CN103635486B - Hla限制性、肽特异性的抗原结合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有类似TCR互补位（即对HLA‑A2限制性肽特异的抗原结合区）的抗原结合蛋白。所述抗原结合蛋白包括各种形式的抗体，包括全长抗体、实质上保持原样的抗体、Fab片段、F(ab')2片段和单链Fv片段。本发明还涉及抗原结合区对各种肽分别具有特异性的融合蛋白，所述融合蛋白例如具有免疫球蛋白或T细胞受体结构域的scFv融合蛋白。此外，本发明还涉及免疫偶联物，其可包含其上连接有放射性同位素、荧光或其他可检测到的标记物的抗体、细胞毒素或其他分子。其中，免疫偶联物可用于运送药物以产生治疗效果或有利于免疫效应器功能。

Description

HLA限制性、肽特异性的抗原结合蛋白

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2011年2月11日提交的名为“HLA-A2限制性、肽特异性单克隆抗体和嵌合抗原受体的制备和用途（GENERATION AND USE OF HLA-A2 RESTRICTED,PEPTIDE-SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS）”的美国临时申请No.61/463,082的优先权。这里以引用的方式将该临时申请的全部内容并入本文。

序列表

本申请包括于2012年2月2日创建的序列表；所述文件为ASCII格式，名为3314019AWO_seqlisting_ST25.txt（序列表），并且大小为47.8kb。这里以引用的方式将该文件的全部内容并入本申请。

技术领域

本发明主要涉及与免疫功能有关的抗原结合蛋白分子。更具体而言，本发明涉及对HLA限制性肽具有特异性的重组抗体、嵌合抗原受体及其片段，其中所述肽来源于目的细胞蛋白或目的病毒蛋白。

背景技术

在过去的十年中，适应性T细胞免疫治疗（adoptive T cell immunotherapy）的进展已经为癌症患者提供了若干有希望的选择。基于T细胞的癌症免疫治疗源于这样的研究：该研究显示出在手术样本和患者预后中的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的数量增加的相关性。通常认为，TIL的浸润表示抗肿瘤机制被激活，并且该浸润是通过肿瘤相关抗原在MHC环境中的表达介导的。这些发现最终导致研究人员试图将抗原特异性T细胞用于癌症治疗。

对于细胞毒性T细胞（CTL）应答的诱导，胞内蛋白通常被蛋白酶体或核内体/溶酶体降解，并且所得肽片段结合至MHC I类分子或MHC II类分子上。这些肽-MHC复合体呈现在细胞表面，它们通过肽-MHC（pMHC）-T细胞受体（TCR）相互作用为T细胞识别提供靶标。接种来源于细胞蛋白质或病毒蛋白质的肽可以诱导HLA-A0201-限制性细胞毒性CD8T细胞，该细胞能够杀死肿瘤细胞或被病毒感染的细胞。

抗体越来越多地被用作对抗癌症、自身免疫性疾病和感染的治疗剂。已经基于治疗抗体的多种作用机制开发了治疗抗体，所述机制包括：1)裸抗体（naked antibodies）通过ADCC或CDC直接杀死肿瘤细胞（例如曲妥珠单抗）；2)阻断或刺激细胞膜分子以诱导细胞死亡（例如西妥昔单抗）；3)中和分泌的部分（例如贝伐珠单抗）；4)通过例如药物、毒素和放射性同位素等附加部分进行杀伤；以及5)通过T细胞效应器功能调节免疫系统。

在几乎所有情况下，为了产生疗效，抗体需要具有关键的性质，包括对其目标抗原的高亲和性、最小的急性和长期副作用、以及在具体应用中对人Fc受体的高亲和性(4)。另外，目标抗原需要在肿瘤中而非正常组织中高水平地表达（特异性或选择性），在患者之间和患者体内的特定肿瘤中表达一致（低异质性），并且应当对癌症细胞的存活而言必不可少，并且不能被下调。

为了实现这些属性，研究人员目前能够重新构建现有抗体以使它们免疫原性降低，修饰Fc区域的蛋白质和碳水化合物残基以增强ADCC和CDC，减小它们的大小以便可能更好的进行肿瘤侵入，突变可变区以改善亲和性，改变抗体化合价以提高活动性，以及构建新的抗体融合蛋白，例如用于多步靶向的抗体融合蛋白(5)以及通过嵌合抗原受体（CAR）而用于重新定向免疫细胞的抗体融合蛋白。此外，在目前已认可的抗体中，研究人员继续确定了能够取得成功的结构属性和宿主特性(6)。

为了消除或中和病原体或疾病靶标（包括细菌、病毒或肿瘤靶标），抗原特异性的、基于抗体的治疗特别引人注目，因为抗体具有高度特异性。

发明内容

因此，本发明基于确定抗原特异性结合序列，可以产生一系列抗原结合蛋白，例如对抗原特异的抗体，所述抗原表现为蛋白质片段（肽）与HLA分子的复合体，其与通常被T细胞受体识别然后进行抗原加工并将蛋白质呈递至T细胞的抗原相似。使用噬菌体展示来选择能够用于构建本发明的抗原结合蛋白的最初的抗原结合分子，本发明的抗原结合蛋白包括抗体和嵌合抗原受体（CAR）。

因此，在一个方面，本发明涉及一种分离的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，包含下列之一：

(A)抗原结合区，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:2、5、8、10、13、14、17、20中的一者；

(B)抗原结合区，其包含V_H和V_L，V_H和V_L分别具有选自以下的氨基酸序列SEQ IDNO:22和23；24和25；26和27；28和29；30和31；32和33；34和35；以及36和37；或者

(C)(i)以下三种轻链（LC）互补决定区（CDR）：

(a)LC CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:56；以及

(b)LC CDR2和CDR3，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:57和64、58和65、59和66、60和67、61和68、61和69、62和70、以及63和71；以及

(ii)以下三种重链（HC）CDR：

(a)HC CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38；以及

(b)LC CDR2和CDR3，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:40和48、41和49、42和50、43和51、44和52、45和53、46和54、以及47和55中的一者。

在一个相关的方面，本发明涉及一种分离的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述分离的抗原结合蛋白为抗体或嵌合抗原受体。所述抗体为全长抗体、实质上保持原样的抗体、Fab片段、F(ab')₂片段或单链可变区片段（scFv）。

在所述分离的抗原结合蛋白中，无论是抗体还是CAR，所述抗原结合区均特异地结合至HLA-肽复合体的表位上。

作为HLA-肽复合体的一部分被本发明的抗原结合蛋白识别的肽包括但不限于：具有氨基酸序列RMFPNAPYL（SEQ ID NO:1）的肽；具有氨基酸序列LLDFVRFMGV（SEQ ID NO:4）的肽；具有氨基酸序列RLTRFLSRV（SEQ ID NO:7）的肽；具有氨基酸序列RIITSTILV（SEQ IDNO:12）的肽；以及具有氨基酸序列LLEEMFLTV（SEQ ID NO:19）的肽。在一些实施方案中，所述肽与HLA-A2抗原结合而被识别。

在又一个方面，本发明的分离的抗原结合蛋白为scFv，其包含选自由SEQ ID NO:2、5、8、10、13、14、17和20构成的组中的氨基酸序列。

在一个相关的方面，所述分离的抗原结合蛋白为融合蛋白，其包含表1至8中任一者所公开的抗原结合区。

在另一个方面，本发明涉及包含第一组分的免疫偶联物，所述第一组分为本发明公开的抗原结合蛋白或其抗原结合片段。所述免疫偶联物包含第二组分，所述第二组分为细胞毒素、可检测的标记、放射性同位素、治疗剂、结合蛋白或具有第二氨基酸序列的分子。当第二组分为结合蛋白或第二抗体时，该结合蛋白或第二抗体对不同于HLA-肽复合体的靶标具有结合特异性。

因此，在一个相关的方面，本发明涉及双特异性抗体，所述双特异性抗体包含本文中所述的抗原结合蛋白或其功能性片段。

附图说明

图1示出了分别来源于EBNA3C scFv克隆315、335、327和345的细菌上清与各种HLA-A2-肽复合体的结合(A)以及纯化的EBNA克隆315scFv与各种HLA-A2-肽复合体的结合(B)，表明克隆315对HLA-A2-LLDFVRFMGV复合体是高度特异的。

图2示出了分别来源于WT-1scFv克隆42、43和45的细菌上清与各种HLA-A2-肽复合体的结合(A)以及纯化的WT-1克隆45scFv与各种HLA-A2-肽复合体的结合(B)，表明WT-1克隆42、43和45对重组HLA-A2-RMFPNAPYL复合体是高度特异的。

图3示出了在用LLDFVRFMGV或另一（不相关）肽脉冲或未脉冲的TAP-缺陷（TAP^-）T2细胞中能够检测到HLA-A2(A)，但EBNA克隆315scFv识别了用LLDFVRFMGV脉冲的T2细胞，而不识别未脉冲的细胞或用不相关肽脉冲的细胞(B)，检测下限约为78nM(C)。

图4示出了在用肽RMFPNAPYL或肽LLDFVRFMGV脉冲或未脉冲的TAP-缺陷（TAP^-）T2细胞中可检测到HLA-A2(A)，但是WT-1克隆45scFv识别用RMFPNAPYL脉冲的T2细胞，而不识别未脉冲或用LLDFVRFMGV脉冲的细胞(B)。

图5示出了当用肽LLDFVRFMGV（中间）或肽KLQCVDLHV（右侧）孵育DIMT BLCL(A)和6268A BLCL(B)并用EBNA克隆315scFv染色时，仅用LLDFVRFMGV脉冲的HLA-A2⁺DIMT肽能被染色，这表明EBNA克隆315和LLDFVRFMGV是HLA-A2限制性的；时程（底部）示出了HLA-A2-LLDFVRFMGV复合体在细胞表面是稳定的。

图6示出了在PCR中所用的Tomlinson文库载体在WT1克隆45scFv和EBNA克隆315scFv序列的两端加上了适当的限制性酶位点（图6A）。图6B示出了在用NheI和ApaI消化后，经消化的PCR产物出现在1%琼脂糖凝胶上。

图7示出了用于产生scFv-Fc融合蛋白用的表达载体（图7B）的全长IgG表达载体（图7A）。A.专有的IgG表达载体（11381bp）的结构。该载体在两个分开的CMV启动子下表达重链和轻链。可变重链（V_H）与第一、第二和第三恒定重链（CH_1,2,3）融合并且在一个启动子下表达，而可变轻链（V_L）与恒定轻链（C_L）融合并且在不同的启动子下表达。该载体被进一步修饰为缺乏重链的第一恒定区（CH₁），并且该载体用于构建scFv-Fc融合蛋白。B.使用NheI和ApaI从IgG载体上切除V_H后，将预消化的、纯化的scFv PCR产物连接至IgG载体，以使与CH_2,3结构域（Fc）融合的scFv表达。

图8示出了使用EBNA克隆315scFv-Fc进行结合研究的结果，其中当在包被有或未包被HLA-A2-LLDFVRFMGV的ELISA板上进行结合检测时（图8A），以及在用肽LLDFVRFMGV脉冲或不用肽脉冲的T2细胞中进行结合检测时（图8B），显示出纯化的EBNA克隆315scFv-Fc能保持其对重组复合体的结合能力。当用浓度减少的肽LLDFVRFMGV孵育T2细胞，然后用EBNA克隆315scFv-Fc染色时，证实了检测下限与scFv在同一范围内（200nM-20nM）（图8C）。

图9示出了使用表面等离子体共振进行的EBNA克隆315对HLA-A2-LLDFVRFMGV的动力学检测结果。

图10示出了使用荧光偶联EBNA克隆315scFv-Fc在T2细胞上对HLA-A2-LLDFVRFMGV复合体定量的结果（图10A）。在37℃下，在不含血清的IMDM培养基中，检测荧光偶联的EBNA克隆315scFv-Fc与用肽LLDFVRFMGV脉冲（20、10或5μM）或不用肽LLDFVRFMGV脉冲（0μM）的T2细胞的结合，持续5小时。除了含有已知量的抗人IgG₁抗体的珠子之外，所述细胞是用scFv-Fc染色的，并且所述细胞的荧光强度与珠子的荧光强度以及它们的结合位点的数量有关。使用这四种肽浓度以及相应量的复合体，建立了标准曲线，R²值为0.9948。图B示出了肽和复合体光谱下端的近视图。

图11示出了当检测纯化的WT1克隆45scFv-Fc与用HLA-A2-RMFPNAPYL包被或未包被的ELISA板的结合时，结合和特异性研究的结果（图11A）。图11B示出了当检测纯化的WT1克隆45scFv-Fc与用肽RMFPNAPYL（40μM）或肽RLTRFLSRV（40μM）脉冲的T2细胞的结合时，scFv-Fc（空心）只能识别RMFPNAPYL脉冲的T2细胞。

图12示出了当DIMT BLCL（上）和6268A BLCL（下）与RMFPNAPYL（右侧）孵育，并且肽-脉冲的BLCL用WT1克隆315scFv-Fc（空心）染色或是用对照scFv（实心）染色时，仅HLA-A2-阳性RMFPNAPYL肽脉冲的DIMT BLCL能被染色。

图13示出了LLDFVRFMGV肽-脉冲的细胞的EBNA克隆315scFv-Fc介导的ADCC（利用⁵¹Cr的释放进行测量）。

图14示出了含有IRES-GFP序列并且具有氨苄青霉素抗性的基于MSCV的载体（左侧），其用于在NK92MI细胞中转导和表达抗-EBNA CAR。A.将EBNA克隆315scFv序列克隆到CAR基因（EBNACAR）中，并且进一步克隆到基于MSCV的载体（左侧）中，该基于MSCV的载体含有IRES-GFP序列并且具有氨苄青霉素抗性。所得CAR（右侧）由位于细胞外表面的scFv和铰链区、跨膜结构域、以及位于细胞内的4-1BB和CD3ζ链构成。B.在使用293T GP2细胞进行逆转录病毒包装并转导到NK92MI细胞中后，相比于空转导（空逆转录病毒）NK92MI细胞（左侧；实心），大约24%的NK92MI细胞含有基于GFP表达的构建体（左侧，空心）。在GFP阳性细胞中，对前20%进行流式细胞分选，并扩增得到稳定转导的细胞群，其具有大于90%的GFP阳性（右侧）。在三个独立的情况下完成逆转录病毒转导，24%具有最高效率。

图15示出了对WT1克隆45CAR载体进行的EcoRI和XhoI消化验证。A.从8个不同的细菌菌落中分离的质粒在连接、转化、以及EcoRI和XhoI消化后，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，并且进行序列验证。根据λHindIII分子标记和100bp分子标记，确定条带为正确的大小（～1500bp和～6000bp）。B.所得WT1克隆45CAR载体的结构与原始St.Jude CAR载体有相同的组分，唯一不同在于scFv序列。

图16示出了表达克隆315CAR的NK92MI细胞可以通过CD107a的表达来特异性地检测肽-脉冲的T2细胞上的HLA-A2-EBNA3C复合体。用20μM的肽LLDFVRFMGV或肽YMFPNAPYL脉冲或者不用肽脉冲T2细胞。然后在37℃下，在含有抗CD107a-PE偶联抗体的培养基中，在存在或不存在肽脉冲的或未脉冲的细胞的情况下，培养具有CAR的NK92MI细胞5小时。A.根据GFP荧光筛选（gate）具有CAR的NK92MI细胞，并且分析CD107a的表达。在不存在任何T2细胞的情况下培养的NK92MI细胞、或者与未脉冲的细胞以及YMFPNAPYL-脉冲的T2细胞共培养的NK92MI细胞是非反应性的，而与LLDFVRFMGV-脉冲的T2细胞共培养的NK92MI细胞导致CD107a的表达与背景水平相比增加27%。B.T2细胞用浓度降低的LLDFVRFMGV脉冲，然后与具有CAR的NK92MI细胞共培养。NK92MI细胞将显著量的CD107a呈递到细胞表面，即使当T2细胞仅用10nM肽脉冲时也是如此。

图17示出了流式细胞仪的结果，其中HLA-A2⁺（DIMT）BLCL和HLA-A2^-（6268A）BLCL用LLDFVRFMGV脉冲，然后在含有抗CD107a-PE偶联抗体的培养基中，在存在或不存在肽脉冲或未脉冲细胞的情况下，培养具有CAR的NK92MI细胞。根据GFP荧光筛选具有CAR的NK92MI细胞并分析CD107a的表达。在不存在任何BLCL的情况下培养的NK92MI细胞、或与LLDFVRFMGV-脉冲的6268A BLCL共培养的NK92MI细胞是非反应性的，而与未脉冲的DIMT BLCL或与LLDFVRFMGV-脉冲的DIMT BLCL共培养的NK92MI细胞导致CD107a的表达与背景水平（脉冲的6268A）相比增加0.5%和25%，这表明表达EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞能够通过CD107a的表达在肽脉冲的BLCL上特异地检测到HLA-A2-EBNA3C复合体。

图18示出了⁵¹Cr释放检验的结果，其中T2细胞用浓度降低的LLDFVRFMGV脉冲，或不用其脉冲。将具有CAR的NK92MI细胞与⁵¹Cr-标记的T2细胞以3:1的E:T比共培养，表明表达EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞能够在肽脉冲的T2细胞上特异地检测到HLA-A2-EBNA3C复合体。即使使用2nM的肽，与未脉冲的T2细胞相比，也可以观察到肽特异的细胞毒性。

图19示出了表达EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞能够通过⁵¹Cr释放在肽脉冲的BLCL上特异地检测到HLA-A2-EBNA3C复合体。BLCL用LLDFVRFMGV脉冲。然后将具有CAR的NK92MI细胞与⁵¹Cr标记的靶细胞一起培养。A.具有CAR的NK92MI细胞能够特异性地区分肽脉冲的DIMT BLCL和肽脉冲的6268A BLCL，这两个不同的靶标之间在细胞毒性方面有显著差异。B.肽脉冲的DIMT BLCL的CAR-介导的杀伤可以用E:T比为20:1的EBNA克隆315scFv-Fc融合蛋白来阻断，但是不能用不相关的同种型相配的scFv-Fc来阻断。

图20示出了⁵¹Cr释放检验的结果，其中将具有CAR的NK92MI细胞与⁵¹Cr标记的未脉冲的BLCL一起培养。A.在不存在任何外源肽的情况下进行共培养时，具有CAR的NK92MI细胞对HLA-A2⁺DIMT BLCL和HLA-A2⁺JG19BLCL的活性比对LA-A2^-6268ABLCL和LA-A2^-GKO BLCL的反应性高。B.未脉冲DIMT BLCL的CAR-介导的杀伤可以用E:T比为10:1的EBNA克隆315scFv-Fc融合蛋白来阻断，但是不能用不相关的同种型相配的scFv-Fc来阻断，这表明表达EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞可以特异地检测到HLA-A2⁺BLCL上的HLA-A2-EBNA3C复合体。

图21示出了EBNA的⁵¹Cr释放检验的结果，其中表达CD16(V)的NK92MI细胞与⁵¹Cr标记的LLDFVRFMGV-脉冲的DIMT BLCL、以及EBNA克隆315或不相关的scFv-Fc一起培养。在15:1的E:T比下，EBNA克隆315scFv-Fc能够杀死30-35%的靶细胞。

图22示出了EBNA的⁵¹Cr释放检验的结果，其中表达克隆315CAR的NK92MI细胞与如上所述的LLDFVRFMGV-脉冲的DIMTBLCL、以及EBNA克隆315或不相关的scFv-Fc一起培养。在与图21相同的E:T比下，具有CAR的细胞能够杀死80-90%的靶细胞，并且使用EBNA克隆scFv-Fc具有特异的抑制作用，这表明CAR介导的杀伤比scFv-Fc-介导的ADCC对肽脉冲的DIMTBLCL更有效。

图23示出了含有IRES-GFP序列并且具有氨苄青霉素抗性的基于MSCV的载体（左侧）被用于在NK92MI细胞中转导和表达抗WT1CAR。A.将WT1克隆45scFv序列克隆到CAR基因（抗WT1CAR）中，并且进一步克隆到基于MSCV的载体中。所得CAR（右侧）由位于细胞外表面的scFv和铰链区、跨膜结构域、以及位于细胞内的4-1BB和CD3ζ链构成。B.使用293T GP2细胞进行逆转录病毒包装并转导入NK92MI细胞中之后，根据GFP的表达，相比于空转导（空逆转录病毒）NK92MI细胞（左侧；实心），大约27.5%的NK92MI细胞含有构建体（左侧，空心）。在GFP阳性细胞中，对前20%进行流式细胞分选，并扩增得到GFP阳性大于98%的稳定转导的细胞群（右侧）。

图24示出了⁵¹Cr释放检验的结果，其中具有CAR的NK92MI细胞能够特异性地区分肽脉冲的DIMT BLCL(■)和肽脉冲的6268ABLCL(●)，这两个不同靶标之间在细胞毒性方面有显著差异，这表明表达WT1克隆45CAR的NK92MI细胞能够特异地检测到肽脉冲的BLCL上的HLA-A2-RMFPNAPYL复合体。

图25示出了肽脉冲的DIMT BLCL的CAR-介导的杀伤可以用E:T比为9:1的市售抗HLA-A2抗体（5μg/ml）来阻断，但是不能用不相关的同种型相配的抗体（5μg/ml）来阻断。

图26示出了表达WT1克隆45CAR的NK92MI细胞能够通过⁵¹Cr的释放特异地检测到DIMT BLCL上的HLA-A2-RMFPNAPYL复合体。A.具有CAR的NK92MI细胞能够特异性地区分DIMTBLCL和6268A BLCL，这两个不同靶标之间在细胞毒性方面有显著差异。B.DIMT BLCL的CAR-介导的杀伤可以用E:T比为2:1的WT1克隆45scFv-Fc融合蛋白（20μg/ml）来阻断，但是不能用不相关的同种型相配的scFv-Fc来阻断。

图27示出了表达WT1克隆45CAR的NK92MI细胞能够通过⁵¹Cr的释放特异地检测到肽脉冲的BLCL上的HLA-A2-RMFPNAPYL复合体。具有CAR的NK92MI细胞能够特异性地区分肽脉冲的DIMTBLCL和肽脉冲的6268A BLCL，这两个不同靶标之间在细胞毒性方面有显著差异。

图28示出了表达WT1克隆45CAR的NK92MI细胞能够通过⁵¹Cr的释放特异地检测到697细胞和OVCAR-3细胞上的HLA-A2-RMFPNAPYL复合体。

具体实施方式

本文所述的所有专利、出版物、申请和其他引用文献均通过引用的方式并入本文中。

在本发明的实践中，使用了分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学中的本技术领域中的许多常规技术。这些技术在以下文献中详细描述，例如：J.F.Sambrook和D.W.Russell编著的Molecular Cloning:a Laboratory Manual第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press2001；Melvyn Little编著的RecombinantAntibodies for Immunotherapy,Cambridge University Press2009；"OligonucleotideSynthesis"(M.J.Gait编著，1984年)；"Animal Cell Culture"(R.I.Freshney编著，1987年)；"Methods in Enzymology"(Academic Press 公司)；"Current Protocols inMolecular Biology"(F.M.Ausubel等编著，1987年,定期更新)；"PCR:The PolymeraseChain Reaction",(Mullis等编著，1994年)；"A Practical Guide to MolecularCloning"(Perbal Bernard V.,1988年)；"Phage Display:A Laboratory Manual"(Barbas等，2001年)。这些参考文献的内容以及包括本领域技术人员众所周知且以此为参照的标准实验方案的其他参考文献（包括制造商说明书）的内容通过引用的方式并入作为本公开的一部分。

本申请中普遍使用以下缩略词：

ADCC：抗体依赖性细胞毒性

ALL：急性淋巴细胞白血病

AML：急性髓细胞性白血病

APC：抗原呈递细胞

β2M：β2-微球蛋白

BiTE：双特异性T细胞参与性抗体（Bi-specific T cell engaging antibody）

BLCL：EBV-转化的B淋巴母细胞细胞系

CAR：嵌合抗原受体

CDC：补体依赖的细胞毒性

CMC：补体介导的细胞毒性

CDR：互补决定区（也可参见下文中的HVR）

C_L：轻链恒定区

CH₁：重链的第一恒定区

CH_1,2,3：重链的第一、第二和第三恒定区

CH_2,3：重链的第二和第三恒定区

CHO：中国仓鼠卵巢

CTL：细胞毒性T细胞

EBNA3C：爱普斯坦-巴尔病毒（EB病毒）核抗原3C

EBV：爱普斯坦-巴尔病毒

ECMV：脑心肌炎病毒

ER：内质网

E:T Ratio：效靶比

Fab：抗体结合片段

FACS：流式细胞分选

FBS：胎牛血清

GFP：绿色荧光蛋白

HC：重链

HEL：鸡卵溶菌酶

HLA：人白细胞抗原

HVR-H：高变区-重链（也可参见CDR）

HVR-L：高变区-轻链

Ig：免疫球蛋白

IPTG：异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷

IRES：内部核糖体进入位点

K_D：解离常数

k_off：解离速率

k_on：结合速率

MHC：主要组织相容性复合体

OPD：邻苯二胺

PEG：聚乙二醇

scFv：单链可变区片段

SPR：表面等离子体共振

TB：极品肉汤

TCE：T细胞表位

TCR：T细胞受体

TIL：肿瘤浸润淋巴细胞

V_H：重链可变区

V_L：轻链可变区

WT1：肾母细胞瘤蛋白1

在下文中，术语的使用将遵循特定的惯例。通常，应当理解本文所用的术语与本领域技术人员所知的术语的含义是一致的。

“抗原结合蛋白”是含有抗原结合区或抗原结合部分的蛋白质或多肽，即，对其结合的另一分子具有强亲和性。抗原结合蛋白包括抗体、抗原受体和融合蛋白。

“抗体”是本领域已知的术语，其是指在免疫系统环境中产生的抗原结合蛋白。本文所用的术语“抗体”包括完整的全长抗体、以及其保留有“抗原结合部分”或“抗原结合区”的任意片段，或是其单链。天然产生的“抗体”是至少含有之间通过二硫键连接的两条重（H）链和两条轻（L）链的球蛋白。每条重链由重链可变区（简写为V_H）和重链恒定区构成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3这三个结构域构成。每条轻链由轻链可变区（简写为V_L）和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域C_L构成。V_H和V_L区还可进一步细分为被称为互补决定区（CDR）的高变区，其中间隔分布有较为保守的被称为骨架区（FR）的区域。每个V_H和每个V_L由以如下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞（即效应细胞）以及经典补体系统的第一组分（C1q）。

本文所用的有关抗体的术语“抗原结合部分”或“抗原结合区”（或简称“抗原部分”）是指抗体的提供抗原特异性的区域或部分；抗原结合蛋白例如抗体的片段包括抗体的保留与抗原（例如HLA-肽复合体）特异性结合能力的一个或多个片段。已经证明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。有关抗体的术语“抗体片段”所包括的抗原结合片段的例子包括Fab片段，构成V_L、V_H、C_L和CH1结构域的单价片段；F(ab)₂片段，包含由位于铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由V_H和CH1结构域构成的Fd片段；由抗体的单条臂上的V_L和V_H结构域构成的Fv片段；由V_H结构域构成的dAb片段（参见文献“Wardet al.,1989Nature341:544-546”）；以及分离出来的互补决定区（CDR）。

此外，虽然Fv片段的两个结构域V_L和V_H是由两个分开的基因编码的，但它们能够利用重组方法通过合成连接物来连接，这使它们能够成为其中V_L区和V_H区配合形成单价分子的单条蛋白质链（称为单链Fv(scFv)）；参见例如文献“Bird et al.,1988Science 242:423-426”；和文献“Huston et al.,1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883”）。这样的单链抗体也应当包含在有关抗体的术语“抗原结合部分”中。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规方法获得的，并且按照与保持原样的抗体相同的方式筛选有效的片段。

“分离的抗体”或“分离的抗原结合蛋白”是已经被鉴定并且从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体或抗原结合蛋白。

通常，MHC-肽复合体只可以被T细胞受体（TCR）识别，这限制了使用基于T细胞的读出检验（readout assay）来检测目标表位的能力。在本公开中，描述了具有基于scFv的抗原结合区的抗原结合蛋白（包括抗体和嵌合抗原受体），所述scFv是使用重组HLA-肽复合体从人scFv噬菌体展示文库中选择出来的。这些分子表现出了精确的特异性，例如，如分别只识别HLA-A2-LLDFVRFMGV复合体和HLA-A2-RMFPNAPYL复合体的抗EBNA抗原结合蛋白和抗WT1抗原结合蛋白所示出的那样。另外，这些分子除了不能与含有其他肽的HLA-复合体结合以外，它们也不能与这些肽本身结合，这进一步表明了它们的类似TCR的特异性。

首先测试本公开的通过噬菌体展示选择的scFv与HLA-阳性细胞表面所存在的肽结合的能力。在肽的存在下培养T2细胞和BLCL后，利用流式细胞术得知细胞能够选择性识别它们。在一种肽LLDFVRFMGV（SEQ ID NO:）的情况下，即使是在脉冲后24小时，也能够在BLCL的表面上检测到所述肽与HLA形成的复合体，这进一步表明了这些抗体的有效性。

在一些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包括具有与重链的第二和第三恒定区（CH_2,3）（形成人免疫球蛋白的底部第三Fc区）融合的scFv序列从而形成二价蛋白的抗体及其片段，这提高了抗体的整体亲和性和稳定性。此外，Fc部分使得其他分子（包括但不限于荧光染料、细胞毒素、放射性同位素等）能够与抗体直接偶联以（例如）用于抗原定量研究、固定抗体以利用表面等离子体共振（SPR）进行亲和性测定、治疗剂的定位输送、利用表达CD16的免疫效应细胞检测Fc-介导的细胞毒性、以及许多其他应用。

通过ELISA和肽脉冲APC来检测纯化的scFv-Fc融合蛋白与它们的靶T细胞表位（TCE）的结合。一旦确认了它们能够保持其特异性，便使用EBNA克隆315这一分子来确定亲和性。证明了该分子能够通过1:1的相互作用与其靶TCE结合，该亲和性是通常的TCR-MHC-肽复合体相互作用的10至100倍。

证明了APC的肽脉冲与抗原密度具有相关性。与定量珠子结合的荧光偶联的scFv-Fc使得能够估计将细胞与不同浓度的肽一起孵育时所形成的复合体的数量。利用该信息，通过流式细胞术，能够估计scFv和scFv-Fc融合蛋白的灵敏度为大约100个复合体。

最后，检测了融合蛋白的Fc部分是否能够保持其效应器功能。利用本发明的scFv实施方案、CD16(V)-转导的NK92MI细胞和肽脉冲的靶细胞，证明了所述抗体通过ADCC保持了其Fc-介导的效应器功能。

本文示出的结果突出了本发明的抗原结合蛋白针对MHC-肽复合体的特异性、灵敏度和有效性。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及能识别来自于胞内蛋白或病毒蛋白的肽/蛋白质片段与MHC I类分子形成的复合体（例如，可出现在细胞表面以被T细胞识别的复合体）的重组抗原结合分子和其一部分。

本发明的分子基于利用噬菌体展示技术鉴定和选择单链可变区片段（scFv），其氨基酸序列为目标MHC限制性肽提供分子特异性，并且构成了本公开所述的所有抗原结合蛋白的基础。因此，scFv可以用于设计“抗体”分子的各种排列，包括（例如）全长抗体；其片段，例如Fab和F(ab')₂；迷你抗体；融合蛋白，包括scFv-Fc融合蛋白；多价抗体，即对相同抗原或不同抗原具有多于一种特异性的抗体，例如双特异性T细胞参与性抗体（BiTe）、三聚体（tribodies）等（参见文献“Cuesta et al.,Multivalent antibodies:when design surpasses evolution.Trends in Biotechnology28:355-3622010”）。

在抗原结合蛋白为全长抗体的一个实施方案中，本发明的抗体的重链和轻链可以是全长的（例如，抗体可以包含至少一条完整的（优选两条）重链以及至少一条（优选两条）完整的轻链）或者可以包含抗原结合部分（Fab、F(ab')₂、Fv或单链Fv片段（“scFv”））。在其他实施方案中，抗体的重链恒定区选自（例如）IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE。在一些实施方案中，免疫球蛋白同种型选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别地选自IgG1（例如人IgG1）。根据所设计的抗体引发的免疫效应器功能来选择抗体类型。

在重组免疫球蛋白的构建中，各种免疫球蛋白同种型的恒定区的合适的氨基酸序列以及制备各种抗体的方法是本领域技术人员已知的。

在一些实施方案中，改变（例如突变）了抗体的恒定区以改变该抗体的性质（例如提高或降低以下的一种或多种：Fc受体结合性、抗体糖化（例如糖基化或岩藻糖基化）、半胱氨酸残基的数目、效应器细胞功能、或补体功能）。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白为抗WT1/HLA-A2抗体或其片段，其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的抗原结合区，并且特异地结合与HLA-A2偶联的具有氨基酸序列RMFPNAPYL（SEQ ID NO:1）的肽。在其他实施方案中，抗WT-1抗体为具有选自表1的VH区和VL区或CDR的scFv-Fc融合蛋白或全长人IgG。

表1.

在另一个实施方案中，抗原结合蛋白为抗EBNA3C抗体或其片段，其具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的抗原结合区，并且特异地结合与HLA-A2偶联的具有氨基酸序列LLDFVRFMGV（SEQ ID NO:4）的肽。在其他实施方案中，抗EBNA3C抗体为具有选自表2的VH区和VL区或CDR的scFv-Fc融合蛋白或全长人IgG

表2

在又一个实施方案中，抗原结合蛋白为抗CCND1抗体或其片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10之一，并且特异地结合与HLA-A2偶联的具有氨基酸序列RLTRFLSRV（SEQ ID NO:7）的肽。在其他实施方案中，抗CCND1抗体为具有选自表3和表4的VH区和VL区或CDR的scFv-Fc融合蛋白或全长人IgG。

表3

表4

在又一个实施方案中，抗原结合蛋白为抗HUD抗体或其片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13、14和17之一，并且具有特异地结合与HLA-A2偶联的具有氨基酸序列RIITSTILV（SEQ ID NO:12）的肽的抗原结合区。在其他实施方案中，抗HUD抗体为具有选自表5至7的VH区和VL区或CDR的scFv-Fc融合蛋白或全长人IgG。表5

表6

表7

在又一个实施方案中，抗原结合蛋白为抗cdr2抗体或其片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20，并且特异地结合与HLA-A2偶联的具有氨基酸序列LLEEMFLTV（SEQ ID NO:19）的肽。在其他实施方案中，抗cdr2抗体为具有选自表8的VH区和VL区或CDR的scFv-Fc融合蛋白或全长人IgG。

表8

根据表1至8，本公开的抗原结合蛋白的实施方案包括但不限于以下：

抗WT-1抗体，其结合HLA限制性肽RMFPNAPYL（SEQ ID NO:1），所述抗体包含：(i)HVR-L1序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO:56），(ii)HVR-L2序列SASQLQS（SEQ ID NO:57），(iii)HVR-L3序列QQGPGTPNT（SEQ ID NO:64），(iv)HVR-H1序列SYAMS（SEQ ID NO:38），(v)HVR-H2序列QIDPWGQETLYADSVKG（SEQ ID NO:40），以及(vi)HVR-H3序列LTGRFDY（SEQ ID NO:48）；

抗EBNA3C抗体，其结合HLA-A2限制性肽LLDFVRFMGV（SEQ ID NO:4），所述抗体包含：(i)HVR-L1序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO:56），(ii)HVR-L2序列LASNLQS（SEQ ID NO:58），(iii)HVR-L3序列QQAEYMPLT（SEQ ID NO:65），(iv)HVR-H1序列GYAMS（SEQ ID NO:39），(v)HVR-H2序列EIAPPGLNTRYADSVKG（SEQ ID NO:41），以及(vi)HVR-H3序列SDTAFDY（SEQ IDNO:49）；

抗CCND1抗体，其结合HLA-A2限制性肽RLTRFLSRV（SEQ ID NO:7），所述抗体包含：(i)HVR-L1序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO:56），(ii)HVR-L2序列YASYLQS（SEQ ID NO:59），(iii)HVR-L3序列QQSSSSPDT（SEQ ID NO:66），(iv)HVR-H1序列SYAMS（SEQ ID NO:38），(v)HVR-H2序列TISDSDATDYADSVKG（SEQ ID NO:42），以及(vi)HVR-H3序列TTDYFDY（SEQ ID NO:50）；

抗CCND1抗体，其结合HLA-A2限制性肽RLTRFLSRV（SEQ ID NO:7），所述抗体包含：(i)HVR-L1序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO:56），(ii)HVR-L2序列AASALQS（SEQ ID NO:60），(iii)HVR-L3序列QQGTDSPAT（SEQ ID NO:67），(iv)HVR-H1序列SYAMS（SEQ ID NO:38），(v)HVR-H2序列DISDDGDATYYADSVKG（SEQ ID NO:43），以及(vi)HVR-H3序列SSTTFDY（SEQ IDNO:51）；

抗HUD抗体，其结合HLA-A2限制性肽RIITSTILV（SEQ ID NO:12），所述抗体包含：(i)HVR-L1序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO:56），(ii)HVR-L2序列DASTLQS（SEQ ID NO:61），(iii)HVR-L3序列QQTDSYPTT（SEQ ID NO:68），(iv)HVR-H1序列SYAMS（SEQ ID NO:38），(v)HVR-H2序列DIASTGYYTDYADSVKG（SEQ ID NO:44），以及(vi)HVR-H3序列NNASFDY（SEQ IDNO:52）；

抗HUD抗体，其结合HLA-A2限制性肽RIITSTILV（SEQ ID NO:12），所述抗体包含：(i)HVR-L1序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO:56），(ii)HVR-L2序列DASTLQS（SEQ ID NO:61），(iii)HVR-L3序列QQDDAYPTT（SEQ ID NO:69），(iv)HVR-H1序列SYAMS（SEQ ID NO:38），(v)HVR-H2序列SISSSGYYTDYADSVKG（SEQ ID NO:45），以及(vi)HVR-H3序列SASSFDY（SEQ IDNO:53）；

抗HUD抗体，其结合HLA-A2限制性肽RIITSTILV（SEQ ID NO:12），所述抗体包含：(i)HVR-L1序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO:56），(ii)HVR-L2序列AASYLQS（SEQ ID NO:62），(iii)HVR-L3序列QQDNNYPTT（SEQ ID NO:70），(iv)HVR-H1序列SYAMS（SEQ ID NO:38），(v)HVR-H2序列SISSDGSYTDYADSVKG（SEQ ID NO:46），以及(vi)HVR-H3序列STDAFDY（SEQ IDNO:54）；以及

抗cdr2抗体，其结合HLA-A2限制性肽LLEEMFLTV（SEQ ID NO:19），所述抗体包含：(i)HVR-L1序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO:56），(ii)HVR-L2序列GASGLQS（SEQ ID NO:63），(iii)HVR-L3序列QQSANAPTT（SEQ ID NO:71），(iv)HVR-H1序列SYAMS（SEQ ID NO:38），(v)HVR-H2序列TINYSGSGTTYADSVKG（SEQ ID NO:47），以及(vi)HVR-H3序列NAAYFDY（SEQ IDNO:55）。

实施例-一般步骤

实施例1：生物素化的MHC-肽复合体的制备

通过在大肠杆菌（E.coli）中过表达HLA-A2重链（HC）和β2微球蛋白（β₂M）作为重组蛋白，然后在高浓度的特异性肽(35,36)的存在下在体外进行重新折叠和组装，生成了可溶性MHC I类/肽复合体。为了获得可溶性MHC/肽复合体，将HC序列诱变以除去胞质区和跨膜区。为了特异性地将重新折叠的单体MHC/肽复合体生物素化，以在C端含有特异的生物素化位点的融合蛋白的形式表达HC(37,38)。这些短序列足以使得可利用生物素蛋白连接酶BirA对该序列内的单个赖氨酸残基进行酶催化的体外生物素化(39)。该步骤由MSKCCTetramer Core Facility进行。

实施例2：生物素化的MHC-肽复合体的噬菌体筛选

实施例2.1：HLA-A2/EBNA3C(EBNA)复合体的噬菌体筛选

根据之前已公开的方法(22)，稍加改变，对含有大约2.85×10⁸个独立的scFv克隆的Tomlinson I+J人scFv噬菌体展示文库(40)进行筛选。首先在1ml PBS中，将来自于两个文库的组合的7.5×10¹²个噬菌体与链霉亲和素顺磁Dynabead磁珠（30μl；Dynal,Oslo,Norway）和150μg未生物素化的HLA-A2-YVDPVITSI(SEQ ID NO:)（不相关的复合体）进行预孵育，以除去所有表达可结合链霉亲素或HLA-A2通用框架的抗体的噬菌体。

然后使用磁铁捕获dynabead磁珠，并将上清（噬菌体与不相关的复合体的混合物）转移到另一个管中并在室温下孵育1小时，所述管中含有7.5μg生物素化的HLA-A2-LLDFVRFMGV（来源于EB病毒EBNA3C）和7.5μg生物素化的HLA-A2-NLVPMVATV（来源于巨细胞病毒（Cytomedullovirus）pp65）。然后将最终的混合物（1ml）加入到200μl的Dynabead（与2%的牛奶一起预孵育并用PBS洗涤）中，在室温下连续旋转以混合内容物15分钟。然后用PBS/0.1%Tween清洗珠子10次，并用PBS清洗3次，然后在室温下用含1mg/ml胰蛋白酶的PBS（0.5ml）将结合的噬菌体从Dynabead上洗脱下来，持续15分钟。

然后在37℃下，在20ml LB培养基中，使用所述噬菌体感染TG1大肠杆菌（E.coli）（对数期生长）1小时。然后向混合物中加入10¹²个KM13辅助噬菌体，再孵育另外的30分钟，通过离心（3000rpm，10分钟）使细胞成团。将得到的细胞团在200ml LB+氨苄青霉素（100μg/ml）+卡那霉素（50μg/ml）中重悬，在30℃下孵育过夜。

第二天早上，以3000rpm离心所述过夜培养物15分钟，在冰上将上清（180ml）与聚乙二醇（PEG）混合1小时，从而使扩增的上一轮筛选的噬菌体沉淀。然后将PEG/噬菌体混合物以3000rpm离心20分钟，所得噬菌体团的一部分用于后续筛选，而剩余部分在15%甘油中在-80℃下冷冻。使用与上述相同的实验方案进行后续筛选，其中Dynabead洗涤步骤增加，并且用于筛选的生物素化的复合体的量降低。

在最后一轮抗体筛选之后（第三或第四轮），洗脱的噬菌体用于感染TG1和HB2151大肠杆菌（E.coli）；如上所述将TG1细胞过夜培养，而将HB2151细胞接种在TYE+氨苄青霉素（100μg/ml）琼脂平板上。第二天早上，挑取琼脂平板上的单菌落，并接种在每孔中含有400μl LB+氨苄青霉素（100μg/ml）的48孔板的各孔中。在37℃下孵育3至6小时后，向每孔中加入200μl50%的甘油溶液，将所述板储存在-80℃下以作为单克隆储藏培养物。

实施例2.2：HLA-A2-RMFPNAPYL(WT-1)复合体的噬菌体筛选

以与上述方法类似的方法进行筛选，其中有略微的改变。首先在1ml PBS中，将来自于两个文库的组合的3.7×10¹²个噬菌体与链霉亲和素顺磁Dynabead磁珠（50μl；Dynal,Oslo,Norway）和20μg未生物素化的HLA-A2-NLVPMVATV（不相关复合体）进行预孵育，从而除去链霉亲和素和HLA-A2结合子。然后使用磁铁捕获dynabead，并将上清（噬菌体与不相关的复合体的混合物）转移到另一个管中并在室温下孵育1小时，所述管中含有5μg生物素化的HLA-A2-RMFPNAPYL（来源于WT1）。然后将最终的混合物（1ml）加入到100μl的Dynabead（与2%牛奶一起预孵育并用PBS洗涤）中，在室温下连续旋转以混合内容物30分钟。然后用PBS/0.1%Tween清洗珠子10次，并用PBS清洗3次，然后用含1mg/ml胰蛋白酶的PBS（0.5ml）在室温下将结合的噬菌体从Dynabead上洗脱下来，持续20分钟。所有后续步骤如上文所述进行。

实施例3：从HB2151中表达和纯化可溶性scFv

利用无菌吸管头将含有HB2151单克隆的单克隆甘油储藏物接种到另一个每孔中含有400μl LB+氨苄青霉素（100μg/ml）的48孔板中，做两个板的重复。然后，将该48孔培养板在37℃下孵育，直到大部分孔的OD600达到0.4。然后向每孔中加入200μl LB+氨苄青霉素（100μg/ml）+异丙基-1-硫化-β-D-吡喃半乳糖苷（IPTG；终浓度1mM）来诱导产生scFv，并且将板在28℃下进一步孵育过夜。第二天早上，所述板以3000rpm的速率离心15分钟，上清用于scFv的筛选。

对于大规模表达和纯化，将单克隆甘油储藏物接种在3ml的极品肉汤（TB）中，并在37℃下孵育直至OD600达到0.8。然后将每3ml培养物分到4个烧瓶中，每个烧瓶含有250mlTB+氨苄青霉素（100μg/ml）。然后在37℃下孵育所述培养物直至OD600达到0.4-0.5，之后加入IPTG使其终浓度为0.5mM，并在30℃下孵育培养物过夜。第二天早上，过夜培养物以4000rpm离心25分钟。丢弃上清，并将团块溶于50ml PBS+10mM咪唑中。使细胞悬液通过细胞均质器（5000磅/平方英寸），所得细胞裂解液在12,000rpm下离心15分钟。然后使上清通过预先铺有硅藻土的0.22μm过滤器，通过离心（100rpm，5分钟）将所得过滤物装载入VivapuremaxiprepMC镍亲和柱（Sartorius Stedim Biotech,欧巴涅,法国）。然后用10ml PBS+30mM咪唑洗涤柱子4次（500rpm，3分钟），使用20ml PBS+300mM咪唑洗脱scFv（500rpm，3分钟）。使用10,000分子量截留膜Vivaspin离心管（Sartorius Stedim Biotech）以3000rpm的速率离心30分钟以浓缩洗脱的scFv，并用常规PBS透析。然后将最终的scFv产物储存在-80℃下。

实施例4：构建scFv-Fc融合蛋白并在DG44CHO细胞中表达

使用专有抗体表达载体（这里称为IgG载体，与pFUSE—hIgG1-Fc1（InvivoGen；加利佛尼亚州圣地亚哥市）类似），首先改变构建体使其含有人IgG₁的CH₂和CH₃结构域（scFv-Fc载体）。然后，对EBNA克隆315和WT1克隆45scFv序列进行PCR扩增，从而使其包含能与scFv-Fc载体兼容的所需的NheI和ApaI限制位点。使用上述酶消化所得的scFv PCR产物和抗体表达质粒（对于NheI，37℃，2小时；对于ApaI，25℃，2小时），然后连接在一起。然后将连接产物转化到大肠杆菌（E.coli）中，接种在TYE+氨苄青霉素（100μg/ml）上，挑取菌落并由MSKCC Sequencing Core Facility对它们中的质粒进行测序。一旦确认这些序列在人IgG₁CH₂和CH₃结构域上游具有正确的scFv序列，便使用Program U-030和100μl溶液V将DNA（5-6μg）电穿孔入5×10⁶个DG44中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（Invitrogen公司）中。然后在OptiCHO培养基（Invitrogen公司）中以每毫升培养基1-5×10⁶个DG44的细胞密度培养所述细胞，OptiCHO培养基中含有G418（500μg/ml；电穿孔7天后加入）。然后将细胞扩增到700ml的培养基中，离心除去细胞，上清用于抗体纯化。

实施例5：可溶性scFv-Fc融合蛋白的表达和纯化

使用KappaSelect亲合层析介质（GE Healthcare）对含有可溶性scFv-Fc融合蛋白的DG44上清进行纯化。首先，将1.5ml KappaSelect树脂装载到柱子上并用20ml PBS活化。使用蠕动泵，以大约1ml/分钟的流速将上清装载到柱上。然后用40ml的PBS洗涤柱子，直到流过式装置（flow-thru）记录到OD280小于0.05。然后用10ml柠檬酸盐缓冲液（pH2.0）从树脂上洗脱scFv-Fc融合蛋白，并且将该融合蛋白直接置于10ml的1M Tris中以进行中和。然后使用50,000MWCOVivaspin离心管（Sartorius Stedim）浓缩洗脱的scFv-Fc，并且利用ELISA和Biacore T100（GE Healthcare）检测其结合重组抗原的能力，并使用流式细胞仪检测T2细胞表面上的天然存在的肽。

实施例6：使用细胞噬菌体克隆以及纯化的scFv和scFv-Fc进行单克隆ELISA

将乙烯基平底微量滴定板（Thermo Fisher）用于ELISA检验。首先，在4℃下用BSA-生物素（10μg/ml；50μl/孔）包被板过夜。第二天早上，丢弃内容物，并在室温下用链霉亲和素（10μg/ml；50μl/孔）孵育板1小时。丢弃内容物并在室温下用重组的生物素化的HLA-A2-肽复合体（5μg/ml；50μl/孔）孵育板1小时。然后在室温下用2%牛奶（150μl/孔）孵育板1小时。封闭后，用PBS洗涤板2次，然后在室温下与HB2151培养板相应孔中的细菌上清、纯化的scFv或纯化的scFv-Fc一起孵育1小时。丢弃内容物，用PBS洗涤板5次，然后在室温下与鼠抗myc标签抗体（Clone9E10；Sigma Aldrich.0.5μg/ml；溶于0.5%牛奶，100μl/孔）孵育1小时以检测scFv，或是在室温下与山羊抗人HRP（Jackson免疫研究实验室.0.5μg/ml；溶于0.5%牛奶，100μl/孔）孵育1小时以检测scFv-Fc。丢弃内容物，用PBS洗涤板5次，接受scFv的那些再用山羊抗鼠HRP（Jackson免疫研究实验室.0.5μg/ml；溶于0.5%牛奶，100μl/孔）在室温下孵育1小时，而接受scFv-Fc的那些用邻苯二胺（OPD）缓冲液（150μl/孔）显影，所述邻苯二胺缓冲液是将20mg溶于40ml柠檬酸盐磷酸盐缓冲液的OPD片与40μl30%过氧化氢合并制得的。通过向每孔中加入30μl的5N硫酸来停止颜色反应，并使用Dynex MRX ELISA酶标仪在490nm下读板。最后，丢弃scFv板中的内容物，用PBS洗涤板5次，并根据上述方法显影。

实施例7：细胞系和肽

将Tap-缺陷型HLA-A2⁺T2细胞、6268A、GKO（均为HLA-A2^-）、DIMT和JG19（均为HLA-A2⁺）B淋巴母细胞细胞系（BLCL）用于抗原呈递研究。细胞在RPMI1640+10%胎牛血清（FBS）中进行常规培养。对于抗原呈递，收集T2细胞并转移到不含血清的IMDM+10μg/mlβ2-微球蛋白（β2M）中。然后，在37℃下，在20μM或更低浓度的LLDFVRFMGV-肽（来源于EBNA3C）或任何量的不相关肽的存在下，培养T2细胞5小时。按照与T2细胞相同的方式对BLCL进行研究，在培养基中吸留有β₂M。对DIMT BLCL的脉冲追踪实验是通过以下方法完成的：首先在37℃下，在不含血清的IMDM中用20μMLLDFVRFMGV对BLCL脉冲5小时。然后细胞用新鲜RPMI1640+10%FBS洗涤，并转移回该培养基中，并在37℃下再培养5小时和24小时，然后在每个时间点使用EBNA克隆315scFv进行流式细胞仪分析。

实施例8：结合动力学分析

使用BIAcore T100（GE Biosciences），通过表面等离子体共振进行动力学测定。简言之，将CM5芯片（GE Biosciences）的前两个流动池用溶于HBS-EP电泳缓冲液（HBS-EPrunning buffer）（0.01MHEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005%Tween20）的标准胺偶联试剂活化，其中使用10mM乙酸盐（pH5）使流动池2固定化有纯化的EBNA克隆315scFv-Fc融合蛋白。然后，以20μl/分钟的速率将目标HLA-A2-肽单体（222nM-13.875nM）注入第一（参照）和第二流动池，持续120秒，然后加入电泳缓冲液，持续另外的180秒内。使用BIAcoreT100Evaluation Software2.0和1:1结合模型（local Rmax）确定动力学的值。

实施例9：流式细胞分析

将肽脉冲的T2细胞和将肽脉冲的BLCL转移到塑料聚苯乙烯圆底管（BectonDickinson Labware）中并用PBS洗涤。然后在冰上将所述细胞与5μg作为靶标纯化的或非特异性纯化的scFv或scFv-Fc一起孵育40分钟。所述细胞用PBS洗涤，然后与1μg生物素化的鼠抗myc抗体（Clone9E10；Sigma Aldrich）或生物素化的特异性鼠抗人IgG Fc（Jackson免疫研究实验室）在冰上孵育30分钟。所述细胞用PBS洗涤，然后与链霉亲和素-PE（BDBiosciences）一起孵育。最后，用PBS再洗涤所述细胞一次，在BD FACS Calibur上分析。

对于CD107a细胞毒性检验，在37℃下，在200μl完全α-基本培养基（12.5%马血清和12.5%FBS）（Invitrogen公司）+10-15μl抗CD107a-PE中，将转导的NK92MI细胞和靶标T2细胞以1:1的效靶（E:T）比（分别为2.5-5.0×10⁵个细胞）共培养5小时。然后细胞混合物用PBS洗涤，并在BD FACS Calibur上分析。

对于FACS分选实验，根据MSKCC Flow Cytometry facility的指导，使用BD Aria流式细胞仪基于GFP强度分选逆转录病毒转导的NK92MI细胞。

实施例10：对肽脉冲的T2细胞上的HLA-A2-LLDFVRFMGV复合体进行定量

对于MHC-肽复合体定量，首先使用APEX Alexa Fluor647抗体标记试剂盒（Invitrogen公司），将EBNA克隆315scFv-Fc直接与AlexaFluor647偶联。所述试剂盒产生了大约10-20μg的标记抗体。

对于定量，在我们实验室的Hong-fen Guo的技术帮助下，使用了Quantum SimplyCellular anti-Human IgG试剂盒（Bangs Laboratories）。简言之，该试剂盒由5种微球群构成；一种为空载的，四种为标记有增加量的抗人IgG的。然后在冰上将珠子和肽脉冲的T2细胞（37℃，5小时）用相同的荧光偶联的EBNA克隆315scFv-Fc标记30分钟。然后所述细胞用PBS洗涤，并与标记的珠子一起在BD FACS Calibur上分析。每个试剂盒所提供的基于Excel的QuickCal分析模板有助于将荧光强度与T2细胞上的抗原密度关联。四个数据点都为两次重复的平均值。

实施例11：构建WT-1克隆45嵌合抗原受体

原始嵌合抗原受体得自St.Jude儿童医院的Dario Campana博士，并且之前已经有所描述(41)。为了在后续实验中具有相容性，购买了scFv-CD3ζ-4-1BB DNA构建体（类似于原始嵌合免疫受体，EcoRI和XhoI在5’末端和3’末端）（Genescript公司的pUC57载体；新泽西州皮斯卡塔韦市），并且使该构建体含有两侧为SfiI和NotI的不相关scFv。从处于LB+氨苄青霉素（100μg/ml）中的细菌储藏物的过夜培养物中纯化（Qiagen miniprep DNA分离试剂盒）含有EBNA克隆315scFv序列的质粒（来自Tomlinson文库的pIT2载体）。使用SfiI（50℃，2小时）和NotI（37℃，2小时）从pIT2载体中切除scFv序列，并将该序列插入购买的预消化的（SfiI和NotI）pUC57载体中。连接后，将产物转化入NEB5-α感受态大肠杆菌（E.coli）（New England Biolabs）中，将细胞接种在TYE+氨苄青霉素（100μg/ml）上，挑取菌落并在LB+氨苄青霉素（100μg/ml）中培养，纯化质粒并用凝胶电泳确定产物大小。然后使用EcoRI（37℃，2小时）和XhoI（37℃，2小时），从pUC57载体上切除具有正确连接产物的质粒，并插入Campana实验室提供给我们的载体中。然后将连接产物转化到如上所述的大肠杆菌中，接种在TYE+氨苄青霉素（100μg/ml）上，挑取菌落并由MSKCCSequencing Core Facility使用反向引物788A(5'-CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3')(SEQ ID NO:72)对质粒进行测序。一旦确定所述序列，将DNA包装在逆转录病毒中并用于感染NK92MI细胞。

实施例12：构建EBNA克隆315嵌合抗原受体

由于相容性问题，使用购自Genescript的pUC57scFv-CD3ζ-4-1BBDNA构建体和上述方法使EBNA克隆315scFv替代WT1克隆45scFv。首先，从处于LB+氨苄青霉素（100μg/ml）中的细菌储藏物的过夜培养物中纯化（Qiagen miniprep DNA分离试剂盒）含有EBNA克隆315scFv序列（来自Tomlinson文库的pIT2载体）的质粒。使用SfiI（在50℃下酶切2小时）和NotI（在37℃下酶切2小时）从pIT2载体中切除scFv序列，并将该序列连接至预消化（SfiI和NotI）的pUC57载体中。连接后，将产物转化到大肠杆菌中，挑取菌落、过夜培养，纯化质粒并用凝胶电泳确定产物大小。然后使用EcoRI（在37℃下酶切2小时）和XhoI（在37℃下酶切1分钟），从pUC57载体上切除具有正确连接产物的质粒。由于EBNA克隆315scFv序列中存在XhoI位点，因此，该DNA用XhoI部分消化，然后用EcoRI完全消化。这使得能够分离保留了完整的scFv序列的正确DNA片段，同时也能从pUC57载体上移除全部CAR序列。插入到Campana实验室提供给我们的载体后，将连接产物转化到如上所述的大肠杆菌中，接种在TYE+氨苄青霉素（100μg/ml）上，挑取菌落并由MSKCC Sequencing Core Facility使用反向引物788A(5'-CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3')(SEQ ID NO:72)对质粒进行测序。一旦确定所述序列，将DNA包装在逆转录病毒中并用于感染NK92MI细胞。

实施例13：逆转录病毒制备、DNA包装和NK92MI细胞的感染

为了制备含有CAR的逆转录病毒，采用以下步骤，其中使用基于293T的逆转录病毒制备细胞系（GP2）。简言之，在1ml不含血清的DMEM中，将7μg的CAR DNA与3.5μg的PCLAmpho辅助构建体和3.5μg的pVSVg合并。然后将该混合物与1ml含有36μl的Lipofectamine2000（Invitrogen公司）的不含血清的DMEM合并，并在室温下孵育20分钟。之后，在10ml的DMEM+10%FBS中混合DNA-Lipofectamine复合体（2ml）和GP2细胞（3-5×10⁶个），并在37℃下培养72小时。然后，在回收时倒掉GP2细胞的上清（12ml），并在4℃下与3ml Lenti-XConcentrator溶液（Clontech公司）孵育12至16小时。然后，以3000rpm的速率离心溶液15分钟，丢弃上清，并将团块溶于含有5×10⁵个NK92MI细胞的1ml完全α-基本培养基中。然后孵育细胞72小时，并用流式细胞术通过GFP确定CAR的表达（CAR基因在CMV启动子下表达，其后为IRES-GFP）。

实施例14：构建scFv-Fc融合蛋白并在DG44CHO细胞中表达

使用与pFUSE—hIgG1-Fc1（InvivoGen；加利佛尼亚州圣地亚哥市）类似的专有抗体表达载体，首先对克隆315scFv序列进行PCR扩增以使其包含所需的NheI和ApaI限制位点。使用上述酶（NheI，37℃下酶切2小时；ApaI，25℃下酶切2小时）消化得到的PCR产物和表达质粒，然后连接在一起。然后将连接产物转化到大肠杆菌（E.coli）中，接种在TYE+氨苄青霉素（100μg/ml）上，挑取菌落并由MSKCCSequencing Core Facility对它们中的质粒进行测序。一旦确认这些序列在人IgG₁CH₂和CH₃结构域上游具有克隆315scFv序列，则使用Program U-030和100μl溶液V，将DNA电穿孔（Amaxa Nucleofactor；Lonza,瑞士）到5×10⁶个DG44中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（Invitrogen）中。然后在OptiCHO培养基（Invitrogen）中以每毫升培养基1-5×10⁶个DG44的细胞密度培养所述细胞，所述OptiCHO培养基中含有G418（500μg/ml，电穿孔7天后加入）。

实施例15：逆转录病毒制备、DNA包装和NK92MI细胞的感染

为了制备含有CAR的逆转录病毒，采用以下步骤，其中使用基于293T的逆转录病毒制备细胞系（GP2）。简言之，在1ml不含血清的DMEM中，将7μg的CAR DNA与3.5μg的PCLAmpho辅助构建体和3.5μg pVSVg合并。然后将该混合物与1ml含有36μl的Lipofectamine2000（Invitrogen公司）的不含血清的DMEM合并，并在室温下孵育20分钟。之后，在10ml的DMEM+10%FBS中混合DNA-Lipofectamine复合体（2ml）和GP2细胞（3-5×10⁶个），并在37℃下培养72小时。然后，在回收时倒掉GP2细胞的上清（12ml），并在4℃下与3ml Lenti-XConcentrator溶液（Clontech公司）孵育12至16小时。然后，以3000rpm的速率离心该溶液15分钟，丢弃上清，并将团块溶于1ml含有5×10⁵个NK92MI细胞的完全α-基本培养基中。然后孵育所述细胞72小时，并用流式细胞术通过GFP确定CAR的表达（CAR基因在CMV启动子下表达，其后为IRES-GFP）。

实施例16：⁵¹Cr释放细胞毒性检验

采用⁵¹铬释放检验评价具有CAR的NK92MI细胞裂解BLCL的能力。简言之，在含有10%FBS的RPMI1640中，将肽脉冲的或未脉冲的⁵¹Cr-标记的BLCL接种于圆底96孔板中（5×10³个细胞/孔）。然后，以不同的效（E）/靶（T）比向含有BLCL的孔中加入具有CAR的NK92MI细胞，并且在37℃下孵育4小时，然后倒掉细胞的培养基，并测量上清中的⁵¹Cr的释放。所有E:T比重复三次，在图表中绘出平均值。使用下式确定%⁵¹Cr释放：((样品释放–自发释放)/(总释放–自发释放))×100。

实施例17：病毒来源的重组HLA-A2-肽复合体的噬菌体亲和筛选

从MSKCC Tetramer Core Facility获得了呈递之前所示的与HLA-A2结合的各种不同肽的生物素化和非生物素化的重组HLA-A2-肽复合体。为了筛选的目的，合并Tomlinson I和J噬菌体展示文库，并首先将其与非生物素化的、不相关的HLA-A2-YVDPVITSI复合体以及链霉亲和素顺磁珠进行预孵育，从而在洗涤步骤中可以最终丢弃所有表达可以与HLA-A2的通用框架结合的抗体的噬菌体、或链霉亲和素磁珠本身。然后，将内容物（噬菌体和不相关复合体）与等摩尔比例的生物素化的HLA-A2-LLDFVRFMGV（EBNA3C）和生物素化的HLA-A2-NLVPMVATV（pp65）同时孵育，并使用链霉亲和素顺磁珠进行捕获。一旦所述珠子与生物素化的复合体结合，便用含有Tween20的PBS洗涤珠子，并用胰蛋白酶将结合的噬菌体从磁珠上洗脱下来。再进行另外两轮筛选后，使用回收得到的噬菌体感染HB2151大肠杆菌（E.coli），并接种在含有氨苄青霉素的琼脂上。第二天早上，挑取单个菌落，在48孔培养板上过夜培养，在预包被有重组HLA-A2-肽复合体的96孔ELISA板上检测其上清中scFv的存在。

根据产出/投入比，前三轮筛选使噬菌体回收率增加55倍，并且scFv仅结合HLA-A2-EBNA3C复合体。如表9所示，噬菌体展示筛选得到了重组HLA-A2-LLDFVRFMGV和HLA-A2-NLVPMVATV复合体。

表9

*第1-3轮：针对生物素化-HLA-A2-pp65肽+生物素化-HLA-A2-EBNA肽的筛选。

**第4轮：仅针对生物素化-HLA-A2-EBNA3C肽的筛选。

***相对信号至少大于背景2倍。

由于HLA-A2上的这些肽来源于病毒相关蛋白，而未见于人源蛋白，因此这些结果有些出乎意料。为了证实这些发现，仅利用HLA-A2-EBNA3C复合体再进行一轮筛选，结果回收得到的噬菌体进一步扩增（109倍），并且得到了类似百分比的与HLA-A2-EBNA3C复合体结合的克隆（第3轮筛选后83%阳性，第4轮筛选后77%阳性）。

3轮噬菌体筛选后，在乙烯基微量滴定板上检验单个克隆的细菌上清与重组的生物素化-HLA-A2-肽复合体的结合。虽然一些克隆（克隆335和345）产生除了靶标HLA-A2-LLDFVRFMGV复合体之外的交叉反应，但发现克隆315和327具有所需的特异性。

针对一组相似的重组生物素化-HLA-A2-肽复合体，再次检测纯化的EBNA克隆315scFv。纯化的EBNA克隆315scFv除了不能通过其自身结合天然的肽之外，其保持了对一组HLA-A2-肽复合体的特异性。包括抗HLA-A2抗体BB7.2在内，证明了所有HLA-A2-肽复合体合适地附着并出现在平板上。

因此，在筛选过程中，发现一些不同的scFv与靶标HLA-A2-EBNA3C复合体结合，然而仅有少量的scFv序列具有绝对的特异性而不与不同来源的HLA-A2-肽复合体结合（图1A）。在所检测的克隆中，EBNA克隆315和327具有相同的肽序列，并进一步进行了研究。在纯化scFv后，随后的ELISA验证证明，EBNA克隆315除了不能通过其自身与肽LLDFVRFMGV结合之外，保留了其对靶标HLA-A2-EBNA复合体的特异性（图1B）。这些最初的结合检验证明所述抗体具有类似TCR的结合能力。

实施例18：WT1来源的重组HLA-A2-肽复合体的噬菌体亲和筛选

按与上述方法相似的方法，使用针对生物素化的HLA-A2-RMFPNAPYL（WT1来源）的噬菌体完成抗体筛选。简言之，首先合并Tomlinson I和J噬菌体展示文库，并且将所述文库与非生物素化的、不相关HLA-A2-NLVPMVATV复合体和链霉亲和素顺磁珠进行预孵育。然后，将内容物（噬菌体和不相关复合体）与生物素化的HLA-A2-RMFPNAPYL一起孵育，并使用链霉亲和素顺磁珠进行捕获。一旦所述珠子与生物素化的复合体结合，用含有Tween20的PBS洗涤珠子，并用胰蛋白酶将结合的噬菌体从珠子上洗脱下来。再进行两轮筛选后，使用回收得到的噬菌体感染HB2151大肠杆菌（E.coli），并接种在含有氨苄青霉素的琼脂上。第二天早上，挑取单个菌落，在48孔培养板上过夜培养，在预包被有重组HLA-A2-肽复合体的96孔ELISA板上检测上清中scFv的存在。

当比较产出/投入比相时，前三轮筛选使噬菌体的富集倍数为90。如表10所示，噬菌体展示筛选得到了重组HLA-A2-RMFPNAPYL复合体。

表10

	第1轮*	第2轮**	第3轮**
				投入	3.7×1012	5.6×1011	1.55×1011
产出	4.0×106	3.2×106	1.52×107
				产出/投入	1.08×10-6	5.7×10-6	9.8×10-5
富集倍数（从第1轮开始）	-	5.3	90.7
				HLA-A2-RMFPNAPYL-特异性克隆***	-	-	3/48

*第1轮：针对5μg复合体的筛选。

**第2-3轮：针对2.5μg复合体的筛选。

***相对信号至少大于背景3倍（不相关HLA-A2-复合体）。

3轮噬菌体筛选后，在乙烯基微量滴定板上检验来自于三个单个克隆的细菌上清与重组生物素化-HLA-A2-肽复合体的结合。所检验的三个克隆都具有所需的只识别HLA-A2-RMFPNAPYL复合体的特异性。发现这三个克隆都具有相同的DNA序列。针对一组相似的重组生物素化的HLA-A2-肽复合体，再次检测纯化的WT1克隆45scFv。纯化的WT1克隆45scFv除了在MHC缺乏的情况下不能结合天然肽之外，保持了其对一组HLA-A2-肽复合体的特异性。包括抗HLA-A2抗体BB7.2在内，证明了所有HLA-A2-肽复合体合适地附着并出现在平板上。

在对48个克隆对特异的HLA-A2-RMFPNAPYL复合体的结合进行筛选之后，发现三个克隆特异性地结合它们的靶标复合体但不能结合展示出不相关肽的复合体（图2A）。在所检测的克隆中，发现它们全部具有相同的肽序列，并且选择WT1克隆45进行进一步研究。在纯化scFv后，随后进行的ELISA验证表明，WT1克隆45除了不能通过其自身结合肽RMFPNAPYL之外，保留了其对靶标HLA-A2-WT1复合体的特异性（图2B）。这些最初的结合检验证明所述抗体具有类似TCR的结合能力。

实施例19：在肽脉冲的T2细胞上用纯化的EBNA克隆315scFv和WT1克隆45scFv进行结合研究和特异性研究

为了证明分离的EBNA克隆315scFv和WT1克隆45scFv能够识别并结合肽脉冲的抗原呈递细胞（APC）表面上的天然复合体，使用了TAP缺陷T2细胞系。首先在含有β₂M的不含血清的培养基中，在37℃下，将T2细胞与LLDFVRFMGV（EBNA3C来源）、RMFPNAPYL（WT1来源）或不相关肽KLQCVDLHV一起孵育。然后洗涤细胞并用纯化的WT1克隆45scFv、EBNA克隆315scFv或不相关scFv染色。此外，肽脉冲的和未脉冲的T2细胞还与抗HLA-A2-FITC（BB7.2）抗体一起孵育。由于之前的研究表明如果肽能够结合T2细胞表面上的HLA-A2，那么HLA-A2分子被稳定化，该稳定化可以通过荧光强度的增强而可视化(81)，因此包括了BB7.2染色对照。如图3A所示，用肽LLDFVRFMGV或肽KLQCVDLHV脉冲的T2细胞引起荧光移动，这与它们结合HLA-A2口袋（pocket）是一致的。然而，EBNA克隆315仅能将用其特异性靶肽LLDFVRFMGV脉冲的T2细胞染色，而不能将用不相关肽脉冲的T2细胞染色（图3B）。当用肽RMFPNAPYL或肽LLDFVRFMGV脉冲T2细胞并用WT1克隆45scFv染色时，获得相似的结果。虽然两种肽链都能稳定HLA-A2分子（图4A），但WT1克隆45scFv只能检测到用肽RMFPNAPYL脉冲的T2细胞（图4B）。这进一步证实它们在检测细胞表面上的天然复合体方面的有效性。

接下来，使用流式细胞仪评价EBNA克隆315scFv的灵敏度，从而通过流式细胞仪定量珠子将灵敏度与抗原密度相关联。简言之，在37℃下在不含血清的IMDM培养基中，TAP缺陷T2细胞用20μM的肽LLDFVRFMGV（图3A上，左侧）或肽KLQCVDLHV（图3A上，右侧）脉冲5小时（实线空心）、或是不用肽脉冲（虚线空心）。然后细胞用鼠抗人HLA-A2-FITC偶联抗体（空心）或对照鼠IgG₁-FITC偶联抗体（实心）染色，并用FACS仪器分析。将来自A的肽脉冲的T2细胞用EBNA克隆315scFv（空心）或对照scFv（实心）染色（图3B）。只有用肽LLDFVRFMGV脉冲的T2细胞（左侧）能够被EBNA克隆315scFv染色，而用KLQCVDLHV脉冲的T2细胞（右侧）不能被染色（图3B）。将T2细胞与浓度降低的肽LLDFVRFMGV一起孵育，然后如上所述用EBNA克隆315scFv染色（图3C）。根据几何平均荧光（扣除了对照scFv背景），检测下限对应用78nM的肽进行脉冲。

通过对与T2细胞一起孵育的肽的量进行滴定，确定了在用EBNA克隆315scFv染色时，低至78nM的浓度仍然能够产生高于背景的荧光信号（图3C）。随着用于荷载的肽浓度的降低，如可以预期的，整体的HLA-A2强度也相应地降低（数据未示出）。

相似地，图4示出了WT1克隆45能够识别肽脉冲的T2细胞上的HLA-A2-RMFPNAPYL。在37℃下在不含血清的IMDM培养基中，TAP缺陷T2细胞用40μM的肽RMFPNAPYL（左侧）或肽LLDFVRFMGV（右侧）脉冲5小时（实线空心）、或是不用肽脉冲（虚线空心）。然后细胞用鼠抗人HLA-A2-FITC偶联抗体（空心）或对照鼠IgG₁-FITC偶联抗体（实心）染色，并用FACS仪器分析（图4A）。来自A的肽脉冲的T2细胞用WT1克隆45scFv（空心）或对照scFv（实心）染色。只有用肽RMFPNAPYL脉冲的T2细胞（左侧）能够被WT1克隆45染色，而用LLDFVRFMGV脉冲的T2细胞（右侧）不能被染色（图4B）。

实施例20：使用肽脉冲的BLCL证明肽LLDFVRFMGV和EBNA克隆315的HLA限制性

特别是因为BLCL通常被用作APC(82)，因此检测这些肽在BLCL上的表达。使用两种BLCL细胞系，一种为HLA-A2⁺（DIMT），另一种为HLA-A2^-（6268A）（图5A）。在37℃下在不含血清的IMDM培养基中，将BLCL与特异的肽LLDFVRFMGV或不相关的肽KLQCVDLHV一起孵育。当与特异的肽一起孵育时，仅HLA-A2⁺DIMTBLCL可以被EBNA克隆315染色（图5B）。与T2细胞的结果相似，荷载了不相关肽的DIMT细胞、或荷载了特异的/不相关肽的6268A不能被EBNA克隆315染色。有意思的是，不用肽脉冲的话，不能成功地将DIMT染色。当染色方案被优化为通过涉及第二和第三试剂的信号放大来检测低水平的抗原，从而检测scFv时，细胞天然呈递的肽的量似乎低于我们的检测水平。

随后，为了研究肽呈递在HLA-A2上的持续时间，使用脉冲追踪实验监测随着时间的变化HLA-A2-EBNA3C复合体在DIMT细胞上的水平。首先，在37℃下在不含血清的IMDM培养基中，将DIMT细胞与肽LLDFVRFMGV一起孵育5小时。之后，细胞用RPMI+10%FBS洗涤两次，并在该培养基中再培养另外的5小时和24小时。在这三个时间点，收集细胞并用纯化的EBNA克隆315scFv或不相关scFv染色。结果表明，脉冲后，HLA-A2-EBNA3C复合体能够容易地在细胞表面上被检测到（图5C）。有趣的是，即使将细胞转移到新鲜培养基中并培养另外的5小时和24小时后，仍然可以检测到MHC-肽复合体，这表明至少在从培养基中除去肽一天之后，肽脉冲的BLCL仍然能够捕获并呈递抗原。该数据进一步支持自体BLCL在制备抗原特异性T细胞中的用途，以及TCE特异性抗体（如EBNA克隆315）在使TCE在APC或靶细胞上的表达精确可视化方面的有效性。

实施例21：构建EBNA克隆315scFv-Fc和WT1克隆45scFv-Fc融合蛋白

首先，利用PCR在EBNA克隆315scFv和WT1克隆45scFv序列的两侧加上所需的限制酶位点（NheI和ApaI），从而使scFv序列适合克隆入scFv-Fc表达载体。利用包含WT1克隆45scFv和EBNA克隆315scFv序列的Tomlinson文库载体完成PCR反应（图7A）。之后用NheI和ApaI消化后，从1%琼脂糖凝胶上移除经消化的PCR产物并纯化（图6B）。

对于scFv-Fc融合蛋白的克隆和表达，使用购自Eurekatherapeutics公司的专有载体（IgG载体）。从该载体中除去重链第一恒定区（CH₁），这是在制备Fc融合蛋白时通常进行的步骤(83)。在制备时，载体用NheI和ApaI消化，然后连接到预消化的来自于图7B的PCR产物上。连接产物提供了能够表达EBNA克隆315scFv或WT1克隆45scFv基因的载体，所述基因在单个CMV启动子之下与人IgG1的CH_2,3结构域串联（scFv-Fc载体；图7B）。在利用DNA测序进一步确认后，使用HindIII使两种融合构建体线性化，并在1%琼脂糖凝胶上电泳。利用HindIII进行消化还能够封闭仍然存在于载体中的轻链的表达，轻链的表达对所有目的都是不希望的。正如所预期的那样，根据两种所消化的质粒相对于λHindIII分子标记物的位置可知，它们以预期的大小（～11,000bp）电泳。然后将每种线性化的质粒导入DG44细胞，并按照上文实施例10所述在OptiCHO培养基中培养。

实施例22：EBNA克隆315scFv-Fc对重组HLA-A2-肽复合体和肽脉冲的T2细胞的结合动力学和灵敏度

为了进一步了解EBNA克隆315和HLA-A2-EBNA3C复合体之间相互作用的亲和性，利用表面等离子体共振来确定这两种蛋白质之间的结合动力学。首先，纯化EBNA克隆315scFv-Fc，并利用ELISA（图8A）以及对各种浓度的肽脉冲的T2细胞进行的流式细胞术（图8B和C）检测其结合能力。这些初步的研究表明，当表达为融合蛋白时，抗体保持了其结合特性。此外，重要的是，发现scFv和scFv-Fc的流式细胞灵敏度是非常具有可比性的（200nM–20nM），这进一步突出了scFv作为单体结合片段的有效性。

接下来，使用Biacore T100（GE Healthcare），按照制造商推荐的方法首先活化CM5芯片（流动池1和2）以进行胺偶联。然后，将纯化的EBNA克隆315scFv-Fc固定在第二流动池上，并且使纯化的HLA-A2-EBNA3C复合体通过两个流动池以作为部分可溶相。扣除背景后（流动池2的信号减去流动池1的信号），确定结合速率（k_on）和解离速率（k_off）（分别为2.361×10⁵M^-1s^-1和6.891×10^-2s^-1），并使用1:1结合模型确定了整体K_D（k_off/k_on）为291nM（图9）；这些动力学速率非常类似于之前分离的针对不同的MHC-肽复合体的Fab(22,31)。相对于已经公开的TCR:MHC I类肽K_D测定值（通常在大约2-50μM范围内(84)），本发明所述的scFv:MHC I类肽相互作用似乎最高强150倍，并且最显著的改善归因于较慢的k_off。之前的支持基于亲和性的T细胞活化模型的研究证明，亲和性越高或解离速率越低将导致干扰素-γ释放和靶细胞裂解越强(85,86)。

最后，为了对位于肽脉冲的T2细胞表面上的HLA-A2-LLDFVRFMGV复合体的量进行定量，决定使用流式细胞定量珠子。该数据还有利于确定EBNA克隆315scFv和scFv-Fc的检测阈。首先，使用市售可得的试剂盒将纯化的EBNA克隆315scFv-Fc与荧光标记物AlexaFluor647偶联。然后，在37℃下，T2细胞用20、10、5或0μM的肽LLDFVRFMGV脉冲5小时。脉冲后，将肽脉冲的T2细胞与含有已知量的抗人IgG₁抗体的珠子一起与荧光标记的EBNA克隆315scFv-Fc一起孵育。当用FACS仪器分析细胞和珠子时，荧光强度是相互关联的，由此估算了与用于脉冲的肽的量相关的位于T2细胞表面的复合体的数量。将这四个值（337,091对20μM、149,688对10μM、76,040对5μM、以及无值对0μM）绘制在图表上，并使用趋势线建立标准曲线（R²=0.9948）（图10A）。此外，当观察光谱的下端时，确定了肽的量小于40nM对应于细胞表面上的复合体小于100个（图10B），这将EBNA克隆315scFv-Fc融合蛋白的检测水平置于该范围内。

实施例23：WT1克隆45scFv-Fc对重组HLA-A2-肽复合体和肽脉冲的细胞的结合和特异性研究

为了进一步研究肽RMFPNAPYL在APC表面上的呈递，首先纯化WT1克隆45scFv-Fc融合蛋白，并确认其与靶标重组HLA-A2-肽复合体的结合（图11A）。如scFv所显示的，融合蛋白保留了其在ELISA板上的结合能力。接下来，决定检测并观察scFv-Fc在肽脉冲的T2细胞上是否能保持其结合能力和特异性。在37℃下，在具有β₂M的不含血清的培养基中，T2细胞用肽RMFPNAPYL或不相关的肽脉冲5小时。通过流式细胞术得知，scFv-Fc能够检测到用RMFPNAPYL肽脉冲的T2细胞，但是不能识别用不相关的肽脉冲的T2细胞（图11B）。这两个检验进一步证明融合蛋白与原始scFv以相同的方式发挥作用。

然后，决定检测肽RMFPNAPYL和scFv-Fc融合蛋白的结合是否受限于HLA-A2。在37℃下，在不含血清的培养基中，HLA-A2⁺BLCL和HLA-A2^-BLCL（分别为DIMT和6268A）用肽RMFPNAPYL脉冲5小时。与EBNA克隆315相似，WT1克隆45scFv-Fc融合蛋白只能识别肽脉冲的DIMT，而不能识别HLA-A2^-6268A BLCL（图12）。这些结果表明肽RMFPNAPYL受限于HLA-A2，并且WT1克隆45只能在该复合体的存在下识别RMFPNAPYL肽。

实施例24：EBNA克隆315scFv-Fc对肽脉冲的细胞的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）

在抗原呈递研究中除了使用scFv-Fc之外，还检测了截短的人IgG₁Fc区是否能够诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。为了避免人供体淋巴细胞之间的变异性，并且为了提高观测到细胞毒性的机会，我们实验室的Hong-fen Guo制备了CD16(V)-转导的NK92MI细胞系。此具有高亲和性多型性（缬氨酸替代了CD16上158位的苯丙氨酸）的NK92细胞变体用IL-2和人CD16激活的Fc受体（FcγRIIIA）转导，从而使ADCC和抗体依赖性免疫治疗的临床反应增强(87,88)。

使用该细胞系以及EBNA克隆315scFv-Fc或不相关的同种型相配的scFv-Fc来检测融合蛋白是否能够诱导针对LLDFVRFMGV-脉冲的LUY（HLA-A2⁺）BLCL的NK92MI介导的ADCC。在E:T比42:1下，EBNA克隆315scFv-Fc在所检测的两个最高浓度（27-32%对13-15%）下导致比背景（具有或没有不相关的scFv-Fc）更强的杀伤（图13）。在其他肽脉冲的、HLA-A2⁺靶BLCL（DIMT和JG19）中也观察到相似等级的杀伤（高于背景）。这些结果表明，这些截短的scFv-Fc融合蛋白尽管比全长免疫球蛋白小约33%，但它们保持了它们的Fc介导的效应器功能。

实施例25：HLA-A2-RMFPNAPYL-特异性嵌合抗原受体的构建和在NK92MI细胞中的逆转录转导

为了产生对HLA-A2-RMFPNAPYL复合体特异的CAR，通常将WT1克隆45scFv与在免疫效应器细胞中发现的免疫调节蛋白的胞内信号结构域融合。获得了CAR表达载体（St.JudeCAR），其中CD19特异性scFv与CD8α铰链区/跨膜区、4-1BB和CD3ζ链融合，将该载体进行修饰，从而用WT1克隆45scFv替代抗CD19scFv。然而，由于St.Jude CAR载体与用于PCR的Tomlinson文库载体之间的限制酶不兼容，因此由Genescript商业合成了含有WT1克隆45scFv的整个CAR基因。所得WT1pUC57载体含有两侧为EcoRI和XhoI的目的WT1克隆45CAR序列。

St.Jude CAR载体的另外一个特征为CAR序列下游的IRES-GFP序列。这使得CAR的表达与GFP直接相关联，而不需要使两个蛋白融合在一起。为了利用这一特征，利用EcoRI和XhoI消化了WT1pUC57载体和St.Jude CAR载体。之后，消化的和未消化的质粒以及λHindIII和100bp分子标记在1%琼脂糖凝胶上电泳。亮带对应预期大小的不含CAR序列的St.Jude质粒（～6500bp），以及不含pUC57质粒的WT1克隆45CAR序列（～1500bp）。从凝胶上切除这些条带，经过DNA纯化后，将两个连接到一起。将连接产物转化到大肠杆菌中后，随机选择8个菌落并分离它们的质粒。然后通过测序确定分离到的质粒是否在CAR存在下含有WT1克隆45scFv序列。另外，这些质粒也用EcoRI和XhoI消化，并与λHindIII和100bp分子标记一起在1%琼脂糖凝胶上电泳以确定它们的大小。在证明了来自于各自的质粒的两个条带具有所期望的大小后，确定克隆是成功的。

一旦获得WT1克隆45CAR（图23），便使用基于293T的GP2细胞系将DNA包装入逆转录病毒中。一旦在培养基中产生逆转录病毒，回收并浓缩病毒。然后在NK92MI生长培养基中使用浓缩的病毒感染500,000至1,000,000个NK92MI细胞。培养3至4天后，利用流式细胞仪根据GFP的表达来比较逆转录病毒感染的NK92MI细胞和空感染的细胞（用空的逆转录病毒感染）。虽然感染效率大约27.5%，但流式细胞分选（FACS）使得能够将GFP阳性细胞群富集至大于98%阳性（图23）。

实施例26：HLA-A2-LLDFVRFMGV-特异性嵌合抗原受体的构建和在NK92MI细胞中的逆转录病毒转导

由于WT1克隆45CAR需要购买WT1pUC57载体，因此在置换不同的scFv时为了方便而向此构建体中加入了另外的限制位点。结果，EBNA克隆315scFv序列可直接从其来源的Tomlinson载体中克隆出来。

第一克隆步骤包括使用SfiI和NotI从WT1pUC57载体中除去WT1克隆45scFv。对含有EBNA克隆315scFv序列的Tomlinson载体进行相同的消化。消化完成后，两种质粒以及λHindIII和100bp分子标记在1%琼脂糖凝胶上电泳。亮带对应不含scFv的WT1pUC57载体，以及从Tomlinson载体上切下的EBNA克隆315scFv。从凝胶上切下这些条带，纯化DNA并连接在一起，从而得到EBNA pUC57载体。然后将连接产物转化到大肠杆菌中，随机选择10个菌落，纯化它们的质粒，并且每个DNA用EcoRI单独消化或是用EcoRI和XhoI消化。如所预期的，由于来源于Tomlison载体的每个scFv序列本身存在XhoI位点（由于从Genescript公司购买CAR时除去了所述位点，pUC57中的WT1克隆45scFv是例外的），因此双酶切产生三条分离的条带。

对于第二克隆步骤，其中从pUC57载体上切除EBNA克隆315CAR序列并添加到St.Jude CAR载体中，需要使用XhoI对EBNApUC57载体进行部分酶切。将从上述10个菌落中分离得到的EBNApUC57质粒合并，并在室温下用XhoI消化1分钟。将其加入1%琼脂糖凝胶的4个分离的孔中，并将该DNA与未酶切的质粒、λHindIII和100bp分子标记一起电泳，从而快速停止反应。确定亮带为线性化EBNA pUC57质粒的所预期的大小（～4300bp）；该线性质粒是在两个XhoI位点中的任意一个上进行随机切割的结果。为了获得完整的CAR序列（～1500bp），从凝胶中分离线性质粒并用EcoRI完全消化。将得到的双酶切和单酶切消化产物与λHindIII和100bp分子标记在1%琼脂糖凝胶上电泳。亮带对应于预期大小的EBNA克隆315CAR基因，从凝胶上切下后，纯化DNA，并连接至预消化（EcoRI和XhoI）的St.JudeCAR载体上。将连接产物转化到大肠杆菌中之后，随机选择10个菌落，分离它们的质粒。然后通过测序确定分离到的质粒是否在CAR存在下含有EBNA克隆315scFv序列。另外，这些质粒也用EcoRI消化，并与λHindIII分子标记一起在1%琼脂糖凝胶上电泳以确定它们的大小。证明了各个条带具有预期的大小后，确定克隆是成功的。

获得EBNA克隆315CAR之后（图14），按照与WT1克隆45CAR相同的方法，将DNA包装入逆转录病毒中并感染NK92MI细胞。培养3至4天后，将感染的NK92MI细胞的GFP表达水平与空感染的细胞进行比较。最初的感染效率大约24%，流式细胞分选（FACS）后，GFP阳性细胞群富集至大于90%阳性（图14）。

实施例27：通过CD107a的表达，具有EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞能够检测到具有特异的HLA-A2-LLDFVRFMGV复合体的细胞

富集NK92MI细胞用于EBNA克隆315CAR表达后，检测它们识别靶标HLA-A2-EBNA3C复合体的能力。作为被靶细胞活化的NK92MI的最初的读数，检验了细胞表面的CD107a表达，CD107a表达是NK细胞和T细胞脱粒的标志(90,91)。T2细胞荷载有20μM的目标肽（LLDFVRFMGV）、不相关肽（YMFPNAPYL），或者不荷载肽。在37℃下在抗CD107a-PE偶联抗体的存在下，利用1:1的效靶比，将T2细胞与表达EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞共培养5小时。如图16A所示，具有EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞不与未脉冲的T2细胞或用不相关的肽脉冲的T2细胞反应，这表明CD107a水平相当于在缺乏靶标的条件下培养的NK92MI细胞的CD107a水平。另一方面，当具有CAR的NK92MI细胞与用肽LLDFVRFMGV脉冲的T2细胞共培养时，27%的GFP⁺细胞表达的CD107a高于背景水平。这些结果表明在对scFv进行工程设计后，CAR能够保持其对靶标HLA-A2-肽复合体的特异性。

接下来，为了对CAR活化NK92MI细胞的灵敏度进行定量测量，滴定了用于脉冲T2细胞的肽LLDFVRFMGV的浓度，并测量了它们活化具有CAR的NK92MI细胞的能力。如图16B所示，具有CAR的NK92MI细胞的响应下限为10nM的肽浓度，并且在浓度为600nM时开始有明显的剂量反应曲线。基于我们之前的定量研究，这一肽浓度对应于在细胞表面上有大约25个复合体。相比于使用EBNA克隆315scFv或scFv-Fc（200-20nM）进行表位检测所需的水平，在利用流式细胞分析检测位于APC表面上的低水平的MHC-肽复合体方面，所述CAR似乎是灵敏度更好的手段。

虽然T2细胞能够呈递任意目的肽，但BLCL天然地能够将它们的肽呈递在它们的MHC I类分子上。类似于T2，这些内源肽可以通过简单地与具有足够高亲和性的替代肽一起孵育而被替换。采用1:1的E:T比，HLA-A2⁺（DIMT）和HLA-A2^-（6268A）BLCL用不含血清的IMDM培养基或含有LLDFVRFMGV的不含血清的IMDM培养基脉冲，如上所述与表达EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞共培养，并使用流式细胞分析仪检验CD107a表达。肽脉冲的DIMT（HLA-A2⁺）诱导了25%的GFP⁺NK92MI细胞表达CD107a（图17），相比之下，肽脉冲的6268A（HLA-A2^-）为0.54%，未脉冲的DIMT为1.09%。该数据进一步证明了EBNA克隆315CAR具有肽特异性和HLA-A2专有性。

实施例28：通过⁵¹Cr释放，具有EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞可破坏具有特异的HLA-A2-LLDFVRFMGV复合体的细胞

虽然NK细胞和T细胞的CD107a表达反映了它们的活化，但靶细胞裂解也可利用常规的⁵¹Cr细胞毒性检验来测定。首先，为了了解⁵¹Cr细胞毒性检验对杀死表达HLA-A2-EBNA3C的靶标的灵敏度，在37℃下用浓度降低的肽LLDFVRFMGV脉冲T2细胞3小时，然后如材料和方法中所述用⁵¹Cr标记T2细胞。然后，标记的T2细胞与表达EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞在37℃下以3:1的E:T比共培养2小时。与CD107a检验的结果（图16B）相似，表达EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞能够以肽依赖的方式杀死T2细胞，其中13.2%的用2nM肽脉冲的T2细胞被杀死，而10.1%的未脉冲的T2细胞被杀死（图18）。相比于可以使用流式细胞抗体染色来检测的情况，对有利于CRA而言，利用两种单独检验（CD107a和⁵¹Cr）的灵敏度水平提高大约10至100倍。

接下来，在不含血清的IMDM中用肽LLDFVRFMGV（20μM）脉冲的DIMT BLCL和6268ABLCL（图19A和B）用作⁵¹Cr释放检验的靶标。与CD107a检验的结果（图17）相似，仅HLA-A2⁺DIMT BLCL被具有CAR的NK92MI细胞裂解（图19A），这可以通过使用纯化的EBNA克隆315scFv-Fc来阻断（图19B）。另外，由于市售的抗HLA-A2（BB7.2）抗体也具有阻断能力（数据未示出），因此阻断细胞毒性的能力不仅限于scFv-Fc蛋白。该阻断数据概括了其它MHC限制性、肽特异性抗体作用于抗原特异性细胞溶解T细胞的结果。

虽然在用不相关的肽人工脉冲靶标时，具有CAR的NK92MI细胞的裂解潜力是明显的，但针对天然加工的HLA-A2-肽复合体的细胞毒性是具有临床相关性的。在本文中，针对一组HLA-A2⁺（DIMT和JG19）和HLA-A2^-（6268A和GKO）未脉冲的BLCL，对具有CAR的NK92MI细胞进行检验。虽然细胞毒性的水平低，对DIMT为23.0%并且对JG19为8.9%（30:1的E:T比），但相比于GKO的3.6%和6268A的1.8%而言，该水平是非常显著的（图20A）。另外，与用不相关的scFv-Fc或缺乏抗体的情况相比，当在EBNA克隆315scFv-Fc的存在下进行细胞毒性检验时，杀伤能力降低了大约46%（图20B）。这些发现证明，类似TCR的CAR在重新设计效应器免疫细胞招募抗原（表达水平低于常规流式细胞术检测限）方面具有有效性和特异性。

最后，由于EBNA克隆315CAR和scFv-Fc融合蛋白具有相同的用于检测HLA-A2-LLDFVRFMGV复合体的可变区序列，因此决定直接比较CAR介导的细胞毒性和ADCC，因为这两种方案目前被独立地用于癌症患者的治疗中。首先，在37℃下在不含血清的IMDM培养基中，用20μM的肽LLDFVRFMGV脉冲DIMT BLCL2小时。然后经脉冲的BLCL用⁵¹Cr标记，并与表达EBNA克隆315CAR或CD16(V)的NK92MI细胞以及EBNA克隆315scFv-Fc或不相关scFv-Fc以15:1的E:T比在37℃下共培养3小时。在EBNA克隆315scFv-Fc浓度为0.5μg/ml时，CD16(V)NK92MI细胞能杀死大约30-35%的细胞，相比之下，用不相关scFv-Fc或完全不用抗体时杀死10-15%的细胞（图21）。当使用较高浓度的scFv-Fc进行ADCC实验时，细胞毒性百分数不发生改变（数据未示出）。另一方面，在相同的E:T比下，具有EBNA克隆315CAR的NK92MI细胞能杀死80-90%的用相同肽脉冲的靶细胞；EBNA克隆315scFv-Fc被包括作为阻断对照（图22）。这些结果表明而言，涉及NK92MI细胞的CAR介导的杀伤在靶细胞裂解方面是远远比所设置的ADCC更有效的方法。

实施例29：通过⁵¹Cr释放，具有WT1克隆45CAR的NK92MI细胞可破坏具有特异的HLA-A2-RMFPNAPYL复合体的细胞

与EBNA克隆315CAR一起，决定检测WT1克隆45CAR在NK92MI细胞环境中的细胞溶解能力。首先，在37℃下在不含血清的IMDM中，用肽RMFPNAPYL（40μg/ml）脉冲DIMT BLCL和6268ABLCL3至5小时。然后靶细胞用⁵¹Cr标记，并与具有CAR的NK92MI细胞在37℃下共培养4小时。在这两种肽脉冲的BLCL中，在10:1的E:T比下仅HLA-A2⁺DIMT可以被裂解（～70%相比于6268A的～5%）（图24）。另外，CAR介导的细胞毒性可以使用市售抗HLA-A2抗体阻断大约45%（图25），这进一步证明了特异性。

接下来，决定检验具有WT1克隆45CAR的NK92MI细胞针对可天然表达HLA-A2-RMFPNAPYL复合体的细胞系的细胞溶解能力。根据以前公开的数据(92)、以及与MSKCC的Richard O’Reilly博士的实验室的讨论，研究人员确定了WT1能够在所有得自EBV无限增殖化的BLCL中组成性地活化。更具体而言，O’Reilly的研究组能够在DIMTBLCL中示出WT1转录本（数据未示出）。结果，我们首先决定检测WT1克隆45CAR介导的针对未脉冲的HLA-A2⁺DIMTBLCL和HLA-A2^-6268A BLCL的杀伤作用。与EBNA克隆315CAR的情况相似，具有WT1克隆45CAR的NK92MI细胞能够以与肽脉冲的DIMT相比较低的能力杀死未脉冲的DIMT。虽然其细胞毒性水平较低，但在20:1的E:T比下对DIMT为～35%，这远高于6268A（～5%）（图26A）。另外，当在WT1克隆45scFv-Fc的存在下进行细胞毒性检验时，与不相关scFv-Fc或缺乏抗体的情况相比，杀伤能力降低大约43%（图26B）。这些发现与使用EBNA克隆315CAR的情况一致，并且进一步表明类似TCR的CAR在重新设计效应器免疫细胞招募抗原方面具有有效性和特异性。

最后，检测了CAR介导的针对两种细胞系的细胞毒性，所述两种细胞系为HLA-A2-阳性细胞系和之前显示能够表达WT1的细胞系。OVCAR-3是由患有卵巢进行性腺癌的患者的恶性腹水建立的细胞系(93)，后来显示其含有WT1mRNA(94)。另外，697是由得自患有复发性急性淋巴细胞白血病（ALL）的儿童的骨髓细胞建立的人前B细胞白血病(95)。从那时起，一些团体已经证实该细胞系也表达高水平的WT1转录本和蛋白质(96,97)。将表达WT1克隆45CAR的NK92MI细胞与⁵¹Cr标记的OVCAR-3和697细胞在37℃下共培养4小时。在20:1的E:T比下，具有CAR的NK92MI细胞能够裂解大约20-30%的697和OVCAR-3细胞，并且其随着检验中所用的效应器细胞的数目的降低而降低。该数据表明这两种细胞类型对具有WT1克隆45CAR的NK92MI细胞敏感，并且该数据提供了它们在治疗HLA-A2⁺/WT1⁺恶性肿瘤中的有效性的进一步证据。

等同形式

认为上述说明书足以使本领域技术人员实施本发明。上述说明和实施例详细证明了本发明的实施方案，并且描述了发明人构思的最佳实施方案。然而，应当理解，无论上文描述的多么详细，本发明可以以许多方式来实施，并且本发明应当根据随附的权利要求书及其等同形式来解释。

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Claims (17)

1.一种分离的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，包含下列之一：

(A)抗原结合区，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:2；

(B)抗原结合区，其包含V_H和V_L，所述V_H和所述V_L分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:22和23；或者

(C)(i)

(a)轻链(LC)互补决定区1(CDR1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:56组成；

(b)LC CDR2，其由氨基酸序列SEQ ID NO:57组成；以及

(c)LC CDR3，其由氨基酸序列SEQ ID NO:64组成；以及

(ii)

(a)重链(HC)互补决定区1(CDR1)，其由氨基酸序列SEQ ID NO:38组成；

(b)HC CDR2，其由氨基酸序列SEQ ID NO:40组成；以及

(c)HC CDR3，其由氨基酸序列SEQ ID NO:48组成；并且

所述抗原结合区特异地与HLA/肽复合体结合，其中所述HLA/肽复合体中的所述肽由氨基酸序列RMFPNAPYL(SEQ ID NO:1)组成。

2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白为抗体。

3.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为嵌合抗原受体(CAR)。

4.根据权利要求2所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体为全长抗体、保持原样的抗体、Fab片段、F(ab')2片段或单链可变区片段(scFv)。

5.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HLA/肽复合体中的所述HLA为HLA-A2。

6.一种融合蛋白，其包含权利要求1所述的抗原结合蛋白。

7.一种分离的单链可变区片段(scFv)，其由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。

8.一种分离的scFv，其包含由氨基酸间隔区连接的V_H和V_L，其中所述V_H和所述V_L分别由SEQ ID NO:22和23所示的氨基酸序列组成。

9.一种免疫偶联物，包含权利要求1所述的抗原结合蛋白或其片段。

10.根据权利要求9所述的免疫偶联物，其包含细胞毒素。

11.根据权利要求9所述的免疫偶联物，其包含对不同于所述HLA-肽复合体的靶标具有结合特异性的结合蛋白或抗体。

12.一种双特异性抗体，其包含权利要求1所述的抗原结合蛋白。

13.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或其抗原结合片段。

14.一种药物组合物，其包含权利要求6所述的融合蛋白。

15.一种药物组合物，其包含权利要求7-8中任一项所述的分离的单链可变区片段。

16.一种药物组合物，其包含权利要求9-11中任一项所述的免疫偶联物。

17.一种药物组合物，其包含权利要求12所述的双特异性抗体。