CN114316067A - 抗癌融合多肽 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了对CD137和HER2/neu两者特异的融合多肽，所述融合多肽可用于将CD137聚集和活化导向至HER2/neu阳性肿瘤细胞。这种融合多肽可用于许多制药应用中，例如用作用于治疗或预防人类疾病如各种肿瘤的抗癌剂和/或免疫调节剂。本公开内容还涉及制备本文所述的融合多肽的方法以及包含这种融合多肽的组合物。本公开内容还涉及编码这种融合多肽的核酸分子以及用于产生这种融合多肽和核酸分子的方法。此外，本申请公开了这种融合多肽以及包含一种或多种这种融合多肽的组合物的治疗和/或诊断用途。

Description

抗癌融合多肽
背景技术
HER2/neu是人表皮生长因子受体家族的成员。已经证明该致癌基因的扩增或过表达在多种肿瘤的发展和进展中起重要作用，包括某些侵袭类型的乳腺癌。与健康组织相比，HER2/neu已被证明在肿瘤细胞上高度差异表达，具有高得多的细胞表面密度。
曲妥珠单抗(Trastuzumab，以
Figure BDA0003361078120000011
出售)，一种靶向HER2/neu的单克隆抗体，指示用于治疗早期或转移性HER2(+)乳腺癌的妇女。尽管单克隆抗体如曲妥珠单抗在这种情况下的显著活性，患有难治疗或晚期癌症的患者的应答率并不理想。例如，虽然与单独化疗相比，联合曲妥珠单抗化疗的临床试验的客观应答率显著上升(32％至50％)，但仍然有另外一半无反应的入组患者(Slamon DJ等人，N Engl J Med.2001Mar 15；344(11):783-92)。因此，需要更好的具有改善的应答率的HER2/neu靶向疗法。
CD137是共刺激免疫受体，是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。它主要在活化的CD4+和CD8+T细胞、活化的B细胞以及天然杀伤(NK)细胞上表达，但也可以被发现于静息的单核细胞和树突状细胞(Li,S.Y.等人，Clin Pharmacol,2013 5(Suppl 1):47-53)或内皮细胞上(Snell,L.M.等人，Immunol Rev 2011Nov；244(1):197-217)。CD137在调节免疫应答中起重要作用，因此是癌症免疫治疗的靶标。CD137配体(CD137L)是唯一已知的CD137天然配体，并在APC的几种类型如活化的B细胞、单核细胞和脾脏树突状细胞上组成型表达，还可在T淋巴细胞上被诱导。
CD137L是以膜结合形式和可溶性变体存在的三聚体蛋白。但是，可溶性CD137L在例如CD137表达淋巴细胞上活化CD137的能力有限，并且需要大的浓度以引发作用(Wyzgol,A.等人，J Immunol 2009Aug 1；183(3):1851-1861)。CD137活化的自然途径通过CD137阳性细胞与CD137L阳性细胞的接合。认为然后CD137活化是通过经由相对细胞上CD137L的聚集来诱导的，从而导致经由TRAF1、2和3的信号传导(Snell,L.M.等人，Immunol Rev 2011Nov；244(1):197-217；Yao,S.等人，Nat Rev Drug Disc 2013Feb；12(2):130-146)以及在CD137阳性T细胞中进一步伴随的下游效应。在通过识别它们各自的同源靶标而活化T细胞的情况下，通过CD137的共刺激引发的效果为进一步的活化增强、生存和增殖的增强、产生促炎细胞因子以及杀死能力的提高。
已经在许多临床前的体内模型中证实了CD137共刺激用于消除癌细胞的益处。例如，CD137L在肿瘤上的强制表达导致肿瘤排斥(Melero,I.等人，Eur J Immunol 1998Mar:28(3):1116-1121)。同样，抗CD137 scFv在肿瘤上的强制表达引起CD4+ T细胞和NK细胞依赖性肿瘤消除(Ye,Z.等人，Nat Med 2002 4:8(4):343-348；Zhang,H.等人，Mol Canc Ther2006Jan:5(1):149-155；Yang,Y.等人，Canc Res 2007Mar 1:67(5):2339-2344)。还证实了全身施用的抗CD137抗体引起肿瘤生长迟延(Martinet,O.等人，Gene Ther2002Jun:9(12):786-792)。
已经表明CD137是人肿瘤中天然存在的肿瘤反应性T细胞的优良标记物(Ye,Q.等人，Clin Canc Res:2014Jan 1:20(1):44-55)，可在过继性T细胞疗法的应用中使用抗CD137抗体来改善CD8+黑素瘤肿瘤浸润淋巴细胞的扩增和活性(Chacon,J.A.等人，PloSOne 2013 8(4):e60031)。
CD137共刺激的潜在治疗好处的临床前示范促进了靶向CD137、BMS-663513(Jure-Kunkel,M.等人，美国专利7288638)和PF-05082566(Fisher,T.S.等人，Canc ImmunolImmunother 2012Oct:61(10):1721-1733)的治疗性抗体的开发；目前两者都处于早期的临床试验中。
然而，仅近来已发现如抗体这样的二价CD137结合剂本身可能不足以将CD137聚集在T细胞或NK细胞上并导致有效的活化，类似于三价可溶性CD137L缺乏活性。最近的出版物利用临床前的小鼠模型，已经提供了体内证据，即其他抗TNFR抗体的作用模式实际上需要抗体通过它们的Fc部分与Fc-γ受体表达细胞上的Fc-γ受体的相互作用(Bulliard,Y.等人，J Exp Med 2013Aug 26:210(9):1685-1693；Bulliard,Y.等人，Immunol Cell Biol2014Jul:92(6):475-480)。因此，目前临床开发中抗体的作用模式可以通过经由Fc-γ受体的非靶向聚集来主导，其几乎可随机地依赖于肿瘤附近Fc表达细胞的存在。
因此，以特异性肿瘤靶向作用模式聚集和活化CD137的疗法的产生尚未满足需求。
为了满足这种未满足的需求，本申请提供了一种通过具有以下特性的融合多肽同时接合CD137和肿瘤抗原HER2/neu的新方法：
(a)对CD137的结合特异性；以及
(b)对HER2/neu的结合特异性；
该融合多肽被设计为通过肿瘤细胞上过表达的HER2来提供淋巴细胞上CD137的肿瘤靶标依赖性活化。预期这样的分子进一步活化位于HER2阳性肿瘤附近的T细胞和/或NK细胞。这样的双特异性可以显示出比抗HER2或抗CD137抗体改进的治疗效果。
定义
以下列表定义了贯穿于本说明书所使用的术语、短语和缩写。本文列出和定义的所有术语旨在涵盖所有的语法形式。
如本文所使用，除非另有说明，“CD137”是指人CD137。CD137也被称为“4-1BB”或“肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)”或“由淋巴细胞活化诱导的(ILA)”)。人CD137是指由UniProt Q07011定义的全长蛋白质、其片段或其变体。
如本文所使用，除非另有说明，“HER2”或“HER2/neu”是指人HER2。Her-2或HER2/neu也被称为“erbB-2”、“c-neu”或“p185”。人Her2是指由UniProt P04626定义的全长蛋白质、其片段或其变体。
如本文所使用，“可检测的亲和力”是指以通常至少约10-5M或更低的亲和力常数结合所选靶标的能力。更低的亲和力通常不能通过常规方法诸如ELISA测量，因此是次要的。
如本文所使用，本公开内容的蛋白质(例如脂质运载蛋白的突变蛋白)或其融合多肽与所选靶标(在本情况下，CD137和/或HER2/neu)的“结合亲和力”，能够通过本领域技术人员已知的许多方法测量(由此测定突变蛋白-配体复合物的KD值)。这样的方法包括但不限于荧光滴定、竞争ELISA、量热法诸如等温滴定量热法(ITC)和表面等离子体共振(BIAcore)。这样的方法在本领域中已经完全建立，其实例也在以下详细描述。
还注意到的是，在各自的结合剂和其配体之间形成复合物受许多不同因素的影响，诸如各自结合配偶体的浓度、竞争剂的存在、所用的缓冲体系的pH和离子强度以及用于测定解离常数KD的实验方法(例如荧光滴定、竞争ELISA或表面等离子体共振，仅举几例)或甚至用于评估实验数据的数学算法。
因此，还对于本领域技术人员显而易见的是，该KD值(在各自的结合剂和其靶标/配体之间形成的复合物的解离常数)可以在一定实验范围内变化，这取决于用于测定特定脂质运载蛋白突变蛋白对于给定配体的亲和力的方法和实验设置。这意味着在测得的KD值中可能会有轻微偏差或公差范围，这取决于KD值是由表面等离子共振(Biacore)、竞争ELISA还是“直接ELISA”测定。
如本文所使用，“突变蛋白”、“突变的”实体(无论蛋白质还是核酸)或“突变体”是指相比于天然存在的(野生型)核酸或蛋白质“参照”骨架，一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入。所述术语还包括如本文所述的突变蛋白的片段和变体。本发明的脂质运载蛋白突变蛋白、其片段或变体优选保持如本文所述的结合于CD137的功能。
本文所使用的与本公开内容的突变蛋白有关的术语“片段”，涉及来源于全长成熟人泪脂质运载蛋白的蛋白质或肽，该蛋白质或肽为N末端和/或C末端缩短的，即缺少至少一个N末端和/或C末端氨基酸。这样的片段可以包括成熟脂质运载蛋白的一级序列的至少10个、更多如20或30或更多个连续氨基酸，并且通常可在成熟脂质运载蛋白的免疫测定中被检测到。一般而言，如本文使用的关于本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白的、或根据本公开内容的组合的或本文所述融合蛋白的相应的蛋白质配体CD137的术语“片段”，涉及N末端和/或C末端缩短的蛋白质或肽配体，其保持全长配体被根据本公开内容的突变蛋白识别和/或结合的能力。
本文所使用的术语“诱变”是指选择实验条件，以使得天然存在于成熟脂质运载蛋白的给定序列位置处的氨基酸可被至少一个在各自的天然多肽序列中的该具体位置处并不存在的氨基酸取代。术语“诱变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸对序列片段长度的(另外的)修饰。因此，在本公开内容的范围内，例如在所选序列位置处的一个氨基酸被三个随机突变的一段所替代，导致相比于野生型蛋白质的相应片段的长度的两个氨基酸残基的插入。这样的插入或缺失可以在本公开内容中的任何能够进行诱变的肽片段中彼此独立地被引入。在本公开内容的一个示例性实施方案中，多个突变的插入可以被引入所选择的脂质运载蛋白骨架的AB环中(参见国际专利申请WO2005/019256，其全部内容通过引用并入本文)。
术语“随机诱变”是指在某一序列位置处不存在预定的单个氨基酸(突变)，但是在诱变期间可在预先确定的序列位置处以一定概率引入至少两个氨基酸。
“同一性”是测量序列的相似性或关系的序列的属性。本公开内容使用的术语“序列同一性”或“同一性”是指在本公开内容的多肽序列与所讨论序列进行(同源性)比对之后，成对相同残基相对于这两个序列中较长一个的残基数的百分比。通过将相同氨基酸残基的数目除以残基总数并将结果乘以100来测量序列同一性。
术语“同源性”在本文中以其通常的含义使用，并且包括在本公开内容的多肽(例如本公开内容的任意脂质运载蛋白突变蛋白)的线性氨基酸序列中等同位置处的相同氨基酸以及被认为是保守取代(例如，通过天冬氨酸残基交换谷氨酸残基)的氨基酸。
例如，本文可以使用BLASTP程序，blastp 2.2.5版本(2002年11月16日；参见Altschul,S.F.等人(1997)Nucl.Acids Res.25,3989-3402)来确定序列同源性或序列同一性的百分比。在这个实施方案中，同源性百分比基于整个多肽序列(包括多肽序列，优选在成对比较中使用野生型蛋白质骨架作为参照)的比对(矩阵：BLOSUM 62；空位罚分：11.1；截止值设置为10-3)。这被计算为按照BLASTP程序输出结果显示的“阳性”(同源氨基酸)的数量除以该程序选择用于比对的氨基酸总数的百分比。
具体地，为了确定不同于野生型脂质运载蛋白的脂质运载蛋白(突变蛋白)的氨基酸序列的氨基酸残基是否对应于野生型脂质运载蛋白的氨基酸序列中的某一位置，技术人员可使用本领域公知的手段和方法，如手动或通过使用计算机程序的比对，计算机程序如代表碱基局部比对检索工具的BLAST2.0或ClustalW或适用于生成序列比对的任何其他合适的程序。因此，野生型脂质运载蛋白可以作为“目标序列”或“参照序列”，而与本文所述的野生型脂质运载蛋白不同的脂质运载蛋白的氨基酸序列作为“查询序列”。术语“参照序列”和“野生型序列”在本文中可互换使用。优选的野生型脂质运载蛋白分别显示于SEQ ID NO：18(Tlc)或SEQ ID NO：17(NGAL)中。分别取决于本发明的脂质运载蛋白突变蛋白是基于Tlc还是基于NGAL，相应的野生型脂质运载蛋白可以用作参照序列或野生型序列。
“空位”是在比对中由于氨基酸的添加或缺失导致的空间。因此，完全相同序列的两个副本具有100％的同一性，但是较不高度保守的并且具有缺失、添加或替代的序列可能具有较低程度的序列同一性。本领域技术人员将认识到，几个计算机程序可用于使用标准参数来测定序列同一性，例如Blast(Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402)、Blast2(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215,403-410)和Smith-Waterman(Smith等人(1981)J.Mol.Biol.147,195-197)。
本公开内容所使用的术语“变体”涉及蛋白质或多肽的衍生物，其包括氨基酸序列的修饰，例如通过取代、缺失、插入或化学修饰。在一些实施方案中，这样的修饰不降低所述蛋白质或多肽的功能性。这样的变体包括这样的蛋白质：在所述蛋白质中一个或多个氨基酸已经被它们各自的D-立体异构体替代，或者被除了天然存在的20个氨基酸之外的氨基酸取代，诸如例如鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、羟赖氨酸、正缬氨酸。然而，这样的取代也可以是保守的，即氨基酸残基被化学上相似的氨基酸残基替代。保守取代的例子为以下组的成员之间的替代：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；以及6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。本文所使用的关于本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白的、或根据本公开内容的组合的或本文所述的融合蛋白的相应的蛋白质配体CD137的术语“变体”，分别涉及CD137或其片段，其与野生型CD137蛋白质相比较分别具有一个或多个如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80或更多个氨基酸取代、缺失和/或插入，所述野生型CD137蛋白质例如如本文所述采用UniProt保藏的CD137参照蛋白质。CD137变体分别与野生型人CD137分别具有优选至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的氨基酸同一性，所述野生型人CD137例如如本文所述采用UniProt保藏的CD137参照蛋白。
“天然序列”脂质运载蛋白是指与来源于自然的相应的多肽具有相同的氨基酸序列的脂质运载蛋白。因此，自然序列脂质运载蛋白可具有来自任何生物体、特别是哺乳动物的各自天然存在的脂质运载蛋白的氨基酸序列。这样的天然序列多肽可从自然分离出来，或者可通过重组或合成方式产生。术语“天然序列”多肽特别地涵盖脂质运载蛋白的天然存在的截短或隐藏形式、天然存在的变体形式例如脂质运载蛋白的可选剪接形式和天然存在的等位基因变体。多肽“变体”是指与天然序列多肽具有至少约50％、60％、70％、80％或至少约85％的氨基酸序列同一性的生物活性多肽。这样的变体包括例如这样的多肽：在所述多肽中一个或多个氨基酸残基在所述多肽的N或C末端被添加或缺失。通常地，变体与天然序列多肽具有至少约70％、包括至少约80％如最少约85％的氨基酸序列同一性，包括至少约90％的氨基酸序列同一性或至少约95％的氨基酸序列同一性。作为说明性实例，前4个N末端氨基酸残基(His-His-Leu-Leu)和最后2个C末端氨基酸残基(Ser-Asp)可在本公开内容的泪脂质运载蛋白(Tlc)突变蛋白中被缺失而不影响该蛋白质例如SEQ ID NOs：32-38的生物学功能。此外，作为另一个说明性实例，某些氨基酸残基可以在本公开内容的脂质运载蛋白2(NGAL)突变蛋白中被缺失而不影响该蛋白质的生物学功能，例如关于SEQ ID NO：42的(Lys-Asp-Pro，位置46-48)。
根据本公开内容所使用的术语“位置”是指本文描述的氨基酸序列内的氨基酸的位置，或本文描述的核酸序列内的核苷酸的位置。为了理解在一个或多个脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列位置的上下文中本文所使用的术语“对应”或“相应的”，相应的位置不仅由前面的核苷酸/氨基酸的数量所决定。相应地，根据本公开内容的可能被取代的给定氨基酸的位置可能由于(突变体或野生型)脂质运载蛋白中其它地方的氨基酸的缺失或添加而变化。类似地，根据本公开内容的可能被取代的给定核苷酸的位置可能由于突变蛋白或野生型脂质运载蛋白5'非翻译区(UTR)(包括启动子和/或任何其他调节序列或基因(包括外显子和内含子))中其它地方的核苷酸的缺失或添加而变化。
因此，对于根据本公开内容的相应位置，优选应当理解的是，核苷酸/氨基酸的位置可能在指定的数目上与相类似的相邻核苷酸/氨基酸不同，但是所述相邻核苷酸/氨基酸(可以交换、缺失或添加)也由一个或多个相应位置所包含。
此外，对于基于根据本公开内容的参照骨架的脂质运载蛋白突变蛋白中的相应位置，优选应当理解的是，核苷酸/氨基酸的位置在结构上对应于(突变体或野生型)脂质运载蛋白中其它地方的位置，即使它们可能在指定的数目上不同，正如本领域技术人员根据脂质运载蛋白中高度保守的整体折叠模式所认识到的。
本文所使用的词语“检测”或“可检测的”在定量和定性水平两者以及在它们的组合上被理解。因此，这包括感兴趣的分子的定量、半定量和定性测量。
“受试者”为脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。本文使用术语“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括但不限于人、家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如羊、狗、马、猫、牛、大鼠、猪、猿诸如食蟹猴等，仅举几个说明性实例。优选地，本文所述哺乳动物是人。
“有效量”是足以实现有益或期望结果的量。有效量可在一次或多次给药中施用。
“样品”被定义为从任何受试者取得的生物样品。生物样品包括但不限于血液、血清、尿液、粪便、精液或组织。
本文所公开的融合多肽的“亚基”被定义为多肽的一段氨基酸，该段定义所述多肽的独特的功能单元，例如提供朝向靶标的结合基序。
附图说明
图1：提供了本申请中描述的代表性融合多肽的设计概述，所述融合多肽是关于靶标HER2和CD137双特异性的。基于对HER2特异性的抗体(SEQ ID NOs：3和4)和对CD137特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO：2)制备代表性融合多肽。所述抗体与所述脂质运载蛋白突变蛋白的直接融合产生了SEQ ID NOs：5和6的融合多肽。利用具有突变S228P、F234A和L235A的工程化IgG4主链，脂质运载蛋白突变蛋白与抗体的四个末端中的任意一个融合(SEQ ID NOs：9和10，SEQ ID NOs：11和12，SEQ ID NOs：13和14，SEQ ID NOs：15和16)。此外，在融合多肽(SEQ ID NOs：7和8)内，进行N297A突变以除去糖基化基序。
图2：描述了ELISA实验的结果，其中测定了代表性融合多肽和基准抗体针对HER2的亲和力。将重组HER2涂覆在微量滴定板上，并从100nM浓度开始滴定测试的试剂。如实施例2中描述通过抗人IgG Fc抗体检测所研究的结合的试剂。使用1:1结合模型拟合数据，其中EC50值和最大信号作为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表2中提供。
图3：显示了ELISA实验的结果，其中测定了代表性融合多肽和阳性对照脂质运载蛋白突变蛋白针对CD137的亲和力。将人CD137的Fc融合物涂覆在微量滴定板上，并从100nM浓度开始滴定测试的试剂。如实施例3中描述通过抗人IgG-Fc抗体检测所研究的结合的试剂。使用1:1结合模型拟合数据，其中EC50值和最大信号作为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表3中提供。
图4：说明了ELISA实验的结果，其中测定了代表性融合多肽同时结合两个靶标(HER2和CD137)的能力。将重组HER2涂覆在微量滴定板上，随后从100nM浓度开始滴定所述融合多肽。然后，加入恒定浓度的生物素化的人CD137-Fc，其如实施例4中描述通过extravidin检测。
图5：显示了T细胞活化试验的结果，其中评估了SEQ ID NOs：15和16的融合多肽共刺激T细胞应答的能力。将不同浓度的SEQ ID NOs：15和16的融合多肽与抗人CD3抗体一起涂覆在塑料皿上，然后将纯化的T细胞在涂覆的表面上孵育。如实施例5中描述测量了上清液白细胞介素2(IL-2)水平。
图6：提供了代表性实验，其中研究了SEQ ID NOs：9和10的融合多肽以HER2靶标依赖性方式共刺激T细胞活化的能力。作为对照，使用了SEQ ID NOs：3和4的单特异性HER2结合抗体。在该实验中，将抗人CD3抗体涂覆在塑料培养皿上，随后将HER2阳性SKBR3细胞在培养皿上培养过夜。第二天，在各种浓度的双特异性融合多肽SEQ ID NOs：9和10(实心圆圈)或SEQ ID NOs：3和4的对照抗体的存在下，将纯化的T细胞在涂覆的表面上孵育。将对于不同浓度的SEQ ID NOs：3和4测定的值作为平均值(虚线)提供。通过基于电化学发光的试验测定了上清液白细胞介素2(IL-2)(A)和IFN-γ(B)。所述实验也是在过量SEQ ID NOs：3和4的存在下进行的，并测量了IL-2(C)和IFN-γ(D)的上清液水平。使用1:1结合模型拟合数据。
图7：提供了代表性实验，其中研究了SEQ ID NOs：11和12的融合多肽以HER2靶标依赖性方式共刺激T细胞活化的能力。详细信息见图6的图例。
图8：提供了代表性实验，其中研究了SEQ ID NOs：13和14的融合多肽以HER2靶标依赖性方式共刺激T细胞活化的能力。详细信息见图6的图例。
图9：提供了代表性实验，其中研究了SEQ ID NOs：15和16的融合多肽以HER2靶标依赖性方式共刺激T细胞活化的能力。详细信息见图6的图例。
图10：提供了关于多肽对FcgRI、FcgRIII和FcRn的亲和力的代表性实验，如实施例7和8中描述。
图11：提供了代表性实验，其中用不同细胞系研究了图中所示融合多肽共刺激T细胞活化的能力。所利用的细胞系是高HER2阳性细胞(SKBR3，BT474)和以类似于健康细胞(HepG2，MCF7)的水平表达HER2的细胞系。在该实验中，将抗人CD3抗体涂覆在塑料培养皿上，随后将研究的细胞系在培养皿上培养过夜。第二天，在各种浓度的双特异性融合多肽的存在下，将纯化的T细胞在涂覆的表面上孵育三天，所述双特异性融合多肽如下：(A)SEQ IDNOs：9和10(实线)或SEQ ID NOs：3和4的对照抗体(虚线)。(B)抗CD137抗体SEQ ID NOs：47和48。(C)抗CD137抗体SEQ ID NOs：49和50。通过基于电化学发光的试验测定上清液白细胞介素2水平。绘制的相对IL-2应答对应于在测试品的存在和不存在(“背景”)下获得的应答的比率。
图12：提供了的在PBS pH 7.4中40℃下孵育4周之前(底部曲线)和之后(顶部曲线)，双特异性融合多肽以及SEQ ID NOs：3和4的对照抗体的代表性尺寸排阻色谱(SEC)痕迹。每种情况下样品浓度为20mg/mL，融合多肽身份如图所示。为更好地可视化，SEC曲线以在y轴上的偏移绘制。
图13：提供了小鼠中双特异性融合多肽以及SEQ ID NOs：3和4的对照抗体的药代动力学分析结果。给雄性CD-1小鼠(每个时间点3只小鼠)以10mg/kg的剂量静脉内注射融合多肽。使用通过靶标HER2和CD137检测完整的双特异性构建体的夹心ELISA检测了药物水平。使用采用靶标HER2和人Fc的夹心ELISA测定了曲妥珠单抗血浆水平。使用二室模型拟合数据。
图14：提供了小鼠中双特异性融合多肽以及SEQ ID NOs：3和4的对照抗体的药代动力学分析结果。雄性曲妥珠单抗-天然
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食蟹猴接受了作为3mg/kg剂量持续60分钟的静脉内输注的测试品。使用通过靶标HER2和CD137检测完整的双特异性构建体的夹心ELISA检测了药物水平。使用采用靶标HER2和人Fc的夹心ELISA测定了曲妥珠单抗血浆水平。使用二室模型拟合数据。
图15：提供了双特异性融合多肽、SEQ ID NOs：3和4的对照抗体以及阳性对照钥孔血蓝蛋白(KLH)的体外T细胞免疫原性评估结果。如实施例13中描述使用基于PBMC的形式进行试验，其中采用32个供体和反映了全球人口分布的人类白细胞抗原(HLA)同种异型：(A)刺激指数(在测试品存在下相对于不存在下的增殖)。以条形指示平均应答。以虚线指示定义应答供体(刺激指数>2)的阈值。(B)应答者数量。
图16：在人源化小鼠肿瘤模型中使用CD137/HER2双特异性物或对照处理后的相对中值肿瘤体积。给NSG小鼠移植允许生长至平均120mm3的皮下SK-OV-3肿瘤。将小鼠随机分入处理组并且静脉内接受7×106个新鲜的人PBMC，以及在第0天并且再次在第7天和第14天的PBMC注射后1小时接受指示的分子和剂量。每组包含10只小鼠，研究SEQ ID NOs：47和48的由7只小鼠组成的组除外。每3-4天记录肿瘤生长。
图17：提供了代表性实验，其中研究了图中所示融合多肽取决于HER2高NCI-N87靶细胞活化CD137通路的能力。在该实验中，将NCI-N87肿瘤靶细胞在培养皿上培养过夜。第二天，在各种浓度的双特异性融合多肽的存在下，将NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat报告细胞加入到涂覆的靶细胞中，所述双特异性融合多肽如下：(A)SEQ ID NOs：9和10(实线)或SEQ IDNOs：3和4的对照抗体(虚线)。(B)抗CD137抗体SEQ ID NOs：47和48。(C)抗CD137抗体SEQ IDNOs：49和50。发光信号(RLU)表示CD137通路活化的相对测量。使用GraphPad Prism软件进行四参数逻辑曲线分析。
图18：(A)显示了在人源化小鼠肿瘤模型中使用CD137/HER2双特异性物或对照处理后的中值肿瘤体积。给NOG小鼠移植允许生长至平均120mm3的皮下SK-OV-3肿瘤。将小鼠随机分入处理组并且静脉内接受7×106个新鲜的人PBMC，以及在第0天并且再次在第7天和第14天的PBMC注射后1小时接受指示的分子和剂量。每组包含10只小鼠。记录肿瘤生长20天，每周两次。(B)显示了人淋巴细胞标志物CD45作为人T细胞在肿瘤上浸润的标志物的免疫组织化学结果，所述肿瘤来自在处理后第20天后收获的两只小鼠。
图19：(A)显示了在该研究的第19天采集的实施例16的处理组和对照组的PMBC的CD45、CD3和CD8表型。左侧的图19A显示了表达人CD45的总PMBC的百分比，而右侧的图19A显示了也表达CD3和CD8的CD45表达PMBC的百分比。该图显示了抗CD137 mAb处理组中增加的CD8+人效应T细胞扩增。(B)显示了实验16的处理组和对照组的死亡数。图19B的绘制的值对应于每10只一组中自发死亡或基于所定义的一般条件标准需要处死的小鼠的数量。
图20：实施例18的处理组和对照组的死亡数。绘制的值对应于每10只一组(SEQ IDNos：9和10，4μg：9只一组)中自发死亡或基于所定义的一般条件标准需要处死的小鼠的数量。
图21：在人源化小鼠肿瘤模型中使用CD137/HER2双特异性物或对照处理后的相对中值肿瘤体积。给NSG小鼠移植允许生长至平均110mm3的皮下SK-OV-3肿瘤。将小鼠随机分入处理组并且静脉内接受7×106个新鲜的人PBMC，以及在第0天并且再次在第7天和第14天的PBMC注射后1小时接受指示的分子和剂量的腹膜内注射。每组包含10只小鼠，仅含有9只小鼠的组7(SEQ ID NOs：9和10，4μg)除外。每3-4天记录肿瘤生长。
图22：人CD45阳性淋巴细胞的免疫组织化学。从带瘤小鼠切取肿瘤，每组多达6个肿瘤用福尔马林固定，包埋于石蜡中，并使用抗人CD45抗体处理用于免疫组织化学。通过3,3'-二氨基联苯胺(DAB)染色鉴定CD45阳性细胞。为了使灰度图像中DAB阳性清晰可视化，该图像的对比度和亮度经数字化调整。
图23：图22所示的图像的DAB阳性的数字化定量。该图示出了与各种对照相比，使用SEQ ID NOs：9和10处理的组中hCD45阳性人淋巴细胞的增加的频率(详见实施例17)。
图24：在该研究的第19天采集的实施例18的处理组和对照组的PMBC的表型。(A)表达人CD45的总PMBC的百分比。(B)表达CD8的CD45表达PMBC的百分比。该图显示了与阴性对照以及SEQ ID NOs：9和10处理组相比，抗CD137 mAb(SEQ ID NOs：47和48)处理组中增加的CD8+人效应子T细胞扩增。
具体实施方式
在一些实施方案中，所述融合多肽包含至少两个任意顺序的亚基：包含对HER2/neu特异的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域的第一亚基，以及包含对CD137特异的脂质运载蛋白突变蛋白的第二亚基。
在一些实施方案中，所述融合多肽还可以包含第三亚基。例如，所述多肽可以包含对CD137特异的亚基。在一些实施方案中，所述第三亚基包含对CD137特异的脂质运载蛋白突变蛋白。
在一些实施方案中，一个亚基可基本如图1中描述连接至另一个亚基。例如，一个脂质运载蛋白突变蛋白可通过肽键连接至所述免疫球蛋白重链结构域(VH)的C末端、VH的N末端、免疫球蛋白轻链(VL)的C末端和/或VL的N末端(参见图1)。在一些具体的实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白亚基可在其N末端和/或其C末端融合至免疫球蛋白亚基。例如，所述脂质运载蛋白突变蛋白可以通过在免疫球蛋白的重链恒定区(CH)的C末端或轻链恒定区(CL)的C末端之间的肽键连接。在更进一步的一些实施方案中，肽键可以是非结构化的(G4S)3连接子，例如，如SEQ ID NO：19所示。
在这方面，一个亚基可以在其N末端和/或其C末端融合至另一个亚基。例如，当一个亚基包含全长免疫球蛋白时，另一个亚基可以通过在第二亚基的N末端与所述免疫球蛋白的重链恒定区(CH)的C末端之间的肽键连接。在进一步的一些实施方案中，第三亚基可以通过在第三结合结构域的N末端与所述免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)的C末端之间的肽键连接。在更进一步的一些实施方案中，肽键可以是非结构化的(G4S)3连接子，例如，如SEQID NO：19所示。
在关于本公开内容的融合多肽的一些实施方案中，其亚基之一包含全长免疫球蛋白，而所述多肽同时接合HER2/neu和CD137，同时可以保存全长免疫球蛋白的Fc区对Fc受体阳性细胞的Fc功能。
在一些实施方案中，包含在本公开内容的融合多肽中的CD137特异性亚基可以是对CD137特异的脂质运载蛋白突变蛋白，诸如SEQ ID NO：2的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，包含在本公开内容的融合多肽中的CD137特异性亚基可以是对CD137特异的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域，诸如单克隆抗体(例如SEQ ID NOs：3和4的抗体)。
在一些实施方案中，包含在本公开内容的融合多肽中的HER2/neu特异性亚基可以是对HER2/neu特异的脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，包含在本公开内容的融合多肽中的HER2/neu特异性亚基可以是对HER2/neu特异的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域。
在一些实施方案中，在本公开内容的融合多肽中，CD137特异性亚基融合至HER2/neu特异性亚基。
在一些更具体的实施方案中，HER2/neu特异性亚基包含全长免疫球蛋白(例如单克隆抗体)或其抗原结合结构域，并且CD137特异性亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白。在一些实施方案中，融合多肽包含选自SEQ ID NOs5和6、7和8、9和10、11和12、13和14或15和16的氨基酸序列。
在关于本公开内容的融合多肽的一些其它实施方案中，其亚基之一包含全长免疫球蛋白，而所述多肽同时接合HER2/neu和CD137，通过蛋白质工程化可以减少或完全抑制全长免疫球蛋白的Fc区对Fc受体阳性细胞的Fc功能。这可以通过例如从IgG1主链转换为IgG4来实现，因为与IgG1相比，已知IgG4显示降低的Fc-γ受体相互作用。为了进一步减少与Fc-γ受体的残留结合，可以将突变引入IgG4主链中，如F234A和L235A。此外，可以将S228P突变引入IgG4主链以最小化IgG4半抗体的交换。在另外一些实施方案中，在所述融合多肽的免疫球蛋白重链中可能存在另外的N297A突变以便去除天然糖基化基序；实施例7提供了修饰同种型的亚类或工程化同种型导致Fc受体结合的丧失的证据。
在关于本公开内容的融合多肽的一些其它实施方案中，其亚基之一包含全长免疫球蛋白，而所述多肽同时接合HER2/neu和CD137，尽管Fc区可以被修饰(例如通过转换同种型或同种型的亚类或通过工程化例如通过工程化如本文所述的同种型)，所述全长免疫球蛋白的Fc区对新生儿Fc受体(FcRn)阳性细胞的Fc功能被保留。实施例8提供了本公开内容的融合多肽的Fc修饰的或Fc工程化的Fc区保持结合FcRn的证据。
在一些实施方案中，由于同时结合肿瘤细胞上的HER2和来自免疫系统的效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的表面上的CD137，本公开内容的融合多肽可以表现出HER2依赖性的效应细胞活化，由此所述免疫系统的效应细胞积极地裂解表达HER2的肿瘤细胞。
在另外一些实施方案中，例如，当在基本如Chacon,J.A.等人PloS one 2013 8(4):e60031中描述的显示靶标依赖性肿瘤浸润淋巴细胞离体扩增的试验中测量时，所述融合多肽能够显示出与这样的融合多肽中包含的免疫球蛋白相当的或更优的HER2依赖性CD137活化水平。在另外一些实施方案中，例如，当在基本如Kohrt,H.等人，J ClinInvest.2012Mar；122(3):1066-75中描述的人乳腺癌体内异种移植模型中测量时，所述融合多肽能够显示出与这样的融合多肽中包含的免疫球蛋白相当的或更优的HER2依赖性CD137活化水平。
在一些实施方案中，包含在本公开内容的融合多肽中的免疫球蛋白的Fc部分可有助于维持所述融合多肽的血清水平，这对于其在体内的稳定性和持久性至关重要。例如，当Fc部分结合到内皮细胞上的和吞噬细胞上的Fc受体时，所述融合多肽可内化并再循环回到血流中，从而增加其在体内的半衰期。
在一些实施方案中，例如，当包含于本公开内容的融合多肽中的对CD137特异的脂质运载蛋白突变蛋白(诸如SEQ ID NO：2的脂质运载蛋白突变蛋白)和所述融合多肽在基本如实施例3中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽可能够以与所述脂质运载蛋白突变蛋白的EC50值至少一样好或更优的EC50值结合CD137。
在一些实施方案中，例如，当所述融合多肽在基本如实施例3中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽可能够以至少约1nM或甚至更低，诸如约0.6nM、约0.5nM、约0.4nM或约0.3nM的EC50值结合CD137。
在一些实施方案中，例如，当包含于本公开内容的融合多肽中的对HER2/neu特异的免疫球蛋白(诸如具有由SEQ ID NOs：3和4提供的重链和轻链的抗体)和所述融合多肽在基本如实施例2中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽可能够以与所述免疫球蛋白的EC50值相当的EC50值结合HER2/neu，。
另一方面，例如，当所述融合多肽在基本如实施例2中描述的ELISA试验中测量时，所述融合多肽可能够以至少约1nM或甚至更低，诸如约0.4nM、约0.3nM或约0.2nM的EC50值将HER2/neu结合到其配体。
在一些实施方案中，例如，当本公开内容的融合多肽在基本如实施例4中描述的ELISA试验中测量时，对CD137和HER2/neu两者特异的所述融合多肽可能够同时结合CD137和HER2/neu。
在一些实施方案中，本公开内容的融合多肽可能够在基本如实施例5中描述的功能性T细胞活化试验中共刺激T细胞应答。在一些实施方案中，本公开内容的融合多肽可能够在基本如实施例5中描述的功能性T细胞活化试验中诱导IL-2和/或IFNγ分泌和T细胞增殖。在另外一些实施方案中，本公开内容的融合多肽可在基本如实施例5中描述的功能性T细胞活化试验中引起成功的T细胞活化。在另外一些实施方案中，本公开内容的融合多肽可基本如实施例6中描述引起在HER2/neu阳性肿瘤细胞附近的由T细胞产生IL-2和/或IFNγ的局部诱导。当本文使用“在HER2/neu阳性细胞附近”时是指结合的T细胞和HER2/neu阳性肿瘤细胞之间的距离，所述T细胞和HER2/neu阳性肿瘤细胞两者均通过本公开内容的一个且同一个融合多肽结合，即“连接”。
A.包含于所述融合多肽中的示例性免疫球蛋白
在一些实施方案中，关于所述融合多肽，第一结合结构域包含对HER2/neu特异的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域。所述免疫球蛋白例如可以是IgG1或IgG4。在进一步的实施方案中，所述免疫球蛋白是针对HER2/neu的单克隆抗体。这样的免疫球蛋白的几个说明性实例包括：曲妥珠单抗(商品名为Herclon、Herceptin)和帕妥珠单抗(Pertuzumab)(也称为2C4，商品名为Perjeta)。
B.包含于所述融合多肽中的示例性脂质运载蛋白突变蛋白
如本文所述，“脂质运载蛋白”被定义为约18-20kDA重量的单体蛋白，其具有圆柱形β折叠片超二次结构区，该区包含多个(优选八个)通过在一端的多个(优选四个)环成对连接的β股以由此定义结合袋。正是在本该刚性的脂质运载蛋白骨架中的环的多样性在脂质运载蛋白家族成员之间产生各种不同的结合模式，每一种能够适应不同尺寸、形状和化学特性的靶标(回顾例如在Flower,D.R.(1996)，见上文；Flower,D.R等人(2000)，见上文；或Skerra,A.(2000)Biochim.Biophys.Acta 1482，337-350中)。实际上，所述蛋白质脂质运载蛋白家族已经自然演化以结合广谱配体，共享异常低水平的整体序列保守性(通常具有小于20％的序列同一性)，仍保持高度保守的整体折叠模式。各种脂质运载蛋白中的位置之间的对应性是本领域技术人员熟知的。参见例如美国专利No.7,250,297。
如上所述，脂质运载蛋白是由其超二次结构定义的多肽，该超二次结构即圆柱形β折叠片超二次结构区，该区包含八个通过在一端的四个环成对连接的β股以由此定义结合袋。本公开内容不限于本文具体公开的脂质运载蛋白突变蛋白。在这方面，本公开内容涉及这样的脂质运载蛋白突变蛋白：其具有圆柱形β折叠片超二次结构区，该区包含八个通过在一端的四个环成对连接的β股以由此定义结合袋，其中所述四个环中的至少三个中的每一个的至少一个氨基酸已经突变，并且其中所述脂质运载蛋白以可检测的亲和力有效地结合CD137。
在一个具体实施方案中，本文所公开的脂质运载蛋白突变蛋白是人泪脂质运载蛋白(TLPC或Tlc)的突变蛋白，该人泪脂质运载蛋白也称为脂质运载蛋白-1，泪前白蛋白或冯·埃布纳腺蛋白。如本文所使用的术语“人泪脂质运载蛋白”或“Tlc”或“脂质运载蛋白-1”是指具有SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P31025(同种型1)的成熟人泪脂质运载蛋白。可以使用SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P31025所示的氨基酸序列作为优选的“参照序列”，更优选使用SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列作为参照序列。
在另一个具体实施方案中，本文所公开的脂质运载蛋白突变蛋白是人脂质运载蛋白2的突变蛋白。本文所使用的术语“人脂质运载蛋白2”或“人Lcn 2”或“人NGAL”是指具有SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188的成熟人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)。本公开内容的人脂质运载蛋白2突变蛋白还可以在本文中被认定为“hNGAL突变蛋白”。可以使用SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188所示的氨基酸序列作为优选的“参照序列”，更优选使用SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列作为参照序列。
在一些实施方案中，以可检测的亲和力结合CD137的脂质运载蛋白突变蛋白可以包含天然半胱氨酸残基被另一个氨基酸例如丝氨酸残基的至少一个氨基酸取代。在一些其它实施方案中，以可检测的亲和力结合CD137的脂质运载蛋白突变蛋白可以包含取代野生型脂质运载蛋白的一个或多个氨基酸的一个或多个非天然半胱氨酸残基。在另一个具体实施方案中，根据本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白包含天然氨基酸被半胱氨酸残基的至少两个氨基酸取代，以由此形成一个或多个半胱氨酸桥。在一些实施方案中，所述半胱氨酸桥可以连接至少两个环区。本文根据Flower(Flower，1996，见上文；Flower等人，2000，见上文)和Breustedt等人(2005，见上文)使用这些区域的定义。在相关的实施方案中，本公开内容教导了一种或多种能够通过结合CD137而活化CD137的下游信号传导通路的脂质运载蛋白突变蛋白。
本公开内容的针对CD137或对CD137特异的蛋白质包括基于所定义的蛋白质骨架的任何数量的特异性结合蛋白突变蛋白。优选地，分别被交换、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个，例如25、30、35、40、45或50个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个，甚至更优选9、10或11个。然而，优选本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白仍然能够结合CD137。
一方面，本公开内容包括至少以可检测的亲和力结合CD137的各种脂质运载蛋白突变蛋白。在这个意义上，CD137可被认为是参照野生型脂质运载蛋白的非天然配体，其中“非天然配体”是指在生理条件下不与野生型脂质运载蛋白结合的化合物。通过在某些序列位置处以一个或多个突变工程化野生型脂质运载蛋白，本发明人已经证实对非天然配体CD137的高亲和力和高特异性是可能的。在一些实施方案中，在编码野生型脂质运载蛋白上的某些序列位置的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多个核苷酸三联体处，可以通过核苷酸三联体的子集在这些位置处的取代进行随机诱变。
此外，本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白可以在对应于参照脂质运载蛋白的线性多肽序列的某些序列位置的序列位置中的任一个或多个(包括至少任1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个)处具有突变的氨基酸残基。
本公开内容的蛋白质可以在突变的氨基酸序列位置之外包含“亲本”蛋白质骨架(例如脂质运载蛋白)的野生型(天然)氨基酸序列。在一些实施方案中，根据本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白还可在一个或多个序列位置处携带一个或多个氨基酸突变，只要这样的突变至少基本不妨碍或不干扰结合活性和所述突变蛋白的折叠即可。能够使用已建立的标准方法(Sambrook,J.等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rdEd.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)在DNA水平上非常容易地完成这样的突变。氨基酸序列的改变的说明性实例是插入或缺失以及氨基酸取代。这样的取代可以是保守的，即氨基酸残基被具有化学相似性质的氨基酸残基替代，所述化学相似性质特别是关于极性以及尺寸的。保守取代的实例是以下组的成员之间的替代：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；以及6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，也可以在氨基酸序列中引入非保守性改变。此外，除了替代单个氨基酸残基，还可以插入或缺失人泪脂质运载蛋白的一级结构的一个或多个连续氨基酸，只要这些缺失或插入获得稳定的折叠/功能性突变蛋白即可(例如，具有截短的N-和C末端的Tlc突变蛋白)。在这样的突变蛋白中，例如，在多肽的N或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基。通常，这样的突变蛋白可以与成熟人泪脂质运载蛋白的氨基酸序列具有至少约70％、包括至少约80％、例如至少约85％的氨基酸序列同一性。作为说明性实例，本公开内容还涵盖如上定义的Tlc突变蛋白，其中成熟人泪脂质运载蛋白的序列的前四个N末端氨基酸残基(His-His-Leu-Leu；位置1-4)和/或成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的最后两个C末端氨基酸残基(Ser-Asp；位置157-158))已经被缺失(SEQ ID NOs：32-38)。此外，作为另一个说明性实例，本公开内容还涵盖如上定义的NGAL突变蛋白，其中成熟人脂质运载蛋白2(hNGAL)的线性多肽序列的氨基酸残基(Lys-Asp-Pro，位置46-48)已被缺失(SEQ ID NO：42)。
当与其他脂质运载蛋白的序列同一性相比较时，本文所公开的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与参照脂质运载蛋白具有高序列同一性。在这种一般情况下，本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列至少基本上类似于所述参照脂质运载蛋白的氨基酸序列，条件为在比对中由于氨基酸的添加或缺失可能存在空位(如下所定义)。在一些实施例中，本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白的相应序列，基本上类似于所述参照脂质运载蛋白的序列，其与所述参照脂质运载蛋白的序列具有至少70％的同一性或序列同源性、至少75％的同一性或序列同源性、至少80％的同一性或序列同源性、至少82％的同一性或序列同源性、至少85％的同一性或序列同源性、至少87％的同一性或序列同源性或至少90％的同一性或序列同源性，包括至少95％的同一性或序列同源性，条件是所改变的位置或序列被保留，并且一个或多个空位是可能的。
如本文所使用，本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白“特异性结合”靶标(例如CD137)，如果它能够区分该靶标与一个或多个参照靶标的话，因为结合特异性不是绝对的，而是相对的性质。能够例如根据Western印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-测试、FACS、IHC和肽扫描来确定“特异性结合”。
在一个实施方案中，本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白在其N末端和/或其C末端被融合至融合配偶体，该融合配偶体为延长突变蛋白的血清半衰期的蛋白质结构域。在进一步的具体实施方案中，所述蛋白质结构域是免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白。
在另一个实施方案中，本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白缀合到延长所述突变蛋白的血清半衰期的化合物。更优选地，所述突变蛋白与选自以下的化合物缀合：聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白。
在另外一个实施方案中，本公开内容涉及包含编码本文所公开的脂质运载蛋白突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本公开内容涵盖含有所述核酸分子的宿主细胞。
一方面，本公开内容提供了结合CD137的人脂质运载蛋白突变蛋白及其有用应用。本公开内容还提供了制备本文所述CD137结合蛋白的方法以及包含这样的蛋白质的组合物。本公开内容的CD137结合蛋白及其组合物可以用于检测样品中CD137的方法或者在受试者中结合CD137的方法。先前并未描述这样具有与本公开内容提供的用途相关的这些特征的人脂质运载蛋白突变蛋白。
1、对CD137特异的示例性脂质运载蛋白突变蛋白
一方面，本公开内容提供了结合CD137的人泪脂质运载蛋白突变蛋白。
在这方面，本公开内容提供了一种或多种能够以通过约300nM或更低、甚至约100nM或更低的KD测量的亲和力结合CD137的Tlc突变蛋白。
在一些实施方案中，这样的Tlc突变蛋白在对应于成熟人泪脂质运载蛋白(SEQ IDNO：18)的线性多肽序列的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。
在一些具体实施方案中，这样的Tlc突变蛋白可以在对应于成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的位置26-34、55-58、60-61、65、104-106和108的一个或多个位置处含有突变的氨基酸残基。
在进一步的具体实施方案中，这样的Tlc突变蛋白还可以在对应于成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的位置101、111、114和153的一个或多个位置处包含突变的氨基酸残基。
在其他具体实施方案中，这种Tlc突变蛋白可以在对应于成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个位置处含有突变的氨基酸残基。
在一些进一步的实施方案中，这种Tlc突变蛋白可以在对应于成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列的序列位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个序列位置处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或甚至更多个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合CD137，特别是人CD137。
在一些更进一步的实施方案中，本公开内容涉及多肽，其中所述多肽为Tlc突变蛋白，与成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列相比较，其在序列位置526-34、55-58、60-61、65、104-106和108处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合CD137，特别是人CD137。
在一些实施方案中，根据本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白可以包含天然半胱氨酸残基被例如丝氨酸残基的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，根据本公开内容的Tlc突变蛋白包含在位置61和/或153处的天然半胱氨酸残基被另一个氨基酸例如丝氨酸残基的氨基酸取代。这方面注意到的是，已经发现去除野生型泪脂质运载蛋白的由半胱氨酸残基61和153形成的结构二硫键(在各自的初始核酸文库的水平上)(参见Breustedt等人，2005，见上文)可以提供这样的泪脂质运载蛋白突变蛋白：该泪脂质运载蛋白突变蛋白不仅稳定地折叠，而且能够以高亲和力结合给定非天然配体。在一些具体实施方案中，根据本公开内容的Tlc突变蛋白包含氨基酸取代Cys61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、Asn、Leu、Tyr、Met、Ser、Pro或Trp和Cys 153→Ser或Ala。已经证明这样的取代可用于防止连接Cys 61和Cys 153的天然存在的二硫键的形成，从而有助于处理突变蛋白。然而，结合CD137并且具有在Cys 61和Cys 153之间形成的二硫键的泪脂质运载蛋白突变蛋白也是本公开内容的一部分。
在一些实施方案中，消除结构性二硫键可提供进一步的优点，即允许非天然人造二硫键(自发)生成或有意引入到本公开内容的突变蛋白中，由此增加突变蛋白的稳定性。例如，在一些实施方案中，在位置61、101和153处的半胱氨酸密码子中的任两个或全部三个被另一个氨基酸的密码子替代。此外，在一些实施方案中，根据本公开内容的Tlc突变蛋白包含在位置101处的天然半胱氨酸残基被丝氨酸残基或组氨酸残基的氨基酸取代。
在一些实施方案中，根据本公开内容的突变蛋白包含在关于成熟人泪脂质运载蛋白的氨基酸序列的位置28或105处的天然氨基酸被半胱氨酸残基的氨基酸取代。
此外，在一些实施方案中，根据本公开内容的突变蛋白包含在位置111处的天然精氨酸残基被脯氨酸残基的氨基酸取代。此外，在一些实施方案中，根据本公开内容的突变蛋白包含在位置114处的天然赖氨酸残基被色氨酸残基或谷氨酸的氨基酸取代。
在一些实施方案中，根据本公开内容的结合CD137的Tlc突变蛋白在对应于成熟人泪脂质运载蛋白(SEQ ID NO：18)的线性多肽序列的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Ala 5→Val或Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Thr 42→Ser；Gly 46→Asp；Lys 52→Glu；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg或Asn；Thr 71→Ala；Val 85→Asp；Lys 94→Arg或Glu；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；Arg 148→Ser；Ser 150→Ile和Cys 153→Ser。在一些实施方案中，根据本公开内容的Tlc突变蛋白在成熟人泪脂质运载蛋白的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、甚至更多个诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或所有突变的氨基酸残基。
在另外一些实施方案中，与成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列相比较，结合CD137的Tlc突变蛋白包含以下氨基酸取代组之一：
1.Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Cys 153→Ser；
2.Ala 5→Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg；Val 85→Asp；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；Cys 153→Ser；157→Pro；
3.Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Asn；Lys 94→Arg；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；Cys 153→Ser；
4.Ala 5→Val；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg；Lys 94→Glu；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；Cys 153→Ser；157→Pro；
5.Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Thr 42→Ser；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Ile；Cys 153→Ser；157→Pro；
6.Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Lys 52→Glu；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Thr 71→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ala 133→Thr；Arg 148→Ser；Ser 150→Ile；Cys 153→Ser；157→Pro；或
7.Ala 5→Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Gly 46→Asp；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Thr 71→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Ile；Cys 153→Ser；157→Pro。
在剩余区域中，即不同于序列位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的区域，本公开内容的Tlc突变蛋白可以在突变的氨基酸序列位置之外包含野生型(天然)氨基酸序列。
在更进一步的实施方案中，根据本公开内容的Tlc突变蛋白与成熟人泪脂质运载蛋白(SEQ ID NO：18)的序列具有至少70％的序列同一性或至少70％的序列同源性。
在进一步的具体实施方案中，本公开内容的Tlc突变蛋白包含SEQ ID NOs：32-38中任一个所示的氨基酸序列或其片段或变体。
在进一步的具体实施方案中，本公开内容的Tlc突变蛋白与选自SEQ ID NOs：32-38的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％或更高的序列同一性。
本公开内容还包括具有选自SEQ ID NOs：32-38的氨基酸序列的Tlc突变蛋白的结构同系物，所述结构同系物关于所述Tlc突变蛋白具有超过约60％、优选超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过92％和最优选超过95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。
根据本公开内容的Tlc突变蛋白可以通过诱变人泪脂质运载蛋白的天然存在形式而获得。在诱变的一些实施方案中，取代(或替代)是保守取代。不过，可以设想任何取代(包括非保守取代或来自以下示例性取代中的一个或多个)，只要脂质运载蛋白突变蛋白保留其结合CD137的能力，和/或其与然后被取代的序列具有序列同一性，即所述序列同一性为与成熟人泪脂质运载蛋白(SWISS-PROT数据库登录号P31025)的氨基酸序列至少60％诸如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的序列同一性即可。
在一些具体实施方案中，本公开内容提供了以通过约200nM或更低的KD测量的亲和力结合CD137的Tlc突变蛋白。
在另外一些实施方案中，本公开内容的Tlc突变蛋白不干扰CD137L与CD137的结合。
另一方面，本公开内容涉及针对CD137或对CD137特异的新型特异性结合的人脂质运载蛋白2(人Lcn2或hNGAL)突变蛋白。
在这方面，本公开内容提供了一种或多种能够以通过200nM或更低、约140nM或更低、约50nM或更低和甚至约10nM或更低的KD测量的亲和力结合CD137的hNGAL突变蛋白。更优选地，所述hNGAL突变蛋白可以具有通过约5nM或更低的KD测量的亲和力。
在一些实施方案中，本公开内容的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL(SEQ IDNO：17)的线性多肽序列的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处包含取代。
在具体实施方案中，本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟hNGAL(SWISS-PROT数据库登录号P80188；SEQ ID NO：2)的线性多肽序列的序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的序列位置处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个取代。优选地，设想本公开内容涉及脂质运载蛋白突变蛋白，其(除了在对应于成熟人NGAL的线性多肽序列的位置36、87和/或96的位置处的一个或多个取代)在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列的位置28、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、94、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处包含取代。
在更进一步的实施方案中，本公开内容涉及多肽，其中所述多肽为hNGAL突变蛋白，与成熟hNGAL(SWISS-PROT数据库登录号P80188；SEQ ID NO：17)的线性多肽序列相比较，其在序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个突变的氨基酸残基，并且其中所述多肽结合CD137，特别是人CD137。
在一些实施方案中，本公开内容的结合CD137的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL(SEQID NO：17)的线性多肽序列的序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134中的任一个或多个处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg或Lys；Gln49→Val，Ile，His，Ser或Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Met，Ala或Gly；Leu 70→Ala，Lys，Ser或Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Met，Arg，Thr或Asn；Trp 79→Ala或Asp；Arg 81→Met，Trp或Ser；Phe 83→Leu；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu和Lys 134→Tyr。
在一些实施方案中，本公开内容的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL的这些序列位置处包含两个或更多个诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、甚至更多个诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个或全部突变的氨基酸残基。
在另外一些实施方案中，本公开内容的结合CD137的hNGAL突变蛋白与所述成熟hNGAL的线性多肽序列相比较，包含以下氨基酸替代：
(a)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；Lys 134→Tyr；
(b)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Met；Leu 70→Lys；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Met；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；Lys 134→Tyr；
(c)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Ala；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；Lys 134→Tyr；
(d)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Ala；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；Lys 134→Tyr；
(e)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Ser；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Ser；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Met；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；Lys 134→Tyr；
(f)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Val；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Arg；Trp 79→Asp；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；Lys 134→Tyr；
(g)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→His；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；Lys 134→Tyr；
(h)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Phe 83→Leu；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；Lys 134→Tyr；或
(i)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ser；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Asn；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；Lys 134→Tyr。
在剩余区域中，即不同于序列位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的区域，本公开内容的hNGAL突变蛋白可以在突变的氨基酸序列位置之外包含野生型(天然)氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述hNGAL突变蛋白与成熟人脂质运载蛋白2的氨基酸序列(SWISS-PROT数据库登录号P80188)具有至少70％或更高的序列同一性。
在进一步的具体实施方案中，根据本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白包含选自SEQ ID NOs：2和39-46的氨基酸序列或其片段或变体。
本公开内容的结合CD137的hNGAL突变蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NOs：2和39-46的序列可以具有高序列同一性，诸如至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％的同一性，包括至少95％的同一性。
本公开内容还包括具有选自SEQ ID NOs：2和39-46的氨基酸序列的hNGAL突变蛋白的结构同系物，所述结构同系物关于所述hNGAL突变蛋白具有超过约60％、优选超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过92％和最优选超过95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。
根据本公开内容的hNGAL突变蛋白可以通过诱变人脂质运载蛋白2的天然存在形式而获得。在诱变的一些实施方案中，取代(或替代)为保守取代。然而，可以设想任何取代(包括非保守取代或来自以下示例性取代中的一个或多个)，只要脂质运载蛋白突变蛋白保留其结合CD137的能力，和/或其与然后被取代的序列具有同一性，即所述同一性为与成熟人脂质运载蛋白2的氨基酸序列(SWISS-PROT数据库登录号P80188)为至少60％诸如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的同一性即可。
在一些具体实施方案中，本公开内容提供了以通过约5nM或更低的KD测量的亲和力结合CD137的hNGAL突变蛋白。
C.所述融合多肽的示例性用途、应用和生产
在一些实施方案中，本公开内容的融合多肽可以经由双重靶向CD137和HER2产生协同效应。例如，如在离体试验和小鼠模型中所证明的，NK细胞的CD137刺激通过增强NK细胞功能和活性而提高曲妥珠单抗的活性(Kohrt,H.等人，J Clin Invest.2012March；122(3):1066-75)。
因此，在医学中存在本公开内容的融合多肽的许多可能的应用。
一方面，本公开内容涉及本文所公开的融合多肽用于检测样品中CD137和HER2的用途以及相应的诊断方法。
另一方面，本公开内容以本文所公开的一种或多种融合多肽用于同时结合CD137和HER2/neu的用途为特征，或者以一种或多种包含这样的多肽的组合物用于同时结合CD137和HER2/neu的用途为特征。
本公开内容还涉及一种或多种所述融合多肽用于与CD137和HER2形成复合物的用途。
因此，在本公开内容的更进一步的方面，所公开的一种或多种融合多肽用于CD137和HER2的检测。这样的用途可以包括以下步骤：在合适的条件下使一种或多种所述融合多肽与怀疑含有CD137和HER2的样品接触的步骤，由此允许在融合多肽与CD137和HER2之间形成复合物；和通过合适的信号检测所述复合物。该可检测的信号可由如上所述的标记或者由于结合本身即复合物形成导致的物理性质的变化所引起。一个实例是表面等离子体共振，表面等离子体共振的值在结合配偶体(其中之一固定在例如金箔的表面上)的结合期间发生变化。
本文所公开的融合多肽还可用于CD137和HER2的分离。这样的用途可以包括以下步骤：在合适的条件下使一种或多种所述融合多肽与料想含有CD137和HER2的样品接触，由此允许在融合多肽与CD137和HER2之间形成复合物；和将该复合物从所述样品中分离。
另一方面，本公开内容以包括根据本公开内容的融合多肽的诊断或分析试剂盒为特征。
除了它们在诊断中使用之外，另一方面，本公开内容预期一种包含本公开内容的融合多肽和药学可接受的赋形剂的药物组合物。
此外，本公开内容提供同时结合CD137和HER2的用作抗癌剂和免疫调节剂的融合多肽。因此，设想本公开内容的融合多肽用于治疗或预防人疾病的方法中，所述疾病例如多种肿瘤，包括乳腺癌的某些侵袭类型。因此，还提供了在有此需要的受试者中治疗或预防人疾病(如各种肿瘤包括乳腺癌的某些侵袭类型)的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开内容的一种或多种融合多肽。
通过同时靶向其中表达HER2/neu的肿瘤细胞并且活化宿主先天免疫系统中与这样的肿瘤细胞相邻的天然杀伤(NK)细胞，本公开内容的融合多肽可以增加靶向的抗肿瘤T细胞的活性，增强抗肿瘤免疫力，同时对肿瘤生长具有直接的抑制作用，由此产生协同的抗肿瘤结果。此外，通过局部抑制致癌基因的活性，并且诱导通过NK细胞的细胞介导的细胞毒性，本公开内容的融合多肽可以减少效应淋巴细胞对健康细胞的副作用，即减少脱靶毒性。
在T细胞中CD137介导的信号传导引起TRAF家族成员的募集和几种激酶的活化，所述激酶包括ASK-1、MKK、MAPK3/MAPK4、p38和JNK/SAPK。激酶活化之后为几种转录因子的活化和核移位，所述转录因子包括ATF-2、Jun和NF-κB。除了增加次优T细胞受体(TCR)诱导的增殖，CD137介导的信号传导保护T细胞、特别是CD8+ T细胞免于活化诱导的细胞死亡(AICD)。
本公开内容涵盖本公开内容的融合多肽或包含这样的融合多肽的组合物用于当接合表达HER2/neu的肿瘤细胞时共刺激T细胞和/或活化CD137的下游信号传导通路的用途。
本公开内容还以当接合在该处表达HER2/neu的肿瘤细胞时共刺激T细胞和/或活化CD137的下游信号传导通路的方法为特征，所述方法包括应用本公开内容的一种或多种融合多肽或包含这样的融合多肽的一种或多种组合物。
此外，本公开内容涉及当接合在该处表达HER2/neu的肿瘤细胞时活化CD137的下游信号传导通路的方法，所述方法包括应用本公开内容的一种或多种融合多肽或包含这样的融合多肽的一种或多种组合物。
本公开内容还预期当接合在该处表达HER2/neu的肿瘤细胞时诱导T淋巴细胞增殖的方法，所述方法包括应用本公开内容的一种或多种融合多肽或包含这样的融合多肽的一种或多种组合物。
本公开内容涵盖本公开内容的融合多肽或包含这样的融合多肽的组合物用于将T细胞上的CD137聚集和活化导向至在该处表达HER2/neu的肿瘤细胞的用途。
本公开内容进一步提供了诱导在HER2/neu阳性肿瘤细胞附近的局部T细胞应答的方法，所述方法包括应用这样的融合多肽。“局部”是指经由CD137结合T细胞并且接合HER2/neu阳性肿瘤细胞时，T细胞在HER2/neu阳性细胞附近产生细胞因子，特别是IL-2和/或IFNγ。这种细胞因子反映了T细胞的活化，其然后能够直接地或通过吸引其它杀伤细胞如T细胞或NK细胞间接地杀死HER2/neu阳性肿瘤细胞。
在另一个实施方案中，本公开内容还涉及包含编码本文所公开的融合多肽的核苷酸序列的核酸分子(DNA和RNA)。在另外一个实施方案中，本公开内容涵盖含有所述核酸分子的宿主细胞。由于遗传密码的简并性允许某些密码子被指定同一氨基酸的其他密码子取代，本公开内容不限于编码如本文所述融合多肽的特定核酸分子，而是涵盖包含编码功能性多肽的核苷酸序列的所有核酸分子。在这方面，本公开内容还涉及编码本公开内容的融合多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码本申请中所公开的脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子(例如DNA)可以与编码本公开内容的免疫球蛋白的另一个核酸分子“可操作地连接”，以允许表达本文所公开的融合多肽。在这方面，可操作的连接是这样的连接：在所述连接中，一个核酸分子的序列元件和另一个核酸分子的序列元件以能够使融合多肽表达为单个多肽的方式连接。
本公开内容还涉及用于生产本公开内容的融合多肽的方法，通过基因工程方法从编码多肽或其中任何亚基的核酸开始生产本公开内容的融合多肽。在一些实施方案中，该方法可以在体内进行，所述多肽可以例如在细菌或真核宿主生物体中产生，然后从该宿主生物或其培养物中分离。也可以在体外产生本公开内容的融合多肽，例如通过使用体外翻译系统。
当在体内产生所述融合多肽时，通过重组DNA技术(如上所述)将编码这样的多肽的核酸引入到合适的细菌或真核宿主生物体中。为此目的，使用已建立的标准方法，首先用包含编码如本文所述融合多肽的核酸分子的克隆载体转化所述宿主细胞。然后在允许表达异源DNA并且因此合成相应的多肽的条件下培养宿主细胞。随后，从细胞或培养基中回收所述多肽。
在本公开内容的一个实施方案中，该方法包括使至少一个编码hNGAL的核酸分子在核苷酸三联体处经受诱变，该核苷酸三联体编码对应于hNGAL(SEQ ID NO：17)的线性多肽序列的序列位置28、40-52、60、68、65、70、71-81、87、89、96、98、100-106、114、118、120、125-137和145的序列位置中的至少一个、有时甚至更多个。
此外，在一些实施方案中，可以在本公开内容的hNGAL突变蛋白中去除在Cys 76和Cys 175之间的天然存在的二硫键。因此，这样的突变蛋白可在具有减少的氧化还原环境(redox milieu)的细胞区室中产生，例如在革兰氏阴性细菌的细胞质中。
本公开内容还包括编码本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子，其在实验性诱变的指定序列位置之外包含另外的突变。这样的突变通常是可容忍的或甚至被证明是有利的，例如，如果它们有助于提高脂质运载蛋白突变蛋白的折叠效率、血清稳定性、热稳定性或配体结合亲和力。
本申请中所公开的核酸分子可以“可操作地连接”至调节序列(或多个调节序列)以允许表达该核酸分子。
核酸分子，例如DNA，如果它包含含有关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件，并且这样的序列“可操作地连接”至编码所述多肽的核苷酸序列，则被称为“能够表达核酸分子”或能够“允许表达核苷酸序列”。可操作的连接是这样的连接：在所述连接中，调节序列元件和要表达的序列以能够进行基因表达的方式连接。基因表达所必需的调节区域的确切性质可能因物种而异，但是通常这些区域包括启动子，所述启动子在原核生物中含有启动子本身(即引导转录起始的DNA元件)以及当转录成RNA时将发出翻译起始信号的DNA元件。这样的启动子区域通常包括涉及转录和翻译起始的5'非编码序列，例如原核生物中的-35/-10盒和Shine-Dalgarno元件或真核生物中的TATA盒、CAAT序列和5'-封端元件。这些区域还可以包括增强子或阻遏子元件以及用于将天然多肽靶向到宿主细胞的特定区室的被翻译信号和前导序列。
此外，所述3'非编码序列可能含有涉及转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定宿主细胞中不是令人满意的功能性的，则它们可能被该细胞中功能性的信号取代。
因此，本公开内容的核酸分子可以包含调节序列例如启动子序列。在一些实施方案中，本公开内容的核酸分子包含启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子例如为tet启动子、lacUV5启动子或T7启动子。可用于在真核细胞中表达的启动子的实例是SV40启动子或CMV启动子。
本公开内容的核酸分子还可以是载体或任何其他种类的克隆载体的一部分，所述克隆载体例如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人造染色体。
在一个实施方案中，核酸分子包含在噬菌粒中。噬菌粒载体表示编码温和噬菌体(例如M13或f1)的基因间区域的载体，或其融合至感兴趣的cDNA的功能部分。细菌宿主细胞经这样的噬菌粒载体和适当的辅助噬菌体(例如M13K07、VCS-M13或R408)超感染后，产生完整噬菌体颗粒，由此使所编码的异源cDNA能够与其相应的展示在噬菌体表面上的多肽物理偶联(参见例如Lowman,H.B.(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26,401-424；或Rodi,D.J.和Makowski,L.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10,87-93)。
除了上述调节序列以及编码如本文所述的融合多肽的核酸序列之外，这样的克隆载体可以包含来源于与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列，以及在转化或转染的细胞上赋予可选表型的选择标记物。大量的合适的克隆载体是本领域已知的，并且是可商购的。
编码如本文所述的融合多肽的DNA分子(例如，SEQ ID NOs：20和31)，特别是含有这样的多肽的编码序列的克隆载体可转化到能够表达该基因的宿主细胞中。可使用标准技术进行转化。因此，本公开内容还涉及含有如本文所述的核酸分子的宿主细胞。
所述转化的宿主细胞在适用于表达编码本公开内容的融合多肽的核苷酸序列的条件下培养。合适的宿主细胞能够是原核的诸如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌，或真核的诸如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、SF9或High5昆虫细胞、永生化哺乳动物细胞系(例如HeLa细胞或CHO细胞)或原代哺乳动物细胞。
在一些实施方案(其中本公开内容的脂质运载蛋白突变蛋白(包括包含在本文所公开的融合多肽中的)包括分子内二硫键)中，可以优选使用适当的信号序列将新生多肽引导至具有氧化还原环境的细胞区室。这样的氧化环境可以由革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌的周质，在革兰氏阳性细菌的细胞外环境中，或在真核细胞的内质网的内腔中提供，通常有利于结构二硫键的形成。
在一些实施方案中，还可以在宿主细胞优选大肠杆菌的胞质溶胶中产生本公开内容的融合多肽。在这种情况下，所述多肽能够以可溶性的和折叠的状态直接获得，或者以包涵体的形式被回收，然后在体外复性。另一个选择是使用特定宿主菌株，所述菌株具有氧化细胞内环境，这因此可允许在胞质溶胶中形成二硫键(Venturi等人(2002)J.Mol.Biol.315,1-8)。
在一些实施方案中，如本文所述的本公开内容的融合多肽可能不一定是通过使用遗传工程生成或产生的。而是，这样的多肽还能通过化学合成诸如Merrifield固相多肽合成或通过体外转录和翻译获得。例如有可能的是，使用分子建模鉴定出有前途的突变，然后在体外合成所需(设计的)突变蛋白或多肽，并且研究对感兴趣的靶标的结合活性。用于蛋白质的固相和/或溶液相合成的方法是本领域熟知的(参见例如Bruckdorfer,T.等人(2004)Curr.Pharm.Biotechnol.5,29-43)。
在另一个实施方案中，本公开内容的融合多肽可以通过使用本领域技术人员已知的已充分建立的方法的体外转录/翻译产生。
本领域技术人员将领会可用于制备本公开内容所预期的、但其蛋白质或核酸序列未在本文中明确公开的融合多肽的方法。作为概述，氨基酸序列的这种修饰包括例如单个氨基酸位置的定向诱变，以便通过引入某些限制酶的切割位点来简化多肽基因或其部分的亚克隆。此外，还能够引入这些突变以进一步提高融合多肽对其靶标(例如CD137和HER2)的亲和力。此外，能够引入突变以调节所述多肽的某些特征，例如如果需要，以改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白质抗性或水溶性或降低聚集倾向。例如，天然存在的半胱氨酸残基可以突变成其它氨基酸以防止二硫键的形成。
对于本领域技术人员来说，在审查以下实施例及其附图后，本公开内容的另外的目标、优点和特征将变得显而易见，而这些实施例和附图并不旨在是限制性的。因此应该理解的是，尽管通过示例性实施方案和可选特征具体公开了本公开内容，本领域技术人员可以对本文公开的在其中实施的公开内容进行修改和改变，并且这样的修改和改变被认为是在本公开内容的范围内。
实施例
实施例1：融合多肽的表达和分析
为同时接合HER2和CD137，我们生成了几种代表性的抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽，将具有由SEQ ID NOs：3和4提供的重链和轻链的抗体经非结构化的(G4S)3连接子(SEQ ID NO：19)和SEQ ID NO：2的脂质运载蛋白突变蛋白融合在一起。所设计的不同形式如图1所示。通过SEQ ID NO：2的脂质运载蛋白突变蛋白融合至具有工程化IgG4主链的抗体的突变变体的四个末端中的任一个生成这样的融合多肽(SEQ ID NOs：9和10。SEQ IDNOs：11和12，SEQ ID NOs：13和14，SEQ ID NOs：15和16)，所述IgG4主链包含S228P突变以在体外和体内最小化IgG4半抗体交换(参见Silva 2015)以及包含F234A和L235A突变以降低Fc-γ受体相互作用(Alegre 1992)。此外，我们生成了SEQ ID NOs：7和8的融合多肽，其与SEQ ID NOs：9和10的融合多肽相比较，在抗体重链中具有另外的N297A突变(参见Bolt1993)以便去除天然糖基化基序。这种去除可能能够进一步降低与Fc-γ受体的相互作用。另外，我们生成了SEQ ID NOs：5和6的融合多肽，其为SEQ ID NO：2的脂质运载蛋白突变蛋白与具有IgG1背景的SEQ ID NOs：3和4的抗体的C-末端重链的直接融合物，因此所述融合多肽保持了所述IgG1抗体的原始Fc-γ相互作用。
构建体通过基因合成而产生并被克隆到哺乳动物表达载体中。然后将它们在CHO细胞中瞬时表达。细胞培养基中融合多肽的浓度使用ForteBio蛋白A传感器(Pall Corp.)进行测量，并使用人IgG1标准品进行定量。所述构建体的滴度如下表1所述。
表1-表达滴度
Figure BDA0003361078120000341
使用蛋白A色谱法，然后在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行尺寸排阻层析(SEC)，纯化所述融合多肽。在SEC纯化后，汇集含有单体蛋白的级分，并再次使用分析型SEC进行分析。根据这一分析，所述融合多肽完全是单体的，没有可检测的多聚物种类或聚集体。
实施例2：融合多肽对HER2的特异性
我们采用ELISA试验来测定融合蛋白与重组HER2(Sino Biological)的亲和力。将靶标溶于PBS(5μg/mL)中，并在4℃下在微量滴定板上涂覆过夜。在每个孵育步骤后，用补充有0.05％(v/v)吐温20的80μL的PBS(PBS-T)洗涤板5次。将板用在PBS中2％BSA(w/v)在室温下封闭1小时，随后洗涤。将不同浓度的基准抗体(SEQ ID NOs：3和4，曲妥珠单抗或
Figure BDA0003361078120000352
，Roche Diagnostics)或融合多肽加入到孔中并在室温下孵育1小时，随后进行洗涤步骤。用在PBS-T中1:5000稀释的抗人IgG Fc-HRP(#109-035-098，JacksonLaboratory)孵育后检测所研究的结合试剂。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。
图2中绘制了实验结果以及由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在下表2中提供，包括数据的S形拟合的误差。对于所有测试的融合多肽所观察到的EC50值都处于相似的范围内(0.22-0.31nM)，并且与基准抗体(SEQ ID NOs：3和4)的EC50值(其为0.16nM)处于相同范围内。
表2-HER2结合的ELISA数据
Figure BDA0003361078120000351
实施例3：融合多肽对CD137的特异性
我们采用ELISA试验来测定融合多肽和SEQ ID NO：2的阳性对照脂质运载蛋白突变蛋白对重组CD137-Fc融合物(#838-4B-100，R&D Systems)的亲和力。将靶标溶于PBS(5μg/mL)中，并在4℃下在微量滴定板上涂覆过夜。在每个孵育步骤后，用80μL的PBS-T洗涤板5次。将板用在PBS中2％BSA(w/v)在室温下封闭1小时，随后洗涤。将不同浓度的单体形式的CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO：2)或融合多肽加入到孔中并在室温下孵育1小时，随后进行洗涤步骤。在室温下用在PBS-T中1:1000稀释的与HRP缀合的抗hNGAL抗体孵育1小时后检测所研究的结合试剂。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。
图3中绘制了实验结果以及由1:1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在下表3中提供，包括数据的S形拟合的误差。对于所有测试的融合多肽所观察到的EC50值在实验误差内几乎相同，范围为0.30nM至0.47nM，稍优于SEQ ID NO：2的阳性对照脂质运载蛋白突变蛋白所获得的值，其为0.49nM。
表3-用于CD137结合的ELISA数据
Figure BDA0003361078120000361
实施例4：在基于ELISA的设置中同时靶标结合的证明
为了证明所述融合多肽与HER2和CD137的同时结合，使用双重结合ELISA形式。在PBS中的重组HER2(Sino Biological)(5μg/mL)在微量滴定板上在4℃下涂覆过夜。在每个孵育步骤后，使用Biotek ELx405选择CW洗涤器，用补充有0.05％(v/v)Tween 20的80μL的PBS(PBS-T)洗涤板5次。将板用在PBS中2％BSA(w/v)在室温下封闭1小时，然后再次洗涤。将不同浓度的融合多肽加入到孔中并在室温下孵育1小时，随后进行洗涤步骤。随后，将生物素化的人CD137-Fc以在PBS-T中1μg/mL的恒定浓度加入1小时。洗涤后，向孔中加入Extravidin-HRP(Sigma-Aldrich，PBS-T中1:5000)1小时。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。
图4中绘制了相应的实验数据。所有测试的融合多肽显示出具有1-4nM范围的EC50值的清晰结合信号，表明这些融合多肽能够同时接合HER2和CD137。
实施例5：使用涂覆的融合多肽进行功能性T细胞活化试验
我们使用T细胞活化试验来评估SEQ ID NOs：15和16的融合多肽共同刺激T细胞应答的能力。为此目的，将不同浓度的SEQ ID NOs：15和16的融合多肽与抗人CD3抗体(OKT3，eBioscience)一起涂覆在塑料盘上，然后将纯化的T细胞在涂覆的表面上孵育。作为读出结果，我们使用4小时BrdU脉冲评估了孵育三天后T细胞的持续增殖，并测量上清液白细胞介素2(IL-2)水平。在下文中，我们提供了实验的详细描述。
通过聚蔗糖(Polysucrose)密度梯度(Biocoll 1.077g/mL，来自Biochrom)离心从血沉棕黄层中分离出来自健康志愿者供体的人外周血单核细胞(PBMC)，遵循Biochrom的方案。使用Pan T细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH)和制造商的方案从所得PBMC分离出T淋巴细胞。将纯化的T细胞在由90％FCS和10％DMSO组成的缓冲液中重新悬浮，立即用液氮冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。对于该试验，将T细胞解冻16小时，并在补充有10％FCS和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)的培养基(RPMI 1640，LifeTechnologies)中培养。
对于每个实验条件使用一式三份样品进行以下程序。将平底组织培养板在4℃下使用200μL的0.5μg/mL的抗CD3抗体和浓度为3μg/mL、10μg/mL和30μg/mL的SEQ ID NOs：15和16的融合多肽的混合物涂覆过夜。作为阴性对照，单独捕获抗CD3抗体，即不添加SEQ IDNOs：15和16的融合多肽。第二天，用PBS洗涤孔两次，并向每个孔中加入在培养基中的100μL的T细胞悬液(相当于5×104个T细胞)。板用透气密封件(4titude)覆盖，并在37℃下、加湿的5％CO2气氛中孵育3天。随后，评估上清液中的IL-2浓度以及细胞增殖。
为了定量T细胞增殖，根据制造商的说明书使用基于BrdU掺入的化学发光细胞增殖ELISA试剂盒(Roche)。简言之，在第3天，向每个孔中加入10μL的BrdU标记溶液，在加湿的5％CO2气氛、37℃下使得再进行增殖4小时。将板以300g离心10分钟，并将所述一式三份样品的上清液合并，并立即在-20℃下储存以进行之后的IL-2定量。随后将板在60℃下干燥1小时。向每个孔中加入200μL的“FixDenat”溶液，并将板在室温下孵育30分钟。通过在室温下孵育2小时，将掺入的BRDU用过氧化物酶标记的抗BrdU抗体标记。通过在PheraStar FS读数器中定量化学发光过氧化物酶催化的反应来评估BrdU水平。
使用来自R&D Systems的IL-2DuoSet DuoSet试剂盒对细胞培养上清液中的人IL-2水平进行定量。以下进行和描述该过程。在第一步中，用在PBS中稀释的1μg/mL的“人IL-2捕获抗体”(R&D System)在室温下涂覆384孔板2小时。随后，使用Biotek EL405选择CW洗涤器(Biotek)，用80μL的PBS-T(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤孔5次。在另外含有1％酪蛋白(w/w)的PBS-T中封闭1小时后，将合并的上清液和在培养基中稀释的系列浓度的IL-2标准品在384孔板中、4℃下孵育过夜。为了允许检测和定量所捕获的IL-2，将100ng/mL的生物素化的山羊抗hIL-2-Bio检测抗体(R&D System)和1μg/mL的Sulfotag标记的链霉亲和素(Mesoscale Discovery)的混合物加入含有0.5％的酪蛋白的PBS-T中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，向每个孔中加入25μL读数缓冲液，并使用Mesoscale Discovery读数器读取每个孔的电化学发光(ECL)信号。使用Mesoscale Discovery软件进行分析和定量。
用于评估T细胞增殖的结果如图5所示。与不含SEQ ID NOs：15和16的融合多肽并且其中单独捕获抗CD3抗体的阴性对照相比，在涂覆有10μg/mL和30μg/mL的SEQ ID NOs：15和16的融合多肽的孔中孵育3天后，存在持续增殖的显著增加。
IL-2测量的结果显示SEQ ID NOs：15和16的融合多肽能够导致成功的T细胞活化(数据未显示)。
实施例6：使用肿瘤细胞结合的融合多肽进行功能性T细胞活化试验
我们采用靶细胞依赖性T细胞活化试验来评估SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14以及SEQ ID NOs：15和16的融合多肽(能够同时结合CD137和HER2)当固定在HER2阳性细胞系上时共同刺激T细胞应答的能力。作为阴性对照，我们使用SEQ ID NOs：3和4的单特异性HER2结合抗体。作为另外的对照，实验是在过量的SEQ IDNOs：3和4的单特异性HER2结合抗体的存在下进行的，以便取代双特异性构建体SEQ IDNOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14以及SEQ ID NOs：15和16与HER2阳性细胞的结合。在实验中，将抗人CD3抗体(OKT3，eBioscience)涂覆在塑料培养皿上，随后将HER2阳性SKBR3细胞在培养皿中培养过夜。第二天，在各种浓度的SEQ ID NOs：9和10、SEQID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14以及SEQ ID NOs：15和16的融合多肽或SEQ ID NOs：3和4的对照抗体的存在下，将纯化的T细胞在涂覆的表面上孵育。作为读出结果，我们测量了上清液白细胞介素2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)水平。在下文中详细描述该实验。
通过聚蔗糖密度梯度(Biocoll 1.077g/mL，来自Biochrom)离心从血沉棕黄层中分离出来自健康志愿者供体的人外周血单核细胞(PBMC)，遵循Biochrom的方案。使用Pan T细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH)和制造商的方案从所得PBMC分离出T淋巴细胞。将纯化的T细胞在由90％FCS和10％DMSO组成的缓冲液中重新悬浮，立即用液氮冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。对于该试验，将T细胞解冻16小时，并在补充有10％FCS和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)的培养基(RPMI 1640，Life Technologies)中培养。
对于每个实验条件使用一式三份样品进行以下程序。在37℃下，使用200μL的0.25μg/mL抗CD3抗体预先涂覆平底组织培养板1小时或不涂覆。随后用PBS洗涤板两次。每孔涂板接种5×104个SKBR3肿瘤细胞，并在37℃下、加湿的5％CO2气氛中，使其粘附过夜。之前已经在标准条件下使SKBR3细胞在培养物中生长，使用Accutase分离，并重新悬浮于培养基中。
在接下来的几天中，在37℃下用浓度为30μg/ml的丝裂霉素C(Sigma Aldrich)处理肿瘤细胞2小时以便阻断其增殖。用PBS洗涤板两次，并向每个孔中加入100μL的T细胞悬浮液(相当于5×104个T细胞)和在范围为25μg/mL至0.4ng/mL的十一个不同浓度下的4种融合多肽中的每一种或者浓度为25μg/mL、0.1μg/mL和0.4ng/mL的阴性对照。平行进行相同的设置，但是加入终浓度为50μg/mL的单特异性HER2结合抗体SEQ ID NOs：3和4。板用透气密封件(4titude)覆盖，并在37℃下、加湿的5％CO2气氛中孵育3天。随后，如下所述评估上清液中的IL-2和IFN-γ浓度。
分别使用来自R&D Systems的IL-2DuoSet试剂盒和IFN-γ DuoSet试剂盒对细胞培养上清液中的人IL-2水平进行定量。对两种细胞因子类似地进行该程序，在下文中仅对IL-2进行描述。在第一步中，用在PBS中稀释的1μg/mL的“人IL-2捕获抗体”(R&D System)在室温下涂覆384孔板2小时。随后，使用Biotek EL405选择CW洗涤器(Biotek)，用80μl的PBS-T(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤孔5次。在另外含有1％酪蛋白(w/w)的PBS-T中封闭1小时后，将合并的上清液和在培养基中稀释的系列浓度的IL-2标准品在384孔板中、4℃下孵育过夜。为了允许检测和定量所捕获的IL-2，将100ng/mL的生物素化的山羊抗hIL-2-Bio检测抗体(R&D System)和1μg/mL的Sulfotag标记的链霉亲和素(Mesoscale Discovery)的混合物加入含有0.5％的酪蛋白的PBS-T中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，向每个孔中加入25μL读数缓冲液，并使用Mesoscale Discovery读数器读取每个孔的电化学发光(ECL)信号。使用Mesoscale Discovery软件进行分析和定量。数据用1:1结合模型拟合，其中EC50值、背景水平和坪水平作为自由参数，斜率固定为1。诱导因子从拟合的值计算为坪水平和背景水平的商数。
图6中描述了双特异性融合多肽SEQ ID NOs：9和10的代表性实验的结果。数据显示，随着双特异性融合多肽的浓度升高，IL-2(图6A)和IFN-γ(图6C)的上清液水平明显增加。在低浓度的双特异性融合多肽下，在上清液中测量的IL-2和IFN-γ浓度相当于对于阴性对照SEQ ID NOs：3和4所测量的背景水平。在过量HER2-结合剂SEQ ID NOs：3和4的存在下，IL-2(图6B)和IFN-γ(图6D)的浓度不再显示SEQ ID NOs：9和10的浓度依赖性增加，而是在背景水平下保持不变。
虽然实验中对于SEQ ID NOs：11和12(图7)和SEQ ID NOs：15和16(图9)而言达到的坪水平较低，但关于IL-2和IFN-γ的浓度依赖性诱导和通过过量的SEQ ID NOs：3和4的阻断的总体结果是相似的。相比之下，随着多肽融合物SEQ ID NOs：13和14(图8)浓度的增加，IL-2或IFN-γ浓度无明显增加。
表4中提供了由数据的S形拟合产生的EC50值和诱导因子，包括使用不同PBMC供体进行实验的独立重复的数据。数据表明，对于SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12以及SEQ ID NOs：15和16，EC50值是可比较的。然而，诱导因子按照SEQ ID NOs：9和10>SEQ IDNOs：11和12>SEQ ID NOs：15和16的顺序降低。
实验清楚地显示了SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12以及SEQ ID NOs：15和16的有效功能活性，而SEQ ID NOs：13和14没有活性。鉴于实施例4和5中证实的所有构建体的亲和力几乎相同，这突出了构建体几何的重要作用。
表4
Figure BDA0003361078120000411
实施例7：对Fc-γ受体hFcγRI/CD64和hFcγRIIIA/CD16a的亲和力
为了测量具有工程化的基于IgG4的主链的多肽融合物(SEQ ID NOs：9和10，SEQID NOs：11和12，SEQ ID NOs：13和14，以及SEQ ID NOs：15和16)与Fc-γ受体hFcγRI/CD64(R&D Systems)和hFcγRIIIA/CD16a(R&D Systems)的结合亲和力，采用基于表面等离子体共振(SPR)的试验。SEQ ID NOs：3和4用作具有IgG1主链的单特异性抗体的对照。SEQ IDNOs：5和6用作基于IgG1的多肽融合物的对照。在SPR亲和力试验中，多肽融合物是生物素化的并使用Biotin CAPture试剂盒(GE Healthcare)捕获在传感器芯片CAP上。用ssDNA寡核苷酸预固定传感器芯片CAP。以2μL/min的流速施加未稀释的Biotin CAPture试剂(与互补的ss-DNA寡核苷酸缀合的链霉抗生物素蛋白)300秒。随后，以5μL/min的流速施加10μg/mL的生物素化的多肽融合物300秒。SEQ ID NOs：3和4以及多肽融合物通过使用
Figure BDA0003361078120000412
NHS-PEG4-Biotin(Thermo Scientific)在室温下孵育2小时而生物素化。通过将反应混合物装载到ZebaTM旋转脱盐板(Thermo Scientific)上除去过量的未反应的生物素试剂。参照通道仅装载Biotin CAPture试剂。
为测定亲和力，在运行缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.05％v/v表面活性剂P20，3mM EDTA，pH 7.4(GE Healthcare))中准备hFcγRI/CD64的三个稀释液(在40、8和1.6或100、25和6nM)，或hFcγRIIIA/CD16a的四至五个稀释液(在200、40、8和1.6nM或1000、333、111、37和12nM)，并应用到芯片表面。应用30μL/min的流速，样品接触时间为180秒，hFcγRI/CD64的解离时间为1800/2700秒，hFcγRIIIA/CD16a的解离时间为300秒。所有的测量在25℃下进行。通过注射含有0.25M NaOH的6M Gua-HCl，然后用运行缓冲液进行额外洗涤并且进行120秒的稳定期来实现传感器芯片CAP表面的再生。在蛋白质测量之前，进行三个再生循环来用于调节目的。使用Biacore T200评估软件(V 2.0)进行数据评估。使用双重参照。对于hFcγRI/CD64，使用1:1结合模型拟合原始数据。对于hFcγRIIIA/CD16a，采用稳态亲和力模型拟合原始数据。
表5显示hFcγRI/CD64的数据的拟合结果。基于IgG1的测试品SEQ ID NOs：3和4以及SEQ ID NOs：5和6均为0.3nM，表明hFcγRI/CD64与Anticalin蛋白的结合不受SEQ IDNOs：3和4的融合物的影响。所述多肽融合物SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12、SEQID NOs：13和14以及SEQ ID NOs：15和16未显示与hFcγRI/CD64的可检测的结合。这些数据表明，通过将同种型从IgG1转换为工程化的IgG4，与hFcγRI/CD64的结合可降低到检测限以下。
表5：
克隆名称 KD[nM]
SEQ ID NOs：3和4 0,3
SEQ ID NOs：5和6 0,3
SEQ ID NOs：9和10 不可确定
SEQ ID NOs：11和12 不可确定
SEQ ID NOs：13和14 不可确定
SEQ ID NOs：15和16 不可确定
表6显示hFcγRIIIA/CD16a的数据的拟合结果。所得到的基于IgG1的测试制品SEQID NOs：3和4以及SEQ ID NOs：5和6与hFcγRIIIA/CD16a的结合亲和力彼此相当，约为350nM，而多肽融合物SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14以及SEQID NOs：15和16未显示与hFcγRIIIA/CD16a的可检测的结合。这些数据表明，通过将同种型从IgG1转换为工程化的IgG4，与hFcγRIIIA/CD16a的结合可降低到检测限以下。
表6：
名称 KD[nM]
SEQ ID NOs：3和4 335±64
SEQ ID NOs：5和6 369±76
SEQ ID NOs：9和10 不可确定
SEQ ID NOs：11和12 不可确定
SEQ ID NOs：13和14 不可确定
SEQ ID NOs：15和16 不可确定
实施例8：对新生儿Fc受体的亲和力
为了测量具有工程化的基于IgG4的主链的多肽融合物(SEQ ID NOs：9和10、SEQID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14以及SEQ ID NOs：15和16)与新生儿Fc受体(FcRn，SinoBiologicals，#CT009-H08H)的结合亲和力，采用基于表面等离子体共振(SPR)的试验。SEQID NOs：3和4用作具有IgG1主链的单特异性抗体的对照。SEQ ID NOs：5和6用作基于IgG1的多肽融合物的对照。在SPR亲和力试验中，根据制造商的说明书，将FcRn共价固定在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上。简言之，在用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化葡聚糖基质的羧基后，使FcRn蛋白的伯胺与表面上的NHS酯反应，直到达到～200RU的信号。最后，通过使1M乙醇胺溶液通过表面来阻断未反应的NHS-酯。整个固定程序中的流速为10μl/min。
为了测定它们的亲和力，在运行缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.05％v/v表面活性剂P20，3mM EDTA，pH 6.0)中制备所有构建体的六个稀释液(1000nM、333nM、111nM、37nM、12nM和4nM)并应用到芯片表面。应用30μL/min的流速，样品接触时间为180秒，解离时间为30秒。所有的测量在25℃下进行。通过注射10mM甘氨酸pH 3.0来实现传感器芯片CAP表面的再生。在蛋白质测量之前，进行三个再生循环用于调节目的。使用双重参照的BiacoreT200评估软件(V 2.0)进行数据评估。采用稳态亲和力模型拟合原始数据。
所得到的所有多肽融合物对FcRn的结合亲和力在1-2μM的范围内，表明将同种型从IgG1转换为IgG4对FcRn结合没有可检测的影响。
表7：
名称 KD[μM]
SEQ ID Nos：3和4 2.0±0.2
SEQ ID Nos：5和6 1.1±0.03
SEQ ID Nos：11和12 1.3±0.07
SEQ ID Nos：13和14 1.8±0.04
SEQ ID Nos：9和10 1.7±0.05
SEQ ID Nos：13和14 1.8±0.01
实施例9：使用具有高和低HER2水平的肿瘤细胞进行功能性T细胞活化试验
我们使用靶细胞依赖性T细胞活化试验来评估SEQ ID NOs：9和10的融合多肽共刺激T细胞应答的能力，作为靶细胞的HER2表达水平的函数。为此目的，我们采用HER2高表达的SKBR3和BT474细胞以及以类似于健康的表达HER2的细胞(HepG2和MCF7)的水平表达HER2的细胞。为了比较，我们研究了SEQ ID NOs：47和48以及SEQ ID NOs：49和50的参照抗CD137单克隆抗体的行为。作为阴性对照，我们使用SEQ ID NOs：3和4的单特异性HER2结合抗体。作为另外的阴性对照，在不添加测试物品的情况下进行实验(“溶媒对照”)。在实验中，将抗人CD3抗体(OKT3，eBioscience)涂覆在塑料培养皿上，随后将SKBR3、BT474、HepG2或MCF7细胞在培养皿上分别培养过夜。第二天，在各种浓度的SEQ ID NOs：9和10的融合多肽、参照抗体SEQ ID NOs：47和48以及SEQ ID NOs：49和50、SEQ ID NOs：3和4的对照抗体的存在下，或在没有添加测试物品的情况下，将纯化的T细胞在经涂覆的表面上孵育。作为读出结果，我们测量了上清液白细胞介素2(IL-2)水平。在下文中详细描述该实验。
通过聚蔗糖密度梯度(Biocoll 1.077g/mL，来自Biochrom)离心从血沉棕黄层分离出来自健康志愿者供体的人外周血单核细胞(PBMC)，遵循Biochrom的方案。使用Pan T细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH)和制造商的方案从所得PBMC分离T淋巴细胞。将纯化的T细胞在由90％FCS和10％DMSO组成的缓冲液中重新悬浮，立即用液氮冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。对于该试验，将T细胞解冻16小时，并在补充有10％FCS和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)的培养基(RPMI 1640，Life Technologies)中培养。
对于每个实验条件使用一式三份样品进行以下程序。在37℃下，使用200μL的0.25μg/mL抗CD3抗体预先涂覆平底组织培养板1小时或不涂覆。随后用PBS洗涤板两次。每孔接种5×104个靶肿瘤细胞，并在37℃下、加湿的5％CO2气氛中，使其粘附过夜。之前已经在标准条件下使所述靶细胞在培养物中生长，使用Accutase分离，并重新悬浮于培养基中。
在接下来的几天中，在37℃下用浓度为30μg/ml浓度的丝裂霉素C(SigmaAldrich)处理肿瘤细胞2小时以便阻断其增殖。用PBS洗涤板两次，向每个孔中加入100μL的T细胞悬液(相当于5×104个T细胞)和在范围为0.05nM至5nM(BT474除外，其浓度范围为0.1pM至50nM)的浓度的SEQ ID NOs：9和10、参照抗体SEQ ID NOs：47和48以及SEQ ID NOs：49和50或阴性对照SEQ ID NOs：3和4或溶媒。板用透气密封件(4titude)覆盖，并在37℃下、加湿的5％CO2气氛中孵育3天。随后，如下所述评估上清液中的IL-2浓度。
使用来自R&D Systems的IL-2DuoSet试剂盒对细胞培养上清液中的人IL-2水平进行定量。在第一步中，用在PBS中稀释的1μg/mL的“人IL-2捕获抗体”(R&D System)在室温下涂覆384孔板2小时。随后，使用Biotek EL405选择CW洗涤器(Biotek)，用80μl的PBS-T(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤孔5次。在另外含有1％酪蛋白(w/w)的PBS-T中封闭1小时后，将合并的上清液和在培养基中稀释的系列浓度的IL-2标准品在384孔板中、4℃下孵育过夜。为了允许检测和定量所捕获的IL-2，将100ng/mL的生物素化的山羊抗hIL-2-Bio检测抗体(R&D System)和1μg/mL的Sulfotag标记的链霉亲和素(Mesoscale Discovery)的混合物加入含有0.5％的酪蛋白的PBS-T中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，向每个孔中加入25μL读数缓冲液，并使用Mesoscale Discovery读数器读取每个孔的电化学发光(ECL)信号。使用Mesoscale Discovery软件进行分析和定量。
图11中绘制了代表性实验的结果。在该图中，在没有测试品的情况下相对于背景IL-2产生绘制数值，因此该数值代表与背景相比较的倍数变化。虽然SEQ ID NOs：3和4(图11A)的阴性对照不在四种细胞系中任一种的情况下导致T细胞上的IL-2诱导，双特异性融合多肽SEQ ID NOs：9和10(图11A)的上升浓度在高HER2表达的SKBR3和BT474细胞的存在下诱导T细胞产生IL-2。然而，对于HepG2和MCF7细胞，没有明显的由于SEQ ID NOs：9和10导致的IL-2增加。这种行为显著不同于第一抗CD137抗体SEQ ID NOs：47和48(其在所有四种细胞系的存在下在T细胞上诱导IL-2(图11B))和第二抗CD137抗体SEQ ID NOs：49和50(其在所述四种细胞系中任一种上均不诱导IL-2(图11C))两者。
实验证明由SEQ ID NOs：9和10定义的融合蛋白以依赖于靶细胞的HER2密度的方式活化T细胞。虽然高HER2表达的SKBR3和BT474细胞如通过IL-2产生测量的显示了清楚的T细胞活化，但是这种效应不会在HepG2和MCF7细胞的情况下发生，所述HepG2和MCF7细胞以相当低的水平表达HER2。这种效应归因于HER2密度而不是归因于所研究的细胞(其使得CD137信号传导无效)带来的共刺激的潜在抑制或缺乏，前述情况通过以下事实变得显而易见：抗CD137抗体SEQ ID NOs：47和48能够在所有四种细胞类型的情况下通过CD137信号传导来活化T细胞。
实施例10：缓冲液中的融合多肽在中性pH和升高的温度下的4周稳定性研究
为了研究由SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14以及SEQID NOs：15和16定义的融合多肽的稳定性，我们采用了实验，其中样品在40℃下、在PBS，pH7.4中以约20mg/mL(范围21-23mg/mL)的浓度孵育4周。为了比较，我们研究了在相同条件下由SEQ ID NOs：3和4定义的多肽的行为。使用离心过滤器(Ultracel-3K，Amicon)将样品从约5mg/mL的浓度浓缩至约20mg/mL，并将该浓缩样品的一部分在-20℃下储存作为参照物质。然后将0.5mL管中的0.1mL浓缩样品(PCR-PT，Sarstedt)在40℃下储存于培养箱(Memmert)中4周。为了研究样品的完整性和单体含量，然后在Agilent 1200系列GPC2系统上使用Superdex200增加色谱柱以0.150mL/min的流速进行分析型尺寸排阻色谱(SEC)。将20μg的样品应用到柱上。通过在280nm波长处的吸收检测在连续气流中的相对蛋白质浓度。
图12提供了如所指出的所有的融合多肽和对照SEQ ID NOs：3和4的SEC分析的结果。每个融合多肽的各自的底部和顶部SEC痕迹分别对应于参照材料，该材料在40℃下孵育4周。比较参照材料和孵育材料，显示了对于双特异性融合多肽或对照SEQ ID NOs：3和4，SEC痕迹不会显著变化，证明了融合多肽抗聚集的稳定性。
实施例11：小鼠中融合多肽的药代动力学
在小鼠中进行由SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14、SEQ ID NOs：15和16以及用于参照的SEQ ID NOs：3和4定义的融合多肽的药代动力学分析，。约5周龄的雄性CD-1小鼠(每个时间点3只小鼠；Charles River Laboratories,Research Models and Services,Germany GmbH)以10mg/kg的剂量在尾部静脉注射融合多肽。测试品以5mL/kg的体积作为大剂量(bolus)施用。在时间点5分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、4天、8天、14天和20天获得来自小鼠的血浆样品。收集足够的全血(在异氟烷麻醉下采集)以获得至少100μL的Li-Heparin血浆/动物和时间。使用通过靶标HER2和CD137检测完整的双特异性构建体的夹心ELISA检测了药物水平。使用采用靶标HER2和人Fc的夹心ELISA测定了曲妥珠单抗血浆水平。通过使用Prism GraphPad 5软件的二室模型拟合数据。
图13显示了构建体SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14以及SEQ ID NOs：15和16的血浆浓度随时间的曲线图，在所有情况下与对于用于参照的SEQID NOs：3和4获得的值一起绘制。在所有情况下，药代动力学看起来相似。从约200μg/mL的血浆浓度开始，血浆水平在48小时内降至约50μg/mL的水平，然后在20天后实验结束时以更慢的速率进一步降低至约25μg/mL的水平。二室模型的双指数衰减成功地被应用于准确描述数据，使用该模型的数据拟合(图13，表8)得到双特异性融合多肽的末期半衰期为15-21天，相比较下，SEQ ID NOs：3和4的末期半衰期为13天。
数据表明双特异性融合物在小鼠中具有长的抗体样末端半衰期。因为所采用的测定融合多肽血浆浓度的试验要求保留对HER2和CD137两者的活性，结果还表明双特异性分子在20天的时间过程中保持是完整和有活性的。
表8：使用基于二室模型的数据拟合获得的小鼠末期半衰期
Figure BDA0003361078120000471
Figure BDA0003361078120000481
实施例12：融合多肽在食蟹猴中的药代动力学
在食蟹猴中进行由SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14、SEQ ID NOs：15和16以及用于参照的SEQ ID NOs：3和4定义的融合多肽的药代动力学分析。雄性食蟹猴在60分钟内接受静脉输注剂量为3mg/kg的测试品。在时间点15分钟、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、9天、11天、14天、18天和24天获得来自食蟹猴的血浆样品。使用通过靶标HER2和CD137检测完整的双特异性构建体的夹心ELISA检测了药物水平。使用采用靶标HER2和人Fc的夹心ELISA测定了曲妥珠单抗血浆水平。通过使用Prism GraphPad5软件的二室模型拟合数据。
图14显示了构建体SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14以及SEQ ID NOs：15和16的血浆浓度随时间的半对数图，在所有情况下与对于用于参照的SEQ ID NOs：3和4获得的值一起绘制。在所有情况下，药代动力学看起来相似。从约70μg/mL的血浆浓度开始，血浆水平在24天的时间过程中降到接近零的水平。二室模型的双指数衰减成功地被应用于准确描述数据，并且使用该模型的数据拟合(图14，表9)得到双特异性融合多肽的末期半衰期范围为约64至99小时，相比较下，SEQ ID NOs：3和4的末期半衰期为86小时。
因此，数据表明双特异性融合物在食蟹猴中具有的末期半衰期与参照多肽SEQ IDNOs：3和4的半衰期非常相似。
表9：使用基于二室模型的数据拟合获得的雄性食蟹猴的末期半衰期：
Figure BDA0003361078120000482
Figure BDA0003361078120000491
实施例13：融合多肽的离体T细胞免疫原性评估
为了研究在人体中形成抗药抗体的风险，进行双特异性融合多肽SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14、SEQ ID NOs：15和16以及用于参照的SEQ IDNOs：3和4、SEQ ID NOs：3和4的对照抗体和阳性对照钥孔血蓝蛋白(KLH)的体外T细胞免疫原性评估。为了进行实验，将来自被选择为涵盖反映全球人口分布的HLA同种异型的32个供体的PBMC解冻、洗涤并以每孔3×105个细胞的密度接种到96孔板上。将在试验介质中稀释的测试品以30μg/mL的浓度加入到细胞中。单独使用试验培养基作为空白，并使用钥孔血蓝蛋白(KLH)作为天然阳性对照。PBMC在37℃下、5％CO2的加湿气氛中孵育7天。在第7天，标记PBMC的表面表型CD3+和CD4+标志物和掺入DNA的EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)，用作细胞增殖标记物。使用Guava easyCyte 8HT流式细胞仪测量CD3+CD4+EdU+增殖细胞的百分比，并使用GuavaSoft InCyte软件进行分析。
图15提供了所有32个供体和所研究的所有测试分子的该试验的结果。在图15A中，绘制刺激指数，其通过在测试品存在下相对于不存在下的增殖比率获得。以虚线指示定义应答供体的阈值(刺激指数>2)。在图15B中，绘制了由该阈值定义的应答供体的数量。显然，应答参照SEQ ID NOs：3和4的供体的数量位于1，因此是小的，而所有32个供体均以阈值以上的强增殖应答阳性对照KLH。对于双特异性融合多肽，应答供体的数量的范围为从零(SEQID NOs：9和10)经1(SEQ ID NOs：15和16)和2(SEQ ID NOs：13和14)至3(SEQ ID NOs：11和12)。
因此，实验证明双特异性融合多肽，特别是SEQ ID NOs：9和10以及SEQ ID NOs：15和16，在体外T细胞免疫原性评估中诱导很小的应答，这表明诱导免疫原性应答的风险很低。
实施例14：人源化小鼠肿瘤模型中CD137/HER2双特异性物对肿瘤生长的抑制
为了在体内小鼠模型中研究SEQ ID NOs：9和10、SEQ ID NOs：11和12、SEQ IDNOs：13和14以及SEQ ID NOs：47和48的活性，我们采用移植人SK-OV-3肿瘤和人PBMC的免疫缺陷型NOG小鼠(Taconic，NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)。
给4-6周龄的NSG小鼠皮下(s.c.)注射在基质胶/PBS(1:1)溶液中的5×106个SK-OV-3细胞。允许肿瘤生长至平均120mm3，并且在实验的第0天，根据肿瘤大小和动物体重将小鼠随机分入处理组。给小鼠尾部静脉静脉内(i.v.)给予7×106个新鲜的人PBMC。在第0天并且再次在第7天和第14天的PBMC注射后1小时，小鼠接受20μg或100μg的处理或对照进入腹腔内。所研究的分子为IgG4同种型对照(Cat#DDXCH04P，Acris Antibodies GmbH)，HER2/CD137双特异性物SEQ ID NOs：9和10(100μg或20μg)、SEQ ID NOs：11和12(100μg或20μg)以及SEQ ID NOs：13和14(100μg)，或SEQ ID NOs：47和48的CD137结合基准抗体(100μg)。每组包含10只小鼠，研究SEQ ID NOs：47和48的由7只小鼠组成的组除外。每3-4天记录肿瘤生长。
图16显示了在研究第14天相对于起始体积的中值肿瘤大小。通过肿瘤生长抑制强度排序，最佳应答由SEQ ID NOs：9和10(100μg)、SEQ ID NOs：9和10(20μg)以及SEQ IDNOs：11和12(100μg)实现，而20μg的较低剂量的SEQ ID NOs：11和12、SEQ ID NOs：13和14(100μg)以及SEQ ID NOs：47和48的CD137结合基准抗体具有类似于同种型对照的中值应答。
实施例15：使用NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat报告细胞研究CD137通路活化
我们采用基于靶细胞的报告试验来评估SEQ ID NOs：9和10的融合多肽(能够同时结合CD137和HER2)取决于靶细胞的HER2状态活化CD137通路的能力。为此目的，我们采用高HER2表达的NCI-N87胃癌细胞，该细胞与工程化以过表达CD137并携带NF-κB萤光素酶报告基因的NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat细胞(Promega，CS196002)混合。为了比较，我们研究了SEQ ID NOs：47和48以及SEQ ID NOs：49和50的参照抗CD137单克隆抗体的行为。作为阴性对照，我们采用SEQ ID NOs：3和4的单特异性HER2结合抗体。作为另外的对照，我们还评估了在不存在NCI-N87细胞的情况下SEQ ID NOs：9和10的融合多肽以及SEQ ID NOs：47和48、SEQ ID NOs：49和50的抗CD137单克隆抗体，SEQ ID NOs：3和4的单特异性HER2结合抗体的CD137通路活化。最后，还进行了不添加测试品(“溶媒对照”)的实验。在没有添加NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat细胞的孔中评估在NCI-N87细胞单独存在下所测量的背景信号。在实验中，将NCI-N87细胞在培养皿上培养过夜。第二天，在各种浓度的SEQ ID NOs：9和10的融合多肽，参照抗体SEQ ID NOs：47和48、SEQ ID NOs：49和50，SEQ ID NOs：3和4的对照抗体的存在下，或在没有添加测试品的情况下，将新鲜解冻的NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat细胞(Promega，CS196002)在涂覆的表面上孵育6小时。作为读出结果，我们测量了通过添加Bio-GloTM缓冲液(Promega，G7940)在Jurkat报告细胞上诱导的发光。在下文中详细描述该实验。
对于每个实验条件使用一式三份样本进行以下程序。将平底组织培养板用于每孔涂覆5×104个靶NCI-N87肿瘤细胞，其中剩下一些没有靶癌细胞的孔作为对照孔。在37℃下、加湿的5％CO2气氛中，使细胞粘附过夜。之前已经在标准条件下使所述靶细胞在培养物中生长，使用Accutase分离，并重新悬浮于培养基中。
第二天，用PBS洗涤板两次，并向每个孔中加入50μL的NF-κB-luc2P/4-1BB Jurkat细胞悬浮液(相当于1.5×105个细胞)和25μL的在范围为0.04nM至10nM的浓度下的SEQ IDNOs：9和10，在范围为0.4nM至10nM的浓度下的参照抗体SEQ ID NOs：47和48、SEQ ID NOs：49和50，浓度为10nM的阴性对照SEQ ID NOs：3和4，或溶媒。板用透气密封件(4titude)覆盖，并在37℃下、加湿5％CO2气氛中孵育6小时。随后，将75μL的Bio-GloTM缓冲液(Promega，G7940)加入到含有细胞(1:1v/v)的每个孔中，并使用发光板读数器(Pherastar)测量发光。使用Graphpad Prism软件进行分析、定量和曲线拟合。
图17中绘制了代表性实验的结果。在该图中，绘制的值以相对发光单位(RLU)提供。与SEQ ID NOs：3和4的阴性对照(图17A)相比，双特异性融合多肽SEQ ID NOs：9和10(图17A)的上升浓度在高HER2表达的NCI-N87细胞的存在下在报告Jurkat细胞中诱导CD137通路活化。此外，当靶NCI-N87细胞缺失时，没有观察到增加的发光。这种行为显著不同于第一抗CD137抗体SEQ ID NOs：47和48(其在存在和不存在NCI-N87细胞的情况下在Jurkat报告细胞中均诱导CD137途径活化(图17B))和第二抗CD137抗体SEQ ID NOs：49和50(其在Jurkat报告细胞中根本不导致CD137通路活化(图17C))两者。
实验证明SEQ ID NOs：9和10以取决于表达HER2的靶细胞的存在的方式活化CD137通路，因为在不存在NCI-N87细胞的情况下没有发生活化。这些数据验证了SEQ ID NOs：9和10在T细胞活化中的作用模式是通过经由接合癌细胞上的HER2而使CD137受体交联来活化CD137通路。通过与抗CD137抗体SEQ ID NOs：47和48的数据相比较进一步强调了HER2阳性细胞特异性作用模式，所述抗CD137抗体SEQ ID NOs：47和48通过CD137信号传导活化T细胞，而不论是否存在靶细胞。
实施例16：人源化小鼠肿瘤模型中CD137/HER2双特异性物对肿瘤的生长抑制
在类似于实施例14的方案中，给移植有HER2阳性肿瘤细胞(SKOV-3)的免疫受损小鼠注射人PBMC，并对其使用SEQ ID NOs：9和10(以100μg/周或20μg/周)、抗CD137抗体SEQID NOs：47和48或对照(其为含PBMC的溶媒(“仅PBMC”)、不含PBMC的溶媒(“无PBMC”)或含PBMC的同种型对照)处理3周。具体地，给NOG小鼠皮下(s.c.)注射SK-OV-3细胞，允许肿瘤生长至平均120mm3，然后随机分入处理组。每个处理组有10只动物。给小鼠尾部静脉静脉内(i.v.)移植新鲜的人PBMC，并在1小时后开始处理。小鼠接受三次的每周一次腹膜内(i.p.)SEQ ID NOs：9和10或SEQ ID NOs：47和48或对照的处理剂量(20μg或100μg)。每周两次记录肿瘤生长。在处理后第20天获得来自两只小鼠的肿瘤，并通过经由对人淋巴细胞标志物CD45染色的免疫组织化学来评估人T细胞的浸润。
在图18中报告了实验的结果。图18A显示了随时间的中值肿瘤生长。不再代表10只小鼠的整个组样本的数据点通过虚线连接。通过肿瘤生长抑制强度排序，最佳应答由SEQID NOs：9和10(100μg)而实现，之后是相同抗体的较低剂量(20μg)，而SEQ ID NOs：47和48的CD137结合基准抗体具有类似于同种型对照的中值应答。图18B显示了研究结束后肿瘤的免疫组织化学。福尔马林固定和石蜡包埋的肿瘤切片(每组2只)经人淋巴细胞标志物CD45染色；如图18B中所示，通过专用软件定量CD45阳性细胞的频率。该图显示，SEQ ID NOs：9和10(100μg)引起人肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的频率增加，而SEQ ID NOs：9和10(20μg)以及对照则没有。
上述结果反映了，与同种型对照或抗CD137基准相比较，SEQ ID NOs：9和10以高剂量(100μg/周)和低剂量(20μg/周)的处理引起更强的肿瘤生长抑制(TGI)。人淋巴细胞标志物CD45的IHC染色显示了高剂量(100μg)SEQ ID NOs：9和10的人TIL频率增加，而低剂量(20μg)SEQ ID NOs：9和10不显示该效应。综合起来，这些数据与SEQ ID NOs：9和10的双重功能一致：一方面，CD137的肿瘤局部性靶向(tumor-localized targeting)引起TIL在肿瘤微环境中的扩增，并且提示SEQ ID NOs：9和10的肿瘤局部性共刺激T细胞活化，而在不存在TIL扩增的情况下用20ug SEQ ID NOs：9和10观察到肿瘤生长抑制，这表明该活性可能由HER2拮抗作用驱动。
实施例17：人源化NOG小鼠SKOV-3肿瘤模型中的PBMC分型和死亡率。
为了评估SEQ ID NOs：9和10的安全性，从实验16的小鼠的小鼠血液样品中分离PBMC。在PBMC移植后第19天采集这些样品，并通过多色FACS分析人表面标志物CD45、CD3和CD8。将外周血重新悬浮于10ml的1x红细胞裂解缓冲液(0.15M NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mMEDTA)中，并在室温下在15ml管中裂解1-3分钟。细胞在4℃下以300×g离心10分钟，用10mlFC-缓冲液(PBS，pH 7.4中2％的胎牛血清)洗涤1×，并重新悬浮于200μl的FC缓冲液中。将细胞以5×105个细胞/孔的密度转移到96孔板中。在4℃下以400×g离心该板3分钟使细胞成团粒状，并去除上清液。将Fc阻断抗体(10μl/孔的在缓冲液中1:100稀释的2.4G2抗体，0,5mg/ml，#553142-BD Bioscience)加入到每个孔中，并将板在室温下孵育15分钟。然后加入针对人靶标hCD45(Life Technologies)、hCD3和hCD8(均为BD Bioscience)的特异性抗体(0.5-1μg/样品)，并将板在4℃下避光孵育30分钟。在另一个洗涤步骤(在4℃下以400×g离心3分钟)之后，将细胞重新悬浮于200μl的FC缓冲液中，用于使用Attune聚焦细胞计数器(蓝色(488nm)/紫色(405nm)激光配置)进行分析。流式细胞术数据用FlowJo数据分析软件进行分析。
图19A显示了在该研究的第19天从实施例16的处理组和对照组采集的PBMC的CD45、CD3和CD8表型。左侧的图19A显示了表达CD45的总PMBC的百分比，而右侧的图19A显示了CD45阳性细胞群中CD3+CD8+ T效应细胞的部分。显然，结果表明，与对照或SEQ ID NOs：9和10相比较，抗CD137抗体SEQ ID NOs：47和48处理引起人淋巴细胞在小鼠外周血中的更强的扩增，并且该扩增与CD8+人效应T细胞的强增加相关。图19B显示了实验16的处理组和对照组的死亡数。图19B的绘制的数值相对应于每10只一组中自发死亡或基于所定义的一般条件标准需要处死的小鼠的数量。结果表明，与研究结束时的对照以及SEQ ID NOs：9和10相比较，抗CD137mAb处理引起具有显著死亡率的加速的移植物抗宿主病。结合PBMC分型数据，结果表明，与对照或SEQ ID NOs：9和10组相比较，抗CD137 mAb处理诱导的加速的异种移植物抗宿主病(xGvHD)是由抗CD137组中的CD8+人效应T细胞的强烈增强的扩增引起的。
实施例18：人源化小鼠肿瘤模型中CD137/HER2双特异性物对肿瘤生长的抑制
为了研究体内小鼠模型中SEQ ID NOs：9和10的活性，我们使用移植人SK-OV-3肿瘤和人PBMC的免疫缺陷型NOG小鼠(Taconic，NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)。平行研究单特异性CD137靶向抗体SEQ ID NOs：47和48以及单特异性HER2靶向构建体(IgG4主链)SEQ IDNOs：51和52以评估受体HER2和CD137的单特异性相对于双特异性靶向的效应。
给4-6周龄的NSG小鼠皮下(s.c.)注射在基质胶/PBS(1:1)溶液中的5×106个SK-OV-3细胞。允许肿瘤生长至平均110mm3，并且在实验的第0天，根据肿瘤大小和动物体重将小鼠随机分入处理组。给小鼠尾部静脉静脉内(i.v.)给予7×106个新鲜的人PBMC。在第0天并且再次在第7天和第14天的PBMC注射后1小时，小鼠接受四个不同浓度(200μg、100μg、20μg或4μg)的HER2/CD137双特异性SEQ ID NOs：9和10、同种型对照(100μg，Cat#C0004，CrownBioscience Inc.,CA)、单特异性CD137靶向抗体SEQ ID NOs：47和48(100μg)和单特异性HER2靶向抗体SEQ ID NOs：51和52(80μg)进入腹腔内。需要注意的是，选择SEQ ID NOs：51和52(80μg)的剂量与100μg的SEQ ID NOs：9和10组的剂量的摩尔数相同。作为阴性对照，还包括接受溶媒和PBMC或仅溶媒(“无PBMC”)的组。每组包含10只小鼠，组SEQ ID NOs：9和10除外，该组由9只小鼠组成，因为有1只小鼠因处理无关的原因在研究的第4天死亡。每3-4天记录肿瘤生长。通过双侧student’s T检验来测定肿瘤生长抑制应答的统计学意义。
图20显示了研究组在移植PBMC后第20天的死亡数。由PBMC异种移植物抗宿主病(xGvHD)引起的死亡率引起自发死亡或基于预定义的标准的伦理处死。引起注意的是，与所有其他组相比较，单特异性CD137靶向抗体SEQ ID NOs：47和48引起了强加速的xGvHD，没有小鼠存活到研究结束。大多数其他组在研究结束前也显示了死亡，在第20天死亡数最多为3个。对于SEQ ID NOs：9和10的四个处理组，没有明显的剂量依赖性，并且死亡数类似于SEQID NOs：51和52组和“仅PBMC”组，表明SEQ ID NOs：9和10对xGvHD的发病没有影响。
图21显示了随时间的绝对中值肿瘤大小。需要注意的是，对于由于死亡而不再完整的组，数值由虚线组合(见上文)。引起注意的是，与含和不含PBMC的溶媒对照组相比较，同种型对照组引起显著的肿瘤生长抑制；在以下讨论中，处理组的相关对照组因此被选为同种型对照组。与该组相比较，每周200μg和100μg剂量的SEQ ID NOs：9和10以及80μg剂量的SEQ ID NOs：51和52具有强的肿瘤生长抑制，其中所有应答均相类似且统计学极为显著(p<0.001)。与同种型对照组相比较，每周20μg剂量的SEQ ID NOs：9和10显示肿瘤生长抑制趋势，但统计学意义为边界线(p＝0.07)。在同种型对照组的肿瘤生长与SEQ ID NOs：47和48的CD137结合基准抗体或CD137/HER2双特异性SEQ ID NOs：9和10(4μg)的最低剂量的肿瘤生长之间，在第20天没有统计学显著差异。综合起来，中值肿瘤生长曲线表明了SEQ IDNOs：9和10的强剂量依赖性的抗肿瘤活性，考虑到SEQ ID NOs：51和52的结果，所述活性看起来主要是由SEQ ID NOs：9和10的抗HER2活性驱动。
实施例19：人源化小鼠肿瘤模型中通过免疫组织化学的肿瘤浸润淋巴细胞的分型
在实施例18中描述的体内研究的后续分析中，来自五个或六个荷瘤小鼠(来自九个研究组中的每一个)的肿瘤在研究结束或伦理处死时被切取，并通过经由对人淋巴细胞标志物CD45染色的免疫组织化学来评估人T细胞的浸润。为此目的，肿瘤用福尔马林固定，包埋于石蜡中，并使用抗人CD45抗体处理用于免疫组织化学。通过3,3'-二氨基联苯胺(DAB)染色鉴定CD45阳性细胞。为了使灰度图像中DAB阳性清晰可视化，该图像的对比度和亮度经数字化调整。
在图22中提供了所有染色的肿瘤部分的概述，而图23提供了CD45阳性细胞的频率通过专用软件数字化定量的结果。图22显示，每周剂量为200μg、100μg或20μg的SEQ IDNOs：9和10处理组与所有其他组相比较之间有明显的定性差异：显然，相应肿瘤切片中的DAB阳性要强得多。“无PBMC”组中完全不存在染色证实了染色程序的选择性。数字定量(图23)证实了这一定性发现：除了4μg的剂量组之外，来自经SEQ ID NOs：9和10处理的动物的肿瘤显示了强的hCD45阳性，表明载玻片中人淋巴细胞的高频率。hCD45-阳性在统计学上显著高于(p<0.01)对照组(“仅PBMC”或同种型对照)或者用HER2-单特异性SEQ ID NOs：51和52或CD137-单特异性基准抗体SEQ ID NOs：47和48处理的组。需要注意的是，后一组甚至显示存在相对于对照组的统计学显著的较低的人淋巴细胞，例如与同种型对照相比较(p＝0.02)。然而，这种效应可能通过由于所需伦理处死而从该组中进行小鼠的较早取样而造成偏差。
综合起来，该数据说明了SEQ ID NOs：9和10的肿瘤局部性共刺激作用模式，每周剂量为20μg或更高时引起肿瘤中人淋巴细胞的频率增加。重要的是，该活性严格地由SEQID NOs：9和10的双特异性活性驱动，因为单特异性HER2靶向抗体SEQ ID NOs：51和52以及单特异性CD137靶向抗体SEQ ID NOs：47和48不显示该活性。相比之下，与阴性对照相比较，单特异性CD137靶向抗体SEQ ID NOs：47和48甚至引起人淋巴细胞的频率降低。
实施例20：人源化小鼠肿瘤模型中的PBMC分型
为了进一步阐明作用模式并评估SEQ ID NOs：9和10的安全性，从实验18的小鼠的小鼠血液样品中分离PBMC。在研究结束时小鼠死后或伦理处死后从最终出血中采集这些样品，并通过多色FACS分析人表面标志物CD45和CD8。将外周血重新悬浮于10ml 1x红细胞裂解缓冲液(0.15M NH4Cl，10mM KHCO 3，0.1mM EDTA)中，并在室温下在15ml管中裂解1-3分钟。细胞在4℃下以300×g离心10分钟，用10ml FC-缓冲液(PBS，pH7.4中2％的胎牛血清)洗涤1×，并重新悬浮于200μl的FC缓冲液中。将细胞以5×105个细胞/孔的密度转移到96孔板中。在4℃下以400×g离心3分钟使细胞成团粒状，并去除上清液。将Fc阻断抗体(10μl/孔的在缓冲液中1:100稀释的2.4G2抗体，0.5mg/ml，#553142-BD Bioscience)加入到每个孔中，并将板在室温下孵育15分钟。然后加入针对人靶标hCD45(Life Technologies)和hCD8(BDBioscience)的特异性抗体(0.5-1μg/样品)，并将板在4℃下避光孵育30分钟。在另一个洗涤步骤(在4℃下以400×g离心3分钟)之后，将细胞重新悬浮于200μl的FC缓冲液中，用于使用Attune聚焦细胞计数器(蓝色(488nm)/紫色(405nm)激光装置)进行分析。流式细胞术数据用FlowJo数据分析软件进行分析。
图24显示了研究结束后来自实施例20的处理组和对照组的PMBC的CD45和CD8表型。图24A显示了表达CD45的总PMBC的百分比，而图24B显示了CD45阳性细胞群中CD45+CD8+T效应细胞的部分。显然，结果表明，与对照或全部剂量的SEQ ID NOs：9和10相比较，抗CD137抗体SEQ ID NOs：47和48处理引起人淋巴细胞在小鼠外周血中的更强的扩增，并且该扩增与CD8+人效应T细胞的强增强相关。结合图20所示的死亡数数据，结果表明，与对照组或SEQ ID NOs：9和10组相比较，通过抗CD137mAb处理诱导的加速的xGvHD是由抗CD137组中CD8+人效应T细胞增强的扩增引起的。
结合实施例18、19和20的证据，可得出以下结论：
(i)SEQ ID NOs：9和10具有双重功能：由于抗HER2效应，和通过HER2-肿瘤靶标局部性CD137靶向实现的人淋巴细胞密度的肿瘤局部性增加，其引起直接的肿瘤消退。
(ii)令人惊讶的是，该直接的抗HER2效应不依赖于任何Fc-γ受体介导的效应子功能，因为CD137/HER2双特异性SEQ ID NOs：9和10以及HER2单特异性抗体SEQ ID NOs：51和52均不应引起任何效应子功能：两者均具有含另外的突变的IgG4抗体主链，该另外的突变基本上消除了Fc-γ受体相互作用。
(iii)通过与单特异性CD137靶向基准抗体相比较，双特异性、肿瘤局部性CD137靶向关于功效和安全性两者的益处变得明显：虽然与对照相比较，CD137/HER2双特异性物引起肿瘤中人淋巴细胞的强增加，但是与对照相比较，单特异性CD137靶向抗体甚至引起降低。另一方面，研究中单特异性CD137靶向抗体引起小鼠外周血中人CD8阳性T细胞的扩增，这一效果对于SEQ ID NOs：9和10而言并不明显。CD8+效应细胞的外周扩增与小鼠经由GvHD的加速死亡相关。CD137的系统活化引起的这种毒性也可能与抗CD137抗体如SEQ ID NOs：47和48的临床应用有关。与单特异性抗CD137基准诸如SEQ ID NOs：47和48相比较，这些观察结果强力证实了SEQ ID NOs：9和10的改善的功效和安全性。
对于本领域技术人员显而易见的是，本申请中描述的体内模型的变体可用于显示SEQ ID NOs：9和10的体内功效的各个方面。通常，这样的模型将基于人HER2受体或其变体为阳性的肿瘤细胞的移植，其通过肿瘤细胞(为天然HER2受体阳性的或通过例如用HER2转染或病毒转导的方法而制成HER2受体阳性的)来实现。这样的细胞可以来源于永生癌细胞系或患者肿瘤。此外，这些模型可依赖于人或鼠来源的同种异体反应的或HLA匹配的和肿瘤反应的T细胞，例如：
(I)基于HER2阳性肿瘤和同种异体反应的PBMC的人源化模型。通常，在这样的模型中使用的小鼠将是在较小或较大程度上免疫受损的。本申请中提供了基于永生细胞系的模型的实例，例如在Sanmamed等人，Cancer Res.2015Sep 1；75(17):3466-78中。后一篇出版物还提供了基于患者来源的肿瘤细胞异种移植物的典型模型的实例。
(II)基于HER2阳性肿瘤和识别肿瘤细胞系上的一种或多种抗原的单克隆或多克隆T细胞的人源化模型。通常，在这样的模型中使用的小鼠将是在较小或较大程度上免疫受损的。肿瘤细胞特异性T细胞和肿瘤细胞的各种组合是可能的。通过经由不同方案产生部分或全部HLA匹配的单克隆或多克隆肿瘤反应性T细胞(例如Erskine等人，J VisExp.2012Aug 8；(66):e3683)或通过用天然T细胞受体转导T细胞(例如Wang等人，CancerImmunol Res.2016Mar；4(3)；204-14，或Hirschhorn-Cymerman等，J Exp Med.2012 Oct 22日；209(11):2113-26)可以获得肿瘤细胞特异性T细胞。人造嵌合抗原受体也可用于替代天然TCR。
(III)患者来源的肿瘤细胞和自体患者来源的PBMC或(扩增的)TIL。通常，在这样的模型中使用的小鼠将是在较小或较大程度上免疫受损的。
(IV)转基因小鼠模型，其中CD137受体为部分或完全人源化的，因此制成能够结合SEQ ID NOs：9和10。转基因小鼠将被通过细胞生物学方法制成表达人HER2的小鼠肿瘤移植。为了增加模型的生理相关性，可将小鼠另外制成CD137配体和/或人HER2转基因的。
在上述或其变体中描述的模型预期能够显示以下药效学效应中的一种或多种：通过直接或间接增强局部增殖的TIL频率的增加；通过直接或间接抑制淋巴细胞死亡的TIL频率的增加；不同于增殖或持续性的TIL活性的增加，所述活性例如产生促炎细胞因子包括但不限于IL-2、IFN-γ或TNF-α，或通过对肿瘤生长的强烈影响证明的杀死肿瘤细胞的能力的提高，所述影响不是由于单独的SEQ ID NOs：9和10的抗HER2活性引起的。受影响的淋巴细胞包括但不限于CD4和CD8阳性T细胞、NK细胞或NKT细胞。其他细胞类型可以显示特定的药效学效应，包括但不限于内皮细胞，例如肿瘤血管的内皮细胞。在肿瘤内皮细胞的情况下，通过SEQ ID NOs：9和10的CD137靶向可以经由靶向受体或增强靶向的可溶性因子的表达而增加向肿瘤内的转运(参见Palazon等人，Cancer Res.2001Feb 1；71(3):801-11)。
该模型可以被直接用于研究另外的效果，例如淋巴细胞亚群的特异性靶向、药效学和毒性作用的剂量依赖性或治疗方案。
本文中说明性描述的实施方式可以适当地在没有本文中未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应作扩大而不限制的理解。此外，本文使用的术语和表达被用作说明性而非限制性的术语，并且不旨在这样的术语和表达的使用排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，而是应理解，在本发明所要求保护的的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解的是，虽然本发明实施方案已经通过优选实施方案和可选特征进行了具体公开，但是本领域技术人员可以采用对其的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为在本发明的范围内。本文所描述的所有专利、专利申请、教科书和同行评议的出版物的全部内容均通过引用并入本文。此外，如果在通过引用并入本文的参考文献中的术语的定义或用途与本文中提供的该术语的定义不一致或相矛盾，则应用本文中提供的该术语的定义而不应用在参考文献中的该术语的定义。落入一般公开内容内的较窄种类和亚属分组中的每一个也构成了本发明的一部分。这包括具有从属类中去除任何主题的附带条件或负面限制的本发明的一般描述，而不管所删除的材料是否在本文中具体叙述。另外，当按照马库什组的方式描述特征时，本领域技术人员将认识到，本公开内容也由此根据该马库什组的任何个别成员或成员亚组来描述。其他实施方案将由以下权利要求变得显而易见。
等同物：本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在被所附权利要求涵盖。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入本文。
序列表
<110> 皮里斯制药有限公司
<120> 抗癌融合多肽
<130> LC17310009P-D
<140> EP 16721154.9
<141> 2016-05-04
<150> EP 15166179.0
<151> 2015-05-04
<150> EP 15167917.2
<151> 2015-05-18
<150> EP 15002702.7
<151> 2015-09-17
<150> EP 15192870.2
<151> 2015-11-04
<150> EP 16150705.8
<151> 2016-01-11
<150> EP 16000862.9
<151> 2016-04-15
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 阴性对照
<400> 1
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Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
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<211> 178
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<223> 阳性对照脂质运载蛋白突变蛋白
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65 70 75 80
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Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
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Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
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<223> 基准抗体重链
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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245 250 255
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 基准抗体轻链
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<213> 人工
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
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420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp
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Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu
465 470 475 480
Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val
485 490 495
Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys
500 505 510
Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val
515 520 525
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530 535 540
Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys
545 550 555 560
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595 600 605
Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro
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Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
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<220>
<223> 融合多肽
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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<220>
<223> 融合多肽
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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115 120 125
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<223> 融合多肽
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<213> 人工
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<223> 融合多肽
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<220>
<223> 融合多肽
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<211> 158
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<213> 人工
<220>
<223> 野生型人Tlc
<400> 18
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50 55 60
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65 70 75 80
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 连接子
<400> 19
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<210> 20
<211> 1929
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合多肽
<400> 20
gaagtccagc tggtcgaatc tggtggtggc ctggtccagc ctggtggatc actgagactg 60
tcctgtgctg cttctggttt caacatcaag gacacctaca tccattgggt cagacaggca 120
cctggcaagg gactggaatg ggtcgcccga atctacccta caaacggcta cactcgctac 180
gccgactccg tcaagggacg ctttaccatc tccgccgaca cctctaaaaa caccgcctac 240
ctgcagatga atagtctgag ggccgaggat actgctgtgt actactgctc acgatgggga 300
ggcgacggct tttacgctat ggattactgg ggacagggaa ctctggtcac tgtgtctagc 360
gctagcacaa agggccctag tgtgtttcct ctggctccct cttccaaatc cacttctggt 420
ggcactgctg ctctgggatg cctggtgaag gattactttc ctgaacctgt gactgtctca 480
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tacatttgta atgtgaacca caaaccatcc aacactaaag tggacaaaaa agtggaaccc 660
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<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 融合多肽
<400> 21
gacatccaga tgacacagtc tccctcttcc ctgtccgctt ctgtgggcga tcgagtgaca 60
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<210> 22
<211> 1920
<212> DNA
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<223> 融合多肽
<400> 22
gaagtccagc tggtcgaatc tggtggtggc ctggtccagc ctggtggatc actgagactg 60
tcctgtgctg cttctggttt caacatcaag gacacctaca tccattgggt cagacaggca 120
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cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccctcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020
ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaggaaga gatgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgacat tgccgtggaa 1140
tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg acagtggata agtcccggtg gcaggaaggc 1260
aatgtgttct cctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagtcc 1320
ctgtccctga gcctgggcaa g 1341
<210> 31
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 融合多肽
<400> 31
caggactcta ctagtgatct gatcccggca ccgccactgt caaaagtccc tctgcaacaa 60
aactttcaag acaatcagtt tcacggcaaa tggtatgtgg tcggccaggc cggaaacatt 120
aggctgcggg aggacaagga ccccatcaaa atgatggcta ccatctacga gctgaaggaa 180
gacaaatctt atgatgtgac aatggtcaag ttcgacgata agaaatgcat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc ccagccggga gagttcaccc tgggcaagat caagtccttc 300
cccggccaca cttccagcct ggtccgcgtg gtctcgacca actataatca gcatgctatg 360
gtgttcttca agttcgtctt tcagaataga gaggagttct acatcacact gtatggacgc 420
accaaggagc tgacaagcga gctgaaagaa aacttcatca ggttttcaaa gtccctgggg 480
ctgcccgaaa atcatatcgt gttcccagtc cccatcgacc agtgtattga tggaggaggc 540
ggaggatccg gcggaggagg aagtggcgga ggaggaagtg acatccagat gacacagtct 600
ccctcttccc tgtccgcttc tgtgggcgat cgagtgacaa tcacctgtag ggctagtcag 660
gatgtgaata ctgctgttgc ttggtaccag cagaaaccag gaaaagcccc taaactgctg 720
atctactctg cctcattcct gtactctggg gtgccttctc gattcagtgg ttctagatct 780
ggcaccgatt tcacactgac catttcttca ctgcaacctg aggattttgc cacctactac 840
tgtcagcagc actacacaac acctcccaca tttggccagg gcacaaaagt ggagatcaaa 900
cggaccgtgg cggcgccttc tgtgttcatt ttccccccat ctgatgaaca gctgaaatct 960
ggcactgctt ctgtggtctg tctgctgaac aacttctacc ctagagaggc caaagtccag 1020
tggaaagtgg acaatgctct gcagagtggg aattcccagg aatctgtcac tgagcaggac 1080
tctaaggata gcacatactc cctgtcctct actctgacac tgagcaaggc tgattacgag 1140
aaacacaaag tgtacgcctg tgaagtcaca catcaggggc tgtctagtcc tgtgaccaaa 1200
tccttcaata ggggagagtg c 1221
<210> 32
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 32
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 33
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 33
Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Arg Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Asp Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 34
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 34
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Asn Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Arg Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 35
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 35
Val Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Arg Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Glu Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 36
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 36
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Ser Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 37
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 37
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Glu
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Ala Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Ser
130 135 140
Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 38
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 38
Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Asp Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Ala Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 39
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 39
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 40
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 40
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 41
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 41
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 42
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 42
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Ser Lys Met
35 40 45
Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr
50 55 60
Gly Val Ser Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile Met Thr Phe
65 70 75 80
Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser
85 90 95
Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr
100 105 110
Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu
115 120 125
Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu
130 135 140
Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu
145 150 155 160
Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
165 170 175
<210> 43
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 43
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Val Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Arg Tyr Asp Ile
65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 44
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 44
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
His Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 45
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 45
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Ser Thr Leu Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 46
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 脂质运载蛋白突变蛋白
<400> 46
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Ser Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asp Val Thr Ala Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Asn Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 47
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参照抗体
<400> 47
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 48
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参照抗体
<400> 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 49
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参照抗体
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 50
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 参照抗体
<400> 50
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 51
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗-IgG4 S228P FALA (重链)
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 52
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 曲妥珠单抗-IgG4 S228P FALA (轻链)
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (35)

1.一种能够结合CD137和HER2/neu的融合多肽，其中所述融合多肽包含至少两个任意顺序的亚基，其中所述第一亚基包含对HER2/neu具有结合特异性的抗体，并且其中所述第二亚基包含对CD137具有结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合多肽，其中与成熟人泪脂质运载蛋白的线性多肽序列(SEQ ID NO:18)相比较，所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基组之一：
(a)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(b)Ala 5→Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg；Val 85→Asp；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys 153→Ser；
(c)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Asn；Lys 94→Arg；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys 153→Ser；
(d)Ala 5→Val；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg；Lys 94→Glu；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys 153→Ser；
(e)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Thr 42→Ser；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser；
(f)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Lys 52→Glu；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Thr 71→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ala 133→Thr；Arg 148→Ser；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser；或
(g)Ala 5→Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Gly 46→Asp；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Thr 71→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser。
3.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NOs:32-38的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的融合多肽，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含选自SEQ ID NOs:32-38或其片段或变体的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的融合多肽，其中与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO:17)相比较，所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基组之一：
(a)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(b)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Met；Leu 70→Lys；Arg 72→Asp；Lys73→Asp；Asp 77→Met；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(c)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Ala；Arg 72→Asp；Lys73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(d)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Ala；Arg 72→Asp；Lys73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(e)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Ser；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Ser；Arg 72→Asp；Lys73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Met；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(f)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Val；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys73→Asp；Asp 77→Arg；Trp 79→Asp；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(g)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→His；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(h)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Phe 83→Leu；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；或
(i)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ser；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys73→Asp；Asp 77→Asn；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr。
6.根据权利要求1或5所述的融合多肽，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NOs:2和39-46的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性。
7.根据权利要求1、5和6中任一项所述的融合多肽，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NOs:2和39-46的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
8.根据权利要求1和5-7中任一项所述的融合多肽，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NOs:2和39-46的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。
9.根据权利要求1和5-8中任一项所述的融合多肽，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含选自SEQ ID NOs:2和39-46或其片段或变体的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的融合多肽，其中一个亚基能够通过肽连接子连接至另一亚基。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的融合多肽，其中所述第一亚基和所述第二亚基通过在所述第二亚基的脂质运载蛋白突变蛋白的N-末端与所述第一亚基的免疫球蛋白的重链恒定区(CH)的C-末端之间的肽连接子连接。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的融合多肽，其中第三亚基通过在所述第三亚基的脂质运载蛋白突变蛋白的N-末端与所述第一亚基的免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)的C-末端之间的肽连接子连接至所述第一亚基。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的融合多肽，其中所述肽连接子为(Gly4Ser)3连接子。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的融合多肽，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的融合多肽，其中所述抗体是曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的融合多肽，其中所述抗体具有由SEQ ID NOs:3和4提供的重链和轻链。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的融合多肽，其中所述抗体具有IgG4主链。
19.根据权利要求18所述的融合多肽，其中所述IgG4主链具有以下选自S228P、N297A、F234A和L235A的突变中的任一个。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含两个SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列和两个SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，两个SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列和两个SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，两个SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列和两个SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，两个SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列和两个SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列，两个SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列和两个SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或两个SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列和两个SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
21.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-20中任一项所述的融合多肽的核苷酸序列。
22.根据权利要求21所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接至调节序列以允许所述核酸分子的表达。
23.根据权利要求21或22所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含于载体或噬菌粒载体中。
24.一种宿主细胞，其包含权利要求21-23中任一项所述的核酸分子。
25.一种生产根据权利要求1-20中任一项所述的融合多肽的方法，其中通过基因工程方法从编码所述融合多肽的核酸开始生产所述融合多肽。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述融合多肽在细菌或真核宿主生物体中产生，并且从该宿主生物体或其培养物中分离。
27.根据权利要求1-20中任一项所述的融合多肽或包含这种融合多肽的组合物在制备用于同时活化CD137的下游信号传导通路和接合HER2/neu阳性肿瘤细胞的药物中的用途。
28.根据权利要求1-20中任一项所述的融合多肽或包含这种融合多肽的组合物在制备用于同时共刺激T细胞和接合HER2/neu阳性肿瘤细胞的药物中的用途。
29.根据权利要求1-20中任一项所述的融合多肽或包含这种融合多肽的组合物在制备用于同时诱导T淋巴细胞增殖和接合HER2/neu阳性肿瘤细胞的药物中的用途。
30.根据权利要求1-20中任一项所述的融合多肽或包含这种融合多肽的组合物在制备用于将T细胞上的CD137聚集和活化导向至HER2/neu阳性肿瘤细胞的药物中的用途。
31.根据权利要求1-20中任一项所述的融合多肽或包含这种融合多肽的组合物在制备用于诱导在HER2/neu阳性肿瘤细胞附近的局部T细胞应答的药物中的用途。
32.根据权利要求1-20中任一项所述的融合多肽或包含这种融合多肽的组合物在制备用于诱导在HER2/neu阳性肿瘤细胞附近的局部NK细胞应答的药物中的用途。
33.根据权利要求1-20中任一项所述的融合多肽或包含这种融合多肽的组合物在制备用于诱导在HER2/neu阳性肿瘤细胞附近的通过T细胞的IL-2和/或IFN-γ产生的药物中的用途。
34.根据权利要求1-20中任一项所述的融合多肽或包含这种融合多肽的组合物在制备用于预防、改善或治疗HER2/neu阳性癌症的药物中的用途。
35.一种药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项所述的融合多肽。
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