KR20220166282A - 조작된 기억-유사 nk 세포 및 이의 조성물을 생성하기 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화되거나, 이에 의해 제시되는 돌연변이체 뉴클레오포스민(NPM1c)의 네오에피토프에 결합하는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포, 또는 이러한 화합물을 발현하는 세포, 및 암의 하나 이상의 증상을 치료 또는 개선하기 위한 방법에서 이들의 용도에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2020년 3월 10일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련번호 제62/987,612호; 2020년 12월 1일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련번호 제63/119,959호; 2020년 12월 3일자로 출원된 미국 가특허 출원 일련번호 제63/121,127호; 및 2021년 1월 8일자로 출원된 미국 실용신안 출원 제17/144,834호의 이익을 주장한다. 각각의 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
정부 후원 성명
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)(NIH)에 의해 수여된 승인 번호 CA197605 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
암의 치료를 위한 세포-기반 면역요법이 개발되고 있다. T 세포, 단핵구-유래된 세포(예를 들어, 대식세포, 수지상 세포) 및 자연 살해(NK) 세포의 입양 세포 전달을 사용하는 접근법이 암 치료로서 연구되고 있다(예를 들어, Andreesen, R. et al (1990) Cancer Res 50:7450-7456; Ruggeri, L. et al (2002) Science 295:2097-2100; Rezvani, K. (2019) Bone Marrow Transplantation 54:785-788 참고). 구체적으로, 생체외(ex vivo)에서 활성화/증식된 NK세포가 환자에 투여되는 입양 세포 요법(ACT)은 현재 시험되고 있는 암 치료 중 하나이다. 이들 접근법은 생체외에서 활성화/증식된 다음에, 전이성 종양과 같은 종양을 퇴치하기 위해 재주입되는 환자로부터 취한 자가 NK 세포의 사용을 포함한다. ACT NK의 지속성, 생체내(in vivo) 증식, 및 이펙터 기능을 향상시키는 전략이 필요하다.
키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법이 암의 치료를 위한 전략 중 하나로서 부각되었다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 항원(예를 들어, 리간드)에 대한 정의된 특이성을 면역 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, 자연 살해 세포 또는 다른 면역 세포) 상에 부여하는 유전자-조작된, 인공 막관통 수용체이며, 이는 항원에 대한 인식 및 결합시 이펙터 세포의 활성화를 야기한다. 그러나, 계통-제한된 또는 종양-연관 항원(TAA)을 표적화하는 현재의 CAR은 정상 조직에서 낮은 항원 발현으로 인해 심각한 독성을 동반할 수 있다(Coulie et al., NAT REV CANCER 14: 135 (2014); Srivastava & Riddell, J IMMUNOL 200: 459 (2018) 참고). 또한, TAA는 종양 세포 생존을 위해 요구되지 않기 때문에, TAA 발현의 손실은 CAR-T 요법에 대한 종양 저항성의 발달의 주요 원인이다(Srivastava & Riddell, J IMMUNOL 200: 459 (2018) 참고). 따라서, 더욱 효과적인 CAR 요법 전략이 필요하다.
일부 양태에서, 본 발명은 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하고, 세포외 결합 도메인이 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는, 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사(ML) 인간 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포는 (a) MHC 클래스 I 단백질 단독, 및/또는 (b) MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 대조군 펩티드에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않고, 선택적으로 대조군 펩티드가 NY-ESO-1 에피토프 또는 인플루엔자 바이러스 M1 에피토프인 세포외 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포는 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하며, NPM1c 네오에피토프는 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9를 포함하고, X1은 A, V, L 또는 I로부터 선택되고, X2는 A, T, S, V, L, I, M 또는 Q로부터 선택되고, X3은 Q 또는 N으로부터 선택되고, X4는 D 또는 E로부터 선택되고, X5는 L, I, V, M, A 또는 F로부터 선택되고, X6은 C, S 또는 A로부터 선택되고, X7은 L, I, V, M, A 또는 F로부터 선택되고, X8은 A, V, L 또는 I로부터 선택되고, X9는 L, I, V, M 또는 A로부터 선택된다. 일부 양태에서, X1은 A 또는 V로부터 선택되고, X2는 V, I 또는 L로부터 선택되고, X3은 Q 또는 N으로부터 선택되고, X4는 D 또는 E로부터 선택되고, X5는 L 또는 I로부터 선택되고, X6은 C 또는 S로부터 선택되고, X7은 V, L 또는 I로부터 선택되고, X8은 A 또는 V로부터 선택되고, X9는 V, I 또는 L로부터 선택된다. 일부 양태에서, X1은 A이고, X2는 V, I 또는 L로부터 선택되고, X3은 Q이고, X4는 D이고, X5는 L이고, X6은 C이고, X7은 L이고, X8은 A이고, X9는 V, I 또는 L로부터 선택된다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, NPM1c 네오에피토프는 AIQDLCLAV(서열번호 1) 또는 AIQDLCVAV(서열번호 71)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, NPM1c 네오에피토프는 CLAVEEVSL(서열번호 72), VEEVSLRK(서열번호 73), AVEEVSLR(서열번호 74), AVEEVSLRK(서열번호 75), CLAVEEVSLRK(서열번호 76)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 네오에피토프는 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 네오에피토프는 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개의 아미노산 잔기 길이이다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02 단백질이거나, HLA-A*02 대립유전자 그룹에 의해 코딩된다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩된다.
일부 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포는
(i) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VH의 CDR인 VH 상보성 결정 영역(CDR)1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및/또는
(ii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VL의 CDR인 VL 상보성 결정 영역(CDR)1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 포함하며, VH CDR1은 아미노산 서열 GFTFSSYA(서열번호 9)를 갖고, VH CDR2는 아미노산 서열 ISGSGGST(서열번호 10)를 갖고, VH CDR3은 아미노산 서열 ARLGYPTTTLLPFDY(서열번호 11)를 갖는다. 일부 양태에서, 세포외 도메인은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하고, VL CDR1은 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 6)를 갖고, VL CD2는 아미노산 서열 AAS(서열번호 7)를 갖고, VL CD3은 아미노산 서열 QQSYSTPLT(서열번호 8)를 갖는다.
일부 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포는 VH 및 VL을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 포함하며, VH는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포는 VH 및 VL을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 포함하며, VH는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포는 scFv인 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 인간 scFv이다. 일부 양태에서, scFv는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, VH CDR1은 아미노산 서열 GFTFSSYA(서열번호 9)를 갖고, VH CDR2는 아미노산 서열 ISGSGGST(서열번호 10)를 갖고, VH CDR3은 아미노산 서열 ARLGYPTTTLLPFDY(서열번호 11)를 갖는다. 일부 양태에서, scFv는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하고, VL CDR1은 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 6)를 갖고, VL CD2는 아미노산 서열 AAS(서열번호 7)를 갖고, VL CD3은 아미노산 서열 QQSYSTPLT(서열번호 8)를 갖는다. 일부 양태에서, scFv는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, scFv는 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 양태에서, 펩티드 링커는 Gly-Ser 링커이다. 일부 양태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)(서열번호 58), (Gly4Ser)2(서열번호 59), (Gly4Ser)3(서열번호 60), 및 (Gly4Ser)4(서열번호 61)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, Gly-Ser 링커는 아미노산 서열 SGSSGGSSSG(서열번호 4)를 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, scFv는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖고; 선택적으로, scFv는 (a) VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1이 아미노산 서열 GFTFSSYA(서열번호 9)를 갖고, VH CDR2가 아미노산 서열 ISGSGGST(서열번호 10)를 갖고, VH CDR3이 아미노산 서열 ARLGYPTTTLLPFDY(서열번호 11)를 갖는 VH; 및/또는 (b) VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1이 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 6)를 갖고, VL CD2가 아미노산 서열 AAS(서열번호 7)를 갖고, VL CD3이 아미노산 서열 QQSYSTPLT(서열번호 8)를 갖는 VL을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 항원은 암 세포의 표면 상에 있다. 일부 양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML)이다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 세포외 도메인은 100 nM 이하, 50 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 0.5 nM 내지 100 nM, 또는 1 nM 내지 15 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 항원에 결합한다.
일부 양태에서, 본 발명의 조작된 NK는 막관통 도메인을 포함하는 CAR을 포함하며, 막관통 도메인은 CD3-제타, CD8, CD28, DAP12, 2B4, NKG2D, CD16, NKp44 또는 NKp46의 막관통 도메인으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 본 발명의 조작된 NK는 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 포함하며, 세포내 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 2B4, DAP10, CD137 및 DAP12로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 세포내 도메인은 CD3-제타 시그널링 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고; 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인을 포함하고, CAR 폴리펩티드는 CD8 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 세포내 도메인은 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 시그널링 도메인, 및 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고; CAR 폴리펩티드는 CD8 막관통 도메인 및 CD8 힌지 영역을 포함하고, CD8 막관통 도메인 및 CD8 힌지 영역은 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하고; 세포외 결합 도메인은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 선도 서열을 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 세포외 결합 도메인은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 세포내 도메인은 자가-절단 펩티드 서열 및 사이토카인을 추가로 포함하고, 자가-절단 펩티드의 절단은 사이토카인을 방출한다. 일부 양태에서, 사이토카인은 IL-12, IL-7, IL-13, IL-15, TNF-α, IFN-γ, 또는 CCL19이다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR 폴리펩티드를 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단은 IL-2, IL-12, IL-7, IL-15, IL-21 및 IL-18의 사이토카인 중 하나 이상 또는 이의 임의의 조합에 대한 일차 인간 NK 세포 또는 일차 인간 NK 세포의 집단의 노출 후 활성화되고, 선택적으로 사이토카인은 재조합 인간 사이토카인이다. 일부 양태에서, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단은 IL-12 및 IL-15; IL-12 및 IL-18; IL-15 및 IL-18; 또는 IL-12, IL-15 및 IL-18의 조합에 대한 노출 후 활성화된다. 일부 양태에서, NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 1-20 ng/mL의 농도 범위의 IL-12; 1-50 ng/mL의 농도 범위의 IL-15 및 10-100 ng/mL의 농도 범위의 IL-18에 노출되고, 선택적으로 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 약 3-48 시간, 약 7-24 시간, 약 16-20 시간, 약 12-24 시간 또는 약 14-16 시간의 기간, 선택적으로 약 16 시간의 기간 동안 약 10 ng/mL IL-12, 약 1 ng/mL IL-15, 및 약 50 ng/mL IL-18에 노출된다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, CAR 폴리펩티드는 하나 이상의 사이토카인에 대한 일차 인간 NK 세포 또는 상기 세포의 집단의 노출 후 도입된다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단은
(i) 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 증가된 IFNγ를 생산하고/하거나;
(ii) 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 향상된 항체-의존적 세포 세포독성을 갖고/갖거나;
(iii) 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 향상된 항-종양 효능을 갖고,
선택적으로, 대조군 NK 세포는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포, 또는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주이다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D 및 CD25의 폴리펩티드 중 하나 이상의 발현은 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 본 발명의 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단에서 증가되고, 선택적으로 대조군 인간 NK 세포는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포이거나, 대조군 인간 NK 세포주는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주이다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, KIR, CD57, NKG2C, DNAM-1 및 CD137의 폴리펩티드 중 하나 이상은 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 본 발명의 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단에서 상대적으로 변화되지 않고, 선택적으로 대조군 인간 NK 세포는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포이거나, 대조군 인간 NK 세포주는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주이다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, CD16 및/또는 CD11b의 발현은 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 본 발명의 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단에서 감소되고, 선택적으로 대조군 인간 NK 세포는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포이거나, 대조군 인간 NK 세포주는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주이다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 IL-15 폴리펩티드, 선택적으로 인간 IL-15 폴리펩티드를 발현한다. 일부 양태에서, IL-15 폴리펩티드는 분비된 IL-15 폴리펩티드 또는 막 결합된 IL-15 폴리펩티드이다. 일부 양태에서, 막 결합된 IL-15 폴리펩티드는 이종 막관통 도메인에 대한 IL-15의 융합체이다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단은 생체내 투여 후 1.5 배, 2 배, 3 배 또는 4 배 증식한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단은 생체내 투여 후 사이토카인에 대한 향상된 반응 또는 활성화 수용체 재-자극을 나타낸다. 일부 양태에서, 향상된 반응은 수주 내지 수개월, 선택적으로 2 주 내지 3 개월의 기간, 3 주 내지 2 개월의 기간, 또는 약 1 개월 동안 유지된다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 (i) NK 세포의 대조군 집단에 대해 IFN-감마의 증가된 발현을 갖고/갖거나; (ii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 그랜자임 B의 증가된 발현을 갖고/갖거나; (iii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 활성화 마커의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 활성화 마커가 CD25, CD69, ICOS, CD226, CD107a 및 CD62L로부터 선택되고/되거나; (iv) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 활성화 수용체의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 활성화 수용체가 NKp30, NKG2D, NKp44로부터 선택되고/되거나; (v) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 성숙 마커의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 성숙 마커가 CD56 및 NKG2A로부터 선택되고/되거나; (vi) NK 세포의 대조군 집단에 대해 CD57의 감소된 발현을 갖고/갖거나; (vii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 TIGIT의 증가된 발현을 갖고/갖거나; (viii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 TRAIL의 감소된 발현을 갖고; 선택적으로, (i)-(viii) 중 어느 하나의 NK 세포의 대조군 집단은 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 비형질도입된 집단이다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 IFN-감마의 증가된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 하나 이상의 활성화 마커의 증가된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, 활성화 마커는 CD107a이다. 일부 양태에서, 활성화 마커는 CD62L이다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 하나 이상의 활성화 수용체의 증가된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, 활성화 수용체는 NKG2D이다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD57의 감소된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD56 및 NKG2A의 증가된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 TIGIT의 증가된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 TRAIL의 감소된 발현을 갖는다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은
(i) 일차 인간 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 얻는 단계;
(ii) NK 세포 또는 상기 세포의 집단을, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 얻기에 충분한 기간 동안 IL-12, IL-15, IL-18 또는 이의 임의의 조합의 양과 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을, NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 형질도입하기 위한 조건 하에 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 렌티바이러스 벡터와 접촉시키는 단계;
(iv) CAR 폴리펩티드를 발현하는 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 단리시키는 단계; 및
(v) 선택적으로, 단리된 세포를 증식시키는 단계
를 포함하는,
본 발명의 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단을 생산하기 위한 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 일차 인간 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 iPSC, 제대혈, 또는 PBMC로부터 유래된다. 일부 양태에서, 일차 인간 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 자가 또는 동종이계이다.
일부 양태에서, 단계 (ii)의 기간은 약 12-16 시간, 선택적으로 약 14-16 시간, 선택적으로 약 16 시간이다. 일부 양태에서, 단계 (iii)은 (iv) 이전에 약 24-72 시간의 기간 동안 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 휴지시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 렌티바이러스 벡터는 비비 외피 당단백질(baboon envelope glycoprotein)(BaEV-gp) 위형화된 렌티바이러스다. 일부 양태에서, 렌티바이러스 벡터는 BaEV-gp를 포함하는 위형화된 렌티바이러스 벡터이며, 예를 들어, BaEV-gp는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 대조군 인간 NK 세포 또는 NK 세포주에 대해 증가된 수준의 IFNγ를 생산하고, 선택적으로 대조군 인간 NK 세포는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포이거나, 대조군 인간 NK 세포주는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주이다.
일부 양태에서, 본 발명은 ASCT-2를 발현하는 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을, 집단을 형질도입하기 위한 조건 하에 이종 폴리펩티드를 코딩하는 위형화된 렌티바이러스 벡터와 접촉시키되, 위형화된 렌티바이러스 벡터가 ASCT-2에 결합하는 당단백질을 포함하고, 이에 의해 이종 폴리펩티드를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 이종 폴리펩티드를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사(ML) NK 세포의 집단을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포는 일차 인간 NK 세포의 집단으로부터 얻어진다. 일부 양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 iPSC, 제대혈, 또는 PBMC로부터 유래된다. 일부 양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 자가 또는 동종이계이다. 일부 양태에서, ASCT-2의 발현은 인간 NK 세포의 대조군 집단에 대해 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단에서 약 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 2 배, 2.5배, 3 배, 3.5 배 또는 4 배 증가되고, 선택적으로 인간 NK 세포의 대조군 집단은 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단은 IL-12, IL-18 및 IL-15에 대한 노출에 의해 예비-활성화된다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단은 IL-12 및 IL-18에 대한 노출에 의해 예비-활성화된다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단은 약 8-24 시간, 선택적으로 12-20 시간, 선택적으로 약 12-16 시간, 선택적으로 약 14-16 시간, 선택적으로 약 16 시간의 기간 동안 예비-활성화된다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단은 약 3-48 시간, 약 7-24 시간, 약 16-20 시간, 약 12-24 시간, 약 14-16 시간, 또는 약 16 시간의 기간 동안 약 10 ng/mL IL-12, 약 50 ng/mL IL-15, 및 약 50 ng/mL IL-18에 대한 노출에 의해 예비-활성화된다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단은 약 3-48 시간, 약 7-24 시간, 약 16-20 시간, 약 12-24 시간, 약 14-16 시간, 또는 약 16 시간의 기간 동안 약 10 ng/mL IL-12 및 약 50 ng/mL IL-18에 대한 노출에 의해 예비-활성화된다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단은 하나 이상의 사이토카인에 대한 노출 후 및 접촉 전에 일정 기간 동안 휴지되고, 일정 기간은 약 24-72 시간이다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단의 적어도 약 10%가 형질도입된다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단의 약 10-90%, 선택적으로 약 35-80%, 선택적으로 약 40-60%, 선택적으로 약 60%가 형질도입된다. 일부 양태에서, 당단백질은 레트로바이러스 당단백질이다. 일부 양태에서, 레트로바이러스 당단백질은 비비 외피(BaEV) 당단백질이다. 일부 양태에서, BaEV 당단백질은 서열번호 107에 의해 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 (i) 일차 인간 NK 세포의 집단을 얻는 단계; (ii) 일차 인간 NK 세포의 집단을, ASCT-2를 발현하는 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 얻기에 충분한 기간 동안 IL-12, IL-18 및 IL-15와 접촉시키는 단계; 및 (iii) (ii)의 집단을, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 형질도입하기 위한 조건 하에 이종 폴리펩티드를 코딩하는 위형화된 렌티바이러스 벡터와 접촉시키되; 위형화된 렌티바이러스 벡터가 ASCT-2에 결합하는 당단백질을 포함하고; 이에 의해 이종 폴리펩티드를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 이종 폴리펩티드를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사(ML) NK 세포의 집단을 생산하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 (i) 일차 인간 NK 세포의 집단을 얻는 단계; (ii) 일차 인간 NK 세포의 집단을, ASCT-2를 발현하는 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 얻기에 충분한 기간 동안 IL-12 및 IL-18과 접촉시키는 단계; 및 (iii) (ii)의 집단을, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 형질도입하기 위한 조건 하에 이종 폴리펩티드를 코딩하는 위형화된 렌티바이러스 벡터와 접촉시키되; 위형화된 렌티바이러스 벡터가 ASCT-2에 결합하는 당단백질을 포함하고; 이에 의해 이종 폴리펩티드를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 이종 폴리펩티드를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사(ML) NK 세포의 집단을 생산하는 방법을 제공한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 당단백질은 레트로바이러스 당단백질이다. 일부 양태에서, 레트로바이러스 당단백질은 비비 외피(BaEV) 당단백질이다. 일부 양태에서, BaEV 당단백질은 서열번호 107에 의해 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 iPSC, 제대혈, 또는 PBMC로부터 유래된다. 일부 양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 자가 또는 동종이계이다. 일부 양태에서, 단계 (ii)의 기간은 약 12-16 시간, 선택적으로 약 14-16 시간, 선택적으로 약 16 시간이다. 일부 양태에서, (iii)의 결과로서 형질도입되는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단의 비율은 적어도 10%이다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단의 약 10-90%, 선택적으로 약 35-80%, 선택적으로 약 40-60%, 선택적으로 약 60%가 형질도입된다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단은 (i) 대조군 인간 NK 세포주에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 증가된 IFNγ를 생산하고/하거나; (ii) 대조군 인간 NK 세포주에 대해 향상된 항체-의존적 세포 세포독성을 갖고/갖거나; (iii) 대조군 인간 NK 세포주에 대해 향상된 항-종양 효능을 갖고, 선택적으로 대조군 인간 NK 세포주는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주이다. 일부 양태에서, CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D 및 CD25의 폴리펩티드 중 하나 이상의 발현은 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 증가된다. 일부 양태에서, CD94는 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 증가된다. 일부 양태에서, NKp30은 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 증가된다. 일부 양태에서, NKp44는 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 증가된다. 일부 양태에서, NKG2D는 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 증가된다. 일부 양태에서, CD25는 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 증가된다. 일부 양태에서, KIR, CD57, NKG2C, DNAM-1 및 CD137의 폴리펩티드 중 하나 이상은 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 상대적으로 변화되지 않는다. 일부 양태에서, KIR은 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 상대적으로 변화되지 않는다. 일부 양태에서, CD57은 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 상대적으로 변화되지 않는다. 일부 양태에서, NKG2C는 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 상대적으로 변화되지 않는다. 일부 양태에서, DNAM-1은 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 상대적으로 변화되지 않는다. 일부 양태에서, CD137은 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 상대적으로 변화되지 않는다. 일부 양태에서, CD16 및/또는 CD11b의 발현은 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단에서 감소된다. 일부 양태에서, 복수의 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단은 CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단은 생체내 투여 후 1.5 배, 2 배, 3 배 또는 4 배 증식된다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단은 생체내 투여 후 사이토카인에 대한 향상된 반응 또는 활성화 수용체 재-자극을 나타낸다. 일부 양태에서, 향상된 반응은 수주 내지 수개월, 선택적으로 2 주 내지 3 개월의 기간, 3 주 내지 2 개월의 기간, 또는 약 1 개월 동안 유지된다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 위형화된 렌티바이러스 벡터는 IL-15 폴리펩티드, 선택적으로 인간 IL-15 폴리펩티드를 추가로 코딩한다. 일부 양태에서, IL-15 폴리펩티드는 분비된 IL-15 폴리펩티드 또는 막 결합된 IL-15 폴리펩티드이다. 일부 양태에서, 막 결합된 IL-15 폴리펩티드는 이종 막관통 도메인, 선택적으로 CD8 막관통 도메인에 융합된다. 일부 양태에서, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단의 증식은 IL-15 폴리펩티드 없이 형질도입된 대조군 ML NK 집단에 대해 형질도입 후 약 1.5 배, 2 배, 3 배 또는 4 배 증가된다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 방법은 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 단리시키는 단계; 및 선택적으로, 세포의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 이종 폴리펩티드는 CAR이다. 일부 양태에서, CAR은 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 결합 도메인을 포함하며, 세포외 결합 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 세포외 결합 도메인은 (a) MHC 클래스 I 단백질 단독, 및/또는 (b) MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 대조군 펩티드에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않고, 선택적으로 대조군 펩티드는 NY-ESO-1 에피토프 또는 인플루엔자 바이러스 M1 에피토프이다. 일부 양태에서, NPM1c 네오에피토프는 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9를 포함하고, X1은 A, V, L 또는 I로부터 선택되고, X2는 A, T, S, V, L, I, M 또는 Q로부터 선택되고, X3은 Q 또는 N으로부터 선택되고, X4는 D 또는 E로부터 선택되고, X5는 L, I, V, M, A 또는 F로부터 선택되고, X6은 C, S 또는 A로부터 선택되고, X7은 L, I, V, M, A 또는 F로부터 선택되고, X8은 A, V, L 또는 I로부터 선택되고, X9는 L, I, V, M 또는 A로부터 선택된다. 일부 양태에서, X1은 A 또는 V로부터 선택되고, X2는 V, I 또는 L로부터 선택되고, X3은 Q 또는 N으로부터 선택되고, X4는 D 또는 E로부터 선택되고, X5는 L 또는 I로부터 선택되고, X6은 C 또는 S로부터 선택되고, X7은 V, L 또는 I로부터 선택되고, X8은 A 또는 V로부터 선택되고, X9는 V, I 또는 L로부터 선택된다. 일부 양태에서, X1은 A이고, X2는 V, I, 또는 L로부터 선택되고 X3은 Q이고, X4는 D이고, X5는 L이고, X6은 C이고, X7은 L이고, X8은 A이고, X9는 V, I, 또는 L로부터 선택된다. 일부 양태에서, NPM1c 네오에피토프는 AIQDLCLAV(서열번호 1) 또는 AIQDLCVAV(서열번호 71)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 네오에피토프는 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함한다. 일부 양태에서, 네오에피토프는 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02 단백질이거나, HLA-A*02 대립유전자 그룹에 의해 코딩된다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩된다.
일부 양태에서, NPM1c 네오에피토프는 CLAVEEVSL(서열번호 72), VEEVSLRK(서열번호 73), AVEEVSLR(서열번호 74), AVEEVSLRK(서열번호 75), CLAVEEVSLRK(서열번호 76)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 네오에피토프는 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02 단백질이거나, HLA-A*02 대립유전자 그룹에 의해 코딩된다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩된다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, CAR의 세포외 도메인은 (i) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VH의 CDR인 VH 상보성 결정 영역(CDR)1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및/또는 (ii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VL의 CDR인 VL 상보성 결정 영역(CDR)1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 양태에서, 세포외 도메인은 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, VH CDR1은 아미노산 서열 GFTFSSYA(서열번호 9)를 갖고, VH CDR2는 아미노산 서열 ISGSGGST(서열번호 10)를 갖고, VH CDR3은 아미노산 서열 ARLGYPTTTLLPFDY(서열번호 11)를 갖는다. 일부 양태에서, 세포외 도메인은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하고, VL CDR1은 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 6)를 갖고, VL CD2는 아미노산 서열 AAS(서열번호 7)를 갖고, VL CD3은 아미노산 서열 QQSYSTPLT(서열번호 8)를 갖는다. 일부 양태에서, 세포외 도메인은 VH 및 VL을 포함하고, VH는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 세포외 도메인은 VH 및 VL을 포함하고, VH는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, CAR의 세포외 도메인은 scFv를 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 인간 scFv이다. 일부 양태에서, scFv는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, VH CDR1은 아미노산 서열 GFTFSSYA(서열번호 9)를 갖고, VH CDR2는 아미노산 서열 ISGSGGST(서열번호 10)를 갖고, VH CDR3은 아미노산 서열 ARLGYPTTTLLPFDY(서열번호 11)를 갖는다. 일부 양태에서, scFv는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하고, VL CDR1은 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 6)를 갖고, VL CD2는 아미노산 서열 AAS(서열번호 7)를 갖고, VL CD3은 아미노산 서열 QQSYSTPLT(서열번호 8)를 갖는다. 일부 양태에서, scFv는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 VH 및 VL을 포함하고, VH는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 양태에서, 펩티드 링커는 Gly-Ser 링커이다. 일부 양태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)(서열번호 58), (Gly4Ser)2(서열번호 59), (Gly4Ser)3(서열번호 60), 및 (Gly4Ser)4(서열번호 61)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, Gly-Ser 링커는 아미노산 서열 SGSSGGSSSG(서열번호 4)를 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, scFv는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖고; 선택적으로, scFv는 (a) VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1이 아미노산 서열 GFTFSSYA(서열번호 9)를 갖고, VH CDR2가 아미노산 서열 ISGSGGST(서열번호 10)를 갖고, VH CDR3이 아미노산 서열 ARLGYPTTTLLPFDY(서열번호 11)를 갖는 VH; 및/또는 (b) VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1이 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 6)를 갖고, VL CD2가 아미노산 서열 AAS(서열번호 7)를 갖고, VL CD3이 아미노산 서열 QQSYSTPLT(서열번호 8)를 갖는 VL을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하고, 항원은 암 세포의 표면 상에 있다. 일부 양태에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML)이다. 일부 양태에서, 세포외 도메인은 100 nM 이하, 50 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 0.5 nM 내지 100 nM, 또는 1 nM 내지 15 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 항원에 결합한다.
일부 양태에서, CAR은 막관통 도메인을 포함하고, 막관통 도메인은 CD3-제타, CD8, CD28, DAP12, 2B4, NKG2D, CD16, NKp44 또는 NKp46의 막관통 도메인으로부터 선택된다. 일부 양태에서, CAR은 세포내 도메인을 포함하고, 세포내 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 2B4, DAP10, CD137 및 DAP12로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 세포내 도메인은 CD3-제타 시그널링 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고; 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인을 포함하고, CAR 폴리펩티드는 CD8 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 세포내 도메인은 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 시그널링 도메인, 및 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고; CAR 폴리펩티드는 CD8 막관통 도메인 및 CD8 힌지 영역을 포함하고, CD8 막관통 도메인 및 CD8 힌지 영역은 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하고; 세포외 결합 도메인은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 선도 서열을 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, CAR의 세포내 도메인은 자가-절단 펩티드 서열 및 사이토카인을 추가로 포함하고, 자가-절단 펩티드의 절단은 사이토카인을 방출한다. 일부 양태에서, 사이토카인은 IL-12, IL-7, IL-13, IL-15, TNF-α, IFN-γ, 또는 CCL19이다. 일부 양태에서, 사이토카인은 IL-15 폴리펩티드이다. 일부 양태에서, IL-15 폴리펩티드는 발현 후 분비된다. 일부 양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 102에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 102의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-15 폴리펩티드는 이종 막관통 도메인에 융합되고, 선택적으로 이종 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인이다. 일부 양태에서, IL-15 폴리펩티드는 막-결합된 IL-15 폴리펩티드로서 발현된다. 일부 양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 100에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 100의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 제조된, 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 제공한다. 일부 양태에서, 조작된 ML NK 세포의 집단은 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포의 존재 하에, (i) IFN감마의 증가된 발현을 갖고/갖거나; (ii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 그랜자임 B의 증가된 발현을 갖고/갖거나; (iii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 활성화 마커의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 활성화 마커가 CD25, CD107a, CD69, ICOS, CD226 및 CD62L로부터 선택되고/되거나; (iv) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 활성화 수용체의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 활성화 수용체가 NKp30, NKG2D, NKp44로부터 선택되고/되거나; (v) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 성숙 마커의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 성숙 마커가 CD56 및 NKG2A로부터 선택되고/되거나; (vi) NK 세포의 대조군 집단에 대해 CD57의 감소된 발현을 갖고/갖거나; (vii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 TIGIT의 증가된 발현을 갖고/갖거나; (viii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 TRAIL의 감소된 발현을 갖고; 선택적으로, NK 세포의 대조군 집단은 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 비형질도입된 집단이다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 IFN-감마의 증가된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 하나 이상의 활성화 마커의 증가된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, 활성화 마커는 CD107a이다. 일부 양태에서, 활성화 마커는 CD62L이다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 하나 이상의 활성화 수용체의 증가된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, 활성화 수용체는 NKG2D이다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD57의 감소된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD56 및 NKG2A의 증가된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 TIGIT의 증가된 발현을 갖는다. 일부 양태에서, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉할 때, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 TRAIL의 감소된 발현을 갖는다.
일부 양태에서, 본 발명은 암을 포함하는 세포의 세포 표면이 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 나타내고, 암을 치료하기에 충분한 양으로 본원에 기재된 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단, 또는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 암은 AML이다. 일부 양태에서, 암을 치료하는 방법은 대상체에서 암 부담을 감소시키는 방법 또는 생존을 증가시키는 방법이다.
다른 양태에서, 본 발명은 AML을 치료하기에 충분한 양으로 본원에 기재된 바와 같은 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단, 또는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, AML 치료를 필요로 하는 대상체에서 AML을 치료하는 방법을 제공한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, AML은 재발된 AML 또는 난치성 AML이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단, 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, AML로부터 관해 중인 대상체에서 AML의 재발을 예방하는 방법을 제공한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 본원에 기재된 임의의 방법은 투여 단계 전에, 대상체가 NPM1c를 발현하는지 여부 또는 대상체가 NPM1 유전자에서 NPM1c 돌연변이를 갖는지 여부, 및 대상체가 NPM1c를 발현하거나 투여 단계와 함께 진행되는 NPM1c 돌연변이를 갖는지를 검출하는 단계를 포함한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 본 발명의 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단은 생체내 투여 후 향상된 증식을 나타낸다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 본원에 기재된 임의의 방법은 하나 이상의 추가 치료제 또는 절차를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 암을 포함하는 세포의 세포 표면이 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 나타내고; 선택적으로, 하나 이상의 추가 치료제 또는 절차와의 조합인, 대상체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서, 본원에 기재된 바와 같은 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단, 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
임의의 상술한 또는 관련된 양태에서, 대상체는 인간이다.
다른 태양에서, 본 발명은 (i) 본원에 기재된 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단, 또는 약학 조성물; (ii) 선택적으로, 하나 이상의 추가 치료제 및 (iii) 대상체에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 하나 이상의 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
도 1은 인간 사이토카인-유도된 기억-유사(본원에서, "기억-유사", "CIML", "ML"로 상호교환적으로 지칭됨) NK 세포 분화의 요약을 나타낸다. 종래의, 나이브(
) NK 세포는 IL-12, IL-15, 및 IL-18의 조합(또는 대조군으로서 IL-15 단독)으로 12-16 시간 동안 예비-활성화되고, 세척되고, 시험관내(in vitro)(생존을 위해 저용량 IL-15를 가짐) 또는 생체내(in vivo)(생존을 위해 rh IL-2 또는 rhIL-15를 갖는 NSG 마우스에서)에서 분화되도록 허용된다. IL-12/15/18 예비-활성화는 광범위한 증식, 및 기억-유사 NK 세포로의 분화를 야기하였다. 제2(재-) 자극시, 기억-유사 NK 세포는 대조군 또는 나이브 NK 세포와 비교하여 향상된 반응을 나타낸다. 이 실시예에서, IFN-γ 생산은 백혈병 표적 세포에 대한 반응으로 원형 NK 세포 기능 판독으로서 나타난다.
도 2a-2c는 일차 종래의 CIML NK 세포에서의 LSL-R 및 ASCT2의 발현을 나타낸다. 도 2a는 종래의 일차 인간 NK 세포(cNK) 또는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포(CIML-NK)인 인간 NK(hNK) 세포에서의 퍼센트(%) LDL-R 발현을 나타내는 그래프이다. 도 2b는 cNK 또는 CIML-NK 세포에서의 퍼센트(%) ASCT2 발현을 나타내는 그래프이다. 도 2c는 비비 외피 당단백질(BaEV-LV)로 위형화된 렌티바이러스에 의해 표적화된 ASCT1/2 대 수포성-구내염-바이러스-G 단백질(VSVG-LV)로 위형화된 렌티바이러스에 의해 표적화된 LDL-R의 NK 세포 상의 상대적 발현을 도시한 개략도이다.
도 3a는 NK 세포 상에서 발현된 항-NPM1c CAR 및 AML 세포 상에서 HLA-A2 복합체(AIQ-HLA-A2 복합체)에 의해 제시된 AIQ(AIQDLCLAV; 서열번호 1)의 이의 인식의 개략도를 나타낸다. 또한, 항-NPM1c-CAR 벡터의 개략도가 나타나 있다. 도 3b는 T 세포 상에서 발현된 항-NPM1c CAR이 AIQ-HLA-A2 복합체를 인식한다는 것을 나타내는 유세포 분석 데이터를 제공한다.
도 4는 NPM1이 AML에서 돌연변이된다는 것을 나타낸다. 개략도는 Xie, et al. Nat Biomed Eng (2021) 5:124로부터 맞춤화되었다.
도 5는 비종래의 렌티바이러스 형질도입 접근법(BaEV로 위형화된 렌티바이러스)을 사용한 CIML NK 세포의 최적화된 CAR-편집을 나타낸다. 항-NPM1c NK 세포 및 비형질도입된(UT) 세포에서 CAR scFv 및 GFP 발현을 정량화하는 흐름도를 나타낸다.
도 6a는 사이토카인 유도된 기억-유사 NK 세포를 생성하기 위해 사용되는 방법 및 CAR-발현 CIML NK 세포를 생성하기 위해 렌티바이러스(예를 들어, BaEV로 위형화됨)를 사용한 CAR 구축물을 이용한 형질도입을 나타내는 개략도이다.
도 6b는 16 시간 동안 50 ng/mL IL-15, 10 ng/mL IL-12, 및 50 ng/mL IL-18의 조합으로 자극된 NK 세포에서의 퍼센트(%) ASCT2 발현을 나타내는 그래프이다.
도 6c-6e는 IL-12 및 IL-18(도 6c-6d) 또는 IL-12, IL-18, 및 IL-15(도 6e)의 조합으로 자극된 hNK 세포에서 qPCR에 의해 정량화된 바와 같은 ASCT mRNA의 발현에서의 배수 변화를 정량화하는 그래프를 제공한다. 대조군 세포를 미처치하거나, IL-15 단독, IL-12 단독, 또는 IL-18 단독으로 처치하였다.
도 6f는 상이한 조합의 사이토카인으로 예비-활성화된 ML NK 세포에서 항-NPM1c CAR을 코딩하는 비비 외피 당단백질(BaEV-LV)로 위형화된 렌티바이러스를 이용한 형질도입 효율을 나타내는 히스토그램이다.
도 7a는 유세포 분석(% 단백질 L 결합으로 나타냄)을 사용하여 CAR 발현을 측정함으로써 결정된 바와 같은 항-NPM1c CAR을 코딩하는 BaEV-LV로 형질주입된 상이한 인간 공여체로부터 얻어진 ML-NK 세포에 대한 형질도입 비율의 그래프를 나타낸다.
도 7b는 GFP를 코딩하는 BaEV-LV로 형질도입된 일차 인간 및 마우스 CIML NK 세포에서의 효율적인 유전자 발현을 나타낸다. PBMC로부터의 일차 hNK 세포를 재조합 인간 IL-12, IL-18, 및 IL-15로 밤새 예비-활성화시켜, 인간 CIML NK 세포를 생성하였다. 비장으로부터의 마우스 NK 세포를 재조합 마우스 IL-12, IL-18, 및 IL-15로 밤새 예비-활성화시켜, 마우스 CIML NK 세포를 생성하였다.
도 7c는 성숙 및 발달의 단계에 기초한 hNK 세포의 특징적인 표현형 마커를 제공한다.
도 7d는 유세포 분석에 의해 저 성숙(NK1 = CD56brightCD16-), 중간 성숙(NK2 = CD56dimCD16+KIRs- 또는 NK3 = CD56dimCD16+KIRs+CD57-), 또는 완전 성숙(NK4 = CD56dimCD16+KIRs+CD57+)으로부터의 성숙의 단계에 기초하여 hNK 세포 서브세트를 구별하기 위해 살아있는 CD56+CD3- 세포 상에서 게이팅(gating)하기 위한 전략을 제공한다.
도 7e는 도 7d에 도시된 게이팅 전략에 따라 구별되는 hNK 세포 서브세트 NK1-NK4에 대한 ASCT2의 표면 발현을 정량화하는 막대 그래프를 제공한다. hNK 세포를 4 개의 상이한 인간 공여체로부터 얻었다.
도 7f는 도 7d에 도시된 게이팅 전략에 따라 구별되는 hNK 세포 서브세트 NK1-NK4에 대한 ASCT2 표면 발현을 정량화하기 위한 히스토그램을 제공한다. 한명의 인간 공여체로부터 얻어진 hNK 세포에 대한 데이터를 나타낸다.
도 8a는 CAR ML-NK 세포의 강한 항-AML 기능을 나타낸다. NPM1c+HLA-A2+ 표적 세포와의 공동-배양 후, 비형질도입된(UT) 세포 및 항-NPM1c-CAR ML NK 세포에서 IFΝγ 및 CD107a 발현을 정량화하는 흐름도(좌측 패널) 및 상응하는 막대 그래프(우측 패널)를 나타낸다.
도 8b-8g는 OCI-AML3(NPM1c+HLA-A2+) 세포와 공동-배양 후 비형질도입된 NK 세포와 비교하여, BaEV-LV를 사용하여 항-NPM1c CAR로 형질도입된 CIML-NK 세포에 대한 표현형 마커의 분석을 나타낸다. 정량화는 CyTOF에 의해 수집된 질량 세포분석 데이터에 기초한이다. 도 8b는 CD107a, 사이토카인(IFΝγ), 및 세포독성 마커(그랜자임 B)의 정량화를 제공하고; 도 8c는 활성화 마커(CD25, CD69, ICOS, CD226, CD62L)의 정량화를 제공하고; 도 8d는 활성화 수용체(NKp30, NGD2D, NKp44)의 정량화를 제공하고; 도 8e는 성숙 마커(CD56, NKG2A, CD57)의 정량화를 제공하고; 도 8f는 고갈 마커 TIGIT의 정량화를 제공하고; 도 8g는 아폽토시스 마커 TRAIL의 정량화를 제공한다.
도 9a는 15 일의 기간에 걸친 비형질도입된(UT) ML NK 세포, CAR-s15(분비된 IL15를 발현하는 항-NPM1c CAR ML NK 세포), 또는 CAR-m15(막-결합된 IL15를 발현하는 항-NPM1c CAR ML NK 세포)의 시험관내 배양액에서의 세포 증식을 측정하는 그래프이다.
도 9b-9c는 형질도입 후 CAR 발현이 유지되었다는 것을 나타내는 막대 그래프(도 9b) 및 상응하는 흐름도(도 9c)를 제공한다. 비형질도입된(UT) 세포, 항-NPM1c CAR 단독 ML NK 세포, CAR-s15 ML NK 세포, 및 CAR-m15 ML NK 세포에서 형질도입 후 4 일차 및 23 일차에 CAR 발현을 측정하였다. CAR 발현은 생존가능한 NK 세포에서 % 단백질 L 결합으로서 나타난다.
도 10a는 NPM1c:HLA-A2-발현 표적 세포와 공동-배양될 때, CAR-s15 ML NK 세포 및 CAR-m15 ML NK 세포가 IFΝγ를 발현하는 것을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. NK 세포를 OCI-AML3(NPM1c+, HLA-A2+, Luc+; 상부 그래프) 또는 OCI-AML2(NPM1c-, HLA-A2+, Luc+; 하부 그래프)인 표적 세포를 사용하여 1:1의 이펙터:표적 비로 공동-배양하였다. 대조군 세포는 비형질도입된 ML NK 세포였다. 세포를 5 시간 동안 공동-배양하고, 유세포 분석을 사용하여 IFΝγ 발현에 대해 분석하였다.
도 10b는 CAR-s15 ML NK 세포 및 CAR-m15 ML NK 세포가 아폽토시스 표적 세포의 퍼센트(%)에 의해 측정된 바와 같이, NPM1c:HLA-A2-발현 표적 세포의 아폽토시스를 유도한다는 것을 나타내는 선 그래프를 제공한다. 표적 세포는 OCI-AML3(NPM1c+, HLA-A2+, Luc+; 상부 그래프) 또는 OCI-AML2(NPM1c-, HLA-A2+, Luc+; 하부 그래프)였다. 세포를 비형질도입된 ML-NK 세포, CAR-s15 ML-NK 세포, 또는 CAR m15 ML-NK 세포와 4 시간 동안 나타낸 E:T 비에서 공동-배양한 다음에, 유세포 분석을 사용하여 아넥신 V 염색에 대해 분석하였다.
도 10c는 상이한 E:T 비에서 비형질도입된 ML-NK 세포, 항-CAR NPM1c-단독 ML-NK 세포, CAR-s15 ML-NK 세포, 또는 CAR-m15 ML-NK 세포를 이용한 24 시간 배양 후 표적 세포(OCI-AML3(NPM1c+, HLA-A2+, Luc+; 좌측 그래프) 또는 OCI-AML2(NPM1c-, HLA-A2+, Luc+; 우측 그래프)에서의 세포 생존을 나타내는 선 그래프를 제공한다.
도 10d-10g는 세포내 NPM1c로부터 유래된 네오에피토프를 표적화하는 조작된 기억-유사 NK CAR이 급성 골수성 백혈병(AML)에 대해 강한 활성 및 특이성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 도 10d는 형질도입 후 72 시간에 일차 인간 CIML NK 세포에서 효율적인 렌티바이러스-매개된(BaEV-LV) CAR 편집을 나타낸다. 도 10e는 항-NPM1c CAR 및 막-결합된 IL-15를 이용한 공동-형질도입이 시험관내에서 CAR-CIML NK 세포 증식을 용이하게 한다는 것을 나타낸다. 도 10f는 유세포 분석 전 4 시간 동안 항-NPM1c CAR이 단독으로 형질도입되거나 항-NPM1c CAR 및 mIL-15로 공동-형질도입되고 OCI-AML3 표적 세포(NPM1c+ HLA-2A+)에 의해 자극된 CIML NK 세포에서의 IFN-감마 및 CD107a 발현을 나타낸다. 도 10g는 항-NPM1c CAR 단독으로 형질도입되거나 항-NPM1c CAR 및 mIL-15로 공동-형질도입된 CIML NK 세포와 4 시간 동안 공동-배양된 OCI-AML3(NPM1c+ HLA-2A+) 표적 세포의 사멸을 나타낸다.
도 11a는 항-NPM1c-CAR-ML NK 세포 생성 및 OCI-AML3-Luc 세포를 함유하는 마우스의 생성 및 CAR 세포를 이용한 후속 처치 및 종양 부하 모니터링의 시각표를 제공한다.
도 11b는 도 11a에 약술된 연구에 관련된 마우스에서의 루시페라아제 발현의 이미지를 제공한다. 루시퍼라아제를 비형질도입된 세포 또는 분비된 IL-15(s15), 막 결합된 IL-15(m15) 또는 CAR 단독(IL-15 없음)을 발현하는 항-NPM1c CAR ML NK 세포를 받은 마우스에서 3 일차, 10 일차, 및 13 일차에 측정하였다.
도 11c는 종양 OCI-AML3 세포를 보유하는 마우스에서 전체(총) 루시페라아제 발현(도 11b에서 영상화된 바와 같음)을 나타내는 선 그래프를 제공한다.
도 12는 자연 살해(NK) 세포의 세포 분류를 나타낸다.
도 13은 NK 세포 반응이 활성화 및 억제 신호의 순 균형(net balance)에 의해 지시된다는 것을 나타내는 개략도이다.
도 14는 NK 세포의 입양 전이의 전략을 나타내는 개략도이다.
도 15는 면역계의 기억을 나타내는 개략도이다. Rosenblum et al, 2016으로부터 맞춤화되었다.
도 16은 IL-12 + IL-18을 이용한 종래의 NK 세포의 활성화가 기억-유사 NK 세포로의 분화를 유도한다는 것을 나타낸다. Romee et al, Blood, 2012; Romee, et al, Science TM, 2016을 참고한다.
도 17은 재발된/난치성 AML에서 기억-유사 NK 세포의 제1-인간내 1 상 연구를 나타낸다.
도 18은 입양 전이 후 CIML NK 세포가 증식한다는 것을 나타낸다. Romee, et al. Science TM, 2016으로부터 맞춤화된다.
도 19는 기억-유사 NK 세포가 안전하고 유망한 임상 활성을 가졌다는 것을 나타낸다. Romee et al, Science TM, 2016을 참고한다.
도 20은 줄기세포 이식 후 재발이 있는 환자에서의 1a/b 상 연구를 약술한 개략도이다. 반수체(haplo)에서의 NK 세포 결함뿐 아니라, 반수체 HCt 후에 재발하는 환자에 대한 효과적이고 안전한 치료 옵션이 없음에 기초하여, 기억 유사 NK 세포의 1 상 연구를 개시하였다. 이식 후 재발은 좌측 패널에 나타낸 바와 같이 매우 열악한 결과와 연관되며, HLA 미스매치는 GVHD의 위험이 증가된 DLI 사용에 대한 위험한 상황일 수 있다. NK 세포를 사용하고, 면역 양립성인, 원래의 줄기 세포 이식편과 동일한 공여체로부터 기억-유사 NK 세포를 생성한다. 그 다음에, 이들은 7 회 용량의 저용량 IL-2를 얻는다.
도 21은 기억-유사 NK("Mem-NK") 세포의 대규모 생체내 증식 및 연장된/지속된 지속성을 나타낸다. 대략 500 배 증식이 나타난다. CIML NK 세포는 적어도 65 일 동안 검출가능하였고, 마우스에서 관찰된 것을 모방하였고, 또한 인간에서 이들 세포의 긴 반감기를 확인하였다. 장기 지속성은 이들을 NK 세포-기반 면역요법 접근법을 위한 플랫폼으로서 꽤 매력적으로 만든다.
도 22는 28 일차에 Treg의 최소 증식을 갖는 성숙 NK 세포의 증식을 나타낸다.
도 23은 모구 형질세포양 DC 신생물(BPDCN)을 갖는 환자가 기억-유사 NK 세포 주입으로 관해를 달성한다는 것을 나타낸다.
도 24는 후기 두경부암에서의 CTLA-4 억제 + 기억-유사 NK 세포 면역 세포 요법을 나타낸다. NK 침윤이 H&N 암 환자에서 PFS를 예측한다는 것을 나타내는 데이터가 있다. 또한, CTAL4 차단 ipi는 종양내 Treg 고갈을 유도한다. 예를 들어, 1 상 시험은 기억-유사 NK 세포를 Ipi와 조합한 다음에, 또한 장기 작용하는 IL-15 초 작용제를 제공한다.
도 25는 항체 모집 분자(ARM)가 새로운 이중특이적 NK 세포 인게이저(engager)라는 것을 나타낸다.
도 26은 자가-HCT를 갖는 MRD+ MM에서 CD38 ARM + Mem-유사 NK 세포의 I/II 상 시험을 나타낸다.
도 27은 CAR 개발을 위한 기억-유사 NK 세포 플랫폼의 개발을 나타낸다.
도 28은 pHIV-CAR-CD19hscFv-P2A-GFP(8606 bp)의 벡터 지도를 나타낸다.
도 2a-2c는 일차 종래의 CIML NK 세포에서의 LSL-R 및 ASCT2의 발현을 나타낸다. 도 2a는 종래의 일차 인간 NK 세포(cNK) 또는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포(CIML-NK)인 인간 NK(hNK) 세포에서의 퍼센트(%) LDL-R 발현을 나타내는 그래프이다. 도 2b는 cNK 또는 CIML-NK 세포에서의 퍼센트(%) ASCT2 발현을 나타내는 그래프이다. 도 2c는 비비 외피 당단백질(BaEV-LV)로 위형화된 렌티바이러스에 의해 표적화된 ASCT1/2 대 수포성-구내염-바이러스-G 단백질(VSVG-LV)로 위형화된 렌티바이러스에 의해 표적화된 LDL-R의 NK 세포 상의 상대적 발현을 도시한 개략도이다.
도 3a는 NK 세포 상에서 발현된 항-NPM1c CAR 및 AML 세포 상에서 HLA-A2 복합체(AIQ-HLA-A2 복합체)에 의해 제시된 AIQ(AIQDLCLAV; 서열번호 1)의 이의 인식의 개략도를 나타낸다. 또한, 항-NPM1c-CAR 벡터의 개략도가 나타나 있다. 도 3b는 T 세포 상에서 발현된 항-NPM1c CAR이 AIQ-HLA-A2 복합체를 인식한다는 것을 나타내는 유세포 분석 데이터를 제공한다.
도 4는 NPM1이 AML에서 돌연변이된다는 것을 나타낸다. 개략도는 Xie, et al. Nat Biomed Eng (2021) 5:124로부터 맞춤화되었다.
도 5는 비종래의 렌티바이러스 형질도입 접근법(BaEV로 위형화된 렌티바이러스)을 사용한 CIML NK 세포의 최적화된 CAR-편집을 나타낸다. 항-NPM1c NK 세포 및 비형질도입된(UT) 세포에서 CAR scFv 및 GFP 발현을 정량화하는 흐름도를 나타낸다.
도 6a는 사이토카인 유도된 기억-유사 NK 세포를 생성하기 위해 사용되는 방법 및 CAR-발현 CIML NK 세포를 생성하기 위해 렌티바이러스(예를 들어, BaEV로 위형화됨)를 사용한 CAR 구축물을 이용한 형질도입을 나타내는 개략도이다.
도 6b는 16 시간 동안 50 ng/mL IL-15, 10 ng/mL IL-12, 및 50 ng/mL IL-18의 조합으로 자극된 NK 세포에서의 퍼센트(%) ASCT2 발현을 나타내는 그래프이다.
도 6c-6e는 IL-12 및 IL-18(도 6c-6d) 또는 IL-12, IL-18, 및 IL-15(도 6e)의 조합으로 자극된 hNK 세포에서 qPCR에 의해 정량화된 바와 같은 ASCT mRNA의 발현에서의 배수 변화를 정량화하는 그래프를 제공한다. 대조군 세포를 미처치하거나, IL-15 단독, IL-12 단독, 또는 IL-18 단독으로 처치하였다.
도 6f는 상이한 조합의 사이토카인으로 예비-활성화된 ML NK 세포에서 항-NPM1c CAR을 코딩하는 비비 외피 당단백질(BaEV-LV)로 위형화된 렌티바이러스를 이용한 형질도입 효율을 나타내는 히스토그램이다.
도 7a는 유세포 분석(% 단백질 L 결합으로 나타냄)을 사용하여 CAR 발현을 측정함으로써 결정된 바와 같은 항-NPM1c CAR을 코딩하는 BaEV-LV로 형질주입된 상이한 인간 공여체로부터 얻어진 ML-NK 세포에 대한 형질도입 비율의 그래프를 나타낸다.
도 7b는 GFP를 코딩하는 BaEV-LV로 형질도입된 일차 인간 및 마우스 CIML NK 세포에서의 효율적인 유전자 발현을 나타낸다. PBMC로부터의 일차 hNK 세포를 재조합 인간 IL-12, IL-18, 및 IL-15로 밤새 예비-활성화시켜, 인간 CIML NK 세포를 생성하였다. 비장으로부터의 마우스 NK 세포를 재조합 마우스 IL-12, IL-18, 및 IL-15로 밤새 예비-활성화시켜, 마우스 CIML NK 세포를 생성하였다.
도 7c는 성숙 및 발달의 단계에 기초한 hNK 세포의 특징적인 표현형 마커를 제공한다.
도 7d는 유세포 분석에 의해 저 성숙(NK1 = CD56brightCD16-), 중간 성숙(NK2 = CD56dimCD16+KIRs- 또는 NK3 = CD56dimCD16+KIRs+CD57-), 또는 완전 성숙(NK4 = CD56dimCD16+KIRs+CD57+)으로부터의 성숙의 단계에 기초하여 hNK 세포 서브세트를 구별하기 위해 살아있는 CD56+CD3- 세포 상에서 게이팅(gating)하기 위한 전략을 제공한다.
도 7e는 도 7d에 도시된 게이팅 전략에 따라 구별되는 hNK 세포 서브세트 NK1-NK4에 대한 ASCT2의 표면 발현을 정량화하는 막대 그래프를 제공한다. hNK 세포를 4 개의 상이한 인간 공여체로부터 얻었다.
도 7f는 도 7d에 도시된 게이팅 전략에 따라 구별되는 hNK 세포 서브세트 NK1-NK4에 대한 ASCT2 표면 발현을 정량화하기 위한 히스토그램을 제공한다. 한명의 인간 공여체로부터 얻어진 hNK 세포에 대한 데이터를 나타낸다.
도 8a는 CAR ML-NK 세포의 강한 항-AML 기능을 나타낸다. NPM1c+HLA-A2+ 표적 세포와의 공동-배양 후, 비형질도입된(UT) 세포 및 항-NPM1c-CAR ML NK 세포에서 IFΝγ 및 CD107a 발현을 정량화하는 흐름도(좌측 패널) 및 상응하는 막대 그래프(우측 패널)를 나타낸다.
도 8b-8g는 OCI-AML3(NPM1c+HLA-A2+) 세포와 공동-배양 후 비형질도입된 NK 세포와 비교하여, BaEV-LV를 사용하여 항-NPM1c CAR로 형질도입된 CIML-NK 세포에 대한 표현형 마커의 분석을 나타낸다. 정량화는 CyTOF에 의해 수집된 질량 세포분석 데이터에 기초한이다. 도 8b는 CD107a, 사이토카인(IFΝγ), 및 세포독성 마커(그랜자임 B)의 정량화를 제공하고; 도 8c는 활성화 마커(CD25, CD69, ICOS, CD226, CD62L)의 정량화를 제공하고; 도 8d는 활성화 수용체(NKp30, NGD2D, NKp44)의 정량화를 제공하고; 도 8e는 성숙 마커(CD56, NKG2A, CD57)의 정량화를 제공하고; 도 8f는 고갈 마커 TIGIT의 정량화를 제공하고; 도 8g는 아폽토시스 마커 TRAIL의 정량화를 제공한다.
도 9a는 15 일의 기간에 걸친 비형질도입된(UT) ML NK 세포, CAR-s15(분비된 IL15를 발현하는 항-NPM1c CAR ML NK 세포), 또는 CAR-m15(막-결합된 IL15를 발현하는 항-NPM1c CAR ML NK 세포)의 시험관내 배양액에서의 세포 증식을 측정하는 그래프이다.
도 9b-9c는 형질도입 후 CAR 발현이 유지되었다는 것을 나타내는 막대 그래프(도 9b) 및 상응하는 흐름도(도 9c)를 제공한다. 비형질도입된(UT) 세포, 항-NPM1c CAR 단독 ML NK 세포, CAR-s15 ML NK 세포, 및 CAR-m15 ML NK 세포에서 형질도입 후 4 일차 및 23 일차에 CAR 발현을 측정하였다. CAR 발현은 생존가능한 NK 세포에서 % 단백질 L 결합으로서 나타난다.
도 10a는 NPM1c:HLA-A2-발현 표적 세포와 공동-배양될 때, CAR-s15 ML NK 세포 및 CAR-m15 ML NK 세포가 IFΝγ를 발현하는 것을 나타내는 막대 그래프를 제공한다. NK 세포를 OCI-AML3(NPM1c+, HLA-A2+, Luc+; 상부 그래프) 또는 OCI-AML2(NPM1c-, HLA-A2+, Luc+; 하부 그래프)인 표적 세포를 사용하여 1:1의 이펙터:표적 비로 공동-배양하였다. 대조군 세포는 비형질도입된 ML NK 세포였다. 세포를 5 시간 동안 공동-배양하고, 유세포 분석을 사용하여 IFΝγ 발현에 대해 분석하였다.
도 10b는 CAR-s15 ML NK 세포 및 CAR-m15 ML NK 세포가 아폽토시스 표적 세포의 퍼센트(%)에 의해 측정된 바와 같이, NPM1c:HLA-A2-발현 표적 세포의 아폽토시스를 유도한다는 것을 나타내는 선 그래프를 제공한다. 표적 세포는 OCI-AML3(NPM1c+, HLA-A2+, Luc+; 상부 그래프) 또는 OCI-AML2(NPM1c-, HLA-A2+, Luc+; 하부 그래프)였다. 세포를 비형질도입된 ML-NK 세포, CAR-s15 ML-NK 세포, 또는 CAR m15 ML-NK 세포와 4 시간 동안 나타낸 E:T 비에서 공동-배양한 다음에, 유세포 분석을 사용하여 아넥신 V 염색에 대해 분석하였다.
도 10c는 상이한 E:T 비에서 비형질도입된 ML-NK 세포, 항-CAR NPM1c-단독 ML-NK 세포, CAR-s15 ML-NK 세포, 또는 CAR-m15 ML-NK 세포를 이용한 24 시간 배양 후 표적 세포(OCI-AML3(NPM1c+, HLA-A2+, Luc+; 좌측 그래프) 또는 OCI-AML2(NPM1c-, HLA-A2+, Luc+; 우측 그래프)에서의 세포 생존을 나타내는 선 그래프를 제공한다.
도 10d-10g는 세포내 NPM1c로부터 유래된 네오에피토프를 표적화하는 조작된 기억-유사 NK CAR이 급성 골수성 백혈병(AML)에 대해 강한 활성 및 특이성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 도 10d는 형질도입 후 72 시간에 일차 인간 CIML NK 세포에서 효율적인 렌티바이러스-매개된(BaEV-LV) CAR 편집을 나타낸다. 도 10e는 항-NPM1c CAR 및 막-결합된 IL-15를 이용한 공동-형질도입이 시험관내에서 CAR-CIML NK 세포 증식을 용이하게 한다는 것을 나타낸다. 도 10f는 유세포 분석 전 4 시간 동안 항-NPM1c CAR이 단독으로 형질도입되거나 항-NPM1c CAR 및 mIL-15로 공동-형질도입되고 OCI-AML3 표적 세포(NPM1c+ HLA-2A+)에 의해 자극된 CIML NK 세포에서의 IFN-감마 및 CD107a 발현을 나타낸다. 도 10g는 항-NPM1c CAR 단독으로 형질도입되거나 항-NPM1c CAR 및 mIL-15로 공동-형질도입된 CIML NK 세포와 4 시간 동안 공동-배양된 OCI-AML3(NPM1c+ HLA-2A+) 표적 세포의 사멸을 나타낸다.
도 11a는 항-NPM1c-CAR-ML NK 세포 생성 및 OCI-AML3-Luc 세포를 함유하는 마우스의 생성 및 CAR 세포를 이용한 후속 처치 및 종양 부하 모니터링의 시각표를 제공한다.
도 11b는 도 11a에 약술된 연구에 관련된 마우스에서의 루시페라아제 발현의 이미지를 제공한다. 루시퍼라아제를 비형질도입된 세포 또는 분비된 IL-15(s15), 막 결합된 IL-15(m15) 또는 CAR 단독(IL-15 없음)을 발현하는 항-NPM1c CAR ML NK 세포를 받은 마우스에서 3 일차, 10 일차, 및 13 일차에 측정하였다.
도 11c는 종양 OCI-AML3 세포를 보유하는 마우스에서 전체(총) 루시페라아제 발현(도 11b에서 영상화된 바와 같음)을 나타내는 선 그래프를 제공한다.
도 12는 자연 살해(NK) 세포의 세포 분류를 나타낸다.
도 13은 NK 세포 반응이 활성화 및 억제 신호의 순 균형(net balance)에 의해 지시된다는 것을 나타내는 개략도이다.
도 14는 NK 세포의 입양 전이의 전략을 나타내는 개략도이다.
도 15는 면역계의 기억을 나타내는 개략도이다. Rosenblum et al, 2016으로부터 맞춤화되었다.
도 16은 IL-12 + IL-18을 이용한 종래의 NK 세포의 활성화가 기억-유사 NK 세포로의 분화를 유도한다는 것을 나타낸다. Romee et al, Blood, 2012; Romee, et al, Science TM, 2016을 참고한다.
도 17은 재발된/난치성 AML에서 기억-유사 NK 세포의 제1-인간내 1 상 연구를 나타낸다.
도 18은 입양 전이 후 CIML NK 세포가 증식한다는 것을 나타낸다. Romee, et al. Science TM, 2016으로부터 맞춤화된다.
도 19는 기억-유사 NK 세포가 안전하고 유망한 임상 활성을 가졌다는 것을 나타낸다. Romee et al, Science TM, 2016을 참고한다.
도 20은 줄기세포 이식 후 재발이 있는 환자에서의 1a/b 상 연구를 약술한 개략도이다. 반수체(haplo)에서의 NK 세포 결함뿐 아니라, 반수체 HCt 후에 재발하는 환자에 대한 효과적이고 안전한 치료 옵션이 없음에 기초하여, 기억 유사 NK 세포의 1 상 연구를 개시하였다. 이식 후 재발은 좌측 패널에 나타낸 바와 같이 매우 열악한 결과와 연관되며, HLA 미스매치는 GVHD의 위험이 증가된 DLI 사용에 대한 위험한 상황일 수 있다. NK 세포를 사용하고, 면역 양립성인, 원래의 줄기 세포 이식편과 동일한 공여체로부터 기억-유사 NK 세포를 생성한다. 그 다음에, 이들은 7 회 용량의 저용량 IL-2를 얻는다.
도 21은 기억-유사 NK("Mem-NK") 세포의 대규모 생체내 증식 및 연장된/지속된 지속성을 나타낸다. 대략 500 배 증식이 나타난다. CIML NK 세포는 적어도 65 일 동안 검출가능하였고, 마우스에서 관찰된 것을 모방하였고, 또한 인간에서 이들 세포의 긴 반감기를 확인하였다. 장기 지속성은 이들을 NK 세포-기반 면역요법 접근법을 위한 플랫폼으로서 꽤 매력적으로 만든다.
도 22는 28 일차에 Treg의 최소 증식을 갖는 성숙 NK 세포의 증식을 나타낸다.
도 23은 모구 형질세포양 DC 신생물(BPDCN)을 갖는 환자가 기억-유사 NK 세포 주입으로 관해를 달성한다는 것을 나타낸다.
도 24는 후기 두경부암에서의 CTLA-4 억제 + 기억-유사 NK 세포 면역 세포 요법을 나타낸다. NK 침윤이 H&N 암 환자에서 PFS를 예측한다는 것을 나타내는 데이터가 있다. 또한, CTAL4 차단 ipi는 종양내 Treg 고갈을 유도한다. 예를 들어, 1 상 시험은 기억-유사 NK 세포를 Ipi와 조합한 다음에, 또한 장기 작용하는 IL-15 초 작용제를 제공한다.
도 25는 항체 모집 분자(ARM)가 새로운 이중특이적 NK 세포 인게이저(engager)라는 것을 나타낸다.
도 26은 자가-HCT를 갖는 MRD+ MM에서 CD38 ARM + Mem-유사 NK 세포의 I/II 상 시험을 나타낸다.
도 27은 CAR 개발을 위한 기억-유사 NK 세포 플랫폼의 개발을 나타낸다.
도 28은 pHIV-CAR-CD19hscFv-P2A-GFP(8606 bp)의 벡터 지도를 나타낸다.
본 발명은 이종 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 CAR)를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 자연 살해(NK) 세포의 집단을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 세포 형질도입의 종래의 방법, 예를 들어 수포성-구내염 바이러스 G(VSVG) 당단백질을 통합하는 표준 위형화된 렌티바이러스 벡터를 사용하는 방법에 대해 사이토카인-유도된 기억 유사 NK 세포의 집단에서 증가된 형질도입 효율을 제공한다. 본원에 나타낸 바와 같이, VSVG 당단백질에 결합하는 LDL 수용체는 NK 세포(예를 들어, 종래의 NK 세포 또는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포)에 의해 열악하게 발현된다. 이론에 구애됨 없이, LDL 수용체의 열악한 발현은 VSVG 당단백질로 위형화된 렌티바이러스 벡터가 NK 세포에서 효과적인 흡수를 겪는 것을 예방한다.
반대로, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포는 증가된 수준의 알라닌, 세린, 시스테인 수송체 2(ASCT2)를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 본원에 나타낸 바와 같이, (i) IL-12 및 IL-18, 또는 (ii) IL-12, IL-18, 및 IL-15로 예비-활성화된 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포는 대조군 NK 세포(예를 들어, IL-15 단독으로 활성화된 종래의 NK 세포)에 대해 약 1.5-2 배 증가된 수준의 ASCT2를 발현한다. 일부 양태에서, ASCT의 수준은 대조군 NK 세포(예를 들어, IL-15 단독으로 활성화된 종래의 NK 세포)에 대해 약 1.5-3 배 증가되었다. 또한, ASCT2에 결합하는 당단백질로 위형화된 렌티바이러스 벡터는 사이토카인-유도된 NK 세포에서 높은 수준의 형질도입(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%)을 야기하는 것으로 밝혀졌다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 당단백질은 ASCT2에 결합하는 비비 외피(BaEV) 당단백질이다. 또한, 높은 수준의 ASCT2를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포에서의 형질도입이 낮은 수준의 ASCT2를 발현하는 대조군 NK 세포(예를 들어, IL-15 단독으로 활성화된 종래의 NK 세포)에 대해 증가된 것으로 나타났다. 이론에 구애됨 없이, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포에 의한 ASCT의 증가된 발현은 ASCT2-결합 당단백질(예를 들어, BaEV)을 포함하는 위형화된 렌티바이러스 벡터의 효율적인 결합 및 흡수를 가능하게 한다.
따라서, 일부 양태에서, 본 발명은 ASCT2를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을 ASCT에 결합하는 당단백질(예를 들어, BaEV)을 포함하는 위형화된 렌티바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 이종 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드)를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 일부 양태에서, ASCT2를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을 제공하는 것은 일차 인간 NK 세포의 집단을 IL-12, IL-18, 및 IL-15와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, ASCT2를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을 제공하는 것은 일차 인간 NK 세포의 집단을 IL-12 및 IL-18과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단, 예를 들어 대조군 NK 세포에 대해 하나 이상의 최적 특성을 갖는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포(예를 들어, IL-15 단독과 접촉된 종래의 NK 세포)의 집단을 얻기에 충분한 기간 동안 접촉된다.
또한, 본 발명은 적어도 부분적으로 인간 일차 NK 세포의 집단에서 ASCT2의 발현이 NK 세포 성숙 및/또는 발달의 단계와 상관관계가 있다는 발견에 기초한다. 본원에 나타낸 바와 같이, 덜 성숙하고, 덜 발달된, "줄기-세포 유사", 및/또는 증식성 표현형이 특징인 마커를 발현하는 인간 일차 NK 세포의 집단의 서브세트(예를 들어, CD56brightCD16low/- NKG2A+CD57-KIRs-)는 더욱 성숙하고/하거나 더욱 발달된 표현형이 특징인 표현형 마커를 발현하는 집단의 서브세트(예를 들어, CD56dimCD16+NKG2A+/-KIRs+CD57+)에 대해 증가된 수준의 ASCT2 발현을 갖는다. 이론에 구애됨 없이, 덜 성숙한 인간 일차 NK 세포에 의한 ASCT2의 높은 발현은 더욱 성숙한 표현형 및 낮은 ASCT 발현을 갖는 인간 일차 NK 세포에 대해 ASCT에 결합하는 당단백질(예를 들어, BaEV)로 위형화된 렌티바이러스를 사용하여 증가된 형질도입 효율을 야기하는 것으로 여겨진다.
또한, 본 발명은 AML의 ~35%에서 종양유전자 돌연변이의 원인자인 뉴클레오포스민에서 4-뉴클레오티드 중복인 NPM1c에서 확인된 종양-특이적 종양원성 원인자 유전자 돌연변이로부터 야기된 세포내 신생항원으로부터 유래된 네오에피토프를 표적화하는 신규 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사 자연 살해(NK) 세포를 제공한다. 돌연변이는 가장 일반적인 HLA-A2 대립유전자에 의해 제시되는 네오에피토프를 생성한다.
본 발명의 항-NPM1c CAR 발현 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포("ML NK" 세포)는 시험관내 및 생체내에서 NPM1c 발현 세포를 효과적으로 사멸시키는 것으로 나타났다. 이론에 구애됨 없이, 본 발명의 조작된 CAR 발현 ML NK 세포는 사이토카인 방출 증후군, 신경독성 및/또는 이식편대숙주병(GVHD)을 적어도 회피하거나, 감소시키거나, 제거함으로써 CAR 발현 T 세포에 대해 치료적 이득을 제공하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 조작된 CAR 발현 ML NK 세포는 종래의 NK 세포에 대해 종양 세포에 대한 향상된 인터페론-γ(INF-γ) 생산 및 세포독성을 갖는 것으로 나타났다. 본원에 나타낸 바와 같이, 이러한 ML NK 세포에 항-NPM1c CAR을 포함시키는 것은 NPM1c를 발현하는 표적 세포의 아폽토시스를 유도하고 이러한 표적 세포의 전체 생존을 감소시키는 세포를 야기하였다. 또한, NPM1c 발현 AML 세포를 마우스에 주사하였을 때, 본 발명의 조작된 CAR 발현 ML NK 세포는 생체내에서 전체 종양 부담을 감소시켰다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 이러한 조작된 CAR 발현 ML NK 세포의 효능은 이러한 세포가 분비되거나 막 결합된 형태로 인간 IL-15를 발현할 때 증가된다. 특히, 인간 IL-15의 막 결합된 형태를 발현하는 본 발명의 조작된 CAR 발현 ML NK 세포는 증가된 지속성 및 생존, 및 향상된 효능을 나타내었다.
따라서, 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포는 NPM1c 돌연변이를 보유하는 암을 치료하기 위한 표적화된 면역요법에 유용하다. 예를 들어, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포는 AML을 치료하기 위한 표적화된 면역요법에 유용하다. 일 양태에서, 본원은 이러한 에피토프가 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화될(또는 이에 의해 제시될) 때, NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현하는 ML NK 세포를 제공한다. 일 양태에서, 본원은 이러한 에피토프가 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화될 때, AIQDLCLAV(서열번호 1), AIQDLCVAV(서열번호 71), CLAVEEVSL(서열번호 72), VEEVSLRK(서열번호 73), AVEEVSLR(서열번호 74), AVEEVSLRK(서열번호 75), CLAVEEVSLRK(서열번호 76)의 아미노산 서열을 갖는 네오에피토프 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현하는 ML NK 세포를 제공한다. 일 양태에서, 본원은 MHC 클래스 I 단백질 단독에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않는 CAR을 발현하는 ML NK 세포를 제공한다. 일 양태에서, 본원은 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 대조군 펩티드(예를 들어, 대조군 펩티드는 NY-ESO-1 에피토프(예를 들어, 서열번호 62를 포함하는 펩티드) 또는 인플루엔자 바이러스 M1 에피토프(예를 들어, 서열번호 63을 포함하는 펩티드)임)에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않는 CAR을 발현하는 ML NK 세포를 제공한다. 일 양태에서, 본원은 NPM1c 네오에피토프 단독(MHC 클래스 I 단백질 없음)에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않는 CAR을 발현하는 ML NK 세포를 제공한다. 일부 양태에서, NPM1c 네오에피토프는 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함하고, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A2 단백질(예를 들어, HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질)이다. 일부 양태에서, 항원은 암 세포의 표면 상에 있다(예를 들어, 암이 NPM1c+인 경우, 예를 들어, 암이 AML인 경우). 일 양태에서, 본원은 HLA-A2 단백질(예를 들어, HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질)과 복합체체화된 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현하는 ML NK 세포를 제공한다.
일 양태에서, 본원은 본원에 기재된 CAR 발현 기억-유사 NK 세포(및 선택적으로, 약학적 허용 담체)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본원에 기재된 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포에 의해 발현된 CAR 폴리펩티드는 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 도메인을 포함하고, 세포외 도메인은 HLA-A2 단백질(예를 들어, HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질)과 복합체화된 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다.
일 양태에서, CAR 폴리펩티드의 발현은 그 표면 상에 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 나타내는 암 세포(예를 들어, 암은 AML임)에 대해 ML NK 세포를 표적화한다. 일 양태에서, CAR 폴리펩티드의 발현은 그 표면 상에 HLA-A2 단백질(예를 들어, HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질)과 복합체화된 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 나타내는 암 세포(예를 들어, 암은 AML임)에 대해 ML NK 세포를 표적화한다.
일 양태에서, 본원은 대상체(예를 들어, 인간)에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 암을 포함하는 세포의 세포 표면은 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 나타내고, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 항-NPM1c CAR 발현 기억-유사 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 암을 포함하는 세포의 세포 표면은 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 나타낸다. 일 양태에서, 암을 포함하는 세포의 세포 표면은 HLA-A2 단백질(예를 들어, HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질)과 복합체화된 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함하는 아미노산 서열을 나타낸다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 바와 같은 항-NPM1c CAR 발현 기억-유사 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체(예를 들어, 인간)에서 NPM1c-양성 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본원은 본원에 기재된 바와 같은 항-NPM1c CAR 발현 기억-유사 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체(예를 들어, 인간)에서 AML을 치료하는 방법을 제공한다.
항-NPM1c 키메라 항원 수용체 발현 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포
일부 실시양태에서, 본 발명은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사(ML) NK 세포, 또는 상기 세포의 집단을 제공한다.
키메라 항원 수용체 폴리펩티드
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포는 CAR 폴리펩티드를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 본원에 기재된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이중특이적 분자를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
CAR은 면역 이펙터 세포(예를 들어, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포)에서 발현될 때, 이러한 면역 이펙터 세포를 항원으로 지시하고, 일반적으로 면역 이펙터 세포를 자극하여, 항원을 나타내는 세포를 사멸시키는 유전자-조작된, 인공 막-결합된 단백질이다. 따라서, CAR은 항-종양 특이성(특히, CAR의 세포외 도메인에 의해 부여되는 항원 특이성)과 같은 소망하는 항원 특이성을 면역 이펙터 세포에 부여하기 위해 사용될 수 있다.
CAR은 일반적으로 세포 상에 나타내어진 하나 이상의 항원에 결합하는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 항원에 대한 세포외 도메인의 결합시 면역 이펙터 세포에 활성화 신호를 전달하는 세포내 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR은 1) 통상적으로 신호 펩티드, 리간드 또는 항원 인식 영역(예를 들어, scFv), 및 가요성 스페이서를 포함하는 세포외 도메인; 2) 막관통(TM) 도메인; 3) 통상적으로 하나 이상의 시그널링 도메인을 포함하는 세포내 도메인(세포질 도메인으로도 알려짐)의 3 개의 도메인을 함유한다. CAR의 세포외 도메인은 세포의 외부에 존재하고 세포외 공간에 노출되며, 이에 의해 이의 리간드/항원과의 상호작용에 접근가능하다. TM 도메인은 CAR이 이펙터 세포의 세포막 내로 고정되게 한다. CAR의 세포내 도메인은 세포외 도메인이 유래되는 단백질과 상이한 신호 변환 단백질로부터 유래된 하나 이상의 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 CAR이 이의 리간드/항원에 대한 결합시 이펙터 세포 활성화를 돕는다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포 활성화는 사이토카인 및 케모카인 생산의 유도뿐 아니라, 이펙터 세포의 세포용해 활성의 활성화를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 종양 세포를 향해 세포독성을 재지시한다.
CAR의 항원 결합 도메인과 표적 세포의 표면 상의 이의 표적 항원의 결합은 CAR의 클러스터링을 야기하고, CAR-함유 세포에 활성화 자극을 전달한다. 일부 실시양태에서, CAR의 주요 특징은 면역 이펙터 세포 특이성을 재지시하여, 이에 의해 주요 조직적합성(MHC) 독립적 방식으로 표적 항원 발현 세포의 세포 사멸을 매개할 수 있는 분자의 증식, 사이토카인 생산, 식세포작용 또는 생산을 촉발시켜, 단클론 항체, 가용성 리간드 또는 세포 특이적 공동-수용체의 세포 특이적 표적화 능력을 이용하는 이의 능력이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CAR 폴리펩티드는 신생항원(예를 들어, 암 또는 종양 신생항원)에 결합하는 세포외 도메인을 포함한다. 암 신생항원은 이러한 암 세포에서 발생하는 돌연변이로 인해 암 세포에만 존재하는 항원이다. 암 항원은 세포내로 발현될 수 있고, 암 세포의 표면 상에 MHC 클래스 I 단백질에 의해 제시될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 고려되는 CAR 폴리펩티드에 의해 표적화되는 암 신생항원은 NPM1c:HLA-A2일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)은 CAR 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, NPM1c:HLA-A2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)은 CAR 폴리펩티드를 생성하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드의 세포외 결합 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질(예를 들어, HLA-2)과 복합체화된 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질 네오에피토프(예컨대, NPM1c 네오에피토프)에 결합한다.
일부 양태에서, 본원은 세포외(항원-결합) 도메인, 막관통 도메인, 및 항원 결합 도메인이 항원에 결합할 때, NK 세포를 자극하기에 충분한 CD3ζ 서열의 세포질 서열, 및 선택적으로 항원-결합 도메인이 항원에 결합할 때, NK 세포의 공동-자극을 제공하는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 또는 4 개)의 공동-자극 단백질의 세포질 서열(예를 들어, B7-H3, BTLA, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD80, CD160, CD244, ICOS, LAG3, LFA-1, LIGHT, NKG2C, 4-1BB, OX40, PD-1, PD-L1, TIM3, 2B4, DAP10, CD137, DAP12, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 중 하나 이상의 세포질 서열)을 포함하는 세포내(세포질) 도메인을 포함하는 CAR 폴리펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, CAR은 링커를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 세포외(항원-결합) 도메인, 링커, 막관통 도메인, 및 세포내(세포질) 도메인을 포함하는 CAR 및 CAR-발현 면역 이펙터 세포의 추가의 양태는 예를 들어 Kakarla et al., Cancer J. 20:151-155, 2014; Srivastava et al., Trends Immunol. 36:494-502, 2015; Nishio et al., Oncoimmunology 4(2): e988098, 2015; Ghorashian et al., Br. J. Haematol. 169:463-478, 2015; Levine, Cancer Gene Ther. 22:79-84, 2015; Jensen et al., Curr. Opin. Immunol. 33:9-15, 2015; Singh et al., Cancer Gene Ther. 22:95-100, 2015; Li et al., Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 22:1753-1756, 2014; Gill et al., Immunol. Rev. 263:68-89, 2015; Magee et al., Discov. Med. 18:265-271, 2014; Gargett et al., Front. Pharmacol. 5:235, 2014; Yuan et al., Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 22:1137-1141, 2014; Pedgram et al., Cancer J. 20:127-133, 2014; Eshhar et al., Cancer J. 20:123-126, 2014; Ramos et al., Cancer J. 20:112-118, 2014; Maus et al., Blood 123:2625-2635, 2014; Jena et al., Curr. Hematol. Malig. Rep. 9:50-56, 2014; Maher et al., Curr. Gene Ther. 14:35-43, 2014; Riches et al., Discov. Med. 16:295-302, 2013; Cheadle et al., Immunol. Rev. 257:83-90, 2014; Davila et al., Int. J. Hematol. 99:361-371, 2014; Xu et al., Cancer Lett. 343:172-178, 2014; Kochenderfer et al., Nat. Rev. Clin. Oncol. 10:267-276, 2013; Hosing et al., Curr. Hematol. Malig. Rep. 8:60-70, 2013; Hombach et al., Curr. Mol. Med. 13:1079-1088, 2013; Xu et al., Leuk. Lymphoma 54:255-260, 2013; Gilham et al., Trends Mol. Med. 18:377-384, 2012; Lipowska-Bhalla et al., Cancer Immunol. Immunother. 61:953-962, 2012; Chmielewski et al., Cancer Immunol. Immunother. 61:1269-1277, 2013; Jena et al., Blood 116:1035-1044, 2010; Dotti et al, Immunology Reviews 257(1): 107-126, 2013; Dai et al., Journal of the National Cancer Institute 108(7): djv439, 2016; Wang and Riviere, Molecular Therapy-Oncolytics 3: 16015, 2016; 미국 특허 출원 공보 제2018/0057609호; 제2018/0037625호; 제2017/0362295호; 제2017/0137783호; 제2016/0152723, 2016/0206656, 2016/0199412, 2016/0208018, 2015/0232880, 2015/0225480호; 제2015/0224143호; 제2015/0224142호; 제2015/0190428호; 제2015/0196599호; 제2015/0152181호; 제2015/0140023호; 제2015/0118202호; 제2015/0110760호; 제2015/0099299호; 제2015/0093822호; 제2015/0093401호; 제2015/0051266호; 제2015/0050729호; 제2015/0024482호; 제2015/0023937호; 제2015/0017141호; 제2015/0017136호; 제2015/0017120호; 제2014/0370045호; 제2014/0370017호; 제2014/0369977호; 제2014/0349402호; 제2014/0328812호; 제2014/0322275호; 제2014/0322216호; 제2014/0322212호; 제2014/0322183호; 제2014/0314795호; 제2014/0308259호; 제2014/0301993호; 제2014/0296492호; 제2014/0294784호; 제2014/0286973호; 제2014/0274909호; 제2014/0274801호; 제2014/0271635호; 제2014/0271582호; 제2014/0271581호; 제2014/0271579호; 제2014/0255363호; 제2014/0242701호; 제2014/0242049호; 제2014/0227272호; 제2014/0219975호; 제2014/0170114호; 제2014/0134720호; 제2014/0134142호; 제2014/0120622호; 제2014/0120136호; 제2014/0106449호; 제2014/0106449호; 제2014/0099340호; 제2014/0086828호; 제2014/0065629호; 제2014/0050708호; 제2014/0024809호; 제2013/0344039호; 제2013/0323214호; 제2013/0315884호; 제2013/0309258호; 제2013/0288368호; 제2013/0287752호; 제2013/0287748호; 제2013/0280221호; 제2013/0280220호; 제2013/0266551호; 제2013/0216528호; 제2013/0202622호; 제2013/0071414호; 제2012/0321667호; 제2012/0302466호; 제2012/0301448호; 제2012/0301447호; 제2012/0060230호; 제2011/0213288호; 제2011/0158957호; 제2011/0104128호; 제2011/0038836호; 제 2007/0036773호; 및 제2004/0043401호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다.
예시적인 세포외(항원-결합) 도메인, 링커, 막관통 도메인, 및 세포내(세포질) 도메인을 포함하는 CAR 및 CAR-발현 면역 이펙터 세포의 추가 양태는 WO 2016/168595호; WO 12/079000호; 제2015/0141347호; 제2015/0031624호; 제2015/0030597호; 제2014/0378389호; 제2014/0219978호; 제2014/0206620호; 제2014/0037628호; 제2013/0274203호; 제2013/0225668호; 제2013/0116167호; 제2012/0230962호; 제2012/0213783호; 제2012/0093842호; 제2012/0071420호; 제2012/0015888호; 제2011/0268754호; 제2010/0297093호; 제2010/0158881호; 제2010/0034834호; 제2010/0015113호; 제2009/0304657호; 제2004/0043401호; 제2014/0322253호; 제2015/0118208호; 제2015/0038684호; 제2014/0024601호; 제2012/0148552호; 제2011/0223129호; 제2009/0257994호; 제2008/0160607호; 제2008/0003683호; 제2013/0121960호; 제2011/0052554호; 및 제2010/0178276호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다.
일부 양태에서, 본원은 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 제공하며, 세포외 도메인은 본원에 기재된 임의의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이중특이적 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 본원은 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공하며, 세포외 결합 도메인은 본원에 기재된 임의의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이중특이적 분자를 포함하고, 이러한 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 이중특이적 분자는 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 결합한다.
일부 양태에서, 본원은 실시예 섹션(예를 들어, 실시예 1 참고)에 기재된 NPM1c CAR의 세포내, 막관통 및/또는 세포외 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.
일부 양태에서, 본원은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 2B4, DAP10, CD137 및 DAP12로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본원은 CD3-제타 시그널링 도메인 및, 선택적으로 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 CD3-제타, CD8, CD28, NKG2D, CD16, NKp44 또는 NKp46의 막관통 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본원은 CD8 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본원은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질 에피토프(예를 들어, NPM1c 네오에피토프)를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본원은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) AIQDLCLAV(서열번호 1) 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본원은 VH 및 VL을 포함하는 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR 폴리펩티드를 제공하며, VH는 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 5와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 3과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 본원은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2, 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 VH를 포함하고/하거나, 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR 폴리펩티드를 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본원은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VH의 CDR인 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고/하거나, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VL의 CDR인 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR 폴리펩티드를 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본원은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 scFv, 또는 서열번호 2와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 scFv를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR 폴리펩티드를 제공한다.
CAR의 세포외(항원 결합) 도메인
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포에서 발현된 CAR 폴리펩티드는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 항원 결합 도메인을 포함한다.
항원 결합 도메인의 비제한적인 예는 단클론 항체(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, 및 IgD)(예를 들어, 완전 인간 또는 키메라(예를 들어, 인간화) 항체), 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편)(예를 들어, 완전 인간 또는 키메라(예를 들어, 인간화) 항체의 단편), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, scFv, scFv-Fc, (scFv)2, scFab, bis-scFv, hc-IgG, BiTE, 단일 도메인 항체(예를 들어, V-NAR 도메인 또는 VhH 도메인), IgNAR, 및 다중특이적(예를 들어, 이중특이적 항체) 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 scFv를 포함한다. 이들 항원 결합 도메인을 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개)의 CDR(예를 들어, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인으로부터의 3 개의 CDR 중 임의의 것 및/또는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인으로부터의 3 개의 CDR 중 임의의 것), 예컨대 면역글로불린 분자(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 분자) 및 면역글로불린 분자의 면역학적-활성(항원-결합) 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 단일-쇄 항체(예를 들어, V-NAR 도메인 또는 VHH 도메인, 또는 본원에 기재된 바와 같은 단일-쇄 항체 중 임의의 것)이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 전체 항체 분자(예를 들어, 인간, 인간화, 또는 키메라 항체) 또는 다량체 항체(예를 들어, 이중-특이적 항체)이다.
일부 실시양태에서, 항원-결합 도메인은 항체 단편 및 다중-특이적(예를 들어, 이중-특이적) 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 항체 및 이의 항원-결합 단편의 예는, 비제한적으로, 단일-쇄 Fv(scFv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2, 이황화-연결된 Fv(sdFv), Fv, 및 VL 또는 VH 도메인을 함유하는 단편을 포함한다.
본원에 제공된 추가 항원 결합 도메인은 다클론, 단클론, 다중-특이적(다량체, 예를 들어 이중-특이적), 인간 항체, 키메라 항체(예를 들어, 인간-마우스 키메라), 단일-쇄 항체, 세포내-제조된 항체(즉, 인트라바디), 및 이의 항원-결합 단편이다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 서브클래스의 것일 수 있다.
항원 결합 도메인의 추가 예는 IgG의 항원-결합 단편(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 항원-결합 단편)(예를 들어, 인간 또는 인간화 IgG, 예를 들어 인간 또는 인간화 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 항원-결합 단편), IgA의 항원-결합 단편(예를 들어, IgA1 또는 IgA2의 항원-결합 단편)(예를 들어, 인간 또는 인간화 IgA, 예를 들어 인간 또는 인간화 IgA1 또는 IgA2의 항원-결합 단편), IgD의 항원-결합 단편(예를 들어, 인간 또는 인간화 IgD의 항원-결합 단편), IgE의 항원-결합 단편(예를 들어, 인간 또는 인간화 IgE의 항원-결합 단편), 또는 IgM의 항원-결합 단편(예를 들어, 인간 또는 인간화 IgM의 항원-결합 단편)이다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 예를 들어, 염수 또는 인산염 완충 염수에서 약 1 x 10-7 M 이상(예를 들어, 약 1 x 10-8 M 이상, 약 1 x 10-9 M 이상, 약 500 nM 이상, 약 100 nM 이상, 약 25 nM 이상, 약 15 nM 이상, 약 7 nM 이상, 약 5 nM 이상, 또는 약 1 nM 이상)의 친화도(KD)로 특정 항원(예를 들어, 종양-연관 항원)에 결합할 수 있다.
통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, CAR에 포함할 항원 결합 도메인의 선택은 이를 필요로 하는 대상체에서 표적화될 세포(예를 들어, 암 세포 또는 종양)의 표면을 정의하는 리간드의 유형 및 수에 의존한다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 암 신생항원과 같은 종양 특이적 항원(TSA)을 인식하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 종양 특이적 항원은 NPM1c:HLA-A2와 같은 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) NMP1c 신생항원일 수 있다. 일부 실시양태에서, NMP1c 신생항원은 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함한다
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 급성 골수성 백혈병의 종양 항원을 인식하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 종양-특이적 항원(TSA), 예컨대 급성 골수성 백혈병 신생항원이다. TSA는 종양 세포에 대해 고유하며 신체의 다른 세포 상에서는 발생하지 않는다. 일 실시양태에서, 종양 항원은 종양 특이적 항원이다. 특정 실시양태에서, 종양-특이적 항원은 환자의 종양 세포를 서열분석하고 종양에서만 발견되는 돌연변이된 단백질을 확인함으로써 결정된다. 이들 항원은 "신생항원"으로서 지칭된다. 신생항원이 확인되면, 치료 항체가 이에 대해 생산될 수 있고, 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 신생항원은 NPM1c 신생항원이다. 일 실시양태에서, NMP1c 신생항원은 NPM1c:HLA-A2와 같이 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화(또는 이에 의해 제시)된다.
CAR 이펙터 세포(예를 들어, CAR ML NK 세포)에 의해 표적화될 수 있는 종양 항원(예를 들어, 종양-연관 항원(TAA) 및 종양-특이적 항원(TSA))은, 비제한적으로, NPM1c:HLA-A2를 포함한다. 일 실시양태에서, 종양 특이적 항원은 NPM1c:HLA-A2이다.
일부 실시양태에서, CAR은 MHC 단백질(예를 들어, MHC 클래스 I 단백질)과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) 네오에피토프(예를 들어, 암 네오에피토프)를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 단백질 단독에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 단백질과 복합체화된 대조군 펩티드에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 (MHC 단백질 없이) 네오에피토프 단독에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않는다.
기능성 MHC 클래스 I 분자는 중쇄 α 쇄 및 β2-마이크로글로불린 쇄를 포함한다. MHC 클래스 I 분자에 의한 펩티드 결합은 중쇄의 α1 및 α2 도메인에 의해 형성되는 MHC 분자의 펩티드-결합 홈 내에서 개별 포켓과 펩티드 아미노산 측쇄의 상호작용에 의해 달성된다. 통상적으로, 인간 백혈구 항원(HLA)에 대해, 주요 결합 에너지는 각각 위치 2 및 펩티드의 C-말단에서의 잔기 및 MHC 분자의 B 및 F 결합 포켓의 상호작용으로부터 유래되지만, 펩티드에 걸친 측쇄는 MHC 결합 능력을 촉진하거나 감소시킬 수 있다(예를 들어, Guo, et al (1992) Nature 360:364; Silver et al (1992) Nature 360:367; Gorga et al (1992) Proteins 12;87; Madden (1995) Annu Rev Immunol 13:587; Madden et al (1993) Cell 75;693; Madden et al (1992) Cell 70:1035; Bjorkman, et al (1987) Nature 329:512; Saper et al (1991) J Mol Biol 219:277 참고). 9 개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드에 대해, C-말단 잔기(위치 9)는 MHC 분자의 F 결합 포켓과 상호작용한다.
MHC 분자는 극히 다형적이며, 수천 개의 대립형질 변이체가 클래스 I A 및 B 좌위에서 확인되었다. 대부분의 다형성은 펩티드 결합 포켓에서 발생하여, MHC 분자는 다양한 펩티드 결합 특이성을 갖는다. 다형성에도 불구하고, HLA 클래스 I 분자는 공유된 펩티드 결합 특이성에 기초하여 그룹(즉, 슈퍼타입(supertype))으로 클러스터링될 수 있다는 것이 당업계에 알려져 있다. 각각의 그룹(슈퍼타입)은 "앵커 잔기(anchor residue)"이거나 MHC 결합을 위해 중요한 잔기인 펩티드의 위치를 반영하는 펩티드 공통 서열에 의해 정의된다. 예를 들어, A2-슈퍼타입의 HLA 클래스 I 분자(즉, HLA-A2 또는 HLA-A*02 대립유전자 그룹에 의해 코딩되는 단백질)는 펩티드의 위치 2에 소형 및 지방족 잔기(예를 들어, 알라닌, 티로신, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 글루타민) 및 C-말단에 지방족(예를 들어, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌) 또는 소형 소수성 잔기(예를 들어, 알라닌, 발린)를 갖는 펩티드에 대한 특이적 결합을 공유한다(예를 들어, Sidney, et al (2008) BMC Immunology 9:1 참고).
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질, 예컨대 HLA-A2와 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) 급성 골수성 백혈병(AML)-연관 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질 네오에피토프(예컨대, NPM1c:HLA-A2)를 포함하는 항원에 결합한다(예를 들어, 특이적으로 결합함).
AML의 게놈 분석은 AML 환자 당 평균 13 개의 코딩 돌연변이를 갖는, 대부분의 다른 성인 암에 비해 낮은 돌연변이 부하를 나타내었다(Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Alexandrov et al., NATURE 500: 415 (2013); Kandoth et al., NATURE 502 333 (2013) 참고). 그러나, AML에서의 체세포 돌연변이는 보통 동일한 유전자에서 발생하며(Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Papaemmanuil et al., N Engl J Med 374: 2209 (2016) 참고), 따라서 이들 핫스팟 돌연변이로부터 유래된 신생항원은 종양-특이적 면역요법을 위한 매력적인 표적이 된다(van der Lee et al., J CLIN INVEST 129: 774 (2019) 참고). 가장 일반적으로 발생하는 돌연변이 중에는 뉴클레오포스민을 코딩하는 중요 원인자 유전자(NPM1; NPM1에 의해 코딩됨)에서의 4-뉴클레오티드 중복이 있으며, 이는 모든 성인 AML 환자의 30-35%에서 발생한다(Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Papaemmanuil et al., N Engl J Med 374: 2209 (2016); Falini et al., N Engl J Med 352: 254 (2005) 참고). NPM1에서의 이러한 돌연변이는 이의 비정상적인 세포질 국소화를 야기하고, 돌연변이체 단백질은 NPM1c로 지칭된다. AML-연관 NPM1c 돌연변이체 단백질은 HLA-A*02:01 대립유전자 및 일부 다른 대립유전자를 갖는 환자의 백혈병 모세포 상에 제한되고 제시된 HLA 클래스 I인 백혈병 신생항원을 생성한다. 예를 들어, NPM1c는 가장 일반적인 HLA-A*0201 대립유전자(인간 집단의 ~50%)에 의해 제시되는 백혈병-특이적 신생항원 에피토프(AIQDLCLAV(서열번호 1), AIQ로 축약됨)를 생산한다(Greiner et al., BLOOD 120: 1282 (2012) 참고).
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질, 예컨대, HLA-A2와 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 결합한다. NPM1c 네오에피토프의 길이는 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드에 적합한 임의의 길이이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프의 길이는 5-20 개 아미노산, 6-19 개 아미노산, 7-18 개 아미노산, 8-17 개 아미노산, 8-16 개 아미노산, 8-15 개 아미노산, 8-15 개 아미노산, 8-14 개 아미노산, 8-13 개 아미노산, 8-12 개 아미노산, 9-12 개 아미노산, 또는 9-11 개 아미노산이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프의 길이는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5 개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프의 길이는 12 개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프의 길이는 11 개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프의 길이는 10 개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프의 길이는 9 개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프의 길이는 8 개의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프는 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 100 개 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드 내의 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개 연속 아미노산의 펩티드이다.
일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프는 HLA-A2인 MHC 클래스 I 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, HLA-A2에 결합하는 NPM1c 네오에피토프는 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 서열의 위치 2는 소형 및 지방족 잔기(예를 들어, 알라닌, 티로신, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 글루타민)이고, 아미노산 서열의 C-말단 잔기는 지방족 잔기(예를 들어, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌) 또는 소형 소수성 잔기(예를 들어, 알라닌, 발린)이다. 일부 실시양태에서, HLA-A2에 결합하는 NPM1c 네오에피토프는 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 서열의 위치 2는 발린, 이소류신 또는 류신이고, 아미노산 서열의 C-말단 잔기는 발린, 류신 또는 이소류신이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프가 8 개의 아미노산 잔기 길이인 경우, C-말단 아미노산은 위치 8이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프가 9 개의 아미노산 잔기 길이인 경우, C-말단 아미노산은 위치 9이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프가 10 개의 아미노산 잔기 길이인 경우, C-말단 아미노산은 위치 10이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프가 11 개의 아미노산 잔기 길이인 경우, C-말단 아미노산은 위치 11이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프가 12 개의 아미노산 잔기 길이인 경우, C-말단 아미노산은 위치 12이다.
HLA-A2에 결합하는 NPM1c로부터 유래된 네오에피토프가 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Greiner (2012) Blood 120:1282는 AIQDLCLAV(서열번호 1) 및 AIQDLCVAV(서열번호 71)를 포함하여, HLA-A2에 결합하는 9-mer NPM1c 네오에피토프에 대한 아미노산 서열을 확인하였다. 추가 예로서, van der Lee (2019) J Clin Invest 129:774는 CLAVEEVSL(서열번호 72)을 포함한 HLA-A2 클래스 I 분자에 결합하는 NPM1c 네오에피토프의 아미노산 서열뿐 아니라, VEEVSLRK(서열번호 73), AVEEVSLR(서열번호 74), AVEEVSLRK(서열번호 75), 및 CLAVEEVSLRK(서열번호 76)을 포함한 다른 HLA 반수체형에 의해 코딩되는 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 NPM1c 네오에피토프의 아미노산 서열을 확인하였다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질의 네오에피토프(예컨대, NPM1c:HLA-A2)를 포함하는 항원에 결합(예를 들어, 특이적으로 결합)하고, 뉴클레오포스민 단백질에서의 돌연변이는 뉴클레오포스민을 코딩하는 유전자에서의 4-뉴클레오티드 중복으로 인한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) 세포질(세포질에 위치된) 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질 네오에피토프(예컨대, NPM1c:HLA-A2)를 포함하는 항원에 결합한다(예를 들어, 특이적으로 결합함). 일부 실시양태에서, 네오에피토프는 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질로부터 유래된 8, 9, 10, 11, 또는 12 개의 아미노산 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 네오에피토프는 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질의 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 개의 아미노산 잔기로부터 유래된 8, 9, 10, 11 또는 12 개의 아미노산 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 네오에피토프는 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질의 C-말단에서 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개의 아미노산 잔기로부터 유래된 8, 9, 10, 11, 또는 12 개의 아미노산 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질은 서열번호 56에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질 네오에피토프는 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 단백질로부터 유래된 8, 9, 10, 11, 또는 12 개의 아미노산 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질 네오에피토프는 서열번호 56에 기재된 아미노산 서열의 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개의 아미노산 잔기로부터 유래된 8, 9, 10, 11, 또는 12 개의 아미노산 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질 네오에피토프는 서열번호 56에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 C-말단에서 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 개의 아미노산 잔기로부터 유래된 8, 9, 10, 11, 또는 12 개의 아미노산 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2 단백질)과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질은 C-말단 아미노산 서열 MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(서열번호 57)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2 단백질)과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) C-말단 아미노산 서열 MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(서열번호 57)를 포함하는 NPM1c 단백질의 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 네오에피토프는 NPM1c 단백질의 C-말단 아미노산 서열 MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(서열번호 57)로부터 유래된 8, 9, 10, 11 또는 12 개의 아미노산 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 HLA-A2 단백질 또는 HLA-A*02 대립유전자 그룹에 의해 코딩되는 단백질과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) NPM1c 네오에피토프(즉, NPM1c:HLA-A2)를 포함하는 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, NPM1c는 인간 NPM1c이다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2 단백질 또는 HLA-A*02 대립유전자 그룹에 의해 코딩되는 단백질)과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) 세포질 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질 네오에피토프를 포함하는 항원에 결합(예를 들어, 특이적으로 결합)하고, 네오에피토프의 아미노산 서열은 AIQDLCLAV(서열번호 1), AIQDLCVAV(서열번호 71), CLAVEEVSL(서열번호 72), VEEVSLRK(서열번호 73), AVEEVSLR(서열번호 74), AVEEVSLRK(서열번호 75) 또는 CLAVEEVSLRK(서열번호 76)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 HLA-A2에 의해 제시된 AIQDLCLAV(서열번호 1), AIQDLCVAV(서열번호 71), CLAVEEVSL(서열번호 72), VEEVSLRK(서열번호 73), AVEEVSLR(서열번호 74), AVEEVSLRK(서열번호 75) 및 CLAVEEVSLRK(서열번호 76)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 HLA-A2에 의해 제시된 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함하는 항원에 결합한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질 단독 및/또는 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 대조군 펩티드에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않는다(예를 들어, 대조군 펩티드는 네오에피토프와 동일한 수의 아미노산을 갖지만, 네오에피토프가 유래되는 단백질과 상이한 단백질로부터 유래됨).
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 세포질 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질 네오에피토프 단독(HLA-A2와 같은 MHC 클래스 I 단백질 없음)에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프는 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함하고, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A2 단백질(예를 들어, HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, NPM1c 네오에피토프는 AIQDLCVAV(서열번호 71), CLAVEEVSL(서열번호 72), VEEVSLRK(서열번호 73), AVEEVSLR(서열번호 74), AVEEVSLRK(서열번호 75) 및 CLAVEEVSLRK(서열번호 76)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A2 단백질(예를 들어, HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질)이다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함하는 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하고, 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)의 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 아미노산이 치환된다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 아미노산 서열 AIQDLCLAV를 포함하는 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하고, 아미노산 서열 AIQDLCLAV의 임의의 1, 2, 3 또는 4 개의 아미노산이 치환된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 AIQDLCLAV 서열(서열번호 1) 내의 기존 잔기의 크기와 유사한 크기의 아미노산 잔기를 이용한 치환이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 항원에 대한 세포외 도메인의 결합에 영향을 주지 않는다(또는 실질적으로 영향을 주지 않음).
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 아미노산 서열 AIQDLCLAV를 포함하는 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하고, 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)의 1, 2 또는 그 이상의 앵커 잔기가 치환된다(예를 들어, 서열번호 1의 위치 2 및/또는 위치 9, 예를 들어, AIQDLCLAV(서열번호 1)의 밑줄친 잔기). 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 항원에 대한 세포외 도메인의 결합 또는 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질(예를 들어, HLA-A2)에 대한 네오에피토프의 결합에 영향을 주지 않는다(또는 실질적으로 영향을 주지 않음). 일부 실시양태에서, AIQDLCLAV(서열번호 1)의 제2 위치에서 아미노산 잔기 I는 아미노산 잔기 L(류신)로 치환된다. 일부 실시양태에서, AIQDLCLAV(서열번호 1)의 제2 위치에서 아미노산 잔기 I는 아미노산 잔기 V(발린), M(메티오닌), 티로신(T), 세린(S), 글루타민(Q) 또는 A(알라닌)로 치환된다. 일부 실시양태에서, AIQDLCLAV(서열번호 1)의 제9 위치에서 아미노산 잔기 V는 아미노산 잔기 I(이소류신), L(류신), M(메티오닌), 또는 A(알라닌)로 치환된다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 아미노산 서열 AIQDLCLAV를 포함하는 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하고, 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)의 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 아미노산이 치환되고, 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 표 1에서 확인된 아미노산 서열을 포함하는 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)에 특이적으로 결합하고, 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)의 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 아미노산이 치환되고, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)에 대해 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화도를 가졌다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)에 특이적으로 결합하고, 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)의 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 아미노산이 치환되고, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)에 대해 동일하거나 더 양호한 친화도로 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)에 결합하고, 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)의 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 아미노산이 치환되고, 항체 또는 항원 결합 단편은 0.1 내지 100 nM(예를 들어, 0.1 내지 50 nM, 0.1 내지 25 nM, 1 0.1 내지 15 nM)의 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)에 결합하고, 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)의 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 아미노산이 치환되고, 세포외 도메인은 100 nM 미만(예를 들어, 50 nM 미만, 25 nM 미만, 15 nM 미만, 7 nM 미만, 6 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 0.9 nM 미만, 0.8 nM 미만, 0.7 nM 미만, 0.6 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.4 nM 미만, 0.3 nM 미만, 0.2 nM 미만 또는 0.1 미만)의 KD로 결합한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 MHC 클래스 I 단백질, 예컨대 HLA-A2에 의해 제시된 NPM1c 에피토프(NPM1c:HLA-A2)에 결합하고, 항암 또는 항-종양 효과(예를 들어, 생체내 항암 효과, 선택적으로 암은 AML임)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하고, 세포외 도메인은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 네오에피토프는 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 단백질은 HLA-A*02 대립유전자 그룹을 포함하는 HLA-A 대립유전자에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, HLA-A 대립유전자는 HLA-A*02:01이다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 본원에 기재된 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 갖는 항-NPM1c:HLA-A2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 본원에 기재된 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는(예를 들어, NPM1c scFv의 CDR을 가짐, 예를 들어 서열 섹션 및 실시예 참고) 항-NPM1c:HLA-A2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, NPM1c:HLA-A2에 결합하는 세포외 도메인은 scFv를 포함한다. NPM1c:HLA-A2에 특이적으로 결합하는 scFv에 대한 예시적 아미노산 서열이 서열번호 2에 기재된다. 일부 실시양태에서, scFv는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, scFv는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과의 동일성에서의 차이의 적어도 95%는 scFv의 프레임워크 영역 내에 있다(또는 상보성 결정 영역(CDR) 내에 있지 않음).
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 5를 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열과의 동일성에서의 차이의 적어도 95%는 VH의 프레임워크 영역 내에 있다(또는 상보성 결정 영역(CDR) 내에 있지 않음).
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 3(NPM1c scFv의 VL의 아미노산 서열)을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, VL은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과의 동일성에서의 차이의 적어도 95% 또는 전부는 VL의 프레임워크 영역 내에 있다(또는 상보성 결정 영역(CDR) 내에 있지 않음).
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 5를 갖는 중쇄 가변 영역(VH), 및 아미노산 서열 서열번호 3을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH 및 VL은 각각 서열번호 5 및 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 5 및 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과의 동일성에서의 차이의 적어도 95% 또는 전부는 VH 및 VL의 프레임워크 영역 내에 있다(또는 상보성 결정 영역(CDR) 내에 있지 않음).
본 발명의 항원 결합 단편의 CDR은 Kabat, Chothia, AbM, Contact 및 IMGT를 포함한 당업계의 다양한 방식으로 정의된다.
일부 양태에서, CDR은 서열 가변성에 기초하는 Kabat 시스템에 따라 정의된다(예를 들어, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391; Kabat EA et al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고). Kabat CDR 위치는 당업계에 알려진 방법에 따라 결정한다. 일 양태에서, 본원에 기재된 항체 및 이의 단편의 CDR은 Kabat 시스템을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 Kabat 시스템을 사용하여 결정된 바와 같은 NPM1c scFv의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 항-NPM1c:HLA-A2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 양태에서, CDR은 면역글로불린 구조 루프 영역의 위치에 기초하는 Chothia 시스템에 따라 정의된다(예를 들어, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273 : 927-948; Chothia C et al, (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; 및 미국 특허 제7,709,226호 참고). 용어 "Chothia CDR" 및 유사 용어는 당업계에서 인식되고, Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917의 방법에 따라 결정된 바와 같은 항체 CDR 서열을 지칭하며, 이는 본원에서 "Chothia CDR"로 지칭된다(또한, 예를 들어 미국 특허 제7,709,226호 및 Martin, A., "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer- Verlag, Berlin (2001) 참고). Chothia CDR 위치는 당업계에 알려진 방법에 따라 결정된다. 일부 양태에서, CDR은 Chothia 시스템을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 Chothia 시스템을 사용하여 결정된 바와 같은 NPM1c scFv의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 항-NPM1c:HLA-A2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 양태에서, CDR은 AbM 시스템에 따라 정의되고, 이는 Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 사이의 절충을 나타내는 AbM 초가변 영역에 기초하고, CDR은 OxfordMolecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular Group, Inc.)를 사용하여 결정된다. AbM CDR 위치는 당업계에 알려진 방법에 따라 결정된다. 일 양태에서, CDR은 AbM 시스템을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 AbM 시스템을 사용하여 결정된 바와 같은 NPM1c scFv의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 항-NPM1c:HLA-A2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 양태에서, CDR은 IMGT 시스템에 따라 정의된다("IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® website imgt.org, founder and director: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, France 참고; 예를 들어, Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7: 132-136 and Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212 참고, 이들 둘 다는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). IMGT CDR 위치는 당업계에 알려진 방법에 따라 결정된다. 일 양태에서, CDR은 IMGT 시스템을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 IMGT 시스템을 사용하여 결정된 바와 같은 NPM1c scFv의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 양태에서, CDR은 Contact 시스템에 따라 정의된다. Contact 정의는 이용가능한 복합 결정 구조의 분석에 기초한다(bioinf.org.uk/abs)(MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 5: 732-745 참고; 또한, 예를 들어 Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer- Verlag, Berlin (2001) 참고). Contact CDR 위치는 당업계에 알려진 방법에 따라 결정된다. 일 양태에서, CDR은 Contact 시스템을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 Contact 시스템을 사용하여 결정된 바와 같은 NPM1c scFv의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 HLA-A2에 의해 제시된 NPM1c 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 기재된 시스템 중 임의의 것에 따라 정의된 바와 같은 NPM1c scFv의 1, 2, 또는 3 개의 VH CDR 및/또는 1, 2, 또는 3 개의 VL CDR을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 HLA-A2에 의해 제시된 NPM1c 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 포함하고, IMGT에 의해 정의되는 바와 같은 NPM1c scFv의 1, 2, 또는 3 개 전부의 VH CDR 및/또는 1, 2, 또는 3 개 전부의 VL CDR을 포함한다.
당업계에 알려진 바와 같이, VH 및 VL은 프레임워크 영역에 의해 둘러싸인 CDR을 함유한다(CDR 및 FR 서열은 VH 및 VL에서 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 서열에 나타남). 선택적으로, 프레임워크 영역은 인간 프레임워크 영역이다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 5를 갖는 VH의 1, 2 또는 3 개 전부의 VH CDR을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 IMGT에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열 서열번호 5를 갖는 VH의 1, 2, 또는 3 개 전부의 VH CDR을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 3을 갖는 VL의 1, 2 또는 3 개 전부의 VL CDR을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 IMGT에 의해 정의된 바와 같은 아미노산 서열 서열번호 3을 갖는 VL의 1, 2 또는 3 개 전부의 VL CDR을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 5를 갖는 VH의 1, 2 또는 3 개 전부의 VH CDR을 갖는 중쇄 가변 영역(VH), 및 아미노산 서열 서열번호 3을 갖는 VL의 1, 2 또는 3 개 전부의 VL CDR을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 9의 VH CDR1, 아미노산 서열 서열번호 10의 VH CDR2, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 11의 VH CDR3을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 9의 VH CDR1, 아미노산 서열 서열번호 10의 VH CDR2, 및 아미노산 서열 서열번호 11의 VH CDR3을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함하고, 서열번호 9, 서열번호 10, 또는 서열번호 11의 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산이 치환되었다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 유사한 크기의 아미노산 잔기를 이용한 치환이다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 항원에 대한 결합에 영향을 주지 않거나(또는 실질적으로 영향을 주지 않거나) 이를 개선한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 6의 VL CDR1, 아미노산 서열 서열번호 7의 VL CDR2, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 8의 VL CDR3을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 6의 VL CDR1, 아미노산 서열 서열번호 7의 VL CDR2, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 8의 VL CDR3을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함하고, 서열번호 6, 서열번호 7, 또는 서열번호 8의 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 아미노산이 치환되었다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 유사한 크기의 아미노산 잔기를 이용한 치환이다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 항원에 대한 결합에 영향을 주지 않거나(또는 실질적으로 영향을 주지 않거나) 이를 개선한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 9의 VH CDR1, 아미노산 서열 서열번호 10의 VH CDR2, 및 아미노산 서열 서열번호 11의 VH CDR3을 갖는 중쇄 가변 영역(VH), 및/또는 아미노산 서열 서열번호 6의 VL CDR1, 아미노산 서열 서열번호 7의 VL CDR2, 및 아미노산 서열 서열번호 8의 VL CDR3을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 서열번호 9의 VH CDR1, 아미노산 서열 서열번호 10의 VH CDR2, 및 아미노산 서열 서열 서열번호 11의 VH CDR3을 갖는 중쇄 가변 영역(VH), 및 아미노산 서열 서열번호 6의 VL CDR1, 아미노산 서열 서열번호 7의 VL CDR2, 및 아미노산 서열 서열번호 8의 VL CDR3을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 본원에 기재된 VH 및 VL을 포함하는 항-NPM1c:HLA-A2 항원 결합 단편을 포함하고, VH 및/또는 VL CDR의 1 , 2 , 3 , 4 또는 5 개의 아미노산이 치환되었다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 VH 및/또는 VL 영역에서 하나 이상의 CDR은 NPM1c:HLA-A2에 대한 특이적 결합이 유지되는 한 1 , 2 , 3 , 4 또는 5 개의 아미노산에 의해 달라질 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 항체 단편은 친화도 성숙되었고, 즉 기재된 항체 또는 단편과 비교하여 하나 이상의 상보성 결정 영역에서 하나 이상의 변경을 가지며, 이러한 하나 이상의 변경은 기재된 항체 또는 단편에 대해 항원에 대한 항체 또는 단편의 친화도에서의 개선을 야기한다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 단편은 100 nM 미만(예를 들어, 50 nM 미만, 25 nM 미만, 15 nM 미만, 7 nM 미만, 6 nM 미만, 5 nM 미만, 4 nM 미만, 3 nM 미만, 2 nM 미만, 1 nM 미만, 0.9 nM 미만, 0.8 nM 미만, 0.7 nM 미만, 0.6 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.4 nM 미만, 0.3 nM 미만, 0.2 nM 미만, 또는 0.1 nM 미만)의 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Kd를 갖는다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 단편은 15 nM 미만, 10 nM 미만, 7 nM 미만, 5 nM 미만 또는 1 nM 미만(예를 들어, 0.01 내지 15 nM, 0.01 내지 10 nM, 0.01 내지 7 nM, 0.01 내지 5 nM, 0.01 내지 1 nM, 0.1 내지 15 nM, 0.1 내지 10 nM, 0.1 내지 7 nM, 0.1 내지 5 nM, 0.1 내지 1 nM, 1 내지 15 nM, 1 내지 10 nM, 1 내지 7 nM, 1 내지 5 nM, 5 내지 15 nM, 5 내지 10 nM, 또는 5 내지 7 nM)의 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Kd를 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 3 개의 경쇄 가변 영역 상보성 결정 영역(VL CDR 1-3) 및 3 개의 중쇄 가변 영역 상보성 결정 영역(VH CDR 1-3)을 포함하는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 양태에서, VH CDR1은 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성, 또는 적어도 81% 서열 동일성, 또는 적어도 82% 서열 동일성, 또는 적어도 83% 서열 동일성, 또는 적어도 84% 서열 동일성, 또는 적어도 85% 서열 동일성, 또는 적어도 86% 서열 동일성, 또는 적어도 87% 서열 동일성, 또는 적어도 88% 서열 동일성, 또는 적어도 89% 서열 동일성, 또는 적어도 90% 서열 동일성, 또는 적어도 91% 서열 동일성, 또는 적어도 92% 서열 동일성, 또는 적어도 93% 서열 동일성, 또는 적어도 94% 서열 동일성, 또는 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 96% 서열 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성, 또는 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VH CDR2는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성, 또는 적어도 81% 서열 동일성, 또는 적어도 82% 서열 동일성, 또는 적어도 83% 서열 동일성, 또는 적어도 84% 서열 동일성, 또는 적어도 85% 서열 동일성, 또는 적어도 86% 서열 동일성, 또는 적어도 87% 서열 동일성, 또는 적어도 88% 서열 동일성, 또는 적어도 89% 서열 동일성, 또는 적어도 90% 서열 동일성, 또는 적어도 91% 서열 동일성, 또는 적어도 92% 서열 동일성, 또는 적어도 93% 서열 동일성, 또는 적어도 94% 서열 동일성, 또는 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 96% 서열 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성, 또는 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VH CDR3은 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성, 또는 적어도 81% 서열 동일성, 또는 적어도 82% 서열 동일성, 또는 적어도 83% 서열 동일성, 또는 적어도 84% 서열 동일성, 또는 적어도 85% 서열 동일성, 또는 적어도 86% 서열 동일성, 또는 적어도 87% 서열 동일성, 또는 적어도 88% 서열 동일성, 또는 적어도 89% 서열 동일성, 또는 적어도 90% 서열 동일성, 또는 적어도 91% 서열 동일성, 또는 적어도 92% 서열 동일성, 또는 적어도 93% 서열 동일성, 또는 적어도 94% 서열 동일성, 또는 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 96% 서열 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성, 또는 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, VL CDR1은 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성, 또는 적어도 81% 서열 동일성, 또는 적어도 82% 서열 동일성, 또는 적어도 83% 서열 동일성, 또는 적어도 84% 서열 동일성, 또는 적어도 85% 서열 동일성, 또는 적어도 86% 서열 동일성, 또는 적어도 87% 서열 동일성, 또는 적어도 88% 서열 동일성, 또는 적어도 89% 서열 동일성, 또는 적어도 90% 서열 동일성, 또는 적어도 91% 서열 동일성, 또는 적어도 92% 서열 동일성, 또는 적어도 93% 서열 동일성, 또는 적어도 94% 서열 동일성, 또는 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 96% 서열 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성, 또는 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL CDR2는 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성, 또는 적어도 81% 서열 동일성, 또는 적어도 82% 서열 동일성, 또는 적어도 83% 서열 동일성, 또는 적어도 84% 서열 동일성, 또는 적어도 85% 서열 동일성, 또는 적어도 86% 서열 동일성, 또는 적어도 87% 서열 동일성, 또는 적어도 88% 서열 동일성, 또는 적어도 89% 서열 동일성, 또는 적어도 90% 서열 동일성, 또는 적어도 91% 서열 동일성, 또는 적어도 92% 서열 동일성, 또는 적어도 93% 서열 동일성, 또는 적어도 94% 서열 동일성, 또는 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 96% 서열 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성, 또는 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, VL CDR3은 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성, 또는 적어도 81% 서열 동일성, 또는 적어도 82% 서열 동일성, 또는 적어도 83% 서열 동일성, 또는 적어도 84% 서열 동일성, 또는 적어도 85% 서열 동일성, 또는 적어도 86% 서열 동일성, 또는 적어도 87% 서열 동일성, 또는 적어도 88% 서열 동일성, 또는 적어도 89% 서열 동일성, 또는 적어도 90% 서열 동일성, 또는 적어도 91% 서열 동일성, 또는 적어도 92% 서열 동일성, 또는 적어도 93% 서열 동일성, 또는 적어도 94% 서열 동일성, 또는 적어도 95% 서열 동일성, 또는 적어도 96% 서열 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성, 또는 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 적어도 10-7M의 항원(예를 들어, NPM1c:MHC 클래스 I)에 대한 결합 친화도(Kd)를 갖는 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 단편은 적어도 10-7M 이상, 적어도 10-8M 이상, 적어도 10-9M 이상, 적어도 500 nM 이상, 적어도 250 nM 이상, 적어도 100 nM 이상, 적어도 50 nM 이상, 적어도 25 nM 이상, 적어도 20 nM 이상, 적어도 15 nM 이상, 또는 적어도 10 nM 이상의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 결합 친화도(Kd)를 갖는다. 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 약 25 nM 이상, 적어도 약 15 nM 이상, 또는 적어도 약 10 nM 이상의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 결합 친화도(Kd)를 갖는다. 일부 양태에서, 항원 결합 단편은 NPM1c:HLA-A2 항원에 대한 결합 친화도(Kd)를 가지며, 0.1 nM 내지 500 nM, 0.1 nM 내지 100 nM, 0.5 nM 내지 100 nM, 0.1 nM 내지 50 nM, 0.5 nM 내지 50 nM, 0.1 nM 내지 25 nM, 0.5 nM 내지 25 nM, 0.1 nM 내지 15 nM, 0.5 nM 내지 15 nM, 0.1 nM 내지 10 nM, 또는 0.5 nM 내지 10 nM, 또는 1 nM 내지 100 nM(또는 이들 사이의 임의의 값)의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 결합 친화도(Kd)를 갖는다. 일부 양태에서, 항원 결합 단편은 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 또는 약 0.5 nM 내지 약 100 nM의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 결합 친화도(Kd)를 갖는다. 일부 양태에서, 항원 결합 단편은 약 0.1 nM 내지 약 50 nM 또는 약 0.5 nM 내지 약 50 nM의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 결합 친화도(Kd)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 적어도 0.5±0.02x104 Ms-1 이상의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Kon을 갖는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 항원 결합 단편은 적어도 1±0.02x104 Ms-1 이상의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Kon을 갖는다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 항원 결합 단편은 적어도 2.5±0.02x104 Ms-1 이상의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Kon을 갖는다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 항원 결합 단편은 적어도 5±0.02x104 Ms-1 이상의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Kon을 갖는다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 항원 결합 단편은 0.5±0.02x104 Ms-1 내지 50±0.02x104 Ms-1의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Kon을 갖는다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 항원 결합 단편은 1±0.02x104 Ms-1 내지 10±0.02x104 Ms-1의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Kon을 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 50±0.02x10-4s-1 미만의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Koff를 갖는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 항원 결합 단편은 10±0.02x10-4s-1 미만의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Koff를 갖는다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 항원 결합 단편은 5±0.02x10-4s-1 미만의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Koff를 갖는다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 항원 결합 단편은 0.5±0.02x10-4s-1 내지 50±0.02x10-4s-1의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Koff를 갖는다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 항원 결합 단편은 1±0.02x10-4s-1 내지 15±0.02x10-4s-1의 NPM1c:MHC 클래스 I 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 Koff를 갖는다.
본원에 제공된 항원 결합 분자는 항원(예컨대 NPM1c:HLA-A2)에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 항원 결합 분자에 의해 결합된 항원은 암 세포의 표면 상에 MHC 클래스 I 분자(예를 들어, HLA-A2)에 의해 제시된다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 AML 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 단일쇄 항체, 예를 들어 단일쇄 Fv(scFv)를 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 인간 또는 인간화 scFv이다. 일부 양태에서, scFv는 링커를 포함한다. 일부 양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 양태에서, 펩티드 링커는 Gly-Ser 링커이다. 일부 양태에서, Gly-Ser 링커는 (Gly4Ser)1(서열번호 58), (Gly4Ser)2(서열번호 59), (Gly4Ser)3(서열번호 60), 및 (Gly4Ser)4(서열번호 61)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, Gly-Ser 링커는 아미노산 서열 SGSSGGSSSG(서열번호 4)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 항체의 항원 결합 단편을 포함하고, 단편은, 비제한적으로, Fv 단편, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 또는 이황화-연결된 Fv(sdFv)일 수 있다. 일 실시양태에서, 세포외 도메인은 Fv 단편을 포함한다. 일 실시양태에서, 세포외 도메인은 Fab 단편을 포함한다. 일 실시양태에서, 세포외 도메인은 F(ab') 단편을 포함한다. 일 실시양태에서, 세포외 도메인은 F(ab')2 단편을 포함한다.
막관통 도메인
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CAR 폴리펩티드는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 천연 공급원으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래된다. 본원에 기재된 CAR에서 사용될 수 있는 막관통 도메인의 비제한적인 예는 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 입실론, CD33, CD37, CD64, CD80, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD86, CD 134, CD137, 또는 CD154로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 적어도 이의 막관통 서열 또는 막관통 서열의 일부를 포함함). 일 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD4 분자로부터의 것이다. 일 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD8 분자로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 합성이다. 예를 들어, 막관통 도메인이 합성 공급원으로부터의 것인 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 소수성 잔기(예를 들어, 류신 및 발린)를 포함(예를 들어, 우세하게 포함)할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 막관통 도메인은 합성 막관통 도메인의 단부에 적어도 하나(예를 들어, 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 또는 적어도 6 개)의 3쌍(triplet)의 페닐알라닌, 트립토판, 및 발린을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR의 막관통 도메인은 CD8 힌지 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 세포질 도메인 내의 서열과 자연적으로 연합된다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 다른 막관통 도메인(예를 들어, 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인)에 대한 도메인의 결합을 회피하여 수용체 복합체의 다른 멤버와의 상호작용을 최소화하기 위해 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)의 아미노산 치환에 의해 변형된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드의 막관통 도메인은 CD8 힌지 및 막관통 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 서열번호 33에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 막관통 도메인은 서열번호 33에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CAR의 막관통 도메인은 CD3-제타, CD8, CD28, DAP12, 2B4, NKG2D, CD16, NKp44, FcYRIIIa, NKp30, actKIR, NKG2C, IL15Rb, 또는 NKp46의 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 CAR의 막관통 도메인은 CD3-제타, CD8 또는 CD28의 막관통 도메인을 포함한다. 이들 실시양태 중 일부에서, CAR의 세포내 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동자극 분자의 공동자극 도메인을 포함한다.
세포내(세포질) 도메인
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드는 세포내 도메인을 포함한다. 세포내 도메인은 예를 들어, NK 세포 또는 ML NK 세포와 같은 면역 이펙터 세포의 활성화를 야기하는 신호를 전달하는 기능을 하는 것으로 알려진 임의의 폴리펩티드 도메인일 수 있다. 이러한 도메인 또는 모티프는 표적 항원에 대한 CAR의 세포외 도메인의 결합에 반응하여 T 림프구의 활성화에 필요한 일차 항원-결합 신호를 전달할 수 있다. 세포내 도메인의 예는, 비제한적으로, ILR 쇄, CD28, 4-1BB 및 CD3ζ를 포함한다.
통상적으로, 세포내 도메인은 ITAM(면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif))을 포함한다.
일 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ시그널링 서열(예를 들어, 이의 ITAM-함유 부분)이거나 이를 포함한다. 일 실시양태에서, 세포내 도메인은 림프구 수용체 쇄를 포함한다. 일 실시양태에서, 세포내 도메인은 TCR/CDR3 복합체 단백질을 포함한다. 일 실시양태에서, 세포내 도메인은 Fc 수용체 서브유닛을 포함한다. 일 실시양태에서, 세포내 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛을 포함한다.
본원에 제공된 CAR의 세포내 도메인은 TCR을 통해 항원-의존적 활성화를 개시하는 시그널링 서열(일차 세포질 시그널링 서열)(예를 들어, CD3ζ 세포질 시그널링 서열) 및 이차 또는 공동-자극 신호를 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는 하나 이상의 공동-자극 단백질의 세포질 서열(이차 세포질 시그널링 서열)의 2 개의 별개의 클래스의 세포질 시그널링 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원은 항원 결합 도메인이 항원에 결합할 때, T 세포를 자극하기에 충분한 CD3ζ의 세포질 서열, 및 선택적으로 NK 세포의 공동-자극을 제공하는 하나 이상의 공동-자극 단백질의 세포질 서열(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40L, CD40, PD-1, PD-L1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, CD160, LIGHT, BTLA, TIM3, CD244, CD80, LAG3, NKG2C, B7-H3, 2B4, DAP10, CD137, DAP12, DNAM-1, NKp80, NTBA, CRACC, CD2, CD3ζ 하나 이상의 인테그린, IL-15R, IL-18R, IL-12R, IL-21R, IRE1a, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, 및 본원에 기재되거나 당업계에 알려진 임의의 ITAM 서열 중 하나 이상의 세포질 서열)을 포함하는 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 단백질의 전체 세포내 시그널링 도메인은 CAR의 세포내 도메인에 포함된다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 공동-자극 단백질의 세포내 시그널링 도메인의 절단된 부분(예를 들어, CAR-발현 면역 이펙터 세포에서 이펙터 기능 신호를 형질도입시키는 세포내 시그널링 도메인의 절단된 부분)을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR의 세포내 도메인은 그 자체로 또는 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 소망하는 세포질 시그널링 서열(들)과 조합된 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR의 세포질 도메인은 CD3ζ 쇄 부분 및 공동자극 세포질 시그널링 서열을 포함할 수 있다. 공동자극 세포질 시그널링 서열은 공동자극 단백질(예를 들어, CD27, CD28, 4-IBB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드)의 세포질 시그널링 서열을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다.
일부 실시양태에서, CAR의 세포내 도메인 내의 세포질 시그널링 서열은 무작위 순서로 위치된다. 일부 실시양태에서, CAR의 세포내 도메인 내의 세포질 시그널링 서열은 특정 순서로 서로 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 링커)는 상이한 세포질 시그널링 서열 사이의 결합을 형성하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ의 세포질 시그널링 서열 및 공동자극 단백질 CD28의 세포질 시그널링 서열을 포함하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 의 세포질 시그널링 서열 및 공동자극 단백질 4-IBB의 세포질 시그널링 서열을 포함하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 의 세포질 시그널링 서열 및 공동자극 단백질 CD28 및 4-IBB의 세포질 시그널링 서열을 포함하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 4-1BB의 세포질 시그널링 서열을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 26 및 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 26 및 27에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 34에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 34에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 35에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 35에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 34 및 35에 기재된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 34 및 35에 기재된 핵산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR은 CD28, CD137(4-lBB로도 알려짐), CD134(OX40으로도 알려짐) 및 CD278(ICOS로도 알려짐)과 같은 단백질로부터 유래된 하나 이상의 공동-자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD137로부터 유래된 공동-자극 도메인을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 세포내 도메인은 사이토카인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 자가-절단 도메인(예를 들어, P2A 자가-절단 펩티드) 및 사이토카인을 추가로 포함하고, 자가-절단 도메인의 절단은 사이토카인을 방출한다. 일부 실시양태에서, 자가-절단 도메인(예를 들어, P2A 자가-절단 펩티드) 및 사이토카인은 CAR 단백질 및 이의 세포내 도메인의 C-말단 단부에 위치한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인은 IL-12, IL-7, IL-13, IL-15, IL-4, IL-10, TNF-α, IFN-γ, TGF-β 및 CCL19 중 하나 이상이다. 일 실시양태에서, 사이토카인은 IL-12이다. 일 실시양태에서, 사이토카인은 IL-7이다. 일 실시양태에서, 사이토카인은 IL-13이다. 일 실시양태에서, 사이토카인은 IL-15이다. 일 실시양태에서, 사이토카인은 IL-4이다. 일 실시양태에서, 사이토카인은 IL-10이다. 일 실시양태에서, 사이토카인은 TNF-α이다. 일 실시양태에서, 사이토카인은 IFN-γ이다. 일 실시양태에서, 사이토카인은 TGF-β이다. 일 실시양태에서, 사이토카인은 CCL19이다. 사이토카인을 발현하도록 변형된 면역 이펙터 세포는 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Adachi et al, 2018, Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4086; Liu et al., 2019, J. Immunol., doi:10.4049/jimmunol.1800033; Krenciute et al., 2017, Cancer Immunol. Res. 597):571-581, doi:10.1158/2326-6066,CIR-16-0376; Liu et al., 2018, Leukemia 32:520-531 참고). 특정 실시양태에서, 사이토카인을 발현하기 위한 본원에 기재된 면역 이펙터 세포의 변형은 Adachi et al, 2018, Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4086; Liu et al., 2019, J. Immunol., doi:10.4049/jimmunol.1800033; Krenciute et al., 2017, Cancer Immunol. Res. 597):571-581, doi:10.1158/2326-6066,CIR-16-0376; or Liu et al., 2018, Leukemia 32:520-531에 기재된 것과 동일하거나, 본원에 기재된 방법에 따른다.
CAR 도메인 사이의 링커
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드는 CAR에서 적어도 하나의 도메인 사이에 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR은 (1) 세포외(항원 결합) 도메인과 막관통 도메인 사이, 및/또는 (2) 막관통 도메인과 세포내(세포질) 도메인 사이에 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드 링커일 수 있다. 예를 들어, 링커는 약 1 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 약 18 개의 아미노산, 약 16 개의 아미노산, 약 14 개의 아미노산, 약 12 개의 아미노산, 약 10 개의 아미노산, 약 8 개의 아미노산, 약 6 개의 아미노산, 약 4 개의 아미노산, 또는 약 2 개의 아미노산; 약 2 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 약 18 개의 아미노산, 약 16 개의 아미노산, 약 14 개의 아미노산, 약 12 개의 아미노산, 약 10 개의 아미노산, 약 8 개의 아미노산, 약 6 개의 아미노산, 또는 약 4 개의 아미노산; 약 4 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 약 18 개의 아미노산, 약 16 개의 아미노산, 약 14 개의 아미노산, 약 12 개의 아미노산, 약 10 개의 아미노산, 약 8 개의 아미노산, 또는 약 6 개의 아미노산; 약 6 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 약 18 개의 아미노산, 약 16 개의 아미노산, 약 14 개의 아미노산, 약 12 개의 아미노산, 약 10 개의 아미노산, 또는 약 8 개의 아미노산; 약 8 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 약 18 개의 아미노산, 약 16 개의 아미노산, 약 14 개의 아미노산, 약 12 개의 아미노산, 또는 약 10 개의 아미노산; 약 10 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 약 18 개의 아미노산, 약 16 개의 아미노산, 약 14 개의 아미노산, 또는 약 12 개의 아미노산; 약 12 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 약 18 개의 아미노산, 약 16 개의 아미노산, 또는 약 14 개의 아미노산; 약 14 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 약 18 개의 아미노산, 또는 약 16 개의 아미노산; 약 16 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 약 20 개의 아미노산, 또는 약 18 개의 아미노산; 약 18 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 약 25 개의 아미노산, 또는 약 20 개의 아미노산; 약 20 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 약 30 개의 아미노산, 또는 약 25 개의 아미노산; 약 25 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 약 35 개의 아미노산, 또는 약 30 개의 아미노산; 약 30 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 약 40 개의 아미노산, 또는 약 35 개의 아미노산; 약 35 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 약 50 개의 아미노산, 또는 약 40 개의 아미노산; 약 40 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 약 60 개의 아미노산, 또는 약 50 개의 아미노산; 약 50 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 약 70 개의 아미노산, 또는 약 60 개의 아미노산; 약 60 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 150 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 약 80 개의 아미노산, 또는 약 70 개의 아미노산; 약 70 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 약 90 개의 아미노산, 또는 약 80 개의 아미노산; 약 80 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 약 100 개의 아미노산, 또는 약 90 개의 아미노산; 약 90 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 약 200 개의 아미노산, 또는 약 100 개의 아미노산; 약 100 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 약 300 개의 아미노산, 또는 약 200 개의 아미노산; 약 200 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산, 약 400 개의 아미노산, 또는 약 300 개의 아미노산; 약 300 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산 또는 약 400 개의 아미노산; 또는 약 400 개의 아미노산 내지 약 500 개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
CAR을 제조하는 방법
CAR 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제조하기 위한 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
본원에 기재된 CAR에 사용하기에 적합한 항체 및 단편은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다.
항체 단편을 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편은 펩신(F(ab')2 단편을 생산하기 위함) 또는 파파인(Fab 단편을 생성하기 위함)과 같은 효소를 사용하여 면역글로불린 분자의 단백질분해 절단에 의해 생산될 수 있다. scFv 단편을 제조하는 방법은 또한 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Ahmad et al., 2012, Clinical and Developmental Immunology, doi: 10.1155/2012/980250; Wang et al., 2006, Anal. Chem. 78, 997-1004; Pansri et al., 2009, BMC Biotechnology 9:6; Chao et al., 2006, Nature Protocols 1(2):755-768 참고). 소망하는 항원-결합 특성을 갖는 scFv는 파지 디스플레이 기술 또는 효모 표면 디스플레이 기술에 의해 선택될 수 있다. scFv는 짧은 폴리펩티드 링커를 통해 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 융합시킴으로써 제작될 수 있다(재조합 발현 기술을 사용함). 단일 도메인 항체(예를 들어, 경쇄가 결여된 항체)를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Riechmann & Muyldermans, 1999, J Immunol 231:25- 38; Nuttall et al, 2000, Curr Pharm Biotechnol 1(3):253-263; Muyldermans, 2001, J Biotechnol 74(4): 277-302 참고).
이중특이적 항체를 생산하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Konterman, 2012, MAbs 4: 182-197; Gramer et al., 2013, MAbs 5:962-973 참고).
선택된 CDR 아미노산 서열이 짧은 서열(예를 들어, 길이가 10-15 개 미만인 아미노산)인 실시양태에서, CDR을 코딩하는 핵산은 예를 들어, Shiraishi et al. (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51(1):129-130 및 미국 특허 제6,995,259호에 기재된 바와 같이 화학적으로 합성될 수 있다. 수용체 항체를 코딩하는 주어진 핵산 서열에 대해, CDR을 코딩하는 핵산 서열의 영역은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 화학적으로 합성된 핵산으로 치환될 수 있다. 화학적으로 합성된 핵산의 5' 및 3' 단부는 공여체 항체의 가변 영역을 코딩하는 핵산에 핵산을 클로닝하는데 사용하기 위한 점착성 단부 제한 효소 부위를 포함하도록 합성될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 항체는 당업계에 알려진 임의의 면역학적 또는 생화학적-기반 방법을 사용하여, 시험관내 또는 생체내에서 항원, 예를 들어 NPM1c:HLA-A2에 대해 주어진 임의의 활성 또는 기능을 조절하는 이의 능력에 대해 스크리닝 및/또는 시험될 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드는 분자 생물학 및 단백질 화학의 업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 다를 코딩하는 핵산은 전사 및 번역 조절 서열을 함유하는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있으며, 이는 예를 들어 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 전사 종결자 신호, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서 또는 활성자 서열을 포함한다. 조절 서열은 프로모터 및 전사 개시 및 종결 서열을 포함한다. 또한, 발현 벡터는 하나 초과의 복제 시스템을 포함하여, 이는 2 개의 상이한 유기체, 예를 들어 발현을 위한 포유동물 또는 곤충 세포 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵 숙주에서 유지될 수 있다.
몇몇 가능한 벡터 시스템은 포유동물 세포에서의 핵산으로부터 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드(예를 들어, 클로닝된 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드)의 발현을 위해 이용가능하다. 벡터의 하나의 클래스는 숙주 세포 게놈으로의 소망하는 유전자 서열의 통합에 의존한다. 안정적으로 통합된 DNA를 갖는 세포는 E. coli gpt(Mulligan and Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:2072) 또는 Tn5 neo(Southern and Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327)와 같은 약물 내성 유전자를 동시에 도입함으로써 선택될 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 유전자 서열에 연결되거나, 또는 공동-형질주입에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다(Wigler et al. (1979) Cell 16:77). 벡터의 제2 클래스는 염색체외 플라스미드에 자가 복제하는 능력을 부여하는 DNA 요소를 이용한다. 이들 벡터는 소 유두종 바이러스(Sarver et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA, 79:7147), 거대세포바이러스, 폴리오마 바이러스(Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1292), 또는 SV40 바이러스(Lusky and Botchan (1981) Nature 293:79)와 같은 동물 바이러스로부터 유래될 수 있다.
발현 벡터는 핵산의 후속 발현에 적합한 방식으로 세포에 도입될 수 있다. 도입 방법은 주로 아래 논의되는 표적화된 세포 유형에 의해 지시된다. 예시적인 방법은 CaPO4 침전, 리포솜 융합, 양이온성 리포솜, 전기천공, 바이러스 감염, 덱스트란-매개된 형질주입, 폴리브렌-매개된 형질주입, 원형질체 융합, 및 직접 미량주사를 포함한다.
폴리펩티드의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 효모, 세균, 곤충, 식물, 및 포유동물 세포를 포함한다. 특히 관심있는 것은 E. coli와 같은 세균, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 진균, SF9와 같은 곤충 세포, 포유동물 세포주(예를 들어, 인간 세포주)뿐 아니라, 일차 세포주이다.
폴리펩티드는 항체 또는 단편을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 단백질의 발현을 허용하기에 충분한 조건 하에서 충분한 시간 동안 배양함으로써 세포로부터 생산될 수 있다. 단백질 발현을 위한 이러한 조건은 발현 벡터 및 숙주세포의 선택에 따라 달라질 것이며, 통상적인 실험을 통해 통상의 기술자에 의해 용이하게 확인될 것이다. 예를 들어, E. coli에서 발현된 항체는 봉입체로부터 재폴딩될 수 있다(예를 들어, Hou et al. (1998) Cytokine 10:319-30 참고). 세균 발현 시스템 및 이의 사용을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, and Molecular Cloning--A Laboratory Manual --3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001) 참고). 코돈, 적합한 발현 벡터 및 적합한 숙주 세포의 선택은 다수의 인자에 따라 달라질 것이고, 필요에 따라 용이하게 최적화될 수 있다. 본원에 기재된 항체(또는 이의 단편)는 포유동물 세포 또는, 비제한적으로, 효모, 바큘로바이러스, 및 시험관내 발현 시스템을 포함하는 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다(예를 들어, Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220 참고).
발현 후에, 폴리펩티드는 단리될 수 있다. 표준 정제 방법은 전기영동, 분자, 면역학적, 및 이온 교환, 소수성, 친화도, 및 역상 HPLC 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피 기술을 포함한다. 예를 들어, 항체는 표준 항-항체 컬럼(예를 들어, 단백질-A 또는 단백질-G 컬럼)을 사용하여 정제될 수 있다. 단백질 농도와 함께 한외여과 및 정용여과 기술이 또한 유용하다. 예를 들어, Scopes (1994) "Protein Purification, 3rd edition", Springer-Verlag, New York city, New York을 참고한다. 필요한 정제의 정도는 소망하는 용도에 따라 달라질 것이다. 일부 경우에, 발현된 항체 또는 이의 단편의 정제가 필요하지 않을 것이다.
폴리펩티드의 수율 또는 순도를 결정하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 브래드포드(Bradford) 분석, UV 분광법, 뷰렛(Biuret) 단백질 분석, 로우리(Lowry) 단백질 분석, 아미도 블랙 단백질 분석, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량 분광법(MS), 및 겔 전기영동 방법(예를 들어, 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 또는 콜로이드성 은 염색과 같은 단백질 염색을 사용함)을 포함한다.
폴리펩티드는 이의 발현 및 정제 후에 변형될 수 있다. 변형은 공유 또는 비공유 변형일 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 변형에 적합한 부위는 예를 들어, 항체 또는 단편의 구조 분석 또는 아미노산 서열 분석을 포함하는 임의의 다양한 기준을 사용하여 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 이종 모이어티에 접합될 수 있다. 이종 모이어티는 예를 들어, 이종 폴리펩티드, 치료제 또는 세포독성제(예를 들어, 독소 또는 약물), 또는 검출가능한 표지, 예컨대, 비제한적으로, 방사성 표지, 효소 표지, 형광 표지, 중금속 표지, 발광 표지, 또는 친화도 태그, 예컨대 비오틴 또는 스트렙타비딘일 수 있다. 적합한 이종 폴리펩티드는 예를 들어, 항체 또는 단편을 정제하는데 사용하기 위한 항원성 태그(예를 들어, FLAG(DYKDDDDK(서열번호 44)), 폴리히스티딘(6-His; HHHHHH(서열번호 45)), 헤마글루티닌(HA; YPYDVPDYA(서열번호 46)), 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST), 또는 말토스-결합 단백질(MBP))를 포함한다. 이종 폴리펩티드는 또한 진단 또는 검출가능한 마커로서 유용한 폴리펩티드(예를 들어, 효소), 예를 들어 루시페라아제, 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP)), 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT)를 포함한다. 적합한 방사성 표지는 예를 들어, 32P, 33P, 14C, 125I, 131I, 35S, 및 3H를 포함한다. 적합한 형광 표지는, 비제한적으로, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 녹색 형광 단백질(GFP), DyLight™ 488, 피코에리트린(PE), 프로피듐 요오다이드(PI), PerCP, PE-Alexa Fluor® 700, Cy5, 알로피코시아닌, 및 Cy7을 포함한다. 발광 표지는 예를 들어, 임의의 다양한 발광 란탄족(예를 들어, 유로퓸 또는 테르븀) 킬레이트를 포함한다. 예를 들어, 적합한 유로퓸 킬레이트는 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(DTPA) 또는 테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)의 유로퓸 킬레이트를 포함한다. 효소 표지는 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, CAT, 루시페라아제, 및 꽃양배추 퍼옥시다아제를 포함한다.
2 개의 단백질(예를 들어, 항체 및 이종 모이어티)은 다수의 알려진 화학적 가교제 중 임의의 것을 사용하여 가교될 수 있다. 이러한 가교제의 예는 "힌더드(hindered)" 이황화 결합을 포함하는 연결을 통해 2 개의 아미노산 잔기를 연결하는 것이다. 이들 연결에서, 가교-결합 유닛 내의 이황화 결합은 (이황화 결합의 측면 상의 기를 방해함으로써) 예를 들어, 환원된 글루타티온 또는 효소 이황화물 환원효소의 작용에 의한 환원으로부터 보호된다. 하나의 적합한 시약, 4-숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α(2-피리딜디티오 톨루엔(SMPT)은 단백질 중 하나의 말단 리신 및 나머지의 말단 시스테인을 이용하여 2 개의 단백질 사이에 이러한 연결을 형성한다. 각각의 단백질 상의 상이한 커플링 모이어티에 의해 가교되는 이종이작용성 시약이 또한 사용될 수 있다. 다른 유용한 가교제는, 비제한적으로, 2 개의 아미노기(예를 들어, N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드), 2 개의 설프히드릴기(예를 들어, 1,4-비스-말레이미도부탄), 아미노기 및 설프히드릴기(예를 들어, 말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르), 아미노기 및 카복실기(예를 들어, 4-[p-아지도살리실아미도]부틸아민), 및 아르기닌의 측쇄에 존재하는 아미노기 및 구아니디늄기(예를 들어, p-아지도페닐 글리옥살 모노하이드레이트)를 연결하는 시약을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방사성 표지는 폴리펩티드의 아미노산 백본에 직접 접합될 수 있다. 대안적으로, 방사성 표지는 유리 아미노기에 결합하여, 관련 단백질의 메타-요오도페닐(mIP) 유도체를 형성하는 큰 분자(예를 들어, 메타-[125I]요오도페닐-N-하이드록시숙신이미드 중 125I([125I]mIPNHS))(예를 들어, Rogers et al. (1997) J Nucl Med 38:1221-1229 참고) 또는 킬레이트(예를 들어, DOTA 또는 DTPA에 대한 것)의 일부로서 포함될 수 있으며, 이는 결국 단백질 백본에 결합된다. 본원에 기재된 폴리펩티드에 방사성 표지 또는 이들을 함유하는 큰 분자/킬레이트를 접합시키는 방법은 당업계에 알려져 있다. 이러한 방법은 단백질에 대한 방사성 표지 또는 킬레이트의 결합을 용이하게 하는 조건(예를 들어, pH, 염 농도, 및/또는 온도) 하에 단백질을 방사성 표지와 함께 항온처리하는 것을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제6,001,329호 참고).
단백질(예를 들어, 항체)에 형광 표지(때때로 "형광단"으로 지칭됨)를 접합하기 위한 방법은 단백질 화학 업계에 알려져 있다. 예를 들어, 형광단은 형광단에 부착된 숙신이미딜(NHS) 에스테르 또는 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르 모이어티를 사용하여 단백질의 유리 아미노기(예를 들어, 리신의 것) 또는 설프히드릴기(예를 들어, 시스테인)에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광단은 이종이작용성 가교제 모이어티, 예컨대 설포-SMCC에 접합될 수 있다. 적합한 접합 방법은 단백질에 대한 형광단의 결합을 용이하게 하는 조건 하에 항체 단백질 또는 이의 단편을 형광단과 함께 항온처리하는 것을 포함한다. 예를 들어, Welch and Redvanly (2003) "Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications," John Wiley and Sons (ISBN 0471495603)를 참고한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 효소적 또는 화학적 처리를 거치거나, 세포로부터 생산되어, 폴리펩티드가 감소된 글리코실화를 갖거나 글리코실화가 부재할 수 있다. 감소된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,933,368호; Wright et al. (1991) EMBO J 10(10):2717-2723; and Co et al. (1993) Mol Immunol 30:1361에 기재되어 있다.
예시적인 CAR 폴리펩티드
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, DAP12 막관통 및 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, CD8 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, CD8 막관통 도메인, 2B4 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, 2B4 막관통 및 세포내 도메인 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, CD28 막관통 도메인 및 세포내 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, NKp46 막관통 도메인, 2B4 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, CD16 막관통 도메인, 2B4 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, NKp44 막관통 도메인, DAP10 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, NKG2D 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, NKG2D 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, NKG2D 막관통 도메인 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, NKG2D 막관통 도메인, DAP12 세포내 도메인, 2B4 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, NKG2D 막관통 도메인, DAP10 세포내 도메인, 2B4 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 NPM1c 항원에 결합하는 세포외 도메인, NKG2D 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 2B4 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 사이토카인에 작동가능하게 연결되어, 사이토카인은 또한 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 절단가능한 링커를 통해 사이토카인에 연결되어, CAR 폴리펩티드 및 사이토카인 둘 다는 절단 후에 별도로 발현된다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 본원에 기재된 IL-15 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 절단가능한 링커를 통해 본원에 기재된 IL-15 폴리펩티드에 연결된다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 CD8 힌지 및 막관통 도메인, 4-1BB 시그널링 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 NPM1c 결합 scFv, 막관통 도메인, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 33의 CD8 힌지 및 막관통 영역, 서열번호 34의 4-1BB 시그널링 도메인, 및 서열번호 35의 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 30의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) CD8 힌지 도메인; (iii) CD8 막관통 도메인; (iv) 4-1BB 세포내 도메인; 및 (v) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) CD8 막관통 도메인; (iii) 4-1BB 세포내 도메인; 및 (iv) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) CD28 막관통 도메인; (iii) CD28 세포내 도메인; 및 (iv) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) DAP12 막관통 도메인; 및 (iii) DAP12 세포내 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) CD28 막관통 도메인; (iii) 2B4 세포내 도메인; 및 (iv) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) 2B4 막관통 도메인; (iii) 2B4 세포내 도메인; 및 (iv) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) CD28 막관통 도메인; (iii) CD28 세포내 도메인; (iv) 4-1BB 세포내 도메인; 및 (v) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) CD16 막관통 도메인; (iii) 2B4 세포내 도메인; 및 (iv) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) NKp44 막관통 도메인; (iii) DAP10 세포내 도메인; 및 (iv) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) NKp46 막관통 도메인; (iii) 2B4 세포내 도메인; 및 (iv) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) NKG2D 막관통 도메인; (iii) 2B4 세포내 도메인; 및 (iv) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) NKG2d 막관통 도메인; (iii) 4-1BB 세포내 도메인; 및 (iv) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) NKG2D 막관통 도메인; (iii) 2B4 세포내 도메인; (iv) DAP12 세포내 도메인; 및 (v) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) NKG2D 막관통 도메인; (iii) 2B4 세포내 도메인; (iv) DAP10 세포내 도메인; 및 (v) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) NKG2D 막관통 도메인; (iii) 4-1BB 세포내 도메인; (iv) 2B4 세포내 도메인; 및 (v) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 항-NPM1c scFv; (ii) NKG2D 막관통 도메인; 및 (iii) CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-NPM1c scFv; (ii) 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 힌지 및 막관통 도메인; (iii) 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 세포내 도메인; 및 (iv) 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 97에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 IL-15 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 폴리펩티드는 이종 막관통 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 서열번호 32에 기재된 핵산 서열에 의해 코딩된 항-NPM1c scFv; (ii) 서열번호 33에 기재된 핵산 서열에 의해 코딩된 CD8 힌지 및 막관통 도메인; (iii) 서열번호 34에 기재된 핵산 서열에 의해 코딩된 4-1BB 세포내 도메인; 및 (iv) 서열번호 35에 기재된 핵산 서열에 의해 코딩된 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 IL-15 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 98에 기재된 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 이종 막관통 도메인을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 (i) 서열번호 32에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된 항-NPM1c scFv; (ii) 서열번호 33에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된 CD8 힌지 및 막관통 도메인; (iii) 서열번호 34에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된 4-1BB 세포내 도메인; 및 (iv) 서열번호 35에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 IL-15 폴리펩티드를 코딩하는, 서열번호 98에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성의 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, IL-15 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 이종 막관통 도메인을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
CAR 폴리펩티드를 코딩하는 벡터
일부 양태에서, 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드는 벡터에 의해 코딩된다.
본원에 기재된 CAR 폴리펩티드에 대한 코딩 서열이 제조되거나 단리되면, 이러한 서열은 임의의 적합한 벡터 또는 레플리콘 내로 클로닝될 수 있다. "코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드(예를 들어, CAR 폴리펩티드)를 "코딩하는" 서열은 적절한 조절 서열(또는 "제어 요소")의 제어 하에 위치할 때, 생체내에서 폴리펩티드로 전사되고(DNA의 경우) 번역되는(mRNA의 경우) 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 3' (카복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은, 비제한적으로, 바이러스, 원핵 또는 진핵 mRNA로부터의 cDNA, 바이러스 또는 원핵 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열도 포함할 수 있다. 전사 종결 서열은 3'에서 코딩 서열까지 위치할 수 있다. 코딩 서열의 전사 및 번역은 통상적으로, 비제한적으로, 전사 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결 신호, 폴리아데닐화 서열(3'에서 번역 종결 코돈까지 위치함), 번역의 개시의 최적화를 위한 서열(5'에서 코딩 서열까지 위치함), 및 번역 종결 서열을 포함하는 "제어 요소"에 의해 조절된다.
많은 클로닝 벡터가 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 적절한 클로닝 벡터의 선택은 선택의 문제이다. 다른 서열에 대한 결찰은 당업계에 알려진 표준 절차를 사용하여 수행된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 연결된 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 하나의 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가 DNA 절편이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 추가 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제가 가능하다(예를 들어, 세균 복제 원점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 사용되는 발현 벡터는 보통 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)와 같은 발현 벡터의 다른 형태를 포함하도록 의도된다.
또한, 용어 "벡터"는 다른 핵산 분자를 전달하거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭할 수 있다. 전달된 핵산은 벡터 핵산 분자에 연결, 예를 들어 삽입될 수 있다. 벡터는 세포에서 자가 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA로 통합시키기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는 예를 들어, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 전이인자, 코스미드, 세균 인공 염색체, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질도입" 또는 "세포 형질도입"은 DNA 또는 RNA 바이러스를 사용하여 핵산(들)을 세포로 전달하는 과정을 지칭한다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 핵산 분자는 발현 벡터에 제공된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자가 벡터 내로 삽입되기 전 또는 후에, 이 작동적 연결에 영향을 주는 방법은 잘 알려져 있다. 발현 제어 서열은 프로모터, 활성자, 인핸서, 작동자, 리보솜 뉴클레아제 도메인, 개시 신호, 종결 신호, 캡 신호, 폴리아데닐화 신호, 및 전사 또는 번역의 제어와 관련된 다른 신호를 포함한다.
"프로모터"는 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터는 유도성 프로모터(프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도됨), 억제성 프로모터(프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 억제됨), 및 구성적 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 프로모터는 또한 조직 특이성을 가질 수 있으며, 예를 들어 CD80 프로모터는 특정 면역 세포에서만 유도성이고, myoD 프로모터는 근육 세포에서만 유도성이다. 용어 "프로모터" 또는 "제어 요소"는 전장 프로모터 영역 및 이들 영역의 기능적(예를 들어, 전사 또는 번역을 제어함) 절편을 포함하는 것으로 의도된다. 프로모터는 공동-자극 분자, 이의 보체의 프로모터 영역의 영역과 동일하거나 실질적으로 동일한 염기쌍 서열을 갖는 경우, 또는 아래 기재된 바와 같이 서열 동일성을 나타내는 경우, 공동-자극 분자를 코딩하는 유전자로부터 "유래"된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 분자는 바이러스 벡터 내에 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 예를 들어, 핵산 분자의 전달 또는 세포의 게놈 내로의 통합을 용이하게 하는 바이러스-유래된 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 전달 플라스미드), 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자를 지칭할 수 있다. 바이러스 입자는 핵산(들)과 함께 다양한 바이러스 구성요소 및 때때로 또한 숙주 세포 구성요소를 포함할 수 있다.
사용에 적합한 바이러스 벡터는 예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 벡터, 헤르페스 바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40), 및 소 유두종 바이러스 벡터(예를 들어, Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 참고)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "레트로바이러스 벡터"는 관심 유전자(즉, 후보 폴리펩티드 또는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 유전자)를 발현하도록 변형된 레트로바이러스를 지칭할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 바이러스 감염 과정을 이용함으로써 유전자(즉, 후보 폴리펩티드 또는 이종 폴리펩티드를 코딩하는 유전자(들))를 숙주 세포에 효율적으로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 게놈 내로 클로닝된(즉, 분자 생물학 기술을 사용하여 삽입된) 외래 또는 이종 표적 유전자는 레트로바이러스에 의한 감염에 민감한 숙주 세포에 효율적으로 전달될 수 있다. 알려진 유전자 조작은 레트로바이러스 게놈의 복제 능력을 방해할 수 있다. 생성된 복제-결핍 벡터는 세포 내로 새로운 유전 물질을 도입하기 위해 사용될 수 있지만, 이들은 복제될 수 없다. 헬퍼 바이러스 또는 패키징 세포주는 벡터 입자 조립 및 세포로부터의 방출을 허용하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 하나 이상의 관심 유전자를 코딩하는 핵산 서열(즉, 다시스트론 핵산 서열은 몇몇 관심 유전자를 코딩할 수 있음), 5' 레트로바이러스 장쇄 말단 반복부(5' LTR), 및 레트로바이러스 장쇄 말단 반복부(3' LTR)를 함유하는 3' 복제-결함 레트로바이러스 게놈을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "렌티바이러스 벡터"는 비-분열 세포에 포함될 수 있는 렌티바이러스 패밀리(예를 들어, HIV, MIV, 말 전염성 빈혈 바이러스, 카프린 관절염-뇌염 바이러스)를 지칭한다. (예를 들어, 미국 특허 제5,994,136호 및 제6,013,516호를 참고하며, 이들 모두는 본원에 참고로 포함됨).
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 위형화된 렌티바이러스 벡터이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "슈도(pseudo) 렌티바이러스 벡터" 또는 "위형화된 렌티바이러스 벡터"는 이들의 향성을 변경시키기 위한 이종 바이러스 외피와 같은 이종 막 단백질을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다. 예를 들어, Cronin et al (2005) CURR. GENE THER. 5:387-398을 참고한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 외피 당단백질은 수포성-구내염 바이러스(VSVG)로부터의 것이다. 자연 발생 또는 조작된 바이러스 외피의 다양한 세트를 갖는 위형화 렌티바이러스 벡터는 특정 세포 유형의 표적화된 형질도입을 허용한다. 예를 들어, 비비 레트로바이러스 외피 당단백질(BaEV-LV)로 위형화된 렌티바이러스 벡터가 개발되었다. 변형된 BaEVg로 위형화된 렌티바이러스 벡터는 VSVg 위형화된 렌티바이러스 벡터와 비교하여 NK 세포를 20 배 이상 형질도입시킬 수 있으며, 이는 많은 부분에서 활성화된 NK 세포가 ASCT-2의 상향조절을 야기하고, 이를 BaEV 위형화된 렌티바이러스 벡터를 이용한 형질도입에 고도로 민감하게 만들기 때문이다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 CAR 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 복제의 원점을 함유하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 일반적으로 표적 세포 내로 특정 유전자를 도입하기 위해 사용되는 플라스미드인 발현 구축물이다. 발현 벡터가 세포 내부에 있다면, 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 세포 전사 및 번역 기계 리보솜 복합체에 의해 생산된다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 인핸서 및 프로모터 영역으로서 작용하는 조절 서열을 함유하도록 조작되고, 발현 벡터 상에서 보유된 유전자의 효율적인 전사를 야기한다. 본 발명의 바이러스 벡터는 대량의 안정적인 메신저 RNA를 발현하고, 따라서 단백질을 발현한다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 강한 프로모터, 강한 종결 코돈, 프로모터와 클로닝된 유전자 사이의 거리의 조절, 및 전사 종결 서열 및 PTIS(휴대용 번역 개시 서열(portable translation initiation sequence))의 삽입과 같은 발현 신호를 갖는다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산이다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상체 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 종결 신호에 작동가능하게 연결될 수 있는 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 이의 구성요소 중 적어도 하나가 이의 다른 구성요소 중 적어도 하나에 대해 이종성이라는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 있으며, 이는 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출될 때만 전사를 개시한다.
사이토카인 유도된 기억-유사 자연 살해 세포
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 포함하는 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사(ML) 자연 살해(NK) 세포, 또는 상기 세포의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 세포의 집단은 자가 또는 동종 NK 세포, 예컨대 인간 공여체 NK 세포로부터 분화되거나 유래된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 세포의 집단은 제대혈(예를 들어, 인간 제대혈)로부터의 NK 세포(들)로부터 분화되거나 유래된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 세포의 집단은 인간 PBMC로부터 분화되거나 유래된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 세포의 집단은 iPSC-유래된 NK 세포(예를 들어, 인간 iPSC)로부터 분화되거나 유래된다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 세포의 집단은 CD56+CD3- 인간 NK 세포로부터 분화된다. 일부 실시양태에서, CD56+CD3- 인간 NK 세포는 인간 PBMC(예를 들어, 공여체 인간 PBMC, 예를 들어, 자가 또는 동종이계)로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, >95% CD56+CD3- 인간 NK 세포는 PBMC로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, CD56+CD3- 인간 NK 세포는 면역밀도 세포 분리, 예를 들어 RosetteSep을 사용하여 단리된다. 일부 실시양태에서, PBMC로부터 CD56+CD3- 인간 NK 세포를 정제하기 위한 방법은 (i) 비-NK 세포를 특정 항체를 사용하여 적혈구와 가교시켜, 이뮤노로제트(immunorosette)를 형성하는 단계; (ii) 세포를 밀도 구배 원심분리를 거쳐, 이뮤노로제트를 펠릿화하는 단계; (iii) NK 세포를 단리시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 NK(hNK) 세포의 집단은 성숙 및/또는 발달의 상이한 단계의 서브세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 성숙 및/또는 발달의 단계는 표현형 마커의 발현에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 성숙 및/또는 발달의 단계는 도 7c에 나타낸 표현형 마커에 기초하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 덜 성숙하고, 덜 발달되고, 더욱 줄기-유사이고/이거나 고도로 증식성인 hNK 세포의 서브세트는 CD56bright CD16low/-NKG2A+KIRs-CD57-의 표현형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 중간 성숙 및/또는 발달 단계의 hNK 세포의 서브세트는 CD56dim, CD16+NKG2A+/-KIRs-CD57- 또는 CD56dimCD16+NKG2A+/-KIRs+CD57-의 표현형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 성숙되고/되거나 발달된 hNK 세포의 서브세트는 CD56dimCD16+NKG2A+/-KIRs+CD57+의 표현형 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 덜 성숙하고/하거나 덜 발달된 hNK 세포의 서브세트는 예를 들어, 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, 더욱 성숙하고/하거나 더욱 발달된 hNK 세포의 서브세트의 ASCT의 평균 발현에 대해 증가된(예를 들어, 약 1. 1배, 1.2 배, 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 1.6 배, 1.7 배, 1.8 배, 1.9 배, 2 배, 2.5 배, 3 배) ASCT2의 평균 발현을 갖는다.
일부 실시양태에서, CD56brightCD16low/-NKG2A+KIRs-CD57-인 hNK 세포의 서브세트는 예를 들어, 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, CD56dimCD16+NKG2A+/-KIRs-CD57-인 hNK 세포의 서브세트의 ASCT의 평균 발현에 대해 증가된(예를 들어, 약 1.1 배, 1.2 배, 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 1.6 배, 1.7 배, 1.8 배, 1.9 배, 2 배, 2.5 배, 3 배) ASCT2의 평균 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, CD56brightCD16low/-NKG2A+KIRs-CD57-인 hNK 세포의 서브세트는 예를 들어, 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, CD56dimCD16+NKG2A+/-KIRs+CD57-인 hNK 세포의 서브세트의 ASCT의 평균 발현에 대해 증가된(예를 들어, 약 1.1 배, 1.2 배, 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 1.6 배, 1.7 배, 1.8 배, 1.9 배, 2 배, 2.5 배, 3 배) ASCT2의 평균 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, CD56brightCD16low/-NKG2A+KIRs-CD57-인 hNK 세포의 서브세트는 예를 들어, 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, CD56dimCD16+NKG2A+/-KIRs+CD57+인 hNK 세포의 서브세트의 ASCT의 평균 발현에 대해 증가된(예를 들어, 약 1.1 배, 1.2 배, 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 1.6 배, 1.7 배, 1.8 배, 1.9 배, 2 배, 2.5 배, 3 배) ASCT2의 평균 발현을 갖는다.
표현형
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사(ML) NK 세포는 대조군 NK 세포 또는 세포의 집단과 비교하여 고유한 마커 세트를 발현한다. 일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포는 IL-15 단독(예를 들어, 인간 IL-15)의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포 또는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주이다. 일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포는 ML NK 세포가 유래되는 NK 세포와 동일한 표현형을 갖는다.
일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포 상에서 발현된 적어도 하나의 세포 표면 마커의 발현은 감소된다. 일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포 상에서 발현된 적어도 하나의 세포 표면 마커는 ML NK 세포 상에서 발현되지 않는다. 일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포 상에서 발현되지 않은 적어도 하나의 세포 표면 마커의 발현은 ML NK 세포 상에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포 상에서 낮은 수준의 발현을 갖는 적어도 하나의 세포 표면 마커의 발현은 ML NK 세포 상에서 증가된다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 본원에 참고로 포함되는 Berrien-Elliott, M. M. et al. Cancer Discovery, DOI: 10.1158/2159-8290.CD-20-0312, December 2020; Romee. R. et al. Sci Transl Med Vol. 8(357), 2016 Sep 21에 기재된 바와 같이 특징화된다.
일부 실시양태에서, CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKGD2 및 CD25의 폴리펩티드 중 하나 이상의 발현은 대조군 NK 세포에 대해 ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단에서 증가된다. 일부 실시양태에서, CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, CD62L 및 CD25의 폴리펩티드 중 하나 이상의 발현은 대조군 NK 세포에 대해 ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단에서 증가된다. 일부 실시양태에서, TRAIL, CD69, CD62L, NKG2A 및 NKp30의 폴리펩티드 중 하나 이상은 대조군 NK 세포에 대해 ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단에서 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 발현은 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 배 증가된다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포의 집단은 TRAIL+CD69+CD62L+NKG2A+NKp30+ NK 세포의 증가된 빈도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 집단의 빈도는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 배 증가된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포의 집단은 CD27+CD127+ NK 세포의 감소된 빈도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 집단의 빈도는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 배 감소된다.
일부 실시양태에서, CD16 및/또는 CD11b의 발현은 대조군 NK 세포에 대해 ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단에서 감소된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 발현은 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 배 감소된다.
일부 실시양태에서, KIR, CD57, NKG2C, DNAM-1, CD137, 및 CD11b의 폴리펩티드 중 하나 이상의 발현은 일차/종래의 NK 세포에 대해 ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단에서 상대적으로 변화되지 않는다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD11bhighCD27lowKLRG1highCD43high의 표현형을 갖는다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 대조군 NK 세포와 비교하여 증가된 CD56 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 대조군 NK 세포와 비교하여 증가된 CD69 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 대조군 NK 세포와 비교하여 증가된 NKG2A 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 대조군 NK 세포와 비교하여 NKG2C의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 대조군 NK 세포와 비교하여 CD94의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 대조군 NK 세포와 비교하여 NKp46의 증가된 발현을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 표면 마커의 발현은 적어도 하나의 사이토카인에 대한 노출 2-24 또는 14-16 시간 이내에 유도된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 발현 프로파일은 적어도 하나의 사이토카인에 대한 노출 2-24 또는 14-16 시간 이내에 유도된다.
기능적 특징
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사(ML) NK 세포는 대조군 NK 세포와 비교하여 향상된 기능적 특징을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포 또는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주이다. 일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포는 ML NK 세포가 유래되는 NK 세포와 동일한 표현형을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 기억-유사(ML) NK 세포는 증가된 증식 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 대조군 NK 세포와 비교하여 증가된 증식을 갖는다. 세포 증식을 측정하기 위한 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있고, 비제한적으로, 세포의 수를 측정하는 것 및/또는 증식 마커를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증식은 세포질 증식 염료를 사용하여 측정되며, 세포 투과성 형광 화학물질은 세포질 구성요소에 결합하고 모든 세포 분열 마다 절반으로 희석된다. 이러한 염료는 시험관내 및 생체내에서 사용될 수 있다. 예는 카보자이플루오르세인 디아세테이트(carbozyfluorescein diacetate)(CFSE)를 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증식은 세포-주기 연관 단백질의 수준을 정량화함으로써 측정된다. 세포 증식을 측정하기 위해 다수의 기술이 적용가능하다. 기술의 예는 유세포 분석, 웨스턴 블롯 분석법, 및 조직 현미경법을 포함한다. 총 세포 수를 계수하는 것을 포함한 세포 증식을 결정하기 위한 수동 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기억-유사(ML) NK 세포는 IFΝγ를 생산한다. 일부 실시양태에서, IFNγ 생산은 대조군 NK 세포(예를 들어, 인간 NK 세포 또는 활성화된 인간 NK 세포)에 대해 ML NK 세포에서 증가된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 NK 세포의 자극시 증가된 IFNγ 생산을 갖는다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 활성화 수용체 또는 종양 표적에 의해 자극된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 암 세포에 대한 노출시 대조군 NK 세포와 비교하여 증가된 IFNγ 생산을 갖는다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 암 세포에 대한 노출시 대조군 NK 세포와 비교하여 증가된 IFNγ 생산을 갖는다. 일부 실시양태에서, IFNγ 생산은 종래의 NK 세포와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99% 증가한다. 일부 실시양태에서, IFNγ 생산은 활성화 후 1-7 일, 7-14 일, 14-21 일, 및 최대 30 일까지 자극시 증가된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 대상체 내로의 이식 후 1-7 일에 증가된 IFNγ를 유지한다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 대상체 내로의 이식 후 적어도 1 개월, 적어도 2 개월, 또는 적어도 3 개월 동안 증가된 IFNγ를 유지한다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 이식 후 적어도 1 주, 적어도 2 주, 적어도 3 주, 적어도 1 개월, 적어도 2 개월, 또는 적어도 3 개월 동안 증가된 IFNγ를 유지한다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 향상된 IFΝγ를 자손 세포로 전달한다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 대조군 NK 세포에 대해 향상된 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC)을 갖는다. ADCC는 NK세포가 이펙터인 종양 세포 및 바이러스 감염된 세포를 포함한 민감한 표적을 사멸시킬 수 있는 과정이다. ADCC는 NK 세포 표면 상의 수용체가 세포의 표면에 결합된 IgGl 또는 IgG3 항체를 인식할 때 촉발된다. 이는 퍼포린 및 그랜자임을 함유하는 세포질 과립의 방출을 촉발시켜, 표적 세포 사멸을 야기한다. NK 세포의 ADCC를 측정하기 위한 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 대조군 NK 세포에 대해 향상된 항-종양 효능을 갖는다. NK 세포의 항-종양 효능을 측정하기 위한 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있으며 본원에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 (i) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 증가된 IFΝγ를 생산하거나; (ii) 향상된 ADCC를 갖거나; (iii) 향상된 항-종양 효능을 갖거나; (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합을 갖는다.
기억-유사 NK 세포를 제조하는 방법
일부 실시양태에서, NK 세포는 기억-유사(ML) NK 세포로 분화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 활성화된 다음에, 일정 기간(예를 들어, 수 시간, 수 일)에 걸쳐 ML NK 세포로 분화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포의 활성화는 ML NK 세포로의 분화를 야기한다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21 및 이의 임의의 조합을 사용하여 활성화된다.
일부 실시양태에서, NK 세포는 일정 기간 동안 IL-12 및 IL-15; IL-12 및 IL-18; IL-15 및 IL-18; 또는 IL-12, IL-15 및 IL-18에 대한 노출에 의해 활성화된다.
일부 실시양태에서, NK 세포는 1-20 ng/mL의 농도 범위의 IL-12에 대한 일정 기간 동안의 노출에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 적어도 1 ng/mL, 적어도 2 ng/mL, 적어도 3 ng/mL, 적어도 4 ng/mL, 적어도 5 ng/mL, 적어도 6 ng/mL, 적어도 7 ng/mL, 적어도 8 ng/mL, 적어도 9 ng/mL, 적어도 10 ng/mL, 적어도 15 ng/mL 또는 적어도 20 ng/mL의 IL-12로 활성화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 10 ng/mL의 IL-12로 활성화된다.
일부 실시양태에서, NK 세포는 1-50 ng/mL의 농도 범위의 IL-15에 대한 일정 기간 동안의 노출에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 1-100 ng/mL의 농도 범위의 IL-15에 대한 일정 기간 동안의 노출에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 적어도 50 ng/mL, 적어도 60 ng/mL, 적어도 70 ng/mL, 적어도 80 ng/mL, 적어도 90 ng/mL, 적어도 95 ng/mL, 적어도 100 ng/mL, 적어도 110 ng/mL, 적어도 120 ng/mL, 적어도 130 ng/mL, 적어도 140 ng/mL, 또는 적어도 150 ng/mL의 IL-15로 활성화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 1 ng/mL의 IL-15로 활성화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 50 ng/mL의 IL-15로 활성화된다.
일부 실시양태에서, NK 세포는 10-100 ng/mL의 농도 범위의 IL-18에 대한 일정 기간 동안의 노출에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 50 ng/mL의 IL-18로 활성화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 적어도 20 ng/mL, 적어도 30 ng/mL, 적어도 40 ng/mL, 적어도 50 ng/mL, 적어도 60 ng/mL, 적어도 70 ng/mL, 적어도 80 ng/mL, 적어도 90 ng/mL, 적어도 95 ng/mL, 또는 적어도 100 ng/mL의 IL-18로 활성화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 50 ng/mL IL-18로 활성화된다.
일부 실시양태에서, NK 세포는 1-20 ng/mL IL-12, 1-50 ng/mL IL-15 및 10-100 ng/mL IL-18에 대한 일정 기간 동안의 노출에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 10 ng/mL IL-12, 1 ng/mL IL-15 및 50 ng/mL IL-18에 대한 일정 기간 동안의 노출에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 10 ng/mL IL-12, 50 ng/mL IL-15 및 50 ng/mL IL-18에 대한 일정 기간 동안의 노출에 의해 활성화된다.
일부 실시양태에서, NK 세포는 사이토카인-활성화된 기억-유사(ML) NK 세포를 형성하기에 충분한 양의 시간 동안 사이토카인의 존재 하에 항온처리된다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-활성화된 기억-유사(ML) NK 세포를 형성하기에 충분한 양의 시간은 약 8 내지 약 24 시간, 약 12 시간, 또는 약 16 시간이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-활성화된 기억-유사(ML) NK 세포를 형성하기에 충분한 양의 시간은 약 16 시간 내지 약 20 시간이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-활성화된 기억-유사(ML) NK 세포를 형성하기에 충분한 양의 시간은 적어도 약 1 시간; 약 2 시간; 약 3 시간; 약 4 시간; 약 5 시간; 약 6 시간; 약 7 시간; 약 8 시간; 약 9 시간; 약 10 시간; 약 11 시간; 약 12 시간; 약 13 시간; 약 14 시간; 약 15 시간; 약 16 시간; 약 17 시간; 약 18 시간; 약 19 시간; 약 20 시간; 약 21 시간; 약 22 시간; 약 23 시간; 약 24 시간; 약 25 시간; 약 26 시간; 약 27 시간; 약 28 시간; 약 29 시간; 약 30 시간; 약 31 시간; 약 32 시간; 약 33 시간; 약 34 시간; 약 35 시간; 약 36 시간; 약 37 시간; 약 38 시간; 약 39 시간; 약 40 시간; 약 41 시간; 약 42 시간; 약 43 시간; 약 44 시간; 약 45 시간; 약 46 시간; 약 47 시간; 또는 약 48 시간이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 12-24 시간, 12-48 시간, 또는 14-16 시간 동안 적어도 하나의 사이토카인에 대한 노출에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 16-20 시간 동안 적어도 하나의 사이토카인에 대한 노출에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 16 시간 동안 적어도 하나의 사이토카인에 대한 노출에 의해 활성화된다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 1-20 ng/mL IL-12, 1-50 ng/mL IL-15 및 10-100 ng/mL IL-18에 대한 12-24 시간 또는 14-16 시간 동안의 노출에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 10 ng/mL IL-12, 1 ng/mL IL-15 및 50 ng/mL IL-18에 대한 12-24 시간 또는 14-16 시간 동안의 노출에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 10 ng/mL IL-12, 50 ng/mL IL-15 및 50 ng/mL IL-18에 대한 12-24 시간, 16-20 시간, 또는 14-16 시간 동안의 노출에 의해 활성화된다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 IL-15와 함께 시험관내에서 유지된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 1 ng/mL의 IL-15와 함께 시험관내에서 유지된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 매일, 2 일마다, 3 일마다, 4 일마다, 또는 5 일마다 IL-15와 접촉된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 2 일마다 IL-15와 접촉된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 3 일마다 IL-15와 접촉된다.
일부 실시양태에서, NK 세포는 NK 세포를 적어도 하나의 사이토카인을 발현하는 세포와 공동-배양함으로써 활성화된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 NK 세포와 수지상 세포 및 대식세포 중 하나 이상의 공동-배양에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 NK 세포와 수지상 세포의 공동-배양에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포는 NK 세포와 공동-배양될 때, ML NK 세포를 생산하기에 충분한 IL-12, IL-15, 및 IL-18 중 어느 하나 이상을 분비한다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 NK 세포와 대식세포의 공동-배양에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 대식세포는 NK 세포와 공동-배양될 때, ML NK 세포를 생산하기에 충분한 IL-12, IL-15, 및 IL-18 중 어느 하나 이상을 분비한다.
예시적인 기억-유사 NK 세포
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 표현형 및 적어도 하나의 기능적 특징을 포함한다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이고, 대조군 NK 세포에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산한다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이고, (i) 대조군 NK 세포에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고, (ii) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 ADCC 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이고, (i) 대조군 NK 세포에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고, (ii) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 항-종양 효능을 갖는다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이고, (i) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 항-종양 효능을 갖고, (ii) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 ADCC 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이고, (i) 대조군 NK 세포에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (ii) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 ADCC 활성을 갖고; (iii) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 항-종양 효능을 갖는다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 대조군 NK 세포에 대해 CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산한다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iii) 향상된 ADCC 활성을 가지며, (i)-(iii)은 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iii) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(iii)은 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) 향상된 ADCC 활성을 갖고; (iii) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(iii)은 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 이의 집단은 (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iii) 향상된 ADCC 활성을 갖고; (iv) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(iv)는 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) CD16 및/또는 CD11lb의 감소된 발현을 갖고; (iii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하며, (i)-(iii)은 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) CD16 및/또는 CD11lb의 감소된 발현을 갖고; (iii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iv) 향상된 ADCC 활성을 가지며, (i)-(iv)는 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) CD16 및/또는 CD11lb의 감소된 발현을 갖고; (iii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iv) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(iv)는 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) CD16 및/또는 CD11lb의 감소된 발현을 갖고; (iii) 향상된 ADCC 활성을 갖고; (iv) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(iv)는 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 이의 집단은 (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) CD16 및/또는 CD11lb의 감소된 발현을 갖고; (iii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iv) 향상된 ADCC 활성을 갖고; (v) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(v)는 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 이의 집단은 (i) CD56bright, CD16low/-, NKG2A+, KIRs-, CD57이고; (ii) 고도로 증식성이고; (iii) 덜 성숙하고; (iv) ASCT2의 증가된 발현을 가지며, (i)-(iv)는 CD56dim, CD16+, NKG2A+/-, KIRs-, CD57-; CD56dim, CD16+, NKG2A+/-, KIRs+, CD57-; 또는 CD56dim, CD16+, NKG2A+/-, KIRs+, CD57+인 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위한 방법
본 발명의 양태는 세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 ASCT2+ 세포를 후보 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함한다. 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 사이토카인으로 활성화되었다. 일부 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 ASCT2+ 세포를 후보 폴리펩티드를 코딩하는 비비 외피(BaEV) 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다.
ASCT1(SLC1A4에 의해 코딩됨)(ASCT1(인간, 유전자 명칭 SLC1A4, 유전자 ID: 6509) 및 ASCT2(SLC1A5에 의해 코딩됨)(ASCT2(인간), 유전자 명칭 SLC1A5, 유전자 ID: 6510)를 포함하는 알라닌/세린/시스테인 수송체는 Ala, Ser, Cys 및 Thr과 같은 작은 중성 아미노산의 나트륨-의존적 교환을 매개한다. 이들의 구조는 글루타메이트 수송체의 것과 유사할 것으로 예측된다. 예를 들어, 알라닌/세린/시스테인-선호 수송체 2(ASCT2)는 세포외 및 세포내 아미노산 풀의 조절에서 역할을 하는 것으로 나타나는 편재적으로 발현되는, 광범위한 특이성의, 나트륨-의존적 중성 아미노산 교환기이다. 생리학적 조건 하에서, ASCT2는 체내에 편재하여 분포된다.
ASCT2는 암에 연루되어 있다. 예를 들어, ASCT2의 과잉발현은 MYC와 같은 종양유전자에 의해 구동되고, 전립선, 폐, 유방, 신장, 위장관 및 간, 여성 생식관, 및 신경계의 암에서 관찰되었다.
본원에 기재된 바와 같이, ASCT2의 발현 수준은 일차 종래의 NK 세포에서 풍부하고, 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포에서 추가로 향상된다. ASCT2는 비비 외피 당단백질 BaEV-gp의 수용체이며, 일차 NK 세포 및 CIML NK 세포와 같은 NK 세포의 비효율적인 형질도입이 비종래의 BaEV 위형화된 렌티바이러스를 이용하여 극복될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, ASCT2(즉, ASCT2+ 세포)의 존재 또는 수준은 BaEV-렌티바이러스 벡터에 의한 형질도입에 대해 더욱 수용성인 세포를 야기한다.
일부 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 ASCT2의 존재 또는 부재 또는 이의 발현을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, ASCT2의 존재 또는 부재 또는 이의 발현은 당업계에 알려진 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 면역분석을 수행하기 위한 절차는 예를 들어, "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; 및 "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 대조군 세포에 대해 ASCT2 단백질을 코딩하는 유전자의 증가된 발현, 또는 ASCT2 단백질의 증가된 수준을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, ASCT2+ 세포는 대조군 세포에 대해 ASCT2의 증가된 발현 또는 단백질 수준을 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "대조군" 또는 "대조군 세포"는 ASCT2 발현 또는 수준과 같은 세포의 유전자형 또는 표현형에서의 변화를 측정하기 위한 기준점을 제공하는 세포를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 대조군 세포는 야생형 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 대조군 세포는 ASCT2-/- 세포와 같은 유전자 변형된 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 대조군 세포는 미성숙 세포 또는 성숙 세포를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 대조군 세포는 비활성화된 NK 세포일 수 있다.
대조군 세포에 대해 증가된 ASCT2 수준과 같은 "대조군과 비교하여 변화된" 샘플 또는 세포는 정상, 미처리 또는 비정상 상태 대조군 샘플로부터의 샘플과 통계적으로 상이한 수준에서 검출될 분석물 또는 진단 또는 치료 표시기(예를 들어, 마커, 예컨대 ASCT2)의 수준을 갖는 것을 지칭할 수 있다. 통계적 유의성, 예를 들어 양성 또는 음성 결과를 구성하는 평균으로부터의 표준 편차의 수의 결정은 통상의 기술자의 능력 내에 있다.
일부 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 대조군 세포의 것에 비해 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100% 큰 발현 또는 단백질 수준을 갖는다.
실시양태에서, ASCT2+ 세포는 ASCT2를 코딩하는 유전자의 발현 또는 임계 초과의 ASCT2의 수준을 특징으로 할 수 있다. 용어 "임계", 예를 들어 ASCT2 임계는 ASCT2에 상응하는 폴리펩티드와 같은 바이오마커에 대한 공여체 세포와 같은 복수의 생물학적 샘플로부터 유래된 값을 지칭할 수 있고, 임계 초과는 증가된 형질주입 효율과 같은 효과와 연관된다.
실시 양태에서, ASCT2+ 세포는 NK 세포이다. "NK 세포"는 선천성 또는 비-종래의 면역과 연관된 림프구의 하위집단을 지칭할 수 있다. NK 세포는 몇몇 특징 및 생물학적 특성, 예를 들어 인간 NK 세포 상의 CD56 및/또는 CD16을 포함하는 특이적 표면 항원의 발현, 세포 표면 상의 알파/베타 또는 감마/델타 TCR 복합체의 부재, 세포의 활성화에 의해 "자가" MHC/HLA 항원을 발현하지 않는 세포에 결합하여 세포를 사멸시키는 능력, NK 활성화 수용체에 대한 리간드를 발현하는 종양 또는 다른 질환에 걸린 세포를 사멸시키는 능력, 자극 또는 억제하는 사이토카인으로 지칭되는 단백질 분자를 방출하는 ("NK 세포 활성")을 특징으로 할 수 있다. NK 세포의 임의의 하위집단은 또한 용어 NK 세포에 포함된다.
NK 세포의 핵심 기능은 바이러스-감염된 세포를 사멸시키는 것, 인간 생식에 대한 기여(임신 탈락막에서의 우성 림프구), 항-종양 반응을 나타내는 것을 포함한다. 예를 들어, 종단 연구는 낮은 NK 세포 활성과 암의 증가된 위험을 상관시켰다. 또한, 암 환자는 보통 결함적 NK 세포 수 및/또는 기능을 갖는다.
NK 세포는 사전 감작 없이 암 표적 세포(예를 들어, 백혈병 모세포)를 사멸시킬 수 있다. 핵심 매개체는 예를 들어, Fc 수용체(CD16a)를 통한 ADCC(리툭시맙, 세툭시맙 등)를 포함한다. 실시양태에서, 세포는 일차 NK 세포와 같은 일차 세포일 수 있다. 예를 들어, 일차 NK 세포는, 예컨대 자기 표지화, 또는 비-NK 세포(즉, T 세포, B 세포, 줄기 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 및 적혈구) 고갈을 포함하는 당업계에 알려진 방법에 의해 PBMC로부터 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 마우스 일차 NK 세포이다. 이러한 세포는 약 20%의 형질도입 비율을 가지며, 따라서 인간 세포에 비해 더욱 더 형질도입에 대해 저항성일 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 실시양태는 트랜스제닉(transgenic) 마우스 모델을 생성하지 않고 그외의 어려운 연구들에 대한 기회를 제공한다.
일부 실시양태에서, 세포는 사이토카인 유도된 기억-유사(CIML) NK 세포일 수 있다. CIML NK 세포는 광범위한 증식 및 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포로의 분화를 야기하는 사이토카인으로 예비-활성화된 NK 세포를 지칭할 수 있다. 예를 들어, Romee, Rizwan, et al. "Cytokine activation induces human memory-like NK cells." Blood 120.24 (2012): 4751-4760을 참고한다. 예를 들어, 휴지 NK 세포는 IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, 또는 이의 임의의 조합과 같은 사이토카인으로 활성화된다. 도 1을 참고하면, 예를 들어 나이브 NK 세포는 IL-12, IL-18 및 선택적으로, IL-15로 예비-활성화되어, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포를 생산한다. 실시양태에서, CIML NK 세포는 활성화되지 않은 세포와 같은 대조군 세포에 대해 향상된 IFN-γ 생산에 의해 확인될 수 있다. 기억-유사 NK 세포의 다른 적합한 바이오마커는, 비제한적으로, CD94, NKG2A, NKG2C, CD69, 및 NKp46을 포함한다.
일 실시양태에서, NK 세포(예를 들어, 사이토카인 유도된 기억-유사(CIML) NK 세포, 휴지 NK 세포, 나이브 NK 세포)는 인터류킨-12 패밀리의 사이토카인으로 예비-활성화될 수 있다. 인터류킨-12 패밀리의 멤버는 예를 들어, 이종이량체 사이토카인 IL-12(서브유닛 IL-12A(p35) 및 IL-12B(p40)를 포함함), IL-23(서브유닛 IL-12B(p40) 및 IL-23 p19를 포함함), IL-27(서브유닛 EBI3 및 IL-27 p28을 포함함), 및 IL-35(서브유닛 EBI3 및 IL-12A(p35)를 포함함)를 포함한다. EBI3은 IL-12 p40에 대한 상동체이다. 이론에 구애됨 없이, NK 세포(예를 들어, 사이토카인 유도된 기억-유사(CIML) NK 세포, 휴지 NK 세포, 나이브 NK 세포)는 IL-12B(p40) 서브유닛 또는 이의 상동체(예컨대, EBI3)로 예비-활성화될 수 있다. 또한, Sun et al., Cytokine. 2015 Oct; 75(2): 249-255를 참고하며, 이는 그 전체가 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포, 예컨대 포유동물 NK 세포이다. 용어 "포유동물 세포"는 포유동물로부터의 세포를 지칭할 수 있다. 실시 양태에서, 세포는 인간 NK 세포와 같은 인간 세포인 한편, 다른 실시양태에서, 세포는 가축, 실험실 동물, 가축, 또는 반려 동물(예를 들어, 설치류, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 말, 토끼 등)로부터 얻어진다. 본 발명은 임의의 특정 종으로부터의 세포로 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 이는 본 발명이 임의의 유형의 포유동물 세포와 함께 사용되기 때문이다. 본 발명은 또한 임의의 유형의 동물로부터 얻어진 정상 세포, 암성 세포, 전-암성 세포, 건강한 세포, 질환에 걸린 세포, 바이러스-감염된 세포, 상이한 조직으로부터의 세포, 성인 및 태아 세포와 같은 상이한 발달 단계에서의 세포 등과 함께 사용된다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 임의의 유형의 동물로부터 얻어진 자연 발생 돌연변이체 세포, 녹아웃 기술, 삽입, 결실, 또는 치환을 사용하여 유전자 조작된 돌연변이체 세포, 화학적으로-유도된 돌연변이체 세포, 방사선-유도된 돌연변이체 세포 등을 포함하는 돌연변이체 세포와 함께 사용된다. 본 발명은 또한 임의의 유형의 동물로부터의 일차 배양된 세포, 세포주 세포, 및 바이러스, 세균, 원생동물, 진균과 같은 병원체로 감염된 세포 등과 함께 사용된다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 양태는 세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 방법은 적어도 하나의 ASCT2+ 세포를 표적 유전자를 코딩하는 벡터를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시양태에서, 방법은 ASCT2+ 세포를 얻거나, 단리시키거나, 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 ASCT2- 세포를 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 IL-12, IL-18, 및/또는 IL-15와 함께 배양(또는 활성화)함으로써 제공될 수 있다. 세포를 "배양하는 단계"는 세포의 생존 및/또는 성장 및/또는 증식에 적합한 조건 하에 세포를 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 지칭한다. 도 1을 참고하면, 예를 들어 나이브 NK 세포는, 하나 이상의 사이토카인과 함께 배양되고 이에 의해 예비-활성화 된 후, ASCT2+ 세포인 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포로 분화되는 ASCT- 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 일정 기간 동안 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 사이토카인으로 예비-활성화 전, 동안, 또는 후에 배양될 수 있다. 예를 들어, IL-12, IL-18, 및/또는 IL-15를 이용한 예비-활성화 후에, 세포는 IL-15와 함께 일정 기간 동안 배양될 수 있다. 다른 예로서, 세포는 형질도입 전, 동안, 또는 후에 배양될 수 있다.
따라서, 실시양태는 ASCT2+ 세포, 예컨대 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포를 얻거나, 단리시키거나, 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, ASCT2의 발현 수준은 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포에서 향상되고, 따라서 ASCT2의 발현 수준 또는 단백질 수준은 ASCT2+ 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다. ASCT2는 비비 외피 당단백질 BaEV-gp의 수용체이며, 이는 NK 세포, 예컨대 CIML NK 세포의 비효율적인 형질도입이 비종래의 BaEV 위형화된 렌티바이러스를 이용하여 극복될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, ASCT2(즉, ASCT2+ 세포)의 존재 또는 수준은 BaEV-렌티바이러스 벡터에 의한 형질도입에 대해 더욱 수용성인 세포를 야기한다.
후보 폴리펩티드
세포 성장, 증식, 및 사멸을 제어하는 종양-특이적 항원은 세포내일 수 있다. 세포내 단백질의 인식은 HLA 분자에 의해 제시되는 항원 펩티드를 인식하는 능력을 요구한다. 보통 NK 세포는 HLA 분자에 의해 제시되는 네오에피토프를 포함하는 에피토프를 인식하는 방법이 없다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이, 유전자-조작된 NK 세포는 세포내 항원을 표적화할 수 있다. 예를 들어, T 세포 수용체(TCR)-유사/모방체 항체로 지칭되는 특정 그룹의 항체는 이들 세포내 항원을 표적화한다. 세포내 종양-특이적 항원은 주조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 시그널링 경로를 통과할 수 있고 종양 세포 표면 상에 종양-특이적 펩티드/MHC 복합체로서 존재할 수 있다. TCR-유사 항체는 진정한 TCR과 동일한 방식으로 종양 세포 표면 상의 펩티드/MHC 복합체를 인식한다. T 세포의 표면 상에 발현된 TCR에 의한 펩티드/MHC 복합체의 인식은 T 세포 증식 및 분화 및 사이토카인 또는 케모카인 분비와 같은 다양한 효과를 촉발시킬 수 있다. 그러나, TCR-유사 항체에 의한 펩티드/MHC 복합체의 인식은 T 세포에서 TCR의 것에 비해 매우 넓은 약리학적 경로를 촉발시킬 수 있다. TCR-유사 항체는 ADCC, CDC, 항체-의존적 세포 식세포작용(ADCP), 또는 아폽토시스의 직접 유도를 촉발시킬 수 있다. 이러한 항체 표적은, 비제한적으로, MAGE1, GP100, hTERT, MUC1, NY-ESO-1, FLT3, TP53, 스플라이소좀 인자, MAGE3, hCGβ, Her2/Neu, Melan-A/MART-1, TARP, p53, 티로시나아제, p68, MIF, 프로티나아제 3, WT1, HA-1H, 및 PRAME를 포함한다. 예를 들어, He, Qinghua, et al. "TCR-like antibodies in cancer immunotherapy." Journal of hematology & oncology 12.1 (2019): 99를 참고한다.
뉴클레오포스민 1(NPM1)은 리보솜 조립/수송, 세포질/핵 이동(trafficking), DNA 중합효소 알파 활성의 조절, 중심체 복제, 및 p53의 조절에 관여하는 인단백질이다. NPM1은 인간에서 NPM1 유전자에 의해 코딩되고, 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 세포내 표적이다. 세포질로의 국소화를 야기하는 NPM1에서의 돌연변이는 돌연변이체 단백질 세포질 뉴클레오포스민 1(NPM1c)로 지칭될 수 있다. NPM1c는 이의 C-말단에 핵외 수송 신호(NES)를 함유한다.
일부 실시양태에서, 후보 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체(또는 CAR)를 포함한다. "키메라 항원 수용체"는 종양 세포에 의해 발현되는 항원을 인식하고 이와 결합하도록 조작된 인공 면역 세포 수용체를 지칭할 수 있다. CAR은 면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포를 위해 설계될 수 있으며, T 세포 수용체(TcR) 복합체의 것과 같은 시그널링 도메인 및 항원 인식 도메인(예를 들어, 항체의 단일쇄 단편(scFv))의 키메라일 수 있다(Enblad Et al., Human Gene Therapy., 2015, 26 (8): 498-505).
따라서, CAR은 항체 또는 이의 단편의 특이성을 NK 세포 또는 T 세포 상에 이식하기 위해 사용될 수 있으며, 이의 코딩 서열의 전달은 레트로바이러스 벡터에 의해 용이해진다. 이들 수용체는 키메라로 지칭되며, 이는 이들이 다른 기원의 부분들로 구성되기 때문이다. 표적 세포, 예를 들어 암 세포와 마주칠 시, CAR NK 세포는 예를 들어, 세포 증식의 일반 자극, 세포가 다른 살아있는 세포에 독성인 정도(즉, 세포독성)를 증가시키는 단계, 및 유기체 내의 다른 세포에 대해 영향을 갖는, 면역계에서 세포에 의해 분비되는 인자의 생산을 증가시키는 단계의 메커니즘에 의해 암 세포를 파괴한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 예컨대 BaEV-LV는 관심 유전자(즉, 후보 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 유전자)를 발현한다. 본원에 사용된 바와 같이, 후보 폴리펩티드는 ASCT2+ 세포 상에서 또는 세포 내에서 발현이 요구되는 임의의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 후보 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편, 독소, 호르몬, 성장 인자, 수용체, 또는 시그널링 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 후보 폴리펩티드 또는 이종 폴리펩티드는 본원에 기재된 CAR이다. 적합한 후보 폴리펩티드는 항체 및 이의 단편을 포함하고, 이의 비제한적인 예는 면역 체크포인트 항체(즉, 면역 체크포인트 억제제)를 포함한다. 이러한 항체 표적은, 비제한적으로, 4-1BB 리간드, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD27, CD28, CD30, CD40, IDO, LIGHT, Nectin 2, OX40, CD70, CD80, CD86, CD96, CD137, CD153, CD154, CD155, CD223, OX40L, PD-1, PD-L1, TIGIT, CD226, CD273, CD357, CTLA-4, DR3, Galectin 9, GITRL, ICOS, ICOSLG, TIM3, TL1A, TNFRSF14, 및 VISTA를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질도입" 또는 "세포 형질도입"은 DNA 또는 RNA 바이러스를 사용하여 핵산(들)을 세포 내로 전달하는 과정을 지칭할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 실시양태는 종래의 렌티바이러스 형질도입 접근법에 대해 형질도입 효율을 개선하거나 증가시킬 수 있다. "형질도입 효율 증가 " 또는 "형질도입 효율 개선"은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 원형질막을 가로질러 세포내로 전달되는 표적 세포(예를 들어, ASCT2+ CIML NK 세포)의 집단의 백분율 또는 비율을 개선하는 위형화된 렌티바이러스 벡터의 능력을 지칭할 수 있다. 면역형광 현미경법, 유세포 분석, 및 다른 적합한 방법이 형질도입 효율을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 예를 들어, 면역형광 현미경법, 유세포 분석, FACS, 및 다른 적합한 방법에 의해 측정한 바와 같이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85%의 형질도입 효율을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 약 3 일 후 세포의 적어도 40%의 형질도입을 야기할 수 있다.
세포에서 형질도입 효율을 증가시키기 위한 예시적인 방법
양태에서, 본 발명은 세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 방법은 적어도 하나의 ASCT2+ 세포, 예를 들어 NK 세포를 후보 폴리펩티드를 코딩하는 비비 외피(BaEV) 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함한다. 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 인터류킨-12 패밀리 멤버 및 IL-18로 활성화되었다. 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 IL-12, IL-18, 및 IL-15로 활성화되었다. 실시 양태에서, 방법은 NK 세포를 얻거나, 단리시키거나, 확인하는 단계 및 NK 세포, 예컨대 ASCT2- 세포를 인터류킨-12 패밀리 멤버 및 IL-18 및 선택적으로, IL-15로 활성화시키는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 인터류킨-12 패밀리 멤버는 IL-12, IL-23, IL-27, 또는 IL-35를 포함한다. 추가 실시양태에서, NK 세포를 활성화시키는 단계는 ASCT2+ 세포를 생산한다. 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포이다. 추가 실시양태에서, 방법은 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포를 얻거나, 단리시키거나, 확인하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, ASCT2+의 발현 또는 수준은 대조군 세포에 대해 증가된다. 추가 실시양태에서, 대조군 세포는 비활성화된 NK 세포이다. 실시양태에서, 대조군 세포는 성숙 NK 세포이다. 실시양태에서, ASCT2 발현은 대조군 세포에 대해 ASCT2+ 세포에서 약 20% 내지 약 30% 증가된다. 실시양태에서, ASCT2의 존재 또는 수준은 BaEV 렌티바이러스 벡터에 의한 형질도입에 대해 더욱 수용성인 세포를 야기한다. 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상으로 활성화되었다. 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 포유동물 세포이다. 추가 실시양태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 추가 실시양태에서, 인간 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리된다/되었다. 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 비비 외피 당단백질(BaEV-gp)로 위형화된다. 실시양태에서, 적어도 하나의 ASCT2+ 세포의 적어도 40%는 약 3 일 후 형질도입된다. 실시양태에서, 형질도입 효율은 종래의 렌티바이러스 형질도입 접근법에 대해 개선된다. 실시양태에서, 후보 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편, 독소, 호르몬, 성장 인자, 수용체, 또는 시그널링 분자, 또는 이의 키메라 항원 수용체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 단편은 체크포인트 억제제에 대해 특이적이다. 추가 실시양태에서, 항체는 항-T-세포 수용체 항체 또는 T-세포 수용체-유사 항체이다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편은 NPM1, NPM1c, MAGE1, GP100, hTERT, MUC1, NY-ESO-1, FLT1, TP53, 스플라이소좀 인자, MAGE3, hCHβ, Her2/Neu, Melan-A/MART-1, TARP, p53, 티로시나아제, p68, MIF, 프로티나아제 3, WT1, HA-1H, 또는 PRAME에 대해 특이적이다. 실시양태에서, 항체는 종양-특이적 세포내 단백질을 표적화한다. 추가 실시양태에서, 세포내 단백질은 NPM1c를 포함한다. 실시양태에서, 배양 배지는 12/15/15/21 및 IL-7을 포함한다.
본 발명의 양태는 또한 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생산된 세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 양태는 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 방법은 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 추가로, 본 발명의 양태는 유전자 조작된 세포를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 방법은 적어도 하나의 ASCT2+ 세포를 폴리펩티드를 코딩하는 비비 외피(BaEV) 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함한다. 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 인터류킨-12 패밀리 멤버 및 IL-18로 활성화되었다. 실시양태에서, 인터류킨-12 패밀리 멤버는 IL-12, IL-23, IL-27, 또는 IL-35를 포함한다.
본 발명의 양태는 또한 적어도 하나의 ASCT2+ 세포를 폴리펩티드를 코딩하는 비비 외피(BaEV) 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시킴으로써 생산된 유전자 조작된 세포에 관한 것이다. 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 인터류킨-12 패밀리 멤버 및 IL-18로 활성화되었다.
또한, 본 발명의 양태는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생산된 세포 또는 적어도 하나의 ASCT2+ 세포를 폴리펩티드를 코딩하는 비비 외피(BaEV) 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시킴으로써 생산된 유전자 조작된 세포를 포함하는 면역요법에 관한 것이다. 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 인터류킨-12 패밀리 멤버 및 IL-18로 활성화되었다.
또한, 본 발명의 양태는 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 방법은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생산된 세포 또는 적어도 하나의 ASCT2+ 세포를 폴리펩티드를 코딩하는 비비 외피(BaEV) 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시킴으로써 생산된 유전자 조작된 세포를 포함하는 면역요법을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, ASCT2+ 세포는 인터류킨-12 패밀리 멤버 및 IL-18로 활성화되었다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 다음의 설명으로부터 용이하게 명확해질 것이다.
사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포를 형질도입하는 방법
본원은 이종 폴리펩티드를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이종 폴리펩티드는 본원에 기재된 임의의 CAR 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 위형화된 렌티바이러스 벡터로 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을 형질도입하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 위형화된 렌티바이러스 벡터는 이종 당단백질, 예를 들어 상이한 외피 바이러스로부터의 당단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 위형화된 렌티바이러스 벡터는 당단백질에 의해 인식되는 수용체가 존재하거나 숙주 세포에 의해 발현되는지 여부에 기초하여 특정 숙주 세포를 인식하고 형질도입할 수 있다. 예를 들어, 표준 위형화된 렌티바이러스 벡터는 LDL 수용체에 결합하는 당단백질 VSV-G를 포함하며, 위형화된 렌티바이러스 벡터는 LDL 수용체를 발현하는 숙주 세포를 인식하고 형질도입한다. 이론에 구애됨 없이, LDL 수용체는 NK 세포(예를 들어, 종래의 NK 세포, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포) 상에서 열악하게 발현되어, VSV-G 당단백질을 포함하는 위형화된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 이들 세포에서 비효과적인 형질도입 효율을 야기한다.
따라서, 본 발명의 방법은 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을, 세포 상에 존재하는 수용체에 결합하는 이종 당단백질을 포함하는 위형화된 렌티바이러스 벡터로 형질도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포는 ASCT-2를 발현하고, 위형화된 렌티바이러스 벡터는 ASCT-2에 결합하는 당단백질을 포함한다. 이론에 구애됨 없이, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포 상에서 ASCT-2의 풍부한 발현은 ASCT-2에 결합하는 당단백질을 포함하는 위형화된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 이들 세포에서 효과적인 형질도입을 야기한다.
일부 실시양태에서, ASCT-2에 결합하는 당단백질은 ASCT-2에 대한 결합을 유지하는 BaEV 당단백질 또는 이의 변이체이다. 일부 실시양태에서, ASCT-2에 결합하는 당단백질은 서열번호 107과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ASCT-2에 결합하는 당단백질은 서열번호 107을 포함한다. 일부 실시양태에서, ASCT-2에 결합하는 당단백질은 서열번호 107로 구성된다.
일부 실시양태에서, ASCT-2에 결합하는 당단백질은 서열번호 108과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ASCT-2에 결합하는 당단백질은 서열번호 108에 의해 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ASCT-2에 결합하는 당단백질은 서열번호 108에 의해 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된다.
일부 실시양태에서, 집단은 ASCT-2를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 폴리펩티드를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을 생산하기 위한 방법은 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을 이종 폴리펩티드를 코딩하는 위형화된 렌티바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하며(예를 들어, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을 형질도입하기 위한 조건 하에), 위형화된 렌티바이러스 벡터는 ASCT-2(예를 들어, BaEV)에 결합하는 당단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 방법에 따라 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 대조군 NK 세포의 집단에 대해 본원에 기재된 하나 이상의 표현형 마커 및/또는 기능적 특징을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 일차 인간 NK 세포의 집단으로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포의 집단은 일차 인간 NK 세포의 동일하거나 상이한 집단으로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 본원에 기재된 방법에 따라 (예를 들어, 자가 또는 동종이계) iPSC, 제대혈, 또는 PBMC로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단 및 대조군 NK 세포의 집단은 동일한 일차 인간 NK 세포의 집단으로부터 얻어지며, 일차 인간 NK 세포의 집단은 본원에 기재된 방법에 따라 (예를 들어, 자가 또는 동종이계) iPSC, 제대혈, 또는 PBMC로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 일차 인간 NK 세포의 집단을 예비-활성화시킴으로써 얻어진다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 Romee R, et al. Blood. 2012;120(24) and/or Romee R, Sci. Transl. Med. 2016; 21:357ra123(본원에 참고로 포함됨)에 기재된 방법에 따라 얻어진다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 하나 이상의 사이토카인에 대한 일정 기간 동안의 노출에 의해 예비-활성화된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-12, IL15, IL18, 및 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 IL-12 및 IL-15; IL-12 및 IL-18; IL-18 및 IL-15; 또는 IL-12, IL-15, 및 IL-18에 대한 일정 기간 동안의 노출에 의해 예비-활성화된다.
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 일차 인간 NK 세포의 집단을 예비-활성화시킴으로써 얻어지며, 일차 인간 NK 세포의 집단은 일정 기간 동안 약 1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL의 농도 범위의 IL-12; 약 1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL의 농도 범위의 IL-15; 및 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도 범위의 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 일정 기간 동안 약 5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL의 농도 범위의 IL-12; 약 25 ng/mL 내지 약 75 ng/mL의 농도 범위의 IL-15; 및 약 25 ng/mL 내지 약 75 ng/mL의 농도 범위의 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 일정 기간 동안 약 5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL의 농도 범위의 IL-12; 및 약 25 ng/mL 내지 약 75 ng/mL의 농도 범위의 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 일정 기간 동안 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 ng/mL의 농도의 IL-12; 약 40, 45, 50, 55, 또는 60 ng/mL의 농도의 IL-15; 및 약 40, 45, 50, 55, 또는 60 ng/mL의 농도의 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 일정 기간 동안 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 ng/mL의 농도의 IL-12; 및 약 40, 45, 50, 55, 또는 60 ng/mL의 농도의 IL-18에 노출된다.
일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 8 내지 약 24 시간의 기간 동안 하나 이상의 사이토카인에 대한 노출에 의해 예비-활성화된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 12 내지 약 20 시간의 기간 동안 하나 이상의 사이토카인에 대한 노출에 의해 예비-활성화된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 12 내지 약 16 시간의 기간 동안 하나 이상의 사이토카인에 대한 노출에 의해 예비-활성화된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 16 내지 약 20 시간의 기간 동안 하나 이상의 사이토카인에 대한 노출에 의해 예비-활성화된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 14 내지 약 16 시간의 기간 동안 하나 이상의 사이토카인에 대한 노출에 의해 예비-활성화된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 시간의 기간 동안 하나 이상의 사이토카인에 대한 노출에 의해 예비-활성화된다.
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 일차 인간 NK 세포의 집단을 예비-활성화시킴으로써 얻어지며, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 8 시간 내지 약 24 시간의 기간 동안 IL-12, IL-15, 및 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 12 시간 내지 약 20 시간의 기간 동안 IL-12, IL-15, 및 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 12 내지 약 16 시간의 기간 동안 IL-12, IL-15, 및 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 16 시간 내지 약 20 시간의 기간 동안 IL-12, IL-15, 및 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 14 시간 내지 약 16 시간의 기간 동안 IL-12, IL-15, 및 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 시간의 기간 동안 IL-12, IL-15 및 IL-18에 노출된다.
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 일차 인간 NK 세포의 집단을 예비-활성화시킴으로써 얻어지며, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 8 시간 내지 약 24 시간의 기간 동안 IL-12 및 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 12 시간 내지 약 20 시간의 기간 동안 IL-12 및 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 12 내지 약 16 시간의 기간 동안 IL-12 및 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 16 시간 내지 약 20 시간의 기간 동안 IL-12 및 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 14 시간 내지 약 16 시간의 기간 동안 IL-12 및 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 시간의 기간 동안 IL-12 및 IL-18에 노출된다.
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 일차 인간 NK 세포의 집단을 예비-활성화시킴으로써 얻어지며, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 8 시간 내지 약 24 시간; 약 12 시간 내지 약 16 시간; 약 16 시간 내지 약 20 시간; 약 14 내지 약 16 시간; 또는 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 시간의 기간 동안 약 1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL의 농도 범위의 IL-12; 약 1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL의 농도 범위의 IL-15; 및 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도 범위의 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 8 시간 내지 약 24 시간; 약 12 시간 내지 약 16 시간; 약 16 시간 내지 약 20 시간; 약 14 내지 약 16 시간; 또는 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 시간의 기간 동안 약 5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL의 농도 범위의 IL-12; 약 25 ng/mL 내지 약 75 ng/mL의 농도 범위의 IL-15; 및 약 25 ng/mL 내지 약 75 ng/mL의 농도 범위의 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 8 시간 내지 약 24 시간; 약 12 시간 내지 약 16 시간; 약 16 시간 내지 약 20 시간; 약 14 내지 약 16 시간; 또는 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 시간의 기간 동안 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 ng/mL의 농도의 IL-12; 약 40, 45, 50, 55, 또는 60 ng/mL의 농도의 IL-15; 및 약 40, 45, 50, 55, 또는 60 ng/mL의 농도의 IL-18에 노출된다.
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 일차 인간 NK 세포의 집단을 예비-활성화시킴으로써 얻어지며, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 8 시간 내지 약 24 시간; 약 12 시간 내지 약 16 시간; 약 16 시간 내지 약 20 시간; 약 14 내지 약 16 시간; 또는 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 시간 동안 약 1 ng/mL 내지 약 20 ng/mL의 농도 범위의 IL-12; 및 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도 범위의 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 8 시간 내지 약 24 시간; 약 12 시간 내지 약 16 시간; 약 16 시간 내지 약 20 시간; 약 14 내지 약 16 시간; 또는 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 시간의 기간 동안, 약 5 ng/mL 내지 약 15 ng/mL의 농도 범위의 IL-12; 및 약 25 ng/mL 내지 약 75 ng/mL의 농도 범위의 IL-18에 노출된다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 NK 세포의 집단은 약 8 시간 내지 약 24 시간; 약 12 시간 내지 약 16 시간; 약 16 시간 내지 약 20 시간; 약 14 내지 약 16 시간; 또는 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 시간의 기간 동안 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 ng/mL의 농도의 IL-12; 및 약 40, 45, 50, 55, 또는 60 ng/mL의 농도의 IL-18에 노출된다.
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 예비-활성화 후에 형질도입된다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 본원에 기재된 방법에 따른 형질도입 전에 일정 기간 동안 휴지된다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 휴지 동안 IL-15에 노출된다. 일부 실시양태에서, 휴지는 약 0.5 ng/mL 내지 10 ng/mL의 IL-15 농도에 대한 노출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 휴지는 약 0.5 ng/mL 내지 5 ng/mL의 IL-15 농도에 대한 노출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 휴지는 약 0.5 ng/mL 내지 2 ng/mL의 IL-15 농도에 대한 노출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 휴지는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 또는 2 ng/mL의 IL-15 농도에 대한 노출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 휴지는 형질도입 전에 약 12 내지 약 96 시간, 약 12 내지 약 72 시간, 약 12 시간 내지 약 48 시간, 약 12 시간 내지 약 24 시간, 약 24 시간 내지 약 72 시간, 또는 약 24 시간 내지 약 48 시간의 기간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포의 집단은 IL-15 단독에 대한 일정 기간 동안의 일차 인간 NK 세포의 노출에 의해 얻어진다. 일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포의 집단은, 선택적으로 약 8 내지 약 24 시간, 약 16 내지 약 20 시간, 약 12 내지 약 16 시간, 약 14 내지 약 16 시간, 또는 약 16 시간의 기간 동안 약 40, 45, 50, 55, 또는 60 ng/mL의 농도의 IL-15에 대한 일차 인간 NK 세포의 노출에 의해 얻어진다. 일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포의 집단은 IL-15에 대한 노출에 의해 유지된다. 일부 실시양태에서, 대조군 NK 세포의 집단은 약 12 내지 약 96 시간, 약 12 내지 약 72 시간, 약 12 시간 내지 약 48 시간, 약 12 시간 내지 약 24 시간, 약 24 시간 내지 약 72 시간, 또는 약 24 시간 내지 약 48 시간의 기간 동안 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 또는 2 ng/mL의 IL-15 농도에 대한 노출에 의해 유지된다.
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 본원에 추가로 기재된 바와 같이, NK 세포의 대조군 집단(예를 들어, IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 NK 세포의 대조군 집단)에 대해 하나 이상의 고유한 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 본원에 추가로 기재된 바와 같이, NK 세포의 대조군 집단(예를 들어, IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 NK 세포의 대조군 집단)에 대해 하나 이상의 고유한 기능적 특징을 갖는다.
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 NK 세포의 대조군 집단(예를 들어, IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 NK 세포의 대조군 집단)에 대해 증가된 ASCT-2 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 NK 세포의 대조군 집단에 대해 ASCT-2의 증가된 표면 발현을 갖는다. 표면 마커의 발현을 측정하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 유세포 분석, 영상화 질량분석법(예를 들어, CyTOF), 조직학, 및 현미경검사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 NK 세포의 대조군 집단에 대해 ASCT-2의 증가된 표면 발현을 가지며, 증가는 예를 들어 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이 적어도 1.1 배, 약 1.2 배, 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 1.6 배, 1.7 배, 1.8 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 3.5 배, 또는 4 배이다. 일부 실시양태에서, 증가는 약 1.5-3 배이다.
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 NK 세포의 대조군 집단에 대해 ASCT-2 RNA 전사체의 증가된 발현을 갖는다. RNA 발현을 정량화하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 정량적 PCR 및 RNA 서열분석을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단에서 ASCT-2 RNA 전사체의 발현은 기억-유사 NK 세포의 대조군 집단에 대해 적어도 약 1.1 배, 약 1.2 배, 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 1.6 배, 1.7 배, 1.8 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 3.5 배, 4 배, 4.5 배, 또는 5 배 증가된다. 일부 실시양태에서, ASCT-2 RNA 전사체의 발현은 약 2 배 내지 약 4 배 증가된다.
일부 실시양태에서, 이종 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 CAR)를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단은 ASCT-2를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단을, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 형질도입하기 위한 조건 하에 이종 폴리펩티드를 코딩하는 위형화된 렌티바이러스 벡터와 접촉시킴으로써 얻어지며, 위형화된 렌티바이러스 벡터는 ASCT-2(예를 들어, BaEV)에 결합하는 당단백질을 포함한다.
위형화된 렌티바이러스 벡터를 얻기 위한 방법은 당업계에 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 위형화된 렌티바이러스 벡터는 (i) 하나 이상의 렌티바이러스 패키징 플라스미드, 전달 플라스미드, 및/또는 외피 플라스미드를 표적 세포(예를 들어, A293T 세포) 내로 형질주입시키는 단계; (ii) 표적 세포를 거의 또는 완전 콘플루언스(confluence)로 성장시키는 단계; (iii) 세포 배양 배지를 수집하는 단계; 및 (iv) 위형화된 렌티바이러스 벡터를 수집하는 단계에 의해 생산된다. 일부 실시양태에서, 위형화된 렌티바이러스 벡터의 역가는 유세포 분석과 같은 당업계에 기재된 방법을 사용하여 결정된다.
일부 실시양태에서, 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사 NK의 집단은 집단을 형질도입하기에 충분한 역가의 위형화된 렌티바이러스 벡터(예를 들어, BaEV 렌티바이러스 벡터)와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사 NK의 집단은 약 5x103, 약 6x103, 약 7x103, 약 8x103, 약 9x103, 약 10x103, 약 11x103, 약 12x103, 약 13x103, 약 14x103, 또는 약 15x103인 위형화된 렌티바이러스 벡터(예를 들어, BaEV 렌티바이러스 벡터)의 감염 다중도(MOI)와 접촉된다. 일부 실시양태에서, 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사 NK의 집단은 약 1 시간 내지 약 5 시간, 선택적으로 약 1 시간 내지 약 1.5 시간의 기간 동안 위형화된 렌티바이러스 벡터(예를 들어, BaEV 렌티바이러스 벡터)와 접촉된다.
일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK의 집단을 이종 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드)를 코딩하는 위형화된 렌티바이러스 벡터(예를 들어, BaEV 렌티바이러스 벡터)와 접촉시키는 단계는 집단의 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%의 형질도입을 야기한다. 일부 실시양태에서, 형질도입은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 이종 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 및/또는 이종 폴리펩티드의 발현을 정량함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 형질도입은 당업계에 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 유세포 분석 또는 CyTOF에 의해 이종 폴리펩티드의 표면 발현을 정량화함으로써 측정된다.
일부 실시양태에서, 방법은 사이토카인-유도된 기억 유사 NK 세포의 집단을 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함한다.
사이토카인 발현 NK 세포
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 사이토카인을 발현하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 막-결합된 IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 막-결합된 IL-15 폴리펩티드는 이종 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 분비된 IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 서열번호 96에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 서열번호 96에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 서열번호 96에 기재된 아미노산 서열을 포함하고 이종 막관통 도메인에 작동가능하게 연결된 IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 서열번호 96에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 이종 막관통 도메인에 작동가능하게 연결된 IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 IL15Ra를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 (i) 자가-절단 펩티드 사용에 의한 IL15 및 IL15Ra의 공동-발현; (ii) IL15 및 IL5Ra의 융합 단백질; (iii) 절단된 IL15Ra의 세포내 도메인을 갖는 IL15/IL15Ra 융합 단백질; (iv) IL15 및 IL15Ra의 막 결합된 스시 도메인(Sushi domain)의 융합 단백질; (v) IL15 및 IL15R의 융합 단백질; (vi) ILI5R의 동종이량체; 및 (v) 막관통 도메인에 융합된 IL-15 폴리펩티드 중 적어도 하나를 발현하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 (i) 자가-절단 펩티드 사용에 의한 IL15 및 IL15Ra의 공동-발현; (ii) IL15 및 IL5Ra의 융합 단백질; (iii) 절단된 IL15Ra의 세포내 도메인을 갖는 IL15/IL15Ra 융합 단백질; (iv) IL15 및 IL15Ra의 막 결합된 스시 도메인의 융합 단백질; (v) IL15 및 IL15R의 융합 단백질; (vi) ILI5R의 동종이량체; (v) 막관통 도메인에 융합된 IL-15 폴리펩티드 중 적어도 하나를 발현하도록 조작되고, (i)-(v) 중 어느 하나는 별도 구축물에서 또는 바이-시스트론 구축물에서 CAR과 공동-발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 외인성 사이토카인 또는 수용체의 부분 또는 완전 펩티드는 본원에 제공된 세포에서 일시적으로 발현된다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 IL-15, 막-결합된 IL-15, 분비된 IL-15, 및 IL-15Ra 중 어느 하나 이상을 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 조작된 ML NK 세포는 본원에 기재된 임의의 IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작될 때, 증가된 세포 증식 및 생존을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 기억-유사 NK 세포는 IL-15 폴리펩티드를 발현하지 않는 기억-유사 NK 세포와 비교하여 증가된 세포 증식을 갖는다.
일부 실시양태에서, IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 기억-유사 NK 세포는 대조군 NK 세포와 비교하여 증가된 세포 증식을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-15 폴리펩티드를 발현하는 조작된 기억-유사 NK 세포는 IL-15 폴리펩티드를 발현하지 않는 종래의 NK 세포 또는 ML NK 세포에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 빠르게 증식한다. 일부 실시양태에서, 기억-유사 NK 세포는 본원에 기재된 임의의 IL15 폴리펩티드를 발현할 때, 종래의 NK 세포와 비교하여 증가된 세포 생존을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 ML NK 세포는 종래의 NK 세포에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 오래 생존한다.
예시적인 항-NPM1c CAR-발현 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 임의의 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하는 사이토카인-유도된 기억-유사 인간 NK 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 본원에 기재된 임의의 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질전환된다.
일부 실시양태에서, 본원은 (i) 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드, 및 (ii) 서열번호 96에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사 인간 NK 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원은 (i) 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드, 및 (ii) 서열번호 96에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 막-결합된 IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사 인간 NK 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원은 (i) 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드, 및 (ii) 서열번호 96에 기재된 아미노산 서열을 포함하고 이종 막관통 도메인에 융합된 IL-15 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사 인간 NK 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 항-NPM1c CAR ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이고, 대조군 NK 세포에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산한다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이고, (i) 대조군 NK 세포에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고, (ii) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 ADCC 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이고, (i) 대조군 NK 세포에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고, (ii) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 항-종양 효능을 갖는다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이고, (i) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 항-종양 효능을 갖고, (ii) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 ADCC 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+이고, (i) 대조군 NK 세포에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (ii) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 ADCC 활성을 갖고; (iii) 대조군 NK 세포에 대해 향상된 항-종양 효능을 갖는다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, 대조군 NK 세포에 대해 CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산한다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iii) 향상된 ADCC 활성을 가지며, (i)-(iii)은 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iii) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(iii)은 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) 향상된 ADCC 활성을 갖고; (iii) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(iii)은 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iii) 향상된 ADCC 활성을 갖고; (iv) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(iv)는 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) CD16 및/또는 CD11lb의 감소된 발현을 갖고; (iii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하며, (i)-(iii)은 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) CD16 및/또는 CD11lb의 감소된 발현을 갖고; (iii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iv) 향상된 ADCC 활성을 가지며, (i)-(iv)는 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) CD16 및/또는 CD11lb의 감소된 발현을 갖고; (iii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iv) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(iv)는 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) CD16 및/또는 CD11lb의 감소된 발현을 갖고; (iii) 향상된 ADCC 활성을 갖고; (iv) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(iv)는 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단은 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR 폴리펩티드를 발현하고, (i) CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D, CD25 또는 이의 임의의 조합의 증가된 발현을 갖고; (ii) CD16 및/또는 CD11lb의 감소된 발현을 갖고; (iii) 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 IFNγ를 생산하고; (iv) 향상된 ADCC 활성을 갖고; (v) 향상된 항-종양 효능을 가지며, (i)-(v)는 대조군 NK 세포에 대한 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 ML NK 세포는 말초 혈액, 제대혈, 또는 림프로부터 단리되거나 증식된 NK 세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 동종이계이다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 자가이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 ML NK 세포는 (본원에 기재된 CAR을 발현하기 위한 이의 변형 후에) 이들이 투여될 대상체에 대해 자가이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 ML NK 세포는 (본원에 기재된 CAR을 발현하기 위한 이의 변형 후에) 이들이 투여될 대상체에 대해 동종이계이다. 동종이계 ML NK 세포가 CAR-발현 면역 이펙터 세포를 제조하기 위해 사용되는 경우, 면역 이펙터 세포는 하나 이상의 면역억제제와 공동-투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, ML NK 세포는 질환 또는 병태(예컨대, 암, 예를 들어 AML)를 갖는 환자로부터 유래되고, 본원에 기재된 임의의 항원(예를 들어, 신생항원)에 대해 특이성을 갖는 적어도 하나의 CAR을 발현하도록 시험관내에서 유전자 변형된다. 예를 들어, 항원은 MHC 클래스 I 단백질에 의해 제시되는 암 신생항원(예컨대, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질 네오에피토프를 포함하는 항원, 예를 들어 NPM1c:HLA-A2)일 수 있다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 단백질에 의해 제시되는 암 신생항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대한 특이성을 갖는 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 ML NK 세포는 그 다음에 환자에서 암(예를 들어, NPM1c-양성 암, 예를 들어 AML)을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포는 CAR에 대한 리간드 또는 항원의 특이적 결합에 의해 자극되거나 유도되고 동일한 환자의 질환 또는 병태의 치료에 유용한 적어도 하나의 이펙터 기능(예를 들어, 사이토카인의 유도)을 수행한다.
CAR을 포함하는 ML NK 세포의 자극(예를 들어, 암 신생항원에 대한 CAR의 세포외 도메인의 결합에 의함)은 CAR 세포의 하나 이상의 항암 활성의 활성화를 야기할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CAR ML NK 세포의 자극은 사이토카인의 분비를 포함하여 CAR 세포의 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성에서의 증가를 야기할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR 이펙터 세포(예를 들어, CAR-ML NK 세포)는 본원에 기재된 임의의 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 결합하는 CAR 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 유용한 CAR 분자를 포함하는 ML NK 세포는 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된(또는 이에 의해 제시된) NPM1c 네오에피토프, 예컨대 NPM1c:HLA-A2에 결합하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 유용한 CAR 분자(예를 들어, CAR-ML NK 세포)를 포함하는 면역 이펙터 세포는 NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다.
일부 실시양태에서, CAR 구축물은 기억-유사 자연 살해(ML NK) 세포에서 발현되거나 기능할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포는 CAR을 발현하지 않는 NK 세포와 비교하여 표적 세포에 대해 증가된 세포독성을 갖는다. 세포독성을 측정하기 위한 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 비제한적으로, 관심 표적 세포의 세포 수를 측정하는 것, 세포 사멸/생존력에 대한 마커, 및 발광을 측정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유세포 분석은 총 세포 수를 정량하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포는 Live/Dead Fixable 염색 키트를 사용하여 염색되고, 유세포 분석을 사용하여 정량화된다. 일부 실시양태에서, 세포독성은 루시페라아제-발현 표적 세포를 사용하여 측정된다. 이펙터 세포와 함께 배양될 때, 표적 세포 용해물의 발광은 세포 세포독성을 계산하기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)은 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, 하나 이상의 표현형 및/또는 기능성 마커의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, 증가된 발현을 갖는 하나 이상의 표현형 및/또는 기능성 마커는 (i) IFN감마; (ii) 그랜자임 B; (iii) CD25, CD69, ICOS, CD226, CD107a, 및 CD62L로부터 선택되는 하나 이상의 활성화 마커; (iv) NKp30, NKG2D, NKp44로부터 선택되는 하나 이상의 활성화 수용체; (vi) CD56 및 NKG2A로부터 선택되는 하나 이상의 성숙 마커; 및/또는 (viii) TIGIT로부터 선택되고, (i)-(viii)은 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)은 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대해 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, IFN-감마의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)은 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대해 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, 그랜자임 B의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)은 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대해 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, CD107a의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)은 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대해 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, TIGIT의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)은 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대해 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, 활성화 마커의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, 활성화 마커는 CD62L이다. 일부 실시양태에서, 활성화 마커는 CD25이다. 일부 실시양태에서, 활성화 마커는 CD69이다. 일부 실시예들에서, 활성화 마커는 ICOS이다. 일부 실시양태에서, 활성화 마커는 CD226이다. 일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)은 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, 활성화 수용체의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, 활성화 수용체는 NKG2D이다. 일부 실시양태에서, 활성화 수용체는 NKp30이다. 일부 실시양태에서, 활성화 수용체는 NKp44이다.
일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)은 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, 하나 이상의 표현형 및/또는 기능성 마커의 감소된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, 감소된 발현을 갖는 하나 이상의 표현형 및/또는 기능성 마커는 (i) CD57; 및/또는 (ii) TRAIL로부터 선택되고, (i)-(ii)는 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)은 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대해 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, TRAIL의 감소된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)은 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대해 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, CD57의 감소된 발현을 갖는다.
일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)는 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, (i) IFN감마의 증가된 발현; (ii) 그랜자임 B의 증가된 발현; (iii) CD25, CD107a, CD69, ICOS, CD226, 및 CD62L로부터 선택되는 하나 이상의 활성화 마커의 증가된 발현; (iv) NKp30, NKG2D, NKp44로부터 선택되는 하나 이상의 활성화 수용체의 증가된 발현; (v) CD56 및 NKG2A로부터 선택되는 하나 이상의 성숙 마커의 증가된 발현; (vi) CD57의 감소된 발현; (vii) TIGIT의 증가된 발현을 갖고/갖거나; (viii) TRAIL의 감소된 발현을 갖고; (i)-(vii)은 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)는 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대해 IFN감마의 증가된 발현 및 CD107a의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)는 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대해 IFN감마, CD107a, 및 그랜자임 B의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, CAR 발현 ML NK 세포(예를 들어, NPM1c:HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 CAR)는 CAR 항원 인식 도메인에 의해 표적화된 항원(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)을 발현하는 표적 세포와 접촉될 때, 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대해 IFN감마, CD107a, 그랜자임 B의 증가된 발현; 및 대조군 NK 세포(예를 들어, 비-CAR 발현 ML NK 세포)에 대해 TRAIL의 감소된 발현을 갖는다.
CAR-발현 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포를 제조하는 방법
본원은 본원에 기재된 임의의 CAR 폴리펩티드를 포함하는 본원에 기재된 임의의 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드 또는 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 통상의 기술자에게 알려진 임의의 방법을 사용하여 ML NK 세포 또는 상기 세포의 집단 내로 도입된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 전기천공, 형질주입, 또는 형질도입에 의해 세포 내로 도입된다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 형질도입을 통해 ML NK 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스는 형질도입을 통해 ML NK 세포 내로 도입된다.
당업계에 알려진 다양한 상이한 방법을 사용하여, 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터 중 임의의 것을 ML NK 세포 내에 도입할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 a CAR 발현 ML NK 세포를 생산하기 위한 방법은 (i) 말초 혈액, 제대혈 또는 림프로부터(예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)로부터) 세포를 얻는 단계, (ii) 선택적으로, 얻어진 세포를 정제하는 단계, (iii) 선택적으로, 세포를 증식시키는 단계, (iv) 세포를 활성화시켜(예를 들어, 사이토카인, 예컨대, 비제한적으로, IL-15, IL12, 및 IL-18을 이용함), 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포를 형성하는 단계, (v) 선택적으로, 활성화된 세포를 증식시키는 단계, (vi) 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 포함하는 발현 벡터로 세포를 형질도입시키는 단계, (vii) CAR을 발현하는 세포를 단리시키는 단계, 및 (viii) 선택적으로, 단리된 세포를 증식시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 ML NK 세포를 생산하기 위한 방법은 (i) 만능 줄기 세포(iPSC)를 얻는 단계, (ii) iPSC가 NK 세포로 분화되도록 유도하는 단계, (ii) NK 세포를 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포로 예비-활성화시키는 단계, (iii) 선택적으로, 활성화된 세포를 증식시키는 단계, (iv) 활성화된 세포를 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 포함하는 발현 벡터로 형질도입시키는 단계, (v) CAR을 발현하는 ML NK 세포를 단리시키는 단계, 및 (vi) 선택적으로, 단리된 세포를 증식시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 유전자 변형은 렌티바이러스를 사용하여 세포 내로 형질도입된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 CAR 폴리펩티드는 비비 레트로바이러스 외피 당단백질 변이체(BaEV-LV)를 사용하여 ML NK 세포 내로 형질도입된다. NK 세포는 BaEV 수용체, 알라닌, 세린, 시스테인 수송체 2(ASCT2)를 발현한다. 일부 실시양태에서, BaEV-LV 형질도입은 본원에 참고로 포함되는 Bari, R., et al. 2019 Frontiers in Immuno. Vol. 10, 2001에 기재된 바와 같이 수행된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 CAR 폴리펩티드는 수포성 구내염 바이러스 GP(VSV-G)-LV를 사용하여 ML NK 세포 내로 형질도입된다. NK 세포는 VSV-G 수용체 저밀도 지질단백질(LDL-R)을 발현한다. 일부 실시양태에서, VSV-G-LV 형질도입은 본원에 참고로 포함되는 
, H., et al. 2019 Mol Ther Methods Clin Dev. 15: 1-8에 기재된 바와 같이 수행된다. 일부 실시양태에서, BaEV의 당단백질은 VSV 당단백질을 대체한다. 일부 실시양태에서, VSV 게놈은 BaEV 당단백질을 발현한다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드는 CAR을 세포 내로 바이러스로 형질도입하기에 충분한 양의 시간 동안 IL-15의 존재 하에 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스)를 통해 사이토카인-유도된 ML NK 세포 내로 형질도입되어, CAR-발현 ML NK 세포를 야기한다. 일부 실시양태에서, CAR-발현 ML NK 세포를 형성하기에 충분한 양의 시간은 약 12 시간 내지 약 24 시간이다. 일부 태양에서, CAR을 ML NK 세포 내로 바이러스로 형질도입(CAR-발현 ML NK 세포를 형성)하기에 충분한 양의 시간은 적어도 약 1 시간; 약 2 시간; 약 3 시간; 약 4 시간; 약 5 시간; 약 6시간; 약 7시간; 약 8 시간; 약 9 시간; 약 10 시간; 약 11 시간; 약 12 시간; 약 13 시간; 약 14 시간; 약 15 시간; 약 16 시간; 약 17 시간; 약 18 시간; 약 19 시간; 약 20 시간; 약 21 시간; 약 22 시간; 약 23 시간; 약 24 시간; 약 25 시간; 약 26 시간; 약 27 시간; 약 28 시간; 약 29 시간; 약 30 시간; 약 31 시간; 약 32 시간; 약 33 시간; 약 34 시간; 약 35 시간; 약 36 시간; 약 37 시간; 약 38 시간; 약 39 시간; 약 40 시간; 약 41 시간; 약 42 시간; 약 43 시간; 약 44 시간; 약 45 시간; 약 46 시간; 약 47 시간; 또는 약 48 시간일 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질도입된 ML NK 세포는 벡터를 발현하고 CAR-발현 ML NK 세포를 형성하기에 충분한 양의 시간 동안 IL-15의 존재 하에 항온처리한다. 일부 실시양태에서, CAR-발현 ML NK 세포를 형성하기에 충분한 양의 시간은 약 3 일 내지 약 8 일이다. 일부 실시양태에서, ML NK 세포를 형성하기에 충분한 양의 시간은 적어도 약 1 일; 약 2 일; 약 3 일; 약 4 일; 약 5 일; 약 6 일; 약 7 일; 약 8 일; 약 9 일; 약 10 일; 약 11 일; 약 12 일; 약 13 일; 또는 약 14 일일 수 있다.
조성물
일부 양태에서, 본원은 본원에 개시된 임의의 항-NPM1c CAR 발현 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포, 또는 상기 세포의 집단을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 제공한다.
약학 조성물은 약학적 허용 담체를 포함할 수 있다. 비제한적으로, 부형제 및 안정제를 포함하는 적절한 약학적 허용 담체가 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA 참고).
약학 조성물은 바람직하게는 약학적-허용 담체(예를 들어, 인간 또는 본원에 고려되는 다른 대상체에 대한 투여에 적합한 하나 이상의 양립성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질) 내에 세포, 테더링(tethering) 수단(예를 들어, 지질 나노입자) 및/또는 단백질 또는 펩티드를 포함하는 멸균 조성물일 수 있다. 담체는 세포, 테더링 수단(예를 들어, 지질 나노입자) 및/또는 단백질 또는 펩티드가 투여를 용이하게 하기 위해 조합되는 천연 또는 합성인 유기 또는 무기 성분일 수 있다. 약학 조성물의 구성요소는 이의 소망하는 약학적 효율을 실질적으로 손상시킬 상호작용을 배제하는 방식으로 혼합된다.
약학적 허용 담체는, 비제한적으로, 완충제, 유화제, 현탁제, 분산제, 등장화제, 습윤제, 킬레이트제, 금속이온봉쇄제, pH 완충제, 용해도 향상제, 항미생물제, 마취제, 및/또는 항산화제를 포함할 수 있다.
약학 조성물을 제형화하기 위한 다양한 부형제 및 조성물을 제조하기 위한 기술이 당업계에 알려져 있다(그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006 참고). 임의의 통상적인 부형제 매질이, 예컨대 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 이와 달리 약학 조성물의 임의의 다른 구성요소(들)와 유해한 방식으로 상호작용함으로써 물질 또는 이의 유도체와 비양립성일 수 있는 경우를 제외하고, 종래의 부형제 매질의 사용은 본 발명의 범위 내에서 고려될 수 있다. 부형제는 예를 들어, 항부착제, 항산화제, 결합제, 코팅, 압축 보조제, 붕해제, 염료(색상), 연화제, 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅, 활택제(유동 향상제), 윤활제, 보존제, 인쇄 잉크, 흡수제, 현탁제 또는 분산제, 감미제, 및 수화수를 포함할 수 있다. 예시적인 부형제는, 비제한적으로, 염수, 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트(이염기성), 칼슘 스테아레이트, 크로스카멜로오스, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로오스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 락토오스, 수크로오스, 덱스트로오스, 마그네슘 스테아레이트, 맥아, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로오스, 메틸 파라벤, 미정질 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 에탄올, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 전분(예를 들어, 전호화 전분), 프로필렌, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 셸락, 실리카 겔, 이산화규소, 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 소듐 시트레이트, 소듐 스테아레이트, 소듐 스타치 글리콜레이트, 소르비톨, 전분(옥수수), 스테아르산, 탈크, 베이스 크림, 티타늄 디옥사이드, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 및 크실리톨을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 약학 조성물은 적어도 하나의 약학적 허용 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 약학적 허용 염의 예는, 비제한적으로, 산 첨가 염, 알칼리 또는 알칼리 토금속 염, 아민과 같은 염기성 잔기의 미네랄 또는 유기산 염; 카복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함한다. 대표적인 산 첨가 염은 아세테이트, 아세트산, 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤젠설폰산, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등 뿐 아니라, 비제한적으로, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하는 비독성 암모늄, 사차 암모늄, 및 아민 양이온을 포함한다.
약학 조성물은 이들이 대상체(예를 들어, 인간)에 대한 투여에 적합하도록 제형화될 수 있다. 약학 조성물은 임의의 투여 경로에 대해 제형화될 수 있다.
약학 조성물은 전신으로 이들을 전달하는 것이 바람직할 때, 주사에 의한, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 주사 전에 용액 또는 현탁액으로 제조하기에 적합한 액체 용액, 현탁액, 에멀션 또는 고체 형태로서 제조될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여량 형태, 예를 들어 앰플 또는 다중-용량 용기로 제시될 수 있다. 약학적 비경구 제형은 성분의 수용액을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 대안적으로, 성분의 현탁액은 오일-기반 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포솜을 포함한다. 비경구로 투여되는 경우, 적합한 약학적 허용 담체는, 비제한적으로, 생리식염수 또는 인산염 완충 염수(PBS), 또는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 글루코오스를 함유하는 용액을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 CAR-발현 세포 또는 상기 세포의 집단은 본원에 개시된 약학 조성물에서 치료적 유효량으로 사용되거나 존재할 수 있다. 치료적 유효량은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.
본원에 고려되는 약학적 허용 조성물은 본원에 기재된 CAR-발현 세포 또는 상기 세포의 집단과 함께, 추가 항암제(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 1, 2, 3 이상의 항암제)를 포함할 수 있다.
치료 방법 및 용도
대략 20,830 명의 AML의 새로운 사례가 진단되었고, 10,460 명의 사망자가 미국에서만 2015년에 이 질환에 기인하였다. 높은 연령은 AML에 대한 위험 인자이기 때문에, 고령화 집단은 질환 발생률이 증가할 수 있다. 종래의 화학요법 및 동종이계 줄기 세포 이식을 견딜 수 있는 환자는 완전한 반응을 달성할 수 있지만, 대다수는 재발을 겪고 질환으로 사망한다. 따라서, 본 발명자들의 발전하는 암 면역요법의 이해의 이점을 이용하는 덜 독성적이고 더욱 효과적인 표적화된 요법을 개발할 필요가 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 임의의 면역 이펙터 세포(예를 들어, ML NK 세포), 또는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료(예를 들어, 암 증식을 억제, 암 진행을 억제)하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 NPM1c-양성 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "NPM1c-양성 암"은 NPM1 유전자에서의 돌연변이(예를 들어, NPM1에서의 4 nt 중복 돌연변이)를 갖는 종양 세포를 포함하는 암을 지칭하며, NPM1에서의 돌연변이는 야생형 NPM1을 발현하는 세포와 비교하였을 때, NPM1 단백질의 증가된 세포질 국소화를 야기한다. 특정 유전자 돌연변이(예를 들어, NPM1에서의 4 nt 중복 돌연변이)의 존재를 결정하기 위해 암에서 유전자 발현을 측정하는 방법은 당업계에 알려져 있고, 대상체로부터 수집된 악성 종양 샘플(예를 들어, 혈액, 골수, 종양, 및/또는 조직 샘플)의 분석을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자에서 작은 복제, 삽입, 또는 결실을 검출하기 위한 방법은 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 액적 디지털 PCR, 생어 서열분석(Sanger sequencing), 및 차세대 서열분석(예를 들어, 전체-게놈 서열분석, 예를 들어 전체-진유전체 서열분석)을 사용하여 수행된다. 일부 양태에서, NPM1c-양성 암은 NPM1 유전자에서 돌연변이(예를 들어, 유전자의 엑손 12에서의 4 염기쌍 프레임시프트 삽입, 대안적 판독 프레임에서 C-말단 11 아미노산을 코딩하는 돌연변이, 또는 MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(서열번호 57)의 C-말단 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 발현을 야기하는 NPM1 돌연변이)를 갖는 것으로 검출된다. 일부 실시양태에서, NPM1c-양성 암은 NPM1 단백질의 증가된 세포질 국소화를 갖는 종양 세포를 포함한다. 예를 들어, 표지된 항-NPM1 항체를 사용하고 현미경 또는 유세포 분석에 의해 국소화를 평가하는, NPM1 세포 국소화를 평가하는 방법이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시양태에서, NPM1c-양성 암으로부터 단리된 종양 세포는 건강한 비-암성 조직 샘플로부터 단리된 세포와 비교하였을 때, NPM1 단백질의 증가된 세포질 국소화를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포, 상기 세포의 집단, 또는 본원에 기재된 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, NPM1c-양성 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 NPM1c-양성 암을 치료(예를 들어, 암의 증식 또는 진행을 억제)하기 위한 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 임의의 ML NK 세포, 상기 세포의 집단, 또는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, AML 치료를 필요로 하는 대상체에서 AML을 치료(예를 들어, AML의 증식 또는 진행을 억제)하는 것을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 NPM1c-양성 AML을 치료하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포, 상기 세포의 집단, 또는 약학 조성물은 암을 치료하기 위한 표적화된 면역요법의 개발에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포, 상기 세포의 집단, 또는 약학 조성물은 AML의 치료를 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포, 상기 세포의 집단, 또는 약학 조성물은 AML 세포를 사멸시키기 위한 세포독성제로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 HLA-A2를 코딩하는 대립유전자(즉, HLA-A*02:01 대립유전자)를 보유하는 대상체에서 NPM1c-양성 암(예를 들어, AML)을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, NPM1c-양성 암(예를 들어, AML)은 HLA-A2의 발현을 갖는 종양 세포를 포함한다. HLA 발현을 결정하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 유세포 분석, 면역조직화학, 및 HLA-A2를 인식하는 표지된 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 포함한다. HLA 발현은 또한 RT-PCR 및 RNA 서열분석에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 암(예를 들어, NPM1c-양성 암, 예를 들어 AML) 치료를 필요로 하는 대상체에서 암(예를 들어, NPM1c-양성 암, 예를 들어 AML)을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 암을 포함하는 세포의 세포 표면은 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 나타내고, 치료는 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포, 상기 세포의 집단, 또는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 암(예를 들어, NPM1c-양성 암, 예를 들어 AML) 치료를 필요로 하는 대상체에서 암(예를 들어, NPM1c-양성 암, 예를 들어 AML)을 치료하는 것을 제공하며, 암을 포함하는 세포의 세포 표면은 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2 또는 HLA-A*02 대립유전자 그룹에 의해 코딩되는 단백질, 예컨대 HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질)과 복합체화된 AIQDLCLAV(서열번호 1) 네오에피토프를 나타내고, 치료는 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 임의의 ML NK 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 임의의 ML NK 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암(예를 들어, 암은 NPM1c-양성이고, 예를 들어 암은 AML임)에 걸린 대상체에서 암 부담을 감소시키거나 생존을 증가시키는 것을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암을 포함하는 세포의 세포 표면은 MHC 클래스 I 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프(예를 들어, 서열번호 1)를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 임의의 ML NK 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 약학 조성물를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암으로부터 관해에 있는 대상체에서 암을 예방하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 암은 재발된 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 난치성 암이다. 일 실시예에서, 암은 후기 단계 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 하나 이상의 다른 요법(예를 들어, 화학요법, 방사선요법, 줄기 세포 이식, 또는 다른 면역요법)에 대해 저항성이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 임의의 ML NK 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, AML 예방을 필요로 하는 대상체에서 AML을 예방하는 것을 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 AML로부터 관해에 있는 대상체에서 AML을 예방하는 것을 제공한다.
일부 실시양태에서, 치료될 암은 AML이다. 일부 실시양태에서, 암은 재발된 AML이다. 일부 실시양태에서, 암은 난치성 AML이다. 일부 실시양태에서, 암은 후기 AML이다. 일부 실시양태에서, 암은 하나 이상의 다른 요법(예를 들어, 화학요법, 방사선요법, 줄기 세포 이식, 또는 다른 면역요법)에 대해 저항성인 AML이다.
본원에 기재된 임의의 요법의 효과성은 요법의 투여 전 및 후(예를 들어, 치료되는 대상체 또는 치료되는 암의 동물 모델에 대한 것) 파라미터(예를 들어, 종양 부담)를 평가함으로써 평가될 수 있다. 본원에 기재된 요법의 치료 효과성을 평가하기 위해 당업계에 알려진 임의의 분석이 사용될 수 있다.
투여의 방법
본원에 기재된 요법은, 비제한적으로, 비경구 투여 경로를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 비경구로 환자에 투여된다. 비경구 투여의 적합한 경로의 비제한적인 예는 정맥내, 근육내, 동맥내, 피하, 종양내, 경막내 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 복강내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 근육내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여는 정맥내, 경막내, 골내 또는 척수내이다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 척수 또는 척추관 내로 투여된다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 척추강내로 투여된다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 골내로 투여된다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 골수 내로 투여된다.
적절한 투여량은 치료되는 특정 암, 치료되는 대상체의 연령, 체중 및 신체 상태, 암의 중증도, 투여 경로, 치료 기간, 치료되는 대상체의 반응성, 동시 또는 병용 요법(있는 경우)의 성질, 특정 투여 경로 및 보건 종사자의 지식 및 전문성 내의 유사 인자에 따라 달라질 것이다. 특정 실시양태에서, 최대 내약 용량, 즉 건전한 의학적 판단에 따른 최고 안전한 용량이 사용되어야 한다. 바람직한 실시양태에서, 요법은 유효량으로 투여되어야 한다. 유효량은 의학적으로 바람직한 결과를 제공하기에 충분한 조성물의 투여량이다.
예를 들어, 대상체가 종양을 갖는 경우, 유효량은 종양 부피 또는 부하를 감소시키는 양일 수 있다(예를 들어, 종양을 영상화함으로써 결정되는 바와 같음). 유효량은 또한 혈액 또는 다른 체액 또는 조직에서 암 세포의 존재 및/또는 빈도에 의해 평가될 수 있다(예를 들어, 생검). 종양이 조직 또는 기관의 정상 기능에 영향을 준다면, 유효량은 조직 또는 기관의 정상 기능을 측정함으로써 평가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 조작된 ML NK 면역 이펙터 세포는 약 또는 적어도 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x10010, 5x10010, 1x1011, 또는 5x1011, 1x10112, 또는 5x1012 세포(또는 그 사이의 임의의 값 또는 범위)의 양으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 CAR ML NK 세포로 치료된 환자는 완전 관해를 경험한다. 일부 실시양태에서, 환자에게는 임의의 조작된 ML NK 세포가 0.5x106 세포/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 환자에게는 CAR-CIML NK 세포가 1.0x106 세포/kg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 환자에게는 CAR-CIML NK 세포가 10x106 세포/kg으로 투여된다.
일정 기간에 걸친 단일 투여 또는 다중 투여를 포함하여 본원에 기재된 요법의 다양한 투여 일정이 고려된다. 투여 방법은, 비제한적으로, 볼루스 투여 및 주입(예를 들어, 연속 또는 펄스 주입)을 포함한다.
본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 치료 식이요법은 주 2 회, 매주 1 회, 2 주마다 1 회, 3 주마다 1 회, 매월 또는 4 주마다 1 회, 6 주마다 1 회, 2 개월 또는 8 주마다 1 회, 또는 3 개월 또는 12 주마다 1 회의 요법의 투여를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 본원에 기재된 임의의 요법의 단일 용량을 받는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 본원에 기재된 임의의 요법의 적어도 2 회, 적어도 3 회, 적어도 4 회, 적어도 5 회, 적어도 6 회, 적어도 8 회, 또는 적어도 10 회 용량을 받는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 매일, 격일로, 또는 일주일에 2 회 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 일정 기간, 예컨대 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월 또는 1 년 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 초기 치료 기간(요법이 예를 들어, 1 회, 1 주에 2 회, 1 주에 1 회, 2 주에 2 회, 또는 1 개월에 1 회 투여되는 경우) 후에, 항체가 투여되지 않는 회피 기간(예를 들어, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월 또는 4 주, 6 주, 2 개월 또는 8 주, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 또는 1 년)가 이어진 다음에, 제2 치료 기간(요법이 예를 들어, 1 회, 1 주에 2 회, 1 주에 1 회, 2 주에 2 회, 또는 1 개월에 1 회 투여되는 경우)이 이어진다. 이러한 초기 치료 및 이러한 제2 치료 기간은, 예를 들어, 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 2 개월 또는 3 개월(초기 치료 기간은 제2 치료 기간과 동일하거나 상이할 수 있음) 지속될 수 있다.
환자 집단
본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는, 비제한적으로, 인간 및 비-인간 척추동물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 포유동물, 예컨대 가정용 애완동물(예를 들어, 개, 고양이, 토끼, 페럿 등), 가축 또는 농장 동물(예를 들어, 소, 돼지, 양, 염소, 돼지, 닭 또는 다른 가금류), 말(예를 들어, 순종 말), 원숭이, 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등) 등이다. 대상체는 또한 물고기 및 다른 수생 종을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 인간이다. 일 실시양태에서, 본 발명은 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료를 위한 표적화된 면역요법으로부터 이득을 얻을 가능성이 있는 임의의 대상체에서 실시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 NPM1c-양성 암(예를 들어, AML)을 갖는 대상체에 사용하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명의 치료 방법 및 용도는 본원에 기재된 임의의 면역요법으로부터 이득을 얻을 수 있는(또는 가능성이 있는) 암을 갖는(예를 들어, 암으로 진단된) 임의의 대상체에서 실시될 수 있다. 암(예를 들어, NPM1c-양성 암, 예를 들어 AML)을 갖는 대상체는 검출가능한 암 세포를 갖는 대상체이다. 본 발명은 암(예를 들어, NPM1c-양성 암, 예를 들어 AML)을 갖는 대상체에 대한 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포의 투여를 고려한다.
일부 양태에서, 본 발명의 치료 방법 및 용도는 NPM1 유전자에서의 돌연변이(예를 들어, 유전자의 엑손 12에서의 4 염기쌍 프레임시프트 삽입, 대안적 판독 프레임에서의 C-말단 11 아미노산을 코딩하는 돌연변이, 또는 MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(서열번호57)의 C-말단 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 발현을 야기하는 NPM1 돌연변이)를 특징으로 하는(예를 들어, 이를 갖는 것으로 알려지거나, 갖는 것으로 예상되거나, 갖는 것으로 검출된) 암을 갖는 임의의 대상체에서 실시될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 치료 방법 및 용도는 돌연변이체 NPM1 단백질(예를 들어, 세포질 국소화를 갖는 NPM1c 돌연변이체 단백질, C-말단 도메인에서 돌연변이를 갖는 단백질, 폴딩된 C-말단 도메인이 결여된 돌연변이체 단백질, MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(서열번호57)의 C-말단 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 서열번호 56에 기재된 단백질, 또는 NPM1c)의 발현을 특징으로 하는(예를 들어, 이를 발현하는 것으로 알려지거나, 발현하는 것으로 예상되거나, 발현하는 것으로 검출된) 암을 갖는 임의의 대상체에서 실시될 수 있다. NPM1c의 돌연변이된 C-말단 서열은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 van der Lee et al., 2019, J. Clin. Invest. 129(2):774-785 참고, 예를 들어, 도 1 참고). 일부 양태에서, 본 발명의 치료 방법 및 용도는 암을 갖는 임의의 대상체에서 실시될 수 있고, 암을 포함하는 세포의 세포 표면은 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된 돌연변이체 뉴클레오포스민 네오에피토프(예컨대, NPM1c 네오에피토프, 예를 들어, AIQDLCLAV(서열번호 1))를 나타낸다(예를 들어, 나타내는 것으로 알려지거나, 나타내는 것으로 예상되거나, 나타내는 것으로 검출됨). 일부 양태에서, 본 발명의 치료 방법 및 용도는 암을 갖는 임의의 대상체에서 실시되고, 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질(예를 들어, HLA-A2)은 암을 포함하는 세포의 세포 표면 상에 NPM1c 네오에피토프(예를 들어, AIQDLCLAV(서열번호 1))를 나타내거나 제시한다.
선택적으로, 본원에 기재된 방법에 따라 치료될 예상 환자의 암 세포는 NPM1 유전자 또는 NPM1 단백질에서의 돌연변이에 대해 시험되거나, 암을 포함하는 세포의 세포 표면이 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프(예를 들어, AIQDLCLAV(서열번호 1))를 포함하는 항원을 나타내는지 여부를 결정하기 위해 시험된다. 일부 양태에서, 환자는 이러한 시험이 NPM1 유전자에서의 돌연변이 또는 NPM1 단백질에서의 돌연변이에 대해 양성이거나, 암 세포의 세포 표면 상에 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질(예를 들어, HLA-A2)과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프(예를 들어, AIQDLCLAV(서열번호 1))를 포함하는 항원을 나타내는 것으로 결정되는 경우, 본원에 기재된 방법에 따라 치료된다.
일부 양태에서, 본 발명의 치료 방법 및 용도는 급성 골수성 백혈병(AML)을 갖는 대상체에서 실시될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 본 발명의 치료 방법 및 용도는 AML로 진단된 대상체에서 실시된다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료될 암을 진단하기 위한 시험은 당업계에 알려져 있고, 일반적인 의료 종사자에게 친숙할 것이다. 이들 실험실 시험은, 비제한적으로, 현미경 분석, 배양 의존적 시험(예컨대, 배양액), 및 핵산 검출 시험을 포함한다. 이들은 습식 마운트(wet mount), 얼룩-증강 현미경, 면역 현미경(예를 들어, FISH), 하이브리드화 현미경, 입자 응집, 효소-결합 면역흡착 분석, 소변 스크리닝 시험, DNA 프로브 하이브리드화, 혈청학적 시험 등을 포함한다. 의료 종사자는 일반적으로 상기 열거된 실험실 시험을 실행하는 것과 함께 완전한 병력을 취하고 완전 신체 검사를 수행한다.
AML의 검출을 위한 방법은, 비제한적으로, 백혈병 세포에 대한 PBMC의 유세포 분석 후, NPM1c 돌연변이에 대한 PCR 및 서열분석을 포함한다. AML 진단을 위한 임상 방법은 당업계에 알려져 있다. AML의 발달에 대한 위험 인자는 흡연, 화학요법, 방사선 요법, 특정 혈액 장애, 및 연령이다.
일 실시양태에서, 치료되는 대상체는 초기 단계 암(예를 들어, AML)으로 진단되었다. 일 실시양태에서, 치료되는 대상체는 후기 단계 암(예를 들어, AML)으로 진단되었다.
특정 실시양태에서, 치료되는 대상체는 AML 진행의 임의의 단계를 갖는다.
일부 양태에서, 치료되는 대상체는 이전에 하나 이상의 다른 암 요법(예를 들어, 화학요법, 방사선요법, 또는 줄기 세포 이식)을 받았다. 특정 실시양태에서, 치료되는 대상체는 이전에 하나 이상의 다른 암 요법(예를 들어, 화학요법, 방사선요법, 또는 줄기 세포 이식)을 받았고, 대상체의 암은 재발되었다. 특정 실시양태에서, 치료되는 대상체는 이전에 하나 이상의 다른 암 요법(예를 들어, 화학요법, 방사선요법, 또는 줄기 세포 이식)을 받았고, 대상체는 하나 이상의 다른 암 요법에 대한 발달된 저항성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 치료되는 대상체는 관해(예를 들어, 암의 부분 관해 또는 완전 관해)에 있다. 특정 실시양태에서, 치료되는 대상체는 하나 이상의 다른 암 요법(예를 들어, 화학요법, 방사선요법, 또는 줄기 세포 이식)에 대해 난치성이다.
다른 실시양태에서, 본원은 본 발명의 치료 방법 및 용도에 따라 본원에 기재된 임의의 면역요법으로부터 이득을 얻을 수 있는(또는 가능성이 있는) 암이 발달할 위험에 있는 대상체를 치료하는 것을 고려한다. 암(예를 들어, AML)이 발달할 위험에 있는 대상체는 정상에 비해 높은 암 발달 확률을 갖는 대상체이다. 이들 대상체는 예를 들어, 암이 발달할 높은 가능성과 연관될 것으로 입증된 유전자 이상을 갖는 대상체, 암에 대한 가족성 기질을 갖는 대상체, 담배, 석면, 또는 다른 화학적 독소와 같은 암 유발제(즉, 발암 물질)에 노출된 대상체, 및 암에 대해 이전에 치료되고 명백한 관해에 있는 대상체를 포함한다. 본 발명은 암(예를 들어, AML)이 발달할 위험에 있는 대상체에 대한 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포의 투여를 고려한다.
일부 실시양태에서, 치료되는 대상체는 성인이다. 일 실시양태에서, 대상체는 18 세 초과의 인간 대상체이다. 일 실시양태에서, 대상체는 21 세 초과의 인간 대상체이다. 일 실시양태에서, 대상체는 45 세 초과의 인간 대상체이다. 일 실시양태에서, 대상체는 65 세 초과의 인간 대상체이다. 일 실시양태에서, 대상체는 18 세 미만의 인간 대상체이다. 일 실시양태에서, 대상체는 45 세 미만(또는 18 내지 45 세, 또는 21 내지 45 세)의 인간 대상체이다. 일 실시양태에서, 대상체는 65 세 미만(또는 18 내지 65 세, 21 내지 65 세, 또는 45 내지 65 세)의 인간 대상체이다.
병용 요법
일부 양태에서, 본원에 기재된 치료 방법 및 용도는 대상체에서 치료 반응을 향상, 예컨대 항-종양 반응을 향상시키고/시키거나 종양에 대해 세포독성인 추가 약제(예를 들어, 화학요법제)를 이용한 대상체의 치료를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 요법은 하나 이상의 항암 요법, 예를 들어 화학요법, 방사선 요법, 줄기 세포 이식, 항암 활성을 갖는 소분자, 다른 항암 면역요법(예를 들어, 다른 항암 항체 또는 이의 단편, 또는 다른 T 세포 요법), 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 항암 요법과 조합하여 대상체에 투여된다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 ML NK 세포는 하나 이상의 항암 요법, 예를 들어 화학요법, 방사선 요법, 줄기 세포 이식, 항암 활성을 갖는 소분자, 다른 항암 면역요법(예를 들어, 다른 항암 항체 또는 이의 단편, 또는 다른 T 세포 요법), 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 항암 요법과 조합하여 대상체에 투여된다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 ML NK 세포, 또는 이를 포함하는 조성물 중 하나 이상은 줄기 세포 이식 또는 다른 항암 면역요법(예를 들어, 다른 항암 항체 또는 이의 단편, 또는 다른 T 세포 요법)과 조합하여 대상체에 투여된다. CAR을 포함하는 ML NK 세포와의 투여를 위해, 세포의 생존력에 음성적으로 영향을 주지 않는 임의의 병용 요법이 본원에서 고려된다.
병용 요법에 사용하기에 적합한 치료제는 단백질 티로신 키나아제 억제제를 포함하는 소분자 화학요법제뿐 아니라, 비제한적으로, 아래에 추가로 논의되는 것들을 포함한 항암 항체와 같은 생물학적 항암제를 포함한다.
일부 양태에서, 병용 요법은 항-종양 면역을 향상시키기 위한 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, PD-L2 억제제, 또는 CTLA-4 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 면역 체크포인트의 다른 조절인자는 TIM-3, OX-40, OX-40L 또는 ICOS를 표적화할 수 있다. 일 실시양태에서, 면역 체크포인트를 조절하는 약제는 항체(예를 들어, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, 또는 OX-40에 대한 길항성 항체)이다. 다른 실시양태에서, 면역 체크포인트를 조절하는 약제는 단백질 또는 소분자 조절인자이다. 다른 실시양태에서, 약제(예를 들어, mRNA)는 면역 체크포인트의 항체 조절인자를 코딩한다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 요법은 TIM-3 억제제와 조합하여 투여된다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 요법은 PD-1 억제제와 조합하여 투여된다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 요법은 PD-L1 억제제와 조합하여 투여된다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 요법은 CTLA-4 억제제와 조합하여 투여된다. 병용 요법에 사용될 수 있는 면역 체크포인트 억제제의 비제한적인 예는 펨브롤리주맙, 알렘투주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, 오파투무맙, 리툭시맙, MEDI0680, PDR001, AMP-224, PF-06801591, BGB-A317, REGN2810, SHR-1210, TSR-042, 아피머, 아벨루맙(MSB0010718C), 아텔리주맙(MPDL3280A), 더발루맙(MEDI4736), BMS936559, 이필리무맙, 트레멜리무맙, AGEN1884, MEDI6469 및 MOXR0916을 포함한다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 화학요법과 조합하여 대상체에 투여된다. 본원에 기재된 병용 요법에 사용될 수 있는 화학요법제의 유형의 예는, 비제한적으로, 알킬화제, 니트로소우레아제, 항대사산물, 백금 복합체 유도체, 토포이소머라아제 억제제, 아로마타아제 억제제, 식물로부터 유래된 알칼로이드, 호르몬 길항제, 항종양 항생제, 및 P-당단백질 억제제를 포함한다. 본원에 기재된 병용 요법에 사용될 수 있는 화학요법 약물의 구체적인 예는, 비제한적으로, 탁솔, 파클리탁셀, 납-파클리탁셀(nab-paclitaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 젬시타빈, 독소루비신, 다우노루비신, 콜히친, 미톡산트론, 타목시펜, 사이클로포스파미드, 메클로레타민, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 우라무스틴, 무스타겐, 이포사미드, 벤다무스틴, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 포테무스틴, 스트렙토조신, 티오테파, 미토마이신, 디아지쿠온, 테트라진, 알트레타민, 다카바진, 미토졸로미드, 테모졸로미드, 프로카바진, 헥사메틸멜라민, 알트레타민, 헥살렌, 트로포스파미드, 에스트라무스틴, 트레오설판, 만노설판, 트리아지쿠온, 카보쿠온, 니무스틴, 라니무스틴, 아자티오프린, 설파닐아미드, 플루오로피리미딘, 티오퓨린, 티오구아닌, 메르캅토퓨린, 클라드리빈, 카페시타빈, 페메트렉세드, 플루다라빈, 메토트렉세이트, 하이드록시우레아, 넬라라빈 또는 클로파라빈, 시타라빈, 데시타빈, 프랄라트렉세이트, 플록스우리딘, 티오쿠아닌, 아자시티딘, 클라드리빈, 펜토스타틴, 메르캅토퓨린, 이마티닙, 닥티노마이신, 세루비딘, 블레오마이신, 악티노마이신, 루테오마이신, 에피루비신, 이다루비신, 플리카마이신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 빈플루닌, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드, 테니포시드, 페리윙클, 빈카, 탁산, 이리노테칸, 토포테칸, 캄프토테신, 테니포시드, 피라루비신, 노비오신, 메르바론, 아클라루비신, 암사크린, 항안드로겐, 항-에스트로겐, 비칼루타미드, 메드록시프로게스테론, 플루옥시메스테론, 디에틸스틸베스트롤, 에스트레이스, 옥트레오티드, 메게스트롤, 랄록시펜, 토레미펜, 풀베스트란트, 프레드니손, 플루타미드, 류프로라이드, 고세렐린, 아미노글루테티미드, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 보로졸, 포르메스탄, 파드로졸, 안드로스텐, 레스베라트롤, 미오스민, 카테킨, 아피게닌 에리오딕티올 이소리퀴리티게닌, 망고스틴, 아미오다론, 아지트로마이신, 캅토프릴, 클라리트로마이신, 사이클로스포린, 피페린, 퀘르세틴, 퀴니딘, 퀴닌, 레세르핀, 리토나비르, 타리퀴다르, 베라파밀, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 트랜스플라틴, 네다플라틴, 사트라플라틴, 트리플라틴 및 카보플라틴을 포함한다.
구체적인 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 요법은 AML의 치료를 위한 하나 이상의 화학요법과 조합하여 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 화학요법은 시타라빈, 다우노루비신, 이다루비신, 클라드리빈, 플루다라빈, 미톡산트론, 에토포시드, 6-티오구아닌, 하이드록시우레아, 프레드니손, 덱사메타손, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 아자시티딘 및 데시타빈으로부터 선택된다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 요법은 방사선 요법과 조합하여 대상체에 투여된다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 요법은 줄기 세포 이식과 조합하여 대상체에 투여된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 요법은 하나 이상의 추가 항암 요법 전, 동안(즉, 동시에) 또는 후에 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 이전에 항암 요법을 받지 않았다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 이전에 항암 요법(예를 들어, 화학요법, 방사선 요법, 또는 줄기 세포 이식)을 받았다.
키트
본 발명의 양태는 키트에 관한 것이다.
용어 "키트"는 샘플의 과정, 방법, 검정, 분석, 또는 조작을 용이하게 하는 물품의 세트를 지칭할 수 있다. 키트는 키트 사용을 위한 설명서(예를 들어, 본 발명의 방법에 대한 설명서), 방법에 대해 요구되는 재료, 용액, 구성요소, 시약, 화학물질, 또는 효소, 및 다른 선택적인 구성요소를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 세포, 벡터, 및 배양 배지는 키트로 제공될 수 있다. 일 실시양태에서, 키트는 (a) 벡터 또는 이의 구성요소를 포함하는 조성물을 함유하는 용기, 및 선택적으로 (b) 정보 자료를 포함한다. 정보 자료는 본원에 기재된 방법 및/또는 치료적 이득을 위한 약제의 사용을 포함하는 설명, 지시, 판촉 또는 다른 자료일 수 있다. 실시양태에서, 키트는 또한 세포와 같은 제2 약제를 포함한다. 예를 들어, 키트는 벡터 또는 이를 포함하는 조성물을 함유하는 제1 용기, 및 세포와 같은 제2 약제를 포함하는 제2 용기를 포함한다.
키트의 정보 자료는 이의 형태가 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 정보 자료는 화합물의 생산에 관한 정보, 화합물의 분자량, 농도, 만료일, 배치(batch) 또는 생산 현장 정보 등을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 정보 자료는 키트의 세포를 형질도입하는 방법 또는 예를 들어, 대상체를 치료하기에 적합한 용량, 투여량 형태, 또는 투여 방식(예를 들어, 본원에 기재된 용량, 투여량 형태, 또는 투여 방식)으로 대상체에 유전자-변형된 세포를 투여하는 방법을 포함한다. 정보는 다양한 포맷으로 제공될 수 있으며, 인쇄된 문자, 컴퓨터 판독가능 자료, 비디오 레코딩, 또는 오디오 레코딩, 또는 실질적인 자료에 대한 링크 또는 주소를 제공하는 정보를 포함한다.
벡터 및/또는 세포와 함께, 키트 내의 조성물은 용매 또는 완충제, 배양 배지, 안정제, 또는 보존제와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 키트의 조성물은 임의의 형태, 예를 들어 액체, 건조 또는 동결건조 형태로 제공될 수 있고, 실질적으로 순수하고/하거나 멸균일 수 있다. 조성물이 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액 또는 알코올 용액일 수 있다. 조성물 또는 이의 구성요소가 건조된 형태로 제공되는 경우, 예를 들어 재구성은 적합한 용매의 첨가에 의한 것이다. 용매, 예를 들어 멸균수 또는 완충액은 선택적으로 키트에 제공될 수 있다.
키트는 약제를 함유하는 조성물 또는 조성물들을 위한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 조성물 및 정보 자료를 위한 별도의 용기, 분할기 또는 구획을 함유한다. 예를 들어, 조성물은 병, 바이알, 또는 주사기에 함유될 수 있고, 정보 자료는 플라스틱 슬리브 또는 패킷에 함유될 수 있다. 다른 실시양태에서, 키트의 별도의 요소는 단일 비분할된 용기 내에 함유된다. 예를 들어, 조성물은 표지의 형태의 정보 자료가 부착된 병, 바이알 또는 주사기에 함유된다. 일부 실시양태에서, 키트는 각각 하나 이상의 단위 투여량 형태(예를 들어, 본원에 기재된 투여량 형태)의 약제를 함유하는 복수(예를 들어, 팩)의 개별 용기를 포함한다. 용기는 조합 단위 투여량, 예를 들어 벡터 및/또는 세포 및 제2 약제를 예를 들어, 소망하는 비율로 포함하는 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 복수의 주사기, 앰플, 포일 패킷, 블리스터 팩(blister pack), 또는 의료 장치를 포함하며, 예를 들어 각각은 단일 조합 단위 용량을 포함한다. 키트의 용기는 밀폐, 방수(예를 들어, 수분 또는 증발에서의 변화에 대해 불투과성), 및/또는 차광성일 수 있다. 키트는 선택적으로 조성물의 투여에 적합한 장치, 예를 들어 주사기 또는 다른 적합한 전달 장치를 포함한다. 장치는 약제 중 하나 또는 둘 다와 함께 예비-로딩되어 제공될 수 있거나, 비어 있지만 로딩에 적합할 수 있다.
일 양태에서, 본원은 (i) 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포, 상기 세포의 집단, 또는 본원에 기재된 약학 조성물; (ii) 선택적으로, 하나 이상의 추가 항암제(예를 들어, 화학요법제), 및 (iii) 대상체에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 설명서를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
일 실시양태에서, 키트는 동일하거나 별도의 적합한 용기에, MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)를 포함하는 항원에 결합하는 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포, 및 약학적 허용 담체(예를 들어, 완충제)를 포함할 수 있다.
적합한 용기는, 비제한적으로, 바이알, 웰, 시험관, 플라스크, 병, 주사기, 주입 백(infusion bag), 또는 본원에 기재된 CAR 폴리펩티드를 발현하는 ML NK 세포가 위치할 수 있는(일부 경우에, 적합하게 분취될 수 있는) 다른 용기 수단을 포함할 수 있다. 추가 구성요소가 제공되는 경우, 키트는 이 구성요소가 위치할 수 있는 추가 용기를 함유할 수 있다. 용기는 소망하는 바이알이 보유되는 사출 또는 블로우-성형된 플라스틱 용기를 추가로 포함할 수 있다. 용기 및/또는 키트는 사용 및/또는 경고에 대한 설명서가 있는 표지를 포함할 수 있다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "NPM1c"는 NPM1 유전자에서 4-뉴클레오티드 중복으로부터 야기되는 돌연변이체 뉴클레오포스민 단백질(NPM1)을 지칭하며, 이는 세포질 국소화를 갖는다. 야생형 NPM1 유전자에 의해 코딩되는 인간 뉴클레오포스민은 서열번호 54(수탁 번호 NM_002520)에 의해 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 4-뉴클레오티드 중복을 갖는 NPM1 유전자에 의해 코딩되는 예시적인 NPM1c 단백질은 서열번호 56에 의해 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 상기 예시적인 NPM1c 단백질의 C-말단 아미노산 서열은 MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(서열번호57)를 포함하며, 야생형 뉴클레오포스민 단백질에 대해 돌연변이되는 서열의 부분은 볼드체로 강조되어 있다(예를 들어, van der Lee et al., 2019, JCI 129(2):774-785; Verhaak, R. et al (2005) Blood 106:3747 참고). 일부 실시양태에서, 본 발명의 NPM1c 네오에피토프는 아미노산 서열 MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(서열번호 57)을 포함하는 NPM1c 단백질로부터 유래된 네오에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 NPM1c 네오에피토프는 MTDQEAIQDLCLAVEEVSLRK(서열번호 57)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 NPM1c의 부분으로부터 유래된 네오에피토프를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "NPM1c:HLA-A2"는 HLA-A2 단백질과 복합체화된 NPM1c의 네오에피토프를 지칭한다. 일부 실시양태에서, NPM1c의 네오에피토프는 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 수치 값을 수정하기 위해 사용될 때, 수치 값 위 및 아래의 최대 10%의 편차가 인용된 값의 의도된 의미 내에 남아 있다는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "VH" 또는 "VH"는 항체의 중쇄 가변 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "VL" 또는 "VL"은 항체의 경쇄 가변 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 기준 폴리펩티드 서열에 대한 용어 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성" 또는 "% 서열 동일성"은 필요한 경우, 최대 % 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. % 아미노산 서열 동일성 결정 목적을 위한 정렬은 당업계에 알려진 다양한 방식으로, 예를 들어 BLASTp, BLAST-2, ALIGN(예를 들어, ALIGN-2) 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭핑된(gapped) 정렬을 얻기 위해, Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402에 기재된 바와 같이 갭핑된 BLAST가 이용될 수 있다. 또한, 2 개의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com에서 이용가능함)의 GAP 프로그램에 포함된 Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 일반적으로 2 개의 경쇄 폴리펩티드 및 2 개의 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 지칭한다(이 용어가 사용되는 문맥이 달리 제시하지 않는 경우). 항체는 IgM, IgG, IgA, IgD, 및 IgE 항체를 포함한 상이한 항체 아이소타입을 포함한다. 용어 "항체"는, 비제한적으로, 다클론 항체, 단클론 항체, 키메라화 또는 키메라 항체, 인간화 항체, 영장류화 항체, 탈면역화 항체, 및 완전 인간 항체를 포함한다. 항체는 임의의 다양한 종, 예를 들어 포유동물, 예컨대 인간, 비-인간 영장류(예를 들어, 오랑우탄, 비비, 또는 침팬지), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 라마, 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 게르빌스(gerbils), 햄스터, 래트, 및 마우스에서 제조되거나 이로부터 유래될 수 있다. 항체는 정제된 또는 재조합 항체일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편", "항원 결합 단편", 또는 유사한 용어는 표적 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편을 지칭한다. 이러한 단편은, 비제한적으로, 단일쇄 항체, 단일쇄 Fv 단편(scFv), Fab 단편, Fab' 단편, 및 F(ab')2 단편을 포함한다. 이 용어는 또한 예를 들어, 단일 도메인 항체, 예컨대 낙타과 단일 도메인 항체를 포함한다. 예를 들어, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem Sci 26:230-235; Nuttall et al. (2000) Curr Pharm Biotech 1:253-263; Reichmann et al. (1999) J Immunol Meth 231:25-38; PCT 출원 공보 WO 94/04678호 및 WO 94/25591호; 및 미국 특허 제6,005,079호를 참고하며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 단일 도메인 항체가 형성되도록 변형을 갖는 2 개의 VH 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체를 제공한다. 또한, 인트라바디, 미니바디, 트리아바디, 및 디아바디 또한 항체 단편의 정의에 포함되며, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위해 양립가능하다. 예를 들어, Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66; Hudson and Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1):177-189; Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123; Rondon and Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51:257-283을 참고하며, 이들 각각의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산 치환" 또는 "치환된"은 (이러한 용어가 치환된 아미노산을 지칭할 때) 사전결정된 아미노산 서열에서의 적어도 하나의 기존 아미노산 잔기의 상이한 아미노산 잔기를 이용한 치환을 지칭한다. 용어 "아미노산 삽입"은 사전결정된 아미노산 서열 내로의 적어도 하나의 추가 아미노산의 포함을 지칭한다. 삽입은 보통 1 또는 2 개의 아미노산 잔기의 삽입으로 구성될 것이지만, 큰 "펩티드 삽입"이 또한 만들어질 수 있다. 치환 또는 삽입된 아미노산 잔기(들)는 자연 발생 또는 비-자연 발생(변형)일 수 있다. 용어 "아미노산 결실"은 사전결정된 아미노산 서열로부터 적어도 하나의 아미노산 잔기의 제거를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 다음을 포함하여 당업계에 정의되어 있으며,
(1) 소수성 측쇄: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu;
(2) 중성 친수성 측쇄: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성 측쇄: Asp, Glu;
(4) 염기성 측쇄: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 측쇄: Gly, Pro; 및
(6) 방향족 측쇄: Trp, Tyr, Phe
를 포함한다.
예를 들어, 비-보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기의 실질적으로 상이한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기(즉, 상이한 패밀리의 멤버인 아미노산 잔기)로의 치환이다.
일부 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기의 친수화 지수를 고려함으로써 이루어진다. 각각의 아미노산에는 이의 소수성 및 전하 특징에 기초한 소수성 지수가 할당된다. 이들은 Ile(+4.5); Val(+4.2); Leu(+3.8); Phe(+2.8); Cys(+2.5); Met(+1.9); Ala(+1.8); Gly(-0.4); Thr(-0.7); Ser(-0.8); Trp(-0.9); Tyr(-1.3); Pro(-1.6); His(-3.2); Glu(-3.5); Gln(-3.5); Asp(-3.5); Asn(-3.5); Lys(-3.9); 및 Arg(-4.5)이다. 폴리펩티드 상에 상호작용적 기능 부여시 친수성 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 이해된다(예를 들어, Kyte et al (1982) J Mol Biol 157:105-131 참고). 일부 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산 잔기를 동일하거나 유사한(예를 들어, 약 +2, +1.5, +1, +0.5, -0.5, -1, -1.5, 또는 -2 이내) 친수성 지수를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환함으로써 이루어진다.
일부 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기의 친수성을 고려함으로써 이루어진다. Arg(+3.0); Lys(+3.0±1); Asp(+3.0±1); Glut(+0.2); Gly(0); Thr(-0.4); Pro(-0.5±1); Ala(-0.5); His(-0.5); Cys(-1.0); Met(-1.3); Val(-1.5); Leu(-1.8); Ile(-1.8); Tyr(-2.3); Phe(-2.5); 및 Trp(-3.4)의 친수성 값이 할당되었다. 일부 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산 잔기를 동일하거나 유사한(예를 들어, 약 +2, +1.5, +1, +0.5, -0.5, -1, -1.5, 또는 -2 이내) 친수성을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환함으로써 이루어진다. 예시적인 아미노산 치환은 표 2에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포" 또는 "ML NK 세포"는 적어도 하나의 사이토카인으로 생체외(ex vivo)에서 활성화되고 동일한 사이토카인의 부재 하의 도전 후에 향상된 기억-유사 기능을 유지하는 NK 세포로부터 유래된 NK 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CIML NK 세포"는 적어도 하나의 사이토카인으로 활성화되고 향상된 활성화 및 인터페론 감마 반응을 나타내는 NK 세포로부터 유래된 NK 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 핵산 분자"는 이의 천연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산 분자는 이의 천연 염색체 위치와 상이한 위치에 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "네오에피토프"는 질환-특이적 돌연변이로부터 발생하는 펩티드를 포함하는 질환-특이적 항원을 지칭하며, 이는 자신과 상이한 것으로 인식되고, 정상 세포가 아닌 질환에 의해 영향을 받은 세포의 표면에 제시된다. "종양 네오에피토프" 또는 "암 네오에피토프"는 종양- 또는 암-특이적 돌연변이로부터 발생하는 펩티드를 포함하는 종양- 또는 암-특이적 항원을 지칭하며, 이는 자신과 상이한 것으로 인식되고, 정상 세포가 아닌 종양/암 세포의 표면 상에 제시된다. 종양- 또는 암-특이적 네오에피토프의 제시는 종양 세포 내에서 종양- 또는 암-특이적 항원의 세포내 가공 및 절단 후에 발생하고, 이에 의해 종양- 또는 암-특이적 돌연변이를 포함하는 8-15 개 아미노산의 하나 이상의 별개의 펩티드를 생산한다. 각각 CD8+ 또는 CD4+ T 세포에 대한 제시를 위해 MHC 클래스 I 또는 II 분자에 결합하는 이들 펩티드의 서브세트는 종양 네오에피토프를 구성한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "KD" 또는 "Kd" 또는 "Kd"는 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 항체(또는 이의 항원 결합 단편)와 항원 사이의 결합 반응의 평형 해리 상수를 지칭한다. KD의 값은 항체 오프-레이트(off-rate) 상수(koff) 대 항체 온-레이트(on-rate) 상수(kon)의 비의 수치 표현이다. KD의 값은 항원에 대한 항체의 결합 친화도와 반비례한다. KD 값이 작을수록 이의 항원에 대한 항체의 친화도는 크다. 친화도는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "koff" 또는 "koff"는 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리를 위한 오프-레이트 상수를 지칭한다. koff의 값은 초 당 붕괴 또는 해리되는 복합체의 분율의 수치 표현이며, 단위 sec-1로 표현된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "kon" 또는 "kon"은 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 항체와 항원의 연합을 위한 온-레이트 상수를 지칭한다. kon의 값은 항체 및 항원의 1 몰(1 M) 용액에서 초 당 형성된 항체/항원 복합체의 수의 수치 표현이며, 단위 M-1sec-1로 표현된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합", "특이적으로 결합하다", "선택적 결합", 및 "선택적으로 결합하다"는 특정 항원 또는 에피토프(예를 들어, NPM1c:HLA-A2)에 대해 상당한 친화도를 나타내고, 일반적으로 다른 항원 및 에피토프(예를 들어, HLA-A2 단독, 예를 들어 NPM1c 네오에피토프 단독, 예를 들어 HLA-A2와 복합체화된 비-NPM1c 네오에피토프)에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 세포외 도메인을 의미하는 것으로 의도된다. "상당한" 또는 바람직한 결합은 10-7, 10-8, 10-9, 또는 10-10 M 이상의 KD를 갖는 결합을 포함한다. 항체 항원 상호작용의 KD(친화도 상수)는 50%의 항체 및 항원 분자가 함께 결합되는 항체의 농도를 나타낸다. 따라서, 적합한 고정된 항원 농도에서, 50%의 높은(즉, 강한) 친화도 항체는 낮은 친화도 항체와 동일한 % 결합을 달성하기 위해 요구되는 것에 비해 낮은 항체 농도에서 항원 분자에 결합할 것이다. 따라서, 낮은 KD 값은 높은(강한) 친화도를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, "양호한" 친화도는 강한 친화도이고, 이의 비교인자에 비해 낮은 수치 값의 것이며, 10-7 M의 KD는 낮은 수치 값의 것이고, 따라서 10-6 M의 KD에 비해 양호한 친화도를 나타낸다. 10-7 M에 비해 양호한(즉, 낮은 KD 값을 가지며, 따라서 강한), 바람직하게는 10-8 M에 비해 양호한 친화도가 일반적으로 바람직하다. 본원에 기재된 것과 중간의 값이 또한 고려되고, 바람직한 결합 친화도는 친화도의 범위로 표시될 수 있으며, 예를 들어 본원에 개시된 NPM1c:HLA-A2에 결합하는 항체에 대한 바람직한 결합 친화도는 10-7 내지 10-12 M, 더욱 바람직하게는 10-8 내지 10-12 M이다.
항원에 "결합하지 않거나" 또는 "실질적으로 결합하지 않는" 항체, 항원 결합 단편 또는 세포외 도메인은 표적외 항원(예를 들어, MHC 클래스 I 단백질 단독, 예를 들어 네오에피토프 단독, 예를 들어 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 대조군 펩티드)에 상당하게 결합하지 않을 것이다. 예를 들어, 일 실시양태에서, NPM1c:HLA-A2에 특이적으로 결합하는 항체는 예를 들어, HLA-A2 단독, NPM1c 네오에피토프 단독, 및/또는 HLA-A2와 복합체화된 비-NPM1c 네오에피토프에 비해 NPM1c:HLA-A2에 대한 적어도 2 배, 바람직하게는 3 배, 또는 4 배 이상 양호한 크기의 결합 친화도(즉, 2, 3, 또는 4 배 이상 낮은 크기의 KD 값을 나타내는 결합)를 나타낼 것이다. 특이적 또는 선택적 결합은 예를 들어, 스캐차드 분석(Scatchard analysis), 비아코어 분석(Biacore analysis), 생체-층 간섭측정, 및/또는 경쟁적(경쟁) 결합 분석에 따르는 것을 포함하여, 이러한 결합을 결정하기 위한 임의의 당업계-인식된 수단에 따라 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "HLA-A"는 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 인간에서 HLA-A 유전자좌에 의해 코딩되는 인간 백혈구 항원(HLA)의 그룹을 지칭한다. HLA는 인간에 대해 특이적인 주조직적합성 복합체(MHC) 항원이다. HLA-A는 인간 MHC 클래스 I 세포 표면 수용체의 3 개 주요 유형 중 하나이다. 나머지는 HLA-B 및 HLA-C이다. HLA-A 단백질은 이종이량체이고, 중 α 쇄 및 작은 β 쇄로 구성된다. α 쇄는 변이체 HLA-A 유전자에 의해 코딩되고, β 쇄(β2-마이크로글로불린)은 비변이체 β2 마이크로글로불린 분자이다. β2 마이크로글로불린 단백질은 인간 게놈의 별도 영역에 의해 코딩된다. HLA-A*02(A*02)는 HLA-A 혈청형 그룹 내의 인간 백혈구 항원 혈청형이다. 혈청형은 HLA-A α-쇄의 α2 도메인의 항체 인식에 의해 결정된다. A*02에 대해, α 쇄는 HLA-A*02 유전자에 의해 코딩되고, β 쇄는 B2M 유전자좌에 의해 코딩된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효 용량" 또는 "유효량"은 소망하는 치료 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양을 지칭한다.
다음의 실시예는 제한의 방식이 아닌 예시의 방식에 의해 제공된다. 본원에 제공된 일반적인 설명을 고려하면, 본 발명의 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있다.
다른 실시양태
E1.
적어도 하나의 ASCT2+ 세포를, 후보 폴리펩티드를 코딩하는 비비 외피(BaEV) 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하고, ASCT2+ 세포가 인터류킨-12 패밀리 멤버 및 IL-18로 활성화된, 세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위한 방법.
E2.
실시양태 E1에 있어서, ASCT2+ 세포가 IL-12, IL-18, 및 IL-15로 활성화된 것인, 방법.
E3.
실시양태 E1에 있어서, NK 세포를 얻거나, 단리시키거나, 확인하는 단계 및 인터류킨-12 패밀리 멤버 및 IL-18 및, 선택적으로 IL-15로 NK 세포를 활성화시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
E4.
실시양태 E1 또는 E3에 있어서, 인터류킨-12 패밀리 멤버가 IL-12, IL-23, IL-27, 또는 IL-35를 포함하는 것인, 방법.
E5.
실시양태 E3에 있어서, NK 세포가 ASCT2-인, 방법.
E6.
실시양태 E3에 있어서, NK 세포를 활성화시키는 단계가 ASCT2+ 세포를 생산하는 것인, 방법.
E7.
실시양태 E1에 있어서, ASCT2+ 세포가 NK 세포인, 방법.
E8.
실시양태 E1에 있어서, ASCT2+ 세포가 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포인, 방법.
E9.
실시양태 E8에 있어서, 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포를 얻거나, 단리시키거나, 확인하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
E10.
실시양태 E1에 있어서, ASCT2+의 발현 또는 수준이 대조군 세포에 대해 증가되는 것인, 방법.
E11.
실시양태 E10에 있어서, 대조군 세포가 비활성화된 NK 세포인, 방법.
E12.
실시양태 E10에 있어서, 대조군 세포가 성숙 NK 세포인, 방법.
E13.
실시양태 E10에 있어서, ASCT2 발현이 대조군 세포에 대해 ASCT2+ 세포에서 약 20% 내지 약 30% 증가되는 것인, 방법.
E14.
실시양태 E1에 있어서, ASCT2의 존재 또는 수준이 BaEV 렌티바이러스 벡터에 의한 형질도입에 대해 더욱 수용성인 세포를 야기하는 것인, 방법.
E15.
실시양태 E1에 있어서, ASCT2+ 세포가 IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23 또는 이의 임의의 조합 중 하나 이상으로 활성화된 것인, 방법.
E16.
실시양태 E1에 있어서, ASCT2+ 세포가 포유동물 세포인, 방법.
E17.
실시양태 E16에 있어서, 포유동물 세포가 인간 세포인, 방법.
E18.
실시양태 E17에 있어서, 인간 세포가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리된 것인, 방법.
E19.
실시양태 E1에 있어서, 렌티바이러스 벡터가 비비 외피 당단백질(BaEV-gp)로 위형화되는 것인, 방법.
E20.
실시양태 E1에 있어서, 적어도 하나의 ASCT2+ 세포의 적어도 40%가 약 3 일 후에 형질도입되는 것인, 방법.
E21.
실시양태 E1에 있어서, 형질도입 효율이 종래의 렌티바이러스 형질도입 접근법에 대해 개선되는 것인, 방법.
E22.
실시양태 E1에 있어서, 후보 폴리펩티드가 항체 또는 이의 단편, 독소, 호르몬, 성장 인자, 수용체, 또는 시그널링 분자, 또는 키메라 항원 수용체를 포함하는 것인, 방법.
E23.
실시양태 E22에 있어서, 키메라 항원 수용체가 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것인, 방법.
E24.
실시양태 E22 또는 실시양태 E23에 있어서, 항체 또는 단편이 체크포인트 억제제에 대해 특이적인 것인, 방법.
E25.
실시양태 E22 또는 실시양태 E23에 있어서, 항체가 항-T-세포 수용체 항체 또는 T-세포 수용체-유사 항체인, 방법.
E26.
실시양태 E25에 있어서, 항체 또는 이의 단편이 NPM1, NPM1c, MAGE1, GP100, hTERT, MUC1, NY-ESO-1, FLT3, TP53, 스플라이소좀 인자, MAGE3, hCGβ, Her2/Neu, Melan-A/MART-1, TARP, p53, 티로시나아제, p68, MIF, 프로티나아제 3, WT1, HA-1H, 또는 PRAME에 대해 특이적인 것인, 방법.
E27.
실시양태 E22 또는 실시양태 E23에 있어서, 항체가 종양-특이적 세포내 단백질을 표적화하는 것인, 방법.
E28.
실시양태 E27에 있어서, 세포내 단백질이 NPM1c를 포함하는 것인, 방법.
E29.
실시양태 E1에 있어서, 배양 배지가 12/15/15/21 및 IL-7을 포함하는 것인, 방법.
E30.
실시양태 E1-E29 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 세포.
E31.
실시양태 E1-E29 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 세포를 암 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 방법.
E32.
적어도 하나의 ASCT2+ 세포를, 폴리펩티드를 코딩하는 비비 외피(BaEV) 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하고, ASCT2+ 세포가 인터류킨-12 패밀리 멤버 및 IL-18로 활성화된, 유전자 조작된 세포를 제조하기 위한 방법.
E33.
실시양태 E32에 있어서, 인터류킨-12 패밀리 멤버가 IL-12, IL-23, IL-27, 또는 IL-35를 포함하는 것인, 방법.
E34.
실시양태 E32의 방법에 의해 생산된 유전자 조작된 세포.
E35.
실시양태 E30의 세포 또는 실시양태 E34의 유전자 조작된 세포를 포함하는 면역요법.
E36.
실시양태 E35의 면역요법을 암 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 방법.
실시예
신생물 세포를 인식하고, 반응하고, 사멸시키는 면역 세포의 능력을 이용하는 세포 요법은 후기 악성종양을 치료하기 위한 유망한 접근법을 나타낸다. 효율적인 세포 형질도입은 T 세포에 대해 달성되었지만, NK 세포에 대해서는 그렇지 않았는데, 이는 NK 세포-기반 암 면역요법 개선에서의 주요 기술적 결점이다. NK 세포는 바이러스-감염되고 악성 형질전환된 세포를 제거할 수 있는 선천성 림프 세포이다. 종래의 렌티바이러스 형질도입 접근법은 수포성 구내염 바이러스 G(VSVG)에 의해 위형화된 표준 렌티바이러스를 사용하지만; NK 세포는 유전자 편집률 1-3%를 갖는 VSVG-위형화된 렌티바이러스 형질도입에 대해 매우 저항성인 것으로 알려져 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 NK 세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위한 조성물 및 방법을 확인하였다. NK 세포의 고유한 수용체 발현 패턴을 연구함으로써, 본 발명자들의 데이터는 LDL-R에 대한 뚜렷한 대조로, ASCT2의 발현 수준이 일차 종래의 NK 세포에서 풍부하고, 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포에서 추가로 향상된다는 것을 나타내었다. ASCT2는 비비 외피 당단백질(BaEV-gp1)의 아미노산 수송체 및 상응하는 수용체이다. 비종래의 BaEV 위형화된 렌티바이러스를 이용함으로써, 본 발명자들은 일차 인간 NK 세포 및 CIML NK 세포에서 형질도입 차단을 극복한다. BaEV 렌티바이러스를 이용한 본 발명자들의 데이터는 일차 NK 세포가 이 비종래의 유전자-편집 접근법에 용이하게 접근가능한 한편, CIML NK 세포는 이들의 나이브 대응물에 비해 렌티바이러스 형질도입에 더욱 순응성이며, 이는 이들의 ASCT2 발현 수준과 잘 상관된다는 것을 확인한다. CIML NK 세포를 이용한 본 발명자들의 형질도입 효율은 현재 40-70%에 근접한다.
약어
AIQ, AIQDLCLAV(서열번호: 1); AML, 급성 골수성 백혈병; alloSCT, 동종이계 조혈모세포 이식; BLI, 생물발광 영상화; CAR, 키메라 항원 수용체; CAR-NK, 키메라 항원 수용체 NK 세포; FACS, 형광-활성화 세포 분류; FBS, 소 태아 혈청; GIL, GILGFVFTL(서열번호: 63); HSC, 조혈모세포; MACS, 자기-활성화 세포 분류; NPM1, 뉴클레오포스민; NPM1c, 돌연변이체 뉴클레오포스민; scFv, 단일-쇄 가변 단편; SLL, SLLMWITQC(서열번호: 62); TAA, 종양-연관 항원; HSPC, 조혈 줄기/전구 세포.
다음 실시예를 위해 다음 물질 및 방법을 사용하였다.
세포주 배양
OCI-AML3 세포를 ATCC로부터 구입하였다. OCI-AML2 세포를 DSMZ로부터 구입하였다. OCI-AML3 세포 및 OCI-AML2를 10% FBS(Life Tech 및 VWR) 및 2 mM L-글루타민(Thermo Fisher Scientific)이 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco)에서 배양하였다.
CAR 벡터 설계
항-NPM1c scFv(서열번호 2), CD8α 선도 서열, 세포외 힌지 도메인 및 막관통 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인, 및 CD3제타 활성화 도메인으로 구성된 CAR의 서열을 통합 DNA 기술(IDT)에 의해 맞춤-합성하였다. 일부 구축물에서, CAR을 절단가능한 링커를 통해 분비되거나 막 결합된 IL-15 뉴클레오티드 서열에 연결하였다. pHIV 벡터(플라스미드 #21373)를 효소 XbaI 및 ClaI로 이중으로 분해하였다. 벡터 백본의 겔 정제 후에, pHIV 백본, CAR 단편 및 P2A-GFP 단편을 제조자의 프로토콜에 따라 HiFi DNA Assembly Master Mix(New England BioLabs)를 사용하여 5' 및 3' 말단에서 이들의 중첩 영역을 기초로 하여 조립하였다. 생성된 플라스미드를 5'-GTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGT-3'(서열번호 69)(정방향) 및 5'-AGGCACAATCAGCATTGGTAGCTG-3'(서열번호 70)(역방향)의 서열분석 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 정확한 서열을 갖는 플라스미드를 pHIV-CAR-GFP로 명명하였다.
CAR-발현 일차 인간 NK 세포의 생성
293T 세포를 pHIV-CAR-GFP, BaEV-gp(또는 pCMV-VSVG), pCMV-Δ8.9, 및 pAdv 플라스미드로 형질주입시킴으로써 렌티바이러스를 생성하였다. 배양 상청액을 48 및 72 시간에 수집하고 렌티바이러스 입자를 25,000 rpm, 4℃에서 2 시간 동안 초원심분리에 의해 펠렛화하였다. 렌티바이러스 입자를 무혈청 DMEM 배지인 경우에 100 μL에 현탁시키고, -80℃에서 동결시켰다. 인간 NK 세포를 피콜 원심분리(ficoll centrifugation)를 사용하여 공여체 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리하고, Rosette Sep(StemCell Technologies, ≥ 95% CD56+CD3-)를 사용하여 정제하였다. NK 세포를 3-5x106 세포를 플레이팅하고, rhIL-12(10 ng/mL) + rhIL-18(50 ng/mL) + rhIL-15(50 ng/mL) 또는 대조군 조건(rhIL-15, 50 ng/mL)을 사용하여 16 시간 동안 활성화시킴으로써 예비-활성화시키고, PBS로 3 회 세척하여, 사이토카인을 제거하고, 생존을 지지하기 위해 rhIL-15(1 ng/mL)가 보충된 10% 인간 AB 혈청(Sigma-Aldrich)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 배양하였으며, 배지 중 50%를 2-3 일마다 신선한 사이토카인으로 교체하였다. NK 세포를 예비-활성화 후 1 일에 렌티바이러스(MOI=10)로 형질도입하였다. CAR-NK 세포를 1 ng/mL 또는 rhIL-15가 보충된 배지에서 증식시켰다. 세포를 10 일 동안 예비-활성화 및 형질도입 후 휴지시켰다.
루시페라아제 활성 측정에 의한 세포독성 분석
CAR-NK 세포의 세포독성 분석을 루시페라아제-발현 표적 세포주를 사용하여 수행하였다. NK 세포를 24 시간 동안 나타낸 이펙터:표적(E:T) 비로 표적 세포와 함께 항온처리하였다. 그 다음에, 세포를 PBS로 1 회 세정하고, 루시페라아제 세포 배양 용해 시약(Promega)에서 용해시키고, 그 후에 루시페라아제 분석 시약(Promega)과 혼합하였다. 용해물의 발광을 플레이트 분광광도계(Infinite M200PRO, TECAN)를 사용하여 분석하였다. 표적 세포 단독의 발광을 기준 대조군으로서 사용하였다. 각각의 샘플의 특이적 용해를 다음 식을 사용하여 계산하였다: 특이적 용해(%) = 100 × {1 - [(CAR-T 그룹에서의 발광/표적 세포 단독에서의 발광)/(비형질도입된 T 그룹에서의 발광/표적 세포 단독에서의 발광)] }.
생체내 표적 세포의 CAR-NK 세포 사멸
NOD-scid IL2rgnull(NSG) 마우스를 Jackson Laboratories로부터 구입하고 다나-파버 암 협회(Dana-Farber Cancer Institute)에서 특정 병원체가 없는(specific pathogen-free)(SPF) 사육장에 수용하였다. 마우스를 이용한 모든 실험을 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인받았다. 간략하게는, 루시페라아제-발현 OCI-AML3 세포(1 × 106)를 꼬리 정맥 주사에 의해 방사선조사된 NSG 마우스에 200 μL의 PBS 중에 주사하였다. 4 일 후, 500k CAR-NK 세포를 총 1x106 NK 세포로 종양-보유 마우스에 주사하였다. Xenogen IVIS-200 Spectrum 카메라를 사용하여 3 일마다 생물발광 영상화(BLI)를 수행하였다.
렌티바이러스의 예시적인 제조:
(1) 플라스미드의 증식:
3 개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드 전부를 Stbl3 화학적 적격 E. coli(Thermo Fisher C737303)에서 성장시켰다. 검증된 플라스미드를 성장시키기 위해, 미디 프랩(Midi Prep)을 위한 100 ㎍/mL 암피실린을 갖는 100 mL의 LB 브로스(broth)(Qiagen # 2945), 또는 엔도-프로 막시 프렙(Endo-free Maxi Prep)을 위한 100 ㎍/mL 암피실린을 갖는 1000 mL LB 브로스(Qiagen #12362)를 사용한다.
(2) 293T 세포 성장:
293T 세포를 20 mL 10% FBS DMEM에서 배양하고, 100% 콘플루언스에 도달하였다. 세포를 15 회 분할을 지나서 계대시키지 않는다. 세포를 거의 100% 콘플루언시까지 성장하도록 계대시키지 않는다. 150 mm x 25 mm 조직 배양 접시(Thermo Fisher Scientific #0877224). 완전 DMEM 배지(10% FBS + P/S + 2 mM L-glut를 가짐).
(3) 293T 세포의 형질주입:
형질주입 전 2 내지 3 일에, 5E6 세포/15 cm 플레이트로 위치시킨다. 거의 100% 콘플루언스까지 성장시킨다. 모든 형질주입 시약을 사용 전에 실온으로 승온시킨다. 다음과 같이 형질주입한다:
접시를 균등하게 배양하기 위해 나선형 방식으로 293T에 적가하여 전달한다.
(선택적): 형질주입 후 8 시간에, 융합체 형성 및 (해당되는 경우) 형광을 확인한다.
+2 일차(형질주입 후 48 시간): 수집하고, 15 mL 예비-승온된 완전 DMEM으로 교체한다. 이차 수집과 함께 농축을 향해 이동하기 전에 상청액을 4℃에서 1 일 동안 보관한다.
+3 일차(형질주입 후 72 시간): 수집한다. 접시를 표백하고 흔든다.
(4) 렌티바이러스의 농축
바이러스 상청액을 수집한다.
원심분리기에서 5분 동안 350xg로 상청액을 회전시켜, 세포 파편을 펠릿화한다. 상청액을 초원심분리 튜브로 여과한다(0.45 um 주사기 필터). 최대 총 부피 ~35mL까지 배지를 첨가하고 홀더와 균형을 맞춘다.
2 시간, 25,000rpm, 4℃로 회전시킨다.
상청액을 붓고; 나머지 배지를 완전히 제거하고 100 uL 무혈청 DMEM 배지를 첨가하여, 펠렛을 밤새 4℃에서 용해시킨다. 상하로 피펫팅하지 않는다. 5 일 다음날, 부드럽게 상하로 피펫팅하여 혼합하고(거품을 형성하지 않도록 주의함), 1.5 mL 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 내로 옮긴다.
100 μL 무혈청 DMEM 배지를 초원심분리 튜브에 첨가하여 세척한다. 부드럽게 상하로 피펫팅하고 동일한 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮긴다.
20-50 uL 분취량을 -80℃에서 동결시킨다.
(5) 렌티바이러스 역가분석
Jurkat 세포주를 사용한 FACS에 의해 바이러스를 역가분석한다.
완전 RPMI(10% FBS, P/S, 및 2mM L-glut를 함유함)에서 Jurkat를 성장시킨다.
비형질도입된 대조군에 대한 2 개의 추가 웰과 함께, 1 uL 폴리브렌(f.c. 10 ug/mL)이 보충된 바이러스 당 1 백만/1 mL 12-웰 x 2 웰(중복)을 플레이팅한다. 웰 당 1 μL의 농축된 BaEV 렌티바이러스를 첨가한다.
원심분리기에서 32℃에서 1 시간 동안 1000xg로 회전감염시키며(spinfect), 브레이크를 끄거나 브레이크를 낮춘다(유출을 예방함).
72 시간에, GFP+(또는 ScFv+)를 흐르게 한다.
FSC/SSC, Live/Dead 염료 음성, GFP+(또는 ScFv+)에 대해 게이트를 연다.
Jurkat에 대해 MOI=1이라고 가정하여, 다음과 같이 바이러스 역가를 계산한다:
비형질도입된 대조군으로부터 배경 GFP+(또는 ScFv+)를 제거하고,
바이러스 농도(감염 단위/μL) =(1E6) * %양성
(6) 인간 일차 기억-유사 NK 세포의 회전감염
20 ug/mL RetroNectin(PBS)을 사용하여 4 ug/cm2 플레이트 면적에 상응하는 부피로 플레이트를 코팅한다. 플레이트를 실온에서 2 시간 동안(또는 대안적으로 4℃에서 밤새) 방치시킨다.
* 24-웰 플레이트의 각각의 웰에 0.5 mL 또는 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 2 mL를 분배한다. 비-처치된, 세포 배양-등급 조직 배양 플레이트 또는 접시를 이 단계에서 사용할 수 있다.
RetroNectin 용액을 제거한 다음에, PBS 중 멸균 2% BSA의 적절한 부피로 차단한다. 플레이트를 실온에서 30 분 동안 방치시킨다.
24-웰 플레이트의 각각의 웰에 대해 0.5 mL 또는 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 대해 2 mL를 사용한다.
BSA 용액을 제거하고, 플레이트를 적절한 부피의 PBS로 1 회 세척한다. 세척 용액을 제거한 후, 플레이트는 사용할 준비가 된다.
NK 세포를 전날 신선한 인간 PBMC(칼라(collar))로부터 단리시키고, 5% 인간 AB 혈청을 갖는 Miltenyi NK 증식 배지에서 106 세포/mL에서 rhIL-2(500 IU/mL) + rhIL-12(10 ng/mL) + rhIL-18(50 ng/mL)로 예비-활성화시켰다.
사이토카인 활성화 16-20 시간 후, 세포를 2 회 세척한 다음에, 500 U/mL IL-2를 갖는 무혈청 NK 증식 배지에서 5 × 106 세포/mL로 현탁하였다. Vectofusin-1 및 렌티바이러스(최종 MOI = 10)의 혼합물(300 uL)을 24-웰 플레이트의 하나의 웰에서의 형질도입을 위해 200 uL 세포 현탁액에 첨가하였다. Vectofusin-1의 최종 농도는 10 ㎍/mL였다.
1000xg, 32℃에서 1 시간 동안의 스피노큘레이션(spinoculation)(매우 간단한 1 회 회전감염) 후, 세포를 렌티바이러스와 함께 48 시간 동안 배양하였다. 그 다음에, 세포 배양 배지를 5% 인간 AB 혈청 및 500 U/mL IL-2를 함유하는 신선한 완전 세포 배양 배지로 교환하였다.
형질도입 후 3-4 일에 CAR 발현을 FACS를 통해 측정하고, 형질도입 후 5-6 일에 FACS 및 루시페라아제 분석을 통해 시험관내 NK 세포 항-종양 기능을 평가한다. 생체내 효능 및 안전성 시험을 위해, CAR-NK 세포를 형질도입 후 6-10 일에 NSG 마우스를 보유하는 종양으로 옮긴다.
통계학적 분석
데이터는 달리 나타내지 않는 경우, 적어도 3 개의 독립적인 실험으로부터 평균 ± s.e.로 나타낸다. 2 개의 독립 그룹을 비교하기 위해 양측 t-검정을 사용하였다. 생체내 종양 성장을 양방향 반복-측정 ANOVA를 사용하여 비교하였다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여, 종양-보유 마우스에서의 생존 패턴을 분석하고, 통계적 차이를 만텔-콕스 로그-랭크(Mantel-Cox log-rank) 시험에 따라 평가하였다. p 값 < 0.05를 통계학적으로 유의미한 것으로 고려하였다. 모든 통계학적 분석을 SPSS Statistics 22 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
실시예 1: CAR 구축물을 이용한 기억-유사 NK 세포 조작
급성 골수성 백혈병(AML)은 주요 치료 도전으로 계속되고 있다.
대략 20,830 명의 AML의 새로운 사례가 진단되었고, 10,460 명의 사망자가 미국에서만 2015년에 이 질환에 기인하였다. 높은 연령은 AML에 대한 위험 인자이기 때문에, 고령화 집단은 질환 발생률이 증가할 수 있다. 종래의 화학요법 및 동종이계 줄기 세포 이식을 견딜 수 있는 환자는 완전한 반응을 달성할 수 있지만, 대다수는 재발을 겪고 질환으로 사망한다(Falini B, et al. Discov. Med. 2010;10(53):281-92). 따라서, 본 발명자들의 발전하는 암 면역요법의 이해의 이점을 이용하는 덜 독성적이고 더욱 효과적인 표적화된 요법을 개발할 필요가 있다. 동종이계 조혈모세포 이식(allo-HSCT)은 효과적인 치료이지만, 진행성 질환, 연령, 동반이환, 또는 HLA-매칭된 공여체의 결여로 인해 많은 환자가 후보가 아니며, 장기 임상 성공은 이식편대숙주병(GVHD), 감염, 및 기관 독성에 의해 제한된다. allo-HSCT에 대한 근본적인 면역 치료 기반인 이식편대백혈병(GVL)은 전통적으로 T 세포에 기인하였지만, 더욱 최근의 연구는 추가 GVL에 중요한 역할을 하는 자연 살해(NK) 세포를 확인하였다(Venstrom JM, et al.N. Engl. J. Med. 2012;367(9):805-816; Cooley S, Blood. 2010;116(14):2411-9). 여기서, 본 발명자들은 선천적 NK 세포 기억에 기초한 입양 면역요법을 위해 NK 세포를 무장시키는 새로운 접근법을 기재한다.
사이토카인 유도된 기억-유사(CIML) NK 세포 및 암 면역요법.
신생물 세포를 인식하고, 반응하고, 사멸시키는 면역 세포의 능력을 이용하는 세포 요법은 후기 악성종양을 치료하기 위한 유망한 접근법을 나타낸다. 이 맥락에서, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포로 관찰된 극적인 임상 반응은 이 접근법의 큰 잠재력을 입증한다. 그러나, 많은 암에서의 종양 특이적 항원의 부재, 종양 표적 항원의 손실, 열악한 생체내 지속성 및 사이토카인 방출 증후군(CRS) 및 신경독성을 포함한 중증 독성은 CAR T 세포 요법에 대해 주요 도전으로 남아있다. 또한, CAR T 세포 주입 후 재발한 환자는 매우 제한된 치료 옵션을 갖는다. NK세포는 바이러스-감염되고 악성 형질전환된 세포를 본질적으로 제거할 수 있는 선천성 림프 세포이다. 종래의 NK 세포는 초기 단계 임상 시험에서 약간의 가능성을 나타내었으나, 이들 주입은 소수의 환자에서 비교적 짧은 관해를 야기하였다. 최근, 패러다임-전환 연구는 NK 세포가 선천적 면역 기억을 나타낸다는 것을 나타내었다. 본 발명자들은 IL-12, IL-15, 및 IL-18을 이용한 간략한 시험관내 예비-활성화가 휴지 NK 세포의 활성화 및 분화를 야기하여, 강한 항-백혈병 활성을 갖는 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포를 생성한다는 것을 발견하였다(도 1)(Romee R, et al. Blood. 2012;120(24)). 본 발명자들의 제1-인간-내 1 상 시험에서, CIML NK는 명백한 독성이 없이, 재발된 난치성 AML을 갖는 환자의 >50%에서 임상 반응을 유도하였다(Romee R, Sci. Transl. Med. 2016; 21:357ra123). 또한, 세포는 증식하고, 확장하고, 환자 내로의 입양 전이 후 향상된 항-백혈병 활성을 유지하였다. Id. 이들 데이터는 CIML NK 세포 요법이 효과적이고, 안전하고, 항-백혈병 임상 활성을 제공한다는 것을 나타낸다. CIML NK 세포는 최근에 allo-HSCT 후 재발된 골수성 악성종양을 갖는 환자에서 본 발명자들의 지속적인 시험을 포함한 몇몇 연구에서 평가되고 있다.
CAR 플랫폼으로서의 CIML NK 세포.
CD19-CAR을 생성하기 위한 플랫폼으로서 동종이계 제대혈 유래된 NK 세포를 사용하는 최근의 연구는 재발된 B 세포 악성종양을 갖는 환자에서 유망한 임상 반응을 나타내었다(Rezvani et al, ASH 2018). 특히, 임상 반응은 최소한의 독성으로 달성되었고, 중증 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 신경독성의 사례는 없었다. 이들 임상 관찰은 NK 세포가 유전자 변형된 입양 세포 요법을 위한 새로운 세포 플랫폼을 나타낸다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 CIML NK CAR을 생성하기 위한 방법을 개발하고 전임상 모델에서 이들 유전자 변형된 NK 세포의 효능을 평가하기 위해 CIML NK 세포 요법에 대한 본 발명자들의 사전 임상 경험과 함께 이들 관찰을 기초로 구축할 것이다. CIML NK 세포는 전임상 동물 모델 및 유전자 비-변형된 CIML NK 세포로 처치된 환자에서 생체내에서 보이는 유리한 안전성 프로파일, 증가된 증식, 연장된 지속성 및 향상된 항-백혈병 기능에 기초한 NK 세포 CAR의 발달을 위한 고유한 플랫폼을 제공한다. 또한, 골수모세포를 표적화하는 이들의 고유한 경향은 CAR T 세포가 양호한 표면 표적 항원의 결여로 인해 주로 중간일 뿐인 이득을 나타내거나 이득을 나타내지 않은 AML에 대해 이들을 매력적으로 만든다.
AML에서의 CAR 표적.
AML은 분자적으로 다양한 악성종양이다. NPM1c에서의 돌연변이는 단백질의 비정상적인 세포질 국소화 및/또는 MHC에 의한 제시를 야기한다. 본 발명자들은 AML 모세포의 세포 표면 상의 NPM1c로부터 생성된 신생항원을 표적화할 수 있는 새로운 CAR 구축물을 성공적으로 생성하고 검증하였다.
기억-유사 NK 세포 플랫폼을 사용한 NPM1c 표적화된 CAR 생성.
본원에 기재된 실시양태는 돌연변이된 NPM1c를 갖는 AML에 대한 NK 세포-기반 CAR을 포함한다. TCR 및 종래의 CAR 접근법과 비교하여, 본 발명자들의 접근법은 NK 세포를 무장시키는 이점을 갖는다. NK 세포는 HLA 발현이 없거나 낮은 표적 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있다. 이는 중요할 수 있으며, 이는 HLA 발현이 결여되거나 낮은 수준의 HLA 분자를 갖는 백혈병 세포가 NK 세포에 의해 사멸될 수 있고, 높은 수준의 HLA를 발현하는 백혈병 세포가 본 발명자들의 CAR-NK 세포에 의해 효율적으로 사멸될 수 있기 때문이다. 항원 손실은 CAR-T 요법 후 종양 저항성의 메커니즘이기 때문에, 본 발명자들의 CAR-NK 세포는 요법 및 질환 재발에 대한 저항성을 감소시키는데 효과적인 것으로 입증될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 본 발명자들의 mem-NK CAR 접근법은 AML에서 T 세포 기반 CAR 접근법에서의 도전 중 하나였던 정상 조혈모세포 및 전구체에 영향을 주지 않으면서 백혈병 모세포의 표적화를 상당히 향상시킬 것이다.
CIML CAR-NK 세포의
시험관내
생성을 위한 방법의 최적화.
본 발명자들은 본 발명자들의 CAR 구축물을 사용하여 CIML NK 세포의 형질도입을 최적화하고 있다. CIML NK는 본 발명자들의 이전에 기재된 방법(Romee R, et al. Blood. 2012;120(24) and Romee R, Sci. Transl. Med. 2016; 21:357ra123)을 사용하여 종래의 말초 혈액 NK 세포(정상적인 건강한 자원자 공여체로부터의 것)로부터 생성되고 있다. 종래의 CIML NK 세포(동일한 공여체로부터의 것)에 본 발명자들의 CAR 구축물을 형질도입하고, 이들의 형질도입 효율에 대해 비교할 것이다. 데이터는 사이토카인 활성화된 NK 세포가 렌티바이러스 형질도입뿐 아니라, 뉴클레오펙션(nucleofection)에 더욱 순응성이라는 것을 나타낸다. 형질도입된 NK 세포를 OCI-AML3(HLA-A2+ 항원 +), GMB(HLA-A2- 항원 -) 및 K562(HLA 음성이지만 NK 세포에 대해 민감함)에 대한 시험관내 활성에 대해 평가한다. 본 발명자들은 또한 환자로부터의 HLA-A2+ 항원+ 일차 AML 모세포에 대한 이들의 활성을 시험할 것이다. 본 발명자들은 또한 NK 세포 특이적 CyTOF 패널을 개발하였고, 이는 본 발명자들이 상세한 면역 서브세트 분석을 가능하게 하는 단일 세포 방식으로 최대 38 개의 마커를 평가하게 한다.
본 발명자들은 AML 및 다른 골수성 악성종양(예를 들어, MDS, MPN)에서 다른 돌연변이된 단백질을 효과적으로 표적화하기 위해 본원의 실시양태를 확장하는 과정에 있다.
이종이식 및 PDX 마우스 모델을 사용한
시험관내
및
생체내
CIML NK 및 T 세포 CAR(동일한 CAR 구축물을 가짐)의 활성 비교.
본 발명자들은 이종이식 및 PDX 마우스 모델에서 이들의 시험관내 및 생체내 활성화, 증식, 지속성 및 효능에 대해 CIML CAR-NK 세포 및 T 세포 CAR(동일한 구축물을 보유함)을 평가할 것이다. 동물을 입양 전이 후 7, 14, 28 및 60 일에 희생시켜, 세포의 생체내 지속성, 증식 및 활성(BLI 종양 영상화 및 생존에 기초함) 및 고갈을 평가할 것이다. 본 발명자들은 또한 이들 마우스에서 골수 및 비장을 포함한 핵심 기관들로의 이들 세포의 이동/귀소를 평가할 것이다.
초기 단계 임상 시험을 위한 시판용 제품을 개발하기 위한 증식 방법 최적화.
공급자 세포주(IL21/41BB 형질도입된 K562 세포)를 사용하는 다양한 생체외 증식 방법 및 무 공급자 방법(Sutlu et al, Cytotherapy 2010)을 동결보존 없이 최적의 단기간 증식 및 신선한 주입에 대해 비교할 것이다(Sutlu T, et al. Cytotherapy. 2010;12(8):1044-55; Denman CJ, et al, PLoS One. 2012;7(1):e30264). 이들 증식 방법을 또한 CliniMACS Prodigy 시스템 상에서 시험할 것이며, 이는 자동화되고 폐쇄된 시스템에서의 제조 공정을 허용하므로, 본 발명자들의 미래 시험을 위해 이상적이다. 본 발명자들은 다른 GMP 설비로 용이하게 전해질 수 있는 짧은 소요 시간을 갖는 자동화된 세포 제조 접근법을 개발할 것이다. 본원에 개략적으로 설명된 바와 같이 공정을 최적화한 후, 본 발명자들은 이 공정을 Dana Farber의 CMCF(세포 조작 코어 설비(Cell Manipulation Core Facility))로 전달할 것이다. 본 발명자들은 CIML NK 세포의 제조를 위한 2 개의 활성 IND를 이미 갖고 있으며, 본 발명자들은 이들 세포의 제조 공정을 이미 검증하였다. 본 발명자들은 CIML NK 세포 CAR을 사용하기 위해 본 발명자들의 IND를 제출하고자 한다.
실시예 2: ASCT2 발현에 기초한 기억-유사 NK 세포의 형질도입 효율의 최적화
유전자 조작된 강한 CAR-NK 세포를 생산하는 기술적 양태는 중요하다. 효율적인 형질도입이 T 세포에 대해 달성되었지만, NK 세포에 대해서는 달성되지 않았는데, 이는 NK 세포-기반 암 면역요법 개선에서의 주요 기술적 결점이다. 종래의 렌티바이러스 형질도입 접근법은 수포성 구내염 바이러스 G(VSVG)에 의해 위형화된 표준 렌티바이러스를 사용하지만; NK 세포는 유전자 편집률 1-3%로 VSVG-위형화된 렌티바이러스 형질도입에 대해 매우 저항성인 것으로 알려져 있다.
CIML NK 세포가 위형화된 렌티바이러스에 의한 형질도입을 매개하기 위해 이용될 수 있는 종래의 NK 세포에 대해 별개의 수용체 발현을 갖는지 평가하였다. CIML NK 세포를 Romee, R. et al. Blood 120, 4751-4760 (2012) 및 Romee, R. et al. Sci Transl Med 8, 357ra123 (2016)에 기재되고 도 1에 나타낸 바와 같이 정상적인 건강한 자원자 공여체로부터 단리된 종래의 말초 혈액 NK 세포로부터 제조하였다. 간략하게는, hNK 세포를 피콜 원심분리 및 Rosette Sep(StemCell Technologies, ≥ 95% CD56+CD3-)에 의한 정제를 사용하여 공여체 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리하였다. hNK 세포를 3-5x106 세포를 플레이팅하고, rhIL-12(10 ng/mL) + rhIL-18(50 ng/mL) + rhIL-15(50 ng/mL) 또는 대조군 조건(rhIL-15, 50 ng/mL)을 사용하여 16 시간 동안 활성화시킴으로써 예비-활성화시키고, PBS로 3회 세척하여 사이토카인을 제거하고, 생존을 지지하기 위해 rhIL-15(1 ng/mL)가 보충된 10% 인간 AB 혈청(Sigma-Aldrich)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 배양하였으며, 배지 중 50%를 2-3 일마다 신선한 사이토카인으로 교체하였다.
VSVG 단백질에 의해 결찰된 수용체인 LDL-R의 발현을 유세포 분석에 의해 평가하였다. 종래의 NK 세포 및 CIML NK 세포 둘 다는 LDL-R의 낮은 발현을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 2a). 따라서, NK 세포에서의 형질도입 차단(즉, VSVG-LV를 사용함)은 VSVG 단백질에 대한 상응하는 수용체인 저밀도 지질단백질 수용체(LDL-R)의 이들의 최소 발현에 기여할 수 있다(도 2c). LDL-R을 이용한 VSVG 단백질의 결찰은 표적 세포의 침입 후 렌티바이러스 부착을 위해 중요하며, 따라서 형질도입 효율의 제한 인자이다(도 2c). NK 세포의 고유한 수용체 발현 패턴을 연구함으로써, 본 발명자들의 데이터는 LDL-R에 대한 뚜렷한 대조로, ASCT2의 발현 수준이 일차 종래의 NK 세포에서 풍부하고, 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포에서 추가로 향상된다는 것을 나타내었다(Romee, R. et al. Blood 120, 4751-4760 (2012); Romee, R., et al. Scientifica (Cairo) 2014, 205796 (2014); Romee, R. et al. Sci Transl Med 8, 357ra123 (2016))(도 2b; 도 2c). ASCT2는 비비 외피 당단백질(BaEV-gp1)의 아미노산 수송체 및 상응하는 수용체이다. 따라서, 이론에 구애됨 없이, 비종래의 BaEV 위형화된 렌티바이러스를 이용하여, 본 발명자들은 일차 인간 NK 세포 및 특히 CIML NK 세포에서 형질도입 차단을 극복할 것이다(도 2c).
실시예 3: 항-NPM1c CAR 기억-유사 NK 세포의 생성.
키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 요법은 암 항원을 표적화하는데 알려진 방법이다. 그러나, CAR-T 세포는 이들의 지속성 및 음성적인 부작용으로 인해 제한된다. 활성을 유지하고 암 세포를 향한 효능을 나타내는 CAR-NK 세포의 생성이 필요하다.
CAR 플랫폼으로의 CIML NK 세포.
CD19-CAR을 생성하기 위한 플랫폼으로서 동종이계 제대혈-유래된 NK 세포를 사용한 연구는 재발된 B 세포 악성종양을 갖는 환자에서 임상 반응을 나타내었다(Liu et al. NEJM. (2020) 382:545-53). 임상 반응은 최소 독성으로 달성되었고 중증 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 신경독성의 사례는 없었으며, 이는 NK 세포가 유전자 변형된 입양 세포 요법을 위한 새로운 세포 플랫폼을 나타낸다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포 요법에 대한 본 발명자들의 이전 임상 경험(Romee R, et al Blood (2012) 120(24):4751-4760; Romee R, et al. Sci Transl Med (2016) 8(357):357ra123)과 함께 이들 관찰을 기반으로 하여, CIML NK CAR을 생성하기 위한 방법을 개발하고 전임상 모델에서 이들 유전자 변형된 NK 세포의 효능을 평가할 것이다. CIML NK 세포(도 1)는 전-임상 모델 및 비-변형된 CIML NK 세포로 처치된 환자에서 나타나는 유리한 안전성 프로파일, 증가된 증식, 연장된 지속성 및 향상된 항-백혈병 기능에 기초하여 NK 세포 CAR의 개발을 위한 고유한 플랫폼을 제공한다. Id.
AML에서 CAR 표적으로서 돌연변이된 NPM1c.
대부분의 CAR-T 세포 요법은 종양-연관 항원(TAA)을 표적화하며, 이는 정상 조직에서의 낮은 수준 발현으로 인한 표적상(on-target)/종양외(off-tumor) 독성 및 종양 세포에 의한 항원 발현 손실로 인한 종양 저항성을 야기할 수 있다. 이 결점을 극복하기 위한 하나의 방식은 종양-특이적 종양원성 원인자 유전자 돌연변이를 표적화하는 것이다. NPM1c로 지칭되는 뉴클레오포스민에서의 4-뉴클레오티드 중복은 AML의 ~30%에서 원인자 종양유전자 돌연변이이다. NPM1c는 HLA-A*0201 대립유전자에 의해 제시되는 백혈병-특이적 신생-항원(AIQDLCLAV; 서열번호 1)을 생성한다. 효모 표면 디스플레이를 사용하여, 본 발명자들은 NPM1c 에피토프-HLA-A2 복합체에 특이적으로 결합하는 인간 단일-쇄 가변 단편(scFv)을 단리하였다. 이 항원을 표적화하는 이전에 확인된 scFv는 미국 가특허 출원 제62/987,612호(본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 본 발명자들은 scFv 인-프레임(in-frame)을 CD8α 힌지 및 막관통(TM) 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인 및 CD3z 활성화 도메인 후, 자가-절단 P2A 및 EGFP를 함유하는 CAR 백본에 클로닝함으로써 CAR 구축물을 생성하였다(도 3a 및 표 3).
이전에 기재된 바와 같이, 항-NPM1c CAR-T 세포는 AIQ-HLA-A2 복합체를 특이적으로 인식한다. 간략하게는, 비오티닐화된 AIQ-HLA-A2와 함께 항온처리된 후, 스트렙타비딘-APC 염색이 이어진 GFP+ 항-NPM1c CAR-T 세포(서열번호 30의 항-NPM1c CAR을 가짐)은 AIQ-HLA-A2 복합체에 결합하지만(도 3b), HLA-A2 제시 대조군 펩티드 에피토프(예를 들어, SLL; SLLMWITQC(서열번호 62)) 또는 HLA-A2 단독에 대해서는 그렇지 않은 것으로 나타났다(데이터는 나타내지 않음). 비형질도입된 T 세포는 3 개의 복합체 중 어느 것에도 결합을 나타내지 않았다. 이 결과는 AIQ-HLA-A2 복합체에 대한 NPM1c-CAR-T 세포(서열번호 30의 항-NPM1c CAR을 가짐)의 특이성을 확인한다. 단리된 scFv를 갖는 조작된 CAR-T 세포는 NPM1c+ HLA-A2+ 백혈병 세포에 대해 시험관내 및 생체내 둘 다에서 강한 세포독성을 나타내었지만, NPM1c- HLA-A2+ 또는 HLA-A2- 종양 세포에 대해서는 그렇지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
여기서, 본 발명자들은 HLA-A*0201과 복합체화된 NPM1c 신생-항원을 인식할 수 있는 CAR 구축물로 형질도입된 CIML NK 세포를 사용함으로써 AML에 대한 NK 세포-기반 CAR을 개발할 것이다. NK 세포는 HLA 발현이 없거나 낮은 표적 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있다. 이는 낮은 수준의 HLA를 갖는 백혈병 세포가 CAR-독립적 메커니즘을 통해 NK 세포에 의해 사멸될 수 있는 한편, 높은 수준의 HLA 및 이에 따라 더욱 NPM1c 신생항원-HLA-A2 표적을 발현하는 백혈병 세포는 NPM1c CAR-NK 세포에 의해 표적화되고 사멸될 수 있기 때문에 중요할 수 있다. 항원 손실은 CAR-T 요법 후 종양 저항성의 중요한 메커니즘이기 때문에, NPM1c CAR-NK 세포는 요법 및 질환 재발에 대한 저항성을 감소시키는데 효과적인 것으로 입증될 수 있다.
CAR CIML NK 세포의 강한 항-AML 기능.
아래 추가로 기재되는 바와 같이, 본 발명자들은 비종래의 렌티바이러스 형질도입 접근법을 통해 항-NPM1c CAR을 CIML NK 세포에 도입하였고, 50% 초과의 CAR-편집 효율을 달성하였다(도 5). 이들의 비형질도입된 대응물과 비교하여, 항-NPM1c CAR(서열번호 30에 따름)을 보유하는 CIML NK 세포는 향상된 항-AML 기능을 획득하였고, 이는 NPM1c+ 표적 AML 세포(OCI-AML3)로 펄싱될(pulsed) 때, 상승된 수준의 IFN-감마 생산뿐 아니라, 탈과립 마커 CD107a의 증가된 발현에 의해 나타난다. 요약하면, 본 발명자들은 NPM1c와 같은 종양-특이적 세포내 단백질을 특이적으로 및 효율적으로 표적화하기 위해 CAR-NK 플랫폼을 구축하였다.
기억-유사 NK 세포
사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포는 IL-12, IL-18, 및 IL15를 포함하는 사이토카인을 이용한 예비-활성화에 의해 야기된 장기 향상된 기능성을 갖는 NK 세포이다. CIML NK 세포는 초기 사이토카인 자극의 부재 하에도 미래 감염 또는 도전 동안 리콜 반응(recall response)을 개시한다. CIML NK 세포를 생성하기 위해, 실시예 2의 방법을 사용하였다. 간략하게는, 말초 혈액 단핵 세포를 인간으로부터 단리시키고, rhIL-12(10 ng/mL) + rhIL-18(50 ng/mL) + rhIL-15(50 ng/mL) 또는 대조군 조건(rhIL-15, 50 ng/mL)으로 16 시간 동안 자극하고, 3 회 세척하여 사이토카인을 제거하고, 생존을 지지하기 위해 rhIL-15(1 ng/mL)가 보충된 10% 인간 AB 혈청(Sigma-Aldrich)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
형질도입
일차 인간 및 마우스 NK 세포의 형질도입은 다양한 도전을 제기하며, 최소 성공을 상이한 유전자 전달 프로토콜로 관찰한다. 이 과정을 매개하기 위해, 위형화된 렌티바이러스-기반 방법을 이용하였다. VSVG-(수포성-구내염-바이러스-G 단백질) 및 BaEV-LV(비비 외피 당단백질) 둘 다는 유전 물질을 NK 세포에 성공적으로 전달하는 것으로 알려져 있다. NK 세포는 VSVG 수용체 저밀도 지질단백질(LDL-R) 및 BaEV 수용체 알라닌, 세린, 시스테인 수송체 2(ASCT2)를 발현한다. 이들 수용체 둘 다의 표면 발현을 유세포 분석을 사용하여 종래의(사이토카인 유도되지 않은) ML NK 세포 상에서 측정하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, LDL-R 수준(도 2a)은 ASCT2(도 2b)에 비해 적게 발현되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 더욱 강한 렌티바이러스 접근법을 생성하기 위해, BaEV로부터의 당단백질(서열번호 107에 의해 기재된 아미노산 서열; 서열번호 108에 의해 기재된 뉴클레오티드 서열)을 코딩 서열 내로 삽입하여, ASCT2를 인식할 BaEV 당단백질로 위형화된 렌티바이러스를 생성하였다. BaEV 당단백질로 위형화되고 항-CD19 CAR을 코딩하는 렌티바이러스 구축물을 도시하는 지도가 도 28에 도시되어 있다. 렌티바이러스 발현 구축물을 도 3a 및 표 3에서 확인되는 항-NPM1c CAR을 발현하기 위해 제조하였으며, BaEV 당단백질("BaEV-LV"라 칭함)로 위형화하였다. 구축물을 EF-1-알파 프로모터의 제어 하에 렌티바이러스 패키징 플라스미드 내로 클로닝하고, 렌티바이러스를 HEK 293T 세포에서의 일시적 형질주입에 의해 생성하였다. 상청액을 함유하는 LV의 역가를 FACS에 의해 정량화하였다.
CAR 형질도입 전에 상이한 사이토카인을 이용한 ML NK 세포의 유도가 ASCT2의 발현에 영향을 주는 경우를 이해하기 위해, 세포를 유도하고 발현에 대해 분석하였다. 구체적으로, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수집하고, 인간 NK(hNK) 세포를 샘플로부터 정제하였다. 그 다음에, hNK 세포를 상기 기재된 용량을 사용하여 IL-15, IL-12, 및/또는 IL-18의 상이한 조합으로(즉, 10 ng/mL의 rhIL-12; 50 ng/mL의 rhIL-18; 50 ng/mL의 rhIL-15) 16 시간 동안 자극하였다. 그 다음에, 세포를 세척하고 상기 기재된 BaEV-LV 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 항-NPM1c CAR(서열번호 30에 기재된 뉴클레오타이드 서열)로 형질도입하고, 72 시간 후, 기능성 항-NPM1c-CAR-ML hNK 세포를 생성하였다(도 6a).
hNK 세포를 IL-15, IL-12, 및 IL-18 중 하나 이상으로 자극하였을 때, ASCT2의 표면 발현은 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이 IL-15, IL-12, 및 IL-18 중 하나 초과를 이용한 자극으로 증가하였다(도 6b). 구체적으로, IL-15, IL-12, 및 IL-18을 이용한 동시 처치는 IL-15 단독에 비해 발현을 더욱 증가시켰다.
정량적 PCR(qPCR)을 사용하여 종래의 NK 세포에 대해 CIML NK 세포에서 mRNA 수준에서 ASCT2 발현이 변경되었는지를 추가로 확인하였다. 간략하게는, 일차 인간 NK 세포를 상기 기재된 방법을 사용하여 3 개의 상이한 건강한 인간 공여체로부터 얻어진 PBMC로부터 단리시켰다. hNK 세포를 웰 당 3-5x106 세포로 플레이팅하고, (i) rhIL-12(10 ng/mL) + rhIL-18(50 ng/mL); 또는 (ii) rhIL-12(10 ng/mL) + rhIL-18(50 ng/mL) + rhIL15(50-ng/mL)에 대한 노출에 의해 16 시간 동안 활성화시켰으며; 대조군 조건은 rhIL-12(10 ng/mL) 단독, rhIL-18(50 ng/mL) 단독, 또는 rhIL-15(50 ng/mL) 단독에 대한 노출이었다. 활성화 후, 세포를 PBS로 3 회 세척하여 사이토카인을 제거하고, qPCR 분석을 위해 RNA를 추출하였다. ASCT2 RNA 전사체의 정량화를 ΔΔCt 방법을 사용하여 수행하였다. 도 6c-6e는 3 개의 상이한 인간 공여체로부터의 활성화된 hNK 세포에 대한 정량화를 제공한다. 도 6c-6d에 나타낸 바와 같이, IL-12 및 IL-18로 활성화된 NK 세포는 대조군 hNK 세포에 대해, 특히 IL-15 단독으로 활성화된 대조군 hNK 세포와 비교하여 ASCT2 RNA 전사체의 증가된 발현을 가졌다. 도 6e에 나타낸 바와 같이, IL-15, IL-12, 및 IL-18로 활성화된 NK 세포는 IL-15 단독으로 활성화된 대조군 hNK 세포에 대해 ASCT2 RNA 전사체에서 >3 배 증가를 가졌다.
이와 함께, 이들 발견은 IL-12 및 IL18 또는 3 개 사이토카인 전부(IL-12, IL-18, IL-15)를 이용한 활성화가 ASCT2 RNA 전사체의 발현 및 hNK 세포에서의 표면 발현을 개선하고 BaEV-LV를 이용한 형질도입 효율을 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
그 다음에, ML-NK 세포를 항-NPM1c CAR로 형질도입하고, 형질도입 효율을 측정하였다. 구체적으로, 상기 기재된 CAR 구축물은 GFP 리포터를 함유한다. GFP 발현 수준을 형질도입된 세포에서 측정하였다. 도 6f는 3 개 사이토카인 전부를 이용한 예비-활성화가 BaEV-LV의 형질도입 효율을 개선하였다는 것을 나타낸다.
BaEV-LV 렌티바이러스 형질도입을 이용한 형질도입을 상이한 인간 공여체로부터 얻어진 CIML-NK 세포에서 평가하였다. CAR 발현을 단백질 L을 사용하여 유세포 분석에 의해 측정하였다(예를 들어, Zheng, et al (2012) J. Transl Med. 10:29 참고). 도 7a에 나타낸 바와 같이, 형질도입 후 단백질 L 결합에 의해 항-NPM1c CAR의 발현으로서 결정된 전체 형질도입 비율은 6 개의 상이한 공여체에 대해 56±14%였다.
또한, BaEV-LV 렌티바이러스 형질도입을 이용한 형질도입을 인간 및 마우스 공여체로부터 얻어진 CIML-NK 세포에서 평가하였다. 인간 CIML-NK 세포를 상기 기재된 바와 같이 PBMC로부터 얻어진 일차 hNK 세포의 rhIL-12, rhIL-15, 및 rhIL-18을 이용한 예비-활성화에 의해 얻었다. 마우스 비장세포를 수집하고, 마우스 NK 세포를 단리시키고, 재조합 마우스 IL-12, IL-15, 및 IL-18로 예비-활성화시킴으로써 마우스 CIML-NK 세포를 얻었다. BaEV로 위형화된 렌티바이러스는 GFP(Lenti-GFP(BaEV))를 코딩하였다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, GFP 발현에 의해 측정된 바와 같은 형질도입의 비율은 인간 및 마우스 CIML-NK 세포 둘 다에서 높았다.
실시예 4: ML NK 세포 서브세트 사이의 ASCT2의 발현
ASCT2 발현이 NK 세포의 서브세트 사이에서 달라졌는지 여부를 추가로 평가하였다. 도 7c에 나타낸 바와 같이, hNK 세포는 이들의 발달 및 성숙 단계에 기초하여 상이한 표현형 마커를 발현한다. 덜 성숙된(예를 들어, 더욱 "줄기-유사") 내지 완전히 성숙된 특징적인 표현형 마커를 아래 표 4에 나타내었다.
유세포 분석을 사용하여, 상기 나타낸 표현형 마커에 기초하여 인간 NK 세포 서브세트를 분석하고, ASCT2 발현을 각각의 서브세트에 대해 결정하였다. 간략하게는, hNK 세포를 실시예 3에 기재된 바와 같이 4 개의 상이한 인간 공여체로부터 얻어진 신선하거나 동결된 PBMC로부터 단리시켰다. 그 다음에, hNK 세포를 밤새 휴지시켰다. 세포를 CD56, CD3, CD16, KIR, CD57, 및 ASCT2를 표적화하는 표지된 항체로 염색하고, 세척한 다음에, 유세포 분석을 거쳤다. 사용된 게이팅 전략을 도 7d에 나타내었으며, 이는 (덜 성숙된 것으로부터 더욱 성숙된 것까지의 순서로) 다음 hNK 서브세트를 확인시켰다:
(i) NK1: CD56bright; CD16-/low;
(ii) NK2: CD56dim; CD16+; KIRs-;
(iii) NK3: CD56dim; CD16+; KIRs-; CD57-;
(iv) NK4: CD56dim; CD16+; KIRs+; CD57+.
도 7e-7f에 나타낸 바와 같이, 높은 표면 수준의 ASCT를 발현하는 집단의 비율은 hNK 세포 서브세트의 성숙 단계와 상관관계가 있었다. 구체적으로, 높은 것으로부터 낮은 것까지의 ASCT2 표면 발현은 hNK 세포에 대해 NK1>NK2>NK3>NK4였다. 데이터는 상이한 인간 공여체로부터 얻어진 hNK 세포 서브세트에 걸쳐 일관적이었다.
실시예 5: 항-NPM1c CAR-ML NK 세포는 급성 골수성 백혈병에 대해 강하다.
급성 골수성 백혈병(AML)은 NPM1c를 발현하는 것으로 알려져 있다. 항-NPM1c CAR-ML NK 세포가 AML에 대해 비형질도입된 NK 세포에 비해 더욱 강한지를 조사하기 위해, 각각의 세포의 집단을 AML 세포주와 함께 배양하고, 둘 다 NK 세포 활성화에 대한 마커인 IFN-γ 및 CD107a의 발현을 측정하였다. 구체적으로, NPM1c+/HLA-A2+인 OCI-AML3 세포를 4 시간 동안 항-NPM1c CAR-ML NK 세포와 함께 공동-배양하였다. 세포를 수집하고, 유세포 분석을 수행하였다. 세포를 CD56, CD107a, 및 IFΝγ에 대해 염색하였다. 항-NPM1c-CAR-ML NK 세포는 비형질도입된 세포(IL15, IL12, 및 IL18로 자극된 ML NK 세포)와 비교하여 IFN-γ 및 CD107a의 증가된 발현을 나타내었다(도 8a). 이 증가된 발현은 표적 AML 세포의 존재 하에 비형질도입된 세포와 비교하여 높은 효능 및 NK 세포 활성화를 제시한다.
질량 세포분석은 단일 세포에 대한 다수의 파라미터의 고-처리량 분석을 허용하고, 인간 NK 세포의 깊은 면역표현형에 대해 사용된다(Strauss-Albee (2015) Sci Transl Med 7:297ra115; Amir, et al (2013) Nat Biotech 31:545). 따라서, NPM1c+ 표적 세포와의 공동-배양 후 항-NPM1c CAR ML-NK 세포의 발현 프로파일의 광범위한 분석을 NK-특이적 CyTOF 패널을 사용하여 수행하였다(예를 들어, Romee et al (2016) Sci Transl Med 8:357ra123 참고). 간략하게는, 항-NPM1c CAR ML-NK 세포 또는 비형질도입된 ML-NK 세포를 6 시간 동안 OCI-AML3 세포와 함께 공동-배양하였다. 그 다음에, 세포를 질량 세포분석 패널을 사용하여 분석하였다. 3 명의 인간 공여체에 대해 다양성을 평가하였다. 정량화를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Diggins, et al (2015) Methods 82:55). 도 8b에 나타낸 바와 같이, CD107a, IFΝγ, 및 그랜자임 B는 비형질도입된 NK 세포에 대해 CAR ML-NK 세포에서 향상되었다. 이들 데이터는 CAR-NK 세포가 백혈병 세포를 사멸시키는 향상된 기능성을 갖는다는 것을 제시한다. 도 8c에 나타낸 바와 같이, 다중 활성화 마커(CD25, CD69, ICOS, 및 CD226)는 CAR ML-NK 세포에서 증가하였다. 활성화 마커 CD62L을 또한 증가시켰다(특히 하나의 공여체로부터의 CAR ML-NK 세포에서). 이들 데이터는 CAR-NK 세포가 이들의 비형질도입된 대응물에 비해 더욱 활성이었다는 것을 나타낸다. 도 8d에 나타낸 바와 같이, 다중의 활성화 수용체(NKp30, NKG2D, NKp44)는 CAR-NK 세포에서 증가하였다. 전체적으로, 이들 데이터는 CAR-NK 세포가 비형질도입된 NK 세포와 비교하여 높은 수준의 활성화 수용체를 발현한다는 것을 나타낸다. 도 8e에 나타낸 바와 같이, 특정 성숙 마커(CD56, NKG2A)는 CAR-NK 세포에서 향상된 한편, 마커 CD57은 감소하였다. 이들 데이터는 CAR-NK 세포가 비형질도입된 NK 세포와 비교하여 덜 성숙하다는 것을 나타낸다. 도 8f에 나타낸 바와 같이, 고갈 마커 TIGIT는 CAR-NK 세포에서 향상되었다. 도 8g에 나타낸 바와 같이, 아폽토시스 마커 TRAIL은 CAR-NK 세포에서 감소하였고, 이는 CAR-NK 세포가 비형질도입된 NK 세포에 대해 개선된 수명을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 6: IL-15를 이용한 공동-형질도입은 항-NPM1c CAR-ML NK 세포의 효능을 개선한다.
IL-15를 이용한 공동-형질도입이 항-NPM1c CAR-ML NK 세포의 효능을 추가로 향상시킬 것인지를 평가하였다. P2A 자가-절단 펩티드를 통해 막 결합된 IL-15(mIL-15) 또는 분비를 겪을 수 있는 IL-15의 가용성 버전(sIL-15)에 연결된 항-NPM1c CAR을 코딩하기 위해 렌티바이러스 구축물을 제조하였다. mIL-15는 C-말단 CD8 힌지 및 막관통 도메인을 포함하였다. mIL-15 및 sIL-15의 전장 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 표 5에 기재하였다. 항-NPM1c-mIL-15 또는 항-NPM1c-sIL15(각각 "CAR-m15" 및 "CAR-s15"로 지칭됨)를 코딩하기 위해 BaEV 당단백질로 위형화된 렌티바이러스 발현 구축물을 제조하였다. CIML NK 세포를 CAR-m15 또는 CAR-s15로 형질도입하였을 때, 형질도입된 세포는 비형질도입(UT) 세포와 유사하게 시험관내에서 증식을 유지하였다(도 9a). 실시예 3에만 기재된 바와 같이 항-NPM1c CAR로 형질도입된 CIMNL NK 세포에 대해 비교하였다. 증식에 걸쳐서도, CAR의 표면 발현(% 단백질 L 결합에 의해 측정된 바와 같음)은 유세포 분석에 의해 형질도입 후 4 일차 및 23 일차에 측정하였을 때 유지되었다(도 9b-9c).
다음으로, NPM1c를 발현하는 AML 표적 세포의 항-NPM1c CAR-ML NK 세포에 의한 특이적 사멸을 NPM1c의 발현이 결여된 AML 세포와 비교하였다. 이를 위해, 항-NPM1c CAR-ML-NK 세포가 NPM1c+ 세포를 향한 이들의 효능과 함께 NPM1c-AML 세포에 대해 강한지 여부를 조사하였다. CIML NK 세포를 CAR-s15 LV 또는 CAR-m15 LV로 형질도입시켰다. AML 세포주를 발현하는 2 개의 루시페라아제의 표적 세포 사멸을 분석하였다; OCI-AML3(NPM1c+, HLA-A2+, Luc+) 및 OCI-AML2(NPM1c-, HLA-A2+, Luc+). 첫번째로, 세포를 항-NPM1c CAR-CIML NK 대 AML 세포의 1:1 비로 공동-배양하고, 공동-배양 5 시간 후에 수집하였다. 유세포 분석에 의해 측정된 IFΝγ 발현이 NPM1c+(OCI-AML3) 세포와 공동배양된 항-NPM1c CAR ML-NK 세포에서 증가하였다(도 10a).
또한, 표적 세포(AML)의 아폽토시스 비율을 4 시간 동안 상이한 이펙터:표적(E:T) 비에서 공동-배양함으로써 측정하였다. 아폽토시스는 NPM1c 음성 세포와 비교하여 NPM1c를 발현하는 이펙터 세포에서 증가되었다(도 10b). CAR 구축물 둘 다는 NPM1c 양성 세포에서 아폽토시스를 유도하는데 성공적이었으며, 이는 아넥신 V 유세포 분석에 의해 측정하였을 때, 초기 아폽토시스를 나타내었다.
NK 세포를 각각의 AML 세포주와 24 시간 동안 공동-배양한 후, 루시페라아제 발현의 측정에 의해 효과적인 세포 사멸을 추가로 측정하였다. 항-NPM1c CAR 단독으로 형질도입된 ML-NK 세포에 대해 비교하였다. 24 시간 동안 상이한 E:T 비에서 배양하였을 때, 표적 세포의 생존율은 OCI-AML3 세포에서 감소된 반면에(도 10c의 좌측 패널), NPM1c-OCI-AML2 세포에서는 생존이 영향을 받지 않았다(도 10c의 우측 패널). 또한, IL15로 공동-형질도입된 ML-NK 세포는 항-NPM1c CAR 단독으로 형질도입된 ML-NK 세포에 대해 NPM1c-발현 표적 세포의 증가된 사멸을 나타내었다. 이와 함께, 이들 결과는 특히 IL-15로 공동-형질도입될 때, NPM1c 발현 AML 세포에 대한 항-NPM1c CAR-CIML NK 세포의 성공적인 효능을 나타내고, NPM1c를 발현하지 않는 AML 세포에 대해서는 세포독성 효과가 없다는 것을 나타낸다.
CAR 단독 또는 CAR 및 mIL15로 형질도입된 CIML NK 세포의 추가의 비교를 수행하였다. 상기 설명한 바와 같이, CAR을 이용한 형질도입은 항-NPM1c CAR을 코딩하는 BaEV-LV를 사용하여, 형질도입 후 72 시간에 측정된 바와 같이 일차 인간 CIML NK 세포에서 효율적인 것으로 밝혀졌다(도 10d). 그러나, CAR 및 mIL-15를 공동-형질도입하기 위해 BaEV-LV를 사용함으로써, CAR을 코딩하는 BaEV-LV 단독으로 형질도입된 세포에 대해 큰 증식이 관찰되었다(도 10e). CAR을 코딩하는 BaEV 및 mIL-15로 형질도입된 CIML NK 세포에서 IFN-감마 및 CD107a의 발현은 OCI-AML 표적 세포를 이용한 4 시간 자극 후, CAR을 코딩하는 BaEV 단독으로 형질도입된 CIML NK 세포와 유사하였다(도 10f). 그러나, CAR 및 mIL-15로 공동-형질도입된 CIML NK 세포는 공동-배양 4 시간 후에 측정하였을 때, 표적 OCI-AML3 세포 사멸에 더욱 효과적이었다(도 10g). 세포 사멸을 7-AAD를 사용한 유세포 분석에 의해 측정하였다.
실시예 7: 항-NPM1c CAR-ML NK 세포는
생체내
에서 AML에 대한 효능을 나타낸다.
생체내에서 항-NPM1c CAR-ML NK 세포의 항백혈병 활성을 시험하기 위해, AML 마우스 모델을 분석하였다. 도 11a에 나타낸 바와 같이, NK 세포를 건강한 인간 공여체의 말초 혈액 단핵구 세포로부터 단리시켰다. 단리 후, 세포를 실시예 3에 기재된 바와 같이 사이토카인과 함께 배양하여, ML-NK 세포를 생성하였다. -10 일차에, 세포를 실시예 3에 기재된 형질도입 방법을 사용하여 항-NPM1c-CAR(서열번호 30)로 형질도입하였다. 세포를 배양하는 동안, -7 일차에, 마우스를 방사선조사하여, 면역 세포를 제거하고, 1x106 AML3-luc 세포를 -5 일차에 주사하였다. 0 일차에, 마우스에 NK 세포를 주사하였다. 주사는 약 500k 항-NPM1c-CAR ML NK 세포를 갖는 총 1x106 세포를 포함하였다. AML 부담을 3 일차, 10 일차, 및 13 일차에 루시페라아제 구축물에 대한 영상화를 사용하여 측정하였다(도 11b). 항-NPM1c CAR-ML NK(및 분비된 IL15 또는 막-결합된 IL15) 처치된 마우스는 12 일차까지 AML 부담에서의 감소를 나타내었다(도 11c). 이들 결과는 전체 AML 부담 감소에서 비형질도입된 NK 세포와 비교하여 항-NPM1c CAR-CIML NK의 성공적인 효능을 나타낸다.
실시예 8: AML 종양에 대한 생체내 효능
CAR CIML NK 세포의 생체내 효능 및 안전성은 액체 및 고체 종양에 대해 입증되고 있다. 본 발명자들은 생체내 항-백혈병 활성에 대해 NPM1c-CAR을 보유하는 CIML NK 세포(3 개의 구축물) 및 동일한 구축물로 형질도입된 CAR-T 세포를 평가할 것이다. 이론에 구애됨 없이, 본 발명자들의 고유한 CIML-NK CAR 접근법은 정상 조혈모세포 및 전구체에 영향을 주지 않거나 중증 독성을 야기하지 않으면서 백혈병 모세포의 표적화를 향상시킬 것이며, 이는 AML에서 T 세포-기반 CAR 접근법을 이용한 주요 도전 중 하나였다. 간략하게는, 본 발명자들은 luc+ OCI-AML3을 이전에 주사한 NSG 마우스를 사용하여 이종이식 마우스 모델에서 이의 활성화, 증식, 지속성 및 효능을 평가할 것이다. 동물을 입양 전이 후 7, 14, 28 및 60 일에 희생시켜, 생체내 지속성, 증식 및 활성(생체발광 종양 영상화 및 생존에 기초함)을 평가할 것이다. 본 발명자들은 또한 골수와 비장을 포함한 핵심 기관으로의 이들 세포의 이동/귀소를 검증할 것이다. NK 세포 고갈이 이의 항-종양 활성에 음성적으로 영향을 주기 때문에 활성 조사 영역인 것을 고려하면(Felices et al., 2018), 본 발명자들은 표적 재-자극시 본 발명자들의 NK-특이적 CyTOF 패널을 통하고 이의 IFN-γ 분비에 의해 세포의 생체내 고갈을 특징화할 것이다(즉, OCI-AML3 및 K562). 본 발명자들은 또한 NSG 마우스에서 입양 전이된 CIML CAR-NK 세포의 증식 및 지속성을 최적화하기 위해 IL-2, IL-15 및 IL-15/IL-15Rα의 효능을 비교할 것이다. 이는 NK 세포 고갈을 예방하기 위한 상이한 투여 전략을 시험하는 것을 포함할 것이다. 이종이식 마우스에서의 초기 최적화 후, 본 발명자들은 DFCI에서 이용가능한 NPM1c+ 환자-유래된 이종이식(PDX) 모델에서 이 전략을 검증할 것이다.
본 발명자들은 또한 고전적인 VSVG-위형화된 렌티바이러스를 시험하였으며, 형질도입 효율은 정규 및 CIML NK 세포에서 1-3%의 범위에서 매우 낮았다. 예를 들어, BaEV 렌티바이러스를 사용하여, 본 발명자들은 또한 IL-15, IL-15 + IL-12, 및 IL-15+IL-12+IL18의 상이한 사이토카인 예비-활성화를 갖는 NK 세포의 형질도입 성능을 비교하였고, 후자(CIML NK 세포를 생성함(Romee et al., 2016))가 최고로 수행되었다는 것을 발견하였다.
실시예 9: 암 면역요법에 사용하기 위한 CAR ML NK 세포의 유리한 특성
본원에 기재된 바와 같은 CAR-기억-유사 NK 세포와 TCR을 발현하도록 조작된 다른 NK 세포 사이의 차이는 예를 들어, 다음을 포함한다:
기억-유사("CIML") 일차 NK 세포 대 다른 비-기억-유사 NK 세포 또는 NK 세포주(예를 들어, NK92 세포주)를 조작된 NK 세포의 진행 중인 대부분의 시험에 사용하였다(Xie et al., 2020). 또한, Mensali et al., 2019; Walseng et al., 2017을 참고한다.
친화도: 본 발명자들의 scFv-기반 CAR 구축물은 펩티드/MHC 복합체에 대한 이의 TCR-기반 대응물에 비해 펩티드/MHC 복합체에 대해 ~100 배 강한 친화도를 갖는다. 표적에 대한 CAR의 강한 결합은 NK 세포의 강한 활성화 및 이에 따른 강한 살해 활성을 야기한다. T 세포에서, 펩티드/MHC와의 TCR 상호작용은 약한 결합 친화도를 보상하기 위해 CD4 또는 CD8과 같은 공동-수용체를 요구하며; 반대로, NK 세포는 최적화된 시그널링 및 강한 활성화 및 기능의 후속 유도를 이상적으로 지지하기 위해 온전한 TCR 시그널링 구획을 갖지 않는다.
현재까지 세포내 항원을 표적화할 수 있는 TCR을 발현하기 위해 T 세포 및 NK 세포주(NK92 세포)를 형질도입하였다. 이는 일차 NK 세포 및 일차 NK CIML 세포를 TCR로 형질도입시킬 수 있는 한편, scFv-기반 CAR 구축물과 비교하여 이들의 많이 낮은 항원/에피토프 친화도와 함께 이러한 형질도입에 대한 실질적인 결점이 있을 수 있다. scFv 기반-CAR 구축물을 사용하여, 본 발명자들은 유리한 형질도입 비율을 달성하고, 일차 NK 및 기억-유사("CIML") NK 세포로 수행되지 않은 세포내 항원을 표적화할 수 있다. 게다가, TCR과 비교하여 scFv의 짧은 길이는 또한 높은 형질도입 비율을 유지하면서 구축물 내로 IL-15의 막 또는 분비 버전과 같은 추가 모듈을 첨가하도록 허용한다.
실시예 10
세포내 NPM1C로부터 유래된 네오에피토프를 표적화하는 조작된 기억-유사 NK CAR은 급성 골수성 백혈병에 대해 강한 활성 및 특이성을 나타낸다.
도입: 급성 골수성 백혈병(AML)은 치료적 도전이 계속되고 있다. 덜 독성적이고 더욱 효과적인 표적화된 요법을 개발할 필요성이 생겨나고 있다. 자연 살해(NK) 세포는 "사멸을 위해 탄생"하였지만, 이식편대숙주병, 사이토카인 방출 증후군, 또는 신경독성의 위험은 없는, 효과적인 암 치료를 위해 중요한 많은 핵심 속성을 보유한다. 또한, 이들의 표적 골수 모세포에 대한 본질적인 경향은 이들을 AML에 대해 매력적으로 만든다. 혈액암에서의 유망한 임상 결과에도 불구하고, NK 세포-기반 요법의 개발은 대부분 NK 세포의 짧은 수명, 부적절한 증식 및 특이적 종양 표적화의 결여로 인해 도전적인 채로 남아있다. 여기서, 본 발명자들은 선천적 세포 기억에 기초한 입양 면역요법을 위해 NK 세포를 무장시키는 새로운 접근법을 이용하였다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 면역 이펙터 세포의 항-종양 특이성 및 활성을 유의미하게 향상시킨다. 본 발명자들의 CAR-NK 세포는 AML에서 종양-특이적 네오에피토프를 표적화하고, 효능을 향상시키고 독성을 최소화하기 위해 이들의 설계에서 강한 기능 경로를 이용한다.
방법:
1. AML에서 CAR 표적으로서 돌연변이된 NPM1c. 대부분의 CAR-T 세포 요법은 종양-연관 항원(TAA)을 표적화하며, 이는 표적상/종양외 독성뿐 아니라, 종양 저항성을 야기할 수 있다. 이들 결점을 극복하는 하나의 방식은 종양-특이적 종양원성 원인자 돌연변이를 표적화하는 것이다. NPM1c로 지칭되는 뉴클레오포스민에서의 4-뉴클레오티드 중복은 AML의 약 35%에서 원인자 종양유전자 돌연변이이다. 돌연변이는 HLA-A2 대립유전자에 의해 제시되는 네오에피토프를 생성한다. 효모 표면 디스플레이를 사용하여, 본 발명자들은 NPM1c 에피토프-HLA-A2 복합체에 특이적으로 결합하지만, HLA-A2 단독 또는 대조군 펩티드가 로딩된 HLA-A2에는 그렇지 않은 인간 단일쇄 가변 단편(scFv)을 단리시켰다.
2. CAR 플랫폼으로서 사이토카인-유도된 기억-유사(CIML) NK 세포. CIML NK 세포는 본 발명자들이 전-임상 모델(Romee et al, Blood 2012) 및 비-변형된 CIML NK 세포로 처치된 환자(Romee et al, Science Trans Med 2016)에서 관찰한 유리한 안전성 프로파일, 증가된 증식, 연장된 지속성 및 향상된 항-백혈병 기능에 기초한 NK 세포 CAR의 개발을 위한 고유한 플랫폼을 제공할 수 있다.
3. 일차 NK 세포에서의 효율적인 유전자 편집. 본 발명자들은 CIML NK 세포 상에서 높은 발현을 갖는 고유한 단백질에 기초한 비종래의 위형화된 렌티바이러스를 이용함으로써 일차 인간 및 마우스 NK 세포에서의 형질도입 차단을 극복하였다.
결과:
1. 단리된 scFv를 갖는 조작된 CAR-T 세포는 NPM1c HLA-A2 백혈병 세포(OCI-AML3) 및 일차 AML 모세포에 대해 시험관내 및 생체내 둘 다에서 강한 세포독성을 나타내지만, NPM1c HLA-A2 백혈병 세포(OCI-AML2) 또는 HLA-A2 종양 세포(PC-3)에 대해서는 그렇지 않다.
2. 그러나, 항-NPM1c CAR-T 세포의 생체내 항-백혈병 효능은 일시적이었고(비형질도입된 T 세포가 입양 전이된 대조군 마우스와 비교하여, 전체 생존은 28 일 내지 42 일 연장되었고, 중간 생존은 21 일 내지 37 일 연장되었음), 무시할 수 없는 독성을 가졌다.
3. 건강한 공여체 혈액(n = 5 공여체)으로부터의 CIML NK 세포를 형질도입하기 위해 비종래의 위형화된 렌티바이러스를 이용하여, 본 발명자들은 높은 형질도입 효율을 갖는 항-NPM1c CAR-NK 세포를 성공적으로 생성하였다(MOI = 10: 형질도입 비율 평균 48%, 범위 32% 내지 65%를 사용함; VSVG 위형화된 렌티바이러스를 이용한 종래의 접근법에 대한 2%, 범위 0.8% 내지 4.5%와 비교함).
4. CAR 설계에서 핵심 사이토카인 경로를 이용하는 것은 실질적으로 CAR-NK 세포 생존(29.7%로부터 75.2%로 향상된 세포 생존력에 의해 나타남) 및 증식(60.2%로부터 94.5%로 ki-67의 증가된 수준에 의해 나타남)을 촉진하였다.
5. 항-NPM1c CAR은 NPM1c 종양유전자를 갖는 AML(OCI-AML3)에 대한 CIML NK 세포의 항-종양 기능(CD107a, IFN감마에 의해 나타냄) 및 종양-특이적 사멸(아넥신 V 및 7-AAD에 의해 측정됨)을 유의미하게 촉진시켰다.
6. CAR 및 사이토카인 시그널링을 갖는 이중-무장된 CIML NK 세포는 AML 표적에 대한 최적의 특이성 및 지속가능성을 나타내었다.
결론: 이들 결과는 혁신적인 CAR-CIML NK 세포가 잠재적으로 감소된 표적상/종양외 독성 및 종양 저항성을 갖는 NPM1c+HLA-A2+ AML을 치료하기 위한 효율적인 세포 면역요법으로서 개발될 수 있다는 것을 나타낸다. 본 발명자들의 연구는 임상에서 골수 악성종양에 대한 CAR-NK 세포 요법의 새로운 개념 및 설계를 구동할 것이다.
본 발명자들은 AML의 30%에서 발생하는 원인자 종양유전자 돌연변이인 NPM1c로부터 유래된 네오에피토프를 표적화하는 새로운 유전자 구축물을 개발하였다.
CAR 개발을 위한 플랫폼으로서 비종래의 위형화된 렌티바이러스 및 기억-유사 NK 세포를 이용하여, 본 발명자들은 NPM1c-CAR-NK 세포의 시험관내 생성을 위해 형질도입 방법을 최적화하였다(~50% 형질도입 비율을 가짐).
CAR-NK 세포는 NPM1c+ AML 세포에 대해 강하고 특이적인 기능을 나타내었다.
이종이식 마우스 모델을 사용한 예비 결과는 생체내에서 CAR-NK 세포의 강한 항-백혈병 효능을 지지하였다(특히, 막-결합된 IL-15를 갖는 구축물에 대한 것).
안전성:
미스매칭된 자연 살해(NK) 세포도 중증 GvHD를 야기하지 않는다.
NK 세포 CAR은 CLL에서 CAR T 세포와 유사한 반응률로 안전하다(CRS 없음/신경독성 없음)(Liu et al, NEJM, 2020).
효능:
AML/MDS에서 CAR T 세포의 제한된 효능
1 상 시험에서 AML에 대한 기억-유사 NK 세포의 강한 반응(Romee et al, STM, 2016)
CAR로 무장된 기억-유사 NK 세포에 의한 골수모세포의 이중 표적화(항원 발현은 CAR을 촉발하지만 HLA 손실은 직접적인 NK 세포 세포독성을 촉발시킴)
추가 참고문헌
균등물
통상의 기술자는 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 특정 물질 및 절차에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있다. 이러한 균등물들은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려되며, 다음 청구항들에 의해 커버된다.
참고에 의한 통합
본원에 인용되는 특허, 특허 출원, 및 공보와 같은 모든 참고문헌의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
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<160> 108
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<210> 1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Leukemia-specific neoantigen epitope of NPM1c
<400> 1
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 2
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv amino acid sequence
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Gly Ile Leu Gly
100 105 110
Thr Thr Ala Ala Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Leu Gly Tyr Pro Thr Thr Thr Leu Leu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VL amino acid sequence
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Gly Ile Leu Gly
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Thr Thr Ala Ala
115
<210> 4
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic: YG1 scFv linker amino acid sequence
<400> 4
Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VH amino acid sequence
<400> 5
Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Pro Thr Thr Thr Leu Leu Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VL CDR1 amino acid sequence (IMGT)
<400> 6
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VL CDR2 amino acid sequence (IMGT)
<400> 7
Ala Ala Ser
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VL CDR3 amino acid sequence (IMGT)
<400> 8
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VH CDR1 amino acid sequence (IMGT)
<400> 9
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VH CDR2 amino acid sequence (IMGT)
<400> 10
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VH CDR3 amino acid sequence (IMGT)
<400> 11
Ala Arg Leu Gly Tyr Pro Thr Thr Thr Leu Leu Pro Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 12
<211> 747
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv nucleic acid sequence
<400> 12
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa atccggaatt ctaggtacta ctgccgctag tggtagtagt 360
ggtggcagta gcagtggtgc cgaggtgcag ctggtggagt ctgggggagg cttggtacag 420
cctggggggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcacctttag cagctatgcc 480
atgagctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt gggtctcagc tattagtggt 540
agtggtggta gcacatacta cgcagactcc gtgaagggcc ggttcaccat ctccagagac 600
aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggccgtg 660
tattactgtg cgaggctggg ttaccctact actaccctac taccctttga ttactggggc 720
caaggtaccc tggtcactgt ctccagt 747
<210> 13
<211> 348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VL nucleic acid sequence
<400> 13
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa atccggaatt ctaggtacta ctgccgct 348
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv linker nucleic acid sequence
<400> 14
agtggtagta gtggtggcag tagcagtggt 30
<210> 15
<211> 369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VH nucleic acid sequence
<400> 15
gccgaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 60
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt agcagctatg ccatgagctg ggtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtgggtctca gctattagtg gtagtggtgg tagcacatac 180
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 240
tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tgtattactg tgcgaggctg 300
ggttacccta ctactaccct actacccttt gattactggg gccaaggtac cctggtcact 360
gtctccagt 369
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VL CDR1 nucleic acid sequence (IMGT)
<400> 16
cagagcatta gcagctat 18
<210> 17
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VL CDR2 nucleic acid sequence (IMGT)
<400> 17
gctgcatcc 9
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VL CDR3 nucleic acid sequence (IMGT)
<400> 18
caacagagtt acagtacccc gctcacg 27
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VH CDR1 nucleic acid sequence (IMGT)
<400> 19
ggattcacct ttagcagcta tgcc 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VH CDR2 nucleic acid sequence (IMGT)
<400> 20
attagtggta gtggtggtag caca 24
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: YG1 scFv VH CDR3 nucleic acid sequence (IMGT)
<400> 21
gcgaggctgg gttaccctac tactacccta ctaccctttg attac 45
<210> 22
<211> 751
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: NPM1c CAR amino acid sequence (with YG1 scFv)
<400> 22
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
100 105 110
Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Ser Gly Ile Leu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Gly Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
195 200 205
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
210 215 220
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Pro Thr Thr Thr Leu Leu Pro
245 250 255
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Thr Asn
485 490 495
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
500 505 510
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
515 520 525
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
530 535 540
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
545 550 555 560
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
565 570 575
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
580 585 590
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
595 600 605
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
610 615 620
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
625 630 635 640
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
645 650 655
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
660 665 670
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
675 680 685
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
690 695 700
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
705 710 715 720
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
725 730 735
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
740 745 750
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Amino acid sequence of the leading sequence in the
NPM1c CAR
<400> 23
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 24
<211> 249
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Amino acid sequence of the YG1 scFv in the NPM1c CAR
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Gly Ile Leu Gly
100 105 110
Thr Thr Ala Ala Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Leu Gly Tyr Pro Thr Thr Thr Leu Leu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 25
<211> 69
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Amino acid sequence of the CD8 hinge and transmembrane
regions in the NPM1c CAR
<400> 25
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 26
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Amino acid sequence of the 4-1BB signaling domain in
the NPM1c CAR
<400> 26
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Amino acid sequence of the CD3-zeta signaling domain
in the NPM1c CAR
<400> 27
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Amino acid sequence of the P2A self-cleaving peptide
in the NPM1c CAR
<400> 28
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 29
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Amino acid sequence of the EGFP region in the NPM1c
CAR
<400> 29
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 30
<211> 2265
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: NPM1c CAR nucleic acid sequence (with YG1 scFv)
<400> 30
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gccgggcaag tcagagcatt agcagctatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 300
cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa cagagttaca gtaccccgct cacgttcggc 360
caagggacca aggtggaaat caaatccgga attctaggta ctactgccgc tagtggtagt 420
agtggtggca gtagcagtgg tgccgaggtg cagctggtgg agtctggggg aggcttggta 480
cagcctgggg ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt tagcagctat 540
gccatgagct gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggtctc agctattagt 600
ggtagtggtg gtagcacata ctacgcagac tccgtgaagg gccggttcac catctccaga 660
gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa atgaacagcc tgagagccga ggacacggcc 720
gtgtattact gtgcgaggct gggttaccct actactaccc tactaccctt tgattactgg 780
ggccaaggta ccctggtcac tgtctccagt accactaccc cagcaccgag gccacccacc 840
ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca 900
gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc 960
cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag 1020
cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact 1080
actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa 1140
ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag 1200
ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1260
ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac 1320
aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa 1380
cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg taccagggac tcagcaccgc caccaaggac 1440
acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg ccgcctcggg gatccggcgc aacaaacttc 1500
tctctgctga aacaagccgg agatgtcgaa gagaatcctg gaccgatggt gagcaagggc 1560
gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 1620
cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 1680
aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 1740
acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 1800
aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 1860
aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 1920
ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 1980
tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 2040
ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 2100
aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 2160
tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 2220
accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtga 2265
<210> 31
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Nucleic acid sequence of the leading sequence in the
NPM1c CAR
<400> 31
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccc 63
<210> 32
<211> 747
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Nucleic acid sequence of the YG1 scFv in the NPM1c CAR
<400> 32
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa atccggaatt ctaggtacta ctgccgctag tggtagtagt 360
ggtggcagta gcagtggtgc cgaggtgcag ctggtggagt ctgggggagg cttggtacag 420
cctggggggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcacctttag cagctatgcc 480
atgagctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt gggtctcagc tattagtggt 540
agtggtggta gcacatacta cgcagactcc gtgaagggcc ggttcaccat ctccagagac 600
aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggccgtg 660
tattactgtg cgaggctggg ttaccctact actaccctac taccctttga ttactggggc 720
caaggtaccc tggtcactgt ctccagt 747
<210> 33
<211> 207
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Nucleic acid sequence of the CD8 hinge and
transmembrane regions in the NPM1c CAR
<400> 33
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120
gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg 180
ctttcactcg tgatcactct ttactgt 207
<210> 34
<211> 126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Nucleic acid sequence of the 4-1BB signaling domain in
the NPM1c CAR
<400> 34
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 35
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Nucleic acid sequence of the CD3-zeta signaling domain
in the NPM1c CAR
<400> 35
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336
<210> 36
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Nucleic acid sequence of the P2A self-cleaving peptide
in the NPM1c CAR
<400> 36
gcaacaaact tctctctgct gaaacaagcc ggagatgtcg aagagaatcc tggaccg 57
<210> 37
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Nucleic acid sequence of the EGFP region in the NPM1c
CAR
<400> 37
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtga 720
<210> 38
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(330)
<223> Human IgG1
<400> 38
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 39
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(326)
<223> Human IgG4 (terminal K absent)
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 40
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(326)
<223> Human IgG4 single mutant (S228P) (terminal K absent)
<400> 40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 41
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(326)
<223> Human IgG4 double mutant (S228P) (L235E) (terminal K absent)
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 42
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(326)
<223> Human IgG4 double mutant (S228P) (L235A) (terminal K absent)
<400> 42
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 43
<211> 297
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: CD20 amino acid sequence
<400> 43
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: FLAG
<400> 44
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: polyhistidine (6-His)
<400> 45
His His His His His His
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: hemagglutinin (HA)
<400> 46
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: HCDR1.1 (anti-CD3) amino acid sequence
<400> 47
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His
1 5 10
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: HCDR1.2 (anti-CD3) amino acid sequence
<400> 48
Arg Tyr Thr Met His
1 5
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: HCDR2 (anti-CD3) amino acid sequence
<400> 49
Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: HCDR3 (anti-CD3) amino acid sequence
<400> 50
Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: LCDR1 (anti-CD3) amino acid sequence
<400> 51
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: LCDR2 (anti-CD3) amino acid sequence
<400> 52
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: LCDR3 (anti-CD3) amino acid sequence
<400> 53
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 54
<211> 294
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(294)
<223> Human wild type nucleophosmin (amino acid sequence)
<400> 54
Met Glu Asp Ser Met Asp Met Asp Met Ser Pro Leu Arg Pro Gln Asn
1 5 10 15
Tyr Leu Phe Gly Cys Glu Leu Lys Ala Asp Lys Asp Tyr His Phe Lys
20 25 30
Val Asp Asn Asp Glu Asn Glu His Gln Leu Ser Leu Arg Thr Val Ser
35 40 45
Leu Gly Ala Gly Ala Lys Asp Glu Leu His Ile Val Glu Ala Glu Ala
50 55 60
Met Asn Tyr Glu Gly Ser Pro Ile Lys Val Thr Leu Ala Thr Leu Lys
65 70 75 80
Met Ser Val Gln Pro Thr Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ile Thr Pro
85 90 95
Pro Val Val Leu Arg Leu Lys Cys Gly Ser Gly Pro Val His Ile Ser
100 105 110
Gly Gln His Leu Val Ala Val Glu Glu Asp Ala Glu Ser Glu Asp Glu
115 120 125
Glu Glu Glu Asp Val Lys Leu Leu Ser Ile Ser Gly Lys Arg Ser Ala
130 135 140
Pro Gly Gly Gly Ser Lys Val Pro Gln Lys Lys Val Lys Leu Ala Ala
145 150 155 160
Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp
165 170 175
Asp Asp Asp Asp Phe Asp Asp Glu Glu Ala Glu Glu Lys Ala Pro Val
180 185 190
Lys Lys Ser Ile Arg Asp Thr Pro Ala Lys Asn Ala Gln Lys Ser Asn
195 200 205
Gln Asn Gly Lys Asp Ser Lys Pro Ser Ser Thr Pro Arg Ser Lys Gly
210 215 220
Gln Glu Ser Phe Lys Lys Gln Glu Lys Thr Pro Lys Thr Pro Lys Gly
225 230 235 240
Pro Ser Ser Val Glu Asp Ile Lys Ala Lys Met Gln Ala Ser Ile Glu
245 250 255
Lys Gly Gly Ser Leu Pro Lys Val Glu Ala Lys Phe Ile Asn Tyr Val
260 265 270
Lys Asn Cys Phe Arg Met Thr Asp Gln Glu Ala Ile Gln Asp Leu Trp
275 280 285
Gln Trp Arg Lys Ser Leu
290
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> C-terminus of human wild type nucleophosmin (amino acid
sequence)
<400> 55
Met Thr Asp Gln Glu Ala Ile Gln Asp Leu Trp Gln Trp Arg Lys Ser
1 5 10 15
Leu
<210> 56
<211> 298
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(298)
<223> Human nucleophosmin encoded by mutant NPM1c gene (amino acid
sequence)
<400> 56
Met Glu Asp Ser Met Asp Met Asp Met Ser Pro Leu Arg Pro Gln Asn
1 5 10 15
Tyr Leu Phe Gly Cys Glu Leu Lys Ala Asp Lys Asp Tyr His Phe Lys
20 25 30
Val Asp Asn Asp Glu Asn Glu His Gln Leu Ser Leu Arg Thr Val Ser
35 40 45
Leu Gly Ala Gly Ala Lys Asp Glu Leu His Ile Val Glu Ala Glu Ala
50 55 60
Met Asn Tyr Glu Gly Ser Pro Ile Lys Val Thr Leu Ala Thr Leu Lys
65 70 75 80
Met Ser Val Gln Pro Thr Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ile Thr Pro
85 90 95
Pro Val Val Leu Arg Leu Lys Cys Gly Ser Gly Pro Val His Ile Ser
100 105 110
Gly Gln His Leu Val Ala Val Glu Glu Asp Ala Glu Ser Glu Asp Glu
115 120 125
Glu Glu Glu Asp Val Lys Leu Leu Ser Ile Ser Gly Lys Arg Ser Ala
130 135 140
Pro Gly Gly Gly Ser Lys Val Pro Gln Lys Lys Val Lys Leu Ala Ala
145 150 155 160
Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp
165 170 175
Asp Asp Asp Asp Phe Asp Asp Glu Glu Ala Glu Glu Lys Ala Pro Val
180 185 190
Lys Lys Ser Ile Arg Asp Thr Pro Ala Lys Asn Ala Gln Lys Ser Asn
195 200 205
Gln Asn Gly Lys Asp Ser Lys Pro Ser Ser Thr Pro Arg Ser Lys Gly
210 215 220
Gln Glu Ser Phe Lys Lys Gln Glu Lys Thr Pro Lys Thr Pro Lys Gly
225 230 235 240
Pro Ser Ser Val Glu Asp Ile Lys Ala Lys Met Gln Ala Ser Ile Glu
245 250 255
Lys Gly Gly Ser Leu Pro Lys Val Glu Ala Lys Phe Ile Asn Tyr Val
260 265 270
Lys Asn Cys Phe Arg Met Thr Asp Gln Glu Ala Ile Gln Asp Leu Cys
275 280 285
Leu Ala Val Glu Glu Val Ser Leu Arg Lys
290 295
<210> 57
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> C-terminus of human nucleophosmin encoded by mutant NPM1c gene
(amino acid sequence)
<400> 57
Met Thr Asp Gln Glu Ala Ile Gln Asp Leu Cys Leu Ala Val Glu Glu
1 5 10 15
Val Ser Leu Arg Lys
20
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Linker
<400> 58
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Linker
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Linker
<400> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Linker
<400> 61
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: NY-ESO-1 neoepitope (SLL)
<400> 62
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> Influenza virus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> influenza virus M1 protein neoepitope (GIL)
<400> 63
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Forward primer
<400> 64
gtcagtaatt gcggttctca cc 22
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Reverse primer
<400> 65
gtacagtggg aacaaagtcg 20
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Forward primer
<400> 66
ccggggtaga acctaaaagt tccg 24
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Reverse primer
<400> 67
tttgttctgc acgcgtggat c 21
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Forward primer
<400> 68
gggtaattaa tcagcgaagc gatg 24
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Forward primer
<400> 69
gttaggccag cttggcactt gatgt 25
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Reverse primer
<400> 70
aggcacaatc agcattggta gctg 24
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: NPM1c neoepitope
<400> 71
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Val Ala Val
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: NPM1c neoepitope
<400> 72
Cys Leu Ala Val Glu Glu Val Ser Leu
1 5
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: NPM1c neoepitope
<400> 73
Val Glu Glu Val Ser Leu Arg Lys
1 5
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: NPM1c neoepitope
<400> 74
Ala Val Glu Glu Val Ser Leu Arg
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: NPM1c neoepitope
<400> 75
Ala Val Glu Glu Val Ser Leu Arg Lys
1 5
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: NPM1c neoepitope
<400> 76
Cys Leu Ala Val Glu Glu Val Ser Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X1 substitution
<400> 77
Val Ile Gln Asp Leu Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X1 substitution
<400> 78
Leu Ile Gln Asp Leu Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X1 substitution
<400> 79
Ile Ile Gln Asp Leu Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X3 substitution
<400> 80
Ala Ile Asn Asp Leu Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X4 substitution
<400> 81
Ala Ile Gln Glu Leu Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X5 substitution
<400> 82
Ala Ile Gln Asp Ile Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X5 substitution
<400> 83
Ala Ile Gln Asp Val Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X5 substitution
<400> 84
Ala Ile Gln Asp Met Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X5 substitution
<400> 85
Ala Ile Gln Asp Ala Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X5 substitution
<400> 86
Ala Ile Gln Asp Phe Cys Leu Ala Val
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X6 substitution
<400> 87
Ala Ile Gln Asp Leu Ser Leu Ala Val
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X6 substitution
<400> 88
Ala Ile Gln Asp Leu Ala Leu Ala Val
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X7 substitution
<400> 89
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Ile Ala Val
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X7 substitution
<400> 90
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Val Ala Val
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X7 substitution
<400> 91
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Met Ala Val
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X7 substitution
<400> 92
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Ala Ala Val
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X7 substitution
<400> 93
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Phe Ala Val
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X8 substitution
<400> 94
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Leu Val Val
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X8 substitution
<400> 95
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Leu Leu Val
1 5
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: AIQ X8 substitution
<400> 96
Ala Ile Gln Asp Leu Cys Leu Ile Val
1 5
<210> 97
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Mature IL-15 amino acid sequence
<400> 97
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 98
<211> 342
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Mature IL-15 nucleotide sequence
<400> 98
aactgggtga atgtaataag tgatttgaaa aaaattgaag atcttattca atctatgcat 60
attgatgcta ctttatatac ggaaagtgat gttcacccca gttgcaaagt aacagcaatg 120
aagtgctttc tcttggagtt acaagttatt tcacttgagt ccggagatgc aagtattcat 180
gatacagtag aaaatctgat catcctagca aacaacagtt tgtcttctaa tgggaatgta 240
acagaatctg gatgcaaaga atgtgaggaa ctggaggaaa aaaatattaa agaatttttg 300
cagagttttg tacatattgt ccaaatgttc atcaacactt ct 342
<210> 99
<211> 2160
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: anti-NPM1c CAR with membrane-bound (mb) IL-15 (DNA)
<400> 99
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gccgggcaag tcagagcatt agcagctatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 300
cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa cagagttaca gtaccccgct cacgttcggc 360
caagggacca aggtggaaat caaatccgga attctaggta ctactgccgc tagtggtagt 420
agtggtggca gtagcagtgg tgccgaggtg cagctggtgg agtctggggg aggcttggta 480
cagcctgggg ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt tagcagctat 540
gccatgagct gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggtctc agctattagt 600
ggtagtggtg gtagcacata ctacgcagac tccgtgaagg gccggttcac catctccaga 660
gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa atgaacagcc tgagagccga ggacacggcc 720
gtgtattact gtgcgaggct gggttaccct actactaccc tactaccctt tgattactgg 780
ggccaaggta ccctggtcac tgtctccagt accactaccc cagcaccgag gccacccacc 840
ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca 900
gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc 960
cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag 1020
cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact 1080
actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa 1140
ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag 1200
ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1260
ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac 1320
aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa 1380
cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg taccagggac tcagcaccgc caccaaggac 1440
acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg ccgcctcggg gatccggcgc aacaaacttc 1500
tctctgctga aacaagccgg agatgtcgaa gagaatcctg gaccgatggc cctccctgtc 1560
accgccctgc tgcttccgct ggctcttctg ctccacgccg ctcggcccaa ctgggtgaat 1620
gtaataagtg atttgaaaaa aattgaagat cttattcaat ctatgcatat tgatgctact 1680
ttatatacgg aaagtgatgt tcaccccagt tgcaaagtaa cagcaatgaa gtgctttctc 1740
ttggagttac aagttatttc acttgagtcc ggagatgcaa gtattcatga tacagtagaa 1800
aatctgatca tcctagcaaa caacagtttg tcttctaatg ggaatgtaac agaatctgga 1860
tgcaaagaat gtgaggaact ggaggaaaaa aatattaaag aatttttgca gagttttgta 1920
catattgtcc aaatgttcat caacacttct accactaccc cagcaccgag gccacccacc 1980
ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca 2040
gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc 2100
cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgttga 2160
<210> 100
<211> 719
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: anti-NPM1c CAR with mbIL-15 (amino acid)
<400> 100
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
100 105 110
Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Ser Gly Ile Leu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Gly Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
195 200 205
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
210 215 220
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Pro Thr Thr Thr Leu Leu Pro
245 250 255
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly
485 490 495
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
500 505 510
Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala
515 520 525
Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp
530 535 540
Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr
545 550 555 560
Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
565 570 575
Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp
580 585 590
Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn
595 600 605
Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
610 615 620
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val
625 630 635 640
His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
645 650 655
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
660 665 670
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
675 680 685
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
690 695 700
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
705 710 715
<210> 101
<211> 1953
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: anti-NPM1c CAR with secreted (s) IL-15 (DNA)
<400> 101
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gccgggcaag tcagagcatt agcagctatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 300
cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa cagagttaca gtaccccgct cacgttcggc 360
caagggacca aggtggaaat caaatccgga attctaggta ctactgccgc tagtggtagt 420
agtggtggca gtagcagtgg tgccgaggtg cagctggtgg agtctggggg aggcttggta 480
cagcctgggg ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt tagcagctat 540
gccatgagct gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggtctc agctattagt 600
ggtagtggtg gtagcacata ctacgcagac tccgtgaagg gccggttcac catctccaga 660
gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa atgaacagcc tgagagccga ggacacggcc 720
gtgtattact gtgcgaggct gggttaccct actactaccc tactaccctt tgattactgg 780
ggccaaggta ccctggtcac tgtctccagt accactaccc cagcaccgag gccacccacc 840
ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca 900
gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc 960
cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag 1020
cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact 1080
actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa 1140
ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag 1200
ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1260
ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac 1320
aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa 1380
cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg taccagggac tcagcaccgc caccaaggac 1440
acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg ccgcctcggg gatccggcgc aacaaacttc 1500
tctctgctga aacaagccgg agatgtcgaa gagaatcctg gaccgatggc cctccctgtc 1560
accgccctgc tgcttccgct ggctcttctg ctccacgccg ctcggcccaa ctgggtgaat 1620
gtaataagtg atttgaaaaa aattgaagat cttattcaat ctatgcatat tgatgctact 1680
ttatatacgg aaagtgatgt tcaccccagt tgcaaagtaa cagcaatgaa gtgctttctc 1740
ttggagttac aagttatttc acttgagtcc ggagatgcaa gtattcatga tacagtagaa 1800
aatctgatca tcctagcaaa caacagtttg tcttctaatg ggaatgtaac agaatctgga 1860
tgcaaagaat gtgaggaact ggaggaaaaa aatattaaag aatttttgca gagttttgta 1920
catattgtcc aaatgttcat caacacttct tga 1953
<210> 102
<211> 650
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: anti-NPM1c CAR with sIL-15 (amino acid)
<400> 102
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
100 105 110
Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Ser Gly Ile Leu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Gly Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
195 200 205
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
210 215 220
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Pro Thr Thr Thr Leu Leu Pro
245 250 255
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly
485 490 495
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
500 505 510
Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala
515 520 525
Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp
530 535 540
Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr
545 550 555 560
Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met
565 570 575
Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp
580 585 590
Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn
595 600 605
Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys
610 615 620
Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val
625 630 635 640
His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
645 650
<210> 103
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: CD8 hinge (DNA)
<400> 103
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120
gacttcgcct gcgat 135
<210> 104
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: CD8 hinge (aa)
<400> 104
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 105
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: CD8 transmembrane (DNA)
<400> 105
atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60
actctttact gt 72
<210> 106
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: CD8 transmembrane (aa)
<400> 106
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 107
<211> 546
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: BaEV glycoprotein (amino acid)
<400> 107
Met Gly Phe Thr Thr Lys Ile Ile Phe Leu Tyr Asn Leu Val Leu Val
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Glu Leu Val Gln Lys
20 25 30
Arg Tyr Gly Arg Pro Cys Asp Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Pro
35 40 45
Pro Ser Asp Arg Val Ser Gln Val Thr Cys Ser Gly Lys Thr Ala Tyr
50 55 60
Leu Met Pro Asp Gln Arg Trp Lys Cys Lys Ser Ile Pro Lys Asp Thr
65 70 75 80
Ser Pro Ser Gly Pro Leu Gln Glu Cys Pro Cys Asn Ser Tyr Gln Ser
85 90 95
Ser Val His Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Tyr Gln Gln Cys Arg Ser Gly
100 105 110
Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gly Gly
115 120 125
Thr Ser Asp Val Gln Val Leu Gly Ser Thr Asn Lys Leu Ile Gln Ser
130 135 140
Pro Cys Asn Gly Ile Lys Gly Gln Ser Ile Cys Trp Ser Thr Thr Ala
145 150 155 160
Pro Ile His Val Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Thr Arg Ile
165 170 175
Lys Ser Val Gln Arg Lys Leu Glu Glu Ile His Lys Ala Leu Tyr Pro
180 185 190
Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Ile Pro Lys Val Arg Asp Asn Leu
195 200 205
Met Val Asp Ala Gln Thr Leu Asn Ile Leu Asn Ala Thr Tyr Asn Leu
210 215 220
Leu Leu Met Ser Asn Thr Ser Leu Val Asp Asp Cys Trp Leu Cys Leu
225 230 235 240
Lys Leu Gly Pro Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Asn Phe Leu Leu Ser
245 250 255
Tyr Val Thr Arg Ser Ser Asp Asn Ile Ser Cys Leu Ile Ile Pro Pro
260 265 270
Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Phe Ser
275 280 285
Pro Ser Tyr Asn Ser Thr Glu Glu Ile Asp Leu Gly His Val Ala Phe
290 295 300
Ser Asn Cys Thr Ser Ile Thr Asn Val Thr Gly Pro Ile Cys Ala Val
305 310 315 320
Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr Leu
325 330 335
Pro Thr Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Asp
340 345 350
Ile Asp Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile Asp
355 360 365
His Phe Ile Tyr Arg Pro Lys Arg Ala Ile Gln Phe Ile Pro Leu Leu
370 375 380
Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly Leu
385 390 395 400
Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu Ile Ser
405 410 415
Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln Val
420 425 430
Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu
435 440 445
Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys Cys
450 455 460
Cys Phe Tyr Val Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asp Lys Ile Lys Thr
465 470 475 480
Leu Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Lys Asp Leu Ala Ser Asn Pro
485 490 495
Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Leu Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Phe Leu
500 505 510
Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Thr Ile Gly Pro Cys Ile
515 520 525
Phe Asn Arg Leu Thr Ala Phe Ile Asn Asp Lys Leu Asn Ile Ile His
530 535 540
Ala Met
545
<210> 108
<211> 1641
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: BaEV glycoprotein (DNA)
<400> 108
atgggtttca ctacgaaaat tatctttctg tataatctgg tactcgtata tgcgggtttc 60
gacgatccca ggaaagcgat cgaacttgtc cagaagagat acgggaggcc ctgtgactgc 120
agcggagggc aagtatcaga acccccctct gatcgggtca gccaagttac ttgcagcggc 180
aaaacagctt acctgatgcc ggatcagaga tggaaatgca aatccatacc caaggacacc 240
agtccgagtg gaccattgca ggaatgtccg tgtaatagtt accaatcaag cgtccattca 300
agttgctaca cgtcatacca gcaatgtcgc tcaggaaata aaacctatta tacggcgaca 360
ctgcttaaaa cccaaacggg tggcacctct gatgttcagg ttctcggaag tacgaataag 420
ttgattcaga gtccctgcaa cggtatcaaa ggccagtcaa tttgttggtc tacgacagcg 480
cctatccatg tgagtgacgg cggtgggccg ttggatacaa cacgaataaa aagtgtacag 540
cggaaacttg aggagataca caaagccctc taccccgagc ttcagtacca tcccctggcc 600
atccctaagg tcagggacaa tctcatggta gacgctcaaa ccctcaacat cctcaatgcc 660
acctacaatc tcttgttgat gtctaacaca agcttggtag atgactgctg gctctgtctt 720
aaattgggcc ctccgactcc cctcgctata cccaacttcc ttctgtcata cgtaacgcgc 780
agctccgaca acatatcatg tctgataatc ccgccgttgc ttgtgcagcc catgcagttc 840
tctaacagct cctgcttgtt cagtccatct tataattcaa cagaagaaat tgatttgggc 900
catgtagctt tcagtaactg tacatcaata actaacgtca ctggccccat ctgcgccgtg 960
aacggttctg tcttcctctg cggcaacaat atggcttata catacttgcc aactaactgg 1020
accggtctgt gtgtattggc cacgctgttg cctgacatag atataatccc tggcgacgaa 1080
cccgtcccta tcccagccat cgaccatttt atttatcgcc ccaagcgcgc gattcagttt 1140
atccctctgc tcgctgggtt gggcattacg gctgctttta ctacgggggc taccggcctt 1200
ggagtgtccg ttacccaata tacgaaactg tccaatcaat tgatttcaga cgtgcaaatc 1260
ttgagctcta ctatccagga tctgcaggac caggtagact ctctggcgga agtcgtcttg 1320
caaaatcggc gggggttgga tctgctgacc gccgagcagg gcggcatctg tcttgctctt 1380
caagaaaaat gctgttttta cgtgaacaaa tcaggtattg taagagataa aataaaaact 1440
ttgcaagaag agctcgaaag gaggcggaaa gacctggcgt ctaatcctct gtggactggc 1500
ctgcaggggc tcctccccta tttgctgccc tttcttggtc cgctcctgac tttgttgctg 1560
ctcctgacta ttgggccatg catcttcaat cgactcaccg cgttcatcaa tgataaactc 1620
aacataatcc acgctatgtg a 1641
Claims (149)
- 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하고, 세포외 결합 도메인이 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는, 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사 인간 NK 세포 또는 상기 세포의 집단.
- 제1항에 있어서,
세포외 결합 도메인이 (a) MHC 클래스 I 단백질 단독 및/또는 (b) MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 대조군 펩티드에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않고, 선택적으로 대조군 펩티드가 NY-ESO-1 에피토프 또는 인플루엔자 바이러스 M1 에피토프인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
NPM1c 네오에피토프가 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9를 포함하고, X1이 A, V, L 또는 I로부터 선택되고, X2가 A, T, S, V, L, I, M 또는 Q로부터 선택되고, X3이 Q 또는 N으로부터 선택되고, X4가 D 또는 E로부터 선택되고, X5가 L, I, V, M, A 또는 F로부터 선택되고, X6이 C, S 또는 A로부터 선택되고, X7이 L, I, V, M, A 또는 F로부터 선택되고, X8이 A, V, L 또는 I로부터 선택되고, X9가 L, I, V, M 또는 A로부터 선택되는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제3항에 있어서,
X1이 A 또는 V로부터 선택되고, X2가 V, I 또는 L로부터 선택되고, X3이 Q 또는 N으로부터 선택되고, X4가 D 또는 E로부터 선택되고, X5가 L 또는 I로부터 선택되고, X6이 C 또는 S로부터 선택되고, X7이 V, L 또는 I로부터 선택되고, X8이 A 또는 V로부터 선택되고, X9가 V, I 또는 L로부터 선택되는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제4항에 있어서,
X1이 A이고, X2가 V, I 또는 L로부터 선택되고, X3이 Q이고, X4가 D이고, X5가 L이고, X6이 C이고, X7이 L이고, X8이 A이고, X9가 V, I 또는 L로부터 선택되는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
NPM1c 네오에피토프가 AIQDLCLAV(서열번호 1) 또는 AIQDLCVAV(서열번호 71)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
NPM1c 네오에피토프가 CLAVEEVSL(서열번호 72), VEEVSLRK(서열번호 73), AVEEVSLR(서열번호 74), AVEEVSLRK(서열번호 75), CLAVEEVSLRK(서열번호 76)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
네오에피토프가 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
네오에피토프가 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개의 아미노산 잔기 길이인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
MHC 클래스 I 단백질이 HLA-A*02 단백질이거나, HLA-A*02 대립유전자 그룹에 의해 코딩되는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
MHC 클래스 I 단백질이 HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩되는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이
(i) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VH의 CDR인 VH 상보성 결정 영역(CDR)1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및/또는
(ii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VL의 CDR인 VL 상보성 결정 영역(CDR)1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함하는,
조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, VH CDR1이 아미노산 서열 GFTFSSYA(서열번호 9)를 갖고, VH CDR2가 아미노산 서열 ISGSGGST(서열번호 10)를 갖고, VH CDR3이 아미노산 서열 ARLGYPTTTLLPFDY(서열번호 11)를 갖는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제13항에 있어서,
세포외 도메인이 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하고, VL CDR1이 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 6)를 갖고, VL CD2가 아미노산 서열 AAS(서열번호 7)를 갖고, VL CD3이 아미노산 서열 QQSYSTPLT(서열번호 8)를 갖는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이 VH 및 VL을 포함하고, VH가 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL이 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이 VH 및 VL을 포함하고, VH가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이 scFv를 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제17항에 있어서,
scFv가 인간 scFv인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제17항 또는 제18항에 있어서,
scFv가 링커를 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제19항에 있어서,
링커가 펩티드 링커인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제20항에 있어서,
펩티드 링커가 Gly-Ser 링커인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제21항에 있어서,
Gly-Ser 링커가 (Gly4Ser)(서열번호 58), (Gly4Ser)2(서열번호 59), (Gly4Ser)3(서열번호 60) 및 (Gly4Ser)4(서열번호 61)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제21항에 있어서,
Gly-Ser 링커가 아미노산 서열 SGSSGGSSSG(서열번호 4)를 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
scFv가 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖고; 선택적으로, scFv가 (a) VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1이 아미노산 서열 GFTFSSYA(서열번호 9)를 갖고, VH CDR2가 아미노산 서열 ISGSGGST(서열번호 10)를 갖고, VH CDR3이 아미노산 서열 ARLGYPTTTLLPFDY(서열번호 11)를 갖는 VH; 및/또는 (b) VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1이 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 6)를 갖고, VL CD2가 아미노산 서열 AAS(서열번호 7)를 갖고, VL CD3이 아미노산 서열 QQSYSTPLT(서열번호 8)를 갖는 VL을 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
scFv가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
항원이 암 세포의 표면 상에 있는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제26항에 있어서,
암이 급성 골수성 백혈병(AML)인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이 100 nM 이하, 50 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 0.5 nM 내지 100 nM, 또는 1 nM 내지 15 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 항원에 결합하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
막관통 도메인이 CD3-제타, CD8, CD28, DAP12, 2B4, NKG2D, CD16, NKp44 또는 NKp46의 막관통 도메인을 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
세포내 도메인이 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 2B4, DAP10, CD137 및 DAP12로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
세포내 도메인이 CD3-제타 시그널링 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고; 막관통 도메인이 CD8 막관통 도메인을 포함하고, CAR 폴리펩티드가 CD8 힌지 영역을 추가로 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포 폴리펩티드 집단. - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
세포내 도메인이 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 시그널링 도메인, 및 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고; CAR 폴리펩티드가 CD8 막관통 도메인 및 CD8 힌지 영역을 포함하고, CD8 막관통 도메인 및 CD8 힌지 영역이 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하고; 세포외 결합 도메인이 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 선도 서열을 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 결합 도메인이 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 scFv인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
세포내 도메인이 자가-절단 펩티드 서열 및 사이토카인을 추가로 포함하고, 자가-절단 펩티드의 절단이 사이토카인을 방출하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제34항에 있어서,
사이토카인이 IL-12, IL-7, IL-13, IL-15, TNF-α, IFN-γ 또는 CCL19인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
CAR 폴리펩티드가 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
IL-2, IL-12, IL-7, IL-15, IL-21 및 IL-18의 사이토카인 중 하나 이상에 대한 일차 인간 NK 세포 또는 일차 인간 NK 세포의 집단의 노출 후 활성화되고, 선택적으로 사이토카인이 재조합 인간 사이토카인인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제37항에 있어서,
IL-12 및 IL-15; IL-12 및 IL-18; IL-15 및 IL-18; 또는 IL-12, IL-15 및 IL-18의 조합에 대한 노출 후 활성화되는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제37항 또는 제38항에 있어서,
NK 세포 또는 상기 세포의 집단이 1-20 ng/mL의 농도 범위의 IL-12; 1-50 ng/mL의 농도 범위의 IL-15 및 10-100 ng/mL의 농도 범위의 IL-18에 노출되고, 선택적으로 NK 세포 또는 상기 세포의 집단이 약 3-48 시간, 약 7-24 시간, 약 16-20 시간, 약 12-24 시간 또는 약 14-16 시간의 기간, 선택적으로 약 16 시간의 기간 동안 약 10 ng/mL IL-12, 약 1 ng/mL IL-15 및 약 50 ng/mL IL-18에 노출되고, 선택적으로 NK 세포 또는 상기 세포의 집단이 약 3-48 시간, 약 7-24 시간, 약 16-20 시간, 약 12-24 시간 또는 약 14-16 시간의 기간, 선택적으로 약 16 시간의 기간 동안 약 10 ng/mL IL-12, 약 50 ng/mL IL-15 및 약 50 ng/mL IL-18에 노출되는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
CAR 폴리펩티드가 하나 이상의 사이토카인에 대한 일차 인간 NK 세포 또는 상기 세포의 집단의 노출 후 도입되는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 증가된 IFNγ를 생산하고/하거나;
(ii) 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 향상된 항체-의존적 세포 세포독성을 갖고/갖거나;
(iii) 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 향상된 항-종양 효능을 갖고,
선택적으로, 대조군 NK 세포가 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포, 또는 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주인,
조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D 및 CD25의 폴리펩티드 중 하나 이상의 발현이 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 NK 세포 또는 상기 세포의 집단에서 증가되고, 선택적으로 대조군 인간 NK 세포가 IL-15 단독 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포이거나, 대조군 인간 NK 세포주가 IL-15 단독 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
KIR, CD57, NKG2C, DNAM-1 및 CD137의 폴리펩티드 중 하나 이상이 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 NK 세포 또는 상기 세포의 집단에서 상대적으로 변화되지 않고, 선택적으로 대조군 인간 NK 세포가 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포이거나, 대조군 인간 NK 세포주가 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
CD16 및/또는 CD11b의 발현이 대조군 인간 NK 세포 또는 인간 NK 세포주에 대해 NK 세포 또는 상기 세포의 집단에서 감소되고, 선택적으로 대조군 인간 NK 세포가 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포이거나, 대조군 인간 NK 세포주가 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
NK 세포 또는 상기 세포의 집단이 CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
IL-15 폴리펩티드, 선택적으로 인간 IL-15 폴리펩티드를 발현하는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제46항에 있어서,
IL-15 폴리펩티드가 분비된 IL-15 폴리펩티드 또는 막 결합된 IL-15 폴리펩티드인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제47항에 있어서,
막 결합된 IL-15 폴리펩티드가 이종 막관통 도메인에 대한 IL-15의 융합체인, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
생체내(in vivo) 투여 후 1.5 배, 2 배, 3 배 또는 4 배 증식되는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
생체내 투여 후 사이토카인에 대한 향상된 반응 또는 활성화 수용체 재-자극을 나타내는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제50항에 있어서,
향상된 반응이 수주 내지 수개월, 선택적으로 2 주 내지 3 개월의 기간, 3 주 내지 2 개월의 기간, 또는 약 1 개월 동안 유지되는, 조작된 NK 세포 또는 세포의 집단. - 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포와 접촉된, 조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단이
(i) NK 세포의 대조군 집단에 대해 IFN 감마의 증가된 발현을 갖고/갖거나;
(ii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 그랜자임 B의 증가된 발현을 갖고/갖거나;
(iii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 활성화 마커의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 활성화 마커가 CD25, CD69, ICOS, CD226, CD107a 및 CD62L로부터 선택되고/되거나;
(iv) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 활성화 수용체의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 활성화 수용체가 NKp30, NKG2D, NKp44로부터 선택되고/되거나;
(v) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 성숙 마커의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 성숙 마커가 CD56 및 NKG2A로부터 선택되고/되거나;
(vi) NK 세포의 대조군 집단에 대해 CD57의 감소된 발현을 갖고/갖거나;
(vii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 TIGIT의 발현 증가된 발현을 갖고/갖거나;
(viii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 TRAIL의 감소된 발현을 갖고;
선택적으로, NK 세포의 대조군 집단이 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 비형질도입된 집단인,
조작된 NK 세포 또는 상기 세포의 집단. - 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 세포의 집단, 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
- (i) 일차 인간 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 얻는 단계;
(ii) NK 세포 또는 상기 세포의 집단을, 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 얻기에 충분한 기간 동안 IL-12, IL-15, IL-18 또는 이의 임의의 조합의 양과 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을, NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 형질도입하기 위한 조건 하에 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 렌티바이러스 벡터와 접촉시키는 단계;
(iv) CAR 폴리펩티드를 발현하는 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 단리시키는 단계; 및
(v) 선택적으로, 단리된 세포를 증식시키는 단계
를 포함하는,
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 세포의 집단을 생산하기 위한 방법. - 제54항에 있어서,
일차 인간 NK 세포 또는 상기 세포의 집단이 iPSC, 제대혈 또는 PBMC로부터 유래되는 것인, 방법. - 제54항 또는 제55항에 있어서,
일차 인간 NK 세포 또는 상기 세포의 집단이 자가 또는 동종이계인, 방법. - 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (ii)의 기간이 약 12-16 시간, 선택적으로 약 14-16 시간, 선택적으로 약 16 시간인, 방법. - 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (iii)이 (iv) 이전에 약 24-72 시간의 기간 동안 NK 세포 또는 상기 세포의 집단을 휴지시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
렌티바이러스 벡터가 비비 외피 당단백질(baboon envelope glycoprotein)(BaEV-gp) 위형화된 렌티바이러스인, 방법. - 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포 또는 상기 세포의 집단이 대조군 인간 NK 세포 또는 NK 세포주에 대해 증가된 수준의 IFNγ를 생산하고, 선택적으로 대조군 인간 NK 세포가 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포이거나, 대조군 인간 NK 세포주가 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주인, 방법. - ASCT-2를 발현하는 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을, 집단을 형질도입하기 위한 조건 하에 이종 폴리펩티드를 발현하는 위형화된 렌티바이러스 벡터와 접촉시키되,
위형화된 렌티바이러스 벡터가 ASCT-2에 결합하는 당단백질을 포함하고,
이에 의해 이종 폴리펩티드를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 생산하는 단계
를 포함하는,
이종 폴리펩티드를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사(ML) NK 세포의 집단을 생산하는 방법. - 제61항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포가 일차 인간 NK 세포의 집단으로부터 얻어지는 것인, 방법. - 제61항 또는 제62항에 있어서,
일차 인간 NK 세포의 집단이 iPSC, 제대혈 또는 PBMC로부터 유래되는 것인, 방법. - 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
일차 인간 NK 세포의 집단이 자가 또는 동종이계인, 방법. - 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
ASCT-2의 발현이 인간 NK 세포의 대조군 집단에 대해 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단에서 약 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 1.6 배, 1.7 배, 1.8 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 3.5 배 또는 4 배 증가되고, 선택적으로 인간 NK 세포의 대조군 집단이 IL-15 단독의 존재 하에 활성화되는 것인, 방법. - 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단이 IL-12, IL-18 및 IL-15에 대한 노출에 의해 예비-활성화되는 것인, 방법. - 제66항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단이 약 8-24 시간, 선택적으로 12-20 시간, 선택적으로 약 12-16 시간, 선택적으로 약 14-16 시간, 선택적으로 약 16 시간의 기간 동안 예비-활성화되는 것인, 방법. - 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단이 약 3-48 시간, 약 7-24 시간, 약 16-20 시간, 약 12-24 시간, 약 14-16 시간 또는 약 16 시간의 기간 동안 약 10 ng/mL IL-12, 약 50 ng/mL IL-15 및 약 50 ng/mL IL-18에 대한 노출에 의해 예비-활성화되는 것인, 방법. - 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단이 하나 이상의 사이토카인에 대한 노출 후 및 접촉 전에 일정 기간 동안 휴지되고, 일정 기간이 약 24-72 시간인, 방법. - 제61항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단의 적어도 약 10%가 형질도입되는 것인, 방법. - 제70항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단의 10-90%, 선택적으로 35-80%, 선택적으로 약 40-60%, 선택적으로 약 60%가 형질도입되는 것인, 방법. - (i) 일차 인간 NK 세포의 집단을 얻는 단계;
(ii) 일차 인간 NK 세포의 집단을, ASCT-2를 발현하는 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 얻기에 충분한 기간 동안 IL-12, IL-18 및 IL-15와 접촉시키는 단계; 및
(iii) (ii)의 집단을, 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 형질도입하기 위한 조건 하에 이종 폴리펩티드를 코딩하는 위형화된 렌티바이러스 벡터와 접촉시키되;
위형화된 렌티바이러스 벡터가 ASCT-2에 결합하는 당단백질을 포함하고;
이에 의해 이종 폴리펩티드를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 생성하는 단계
를 포함하는,
이종 폴리펩티드를 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 기억-유사(ML) NK 세포의 집단을 생산하는 방법. - 제61항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
당단백질이 레트로바이러스 당단백질인, 방법. - 제73항에 있어서,
레트로바이러스 당단백질이 비비 외피(BaEV) 당단백질인, 방법. - 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
일차 인간 NK 세포의 집단이 iPSC, 제대혈 또는 PBMC로부터 유래되는 것인, 방법. - 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
일차 인간 NK 세포의 집단은 자가 또는 동종이계인, 방법. - 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (ii)의 기간이 약 12-16 시간, 선택적으로 약 14-16 시간, 선택적으로 약 16 시간인, 방법. - 제61항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단이
(i) 대조군 인간 NK 세포주에 대해 하나 이상의 사이토카인 및/또는 종양 표적의 존재 하에 증가된 IFNγ를 생산하고/하거나;
(ii) 대조군 인간 NK 세포주에 대해 향상된 항체-의존적 세포 세포독성을 갖고/갖거나;
(iii) 대조군 인간 NK 세포주에 대해 향상된 항-종양 효능을 갖고,
선택적으로 대조군 인간 NK 세포주가 IL-15 단독의 존재 하에 활성화된 인간 NK 세포주인,
방법. - 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
(iii)의 결과로서 형질도입되는 사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단의 비율이 적어도 10%인, 방법. - 제79항에 있어서,
사이토카인-유도된 기억-유사 NK 세포의 집단의 10-90%, 선택적으로 약 35-80%, 선택적으로 약 40-60%, 선택적으로 약 60%가 형질도입되는 것인, 방법. - 제61항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
CD94/NKG2A, NKp30, NKp44, NKG2D 및 CD25의 폴리펩티드 중 하나 이상의 발현이 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 증가되는 것인, 방법. - 제61항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
KIR, CD57, NKG2C, DNAM-1 및 CD137의 폴리펩티드 중 하나 이상이 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 NK 세포의 집단에서 상대적으로 변화되지 않는 것인, 방법. - 제61항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
CD16 및/또는 CD11b의 발현이 대조군 인간 NK 세포주에 대해 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단에서 감소되는 것인, 방법. - 제61항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
복수의 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단이 CD25+NKG2A+NKp30+NKp44+인, 방법. - 제61항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단이 생체내 투여 후 1.5 배, 2 배, 3 배 또는 4 배 증식되는 것인, 방법. - 제61항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단이 생체내 투여 후 사이토카인에 대한 향상된 반응 또는 활성화 수용체 재-자극을 나타내는 것인, 방법. - 제61항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
향상된 반응이 수주 내지 수개월, 선택적으로 2 주 내지 3 개월의 기간, 3 주 내지 2 개월의 기간, 또는 약 1 개월 동안 유지되는 것인, 방법. - 제61항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
위형화된 렌티바이러스 벡터가 IL-15 폴리펩티드, 선택적으로 인간 IL-15 폴리펩티드를 추가로 코딩하는 것인, 방법. - 제88항에 있어서,
IL-15 폴리펩티드가 분비된 IL-15 폴리펩티드 또는 막 결합된 IL-15 폴리펩티드인, 방법. - 제88항 또는 제89항에 있어서,
막 결합된 IL-15 폴리펩티드가 이종 막관통 도메인, 선택적으로 CD8 막관통 도메인에 융합되는 것인, 방법. - 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단의 증식이 IL-15 폴리펩티드 없이 형질도입된 대조군 ML NK 집단에 대해 형질도입 후 약 1.5 배, 2 배, 3 배 또는 4 배 증가되는 것인, 방법. - 제61항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단을 단리시키는 단계; 및 선택적으로, 세포의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제61항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서,
이종 폴리펩티드가 CAR인, 방법. - 제93항에 있어서,
CAR이 세포내 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 결합 도메인을 포함하고, 세포외 결합 도메인이 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 것인, 방법. - 제94항에 있어서,
세포외 결합 도메인이 (a) MHC 클래스 I 단백질 단독 및/또는 (b) MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 대조군 펩티드에 결합하지 않거나, 실질적으로 결합하지 않고, 선택적으로 대조군 펩티드가 NY-ESO-1 에피토프 또는 인플루엔자 바이러스 M1 에피토프인, 방법. - 제94항 또는 제95항에 있어서,
NPM1c 네오에피토프가 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9를 포함하고, X1이 A, V, L 또는 I로부터 선택되고, X2가 A, T, S, V, L, I, M 또는 Q로부터 선택되고, X3이 Q 또는 N으로부터 선택되고, X4가 D 또는 E로부터 선택되고, X5가 L, I, V, M, A 또는 F로부터 선택되고, X6이 C, S 또는 A로부터 선택되고, X7이 L, I, V, M, A 또는 F로부터 선택되고, X8이 A, V, L 또는 I로부터 선택되고, X9가 L, I, V, M 또는 A로부터 선택되는 것인, 방법. - 제96항에 있어서,
X1이 A 또는 V로부터 선택되고, X2가 V, I 또는 L로부터 선택되고, X3이 Q 또는 N으로부터 선택되고, X4가 D 또는 E로부터 선택되고, X5가 L 또는 I로부터 선택되고, X6이 C 또는 S로부터 선택되고, X7이 V, L 또는 I로부터 선택되고, X8이 A 또는 V로부터 선택되고, X9가 V, I 또는 L로부터 선택되는 것인, 방법. - 제97항에 있어서,
X1이 A이고, X2가 V, I, 또는 L로부터 선택되고, X3이 Q이고, X4가 D이고, X5가 L이고, X6이 C이고, X7이 L이고, X8이 A이고, X9가 V, I, 또는 L로부터 선택되는 것인, 방법. - 제94항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
NPM1c 네오에피토프가 AIQDLCLAV(서열번호 1) 또는 AIQDLCVAV(서열번호 71)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제94항 또는 제95항에 있어서,
NPM1c 네오에피토프가 CLAVEEVSL(서열번호 72), VEEVSLRK(서열번호 73), AVEEVSLR(서열번호 74), AVEEVSLRK(서열번호 75), CLAVEEVSLRK(서열번호 76)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
네오에피토프가 아미노산 서열 AIQDLCLAV(서열번호 1)를 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,
네오에피토프가 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개의 아미노산 잔기 길이인, 방법. - 제94항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
MHC 클래스 I 단백질이 HLA-A*02 단백질이거나, HLA-A*02 대립유전자 그룹에 의해 코딩되는 것인, 방법. - 제94항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
MHC 클래스 I 단백질이 HLA-A*02:01 대립유전자에 의해 코딩되는 것인, 방법. - 제94항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이
(i) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VH의 CDR인 VH 상보성 결정 영역(CDR)1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및/또는
(ii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VL의 CDR인 VL 상보성 결정 영역(CDR)1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하고, VH CDR1이 아미노산 서열 GFTFSSYA(서열번호 9)를 갖고, VH CDR2가 아미노산 서열 ISGSGGST(서열번호 10)를 갖고, VH CDR3이 아미노산 서열 ARLGYPTTTLLPFDY(서열번호 11)를 갖는 것인, 방법. - 제106항에 있어서,
세포외 도메인이 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하고, VL CDR1이 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 6)를 갖고, VL CD2가 아미노산 서열 AAS(서열번호 7)를 갖고, VL CD3이 아미노산 서열 QQSYSTPLT(서열번호 8)를 갖는 것인, 방법. - 제94항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이 VH 및 VL을 포함하고, VH가 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL이 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이 VH 및 VL을 포함하고, VH가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고/하거나, VL이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이 scFv를 포함하는 것인, 방법. - 제110항에 있어서,
scFv가 인간 scFv인, 방법. - 제110항 또는 제112항에 있어서,
scFv가 링커를 포함하는 것인, 방법. - 제112항에 있어서,
링커가 펩티드 링커인, 방법. - 제113항에 있어서,
펩티드 링커가 Gly-Ser 링커인, 방법. - 제114항에 있어서,
Gly-Ser 링커가 (Gly4Ser)(서열번호 58), (Gly4Ser)2(서열번호 59), (Gly4Ser)3(서열번호 60) 및 (Gly4Ser)4(서열번호 61)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법. - 제115항에 있어서,
Gly-Ser 링커가 아미노산 서열 SGSSGGSSSG(서열번호 4)를 포함하는 것인, 방법. - 제111항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서,
scFv가 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖고; 선택적으로, scFv가 (a) VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VH CDR1이 아미노산 서열 GFTFSSYA(서열번호 9)를 갖고, VH CDR2가 아미노산 서열 ISGSGGST(서열번호 10)를 갖고, VH CDR3이 아미노산 서열 ARLGYPTTTLLPFDY(서열번호 11)를 갖는 VH; 및/또는 (b) VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하고, VL CDR1이 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 6)를 갖고, VL CD2가 아미노산 서열 AAS(서열번호 7)를 갖고, VL CD3이 아미노산 서열 QQSYSTPLT(서열번호 8)를 갖는 것인, 방법. - 제111항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서,
scFv가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서,
항원이 암 세포의 표면 상에 있는 것인, 방법. - 제119항에 있어서,
암이 급성 골수성 백혈병(AML)인, 방법. - 제94항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 도메인이 100 nM 이하, 50 nM 이하, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 0.5 nM 내지 100 nM, 또는 1 nM 내지 15 nM의 평형 해리 상수(Kd)로 항원에 결합하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서,
막관통 도메인이 CD3-제타, CD8, CD28, DAP12, 2B4, NKG2D, CD16, NKp44 또는 NKp46의 막관통 도메인을 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서,
세포내 도메인이 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 2B4, DAP10, CD137 및 DAP12로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서,
세포내 도메인이 CD3-제타 시그널링 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고; 막관통 도메인이 CD8 막관통 도메인을 포함하고, CAR 폴리펩티드가 CD8 힌지 영역을 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서,
세포내 도메인이 서열번호 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 시그널링 도메인, 및 서열번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하고; CAR 폴리펩티드가 CD8 막관통 도메인 및 CD8 힌지 영역을 포함하고, CD8 막관통 도메인 및 CD8 힌지 영역이 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하고; 세포외 결합 도메인이 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 선도 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 결합 도메인이 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 scFv인, 방법. - 제94항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서,
CAR 폴리펩티드가 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서,
세포내 도메인이 자가-절단 펩티드 서열 및 사이토카인을 추가로 포함하고, 자가-절단 펩티드의 절단이 사이토카인을 방출하는 것인, 방법. - 제128항에 있어서,
사이토카인이 IL-12, IL-7, IL-13, IL-15, TNF-α, IFN-γ 또는 CCL19인, 방법. - 제128항 또는 제129항에 있어서,
사이토카인이 IL-15 폴리펩티드인, 방법. - 제130항에 있어서,
IL-15 폴리펩티드가 발현 후 분비되는 것인, 방법. - 제130항 또는 제131항에 있어서,
CAR 폴리펩티드가 서열번호 102에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 102의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제130항에 있어서,
IL-15 폴리펩티드가 이종 막관통 도메인에 융합되고, 선택적으로 이종 막관통 도메인이 CD8 막관통 도메인인, 방법. - 제133항에 있어서,
IL-15 폴리펩티드가 막-결합된 IL-15 폴리펩티드로서 발현되는 것인, 방법. - 제133항 또는 제134항에 있어서,
CAR 폴리펩티드가 서열번호 100에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 100의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법. - 제94항 내지 제135항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된, 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 포함하는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 조작된 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 집단.
- 제136항에 있어서,
MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 제시하는 표적 세포의 존재 하에,
(i) IFN감마의 증가된 발현을 갖고/갖거나;
(ii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 그랜자임 B의 증가된 발현을 갖고/갖거나;
(iii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 활성화 마커의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 활성화 마커가 CD25, CD107a, CD69, ICOS, CD226 및 CD62L로부터 선택되고/되거나;
(iv) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 활성화 수용체의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 활성화 수용체가 NKp30, NKG2D, NKp44로부터 선택되고/되거나;
(v) NK 세포의 대조군 집단에 대해 하나 이상의 성숙 마커의 증가된 발현을 갖고, 하나 이상의 성숙 마커가 CD56 및 NKG2A로부터 선택되고/되거나;
(vi) NK 세포의 대조군 집단에 대해 CD57의 감소된 발현을 갖고/갖거나;
(vii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 TIGIT의 증가된 발현을 갖고/갖거나;
(viii) NK 세포의 대조군 집단에 대해 TRAIL의 감소된 발현을 갖고;
선택적으로, NK 세포의 대조군 집단이 사이토카인-유도된 ML NK 세포의 비형질도입된 집단인,
조작된 ML NK 세포의 집단. - 암을 포함하는 세포의 세포 표면이 클래스 I 주조직적합성 복합체(MHC 클래스 I) 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 나타내고, 암을 치료하기에 충분한 양으로 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 세포의 집단, 제136항 또는 제137항의 조작된 ML NK 세포의 집단 또는 제53항의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
- 제138항에 있어서,
암이 AML인, 방법. - 제138항 또는 제139항에 있어서,
암을 치료하는 방법이 대상체에서 암 부담을 감소시키는 방법 또는 생존을 증가시키는 방법인, 방법. - AML을 치료하기에 충분한 양으로 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 세포의 집단, 제136항 또는 제137항의 조작된 ML NK 세포의 집단 또는 제53항의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, AML 치료를 필요로 하는 대상체에서 AML을 치료하는 방법.
- 제138항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서,
AML이 재발된 AML 또는 난치성 AML인, 방법. - 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 세포의 집단, 제136항 또는 제137항의 조작된 ML NK 세포의 집단 또는 제53항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, AML로부터 관해 중인 대상체에서 AML의 재발을 예방하는 방법.
- 제138항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서,
투여 단계 전에, 대상체가 NPM1c를 발현하는지 여부 또는 대상체가 NPM1 유전자에서 NPM1c 돌연변이를 갖는지 여부, 및 대상체가 투여 단계를 진행하면서 NPM1c를 발현하거나 NPM1c 돌연변이를 갖는지를 검출하는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제138항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서,
조작된 세포 또는 세포의 집단이 생체내 투여 후 향상된 증식을 나타내는 것인, 방법. - 제138항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 추가 치료제 또는 절차를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 암을 포함하는 세포의 세포 표면이 MHC 클래스 I 단백질과 복합체화된 NPM1c 네오에피토프를 나타내고; 선택적으로, 하나 이상의 추가 치료제 또는 절차와의 조합인, 대상체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서, 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 세포의 집단, 제136항 또는 제137항의 조작된 ML NK 세포의 집단 또는 제53항의 약학 조성물의 용도.
- 제138항 내지 제146항 중 어느 한 항, 또는 제147항에 있어서,
대상체가 인간인 방법, 또는 용도. - (i) 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 세포의 집단, 제136항 또는 제137항의 조작된 ML NK 세포의 집단 또는 제53항의 약학 조성물; (ii) 선택적으로, 하나 이상의 추가의 치료제 및 (iii) 대상체에서 암을 치료하는데 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 하나 이상의 용기를 포함하는 키트.
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