CN117999344A - Nkg2d嵌合抗原受体和pd1抑制剂联合治疗癌症的方法和药物 - Google Patents

Nkg2d嵌合抗原受体和pd1抑制剂联合治疗癌症的方法和药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了新的嵌合抗原受体以及其与PD1抑制剂的组合。本发明提供了表达所述嵌合抗原受体以及其与PD1抑制剂的组合物的表达载体和宿主细胞。本发明还提供了嵌合抗原受体及其与PD1抑制剂的组合物在治疗癌症或制备治疗癌症的药物中的用途。本发明提供的药物和方法能够有效地治疗癌症特别是骨髓瘤和实体瘤。

Description

NKG2D嵌合抗原受体和PD1抑制剂联合治疗癌症的方法和药物
本申请要求以下中国专利申请的优先权：申请日为2022年7月14日、申请号为202210823835.1、发明名称为“NKG2D嵌合抗原受体和PD1抑制剂联合治疗癌症的方法和药物”，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及免疫学和医药领域。具体的，本发明提供了新的嵌合抗原受体以及其与PD1抑制剂的组合。本发明还提供了所述新的嵌合抗原受体及其与PD1抑制剂的组合在治疗癌症或制备治疗癌症的药物中的用途。
背景技术
过继细胞转移(adoptive cell therapy,ACT)，作为免疫治疗的一种方式在治疗血液系统恶性肿瘤和恶性黑色素瘤方面已显示出显着的成绩。嵌合抗原受体T细胞(CAR T)使用基因修饰的T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，特异性地靶向肿瘤相关抗原(TAA)，在治疗B细胞恶性肿瘤的临床试验中显示出令人鼓舞的结果。
NKG2D(natural-killer group 2 member D，或NKG2D受体)，即杀伤细胞凝集素样受体亚家族K成员1，是在所有自然杀伤细胞，自然杀伤T细胞和γδ+T细胞表达的II型跨膜蛋白。在人体中，NKG2D受体主要与两种配体结合，这两种配体分别是UL16-结合蛋白(UL16-binding protein，ULBP)和MHC I型链相关蛋白A/B(MHC class I-chain-related protein，MICA/B)。在自然杀伤细胞和T细胞中，DNAX活化蛋白10(DAP10)是NKG2D受体的细胞表面衔接子。本领域已经有NKG2D受体-NKG2D配体系统用于嵌合抗原受体(CAR)治疗的应用。WO2019/192526A1公开了一种NKG2D嵌合抗原受体和DAP10的联合在治疗癌症的方法中的用途，其中的NKG2D嵌合抗原受体包括NKG2D的a.a.82-216片段；作为铰链区的IgG1重链恒定区；CD8跨膜结构域；CD28 的胞内信号传导结构域；4-1BB胞内信号传导结构域和CD3ζ的胞内信号传导结构域。
在CAR T细胞对癌症，特别是在实体瘤中存在免疫抑制微环境(TME)的负面影响。这种环境增加抑制T细胞中的抑制性受体(IR)，例如：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，T细胞免疫球蛋白结构域和含粘蛋白结构域的蛋白质3(TIM-3；也称为HAVCR2)，淋巴细胞激活基因3(LAG-3)和程序性死亡1(PD-1)。这些分子在持续激活后引起T细胞功能产生障碍和衰竭，从而导致肿瘤逃逸。免疫细胞表面的PD-1(programmed death 1，程序化死亡分子-1)会与肿瘤细胞表面产生的免疫球蛋白样的分子PD-L1(programmed cell death-Ligand 1，细胞程式死亡-配体1)或PDL-2相互结合，结合后产生分子信号降低免疫细胞(如T细胞)的活性，从而阻断了免疫细胞对肿瘤细胞的攻击。肿瘤利用这种方式将自己隐蔽起来，因此得以生存。
本领域需要更有效的用于治疗癌症的治疗方法，包括改进的过继细胞转移疗法。
发明内容
本发明发现具有NKG2D抗原受体结构的CAR和/或其辅助蛋白DAP10的CAR-T细胞，能够有效地识别具有NKG2D配体的癌症细胞，并激活肿瘤细胞特异性的抗肿瘤细胞免疫应答和杀伤相关肿瘤细胞。本发明还首次证明，本发明提供的具有NKG2D抗原受体结构的CAR和/或其辅助蛋白DAP10的CAR-T细胞，结合阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段时，能够显著增强杀伤肿瘤特别是实体瘤(包括肺癌、肝癌和骨髓瘤等)的的效果
具体的，本发明提供了一种免疫细胞，其表达：i)嵌合抗原受体(CAR)，以及ii)阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段。其中嵌合抗原受体包含：(a)抗原结合结构域，其包括NKG2D或其活性片段；(b)跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。本发明中所述嵌合抗原受体和其辅助蛋白DAP10联合使用。本发明还提供了编码表达所述嵌合抗原受体和/或DAP10以及所述阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的核酸和表达载体。本发明还提供了采用所述免疫细胞，编码表达所述嵌合抗原受体和/或DAP10以及所述阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的核酸和表达载体在治疗癌症的方法和制备治疗癌症的药物中 的用途。
在本发明的一个方面，提供了一种新的免疫细胞，其表达：
i)嵌合抗原受体(CAR)及其辅助蛋白，以及
ii)阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段。
在本发明的其中一个方面，所述CAR包含：(a)抗原结合结构域，其包括NKG2D或其活性片段，优选为NKG2D的a.a.82-216片段；(b)跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。在本发明的其中一个方面，所述CAR的辅助蛋白为DAP10。
在本发明的其中一个方面，所述嵌合抗原受体(CAR)和其辅助蛋白组合应用，例如，所述工程化免疫细胞同时表达所述CAR和所述辅助蛋白。其中，所述辅助蛋白为DAP10或其活性片段。在本发明的其中一个方面，所述DAP10具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
“NKG2D”或“NKG2D受体”，亦称“NKG2-D”、“CD314”、“KLRK1”、“杀伤细胞凝集素样受体亚家族K成员1”，是指哺乳动物特别是人的杀伤细胞激活性受体基因(其mRNA如NCBI RefSeq NM_007360)或其基因产物(如NCBI RefSeq NP_031386)或其天然存在的变体。
DAP10(membrane protein 10)是指哺乳动物特别是人的表面蛋白基因或其基因产物(如GenBank:AAG29425.1所示)。DAP10的活性包括与NKG2D形成复合体(Wu,J.等，Science 285(5428),730-732，1999)。
在本发明的其中一个方面，所述嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域包含NKG2D的活性片段。所述活性片段例如为NKG2D的a.a.82-216片段，即具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第82-216个氨基酸，其氨基酸序列如下:
在本发明的其中一个方面，所述抗原结合结构域可包含前导序列(leader peptide)。前导序列可协助蛋白在细胞膜上的表达或进出膜。本领域已知的前导序列可用于本发明的CAR。在本发明中，前导序列可以位于所述NKG2D或其活性片段的上游。在本发明的其中一种实施方案中，在所述前导序列为CD33的前导序列，其具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列。前导序列可以促进CAR在细胞表面上的表达，但是在表达的CAR中存在前导序列不是CAR发挥功能所必需的。在本发明的实施方案中，CAR在细胞表面上表达 后，前导序列可以从CAR上切除。因此，在本发明的实施方案中，CAR可以没有前导序列。
在本发明的其中一个方面，所述CAR包括跨膜结构域。本领域已知的跨膜结构域可用于本发明。跨膜结构域包括T细胞受体的α、β、或ζ、CD28,CD3ε,CD45,CD4,CD5，CD8,CD9,CD16,CD22,CD33,CD37,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137,CD154,KIRDS2,OX40,CD2,CD27,LFA-1(CD11a，CD18),ICOS(CD278),4-1BB(CD137),GITR，CD40，BAFFR,HVEM(LIGHTR),SLAMF7,NKp80(KLRF1)等的跨膜结构域。
在本发明的其中一个方面，本发明的CAR的跨膜结构域包含i)CD8和/或ii)CD28的跨膜结构域。在本发明的一个实施方式中，CAR的跨膜结构域为CD28的跨膜结构域。在本发明的其中又一个方面，本发明的CAR的跨膜结构域具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方式中，CAR的跨膜结构域为CD8的跨膜结构域。
在本发明的其中一个方面，所述CAR包括胞内信号传导结构域。包含可用于本发明的胞内信号传导结构域的实例包括来自CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137、ICOS和CD154的胞内信号传导结构域。
优选的，本发明CAR的细胞内T细胞信号传导结构域包含以下任何一种或多种的：i)CD28，ii)4-1BB，和/或iii)CD3ζ的胞内信号传导结构域。在优选的实施方案中，本发明CAR的细胞内T细胞信号传导结构域为CD28、4-1BB和CD3ζ的胞内信号传导结构域。更优选的，本发明CAR的细胞内T细胞信号传导结构域从氨基端到羧基端按顺序为CD28、4-1BB和CD3ζ。其中，CD28为T细胞共刺激中重要的T细胞标志物。4-1BB，也被称为CD137，向T细胞传送有效的共刺激信号，从而促进T淋巴细胞的分化并增强其长期存活。CD3ζ与TCR联合以产生信号并含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在本发明的其中又一个方面，所述CAR的细胞内T细胞信号传导结构域包含的CD28的胞内信号传导结构域具有例如SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在本发明的其中又一个方面，所述CAR的细胞内T细胞信号传导结构域包含的4-1BB的胞内信号传导结构域具有例如SEQ ID NO：12的氨基酸序列。在本发明的其中又一个方面，所述CAR的细胞内T细胞信号传导结构域包含的CD3ζ的胞内信号传导结构域具有例如SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在包含多个胞内信号传导结构域的CAR中，可在胞内结构域之间插入寡肽接头或多肽接头以连接各结构域。优选地，可使用长度为2-10个氨基 酸的接头。尤其是，可使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头。
在本发明的其中一种实施方案中，所述CAR包含(a)抗原结合结构域，其为NKG2D的a.a.82-216片段；(b)CD28的跨膜结构域和(c)从氨基端按顺序为CD28、4-1BB和CD3ζ的胞内信号传导结构域。
在本发明的其中一个方面，其中所述CAR中，(a)抗原结构域和(b)跨膜结构域之间还具有铰链区。铰链区也称为间隔区，其存在于CAR的跨膜域与胞外域之间。本领域已知的铰链区可用于本发明，包括由CD8a铰链、IgG1铰链或FcyRll铰链等。在本发明的其中一个方面，所述铰链区为IgG的重链恒定区序列(IgGHc)如IgG1Hc，IgG2Hc，IgG3Hc，IgG4Hc等。在本发明的其中又一个方面，(a)抗原结构域和(b)跨膜结构域之间的铰链区包含IgG1Hc或其片段或变体，其氨基酸序列例如为SEQ ID NO：6。
包括在本发明范围内的是本文描述的本发明的蛋白质的功能变体，如CAR或其中各功能片段(包括抗原结合结构域，跨膜结构域，胞内信号传导结构域，铰链区，前导序列等)的功能变体。本文使用的术语“功能变体”是指具有与亲本蛋白质，如CAR大量的或显著的序列同一性或相似性的CAR、多肽或蛋白质，所述功能变体保留了CAR变体的生物活性。功能变体涵盖，例如，本文描述的CAR(亲本CAR)的那些变体，其保留了能够以与亲本CAR类似的程度、以与亲本CAR相同的程度或以比亲本CAR更高的程度识别靶细胞。关于亲本CAR，功能变体的氨基酸序列与亲本CAR的氨基酸序列可，例如，具有至少约30％、约50％、约75％、约80％、约90％、约98％、约99％或更高的同一性。
功能变体可，例如，包含具有至少一个保守性氨基酸置换的亲本CAR的氨基酸序列。替代地或另外地，功能变体可包含具有至少一个非保守性氨基酸置换的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，优选的是不会干扰或抑制功能变体的生物活性的非保守性氨基酸置换。非保守性氨基酸置换可以增强功能变体的生物活性，使得功能变体的生物活性与亲本CAR相比有所增加。
在本发明的一个方面，在本发明提供的工程化免疫细胞中还表达ii)阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段。
“PD-1”是程序性细胞死亡蛋白质1，也被称为CD279，是PD-L1的细胞表面受体。PD-1结合两种配体PD-L1和PD-L2。PD-1是跨膜蛋白质，所述跨膜蛋白质包含胞外域，随后是跨膜区和胞内域。在本申请中，PD-1可包括全长和/或未加工的PD-1以及由细胞中的加工产生的任何中间体，以及包括PD-1变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示 例性人PD-1蛋白质的氨基酸序列可以例如在NCBI蛋白质数据库登录号NP—005009下找到。
“PD-L1”是指程序性细胞死亡配体1、也被称为CD274或B7-H1的。天然PD-L1包括两个胞外域、跨膜域和胞浆域。示例性人全长PD-L1蛋白质的氨基酸序列可以例如在NCBI蛋白质数据库登录号NP-054862下找到。“PD-L2”是指程序性细胞死亡1配体2，也被称为CD273。示例性人全长PD-L2蛋白质的氨基酸序列可以例如在NCBI蛋白质数据库登录号NP—079515下找到。
PD-1在与配体PD-L1和PD-L2接合时是激活T细胞的负免疫调节剂。PD-L1的上调是肿瘤细胞可以逃避宿主免疫系统的一种机制。通过拮抗性抗体进行的PD-1阻断可诱导通过宿主内源性免疫系统介导的抗肿瘤应答。
各种PD-1/PD-L1抑制剂或PD-1/PD-L2抑制剂都可以用于本发明。PD-1/PD-L1抑制剂是指破坏PD-1/PD-L1信号通路的试剂，包括生物大分子或化学小分子等。在一些实施方案中，抑制剂通过与PD-1和/或PD-L1结合来抑制PD-1/PD-L1信号通路。在一些实施方案中，抑制剂还与PD-L2结合。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂阻断PD-1与PD-L1和/或PD-L2结合。实施抑制剂可例如为抗体、融合蛋白或PD-1/PD-L1信号通路的小分子抑制剂。
在本发明的其中一个方面，所述ii)阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段为PD-1抗体或其活性片段，例如为PD-1抗体的单链可变片段(scFv)、Fab、F(ab′)2、Fv、Fd或dAb。
如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖包含抗原结合位点的任何多肽，而不论其是在体外或是在体内生产的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂交的、突变的以及移植的抗体。在本文中，术语“抗体”也包括抗体片段如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb，以及保留抗体活性(即抗原结合功能如特异性结合PD-1能力)的其它抗体片段。
如本文所用，“抗体片段”是指(i)单价抗体衍生物和单特异性抗体衍生物，所述单价抗体衍生物和单特异性抗体衍生物包括抗体的可变重链和/或轻链或功能片段并且缺少Fc部分；以及(ii)BiTE(串联scFv)、DART、双抗体和单链双抗体(scDB)。因此，抗体片段是例如选自由以下组成的组：Fab、 Fab'、scFab、scFv、Fv片段、纳米抗体、VHH、dAb、最小识别单位、单链双抗体(scDb)、BiTE以及DART。所述抗体片段具有低于60kDa的分子量。
不同类型抗体的亚基结构和三维构象是本领域众所周知的。简言之，每条轻链由N-末端可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)组成。每条重链由N-末端可变结构域(VH)、三或四个恒定结构域(CH)、以及铰链区组成。最接近于VH的CH结构域被命名为CH1。VH和VL结构域由四个具有相对保守序列的区域组成，称为构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)，它们构成三个高变序列区域的支架，所述高变序列区域称为互补决定区(CDR)。CDR含有大多数负责与抗原特异性相互作用的残基。三个CDR被称为CDR1、CDR2和CDR3。重链上的CDR组分被称为H1、H2和H 3，而轻链上的CDR组分被相应地称为L1、L2和L3。CDR3，并且特别是H3，是抗原结合结构域内分子多样性的最大来源。例如，H3可短至2个氨基酸残基或者多于26个。
Fab片段(抗原结合片段)由通过恒定区之间的二硫键共价连接的VH-CH1和VL-CL结构域组成。为克服在宿主细胞中共表达时Fv中非共价连接的VH和VL结构域解离的倾向，可构建单链(sc)Fv片段(scFv)。在scFv中，柔性且足够长的多肽或者将VH的C-末端连接于VL的N-末端，或者将VL的C-末端连接于VH的N-末端。最常见地，利用15个残基的(Gly4Ser)3肽作为接头，但其它接头也是本领域公知的。
一般地，此类片段包含抗原结合结构域。抗原结合结构域一般地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，不过，它并非必需两者都包含。例如，所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域组成，但仍保留了完整抗体的一些抗原结合功能。
在一些实施方案中，抑制PD-1的抗体与PD-1结合并阻断PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合。
阻断与配体的结合是指抑制PD-1与PD-1配体(诸如PD-L1)之间的相互作用的能力。这种抑制可以通过任何机制发生，该机制包括直接干扰配体结合(例如由于与PD-1上的结合位点重叠)、和/或由改变配体亲和力的抗体诱导的PD-1的构象变化等。被称为“功能性的”抗体和抗体片段的以具有这样的性质为特征。
在一些实施方案中，抑制PD-1的抗体是识别和结合PD-1的抗体，其抑制PD-1活性。PD-1活性是指与PD-1相关的一种或多种免疫调节活性。PD-1为TcR/CD28介导的免疫应答的负调节物。
可通过本领域各种已知的方法制备或鉴定抑制PD-1的抗体或抗PD-1抗体。一般而言，例如，可利用传统的杂交瘤技术、重组DNA方法或由抗 体文库实施的噬菌体展示制备抗体。
本领域已公开的各种抑制PD-1的抗体如纳武单抗或帕博利珠单抗或PDR001等可以用于本发明。可用于本发明的示例性PD-1抗体为纳武单抗(Nivolumab)，以及纳武单抗的活性片段，如其单链可变片段(scFv)、Fab、F(ab′)2、Fv、Fd或dAb，这些片段可包括纳武单抗的重链和轻链、或重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的各种组合，并具有识别和结合PD-1的活性。纳武单抗描述于美国专利号8,008,449和Wang et al.，2014CancerImmunol Res.2(9)：846-56中。纳武单抗为完全的人IgG4(S241P)抗PD-1抗体，其选择性地阻止PD-1与配体PD-L1和PD-L2的相互作用，由此阻断抗肿瘤T细胞功能的下调。
在一些实施例中，用于本发明的示例性抗PD-1抗体为纳武单抗的单链可变片段(scFv)，其包括包括纳武单抗的重链和轻链。在一些实施例中，用于本发明的示例性纳武单抗的scFv具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列。其中重链和轻链通过GS连接序列(GSTSGGGSGGGSGGGGSS)连接。
在本发明的其中又一个方面，所述ii)阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段被分泌。例如，所述PD-1抗体或其活性片段具有信号肽。信号肽是附接到待分泌的蛋白质的N-末端的5个到30个氨基酸肽并且被附接以增加蛋白质分泌。在优选的实施例中，所述信号肽是IL-2信号肽。在一些实施例中，信号肽具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
本发明还提供了对前文所述的嵌合抗原受体(CAR)和/或其辅助蛋白如DAP10，以及阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段进行编码的核酸，以及包括这种核酸的载体。
本发明提供的核酸可包含编码前文描述的嵌合抗原受体(CAR)的前导序列、抗原结合结构域、跨膜结构域和/或细胞内T细胞信号传导结构域、铰链区等的核苷酸序列；编码前文描述的嵌合抗原受体(CAR)的辅助蛋白如DAP10或其活性片段的核苷酸序列；以及编码前文描述的阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段如其重链或轻链、其重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列；或其任意组合。
在本发明的其中一个方面，提供了分离的核酸，其包括编码前面所述的嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，所述CAR包含：(a)抗原结合结构域，其包括NKG2D或其活性片段；(b)跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域，
在本发明的其中又一个方面，其中编码所述CAR的抗原结合结构域的核苷酸序列包含编码NKG2D的活性片段，优选为编码NKG2D的a.a.82-216片段的核苷酸序列，例如其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在本发明的其中又一个方面，其中编码所述跨膜结构域的核苷酸序列包括编码CD8和/或CD28的跨膜结构域，优选为CD28的跨膜结构域的核苷酸序列，例如为SEQ ID NO：7的核苷酸序列。
在本发明的其中又一个方面，其中编码所述胞内信号传导结构域的核苷酸序列包括编码CD28，4-1BB和CD3ζ的胞内信号传导结构域中的一个或多个的核苷酸序列，优选包括编码CD28，4-1BB和CD3ζ的胞内信号传导结构域的核苷酸序列，更优选包括编码从氨基端到羧基端按顺序为CD28、4-1BB和CD3ζ的蛋白质的核酸序列；
本发明的其中又一个方面，所述编码CD28的胞内信号传导结构域的核酸具有例如SEQ ID NO：9的核苷酸序列；
本发明的其中又一个方面，所述编码4-1BB的胞内信号传导结构域具有例如SEQ ID NO：11的核苷酸序列；
本发明的其中又一个方面，所述编码CD3ζ的胞内信号传导结构域具有例如SEQ ID NO：13的核苷酸序列；
本发明的其中又一个方面，其中编码所述CAR的胞内信号传导结构域的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：20的核苷酸序列，其包括编码CD28，4-1BB和CD3ζ的胞内信号传导结构域的核苷酸序列。
本发明的其中又一个方面，本发明提供的核酸中还包括编码(a)抗原结构域和(b)跨膜结构域之间还具有的铰链区的核苷酸序列，优选为编码IgG1Hc的核苷酸序列，其具有例如SEQ ID NO：5的核苷酸序列。
本发明的其中又一个方面，本发明提供的核酸中还包括编码位于所述NKG2D或其活性片段的上游的前导序列的核苷酸序列，优选为编码CD33的前导序列的核苷酸序列，例如为SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
本发明的其中又一个方面，本发明提供的核酸中还包括编码该嵌合抗原受体(CAR)和所述辅助蛋白的核苷酸序列，所述CAR包含：(a)抗原结合结构域，其包括NKG2D或其活性片段；(b)跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域，以及所述辅助蛋白为DAP10或其活性片段。其中，编码所述CAR的抗原结合结构域的核苷酸序列包含编码NKG2D的活性片段，例如为NKG2D的a.a.82-216片段的核苷酸序列，例如为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。以及，其中编码所述DAP10的核酸具有序列为SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
在本发明的其中又一个方面，本发明提供的核酸中还包括编码阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的核苷酸序列。本发明的其中又一个方面，所述核酸包括编码所述抗体的单链可变片段(scFv)、Fab、F(ab′)2、Fv、Fd或dAb的核苷酸序列。本发明的其中又一个方面，所述核酸包括编码所述抗体的重链和/或轻链的核苷酸序列。本发明的其中又一个方面，所述核酸包括编码所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或其CDR、或其任意组合的核苷酸序列。
在本发明的其中又一个方面，本发明提供的核酸中还包括至少一个IRES序列和/或至少一个2A序列，如P2A，T2A，E2A和F2A。其有助于将一个核酸片段上的多个ORF分隔开，单个mRNA转录物将会产生多个蛋白。在本发明的其中一个实施方式中，编码所述CAR和/或所述DAP10与所述阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的核酸片段之间具有2A序列如T2A的核苷酸序列。在本发明的其中一个实施方式中，编码所述CAR和所述DAP10的核酸片段之间具有2A序列如P2A的核苷酸序列。在本发明的其中一个实施方式中，编码所述CAR和所述DAP10的核酸片段之间具有IRES的核苷酸序列。
本发明的实施方案还提供分离或纯化的核酸，所述核酸包含与本文描述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文描述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
本发明还提供包含与本文描述的任何核酸具有至少约70％或更高，如约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的同一性的核苷酸序列的核酸。
在实施方案中，本发明的核酸可掺入至重组表达载体中。在这方面，本发明的实施方案提供包含本发明的任何核酸的重组表达载体。为了本文的目的，术语“重组表达载体”意指基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列，并且在足以在细胞内表达mRNA、蛋白质、多肽或肽的条件下载体与细胞接触时，所述基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体允许宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。
在实施方案中，本发明的重组表达载体可为任何合适的重组表达载体，并且可用于转化或转染任何合适的宿主细胞。本发明的合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或这两者的那些载体，如质粒和病毒。载体可选自pUC系列(FermentasLife Sciences,Glen Burnie,MD)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列 (Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。也可使用噬菌体载体，如λGT10、λGTl1、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λΝΜ1149。植物表达载体的实例包括pBI0l、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以为病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体。
重组表达载体可包含天然或非天然的启动子，其可操作地连接至编码CAR(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列或至与编码CAR的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子可为非病毒启动子或病毒启动子，如EF1α启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子。EF1α启动子来源于EF1a启动子来自人类靶向延长因子1α(EF1A)基因。在本发明的其中又一个方面，本发明的重组表达载体中采用EF1α启动子。
在本发明的一个方面，还提供了前述本发明的嵌合抗原受体(CAR)和辅助蛋白，以及和阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的表达载体。在本发明的其中一个方面，所述表达载体包含编码所述CAR的核酸和编码辅助蛋白的核酸，以及和阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的核酸。所述CAR包含：(a)抗原结合结构域，其包括NKG2D或其活性片段；(b)跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域，以及所述辅助蛋白为DAP10或其活性片段。在本发明的其中又一个方面，本发明的嵌合抗原受体(CAR)和辅助蛋白的表达载体可以在不同载体上具有编码所述嵌合抗原受体(CAR)或所述辅助蛋白的核酸。优选的，本发明的嵌合抗原受体(CAR)和辅助蛋白的表达载体在同一个载体上具有编码所述嵌合抗原受体(CAR)和所述辅助蛋白的核酸。
在本发明的一个方面，本发明的表达载体中还包括编码所述抗原结构域的序列的上游的转录子。
在本发明的一个方面，本发明的表达载体中编码所述抗原结构域的序列的上游具有启动子，例如为EF1α启动子。
在本发明的一个方面，本发明的表达载体中编码所述阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的核酸包括编码PD-1抗体或其活性片段，例如为PD-1抗体的单链可变片段(scFv)、Fab、F(ab′)2、Fv、Fd或dAb的核苷酸序列。
在本发明的一个方面，本发明的表达载体中还包括编码位于所述PD-1抗体或其活性片段的上游的信号肽的核苷酸序列，优选为编码IL-2的前导序列的核苷酸序列。
在本发明的一个方面，本发明的表达载体中，编码CAR和/或DAP10与所述阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的核酸片段之间还具有IRES或2A序列的核苷酸序列。例如，当所述表达载体具有编码CAR和DAP10的序列时，在编码DAP10与所述阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的核酸片段之间还具有IRES或2A序列(如T2A)的核苷酸序列，编码T2A的序列例如为如SEQ ID NO：21所示的序列。
在本发明的其中一个方面，还提供了表达前面描述的嵌合抗原受体(CAR)的宿主细胞。在本发明的其中一个方面，还提供了表达前面描述的嵌合抗原受体(CAR)和辅助蛋白的组合的宿主细胞。在本发明的其中一个方面，还提供包含前面描述的任何重组表达载体的宿主细胞。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可含有本发明重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可为真核细胞，如植物、动物、真菌或藻类，或者可为原核细胞，如细菌或原生动物。宿主细胞可为培养的细胞或原代细胞，即直接分离自生物体，如人。宿主细胞可为粘附细胞或悬浮细胞，即在悬浮液中生长的细胞。合适的宿主细胞为本领域中已知的并且包括，例如DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞可以为原核细胞，如DH5α细胞。为了产生重组CAR的目的，宿主细胞可以为哺乳动物细胞。宿主细胞可以为人细胞。宿主细胞可为任何细胞类型，可来源于任何类型的组织并且可为任何发育阶段。例如，宿主细胞可以为外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。
在本发明的其中一个方面，宿主细胞为免疫细胞，特别是工程化免疫细胞。工程化免疫细胞是指经遗传修饰以表达本文所描述的蛋白质的免疫细胞。在本发明的其中一个方面，所述细胞是自体的。在本发明的其中另一个方面，所述细胞是同种异体的。
所述免疫细胞可以是：T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、人类胚胎干细胞、造血干细胞(HSC)、或诱导性多能干细胞(iPS)。
在本发明的其中一个方面，宿主细胞为T细胞。为了本文的目的，T细胞可为任何T细胞，如培养的T细胞，例如原代T细胞或来自培养的T细胞系的T细胞，如Jurkat、SupTl等，或从哺乳动物获得的T细胞。T细胞可从许多来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或液体。T细胞也可被富集或纯化。T细胞可以为人T细胞。T细胞可以为分离自人的T细胞。T细胞可为任何类型的T细胞并且可为任何发育阶 段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞如Th 1和Th 2细胞、CD8+T细胞(如细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、初始T细胞等。T细胞可以为CD8+T细胞或CD4+T细胞。
在本发明的其中一个方面，宿主细胞是自然杀伤(NK)细胞。NK细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。
本文中，“信号序列”或“前导序列”是指在新合成蛋白的N-端处的指导其进入分泌通路的肽序列(长度为5、10、15、20、25、30个氨基酸)。
本发明的CAR物质可以配制成药物组合物。在这方面，本发明的实施方案提供包含任何CAR、功能部分、功能变体、核酸、表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)以及药学上可接受的载体的药物组合物。含有任何本发明的CAR物质的本发明药物组合物可包含多于一种的本发明CAR物质，如CAR和核酸，或两种或更多种不同的CAR。可选地，药物组合物可包含与其它药物活性剂或药物如化学治疗剂，如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱、长春新碱等组合的本发明的CAR物质。在优选的实施方案中，药物组合物包含本发明的宿主细胞或其群体。
关于药物组合物，药学上可接受的载体可为任何常规使用的那些载体并且仅受限于化学-物理考虑因素，如溶解性和与活性剂缺乏反应性以及给予途径。本文描述的药学上可接受的载体，例如媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂，为本领域技术人员熟知的并且公众容易获得。优选的是对活性剂为化学惰性的药学上可接受的载体和在使用条件下无有害的副作用或毒性的药学上可接受的载体。
为了本发明方法的目的，其中给予宿主细胞或细胞群体时，所述细胞可为与哺乳动物同种异体或哺乳动物自体的细胞。优选地，所述细胞为哺乳动物自体的。
本文提及的哺乳动物可为任何哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，如小鼠和仓鼠，以及兔形目的哺乳动物，如兔子。哺乳动物可以来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(犬)。哺乳动物可以来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)或奇蹄目，包括马科动物(马)。哺乳动物可以为灵长目、猿目或猴目(猴)或猿猴亚目(人和猿)。优选地，哺乳动物为人。
本发明的药物组合物可用于治疗或预防癌症。
本发明还提供了采用前面所述的本发明的嵌合抗原受体(CAR)和/或辅 助蛋白DAP10、或所述嵌合抗原受体(CAR)和/或辅助蛋白DAP10与阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的组合，或所述核酸或是所述表达载体，或所述工程化免疫细胞治疗或预防癌症的方法。本发明还提供了前面所述的本发明的嵌合抗原受体(CAR)和/或辅助蛋白DAP10、或所述嵌合抗原受体(CAR)和/或辅助蛋白DAP10与阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的组合，或所述核酸或是所述表达载体，或所述工程化免疫细胞在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
所述癌症可为任何癌症，包括白血病、淋巴瘤或实体瘤，例如白血病为急性淋巴细胞性白血病，急性骨髓性白血病，急性早幼粒细胞白血病，急性淋巴细胞性白血病，慢性骨髓性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，单核细胞白血病和毛细胞白血病；淋巴瘤为：霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；伯基特淋巴瘤；和小淋巴细胞性淋巴瘤；实体瘤为膀胱癌、尿道、输尿管以及肾盂的尿道上皮细胞癌、骨髓瘤包括多发性骨髓瘤、肾脏癌、乳癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、前列腺癌、神经胶母细胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、软组织肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、胰脏癌和胃癌等。在本发明的其中一个方面，所述癌症为NKG2D相关癌症。在所述癌症中，NKG2D受体-NKG2D配体系统在癌症细胞中表达和发挥生理生化作用。在这些癌症的细胞上，通常表达NKG2D配体，包括UL16-结合蛋白(UL16-binding protein，ULBP)或MHC I型链相关蛋白A/B(MHC class I-chain-related protein，MICA/B)。
在本发明的其中一个方面，所述癌症为肝癌。
在本发明的其中一个方面，所述癌症为肺癌。
在本发明的其中一个方面，所述癌症为骨髓瘤。
附图说明
图1表达载体构建图。A:pcD-NKG2D CAR-DAP10表达载体；B:pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A表达载体；CpcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B表达载体。
图2表达载体pcD-NKG2D CAR-DAP10插入片段核苷酸序列和说明示意图。
图3表达载体pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A插入片段核苷酸序列和说明示意图。
图4表达载体pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B插入片段核苷酸序列和说明示意图。
图5.CAR-T细胞以及结合PD1抗体活性片段杀灭癌细胞效果图。图5(A)-图5(E)显示对各种肿瘤细胞的杀灭效果。
图6.CAR T细胞以及结合PD1抗体活性片段与靶细胞共培养分泌IFN-γ的效果图。图6(A)-图6(C)显示在各种肿瘤细胞中共培养分泌IFN-γ的效果。
具体实施方式
实施例1实验和方法
细胞
白细胞层(buffy coat)从香港红十字会输血服务组织(Hong Kong Red Cross Blood Transfusion Service)获得。通过使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)从白细胞层中分离外周血单核细胞(PBMC)。通过使用CD3/CD28 Dynabeads(Thermo)从PBMC分离T细胞。将分离自PBMC的T细胞在由补充有5％人血清(Sigma)，2mM L-谷氨酰胺(Thermo)和50U/ml IL-2(Peprotech)的AIM-V培养基(Thermo)组成的起始培养基或由补充有5％人血清，2mM L-谷氨酰胺和300U/ml IL-2的AIM-V培养基组成的扩增培养基(expansion medium)。
所有以下细胞系来自ATCC、ECACC或中国科学院细胞库。
在补充有10％FBS(Thermo)，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素(Thermo)的DMEM培养基(Thermo)中培养人胚胎肾上皮细胞系-293T(ATCC#CRL-3216)。
在补充有10％FBS，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI1640培养基(Thermo)中培养NCI-H929(ATCC#CRL-9608)和U266B1(ATCC#TIB-196)，肺癌细胞系-NCI-H522(ATCC#CRL-5810)，。
在补充有10％FBS，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的F12培养基(Thermo)中培养肺癌细胞系-A549(ATCC#CCL-185)，前列腺癌细胞系-PC3(ATCC#CRL-1435)。
逆转录病毒质粒构建
慢病毒包装，浓缩和纯化
通过磷酸钙转染法将第三代慢病毒质粒pMDLg/pRRE，pMD2.G，pRSV-Rev和构建的表达载体以2：1：1：4的比例将质粒共转染293T细胞产生慢病毒。将新收集或解冻的含有慢病毒的上清液以300g离心3分钟以排除上清液中的细胞碎片。将上清液通过连接至30-ml注射器(TERUMO)的0.45-μm微型注射器过滤器过滤。将上清液在20000g，4℃下离心90分 钟。超速离心后，除去上清液。将1/10起始慢病毒体积的AIM-V培养基加入离心管中重新悬浮沉淀。通过移液将慢病毒悬浮液混合。将浓缩的慢病毒分装并储存在-80℃冰箱中。
慢病毒滴度测定
在补充有10％FBS，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1ml RPMI1640培养基中，将1×105个Jurkat细胞接种到12孔板的每个孔中。过夜培养后，将不同量的(5μl至100μl)浓缩的慢病毒分别加入孔中。样品重复三次以提高准确性。加入聚凝胺(Sigma)至每个孔中6ug/ul的终浓度。24小时后，通过离心收集细胞并重悬于1ml补充有10％FBS，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的新鲜RPMI1640培养基中。另外48小时后，收集细胞并通过流式细胞术测定表达CAR的Jurkat细胞的百分比。慢病毒滴度按下式计算。
T细胞分离，转导和培养
通过使用包被有CD3和CD28抗体的Dynabeads，以3：1的磁珠与细胞比率用于分离1×107个PBMC的CD3+细胞。将细胞和磁珠混合物在摇床上在室温下孵育1小时。用磁铁进行CD3+细胞富集，并以1x106个细胞/ml重新悬浮在起始培养基中。24小时后，通过离心(300xg，3分钟)收集细胞。丢弃上清液。将500μl AIM-V培养基中5×108TU慢病毒加入细胞并以2000×g离心2小时。将细胞重悬于慢病毒培养物中并加入1.5ml起始培养基。将细胞放回6孔板并置于培养箱(37度，5％CO2)中。24小时后，再次进行转导。另外24小时后，通过离心(300xg，3分钟)收集细胞并重悬于2ml扩增培养基中。将细胞放回6孔板并置于培养箱(37度，5％CO2)中。72小时后，将细胞转移至100-cm培养皿并以4×105个细胞/ml的浓度重新悬浮于扩增培养基中。转导率可以通过使用流式细胞仪来确定，并且当T细胞足够时可以进行细胞毒性测定。
蛋白表达和流式细胞术分析
为了检测细胞表面上的CAR表达(T细胞和Jurkat细胞)，将1×106个细胞重悬于1ml PBS缓冲液中并用生物素山羊抗人IgG(H+L)(Jason Lab)染色，随后用链霉亲和素-Apc(eBioscience)。
细胞毒性分析
通过离心收集靶细胞并以1×106个细胞/ml的浓度重悬于PBS中。将5ml 细胞用2.5ul Oregon Green 488(Thermo)在37度下染色20分钟。加入20ml培养基以吸收过量的染料。将靶细胞以4×105个细胞/ml的浓度重新悬浮于培养基中。
通过离心收集T细胞并用靶细胞所需的培养基重新悬浮，浓度为1.6×106个细胞/ml。
将T细胞和靶细胞以4,2,1和0.5的比率混合。补充RPMI1640+10％FBS培养基至1ml。
放入37℃、5％CO2培养箱中共培养24h。通过离心收集细胞并重悬于500μl 7-AAD溶液(1μg/ml)中。细胞在冰上孵育30分钟。用流式细胞仪分析死亡率(7-AAD：激发波长561nm，发射波长670nm)。
实施例2表达NKG2D CAR或共表达anti-PD1的质粒的构建
1.构建pcD-NKG2D CAR-DAP10
pcD-NKG2D CAR-DAP10具有如图1A所示的结构。
pcD-NKG2D CAR-DAP10以pCDH质粒为骨架，其包含如图2所示的编码NKG2D CAR和DAP10的核酸片段。该核酸片段从5’端到3’端主要包括：1.CD33前导序列；2.NKG2D的a.a.82-216片段；3.作为铰链区的IgG1Hc序列；4.CD28跨膜结构域；5.CD28的胞内信号传导结构域；6.4-1BB胞内信号传导结构域；7.CD3ζ的胞内信号传导结构域；8.IRES；9.DAP10。
将上述核酸片段插入到pCDH质粒的EF1α启动子下游。将带有插入片段的质粒转化感受态大肠杆菌，涂布平板，次日挑取单克隆进行测序鉴定。
2.构建pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A
pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A具有如图1B所示的结构。
pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A的构建方法和材料与pcD-NKG2D CAR-DAP10相似，包含如图3所示的编码NKG2D CAR和DAP10，以及抗PD1-ScFv的核酸片段。该核酸片段从5’端到3’端包括：1.CD33前导序列；2.NKG2D的a.a.82-216片段；3.作为铰链区的IgG1Hc序列；4.CD28跨膜结构域；5.CD28的胞内信号传导结构域；6.4-1BB胞内信号传导结构域；7.CD3ζ的胞内信号传导结构域；8.IRES；9.DAP10；10.T2A连接子；11.IL2信号肽；12.抗PD1-ScFv片段。其中所述抗PD1-ScFv片段为来自Anti-PD1抗体Nivolumab的ScFv片段，其具有如下氨基酸序列：
在编码上述抗PD1-ScFv片段的核酸上游具有编码IL-2信号肽的序列。所述IL-2信号肽具有如下氨基酸序列：MYRMQLLSCIALSLALVTNS。
将上述核酸片段插入到pCDH质粒的EF1α启动子下游。将带有插入片段的质粒转化感受态大肠杆菌，涂布平板，次日挑取单克隆进行测序鉴定。
3.构建pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B
pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A具有如图1C所示的结构。
pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B的构建方法和材料与pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A相似，包含如图4所示的编码NKG2D CAR和DAP10，以及抗PD1-ScFv的核酸片段。pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B与pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A的插入片段的区别在于NKG2D CAR和DAP10之间通过P2A片段连接，而不是IRES。该核酸片段从5’端到3’端包括：1.CD33前导序列；2.NKG2D的a.a.82-216片段；3.作为铰链区的IgG1Hc序列；4.CD28跨膜结构域；5.CD28的胞内信号传导结构域；6.4-1BB胞内信号传导结构域；7.CD3ζ的胞内信号传导结构域；8.P2A连接子；9.DAP10；10.T2A连接子；11.IL2信号肽；12.抗PD1-ScFv片段。
将上述核酸片段插入到pCDH质粒的EF1α启动子下游。将带有插入片段的质粒转化感受态大肠杆菌，涂布平板，次日挑取单克隆进行测序鉴定。实施例3表达NKG2D CAR或共表达anti-PD1的慢病毒载体的构建
分别以pcD-NKG2D CAR-DAP10、pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A和pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B作为表达质粒，与第三代慢病毒质粒pMDLg/pRRE，pMD2.G，pRSV-Rev，共转染293T细胞制备得到对应的慢病毒载体。
根据实施例1记载方法计算慢病毒表达DRCAR-DAP10和/或抗PD1-ScFv的能力。
实施例4共表达NKG2D和anti-PD1的CAR-T细胞体外杀伤癌细胞
根据实施例1记载的方法，从人的PBMC中提取和获得T细胞。然后用实施例3制备得到的分别用NKG2D CAR-DAP10、NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A和pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B制备得到的慢病毒转染T细胞。
根据实施例1记载的方法进行细胞毒性测定，检查表达CAR的T细胞对各种肿瘤细胞的特异性细胞毒性作用。其中，分别以NKG2D CAR-DAP10、NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B和pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A制备得到的T细胞(简称NKG2D CAR T细胞)和未用慢病毒转染的T细胞作为效应细胞，以癌细胞(包括骨髓瘤NCI-H929和NCI-H929，以及肺癌细胞系A549、NCI-H522和NCI-H23)作为靶细胞。
结果如图5A-图5E所示，在相同实验条件下，与不含有CAR的正常T细胞相比，表达NKG2D CAR和DAP10的T细胞和共表达可分泌的抗PD1-ScFv片段的CAR T细胞都能够诱导显著更多的靶肿瘤细胞死亡。
同时，结果还显示，对多种肿瘤细胞，表达NKG2D CAR和DAP10同时表达可分泌的抗PD1-ScFv片段的CAR T细胞相对只表达NKG2D CAR和DAP10的CAR T细胞能够诱导显著更多的靶肿瘤细胞死亡。
实施例5共表达NKG2D和anti-PD1的CAR T细胞与靶细胞共培养分泌IFN-γ
将实施例4中制备得到的分别表达NKG2D CAR-DAP10、NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A和pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B的CAR T细胞和未用慢病毒转染的T细胞收集和计数，以癌细胞(包括骨髓瘤NCI-H929和NCI-H929，以及肺癌细胞系A549、NCI-H522和NCI-H23)作为靶细胞。在96孔板中加入T细胞或CAR-T细胞，每孔100μL，再分别加入0μL、25μL、50μL、100μL靶细胞，同时设置只有靶细胞的对照组。补充X-VIVO 15+5％HS+1％L-glutamine培养基至200μL，放入37℃、5％CO2培养箱中共培养24h。
收集80μL上清液，按照Human IFN-γELISA set kit(BD)说明书步骤检测IFN-γ的浓度。
结果如图6A-图6C所示，在相同实验条件下，与不含有CAR的正常T细胞相比，表达NKG2D CAR和DAP10同时表达可分泌的抗PD1-ScFv片段的CAR T细胞能够显著增加IFN-γ的产生。
同时，结果还显示，对多种肿瘤细胞，表达NKG2D CAR和DAP10同时表达可分泌的抗PD1-ScFv片段的CAR T细胞相对只表达NKG2D CAR和DAP10的CAR T细胞能够增加IFN-γ的产生。
实施例6共表达NKG2D和anti-PD1的CAR T细胞在人肺癌移植动物模型体内抑制肿瘤
将实施例4中制备得到的分别表达NKG2D CAR-DAP10、NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A和pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B的CAR T细胞在人源异种移植A549-luc模型上进行体内药效学研究。
此研究由第三方亦康(北京)医药科技有限公司进行。
实验动物：
种属品系：Mus Musculus，NCG。周龄：6-8周；雌性；体重18-22g。实验动物提供商：江苏集萃药康生物科技股份有限公司
将带有荧光素酶标记的人肺癌细胞A549-luc通过尾静脉接种一次于雌性NCG小鼠体内，细胞接种量为1×107/小鼠。接种后3天根据活体成像信号随机分组，每组5只动物，共5组，分别为：Vehicle(iv，给药一次)组、Vector-T(1×107cells/mouse，iv，once)组、表达NKG2D CAR-DAP10的CAR T细胞(CART，1×107cells/mouse，iv，once)组、表达NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A的CAR T细胞(CART-L，1×107cells/mouse，iv，once)组和表达NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B的CAR T细胞(CART-S，1×107cells/mouse，iv，once)组。
检测指标：
1)动物给药后的反应：分组后每周两次称量小鼠体重，记录小鼠体重的变化与给药时间的关系。同时观察小鼠的存活情况和健康状况如给药期间动物活动等一般状态。
2)体内生物发光信号：分组后每周一次将小鼠腹腔注射荧光素底物(15mg/mL，10μL/g)，小鼠经异氟烷麻醉后，使用小动物活体成像仪(IVIS Lumina Series III，PerkinElmer)采集发光信号，检测活体动物的肿瘤生长特性，一共成像6次。
3)荷瘤鼠生存期：观察小鼠健康状态，记录每只小鼠死亡或至安乐死终点时实施安乐死的生存时间，计算各组荷瘤鼠生存期中位数(MST)和治疗组荷瘤鼠生存期的延长率(ILS％)，计算公式为：(治疗组MST/对照组MST-1)×100％。观察至分组后35天结束。
生物标本采集及检测：
1)治疗开始后每周(自PG-D7起)经小鼠眼眶静脉丛采集外周血一次，即PG-D7、PG-D14、PG-D21、PG-D28、PG-D35，每次3只动物，共计58份，通过流式细胞术(FACS)检测人源hCD3阳性细胞比例(hCD3+％)。
2)治疗开始后32天(PG-D32)和实验结束时(PG-D35)，对于存活动物执行安乐死时采集血清，共4份，备用于后续ELISA检测IFN-γ。
3)实验结束时及实验动物达安乐死标准时，对于存活动物，安乐死后进行大体解剖并采集小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)，共计10份，进行HE染色，镜下观察病理改变；进行CAR的免疫组化染色(IHC)，观察是否有脱靶。
结果如下。
1)实验动物给药后反应及体重变化
CART、CART-L、CART-S在给药时均未见明显急性不良反应。Vehicle组和各治疗组小鼠随病程进展自PG-D12起陆续发病和死亡。Vehicle组和Vector-T组在治疗期间小鼠体重自分组后17天(PG-D17)呈下降趋势；CART组、CART-L组、CART-S组在实验期间小鼠体重相对稳定(图7)。
2)小鼠活体成像观察
在肿瘤接种后，Vehicle组小鼠的生物发光信号随着肿瘤发病而逐渐增强。CART组、CART-L组、CART-S组在给药后早期即表现出对肿瘤生长的明显抑制。至PG-D21(即肿瘤接种后24天)，Vehicle组、Vector-T组和CART-L组分别有2只、2只、1只小鼠出现死亡，因此以PG-D14的生物发光信号进行统计分析，其中CART组、CART-L组、CART-S组的生物发光信号强度均显著低于Vehicle组，而Vector-T组与Vehicle组组间比较无显著性差异；治疗组间比较，CART-L组和CART-S组组间比较无显著性差异。
3)荷瘤小鼠生存期
实验在细胞接种后38天(PG-D35)结束生存期观察。Vehicle组和Vector-T组分别自PG-D12和PG-D19陆续发病死亡，中位生存期均为24天。CART组、CART-L组、CART-S组小鼠分别自PG-D28、PG-D14、PG-D28陆续发病死亡，截止到PG-D35结束生存期观察时，各有1只实验动物存活。Vector-T组、CART组、CART-L组和CART-S组的中位生存期分别为24天、30天、31和32天，生存期延长率分别为0％、25％、29％和33％。
实施例7共表达NKG2D和anti-PD1的CAR T细胞在临床实验中抑制肿瘤
将实施例4中制备得到的分别表达NKG2D CAR-DAP10、NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-A和pcD-NKG2D CAR-DAP10-anti-PD1-B的CAR T细胞做临床测试。
本临床研究获得北京大学第一医院伦理审查委员会审批，在中国临床试验注册中心注册。受试者签署正式知情同意书，按照纳排标准招募非小细胞肺癌(Non small cell lung cancer，NSCLC)患者和正常人对照，按照随机数字对照表法将被试和正常对照随机分配至测试组和对照组。
以上实验结果表明，本发明提供的具有NKG2D抗原受体结构的CAR和CAR-T细胞，能够有效地识别具有NKG2D配体的癌症细胞，并激活肿瘤细胞特异性的抗肿瘤细胞免疫应答和杀伤相关肿瘤细胞。实验还证明，本发明提供的具有NKG2D抗原受体结构的CAR和CAR-T细胞，结合可分泌的抗PD-1scFv时，能够显著增强杀伤肿瘤包括实体瘤(包括肺癌和骨髓瘤等)的效果。
上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。
如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。

Claims (16)

  1. 一种免疫细胞，其表达：
    i)嵌合抗原受体(CAR)，
    ii)阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段，以及
    iii)DAP10或其活性片段，
    其中所述CAR包含：(a)抗原结合结构域，其包括NKG2D或其活性片段，优选为NKG2D的a.a.82-216片段；(b)跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。
  2. 权利要求1的免疫细胞，其中ii)为PD-1抗体或其活性片段，例如为PD-1抗体的单链可变片段(scFv)、Fab、F(ab′)2、Fv、Fd或dAb。
  3. 权利要求2的免疫细胞，其中所述PD-1抗体或其活性片段被分泌，例如，所述PD-1抗体或其活性片段具有信号肽，优选的，其为IL-2信号肽。
  4. 权利要求1的免疫细胞，其中所述CAR的跨膜结构域为CD8和/或CD28的跨膜结构域，优选为CD28的跨膜结构域。
  5. 权利要求1的免疫细胞，其中所述CAR的胞内信号传导结构域的核苷酸序列包括CD28，4-1BB和CD3ζ的胞内信号传导结构域中的一个或多个，优选包括CD28，4-1BB和CD3ζ的胞内信号传导结构域的核苷酸序列，更优选包括从氨基端到羧基端按顺序为CD28、4-1BB和CD3ζ的蛋白质。
  6. 权利要求1的免疫细胞，其中还包括(a)抗原结构域和(b)跨膜结构域之间的铰链区，优选为IgG重链恒定区片段(IgGHc)，如IgG1Hc、IgG2Hc、IgG3Hc和IgG4Hc。IgG1Hc。
  7. 权利要求1的免疫细胞，其中所述免疫细胞是：T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、自然杀伤(NK)细胞、人类胚胎干细胞、造血干细胞(HSC)、或诱导性多能干细胞(iPS)，
    优选的所述免疫应答细胞是自体的。
  8. 分离的核酸，其包括编码权利要求1-8中任一项定义的细胞表达的以下组分的核苷酸序列：
    i)嵌合抗原受体(CAR)，
    ii)阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段，以及
    iii)DAP10或其活性片段，
    其中所述CAR包含：(a)抗原结合结构域，其包括NKG2D或其活性片段，优选为NKG2D的a.a.82-216片段；(b)跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域。
  9. 权利要求9所述的核酸，其中在编码所述CAR和/或DAP10与所述阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段的核酸之间具有IRES或2A序列(如T2A)的核苷酸序列。
  10. 嵌合抗原受体(CAR)表达载体，其包含权利要求9或10所述的核酸，其具有编码以下组分的核苷酸序列：
    i)嵌合抗原受体(CAR)，
    ii)阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的抗体或其活性片段，以及
    iii)DAP10或其活性片段，
    其中所述CAR包含：(a)抗原结合结构域，其包括NKG2D或其活性片段，优选为NKG2D的a.a.82-216片段；(b)跨膜结构域和(c)胞内信号传导结构域,
    优选的，其在编码所述抗原结构域的序列的上游具有启动子。
  11. 权利要求11的表达载体，其为质粒。
  12. 权利要求11的表达载体，其为病毒载体，例如杆状病毒表达载体，腺病毒载体，逆转录病毒载体，孢疹病毒载体或慢病毒载体，优选为慢病毒载体。
  13. 药物组合物，其含有权利要求1-8中任一项的免疫细胞，或权利要求9-10中任一项的核酸，或权利要求11-13中任一项的表达载体，其优选用于治 疗或预防癌症，所述癌症可为白血病、淋巴瘤、或实体瘤。
  14. 权利要求14所述的药物组合物，其中所述癌症为实体瘤，例如为骨髓瘤如多发性骨髓瘤、膀胱癌、尿道、输尿管以及肾盂的尿道上皮细胞癌、肾脏癌、乳癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、前列腺癌、神经胶母细胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、软组织肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、胰脏癌或胃癌，优选的，所述癌症为骨髓瘤或肺癌。
  15. 治疗疾病的方法，其给予患者含有权利要求1-8中任一项的免疫细胞，或权利要求9-10中任一项的核酸，或权利要求11-13中任一项的表达载体，其优选用于治疗或预防癌症，所述癌症可为白血病、淋巴瘤、实体瘤。
  16. 权利要求16所述的方法，其中所述癌症为实体瘤，例如为骨髓瘤如多发性骨髓瘤、膀胱癌、尿道、输尿管以及肾盂的尿道上皮细胞癌、肾脏癌、乳癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、前列腺癌、神经胶母细胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、软组织肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、胰脏癌或胃癌，优选的，所述癌症为骨髓瘤或肺癌。
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