JP2023517063A - 操作されたメモリー様nk細胞を作製するための方法およびその組成物 - Google Patents

操作されたメモリー様nk細胞を作製するための方法およびその組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成しているかもしくはそれによって提示される変異型ヌクレオフォスミン(NPM1c)のネオエピトープに結合するキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞、またはそのような化合物を発現する細胞、および、がんを治療するため、またはその1つもしくは複数の症状を寛解させるための方法におけるそれらの使用に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年3月10日に出願された米国仮特許出願第62/987,612号明細書;2020年12月1日に出願された米国仮特許出願第63/119,959号明細書;2020年12月3日に出願された米国仮特許出願第63/121,127号明細書;および2021年1月8日に出願された米国実用新案出願第17/144,834号明細書の利益を主張する。各出願の内容はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
米国政府による資金提供の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所(NIH)によって授与された助成金番号CA197605に基づき、政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
細胞ベースの免疫療法が、がんの治療のために開発中である。T細胞、単球由来細胞(例えば、マクロファージ、樹状細胞)およびナチュラルキラー(NK)細胞の養子細胞移入を使用するアプローチが、がん治療として検討されている(例えば、Andreesen, R. et al (1990) Cancer Res 50:7450-7456; Ruggeri, L. et al (2002) Science 295:2097-2100; Rezvani, K. (2019) Bone Marrow Transplantation 54:785-788を参照)。具体的には、ex vivoで活性化/増大させたNK細胞を患者に投与する養子細胞療法(ACT)は、現在試験されているがん治療の一つである。これらのアプローチは、患者から採取され、ex vivoで活性化/増大されて、次いで腫瘍、例えば、転移性腫瘍と闘うために再注入される自己NK細胞の使用を伴う。ACT NKの持続性、in vivo増大、およびエフェクター機能を増強する戦略が求められている。
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞治療は、がん治療のための戦略の一つとして登場してきた。キメラ抗原受容体(CAR)は、抗原(例えば、リガンド)に対する規定された特異性を免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、ナチュラルキラー細胞または他の免疫細胞)に付与して、抗原を認識してそれに結合した際にエフェクター細胞の活性化をもたらす、遺伝子操作された人工膜貫通受容体である。しかし、細胞系統限定的な抗原または腫瘍関連抗原(TAA)を標的とする現在のCARは、正常組織で低い抗原発現があるため、強い毒性を伴う可能性がある(Coulie et al., NAT REV CANCER 14: 135 (2014); Srivastava & Riddell, J IMMUNOL 200: 459 (2018)を参照)。さらに、TAAは腫瘍細胞の生存に必要ではないため、TAA発現の喪失は、CAR-T療法に対する腫瘍抵抗性の発生の主な原因となる(Srivastava & Riddell, J IMMUNOL 200: 459 (2018)を参照)。したがって、より効果的なCAR療法戦略が必要とされている。
一部の態様では、本開示は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドを発現する、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様(ML)ヒトNK細胞または前記細胞の集団であって、細胞外結合ドメインが、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、操作されたMLヒトNK細胞または前記細胞の集団を提供する。
一部の態様では、本開示の操作されたNK細胞は、(a)MHCクラスIタンパク質単独、および/または(b)MHCクラスIタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合しない細胞外結合ドメインを含むCARを含み、任意選択で、対照ペプチドがNY-ESO-1エピトープまたはインフルエンザウイルスM1エピトープである。
一部の態様では、本開示の操作されたNK細胞は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを含む抗原に結合する細胞外結合ドメインを含むCARを含み、NPM1cネオエピトープは、アミノ酸配列Xを含み、式中、XはA、V、LまたはIから選択され、XはA、T、S、V、L、I、MまたはQから選択され、XはQまたはNから選択され、XはDまたはEから選択され、XはL、I、V、M、AまたはFから選択され、XはC、S、またはAから選択され、XはL、I、V、M、A、またはFから選択され、XはA、V、LまたはIから選択され、XはL、I、V、MまたはAから選択される。一部の態様では、XはAまたはVから選択され、XはV、I、またはLから選択され、XはQまたはNから選択され、XはDまたはEから選択され、XはLまたはIから選択され、XはCまたはSから選択され、XはV、LまたはIから選択され、XはAまたはVから選択され、XはV、I、またはLから選択される。一部の態様では、XはAであり、XはV、I、またはLから選択され、XはQであり、XはDであり、XはLであり、XはCであり、XはLであり、XはAであり、XはV、I、またはLから選択される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、NPM1cネオエピトープは、AIQDLCLAV(配列番号1)またはAIQDLCVAV(配列番号71)から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、NPM1cネオエピトープは、CLAVEEVSL(配列番号72)、VEEVSLRK(配列番号73)、AVEEVSLR(配列番号74)、AVEEVSLRK(配列番号75)、CLAVEEVSLRK(配列番号76)から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ネオエピトープは、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ネオエピトープは、7、8、9、10、11、または12アミノ酸残基長である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、MHCクラスIタンパク質は、HLA-A*02タンパク質であるか、またはHLA-A*02アレルグループによってコードされる。一部の態様では、MHCクラスIタンパク質は、HLA-A*02:01アレルによってコードされる。
一部の態様では、本開示の操作されたNK細胞は、
(i)重鎖可変領域(VH)相補性決定領域(CDR)1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHであって、前記VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3は、配列番号5のアミノ酸配列を有するVHのCDRである、VH、ならびに/または
(ii)軽鎖可変領域(VL)相補性決定領域(CDR)1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLであって、前記VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3は、配列番号3のアミノ酸配列を有するVLのCDRである、VL
を含む細胞外ドメインを含むCARを含む。
一部の態様では、本開示の操作されたNK細胞は、VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHを含む細胞外ドメインを含むCARを含み、VH CDR1はアミノ酸配列GFTFSSYA(配列番号9)を有し、VH CDR2はアミノ酸配列ISGSGGST(配列番号10)を有し、VH CDR3はアミノ酸配列ARLGYPTTTLLPFDY(配列番号11)を有する。一部の態様では、細胞外ドメインは、VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLを含み、VL CDR1はアミノ酸配列QSISSY(配列番号6)を有し、VL CD2はアミノ酸配列AAS(配列番号7)を有し、VL CD3はアミノ酸配列QQSYSTPLT(配列番号8)を有する。
一部の態様では、本開示の操作されたNK細胞は、VHおよびVLを含む細胞外ドメインを含むCARを含み、VHは、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み、および/またはVLは、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示の操作されたNK細胞は、VHおよびVLを含む細胞外ドメインを含むCARを含み、VHは配列番号5のアミノ酸配列を含み、および/またはVLは配列番号3のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示の操作されたNK細胞は、scFvである細胞外ドメインを含むCARを含む。一部の態様では、scFvはヒトscFvである。一部の態様では、scFvは、VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHを含み、VH CDR1はアミノ酸配列GFTFSSYA(配列番号9)を有し、VH CDR2はアミノ酸配列ISGSGGST(配列番号10)を有し、VH CDR3はアミノ酸配列ARLGYPTTTLLPFDY(配列番号11)を有する。一部の態様では、scFvは、VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLを含み、VL CDR1はアミノ酸配列QSISSY(配列番号6)を有し、VL CD2はアミノ酸配列AAS(配列番号7)を有し、VL CD3はアミノ酸配列QQSYSTPLT(配列番号8)を有する。一部の態様では、scFvはVHおよびVLを含み、VHは、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み、および/またはVLは、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む。一部の態様では、scFvはVHおよびVLを含み、VHは配列番号5のアミノ酸配列を含み、および/またはVLは配列番号3のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、scFvはリンカーを含む。一部の態様では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーはGly-Serリンカーである。一部の態様では、Gly-Serリンカーは、(Gly4Ser)(配列番号58)、(Gly4Ser)2(配列番号59)、(Gly4Ser)3(配列番号60)、および(Gly4Ser)4(配列番号61)からなる群から選択される。一部の態様では、Gly-Serリンカーは、アミノ酸配列SGSSGGSSSG(配列番号4)を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、scFvは、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、または少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有し、任意選択で、scFvは、(a)VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHであって、VH CDR1はアミノ酸配列GFTFSSYA(配列番号9)を有し、VH CDR2はアミノ酸配列ISGSGGST(配列番号10)を有し、VH CDR3はアミノ酸配列ARLGYPTTTLLPFDY(配列番号11)を有する、VH;および/または(b)VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLであって、VL CDR1はアミノ酸配列QSISSY(配列番号6)を有し、VL CD2はアミノ酸配列AAS(配列番号7)を有し、VL CD3はアミノ酸配列QQSYSTPLT(配列番号8)を有する、VLを含む。一部の態様では、scFvは配列番号2のアミノ酸配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、抗原は、がん細胞の表面にある。一部の態様では、がんは、急性骨髄性白血病(AML)である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、細胞外ドメインは、100nMもしくはそれ未満、50nMもしくはそれ未満、20nMもしくはそれ未満、10nMもしくはそれ未満、0.5nMから100nMまで、または1nMから15nMまでの平衡解離定数(Kd)で抗原に結合する。
一部の態様では、本開示の操作されたNKは、膜貫通ドメインを含むCARを含み、膜貫通ドメインは、CD3-ゼータ、CD8、CD28、DAP12、2B4、NKG2D、CD16、NKp44またはNKp46の膜貫通ドメインから選択される。一部の態様では、本開示の操作されたNKは、細胞内ドメインを含むCARを含み、細胞内ドメインは、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、2B4、DAP10、CD137およびDAP12からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の共刺激ドメインを含む。一部の態様では、細胞内ドメインは、CD3-ゼータシグナル伝達ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインを含み、膜貫通ドメインはCD8膜貫通ドメインを含み、CARポリペプチドはCD8ヒンジ領域をさらに含む。一部の態様では、細胞内ドメインは、配列番号27に示されるアミノ酸配列を含むCD3-ゼータシグナル伝達ドメイン、および配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む4-1BB共刺激ドメインを含み、CARポリペプチドは、CD8膜貫通ドメインおよびCD8ヒンジ領域を含み、CD8膜貫通ドメインおよびCD8ヒンジ領域は、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含み、細胞外結合ドメインは、抗体、またはその抗原結合断片、および配列番号23に示されるアミノ酸配列を含むリーディング配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、細胞外結合ドメインは、配列番号24に示されるアミノ酸配列、または配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含むscFvである。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、細胞内ドメインは、自己切断性ペプチド配列およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ペプチドの切断によりサイトカインが放出される。一部の態様では、サイトカインは、IL-12、IL-7、IL-13、IL-15、TNF-α、IFN-γ、またはCCL19である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたNK細胞は、配列番号22に示されるアミノ酸配列、または配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含むCARポリペプチドを含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたNK細胞または細胞の集団は、初代ヒトNK細胞または初代ヒトNK細胞の集団の、以下のサイトカイン:IL-2、IL-12、IL-7、IL-15、IL-21、およびIL-18のうちの1つもしくは複数、またはそれらの任意の組合せへの曝露後に活性化され、任意選択で、サイトカインは組換えヒトサイトカインである。一部の態様では、操作されたNK細胞または細胞の集団は、IL-12およびIL-15;IL-12およびIL-18;IL-15およびIL-18;またはIL-12、IL-15およびIL-18の組合せへの曝露後に活性化される。一部の態様では、NK細胞または前記細胞の集団は、1~20ng/mLの濃度範囲にあるIL-12;1~50ng/mLの濃度範囲にあるIL-15および10~100ng/mLの濃度範囲にあるIL-18に曝露され、任意選択で、NK細胞または前記細胞の集団は、約10ng/mLのIL-12、約1ng/mLのIL-15、および約50ng/mLのIL-18に、約3~48時間、約7~24時間、約16~20時間、約12~24時間または約14~16時間の期間にわたり、任意選択で約16時間の期間にわたり曝露される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、CARポリペプチドは、初代ヒトNK細胞または前記細胞の集団の、1つまたは複数のサイトカインへの曝露後に導入される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたNK細胞または細胞の集団は、
(i)1つもしくは複数のサイトカインおよび/もしくは腫瘍標的の存在下で、対照ヒトNK細胞もしくはヒトNK細胞株に比して、産生するIFNγが増加しており;
(ii)対照ヒトNK細胞もしくはヒトNK細胞株に比して、抗体依存性細胞傷害が増強しており;ならびに/または
(iii)対照ヒトNK細胞もしくはヒトNK細胞株に比して、抗腫瘍効果が増強しており、
任意選択で、対照NK細胞は、IL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞、またはIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、以下のポリペプチド:CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、およびCD25のうちの1つまたは複数の発現は、本開示の操作されたNK細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトNK細胞またはヒトNK細胞株に比して増加しており、任意選択で、対照ヒトNK細胞はIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞であるか、または対照ヒトNK細胞株はIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、以下のポリペプチド:KIR、CD57、NKG2C、DNAM-1およびCD137のうちの1つまたは複数は、本開示の操作されたNK細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトNK細胞またはヒトNK細胞株に比して相対的に不変であり、任意選択で、対照ヒトNK細胞はIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞であるか、または対照ヒトNK細胞株はIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、CD16および/またはCD11bの発現は、本開示の操作されたNK細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトNK細胞またはヒトNK細胞株に比して減少しており、任意選択で、対照ヒトNK細胞はIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞であるか、または対照ヒトNK細胞株はIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、IL-15ポリペプチド、任意選択でヒトIL-15ポリペプチドを発現する。一部の態様では、IL-15ポリペプチドは、分泌型IL-15ポリペプチドであるか、または膜結合型IL-15ポリペプチドである。一部の態様では、膜結合型IL-15ポリペプチドは、IL-15と異種性膜貫通ドメインの融合物である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたNK細胞または細胞の集団は、in vivo投与後に1.5倍、2倍、3倍、または4倍に増大する。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたNK細胞または細胞の集団は、in vivo投与後に、サイトカインに対する応答増強または活性化受容体の再刺激を示す。一部の態様では、応答増強は、数週間から数か月間にわたり、任意選択で、2週間から3か月間までの期間、3週間から2か月間までの期間、または約1か月間にわたり維持される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、(i)NK細胞の対照集団に比して、IFN-γの発現増加を有し;(ii)NK細胞の対照集団に比して、グランザイムBの発現増加を有し;(iii)NK細胞の対照集団に比して、1つもしくは複数の活性化マーカーの発現増加を有し、ここで1つもしくは複数の活性化マーカーは、CD25、CD69、ICOS、CD226、CD107a、およびCD62Lから選択され;(iv)NK細胞の対照集団に比して、1つもしくは複数の活性化受容体の発現増加を有し、ここで1つもしくは複数の活性化受容体は、NKp30、NKG2D、NKp44から選択され;(v)NK細胞の対照集団に比して、1つもしくは複数の成熟マーカーの発現増加を有し、ここで1つもしくは複数の成熟マーカーは、CD56およびNKG2Aから選択され;(vi)NK細胞の対照集団に比して、CD57の発現減少を有し;(vii)NK細胞の対照集団に比して、TIGITの発現増加を有し;ならびに/または(viii)NK細胞の対照集団に比して、TRAILの発現減少を有し;任意選択で、(i)~(viii)のいずれか1つのNK細胞の対照集団は、サイトカイン誘導性ML NK細胞の非形質導入集団である。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、IFN-γの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、1つまたは複数の活性化マーカーの発現増加を有する。一部の態様では、活性化マーカーはCD107aである。一部の態様では、活性化マーカーはCD62Lである。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、1つまたは複数の活性化受容体の発現増加を有する。一部の態様では、活性化受容体はNKG2Dである。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、CD57の発現減少を有する。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、CD56およびNKG2Aの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、TIGITの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、TRAILの発現減少を有する。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される操作されたNK細胞または細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
一部の態様では、本開示は、本開示の操作されたNK細胞または細胞の集団を作製するための方法であって、
(i)初代ヒトNK細胞または前記細胞の集団を得るステップ;
(ii)NK細胞または前記細胞の集団を、ある量のIL-12、IL-15、IL-18、またはそれらの任意の組合せと、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞または前記細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させるステップ;
(iii)ステップ(ii)のNK細胞または前記細胞の集団を、CARポリペプチドをコードするレンチウイルスベクターと、NK細胞または前記細胞の集団に形質導入するための条件下で接触させるステップ;
(iv)CARポリペプチドを発現するNK細胞または前記細胞の集団を単離するステップ;および
(v)任意選択で、単離された細胞を増大させるステップ
を含む方法を提供する。
一部の態様では、初代ヒトNK細胞または前記細胞の集団は、iPSC、臍帯血、またはPBMCに由来する。一部の態様では、初代ヒトNK細胞または前記細胞の集団は、自己性または同種性である。
一部の態様では、ステップ(ii)における期間は、約12~16時間、任意選択で約14~16時間、任意選択で約16時間である。一部の態様では、ステップ(iii)は、(iv)の前に約24~72時間の期間にわたり、NK細胞または前記細胞の集団を休ませることをさらに含む。
一部の態様では、レンチウイルスベクターは、ヒヒエンベロープ糖タンパク質(BaEV-gp)シュードタイプ化レンチウイルスである。一部の態様では、レンチウイルスベクターは、BaEV-gpを含むシュードタイプ化レンチウイルスベクターであり、例えば、BaEV-gpは配列番号107のアミノ酸配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞または前記細胞の集団は、対照ヒトNK細胞もしくはNK細胞株に比して、増大したレベルでIFNγを産生し、任意選択で、対照ヒトNK細胞はIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞であるか、または対照ヒトNK細胞株はIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である。
一部の態様では、本開示は、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性メモリー様(ML)NK細胞の集団を作製する方法であって、ASCT-2を発現するサイトカイン誘導性ML NK細胞の集団を、異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、集団に形質導入するための条件下で接触させるステップであって、シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ASCT-2に結合する糖タンパク質を含み、それによって、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性ML NK細胞の集団を作製する、ステップを含む方法を提供する。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞は、初代ヒトNK細胞の集団から得られる。一部の態様では、初代ヒトNK細胞の集団は、iPSC、臍帯血、またはPBMCに由来する。一部の態様では、初代ヒトNK細胞の集団は、自己性または同種性である。一部の態様では、ASCT-2の発現は、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団において、ヒトNK細胞の対照集団に比して、約1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、または4倍に増加しており、任意選択で、ヒトNK細胞の対照集団は、IL-15単独の存在下で活性化されている。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団は、IL-12、IL-18、およびIL-15への曝露によって予め活性化される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団は、IL-12およびIL-18への曝露によって予め活性化される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団は、約8~24時間、任意選択で12~20時間、任意選択で約12~16時間、任意選択で約14~16時間、任意選択で約16時間の期間にわたり予め活性化される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団は、約10ng/mLのIL-12、約50ng/mLのIL-15、および約50ng/mLのIL-18への、約3~48時間、約7~24時間、約16~20時間、約12~24時間、約14~16時間、または約16時間の期間にわたる曝露によって予め活性化される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団は、約10ng/mLのIL-12および約50ng/mLのIL-18への、約3~48時間、約7~24時間、約16~20時間、約12~24時間、約14~16時間、または約16時間の期間にわたる曝露によって予め活性化される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団を、1つまたは複数のサイトカインへの曝露後、および接触の前に、ある期間にわたって休ませ、その期間は約24~72時間である。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団の少なくとも約10%が形質導入される。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団の約10~90%が形質導入され、任意選択で約35~80%、任意選択で約40~60%、任意選択で約60%が形質導入される。一部の態様では、糖タンパク質は、レトロウイルス糖タンパク質である。一部の態様では、レトロウイルス糖タンパク質は、ヒヒエンベロープ(BaEV)糖タンパク質である。一部の態様では、BaEV糖タンパク質は、配列番号107によって示されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示は、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性メモリー様(ML)NK細胞の集団を作製する方法であって、(i)初代ヒトNK細胞の集団を得るステップ;(ii)初代ヒトNK細胞の集団を、IL-12、IL-18、およびIL-15と、ASCT-2を発現するサイトカイン誘導性ML NK細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させるステップ;ならびに(iii)(ii)の集団を、異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団に形質導入するための条件下で接触させるステップであって、シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ASCT-2に結合する糖タンパク質を含み;それによって、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性ML NK細胞の集団を作製する、ステップを含む方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性メモリー様(ML)NK細胞の集団を作製する方法であって、(i)初代ヒトNK細胞の集団を得るステップ;(ii)初代ヒトNK細胞の集団を、IL-12およびIL-18と、ASCT-2を発現するサイトカイン誘導性ML NK細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させるステップ;ならびに(iii)(ii)の集団を、異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団に形質導入するための条件下で接触させるステップ;を含み、シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ASCT-2に結合する糖タンパク質を含み;それによって、異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性ML NK細胞の集団を作製する、方法を提供する。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、糖タンパク質は、レトロウイルス糖タンパク質である。一部の態様では、レトロウイルス糖タンパク質は、ヒヒエンベロープ(BaEV)糖タンパク質である。一部の態様では、BaEV糖タンパク質は、配列番号107によって示されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、初代ヒトNK細胞の集団は、iPSC、臍帯血、またはPBMCに由来する。一部の態様では、初代ヒトNK細胞の集団は、自己性または同種性である。一部の態様では、ステップ(ii)における期間は、約12~16時間、任意選択で約14~16時間、任意選択で約16時間である。一部の態様では、(iii)の結果として形質導入される、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団の割合は、少なくとも10%である。一部の態様では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団の約10~90%が形質導入され、任意選択で約35~80%、任意選択で約40~60%、任意選択で約60%が形質導入される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団は、(i)1つもしくは複数のサイトカインおよび/もしくは腫瘍標的の存在下で、対照ヒトNK細胞株に比して、産生するIFNγが増加しており;(ii)対照ヒトNK細胞株に比して、抗体依存性細胞傷害が増強しており;ならびに/または(iii)対照ヒトNK細胞株に比して、抗腫瘍効果が増強しており、任意選択で、対照ヒトNK細胞株は、IL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である。一部の態様では、以下のポリペプチド:CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、およびCD25のうちの1つまたは複数の発現は、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して増加している。一部の態様では、CD94は、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して増加している。一部の態様では、NKp30は、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して増加している。一部の態様では、NKp44は、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して増加している。一部の態様では、NKG2Dは、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して増加している。一部の態様では、CD25は、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して増加している。一部の態様では、以下のポリペプチド:KIR、CD57、NKG2C、DNAM-1およびCD137のうちの1つまたは複数は、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、KIRは、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、CD57は、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、NKG2Cは、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、DNAM-1は、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、CD137は、サイトカイン誘導性NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して相対的に不変である。一部の態様では、CD16および/またはCD11bの発現は、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団において、対照ヒトNK細胞株に比して減少している。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団の多数は、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+である。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団は、in vivo投与後に1.5倍、2倍、3倍、または4倍に増大する。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団は、in vivo投与後に、サイトカインに対する応答増強または活性化受容体の再刺激を示す。一部の態様では、応答増強は、数週間から数か月間にわたり、任意選択で、2週間から3か月間までの期間、3週間から2か月間までの期間、または約1か月間にわたり維持される。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、IL-15ポリペプチド、任意選択でヒトIL-15ポリペプチドをさらにコードする。一部の態様では、IL-15ポリペプチドは、分泌型IL-15ポリペプチドであるか、または膜結合型IL-15ポリペプチドである。一部の態様では、膜結合型IL-15ポリペプチドは、異種性膜貫通ドメイン、任意選択でCD8膜貫通ドメインと融合している。一部の態様では、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団の増大は、IL-15ポリペプチドを伴わない形質導入を受けた対照ML NK集団に比して、形質導入の後に約1.5倍、2倍、3倍、または4倍への増加である。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本方法は、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団を単離するステップ;および任意選択で、細胞の集団を増大させるステップをさらに含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、異種性ポリペプチドはCARである。一部の態様では、CARは、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含み、細胞外結合ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する。一部の態様では、細胞外結合ドメインは、(a)MHCクラスIタンパク質単独、および/または(b)MHCクラスIタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合せず、任意選択で、対照ペプチドはNY-ESO-1エピトープまたはインフルエンザウイルスM1エピトープである。一部の態様では、NPM1cネオエピトープはアミノ酸配列Xを含み、式中、XはA、V、LまたはIから選択され、XはA、T、S、V、L、I、MまたはQから選択され、XはQまたはNから選択され、XはDまたはEから選択され、XはL、I、V、M、AまたはFから選択され、XはC、S、またはAから選択され、XはL、I、V、M、A、またはFから選択され、XはA、V、LまたはIから選択され、XはL、I、V、MまたはAから選択される。一部の態様では、XはAまたはVから選択され、XはV、I、またはLから選択され、XはQまたはNから選択され、XはDまたはEから選択され、XはLまたはIから選択され、XはCまたはSから選択され、XはV、LまたはIから選択され、XはAまたはVから選択され、XはV、I、またはLから選択される。一部の態様では、XはAであり、XはV、I、またはLから選択され、XはQであり、XはDであり、XはLであり、XはCであり、XはLであり、XはAであり、XはV、I、またはLから選択される。一部の態様では、NPM1cネオエピトープは、AIQDLCLAV(配列番号1)またはAIQDLCVAV(配列番号71)から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ネオエピトープは、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)を含む。一部の態様では、ネオエピトープは、7、8、9、10、11、または12アミノ酸残基長である。一部の態様では、MHCクラスIタンパク質は、HLA-A*02タンパク質であるか、またはHLA-A*02アレルグループによってコードされる。一部の態様では、MHCクラスIタンパク質は、HLA-A*02:01アレルによってコードされる。
一部の態様では、NPM1cネオエピトープは、CLAVEEVSL(配列番号72)、VEEVSLRK(配列番号73)、AVEEVSLR(配列番号74)、AVEEVSLRK(配列番号75)、CLAVEEVSLRK(配列番号76)から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ネオエピトープは、7、8、9、10、11、または12アミノ酸残基長である。一部の態様では、MHCクラスIタンパク質は、HLA-A*02タンパク質であるか、またはHLA-A*02アレルグループによってコードされる。一部の態様では、MHCクラスIタンパク質は、HLA-A*02:01アレルによってコードされる。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、CARの細胞外ドメインは、(i)重鎖可変領域(VH)相補性決定領域(CDR)1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHであって、VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3は、配列番号5のアミノ酸配列を有するVHのCDRである、VH、ならびに/または(ii)軽鎖可変領域(VL)相補性決定領域(CDR)1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLであって、VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3は、配列番号3のアミノ酸配列を有するVLのCDRである、VLを含む。一部の態様では、細胞外ドメインはVH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHを含み、VH CDR1はアミノ酸配列GFTFSSYA(配列番号9)を有し、VH CDR2はアミノ酸配列ISGSGGST(配列番号10)を有し、VH CDR3はアミノ酸配列ARLGYPTTTLLPFDY(配列番号11)を有する。一部の態様では、細胞外ドメインは、VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLを含み、VL CDR1はアミノ酸配列QSISSY(配列番号6)を有し、VL CD2はアミノ酸配列AAS(配列番号7)を有し、VL CD3はアミノ酸配列QQSYSTPLT(配列番号8)を有する。一部の態様では、細胞外ドメインはVHおよびVLを含み、VHは、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み、および/またはVLは、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む。一部の態様では、細胞外ドメインはVHおよびVLを含み、VHは配列番号5のアミノ酸配列を含み、および/またはVLは配列番号3のアミノ酸配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、CARの細胞外ドメインは、scFvを含む。一部の態様では、scFvはヒトscFvである。一部の態様では、scFvは、VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHを含み、VH CDR1はアミノ酸配列GFTFSSYA(配列番号9)を有し、VH CDR2はアミノ酸配列ISGSGGST(配列番号10)を有し、VH CDR3はアミノ酸配列ARLGYPTTTLLPFDY(配列番号11)を有する。一部の態様では、scFvは、VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLを含み、VL CDR1はアミノ酸配列QSISSY(配列番号6)を有し、VL CD2はアミノ酸配列AAS(配列番号7)を有し、VL CD3はアミノ酸配列QQSYSTPLT(配列番号8)を有する。一部の態様では、scFvはVHおよびVLを含み、VHは、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み、および/またはVLは、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む。一部の態様では、scFvはVHおよびVLを含み、VHは配列番号5のアミノ酸配列を含み、ならびに/またはVLは配列番号3のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、scFvはリンカーを含む。一部の態様では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーはGly-Serリンカーである。一部の態様では、Gly-Serリンカーは、(Gly4Ser)(配列番号58)、(Gly4Ser)2(配列番号59)、(Gly4Ser)3(配列番号60)、および(Gly4Ser)4(配列番号61)からなる群から選択される。一部の態様では、Gly-Serリンカーは、アミノ酸配列SGSSGGSSSG(配列番号4)を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、scFvは、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、または少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有し、任意選択で、scFvは、(a)VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHであって、VH CDR1はアミノ酸配列GFTFSSYA(配列番号9)を有し、VH CDR2はアミノ酸配列ISGSGGST(配列番号10)を有し、VH CDR3はアミノ酸配列ARLGYPTTTLLPFDY(配列番号11)を有する、VH;ならびに/または(b)VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLであって、VL CDR1はアミノ酸配列QSISSY(配列番号6)を有し、VL CD2はアミノ酸配列AAS(配列番号7)を有し、VL CD3はアミノ酸配列QQSYSTPLT(配列番号8)を有する、VLを含む。一部の態様では、scFvは、配列番号2のアミノ酸配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、CARの細胞外結合ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、抗原はがん細胞の表面にある。一部の態様では、がんは急性骨髄性白血病(AML)である。一部の態様では、細胞外ドメインは、100nMもしくはそれ未満、50nMもしくはそれ未満、20nMもしくはそれ未満、10nMもしくはそれ未満、0.5nMから100nMまで、または1nMから15nMまでの平衡解離定数(Kd)で抗原に結合する。
一部の態様では、CARは膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、CD3-ゼータ、CD8、CD28、DAP12、2B4、NKG2D、CD16、NKp44またはNKp46の膜貫通ドメインから選択される。一部の態様では、CARは細胞内ドメインを含み、細胞内ドメインは、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、2B4、DAP10、CD137およびDAP12からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の共刺激ドメインを含む。一部の態様では、細胞内ドメインは、CD3-ゼータシグナル伝達ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインを含み、膜貫通ドメインはCD8膜貫通ドメインを含み、CARポリペプチドはCD8ヒンジ領域をさらに含む。一部の態様では、細胞内ドメインは、配列番号27に示されるアミノ酸配列を含むCD3-ゼータシグナル伝達ドメイン、および配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む4-1BB共刺激ドメインを含み、CARポリペプチドは、CD8膜貫通ドメインおよびCD8ヒンジ領域を含み、CD8膜貫通ドメインおよびCD8ヒンジ領域は、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含み、細胞外結合ドメインは、抗体、またはその抗原結合断片、および配列番号23に示されるアミノ酸配列を含むリーディング配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、CARの細胞外結合ドメインは、配列番号24に示されるアミノ酸配列、または配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含むscFvである。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、CARポリペプチドは、配列番号22に示されるアミノ酸配列、または配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、CARの細胞内ドメインは、自己切断性ペプチド配列およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ペプチドの切断によりサイトカインが放出される。一部の態様では、サイトカインは、IL-12、IL-7、IL-13、IL-15、TNF-α、IFN-γ、またはCCL19である。一部の態様では、サイトカインはIL-15ポリペプチドである。一部の態様では、IL-15ポリペプチドは発現後に分泌される。一部の態様では、CARポリペプチドは、配列番号102に示されるアミノ酸配列、または配列番号102のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む。一部の態様では、IL-15ポリペプチドは異種性膜貫通ドメインと融合しており、任意選択で異種性膜貫通ドメインはCD8膜貫通ドメインである。一部の態様では、IL-15ポリペプチドは、膜結合型IL-15ポリペプチドとして発現される。一部の態様では、CARポリペプチドは、配列番号100に示されるアミノ酸配列、または配列番号100のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示は、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含むCARを発現する操作されたサイトカイン誘導性ML NK細胞の集団であって、本明細書に記載される方法に従って調製される集団を提供する。一部の態様では、操作されたML NK細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞の存在下で、(i)IFNγの発現増加を有し;(ii)NK細胞の対照集団に比して、グランザイムBの発現増加を有し;(iii)NK細胞の対照集団に比して、1つもしくは複数の活性化マーカーの発現増加を有し、ここで1つもしくは複数の活性化マーカーは、CD25、CD107a、CD69、ICOS、CD226、およびCD62Lから選択され;(iv)NK細胞の対照集団に比して、1つもしくは複数の活性化受容体の発現増加を有し、ここで1つもしくは複数の活性化受容体は、NKp30、NKG2D、NKp44から選択され;(v)NK細胞の対照集団に比して、1つもしくは複数の成熟マーカーの発現増加を有し、ここで1つもしくは複数の成熟マーカーは、CD56およびNKG2Aから選択され;(vi)NK細胞の対照集団に比して、CD57の発現減少を有し;(vii)NK細胞の対照集団に比して、TIGITの発現増加を有し;ならびに/または(viii)NK細胞の対照集団に比して、TRAILの発現減少を有し;任意選択で、NK細胞の対照集団は、サイトカイン誘導性ML NK細胞の非形質導入集団である。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、IFN-γの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、1つまたは複数の活性化マーカーの発現増加を有する。一部の態様では、活性化マーカーはCD107aである。一部の態様では、活性化マーカーはCD62Lである。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、1つまたは複数の活性化受容体の発現増加を有する。一部の態様では、活性化受容体はNKG2Dである。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、CD57の発現減少を有する。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、CD56およびNKG2Aの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、TIGITの発現増加を有する。一部の態様では、操作されたNK細胞または前記細胞の集団は、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触された場合に、TRAILの発現減少を有する。
一部の態様では、本開示は、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示しており、本明細書に記載される、操作されたNK細胞もしくは細胞の集団、または医薬組成物を、がんを治療するのに十分な量で対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、がんはAMLである。一部の態様では、がんを治療する方法は、がんの量を減少させる方法、または対象における生存期間を延長させる方法である。
他の態様では、本開示は、AMLの治療を必要とする対象においてAMLを治療する方法であって、本明細書に記載される、操作されたNK細胞もしくは細胞の集団、または医薬組成物を、AMLを治療するのに十分な量で対象に投与するステップを含む方法を提供する。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、AMLは、再発性AMLまたは難治性AMLである。
他の態様では、本開示は、AMLから寛解している対象においてAMLの再発を予防する方法であって、本明細書に記載される、操作されたNK細胞もしくは細胞の集団、または医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本明細書に記載される方法のいずれかは、投与のステップの前に、対象がNPM1cを発現するか否か、または対象がNPM1遺伝子におけるNPM1c変異を有するか否かを検出するステップ、および対象がNPM1cを発現するかまたはNPM1c変異を有する場合、投与のステップに進むステップを含む。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示の操作されたNK細胞または細胞の集団は、in vivo投与後に増大の増強を示す。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本明細書に記載される方法のいずれかは、1つまたは複数の追加の治療薬または手順を投与するステップをさらに含む。
一部の態様では、本開示は、対象におけるがんを治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される、操作されたNK細胞もしくは細胞の集団、または医薬組成物の使用であって、がんを含む細胞の細胞表面が、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示し;任意選択で、1つまたは複数の追加の治療薬または手順と組み合わされる、使用を提供する。
前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、対象はヒトである。
他の態様では、本開示は、(i)本明細書に記載される、操作されたNK細胞もしくは細胞の集団、または医薬組成物;(ii)任意選択で、1つまたは複数の追加の治療薬、および(iii)対象におけるがんの治療に使用するための説明書を含む1つまたは複数の容器を含むキットを提供する。
ヒトサイトカイン誘導性メモリー様(本明細書では相互交換可能に「メモリー様」、「CIML」、「ML」と称する)NK細胞分化の概要を示す図である。従来型のナイーブNK細胞を、IL-12、IL-15、およびIL-18の組合せ(または対照としてIL-15単独)によって12~16時間、予め活性化し、洗浄して、in vitroで(生存のための低用量のIL-15とともに)またはin vivoで(生存のためのrh IL-2またはrh IL-15とともにNSGマウスで)分化させる。IL-12/15/18で予め活性化することによって、大規模な増大およびメモリー様NK細胞への分化が生じた。2回目の(再)刺激に際して、メモリー様NK細胞は、対照またはナイーブなNK細胞と比較して、応答の増強を呈する。本例では、白血病標的細胞に応答して、プロトタイプNK細胞機能の読み出しとしてIFN-γの産生が示される。 初代の従来型NK細胞およびCIML NK細胞におけるLSL-RおよびASCT2の発現を示す図である。図2Aは、従来型初代ヒトNK細胞(cNK)またはサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞(CIML-NK)であったヒトNK(hNK)細胞におけるLDL-Rの発現のパーセント(%)を示すグラフである。図2Bは、cNK細胞またはCIML-NK細胞におけるASCT2の発現のパーセント(%)を示すグラフである。 初代の従来型NK細胞およびCIML NK細胞におけるLSL-RおよびASCT2の発現を示す図である。図2Cは、ヒヒエンベロープ糖タンパク質によってシュードタイプ化したレンチウイルス(BaEV-LV)が標的とするASCT1/2と、水疱性口内炎ウイルスGタンパク質によってシュードタイプ化したレンチウイルス(VSVG-LV)が標的とするLDL-Rの、NK細胞における相対的発現を示す概略図である。 図3Aは、NK細胞上に発現された抗NPM1c CAR、およびそれによるAML細胞上のHLA-A2複合体によって提示されたAIQ(AIQDLCLAV、配列番号1)(AIQ-HLA-A2複合体)の認識の概略を示す図である。抗NPM1c-CARベクターの概略図も示す。図3Bは、T細胞上に発現された抗NPM1c CARがAIQ-HLA-A2複合体を認識することを示すフローサイトメトリーデータを提供する図である。 AMLにおいてNPM1が変異していることを示す図である。概略図はXie, et al. Nat Biomed Eng (2021) 5:124から改編した。 非従来型レンチウイルス形質導入アプローチ(BaEVによってシュードタイプ化したレンチウイルス)を使用するCIML NK細胞の最適化されたCAR編集を示す図である。抗NPM1c NK細胞および非形質導入(UT)細胞におけるCAR scFvおよびGFPの発現を定量するフロープロットを示す。 図6Aは、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞を生成するために使用した方法およびレンチウイルス(例えばBaEVによってシュードタイプ化)を使用してCAR発現CIML NK細胞を生成するCAR構築物による形質導入を示す概略図である。図6Bは、50ng/mLのIL-15、10ng/mLのIL-12、および50ng/mLのIL-18の組合せで16時間、刺激したNK細胞におけるASCT2の発現のパーセント(%)を示すグラフである。 図6C~6Eは、IL-12およびIL-18の組合せ(図6C~図6D)、またはIL-12、IL-18、およびIL-15の組合せ(図6E)で刺激したhNK細胞におけるqPCRによって定量したASCT mRNAの発現の倍数変化を定量したグラフを提供する図である。対照細胞は、未処理、またはIL-15単独、IL-12単独、もしくはIL-18単独で処理した。 図6Fは、サイトカインの異なる組合せによって予め活性化したML NK細胞における、抗NPM1c CARをコードするヒヒエンベロープ糖タンパク質によってシュードタイプ化したレンチウイルス(BaEV-LV)による形質導入効率を示すヒストグラムである。 図7Aは、フローサイトメトリーを使用してCARの発現を測定することによって決定した、異なるヒトドナーから得て抗NPM1c CARをコードするBaEV-LVを形質導入したML-NK細胞についての形質導入率のグラフである(プロテインL結合の%として表す)。 図7Bは、GFPをコードするBaEV-LVを形質導入した初代ヒトおよびマウスのCIML NK細胞における効率的な遺伝子発現を示す図である。PBMC由来の初代hNK細胞を組換えヒトIL-12、IL-18、およびIL-15とともに終夜、予め活性化して、ヒトCIML NK細胞を生成させた。マウス脾由来のNK細胞を組換えマウスIL-12、IL-18、およびIL-15とともに終夜、予め活性化して、マウスCIML NK細胞を生成させた。 図7Cは、成熟および発達の段階に基づくhNK細胞の表現型マーカーの特徴を提供する図である。図7Dは、フローサイトメトリー分析によって、hNK細胞のサブセットを成熟の段階に基づいて低成熟(NK1=CD56brightCD16)、中成熟(NK2=CD56dimCD16KIRsまたはNK3=CD56dimCD16KIRsCD57)、または完全成熟(NK4=CD56dimCD16KIRsCD57)から区別する、生存しているCD56CD3細胞についてゲーティングするための戦略を提供する図である。 (図7Dの続き) 図7Eは、図7Dに示すゲーティング戦略に従って区別されるhNK細胞のサブセットNK1~NK4についてのASCT2の表面発現を定量する棒グラフを提供する図である。hNK細胞は4名の異なるヒトドナーから得た。図7Fは、図7Dに示すゲーティング戦略に従って区別されるhNK細胞のサブセットNK1~NK4についてのASCT2の表面発現を定量するヒストグラムを提供する図である。1名のヒトドナーから得たhNK細胞についてのデータを示す。 図8Aは、CAR ML-NK細胞の強力な抗AML機能を示す図である。NPM1cHLA-A2標的細胞との共培養の後の非形質導入(UT)細胞および抗NPM1c-CAR ML NK細胞におけるIFNγおよびCD107aの発現を定量するフロープロット(左パネル)および対応する棒グラフ(右パネル)を示す。 図8B~8Gは、OCI-AML3(NPM1cHLA-A2)細胞との共培養の後の、非形質導入NK細胞と比較した、BaEV-LVを使用して抗NPM1c CARを形質導入したCIML-NK細胞上の表現型マーカーの解析を示す図である。定量はCyTOFによって収集したマスサイトメトリーデータに基づいている。図8Bは、CD107a、サイトカイン(IFNγ)、および細胞傷害性マーカー(グランザイムB)の定量を提供する。 図8B~8Gは、OCI-AML3(NPM1cHLA-A2)細胞との共培養の後の、非形質導入NK細胞と比較した、BaEV-LVを使用して抗NPM1c CARを形質導入したCIML-NK細胞上の表現型マーカーの解析を示す図である。定量はCyTOFによって収集したマスサイトメトリーデータに基づいている。図8Cは、活性化マーカー(CD25、CD69、ICOS、CD226、CD62L)の定量を提供する。 図8B~8Gは、OCI-AML3(NPM1cHLA-A2)細胞との共培養の後の、非形質導入NK細胞と比較した、BaEV-LVを使用して抗NPM1c CARを形質導入したCIML-NK細胞上の表現型マーカーの解析を示す図である。定量はCyTOFによって収集したマスサイトメトリーデータに基づいている。図8Dは、活性化受容体(NKp30、NGD2D、NKp44)の定量を提供する。 図8B~8Gは、OCI-AML3(NPM1cHLA-A2)細胞との共培養の後の、非形質導入NK細胞と比較した、BaEV-LVを使用して抗NPM1c CARを形質導入したCIML-NK細胞上の表現型マーカーの解析を示す図である。定量はCyTOFによって収集したマスサイトメトリーデータに基づいている。図8Eは成熟マーカー(CD56、NKG2A、CD57)の定量を提供する。 図8B~8Gは、OCI-AML3(NPM1cHLA-A2)細胞との共培養の後の、非形質導入NK細胞と比較した、BaEV-LVを使用して抗NPM1c CARを形質導入したCIML-NK細胞上の表現型マーカーの解析を示す図である。定量はCyTOFによって収集したマスサイトメトリーデータに基づいている。図8Fは、疲弊マーカー(TIGIT)の定量を提供する。図8Gは、アポトーシスマーカー(TRAIL)の定量を提供する。 図9Aは、非形質導入(UT)ML NK細胞、CAR-s15(分泌型IL15を発現する抗NPM1c CAR ML NK細胞)、またはCAR-m15(膜結合IL15を発現する抗NPM1c CAR ML NK細胞)の15日間にわたるin vitro培養における細胞の増大を測定するグラフである。 図9Bは、CARの発現が形質導入の後も維持されていることを示す棒グラフ(図9B)および対応するフローチャート(図9C)を提供する図である。CARの発現は、非形質導入(UT)細胞、抗NPM1c CARのみのML NK細胞、CAR-s15 ML NK細胞、およびCAR-m15 ML NK細胞において形質導入後4日目および23日目に測定した。CARの発現は、生存NK細胞中のプロテインL結合の%として示す。 図9Cは、CARの発現が形質導入の後も維持されていることを示す棒グラフ(図9B)および対応するフローチャート(図9C)を提供する図である。CARの発現は、非形質導入(UT)細胞、抗NPM1c CARのみのML NK細胞、CAR-s15 ML NK細胞、およびCAR-m15 ML NK細胞において形質導入後4日目および23日目に測定した。CARの発現は、生存NK細胞中のプロテインL結合の%として示す。 図10Aは、CAR-s15 ML NK細胞およびCAR-m15 ML NK細胞が、NPM1c:HLA-A2発現標的細胞と共培養した場合にIFNγを発現することを示す棒グラフを提供する図である。NK細胞は、OCI-AML3(NPM1c+、HLA-A2+、Luc、上部グラフ)またはOCI-AML2(NPM1c-、HLA-A2+、Luc+、下部グラフ)である標的細胞を使用してエフェクター:標的比1:1で共培養した。対照細胞は非形質導入ML NK細胞であった。細胞は5時間共培養し、フローサイトメトリーを使用してIFNγの発現について解析した。 図10Bは、CAR-s15 ML NK細胞およびCAR-m15 ML NK細胞が、アポトーシス標的細胞のパーセント(%)によって測定して、NPM1c:HLA-A2発現標的細胞のアポトーシスを誘導することを示す線グラフを提供する図である。標的細胞は、OCI-AML3(NPM1c+、HLA-A2+、Luc+、上部グラフ)またはOCI-AML2(NPM1c、HLA-A2+、Luc+、下部グラフ)であった。細胞は、非形質導入ML-NK細胞、CAR-s15 ML-NK細胞、またはCAR m15 ML-NK細胞と4時間、表示したE:T比で共培養し、次いでフローサイトメトリーを使用してアネキシンV染色について解析した。 図10Cは、非形質導入ML-NK細胞、抗CAR NPM1cのみのML-NK細胞、CAR-s15 ML-NK細胞、またはCAR-m15 ML-NK細胞との異なるE:T比での24時間の培養の後の、標的細胞(OCI-AML3(NPM1c+、HLA-A2+、Luc+、左グラフ)またはOCI-AML2(NPM1c-、HLA-A2+、Luc+、右グラフ)における細胞の生存率を示す線グラフを提供する図である。 図10D~10Gは、細胞内NPM1cから誘導されたネオエピトープを標的とする操作されたメモリー様NK CARが、急性骨髄性白血病(AML)に対して強力な活性および特異性を呈することを示す図である。図10Dは、形質導入後72時間における初代ヒトCIML NK細胞における効率的なレンチウイルス媒介(BaEV-LV)CAR編集を示す。 図10D~10Gは、細胞内NPM1cから誘導されたネオエピトープを標的とする操作されたメモリー様NK CARが、急性骨髄性白血病(AML)に対して強力な活性および特異性を呈することを示す図である。図10Eは、抗NPM1c CARと膜結合IL-15との共形質導入によって、in vitroにおけるCAR-CIML NK細胞の増大が促進されることを示す。 図10D~10Gは、細胞内NPM1cから誘導されたネオエピトープを標的とする操作されたメモリー様NK CARが、急性骨髄性白血病(AML)に対して強力な活性および特異性を呈することを示す図である。図10Fは、フローサイトメトリー分析の前に、抗NPM1c CAR単独を形質導入、または抗NPM1c CARおよびmIL-15を共形質導入し、OCI-AML3標的細胞(NPM1c+HLA-2A+)によって4時間刺激したCIML NK細胞におけるIFN-ガンマおよびCD107aの発現を示す。図10Gは、抗NPM1c CAR単独を形質導入、または抗NPM1c CARおよびmIL-15を共形質導入したCIML NK細胞と4時間共培養したOCI-AML3(NPM1c+HLA-2A+)標的細胞の殺滅を示す。 図11Aは、抗NPM1c-CAR-ML NK細胞の生成およびOCI-AML3-Luc細胞を含むマウスの生成、ならびに引き続くCAR細胞による処置、ならびに腫瘍負荷のモニタリングの時系列を提供する図である。 図11Bは、図11Aに概略を示した研究に含めたマウスにおけるルシフェラーゼの発現の画像を提供する図である。ルシフェラーゼは、非形質導入細胞または分泌型IL-15(s15)、膜結合IL-15(m15)、もしくはCARのみ(IL-15なし)を発現する抗NPM1c CAR ML NK細胞を投与したマウスにおいて、3日目、10日目、および13日目に測定した。 図11Cは、腫瘍OCI-AML3細胞を担持したマウスにおける全体の(全)ルシフェラーゼの発現(画像は図11B)を示す線グラフを提供する図である。 ナチュラルキラー(NK)細胞の細胞選別を示す図である。 NK細胞の応答が活性化シグナルと阻害シグナルとの正味のバランスによって支配されていることを示す概略図である。 NK細胞の養子免疫伝達の戦略を示す概略図である。 免疫系におけるメモリーを示す概略図である。Rosenblum et al, 2016から改編した。 IL-12およびIL-18による従来型NK細胞の活性化によってメモリー様NK細胞への分化が誘導されることを示す図である。Romee et al, Blood, 2012; Romee, et al, Science TM, 2016を参照されたい。 再発/難治性AMLにおけるヒトでは最初のメモリー様NK細胞の第1相試験を示す図である。 養子免疫伝達の後でCIML NK細胞が増殖し増大することを示す図である。Romee, et al. Science TM, 2016から改編した。 (図18-1の続き) (図18-2の続き) メモリー様NK細胞が安全であり、有望な臨床活性を有していることを示す図である。Romee et al, Science TM, 2016を参照されたい。 幹細胞移植後の再発を有する患者における第1a/b相試験の概要を示す概略図である。ハプロにおけるNK細胞の欠損およびその上にハプロHCtの後で再発した患者について効果的かつ安全な治療の選択肢が存在しないことに基づいて、メモリー様NK細胞の第1相試験を開始した。左パネルに示すように、移植後の再発には極めて不良な転帰が伴っており、HLAのミスマッチは、GVHDのリスクが増大したDLIを使用するためには危険な状況になることがある。NK細胞を使用し、元の幹細胞移植と同じドナーからの免疫適合性のメモリー様NK細胞を生成した。次いで患者は低用量IL-2の7回の投与を受ける。 メモリー様NK(「Mem-NK」)細胞のin vivoにおける多量の増大および長期の/保持された持続性を示す図である。ほぼ500倍の増大を示す。CIML NK細胞は少なくとも65日間は検出可能で、マウスで観察されたことに類似しており、ヒトにおけるこれらの細胞の長い半減期が確認された。持続性が長いことによって、これらの細胞は、NK細胞に基づく免疫療法のアプローチのためのプラットフォームとして極めて魅力的なものにされる。 28日目におけるTregの最小の増大を伴う成熟NK細胞の増大を示す図である。 芽球化形質細胞様DC新生物(BPDCN)を有する患者がメモリー様NK細胞の注入によって寛解に達することを示す図である。 進行性の頭頚部がんにおけるCTLA-4の阻害およびメモリー様NK細胞による免疫細胞療法を示す図である。H&Nがん患者においてNKの浸潤によってPFSが予測されることを示すデータがある。また、CTAL4遮断ipiは腫瘍内Tregの枯渇を誘導する。例えば、第1相治験は、メモリー様NK細胞とIpiを組み合わせ、次いで長時間作用型IL-15スーパーアゴニストも与える。 抗体動員分子(ARM)が新規な二重特異的NK細胞エンゲージャーであることを示す図である。 自己HCTを伴うMRDMMにおけるCD38 ARMおよびメモリー様NK細胞の第I/II相治験を示す図である。 CARの開発のためのメモリー様NK細胞プラットフォームの開発を示す図である。 pHIV-CAR-CD19hscFv-P2A-GFP(8606bp)のベクターマップを示す図である。
本開示は、異種性ポリペプチド(例えば、本明細書に記載されるCAR)を発現するサイトカイン誘導性メモリー様ナチュラルキラー(NK)細胞の集団を作製するための方法を提供する。本明細書に記載されるように、本開示の方法は、細胞形質導入の従来の方法、例えば、水疱性口内炎ウイルスG(VSVG)糖タンパク質を組み込んだ古典的なシュードタイプ化レンチウイルスベクターを使用する方法に比して、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団における形質導入効率の増大をもたらす。本明細書において実証されるように、VSVG糖タンパク質に結合するLDL受容体は、NK細胞(例えば、従来のNK細胞またはサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞のいずれも)によってほとんど発現されない。理論には拘束されないが、LDL受容体がほとんど発現されないことにより、VSVG糖タンパク質によってシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターがNK細胞への効果的な取り込みを生じることが妨げられる。
対照的に、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞は、アラニン・セリン・システイン輸送体2(ASCT2)を増大したレベルで発現することが発見された。本明細書において実証されるように、(i)IL-12およびIL-18、または(ii)IL-12、IL-18、およびIL-15によって予め活性化されたサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞は、対照NK細胞(例えば、IL-15のみによって活性化された従来のNK細胞)に比して、約1.5~2倍に増大したレベルでASCT2を発現する。一部の態様では、ASCTのレベルは、対照NK細胞(例えば、IL-15のみによって活性化された従来のNK細胞)に比して、約1.5~3倍に増大した。さらに、ASCT2に結合する糖タンパク質によってシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターは、サイトカイン誘導性NK細胞において高レベルの形質導入(例えば、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%)をもたらすことが発見された。一部の実施形態では、レトロウイルス糖タンパク質は、ASCT2に結合するヒヒエンベロープ(BaEV)糖タンパク質である。その上、高レベルのASCT2を発現するサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞における形質導入は、低レベルのASCT2を発現する対照NK細胞(例えば、IL-15のみによって活性化された従来のNK細胞)に比して増加することが実証された。理論には拘束されないが、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞によるASCTの発現増加は、ASCT2結合性糖タンパク質を含むシュードタイプ化レンチウイルスベクター(例えば、BaEV)の効率的な結合および取り込みを可能にする。
したがって、一部の態様では、本開示は、異種性ポリペプチド(例えば、本明細書に記載されるCARポリペプチド)を発現するサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団を作製するための方法であって、ASCT2を発現するサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団を、ASCTに結合する糖タンパク質を含むシュードタイプ化レンチウイルスベクター(例えば、BaEV)と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の態様では、ASCT2を発現するサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団の提供は、初代ヒトNK細胞の集団を、IL-12、IL-18、およびIL-15と接触させることを含む。一部の態様では、ASCT2を発現するサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団の提供は、初代ヒトNK細胞の集団をIL-12およびIL-18と接触させることを含む。一部の態様では、初代ヒトNK細胞の集団を、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団、例えば、対照NK細胞(例えば、IL-15のみと接触させた従来のNK細胞)に比して1つまたは複数の最適な特性を有する、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させる。
加えて、本開示は、少なくとも一部には、ヒト初代NK細胞の集団におけるASCT2の発現が、NK細胞の成熟および/または発生の段階と相関することの発見に基づく。本明細書において実証されるように、相対的に成熟しておらず、発生が進んでおらず、“幹細胞様”であり、および/または増殖性である表現型に特徴的なマーカーを発現するヒト初代NK細胞の集団のサブセット(例えば、CD56brightCD16low/-NKG2ACD57KIRs)は、より成熟しており、および/または発生が進んでいる表現型に特徴的な表現型マーカーを発現する集団のサブセット(例えば、CD56dimCD16NKG2A+/-KIRsCD57)に比して、ASCT2発現のレベルが増大している。理論には拘束されないが、相対的に成熟していないヒト初代NK細胞によるASCT2の発現がより高いことは、より成熟している表現型を有し、かつASCT発現がより低いヒト初代NK細胞に比して、ASCTに結合する糖タンパク質によってシュードタイプ化されたレンチウイルス(例えば、BaEV)を使用する形質導入効率の増大をもたらすと考えられる。
さらに、本開示は、ヌクレオフォスミンにおける4ヌクレオチド重複でありAMLの約35%においてがん遺伝子変異のドライバーとなっている、NPM1cにおいて同定された腫瘍特異的発がんドライバー遺伝子変異に起因する細胞内ネオ抗原に由来するネオエピトープを標的とする新規キメラ抗原受容体(CAR)を発現する、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ナチュラルキラー(NK)細胞を提供する。この変異は、最も一般的なHLA-A2アレルによって提示されるネオエピトープを作り出す。
本開示の抗NPM1c CAR発現サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞(“ML NK”細胞)は、NPM1c発現細胞をin vitroおよびin vivoで効果的に殺滅することが示されている。理論には拘束されないが、本開示の操作されたCAR発現ML NK細胞は、少なくともサイトカイン放出症候群、神経毒性および/または移植片対宿主病(GVHD)を回避する、軽減する、または排除することによって、CARを発現するT細胞を上回る治療上の利益をもたらすと考えられる。本開示の操作されたCAR発現ML NK細胞は、従来のNK細胞に比して、インターフェロン-γ(INF-γ)産生および腫瘍細胞に対する細胞傷害が増強していることが示されている。本明細書において実証されるように、抗NPM1c CARをそのようなML NK細胞に組み入れることにより、NPM1cを発現する標的細胞のアポトーシスを誘導し、かつそのような標的細胞の全生存期間を減少させる細胞がもたされた。さらに、NPM1cを発現するAML細胞をマウスに注射した場合に、本開示の操作されたCAR発現ML NK細胞は、in vivoで全体的腫瘍量を減少させた。本明細書にさらに記載されるように、そのような操作されたCAR発現ML NK細胞の有効性は、そのような細胞が分泌型または膜結合型のヒトIL-15を発現する場合に高くなる。特に、膜結合型のヒトIL-15を発現する本開示の操作されたCAR発現ML NK細胞は、持続性および生存性の増大、ならびに有効性の増強を示した。
したがって、本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するML NK細胞は、NPM1c変異を保有するがんを治療するための標的化免疫療法のために有用である。例えば、本明細書に開示されるCARポリペプチドを発現するML NK細胞は、AMLを治療するための標的化免疫療法のために有用である。一態様では、NPM1cネオエピトープがMHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成している(またはそれによって提示される)場合に、そのようなエピトープを含む抗原に特異的に結合するCARを発現するML NK細胞が、本明細書において提供される。一態様では、以下のアミノ酸配列:AIQDLCLAV(配列番号1)、AIQDLCVAV(配列番号71)、CLAVEEVSL(配列番号72)、VEEVSLRK(配列番号73)、AVEEVSLR(配列番号74)、AVEEVSLRK(配列番号75)、CLAVEEVSLRK(配列番号76)のうちのネオエピトープがMHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成している場合に、そのようなエピトープの1つまたは複数に特異的に結合するCARを発現するML NK細胞が、本明細書において提供される。一態様では、MHCクラスIタンパク質単独には結合しないか、または実質的に結合しないCARを発現するML NK細胞が、本明細書において提供される。一態様では、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成した対照ペプチド(例えば、対照ペプチドは、NY-ESO-1エピトープ(例えば、配列番号62を含むペプチド)またはインフルエンザウイルスM1エピトープ(例えば、配列番号63を含むペプチド)である)には結合しないか、または実質的に結合しないCARを発現するML NK細胞が、本明細書において提供される。一態様では、NPM1cネオエピトープ単独(MHCクラスIタンパク質を伴わない)には結合しないか、または実質的に結合しないCARを発現するML NK細胞が、本明細書において提供される。一部の態様では、NPM1cネオエピトープは、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)を含み、MHCクラスIタンパク質は、HLA-A2タンパク質(例えば、HLA-A*02:01アレルによってコードされるタンパク質)である。一部の態様では、抗原はがん細胞の表面にある(例えば、がんがNPM1c+である場合、例えば、がんがAMLである場合)。一態様では、HLA-A2タンパク質(例えば、HLA-A*02:01アレルによってコードされるタンパク質)と複合体を形成したAIQDLCLAV(配列番号1)を含むアミノ酸配列に特異的に結合するCARを発現するML NK細胞が、本明細書において提供される。
一態様では、本明細書に記載されるCAR発現メモリー様NK細胞(および任意選択で、薬学的に許容される担体)を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
一態様では、本明細書に記載されるサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞によって発現されるCARポリペプチドは、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインは、HLA-A2タンパク質(例えば、HLA-A*02:01アレルによってコードされるタンパク質)と複合体を形成したAIQDLCLAV(配列番号1)を含むアミノ酸配列に特異的に結合する。
一態様では、CARポリペプチドの発現は、ML NK細胞を、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを表面に提示しているがん細胞(例えば、がんはAMLである)に標的化させる。一態様では、CARポリペプチドの発現は、ML NK細胞を、HLA-A2タンパク質(例えば、HLA-A*02:01アレルによってコードされるタンパク質)と複合体を形成したアミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)を表面に提示しているがん細胞(例えば、がんはAMLである)に標的化させる。
一態様では、対象(例えば、ヒト)においてがんを治療する方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、MHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示しており、本明細書に記載される抗NPM1c CAR発現メモリー様NK細胞または前記細胞の集団を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。一態様では、がんを含む細胞の細胞表面は、MHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する。一態様では、がんを含む細胞の細胞表面は、HLA-A2タンパク質(例えば、HLA-A*02:01アレルによってコードされるタンパク質)と複合体を形成したAIQDLCLAV(配列番号1)を含むアミノ酸配列を提示する。
一部の態様では、対象(例えば、ヒト)においてNPM1c陽性がんを治療する方法であって、本明細書に記載される抗NPM1c CAR発現メモリー様NK細胞または前記細胞の集団を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。
一態様では、対象(例えば、ヒト)においてAMLを治療する方法であって、本明細書に記載される抗NPM1c CAR発現メモリー様NK細胞または前記細胞の集団を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。
サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞を発現する抗NPM1cキメラ抗原受容体
一部の実施形態では、本開示は、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドを発現するように操作された、サイトカイン誘導性メモリー様(ML)NK細胞、または前記細胞の集団を提供する。
キメラ抗原受容体ポリペプチド
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞は、CARポリペプチドを発現するように操作される。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、本明細書に記載される抗体、もしくはその抗原結合断片、または二重特異性分子を含む細胞外ドメインを含む。
CARは、遺伝子操作された人工的な膜結合タンパク質であり、免疫エフェクター細胞(例えば、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞)において発現された場合に、そのような免疫エフェクター細胞を抗原に導き、一般に、免疫エフェクター細胞を刺激して、抗原を提示する細胞を殺滅する。したがって、CARは、免疫エフェクター細胞に所望の抗原特異性、例えば、抗腫瘍特異性(特に、抗原特異性はCARの細胞外ドメインによって付与される)を付与するために使用され得る。
CARは一般に、細胞上に提示される1つまたは複数の抗原に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞外ドメインが1つまたは複数の抗原に結合した際に活性化シグナルを免疫エフェクター細胞に伝達する細胞内ドメインとを含む。ある特定の実施形態では、CARは、以下の3つのドメインを含有する:1)典型的にはシグナルペプチド、リガンドまたは抗原認識領域(例えば、scFv)および可動性スペーサーを含む、細胞外ドメイン;2)膜貫通(TM)ドメイン;3)典型的には1つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン(細胞質ドメインとしても知られる)。CARの細胞外ドメインは細胞の外側に存在し、細胞外空間に露出されているため、そのリガンド/抗原との相互作用のためにアクセス可能である。TMドメインは、CARがエフェクター細胞の細胞膜に係留されることを可能にする。CARの細胞内ドメインは、細胞外ドメインの由来となったタンパク質とは異なるシグナル伝達タンパク質に由来する1つまたは複数の細胞質ドメインを含み得る。細胞内ドメインは、CARがそのリガンド/抗原に結合した際にエフェクター細胞活性化を助ける。一部の実施形態では、エフェクター細胞活性化は、サイトカインおよびケモカインの産生の誘導、ならびにエフェクター細胞の細胞溶解活性の活性化を含む。一部の実施形態では、CARは、細胞傷害性を腫瘍細胞へと再方向付けする。
CARの抗原結合ドメインと標的細胞の表面上のその標的抗原とのエンゲージメントは、CARのクラスター化をもたらし、活性化刺激をCAR含有細胞に送達する。一部の実施形態では、CARの主な特徴は、免疫エフェクター細胞の特異性を再方向付けし、それによって、増殖、サイトカイン産生、ファゴサイトーシス、またはモノクローナル抗体、可溶性リガンド、もしくは細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を活用する主要組織適合複合体(MHC)非依存的な様式で標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を誘発する、その能力である。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるCARポリペプチドは、ネオ抗原(例えば、がんネオ抗原または腫瘍ネオ抗原)に結合する細胞外ドメインを含む。がんネオ抗原は、そのようながん細胞に生じた変異が原因で、がん細胞のみに存在する抗原である。がん抗原は、細胞内で発現されて、がん細胞の表面上のMHCクラスIタンパク質によって提示され得る。例えば、本明細書で想定されるCARポリペプチドによって標的化されるがんネオ抗原は、NPM1c:HLA-A2であってもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合断片(例えば、scFv)は、CARポリペプチドを作るために使用される。一部の実施形態では、NPM1c:HLA-A2に結合する抗体またはその抗原結合断片(例えば、scFv)が、CARポリペプチドを作製するために使用される。一部の実施形態では、CARポリペプチドの細胞外結合ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質(例えば、HLA-2)と複合体を形成した(またはそれによって提示される)変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープ(例えば、NPM1cネオエピトープ)に結合する。
一部の態様では、細胞外(抗原結合)ドメインと、膜貫通ドメインと、抗原結合ドメインが抗原に結合した際にNK細胞を刺激するのに十分なCD3ζ配列の細胞質配列を含む細胞内(細胞質)ドメインと、さらに任意選択で、抗原結合ドメインが抗原に結合した場合にNK細胞の共刺激をもたらす、1つまたは複数の(例えば、2つ、3つ、または4つの)共刺激タンパク質の細胞質配列(例えば、B7-H3、BTLA、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD80、CD160、CD244、ICOS、LAG3、LFA-1、LIGHT、NKG2C、4-1BB、OX40、PD-1、PD-L1、TIM3、2B4、DAP10、CD137、DAP12、およびCD83に特異的に結合するリガンドのうちの1つまたは複数の細胞質配列)とを含む、CARポリペプチドが、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、CARは、リンカーをさらに含み得る。例示的な細胞外(抗原結合)ドメイン、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞内(細胞質)ドメインを含む、CARおよびCAR発現免疫エフェクター細胞のさらなる態様は、例えば、Kakarla et al., Cancer J. 20:151-155, 2014; Srivastava et al., Trends Immunol. 36:494-502, 2015; Nishio et al., Oncoimmunology 4(2): e988098, 2015; Ghorashian et al., Br. J. Haematol. 169:463-478, 2015; Levine, Cancer Gene Ther. 22:79-84, 2015; Jensen et al., Curr. Opin. Immunol. 33:9-15, 2015; Singh et al., Cancer Gene Ther. 22:95-100, 2015; Li et al., Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 22:1753-1756, 2014; Gill et al., Immunol. Rev. 263:68-89, 2015; Magee et al., Discov. Med. 18:265-271, 2014; Gargett et al., Front. Pharmacol. 5:235, 2014; Yuan et al., Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 22:1137-1141, 2014; Pedgram et al., Cancer J. 20:127-133, 2014; Eshhar et al., Cancer J. 20:123-126, 2014; Ramos et al., Cancer J. 20:112-118, 2014; Maus et al., Blood 123:2625-2635, 2014; Jena et al., Curr. Hematol. Malig. Rep. 9:50-56, 2014; Maher et al., Curr. Gene Ther. 14:35-43, 2014; Riches et al., Discov. Med. 16:295-302, 2013; Cheadle et al., Immunol. Rev. 257:83-90, 2014; Davila et al., Int. J. Hematol. 99:361-371, 2014; Xu et al., Cancer Lett. 343:172-178, 2014; Kochenderfer et al., Nat. Rev. Clin. Oncol. 10:267-276, 2013; Hosing et al., Curr. Hematol. Malig. Rep. 8:60-70, 2013; Hombach et al., Curr. Mol. Med. 13:1079-1088, 2013; Xu et al., Leuk. Lymphoma 54:255-260, 2013; Gilham et al., Trends Mol. Med. 18:377-384, 2012; Lipowska-Bhalla et al., Cancer Immunol. Immunother. 61:953-962, 2012; Chmielewski et al., Cancer Immunol. Immunother. 61:1269-1277, 2013; Jena et al., Blood 116:1035-1044, 2010; Dotti et al, Immunology Reviews 257(1): 107-126, 2013; Dai et al., Journal of the National Cancer Institute 108(7): djv439, 2016; Wang and Riviere, Molecular Therapy-Oncolytics 3: 16015, 2016;米国特許出願公開第2018/0057609号明細書号明細書;同2018/0037625号明細書;同2017/0362295号明細書;同2017/0137783号明細書;同2016/0152723号明細書、同2016/0206656号明細書、同2016/0199412号明細書、同2016/0208018号明細書、同2015/0232880号明細書、同2015/0225480号明細書;同2015/0224143号明細書;同2015/0224142号明細書;同2015/0190428号明細書;同2015/0196599号明細書;同2015/0152181号明細書;同2015/0140023号明細書;同2015/0118202号明細書;同2015/0110760号明細書;同2015/0099299号明細書;同2015/0093822号明細書;同2015/0093401号明細書;同2015/0051266号明細書;同2015/0050729号明細書;同2015/0024482号明細書;同2015/0023937号明細書;同2015/0017141号明細書;同2015/0017136号明細書;同2015/0017120号明細書;同2014/0370045号明細書;同2014/0370017号明細書;同2014/0369977号明細書;同2014/0349402号明細書;同2014/0328812号明細書;同2014/0322275号明細書;同2014/0322216号明細書;同2014/0322212号明細書;同2014/0322183号明細書;同2014/0314795号明細書;同2014/0308259号明細書;同2014/0301993号明細書;同2014/0296492号明細書;同2014/0294784号明細書;同2014/0286973号明細書;同2014/0274909号明細書;同2014/0274801号明細書;同2014/0271635号明細書;同2014/0271582号明細書;同2014/0271581号明細書;同2014/0271579号明細書;同2014/0255363号明細書;同2014/0242701号明細書;同2014/0242049号明細書;同2014/0227272号明細書;同2014/0219975号明細書;同2014/0170114号明細書;同2014/0134720号明細書;同2014/0134142号明細書;同2014/0120622号明細書;同2014/0120136号明細書;同2014/0106449号明細書;同2014/0106449号明細書;同2014/0099340号明細書;同2014/0086828号明細書;同2014/0065629号明細書;同2014/0050708号明細書;同2014/0024809号明細書;同2013/0344039号明細書;同2013/0323214号明細書;同2013/0315884号明細書;同2013/0309258号明細書;同2013/0288368号明細書;同2013/0287752号明細書;同2013/0287748号明細書;同2013/0280221号明細書;同2013/0280220号明細書;同2013/0266551号明細書;同2013/0216528号明細書;同2013/0202622号明細書;同2013/0071414号明細書;同2012/0321667号明細書;同2012/0302466号明細書;同2012/0301448号明細書;同2012/0301447号明細書;同2012/0060230号明細書;同2011/0213288号明細書;同2011/0158957号明細書;同2011/0104128号明細書;同2011/0038836号明細書;同2007/0036773号明細書;および同2004/0043401号明細書に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
例示的な細胞外(抗原結合)ドメイン、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞内(細胞質)ドメインを含む、CARおよびCAR発現免疫エフェクター細胞のさらなる態様は、国際公開第2016/168595号パンフレット;国際公開第12/079000号パンフレット号;同2015/0141347号パンフレット;同2015/0031624号パンフレット;同2015/0030597号パンフレット;同2014/0378389号パンフレット;同2014/0219978号パンフレット;同2014/0206620号パンフレット;同2014/0037628号パンフレット;同2013/0274203号パンフレット;同2013/0225668号パンフレット;同2013/0116167号パンフレット;同2012/0230962号パンフレット;同2012/0213783号パンフレット;同2012/0093842号パンフレット;同2012/0071420号パンフレット;同2012/0015888号パンフレット;同2011/0268754号パンフレット;同2010/0297093号パンフレット;同2010/0158881号パンフレット;同2010/0034834号パンフレット;同2010/0015113号パンフレット;同2009/0304657号パンフレット;同2004/0043401号パンフレット;同2014/0322253号パンフレット;同2015/0118208号パンフレット;同2015/0038684号パンフレット;同2014/0024601号パンフレット;同2012/0148552号パンフレット;同2011/0223129号パンフレット;同2009/0257994号パンフレット;同2008/0160607号パンフレット;同2008/0003683号パンフレット;同2013/0121960号パンフレット;同2011/0052554号パンフレット;同2010/0178276号パンフレットに記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
一部の態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むCARであって、細胞外ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの抗体、もしくはその抗原結合断片、または二重特異性分子を含むCARが、本明細書において提供される。一部の態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)であって、細胞外結合ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの抗体、もしくはその抗原結合断片、または二重特異性分子を含み、そのような抗体、その抗原結合断片、または二重特異性分子が、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成した(またはそれによって提示される)NPM1cネオエピトープを含む抗原に結合する、CARが、本明細書において提供される。
一部の態様では、実施例の項に記載される(例えば、実施例1を参照)、NPM1c CARの細胞内、膜貫通および/または細胞外ドメインを有するキメラ抗原受容体(CAR)が、本明細書において提供される。
一部の態様では、以下:CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、2B4、DAP10、CD137およびDAP12、からなる群から選択される、1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むCARが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、CD3-ゼータシグナル伝達ドメインと、任意選択で、4-1BB共刺激ドメインとを含む細胞内ドメインを含むCARが、本明細書において提供される。一部の態様では、CD3-ゼータ、CD8、CD28、NKG2D、CD16、NKp44またはNKp46の膜貫通ドメインを含むCARが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、CD8膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含むCARが、本明細書において提供される。一部の態様では、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片(例えば、scFv)を含む細胞外ドメインを含むCARが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成した(またはそれによって提示される)変異型ヌクレオフォスミンタンパク質エピトープ(例えば、NPM1cネオエピトープ)を含む抗原に特異的に結合する、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片(例えば、scFv)を含む細胞外ドメインを含むCARが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成した(またはそれによって提示される)AIQDLCLAV(配列番号1)ネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片(例えば、scFv)を含む細胞外ドメインを含むCARが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、VHおよびVLを含む本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片(例えば、scFv)を含む細胞外ドメインを含むCARポリペプチドであって、VHが、配列番号5のアミノ酸配列、または配列番号5と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%もしくは99%同一なアミノ酸配列を含み、VLが、配列番号3のアミノ酸配列、または配列番号3と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%もしくは99%同一なアミノ酸配列を含む、CARポリペプチドが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、配列番号9のアミノ酸配列を有するVH CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を有するVH CDR2、配列番号11のアミノ酸配列を有するCDR3を含むVHを含み、ならびに/または配列番号6のアミノ酸配列を有するVL CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を有するVL CDR2、および配列番号8のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含むVLを含む、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片(例えば、scFv)を含む細胞外ドメインを含むCARポリペプチドが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHを含み、VHのCDRが配列番号5のアミノ酸配列を有し、ならびに/またはVL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLを含み、VLのCDRが配列番号3のアミノ酸配列を有する、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片(例えば、scFv)を含む細胞外ドメインを含むCARポリペプチドが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸配列を有するscFv、または配列番号2と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%もしくは99%同一なアミノ酸配列を有するscFvを含む細胞外ドメインを含むCARポリペプチドが、本明細書において提供される。
CARの細胞外(抗原結合)ドメイン
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞において発現されるCARポリペプチドは、細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは抗原結合ドメインを含む。
抗原結合ドメインの非限定的な例には、以下のものが挙げられる:モノクローナル抗体(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、およびIgD)(例えば、完全ヒト抗体またはキメラ(例えば、ヒト化)抗体)、抗体の抗原結合断片(例えば、Fab、Fab’、またはF(ab’)断片)(例えば、完全ヒト抗体またはキメラ(例えば、ヒト化)抗体の断片)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、scFv、scFv-Fc、(scFv)、scFab、bis-scFv、hc-IgG、BiTE、単一ドメイン抗体(例えば、V-NARドメインまたはVhHドメイン)、IgNAR、および多重特異性(例えば、二重特異性抗体)抗体。一部の実施形態では、抗原結合ドメインはscFvを含む。これらの抗原結合ドメインを作製する方法は、当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、標的抗原に特異的に結合し得る抗体、例えば、免疫グロブリン分子(例えば、軽鎖または重鎖免疫グロブリン分子)および免疫グロブリン分子の免疫学的活性(抗原結合)断片の、少なくとも1つの(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの)CDR(例えば、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン由来の3つのCDRのうちのいずれか、および/または免疫グロブリン重鎖可変ドメイン由来の3つのCDRのうちのいずれか)を含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖抗体(例えば、V-NARドメインもしくはVHドメイン、または本明細書に記載される単鎖抗体のいずれか)である。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体分子全体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)またはマルチマー抗体(例えば、二重特異性抗体)である。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインには、抗体断片および多重特異性(例えば、二重特異性)抗体または抗体断片が含まれる。抗体およびその抗原結合断片の例としては、単鎖Fv(scFv)、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)、ジスルフィド連結Fv(sdFv)、Fv、およびVLドメインまたはVHドメインのいずれかを含有する断片が挙げられるが、これらには限定されない。
本明細書において提供されるさらなる抗原結合ドメインは、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性(マルチマー、例えば、二重特異性)の、ヒト抗体、キメラ抗体(例えば、ヒト-マウスキメラ)、単鎖抗体、細胞内で生成される抗体(すなわち、イントラボディ)、およびそれらの抗原結合断片である。抗体またはその抗原結合断片は、任意の型(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えば、IgG、IgG、IgG、IgG、IgA、およびIgA)、またはサブクラスのものであり得る。
抗原結合ドメインのさらなる例は、IgGの抗原結合断片(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4の抗原結合断片)(例えば、ヒトまたはヒト化IgG、例えば、ヒトまたはヒト化IgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4の抗原結合断片)、IgAの抗原結合断片(例えば、IgA1またはIgA2の抗原結合断片)(例えば、ヒトまたはヒト化IgA、例えば、ヒトまたはヒト化IgA1もしくはIgA2の抗原結合断片)、IgDの抗原結合断片(例えば、ヒトまたはヒト化IgDの抗原結合断片)、IgEの抗原結合断片(例えば、ヒトまたはヒト化IgEの抗原結合断片)、またはIgMの抗原結合断片(例えば、ヒトまたはヒト化IgMの抗原結合断片)である。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、例えば、食塩水中またはリン酸緩衝食塩水中で、特定の抗原(例えば、腫瘍関連抗原)に、約1×10-7Mまたはより強い(例えば、約1×10-8Mもしくはより強い、約1×10-9Mもしくはより強い、約500nMもしくはより強い、約100nMもしくはより強い、約25nMもしくはより強い、約15nMもしくはより強い、約7nMもしくはより強い、約5nMまたはそれ未満、または約1nMもしくはより強い)親和性(K)で結合することができる。
当業者には理解されるように、CARに含められる抗原結合ドメインの選択は、それを必要とする対象において標的とされる細胞(例えば、がん細胞または腫瘍)の表面を規定するリガンドの型および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインを、腫瘍特異的抗原(TSA)、例えば、がんネオ抗原を認識するように選択してもよい。例えば、腫瘍特異的抗原は、MHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成した(またはそれによって提示される)NMP1cネオ抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)であってもよい。一部の実施形態では、NMP1cネオ抗原は、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、急性骨髄性白血病の腫瘍抗原を認識する抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原(TSA)、例えば、急性骨髄性白血病ネオ抗原である。TSAは、腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞上には存在しない。一実施形態では、腫瘍抗原は腫瘍特異的抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍特異的抗原は、患者の腫瘍細胞を配列決定し、腫瘍中にのみ見出される変異したタンパク質を同定することによって決定される。これらの抗原は、「ネオ抗原」と称される。ネオ抗原がひとたび同定されると、それに対して治療用抗体を産生させて、本明細書に記載される方法に使用することができる。一実施形態では、ネオ抗原はNPM1cネオ抗原である。一実施形態では、NMP1cネオ抗原は、MHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2)、例えば、NPM1c:HLA-A2と複合体を形成している(またはそれによって提示される)。
CARエフェクター細胞(例えば、CAR ML NK細胞)によって標的化し得る腫瘍抗原(例えば、腫瘍関連抗原(TAA)および腫瘍特異的抗原(TSA))には、NPM1c:HLA-A2が含まれるが、これには限定されない。一実施形態では、腫瘍特異的抗原はNPM1c:HLA-A2である。
一部の実施形態では、CARは、MHCタンパク質(例えば、MHCクラスIタンパク質)と複合体を形成した(またはそれによって提示される)ネオエピトープ(例えば、がんネオエピトープ)を含む抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCタンパク質単独には結合しないか、または実質的に結合しない。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合しない。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ネオエピトープ単独(MHCタンパク質を伴わない)には結合しないか、または実質的に結合しない。
機能的MHCクラスI分子は、α重鎖およびβ2-ミクログロブリン鎖を含む。MHCクラスI分子によるペプチド結合は、ペプチドアミノ酸側鎖と、重鎖のα1およびα2ドメインによって形成されるMHC分子のペプチド結合グルーブ内部の分散したポケットとの相互作用によって達成される。典型的には、ヒト白血球抗原(HLA)の場合、主な結合エネルギーは、ペプチドの位置2およびC末端の残基とMHC分子のそれぞれBおよびF結合ポケットとの相互作用に由来するが、ペプチド全域にわたる側鎖がMHCの結合能力を向上させるかまたは減じさせることができる(例えば、Guo, et al (1992) Nature 360:364; Silver et al (1992) Nature 360:367; Gorga et al (1992) Proteins 12;87; Madden (1995) Annu Rev Immunol 13:587; Madden et al (1993) Cell 75;693; Madden et al (1992) Cell 70:1035; Bjorkman, et al (1987) Nature 329:512; Saper et al (1991) J Mol Biol 219:277を参照)。9アミノ酸残基のペプチドの場合、C末端残基(位置9)は、MHC分子のF結合ポケットと相互作用する。
MHC分子は極めて多型性であり、数千ものアレル変異体がクラスIAおよびB座位で同定されている。多型のほとんどはペプチド結合ポケットに存在し、その結果、MHC分子は多岐にわたるペプチド結合特異性を有する。この多型性にもかかわらず、当技術分野では、HLAクラスI分子を、共通のペプチド結合特異性に基づいて、複数のグループ(すなわち、スーパータイプ)にまとめることができることが公知である。各グループ(スーパータイプ)は、「アンカー残基」またはMHC結合のために重要な残基であるペプチドの位置を反映するペプチドコンセンサス配列によって定義される。例えば、A2-スーパータイプのHLAクラスI分子(すなわち、HLA-A2、またはHLA-A*02アレルグループによってコードされるタンパク質)は、ペプチドの位置2に小型の脂肪族残基(例えば、アラニン、チロシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン)、ならびにC末端に脂肪族残基(例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン)または小型の疎水性残基(例えば、アラニン、バリン)を有するペプチドに対して、共通の特異的結合を有する(例えば、Sidney, et al (2008) BMC Immunology 9:1を参照)。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質、例えば、HLA-A2と複合体を形成した(またはそれによって提示される)急性骨髄性白血病(AML)関連変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に結合する(例えば、特異的に結合する)。
AMLのゲノム解析により、AMLは他のほとんどの成人がんよりも変異負荷が少なく、AML患者あたりのコーディング変異は平均13個であることが示されている(Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Alexandrov et al., NATURE 500: 415 (2013); Kandoth et al., NATURE 502 333 (2013)を参照)。しかし、AMLにおける体細胞変異は、しばしば同一の遺伝子に存在し(Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Papaemmanuil et al., N Engl J Med 374: 2209 (2016)を参照)、このため、これらのホットスポット変異に由来するネオ抗原は、腫瘍特異的免疫療法の魅力的な標的となっている(van der Lee et al., J CLIN INVEST 129: 774 (2019)を参照)。最もよく見られる変異の一つに、ヌクレオフォスミン(NPM1;NPM1によってコードされる)をコードする重要なドライバー遺伝子における4ヌクレオチド重複があり、これは成人AML患者全体の30~35%に存在する(Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Papaemmanuil et al., N Engl J Med 374: 2209 (2016); Falini et al., N Engl J Med 352: 254 (2005)を参照)。NPM1におけるそのような変異は異常な細胞質局在をもたらし、この変異型タンパク質はNPM1cと称される。AMLに関連するNPM1c変異型タンパク質は、HLAクラスI拘束性であって、HLA-A*02:01アレルおよび他のいくつかのアレルを有する患者の白血病性芽球上に提示される白血病性ネオ抗原を生成する。例えば、NPM1cは、最も一般的なHLA-A*0201アレル(ヒト集団の約50%)によって提示される白血病特異的ネオ抗原エピトープ(AIQDLCLAV(配列番号1)、AIQと略記)を生じる(Greiner et al., BLOOD 120: 1282 (2012)を参照)。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質、例えば、HLA-A2と複合体を形成した(またはそれによって提示される)NPM1cネオエピトープを含む抗原に結合する。NPM1cネオエピトープの長さは、MHCクラスI分子に結合するペプチドにとって妥当である任意の長さである。一部の実施形態では、NPM1cネオエピトープの長さは、5~20アミノ酸、6~19アミノ酸、7~18アミノ酸、8~17アミノ酸、8~16アミノ酸、8~15アミノ酸、8~15アミノ酸、8~14アミノ酸、8~13アミノ酸、8~12アミノ酸、9~12アミノ酸、または9~11アミノ酸である。一部の実施形態では、NPM1cネオエピトープの長さは、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5アミノ酸である。一部の実施形態では、NPM1cネオエピトープの長さは12アミノ酸である。一部の実施形態では、NPM1cネオエピトープの長さは11アミノ酸である。一部の実施形態では、NPM1cネオエピトープの長さは10アミノ酸である。一部の実施形態では、NPM1cネオエピトープの長さは9アミノ酸である。一部の実施形態では、NPM1cネオエピトープの長さは8アミノ酸である。一部の実施形態では、NPM1cネオエピトープは、10、15、20、30、40、50、または100アミノ酸残基長のポリペプチドの内部の、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5個の連続したアミノ酸のペプチドである。
一部の実施形態では、NPM1cネオエピトープは、HLA-A2であるMHCクラスIタンパク質に結合する。一部の実施形態では、HLA-A2に結合するNPM1cネオエピトープは、アミノ酸配列の位置2が小型の脂肪族残基(例えば、アラニン、チロシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン)であって、アミノ酸配列のC末端残基が脂肪族残基(例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン)または小型の疎水性残基(例えば、アラニン、バリン)である、アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、HLA-A2に結合するNPM1cネオエピトープは、アミノ酸配列の位置2がバリン、イソロイシンまたはロイシンであって、アミノ酸配列のC末端残基がバリン、ロイシン、またはイソロイシンである、アミノ酸配列を含む。NPM1cネオエピトープが8アミノ酸残基長である、一部の実施形態では、C末端アミノ酸は位置8である。NPM1cネオエピトープが9アミノ酸残基長である、一部の実施形態では、C末端アミノ酸は位置9である。NPM1cネオエピトープが10アミノ酸残基長である、一部の実施形態では、C末端アミノ酸は位置10である。NPM1cネオエピトープが11アミノ酸残基長である、一部の実施形態では、C末端アミノ酸は位置11である。NPM1cネオエピトープが12アミノ酸残基長である、一部の実施形態では、C末端アミノ酸は位置12である。
HLA-A2に結合する、NPM1cに由来するネオエピトープは、当技術分野で公知である。例えば、Greiner (2012) Blood 120:1282は、AIQDLCLAV(配列番号1)およびAIQDLCVAV(配列番号71)を含む、HLA-A2に結合する9merのNPM1cネオエピトープのアミノ酸配列を同定している。さらなる一例として、van der Lee (2019) J Clin Invest 129:774は、CLAVEEVSL(配列番号72)を含む、HLA-A2クラスI分子に結合するNPM1cネオエピトープのアミノ酸配列、さらには、VEEVSLRK(配列番号73)、AVEEVSLR(配列番号74)、AVEEVSLRK(配列番号75)、およびCLAVEEVSLRK(配列番号76)を含む、他のHLAハプロタイプによってコードされるMHCクラスI分子に結合するNPM1cネオエピトープのアミノ酸配列を同定している。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質との複合体を形成した(またはそれによって提示される)変異型ヌクレオフォスミンタンパク質のネオエピトープを含む抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に結合し(例えば、特異的に結合し)、ヌクレオフォスミンタンパク質における変異は、ヌクレオフォスミンをコードする遺伝子における4ヌクレオチド重複に起因する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質との複合体を形成した(またはそれによって提示される)細胞質性(細胞質中に位置する)変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に結合する(例えば、特異的に結合する)。一部の実施形態では、ネオエピトープは、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質に由来する8、9、10、11、または12アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、ネオエピトープは、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質の10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100アミノ酸残基に由来する、8、9、10、11、または12アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、ネオエピトープは、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質のC末端の10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100アミノ酸残基に由来する、8、9、10、11、または12アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質は、配列番号56によって示されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、配列番号56のアミノ酸配列を含むタンパク質に由来する、8、9、10、11、または12アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、配列番号56によって示されるアミノ酸配列の10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100アミノ酸残基に由来する、8、9、10、11、または12アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、配列番号56によって示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のC末端の10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100アミノ酸残基に由来する、8、9、10、11、または12アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2タンパク質)と複合体を形成した(またはそれによって提示される)配列番号56のアミノ酸配列を含むタンパク質のネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する。
一部の実施形態では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質は、C末端アミノ酸配列MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(配列番号57)を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2タンパク質)と複合体を形成した(またはそれによって提示される)C末端アミノ酸配列MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(配列番号57)を含むNPM1cタンパク質のネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、ネオエピトープは、NPM1cタンパク質のC末端アミノ酸配列MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(配列番号57)に由来する、8、9、10、11、または12アミノ酸のペプチドである。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、HLA-A2タンパク質またはHLA-A*02アレルグループによってコードされるタンパク質との複合体を形成した(またはそれによって提示される)NPM1cネオエピトープを含む抗原(すなわち、NPM1c:HLA-A2)に特異的に結合する。一部の実施形態では、NPM1cはヒトNPM1cである。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2タンパク質またはHLA-A*02アレルグループによってコードされるタンパク質)と複合体を形成した(またはそれによって提示される)細胞質性変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原に結合し(例えば、特異的に結合し)、ネオエピトープのアミノ酸配列は、AIQDLCLAV(配列番号1)、AIQDLCVAV(配列番号71)、CLAVEEVSL(配列番号72)、VEEVSLRK(配列番号73)、AVEEVSLR(配列番号74)、AVEEVSLRK(配列番号75)またはCLAVEEVSLRK(配列番号76)を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、HLA-A2によって提示されるAIQDLCLAV(配列番号1)、AIQDLCVAV(配列番号71)、CLAVEEVSL(配列番号72)、VEEVSLRK(配列番号73)、AVEEVSLR(配列番号74)、AVEEVSLRK(配列番号75)およびCLAVEEVSLRK(配列番号76)から選択されるアミノ酸配列を含む抗原に結合する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、HLA-A2によって提示されるアミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)を含む抗原に結合する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質単独および/またはMHCクラスIタンパク質と複合体を形成した対照ペプチド(例えば、対照ペプチドは、ネオエピトープと同じ数のアミノ酸を有するが、ネオエピトープの由来となったタンパク質とは異なるタンパク質に由来する)には結合しないか、または実質的に結合しない。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、細胞質性変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープ単独(MHCクラスIタンパク質、例えば、HLA-A2を伴わない)には結合しないか、または実質的に結合しない。
一部の実施形態では、NPM1cネオエピトープは、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)を含み、MHCクラスIタンパク質は、HLA-A2タンパク質(例えば、HLA-A*02:01アレルによってコードされるタンパク質)である。一部の実施形態では、NPM1cネオエピトープは、AIQDLCVAV(配列番号71)、CLAVEEVSL(配列番号72)、VEEVSLRK(配列番号73)、AVEEVSLR(配列番号74)、AVEEVSLRK(配列番号75)およびCLAVEEVSLRK(配列番号76)から選択されるアミノ酸配列を含み、MHCクラスIタンパク質は、HLA-A2タンパク質(例えば、HLA-A*02:01アレルによってコードされるタンパク質)である。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)を含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)のうちのいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つのアミノ酸は置換されている。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列AIQDLCLAVを含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、アミノ酸配列AIQDLCLAVのうちのいずれか1つ、2つ、3つまたは4つのアミノ酸は置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、AIQDLCLAV配列(配列番号1)における既存の残基と類似のサイズのアミノ酸残基による置換である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、抗原への細胞外ドメインの結合に影響しない(または実質的に影響しない)。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列AIQDLCLAVを含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)のうちの1つ、2つ、またはより多くのアンカー残基が置換されている(例えば、配列番号1の位置2および/または位置9、例えば、AIQDLCLAV(配列番号1)の下線が付された残基)。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、抗原への細胞外ドメインの結合、またはクラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質(例えば、HLA-A2)へのネオエピトープの結合に影響しない(または実質的に影響しない)。一部の実施形態では、AIQDLCLAV(配列番号1)の第2位にあるアミノ酸残基Iは、アミノ酸残基L(ロイシン)で置換されている。一部の実施形態では、AIQDLCLAV(配列番号1)の第2位にあるアミノ酸残基Iは、アミノ酸残基V(バリン)、M(メチオニン)、チロシン(T)、セリン(S)、グルタミン(Q)またはA(アラニン)で置換されている。一部の実施形態では、AIQDLCLAV(配列番号1)の第9位にあるアミノ酸残基Vは、アミノ酸残基I(イソロイシン)、L(ロイシン)、M(メチオニン)、またはA(アラニン)で置換されている。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列AIQDLCLAVを含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)のうちのいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つのアミノ酸は置換されており、置換は保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成した、表1に特定されているアミノ酸配列を含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する。
Figure 2023517063000002
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)に特異的に結合し、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)のうちのいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つのアミノ酸は置換されており、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)に対して同じまたは実質的に同じ結合親和性を有する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)に特異的に結合し、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)のうちのいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つのアミノ酸は置換されており、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)に対して、同じまたはより良好な親和性で特異的に結合する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)に結合し、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)のうちのいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つのアミノ酸は置換されており、抗体または抗原結合断片は、0.1~100nM(例えば、0.1~50nM、0.1~25nM、0.1~15nM)のKを有する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)に結合し、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)のうちのいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つのアミノ酸は置換されており、細胞外ドメインは、100nM未満(例えば、50nM未満、25nM未満、15nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満、1nM未満、0.9nM未満、0.8nM未満、0.7nM未満、0.6nM未満、0.5nM未満、0.4nM未満、0.3nM未満、0.2nM未満、または0.1nM未満)のKで結合する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、MHCクラスIタンパク質、例えば、HLA-A2によって提示されるNPM1cエピトープに結合し(NPM1c:HLA-A2)、抗がん効果または抗腫瘍効果(例えば、in vivoの抗がん効果、任意選択で、がんはAMLである)を有する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを含む抗原に特異的に結合し、細胞外ドメインは、重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)を含む。一部の実施形態では、ネオエピトープは、AIQDLCLAV(配列番号1)を含むアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、MHCクラスIタンパク質は、HLA-A*02アレルグループを含むHLA-Aアレルによってコードされる。一部の実施形態では、HLA-AアレルはHLA-A*02:01である。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、本明細書に記載される重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を有する抗NPM1c:HLA-A2抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、本明細書に記載される1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を有する(例えば、NPM1c scFvのCDRを有する。例えば、配列の項および実施例を参照)抗NPM1c:HLA-A2抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、NPM1c:HLA-A2に結合する細胞外ドメインは、scFvを含む。NPM1c:HLA-A2に特異的に結合するscFvの例示的なアミノ酸配列は、配列番号2に示されている。一部の実施形態では、scFvは、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、scFvは、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列との同一性の違いの少なくとも95%は、scFvのフレームワーク領域にある(または相補性決定領域(CDR)にはない)。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号5を有する重鎖可変領域(VH)を含む抗NPM1c:HLA-A2抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号5に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域(VH)を含む抗NPM1c:HLA-A2抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、VHは、配列番号5に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号5に示されるアミノ酸配列との同一性における違いの少なくとも95%は、VHのフレームワーク領域にある(または相補性決定領域(CDR)にはない)。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号3(NPM1c scFvのVLのアミノ酸配列)を有する軽鎖可変領域(VL)を含む抗NPM1c:HLA-A2抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む抗NPM1c:HLA-A2抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、VLは、配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号3に示されるアミノ酸配列との同一性における違いの少なくとも95%またはすべては、VLのフレームワーク領域にある(または相補性決定領域(CDR)にはない)。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号5を有する重鎖可変領域(VH)、およびアミノ酸配列配列番号3を有する軽鎖可変領域(VL)を含む、抗NPM1c:HLA-A2抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号5に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)、および配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、抗NPM1c:HLA-A2抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、VHおよびVLのそれぞれは、それぞれ配列番号5および配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号5および配列番号3に示されるアミノ酸配列との同一性における違いの少なくとも95%またはすべては、VHおよびVLのフレームワーク領域にある(または相補性決定領域(CDR)にはない)。
本開示の抗原結合断片のCDRは、Kabat、Chothia、AbM、Contact、およびIMGTを含む、当技術分野における様々な手法で定義される。
一部の態様では、CDRは、Kabatシステムに従って定義され、これは配列可変性に基づく(例えば、Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391; Kabat EA et al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照)。Kabat CDRの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、本明細書に記載される抗体およびその断片のCDRは、Kabatシステムを使用して決定される。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、Kabatシステムを使用して決定される、NPM1c scFvの1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を有する抗NPM1c:HLA-A2抗体またはその抗原結合断片を含む。
一部の態様では、CDRは、Chothiaシステムに従って定義され、これは免疫グロブリン構造ループ領域の位置に基づく(例えば、Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273 : 927-948; Chothia C et al, (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82;および米国特許第7,709,226号明細書を参照)。「Chothia CDR」という用語および同様の用語は、当技術分野で認識されており、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917の方法に従って決定される抗体CDR配列を指し、これを本明細書では「Chothia CDR」と称する(例えば、米国特許第7,709,226号明細書およびMartin, A., "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer- Verlag, Berlin (2001)を参照)。Chothia CDRの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一部の態様では、CDRは、Chothiaシステムを使用して決定される。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、Chothiaシステムを使用して決定される、NPM1c scFvの1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を有する抗NPM1c:HLA-A2抗体またはその抗原結合断片を含む。
一部の態様では、CDRは、AbMシステムに従って定義され、これはKabat CDRとChothia構造ループとの折衷案に相当するAbM超可変領域に基づいており、CDRはOxfordMolecularのAbM抗体モデリングソフトウェア(Oxford Molecular Group, Inc.)を使用して決定される。AbM CDRの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、CDRは、AbMシステムを使用して決定される。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、AbMシステムを使用して決定される、NPM1c scFvの1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を有する抗NPM1c:HLA-A2抗体またはその抗原結合断片を含む。
一部の態様では、CDRは、IMGTシステムに従って定義される(IMGT(登録商標)、international ImMunoGeneTics information system(登録商標)のウェブサイトimgt.org, founder and director: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Franceを参照;例えば、Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7: 132-136およびLefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212を参照。これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。IMGT CDRの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、CDRは、IMGTシステムを使用して決定される。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、IMGTシステムを使用して決定される、NPM1c scFvの1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を有する抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含む。
一部の態様では、CDRは、Contactシステムに従って定義される。Contactの定義は、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく(bioinf.org.uk/abs)(MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 5: 732-745を参照;例えば、Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer- Verlag, Berlin (2001)も参照のこと)。Contact CDRの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、CDRは、Contactシステムを使用して決定される。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、Contactシステムを使用して決定される、NPM1c scFvの1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を有する抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、HLA-A2によって提示されるNPM1cエピトープに特異的に結合する抗原結合断片を含み、上記のシステムのいずれかに従って定義される、NPM1c scFvの1つ、2つ、もしくは3つのVH CDRおよび/または1つ、2つ、もしくは3つのVL CDRを含む。例えば、一部の実施形態では、細胞外ドメインは、HLA-A2によって提示されるNPM1cエピトープに特異的に結合する抗原結合断片を含み、IMGTによって定義される、NPM1c scFvの1つ、2つ、もしくは3つすべてのVH CDRおよび/または1つ、2つ、もしくは3つすべてのVL CDRを含む。
当技術分野で公知であるように、VHおよびVLは、フレームワーク領域によって囲まれたCDRを含有する(CDRおよびFR配列は、VHおよびVLにおいて以下の順序で出現する:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)。任意選択で、フレームワーク領域はヒトフレームワーク領域である。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号5を有する重鎖可変領域(VH)の1つ、2つまたは3つすべてのVH CDRを有するVHを含む抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、IMGTによって定義される、アミノ酸配列配列番号5を有する重鎖可変領域(VH)の1つ、2つ、または3つすべてのVH CDRを有するVHを含む抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号3を有する軽鎖可変領域(VL)の1つ、2つまたは3つすべてのVL CDRを有するVLを含む抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、IMGTによって定義される、アミノ酸配列配列番号3を有する軽鎖可変領域(VL)の1つ、2つまたは3つすべてのVL CDRを有するVLを含む抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号5を有する重鎖可変領域(VH)の1つ、2つまたは3つすべてのVH CDRを有するVH、およびアミノ酸配列配列番号3を有する軽鎖可変領域(VL)の1つ、2つまたは3つすべてのVL CDRを有するVLを含む、抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号9の重鎖可変領域(VH)CDR1、アミノ酸配列配列番号10のVH CDR2、および/またはアミノ酸配列配列番号11のVH CDR3を有するVHを含む抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号9の重鎖可変領域(VH)CDR1、アミノ酸配列配列番号10のVH CDR2、およびアミノ酸配列配列番号11のVH CDR3を有するVHを含む抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含み、配列番号9、配列番号10、または配列番号11の1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸は置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸置換は保存的置換である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、類似のサイズのアミノ酸残基による置換である。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、抗原への結合に影響せず(または実質的に影響せず)、または改善する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号6の軽鎖可変領域(VL)CDR1、アミノ酸配列配列番号7のVL CDR2、および/またはアミノ酸配列配列番号8のVL CDR3を有するVLを含む抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号6の軽鎖可変領域(VL)CDR1、アミノ酸配列配列番号7のVL CDR2、および/またはアミノ酸配列配列番号8のVL CDR3を有するVLを含む抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含み、配列番号6、配列番号7、または配列番号8の1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸が置換されている。一部の実施形態では、アミノ酸置換は保存的置換である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、類似のサイズのアミノ酸残基による置換である。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、抗原への結合に影響せず(または実質的に影響せず)、または改善する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号9の重鎖可変領域(VH)CDR1、アミノ酸配列配列番号10のVH CDR2、およびアミノ酸配列配列番号11のVH CDR3を有するVH、ならびに/またはアミノ酸配列配列番号6の軽鎖可変領域(VL)CDR1、アミノ酸配列配列番号7のVL CDR2、およびアミノ酸配列配列番号8のVL CDR3を有するVLを含む、抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、アミノ酸配列配列番号9の重鎖可変領域(VH)CDR1、アミノ酸配列配列番号10のVH CDR2、およびアミノ酸配列配列番号11のVH CDR3を有するVH、ならびにアミノ酸配列配列番号6の軽鎖可変領域(VL)CDR1、アミノ酸配列配列番号7のVL CDR2、およびアミノ酸配列配列番号8のVL CDR3を有するVLを含む、抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、本明細書に記載されるVHおよびVLを含む抗NPM1c:HLA-A2抗原結合断片を含み、VHおよび/またはVL CDRの1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸は置換されている。
一部の態様では、本明細書に記載されるVHおよび/またはVL領域における1つまたは複数のCDRは、NPM1c:HLA-A2への特異的結合が維持される限り、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸が異なってもよい。
一部の態様では、本明細書に提供される抗体断片は、親和性成熟しており、すなわち、記載される抗体または断片と比較して、1つまたは複数の相補性決定領域において1つまたは複数の変更を有し、そのような1つまたは複数の変更は、記載される抗体または断片に比して、抗原に対する抗体または断片の親和性の改善をもたらす。一部の態様では、本明細書に提供される抗体または断片は、抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、100nM未満(例えば、50nM未満、25nM未満、15nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満、1nM未満、0.9nM未満、0.8nM未満、0.7nM未満、0.6nM未満、0.5nM未満、0.4nM未満、0.3nM未満、0.2nM未満、または0.1nM未満)のKdを有する。一部の態様では、本明細書に提供される抗体または断片は、抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、15nM未満、10nM未満、7nM未満、5nM未満、または1nM未満(例えば、0.01から15nM、0.01から10nM、0.01から7nM、0.01から5nM、0.01から1nM、0.1から15nM、0.1から10nM、0.1から7nM、0.1から5nM、0.1から1nM、1から15nM、1から10nM、1から7nM、1から5nM、5から15nM、5から10nM、または5から7nM)のKdを有する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、3つの軽鎖可変領域相補性決定領域(VL CDR 1~3)および3つの重鎖可変領域相補性決定領域(VH CDR 1~3)を含む抗原結合断片を含む。一部の態様では、VH CDR1は、配列番号9に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性、または少なくとも81%の配列同一性、または少なくとも82%の配列同一性、または少なくとも83%の配列同一性、または少なくとも84%の配列同一性、または少なくとも85%の配列同一性、または少なくとも86%の配列同一性、または少なくとも87%の配列同一性、または少なくとも88%の配列同一性、または少なくとも89%の配列同一性、または少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも91%の配列同一性、または少なくとも92%の配列同一性、または少なくとも93%の配列同一性、または少なくとも94%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性、または少なくとも96%の配列同一性、または少なくとも97%の配列同一性、または少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、VH CDR2は、配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性、または少なくとも81%の配列同一性、または少なくとも82%の配列同一性、または少なくとも83%の配列同一性、または少なくとも84%の配列同一性、または少なくとも85%の配列同一性、または少なくとも86%の配列同一性、または少なくとも87%の配列同一性、または少なくとも88%の配列同一性、または少なくとも89%の配列同一性、または少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも91%の配列同一性、または少なくとも92%の配列同一性、または少なくとも93%の配列同一性、または少なくとも94%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性、または少なくとも96%の配列同一性、または少なくとも97%の配列同一性、または少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、VH CDR3は、配列番号11に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性、または少なくとも81%の配列同一性、または少なくとも82%の配列同一性、または少なくとも83%の配列同一性、または少なくとも84%の配列同一性、または少なくとも85%の配列同一性、または少なくとも86%の配列同一性、または少なくとも87%の配列同一性、または少なくとも88%の配列同一性、または少なくとも89%の配列同一性、または少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも91%の配列同一性、または少なくとも92%の配列同一性、または少なくとも93%の配列同一性、または少なくとも94%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性、または少なくとも96%の配列同一性、または少なくとも97%の配列同一性、または少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、VL CDR1は、配列番号6に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性、または少なくとも81%の配列同一性、または少なくとも82%の配列同一性、または少なくとも83%の配列同一性、または少なくとも84%の配列同一性、または少なくとも85%の配列同一性、または少なくとも86%の配列同一性、または少なくとも87%の配列同一性、または少なくとも88%の配列同一性、または少なくとも89%の配列同一性、または少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも91%の配列同一性、または少なくとも92%の配列同一性、または少なくとも93%の配列同一性、または少なくとも94%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性、または少なくとも96%の配列同一性、または少なくとも97%の配列同一性、または少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、VL CDR2は、配列番号7に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性、または少なくとも81%の配列同一性、または少なくとも82%の配列同一性、または少なくとも83%の配列同一性、または少なくとも84%の配列同一性、または少なくとも85%の配列同一性、または少なくとも86%の配列同一性、または少なくとも87%の配列同一性、または少なくとも88%の配列同一性、または少なくとも89%の配列同一性、または少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも91%の配列同一性、または少なくとも92%の配列同一性、または少なくとも93%の配列同一性、または少なくとも94%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性、または少なくとも96%の配列同一性、または少なくとも97%の配列同一性、または少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、VL CDR3は、配列番号8に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性、または少なくとも81%の配列同一性、または少なくとも82%の配列同一性、または少なくとも83%の配列同一性、または少なくとも84%の配列同一性、または少なくとも85%の配列同一性、または少なくとも86%の配列同一性、または少なくとも87%の配列同一性、または少なくとも88%の配列同一性、または少なくとも89%の配列同一性、または少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも91%の配列同一性、または少なくとも92%の配列同一性、または少なくとも93%の配列同一性、または少なくとも94%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性、または少なくとも96%の配列同一性、または少なくとも97%の配列同一性、または少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、抗原(例えば、NPM1c:MHCクラスI)に対して少なくとも10-7Mの結合親和性(Kd)を有する抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、少なくとも10-7Mもしくはより強い、少なくとも10-8Mもしくはより強い、少なくとも10-9Mもしくはより強い、少なくとも500nMもしくはより強い、少なくとも250nMもしくはより強い、少なくとも100nMもしくはより強い、少なくとも50nMもしくはより強い、少なくとも25nMもしくはより強い、少なくとも20nMもしくはより強い、少なくとも15nMもしくはより強い、または少なくとも10nMもしくはより強い結合親和性(Kd)を有する。一部の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、少なくとも約25nMもしくはより強い、少なくとも約15nMもしくはより強い、または少なくとも約10nMもしくはより強い結合親和性(Kd)を有する。一部の態様では、抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、0.1nMと500nM、0.1nMと100nM、0.5nMと100nM、0.1nMと50nM、0.5nMと50nM、0.1nMと25nM、0.5nMと25nM、0.1nMと15nM、0.5nMと15nM、0.1nMと10nM、もしくは0.5nMと10nMの間(または前の値から後の値まで)、または1nMから100nM(またはその間の任意の値)の結合親和性(Kd)を有する。一部の態様では、抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、約0.1nMと約100nMまたは約0.5nMと約100nMの間(または前の値から後の値まで)の結合親和性(Kd)を有する。一部の態様では、抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、約0.1nMと約50nMまたは約0.5nMと約50nMの間(または前の値から後の値まで)の結合親和性(Kd)を有する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、少なくとも0.5±0.02×10Ms-1またはより高いKonを有する抗原結合断片を含む。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、少なくとも1±0.02×10Ms-1またはより高いKonを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、少なくとも2.5±0.02×10Ms-1またはより高いKonを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、少なくとも5±0.02×10Ms-1またはより高いKonを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、0.5±0.02×10Ms-1と50±0.02×10Ms-1の間(または前の値から後の値まで)のKonを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、1±0.02×10Ms-1と10±0.02×10Ms-1の間(または前の値から後の値まで)のKonを有する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、50±0.02×10-4-1未満のKoffを有する抗原結合断片を含む。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、10±0.02×10-4-1未満のKoffを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、5±0.02×10-4-1未満のKoffを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、0.5±0.02×10-4-1と50±0.02×10-4-1の間(または前の値から後の値まで)のKoffを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗原結合断片は、NPM1c:MHCクラスI抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して、between1±0.02×10-4-1と15±0.02×10-4-1の間(または前の値から後の値まで)のKoffを有する。
本明細書に提供される抗原結合分子は、抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に特異的に結合する。一部の態様では、抗原結合分子による結合を受ける抗原は、がん細胞の表面上のMHCクラスI分子(例えば、HLA-A2)によって提示される。一部の実施形態では、がん細胞はAML細胞である。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、単鎖抗体、例えば、単鎖Fv(scFv)を含む。一部の態様では、scFvは、ヒトまたはヒト化scFvである。一部の態様では、scFvはリンカーを含む。一部の態様では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーはGly-Serリンカーである。一部の態様では、Gly-Serリンカーは、(Gly4Ser)1(配列番号58)、(Gly4Ser)2(配列番号59)、(Gly4Ser)3(配列番号60)、および(Gly4Ser)4(配列番号61)からなる群から選択される。一部の態様では、Gly-Serリンカーは、アミノ酸配列SGSSGGSSSG(配列番号4)を含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、抗体の抗原結合断片を含み、断片は、限定されないが、Fv断片、Fab断片、F(ab’)断片、F(ab’)断片、またはジスルフィド連結Fv(sdFv)であり得る。一実施形態では、細胞外ドメインはFv断片を含む。一実施形態では、細胞外ドメインはFab断片を含む。一実施形態では、細胞外ドメインはF(ab’)断片を含む。一実施形態では、細胞外ドメインはF(ab’)断片を含む。
膜貫通ドメイン
一部の実施形態では、本明細書に提供されるCARポリペプチドは、膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、天然の供給源に由来する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。本明細書に記載されるCARに使用し得る膜貫通ドメインの非限定的な例は、T細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137、またはCD154に由来し得る(例えば、少なくともその膜貫通配列または膜貫通配列の一部を含む)。一実施形態では、膜貫通ドメインはCD4分子に由来する。一実施形態では、膜貫通ドメインはCD8分子に由来する。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは合成性である。例えば、膜貫通ドメインが合成供給源に由来する一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、疎水性残基(例えば、ロイシンおよびバリン)を含み得る(例えば、主として含む)。一部の実施形態では、合成膜貫通ドメインは、合成膜貫通ドメインの最後に、少なくとも1つの(例えば、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つの)フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットを含む。一部の実施形態では、CARの膜貫通ドメインは、CD8ヒンジドメインを含む。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞質ドメイン内の配列に天然で付随する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑える目的で、ドメインの他の膜貫通ドメイン(例えば、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメイン)への結合を回避するために、1つまたは複数(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10)のアミノ酸置換によって改変される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるCARポリペプチドの膜貫通ドメインは、CD8ヒンジおよび膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号25に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号33に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号33に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるCARの膜貫通ドメインは、CD3-ゼータ、CD8、CD28、DAP12、2B4、NKG2D、CD16、NKp44、FcγRIIIa、NKp30、actKIR、NKG2C、IL15Rb、またはNKp46の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるCARの膜貫通ドメインは、CD3-ゼータ、CD8またはCD28の膜貫通ドメインを含む。これらの実施形態のうちの一部では、CARの細胞内ドメインは、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される共刺激分子の共刺激ドメインを含む。
細胞内(細胞質)ドメイン
一部の実施形態では、本明細書に記載されるCARポリペプチドは、細胞内ドメインを含む。細胞内ドメインは、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、NK細胞またはML NK細胞の活性化を引き起こすシグナルを伝達するように機能することが知られている任意のポリペプチドドメインであり得る。そのようなドメインまたはモチーフは、CARの細胞外ドメインの標的抗原への結合に応答したTリンパ球の活性化のために必要な一次抗原結合シグナルを伝達することができる。細胞内ドメインの例には、ILR鎖、CD28、4-1BBおよびCD3ζが含まれるが、これらに限定されない。
典型的には、細胞内ドメインは、ITAM(免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ)を含む。
一実施形態では、細胞内ドメインは、CD3ζシグナル伝達配列(例えば、そのITAM含有部分)であるか、またはそれを含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、リンパ球受容体鎖を含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、TCR/CDR3複合体タンパク質を含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、Fc受容体サブユニットを含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、IL-2受容体サブユニットを含む。
本明細書に提供されるCARの細胞内ドメインは、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列を含むことができる:TCRを介した抗原依存性活性化を開始させるシグナル伝達配列(初代細胞質シグナル伝達配列)(例えば、CD3ζ細胞質シグナル伝達配列)、および二次または共刺激シグナルを与えるように抗原非依存的様式で作用する共刺激タンパク質のうちの1つまたは複数の細胞質配列(二次細胞質シグナル伝達配列)。
ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインが抗原に結合した場合にT細胞を刺激するのに十分なCD3ζの細胞質配列、および任意選択で、NK細胞の共刺激をもたらす共刺激タンパク質のうちの1つまたは複数の細胞質配列(例えば、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C、B7-H3、2B4、DAP10、CD137、DAP12、DNAM-1、NKp80、NTBA、CRACC、CD2、CD3ζ、1つまたは複数のインテグリン、IL-15R、IL-18R、IL-12R、IL-21R、IRE1a、CD83に特異的に結合するリガンド、および本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知であるITAM配列のいずれかのうちの1つまたは複数の細胞質配列)を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメイン全体が、CARの細胞内ドメインに含められる。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分(例えば、CAR発現免疫エフェクター細胞においてエフェクター機能シグナルを伝達する細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分)を含む。一部の実施形態では、CARの細胞内ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを、それ自体で、またはCARの状況において有用な任意の他の所望の細胞質シグナル伝達配列と組み合わせて含むように設計することができる。一部の実施形態では、CARの細胞質ドメインは、CD3ζ鎖部分および共刺激細胞質シグナル伝達配列を含み得る。共刺激細胞質シグナル伝達配列は、共刺激タンパク質(例えば、CD27、CD28、4-IBB(CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド)の細胞質シグナル伝達配列を含むCARの一部分を指す。
一部の実施形態では、CARの細胞内ドメイン内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序で配置される。一部の実施形態では、CARの細胞内ドメイン内の細胞質シグナル伝達配列は、特定の順序で互いに連結される。一部の実施形態では、リンカー(例えば、本明細書に記載されるリンカーのいずれか)を、異なる細胞質シグナル伝達配列の間に連鎖を形成するために使用することができる。
一部の実施形態では、細胞内ドメインは、CD3ζの細胞質シグナル伝達配列および共刺激タンパク質CD28の細胞質シグナル伝達配列を含むように設計される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、CD3ζの細胞質シグナル伝達配列および共刺激タンパク質4-IBBの細胞質シグナル伝達配列を含むように設計される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、CD3ζの細胞質シグナル伝達配列ならびに共刺激タンパク質CD28および4-1BBの細胞質シグナル伝達配列を含むように設計される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、4-1BBの細胞質シグナル伝達配列を含まない。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、配列番号26に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、配列番号27に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、配列番号27に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、配列番号26および27に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、配列番号26および27に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号34に示される核酸配列を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号34に示される核酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号35に示される核酸配列を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号35に示される核酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号34および35に示される核酸配列を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号34および35に示される核酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARは、CD28、CD137(4-lBBとしても知られる)、CD134(OX40としても知られる)およびCD278(ICOSとしても知られる)などのタンパク質に由来する1つまたは複数の共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、CARは、CD137に由来する共刺激ドメインを含まない。
ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、サイトカインをさらに含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、自己切断性ドメイン(例えば、P2A自己切断性ペプチド)およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ドメインの切断によりサイトカインが放出される。一部の実施形態では、自己切断性ドメイン(例えば、P2A自己切断性ペプチド)およびサイトカインは、CARタンパク質およびその細胞内ドメインのC末端に配置される。一部の実施形態では、サイトカインは、以下のもの:IL-12、IL-7、IL-13、IL-15、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-βおよびCCL19のうちの1つまたは複数である。一実施形態では、サイトカインはIL-12である。一実施形態では、サイトカインはIL-7である。一実施形態では、サイトカインはIL-13である。一実施形態では、サイトカインはIL-15である。一実施形態では、サイトカインはIL-4である。一実施形態では、サイトカインはIL-10である。一実施形態では、サイトカインはTNF-αである。一実施形態では、サイトカインはIFN-γである。一実施形態では、サイトカインはTGF-βである。一実施形態では、サイトカインはCCL19である。サイトカインを発現するように改変された免疫エフェクター細胞は、当技術分野で公知である(例えば、Adachi et al, 2018, Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4086; Liu et al., 2019, J. Immunol., doi:10.4049/jimmunol.1800033; Krenciute et al., 2017, Cancer Immunol. Res. 597):571-581, doi:10.1158/2326-6066,CIR-16-0376; Liu et al., 2018, Leukemia 32:520-531を参照)。ある特定の実施形態では、サイトカインを発現させるための、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞の改変は、Adachi et al, 2018, Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4086; Liu et al., 2019, J. Immunol., doi:10.4049/jimmunol.1800033; Krenciute et al., 2017, Cancer Immunol. Res. 597):571-581, doi:10.1158/2326-6066,CIR-16-0376;もしくはLiu et al., 2018, Leukemia 32:520-531に記載されているものと同じであるか、またはそこに記載されている方法に従う。
CARドメイン間のリンカー
一部の実施形態では、本明細書に記載されるCARポリペプチドは、CARにおける少なくとも1つのドメイン間にリンカーを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるCARは、(1)細胞外(抗原結合)ドメインと膜貫通ドメインの間、および/または(2)膜貫通ドメインと細胞内(細胞質)ドメインの間に、リンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドリンカーであり得る。例えば、リンカーは、約1アミノ酸と約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、約30アミノ酸、約25アミノ酸、約20アミノ酸、約18アミノ酸、約16アミノ酸、約14アミノ酸、約12アミノ酸、約10アミノ酸、約8アミノ酸、約6アミノ酸、約4アミノ酸、もしくは約2アミノ酸の間;約2アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、約30アミノ酸、約25アミノ酸、約20アミノ酸、約18アミノ酸、約16アミノ酸、約14アミノ酸、約12アミノ酸、約10アミノ酸、約8アミノ酸、約6アミノ酸、もしくは約4アミノ酸まで;約4アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、約30アミノ酸、約25アミノ酸、約20アミノ酸、約18アミノ酸、約16アミノ酸、約14アミノ酸、約12アミノ酸、約10アミノ酸、約8アミノ酸、もしくは約6アミノ酸まで;約6アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、約30アミノ酸、約25アミノ酸、約20アミノ酸、約18アミノ酸、約16アミノ酸、約14アミノ酸、約12アミノ酸、約10アミノ酸、もしくは約8アミノ酸まで;約8アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、約30アミノ酸、約25アミノ酸、約20アミノ酸、約18アミノ酸、約16アミノ酸、約14アミノ酸、約12アミノ酸、もしくは約10アミノ酸まで;約10アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、約30アミノ酸、約25アミノ酸、約20アミノ酸、約18アミノ酸、約16アミノ酸、約14アミノ酸、もしくは約12アミノ酸まで;約12アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、約30アミノ酸、約25アミノ酸、約20アミノ酸、約18アミノ酸、約16アミノ酸、もしくは約14アミノ酸まで;約14アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、約30アミノ酸、約25アミノ酸、約20アミノ酸、約18アミノ酸、もしくは約16アミノ酸まで;約16アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、約30アミノ酸、約25アミノ酸、約20アミノ酸、もしくは約18アミノ酸まで;約18アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、約30アミノ酸、約25アミノ酸、もしくは約20アミノ酸まで;約20アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、約30アミノ酸、もしくは約25アミノ酸まで;約25アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、約35アミノ酸、もしくは約30アミノ酸まで;約30アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、約40アミノ酸、もしくは約35アミノ酸まで;約35アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、約50アミノ酸、もしくは約40アミノ酸まで;約40アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、約60アミノ酸、もしくは約50アミノ酸まで;約50アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、約70アミノ酸、もしくは約60アミノ酸まで;約60アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約150アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、約80アミノ酸、もしくは約70アミノ酸まで;約70アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、約90アミノ酸、もしくは約80アミノ酸まで;約80アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、約100アミノ酸、もしくは約90アミノ酸まで;約90アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、約200アミノ酸、もしくは約100アミノ酸まで;約100アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、約300アミノ酸、もしくは約200アミノ酸まで;約200アミノ酸から約500アミノ酸、約400アミノ酸、もしくは約300アミノ酸まで;約300アミノ酸から約500アミノ酸もしくは約400アミノ酸まで;または約400アミノ酸から約500アミノ酸までの長さを有し得る。
CARを製造する方法
CARポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸分子を製造するための方法は、当業者に公知である。例示的な方法について本明細書に記載する。
本明細書に記載されるCARにおける使用のために好適な抗体および断片は、当技術分野で公知の方法によって作製することができる。
抗体断片を製造する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Fab断片およびF(ab’)2断片は、ペプシン(F(ab’)2断片を生成させるため)またはパパイン(Fab断片を生成させるため)などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク分解切断によって生成させることができる。scFv断片を製造する方法も当技術分野で公知である(例えば、Ahmad et al., 2012, Clinical and Developmental Immunology, doi: 10.1155/2012/980250; Wang et al., 2006, Anal. Chem. 78, 997-1004; Pansri et al., 2009, BMC Biotechnology 9:6; Chao et al., 2006, Nature Protocols 1(2):755-768を参照)。所望の抗原結合特性を有するscFvを、ファージディスプレイ技術または酵母表面ディスプレイ技術によって選択することができる。scFvは、短いポリペプチドリンカーを介して免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインを融合させること(組換え発現手法を使用して)によって構築することができる。単一ドメイン抗体(例えば、軽鎖を欠く抗体)を製造する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Riechmann & Muyldermans, 1999, J Immunol 231:25- 38; Nuttall et al, 2000, Curr Pharm Biotechnol 1(3):253-263; Muyldermans, 2001, J Biotechnol 74(4): 277-302を参照)。
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知である(例えば、Konterman, 2012, MAbs 4: 182-197; Gramer et al., 2013, MAbs 5:962-973を参照)。
選択されたCDRアミノ酸配列が短い配列(例えば、10~15アミノ酸長未満)である実施形態では、CDRをコードする核酸を、例えば、Shiraishi et al. (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51(1):129-130および米国特許第6,995,259号明細書に記載されたように化学合成することができる。アクセプター抗体をコードする所与の核酸配列について、CDRをコードする核酸配列の領域を、標準的な分子生物学の手法を使用して化学合成された核酸で置き換えることができる。化学合成された核酸の5’および3’末端は、その核酸をドナー抗体の可変領域をコードする核酸中にクローニングする際に使用するための突出末端制限酵素部位を含むように合成することができる。
本明細書に記載される抗体のいずれかを、当技術分野で公知の任意の免疫学または生化学に基づく方法を使用して、in vitroまたはin vivoのいずれかで、抗原、例えば、NPM1c:HLA-A2に起因する活性または機能のいずれかを調節するその能力について、スクリーニングおよび/または試験することができる。
本明細書に記載されるポリペプチドは、分子生物学およびタンパク質化学の技術分野で公知の種々の手法を使用して作製することができる。例えば、抗体の重鎖および軽鎖ポリペプチドの一方または両方をコードする核酸を、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写停止配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列を含む、転写調節配列および翻訳調節配列を含有する発現ベクターに挿入することができる。調節配列には、プロモーター、ならびに転写開始配列および転写停止配列が含まれる。加えて、発現ベクターは、それが2つの異なる生物において、例えば、発現のための哺乳動物細胞または昆虫細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主において維持され得るように、複数の複製系を含み得る。
哺乳動物細胞における核酸からの、本明細書に記載されるいずれかのポリペプチド(例えば、クローニングされた重鎖および軽鎖ポリペプチド)の発現のために、いくつかの可能性のあるベクター系を利用することができる。ベクターの1つのクラスは、所望の遺伝子配列の宿主細胞ゲノムへの組込みに依拠する。安定に組み込まれたDNAを有する細胞は、薬剤耐性遺伝子、例えば、大腸菌(E. coli)gpt(Mulligan and Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:2072)またはTn5 neo(Southern and Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327)を、同時に導入することによって選択することができる。選択マーカー遺伝子は、発現させようとするDNA遺伝子配列に連結させてもよく、またはコトランスフェクションによって同じ細胞に導入することもできる(Wigler et al. (1979) Cell 16:77)。ベクターの第2のクラスは、染色体外プラスミドに自己複製能を付与するDNAエレメントを利用する。これらのベクターは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス(Sarver et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA, 79:7147)、サイトメガロウイルス、ポリオーマウイルス(Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1292)、またはSV40ウイルス(Lusky and Botchan (1981) Nature 293:79)に由来し得る。
発現ベクターは、核酸のその後の発現のために好適な様式で、細胞に導入することができる。導入の方法は、以下に述べるように、標的となる細胞の型によって主に決まる。例示的な方法には、CaPO4沈殿、リポソーム融合、カチオン性リポソーム、エレクトロポレーション、ウイルス感染、デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、および直接マイクロインジェクションが含まれる。
ポリペプチドの発現のための適切な宿主細胞には、酵母、細菌、昆虫、植物、および哺乳動物細胞が含まれる。特に関心が持たれるのは、大腸菌(E. coli)などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの真菌、SF9などの昆虫細胞、哺乳動物細胞株(例えば、ヒト細胞株)、ならびに初代細胞株である。
ポリペプチドは、抗体または断片をコードする核酸を含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を、タンパク質の発現を可能にするのに十分な条件下で、ある長さの時間をかけて培養することによって、細胞から産生させることができる。タンパク質発現のためのそのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって異なると考えられ、慣行的な実験を通して当業者によって容易に確認されるであろう。例えば、大腸菌(E. coli)で発現された抗体を、封入体からリフォールディングさせることができる(Hou et al. (1998) Cytokine 10:319-30を参照)。細菌発現系およびそれらの使用のための方法は、当技術分野で周知である(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, and Molecular Cloning--A Laboratory Manual --3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)を参照)。コドン、好適な発現ベクターおよび好適な宿主細胞の選択は、いくつかの要因に応じて異なり、必要に応じて容易に最適化され得る。本明細書に記載される抗体(またはその断片)は、哺乳動物細胞において、または酵母、バキュロウイルス、およびin vitro発現系を含むがこれらに限定されない、他の発現系において発現させることができる(例えば、Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220を参照)。
発現の後に、ポリペプチドを単離することができる。標準的な精製方法には、電気泳動的、分子的、免疫学的な手法、ならびにイオン交換、疎水性、アフィニティー、および逆相HPLCクロマトグラフィーを含む、クロマトグラフィー手法が含まれる。例えば、抗体は、標準的な抗抗体カラム(例えば、プロテインAまたはプロテインGカラム)を使用して精製することができる。タンパク質濃縮と組み合わせた、限外濾過およびダイアフィルトレーションの手法も有用である。例えば、Scopes (1994) “Protein Purification, 3rd edition,”Springer-Verlag, New York City, New Yorkを参照。必要な精製の度合いは、所望の用途よって異なると考えられる。一部の例では、発現された抗体またはその断片の精製は必要ではない。
ポリペプチドの収量または純度を決定するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、Bradfordアッセイ、UV分光法、Biuretタンパク質アッセイ、Lowryタンパク質アッセイ、アミドブラックタンパク質アッセイ、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)法、質量分析(MS)法、およびゲル電気泳動法(例えば、タンパク質染色、例えば、クーマシーブルーまたはコロイド銀染色を使用する)が含まれる。
ポリペプチドは、その発現および精製の後に改変することができる。改変は、共有結合性または非共有結合性の改変であり得る。そのような改変は、例えば、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、ポリペプチドに導入することができる。改変のための好適な部位は、例えば、抗体または断片の構造分析またはアミノ酸配列分析を含む、種々の基準のいずれかを使用して選択することができる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、異種部分にコンジュゲートさせることができる。異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療薬もしくは細胞傷害性薬剤(例えば、毒素または薬物)、または検出可能な標識、例えば、限定はされないが、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、重金属標識、発光標識、またはビオチンもしくはストレプトアビジンなどのアフィニティータグであり得る。好適な異種ポリペプチドには、例えば、抗体または断片の精製に使用するための、抗原タグ(例えば、FLAG(DYKDDDDK(配列番号44))、ポリヒスチジン(6-His;HHHHHH(配列番号45)、ヘマグルチニン(HA;YPYDVPDYA(配列番号46))、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、またはマルトース結合タンパク(MBP))が含まれる。異種ポリペプチドにはまた、診断マーカーまたは検出マーカーとして有用であるポリペプチド(例えば、酵素)、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP))、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)も含まれる。好適な放射性標識には、例えば、32P、33P、14C、125I、131I、35S、および3Hが含まれる。好適な蛍光標識には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、DyLight(商標)488、フィコエリトリン(PE)、ヨウ化プロピジウム(PI)、PerCP、PE-Alexa Fluor(登録商標)700、Cy5、アロフィコシアニン、およびCy7が含まれるが、これらに限定されない。発光標識には、例えば、種々の発光ランタニド(例えば、ユーロピウムまたはテルビウム)キレートのいずれかが含まれる。例えば、好適なユーロピウムキレートには、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)またはテトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)のユーロピウムキレートが含まれる。酵素標識には、例えば、アルカリホスファターゼ、CAT、ルシフェラーゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれる。
2つのタンパク質(例えば、抗体および異種部分)は、いくつかの公知の化学架橋剤のいずれかを使用して架橋することができる。そのような架橋剤の例は、「妨害された」ジスルフィド結合を含む連結を介して2つのアミノ酸残基を連結するものである。これらの連結において、架橋単位内のジスルフィド結合は、例えば、還元型グルタチオンまたは酵素ジスルフィド還元酵素の作用による還元から、(ジスルフィド結合のいずれか一方の側の妨害基によって)保護される。1つの好適な試薬である4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α(2-ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)は、一方のタンパク質の末端リシンおよび他方のものの末端システインを利用して、2つのタンパク質間にそのような連結を形成する。各タンパク質上の異なるカップリング部分によって架橋するヘテロ二官能性試薬を使用することもできる。他の有用な架橋剤には、2つのアミノ基を連結する試薬(例えば、N-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド)、2つのスルフヒドリル基を連結する試薬(例えば、1,4-ビス-マレイミドブタン)、アミノ基とスルフヒドリル基とを連結する試薬(例えば、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、アミノ基とカルボキシル基とを連結する試薬(例えば、4-[p-アジドサリチルアミド]ブチルアミン)、およびアミノ基とアルギニンの側鎖に存在するグアニジニウム基とを連結する試薬(例えば、p-アジドフェニルグリオキサール一水和物)が含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、放射性標識を、ポリペプチドのアミノ酸骨格に直接コンジュゲートさせることができる。あるいは、放射性標識を、遊離アミノ基に結合して関連タンパク質のメタヨードフェニル(mIP)誘導体を形成するより大きな分子(例えば、メタ-[125I]ヨードフェニル-N-ヒドロキシスクシンイミド([125I]mIPNHS中の125I)(例えば、Rogers et al. (1997) J Nucl Med 38:1221-1229を参照)またはキレート剤(例えば、DOTAまたはDTPA)の一部として含めて、次いでそれをタンパク質骨格に結合させてもよい。放射性標識またはそれを含有するより大きな分子/キレート剤を、本明細書に記載されるポリペプチドにコンジュゲートさせる方法は、当技術分野で公知である。そのような方法は、タンパク質への放射性標識またはキレート剤の結合を助長する条件(例えば、pH、塩濃度、および/または温度)下で、タンパク質を放射性標識とインキュベートすることを伴う(例えば、米国特許第6,001,329号明細書を参照)。
蛍光標識(「フルオロフォア」と称される場合もある)を、タンパク質(例えば、抗体)にコンジュゲートさせる方法は、タンパク質化学の技術分野で公知である。例えば、フルオロフォアを、フルオロフォアに結び付いたスクシンイミジル(NHS)エステルまたはテトラフルオロフェニル(TFP)エステル部分を使用して、タンパク質の遊離アミノ基(例えば、リシンの)またはスルフヒドリル基(例えば、システインの)にコンジュゲートさせることができる。一部の実施形態では、フルオロフォアを、スルホ-SMCCなどのヘテロ二官能性架橋剤部分にコンジュゲートさせることができる。好適なコンジュゲーション法は、抗体タンパク質、またはその断片を、フルオロフォアのタンパク質への結合を助長する条件下でフルオロフォアとインキュベートすることを伴う。例えば、Welch and Redvanly (2003) “Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications,”John Wiley and Sons (ISBN 0471495603)を参照。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、グリコシル化されていてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを、ポリペプチドのグリコシル化が減少しているかまたは存在しないように、酵素的もしくは化学的な処理に供するか、または細胞から産生させることができる。グリコシル化が減少した抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第6,933,368号明細書;Wright et al. (1991) EMBO J 10(10):2717-2723; and Co et al. (1993) Mol Immunol 30:1361に記載されている。
例示的なCARポリペプチド
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、DAP12膜貫通および細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、4-1BB細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD28細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、2B4細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、2B4膜貫通および細胞内ドメイン、ならびにCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、CD28膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、4-1BB細胞内ドメイン、ならびにCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、NKp46膜貫通ドメイン、2B4細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、CD16膜貫通ドメイン、2B4細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、NKp44膜貫通ドメイン、DAP10細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、NKG2D膜貫通ドメイン、4-1BB細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、NKG2D膜貫通ドメイン、4-1BB細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、NKG2D膜貫通ドメインおよびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、NKG2D膜貫通ドメイン、DAP12細胞内ドメイン、2B4細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、NKG2D膜貫通ドメイン、DAP10細胞内ドメイン、2B4細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、NPM1c抗原に結合する細胞外ドメイン、NKG2D膜貫通ドメイン、4-1BB細胞内ドメイン、2B4細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、あるサイトカインが細胞内でも発現されるように、そのサイトカインに作動可能に連結される。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、CARポリペプチドおよびサイトカインの両方が切断後に別々に発現されるように、切断可能なリンカーを介してサイトカインに連結される。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、本明細書に記載されるIL-15ポリペプチドに作動可能に連結される。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、本明細書に記載されるIL-15ポリペプチドに、切断可能なリンカーを介して連結される。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、CD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン、4-1BBシグナル伝達ドメイン、ならびにCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、NPM1c結合性scFv、膜貫通ドメイン、4-1BB細胞内ドメイン、およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、配列番号33のCD8ヒンジおよび膜貫通領域、配列番号34の4-1BBシグナル伝達ドメイン、ならびに配列番号35のCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、配列番号30の核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)CD8ヒンジドメイン;(iii)CD8膜貫通ドメイン;(iv)4-1BB細胞内ドメイン;および(v)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)CD8膜貫通ドメイン;(iii)4-1BB細胞内ドメイン;および(iv)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)CD28膜貫通ドメイン;(iii)CD28細胞内ドメイン;および(iv)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)DAP12膜貫通ドメイン;および(iii)DAP12細胞内ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)CD28膜貫通ドメイン;(iii)2B4細胞内ドメイン;および(iv)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)2B4膜貫通ドメイン;(iii)2B4細胞内ドメイン;および(iv)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)CD28膜貫通ドメイン;(iii)CD28細胞内ドメイン;(iv)4-1BB細胞内ドメイン;および(v)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)CD16膜貫通ドメイン;(iii)2B4細胞内ドメイン;および(iv)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)NKp44膜貫通ドメイン;(iii)DAP10細胞内ドメイン;および(iv)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)NKp46膜貫通ドメイン;(iii)2B4細胞内ドメイン;および(iv)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)NKG2D膜貫通ドメイン;(iii)2B4細胞内ドメイン;および(iv)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)NKG2d膜貫通ドメイン;(iii)4-1BB細胞内ドメイン;および(iv)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)NKG2D膜貫通ドメイン;(iii)2B4細胞内ドメイン;(iv)DAP12細胞内ドメイン;および(v)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)NKG2D膜貫通ドメイン;(iii)2B4細胞内ドメイン;(iv)DAP10細胞内ドメイン;および(v)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)NKG2D膜貫通ドメイン;(iii)4-1BB細胞内ドメイン;(iv)2B4細胞内ドメイン;および(v)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)抗NPM1c scFv;(ii)NKG2D膜貫通ドメイン;および(iii)CD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)配列番号24に示されるアミノ酸配列を含む抗NPM1c scFv;(ii)配列番号25に示されるアミノ酸配列を含むCD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン;(iii)配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む4-1BB細胞内ドメイン;ならびに(iv)配列番号27に示されるアミノ酸配列を含むCD3ζシグナル伝達ドメインを含むアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドは、配列番号97に示されるアミノ酸配列を含むIL-15ポリペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、IL-15ポリペプチドは、異種性膜貫通ドメインをさらに含む。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)配列番号32に示される核酸配列によってコードされる抗NPM1c scFv;(ii)配列番号33に示される核酸配列によってコードされるCD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン;(iii)配列番号34に示される核酸配列によってコードされる4-1BB細胞内ドメイン;ならびに(iv)配列番号35に示される核酸配列によってコードされるCD3ζシグナル伝達ドメインを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、CARをコードするヌクレオチド配列は、IL-15ポリペプチドをコードする、配列番号98に示される核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、IL-15ポリペプチドをコードする核酸配列は、異種性膜貫通ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、CARポリペプチドは、(i)配列番号32に示される核酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する核酸配列によってコードされる抗NPM1c scFv;(ii)配列番号33に示される核酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する核酸配列によってコードされるCD8ヒンジおよび膜貫通ドメイン;(iii)配列番号34に示される核酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する核酸配列によってコードされる4-1BB細胞内ドメイン;ならびに(iv)配列番号35に示される核酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する核酸配列によってコードされるCD3ζシグナル伝達ドメインを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、CARをコードするヌクレオチド配列は、IL-15ポリペプチドをコードする、配列番号98に示される核酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、IL-15ポリペプチドをコードする核酸配列は、異種性膜貫通ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。
CARポリペプチドをコードするベクター
一部の態様では、本明細書に記載されるCARポリペプチドは、ベクターによってコードされる。
本明細書に記載されるCARポリペプチドのコード配列がひとたび調製または単離されると、そのような配列を、任意の好適なベクターまたはレプリコンにクローニングすることができる。「コード配列」または選択されたポリペプチド(例えば、CARポリペプチド)を「コードする」配列は、適切な調節配列(または「制御エレメント」)の制御下に置かれた場合に、in vivoで転写(DNAの場合)され、ポリペプチドに翻訳(mRNAの場合)される核酸分子である。コード配列の境界は、5’(アミノ)末端の開始コドンおよび3’(カルボキシ)末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列としては、ウイルス、原核生物または真核生物のmRNA由来のcDNA、ウイルスまたは原核生物のDNA由来のゲノムDNA配列、さらには合成DNA配列が挙げられるが、これらに限定されない。転写終結配列はコード配列の3’側に位置してもよい。コード配列の転写および翻訳は、典型的には、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列(翻訳停止コドンの3’側に位置する)、翻訳開始の最適化のための配列(コード配列の5’側に位置する)、および翻訳終結配列を含むが、これらに限定されない「制御エレメント」によって調節される。
多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択は、自由に選択可能な事柄である。他の配列へのライゲーションは、当技術分野で公知の標準的な手順を使用して行われる。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有し、それに連結された別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの1つの種類は「プラスミド」であり、これは追加のDNAセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖DNAループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、この場合は追加のDNAセグメントをウイルスゲノム中にライゲートすることができる。ある特定のベクターは、それが導入された宿主細胞において自律複製が可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、ある特定のベクターは、それに作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターを、本明細書では「組換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と称する。一般に、組換えDNA手法に使用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、互換可能に使用され得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)も含むことを意図している。
さらに、「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移行させるかまたは輸送することができる核酸分子を指すことができる。移行される核酸を、ベクター核酸分子に連結すること、例えば、それに挿入することができる。ベクターは、細胞内での自律複製を導く配列を含むことができ、または宿主細胞DNAへの組込みを可能にするのに十分な配列を含むことができる。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド(例えば、DNAプラスミドまたはRNAプラスミド)、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損レトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「形質導入」または「細胞形質導入」という用語は、DNAウイルスまたはRNAウイルスを使用して、核酸を細胞に移入するプロセスを指す。
一部の態様では、本明細書に記載される核酸分子は、発現ベクター中にある状態で提供される。一部の実施形態では、ベクターは、適切な発現制御配列に作動可能に連結されたペプチドをコードする核酸分子を含む。核酸分子がベクターに挿入される前または後のいずれかで、この作動可能な連結に影響を及ぼす方法は周知である。発現制御配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソームヌクレアーゼドメイン、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが含まれる。
「プロモーター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始させるヌクレオチド配列である。プロモーターとしては、誘導性プロモーター(プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される)、抑制性プロモーター(プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって抑制される)、および構成的プロモーターが挙げられる。加えて、そのようなプロモーターが組織特異性を有することもでき、例えば、CD80プロモーターはある特定の免疫細胞においてのみ誘導可能であり、myoDプロモーターは筋細胞においてのみ誘導可能である。「プロモーター」または「制御エレメント」という用語は、完全長プロモーター領域およびこれらの領域の機能的(例えば、転写または翻訳を制御する)セグメントを含むことが意図される。プロモーターは、それが共刺激分子のプロモーター領域のある領域、もしくはその相補物と、同じもしくは実質的に同じ塩基対配列を有する場合、またはそれが以下に記載されるような配列同一性を示す場合に、共刺激分子をコードする遺伝子に「由来する」。
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、ウイルスベクター中にある状態で提供される。本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、例えば、核酸分子の移行もしくは細胞のゲノム中への組込みを助長するウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子(例えば、移入プラスミド)、または核酸の移行を媒介するウイルス粒子を指すことができる。ウイルス粒子は、核酸の他に、様々なウイルス成分および時に宿主細胞成分をも含むことができる。
使用のために好適なウイルスベクターには、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、シミアンウイルス40(SV40)ベクター、およびウシパピローマウイルスベクターが含まれる(例えば、Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照)。本明細書で使用される場合、「レトロウイルスベクター」という用語は、目的の遺伝子(すなわち、候補ポリペプチドまたは異種ポリペプチドをコードする遺伝子)を発現するように改変されたレトロウイルスを指すことができる。レトロウイルスベクターは、ウイルス感染プロセスを利用することによって、遺伝子(すなわち、候補ポリペプチドまたは異種ポリペプチドをコードする遺伝子)を宿主細胞に効率的に移入するために使用することができる。レトロウイルスゲノム中にクローニングされた(すなわち、分子生物学的手法を使用して挿入された)外来性または異種性の標的遺伝子は、レトロウイルスによる感染への感受性のある宿主細胞に効率的に送達され得る。公知の遺伝子操作により、レトロウイルスゲノムの複製能を破壊することができる。その結果得られる複製欠損ベクターは、新しい遺伝物質を細胞に導入するために使用し得るが、複製は行えない。ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株は、ベクター粒子の組立ておよび細胞からの放出を可能にするために使用され得る。そのようなレトロウイルスベクターは、目的の1つまたは複数の遺伝子(すなわち、ポリシストロン核酸配列は、目的のいくつかの遺伝子をコードし得る)、5’レトロウイルス長鎖末端反復(5’LTR)、および3’レトロウイルス長鎖末端反復(3’LTR)を含有する複製欠損レトロウイルスゲノムをコードする核酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。本明細書で使用される場合、「レンチウイルスベクター」という用語は、非分裂細胞に組み入れることができるレンチウイルス科(例えば、HIV、MIV、ウマ伝染性貧血ウイルス、カプリン関節炎脳炎ウイルス)を指す。(例えば、米国特許第5,994,136号明細書および同第6,013,516号明細書を参照。これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる)。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、シュードタイプ化レンチウイルスベクターである。本明細書で使用される場合、「シュードレンチウイルスベクター」または「シュードタイプ化レンチウイルスベクター」という用語は、その指向性を変更するための異種膜タンパク質、例えば、異種ウイルスエンベロープを含有するレンチウイルスベクターを指す。例えば、Cronin et al (2005) CURR. GENE THER. 5:387-398を参照。例えば、一部の実施形態では、エンベロープ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス(VSVG)由来である。天然に存在するかまたは操作されたウイルスエンベロープの多様なセットを用いるレンチウイルスベクターのシュードタイプ化は、特定の細胞型の標的化形質導入を可能にする。例えば、ヒヒのレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質によってシュードタイプ化されたレンチウイルスベクター(BaEV-LV)が開発されている。改変BaEVgによってシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターは、VSVgシュードタイプ化レンチウイルスベクターと比較して、NK細胞への形質導入を20倍またはそれ以上で行うことができ、これは主として、活性化NK細胞がASCT-2のアップレギュレーションを生じ、BaEVシュードタイプ化レンチウイルスベクターによる形質導入に対して非常に感受性にさせるためである。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、CARポリペプチドを発現することができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製起点を含有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターはプラスミドである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは発現構築物であり、これは一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドである。ひとたび発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質が、細胞の転写および翻訳装置であるリボソーム複合体によって産生される。一部の実施形態では、プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として作用して、発現ベクター上に保有される遺伝子の効率的な転写を招く、調節配列を含有するように操作される。本開示のウイルスベクターは、大量の安定なメッセンジャーRNAを発現し、それ故に大量のタンパク質を発現する。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、発現シグナル、例えば、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローニングされた遺伝子との距離の調整、ならびに転写終止配列およびPTIS(ポータブル翻訳開始配列)の挿入を有する。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、環状プラスミドまたは直鎖状核酸である。環状プラスミドおよび直鎖状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、終結シグナルに作動可能に連結されていてもよいCARポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターは、その成分のうちの少なくとも1つが、他の成分のうちの少なくとも1つに対して異種性であることを意味する。一部の実施形態では、発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、恒常的プロモーター、または宿主細胞が何らかの特定の外部刺激に曝露された場合にのみ転写を開始させる誘導性プロモーターの制御下にある。
サイトカイン誘導性メモリー様ナチュラルキラー細胞
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるCARポリペプチドを含む、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様(ML)ナチュラルキラー(NK)細胞、または前記細胞の集団を提供する。一部の実施形態では、ML NK細胞または細胞の集団は、自己性または同種性NK細胞、例えば、ヒトドナーNK細胞から分化しているか、またはそれに由来する。一部の実施形態では、ML NK細胞または細胞の集団は、臍帯血(例えば、ヒト臍帯血)由来のNK細胞から分化しているか、またはそれに由来する。一部の実施形態では、ML NK細胞または細胞の集団は、ヒトPBMCから分化しているか、またはそれに由来する。一部の実施形態では、ML NK細胞または細胞の集団は、iPSC(例えば、ヒトiPSC)由来のNK細胞から分化しているか、またはそれに由来する。
一部の実施形態では、ML NK細胞または細胞の集団は、CD56+CD3-ヒトNK細胞から分化している。一部の実施形態では、CD56+CD3-ヒトNK細胞は、ヒトPBMC(例えば、ドナーヒトPBMC、例えば、自己性または同種性)から精製される。一部の実施形態では、95%超のCD56+CD3-ヒトNK細胞が、PBMCから精製される。一部の実施形態では、CD56+CD3-ヒトNK細胞は、免疫密度細胞分離、例えば、RosetteSepを使用して単離される。一部の実施形態では、CD56+CD3-ヒトNK細胞をPBMCから精製するための方法は、(i)特異的抗体を使用して非NK細胞を赤血球と架橋させて、イムノロゼットを形成させるステップ;(ii)細胞を密度勾配遠心法に供して、イムノロゼットをペレット化するステップ;(iii)NK細胞を単離するステップを含む。
一部の実施形態では、ヒトNK(hNK)細胞の集団は、成熟および/または発生の段階の異なるサブセットを含む。一部の実施形態では、成熟および/または発生の段階は、表現型マーカーの発現によって決定される。一部の実施形態では、成熟および/または発生の段階は、図7Cに示される表現型マーカーに基づいて決定される。一部の実施形態では、相対的に成熟しておらず、発生が進んでおらず、より幹細胞様であり、および/または増殖性が高いhNK細胞のサブセットは、以下の表現型マーカーを発現する:CD56brightCD16low/-NKG2AKIRsCD57。一部の実施形態では、成熟および/または発生の段階が中等度であるhNK細胞のサブセットは、以下の表現型マーカーを発現する:CD56dim、CD16NKG2A+/-KIRsCD57またはCD56dimCD16NKG2A+/-KIRsCD57。一部の実施形態では、成熟した、および/または発生が進んでいるhNK細胞のサブセットは、以下の表現型マーカーを発現する:CD56dimCD16NKG2A+/-KIRsCD57。一部の実施形態では、相対的に成熟していない、および/またはより発生が進んでいないhNK細胞のサブセットは、例えば、フローサイトメトリーによる測定で、より成熟した、および/またはより発生が進んでいるhNK細胞のサブセットのASCTの平均発現に比して、ASCT2の平均発現が、(例えば、約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍に)増加している。
一部の実施形態では、CD56brightCD16low/-NKG2AKIRsCD57であるhNK細胞のサブセットは、例えば、フローサイトメトリーによる測定で、CD56dimCD16NKG2A+/-KIRsCD57であるhNK細胞のサブセットのASCTの平均発現に比して、ASCT2の平均発現が、(例えば、約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍に)増加している。一部の実施形態では、CD56brightCD16low/-NKG2AKIRsCD57であるhNK細胞のサブセットは、例えば、フローサイトメトリーによる測定で、CD56dimCD16NKG2A+/-KIRsCD57-であるhNK細胞のサブセットのASCTの平均発現に比して、ASCT2の平均発現が、(例えば、約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍に)増加している。一部の実施形態では、CD56brightCD16low/-NKG2AKIRsCD57であるhNK細胞のサブセットは、例えば、フローサイトメトリーによる測定で、CD56dimCD16NKG2A+/-KIRsCD57であるhNK細胞のサブセットのASCTの平均発現に比して、ASCT2の平均発現が、(例えば、約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍に)増加している。
表現型
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様(ML)NK細胞は、対照NK細胞または細胞の集団に比して、マーカーの特有のセットを発現する。一部の実施形態では、対照NK細胞は、IL-15単独(例えば、ヒトIL-15)の存在下で活性化されたヒトNK細胞、またはIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である。一部の実施形態では、対照NK細胞は、ML NK細胞の由来となったNK細胞と同じ表現型を有する。
一部の実施形態では、対照NK細胞上で発現される少なくとも1つの細胞表面マーカーの発現が、減少している。一部の実施形態では、対照NK細胞上で発現される少なくとも1つの細胞表面マーカーが、ML NK細胞上では発現されない。一部の実施形態では、対照NK細胞上では発現されない少なくとも1つの細胞表面マーカーの発現が、ML NK細胞上では発現される。一部の実施形態では、対照NK細胞上では発現のレベルが低い、少なくとも1つの細胞表面マーカーの発現が、ML NK細胞上では増加している。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、参照により本明細書に組み込まれる、以下に記載されるものとして特徴付けられる:Berrien-Elliott, M. M. et al. Cancer Discovery, DOI: 10.1158/2159-8290.CD-20-0312, December 2020; Romee. R. et al. Sci Transl Med Vol. 8(357), 2016 Sep 21.
一部の実施形態では、以下のポリペプチド:CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKGD2およびCD25のうちの1つまたは複数の発現が、ML NK細胞または前記細胞の集団において、対照NK細胞に比して増加している。一部の実施形態では、以下のポリペプチド:CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、CD62LおよびCD25のうちの1つまたは複数の発現が、ML NK細胞または前記細胞の集団において、対照NK細胞に比して増加している。一部の実施形態では、以下のポリペプチド:TRAIL、CD69、CD62L、NKG2A、およびNKp30のうちの1つまたは複数が、ML NK細胞または前記細胞の集団において、対照NK細胞に比して増加している。一部の実施形態では、ポリペプチドの発現が、少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍または10倍に増加している。
一部の実施形態では、ML NK細胞の集団は、TRAIL+CD69+CD62L+NKG2A+NKp30+NK細胞を、増加した頻度で含む。一部の実施形態では、細胞集団の頻度は、少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍または10倍に増加している。一部の実施形態では、ML NK細胞の集団は、CD27+CD127+NK細胞を、減少した頻度で含む。一部の実施形態では、細胞集団の頻度は、少なくとも1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、8分の1、9分の1または10分の1に減少している。
一部の実施形態では、CD16および/またはCD11bの発現は、ML NK細胞または前記細胞の集団において、対照NK細胞に比して減少している。一部の実施形態では、ポリペプチドの発現は、少なくとも1.5分の1、2分の1、3分の1、4分の1、5分の1、6分の1、7分の1、8分の1、9分の1または10分の1に減少している。
一部の実施形態では、以下のポリペプチド:KIR、CD57、NKG2C、DNAM-1、CD137、およびCD11bのうちの1つまたは複数の発現が、ML NK細胞または前記細胞の集団において、初代/従来のNK細胞に比して相対的に不変である。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、以下の表現型を有する:CD11bhighCD27lowKLRG1highCD43high
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+である。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、対照NK細胞と比較してCD56発現が増加している。一部の実施形態では、ML NK細胞は、対照NK細胞と比較してCD69発現が増加している。一部の実施形態では、ML NK細胞は、対照NK細胞と比較してNKG2A発現が増加している。一部の実施形態では、ML NK細胞は、対照NK細胞と比較してNKG2Cの発現が増加している。一部の実施形態では、ML NK細胞は、対照NK細胞と比較してCD94の発現が増加している。一部の実施形態では、ML NK細胞は、対照NK細胞と比較してNKp46の発現が増加している。
一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞表面マーカーの発現は、少なくとも1つのサイトカインへの曝露から2~24時間以内または14~16時間以内に誘導される。一部の実施形態では、本明細書に記載される発現プロファイルは、少なくとも1つのサイトカインへの曝露から2~24時間以内または14~16時間以内に誘導される。
機能特性
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様(ML)NK細胞は、対照NK細胞と比較して、機能特性が増強している。一部の実施形態では、対照NK細胞は、IL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞、またはIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である。一部の実施形態では、対照NK細胞は、ML NK細胞の由来となったNK細胞と同じ表現型を有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるメモリー様(ML)NK細胞は、増殖能が増加している。一部の実施形態では、ML NK細胞は、対照NK細胞と比較して増殖が増加している。細胞増殖を測定するための方法は、当業者に公知であり、細胞の数を測定すること、および/または増殖マーカーを測定することが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、増殖は細胞質増殖色素を使用して測定され、この場合には、細胞透過性蛍光化学物質がサイトゾル成分に結合し、細胞分裂のたびに半分に希釈される。そのような色素は、in vitroおよびin vivoで使用することができる。例として、二酢酸カルボジフルオレセイン(CFSE)の測定が挙げられる。一部の実施形態では、増殖は、細胞周期関連タンパク質のレベルを定量することによって測定される。細胞増殖の測定には複数の手法が適用可能である。手法の例としては、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット分析、および組織顕微鏡検査が挙げられる。総細胞数の計数を含む、細胞増殖を決定するための人手による方法を使用してもよい。
一部の実施形態では、メモリー様(ML)NK細胞は、IFNγを産生する。一部の実施形態では、IFNγ産生は、ML NK細胞において、対照NK細胞(例えば、ヒトNK細胞または活性化ヒトNK細胞)と比較して増加している。一部の実施形態では、ML NK細胞は、NK細胞の刺激時のIFNγ産生が増加している。一部の実施形態では、NK細胞は、活性化受容体または腫瘍標的によって刺激される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、がん細胞への曝露時に、対照NK細胞と比較してIFNγ産生が増加している。一部の実施形態では、ML NK細胞は、がん細胞への曝露時に、対照NK細胞と比較してIFNγ産生が増加している。一部の実施形態では、IFNγ産生は、従来のNK細胞と比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも99%増加する。一部の実施形態では、IFNγ産生は、刺激時に活性化の後、1~7日間、7~14日間、14~21日間、および最長で30日間増加する。一部の実施形態では、ML NK細胞は、対象への移植後、IFNγの増加を1~7日間維持する。一部の実施形態では、ML NK細胞は、対象への移植後、IFNγの増加を少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、または少なくとも3か月間維持する。一部の実施形態では、ML NK細胞は、移植後、IFNγの増加を少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1か月間、少なくとも2か月間、または少なくとも3か月間にわたり維持する。一部の実施形態では、ML NK細胞は、IFNγの増強を子孫細胞に伝える。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、対照NK細胞と比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)が増強している。ADCCは、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を含む感受性標的を殺滅することができるプロセスであり、NK細胞がエフェクターである。ADCCは、NK細胞表面上の受容体が、細胞表面に結合したIgG1またはIgG3抗体を認識した場合に誘発される。これは、パーフォリンとグランザイムを含有する細胞質顆粒の放出を誘発して、標的細胞死を招く。NK細胞のADCCを測定するための方法は、当業者に公知である。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、対照NK細胞と比較して、抗腫瘍効果が増強している。NK細胞の抗腫瘍効果を測定するための方法は、当業者に公知であり、本明細書に記載される。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、(i)は、1つもしくは複数のサイトカインおよび/もしくは腫瘍標的の存在下で、産生するIFNγが増加しており;(ii)ADCCが増強しており;(iii)抗腫瘍効果が増強しており;または(iv)(i)~(iii)の任意の組合せを有する。
メモリー様NK細胞を製造する方法
一部の実施形態では、NK細胞は、メモリー様(ML)NK細胞に分化している。一部の実施形態では、NK細胞は、活性化され、次いで、一定期間(例えば、数時間、数日間)をかけてML NK細胞に分化する。一部の実施形態では、NK細胞の活性化は、ML NK細胞への分化をもたらす。一部の実施形態では、NK細胞は、サイトカイン、例えば、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18およびIL-21、ならびにそれらの任意の組合せを使用して活性化される。
一部の実施形態では、NK細胞は、IL-12およびIL-15;IL-12およびIL-18;IL-15およびIL-18;またはIL-12、IL-15およびIL-18への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。
一部の実施形態では、NK細胞は、1~20ng/mLの濃度範囲にあるIL-12への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、NK細胞は、少なくとも1ng/mL、少なくとも2ng/mL、少なくとも3ng/mL、少なくとも4ng/mL、少なくとも5ng/mL、少なくとも6ng/mL、少なくとも7ng/mL、少なくとも8ng/mL、少なくとも9ng/mL、少なくとも10ng/mL、少なくとも15ng/mL、または少なくとも20ng/mLのIL-12により活性化される。一部の実施形態では、NK細胞は、10ng/mLのIL-12により活性化される。
一部の実施形態では、NK細胞は、1~50ng/mLの濃度範囲にあるIL-15への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、NK細胞は、1~100ng/mLの濃度範囲にあるIL-15への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、NK細胞は、少なくとも50ng/mL、少なくとも60ng/mL、少なくとも70ng/mL、少なくとも80ng/mL、少なくとも90ng/mL、少なくとも95ng/mL、少なくとも100ng/mL、少なくとも110ng/mL、少なくとも120ng/mL、少なくとも130ng/mL、少なくとも140ng/mL、または少なくとも150ng/mLのIL-15により活性化される。一部の実施形態では、NK細胞は、1ng/mLのIL-15により活性化される。一部の実施形態では、NK細胞は、50ng/mLのIL-15により活性化される。
一部の実施形態では、NK細胞は、10~100ng/mLの濃度範囲にあるIL-18への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、NK細胞は、50ng/mLのIL-18により活性化される。一部の実施形態では、NK細胞は、少なくとも20ng/mL、少なくとも30ng/mL、少なくとも40ng/mL、少なくとも50ng/mL、少なくとも60ng/mL、少なくとも70ng/mL、少なくとも80ng/mL、少なくとも90ng/mL、少なくとも95ng/mL、または少なくとも100ng/mLのIL-18により活性化される。一部の実施形態では、NK細胞は、50ng/mLのIL-18により活性化される。
一部の実施形態では、NK細胞は、1~20ng/mLのIL-12、1~50ng/mLのIL-15および10~100ng/mLのIL-18への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、NK細胞は、10ng/mLのIL-12、1ng/mLのIL-15および50ng/mLのIL-18への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。一部の実施形態では、NK細胞は、10ng/mLのIL-12、50ng/mLのIL-15および50ng/mLのIL-18への、ある期間にわたる曝露によって活性化される。
一部の実施形態では、NK細胞は、サイトカイン活性化メモリー様(ML)NK細胞を形成させるのに十分な長さの時間にわたり、サイトカインの存在下でインキュベートされる。一部の実施形態では、サイトカイン活性化メモリー様(ML)NK細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、約8時間から約24時間、約12時間、または約16時間までの間である。一部の実施形態では、サイトカイン活性化メモリー様(ML)NK細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、約16時間から約20時間までの間である。一部の実施形態では、サイトカイン活性化メモリー様(ML)NK細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、少なくとも約1時間;約2時間;約3時間;約4時間;約5時間;約6時間;約7時間;約8時間;約9時間;約10時間;約11時間;約12時間;約13時間;約14時間;約15時間;約16時間;約17時間;約18時間;約19時間;約20時間;約21時間;約22時間;約23時間;約24時間;約25時間;約26時間;約27時間;約28時間;約29時間;約30時間;約31時間;約32時間;約33時間;約34時間;約35時間;約36時間;約37時間;約38時間;約39時間;約40時間;約41時間;約42時間;約43時間;約44時間;約45時間;約46時間;約47時間;または約48時間である。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、12~24時間、12~48時間、または14~16時間にわたる、少なくとも1つのサイトカインへの曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、16~20時間にわたる、少なくとも1つのサイトカインへの曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、16時間にわたる、少なくとも1つのサイトカインへの曝露によって活性化される。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、12~24時間または14~16時間にわたる、1~20ng/mLのIL-12、1~50ng/mLのIL-15および10~100ng/mLのIL-18への曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、12~24時間または14~16時間にわたる、10ng/mLのIL-12、1ng/mLのIL-15および50ng/mLのIL-18への曝露によって活性化される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、12~24時間、16~20時間、または14~16時間にわたる、10ng/mLのIL-12、50ng/mLのIL-15および50ng/mLのIL-18への曝露によって活性化される。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、in vitroでIL-15を用いて維持される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、in vitroで1ng/mLのIL-15を用いて維持される。一部の実施形態では、ML NK細胞を、毎日、2日ごと、3日ごと、4日ごと、または5日ごとにIL-15と接触させる。一部の実施形態では、ML NK細胞を、2日ごとにIL-15と接触させる。一部の実施形態では、ML NK細胞を、3日ごとにIL-15と接触させる。
一部の実施形態では、NK細胞は、NK細胞を少なくとも1つのサイトカインを発現する細胞と共培養することによって活性化される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、NK細胞と、樹状細胞およびマクロファージのうちの1つまたは複数との共培養によって生成される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、NK細胞と樹状細胞との共培養によって生成される。一部の実施形態では、樹状細胞は、NK細胞と共培養された場合、ML NK細胞を生成させるのに十分なIL-12、IL-15、およびIL-18のうちのいずれか1つまたは複数を分泌する。一部の実施形態では、ML NK細胞は、マクロファージとNK細胞との共培養によって生成される。一部の実施形態では、マクロファージは、NK細胞と共培養した場合に、ML NK細胞を生成させるのに十分なIL-12、IL-15、およびIL-18のうちのいずれか1つまたは複数を分泌する。
例示的なメモリー様NK細胞
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、本明細書に記載される表現型および少なくとも1つの機能特性を含む。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+であり、1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下で、対照NK細胞に比してIFNγを産生する。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+であり、(i)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下で、対照NK細胞に対してIFNγを産生し、ならびに(ii)対照NK細胞に比してADCC活性が増強している。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+であり、(i)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下で、対照NK細胞に比してIFNγを産生し、ならびに(ii)対照NK細胞に比して抗腫瘍効果が増強している。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+であり、(i)対照NK細胞に比して抗腫瘍効果が増強しており、および(ii)対照NK細胞に比してADCC活性が増強している。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+であり、(i)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下で、対照NK細胞に比してIFNγを産生し;(ii)対照NK細胞に比してADCC活性が増強しており;ならびに(iii)対照NK細胞に比して抗腫瘍効果が増強している。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており、1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下で、対照NK細胞に比してIFNγを産生する。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;ならびに(iii)ADCC活性が増強しており、ここで(i)~(iii)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;ならびに(iii)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(iii)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)ADCC活性が増強しており;ならびに(iii)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(iii)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記の集団は、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;(iii)ADCC活性が増強しており;ならびに(iv)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(iv)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)CD16および/またはCD11lbの発現が減少しており;ならびに(iii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し、ここで(i)~(iii)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)CD16および/またはCD11lbの発現が減少しており;(iii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;ならびに(iv)ADCC活性が増強しており、ここで(i)~(iv)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)CD16および/またはCD11lbの発現が減少しており;(iii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;ならびに(iv)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(iv)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)CD16および/またはCD11lbの発現が減少しており;(iii)ADCC活性が増強しており;ならびに(iv)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(iv)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記の集団は、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)CD16および/またはCD11lbの発現が減少しており;(iii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;(iv)ADCC活性が増強しており;ならびに(v)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(v)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記の集団は、(i)CD56bright、CD16low/-、NKG2A、KIRs、CD57であり;(ii)増殖性が高く;(iii)相対的に成熟しておらず;(iv)ASCT2の発現が増加しており、ここで(i)~(iv)は、CD56dim、CD16、NKG2A+/-、KIRs、CD57-;CD56dim、CD16、NKG2A+/-、KIRs、CD57;またはCD56dim、CD16、NKG2A+/-、KIRs、CD57である対照NK細胞に比してである。
細胞の形質導入効率を高めるための方法
本開示の複数の態様は、細胞の形質導入効率を高める方法を対象とする。複数の実施形態では、本方法は、少なくとも1つのASCT2細胞を、候補ポリペプチドをコードするベクターを含む細胞培地と接触させるステップを含む。複数の実施形態では、ASCT2細胞は、サイトカインにより活性化されている。一部の態様では、本開示は、少なくとも1つのASCT2細胞を、候補ポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ(BaEV)レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させるステップを含む、細胞の形質導入効率を高める方法を対象とする。
ASCT1(SLC1A4によってコードされる)(ASCT1(ヒト、遺伝子名称 SLC1A4、遺伝子ID:6509)およびASCT2(SLC1A5によってコードされる)(ASCT2(ヒト)、遺伝子名称SLC1A5、遺伝子ID:6510)を含むアラニン/セリン/システイン輸送体は、小型の中性アミノ酸、例えば、Ala、Ser、CysおよびThrのナトリウム依存性交換を媒介する。それらの構造は、グルタミン酸輸送体のものに類似していると予想されている。例えば、アラニン/セリン/システイン選好性輸送体2(ASCT2)は、遍在性に発現され、幅広い特異性を示すナトリウム依存性中性アミノ酸交換体であり、細胞外および細胞内のアミノ酸プールの調節に役割を果たすようである。生理的条件下では、ASCT2は体内に遍在して分布している。ASCT2はがんへの関与が指摘されている。例えば、ASCT2の過剰発現は、MYCのようながん遺伝子によって推進され、前立腺、肺、乳房、腎臓、消化管および肝臓、女性生殖器、ならびに神経系のがんで観察されている。
本明細書に記載されるように、ASCT2の発現レベルは、従来の初代NK細胞において高く、サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞ではさらに増強している。ASCT2は、ヒヒエンベロープ糖タンパク質BaEV-gpの受容体であり、このことは、NK細胞、例えば、初代NK細胞およびCIML NK細胞への非効率的な形質導入を、従来とは異なるBaEVシュードタイプ化レンチウイルスを利用して克服し得ることを指し示す。したがって、ASCT2の存在またはレベル(すなわち、ASCT2細胞)により、BaEV-レンチウイルスベクターによる形質導入に対してより受容性の高い細胞がもたらされる。
一部の実施形態では、ASCT2細胞は、ASCT2またはその発現の有無によって特徴付けることができる。例えば、ASCT2またはその発現の有無は、当技術分野で公知の手法によって決定することができる。例えば、イムノアッセイを実施するための手順は、例えば、"ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; and "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。
一部の実施形態では、ASCT2細胞は、対照細胞に比して、ASCT2タンパク質をコードする遺伝子の発現の増加またはASCT2タンパク質のレベルの増大によって特徴付けることができる。例えば、ASCT2細胞は、対照細胞に比して、ASCT2の発現の増加またはタンパク質レベルの増大を有し得る。本明細書で使用される場合、「対照」または「対照細胞」は、細胞の遺伝型または表現型、例えば、ASCT2の発現またはレベルの変化を測定するための基準点を与える細胞を指すことができる。例えば、対照細胞には、野生型細胞が含まれ得る。他の実施形態では、対照細胞には、遺伝子改変細胞、例えば、ASCT2-/-細胞が含まれ得る。さらに他の実施形態では、対照細胞には、未熟細胞または成熟細胞が含まれ得る。複数の実施形態では、対照細胞は、不活性化NK細胞であり得る。
「対照と比較して変化した」試料または細胞、例えば、対照細胞に比してのASCT2レベルの増大は、分析物または診断上もしくは治療上の指標(例えば、ASCT2などのマーカー)のレベルが、正常、未治療、または異常状態の対照試料からの試料とは統計的に異なるレベルで検出されることを指すことができる。統計的有意性の決定は当業者の能力の範囲内であり、例えば、陽性または陰性の結果を構成する、平均からの標準偏差の数である。
一部の実施形態では、ASCT2細胞は、対照細胞のものよりも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%または約100%大きい発現レベルまたはタンパク質レベルを有する。
複数の実施形態では、ASCT2細胞は、ASCT2をコードする遺伝子の発現、または閾値を上回るASCT2のレベルによって特徴付けることができる。「閾値」という用語、例えば、ASCT2閾値は、ASCT2に対応するポリペプチドなどのバイオマーカーについて、ドナー細胞などの複数の生体試料から導き出される値であって、その値を上回るとトランスフェクション効率の増加などの影響を伴う値を指すことができる。
複数の実施形態では、ASCT2細胞はNK細胞である。「NK細胞」は、自然免疫または非従来型免疫に関連するリンパ球の亜集団を指すことができる。NK細胞は、いくつかの特徴および生物学的特性によって特徴付けることができ、これには例えば、ヒトNK細胞上でのCD56および/またはCD16を含む特定の表面抗原の発現、細胞表面上のα/βまたはγ/δTCR複合体の欠如、「自己」MHC/HLA抗原を発現しない細胞に細胞の活性化によって結合し、それによって細胞を殺滅する能力、NK活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍または他の罹患細胞を殺滅する能力、刺激または抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する(「NK細胞活性」)がある。NK細胞のあらゆる亜集団も、NK細胞という用語に含まれる。
NK細胞の重要な機能としては、ウイルス感染細胞の殺滅、ヒトの生殖への寄与(妊娠脱落膜において支配的なリンパ球)、および抗腫瘍応答が挙げられる。例えば、長期的研究により、NK細胞活性の低さとがんリスクの増加が相関付けられている。また、がん患者はしばしば、NK細胞の数および/または機能に欠陥がある。NK細胞は、事前の感作なしにがん標的細胞(例えば、白血病性芽球)を殺滅することができる。重要なメディエーターには、例えば、Fc受容体(CD16a)を介するADCC(リツキシマブ、セツキシマブなど)が含まれる。
複数の実施形態では、細胞は初代細胞、例えば、初代NK細胞であり得る。例えば、初代NK細胞は、磁気標識、または非NK細胞(すなわち、T細胞、B細胞、幹細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、および赤血球細胞)の枯渇を含む、当技術分野で公知の方法などによって、PBMCから単離することができる。
一部の実施形態では、細胞はマウス初代NK細胞である。そのような細胞の形質導入率は約20%であり、このため、ヒト細胞よりも形質導入に対してさらに抵抗性である可能性がある。したがって、本明細書に記載される実施形態は、トランスジェニックマウスモデルを作出することなく、そうでなければ困難である研究に対して機会を提供する。
一部の実施形態では、細胞は、サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞であり得る。CIML NK細胞は、広範な増殖、およびサイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞への分化をもたらす、サイトカインにより予め活性化されたNK細胞を指すことができる。例えば、Romee, Rizwan, et al. "Cytokine activation induces human memory-like NK cells." Blood 120.24 (2012): 4751-4760を参照。例えば、休止NK細胞は、サイトカイン、例えば、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、またはそれらの任意の組合せによって活性化される。例えば、図1を参照すると、ナイーブNK細胞は、IL-12、IL-18、および任意選択でIL-15により予め活性化されて、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞が生成する。複数の実施形態では、CIML NK細胞を、対照細胞、例えば、活性化されていない細胞に比してIFN-γ産生が増強していることによって同定することができる。メモリー様NK細胞の他の好適なバイオマーカーには、CD94、NKG2A、NKG2C、CD69、およびNKp46が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、NK細胞(例えば、サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞、休止NK細胞、ナイーブNK細胞)を、インターロイキン-12ファミリーのサイトカインにより予め活性化することができる。インターロイキン-12ファミリーのメンバーには、例えば、ヘテロ二量体サイトカインであるIL-12(サブユニットIL-12A(p35)およびIL-12B(p40)を含む)、IL-23(サブユニットIL-12B(p40)およびIL-23 p19を含む)、IL-27(サブユニットEBI3およびIL-27 p28を含む)、およびIL-35(サブユニットEBI3およびIL-12A(p35)を含む)が含まれる。EBI3はIL-12 p40のホモログである。理論に拘束されることは望まないが、NK細胞(例えば、サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞、休止NK細胞、ナイーブNK細胞)を、IL-12B(p40)サブユニットまたはそのホモログ(例えば、EBI3)により予め活性化することができる。その全体が参照により組み込まれる、Sun et al., Cytokine. 2015 Oct; 75(2): 249-255も参照。
一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞、例えば、哺乳動物NK細胞である。「哺乳動物細胞」という用語は、哺乳動物由来の細胞を指すことができる。複数の実施形態では、細胞はヒト細胞、例えば、ヒトNK細胞であるが、一方、他の複数の実施形態では、細胞は、飼育動物、実験動物、家畜、または伴侶動物(例えば、齧歯類の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギなど)から得られる。本発明を何らかの特定の種由来の細胞に限定することは意図していないが、これは、本発明があらゆる種類の哺乳動物細胞に用途があるためである。本発明はまた、あらゆる種類の動物から得られる、正常細胞、がん性細胞、前がん細胞、健常細胞、罹患細胞、ウイルス感染細胞、様々な組織由来の細胞、様々な発生段階の細胞、例えば、成体細胞および胎児細胞にも用途がある。さらなる実施形態では、本発明は、あらゆる種類の動物から得られる、天然に存在する変異細胞、ノックアウト技術、挿入、欠失、または置換を使用して遺伝子操作された変異細胞、化学的に誘導された変異細胞、放射線で誘導された変異細胞などを含む変異細胞にも用途がある。本発明はさらに、あらゆる種類の動物に由来する、初代培養細胞、細胞株細胞、および病原体、例えば、ウイルス、細菌、原虫、真菌などが感染した細胞にも用途がある。
本明細書に記載されるように、本開示の複数の態様は、細胞の形質導入効率を高めるための方法を対象とする。例えば、本方法は、少なくとも1つのASCT2細胞を、標的遺伝子をコードするベクターを含む細胞培地と接触させるステップを含む。
複数の実施形態では、本方法は、ASCT2細胞を得る、単離する、または同定するステップを含み得る。複数の実施形態では、ASCT2細胞は、ASCT2細胞を、1つまたは複数のサイトカイン、例えば、IL-12、IL-18、および/またはIL-15とともに培養(または活性化)することによって提供することができる。細胞を「培養すること」は、細胞を細胞培地と、細胞の生存および/または成長および/または増殖に適した条件下で接触させることを指すことができる。例えば、図1を参照すると、ナイーブNK細胞はASCT細胞であり、これは、1つまたは複数のサイトカインとともに培養して、それらによって予め活性化された後に、ASCT2細胞であるサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞に分化する。一部の実施形態では、細胞をある期間にわたり培養することができる。例えば、細胞を、1つまたは複数のサイトカインにより予め活性化する前、その間、またはその後に培養することができる。例えば、IL-12、IL-18、および/またはIL-15により予め活性化した後に、細胞をIL-15とともにある期間にわたり培養することができる。別の例として、細胞を、形質導入の前、その間、またはその後に培養することができる。
したがって、複数の実施形態は、ASCT2細胞、例えば、サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞を得る、単離する、または同定するステップを含むことができる。本明細書に記載されるように、ASCT2の発現レベルは、サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞において増強しており、したがって、ASCT2の発現レベルまたはタンパク質レベルを使用して、ASCT2細胞を同定することができる。ASCT2はヒヒエンベロープ糖タンパク質BaEV-gpの受容体であり、このことは、NK細胞、例えば、CIML NK細胞の非効率的な形質導入を、従来とは異なるBaEVシュードタイプ化レンチウイルスを利用して克服し得ることを指し示す。したがって、したがって、ASCT2の存在またはレベル(すなわち、ASCT2細胞)により、BaEV-レンチウイルスベクターによる形質導入に対してより受容性の高い細胞がもたらされる。
候補ポリペプチド
細胞の成長、増殖、および死を制御する腫瘍特異的抗原が、細胞内に存在する可能性がある。細胞内タンパク質の認識には、HLA分子によって提示される抗原ペプチドを認識する能力が必要である。通常、NK細胞は、HLA分子によって提示される、ネオエピトープを含むエピトープを認識する手段を持たない。これまで見てきたように、本明細書に記載される遺伝子操作されたNK細胞は、細胞内抗原を標的とすることができる。例えば、T細胞受容体(TCR)様/模倣抗体と呼ばれる特定の抗体の群は、これらの細胞内抗原を標的とする。細胞内の腫瘍特異的抗原は、主要組織適合複合体(MHC)クラスIシグナル伝達経路を経て、腫瘍細胞表面に腫瘍特異的ペプチド/MHC複合体として提示される。TCR様抗体は、腫瘍細胞表面のペプチド/MHC複合体を、真正のTCRと同じ様式で認識する。T細胞表面に発現されたTCRによるペプチド/MHC複合体の認識は、様々な影響、例えば、T細胞の増殖および分化、ならびにサイトカインまたはケモカインの分泌を誘発することができる。しかし、TCR様抗体によるペプチド/MHC複合体の認識は、T細胞におけるTCRの認識よりもはるかに幅広い薬理学的経路を誘発することができる。TCR様抗体は、ADCC、CDC、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、またはアポトーシスの直接誘導を誘発し得る。そのような抗体標的としては、MAGE1、GP100、hTERT、MUC1、NY-ESO-1、FLT3、TP53、スプライソソーム因子、MAGE3、hCGβ、Her2/Neu、Melan-A/MART-1、TARP、p53、チロシナーゼ、p68、MIF、プロテイナーゼ3、WT1、HA-1H、およびPRAMEが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、He, Qinghua, et al. "TCR-like antibodies in cancer immunotherapy." Journal of hematology & oncology 12.1 (2019): 99を参照。
ヌクレオフォスミン1(NPM1)は、リボソームの集合/輸送、細胞質/核輸送、DNAポリメラーゼα活性の調節、中心体複製、およびp53の調節に関与するリンタンパク質である。NPM1は、ヒトではNPM1遺伝子によってコードされ、急性骨髄性白血病(AML)の細胞内標的である。細胞質への局在化をもたらすNPM1における変異は、変異タンパク質細胞質ヌクレオフォスミン1(NPM1c)と称することができる。NPM1cはそのC末端に核輸出シグナル(NES)を含む。
一部の実施形態では、候補ポリペプチドは、キメラ抗原受容体(またはCAR)を含む。「キメラ抗原受容体」は、腫瘍細胞によって発現される抗原を認識して、それに結合するように操作された、人工免疫細胞受容体を指すことができる。CARは、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞またはNK細胞のために設計することができ、それはT細胞受容体(TcR)複合体などのシグナル伝達ドメインと、抗原認識ドメインとのキメラであり得る(例えば、抗体の単鎖Fv断片(scFv))(Enblad Et al., Human Gene Therapy., 2015, 26 (8): 498-505)。
したがって、CARを使用して、抗体またはその断片の特異性をNK細胞またはT細胞に移植することができ、そのコード配列の移行はレトロウイルスベクターによって助長される。これらの受容体がキメラと呼ばれるのは、起源の異なる部分で構成されているためである。標的細胞、例えば、がん細胞に遭遇すると、CAR NK細胞は、例えば、以下の機序によってがん細胞を破壊する:細胞増殖の一般的な刺激、細胞が他の生細胞に対して傷害性である度合い(すなわち、細胞傷害性)を高めること、および免疫系の細胞によって分泌され、生物内部の他の細胞に影響を及ぼす因子の産生を増加させること。
本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるベクター、例えば、BaEV-LVは、目的の遺伝子(すなわち、候補ポリペプチドをコードする遺伝子、異種性ポリペプチドをコードする遺伝子、本明細書に記載されるCARをコードする遺伝子)を発現する。本明細書で使用される場合、候補ポリペプチドは、ASCT2+細胞上または細胞内での発現が所望される任意のポリペプチドまたはその断片を指すことができる。例えば、候補ポリペプチドは、抗体もしくはその断片、毒素、ホルモン、増殖因子、受容体、またはシグナル伝達分子であり得る。一部の実施形態では、候補ポリペプチドまたは異種性ポリペプチドは、本明細書に記載されるCARである。好適な候補ポリペプチドには、抗体およびその断片が含まれ、その非限定的な例には、免疫チェックポイント抗体(すなわち、免疫チェックポイント阻害剤)が含まれる。そのような抗体標的には、4-1BBリガンド、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD27、CD28、CD30、CD40、IDO、LIGHT、ネクチン2、OX40、CD70、CD80、CD86、CD96、CD137、CD153、CD154、CD155、CD223、OX40L、PD-1、PD-L1、TIGIT、CD226、CD273、CD357、CTLA-4、DR3、ガレクチン9、GITRL、ICOS、ICOSLG、TIM3、TL1A、TNFRSF14、およびVISTAが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「形質導入」または「細胞形質導入」という用語は、DNAウイルスまたはRNAウイルスを使用して、核酸を細胞に移入するプロセスを指すことができる。
本明細書に記載される実施形態は、従来のレンチウイルス形質導入アプローチに比して、形質導入効率を改善するかまたは高めることができる。「形質導入効率を高めること」または「形質導入効率を改善すること」は、ポリペプチドをコードする遺伝子が細胞膜を横切って細胞内に送達される標的細胞(例えば、ASCT2+ CIML NK細胞)の集団のパーセンテージまたは割合を改善する、シュードタイプ化レンチウイルスベクターの能力を指すことができる。免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、および他の好適な方法を使用して、形質導入効率を評価することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、FACS、および他の好適な方法による測定で、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、または85%の形質導入効率を可能にすることができる。例えば、本明細書に記載される方法は、約3日後に細胞の少なくとも40%の形質導入をもたらし得る。
細胞における形質導入効率を高めるための例示的な方法
複数の態様では、本発明は、細胞の形質導入効率を高める方法を提供する。例えば、本方法は、少なくとも1つのASCT2細胞、例えば、NK細胞を、候補ポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ(BaEV)レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させるステップを含む。複数の実施形態では、ASCT2細胞は、インターロイキン-12ファミリーのメンバーおよびIL-18により活性化されている。複数の実施形態では、ASCT2細胞は、IL-12、IL-18、およびIL-15により活性化されている。複数の実施形態では、本方法は、NK細胞を得て、単離して、または同定して、NK細胞、例えば、ASCT2細胞を、インターロイキン-12ファミリーのメンバーおよびIL-18、ならびに任意選択でIL-15により活性化するステップを含む。さらなる実施形態では、インターロイキン-12ファミリーのメンバーは、IL-12、IL-23、IL-27、またはIL-35を含む。さらなる実施形態では、NK細胞の活性化により、ASCT2細胞が生成される。複数の実施形態では、ASCT2細胞は、サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞である。さらなる実施形態では、本方法は、サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞を得る、単離する、または同定するステップを含む。ある特定の実施形態では、ASCT2の発現またはレベルは、対照細胞に対して増加している。さらなる実施形態では、対照細胞は、不活性化されたNK細胞である。複数の実施形態では、対照細胞は成熟NK細胞である。複数の実施形態では、ASCT2発現は、ASCT2細胞において、対照細胞に比して約20%~約30%増加している。複数の実施形態では、ASCT2の存在またはレベルは、BaEVレンチウイルスベクターによる形質導入に対してより受容性である細胞をもたらす。複数の実施形態では、ASCT2細胞は、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23またはそれらの任意の組合せのうちの1つまたは複数により活性化されている。複数の実施形態では、ASCT2細胞は哺乳動物細胞である。さらなる実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。さらなる実施形態では、ヒト細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)から単離される/単離されている。複数の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒヒエンベロープ糖タンパク質(BaEV-gp)によりシュードタイプ化されている。複数の実施形態では、約3日後に少なくとも1つのASCT2細胞のうちの少なくとも40%が形質導入されている。複数の実施形態では、形質導入効率は、従来のレンチウイルス形質導入アプローチに比して改善している。複数の態様では、候補ポリペプチドには、抗体またはその断片、毒素、ホルモン、増殖因子、受容体、もしくはシグナル伝達分子、またはそれらのキメラ抗原受容体が含まれる。さらなる実施形態では、抗体または断片は、チェックポイント阻害剤に対して特異的である。さらなる実施形態では、抗体は、抗T細胞受容体抗体またはT細胞受容体様抗体である。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、NPM1、NPM1c、MAGE1、GP100、hTERT、MUC1、NY-ESO-1、FLT1、TP53、スプライソソーム因子、MAGE3、hCHβ、Her2/Neu、Melan-A/MART-1、TARP、p53、チロシナーゼ、p68、MIF、プロテイナーゼ3、WT1、HA-1H、またはPRAMEに対して特異的である。複数の態様では、抗体は、腫瘍特異的細胞内タンパク質を標的とする。さらなる実施形態では、細胞内タンパク質は、NPM1cを含む。複数の態様では、培地は12/15/15/21およびIL-7を含む。
本発明の複数の態様はまた、本明細書に記載される方法のいずれかによって産生される細胞に向けても描写される。
さらに、本発明の複数の態様は、がんを治療する方法に向けても描写される。例えば、そのような方法は、本明細書に記載される方法のいずれか1つによって産生される細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
さらに、本発明の複数の態様は、遺伝子操作された細胞を製造する方法に向けても描写される。例えば、そのような方法は、少なくとも1つのASCT2細胞を、あるポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ(BaEV)レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させるステップを含む。複数の実施形態では、ASCT2細胞は、インターロイキン-12ファミリーのメンバーおよびIL-18により活性化されている。複数の実施形態では、インターロイキン-12ファミリーのメンバーは、IL-12、IL-23、IL-27、またはIL-35を含む。
また、本発明の複数の態様は、少なくとも1つのASCT2細胞を、ポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ(BaEV)レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させることによって作製される遺伝子操作された細胞に向けても描写される。複数の実施形態では、ASCT2細胞は、インターロイキン-12ファミリーのメンバーおよびIL-18で活性化されている。
さらに、本発明の複数の態様は、本明細書に記載されるいずれかの方法によって作製された細胞、または少なくとも1つのASCT2細胞を、あるポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ(BaEV)レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させることによって作製される、遺伝子操作された細胞を含む免疫療法に向けても描写される。複数の実施形態では、ASCT2細胞は、インターロイキン-12ファミリーのメンバーおよびIL-18により活性化されている。
また、本発明の複数の態様は、がんを治療する方法に向けても描写される。例えば、そのような方法は、本明細書に記載されるいずれかの方法によって作製された細胞、または少なくとも1つのASCT2細胞を、あるポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ(BaEV)レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させることによって作製される、遺伝子操作された細胞を含む免疫療法を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。複数の実施形態では、ASCT2細胞は、インターロイキン-12ファミリーのメンバーおよびIL-18により活性化されている。
本発明の他の目的および利点は、以下の説明から容易に明らかになるであろう。
サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の形質導入の方法
異種性ポリペプチドを発現するサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団を作製するための方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、異種性ポリペプチドは、本明細書に記載されるいずれかのCARポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、本方法は、シュードタイプ化レンチウイルスベクターにより、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団に形質導入するステップを含む。本明細書に記載されるように、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、異種性糖タンパク質、例えば、異なるエンベロープウイルス由来の糖タンパク質を含む。一部の実施形態では、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、糖タンパク質によって認識される受容体が存在するか、または宿主細胞によって発現されるかに基づいて、特定の宿主細胞を認識して形質導入することができる。例えば、古典的なシュードタイプ化レンチウイルスベクターは、LDL受容体に結合する糖タンパク質VSV-Gを含み、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、LDL受容体を発現する宿主細胞を認識して形質導入する。理論には拘束されないが、LDL受容体はNK細胞上(例えば、従来のNK細胞、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞)ではほとんど発現されず、このため、VSV-G糖タンパク質を含むシュードタイプ化レンチウイルスベクターを使用したこれらの細胞における形質導入効率は効果的でない。
したがって、本開示の方法は、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団に、細胞上に存在する受容体に結合する異種性糖タンパク質を含むシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより、形質導入するステップを含む。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞はASCT-2を発現し、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、ASCT-2に結合する糖タンパク質を含む。理論には拘束されないが、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞上でのASCT-2の高い発現は、ASCT-2に結合する糖タンパク質を含むシュードタイプ化レンチウイルスベクターを使用したこれらの細胞における有効な形質導入をもたらす。
一部の実施形態では、ASCT-2に結合する糖タンパク質は、ASCT-2への結合を維持しているBaEV糖タンパク質またはそのバリアントである。一部の実施形態では、ASCT-2に結合する糖タンパク質は、配列番号107と少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ASCT-2に結合する糖タンパク質は、配列番号107を含む。一部の実施形態では、ASCT-2に結合する糖タンパク質は、配列番号107からなる。
一部の実施形態では、ASCT-2に結合する糖タンパク質は、配列番号108と少なくとも70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ASCT-2に結合する糖タンパク質は、配列番号108によって示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ASCT-2に結合する糖タンパク質は、配列番号108によって示されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドからなる。
一部の実施形態では、集団は、ASCT-2を発現するサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞を含む。一部の実施形態では、異種性ポリペプチドを発現するサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団を作製するための方法は、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団を、異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと(例えば、サイトカイン誘導性のメモリー様NK細胞の集団に形質導入する条件下で)接触させるステップであって、シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ASCT-2に結合する糖タンパク質(例えば、BaEV)を含むステップを含む。
一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される方法によるサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団を提供するステップを含む。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、対照NK細胞の集団に比して、本明細書に記載される1つまたは複数の表現型マーカーおよび/または機能特性を含む。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、初代ヒトNK細胞の集団から得られる。一部の実施形態では、対照NK細胞の集団は、初代ヒトNK細胞の同じまたは異なる集団から得られる。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、本明細書に記載される方法による(例えば、自己性または同種性)iPSC、臍帯血、またはPBMCに由来する。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団および対照NK細胞の集団は、初代ヒトNK細胞の同じ集団から得られ、初代ヒトNK細胞の集団は、本明細書に記載される方法による(例えば、自己性または同種性)iPSC、臍帯血、またはPBMCに由来する。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、初代ヒトNK細胞の集団を予め活性化することによって得られる。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、Romee R, et al. Blood. 2012;120(24) and/or Romee R, Sci. Transl. Med. 2016; 21:357ra123(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている方法に従って得られる。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、1つまたは複数のサイトカインへの、ある期間にわたる曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、1つまたは複数のサイトカインは、IL-12、IL-15、IL-18、およびそれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、IL-12およびIL-15;IL-12およびIL-18;IL-18およびIL-15;またはIL-12、IL-15、およびIL-18への、ある期間にわたる曝露によって予め活性化される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、初代ヒトNK細胞の集団を予め活性化することによって得られ、初代ヒトNK細胞の集団は、約1ng/mLから約20ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-12;約1ng/mLから約50ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-15;および約10ng/mLから約100ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-18に、ある期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約5ng/mLから約15ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-12;約25ng/mLから約75ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-15;および約25ng/mLから約75ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-18に、ある期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約5ng/mLから約15ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-12;および約25ng/mLから約75ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-18に、ある期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ng/mLの濃度のIL-12;約40、45、50、55、または60ng/mLの濃度のIL-15;および約40、45、50、55、または60ng/mLの濃度のIL-18に、ある期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ng/mLの濃度のIL-12;および約40、45、50、55、または60ng/mLの濃度のIL-18に、ある期間にわたり曝露される。
一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約8時間から約24時間の間の期間にわたる、1つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約12時間から約20時間の間の期間にわたる、1つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約12時間から約16時間の間の期間にわたる、1つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約16時間から約20時間の間の期間にわたる、1つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約14時間から約16時間の間の期間にわたる、1つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約12、13、14、15、16、17、18、19、または20時間の期間にわたる、1つまたは複数のサイトカインへの曝露によって予め活性化される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、初代ヒトNK細胞の集団を予め活性化することによって得られ、初代ヒトNK細胞の集団は、約8時間から約24時間の間の期間にわたり、IL-12、IL-15、およびIL-18に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約12時間から約20時間の間の期間にわたり、IL-12、IL-15、およびIL-18に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約12時間から約16時間の間の期間にわたり、IL-12、IL-15、およびIL-18に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約16時間から約20時間の間の期間にわたり、IL-12、IL-15、およびIL-18に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約14時間から約16時間の間の期間にわたり、IL-12、IL-15、およびIL-18に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約12、13、14、15、16、17、18、19、または20時間の間の期間にわたり、IL-12、IL-15、およびIL-18に曝露される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、初代ヒトNK細胞の集団を予め活性化することによって得られ、初代ヒトNK細胞の集団は、約8時間から約24時間の間の期間にわたり、IL-12およびIL-18に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約12時間から約20時間の間の期間にわたり、IL-12およびIL-18に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約12時間から約16時間の間の期間にわたり、IL-12およびIL-18に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約16時間から約20時間の間の期間にわたり、IL-12およびIL-18に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約14時間から約16時間の間の期間にわたり、IL-12およびIL-18に曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約12、13、14、15、16、17、18、19、または20時間の間の期間にわたり、IL-12およびIL-18に曝露される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、初代ヒトNK細胞の集団を予め活性化することによって得られ、初代ヒトNK細胞の集団は、約1ng/mLから約20ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-12;約1ng/mLから約50ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-15;および約10ng/mLから約100ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-18に、約8時間から約24時間の間;約12時間から約16時間の間;約16時間から約20時間の間;約14時間から約16時間の間;または約12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20時間の期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約5ng/mLから約15ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-12;約25ng/mLから約75ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-15;および約25ng/mLから約75ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-18に、約8時間から約24時間の間;約12時間から約16時間の間;約16時間から約20時間の間;約14時間から約16時間の間;または約12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20時間の期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ng/mLの濃度のIL-12;約40、45、50、55、または60ng/mLの濃度のIL-15;および約40、45、50、55、または60ng/mLの濃度のIL-18に、約8時間から約24時間の間;約12時間から約16時間の間;約16時間から約20時間の間;約14から約16時間の間;または約12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20時間の期間にわたり曝露される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、初代ヒトNK細胞の集団を予め活性化することによって得られ、初代ヒトNK細胞の集団は、約1ng/mLから約20ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-12;および約10ng/mLから約100ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-18に、約8時間から約24時間の間;約12時間から約16時間の間;約16時間から約20時間の間;約14時間から約16時間の間;または約12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20時間の期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約5ng/mLから約15ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-12;および約25ng/mLから約75ng/mLの間の濃度範囲にあるIL-18に、約8時間から約24時間の間;約12時間から約16時間の間;約16時間から約20時間の間;約14時間から約16時間の間;または約12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20時間の期間にわたり曝露される。一部の実施形態では、初代ヒトNK細胞の集団は、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ng/mLの濃度のIL-12;および約40、45、50、55、または60ng/mLの濃度のIL-18に、約8時間から約24時間の間;約12時間から約16時間の間;約16時間から約20時間の間、;約14時間から約16時間の間;または約12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20時間の期間にわたり曝露される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、予めの活性化の後に形質導入される。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団を、本明細書に記載される方法による形質導入の前に、ある期間にわたり休ませる。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、休止中にIL-15に曝露される。一部の実施形態では、休止は、約0.5ng/mLから5ng/mLの間の濃度のIL-15への曝露を含む。一部の実施形態では、休止は、約0.5ng/mLから2ng/mLの間の濃度のIL-15への曝露を含む。一部の実施形態では、休止は、約0.5、0.6、0.7、0,8、0.9、1.0、1.5、または2ng/mLの濃度のIL-15への曝露を含む。一部の実施形態では、休止は、形質導入の前に、約12時間から約96時間の間、約12時間から約72時間の間、約12時間から約48時間の間、約12時間から約24時間の間、約24時間から約72時間の間、または約24時間から約48時間の間の期間にわたり行われる。
一部の実施形態では、対照NK細胞の集団は、IL-15のみへの、ある期間にわたる初代ヒトNK細胞の曝露によって得られる。一部の実施形態では、対照NK細胞の集団は、約40、45、50、55、または60ng/mLの濃度のIL-15への、任意選択で約8時間から約24時間の間、約16時間から約20時間の間、約12時間から約16時間の間、約14時間から約16時間の間、または約16時間の間の期間にわたる、初代ヒトNK細胞の曝露によって得られる。一部の実施形態では、対照NK細胞の集団は、IL-15への曝露によって維持される。一部の実施形態では、対照NK細胞の集団は、約0.5、0.6、0.7、0,8、0.9、1.0、1.5、または2ng/mLの濃度のIL-15への、約12時間から約96時間の間、約12時間から約72時間の間、約12時間から約48時間の間、約12時間から約24時間の間、約24時間から約72時間の間、または約24時間から約48時間の間の期間にわたる曝露によって維持される。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、本明細書にさらに記載されるように、NK細胞の対照集団(例えば、IL-15単独の存在下で活性化されたNK細胞の対照集団)に比して、1つまたは複数の特有のマーカーを発現する。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、本明細書にさらに記載されるように、NK細胞の対照集団(例えば、IL-15単独の存在下で活性化されたNK細胞の対照集団)に比して、1つまたは複数の特有の機能特性を有する。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、NK細胞の対照集団(例えば、IL-15単独の存在下で活性化されたNK細胞の対照集団)に比して、ASCT-2発現が増加している。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、NK細胞の対照集団に比して、ASCT-2の表面発現が増加している。表面マーカーの発現を測定する方法は当技術分野で公知であり、フローサイトメトリー、質量分析イメージング(例えば、CyTOF)、組織学的検査、および顕微鏡検査が含まれる。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、NK細胞の対照集団に比してASCT-2の表面発現が増加しており、例えば、フローサイトメトリーによる測定で、増加は、少なくとも1.1倍、約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、または4倍への増加である。一部の実施形態では、増加は約1.5~3倍への増加である。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、NK細胞の対照集団に比して、ASCT-2 RNA転写物の発現が増加している。RNA発現を定量するための方法は当技術分野で公知であり、定量的PCRおよびRNAシークエンシングが含まれる。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団におけるASCT-2 RNA転写物の発現は、メモリー様NK細胞の対照集団に比して、少なくとも約1.1倍、約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、または5倍に増加している。一部の実施形態では、ASCT-2 RNA転写物の発現は、約2倍~約4倍に増加している。
一部の実施形態では、異種性ポリペプチド(例えば、本明細書に記載されるCAR)を発現する操作されたサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団は、ASCT-2を発現するサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団を、異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、サイトカイン誘導性ML NK細胞の集団に形質導入するための条件下で接触させることによって得られ、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、ASCT-2に結合する糖タンパク質(例えば、BaEV)を含む。
シュードタイプ化レンチウイルスベクターを得るための方法は、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、シュードタイプ化レンチウイルスベクターは、(i)1つまたは複数のレンチウイルスパッケージングプラスミド、伝達プラスミド、および/またはエンベローププラスミドを、標的細胞(例えば、A293T細胞)にトランスフェクトすること;(ii)標的細胞をほぼ集密にまたは完全な集密になるまで増殖させること;(iii)細胞培地を採取すること;および(iv)シュードタイプ化レンチウイルスベクターを収集すること、によって作製される。一部の実施形態では、シュードタイプ化レンチウイルスベクターの力価は、当技術分野で記載されている方法、例えば、フローサイトメトリーを使用して決定される。
一部の実施形態では、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様NKの集団を、集団に形質導入するのに十分な、ある力価のシュードタイプ化レンチウイルスベクター(例えば、BaEVレンチウイルスベクター)と接触させる。一部の実施形態では、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様NKの集団を、約5×10、約6×10、約7×10、約8×10、約9×10、約10×10、約11×10、約12×10、約13×10、約14×10、または約15×10である感染多重度(MOI)のシュードタイプ化レンチウイルスベクター(例えば、BaEVレンチウイルスベクター)と接触させる。一部の実施形態では、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様NKの集団を、シュードタイプ化レンチウイルスベクター(例えば、BaEVレンチウイルスベクター)と、約1時間から約5時間の間、任意選択で約1時間から約1.5時間までの期間にわたり接触させる。
一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NKの集団と、異種性ポリペプチド(例えば、本明細書に記載されるCARポリペプチド)をコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクター(例えば、BaEVレンチウイルスベクター)との接触は、集団の少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、または90%の形質導入をもたらす。一部の実施形態では、形質導入は、当技術分野で公知の方法を使用して、異種性ポリペプチドをコードするmRNAの発現および/または異種性ポリペプチドを定量することによって測定される。一部の実施形態では、形質導入は、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、フローサイトメトリーまたはCyTOFによって、異種性ポリペプチドの表面発現を定量することによって測定される。
一部の実施形態では、本方法は、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の集団を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞の集団を増大させるステップをさらに含む。
サイトカイン発現NK細胞
一部の実施形態では、ML NK細胞は、サイトカインを発現するように操作される。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、IL-15ポリペプチドを発現するように操作される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、膜結合型IL-15ポリペプチドを発現するように操作される。一部の実施形態では、膜結合型IL-15ポリペプチドは、異種性膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ML NK細胞は、分泌型IL-15ポリペプチドを発現するように操作される。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、配列番号96に示されるアミノ酸配列を含むIL-15ポリペプチドを発現するように操作される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、配列番号96に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むIL-15ポリペプチドを発現するように操作される。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、配列番号96に示されるアミノ酸配列を含み、異種性膜貫通ドメインと作動可能に連結されているIL-15ポリペプチドを発現するように操作される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、配列番号96に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、異種性膜貫通ドメインと作動可能に連結されているIL-15ポリペプチドを発現するように操作される。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、IL15Raを発現するように操作される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、以下のもの:(i)自己切断性ペプチドを使用することによるIL15およびIL15Raの同時発現;(ii)IL15とIL5Raとの融合タンパク質;(iii)IL15Raの細胞内ドメインが短縮しているIL15/IL15Ra融合タンパク質;(iv)IL15とIL15Raの膜結合型Sushiドメインとの融合タンパク質;(v)IL15とIL15Rとの融合タンパク質;(vi)ILI5Rのホモ二量体;ならびに(v)膜貫通ドメインと融合したIL-15ポリペプチド、のうちの少なくとも1つを発現するように操作される。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、以下のもの:(i)自己切断性ペプチドを使用することによるIL15およびIL15Raの同時発現;(ii)IL15とIL5Raとの融合タンパク質;(iii)IL15Raの細胞内ドメインが短縮しているIL15/IL15Ra融合タンパク質;(iv)IL15とIL15Raの膜結合型Sushiドメインとの融合タンパク質;(v)IL15とIL15Rとの融合タンパク質;(vi)ILI5Rのホモ二量体;(v)膜貫通ドメインと融合したIL-15ポリペプチド、のうちの少なくとも1つを発現するように操作され、(i)~(v)のうちのいずれか1つを、別々の構築物において、またはバイシストロン構築物において、CARと同時発現させることができる。一部の実施形態では、細胞表面外因性サイトカインまたは受容体の部分ペプチドまたは完全ペプチドが、本明細書に提供される細胞において一過性に発現される。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、IL-15、膜結合型IL-15、分泌性IL-15、およびIL-15Raのうちのいずれか1つまたは複数を発現するように操作される。一部の実施形態では、操作されたML NK細胞は、本明細書に記載されるいずれかのIL-15ポリペプチドを発現するように操作された場合に、細胞増殖および生存期間が増加している。一部の実施形態では、IL-15ポリペプチドを発現するように操作されたメモリー様NK細胞は、IL-15ポリペプチドを発現していないメモリー様NK細胞と比較して、細胞増殖が増加している。
一部の実施形態では、IL-15ポリペプチドを発現するように操作されたメモリー様NK細胞は、対照NK細胞と比較して、細胞増殖が増加している。一部の実施形態では、IL-15ポリペプチドを発現している操作されたメモリー様NK細胞は、従来のNK細胞またはIL-15ポリペプチドを発現していないML NK細胞よりも、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%速く増殖する。一部の実施形態では、メモリー様NK細胞は、本明細書に記載されるいずれかのIL15ポリペプチドを発現している従来のNK細胞と比較して、細胞生存期間が増加している。一部の実施形態では、操作されたML NK細胞は、従来のNK細胞よりも、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%長く生存する。
例示的な抗NPM1c CAR発現サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞
一部の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかのキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドを発現するサイトカイン誘導性メモリー様ヒトNK細胞が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞または前記細胞の集団は、本明細書に記載されるいずれかのキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドをコードする核酸により、形質転換される。
一部の実施形態では、(i)配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチド、および(ii)配列番号96に示されるアミノ酸配列を含むIL-15ポリペプチドを発現するように操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ヒトNK細胞が、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、(i)配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチド、および(ii)配列番号96に示されるアミノ酸配列を含む膜結合型IL-15ポリペプチドを発現するように操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ヒトNK細胞が、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、(i)配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチド、および(ii)配列番号96に示されるアミノ酸配列を含み、異種性膜貫通ドメインと融合したIL-15ポリペプチドを発現するように操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ヒトNK細胞が、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、抗NPM1c CAR ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+であり、1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下で、対照NK細胞に比してIFNγを産生する。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+であり、(i)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下で、対照NK細胞に比してIFNγを産生し、ならびに(ii)対照NK細胞に比してADCC活性が増強している。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+であり、(i)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下で、対照NK細胞に比してIFNγを産生し、ならびに(ii)対照NK細胞に比して抗腫瘍効果が増強している。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+であり、(i)対照NK細胞に比して抗腫瘍効果が増強しており、および(ii)対照NK細胞に比してADCC活性が増強している。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+であり、(i)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下で、対照NK細胞に比してIFNγを産生し;(ii)対照NK細胞に比してADCC活性が増強しており;ならびに(iii)対照NK細胞に比して抗腫瘍効果が増強している。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており、1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下で、対照NK細胞に比してIFNγを産生する。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;ならびに(iii)ADCC活性が増強しており、ここで(i)~(iii)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;ならびに(iii)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(iii)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)ADCC活性が増強しており;ならびに(iii)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(iii)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;(iii)ADCC活性が増強しており;ならびに(iv)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(iv)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)CD16および/またはCD11lbの発現が減少しており;ならびに(iii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し、ここで(i)~(iii)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)CD16および/またはCD11lbの発現が減少しており;(iii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;ならびに(iv)ADCC活性が増強しており、ここで(i)~(iv)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)CD16および/またはCD11lbの発現が減少しており;(iii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;ならびに(iv)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(iv)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)CD16および/またはCD11lbの発現が減少しており;(iii)ADCC活性が増強しており;ならびに(iv)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(iv)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、ML NK細胞または前記細胞の集団は、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むscFvを含むCARポリペプチドを発現し、(i)CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、CD25またはそれらの任意の組合せの発現が増加しており;(ii)CD16および/またはCD11lbの発現が減少しており;(iii)1つまたは複数のサイトカインおよび/または腫瘍標的の存在下でIFNγを産生し;(iv)ADCC活性が増強しており;ならびに(v)抗腫瘍効果が増強しており、ここで(i)~(v)は対照NK細胞に比してである。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるML NK細胞は、末梢血、臍帯血、またはリンパ液から単離されるかまたは増大されたNK細胞に由来する。一部の実施形態では、NK細胞は同種性である。一部の実施形態では、NK細胞は自己性である。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるML NK細胞は、(本明細書に記載されるCARを発現するようなその改変の後に)それが投与される対象にとって自己性である。一部の実施形態では、本明細書に提供されるML NK細胞は、(本明細書に記載されるCARを発現するようなその改変の後に)それが投与される対象にとって同種性である。同種性ML NK細胞を使用してCAR発現免疫エフェクター細胞を調製する場合、免疫エフェクター細胞を、1つまたは複数の免疫抑制剤と同時投与することができる。
一部の実施形態では、ML NK細胞は、疾患または状態(例えば、がん、例えば、AML)を有する患者に由来し、本明細書に記載されるいずれかの抗原(例えば、ネオ抗原)に対する特異性を有する少なくとも1つのCARを発現するようにin vitroで遺伝子改変されている。例えば、抗原は、MHCクラスIタンパク質によって提示されるがんネオ抗原(例えば、MHCクラスIタンパク質、例えば、NPM1c:HLA-A2と複合体を形成した変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原)であり得る。一部の実施形態では、MHCクラスIタンパク質(例えば、NPM1c:HLA-A2)によって提示されるがんネオ抗原に対する特異性を有するCARを発現するように遺伝子改変されたML NK細胞は、次いで、患者におけるがん(例えば、NPM1c陽性がん、例えば、AML)を治療するために投与される。一部の実施形態では、ML NK細胞は、リガンドまたは抗原のCARへの特異的結合によって刺激または誘導され、同じ患者の疾患または状態の治療のために有用な、少なくとも1つのエフェクター機能(例えば、サイトカインの誘導)を果たす。
(例えば、CARの細胞外ドメインのがんネオ抗原への結合による)CARを含むML NK細胞の刺激は、CAR細胞の1つまたは複数の抗がん活性の活性化をもたらし得る。例えば、一部の実施形態では、CAR ML NK細胞の刺激は、サイトカインの分泌を含む、CAR細胞の細胞溶解活性またはヘルパー活性の増加をもたらし得る。
一部の実施形態では、CARエフェクター細胞(例えば、CAR-ML NK細胞)は、本明細書に記載されるいずれかの抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)に結合するCAR分子を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法において有用なCAR分子を含むML NK細胞は、MHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成した(またはそれによって提示される)NPM1cネオエピトープ、例えば、NPM1c:HLA-A2に結合する細胞外ドメインを含むCARを発現する。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法において有用なCAR分子を含む免疫エフェクター細胞(例えば、CAR-ML NK細胞)は、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCARを発現する。
一部の実施形態では、CAR構築物は、メモリー様ナチュラルキラー(ML NK)細胞において発現されること、または機能することができる。
一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞は、CARを発現していないNK細胞と比較して、標的細胞に対する細胞傷害が増加している。細胞傷害を測定するための方法は当業者に公知であり、目的の標的細胞の細胞数を測定すること、細胞死/生存率に関するマーカーを測定すること、および発光が含まれるが、これらに限定されない。例えば、一部の実施形態では、フローサイトメトリー分析は、総細胞数を定量するために使用される。一部の実施形態では、細胞を、Live/Dead Fixable染色キットを使用して染色し、フローサイトメトリーを使用して定量する。一部の実施形態では、細胞傷害は、ルシフェラーゼ発現標的細胞を使用して測定される。エフェクター細胞とともに培養した場合、標的細胞溶解物の発光を使用して細胞傷害を計算する。
一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞と接触された場合に、1つまたは複数の表現型および/または機能的マーカーの発現が増加する。一部の実施形態では、発現増加を有する1つまたは複数の表現型および/または機能的マーカーは、(i)IFNγ;(ii)グランザイムB;(iii)CD25、CD69、ICOS、CD226、CD107a、およびCD62Lから選択される1つまたは複数の活性化マーカー;(iv)NKp30、NKG2D、NKp44から選択される1つもしくは複数の活性化受容体;(vi)CD56およびNKG2Aから選択される1つもしくは複数の成熟マーカー;ならびに/または(viii)TIGITから選択され、ここで(i)~(viii)は対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比してである。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞と接触された場合に、対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比して、IFN-γの発現が増加している。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞と接触された場合に、対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比して、グランザイムBの発現が増加している。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞と接触された場合に、対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比して、CD107aの発現が増加している。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞と接触された場合に、対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比して、TIGITの発現が増加している。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞と接触された場合に、対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比して、活性化マーカーの発現が増加している。一部の実施形態では、活性化マーカーはCD62Lである。一部の実施形態では、活性化マーカーはCD25である。一部の実施形態では、活性化マーカーはCD69である。一部の実施形態では、活性化マーカーはICOSである。一部の実施形態では、活性化マーカーはCD226である。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞と接触された場合に、活性化受容体の発現が増加している。一部の実施形態では、活性化受容体はNKG2Dである。一部の実施形態では、活性化受容体はNKp30である。一部の実施形態では、活性化受容体はNKp44である。
一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞と接触された場合に、1つまたは複数の表現型および/または機能的マーカーの発現が減少している。一部の実施形態では、発現減少を有する1つまたは複数の表現型および/または機能的マーカーは、(i)CD57;および/または(ii)TRAILから選択され、ここで(i)~(ii)は対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比してである。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞と接触された場合に、対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比して、TRAILの発現が減少している。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞と接触された場合に、対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比して、CD57の発現が減少している。
一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞に接触された場合に、(i)IFNγの発現増加;(ii)グランザイムBの発現増加;(iii)CD25、CD107a、CD69、ICOS、CD226、およびCD62Lから選択される1つもしくは複数の活性化マーカーの発現増加;(iv)NKp30、NKG2D、NKp44から選択される1つもしくは複数の活性化受容体の発現増加;(v)CD56およびNKG2Aから選択される1つもしくは複数の成熟マーカーの発現増加;(vi)CD57の発現減少;(vii)TIGITの発現増加;ならびに/または(viii)TRAILの発現減少を有し、ここで(i)~(vii)は対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比してである。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞に接触された場合に、対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比して、IFNγの発現増加およびCD107aの発現増加を有する。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞に接触された場合に、対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比して、IFNγ、CD107a、およびグランザイムBの発現増加を有する。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞(例えば、NPM1c:HLA-A2結合ドメインを含むCAR)は、CAR抗原認識ドメインによって標的化される抗原(例えば、NPM1c:HLA-A2)を発現する標的細胞に接触された場合に、対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比して、IFNγ、CD107a、グランザイムBの発現増加;および対照NK細胞(例えば、CAR非発現ML NK細胞)に比して、TRAILの発現減少を有する。
CAR発現サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞を製造する方法
本明細書に記載されるいずれかのCARポリペプチドを含む、本明細書に記載されるサイトカイン誘導性メモリー様NK細胞のいずれかを生成するために使用し得る方法が、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、CARポリペプチドまたはCARポリペプチドをコードする核酸分子は、当業者に公知の任意の方法を使用して、ML NK細胞または前記細胞の集団に導入される。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるCARポリペプチドをコードする核酸分子は、エレクトロポレーション、トランスフェクション、または形質導入によって細胞に導入される。
一部の実施形態では、CARポリペプチドをコードする核酸分子は、形質導入を介してML NK細胞に導入される。一部の実施形態では、CARポリペプチドをコードする核酸分子を含むレンチウイルスを、形質導入を介してML NK細胞に導入する。
当技術分野で公知の種々の異なる方法を使用して、本明細書に記載されるCARポリペプチドをコードする核酸のいずれか、または本明細書に記載されるCARポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを、ML NK細胞に導入することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるCAR発現ML NK細胞を作製するための方法は、(i)末梢血、臍帯血またはリンパ液から(例えば、末梢血単核細胞(PMBC)から)細胞を得ること、(ii)任意選択で、得られた細胞を精製すること、(iii)任意選択で、細胞を増大させること、(iv)細胞を(例えば、サイトカイン、例えば、これらに限定されないが、IL-15、IL12、およびIL-18により)活性化して、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞を形成させること、(v)任意選択で、活性化された細胞を増大させること、(vi)本明細書に記載されるCARポリペプチドを含む発現ベクターにより細胞に形質導入すること、(vii)CARを発現する細胞を単離すること、および(viii)任意選択で、単離された細胞を増大させることを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるCAR発現ML NK細胞を作製するための方法は、(i)多能性幹細胞(iPSC)を得ること、(ii)iPSCを誘導してNK細胞に分化させること、(ii)NK細胞を、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞へと予め活性化すること、(iii)任意選択で、活性化された細胞を増大させること、(iv)本明細書に記載されるCARポリペプチドを含む発現ベクターにより、活性化された細胞に形質導入すること、(v)CARを発現するML NK細胞を単離すること、および(vi)任意選択で、単離された細胞を増大させることを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変のいずれかを、レンチウイルスを使用して細胞に形質導入する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかのCARポリペプチドは、ヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質バリアント(BaEV-LV)を使用して、ML NK細胞に形質導入される。NK細胞は、BaEV受容体であるアラニン・セリン・システイン輸送体2(ASCT2)を発現する。一部の実施形態では、BaEV-LV形質導入は、参照により本明細書に組み込まれる、Bari, R., et al. 2019 Frontiers in Immuno. Vol. 10, 2001に記載されているように行われる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかのCARポリペプチドは、水疱性口内炎ウイルスGP(VSV-G)-LVを使用して、ML NK細胞に形質導入される。NK細胞は、VSV-G受容体である低密度リポタンパク質(LDL-R)を発現する。一部の実施形態では、VSV-G-LV形質導入は、参照により本明細書に組み込まれる、Tomas, H., et al. 2019 Mol Ther Methods Clin Dev. 15: 1-8に記載されているように行われる。一部の実施形態では、BaEVの糖タンパク質が、VSV糖タンパク質を置き換える。一部の実施形態では、VSVゲノムは、BaEV糖タンパク質を発現する。
一部の実施形態では、CARポリペプチドが、サイトカイン誘導性ML NK細胞に、IL-15の存在下で、細胞にCARをウイルス性に形質導入するのに十分な時間にわたり、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルス)を介して形質導入されて、その結果、CAR発現ML NK細胞がもたらされる。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、約12時間から約24時間の間である。一部の実施形態では、CARをML NK細胞にウイルス性に形質導入する(CAR発現ML NK細胞を形成させる)のに十分な時間の長さは、少なくとも約1時間;約2時間;約3時間;約4時間;約5時間;約6時間;約7時間;約8時間;約9時間;約10時間;約11時間;約12時間;約13時間;約14時間;約15時間;約16時間;約17時間;約18時間;約19時間;約20時間;約21時間;約22時間;約23時間;約24時間;約25時間;約26時間;約27時間;約28時間;約29時間;約30時間;約31時間;約32時間;約33時間;約34時間;約35時間;約36時間;約37時間;約38時間;約39時間;約40時間;約41時間;約42時間;約43時間;約44時間;約45時間;約46時間;約47時間;または約48時間であり得る。
一部の実施形態では、CARポリペプチドをコードする核酸を含むベクターにより形質導入されたML NK細胞を、IL-15の存在下で、ベクターを発現させてCAR発現ML NK細胞を形成させるのに十分な長さの時間にわたりインキュベートする。一部の実施形態では、CAR発現ML NK細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、約3日間から約8日間の間である。一部の実施形態では、ML NK細胞を形成させるのに十分な時間の長さは、少なくとも約1日間;約2日間;約3日間;約4日間;約5日間;約6日間;約7日間;約8日間;約9日間;約10日間;約11日間;約12日間;約13日間;または約14日間であり得る。
組成物
一部の態様では、本明細書に開示される、いずれかの抗NPM1c CAR発現サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞、または前記細胞の集団を含む組成物(例えば、医薬組成物)が、本明細書において提供される。
医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。賦形剤および安定剤を含むがこれらに限定されない、適切な薬学的に許容される担体が、当技術分野で公知である(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PAを参照)。
医薬組成物は、好ましくは薬学的に許容される担体(例えば、本明細書において想定されるヒトまたは他の対象への投与のために好適な、1つまたは複数の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質)の中に、細胞、係留手段(例えば、脂質ナノ粒子)および/またはタンパク質もしくはペプチドを含む無菌組成物であり得る。担体は、有機または無機成分、天然性または合成性、であり得、それが細胞、係留手段(例えば、脂質ナノ粒子)および/またはタンパク質もしくはペプチドと組み合わされることで、投与が容易になる。医薬組成物の構成成分は、それらの所望の医薬効率を実質的に損なうと考えられる相互作用が起こらないような様式で混合される。
薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、分散剤、等張剤、湿潤剤、キレート剤、封鎖剤、pH緩衝剤、溶解促進剤、抗菌剤、麻酔剤、および/または抗酸化剤が挙げられるが、これらに限定されない。
医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製するための手法は、当技術分野で公知である(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照;これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内であると考えられるが、ただし、任意の従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的効果を生じることによって、または別様に医薬組成物の他のいずれかの構成成分と有害な様式で相互作用することによって、物質またはその誘導体と不適合であり得る場合を除く。賦形剤としては、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮補助剤、崩壊剤、色素(着色剤)、エモリエント、乳化剤、充填剤(希釈剤)、フィルム形成剤またはコーティング剤、滑剤(流動増強剤)、潤沢剤、保存剤、印刷用インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和の水が挙げられる。例示的な賦形剤としては、食塩水、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム(二塩基性)、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、スクロース、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、麦芽、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、デンプン(例えば、アルファ化デンプン)、プロピレン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、シリカゲル、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン(トウモロコシ)、ステアリン酸、タルク、ベースクリーム、二酸化チタン、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンC、およびキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される塩を含み得る。本開示の組成物中に含まれ得る、薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の酸付加塩、アルカリまたはアルカリ土類金属塩、鉱酸塩または有機酸塩;カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素塩、塩酸塩、ヨウ化水素塩、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの他、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されない非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。
医薬組成物は、対象(例えば、ヒト)への投与のために好適であるように製剤化することができる。医薬組成物は、任意の投与経路のために製剤化することができる。
医薬組成物は、それを全身性に送達することが望ましい場合には、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化することができる。そのような製剤は、注射の前に溶液または懸濁液にするのに好適な液体溶液、懸濁液、エマルジョンまたは固体形態として調製することができる。注射用の製剤は、例えば、アンプルまたは複数回投与容器の中にある、単位剤形として用意することができる。非経口用の医薬製剤には、成分の水溶液が含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有することができる。あるいは、成分の懸濁液を、油性の懸濁液として調製することもできる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、胡麻油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。非経口的に投与される場合、好適な薬学的に許容される担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水(PBS)、または、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはグルコースを含有する溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されるCAR発現細胞または前記細胞の集団は、治療有効量で使用されるか、または本明細書に開示される医薬組成物中に治療有効量で存在することができる。治療有効量は、標準的な臨床手法によって決定することができる。
本明細書において想定される薬学的に許容される組成物は、本明細書に記載されるCAR発現細胞または前記細胞の集団に加えて、追加の抗がん剤(例えば、本明細書に記載される任意の1つ、2つ、3つまたはそれ以上の抗がん剤)を含み得る。
治療方法および使用
2015年に米国だけで、およそ20,830人のAMLの新たな症例が診断され、10,460人がこの疾患が原因で死亡した。高齢がAMLの危険因子であるため、疾患の発生率は人口の高齢化とともに増加し得る。従来の化学療法および同種幹細胞移植に耐えることができる患者は完全寛解を達成することができるが、大多数は再発を経験し、この疾患により死亡する。したがって、我々のがん免疫療法の理解の進歩を利用する、より毒性が少なく、より効果的な標的化療法を開発するニーズがある。
一部の実施形態では、本開示は、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する(例えば、がん増殖を抑制する、がん進行を抑制する)ための方法であって、本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するいずれかの免疫エフェクター細胞(例えば、ML NK細胞)、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、NPM1c陽性がんを治療するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「NPM1c陽性がん」は、NPM1遺伝子に変異(例えば、NPM1における4nt重複変異)を有する腫瘍細胞を含むがんを指し、NPM1における変異は、野生型NPM1を発現する細胞と比較した場合に、NPM1タンパク質の細胞質局在の増加をもたらす。特定の遺伝子変異(例えば、NPM1における4nt重複変異)の存在を決定するために、がんにおける遺伝子発現を測定する方法は、当技術分野で公知であり、対象から収集した悪性腫瘍試料(例えば、血液、骨髄、腫瘍、および/または組織試料)の分析が含まれる。一部の実施形態では、遺伝子における小さな重複、挿入、または欠失を検出するための方法は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、液滴デジタルPCR、Sangerシークエンシング、および次世代シークエンシング(例えば、全ゲノムシークエンシング、例えば、全エクソームシークエンシング)を使用して行われる。一部の態様では、NPM1c陽性がんは、NPM1遺伝子における変異(例えば、遺伝子のエクソン12における4塩基対フレームシフト挿入、代替的リーディングフレームにおけるC末端11アミノ酸をコードする変異、または以下のC末端アミノ酸配列:MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(配列番号57)を含むタンパク質の発現をもたらすNPM1変異)を有することが検出される。一部の実施形態では、NPM1c陽性がんは、NPM1タンパク質の細胞質局在が増加した腫瘍細胞を含む。NPM1の細胞局在を評価する方法は当技術分野で公知であり、例えば、標識された抗NPM1抗体を使用し、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーによって局在を評価する。一部の実施形態では、NPM1c陽性がんから単離された腫瘍細胞は、健常な非がん性組織試料から単離された細胞と比較した場合に、NPM1タンパク質の細胞質局在が増加している。
一部の実施形態では、本開示は、NPM1c陽性がんの治療を必要とする対象においてNPM1c陽性がんを治療する(例えば、がんの増殖または進行を抑制する)ための方法であって、本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するML NK細胞、前記細胞の集団、または本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、AMLの治療を必要とする対象においてAMLを治療する(例えば、AMLの増殖または進行を抑制する)ための方法であって、本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するいずれかのML NK細胞、前記細胞の集団、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、NPM1c陽性AMLの治療を提供する。
一部の実施形態では、本開示の、CARポリペプチドを発現するML NK細胞、前記細胞の集団、または医薬組成物を、がんを治療するための標的化免疫療法の開発に使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の、CARポリペプチドを発現するML NK細胞、前記細胞の集団、または医薬組成物を、AMLの治療のために使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の、CARポリペプチドを発現するML NK細胞、前記細胞の集団、または医薬組成物を、AML細胞を殺滅するための細胞傷害性薬剤として使用することができる。
一部の実施形態では、本開示は、HLA-A2をコードするアレル(すなわち、HLA-A*02:01アレル)を保有する対象においてNPM1c陽性がん(例えば、AML)を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、NPM1c陽性がん(例えば、AML)は、HLA-A2の発現を有する腫瘍細胞を含む。HLA発現を決定する方法は当技術分野で公知であり、HLA-A2を認識する標識抗体を使用するフローサイトメトリー、免疫組織化学、およびウエスタンブロット法が含まれる。HLA発現を、RT-PCRおよびRNAシークエンシングによって決定することもできる。
一部の実施形態では、本開示は、がん(例えば、NPM1c陽性がん、例えば、AML)の治療を必要とする対象においてがんを治療するための方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、MHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示しており、治療が、本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するML NK細胞、前記細胞の集団、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、がん(例えば、NPM1c陽性がん、例えば、AML)の治療を必要とする対象においてがんを治療するための方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、MHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2、またはHLA-A*02アレルグループによってコードされるタンパク質、例えば、HLA-A*02:01アレルによってコードされるタンパク質)と複合体を形成したAIQDLCLAV(配列番号1)ネオエピトープを提示しており、治療が、本明細書に記載されるいずれかのCARポリペプチド、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を発現するML NK細胞を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するいずれかのML NK細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む、がん(例えば、がんはNPM1c陽性であり、例えば、がんはAMLである)を有する対象におけるがんの量の減少、または生存期間の延長を提供する。ある特定の実施形態では、がんを含む細胞の細胞表面は、MHCクラスIタンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成したNPM1cネオエピトープ(例えば、配列番号1)を提示する。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するいずれかのML NK細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む、がんから寛解している対象におけるがんの予防を提供する。
一部の実施形態では、がんは再発性がんである。一部の実施形態では、がんは難治性がんである。一実施形態では、がんは進行期がんである。一部の実施形態では、がんは、1つまたは複数の他の治療法(例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、または別の免疫療法)に対して抵抗性である。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するいずれかのML NK細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む、AMLの予防を必要とする対象におけるAMLの予防を提供する。一実施形態では、本開示は、AMLから寛解している対象におけるAMLの予防を提供する。
一部の実施形態では、治療しようとするがんはAMLである。一部の実施形態では、がんは再発性AMLである。一部の実施形態では、がんは難治性AMLである。一部の実施形態では、がんは進行AMLである。一部の実施形態では、がんは、1つまたは複数の他の治療法(例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、または別の免疫療法)に対して抵抗性であるAMLである。
本明細書に記載される任意の治療法の有効性は、(例えば、治療される対象または治療されるがんの動物モデルへの)治療法の前後のパラメーター(例えば、腫瘍量)を評価することによって評価することができる。当技術分野で公知の任意のアッセイを使用して、本明細書に記載される治療法の治療有効性を評価することができる。
投与の方法
本明細書に記載される治療法は、非経口的な投与経路を含むがこれに限定されない任意の好適な手段によって対象に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、患者に非経口的に投与される。非経口的投与の好適な経路の非限定的な例としては、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、腫瘍内、髄腔内および腹腔内投与が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、腹腔内に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、筋肉内に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、皮下に投与される。ある特定の実施形態では、投与は、静脈内、髄腔内、骨内または脊髄内である。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、脊髄内または脊柱管内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、髄腔内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、骨内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、骨髄内に投与される。
適切な投与量は、治療される特定のがん、治療される対象の年齢、体重および身体状態、がんの重症度、投与の経路、治療の期間、治療される対象の反応性、同時または併用療法の性質(もしあれば)、具体的な投与経路、ならびに医療従事者の知識および専門知識の範囲にある同様の要因によって異なると考えられる。ある特定の実施形態では、最大耐量、すなわち、堅実な医学的判断による最大の安全用量が使用されるべきである。好ましい態様では、治療法は、有効量で投与されるべきである。有効量は、医学的に望ましい結果を提供するのに十分な組成物の投与量である。
例えば、対象が腫瘍を有する場合、有効量は、(例えば、腫瘍を画像化することによって決定される)腫瘍体積または負荷を減少させる量であり得る。有効量を、血液または他の体液もしくは組織(例えば、生検試料)中のがん細胞の存在および/または頻度によって評価してもよい。腫瘍が組織または臓器の正常な機能に影響を及ぼしている場合、有効量は、組織または臓器の正常な機能を測定することによって評価することができる。
ある特定の実施形態では、操作されたML NK免疫エフェクター細胞は、約または少なくとも1×10、5×10、1×10、5×10、1×10、5×10、1×10、5×10、1×10、5×10、1×10、5×10、1×1010、5×1010、1×1011、または5×1011、1×1012、または5×1012個(またはその間の任意の値もしくは範囲)の量で投与される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかのCAR ML NK細胞により治療された対象は、完全寛解を経験する。一部の実施形態では、患者は、いずれかの操作されたML NK細胞を0.5×10個/kgの用量で投与される。一部の実施形態では、患者は、CAR-CIML NK細胞を1.0×10個/kgの用量で投与される。一部の実施形態では、患者は、CAR-CIML NK細胞を10×10個/kgの用量で投与される。
単回投与またはある期間にわたる複数回投与を含む、本明細書に記載される治療法の様々な投薬スケジュールが想定されている。投与の方法には、ボーラス投与および注入(例えば、連続注入またはパルス注入)が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される方法に使用するための治療レジメンとしては、1週間に2回、毎週1回、2週間ごとに1回、3週間ごとに1回、1か月間もしくは4週間ごとに1回、6週間ごとに1回、2か月間もしくは8週間ごとに1回、または3か月間もしくは12週間ごとに1回の治療法の投与を挙げることができる。ある特定の実施形態では、対象は、本明細書に記載されるいずれかの治療法の単回の用量を投与される。ある特定の実施形態では、対象は、本明細書に記載されるいずれかの治療法の少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも8回、または少なくとも10回の用量を投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、毎日、1日おきに、または1週間に2回投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、ある期間、例えば、1週間、2週間、3週間、4週間、6週間、2か月間、3か月間、4か月間、5か月間、6か月間、または1年間にわたり投与される。
一部の実施形態では、最初の治療期間(治療法が、例えば、単回、1週間に2回、1週間に1回、2週間に2回、または1か月間に1回投与される)に続いて、抗体が投与されない休薬期間(例えば、1週間、2週間、3週間、1か月間もしくは4週間、6週間、2か月間もしくは8週間、3か月間、4か月間、5か月間、6か月間、または1年間にわたる)があり、次いで、第2の治療期間(治療法が、例えば、単回、1週間に2回、1週間に1回、2週間に2回、または1か月間に1回投与される)がある。そのような最初の治療期間およびそのような第2の治療期間は、例えば、2週間、3週間、4週間、6週間、2か月間、または3か月間継続され得る(最初の治療期間は第2の治療期間と同じであってもよく、または異なってもよい)。
患者集団
本明細書に記載される方法に従って治療される対象としては、ヒトおよび非ヒト脊椎動物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、哺乳動物、例えば、家飼いペット(例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレットなど)、家畜または農業動物(例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリまたは別の家禽)、ウマ(例えば、純血種のウマ)、サル、実験動物(例えば、マウス、ラット、ウサギなど)その他である。対象にはまた、魚類および他の水生動物種も含まれる。好ましい一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象はヒトである。一実施形態では、本開示は、急性骨髄性白血病(AML)の治療のための標的化免疫療法によって利益を得る可能性が高いと考えられるあらゆる対象において実施することができる。一部の実施形態では、本開示は、NPM1c陽性がん(例えば、AML)を有する対象における使用のためのものである。
一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、本明細書に記載されるいずれかの免疫療法から利益を得ることができる(またはその可能性が高い)がんを有する(例えば、それを有すると診断された)任意の対象において実施することができる。がん(例えば、NPM1c陽性がん、例えば、AML)を有する対象は、検出可能ながん細胞を有する対象である。本開示は、がん(例えば、NPM1c陽性がん、例えば、AML)を有する対象に対する、本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するML NK細胞の投与を想定している。
一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、NPM1遺伝子における変異(例えば、遺伝子のエクソン12における4塩基対フレームシフト挿入、代替的リーディングフレームにおけるC末端11アミノ酸をコードする変異、または以下のC末端アミノ酸配列:MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(配列番号57)を含むタンパク質の発現をもたらすNPM1変異)によって特徴付けられる(例えば、それを有することが知られている、有することが予想される、または有することが検出された)がんを有する、任意の対象において実施することができる。ある特定の実施形態では、本開示の治療方法および使用は、変異型NPM1タンパク質(例えば、細胞質局在を有するNPM1c変異型タンパク質、C末端ドメインにおける変異を有するタンパク質、フォールディングしたC末端ドメインを欠く変異型タンパク質、以下のC末端アミノ酸配列:MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(配列番号57)を含むタンパク質、配列番号56によって示されるタンパク質、またはNPM1c)の発現によって特徴付けられる(例えば、発現することが知られている、発現することが予想される、または発現することが検出された)がんを有する、任意の対象において実施することができる。NPM1cの変異したC末端配列は当技術分野で公知である(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、van der Lee et al., 2019, J. Clin. Invest. 129(2):774-785を参照。例えば、図1を参照)。一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、がんを有する任意の対象において実施することができ、そのがんを含む細胞の細胞表面は、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成した変異型ヌクレオフォスミンネオエピトープ(例えば、NPM1cネオエピトープ、例えば、AIQDLCLAV(配列番号1))を提示する(例えば、提示することが知られている、提示することが予想される、または提示することが検出された)。一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、がんを有する任意の対象において実施することができ、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質(例えば、HLA-A2)は、そのがんを含む細胞の細胞表面に、NPM1cネオエピトープ(例えば、AIQDLCLAV(配列番号1))を提示するかまたは呈する。
任意選択で、本明細書に記載される方法に従って治療される予定の見込みのある患者のがん細胞が、NPM1遺伝子もしくはNPM1タンパク質における変異について検査され、またはがんを含む細胞の細胞表面がクラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成したNPM1cネオエピトープ(例えば、AIQDLCLAV(配列番号1))を含む抗原を提示するか否かを決定するために検査される。一部の態様では、そのような検査が、NPM1遺伝子における変異もしくはNPM1タンパク質における変異に関して陽性である場合、またはクラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質(例えば、HLA-A2)と複合体を形成したNPM1cネオエピトープ(例えば、AIQDLCLAV(配列番号1))を含む抗原をがん細胞の細胞表面に提示していると決定された場合には、患者は、本明細書に記載される方法に従って治療される。
一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、急性骨髄性白血病(AML)を有する対象において実施することができる。特定の一実施形態では、本開示の治療方法および使用は、AMLと診断された対象において実施される。
本明細書に記載される方法によって治療されるがんを診断するための検査は、当技術分野で公知であり、通常の医療従事者には熟知されていると考えられる。これらの臨床検査には、顕微鏡分析、培養依存性検査(培養など)、および核酸検出検査が挙げられるが、これらに限定されない。これらには、湿式マウント、染色増強顕微鏡検査、免疫顕微鏡検査(例えば、FISH)、ハイブリダイゼーション顕微鏡検査、粒子凝集、酵素結合免疫吸着検定法、尿スクリーニング検査、DNAプローブハイブリダイゼーション、血清学的検査などが含まれる。医師は一般に、以上に列挙した臨床検査を実行することに加えて、全病歴を聴取し、完全な身体診察を行う。
AMLの検出のための方法には、白血病細胞に関するPBMCのフローサイトメトリーと、それに続くNPM1c変異に関するPCRおよび配列決定が含まれるが、これらに限定されない。AML診断のための臨床的方法は当技術分野で公知である。AML発症の危険因子には、喫煙、化学療法、放射線療法、特定の血液疾患、および加齢が含まれる。
一実施形態では、治療される対象は、早期がん(例えば、AML)と診断されている。一実施形態では、治療される対象は、進行期がん(例えば、AML)と診断されている。
一部の実施形態では、治療される対象は、AML進行のいずれかの段階にある。
一部の態様では、治療される対象は、以前に1つまたは複数の他のがん治療(例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植)を受けている。ある特定の実施形態では、治療される対象は、以前に1つまたは複数の他のがん治療(例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植)を受けており、対象のがんが再発している。ある特定の実施形態では、治療される対象は、以前に1つまたは複数の他のがん治療(例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植)を受けており、対象は、1つまたは複数の他のがん治療に対して抵抗性を生じている。ある特定の実施形態では、治療される対象は、寛解状態にある(例えば、がんの部分寛解または完全寛解にある)。ある特定の実施形態では、治療される対象は、1つまたは複数の他のがん治療(例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植)に対して難治性である。
他の実施形態では、本開示の治療方法および使用に従って、本明細書に記載されるいずれかの免疫療法から利益を得ることができる(または得られる可能性が高い)がんを発症するリスクのある対象を治療することが、本明細書において想定される。がん(例えば、AML)を発症するリスクのある対象は、がんを発症する確率が通常よりも高い対象である。これらの対象には、例えば、がんを発症する可能性の高さと関連することが実証されている遺伝子異常を有する対象、がんの家族性素因を有する対象、タバコ、アスベスト、または他の毒性化学物質などのがん原因物質(すなわち、発がん物質)に曝露された対象、およびがんの治療歴があって見かけ上は寛解状態にある対象が含まれる。本開示は、本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するML NK細胞の、がん(例えば、AML)を発症するリスクのある対象への投与を想定している。
一部の実施形態では、治療される対象は成人である。一実施形態では、対象は、18歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、21歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、45歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、65歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、18歳未満のヒト対象である。一実施形態では、対象は、45歳未満(または18歳から45歳の間、もしくは21歳から45歳の間)のヒト対象である。一実施形態では、対象は、65歳未満(または18歳から65歳の間、21歳から65歳の間、もしくは45歳から65歳の間)のヒト対象である。
併用療法
一部の態様では、本明細書に記載される治療方法および使用は、治療応答を増強する、例えば、対象における抗腫瘍応答を増強する、および/または腫瘍に対して細胞傷害性である(例えば、化学療法剤)、追加の薬剤による対象の治療をさらに含む。
一部の態様では、本明細書に記載される治療法は、1つまたは複数の抗がん療法、例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、抗がん活性を有する小分子、別の抗がん免疫療法(例えば、別の抗がん抗体もしくはその断片、または別のT細胞療法)、または当技術分野で公知の任意の他の抗がん療法と組み合わせて、対象に投与される。
一部の態様では、本明細書に記載されるCAR発現ML NK細胞は、1つまたは複数の抗がん療法、例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、抗がん活性を有する小分子、別の抗がん免疫療法(例えば、別の抗がん抗体もしくはその断片、または別のT細胞療法)、または当技術分野で公知の任意の他の抗がん療法と組み合わせて、対象に投与される。
一部の態様では、本明細書に記載されるCAR発現ML NK細胞のうちの1つもしくは複数、またはそれらを含む組成物は、幹細胞移植または別の抗がん免疫療法(例えば、別の抗がん抗体もしくはその断片、または別のT細胞療法)と組み合わせて、対象に投与される。CARを含むML NK細胞による投与については、細胞の生存性に負の影響を及ぼさないと考えられるいずれかの併用療法が、本明細書において想定される。
併用療法における使用のために好適な治療薬には、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤を含む小分子化学療法薬、ならびに以下でさらに考察するものを含むがこれらに限定されない生物学的抗がん剤、例えば、抗がん抗体が含まれる。
一部の態様では、併用療法は、抗腫瘍免疫を増強するための免疫チェックポイント阻害剤、例えば、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、PD-L2阻害剤、またはCTLA-4阻害剤を、対象に投与するステップを含む。免疫チェックポイントの他のモジュレーターは、TIM-3、OX-40、OX-40LまたはICOSを標的とすることができる。一実施形態では、免疫チェックポイントを調節する薬剤は、抗体(例えば、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3またはOX-40に対する拮抗抗体)である。別の実施形態では、免疫チェックポイントを調節する薬剤は、タンパク質モジュレーターまたは低分子モジュレーターである。別の実施形態では、薬剤(例えば、mRNA)は、免疫チェックポイントの抗体モジュレーターをコードする。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、TIM-3阻害剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、PD-1阻害剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、PD-L1阻害剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、CTLA-4阻害剤と組み合わせて投与される。併用療法に使用することができる免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、ペムブロリズマブ、アレムツズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、MEDI0680、PDR001、AMP-224、PF-06801591、BGB-A317、REGN2810、SHR-1210、TSR-042、アフィマー、アベルマブ(MSB0010718C)、アテゾリズマブ(MPDL3280A)、デュルバルマブ(MEDI4736)、BMS936559、イピリムマブ、トレメリムマブ、AGEN1884、MEDI6469およびMOXR0916が挙げられる。
特定の一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、化学療法と組み合わせて対象に投与される。本明細書に記載される併用療法に使用することができる化学療法薬の種類の例としては、アルキル化剤、ニトロソ尿素剤、代謝拮抗剤、白金錯体誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、植物由来のアルカロイド、ホルモン拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、およびP糖タンパク質阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される併用療法に使用することができる化学療法薬の具体的な例としては、タキソール、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、5-フルオロウラシル(5-FU)、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、コルヒチン、ミトキサントロン、タモキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ウラムスチン、ムスタルゲン、イホスファミド、ベンダムスチン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾシン、チオテパ、マイトマイシン、ジアジクオン、テトラジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、アルトレタミン、ヘキサレン、トロホスファミド、エストラムスチン、トレオスルファン、マンノスルファン、トリアジクオン、カルボクオン、ニムスチン、ラニムスチン、アザチオプリン、スルファニラミド、フルオロピリミジン、チオプリン、チオグアニン、メルカプトプリン、クラドリビン、カペシタビン、ペメトレキセド、フルダラビン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、ネララビンまたはクロファラビン、シタラビン、デシタビン、プララトレキサート、フロクスウリジン、チオクアニン、アザシチジン、クラドリビン、ペントスタチン、メルカプトプリン、イマチニブ、ダクチノマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、ペリウィンクル、ビンカ、タキサン、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、テニポシド、ピラルビシン、ノボビオシン、メルバロン、アクラルビシン、アムサクリン、抗アンドロゲン薬、抗エストロゲン薬、ビカルタミド、メドロキシプロゲステロン、フルオキシメステロン、ジエチルスチルベストロール、エストラース、オクトレオチド、メゲストロール、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、プレドニゾン、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、アミノグルテチミド、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタン、ファドロゾール、アンドロステン、レスベラトロール、ミオスミン、カテキン、アピゲニンエリオジクチオールイソリキリチゲニン、マンゴスチン、アミオダロン、アジスロマイシン、カプトプリル、クラリスロマイシン、シクロスポリン、ピペリン、ケルセチン、キニジン、キニン、レセルピン、リトナビル、タリキダル、ベラパミル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、トランスプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、トリプラチンおよびカルボプラチンが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、AMLの治療のための1つまたは複数の化学療法と組み合わせて、対象に投与される。一部の実施形態では、1つまたは複数の化学療法は、シタラビン、ダウノルビシン、イダルビシン、クラドリビン、フルダラビン、ミトキサントロン、エトポシド、6-チオグアニン、ヒドロキシ尿素、プレドニゾン、デキサメタゾン、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、アザシチジン、およびデシタビンから選択される。
特定の一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、放射線療法と組み合わせて対象に投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法は、幹細胞移植と組み合わせて対象に投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法は、1つまたは複数の追加の抗がん治療法の前、その間(すなわち、同時に)またはその後に投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、以前に抗がん治療を受けていない。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、以前に抗がん療法(例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植)を受けている。
キット
本発明の複数の態様は、キットを対象とする。
「キット」という用語は、試料のプロセス、方法、アッセイ、分析、または操作を容易にする一連の物品を指すことができる。キットは、キットを使用するための説明書(例えば、本発明の方法についての説明書)、資料、溶液、構成成分、試薬、化学物質、または方法に必要とされる酵素、および他の任意の構成成分を含むことができる。
例えば、本明細書に記載される細胞、ベクター、および培地を、キットの中に提供することができる。一実施形態では、キットは、(a)ベクターまたはその構成成分を含む組成物を含有する容器、および任意選択で(b)情報資料を含む。情報資料は、本明細書に記載される方法および/または治療上の利益のための薬剤の使用を範囲に含む、記述的資料、指示資料、販売用資料または他の資料であり得る。一実施形態では、キットは、第2の薬剤、例えば、細胞も含む。例えば、キットは、ベクターまたはそれを含む組成物を含有する第1の容器と、第2の薬剤、例えば、細胞を含む第2の容器とを含む。
キットの情報資料は、その形態に限定されない。一実施形態では、情報資料は、化合物の生産についての情報、化合物の分子量、濃度、使用期限、バッチまたは生産の場所の情報などを含み得る。一実施形態では、情報資料は、キットの細胞に形質導入する方法、または遺伝子改変された細胞を、例えば、対象を治療するために、好適な用量、剤形、または投与様式(例えば、本明細書に記載される用量、剤形、または投与様式)で、対象に投与する方法を範囲に含む。情報は、印刷された文面、コンピュータ読み取り可能な資料、ビデオ記録、もしくはオーディオ記録、または重要な資料へのリンクもしくはアドレスを提供する情報を含む、種々の形式で提供することができる。
ベクターおよび/または細胞に加えて、キット中の組成物は、他の成分、例えば、溶媒もしくは緩衝液、培地、安定剤、または保存剤を含むことができる。そのキットの組成物は、任意の形態、例えば、液体、乾燥または凍結乾燥形態で提供することができ、実質的に純粋および/または無菌であり得る。組成物が液体溶液中に提供される場合、液体溶液は水溶液またはアルコール溶液であり得る。組成物またはその成分が乾燥形態として提供される場合、復元は、例えば、好適な溶媒の添加によって行われる。溶媒、例えば、滅菌水または緩衝液を、任意選択でキット中に提供することができる。
キットは、薬剤を含有する1つまたは複数の組成物のための1つまたは複数の容器を含むことができる。一部の実施形態では、本キットは、組成物および情報資料のための別々の容器、仕切り、または区画を含有する。例えば、本組成物は、瓶、バイアル、またはシリンジの中に含有されることが可能であり、情報資料は、プラスチックスリーブまたはパケット内に含有されることが可能である。他の実施形態では、キットの別々の要素は、単一の分割されていない容器に含有されている。例えば、組成物は、ラベルの形態で情報資料が添付された瓶、バイアル、またはシリンジの中に含有されている。一部の実施形態では、キットは、それぞれが薬剤の1つまたは複数の単位剤形(例えば、本明細書に記載される剤形)を含有する、複数(例えば、1パック)の個々の容器を含む。容器は、組合せ単位投与量、例えば、ベクターおよび/または細胞と第2の薬剤とを含む単位を、例えば、所望の比率で含むことができる。例えば、キットは、例えば、それぞれが単回の組合せ単位用量を含有する、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、ブリスター包装、または医用デバイスを含む。キットの容器は、気密性、耐水性(例えば、湿度の変化または蒸発を通さない)、および/または遮光性であり得る。キットは、任意選択で、組成物の投与のために好適なデバイス、例えば、シリンジまたは他の好適な送達デバイスを含む。デバイスは、薬剤の一方もしくは両方が予め充填された上で提供されてもよく、または空であってもよいが、充填には好適である。
一態様では、(i)本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するML NK細胞、前記細胞の集団、または本明細書に記載される医薬組成物;(ii)任意選択で、1つまたは複数の追加の抗がん剤(例えば、化学療法薬)、および(iii)対象におけるがんの治療に使用するための説明書を含む1つまたは複数の容器を含むキットが、本明細書において提供される。
一実施形態では、キットは、同一または別々の好適な容器内に、MHCクラスIタンパク質(例えば、NPM1c:HLA-A2)と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを含む抗原に結合するCARポリペプチドを発現するML NK細胞と、薬学的に許容される担体(例えば、緩衝液)とを含み得る。
好適な容器としては、限定はされないが、バイアル、ウェル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、注入バッグ、または他の容器手段を挙げることができ、その中に、本明細書に記載されるCARポリペプチドを発現するML NK細胞を収めることができる(場合によっては、好適に分割されている)。追加の構成成分が用意される場合、キットは、この構成成分を収めることができる追加の容器を含むことができる。容器は、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器をさらに含んでもよい。容器および/またはキットは、使用上の指示および/または警告を記載したラベルを含むことができる。
定義
本明細書で使用される場合、「NPM1c」という用語は、NPM1遺伝子における4ヌクレオチド重複に起因し、細胞質局在を有する、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質(NPM1)を指す。野生型NPM1遺伝子によってコードされるヒトヌクレオフォスミンは、配列番号54によって示されるアミノ酸配列(受託番号NM_002520)を有する。4ヌクレオチド重複を有するNPM1遺伝子によってコードされる例示的なNPM1cタンパク質は、配列番号56によって示されるアミノ酸配列を含む。さらに、前記例示的なNPM1cタンパク質のC末端アミノ酸配列は、MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(配列番号57)を含み、これは、太字で強調表示されている、野生型ヌクレオフォスミンタンパク質に比して変異している配列の部分を有する(例えば、van der Lee et al., 2019, JCI 129(2):774-785; Verhaak, R. et al (2005) Blood 106:3747を参照)。一部の実施形態では、本開示のNPM1cネオエピトープは、アミノ酸配列MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(配列番号57)を含むNPM1cタンパク質に由来するネオエピトープを含む。一部の実施形態では、本開示のNPM1cネオエピトープは、MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(配列番号57)を含むアミノ酸配列を有するNPM1cの部分に由来するネオエピトープを含む。
本明細書で使用される場合、「NPM1c:HLA-A2」という用語は、HLA-A2タンパク質と複合体を形成したNPM1cのネオエピトープを指す。一部の実施形態では、NPM1cのネオエピトープは、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)を含む。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、数値を改変して使用される場合、その数値の最大で上下10%の偏差が、列挙された値の意図される意味の範囲内にあることを示す。
本明細書で使用される場合、「VH」または「V」という用語は、抗体の重鎖可変領域を指す。
本明細書で使用される場合、「VL」または「V」という用語は、抗体の軽鎖可変領域を指す。
本明細書で使用される場合、参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」または「パーセント配列同一性」という用語は、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後に、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野で公知の様々な方法で、例えば、公開されているコンピュータソフトウェア、例えば、BLASTp、BLAST-2、ALIGN(例えば、ALIGN-2)またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアを使用して、達成することができる。比較の目的のためのギャップありアラインメントを得るためには、Gapped BLASTを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されているように利用することができる。加えて、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)内のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))のアルゴリズムを、Blossum 62マトリックスまたはPAM 250マトリックスのいずれか、16、14、12、10、8、6、または4のギャップ加重、および1、2、3、4、5、または6の長さ加重で使用して、決定することができる。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、一般に、2つの軽鎖ポリペプチドおよび2つの重鎖ポリペプチドを含む抗体を指す(この用語が使用される文脈が別のものを示唆する場合を除く)。抗体には、IgM、IgG、IgA、IgD、およびIgE抗体を含む異なる抗体アイソタイプが含まれる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化抗体またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、および完全ヒト抗体を含む。抗体は、種々の種、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、オランウータン、ヒヒ、またはチンパンジー)、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、およびマウスのいずれかにおいて作られるか、またはそれらに由来し得る。抗体は、精製された抗体または組換え抗体であることができる。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」、「抗原結合断片」という用語、または類似の用語は、標的抗原に結合する能力を保っている抗体の断片を指す。そのような断片には、例えば、単鎖抗体、単鎖Fv断片(scFv)、Fab断片、Fab’断片、またはF(ab’)断片が含まれる。この用語には、例えば、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ単一ドメイン抗体も含まれる。例えば、Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem Sci 26:230-235; Nuttall et al. (2000) Curr Pharm Biotech 1:253-263; Reichmann et al. (1999) J Immunol Meth 231:25-38;PCT出願国際公開第94/04678号パンフレットおよび国際公開第94/25591号パンフレット;ならびに米国特許第6,005,079号明細書を参照されたく、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本開示は、単一ドメイン抗体が形成されるような改変を有する2つのVHドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。加えて、イントラボディ、ミニボディ、トリボディ、およびダイアボディも、抗体断片の定義に含まれ、本明細書に記載される方法における使用に適合する。例えば、Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66; Hudson and Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1):177-189; Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123; Rondon and Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51:257-283を参照されたく、それぞれの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸置換」または「置換された」という用語(そのような用語が置換されたアミノ酸と称される場合)は、所定のアミノ酸配列における少なくとも1つの既存のアミノ酸残基の、異なるアミノ酸残基による置き換えを指す。「アミノ酸挿入」という用語は、少なくとも1つの追加のアミノ酸の、所定のアミノ酸配列への組み入れを指す。挿入は通常、1つまたは2つのアミノ酸残基の挿入からなるが、より大きな「ペプチド挿入」を行うこともできる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、天然に存在するものであってもよく、天然に存在しないもの(改変されたもの)であってもよい。「アミノ酸欠失」という用語は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも1つのアミノ酸残基の除去を指す。
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、これには以下のものが含まれる:
(1)疎水性側鎖:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu;
(2)中性親水性側鎖:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性側鎖:Asp、Glu;
(4)塩基性側鎖:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する側鎖:Gly、Pro;および
(6)芳香族側鎖:Trp、Tyr、Phe。
例えば、非保存的アミノ酸置換は、実質的に異なる側鎖(すなわち、異なるファミリーのメンバーであるアミノ酸残基)を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換である。
一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基のハイドロパシー指数を考慮することによって行われる。各アミノ酸に、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられている。それらは以下の通りである:Ile(+4.5);Val(+4.2);Leu(+3.8);Phe(+2.8);Cys(+2.5);Met(+1.9);Ala(+1.8);Gly(-0.4);Thr(-0.7);Ser(-0.8);Trp(-0.9);Tyr(-1.3);Pro(-1.6);His(-3.2);Glu(-3.5);Gln(-3.5);Asp(-3.5);Asn(-3.5);Lys(-3.9);およびArg(-4.5)。ポリペプチドに相互作用機能を付与する上でのハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野で理解されている(例えば、Kyte et al (1982) J Mol Biol 157:105-131を参照)。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、1つのアミノ酸残基を、同一または類似の(例えば、約+2、+1.5、+1、+0.5、-0.5、-1、-1.5、または-2以内)ハイドロパシー指数を有する別のアミノ酸残基で置き換えることによって行われる。
一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性を考慮することによって行われる。以下の親水性値が割り当てられている:Arg(+3.0);Lys(+3.0±1);Asp(+3.0±1);Glut(+0.2);Gly(0);Thr(-0.4);Pro(-0.5±1);Ala(-0.5);His(-0.5);Cys(-1.0);Met(-1.3);Val(-1.5);Leu(-1.8);Ile(-1.8);Tyr(-2.3);Phe(-2.5);およびTrp(-3.4)。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、1つのアミノ酸残基を、同一または類似の(例えば、約+2、+1.5、+1、+0.5、-0.5、-1、-1.5、または-2以内)親水性を有する別のアミノ酸残基で置き換えることによって行われる。例示的なアミノ酸置換は表2に示されている。
Figure 2023517063000003
本明細書で使用される場合、「サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞」または「ML NK細胞」という用語は、少なくとも1つのサイトカインによりex vivoで活性化され、同じサイトカインの非存在下における負荷後に増強されたメモリー様機能を維持する、NK細胞に由来するNK細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「CIML NK細胞」という用語は、少なくとも1つのサイトカインにより活性化され、増強された活性化およびインターフェロン-γ応答を示す、NK細胞に由来するNK細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された核酸分子」という用語は、その自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸分子は、その天然の染色体位置とは異なる位置に存在する。
本明細書で使用される場合、「ネオエピトープ」は、疾患特異的変異によって生じるペプチドを含む疾患特異的抗原を指し、これは自己とは異なるものとして認識され、正常細胞ではなく、疾患によって影響を受けた細胞の表面上に提示される。「腫瘍ネオエピトープ」または「がんネオエピトープ」という用語は、腫瘍特異的またはがん特異的変異から生じるペプチドを含む腫瘍特異的またはがん特異的抗原を指し、これは自己とは異なるものとして認識され、正常細胞ではなく、腫瘍/がん細胞の表面上に提示される。腫瘍特異的またはがん特異的ネオエピトープの提示は、腫瘍細胞内での腫瘍特異的またはがん特異的抗原の細胞内プロセシングおよび切断の後に生じ、それによって、腫瘍特異的またはがん特異的変異を含む8~15アミノ酸の1つまたは複数の異なるペプチドが生成される。それぞれCD8+ T細胞またはCD4+ T細胞への提示のためにMHCクラスI分子またはクラスII分子に結合するこれらのペプチドのサブセットが、腫瘍のネオエピトープを構成する。
本明細書で使用される場合、「K」または「Kd」または「K」という用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有し、抗体(またはその抗原結合断片)と抗原との間の結合反応の平衡解離定数を指す。Kの値は、抗体オフ速度定数(koff)の抗体オン速度定数(kon)に対する比の数値表現である。Kの値は、抗原に対する抗体の結合親和性に反比例する。K値が小さいほど、抗原に対する抗体の親和性は高い。親和性は、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。
本明細書で使用される場合、用語「koff」または「koff」は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有し、抗体/抗原複合体からの抗体の解離に関するオフ速度定数を指す。koffの値は、1秒間あたりに崩壊または解離する複合体の割合の数値表現であり、単位secー1で表される。
本明細書で使用される場合、「kon」または「kon」という用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有し、抗体と抗原との会合に関するオン速度定数を指す。konの値は、抗体および抗原の1モル(1M)溶液中で1秒間あたりに形成される抗体/抗原複合体の数の数値表現であり、単位Mー1secー1で表される。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」、「特異的に結合する」、「選択的結合」および「選択的に結合する」という用語は、特定の抗原またはエピトープ(例えば、NPM1c:HLA-A2)に対して感知可能な親和性を示し、一般に、他の抗原およびエピトープ(例えば、HLA-A2単独、例えば、NPM1cネオエピトープ単独、例えば、HLA-A2と複合体を形成した非NPM1cネオエピトープ)には結合しないか、または実質的に結合しない、抗体もしくはその抗原結合断片、または細胞外ドメインを意味することを意図している。「感知可能な」または好ましい結合には、10-7、10-8、10-9、もしくは10-10Mまたはより良好なKとの結合が含まれる。抗体抗原相互作用のK(親和定数)は、抗体および抗原分子の50%が結合する抗体の濃度を示す。したがって、好適な一定の抗原濃度では、親和性のより高い(すなわち、より強い)抗体の50%は、親和性のより低い抗体と同じパーセント結合を達成するために必要とされるよりも低い抗体濃度で抗原分子に結合すると考えられる。したがって、K値が低いほど、より高い(強い)親和性を示す。本明細書で使用される場合、「より良好な」親和性は、より強い親和性であり、その比較対象よりも低い数値であり、10-7MのKは、10-6MのKよりも低い数値であり、したがって、より良好な親和性を表す。10-7Mよりも良好な(すなわち、K値が低く、したがってより強い)、好ましくは10-8Mよりも良好な親和性が一般に好ましい。本明細書に記載される値の中間値も想定しており、好ましい結合親和性は親和性の範囲として示すことができ、例えば、本明細書に開示されるNPM1c:HLA-A2に結合する抗体について好ましい結合親和性は10-7~10-12M、より好ましくは10-8~10-12Mである。
抗原に「結合しない」または「実質的に結合しない」抗体、抗原結合断片または細胞外ドメインは、オフターゲット抗原(例えば、MHCクラスIタンパク質単独、例えば、ネオエピトープ単独、例えば、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成した対照ペプチド)に感知できる程度には結合しないものである。例えば、一実施形態では、NPM1c:HLA-A2に特異的に結合する抗体は、例えば、HLA-A2単独、NPM1cネオエピトープ単独、および/またはHLA-A2と複合体を形成した非NPM1cネオエピトープよりも、NPM1c:HLA-A2に対して少なくとも2桁、好ましくは3桁、または4桁もしくはそれを上回る高さの良好な結合親和性(すなわち、2桁、3桁、または4桁もしくはそれよりも小さいK値を示す結合)を示す。特異的または選択的結合は、そのような結合を決定するための当技術分野で認識されている任意の手段に従って決定することができ、これには例えば、Scatchard分析、Biacore分析、バイオレイヤー干渉法、および/または競合的(競合)結合アッセイが含まれる。
本明細書で使用される場合、「HLA-A」という用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有し、ヒトにおけるHLA-A座位によってコードされるヒト白血球抗原(HLA)の群を指す。HLAは、ヒトに特異的な主要組織適合抗原複合体(MHC)抗原である。HLA-Aは、ヒトMHCクラスI細胞表面受容体の主要な3種類のうちの1つである。他にはHLA-BおよびHLA-Cがある。HLA-Aタンパク質はヘテロ二量体であり、α重鎖およびより小さいβ鎖で構成される。α鎖はバリアントHLA-A遺伝子によってコードされ、β鎖(β2-ミクログロブリン)はインバリアントなβ2ミクログロブリン分子である。β2ミクログロブリンタンパク質は、ヒトゲノムの別の領域によってコードされる。HLA-A*02(A*02)は、HLA-A血清型群に属するヒト白血球抗原血清型である。この血清型は、HLA-Aα鎖のα2ドメインの抗体認識によって決定される。A*02の場合、α鎖はHLA-A*02遺伝子によってコードされ、β鎖はB2M座位によってコードされる。
本明細書で使用される場合、「有効用量」または「有効量」という用語は、所望の治療効果を達成するのに、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。
以下の実施例は、説明のために提供され、限定としては提供されない。本発明の様々な他の実施形態は、本明細書において提供される一般的な説明を前提として、実施することができる。
他の実施形態
E1.細胞の形質導入効率を高めるための方法であって、少なくとも1つのASCT2細胞を、候補ポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ(BaEV)レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させるステップであって、ASCT2細胞がインターロイキン-12ファミリーのメンバーおよびIL-18により活性化されているステップを含む方法。
E2.ASCT2細胞がIL-12、IL-18、およびIL-15により活性化されている、実施形態E1に記載の方法。
E3.NK細胞を得る、単離する、または同定するステップ、ならびにNK細胞をインターロイキン-12ファミリーのメンバーおよびIL-18、ならびに任意選択で、IL-15により活性化するステップを含む、実施形態E1に記載の方法。
E4.インターロイキン-12ファミリーのメンバーが、IL-12、IL-23、IL-27、またはIL-35を含む、実施形態E1またはE3に記載の方法。
E5.NK細胞がASCT2である、実施形態E3に記載の方法。
E6.NK細胞の活性化により、ASCT2細胞が生成される、実施形態E3に記載の方法。
E7.ASCT2細胞がNK細胞である、実施形態E1に記載の方法。
E8.ASCT2細胞がサイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞である、実施形態E1に記載の方法。
E9.サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞を得る、単離する、または同定するステップを含む、実施形態E8に記載の方法。
E10.ASCT2の発現またはレベルが対照細胞に比して増加している、実施形態E1に記載の方法。
E11.対照細胞が不活性化NK細胞である、実施形態E10に記載の方法。
E12.対照細胞が成熟NK細胞である、実施形態E10に記載の方法。
E13.ASCT2発現が、ASCT2細胞において、対照細胞に比して約20%から約30%増加している、実施形態E10に記載の方法。
E14.ASCT2の存在またはレベルが、BaEVレンチウイルスベクターによる形質導入に対してより受容性である細胞をもたらす、実施形態E1に記載の方法。
E15.ASCT2細胞が、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23またはそれらの任意の組合せのうちの1つまたは複数により活性化されている、実施形態E1に記載の方法。
E16.ASCT2細胞が哺乳動物細胞である、実施形態E1に記載の方法。
E17.哺乳動物細胞がヒト細胞である、実施形態E16に記載の方法。
E18.ヒト細胞が末梢血単核細胞(PBMC)から単離されている、実施形態E17に記載の方法。
E19.レンチウイルスベクターがヒヒエンベロープ糖タンパク質(BaEV-gp)によってシュードタイプ化されている、実施形態E1に記載の方法。
E20.少なくとも1つのASCT2細胞のうちの少なくとも40%が約3日後に形質導入されている、実施形態E1に記載の方法。
E21.形質導入効率が従来のレンチウイルス形質導入アプローチに比して改善されている、実施形態E1に記載の方法。
E22.候補ポリペプチドが、抗体もしくはその断片、毒素、ホルモン、増殖因子、受容体、またはシグナル伝達分子、キメラ抗原受容体を含む、実施形態E1に記載の方法。
E23.キメラ抗原受容体が抗体またはその断片を含む、実施形態E22に記載の方法。
E24.抗体または断片がチェックポイント阻害剤に対して特異的である、実施形態E22または実施形態E23に記載の方法。
E25.抗体が抗T細胞受容体抗体またはT細胞受容体様抗体である、実施形態E22または実施形態E23に記載の方法。
E26.抗体またはその断片が、NPM1、NPM1c、MAGE1、GP100、hTERT、MUC1、NY-ESO-1、FLT3、TP53、スプライソソーム因子、MAGE3、hCGβ、Her2/Neu、Melan-A/MART-1、TARP、p53、チロシナーゼ、p68、MIF、プロテイナーゼ3、WT1、HA-1H、またはPRAMEに対して特異的である、実施形態E25に記載の方法。
E27.抗体が腫瘍特異的細胞内タンパク質を標的とする、実施形態E22または実施形態E23に記載の方法。
E28.細胞内タンパク質がNPM1cを含む、実施形態E27に記載の方法。
E29.培地が12/15/15/21およびIL-7を含む、実施形態E1に記載の方法。
E30.実施形態E1~E29のいずれか1つに記載の方法によって作製された細胞。
E31.がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に対して、実施形態E1~E29のいずれか1つに記載の方法によって作製された細胞を投与するステップを含む方法。
E32.遺伝子操作された細胞を製造する方法であって、少なくとも1つのASCT2細胞を、あるポリペプチドをコードするヒヒエンベロープ(BaEV)レンチウイルスベクターを含む細胞培地と接触させるステップであって、ASCT2細胞がインターロイキン-12ファミリーのメンバーおよびIL-18により活性化されているステップを含む方法。
E33.インターロイキン-12ファミリーのメンバーが、IL-12、IL-23、IL-27、またはIL-35を含む、実施形態E32に記載の方法。
E34.実施形態E32に記載の方法によって作製される、遺伝子操作された細胞。
E35.実施形態E30に記載の細胞または実施形態E34に記載の遺伝子操作された細胞を含む免疫療法。
E36.がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に対して、実施形態E35に記載の免疫療法を投与するステップを含む方法。
新生細胞を認識し、これに応答し、これを殺滅する免疫細胞の能力を利用する細胞療法は、進行した悪性疾患を治療するための有望なアプローチを代表している。効率的な細胞形質導入はT細胞については達成されているが、NK細胞については達成されておらず、NK細胞に基づくがん免疫療法の改善において主要な技術的難点となっている。NK細胞は、ウイルスに感染したおよび悪性に転化した細胞を除去することができる先天的なリンパ球様細胞である。従来のレンチウイルス形質導入アプローチでは、水疱性口内炎ウイルスG(VSVG)によってシュードタイプ化されたカノニカルなレンチウイルスを使用している。しかし、NK細胞はVSVGによってシュードタイプ化されたレンチウイルスによる形質導入には極めて抵抗性で、遺伝子編集率は1~3%であることが知られている。本明細書に記載するように、本発明者らは、NK細胞の形質導入効率を増大させる組成物および方法を特定した。NK細胞の特有の受容体発現パターンを研究することにより、本発明者らのデータは、LDL-Rとは大きく異なって、ASCT2の発現レベルが従来型の初代NK細胞において高く、サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞においてさらに増強していることを示した。ASCT2はアミノ酸輸送体であり、ヒヒエンベロープ糖タンパク質(BaEV-gpl)の対応する受容体である。非従来型BaEVシュードタイプ化レンチウイルスを利用することにより、初代ヒトNK細胞およびCIML NK細胞における形質導入のブロックが克服される。BaEVレンチウイルスを使用する本発明者らのデータによって、初代NK細胞はこの非従来型遺伝子編集アプローチにとって容易にアクセス可能である一方、CIML NK細胞は、そのナイーブな対応物よりもレンチウイルスによる形質導入を受けやすいことが確認され、これはそれらのASCT2発現レベルとよく相関している。CIML NK細胞による本発明者らの形質導入効率は、今や40~70%に近い。
略語
AIQ:AIQDLCLAV(配列番号1)、AML:急性骨髄性白血病、アロSCT:同種造血幹細胞移植、BLI:生物発光イメージング、CAR:キメラ抗原受容体、CAR-NK:キメラ抗原受容体NK細胞、FACS:蛍光活性化細胞選別、FBS:ウシ胎児血清、GIL:GILGFVFTL(配列番号63)、HSC:造血幹細胞、MACS:磁気活性化細胞選別、NPM1:ヌクレオフォスミン、NPM1c:変異型ヌクレオフォスミン、scFv:一本鎖可変断片、SLL:SLLMWITQC(配列番号62);TAA:腫瘍随伴抗原、HSPC:造血幹/前駆細胞。
以下の実施例には以下の材料および方法を使用した。
細胞株の培養
OCI-AML3細胞はATCCから購入した。OCI-AML2細胞はDSMZから購入した。OCI-AML3細胞およびOCI-AML2は、10%のFBS(Life TechおよびVWR)および2mMのL-グルタミン(Thermo Fisher Scientific)を補充したRPMI 1640培地(Gibco)中で培養した。
CARベクターの設計
抗NPM1c scFv(配列番号2)、CD8αリーダー配列、細胞外ヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン、4-1BB共刺激ドメイン、ならびにCD3ゼータ活性化ドメインからなるCARの配列は、Integrated DNA Technologies(IDT)によって特注で合成した。いくつかの構築物では、切断性リンカーを介してCARを分泌型または膜結合型のIL-15ヌクレオチド配列に連結した。pHIVベクター(プラスミド#21373)は、酵素XbaIおよびClaIによって二重消化した。ベクター骨格をゲル精製した後、pHIV骨格、CAR断片、およびP2A-GFP断片を、HiFi DNA Assembly Master Mix(New England BioLabs)を使用し、製造者のプロトコールに従って、5’および3’末端におけるそれらの重複領域に基づいてアセンブルした。得られたプラスミドを、以下のシーケンシングプライマー、5’-GTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGT-3’(配列番号69)(フォワード)および5’-AGGCACAATCAGCATTGGTAGCTG-3’(配列番号70)(リバース)を使用してシーケンシングした。適正な配列を有するプラスミドを、pHIV-CAR-GFPと命名した。
CAR発現初代ヒトNK細胞の生成
レンチウイルスは、293T細胞にpHIV-CAR-GFP、BaEV-gp(またはpCMV-VSVG)、pCMV-Δ8.9、およびpAdvプラスミドをトランスフェクトすることによって生成した。48時間および72時間で培養上清を採取し、25,000rpm、4℃、2時間の超遠心によってレンチウイルス粒子をペレット化した。レンチウイルス粒子を100μLの無血清DMEM培地中に懸濁し、-80℃で凍結した。ヒトNK細胞は、ドナー末梢血単核細胞(PBMC)からフィコール遠心分離を使用して単離し、Rosette Sep(StemCell Technologies、CD56+CD3- 95%以上)を使用して精製した。NK細胞は、3~5×10個の細胞をプレートに播種し、rhIL-12(10ng/mL)+rhIL-18(50ng/mL)+rhIL-15(50ng/mL)または対照条件(rhIL-15、50ng/mL)を使用して16時間活性化することによって予め活性化し、PBSで3回洗浄してサイトカインを除去し、生存を支持するためにrhIL-15(1ng/mL)を補充した10%のヒトAB血清(Sigma-Aldrich)含有完全RPMI 1640培地中で培養した。培地の50%を2~3日ごとに新鮮なサイトカインで置き換えた。予め活性化した1日後に、NK細胞にレンチウイルスを形質導入した(MOI=10)。CAR-NK細胞は1ng/mLのrhIL-15を補充した培地中で増大させた。予め活性化し形質導入した後、細胞を10日間休ませた。
ルシフェラーゼ活性の測定による細胞傷害性のアッセイ
CAR-NK細胞の細胞傷害性のアッセイは、ルシフェラーゼ発現標的細胞株を使用して実施した。NK細胞を標的細胞とともに、表示したエフェクター:標的(E:T)比で24時間インキュベートした。次いで細胞をPBS中で1回すすぎ、ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬(Promega)で溶解し、続いてルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)と混合した。プレート分光光度計(Infinite M200PRO、TECAN)を使用して、細胞溶解物の発光を解析した。標的細胞単独の発光をベースライン対照として使用した。各試料の比細胞溶解性は、以下の式を使用して計算した。比細胞溶解性(%)=100×{1-[(CAR-T群における発光/標的細胞単独における発光)/(非形質導入T群における発光/標的細胞単独における発光)]}
in vivoにおけるCAR-NK細胞による標的細胞の殺滅
NOD-scid IL2rgnull(NSG)マウスはJackson Laboratoriesから購入し、Dana-Farber Cancer Instituteの特定病原体のない(SPF)動物舎に収容した。マウスでの全ての実験は、Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。簡単に述べると、200μLのPBS中のルシフェラーゼ発現OCI-AML3細胞(1×10個)を、照射したNSGマウスの尾静脈に注射した。4日後に、500k個のCAR-NK細胞を全NK細胞1×10個として腫瘍担持マウスに注射した。3日ごとにXenogen IVIS-200 Spectrumカメラを使用して生体発光イメージング(BLI)を実施した。
レンチウイルスの例示的な調製:
(1)プラスミドの増大:
3種全てのレンチウイルスパッケージングプラスミドを、Stbl3化学的コンピテントな大腸菌(E. coli)(Thermo Fisher、C737303)中で増殖させる。バリデートされたプラスミドを増殖させるため、Midi Prep(Qiagen、#2945)用に100μg/mLのアンピシリンを含む100mlのLBブロス、またはEndo-free Maxi Prep(Qiagen、#12362)用に100μg/mLのアンピシリンを含む1000mlのLBブロスを使用する。
(2)293T細胞の増殖
20mlの10%FBS DMEM中で293T細胞を培養し、100%コンフルエンスに達させる。細胞は15スプリットを超えて継代しない。細胞は100%コンフルエンシー近くに増殖するまで継代しない。150mm×25mmの組織培養皿(Thermo Fisher Scientific、#0877224)。完全DMEM培地(10%のFBS+P/S+2mMのL-glutを含む)。
(3)293T細胞のトランスフェクション:
トランスフェクションの2~3日前に、15cmのプレートあたり5E6個の細胞を播種する。ほぼ100%コンフルエンスまで増殖させる。使用前に全てのトランスフェクション試薬を室温まで放置して加温する。以下のようにトランスフェクトする。
Figure 2023517063000004
培養皿に均一にらせん状に293Tに滴下して移す。
(必要に応じて)トランスフェクション後8時間で、合胞体の形成および(適用可能であれば)蛍光について確認する。
2日目(トランスフェクション後48時間):収穫し、予め加温した15mLの完全DMEMで置き換える。上清を4℃で1日保存した後で、2次収穫物と一緒の濃縮に進む。
3日目(トランスフェクション後72時間):収穫。プレートを脱色して軽く混ぜる。
(4)レンチウイルスの濃縮
ウイルス上清を採取する。
上清を遠心分離機で5分、350×gで遠心して細胞デブリをペレット化する。上清を超遠心チューブ中に濾過(0.45μmシリンジフィルター)する。全体積約35mLまで培地を加え、ホルダーとともにバランスさせる。
25,000rpm、4℃で2時間、遠心する。
上清を捨てる。残存した培地を完全に除き、100μlの無血清DMEM培地を加えて4℃で終夜、ペレットを溶解する。上下にピペッティングしない。翌日、穏やかに上下にピペッティングして混合し(泡を立てないように注意)、1.5mLのエッペンドルフチューブに移す。
100μLの無血清DMEM培地を超遠心チューブに加えて洗浄する。穏やかに上下にピペッティングして同じ1.5mLのエッペンドルフチューブに移す。
20~50μlのアリコートを-80℃で凍結する。
(5)レンチウイルスの滴定
Jurkat細胞株を使用するFACSによってウイルスを滴定する。
完全RPMI(10%のFBS、P/S、および2mMのL-glutを含有)中でJurkatを増殖させる。
1μLのポリブレン(f.c.10μg/mL)を補充した12ウェルにウイルスあたり2ウェル(二連測定)で、100万個/1mLをプレートに播種する。さらに2ウェルを非形質導入対照とする。ウェルあたり1μLの濃縮BaEVレンチウイルスを添加する。
遠心分離機で、1000×g、32℃で1時間、スピンフェクトする。ブレーキはオフまたはローとする(漏洩防止のため)。
72時間で、GFP+(またはScFv+)のために流す。
FSC/SSC、生/死色素陰性、GFP+(またはScFv+)についてゲーティングする。
JurkatについてMOI=1と仮定し、以下のようにウイルスタイターを計算する。
非形質導入対照からバックグラウンドGFP+(またはScFv+)を差し引く。
ウイルス濃度(感染単位/μL)=(1E6)×陽性%
(6)ヒト初代メモリー様NK細胞のスピンフェクション
4μg/cmプレート面積に相当する体積の20μg/mlのRetroNectin(PBS)を使用してプレートをコートする。プレートを室温で2時間(あるいは4℃で終夜)放置する。
*24ウェルプレートの各ウェルに0.5ml、または6ウェルプレートの各ウェルに2mlを分注する。このステップで未処理の細胞培養グレードの組織培養プレートまたは培養皿を使用することができる。
RetroNectin溶液を除き、次いで適切な体積の無菌PBS中2%BSAでブロックする。プレートを室温で30分放置する。
24ウェルプレートの各ウェルに0.5ml、または6ウェルプレートの各ウェルに2mlを使用する。
BSA溶液を取り除き、適切な体積のPBSでプレートを1回洗浄する。洗浄液を取り除いた後、プレートは直ちに使用可能である。
NK細胞は前日に新鮮ヒトPBMC(カラー)から単離し、5%ヒトAB血清を含むMiltenyiのNK増大培地中、10細胞/mLで、rhIL-2(500IU/ml)+rhIL-12(10ng/ml)+rhIL-18(50ng/ml)によって予め活性化した。
サイトカイン活性化の16~20時間後、細胞を2回洗浄し、次いで500U/mLのIL-2を含む無血清NK増大培地中に5×10細胞/mLで懸濁した。24ウェルプレートの1つのウェルにおける形質導入のために、Vectofusin-1とレンチウイルスとの混合物(300μl)(最終MOI=10)を200μLの細胞懸濁液に加えた。Vectofusin-1の最終濃度は10μg/mLであった。
1000×g、32℃、1時間のスピノキュレーション(極めて簡単かつ1回のスピンフェクション)の後、細胞をレンチウイルスとともに48時間培養した。次いで細胞培地を、5%のヒトAB血清および500U/mLのIL-2を含む新鮮な完全細胞培養培地に交換した。
形質導入後3~4日目にFACSによってCARの発現を測定し、形質導入後5~6日目にin vitroのNK細胞の抗腫瘍機能をFACSおよびルシフェラーゼアッセイによって評価する。in vivoでの有効性および安全性の試験のため、形質導入後6~10日目にCAR-NK細胞を腫瘍担持NSGマウスに移入する。
統計解析
他に述べない限り、データは少なくとも3回の独立した実験からの平均±s.e.として表す。2つの独立群を比較するために、両側t検定を使用した。in vivoにおける腫瘍成長は、2方向繰り返し測定ANOVAを使用して比較した。腫瘍担持マウスにおける生存パターンを解析するためにカプラン・マイヤー法を使用し、統計的差はマンテル・コックスログランク検定に従って評価した。p値0.05未満を統計的有意とみなした。全ての統計解析はSPSS Statistics 22ソフトウェアを使用して実施した。
[実施例1]
CAR構築物によるメモリー様NK細胞の操作
急性骨髄性白血病(AML)は治療上の主要な課題であり続けている。
2015年に米国だけでほぼ20,830人のAMLの新たな症例が診断され、10,460人がこの疾患が原因で死亡した。高齢がAMLの危険因子であるので、疾患の発生率は人口の高齢化とともに増大し得る。従来の化学療法および同種幹細胞移植に耐えることができる患者は完全奏功を達成することができるが、大多数は再発を経験し、この疾患により死亡する(Falini B, et al. Discov. Med. 2010;10(53):281-92)。したがって、我々のがん免疫療法の理解の進歩を利用した毒性が低くより効果的な標的化療法を開発するニーズがある。同種造血幹細胞移植(アロHSCT)は効果的な治療であるが、疾患の進行、年齢、合併症、またはHLA適合ドナーの欠如のため、多くの患者はその候補ではなく、長期の臨床的成功はグラフト対宿主病(GVHD)、感染、および臓器毒性によって限られている。アロHSCTの根底にある免疫療法の基礎であるグラフト対白血病(GVL)は伝統的にT細胞に帰されていたが、最近の研究によって、さらなるGVLに重要な役割を果たしているナチュラルキラー(NK)細胞が同定されている(Venstrom JM, et al.N. Engl. J. Med. 2012;367(9):805-816; Cooley S, Blood. 2010;116(14):2411-9)。ここで本発明者らは、先天的NK細胞メモリーに基づく養子免疫療法のためにNK細胞を武装させる新たなアプローチについて述べる。
サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞およびがんの免疫療法
新生細胞を認識し、これに応答し、これを殺滅する免疫細胞の能力を利用する細胞療法は、進行した悪性疾患を治療するための有望なアプローチを代表している。この文脈では、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞において観察された劇的な臨床奏功は、このアプローチの大きな可能性を実証している。しかし、大多数のがんにおける腫瘍特異抗原の非存在、腫瘍標的抗原の喪失、in vivoでの持続性の低さ、ならびにサイトカイン放出症候群(CRS)および神経毒性を含む重篤な毒性が、CAR T細胞療法における主要な課題として残っている。さらに、CAR T細胞注入後に再発した患者は、治療オプションが極めて限られている。NK細胞は本来、ウイルス感染した、および悪性に転化した細胞を除去することができる先天的なリンパ球様細胞である。従来型NK細胞は早期相の臨床試験でいくらかの有望性を示したが、これらの注入は少数の患者で比較的短期の寛解をもたらした。最近、NK細胞は先天的免疫メモリーを呈するというパラダイムシフト研究が示された。本発明者らは、IL-12、IL-15、およびIL-18で、in vitroで短時間、予め活性化することによって、休眠しているNK細胞の活性化および分化がもたらされ、強力な抗白血病活性を有するサイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞が生成することを発見した(図1)(Romee R, et al. Blood. 2012;120(24))。本発明者らのヒトで最初の第1相治験において、CIML NKは再発した難治性のAML患者の50%超において臨床奏功を誘導し、明らかな毒性はなかった(Romee R, Sci. Transl. Med. 2016; 21:357ra123)。さらに、患者への養子免疫伝達の後で、細胞は増殖し、増大し、増強された抗白血病活性を維持していた(同文献)。これらのデータは、CIML NK細胞療法が効果的かつ安全であり、抗白血病臨床活性を提供することを実証している。CIML NK細胞は、アロHSCTの後で再発した骨髄悪性疾患を有する患者における本発明者らの進行中の治験を含むいくつかの研究において現在評価中である。
CARプラットフォームとしてのCIML NK細胞。
CD19-CARを生成するためのプラットフォームとして同種臍帯血由来NK細胞を使用する最近の研究によって、再発したB細胞悪性疾患の患者における有望な臨床奏功が示されてきた(Rezvani et al, ASH 2018)。注目すべきことに、臨床奏功は最小の毒性で、重篤なサイトカイン放出症候群(CRS)または神経毒性の症例を伴わずに達成された。これらの臨床観察は、NK細胞が遺伝子改変された養子細胞療法のための新たな細胞プラットフォームを代表することを示している。本発明者らは、CIML NK細胞療法におけるこれまでの臨床経験とともにこれらの観察に基づいて、CIML NK CARを生成する方法を開発し、これらの遺伝子改変されたNK細胞の有効性を前臨床モデルで評価する。CIML NK細胞は、前臨床動物モデルおよび遺伝子改変されていないCIML NK細胞で処置された患者においてin vivoで見られた好ましい安全性プロファイル、増加した増殖、延長された持続性、および増強された抗白血病機能に基づくNK細胞CARの開発のための独特のプラットフォームを提供する。さらに、骨髄芽細胞を標的とするCIML NK細胞の本来の傾向により、CIML NK細胞は、主として良好な表面標的抗原がないためにCAR T細胞が僅かな利点しか示さず、または利点を示さないAMLについて魅力的なものになっている。
AMLにおけるCAR標的
AMLは分子的に多様な悪性疾患である。NPM1cにおける変異は、タンパク質の異常な細胞質内局在および/またはMHCによる提示をもたらす。本発明者らは、AML芽細胞の細胞表面でNPM1cから生成されるネオ抗原を標的とすることができる新たなCAR構築物の生成およびバリデーションに成功した。
メモリー様NK細胞プラットフォームを使用するNPM1c標的CARの生成
本明細書に記載した実施形態は、変異したNPM1cを有するAMLに対するNK細胞系CARを含む。TCRおよび従来のCARのアプローチと比較して、本発明者らのアプローチは、NK細胞を武装させるという利点を有している。NK細胞は、HLAの発現を有しないか、発現が低い標的細胞を認識して殺滅することができる。HLAの発現を有しないか、低レベルのHLA分子を有する白血病細胞はNK細胞によって殺滅され、高レベルのHLAを発現する白血病細胞は本発明者らのCAR-NK細胞によって効率的に殺滅できるので、これは重要であり得る。抗原の喪失がCAR-T療法に続く腫瘍耐性の機序であるので、本発明者らのCAR-NK細胞は、療法への耐性および疾患の再発の低減において効果的であることが証明できる。理論に縛られることは望まないが、本発明者らのmem-NK CARアプローチは、AMLにおけるT細胞に基づくCARアプローチに伴う課題の1つであった正常な造血幹細胞および前駆細胞への影響なしに、白血病芽細胞へのターゲティングを顕著に増強することになる。
CIML CAR-NK細胞のin vitro生成法の最適化。
本発明者らは、本発明者らのCAR構築物を使用するCIML NK細胞の形質導入の最適化を行なっている。CIML NKは、本発明者らが以前に述べた方法(Romee R, et al. Blood. 2012;120(24)およびRomee R, Sci. Transl. Med. 2016; 21:357ra123)を使用して、従来の(正常健康ボランティアドナー由来の)末梢血NK細胞から生成している。従来のNK細胞およびCIML NK細胞(同じドナー由来)に本発明者らのCAR構築物を形質導入し、それらの形質導入効率について比較する。データは、サイトカインによって活性化されたNK細胞の方が、レンチウイルスによる形質導入およびヌクレオフェクションを受けやすいことを示している。形質導入されたNK細胞をOCI-AML3(HLA-A2+抗原+)、GMB(HLA-A2-抗原-)、およびK562(HLA陰性であるがNK細胞の影響を受けやすい)に対するin vitro活性について評価する。患者由来のHLA-A2+抗原+初代AML芽細胞に対するそれらの活性についても試験する。NK細胞に特異的なCyTOFパネルも開発した。これにより、単一細胞の様式で38個までのマーカーを評価することができ、免疫サブセットの詳細な解析が可能になる。
本発明者らは、AMLおよびその他の骨髄悪性疾患(例えばMDS、MPN)におけるその他の変異タンパク質を効果的に標的とするために、本明細書における実施形態を拡張する過程にある。
異種移植およびPDXマウスモデルを使用するin vitroおよびin vivoにおけるCIML NKおよびT細胞CAR(同じCAR構築物による)の活性の比較。
CIML CAR-NK 細胞およびT細胞CAR(同じ構築物を担持する)を、異種移植およびPDXマウスモデルにおけるin vitroおよびin vivoの活性化、増殖、持続性、および有効性について評価する。養子免疫伝達後、7日、14日、28日、および60日目に動物を犠牲死させ、in vivoにおける持続性、増大、および活性(BLI腫瘍イメージングおよび生存に基づく)および細胞の疲弊について評価する。これらのマウスの骨髄および脾を含む重要な臓器へのこれらの細胞のトラフィッキング/ホーミングも評価する。
早期相臨床試験のための既製品を開発するための増大法の最適化。
フィーダー細胞株(IL21/41BBを形質導入したK562細胞)を使用する種々のex vivo増大法と、フィーダーフリー法(Sutlu et al, Cytotherapy 2010)とを、最適の短期の増大および凍結保存なしの新鮮な注入について比較する(Sutlu T, et al. Cytotherapy. 2010;12(8):1044-55; Denman CJ, et al, PLoS One. 2012;7(1):e30264)。これらの増大法をCliniMACS Prodigyシステムにおいても試験する。このシステムは自動化された閉鎖系の製造プロセスが可能であり、したがって将来の治験に理想的である。入れ替え時間が短く、他のGMP設備にも容易に応用できる自動化細胞製造アプローチを開発する。本明細書に概要を記載したようにプロセスを最適化した後で、このプロセスをDana FarberにおけるCMCF(Cell Manipulation Core Facility)に移す。本発明者らは既にCIML NK細胞の製造のための2つの有効なINDを有しており、これらの細胞の製造プロセスのバリデーションが完了している。本発明者らは、CIML NK細胞CARを使用するための本発明者らのINDを提出することを意図している。
[実施例2]
ASCT2の発現に基づくメモリー様NK細胞の形質導入効率の最適化
遺伝子操作された強力なCAR-NK細胞を産生する技術的側面は重要である。効率的な形質導入はT細胞については達成されているが、NK細胞については達成されておらず、NK細胞に基づくがんの免疫療法の改善において主要な技術的難点となっている。従来のレンチウイルス形質導入アプローチでは、水疱性口内炎ウイルスG(VSVG)によってシュードタイプ化されたカノニカルなレンチウイルスを使用している。しかし、NK細胞はVSVGによってシュードタイプ化されたレンチウイルスによる形質導入には極めて抵抗性で、遺伝子編集率は1~3%であることが知られている。
CIML NK細胞が、シュードタイプ化レンチウイルスによる形質導入を媒介するために利用することができる従来型NK細胞に対して区別できる受容体発現を有するか否かを評価した。CIML NK細胞は、Romee, R. et al. Blood 120, 4751-4760 (2012)およびRomee, R. et al. Sci Transl Med 8, 357ra123 (2016)に記載し、図1に示すように、正常健康ボランティアドナーから単離した従来型末梢血NK細胞から調製した。簡単に述べると、ドナーの末梢血単核細胞(PBMC)からフィコール遠心分離およびRosette Sep(StemCell Technologies、CD56+CD3- 95%以上)による精製を使用してhNK細胞を単離した。3~5×10個の細胞をプレートに播種し、rhIL-12(10ng/mL)+rhIL-18(50ng/mL)+rhIL-15(50ng/mL)または対照条件(rhIL-15、50ng/mL)を使用して16時間活性化することによってhNK細胞を予め活性化し、PBSで3回洗浄してサイトカインを除去し、生存を支持するためにrhIL-15(1ng/mL)を補充した10%のヒトAB血清(Sigma-Aldrich)含有完全RPMI 1640培地中で培養した。培地の50%を2~3日ごとに新鮮なサイトカインで置き換えた。
VSVGタンパク質によってライゲートされる受容体であるLDL-Rの発現を、フローサイトメトリーによって評価した。従来型NK細胞とCIML NK細胞との両方がLDL-Rの低い発現を有していることが見出された(図2A)。したがって、NK細胞における形質導入のブロック(即ちVSVG-LVを使用する)は、VSVGタンパク質の対応する受容体である低密度リポタンパク質受容体(LDL-R)の最小の発現に起因すると考えられる(図2C)。VSVGタンパク質のLDL-Rとのライゲーションは標的細胞への侵入に続くレンチウイルスの付着のために重要であり、したがってこれは形質導入効率を制限する要素である(図2C)。NK細胞の特有の受容体発現パターンを研究することにより、本発明者らのデータは、LDL-Rとは大きく異なって、ASCT2の発現レベルが初代の従来型NK細胞において高く、サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞においてさらに増強していることを示した(Romee, R. et al. Blood 120, 4751-4760 (2012); Romee, R., et al. Scientifica (Cairo) 2014, 205796 (2014); Romee, R. et al. Sci Transl Med 8, 357ra123 (2016))(図2B、図2C)。ASCT2はアミノ酸輸送体であり、ヒヒエンベロープ糖タンパク質(BaEV-gp1)の対応する受容体である。したがって、理論に縛られることは望まないが、非従来型BaEVシュードタイプ化レンチウイルスを利用することにより、初代ヒトNK細胞、特にCIML NK細胞における形質導入のブロックを克服することができよう(図2C)。
[実施例3]
抗NPM1c CARメモリー様NK細胞の生成。
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、がん抗原の標的化における公知の方法である。しかし、CAR-T細胞はその持続性および不都合な副反応のために限定されている。活性を失わず、がん細胞に対する能力を示すCAR-NK細胞の生成が必要とされている。
CARプラットフォームとしてのCIML NK細胞。
CD19-CARを生成するためのプラットフォームとして同種臍帯血由来NK細胞を使用する研究によって、再発したB細胞悪性疾患の患者における臨床奏功が示されてきた(Liu et al. NEJM. (2020) 382:545-53)。臨床奏功は最小の毒性で、重篤なサイトカイン放出症候群(CRS)または神経毒性の症例を伴わずに達成され、NK細胞が遺伝子改変された養子細胞療法のための新たな細胞プラットフォームを代表することを示している。本発明者らは、サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞療法におけるこれまでの臨床経験(Romee R, et al Blood (2012) 120(24):4751-4760; Romee R, et al. Sci Transl Med (2016) 8(357):357ra123)とともにこれらの観察に基づいて、CIML NK CARを生成する方法を開発し、これらの遺伝子改変されたNK細胞の有効性を前臨床モデルで評価する。CIML NK細胞(図1)は、前臨床モデルおよび改変されていないCIML NK細胞で処置された患者において見られた好ましい安全性プロファイル、増加した増殖、延長された持続性、および増強された抗白血病機能に基づくNK細胞CARの開発のための独特のプラットフォームを提供する(同文献)。
AMLにおけるCAR標的としての変異NPM1c
大部分のCAR-T細胞療法は腫瘍関連抗原(TAA)を標的としている。この療法は、正常組織中での発現レベルが低いことによるオンターゲット/オフ腫瘍毒性、および腫瘍細胞による抗原発現の喪失に対する腫瘍耐性をもたらすことがある。この欠点を克服する1つの方法は、腫瘍特異的発がんドライバー遺伝子変異を標的とすることである。ヌクレオフォスミンにおける4ヌクレオチドの複製はNPM1cとも称され、AMLの約30%におけるドライバー発がん遺伝子の変異である。NPM1cはHLA-A0201アレルによって提示される白血病特異的ネオ抗原(AIQDLCLAV;配列番号1)を生成する。本発明者らは、酵母表面ディスプレイを使用し、NPM1cエピトープ-HLA-A2複合体に特異的に結合するヒト一本鎖可変断片(scFv)を単離した。この抗原を標的とする以前同定されたscFvは、米国仮特許出願第62/987,612号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。本発明者らは、CD8αヒンジおよび膜貫通(TM)ドメイン、4-1BB共刺激ドメイン、およびCD3z活性化ドメイン、それに続く自己切断性のP2AおよびEGFPを含むCAR骨格にscFvをインフレームでクローニングすることによって、CAR構築物を創成した(図3Aおよび表3)。
Figure 2023517063000005
既に述べたように、抗NPM1c CAR-T細胞は、AIQ-HLA-A2複合体を特異的に認識する。簡単に述べると、ビオチン化AIQ-HLA-A2とインキュベートし、続いてストレプトアビジン-APCによって染色したGFP+抗NPM1c CAR-T細胞(配列番号30の抗NPM1c-CARを含む)は、AIQ-HLA-A2複合体と結合することが示された(図3B)が、対照ペプチドエピトープ(例えばSLL;SLLMWITQC(配列番号62))を提示するHLA-A2またはHLA-A2単独(データは示していない)とは結合しなかった。非形質導入T細胞は、3つの複合体のいずれにも結合性を示さなかった。これらの結果により、NPM1c-CAR-T細胞(配列番号30の抗NPM1c CARを含む)のAIQ-HLA-A2複合体への特異性が確認される。単離したscFvを含む操作されたCAR-T細胞は、NPM1c+HLA-A2+の白血病細胞に対してin vitroとin vivoの両方で強力な細胞傷害性を呈したが、NPM1c-HLA-A2+またはHLA-A2-の腫瘍細胞に対しては細胞傷害性を呈さなかった(データは示していない)。
ここで本発明者らは、HLA-A0201との複合体中でNPM1cネオ抗原を認識することができるCAR構築物を形質導入したCIML NK細胞を使用することによって、AMLに対するNK細胞に基づくCARを開発する。NK細胞は、HLA発現がないか少ない標的細胞を認識してこれを殺滅することができる。低レベルのHLAを有する白血病細胞はCARによらない機序を介してNK細胞によって殺滅される一方、高レベルのHLA、したがってより多くのNPM1cネオ抗原-HLA-A2標的を発現するこれらの白血病細胞はNPM1c CAR-NK細胞によって標的とされ、殺滅され得るので、これは重要であり得る。抗原の喪失はCAR-T療法に続く腫瘍の耐性の重要な機序であるので、NPM1c CAR-NK細胞は、治療への耐性および疾患の再発の低減において効果的であることが証明できる。
CAR CIML NK細胞の強力な抗AML機能。
以下さらに述べるように、本発明者らは、非従来型のレンチウイルス形質導入アプローチを介して抗NPM1c CARをCIML NK細胞に導入し、50%を超えるCAR編集効率を達成した(図5)。それらの非形質導入対照物と比較して、抗NPM1c CAR(配列番号30による)を有するCIML NK細胞は、NPM1c+標的AML細胞(OCI-AML3)でパルス処理した際にIFNガンマの産生の上昇したレベルおよび脱顆粒マーカーCD107aの発現の増加によって示される抗AML機能の増強を獲得した。まとめると、本発明者らは、NPM1cのような腫瘍特異的細胞内タンパク質を特異的かつ効率的に標的とするCAR-NKプラットフォームを構築した。
メモリー様NK細胞
サイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞は、IL-12、IL-18、およびIL15を含むサイトカインで予め活性化することによって惹起された長期の増強された機能性を有するNK細胞である。CIML NK細胞は、初期のサイトカイン刺激がなくても将来の感染またはチャレンジの間にリコール応答を開始する。CIML NK細胞を生成するため、実施例2の方法を使用した。簡単に述べると、ヒトから末梢血単核細胞を単離してrhIL-12(10ng/mL)+rhIL-18(50ng/mL)+rhIL-15(50ng/mL)または対照条件(rhIL-15、50ng/mL)で16時間刺激し、3回洗浄してサイトカインを除去し、生存を支持するためにrhIL-15(1ng/mL)を補充した10%ヒトAB血清(Sigma-Aldrich)を含む完全RPMI 1640培地中で培養した。
形質導入
初代ヒトおよびマウスNK細胞の形質導入には種々の課題があり、様々な遺伝子移入プロトコールではわずかな成功しか観察されていない。このプロセスを媒介するため、シュードタイプ化されたレンチウイルスに基づく方法を利用した。VSVG(水疱性口内炎ウイルスG)タンパク質とBaEV-LV(ヒヒエンベロープ糖タンパク質)との両方が遺伝物質をNK細胞に成功裡に移入することが知られている。NK細胞は、VSVG受容体である低密度リポタンパク質(LDL-R)およびBaEV受容体であるアラニン、セリン、システイン輸送体2(ASCT2)を発現する。これら両方の受容体の表面発現を、フローサイトメトリーを使用して従来型(サイトカイン誘導性でない)およびMLのNK細胞について測定した。実施例2に記載したように、LDL-Rのレベル(図2A)はASCT2(図2B)より少なく発現したことを見出された。したがって、より強力なレンチウイルスアプローチを生成するため、BaEV由来の糖タンパク質(配列番号107で記載されるアミノ酸配列;配列番号108で記載されるヌクレオチド配列)をコード配列に挿入し、ASCT2を認識するBaEV糖タンパク質を有するシュードタイプ化されたレンチウイルスを生成した。BaEV糖タンパク質によってシュードタイプ化され、抗CD19 CARをコードするレンチウイルス構築物を示すマップを図28に示す。図3Aおよび表3で同定した抗NPM1c CARを発現するためにレンチウイルス発現構築物を調製し、BaEV糖タンパク質によってシュードタイプ化した(「BaEV-LV」と称する)。EF-1アルファプロモーターの制御下に構築物をレンチウイルスパッケージングプラスミドにクローニングし、HEK 293T細胞における一時的トランスフェクションによってレンチウイルスを生成した。LVを含む上清のタイターは、FACSによって定量した。
CAR形質導入に先立つ異なるサイトカインによるML NK細胞の誘導がASCT2の発現に影響したか否かを理解するため、細胞を誘導して、発現についてアッセイした。具体的には、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を採取し、試料からヒトNK(hNK)細胞を精製した。次いで上記の用量(即ち10ng/mLのrhIL-12、50ng/mLのrhIL-18、50ng/mLのrhIL-15)を使用して、IL-15、IL-12、および/またはIL-18の異なる組合せでhNK細胞を16時間刺激した。次いで細胞を洗浄し、上記のBaEV-LVレンチウイルス形質導入を使用して抗NPM1c CAR(配列番号30で記載されるヌクレオチド配列)を形質導入し、72時間後に機能性抗NPM1c-CAR-ML hNK細胞を生成した(図6A)。
hNK細胞をIL-15、IL-12、およびIL-18の1つまたは複数で刺激するとASCT2の表面発現はフローサイトメトリーで測定して、IL-15、IL-12、およびIL-18の2つ以上による刺激によって増加した(図6B)。具体的には、IL-15、IL-12、およびIL-18による同時処理によって、IL-15単独によるよりも発現が増加した。
ASCT2の発現がCIML NK細胞におけるmRNAレベルで従来型NK細胞と比較して変化したか否かを、定量PCR(qPCR)を使用してさらに確認した。簡単に述べると、上記の方法を使用して3名の異なる健康なヒトドナーから得たPBMCから初代ヒトNK細胞を単離した。hNK細胞を1ウェルあたり3~5×10個細胞で播種し、(i)rhIL-12(10ng/mL)+rhIL-18(50ng/mL)、または(ii)rhIL-12(10ng/mL)+rhIL-18(50ng/mL)+rhIL15(50ng/mL)への曝露によって16時間活性化した。対照条件はrhIL-12(10ng/mL)単独、rhIL-18(50ng/mL)単独、またはrhIL-15(50ng/mL)単独への曝露であった。活性化の後、細胞をPBSで3回洗浄してサイトカインを除去し、qPCRアッセイのためにRNAを抽出した。ASCT2 RNA転写物の定量はΔΔCt法を使用して実施した。図6C~6Eに、3名の異なるヒトドナー由来の活性化hNK細胞の定量を提供する。図6C~6Dに示すように、IL-12およびIL-18で活性化したNK細胞は、対照のhNK細胞と比較して、特にIL-15のみで活性化した対照のhNK細胞と比較して、ASCT2 RNA転写物の発現が増加していた。図6Eに示すように、IL-15、IL-12、およびIL-18で活性化したNK細胞は、IL-15のみで活性化した対照のhNK細胞と比較して3倍を超えるASCT2 RNA転写物の増加を有していた。
合わせて、これらの知見は、IL-12およびIL-18、または3種全てのサイトカイン(IL-12、IL-18、IL-15)による活性化によってASCT2 RNA転写物の発現およびhNK細胞における表面発現が改善され、BaEV-LVによる形質導入効率が増大し得ることを示している。
次いでML-NK細胞に抗NPM1c CARを形質導入し、形質導入効率を測定した。具体的には、上記のCAR構築物はGFPレポーターを含んでいる。形質導入した細胞においてGFP発現レベルを測定した。図6Fに、3種全てのサイトカインで予め活性化することによってBaEV-LVの形質導入効率が改善されたことを示す。
異なるヒトドナーから得たCIML-NK細胞において、BaEV-LVレンチウイルス形質導入による形質導入を評価した。CAR発現は、プロテインLを使用するフローサイトメトリーによって測定した(例えばZheng, et al (2012) J. Transl Med. 10:29を参照)。図7Aに示すように、形質導入後のプロテインL結合によって抗NPM1c CARの発現として決定した全形質導入率は、異なる6名のドナーについて56±14%であった。
さらに、ヒトおよびマウスのドナーから得たCIML-NK細胞において、BaEV-LVレンチウイルス形質導入による形質導入を評価した。ヒトCIML-NK細胞は、上記のようにPBMCから得た初代hNK細胞をrhIL-12、rhIL-15、およびrhIL-18で予め活性化することによって得た。マウスCIML-NK細胞は、マウス脾細胞を収穫し、マウスNK細胞を単離し、組換えマウスIL-12、IL-15、およびIL-18で予め活性化することによって得た。BaEVでシュードタイプ化したレンチウイルスはGFPをコードしていた(Lenti-GFP(BaEV))。図7Bに示すように、GFPの発現によって測定した形質導入率はヒトとマウスとの両方のCIML-NK細胞で高かった。
[実施例4]
ML NK細胞サブセットの中でのASCT2の発現
ASCT2の発現がNK細胞のサブセットの中で変動するか否かをさらに評価した。図7Cに示すように、hNK細胞はそれらの発達および成熟の段階に基づいて異なる表現型マーカーを発現する。低い成熟度(例えば、より「幹細胞様」)から完全成熟までの特徴的な表現型マーカーを下の表4に示す。
Figure 2023517063000006
フローサイトメトリー分析を使用して、上に示した表現型マーカーに基づくヒトNK細胞サブセットを解析し、それぞれのサブセットについてASCT2の発現を決定した。簡単に述べると、実施例3に記載したように、4名の異なるヒトドナーから得た新鮮または凍結PBMCからhNK細胞を単離した。次いでhNK細胞を終夜休ませた。CD56、CD3、CD16、KIR、CD57、およびASCT2を標的とする標識抗体で細胞を染色し、洗浄し、次いでフローサイトメトリー分析に供した。使用したゲーティング戦略を図7Dに示す。これにより、以下のhNKサブセット(低成熟から高成熟の順)の同定が可能になった。
(i)NK1:CD56bright;CD16-/low
(ii)NK2:CD56dim;CD16;KIR
(iii)NK3:CD56dim;CD16;KIR;CD57
(iv)NK4:CD56dim;CD16;KIR;CD57
図7E~7Fに示すように、高い表面レベルのASCT2を発現する集団の割合は、hNK細胞サブセットの成熟の段階と相関していた。具体的には、ASCT2の表面発現の高いものから低いものへ、hNK細胞についてNK1>NK2>NK3>NK4であった。データは、異なるヒトドナーから得たhNK細胞のサブセットにわたって一致していた。
[実施例5]
抗NPM1c CAR-ML NK細胞は急性骨髄性白血病に対して強力である
急性骨髄性白血病(AML)はNPM1cを発現することが知られている。抗NPM1c CAR-ML NK細胞がAMLに対して非形質導入NK細胞より強力か否かを検討するため、それぞれの細胞集団をAML細胞株とともに培養し、いずれもNK細胞の活性化のマーカーであるIFN-γおよびCD107aの発現を測定した。具体的には、NPM1c+/HLA-A2+であるOCI-AML3細胞を抗NPM1c CAR-ML NK細胞とともに4時間、共培養した。細胞を採取し、フローサイトメトリー分析を実施した。細胞はCD56、CD107a、およびIFNγについて染色した。抗NPM1c-CAR-ML NK細胞は、非形質導入細胞(IL15、IL12、およびIL18で刺激したML NK細胞)と比較して増加したIFN-γおよびCD107aの発現を示した(図8A)。この発現の増加は、標的AML細胞の存在下において非形質導入細胞と比較したより高い能力およびNK細胞の活性化を示唆している。
マスサイトメトリーは単一細胞上の多数のパラメーターの高スループット解析を可能にし、ヒトNK細胞を深く免疫フェノタイピングするために使用されている(Strauss-Albee (2015) Sci Transl Med 7:297ra115; Amir, et al (2013) Nat Biotech 31:545)。したがって、NPM1c+標的細胞との共培養の後の抗NPM1c CAR ML-NK細胞の発現プロファイルの広範囲な解析を、NK特異的CyTOFパネルを使用して実施した(例えばRomee et al (2016) Sci Transl Med 8:357ra123を参照)。簡単に述べると、抗NPM1c CAR ML-NK細胞または非形質導入ML-NK細胞を、OCI-AML3細胞と6時間、共培養した。次いでマスサイトメトリーパネルを使用して細胞を解析した。多様性は3名のヒトドナーについて評価した。定量は、以前記載したように実施した(Diggins, et al (2015) Methods 82:55)。図8Bに示すように、CD107a、IFNγ、およびグランザイムBは、CAR ML-NK細胞において非形質導入NK細胞と比較して増強していた。これらのデータは、CAR-NK細胞が白血病細胞の殺滅のための増強された機能を有していることを示唆している。図8Cに示すように、CAR ML-NK細胞において多数の活性化マーカー(CD25、CD69、ICOS、およびCD226)が増加した。活性化マーカーCD62Lも(特に1名のドナー由来のCAR ML-NK細胞において)増加していた。これらのデータは、CAR-NK細胞がそれらの非形質導入対応物よりも活性であることを示している。図8Dに示すように、多数の活性化受容体(NKp30、NKG2D、およびNKp44)がCAR-NK細胞において増加した。全体として、これらのデータは、CAR-NK細胞が非形質導入NK細胞と比較して高いレベルの活性化受容体を発現することを示している。図8Eに示すように、ある種の成熟マーカー(CD56、NKG2A)がCAR-NK細胞中で増強された一方、マーカーCD57は減少した。これらのデータは、CAR-NK細胞の成熟度が非形質導入NK細胞と比較して低いことを示している。図8Fに示すように、疲弊マーカーTIGITはCAR-NK細胞中で増強していた。図8Gに示すように、アポトーシスマーカーTRAILはCAR-NK細胞中で減少しており、CAR-NK細胞が非形質導入NK細胞と比較して改善された寿命を有していることを示している。
[実施例6]
IL-15との共形質導入は抗NPM1c CAR-ML NK細胞の効力を改善する
IL-15との共形質導入が抗NPM1c CAR-ML NK細胞の効力をさらに増強するか否かを評価した。P2A自己切断性ペプチドを介して膜結合IL-15(mIL-15)または分泌され得るIL-15の可溶性バージョン(sIL-15)に連結された抗NPM1c CARをコードするレンチウイルス構築物を調製した。mIL-15にはC末端CD8ヒンジおよび膜貫通ドメインとが含まれていた。mIL-15およびsIL-15の完全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を表5に記載する。抗NPM1c-mIL-15または抗NPM1c-sIL-15をコードする、BaEV糖タンパク質によってシュードタイプ化したレンチウイルス発現構築物(それぞれ「CAR-m15」および「CAR-s15」と称する)を調製した。CIML NK細胞にCAR-m15またはCAR-s15を形質導入すると、形質導入された細胞は非形質導入(UT)細胞と同様にin vitroで増大を維持していた(図9A)。比較は、実施例3に記載したように抗NPM1c CARのみを形質導入したCIMNL NK細胞に対して行なった。増大全体を通じても、形質導入後4日目および23日目にフローサイトメトリーによって測定すると、(プロテインLの結合パーセントによって測定した)CARの表面発現が維持されていた(図9B~9C)。
Figure 2023517063000007
次に、NPM1cを発現するAML標的細胞の抗NPM1c CAR-ML NK細胞による特異的殺滅を、NPM1cの発現を欠くAML細胞と比較した。これを行なうため、抗NPM1c CAR-ML-NK細胞がそのNPM1c+細胞に対する効力に加えてNPM1c- AML細胞に対して効力があるか否かを検討した。CIML NK細胞にCAR-s15 LVまたはCAR-m15 LVを形質導入した。ルシフェラーゼを発現する2つのAML細胞株、OCI-AML3(NPM1c+、HLA-A2+、Luc+)およびOCI-AML2(NPM1c-、HLA-A2+、Luc+)の標的細胞殺滅をアッセイした。まず、抗NPM1c CAR-CIML NKとAML細胞の1:1の比率で細胞を共培養し、共培養の5時間後に採取した。フローサイトメトリー分析によって測定したIFNγの発現は、NPM1c+(OCI-AML3)細胞と共培養した抗NPM1c CAR ML-NK細胞において増加した(図10A)。
さらに、異なるエフェクター:標的(E:T)比で4時間共培養することによって、標的細胞(AML)のアポトーシス率を測定した。アポトーシスはNPM1cを発現するエフェクター細胞中でNPM1c陰性細胞と比較して増加した(図10B)。両方のCAR構築物はNPM1c陽性細胞においてアポトーシスを誘導することができ、これらはアネキシンVフローサイトメトリーによって測定して早期のアポトーシスを示した。
NK細胞とそれぞれのAML細胞株を24時間共培養し、続いてルシフェラーゼ発現を測定することによって、効果的な細胞殺滅をさらに測定した。比較は、抗NPM1c CARのみを形質導入したML-NK細胞に対して行なった。異なるE:T比で24時間培養した場合、標的細胞の生存率はOCI-AML3細胞で低減した(図10Cの左パネル)一方、NPM1c-のOCI-AML2細胞では生存は影響されなかった(図10Cの右パネル)。さらに、IL-15を共形質導入したML-NK細胞は、抗NPM1c CARのみを形質導入したML-NK細胞と比較して、NPM1cを発現する標的細胞の殺滅の増加を実証した。合わせて、これらの結果は、特にIL-15と共形質導入した場合に、NPM1cを発現しているAML細胞に対して抗NPM1c CAR-CIML NK細胞が成功した効力を有し、NPM1cを発現していないAML細胞に対しては細胞傷害効果がないことを実証している。
CAR単独またはCARとmIL15とを形質導入したCIML NK細胞のさらなる比較を実施した。上で説明したように、CARによる形質導入は、抗NPM1c CARをコードするBaEV-LVを使用する形質導入後72時間で測定して、初代ヒトCIML NK細胞において効率的であることが見出された(図10D)。しかし、CARおよびmIL-15を共形質導入するためにBaEV-LVを使用することにより、CARのみをコードするBaEV-LVを形質導入した細胞と比較して、より大きな増大が観察された(図10E)。OCI-AML標的細胞との4時間の刺激の後、CARおよびmIL-15をコードするBaEVを形質導入したCIML NK細胞におけるIFN-ガンマおよびCD107aの発現は、CARのみをコードするBaEVを形質導入したCIML NK細胞と同様であった(図10F)。しかし、CARおよびmIL-15を共形質導入したCIML NK細胞は、共培養後4時間で測定すると、標的OCI-AML3細胞の殺滅がより効果的であった(図10G)。細胞死は、7-AADを使用するフローサイトメトリー分析によって測定した。
[実施例7]
抗NPM1c CAR-ML NK細胞はin vivoでAMLに対する有効性を示す
in vivoにおける抗NPM1c CAR-ML NK細胞の抗白血病活性を検討するため、AMLマウスモデルを解析した。図11Aに示すように、健康なヒトドナーの末梢血単核細胞からNK細胞を単離した。単離に続いて、実施例3に記載したように細胞をサイトカインとともに培養してML-NK細胞を生成した。-10日目に、実施例3に記載した形質導入法を使用して細胞に抗NPM1c-CAR(配列番号30)を形質導入した。細胞を培養している間、-7日目にマウスに照射して免疫細胞を除去し、-5日目に1×10個のAML3-luc細胞を注射した。0日目に、マウスにNK細胞を注射した。注射には約0.5×10個の抗NPM1c-CAR ML NK細胞を含む1×10個の全細胞が含まれていた。AML負荷は、3日目、10日目、および13日目にルシフェラーゼ構築物のイメージングを使用して測定した(図11B)。抗NPM1c CAR-ML NK(および分泌型IL15または膜結合IL15)で処置したマウスは、12日目までにAML負荷の低減を示した(図11C)。これらの結果は、全AML負荷の低減において非形質導入NK細胞と比較した抗NPM1c CAR-CIML NKの成功した効力を示している。
[実施例8]
AML腫瘍に対するin vivo有効性
CAR CIML NK細胞のin vivoにおける有効性および安全性は、液状および固形の腫瘍に対してバリデート中である。本発明者らは、NPM1c-CAR(3種の構築物)を有するCIML NK細胞および同じ構築物を形質導入したCAR-T細胞のin vivo抗白血病活性を評価する。理論に縛られることは望まないが、本発明者らの独特のCIML-NK CARアプローチは、正常な造血幹細胞および前駆細胞への影響または重篤な毒性の惹起なしに、白血病芽細胞へのターゲティングを増強することになる。これは、AMLにおけるT細胞に基づくCARアプローチに伴う主要な課題の1つであった。簡単に述べると、本発明者らは、予めluc+OCI-AML3を注射したNSGマウスを使用する異種移植マウスモデルにおける活性化、増殖、持続性、および有効性を評価する。養子免疫伝達後7日目、14日目、28日目、および60日目に動物を犠牲死させ、(生物発光腫瘍イメージングおよび生存に基づいて)in vivoの持続性、増大、および活性を評価する。骨髄および脾を含む主要臓器へのこれらの細胞のトラフィッキング/ホーミングもバリデートする。NK細胞の疲弊はそれらの抗腫瘍活性に負に影響することから検討の活動分野であることを前提として(Felices et al., 2018)、本発明者らのNK特異的CyTOFパネルを介し、また標的再刺激(即ち、OCI-AML3およびK562)におけるそのIFN-γ分泌によって、細胞のin vivo疲弊を特徴解析する。本発明者らは、NSGマウスにおいて養子免疫伝達したCIML CAR-NK細胞の増大および持続性を最適化するIL-2、IL-15、およびIL-15/IL-15Rαの効力も比較する。これには、NK細胞の疲弊を防止する異なる投薬戦略を試験することが含まれる。異種移植マウスにおける初期の最適化の後、DFCIで利用可能なNPM1c+患者由来の異種移植(PDX)モデルにおいてこの戦略をバリデートする。
本発明者らは古典的なVSVGシュードタイプ化レンチウイルスも試みた。形質導入効率は極めて低く、通常のNK細胞およびCIML NK細胞において1~3%の範囲であった。例えば、BaEVレンチウイルスを使用して異なるサイトカイン、IL-15、IL-15+IL-12、およびIL-15+IL-12+IL18によって予め活性化を行なったNK細胞の形質導入性能も比較し、後者(CIML NK細胞を生成(Romee et al., 2016))が最も良く機能したことを見出した。
[実施例9]
がん免疫療法における使用のためのCAR ML NK細胞の有利な特性
本明細書に記載したCARメモリー様NK細胞と、TCRを発現するように操作された他のNK細胞との相違には、例えば以下のものが含まれる。
操作されたNK細胞の進行中の治験の大部分において、他の非メモリー様NK細胞またはNK細胞株(例えばNK92細胞株)に対してメモリー様(「CIML」)初代NK細胞を使用した(Xie et al., 2020)。Mensali et al., 2019; Walseng et al., 2017も参照されたい。
親和性:本発明者らのscFv系CAR構築物は、ペプチド/MHC複合体に対して、それらのペプチド/MHC複合体に対するTCR系対応物の約100倍強い親和性を有する。標的へのCARのより強い結合はNK細胞のより強い活性化をもたらし、したがってより強い殺滅活性をもたらす。T細胞においては、TCRのペプチド/MHCとの相互作用は、弱い結合親和性を補償するためにCD4またはCD8等の共受容体を必要とする。対照的に、NK細胞は、最適化されたシグナル伝達および引き続く強固な活性化および機能の誘導を理想的に支持するためのインタクトなTCRシグナル伝達コンパートメントを有しない。
今までのところ、細胞内抗原を標的とすることができるTCRを発現するために、T細胞およびNK細胞株(NK92細胞)が形質導入された。初代NK細胞および初代NK CIML細胞にTCRを形質導入することはできるが、そのような形質導入に関しては、scFv系CAR構築物と比較して極めて低い抗原/エピトープ親和性に加えて実質的な欠点が存在し得る。scFv系CAR構築物を使用して好ましい形質導入率を達成し、細胞内抗原を標的とすることができる。これは初代NK細胞およびメモリー様(「CIML」)NK細胞ではなされなかった。さらに、scFvはTCRと比較して短いので、高い形質導入率を維持しつつ、IL-15の膜型または分泌型のバージョン等のさらなるモジュールを構築物に添加することができる。
[実施例10]
細胞内NPM1C由来のネオエピトープを標的とする操作されたメモリー様NK CARSは急性骨髄性白血病に対する強力な活性および特異性を呈する
序論:急性骨髄性白血病(AML)は治療上の課題であり続けている。毒性が低く、有効性が高い標的化療法の開発に対するニーズが出現している。ナチュラルキラー(NK)細胞は、効果的ながん療法のために重要な鍵となる属性の多くを保有しており、「生まれつきのキラー」であるが、移植片対宿主疾患、サイトカイン放出症候群、または神経傷害性の明らかなリスクはない。さらに、骨髄芽細胞を標的とするNK細胞の本来の傾向により、これらはAMLについて魅力的なものになっている。血液がんにおける有望な臨床結果にも関わらず、NK細胞に基づく療法の開発は、主としてNK細胞の寿命が短いこと、増殖が不適切であること、および特異的腫瘍ターゲティングの欠如のために、困難なままである。ここで本発明者らは、先天的な細胞記憶に基づく養子免疫療法のためにNK細胞を武装させる新たなアプローチを利用した。キメラ抗原受容体(CAR)は、免疫エフェクター細胞の抗腫瘍特異性および活性を顕著に増強する。本発明者らのCAR-NK細胞は、AMLにおける腫瘍特異的ネオエピトープを標的とし、有効性を増強し毒性を最小化する設計における強力な機能経路を利用している。
方法:
1.AMLにおけるCARの標的としての変異NPM1c。大部分のCAR-T細胞療法は腫瘍関連抗原(TAA)を標的としており、これはオンターゲット/オフ腫瘍毒性および腫瘍耐性をもたらすことがある。この欠点を克服する1つの方法は、腫瘍特異的発がんドライバー変異を標的とすることである。ヌクレオフォスミンにおける4ヌクレオチドの複製はNPM1cとも称され、AMLの約35%におけるドライバー発がん変異である。変異は、HLA-A2アレルによって提示されるネオエピトープを創成する。本発明者らは、酵母表面ディスプレイを使用し、NPM1cエピトープ-HLA-A2複合体には特異的に結合するが、HLA-A2単独または対照ペプチドを負荷したHLA-A2には結合しないヒト一本鎖可変断片(scFv)を単離した。
2.CARプラットフォームとしてのサイトカイン誘導性メモリー様(CIML)NK細胞。CIML NK細胞は、前臨床モデル(Romee et al, Blood 2012)および未改変のCIML NK細胞で処置した患者(Romee et al, Science Trans Med 2016)で観察した、好ましい安全性プロファイル、増加した増殖、延長された持続性、および増強された抗白血病機能に基づくNK細胞CARの開発のための独特のプラットフォームを提供することができる。
3.初代NK細胞における効率的な遺伝子編集。本発明者らは、CIML NK細胞上で高い発現を有する独特のタンパク質に基づく非従来型のシュードタイプ化レンチウイルスを利用することによって、初代ヒトおよびマウスのNK細胞における形質導入の障害を克服した。
結果
1.単離されたscFvを有する操作されたCAR-T細胞は、in vitroおよびin vivoの両方において、NPM1c HLA-A2白血病細胞(OCI-AML3)および初代AML芽細胞に対して強力な細胞傷害性を呈するが、NPM1c HLA-A2白血病細胞(OCI-AML2)またはHLA-A2腫瘍細胞(PC-3)に対しては細胞傷害性を示さない。
2.しかし、抗NPM1c CAR-T細胞のin vivoでの抗白血病有効性は一過性であり(非形質導入T細胞で養子免疫伝達を行なった対照マウスと比較して、全生存期間は28日から42日に、メディアン生存期間は21日から37日に延長した)、無視できない毒性があった。
3.本発明者らは、非従来型シュードタイプ化レンチウイルスを利用して健康なドナー血液(n=5ドナー)由来のCIML NK細胞を形質導入し、高い形質導入効率を有する抗NPM1c CAR-NK細胞を生成することに成功した(MOI=10を使用し、形質導入率平均48%、範囲32%~65%;VSVGシュードタイプ化レンチウイルスを使用する従来型アプローチの2%、範囲0.8%~4.5%と比較)。
4.CARの設計において鍵となるサイトカイン経路を利用することにより、CAR-NK細胞の生存率(細胞生存率の29.7%から75.2%への増強によって示される)および増殖(ki-67の60.2%から94.5%へのレベルの増加によって特徴付けられる)が実質的に促進された。
5.抗NPM1c CARは、NPM1c発がん遺伝子を有するAML(OCI-AML3)に対するCIML NK細胞の抗腫瘍機能(CD107a、IFNガンマによって表される)および腫瘍特異的殺滅(アネキシンVおよび7-AADによって測定される)を有意に促進した。
6.CARおよびサイトカインシグナル伝達を有する二重武装CIML NK細胞は、AML標的に対して最適の特異性および持続性を呈した。
結論:これらの結果は、NPM1c+HLA-A2+ AMLを治療するための効率的な細胞免疫療法として、オンターゲット/オフ腫瘍毒性および腫瘍耐性が潜在的に低減した革新的なCAR-CIML NK細胞を開発することができることを示している。本発明者らの研究は、診療所における骨髄悪性疾患に対するCAR NK細胞療法の新たな構想および設計を推進することになる。
本発明者らは、AMLの30%に起こるドライバー発がん変異であるNMP1cに由来するネオエピトープを標的とする新たな遺伝子構築物を開発した。
非従来型シュードタイプ化レンチウイルスおよびメモリー様NK細胞をCAR開発のプラットフォームとして利用して、本発明者らは、NPM1c-CAR-NK細胞のin vitro生成のための形質導入方法を(約50%の形質導入率で)最適化した。
CAR-NK細胞は、NPM1c+ AML細胞に対する強力かつ特異的な機能を呈した。
異種移植マウスモデルを使用した予備的な結果は、CAR-NK細胞のin vivoにおける強固な抗白血病有効性を支持した(特に膜結合IL-15を含む構築物について)。
安全性:
ミスマッチしたナチュラルキラー(NK)細胞でさえ、重篤なGvHDを起こさなかった。
NK細胞CARは安全であり(CRSなし/神経傷害性なし)、奏効率はCLLにおけるCAR T細胞と同様である(Liu et al, NEJM, 2020)。
有効性:
AML/MDSにおけるCAR T細胞の限定された有効性。
第1相治験におけるAMLに対するメモリー様NK細胞の強固な応答(Romee et al, STM, 2016)。
CARで武装したメモリー様NK細胞による骨髄芽細胞の二重ターゲティング(抗原発現がCARを誘発する一方、HLA喪失がNK細胞の直接細胞傷害性を誘発する)。
配列
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追加参考文献
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Figure 2023517063000024
均等物
当業者であれば、日常的な実験を超えるものは使用せずに、本明細書に記載した特定の物質および手技に対して数多くの均等物を認識しまたは確認することが可能である。そのような均等物は本発明の範囲内であると考えられ、以下の特許請求の範囲に網羅される。
参照による組み込み
本明細書で引用した特許、特許出願、および刊行物等の全ての参考文献の開示は、全体としてこれにより参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (149)

  1. 細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドを発現する、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様ヒトNK細胞または前記細胞の集団であって、前記細胞外結合ドメインが、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、操作されたNK細胞または前記細胞の集団。
  2. 前記細胞外結合ドメインが、(a)前記MHCクラスIタンパク質単独、および/または(b)前記MHCクラスIタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合せず、任意選択で、前記対照ペプチドがNY-ESO-1エピトープまたはインフルエンザウイルスM1エピトープである、請求項1に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  3. 前記NPM1cネオエピトープが、アミノ酸配列Xを含み、式中、XはA、V、LまたはIから選択され、XはA、T、S、V、L、I、MまたはQから選択され、XはQまたはNから選択され、XはDまたはEから選択され、XはL、I、V、M、AまたはFから選択され、XはC、S、またはAから選択され、XはL、I、V、M、A、またはFから選択され、XはA、V、LまたはIから選択され、XはL、I、V、MまたはAから選択される、請求項1または2に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  4. がAまたはVから選択され、XがV、I、またはLから選択され、XがQまたはNから選択され、XがDまたはEから選択され、XがLまたはIから選択され、XがCまたはSから選択され、XがV、LまたはIから選択され、XがAまたはVから選択され、XがV、I、またはLから選択される、請求項3に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  5. がAであり、XがV、I、またはLから選択され、XがQであり、XがDであり、XがLであり、XがCであり、XがLであり、XがAであり、XがV、I、またはLから選択される、請求項4に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  6. 前記NPM1cネオエピトープが、AIQDLCLAV(配列番号1)またはAIQDLCVAV(配列番号71)から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  7. 前記NPM1cネオエピトープが、CLAVEEVSL(配列番号72)、VEEVSLRK(配列番号73)、AVEEVSLR(配列番号74)、AVEEVSLRK(配列番号75)、CLAVEEVSLRK(配列番号76)から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  8. 前記ネオエピトープが、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  9. 前記ネオエピトープが、7、8、9、10、11、または12アミノ酸残基長である、請求項1~8のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  10. 前記MHCクラスIタンパク質が、HLA-A*02タンパク質であるか、またはHLA-A*02アレルグループによってコードされる、請求項1~9のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  11. 前記MHCクラスIタンパク質が、HLA-A*02:01アレルによってコードされる、請求項1~10のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  12. 前記細胞外ドメインが、
    (i)重鎖可変領域(VH)相補性決定領域(CDR)1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHであって、前記VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3は、配列番号5のアミノ酸配列を有するVHのCDRである、VH、ならびに/または
    (ii)軽鎖可変領域(VL)相補性決定領域(CDR)1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLであって、前記VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3は、配列番号3のアミノ酸配列を有するVLのCDRである、VL
    を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  13. 前記細胞外ドメインが、VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHを含み、前記VH CDR1がアミノ酸配列GFTFSSYA(配列番号9)を有し、前記VH CDR2がアミノ酸配列ISGSGGST(配列番号10)を有し、前記VH CDR3がアミノ酸配列ARLGYPTTTLLPFDY(配列番号11)を有する、請求項1~12のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  14. 前記細胞外ドメインが、VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLを含み、前記VL CDR1がアミノ酸配列QSISSY(配列番号6)を有し、前記VL CD2がアミノ酸配列AAS(配列番号7)を有し、前記VL CD3がアミノ酸配列QQSYSTPLT(配列番号8)を有する、請求項13に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  15. 前記細胞外ドメインがVHおよびVLを含み、前記VHが、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み、ならびに/または前記VLが、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  16. 前記細胞外ドメインがVHおよびVLを含み、前記VHが配列番号5のアミノ酸配列を含み、ならびに/または前記VLが配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  17. 前記細胞外ドメインがscFvを含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  18. 前記scFvがヒトscFvである、請求項17に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  19. 前記scFvがリンカーを含む、請求項17または18に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  20. 前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項19に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  21. 前記ペプチドリンカーがGly-Serリンカーである、請求項20に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  22. 前記Gly-Serリンカーが、(Gly4Ser)(配列番号58)、(Gly4Ser)2(配列番号59)、(Gly4Ser)3(配列番号60)、および(Gly4Ser)4(配列番号61)からなる群から選択される、請求項21に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  23. 前記Gly-Serリンカーが、アミノ酸配列SGSSGGSSSG(配列番号4)を含む、請求項21に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  24. 前記scFvが、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、または少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有し、任意選択で、前記scFvが、(a)VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHであって、前記VH CDR1はアミノ酸配列GFTFSSYA(配列番号9)を有し、前記VH CDR2はアミノ酸配列ISGSGGST(配列番号10)を有し、前記VH CDR3はアミノ酸配列ARLGYPTTTLLPFDY(配列番号11)を有する、VH;ならびに/または(b)VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLであって、前記VL CDR1はアミノ酸配列QSISSY(配列番号6)を有し、前記VL CD2はアミノ酸配列AAS(配列番号7)を有し、前記VL CD3はアミノ酸配列QQSYSTPLT(配列番号8)を有する、VLを含む、請求項17~23のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  25. 前記scFvが配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項17~24のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  26. 前記抗原ががん細胞の表面にある、請求項1~25のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  27. 前記がんが急性骨髄性白血病(AML)である、請求項26に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  28. 前記細胞外ドメインが、100nMもしくはそれ未満、50nMもしくはそれ未満、20nMもしくはそれ未満、10nMもしくはそれ未満、0.5nMから100nMまで、または1nMから15nMまでの平衡解離定数(Kd)で前記抗原に結合する、請求項1~27のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  29. 前記膜貫通ドメインが、CD3-ゼータ、CD8、CD28、DAP12、2B4、NKG2D、CD16、NKp44またはNKp46の膜貫通ドメインを含む、請求項1~28のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  30. 前記細胞内ドメインが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、2B4、DAP10、CD137およびDAP12からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の共刺激ドメインを含む、請求項1~29のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  31. 前記細胞内ドメインがCD3-ゼータシグナル伝達ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインを含み、前記膜貫通ドメインがCD8膜貫通ドメインを含み、前記CARポリペプチドがCD8ヒンジ領域をさらに含む、請求項1~30のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  32. 前記細胞内ドメインが、配列番号27に示されるアミノ酸配列を含むCD3-ゼータシグナル伝達ドメイン、および配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む4-1BB共刺激ドメインを含み、前記CARポリペプチドがCD8膜貫通ドメインおよびCD8ヒンジ領域を含み、前記CD8膜貫通ドメインおよびCD8ヒンジ領域が、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含み、前記細胞外結合ドメインが、前記抗体、またはその抗原結合断片、および配列番号23に示されるアミノ酸配列を含むリーディング配列を含む、請求項1~31のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  33. 前記細胞外結合ドメインが、配列番号24に示されるアミノ酸配列、または配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含むscFvである、請求項1~32のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  34. 前記細胞内ドメインが、自己切断性ペプチド配列およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ペプチドの切断により前記サイトカインが放出される、請求項1~33のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  35. 前記サイトカインが、IL-12、IL-7、IL-13、IL-15、TNF-α、IFN-γ、またはCCL19である、請求項34に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  36. 前記CARポリペプチドが、配列番号22に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む、請求項1~28のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  37. 前記操作されたNK細胞または細胞の集団が、初代ヒトNK細胞または初代ヒトNK細胞の集団の、以下のサイトカイン:IL-2、IL-12、IL-7、IL-15、IL-21、およびIL-18のうちの1つまたは複数への曝露後に活性化され、任意選択で、前記サイトカインが組換えヒトサイトカインである、請求項1~36のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  38. IL-12およびIL-15;IL-12およびIL-18;IL-15およびIL-18;またはIL-12、IL-15およびIL-18の組合せへの曝露後に活性化される、請求項37に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  39. 前記NK細胞または前記細胞の集団が、1~20ng/mLの濃度範囲にあるIL-12、1~50ng/mLの濃度範囲にあるIL-15および10~100ng/mLの濃度範囲にあるIL-18に曝露され、任意選択で、前記NK細胞または前記細胞の集団が、約10ng/mLのIL-12、約1ng/mLのIL-15、および約50ng/mLのIL-18に、約3~48時間、約7~24時間、約16~20時間、約12~24時間または約14~16時間の期間にわたり、任意選択で約16時間の期間にわたり曝露され、任意選択で、前記NK細胞または前記細胞の集団が、約10ng/mLのIL-12、約50ng/mLのIL-15、および約50ng/mLのIL-18に、約3~48時間、約7~24時間、約16~20時間、約12~24時間または約14~16時間の期間にわたり、任意選択で約16時間の期間にわたり曝露される、請求項37または38に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  40. 前記CARポリペプチドが、前記初代ヒトNK細胞または前記細胞の集団の、1つまたは複数のサイトカインへの曝露後に導入される、請求項37~39のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  41. (i)1つもしくは複数のサイトカインおよび/もしくは腫瘍標的の存在下で、対照ヒトNK細胞もしくはヒトNK細胞株に比して、産生するIFNγが増加している;
    (ii)対照ヒトNK細胞もしくはヒトNK細胞株に比して、抗体依存性細胞傷害が増強している;ならびに/または
    (iii)対照ヒトNK細胞もしくはヒトNK細胞株に比して、抗腫瘍効果が増強しており、
    任意選択で、前記対照NK細胞が、IL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞、またはIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である、請求項1~40のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  42. 以下のポリペプチド:CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、およびCD25のうちの1つまたは複数の発現が、前記NK細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトNK細胞またはヒトNK細胞株に比して増加しており、任意選択で、前記対照ヒトNK細胞がIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞であるか、または前記対照ヒトNK細胞株がIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である、請求項1~41のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  43. 以下のポリペプチド:KIR、CD57、NKG2C、DNAM-1およびCD137のうちの1つまたは複数が、前記NK細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトNK細胞またはヒトNK細胞株に比して相対的に不変であり、任意選択で、前記対照ヒトNK細胞がIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞であるか、または前記対照ヒトNK細胞株がIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である、請求項1~42のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  44. CD16および/またはCD11bの発現が、前記NK細胞または前記細胞の集団において、対照ヒトNK細胞またはヒトNK細胞株に比して減少しており、任意選択で、前記対照ヒトNK細胞がIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞であるか、または前記対照ヒトNK細胞株がIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である、請求項1~43のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  45. 前記NK細胞または前記細胞の集団が、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+である、請求項1~44のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  46. IL-15ポリペプチド、任意選択でヒトIL-15ポリペプチドを発現する、請求項1~45のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  47. 前記IL-15ポリペプチドが、分泌型IL-15ポリペプチドであるか、または膜結合型IL-15ポリペプチドである、請求項46に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  48. 前記膜結合型IL-15ポリペプチドが、IL-15と異種性膜貫通ドメインの融合物である、請求項47に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  49. in vivo投与後に1.5倍、2倍、3倍、または4倍に増大する、請求項1~48のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  50. in vivo投与後に、サイトカインに対する応答増強または活性化受容体の再刺激を示す、請求項1~49のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  51. 前記応答増強が、数週間から数か月間にわたり、任意選択で、2週間から3か月間までの期間、3週間から2か月間までの期間、または約1か月間にわたり維持される、請求項50に記載の操作されたNK細胞または細胞の集団。
  52. MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示する標的細胞と接触させた、前記操作されたNK細胞または前記細胞の集団が、
    (i)NK細胞の対照集団に比して、IFNγの発現増加を有し;
    (ii)NK細胞の対照集団に比して、グランザイムBの発現増加を有し;
    (iii)NK細胞の対照集団に比して、1つもしくは複数の活性化マーカーの発現増加を有し、ここで前記1つもしくは複数の活性化マーカーは、CD25、CD69、ICOS、CD226、CD107a、およびCD62Lから選択され;
    (iv)NK細胞の対照集団に比して、1つもしくは複数の活性化受容体の発現増加を有し、ここで前記1つもしくは複数の活性化受容体は、NKp30、NKG2D、NKp44から選択され;
    (v)NK細胞の対照集団に比して、1つもしくは複数の成熟マーカーの発現増加を有し、ここで前記1つもしくは複数の成熟マーカーは、CD56およびNKG2Aから選択され;
    (vi)NK細胞の対照集団に比して、CD57の発現減少を有し;
    (vii)NK細胞の対照集団に比して、TIGITの発現増加を有し;ならびに/または
    (viii)NK細胞の対照集団に比して、TRAILの発現減少を有し;
    任意選択で、NK細胞の前記対照集団が、サイトカイン誘導性ML NK細胞の非形質導入集団である、請求項1~51のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞または前記細胞の集団。
  53. 請求項1~52のいずれか一項に記載の操作された細胞または細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  54. 請求項1~52のいずれか一項に記載の操作された細胞または細胞の集団を作製するための方法であって、
    (i)初代ヒトNK細胞または前記細胞の集団を得るステップ;
    (ii)前記NK細胞または前記細胞の集団を、ある量のIL-12、IL-15、IL-18、またはそれらの任意の組合せと、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞または前記細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させるステップ;
    (iii)ステップ(ii)の前記NK細胞または前記細胞の集団を、前記CARポリペプチドをコードするレンチウイルスベクターと、NK細胞または前記細胞の集団に形質導入するための条件下で接触させるステップ;
    (iv)前記CARポリペプチドを発現する前記NK細胞または前記細胞の集団を単離するステップ;および
    (v)任意選択で、単離された前記細胞を増大させるステップ
    を含む方法。
  55. 前記初代ヒトNK細胞または前記細胞の集団が、iPSC、臍帯血、またはPBMCに由来する、請求項54に記載の方法。
  56. 前記初代ヒトNK細胞または前記細胞の集団が、自己性または同種性である、請求項54または55に記載の方法。
  57. ステップ(ii)における前記期間が、約12~16時間、任意選択で約14~16時間、任意選択で約16時間である、請求項54~56のいずれか一項に記載の方法。
  58. ステップ(iii)が、(iv)の前に約24~72時間の期間にわたり、前記NK細胞または前記細胞の集団を休ませることをさらに含む、請求項54~57のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記レンチウイルスベクターが、ヒヒエンベロープ糖タンパク質(BaEV-gp)シュードタイプ化レンチウイルスである、請求項54~58のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞または前記細胞の集団が、対照ヒトNK細胞もしくはNK細胞株に比して、増大したレベルでIFNγを産生し、任意選択で、前記対照ヒトNK細胞がIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞であるか、または前記対照ヒトNK細胞株がIL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である、請求項54~58のいずれか一項に記載の方法。
  61. 異種性ポリペプチドを発現する、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様(ML)NK細胞の集団を作製する方法であって、
    ASCT-2を発現するサイトカイン誘導性ML NK細胞の集団を、前記異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、前記集団に形質導入するための条件下で接触させるステップであって、
    前記シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ASCT-2に結合する糖タンパク質を含み、
    それによって、前記異種性ポリペプチドを発現する操作されたサイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団を作製する、ステップ
    を含む方法。
  62. 前記サイトカイン誘導性ML NK細胞が、初代ヒトNK細胞の集団から得られる、請求項61に記載の方法。
  63. 初代ヒトNK細胞の前記集団が、iPSC、臍帯血、またはPBMCに由来する、請求項61または62に記載の方法。
  64. 初代ヒトNK細胞の前記集団が、自己性または同種性である、請求項61~63のいずれか一項に記載の方法。
  65. ASCT-2の発現が、サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団において、ヒトNK細胞の対照集団に比して、約1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、または4倍に増加しており、任意選択で、ヒトNK細胞の前記対照集団がIL-15単独の存在下で活性化されている、請求項61~64のいずれか一項に記載の方法。
  66. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団が、IL-12、IL-18、およびIL-15への曝露によって予め活性化される、請求項61~65のいずれか一項に記載の方法。
  67. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団が、約8~24時間、任意選択で12~20時間、任意選択で約12~16時間、任意選択で約14~16時間、任意選択で約16時間の期間にわたり予め活性化される、請求項66に記載の方法。
  68. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団が、約10ng/mLのIL-12、約50ng/mLのIL-15、および約50ng/mLのIL-18への、約3~48時間、約7~24時間、約16~20時間、約12~24時間、約14~16時間、または約16時間の期間にわたる曝露によって予め活性化される、請求項61~65のいずれか一項に記載の方法。
  69. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団を、1つまたは複数のサイトカインへの前記曝露後、および接触の前に、ある期間にわたって休ませ、前記期間が約24~72時間である、請求項61~68のいずれか一項に記載の方法。
  70. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団の少なくとも約10%が形質導入される、請求項61~69のいずれか一項に記載の方法。
  71. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団の10~90%が形質導入され、任意選択で35~80%、任意選択で約40~60%、任意選択で約60%が形質導入される、請求項70に記載の方法。
  72. 異種性ポリペプチドを発現する、操作されたサイトカイン誘導性メモリー様(ML)NK細胞の集団を作製する方法であって、
    (i)初代ヒトNK細胞の集団を得るステップ;
    (ii)初代ヒトNK細胞の前記集団を、IL-12、IL-18、およびIL-15と、ASCT-2を発現するサイトカイン誘導性ML NK細胞の集団を得るのに十分な期間にわたり接触させるステップ;ならびに
    (iii)(ii)の前記集団を、前記異種性ポリペプチドをコードするシュードタイプ化レンチウイルスベクターと、サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団に形質導入するための条件下で接触させるステップであって、
    前記シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ASCT-2に結合する糖タンパク質を含み;
    それによって、前記異種性ポリペプチドを発現する、操作されたサイトカイン誘導性ML NK細胞の集団を作製する、ステップ
    を含む方法。
  73. 前記糖タンパク質が、レトロウイルス糖タンパク質である、請求項61~72のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記レトロウイルス糖タンパク質が、ヒヒエンベロープ(BaEV)糖タンパク質である、請求項73に記載の方法。
  75. 初代ヒトNK細胞の前記集団が、iPSC、臍帯血、またはPBMCに由来する、請求項72~74のいずれか一項に記載の方法。
  76. 初代ヒトNK細胞の前記集団が、自己性または同種性である、請求項72~75のいずれか一項に記載の方法。
  77. ステップ(ii)における前記期間が、約12~16時間、任意選択で約14~16時間、任意選択で約16時間である、請求項72~76のいずれか一項に記載の方法。
  78. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団が、
    (i)1つもしくは複数のサイトカインおよび/もしくは腫瘍標的の存在下で、対照ヒトNK細胞株に比して、産生するIFNγが増加している;
    (ii)対照ヒトNK細胞株に比して、抗体依存性細胞傷害が増強している;ならびに/または
    (iii)対照ヒトNK細胞株に比して、抗腫瘍効果が増強しており、
    任意選択で、前記対照ヒトNK細胞株が、IL-15単独の存在下で活性化されたヒトNK細胞株である、請求項61~77のいずれか一項に記載の方法。
  79. (iii)の結果として形質導入される、サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の前記集団の割合が、少なくとも10%である、請求項72~78のいずれか一項に記載の方法。
  80. サイトカイン誘導性メモリー様NK細胞の前記集団の10~90%が形質導入され、任意選択で約35~80%、任意選択で約40~60%、任意選択で約60%が形質導入される、請求項79に記載の方法。
  81. 以下のポリペプチド:CD94/NKG2A、NKp30、NKp44、NKG2D、およびCD25のうちの1つまたは複数の発現が、サイトカイン誘導性NK細胞の前記集団において、対照ヒトNK細胞株に比して増加している、請求項61~80のいずれか一項に記載の方法。
  82. 以下のポリペプチド:KIR、CD57、NKG2C、DNAM-1およびCD137のうちの1つまたは複数が、サイトカイン誘導性NK細胞の前記集団において、対照ヒトNK細胞株に比して相対的に不変である、請求項61~81のいずれか一項に記載の方法。
  83. CD16および/またはCD11bの発現が、サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団において、対照ヒトNK細胞株に比して減少している、請求項61~82のいずれか一項に記載の方法。
  84. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団の多数が、CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+である、請求項61~83のいずれか一項に記載の方法。
  85. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団が、in vivo投与後に1.5倍、2倍、3倍、または4倍に増大する、請求項61~84のいずれか一項に記載の方法。
  86. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団が、in vivo投与後に、サイトカインに対する応答増強または活性化受容体の再刺激を示す、請求項61~85のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記応答増強が、数週間から数か月間にわたり、任意選択で、2週間から3か月間までの期間、3週間から2か月間までの期間、または約1か月間にわたり維持される、請求項61~86のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記シュードタイプ化レンチウイルスベクターが、IL-15ポリペプチド、任意選択でヒトIL-15ポリペプチドをさらにコードする、請求項61~87のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記IL-15ポリペプチドが、分泌型IL-15ポリペプチドであるか、または膜結合型IL-15ポリペプチドである、請求項88に記載の方法。
  90. 前記膜結合型IL-15ポリペプチドが、異種性膜貫通ドメイン、任意選択でCD8膜貫通ドメインと融合している、請求項88または89に記載の方法。
  91. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団の増大が、前記IL-15ポリペプチドを伴わない形質導入を受けた対照ML NK集団に比して、前記形質導入の後に1.5倍、2倍、3倍、または4倍への増加である、請求項88~90のいずれか一項に記載の方法。
  92. サイトカイン誘導性ML NK細胞の前記集団を単離するステップ;および任意選択で、前記細胞集団を増大させるステップをさらに含む、請求項61~91のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記異種性ポリペプチドがCARである、請求項61~92のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記CARが、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含み、前記細胞外結合ドメインが、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、請求項93に記載の方法。
  95. 前記細胞外結合ドメインが、(a)前記MHCクラスIタンパク質単独、および/または(b)前記MHCクラスIタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合せず、任意選択で、前記対照ペプチドがNY-ESO-1エピトープまたはインフルエンザウイルスM1エピトープである、請求項94に記載の方法。
  96. 前記NPM1cネオエピトープが、アミノ酸配列Xを含み、式中、XはA、V、LまたはIから選択され、XはA、T、S、V、L、I、MまたはQから選択され、XはQまたはNから選択され、XはDまたはEから選択され、XはL、I、V、M、AまたはFから選択され、XはC、S、またはAから選択され、XはL、I、V、M、A、またはFから選択され、XはA、V、LまたはIから選択され、XはL、I、V、MまたはAから選択される、請求項94または95に記載の方法。
  97. がAまたはVから選択され、XがV、I、またはLから選択され、XはQまたはNから選択され、XはDまたはEから選択され、XがLまたはIから選択され、XがCまたはSから選択され、XがV、LまたはIから選択され、XがAまたはVから選択され、XがV、I、またはLから選択される、請求項96に記載の方法。
  98. がAであり、XがV、I、またはLから選択され、XがQであり、XがDであり、XがLであり、XがCであり、XがLであり、XがAであり、XがV、I、またはLから選択される、請求項97に記載の方法。
  99. 前記NPM1cネオエピトープが、AIQDLCLAV(配列番号1)またはAIQDLCVAV(配列番号71)から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項94~98のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記NPM1cネオエピトープが、CLAVEEVSL(配列番号72)、VEEVSLRK(配列番号73)、AVEEVSLR(配列番号74)、AVEEVSLRK(配列番号75)、CLAVEEVSLRK(配列番号76)から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項94または95に記載の方法。
  101. 前記ネオエピトープが、アミノ酸配列AIQDLCLAV(配列番号1)を含む、請求項94~99のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記ネオエピトープが、7、8、9、10、11、または12アミノ酸残基長である、請求項94~101のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記MHCクラスIタンパク質が、HLA-A*02タンパク質であるか、またはHLA-A*02アレルグループによってコードされる、請求項94~102のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記MHCクラスIタンパク質が、HLA-A*02:01アレルによってコードされる、請求項94~103のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記細胞外ドメインが、
    (i)重鎖可変領域(VH)相補性決定領域(CDR)1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHであって、前記VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3は、配列番号5のアミノ酸配列を有するVHのCDRである、VH、ならびに/または
    (ii)軽鎖可変領域(VL)相補性決定領域(CDR)1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLであって、前記VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3は、配列番号3のアミノ酸配列を有するVLのCDRである、VL
    を含む、請求項94~104のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記細胞外ドメインが、VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHを含み、前記VH CDR1がアミノ酸配列GFTFSSYA(配列番号9)を有し、前記VH CDR2がアミノ酸配列ISGSGGST(配列番号10)を有し、前記VH CDR3がアミノ酸配列ARLGYPTTTLLPFDY(配列番号11)を有する、請求項94~105のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記細胞外ドメインが、VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLを含み、前記VL CDR1がアミノ酸配列QSISSY(配列番号6)を有し、前記VL CD2がアミノ酸配列AAS(配列番号7)を有し、前記VL CD3がアミノ酸配列QQSYSTPLT(配列番号8)を有する、請求項106に記載の方法。
  108. 前記細胞外ドメインがVHおよびVLを含み、前記VHが、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、または少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含み、ならびに/または前記VLが、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90%同一な、または少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む、請求項94~107のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記細胞外ドメインがVHおよびVLを含み、前記VHが配列番号5のアミノ酸配列を含み、ならびに/または前記VLが配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項94~108のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記細胞外ドメインがscFvを含む、請求項94~109のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記scFvがヒトscFvである、請求項110に記載の方法。
  112. 前記scFvがリンカーを含む、請求項110または112に記載の方法。
  113. 前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項112に記載の方法。
  114. 前記ペプチドリンカーがGly-Serリンカーである、請求項113に記載の方法。
  115. 前記Gly-Serリンカーが、(Gly4Ser)(配列番号58)、(Gly4Ser)2(配列番号59)、(Gly4Ser)3(配列番号60)、および(Gly4Ser)4(配列番号61)からなる群から選択される、請求項114に記載の方法。
  116. 前記Gly-Serリンカーが、アミノ酸配列SGSSGGSSSG(配列番号4)を含む、請求項115に記載の方法。
  117. 前記scFvが、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、または少なくとも95%同一なアミノ酸配列を有し、任意選択で、前記scFvが:(a)VH CDR1、VH CDR2およびVH CDR3を含むVHであって、前記VH CDR1はアミノ酸配列GFTFSSYA(配列番号9)を有し、前記VH CDR2はアミノ酸配列ISGSGGST(配列番号10)を有し、前記VH CDR3はアミノ酸配列ARLGYPTTTLLPFDY(配列番号11)を有する、VH;ならびに/または(b)VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3を含むVLであって、前記VL CDR1はアミノ酸配列QSISSY(配列番号6)を有し、前記VL CD2はアミノ酸配列AAS(配列番号7)を有し、前記VL CD3はアミノ酸配列QQSYSTPLT(配列番号8)を有する、VLを含む、請求項111~116のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記scFvが配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項111~117のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記抗原ががん細胞の表面にある、請求項94~118のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記がんが急性骨髄性白血病(AML)である、請求項119に記載の方法。
  121. 前記細胞外ドメインが、100nMもしくはそれ未満、50nMもしくはそれ未満、20nMもしくはそれ未満、10nMもしくはそれ未満、0.5nMから100nMまで、または1nMから15nMまでの平衡解離定数(Kd)で前記抗原に結合する、請求項94~120のいずれか一項に記載の方法。
  122. 前記膜貫通ドメインが、CD3-ゼータ、CD8、CD28、DAP12、2B4、NKG2D、CD16、NKp44またはNKp46の膜貫通ドメインを含む、請求項94~121のいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記細胞内ドメインが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、2B4、DAP10、CD137およびDAP12からなる群から選択される1つまたは複数の共刺激分子の1つまたは複数の共刺激ドメインを含む、請求項94~122のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記細胞内ドメインがCD3-ゼータシグナル伝達ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインを含み、前記膜貫通ドメインがCD8膜貫通ドメインを含み、前記CARポリペプチドがCD8ヒンジ領域をさらに含む、請求項94~123のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記細胞内ドメインが、配列番号27に示されるアミノ酸配列を含むCD3-ゼータシグナル伝達ドメイン、および配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む4-1BB共刺激ドメインを含み、前記CARポリペプチドがCD8膜貫通ドメインおよびCD8ヒンジ領域を含み、前記CD8膜貫通ドメインおよび前記CD8ヒンジ領域が、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含み、前記細胞外結合ドメインが、前記抗体、またはその抗原結合断片、および配列番号23に示されるアミノ酸配列を含むリーディング配列を含む、請求項94~124のいずれか一項に記載の方法。
  126. 前記細胞外結合ドメインが、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含むscFvである、請求項94~125のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記CARポリペプチドが、配列番号22に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む、請求項94~121のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記細胞内ドメインが、自己切断性ペプチド配列およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ペプチドの切断により前記サイトカインが放出される、請求項94~126のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記サイトカインが、IL-12、IL-7、IL-13、IL-15、TNF-α、IFN-γ、またはCCL19である、請求項128に記載の方法。
  130. 前記サイトカインがIL-15ポリペプチドである、請求項128または129に記載の方法。
  131. 前記IL-15ポリペプチドが発現後に分泌される、請求項130に記載の方法。
  132. 前記CARポリペプチドが、配列番号102に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号102のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む、請求項130または131に記載の方法。
  133. 前記IL-15ポリペプチドが異種性膜貫通ドメインと融合しており、任意選択で前記異種性膜貫通ドメインがCD8膜貫通ドメインである、請求項130に記載の方法。
  134. 前記IL-15ポリペプチドが、膜結合型IL-15ポリペプチドとして発現される、請求項133に記載の方法。
  135. 前記CARポリペプチドが、配列番号100に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号100のアミノ酸配列と少なくとも70%同一な、少なくとも75%同一な、少なくとも80%同一な、少なくとも85%同一な、少なくとも90%同一な、もしくは少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含む、請求項133または134に記載の方法。
  136. クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含むCARを発現する、操作されたサイトカイン誘導性ML NK細胞の集団であって、請求項94~135のいずれか一項に記載の方法に従って調製される集団。
  137. MHCクラスIタンパク質と複合体を形成した前記NPM1cネオエピトープを提示する標的細胞の存在下で、
    (i)IFNγの発現増加を有し;
    (ii)NK細胞の対照集団に比して、グランザイムBの発現増加を有し;
    (iii)NK細胞の対照集団に比して、1つまたは複数の活性化マーカーの発現増加を有し、ここで前記1つまたは複数の活性化マーカーは、CD25、CD107a、CD69、ICOS、CD226、およびCD62Lから選択され;
    (iv)NK細胞の対照集団に比して、1つまたは複数の活性化受容体の発現増加を有し、ここで前記1つまたは複数の活性化受容体は、NKp30、NKG2D、NKp44から選択され;
    (v)NK細胞の対照集団に比して、1つまたは複数の成熟マーカーの発現増加を有し、ここで前記1つまたは複数の成熟マーカーは、CD56およびNKG2Aから選択され;
    (vi)NK細胞の対照集団に比して、CD57の発現減少を有し;
    (vii)NK細胞の対照集団に比して、TIGITの発現増加を有し;ならびに/または
    (viii)NK細胞の対照集団に比して、TRAILの発現減少を有し;
    任意選択で、NK細胞の前記対照集団が、サイトカイン誘導性ML NK細胞の非形質導入集団である、請求項136に記載の操作されたML NK細胞の集団。
  138. がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、前記がんを含む細胞の細胞表面が、クラスI主要組織適合複合体(MHCクラスI)タンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示しており、請求項1~52のいずれか一項に記載の操作された細胞もしくは細胞の集団、請求項136もしくは137に記載の操作されたML NK細胞の集団、または請求項53に記載の医薬組成物を、前記がんを治療するのに十分な量で前記対象に投与するステップを含む方法。
  139. 前記がんがAMLである、請求項138に記載の方法。
  140. がんを治療する前記方法が、がんの量を減少させる方法、または対象における生存期間を延長させる方法である、請求項138または139に記載の方法。
  141. AMLの治療を必要とする対象においてAMLを治療する方法であって、請求項1~52のいずれか一項に記載の操作された細胞もしくは細胞の集団、請求項136もしくは137に記載の操作されたML NK細胞の集団、または請求項53に記載の医薬組成物を、AMLを治療するのに十分な量で前記対象に投与するステップを含む方法。
  142. 前記AMLが、再発性AMLまたは難治性AMLである、請求項138~141のいずれか一項に記載の方法。
  143. AMLから寛解している対象においてAMLの再発を予防する方法であって、請求項1~52のいずれか一項に記載の操作された細胞もしくは細胞の集団、請求項136もしくは137に記載の操作されたML NK細胞の集団、または請求項53に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
  144. 前記投与のステップの前に、前記対象がNPM1cを発現するか否か、または前記対象がNPM1遺伝子におけるNPM1c変異を有するか否かを検出し、前記対象がNPM1cを発現するかまたはNPM1c変異を有する場合、前記投与のステップに進むステップを含む、請求項138~143のいずれか一項に記載の方法。
  145. 前記操作された細胞または細胞の集団が、in vivo投与後に増大の増強を示す、請求項138~144のいずれか一項に記載の方法。
  146. 1つまたは複数の追加の治療薬または手順を投与するステップをさらに含む、請求項138~145のいずれか一項に記載の方法。
  147. 対象におけるがんを治療するための医薬の製造における、請求項1~52のいずれか一項に記載の操作された細胞もしくは細胞の集団、請求項136もしくは137に記載の操作されたML NK細胞の集団、または請求項53に記載の医薬組成物の使用であって、前記がんを含む細胞の細胞表面が、MHCクラスIタンパク質と複合体を形成したNPM1cネオエピトープを提示し;任意選択で、前記使用が、1つまたは複数の追加の治療薬または手順と組み合わされたものである、使用。
  148. 前記対象がヒトである、請求項138~146のいずれか一項に記載の方法、または請求項147に記載の使用。
  149. (i)請求項1~52のいずれか一項に記載の操作された細胞もしくは細胞の集団、請求項136もしくは137に記載の操作されたML NK細胞の集団、または請求項53に記載の医薬組成物;(ii)任意選択で、1つまたは複数の追加の治療薬、および(iii)対象におけるがんの治療に使用するための説明書を含む1つまたは複数の容器を含むキット。
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