TW201920653A - 調節細胞表達的生物活性之結合分子 - Google Patents

調節細胞表達的生物活性之結合分子 Download PDF

Info

Publication number
TW201920653A
TW201920653A TW107110709A TW107110709A TW201920653A TW 201920653 A TW201920653 A TW 201920653A TW 107110709 A TW107110709 A TW 107110709A TW 107110709 A TW107110709 A TW 107110709A TW 201920653 A TW201920653 A TW 201920653A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
binding
cell
membrane protein
antibody
antigen
Prior art date
Application number
TW107110709A
Other languages
English (en)
Inventor
塞西莉亞 安娜 威爾漢米娜 潔茱貞
馬克 索羅斯比
克魯夫 康納里斯 艾迪恩 德
瑞斯 庫斯特
賽拉斯 喬漢尼斯 泰肯
唐 隆特堡
Original Assignee
荷蘭商米樂斯股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 荷蘭商米樂斯股份有限公司 filed Critical 荷蘭商米樂斯股份有限公司
Publication of TW201920653A publication Critical patent/TW201920653A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本發明提供刺激在細胞上的TNF受體超家族的成員的活性的手段和方法。本發明亦提供結合分子，例如包含至少兩個抗原結合位的抗體，其中第一抗體結合位可結合所述成員的胞外部分且第二抗體結合位可結合第二(不同的)膜蛋白質的胞外部分。

Description

調節細胞表達的生物活性之結合分子
本發明有關於結合分子的領域。特別是其有關於用於治療涉及異常細胞(aberrant cell)之疾病的治療性結合分子的領域。其更有關於結合二或更多個不同的膜相關蛋白質的胞外部分的結合分子，且藉此調節由細胞表達的生物活性。
僅管在治療疾病上已有許多進步及導致癌症的分子事件的知識的增長，在世界上，癌症仍為發病及死亡的主要原因。癌症為全球第二主要死因。根據世界衛生組織(World Health Organization)，癌症是2015年八百八十萬起死亡的原因。全球將近六分之一的死亡是因為癌症。舉例而言，大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是全世界第三常見的癌症。2008年，一百二十三萬人被診斷出有此疾病。在歐洲，大腸癌為第二常見的癌症，其中在2012年約診斷出447,000起新案例(佔全部的13%)。大腸癌為第四常見的癌症死因，估計是每年608,000(歐洲148,000)起死亡的原因。雖然一些新的治療在CRC中已有進步，但許多都在臨床試驗中失敗；轉移性CRC大部分仍為無法治癒的。
傳統上，大部分的癌症藥物的發現聚焦於阻斷基本的細胞功能和殺死分裂細胞之試劑。然而，在癌症末期(advanced cancer)的情況下，不論多積極地使用，甚至到了病人因治療而遭受生命威脅的副作用所苦，化學療法很少產生完全的治癒。在大部分情況下，病人中的腫瘤停止生長或暫時性縮小(稱為緩解(remission))，卻又開始增殖，有時候更快速(稱為復發(relapse))，且變得越來越更難以治療。最近，癌症藥物的發展的焦點已從廣效地細胞毒殺化學療法移至較低毒性的標靶抑制細胞生長療法(targeted cytostatic therapy)。癌症末期的治療已在臨床上證實於血癌(leukemia)和一些其他癌症中有效。然而，在大部分的惡性腫瘤中，標靶方法仍證實沒有有效到能完全地清除大部分病人中的癌症。黑色素瘤(melanoma)為非常頻繁發生的癌症的另一範例。當不夠早偵測到，癌症有可能在很難治療的階段發生轉移。免疫干涉(immune-intervention)治療已顯示對至少一些有轉移的黑色素瘤病人有效。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)為很少在夠早進行手術的階段發現的癌症種類。此外，這些種類的癌症已經成功地用免疫干涉治療來治療。
使用各種不同的方法，包含例如導向癌症依賴用於生存及/或生長的訊息傳遞蛋白質的小分子；有腫瘤特異性的蛋白質之疫苗；具有主動地殺死腫瘤細胞的免疫細胞之細胞療法和將腫瘤作為細胞毒殺分子的標靶之抗體；妨礙訊息傳遞之抗體及/或將宿主的免疫系統(重)導向至腫瘤細胞之抗體，已實現以癌症為標靶。阻斷CTLA-4或PD-1軸的單株抗體已顯 示為在黑色素瘤、NSCLC、腎細胞癌(renal cell carcinoma)和泌尿上皮癌(urothelial carcinoma)病人的子集(subset)中，誘導持久的臨床回應。
本發明提供(重)導向免疫系統成分(component)的之新穎手段及方法。本發明亦有關於調節由細胞表達的生物活性之手段及方法。
本發明提供一種刺激在細胞上的TNF受體超家族成員的活性之方法，此方法包括提供第一細胞及第二細胞，其中第一細胞具有所述成員於細胞膜上且所述第二細胞具有第二膜蛋白質於細胞膜上。此方法包括以包含兩個抗原結合位的結合分子接觸所述細胞，其中第一抗原結合位可結合所述成員(第一膜蛋白質)的胞外部分且第二抗原結合位可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分，藉此刺激在所述第一細胞上的所述成員的活性。在一些實施例中，所述方法為體外(in vitro)方法。在一些實施例中，TNF受體超家族的所述成員為CD137或OX40，較佳地為CD137。在一些實施例中，所述第二膜蛋白質不是TNF受體超家族的成員。在一些實施例中，所述第二膜蛋白質是B7家族的成員。在一些實施例中，所述第二膜蛋白質為PD-L1。
在一較佳實施例中，此方法更包括提供另一結合分子(第二結合分子)，其包含可結合TNF受體超家族的所述成員的胞外部分之抗原結合位及可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分之抗原結合位，其中所述第一和第二結合分子結合： -在所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基；-在所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；或-在所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基及所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；此方法更包括將所述第一和第二細胞與所述第一和第二結合分子一起培養，藉此刺激或增強在所述第一細胞上的TNF受體超家族的所述成員的活性。
本發明也提供一種結合分子，其包括可結合TNF受體超家族(第一膜蛋白質)的成員的胞外部分之抗原結合位及可結合第二膜蛋白質的胞外部分之抗原結合位。TNF受體超家族成員較佳地為CD137或OX40，較佳地為CD137。在一些實施例中，所述第二膜蛋白質不是TNF受體超家族的成員。所述第二膜蛋白質較佳地為B7家族的成員。在一些實施例中，所述二膜蛋白質為PD-L1。
本發明更提供一種部分的組合物或套組，其包括一或多個結合分子，所述結合分子包括可結合TNF受體超家族的成員(第一膜蛋白質)的胞外部分之抗原結合位及可結合第二膜蛋白質的胞外部分之抗原結合位。在一較佳實施例中，本發明提供一種部分的組合物或套組，其包括兩個或更多之此類的抗原結合分子；其中至少兩個之所述結合分子可接合：-在所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基；-在所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；或-在所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基及所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基。較佳地，至少兩個之結合分子結合 在所述第一膜蛋白質上相同的抗原決定基且結合在所述第二膜蛋白質上不同的抗原決定基。
本發明更提供一種刺激細胞上的CD137或OX40的活性的方法。此方法包括提供第一細胞和第二細胞，其中所述第一細胞具有CD137或OX40於細胞膜上，且所述第二細胞具有第二膜蛋白質於細胞膜上，且以包括可結合至所述CD137或OX40(第一膜蛋白質)的胞外部分的抗原結合位及可結合至第二膜蛋白質的胞外部分的抗原結合位之結合分子(第一結合分子)，來接觸所述第一細胞和第二細胞。此方法更包括將所述第一細胞和所述第二細胞與所述第一結合分子一起培養，藉此刺激在所述第一細胞上的所述CD137或OX40的活性。在一些實施例中，所述第二膜蛋白質不是TNF受體超家族的成員。在一些實施例中，所述方法為體外(in vitro)方法。
在一較佳實施例中，此方法更包括提供另一結合分子(第二結合分子)，其包含可結合所述第一膜蛋白質的胞外部分之抗原結合位及可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分之抗原結合位，其中所述第一和第二結合分子結合：-在所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基；-在所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；或-在所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基及所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；此方法更包括將所述第一細胞和所述第二細胞與所述第一和第二結合分子一起培養，藉此刺激在所述第一細胞上的CD137或OX40的活性。
在一些實施例中，根據本發明的結合分子包括可結合TNF受體超家族成員的胞外部分之抗原結合位及可結合B7家族成員之抗原結合位。在一些實施例中，根據本發明的所述結合分子之抗原結合位由一個可結合TNF受體超家族成員的胞外部分之抗原結合位及一個可結合B7家族成員的胞外部分之抗原結合位所組成。在一些實施例中，根據本發明的所述結合分子包括可結合CD137的胞外部分之抗原結合位及可結合B7家族成員之抗原結合位。在一些實施例中，根據本發明的所述結合分子之抗原結合位由一個可結合CD137的胞外部分之抗原結合位及一個可結合B7家族成員之抗原結合位所組成。在一些實施例中，根據本發明的所述結合分子包括可結合CD137的抗原結合位及可結合PD-L1的抗原結合位。在一些實施例中，根據本發明的所述結合分子的抗原結合位由一個可結合CD137的抗原結合位及一個可結合PD-L1的抗原結合位所組成。在一些實施例中，根據本發明的所述結合分子具有不超過兩個抗原結合位。
如本文所述之結合分子較佳地為抗體。
本發明更提供一種刺激在細胞上的TNF受體超家族成員的活性之方法，其包括提供第一細胞和第二細胞，其中所述第一細胞具有所述成員(第一膜蛋白質)於細胞膜上且所述第二細胞具有第二膜蛋白質於細胞膜上，此方法包括以根據本發明之包括至少兩個可變域的抗體接觸所述細胞，其中一個可變域包括可結合所述第一膜蛋白質的胞外部分的第一抗原結合位，而另一可變域包含可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分 的第二抗原結合位，藉此，刺激在所述第一細胞上的所述成員的活性。在一些實施例中，所述方法為體外方法。
本發明更提供一抗體或其功能部、衍生物及/或類似物，包括：-可結合至TNF受體超家族成員(第一膜蛋白質)的胞外部分之可變域；及-可結合至第二膜蛋白質的胞外部分之可變域。第一膜蛋白質較佳地為CD137或OX40，較佳地為CD137。在一些實施例中，所述第二膜蛋白質不是TNF受體超家族的成員。
結合分子較佳地為雙特異性抗體。本發明更提供一種刺激在細胞上的TNF受體超家族成員的活性的方法，其包括提供第一細胞和第二細胞，其中所述第一細胞具有所述成員(第一膜蛋白質)於細胞膜上且所述第二細胞具有第二膜蛋白質於細胞膜上，此方法包括以包含兩個可變域之雙特異性抗體接觸所述細胞，其中一個可變域包括可結合所述第一膜蛋白質的胞外部分之第一抗原結合位，而另一可變域包括可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分之第二抗原結合位，藉此，刺激在所述第一細胞上的所述成員的活性。在一些實施例中，所述方法為體外方法。亦提供一種雙特異性抗體，其包括具有可結合TNF受體超家族成員(第一膜蛋白質)的胞外部分的抗原結合位之可變域及具有可結合第二膜蛋白質的胞外部分的抗原結合位之可變域。第一膜蛋白質較佳地為CD137或OX40，較佳地為CD137。第二膜蛋白質較佳地不是TNF受體超家族的成員。
在一些實施例中，一種根據本發明的抗體包括可 變域，其包括可結合TNF受體超家族成員的胞外部分的抗原結合位及可結合B7家族成員的抗原結合位。在一些實施例中，根據本發明之所述抗體的抗原結合位由一個可結合TNF受體超家族成員的胞外部分之抗原結合位及一個可結合B7家族成員的胞外部分之抗原結合位所組成。在一些實施例中，根據本發明之所述抗體包括可結合CD137的胞外部分的抗原結合位及可結合B7家族成員的抗原結合位。在一些實施例中，根據本發明之所述抗體的抗原結合位由一個可結合CD137的胞外部分的抗原結合位及一個可結合B7家族成員的抗原結合位所組成。在一些實施例中，根據本發明之所述抗體包括可結合CD137的抗原結合位及可結合PD-L1的抗原結合位。在一些實施例中，根據本發明之所述抗體的抗原結合位由一個可結合CD137的抗原結合位及一個可結合PD-L1的抗原結合位所組成。在一些實施例中，根據本發明的所述抗體具有不超過兩個抗原結合位。
更提供一種醫藥組合物，其包括一或多個結合分子，較佳為本發明之抗體或其變異體。
亦提供一種核酸分子或核酸分子的集合，其編碼本發明之抗體或其變異體的重鏈或重鏈可變區。
亦提供一種核酸分子或核酸分子的集合，其編碼本發明之抗體。
本發明之抗體較佳地包括重鏈可變區，其包括如第3圖中所示之MF的胺基酸序列。在一較佳實施例中，抗體更包括輕鏈可變區，其包括第1圖中所示的輕鏈可變區的胺基 酸序列。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包括如第1A圖所示之胺基酸序列。在一較佳實施例中，重鏈包括IgG1抗體的恆定區，較佳地為人類IgG1抗體。在一較佳實施例中，所述IgG1恆定區的CH2區設計為減少抗體的ADCC及/或CDC活性。在一較佳實施例中，CH2區包括如第2E圖中所示之序列。在一較佳實施例中，抗體的CH3區設計為促進重鏈的異質二聚體化(heterodimerization)。在一較佳實施例中，一個重鏈包括如第2F圖中所示之序列，而另一重鏈包括如第2G圖中所示之序列。
還提供一種細胞，其包括單獨或一起編碼本發明之抗體或其變異體的一或多個核酸分子。亦提供使用如所述的細胞，來產生本發明之抗體或其變異體的方法，較佳地加上自細胞的培養物中收獲抗體或其變異體。
更提供一種包括本發明之抗體及其變異體的細胞系統。
也提供一種治療具有涉汲異常細胞(aberrant cell)的疾病例如癌症，或具有病毒或寄生蟲慢性感染的個體的方法。此方法包括對有此需求的個體投予結合分子、較佳地本發明之抗體或其變異體。
本發明更提供一種結合分子，較佳地為本發明之抗體或其變異體；較佳地為本發明之雙特異性抗體或其變異體，用於在具有涉及異常細胞的疾病例如癌症，或具有病毒或寄生蟲慢性感染的個體的治療中的用途。
在一較佳實施例中，寄生蟲為胞內寄生蟲。
更提供一種刺激在個體中針對所述個體中的異常細胞的免疫反應的方法，此方法包括對所述個體提供(投予)結合分子，較佳地為本發明之抗體或其變異體，較佳地為雙特異性抗體或其變異體。異常細胞較佳地為癌細胞、病毒感染的細胞、寄生蟲或寄生蟲感染的細胞。在一較佳實施例中，細胞為癌細胞或贅生細胞(neoplastic cell)。
第1圖顯示在單及雙特異性IgG中使用的共同輕鏈。
第1A圖顯示共同輕鏈的胺基酸序列。第1B圖顯示共同輕鏈可變域的DNA序列及轉譯(IGKV1-39/jk1)。第1C圖顯示共同輕鏈恆定區的DNA序列及轉譯。第1D圖顯示IGKV1-39/jk5的共同輕鏈可變域的轉譯。第1E圖顯示IGKV1-39A的V區。
第2圖顯示用於產生雙特異性分子的IgG重鏈。第2A圖顯示VH為編碼第3圖中所示的MF的胺基酸序列的核酸。第2B圖顯示CH1區。第2C圖顯示鉸鏈區(hinge region)。第2D圖顯示CH2區。第2E圖顯示含有L235G及G238R取代的CH2。第2F圖顯示含有L351K及T366K(KK)取代的CH3域。第2G圖顯示含有L351D及L368E(DE)取代的CH3域。
第3圖顯示重鏈可變區的胺基酸序列。第3A圖顯示CD137特異性選殖體的VH序列。第3B圖顯示PD-L1特異性選殖體的VH序列。第3C圖顯示OX40特異性選殖體的VH序列。第 3D圖顯示PD-L1特異性選殖體的VH序列。
符號MF意指含有如所示的重鏈可變區及共同輕鏈的抗原結合片段(fragment antigen binding，fab)。輕鏈的胺基酸序列在第1A圖中被指出。劃底線的序列分別指出根據Kabat編號的CDR1、CDR2及CDR3區的每個胺基酸序列。
第4圖顯示pIRES-Neo3(MV1363)的載體地圖及特徵。
第5圖顯示pVAX1的載體地圖及特徵。
第6圖顯示用來產生「免疫」噬菌體展示庫(phage display library)之噬菌質體(phagemid)載體MV1473的載體地圖及特徵。
第7圖顯示IgG表達載體MV1452或MV1453的載體地圖與特徵，IgG表達載體MV1452或MV1453用於在KK變異體重鏈或DE變異體重鏈中分別表達CD137、PD-1、PD-L1及OX40特異性Fab臂，以產生雙特異性IgG。
第8圖顯示VH基因的胺基酸序列，當VH基因組合共同輕鏈成為MF1337時，是對破傷風毒素(tetanus toxin)特異性的；且VH基因存在於用於產生PD-L1xTT雙特異性IgG分子的DE變異體重鏈中。劃底線的序列分別指出CDR1、CDR2及CDR3區的每個胺基酸序列。
第9圖顯示IgG表達載體MV1377的載體地圖及特徵，IgG表達載體MV1377用於在DE變異體重鏈中，表達TT特異性的Fab臂MF1337，以產生雙特異性IgG。
第10圖顯示PD-1/PD-L1阻斷測定(blocking assay)。
在雙特異性IgG的濃度為10μg/ml時，評估抗PD-L1抗 體組(panel)對於阻斷PD-L1對塗佈的PD-1的交互作用的能力。以取自二價基準(benchmark)PD-L1抗體MPDL3280A在濃度為10μg/ml(100%阻斷)時的數據，將數據標準化。代表範例顯示於PD-L1組中。藉由與非PD-1/PD-L1特異性人類同型(isotype)抗體一起培養，建立最大結合(標準化至0%阻斷)。於第3圖所示但未在此呈現之包括MF序列的所有PD-L1可變域阻斷PD-1/PD-L1交互作用大於70%。
第11圖顯示在Jurkat CD137-NFkBluc細胞中，CD137經由二價CD137抗體的活化。
第12圖顯示在Jurkat CD137-NFkBluc細胞中，在IgG交聯抗體不存在(左)或存在(右)下，CD137經由CD137xPD-L1抗體的活化。MF數字意指存在於CD137xPD-L1雙特異性抗體中的CD137 Fab。
第13圖顯示，藉由IL-2的釋放，來測量經由組合PD-L1 Fab臂(MF5594)之二價CD137抗體(上)或單價抗體(下)的初代T細胞的活化。
PG6744：含有兩個MF6744臂的二價CD137抗體(亦標記為6744x6744)。
PG6783：含有兩個MF6783臂的二價CD137抗體(亦標記為6783x6783)。
PG6860：含有兩個MF6860臂的二價CD137抗體(亦標記為6860x6860)。
20H4.9：基於WO 2005/035584之抗CD137參考抗體。
第14圖顯示在過度表達PD-L1的CHO細胞或CHO野生 型細胞的存在下，在Jurkat-CD137-luc細胞上的CD137的活化。藉由螢光素酶(luciferase)的表達expression，來測量CD137的活化。
PG6744：二價CD137抗體(6744x6744)。
PB14671：雙特異性CD137xPD-L1抗體(6744x5361)。
PB14580：雙特異性CD137xPD-L1抗體(6744x5594)
PB14890：雙特異性CD137xTT抗體(6744x1337)
PG6783：二價CD137抗體(6783x6783)
PB14681：雙特異性CD137xPD-L1抗體(6783x5361)
PB14590：雙特異性CD137xPD-L1抗體(6783x5594)
PB15855：雙特異性CD137xTT抗體(6783x1337)
20H4.9：基於WO 2005/035584之抗CD137參考抗體。
第15圖顯示在過度表達PD-L1的CHO細胞或CHO野生型細胞的存在下，經二價CD137抗體、CD137xPD-L1雙特異性抗體或CD137xPD-L1 Oligoclonics®組合的初代T細胞的活化。藉由IL-2的釋放來測量活化。
PG6744：二價CD137抗體(6744x6744)。
PB14671：二價CD137xPD-L1抗體(6744x5361)。
PB14580：二價CD137xPD-L1抗體(6744x5594)。
PB14890：二價CD137xTT抗體(6744x1337)。
20H4.9：基於WO 2005/035584之抗CD137參考抗體。
MOR7480：基於US 8,337,850之抗CD137參考抗體。
第16圖顯示在健康捐贈者的血液細胞中，SEB刺激之IL-2的產生被抗CD137xPD-L1雙特異性抗體或抗CD137xPD-L1 Oligoclonics®增強。
PB14580：雙特異性CD137xPD-L1抗體(6744x5594)。
PB14671：雙特異性CD137xPD-L1抗體(6744x5361)。
MPDL3280A：基於WO 2010/077634之抗PD-L1參考抗體。
PB9469：雙特異性PD-L1xTT抗體(5594x1337)
PB14890：雙特異性CD137xTT抗體(6744x1337)
20H4.9：基於WO 2005/035584之抗CD137參考抗體。
Ctrl Ab：PG2708p213；抗RSV-G。
第17圖顯示在健康捐贈者血液細胞中，相較於抗CTLA-4抗體10D1(其係基於易普利姆瑪(ipilumumab))，SEB刺激之IL-2的產生顯著地被抗CD137xPD-L1雙特異性抗體增強。
第18圖顯示在過度表達PD-L1的CHO細胞(左圖)或CHO野生型細胞(右圖)的存在下，在Jurkat-OX-40 NFkB-luc細胞上的OX-40的活化。藉由螢光素酶的表達，來測量活化。PD-L1 Fab臂MF5561；PD-1 Fab臂MF6256(於第43圖中顯示序列)。
第19圖顯示於T細胞活化測定中(12個CD137 Fab臂)，篩選CD137xPD-L1抗體。在過度表達PD-L1的CHO細胞(上圖)或CHO野生型細胞(下圖)的存在下，用以下所指的抗體組的劑量依存滴定(dose dependent titration)，於37℃刺激來自單一捐贈者的T細胞72小時。使用AlphaLISA藉由IL-2的釋放來測量CD137的活化，以IL-2計數表示。正對照抗體20H4.9(於此圖中稱為PG6619)，與抗TT負對照抗體PG1337(負對照抗體)。
第20圖顯示於SEB PBMC測定(12個CD137 Fab臂)中，篩選CD137xPD-L1抗體。在2μg/ml的SEB的存在下，於SEB PBMC測定中，測試CD137xPD-L1抗體。使用AlphaLISA，藉由IL-2的釋放，來測量CD137的活化，以IL-2計數表示。正對照抗體；抗CTLA-4正對照抗體(基於易普利姆瑪(ipilimumab)，10D1)與抗RSV-G負對照抗體PG2708(負對照抗體)。
第21圖顯示於SEB PBMC測定中(8個CD137 Fab臂)，篩選CD137xPD-L1抗體。在2μg/ml的SEB的存在下，於SEB PBMC測定中，測試CD137xPD-L1抗體。使用AlphaLISA，藉由IL-2的釋放，來測量CD137的活化，以IL-2計數表示。正對照抗體；抗CTLA-4正對照抗體(基於易普利姆瑪，10D1)與抗RSV-G負對照抗體PG2708(負對照抗體)。
第22圖顯示，以流式細胞術(flow cytometry)判定雙特異性抗CD137xPD-L1抗體及其親本二價抗CD137抗體結合至人類和食蟹獼猴(cynomolgus)CD137。
第23圖顯示，以流式細胞術判定雙特異性抗CD137xPD-L1抗體及其親本二價抗PD-L1抗體結合至人類和恆河猴(rhesus macaque)PD-L1。
第24圖顯示，以流式細胞術判定雙特異性抗CD137xPD-L1抗體及其親本二價抗PD-L1抗體結合至活化的T細胞。
第25圖顯示，以ELISA判定雙特異性抗CD137xPD-L1抗體及其親本二價抗PD-L1抗體阻斷PD-L1配位體的結合。
第26圖顯示，以流式細胞術判定雙特異性抗CD137xPD-L1抗體及其親本二價抗PD-L1抗體阻斷CD137配位體的結合。
第27圖顯示，於體外(in vitro)阻斷報導者測定(blockade reporter assay)中，雙特異性抗CD137xPD-L1抗體及其親本二價抗體阻斷PD-L1和PD-1之間的交互作用。
第28A圖顯示，相較於CHO野生型細胞，在每個細胞表達不同PD-L1結合位的CHO細胞的存在下，在Jurkat-CD137-luc細胞上的CD137的轉活化(transactivation)。藉由螢光素酶的表達，來測量CD137的活化。
第28B圖顯示，在每個細胞PD-L1表達不同PD-L1結合位的人類腫瘤細胞的存在下，CD137在Jurkat-CD137-luc細胞上的轉活化。藉由螢光素酶表達，來測量CD137的活化。
第28C圖顯示，在CHO-PD-L1、ES-2或CHO野生型細胞的存在下，Jurkat-CD137-luc細胞上的CD137的轉活化。於10μg/ml，三重複測試IgG。藉由螢光素酶的表達，來測量CD137的活化。以下為受試抗體及其組成。
第29圖顯示，於T細胞活化測定中，比較CD137xPD-L1抗體與單一及組合之參考對照。CD137的活化係被測量成IL-2及TNFα細胞激素的釋放，並藉由Luminex分析。
第30圖顯示，相較於單一或組合之參考對照抗體，於T細胞活化測定中，CD137xPD-L1抗體PB17311的活性。CD137的活化係藉由多個細胞激素的釋放來測量，並藉由Luminex分析(25plex)。
第31圖顯示，在SEB刺激測定的期間，不管PBMC捐贈者或SEB的濃度，雙特異性抗CD137xPD-L1抗體透過PBMC持續地增強IL-2的釋放。CD137的活化係被測量成IL-2的釋放，並藉由Luminex分析來測量。
第32圖顯示，在SEB刺激測定的期間，雙特異性抗CD137xPD-L1抗體比抗CD137基準抗體或等莫耳(equimolar)混合的抗CD137及抗PD-L1基準抗體更有效地增強細胞激素的釋放。CD137的活化係被測量成IL-2、IFNγ、TNFα細胞激素的釋放，並藉由Luminex分析來測量。
第33圖顯示以IFNγ釋放的增強，來展現PB17311抑制經抗CD3/CD28刺激的PBMC之經M2巨噬細胞媒介的抑制(suppression)。
第34圖顯示，在CD8+ T細胞的啟動(priming)之後，PB17311增強T細胞的擴張。
第35圖顯示，在啟動之後，PB17311增強初始T細胞(naïve T cell)分化成中央記憶及效應(effector)T細胞。TN/SCM：初始/幹細胞記憶；TCM，中央記憶，TEM，效應記憶；TE，末端效應 細胞。
第36圖顯示，在總T細胞群體中，PB17311對CD107a及細胞激素的表達的影響。TEM，效應記憶；TE，末端效應細胞。
第37圖顯示，在T細胞子集(subset)中，PB17311對CD107a及細胞激素的表達的影響。
第38圖顯示PB17311對腫瘤浸潤CD4及CD8 T細胞的增殖的影響，其中腫瘤浸潤CD4及CD8 T細胞衍生自大腸癌中的肝轉移(liver metastasis in colorectal cancer，LM-CRC)及肝癌(hepatic carcinoma，HCC)。
第39圖顯示在用於PB17311的CD137中的關鍵殘基之鑑別及視覺化。(A)對各個突變的選殖體而言，平均結合值被繪製為選殖體的平均CD137表達值(灰色圓圈)的函數，以對照抗體的結合來測量。以取自WT選殖體的結合的百分比來表示結合。點線指的是用於鑑別關鍵選殖體(黑點)的閾值。(B)表格列出所有經鑑別的關鍵殘基的平均結合反應性(及範圍)。用於PB17311抗體結合的關鍵殘基(以黑色勾勒)對PB17311抗體的結合為陰性(小於20%的結合至WT)，但對對照抗體555955單株抗體為陽性(大於70%的WT)。(C)基於結合至人類OX40(PDB ID# 2HEY,Compaan et al.,2006)的小鼠OX40L的結構，將關鍵殘基(框住的輪廓)視覺化於CD137模型上。未經證實的殘基C133以灰色顯示。
第40圖顯示，於異種移殖(xenograft)小鼠模型中，在第19天，CD137xPD-L1雙特異性抗體PB17311對中位數腫瘤體 積的影響。MTV，中位數的腫瘤體積；TGI，腫瘤生長抑制；當與組別1比較時，以*(0.01<P<0.05)及***(P<0.001)指出於曼-惠特尼檢定(Mann-Whitney test)中是統計顯著者。
第41圖顯示sCD137對T細胞活化的干擾。評估可溶性CD137對雙特異性CD137xPD-L1抗體活化人類初代T細胞的能力的影響。
第42圖顯示CD137胞外域的胺基酸序列。
第43圖顯示MF6256的胺基酸序列。
腫瘤壞死因子受體超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)為一群受體。他們通常以透過胞外的富含半胱胺酸域(cysteine-rich domain)，來結合腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)的能力為特點。除了神經生長因子(nerve growth factor，NGF)以外，所有TNF皆與原型(archetypal)TNF-alpha同源(homologous)。在其活性型中，大部分的TNF受體在細胞膜(plasma membrane)中形成三聚體複合物。因此，大部分的TNF受體含有跨膜域(transmembrane domain，TMD)且位於細胞膜上。然而，一些可被切成可溶型式(例如TNFR1)，而一些完全地缺少TMD(例如DcR3)。本發明之結合至TNF受體超家族成員的抗體結合超家族的膜結合成員。只存在於不與細胞膜結合的型式中的成員不在本發明的範圍內。
一旦與受體的配位體結合，TNF受體參與對細胞 內部的訊息傳遞。一些受體需要特定的轉接蛋白質(adaptor protein)，例如TRADD、TRAF、RIP及FADD，以用於下游的訊息傳遞。在本發明的背景下，TNF超家族的各種成員為較佳。這些包含腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1)；腫瘤壞死因子受體2；淋巴毒素beta受體(lymphotoxin beta receptor)；OX40；CD40；Fas受體；CD27；CD30；CD137；死亡受體3(death receptor 3)；死亡受體4；死亡受體5；死亡受體6；RANK；TROY；BAFF受體；B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)及跨膜活化子與鈣調節親環素配位體交互作用蛋白質(trans-membrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand-interacting protein，TACI)。
腫瘤壞死因子受體1為腫瘤壞死因子alpha的主要受體之一。此受體具有很多的替代名稱，其中一些為腫瘤壞死因子超家族成員1A(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 1A)；TNFRSF1A；TNF-R1；TNF-RI；TNFR-I；TNFR1；TNFAR；P60；P55；腫瘤壞死因子受體1A同型異構物beta(Tumor Necrosis Factor Receptor 1A Isoform Beta)；腫瘤壞死因子結合蛋白質1(Tumor Necrosis Factor Binding Protein 1)；腫瘤壞死因子受體第1型(Tumor Necrosis Factor Receptor Type 1)；腫瘤壞死因子受體第I型(Tumor Necrosis Factor Receptor Type I)；腫瘤壞死因子alpha受體；腫瘤壞死因子受體1；CD120a抗原；TNFR1-D2；TNF-R-I；TNF-R55；CD120a；TNFR55；TNFR60；TNF-R；P55-R；Tbp1；FPF；及 MS5。腫瘤壞死因子受體1的外部身份為HGNC：11916；Entrez Gene：7132；Ensembl：ENSG00000067182；OMIM：191190及UniProtKB：P19438。
腫瘤壞死因子受體2為結合腫瘤壞死因子alpha(tumor necrosis factor-alpha，TNFα)的膜受體。此受體具有許多替代名稱，其中一些為：腫瘤壞死因子受體超家族成員1B(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 1B)；TNFRSF1B；腫瘤壞死因子受體第II型(Tumor Necrosis Factor Receptor Type II)；腫瘤壞死因子受體2；P80 TNF-Alpha受體；TNF-RII；TNF-R2；TNFR2；TNFBR；P75；腫瘤壞死因子結合蛋白質2(Tumor Necrosis Factor Binding Protein 2)；腫瘤壞死因子beta受體；P75 TNF受體；CD120b抗原；恩博(Etanercept)；TNF-R-II；TNF-R75；P75TNFR；TNFR-II；CD120b；TNFR1B；TNFR80；TBPII。腫瘤壞死因子受體2的外部身份為：HGNC：11917；Entrez Gene：7133；Ensembl：ENSG00000028137；OMIM：191191；及UniProtKB：P20333。
淋巴毒素beta受體表達於大部分的細胞種類的表面上，包含上皮和骨髓族系(lineage)的細胞，但通常不在正常的T及B淋巴球上。此蛋白質結合淋巴毒素膜型式(淋巴毒素alpha及淋巴毒素beta的複合體)。編碼的蛋白質及其配位體在淋巴組織及轉形的細胞的發育(development)及組織(organization)中起作用。在一些範例中，此蛋白質的活化可引起細胞凋亡。此蛋白質以許多化名(alias)為人所熟知，其中有：LTBR；腫瘤壞死因子受體2相關蛋白質(tumor necrosis factor receptor 2-related protein)；腫瘤壞死因子受體第III型；腫瘤壞死因子C受體；D12S370；TNFRSF3；TNFCR；TNFR3；淋巴毒素beta受體(TNFR超家族，成員3)；淋巴毒素B受體；LT-BETA-R；TNF-R-III；TNFR2-RP；TNF-RIII；TNFR-III；TNFR-RP；及CD18。淋巴毒素beta受體的外部身份為HGNC：6718；Entrez Gene：4055；Ensembl：ENSG00000111321；OMIM：600979及UniProtKB：P36941。
OX40不是持續地(constitutively)表達於休息的初始T細胞上。不像CD28，OX40為二級共刺激免疫檢查點分子(secondary co-stimulatory immune checkpoint molecule)，在活化之後的24至72小時後表達；其配位體，OX40L，亦不表達於休息的抗原呈現細胞上，但跟在抗原呈現細胞的活化之後。OX40的表達依賴T細胞的活化。沒有CD28，OX40的表達通常會被延宕且以較低的量存在。此蛋白質以許多化名為人所熟知，其中有：TNFRSF4；腫瘤壞死因子受體超家族成員4；TAX經轉譯活化的糖蛋白質1受體(TAX Transcriptionally-Activated Glycoprotein 1 Receptor)；OX40L受體；ACT35抗原；CD134抗原；TXGP1L；Tax-經轉譯活化的糖蛋白質1受體(Tax-Transcriptionally Activated Glycoprotein 1 Receptor)；淋巴活化抗原ACT35(lymphoid activation antigene ACT35)；OX40細胞表面抗原；ATC35抗原；OX40抗原；ACT35；CD134；及IMD16。OX40的外部身份為HGNC：11918；Entrez Gene：7293；Ensembl：ENSG00000186827；OMIM：600315及UniProtKB：P43489。
CD40為在抗原呈現細胞上發現的共刺激蛋白質且參與抗原呈現細胞的活化。T輔助細胞上的CD154(CD40L)結合至CD40，活化抗原呈現細胞且誘導胞內經CD40的訊息傳遞及各種下游的效果。此蛋白質以許多不同的化名為人所熟知，其中有：CD40分子；CD40分子TNF受體超家族成員5；CD40L受體；TNFRSF5；CDW40；Bp50；腫瘤壞死因子受體超家族，成員5；B細胞表面抗原CD40；B-細胞表面抗原CD40；B細胞相關分子(B Cell-Associated Molecule)；CD40抗原；及P50。CD40的外部身份為HGNC：11919；Entrez Gene：958；Ensembl：ENSG00000101017；OMIM：109535；及UniProtKB：P25942。
Fas受體為在引起計劃性細胞死亡(programmed cell death)(細胞凋亡(apotosis))的細胞的表面上的死亡受體。Fas受體形成許多顯著的細胞凋亡路徑中的一者的一部分。Fas受體以許多替代名稱為人所熟知，例如：Fas細胞表面死亡受體；腫瘤壞死因子受體超家族，成員6；媒介細胞凋亡之表面抗原FAS(Apoptosis-Mediating Surface Antigen FAS)；TNF受體超家族成員6；FASLG受體；CD95抗原；TNFRSF6；APT1；FAS1；APO-1細胞表面抗原；細胞凋亡抗原1；Apo-1抗原；Fas AMA；ALPS1A；APO-1；FASTM；及CD95。FAS的外部身份為HGNC：11920；Entrez Gene：355；Ensembl：ENSG00000026103；OMIM：134637；及UniProtKB：P25445。
CD27被認為對T細胞免疫性的產生及長期維持而言是重要的。CD27結合至配位體CD70，且在調控B細胞的活化及免疫球蛋白質的合成中起作用。CD27轉導引起NF-κB及 MAPK8/JNK活化的訊息。CD27結合蛋白質(SIVA)，一種促細胞凋亡蛋白質(proapoptotic protein)，可結合至此受體且被認為在經此受體誘導的細胞凋亡中起作用。在其他名稱之中，此蛋白質的替代名稱：CD27分子；腫瘤壞死因子受體超家族，成員7；T細胞活化抗原CD27；CD27L受體；TNFRSF7；T14；T細胞活化抗原S152；CD27抗原；s152.LPFS2；S152及Tp55。CD27的外部身份為：HGNC：11922；Entrez Gene：939；Ensembl：ENSG00000139193；OMIM：186711；及UniProtKB：P26842。
CD30由活化的T及B細胞表達。TRAF2及TRAF5被認為與此受體交互作用，且媒介引起NF-κB活化的訊息轉導(signal transduction)。CD30為細胞凋亡的正調控子，且亦已顯示出限制自體反應性(autoreactive)CD8效應T細胞的增殖潛力，且保護身體免於自體免疫的傷害。CD30以許多不同的名稱為人所熟知，例如：TNFRSF8；腫瘤壞死因子受體超家族成員8；淋巴球活化抗原CD30；CD30L受體：Ki-1抗原；D1S166E；CD30；細胞激素受體CD30；CD30抗原；及Ki-1。CD30的外部身份為：HGNC：11923；Entrez Gene：943；Ensembl：ENSG00000120949；OMIM：153243；及UniProtKB：P28908。
CD137可由活化的T細胞表達。CD137亦發現於其他細胞上，例如樹突細胞、自然殺手細胞、顆粒細胞(granulocyte)及在發炎位置的血管壁的細胞。此蛋白質以其對T細胞的活化的共刺激活性為人所熟知。CD137以許多不同的名稱為人所熟知，例如：TNFRSF9；TNF受體超家族成員9；腫瘤壞死因子受體超家族成員9；T-Cell抗原4-1BB同源物； 4-1BB配位體受體；T細胞抗原ILA；CD137抗原；CDw137；ILA；經介質素活化的受體(Interleukin-Activated Receptor)，小鼠Ly63的同源物(Homolog Of Mouse Ly63)；經淋巴球的活化所誘導(Induced By Lymphocyte Activation，ILA)；小鼠4-1BB的同源物(Homolog Of Mouse Ly4-1BB)；受體蛋白質4-1BB；T細胞抗原ILA；及4-1BB。CD137的外部身份為HGNC：11924；Entrez Gene：3604；Ensembl：ENSG00000049249；OMIM：602250；及UniProtKB：Q07011。CD137為可誘導的受體，其最常在活化的CD8+ T細胞上被上調。CD137的訊息傳遞藉由活化NF-κB，來增強T細胞功能[Arch et al,1998]。其他細胞免疫細胞種類包含CD4+ T細胞、單核球、B細胞、樹突細胞(dendritic cell，DC)子群體及顆粒細胞(granulocyte)，且NK細胞可以各種量表達CD137[Shao et al,2011]。在單核球中，CD137可被以脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)及IL-1β的活化所誘導。在B淋巴球中，CD137的表達被抗細胞表面免疫球蛋白質的抗體及用EBV的轉形所誘導。在樹突細胞中，CD137的接合(ligation)，除了增強他們的發炎細胞激素(IL-6及IL-12)的產生及他們的存活以外，透過B7共刺激分子(CD80及CD86)的上調誘導他們的成熟[Makkouk et al,2015]。CD137的接合對嗜中性球(neutrophil)的自然功能為增加細菌及寄生蟲感染的吞噬作用(phagocytosis)。此外，在體外嗜中性球及嗜酸性球(eosinophil)中，CD137的接合阻斷由IL-3/IL-5/GM-CSF受體媒介的抗細胞凋亡訊息，藉此防止顆粒球的累積[Simon,2001；Vinay et al,2011]。在非淋巴細胞中，例如軟骨細胞(chondrocyte)、內皮細 胞及腫瘤細胞，CD137的表達由細胞激素的刺激所驅動，例如IL-1β對軟骨細胞、發炎細胞激素TNFalpha/IFNγ/IL-1β對內皮細胞及IFNγ對腫瘤細胞。刺激CD137的配位體(CD137L)表達於活化的抗原呈現細胞上。CD137以單聚體或二聚體存在於膜中CD137[Pollok et al,1993]。
死亡受體3由活化且經歷過抗原(antigen-experienced)的T淋巴球所表達。此受體亦由FoxP3陽性調節型T淋巴球(regulatory T lymphocyte)所表達。此受體的配位體為TL1A(TNFSF15)，其在類鐸受體(Toll-Like Receptor)或Fc受體活化之後，於抗原呈現細胞及一些內皮細胞中被上調。已報導編碼特殊同型異構物的各種選擇性剪接轉錄變異體(alternatively spliced transcript variant)，其中大部分為潛在地被分泌的分子。此受體被認為參與控制由T細胞的活化所誘導的淋巴球增殖。活化被認為依賴於T細胞體先前的參與。配位體的結合透過IL-2受體增加T細胞對內源性IL-2的敏感性，且增強T細胞增殖。體內(In vivo)活化可能對那些遇到同源抗原(cognate antigen)的T細胞有特異性。在休息時，且對於沒有潛在自體免疫的個體而言，規律地遇到同源抗原的T細胞大多數為FoxP3+調節型T細胞。於不存在任何其他外源訊息的刺激下，死亡受體3的刺激刺激FoxP3+調節型(CD4陽性)T細胞的深刻且特異性增殖。死亡受體3的治療性促效劑可用於刺激Treg的擴張，其可在氣喘、同種異體固體器官移植(allogeneic solid organ transplantation)及眼角膜炎(ocular keratitis)的實驗模型中降低發炎。在另一方面，受體與自體抗 原或疫苗抗原的共刺激可分別引起免疫病理學的惡化或增強的經疫苗刺激的免疫性。受體的刺激對T細胞媒介的免疫性有特異性，其可用於增強或減緩發炎，取決於外來和自身抗原的可用性(availability)的時間背景和品質。在人類中，TNFRSF25的刺激可引起與以共刺激阻斷為標靶的分子(costimulatory blockade targeting molecule)，例如CTLA-4及PD-1，類似但更可控的效應。死亡受體3亦以許多其他名稱為人所熟知，例如TNFRSF25；腫瘤壞死因子受體超家族成員25；腫瘤壞死因子受體超家族，成員12(轉位鏈相關膜蛋白質(Translocating Chain-Association Membrane Protein))；死亡的淋巴球相關受體；媒介細胞凋亡的受體TRAMP；媒介細胞凋亡的受體DR3；誘導細胞凋亡的受體AIR；蛋白質WSL-1；TNFRSF12；APO-3；DDR3；LARD；DR3；誘導細胞凋亡的受體；死亡受體beta；蛋白質WSL；WSL-LR；TRAMP；WSL-1；APO3；WSL1；TR3；及WSL。死亡受體3的外部身份為HGNC：11910；Entrez Gene：8718；Ensembl：ENSG00000215788；OMIM：603366；及UniProtKB：Q93038。
死亡受體4為結合TRAIL的TNF受體超家族的細胞表面受體，且被認為轉導細胞死亡訊息及誘導細胞的細胞凋亡。死亡受體4以許多名稱為人所熟知，例如：TNFRSF10A；腫瘤壞死因子受體超家族成員10a；TNF相關的誘導細胞凋亡之配位體受體1(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptor 1)；死亡受體4；TRAIL受體1；TRAIL-R1；TRAILR1；APO2；DR4；腫瘤壞死因子受體成員10a變異體2；細胞毒殺 TRAIL受體；CD261抗原；TRAILR-1及CD261。死亡受體4的外部身份為HGNC：11904；Entrez Gene：8797；Ensembl：ENSG00000104689；OMIM：603611；及UniProtKB：O00220。
死亡受體5為結合TRAIL且媒介細胞凋亡的TNF受體超家族的細胞表面受體。此受體可被誘導腫瘤壞死因子相關的細胞凋亡之配位體(TNFSF10/TRAIL/APO-2L)所活化，且轉導細胞凋亡訊息。此受體以許多不同的名稱為人所熟知，其中有：TNFRSF10B；腫瘤壞死因子受體超家族成員10b；誘導TNF相關的細胞凋亡之配位體受體2；死亡受體5；TRAIL-R2；TRAILR2；KILLER；TRICK2；ZTNFR9；DR5；可誘導經P53調控的DNA損傷之細胞死亡受體(P53-Regulated DNA Damage-Inducible Cell Death Receptor)(Killer)；類腫瘤壞死因子受體蛋白質ZTNFR9；含有TRAIL/Apo-2L的受體之死亡域(Death Domain Containing Receptor For TRAIL/Apo-2L)；誘導細胞凋亡之蛋白質TRICK2A/2B；誘導細胞凋亡之受體TRAIL-R2；TNF受體超家族成員10b；細胞毒殺TRAIL受體2；類Fas蛋白質；TRAIL受體2；CD262抗原；KILLER/DR5；TRICK2A；TRICK2B；TRICKB；及CD262。死亡受體5的外部身份為：HGNC：11905；Entrez Gene：8795；Ensembl：ENSG00000120889；OMIM：603612；及UniProtKB：O14763。
死亡受體6一旦活化，就可誘導細胞的細胞凋亡。於小鼠中的基因剔除(knockout)研究建議，此受體在T輔助細胞的活化中起作用，且可能參與發炎及免疫調控。此受體亦被認為參與腦中導致阿茲海默症(Alzheimer's disease)的神經退 化(neurodegeneration)及於壓力回應及細胞生存中的訊息轉導。過度的表達誘導表達細胞的細胞凋亡。類澱粉前驅蛋白質(amyloid precursor protein，APP)是此受體的自然配位體，且先被切成Aβ及N-APP。N-APP為與DR6交互作用，以引起阿茲海默症病人中的軸突降解(axonal degradation)的片段。死亡受體6亦以許多其他名稱為人所熟知，例如TNFRSF21；腫瘤壞死因子受體超家族成員21；DR6；TNFR相關的死亡受體6(TNFR-Related Death Receptor 6)；CD358抗原；BM-018；及CD358。死亡受體6的外部身份為HGNC：13469；Entrez Gene：27242；Ensembl：ENSG00000146072；OMIM：605732；UniProtKB：O75509。
RANK為RANK配位體(RANK-Ligand，RANKL)的受體，且為調控蝕骨細胞(osteoclast)的分化及活化的RANK/RANKL/OPG訊息傳遞路徑的一部分。其與骨骼重組(bone remodeling)及修復、免疫細胞功能、淋巴節發育、熱調控及乳腺發育相關。蝕骨細胞抑制因子(Osteoprotegerin，OPG)為RANK的誘餌受體，且藉由爭奪RANKL，來調控RANK訊息傳遞路徑的刺激。RANK的細胞質域傳送訊息至下游的目標，例如NF-κB及JNK。RANK在骨骼肌、胸腺、肝、大腸、小腸、腎上腺、蝕骨細胞、乳腺上皮細胞、前列腺、血管細胞及胰臟中表達。NF-κB的活化時常由RANKL媒介，但單獨RANK的過度表達亦可活化NF-κB路徑。RANK以許多不同的名稱為人所熟知，例如：TNFRSF11A；腫瘤壞死因子受體超家族成員11a NFKB活化子(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 11 NFKB Activator)；雜合性缺失，18，染色體區1(Loss Of Heterozygosity,18,Chromosomal Region 1)；蝕骨細胞分化因子受體；NF-KB的受體活化子；骨骼2的佩吉特氏症(Paget Disease Of Bone 2)；ODFR；腫瘤壞死因子受體超家族，成員11a，NFKB的活化子(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily,Member 11a,Activator Of NFKB)；腫瘤壞死因子受體超家族成員11a，NFKB活化子(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 11a,NFKB Activator)；核因子kappa B的受體活化子(Receptor Activator Of Nuclear Factor-Kappa B)；CD265抗原；LOH18CR1；TRANCER；CD265；OPTB7；OSTS；PDB2；FEO及OFE。RANK的外部身份為：HGNC：11908；Entrez Gene：8792；Ensembl：ENSG00000141655；OMIM：603499及UniProtKB：Q9Y6Q6。
BAFF受體為辨認BAFF的TNF受體超家族的膜蛋白質。B細胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)增強B細胞於體外(in vitro)的存活，且為周邊B細胞(peripheral B-cell)群體的調控子。BAFF受體為BAFF的受體，且為含有單一胞外的富含苯丙胺酸域(phenylalanine-rich domain)的第III型跨膜蛋白質。據認為，此受體是經BAFF媒介之B細胞的存活所需的主要受體。BAFF還被TNF受體B細胞成熟抗原(TNF receptors B-cell maturation antigen，BCMA)和跨膜活化子和鈣調節性親環蛋白質配位體交互作用蛋白質(trans-membrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand-interacting protein，TACI)結合。此BAFF受體以許多不同的名稱為人所 熟知，例如TNFRSF13C；腫瘤壞死因子受體超家族成員13C；B細胞活化因子受體(B-Cell-Activating Factor Receptor)；BLyS受體3；BAFF-R；BAFFR；活化B細胞的因子受體(B Cell-Activating Factor Receptor)；CD268抗原；氟奮乃靜(Prolixin)；BROMIX；CD268；CVID4；及BR3。BAFF受體的外部身份為HGNC：17755；Entrez Gene：115650；Ensembl：ENSG00000159958；OMIM：606269；及UniProtKB：Q96RJ3。
B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)是辨認B細胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)的TNF受體超家族的細胞表面受體。此受體優先地表達在成熟B淋巴球中，且被認為對B細胞的發育及自體免疫反應而言是重要的。此受體已顯示特異性地結合至腫瘤壞死因子(配位體)超家族，成員13b(TNFSF13B/TALL-1/BAFF)，且引起NF-kappaB及MAPK8/JNK的活化。B-cell成熟抗原亦以許多化名為人所熟知，例如TNFRSF17；腫瘤壞死因子受體超家族成員17；B細胞成熟蛋白質；BCM；B細胞成熟因子；CD269抗原；TNFRSF13A；及CD269。BCMA的外部身份為HGNC：11913；Entrez Gene：608；Ensembl：ENSG00000048462；OMIM：109545；及UniProtKB：Q02223。
跨膜活化子和鈣調節性親環蛋白質配位體交互作用蛋白質(trans-membrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand-interacting protein，TACI)。被此基因編碼的蛋白質為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體超家族之對淋巴球特異性成員。此蛋白質與鈣調節子及親環蛋白 質配位體(calcium-modulator and cyclophilin ligand，CAML)交互作用。此蛋白質亦可結合BAFF及APRIL(TNSF13或CD256)。TACI誘導轉錄因子NFAT、AP1及NF-kappa-B的活化，且藉由與TNF配位體交互作用，在體液免疫(humoral immunity)中起作用。TACI缺乏的小鼠已增加脾臟B細胞及血清Ig，這建議為意指TACI於B細胞存活中潛在的負調控角色。然而，更簡單的解釋可能是，缺乏TACI允許更多的循BAFF變為可用，其可結合至BR3且增加B細胞的數量。與TACI相關的疾病包含免疫缺陷，常見變數，2(immunodeficiency,common variable,2)及免疫球蛋白質A缺陷2(immunoglobulin a deficiency 2)。編碼TACI的基因位於染色體17上的Smith-Magenis症候群區中。TACI亦以許多其他名稱為人所熟知，例如TNFRSF13B，腫瘤壞死因子受體超家族成員13B；跨膜活化子及CAML交互作用子(Transmembrane Activator And CAML Interactor)；腫瘤壞死因子受體13B；CD267抗原；TNFRSF14B；CD267；CVID2；IGAD2；CVID；及RYZN 3。TACI的外部身份為HGNC：18153；Entrez Gene：23495；Ensembl：ENSG00000240505；OMIM：604907；及UniProtKB：O14836。
TROY在胚胎發育的期間表達。已經顯示，當在細胞中過度表達時，活化JNK訊息傳遞路徑。此受體的活化可誘導細胞凋亡。此受體被認為在胚胎發育中起作用)。已描述編碼特殊同型異構物之選擇性剪接轉錄變異體。TROY亦以許多其他名稱為人所熟知，例如TNFRSF19；腫瘤壞死因子受體超家族成員19；毒性及JNK誘導子(Toxicity And JNK Inducer)； TRADE；TAJ；及TAJ-Alpha。TROY的外部身份為HGNC：11915；Entrez Gene：55504；Ensembl：ENSG00000127863；OMIM：606122；及UniProtKB：Q9NS68。
B7家族包含許多結構相關的細胞表面蛋白質，他們結合至淋巴球上調控免疫反應的受體。藉由細胞表面之對抗原特異性的T細胞受體或B細胞受體的參與，來啟動淋巴球的活化。同時由B7配位體傳送的額外訊息更決定這些細胞的免疫反應。由B7家族成員透過淋巴球上的受體的CD28家族傳送這些所謂的「共刺激」或「共抑制性」訊息。B7家族成員與共刺激受體的結合增強免疫反應，而與共抑制性受體的結合減弱免疫反應。目前，以下成員被認為是此家族的一部分：B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、可誘導之共刺激子配位體(inducible costimulator ligand，ICOS-L)、計劃性死亡1配位體(programmed death-1 ligand，PD-L1)、計劃性死亡2配位體(PD-L2)、B7-H3(CD276)、B7-H4、B7-H5、B7-H6及B7-H7。B7家族成員在淋巴及非淋巴組織中表達。成員對調控免疫反應的影響顯示於具有B7家族基因突變的小鼠中的免疫缺陷和自體免疫疾病中。操縱由B7配位體傳送的訊息，已顯示出治療自體免疫、發炎疾病及癌症的潛力。
因為B7家族成員傳送「共刺激」或「共抑制性」訊息至淋巴球，從而增強或減弱免疫反應，所以結合TNF受體超家族成員的胞外部分及B7家族成員的胞外部分的根據本發明之結合分子或抗體或其變異體提供可特別地好促進期望的免疫反應的益處。因此，藉由以B7家族的成員為標靶，有 可能增強刺激訊息及/或抵消抑制訊息，藉此誘導或增強期望的免疫反應，例如對抗異常細胞。
CD80為在活化的B細胞及單核球上發現的蛋白質，其提供T細胞的活化及生存所必要的共刺激訊息。CD80為T細胞表面上的兩個不同蛋白質的配位體：CD28及CTLA-4。當CD80與CD28結合時，其與共刺激相關，而結合至CTLA4與免疫反應的減弱相關。CD80與CD86協同地(in tandem)作用，以活化T細胞。CD80被報導為亦結合PD-L1。CD80以許多其他名稱為人所熟知，例如CD80分子；CD80抗原；CD28抗原配位體1；B7-1抗原；B淋巴球活化抗原B7；CTLA-4反受體B7.1(CTLA-4 Counter-Receptor B7.1)；活化B7-1抗原；CD28LG1；CD28LG；LAB7；BB1；B7；共刺激因子CD80；CD80抗原；及B7-1。CD80的外部身份為HGNC：1700；Entrez Gene：941；Ensembl：ENSG00000121594；OMIM：112203；及UniProtKB：P33681。
CD86為在抗原呈現細胞上表達的蛋白質。CD86可提供用於T細胞活化及生存的共刺激訊息。其為T細胞表面上兩個不同蛋白質的配位體：CD28及CTLA-4。當CD86與CD28結合時，其與共刺激相關，而結合至CTLA4與免疫反應的減弱相關。CD86與CD80協同地(in tandem)作用，以活化T細胞。CD86以許多其他名稱為人所熟知，例如CD86分子；CD86抗原；CD28抗原配位體2；B7-2抗原；CTLA-4反受體B7.2；CD28LG2；FUN-1；BU63；B70；B淋巴球活化抗原B7-2；活化B7-2抗原；CD86抗原；LAB72；及B7-2。CD86的外部 身份為HGNC：1705；Entrez Gene：942；Ensembl：ENSG00000114013；OMIM：601020；及UniProtKB：P42081。
可誘導的T細胞共刺激子配位體(Inducible T-Cell Co-Stimulator Ligand，ICOSL或CD275)由APC及許多非血液性組織持續地表達。表達可被進行中的發炎所下調。ICOSL目前已知與人類中的ICOS、CD28及CTLA-4交互作用。ICOSL/CD28的交互作用似乎共刺激人類T細胞對異體抗原(allogeneic antigen)的初級反應及記憶回憶反應。ICOSL/CTLA-4被認為引起共抑制性訊息。ICOSL亦以ICOSLG；B7相關蛋白質1；B7同源物2(B7 Homolog 2)；類B7蛋白質G150；B7同源物2(B7 Homologue 2)；B7RP-1；B7-H2；B7RP1；B7H2；跨膜蛋白質B7-H2 ICOS配位體(Transmembrane Protein B7-H2 ICOS Ligand)；CD275抗原；KIAA0653；ICOS-L；LICOS；及GL50為人所熟知。ICOSL的外部身份為HGNC：17087；Entrez Gene：23308；Ensembl：ENSG00000160223；OMIM：605717；及UniProtKB：O75144。
PD-L1為第1型跨膜蛋白質，其在特定事件的期間，例如懷孕、組織異體移植(tissue allograft)、自體免疫疾病及其他疾病狀態例如肝炎，於抑制免疫反應中起作用。PD-L1在各種類型的癌症中表達，特別是在NSCLC(Boland et al.,2013；Velcheti et al.,2014)、黑色素瘤、腎細胞癌、胃癌、肝細胞癌以及各種血癌和多發性骨髓瘤(multiple myeloma)(Bernstein et al.,2014；Thompson et al.,2005)。PD-L1存在於癌細胞的細胞質及細胞膜中，但並不是所有癌症或腫瘤內的所有細胞都表 達PD-L1(Dong et al.,2002)。多個腫瘤微環境細胞藉由上調PD-L1的表達，來促進免疫抑制。此效應被稱為「適應性免疫耐受性(adaptive immune resistance)」，因為腫瘤回應於由活化的T細胞所產生的IFN-γ，藉由誘導PD-L1以保護自己(Sharma et al.,2017)。PD-L1亦可被致癌基因(ongcogene)調控，此機制以先天免疫抗性(inherent immune resistance)為人所熟知(Akbay et al.,2013)。在腫瘤微環境內，PD-L1亦在骨髓細胞和活化的T細胞上表達(Tumeh et al.,2014)。透過多種促發炎分子，包含第I和II型IFN-γ、TNF-α、LPS、GM-CSF及VEGF，還有細胞激素IL-10及IL-4，來誘導PD-L1的表達，其中IFN-γ是最有效的誘導子(Kondo et al.,2010；Sznol and Chen,2013)。
PD-L1結合至PD-1或B7.1(CD80)傳遞減少表達PD-1的T細胞的增殖的抑制訊息。PD-1被認為能夠透過細胞凋亡，來控制外來抗原特異性T細胞的累積。PD-L1由多種癌細胞表達，且其表達被認為至少部分負責減緩對抗癌細胞的免疫反應。PD-L1是蛋白質的B7家族的成員，且以各種其他名稱為人所熟知，例如CD274分子；CD274抗原；B7同源物1；PDCD1配位體1；PDCD1LG1；PDCD1L1；B7H1；PDL1；計劃性細胞死亡1配位體1；計劃性死亡配位體1；B7-H1；及B7-H。CD274的外部身份為HGNC：17635；Entrez Gene：29126；Ensembl：ENSG00000120217；OMIM：605402；UniProtKB：Q9NZQ7。
PD-L2是PD-1的第二配位體。PD-1藉由PD-L2 的參與抑制了由T細胞受體(T cell receptor，TCR)媒介的增殖及由CD4+ T細胞產生的細胞激素。在低抗原濃度時，PD-L2/PD-1的結合抑制B7-CD28訊息。在高抗原濃度時，PD-L2/PD-1的結合降低細胞激素的產生。藉由干擾素gamma的處理，在抗原呈現細胞上上調PD-L的表達。其在一些正常組織及各種腫瘤中表達。PD-L1及PD-L2被認為具有重疊的功能且調控T細胞的回應。此蛋白質以許多其它名稱為人所熟知，例如計劃性細胞死亡1配位體2；B7樹突細胞分子；計劃性死亡配位體2；嗜乳脂蛋白質B7-DC(Butyrophilin B7-DC)；PDCD1配位體2；PD-1配位體2(PD-1 Ligand 2)；PDCD1L2；B7-DC；CD273；B7DC；PDL2；PD-1-配位體2(PD-1-Ligand 2)；CD273抗原；BA574F11.2；及Btdc。PD-L2的外部身份為HGNC：18731；Entrez Gene：80380；Ensembl：ENSG00000197646；OMIM：605723；及UniProtKB：Q9BQ51。
B7-H3(CD276)的表達在各種惡性腫瘤中增加，且可在正常及腫瘤衍生的循環內皮細胞之間區分(Kraan et al British Journal of Cancer(2014)111,149-156)。受體的刺激引導人類骨髓基質細胞(marrow stromal cell)分化為成骨細胞(Xu et al 2011；Immunobiology 216(2011)1311-1317)。此蛋白質在人類中含有4個類Ig域，而小鼠蛋白質似乎具有兩個這樣的區域。此蛋白質被認為是在類骨髓細胞(TREM)轉錄體2(myeloid cells(TREM)-like transcript 2，TLT-2或TREMML2)上表達的觸發受體(triggering receptor)的第一個被鑑定出來的配位體。後者蛋白質結合B7-H3(4Ig-B7-H3)且共刺激CD8 T 細胞的活化(Hofmeyer et al 2009 PNAS 105；10277-10278)。CD276被廣泛地表達。其作為T細胞共刺激子。CD276亦以許多其它名稱為人所熟知，例如CD276分子；共刺激分子；CD276抗原；B7同源物3；4Ig-B7-H3；B7-H3；B7H3；及B7RP-2。CD276的外部身份為HGNC：19137；Entrez Gene：80381；Ensembl：ENSG00000103855；OMIM：605715；及UniProtKB：Q5ZPR3。
B7-H4(VTCN1)的mRNA似乎廣泛地表達，但只有少數細胞主動地在膜上表達此蛋白質。B7-H4的表達和與活化的T細胞的結合藉由細胞週期停滯、減少增殖及減少IL-2的產生，來抑制T細胞效應子功能。在各種人類癌症中，於癌細胞和免疫抑制性腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)的表面上上調B7-H4。透過B7-B4路徑的訊息傳遞導致抑制經TCR媒介的CD4+及CD8+ T細胞增殖、細胞週期的進程及IL-2的產生。B7-H4亦以許多其它名稱為人所熟知，例如含有V-Set域的T細胞活化抑制子1(V-Set Domain Containing T Cell Activation Inhibitor 1)；免疫共刺激蛋白質B7-H4；T細胞共刺激分子B7x(T-Cell Costimulatory Molecule B7x)；B7超家族成員1；B7同源物4；B7h.5；B7H4；T細胞共刺激蛋白質B7x(T Cell Costimulatory Molecule B7x)；B7家族成員，H4；蛋白質B7S1；PRO1291；VCTN1；B7S1；B7X；及H42。B7-H4的外部身份為HGNC：28873；Entrez Gene：79679；Ensembl：ENSG00000134258；OMIM：608162及UniProtKB：Q7Z7D3。
B7-H5(VISTA)是B7家族的55至65kDa的成員。其為在骨骼中、在胚胎幹細胞(embryonic stem cell，ESC)上及在腫瘤細胞表面上表達的跨膜分子。在腫瘤細胞上，此蛋白質既促進MT1-MMP的表達及活性，且作為MT1-MMP的基質。這增加了細胞移動的可能性。此蛋白質以許多其它名稱為人所熟知，例如染色體10開放閱讀框架54(Chromosome 10 Open Reading Frame 54)；含V-Set域的免疫調控受體(V-Set Domain-Containing Immunoregulatory Receptor)；T細胞活化的V域Ig抑制子(V-Domain Ig Suppressor Of T Cell Activation)；壓力誘導的分泌型蛋白質1(Stress-Induced Secreted Protein-1)；Sisp-1；SISP1；壓力誘導的分泌型蛋白質1(Stress Induced Secreted Protein 1)；血小板受體GI24；血小板受體Gi24；死亡域1 alpha(Death Domain1alpha)；DD1alpha；B7H5；及GI24。此蛋白質的外部身份為：HGNC：30085；Entrez Gene：64115；Ensembl：ENSG00000107738；OMIM：615608；及UniProtKB：Q9H7M9。
B7-H6屬於B7家族(見MIM 605402)且在腫瘤細胞上選擇性地表達。B7-H6與NKp30(NCR3；MIM 611550)的結合導致自然殺手(natural killer，NK)細胞的活化及細胞毒性(Brandt et al.,2009 J Exp Med.2009 Jul 6；206(7)：1495-503)。自然殺手(NK)細胞為參與消除腫瘤的先天免疫系統的淋巴球。B7-H6為結合NKp30的腫瘤細胞表面分子，NKp30是觸發抗腫瘤NK細胞的細胞毒性及細胞激素的分泌的人類受體。B7-H6的其它名稱為NCR3LG1；自然殺手細胞細胞毒性受體3配位 體1(Natural Killer Cell Cytotoxicity Receptor 3 Ligand 1)；B7同源物6；B7H6；含有假類Ig域的蛋白質(Putative Ig-Like Domain-Containing Protein)DKFZp686O24166/DKFZp686I21167；及DKFZp686O24166。B7-H6的外部身份為HGNC：42400；Entrez Gene：374383；Ensembl：ENSG00000188211；OMIM：613714；及UniProtKB：Q68D85。
在胎盤的滋養層細胞(trophoblastic cell)及腸道、腎臟，膽囊和胸的上皮中，但不在其它大部分的器官中，偵測到B7-H7(HHLA2)蛋白質。在來自乳、肺、甲狀腺、黑色素瘤、胰、卵巢、肝、膀胱、大腸、前列腺、腎和食道的人類癌症中廣泛地表達HHLA2蛋白質。HHLA2的高度表達與區域的淋巴結轉移和分期(stage)相關(Janakiram et al.Clin Cancer Res；21(10)：2359-66；May 15,2015)。TMIGD2被鑑定為HHLA2的受體之一。B7-H7以許多不同的名稱為人所熟知，例如HERV-HLTR關聯2(HERV-H LTR-Associating 2)；人類內源性反轉錄病毒H長末端重複相關蛋白質2(Human Endogenous Retrovirus-H Long Terminal Repeat-Associating Protein 2)；B7H7及B7y。B7-H7的外部身份為HGNC：4905；Entrez Gene：11148；Ensembl：ENSG00000114455；OMIM：604371及UniProtKB：Q9UM44。
計劃性細胞死亡1蛋白質(Programmed Cell Death 1 protein，PD-1)是屬於受體的CD28家族的細胞表面受體，且在T細胞及前B細胞(pro-B cell)上表達。目前已知PD-1結合 兩個配位體，PD-L1及PD-L2。PD-1，作為免疫檢查點，藉由抑制T細胞的活化，在下調免疫系統中扮演重要角色，接著減少自體免疫並促進自身耐受性(self-tolerance)。PD-1的抑制效果被認為是，透過促進淋巴節中抗原特異性T細胞中的細胞凋亡(計劃性細胞死亡)，同時減少調節性T細胞(抑制性T細胞)中的細胞凋亡的雙重機制來實現。PD-1亦以許多不同的化名為人所熟知，例如PDCD1；計劃性細胞死亡1；全身性紅斑性狼瘡易感性2(Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility 2)；蛋白質PD-1；HPD-1；PD1；計劃性細胞1蛋白質；CD279抗原；CD279；HPD-L；HSLE1；SLEB2；及PD-1。PD-1的外部身份為HGNC：8760；Entrez Gene：5133；Ensembl：ENSG00000188389；OMIM：600244；及UniProtKB：Q15116。阻斷PD-1活性的新型藥物，PD-1抑制子，活化免疫系統，以攻擊腫瘤，因此成功用於治療某些類型的癌症。
CLEC12A亦被稱為C型凝集素域家族12，成員A(C-Type Lectin Domain Family 12,member A)；C型凝集素蛋白質CLL-1；MICL；樹突細胞相關凝集素2；C型凝集素超家族；骨髓抑制性類C型凝集素受體(Myeloid Inhibitory C-Type Lectin-Like Receptor)；類C型凝集素分子1(C-Type Lectin-Like Molecule-1)；CLL-1；DCAL2；CLL1；類C型凝集素分子1(C-Type Lectin-Like Molecule 1)；DCAL-2；類殺手細胞凝集素受體次家族L，成員1(Killer cell lectin like receptor subfamily L,member 1，KLRL1)；CD371(Bakker A.et al.Cancer Res.2004,64,p8843 50；GenBankTM access.No： AY547296；Zhang W.et al.GenBankTM access.No：AF247788；A.S.Marshall,et al.J Biol Chem 2004,279,p14792-802；GenBankTM access.No：AY498550；Y.Han et al.Blood 2004,104,p2858 66；H.Floyd,et al.GenBankTM access.No：AY426759；C.H.Chen,et al.Blood 2006,107,p1459 67)。身份：HGNC：31713；Entrez Gene：160364；Ensembl：ENSG00000172322；OMIM：612088；UniProtKB：Q5QGZ9。CLEC12A是在急性骨髓血癌(acute myeloid leukemia，AML)中的血癌母細胞上及血癌幹細胞上表達的抗原，其中血癌幹細胞包含CD34陰性或低表達CD34的血癌幹細胞(側群(side population))(A.B.Bakker et al.Cancer Res 2004,64,p8443 50；Van Rhenen et al.2007 Blood 110：2659；Moshaver et al.2008 Stem Cells 26：3059)。CLEC12A的表達另外被認為限於造血族系，特別是周邊血液及骨髓中的骨髓細胞，即顆粒細胞、單核球及樹突細胞前驅體。更重要地是，CLEC12A不存在於造血幹細胞上。此表達輪廓(expression profile)使CLEC12A在AML中成為特別有利的標靶。CLEC12A的全長型式包含275個胺基酸殘基，包含在大多數其它同型異構物中不存在的10個胺基酸的額外胞內段，且顯示嚴格的骨髓表達輪廓(表面表達及mRNA量)。術語「CLEC12A或其功能等價物」意指如上所述的所有(例如剪接和突變)變異體及其保留嚴格的骨髓表達輪廓(在表面表達量及mRNA量兩者)的同型異構物，如Bakker et al.Cancer Res 2004,64,p8443-50及Marshall 2004-J Biol Chem 279(15),p14792-802中所述。本發明的CLEC12A結合抗體結 合人類CLEC12A。在本文提及CLEC12A時，除非另外說明，否則所提及的是人類CLEC12A。
「ErbB1」或「EGFR」是四種受體酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)，命名為Her-或cErbB-1、-2、-3及-4，的家族的成員。EGFR具有由四個次域(sub-domain)構成的胞外域(extracellular domain，ECD)，其中兩者參與配位體的結合，而其中一者參與同質二聚體化(homo-dimerisation)及異質二聚體化(hetero-dimerisation)。本節所使用的參考文獻編號意指在以「說明書中引用的參考文獻」為標題的列表中的參考文獻的編號。EGFR整合來自各種配位體的胞外訊息，以產生不同的胞內反應。EGFR活化的主要訊息轉導路徑由Ras有絲分裂活化蛋白質激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)有絲分裂訊息傳遞級聯(mitogenic signalling cascade)構成。藉由將Grb2募集至酪胺酸磷酸化的EGFR，來啟動此路徑的活化。這透過結合Grb2的Ras-鳥嘌呤核苷酸交換因子(Grb2-bound Ras-guanine nucleotide exchange factor)無七之子(Son of Sevenless，SOS)，來引發Ras的活化。此外，PI3-激酶-Akt訊息轉導路徑亦由EGFR活化，儘管在Her3共表達的情況下，此活化更強。EGFR涉及許多人類上皮惡性腫瘤，特別是胸、膀胱、非小細胞肺癌肺、大腸、卵巢、頭頸和腦的癌症。已經發現，基因的活化突變，以及受體及其配位體的過度表達，引起自分泌(autocrine)活化迴路。因此，此RTK已廣泛地作為癌症治療的標靶。以RTK為目標的小分子抑制子和針對胞外配位體結合域的單株抗體(monoclonal antibody，mAb) 都已經開發出來，且儘管大部分針對選擇的一組病人，目前為止已經顯示許多臨床的成功。人類EGFR蛋白質和編碼它的基因的資料庫登錄號是(GenBank NM_005228.3)。主要給予登錄號，以提供另一種鑑別EGFR蛋白質為標靶的方法。舉例而言，因為編碼基因的突變，被抗體結合的EGFR蛋白質的實際序列可以改變，例如在一些癌症及類似癌症中發生的那些。除非另外說明，在本文提到EGFR的地方意指人類EGFR。結合EGFR的抗原結合位結合EGFR及其各種變異體，例如在EGFR陽性腫瘤上表達的那些。
本文所使用的「ErbB-2」或「HER2」意指在人類中由ERBB-2基因所編碼的蛋白質。此基因或蛋白質的替代名稱包含CD340；HER-2；HER-2/neu；MLN 19；NEU；NGL；TKR1。ERBB-2基因常被稱為HER2(來自人類上皮生長因子受體2)。在本文提到ErbB-2的地方，意指人類ErbB-2。包含結合ErbB-2之抗原結合位的抗體結合人類ErbB-2。由於人類和其它哺乳動物同源基因(ortholog)之間的序列及三級結構的-相似性，ErbB-2抗原結合位也可結合這樣的同源基因，但不一定如此。人類ErbB-2蛋白質和編碼它的基因的資料庫登錄號為(NP_001005862.1、NP_004439.2 NC_000017.10 NT_010783.15 NC_018928.2)。主要給予登錄號，以提供另一種鑑別ErbB-2作為標靶的方法。舉例而言，因為編碼基因的突變，例如在一些癌症及類似癌症中發生的那些，被抗體結合的ErbB-2蛋白質的實際序列可以改變。ErbB-2抗原結合位結合ErbB-2及其各種變異體，例如由ErbB-2陽性腫瘤細胞表達 的那些。
本文所使用的「ErbB-3」或「HER3」意指在人類中由ERBB-3基因所編碼的蛋白質。基因或蛋白質的替代名稱包含HER3；LCCS2；MDA-BF-1；c-ErbB-3；c-erbb-3；erbb-3-S；p180-Erbb-3；p45-sErbb-3；及p85-sErbb-3。在本文提到ErbB-3的地方，除非另外說明，意指人類ErbB-3。包含結合ErbB-3之抗原結合位的抗體結合人類ErbB-3。由於人類和其它哺乳動物同源基因之間的序列及三級結構的相似性，ErbB-3抗原結合位也可結合這樣的同源基因，但不一定如此。人類ErbB-3蛋白質和編碼它的基因的資料庫登錄號為(NP_001005915.1 NP_001973.2、NC_000012.11 NC_018923.2 NT_029419.12)。主要給予登錄號，以提供另一種鑑別ErbB-3作為標靶的方法。舉例而言，因為編碼基因的突變，例如在一些癌症及類似癌症中發生的那些，被抗體結合的ErbB-3蛋白質的實際序列可以改變。ErbB-3抗原結合位結合ErbB-3及其各種變異體，例如由ErbB-3陽性腫瘤細胞表達的那些。
LGR4是含有富含白胺酸重複的G蛋白質偶聯受體4(Leucine-Rich Repeat Containing G-Protein-Coupled Receptor 4)。此基因或蛋白質的替代名稱為：GPR48；G蛋白質偶聯受體48；BNMD17；含有富含白胺酸重複的G蛋白質偶聯受體4(Leucine-Rich Repeat-Containing G-Protein-Coupled Receptor 4)；含有富含白胺酸重複的G蛋白質偶聯受體4(Leucine-Rich Repeat-Containing G-Protein Coupled Receptor 4)；G蛋白質偶聯受體48(G-Protein Coupled Receptor 48)。
本發明之結合LGR4的蛋白質或抗體結合人類LGR4。由於人類和其它哺乳動物同源基因之間的序列及三級結構的相似性，本發明之LGR4結合蛋白質或抗體也可結合這樣的同源基因，但不一定如此。人類LGR4蛋白質和編碼它的基因的資料庫登錄號為(NC_000011.10；NC_018922.2；NT_009237.19；NP_060960.2)。主要給予登錄號，以提供另一種鑑別LGR4作為標靶的方法。舉例而言，因為編碼基因的突變，例如在一些癌症及類似癌症中發生的那些，結合的LGR4蛋白質的實際序列可以改變。LGR4抗原結合位結合LGR4及其各種變異體，例如由LGR4陽性腫瘤細胞表達的那些。
LGR5是含有富含白胺酸重複的G蛋白質偶聯受體5(Leucine-Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 5)。此基因或蛋白質的替代名稱為含有富含白胺酸重複的G蛋白質偶聯受體5(Leucine-Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 5)；含有富含白胺酸重複的G蛋白質偶聯受體5(Leucine-Rich Repeat-Containing G Protein-Coupled Receptor 5)；G蛋白質偶聯受體HG38；G蛋白質偶聯受體49(G-Protein Coupled Receptor 49)；G蛋白質偶聯受體67；GPR67；GPR49；孤兒G蛋白質偶聯受體HG38(Orphan G Protein-Coupled Receptor HG38)；G蛋白質偶聯受體49(G Protein-Coupled Receptor 49)；GPR49；HG38及FEX。
本發明之結合LGR5的蛋白質或抗體結合人類LGR5。由於人類和其它哺乳動物同源基因之間的序列及三級結構的相似性，本發明之LGR5結合蛋白質或抗體也可結合這 樣的同源基因，但不一定如此。人類LGR5蛋白質和編碼它的基因的資料庫登錄號為(NC_000012.12；NT_029419.13；NC_018923.2；NP_001264155.1；NP_001264156.1；NP_003658.1)。主要給予登錄號，以提供另一種鑑別LGR5作為目標的方法。舉例而言，因為編碼基因的突變，例如在一些癌症及類似癌症中發生的那些，被結合的LGR5蛋白質的實際序列可以改變。LGR5抗原結合位結合LGR5及其各種變異體，例如由LGR5陽性腫瘤細胞表達的那些。
ZNRF3為鋅和無名指3(Zinc And Ring Finger 3)。此基因或蛋白質的替代名稱為鋅和無名指3(Zinc And Ring Finger 3)；鋅/無名指蛋白質3(Zinc/RING Finger Protein 3)；無名指蛋白質203(RING Finger Protein 203)；KIAA1133；RNF203；新C3HC4型鋅手指(無名指)(Novel C3HC4 Type Zinc Finger(Ring Finger))；E3泛素-蛋白質連接酶ZNRF3(E3 Ubiquitin-Protein Ligase ZNRF3)；CTA-292E10.6；EC 6.3.2.；及BK747E2.3 3。
本發明之結合ZNRF3的蛋白質或抗體結合人類ZNRF3。由於人類和其它哺乳動物同源基因之間的序列及三級結構的相似性，本發明之ZNRF3結合蛋白質或抗體也可結合這樣的同源基因，但不一定如此。人類ZNRF3蛋白質和編碼它的基因的資料庫登錄號為(NC_000022.11；NT_011520.13；NC_018933.2；NP_001193927.1；NP_115549.2)。主要給予登錄號，以提供另一種鑑別ZNRF3作為目標的方法。舉例而言，由於編碼基因的突變，例如在一些癌症及類似癌症中發生的那 些，被結合的ZNRF3蛋白質的實際序列可以改變。ZNRF3抗原結合位結合ZNRF3及其各種變異體，例如由ZNRF3陽性腫瘤細胞表達的那些。
RNF43為無名指蛋白質43(Ring Finger Protein 43)。此基因或蛋白質的替代名稱為無名指蛋白質43(Ring Finger Protein 43)；RNF124；E3泛素-蛋白質連接酶RNF43(E3 Ubiquitin-Protein Ligase RNF43)；無名指蛋白質43(RING Finger Protein 43)；EC 6.3.2.；URCC。
本發明之結合RNF43的蛋白質或抗體結合人類RNF43。由於人類和其它哺乳動物同源基因之間的序列及三級結構的相似性，本發明之RNF43結合蛋白質或抗體也可結合這樣的同源基因，但不一定如此。人類RNF43蛋白質和編碼它的基因的資料庫登錄號為(NC_000017.11；NT_010783.16；NC_018928.2；NP_001292473.1；NP_001292474.1；NP_060233.3)。主要給予登錄號，以提供另一種鑑別RNF43作為目標的方法。舉例而言，因為編碼基因的突變，例如在一些癌症及類似癌症中發生的那些，被結合的RNF43蛋白質的實際序列可以改變。RNF43抗原結合位結合RNF43及其各種變異體，例如由RNF43陽性腫瘤細胞表達的那些。
提及序列識別符(sequence identifier)，以識別那個蛋白質被作為標靶。結合分子，例如本發明之結合抗體，亦辨認至少其變異體中的一些，例如其對偶變異體(allelic variant)、剪接變異體(splice variant)及突變變異體，只要抗體各自的可變域所辨認的抗原決定基沒有受影響。一些替代名稱可能或可 能沒用於指其它蛋白質。給予名稱僅用於參考的目的。結合分子，例如本發明之抗體，結合至在細胞上表達的蛋白質。只要結合分子結合的抗原決定基可用，其亦可結合至此蛋白質的變異體。因此，只要抗原決定基可用，剪接變異體或突變蛋白質(如果有)亦會被結合。結合分子結合至指定的蛋白質意指其可作為一種性質結合至蛋白質，且不意味著結合蛋白質實際上被目標結合，雖然它可以。這也不意指抗體不會結合至其它蛋白質。目前，這樣的交叉反應(cross-reactivity)對於結合分子，例如本發明之抗體，是未知的。然而，沒有明確地排除這種交叉反應可能存在。
本發明揭露一種結合TNF受體超家族的成員的胞外部分(第一膜蛋白質)的結合分子及第二膜蛋白質的胞外部分。所述第二膜蛋白質較佳地不是TNF受體超家族的成員。這樣的結合分子亦更稱為「本發明之結合分子」。結合分子較佳地為結合蛋白質。在一較佳實施例中，結合分子為抗體或其變異體，較佳地為雙等異性抗體或其變異體。還提供包含兩個或更多個如本文所述的結合分子的部分的組合物及套組。
本發明之結合分子較佳地為抗體(或如本案中別處所述的其變異體)、擬抗體(antibody mimetic)、多肽、適體(aptamer)或前述之組合。這些蛋白質或適體通常結合至一個目標。本發明之結合分子結合至兩個或更多個目標。結合分子較佳地結合兩個目標。抗體或雙特異性抗體的變異體維持這個面向。結合蛋白質或適體具有與目標結合的結合位(抗原結合位)。結合蛋白質或適體較佳地包含兩個或更多個較佳地具有對目 標(抗原)的結合位的區域(domain)，較佳地為一個結合位一個區域。這樣的區域較佳地為抗體可變域或其變異體。抗體可變域一直是許多研究的主題。製造許多與可變域或其部分類似的變異體，此變異體保留了正常可變域的結合特異性。這樣的變異體的非限制性範例在本文其它地方描述。
應該理解是，可藉由習知的方法，將這些抗體、擬抗體、多肽及適體的任何組合連接在一起。舉例而言，在一些實施例中，本發明之結合分子為共軛物或融合蛋白質。對抗體而言，製造多特異性抗體的技術已發展到還包含具有與正常單特異性抗體相同的整體結構，但其中抗體的兩個臂各自結合不合目標的雙特異性抗體。
和抗體一樣，擬抗體為可特異性地結合抗原，但結構上與抗體無關的多肽。擬抗體通常是莫耳質量約3至20kDa的人工胜肽或蛋白質。與抗體相比，共同的優點是更好的可溶性、組織滲透性、對熱及酵素的穩定性以及相對較低的生產成本。擬抗體的非限制性範例為親和體分子(affibody molecule)(通常基於蛋白質A的Z域)；親和素(affilin)(通常基於Gamma-B結晶或泛素)；affimer(通常基於胱蛋白質(Cystatin))；affitin(通常基於來自嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)的Sac7d)；alphabody(通常基於三重螺旋捲曲螺旋(Triple helix coiled coil))；anticalins(通常基於脂質載運蛋白質(lipocalin))；avimer(通常基於各種膜受體的A域)；DARPin(通常基於錨蛋白質重複基序(ankyrin repeat motif))；fynomer(通常基於Fyn 7的SH3域)；kunitz域胜肽(通常基於 各種蛋白質酶抑制子的Kunitz域)；以及單體(monobody)(通常基於纖維粘連蛋白質(fibronectin)的第III型域)。
單體是人工的結合蛋白質，其使用纖維粘連蛋白質第III型域(fibronectin type III domain，FN3)作為分子支架建造。對於產生標靶結合蛋白質而言，單體是抗體的簡單且強健的替代物。術語「單體」在1998年由Koide團隊所創造(coin)，他們發表了第一篇論文，使用人類纖維粘連蛋白質的第十FN3域，展示了單體的概念。
單體及其它擬抗體通常從組合庫中產生，其中使用分子展示和定向進化技術，例如噬菌體展示、mRNA展示及酵母菌表面展示，將部分的支架多樣化。許多擬抗體對其各自的標靶具有高親和性及高度特異性。
適體是結合至特定標靶分子的寡核苷酸或胜肽分子。通常藉由從大的隨機序列池(random sequence pool)選擇適體，來創造適體，但天然適體亦存在於核糖開關(riboswitch)中。適體可用於基礎研究及臨床目的作為大分子。
如本文所使用，術語「共軛物」是指已經共價連接的兩個或更多個分子，其選擇性地透過連接區共價連接。舉例而言，在一些實施例中，共軛物為藉由連接區連接至第二蛋白質或非蛋白質基團(moiety)的第一蛋白質或非蛋白質基團。舉例而言，在本發明之結合分子的一些實施例中，其包含或由已經共價連接的兩個或更多個抗體組成。共軛物不限於第一基團或第二基團，但在一些實施例中，亦可具有藉由另外的連結區連接的第三、第四或更多基團。如本案其它地方所述，蛋白 質基團的範例包含但不限於：多肽、擬肽(peptidomimetic)或抗體(或如本案中其它地方所述的抗體部分、衍生物或類似物)。非蛋白質基團的範例包含但不限於適體。可使用許多類型的接頭(linker)，且根據共軛物中的分子類型及接頭所需的性質(長度、彈性、對蛋白質酶活性的抗性及其它類似的特性)，選擇合適的接頭。這樣的接頭可包含核苷酸、多肽或合適的人工材料。舉例而言，接頭可為彈性胜肽接頭。在某些實施例中，接頭可為可切割接頭，允許部分的共軛物彼此分離。在其它實施例中，胜肽接頭可為螺旋接頭。用於連接蛋白質和其它分子的各種範例及套組為本領域所習知的。如本文所使用，術語「融合蛋白質(fusion protein)」是指包含兩個或更多個多肽或蛋白質的蛋白質，其中前述多肽或蛋白質已經在DNA層級藉由重組(recombination)連接在一起，且以單一多肽一起表達。融合蛋白質也可包含亦由DNA編碼且與融合蛋白質一起表達的胜肽連接區。為融合蛋白質的一部分的胜肽接頭可設計為具有特定的特性，例如彈性、親水性、蛋白質酶抗性、可裂性等。所有這些性質都可在DNA序列內設計，且設計接頭的方法亦為本領域非常習知。舉例而言，抗體可藉由本領域非常習知的方法，將抗體連接在一起，並且如本文所述，形成雙特異性或多標靶抗體。再者，可藉由本領域各種習知的方法，例如藉由使用諸如Biclonics®(見，例如WO 2013/157954)的技術，來建造雙特異性抗體。雙特異性單株抗體(bispecific monoclonal antibody，BsMAb、BsAb)通常包含兩個不同單株抗體的結合域，因此結合至兩個不同的抗原決定基。Biclonics®分子，以及其 它全長IgG雙特異性抗體具有兩個不同的抗原結合特異性，其由scFv的Fab的全長IgG分子的兩個不同可變區所編碼。如本文其它地方所詳述的，可藉由用編碼兩個不同的共同輕鏈(common light chain，cLC)抗體的遺傳構築體(construct)共轉染個別細胞，來生產Biclonics®。CH3工程確保有效率的異質二聚體化及基本上純的雙特異性抗體的形成。
本發明之結合分子較佳地為抗體或其變異體。本發明之結合分子較佳地為雙特異性抗體或其變異體。
抗體通常透過所謂的抗原結合位結合其目標。未修飾的抗原結合位通常由抗體的可變域形成並存在於其中。可變域含有所述抗原結合位。結合抗原的可變域為包含結合抗原的抗原結合位的可變域。
在一實施例中，抗體可變域包含重鏈可變區(heavy chain variable region，VH)和輕鏈可變區(light chain variable region，VL)。抗原結合位可存在於組合的VH/VL可變域中，或只在VH區或只在VL區中。當抗原結合位存在於可變域的兩個區的一者中時，對應的可變區可有助於結合可變區的折疊及/或穩定性，但不顯著地有助於抗原自身的結合。
如本文所使用，抗原結合是指抗體對其抗原的典型結合能力。可以用各種方式，評估抗體與抗原的結合。一種方式是將抗體與抗原(較佳地為表達抗原的細胞)一起培養，移除未結合的抗體(較佳藉由洗滌步驟)，且藉由結合至結合的抗體的標記抗體，來偵測結合的抗體。
通常透過抗體的互補決定區(complementarity determining region，CDR)及抗原和可變域的特異性三維結構，從而允許這兩個結構精準地結合在一起(類似鎖和鑰匙的交互作用)，來媒介經抗體的抗原結合，與隨機、非特異性的蛋白質附著不同。由於抗體通常辨認部分抗原，其稱為抗原的抗原決定基，因此這樣的抗原決定基也可存在於其它化合物中，根據本發明之抗體也可辨認其它蛋白質，如果這樣的其它化合物含有相同的抗原決定基。因此，術語「結合」不排除抗體結合至另一蛋白質或含有相同抗原決定基的蛋白質。這種其它蛋白質較佳地不是人類蛋白質。
本發明之蛋白質，例如抗體，通常除了在出生後，較佳地為成年人類的細胞膜上的特定目標蛋白質以外，不會結合至其它蛋白質。
如本文所使用的術語「抗體」意指蛋白質(proteinaceous)分子，較佳地屬於蛋白質的免疫球蛋白質類型，其含有一或更多個結合抗原上的抗原決定基的可變域，其中這樣的域衍生自或與抗體的可變域共有序列同源性。用於治療用途的抗體較佳地盡可能地接近待治療受試者的天然抗體(例如人類抗體用於人類受試者)。可用特異性及親和力來表示抗體結合。特異性決定那個抗原或其抗原決定基被結合域特異性地結合。親和力是與特定抗原或抗原決定基結合的強度的度量。較佳地，根據本發明之抗體的個別臂的親和力在奈米莫耳範圍內。抗體，例如本發明之雙特異性抗體，通常包含天然抗體的恆定域(Fc部分)，其可如本文其它地方所述地被工程化，例如，以降低ADCC及/或CDC活性。本發明之抗體通常為雙特異性 全長抗體，較佳地為人類IgG次類的雙特異性全長抗體。
術語「可變域」、「VH/VL對」、「VH/VL」在本文可互換使用。可變域由重鏈的可變區及輕鏈的可變區構成。重鏈的可變區通常由重排的VDJ區形成。輕鏈的可變區通常由重排的VJ區形成。現在也可使用，例如可用於功能性抗體的大量序列資訊，來人工生產VDJ/VJ區。
在一些實施例中，根據本發明的結合分子或抗體或變異體包含可結合TNF受體超家族成員的胞外部分的抗原結合位及可結合B7家族成員的抗原結合位。在一些實施例中，根據本發明的結合分子或抗體或變異體包含可結合CD137的胞外部分的抗原結合位及可結合B7家族成員的抗原結合位。在一些實施例中，根據本發明的結合分子或抗體或變異體包含可結合CD137的抗原結合位及可結合PD-L1的抗原結合位。
在一些實施例中，根據本發明的結合分子或抗體或變異體具有不超過兩個抗原結合位。這意味著，這樣的結合分子或抗體或變異體的抗原結合部分由兩個抗原結合位所組成，不存在額外的抗原結合位。兩個抗原結合位中的每一個較佳地含有免疫球蛋白質VH/VL對。較佳地，本發明的結合分子或抗體或變異體的抗原結合部由一個可結合TNF受體超家族成員的胞外部分的免疫球蛋白質可變域及一個可結合第二膜蛋白質的免疫球蛋白質可變域所組成。某些較佳實施例為具有IgG形式的免疫球蛋白質，相較於多價化合物，提供了根據本發明的二價結合分子/抗體/變異體的半衰期通常更長的益處。再者，相較於多價化合物，根據本發明的二價結合分子的免疫 原性通常較低。根據這些實施例的分子/抗體/變異體較佳地維持天然IgG的結構，且因此維持與天然IgG的那個結構相關的所有益處。
如本文所使用，術語「多價」包含三個或更多個特異性，其例如存在於三價及四價結合分子中。
一些實施例提供本發明的結合分子或抗體或變異體，其中所述結合分子或抗體或變異體的抗原結合位由一個可結合TNF受體超家族成員的胞外部分之抗原結合位及一個可結合B7家族成員之抗原結合位所組成。在一些實施例中，根據本發明的所述結合分子或抗體或變異體的抗原結合位由一個可結合CD137的胞外部分之抗原結合位及一個可結合B7家族成員之抗原結合位所組成。在一些實施例中，根據本發明的所述結合分子或抗體或變異體的抗原結合位由一個可結合CD137的抗原結合位及一個可結合PD-L1的抗原結合位。
如本文所使用，術語「抗原結合位」意指特異性接合抗原的抗原決定基的結合分子或抗體的位置。這樣的抗原結合位較佳地衍生自或與抗體的可變域共享序列同源性，特別是前述之CDR區。在一些較佳實施例中，所述抗原結合位是由免疫球蛋白質VH/VL對所形成的免疫球蛋白質可變域。在另一些實施例中，所述抗原結合位衍生自擬抗體，例如來自親和體分子、親和素、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、fynomer、kunitz域胜肽或單體，這些先前在本文描述。
本發明之抗體較佳地為「全長」抗體。根據本發 明之術語「全長」被定義為包括基本上完整的抗體，沒有一或多個尺寸大於20個胺基酸殘基的人工添加的基團，例如額外的抗原結合位或額外的活化位或額外的配位體或額外的配位體結合基團。然而，全長抗體不一定具有完整抗體的所有功能。為避免疑慮，全長抗體含有兩個重鏈及兩個輕鏈。各鏈含有恆定(constant，C)和可變(variable，V)區，其可被分解成許多區域，對重鏈標記為CH1、CH2、CH3、VH域；而對輕鏈標記為CL、VL域。重鏈的區域較佳地以天然抗體的順序存在(VH-CH1-CH2-CH3；意指VH域鄰近CH1域，接著是CH2域，再接著是CH3域)。輕鏈的區域較佳地以天然抗體的順序存在(VL-CL；意指VL域鄰近CL域)。抗體藉由Fab片段部分中含有的可變域結合至抗原。抗體可透過恆定域，大部分透過Fc部分與免疫系統的分子及細胞交互作用。在一些實施例中，本發明之抗體為IgG，較佳地為全長IgG。全長IgG抗體是較佳的，因為其通常具有有利的半衰期，且由於為了免疫原性的理由，希望保持靠近完全地自體(人類)分子。在一些實施例中，本發明之抗體為全長IgG1、全長IgG2、全長IgG3或全長IgG4抗體。
根據本發明之全長抗體包含抗體，其中提供期望的特性或僅是原始鏈中的那些的替代物的突變可存在。這樣的突變不應該是任何區的實質部分的缺失。然而，其中一或多個胺基酸殘基為胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，基本上沒有改變所得抗體的抗原結合特性的抗體包含在術語「全長抗體」內。舉例而言，IgG抗體可在恆定區中具有1至20個胺 基酸殘基插入、取代、缺失或前述之組合。
本發明之抗體或其功能部分、衍生物及/或類似物較佳地為雙特異性抗體或其功能部分、衍生物及/或類似物。在一較佳實施例中，其為具有減少的效應子功能的雙特異性IgG抗體。在一較佳實施例中，本發明之抗體為雙特異性全長抗體。本發明之抗體較佳地為雙特異性全長IgG抗體，較佳在CH2/低鉸鏈區中突變，以減少效應子功能。基於IgG1在人類中的長循環半衰期，在CH2/低鉸鏈區中突變以減少效應子功能的IgG1是有利的。為了防止在人類中任何的免疫原性，較佳地，根據本發明之雙特異性抗體為人類抗體。
術語「雙特異性(bispecific，bs)」意指抗體(如以上所定義)的一部分結合至抗原上的一個抗原決定基，而第二部分結合至相同抗原或不同抗原上的不同抗原決定基。不同的抗原決定基通常存在於不同的抗原上。然而，不同的抗原決定基也可存在於相同的抗原上。根據本發明，所述第一和第二抗原事實上為兩個不同蛋白質。較佳的雙特異性抗體為包括部分的兩個不同單株抗體，因此可結合至兩個不同的抗原決定基，較佳地為兩個不同的抗原上的兩個不同的抗原決定基。取決於被雙特異性抗體辨認的這兩個抗原的表達量、(次)細胞定位及化學計量，抗體的兩個Fab臂可能或可能不會同時地結合其抗原決定基。雙特異性抗體的一臂通常含有一抗體的可變域，而另一臂含有另一抗體的可變域(即，雙特異性抗體的一臂藉由一重鏈配對一輕鏈來形成；而另一個臂藉由不同的重鏈配對輕鏈來形成)。本發明之雙特異性抗體的重鏈可變區通常彼此不 同，而在本發明之雙特異性抗體中，輕鏈可變區較佳地為相同。其中不同重鏈可變區與相同或共同的輕鏈可變區結合的雙特異性抗體亦被稱為具有共同輕鏈可變區(common light chain variable region，cLcv)的雙特異性抗體。較佳地，輕鏈恆定區也是相同的。這樣的雙特異性抗體被稱為具有共同輕鏈(common light chain，cLc)。因此，更提供根據本發明之雙特異性抗體，其中兩個臂包含共同輕鏈。
如本文所述的雙特異性抗體較佳地包含共同輕鏈可變域、較佳地為共同輕鏈。根據本發明之術語「共同輕鏈」是指可相同或具有一些胺基酸序列差異的輕鏈，而全長抗體的結合特異性不受影響。舉例而言，在本文所使用的共同輕鏈的定義範圍內，例如藉由導入和測試保守性胺基酸改變、在當與重鏈配對時，沒有或只有部分助於結合特異性的區域中的胺基酸的改變及前述類似方法，來製備或發現不相同但功能上等價的輕鏈是可能的。有或沒有術語「重新排列」的添加，術語「共同輕鏈」、「共同LC」、「cLC」、「單一輕鏈」皆可在本文互換使用。有或沒有術語「重新排列」的添加，術語「共同輕鏈可變區」、「共同VL」、「共同LCv」、「cLCv」、「單一VL」皆可在本文互換使用。本發明的一較佳面向是雙特異性抗體具有共同輕鏈(可變區)，其可與至少兩個，且較佳為多個不同結合特異性的重鏈(可變區)組合，以形成具有功能性抗原結合域的抗體(WO2004/009618、WO2009/157771)。共同輕鏈(可變區)較佳地為人類輕鏈(可變區)。共同輕鏈(可變區)較佳地具有生殖序列(germline sequence)。較佳的生殖序列為人類 庫(repertoire)中常用且具有良好的熱力學穩定性、產量及可溶性的輕鏈可變區。較佳的生殖輕鏈為O12。共同輕鏈較佳地為重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(第1A圖)。共同輕鏈可變區較佳地為生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01的可變區。共同輕鏈較佳地包含如第1B或1D圖所繪示的輕鏈可變區，其中具有0至5個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合的。共同輕鏈較佳地更包含輕鏈恆定區，較佳地為kappa輕鏈恆定區。可針對用來表達共同輕鏈蛋白質的細胞系統，將編碼共同輕鏈的核酸密碼子最佳化(codon optimize)。編碼的核酸可偏離生殖核酸序列(germ-line nucleic acid sequence)。
在一較佳實施例中，輕鏈包括輕鏈區，輕鏈區包含如第1A圖所繪示的O12/IgVκ1-39*01基因片段的胺基酸序列，其具有0至10個、較佳0至5個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合。詞組「O12輕鏈」將在整份說明書中作為「輕鏈區包含如第1A圖所繪示的O12/IgVκ1-39*01基因片段的胺基酸序列，其具有0至10個、較佳0至5個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合」的縮寫。IgVκ1-39是免疫球蛋白質可變kappa 1至39(Immunoglobulin Variable Kappa 1-39)基因的縮寫。此基因也以免疫球蛋白質kappa可變1至39；IGKV139；IGKV1-39；O12a或O12為人所熟知。此基因的外部身份為HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。第1E圖給予了IgVκ1-39的較佳胺基酸序列。這列出了V區的序列。V區可與五個J區中的一個組合。 第1B和1D圖描述與J區組合的IgVκ1-39的兩個較佳序列。連接的序列被標示為IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替代名稱為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(根據IMGT資料庫全球網站imgt.org命名)。
較佳地，包含輕鏈可變區的O12/IgVκ1-39*01為生殖序列。更佳地，包含輕鏈可變區的IGJκ1*01或IGJκ5*01為生殖序列。在一較佳實施例中，IGKV1-39/jk1或IGKV1-39/jk5輕鏈可變區為生殖序列。
在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含生殖O12/IgVκ1-39*01。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。輕鏈可變區較佳地包含生殖kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或生殖kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ5*01，較佳地為生殖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。
相對於生殖序列，即有機體的非淋巴細胞中的正常序列，產生具有O12輕鏈的抗體的成熟B細胞常常產生已經過一或多個突變的輕鏈。負責這些突變的過程常被稱為體細胞(超)突變(somatic(hyper)mutation)。產生的輕鏈被稱為親和力成熟的輕鏈(affinity matured light chain)。當衍生自O12生殖序列時，這樣的輕鏈是O12-衍生輕鏈。在本說明書中，詞組「O12輕鏈」將包含O12-衍生輕鏈。藉由體細胞超突變導入的突變當然也可在實驗室中人工導入。在實驗室中，其它突變也可被導入，而不影響輕鏈的種類，不一定是量的性質。如果 輕鏈包含如第1A、1B、1D或1E圖所示的序列，其中具有0至10個，較佳0至5個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合，則輕鏈至少是O12輕鏈。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A、1B、1D或1E圖所示的序列的輕鏈，其中具有0至9個、0至8個、0至7個、0至6個、0至5個、0至4個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A、1B、1D、1E圖所示的具有0至5個、較佳0至4個、更佳0至3個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合的序列的輕鏈。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A、1B、1D或1E圖所示的序列的輕鏈，其中具有0至2個、較佳0至1個、最佳0個胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A圖或第1B圖所示的序列的輕鏈，其具有所提及的胺基酸插入、缺失、取代、添加或前述之組合。在一較佳實施例中，輕鏈包含第1A圖的序列。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含第1B圖的序列。
共同輕鏈(可變區)可為lambda輕鏈，因此這個也在本發明的背景下提供，但是kappa輕鏈是較佳的。本發明的共同輕鏈的恆定部分可為kappa或lambda輕鏈的恆定區。其較佳地為kappa輕鏈的恆定區，較佳地其中所述共同輕鏈為生殖輕鏈，較佳地為包含IgVK1-39基因片段的重新排列之生殖人類kappa輕鏈，更佳地為重新排列之生殖人類kappa輕鏈IgVK1-39*01/IGJK1*01(第1圖)。術語重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39 輕鏈或縮寫huVκ1-39或僅1-39可在整份申請案中交換使用。顯然地，本發明所屬技術領域中具有通常知識中會理解的是，「共同」亦指胺基酸序列不同的輕鏈的功能等價物。存在所述輕鏈的許多變異體，其中存在不影響功能性結合區形成的突變(缺失、取代、添加)。
IgVκ1-39是免疫球蛋白質可變kappa 1至39基因(Immunoglobulin Variable Kappa 1-39 Gene)的縮寫。此基因亦以免疫球蛋白質kappa可變1至39；IGKV139；IGKV1-39；O12a或O12為人所熟知。此基因的外部身份為HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。第1圖給予了IgVκ1-39的較佳胺基酸序列。這列出了V區的序列。V區可與五個J區中的一個組合。第1圖描述與J區組合的IgVκ1-39的兩個較佳序列。連接的序列被標示為IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替代名稱為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(根據IMGT資料庫全球網站imgt.org命名)。
共同輕鏈可變區較佳地連接至kappa輕鏈恆定區。在一較佳實施例中，輕鏈包含kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一較佳實施例中，輕鏈包含IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。
產生共同輕鏈的細胞可產生，例如重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01及包含與lambda恆定區融合的所提及的輕鏈的可變區的輕鏈。
如本文所述的雙特異性抗體或其變異體較佳地具 有一個結合TNF受體超家族成員的胞外部分的重鏈可變區/輕鏈可變區(VH/VL)組合及結合第二膜蛋白質的胞外部分的第二VH/VL組合，其中所述第二膜蛋白質不是TNF受體超家族的成員。
如本文所述的雙特異性抗體或其變異體較佳地具有一個結合TNF受體超家族成員的胞外部分的重鏈可變區/輕鏈可變區(VH/VL)組合及結合B7家族成員的胞外部分的第二VH/VL組合。如本文所述，由於B7家族成員傳送「共刺激」或「共抑制」訊息至淋巴球，藉此增強或減弱免疫反應，所以這提供了可特別良好地促進期望的免疫反應的優點。因此，藉由以B7家族的成員為標靶，增強刺激訊息及/或抵消抑制訊息，從而誘導或增強期望的免疫反應，例如對抗異常細胞，是可能的。
在一較佳實施例中，所述第一VH/VL組合中的VL類似於所述第二VH/VL組合中的VL。在一更佳實施例中，第一和第二VH/VL組合中的VL是相同的。在一較佳實施例中，雙特異性抗體為全長抗體，其具有一個結合TNF受體超家族成員的胞外部分的重/輕(H/L)鏈組合及一個結合B7家族成員的胞外部分的H/L鏈組合。在一較佳實施例中，所述第一H/L鏈組合中的輕鏈類似於所述第二H/L鏈組合中的輕鏈。在一更佳實施例中，第一和第二H/L鏈組合中的輕鏈是相同的。
已經發表許多方法，以有利於雙特異性抗體或反之亦然，單特異性抗體的產生。在本發明中，較佳地，細胞有利於雙特異性抗體的產生，而不是各自的單特異性抗體的產生。 這個通常藉由修飾重鏈的恆定區來達成，如此一來它們有利於異質二聚體化(即與其它重/輕鏈組合的重鏈二聚體化)，而不是同質二聚體化。在一較佳實施例中，本發明之雙特異性抗體包含具有相容的異質二聚體化域之兩個不同免疫球蛋白質重鏈。本領域中已描述了各種相容的異質二聚體化域。相容的異質二聚體化域較佳地為相容的免疫球蛋白質重鏈CH3異質二聚體化域。當使用野生型CH3域時，兩個不同重鏈(A及B)和共同輕鏈的共表達會產生三種不同的抗體種類AA、AB及BB。AA及BB是兩種單特異性二價抗體的代號，而AB是雙特異性抗體的代號。為了增加期望的雙特異性產物(AB)，可採用CH3工程，或換句話說，可使用具有相容的異質二聚體化域的重鏈，如下文所定義。本領域描述了可達成重鏈的這種異質二聚體化的各種方式。一個方式是產生「旋鈕入孔(knob into hole)」雙特異性抗體。參見美國專利申請20030078385(Arathoon等人)。
如本文所用的術語「相容的異質二聚體化域」是指蛋白質域經工程化，使得工程化的域A’會優先與工程化的域B’形成異質二聚體蛋白質域，反之亦然，而A’-A’及B’-B’之間的同質二聚體化減少。
在US13/866,747(現在發佈為US 9,248,181)、US14/081,848(現在發佈為US 9,358,286)及PCT/NL2013/050294(發佈為WO2013/157954)(藉由引用併入本文)中，揭露了使用相容的異質二聚體化域，來產生雙特異性抗體的方法和手段。這些手段和方法也可有利地用於本發明 中。具體而言，本發明之雙特異性抗體較佳地包含產生基本上只有雙特異性全長IgG分子的突變。較佳的突變為在第一CH3域(「KK變異體」重鏈)中的胺基酸取代L351K及T366K(EU編號)和在第二域(「DE變異體」重鏈)中的胺基酸取代L351D和L368E，或反之亦然。先前在我們的US 9,248,181及US 9,358,286專利，還有WO2013/157954 PCT申請中展示，DE變異體及KK變異體優先配對，以形成異質二聚體(所謂的「DEKK」雙特異性分子)。由於在相同的重鏈之間的CH3-CH3界面中，帶電殘基之間的排斥，幾乎不會發生DE變異體重鏈的同質二聚體化(DEDE同質二聚體)。
可藉由編碼輕鏈及兩個不同重鏈的質體或質體們的(瞬時)轉染，來產生雙特異性抗體，其中所述重鏈經過CH3工程化，以確保有效率的異質二聚體化及雙特異性抗體的形成。這些鏈在單一細胞中的產生導致偏向形成雙特異性抗體，而不是形成單特異性抗體。產生基本上只有雙特異性全長IgG1分子的較佳突變為在第351及366位的胺基酸取代，例如第一CH3域(「KK變異體」重鏈)中的L351K及T366K(根據EU編號編號)和在第351及368位的胺基酸取代，例如在第二CH3域(「DE變異體」重鏈)中的L351D和L368E，或反之亦然。
在一實施例中，包含結合CD137的可變域的重/輕鏈組合包含重鏈的DE變異體。在此實施例中，包含除了CD137以外，還可結合至抗原的可變域的重鏈/輕鏈組合包含重鏈的KK變異體。將理解的是，本發明的實施例也可包含結合CD137的可變域且該可變域包含重鏈的KK變異體，以及對 本發明所屬技術領域中具有通常知識者習知之用於促進與可結合至CD137以外的抗原的可變域的異質二聚體化的其他變異體。
Fc區媒介抗體的效應子功能，例如補體依賴性細胞毒殺性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)、抗體依賴性細胞毒殺性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)和抗體依賴性細胞吞噬作用(antibody-dependent cell phagocytosis，ADCP)。取決於治療性抗體或Fc融合蛋白質的應用，降低或增強效應子功能可為期望的。在本發明中，效應子功能降低是較佳的。如在本發明的一些實施例中那樣活化、增強或刺激免疫反應時，可能期望降低效應子功能。在其它之中，效應子功能降低的抗體可被用來將免疫細胞的細胞表面分子作為標靶。
發現IgG結合至FcγR或C1q需要位在鉸鏈區及CH2域中的殘基。CH2域(第2D圖)與FcγR或C1q的結合相關。將IgG2殘基於第233-236位與將IgG4殘基於第327、330及331位取代進入IgG1，顯著降低ADCC和CDC(Armour et al.,1999.Eur J Immunol.29(8)：2613-24；Shields et al.,2001.J Biol Chem.276(9)：6591-604)。再者，Idusogie等人展示，在不同位置的丙胺酸取代，包含K322，顯著地降低補體的活化(Idusogie et al.,2000.J Immunol.164(8)：4178-84)。
由於它們效應子功能降低，IgG4抗體代表用於受體阻斷而不消耗細胞的IgG次類。IgG4分子可在稱為Fab臂交換(Fab-arm exchange)的動態過程中交換半分子 (half-molecule)。此現象可發生在治療性抗體及內源性IgG4之間。S228P突變是確保Fab臂交換的能力減少的突變的範例。(Labrijn.et al.,2009.Nat Biotechnol.27(8)：767-71)
具有降低的效應子功能的抗體較佳地為IgG抗體，其包含經修飾的CH2/低鉸鏈區，例如以減少Fc受體的交互作用或減少C1q的結合。在一些實施例中，本發明的抗體是IgG抗體，其具有突變異體CH2及/或下鉸鏈域，如此一來雙特異性IgG抗體與Fc-gamma受體的交互作用降低。包含突變異體CH2區的抗體較佳地為IgG1抗體。這樣的突變異體IgG1 CH2及/或下鉸鏈域較佳地包含第235及/或236位(EU編號)的胺基取代、較佳為L235G及/或G236R取代(第2E圖)。
如本文所述的抗體或雙特異性抗體的變異體包含抗體或雙特異性抗體的功能部分、衍生物及/或類似物。變異體維持(雙特異性)抗體的結合特異性。功能部分、衍生物及/或類似物維持(雙特異性)抗體的結合特異性。如本文所述，藉由與第一膜蛋白質的胞外部分及第二膜蛋白質的結合能力，來定義結合特異性。
如本文所述，抗體的功能部分、或較佳地，雙特異性抗體的功能部分為包含結合TNF受體超家族成員的胞外部分的可變域及結合所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的一部分。例如，合適的部分是藉由用胃蛋白質酶(pepsin)消化雙特異性抗體，來創造的F(ab’)2片段。包含所述可變域的其它部分包含於本發明中。
如本文所述，抗體的功能部分、或較佳地，雙特 異性抗體的功能部分為包含結合TNF受體超家族成員的胞外部分的可變域及結合藉由接頭連接的所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的蛋白質。可變域可為可變域本身、或Fab片段或類可變域分子，例如包含藉由接頭連接在一起的VH及VL的單鏈Fv片段。類可變域分子的其它範例是所謂的單域抗體片段。單域抗體片段(single-domain antibody fragment，sdAb)為具有單體可變抗體區的抗體片段。如同整個抗體，它能夠選擇性結合至特定的抗原。由於分子重量僅為12至15kDa，單域抗體片段比由兩個重蛋白質鏈及兩個輕鏈構成的常見抗體(150至160kDa)要小得多，甚至小於Fab片段(約50kDa，一個輕鏈及半個重鏈)及單鏈可變片段(約25kDa，兩個可變區，一個來自輕鏈而一個來自重鏈)。單域抗體本身並不比正常抗體(通常為90至100kDa)小得多。單域抗體片段大部分是從在駱駝(camelid)中發現的重鏈抗體工程化；這些被稱為VHH片段(奈米體®(Nanobodies®))。一些魚類亦具有重鏈唯一抗體(IgNAR，「免疫球蛋白質新抗原受體(immunoglobulin new antigen receptor)」)，從中可以獲得被稱為VNAR片段的單域抗體片段。另一種方法是將來自人類或小鼠的普通免疫球蛋白質G(immunoglobulin，IgG)的二聚體可變域分成單體。雖然大部分對單域抗體的研究目前是基於重鏈可變域，但衍生自輕鏈的奈米體也已顯示特異性地結合至目標抗原決定基。類可變域分子的其他非限制性範例為VHH、人類域抗體(Human Domain Antibody，dAb)及單體(unibody)。較佳的功能部分為包含可變域的部分，所述可變域包含重鏈可變區及輕鏈可變區。這樣的 可變域的非限制性範例為F(ab)片段及單鏈Fv片段。(類)可變域連接的雙特異性抗體形式是例如人類血清白蛋白質(Human Serum Albumine，HSA)與兩個不同的scFv結合；雙特異性迷你抗體(bispecific miniantibody)包含兩個不同scFv結合在一起，其透過二聚體基序或自我聯結二級結構，例如螺旋束或捲曲螺旋，以引起scFv片段的二聚體化(Morrison(2007)Nat.Biotechnol 25：1233-34)。在WO2009/126920中描述合適的HAS接頭及使scFv偶聯至接頭的方法的範例。
本發明的抗體或其功能部分、衍生物及/或類似物，或較佳地，本發明的雙特異性抗體或其功能部分、衍生物及/類似物較佳地用於人類中。為此，本發明的抗體或其功能部分、衍生物及/或類似物較佳地為人類或人源化抗體。人類對多肽的耐受性受許多不同的面向所支配。免疫力，不論是經T細胞媒介、經B細胞媒介或其它，皆是包含在人類對多肽的耐受性的變數之一。本發明的雙特異性抗體的恆定區較佳地包含人類重鏈恆定區，所述人類重鏈恆定區較佳地包含如第2圖所繪示的序列；及人類輕鏈恆定區，所述人類輕鏈恆定區較佳地包含如第1C圖所繪示的序列。恆定區可與天然出現的人類抗體的恆定區含有一或更多個，較佳不超過10個、較佳不超過5個胺基酸差異。較佳地，恆定部分完全地衍生自天然出現的人類抗體。如WO2009/157771中所述，本文產生的各種抗體衍生自以各自的目標免疫的共同輕鏈小鼠。本文產生的各種抗體衍生自人類抗體可變域庫。因此，這些可變域為人類的。獨特的CDR區可衍生自人類、合成的或衍生自另一有機體。除了CDR 區之外，可變區至少是人類可變區，當其具有與天然出現的人類抗體的可變區的胺基酸序列相同的胺基酸序列時。在這樣的實施例中，結合TNF受體超家族的成員或B7家族的膜結合成員的抗體的可變域的VH，或本發明的抗體中的輕鏈可與天然出現的人類抗體含有一或更多個、較佳不超過5個胺基酸差異，不算上CDR區的胺基酸序列中可能的差異。在體細胞超突變的背景下，這樣的突變也在自然界中發生。
至少就重鏈可變區而言，抗體可衍生自各種動物物種。將這樣的例如鼠類重鏈可變區人源化是常見做法。有各種方式可以達成這件事，其中有使用符合鼠類重鏈可變區的三維結構的三維結構，將CDR移植(CDR-grafting)至人類重鏈可變區；鼠類重鏈可變區的去免疫，其較佳地藉由自鼠類重鏈可變區移除已知或疑似的T或B細胞抗原決定基來完成。所述移除通常是藉由抗原決定基中的一或更多個胺基酸取代為另一胺基酸(通常為保守的)，使抗原決定基的序列受到修飾，從而使其不再是T或B細胞的抗原決定基。
去免疫的鼠類重鏈可變區在人類中比原始鼠類重鏈可變區具有較低的免疫原性。較佳地，本發明之可變區或域進一步被人源化，例如被虛飾(veneer)。藉由使用虛飾技術，容易被免疫系統遇到的外部殘基選擇性地以人類殘基取代，以提供包含弱免疫原性或大致上無免疫原性的虛飾表面的雜交分子。本發明所用的動物較佳為哺乳類、更佳為靈長類、最佳為人類。
根據本發明的抗體或雙特異性抗體或前述之功能 部分、衍生物和/或類似物較佳地包含人類抗體的恆定區。根據它們重鏈恆定域的差異，抗體分成五個類型，或同型(isotype)：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。這些類型或同型包含所述重鏈中的至少一個以相對應的希臘字母命名。在一較佳實施例中，本發明提供了根據本發明的抗體，其中所述恆定區係選自IgG恆定區所組成的群組，即選自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4所組成的群組。較佳地，所述恆定區為IgG4或IgG1恆定區(第2圖)，更佳為突變的IgG1恆定區。IgG1恆定區中的一些變異在自然界中發生且/或在不改變所得抗體的免疫學性質的情況下允許那些變異。通常在恆定區中，允許在約1至10個之間的胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。可如本文所示，使恆定區突變，以實現有效率的異質二聚體化，以減少效應子功能或為了其它原因，包含半衰期、穩定性及其它類似原因。
合理的方法已朝最小化人類背景中非人類殘基的含量發展。有各種方法可以成功將一抗體的抗原結合性質移植到另一抗體上。抗體的結合特性可主要位於CDR3區的確切序列中，通常由可變區中的CDR1和CDR2區的序列與整個可變區的適當結構組合作為一個整體所支持。目前有各種方法可用於將CDR區移植到另一抗體的合適可變區上。這些方法中的一些於J.C.Almagrol and J.Fransson(2008)Frontiers in Bioscience 13,1619-1633中回顧，其透過引用包含於本文。
包含如第3圖所示的可變重鏈序列的可變域的輕鏈可變區較佳為O12或基於O12的生殖輕鏈，較佳為重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或其片段或功 能性衍生物(根據IMGT資料庫全球網站imgt.org命名)。使用術語重排的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39輕鏈或簡稱huVκ1-39。輕鏈可具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合。提及的1、2、3、4或5個胺基酸取代較佳為保守性胺基酸取代、插入、缺失、取代或前述之組合，較佳地不在VL鏈的CDR3區中，較佳地不在VL鏈的CDR1、CDR2或CDR3區或FR4區中。第1圖中描繪共同輕鏈的較佳序列。
各種方法可用於生產雙特異性抗體。一個方法涉及在細胞中表達兩個不同的重鏈和兩個不同的輕鏈並收集此細胞產生的抗體。以這種方式產生的抗體通常會含有具有不同重鏈和輕鏈組合的抗體集合，其中一些是期望的雙特異性抗體。雙特異性抗體之後可從此集合純化。雙特異性抗體與此細胞產生的其他抗體的比例可用各種方式增加。在本發明的一較佳實施例中，藉由在細胞中不表達兩個不同的輕鏈，而是表達兩個基本上相同的輕鏈，來增加比例。這兩個基本上相同的輕鏈可為具有基本上相同的輕鏈可變區和不同的輕鏈恆定區，或較佳地，兩個基本上相同的輕鏈恆定區的輕鏈。這個概念在本發明所屬技術領域中也被稱為「共同輕鏈」方法。當基本上相同的輕鏈與兩個不同的重鏈一起工作，允許具有不同抗原結合位和伴隨不同結合性質的可變域形成時，相較於表達兩個基本上不同的輕鏈，雙特異性抗體與由此細胞產生的其它抗體的比率顯著改善。可藉由刺激兩條不同重鏈彼此配對，而不是兩條相同重鏈的配對，進一步提高由此細胞產生的雙特異性抗體的比例。 本發明所屬技術領域描述可實現這樣的重鏈異質二聚體化的各種方式。在美國臨時申請案61/635,935中描述了一較佳方法，其已由美國常規申請號13/866,747和PCT申請號PCT/NL2013/050294(WO2013/157954A1)追蹤，這些透過引入本文作為參考。揭露了(自單一細胞)產生雙特異性抗體的方法和手段，由此提供有利於形成雙特異性抗體，而不是形成單特異性抗體的手段。這些方法也可有利地用於本發明中。因此，本發明提供了一種(自單一細胞)產生根據本發明的雙特異性抗體的方法，其中所述雙特異性抗體包含能夠形成界面的兩個CH3域，所述方法包含在所述細胞中提供a)第一核酸分子，其編碼包含重鏈的第一CH3域，b)第二核酸分子，其編碼包含重鏈的第二CH3域，其中提供所述核酸分子優先配對包含重鏈的所述第一和第二CH3域的手段，所述方法更包含培養所述宿主細胞並允許表達所述兩個核酸分子並自培養物中收穫所述雙特異性抗體的步驟。所述第一和第二核酸分子可為相同核酸分子、載體或基因遞送載體的一部分，且可在宿主細胞的基因組的相同位置整合。或者，所述第一和第二核酸分子分別提供給所述細胞。宿主細胞包含至少一個輕鏈，較佳地及共同的輕鏈。
一較佳實施例提供一種自單一細胞產生根據本發明的雙特異性抗體的方法，其中所述雙特異性抗體包含能夠形成界面的兩個CH3域，所述方法包括提供：
-細胞，其具有a)編碼重鏈的第一核酸分子，此重鏈包含抗原結合位，此抗原結合位可結合至TNF受體超家族的與膜 結合成員的胞外部分且含有第一CH3域，以及b)編碼重鏈的第二核酸分子，此重鏈包含抗原結合位，此抗原結合位可結合至與膜結合的第二蛋白質的細胞外部分且含有第二CH3域，其中提供所述核酸分子優先配對所述第一和第二CH3域的手段，
所述方法更包含培養所述細胞且允許表達由所述兩個核酸分子編碼的蛋白質且自培養物收穫所述雙特異性IgG抗體的步驟。在一特別較佳實施例中，所述細胞還具有編碼共同輕鏈的第三核酸分子。所述第一、第二和第三核酸分子可為相同核酸分子、載體或基因遞送載體的一部分，並可在宿主細胞的基因組的相同位置整合。或者，所述第一、第二和第三核酸分子分別提供給所述細胞。如上所述，較佳的共同輕鏈係基於O12，較佳地，它是重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。優先配對所述第一和所述第二CH3域的手段較佳為重鏈編碼區的CH3域中的相應突變。產生基本上僅雙特異性抗體的較佳突變是第一CH3域中的胺基酸取代L351K和T366K(根據EU編號編號)和第二CH3域中的胺基酸取代L351D和L368E，反之亦然(第2圖)。因此，更提供根據本發明的產生雙特異性抗體的方法，其中所述第一CH3域包含胺基酸取代L351K和T366K(根據EU編號編號)，並且其中所述第二CH3域包含胺基酸取代L351D和L368E，所述方法更包括培養所述細胞並允許表達由所述核酸分子編碼的蛋白質且自培養物收穫所述雙特異性抗體的步驟。還提供了根據本發明的產生雙特異性抗體的方法，其中所述第一CH3域包 含胺基酸取代L351D和L368E(根據EU編號編號)，且其中所述第二CH3域包含胺基酸取代L351K和T366K，所述方法更包括培養所述細胞並允許表達所述核酸分子且自培養物收穫所述雙特異性抗體的步驟。可藉由這些方法產生的抗體也是本發明的一部分。CH3異質二聚體化域較佳為IgG1異質二聚體化域。包含CH3異質二聚體化域的重鏈恆定區較佳為IgG1恆定區。
TNF受體超家族的成員(第一膜蛋白質)較佳為CD137；OX40；CD40或CD30。在一較佳實施例中，第一膜蛋白質是CD137或OX40，較佳為CD137。本發明的結合分子較佳地包含用於所述第一膜蛋白質的一個(抗原)結合位。在一些實施例中，本發明的結合分子對於所述第一膜蛋白質而言是單價的。結合分子較佳地包含用於所述第二膜蛋白質的一個(抗原)結合位。在一些實施例中，本發明的結合分子對於所述第二膜蛋白質而言是單價的。在一些實施例中，本發明的結合分子對於所述第一膜蛋白質而言是單價的且對於所述第二膜蛋白質而言是單價的。在一些實施例中，本發明的結合分子對於TNF受體超家族的成員而言是單價的且對於B7家族的成員而言是單價的。在一些實施例中，本發明的結合分子對於CD137而言是單價的且對於B7家族的成員而言是單價的。在一些實施例中，本發明的結合分子對於CD137而言是單價的並且對於PD L1而言是單價的。二價單株抗CD137抗體為本發明所屬技術領域所習知，能活化CD137，而先前技術的單價CD137結合分子通常不會活化。
如本文所述的第一膜蛋白質是TNF受體超家族的成員，其為細胞膜蛋白質。如果蛋白質具有跨膜區存在於其所在之細胞的細胞膜中，則此蛋白質被認為是細胞上的膜蛋白質。這通常是如本文所述的第一細胞。蛋白質可具有其它跨膜區。在這樣的情況下，存在於細胞膜中的所有跨膜區都存在於相同細胞的細胞膜中。第一膜蛋白質是細胞膜蛋白質，當此細胞膜蛋白質存在於細胞膜上時，其具有胞外部分。細胞膜是細胞的膜，其將細胞內部與細胞外部分開。如本文所述，第一膜蛋白質通常在第一細胞的細胞膜上。在本發明的結合分子或本發明的方法或用途的背景中，如本文所述，第一膜蛋白質通常在第一細胞的細胞膜上。第一膜蛋白質可存在於所述第二細胞上，但較佳的是第一膜蛋白質在所述第二細胞上的表達可以忽略。通常，相較於第一膜蛋白質在第一細胞上的表達，所述第一膜蛋白質在所述第二細胞上的量至多為10%。第二細胞較佳地不顯著表達所述第一膜蛋白質。如果用對所述第一膜蛋白質特異性的抗體，藉由FACS測定中的免疫螢光，無法偵測到第一膜蛋白質(高於背景)，則表達至少不顯著。
第二膜蛋白質同樣是細胞膜蛋白質。它具有跨膜區存在於細胞的細胞膜中。這通常是如本文所述的第二細胞。第二蛋白質可有其它跨膜區。在這樣的情況下，存在於細胞膜中的所有跨膜區都存在於相同細胞的細胞膜中。第二膜蛋白質是細胞膜蛋白質，當此細胞膜蛋白質存在於細胞膜上時，其具有胞外部分。在本發明的結合分子或本發明的方法或用途的背景下，如本文所述，第二膜蛋白質通常在第二細胞的細胞膜上。 第二膜蛋白質可存在於所述第一細胞上，但較佳的是第二膜蛋白質在所述第一細胞上的表達可忽略。通常，相較於第二膜蛋白質在第二細胞上的表達，所述第二膜蛋白質在所述第一細胞上的量至多為10%。第一細胞較佳地不顯著表達所述第二膜蛋白質。如果用對所述第二膜蛋白質特異性的抗體，藉由FACS測定中的免疫螢光，無法偵測到第二膜蛋白質(高於背景)，則表達至少不顯著。
根據一些實施例，根據本發明的結合分子或(雙特異性)抗體或變異體具有一個可結合TNF受體超家族成員的胞外部分的抗原結合位，及可結合非TNF受體超家族成員的第二膜蛋白質的第二抗原結合位。這提供至少部分地避免(免疫)細胞的順式(in cis)活化，例如表達TNF受體超家族的幾個不同成員的T細胞，藉此減少因非特異性T細胞的活化所引起的潛在不良副作用和毒性的優點。本發明的這些實施例與先前技術的方法形成對比，先前技術方法是有關於結合至TNF超家族的受體的結合試劑，特別是有關於結合至TNF超家族的至少兩個不同受體的結合試劑。這樣的先前技術方法可導致T細胞的順式活化，意指第二目標不存在，且可涉及過量T細胞反應的風險，例如導致細胞激素風暴。因此，相較於具有可結合TNF受體超家族成員的胞外部分的第一抗原結合位及可結合非TNF受體超家族成員的膜蛋白質的第二抗原結合位，這樣的先前技術方法具有不良副作用增加的可能性。
還提供一種抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含可結合CD137或OX40的胞外部分的抗原結合位和 可結合第二膜蛋白質的胞外部分的抗原結合位，其中所述第二膜蛋白質不是TNF受體超家族的成員。還提供了刺激細胞上的TNF受體超家族成員活性的方法，此方法包括提供第一細胞和第二細胞，其中所述第一細胞具有TNF受體超家族的所述成員於細胞膜上，且所述第二細胞具有第二膜蛋白質於細胞膜上，此方法包括使所述細胞與包含兩個可變域的抗體或其功能部分，衍生物和/或類似物接觸，其中一個可變域包含可結合TNF受體超家族的所述成員的胞外部分之第一抗原結合位，而另一可變域包含可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分之第二抗原結合位，從而刺激所述成員在所述第一細胞上的活性；其中所述第二膜蛋白質不是TNF受體超家族的成員。在一些實施例中，所述方法是體外(in vitro)方法。
在一些實施例中，所述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包含一個可結合TNF受體超家族的所述成員的抗原結合位和一個可結合非TNF受體超家族成員的所述第二膜蛋白質的抗原結合位。在一些實施例中，本發明的所述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物的抗原結合部分由一個可結合所述TNF受體超家族的所述成員的胞外部分的免疫球蛋白質可變域和一個可以結合非TNF受體超家族成員的所述第二膜蛋白質的免疫球蛋白質可變域所組成。所述雙特異性抗體較佳為全長抗體。在一些實施例中，所述雙特異性抗體是全長IgG，即全長IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳為全長IgG1或全長IgG4。
更提供一種抗體或其功能部分，衍生物和/或類似 物，其包含可結合CD137或OX40的胞外部分的抗原結合位和可結合第二膜蛋白質的胞外部分的抗原結合位，其中所述第二膜蛋白質是B7家族的成員，較佳為PD L1。還提供刺激細胞上的TNF受體超家族成員活性的方法，此方法包括提供第一細胞和第二細胞，其中所述第一細胞具有TNF受體超家族的所述成員於細胞膜上，且所述第二細胞具有第二膜蛋白質於細胞膜上，此方法包括使所述細胞與包含兩個可變域的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物接觸，其中一個可變域包含可結合TNF受體超家族的所述成員的胞外部分的第一抗原結合位而另一可變域包含可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分的第二抗原結合位，從而刺激所述成員在所述第一細胞上的活性；其中所述第二膜蛋白質是B7家族的成員，較佳為PD-L1。在一些實施例中，所述方法是體外方法。
在一些實施例中，所述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包含一個可結合TNF受體超家族的所述成員的抗原結合位和一個可結合是B7家族的所述第二膜蛋白質，較佳為PD-L1，的抗原結合位。在一些較佳實施例中，本發明的所述抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物的抗原結合部分由一個可結合TNF受體超家族的所述成員的胞外部分的免疫球蛋白質可變域和一個可以結合是B7家族成員的所述第二膜蛋白質，較佳為PD-L1，的免疫球蛋白質可變域所組成。所述雙特異性抗體較佳為全長抗體。在一些實施例中，所述雙特異性抗體是全長IgG，即IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳為全長IgG1或全長IgG4。
「阻斷」所述第一膜蛋白質結合至其結合配偶體(binding partner)的可變域干擾第一膜蛋白質結合至所述結合配偶體。這樣的可變域可結合第一膜蛋白質。這樣的阻斷可變域可結合所述第一膜蛋白質上的抗原決定基並與第一膜蛋白質的結合配偶體競爭結合抗原決定基。這樣的阻斷可變域和第一膜蛋白質的結合配偶體也可結合至所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基。在這種情況下，阻斷活性可以是例如，由結合配偶體的結合減少、和/或當其已經結合至所述第一膜蛋白質時，結合配偶體的置換(displacement)、和/或阻斷可變域，可防止配偶體透過空間位阻(steric hindrance)，結合至第一膜蛋白質結合所引起。所有這些和其他機制可至少部分地防止所述結合配偶體結合至所述第一膜蛋白質。
在一實施例中，包含結合TNF受體超家族成員的抗原結合位的區域阻斷此成員結合至此成員的配位體。TNF受體超家族成員-配位體的交互作用已於本發明所屬技術領域中廣泛研究。基本上，TNF受體超家族的成員通常已知具有至少一個配位體。已知的受體配位體對的範例是TNF受體，腫瘤壞死因子受體1和2與配位體TNF-alpha；受體OX40與配位體OX40L；受體CD40與配位體CD154；Fas受體與配位體FasL；CD30受體與配位體CD153；及受體CD137與配位體CD137L。在一些實施例中，包含結合TNF受體超家族成員的抗原結合位的可變域不阻斷此成員結合至此成員的配位體。
在一些實施例中，區域包含結合TNF受體超家族成員並阻斷其TNF受體超家族目標膜蛋白質結合至其結合配 偶體的抗原結合位。所述可變域可進一步定性，使得當以包含兩個所述可變域的單特異性二價抗體提供時，其在無交聯下，不會刺激TNF-受體超家族成員在細胞上的活性。在一些實施例中，包含結合TNF受體超家族成員的抗原結合位的區域包含阻斷CD137結合至CD137L的可變域，所述可變域的進一步特徵在於，當以包含兩個所述可變區的單特異性二價抗體，它不刺激CD137在細胞上的活性。
術語「結合配偶體；結合對；受體配位體對」及前述類似術語是指可彼此結合且由於此結合而發揮活性的蛋白質。至少一個配偶體或配對是細胞的細胞膜上的膜蛋白質。此活性通常施加在具有這種膜蛋白質於細胞上的細胞上。
當與不存在可變域的結合相比時，阻斷如本文所述的膜蛋白質特異性結合對的結合的可變域通常會減少此配對的結合。這較佳於體外測定中測量。通常藉由將可變域與其可結合的膜蛋白質一起培養，且隨後將混合物與配對中的其它成員一起培養，來完成這個。然後，比較此配對的結合與此配對不存在可變域的結合。可變域可完全地阻止第一膜蛋白質結合至其結合配偶體。它也可部分地阻止結合對的結合。當與不存在可變域的結合相比時，阻斷膜蛋白質的特異性結合對的結合的可變域較佳地減少此配對的結合至少50%、較佳至少60%、較佳至少70%、較佳至少80%，並且更佳至少90%。藉由可變域阻斷結合在本文中定義為使用包含兩個相同的所述可變域的二價單株抗體所獲得的阻斷。當存在於包含所述可變域和結合第二膜蛋白質的可變域的抗體中時，所述可變域也當然阻斷 此結合。
可結合CD137的胞外部分並至少部分阻斷CD137配位體結合至CD137的特異性可變域包含：MF6783；MF6861；MF6795；MF6808；MF6798；MF6754；MF6763；MF6744；MF6785；MF6825；MF6737；MF6749；MF6788；或MF6797的VH的胺基酸序列的可變域。
可結合PD-L1的胞外部分並阻斷PD1結合至PD-L1的特異性可變域是包含：MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5359；MF5377；MF5382；MF5424；MF5426；MF5439；MF5442；MF5553；MF5557；MF5561；MF5576；MF5594；或MF5708的VH的胺基酸序列的可變域。胺基酸序列於第3圖中描述。
結合TNF受體超家族成員的可變域較佳為，當其以包含兩個所述區域的單特異性二價抗體提供時，不會刺激TNF受體超家族成員在細胞上的活性的可變域。在二價單特異性抗體的背景下的所述可變域包含兩個相同的所述可變域，且不刺激包含TNF受體超家族成員的細胞的活性。
通常藉由測量細胞的生物活性，來測量刺激TNF受體超家族成員在細胞上的活性。活性的類型取決於TNF受體超家族的哪個成員被分析。例如，對於OX40和CD137，可測量OX40和/或CD137陽性T細胞的活化狀態。OX40和CD137是刺激活化的T細胞的活化的所謂共刺激蛋白質。在範例部分中提供測量T細胞活化的合適方法。一種方法是測量由活化的T細胞或包含所述T細胞的組合物所產生的IL-2，IFNγ和/或 TNFα。其它TNF受體具有不同的生物活性。例如，CD30在活化的T細胞和B細胞上表達並且是細胞凋亡的正調節子。可藉由測量回應於本發明的結合分子的活化的B細胞或T細胞的細胞凋亡，來測量CD30的刺激。CD40是在抗原呈現細胞上，例如巨噬細胞，發現的共刺激蛋白質，且刺激進一步刺激抗原呈現細胞的活化。當在本文討論的結合分子存在下、較佳地在根據本發明的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物的存在下，測量的活性高於在其他相同條件下，但在結合分子不存在下、較佳地在根據本發明的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物不存在下，測量的活性的時候，TNF受體超家族成員的活性受到刺激。刺激活性包含誘導活性和增強已經存在的活性。
較佳地，藉由測量包含CD137或OX40的細胞的生物活性，來測量CD137或OX40的刺激活性。生物活性較佳為CD137或OX40表達細胞的活化狀態。CD137和OX40是在免疫細胞上，包含活化的T細胞，表達的共刺激分子。較佳地，藉由測定免疫細胞的，例如活化的T細胞的活化程度，來測量CD137或OX40的活性的刺激。在個體中，較佳地，藉由測量個體的免疫細胞和/或T細胞的活化，來測量CD137或OX40的活性的刺激。或者，也可藉由，在適用的情況下，測量個體中的腫瘤反應來測定；個體的病毒載量(load)；或個體的寄生蟲載量。
本發明還提供接合(engage)和/或活化T細胞的方法，此方法包括提供包含T細胞和所述T細胞將接合或活化的 細胞(第二細胞)的系統，並提供所述系統至少一個抗體，較佳至少一個雙特異性抗體，此抗體包含可結合TNF受體超家族成員的可變域和可結合第二蛋白質的胞外部分的可變域，並將所述系統培養於允許T細胞變成被接合和/或活化的條件下。在一些實施例中，所述方法是體外方法。所述TNF受體超家族成員較佳為CD137或OX40，最佳為CD137，且所述第二膜蛋白質較佳地不是TNF受體超家族的成員。所述第二膜蛋白質較佳是B7家族的成員，最佳為PD-L1。所述T細胞將要接合或活化的細胞較佳為免疫細胞(例如抗原呈現細胞或巨噬細胞)、贅生細胞(neoplastic)、病毒感染的細胞或胞內寄生蟲感染的細胞。接合和/或活化T細胞將T細胞引導至特定的目標。活化T細胞是活化所述T細胞的T細胞受體。接合T細胞通常是活化T細胞。接合也可將已活化的T細胞引導至抗體所指定的目標。允許所述T細胞變為被接合和/或活化的條件通常是培養條件，但也可在非人類動物中培養。條件是在抗體不存在下，T細胞不會被接合。如果測量T細胞的集合，其中一些可已被接合或活化，假使此集合含有足夠的未被接合或活化的T細胞。
本發明的抗體可以將兩個細胞緊密靠近在一起，允許細胞之間的交互作用，此交互作用由TNF受體超家族成員以外的蛋白質和由本發明的抗體結合的第二膜蛋白質介導。一個這樣的交互作用是一個細胞的T細胞受體與另一種細胞上的MHC交互作用。
所述第一和第二細胞較佳是不同的細胞。不同的 細胞可皆表達所述第一和第二膜蛋白質。然而，通常第一膜蛋白質僅在所述第一細胞上表達，而所述第二膜蛋白質僅在所述第二細胞上表達。如果第一細胞不表達所述第二膜蛋白質；所述第二細胞不表達所述第一膜蛋白質；或更佳為前述之組合，則生物活性通常更受到刺激。當TNF受體超家族成員是OX40；CD137；CD30或CD40時，較佳的是所述第一細胞是免疫細胞，較佳為T細胞。在這些情況下，較佳的是第二細胞是異常細胞、腫瘤細胞或免疫細胞(例如巨噬細胞或抗原呈現細胞)。異常細胞是通常不存在於健康個體中的細胞。此類細胞的非限制性較佳範例是癌細胞、病毒感染的細胞、寄生蟲感染的細胞或誘導表達第二膜蛋白質的細胞。合適的第二個細胞也是免疫細胞。這種細胞的較佳範例是樹突細胞、巨噬細胞、骨髓族系的其它細胞或B細胞。在一些情況下，由於相鄰細胞，例如免疫細胞、纖維母細胞(fibroblast)或癌細胞，所釋放的抑制因子，細胞可表達第二膜蛋白質。在一些實施例中，所述第二細胞是在主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex，MHC)的背景下，呈現腫瘤抗原或致病性抗原，例如病毒抗原或寄生蟲抗原，的抗原呈現細胞。所述MHC複合物較佳是人類白血球抗原(human leukocyte antigen，HLA)複合物。在此背景下，本發明的抗體可體外增強抗原初始T細胞的擴張和分化。誘導且增強對抗腫瘤抗原的新T細胞反應通常會導致更有效的腫瘤免疫和癌細胞根除(eradication)。
CD137可被活化的T細胞表達。也在其他細胞，例如樹突細胞、自然殺手細胞、顆粒細胞和的血管壁發炎位置 的細胞上也有發現。此蛋白質以其對T細胞活化的共刺激活性為人所熟知。配位體CD137L在單核細胞、巨噬細胞和其他細胞上表達。CD137與CD137配位體的結合在受體和含有配位體的細胞中均發揮作用。配位體或受體的活化可用各種方式達成。常見的方法是塗佈至組織培養盤上或透過抗體進行交聯(回顧請參見Schwartz，2004，)。CD137在先天性和適應性免疫細胞上的表達，加上其增強抗腫瘤反應的能力，已將其建立為增強腫瘤免疫性的治療目標。各種CD137靶向的免疫治療劑已達到臨床發展(回顧請參見Makkouk等人，2016)。受體或配位體的活化似乎需要在細胞膜中同質結合，以發揮其作用。有兩個CD137結合位的抗體能夠活化受體或配位體。因此，這種抗體對於CD137是二價的。也產生僅有一個CD137結合位的分子。先前技術的這種單價結合分子無法活化受體(McNamara 2008)。相反地，即使對於CD137是單價，根據本發明的結合分子或抗體或變異體也能夠活化CD137。
OX40是在T細胞上表達的二級共刺激免疫檢查點分子。OX40的表達不是持續性的，通常在活化後的24至72小時後表達；其配位體OX40L也不在休息的抗原呈現細胞上表達，而是在其活化之後。
在本發明中，發現如果結合分子也具有第二膜蛋白質的結合位於另一細胞(第二細胞)上，包括當第二膜蛋白質不是TNF受體超家族成員的成員時，則僅有一個TNF受體超家族成員(第一膜蛋白質)的結合位的結合分子可以活化(第二種細胞)。第二膜蛋白質可為TNF受體超家族的受體的配位體。 然而，它通常不是TNF受體超家族成員，即第一膜蛋白質的配位體。第二膜蛋白質可為TNF受體超家族成員的配位體，但不是第一膜蛋白質的配位體。
刺激在細胞上的TNF受體超家族成員的活性通常需要將兩個或更多個受體複合物放在一起。排列在細胞表面膜上的同質三聚體配位體通常藉由使多個TNF受體超家族成員複合物在相鄰細胞上接合來實現這個。據認為，TNF受體超家族複合物的聚集促進細胞活性的刺激。例如，從僅具有CD137受體的細胞質部分的人工受體中，這也顯而易見。各種人工受體的細胞質部分的緊密靠近也刺激含有人工受體的細胞。對TNF受體超家族成員特異的二價單特異性抗體也能夠模擬配位體作用並刺激活性。據認為抗體的臂使受體聚在一起或聚集。這樣的活性也被稱為受體的交聯。有時可藉由提供抗抗體的抗體進一步刺激活性，這提供了受體的進一步交聯。僅有一個TNF受體超家族成員的結合位的先前技術的結合分子通常不能夠刺激此活性。這樣的分子不能使TNF受體超家族成員聚集或交聯。然而，根據本發明的結合分子或抗體或變異體能夠刺激TNF受體超家族成員的活性，包含當它對於所述TNF-受體超家族成員是單價時。不受任何理論的束縛，據相信根據本發明的雙特異性抗體也可聚集TNF受體超家族受體複合物，藉此促進TNF受體超家族成員的活化。當根據被本發明抗體結合的第二膜蛋白質是B7家族的成員時，例如PD-L1，這尤其如此。
在本發明的一個面向，第二膜蛋白質存在於細胞 膜上，作為包含兩個或更多個所述第二膜蛋白質例子的多聚體蛋白質的一部分。這樣的多聚體蛋白質可提供兩個或更多個用於本發明的結合分子之抗原結合位的抗原決定基。在這種情況下，在另一細胞上的結合的TNF受體超家族成員將變為聚集的且刺激含有TNF受體的細胞的活性。本發明的結合分子可透過結合至不同細胞上的另一蛋白質而強制TNF受體超家族成員的接近。與順式交聯相反，此特徵也被稱為反式交聯，透過在相同細胞上結合兩個或更多個TNF受體超家族成員例子的結合分子。在一些實施例中，第二膜蛋白質是同質二聚體或同質三聚體。同質二聚體是由兩個相同的多肽單元構成的蛋白質。同質三聚體是由三個相同的多肽單元構成的蛋白質。不受任何理論的束縛，據相信，用於第二膜蛋白質的抗原結合位的抗原決定基共同結合許多結合分子。因此，這些功能可作為迫使兩個或更多個TNF受體超家族成員緊密接近的錨。接近度足夠靠近，以刺激細胞上的TNF受體超家族成員的活性。
在另一實施例中，所述第二膜蛋白質是存在於細胞膜上的一個或更多個離散區(discrete zone)中的蛋白質。細胞膜不會提供細胞膜的所有組成均勻分佈。目前已知，細胞膜具有其中細胞膜的一個或更多個組成比膜的其他部分更頻繁存在的區塊(回顧請參見Vereb,G.,et al.2003 Proc.Natl.Acad.Sci.100.14：8053-8058)。所述區塊較佳為細胞膜上的蛋白質聚集、區域、微域或隔室，較佳為免疫突觸。不受任何理論束縛，據相信，非隨機分佈有利於TNF受體超家族成員的緊密接近。
在另一些實施例中，藉由提供兩個或更多個結合分子，其結合TNF受體超家族的相同成員(第一膜蛋白質)及相同的第二膜蛋白質，來達成刺激細胞上的TNF受體超家族成員的活性。涉及兩個或更多個結合分子的實施例也被稱為Oligoclonics®實施例。舉例而言，如第15和16圖所示，Oligoclonics®實施例可引起T細胞活化。在WO 2013/157953和WO2004/009618中揭露製造這種Oligoclonics®產品的一般方法，並且透過引用併入本文。術語「Oligoclonics」是註冊商標，由®表示。在一Oligoclonics®實施例中，至少兩個結合分子結合在所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基；在所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；或在所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基及在所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基。Oligoclonics®實施例允許兩個或更多個結合分子結合至第一和/或第二膜蛋白質的相同分子，從而刺激在細胞上的TNF受體超家族成員的活性。較佳的是，至少兩個結合分子結合在所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；或結合在所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基及在所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基。在一特別較佳實施例中，至少兩種結合分子結合在所述第一膜蛋白質上的相同抗原決定基及在所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基。在一些Oligoclonics®實施例中，這兩個結合分子阻斷TNF受體超家族成員-配位體的交互作用。在另一些Oligoclonics®實施例中，這兩個結合分子不會阻斷TNF受體超家族成員-配位體的交互作用。在第一和第二膜蛋白質上的不同抗原決定基較佳為如此，使得結合其中一個抗原決定 基的結合分子和結合不同抗原決定基的結合分子的同時結合是可能的。在一較佳實施例中，不同的抗原決定基是非競爭性抗原決定基。在一較佳實施例中，第一個和第二個所述結合分子可結合CD137或OX40的相同區域。在一較佳實施例中，所述第一和第二結合分子結合CD137或OX40上的相同抗原決定基。
第二膜蛋白質較佳為多聚體細胞激素受體、B7家族的成員、CD28家族的成員；ATP結合匣轉運蛋白質(ATP-binding cassette transporter)(ABC轉運蛋白質(ABC transporter))的成員；水通道蛋白質(aquaporin)；絲胺酸/酥胺酸激酶受體(serine/threonine kinase receptor)家族的成員；受體酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinase)家族的成員。在一較佳實施例中，第二膜蛋白質是B7家族的成員。在一較佳實施例中，B7家族成員是CD80；CD86；PD-L1；PD-L2；ICOSL；B7-H3；B7-H4；B7-H5；B7-H6；或B7-H7。較佳的是，第二膜蛋白質是B7家族的共抑制性蛋白質。在此較佳實施例中，較佳的是，結合第二膜蛋白質的可變域阻斷B7家族成員結合至CD28家族的其配偶體。以此方式，由第二膜蛋白質提供至第一細胞的潛在共抑制訊息減少。在一特別較佳實施例中，第二膜蛋白質是PD-L1或PD-L2，較佳為PD-L1。在另一較佳實施例中，第二膜蛋白質是EGF受體家族的成員(ErbB)；胰島素受體家族；IGF受體家族；FGF受體家族；VEGF受體家族；HGF受體家族；或AXL受體家族。第二膜蛋白質較佳為EGF受體家族的成員(ErbB)，較佳為EGFR；ErbB-2或ErbB-3，較佳為ErbB-2。 較佳的是，結合EGF受體家族的成員EGFR、ErbB-3或ErbB-4的可變域阻斷生長因子結合至所述成員。在此實施例中，在所述第二細胞上的EGF受體家族成員的活性降低。
在本發明的實施例中，第二膜蛋白質是結合對的成員。例如，EGF受體(EGFR)和EGF形成結合對。合適的結合對的其他非限制性範例是HER3和調蛋白質(heregulin)；LGR5-R脊椎蛋白質(LGR5-R spondin)；LGR4-R脊椎蛋白質(LGR4-R spondin)；或CD28家族的B7家族成員配位體及前述之受體。在本發明的一較佳實施例中，如本文所述的結合分子阻斷第二膜蛋白質結合至結合對的互補成員。這樣的結合分子通常刺激在細胞上的TNF受體超家族成員的活性並阻斷第二膜蛋白質的活性。這樣的結合分子特別適用於第二細胞是腫瘤細胞或治療癌症個體的情況。在一較佳實施例中，第二膜蛋白質是B7家族的成員，較佳地為PD-L1或PD-L2，較佳地為PD-L1成員，且所述至少一個結合分子較佳地阻斷所述B7家族成員結合至其CD28家族的正常受體。在一較佳實施例中，第二膜蛋白質是PD-L1，且所述至少一個結合分子較佳地阻斷PD-L1結合至PD-1。
本發明提供增強CD137表達細胞中的生物效應的方法，此方法包括向系統提供第一細胞和第二細胞，其中所述第一細胞包含CD137於細胞膜上，且所述第二細胞包含蛋白質於細胞膜上，且所述蛋白質具有兩個或更多個例子的相同抗原決定基(即，存在兩個或更多個拷貝的相同抗原決定基)在所述蛋白質的胞外部分上，且向所述系統提供包含CD137的胞 外部分的結合位的結合分子，及所述抗原決定基的結合位，此述方法更包含在允許所述生物活性增強的條件下，培養所述系統。在一些實施例中，所述方法是體外方法。在一些實施例中，所述CD137表達細胞是免疫細胞，較佳為T細胞，且所述第二細胞是腫瘤細胞。在一些實施例中，所述CD137表達細胞是免疫細胞，較佳為T細胞，且所述第二細胞是另一免疫細胞。在一些實施例中，所述CD137表達細胞是免疫細胞，較佳為T細胞，並且所述第二細胞是骨髓族系的細胞。在一些實施例中，所述CD137表達細胞是免疫細胞，較佳為T細胞，且所述第二細胞是抗原呈現細胞。所述抗原呈現細胞在MHC的背景下，較佳地在HLA的背景下，較佳地呈現腫瘤抗原或致病性抗原。
如果TNF受體超家族成員由細胞表達，細胞通常在膜上具有此成員。表達可以用各種方式測量。經常使用定量RNA特異性PCR。免疫組織化學(immunohistochemistry)或使用免疫螢光的FACS分析也經常使用。
提供第一細胞和第二細胞的合適系統為細胞培養。另一合適系統是包含第一細胞和第二細胞的非人類動物。其他合適系統是離體(ex vivo)系統，其中細胞保持活性形式，但其中細胞的生長不一定被促進。第一和第二細胞可在，例如不一定促進生長但允許測量生物活性的測定條件下，一起培養。
在允許細胞表達由所述第一膜蛋白質和所述第二膜蛋白質的結合媒介的所述生物活性的條件下，培養所述系統意指將系統維持在第一和第二細胞可表現出生物活性的條件下，作為結合配偶體的結果。體內(in vivo)或體外(in vitro)培 養不需涉及超過足夠的時間來使生物活性變得明顯。
與可變域不存在時的結合相比，不阻斷如本文所述的膜蛋白質的特異性結合對的結合的可變域通常不降低此配對的結合。這較佳地在體外測定中測量。通常，這是藉由將可變域與其可結合的膜蛋白質一起培養並隨後將混合物與配對中的另一成員一起培養來完成。然後，將配對的結合與可變域不存在的配對的結合進行比較。如果當與可變域不存在的結合相比較時，可變域減少配對的結合不超過50%、較佳不超過40%、較佳不超過30%、較佳不超過20%且更佳不超過10%，則可變域被認為不阻斷膜蛋白質的特異性結合對的結合。透過可變域的結合和阻斷或非阻斷對結合對的另一成員的結合在本文中被定義為使用包含兩個相同的所述可變域中的二價單株抗體獲得的阻斷。阻斷或非阻斷被定義為用包含所述兩個相同的所述可變域的二價單特異性抗體獲得。
可結合CD137的胞外域且不阻斷CD137結合至CD137L的特異性可變域是包含MF6860；MF6848；MF6805；MF6832；MF6870；MF6862；MF6875；或MF6873的VH的胺基酸序列的可變域。
可結合PD-L1的胞外域並且不阻斷PD1結合至PD-L1的特異性可變域是包含MF5361的VH的胺基酸序列的可變域。
可用各種方式確定可變域的在種類上，不一定在量上的功能面向，例如結合至抗原、受體配位體交互作用的阻斷能力、可變域的生物活性等。合適的形式是Fab片段或抗體。 合適的抗體形式是包含兩個可變域的單特異性二價抗體。另一合適的形式是，例如包含待測試的可變域和另一可變域的雙特異性抗體。另一可變區較佳是相對於待執行的測定，具有中性特異性的可變域。合適的中性可變域是可結合破傷風類毒素的可變域。
本發明的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳包含阻斷其TNF受體超家族目標膜蛋白質結合至前述之結合配偶體的可變域。在一些實施例中，本發明的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包含阻斷其TNF受體超家族目標膜蛋白質結合至前述之結合配偶體，且當以包含兩個所述可變域的單特異性二價抗體提供時，不刺激細胞上的TNF受體超家族成員的活性的可變域。在一些實施例中，本發明的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物包含阻斷CD137結合至CD137L，且當以包含兩個所述可變域的單特異性二價抗體提供時，不刺激細胞上CD137的活性的可變域。
本發明還提供治療具有癌症的個體的方法，此方法包括投予本發明的結合分子，較佳地本發明的抗體或功能部分，衍生物和/或類似物或本發明的雙特異性抗體至需要前述的個體。個體較佳是具有癌症的個體。在一些實施例中，癌症是包含表達所述第二膜蛋白質的癌細胞的癌症。在一些實施例中，癌症是包含表達B7家族成員的癌細胞的癌症。在一些實施例中，所述個體的骨髓族系的免疫細胞和/或細胞表達所述第二膜蛋白質，較佳地B7家族的成員。在一些實施例中，所述個體的抗原呈現細胞(antigen-presenting cell，APC)表達所述 第二膜蛋白質，較佳B7家族的成員。根據這些實施例，癌細胞可表達或可不表達所述第二膜蛋白質。當APC表達所述第二膜蛋白質時，所述癌症的抗原由個體的這類APC呈現，且可透過本發明的抗體或功能部分、衍生物和/或類似物，其能夠結合免疫細胞和個體的免疫細胞、APC或腫瘤細胞，來誘導免疫細胞(較佳為T細胞)的轉活化。在一些實施例中，使用結合CD137和B7家族的成員，較佳地PD L1的本發明抗體或功能部分、衍生物和/或類似物。本發明的這類抗體或功能部分、衍生物和/或類似物可藉由結合CD137表達免疫細胞(較佳地為T細胞)和腫瘤細胞和/或免疫細胞和/或骨髓族系的細胞和/或表達B7家族的所述成員的APC來轉活化免疫細胞。
癌症較佳是腺癌(adenocarcinoma)。較佳的癌症是大腸癌(colorectal cancer)；胰腺癌(pancreatic cancer)；肺癌；乳癌；肝癌；前列腺癌；卵巢癌；子宮頸癌(cervical cancer)；子宮內膜癌(endometrial cancer)；頭頸癌；黑色素瘤；睾丸癌；泌尿上皮癌(urothelial cancer)；腎癌；胃癌；或類癌癌症。在一較佳實施例中，癌症是大腸癌；胰腺癌；肺癌；乳癌；肝癌；前列腺癌；卵巢癌；子宮頸癌；子宮內膜癌；頭頸癌；或黑素瘤。在一特別較佳實施例中，癌症是大腸癌；胰腺癌；肺癌；乳癌；或肝癌。在一特別較佳實施例中，癌症是胃腸癌。在一較佳實施例中，癌症是大腸癌。在此實施例中，結合分子，較佳為抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，較佳地是具有可結合CD137或OX40的可變域和可結合PD-L1的可變域的抗體。結合CD137或OX40的可變域較佳地阻斷CD137結合 至CD137配位體，或在OX40的情況下，阻斷OX40結合至OX40配位體。結合PD-L1的可變域較佳地阻斷PD-1結合至PD-L1。
進一步提供離體系統，其包含本發明的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物或雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，及所述第一細胞和所述第二細胞。第一和所述第二細胞較佳地分別在細胞膜上表達所述第一和所述第二膜蛋白質。此系統較佳為適用於所述第一細胞的維持和/或生長的細胞系統。細胞系統較佳地適用於所述第二細胞的維持和/或生長。例如，這樣的系統適用於提高和/或繁殖針對異常細胞的免疫細胞。隨後可將此類免疫細胞投予至有此需要的個體，例如癌症病人。免疫細胞較佳地包含T細胞或NK細胞，較佳為細胞毒性T細胞。免疫細胞對有此需要的個體較佳地是自體的(autologous)。
還提供刺激個體對抗在所述個體中的異常細胞的免疫反應的方法，此方法包括向所述個體提供本發明的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物。異常細胞較佳為癌細胞、病毒感染的細胞、寄生蟲或寄生蟲感染的細胞。在一較佳實施例中，細胞是癌細胞或贅生細胞。在此實施例中，抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地是具有可結合CD137或OX40的胞外部分的可變域和可結合PD-L1的可變域的抗體。結合CD137或OX40的可變域較佳地阻斷CD137結合至CD137配位體，或者在OX40的情況下，阻斷OX40結合至OX40OX配位體。結合PD-L1的可變域較佳地阻斷PD-1結合至PD-L1。
贅生物(neoplasm)是組織的異常生長，且當它也形成一塊時，通常稱為腫瘤。本發明中的贅生物通常形成一塊。贅生細胞是來自已形成一塊的贅生物的細胞。世界衛生組織(The World Health Organization，WHO)將贅生物分為四大類：良性贅生物(benign neoplasm)、原位贅生物(in situ neoplasm)、惡性贅生物(malignant neoplasm)和有不確定或未知行為的贅生物。惡性贅生物也簡單地以癌症為人所熟知。
刺激免疫反應包括誘導免疫反應及增強已經存在的免疫反應。可藉由，在適用的情況下，測量個體的腫瘤載量；個人的病毒載量；個體的寄生蟲載量，來測量個體的免疫反應。
所述病毒感染的細胞較佳為感染免疫缺陷病毒、皰疹病毒(herpes virus)，較佳地單純皰疹病毒(herpes simplex virus)，水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus)、巨細胞病毒(cytomegalovirus)或愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、乳突瘤病毒(papilloma virus)、肝炎病毒，較佳地A型、B型或C型肝炎病毒，麻疹病毒(measles virus)或腺病毒(adenovirus)。病毒較佳為已知能夠持續存在於個體中的病毒。持續性感染的特徵在於病毒未被清除但仍存在於受感染個體的特定細胞中的那些感染。持續感染可有關於沉默和有生產力感染的階段，而不會迅速殺死或甚至產生宿主細胞的過度損傷。持續的病毒-宿主交互作用可能是潛伏、慢性和/或緩慢的感染。
寄生蟲感染的細胞是感染胞內寄生蟲的細胞。這 類寄生蟲是能夠在宿主細胞內生長和繁殖的寄生性微生物。一些胞內寄生蟲也可以生活在細胞外。這類寄生蟲是所謂的兼性(facultative)胞內寄生蟲。非限制性範例是單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogene)、退伍軍人菌(Legionella)、某些種類的分枝桿菌(mycobacterium)和新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)。較佳的胞內寄生蟲是不能在宿主細胞外生長的寄生蟲，較佳的範例是披衣菌(Chlamydia)和緊密相關的物種、某些種類的分枝桿菌，例如麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、某些原生動物，包括：頂複合器蟲(Apicomplexan)(瘧原蟲屬(Plasmodium spp.))、弓形蟲(Toxoplasma gondii)和隱孢子蟲(Cryptosporidium)和錐蟲(trypanosomatid)。
本發明還提供編碼根據本發明的抗體重鏈可變區的核酸分子。核酸分子(通常是體外、單離或重組核酸分子)較佳地編碼第3圖所示的重鏈可變區中的任一個或第3圖中所示的重鏈可變區，其具有1、2、3、4或5個胺基酸的插入、缺失、取代或前述組合。在一較佳實施例中，核酸分子包含如第3圖所示的序列。核酸分子較佳地使用以要使用的抗體產生細胞中的表達進行最佳化的密碼子。較佳地，將編碼第3圖所示的重鏈可變區的核酸或其中具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合之編碼第3圖所示重鏈可變區的核酸，，進行密碼子最佳化，用於人類細胞，較佳為Per.C6TM；或中國倉鼠，較佳為CHO中的表達。本發明更提供編碼所提及的重鏈可變區和第2圖的重鏈恆定區的核酸分子。
如本發明所用的核酸分子通常但不僅為是核糖核 酸(ribonucleic acid，RNA)或去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可取得替代核酸。例如，根據本發明的核酸分子包含於細胞中。當所述核酸分子在所述細胞中表達時，所述細胞可產生根據本發明的抗體。因此，在一實施例中的本發明提供包含根據本發明的抗體和/或根據本發明的核酸分子的細胞。當所述細胞產生重鏈和輕鏈時，產生抗體。提供可產生本發明抗體的細胞。細胞較佳地包含編碼包含抗體重鏈可變區的抗體重鏈的核酸分子，其中所述抗體重鏈可變區與常見輕鏈組合時，可結合所述第一膜蛋白質。所述細胞較佳地更包含編碼抗體重鏈可變區的抗體重鏈的核酸分子，其中當所述抗體重鏈可變區與共同輕鏈組合時，可結合所述第二膜蛋白質。所述細胞較佳地更包含編碼共同輕鏈的核酸分子。所述細胞較佳為動物細胞，更佳為哺乳動物細胞，更佳為靈長類細胞，最佳為人類細胞。為了本發明的目的，合適的細胞是能夠包含且較佳地生產根據本發明的抗體和/或根據本發明的核酸的任何細胞。
本發明更提供包含根據本發明的抗體的細胞。還提供包含單獨或共同編碼本發明抗體的一或更多個核酸分子的細胞。所述一或更多個核酸分子是可表達的核酸分子，這意味著它們含有編碼蛋白質的區域的RNA轉錄和轉譯的順式所需的訊息。較佳地，所述細胞(通常是體外、單離或重組細胞)產生所述抗體。在一較佳實施例中，所述細胞是融合瘤(hybridoma)細胞、中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞、NS0細胞或PER-C6TM細胞。在特別較佳實施例中，所 述細胞是CHO細胞。更提供包含根據本發明的細胞的細胞培養。各種機構和公司已經開發出用於大規模生產抗體的細胞系，例如用於臨床用途。這類細胞系的非限制性範例是CHO細胞，NS0細胞或PER.C6TM細胞。這些細胞也用於其他目的，例如蛋白質的生產。為了蛋白質和抗體的工業規模生產而開發的細胞系，在本文中更稱為工業細胞系。因此，在一較佳實施例中，本發明提供開發用於大規模生產抗體，以用於生產本發明的抗體的的細胞系的用途。本發明更提供用於產生包含核酸分子的抗體的細胞，其中核酸分子編碼如第3、1和2圖所示的VH、VL和/或重鏈。較佳地，所述核酸分子包含如所第1和2圖所示的序列。
本發明更提供生產抗體的方法，此方法包括培養本發明的細胞且自所述培養物中收穫所述抗體。較佳地，所述細胞在無血清培養基中培養。較佳地，所述細胞適於懸浮生長。更提供可藉由根據本發明的生產抗體的方法所獲得的抗體。抗體較佳地自培養物的培養基純化。較佳地，所述抗體是親和純化(affinity purified)。
本發明的細胞為例如融合瘤細胞系、CHO細胞、293F細胞、NS0細胞或本領域已知的任何其它適用於臨床目的的抗體生產的細胞類型，特別是用於生產用於人類給藥的抗體。在一特別較佳實施例中，所述細胞是人類細胞，較佳為經腺病毒E1區或其功能等價物轉形的細胞。這類細胞系的較佳範例是PER.C6TM細胞系或其等價物。在一特別較佳實施例中，所述細胞是CHO細胞或其變異體，較佳地為利用穀胺醯胺合成 酶(glutamine synthetase，GS)載體系統，來表達抗體的變異體。
本發明更提供了包含一或更多個根據本發明的抗體或其變異體的藥物組合物。此藥物組合物較佳地包含藥學上可接受的賦形劑(excipient)或載體(carrier)。
本發明的抗體或其變異體可更包含標籤(label)，較佳為用於體內成像的標籤。對於治療應用來說，這樣的標籤通常不是必需的。在例如診斷設置中，標籤可以是有幫助的，例如視覺化體內的目標細胞。各種標籤是適合的，且許多在本領域中是眾所皆知的。在一較佳實施例中，標籤是用於偵測的放射性標籤。在另一較佳實施例中，標籤是紅外線標籤。較佳地，紅外線標籤適合體內成像。本領域技術人員可取得各種紅外線標籤。較佳的紅外標籤是，例如IRDye 800；IRDye 680RD；IRDye 680LT；IRDye 750；IRDye 700DX；IRDye 800RS；IRDye 650；IRDye 700亞磷醯胺(phosphoramidite)；IRDye 800亞磷醯胺(LI-COR USA；4647 Superior Street；Lincoln，Nebraska)。
待投予至病人的根據本發明的抗體的量通常在治療窗口(therapeutic window)中，意味著使用足夠的量，以獲得治療效果，而此量不超過會導致不可接受的程度的副作用的閾值(threshold)。獲得期望的治療效果所需的抗體量越低，治療窗通常會越大。因此，在低劑量下發揮足夠治療效果的根據本發明的抗體是較佳的。劑量可以在Nivolumab的給藥方案的範圍內。劑量也可更低。
如實施例8所述(第28A和28B圖)，在腫瘤抑制環境中，在周圍細胞上的PD-L1的表達預期會達到將導致T 細胞上的CD137活化的密度閾值。因此，雙特異性抗體將能夠活化腫瘤內的T細胞，且不會或者顯著較低程度地作用於表達低PD-L1細胞表面量的細胞。在CD137xPD-L1雙特異性抗體含有阻斷PD-L1的Fab臂的情況下，此抗體將另外克服PD-1/PD-L1阻斷。通過「反式」作用，CD137xPD-L1抗體將釋放PD-1/PD-L1阻斷，同時藉由活化CD137來活化T細胞。因此，CD137xPD-L1抗體可以增強局部T細胞反應，導致釋放大量的細胞激素(實施例9)，其繼而可活化腫瘤微環境中的其他免疫細胞並至少部分地克服腫瘤中的局部免疫抑制。本發明人已顯示，相較於基於具有同類特異性的先前技術基準抗體的抗體，例如基於Urelumab(抗CD137)或基於Atezolizumab(抗PD-L1)的抗體，根據本發明的雙特異性抗體時常具有更好的T細胞活化性質。在範例中，相較於兩個這樣的基於基準的抗體的混合物，以本發明的雙特異性抗體達成更強的T細胞活化活性。例如，這顯示於在當前範例的T細胞轉活化測定和SEB刺激測定中。還展現，根據本發明的雙特異性抗體能夠逆轉由腫瘤相關的M2巨噬細胞誘導的免疫抑制，且能夠體外(重)刺激單離自病人腫瘤的腫瘤特異性T細胞。根據本發明的雙特異性抗體可(重)刺激腫瘤特異性CD4+效應記憶T細胞、腫瘤特異性CD8+效應記憶T細胞和腫瘤特異性CD8+末端分化(terminally differentiated)T細胞，而基於Atezolizumab的基準抗PD-L1抗體通常只(重)刺激CD4+ T細胞。因此，相較於基準抗體(包括CD8+ T細胞)，根據本發明的雙特異性抗體具有(再)刺激抗原特異性T細胞的更可變的子集的能力。
藉由活化經歷抗原的CD8 T細胞，再活化現有的針對腫瘤的細胞毒性T細胞反應之後，可之外，CD137xPD-L1雙特異性抗體可增強重新(de novo)CD8+ T細胞抗腫瘤反應。藉由將死的腫瘤細胞或被抗原呈現細胞吞噬的腫瘤細胞而流入環境中的腫瘤(新)抗原被運輸至引流淋巴結或三級淋巴結構，其為在腫瘤組織中發現的異位淋巴組織形成。在局部腫瘤環境中，將腫瘤抗原呈現給一經抗原識別就擴張和分化的初始CD8+ T細胞。
如實施例所示，相較於基於Urelumab或Atezolizumab的基準抗體，在CD8+ T細胞引發後，根據本發明的抗體可增強T細胞的擴張至較高的程度。在實施例中，已展現，根據本發明的抗體可誘導比基於Urelumab和基於Atezolizumab的基準抗體的混合物還強的抗原特異性CD8+ T細胞的擴張和分化，這將有助於大的腫瘤特異性記憶和末端分化的殺手T細胞群體的產生。
根據本發明的抗體或其變異體，特別是雙特異性抗體或其變異體可具有比有可變域的二價單特異性抗體的組合更少的副作用。阻斷抑制性和/或共刺激分子的抗體組合有益於對現有免疫療法無反應的病人。然而，免疫調節受體(immune-modulatory receptor，iMOD)的雙重阻斷已顯示增加免疫相關的毒性。根據本發明的抗體或其變異體，特別是雙特異性抗體或其變異體適合解決iMOD的雙重阻斷，因為它們可發揮不能透過單選殖體抗體組合再現的功能活性，且可更選擇性地以特定細胞族群為目標，這減少了病人的安全責任。不受任 何理論的束縛，據相信，相較於單特異性抗體(的組合)，本發明的雙特異性抗體或其變異體的不良副作用的機會減少，至少部分是因為本發明的雙特異性抗體或其變異體通常展現反式的T細胞活化，而其具有低順式T細胞活化活性。在本發明的背景中，使用具有低順式T細胞活化活性的抗體是較佳的，因為這減少了潛在的非特異性T細胞反應。根據本發明的抗體或雙特異性抗體或前述之功能部分、衍生物和/或類似物具有比有可變域的二價單特異性抗體的組合更低的免疫相關毒性。
鑑於以上所述，根據本發明的雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳用於治療應用。
藉由將抗體選殖至在CH3區中含有驅動重鏈異質二聚體化的突變的互補表達載體中，作為雙特異性抗體產生抗體。許多雙特異性抗體以小規模生產並在癌細胞系的結合和功能測定中進行測試。本發明的抗體，特別是本發明的雙特異性抗體可將低毒性輪廓與高效力結合。本發明的抗體可於各種類型和系列的免疫目標治療中是有用的。相較於兩臂皆結合相同抗原的抗體，本發明的抗體可具有增加的治療窗口。
更提供根據本發明的雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物在製備用於治療或預防異常細胞、腫瘤和/或轉移的形成的藥物的用途。所述轉移起源的腫瘤較佳為對所述第二細胞膜蛋白質陽性，較佳地對於B7家族成員為陽性的腫瘤。
在懸浮液293F細胞瞬時轉染後，本發明的抗體可以大於50mg/L的量產生。雙特異性抗體可純化至純度大於98%， 產率大於70%。分析特徵研究顯示雙特異性IgG1抗體輪廓與二價單特異性IgG1相當。
本發明亦提供可結合至TNF受體超家族的膜結合成員的胞外部分和膜結合的第二膜蛋白質的胞外部分，較佳為B7家族的成員，的雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物。在一些實施例中，所述雙特異性抗體或其功能部分、衍生物或類似物包含一個可結合TNF受體超家族的所述成員的抗原結合位和一個可結合所述第二蛋白質的抗原結合位，較佳為B7家族的所述成員。在一些較佳實施例中，本發明的所述雙特異性抗體或其功能部分、衍生物或類似物的抗原結合部分由一個可結合TNF受體超家族的所述成員的胞外部分的免疫球蛋白質可變域和一個可結合B7家族的所述成員的免疫球蛋白質可變域所組成。所述雙特異性抗體或其功能部分、衍生物或類似物對於TNF受體超家族的所述成員較佳是單價的，且對於B7家族的所述成員較佳是單價的。所述雙特異性抗體較佳為全長抗體。在一些實施例中，所述雙特異性抗體是全長IgG，即全長IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳為全長IgG1或全長IgG4。
本發明還提供可結合至CD137的胞外部分和PD-L1的胞外部分的雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物。所述雙特異性抗體或其功能部分、衍生物或類似物較佳地包含兩個抗原結合位。所述雙特異性抗體或其功能部分、衍生物或類似物較佳地包含一個可結合CD137的抗原結合位和一個可結合PD-L1的抗原結合位。在一些較佳實施例中，本 發明的所述雙特異性抗體或功能部分、衍生物或類似物的抗原結合部分由一個可結合CD137的胞外部分的免疫球蛋白質可變域和一個可結合PD-L1的免疫球蛋白質可變域所組成。所述雙特異性抗體或其功能部分、衍生物或類似物對於CD137較佳是單價的且對於PD-L1是單價的。在一些實施例中，可結合CD137的抗原結合位能夠阻斷CD137結合至CD137L。在一些實施例中，可結合CD137的抗原結合位不能阻斷CD137結合至CD137L。在一些實施例中，可結合PD-L1的抗原結合位能夠阻斷PD-L1結合至PD1。在一些實施例中，可結合PD-L1的抗原結合位不能阻斷PD-L1結合至PD1。所述雙特異性抗體較佳是全長抗體。在一些實施例中，所述雙特異性抗體是全長IgG，即全長IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳為全長IgG1或全長IgG4。
還提供了用於治療具有癌症的個體的方法，此方法包括將本發明的結合分子或雙特異性抗體或本發明的功能部分，衍生物或類似物投予至有前述需求的個體。
本發明更提供本發明的結合分子或本發明的雙特異性抗體或功能部分、衍生物或類似物於治療具有癌症的個體中的用途。
更提供了細胞系統，此細胞系統包含本發明的抗體或雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物以及表達TNF受體超家族的膜結合成員的第一細胞和表達膜結合的第二膜蛋白質的第二細胞，較佳為B7家族的成員。
本發明提供刺激在細胞上的TNF受體超家族成員 的活性的方法，此方法包括提供第一細胞和第二細胞，其中所述第一細胞具有所述成員在細胞膜上，且所述第二細胞具有第二膜蛋白質在細胞膜上。此方法包括使所述細胞接觸包含兩個可變域的雙特異性抗體或其變異體，其中一個可變域包含可結合所述TNF受體超家族的所述成員的胞外部分的第一抗原結合位，且其中另一個可變域包含可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分的第二抗原結合位，藉此刺激所述成員在所述第一細胞上的活性。在一些實施例中，所述雙特異性抗體包含一個可結合TNF受體超家族的所述成員的抗原結合位。在一些實施例中，所述方法是體外方法。在一較佳實施例中，TNF受體超家族的所述成員是CD137或OX40。所述第二膜蛋白質較佳不是TNF受體超家族的成員。所述雙特異性抗體對於TNF受體超家族的所述成員較佳是單價的，且對於所述第二膜蛋白質是單價的，較佳地對於B7家族的成員是單價的。所述雙特異性抗體較佳為全長抗體。在一些實施例中，所述雙特異性抗體是全長IgG，即全長IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳為全長IgG1或全長IgG4。
所述第一細胞較佳地不在細胞膜上顯著表達所述第二膜蛋白質。所述第二膜蛋白質較佳是存在於細胞膜上一個或多個區塊中的蛋白質。所述區塊較佳為在細胞膜上的分子集團、區域、微域或隔室，較佳為免疫突觸。所述第二膜蛋白質較佳存在於細胞膜上，作為包含兩個或更多個所述第二膜蛋白質的例子的多聚體蛋白質的一部分。在一些實施例中，所述第二膜蛋白質存在於細胞膜上，作為同質二聚體或同質三聚體的 一部分。在一較佳實施例中，所述第二膜蛋白質是多聚體細胞激素受體、B7家族的成員、CD28家族的成員；ATP結合匣轉運蛋白質(ABC轉運蛋白質)的成員；水通道蛋白質；絲胺酸/酥胺酸激酶受體家族的成員；受體酪胺酸激酶家族的成員。第二膜蛋白質較佳為B7家族的成員，較佳PD-L1或PD-L2，較佳PD-L1成員。在一較佳實施例中，第二膜蛋白質是EGF受體家族(ErbB)的成員；IGF受體家族；FGF受體家族；VEGF受體家族；HGF受體家族；或AXL受體家族。第二膜蛋白質較佳是EGF受體家族(ErbB)的成員，較佳為EGFR；ErbB-2或ErbB-3，較佳為ErbB-2。較佳地，結合TNF受體超家族成員的可變域阻斷配位體結合至成員。結合TNF受體超家族的所述成員的胞外部分的可變域較佳地被定義為，當以包含兩個結合TNF受體超家族的所述成員的所述可變域的二價單特異性抗體形式時，不會刺激細胞上所述TNF受體超家族成員的活性的可變域。方法較佳更包括提供另一雙特異性抗體，其包含可結合TNF受體超家族的所述成員的胞外部分的抗原結合位和可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分的抗原結合位，其中所述第一和第二雙特異性抗體結合：-所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基；-所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；或-所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基及所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；此方法還包括將所述第一和第二細胞與所述第一和第二雙特異性抗體一起培養，從而刺激所述第一細胞上的TNF受 體超家族的所述成員的活性。在一些實施例中，所述方法是體外方法。在一較佳實施例中，TNF受體超家族成員是CD137或OX40。在一些實施例中，所述第一和所述第二雙特異性抗體各自包含一個可結合TNF受體超家族的所述成員的抗原結合位。所述第二膜蛋白質較佳不是TNF受體超家族的成員。所述第一和/或所述第二雙特異性抗體較佳對於TNF受體超家族的所述成員是單價的，且對於所述第二膜蛋白質是單價的，較佳地對於B7家族的所述成員是單價的。所述第一和/或所述第二雙特異性抗體較佳是全長抗體。在一些實施例中，所述第一和/或所述第二雙特異性抗體是全長IgG，即全長IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳全長IgG1或全長IgG4。
可結合所述第二膜蛋白質的第一和第二雙特異性抗體的抗原結合位較佳地結合所述第二膜蛋白質的胞外部分上的不同抗原決定基。所述第二膜蛋白質的胞外部分上的不同抗原決定基較佳是非競爭性抗原決定基。
還提供包含可結合CD137或OX40的胞外部分的抗原結合位和可結合第二膜蛋白質的胞外部分的抗原結合位的雙特異性抗體。在一些實施例中，所述雙特異性抗體包含一個可結合所述CD137或OX40的抗原結合位。所述第二膜蛋白質較佳不是TNF受體超家族的成員。第二膜蛋白質較佳不由T細胞表達至顯著程度。第二膜蛋白質較佳在免疫細胞、骨髓族系的細胞、抗原呈現細胞、腫瘤細胞、病毒感染的細胞或寄生蟲感染的細胞上表達。較佳地，所述第二膜蛋白質是存在於細胞膜上一個或多個區中的蛋白質。此區較佳是細胞膜上的聚集、 區域、微域或隔室，較佳為免疫突觸。在一些實施例中，所述第二膜蛋白質較佳存在於細胞膜上，作為包含兩個或更多個所述第二膜蛋白質的多聚體蛋白質的一部分。在一些實施例中，所述第二膜蛋白質存在於細胞膜上，作為同質二聚體或同質三聚體的一部分。較佳地，所述第二膜蛋白質是多聚體細胞激素受體、B7家族的成員、CD28家族的成員；ATP結合匣轉運蛋白質(ABC轉運蛋白質)的成員；水通道蛋白質；絲胺酸/酥胺酸激酶受體家族的成員；受體酪胺酸激酶家族的成員。第二膜蛋白質較佳為B7家族的成員，較佳PD-L1或PD-L2，較佳PD-L1成員。在一些實施例中，第二膜蛋白質是EGF受體家族(ErbB)的成員；胰島素受體家族；IGF受體家族；FGF受體家族；VEGF受體家族；HGF受體家族；或AXL受體家族。在一些實施例中，第二膜蛋白質是EGF受體家族(ErbB)的成員，較佳為EGFR；ErbB-2或ErbB-3，較佳為ErbB-2。結合所述CD137或OX40的可變域較佳地阻斷配位體與成員的結合。結合所述CD137或OX40的細胞外部分的可變域被較佳定義為，當以包含兩個結合所述CD137或OX40的所述可變域的二價單特異性抗體形式時，不會刺激在細胞上的CD137或OX40活性的可變域。所述雙特異性抗體較佳地對於CD137或OX40是單價的，且對於所述第二膜蛋白質是單價的。所述雙特異性抗體較佳為全長抗體。在一些實施例中，所述雙特異性抗體是全長IgG，即全長IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳全長IgG1或全長IgG4。
本發明亦提供包含一個或更多個根據本發明的雙 特異性抗體的組合物。還提供包含兩個或更多個本發明的雙特異性抗體的部分組合物或套組，其中第一和第二雙特異性抗體的可結合CD137或OX40的抗原結合位結合所述CD137或OX40上的不同抗原決定基。還提供了刺激細胞上的CD137或OX40活性的方法，此方法包括提供第一細胞和第二細胞，其中所述第一細胞具有所述CD137或OX40(第一膜蛋白質)於細胞膜上，且所述第二細胞具有第二膜蛋白質於細胞膜上。此方法包括使所述細胞接觸包含兩個可變域的根據本發明的雙特異性抗體(第一雙特異性抗體)，其中一個可變域包含可結合所述第一膜蛋白質的胞外部分的第一抗原結合位，而另一可變域包含可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分的第二抗原結合位，由此刺激在所述第一細胞上的所述第一膜蛋白質的活性。在一些實施例中，所述雙特異性抗體包含一個可結合所述第一膜蛋白質的抗原結合位。在一些實施例中，所述方法是體外方法。此方法較佳地更包括提供根據本發明的另一雙特異性抗體(第二雙特異性抗體)，其包含具有可結合所述第一種膜蛋白質的胞外部分的抗原結合位的可變域；和具有可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分的抗原結合位的可變域，其中所述第一和第二雙特異性抗體結合：-所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基；-所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；或-所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基；和所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；此方法更包括將所述第一和第二細胞與所述第一和第二 雙特異性抗體一起培養，從而刺激所述第一細胞上的CD137或OX40的活性。第二膜蛋白質較佳是B7家族的成員，更佳為PD-L1。
如下文所示的由MF序列定義的抗體較佳是具有兩個不同可變域的雙特異性抗體，其中這些可變域中的一個包含所示序列。
包含可結合CD137的胞外部分的可變域的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含具有CDR3區的重鏈可變區，其中重鏈可變區包含MF6754；MF6763；MF6785；或MF6797的可變重鏈區的CDR3區的胺基酸序列(第3圖)。
包含可結合至CD137的胞外部分的可變域的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含具有CDR1、CDR2和CDR3區的重鏈可變區，其中重鏈可變區包含MF6754；MF6763；MF6785；或MF6797所示的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列(第3圖)。CDR1、CDR2和CDR3序列較佳選自相同的VH區。
包含可結合至CD137的胞外部分的可變域的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含MF6754；MF6763；MF6785；或MF6797的可變重鏈區的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插人、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF的VH胺基酸序列。胺基酸插入，缺失，取代或其組合(如果有的話)較佳地不在CDR區的胺基酸序列中。
包含可結合至PD-L1的胞外部分的可變域的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含具有CDR3區的重鏈可變區，其中重鏈可變區包含MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5424；MF5561；MF5439；MF5553；MF5594；MF5426；MF5442或MF5361的可變重鏈區的CDR3區的胺基酸序列(第3圖)。
包含可結合至PD-L1的胞外部分的可變域的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含具有CDR1、CDR2和CDR3區的重鏈可變區，其中重鏈可變區包含MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5424；MF5561；MF5439；MF5553；MF5594；MF5426；MF5442或MF5361所示的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列(第3圖)。CDR1，CDR2和CDR3序列較佳選自相同的VH區。
包含可結合至PD-L1的胞外部分的可變域的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5424；MF5561；MF5439；MF5553；MF5594；MF5426；MF5442或MF5361的可變重鏈區的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF的VH胺基酸序列。胺基酸插入、缺失、取代或其組合(如果有的話)較佳地不在CDR區的胺基酸序列中。
抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包 含可結合至CD137的胞外部分的可變域及可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，其中可結合至CD137的胞外部分的可變域阻斷CD137與CD137配位體的結合，且可結合至PD-L1的胞外部分的可變域阻斷PD-1與PD-L1結合。在此抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物中結合PD-L1的胞外部分的可變定義區較佳地包含具有CDR3的胺基酸序列或MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5424；MF5561；MF5439；MF5553；MF5594；MF5426；MF5442或MF5361的VH中之一的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區(第3圖)。在一較佳實施例中，結合PD-L1的胞外部分的可變區包含具有MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5424；MF5561；MF5439；MF5553；MF5594；MF5426；MF5442或MF5361的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF的VH胺基酸序列。
在此抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物中的結合CD137的胞外部分的可變域較佳地包含具有CDR3的胺基酸序列或MF6754；MF6763；MF6785；或MF6797的VH之一的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區(第3圖)。在一較佳實施例中，結合CD137的胞外部分的可變域包含具有MF6754；MF6763；MF6785；或MF6797的VH的胺基酸序列的VH區，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插 入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF的VH胺基酸序列。胺基酸插入、缺失、取代或其組合(如果有的話)較佳地不在CDR區的胺基酸序列中。在此抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物中的特別較佳的組合是包含MF6797和MF7702；MF6763和MF7702；MF6785和MF7702；MF6797和MF5553；MF6763和MF5553；MF6785和MF5553；MF6754和MF5424；MF6763和MF5561；MF6785和MF5439；MF6797和MF5553；MF6744和MF5594；MF6744和MF5361；MF6783和MF5361；或MF6783和MF5594的所示序列或其變異體的可變域的組合。
如本文所述的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含-CD137結合可變域，其包含具有CDR3的胺基酸序列或MF6754的VH的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有CDR3的胺基酸序列或MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5594；MF5424；MF5426；MF5553；MF5442；MF5561；MF5439或MF5361的VH的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區(第3圖)。
抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳包含-CD137結合可變域，其包含MF6754的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、 取代或前述之組合，相對於所示的MF6754的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5594；MF5424；MF5426；MF5553；MF5442；MF5561；MF5439或MF5361的VH的胺基酸序列的VH區(第3圖)，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF的VH的胺基酸序列。
如本文所述的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含- CD137結合可變域，其包含具有CDR3的胺基酸序列或MF6763的VH的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；及- PD-L1結合可變域，其包含具有CDR3的胺基酸序列或MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5594；MF5424；MF5426；MF5553；MF5442；MF5561；MF5439或MF5361的VH的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區(第3圖)。
抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳包含-CD137結合可變域，其包含MF6763的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6763的VH的胺基酸序 列；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5594；MF5424；MF5426；MF5553；MF5442；MF5561；MF5439或MF5361的VH的胺基酸序列的VH區(第3圖)，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF的VH的胺基酸序列。
如本文所述的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含- CD137結合可變域，其包含具有CDR3的胺基酸序列或MF6785的VH的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；及- PD-L1結合可變域，其包含具有CDR3的胺基酸序列或MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5594；MF5424；MF5426；MF5553；MF5442；MF5561；MF5439或MF5361的VH的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區(第3圖)。
抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳包含-CD137結合可變域，其包含MF6785的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6785的VH的胺基酸序列；及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5594；MF5424；MF5426；MF5553；MF5442；MF5561；MF5439或MF5361的VH的胺基酸序列的VH區(第3圖)，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF的VH的胺基酸序列。
如本文所述的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含- CD137結合可變域，其包含具有CDR3的胺基酸序列或MF6797的VH的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；及- PD-L1結合可變域，其包含具有CDR3的胺基酸序列或MF5554；MF5576；MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5594；MF5424；MF5426；MF5553；MF5442；MF5561；MF5439或MF5361的VH的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區(第3圖)。
抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳包含-CD137結合可變域，其包含MF6797的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6797的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5554；MF5576； MF5578；MF9375；MF9376；MF7702；MF5594；MF5424；MF5426；MF5553；MF5442；MF5561；MF5439或MF5361的VH的胺基酸序列的VH區(第3圖)，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF的VH的胺基酸序列。
如實施例所示，具有基於MF5553的PD-L1結合可變域的抗體組合不同的CD137結合可變域，包含MF6754、MF6763、MF6785和MF6797，提供特別好的T細胞活化結果。
因此，更提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6754的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5553的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6754的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5553的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含MF6754的VH的胺基酸序列， 其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6754的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含MF5553的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF5553的VH的胺基酸序列。
更提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6763的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5553的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6763的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5553的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含MF6763的VH的胺基酸序列， 其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6763的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含MF5553的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF5553的VH的胺基酸序列。
更提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6785的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5553的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6785的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5553的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含MF6785的VH的胺基酸序列， 其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6785的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含MF5553的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF5553的VH的胺基酸序列。
更提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6797的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5553的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6797的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5553的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含MF6797的VH的胺基酸序列， 其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6797的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含MF5553的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF5553的VH的胺基酸序列。
實施例中進一步顯示，具有基於MF7702的PD-L1結合可變域的抗體組合不同的CD137結合可變域，包含MF6763、MF6785和MF6797，提供特別好的T細胞活化結果。
因此，更提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6797的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF7702的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6797的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF7702的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含MF6797的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6797的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含MF7702的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF7702的VH的胺基酸序列。
更提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6763的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF7702的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6763的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF7702的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含MF6763的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6763的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含MF7702的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF7702的VH的胺基酸序列。
更提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6785的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF7702的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6785的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF7702的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含MF6785的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6785的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含MF7702的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF7702的VH的胺基酸序列。
再者，在範例中顯示，具有基於MF6744的CD137結合可變域和基於MF5594的PD-L1結合可變域的雙特異性抗體提供特別好的T細胞活化；見例如第14至16圖。重要的是，相較於基於抗體Urelumab的抗體，此類抗體具有更強的T細胞活化潛力。
因此，更提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6744的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5594的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或 類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6744的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5594的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含MF6744的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6744的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含MF5594的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF5594的VH的胺基酸序列。
再者，在範例中顯示，具有基於MF6744的CD137結合可變域和基於MF5361的PD-L1結合可變域的雙特異性抗體提供特別好的T細胞活化；見例如第14至16圖。重要的是，相較於基於抗體Urelumab的抗體，此類抗體具有更強的T細胞活化潛力。
因此，更提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含： -CD137結合可變域，其包含具有MF6744的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5361的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6744的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5361的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含MF6744的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6744的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含MF5361的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF5361的VH的胺基酸序列。
再者，在實施例中顯示，具有基於MF6783的CD137結合可變域和基於MF5361的PD-L1結合可變域的雙特 異性抗體提供特別好的T細胞活化；例如參見第14至15圖。重要的是，與基於抗體Urelumab的抗體相比，此類抗體具有更強的T細胞活化潛能。
因此，更提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6783的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5361的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6783的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5361的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含MF6783的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6783的VH的胺基酸序列；及-PD-L1結合可變域，其包含MF5361的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF5361的VH的胺基酸序列。
再者，在範例中顯示，具有基於MF6783的CD137結合可變域和基於MF5594的PD-L1結合可變域的雙特異性抗體提供特別好的T細胞活化，參見例如第14至15圖。
因此，更提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6783的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5594的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含具有MF6783的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域，其包含具有MF5594的VH的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其包含：-CD137結合可變域，其包含MF6783的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6783的VH的胺基酸序 列；及-PD-L1結合可變域，其包含MF5594的VH的胺基酸序列，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF5594的VH的胺基酸序列。
此外，在實施例例中顯示，具有基於MF6744的CD137結合可變域和基於MF5361的PD-L1結合可變域的雙特異性抗體，加上具有基於MF6744的CD137結合可變域和基於MF5594的PD-L1結合可變域的雙特異性抗體的組合，(應用為雙重雙特異性，例如Oligoclonics®實施例)提供了優異的T細胞活化(見第14至16圖)，且優於基於Urelumab的抗體。
因此，更提供一種部分混合物或套組，包括：-包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第一雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結合可變域包含具有MF6744的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區，且PD-L1結合可變域包含具有MF5594的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第二雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結合可變域包含具有MF6744的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區，且PD-L1結合可變域包含具有MF5361的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供一種部分混合物或套組，包括： -包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第一雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結合可變域包含具有MF6744的VH的CDR1、CDR2、CDR3區的胺基酸序列的VH區，且PD-L1結合可變域包含具有MF5594的VH的CDR1、CDR2、CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第二雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結合可變域包含具有MF6744的VH的CDR1、CDR2、CDR3區的胺基酸序列的VH區，且PD-L1結合可變域包含具有MF5361的VH的CDR1、CDR2、CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供一種部分混合物或套組，包括：-包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第一雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結合可變域包含具有MF6744的VH的胺基酸序列的VH區，且MF6744具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6744的VH的胺基酸序列；且其中PD-L1結合可變域包含具有MF5594的VH的胺基酸序列的VH區，且MF5594具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF5594的VH的胺基酸序列；及-包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第一雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結 合可變域包含具有MF6744的VH的胺基酸序列的VH區，且MF6744具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6744的VH的胺基酸序列；且其中PD-L1結合可變域包含具有MF5361的VH的胺基酸序列的VH區，且MF5361具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF5361的VH的胺基酸序列。
此外，在範例中顯示，相較於基於Urelumab的抗體，具有基於MF6744的CD137結合可變域和基於MF5361的PD-L1結合可變域的雙特異性抗體，加上具有基於MF6783的CD137結合可變域和基於MF5594的PD-L1結合可變域的雙特異性抗體的組合，(應用為雙重雙特異性，例如Oligoclonics®實施例)提供了優異的T細胞活化。
因此，更提供一種部分混合物或套組，包括：-包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第一雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結合可變域包含具有MF6783的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區，且PD-L1結合可變域包含具有MF5594的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第二雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結合可變域包含具有MF6744的VH的CDR3區的胺基酸序列的 VH區，且PD-L1結合可變域包含具有MF5361的VH的CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供一種部分混合物或套組，包括：-包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第一雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結合可變域包含具有MF6783的VH的CDR1、CDR2、CDR3區的胺基酸序列的VH區，且PD-L1結合可變域包含具有MF5594的VH的CDR1、CDR2、CDR3區的胺基酸序列的VH區；及-包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第二雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結合可變域包含具有MF6744的VH的CDR1、CDR2、CDR3區的胺基酸序列的VH區，且PD-L1結合可變域包含具有MF5361的VH的CDR1、CDR2、CDR3區的胺基酸序列的VH區。
還提供一種部分混合物或套組，包括：-包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第一雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結合可變域包含具有MF6783的VH的胺基酸序列的VH區，且MF6783具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6783的VH的胺基酸序列；且其中PD-L1結合可變域包含具有MF5594的VH的胺基酸序列的VH區，且MF5594具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示 的MF5594的VH的胺基酸序列；及-包含CD137結合可變域及PD-L1結合可變域的第一雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中CD137結合可變域包含具有MF6744的VH的胺基酸序列的VH區，且MF6744具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF6744的VH的胺基酸序列；且其中PD-L1結合可變域包含具有MF5361的VH的胺基酸序列的VH區，且MF5361具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF5361的VH的胺基酸序列。
實施例中還顯示，具有良好T細胞活化性質的MF6797的CD137特異性VH的結合與包含CD137胺基酸序列的Arg66、Gly70和Phe72的胺基酸的存在相關，如第42圖所示。
因此，本發明還提供能夠結合CD137的單離、合成或重組抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中所述抗體或功能部分、衍生物或類似物與CD137的結合與包含CD137胺基酸序列的Arg66、Gly70和Phe72的胺基酸的存在相關，如第42圖所示。所述抗體或功能部分，衍生物或類似物與CD137的結合較佳地也與包含的CD137胺基酸序列的Val71相關，如第42圖所示。
術語「Arg66」是指CD137序列的第66位上的精 胺酸殘基，如第42圖所示。術語「Gly70」是指CD137序列的第70位上的甘胺酸殘基，如第42圖所示。術語「Val71」是指CD137序列第71位的纈胺酸殘基，如第42圖所示。術語「Phe72」是指CD137序列第72位的苯丙胺酸殘基，如第42圖所示。
抗體或功能部分、衍生物或類似物與CD137的結合與所記載的胺基酸殘基的存在相關，如果當這些殘基中的任何一個被丙胺酸取代時，抗體或功能部分、衍生物或類似物與所得CD137蛋白質的結合減少。
一些實施例提供能夠結合CD137的單離、合成或重組抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其中所述抗體或功能部分、衍生物或類似物特異性結合CD137胺基酸序列的胺基酸Arg66、Gly70和Phe72，如第42圖所示。所述抗體或功能部分、衍生物或類似物較佳地亦特異性結合CD137胺基酸序列的胺基酸Val71，如第42圖所示。
一些較佳實施例提供能夠結合至CD137和PD-L1且具有基於MF6797的CD137結合可變域和基於MF7702的PD-L1結合可變域的雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物。具有特別好的T細胞活化特性的這種雙特異性抗體與CD137和PD-L1的結合與包含所述CD137胺基酸殘基的胺基酸相關。
既然已經鑑別所述CD137胺基酸殘基，產生或選擇特異性結合這些胺基酸殘基的抗體或其變異體就已變為有可能。特異性結合某些胺基酸殘基的結合分子的產生和/或選 擇可使用本發明所屬技術領域眾所熟知的方法進行，例如藉由以含有特定區域的抗原片段免疫能夠產生抗體的轉基因非人類動物，其中特定區域包含目標胺基酸殘基。或者，藉由篩選抗體噬菌體展示庫，得到結合至鑑定的胺基酸殘基的噬菌體。
更提供與抗體PB17311競爭結合至CD137和/或PD-L1的抗體或其變異體。例如，使用競爭測定來鑑定競爭性抗體或其變異體，其中將包含CD137和/或PD-L1的細胞與PB17311和候選抗體或其變異體一起培養。相較於對照，其中將包含CD137和/或PD-L1的細胞與PB17311一起培養，但沒有候選抗體或其變異體，能夠減少結合的PB17311的量的候選抗體或其變異體是競爭性抗體或變異體。
一些實施例提供與抗體PB17311競爭結合至CD137和/或PD-L1的單離、合成或重組抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物。
一些實施例提供分離、合成或重組抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物，其與抗體PB17311競爭結合至CD137胺基酸序列的胺基酸Arg66、Gly70和Phe72，如第42圖所示，更佳地競爭結合至CD137胺基酸序列的胺基酸Arg66、Gly70、Val71和Phe72，如第42圖所示。
一些實施例提供與抗體PB17309競爭結合至CD137和/或PD-L1的單離、合成或重組抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物。
一些實施例提供與抗體PB17310競爭結合至CD137和/或PD-L1的單離、合成或重組抗體或其功能部分、 衍生物和/或類似物。
例如，使用競爭測定，其中在候選抗體或其變異體不存在下，PB17309或PB17310與包含CD137和/或PD-L1的細胞的結合與在所述候選抗體或其變異體存在下，PB17309或PB17310與包含CD137和/或PDL1的細胞的結合進行比較，來單離與PB17309或PB17310競爭結合至CD137和/或PD-L1的抗體或其變異體。相較於對照，其中包含CD137和/或PD-L1的細胞與PB17309或PB17310一起培養，但沒有所述候選抗體或其變異體，能夠減少結合的PB17309或PB17310的量的候選抗體或其變異體被鑑定為競爭性抗體或其變異體。
如本文所述的OX40×PD L1雙特異性抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳包含-OX40結合可變域，其包含具有MF6629；MF6630；MF6637；MF6643；MF6645；MF6648；MF6655；MF6658；MF6660；MF6675；MF6686；MF6690；MF6692；MF6700；MF6706；MF6714；MF6721；MF6722；MF6724；MF6728；MF6729；MF6826；MF6940；MF6942；MF6943；MF6944；MF6947；MF6949；MF7331；MF7332；MF7334；MF7341；MF7345；MF7350；MF7351；MF7352；MF7353；MF7356；MF7358；MF7365；MF7366；MF7371；MF7372；MF7374；MF7378；MF7382；MF7383；MF7394；MF7395；或MF7397的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；及-PD-L1結合可變域。PD-L1結合可變區較佳地包含具有如 第3圖所示的PD-L1特異性VH的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區。在如針對MF5594；MF5424；MF5426；MF5553；MF5442；MF5561；MF5426；或MF5439所描繪的PD-L1特異性VH的較佳實施例中(第3圖)。
抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物較佳地包含-OX40結合可變域，其包含MF6629；MF6630；MF6637；MF6643；MF6645；MF6648；MF6655；MF6658；MF6660；MF6675；MF6686；MF6690；MF6692；MF6700；MF6706；MF6714；MF6721；MF6722；MF6724；MF6728；MF6729；MF6826；MF6940；MF6942；MF6943；MF6944；MF6947；MF6949；MF7331；MF7332；MF7334；MF7341；MF7345；MF7350；MF7351；MF7352；MF7353；MF7356；MF7358；MF7365；MF7366；MF7371；MF7372；MF7374；MF7378；MF7382；MF7383；MF7394；MF7395；或MF7397的VH的胺基酸序列的VH區，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的VH的胺基酸序列及；-PD-L1結合可變域。PD-L1結合可變域較佳地包含具有MF5594；MF5424；MF5426；MF5553；MF5442；MF5561；MF5426；或MF5439的VH的胺基酸序列(第3圖)的VH區，其中具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或前述之組合，相對於所示的MF的VH的胺基酸序列(第3圖)。
在提及的H、VH、VH中，所提及的最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地0、1、2、3、4或5個胺基酸取代為保守性胺基酸取代。插入、缺失、取代或前述之組合較佳地不在H、VH、L或VL鏈的CDR3區中，較佳地不在VH或VL鏈的CDR1、CDR2或CDR3區中，較佳地不在FR4區中。
為了清楚的目的和簡要描述，本文描述特徵作為相同或分開的實施例的一部分。然而，應該理解的是，本發明的範圍可包含具有所描述的全部或部分特徵的實施例。
在以下的實施例中進一步說明本發明。這些實施例並不限制本發明的範圍，而僅僅是為了闡明本發明。
實施例
如本文所使用的「MFXXXX」，其中X獨立地為數字0至9，是指包含可變域的Fab，其中VH具有由4位數字所鑑定的胺基酸序列。除非另外指出，否則可變域的輕鏈可變區通常具有第1A圖的序列，通常為第1B圖。「MFXXXX VH」是指由4位數字所鑑定的VH的胺基酸序列。MF更包含輕鏈的恆定區和通常與輕鏈的恆定區交互作用的重鏈的恆定區。PG是指包含相同重和輕鏈的單特異性抗體。PB是指具有兩個不同重鏈的雙特異性抗體。重鏈(VH)的可變區不同且通常CH3區也是，其中一個重鏈具有其CH3域的KK突變，而另一個具 有其CH3域的互補DE突變(見參考文獻PCT/NL2013/050294(公開為WO2013/157954)。
實施例1
用於選擇和篩選的材料的產生
細胞系的培養
從ATCC購買人ES-2細胞(目錄編號CRL-1978)並常規保存在補充10% FBS(Lonza)的McCoy's 5A(Gibco)中。從Invitrogen獲得Freestyle 293F細胞(目錄編號p/n51-0029)併常規保存在293 FreeStyle培養基中。自ATCC購買HEK293T(目錄編號ATCC-CRL-11268)和CHO-K1(目錄編號DSMZ ACC110)細胞系並常規維持在補充L-穀胺醯胺(glutamine)(Gibco)和FBS(Lonza)的DMEM/F12(Gibco)中。
用於免疫和產生穩定的細胞系的OX40、CD137及PD-L1表達載體的產生
合成或透過在含有目標cDNA的市售表達構築體(expression construct)上的PCR擴張，其中目標cDNA具有導入用於選殖的獨限制位及用於有效率轉譯的科扎克一致序列(kozak consensus sequence)的特定引子，來獲得包含用於選殖的獨特限制位和用於有效率轉譯的科扎克一致序列的每個目標的全長cDNA。透過NheI/EcoRI，將每個目標的cDNA選殖至真核表達構築體，例如pIRES-Neo3(Clontech；第4圖)或pVAX1(Thermo Fisher Scientific，第5圖)中，分別產生pIRES-Neo3_[目標名]和pVAX1_[目標名]。藉由比較NCBI參考胺基酸序列，來驗證插入序列。pIRES-Neo3構築體用於產 生穩定的細胞系。pVAX1構築體用於免疫目的。有關所得構築體的名稱的概述，請參見表1。
用於在細胞表面表達的全長huCD137插入物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：NP_001552.2相同)：
其中：
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRS：訊息胜肽。 ：huCD137 的ECD。
IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV：預測的TM區。
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL：胞內尾部。
用於在細胞表面表達的全長獼猴(Macaca fascicularis)CD137插入物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：ABY47575.1相同)：
其中：MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRS：訊息胜肽。 ：maCD137 的ECD。
IIFFLALTSTVVLFLLFFLVLRFSVV：預測的TM區。
KRSRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL：胞內尾部。
用於在細胞表面表達的全長大鼠CD137插入物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：XP_008762505.1相同)：
其中：MGSSCYNMVVTVLLVVGTEEVRA：訊息胜肽。 ：raCD137 的ECD。
VLTLFLALTLALLLFLIFIILWF：預測的TM區。
SVPKWLRKKFPHIFKQPFKKAVRTAQEEDACSCRFPEEEEGGGGSYEL：胞內尾部。
用於在細胞表面表達的全長huPD-L1插入物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：AAI13735.1相同)：
其中：MRIFAVFIFMTYWHLLNA：訊息胜肽。 ：huPD-L1的ECD。
THLVILGAILLCLGVALTFIF：預測的TM區。
RLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET：胞內尾部。
用於在細胞表面表達的全長獼猴PD-L1插入物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：ABO33161.1相同)：
其中：MRIFAVFIFTIYWHLLNA：訊息胜肽。 ：maPD-L1的ECD。
THLVILGAIFLLLGVALTFIF：預測的TM區。
YLRKGRMMDMKKSGIRVTNSKKQRDTQLEET：胞內尾部。
用於在細胞表面表達的全長人類OX40插入物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：NP_003318.1相同)：
其中：MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTG：訊息胜肽。 ：ECD。
VAAILGLGLVLGLLGPLAILL：預測的TM區。
ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI：胞內尾部。
用於在細胞表面表達的全長大鼠(Rattus norvegicus)OX40插入物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：NP_037181.1相同)：
其中：MYVWVQQPTAFLLLGLSLG：訊息胜肽。 ：ECD。
AFAVILGLGLGLLAPLTVLLALYLL：預測的TM區。
RKAWRSPNTPKPCWGNSFRTPIQEEQTDTHFTLAKI：胞內尾部。
用於在細胞表面表達的全長獼猴(Macaca fascicularis)OX40插入物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：XP_005545179.1相同)：
其中：MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTTAK：訊息胜肽。 ：ECD。
VAAILGLGLALGLLGPLAMLL：預測的TM區。
ALLLLRRDQRLPPDAPKAPGGGSFRTPIQEEQADAHSALAKI：胞內尾部。
表達CD137、OX40或PD-L1的穩定細胞系的產生
pIRES-Neo3_[目標名]表達構築體(表1)用於產生穩定表達個別之蛋白質的Freestyle 293F或CHO-K1選殖體。使用lipofectamine轉染，將構築體瞬時轉染於CHO-K1細胞中，或使用PEI轉染於Freestyle 293F細胞，並使用與各個蛋白質反應的抗體，藉由FACS來篩選。確認表達後，將瞬時轉染的細胞以有限稀釋度接種且培養於與所用的表達構築體相關的 選擇壓力下，以獲得穩定的細胞選殖體。在選擇的2至3週後，藉由FACS篩選選殖體。藉由連續繼代，擴張所選的選殖體，在FACS中重新檢測並冷凍至-150℃。穩定表達異源(heterologous)蛋白質的選殖體名稱是CHO-K1_[目標名]細胞或Freestyle 293F_[目標名]細胞。關於用於產生穩定細胞系的構築體及其產生的名稱的概述，請參見表1。
實施例2
免疫、選擇及篩選
用於免疫的小鼠
為了產生結合至huCD137、huOX40和huPD-L1的人類抗體，用重組蛋白質或編碼如下簡要描述的蛋白質的DNA，來免疫轉基因(transgenic)人類Vκ1-39輕鏈(共同輕鏈小鼠，參見WO2009/157771)和人類重鏈(HC)微基因座(minilocus)(包含人類V基因片段、全部人類D和全部人類J的選擇)的小鼠。這些小鼠被稱為「MeMo®」小鼠。
蛋白質免疫
藉由用重組蛋白質和Gerbu佐劑MM(Gerbu Biotechnik c# 3001)的皮下注射，來免疫「MeMo」小鼠。重組huPD-L1-His(SinoBiological；目錄編號10084-H08H)、huOX40-Fc(R & D；目錄編號3388-OX)和huOX40-His(SinoBiological；目錄編號10481-H08H)用於免疫。沒有對CD137抗體組的產生執行蛋白質免疫。用在總體積為100μl的混合40μl的佐劑的PBS中的40μg重組蛋白質，來免疫小鼠。隨後在第14天和第28天，將小鼠以在總體積為50μl的 具有20μl的佐劑的PBS中的20μg的重組蛋白質來追加。在第35天收集小鼠血清，以確定血清力價(serum titer)。血清力價低的小鼠接受額外的追加免疫和血清分析循環。每個循環由兩次的每週使用在50μl的PBS中的20μl的重組蛋白質的免疫，接著一週後收集用於力價分析的血清所組成。顯示對人和獼猴目標高血清力價的小鼠接受由連續三天，每日以在50μl的PBS中的20μg的重組蛋白質的注射所組成的最終追加免疫。最後一次注射後一天，收集小鼠淋巴組織。
DNA免疫
透過使用微色素沉澱(micropigmentation)裝置的DNA紋身(DNA tatooing)，來免疫「MeMo®」小鼠。用20μg的編碼目標抗原的質體DNA(pVAX1_[目標名]，表1)，來執行DNA紋身免疫。用僅編碼人類目標的DNA(PD-L1)或藉由編碼人類和大鼠(CD137、OX40)目標的DNA的交替免疫，來免疫小鼠，以獲得物種交叉反應(cross-reactive)抗體。對於PD-L1免疫，通過，在藉由用0.5mg的抗CD25抗體PC61.5(Bioceros)注射小鼠，以破壞耐受性的免疫開始的四天前，耗竭Treg細胞。在第0、3、6、14、17、28和31天免疫小鼠。在第35天收集小鼠血清，以確定血清力價。對人類和/或獼猴目標具有低血清反應性的小鼠接受用人類、大鼠或獼猴DNA抗原的追加免疫和血清分析的額外循環。每個循環由兩次的每週DNA免疫接種，接著一週後收集用於力價分析的血清所組成。對表達人類和獼猴目標的細胞，顯示強血清反應性的小鼠接受最終追加免疫，接著3天後收集淋巴組織。
蛋白質和DNA免疫(僅OX40)的組合
將小鼠用重組huOX40-His(SinoBiological；目錄編號10481-H08H)來免疫並藉由交替的DNA(pVAX1_raOX40)和蛋白質(huOX40-His)免疫，來追加，以獲得物種交叉反應抗體。因此，用在混合40μl的佐劑之總體積為100μl的PBS中的40μg的重組蛋白質，來免疫小鼠。隨後在第14和17天，藉由用20μg的pVAX1_raOX40的DNA紋身，接著在第28天，將小鼠以在具有20μl的佐劑之總體積為50μl的PBS中的20μg的huOX40-His蛋白質的蛋白質免疫來追加。在第35天收集小鼠血清以確定血清力價。具有低人類和/或獼猴血清力價的小鼠接受追加免疫和血清分析的額外循環。每個循環由兩次每週的用20μg的huOX40-His、pVAX1_raOX40或pVAX1_maOX40的蛋白質或DNA免疫，接著一週後收集用於力價分析的血清所組成。顯示對人和獼猴靶標高血清力價的小鼠接受由連續三天每日注射於50μl的PBS中的20μg的重組蛋白質所組成的最終加強免疫。最後一次注射的一天後，收集小鼠淋巴組織。
血清力價的確定
藉由使用表達人類和獼猴目標抗原的細胞系的FACS分析，來確定血清力價(表1)。
合成的噬菌體Fab庫的產生
基於被選擇為在天然全集(repertoire)中經常使用的生殖人類VH基因和規範序列多樣性的全集來建造合成庫。使用PCR，將合成的HCDR3區添加至這些VH基因。這是使 用黏著(anneal)VH基因的框架1，且包含用於選殖的SfiI限制位的順向引子來完成。反向引子包含黏著至VH基因的框架3的序列，接著藉由隨機化序列以編碼HCDR3多樣性，且編碼框架4的序列亦含有用於選殖的BstEII和XhoI限制位。基於在HCDR3內某些位置的胺基酸殘基的使用頻率，合成的CDR3區是完全隨機的或編碼較有限的多樣性。使用所述限制酶，將編碼VH基因的PCR產物選殖至噬菌體展示載體中，與噬菌體M13基因3蛋白質融合，並且亦含有共同輕鏈編碼基因。大規模的連接和大腸桿菌TG1的轉形產生在噬菌體上展示的合成Fab片段的大庫，其用於淘選抗原或細胞，以鑑定抗原特異性Fab片段。
藉由RT-PCR，自經免疫的小鼠產生「免疫」噬菌體Fab庫
自小鼠移出脾臟和引流淋巴結，對其觀察到對各自目標蛋白質的顯著體液反應。
自脾臟和腹股溝(inguinal)淋巴結產生單一細胞懸浮液，隨後將這些組織裂解於Trizol LS試劑(Thermo Scientific c# 10296028)中並儲存在-80℃直至使用。
從成功免疫的小鼠中，腹股溝淋巴結被用於建造「免疫」噬菌體抗體全集。從淋巴組織的單一細胞懸液中萃取RNA。在使用IgG-CH1特異性引子的RT反應中，使用1μg的總RNA。基本上如Marks等人所述(J Mol Biol.1991 Dec 5；222(3)：581-97)，隨後所得cDNA，使用內部(in-house)適應的VH特異性引子，來擴張編碼VH的cDNA的多株池 (polyclonal pool)。然後將所得的PCR產物選殖到噬質體載體(phagemid vector)中(第6圖)，以在噬菌體上展示Fab片段，如de Haard等人(J Biol Chem.1999 Jun 25；274(26)：18218-30)所述，除了輕鏈(第1A和1B圖)對於每個抗體是相同的且由載體編碼。連接後，噬質體用於轉形大腸桿菌TG1細菌，且將轉形的細菌塗盤至含有安比西林(ampicillin)和葡萄糖的LB-瓊脂盤上。所有的噬菌體庫含有大於4×105個轉形體(transformant)，且具有插入頻率大於90%。生長隔夜後，收穫細菌並根據已建立的規章(protocol)，用於製備噬菌體(de Haard et al.,J Biol Chem.1999 Jun 25；274(26)：18218-30)。
使用重組蛋白質，自合成和「免疫」噬菌體Fab庫中，選擇攜帶特異性結合至人類目標蛋白質的Fab片段的噬菌體
使用在被直接塗佈的重組蛋白質上的噬菌體展示，產生的噬菌體Fab庫用於選擇目標特異性Fab。對於PD-L1，使用huPD-L1-His(Sinobiological；目錄編號10084-H08H)、huPD-L1-Fc(R & D，目錄編號156-B7)和maPD-L1-His(Sinobiological；目錄編號90251-C08H)。對於CD137，使用huCD137-Fc(R & D；目錄編號838-4B)、raCD137-Fc(R & D；目錄編號7968-4B)、moCD137-Fc(R & D；目錄編號937-4B)、huCD137-His(SinoBiological；目錄編號10041-H08H)和huCD137-Fc(Enzo；目錄編號ALX-522-031-C050)，而對於OX40，使用huOX40-Fc(R & D；目錄編號3388-OX)和huOX40-His(Sinobiological；目錄編號10481-H08H)。
對於以重組蛋白質的選擇，將蛋白質塗佈至MAXISORPTM ELISA盤的孔上。用在PBS中的4%的乾燥脫脂牛奶(Marvel)，阻斷MAXISORPTM ELISA盤。也用4%的Marvel，且當使用Fc標記的重組蛋白質時，在噬菌體庫添加至被塗佈的抗原之前，也使用過量的人類IgG，以耗盡Fc區結合物，來阻斷噬菌體Fab庫。
在振盪條件下，噬菌體庫與塗佈的蛋白質的培養於室溫執行1.5小時。然後用PBS中的0.05%Tween-20洗滌盤子或試管(tube)十五次，接著用PBS洗滌5次。使用胰蛋白質酶(trypsin)洗脫(elute)結合的噬菌體20分鐘，之後用AEBSF胰蛋白質酶抑製劑(Sigma)中和胰蛋白質酶。
將洗脫物(eluate)添加至大腸桿菌TG-1，並在37℃下培養，以用於噬菌體感染。隨後將感染的細菌塗盤在含有安比西林和葡萄糖的瓊脂盤上，並在37℃下培養隔夜。取決於目標，自選擇輸出，以在ELISA或FACS中的目標結合篩選出單一選殖體。
對於用合成噬菌體Fab庫的選擇，在挽救第一輪選擇輸出後，使用與所述第一輪選擇相同的規章，執行第二輪選擇。
使用穩定表達目標蛋白質的細胞，自「免疫」噬菌體Fab庫中，選擇攜帶特異性結合至人類目標的Fab片段的噬菌體
使用在表達各自目標細胞上的噬菌體展示，選擇自經目標免疫的小鼠產生的噬菌體Fab庫。表達CD137、OX40 或PD-L1(表1)的穩定細胞系用於第一輪選擇。用PBS中的10% FBS阻斷細胞。阻斷之後，將挽救的噬菌體與阻斷的細胞一起培養。細胞加噬菌體在4℃培養1小時。使用1ml的在PBS中的10% FBS，來洗滌細胞(5次)。結合的噬菌體用胰蛋白質酶洗脫20分鐘，之後用AEBSF胰蛋白質酶抑製劑(Sigma)中和胰蛋白質酶。將洗脫物加入到大腸桿菌TG-1，並在37℃培養，以用於噬菌體感染。隨後，將噬菌體感染的細菌塗盤在含有安比西林和葡萄糖的瓊脂盤上，並在37℃培養隔夜。
對於PD-L1，用與第一輪選擇相同的規章，執行用內源性表達huPD-L1的ES-2細胞的第二輪選擇。選擇後，以在FACS中的目標結合，來篩選出單一選殖體。
在ELISA中篩選出目標特異性Fab選殖體
在單一選殖體中，製備可溶性Fab或噬菌體(J Mol Biol.1991 Dec 5；222(3)：581-97；J Biol Chem.1999 Jun 25；274(26)：18218-30)。在PBS(阻斷緩衝液)中的4%乾燥脫脂奶(Marvel)中稀釋獲得的可溶性Fab或噬菌體樣品(分別為1：5或1：10)，並在ELISA中測試與以如同用於選擇的相同抗原塗佈的孔的結合、或與用於以raCD137-Fc(R & D；目錄編號7968-4B)或moCD137-Fc(R & D；目錄編號937-4B)執行的所有選擇輸出的huCD137-Fc(R & D；目錄編號838-4B)塗佈的孔的結合。
藉由用在阻斷緩衝液中以1：1000稀釋的抗myc抗體(Roche；目錄編號：11667203001)染色，接著用在阻斷緩衝液中1：5000稀釋的HRP共軛的抗小鼠IgG抗體(Jackson Immunoresearch；目錄編號：715-035-150)，來偵測結合的Fab。藉由用在阻斷緩衝液中以1：5000稀釋的HRP共軛的單株抗M13抗體(GE healthcare；目錄編號27-9421-01)染色，來檢測結合的噬菌體。
每次抗體染色後，用PBS-T(PBS-0.05% v/v Tween 20)洗滌孔。透過TMB/H2O2染色視覺化結合的二次抗體(secondary antibody)，並且透過OD450nm測量來定量染色。當OD450nm高於用負對照Fab獲得的背景訊號至少三倍時，認為選殖體結合目標。
對所有目標特異性選殖體的編碼VH的cDNA定序。然後，關於與在細胞上表達的目標的結合，於FACS中分析基於序列相同度(sequence identity)和分子集團分析(cluster analysis)的獨特選殖體的選擇，如下文對從細胞選擇輸出獲得的選殖體所述。
在FACS中篩選目標特異性Fab選殖體
在表達各自目標的細胞上選擇的單一選殖體中，如(J Mol Biol.1991 Dec 5；222(3)：581-97；J Biol Chem.1999 Jun 25；274(26)：18218-30)所述，製備可溶性Fab或噬菌體。透過與1：5稀釋的Fab樣品與1：1000稀釋的抗myc抗體(Gentaur；目錄編號04-CMYC-9E10)的混合物一起培養於FACS緩衝液(PBS中的0.5% HI-FBS)中，測試Fab樣品在FACS中與表達人和獼猴目標細胞(表1)的結合。透過與以1：500稀釋的APC共軛山羊抗小鼠IgG抗體(BD Bioscience；目錄編號550826)一起培養於FACS緩衝液中，來偵測結合的Fab/抗myc 複合體。
透過在阻斷緩衝液中，以1：3稀釋噬菌體樣品並與目標表達細胞一起培養1小時，來測試噬菌體樣品在FACS中的結合。透過用生物素化(biotinylated)抗M13抗體(Fitzgerald，目錄編號61R-M101ABTB62-FEZ，在FACS緩衝液中1：125，在冰上30分鐘)和PE標記的鏈黴親和素(streptavidin)(Invitrogen，目錄編號SA1004-4；在FACS緩衝液中1：400，冰上15分鐘)。每次抗體培養之後，用FACS緩衝液洗滌孔三次。使用FACS Accuri C6儀器(Becton和Dickinson)，分析染色的細胞。當平均螢光強度高於用負對照Fab獲得的背景訊號至少三倍時，選殖體被認為是陽性。
結果
第3圖描繪了藉由所述方法獲得的24個CD137特異性選殖體、14個PD-L1特異性選殖體和50個OX40特異性選殖體的VH序列。
實施例3
以IgG形式，對huCD137、huOX40及huPD-L1特異性Fab選殖體定性
將人類CD137、OX40及PD-L1特異性Fab再選殖至IgG形式
根據標準化的分子生物學技術，使用Sfi1-BstEII消化並連接消化的cDNA，將基於CDR3序列和VH生殖的差異的獨特選殖體的選擇，其結合在細胞上表達的人和獼猴目標蛋白質，再選殖到IgG表達質體，例如MV1452(第7圖)，其 含有共同輕鏈(第1圖)。
含有人類CD137、OX40或PD-L1特異性Fab和破傷風毒素特異性Fab的雙特異性IgG的表達
藉由瞬時共轉染兩個編碼具有不同VH域的IgG的質體，來產生雙特異性抗體，使用專有的(proprietary)CH3工程技術，以確保有效率的異質二聚體化和雙特異性抗體的形成。存在於含有重鏈的兩個質體上的共同輕鏈也共轉染在相同的細胞中。在我們的共同未決的申請中(例如，WO2013/157954和WO2013/157953；透過引用併入本文)，我們已經揭露從單細胞生產雙特異性抗體的方法和手段，由此提供有利於形成雙特異性抗體而不是形成單特異性抗體的手段。這些方法也可有利地用於本發明中。具體地，產生基本上僅雙特異性全長IgG分子的較佳突變是在第351和366位的胺基酸取代，例如在第一CH3域中的L351K和T366K(根據EU編號編號)(「KK變異體」重鏈)和在第351和368位的胺基酸取代，例如在第二CH3域中的L351D和L368E(「DE變異體」重鏈)，或反之亦然。先前在我們的共同未決的申請中，證明帶負電荷的DE變異體重鏈和帶正電荷的KK變異體重鏈優先配對，以形成異質二聚體(所謂的「DEKK」雙特異性分子)。由於相同重鏈之間CH3-CH3界面中帶電殘基之間的強烈斥力，幾乎不會發生DE變異體重鏈(DE-DE同質二聚體)或KK變異體重鏈(KK-KK同質二聚體)的同質二聚體化。
將編碼所述結合人類CD137、OX40和PD-L1的抗體的VH基因選殖至編碼帶正電的CH3域的IgG表達載體中， 例如MV1452。將以破傷風毒素(tetanus toxin，TT)為目標的抗體(第8圖)選殖至編碼帶負電的CH3域的MV1377IgG表達載體(第9圖)中。為了以IgG形式表達CD137抗體組，整組也被選殖到帶負電荷的CH3域載體中，以能夠產生單特異性CD137xCD137二價IgG。
在振盪器平台上，懸浮生長適應的293F Freestyle細胞培養於T125燒瓶中，直至密度為3.0×106個細胞/ml。在24深孔盤(24孔格式)的每個孔中以0.3至0.5x106個活細胞/ml的密度接種細胞。用兩個編碼不同抗體的質體的混合物，瞬時轉染細胞，選殖到專有載體系統中。轉染後7天，收穫細胞上清液並通過0.22μM過濾器(Sartorius)來過濾。將無菌上清液保存在4℃直至抗體的純化。
(雙特異性)IgG的純化
使用蛋白質A親和層析，以小規模(<500μg)執行IgG的純化。使用過濾，在24孔過濾板中的無菌條件下，執行小規模純化。首先，將培養基的pH調節至pH 8.0，隨後將含有IgG的上清液與蛋白質A Sepharose CL-4B珠(50% v/v)(Pierce)一起於25℃、在振蕩平台上600rpm，培養2小時。接下來，透過過濾收穫珠子。用PBS pH 7.4洗滌珠子兩次。然後用0.1M檸檬酸鹽緩衝液在pH3.0洗脫結合的IgG，且洗脫物立刻用Tris pH 8.0中和。使用多屏Ultracel 10多盤(multiscreen Ultracel 10 multiplate)(Millipore)，藉由離心，執行緩衝液交換。最後，在PBS pH7.4中收穫樣品。使用Octet測量IgG濃度。蛋白質樣品儲存於4℃。
使用Octet進行IgG定量
為了確定純化的IgG的量，使用總人類IgG(Sigma Aldrich，目錄編號No.I4506)作為標準，使用蛋白質A生物傳感器(Forte-Bio，根據供應商建議)，藉由Octet分析，來確定抗體濃度。
huCD137xCD137二價IgG和huOX40xTT以及huPD-L1xTT雙特異性IgG的特異性分析
測試huCD137xCD137二價IgG和huOX40xTT以及huPD-L1xTT雙特異性IgG在FACS中，與表達相關人類和獼猴同源基因(表1)的穩定細胞系及野生型(WT)細胞的結合。因此，收穫細胞並在FACS緩衝液(PBS/0.5% BSA/0.5mM EDTA)中稀釋至106個細胞/ml。將1至2x105個細胞加至U底96孔盤中的每個孔中。細胞在4℃以300g離心2分鐘。透過將盤子倒置，來丟棄上清液。加入50μl濃度為10μg/ml的每個IgG樣品並在冰上培養1小時。將細胞離心一次，移除上清液並用150μl的FACS緩衝液洗滌細胞兩次。加入50μl的1：400稀釋的山羊抗人類IgG PE(Invitrogen)，並在黑暗中在冰上培養30分鐘。加入FACS緩衝液後，將細胞離心一次，移除上清液並用FACS緩衝液洗滌細胞兩次。在HTS設置中，在FACSCanto流式細胞儀(Becton和Dickinson)上分析細胞。藉由測量染色的細胞族群的平均螢光強度(mean fluorescence intensity，MFI)，來評估抗體與細胞的結合。當MFI至少是用(負對照)非結合抗體(針對破傷風類毒素)染色的相同細胞群的5倍時，抗體被認為結合它們的目標。
以阻斷CD137與CD137L交互作用的能力，將存在於CD137xCD137二價IgG中的huCD137特異性Fab臂分類
測試二價IgG形式的huCD137結合選殖體的阻斷CD137與CD137L交互作用的能力。因此，用1.25μg/ml的在PBS中的重組CD137-Fc(R & D；目錄編號838-4B)塗佈Maxisorp 96孔盤的孔並在4℃培養隔夜。用PBST(0.05% v/v在PBS中的Tween20)洗滌孔兩次，隨後用含2% BSA的PBS(阻斷緩衝液)，在室溫下阻斷1小時。在那之後，在20μg/ml的IgG存在或不存在情況下，將孔與阻斷緩衝液中稀釋的0.25μg/ml CD137L-muCD8生物素(Ancell；目錄編號503-030)在室溫下一起培養1小時。接下來，重複洗滌步驟，並將孔與在阻斷緩衝液中以1：2000稀釋的HRP共軛的鏈黴親和素(Becton Dickinson；目錄編號554066)在室溫下一起培養30分鐘。為了偵測結合的鏈黴親和素，用PBST洗滌孔三次，並與TMB基質組成A和B(1：1的比例)(Becton Dickinson；目錄編號分別為51-2606KC和51-2607KC)一起培養。用1M的H2SO4 10分鐘後，停止反應，並使用ELISA盤讀取儀測量OD450nm。根據結果，將選殖體分為4個不同的組：與加入TT特異性競爭抗體的對照(0%阻斷)相比，當在20μg/ml的IgG(CD137xCD137)濃度下，ELISA訊號降低超過70%時，認為「阻斷性選殖體」完全阻斷CD137與CD137L的交互作用；「部分阻斷性選殖體」將訊號降低25至70%；「非阻斷性選殖體」顯示出降低至最多25%或增強至最多25%的ELISA訊號；「增 強選殖體」顯示ELISA訊號增加超過25%。用作為CD137xCD137雙特異性分子測試的CD137抗體組的代表性選擇獲得的結果顯示在表2中。
以區域特異性，將存在於CD137xCD137二價IgG中的huCD137特異性Fab臂分類
也在HEK293T細胞上，測試二價IgG形式的所述huCD137結合選殖體在FACS中的區域特異性，其中HEK293T細胞用8個不同pIRES-Neo3小鼠/人類CD137雜合表達構築體，FL小鼠CD137pIRES-Neo3表達構築體(參見下文的胺基酸插入序列)或用於產生穩定表達huCD137的Freestyle 293F細胞(表1)的pIRES-Neo3_huCD137表達構築體進行轉染。在抗體組的特異性分析的期間，使用如上所述相同的FACS方案。為了產生雜合構築體，將小鼠和人類CD137的胞外域分成5個區域；4個基於Uniprot參考序列Q07011(huCD137)和P20334(moCD137)的富含半胱胺酸域和1個從富含半胱胺酸域4的末端至跨膜域的鉸鏈域。透過NheI/EcoRI，將下列胺基酸插入序列選殖到pIRES-Neo3(第4圖)中；粗體文字是訊號胜肽。下劃線的文字是與人類CD137相同的序列。斜體文字表示跨膜和胞內域序列。
全長小鼠CD137的胺基酸序列。
mo/huCD137嵌合插入物A(人類富含半胱胺酸域1；富含半胱胺酸域2的小鼠序列)的胺基酸序列。
mo/huCD137嵌合插入物B(人類富含半胱胺酸域1和2；來自富含半胱胺酸域3的小鼠序列順向)的胺基酸序列。
mo/huCD137嵌合插入物C(人類富含半胱胺酸域1至3；來自富含半胱胺酸域4的小鼠序列順向)的胺基酸序列。
mo/huCD137嵌合插入物D(人類富含半胱胺酸域1至4；來自鉸鏈域的小鼠序列順向)的胺基酸序列。
mo/huCD137嵌合插入物E(小鼠富含半胱胺酸域1；來自富含半胱胺酸域2的人類序列順向)的胺基酸序列。
mo/huCD137嵌合插入物F(小鼠富含半胱胺酸域1和2；來自富含半胱胺酸域3的人類序列順向)的胺基酸序列。
mo/huCD137嵌合插入物G(小鼠富含半胱胺酸域1至3；來自富含半胱胺酸域4的人類序列順向)的胺基酸序列。
mo/huCD137嵌合插入物H(小鼠富含半胱氨酸域1至4；來自鉸鏈域的人類序列順向)的胺基酸序列。
根據用嵌合和全長小鼠和人類CD137構築體獲得的FACS結果，根據觀察到的結合模式，將選殖體分類。當MFI至少是用(負對照)非結合抗體(針對破傷風類毒素)染色的 相同細胞族群的三倍時，抗體被認為結合(嵌合)CD137。
結果
CD137特異性Fab臂的區域特異性描述於表2中。
以能夠阻斷OX40與OX40L的交互作用的能力，將存在於OX40xTT雙特異性IgG中的huOX40特異性Fab臂分類
測試雙特異性IgG形式的huOX40結合選殖體(OX40xTT)的阻斷OX40與OX40L交互作用的能力。因此，以0.156μg/ml的在PBS中之重組huOX40-Fc(R & D；目錄編號3388-OX)塗佈Maxisorp 96孔盤的孔，並在4℃培養隔夜。用PBST(0.05% v/v在PBS中之Tween 20)洗滌孔兩次，隨後用在PBS(阻斷緩衝液)中的4%乾燥脫脂牛奶(ELK)，在室溫下阻斷1小時。在那之後，存在或不存在雙特異性OX40xTT IgG(20μg/ml)的情況下，用在阻斷緩衝液中稀釋的0.016μg/ml的OX40L(R & D；目錄編號1054-OX)將孔在室溫下培養1小時。接下來，用PBST洗滌孔3次，隨後與在2% BSA/PBS中稀釋至0.5μg/ml的生物素化抗OX40L抗體(R & D；目錄編號BAF1054)一起培養1小時。接下來，重複洗滌步驟，並將孔與在2% BSA/PBS中1：2000稀釋的HRP共軛的鏈黴親和素(Becton Dickinson，目錄編號554066)一起培養於室溫30分鐘。為了偵測結合的鏈黴親和素，用PBST洗滌孔三次，並與TMB基質組成A和B(1：1比例)(Becton Dickinson，分別為目錄編號51-2606KC和51-2607KC)一起培養。用1M的H2SO4 10分鐘後，停止反應，並使用ELISA盤讀取儀測量OD450nm。
根據結果，將選殖體分成2個不同的組：與加入TT特異性競爭抗體的對照(0%阻斷)相比，在20μg/ml的IgG(OX40xTT)濃度下，「阻斷性選殖體」降低ELISA訊號大於24%；「非阻斷性選殖體」顯示出ELISA訊號被低於24%降低或增強。以雙特異性IgG形式(OX40xTT)的huOX40結合選殖體的不同子集，執行此實驗兩次。在表5中給予作為OX40xTT雙特異性分子測試的OX40抗體組的結果。
以區域特異性，將存在於OX40xTT雙特異性IgG中的huOX40特異性Fab臂分類
在HEK293T細胞上，測試雙特異性OX40xTT IgG形式的huOX40結合選殖體在FACS中的區域特異性，其中HEK293T細胞用8個不同pIRES-Neo3大鼠/人類OX40雜合表達構築體(參見下面的胺基酸插入序列)，用於產生穩定表達raOX40和huOX40的Freestyle 293F細胞的pIRES-Neo3_raOX40或pIRES-Neo3_huOX40表達構築體(表1)。如上所述，在抗體組的特異性分析過程中使用相同的FACS方案。為了產生雜合構築體，將大鼠和人類OX40的胞外域分成5個區域，4個基於Uniprot參考序列P43489(huOX40)和P15725(raOX40)的富含半胱胺酸域和1個從富含半胱胺酸域4的末端至跨膜域的鉸鏈域。透過NheI/EcoRI，將下列胺基酸插入序列選殖到pIRES-Neo3(第4圖)中；粗體文字是訊號胜肽。下劃線的文字是與人類OX40相同的序列。斜體文字表示跨膜和胞內域序列。
ra/huOX40嵌合插入物A(人富含半胱胺酸域1； 來自富含半胱胺酸域2的大鼠序列順向)的胺基酸序列。
ra/huOX40嵌合插入物B(人類富含半胱胺酸域1和2；來自富含半胱胺的酸域3的大鼠序列順向)的胺基酸序列。
ra/huOX40嵌合插入物C(人類富含半胱氨酸域1至3；來自富含半胱胺酸域4的大鼠序列順向)的胺基酸序列。
ra/huOX40嵌合插入物D(人類富含半胱氨酸域1至4；來自鉸鏈域的大鼠序列順向)的胺基酸序列。
ra/huOX40嵌合插入物E(大鼠富含半胱胺酸域1；來自富含半胱胺酸域2的人類序列順向)的胺基酸序列。
ra/huOX40嵌合插入物F(大鼠富含半胱胺酸域1和2；來自富含半胱胺酸域3的人類序列向前)的胺基酸序列。
ra/huOX40嵌合插入物G(大鼠富含半胱胺酸域1至3；來自富含半胱胺酸域4的人類序列順向)的胺基酸序列。
ra/huOX40嵌合插入物H(大鼠富含半胱胺酸域1至4；來自鉸鏈域的人類序列順向)的胺基酸序列。
根據用嵌合和全長小鼠和人類OX40構築體獲得的FACS結果，根據觀察到的結合模式，將選殖體分類。當MFI至少是用(負對照)非結合抗體(針對破傷風類毒素)染色的相同細胞族群的三倍時，抗體被認為結合(嵌合)OX40。
在表5中給予雙特異性OX40xTT IgG形式的huOX40結合選殖體的結果。
以阻斷PD-1/PD-L1交互作用的能力，將存在於PD-L1xTT雙特異性IgG中的huPD-L1特異性Fab臂分類
測試14個huPD-L1結合選殖體(在第3圖中描述的VH序列)的阻斷PD-L1與PD-1的交互作用的能力，以及它們阻斷PD-L1和CD80之間的交互作用的能力。因此，分別以1和3μg/ml，將PD1-Fc(R & D systems；目錄編號1086-PD)或CD80-Fc(R & D systems；目錄編號140-B1)塗佈至maxisorp盤。用在PBS中的4%的BSA阻斷塗佈的孔。在那之後，存在或不存在在0.15至20μg/ml範圍內的huPD-L1xTT雙特異性IgG的情況下，加入0.55μg/ml生物素化PD-L1(BPS bioscience；目錄編號71105)。用在阻斷緩衝液中以1：2000稀釋的HRP共軛的鏈黴親和素(Becton Dickinson；目錄編號554066)，來偵測結合的生物素化PD-L1。在每個培養步驟後，用PBS-T(PBS-0.05% v/v Tween 20)洗滌ELISA盤三次。藉由TMB/H2O2染色，將結合的鏈黴親和素視覺化，並且透過OD450nm測量，對染色定量。與添加TT特異性競爭抗體的對照相比，當在10μg/ml的IgG(PD-L1xTT)濃度下，ELISA訊號降低超過70%時，選殖體被認為阻斷PD-1與PD-L1的交互作用。參見第10圖， 用作為PD-L1xTT雙特異性分子測試的代表性選擇的PD-L1抗體組獲得的結果。除了MF5361之外，在第10圖中描繪的PD-L1特異性Fab臂阻斷PD-1/PD-L1的交互作用大於70%。此外，包含第3圖所繪示的MF序列的所有其他PD-L1特異性Fab臂也阻斷PD-1/PD-L1的交互作用大於70%(數據未顯示)。
總之，除MF5361之外，測試的huPD-L1特異性Fab臂阻斷PD-1/PD-L1的交互作用。
親和力排序存在於CD137xCD137、OX40xTT和PD-L1xTT雙特異性IgG中的huCD137、huOX40和huPD-L1特異性Fab臂
在FACS中顯示結合各自的人類和獼猴同源基因的雙特異性抗體排序在FACS中兩者同源基因的明顯親和力上。因此，收穫表達各自同源基因(表1)的穩定細胞系並在FACS緩衝液(PBS/0.5% BSA/0.5mM EDTA)中稀釋至1×106個細胞/ml。細胞在4℃以300g離心2分鐘。透過將盤子倒置來丟棄上清液。將50μl的每個IgG樣品，其以10至0.01μg/ml的一11步驟2倍稀釋系列，加入並在冰上培養1小時。將細胞離心一次，移除上清液並用150μl的FACS緩衝液洗滌細胞兩次。加入50μl以1：400稀釋的山羊抗人類IgG PE(Invitrogen)並在黑暗中在冰上培養30分鐘。加入FACS緩衝液後，將細胞離心一次，移除上清液並用FACS緩衝液洗滌細胞兩次。在HTS設置中，在FACSCanto流式細胞儀(Becton和Dickinson)上分析細胞。透過測量染色的細胞族群的平均螢光強度(MFI)，來評估抗體與細胞的結合。當MFI至少是用(負對照)非結合抗體 (針對破傷風類毒素)染色的相同細胞群的5倍時，抗體被認為結合它們的目標。
參考抗體
抑制PD-L1和CD137和CTLA-4功能的抗體是本發明所屬技術領域中習知的。根據公佈的訊息，建造單株二價抗體並在293F Freestyle或CHO-S細胞中表達。抗PD-L1抗體MPDL3280A(基於Atezolizumab的替代物)是基於WO2010077634A1中揭露的信息。分別從WO 2005/035584和WO2015119923獲得抗CD137抗體20H4.9(基於Urelumab的替代物)和PF-05082566(基於Utomilumab的替代物)的訊息。自US8337850B2獲得MOR7480的VH訊息並選殖到IgG1骨架中。從PCT公開號WO 01/14424獲得關於抗CTLA-4抗體10D1(基於易普利姆瑪(Ipilimumab)的替代物)的訊息。
實施例4
材料與方法
PBMC單離
從膚色血球層(buffy coat)(Sanquin)獲得人類全血並用PBS以1：1稀釋。於Leucosep管(Greiner Bio-One目錄編號227 290)中填充在室溫(RT)下加熱的17.5m的Ficoll-Paque Plus(Amersham Biosciences目錄編號17-1440-02)。Ficoll-Paque Plus在室溫下以1000×g旋轉30秒。將30ml的稀釋全血倒在上面。將試管在室溫以1000×g旋轉10分鐘，收集單核PBMC界面，在PBS中洗滌兩次並重新懸浮於250μl的PBS中。計數PBMC並在組織培養基(含10% FCS的DMEM)中重新調整至1×106/ml，並透過加入等體積的冰冷的冷凍培養基(80%培養基/20% DMSO)進行冷凍。以1ml等分試樣，將細胞儲存於-150℃下，直至進一步使用。
T細胞活化測定
將PBMC解凍並加入9倍體積的培養基(含L-穀胺醯胺和10%熱失活FBS的RPMI1640)。在室溫下以150g，離心細胞10分鐘。將細胞沉澱物重新懸浮於10ml的培養基中，透過於37℃、5% CO2、95%的相對濕度下，在50ml的falcon管中培養隔夜，允許細胞靜置。隔天，使用如製造商所述的Easy Sep T細胞富集(pan CD3)純化程序(Easy Sep T cell enrichment(pan CD3)purification procedure)(Stem cell Technologies目錄編號19051)，單離T淋巴細胞。EasySep程序使用陰性選擇。簡而言之，在室溫以150g將PBMC離心10分鐘。將細胞沉澱物重新懸浮於有1mM EDTA的2ml PBS+2% FBS中。將細胞懸浮液通過30μm篩網尼龍過濾器過濾。計數細胞並在有1mM EDTA的PBS+2% FBS中，重新調整至5×107細胞/ml。將50μl的EasySep人T細胞富集雞尾酒(Human T Cell Enrichment cocktail)加至每個2ml的細胞體積中，混合並允許在室溫培養10分鐘。接下來，將50μl EasySep D磁性顆粒(Magnetic Particle)加至每個2ml的細胞體積中，並允許室溫培養5分鐘。用PBS+含有1mM EDTA的2% FBS，使總體積達到2.5ml。接下來，將試管置於磁體中，允許不期望的細胞部分在室溫下與磁體結合5分鐘。接下來，顛倒試管並將純化的T細胞級分倒入新試管中，透過在室溫下，以150g離心10 分鐘收集細胞，隨後以1x105個細胞/ml的濃度重新懸浮於培養基中。對於T細胞活化測定，用30μg/mL的在PBS中之抗CD3 UCHT1塗佈96孔盤(96孔平底盤-Cellstar # 655180)的內孔隔夜。隔天，盤子用PBS洗滌。製備抗體稀釋液(80μg/ml)，並在室溫下與交聯抗體aHuIgG-Fc(Bethyl目錄編號# A80-104A)以1：1的比例培養15分鐘。接下來，製備混合物的系列稀釋液。向每個孔中加入100μL的經交聯的抗體，然後加入100μL的純化T細胞懸浮液。每個盤子含有作為參考對照的陰性(PG1337)和陽性對照抗體(Urelumab)的系列稀釋液。在測試IL-2分泌和/或抗原的細胞表面表達之前，在37℃，95%相對濕度的5% CO2下，刺激T細胞培養物3天。透過AlphaLISA(Perkin Elmer目錄編號AL221C)決定釋放的IL-2的濃度。透過流式細胞術，測定與檢查點抑制或共刺激性抗原有關的細胞表面抗原的表達。
SEB測定
藉由使用經金黃色葡萄球菌B型腸毒素(Staphylococcus enterotoxin B，SEB)刺激的PBMC，決定雙特異性抗體的功能活性。SEB特異性活化表達Vβ3和Vβ8 T細胞受體鏈的T細胞。將來自3個捐贈者的PBMC解凍、洗滌、計數並重新懸浮於培養基(RPMI1640加上10%熱失活的FBS)中至2×106個細胞/ml的濃度。在SEB(2000或125ng/ml)存在下，將細胞接種於平底96孔盤(2×105個細胞/孔)中。將從20μg/ml開始的抗體系列稀釋液加入。每個盤子含有作為參考對照的陰性(PG1337)和陽性對照抗體(基於易普利姆瑪)的系列稀釋液。 在測試細胞激素分泌和/或抗原的細胞表面表達之前，在37℃，95%相對濕度的5% CO2下，刺激細胞3天。
PD-1/PD-L1阻斷報導者測定
所使用PD-1/PD-L1阻斷報導者測定是由Promega開發，且基於雙細胞系統；表達PD-L1的CHO細胞和過度表達PD-1的T細胞活化子及Jurkat/NEAT-RE報導者細胞系。使用Promega的解凍和使用形式，執行PD-1/PD-L1阻斷報告者測定。在14.5ml的細胞恢復培養基(Cell Recovery Medium)(含有10% FBS的DMEM/F12)中解凍表達PD-L1的CHO細胞(目錄編號C187103)。接下來，將50μl的細胞懸浮液加至96孔半區域盤(Corning，目錄編號3688)的內孔中。將盤子在37℃、5% CO2、95%相對濕度下，培養隔夜。隔天，移除培養基並將以系列稀釋(起始濃度10μg/ml)的20μl在測定培養基(含有4% FBS的RPMI 1640)中的測試抗體加至每個孔中。每個盤子含有作為參考對照的陰性(PG1337)和陽性對照抗體(基於Nivolumab/MPDL3280A)的系列稀釋液。在5.9ml的測定培養基中解凍PD-1效應細胞(目錄編號C187105)，並將20μl的細胞懸浮液加至每個孔中。將盤子在37℃、5% CO2、95%相對濕度下培養6小時或隔夜。隔天加入40μl的螢光素酶(Bio-Glo螢光素酶測定系統，目錄編號G794L)，並使用BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate讀取儀，測量螢光素酶活性的量。與負對照抗體相比，測定了螢光素酶活性的效力。
篩選PD-L1抗體組
將來自PD-L1抗體組的VH重新選殖到帶電荷的 工程化Fc沉默載體中，使得一但表達抗體重鏈，就強制重鏈的異質二聚體化，導致轉染後雙特異性抗體的產生。將PD-L1 Fab臂重新選殖到MV1624載體中。將PD-L1抗體與MF1337(以TT為目標的Fab臂)組合，以單價方式產生以PD-L1為目標的雙特異性抗體。如表3所示，單價形式的PD-L1抗體組按照活性排序。
細胞激素測定
ELISA：在不同時間刺激T細胞或PBMC後，離心盤子並移除培養基。根據製造商的說明書(Perkin Elmer)，透過AlphaLISA，偵測細胞激素的量。基於標準曲線計算濃度。
Luminex測定：用於決定體外細胞激素產生的另一方法是使用由eBioscience開發的多重分析(multiplex analysis)。根據製造商的說明書，在培養物上清液中測量IFN-γ，IL-2和TNF-α的量。透過eBioscience分析軟體分析結果。
Jurkat CD137-NFkBluc的產生
藉由在Jurkat E6細胞中穩定整合全長CD137構築體和NF-κB螢光素酶報導者構築體，以產生Jurkat CD137-NFkBluc穩定的報導者細胞系。因此，轉染全長CD137 MV1604[pIRESneo3](Clontech)，並在抗生素選擇後產生表達CD137的穩定選殖體。接下來，在具有最高CD137表達的選殖體中轉染NF-κB螢光素酶報導者構築體pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega)，並且在抗生素選擇後，選擇表達CD137和NF-κB螢光素酶的穩定選殖體。在藉由盤子結合的CD3抗體(選殖體OKT-3)和PMA/離子黴素 (ionomycin)的初始活化後，以回應CD137L的能力來選擇選殖體。顯示最高活化窗口的選殖體在CD137報導測定中作為解凍和使用形式。
CD137報導者測定
對於直接的CD137活化測定，用2μg/ml的在PBS中之抗CD3(OKT3)，塗佈96孔盤(Costar，目錄編號3917)隔夜。對於由交聯媒介的CD137活化測定，用2μg/ml的在PBS中之抗CD3+10μg/ml抗人類IgG(Bethyl，A80-104A)，塗佈96孔盤(Costar，目錄編號3917)。隔天，用PBS洗滌盤子。將所述Jurkat CD137-NFkBluc細胞解凍並用含有10%熱失活胎牛血清的DMEM/F12培養基(測定培養基)洗滌。以2×106個細胞/ml的密度重新懸浮細胞。將25μl的細胞懸浮液塗盤至塗佈的96孔測定盤的內孔中。將連續稀釋(起始濃度20μg/ml)的25μl測試抗體加到每個孔中，隨後加入25μl的測定培養基。每個盤子含有作為參考對照的陰性(PG1337)和陽性對照抗體的連續稀釋液。在37℃、5% CO2、95%相對濕度下，將盤子培養隔夜。隔天，加入50μl的螢光素酶(Promega，Bright-GloTM，目錄編號E2610)，並使用BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate讀取儀，測量螢光素酶活性的量。
雙特異性抗體的大規模生產
使用聚乙烯亞胺(polyetyleneimine，PEI)作為轉染試劑，以2.5：1的PEI/DNA質量比，在FreeStyleTM 293-F細胞(Invitrogen)中產生蛋白質。在0.4至2L規模中，使用的1：1的DNA質量比，轉染雙特異性抗體。藉由與MabSelect SuRe LX 瓊脂糖(GE Healthcare)分批(batch-wise)培養，純化細胞上清液，然後進行酸性洗脫並使用Tris中和。因此，將蛋白質脫鹽(desalt)並離心，接著使用在25mM磷酸鹽緩衝液pH6.0中平衡的資源S(Resource S)(GE Healthcare)柱，進行陽離子交換純化。使用至1M NaCl的梯度洗脫，來洗脫蛋白質，且收集含蛋白質的級分(fraction)並使用NuPAGE 4-12% Bis-Tris蛋白質膠(Invitrogen)分析。合併含有雙特異性抗體的級分並將其應用於在PBS中平衡的Superdex200 26/600膠體過濾柱(GE Healthcare)。收集級分並在NuPAGE上分析，然後合併含有單體抗體的級分且無菌過濾(0.22μm)。
結果
CD137報導者測定
在所述CD137直接活化報導者測定中篩選CD137二價抗體組。在第11圖中顯示選擇抗體的代表圖。60%的抗體組能夠直接活化CD137至不同程度。
篩選CD137xPD-L1抗體組
CD137二價抗體在癌症藥物開發中的一個限制是CD137表達細胞的全身活化。這可能導致抗體的毒性，由於非特異性目標[Melero,2013]。透過選擇性地以細胞為目標，或者透過以共同表達兩個目標的細胞為目標，例如兩個腫瘤抗原，或者透過以兩個不同的細胞為目標，其各自表達目標之一，雙特異性抗體可克服此限制。後者只能在細胞彼此靠近時發生。為了研究CD137選擇性活化的可能性，產生了由一個以CD137為目標的Fab臂和一個以PD-L1為目標的Fab臂構成的雙特異 性抗體。PD-L1代表在腫瘤細胞上以高濃度存在的抗原以及存在於腫瘤位，在活化T細胞上的高度表達的抗原[Pulko等人，2011]。因此，當在相同細胞上以CD137和PD-L1為目標時，雙特異性CD137xPD-L1抗體能夠以「順式(cis)」活化CD137，或者透過以免疫細胞上的CD137和相鄰細胞上的PD-L1為目標，以「反式(trans)」活化CD137。除此機制之外，包含PD-1阻斷性Fab臂將能夠將抑制訊號轉變為刺激訊號。
將來自CD137和PD-L1抗體組的VH重新選殖至帶電的工程化Fc沉默載體中，使得一旦表達抗體重鏈時，強制重鏈的異質二聚體化，導致轉染後產生雙特異性抗體。以24孔形式且以純化的IgG形式，產生總共320個CD137xPD-L1雙特異性抗體，其包含40個不同的CD137 Fab臂和表3中所示的8個不同的PD-L1 Fab臂。測試所有抗體直接或在抗人類IgG交聯抗體存在下，在CD137-luc報導者系統中誘導劑量依賴性螢光素酶表達的能力。替代抗體20H4.9和MOR7480作為參考抗體包含於各個測定中。
在第12圖中顯示抗人類IgG交聯抗體不存在或存在的情況下，幾個CD137xPD-L1雙特異性抗體的CD137-luc報導者測定中的功能活性的範例。此圖顯示，因為這將螢光素酶活性的量級增加25%，所以CD137xPD-L1雙特異性抗體活化經CD137誘導的螢光素酶活性的能力高度依賴於透過抗人類IgG抗體的交聯。對於本領域已知為20H4.9的抗CD137抗體，也已經觀察到CD137連接後，顯著增強IFN-γ的產生(WO 2005/035584)。雙特異性抗體組的前25%的CD137xPD-L1由 22個CD137 Fab臂組合總共8個的PD-L1 Fab臂組中的1至7個PD-L1 Fab臂構成。
接著，與結合以破傷風類毒素為目標的無關Fab臂的二價親本CD137抗體和親本CD137 Fab臂相比，測試前25%的CD137xPD-L1雙特異性抗體組在初代T細胞活化測定中誘導IL-2釋放的能力。在此實驗設置中，可以監測單價活化與二價活化。第13圖的上圖顯示了一組三個抗體，其中如果這三個抗體以CD137xCD137二價形式存在於20H4.9參考抗體的範圍內，一旦CD137活化，這三個抗體就誘導IL-2分泌。相反地，如第13圖的下圖所示，CD137xPD-L1雙特異性抗體均不能將IL-2分泌誘導至二價CD137親本Fab的程度。所有CD137xPD-L1雙特異性抗體顯示與CD137xTT變異體相同的活性，表示CD137訊號複合物不能透過在相同細胞表面結合至CD137和PD-L1而有效地形成(「順式」結合)。此CD137xPD-L1雙特異性抗體組缺乏順式(in cis)T細胞活化是有利的，因為這減少了由非特異性T細胞活化所引起的體內毒性的可能性。
轉活化測定(transactivation assay)
為了測試雙特異性CD137xPD-L1抗體是否能夠以「反式」活化CD137，在雙細胞測定中測試雙特異性抗體，由此透過第二細胞的交聯，發生免疫細胞中的CD137訊號傳導。體外測定由兩個不同的細胞系構成，即模擬表達PD-L1的腫瘤細胞的CHO-PD-L1細胞和代表免疫細胞的Jurkat CD137-luc報導者細胞。使用與CD137-luc報導者相同的測定設置，其中 經塗佈的抗CD3提供第一T細胞活化訊號。所使用的效應目標細胞比例為4：1，其中目標細胞為CHO野生型或CHO-PD-L1細胞。第14圖顯示在CHO-PD-L1細胞的存在下，由相同CD137Fab臂(MF6744)和兩個不同PD-L1 Fab臂(分別為MF5361或MF5594)所構成的CD137雙特異性抗體PB14671和PB14580均能夠誘導CD137報導者的活性，而在野生型CHO野生型細胞的存在下，沒有發生CD137的刺激的範例。此外，在CHO-PD-L1細胞的存在下，由相同CD137 Fab臂(MF6783)和兩個不同PD-L1 Fab臂(分別為MF5361或MF5594)構成的CD137雙特異性抗體PB14671和PB14580均能夠誘導CD137報導者的活性，而在野生型CHO野生型細胞的存在下，沒有發生CD137的刺激。再者，所有CD137xPD-L1雙特異性抗體與參考對照抗體20H4.9一樣有效。CD137xPD-L1雙特異性抗體PB14580和PB14671(Oligoclonics®形式)的組合誘導高螢光素酶活性。
以初代T細胞進行轉活化測定
藉由在T細胞活化測定中加入CHO野生型或CHO-PD-L1細胞，將轉活化測定重新格式化(reformat)為初代細胞。使用對CHO-PD-L1和CHO野生型細胞在測定開始時的效應目標細胞比為1：1.8。對於T細胞活化測定，用30μg/mL的在PBS中的抗CD3 OKT-3塗佈96孔盤(96孔平底盤-Cellstar # 655180)的內孔隔夜。隔天，用PBS洗滌盤子。加入50μl的抗體溶液，然後每孔加入25μl的純化的2×106個細胞/孔的T細胞懸浮液及依所述比例的25μl純化的CHO-K1或 CHO-PD-L1。在測試IL-2分泌之前，在37℃、95%相對濕度的5% CO2下刺激培養物3天。透過AlphaLISA(Perkin Elmer目錄編號AL221C)決定釋放的IL-2的濃度。
測試兩個CD137xPD-L1雙特異性抗體(PB14671和PB14580)，以及Oligoclonics®形式和CD137xTT形式。在第15圖中描繪的第3天的IL-2釋放顯示，在CHO-PD-L1細胞存在下，CD137xPD-L1抗體在T細胞中誘導IL-2產生的程度高於對照抗體20H4.9。再者，CD137xTT形式未能誘導IL-2釋放。在CHO野生型細胞存在下，IL-2的量以背景量產生，除了對照抗體20H4.9外。兩個CD137xPD-L1雙特異性抗體(Oligoclonics®形式)的組合誘導高螢光素酶活性，從而證實了先前的實驗。Oligoclonics®形式可以相同的CD137抗原決定基和兩個不同的PD-L1抗原決定基為目標(如第14和15圖所示)或以兩個不同的CD137域和兩個不同的PD-L1域為目標。
SEB測定
為了在存在表達PD-L1的APC的生理環境中測試CD137xPD-L1雙特異性抗體，在SEB測定中測試了兩個CD137xPD-L1抗體(PB14671和PB14580)、CD137xTT抗體和Oligoclonics®形式。其中一個CD137xPD-L1雙特異性抗體(PB14580)顯示，與負對照抗體相比，更高的活化，且與以CD137(20H4.9)或PD-L1(MPDL3280A)為目標的參考抗體相比，更有效；參見第16圖。透過CD137xPD-L1 Oligoclonics®形式來誘導IL-2也是有效的。
額外測試
將代表11個不同CD137分類A至K(表2)的24個抗CD137 Fab臂組與7個PD-L1特異性阻斷Fab臂和一個PD-L1特異性非阻斷Fab臂(表3)組合，且以24孔形式產生。隨後在系列滴定中，測試產生的CD137xPD-L1雙特異性抗體在CHO-PD-L1細胞或CHO野生型細胞存在下，於CD137-luc報導者系統中誘導劑量依賴性螢光素酶表達的能力。包含20H4.9和負對照抗體作為參考抗體(第19圖)。在存在或不存在CHO-PD-L1細胞或CHO野生型細胞的情況下，於活化的T細胞測定中，在連續滴定中選擇並測試顯示最高誘導螢光素酶的抗體(共56個)。平行地，在SEB測定中測試抗體。測量IL-2釋放作為CD137活化的讀數。在表7中顯示在T細胞活化測定中測試的24個雙特異性抗體的特徵及活性的概述。
選擇在活化的T細胞和SEB測定中，發現對兩個PD-L1臂均有活性的十二個CD137 Fab臂，以與7個不同的PD-L1 Fab臂組合。除了作為二價單特異性IgG產生外，這12個CD137臂作為雙特異性/單價CD137xPD-L1抗體產生，每個與7個不同的PD-L1臂中的一個組合。因此，在SEB測定中以劑量依賴性滴定，以IL-2的釋放作為讀數，測試總共84個雙特異性CD137xPD-L1抗體。第20圖中的數據顯示，當以CD137xPD-L1形式存在時；與其他Fab臂相比，12個CD137 Fab臂中的4個(MF6783、MF6749、MF6737和MF6788)在SEB測定中顯示出更低的效力。因此，包含這四個CD137 Fab臂的CD137xPD-L1雙特異性抗體被排除用於進一步測試。在額外的SEB測試的期間，包含MF6808、MF6763、MF6754、MF6785 和MF6797的CD137xPD-L1組合誘導最高的IL-2細胞激素釋放。(第21圖)。包含MF6805、MF6744和MF6825的CD137xPD-L1組合誘導較少量的IL-2細胞激素分泌。在系列滴定的SEB測定期間，藉由測量由Luminex多重(Luminex multiplex)測定的IL-2、IFNγ和TNFα釋放的誘導，進一步分析包含MF6808、MF6763、MF6754、MF6785和MF6797的CD137xPD-L1組合的效力。接下來，按照IL-2的釋放的EC50值排序抗體(表4)。包含四個不同CD137 Fab臂的28個CD137xPD-L1雙特異性抗體組(表4)，在SEB測定中顯示最高的活性。這四個CD137 Fab臂可以被映射到CD137中的相同結合區(結合域2)，再者，全部都可完全地阻斷CD137和CD137L之間的交互作用。它們都沒有在Jurkat CD137報導者篩選中顯示出作為二價單株抗體的催動活性(第17圖)。28個CD137xPD-L1雙特異性抗體的CIEX輪廓顯示，包含基於MF5553的PD-L1 Fab臂(例如MF7702)的CD137xPD-L1抗體在考慮作為用於製造的領導候選抗體方面，具有最佳的CIEX輪廓。
實施例5
抗CD137抗體組的親和力排序
透過Biacore，決定與PD-L1 Fab臂組合，來反式誘導T細胞活化的抗CD137Fab組的親和力。
為此，人類重組CD137蛋白質偶聯至晶片，並且Biacore T100儀器分析以單價雙特異性形式的不同抗CD137抗體的親和力：一個Fab臂對CD137特異性，而另一Fab臂對 無關的配位體，即破傷風類毒素(tetanus toxoid，TT)。
在這些實驗中，以小規模生產(24孔形式，參見實施例2的方式)，透過在Freestyle 293F細胞中瞬時轉染編碼的構築體，來產生雙特異性抗(CD137xTT)IgG。在每次轉染中，編碼所選的抗CD137序列中之一的構築體與編碼抗TT序列的MF1337組合。
然後使用Biacore T100儀器上的表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)，來決定抗體的親和力。為此，將huCD137-Fc蛋白質(RND Systems # 838-4B)在醋酸鈉偶聯緩衝液，pH 5.0中稀釋至5μg/ml，且偶聯至CM5生物傳感器晶片的池(cell)2的表面，至150共振單元(resonance unit，RU)。流通池(flow cell)1作為負對照表面。為了決定動力學解離速率常數(Koff值)，將測試抗體在HEPES緩衝鹽水(HEPES buffered saline，HBS)中稀釋至15μg/ml(100nM)並以30μl/min在經CD137塗佈的傳感器晶片的流通池1和流通池2流動。用10μl的100mM HCl的脈衝執行再生。使用在BIAevaluation軟體中擬合的曲線，由獲得的傳感圖(即，回應對時間的圖)決定解離速率常數。
為了測量抗體組的結合動力學及獲得抗體結合至CD137的動力學結合和解離速率常數，使此測試抗體不同濃度的子集在新塗佈的晶片的流動池1和2的表面上流動。將抗體在HBS中稀釋至200nM(即30μg/ml)，系列稀釋兩倍(4個稀釋度，100nM-50nM-25nM-12.5nM)，然後在高流動速率(30μl/min)下，於動力運轉(kinetic run)中測試與晶片的結合。用 10μl的100mM HCl的脈衝執行再生。使用BIAevaluation軟體，分析獲得的傳感圖，並測定動力學結合(kinetic association，Ka)和解離(kinetic dissociation，Kd)速率常數，從而產生不同抗CD137 Fab臂的親和力(KD值)的數據。對於每個抗體濃度，分開測定開啟率(on-rate)和解離率(off-rate)，然後平均。
結果顯示在表6中。所有測試的抗CD137Fab在低nM的範圍內具有親和力。
實施例6
Jurkat OX40-NFkBluc的產生
藉由在Jurkat E6細胞中穩定地整合全長OX-40構築體和NF-κB螢光素酶報導者構築體，以產生Jurkat OX-40-NFkBluc穩定報導者細胞系。因此，轉染全長OX-40MV1616[pIRESneo3](Clontech)，且在抗生素選擇後，產生表達OX-40的穩定選殖體。接下來，將NF-κB螢光素酶報告者構築體pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega)轉染至具有最高OX-40表達的選殖體中，並在抗生素選擇後，選擇穩定表達OX-40和NF-κB螢光素酶的選殖體。在透過盤子結合的CD3抗體(選殖體OKT-3)和PMA/離子黴素進行初始活化後，依回應OX-40L的能力，選擇選殖體。顯示最高活化窗口的選殖體被用作為OX-40報導者測定中的解凍和使用形式。
OX-40報導者測定
對於透過交聯媒介的直接OX-40活化測定和OX-40活化測定，用2μg/ml的在PBS中之抗-CD3(OKT3)塗佈96孔盤(Costar，目錄編號3917)隔夜。隔天，用PBS洗滌 盤子。將Jurkat OX-40-NFkBluc解凍並用含有10%的熱失活胎牛血清的DMEM/F12培養基(測定培養基)洗滌。以5×105個細胞/ml的密度重新懸浮細胞。將25μl的細胞懸浮液塗盤在經塗佈的96孔測定盤的內孔中。將測試抗體與2.5倍的aHuIgG-Fc(Bethyl，目錄編號A80-104A)抗體組合，且製備系列稀釋液(起始濃度測試IgG 20μg/ml)。將抗體混合物在室溫下培養15分鐘。接下來，將50μl的抗體混合物加到細胞中，然後加入25μl的測定培養基。每一盤含有作為參考對照的陰性(PG1337)和陽性對照抗體的連續稀釋液。將盤子在37℃、5% CO2、95%相對濕度下，培養6小時。加入50μl的螢光素酶(Promega，Bright-GloTM，目錄編號E2610)，且使用BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate讀取儀測量螢光素酶活性的量。
在OX-40直接活化報導者測定和T細胞活化測定中，篩選OX-40二價抗體組。選擇四個不同的OX-40 Fab臂，來測試雙特異性OX40xPD-L1或OX40xPD-1抗體是否能夠以「順式」或「反式」活化OX40。因此，使用過度表達PD-L1和Jurkat OX-40-NFkBluc的CHO細胞，在雙細胞系統中測試雙特異性抗體。在CHO細胞上以「反式」提供PD-L1，而在活化的Jurkat OX-40-NFkBluc報導者細胞上以「順式」提供PD-1。使用與Jurkat OX-40-NFkBluc測定法相同的測定設置，其中經塗佈的抗CD3提供第一T細胞活化訊號。所使用的效應目標細胞比例為4：1，其中目標細胞為CHO野生型或CHO-PD-L1細胞。第18圖顯示了與PD-L1(MF5561)或PD-1 (MF6256)阻斷Fab臂組合的四個不同的OX40 Fab臂的範例。在CHO-PD-L1細胞存在下，OX40xPD-L1抗體誘導OX40報導者活性達到與基於易普利姆瑪的抗CTLA4抗體相同的程度。相反地，OX40xPD-1抗體顯示基礎活性。表達PD-L1的細胞不存在時，OX40xPD-L1抗體的活性返回至基準線。
實施例7
在實施例4中，鑑於它們的T細胞轉活化能力，決定5個CD137特異性Fab臂是較佳的。
在此實施例中，使用了由三個候選CD137臂(6763、6785和6797)和一個PD-L1臂(7702)所組成的一組三個雙特異性抗體。雙特異性抗體在293F Freestyle細胞中產生，並透過protA、CIEX和膠體過濾純化。隨後，在幾個測定中測試抗體。我們以親本二價單特異性形式(抗CD137或抗PD-L1)和雙特異性形式(抗CD137xPD-L1)測試了四種Fab臂，並將這些抗體與基準抗CD137抗體20H4.9、基準抗PD-L1抗體YW243.55.S70和負對照抗體(抗RSV抗體PG2708)比較。
對於此實施例中描述的測定的材料和方法，也在實施例4提及。
以下列出抗體。
FACS分析
抗原特異性及親和力
使用表達huCD137或cyCD137的293FF穩定細胞選殖體，藉由FACS分析，驗證單特異性和雙特異性IgG與人類(hu)和食蟹獼猴(cy)CD137的結合。對此，將細胞與8步驟系列滴定(8-step serial titration)的抗體一起培養，並透過之後二級抗體的結合，即與螢光染劑藻紅蛋白質(phycoerythrin，PE)結合的抗人類IgG，來分析結合強度。在第22圖中顯示以每個測試抗體的平均PE螢光表示的結合強度。在單特異性親本抗CD137抗體中，PG6785以最高親和力結合至人類CD137，接著是PG6797，然後是PG6763。雙特異性PB17311(6797x7702)以最高親和力結合huCD137，接著是PB17309(6763x7702)，然後是PB17310(6785x7702)。在親本抗CD137抗體中，PG6785再次以最高親和力結合至食蟹獼猴CD137，這次接著是PG6797，然後是PG6763。雙特異性PB17311(6797x7702)以最高的親和力結合cyCD137，接著是PB17309(6763x7702)，然後是PB17310(6785x7702)。值得注意的是，如第22圖所示，當這三種CD137特異性Fab臂存在於雙特異性單價抗體中時，它們能夠同樣良好地結合huCD137和cyCD137，如對單特異性二價親本抗體所觀察到的。
單特異性和雙特異性IgG與人類(human，hu)和恆 河猴(rhesus macaque，re)PD-L1的結合係藉由使用表達huPD-L1或rePD-L1的CHO-K1穩定細胞選殖體的FACS分析來驗證。為此，將細胞與8步驟系列滴定的抗體一起培養，並透過隨後二級抗體抗人類IgG-PE的結合，來分析結合強度。在第23圖中顯示各個測試抗體以平均螢光強度(MFI)表示的結合強度。如同所預期的，親本抗CD137抗體不會結合人或恆河猴PD-L1，而親本抗PD-L1 PG7702抗體會。重要的是，全部三種雙特異性抗體強力地結合至PD-L1，全部都有比正對照抗體高的親和力。這意味著即使當存在於單價雙特異性抗體中時，與二價對照抗體YW243.55.S70相比，MF7702臂對PD-L1具有更高的親和力。
結合至活化的T細胞
我們測試了抗體組對活化的T細胞的結合親和力。為此，從捐贈者收集週邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)並使其靜止隔夜。隨後，單離T細胞並藉由將它們在塗佈抗CD3抗體OKT3的盤子上培養3天，來活化T細胞。收穫活化的T細胞，並用在抗體組中之IgG的系列滴定和用對照IgG染色。透過隨後第二抗體抗人類IgG-PE，的結合，在FACS上測量抗體結合。第24圖顯示各個測試抗體以MFI表示的結合強度，其中左邊顯示雙特異性IgG的結合，而右側顯示單特異性IgG的結合。PB17311(6797x7702)顯示最有效的結合。重要的是，正對照抗體的結合親和力低於雙特異性抗體的結合親和力。這意味著，與PD-L1特異性基準抗體YW243.55.S70(基於Atezolizumab)和CD137特異性基準抗體 20H4.9(其基於Urelumab)相比，本發明的雙特異性抗體對活化的T細胞具有較高的親和力。
配位體阻斷測定
PD-1/PD-L1競爭測定
在PD-1/PD-L1競爭ELISA中，測試雙特異性和單特異性IgG阻斷PD-L1配位體結合的能力，由此預期增加量的含有抗PD-L1臂的抗體可減少可結合用PD-1 Fc塗佈的盤子的生物素化PD-L1的量。為此，將1μg/ml PD-1-Fc(R & D；#.1086-PD)塗佈至maxisorp盤上，且在從10μg/ml的濃度開始的各個抗體的系列稀釋液存在或不存在的情況下，在溶液中加入生物素化的PD-L1(BPS Bioscience；目錄編號71105)。透過隨後與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)共軛的鏈黴親和素的結合且加入HRP會催化成有色產物的無色基質，來檢測結合的PD-L1。使用ELISA盤讀取儀在450nm測量的溶液的光密度(optical density，OD)是結合的PD-L1的指標。結合曲線顯示於第25圖，其中左側顯示雙特異性IgG的結合，而右側顯示單特異性IgG的結合。如預期的，正對照抗PD-L1抗體顯示高程度的阻斷活性，而負對照抗體沒有顯示。單特異性抗CD137抗體對於PD-L1阻斷也是陰性的。對於含有至少一個抗PD-L1臂的IgG而言，全都能夠阻斷PD-1/PD-L1結合。發現親本單特異性抗PD-L1抗體PG7702在阻斷PD-L1結合的方面與基準抗PD-L1抗體YW243.55.S70一樣有效。雙特異性IgG都具有良好、相似程度的阻斷活性。
以細胞為基礎的huCD137配位體阻斷測定
也測試了雙特異性和單特異性IgG阻斷CD137配位體結合的能力。我們測試了在親本二價單特異性形式(抗CD137或抗PD-L1)中和在雙特異性形式(抗CD137xPD-L1)中的三種候選CD137臂(6763、6785和6797)和PD-L1臂(7702)，並將這些抗體與基準抗CD137抗體20H4.9和PF-05082566以及負對照抗體(抗RSV抗體PG2708)進行比較。
為了在生理相關的條件下分析CD137配位體阻斷，使用流式細胞術在以細胞為基礎的huCD137配位體阻斷測定中，測試雙特異性和單特異性IgG。在此測定中，增加量的含有抗CD137臂的抗體預期減少可結合至穩定表達huCD137的CHO-K1細胞的huCD137L重組蛋白質的量。為此，將CHO(huCD137)細胞與huCD137L蛋白質共培養，加上各個抗體的系列稀釋液。用二級生物素共軛的抗huCD137L抗體，接著藉由用與藻紅蛋白質(PE)共軛的鏈黴親和素的染色，偵測結合的huCD137L。
方法
收穫穩定表達huCD137的CHO細胞，計數並在FACS緩衝液中稀釋至5×105個細胞/ml，且將200μl(含有1×105個細胞)加入到U底96孔微量滴定盤的每個孔。細胞保持在冰上。細胞在4℃以300g旋轉3分鐘，並藉由加入200μl的冰冷FACS緩衝液洗滌。細胞在4℃以300g再次旋轉3分鐘，並將沉澱物重新懸浮於25μl的在FACS緩衝液中之抗體稀釋液(3倍系列稀釋，從25至0.034μg/ml)，加上25μl的huCD137L-FLAG蛋白質(Adipogen # AG-40A-0198T；終濃度 0.06μg/ml)溶液。將盤子在黑暗中在冰上培養60分鐘。然後藉由加入200μl的冰冷FACS緩衝液洗滌細胞兩次，並在4℃以300g旋轉3分鐘。然後加入50μl/孔的在冰冷FACS緩衝液中稀釋至1μg/ml的生物素化多株山羊huCD137L抗體(R & D Systems # BAF2295)。將細胞重新懸浮並將盤子在黑暗中在冰上培養60分鐘，接著如前所述洗滌兩次。然後加入50μl/孔的在冰冷FACS緩衝液中1：200稀釋的鏈黴親和素-PE。將細胞重新懸浮並將盤子在黑暗中在冰上培養30分鐘，接著如前所述洗滌兩次。將細胞重新懸浮於每孔100μl的FACS緩衝液中且藉由加入100μl的4%三聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)溶液進行固定。根據BD手冊中的說明，使用BD FACSCanto流式細胞儀測量樣品。以結合的鏈黴親和素-PE的平均螢光強度(MFI)表示huCD137配位體的結合程度。
結果
獲得的結合曲線顯示於第26圖中。如預期的，負對照不阻斷CD137配位體結合。配位體結合經陽性對照抗體的阻斷則不同：基準抗體PF-05082566顯示強阻斷，而20H4.9顯示相對弱且不完全的阻斷。在這三種單特異性抗CD137抗體中，PG6785是最好的阻斷劑，而PG6797(PB17311的親本)是第二好。這三種相應的雙特異性抗CD137x抗PD-L1抗體也能夠阻斷CD137配位體結合。由於這是以細胞為基礎的測定，所以這些結果表示生理相關條件。
PD-1/PD-L1報導者測定
定性候選抗CD137xPD-L1抗體的另一步驟是確定 它們是否可阻斷PD-1/PD-L1路徑，且將其與對PD-L1特異性的對照抗體的活性比較。在由Promega開發、以雙細胞系統為基礎：表達PD-L1和T細胞受體活化子的CHO細胞和過度表達PD-1的Jurkat/NFAT-RE報導者細胞系，的生理相關PD-1/PD-L1阻斷報導者測定中，體外測試此阻斷活性。Jurkat T細胞含有可透過NFAT(活化的T細胞的核因子)路徑被活化的螢光素酶報導者基因。PD-1與PD-L1的交互作用抑制此路徑的活化。然而，阻斷PD-1/PD-L1與抗PD-1或PD-L1的抗體的交互作用可活化NFAT路徑。因此，PD-1/PD-L1的阻斷程度越大，螢光素酶報導者基因的活化越強。為此，在加入過表達PD-1的Jurkat/NFAT-RE報導者細胞之前，將各個抗體的連續稀釋液加入表達PD-L1的CHO細胞。於第27圖中顯示以報導者基因的誘導倍數表示的24小時後的阻斷程度，其中左側顯示雙特異性IgG的結合，右側顯示單特異性抗PD-L1 IgG的結合。同樣地，二價親本抗體7702比正對照基準抗體YW243.55.S70更有效。雙特異性IgG都具有良好、相似程度的阻斷活性。
實施例8
PD-L1表達量對經CD137xPD-L1雙特異性的CD137轉活化的影響
細胞系的培養
從ATCC購買MDA-MB231細胞(目錄編號CRM-HTB-26)並常規保存在補充100mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)(Gibco)、MEM非必需胺基酸(Gibco)和10% FBS (Lonza)的DMEM高葡萄糖(Gibco)中。從ATCC獲得BxPC-3細胞(目錄編號CRL-1687)並常規保存在補充10% FBS(Lonza)的RPMI-1640(Gibco)中。
CD137xPD-L1抗體的作用模式
使用Jurkat CD137-luc報導者轉活化測定，來決定經CD137xPD-L1抗體媒介的轉活化是否會在生理性的PD-L1表達量發生，且是否與PD-L1的表達量相關。因此，通過QIFIKIT分析(DAKO)，以確定PD-L1在各種CHO-PD-L1細胞系和人類腫瘤細胞系上的結合位的數量。選擇三種CHO-PD-L1細胞系，其顯示對應於表達相對大(ES-2細胞)、中等(MDA-MB231)或少(BxPC-3)量的PD-L1的人類腫瘤細胞系的PD-L1表達量。第28A圖顯示了在使用這三種選擇的CHO細胞系中三種CD137xPD-L1雙特異性抗體的範例，其中選擇的CHO細胞系表達每個細胞~6,000至~72,000個PD-L1結合位。數據顯示，當細胞上存在超過38×104個PD-L1拷貝時，CD137xPD-L1雙特異性抗體顯示高度活化。在少量PD-L1的情況下；在每個細胞僅表達~6000個PD-L1結合位的CHO細胞的存在下，觀察到低程度的活化。因此，經CD137xPD-L1雙特異性抗體的轉活化將發生在表達大量PD-L1的細胞附近，例如發生在免疫抑制性腫瘤微環境中，因此替CD137xPD-L1雙特異性抗體提供最佳治療窗口。
第28A圖顯示對於所有測試的抗體，CD137xPD-L1雙特異性抗體媒介的NF-kB活化和CHO細胞上的PD-L1表達量之間的正相關。
第28B圖顯示Jurkat CD137-luc報導者轉活化測定的範例，其中CHO-PD-L1細胞取代表達高、中及低表面PD-L1的量的人類腫瘤細胞系。此實驗證實CD137xPD-L1雙特異性抗體媒介的轉活化與輔助細胞的PD-L1表達量相關，以及CD137xPD-L1雙特異性抗體能夠在表達大量PD-L1的腫瘤細胞的存在下轉活化。
接下來，評估在表達PD-L1的輔助細胞存在下的CD137轉活化是否為CD137xPD-L1雙特異性抗體的特定性狀(trait)。第28C圖顯示一範例，其中對CD137xPD-L1雙特異性抗體、它們的親本單特異性二價(CD137xCD137)和親本單特異性單價CD137(CD137xTT)和PD-L1(TTxPD-L1)單特異性抗體評估在表達PD-L1的輔助細胞存在下的Jurkat CD137-luc報導者細胞轉活化。所有的IgG均以10μg/ml進行測試。數據顯示，在表達PD-L1的CHO或ES-2細胞存在下，僅CD137xPD-L1雙特異性抗體媒介轉活化。如預期的，參考對照抗體20H4.9直接活化Jurkat CD137-luc報導者細胞並且不依賴於經輔助細胞的PD-L1表達。
實施例9
CHO-PD-L1 x T細胞轉活化測定
為了確定使用雙特異性IgG的附加價值，我們評估了幾種雙特異性抗-CD137xPD-L1抗體在轉活化測定中誘導T細胞釋放細胞激素的能力，並將它們的活化與針對PD-L1(YW243.55.S70)和CD137(20H4.9)的基準二價抗體的活化進行比較。這些基準抗體是單獨和等莫耳組合測試。為此，將來 自單一健康捐贈者的純化和活化的T細胞與CHO-PD-L1細胞和測試抗體的連續稀釋液共同培養3天(關於上測定的詳細描述，也參見實施例4)。隨後在未稀釋的培養物上清液中測量IL-2、IFNγ和TNFα的量。第29圖中顯示在此轉活化測定中測量的細胞激素釋放的程度。如第29圖所示，在誘導細胞激素釋放的方面，三種雙特異性抗體都比任一種參考抗體更有效。重要的是，在誘導細胞激素釋放的方面，三種雙特異性抗體中的每一種都比兩種參考抗體的組合更有效，表明它們具有較優良的T細胞活化特性。
在T細胞轉活化測定的期間，細胞激素的釋放
為了確定使用雙特異性IgG的附加價值，我們以它們在轉活化測定中活化T細胞釋放細胞激素的能力，比較了其中一種雙特異性抗體(PB17311；6797×7702)與其親本單特異性二價親本IgG的混合物以及與針對PD-L1和CD137的基準二價抗體。這些基準抗體以臨床中使用的治療性抗體為基礎：抗PD-L1選殖體YW243.55.S70是以Atezoluzumab為基礎，抗CD137選殖體20H4.9是以Urelumab為基礎，而抗CD137選殖體PF-05082566是以Utomilumab為基礎。這些基準抗體是單獨和等莫耳組合測試。
在這些實驗中，以20μg/ml開始的6步驟10倍滴定(6-step 10-fold titration)，來測試抗體。將來自2個捐贈者的PBMC解凍並加入9倍體積的培養基(含L-穀胺醯胺和10%熱失活的FBS的RPMI1640)。細胞在室溫下以150g離心10分鐘。將細胞沉澱物重新懸浮於10ml培養基中，且藉由在37 ℃，5% CO2，95%相對濕度的50ml falcon管中培養隔夜，允許細胞靜置。在準備轉活化測定中，用5μg/mL的在PBS中之抗CD3抗體(選殖體OKT3)塗佈96孔盤(Cellstar，目錄編號655180)的內孔隔夜。
隔天，使用如製造商所述的Easy Sep T細胞富集(pan CD3)純化程序(Stem cell Technologies，目錄編號19051)單離T淋巴細胞。EasySep程序使用負選擇(negative selection)。簡而言之，將PBMC在室溫以150g離心10分鐘。將細胞沉澱物重新懸浮於2ml PBS+含有1mM EDTA的2% FBS中。將細胞懸浮液通過30μm篩網尼龍過濾器過濾。計數細胞並重新調整至5×107個細胞/ml於PBS+含有1mM EDTA的2% FBS中。將50μl的EasySep人類T細胞富集雞尾酒加至每個2ml細胞體積，混合並允許其在室溫培養10分鐘。接下來，將50μl的EasySep D磁性顆粒加入到每2ml細胞體積中並允許其在室溫培養5分鐘。用PBS+含有1mM EDTA的2% FBS，使總體積達到2.5ml。允許不期望的細胞部分在室溫下與磁體結合5分鐘。接下來，顛倒試管並將純化的T細胞級分倒入新試管中，透過在室溫下，以150g離心10分鐘收穫細胞，隨後以1x106個細胞/ml的濃度重新懸浮於培養基中。
同一天，經預塗佈的96孔盤用PBS洗滌且加入25μl的預稀釋的抗體，接著加入50μl的純化T細胞(50,000個細胞/孔)和25μl的CHO-PD-L1細胞(30,000細胞/孔)。允許細胞在37℃培養72小時。然後收集上清液且新鮮測試或儲存於-80℃。根據製造商的說明，通過Luminex Multiplex測定， 測量在未稀釋的培養上清液中細胞激素的量。透過eBioscience分析軟體分析結果。
對於16種細胞激素的子集，PB17311在轉活化測定中誘導的量高於基準抗CD137抗體20H4.9單獨誘導或與基準抗PD-L1抗體YW243.55.S70組合誘導的量(見第30圖)。此子集由GM-CSF、IL-2、IL-13、IFNγ、TNFβ、IL-17A、TNFα、IL-18、IL-1α、IL-22、IL-4、IL-31、IL-6、IL-5、IL-21和IL-9構成。PB17311誘導的細胞激素的量觀察到增加最多的是GM-CSF、IL-2、IL-13、IL-17A、IFNγ、TNF-α、TNF-β、IL-18、IL-22和IL-4。對於IL-1β、IL-1RA、IL-7、IL-10、IL-12p70、IL-15、IL-23或IL-27，沒有觀察到顯著的抗體媒介的細胞激素釋放。當細胞僅與抗PD-L1抗體YW243.55.S70或僅與抗CD137抗體PF-05082566或與親本6797(CD137)或與PD-L1(7702)二價抗體一起培養時，未觀察到細胞激素釋放的增加。
總之，此實驗顯示，與基準抗CD137抗體20H4.9本身或與基準抗CD137抗體20H4.9和基準抗PD-L1抗體YW243.55.S70的組合相比，雙特異性抗體PB17311具有改善的T細胞活化能力。
PB17311的一個重要優勢是此雙特異性抗體比兩種基準抗體的混合物更有效地活化T細胞。
實施例10
SEB測定
為了進一步對三種CD137xPD-L1雙特異性抗體PB17309、PB17310和PB17311定性，確定了其在金黃色葡萄 球菌B型腸毒素(SEB)存在下，增強藉由PBMC的細胞激素的釋放的能力。為此，將來自3個捐贈者的純化PBMC，在SEB(2000或125ng/ml)和三種候選雙特異性抗體或對照抗體的系列稀釋液的存在下培養3天。此實驗中的參考對照抗體是抗-CTLA4抗體10D1，其已在此試驗中顯示誘導有效的細胞激素釋放。
藉由Luminex Multiplex測定，在培養物上清液中測量細胞激素的量。在兩種不同SEB濃度下，來自三個不同捐贈者的PBMC釋放IL-2的結果顯示於第31圖中。此比較表示所有3種二價CD137xPD-L1抗體的活性輪廓在三個捐贈者中都是一致的。他們亦顯示PB17309和PB17311是雙特異性抗體中最有效的。所有三種PB17309(6763×7702)、PB17310(6785×7702)和PB17311(6797×7702)皆比正對照抗體更有效。在SEB濃度為2000ng/ml時，由來自單一捐贈者(編號1038)的PBMC釋放的IL-2、IFNγ和TNFα的量的結果顯示於第32圖中，從而將由CD137xPD-L1雙特異性抗體誘導的細胞激素釋放與由CD137(20H4.9)或PD-L1(YW243.55.S70)的基準二價抗體，單獨或以等莫耳混合物誘導的細胞激素釋放進行比較。此比較展示了，CD137xPD-L1雙特異性抗體明顯地比每種基準二價抗體更有效地活化PBMC。重要的是，在活化PBMC的方面，每種CD137xPD-L1雙特異性抗體都比YW243.55.S70和20H4.9的混合物更有效率，這再次展示了，在表達PD-L1的細胞存在下，這些雙特異性抗體的優越的T細胞活化特性可提供雙特異性分子的反式(in trans)活化。
實施例11
PB17309、PB17310及PB17311對抗CD3/CD28刺激的PBMC的由M2巨噬細胞媒介的抑制的影響
經典活化的巨噬細胞(M1巨噬細胞)可在癌化(carcinogenesis)的早期階段殺死腫瘤。然而，在從早期轉形至晚期腫瘤階段的期間，腫瘤微環境的動態變化逐漸推動從M1到M2巨噬細胞的轉變。腫瘤相關的M2巨噬細胞分泌免疫抑制性細胞激素，且藉由與PD-1連接誘導免疫抑制。因此，M2巨噬細胞抑制T細胞增殖和細胞激素產生。
由Aquila Biomedical開發的M2巨噬細胞抑制測定已用於證明抗PD-1抗體可部分地逆轉M2巨噬細胞對T細胞增殖的抑製作用。我們使用此測定來檢測PB17309、PB17310和PB17311對M2巨噬細胞的再極化(repolarization)的影響，使用IFN-γ表達作為讀數，並將其與由負同型對照(抗RSV-G抗體PG2708)和兩種參考抗體(抗CD137基準抗體20H4.9和抗PD-L1基準抗體YW243.55.570)媒介的影響進行比較。
M2抑制測定
從五名健康志願者收集的新鮮血液中單離週邊血液單核細胞(PBMC)。透過陰性選擇(沒有CD16消耗)，使用磁性細胞分選(magnetic cell sorting)來分離單核細胞。來自5個捐贈者中的每一個的PBMC的子集也被冷凍保存，以用於稍後的PBMC/M2共培養的測定。透過將分離的單核細胞與M-CSF(50ng/mL)一起在RPMI-10(RPMI-1640、10%熱失活的FBS、100U/mL青黴素(penicillin)、100μg/mL鏈黴素(streptomycin) 和2mM L-穀胺醯胺、50μM β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol))中，培養於96孔圓底盤中8天，產生M2巨噬細胞。在培養期間，在第3天和第6天用以M-CSF補充的新鮮RPMI-10補充細胞。在第8天，移除培養基，加入新鮮培養基(不含M-CSF)，並用LPS(0.1μg/mL)活化細胞2小時。然後，洗滌巨噬細胞，以移除LPS並補充新鮮培養基(不含M-CSF)。在存在或不存在測試抗體或同型對照(10μg/ml)的情況下，將M2巨噬細胞與自體PBMC(解凍並洗滌)以4：1的比例(PBMC：M2)共培養，三重複。交叉談話(cross-talk)24小時後，用抗CD3(1μg/mL)和抗CD28(2μg/mL)刺激培養物3天，以透過TCR受體複合物活化T細胞。然後，透過ELISA，在培養物上清液中測量IFN-γ，其中在合適的ELISA稀釋液中，以1：10或1：20稀釋上清液，使值處於套組的檢測範圍內。使用比例配對t檢定(ratio paired t-test)、或用於多重比較之單因子變數分析(one-way ANOVA)，伴隨事後(post-hoc)Dunnett’s(用於對照和多個組之間的比較)或Holm-Sidak(用於所有組之間的比較)多重比較檢定對試驗物質和適當對照進行統計分析。當P<0.05時，假設統計顯著性。
結果
結果顯示於第33圖中，數據以PBMC的抗-CD3/CD28刺激後，透過ELISA偵測的IFN-γ的三重複的平均量來呈現。從這些結果很清楚的，在M2巨噬細胞不存在的情況下培養的PBMC，在用CD3和CD28刺激後，產生更大量的IFN-γ(比較「僅PBMC」與「未刺激」條件；*表示P<0.05)。 儘管對不同捐贈者獲得的結果具有異質性，但推斷所有三種雙特異性抗體都增加了在M2：PBMC共培養物中IFN-γ的產生。儘管沒有統計顯著性，但相對於用PG2708同型對照處理的那些，PB17309和PB17310顯示IFN-γ產生增加的傾向。重要的是，與用PG2708同型對照處理的那些相比，PB17311的添加顯著地增加在M2：PBMC共培養物中IFN-γ的產生(**表示P<0.01)。用PB17309和PB17310獲得的結果與用抗CD137基準抗體20H4.9和用抗PD-L1基準抗體YW243.55.570獲得的結果相當。用PB17309和PB17310獲得的結果也與用兩種參考抗體組合得到的結果相當。
實施例12
PB17311對初始人類CD8+ T細胞啟動的影響
根據本發明的CD137xPD-L1雙特異性抗體藉由橋接T細胞上的CD137和輔助細胞上的PD-L1，來誘導T細胞的活化。這被認為是透過阻斷PD-1/PD-L1路徑，引起CD137訊息傳遞和增強抗原依賴性TCR活化。如目前實施例中所示，在表達PD-L1的腫瘤存在的情況下，根據本發明的CD137x PD L1雙特異性抗體促進抗原特異性T細胞的(再)活化。這與已知CD137共刺激允許T細胞的擴張、細胞激素產生和存活(Bertram等人2004)是一致的。然而，我們也想證明根據本發明的CD137xPD-L1雙特異性抗體重新(de novo)促進對腫瘤新抗原有效的T細胞反應。在小鼠感染模型中，初始CD8+T細胞的啟動(priming)已經顯示CD137共刺激促進中央記憶和效應T細胞族群的形成(Zhao等人2012)。因此，我們評估了由 我們的雙特異性抗體之一(PB17311；6797x7702)媒介的對初始人類CD8+ T細胞的啟動的影響。
由於初始T細胞前驅細胞的數量低，人類T細胞的抗原特異性啟動很難評估。然而，已經發現在黑色素瘤中過度表達的抗原-腫瘤相關抗原Melan-A-特別適合評估人類T細胞中的初始T細胞反應。這是因為對此HLA-A0201限制性Melan-A 27-35胜肽抗原決定基有特異性的T細胞的程度比對其他自身或腫瘤相關抗原的T細胞的程度高約10倍；此抗原決定基被約1000個初始T細胞中的1個識別。以此抗原決定基為基礎，Wölfl和Greenberg(2014)開發了一種體外啟動系統，其可靠地評估CD8+ T細胞的啟動條件。此方法以人類CD8 T細胞或ASAP-T8的抗原特異性活化和啟動為人所熟知。在ASAP-T8測定中，將單離的初始CD8+ T細胞與裝載胜肽抗原的由自體單核細胞衍生的樹突細胞共培養10天，接著定量和定性分析抗原特異性T細胞。
在此實施例中，根據在Wolfl和Greenberg(2014)中詳細描述方法，使用自兩個獨立捐贈者(編號1064和1066)的週邊血液單核細胞(PBMC)，以執行ASAP-T8測定。測定中測試的抗體和對照是抗CD137xPD-L1抗體PB17311、抗CD137基準抗體20H4.9、抗PD-L1基準抗體YW243.55.570、兩個基準抗體的等莫耳混合物和負對照抗RSV-G抗體PG2708。從DC：T細胞培養開始加入測試抗體，並且在第一次餵食期間再次加入。
衍生自單核球的成熟樹突細胞(mature dendritic cell，mDC)的產生
使用按照Wölfl和Greenberg(2014)所述的詳細方法的規章，產生衍生自單核球的成熟樹突細胞。為此，在ASAP-T8測定開始的前四天，將來自HLA-A2+捐贈者的PBMC解凍，在室溫以300g旋轉5分鐘，並重新懸浮於培養基中(CellGro樹突細胞培養基(CellGenix，目錄編號2005)+1%人類血清)至1×107/ml。然後，將2ml的此細胞懸浮液加至6孔盤的每個孔中。在37℃培養2-3小時，以允許趴附至塑料上後，移除培養基並透過用PBS洗滌，移除非趴附細胞。將3ml的補充10ng/ml的IL-4和1600IU/ml的GM-CSF的溫培養基加至每個孔，接著在37℃培養2天。再加入1.5ml的補充IL-4和GM-CSF的新鮮培養基後，將細胞再培養24小時。
然後，藉由移除3ml的上清液，接著劇烈地重新懸浮在剩餘的培養基中的細胞，並用冰冷的PBS洗滌，以移除任何剩餘的細胞，來收穫未成熟的DC。合併細胞且計數且在室溫下以300g離心5分鐘。將沉澱物以1×106個細胞/ml重新懸浮於預熱的培養基中，此培養基補充GM-CSF(800IU/ml)、IL-4(10ng/ml)、LPS(10ng/ml)和IFNγ(100IU/ml)。將2ml的細胞懸浮液(2×106個細胞)加到新的6孔盤的孔中。將在DMSO中溶解成5μg/μl的Melan-A抗原胜肽(JPT，目錄編號SP-MHCI-0006)以2.5μg/ml添加到適當的孔中，並將細胞在37℃下培養16小時。
在檢查DC形態後，透過用移液管劇烈地重新懸浮收穫mDC且用冰冷的PBS沖洗空的孔，以確保移除所有趴附 細胞。計數經胜肽脈衝的mDC和沒有分開合併的mDC以及活細胞。有mDC的試管始終置於冰上並用30Gy(3000Rad)照射，以防止在後續延長的細胞共培養期間，污染細胞的潛在增殖。然後，將細胞在室溫以300g旋轉5分鐘，並以5x105個細胞/ml重新懸浮於CellGro DC培養基+5%人類血清(HS)中。
初始CD8 T細胞的產生
在ASAP-T8測定開始的前一天，將來自與用於產生mDC的相同HLA-A2+捐贈者的PBMC解凍，在室溫以300g離心5分鐘，且以5×107個細胞/ml，重新懸浮於冷PBS/HS/EDTA緩衝液(含有2% HS和1mM EDTA的PBS)中。使用EasySEP人類初始CD8+ T細胞單離套組(STEMCELL，目錄編號19258)，將細胞用於初始CD8 T細胞單離。
每ml的細胞樣品，加入50μl的EasySep單離雞尾酒，接著，混合且在室溫下培養10分鐘。然後將EasySep磁性顆粒渦旋(vortex)30秒，且，每ml樣品加入100μl顆粒，以不需要的細胞為目標，用於移除。在室溫下培養10分鐘後，透過添加EasySep緩衝液，使細胞懸浮液達到2.5ml的總體積，並透過輕輕地移液，將細胞混合，接著轉移至5ml Falcon試管中。移除蓋子，且將試管放入EasySep磁體中。在室溫下5分鐘後，透過一次連續運動反轉磁體和試管，將所需的級分倒入新的5ml Falcon試管中，留下磁性標記的不要的細胞結合在原試管內。在返回到直立位置之前，將磁體和試管倒置3秒，留下任何從試管口懸掛的液滴。將有不要的細胞的舊試管從磁體中移除，並將有負富含細胞級分的新試管置於磁體中，用於 第二次分離。在室溫下5分鐘後，以相同的方式倒出所需的部分。
對負選的富含細胞計數，然後在室溫以300g離心5分鐘，並以3×106個細胞/ml的終濃度，重新懸浮於補充5% HS且含有5ng/ml的IL-7的CellGro DC培養基中，以允許最佳的T細胞啟動。以2ml/孔，將細胞轉移至6孔盤板並培養隔夜。
ASAP-T8測定
按照Wolfl和Greenberg(2014)中所述的詳細方法，對每個捐贈者執行此測定，三重複。收穫已與IL-7預培養的T細胞，合併且計數，然後在室溫下以300g旋轉5分鐘。將沉澱物以2x106個細胞/ml重新懸浮於培養基中，並以60ng/ml將IL-21加入，以增強CD8+ T細胞的啟動。藉由將經胜肽脈衝的mDC或非脈衝的DC與T細胞以1：1的v/v比例混合，產生4：1的T細胞：DC比例和30ng/ml的最終IL-21濃度，製備兩種DC/T細胞混合物。以最終濃度10μg/ml，將測試抗體加入。然後，將500μl的每種細胞混合物轉移至48孔盤的各個孔。
將細胞在37℃共培養總共10天，其涉及兩個餵食步驟和轉移至新鮮盤子。先在72小時後，在20μg/ml的測試抗體(最終IgG濃度10μg/ml)存在或不存在的情況下，用含有5% HS和10ng/ml的IL-15和10ng/ml的IL-7(細胞激素的終濃度為5ng/ml)的額外的500μl溫培養基餵食細胞，並培養48小時。為了允許更多的擴張空間，且減少來自DC製備的殘留(塑料趴附性)骨髓細胞的數量，然後將細胞和培養基轉移到24 孔板中的新鮮孔，其中已加入1ml的含有5% HS和10ng/ml IL-15和IL-7。再培養120小時後，細胞準備好分析。
在共培養的第10天，收集來自個別孔的細胞，且計數以確定每孔的絕對細胞計數。然後，用螢光標記的Melan-A特異性葡聚糖多聚體(dextramer)(Immudex，目錄編號WB2162-APC)，染色T細胞。在此葡聚糖多聚體中，葡聚糖聚合物骨架攜帶大於10個MHC-胜肽複合物和螢光染料分子(異藻藍素(allophycocyanin))，藉此允許藉由FACS分析檢測Melan-A胜肽特異性CD8+ T細胞。細胞亦用針對特定T細胞子集上的標記物的其他抗體來染色。為此，將來自個別孔的細胞，以50,000個細胞/孔轉移至96孔FACS盤的孔中。細胞以300g離心5分鐘，移除上清液，接著加入40μl的葡聚糖多聚體(在PBS+5%FBS中1：50稀釋)，且在室溫下在黑暗中培養20分鐘。然後，將額外的對CD8、CD45RA和CCR7特異性的抗體(濃縮5倍)加在10μl的FACS緩衝液中。將細胞在4℃在黑暗中培養20分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌兩次。在4℃培養10分鐘後，細胞準備好透過FACS分析。
結果
T細胞擴張
葡聚糖多聚體陽性族群代表在啟動時擴張且佔總CD8 T細胞族群的5-24%的抗原特異性細胞。使用葡聚糖多聚體陽性CD8陽性T細胞族群的相對大小和絕對細胞數用來計算每孔抗原特異性CD8+ T細胞的數量，且以在培養物中的抗原特異性CD8+T細胞的數目，相對於不含抗體的樣品，表示 來自每個捐贈者的數據(見第34圖)。顯示的數據來自執行三重複的實驗，且誤差線代表標準偏差。
從這些結果，當在啟動的期間存在肽抗原時，葡聚糖多聚體陽性抗原特異性CD8+ T細胞族群擴張是清楚的(比較第34圖中的「無胜肽對照」和「無抗體」條件)。
相對於負對照抗體，抗CD137參考抗體20H4.9增強了抗原特異性CD8+ T細胞的擴張，但僅在一個捐贈者(PBMC1064)中。
抗PD-L1參考抗體YW243.55.S70不影響擴張。
相對於負對照抗體，CD137xPD-L1抗體PB17311顯著地增強兩個捐贈者中抗原特異性CD8+ T細胞的擴張。PB17311比抗CD137參考抗體20H4.9更高程度地增強了抗原特異性CD8+ T細胞的擴張。與抗PD-L1抗體YW243.55.S70和抗CD137參考抗體20H4.9的組合相比，PB17311具有更高的CD8+ T細胞擴張活性。這意味著，在啟動初始CD8+ T細胞的方面，此CD137 x PD L1雙特異性抗體比CD137特異性和PD-L1特異性基準抗體更有效。
T細胞分化
抗原特異性一啟動，初始T細胞開始分化。在此分化過程的期間，在細胞表面上的CCR7和CD45RA的表達被下調，其中CD45RA在終末分化(terminally differentiated)的效應T細胞上重新表達。因此，CCR7和CD45RA表達的下調是分化的指標。藉由門控(gate)CD8+葡聚糖多聚體+細胞，然後確定不同T細胞子集內細胞的相對數量，來分析分化標記物 CCR7和CD45RA的表達。子集被定義為T初始/記憶幹細胞(TN/TSCM)：CD45RA+CCR7+；中央記憶T細胞(TCM)：CD45RA-CCR7+；效應記憶T細胞(TEM)：CD45RA-CCR7-；和終末分化的效應T細胞(TTE)：CD45RA+CCR7-。以每個T細胞子集在CD8+葡聚糖多聚體+T細胞族群中的百分比，來表示自每個捐贈者的數據(參見第35圖)。
相對於負對照抗體，CD137xPD-L1抗體PB17311增強兩個捐贈者中的抗原特異性CD8+ T細胞的分化。當我們比較在負對照抗體存在時啟動的T細胞和在抗體存在下啟動的那些T細胞時，我們發現PB17311降低具有初始細胞表型(TN/TSCM)的抗原特異性CD8+ T細胞的相對數量，並增加效應記憶和終末分化的效應細胞族群的相對數量(第35圖中的TEM和TTE)。PB17311以高於參考抗體20H4.9的程度，增強抗原特異性CD8+ T細胞的分化，如相較於經20H4.9培養的CD8+ T細胞族群，在經PB17311培養的CD8+ T細胞族群內的效應記憶和終末分化效應細胞族群的相對數量的增加所示。與抗PD-L1抗體YW243.55.S70和抗CD137參考抗體20H4.9的組合相比，PB17311甚至以較高的程度，增強抗原特異性CD8+ T細胞的分化。這意味著此CD137xPD-L1雙特異性抗體比CD137特異性和PD-L1特異性基準抗體更有效地增強初始T細胞在啟動時的分化。
不受任何理論的束縛，據認為CD137xPD-L1抗體PB17311對CD8+T細胞啟動的有效作用主要取決於T細胞中CD137訊息傳遞的誘導。藉由結合抗原識別後在T細胞表面表 達的CD137和在成熟DC上的PD-L1，PB17311允許CD137訊息傳遞所需的CD137受體聚集。
總之，這些結果表明CD137/PD-L1雙特異性抗體PB17311增強體外初始CD8+ T細胞的擴張和分化。
與抗PD-L1基準抗體YW243.55.S70和抗CD137基準抗體20H4.9(的組合)相比，PB17311具有增加的擴張和分化潛能。這表明PB17311在誘導或增強針對現有腫瘤的新T細胞反應中更為有效。
實施例13
PB17311對T細胞的CD107a及細胞激素的表達的影響
如實施例10所示，CD137xPD-L1雙特異性抗體可增強經SEB活化的PBMC的上清液中的IL-2、TNFα和IFNγ的產生。在這裡，我們使用胞內細胞激素染色和FACS分析，來鑑定在用CD137xPD-L1雙特異性抗體PB17311處理後，負責增強細胞激素的產生的T細胞子集。我們亦評估CD107a表達作為CD8+ T細胞的細胞毒性的標記物。我們比較PB17311與抗CD137基準抗體20H4.9、抗PD-L1基準抗體YW243.55.570、兩個參考抗體的等莫耳混合物和負對照抗RSV-G抗體PG2708的影響。
為此，在抗體存在或不存在的情況下，用SEB(320ng/ml)刺激PBMC 24小時，且對標記物CD3、CD4、CD8、CCR7、CD45RO和CD107a，對細胞激素IL-2、IFNγ和TNFα進行染色，並使用活力染劑(viability dye)。在SEB和抗體不存在的 情況下培養的PBMC被包含作為SEB刺激的對照(未受刺激)。在總T細胞族群(CD3+細胞)中和在以下CD4和CD8 T細胞子集中：初始T細胞(CD45RO-CCR7+)、中樞記憶T細胞(CD45RO+CCR7+)、效應記憶T細胞(CD45RO+CCR7-)和終末分化效應T細胞(CD45RO-CCR7-)，分析CD107a和細胞激素的表達。結果僅針對觀察到最顯著差異的子集顯示：CD4效應記憶(effector memory，EM)細胞、CD8 EM細胞和CD8終末分化的效應(terminally differentiated effector，TE)細胞。
方法
FACS分析中用於偵測胞內和胞外目標的抗體列表。
*在SEB刺激的期間添加至細胞
將衍生自單一健康捐贈者的冷凍保存的PBMC解凍並靜置隔夜。然後計數細胞，以200g離心12分鐘，且以2×106個細胞/ml的濃度，將沉澱物重新懸浮於PBMC培養基中(RPMI1640、10%熱失活FBS和1%青黴素-鏈黴素)。將100μl細胞懸浮液加至兩盤96孔圓底盤的孔中，其中已加入100μl含有SEB和測試抗體的PBMC培養基。最終SEB濃度是320 ng/ml。每種抗體以1μg/ml的單一濃度(除了以0.5+0.5μg/ml測試的YW243.55.570和20H4.9的組合外)進行三重複測試。亦包括沒有SEB或抗體的對照孔。在37℃、5% CO2、95%濕度下刺激24小時。在最後12小時的培養期間，將抗CD107a和布雷非德菌素A(Brefeldin A)(Golgiplug，BD)與孟寧素(Monensin)(Golgistop，BD)的混合物加入到每個孔中。
然後，合供重複的盤子，並用對相關標記物和細胞激素有特異性的抗體(於所述抗體列表中提供概述)對PBMC染色。由於固定後，CD3、CD4和CD8的偵測不受損害，所以針對這些目標的抗體在胞內染色步驟與抗胞內細胞激素的抗體一起添加。由於它們對固定的敏感性，胞外目標CCR7和CD45RO在固定步驟之前染色。為此，將盤子以350g離心3分鐘，將細胞重新懸浮於每孔100μl的PBS中，並合併來自重複盤子的細胞。如前所述離心盤子，並將細胞重新懸浮於每孔100μl的1：1000稀釋的可固定的活力染劑(Fixable Viability Dye)(eBioscience，目錄編號65-0866)中。在室溫下在黑暗中培養10分鐘後，將150μl的FACS緩衝液(PBS pH 7.4、0.5% BSA、0.5mM EDTA)加至每個孔中。將盤子離心且將細胞重新懸浮於25μl的在FACS緩衝液中稀釋的抗CCR7抗體中。在37℃、5% CO2、95%濕度下培養15分鐘後，加入25μl的在FACS緩衝液中稀釋的抗CD45RO抗體。在室溫下在黑暗中培養30分鐘後，將150μl的FACS緩衝液加至每個孔。如前所述離心盤子並將細胞重新懸浮於200μl的FACS緩衝液中。將盤子離心並將細胞重新懸浮於100μl的BD固定/透化溶液(BD Fixation/Permeabilization solution)(BD Biosciences，目錄編號554714)中。在室溫下在黑暗中培養10分鐘後，加入100μl的BD Perm/Wash緩衝液(BD Biosciences，目錄編號554714)。然後將盤子以350g離心3分鐘，且將細胞重新懸浮於200μl的BD Perm/Wash緩衝液中。
在此固定和透化步驟後，將盤子以500g離心3分鐘，並將細胞重新懸浮於50μl的含有對胞內目標特異性的抗體的BD Perm/Wash緩衝液的溶液中。此溶液含有針對胞內目標IFNγ、IL-2和TNFα的抗體以及針對CD3、CD4和CD8的抗體。將盤子在室溫下在黑暗中培養1小時，然後將150μl的BD Perm/Wash緩衝液加至每個孔。然後，將盤子以350g離心3分鐘且將細胞重新懸浮於200μl的BD Perm/Wash緩衝液中。再次將盤子以350g離心3分鐘，將細胞重新懸浮於100μl的固定溶液(PBS pH 7.4、0.5% BSA、0.5mM EDTA、1% 甲醛)中，且儲存於4℃直到隔天獲取。
使用BD Fortessa流式細胞儀測量樣品，且使用FlowJo軟體版本10分析數據。細胞族群，分析如下：通過繪製FSC-A與FSC-H圖，來區分單倍體與雙倍體。藉由門控對存活染色陰性的族群，排除死細胞。T細胞被鑑定為CD3+且分為CD4+和CD8+子集。根據CCR7和CD45RO的表達，將這些T細胞子集進一步分為初始、中央記憶、效應記憶和終末分化的效應細胞。評估細胞激素和CD107a在總T細胞族群內和在子族群內的表達，並且以T細胞總族群的百分比表示。
結果
在第36圖中顯示總T細胞族群中CD107a、IFNγ、IL-2和TNFα的胞內量，其中三個個別的T細胞子集(CD4 TEM、CD8 TEM和CD8 TTE)表達的量在第37圖中所示。在這些圖中，虛線代表當用SEB和負對照抗體PG2708刺激時，對指定標誌物陽性的細胞的平均百分比。長條(bar)代表使用衍生自單一捐贈者的細胞，進行三重複的實驗的平均值±SD。為了測試顯著性差異，透過單因子變數分析，接著透過Dunnett’s多重比較檢定，將每個條件與負對照抗體PG2708(負對照抗體)進行比較。P值用星號表示如下：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
相對於負對照抗體，PB17311增強總T細胞族群中CD107a、IL-2和IFNγ的產生(第36圖)。值得注意的是，與抗CD137基準抗體20H4.9、抗PD-L1基準抗體YW243.55.570相比以及亦與兩個參考抗體的等莫耳混合物相比，PB17311更增強CD107a的產生。由此得出結論，與20H4.9、YW243.55.570或前述之混合物相比，與PB17311培養後，更增強CD8+ T細胞的細胞毒性。與20H4.9和YW243.55.570相比，與PB17311一起培養後，IL-2和IFNγ的產生也似乎更高。
當我們更詳細地查看個別T細胞子集時，我們發現PB17311增強CD4TEM細胞中所有三種細胞激素的表達。與相比，PB17311也在CD8TEM和TTE族群中，以比基準抗體20H4.9、YW243.55.570及前述之混合物更高的程度，增強CD107a的表達，表示其比這些基準抗體的混合物更增強CD8 T細胞的細胞毒性。
結論
這些結果與之前觀察到的一致，即在SEB刺激時，CD137xPD-L1雙特異性抗體增強PBMC產生IL-2、TNFα和IFNγ。他們證明PB17311引起表達細胞激素的T細胞數量的顯著增加，且PB17311比20H4.9和YW243.55.S70基準抗體更有效地誘導在CD8TEM和TTE子集上細胞毒性標記物CD107a的表達。值得注意的是，跟與20H4.9、YW243.55.570或前述之混合物培養後的IFNγ和TNFα的產生相比，與PB17311培養後，CD8 TEM和TTE族群的IFNγ和TNFα的產生也更高，表示PB17311具有較高的活化CD8+ T細胞的潛力。跟與20H4.9培養相比，與PB17311培養後，CD4 TEM族群的IL-2的產生也似乎更高，而跟與YW243.55.570培養相比，程度較低。
實施例14
PB17311對腫瘤浸潤T細胞增殖的影響
抗CD137xPD-L1雙特異性抗體的初始篩選使用基於初代T細胞的測定。然而，此類測定缺乏驅動腫瘤與其微環境的共同演化的細胞交互作用的複雜性。為了在腫瘤相關設置下測試我們的雙特異性抗體，我們也利用了最近開發的基於從病人腫瘤材料單離的T細胞的測定。Zhou等人已經開發出從肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)或大腸癌(colorectal cancer，CRC)病人獲得新鮮腫瘤材料，並單離腫瘤浸潤細胞(骨髓和淋巴細胞)，以測試以免疫檢查點抑製劑為目標的抗體對腫瘤浸潤T細胞功能的影響的方法(Zhou等人，2017)。在這裡，我們從HCC病人或大腸癌肝轉移(liver metastasis in CRC，LM-CRC)病人獲得材料，以測試抗CD137xPD-L1雙特異性抗 體PB17311是否可再活化衍生自這些病人的腫瘤浸潤CD4和CD8 T細胞。
[方法]
為此，從四名LM-CRC的病人和三名有資格手術切除腫瘤的HCC病人獲得新鮮的腫瘤材料。手術前至少三個月，病人均未接受化療或免疫抑制治療。Zhou等人(2017)描述的方法如下：透過切成小塊，從新鮮組織單離腫瘤浸潤骨髓和淋巴細胞，接著在37℃、0.5mg/ml的膠原酶IV(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO)和0.2mg/ml DNAse I(Roche，Indianapolis,IN)中消化20-30分鐘。通過100-μm孔細胞過濾器(BD Biosciences，Erembodegem，比利時)，過濾所得的細胞懸浮液，並透過Ficoll密度梯度離心，獲得單核白血球。生存力由錐蟲藍(trypan blue)排除法確定。然後用0.1μM的螢光染劑羧基螢光素二乙酸酯琥珀醯亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE，Invitrogen)標記細胞並懸浮於補充10%人類AB型血清、2mM L-穀胺醯胺、50mM HEPES緩衝液、1%青黴素-鏈黴素、5mM丙酮酸鈉和1%最低必需培養基非必需胺基酸(minimum essential medium non-essential amino acid，MEM NEAA)。對於在100μl中1x105個細胞HCC和1至2x105個細胞LM-CRC，轉移至96孔圓底盤的每個孔。然後在測試抗體不存在或存在的情況下，刺激腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)，以誘導活化，如下：對含有衍生自HCC病人的TIL的孔加入100μl的相同培養基，其含有測試抗體和1×105個已擴張且隨後用編碼全長腫瘤抗原 磷脂醯肌醇蛋白質聚醣3(glypican-3，GPC3)或黑色素瘤相關抗原C2(MAGEC2)的mRNA轉染的經自體CD40活化的B細胞母細胞。共培養這些細胞六天。對含有衍生自LM-CRC病人的TIL的孔加入100μl的相同培養基，其含有測試抗體和用抗人類CD3/CD28(Gibco-Life Technologies AS，挪威)塗佈四天的dynabead。培養後，收穫CFSE標記的細胞並用CD8、CD4、CD3抗體染色。使用7-胺基放線菌素D(7-aminoactinomycin D，7AAD；Invitrogen,Paisley UK)排除死細胞，且透過流式細胞術分析，基於CFSE稀釋，來確定T細胞增殖。透過FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences,San Diego,USA)測量細胞且使用FlowJo軟體分析。
將CD137xPD-L1雙特異性抗體PB17311與其單特異性二價親本抗體PG6797和PG7702、以及與抗CD137參考抗體20H4.9、抗PD-L1參考抗體YW243.55.S70和針對不相關RSV-G抗原的負對照抗體PG2708進行比較。沒有抗體的樣品被包含作為對照，且所有條件以10μg/ml的IgG濃度在雙份中測試。
對於衍生自LM-CRC的樣品，在抗體存在下的CD4 T細胞增殖只能在四個捐贈者中的三個中確定，因為第四個捐贈者的CD4T細胞增殖的基線程度已經非常高(大於60%增殖細胞)。CD8 T細胞增殖可在來自所有四個LM-CRC捐贈者的樣品中確定。關於衍生自HCC的樣品，對於所有三個捐贈者都產生了表達GPC3的自體B細胞，但是MAGEC2的表達僅對於三個捐贈者中的兩個是可能的。這導致總共5次使用來自 這三個HCC捐贈者的細胞的增殖實驗。
結果以平均值±SEM表示。
結果
結果顯示於第38圖中。藉由在負對照抗體存在的情況下，測量增殖T細胞的百分比(低程度的CFSE)，確定CD4 TIL(右上圖)和CD8 TIL(右下圖)的基線增殖。以增殖超過基線的增加百分比，計算樣品的CD4(左上)和CD8(左下)增殖。值是平均值±SEM(LM-CRC：CD4 n=3、CD8 n=4；HCC：CD4和CD8 n=5)。
CD137xPD-L1雙特異性抗體PB17311明顯增強了兩種腫瘤類型中CD4和CD8 TIL兩者的增殖，且結果表明其表現優於其親本抗體PG6797和PG7702。結果也表明YW243.55.S70刺激CD4和CD8 T細胞增殖至相同程度。PB17311和20H4.9也增強了CD4 T細胞的增殖，但更有效地增強了CD8T細胞的增殖。
這些實驗證明了使用雙特異性CD137xPD-L1抗體的附加價值，且PB17311增強衍生自HCC和LM-CRC病人的CD4和CD8 TIL的增殖。重要的是，這意味著根據本發明的雙特異性抗體可再刺激癌症病人的抗原特異性CD4+ T細胞和抗原特異性CD8+ T細胞，且其可比基準抗體YW243.55.S70更有效地刺激CD8+ TIL的增殖。
實施例15
透過丙胺酸掃描，進行PB17311抗原決定基分析
進行抗原決定基分析，以鑑定包含或為由存在於 PB17311中的抗CD137 Fab臂(MF6797)識別的抗原決定基的一部分的殘基組。
分析PB17311結合的CD137抗原的潛在非線性抗原決定基需要知道CD137的三維蛋白質結構。CD137是25.4kDa(胞外17.3kDa)的相對小的蛋白質，沒有清楚的特殊區域。然而，對於CD137已經描述了定義的「重複區」或富含半胱胺酸域(cysteine-rich domain，CRD)。文獻中關於CD137的蛋白質結構的報導是有限的。Yi等人(2014)已描述CD137的配位體結合位位於CD137的區域(region)3中，基於與截短的表達構築體的結合研究。儘管CD137沒有晶體結構，但根據TNFR1發布了同源模型(Won等人，2010)。TNFR1是腫瘤壞死因子受體超家族中的膜結合蛋白質，其中CD137也是成員。涉及人類/小鼠CD137嵌合構築體的區域/交換實驗的結果建議，抗-CD137Fab臂(MF6797)結合至CRD1和/或2。CD137L阻斷數據亦建議MF6797抗原決定基接近於或與CD137配位體結合位重疊。
PD-L1也是31.1kDa(胞外25.2kDa)的相對小蛋白質，對其尚未有定義的特殊區域(region)或區域(domain)。然而，PD-L1的晶體結構與PD-L1的複合物一樣是已知的。
在這些實驗中，散彈槍誘變(shotgun mutagenesis)用於產生一系列突變蛋白質，其中單一殘基透過用丙胺酸殘基取代而突變。然後，在人類細胞中表達突變CD137蛋白質，允許分析複雜的蛋白質或僅能在人類細胞中表達並正確折疊的蛋白質。透過螢光染色，測量與抗體的功能性結合，產生結 合圖譜和鑑定對於抗體結合重要的殘基。藉由使用Davidson和Doranz(2014)中描述的方法的Integral Molecular，進行散彈槍誘變實驗和分析。
首先，基於攜帶野生型CD137 cDNA的質體，為目標蛋白質產生突變庫(Xxx突變為Ala，Ala突變為Ser)。這產生了CD137的163個突變cDNA選殖體，對所有這些都定序以驗證突變。因此，將這些突變cDNA選殖體與野生型(，wild-type，WT)構築體一起轉染到HEK-293T細胞中用於比較。隨後，透過流式細胞術，分析表達每個突變選殖體的HEK-293T細胞，由此將每種突變蛋白質蛋與PB17311的結合和對CD137特異性的對照抗體(小鼠IgG1，BD Biosciences目錄編號555955)進行比較。此對照抗體不與PB17311競爭結合。針對人或小鼠IgG的螢光標記的二級抗體用於偵測PB17311或對照抗體的結合。
為了鑑定具有高CD137表達但與PB17311低結合的選殖體，我們比較了PB17311的結合與相關對照抗體的結合(參見第39A圖)。對於每個選殖體，將平均結合值繪製為藉由對照抗體結合測量的選殖體的平均表達值的函數。為了鑑定初步的關鍵選殖體，我們應用了大於70%的WT與對照抗體的結合和小於20%的WT對PB17311抗體的反應性的閾值。使用這些閾值鑑定的初步關鍵選殖體以黑色圓圈顯示於第39A圖中。
結果指出CD137中對PB17311結合重要的殘基是Arg66、Gly70和Phe72。Val71也似乎參與PB17311的結合(見 第39B圖)。雖然基於結合閾值，Cys133起初被鑑定為的關鍵殘基，但它與其他關鍵殘基相對較遠，且由於雙硫鍵的破壞，半胱胺酸突變傾向於引起蛋白質構型的輕微畸變。因此，Cys133不被認為是PB17311抗原決定基的一部分。在Arg66、Gly70和Phe72突變的蛋白質與PB17311的低反應性表明這些殘基是PB17311結合的主要有力貢獻者，其中Val71的貢獻較小。
實施例16
在異種移植小鼠模型中，CD137xPD-L1雙特異性抗體的抗腫瘤功效
為了測試選殖體中的一個示例性選殖體，CD137xPD-L1雙特異性抗體PB17311，的抗腫瘤功效，在實驗動物中且將其與參考抗體比較，將抗體PB17311投予至攜帶異種移植腫瘤的小鼠。所選的小鼠模型是在注射人類癌細胞系之前，藉由用人類週邊血液單核細胞(PBMC)植入而使免疫受損的小鼠人源化的模型。然後，在3週的期間，評估皮下固體腫瘤的生長。
CD137xPD-L1雙特異性抗體的抗CD137和抗PD-L1 Fab與人類和食蟹獼猴的同源基因交叉反應(cross-react)，但不與小鼠蛋白質交叉反應。選擇所述模型是因為它允許在人源化系統中測試抗體的體內活性，由此抗體的抗腫瘤反應由人類T細胞而非小鼠T細胞所媒介。這類型的模型已成功地用於評定各種免疫調節目標療法(immunomodulatory targeted therapy)，其包括幾種抗CD137單 株抗體。例如，已在攜帶HT29細胞的經PBMC人源化Rag2 -/-IL2Rg剔除小鼠中評估了20H4.9的功效(Sanmamed等人，2015)，已在用PBMC和人類腫瘤細胞PC3、LoVo或WM-266(Fisher等人，2012)的混合物異種移植的SCID-米色小鼠中，評估了Utomilumab功效。在這兩種模型中，與對照經IgG處理的動物相比，抗CD137單株抗體顯示顯著的經T細胞媒介的抗腫瘤活性。
在本文使用的異種移植小鼠模型中，注射到經PBMC人源化的小鼠中的癌細胞是RKO細胞，即表達相對大量的PD-L1但不表達CD137的公認的人類大腸癌細胞系。注射至免疫受損小鼠中的PBMC早在植入後5天即顯示表達CD137，且持續至少到第22天(Sanmamed等人，2015)，指出帶有RKO細胞的經PBMC人源化的小鼠是理想用於，以「反式」構型(RKO細胞上的PD-L1和T細胞上的CD137)表達CD137xPD-L1雙特異性抗體的目標的模型。此外，PBMC捐贈者在植入後至少40天不會引起移植物抗宿主病(graft versus host disease)。因此，此模型對於評定免疫調節劑的功效是強有力的。
方法
透過尾靜脈注射，將3×107個人類PBMC植入9週齡的母NOD SCID Gamma(NSG)小鼠。7天後，每隻測試小鼠在右側接受在0.1mL的50%基質膠(Matrigel)中之5×106個RKO腫瘤細胞的皮下注射。當平均腫瘤體積接近50至80mm3的目標範圍時，透過卡尺(caliper)監測腫瘤生長。腫瘤 細胞植入4天後，被指定為研究的第1天，將具有個別腫瘤體積40至63mm3的動物分成4組，每組8只動物。
在第1、4、8、11、15和18天，各組中的腫瘤攜帶動物以在100μL的PBS中100μg的劑量接受六次抗體的腹腔注射(intraperitoneal injection)。這四個不同的組接受負對照(IgG)、或基準抗體20H4.9(抗CD137)或YW243.55.S70(抗PD-L1)、或PB17311(抗CD137xPD-L1)。使用卡尺測量腫瘤體積一周三次，直至於第19天評估腫瘤生長抑制時研究結束。
腫瘤生長抑制(tumor growth inhibition，TGI)被定義為治療和對照小鼠的第19天中位腫瘤體積(median tumor volume)之間的百分比差異，其中使用曼-惠特尼檢定(Mann-Whitney test)，組間差異在P0.05時被認為是統計上顯著的。透過體重測量和頻繁觀察治療相關不良事件的臨床徵兆，來評估治療耐受性。
第40圖提供按組分組的腫瘤體積分佈的盒和鬚狀圖。在第19天，在IgG對照中的小鼠的中位腫瘤體積(MTV)為517mm3，其中個別腫瘤體積範圍為429至807mm3。在這三組治療組中，PB17311(其中MTV為264mm3，49% TGI)與YW243.55.S70(其中MTV為283mm3，45% TGI)和20H4.9(其中MTV為339mm3和34%TGI)同樣有效。所有治療均導致MTV顯著低於對照組中的MTV(對於20H4.9，P<0.05；對於PB17311和YW243.55.S70，P<0.001)。接受20H4.9的一隻動物在第8天死亡；屍檢揭示了粉紅色的肺和斑駁的肝臟。此組中的動物亦經歷最大的平均體重損失(第15天最低點為-8.0%)。 除此之外，治療耐受性良好。
總之，CD137xPD-L1雙特異性抗體PB17311作為用於以人類PBMC移植的NSG小鼠中的人類RKO大腸癌的治療，提供統計學上顯著的存活益處。與20H4.9相比，用PB17311的治療結果更好，副作用更少。
實施例17
sCD137干擾以CD137為目標的抗體的催動活性
與二價CD137抗體相比，可溶性CD137對雙特異性CD137xPD-L1抗體的激動活性的干擾較小
CD137表達受到自細胞表面脫落的抗原的調控。脫落的抗原(shed CD137，sCD137)於血液以及胞外空間中發現，因此可以作為用於清除以CD137為目標的抗體的競爭槽(competing sink)。
研究已顯示sCD137從表達大量的CD137的免疫細胞，例如調節性T細胞(Ridgway等人，2014)中脫落，且sCD137和sCD137L均由大腸癌病人的癌細胞產生(Dimberg等人，2006)。此外，腫瘤細胞系暴露於缺氧條件，促進CD137表達，最主要的形式是可溶性變異體(Labiano等人，2016)。儘管健康捐贈者中sCD137的平均血清量範圍為0.02至0.2ng/ml，但已知各種疾病狀態中的量較高，範圍為0.2至3.6ng/ml(Michel等人，1998；Shao等人，2012)。sCD137似乎調節活化的T細胞：當脫落至腫瘤微環境中時，其減緩免疫系統的活性，從而媒介免疫逃逸(immune escape)。據認為sCD137與膜結合的CD137競爭結合CD137L，從而阻斷透過在T細胞 上表達的CD137的訊息傳遞。
有鑑於所述機制，確定sCD137是否會影響雙特異性CD137xPD-L1抗體PB17311和參考抗體體外活化人初代T細胞的能力。在過量sCD137不存在或存在的情況下，在Jurkat報導者/CHO-PD-L1轉活化測定中，測量此類活化。在此測定中，Jurkat報導者T細胞系表達CD137，且報導者基因被對CD137有特異性的抗體活化。將T細胞與過度表達PD-L1的CHO細胞共培養，所述過度表達PD-L1的CHO細胞模擬表達PD-L1的腫瘤細胞且是由雙特異性CD137xPD-L1抗體活化T細胞所必需的。
為此，用2μg/mL的在PBS中之抗CD3抗體OKT-3(eBioscience，目錄編號16-0037-85)塗佈平底96孔盤(Costar，目錄編號3917)隔夜。隔天，將Jurkat CD137-NFkBluc報導者細胞解凍並用含有10%熱失活的胎牛血清(測定培養基)的DMEM/F12培養基洗滌。細胞以2×106個細胞/ml的密度重新懸浮。在加入25μL的測試抗體(終濃度200ng/mL)之前，用PBS洗滌預塗佈的96孔盤兩次，接著加入25μL的以20μg/mL(終濃度)開始的五步三倍稀釋sCD137(R & D，目錄編號9220-4B)的混合。然後，加入25μL的Jurkat NFκBluc(50000個細胞/孔，2×106個細胞/ml)，接著加入25μL的CHO-K1/CHO.huPD-L1細胞(12500個細胞/孔，5×105個細胞/ml)。隔天，將盤子平衡至室溫，且每孔加入100μl的Bright-Glo(室溫)(一次最多4盤)，接著在室溫培養5分鐘。在Biotek Synergy 2多模式微盤讀取儀(發光模式)上測量盤子。就螢光素 酶活性而言，以不加入重組蛋白質所獲得的百分比表示活化。
結果顯示於第41圖中，且指出高濃度的可溶性CD137確實可干擾兩種測試抗體的催動活性。然而，重要的是，sCD137競爭似乎對抗CD137參考抗體(選殖體20H4.9)比對雙特異性CD137xPD-L1抗體PB17311有更大的影響。由此得出結論，與基準抗體20H4.9相比，PB17311的體內效果對免疫抑制機制較不敏感。
表格
表2描述基於FACS輪廓、區域、作為二價抗體的催動活性和CD137阻斷活性的分類的CD137 Fab臂組。
表5。OX40選殖體的配位體阻斷能力和區域特異性。在兩個分開的實驗中確定阻斷能力。NA=未分析；ND=未確定(由於與大鼠和人OX40結合，因此不能確定區域特異
表6
MF，獨特ID Fab；CDR3，CDR3的序列；VH生殖，衍生的VH；Bin，特異性分組至分類(P1306-S33)；區域，使用小鼠人交換區域的構築體，將抗體映射到的CD137域(1或2意指抗體不能清晰地映射到兩個區域之一)；催動二價，二價抗體活化Jurkat-NFκB-luc-CD137的能力；% CD137L阻斷，Fab臂阻斷與CD137交互作用的能力；報導者，來自報導 者測定的數據；T細胞，來自T細胞測定的數據；PD-L1 NB，CD137 Fab與PD-L1非阻斷性Fab臂組合；PD-L1 B，CD137 Fab與PD-L1阻斷Fab臂組合。
參考文獻
Akbay, E. A., Koyama, S., Carretero, J., Altabef, A., Tchaicha, J. H., Christensen, C. L., Mikse, O. R., Cherniack, A. D., Beauchamp, E. M., Pugh, T. J., et al. (2013). Activation of the PD-1 Pathway Contributes to Immune Escape in EGFR-Driven Lung Tumors Cancer Discov 3, 1355-1363
Arch, R. H., & Thompson, C. B. (1998). 4-1BB and Ox40 are members of a tumor necrosis factor (TNF)-nerve growth factor receptor subfamily that bind TNF receptor-associated factors and activate nuclear factor kappaB. Mol Cell Biol, 18(1), 558-65. http://doi org/10.1016/j.bulcan.2015.03.022
Bernstein, M. B., Garnett, C. T., Zhang, H., Velcich, A., Wattenberg, M. M., Gameiro, S. R., Kalnicki, S., Hodge, J. W., and Guha, C. (2014). Radiation-induced modulation of costimulatory and coinhibitory T-cell signaling molecules on human prostate carcinoma cells promotes productive antitumor immune interactions. Cancer Biother Radiopharm 29, 153-161
Bertram et al. Role of T cell costimulation in anti-viral immunity. Seminars in Immunology, 16(3), 2004
Boland, J. M., Kwon, E. D., Harrington, S. M., Wampfler, J. A., Tang, H., Yang, P., and Aubry, M. C. (2013). Tumor B7-H1 and B7-H3 expression in squamous cell carcinoma of the lung. Clin Lung Cancer 14, 157-163.
Compaan, D.M., Hymowitz, S.G. (2006). The crystal structure of the costimulatory OX40-OX40L complex. Structure 14, 1321-1330.
Davidson, E. and Doranz, B.J. (2014) A high-throughput shotgun mutagenesis approach to mapping B-cell antibody epitope. Immunology 143, 13-20.
Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G., Tamada, K., et al. (2002). Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med 8, 793-800.
Makkouk A, Chester C, Kohrt H. Rationale for anti-CD137 cancer immunotherapy. Eur J of Cancer 54 (2016): 112-119
McNamara J, Kolonias D, Pastor F, Mittler R, Chen L, Giangrande P, Sullenger B, Gilboa E. Multivalent 4-1 BB binding aptamers costimulate CD8+ T cells and inhibit tumor growth in mice.
Melero I, Hirschhorn-Cymerman D, Morales-Kastresana A, Sanmamed MF, Wolchok JD. Agonist antibodies to TNFR molecules that costimulate T and NK cells. Clin Cancer Res 2013.
Michel, J., et al., A soluble form of CD137 (ILA/4-1BB), a member of the TNF receptor family, is released by activated lymphocytes and is detectable in sera of patients with rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology, 1998. 28(1): p. 290-295.
Fisher et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunology Immunotherapy, 61, 2012.
Pollok, K. E., Kim, Y. J., Zhou, Z., Hurtado, J., Kim, K. K., Pickard, R. T., & Kwon, B. S. (1993). Inducible T cell antigen 4-1BB. Analysis of expression and function. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950), 150(3), 771-81. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7678621
Pulko V, Harris KJ, Liu X, Gibbons RM, Harrington SM, Krco CJ, Kwon ED, Dong H J. B7-H1 expressed by activated CD8 T cells is essential for their survival. Immunol. 2011.
Sanmamed et al. Nivolumab and 20H4.9 enhance antitumor activity of human T lymphocytes engrafted in Rag2-/-IL2 Rγnull immunodeficient mice. Cancer Research, 75(17), 2015.
Schwarz H. Biological activities of reverse signal transduction through CD137 ligand. J Leukoc Biol 77 (2005): 281-286
Shao, Z., et al., Admission levels of soluble CD137 are increased in patients with acute pancreatitis and are associated with subsequent complications. Experimental and Molecular Pathology, 2012. 92(1): p. 1-6.
Shao, Z., & Schwarz, H. (2011). CD137 ligand, a member of the tumor necrosis factor family, regulates immune responses via reverse signal transduction. Journal of Leukocyte Biology, 89(1), 21-29. http://doi.org/10.1189/jlb.0510315
Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., and Ribas, A. (2017). Primary, Adaptive, and Acquired Resistance to Cancer Immunotherapy. Cell 168, 707-723.
Simon, H. U. (2001). Evidence for a pro-apoptotic function of CD137 in granulocytes. Swiss Medical Weekly, 131(31-32), 455-458. http://doi.org/2001/31/smw-09668
Sznol, M., and Chen, L. (2013). Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer. Clin Cancer Res 19, 1021-1034.
Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Leibovich, B. C., and Kwon, E. D. (2005). Costimulatory molecule B7-H1 in primary and metastatic clear cell renal cell carcinoma. Cancer 104, 2084-2091.
Tumeh, P. C., Harview, C. L., Yearley, J. H., Shintaku, I. P., Taylor, E. J. M., Robert, L., Chmielowski, B., Spasic, M., Henry, G., Ciobanu, V., et al. (2014). PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature 515, 568-571.
Velcheti, V., Schalper, K. A., Carvajal, D. E., Anagnostou, V. K., Syrigos, K. N., Sznol, M., Herbst, R. S., Gettinger, S. N., Chen, L., and Rimm, D. L. (2014). Programmed death ligand-1 expression in non-small cell lung cancer. Lab Invest 94, 107-116.
Vinay, D. S., & Kwon, B. S. (2011). 4-1BB signaling beyond T cells. Cellular & Molecular Immunology, 8(4), 281-4. http://doi.org/10.1038/cmi.2010.82
Wolf B., Morgan H., Krieg J., et al. A whole blood in vitro cytokine release assay with aqueous monoclonal antibody presentation for the prediction of therapeutic protein induced cytokine release syndrome in humans. Cytokine 60:828-831, 2012.
Wölfl and Greenberg. Antigen-specific activation and cytokine-facilitated expansion of naive, human CD8+ T cells. Nature protocols 9(4), 2014
Won, E. Y., Cha, K., Byun, J. S., Kim, D. U., Shin, S., Ahn, B., ... Cho, H. S. (2010). The structure of the trimer of human 4-1BB ligand is unique among members of the tumor necrosis factor superfamily. Journal of Biological Chemistry, 285(12), 9202-9210. https://doi.org/10.1074/jbc.M109.084442
Yi, L., Zhao, Y., Wang, X., Dai, M., Hellström, K. E., Hellström, I., & Zhang, H. (2014). Human and mouse CD137 have predominantly different binding CRDs to their respective ligands. PLoS ONE, 9(1). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086337
Zhang, F., Wei, H., Wang, X., Bai, Y., Wang, P., Wu, J., Jiang, X., Wang, Y., Cai, H., Xu, T., Zhou, A. (2017). Structural basis of a novel PD-L1 nanobody for immune checkpoint blockade. Cell Discovery 3, 17004.
Zhao et al. Targeting 4-1BB (CD137) to enhance CD8 T cell responses with poxviruses and viral antigens. Frontiers in Immunology 3, 2012
Zhou et al. Antibodies Against Immune Checkpoint Molecules Restore Functions of Tumor-infiltrating T cells in Hepatocellular Carcinomas. Gastroenterology 2017 doi: 10.1053/j.gastro.2017.06.017.

Claims (44)

  1. 一種刺激在一細胞上的TNF受體超家族的一成員的活性的方法，包括提供一第一細胞及一第二細胞，其中該第一細胞具有該成員於細胞膜上且該第二細胞具有一第二膜蛋白質於細胞膜上，該方法包括以包含兩個可變域的一雙特異性抗體接觸該些細胞，其中一可變域包括能結合該成員的一胞外部分之一第一抗原結合位且另一可變域包括能結合該第二膜蛋白質的一胞外部分之一第二抗原結合位，藉此刺激在該第一細胞上的該成員的活性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第二膜蛋白質不是TNF受體超家族的一成員。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該雙特異性抗體包括兩個抗原結合位。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中的任一項所述之方法，其中該雙特異性抗體的該些抗原結合位由能結合TNF受體超家族的該成員的一胞外部分的一免疫球蛋白質可變域和能結合該第二膜蛋的一免疫球蛋白質可變域所組成。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中的任一項所述之方法，其中該雙特異性抗體是一全長抗體。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中的任一項所述之方法，其中該雙特異性抗體是一IgG。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中的任一項所述之方法，其中該第一細胞不會在細胞膜上顯著地表達該第二膜蛋白質。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中的任一項所述之方法，其中 該第二膜蛋白質是存在於細胞膜上的一或更多區塊(zone)中的一膜蛋白質
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該區塊為在細胞膜上、較佳地在一免疫突觸上，的一分子集團(cluster)、一區域(domain)、一微域(microdomain)或一隔室(compartment)。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中的任一項所述之方法，其中該第二膜蛋白質存在於細胞膜上，作為一多聚體膜蛋白質的一部分，該多聚體膜蛋白質包括二或更多個該第二膜蛋白質的範例。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中的任一項所述之方法，其中該第二膜蛋白質存在於細胞膜上，作為一同質二聚體或一同質三聚體的一部分。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中的任一項所述之方法，其中該第二膜蛋白質為B7家族的一成員。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該第二膜蛋白質為PD-L1或PD-L2，較佳地為PD-L1。
  14. 如申請專利範圍第1至13項中的任一項所述之方法，其中結合TNF受體超家族的該成員的該可變域阻斷一配位體結合至該成員。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中的任一項所述之方法，其中結合TNF受體超家族的該成員的一胞外部分之該可變域被定義為，當處於包括結合TNF受體超家族的該成員的該些可變域中的兩個的一二價單特異性抗體型式時，不會刺激 在一細胞上的該TNF受體超家族成員的活性的一可變域。
  16. 如申請專利範圍第1至15項中的任一項所述之方法，更包括提供另一雙特異性抗體，其包括能結合TNF受體超家族的該成員的一胞外部分之一抗原結合位以及可結合該第二膜蛋白質的一胞外部分之一抗原結合位，其中該第一和第二雙特異性抗體結合：-在該第一膜蛋白質上的不同抗原決定基；-在該第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；或-在該第一膜蛋白質上的不同抗原決定基及該第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；該方法更包括將該第一和該第二細胞與該第一和該第二雙特異性抗體一起培養，藉此刺激在該第一細胞上的TNF受體超家族的該成員的活性。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該第一和該第二雙特異性抗體各包括能結合TNF受體超家族的該成員之一抗原結合位。
  18. 如申請專利範圍第16或17項所述之方法，其中能結合該第二膜蛋白質的該第一和該第二雙特異性抗體之該些抗原結合位結合在該膜第二膜蛋白質的該胞外部分上之不同抗原決定基。
  19. 如申請專利範圍第16至18項中的任一項所述之方法，其中在該第二膜蛋白質的該胞外部分上之該些不同的抗原決定基為非競爭型抗原決定基。
  20. 如申請專利範圍第1至19項中的任一項所述之方法，其中 該TNF受體超家族成員為CD137或OX40。
  21. 一種雙特異性抗體，包括能結合CD137的一胞外部分之一抗原結合位以及能結合一第二膜蛋白質的一胞外部分之一抗原結合位。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之雙特異性抗體，其中該第二膜蛋白質不是TNF受體超家族的一成員。
  23. 如申請專利範圍第21或22項所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包括兩個抗原結合位。
  24. 如申請專利範圍第21至23項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體的該些抗原結合位由能結合TNF受體超家族的該成員的一胞外部分之一免疫球蛋白質可變域及能結合該第二膜蛋白質之一免疫球蛋白質可變域所組成。
  25. 如申請專利範圍第21至24項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體為一全長抗體。
  26. 如申請專利範圍第21至25項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體為一IgG。
  27. 如申請專利範圍第21至26項中的任一項所述之雙特異性抗體，包括可結合該CD137的一抗原結合位。
  28. 如申請專利範圍第21至27項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中該第二膜蛋白質不是由一T細胞以一顯著程度表達。
  29. 如申請專利範圍第21至28項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中該第二膜蛋白質表達於一抗原呈現細胞、一腫 瘤細胞、一病毒感染細胞或一寄生蟲感染細胞上。
  30. 如申請專利範圍第21至29項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中該第二膜蛋白質為存在於細胞膜上的一或多個區塊中之一膜蛋白質。
  31. 如申請專利範圍第30項所述之雙特異性抗體，其中該區塊為在細胞膜上、較佳地在一免疫突觸上的一分子集團、一區域、一微域或一隔室。
  32. 如申請專利範圍第21至31項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中該第二膜蛋白質存在於細胞膜上，作為一多聚體膜蛋白質的一部分，該多聚體膜蛋白質包括該些第二膜蛋白質中的兩者或更多。
  33. 如申請專利範圍第21至32項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中該第二膜蛋白質存在於細胞膜上，作為一同質二聚體或一同質三聚體的一部分。
  34. 如申請專利範圍第21至33項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中該第二膜蛋白質為B7家族的一成員。
  35. 如申請專利範圍第21至34項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中該第二膜蛋白質為PD-L1或PD-L2，較佳地為PD-L1。
  36. 如申請專利範圍第21至35項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中結合CD137的該可變域阻斷一配位體結合至該CD137。
  37. 如申請專利範圍第21至36項中的任一項所述之雙特異性抗體，其中結合CD137的一胞外部分之該可變域被定義為， 當處於包括結合CD137的該些可變域中的兩個之一二價單特異性抗體型式時，不會刺激在一細胞上的CD137的活性之一可變域。
  38. 一種部分的組合物或套組，包括根據申請專利範圍第21至37項中任一項所述之一或多個雙特異性抗體。
  39. 一種部分的組合物或套組，包括申請專利範圍第21至37項中任一項所述之該些雙特異性抗體中的兩個或更多，其中能結合一第一及一第二雙特異性抗體的CD137或OX40之該些抗原結合位結合在該CD137或OX40上的不同抗原決定基。
  40. 一種刺激在一細胞上的CD137的活性之方法，包括提供一第一細胞和一第二細胞，其中該第一細胞具有該CD137(第一膜蛋白質)在細胞膜上，且該第二細胞具有一第二膜蛋白質在細胞膜上，該方法包括以包含兩個可變域的一雙特異性抗體(第一雙特異性抗體)接觸該些細胞，其中一個可變域包括能結合該第一膜蛋白質的一胞外部分之一第一抗原結合位且另一個可變域包括能結合該第二膜蛋白質的一胞外部分之一第二抗原結合位，藉此刺激在該第一細胞上的該成員的活性。
  41. 如申請專利範圍第40項所述之方法，更包括提供另一雙特異性抗體(第二雙特異性抗體)，其包括包含可結合該第一膜蛋白質的一胞外部分之一抗原結合位一可變域；以及包含可結合該第二膜蛋白質的一胞外部分之一抗原結合位之一可變域，其中該第一和第二雙特異性抗體結合： -在該第一膜蛋白質上的不同抗原決定基；-在該第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；或-在該第一膜蛋白質上的不同抗原決定基及該第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；該方法更包括將該第一和該第二細胞與該第一和該第二雙特異性抗體一起培養，藉此刺激在該第一細胞上的CD137的活性。
  42. 如申請專利範圍第40或41項所述之方法，其中該第二膜蛋白質為B7家族的一成員。
  43. 一種抗體或其功能部、衍生物及/或類似物，其可結合CD137和PD-L1。
  44. 一種如申請專利範圍第43項所述之抗體或功能部分或衍生物或類似物，其為一雙特異性抗體。
TW107110709A 2016-09-23 2018-03-28 調節細胞表達的生物活性之結合分子 TW201920653A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16190499 2016-09-23
PCT/NL2017/050634 WO2018056821A1 (en) 2016-09-23 2017-09-22 Binding molecules that modulate a biological activity expressed by a cell
??PCT/NL2017/050634 2017-09-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201920653A true TW201920653A (zh) 2019-06-01

Family

ID=57132987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107110709A TW201920653A (zh) 2016-09-23 2018-03-28 調節細胞表達的生物活性之結合分子

Country Status (17)

Country Link
US (1) US11685786B2 (zh)
EP (2) EP3515951B1 (zh)
JP (2) JP7305538B2 (zh)
KR (1) KR20190065318A (zh)
CN (2) CN109983033B (zh)
AU (2) AU2017332452B2 (zh)
BR (1) BR112019005895A2 (zh)
CA (1) CA3038020A1 (zh)
EA (1) EA201990578A1 (zh)
IL (2) IL311603A (zh)
MA (1) MA46278A (zh)
MX (1) MX2019003241A (zh)
NZ (1) NZ751956A (zh)
PH (1) PH12019550044A1 (zh)
TW (1) TW201920653A (zh)
UA (1) UA127449C2 (zh)
WO (1) WO2018056821A1 (zh)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10202001779UA (en) 2015-01-20 2020-04-29 Igm Biosciences Inc Tumor necrosis factor (tnf) superfamily receptor binding molecules and uses thereof
CN109563171B (zh) 2016-06-20 2023-09-19 F-星治疗有限公司 结合pd-l1和lag-3的结合分子
AU2017281157A1 (en) 2016-06-20 2019-01-31 F-Star Therapeutics Limited LAG -3 binding members
MA45672A (fr) 2016-07-14 2019-05-22 Biontech Ag Anticorps multispécifiques dirigés contre cd40 et cd137
GB201612520D0 (en) 2016-07-19 2016-08-31 F-Star Beta Ltd Binding molecules
BR112019005895A2 (pt) 2016-09-23 2019-06-11 Merus N.V. moléculas de ligação que modulam uma atividade biológica expressa por uma célula
US11459394B2 (en) 2017-02-24 2022-10-04 Macrogenics, Inc. Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof
MX2019012223A (es) 2017-04-13 2019-12-09 Agenus Inc Anticuerpos anti-cd137 y metodos de uso de los mismos.
EA202090005A1 (ru) * 2017-07-06 2020-06-18 Мерус Н.В. Антитела, модулирующие биологическую активность, проявляемую клеткой
AU2018309339A1 (en) 2017-08-04 2020-02-20 BioNTech SE Binding agents binding to PD-L1 and CD137 and use thereof
CN111741976A (zh) 2017-12-19 2020-10-02 F星贝塔有限公司 包括pd-l1抗原结合位点的fc结合片段
WO2019190327A2 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Merus N.V. Multivalent antibody
WO2019191704A1 (en) * 2018-03-30 2019-10-03 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting cd22 and uses thereof
CN110869390B (zh) 2018-04-09 2021-05-11 上海原能细胞医学技术有限公司 抗pd-l1抗体及其用途
JP7332194B2 (ja) * 2018-06-29 2023-08-23 スーチョウ スマートヌクライド バイオファーマシューティカル カンパニー リミテッド Ｐｄ－ｌ１結合ポリペプチドおよびそれらの使用
KR20210030956A (ko) 2018-07-12 2021-03-18 에프-스타 베타 리미티드 Pd-l1 및 cd137에 결합하는 항체 분자
GB201811404D0 (en) * 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd Anti-CD137 Antibodies
EP3636320A1 (en) * 2018-10-09 2020-04-15 Numab Therapeutics AG Antibodies targeting cd137 and methods of use thereof
KR20210076907A (ko) * 2018-10-09 2021-06-24 누맙 세러퓨틱스 아게 Cd137을 표적화하는 항체 및 이의 사용 방법
MA54139A (fr) * 2018-11-06 2021-09-15 BioNTech SE Formulation d'anticorps
AU2020276500A1 (en) * 2019-05-10 2021-12-16 Lyvgen Biopharma Holdings Limited Humanized anti-CD137 antibodies and uses thereof
CA3144617A1 (en) * 2019-06-26 2020-12-30 Ap Biosciences, Inc. Antibodies for t-cell activation
US11466086B2 (en) * 2019-10-11 2022-10-11 Nanjing Leads Biolabs Co., Ltd. Antibodies binding 4-1BB and uses thereof
JP2023513896A (ja) * 2020-02-04 2023-04-04 ジェンマブ エー／エス 療法において使用するための抗体
EP4106813A4 (en) * 2020-02-21 2024-03-27 Macrogenics Inc CD137-BINDING MOLECULES AND USES THEREOF
WO2021222074A1 (en) * 2020-04-28 2021-11-04 Ohio University Methods for extending the shelf-life of stored donor blood and/or red blood cells and treated red blood cell compositions produced thereby
CA3175227A1 (en) 2020-05-21 2021-11-25 Cornelis De Kruif Methods and means for the production of ig-like molecules
EP4197545A1 (en) * 2020-07-31 2023-06-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition including cell expressing chimeric receptor
CN113416249B (zh) * 2020-10-21 2023-04-07 北京智仁美博生物科技有限公司 针对破伤风毒素的组合物
EP4262853A1 (en) 2020-12-16 2023-10-25 Merus N.V. Multispecific antibodies for the treatment of cancer
EP4314061A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Merus N.V. Novel multispecific antibodies
WO2023146394A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Merus N.V. Combination therapy for the treatment of cancer
US20230416396A1 (en) * 2022-05-18 2023-12-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen binding molecules that bind cd38 and 4-1bb, and uses thereof

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
CN1371416B (zh) 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
BR0108001A (pt) * 2000-02-01 2004-01-06 Tanox Inc Moléculas ativadoras de apc com ligação para cd-40
ES2368733T3 (es) 2002-07-18 2011-11-21 Merus B.V. Producción recombinante de mezclas de anticuerpos.
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
RU2007135216A (ru) * 2005-02-23 2009-03-27 Мерримак Фармасьютикалз, Инк. (Us) Биспецифические связывающие агенты для модулирования биологической активности
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
CA2721093A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
RU2731084C2 (ru) 2008-06-27 2020-08-28 Мерюс Н.В. Продуцирующие антитела млекопитающие, не являющиеся человеком
HUE034832T2 (hu) 2008-12-09 2021-12-28 Hoffmann La Roche Anti-PD-L1 antitestek és alkalmazásuk T-sejt-funkció fokozására
KR20130080871A (ko) 2009-03-20 2013-07-15 제넨테크, 인크. 이중특이적 항-ｈｅｒ 항체
WO2011161244A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Vaccibody As Homodimeric protein constructs
PL2614082T3 (pl) 2010-09-09 2019-02-28 Pfizer Inc. Cząsteczki wiążące 4-1BB
KR102382304B1 (ko) 2012-04-20 2022-04-04 메뤼스 엔.페. Ig-유사 분자의 제조방법 및 제조수단
WO2014116846A2 (en) * 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
JP6361039B2 (ja) 2013-04-03 2018-07-25 アイビーシー ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド 疾患に対する免疫反応を誘導するための併用療法
CN105873953A (zh) * 2013-11-04 2016-08-17 格兰马克药品股份有限公司 重靶向t细胞的异源二聚免疫球蛋白的产生
KR20160099092A (ko) 2013-12-17 2016-08-19 제넨테크, 인크. Ox40 결합 효능제 및 pd-1 축 결합 길항제를 포함하는 조합 요법
ES2783026T3 (es) 2014-02-04 2020-09-16 Pfizer Combinación de un antagonista de PD-1 y un agonista de 4-1BB para el tratamiento de cáncer
EP3130606B1 (en) 2014-04-07 2021-10-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Immunoactivating bispecific antibodies
US20150307620A1 (en) * 2014-04-16 2015-10-29 University Of Connecticut Linked immunotherapeutic agonists that costimulate multiple pathways
SG10202003171TA (en) * 2015-01-08 2020-05-28 BioNTech SE Agonistic tnf receptor binding agents
GB201500319D0 (en) * 2015-01-09 2015-02-25 Agency Science Tech & Res Anti-PD-L1 antibodies
BR112017015136A2 (pt) * 2015-01-14 2018-01-30 Compass Therapeutics Llc polipeptídeo de construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, conjugado, composição farmacêutica, método para tratar um indivíduo com câncer, método para inibir ou reduzir o crescimento de câncer, composição, célula, método de fazer um polipeptídeo de construto de ligação ao antígeno imunomodulador multiespecífico, vetor ou conjunto de vetores e kit
US20180044429A1 (en) * 2015-03-09 2018-02-15 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
WO2016164480A1 (en) * 2015-04-07 2016-10-13 Genentech, Inc. Antigen binding complex having agonistic activity and methods of use
EP3988577A1 (en) * 2015-05-21 2022-04-27 Alligator Bioscience AB Anti-cd137 antibodies
CA2987410A1 (en) * 2015-05-29 2016-12-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against ox40 and uses thereof
WO2016207273A2 (en) * 2015-06-23 2016-12-29 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
CN115746143A (zh) 2015-10-02 2023-03-07 豪夫迈·罗氏有限公司 对共刺激性tnf受体特异性的双特异性抗体
PE20181349A1 (es) 2015-10-07 2018-08-22 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecificos con tetravalencia para un receptor de fnt coestimulador
US11447557B2 (en) * 2015-12-02 2022-09-20 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
CN108883153A (zh) 2016-01-11 2018-11-23 印希比股份有限公司 多价和多特异性ox40结合融合蛋白
IL260530B2 (en) 2016-01-11 2024-01-01 Inhibrx Inc Multispecific and multivalent 41BB-binding fusion proteins, preparations containing them and their uses
WO2017182672A1 (en) * 2016-04-22 2017-10-26 Alligator Bioscience Ab Novel bispecific polypeptides against cd137
AR108377A1 (es) * 2016-05-06 2018-08-15 Medimmune Llc Proteínas de unión biespecíficas y sus usos
EP3464367B1 (en) 2016-05-27 2020-09-09 AbbVie Biotherapeutics Inc. Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen
WO2018045110A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
BR112019005895A2 (pt) 2016-09-23 2019-06-11 Merus N.V. moléculas de ligação que modulam uma atividade biológica expressa por uma célula
CN110305210B (zh) 2018-03-27 2023-02-28 信达生物制药(苏州)有限公司 新型抗体分子、其制备方法及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP3515951B1 (en) 2024-02-28
AU2017332452B2 (en) 2021-01-07
EA201990578A1 (ru) 2019-10-31
WO2018056821A1 (en) 2018-03-29
JP2019537429A (ja) 2019-12-26
US20200017595A1 (en) 2020-01-16
JP2023116811A (ja) 2023-08-22
KR20190065318A (ko) 2019-06-11
MX2019003241A (es) 2019-11-12
WO2018056821A8 (en) 2019-05-02
EP4342912A2 (en) 2024-03-27
AU2021202085A1 (en) 2021-04-29
CN109983033B (zh) 2023-10-31
CN109983033A (zh) 2019-07-05
NZ751956A (en) 2022-01-28
CN117510643A (zh) 2024-02-06
AU2017332452A1 (en) 2019-04-11
PH12019550044A1 (en) 2019-11-11
UA127449C2 (uk) 2023-08-30
JP7305538B2 (ja) 2023-07-10
CA3038020A1 (en) 2018-03-29
EP3515951A1 (en) 2019-07-31
US11685786B2 (en) 2023-06-27
BR112019005895A2 (pt) 2019-06-11
MA46278A (fr) 2019-07-31
EP4342912A3 (en) 2024-05-22
IL311603A (en) 2024-05-01
IL265541B1 (en) 2024-04-01
IL265541A (en) 2019-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7305538B2 (ja) 細胞によって発現される生物活性を調節する結合分子
US20240034794A1 (en) Binding molecules that modulate a biological activity expressed by a cell
US11732043B2 (en) Antibodies that modulate a biological activity expressed by a cell
CN113164626A (zh) 嵌合受体多肽及其用途
TW201920657A (zh) 藉由細胞表現之調控生物活性的抗體
KR20210044243A (ko) Ox40 결합 폴리펩티드 및 이의 용도
KR20230020421A (ko) Cd70 특이적 융합 단백질을 사용하는 tcr 재프로그래밍을 위한 조성물 및 방법
US20230265185A1 (en) Anti-cd22 single domain antibodies and therapeutic constructs
US20240209105A1 (en) Binding molecules that bind cd137 and pd-l1
CN117999344A (zh) Nkg2d嵌合抗原受体和pd1抑制剂联合治疗癌症的方法和药物