KR20140014165A

KR20140014165A - 에이치엘에이 제한된, 펩타이드특이성 항원 결합 단백질

Info

Publication number: KR20140014165A
Application number: KR1020137023992A
Authority: KR
Inventors: 나이-꽁 청; 디미터 타세브; 지안 후
Original assignee: 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터
Priority date: 2011-02-11
Filing date: 2012-02-13
Publication date: 2014-02-05
Also published as: SG193023A1; US9040669B2; CA2826942A1; EP2673300A1; WO2012109659A1; EP2673300B1; US20140024809A1; US20140296492A1; US9453075B2; KR101944557B1; CN103635486B; EA201391159A1; AU2012214132B2; SG10201602159VA; EA201401134A1; NZ702372A; EP3006467A1; ZA201306646B; HK1223942A1; US20150322154A1

Abstract

TCR-유사 파라토프, 즉 HLA-A2 제한된 펩타이드에 특이적인 항원 결합 영역을 갖는 항원 결합 단백질을 개시한다. 상기 항원 결합 단백질은 완전 길이 항체, 실질적으로 완전한 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 및 단일 쇄 Fv 단편을 포함하여 다양한 형태의 항체들을 포함한다. 융합 단백질, 예를 들어 각각의 펩타이드에 대한 항원 결합 영역의 특이성을 포함하는, 면역글로불린 또는 T-세포 수용체 도메인과의 scFv 융합물이 또한 본 발명에 의해 고려된다. 더욱 또한, 면역접합체는 방사성 동위원소, 형광 또는 다른 검출 가능한 마커, 세포독소, 또는 다른 분자가 결합된 항체들을 포함하며, 상기는 또한 본 발명에 의해 포함된다. 다른 것들 중에서도, 면역접합체를, 치료 효과를 유도하거나 또는 면역 효과기 작용을 촉진하기 위한 작용제의 전달을 위해 사용할 수 있다.

Description

에이치엘에이 제한된, 펩타이드특이성 항원 결합 단백질{HLARESTRICTED, PEPTIDESPECIFIC ANTIGEN BINDING PROTEINS}

본 발명은 일반적으로 면역 작용에 관련된 항원-결합 단백질 분자에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 HLA-제한된 펩타이드에 대한 특이성을 갖는 재조합 항체, 키메릭 항원 수용체 및 그의 단편에 관한 것이며, 여기에서 상기 펩타이드는 관심 세포 또는 바이러스 단백질로부터 유래한다.

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2011년 2월 11일자로 출원된, HLA-A2 제한된, 펩타이드-특이성 단클론 항체 및 키메릭 항원 수용체의 생성 및 용도란 표제 하의 미국 가 출원 제 61/463,082 호의 우선권을 청구한다. 상기 가 출원은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.

서열 목록

본 출원은 2012년 2월 2일자로 생성된 서열 목록을 함유하며; ASCII 포맷의 파일이 3314019AWO_seqlisting_ST25.txt로 표시되고 크기가 47.8 킬로바이트이다. 상기 파일은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.

배경 정보

입양 T 세포 면역요법의 진보는 과거 십년 동안 암 환자들을 다수의 가망 있는 선택으로 이끌었다. 암에 대한 T-세포 기본 면역요법은 수술 적출물 및 환자 결과에서 종양 침윤 림프구(TIL)의 증가된 수의 상관관계를 입증한 연구로부터 유래한다. 일반적으로 상기 TIL의 침윤은 항-종양 기전의 활성화를 나타내고 상기 침윤은 MHC와 관련하여 종양 관련된 항원의 발현을 통해 매개되는 것으로 여겨진다. 이러한 발견은 결국 연구자들로 하여금 암 치료에 항원-특이성 T 세포를 시도하고 이용하게 하였다.

세포독성 T-세포(CTL) 반응의 유도의 경우, 세포내 단백질은 대개 프로테아솜 또는 엔도/리소솜에 의해 분해되고, 생성되는 펩타이드 단편은 MHC 부류 I 또는 II 분자에 결합한다. 이들 펩타이드-MHC 복합체는 세포 표면에서 나타나고 여기에서 상기 복합체는 펩타이드-MHC(pMHC)-T 세포 수용체(TCR) 상호작용을 통해 T 세포 인식을 위한 표적을 제공한다. 세포 및 바이러스 단백질로부터 유래한 펩타이드에 의한 백신화는 HLA-A0201-제한된 세포독성 CD8 T 세포를 유도할 수 있으며, 상기 세포는 종양 세포 또는 바이러스-감염된 세포를 죽일 수 있다.

항체가 암, 자가면역 질병 및 감염과 싸우기 위한 치료제로서 점점 더 많이 사용되고 있다. 치료 항체는 그의 다수의 작용 기전을 근거로 활용되어 왔으며, 상기 작용 기전은 하기를 포함한다: 1) 노출된 항체는 ADCC 또는 CDC에 의해 직접 종양 세포를 살해한다(예를 들어 트라스투주맵), 2) 세포막 분자를 차단하거나 자극하여 세포사 유도(예를 들어 세툭시맵), 3) 분비된 부분 중화(예를 들어 베바시주맵), 4) 부착된 부분, 예를 들어 약물, 독소, 방사성동위원소를 통한 살해, 및 5) T 세포 효과기 작용을 통한 면역계 조절.

거의 모든 경우에 있어서, 치료 이점을 생성시키기 위해, 항체는 그의 표적화된 항원에 대한 높은 친화성, 최소의 급성 및 장기간 부작용, 및 특정한 용도에서, 인간 Fc 수용체에 대한 높은 친화성을 포함한 중요한 성질들을 가져야 한다(4). 또한, 상기 표적화된 항원은 정상 조직 상에서가 아닌, 종양 상에서 높은 수준으로 발현되어야 하고(특이성 또는 선택성), 환자 중에서 및 환자 내에서 특정한 종양 중에서 일관되게 발현되어야 하며(낮은 이질성), 암세포의 생존에 필수적이거나 또는 하향 조절될 듯 하지 않아야 한다.

이러한 특성들을 성취하기 위해서, 현재 연구자들은 기존의 항체를, 덜 면역원성으로 만들고, Fc 영역 중의 단백질과 탄수화물 잔기를 모두 ADCC 및 CDC가 증대하도록 변형시키며, 잠재적으로 보다 양호한 종양 침투를 위해 상기 항체의 크기를 수축시키고, 친화성을 개선시키기 위해 가변 영역을 돌연변이시키며, 항체 역가를 변화시킴으로써 결합활성을 증가시키고, 신규의 항체-융합 단백질, 예를 들어 다단계 표적화를 위한 단백질을 제작하고(5) 면역 세포가 키메릭 항원 수용체(CAR)를 경유하도록 재배향하기 위해 재설계할 수 있다. 더욱 또한, 연구자들은 현재 승인된 항체들 가운데 성공에 기여할 수 있는 구조적 특성 및 숙주 특징을 계속해서 규정하고 있다(6).

세균, 바이러스 또는 종양 표적을 포함한 병원체 또는 질병 표적을 제거하거나 중화하기 위한 목적에 대해서, 항원-특이성의 항체-기본 치료가 상기 항체의 예민한 특이성으로 인해 특히 매력적이다.

따라서, 본 발명은 그것으로부터 다양한 항원-결합 단백질을 생성시킬 수 있는, 예를 들어 상기 단백질의 항원 처리 및 T-세포에의 제공에 따라서 상기 T-세포 수용체에 의해 전형적으로 인식되는 것과 유사한 HLA 분자와 단백질 단편(펩타이드)과의 복합체를 나타내는 항원 특이성 항체를 생성시킬 수 있는, 항원-특이성 결합 서열의 확인을 기본으로 한다. 파지 디스플레이를 사용하여, 본 발명의 항원-결합 단백질을 설계할 수 있는 초기 항원-결합 분자(항체 및 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함한다)를 선택한다.

따라서, 하나의 태양에서, 본 발명은

(A) 서열번호: 2, 5, 8, 10, 13, 14, 17, 20 중 하나의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 영역;

(B) 각각, 서열번호: 22 및 23; 24 및 25; 26 및 27; 28 및 29; 30 및 31; 32 및 33; 34 및 35; 및 36 및 37 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 V_L을 포함하는 항원 결합 영역; 및

(C) (i) 하기 3 개의 경쇄(LC) 상보성 결정 영역(CDR):

(a) 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR1; 및

(b) 각각, 서열번호: 57 및 64, 58 및 65, 59 및 66, 60 및 67, 61 및 68, 61 및 69, 62 및 70, 및 63 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2 및 CDR3; 및

(ii) 하기 3 개의 중쇄(HC) CDR:

(a) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR1; 및

(b) 각각, 서열번호: 40 및 48, 41 및 49, 42 및 50, 43 및 51, 44 및 52, 45 및 53, 46 및 54, 및 47 및 55 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2 및 CDR3

중 하나를 포함하는 단리된 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

관련된 태양에서, 본 발명은 단리된 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기에서 상기 단리된 항원-결합 단백질은 항체 또는 키메릭 항원 수용체이다. 상기 항체는 완전-길이 항체, 실질적으로 완전한 항체, Fab 단편, F(ab')₂ 단편 또는 단일 쇄 가변 단편(scFv)이다.

상기 단리된 항원-결합 단백질에서, 항체든 CAR이든 간에, 상기 항원-결합 영역은 HLA-펩타이드 복합체의 에피토프에 특이적으로 결합한다.

HLA-펩타이드 복합체의 부분으로서 본 발명의 항원-결합 단백질에 의해 인식되는 펩타이드는 비제한적으로 아미노산 서열 RMFPNAPYL (서열번호: 1)을 갖는 펩타이드; 아미노산 서열 LLDFVRFMGV (서열번호: 4)을 갖는 펩타이드; 아미노산 서열 RLTRFLSRV (서열번호: 7)을 갖는 펩타이드; 아미노산 서열 RIITSTILV (서열번호: 12)을 갖는 펩타이드; 및 아미노산 서열 LLEEMFLTV (서열번호: 19)을 갖는 펩타이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 펩타이드는 HLA-A2 항원과 관련하여 인식된다.

더욱 또 다른 태양에서, 본 발명의 단리된 항원-결합 단백질은 서열번호: 2, 5, 8, 10, 13, 14, 17 및 20으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다.

관련된 태양에서, 상기 단리된 항원-결합 단백질은 표 1 내지 8 중 어느 하나에 개시된 바와 같은 항원-결합 영역을 포함하는 융합 단백질이다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 항원-결합 단백질, 또는 그의 항원-결합 단편인 제 1 성분을 포함하는 면역접합체에 관한 것이다. 상기 면역접합체는 세포독소, 검출 가능한 표지, 방사성 동위원소, 치료제, 결합 단백질 또는 제 2 아미노산 서열을 갖는 분자인 제 2 성분을 포함한다. 상기 제 2 성분이 결합 단백질 또는 제 2 항체인 경우에, 상기 결합 단백질 또는 제 2 항체는 상기 HLA-펩타이드 복합체와 상이한 표적에 대해 결합 특이성을 갖는다.

따라서, 관련된 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시한 바와 같은 항원-결합 단백질 또는 그의 작용 단편을 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이다.

도 1은 개별적인 EBNA3C scFv 클론 315, 335, 327 및 345 (A) 및 정제된 EBNA 클론 315 scFv (B)로부터의 세균 상등액의 다양한 HLA-A2-펩타이드 복합체에의 결합을 도시하며, 이는 클론 315가 HLA-A2-LLDFVRFMGV 복합체에 매우 특이성임을 나타낸다.
도 2는 개별적인 WT-1 scFv 클론 42, 43 및 45 (A) 및 정제된 WT-1 클론 45 scFv (B)로부터의 세균 상등액의 다양한 HLA-A2-펩타이드 복합체에의 결합을 도시하며, 이는 WT-1 클론 42, 43 및 45가 재조합 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체에 매우 특이성임을 나타낸다.
도 3은 HLA-A2가 LLDFVRFMGV 또는 또 다른 (관련되지 않은) 펩타이드로 펄스화되거나 펄스화되지 않은 TAP-결함(TAP^-) T2 세포 상에서 검출될 수 있지만(A) EBNA 클론 315 scFv는 LLDFVRFMGV로 펄스화된 T2 세포를 인식하지만 펄스화되지 않은 세포 또는 관련되지 않은 펩타이드로 펄스화된 세포는 인식하지 못하고(B), 약 78 nM에서 검출 하한을 가짐(C)을 도시한다.
도 4는 HLA-A2가 RMFPNAPYL 또는 LLDFVRFMGV로 펄스화되거나 펄스화되지 않은 TAP-결함(TAP^-) T2 세포 상에서 검출될 수 있지만(A) WT-1 클론 45 scFv는 RMFPNAPYL로 펄스화된 T2 세포를 인식하지만 펄스화되지 않은 세포 또는 LLDFVRFMGV로 펄스화된 세포는 인식하지 못함(B)을 도시한다.
도 5는 DIMT(A) 및 6268A(B) BLCL을 LLDFVRFMGV(중간 패널) 또는 KLQCVDLHV 펩타이드(오른쪽 패널)와 함께 배양하고 EBNA 클론 315 scFv로 염색한 경우, 오직 LLDFVRFMGV로 펄스화된 HLA-A2⁺ DIMT 펩타이드만이 염색될 수 있음을 도시하며, 이는 EBNA 클론 315 및 LLDFVRFMGV가 HLA-A2 제한됨을 나타내고; 시간 과정(기부 패널)은 상기 HLA-A2-LLDFVRFMGV 복합체가 상기 세포 표면상에서 안정함을 나타낸다.
도 6은 WT1 클론 45 및 EBNA 클론 315 scFv 서열의 어느 한쪽에 적합한 제한 효소 부위를 가하기 위해서 PCR에 사용된 톰린슨(Tomlinson) 라이브러리 벡터를 도시한다(도 6A). 도 6B는 NheI 및 ApaI에 의한 절단에 따라 1% 아가로스 젤 상에 나타난 절단된 PCR 산물을 도시한다.
도 7은 scFv-Fc 융합 단백질(도 7B)에 대한 발현 벡터를 생성시키기 위해 사용된 완전 IgG 발현 벡터(도 7A)를 도시한다. A. 독점 IgG 발현 벡터(11381 bp)의 구조. 상기 벡터는 2 개의 별도의 CMV 프로모터 하에서 중쇄 및 경쇄를 발현한다. 가변 중쇄(V_H)는 제 1, 제 2 및 제 3 불변 중쇄(CH_1,2,3)에 융합되고 하나의 프로모터 하에서 발현되는 반면 가변 경쇄(V_L)는 불변 경쇄(C_L)에 융합되고 상이한 프로모터 하에서 발현된다. 상기 벡터를 상기 중쇄의 제 1 불변 영역(CH₁)이 결여되도록 추가로 변형시켰으며, 상기 벡터를 scFv-Fc 융합 단백질의 제작에 사용하였다. B. NheI 및 ApaI을 사용하여 상기 IgG 벡터로부터 V_H의 절제 후에, 예비-절단된, 정제된 scFv PCR 산물을 상기 IgG 벡터에 연결하여 CH_2,3 도메인(Fc)에 융합된 scFv의 발현을 허용하였다.
도 8은 EBNA 클론 315 scFv-Fc를 사용하는 결합 연구의 결과를 도시하며, 여기에서 정제된 EBNA 클론 315 scFv-Fc는, HLA-A2-LLDFVRFMGV로 코팅되거나 코팅되지 않은 ELISA 플레이트 상에서의 결합에 대해 시험할 때(도 8A) 및 LLDFVRFMGV 펩타이드로 펄스화되거나 펄스화되지 않은 T2 세포 상에서의 결합에 대해 시험할 때(도 8B) 재조합 복합체에 대한 그의 결합 능력을 유지함을 나타내었다. T2 세포를 감소하는 농도의 LLDFVRFMGV 펩타이드와 함께 배양하고 후속으로 EBNA 클론 315 scFv-Fc로 염색한 경우, 검출 하한이 상기 scFv와 동일한 범위 내에 있는 것으로 입증되었다(200 nM 내지 20 nM)(도 8C).
도 9는 표면 플라스몬 공명을 사용하는 HLA-A2-LLDFVRFMGV에 대한 EBNA 클론 315의 동역학 측정 결과를 도시한다.
도 10은 형광-접합된 EBNA 클론 315 scFv-Fc를 사용하는 T2 세포 상에서의 HLA-A2-LLDFVRFMGV 복합체 정량분석의 결과를 도시한다(도 10A). 형광-접합된 EBNA 클론 315 scFv-Fc를 37 ℃에서 5 시간 동안 무혈청 IMDM 배지에서 LLDFVRFMGV 펩타이드로 펄스화하거나(20, 10 또는 5 μM) 또는 펄스화하지 않은(0 μM) T2 세포 상에서의 결합에 대해 시험하였다. 상기 세포를, 기지량의 항-인간 IgG₁ 항체를 함유하는 비드 외에, 상기 scFv-Fc로 염색하고 상기 세포의 형광 강도를 상기 비드의 형광 강도 및 그의 결합 부위의 수와 상관지었다. 이들 4 개의 펩타이드 농도 및 상응하는 복합체 수를 사용하여, 표준 곡선을 0.9948의 R² 값으로 생성시켰다. 도 B는 상기 펩타이드 및 복합체 스펙트럼의 하단부의 클로즈업 시야를 도시한다.
도 11은 정제된 WT1 클론 45 scFv-Fc를 HLA-A2-RMFPNAPYL로 코팅하거나 코팅하지 않은 ELISA 플레이트 상에서의 결합에 대해 시험한 경우의 결합 및 특이성의 결과를 도시한다(도 11A). 도 11B는 정제된 WT1 클론 45 scFv-Fc를 RMFPNAPYL 또는 RLTRFLSRV 펩타이드(40 μM)로 펄스화한 T2 세포 상에서의 결합에 대해 시험한 경우, 상기 scFv-Fc(채워지지 않은 선)는 오직 RMFPNAPYL-펄스화된 T2 세포만을 인식할 수 있었음을 도시한다.
도 12는 DIMT(상부) 및 6268A(기부) BLCL을 RMFPNAPYL(오른쪽 패널)과 배양하고 상기 펩타이드-펄스화된 BLCL을 WT1 클론 315 scFv-Fc(채워지지 않은 선) 또는 대조용 scFv(채워진 선)로 염색한 경우, 오직 HLA-A2-양성 RMFPNAPYL 펩타이드-펄스화된 DIMT BLCL만이 염색될 수 있었음을 도시한다.
도 13은 LLDFVRFMGV 펩타이드-펄스화된 세포의 EBNA 클론 315 scFv-Fc 매개된 ADCC(⁵¹Cr 방출을 사용하여 측정됨)를 도시한다.
도 14는 NK92MI 세포에서 항-EBNA CAR의 형질도입 및 발현에 사용된 암피실린-내성과 함께 IRES-GFP 서열을 함유하는 MSCV-기재 벡터(왼쪽 패널)를 도시한다. A 상기 EBNA 클론 315 scFv 서열을 CAR 유전자 내로 클로닝하였으며(EBNA CAR) 추가로 암피실린-내성과 함께 IRES-GFP 서열을 함유한 MSCV-기재 벡터(왼쪽 패널) 내로 클로닝하였다. 상기 생성되는 CAR(오른쪽 패널)은 상기 세포 내에 존재하는 4-1BB 및 CD3ζ 쇄와 함께, 세포외 표면 상의 scFv 및 힌지 영역, 막관통 도메인으로 구성된다. B 293T GP2 세포를 사용하는 레트로바이러스 패키징 및 NK92MI 세포 내로의 형질도입 후에, 상기 NK92MI 세포의 대략 24%가 모의 형질도입된(빈 레트로바이러스) NK92MI 세포(왼쪽 패널; 채워진 선)에 비해 GFP 발현에 근거한 구조물(왼쪽 패널; 채워지지 않은 선)을 함유하였다. 상기 GFP-양성 세포 중에서, 상부 20%는 유식 세포측정에 의해 분류되었고 확대되어 안정하게 형질도입된 세포의 집단을 제공하였으며 이는 90% 초과의 GFP 양성이었다(오른쪽 패널). 레트로바이러스 형질도입을 3 가지 별도의 경우들로 수행하였으며, 24%가 가장 높은 효율이었다.
도 15는 WT1 클론 45 CAR 벡터의 EcoRI 및 XhoI 절단 확인을 도시한다. A. 서열 확인과 함께, 단리, 형질전환 및 EcoRI 및 XhoI 절단 후에 8 개의 상이한 세균 콜로니로부터 단리된 플라스미드를 1% 아가로스 젤 상에서 실행시켰다. 람다 HindIII 및 100 bp 마커를 근거로, 밴드들이 정확한 크기(약 1500 bp 및 약 6000 bp)임이 측정되었다. B. 상기 생성되는 WT1 클론 45 CAR 벡터의 구조는 원래의 세인트 주드(St. Jude) CAR 벡터와 동일한 성분들을 가지며, 유일한 차이는 scFv 서열이다.
도 16은 클론 315 CAR-발현 NK92MI 세포가 CD107a 발현을 통해 펩타이드-펄스화된 T2 세포 상에서 HLA-A2-EBNA3C 복합체를 특이적으로 검출할 수 있음을 도시한다. T2 세포를 LLDFVRFMGV 또는 YMFPNAPYL 펩타이드 20 μM로 펄스화하거나 펄스화하지 않았다. 이어서 CAR-구비된(equipped) NK92MI 세포를 펩타이드 펄스화되거나 펄스화되지 않은 세포의 존재 또는 부재 하에서 37 ℃에서 5 시간 동안 항-CD107a-PE 접합된 항체를 함유하는 배지에서 배양하였다. A. CAR-구비된 NK92MI 세포를 GFP 형광을 기준으로 거르고(gated) CD107a 발현에 대해 분석하였다. 임의의 T2 세포 없이 배양된 NK92MI 세포 또는 펄스화되지 않은 T2 세포 및 YMFPNAPYL-펄스화된 T2 세포와 함께 배양된 세포들은 비반응성인 반면 LLDFVRFMGV-펄스화된 T2 세포와 함께 배양된 NK92MI 세포는 배경 수준 이상의 27%의 CD107a 발현의 증가를 도출하였다. B. T2 세포를 감소하는 농도의 LLDFVRFMGV로 펄스화하고 후속으로 CAR-구비된 NK92MI 세포와 함께 배양하였다. NK92MI 세포는 T2 세포가 단지 10 nM의 펩타이드로 펄스화된 경우에조차 그의 세포 표면 상에 현저한 양의 CD107a를 제공하였다.
도 17은 HLA-A2⁺(DIMT) 및 HLA-A2^-(6268A) BLCL이 LLDFVRFMGV로 펄스화하고 이어서 CAR-구비된 NK92MI 세포를 펩타이드 펄스화되거나 펄스화되지 않은 세포와 함께 또는 상기 세포 없이 항-CD107a-PE 접합된 항체를 함유하는 배지에서 배양한 유식 세포측정의 결과를 도시한다. CAR-구비된 NK92MI 세포를 GFP 형광을 기준으로 거르고 CD107a 발현에 대해 분석하였다. 임의의 BLCL 없이 배양된 NK92MI 세포 또는 LLDFVRFMGV-펄스화된 6268A BLCL과 함께 배양된 세포들은 비반응성인 반면 펄스화되지 않은 DIMT BLCL 또는 LLDFVRFMGV-펄스화된 DIMT BLCL과 함께 배양된 NK92MI 세포는 배경 수준(펄스화된 6268A) 이상의 0.5% 및 25%의 CD107a 발현의 증가를 도출하였으며, 이는 상기 EBNA 클론 315 CAR-발현 NK92MI 세포가 CD107a 발현을 통해 펩타이드-펄스화된 BLCL 상에서 HLA-A2-EBNA3C 복합체를 특이적으로 검출할 수 있음을 보인다.
도 18은 T2 세포를 감소하는 농도의 LLDFVRFMGV로 펄스화하거나 또는 펄스화하지 않은 ⁵¹Cr 방출 분석의 결과를 도시한다. CAR-구비된 NK92MI 세포를 3:1 E:T 비로 ⁵¹Cr-표지된 T2 세포와 함께 배양하였으며 이는 EBNA 클론 315 CAR-발현 NK92MI 세포가 펩타이드-펄스화된 T2 세포 상에서 HLA-A2-EBNA3C 복합체를 특이적으로 검출할 수 있음을 입증한다. 2 nM의 펩타이드의 경우에조차, 펄스화되지 않은 T2 세포에 비해 펩타이드-특이성 세포독성을 관찰할 수 있었다.
도 19는 EBNA 클론 315 CAR-발현 NK92MI 세포가 ⁵¹Cr 방출을 통해 펩타이드-펄스화된 BLCL 상에서 HLA-A2-EBNA3C 복합체를 특이적으로 검출할 수 있음을 도시한다. BLCL을 LLDFVRFMGV로 펄스화하였다. 이어서 CAR-구비된 NK92MI 세포를 ⁵¹Cr 표지된 표적 세포와 배양하였다. A. CAR 구비된 NK92MI 세포는 펩타이드 펄스화된 DIMT와 6268A BLCL 사이를 특이적으로 식별할 수 있었으며, 상기 2 개의 상이한 표적들 간의 세포독성에 있어서 분명한 차이가 있었다. B. 펩타이드-펄스화된 DIMT BLCL의 CAR-매개된 살해를 상기 EBNA 클론 315 scFv-Fc 융합 단백질을 사용하여 차단할 수 있었으나, 20:1 E:T 비에서 관련되지 않은, 아이소타입-합치된 scFv-Fc에 의해서는 차단할 수 없었다.
도 20은 CAR-구비된 NK92MI 세포를 ⁵¹Cr 표지된, 펄스화되지 않은 BLCL과 배양한 ⁵¹Cr 방출 분석의 결과를 도시한다. A. CAR-구비된 NK92MI 세포는 임의의 외부 펩타이드의 부재 하에서 함께 배양 시 HLA-A2^- 6268A 및 GKO BLCL에 비해 HLA-A2⁺ DIMT 및 JG19 BLCL에 대해 더 반응성이었다. B. 펄스화되지 않은 DIMT BLCL의 CAR-매개된 살해를 상기 EBNA 클론 315 scFv-Fc 융합 단백질을 사용하여 차단할 수 있었으나, 10:1 E:T 비의 관련되지 않은, 아이소타입-합치된 scFv-Fc에 의해서는 차단할 수 없었으며, 이는 EBNA 클론 315 CAR-발현 NK92MI 세포가 HLA-A2⁺ BLCL 상의 HLA-A2-EBNA3C 복합체를 특이적으로 검출할 수 있음을 입증한다.
도 21은 CD16(V)-발현 NK92MI 세포를 ⁵¹Cr 표지된, LLDFVRFMGV-펄스화된 DIMT BLCL 및 EBNA 클론 315 또는 관련되지 않은 scFv-Fc와 배양한 EBNA의 ⁵¹Cr 방출 분석의 결과를 도시한다. 15:1의 E:T 비에서, EBNA 클론 315 scFv-Fc는 표적 세포의 30 내지 35%를 살해할 수 있었다.
도 22는 클론 315 CAR-발현 NK92MI 세포를 상기와 같이 LLDFVRFMGV-펄스화된 DIMT BLCL 및 EBNA 클론 315 또는 관련되지 않은 scFv-Fc와 배양한 EBNA의 ⁵¹Cr 방출 분석의 결과를 도시한다. 도 21에서와 같은 E:T 비에서, 상기 CAR-구비된 세포는 EBNA 클론 scFv-Fc를 사용한 특이적인 억제와 함께 표적 세포의 80 내지 90%를 살해할 수 있었으며, 이는 CAR-매개된 살해가 펩타이드-펄스화된 DIMT BLCL 상에서 scFv-Fc-매개된 ADCC보다 더 효능 있음을 입증한다.
도 23은 NK92MI 세포에서 항-WT1 CAR의 형질도입 및 발현에 사용된 암피실린-내성과 함께 IRES-GFP 서열을 함유하는 MSCV-기재 벡터(왼쪽 패널)를 도시한다. A. 상기 WT1 클론 45 scFv 서열을 CAR 유전자 내로 클로닝하고(항-WT1 CAR) MSCV-기재 벡터 내로 추가로 클로닝하였다. 생성되는 CAR(오른쪽 패널)은 상기 세포 내에 존재하는 4-1BB 및 CD3ζ 쇄와 함께, 세포외 표면 상의 scFv 및 힌지 영역, 막관통 도메인으로 구성된다. B 293T GP2 세포를 사용하는 레트로바이러스 패키징 및 NK92MI 세포 내로의 형질도입 후에, 상기 NK92MI 세포의 대략 27.5%가 모의 형질도입된(빈 레트로바이러스) NK92MI 세포(왼쪽 패널; 채워진 선)에 비해 GFP 발현에 근거한 구조물(왼쪽 패널; 채워지지 않은 선)을 함유하였다. 상기 GFP-양성 세포 중에서, 상부 20%는 유식 세포측정에 의해 분류되었고 확대되어 안정하게 형질도입된 세포의 집단을 제공하였으며 이는 98% 초과의 GFP 양성이었다(오른쪽 패널).
도 24는 CAR 구비된 NK92MI 세포가 펩타이드 펄스화된 DIMT(■)와 6268A BLCL(●) 사이를 특이적으로 식별할 수 있는 ⁵¹Cr 방출 분석의 결과를 도시하며, 상기 2 개의 상이한 표적들 간에는 세포독성에 있어서 분명한 차이가 있었고, 이는 WT1 클론 45 CAR을 발현하는 NK92MI 세포가 펩타이드-펄스화된 BLCL 상의 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체를 특이적으로 검출할 수 있음을 입증한다.
도 25는 펩타이드-펄스화된 DIMT BLCL의 CAR-매개된 살해를 상업적인 항-HLA-A2 항체(5 ㎍/㎖)를 사용하여 차단할 수 있었으나, 9:1 E:T 비의 관련되지 않은, 아이소타입-합치된 항체(5 ㎍/㎖)에 의해서는 차단할 수 없었음을 도시한다.
도 26은 WT1 클론 45 CAR을 발현하는 NK92MI 세포가 ⁵¹Cr 방출을 통해 DIMT BLCL 상의 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체를 특이적으로 검출할 수 있음을 도시한다. A. CAR-구비된 NK92MI 세포는 DIMT와 6268A BLCL 사이를 특이적으로 식별할 수 있었으며, 이때 상기 2 개의 상이한 표적들 간의 세포독성에 있어서 분명한 차이가 있었다. B. DIMT BLCL의 CAR-매개된 살해를 상기 WT1 클론 45 scFv-Fc 융합 단백질(20 ㎍/㎖)을 사용하여 차단할 수 있었으나, 2:1 E:T 비의 관련되지 않은, 아이소타입-합치된 scFv-Fc에 의해서는 차단할 수 없었다.
도 27은 WT1 클론 45 CAR을 발현하는 NK92MI 세포가 ⁵¹Cr 방출을 통해 펩타이드-펄스화된 BLCL 상의 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체를 특이적으로 검출할 수 있음을 도시한다. A. CAR-구비된 NK92MI 세포는 펩타이드 펄스화된 DIMT와 6268A BLCL 사이를 특이적으로 식별할 수 있었으며, 이때 상기 2 개의 상이한 표적들 간의 세포독성에 있어서 분명한 차이가 있었다.
도 28은 WT1 클론 45 CAR을 발현하는 NK92MI 세포가 ⁵¹Cr 방출을 통해 697 및 OVCAR-3 세포 상의 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체를 특이적으로 검출할 수 있음을 도시한다.

본 발명에서 인용된 모든 특허, 공보, 출원 및 다른 참고문헌들은 본 출원에 내용 전체가 참고로 인용된다.

본 발명의 실시에 있어서, 당해 분야의 기술 내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 다수의 통상적인 기법들을 사용한다. 이들 기법은 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: a Laboratory Manual 3rd edition, J.F. Sambrook and D.W. Russell, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001]; [Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Melvyn Little, ed. Cambridge University Press 2009]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994)]; ["A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)]; ["Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001)]에 더욱 상세히 개시되어 있다. 제조사의 설명서를 포함하여, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있고 이들에 의해 의존되는 표준 프로토콜을 함유하는 상기 참고문헌 및 다른 참고문헌들은 본 명세의 일부로서 본 발명에 참고로 인용된다.

하기의 약어들은 본 출원 전체를 통해 사용된다:

ADCC: 항체-의존성 세포 세포독성

ALL: 급성 림프구성 백혈병

AML: 급성 골수성 백혈병

APC: 항원 제공 세포

β2M: 베타-2-미세글로불린

BiTE: 이중-특이성 T 세포 유인 항체

BLCL: EBV-형질전환된 B-세포 림프모구성 세포주

CAR: 키메릭 항원 수용체

CDC: 보체 의존성 세포독성

CMC: 보체 매개된 세포독성

CDR: 상보성 결정 영역(또한 하기 HVR 참조)

C_L: 경쇄의 불변 도메인

CH₁: 중쇄의 제 1 불변 도메인

CH_1,2,3: 중쇄의 제 1, 제 2 및 제 3 불변 도메인

CH_2,3: 중쇄의 제 2 및 제 3 불변 도메인

CHO: 중국 햄스터 난소

CTL: 세포독성 T 세포

EBNA3C: 엡스타인-바 핵 항원 3C

EBV: 엡스타인-바 바이러스

ECMV: 뇌심근염 바이러스

ER: 소포체

E:T 비: 효과기:표적 비

Fab: 항체 결합 단편

FACS: 유동 지원된 세포측정 세포 분류

FBS: 소 태아 혈청

GFP: 녹색 형광 단백질

HC: 중쇄

HEL: 난백 라이소자임

HLA: 인간 백혈구 항원

HVR-H: 초가변영역-중쇄(또한 CDR 참조)

HVR-L: 초가변영역-경쇄

Ig: 면역글로불린

IPTG: 아이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노사이드

IRES: 내부 리보솜 유입점

K_D: 해리 상수

k_off: 해리율

k_on: 결합률

MHC: 주 조직적합 복합체

OPD: O-페닐렌다이아민

PEG: 폴리에틸렌 글리콜

scFv: 단일-쇄 가변 단편

SPR: 표면 플라스몬 공명

TB: 테리픽 브로쓰(Terrific Broth)

TCE: T 세포 에피토프

TCR: T 세포 수용체

TIL: 종양 침윤 림프구

V_H: 가변 중쇄

V_L: 가변 경쇄

WT1: 윌름스 종양 단백질 1

하기의 설명에서, 몇몇 규약들은 용어의 관례를 따를 것이다. 일반적으로, 본 발명에 사용되는 용어들을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 바와 같은 용어들의 의미와 일치되게 해석하고자 한다.

"항원-결합 단백질"은 항원-결합 영역 또는 항원-결합 부분을 포함하는, 즉 결합되는 또 다른 분자에 대해 강한 친화성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 항원-결합 단백질은 항체, 항원 수용체 및 융합 단백질을 포함한다.

당해 분야에 공지된 바와 같은 "항체" 및 "항체들"이란 용어는 면역계와 관련하여 발생하는 항원 결합 단백질을 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "항체"란 용어는 상기 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 영역"을 보유하는 완전한 전체 길이 항체 및 그의 임의의 단편 또는 그의 단일 쇄를 포함한다. 천연 "항체"는 다이설파이드 결합에 의해 상호-연결되는 적어도 2 개의 중쇄(H) 및 2 개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 발명에서 V_H라 약기함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 상기 중쇄 불변 영역은 3 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 발명에서 V_L이라 약기함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 C_L로 구성된다. 상기 V_H 및 V_L 영역들은, 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는 보다 보존된 영역들이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는 초가변성의 영역들로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 하기의 순서로 아미노-말단에서부터 카복시-말단으로 배열된 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 상기 항체의 불변 영역은 면역글로불린의, 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 다양한 세포(예를 들어 효과기 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제 1 성분(C1q)에 대한 결합을 매개할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 영역"(또는 간단히 "항원 부분")이란 용어는 항원 특이성을 부여하는 항체의 영역 또는 부분을 지칭하며; 따라서 항원-결합 단백질, 예를 들어 항체의 단편은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편(예를 들어 HLA-펩타이드 복합체)을 포함한다. 항체의 항원-결합 작용은 완전 길이 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항체 단편"이란 용어 내에 포함되는 항원-결합 단편의 예는 Fab 단편, V_L, V_H, C_L 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편; F(ab)₂ 단편, 힌지 영역에서 다이설파이드 가교에 의해 결합된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; V_H 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; 항체의 단일 가지의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; V_H 도메인으로 이루어지는 dAb 단편(문헌[Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.

더욱 또한, 상기 Fv 단편의 2 개의 도메인, V_L 및 V_H가 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, 상기 V_L 및 V_H 영역들이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 만들어질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다(단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지됨; 예를 들어 문헌[Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883]을 참조하시오). 상기와 같은 단일 쇄 항체를 또한 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어 내에 포함시키고자 한다. 이들 항체 단편을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 수득하며, 상기 단편을 완전 항체와 동일한 방식으로 유용성을 위해 선별한다.

"단리된 항체" 또는 "단리된 항원-결합 단백질"은 그의 천연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수된 것이다.

전통적으로, MHC-펩타이드 복합체는 오직 T-세포 수용체(TCR)에 의해서만 인식될 수 있었으며, 이는 T 세포-기재 판독 분석의 사용을 위해 관심 에피토프를 검출하는 우리의 능력을 제한하였다. 본 명세에서, 재조합 HLA-펩타이드 복합체를 사용하여 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택되는 scFv를 기본으로 하는 항원-결합 영역을 갖는, 항체 및 키메릭 항원 수용체를 포함한 항원 결합 단백질을 개시한다. 이들 분자는 예를 들어 각각 오직 HLA-A2-LLDFVRFMGV 및 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체만을 인식하는 항-EBNA 및 항-WT1 항원-결합 단백질에 대해 나타나는 바와 같이 정교한 특이성을 나타내었다. 또한, 다른 펩타이드를 함유하는 HLA-복합체에 결합할 수 없음과 함께, 상기 분자는 또한 펩타이드 자신에 결합할 수 없었으며, 이는 그의 TCR-유사 특이성을 입증한다.

파지 디스플레이에 의해 선택된 본 명세의 scFv는 초기에 HLA-양성 세포의 표면 상에 제공된 펩타이드에 결합하는 그의 능력에 대해 시험되었다. T2 세포 및 BLCL을 펩타이드의 존재 하에서 배양한 후에, 상기 세포는 유식 세포측정을 사용하여 상기 펩타이드를 선택적으로 인식할 수 있었다. 하나의 펩타이드, LLDFVRFMGV(서열번호:)의 경우에, 상기 펩타이드가 HLA와 형성된 복합체를 24 시간 펄스화 후에 조차도 BLCL의 표면 상에서 검출할 수 있었으며, 이는 상기 항체의 유용성을 입증한다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 중쇄의 제 2 및 제 3 불변 도메인(CH_2,3)에 융합하여 인간 면역글로불린의 Fc 영역의 아래 1/3을 형성하여 2가 단백질 및 그의 단편을 제공하는 scFv 서열을 갖는 항체를 포함하며, 이는 상기 항체의 전체 결합 활성 및 안정성을 증가시킨다.

또한, Fc 부분은, 예를 들어 항원 정량분석 연구에 사용하기 위해서, 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하는 친화성 측정을 위해 항체를 고정화시키기 위해서, 치료제의 표적화된 전달을 위해서, CD16-발현 면역 효과기 세포를 사용하여 Fc-매개된 세포독성을 시험하기 위해서 및 다수의 다른 용도를 위해서, 다른 분자, 예를 들어 비제한적으로 형광 염료, 세포독소, 방사성 동위원소 등의 항체에의 직접적인 접합을 허용한다.

상기 정제된 scFv-Fc 융합 단백질을 ELISA 및 펩타이드-펄스화된 APC에 의해 그의 표적화된 T-세포 에피토프(TCE)에의 결합에 대해 시험하였다. 일단 상기 단백질이 그의 특이성을 유지하는 것으로 확인되었으면, 하나의 분자, EBNA 클론 315를 친화성 측정을 위해 사용하였다. 상기 분자는 전형적인 TCR-MHC-펩타이드 복합체 상호작용에 비해 10 내지 100 배 더 큰 친화성으로 1:1 상호작용을 통해 그의 표적화된 TCE에 결합할 수 있음이 입증되었다.

항원 밀도와 APC의 펩타이드 펄스화의 상관관계가 입증되었다. 정량분석 비드와 결합된, 형광-접합된 scFv-Fc는 세포를 상이한 농도의 펩타이드와 함께 배양할 때 형성되는 복합체 수의 어림을 허용하였다. 상기 정보를 사용하여, 유식 세포측정에 의해, 대략 100 복합체인 scFv 및 scFv-Fc 융합 단백질의 감도를 어림하는 것이 가능하였다.

마지막으로, 상기 융합 단백질의 Fc 부분이 그의 효과기 작용을 유지하는지의 여부를 시험하였다. 본 발명의 scFv 실시태양, CD16(V)-형질도입된 NK92MI 세포, 및 펩타이드-펄스화된 표적 세포를 사용하여, 상기 항체가 ADCC에 의해 그의 Fc-매개된 효과기 작용을 유지함을 입증하였다.

여기에서 제공된 결과는 MHC-펩타이드 복합체의 표적화에 있어서 본 발명의 항원 결합 단백질의 특이성, 감도 및 유용성을 강조한다.

따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 세포내 또는 바이러스 단백질로부터 유래한 펩타이드/단백질 단편의 복합체, 및 예를 들어 상기 복합체가 T-세포에 의한 인식을 위해 세포 표면에 존재할 수도 있으므로, MHC 부류 I 분자를 인식하는 재조합 항원-결합 분자 및 그의 부분에 관한 것이다.

본 발명의 분자는 파지 디스플레이를 사용하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 확인 및 선택을 기본으로 하며, 상기 분자의 아미노산 서열은 관심 MHC 제한된 펩타이드에 대한 상기 분자의 특이성을 부여하고 본 명세의 모든 항원 결합 단백질들의 토대를 형성한다. 따라서, 상기 scFv를 사용하여, 예를 들어 완전 길이 항체, 그의 단편, 예를 들어 Fab 및 F(ab')₂, 미니항체, scFv-Fc 융합물을 포함한 융합 단백질, 다가 항체, 즉 동일한 항원 또는 상이한 항원에 대해 하나보다 많은 특이성을 갖는 항체, 예를 들어 이중특이성 T-세포 유인 항체(BiTe), 트라이바디 등을 포함한 "항체" 분자들의 다양한 배열을 설계할 수 있다(문헌[Cuesta et al., Multivalent antibodies: when design surpasses evolution. Trends in Biotechnology 28:355-362 2010]을 참조하시오).

상기 항원-결합 단백질이 완전 길이 항체인 실시태양에서, 본 발명 항체의 중쇄 및 경쇄는 완전 길이이거나(예를 들어 항체가 하나 이상, 및 바람직하게는 2 개의 완전한 중쇄, 및 하나 이상, 및 바람직하게는 2 개의 완전한 경쇄를 포함할 수 있다), 또는 항원-결합 부분(Fab, F(ab')₂, Fv 또는 단일 쇄 Fv 단편("scFv"))을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 항체 중쇄 불변 영역을 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE로부터 선택한다. 일부 실시태양에서, 상기 면역글로불린 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 보다 특히 IgG1(예를 들어 인간 IgG1)으로부터 선택된다. 항체 유형의 선택은 상기 항체를 유도해 내도록 설계된 면역 효과기 작용에 따라 변할 것이다.

재조합 면역글로불린의 제작에 있어서, 다양한 면역글로불린 아이소타입의 불변 영역에 대한 적합한 아미노산 서열 및 광범위한 항체 배열의 생성 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.

일부 실시태양에서, 상기 항체의 불변 영역을, 항체의 성질들을 변형시키기 위해서(예를 들어 Fc 수용체 결합, 항체 탄수화물, 예를 들어 글리코실화 또는 퓨코실화, 시스테인 잔기의 수, 효과기 세포 작용, 또는 보체 작용 중 하나 이상을 증가시키거나 감소시키기 위해서) 변경시킨다, 예를 들어 돌연변이시킨다.

하나의 실시태양에서, 상기 항원 결합 단백질은, 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하고 HLA-A2와 함께 아미노산 서열 RMFPNAPYL(서열번호: 1)을 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항원 결합 영역을 갖는 항-WT1/HLA-A2 항체 또는 그의 단편이다. 다른 실시태양에서, 상기 항-WT-1 항체는 표 1 중에서 선택된 VH 및 VL 영역 또는 CDR을 갖는 scFv-Fc 융합 단백질 또는 완전 길이 인간 IgG이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 항원 결합 단백질은, 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하고 HLA-A2와 함께 아미노산 서열 LLDFVRFMGV(서열번호: 4)를 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항원 결합 영역을 갖는 항-EBNA3C 항체 또는 그의 단편이다. 다른 실시태양에서, 상기 항-EBNA3C 항체는 표 2 중에서 선택된 VH 및 VL 영역 또는 CDR을 갖는 scFv-Fc 융합 단백질 또는 완전 길이 인간 IgG이다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 항원 결합 단백질은, 서열번호: 8 및 10 중 하나의 아미노산 서열을 포함하고 HLA-A2와 함께 아미노산 서열 RLTRFLSRV(서열번호: 7)를 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항원 결합 영역을 갖는 항-CCND1 항체 또는 그의 단편이다. 다른 실시태양에서, 상기 항-CCND1 항체는 표 3 및 4 중에서 선택된 VH 및 VL 영역 또는 CDR을 갖는 scFv-Fc 융합 단백질 또는 완전 길이 인간 IgG이다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 항원 결합 단백질은, 서열번호: 13, 14 및 17 중 하나의 아미노산 서열을 포함하고 HLA-A2와 함께 아미노산 서열 RIITSTILV(서열번호: 12)를 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항원 결합 영역을 갖는 항-HUD 항체 또는 그의 단편이다. 다른 실시태양에서, 상기 항-HUD 항체는 표 5 내지 7 중에서 선택된 VH 및 VL 영역 또는 CDR을 갖는 scFv-Fc 융합 단백질 또는 완전 길이 인간 IgG이다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 항원 결합 단백질은, 서열번호: 20의 아미노산 서열을 포함하고 HLA-A2와 함께 아미노산 LLEEMFLTV(서열번호: 19)를 갖는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항-cdr2 항체 또는 그의 단편이다. 다른 실시태양에서, 상기 항-cdr2 항체는 표 8 중에서 선택된 VH 및 VL 영역 또는 CDR을 갖는 scFv-Fc 융합 단백질 또는 완전 길이 인간 IgG이다.

표 1 내지 8에 따른 본 명세의 항원-결합 단백질의 실시태양들은 비제한적으로 하기를 포함한다:

(i) RASQSISSYLN (서열번호: 56)의 HVR-L1 서열 (ii) SASQLQS (서열번호: 57)의 HVR-L2 서열 (iii) QQGPGTPNT (서열번호: 64)의 HVR-L3 서열 (iv) SYAMS (서열번호: 38)의 HVR-H1 서열 (v) QIDPWGQETLYADSVKG (서열번호: 40)의 HVR-H2 서열, 및 (vi) LTGRFDY (서열번호: 48)의 HVR-H3 서열을 포함하는 HLA-제한된 펩타이드 RMFPNAPYL (서열번호: 1)에 결합하는 항-WT-1 항체;

(i) RASQSISSYLN (서열번호: 56)의 HVR-L1 서열 (ii) LASNLQS (서열번호: 58)의 HVR-L2 서열 (iii) QQAEYMPLT (서열번호: 65)의 HVR-L3 서열 (iv) GYAMS (서열번호: 39)의 HVR-H1 서열 (v) EIAPPGLNTRYADSVKG (서열번호: 41)의 HVR-H2 서열, 및 (vi) SDTAFDY (서열번호: 49)의 HVR-H3 서열을 포함하는 HLA-A2 제한된 펩타이드 LLDFVRFMGV (서열번호: 4)에 결합하는 항-EBNA3C 항체;

(i) RASQSISSYLN (서열번호: 56)의 HVR-L1 서열 (ii) YASYLQS (서열번호: 59)의 HVR-L2 서열 (iii) QQSSSSPDT (서열번호: 66)의 HVR-L3 서열 (iv) SYAMS (서열번호: 38)의 HVR-H1 서열 (v) TISDSDATDYADSVKG (서열번호: 42)의 HVR-H2 서열, 및 (vi) TTDYFDY (서열번호: 50)의 HVR-H3 서열을 포함하는 HLA-A2 제한된 펩타이드 RLTRFLSRV (서열번호: 7)에 결합하는 항-CCND1 항체;

(i) RASQSISSYLN (서열번호: 56)의 HVR-L1 서열 (ii) AASALQS (서열번호: 60)의 HVR-L2 서열 (iii) QQGTDSPAT (서열번호: 67)의 HVR-L3 서열 (iv) SYAMS (서열번호: 38)의 HVR-H1 서열 (v) DISDDGDATYYADSVKG (서열번호: 43)의 HVR-H2 서열, 및 (vi) SSTTFDY (서열번호: 51)의 HVR-H3 서열을 포함하는 HLA-A2 제한된 펩타이드 RLTRFLSRV (서열번호: 7)에 결합하는 항-CCND1 항체;

(i) RASQSISSYLN (서열번호: 56)의 HVR-L1 서열 (ii) DASTLQS (서열번호: 61)의 HVR-L2 서열 (iii) QQTDSYPTT (서열번호: 68)의 HVR-L3 서열 (iv) SYAMS (서열번호: 38)의 HVR-H1 서열 (v) DIASTGYYTDYADSVKG (서열번호: 44)의 HVR-H2 서열, 및 (vi) NNASFDY (서열번호: 52)의 HVR-H3 서열을 포함하는 HLA-A2 제한된 펩타이드 RIITSTILV (서열번호: 12)에 결합하는 항-HUD 항체;

(i) RASQSISSYLN (서열번호: 56)의 HVR-L1 서열 (ii) DASTLQS (서열번호: 61)의 HVR-L2 서열 (iii) QQDDAYPTT (서열번호: 69)의 HVR-L3 서열 (iv) SYAMS (서열번호: 38)의 HVR-H1 서열 (v) SISSSGYYTDYADSVKG (서열번호: 45)의 HVR-H2 서열, 및 (vi) SASSFDY (서열번호: 53)의 HVR-H3 서열을 포함하는 HLA-A2 제한된 펩타이드 RIITSTILV (서열번호: 12)에 결합하는 항-HUD 항체;

(i) RASQSISSYLN (서열번호: 56)의 HVR-L1 서열 (ii) AASYLQS (서열번호: 62)의 HVR-L2 서열 (iii) QQDNNYPTT (서열번호: 70)의 HVR-L3 서열 (iv) SYAMS (서열번호: 38)의 HVR-H1 서열 (v) SISSDGSYTDYADSVKG (서열번호: 46)의 HVR-H2 서열, 및 (vi) STDAFDY (서열번호: 54)의 HVR-H3 서열을 포함하는 HLA-A2 제한된 펩타이드 RIITSTILV (서열번호: 12)에 결합하는 항-HUD 항체; 및

(i) RASQSISSYLN (서열번호: 56)의 HVR-L1 서열 (ii) GASGLQS (서열번호: 63)의 HVR-L2 서열 (iii) QQSANAPTT (서열번호: 71)의 HVR-L3 서열 (iv) SYAMS (서열번호: 38)의 HVR-H1 서열 (v) TINYSGSGTTYADSVKG (서열번호: 47)의 HVR-H2 서열, 및 (vi) NAAYFDY (서열번호: 55)의 HVR-H3 서열을 포함하는 HLA-A2 제한된 펩타이드 LLEEMFLTV (서열번호: 19)에 결합하는 항-cdr2 항체.

실시예 - 일반적인 과정

실시예 1: 비오틴화된 MHC-펩타이드 복합체의 생산

용해성 MHC 부류 I/펩타이드 복합체를, 에스케리키아 콜라이에서 재조합 단백질로서 HLA-A2 중쇄(HC) 및 β2 미세글로불린(β₂M)의 과발현 및 후속으로 고 농도의 특이적인 펩타이드의 존재 하에서 시험관 내 리폴딩 및 조립에 의해 생성시켰다(35,36). 용해성 MHC/펩타이드 복합체를 수득하기 위해서, 상기 HC 서열을 돌연변이시켜 시토솔 및 막관통 영역을 제거하였다. 리폴딩된 단량체성 MHC/펩타이드 복합체를 특이적으로 비오틴화시키기 위해서, 상기 HC를 C-말단에서 특이적인 비오틴화 부위를 함유하는 융합 단백질로서 발현시켰다(37,38). 상기 짧은 서열은 비오틴 단백질 리가제 BirA를 사용하여 상기 서열 내에 단일 리신 잔기의 효소적인 시험관 내 비오틴화에 충분하다(39). 이러한 과정을 MSKCC 테트라머 코어(Tetramer Core) 설비에 의해 수행하였다.

실시예 2: 비오틴화된 MHC-펩타이드 복합체 상에서 파지의 선택

실시예 2.1: HLA-A2/EBNA3C(EBNA) 복합체 상에서 파지의 선택

대략 2.85 x 10⁸ 의 독립적인 scFv 클론을 함유하는 톰린슨 I + J 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리(40)를 앞서 공개된 방법(22)에 따라, 변형하여 선택에 사용하였다. 상기 두 라이브러리의 조합으로부터 7.5 x 10¹² 파지를 먼저 1 ㎖의 PBS 중의 스트렙트아비딘 상자성 다이나비드(Dynabead)(30 ㎕; 다이날(Dynal), 노르웨이 오슬로 소재) 및 150 ㎍의 비오틴화되지 않은 HLA-A2-YVDPVITSI(서열번호:)(관련되지 않은 복합체)와 함께 예비 배양하여, 스트렙트아비딘 또는 HLA-A2의 일반적인 프레임워크에 결합하는 항체를 발현한 임의의 파지를 제거하였다.

상기 다이나비드를 후속으로 자석을 사용하여 포획하고 상등액(파지 및 관련되지 않은 복합체 혼합물)을 7.5 ㎍의 비오틴화된 HLA-A2-LLDFVRFMGV(엡스타인-바 바이러스 EBNA3C-유래된) 및 7.5 ㎍의 비오틴화된 HLA-A2-NLVPMVATV(사이토메둘로바이러스(Cytomedullovirus) pp65-유래된)를 함유하는 별도의 튜브로 옮기고 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서 최종 혼합물(1 ㎖)을 200 ㎕의 다이나비드(2% 우유와 함께 예비배양하고 PBS로 세척된)에 가하고 내용물을 연속적으로 회전시키면서 RT에서 15 분 동안 혼합하였다. 이어서 상기 비드를 PBS/0.1% 트윈으로 10 회 및 PBS로 3 회 세척하고 결합된 파지를 RT에서 15 분간 PBS(0.5 ㎖) 중의 1 ㎎/㎖ 트립신을 사용하여 상기 다이나비드로부터 용리시켰다.

이어서 상기 파지를 사용하여 20 ㎖의 LB 중에서 37 ℃에서 1 시간 동안 TG1 에스케리키아 콜라이(대수기로 성장 중인)를 감염시켰다. 10¹² KM13 헬퍼 파지를 후속으로 상기 혼합물에 가하고, 추가로 30 분 동안 추가 배양하고, 상기 세포를 원심분리(10 분간 3000 rpm)를 사용하여 펠릿화하였다. 생성되는 세포 펠릿을 200 ㎖ LB + 암피실린(100 ㎍/㎖) + 가나마이신(50 ㎍/㎖) 중에 재현탁시키고 30 ℃에서 밤새 배양하였다.

다음날 아침, 상기 밤새 배양물을 3000 rpm에서 15 분간 원심분리하고 상등액(180 ㎖)을 얼음 상에서 1 시간 동안 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 혼합하여 선행의 선택 라운드로부터 증폭된 파지를 침전시켰다. 이어서 상기 PEG/파지 혼합물을 3000 rpm에서 20 분간 원심분리시키고, 생성되는 파지 펠릿의 일부를 후속의 패닝 라운드에 사용하는 반면 나머지는 -80 ℃에서 15% 글리세롤 중에서 동결시켰다. 후속의 패닝 라운드들을 상기와 동일한 프로토콜을 사용하여 수행하였으며 이때 다이나비드 세척 단계를 증가시키고 선택에 사용된 비오틴화된 복합체의 양은 감소시켰다.

최종 라운드의 항체 선택(제 3 또는 제 4 라운드) 후에, 용리된 파지를 사용하여 TG1 및 HB2151 에스케리키아 콜라이를 모두 감염시켰으며; TG1 세포를 상기 언급한 바와 같이 밤새 배양한 반면 HB2151 세포는 TYE + 암피실린(100 ㎍/㎖) 아가 플레이트 상에 도말하였다. 다음날 아침, 상기 아가 플레이트로부터 개별적인 콜로니를 골라 내어 400 ㎕ LB + 암피실린(100 ㎍/㎖)/웰을 함유하는 48-웰 플레이트의 개별적인 웰의 접종에 사용하였다. 37 ℃에서 3 내지 6 시간 배양 후에, 200 ㎕의 50% 글리세롤 용액을 각 웰에 가하고 상기 플레이트를 -80 ℃에서 단클론 모 배양물로서 보관하였다.

실시예 2.2: HLA-A2-RMFPNAPYL(WT-1) 복합체 상에서 파지의 선택

선택을, 약간 변형시켜 상기 방법과 유사하게 수행하였다. 상기 두 라이브러리의 조합으로부터 3.7 x 10¹² 파지를 먼저 1 ㎖의 PBS 중의 스트렙트아비딘 상자성 다이나비드(50 ㎕; 다이날, 노르웨이 오슬로 소재) 및 20 ㎍의 비오틴화되지 않은 HLA-A2-NLVPMVATV(관련되지 않은 복합체)와 함께 예비 배양하여 스트렙트아비딘 또는 HLA-A2 결합제를 고갈시켰다. 상기 다이나비드를 후속으로 자석을 사용하여 포획하고 상등액(파지 및 관련되지 않은 복합체 혼합물)을 5 ㎍의 비오틴화된 HLA-A2-RMFPNAPYL(WT1-유래된)을 함유하는 별도의 튜브로 옮기고 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서 최종 혼합물(1 ㎖)을 100 ㎕의 다이나비드(2% 우유와 함께 예비배양하고 PBS로 세척된)에 가하고 내용물을 연속적으로 회전시키면서 RT에서 30 분 동안 혼합하였다. 이어서 상기 비드를 PBS/0.1% 트윈으로 10 회 및 PBS로 3 회 세척하고 결합된 파지를 RT에서 20 분간 PBS(0.5 ㎖) 중의 1 ㎎/㎖ 트립신을 사용하여 상기 다이나비드로부터 용리시켰다. 모든 후속 단계들을 상기와 같이 수행하였다.

실시예 3: HB2151로부터 용해성 scFv의 발현 및 정제

개별적인 HB2151 클론을 함유하는 단클론 글리세롤 모액을 사용하여, 400 ㎕ LB + 암피실린(100 ㎍/㎖)/웰을 함유하는 별도의 48-웰 플레이트를 멸균 피펫 팁으로 복제-플레이트 유형 포맷으로 접종하였다. 상기 48-웰 배양물 플레이트를 후속으로, 상기 웰의 대부분이 0.4의 OD600에 도달할 때까지 37 ℃에서 배양하였다. 200 ㎕ LB + 암피실린(100 ㎍/㎖) + 아이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노사이드(IPTG; 1 mM 최종 농도)를 후속으로 각 웰에 가하여 scFv 생산을 유도하고 상기 플레이트를 28 ℃에서 밤새 추가로 배양하였다. 다음날 아침, 상기 플레이트를 3000 rpm에서 15 분간 원심분리하고 상등액을 scFv 선별에 사용하였다.

대규모 발현 및 정제를 위해서, 단클론 글리세롤 모액을 사용하여 3 ㎖의 테리픽 브로쓰(TB)에 접종하고 0.8의 OD600에 도달할 때까지 37 ℃에서 배양하였다. 각각 3 ㎖의 배양물을 후속으로 4 개의 플라스크 중에 분할하였으며, 이들은 각각 250 ㎖ TB + 암피실린(100 ㎍/㎖)을 함유하였다. 이어서 상기 배양물을 0.4 내지 0.5의 OD600에 도달할 때까지 37 ℃에서 배양하고, 그 후에 IPTG를 0.5 mM의 최종 농도로 가하고 상기 배양물을 30 ℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침, 상기 밤새 배양물을 4000 rpm에서 25 분간 원심분리시켰다. 상등액을 버리고 펠릿을 50 ㎖ PBS + 10 mM 이미다졸에 용해시켰다. 상기 세포 현탁액을 세포 균질화기(5000 파운드/제곱 인치)에 통과시키고 생성되는 세포 용해물을 12,000 rpm에서 15 분 동안 원심분리시켰다. 이어서 상기 상등액을 규조토로 사전-층상화된 0.22 ㎛ 필터 위로 통과시키고, 생성되는 여액을 원심분리(5 분간 100 rpm)를 사용하여 비바퓨어 맥시프렙MC(Vivapure maxiprepMC) 니켈 친화성 컬럼(사토리우스 스테딤 바이오테크(Sartorius Stedim Biotech), 프랑스 오바뉴 소재) 상에 로딩하였다. 이어서 상기 컬럼을 10 ㎖ PBS + 30 mM 이미다졸(3 분간 500 rpm)을 사용하여 4 회 세척하고 상기 scFv를 20 ㎖ PBS + 300 mM 이미다졸(3 분간 500 rpm)을 사용하여 용리시켰다. 상기 용리된 scFv를 3000 rpm에서 30 분간 10,000 분자량 컷-오프 멤브레인 비바스핀(Vivaspin) 원심분리기 튜브를 사용하여 농축시키고(사토리우스 스테딤 바이오테크) 표준 PBS 내로 다시 투석시켰다. 최종 scFv 생성물을 후속으로 -80 ℃에서 보관하였다.

실시예 4: scFv-Fc 융합 단백질의 제작 및 DG44 CHO 세포에서 발현

pFUSE-hIgG1-Fc1(인비보젠(InvivoGen); 미국 캘리포니아 샌디에고 소재)과 유사한 독점 항체 발현 벡터(본 발명에서 IgG 벡터라 칭함)를 사용하여, 상기 구조물을 먼저 인간 IgG₁의 CH₂ 및 CH₃ 도메인을 함유하도록 변형시켰다(scFv-Fc 벡터). 후속으로, EBNA 클론 315 및 WT1 클론 45 scFv 서열을, 필요한 NheI 및 Apal 제한 부위(상기 scFv-Fc 벡터에 적합할 것이다)를 함유하도록 PCR 증폭시켰다. 상기 생성되는 scFv PCR 산물 및 항체 발현 플라스미드를 상기 효소(37 ℃에서 2 시간 동안 NheI 및 25 ℃에서 2 시간 동안 Apal)를 사용하여 절단하고 이어서 함께 연결시켰다. 이어서 상기 연결 산물을 에스케리키아 콜라이 내로 형질전환시키고, TYE + 암피실린(100 ㎍/㎖) 상에 도말하고, 콜로니를 골라 내어 그의 플라스미드를 MSKCC 서열화 코어 설비에서 서열화하였다. 일단 상기 서열이 상기 인간 IgG₁ CH₂ 및 CH₃ 도메인의 상류에 정확한 scFv 서열을 갖는 것으로 확인되었으면, 상기 DNA(5 내지 6 ㎍)를, 프로그램 U-030 및 100 ㎕ 용액 V를 사용하여 5 x 10⁶ DG44 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(인비트로젠(Invitrogen)) 내로 일렉트로포레이션시켰다(아막사 뉴클레오팩터(Amaxa Nucleofactor); 스위스 론자 소재). 이어서 상기 세포를 배지 ㎖당 1 내지 5 x 10⁶ DG44의 세포 밀도로 G418(500 ㎍/㎖; 일렉트로포레이션 후 7일째에 가한)을 함유하는 OptiCHO 배지(인비트로젠)에서 배양하였다. 이어서 상기 세포를 대략 700 ㎖의 배양 배지로 확대시키고, 이를 원심분리시켜 항체 정제에 사용된 상등액 및 세포를 제거하였다.

실시예 5: 용해성 scFv-Fc 융합 단백질의 발현 및 정제

상기 용해성 scFv-Fc 융합 단백질을 함유하는 DG44 상등액을 카파셀렉트(KappaSelect) 친화성 크로마토그래프 배지(GE 헬쓰케어)를 사용하여 정제하였다. 먼저, 1.5 ㎖의 카파셀렉트 수지를 컬럼 상에 로딩하고 20 ㎖의 PBS로 활성화하였다. 상기 상등액을 연동 펌프를 사용하여 대략 1 ㎖/분의 유속으로 상기 컬럼에 로딩하였다. 상기 컬럼을 후속으로 상기 통과액이 0.05 미만의 OD280을 기록할 때까지 40 ㎖의 PBS를 사용하여 세척하였다. 이어서 상기 scFv-Fc 융합 단백질을 중화를 위해 10 ㎖의 시트레이트 완충제(pH 2.0)를 사용하여 상기 수지로부터 10 ㎖의 1 M 트리스 내로 직접 용리시켰다. 상기 용리된 scFv-Fc를 후속으로 50,000 MWCO 비바스핀 원심분리 튜브(사토리우스 스테딤)를 사용하여 농축시키고 ELISA 및 비아코어(Biocore) T100(GE 헬쓰케어)을 사용하여 재조합 항원뿐만 아니라 유식 세포측정을 사용하여 T2 세포의 표면 상에 자연적으로 제공된 펩타이드에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다.

실시예 6: 세균 파지 클론 및 정제된 scFv 및 scFv-Fc에 대한 단클론 ELISA

비닐 편평 바닥 미세적정 플레이트(써모 피셔(Thermo Fisher))를 ELISA 분석에 사용하였다. 플레이트를 처음에 4 ℃에서 BSA-비오틴(10 ㎍/㎖; 50 ㎕/웰)으로 밤새 코팅하였다. 다음날 아침, 내용물을 버리고 상기 플레이트를 RT에서 1 시간 동안 스트렙트아비딘(10 ㎍/㎖; 50 ㎕/웰)과 함께 배양하였다. 내용물을 버리고 상기 플레이트를 RT에서 1 시간 동안 재조합 비오틴화된 HLA-A2-펩타이드 복합체(5 ㎍/㎖; 50 ㎕/웰)와 함께 배양하였다. 이어서 상기 플레이트를 RT에서 1 시간 동안 2% 우유(150 ㎕/웰)와 함께 배양하였다. 차단 후에, 상기 플레이트를 PBS로 2 회 세척하고 이어서 RT에서 1 시간 동안 그의 각각의 HB2151 배양물 플레이트 웰로부터의 세균 상등액, 정제된 scFv, 또는 정제된 scFv-Fc와 함께 배양하였다. 내용물을 버리고, 상기 플레이트를 PBS로 5 회 세척하고, 이어서 RT에서 1 시간 동안, scFv를 검출하기 위한 마우스-항-myc 태그 항체(클론 9E10; 시그마 알드리치. 0.5 ㎍/㎖; 0.5% 우유 중의 100 ㎕/웰), 또는 scFv-Fc를 검출하기 위한 염소-항-인간-HRP(잭슨 임뮤노리써치 레보라토리즈(Jackson Immunoresearch Laboratories). 0.5 ㎍/㎖; 0.5% 우유 중의 100 ㎕/웰)과 함께 배양하였다. 내용물을 버리고, 상기 플레이트를 PBS로 5 회 세척하고, 상기 scFv를 수용한 것은 RT에서 1 시간 동안 염소-항-마우스-HRP(잭슨 임뮤노리써치 레보라토리즈. 0.5 ㎍/㎖; 0.5% 우유 중의 100 ㎕/웰)과 함께 배양한 반면 상기 scFv-Fc를 수용한 것은 o-페닐렌다이아민(OPD) 완충제(150 ㎕/웰)(시트레이트 포스페이트 완충제 40 ㎖ 중의 OPD 정제 20 ㎎을 40 ㎕의 30% 과산화 수소와 배합함으로써 제조하였다)를 사용하여 전개시켰다. 30 ㎕의 5N 황산을 각 웰에 가함으로써 색상 반응을 정지시키고 상기 플레이트를 490 ㎚에서 다이넥스(Dynex) MRX ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 최종적으로, 상기 scFv 플레이트의 내용물을 버리고, 상기 플레이트를 PBS로 5 회 세척하고, 상기 방법에 따라 전개시켰다.

실시예 7: 세포주 및 펩타이드

Tap-결함 HLA-A2⁺ T2 세포, 6268A, GKO(둘 다 HLA-A2^-), DIMT 및 JG19(둘 다 HLA-A2⁺) B-세포 림프모구성 세포주(BLCL)를 항원 제공 연구를 위해 사용하였다. 세포를 RPMI 1640 + 10% 소 태아 혈청(FBS) 중에서 통상적으로 배양하였다. 항원 제공을 위해서, T2 세포를 수확하고 무혈청 IMDM + 10 ㎍/㎖ β2-미세글로불린(β2M)으로 옮겼다. 이어서 상기 T2 세포를 37 ℃에서 5 시간 동안 20 μM 이하의 LLDFVRFMGV-펩타이드(EBNA3C로부터 유래된) 또는 임의의 수의 관련없는 펩타이드와 함께 배양할 수 있었다. BLCL을 사용한 연구를 상기 배지에서 β₂M의 흡장과 함께 T2 세포를 사용한 바와 동일한 방식으로 수행하였다. DIMT BLCL을 사용한 펄스-추적 실험을, 먼저 상기 BLCL을 37 ℃에서 5 시간 동안 무혈청 IMDM 중에서 20 μM LLDFVRFMGV로 펄스화함으로써 수행하였다. 이어서 상기 세포를 새로운 RPMI 1640 + 10% FBS로 세척하고, 상기 배양 배지로 다시 옮기고, 37 ℃에서 5 및 24 시간 동안 추가로 배양한 다음, 매 시점에서 EBNA 클론 315 scFv를 사용하여 유식 세포측정 분석하였다.

실시예 8: 결합 동역학 분석

동역학 측정을 BIAcore T100(GE 바이오사이언스)을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 수행하였다. 간단히, CM5 칩(GE 바이오사이언스)의 처음 2 개의 유동 세포를, 10 mM 아세테이트(pH 5)를 사용하여 정제된 EBNA 클론 315 scFv-Fc 융합 단백질로 고정화시킨 유동 세포 2와 함께 HBS-EP 실행 완충제(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 트윈 20) 중의 표준 아민 커플링 시약을 사용하여 활성화하였다. 후속으로, 상기 표적 HLA-A2-펩타이드 단량체(222 nM - 13.875 nM)를 상기 제 1(비교) 및 제 2 유동 세포 모두 상에 20 ㎕/분으로 120초 동안 주입한 다음 추가로 180 초 동안 실행 완충제를 가하였다. 동역학 값을 BIAcore T100 평가 소프트웨어 2.0 및 1:1 결합 모델(국소 Rmax)을 사용하여 측정하였다.

실시예 9: 유식 세포측정

펩타이드-펄스화된 T2 세포 및 BLCL을 플라스틱 폴리스타이렌 환저 튜브(벡톤 딕킨슨 랩웨어(Becton Dickinson Labware))로 옮기고 PBS로 세척하였다. 상기 세포를 후속으로 얼음 상에서 40 분 동안 5 ㎍의 표적화되거나 또는 비-특이적으로 정제된 scFv 또는 scFv-Fc와 함께 배양하였다. 상기 세포를 PBS로 세척하고 이어서 1 ㎍의 비오틴화된 마우스-항-myc 항체(클론 9E10; 시그마 알드리치) 또는 비오틴화된 마우스-항-인간 IgG Fc-특이성(잭슨 임뮤노리써치 레보라토리즈)과 함께 얼음 상에서 30 분 동안 배양하였다. 상기 세포를 PBS로 세척하고 이어서 스트렙트아비딘-PE(BD 바이오사이언스)와 함께 배양하였다. 최종적으로, 상기 세포를 PBS로 한 번 더 세척하고 BD FACS Calibur 상에서 분석하였다.

CD107a 세포독성 분석을 위해서, 형질도입된-NK92MI 세포 및 표적 T2 세포를 200 ㎕의 완전 알파 필수 배지(12.5% 말 혈청 및 12.5% FBS)(인비트로젠) + 10 내지 15 ㎕의 항-CD107a-PE 중에서 1:1 효과기:표적(E:T) 비(각각 2.5 내지 5.0 x 10⁵ 세포)로 37 ℃에서 5 시간 동안 공동 배양하였다. 이어서 상기 세포 혼합물을 PBS로 세척하고 BD FACS Caliber 상에서 분석하였다.

FACS 분류 실험을 위해서, 레트로바이러스에 의해 형질도입된 NK92MI 세포를 MSKCC 유식 세포측정 설비의 안내 하에서 BD 아리아(Aria) 유식 세포 측정기를 사용하여 GFP 강도를 기준으로 분류하였다.

실시예 10: 펩타이드-펄스화된 T2 세포 상의 HLA-A2-LLDFVRFMGV 복합체의 정량분석

MHC-펩타이드 복합체 정량분석을 위해서, EBNA 클론 315 scFv-Fc를 먼저 APEX 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 항체 표지화 키트(인비트로젠)를 사용하여 알렉사 플루오르 647에 직접 접합시켰다. 상기 키트는 약 10 내지 20 ㎍의 표지된 항체를 제공한다.

정량분석을 위해서, 콴텀 심플리(Quantum Simply) 세포 항-인간 IgG 키트를 우리 실험실의 홍펜 구오(Hong-fen Guo)의 기술적 지원과 함께 사용하였다(뱅스 레보라토리즈(Bangs Laboratories)). 간단히, 상기 키트는 5개의 미소구 집단들로 구성되며; 하나는 블랭크이고 4 개는 증가량의 항-인간 IgG로 표지된다. 이어서 상기 비드 및 펩타이드 펄스화된 T2 세포(5 시간 동안 37 ℃)를 얼음 상에서 30 분 동안 상기 동일한 형광 접합된 EBNA 클론 315 scFv-Fc로 표지하였다. 이어서 상기 세포를 PBS로 세척하고 상기 표지된 비드와 함께 BD FACS Calibur 상에서 분석하였다. 각 키트에 제공된 엑셀-기재 QuickCal 분석 주형은 형광 강도를 상기 T2 세포 상의 항원 밀도와 상관짓는데 도움을 준다. 상기 4 개의 데이터 점들은 각각 중복수행의 평균이다.

실시예 11: WT-1 클론 45 키메릭 항원 수용체의 제작

원래의 키메릭 항원 수용체를 세인트 주드 아동 병원의 다리오 캄파나(Dario Campana) 박사로부터 수득하였으며 이는 앞서 개시되었다(41). 차후의 적합성을 위해서, scFv-CD3ζ-4-1BB DNA 구조물(원래의 키메릭 면역 수용체에서 보이는 것과 유사하며, 5' 및 3' 단부에 인접하여 EcoRI 및 XhoI가 있다)을 구입하였으며(진스크립트(Genescript)로부터 pUC57 벡터; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 이는 Sfil 및 NotI가 측면에 인접한 관련없는 scFv를 함유하였다. 상기 EBNA 클론 315 scFv 서열을 함유하는 플라스미드(톰린슨 라이브러리로부터 pIT2 벡터)를 LB + 암피실린(100 ㎍/㎖) 중의 세균 모액의 밤새 배양물로부터 정제하였다(퀴아겐 미니프렙(Qiagen miniprep) DNA 단리 키트). 상기 scFv 서열을 Sfil(2 시간 동안 50 ℃) 및 NotI(2 시간 동안 37 ℃)를 사용하여 pIT2 벡터로부터 절제하고 상기 구입되고 사전 절단된(Sfil 및 NotI) pUC57 벡터에 삽입하였다. 연결 후에, 상기 생성물을 NEB 5-알파 수용 에스케리키아 콜라이(뉴잉글랜드 바이오랩)로 형질전환시키고, 상기 세포를 TYP + 암피실린(100 ㎍/㎖) 상에 도말하고, 콜로니를 골라 내어 LB + 암피실린(100 ㎍/㎖)에서 배양하고, 그의 플라스미드를 정제하고 생성물 크기를 젤 전기영동에 의해 확인하였다. 정확한 연결 생성물을 갖는 것으로 밝혀진 플라스미드를 후속으로 EcoRI(2 시간 동안 37 ℃) 및 XhoI(2 시간 동안 37 ℃)를 사용하여 상기 pUC57 벡터로부터 절제하고 이를 상기 캄파나 실험실에 의해 우리에게 제공된 벡터 내에 삽입하였다. 이어서 상기 연결 생성물을 상기와 같이 에스케리키아 콜라이 내로 형질전환시키고, TYE + 암피실린(100 ㎍/㎖) 상에 도말하고, 콜로니를 골라 내고 그의 플라스미드를 MSKCC 서열화 코어 설비에서 역 프라이머 788A(5'-CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3')(서열번호: 72)를 사용하여 서열화하였다. 일단 상기 서열이 확인되었으면, DNA를 레트로바이러스 내로 패키징하고 NK92MI 세포를 감염시키는데 사용하였다.

실시예 12: EBNA 클론 315 키메릭 항원 수용체의 제작

적합성 문제로 인해, 진스크립트로부터 구입하고 상기 언급한 pUC57 scFv-CD3ζ-4-1BB DNA 구조물을 사용하여 상기 WT1 클론 45 scFv를 EBNA 클론 315 scFv로 대체하였다. 먼저, 상기 EBNA 클론 315 scFv 서열을 함유하는 플라스미드(톰린슨 라이브러리로부터 pIT2 벡터)를 LB + 암피실린(100 ㎍/㎖) 중의 세균 모액의 밤새 배양물로부터 정제하였다(퀴아겐 미니프렙 DNA 단리 키트). 상기 scFv 서열을 Sfil(2 시간 동안 50 ℃) 및 NotI(2 시간 동안 37 ℃)를 사용하여 pIT2 벡터로부터 절제하고 상기 사전 절단된(Sfil 및 NotI) pUC57 벡터에 연결하였다. 연결 후에, 상기 생성물을 에스케리키아 콜라이 내로 형질전환시키고, 콜로니를 골라 내고, 밤새 배양하고, 그의 플라스미드를 정제하고 생성물 크기를 젤 전기영동에 의해 확인하였다. 정확한 연결 생성물을 갖는 것으로 밝혀진 플라스미드를 후속으로 EcoRI(2 시간 동안 37 ℃) 및 XhoI(1 분 동안 37 ℃)를 사용하여 상기 pUC57 벡터로부터 절제하였다. 상기 EBNA 클론 315 scFv 서열 내부의 XhoI 부위의 존재로 인해, 상기 DNA를 XhoI로 부분 절단하고 이어서 EcoRI를 사용하여 완전히 절단하였다. 이는 상기 pUC57 벡터로부터 전체 CAR 서열을 제거하면서 상기 scFv 서열의 완전성을 유지하는 정확한 DNA 단편을 단리할 수 있게 하였다. 캄파나 실험실에 의해 우리에게 제공된 벡터 내에 삽입 후에, 상기 연결 생성물을 상기와 같이 에스케리키아 콜라이 내로 형질전환시키고, TYE + 암피실린(100 ㎍/㎖) 상에 도말하고, 콜로니를 골라 내고 그의 플라스미드를 MSKCC 서열화 코어 설비에서 역 프라이머 788A(5'-CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3')(서열번호: 72)를 사용하여 서열화하였다. 일단 상기 서열이 확인되었으면, DNA를 레트로바이러스 내로 패키징하고 NK92MI 세포를 감염시키는데 사용하였다.

실시예 13: 레트로바이러스 생산, DNA 패키징, 및 NK92MI 세포의 감염

CAR-함유 레트로바이러스의 생산을 위해서, 293T-기재 레트로바이러스 생산 세포주(GP2)를 사용하는 하기의 과정을 사용하였다. 간단히, 7 ㎍의 CAR DNA를 1 ㎖의 무혈청 DMEM 중의 3.5 ㎍의 PCLAmpho 헬퍼 구조물 및 3.5 ㎍의 pVSVg와 합하였다. 이어서 상기 혼합물을 36 ㎕의 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 함유하는 1 ㎖ 무혈청 DMEM과 합하고 RT에서 20 분 동안 배양하였다. 그 후에, 상기 DNA-리포펙타민 복합체(2 ㎖)를 10 ㎖의 DMEM + 10% FBS 중의 GP2 세포(3 내지 5 x 10⁶)와 혼합하고 37 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 후속으로, 상기 상등액(12 ㎖)은 상기 회수 중 GP2 세포가 고갈되었고 이를 4 ℃에서 12 내지 16 시간 동안 3 ㎖ 렌티(Lenti)-X 농축제 용액(클론테크(Clontech))과 배양하였다. 그 후에, 상기 용액을 3000 rpm에서 15 분간 원심분리시키고, 상등액을 버리고, 펠릿을 5 x 10⁵ NK92MI 세포를 함유하는 1 ㎖ 완전 알파 필수 배지에 용해시켰다. 이어서 상기 세포를 72 시간 동안 배양하고 GFP를 통해 CAR 발현에 대해 유식 세포측정에 의해 검사하였다(상기 CAR 유전자를 CMV 프로모터에 이어서 IRES-GFP 하에서 발현시킨다).

실시예 14: scFv-Fc 융합 단백질의 제작 및 DG44 CHO 세포에서 발현

pFUSE-hIgG1-Fc1(인비보젠; 미국 캘리포니아 샌디에고 소재)과 유사한 독점 항체 발현 벡터를 사용하여, 클론 315 scFv 서열을 먼저, 필요한 NheI 및 Apal 제한 부위를 함유하도록 PCR 증폭시켰다. 상기 생성되는 PCR 산물 및 발현 플라스미드를 상기 효소(37 ℃에서 2 시간 동안 NheI 및 25 ℃에서 2 시간 동안 Apal)를 사용하여 절단하고 함께 연결시켰다. 이어서 상기 연결 산물을 에스케리키아 콜라이 내로 형질전환시키고, TYE + 암피실린(100 ㎍/㎖) 상에 도말하고, 콜로니를 골라 내어 그의 플라스미드를 MSKCC 서열화 코어 설비에서 서열화하였다. 일단 상기 서열이 상기 인간 IgG₁ CH2 및 CH3 도메인의 상류에 상기 클론 315 scFv 서열을 갖는 것으로 확인되었으면, 상기 DNA를, 프로그램 U-030 및 100 ㎕ 용액 V를 사용하여 5 x 10⁶ DG44 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(인비트로젠) 내로 일렉트로포레이션시켰다(아막사 뉴클레오팩터; 스위스 론자 소재). 이어서 상기 세포를 배지 ㎖당 1 내지 5 x 10⁶ DG44의 세포 밀도로 G418(500 ㎍/㎖; 일렉트로포레이션 후 7일째에 가한)을 함유하는 OptiCHO 배지(인비트로젠)에서 배양하였다.

실시예 15: 레트로바이러스 생산, DNA 패키징, 및 NK92MI 세포의 감염

CAR-함유 레트로바이러스의 생산을 위해서, 293T-기재 레트로바이러스 생산 세포주(GP2)를 사용하는 하기의 과정을 사용하였다. 간단히, 7 ㎍의 CAR DNA를 1 ㎖의 무혈청 DMEM 중의 3.5 ㎍의 PCLAmpho 헬퍼 구조물 및 3.5 ㎍의 pVSVg와 합하였다. 이어서 상기 혼합물을 36 ㎕의 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 함유하는 1 ㎖ 무혈청 DMEM과 합하고 RT에서 20 분 동안 배양하였다. 그 후에, 상기 DNA-리포펙타민 복합체(2 ㎖)를 10 ㎖의 DMEM + 10% FBS 중의 GP2 세포(3 내지 5 x 10⁶)와 혼합하고 37 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 후속으로, 상기 상등액(12 ㎖)은 상기 회수 중 GP2 세포가 고갈되었고 이를 4 ℃에서 12 내지 16 시간 동안 3 ㎖ 렌티-X 농축제 용액(클론테크)과 배양하였다. 그 후에, 상기 용액을 3000 rpm에서 15 분간 원심분리시키고, 상등액을 버리고, 펠릿을 5 x 10⁵ NK92MI 세포를 함유하는 1 ㎖ 완전 알파 필수 배지에 용해시켰다. 이어서 상기 세포를 72 시간 동안 배양하고 GFP를 통해 CAR 발현에 대해 유식 세포측정에 의해 검사하였다(상기 CAR 유전자를 CMV 프로모터에 이어서 IRES-GFP 하에서 발현시킨다).

실시예 16: ⁵¹Cr 방출 세포독성 분석

BLCL을 용해시키는 CAR 구비된 NK92MI 세포의 능력을 ⁵¹크로뮴 방출 분석을 사용하여 평가하였다. 간단히, 펩타이드 펄스화된 또는 펄스화되지 않은 ⁵¹Cr-표지된 BLCL을 10% FBS를 갖는 RPMI 1640 중의 환저 96-웰 플레이트(5 x 10³ 세포/웰)에 도말하였다. 후속으로, CAR 구비된 NK92MI 세포를 상기 BLCL 함유 웰에 상이한 효과기(E)/표적(T) 비로 가하고 37 ℃에서 4 시간 동안 배양하고, 그 후에 상기 배양물은 세포가 고갈되었으며, ⁵¹Cr-방출을 상기 상등액에서 측정하였다. 모든 E:T 비를 3 회 중복하였으며, 평균을 그래프 상에 작성하였다. ⁵¹Cr 방출%를 하기 식을 사용하여 측정하였다: ((샘플 방출 - 자발적인 방출)/(전체 방출 - 자발적인 방출)) x 100.

실시예 17: 바이러스-유래된 재조합 HLA-A2-펩타이드 복합체 상에서 파지의 친화성 선택

HLA-A2에 결합하는 것으로 앞서 입증된 다양한 상이한 펩타이드들을 제공하는 비오틴화된 및 비오틴화되지 않은 재조합 HLA-A2-펩타이드 복합체를 MSKCC 테트라머 코어 설비로부터 수득하였다. 선택을 목적으로, 상기 톰린슨 I 및 J 파지 디스플레이 라이브러리를 합하고, HLA-A2의 일반적인 프레임워크에 결합할 수도 있는 항체를 발현하는 임의의 파지, 또는 스트렙트아비딘 비드 자체가 세척 단계 동안 결국 버려지도록, 스트렙트아비딘 상자성 비드와 함께 먼저 비오틴화되지 않은, 관련되지 않은 HLA-A2-YVDPVITSI 복합체와 예비배양하였다. 후속으로, 상기 내용물(파지 및 관련되지 않은 복합체)을 비오틴화된 HLA-A2-LLDFVRFMGV(EBNA3C) 및 비오틴화된 HLA-A2-NLVPMVATV(pp65)와 동몰 비로 동시에 배양하고 스트렙트아비딘 상자성 비드를 사용하여 포획하였다. 일단 상기 비드가 상기 비오틴화된 복합체에 결합되었으면, 상기 비드를 트윈 20을 함유하는 PBS로 세척하고 상기 결합된 파지를 트립신을 사용하여 상기 비드로부터 용리시켰다. 2 회의 추가 라운드의 선택 후에, 상기 회수된 파지를 사용하여 HB2151 에스케리키아 콜라이를 감염시키고 암피실린-함유 아가 상에 도말하였다. 다음날 아침, 개별적인 콜로니를 골라 내어 48-웰 배양물 플레이트에서 밤새 배양하고, 그의 상등액을 재조합 HLA-A2-펩타이드 복합체로 예비 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트 상의 scFv의 존재에 대해 시험하였다.

상기 처음 3회의 선택 라운드는 결과/투입 비를 기준으로 파지 회수의 55 배 증가, 및 오직 HLA-A2-EBNA3C 복합체에만 결합된 scFv를 생성시켰다. 재조합 HLA-A2-LLDFVRFMGV 및 HLA-A2-NLVPMVATV 복합체 상의 파지 디스플레이 선택 결과를 표 9에 나타낸다.

상기 결과는 HLA-A2 상의 2 개의 펩타이드가 모두 바이러스-관련된 단백질로부터 유래되었고, 이는 인간 단백질 레퍼토리에서는 보이지 않기 때문에 다소 놀라운 것이었다. 이러한 발견을 확인하기 위해서, 추가 라운드의 선택을 오직 HLA-A2-EBNA3C 복합체 단독 상에서 수행하였으며, 그 결과 회수된 파지가 추가로 증폭되었고(109 배) 상기 HLA-A2-EBNA3C 복합체에 결합된 클론들의 백분율은 유사하였다(라운드 3 후에 83% 양성 및 라운드 4 후에 77%).

3 회 라운드의 파지 선택 후에 개별적인 클론으로부터의 세균 상등액을 비닐 미세적정 플레이트 상의 재조합 비오틴화된-HLA-A2-펩타이드 복합체에 대한 결합에 대해 시험하였다. 다수의 클론들이 상기 표적화된 HLA-A2-LLDFVRFMGV 복합체 이상으로 교차 반응성을 생성시킨 반면(클론 335 및 345), 클론 315 및 327은 목적하는 특이성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

정제된 EBNA 클론 315 scFv를 재조합, 비오틴화된 HLA-A2-펩타이드 복합체의 유사한 패널에 대해 재시험하였다. 정제된 EBNA 클론 315 scFv는 단독으로 고유 펩타이드에 결합할 수 없음 외에, HLA-A2-펩타이드 복합체의 패널에 대해 그의 특이성을 유지하였다. 상기 항-HLA-A2 항체 BB7.2를 포함시켜 모든 HLA-A2-펩타이드 복합체가 상기 플레이트에 적합하게 부착되고 제공됨을 입증하였다.

따라서 상기 선별 과정 동안, 다수의 상이한 scFv가 상기 표적화된 HLA-A2-EBNA3C 복합체에 결합하는 것으로 밝혀졌으나, 오직 몇몇 scFv 서열만이 절대 특이성을 생성시켰으며 상이한 기원의 HLA-A2-펩타이드 복합체에 결합하지 않았다(도 1A). 시험된 클론들 중에서, EBNA 클론 315 및 327은 동일한 펩타이드 서열을 가졌으며 추가로 특성화하였다. scFv 정제 후에, 후속의 확인 ELISA는 EBNA 클론 315가 단독으로 LLDFVRFMGV 펩타이드에 결합할 수 없음 외에, 상기 표적화된 HLA-A2-EBNA 복합체에 대한 그의 특이성을 유지하였음을 입증한다(도 1B). 이러한 초기 결합 분석은 상기 항체의 TCR-유사 결합 능력을 입증한다.

실시예 18: WT1-유래된 재조합 HLA-A2-펩타이드 복합체 상의 파지의 친화성 선택

비오틴화된 HLA-A2-RMFPNAPYL(WT1-유래된)에 대한 파지를 사용하는 항체 선택을 상술한 바와 유사한 방식으로 수행하였다. 간단히, 상기 톰린슨 I 및 J 파지 디스플레이 라이브러리를 먼저 합하고, 비오틴화되지 않은, 관련되지 않은 HLA-A2-NLVPMVATV 복합체 및 스트렙트아비딘 상자성 비드와 함께 예비배양하였다. 후속으로, 상기 내용물(파지 및 관련되지 않은 복합체)을 비오틴화된 HLA-A2-RMFPNAPYL과 배양하고 새로운 스트렙트아비딘 상자성 비드를 사용하여 포획하였다. 일단 상기 비드가 상기 비오틴화된 복합체에 결합되었으면, 상기 비드를 트윈 20을 함유하는 PBS로 세척하고 상기 결합된 파지를 트립신을 사용하여 상기 비드로부터 용리시켰다. 2 회의 추가 라운드의 선택 후에, 상기 회수된 파지를 사용하여 HB2151 에스케리키아 콜라이를 감염시키고 암피실린-함유 아가 상에 도말하였다. 다음날 아침, 개별적인 콜로니를 골라 내어 48-웰 배양물 플레이트에서 밤새 배양하고, 그의 상등액을 재조합 HLA-A2-펩타이드 복합체로 예비 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트 상의 scFv의 존재에 대해 시험하였다.

상기 처음 3회 라운드의 선택은 결과/투입 비를 비교할 때 파지의 90 배 농축을 생성시켰다. 재조합 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체 상의 파지 디스플레이 선택 결과를 표 10에 나타낸다.

3 회 라운드의 파지 선택 후에 3개의 개별적인 클론으로부터의 세균 상등액을 비닐 미세적정 플레이트 상의 재조합 비오틴화된-HLA-A2-펩타이드 복합체에 대한 결합에 대해 시험하였다. 시험된 3 개의 클론이 모두 오직 상기 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체만을 인식하는데 필요한 특이성을 가졌다. 상기 3 개의 클론은 모두 동일한 DNA 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다. 정제된 WT1 클론 45 scFv를 재조합, 비오틴화된 HLA-A2-펩타이드 복합체의 유사한 패널에 대해 재시험하였다. 정제된 WT1 클론 45 scFv는 MHC의 환경 밖에서 고유 펩타이드에 결합할 수 없음 외에, HLA-A2-펩타이드 복합체의 패널에 대해 그의 특이성을 유지하였다. 상기 항-HLA-A2 항체 BB7.2를 포함시켜 모든 HLA-A2-펩타이드 복합체가 상기 플레이트에 적합하게 부착되고 제공됨을 입증하였다.

따라서, 특이성 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체에 대한 결합에 대해 48 개 클론을 선별한 후에, 3 개의 클론이 그의 표적화된 복합체에 대해 특이적으로 결합하지만 관련되지 않은 펩타이드를 나타내는 복합체에는 결합하지 못하는 것으로 밝혀졌다(도 2A). 시험된 클론들 중에서, 이들은 모두 동일한 펩타이드 서열을 갖는 것으로 밝혀졌으며 WT1 클론 45를 추가의 특성화를 위해 선택하였다. scFv 정제 후에, 후속의 확인 ELISA는 WT1 클론 45가 단독으로 RMFPNAPYL 펩타이드에 결합할 수 없음 외에, 상기 표적화된 HLA-A2-WT1 복합체에 대한 그의 특이성을 유지하였음을 입증한다(도 2B). 이러한 초기 결합 분석은 상기 항체의 TCR-유사 결합 능력을 입증한다.

실시예 19: 펩타이드-펄스화된 T2 세포 상의 정제된 EBNA 클론 315 및 WT1 클론 45 scFv에 대한 결합 및 특이성 연구

상기 단리된 EBNA 클론 315 및 WT1 클론 45 scFv가 펩타이드-펄스화된 항원 제공 세포(APC)의 표면 상의 그의 고유 복합체를 인식하고 이에 결합할 수 있음을 입증하기 위해서, TAP-결함 T2 세포주를 사용하였다. T2 세포를 먼저 β₂M을 함유하는 무혈청 배지 중의 LLDFVRFMGV(EBNA3C-유래된), RMFPNAPYL(WT1-유래된) 또는 관련되지 않은 펩타이드 KLQCVDLHV와 함께 37 ℃에서 5 시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 후속으로 세척하고 정제된 WT1 클론 45, EBNA 클론 315 또는 관련되지 않은 scFv로 염색하였다. 또한, 펩타이드 펄스화된 및 펄스화되지 않은 T2 세포를 또한 항-HLA-A2-FITC(BB7.2) 항체와 함께 배양하였다. 상기 BB7.2 염색 대조군을, 펩타이드가 T2 세포 표면 상의 HLA-A2에 결합할 수 있는 경우 상기 HLA-A2 분자가 안정화되고 상기 안정화를 형광 강도의 증가에 의해 가시화할 수 있음을 입증하는 선행 연구로 인해 포함시켰다(81). 도 3A에 도시된 바와 같이, 상기 LLDFVRFMGV 또는 KLQCVDLHV 펩타이드로 펄스화된 T2 세포는 형광 이동을 생성시켰으며, 이는 HLA-A2 포켓에 대한 그의 결합과 일치한다. 그러나, EBNA 클론 315는 오직 그의 특이성 표적 펩타이드 LLDFVRFMGV로 펄스화된 T2 세포만을 염색할 수 있었으며 관련되지 않은 펩타이드는 아니었다(도 3B). 유사한 결과가, T2 세포를 상기 RMFPNAPYL 또는 LLDFVRFMGV 펩타이드로 펄스화하고 WT1 클론 45 scFv로 염색한 경우 획득되었다. 상기 두 펩타이드가 모두 상기 HLA-A2 분자를 안정화시킬 수 있었지만(도 4A), WT1 클론 45 scFv는 오직 상기 RMFPNAPYL 펩타이드로 펄스화된 T2 세포만을 검출할 수 있었다(도 4B). 이는 상기 세포 표면 상의 고유 복합체를 검출하는 그의 유용성을 추가로 입증한다.

이어서, 유식 세포측정을 사용하는 EBNA 클론 315 scFv의 검출 감도를, 유식 세포측정 정량분석 비드를 사용하여 항원 밀도와 감도를 상관짓기 위해서 평가하였다. 간단히, TAP-결함 T2 세포를 37 ℃에서 5 시간 동안 무혈청 IMDM 배지 중의 20 μM의 LLDFVRFMGV(도 3A, 상부, 왼쪽 패널) 또는 KLQCVDLHV 펩타이드(도 3A, 상부, 오른쪽 패널)로 펄스화하거나(실선, 채워지지 않은 선), 또는 펄스화하지 않았다(점선, 채워지지 않은 선). 이어서 상기 세포를 마우스-항-인간 HLA-A2-FITC 접합된 항체(채워지지 않은 선) 또는 대조용 마우스 IgG₁-FITC 접합된 항체(채워진 선)로 염색하고 FACS 기계 상에서 분석하였다. A로부터 펩타이드-펄스화된 T2 세포를 EBNA 클론 315 scFv(채워지지 않은 선) 또는 대조용 scFv(채워진 선)로 염색하였다(도 3B). LLDFVRFMGV 펩타이드(왼쪽 패널)로 펄스화된 T2 세포만이 상기 EBNA 클론 315 scFv에 의해 염색될 수 있었으나, KLQCVDLHV(오른쪽 패널)로 펄스화된 것은 염색될 수 없었다(도 3B). T2 세포를 감소하는 농도의 LLDFVRFMGV 펩타이드와 함께 배양하고 후속으로 상기와 같이 EBNA 클론 315 scFv로 염색하였다(도 3C). 기하 평균 형광(대조용 scFv 배경 공제된)을 기준으로, 검출 하한은 펄스화에 사용된 78 nM의 펩타이드에 상응한다.

상기 T2 세포와의 배양에 사용된 펩타이드의 양을 하향 적정함으로써, EBNA 클론 315 scFv로 염색 시 78 nM 만큼 낮은 농도가 여전히 배경 이상의 형광 신호를 생성시킬 수 있는 것으로 측정되었다(도 3C). 로딩에 사용된 펩타이드의 감소하는 농도에 따라, 예상되는 바와 같이 전체 HLA-A2 강도(데이터 도시 안 됨)가 상응하게 감소되었다.

유사하게, 도 4는 WT1 클론 45가 펩타이드-펄스화된 T2 세포 상의 HLA-A2-RMFPNAPYL을 인식할 수 있음을 도시한다. TAP-결함 T2 세포를 37 ℃에서 5 시간 동안 무혈청 IMDM 배지 중의 40 μM의 RMFPNAPYL(왼쪽 패널) 또는 LLDFVRFMGV 펩타이드(오른쪽 패널)로 펄스화하거나(실선, 채워지지 않은 선), 또는 펄스화하지 않았다(점선, 채워지지 않은 선). 이어서 상기 세포를 마우스-항-인간 HLA-A2-FITC 접합된 항체(채워지지 않은 선) 또는 대조용 마우스 IgG1-FITC 접합된 항체(채워진 선)로 염색하고 FACS 기계 상에서 분석하였다(도 4A). A로부터 펩타이드-펄스화된 T2 세포를 WT1 클론 45 scFv(채워지지 않은 선) 또는 대조용 scFv(채워진 선)로 염색하였다. RMFPNAPYL 펩타이드(왼쪽 패널)로 펄스화된 T2 세포만이 상기 WT1 클론 45에 의해 염색될 수 있었으나, LLDFVRFMGV(오른쪽 패널)로 펄스화된 것은 염색될 수 없었다(도 4B).

실시예 20: 펩타이드-펄스화된 BLCL을 사용하여 LLDFVRFMGV 펩타이드 및 EBNA 클론 315의 HLA 제한을 입증한다

BLCL 상의 상기 펩타이드의 발현을, 특히 BLCL이 APC로서 통상적으로 사용되므로(82), 조사하였다. 2 개의 BLCL 주, 즉 HLA-A2⁺(DIMT) 하나 및 HLA-A2^-(6268A) 하나를 사용하였다(도 5A). 상기 BLCL을 특이성 LLDFVRFMGV 또는 관련되지 않은 KLQCVDLHV 펩타이드와 함께 37 ℃에서 5 시간 동안 무혈청 IMDM 배지에서 배양하였다. 상기 특이성 펩타이드와 함께 배양 시, 오직 HLA-A2⁺ DIMT BLCL만이 EBNA 클론 315에 의해서 염색될 수 있었다(도 5B). T2 세포에 대해 나타난 결과와 유사하게, 상기 관련되지 않은 펩타이드가 로딩된 DIMT 세포, 또는 상기 특이성/관련되지 않은 펩타이드가 로딩된 6268A는 EBNA 클론 315로 염색될 수 없었다. 펩타이드 펄스화의 부재 하에서 우리는 DIMT 염색을 성공할 수 없었다는 기록은 흥미롭다. 우리의 염색 접근법은 상기 scFv를 검출하기 위한 2차 및 3차 시약을 수반하는 신호 증폭을 통해 낮은 수준의 항원을 검출하기 위해 최적화되었지만, 상기 세포가 자연적으로 제공하는 펩타이드의 양은 우리의 검출 수준 이하인 듯하다.

후속으로, HLA-A2 상의 펩타이드 제공의 지속시간을 연구하고자, 펄스-추적 실험을 시간에 따른 DIMT 세포 상의 HLA-A2-EBNA3C 복합체 수준을 모니터하기 위해 설정하였다. 처음에, DIMT 세포를 상기 LLDFVRFMGV 펩타이드와 함께 37 ℃에서 5 시간 동안 무혈청 IMDM 배지에서 배양하였다. 그 후에, 상기 세포를 RPMI + 10% FBS로 2 회 세척하고 상기 배지에서 추가로 5 시간 및 24 시간 동안 추가 배양하였다. 이들 3 개의 각각의 시간 시점에서, 세포를 수확하고 정제된 EBNA 클론 315 scFv 또는 관련되지 않은 scFv로 염색하였다. 상기 결과는 펄스화 후에 상기 HLA-A2-EBNA3C 복합체가 상기 세포 표면 상에서 쉽게 검출될 수 있었음을 보인다(도 5C). 흥미롭게, 상기 세포를 새로운 배지로 옮기고 추가로 5 및 24 시간 동안 배양한 후에조차, 상기 MHC-펩타이드 복합체를 여전히 검출할 수 있었으며, 이는 펩타이드-펄스화된 BLCL이 상기 펩타이드를 상기 배지로부터 제거한 후 적어도 하룻동안 항원 상에서 유지되고 항원을 제공할 수 있음을 의미한다. 상기 데이터는 항원 특이성 T 세포의 생성에서 자가 BLCL의 용도와, APC 또는 표적 세포 상에서 TCE 발현의 정확한 가시화에 있어서 EBNA 클론 315와 같은 TCE-특이성 항체의 유용성을 추가로 지지한다.

실시예 21: EBNA 클론 315 및 WT1 클론 45 scFv-Fc 융합 단백질의 제작

처음에, 상기 EBNA 클론 315 및 WT1 클론 45 scFv 서열의 어느 한 쪽에 목적하는 제한 효소 부위(NheI 및 ApaI)를 가하기 위해서 PCR을 사용하여 scFv-Fc 발현 벡터 내로의 클로닝에 적합한 scFv 서열을 제조하였다. 상기 PCR 반응을 WT1 클론 45 및 EBNA 클론 315 scFv 서열을 함유하는 톰린슨 라이브러리 벡터 상에서 수행하였다(도 7A). NheI 및 ApaI를 사용하는 후속 절단 후에, 상기 절단된 PCR 산물을 1% 아가로스 젤로부터 제거하고 정제하였다(도 6B).

상기 scFv-Fc 융합 단백질의 클로닝 및 발현에 관하여, 유레카 쎄라퓨틱스(Eureka therapeutics)로부터 수득한 독점 벡터(IgG 벡터)를 사용하였다. 제 1 불변 중쇄(CH₁)를 상기 벡터로부터 제거하였으며, 이는 Fc 융합 단백질을 생성시킬 때 전형적으로 수행되는 어떤 것이다(83). 일단 생성되었으면, 상기 벡터를 NheI 및 ApaI로 절단하고 이어서 도 7B로부터의 예비절단된 PCR 산물에 연결시켰다. 상기 연결된 산물은 단일 CMV 프로모터 하에서 인간 IgG1의 CH_2,3 도메인에 나란히 EBNA 클론 315 또는 WT1 클론 45 scFv 유전자를 발현한 벡터(scFv-Fc 벡터; 도 7B)를 제공하였다. DNA 서열화를 사용하여 추가로 확인 후에, 상기 2 개의 융합 구조물을 HindIII를 사용하여 선형화하고 1% 아가로스 젤 상에서 실행시켰다. HindIII에 의한 절단은 또한 우리로 하여금 상기 벡터 중에 여전히 존재하는 경쇄의 발현(이는 모든 집약적인 목적들에 대해 바람직하지 못하다)을 차단하게 하였다. 예상된 바와 같이, 상기 2 개의 절단된 플라스미드는 모두 람다 HindIII 마커에 대해 그의 위치를 기준으로 예상 크기(약 11,000 bp)로 이동하였다. 각각의 선형화된 플라스미드를 후속으로 DG44 세포 내로 도입시키고 상기 실시예 10에 개시된 바와 같이 OptiCHO 배지에서 배양하였다.

실시예 22: 재조합 HLA-A2-펩타이드 복합체 및 펩타이드-펄스화된 T2 세포 상의 EBNA 클론 315 scFv-Fc의 결합 동역학 및 감도

EBNA 클론 315와 HLA-A2-EBNA3C 복합체 간의 상호작용의 친화성을 더욱 이해하기 위해서, 표면 플라스몬 공명을 사용하여 이들 두 단백질 간의 결합 동역학을 측정하였다. 먼저, 상기 EBNA 클론 315 scFv-Fc를 정제하고 그의 결합 능력을 가변 농도로 펩타이드-펄스화된 T2 세포를 통해 유식 세포측정과 함께 ELISA(도 8A)를 사용하여 시험하였다(도 8B 및 C). 이들 초기 연구는 상기 항체가 융합 단백질로서 발현 시 그의 결합 특징을 유지함을 입증한다. 또한, 상기 scFv 및 scFv-Fc의 유식 세포측정 감도가 매우 동등하다(200 nM 내지 20 nM)는 기록은 중요하며, 이는 단량체성 결합 단편으로서 상기 scFv의 유용성을 더욱 강조한다.

이어서, Biacore T100(GE 헬쓰케어)을 사용하여, CM5 칩(유동 세포 1 및 2)을 처음에 제조사의 권장을 근거로 아민 결합을 위해 활성화시켰다. 상기 정제된 EBNA 클론 315 scFv-Fc를 후속으로 제 2 유동 세포 상에 고정화하고 상기 정제된 HLA-A2-EBNA3C 복합체를 용해성 상의 부분으로서 상기 두 유동 세포 모두의 위로 통과시켰다. 배경 공제(유동 세포 2로부터의 신호 - 유동 세포 1로부터의 신호) 후에, 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 측정하여(각각 2.361 x 10⁵ M^-1s^-1 및 6.891 x 10^-2 s^-1), 1:1 결합 모델을 사용하여 291 nM의 전체 K_D(k_off/k_on)를 생성시켰으며(도 9); 이들 동역학 속도는 상이한 MHC-펩타이드 복합체에 대해 앞서 단리된 Fab와 매우 유사하였다(22,31). 공개된 TCR:MHC 부류 I-펩타이드 K_D 측정(전형적으로 2 내지 50 μM에 이웃하는 범위)(84)에 대해, 우리의 scFv:MHC 부류 I-펩타이드 상호작용은 기껏해야 150 배 더 강한 것처럼 보이며, 이때 가장 의미 있는 개선은 보다 느린 k_off에 기인하였다. 친화성-기재 T 세포 활성화 모델을 지지하는 선행 연구는 보다 큰 전체 친화성 또는 보다 느린 해리 속도가 보다 큰 인터페론-감마 방출 및 표적 세포 용해를 도출함을 주장한다(85,86).

마지막으로, 펩타이드-펄스화된 T2 세포의 표면 상의 HLA-A2-LLDFVRFMGV 복합체의 양을 정량분석하고자, 우리는 유식 세포측정 정량분석 비드를 사용하기로 결정하였다. 상기 데이터는 또한 EBNA 클론 315 scFv 및 scFv-Fc의 검출 한계를 측정하는데 유용할 것이다. 먼저, 정제된 EBNA 클론 315 scFv-Fc를 상업적으로 입수할 수 있는 키트를 사용하여 형광 표지, 알렉사 플루오르 647에 접합시켰다. 후속으로, T2 세포를 37 ℃에서 5 시간 동안 20, 10, 5 또는 0 μM의 LLDFVRFMGV 펩타이드로 펄스화하였다. 펄스화 후에, 상기 펩타이드-펄스화된 T2 세포를, 기지량의 항-인간 IgG₁ 항체를 함유하는 비드와 함께 상기 형광-표지된 EBNA 클론 315 scFv-Fc와 함께 배양하였다. 일단 상기 세포 및 비드를 상기 FACS 기계 상에서 분석하였으면, 형광 강도들을 서로 상관시켜, 펄스화에 사용된 펩타이드의 양에 대한 상기 T2 세포 표면 상의 복합체의 수를 추정하였다. 이들 4 개의 값(20 μM에 대한 337,091 부위, 10 μM에 대한 149,688 부위, 5 μM에 대한 76,040 부위, 및 0 μM에 대한 0 부위)을 그래프 상에 플롯팅하고 추세선을 사용하여 표준 곡선을 생성시켰다(R² = 0.9948)(도 10A). 더욱 또한, 상기 스펙트럼의 하단부 검토 시, 우리는 40 nM 미만의 펩타이드 량이 상기 세포 표면 상의 100 개 미만의 복합체에 상응하며(도 10B), 이는 상기 EBNA 클론 315 scFv-Fc 융합물의 검출 수준이 상기 범위 내에 있음을 결정하였다.

실시예 23: 재조합 HLA-A2-펩타이드 복합체 및 펩타이드-펄스화된 세포 상의 WT1 클론 45 scFv-Fc의 결합 및 특이성 연구

APC 표면 상의 RMFPNAPYL 펩타이드의 제공에 관한 추가의 연구를 수행하기 위해서, 상기 WT1 클론 45 scFv-Fc 융합 단백질을 먼저 정제하고 그의 표적화된 재조합 HLA-A2-펩타이드 복합체에 대한 결합에 대해 확인하였다(도 11A). scFv에 대해 나타난 바와 같이, 상기 융합 단백질은 ELISA 플레이트 상에서 그의 결합 능력을 유지하였다. 이어서, 우리는 상기 scFv-Fc가 펩타이드-펄스화된 T2 세포에 대한 그의 결합 능력 및 특이성을 유지하는지의 여부를 검사하고 알아보기로 하였다. T2 세포를 37 ℃에서 5 시간 동안 β₂M이 있는 무혈청 배지 중의 RMFPNAPYL 펩타이드 또는 관련되지 않은 펩타이드로 펄스화하였다. 유식 세포측정을 사용하여, 상기 scFv-Fc는 상기 RMFPNAPYL 펩타이드로 펄스화된 T2 세포를 검출할 수 있었지만, 관련되지 않은 펩타이드로 펄스화된 세포는 인식하지 못했다(도 11B). 이들 두 분석은 상기 융합 단백질이 원래의 scFv와 동일한 방식으로 작용함을 추가로 확인하였다.

후속으로, 우리는 상기 RMFPNAPYL 펩타이드 및 scFv-Fc 융합 단백질의 결합이 HLA-A2로 제한되는지의 여부를 시험하기로 하였다. HLA-A2⁺ 및 HLA-A2^- BLCL(각각 DIMT 및 6268A)을 37 ℃에서 5 시간 동안 무혈청 배지 중의 RMFPNAPYL 펩타이드로 펄스화하였다. EBNA 클론 315와 유사하게, 상기 WT1 클론 45 scFv-Fc 융합 단백질은 오직 상기 펩타이드 펄스화된 DIMT만을 인식할 수 있었고 HLA-A2^- 6268A BLCL은 인식할 수 없었다(도 12). 이러한 결과는 상기 RMFPNAPYL 펩타이드가 HLA-A2로 제한되며 WT1 클론 45는 오직 상기 복합체와 관련하여 상기 HLA-A2를 인식할 수 있음을 입증한다.

실시예 24: 펩타이드-펄스화된 세포 상의 EBNA 클론 315 scFv-Fc의 항체-의존적인 세포 세포독성(ADCC)

항원 제공 연구를 위해 상기 scFv-Fc를 사용하는 이외에, 우리는 절두된 인간 IgG₁ Fc 영역이 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 인간 공여체 림프구들 간의 변화성을 피하고, 세포독성 관찰 기회를 증가시키고자, 우리 실험실의 홍-펜 구오는 CD16(V)-형질도입된 NK92MI 세포주를 생성시켰다. 상기 NK92 세포 변체를 ADCC 및 항체-기재 면역요법에 대한 임상 반응의 증대에 기여하는 높은 친화성 다형성(CD16 상의 158 번 위치의 페닐알라닌 대신에 발린)을 함유하는 IL-2 및 인간 CD16 활성화 Fc 수용체(FcγRIIIA) 모두로 형질도입시킨다(87,88).

우리는 상기 세포주를 상기 융합 단백질이 LLDFVRFMGV-펄스화된 LUY(HLA-A2⁺)BLCL에 대해 NK92MI-매개된 ADCC를 유도할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해서 EBNA 클론 315 scFv-Fc 또는 관련되지 않은, 아이소타입-합치된 scFv-Fc와 함께 사용하였다. 42:1의 E:T 비에서, EBNA 클론 315 scFv-Fc는 시험된 2 개의 최고 농도에서 배경(관련되지 않은 scFv-Fc의 존재 또는 부재)보다 더 큰 살해를 도출하였다(27 내지 32% 대 13 내지 15%)(도 13). 유사한 살해 크기(배경에 대해)가 또한 다른 펩타이드-펄스화된, HLA-A2⁺ 표적 BLCL(DIMT 및 JG19)에 대해 관찰되었다. 이러한 결과는 상기 절두된 scFv-Fc 융합 단백질이, 전체 면역글로불린보다 약 33% 더 작음에도 불구하고, 그의 Fc-매개된 효과기 작용을 유지함을 보인다.

실시예 25: NK92MI 세포 내로의 HLA-A2-RMFPNAPYL-특이성 키메릭 항원 수용체의 제작 및 레트로바이러스 형질도입

상기 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체에 특이적인 CAR을 생성시키기 위해서, 상기 WT1 클론 45 scFv를 전형적으로는 면역 효과기 세포에서 발견되는 면역-조절 단백질의 세포 내 신호전달 도메인에 융합시킬 수 있다. CD19-특이성 scFv가 CD8α 힌지/막관통 영역, 4-1BB 및 CD3ζ 쇄에 융합된 CAR 발현 벡터(세인트 주드 CAR)를 수득하였으며 이를 항-CD19 scFv가 WT1 클론 45 scFv로 교체되도록 변형시켰다. 그러나, 상기 세인트 주드 CAR 벡터와 PCR에 사용된 톰린슨 라이브러리 벡터 간의 제한 효소 부적합성 문제로 인해, 상기 WT1 클론 45 scFv를 함유하는 전체 CAR 유전자를 진스크립트에 의해 상업적으로 합성하였다. 생성되는 WT1 pUC57 벡터는 EcoRI 및 XhoI가 측면에 인접한 목적하는 WT1 클론 45 CAR 서열을 함유하였다.

상기 세인트 주드 CAR 벡터에 대한 추가적인 특징은 상기 CAR 서열 하류의 IRES-GFP 서열이다. 상기는 상기 두 단백질을 함께 융합시켜야 할 필요 없이 CAR 발현과 GFP와의 직접적인 상관관계를 허용하였다. 상기 특징을 이용하기 위해서, 우리는 상기 WT1 pUC57 벡터 및 세인트 주드 CAR 벡터를 EcoRI 및 XhoI를 사용하여 절단시켰다. 그 후에, 상기 절단된 및 절단되지 않은 플라스미드를 람다 HindIII 및 100 bp 마커와 함께 1% 아가로스 젤 상에서 실행시켰다. 강조된 밴드는 상기 CAR 서열(약 6500 bp)이 결여된 세인트 주드 플라스미드 및 상기 pUC57 플라스미드(약 1500 bp)가 결여된 WT1 클론 45 CAR 서열의 예상된 크기에 상응하였다. 이들 밴드를 상기 젤로부터 절제하고, DNA 정제 후에, 상기 둘을 함께 연결시켰다. 상기 연결 산물을 에스케리키아 콜라이 내로 형질전환시킨 후에, 8 개의 콜로니를 랜덤하게 선택하고 그들의 플라스미드를 단리하였다. 이어서 상기 단리된 플라스미드를, 상기 플라스미드가 상기 CAR과 관련하여 WT1 클론 45 scFv 서열을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 서열화함으로써 확인하였다. 또한, 상기 플라스미드를 또한 EcoRI 및 XhoI로 절단하고 람다 HindIII 및 100 bp 마커와 함께 1% 아가로스 젤 상에 실행시켜 그들의 크기를 확인하였다. 각각의 플라스미드로부터의 2 개의 밴드가 모두 예상된 크기를 제공함을 입증한 후에, 상기 클로닝이 성공적인 것으로 결정되었다.

일단 상기 WT1 클론 45 CAR이 생성되었으면(도 23), 상기 DNA를 293T-기재 GP2 세포주를 사용하여 레트로바이러스 내로 패키징하였다. 일단 상기 레트로바이러스가 상기 배양 배지에서 생성되었으면, 이를 회수하고 농축시켰다. 이어서 상기 농축된 바이러스를 사용하여 NK92MI 생육 배지 중의 500,000 내지 1,000,000 NK92MI 세포를 감염시켰다. 3 내지 4일의 배양 후에, 상기 레트로바이러스로 감염된 NK92MI 세포를 세포 유식측정에 의해 GFP 발현에 관하여 모의-감염된 세포(빈 레트로바이러스로 감염된)와 비교하였다. 상기 감염 효율이 대략 27.5%이었지만, 유동 지원된 세포측정 세포 분류(FACS)는 우리로 하여금 상기 GFP-양성 집단을 98% 초과 양성으로 농축시키게 하였다(도 23).

실시예 26: NK92MI 세포 내로 HLA-A2-LLDFVRFMGV-특이성 키메릭 항원 수용체의 제작 및 레트로바이러스 형질도입

상기 WT1 클론 45 CAR은 WT1 pUC57 벡터의 구입을 요하므로, 상이한 scFv를 교환하는 경우 보다 더 용이하기 위해서 상기 구조물에 추가적인 제한 부위들을 가하였다. 그 결과, EBNA 클론 315 scFv 서열을 상기가 유래된 톰린슨 벡터로부터 직접 클로닝되게 할 수 있었다.

첫 번째 클로닝 단계는 Sfil 및 NotI를 사용하여 WT1 pUC57 벡터로부터 WT1 클론 45 scFv의 제거를 수반하였다. 동일한 절단을 EBNA 클론 315 scFv 서열을 함유하는 톰린슨 벡터에 대해 수행하였다. 일단 절단되었으면, 상기 두 플라스미드를 람다 HindIII 및 100 bp 마커와 함께 1% 아가로스 젤 상에서 실행시켰다. 강조된 밴드는 scFv가 없는 WT1 pUC57 벡터에 상응하였으며, EBNA 클론 315 scFv를 상기 톰린슨 벡터로부터 절제하였다. 이들 밴드를 상기 젤로부터 절제하고, DNA를 정제하고 함께 연결시켜 EBNA pUC57 벡터를 제공하였다. 상기 연결 산물을 후속으로 에스케리키아 콜라이 내로 형질전환시키고, 10 개의 콜로니를 랜덤하게 선택하고 그들의 플라스미드를 정제하고, 각각의 DNA를 EcoRI 단독 또는 EcoRI 및 XhoI로 절단하였다. 예상된 바와 같이, 상기 톰린슨 벡터로부터 유래된 모든 scFv 서열 내에 내재하는 XhoI 부위로 인해(pUC57과 관련하여 WT1 클론 45 scFv는 예외이며, 그 이유는 상기 부위가 진스크립트로부터 CAR로서 구입 시 제거되기 때문이었다), 이중 절단은 3 개의 별도의 밴드들을 제공하였다.

상기 EBNA 클론 315 CAR 서열을 pUC57 벡터로부터 절제하고 세인트 주드 CAR 벡터에 가하는 두 번째 클로닝 단계에 대해서, XhoI를 사용하는 EBNA pUC57 벡터의 부분 절단이 필요하였다. 상기 10 개의 콜로니로부터 단리한 EBNA pUC57 플라스미드를 합하고 실온에서 1 분간 XhoI로 절단하였다. 상기를 4 개의 1% 아가로스 젤의 별도의 웰에 가하고 DNA를 절단되지 않은 플라스미드, 람다 HindIII 및 100 bp 마커와 함께 실행시킴으로써 상기 반응을 급속히 정지시켰다. 강조된 밴드들은 예상된 크기의 선형화된 EBNA pUC57 플라스미드(약 4300 bp)인 것으로 측정되었으며; 상기 선형화된 플라스미드는 상기 2 개의 XhoI 부위 중 어느 하나에서의 랜덤 절단의 결과이다. 후속으로, 완전한 CAR 서열(약 1500 bp)을 수득하기 위해서, 상기 선형화된 플라스미드를 상기 젤로부터 단리하고 EcoRI로 완전히 절단하였다. 상기 생성되는 이중 및 단일 절단물을 람다 HindIII 및 100 bp 마커와 함께 1% 아가로스 젤 상에서 실행시켰다. 강조된 밴드는 예상된 크기의 EBNA 클론 315 CAR 유전자에 상응하였으며, 그 결과 상기를 상기 젤로부터 절제하고, DNA 정제하고, 상기 예비절단된(EcoRI 및 XhoI) 세인트 주드 CAR 벡터에 연결시켰다. 상기 연결 산물을 에스케리키아 콜라이 내로 형질전환시킨 후에, 10 개의 콜로니를 랜덤하게 선택하고 그들의 플라스미드를 단리하였다. 이어서 상기 단리된 플라스미드를, 상기 플라스미드가 상기 CAR과 관련하여 EBNA 클론 315 scFv 서열을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 서열화함으로써 확인하였다. 또한, 상기 플라스미드를 EcoRI으로 또한 절단하고 람다 HindIII 마커와 함께 1% 아가로스 젤 상에서 실행시켜 그들의 크기를 확인하였다. 상기 밴드가 예상된 크기를 제공함을 입증한 후에, 상기 클로닝이 성공적인 것으로 결정되었다.

상기 EBNA 클론 315 CAR이 생성된 후에(도 14), 상기 DNA를 상기 WT1 클론 45 CAR의 경우와 동일한 방식으로 레트로바이러스 내로 패키징하고 NK92MI 세포의 감염에 사용하였다. 3 내지 4일의 배양 후에, 상기 감염된 NK92MI 세포의 GFP 발현 수준을 모의-감염된 세포와 비교하였다. 상기 초기 감염 효율은 대략 24%이었으며, 유동 지원된 세포측정 세포 분류(FACS) 후에, 상기 GFP-양성 집단을 90% 초과 양성으로 농축시켰다(도 14).

실시예 27: EBNA 클론 315 CAR-구비된 NK92MI 세포는 CD107a 발현을 통해 특이성 HLA-A2-LLDFVRFMGV 복합체를 갖는 세포를 검출할 수 있다

일단 상기 NK92MI 세포를 EBNA 클론 315 CAR 발현을 위해 농축시켰으면, 상기 세포를 상기 표적화된 HLA-A2-EBNA3C 복합체를 인식하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 표적 세포에 의한 NK92MI 활성화의 초기 판독으로서, 우리는 NK 세포 및 T 세포 탈과립의 마커인 CD107a의 세포 표면 발현에 대해 분석하였다(90,91). T2 세포를 20 μM의 표적화된 펩타이드(LLDFVRFMGV), 관련되지 않은 펩타이드(YMFPNAPYL)와 함께 또는 펩타이드 없이 로딩하였다. 1:1 E:T 비를 사용하여, 상기 T2 세포를 37 ℃에서 5 시간 동안 항-CD107a-PE 접합된 항체의 존재 하에서 EBNA 클론 315 CAR-발현 NK92MI 세포와 함께 배양하였다. 도 16A에 나타낸 바와 같이, 상기 EBNA 클론 315 CAR이 구비된 NK92MI 세포는 펄스화되지 않은 T2 세포 또는 관련되지 않은 펩타이드로 펄스화된 T2 세포에 반응하지 않았으며, 이는 표적의 부재 하에서 배양된 NK92MI 세포의 수준에 필적하는 CD107a 수준을 나타낸다. 다른 한편으로, 상기 CAR-구비된 NK92MI 세포를 상기 LLDFVRFMGV 펩타이드로 펄스화된 T2 세포와 함께 배양한 경우, GFP⁺ 세포의 27%가 배경 수준 이상으로 CD107a를 발현하였다. 이러한 결과는 scFv 가공 후에, 상기 CAR이 상기 표적화된 HLA-A2-펩타이드 복합체에 대한 그의 특이성을 유지할 수 있음을 나타낸다.

이어서, 상기 CAR이 NK92MI 세포의 활성화에 있어서 얼마나 민감한지를 정량적으로 측정하기 위해서, 우리는 T2 세포 펄스화에 사용된 상기 LLDFVRFMGV 펩타이드의 농도를 하향 적정하고 상기 CAR-구비된 NK92MI 세포를 활성화하는 그의 능력을 측정하였다. 도 16B에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 CAR-구비된 NK92MI에 의한 반응의 하한은 10 nM의 펩타이드 농도에서 존재하였으며, 이때 명백한 용량 반응 곡선이 600 nM 농도에서 시작하였다. 우리의 초기 정량분석 연구를 근거로, 상기 펩타이드 농도는 상기 세포 표면 상에서 대략 25 복합체에 상응한다. 상기 EBNA 클론 315 scFv 또는 scFv-Fc(200 내지 20 nM)를 사용하는 에피토프 검출에 필요한 수준에 비해, 상기 CAR은 세포 유식측정 분석을 사용하여 APC의 표면 상의 MHC-펩타이드 복합체의 낮은 수준을 검출함에 있어서 보다 민감한 접근법인 것처럼 보인다.

T2 세포가 임의의 관심 펩타이드를 제공할 수 있는 반면, BLCL은 그의 MHC 부류 I 분자 상에 그 자신의 펩타이드를 자연적으로 제공한다. T2와 유사하게, 이들 내생적인 펩타이드를 충분히 높은 친화성의 대체 펩타이드와 간단한 배양에 의해 교체할 수 있다. 1:1 E:T 비를 사용하여, HLA-A2⁺(DIMT) 및 HLA-A2^-(6268A) BLCL을 무혈청 IMDM 배지 또는 LLDFVRFMGV를 함유하는 배지로 펄스화하고, 상기 논의된 바와 같이 EBNA 클론 315 CAR-발현 NK92MI 세포와 함께 배양하고, 유식 세포측정을 사용하여 CD107a 발현에 대해 분석하였다. 펩타이드 펄스화된 DIMT(HLA-A2⁺)는, 펩타이드 펄스화된 6268A(HLA-A2^-)의 경우 0.54% 및 펄스화되지 않은 DIMT의 경우 1.09%와 대조적으로, GFP⁺ NK92MI 세포의 25%가 CD107a를 발현하도록 유도하였다(도 17). 상기 데이터는 또한 상기 EBNA 클론 315 CAR의 펩타이드 특이성 및 HLA-A2 배타성을 모두 입증한다.

실시예 28: EBNA 클론 315 CAR-구비된 NK92MI 세포는 ⁵¹Cr 방출을 통해 특이성 HLA-A2-LLDFVRFMGV 복합체를 갖는 세포를 파괴할 수 있다

NK 세포 및 T 세포 상의 CD107a 발현은 그들의 활성화를 반영하지만, 표적 세포 용해를 또한 통상적인 ⁵¹Cr 세포독성 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 먼저, 상기 ⁵¹Cr 세포독성 분석이 HLA-A2-EBNA3C 발현 표적 살해에 관하여 얼마나 민감한지에 대한 착상을 얻기 위해서, T2 세포를 37 ℃에서 3 시간 동안 감소하는 농도의 LLDFVRFMGV 펩타이드로 펄스화하고 후속으로 상기 물질 및 방법에 개시된 바와 같이 ⁵¹Cr로 표지하였다. 이어서 상기 표지된 T2 세포를 37 ℃에서 2 시간 동안 3:1 E:T 비로 EBNA 클론 315 CAR-발현 NK92MI 세포와 함께 배양하였다. 상기 CD107a 분석에서 나타난 결과(도 16B)와 유사하게, EBNA 클론 315 CAR 발현 NK92MI 세포는 T2 세포를 펩타이드-의존적인 방식으로 살해할 수 있었으며, 이때 펄스화되지 않은 T2 세포의 10.1%에 비해 2 nM 펩타이드-펄스화된 T2 세포의 13.2%가 살해되었다(도 18). 감도 수준은 유식 세포측정 항체 염색을 사용하여 검출될 수 있는 경우에 비해, 2 개의 별도의 분석(CD107a 및 ⁵¹Cr)을 사용하여 CAR에 유리하게 10 내지 100 배 더 큰 정도이다.

이어서, 무혈청 IMDM 중의 LLDFVRFMGV 펩타이드(20 μM)로 펄스화된 DIMT 및 6268A BLCL(도 19A 및 B)을 ⁵¹Cr 방출 분석에 표적으로서 사용하였다. 상기 CD107a 분석으로부터의 결과와 유사하게(도 17), 오직 HLA-A2⁺ DIMT BLCL만이 상기 CAR-구비된 NK92MI 세포에 의해서 용해되었으며(도 19A), 이는 정제된 EBNA 클론 315 scFv-Fc를 사용하여 차단될 수 있다(도 19B). 또한, 세포독성을 차단하는 능력은 상기 scFv-Fc 단백질로 제한되지 않았는데, 그 이유는 상업적인 항-HLA-A2(BB7.2) 항체도 또한 차단 능력을 가졌기 때문이다(데이터 도시 안 됨). 이러한 차단 데이터는 항원-특이성 세포용해성 T 세포 상의 다른 MHC-제한된, 펩타이드-특이성 항체에 대해 나타난 결과를 재현한다.

상기 CAR-구비된 NK92MI 세포의 용해 잠재성은, 표적을 관련된 펩타이드로 인공적으로 펄스화한 경우 명백히 자명했지만, 자연적으로 가공된 HLA-A2-펩타이드 복합체에 대한 세포독성은 임상적으로 관련된다. 여기에서, CAR-구비된 NK92MI 세포를 HLA-A2⁺(DIMT 및 JG19) 및 HLA-A2^-(6268A 및 GKO) 펄스화되지 않은 BLCL의 패널에 대해 시험하였다. 세포독성 수준은 DIMT의 경우 23.0% 및 JG19의 경우 8.9%로 낮은 반면(30:1 E:T 비), 이는 GKO에 대한 3.6% 및 6268A에 대한 1.8%에 비해 대단히 현저하였다(도 20A). 또한, 상기 세포독성 분석을 EBNA 클론 315 scFv-Fc의 존재 하에서 수행한 경우, 상기 살해 능력은 관련되지 않은 scFv-Fc의 존재 또는 항체의 부재 하의 경우에 비해 대략 46%까지 감소될 수 있었다(도 20B). 이러한 발견은 통상적인 유식 세포측정을 사용하여 검출 한계 아래의 발현을 갖는 항원을 유인하는 효과기 면역 세포 재프로그래밍에 있어서 TCR-유사 CAR의 유용성 및 특이성을 입증한다.

마지막으로, 상기 EBNA 클론 315 CAR 및 scFv-Fc 융합 단백질이 모두 상기 HLA-A2-LLDFVRFMGV 복합체의 검출에 사용되는 동일한 가변 서열들을 갖기 때문에, 우리는 CAR-매개된 세포독성을 ADCC와 직접 비교하기로 했으며, 그 이유는 상기 두 접근법이 모두 현재 암 환자의 치료에 독립적으로 사용 중이기 때문이다. 먼저, 상기 DIMT BLCL을 37 ℃에서 2 시간 동안 무혈청 IMDM 배지 중의 20 μM의 LLDFVRFMGV 펩타이드로 펄스화하였다. 이어서 상기 펄스화된 BLCL을 ⁵¹Cr로 표지하고 EBNA 클론 315 CAR 또는 CD16(V)-발현 NK92MI 세포와, EBNA 클론 315 scFv-Fc 또는 관련되지 않은 scFv-Fc와 함께 15:1의 E:T 비로 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 0.5 ㎍/㎖의 EBNA 클론 315 scFv-Fc 농도에서, CD16(V) NK92MI 세포는, 관련되지 않은 scFv-Fc의 경우 또는 전혀 항체가 없는 경우의 10 내지 15%에 비해, 세포의 약 30 내지 35%를 살해할 수 있었다(도 21). 상기 ADCC 실험을 보다 높은 scFv-Fc 농도를 사용하여 수행한 경우, 세포독성 백분율은 변하지 않았다(데이터 도시 안 됨). 다른 한편으로, 동일한 E:T 비에서, EBNA 클론 315 CAR-구비된 NK92MI 세포는 상기 동일한 펩타이드-펄스화된 표적 세포의 80 내지 90%를 살해할 수 있었으며; 상기 EBNA 클론 315 scFv-Fc를 차단 대조군으로서 포함시켰다(도 22). 이러한 결과는 NK92MI 세포를 수반하는 CAR-매개된 살해가 우리의 설정에서 ADCC에 비해 표적 세포 용해의 훨씬 더 효능 있는 수단임을 입증한다.

실시예 29: WT1 클론 45 CAR-구비된 NK92MI 세포는 ⁵¹Cr 방출을 통해 특이성 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체를 갖는 세포를 파괴할 수 있다

상기 EBNA 클론 315 CAR과 함께, 우리는 NK92MI 세포와 관련하여 상기 WT1 클론 45 CAR의 세포용해 능력을 시험하기로 했다. 먼저, DIMT 및 6268A BLCL을 37 ℃에서 3 내지 5 시간 동안 무혈청 IMDM 중의 RMFPNAPYL 펩타이드(40 ㎍/㎖)로 펄스화하였다. 후속으로, 상기 표적 세포를 ⁵¹Cr로 표지하고 37 ℃에서 4 시간 동안 상기 CAR-구비된 NK92MI 세포와 함께 배양하였다. 상기 두 펩타이드-펄스화된 BLCL 중에서, 오직 HLA-A2⁺ DIMT 만이 10:1 E:T 비로 용해될 수 있었다(약 70% 대 6268A 경우의 약 5%)(도 24). 또한, CAR-매개된 세포독성을 상업적인 항-HLA-A2 항체를 사용하여 대략 45%까지 차단할 수 있었으며(도 25), 이는 특이성을 추가로 입증한다.

이어서, 우리는 상기 HLA-A2-RMFPNAPYL 복합체를 자연적으로 발현할 수도 있는 세포주에 대한 WT1 클론 45 CAR-구비된 NK92MI 세포의 세포용해 능력을 시험하기로 하였다. 앞서 공개된 데이터(92), 및 MSKCC의 리차드 오레일리(Richard O'Reilly) 박사의 실험실과의 대화로 인해, 연구자들은 WT1이 EBV 불멸화로부터 유도된 모든 BLCL에서 구성적으로 활성화될 수 있음을 입증하였다. 보다 구체적으로, 오레일리의 그룹은 DIMT BLCL에서 WT1 전사물을 보일 수 있었다(데이터 도시 안 됨). 그 결과, 우리는 먼저 펄스화디지 않은 HLA-A2⁺ DIMT 및 HLA-A2^- 6268A BLCL에 대한 WT1 클론 45 CAR-매개된 살해를 시험하기로 하였다. 상기 EBNA 클론 315 CAR의 경우 나타난 바와 유사하게, WT1 클론 45 CAR-구비된 NK92MI 세포는 펩타이드-펄스화된 DIMT보다 더 낮은 능력으로 펄스화되지 않은 DIMT를 살해할 수 있었다. 상기 세포독성의 수준이 20:1 E:T에서 DIMT의 경우 약 35%로 더 낮았지만, 이는 6268A(약 5%)에 비해 훨씬 더 컸다(도 26A). 또한, 상기 세포독성 분석을 WT1 클론 45 scFv-Fc의 존재 하에서 수행한 경우, 상기 살해 능력을 관련되지 않은 scFv-Fc에 비해 또는 항체의 부재 하에서에 비해 대략 43%까지 감소시킬 수 있었다(도 26B). 이러한 발견은 상기 EBNA 클론 315 CAR을 사용하여 나타난 경우에 매우 상응하며 이는 추가로 항원을 유인하는 효과기 면역 세포의 재프로그램화에 있어서 TCR-유사 CAR의 유용성 및 특이성을 입증한다.

마지막으로, HLA-A2-양성이고 WT1을 발현하는 것으로 앞서 입증된 2 개의 세포주에 대한 CAR-매개된 세포독성을 시험하였다. OVCAR-3은, 진행성 난소 선암종을 앓고 있고(93) 나중에 WT1 mRNA를 함유하는 것으로 나타난(94) 환자의 악성 복수로부터 확립된 세포주이다. 또한, 697은 재발된 급성 림프구성 백혈병(ALL)이 있는 어린이(95)로부터 얻은 골수 세포로부터 확립된 인간 전-B 세포 백혈병이다. 그때 부터, 다수의 그룹들이 상기 세포주가 또한 높은 수준의 WT1 전사물과 단백질을 모두 발현함을 입증하였다(96,97). WT1 클론 45 CAR-발현 NK92MI 세포를 ⁵¹Cr 표지된 OVCAR-3 및 697 세포와 37 ℃에서 4 시간 동안 함께 배양하였다. CAR-구비된 NK92MI 세포는 20:1 E:T 비로 697 및 OVCAR-3 세포의 대략 20 내지 30%를 용해시킬 수 있었으며, 이는 상기 분석에 사용된 효과기 세포의 수에 따라 감소하였다. 상기 데이터는 이들 2 개의 세포 유형이 WT1 클론 45 CAR-구비된 NK92MI 세포에 민감함을 입증하며 HLA-A2⁺/WT1⁺ 암의 치료에 있어서 그의 유용성에 대한 증거를 추가로 제공한다.

등가물

상기 서면 명세서는 당해 분야의 숙련가가 본 발명을 실시할 수 있게 하기에 충분한 것으로 간주된다. 상기 명세 및 실시예는 본 발명의 몇몇 실시태양들을 상세히 설명하고 상기 발명자들에 의해 고려되는 최선의 방식을 기술한다. 그러나, 상기를 얼마나 상세히 나타낼 수 있든, 본 발명을 다수의 방식으로 실시할 수 있고 본 발명을 첨부된 청구의 범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석해야 함을 알 것이다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> Nai-Kong, Cheung Dimiter, Tassev <120> HLA-A2 Restricted Peptide-Specific Antibodies and Chimeric Antigen Receptors <130> 3314.019WO <160> 75 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 2 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Asp Pro Trp Gly Gln Glu Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 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tccagatgac ccagtctcca 420 tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480 attagcagct atttaaattg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540 tattcggcat cccagttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt 660 caacagggtc cggggactcc taatacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 720 gcc 723 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe Met Gly Val 1 5 10 <210> 5 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ala Pro Pro Gly Leu Asn Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Asp 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Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Thr Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 130 135 140 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 145 150 155 160 Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 165 170 175 Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg 180 185 190 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 195 200 205 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Ser 210 215 220 Ser Pro Asp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala 225 230 235 240 Ala <210> 9 <211> 723 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 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atttaaattg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540 tatgatgcat ccactttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt 660 caacagactg attcttatcc tactacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 720 <210> 16 <211> 720 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct attagtagtt ctggtagtta tacagattac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatctgct 300 tcttcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcgagcgg tggaggcggt 360 tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg tcgacggaca tccagatgac ccagtctcca 420 tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480 attagcagct atttaaattg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540 tatgatgcat ccactttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt 660 caacaggatg atgcttatcc tactacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 720 <210> 17 <211> 240 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr Asp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 145 150 155 160 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp 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gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540 tatgctgcat cctatttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600 acagatttct ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt 660 caacaggata ataattatcc tactacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 720 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Leu Leu Glu Glu Met Phe Leu Thr Val 1 5 <210> 20 <211> 240 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Ala Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 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tctcgagcgg tggaggcggt 360 tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg tcgacggaca tccagatgac ccagtctcca 420 tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480 attagcagct atttaaattg gtatcagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540 tatggtgcat ccggtttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600 acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttactactgt 660 caacagtctg ctaatgctcc tactacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 720 <210> 22 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Asp Pro Trp Gly Gln Glu Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 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<400> 48 Leu Thr Gly Arg Phe Asp Tyr 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ser Asp Thr Ala Phe Asp Tyr 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Thr Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Ser Ser Thr Thr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Asn Asn Ala Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Ser Ala Ser Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ser Thr Asp Ala Phe Asp Tyr 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Asn Ala Ala Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Ser Ala Ser Gln Leu Gln Ser 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Leu Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Tyr Ala Ser Tyr Leu Gln Ser 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Ala Ala Ser Ala Leu Gln Ser 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Ala Ala Ser Tyr Leu Gln Ser 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gly Ala Ser Gly Leu Gln Ser 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Gln Gln Gly Pro Gly Thr Pro Asn Thr 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Gln Gln Ala Glu Tyr Met Pro Leu Thr 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Gln Gln Ser Ser Ser Ser Pro Asp Thr 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Gln Gln Gly Thr Asp Ser Pro Ala Thr 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gln Gln Thr Asp Ser Tyr Pro Thr Thr 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Gln Gln Asp Asp Ala Tyr Pro Thr Thr 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Gln Gln Asp Asn Asn Tyr Pro Thr Thr 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Gln Gln Ser Ala Asn Ala Pro Thr Thr 1 5 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 72 cccttgaacc tcctcgttcg acc 23 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 73 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 74 Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 75 Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile 1 5

Claims

(A) 서열번호: 2, 5, 8, 10, 13, 14, 17 및 20 중 하나의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 영역;
(B) 각각, 서열번호: (i) 22 및 23; (ii) 24 및 25; (iii) 26 및 27; (iv) 28 및 29; (v) 30 및 31; (vi) 32 및 33; (vii) 34 및 35; 및 (viii) 36 및 37 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 V_L을 포함하는 항원 결합 영역; 및
(C) (i) 하기 3 개의 경쇄(LC) 상보성 결정 영역(CDR):
(a) 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR1; 및
(b) 각각, 서열번호: 57 및 64, 58 및 65, 59 및 66, 60 및 67, 61 및 68, 61 및 69, 62 및 70, 및 63 및 71의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2 및 CDR3; 및
(ii) 하기 3 개의 중쇄(HC) CDR:
(a) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR1; 및
(b) 각각, 서열번호: 40 및 48, 41 및 49, 42 및 50, 43 및 51, 44 및 52, 45 및 53, 46 및 54, 및 47 및 55 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2 및 CDR3
중 하나를 포함하는, 단리된 항원-결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편.
제 1 항에 있어서,
항체인 단리된 항원-결합 단백질.
제 1 항에 있어서,
키메릭 항원 수용체(CAR)인 단리된 항원-결합 단백질.
제 2 항에 있어서,
항체가 완전-길이 항체, 실질적으로 완전한 항체, Fab 단편, F(ab')₂ 단편 또는 단일 쇄 가변 단편(scFv)인 단리된 항원-결합 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
HLA/펩타이드 복합체 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항원-결합 단백질.
제 5 항에 있어서,
(A) 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 영역;
(B) 각각, 서열번호: 22 및 23의 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 V_L을 포함하는 항원 결합 영역; 및
(C) (i) (a) 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2; 및
(c) 서열번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3; 및
(ii) (a) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2; 및
(c) 서열번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3
중 하나를 포함하는 단리된 항원-결합 단백질.
제 6 항에 있어서,
HLA/펩타이드 복합체의 펩타이드가 아미노산 서열 RMFPNAPYL(서열번호: 1)를 갖는 단리된 항원-결합 단백질.
제 5 항에 있어서,
(A) 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 영역;
(B) 각각, 서열번호: 24 및 25의 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 V_L을 포함하는 항원 결합 영역; 및
(C) (i) (a) 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2; 및
(c) 서열번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3; 및
(ii) (a) 서열번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2; 및
(c) 서열번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3
중 하나를 포함하는 단리된 항원-결합 단백질.
제 8 항에 있어서,
HLA/펩타이드 복합체의 펩타이드가 아미노산 서열 LLDFVRFMGV(서열번호: 4)를 갖는 단리된 항원-결합 단백질.
제 5 항에 있어서,
(A) 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 영역;
(B) 각각, 서열번호: 26 및 27의 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 V_L을 포함하는 항원 결합 영역; 및
(C) (i) (a) 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2; 및
(c) 서열번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3; 및
(ii) (a) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2; 및
(c) 서열번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3
중 하나를 포함하는 단리된 항원-결합 단백질.
제 5 항에 있어서,
(A) 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 영역;
(B) 각각, 서열번호: 28 및 29의 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 V_L을 포함하는 항원 결합 영역; 및
(C) (i) (a) 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2; 및
(c) 서열번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3; 및
(ii) (a) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2; 및
(c) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3
중 하나를 포함하는 단리된 항원-결합 단백질.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
HLA/펩타이드 복합체의 펩타이드가 아미노산 서열 RLTRFLSRV(서열번호: 7)를 갖는 단리된 항원-결합 단백질.
제 5 항에 있어서,
(A) 서열번호: 13의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 영역;
(B) 각각, 서열번호: 30 및 31의 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 V_L을 포함하는 항원 결합 영역; 및
(C) (i) (a) 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2; 및
(c) 서열번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3; 및
(ii) (a) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2; 및
(c) 서열번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3
중 하나를 포함하는 단리된 항원-결합 단백질.
제 5 항에 있어서,
(A) 서열번호: 14의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 영역;
(B) 각각, 서열번호: 32 및 33의 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 V_L을 포함하는 항원 결합 영역; 및
(C) (i) (a) 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2; 및
(c) 서열번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3; 및
(ii) (a) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2; 및
(c) 서열번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3
중 하나를 포함하는 단리된 항원-결합 단백질.
제 5 항에 있어서,
(A) 서열번호: 17의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 영역;
(B) 각각, 서열번호: 34 및 35의 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 V_L을 포함하는 항원 결합 영역; 및
(C) (i) (a) 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2; 및
(c) 서열번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3; 및
(ii) (a) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2; 및
(c) 서열번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3
중 하나를 포함하는 단리된 항원-결합 단백질.
제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
HLA/펩타이드 복합체의 펩타이드가 아미노산 서열 RIITSTILV(서열번호: 12)를 갖는 단리된 항원-결합 단백질.
제 5 항에 있어서,
(A) 서열번호: 20의 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 영역;
(B) 각각, 서열번호: 36 및 37의 아미노산 서열을 갖는 V_H 및 V_L을 포함하는 항원 결합 영역; 및
(C) (i) (a) 서열번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR2; 및
(c) 서열번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 LC CDR3; 및
(ii) (a) 서열번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC) 상보성 결정 영역 1(CDR1);
(b) 서열번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR2; 및
(c) 서열번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 HC CDR3
중 하나를 포함하는 단리된 항원-결합 단백질.
제 17 항에 있어서,
HLA/펩타이드 복합체의 펩타이드가 아미노산 서열 LLEEMFLTV(서열번호: 19)를 갖는 단리된 항원-결합 단백질.
제 5 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
HLA/펩타이드 복합체의 HLA가 HLA-A2인 단리된 항원-결합 단백질.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질을 포함하는 융합 단백질.
서열번호: 2, 5, 8, 10, 13, 14, 17 및 20으로 나타낸 아미노산 서열들 중 하나를 포함하는 단리된 단일-쇄 가변 단편(scFv).
아미노산 스페이서에 의해 결합된 V_H 및 V_L을 포함하는 단리된 scFv로, 상기 V_H 및 V_L이 각각, 서열번호: (i) 22 및 23; (ii) 24 및 25; (iii) 26 및 27; (iv) 28 및 29; (v) 30 및 31; (vi) 32 및 33; (vii) 34 및 35; 및 (viii) 36 및 37로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단리된 scFv.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질 또는 그의 단편인 제 1 성분을 포함하는 면역접합체.
제 23 항에 있어서,
제 2 아미노산 서열을 갖는 제 2 성분을 포함하는 면역접합체.
제 14 항에 있어서,
세포독소를 또한 포함하는 면역접합체.
제 14 항에 있어서,
제 2 성분이 HLA-펩타이드 복합체와 상이한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 단백질 또는 항체인 면역접합체.
제 1 항의 항원-결합 단백질을 포함하는 이중특이성 항체.
제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 약학 조성물.