獲益的潛力。
此外，本發明人意外地發現當製備本發明的專一性結合物件時，本發明的專一性結合物件除了含有座落於該專一性結合物件的CH3域之一PD-L1抗原結合位址，還含有來自伊匹單抗(ipilimumab)的CTLA-4之CDR-為基的抗原結合位址，且於葡萄球菌腸毒素B分析(SEB分析)中測試其等，該專一性結合物件比起(i)包含相同的PD-L1抗原結合位址於CH3域及不相關抗原的CDR-為基的抗原結合位址之專一性結合物件，(ii)伊匹單抗，或(i)及(ii)之組合，展現出更大的T細胞活化。此證明了納入抗-PD-L1抗原結合位址至CH3域及第二抗原之CDR-為基的抗原結合位址二者至相同的專一性結合物件，與組合使用包含相同的抗原結合位址之二種個別的分子相比，能導致該專一性結合物件活性協同性增加。
因而，除了該專一性結合物件的CH3域之PD-L1抗原結合位址之外，該專一性結合物件可進一步包含一或更多額外的抗原結合位址以創造一種雙或多專一性分子。較佳地，該專一性結合物件包含一CDR-為基的抗原結合位址。天然存在的免疫球蛋白分子內找到CDR-為基的抗原結合位址且其等之結構為本技藝眾所周知的。於該專一性結合物件包含一CDR-為基的抗原結合位址的情況下，該專一性結合物件較佳為一種抗體分子。該抗體分子不特別限制，但有條件是其包含如此所定義的一CH3域及一CDR-為基的抗原結合位址。於優選的具體例中，該抗體分子為一人類免疫球蛋白G分子，例如一種人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子，更佳為一種人類IgG1分子。人類免疫球蛋白G分子的序列為本技藝已知的且導入本文所揭示的CH3域或CH3域序列至此一分子之內對熟悉此藝者不會出現任何困難。
於優選的具體例中，本發明之專一性結合物件包含(i)序列辨識編號：45、46、49、50、72、73、76、77、80、81、33、34、25、26、29、30、37、38、40或41內列出的序列，較佳為序列辨識編號：45、46、49、50、72、73、76、77、80、81、33或34內列出的序列，以及(ii)一CDR-為基的抗原結合位址。
於預期結合抗原對癌症治療有助益的情況下，該CDR-為基的抗原結合位址可與該抗原結合。
於一具體例中，於該專一性結合物件包含一CDR-為基的抗原結合位址的情況下，該CDR-為基的抗原結合位址可與非多餘及互補的檢查點抑制劑結合，例如CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3、VISTA、CD73、CSF-1R、KIR. B7-H3、B7-H4、2B4、NKG2A、CD47、SIRPα、BTLA、CCR4、CD200R或TGFβ。
抑制PD-1/PD-L1中心及刺激共刺激分子代表提升人類患者的免疫反應之互補策略。通過檢查點阻斷而反轉T細胞衰竭可允許此等細胞更有力地活化且發展充分的抗腫瘤活性。因而，於另一具體例中，本發明之專一性結合物件可包含一CDR-為基的抗原結合位址，該CDR-為基的抗原結合位址會與T細胞表現的共刺激分子結合，且為T細胞表現的共刺激分子之促效劑，共刺激分子為例如OX40、ICOS、CD40、HVEM、NKG2D或TNFR2。
於另外的具體例中，本發明之專一性結合物件可包含一CDR-為基的抗原結合位址，其會與腫瘤關聯性抗原(TAA)結合。預期此等專一性結合物件會通過局部化的免疫活化而導致腫瘤專一性T細胞反應。TAAs之實例為c-Met、B7-H3、B7-H4、EGFR、HER-2、EPCAM、CEACAM、FAP、VEGF、MSLN、GPC3、CD38、CD19及CD20。
如上所詳述，感染性疾病與腫瘤學顯示出許多相似之處。可利用PD-L1於免疫調節的角色來使對抗病原體的免疫反應達到最大。免疫調控於治療感染性疾病的背景中為醫學新興的領域且早期評論暗示PD-L1阻斷可改善感染的生物反應，特別地，幫助抵消T細胞衰竭、管理免疫媒介的廓清作用及產生長期的免疫性(Wykes and Lewin, 2018)。
於一些感染性疾病中，過大的前炎性反應及次優的抗原專一性T細胞活性是嚴重組織損傷的原因(Rao M.等人，2017)。不希望受理論束縛，認為使用包含CDR-為基的抗原結合位址之本發明專一性結合物件藉由使對病原體環境有益的免疫調控活性局部化，而可於治療此等疾病方面獲得應用。
任擇地，使用包含會與致效作用或拮抗作用的免疫細胞標靶結合之CDR-為基的抗原結合位址之本發明專一性結合物件，可導致T細胞專一性及活性增加。
因而，於一具體例中，於該專一性結合物件包含一CDR-為基的抗原結合位址的情況下，該CDR-為基的抗原結合位址可結合免疫細胞標靶，例如PD-1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM3、OX40、CD40、ICOS、CD28或CD80。
任擇地，於該專一性結合物件包含一CDR-為基的抗原結合位址的情況下，該CDR-為基的抗原結合位址可結合致病的標靶，即人類病原體表現的抗原。病原體可為病毒、細菌、真菌或寄生蟲。較佳地，病原體為病毒、細菌或真菌。更佳地，病原體為病毒或細菌。最佳地，病原體為病毒。病毒抗原之實例包括人類免疫不全病毒(HIV)表現的蛋白p24、gp120及gp41、B型肝炎病毒(HBV)表現的B型肝炎表面抗原(HBsAg)、及流行性感冒病毒表現的血球凝集素及神經胺糖酸酶。細菌抗原之實例包括結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )表現的Rv1733、Rv2389及Rv2435n。
於一些具體例中，本發明之專一性結合物件的CDR-為基的抗原結合位址不與OX40結合。此外或任擇地，本發明之專一性結合物件的CDR-為基的抗原結合位址不與CD137結合。此外或任擇地，本發明之專一性結合物件的CDR-為基的抗原結合位址不與CD27結合。此外或任擇地，本發明之專一性結合物件的CDR-為基的抗原結合位址可能不與糖皮質素-誘發的TNFR-相關蛋白(GITR)結合。此外或任擇地，本發明之專一性結合物件的CDR-為基的抗原結合位址可能不與淋巴細胞活化基因3(LAG-3)結合。此外或任擇地，本發明之專一性結合物件的CDR-為基的抗原結合位址可能不與可誘發的T-細胞共刺激劑(Inducible T-cell COStimulator) (ICOS)結合。舉例而言，本發明之專一性結合物件的CDR-為基的抗原結合位址於下列情況下不與ICOS結合：(i) 該專一性結合物件之PD-L1結合位址包含一第一序列座落於該CH3域的該AB結構環之位置14至18處，其中該專一性結合物件於該CH3域的位置14、15或16處包含一胺基酸缺失，且其中該第一序列係由序列辨識編號：23內列出的序列組成，一第二序列座落於該CH3域的該CD結構環之位置45.1至78處，其中該第二序列係由序列辨識編號：11內列出的序列組成，以及一第三序列座落於該CH3域的該EF結構環之位置92至100處，其中該第三序列係由序列辨識編號：31內列出的序列組成；(ii)該專一性結合物件之CH3域包含序列辨識編號：32內列出的序列；及/或(iii) 該專一性結合物件包含序列辨識編號：33或34內列出的序列。
該專一性結合物件可以進一步複合至一免疫系統調控劑、胞毒型分子、放射性同位素或可偵測的標示。免疫系統調控劑可以為胞毒型分子，例如細胞介素。
本發明亦提供一種編碼本發明之專一性結合物件或抗體分子的核酸，以及一種包含此一核酸之載體。
亦提供一種重組宿主細胞，其包含本發明之核酸或載體。此一重組宿主細胞可用於生產本發明之專一性結合物件。因而，亦提供一種生產本發明的專一性結合物件或抗體分子之方法，該方法包含於用於生產該專一性結合物件或抗體分子的條件下培養該重組宿主細胞。該方法可進一步包含單離及/或純化該專一性結合物件或抗體分子的步驟。
本發明之專一性結合物件及抗體預期會於治療應用方面獲得應用，特別是人類之治療應用，例如癌症治療，治療感染性疾病、及治療發炎、與發炎相關的疾病及病況、及發炎疾病。因而，亦提供一種藥學組成物，其包含如本發明之專一性結合物件或抗體分子及一藥學上可接受的賦形劑。
本發明進一步提供一種本發明之專一性結合物件或抗體分子，供用於一種治療方法。亦提供一種治療一患者的方法，其中該方法包含投予一治療有效量的如本發明之專一性結合物件或抗體分子至該患者。進一步提供一種如本發明之專一性結合物件或抗體分子供用於製造一藥劑之用途。如本文所述，一患者較佳為一人類患者。
本發明亦提供一種本發明之專一性結合物件或抗體分子，供用於治療一患者癌症的方法。亦提供一種治療一患者癌症的方法，其中該方法包含投予一治療有效量的如本發明之專一性結合物件或抗體分子至該患者。進一步提供一種如本發明之專一性結合物件或抗體分子供用於製造一藥劑之用途，該藥劑用於治療一患者的癌症。該治療可進一步包含投予第二抗癌劑及/或療法，例如一種抗腫瘤疫苗及/或化學治療藥物至該患者。該第二抗癌劑及/或療法與本發明之專一性結合物件或抗體分子可以同時、分別或相繼投予至該患者。
本發明亦提供一種本發明之專一性結合物件或抗體分子，供用於治療一患者感染性疾病的方法。亦提供一種治療一患者感染性疾病的方法，其中該方法包含投予一治療有效量的如本發明之專一性結合物件或抗體分子至該患者。進一步提供一種如本發明之專一性結合物件或抗體分子供用於製造一藥劑之用途，該藥劑用於治療一患者的感染性疾病。該治療可進一步包含投予用於治療該感染性疾病的第二製劑及/或療法至該患者。該第二製劑及/或療法與本發明之專一性結合物件或抗體分子可以同時、分別或相繼投予至該患者。
本發明亦提供一種本發明之專一性結合物件或抗體分子，供用於治療一患者發炎、與發炎相關的一疾病或病況、或發炎疾病的方法。亦提供一種治療一患者發炎、與發炎相關的一疾病或病況、或發炎疾病的方法，其中該方法包含投予一治療有效量的如本發明之專一性結合物件或抗體分子至該患者。進一步提供一種如本發明之專一性結合物件或抗體分子供用於製造一藥劑之用途，該藥劑用於治療一患者的發炎、與發炎相關的一疾病或病況、或發炎疾病。該治療可進一步包含投予用於治療該發炎、與發炎相關的疾病或病況、或發炎疾病的第二製劑及/或療法至該患者。該第二製劑及/或療法與本發明之專一性結合物件或抗體分子可以同時、分別或相繼投予至該患者。
較佳實施例之詳細說明
本發明係有關於結合PD-L1的專一性結合物件。具體而言，本發明的專一性結合物件包含一PD-L1抗原結合位址座落於該專一性結合物件的恆定域內。術語“PD-L1”可以指人類PD-L1及/或食蟹獼猴PD-L1，除非上下文另有要求。較佳地，術語“PD-L1”係指人類PD-L1。
術語“專一性結合物件”描述一種免疫球蛋白或其片段，其包含一恆定域，較佳為CH3域，其包含一PD-L1抗原結合位址。較佳地，該專一性結合物件包含一CH2及CH3域，其中該CH2或CH3域，較佳為CH3域，包含一PD-L1抗原結合位址。於優選的具體例中，該專一性結合物件進一步包含一免疫球蛋白鉸鏈區或其部分，於該CH2域的N端。此一分子於此可稱為一抗原結合Fc片段或FcabTM 。該專一性結合物件可以是部分或完全合成產生的。
當使用於本文中，術語“專一性結合物件”因而包括片段，條件是該片段包含一PD-L1抗原結合位址座落於該專一性結合物件的一恆定域內，例如CL、CH1、CH2或CH3域，較佳為CH1、CH2或CH3域，最佳為CH3域。除非上下文另有要求，否則當使用於本文中，術語“專一性結合物件”因而等效於“專一性結合物件或其片段”。
於優選具體例中，該專一性結合物件為抗體分子。術語“抗體分子”包含抗體分子片段，條件是此片段包含一恆定域，例如CH1、CH2或CH3域，較佳為CH3域，其包含一PD-L1抗原結合位址。該抗體分子可以為人類或人化的。該抗體分子較佳為單株抗體分子。抗體分子的實例為免疫球蛋白同型，例如免疫球蛋白G及其等之同型亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，以及其片段。
取得單株及其他抗體並使用重組DNA科技技術來生產保留原始抗體專一性的其他抗體或嵌合分子是有可能的。此等技術可涉及導入CDRs或可變異區域，至不同的免疫球蛋白之內。導入一免疫球蛋白的CDRs至另一免疫球蛋白之內係描述於，舉例而言EP-A-184187、GB 2188638A及EP-A-239400之內。相似的技術可使用於相關的恆定域序列，其係藉由導入PD-L1抗原結合位址至另一恆定域之內，例如不同的CH3域，或CH1或CH2域。
因抗體可以以許多方式予以修飾，所以術語“專一性結合物件”應該解釋為涵蓋抗體片段、衍生物、功能等效物及抗體同源物，不論是天然或完全或部分合成的。一種包含一CH3域的抗體片段之實例為一種抗體的Fc域。一種包含CDR序列及CH3域二者之抗體片段之實例為微型抗體(minibody)，其包含連結一CH3域之scFv(Hu等人，1996)。
本發明之專一性結合物件與PD-L1結合。於此上下文中結合可以指專一的結合。術語“專一的”可以指專一性結合物件與其專一的結合伙伴，於此為PD-L1，以外的分子不會表現出任何明顯結合的情況。術語“專一的”也可適用於專一性結合物件對一些抗原所攜帶的特定抗原決定位，如PD-L1上的抗原決定位為專一的情況中，在這種情況下專一性結合物件能與攜帶抗原決定位的各種抗原結合。專一性結合物件與程式性死亡配體1(PD-1)及CD80，如人類及小鼠CD80，以及人類及小鼠PD-1可能不結合，或可能不顯示出任何明顯結合。
本發明的專一性結合物件較佳包含一PD-L1抗原結合位址。
該PD-L1抗原結合位址係座落於該專一性結合物件的恆定域內，例如CH1、CH2、CH3或CH4域。較佳地，該PD-L1抗原結合位址係座落於該專一性結合物件的CH3域內。
該PD-L1結合位址較佳包含：
(i)一第一序列座落於該AB結構環內，其中該專一性結合物件於該恆定域的位置14、15或16處包含一胺基酸缺失，且其中該第一序列係由下列組成：
(a)胺基酸序列SGYW(序列辨識編號：23)，或
(b)序列辨識編號：23之一變異體，其中
該絲胺酸(S)係用胺基酸A、E、F、G、H、I、L、P、R、T、V、或Y予以取代，及/或
該甘胺酸(G)係用胺基酸A、D、E、F、H、K、L、N、P、R、T、V、或Y予以取代；
(ii)一第二序列座落於該CD結構環，其中該第二序列係由下列組成：
(a)胺基酸序列EPQYWA(序列辨識編號：11)，或
(b)序列辨識編號：11之一變異體，其中
該麩胺酸(E)係用胺基酸A、G、H、I、L、N、Q、R、S、或W予以取代，及/或
該脯胺酸(P)係用胺基酸A、D、E、G、H、N、Q、W、或Y予以取代，及/或
該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸H、或N予以取代，及/或
該酪胺酸(Y)係用胺基酸A、D、H、T、或V予以取代，及/或
該丙胺酸(A)係用胺基酸D、E、G、L、R、S、或W予以取代；及
(iii)一第三序列座落於該EF結構環，其中該第三序列係由下列組成：
(a)胺基酸序列SNWRWQMD1 D2 (序列辨識編號：19)，或
(b)序列辨識編號：19之一變異體，其中
該絲胺酸(S)係用胺基酸A、或G予以取代，及/或
該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸A、E、F、G、H、I、K、L、Q、R、S、T、或Y予以取代，及/或
該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸A、D、E、F、G、H、K、L、N、R、S、或V予以取代，及/或
該甲硫胺酸(M)係用胺基酸H、S、F、I、L、V、W、或Y予以取代，及/或
該天冬胺酸(D1 )係用胺基酸E、A、I、L、R、S、T、V、W、Y、或G予以取代，及/或
該天冬胺酸(D2 )係用胺基酸A、E、F、I、K、L、N、R、V、W、或Y予以取代；以及
其中於該CH3域的位置101處的該胺基酸為纈胺酸(V)、丙胺酸(A)或不存在。
於任擇優選的具體例中，該PD-L1結合位址包含：
(i)一第一序列座落於該AB結構環內，其中該專一性結合物件於該恆定域的位置14、15或16處包含一胺基酸缺失，且其中該第一序列係由下列組成：
(a)胺基酸序列SGYW(序列辨識編號：23)，或
(b)序列辨識編號：23之一變異體，其中
該絲胺酸(S)係用胺基酸A、E、F、G、H、I、L、P、R、T、V、或Y予以取代，及/或
該甘胺酸(G)係用胺基酸A、D、E、F、H、K、L、N、P、R、T、V、或Y予以取代；
(ii)一第二序列座落於該CD結構環，其中該第二序列係由下列組成：
(a)胺基酸序列EPQYWA(序列辨識編號：11)，或
(b)序列辨識編號：11之一變異體，其中
該麩胺酸(E)係用胺基酸A、G、H、I、L、N、Q、R、S、或W予以取代，及/或
該脯胺酸(P)係用胺基酸A、D、E、G、H、N、Q、W、或Y予以取代，及/或
該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸H、或N予以取代，及/或
該酪胺酸(Y)係用胺基酸A、D、H、T、或V予以取代，及/或
該丙胺酸(A)係用胺基酸D、E、G、L、R、S、或W予以取代；及
(iii)一第三序列座落於該EF結構環，其中該第三序列係由下列組成：
(a)胺基酸序列SNWRWQMD1 D2 (序列辨識編號：19)，或
(b)序列辨識編號：19之一變異體，其中
該絲胺酸(S)係用胺基酸A、或G予以取代，及/或
該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸A、E、F、G、H、I、K、L、Q、R、S、T、或Y予以取代，及/或
該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸A、D、E、F、G、H、K、L、N、R、S、或V予以取代，及/或
該甲硫胺酸(M)係用胺基酸H、S、F、I、L、V、W、或Y予以取代，及/或
該天冬胺酸(D1 )係用胺基酸E、A、I、L、R、S、T、V、W、或Y予以取代，及/或
該天冬胺酸(D2 )係用胺基酸A、E、F、I、K、L、N、R、V、W、或Y予以取代；以及
其中於該CH3域的位置101處的該胺基酸為纈胺酸(V)、或不存在。
本發明之專一性結合物件可進一步包含一精胺酸(R)於該專一性結合物件之該CH3域的位置113處。此外或任擇地，本發明之專一性結合物件可包含下列額外的突變：
(i)於該CH3域的位置84.1處的該胺基酸可為脯胺酸(P)；及/或
(ii)於該CH3域的位置85.3處的該胺基酸可為蘇胺酸(T)；及/或
(iii)於該CH3域的位置101處的該胺基酸可為丙胺酸(A)。
除非另有說明，否則本文之胺基酸殘基係根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方式予以編號。Lefranc等人，2005中描述IMGT編號方式。
較佳地，第一序列係座落於該CH3域的殘基14至18處，第二序列係座落於該CH3域的位置45.1至78處，及/或第三序列係座落於該CH3域的位置92至100或92至101處，其中該胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics(IMGT)編號方式。
依照任擇的IMGT編號，該CH3域的殘基位置，包括本文所述之修飾，可任擇地依據序列辨識編號：4內列出的野生型IgG1 CH3域序列的殘基之連續編號，亦稱為IMGT外顯子編號、EU編號或Kabat編號來表示。
圖 1B 及 C 顯示WT IgG1 CH3域殘基(序列辨識編號：4)的IMGT編號、連續編號(IMGT外顯子編號)、EU編號及Kabat編號之間的協和。
圖 1A 顯示相對於序列辨識編號：4內列出的野生型CH3域序列，Fcabs FS17-33、FS17-33-37、FS17-33-116；FS17-33-288、FS17-33-289、FS17-33-296、FS17-33-334、FS17-33-449、FS17-33-451、FS17-33-488、FS17-33-539及FS17-33-548的CH3域之修飾的殘基位置之IMGT編號與連續編號之間的協和。
因而，舉例而言，於本申請案提及CH3域的該AB結構環位置14至18處、該CD結構環位置45.1至78處，及/或該EF結構環位置92至100處的修飾的情況下，殘基編號係根據IMGT編號方式的情況下，修飾的位置根據序列辨識編號：4的胺基酸殘基之連續編號分別為CH3域的位置18至22、46至51以及73至81，如圖 1A 所示。
於優選的具體例中，該PD-L1結合位址包含一第一序列座落於該AB環內，一第二序列座落於該CD環內以及一第三序列座落於該EF環內，
其中該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：19內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：27內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：31內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：35內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：42內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：43內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：43內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：78內列出的該序列；或
該第一序列具有序列辨識編號：42內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：74內列出的該序列且於該專一性結合物件的該CH3域的位置113處的該殘基為精胺酸(R)。
最佳地，該PD-L1結合位址包含一第一序列座落於該AB環內，一第二序列座落於該CD環內以及一第三序列座落於該EF環內，其中
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：31內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：42內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：43內列出的該序列；或
該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：43內列出的該序列。
於任擇最優選的具體例中，本發明的專一性結合物件之PD-L1結合位址可包含一第一序列座落於該AB環內，一第二序列座落於該CD環內以及一第三序列座落於該EF環內，
其中該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：78內列出的該序列；或
該第一序列具有序列辨識編號：42內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：74內列出的該序列且於該專一性結合物件的該CH3域的位置113處的該殘基為精胺酸(R)；或
該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：70內列出的該序列，其中於該專一性結合物件的該CH3域的位置84.1、85.3、101及113處的該等殘基分別為脯胺酸(P)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)及精胺酸(R)。
第一、第二及第三序列較佳座落於該專一性結合物件的恆定域之結構環內。將序列導入至抗體恆定域之結構環區域內以創造新的抗原結合位址，係描述於舉例而言，WO2006/072620及WO2009/132876內。
抗體恆定域之結構環包括AB、CD及EF環。於CH3域中，AB、CD及EF環係座落於CH3域的殘基11-18、43-78及92-101處。較佳地，第一序列係座落於該CH3域的殘基14至18處，第二序列係座落於該CH3域的位置45.1至78處，及/或第三序列係座落於該CH3域的位置92至100或92至101處。
本發明之專一性結合物件於位置38處可進一步包含一丙胺酸及纈胺酸殘基，較佳為丙胺酸。特別地，一種包含一第一、第二及第三序列之專一性結合物件，其中
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：31內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：42內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：43內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：43內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：78內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：42內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：74內列出的該序列，且於該專一性結合物件的該CH3域的位置113處的該殘基為精胺酸(R)；或
該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：70內列出的該序列，其中於該專一性結合物件的該CH3域的位置84.1、85.3、101及113處的該等殘基分別為脯胺酸(P)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)及精胺酸(R)；
可進一步包含一丙胺酸殘基於位置38處。
相似地，一種包含一第一、第二及第三序列之專一性結合物件，其中
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：19內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：27內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：31內列出的該序列；或
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：35內列出的該序列，
可進一步包含一纈胺酸殘基於位置38處。
此外或任擇地，本發明之專一性結合物件可進一步包含一纈胺酸殘基或一胺基酸缺失於該CH3域的位置101處(如圖1A所示)。特別地，一種包含一第一、第二及第三序列之專一性結合物件，其中
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：19內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：27內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：31內列出的該序列；
該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：35內列出的該序列；
可包含一胺基酸缺失於該CH3域的位置101處。
任擇地，本發明之專一性結合物件可進一步包含一丙胺酸殘基(A)於該CH3域的位置101處(如圖1A所示)。特別地，一種包含一第一、第二及第三序列之專一性結合物件，其中
該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：70內列出的該序列，其中於該專一性結合物件的該CH3域的位置84.1、85.3及113處的該等殘基分別為脯胺酸(P)、蘇胺酸(T)及精胺酸(R)，可包含一丙胺酸殘基(A)於該CH3域的位置101處。
於優選的具體例中，本發明之專一性結合物件包含一CH3域，其包含、具有或由下列所組成：序列辨識編號：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的該序列，較佳為帶有序列辨識編號：28、32、36、39、44、48、75或79內列出的該序列之一CH3域。
本發明之專一性結合物件可包含一CH3域，其包含、具有或由下列所組成：序列辨識編號：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的該序列，其中序列辨識編號：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79內所示最接近該序列C端處的離胺酸殘基(K)已經缺失。
此外，本發明之專一性結合物件可包含一免疫球蛋白G分子之一CH2域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子的CH2域。較佳本發明之專一性結合物件包含一IgG1分子的CH2域。該CH2域可具有序列辨識編號：6內列出的序列。
該專一性結合物件之CH2域可包含一個或更多個突變其能減少或廢除CH2域與一個或更多個Fcγ受體，例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII及/或補體的結合作用。本發明人假設與Fcγ受體的結合作用減少或廢除會降低或消除該抗體分子所媒介的抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)。相似地，與補體的結合作用減少或廢除預期會降低或消除該抗體分子所媒介的補體依賴性細胞毒性(CDC)。減少或廢除CH2域與一個或更多個Fcγ受體及/或補體之結合作用的突變為本技藝已知的(Wang等人，2018)。此等突變包括Bruhns等人，2009及Hezareh等人，2001之內描述的“LALA突變”，其涉及以丙胺酸取代CH2域之IMGT位置1.3及1.2之白胺酸殘基(L1.3A及L1.2A)。任擇地，經由藉著使CH2域之IMGT位置84.4之天冬醯胺酸(N)突變為丙胺酸、甘胺酸或麩醯胺酸(N84.4A、N84.4G或N84.4Q)，而使保守的N-鍵接醣基化位址突變來產生無醣基化的抗體，亦已知會降低IgG1效應子功能(Wang等人，2018)。作為另一種選擇，已知經由使CH2域之IMGT位置114之脯胺酸突變為丙胺酸或甘胺酸(P114A或P114G)會降低補體活化(C1q結合)及ADCC(Idusogie等人，2000；Klein等人，2016)。亦可組合此等突變俾以產生具有進一步降低或沒有ADCC或CDC活性的抗體分子。
因而，該專一性結合物件可包含一CH2域，其中該CH2域包含：
(i)丙胺酸殘基於位置1.3及1.2處；及/或
(ii)一丙胺酸或甘胺酸於位置114處；及/或
(iii)一丙胺酸、麩醯胺酸或甘胺酸於位置84.4處；
其中該胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方式。
於優選的具體例中，該專一性結合物件包含一CH2域，其中該CH2域包含：
(i)一丙胺酸殘基於位置1.3處；及
(ii)一丙胺酸殘基於位置1.2處；
其中該胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方式。
舉例而言，該CH2域可包含序列辨識編號：5內列出的該序列。
於任擇優選的具體例中，該抗體分子包含一CH2域，其中該CH2域包含：
(i) 一丙胺酸殘基於位置1.3處；
(ii) 一丙胺酸殘基於位置1.2處；及
(iii) 一丙胺酸於位置114處；
其中該胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方式。
舉例而言，該CH2域可具有序列辨識編號：82內列出的該序列。
於優選的具體例中，除了座落於該專一性結合物件的恆定域之PD-L1抗原結合位址之外，該專一性結合物件還可包含與一個或更多個另外的抗原結合的一個或更多個另外的抗原結合位址。該一個或更多個另外的抗原結合位址較佳與其等同源抗原專一地結合。
該一個或更多個另外的抗原結合位址可與PD-L1或另一抗原結合。該專一性結合物件因而可為多專一性，例如雙專一性、三專一性或四專一性分子，較佳為雙專一性分子。於優選的具體例中，該專一性結合物件能同時與PD-L1以及該一個或更多個另外的抗原結合。
已知抗體分子具有模組架構，其包含離散的域，其可以多種不同方式組合以創造多專一性，例如雙專一性、三專一性或四專一性抗體格式。例示性多專一性抗體格式係舉例而言，於Spiess等人(2015) and Kontermann (2012)內描述。本發明之專一性結合物件可以此多專一性抗體格式來使用。這情況通過該專一性結合物件之恆定域，例如CH3域內存在抗原結合位址而導入另外的抗原結合位址至此多專一性抗體格式內有額外的優勢。
舉例而言，本發明的專一性結合物件可為異二聚體抗體分子，例如異二聚體完整免疫球蛋白分子或其片段。在這種情況下，抗體分子的一部份會具有如本文所述之一序列或多個序列。舉例而言，於本發明的專一性結合物件為雙專一性異二聚體抗體分子的情況下，該專一性結合物件可包含一重鏈、其含有如本文所述之CH3域、與一結合PD-L1以外的抗原之重鏈配對。製備異二聚體抗體的技術為本技藝已知的且包括旋鈕至孔洞(knobs-into-holes (KIHs))技術，其涉及工程處理抗體分子的CH3域來創造“旋鈕”或“孔洞”以促進鏈的異質二聚合。任擇地，異二聚體抗體製備可通過導入電荷對(charge pairs)至抗體分子內以藉由靜電排斥避免CH3域之同質二聚合且藉由靜電吸引而直接異質二聚合。異二聚體抗體格式之實例包括CrossMab、mAb-Fv、SEED-體(SEED-body)及KIH IgG。
任擇地，本發明之多專一性專一性結合物件可以包含完整免疫球蛋白分子或其片段及額外的抗原結合部份(moiety)或部份(moieties)。該抗原結合部份舉例而言可以為Fv、scFv或單域抗體，且可以與完整免疫球蛋白分子或其片段融合。包含與完整免疫球蛋白分子融合之額外的抗原結合部份之多專一性抗體分子之實例包括DVD-IgG、DVI-IgG、scFv4-IgG、IgG-scFv及scFv-IgG分子(Spiess等人，2015；圖1)。包含與含CH3域的免疫球蛋白片段融合、額外的抗原結合部份之多專一性抗體分子之實例包括舉例而言，sc雙價抗體(diabody)-CH3、雙價抗體-CH3及scFv-CH3 KIH(Spiess等人，2015；圖1)。
其他合適的多專一性格式對本技術人員來說是顯而易見的。
於優選的具體例中，如本發明之專一性結合物件包含一第二抗原結合位址，其中該第二抗原結合位址較佳為一CDR-為基的抗原結合位址。術語“CDR-為基的抗原結合位址”係指一種專一性結合物件可變異區域之抗原結合位址，該專一性結合物件可變異區域係由六個CDR殘基組成。
該第二抗原結合位址較佳對一檢查點抑制劑、共刺激分子或腫瘤關聯性抗原為專一的。
對抗一假定的抗原，例如一腫瘤關聯性抗原之抗體分子，及此一抗體分子之CDR序列之判定，係在本技術人員的能力範圍內且許多合適的技術係本技藝已知的。再者，對抗各種免疫系統調控劑的抗體，包括CDR序列，為本技藝已知的。因而，製備一種專一性結合物件，其除了包含如本文所述之PD-L1結合位址以外還包含用於第二抗原的一CDR-為基的抗原結合位址，對於熟悉此藝者是沒有困難的。
於某些實例中，本發明之專一性結合物件不包含一CDR-為基的抗原結合位址。
本發明之專一性結合物件亦可包含於此所揭示的結構環、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、CDR、VH域、VL域、輕鏈或重鏈序列之變異體。可藉由序列改變或突變及篩選的方法來得到合適的變異體。於優選的具體例中，一種包含一或更多變異體序列的專一性結合物件保留親代專一性結合物件的一或更多功能特徵，例如PD-L1之結合專一性及/或結合親和力。舉例而言，一種包含一或更多變異體序列的專一性結合物件較佳以如該(親代)專一性結合物件相同的親和力，或比該(親代)專一性結合物件更高的親和力與PD-L1結合。該親代專一性結合物件為一種專一性結合物件其不含已經併入變異體專一性結合物件內的胺基酸取代、缺失及/或插入。
舉例而言，本發明之專一性結合物件可包含一結構環、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、CDR、VH域、VL域、輕鏈或重鏈序列，其與於此所揭示的結構環、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、CDR、VH域、VL域、輕鏈或重鏈序列，有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%的序列同一性。
於一優選的具體例中，本發明的專一性結合物件包含一CH3域序列，其與序列辨識編號：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的CH3域序列，更佳為序列辨識編號：28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的CH3域序列，最佳為序列辨識編號：32、44、48、71、75或79內列出的CH3域序列，有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%的序列同一性。特別地，本發明之專一性結合物件包含一CH3域，其與序列辨識編號：24內列出的CH3域序列有至少96%的序列同一性。
於另一優選的具體例中，本發明的專一性結合物件包含一CH2域序列，其與序列辨識編號：5或6內列出的CH2域序列有至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%的序列同一性。
於另一優選的具體例中，本發明的專一性結合物件包含一序列或由一序列所組成，該序列與序列辨識編號：25、26、29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49、50、72、73、76、77、80或81內列出的序列，最佳與序列辨識編號：45、46、49、50、72、73、76、77、80或81內列出的序列有至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%的序列同一性。於任擇最優選的具體例中，本發明的專一性結合物件包含一序列或由一序列所組成，該序列與序列辨識編號：33或34內列出的序列有至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%的序列同一性。
表9A、B及C顯示實施例製備的分子之背景，如果Fcab與PD-L1結合時的解離速率，與親代親代的解離速率相比之下，沒有增加就無法修飾結構環的某些殘基。
因而，於下列專一性結合物件的情況下，其：
(i)包含一CH3域序列，其係由其與序列辨識編號：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的(親代)序列之序列同一性所界定；或
(ii)包含一序列或由一序列所組成，其係由其與如前段及本文其他地方內所列出，序列辨識編號：25、26、29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49、50、72、73、76、77、80或81內列出的(親代)序列之序列同一性所界定，
與該親代序列相比之下，較佳維持該CH3域的位置14、15或16處之胺基酸缺失及/或該CH3域的位置17、18處之胺基酸較佳為未經修飾的；
與該親代序列相比之下，該CH3域的位置77處及選擇性地位置45.3處之胺基酸較佳為未經修飾的；及/或
與該親代序列相比之下，該CH3域的位置94處及選擇性地位置92處之胺基酸較佳為未經修飾的。
序列同一性一般係參考演算法GAP(Wisconsin GCG軟體包，Accelerys Inc, San Diego USA)來定義。GAP使用Needleman及Wunsch演算法來排列兩個完整序列，其使得匹配數目最大且間隙數目最小。一般而言，使用預設參數，且空格創造罰分(gap creation penalty)等於12以及空格擴展罰分等於4。使用GAP可能是較佳的但是也可使用其他的演算法，例如BLAST(其使用Altschul等人，1990的方法)、FASTA(其使用Pearson and Lipman，1988的方法)，或Smith-Waterman演算法(Smith and Waterman，1981)，或之前的Altschul等人，1990之TBLASTN程式，一般使用預設參數。特別地，可以使用psi-Blast演算法(Altschul等人，1997)。
本發明之專一性結合物件亦可包含一結構環、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、CDR、VH域、VL域、輕鏈或重鏈序列，其與於此所揭示的一結構環、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、CDR、VH域、VL域、輕鏈或重鏈序列相比，具有一或更多個胺基酸序列改變(加入、缺失、取代及/或插入一胺基酸殘基)，較佳20個改變或更少、15個改變或更少、10個改變或更少、5個改變或更少、4個改變或更少、3個改變或更少、2個改變或更少或是1個改變。特別地，可以於該專一性結合物件之一或更多框架區域內進行改變。
於優選的具體例中，本發明之專一性結合物件可包含一CH3域序列，其與序列辨識編號：24、28、32、36、39、44、48、71、75或79內列出的CH3域序列相比，具有一或更多個胺基酸序列改變(加入、缺失、取代及/或插入一胺基酸殘基)，較佳20個改變或更少、15個改變或更少、10個改變或更少、5個改變或更少、4個改變或更少、3個改變或更少、2個改變或更少或是1個改變。
於另外的優選具體例中，本發明之專一性結合物件包含一CH2域序列，其與序列辨識編號：5或6內列出的CH2域序列相比，具有一或更多個胺基酸序列改變(加入、缺失、取代及/或插入一胺基酸殘基)，較佳20個改變或更少、15個改變或更少、10個改變或更少、5個改變或更少、4個改變或更少、3個改變或更少、2個改變或更少或是1個改變。
於另外的優選具體例中，本發明之專一性結合物件包含一序列或由一序列所組成，該序列與序列辨識編號：25、26、29、30、33、34、37、38、40、41、45、46、49、50、72、73、76、77、80或81內列出的序列相比，具有一或更多個胺基酸序列改變(加入、缺失、取代及/或插入一胺基酸殘基)，較佳40個改變或更少、30個改變或更少、20個改變或更少、15個改變或更少、10個改變或更少、5個改變或更少、4個改變或更少、3個改變或更少、2個改變或更少或是1個改變。
亦預期一種專一性結合物件，其與本發明之專一性結合物件競爭與PD-L1之結合，或其與如本發明之專一性結合物件結合PD-L1上相同的抗原決定位，其中該專一性結合物件較佳包含一PD-L1抗原結合位址座落於該專一性結合物件的一CH3域內。用於決定二種抗體競爭一抗原之方法係本技藝已知。舉例而言，二種抗體與一抗原結合之競爭能使用表面電漿子共振，諸如Biacore來判定。用於定位一種抗體結合的抗原決定位之方法同樣為本技藝已知的。
本發明之專一性結合物件可結合人類PD-L1及/或食蟹獼猴PD-L1。較佳地，本發明之專一性結合物件結合人類PD-L1。
本發明之專一性結合物件較佳能與細胞表面上表現的PD-L1結合。細胞較佳為癌細胞。
於該專一性結合物件包含對第二抗原專一的一第二抗原結合位址，諸如一CDR-為基的抗原結合位址的情況中，該專一性結合物件較佳能同時結合PD-L1及第二抗原。較佳地，該專一性結合物件能同時結合PD-L1及第二抗原，其中PD-L1及第二抗原係表現於單一細胞表面上或二個分開的細胞表面上。
本發明之專一性結合物件較佳以5 nM、4 nM、3 nM或2 nM的親和力，或更大的親和力與單體PD-L1，較佳為人類單體PD-L1結合。較佳地，本發明之專一性結合物件係以2 nM的親和力(KD )，或更大的親和力與PD-L1，較佳為人類PD-L1結合。
本發明之專一性結合物件較佳以20 nM、19 nM、18 nM、17 nM或16 nM的親和力(KD )，或更大的親和力與細胞表面上表現的PD-L1，較佳為人類PD-L1結合。較佳地，本發明之專一性結合物件係以16 nM的親和力(KD )，或更大的親和力與PD-L1，較佳為人類PD-L1結合。
一專一性結合物件與同源抗原，諸如PD-L1的結合親和力能由，舉例而言表面電漿子共振(SPR)，如Biacore來判定。一專一性結合物件與細胞表面上表現的同源抗原，諸如PD-L1的結合親和力能由流動式細胞測量術來判定。
Fcabs具有比單株抗體更小的結合界面，因Fcabs的結合位址形成相對緊密的抗體片段帶有位處極接近的二個結合位址。相反地，典型的mAb之Fab臂係由一種撓性鉸鏈區分隔開。Fcab的二個抗原結合位址當與典型的mAb之該等相比之下，亦在空間上彼此接近。基於此更小的結合界面及二個結合位址降低的可撓性，抗-PD-L1 Fcabs能以如PD-L1專一性單株抗體相似的親和力及效能結合且抑制PD-L1是令人驚異的。
當該專一性結合物件呈完整的免疫球蛋白分子形式，於此亦稱為mAb2 時，該專一性結合物件於T細胞活化分析，諸如DO11.10分析內可具有9 nM或更小、8 nM或更小、7 nM或更小、6 nM或更小、5 nM或更小、4 nM或更小、3 nM或更小、或2 nM或更小，較佳2 nM或更小的EC50 。
當該專一性結合物件呈由CH3域、CH2域及座落於該CH2域的N端之截斷的免疫球蛋白鉸鏈區所組成之Fcab形式時，該專一性結合物件於T細胞活化分析，諸如DO11.10分析內可具有2 nM或更小、1 nM或更小、或0.5 nM或更小，較佳0.5 nM或更小的EC50 。
DO11.10分析為一種T淋巴細胞及B淋巴細胞融合瘤細胞株為基礎的IL-2釋放分析且可用於本發明的專一性結合物件之功能篩選。IL-2釋放是T細胞活化的指標。DO11.10分析可為本文之實施例6中所述的DO11.10分析。
舉例而言，DO11.10分析可包含，舉例而言於實驗培養基，例如沒有嘌呤黴素之完全DO11.10培養基內製備感興趣的專一性結合物件之稀釋。該專一性結合物件與用含人類PD-L1的慢病毒載體轉導以過度表現人類PD-L1的4x105 /ml B細胞融合瘤細胞(亦稱為“B細胞融合瘤細胞”) (例如LK35.2 hPD-L1細胞)可以於實驗培養基內、於例如於96-圓底平盤內、每孔存在2.46 µM OVA胜肽(例如100 µL B細胞融合瘤細胞/專一性結合物件)混合物，以1:1予以混合，以及可以於5% CO2 、37℃下孵育歷時1小時。可以添加配於100 µl體積實驗培養基內、以空的慢病毒載體轉導、每ml 2x105 DO11.10 T細胞融合瘤細胞(稱為“DO11.10 T細胞”；(如，DO11.10 pLVX細胞)至100 µl的B細胞融合瘤細胞/專一性結合物件混合物。繼而混合細胞然後於5% CO2 、37℃下孵育歷時24小時。收集上清液且用小鼠IL-2 ELISA套組(例如來自eBioscience, 88-7024-88或R&D systems, SM2000)予以分析。使用平盤讀數器例如有Gen5軟體的平盤讀數器，BioTek，於450 nm下讀取平盤。450 nm的吸光度值可減去570 nm的吸光度值用於校正的目的。可以根據四參數邏輯曲線擬合(例如Gen5軟體，BioTek)來計算細胞介素濃度的標準曲線。可以繪製小鼠IL-2濃度相對於專一性結合物件的log濃度的圖。產生的曲線可以，舉例而言使用GraphPad Prism、使用log(促效劑)相對反應方程式來擬合。
於DO11.10 T細胞活化分析的情況下，舉例而言，可以利用Lenti-X HTX包裝系統、使用慢病毒轉導方法論來製備以空的慢病毒載體轉導的DO11.10 T細胞融合瘤細胞，以產生含空的慢病毒載體pLVX之DO11.10細胞。Lenti-X表現載體(pLVX)可以與Lenti-X HTX包裝混合物共轉染至Lenti-X 293T細胞株內以產生病毒。DO11.10細胞株可以使用以Lenti-X HTX包裝系統生產的慢病毒顆粒予以轉導。
於DO11.10 T細胞活化分析的情況下，舉例而言，可以利用Lenti-X HTX包裝系統、使用慢病毒轉導方法論來製備用含人類PD-L1而過度表現人類PD-L1的慢病毒載體轉導的B細胞淋巴瘤細胞，例如LK35.2 B細胞淋巴瘤細胞(ATCC, HB-98)。含人類PD-L1 cDNA的Lenti-X表現載體(pLVX)可以與Lenti-X HTX包裝混合物共轉染至Lenti-X 293T細胞株內以產生病毒。B細胞淋巴瘤細胞可以使用以Lenti-X HTX包裝系統生產的慢病毒載體予以轉導。
當該專一性結合物件呈完整的免疫球蛋白分子形式，於此亦稱為mAb2 時，該專一性結合物件於葡萄球菌腸毒素B(SEB)分析中可具有5 nM或更小、4 nM或更小、3 nM或更小、或2 nM或更小，較佳2 nM或更小的EC50 。
當該專一性結合物件呈由CH3域、CH2域及座落於該CH2域的N端之截斷的免疫球蛋白鉸鏈區所組成之Fcab形式時，該專一性結合物件於葡萄球菌腸毒素B(SEB)分析中可具有5 nM或更小、4 nM或更小、3 nM或更小、2 nM或更小、1 nM或更小、0.5 nM或更小、0.3 nM或更小、或0.2 nM或更小，較佳0.2 nM或更小的EC50 。
葡萄球菌腸毒素B為(SEB)一種超級抗原，且會與抗原呈現細胞(APCs)上的第II類MHC分子及T細胞受體(TCR)的vβ鏈結合，造成T細胞的非專一性分析活化及細胞介素釋放。T細胞活化沒有要求存在抗原專一性TCRs。SEB分析使用經刺激的人類末梢血液單核細胞(PBMCs)及生理水平的檢查點抑制劑，以及能用來確認專一性結合物件提升人類系統內的T細胞活化。
SEB分析可為本文實施例7中所述的SEB分析。
舉例而言，SEB分析可包含：
(i) 舉例而言，藉由Ficoll梯度分離而自白血球椎(cones)單離PBMC。CD4+ T細胞可以使用人類CD4+ T細胞單離套組(例如來自Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-533)予以單離。可以藉由渦流使人類T-活化劑CD3/CD28標記磁珠(Dynabeads) (例如來自Life technologies, 11131D)再懸浮。小珠可移至無菌15ml管以及可以添加10ml RPMI(例如來自Life Technologies, 61870044)加上10% FBS(例如來自Life Technologies, 10270106)及1x青黴素鏈黴素(例如來自Life Technologies, 15140122)來清洗標記磁珠。可以丟棄上清液。以1.0 x106 個細胞/ml配於RPMI加上10% FBS及1x青黴素鏈黴素溶液及50 IU/ml重組人類IL2(例如來自Peprotech, 200-02-50μg)之所需量的CD4+ T細胞、以小珠對細胞比3:1，可移至T75燒瓶(例如來自Greiner Bio-one, 690195)以及於37℃ + 5% CO2 下孵育。3天之後可溫和地再懸浮細胞且計數。可以藉由添加新鮮的培養基(例如RPMI-10% FBS+青黴素鏈黴素溶液1X + 50IU/ml rhuIL2)使細胞密度維持在0.8-1 x 106 個細胞/ml之間。於第7或8天，可以移去CD3/28小珠。CD4+ T細胞可以以1 x 106 個細胞/ml新鮮的培養基RPMI-10% FBS+青黴素鏈黴素溶液1X加上減少的10IU/ml rhuIL2休息過夜；
(ii) 舉例而言，使用(i)所述的方法，例如利用人類泛單核球(Pan Monocyte)單離套組(例如來自Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-537)而自人類PBMCs單離未觸動的單核球。單核球可以，例如使用人類Mo-DC分化培養基(例如來自Miltenyi Biotec Ltd, 130-094-812)而分化成iDCs；及/或
(iii) 製備感興趣的專一性結合物件於，例如AIM培養基(例如來自Gibco, 12055-091)內之稀釋。MoiDCs，例如最初於(ii)中製備者，可以以1:10比率與來自相同供體的T細胞混合(5 ml、2x105 個細胞/ml的iDCs可組合以5ml、2x106 個細胞/ml的T細胞)。可添加0.1 µg/ml、20 µl的SEB(例如來自Sigma, S4881)至10 ml的細胞。於圓底96孔平盤內，可添加100 µl的細胞/SEB混合物至100 µl的專一性結合物件稀釋，提供每孔配於200 µl培養基(例如AIM培養基)之104 iDC細胞對105 T細胞比率及0.1 ng/ml SEB。細胞可以於5%CO2 、37℃下孵育歷時4天。可以用ELISA來分析上清液的IFNᵧ，例如人類IFNᵧ ELISA套組(例如來自R&D Systems, PDIF50)。分析可以使用以PBA(DPBS, 2% BSA(例如來自Sigma, A7906-100G))1:30稀釋的上清液來執行。可以繪製人類IFNᵧ濃度相對於專一性結合物件的log濃度的圖。產生的曲線可以，舉例而言使用GraphPad Prism軟體、使用log(促效劑)相對反應方程式來擬合。
該專一性結合物件可以以30 nM或更小、20 nM或更小、15 nM或更小、14 nM或更小、13 nM或更小、12 nM或更小、或11 nM或更小，較佳11 nM或更小的EC50 ，能阻斷PD-L1及PD-1，較佳人類PD-L1及人類PD-1之間的交互作用。
當該專一性結合物件呈完整的免疫球蛋白分子形式，於此亦稱為mAb2 時，該專一性結合物件可以以50 nM或更小、45 nM或更小、40 nM或更小、或30 nM或更小，較佳30 nM或更小的EC50 ，而能阻斷PD-L1及CD80，較佳人類PD-L1及人類CD80之間的交互作用。
當該專一性結合物件呈由CH3域、CH2域及座落於該CH2域的N端之截斷的免疫球蛋白鉸鏈區所組成之Fcab形式時，該專一性結合物件可以以20 nM或更小、15 nM或更小、14 nM或更小、13 nM或更小、12 nM或更小、11 nM或更小、或10 nM或更小，較佳10 nM或更小的EC50 ，而能阻斷PD-L1及CD80，較佳人類PD-L1及人類CD80之間的交互作用。
測試本發明之專一性結合物件阻斷人類PD-L1及人類PD-1或人類CD80之間交互作用的能力的方法為本技藝已知的且於本文中說明。舉例而言，阻斷人類PD-L1及人類PD-1或人類CD80之間的交互作用可以使用細胞為基的受體結合分析來測試。2 μg/mL生物素化人類PD-L1可以孵育歷時1小時且滴定範圍自400 nM至3 pM的Fcabs濃度。混合物與過度表現人類PD-1或人類CD80的細胞，例如HEK293細胞，可以孵育再一個小時。細胞上結合的生物素化人類PD-L1位準可以使用鏈黴抗生物素(streptavidin)647來偵測且可使用FACS來測量螢光位準，偵測的螢光位準藉以表示PD-L1與細胞表現的PD-1或人類CD80之結合位準。
該專一性結合物件可具有60℃或更高、61℃或更高、62℃或更高、63℃或更高、64℃或更高、65℃或更高、66℃或更高、67℃或更高、或68℃或更高，較佳為65℃或更高、66℃或更高、67℃或更高、或68℃或更高，更佳為66℃或更高、67℃或更高、或68℃或更高的熔化溫度。當測量熔化溫度時，該專一性結合物件可呈完整的免疫球蛋白分子形式，於此亦稱為mAb2 。
本發明之專一性結合物件的熔化溫度可藉由已知的方法來測量。舉例而言，本發明之專一性結合物件的熔化溫度可藉由微差掃描熱量法(DSC)或微差掃描螢光分析法(differential scanning fluorimetry) (DSF)來測量。
治療抗體之聚集可能導致藥物效能喪失且可能造成不必要的免疫原性(immunogenicity)。因而顯示很少或沒有聚集的抗體以此目的而言是首選。當該專一性結合物件呈水溶液時，該專一性結合物件可顯示不超過5%、4%或3%，較佳為3%之聚集。呈水溶液之該專一性結合物件之聚集能使用，舉例而言粒徑篩析層析法(SEC)來判定。
本發明之專一性結合物件可以複合至一種生物活性劑、治療劑或可偵測的標示。在這種情況下，該專一性結合物件可以稱為複合物(conjugate)。此等複合物於治療如本文所述的疾病及病況方面獲得應用。
舉例而言，該專一性結合物件可以複合至一免疫系統調控劑、胞毒型分子、放射性同位素或可偵測的標示。免疫系統調控劑或胞毒型分子可以為一細胞介素。免疫系統調控劑亦可以為一種細胞表面受體或其生物活性片段，例如一種包含受體的配體結合域或由受體的配體結合域所組成的片段。任擇地，免疫系統調控劑可以為一種細胞表面受體的配體，例如一胜肽配體，或配體的生物活性片段，例如一種包含配體的受體結合域或由配體的受體結合域所組成的片段。可偵測的標示可以為一放射性同位素，諸如非治療放射性同位素。
該專一性結合物件可以藉由肽鍵或鍵接子而與生物活性劑、治療劑或可偵測的標示複合，換言之於融合多肽之內，該融合多肽包含該生物活性劑、治療劑或可偵測的標示及該專一性結合物件或其多肽鏈組分。其他用於複合的構件包括化學複合，尤其是使用雙功能製劑之交聯作用(諸如使用DOUBLE-REAGENTSTM Cross-linking Reagents Selection Guide, Pierce)。
該專一性結合物件及生物活性劑、治療劑或可偵測的標示因而可以，舉例而言經由任何合適的化學鍵或經由鍵接子，例如胜肽鍵接子，而直接彼此連接。
胜肽鍵接子可以為短的(2-20，較佳2-15個胺基酸殘基長(stretch))。合適的胜肽鍵接子序列之實例係本技藝已知的。可以使用一或更多不同的鍵接子。鍵接子長度可以為約5個胺基酸。
化學鍵可以為，舉例而言，共價或離子鍵。共價鍵之實例包括胜肽鍵(醯胺鍵)及雙硫鍵。舉例而言，該專一性結合物件及生物活性劑、治療劑或可偵測的標示(診斷劑)可以舉例而言，藉由胜肽鍵(醯胺鍵)予以共價鍵接。生物活性劑、治療劑或可偵測的標示可以藉由共價鍵，如胜肽鍵(醯胺鍵)，直接與該專一性結合物件的C端或N端末端連接。在特定的具體例中，生物活性劑、治療劑或可偵測的標示係藉由胜肽鍵(醯胺鍵)直接與該專一性結合物件的N端末端連接。因而，該專一性結合物件及生物活性劑、治療劑或可偵測的標示(診斷劑)可以生產(分泌)為單鏈多肽。
本發明亦提供編碼本發明之抗體分子之經單離的核酸。使用本技藝眾所周知的方法來製備此核酸對於熟悉此藝者沒有困難。一種經單離的核酸可，舉例而言藉由表現於細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞內，而用來表現本發明之專一性結合物件。較佳的宿主細胞為哺乳動物細胞諸如CHO、HEK或NS0細胞。一般而言會提供用於表現重組載體的形式之核酸。
包含此核酸及載體之活體外 宿主細胞為本發明的一部分，因表現本發明的專一性結合物件為其等之用途，其可隨後自細胞培養物純化且選擇性地調配成一藥學組成物。本發明因而進一步提供一種生產本發明專一性結合物件之方法，其包含於用於生產該專一性結合物件的條件下培養本發明的重組宿主細胞。用於培養如上提及合適的宿主細胞之方法為本技藝眾所周知的。該方法可進一步包含單離及/或純化該專一性結合物件。該方法亦可包含調配該專一性結合物件成一藥學組成物，選擇性地加上一藥學上可接受的賦形劑或如以下所述之其他物質。
已知PD-L1表現於許多癌細胞上，及免疫系統細胞上。
因而，本發明的專一性結合物件可用於一種治療一患者癌症的方法。患者較佳為人類患者。
使用本發明之專一性結合物件要治療的癌症細胞可表現PD-L1，舉例而言於其等之細胞表面上。在一具體例中，要治療的癌症細胞可能已經判定表現PD-L1，舉例而言於其等之細胞表面上。用於判定一種抗原於細胞表面上的表現之方法為本技藝已知的且包括，舉例而言，流動式細胞測量術。
業已在臨床試驗中研究使用抗-PD-L1或抗-PD-1抗體治療對抗各種癌症且顯現出大有可為的結果。此等包括下列實性腫瘤，例如卵巢癌、前列腺癌、結腸直腸癌(colorectal cancer)、纖維肉瘤、腎細胞癌、黑色素瘤(晚期及轉移的黑色素瘤)、胰臟癌、乳癌、多形性神經膠質母細胞瘤、肺癌(譬如非小細胞肺癌及小細胞肺癌)、頭頸部癌症(譬如頭頸部鱗狀細胞癌)、胃癌(stomach cancer) (胃癌(gastric cancer))、膀胱癌、子宮頸癌(cervical cancer)、子宮癌(子宮內膜癌、子宮子宮頸癌(uterine cervical cancer))、陰門癌、睪丸癌、陰莖癌、食道癌、肝細胞癌、鼻咽癌、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、間皮瘤、DNA誤配修補缺陷型結腸直腸癌、DNA誤配修補缺陷型子宮內膜癌、甲狀腺癌、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)(譬如瀰漫型大B細胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、緩慢型(indolent)非何杰金氏淋巴瘤、外膜細胞淋巴瘤)、白血病(譬如慢性淋巴球性白血病、骨髓性白血病、急性類淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastoid leukaemia)或慢性類淋巴母細胞白血病)、多發性骨髓瘤及周邊T細胞淋巴瘤。本發明的專一性結合物件因而可於治療此等癌症方面獲得應用。此等癌症腫瘤已知或預期會含有表現PD-L1的免疫細胞，例如TILs。
特別地，使用抗-PD-L1抗體進行的黑色素瘤、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、腎細胞癌、胃癌、頭頸部癌症(譬如頭頸部鱗狀細胞癌)、間皮瘤、肺癌(譬如非小細胞肺癌)、卵巢癌、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、胰臟癌、黑色素瘤及肝細胞癌之治療，業已在臨床試驗中研究且顯現出大有可為的結果。因而，要使用本發明之抗體分子治療的癌症可以為黑色素瘤、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、腎細胞癌、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌症(譬如頭頸部鱗狀細胞癌)、間皮瘤、肺癌(譬如非小細胞肺癌)、卵巢癌、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、胰臟癌、黑色素瘤或肝細胞癌。
於本申請案提及一特定種類的癌症的情況中，諸如乳癌，此係指相關組織，在這種情況下為乳房組織的惡性轉化。一種源自於不同組織，諸如卵巢組織惡性轉化的癌症，可能於身體的另一位置，諸如乳房導致轉移性病灶，但是本文不會由此稱為乳癌而是稱為卵巢癌。
癌症可為原發性或繼發性癌症。因而，本發明之專一性結合物件可用於一種治療一患者癌症的方法，其中該癌症為原發性腫瘤及/或腫瘤轉移。
亦預期本發明的專一性結合物件於治療感染性疾病方面獲得應用，諸如病毒、細菌、真菌及/或寄生蟲感染。較佳地，感染性疾病為病毒、細菌或真菌疾病，更佳為病毒或細菌疾病，最佳為病毒疾病。感染性疾病可為慢性或急性，但較佳為慢性。
可以用如本發明的專一性結合物件治療的病毒疾病之實例包括：人類免疫不全病毒(HIV)、流行性感冒病毒、腸病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、A型肝炎病毒(HAV)、D型肝炎病毒(HDV)及E型肝炎病毒(HEV)、呼吸道融合細胞病毒(RSV)、疱疹病毒(例如艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)、單純疱疹病毒1(HSV-1)、單純疱疹病毒2(HSV-2)、細胞巨大病毒(CMV))及乳頭瘤病毒感染。
可以用本發明的專一性結合物件治療的細菌疾病之實例包括：結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )、革蘭氏陰性細菌(例如不動桿菌屬(Acinetobacter )、克留氏菌屬(Klebisella )、腸桿菌屬(Enterobacter ))、革蘭氏陽性細菌(例如困難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile )、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )) 及李氏菌屬(Listeria )( 例如單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogene ))感染。
可以用本發明的專一性結合物件治療的真菌疾病之實例包括：麴菌屬(Aspergillus )及念珠菌屬(Candidia )感染。
可以用本發明的專一性結合物件治療的寄生蟲疾病之實例包括：瘧疾、弓蟲屬及利什曼原蟲屬感染。
亦預期本發明的專一性結合物件於治療發炎、與發炎相關的疾病及病況、及發炎疾病方面獲得應用，諸如中風、中風相關的發炎，及血管發炎或血管炎，諸如，中及大血管血管炎，或中樞及/或周邊神經系統血管炎。
本發明之專一性結合物件係設計用於治療患者，較佳為人類患者之方法中。專一性結合物件通常以藥學組成物之形式投予，該藥學組成物可包含該專一性結合物件以外之至少一組分，例如一種藥學上可接受的賦形劑。舉例而言，本發明之藥學組成物，除了活性成分之外，可包含一藥學上可接受的賦形劑、載劑、緩衝液、安定劑或本技藝熟悉此藝者眾所周知的其他物質。此等物質不應具有毒性並且不應干擾活性成分之功效。載體或其他物質的確切性質將依投予途徑而定，投予途徑可為經由注射，如靜脈或皮下注射。該專一性結合物件可靜脈內或皮下投予。
液態藥學組成物一般包含一液態載劑，諸如水、石油、動物或植物油、礦油或合成油。可包括生理食鹽水溶液、右旋糖或其他醣溶液或二醇類諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
就靜脈注射或病痛部位的注射而言，該專一性結合物件或包含該專一性結合物件的藥學組成物較佳係呈一種非經腸可接受的水溶液形式，其係無熱原及具有適宜的pH值、等滲透壓性及穩定性。本技藝相關技藝者能使用，舉例而言，等滲透壓性載劑如氯化鈉注射液、林格氏(Ringer)注射液、乳酸林格氏注射液來製備適宜的溶液。可視需要使用防腐劑、安定劑、緩衝液、抗氧化劑及/或其他添加劑。許多用於製備藥學調配物的方法係本技藝熟悉此藝者已知的。參見，舉例而言，Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
一種包含如本發明之專一性結合物件的組成物可以單獨投予或是組合以其他的治療同時或相繼投予，或與另一種治療劑(agent)或治療劑(agents)作為一種組合製備物，取決於待治療的病況。舉例而言，本發明之專一性結合物件可以與用於待治療的疾病，例如以上提及的癌症現存的治療劑組合。舉例而言，本發明之專一性結合物件可以組合以第二種抗癌療法，例如化學療法、抗腫瘤疫苗接種(亦稱為癌症疫苗接種)、放射療法、免疫療法、溶瘤病毒、嵌合抗原受體(CAR)T細胞療法或激素療法投予至患者。
本發明之專一性結合物件預期可作用為抗癌療法，例如化學療法、抗腫瘤疫苗接種或放射療法的佐劑。不希望受理論束縛，認為投予該專一性結合物件至患者作為化學療法、抗腫瘤疫苗接種或放射療法的一部分會觸發對抗癌症關聯性抗原PD-L1，比化學療法、抗腫瘤疫苗接種或放射療法單獨達成的免疫反應更大的免疫反應。
一種治療一患者癌症的方法因而可包含投予一治療有效量的如本發明之專一性結合物件組合以一化學治療藥物、抗腫瘤疫苗、放射性核種、免疫治療藥物、溶瘤病毒、CAR-T細胞或激素療法製劑至該患者。該化學治療藥物、抗腫瘤疫苗、放射性核種、免疫治療藥物、溶瘤病毒、CAR-T細胞或激素療法製劑較佳為用於所談論的癌症之化學治療藥物、抗腫瘤疫苗、放射性核種、免疫治療藥物、溶瘤病毒、CAR-T細胞或激素療法製劑，亦即已經證實對治療所談論的癌症有效的化學治療藥物、抗腫瘤疫苗、放射性核種、免疫治療藥物、溶瘤病毒、CAR-T細胞或激素療法製劑。已經證實對治療所談論的癌症有效之合適的化學治療藥物、抗腫瘤疫苗、放射性核種、免疫治療藥物、溶瘤病毒、CAR-T細胞或激素療法製劑之挑選係在本技術人員的能力範圍內。
舉例而言，於該方法包含投予一治療有效量的如本發明之專一性結合物件組合以一種化學治療劑至該患者的情況中，該化學治療劑可以選自於下列所組成的群組：紫杉烷(taxanes)、胞毒型(cyctotoxic)抗生素、酪胺酸激酶抑制劑、PARP抑制劑、B-RAF酵素抑制劑、烷化劑、鉑類似物、核苷類似物、沙利竇邁(thalidomide)衍生物、抗惡性腫瘤化學治療劑及其他。紫杉烷包括多烯紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)及nab-紫杉醇；胞毒型抗生素包括放線菌素(actinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、蒽環(anthracyclines)、多柔比星(doxorubicin)及戊柔比星(valrubicin)；酪胺酸激酶抑制劑包括舒尼替尼(sunitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉菲替尼(gefitinib)、阿西替尼(axitinib)、PLX3397、伊馬替尼(imatinib)、考比替尼(cobemitinib)及曲美替尼(trametinib)；PARP抑制劑包括尼拉帕尼(piraparib)；B-Raf酵素抑制劑包括維羅非尼(vemurafenib)及達拉菲尼(dabrafenib)；烷化劑包括達卡巴嗪(dacarbazine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、替莫唑胺(temozolomide)；鉑類似物包括卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)及奥沙利鉑(oxaliplatin)；核苷類似物包括吉西他汀(gemcitabine)及阿扎胞苷(azacitidine)；抗惡性腫瘤劑包括氟達拉濱(fludarabine)。合適用於本發明之其他的化學治療劑包括胺甲喋呤(methotrexate)、地法替尼(defactinib)、恩替諾特(entinostat)、培美曲塞(pemetrexed)、卡培他濱(capecitabine)、艾日布林(eribulin)、伊立替康(irinotecan)、氟尿嘧啶(fluorouracil)及長春鹼(vinblastine)。
癌症治療之疫苗接種策略已於臨床中執行且於科學文獻中詳盡地討論(諸如Rosenberg, S.，2000)。此主要涉及激起免疫系統以對自體或同種異體癌症細胞表現的各種細胞標記起反應，其係藉由使用該等細胞作為疫苗接種方法，自體或同種異體癌症細胞二者帶有或不帶有顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)。GM-CSF於抗原呈現激起強大的反應且當與該策略一起使用時運作得特別好。
於該方法包含投予一治療有效量的如本發明之專一性結合物件組合以一種免疫治療藥物至該患者的情況中，該免疫治療藥物可以選自於下列所組成的群組：與一種查核點抑制劑、共刺激分子或可溶性因子結合的抗體，諸如與CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3、VISTA、CD73、CSF-1R、KIR、OX40、CD40、HVEM、TGFB、IL-10、CSF-1結合的抗體。任擇地，免疫治療藥物可以為選自於下列所組成的群組之一種或更多種細胞介素或細胞介素為基的療法：IL-2、複合的IL2之前驅藥、GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21、及第一型干擾素。
可按一“治療有效量”予以投予，此為足以顯示對於患者之益處之一量。該益處至少可改善至少一症狀。因而，“治療”一指定疾病係指改善至少一症狀。所投予的實際量及投予速率與時程，將依所治療病況的性質與嚴重性、所治療的特定患者、個別患者的臨床狀況、該障礙的肇因、組成物的遞輸部位、專一性結合物件的類型、投予方法、投予日程安排及執業醫師所知的其他因素而定。開立治療處方，例如決定劑量等等，係屬於普通科醫師及其他醫師的責任範圍內，及可能依所治療疾病的症狀嚴重性及/或惡化程度而定。適當的專一性結合物件劑量係本技藝眾所周知的(Ledermann等人，1991；及Bagshawe等人，1991)。可使用本文所示的特定劑量或Physician's Desk Reference (2003)中所指出之適合所投予專一性結合物件的特定劑量。可藉由比較其活體外 活性與在動物模式之活體內 活性而判定一專一性結合物件的治療有效量或適宜劑量。用於外推小鼠及其他測試動物之有效劑量至人類的方法係已知的。確切劑量將依數項因子而定，包括待治療區域的大小與位置以及該專一性結合物件的確切性質。治療可以以每天、每星期二次、每星期或每個月的間隔予以重複，由醫師自行決定。可在手術之前及/或之後給予治療，並且可投予或直接施用在外科手術治療的解剖部位上。
鑑於本揭露內容，包括下列實驗例證在內，本發明另外的態樣與具體例將為本技藝熟悉此藝者所顯而易見者。
於本文所用之“及/或”應視為兩種指定特徵或組分中之每一者具有或不具有另一者之特定揭示內容。舉例而言，“A及/或B”應視為(i)A、(ii)B以及(iii)A及B之每一者的特定揭示內容，如同各者係在本文中個別陳述一樣。
除非上下文另有規定，以上所列特性之說明與定義並非受限於本發明的任一特定態樣或具體例且同樣適用於所述的所有態樣與具體例。
現在將藉由實施例且參考以上所述之圖式來說明本發明的特定態樣與具體例。
實施例
實施例 1- 抗 人類PD-L1 Fcabs 之初始的選擇(Naïve selection)
1.1 蛋白生物素化
購買帶有C端人類IgG標誌的重組人類PD-L1(R&D Systems, 157-B7)、人類PD-1(R&D Systems, 1086-PD)及小鼠PD-L1(R&D Systems, 1019-B7)且使用Lightning Link類型A生物素化套組(Lightning Link Type A Biotinylation kit) (Innova Biosciences, 370-0010)予以生物素化。簡言之，於100 µl PBS內重組100 µg冷凍乾燥蛋白成1 mg/ml終濃度且添加10 µl修飾劑試劑至經稀釋蛋白並溫和地混合。將溶液加至一小瓶的Lightning-Link混合物並溫和地再懸浮以及於室溫下孵育過夜。添加淬滅劑溶液(10 µl)以及於室溫下孵育30分鐘，然後以10 µl等分試樣儲存生物素化蛋白於-80℃下。
1.2 噬菌體庫
使用具有AB(殘基11-18)及EF(殘基92-101)環內隨機化、展示人類IgG1(IMGT編號1.4-130)的CH3域之初始的噬菌體庫來選擇以上所述的PD-L1抗原。使用鏈黴抗生物素蛋白標記磁珠(Streptavidin Dynabeads) (Thermo Fisher, 11205D)及偶合至標記磁珠的中性親和素結合蛋白(Thermo Fisher, 31000)來進行庫之三輪選擇以單離結合生物素化PD-L1 Fc的噬菌體。此外，每次選擇添加人類血漿過量的IgG Fc片段以避免單離出Fc結合者。
用ELISA來篩選與PD-L1結合之產品以及亞選殖(sub-cloned)陽性結合者且使用EasySelect畢赤酵母表現套組(EasySelectPichia Expression Kit) (Life Technologies, K1740-01)予以表現為可溶性Fcabs(含截斷的鉸鏈)於巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )內。於挑出的30個獨特的Fcab殖株中，18個殖株在從噬菌體轉移至可溶性表現平台時表現為可溶性蛋白。
1.3 ELISA為基的阻斷分析
人類PD-L1-結合Fcabs阻斷人類PD-L1 Fc及PD-1或CD80之間交互作用的能力係使用重組生物素化人類PD-L1(實施例1.1 中所述)及重組人類PD-1 Fc(R&D Systems, 1086-PD)或CD80 Fc(R&D Systems, 140-B1)、以ELISA為基的受體結合分析(RBA)予以研究。
簡言之，重組人類PD-1 Fc或CD80 Fc係分別以0.5或1.0 µg/ml塗覆於Maxisorp平盤(Thermo Scientific, 439454)上。平盤於4 ℃下孵育過夜、以PBS清洗一次以及隨後用含1%吐溫的300 µl PBS於室溫下進行阻斷2小時。相應濃度的Fcab(0.5至500 nM，2倍稀釋)、對照IgG Fc(10-10000 nM，2倍稀釋)或對照抗體(0.010至10 nM，2倍稀釋)係與250 ng/µl生物素化PD-L1 Fc在室溫下、於100 µl PBS內孵育1小時同時以450 rpm搖動。測試對照IgG Fc達10000 nM的濃度以判定任何非專一性阻斷活性。使用的對照mAbs為抗-人類PD-L1 mAb(MIH1, Affymetrix eBioscience, 14-5983-82)及PD-L1 mAb YW243.55.S70(“S70”)(專利公開號碼：US 2013/0045202 A1)。
丟棄阻斷溶液且添加生物素化PD-L1 Fc/Fcab或對照抗體混合物至maxisorp平盤以及於室溫下孵育1小時同時以450 rpm搖動。平盤係以300 µl PBS/吐溫0.05%清洗3x，接著以1x PBS清洗3次。與辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase (HRP))複合的鏈黴抗生物素蛋白係以1:1000稀釋於PBS內以及添加100 µl至孔且於4 ℃下孵育1小時同時以450 rpm搖動。以300 µl PBS/吐溫0.05%清洗平盤3x，接著以1x PBS清洗3次。各孔添加100 µl TMB基質(eBioscience, 00-4201-56)。於添加TMB後2-10分鐘之間藉由加入50 µl 1M硫酸溶液來終止反應。於加入硫酸30分鐘內、以96孔平盤讀數器於450-630 nm下讀取OD以及使用GraphPad Prism軟體(GraphPad Software, Inc.)來分析。
測試18個殖株，其中三個，FS17-19、FS17-26及FS17-33，能阻斷人類PD-L1 Fc及PD-1之間的交互作用。關於此等殖株，進行完全劑量反應RBA且分析其等阻斷PD-L1與CD80之間交互作用的能力。FS17-19、FS17-26及FS17-33全部均顯示出對PD-L1:PD-1交互作用及PD-L1:CD80交互作用有效力的阻斷活性(資料未顯示)。
1.4 Fcabs與重組PD-L1的結合
FS17-19、FS17-26及FS17-33與重組人類及小鼠PD-L1 Fc的結合係使用BIAcore 3000(GE Healthcare)、藉由表面電漿子共振來測量。
簡言之，使用鏈黴抗生物素感測器晶片(GE Healthcare, BR100032)來塗覆人類PD-L1 Fc(實施例1.1 中所述)於流動室2上，小鼠PD-L1 Fc(實施例1.1 中所述)於流動室4上，以及流動室1不塗覆且使用作為參考。人類PD-L1 Fc及小鼠PD-L1 Fc係以大約10000 RU予以偶合。以HBS-EP緩衝液(GE Healthcare, BR100669)稀釋的Fcabs係以10 µM或3.3 µM及3倍稀釋注射5分鐘然後允許於緩衝液內解離3分鐘。因Fcabs於緩衝液內完全解離所以不需要再生。減去的數據(流動室2–流動室1或流動室4–流動室1)係使用BIAevaluation 3.2來分析以確認結合作用。
結合數據(未顯示)證實FS17-19、FS17-26及FS17-33會與人類PD-L1 Fc結合。亦發現FS17-19與小鼠PD-L1 Fc的交叉反應性很弱，但FS17-26及FS17-33不是。
1.5 表現人類PD-L1、食蟹獼猴PD-L1、小鼠PD-L1、人類CD80、小鼠CD80及人類PD-1之HEK 293細胞的發展
人類、小鼠及恆河獼猴PD-L1序列(序列辨識編號61、62及63)係使用KpnI及NotI限制位予以亞選殖至pcDNA5FRT載體(Life Technologies)內。人類及小鼠CD80及人類PD-1(序列辨識編號65、66及64)係使用HindIII及NotI限制位。此等載體繼而使用脂質體2000(Life Technologies, 11668-019)轉形至Flp-In T-REx 293細胞株(Life Technologies, R780-07)之內。細胞係生長於含有10% FBS、100 µg/ml潮黴素B(Melford Laboratories Ltd, Z2475)及15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)之DMEM內3-4週直到形成穩定轉形的細胞群落。此等群落係於1 µg/ml多西環素(Sigma Aldrich, D9891)存在下擴大以及使用PE複合的抗人類PD-L1(MIH1)抗體(BD Biosciences, 557924)、PE複合的抗小鼠PD-L1(MIH5)抗體(BD Biosciences, 558091)、PE複合的抗人類CD80抗體(L307.4, BD Biosciences 557227)、PE複合的抗人類PD-1抗體(MIH4, BD Biosciences, 557946)或FITC-複合的抗小鼠CD80抗體(16-10A1, BD Biosciences, 553768)來測試PD-L1、CD80或PD-1的表現。使用細胞解離緩衝液使細胞分離、用PBS清洗一次且於96孔平盤的孔內平盤培養2x105 個細胞然後以1:20 PBS稀釋之抗體於4 ℃下孵育1小時。用PBS清洗細胞一次然後以Accuri C6細胞計數器(BD Biosciences)來測量以及使用FlowJoX來分析數據。於各別細胞株偵測到人類、恆河獼猴及小鼠PD-L1，以及人類CD80、小鼠CD80及人類PD-1之表現。
1.6 細胞為基的結合分析
繼而測試FS17-19、FS17-26及FS17-33 Fcab與HEK細胞表現的人類PD-L1、人類CD80、人類PD-1、小鼠CD80或小鼠PD-L1之結合(關於細胞株的生產細節參見實施例 1.5 )。
簡言之，過度表現此等蛋白的HEK 293細胞係生長於含有10% FBS(Life Technologies, 10270-1-6)、100 µg/ml潮黴素B(Melford Laboratories Ltd, Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Melford Laboratories Ltd, B1105)之DMEM(Life Technologies, 61965-026)內且使用細胞解離緩衝液(Life Technologies, 13151-014)與組織培養燒瓶分離並且以2x105 個細胞/孔播種於V-底96-孔平盤內。Fcabs係以1 µM配於100 µl體積與細胞於4 ℃下孵育1小時。添加如製造商建議濃度的PE-或FITC複合的對照mAbs於100 µl體積內在4 ℃下1小時。實施例 1.5 使用的抗體於此實驗係用作為對照抗體。平盤係用PBS、藉由於4 ℃下以1500 rpm離心3 min以清洗平盤一次以及移去上清液。二級抗體(山羊抗人類Fc Alexa Fluor 488，Jackson ImmunoResearch，109-546-098)係以1:1000稀釋於PBS內以及於4 ℃下添加100 µl至細胞歷時30分鐘(平盤保持於黑暗中)。如前，用PBS清洗平盤一次後，使丸粒再懸浮於含1 mg/ml DAPI(Biotium, 40043)的100 µl PBS內。以Accuri C6細胞儀(BD Bioscience)來讀取平盤並使用FlowJoX來分析數據。
發現FS17-19、FS17-26及FS17-33與細胞表面人類PD-L1專一性結合但是不會與人類PD-1、人類CD80、小鼠PD-L1或小鼠CD80專一性結合。
1.7 細胞為基的阻斷分析
Fcabs FS17-19、FS17-26及FS17-33阻斷重組PD-L1與細胞結合的PD-1之結合的能力係以細胞為基的阻斷分析來判定。
簡言之，表現人類PD-L1的HEK 293細胞(參見實施例 1.5 )係以每孔1x105 個細胞播種於V底96孔平盤PBS內。相應濃度的Fcab(78至10000 nM，2倍稀釋)、對照IgG Fc(10000 nM)或對照抗體(500 nM)與250 ng/µl生物素化PD-L1 Fc係於室溫下於100 µl 1x PBS內孵育1小時同時以450 rpm搖動。使用抗-人類PD-L1 mAb(MIH1)作為對照。平盤係於4 ℃下以1500 rpm離心3分鐘以使細胞成丸粒。丟棄PBS以及添加預孵育的Fcab或對照抗體/生物素化hPD-L1 Fc混合物至孔於4 ℃下歷時1小時。平盤係於4 ℃下以1500 rpm離心3分鐘以使細胞成丸粒，丟棄上清液以及細胞再懸浮於PBS內。與Alexa 647複合的鏈黴抗生物素蛋白係以1:1000稀釋於PBS內以及添加100 µl至孔於4 ℃下歷時30分鐘。平盤係如先前所執行地予以離心，丟棄上清液以及使細胞再懸浮於PBS內。以Accuri C6細胞儀(BD Bioscience)來讀取平盤並使用FlowJoX來分析數據。
與ELISA為基的阻斷分析結果一致，FS17-19、FS17-26及FS17-33於所測試的濃度顯示出有效力的阻斷活性。Fcabs FS17-19及FS17-33顯示出比Fcab FS17-26更高的阻斷活性且因而被挑選用於親和力成熟。
1.8 初始選擇程序的總結
來自初始的噬菌體庫之初始篩選所辨識的30種Fcabs，三種抗-人類PD-L1 Fcabs(FS17-19、FS17-26及FS17-33)顯示出有效力的PD-L1/PD-1及PD-L1/CD80阻斷活性。Fcabs FS17-19及FS17-33二者於ELISA分析及細胞為基的分析二者中均顯示出比Fcab FS17-26更高的阻斷活性，以及與重組及細胞表面PD-L1 Fc的專一性結合，且因而被挑選用於如以下實施例 2 中所述進一步的親和力成熟。
實施例2- 實施例1 辨識的Fcab 殖株 之親和力成熟及功能改良
2.1 Fcab FS17-19之親和力成熟及功能改良
Fcab FS17-19進行多輪親和力成熟從AB及EF環之NNK移動(NNK walk)開始，其係使用如以下2.2.1所述的方法相似的方法。NNK移動導致衍生自FS17-19的殖株，其於DO11 T細胞活化分析中測量時具有非常低的功能活性(關於方法論參見實施例 6 )，帶有低於陽性對照抗-PD-L1抗體S1 300倍的EC50 。為了改良功能活性，使用如以下3.1中所述相似的方法，進行AB、CD及EF環隨機化。含AB環突變的殖株於DO11 T細胞活化分析中顯示出對照抗體S1的80倍內之改良的活性。一種從AB環庫選出的Fcab殖株進行進一步輪次的親和力成熟，只集中在CD及EF環。從此次成熟而來的殖株並未顯示出超越上一輪殖株的功能活性之任何改良。
儘管以上所述大規模的親和力成熟策略，但是要從FS17-19譜系鑑定出於DO11 T細胞活化分析具有可接受位準的功能活性之殖株是不可能的，且因而放棄這譜系方面的工作。
2.2 Fcab FS17-33之親和力成熟及功能改良
自初始的噬菌體選擇單離出抗人類PD-L1 Fcab FS17-33，如以上實施例 1 中所述。此研究的目標是要藉由執行NNK移動通過AB及EF環而隨機化結合環內個別的殘基來改良FS17-33的活性。
2.2.1 結合 環 的NNK 移動
為了鑑定Fcab FS17-33內會改良PD-L1/PD-1阻斷活性的突變，藉由每次使Fcab FS17-33的AB及EF環中的一個胺基酸殘基多樣化來產生簡約突變誘發庫，導致總計12個別的庫(參見以下的表 1 )。用具有低冗餘性的NNK密碼子來製作該等庫以代表感興趣的位置所有可能的胺基酸。依據Quickchange Lightning定點誘變套組(Agilent, 200518)之指導方針來設計順向及反向引子，該套組係用來創造該等庫。
表 1 ： FS17-33的AB及EF結合環的胺基酸序列。‘~’符號表示FS17-33序列與野生型IgG1 Fc相比之下的一缺失。X表示在NNK移動時掃描的單一胺基酸。
簡言之，FS17-33 Fcab序列(CH3、CH2及截斷的鉸鏈，額外含LALA突變於該CH2域)選殖至pTT5表現載體(National Research Council of Canada)內導致載體pTT5-FS17-33AA。已知於人類IgG1之CH2域導入LALA突變會降低Fc g受體結合(Bruhns, P.，等人，2009及Hezareh等人，2001)。此係使用作為突變誘發庫的模板。用DpnI於37℃下處理PCR反應5 min以移除任何親代DNA然後轉形至大腸桿菌 (Mix and Go, Zymo research, T3009)內且於含胺苄青黴素的L平盤上平盤培養。隔天挑選轉形體且定序以確認突變。
使用標準的DNA單離方法來製備轉染用的DNA且於HEK Expi293細胞內表現簡約庫(使用ExpiFectamine 293轉染套組(Life Technologies, A14524)轉染DNA至Expi293F細胞內(Life technologies, A14527)。使用Octet (ForteBio)、藉由BLI來判定轉染的HEK上清液之Fcab濃度。Fcabs係使用mAb Select SuRe蛋白A管柱予以純化。
HEK 293上清液隨後係以二種濃度、以ELISA為基的RBA來分析(10 nM及50 nM，關於方法論參見實施例 1.3 )。於此分析中帶有與FS17-33蛋白相比，可能改良的PD-L1/PD-1阻斷活性之Fcabs係予以挑選且定序。此辨識出FS17-33序列內對於結合PD-L1是關鍵性，即於辨識出很少或沒有任擇的胺基酸為合適的取代(參見以下的表 2 )的情況下，的特定位置以及可能有數種可能任擇的胺基酸的位置。數種突變體多次被鑑別出，其強化了分析結果的信賴度。
表 2 ： FS17-33的AB及EF環內各突變位置辨識的胺基酸取代數目。殘基編號根據IMGT編號。
使ELISA為基的阻斷分析中具有最高活性二十七種Fcabs表現、純化且以細胞為基的阻斷分析來測試(關於方法論參見實施例 2.2.2 )。4種AB環及3種EF環殖株繼而藉由剪接重疊延伸PCR予以混洗來產生新的組合(Horton等人，2013)。混洗的Fcabs選殖至pTT5表現載體內、表現且以ELISA為基的阻斷(如以下1.3中所述)及細胞為基的阻斷分析(如以下2.2.2中所述)二者再次測試PD-L1/PD-1的阻斷作用。
環混洗後辨識出的殖株之一為FS17-33-37，其，與FS17-33相比，於AB環有一單一改變(S15V)且於EF環有一單一改變(G99D)。殖株FS17-33-37之AB及EF環係顯示於表 3 內。
表 3 ： FS17-33-37及FS17-33 Fcabs的AB及EF環內的殘基比較。殘基編號根據IMGT編號。‘~’符號表示FS17-33序列與野生型IgG1 Fc相比下的一缺失。
2.2.2 阻斷活性
實施例2.2.1 生產的殖株之阻斷活性係於細胞為基的分析中、使用過度表現人類PD-L1的HEK 293細胞(細胞株的發展參見1.5)予以分析。簡言之，表現人類PD-L1的HEK 293細胞係以每孔1x105 個細胞播種於V-底96-孔平盤PBS內。相應濃度的Fcab或陽性對照抗-PD-L1 mAb YW243.55.S1(“S1”) (專利公開號碼US 2013/0045202 A1)與500 ng/ml生物素化PD-1 Fc係於100 µl 1x PBS內孵育45分鐘同時以450 rpm搖動。平盤係於4 ℃下以1500 rpm離心3分鐘以使細胞成丸粒。丟棄PBS以及添加預孵育的Fcab或陽性對照/生物素化hPD-1 Fc混合物至孔於4 ℃下歷時1小時。平盤係於4 ℃下以1500 rpm離心3分鐘以使細胞成丸粒，丟棄上清液以及細胞再懸浮於PBS內。與Alexa 488複合的鏈黴抗生物素蛋白係以1:1000稀釋於PBS內以及添加100 µl至孔內於4 ℃下歷時30分鐘。平盤係於4 ℃下以1500 rpm離心3分鐘以使細胞成丸粒，丟棄上清液以及細胞再懸浮於有DAPI之PBS內。以FACS Canto (BD Bioscience)來讀取平盤並使用FlowJoX來分析數據。
辨識出與FS17-33相比活性有改良的Fcab殖株。此之實例係闡述於以下的表 4 中，與親代FS17-33殖株相比，其顯現出FS17-33-37改良的阻斷活性。此結合活性相似於陽性對照S1 mAb。
表 4 ： FS17-33-37 Fcab與親代FS17-33 Fcab相比之PD-L1/PD-1阻斷活性。
2.2.3 與 人類 及食 蟹獼猴 PD-L1 之 細胞 結合作用
為了測試細胞表面人類及食蟹獼猴PD-L1之結合作用，所以測試細胞為基的阻斷分析中具有最高活性的11種Fcabs殖株，包括FS17-33-37，與過度表現人類或食蟹獼猴PD-L1的HEK 293細胞之結合作用(關於方法論參見實施例 1.5 )。全部的Fcabs顯現出與人類PD-L1之劑量依賴式結合作用及大約5-10 nM之EC50 ，以及以大約100-200 nM之EC50 值與食蟹獼猴PD-L1結合。
2.2.4 DO11.10 T 細胞 活化分析
已知抑制PD-L1/PD-1的交互作用會導致T細胞活化增加(Stewart等人，2015)。因FS17-33-衍生的Fcabs顯現出有效力的PD-L1/PD-1交互作用之阻斷活性，預期其等亦會增加T細胞活化。為了測試此情況，利用DO11.10 T細胞活化分析來測試20個FS17-33衍生的Fcabs且與作為陽性對照之抗-PD-L1 mAb S1相比。於實施例6 中更詳細地說明該分析。
結果顯現出FS17-33衍生的殖株於此分析中能提升T細胞活化但是與抗-PD-L1陽性對照抗體S1相比活性非常弱(資料未顯示)。此為出乎意料的，因測試的Fcab殖株之PD-L1/PD-1阻斷活性的差異係在陽性對照的3-10倍之內。
2.2.5 FS17-33-37 之特徵化
Fcab殖株FS17-33-37係基於其於DO11.10 T細胞活化分析中之低/最小非專一性活性(無OVA胜肽)且根據其之粒徑篩析(SE)-HPLC剖繪而被挑選用於進一步的親和力成熟。粒徑篩析層析法(SEC)剖繪係以單體蛋白百分率及溶析時間來評估，偏好溶析時間接近野生型IgG Fc的溶析時間的殖株(參見圖 2 )。執行細胞結合作用、細胞為基的阻斷分析及DO11.10 T細胞活化分析之FS17-33-37的全劑量滴定以進一步特徵化FS17-33-37(資料未顯示)。結果確認FS17-33-37顯現出有效力的細胞結合作用及阻斷活性但是於DO11.10 T細胞活化分析之活性很弱。
2.2.6 Fcab FS17-33 之親和力成熟及功能改良的總結
FS17-33 Fcab的NNK移動突變誘發導致辨識出帶有增高的PD-L1:PD-1阻斷活性之多種殖株，達與抗-PD-L1陽性對照S1 mAb相似的位準。此外，抗人類PD-L1結合FS17-33衍生的Fcabs為食蟹獼猴PD-L1交叉反應性的。
然而，FS17-33譜系與陽性對照S1 mAb相比，於DO11.10 T細胞活化分析中令人意外的活性非常弱。此數據似乎與阻斷數據不一致。因DO11.10 T細胞活化分析比阻斷分析為生理上更相關的效能分析，FS17-33衍生的Fcabs殖株之功能活性與陽性對照抗體相比之下為更低1000倍。
不希望受理論束縛，假設是當以DO11.10 T細胞活化分析測量時，FS17-33-衍生的Fcabs可能無法以足夠高的親和力與單體PD-L1結合以導致功能活性。阻斷及結合分析得到的結果可能受到了總結合性效應(avidity effect)的影響，其為此等分析使用的高位準人類PD-L1的的結果。
因而進行更大量的結合環隨機化、目的是辨識出帶有更高的PD-L1親和力及功能活性之Fcabs。FS17-33-37係基於其之專一性活性及SEC-HPLC剖繪，而被選擇作為進一步親和力成熟之親代殖株，如以下之實施例 3 中所述者。
實施例3-Fcab 殖株 FS17-33-37 之親和力成熟及功能改良
3.1 親和力成熟
為了得到具有改良活性的Fcab，使FS17-33-37親和力成熟以導入最大的多樣性。具體而言，使用FS17-33-37 PTT5質體DNA(參見2.2.1)作為模板來製備含隨機化環的庫。AB環(殘基14-18)、CD環(殘基45.1-78)及EF環(殘基92-94及97-101)的一部分係使用NNK引子(AB環)或ELLA引子(CD及EF環)予以隨機化。ELLA引子詳細指明各胺基酸使用的密碼子及其等於混合物內之相對豐度。只有半胱胺酸被排除在混合物外且任何其他的胺基酸沒有偏差。個別的環庫(AB、CD及EF環的各者有一個庫)經歷幾輪次的選擇以使得富含與親代殖株FS17-33-37相比，與生物素化hPD-L1-his(包含his-標誌)的結合有改良的Fcab殖株。
為了進一步改良成熟殖株對PD-L1之親和力，將來自各單一環庫的產品以無偏差的方式混洗以辨識出具有最高的hPD-L1親和力之環組合。混洗由選擇作用而來的產品，其係藉由從各單一環庫挑選的細胞單離DNA且藉由剪接重疊延伸PCR予以混洗來產生無偏差的環重組。繼而使用此DNA來創造新的酵母菌展示庫。使用擴增的PCR產品連同酵母菌載體(pYD1dem, Invitrogen V835-01)來轉形酵母菌細胞(EBY100, Invitrogen V835-01)。混洗的庫繼而經歷多輪次的選擇作用以使得富含具有最高的單體PD-L1親和力之殖株。
挑選的Fcabs與重組蛋白單體及二聚體PD-L1抗原二者的結合予以篩選。單體His-標誌的抗原(Acro biosystems Cat #PD1-H5229)係使用Pierce LC-LC生物素化套組(Thermo Fisher Scientific 21338)予以生物素化同時生物素化二聚體抗原為市場上可買到的(BPS Bioscience #71105)。
從篩選挑出104個Fcab殖株供可溶性表現。可溶性Fcabs係從pTT5 Fcab表現載體表現於HEK細胞中且使用mAb Select SuRe蛋白A管柱予以純化。
3.2 SEC剖繪
進行粒徑篩析層析法(SEC)以判定3.1中辨識的任一親和力成熟的Fcabs是否顯現出聚集。所有純化的Fcabs係藉由SE-HPLC、使用Agilent 1100系列HPLC加上Zorbax GF-250管柱(Agilent)予以分析。所有EF環含有MFYGP部分的殖株顯現出過量的聚集或完全不進入管柱。結果，此等殖株不被視為代表Fcabs合適的候選者且不經進一步測試。剩餘的40個殖株沒有顯現出聚集體的峰，但是其等的確有分裂峰或肩峰。舉例而言，如圖 2 所示，殖株FS17-33-116顯示一分裂峰(B )其於親代Fcab FS17-33-37殖株(A)不存在。此等偏差可能的原因稍後會討論，但不視為從候選者選擇方法移去此等Fcabs殖株的理由。
3.3 表現的Fcabs之解離速率篩選
可溶性表現於HEK細胞之後，由使用單體、His-標誌的抗原之選擇作用而來的Fcabs係使用BIAcore來篩選其等與人類PD-L1結合時之解離速率。簡言之，生物素化抗原係以10μg/mL塗覆於晶片上達585 RU且由表現的殖株而來的上清液以30 µL/分鐘從晶片上面流過。單體及二聚體PD-L1抗原二者均進行此分析。解離進行6分鐘。使用BIAevaluate軟體來進行分析。曲線係雙重減去空白流動室及沒有Fcab的運行。繼而使曲線對齊並正規化用於比較。假設是與PD-L1結合時具有較慢的解離速率之殖株，由於持續阻斷PD-L1與其配體的結合而會提升T細胞活化的活性。測試的40個Fcab殖株中的33個在與PD-L1結合時顯現出與親代殖株FS17-33-37相比下明顯改良的(較慢的)解離(dissociation) (解離(off))速率，且被挑選用於如以下3.4中所述之進一步的功能篩選。
3.4 功能篩選
為了判定3.1中所述的親和力成熟是否導致功能活性改良，使用DO11.10 T細胞活化分析來測試3.3中辨識出的33個Fcab殖株之活性且與作為陽性對照之抗-PD-L1抗體S70作比較(關於實驗的細節參見實施例 6.1 )。此分析中使用各Fcab滴定來計算各Fcab的EC50 值以方便比較。五個殖株(FS17-33-85、FS17-33-87、FS17-33-114及FS17-33-116)全部都具有0.28至0.5 nM之間的EC50 值，其可比得上陽性對照，S70抗體。
殖株FS17-33-85、FS17-33-87、FS17-33-114及FS17-33-116具有非常相似的序列且只有1或2個胺基酸差異，其等沒有一個是在AB或CD環內(參見表 5 ，其辨識出此等殖株之間的差異，其等全部都座落於EF環或框架區域內)。出乎意料地，來自混洗庫的所有殖株內都存在的AB環序列(參見3.1)於個別的AB環庫之篩選中沒有辨識出且含有一胺基酸缺失，且介於殘基14至18之間的AB環序列的結果長度只有4個胺基酸，而非5個。該缺失確實的位置是未知的。因於該AB環位置17及18處之殘基無法用另一胺基酸取代而不會使Fcab與PD-L1結合時的解離速率明顯的惡化(更快) (參見以下的表 9A )，該缺失必定是座落於該AB環之殘基14、15或16。認為該缺失係源自於意外截斷的突變誘發引子之混洗庫人工製品。環區域包含此等缺失之Fcab殖株通常會於選擇方法期間移除，因缺失很少會導致保留抗原結合活性的Fcabs。即使從AB殖株之篩選未辨識出有一缺失的AB序列，但是此序列必定如罕見的殖株或親和力較低的結合物已存在於產品池內。然而，當此截斷的AB序列與另一環混洗時，其變成占優勢的AB環，暗示著此缺失於含新的CD環序列的情況中，對於混洗的Fcab殖株的抗原結合活性及/或結構貢獻很大。設若實行更直接的混洗方法，其中來自AB環選擇辨識出最好的序列會與來自CD環選擇最好的序列組合，則AB環包含此缺失之Fcab殖株不會被辨識出。代表性FS17-33-116殖株與野生型Fcab序列相比之AB環的缺失係顯示於圖 1 內。再者，如以下4.3中更詳細說明的，復原AB環內此缺失的殘基會造成結合親和力顯著喪失。因而AB環內存在此缺失對於Fcabs與PD-L1的結合是重要的。
表 5 ：
3.5 Fcab FS17-33-116之進一步特徵化
既然3.4中辨識出的所有Fcab殖株都含有非常相似的序列，所以挑選一代表性殖株(FS17-33-116)用於進一步特徵化。考慮到此等Fcab殖株全部於DO11.10 T細胞活化分析具有的EC50 都可比得上陽性對照，S70抗體之EC50 ，所以同樣可挑選表 5 中列出的任何其他Fcab殖株用於進一步特徵化。FS17-33-116對於PD-L1之親和力係使用Biacore來測量，利用蛋白A來捕獲Fcab。滴定濃度之單體PD-L1-his人類抗原係以高流速流過晶片上以使質量輸送限制減到最少。KD s之測量係使用1:1之擬合分析加上無折射率校正且R最大 (Rmax )設定在局部(local)。Fcab殖株FS17-33-116與親代殖株FS17-33-37相比，於親和力顯示出很大的改良，以及與陽性對照抗體S70相比，顯示出改良的親和力(參見表 6 )。此主要是由於Fcab在與PD-L1結合時的解離速率較慢。
表 6 :
為了測試殖株FS17-33-116對於PD-L1的專一性，將PD-1(R&D systems 1086-PD)及PD-L2(R&D systems 1224-PL)和PD-L1一起塗覆於Biacore晶片上。Fcab繼而以1000倍濃度範圍從晶片上面流過。此等濃度的PD-1或PD-L2觀察到沒有結合。然而，Fcab與PD-L1確實有結合。此表示Fcab FS17-33-116與PD-L1專一性結合。
為了進一步評估FS17-33-116之功能活性，以SEB分析來測試Fcab(關於實驗的細節參見實施例 7 .1 )。因為此分析使用患者捐贈的細胞，該等細胞表現內生位準的PD-L1。此等表現位準遠低於DO11.10分析使用的LK35.2細胞。於SEB分析中，FS17-33-116 Fcab於效能及功效二者上均比得上陽性對照S70抗體(參見表 7 )。作為陰性對照的抗-FITC抗體，4420，沒有看見活性。因S70抗體業已顯現為具有臨床的功效，所以預期FS17-33-116 Fcab會相似地具有臨床的功效。
表7 ： SEB分析
3.6 呈mAb2 格式的FS17-33-116之建構及表現
Fcabs可以併入傳統的免疫球蛋白分子以提供雙專一性抗體，由於併入Fcab所以其包含免疫球蛋白分子的CDR-為基的抗原結合位址及免疫球蛋白分子的恆定域之額外的結合位址。此等分子亦稱為mAb2 分子。亦可製備“假”mAb2 。“假”mAb2 為一種mAb2 ，其已經併入感興趣的Fcab至包含針對一抗原之CDR-為基的抗原結合位址之免疫球蛋白分子，該抗原於要使用“假”mAb2 的情況下預期不會與之結合。此允許Fcab可在沒有來自該分子的CDR-為基的抗原結合位址之任何影響的情況下、以比得上完整的免疫球蛋白分子的格式予以測試。
製備包含以上所述的FS17-33-116抗人類PD-L1 Fcab之IgG1所組成的“假”mAb2 俾以允許此呈mAb2 格式的Fcabs之特徵化。此假mAb2 之製備係藉由以FS17-33-116 Fcab的CH3域的一部分，包含AB、CD及EF環，取代抗-FITC抗體4420的CH3域對應區域，且亦包含LALA突變於該抗體重鏈的CH2域。抗體4420的重鏈及輕鏈序列係分別顯示於序列辨識編號51及52內(Bedzyk, W. D.等人，1989及Bedzyk, W. D.等人，1990)。假mAb2 稱為FS17-33-116/4420 mAb2 。藉由暫時表現於HEK293-6E細胞來生產假mAb2 及使用mAb Select SuRe蛋白A管柱予以純化。
“假”FS17-33-116/4420 mAb2 與Fcab FS17-33-116作比較以確保維持所欲的品質。mAb2 之SEC剖繪顯示mAb2 不再有明顯的分裂峰或肩峰(參見圖 2C )。4420 mAb如同預期，觀察到小量的聚集，因已知此抗體會聚集。繼而測試FS17-33-116/4420 mAb2 之結合及功能活性。
以DO11.10 T細胞活化分析來測試FS17-33-116/4420 mAb2 (關於方法論參見實施例 6 )。FS17-33-116/4420 mAb2 與FS17-33-116 Fcab相比，於此分析中顯現出活性下降。此下降是顯著的，但很小。FS17-33-116/4420 mAb2 之EC50 保持低於1nM。因FS17-33-116/4420 mAb2 與FS17-33-116對於PD-L1的內在親和力是相同的，所以一般認為FS17-33-116/4420 mAb2 於DO11.10分析中觀察到的活性下降最可能的原因是由於FS17-33-116 Fcab與S17-33-116/4420 mAb2 相比之下，較高的總結合性。因Fcab，而非mAb2 於使用SEC分析時顯示有一分裂峰，據推測Fcab形成二聚體，其於細胞為基分析例如DO11.10分析的情況中，能經由總結合性而促進Fcab的活性。為了著手解決這個問題，該分子係經由分析用超高速離心、使用Beckman Optima XL-1儀器予以分析。
來自此實驗的資料顯現出Fcab有二個峰而mAb2 只有一個峰。計算的Fcab質量與第一個峰的單體及第二個峰的二聚體一致。二聚合的量為濃度依賴式的且交互作用的KD 估計為2 µM。縱然此交互作用很弱，但此等資料支持這個概念—Fcab係經由細胞表面通過自相互作用媒介的總結合性而促進Fcab於細胞為基的功能分析中的活性。此外，陽性對照抗體S70對於PD-L1的內在親和力與FS17-33-116相似且於一種混合淋巴球反應(MLR)分析中的活性與FS17-33-116相等。因抗體為二價的，據推測單價的Fab由於喪失總結合性而會有與mAb2 相似的活性。為了測試此假設，使鉸鏈上方的S70 Fab臂消化遠離Fc部分導致單價的Fab域。繼而純化此等域，其係使用蛋白A以移去Fc域，抗-his以移去酵素且最終經歷SEC以純化單體的餾份。繼而以MLR分析來測試此等Fab臂且顯現出相當於此分析中觀察到的Fcab及mAb2 之間的活性下降之活性損失，提供對於Fcab及mAb2 之間的活性降低是由於Fcab的總結合性之假設額外的支持。
3.7 Fcab殖株FS17-33-37之親和力成熟及功能改良的總結
Fcab殖株之親和力成熟產生了解離速率及功能活性有顯著改良的FS17-33-37。此等殖株之一，FS17-33-116，於DO11.10及SEB分析二者中均顯現出與臨床驗證的陽性對照S70抗體相似的活性。因陽性對照mAb業已顯現為具有臨床的功效，所以預期FS17-33-116 Fcab及包含此Fcab的分子，如mAb2 分子，也會具有臨床的功效。
FS17-33-116 Fcab亦插入至“假”mAb2 格式內且觀察到如Fcab格式報告相似的結果，雖然於DO11.10 T細胞活化分析測量時活性有輕微減少。不希望受理論束縛，據信Fcabs而非mAb2 ，於細胞為基的分析的情況下自締合且形成二聚體，以及這可以解釋FS17-33-116之Fcab及假mAb2 格式之間的活性差異。
實施例4-Fcab 殖株 FS17-33-116 之 進一步 改良
當如實施例 3 中所述的FS17-33-116 Fcab對於PD-L1展現出高親和力以及於DO11.10 T細胞活化分析中展現出高活性時，一般認為可以進行Fcab進一步的改良以移除潛在的製造序列責任(sequence liabilities)並且改良生物物理性質。特別地，FS17-33-116 Fcab含有一甲硫胺酸於EF環內且顯現出很小程度的二聚合。因而，進一步工程處理FS17-33-116殖株以著手解決此等問題。
4.1 甲硫胺酸取代
FS17-33譜系的EF環內於初始選擇階段出現一甲硫胺酸。既然此狀況可能為序列責任(sequence liabilities)並且經過多輪親和力成熟仍保留此殘基，因而找到會改良活性的取代物的可能性是非常小的。取而代之的目標是要找到能以活性最小損失且使生成的Fcab與PD-L1之結合惡化的一殘基來替換甲硫胺酸。
使用含有簡併密碼子NNK於FS17-33-116的EF環之IMGT位置M98處的引子來進行定點誘變。該引子不包括編碼半胱胺酸及甘胺酸的密碼子，因此等胺基酸一般亦認為是潛在的序列責任。
使Met取代殖株表現且以Fcabs於解離速率篩選方式予以測試以鑑定具有如殖株FS17-33-116與人類PD-L1相似的結合動力學之殖株。從此實驗可見以疏水性殘基替換Met於Fcab與PD-L1結合時的解離速率的增加最小(於親代殖株FS17-33-116解離速率的二倍以內)。唯一的例外是脯胺酸，其顯現出所有測試的Fcab殖株中最快的解離速率。
所有的Fcab殖株繼而都以蛋白A管柱予以純化供進一步測試。Fcab殖株中的十個殖株沒有溶析離蛋白A管柱且因而不含括於進一步分析內。此含括了色胺酸取代甲硫胺酸的Fcab，其顯現出親代殖株二倍以內的解離速率。
純化的Fcab殖株繼而置於SEC管柱上以評估聚集作用。從這個分析，苯丙胺酸或酪胺酸取代甲硫胺酸的Fcabs顯現出明顯的聚集且滯留於管柱。因而，此等殖株不含括於進一步分析內。辨識出三個Fcab殖株具有親代殖株二倍以內的解離速率。此等包含白胺酸、異白胺酸或纈胺酸取代位置98處的甲硫胺酸。此等分別為Fcabs FS17-33-289、FS17-33-288及FS17-33-296，如圖 1 及以下的序列辨識編號31、27及35所示。
此外，製備Fcab殖株其中框架突變A38V回復野生型丙胺酸以降低Fcabs的突變負荷。殖株FS17-33-116觀察到A38V突變但是於具相似活性的同胞殖株沒有觀察到(參見表 5 )。根據FS17-33-289 Fcab來製作此回復突變，且生成的Fcab稱為FS17-33-334。圖 1 提供此等殖株的AB、CD及EF環的序列及位置38處之殘基的總結。
繼而測試以Fcab及假mAb2 格式二者之FS17-33-289、FS17-33-288、FS17-33-296及FS17-33-334其等與PD-L1的結合親和力、阻斷PD-1/PD-L1交互作用的能力及於DO11.10 T細胞活化分析中的活性(關於假mAb2 的生產細節參見4.2)，如以下之實施例 6 及7 中進一步所述。
4.2 呈mAb2 格式的Fcabs FS17-33-289、FS17-33-288、FS17-33-296、FS17-33-334、FS17-33-449及FS17-33-451之建構及表現
為了測試呈完整的免疫球蛋白分子形式之Fcabs的PD-L1結合親和力，PD-1/PD-L1阻斷活性，及DO11.10 T細胞活化分析的功能活性，如以下所述予以建構及表現包含Fcabs的各種mAb2 。
4.2.1 “ 假”mAb2 的建構及表現
製備包含Fcabs，包括如以上4.1中所述的Facbs FS17-33-289、FS17-33-288、FS17-33-296、FS17-33-334以及如以下4.3中所述的FS17-33-449及FS17-33-451，之IgG1所組成的“假”mAb2 俾以允許呈mAb2 格式的此等Fcabs之特徵化。此等假mAb2 係製備藉由以Fcab的CH3域的一部分，包含AB、CD及EF環，取代抗-母雞卵白溶菌酶抗體HelD1.3的CH3域的對應區域，無論是否有LALA突變於該抗體重鏈的CH2域。有LALA突變的抗體HelD1.3的重鏈及輕鏈序列係分別顯示於序列辨識編號53及54內。HelD1.3抗體的生產係描述於Tello等人1993之內。藉由暫時表現於HEK293-6E細胞來生產假mAb2 及使用mAb Select SuRe蛋白A管柱予以純化。表 8 列出生產的假mAb2 。
此外，包含如以下4.3中所述的FS17-33-449及FS17-33-451抗人類PD-L1 Fcabs之“假”mAb2 係如前段所述予以製備但是使用抗細胞巨大病毒(CMV)gH醣蛋白抗體MSL109。MSL109抗體的生產係描述於WO1994/016730 A1之內。製備帶有LALA突變於CH2域內的此等抗體。有LALA突變的抗體MSL109的重鏈及輕鏈序列係顯示於序列辨識編號55及56內。藉由暫時表現於HEK293-6E細胞來生產mAb2 及使用mAb Select SuRe蛋白A管柱予以純化。
4.2.2 抗-CTLA-4 mAb2 的建構及表現
以上所述的方式製備4.1及4.3中所述包含FS17-33-289、FS17-33-449及FS17-33-451抗人類PD-L1 Fcabs之mAb2 但是使用抗-CTLA-4 mAb伊匹單抗。製備不帶有LALA突變於CH2域內的此等抗體。伊匹單抗的重鏈及輕鏈序列係顯示於序列辨識編號67及68內。藉由暫時表現於HEK293-6E細胞來生產包含mAb2 的CTLA-4及使用mAb Select SuRe蛋白A管柱予以純化。
表8 提供所生產及表現的mAb2 之總結。
表8
4.3 結合環的NNK移動
為了辨識生物物理性質有改良、突變負荷降低及最佳化的PD-L1親和力之Fcabs，親代Fcab殖株之AB、CD及EF環的各位置(AB及EF環為Fcab FS17-33-116，以及CD環為假mAb2 F17-33-334AA/HelD1.3)係以所有可能的胺基酸取代予以突變且篩選生成的Fcabs結合PD-L1及功能活性，接著評估其等之生物物理性質。
表9A-C 列出AB、CD及EF環的各位置不同胺基酸取代的數目，以及相應位置的專一性胺基酸取代，其導致Fcab/mAb2 對於PD-L1之解離速率與親代Fcabs相比沒有降低多於二倍，親代Fcabs對AB及EF環突變體為Fcab FS17-33-116以及對CD環突變體為假mAb2 F17-33-334AA/HelD1.3。注意到EF環的位置95及96處的殘基於初始或親和力成熟庫沒有突變，因已知此等位置的殘基對於EF環的結構完整性是重要的(Hasenhindl等人，2013)。
與PD-L1之結合係使用Octet系統來測量。AB及EF環突變體與PD-L1之結合係以Fcab格式來測量，而CD環突變體係以抗體HelD1.3為基的假mAb2 格式來測量。此等假mAb2 係如以上實施例 4.2.1 中所述予以建構。
Fcab及假mAb2 格式係經由蛋白A尖端(tip)來捕獲然後接觸單體PD-L1-his。繼而使用Octet分析軟體來計算Fcab/假mAb2 與PD-L1結合時的解離速率，且與親代殖株FS17-33-116或F17-33-334AA/HelD1.3相比。一般而言，解離速率二倍的差異係在此型分析的誤差內且因而認為落在此範圍內的殖株在與PD-L1結合時會具有如親代殖株，FS17-33-116或F17-33-334AA/HelD1.3相等的解離速率。
AB環的二個位置、CD環的二個位置及EF環的三個位置(殘基15、16、45.1、45.2、93、97及100)能以超過一半的測試胺基酸予以取代，導致Fcab/假mAb2 在與PD-L1結合時的解離速率與相關的親代Fcab/mock mAb2 相比，沒有惡化(更快)多於二倍。此等位置因而認為是容許的(permissive)。其他的位置能耐受較少的取代，且一些位置完全不耐受任何取代(表9A-C )。突變與相關的親代殖株相比，與PD-L1的結合或功能活性沒有發現改良。
表9A
表9B
表9C
接著，於親代殖株在各容許的位置還沒有包含野生型(WT)胺基酸(殘基15、16、45.1、93及100；“WT Fcab”的序列參見圖1 )的情況下，該位置帶有一WT胺基酸的Fcab殖株係以假mAb2 格式予以測試以判定其等與PD-L1結合時的解離速率。假mAb2 係如以上實施例 4.2.1 中所述、以HelD1.3抗體為基予以建構。使用Biacore 3000儀器來判定解離速率，其中蛋白A晶片捕獲假mAb2 且使單體hPD-L1流過捕獲的抗體上。繼而使用來自GE的Biaevaluate軟體來計算解離速率。發現於AB環的位置15及16處以及EF環的位置93及100處之WT回復與相同假mAb2 格式的親代殖株相比之下，對於假mAb2 與PD-L1結合時的解離速率影響最小。
此外，製備AB及EF環缺失的殘基14及101復原成WT殘基的Fcabs並且予以測試。於假mAb2 與PD-L1結合時的解離速率顯現出最小的惡化至沒有惡化(更快)的WT回復之Fcabs，亦與AB及EF環殘基14及101之缺失組合。意外地，復原AB環的位置14處缺失的殘基會造成假mAb2 與PD-L1結合時的解離速率明顯的惡化(更快)並且此等Fcab殖株沒有進一步的研究。然而，復原EF環缺失的殘基其自身對PD-L1結合沒有影響，但是將此與EF環的任何其他WT回復組合確實會造成親和力顯著的下降。最後，AB環的位置15及16處之WT回復與EF環的位置101處之缺失復原重組。包含AB環的位置15處及EF環的位置101處之WT回復的此等殖株之一FS17-33-449，顯現出比得上親代殖株之PD-L1結合作用且如以下所述予以進一步分析。
根據殖株於DO11.10 T細胞活化分析(關於實驗的細節參見實施例 6 )測量時與親代殖株FS17-33-334AA/HELD1.3(此假mAb2 之製備參見4.2.1)相比，顯現出活性的損失沒有多於二倍，而從以上所述的NNK移動突變誘發篩選來挑選呈假mAb2 格式的Fcab殖株的一個子集(以FS17-33-334AA/HELD1.3為基礎製備的假mAb2 )。二倍的活性差異係在此分析的誤差內且因而認為落在此範圍內的假mAb2 於DO11.10 T細胞活化分析會具有比得上親代殖株FS17-33-334AA/HELD1.3的活性。此假mAb2 殖株的子集當以SEC分析測量時(關於實驗的細節參見3.2)，亦沒有顯示任何多於3%的總蛋白聚集之跡象。結果係顯示於表 9D 內。
Fcabs的子集，包含帶有AB環的位置15處與EF環的位置93、97及100處之突變的Fcabs，藉此位置15處的S會換成E、H、L、F或Y，位置93處之N會換成A、Q或H，位置97處之Q會換成R、H或S，以及位置100處之D會換成A。
表9D
以上所述假mAb2 的子集繼而藉由替換EF環的位置101處之缺失的胺基酸予以進一步修飾藉此創造第二組假mAb2 分子，其包含與WT Fcab(參見圖1 )相比之下數量減少的突變且因而突變負荷有降低。此第二組假mAb2 ，包括含一野生型回復於容許的位置15之FS17-33-449AA/HELD1.3，予以測試DO11.10 T細胞活化分析之功能(關於實驗的建立參見實施例 6 )以及與hPD-L1之結合作用。結果係顯示於表 9E 內。於DO11.10分析中所有的殖株都顯現出與親代mAb2 FS17-33-334AA/HELD1.3相當的功能活性(除了FS17-33-456AA/HELD1.3、FS17-33-457AA/HELD1.3及FS17-33-462AA/HELD1.3之外，其等不含括於進一步分析內)，證明了導入一纈胺酸於該CH3域的EF環的位置101處是耐受良好的。當藉由動態光散射(DLS)、蛋白A純化及溶解度分析予以分析時，二個殖株展現出改良的生物物理性質。此等殖株為FS17-33-449AA/HELD1.3及 FS17-33-451AA/HELD1.3，其因而從此最終組挑選為主要候選者。
表9E
實施例5–Fcabs 及mAb2 的 結合 親和力及PD-1/PD-L1 阻斷活性
繼而測試呈Fcab(關於細節參見4.1及4.2)及mAb2 格式(關於細節參見實施例 4 )二者之FS17-33-288、FS17-33-289、FS17-33-296、FS17-33-334、FS17-33-449及FS17-33-451 Fcab殖株，其等與人類PD-L1結合的能力及阻斷PD-1/PD-L1交互作用的能力。如實施例 4 中所述，生產此等Fcabs及mAb2 背後的目的是要移除序列責任並且改良生物物理性質，同時維持Fcab FS17-33-116的結合、阻斷及功能性質。
5.1 與PD-L1的結合
Fcab及mAb2 與人類PD-L1的結合係藉由BIAcore及細胞結合分析二者予以評估。為了測量殖株對單體hPD-L1-his之親和力，用塗覆於CM5晶片(GE 28-9582-20 AC)上的抗-Fab抗體來捕獲mAb2 且使用Biacore T200(GE)、用蛋白A晶片(GE 29127556)來捕獲Fcabs。為了使質量輸送效應減到最少，使捕獲位準最小化至200RU且使用75 μl/min的快速流速。人類(Acro biosciences PD1-H5229)及食蟹獼猴(Acro Biosciences PD1-C52H4)單體抗原二者均予以滴定且從捕獲的mAb2 上面流過。用Biacore T200評估軟體來完成數據分析。減去空白流動室及沒有抗原的運行之曲線係使用1:1擬合模型且沒有批量分析以及局部分析R最大 予以分析。
細胞的結合分析係藉由孵育Fcabs或mAb2 蛋白與對照HEK293細胞或過度表現hPD-L1的HEK293細胞或恆河獼猴PD-L1細胞於4 ℃下一小時來執行。Fcab/mAb結合隨後係使用抗人類Fc 488偵測抗體來偵測。螢光信號強度係使用FACS canto來測量。
此等結合實驗的結果係總結於表 10 內。表10顯示出所有測試的殖株對於單體及細胞表現的人類及食蟹獼猴PD-L1都具有高親和力。
表10 ：
5.2 阻斷活性
Fcabs及假mAb2 阻斷hPD-1/hPD-L1及hPD-L1/hCD80之間交互作用的能力係以細胞為基的受體結合分析(RBA)予以測試。簡言之，生物素化hPD-L1-Fc-Avi係以範圍自400 nM至3 pM滴定濃度的Fcabs予以孵育歷時1小時。混合物與過度表現hPD-1或hCD80的HEK293細胞予以孵育再一個小時。HEK293細胞上結合的生物素化hPD-L1-Fc-Avi位準係使用鏈黴抗生物素647來偵測且使用FACS Canto(BD Biosciences)來測量螢光位準。
此等阻斷實驗的結果係顯示於表 11 內。表11顯示所有測試的殖株都能有效力的阻斷hPD-1/hPD-L1及hPD-L1/hCD80的交互作用。
表11
* 此等實驗的PD-L1濃度從2 μg/mL增加至50 μg/mL導致更高的EC50 值。
實施例6-Fcab 分子於DO11.10 T 細胞 活化分析之活性
6.1 Fcab分子於人類PD-L1 DO11.10 T細胞活化分析之活性
含LALA突變的Fcabs組係以Fcab及mAb2 格式於DO11.10為基的T細胞活化分析予以測試。mAb2 係如實施例 4 所述予以生產且以如下所述的DO11.10 T細胞分析來測試。
一種DO11.10 OVA-專一性T淋巴細胞及LK35.2 B淋巴細胞融合瘤細胞株為基的IL-2釋放分析係用於mAb2 之功能篩選。IL-2釋放是T細胞活化的指標。表現內生的鼠類PD-1之T細胞，係用空載體(pLVX)予以轉染。B細胞係用人類PD-L1建構物予以轉染。
測試有或沒有LALA突變(AA)的mAb2 ，取決於所談論的mAb2 。mAb2 的Fab部分為針對母雞卵白溶菌酶(HelD1.3)、FITC分子(4420)、人類CTLA-4(伊匹單抗)之單株抗體的可變異區域。實施例 4 提供關於建構此等mAb2 的細節。
6.1.1 生產具有空載體的T 細胞 株
使用慢病毒(lentiviral)轉導方法論來產生含空慢病毒載體pLVX的DO11.10細胞(National Jewish Health)，其係利用Lenti-X HTX包裝系統(Clontech, Cat. No 631249)來進行。Lenti-X表現載體(pLVX) (Cat. No 631253)係與Lenti-X HTX包裝混合物共轉染至Lenti-X 293T細胞株(Cat. No 632180)之內以產生病毒。DO11.10細胞株係使用Lenti-X HTX包裝系統生產的慢病毒顆粒予以轉導。
6.1.2 生產過度表現PD-L1 的 抗原呈現細胞
使用慢病毒轉導方法論來產生過度表現人類PD-L1的LK35.2 B細胞淋巴瘤細胞(ATCC, HB-98)，其係利用Lenti-X HTX包裝系統(Cat. No 631249)來進行。含人類PD-L1 cDNA的Lenti-X表現載體(pLVX) (Cat. No 631253)係與Lenti-X HTX包裝混合物共轉染至Lenti-X 293T細胞株(Cat. No 632180)之內以產生病毒。LK35.2細胞株係使用Lenti-X HTX包裝系統生產的慢病毒載體予以轉導。
6.1.3 培養基及胜肽
細胞培養基：DMEM(Gibco, 61965-026) 10% FBS(Gibco, 10270-106)、1 mM丙酮酸鈉(Gibco, 11360-070)、1 µg/ml嘌呤黴素(puromycin) (Gibco, A11138-03)
實驗培養基：沒有嘌呤黴素之完全DO11.10培養基。
OVA胜肽(MW=1773.9 Da)：H-ISQAVHAAHAEINEAGR-OH(肽掃描(Pepscan))
細胞：
․DO11.10 pLVX：以空的慢病毒載體轉導的DO11.10 T細胞融合瘤；
․LK 35.2 hPD-L1：以含hPD-L1的慢病毒載體轉導以過度表現人類PD-L1的B細胞融合瘤
於實驗培養基內製備Fcabs、mAb2 、抗人類陽性對照mAb(S1或S70)或人類IgG1同型對照mAb(抗-HELD1.3或MSL)之稀釋。Fcabs、mAb2 或對照mAbs係以1:1與4x105 /ml LK35.2 hPD-L1細胞於實驗培養基內混合、於存在2.46 µM OVA胜肽(96-圓底平盤內每孔100 µL LK35.2 hPD-L1/(Fcabs、mAb2 或對照mAbs)混合物)以及於5% CO2 、37℃下孵育歷時1小時。將配於100 µl體積實驗培養基內的2x105 DO11.10 pLVX細胞/ml添加至100 µl的LK35.2 hPD-L1/(Fcabs、mAb2 或對照mAbs)混合物。繼而混合細胞然後於5% CO2 、37℃下孵育歷時24小時。收集上清液且用小鼠IL-2 ELISA套組(eBioscience, 88-7024-88或R&D systems, SM2000)、遵循製造商的指示予以分析。使用平盤讀數器及Gen5軟體，BioTek於450 nm下讀取平盤。450 nm的吸光度值減去570 nm的吸光度值(校正)。根據四參數邏輯曲線擬合(Gen5軟體，BioTek)來計算細胞介素濃度的標準曲線。繪製小鼠IL-2濃度vs Fcab、mAb2 或陽性對照mAb的log濃度的圖以及產生的曲線係以GraphPad Prism、使用log(促效劑)vs反應方程式來擬合。
結果顯示於圖 3 和4 及表 12 內。人類Fcabs於T細胞活化分析中顯示顯著的活性且於0.2 nM範圍之效能(EC50 )可比得上陽性對照mAbS1抗體。Fcab及假mAb2 二者均釋放PD-L1媒介的T細胞抑制作用。然而，Fcab轉換成假mAb2 格式導致IL-2釋放之部分減少。
表12 ： 抗人類PD-L1 Fcabs及假mAb2 於DO11.10 T細胞活化分析的EC50 值
實施例7-mAb2 分子於SEB 分析的活性
接著，此等呈mAb2 格式的Fcabs的活性係以SEB分析予以測試。如實施例 4 中所述來生產mAb2 。
7.1 葡萄球菌腸毒素B分析
Fcab、PD-L1假mAb2 及PD-L1/CTLA-4 mAb2 係以人類PBMC為基的葡萄球菌腸毒素B分析(SEB分析)中予以測試。葡萄球菌腸毒素B為一種超抗原，以及與抗原呈現細胞(APCs)上之第II類MHC分子及T細胞受體(TCR)之vβ鏈結合，造成非專一性T細胞活化及細胞介素釋放。要看見T細胞活化不需要抗原呈現。SEB分析使用經刺激的人類細胞(PBMCs)及生理水平的檢查點抑制劑，以及能用來確認mAb2 提升人類系統內的T細胞活化。
7.1.1 產生擴增的T 細胞
藉由Ficoll梯度分離而自白血球椎(cones)單離PBMCs。CD4+ T細胞係使用人類CD4+ T細胞單離套組(Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-533)、依照製造商的指示予以單離。藉由渦流使人類T-活化劑CD3/CD28標記磁珠(Life technologies, 11131D)再懸浮。小珠移至無菌15ml管以及添加10ml RPMI(Life Technologies, 61870044)加上10% FBS(Life Technologies, 10270106)及1x青黴素鏈黴素(Life Technologies, 15140122)來清洗標記磁珠。丟棄上清液。配於RPMI加上10% FBS及1x青黴素鏈黴素溶液及50 IU/ml重組人類IL2(Peprotech, 200-02-50ug )之所需量的CD4+ T細胞係以1.0 x106 個細胞/ml、以小珠對細胞比3:1移至T75燒瓶(Greiner Bio-one, 690195)以及於37℃ + 5% CO2 下孵育。3天之後溫和地再懸浮細胞且計數。視需要藉由添加新鮮的培養基(RPMI-10% FBS+青黴素鏈黴素溶液1X + 50IU/ml rhuIL2)以使細胞密度維持在0.8-1 x 106 個細胞/ml之間。於第7或第8天，移去CD3/28小珠以及CD4+ T細胞係以1 x 106 個細胞/ml新鮮的培養基RPMI-10% FBS+青黴素鏈黴素溶液1X加上減少的10IU/ml rhuIL2休息過夜。細胞冷凍儲存至需要。
7.1.2 產生MoiDCs
未觸動的單核球係使用人類泛單核球(Pan Monocyte)單離套組，(Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-537)、遵循製造商的指示而自人類PBMCs單離。單核球係使用人類Mo-DC分化培養基(Miltenyi Biotec Ltd, 130-094-812)、遵循製造商的指示予以分化成iDCs。
7.1.3 SEB 分析
擴增的T細胞及MoiDCs係於實驗前解凍，用AIM培養基(Gibco, 12055-091)來清洗以及於AIM培養基內、在5%CO2 、37℃下孵育。
於AIM培養基內製備Fcabs、mAb2 、抗人類陽性對照mAb(S1(有或沒有LALA突變)或S70)或人類IgG1同型對照mAb(抗-HELD1.3或抗-FITC殖株4420)之稀釋。MoiDCs係以1:10比率與來自相同供體的T細胞混合(2x105 個細胞/ml的iDCs 5 ml組合以2x106 個細胞/ml的T細胞5ml)。將0.1 µg/ml、20 µl的SEB(Sigma, S4881)添加至10 ml的細胞。於圓底96孔平盤內，添加100 µl的細胞/SEB混合物至100 µl的抗體稀釋，提供每孔配於200 µl AIM培養基之104 iDC細胞對105 T細胞比率及0.1 ng/ml SEB。細胞係於5% CO2 、37℃下孵育歷時4天。收集上清液且立即用人類IFNᵧ ELISA套組(R&D Systems, PDIF50)予以分析或於-20℃下冷凍供進一步分析。分析係使用以PBA(DPBS, 2% BSA(Sigma, A7906-100G))1:30稀釋的上清液、根據套組製造商的指示來執行。繪製人類IFNᵧ濃度vs mAb2 或mAb的log濃度的圖以及以GraphPad Prism軟體、使用log(促效劑)vs反應方程式來擬合產生的曲線。表 13 顯示來自個別細胞供體的細胞於SEB分析中之EC50 值及IFNγ釋放的跨度(span of the IFNγ release)。圖 5 顯示單一供體之SEB分析代表圖。如同於DO11.10 T細胞活化分析所示，一些Fcab殖株顯示出接近抗-PD-L1陽性對照(S70)之活性。然而，Fcab轉換成假mAb2 格式導致IFNγ釋放之部分減少。此外，該結果證明Fcabs內存在LALA突變不會干擾其等之活性，如圖 5C 所示。如以上3.6中所解釋，Fcab自締合，導致形成二聚體。於假mAb2 格式方面，此自締合作廢。不希望受理論束縛，一般認為形成二聚體Fcabs能經由總結合性而促進Fcab於細胞為基的分析，例如SEB分析中的活性。
表 13
PD-L1 Fcabs，FS17-33-449及FS17-33-451，亦與抗-CTLA-4 Fab伊匹單抗(關於建構的細節參見實施例 4 )配對並且以SEB分析評估mAb2 的活性與假mAb2 (帶有FS17-33-449/HELD1.3或FS17-33-451/HELD1.3)及伊匹單抗單獨或是假mAb2 及伊匹單抗之組合作比較。PD-L1/CTLA-4 mAb2 顯現出比作為單一製劑的假mAb2 及伊匹單抗或是組合更大的活性。於3個分析中的一者，FS17-33-449/CTLA-4 mAb2 確實顯現出不大於但可比得上的假mAb2 及伊匹單抗組合的活性。此結果顯現出以mAb2 可達成較佳的協同性活性。圖 6B 提供闡明此等結果的SEB分析之代表圖。
實施例8- 具有改良 的 穩定性之抗-PD-L1 Fcab 分子 的 選擇
當藉由動態光散射(DLS)、蛋白A純化及溶解度分析予以分析時，Fcab分子，FS17-33-449及FS17-33-451具有改良的生物物理性質(參見實施例 4 .3 )。然而，此等分子的Fc域之熔化溫度(Tm )比野生型Fc域之熔化溫度更低。下降的熔化溫度暗示此等分子可能比野生型Fc域更不穩定，此強力地有可能影響此等分子於製造期間的完整性及溶解度及/或此等分子於長期儲存期間的穩定性。
為了鑑定熔化溫度提高的分子，Fcabs FS17-33-449及FS17-33-451，於如以下所述的易出錯噬菌體展示庫選擇期間施予熱應力。此選擇活動的目標是要鑑定出突變，該突變能增高Fcab分子的熔化溫度且因而其等之熱穩定性而不降低Fcabs之目標結合及活性。
8.1 從易出錯庫選擇具有改良的穩定性之抗-PD-L1 Fcab分子
既然結合環及框架內的突變能強力地改良殖株的穩定性，所以於整個CH3域各處執行易出錯PCR(Diversify® PCR隨機突變誘發套組(Takara Clontech, 630703)以從Fcab殖株，FS17-33-449及FS17-33-451，各者產生CH3域庫。執行連續兩輪PCR以達成每CH3片段平均6±2個突變。突變的CH3域繼而連接至噬粒載體(phagemid vector)pADL-23c(許可得自Antibody Design Laboratories)之內並轉形至大腸桿菌 (TG1, Lucigen, 60502-PQ997-A)內。CH3域庫繼而經歷選擇熔化溫度較高的CH3域，其係藉由先加熱噬菌體至80℃歷時10分鐘，接著選擇以20 nM濃度與人類PD-L1(hPD-L1)抗原結合者。使用如實施例 3.1 中所述的生物素化的人類PD-L1-his(Acro biosciences, PD1-H5229)，作為選擇作用之抗原來源。於一輪選擇作用後，以噬菌體ELISA來篩選與hPD-L1結合之產品以及將命中者定序。辨識出86個獨特的CH3域序列。一種突變，(於EF環內)該CH3域的位置99處的該天冬胺酸殘基(D)改變成甘胺酸殘基(G)，於生成的殖株族群內有過多代表(overrepresented)。有趣的是，此突變代表CH3域的位置99處回復野生型序列(參見，舉例而言，圖 1A )。
將挑出的CH3域亞選殖且表現為CH2域帶有LALA突變之“假”(MSL109)mAb2 格式，如實施例 4.2.1 中所述，用於進一步篩選。CH2域帶有LALA突變之“假”(MSL109)mAb2 格式的親代FS17-33-449及FS17-33-451殖株係使用作為對照。繼而使用Octet系統來測試上清液與hPD-L1抗原之結合以及29種殖株顯現出保留與此抗原之結合。繼而大規模表現此等殖株且該等殖株中的21種可於表現後純化。接著如實施例 5.1 中所述測量此等21種殖株之KD 值，且結果係總結於表 14 內。21種殖株係根據其等與hPD-L1之結合KD 值低於1 nM來挑選其中的17種且使用如實施例 6 中所述的方法來測試其等於DO11.10 T細胞活化分析的活性(分析結果參見表 14 )。根據其等於DO11.10分析中之EC50 值、有最高活性的六種Fcab殖株之熱穩定性繼而予以評估，其係藉由使用微差掃描熱量法(DSC)來判定此等Fcabs的熔化溫度(結果參見表 14 )。因Fcab殖株之CH2及CH3域的Tm只顯現出很小的差異，所以不可能從剖繪判定哪個峰分別代表CH2域及代表CH3域。因而表 14 報告了第1峰及第2峰的Tms，且最低的轉移溫度為最代表總體分子的Tm。該等Fcabs中的三種與親代Fcab，即Fcabs FS17-33-488、FS17-33-539及FS17-33-548相比，顯現出熔化溫度明顯的增加。表 15 顯示此等三種Fcabs之EF環序列及此等Fcabs所含的CH3域之任何額外的框架突變。全部三種Fcabs於該CH3域的位置99處都含有天冬胺酸(D)回復成野生型甘胺酸(G)。此外，Fcabs FS17-33-488及FS17-33-539二者於CH3域的位置113處均含組胺酸(H)突變成為精胺酸(R)殘基。因此等二種Fcabs有不同的親代殖株(細節參見表 15 )，所以此突變，還有D99G回復，獨立出現二次，表示此等突變可能於此等Fcabs之熔化溫度，且因而熱穩定性的增加扮演重要角色。Fcab FS17-33-488於該CH3域的框架亦包含一丙胺酸殘基於位置101處，以及額外的突變(細節參見表 15 )。
從測試的Fcabs組挑選Fcab殖株FS17-33-539及FS17-33-548予以進一步分析，因與包括大量突變的FS17-33-488 Fcab相比，此等組合了改良的熔化溫度加上很低的突變負荷。此外，與相關的親代殖株之熔化溫度(FS17-33-449或FS17-33-451；細節參見表 15 )相比之下，此等二殖株觀察到熔化溫度比FS17-33-488殖株(增加大約2℃)更大的改良(增加3-4℃) (表 14 )。
表 14
表 15
8.2 具有改良的穩定性之Fcab分子與PD-L1的結合作用
大規模生產實施例 8.1 中辨識出的Fcabs，FS17-33-539AA/MSL109及FS17-33-548AA/MSL109，且如實施例 4.2.1 中所述予以純化。假mAb2 與hPD-L1的結合係藉由利用Biacore T200系統(GE Healthcare)之SPR，及如實施例 5.1 中所述的細胞結合分析二者予以評估。為了測量殖株對單體hPD-L1-his之親和力，使用Biacore T200系統、用塗覆於CM5晶片(GE 28-9582-20 AC)上的抗-Fab抗體來捕獲假mAb2 。為了使質量輸送效應減到最少，使捕獲位準最小化至200RU且使用75 μl/min的快速流速。人類(Acro biosciences, PD1-H5229)及食蟹獼猴(Acro Biosciences, PD1-C52H4)單體抗原二者均予以滴定且從捕獲的假mAb2 上面流過。用Biacore T200評估軟體來完成數據分析。減去空白流動室及沒有抗原的運行之曲線分析係使用1:1擬合模型且沒有批量分析以及局部分析R最大 。
細胞的結合分析係藉由孵育假mAb2 與對照HEK293細胞或過度表現hPD-L1的HEK293細胞或恆河獼猴PD-L1細胞於4 ℃下歷時一小時來執行。假mAb2 結合隨後係使用抗人類Fc 488偵測抗體來偵測。螢光信號強度係使用FACS Canto流式細胞儀(BD Biosciences)來測量。
此等結合實驗的結果係總結於表 16 內。表 16 顯示出所有測試的假mAb2 對於單體及細胞表現的人類及食蟹獼猴PD-L1都具有高親和力。
表 16
8.3 具有改良的穩定性之Fcab分子的阻斷活性
假mAb2 阻斷hPD-1/hPD-L1及hPD-L1/hCD80之間交互作用的能力係以細胞為基的受體阻斷分析(RBA)予以測試。使用呈IgG1框架且包含LALA突變的抗-PD-L1抗體S70(G1AA/S70)作為陽性對照。簡言之，生物素化hPD-L1-Fc-Avi係以範圍自2000 nM至3 pM滴定濃度的假mAb2 予以孵育歷時1小時。混合物與過度表現hPD-1或hCD80的HEK293細胞予以孵育再一個小時。HEK293細胞上結合的生物素化hPD-L1-Fc-Avi位準係使用鏈黴抗生物素647來偵測且使用FACS Canto流式細胞儀來測量螢光位準。
此等阻斷實驗的結果係顯示於表 17 內。表17 顯示所有測試的殖株都能完全阻斷hPD-1/hPD-L1及hPD-L1/hCD80的交互作用。
表17 ：
8.4 具有改良的穩定性之Fcab於人類T細胞活化分析中的活性
假mAb2 的活性係如實施例 6.1 中所述於DO11.10細胞為基的T細胞活化分析予以測試，以及如實施例 7.1 中所述的SEB分析予以測試。結果顯示於表 18 內。由於分析之間可見的變異性的可能，例如取決於SEB分析使用之經刺激的PBMCs供體來源，所以二個分析均含括親代殖株中之一者，FS17-33-451(呈“假”MSL109 mAb2 格式且包含LALA突變)，作為直接比較器。測試的假mAb2 二者於二個分析均保留T細胞活化的活性。假mAb2 於此等分析之EC50 不是有改良，就是可比得上，親代殖株FS17-33-451AA/MSL109的該者。
表18 ：
8.5 藉由微差掃描熱量法(DSC)來評估熱穩定性
FS17-33-539及FS1733-548 Fcabs(呈假MSL109 mAb2 格式且有LALA突變)的熔化溫度(Tm )係使用Microcal VP-毛細管微差掃描熱量儀來測量。含括G1AA/MSL109 mAb2 作為此分析的陽性對照因其含有野生型CH3域及含LALA的CH2域。測量配於樣本緩衝液、濃度0.2 mg/ml之樣本。掃描速率設定於60℃/hr且收集35℃與100℃之間的數據。用Origin 7.0軟體執行數據分析。結果係顯示於表 19 內。如同小規模生產殖株時所見(參見表 14 )，呈假mAb2 格式的FS17-33-539及FS1733-548 Fcab分子與相關的親代殖株相比，展現出Fc域的熔化溫度改良達3-4℃。
表 19 ：
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本說明書所提及之所有文件係以其等之整體併入以作為參考資料。
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序列表
WT Fcab CH3 域結構環的胺基酸序列
WT Fcab AB環–LTKNQ (序列辨識編號：1)
WT Fcab CD環–QPENNY (序列辨識編號：2)
WT Fcab EF環–DKSRWQQGNV (序列辨識編號：3)
WT Fcab CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號：4)
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的WT Fcab 、FS17-33 及FS17-33-37/116/288/289/296/334/449/451/488/539/548 的CH2 域的胺基酸序列( 序列辨識編號：5)
LALA突變的位置劃底線
APEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
Fcab FS17-33-116/288/289/296/334/449/451 CH3 域結構環的一致序列
AB環–X1 GYW (序列辨識編號：10)
CD環–EPQYWA (序列辨識編號：11)
EF環–SNWRWQX2 DDX3 (序列辨識編號：12)
X1 =V、S、T或E
X2 = M、I、L、V
X3 = V或不存在
Fcab FS17-33 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33 AB環– QSGYW (序列辨識編號：13)
FS17-33 CD環– QPENNY (序列辨識編號：2)
FS17-33 EF環– SNWRWQMGD (序列辨識編號：14)
Fcab FS17-33 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 15)
GQPREPQVYTLPPSRDEQSGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMGDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 16)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDEQSGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMGDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 17)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDEQSGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMGDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的WT Fcab 、FS17-33 及FS17-33-37/116/288/289/296/334/449/451/488/539/548 的CH2 域的胺基酸序列( 序列辨識編號：6)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
WT Fcab 、FS17-33 及FS17-33-37/116/288/289/296/334/449/451/488/539/548 的 截斷 的 鉸鏈區的胺基酸序列( 序列辨識編號：7)
TCPPCP
有 LALA 突變的 WT Fcab 的胺基酸序列( 序列辨識編號：8)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無 LALA 突變的 WT Fcab 的胺基酸序列( 序列辨識編號：9)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fcab FS17-33-37 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33 AB環– QVGYW (序列辨識編號：18)
FS17-33 CD環 – QPENNY (序列辨識編號：2)
FS17-33 EF環– SNWRWQMDD (序列辨識編號：19)
Fcab FS17-33-37 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 20)
GQPREPQVYTLPPSRDEQVGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33-37 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 21)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDEQVGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33-37 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 22)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDEQVGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fcab FS17-33-116 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33-116 AB環– SGYW (序列辨識編號：23)
FS17-33-116 CD環 – EPQYWA (序列辨識編號：11)
FS17-33-116 EF環– SNWRWQMDD (序列辨識編號：19)
Fcab FS17-33-116 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 24)
GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33-116 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 25)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33-116 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 26)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQMDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fcab FS17-33-288 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33-288 AB環 – SGYW (序列辨識編號：23)
FS17-33-288 CD環 – EPQYWA (序列辨識編號：11)
FS17-33-288 EF環 – SNWRWQIDD (序列辨識編號：27)
FS17-33-288 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 28)
GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQIDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33-288 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 29)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQIDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33-288 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 30)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQIDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fcab FS17-33-289 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33-289 AB環– SGYW (序列辨識編號：23)
FS17-33-289 CD環 – EPQYWA (序列辨識編號：11)
FS17-33-289 EF環– SNWRWQLDD (序列辨識編號：31)
Fcab FS17-33-289 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 32)
GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33-289 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 33)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33-289 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 34)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fcab FS17-33-296 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33-296 AB環 – SGYW (序列辨識編號：23)
FS17-33-296 CD環 – EPQYWA (序列辨識編號：11)
FS17-33-296 EF環– SNWRWQVDD (序列辨識編號：35)
Fcab FS17-33-296 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 36)
GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQVDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33-296 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 37)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQVDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33-296 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 38)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQVDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fcab FS17-33-334 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33-334 AB環– SGYW (序列辨識編號：23)
FS17-33-334 CD環– EPQYWA (序列辨識編號：11)
FS17-33-334 EF環– SNWRWQLDD (序列辨識編號：31)
Fcab FS17-33-334 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 39)
GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33-334 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 40)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33-334 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 41)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDESGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fcab FS17-33-449 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33-449 AB環– TGYW (序列辨識編號：42)
FS17-33-449 CD環– EPQYWA (序列辨識編號：11)
FS17-33-449 EF環– SNWRWQLDDV (序列辨識編號：43)
Fcab FS17-33-449 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 44)
GQPREPQVYTLPPSRDETGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33-449 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 45)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDETGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33-449 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 46)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDETGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fcab FS17-33-451 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33-451 AB環 – EGYW (序列辨識編號：47)
FS17-33-451 CD環 – EPQYWA (序列辨識編號：11)
FS17-33-451 EF環 – SNWRWQLDDV (序列辨識編號：43)
Fcab FS17-33-451 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 48)
GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33-451 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 49)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33-451 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 50)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLDDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的IgG1 4420 抗體重鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 51)
於以下的重鏈序列以及以下列出的抗體HelD1.3、MSL109、S70及S1之重鏈序列中，可變異域序列係以斜體顯示，CH1域序列劃底線，鉸鏈區序列劃上雙底線，CH2域序列以粗體顯示，以及CH3域序列以不加修飾的字體顯示。
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的IgG1 4420 抗體輕鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 52)
於以下的輕鏈序列以及以下列出的抗體HelD1.3、MSL109、S70及S1之輕鏈序列中，可變異域序列係以斜體顯示，以及恆定域序列劃底線。
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
有LALA 突變的HelD1.3 抗體重鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 53)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDYNSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的HelD1.3 抗體輕鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 54)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPRTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
有LALA 突變的MSL109 抗體重鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 55)
EEQVLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSPYSVFWVRQAPGKGLEWVSSINSDSTYKYYADSVKGRFTISRDNAENSIFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRSYYAFSSGSLSDYYYGLDVWGQGTTVIVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的MSL109 抗體輕鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 56)
DIVMTQSPLSLSVTPGEPASISCRSSQSLLHTNGYNYLDWYVQKPGQSPQLLIYLASNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYCMQALQIPRTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
有LALA 突變的S70 抗體重鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 57)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的S70 抗體輕鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 58)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
有LALA 突變的S1 抗體重鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 59)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的S1 抗體輕鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 60)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLFTPPTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
人類PD-L1 之胺基酸序列( 序列辨識編號：61)
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
鼠類PD-L1 之胺基酸序列( 序列辨識編號：62)
MRIFAGIIFTACCHLLRAFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPATHPPQNRTHWVLLGSILLFLIVVSTVLLFLRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKNRNDTQFEET
食 蟹獼猴PD-L1 之胺基酸序列( 序列辨識編號：63)
MRIFAVFIFTIYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLDPEENHTAELVIPELPLALPPNERTHLVILGAIFLLLGVALTFIFYLRKGRMMDMKKCGIRVTNSKKQRDTQLEET
人類PD-1 之胺基酸序列( 序列辨識編號：64)
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVV
TEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPN
GRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSP
RPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPV
FSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQP
LRPEDGHCSWPL
人類CD80 之胺基酸序列( 序列辨識編號：65)
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKE
VATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIV
ILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRI
ICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLI
KYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRR
NERLRRESVRPV
小鼠CD80 之胺基酸序列( 序列辨識編號：66)
MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSK
SVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVWPEYKNRTLYDNTTY
SLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKLSIKADFSTPNITESGNPSADT
KRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELPGINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIK
CLIKYGDAHVSEDFTWEKPPEDPPDSKNTLVLFGAGFGAVITVVVIVVIIKCFCKHRS
CFRRNEASRETNNSLTFGPEEALAEQTVFL
無LALA 突變的伊匹單抗抗體重鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 67)
CDRs劃底線。CH3序列以粗體顯示
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSY TMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNK YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的伊匹單抗抗體輕鏈的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 68)
CDRs序列劃底線
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSY LAWYQQKPGQAPRLLIYGAF SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
人類 IgG1 鉸鏈區 之胺基酸序列( 序列辨識編號：69)
EPKSCDKTHTCPPCP
Fcab FS17-33-488 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33-488 AB環 – EGYW (序列辨識編號：47)
FS17-33-488 CD環 – EPQYWA (序列辨識編號：11)
FS17-33-488 EF環 – SNWRWQLGDA (序列辨識編號：70)
Fcab FS17-33-488 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 71)
GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVPDSDGTFFLYSKLTVSNWRWQLGDAFSCSVMHEALRNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33-488 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 72)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVPDSDGTFFLYSKLTVSNWRWQLGDAFSCSVMHEALRNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33-488 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 73)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVPDSDGTFFLYSKLTVSNWRWQLGDAFSCSVMHEALRNHYTQKSLSLSPGK
Fcab FS17-33-539 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33-539 AB環 – TGYW (序列辨識編號：42)
FS17-33-539 CD環– EPQYWA (序列辨識編號：11)
FS17-33-539 EF環– SNWRWQLGDV (序列辨識編號：74)
Fcab FS17-33-539 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 75)
GQPREPQVYTLPPSRDETGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLGDVFSCSVMHEALRNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33- 539 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 76)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDETGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLGDVFSCSVMHEALRNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33- 539 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 77)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDETGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLGDVFSCSVMHEALRNHYTQKSLSLSPGK
Fcab FS17-33-548 CH3 域結構環的胺基酸序列
FS17-33-548 AB環 – EGYW (序列辨識編號：47)
FS17-33-548 CD環 – EPQYWA (序列辨識編號：11)
FS17-33-548 EF環 – SNWRWQLGDV (序列辨識編號：78)
Fcab FS17-33-548 CH3 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 79)
GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變的 Fcab FS17-33- 548 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 80)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
無LALA 突變的 Fcab FS17-33- 548 的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 81)
鉸鏈區(劃底線)，CH2域(粗體)及CH3域(斜體)
TCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDEEGYWVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPQYWAKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVSNWRWQLGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA 突變及 P114A 突變 的CH2 域的胺基酸序列 ( 序列辨識編號： 82)
LALA突變劃底線；P114A突變粗體並劃底線
APEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL A APIEKTISKAK
圖 1A 顯示Fcabs FS17-33、FS17-33-37、FS17-33-116；FS17-33-288、FS17-33-289、FS17-33-296、FS17-33-334、FS17-33-449、FS17-33-451、FS17-33-488、FS17-33-539及FS17-33-548，以及野生型(WT)Fcab的CH3域之AB、CD及EF環及框架位置38、84.1、85.3及113之序列。表明依據IMGT編號系統之殘基編號。圖 1B 及 C 顯示供用於IgG1 CH3域，以及野生型IgG1 CH3域胺基酸序列之CH3域殘基的抗體殘基編號系統之協和，包括IMGT、連續編號(IMGT外顯子編號)、EU編號及Kabat編號系統。圖 1D 顯示Fcabs FS17-33、FS17-33-37、FS17-33-116；FS17-33-288、FS17-33-289、FS17-33-296、FS17-33-334、FS17-33-449、FS17-33-451、FS17-33-488、FS17-33-539及FS17-33-548，以及野生型(WT) Fcab的CH3域序列之排列比對。
圖2 顯示二種Fcabs(A 及B )及mAb2 (C )之粒徑篩析層析法(SEC)剖繪。親代Fcab FS17-33顯示有肩峰(shoulder)的單一峰(A )。Fcab FS17-33-116顯示一分裂峰(B )。SEC分析顯示mAb2 FS17-33-116/4420(C )有小量的聚集，親代4420 mAb可見典型的聚集。不像Fcabs，沒有明顯的分裂峰或肩峰。
圖3A 顯示抗-PD-L1 Fcab，FS17-33-116AA，抑制人類PD-L1活性其於DO11.10 T細胞活化分析中導致IL-2釋放。此釋放比得上陽性對照抗-PD-L1 mAb，YW243.55.S1(S1)。抗-PD-L1 Fcab，FS17-33-37AA，及野生型(WT) Fcab於此分析中顯示沒有明顯的T細胞活化。圖 3B 顯示抗-PD-L1 Fcabs、FS17-33-288AA、FS17-33-289AA及FS17-33-296AA，全體於DO11.10 T細胞活化分析之IL-2釋放都顯示出可比得上陽性對照mAb，S1之IL-2釋放。全部測試的Fcabs都含LALA突變於CH2域，如同殖株名稱“AA”所示。
圖 4A 顯示抗-PD-L1 Fcabs、FS17-33-288AA、FS17-33-289AA及FS17-33-296AA及FS17-33-334AA，呈Fcab及假mAb2 格式，抑制人類PD-L1，於DO11.10 T細胞活化分析中導致IL-2釋放。Fcab轉換成假mAb2 格式於此分析中導致IL-2釋放之部分減少。圖 4B 顯示抗-PD-L1 Fcabs、FS17-33-449及FS17-33-451，呈假mAb2 格式，也能抑制PD-L1且於DO11.10 T細胞活化分析中釋放IL-2。
圖5 顯示SEB分析的代表圖。與IgG1同型對照mAb HelD1.3相比，Fcab及假mAb2 二者均顯示出T細胞釋放的IFNγ提高(A 及B )。Fcab之活性接近或比得上抗-PD-L1陽性對照mAb，YW243.55.S70 (S70)。呈假mAb2 格式的Fcabs於此分析中顯示出IFNγ釋放之輕微減少。圖 5C 顯示Fcabs內存在LALA突變(AA)不會干擾其等於SEB分析之活性。
圖 6A 及 B 顯示SEB分析的代表圖。當與伊匹單抗(抗-CTLA-4)相比，假mAb2 及PD-L1/CTLA-4 mAb2 二者均顯示出T細胞釋放的IFNγ提高。

















































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































Claims (57)

  1. 一種結合程式性死亡配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)的專一性結合物件，其包含一PD-L1抗原結合位址座落於該專一性結合物件的一CH3域，其中該PD-L1結合位址包含： (i) 一第一序列座落於該CH3域的AB結構環之位置14至18處，其中該專一性結合物件於該CH3域的位置14、15或16處包含一胺基酸缺失，且其中該第一序列係由下列組成： (a)胺基酸序列SGYW(序列辨識編號：23)，或 (b)序列辨識編號：23之一變異體，其中 該絲胺酸(S)係用胺基酸A、E、F、G、H、I、L、P、R、S、T、V、或Y予以取代，及/或 該甘胺酸(G)係用胺基酸A、D、E、F、H、K、L、N、P、R、T、V、或Y予以取代； (ii) 一第二序列座落於該CH3域的CD結構環之位置45.1至78處，其中該第二序列係由下列組成： (a)胺基酸序列EPQYWA(序列辨識編號：11)，或 (b)序列辨識編號：11之一變異體，其中 該麩胺酸(E)係用胺基酸A、G、H、I、L、N、Q、R、S、或W予以取代，及/或 該脯胺酸(P)係用胺基酸A、D、E、G、H、N、Q、W、或Y予以取代，及/或 該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸H、或N予以取代，及/或 該酪胺酸(Y)係用胺基酸A、D、H、T、或V予以取代，及/或 該丙胺酸(A)係用胺基酸D、E、G、L、R、S、或W予以取代；及 (iii) 一第三序列座落於該CH3域的EF結構環之位置92至100處，其中該第三序列係由下列組成： (a)胺基酸序列SNWRWQMDD(序列辨識編號：19)，或 (b)序列辨識編號：19之一變異體，其中 於位置92處的該絲胺酸(S)係用胺基酸A、或G予以取代，及/或 於位置93處的該天冬醯胺酸(N)係用胺基酸A、E、F、G、H、I、K、L、Q、R、S、T、或Y予以取代，及/或 於位置97處的該麩醯胺酸(Q)係用胺基酸A、D、E、F、G、H、K、L、N、R、S、或V予以取代，及/或 於位置98處的該甲硫胺酸(M)係用胺基酸F、I、L、V、W、或Y予以取代，及/或 於位置99處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸E、A、I、L、R、S、T、V、W、Y、或G予以取代，及/或 於位置100處的該天冬胺酸(D)係用胺基酸A、E、F、I、K、L、N、R、V、W、或Y予以取代；以及 其中於該CH3域的位置101處的該胺基酸為纈胺酸(V)、丙胺酸(A)或不存在； 其中該胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方式。
  2. 如請求項1之專一性結合物件，其中該專一性結合物件包含總計高達五個胺基酸取代於該第一、第二及第三序列內。
  3. 如請求項1或2之專一性結合物件，其中於位置98處的該甲硫胺酸(M)係用胺基酸L予以取代。
  4. 如請求項1至3中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件包含高達二個胺基酸取代於該第一序列內及/或高達三個胺基酸取代於該第三序列內。
  5. 如請求項1至4中任一項之專一性結合物件，其中 該第一序列係由下列組成： (a)胺基酸序列SGYW(序列辨識編號：23)，或 (b)序列辨識編號：23之一變異體，其中該絲胺酸(S)係用胺基酸E或T予以取代； 該第二序列係由胺基酸序列EPQYWA(序列辨識編號：11)組成；及 該第三序列係由下列組成： (a)胺基酸序列SNWRWQMD1 D2 (序列辨識編號：19)，或 (b)序列辨識編號：19之一變異體，其中該甲硫胺酸(M)係用胺基酸I、L、或V予以取代；及 該天冬胺酸(D1 )係選擇性地用甘胺酸(G)予以取代；及 其中於該CH3域的位置101處的該胺基酸為纈胺酸(V)、丙胺酸(A)或不存在。
  6. 如請求項1至5中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列具有序列辨識編號：42內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：43內列出的該序列。
  7. 如請求項1至5中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：43內列出的該序列。
  8. 如請求項1至5中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：78內列出的該序列。
  9. 如請求項1至5中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列具有序列辨識編號：42內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：74內列出的該序列且於該專一性結合物件的該CH3域的位置113處的該殘基為精胺酸(R)。
  10. 如請求項1至5中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列具有序列辨識編號：47內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：70內列出的該序列，其中於該專一性結合物件的該CH3域的位置84.1、85.3、101及113處的該等殘基分別為脯胺酸(P)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)及精胺酸(R)。
  11. 如請求項1至5中任一項之專一性結合物件，其中該該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：31內列出的該序列。
  12. 如請求項1至5中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：19內列出的該序列。
  13. 如請求項1至5中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：27內列出的該序列。
  14. 如請求項1至5中任一項之專一性結合物件，其中該第一序列具有序列辨識編號：23內列出的該序列、該第二序列具有序列辨識編號：11內列出的該序列以及該第三序列具有序列辨識編號：35內列出的該序列。
  15. 如請求項6至9中任一項之專一性結合物件，其中於該CH3域的位置101處的該胺基酸為纈胺酸(V)。
  16. 如請求項1至15中任一項之專一性結合物件，其中該CH3域為一人類IgG1 CH3域。
  17. 如請求項1至16中任一項之專一性結合物件，其中於該CH3域的位置38處的該胺基酸為一纈胺酸或丙胺酸殘基。
  18. 如請求項1至17中任一項之專一性結合物件，其中於該CH3域的位置38處的該胺基酸為一丙胺酸殘基。
  19. 如請求項1至18中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件包含序列辨識編號：44、48、71、75、79、32、24、28、36或39內列出的該CH3域。
  20. 如請求項1至19中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件包含序列辨識編號：44、48、71、75、79或32內列出的該CH3域。
  21. 如請求項1至20中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件進一步包含一CH2域。
  22. 如請求項1至21中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2域。
  23. 如請求項1至22中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件包含人類IgG1的CH2域。
  24. 如請求項21至23中任一項之專一性結合物件，其中該CH2域具有序列辨識編號：5、6或82內列出的該序列。
  25. 如請求項1至24中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件進一步包含一免疫球蛋白鉸鏈區或其部分於該CH2域的N端。
  26. 如請求項25之專一性結合物件，其中該鉸鏈區或其部分為一人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4鉸鏈區或其部分。
  27. 如請求項26之專一性結合物件，其中該鉸鏈區或其部分為一人類IgG1鉸鏈區或其部分。
  28. 如請求項25至27中任一項之專一性結合物件，其中該鉸鏈區包含序列辨識編號：7內列出的該序列或由序列辨識編號：7內列出的該序列所組成。
  29. 如請求項1至28中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件包含下列或由下列所組成：序列辨識編號：45、46、49、50、72、73、76、77、80、81、33、34、25、26、29、30、37、38、40或41內列出的該序列。
  30. 如請求項1至28中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件包含下列或由下列所組成：序列辨識編號：45、46、49、50、72、73、76、77、80、81、33或34內列出的該序列。
  31. 如請求項1至30中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件進一步包含一第二抗原結合位址。
  32. 如請求項31之專一性結合物件，其中該第二抗原結合位址為一CDR-為基的抗原結合位址。
  33. 如請求項1至32中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件為一抗體分子。
  34. 如請求項33之專一性結合物件，其中該抗體分子為一人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子。
  35. 如請求項34之專一性結合物件，其中該抗體分子為一人類IgG1分子。
  36. 如請求項32至35中任一項之專一性結合物件，其中該抗體分子的該CDR-為基的抗原結合位址係與一檢查點抑制劑、共刺激分子或腫瘤關聯性抗原結合。
  37. 如請求項32至36中任一項之專一性結合物件，其中該抗體分子的該CDR-為基的抗原結合位址不與OX40、可誘發的T-細胞共刺激劑(Inducible T-cell COStimulator) (ICOS)或CD137結合。
  38. 如請求項32至37中任一項之專一性結合物件，其中該抗體分子的該CDR-為基的抗原結合位址不與CD27或糖皮質素-誘發的TNFR-相關蛋白(GITR)結合。
  39. 如請求項32至38中任一項之專一性結合物件，其中該抗體分子的該CDR-為基的抗原結合位址不與淋巴細胞活化基因3(LAG-3)結合。
  40. 如請求項32至39中任一項之專一性結合物件，其中該專一性結合物件或抗體分子係複合至一免疫系統調控劑、胞毒型分子、放射性同位素或可偵測的標示。
  41. 如請求項40之專一性結合物件，其中該免疫系統調控劑或胞毒型分子是一細胞介素。
  42. 如請求項40之專一性結合物件，其中該免疫系統調控劑係一細胞表面受體或其生物活性片段；或一細胞表面受體的一配體或該配體的一生物活性片段。
  43. 一種核酸，其編碼如請求項1至42中任一項之專一性結合物件或抗體分子。
  44. 一種載體，其包含如請求項43之核酸。
  45. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項43之核酸或如請求項44之載體。
  46. 一種生產如請求項1至42中任一項之專一性結合物件或抗體分子之方法，其包含於用於生產該專一性結合物件或抗體分子的條件下培養如請求項45之重組宿主細胞。
  47. 如請求項46之方法，其進一步包含單離及/或純化該專一性結合物件或抗體分子。
  48. 一種藥學組成物，其包含如請求項1至42中任一項之專一性結合物件或抗體分子及一藥學上可接受的賦形劑。
  49. 如請求項1至42中任一項之專一性結合物件或抗體分子，供用於一治療一患者癌症的方法。
  50. 一種治療一患者的癌症的方法，其中該方法包含投予一治療有效量的如請求項1至42中任一項之專一性結合物件或抗體分子至該患者。
  51. 如請求項49或50之供用的專一性結合物件或抗體分子或方法，其中該方法進一步包含投予一第二抗癌治療(therapeutic)至該患者。
  52. 如請求項1至42中任一項之專一性結合物件或抗體分子，供用於一治療一感染性疾病的方法。
  53. 一種治療一患者的一感染性疾病的方法，其中該方法包含投予一治療有效量的如請求項1至42中任一項之專一性結合物件或抗體分子至該患者。
  54. 如請求項52或53之供用的專一性結合物件或抗體分子或方法，其中該感染性疾病係一慢性感染性疾病。
  55. 如請求項1至42中任一項之專一性結合物件或抗體分子，供用於一治療發炎、與發炎相關的一疾病或病況、或一發炎疾病的方法。
  56. 一種治療一患者發炎、與發炎相關的一疾病或病況、或一發炎疾病的方法，其中該方法包含投予一治療有效量的如請求項1至42中任一項之專一性結合物件或抗體分子至該患者。
  57. 如請求項52或53之供用的專一性結合物件或抗體分子或方法，其中該發炎、與發炎相關的疾病或病況、或發炎疾病係中風、中風相關的發炎或血管發炎。
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