JP2024510739A - 新規な細胞治療システム - Google Patents
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Abstract
本発明は、(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的部分;および(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含む架橋分子とを含む治療薬、組成物、キットおよび処置方法に関する。【選択図】なし
Description
[0001]本発明は、キメラ抗原受容体、抗原受容体を発現するエフェクター細胞、ならびにがんを含む種々の状態の予防および/または処置のために抗原受容体を使用する方法に関する。
関連出願
[0002]本出願は、各々の内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、オーストラリア仮出願第2021900708号、同第2021902565号および同第2021902830号からの優先権を主張する。
関連出願
[0002]本出願は、各々の内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、オーストラリア仮出願第2021900708号、同第2021902565号および同第2021902830号からの優先権を主張する。
[0003]がん免疫療法は急速に成長している分野である。キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞の開発は、養子細胞治療に革命をもたらしている。
[0004]このアプローチの可能性は、臨床試験において実証されており、CAR T細胞が、B細胞悪性腫瘍、神経芽細胞腫、および肉腫の成人患者および小児患者に注入された。現在まで、64の異なる腫瘍関連抗原に結合するように標的化されたCAR T細胞の有効性を試験するように設計された500を超える臨床試験が世界中で出現している。これらのうち、3種のCD19特異的CAR T細胞生成物が、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、大細胞型B細胞リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫の処置に承認されている。現在まで、CAR T療法の成功の大部分は、いわゆる「液性」腫瘍との関連において、またはCARがCD19、CD22またはB細胞成熟抗原(BCMA)に方向付けられる場合において観察されている。
[0004]このアプローチの可能性は、臨床試験において実証されており、CAR T細胞が、B細胞悪性腫瘍、神経芽細胞腫、および肉腫の成人患者および小児患者に注入された。現在まで、64の異なる腫瘍関連抗原に結合するように標的化されたCAR T細胞の有効性を試験するように設計された500を超える臨床試験が世界中で出現している。これらのうち、3種のCD19特異的CAR T細胞生成物が、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、大細胞型B細胞リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫の処置に承認されている。現在まで、CAR T療法の成功の大部分は、いわゆる「液性」腫瘍との関連において、またはCARがCD19、CD22またはB細胞成熟抗原(BCMA)に方向付けられる場合において観察されている。
[0005]CAR T細胞治療の臨床応用には、いくつかの課題が残されている。これらには、固形腫瘍との関連において十分な治療応答を達成することが困難であることが含まれ、CAR T細胞の不十分な活性化、拡大および持続、ならびに/または免疫抑制性腫瘍微小環境によるものと考えられる。さらに、CAR T療法の長期臨床応用は、一特異的CAR T細胞の選択圧、抗原陰性エスケープバリアント、および抗原枯渇によって負の影響を受ける可能性がある。さらに、健常組織における標的抗原の発現レベルが低いと、重度の「オンターゲット、オフ腫瘍」毒性が生じる可能性がある。最後に、サイトカイン放出症候群(CRS)およびCAR T細胞関連脳症症候群(CRES)は、CAR T細胞療法の副作用として頻繁に観察される。
[0006]結果として、CAR療法、好ましくはCAR-T療法に対する新しい改善されたアプローチが必要とされている。
[0007]本明細書における先行技術への言及は、この先行技術が、いずれかの管轄区域における技術常識の一部を形成すること、またはこの先行技術が当業者によって関連性があると理解され、関連性があるとみなされ、および/または他の先行技術と組み合わされると合理的に予測され得ることの認識または示唆ではない。
[0008]一態様では、本発明は、
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む二成分治療薬を提供する。
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む二成分治療薬を提供する。
[0009]任意の態様では、腫瘍特異的抗原は、固形腫瘍または液性腫瘍上に発現される抗原である。一実施形態では、腫瘍特異的抗原は、nfP2X7、EGFRvIIIまたはCLDN6のいずれか1つである。
[0010]一態様では、本発明は、
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む二成分治療薬を提供する。
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む二成分治療薬を提供する。
[0011]別の態様では、本発明は、
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む組成物を提供する。
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む組成物を提供する。
[0012]別の態様では、本発明は、
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含むキットを提供する。
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含むキットを提供する。
[0013]任意の実施形態では、架橋分子は、ポリペプチド、または架橋分子、例えば、DNAアプタマーの機能を有する分子にコンジュゲートされるポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、免疫細胞またはその前駆体によって発現され得る。あるいは、治療薬、組成物またはキットは、ポリペプチド、または上記ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
[0014]さらなる態様では、本発明は
(i)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体であって、抗原認識ドメインが第1の腫瘍抗原と結合し、第1の腫瘍抗原が腫瘍特異的抗原(好ましくは機能不全P2X7受容体)である受容体、ならびに
(ii)(a)第2の腫瘍抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片と、(b)腫瘍特異的抗原(好ましくは機能不全P2X7受容体)のペプチドまたは断片とを含む融合タンパク質の形態で架橋分子をコードする誘導性発現構築物
を含む免疫細胞またはその前駆体を提供する。
(i)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体であって、抗原認識ドメインが第1の腫瘍抗原と結合し、第1の腫瘍抗原が腫瘍特異的抗原(好ましくは機能不全P2X7受容体)である受容体、ならびに
(ii)(a)第2の腫瘍抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片と、(b)腫瘍特異的抗原(好ましくは機能不全P2X7受容体)のペプチドまたは断片とを含む融合タンパク質の形態で架橋分子をコードする誘導性発現構築物
を含む免疫細胞またはその前駆体を提供する。
[0015]別の態様では、本発明は、
(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分と、
(ii)受容体の抗原認識ドメインによって認識されるかまたはその結合を受けることができる腫瘍特異的抗原エピトープ部分(好ましくは、機能不全P2X7受容体エピトープ部分)であって、受容体がキメラ抗原受容体であってもよい、腫瘍特異的抗原エピトープ部分と
を含む架橋分子を提供する。
(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分と、
(ii)受容体の抗原認識ドメインによって認識されるかまたはその結合を受けることができる腫瘍特異的抗原エピトープ部分(好ましくは、機能不全P2X7受容体エピトープ部分)であって、受容体がキメラ抗原受容体であってもよい、腫瘍特異的抗原エピトープ部分と
を含む架橋分子を提供する。
[0016]架橋分子は、ポリペプチド、例えば、融合タンパク質またはキメラタンパク質であり得る。代替の実施形態では、架橋分子は、連結分子を介して連結されるポリペプチドまたはペプチドを含み得る。
[0017]別の態様では、本発明は、本明細書に記載される架橋分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。好ましくは、核酸は、標的化部分をコードする第1のヌクレオチド配列、および腫瘍特異的抗原エピトープ部分をコードする第2のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、機能不全P2X7受容体エピトープ部分である。
[0018]別の態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターまたは発現構築物を提供する。一態様では、ベクターまたは発現構築物は、抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、抗原認識ドメインは、本明細書に記載される、細胞表面上に発現される機能不全P2X7受容体を認識する。
[0019]別の態様では、本発明は、対象における障害を処置する方法を提供し、該方法は、対象に、
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現する細胞であって、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原(好ましくは、腫瘍特異的抗原は機能不全P2X7受容体である)に結合する細胞と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を投与することを含み、それによって対象における障害を処置する。
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現する細胞であって、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原(好ましくは、腫瘍特異的抗原は機能不全P2X7受容体である)に結合する細胞と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を投与することを含み、それによって対象における障害を処置する。
[0020]別の態様では、本発明は、対象においてがんを処置する方法を提供し、該方法は、
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を投与することを含む。
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を投与することを含む。
[0021]別の態様において、本発明は、標的細胞を殺滅する方法を提供し、該方法は、標的細胞を
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子
に曝露させることを含み、それによって標的細胞を殺滅する。
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子
に曝露させることを含み、それによって標的細胞を殺滅する。
[0022]標的細胞は、がん細胞、またはMHCクラス受容体上に感染性因子由来のペプチドを提示することができる細胞であり得る。標的細胞は、腫瘍特異的抗原、例えば、機能不全P2X7受容体を発現しても発現していなくてもよい。
[0023]任意の態様では、標的細胞は、機能不全P2X7受容体を発現する任意の細胞、例えばがん細胞であり得る。
[0024]任意の実施形態では、2種以上の架橋分子を対象に投与することができ、各架橋分子は標的細胞上の異なる細胞表面分子に結合する標的化部分を含む。例えば、がんを処置する方法との関連において、投与される各架橋分子は、異なる標的化部分を含み得、したがって、がん細胞上に存在する異なる腫瘍関連抗原に結合し得る。このような実施形態は、単一クラスのCAR T細胞の腫瘍抗原上に存在する複数の抗原への再方向付けを容易にし(同時を含む)、したがって、がん細胞を殺滅するための多面的アプローチを提供する。
[0024]任意の実施形態では、2種以上の架橋分子を対象に投与することができ、各架橋分子は標的細胞上の異なる細胞表面分子に結合する標的化部分を含む。例えば、がんを処置する方法との関連において、投与される各架橋分子は、異なる標的化部分を含み得、したがって、がん細胞上に存在する異なる腫瘍関連抗原に結合し得る。このような実施形態は、単一クラスのCAR T細胞の腫瘍抗原上に存在する複数の抗原への再方向付けを容易にし(同時を含む)、したがって、がん細胞を殺滅するための多面的アプローチを提供する。
[0025]したがって、任意の態様において、がんを処置する方法は、2種以上の架橋分子を投与することを含み、各架橋分子は、標的細胞上の異なる細胞表面抗原に結合するための標的化部分を含む。
[0026]さらなる実施形態では、架橋分子は、がん細胞によって発現される同細胞表面抗原上の異なるエピトープに結合し得る。したがって、さらなる実施形態では、本発明の方法は、2種以上の架橋分子を投与することを含み、各架橋分子は、標的細胞上の同細胞表面抗原上の異なるエピトープに結合するための標的化部分を含む。
[0027]さらになお、本発明は、CAR T細胞を異なるがん抗原に再方向付けするための架橋分子を、それを必要とする対象に同期して投与することができる方法を提供する。これは、CAR T細胞が、患者の治療レジメンの経過中の異なる時間に、異なる抗原を介してがん細胞に結合するように方向付けられ得るように、治療アプローチを微調整することを可能にする。
[0028]さらなる実施形態において、単一の架橋分子は、単一の分子が標的細胞上の1を超える細胞表面分子に対する標的化部分を含むように、1を超える標的化部分を含み得る。
[0029]さらになお、単一の架橋分子は、単一の分子が標的細胞上の同じ細胞表面分子に対する標的化部分を含むが、標的化部分が細胞表面分子上の異なるエピトープに結合するように、1を超える標的化部分を含み得る。
[0030]本明細書中の処置方法を対象とする態様の任意の実施形態では、架橋分子は、対象への注入を介して送達され得るか、またはキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞によって発現され得る。架橋分子は、ポリペプチドであり得、免疫細胞に含有される誘導性または構成的な発現構築物中にコードされる。
[0031]任意の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全P2X7受容体のアデノシン三リン酸(ATP)結合部位に付随するエピトープに結合する。一部の実施形態では、機能不全P2X7受容体は、機能的P2X7受容体(例えば、野生型配列を有し、ATP結合受容体の立体構造または折り畳みを有する受容体)のATP結合能力と比較して、ATP結合部位でATPに結合する能力が減少している。一部の実施態様では、機能不全P2X7受容体は、ATP結合部位でATPに結合することができない。
[0032]任意の実施形態では、機能不全P2X7受容体は、受容体を機能不全にさせる立体構造変化を有する。一部の実施形態では、立体構造変化は、トランス立体構造からシス立体構造へのアミノ酸の変化である。一部の実施形態では、トランス立体構造からシス立体構造に変化したアミノ酸は、機能不全P2X7受容体のアミノ酸位置210でプロリンである。
[0033]任意の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全P2X7受容体のアミノ酸位置210にプロリンを含むエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全P2X7受容体のアミノ酸位置200のグリシンからアミノ酸位置216のシステインまで(両端を含む)に広がる1つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。
[0034]受容体の抗原認識ドメインは、機能不全P2X7受容体と相互作用することができ、特異的に結合することができる任意の適切な分子であり得る。しかしながら、一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全P2X7受容体に結合する抗体またはその断片のアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全P2X7受容体に結合する抗体の断片-抗原結合(Fab)部分のアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
[0035]任意の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全P2X7受容体に結合する一本鎖可変断片(scFv)または多価scFvのアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態では、多価scFvは、二価または三価scFvである。
[0036]任意の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全P2X7受容体に結合する単一抗体ドメイン(sdAb)とのアミノ酸配列相同性を含む。
[0037]任意の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全P2X7受容体に結合する抗体の1つ以上の相補性決定領域(CDR)とのアミノ酸配列相同性を含む結合ポリペプチドを含む。任意の実施形態では、結合ポリペプチドは、機能不全P2X7受容体に結合する抗体のVHおよび/またはVL鎖のCDR1、2および3ドメインとのアミノ酸配列相同性を含む。好ましい実施形態では、結合ポリペプチドは、抗体のVHおよび/もしくはVL鎖のCDRのアミノ酸配列、または抗体のVHおよび/もしくはVL鎖のアミノ酸配列、または抗体もしくはその断片のアミノ酸配列を含み、抗体またはその断片は、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、PCT/AU2002/000061またはPCT/AU2002/001204(または対応する米国特許第7,326,415号、米国特許第7,888,473号、米国特許第7,531,171号、米国特許第8,080,635号、米国特許第8,399,617号、米国特許第8,709,425号、米国特許第9,663,584号、もしくは米国特許第10,450,380号)、PCT/AU2007/001540(または対応する米国特許第8,067,550号)、PCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010/0036101号)、PCT/AU2008/001364(または対応する米国特許第8,440,186号、米国特許第9,181,320号、米国特許第9,944,701号もしくは米国特許第10,597,451号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2008/001365(または対応する米国特許第8,293,491号もしくは米国特許第8,658,385号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2009/000869(または対応する米国特許第8,597,643号、米国特許第9,328,155号もしくは米国特許第10,238,716号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2010/001070(対応する国際公開第/2011/020155号、米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、もしくは米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)、およびPCT/AU2010/001741(対応する国際公開第2011/075789号もしくは米国特許第8,835,609号のうちのいずれか1つ)に記載される任意の抗体のアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体は、PCT/AU2010/001070(または対応する米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、もしくは米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)に記載される2-2-1のCDRアミノ酸配列、またはPCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010/0036101号)に記載されるBPM09、およびアクセッション番号06080101であるEuropean Collection of Cultures(ECACC)で寄託されたハイブリドーマAB253によって産生されるものを含む。
[0037]任意の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全P2X7受容体に結合する抗体の1つ以上の相補性決定領域(CDR)とのアミノ酸配列相同性を含む結合ポリペプチドを含む。任意の実施形態では、結合ポリペプチドは、機能不全P2X7受容体に結合する抗体のVHおよび/またはVL鎖のCDR1、2および3ドメインとのアミノ酸配列相同性を含む。好ましい実施形態では、結合ポリペプチドは、抗体のVHおよび/もしくはVL鎖のCDRのアミノ酸配列、または抗体のVHおよび/もしくはVL鎖のアミノ酸配列、または抗体もしくはその断片のアミノ酸配列を含み、抗体またはその断片は、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、PCT/AU2002/000061またはPCT/AU2002/001204(または対応する米国特許第7,326,415号、米国特許第7,888,473号、米国特許第7,531,171号、米国特許第8,080,635号、米国特許第8,399,617号、米国特許第8,709,425号、米国特許第9,663,584号、もしくは米国特許第10,450,380号)、PCT/AU2007/001540(または対応する米国特許第8,067,550号)、PCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010/0036101号)、PCT/AU2008/001364(または対応する米国特許第8,440,186号、米国特許第9,181,320号、米国特許第9,944,701号もしくは米国特許第10,597,451号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2008/001365(または対応する米国特許第8,293,491号もしくは米国特許第8,658,385号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2009/000869(または対応する米国特許第8,597,643号、米国特許第9,328,155号もしくは米国特許第10,238,716号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2010/001070(対応する国際公開第/2011/020155号、米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、もしくは米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)、およびPCT/AU2010/001741(対応する国際公開第2011/075789号もしくは米国特許第8,835,609号のうちのいずれか1つ)に記載される任意の抗体のアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体は、PCT/AU2010/001070(または対応する米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、もしくは米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)に記載される2-2-1のCDRアミノ酸配列、またはPCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010/0036101号)に記載されるBPM09、およびアクセッション番号06080101であるEuropean Collection of Cultures(ECACC)で寄託されたハイブリドーマAB253によって産生されるものを含む。
[0038]一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態では、活性化受容体は、CD3補助受容体複合体のメンバーであるか、またはFc受容体である。一部の実施形態では、CD3補助受容体複合体に由来する部分は、CD3-ζである。一部の実施形態では、Fc受容体に由来する部分は、FcεRIまたはFcγRIである。
[0039]一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体に由来する部分および共刺激受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態では、共刺激受容体は、CD27、CD28、CD30、CD40、DAP10、OX40、4-1BB(CD137)およびICOSからなる群から選択される。
[0040]任意の態様では、抗原受容体を発現する細胞は、免疫細胞、例えば、本明細書に記載される免疫細胞、または免疫細胞に分化することができる細胞(例えば、免疫細胞の前駆体)であり得る。免疫細胞に分化することができる細胞(例えば、機能不全P2X7 CARを発現するT細胞)は、幹細胞、多系統前駆細胞、または人工多能性幹細胞であり得る。
[0041]前述の態様の任意の実施形態では、抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体は、キメラ受容体抗原(CAR)である。
[0042]任意の態様では、標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分は、ペプチドまたは抗体もしくは抗体断片を含むかあるいはそれからなる。あるいは、標的化部分は、標的細胞表面上に存在するタンパク質または受容体のためのリガンドまたは結合パートナーを含み得る。
[0042]任意の態様では、標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分は、ペプチドまたは抗体もしくは抗体断片を含むかあるいはそれからなる。あるいは、標的化部分は、標的細胞表面上に存在するタンパク質または受容体のためのリガンドまたは結合パートナーを含み得る。
[0043]標的化部分は、可溶性T細胞受容体(TcR)または一本鎖T細胞受容体結合モチーフまたはT細胞受容体様mAbをさらに含み得る。このような実施形態では、標的化部分は、MHC(HLA)IおよびII分子を介して細胞表面上に提示される感染性因子由来の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来するペプチドの結合に特に適している。標的化部分はまた、MHC分子によって提示されるペプチドの結合に適することができ、ペプチドは、がんに関連する突然変異を含み、例えば、がん精巣抗原(WT1、NY-ESO-1、PRAMEファミリー(例えば、PRA100、PRA142、PRA300、PRA425およびその他)、MAGEファミリー(例えば、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A12およびその他)、CT83、SSX2、GAGE、BAGE、PAGE)または他のがん特異的突然変異が含まれる。
[0044]任意の実施形態では、細胞表面分子は、抗原、好ましくは本明細書に記載される抗原を含み得る。
[0045]細胞表面分子は、タンパク質、脂質部分、糖タンパク質、糖脂質、糖質、多糖、核酸、MHC結合ペプチド、またはそれらの組合せから選択され得る。
[0045]細胞表面分子は、タンパク質、脂質部分、糖タンパク質、糖脂質、糖質、多糖、核酸、MHC結合ペプチド、またはそれらの組合せから選択され得る。
[0046]細胞表面分子は、細菌、ウイルス、および他の微生物の部分(例えば、被膜、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛、および毒素)を含み得る。細胞表面分子は、標的細胞によって発現され得る。
[0047]細胞表面分子は、標的細胞によって発現されないことがある。非限定的な例として、細胞表面分子は、標的細胞ではなく、標的細胞または標的細胞の細胞表面分子に結合する細胞によって発現されるリガンドであり得る。また、非限定的な例によって、細胞表面分子は、標的細胞の細胞表面または細胞表面受容体に結合する毒素、外因性分子またはウイルスタンパク質であり得る。
[0048]任意の態様または実施形態では、架橋分子の標的化部分は、受容体の抗原認識と同じ抗原またはエピトープに結合しない。例えば、架橋分子の標的部分は、機能不全P2X7受容体、E200、E300、もしくはE200/E300複合エピトープ、または本明細書に記載される機能不全P2X7受容体上に存在する任意の他のエピトープに結合しない。
[0049]標的化部分は、標的化抗体または抗体断片であり得る。標的化抗体または抗体断片は、免疫グロブリン(Ig)であり得る。免疫グロブリンは、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、それらの断片またはそれらの修飾から選択され得る。免疫グロブリンはIgGであり得る。IgGはIgG1であり得る。IgGは任意のIgGサブクラスであり得る。
[0050]任意の実施形態では、本発明の架橋分子は、1を超える標的化部分を含み得る。例えば、ある特定の非限定的な実施形態では、架橋分子は、2つの異なる抗体、またはその断片を含み得る。抗体は、標的細胞上の同一の細胞表面分子の異なるエピトープに結合し得る。あるいは、抗体は、標的細胞上の異なる細胞表面分子のエピトープに結合し得る。
[0051]機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、P2X7受容体、またはATPと結合することができない隣接する正しくパッキングされたモノマー間の界面で形成される3つのATP結合部位のうちの少なくとも1つを有するP2X7受容体の断片の形態で提供され得る。このような受容体は、非選択的カルシウムチャネルの開口をアポトーシス孔まで延長することができない。
[0052]任意の態様では、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、機能不全P2X7受容体の断片を含むかまたはそれからなる。例示的な断片には、GHNYTTRNILPGLNITC(配列番号2;本明細書では「E200エピトープ」とも称する)およびそのバリアント(例示的なバリアントは配列番号3~10および15~30および168に提供される);KYYKENNVEKRTLIKVF(配列番号12および13;本明細書では「E300」エピトープとも称する);またはGHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK(配列番号14;本明細書では「E200/E300」または「複合」エピトープとも称する)が挙げられる。さらなる例は、本明細書の表1に提供される。
[0053]任意の態様では、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、機能不全P2X7受容体に結合するが、機能的P2X7受容体に結合する抗体には結合しない抗体の結合を受ける。
[0054]任意の態様では、架橋分子は、2種以上の機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含み得る。2種以上の機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、同じ配列もしくは異なる配列を含み得るかまたはそれらから構成され得る。例えば、任意の態様では、架橋分子は、E200エピトープの形態で機能不全P2X7受容体エピトープ部分と、E300エピトープの形態でさらなる機能不全P2X7受容体エピトープ部分とを含み得る。あるいは、任意の態様では、架橋分子は、E200エピトープの形態で機能不全P2X7受容体エピトープ部分と、複合エピトープの形態でさらなる機能不全P2X7受容体エピトープ部分とを含み得る。さらになお、任意の態様では、架橋分子は、E200エピトープの形態で第1の機能不全P2X7受容体エピトープ部分と、E200エピトープの形態でさらなる機能不全P2X7受容体エピトープ部分とを含み得る。
[0055]本明細書で使用される場合、文脈上別段の必要がある場合を除く、用語「含む(comprise)」および用語の変形、例えば「含んでいる」、「含む(comprises)」、および「含まれる(comprised)」は、さらなる添加剤、成分、整数または工程を除外することを意図しない。
[0056]本発明のさらなる態様および前段落に記載された態様のさらなる実施形態は、以下の説明から明らかになり、一例として、添付の図面を参照して与えられる。
実施形態の詳細な説明
[0095]ここで、本発明のある特定の実施形態を詳細に参照する。本発明を実施形態とともに記載するが、本発明をこれらの実施形態に限定するものではないことが理解される。反対に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物、修飾物、および均等物をカバーすることを意図している。
[0095]ここで、本発明のある特定の実施形態を詳細に参照する。本発明を実施形態とともに記載するが、本発明をこれらの実施形態に限定するものではないことが理解される。反対に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物、修飾物、および均等物をカバーすることを意図している。
[0096]当業者は、本発明の実施において使用することができる、本明細書に記載されたものと類似または均等の多くの方法および材料を認識するであろう。本発明は、記載される方法および材料に決して限定されるものではない。
[0097]この明細書において開示され、定義される発明は、テキストまたは図面から言及されまたは明白な2つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組合せに及ぶことが理解される。これらの異なる組合せの全ては、本発明の種々の代替的な態様を構成する。
[0098]本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0099]本発明は、先行技術の欠点のうちの1つ以上に対処することを目的とし、機能不全P2X7受容体などの腫瘍特異的抗原のがん特異的発現を利用することができるという本発明者らの認識に基づいて、以下のことを行う:
a)機能不全P2X7受容体などの腫瘍特異的抗原に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を発現する免疫細胞の標的を拡大する;および/または
b)オンターゲット効果、オフ腫瘍効果を最小限に抑える種々の設定において、標的化細胞殺滅に対する調節可能な「切り替え可能な」アプローチを提供する;ならびに
c)アダプター分子に対する異常な免疫応答を最小限に抑える。
[0099]本発明は、先行技術の欠点のうちの1つ以上に対処することを目的とし、機能不全P2X7受容体などの腫瘍特異的抗原のがん特異的発現を利用することができるという本発明者らの認識に基づいて、以下のことを行う:
a)機能不全P2X7受容体などの腫瘍特異的抗原に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を発現する免疫細胞の標的を拡大する;および/または
b)オンターゲット効果、オフ腫瘍効果を最小限に抑える種々の設定において、標的化細胞殺滅に対する調節可能な「切り替え可能な」アプローチを提供する;ならびに
c)アダプター分子に対する異常な免疫応答を最小限に抑える。
[0100]本発明は、第1の成分および第2の成分を含む新規な処置様式を提供する。第1の成分は、細胞表面上に発現される機能不全P2X7受容体に結合するCAR(本明細書では「nfP2X7に方向付けられたCAR」とも呼ばれる)を含む免疫細胞の投与である。第2の成分は、腫瘍特異的CAR(例えば、nfP2X7に方向付けられたCAR)を、がん関連抗原などの他の細胞表面分子、例えば、CD19、CD20、CD33、GD2、MHC IおよびIIを介してまたはアクセス可能な表面抗原曝露の任意の他のメカニズムを介して種々の長さのペプチドとして提示される細胞内プロセシングされたタンパク質に再方向付けすることができる架橋分子の投与(または発現)である。
[0101]標的化細胞表面分子は、がん(がん細胞の表面上に発現される腫瘍関連抗原など)と関連し得る。さらなる実施形態では、標的化細胞表面分子は、感染と関連し得るか、または任意の他の疾患(自己免疫疾患を含む)と関連し得る。このような実施形態では、分子は、疾患に関連する細胞表面抗原であり得るか、または細胞上に提示されるペプチド/HLA複合体を含み得る。ある特定の例では、分子はB細胞系列の悪性腫瘍においてCD19を含み得る。分子は、がん特異的タンパク質(がん精巣抗原などの遺伝子異常およびがん患者に特異的な他のもの)に関する標的化ペプチドを含み得る。分子は、感染性因子、例えば、ウイルス、細菌、原虫、ビリオン、プリオンおよび真菌由来のペプチドを含むペプチド/HLA複合体であり得る。分子は、自己免疫疾患に関連するペプチド(例えば、狼瘡に関連するSmペプチド)を含むペプチド/HLA複合体であり得る。
[0102]さらに、本発明は、既存の「アダプターCAR」アプローチに優るいくつかの利点を提供する。より詳細には、アダプターCAR T細胞技術は、従来のCARの腫瘍標的化およびシグナル伝達部分を脱共役させるアプローチに基づいており、アダプターCARおよび可溶性の腫瘍特異的アダプター分子からなる二又系をもたらす。アダプターCARの基本構造は、従来のCAR設計に対応するが、細胞外ドメインは、腫瘍関連抗原とは相互作用せず、代わりに、アダプター分子に組み込まれた結合パートナーと相互作用する。二機能的アダプター分子は、順に、標的細胞(腫瘍細胞)特異性を提供し、腫瘍とアダプターCAR T細胞との間の界面でリンカーとして作用する。この複合体は、次に、従来のCAR T細胞と同様に、抗腫瘍応答を媒介することができる。
[0103]アダプターCARシステムの二重原理は、アダプターCAR T細胞活性を正確に制御するための重要な分子安全スイッチを提供するが、現在までに開発されたシステムではいくつかの限界が同定されている。
[0104]例えば、1つのシステムは、種々の腫瘍特異的アダプター分子にカップリングされる合成色素FITCを標的とするscFvベースのα-FITC CARに依存する。α-FITC CAR T細胞産物の完全なヒト化にもかかわらず、FITCの免疫原性は、治療マウスモデルにおける抗α-FITC抗体の出現によって強調されるように、臨床移行にとっての一つの懸念である。
[0105]別の例では、アダプター分子は、標準scFvベースのアダプターCARを再方向付けするための小ペプチドタグを含む。しかしながら、アダプター分子に含まれる小さなペプチドタグの免疫原性に関して、特にタグがヒト以外の配列、またはヒト核タンパク質に由来する配列を含む場合に、懸念が再び提起されている。
[0106]従来技術のアプローチとは対照的に、本発明は、機能不全P2X7に結合するCARの特異性、および機能不全P2X7受容体に由来するエピトープの独特な特性の両方を利用する。
[0107]本発明は、以下の点において、既存のモノ抗原に方向付けられたCAR T療法に優る利点を提供する:
・機能的であるCAR T細胞(すなわち、CAR T細胞を活性化するためのスイッチ分子の使用の必要性がない)を利用する;
・機能不全P2X7受容体はがん細胞の表面のみに露出されるため、健康な細胞に結合しないCAR T細胞を利用する;
〇これは、免疫抑制剤の投与の必要性がないことを意味する;
〇これはまた、非がん性細胞にも見出される抗原に結合するCARの使用を含む他のアプローチと比較して、副作用が有意に減少することを意味する;
・機能不全P2X7受容体に由来するエピトープの形式で、架橋分子上に非免疫原性であり、天然に存在するヒトエピトープを含む。
・機能的であるCAR T細胞(すなわち、CAR T細胞を活性化するためのスイッチ分子の使用の必要性がない)を利用する;
・機能不全P2X7受容体はがん細胞の表面のみに露出されるため、健康な細胞に結合しないCAR T細胞を利用する;
〇これは、免疫抑制剤の投与の必要性がないことを意味する;
〇これはまた、非がん性細胞にも見出される抗原に結合するCARの使用を含む他のアプローチと比較して、副作用が有意に減少することを意味する;
・機能不全P2X7受容体に由来するエピトープの形式で、架橋分子上に非免疫原性であり、天然に存在するヒトエピトープを含む。
[0108]したがって、本発明は、CAR T療法とともにアダプター/架橋分子の使用における新しい概念およびアプローチを提供する。
[0109]より詳細には、機能不全nfP2X7受容体に結合するCAR(本明細書ではnfP2X7 CARとも呼ばれる)の特異性は、機能不全P2X7が形質転換細胞の表面のみに露出されるという事実に起因する。さらに、架橋分子中にnfP2X7由来のエピトープを含めることによって、CAR媒介性認識は、対応する架橋分子を介して、目的とする任意の標的抗原を含むように広げることができる。nfP2X7 CARは、機能不全P2X7受容体、例えば、E200(またはE300もしくはE200-300複合体)エピトープのみを認識するが、しかしながら、架橋分子の使用は、細胞表面上に発現される任意のアクセス可能な認識部位によって、無制限の標的化を容易にする。例えば、nfP2X7 CARは、細胞表面上のCD19結合のための標的化部分、およびnfP2X7からのE200エピトープを含む架橋分子の使用を介して、CD19陽性細胞に結合するようにさらに方向付けられ得る(または再方向付けされ得る)。
[0109]より詳細には、機能不全nfP2X7受容体に結合するCAR(本明細書ではnfP2X7 CARとも呼ばれる)の特異性は、機能不全P2X7が形質転換細胞の表面のみに露出されるという事実に起因する。さらに、架橋分子中にnfP2X7由来のエピトープを含めることによって、CAR媒介性認識は、対応する架橋分子を介して、目的とする任意の標的抗原を含むように広げることができる。nfP2X7 CARは、機能不全P2X7受容体、例えば、E200(またはE300もしくはE200-300複合体)エピトープのみを認識するが、しかしながら、架橋分子の使用は、細胞表面上に発現される任意のアクセス可能な認識部位によって、無制限の標的化を容易にする。例えば、nfP2X7 CARは、細胞表面上のCD19結合のための標的化部分、およびnfP2X7からのE200エピトープを含む架橋分子の使用を介して、CD19陽性細胞に結合するようにさらに方向付けられ得る(または再方向付けされ得る)。
[0110]P2X7は、ヒト組織、特に免疫細胞および神経細胞において一般的に発現されるヒト受容体タンパク質である。P2X7受容体に対する自己免疫応答は報告されておらず、登録されていない。E200、E300およびE200/E300などの例示的な標的化されるエピトープは、遺伝的に規定されているのではなく、P2X7の三次構造の立体構造変化に起因するのみである。したがって、これらは、P2X7配列の非変化部分である非免疫原性ペプチド配列である。アジュバントおよびコンジュゲートを使用する人工条件下でのみ、標的に対する免疫応答を生成することができる。
[0111]架橋分子中の非免疫原性認識部位、例えば、E200もしくはE300のペプチド配列、または複合ペプチドE200-300の利点は、中和抗体の誘導および/または細胞のT細胞媒介性拒絶の誘導なしに、種々の特異性を有する架橋分子の長期適用を容易にする。これは、先行技術に記載された架橋/アダプター分子の設計に優る顕著な利点を表す。
[0112]さらに、nfP2X7 CARは、がん組織のみを特異的に標的とし、したがって、本発明のアプローチは、「オンターゲット、オフ腫瘍」効果およびCARのオフターゲット結合を介した健康な組織への損傷の最小限のリスクを提示する。したがって、本発明は、nfP2X7 CARの特異性を2つの方法で活用する:第1に、nfP2X7 CARがnfP2X7を発現する細胞(がん細胞のみ)のみを標的とするという事実に依存し、第2に、nfP2X7の結合を受けるように操作された架橋分子を使用して、nfP2X7 CARを発現する免疫細胞を、スイッチ可能であり、調整可能な方法で他の腫瘍関連抗原および/または特異的標的抗原に再方向付けすることができるという事実に依存する。
[0113]したがって、本発明の架橋分子の使用は、任意の表面発現した標的抗原の標的化のためにnfP2X7 CARを発現する免疫細胞の再方向付けを可能にする。
[0114]本アプローチの具体的な利点は、標的化が、インビボでの架橋分子治療薬が循環中に持続する期間に限定されることである。これは、健常組織における標的抗原の「オンターゲット、オフ腫瘍」発現から生じる任意の毒性が最小限に抑えられることを意味する。これは、架橋分子が一旦体から除去されると、nfP2X7 CAR細胞は、再び、腫瘍特異的にnfP2X7を標的化することができるのみであるためである。言い換えれば、nfP2X7以外の標的抗原の標的化は架橋分子依存性であるため、標的化は架橋分子の適用によって制御することができる。これは、CAR T細胞が、nfP2X7以外の抗原を介してがん細胞に一時的に方向付けられ得るように、架橋分子の標的化部分の結合を受けた抗原を介してがん細胞の標的化を「スイッチオン」および「スイッチオフ」するための簡単なアプローチを実施することを容易にする。さらに、CAR T細胞が他のがん抗原に再方向付けされる時間の長さは、架橋分子が必要な患者に投与される時間によって調節することができる。
[0114]本アプローチの具体的な利点は、標的化が、インビボでの架橋分子治療薬が循環中に持続する期間に限定されることである。これは、健常組織における標的抗原の「オンターゲット、オフ腫瘍」発現から生じる任意の毒性が最小限に抑えられることを意味する。これは、架橋分子が一旦体から除去されると、nfP2X7 CAR細胞は、再び、腫瘍特異的にnfP2X7を標的化することができるのみであるためである。言い換えれば、nfP2X7以外の標的抗原の標的化は架橋分子依存性であるため、標的化は架橋分子の適用によって制御することができる。これは、CAR T細胞が、nfP2X7以外の抗原を介してがん細胞に一時的に方向付けられ得るように、架橋分子の標的化部分の結合を受けた抗原を介してがん細胞の標的化を「スイッチオン」および「スイッチオフ」するための簡単なアプローチを実施することを容易にする。さらに、CAR T細胞が他のがん抗原に再方向付けされる時間の長さは、架橋分子が必要な患者に投与される時間によって調節することができる。
[0115]したがって、本発明は、種々の設定において適用を見出すことは明らかであるべきである。例えば、腫瘍学的処置との関連において、本発明は、がん細胞上に存在する多数の抗原を標的とするために、単一のクラスのCAR分子(すなわち、がん細胞上に存在する機能不全P2X7受容体と結合するための)の使用を可能にする。より具体的には、CD19結合のための標的化部分を含む架橋分子を使用して、CAR-T細胞は、機能不全P2X7受容体とCD19の両方において、がん細胞に標的化され得る。これは、複数の部位を標的としているため、がん細胞が殺滅される可能性を最大限にする。さらに、複数の架橋分子、または1を超える標的化部分を含む架橋分子の使用は、CAR T細胞によるがん細胞表面の「ペインティング」を容易にすることは明らかであるべきである。換言すれば、本発明は、種々の異なる架橋分子の使用を提供し、各々は、単一種のCAR T細胞の結合を受けるためのエピトープを含むが、CAR T細胞が複数のがん抗原を介してがん細胞に結合するように方向付けられ得るように、異なる標的化部分を含む。このようにして、がん細胞は、複数の部位でCAR T細胞によって標的化され、その結合を受けることができ、これは、細胞殺滅の効力を増大させる。
[0116]このアプローチはまた、バーキットリンパ腫または種々の上皮、間葉、神経もしくは胚起源から生じる固形腫瘍のサブカテゴリーなどの機能不全P2X7受容体を低レベルで発現するがんの場合に特に有用である。低発現がん細胞型の別の例は、トリプル陰性乳がん(例えば、MDA-MB-231細胞株)であり得る。他の例には、PDXモデルからの組織アレイにおいて試験された固形腫瘍組織が含まれ、そのうちのいくつかは、他のがんよりも低い受容体発現を示す。このような例には、限定されないが、神経芽細胞腫、大腸がん、肺がん、乳がんまたは脳がんが含まれる。
[0117]さらなる例では、本発明は、病原体(好ましくは細胞内病原体)による感染の重症度を予防または最小限にするという関連において適用を見出す。腫瘍学的状況に限定されないが、これは、がん治療を受け、免疫不全(したがって、日和見または他の病原体による感染に感受性)である患者の処置において特に有用であり得る。このように、機能不全P2X7受容体に結合するCAR T細胞による処置を受けた(または継続して受けている)患者は、同時に、CAR T細胞を、それらの細胞表面上のMHC分子上に感染性因子由来のペプチドを提示する細胞に再方向付けすることを容易にする架橋分子を投与することができる。換言すれば、本発明は、がんおよび感染症の同時または連続的処置のためのプラットフォームを提供する。
[0118]基本原理、ならびにnfP2X7 E200由来のペプチドタグ化された架橋分子および架橋分子の異なるフォーマットを介したnfPX7 CARを発現するエフェクター細胞のエンゲージメントを図1~3に図示し、概説する。
[0119]架橋分子の存在なしにnfP2X7R CARを用いると、nfP2X7 CARを発現するエフェクター細胞は、がん特異的標的化を示す(シナリオI、図11を参照されたい)。
[0120]nfP2X7の機能的に陰性ながん(nfP2X7に対して非常に低いかまたは陰性である)への適用性を広げるために、nfP2X7 CARを発現するエフェクター細胞は、CD33に例示されるがん関連抗原またはTcR様mAbを介するがん特異的抗原を標的とする架橋分子を介してがん細胞に再方向付けされ得る。架橋分子の特異性は、TcR様mAbまたはリガンドを介してMHCペプチド提示(クラスIおよびII)との関連において、任意の表面発現標的抗原または提示抗原が、同じ作用様式でnfP2X7 CARを発現するエフェクター細胞をエンゲージし得ることを限定せずに意味する(シナリオII、図11を参照されたい)。
[0121]ほとんどの場合、nfP2X7 CARを発現するエフェクター細胞の二重機能が利用される(シナリオIII、図11を参照されたい)。これは、シナリオIとIIの組合せであり、nfP2X7 CAR発現エフェクター細胞が、がん細胞上に発現されるnfP2X7を介してがん細胞に直接的にエンゲージされ、さらに、CD33に例示されるがん関連抗原またはTcR様mAbを介するがん特異的抗原を標的とする架橋分子を介してがん細胞に動員されることを意味する。
定義
[0122]別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
[0122]別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
[0123]本明細書を解釈する目的で、以下の定義が一般的に適用され、適宜、単数形で使用される用語はまた複数形を含み、その逆もまた同様である。
[0124]「プリン作動性受容体」とは、一般的に、プリン(例えば、ATP)をリガンドとして使用する受容体を指す。
[0124]「プリン作動性受容体」とは、一般的に、プリン(例えば、ATP)をリガンドとして使用する受容体を指す。
[0125]「P2X7受容体」とは、一般的に、3つのタンパク質サブユニットまたはモノマーから形成されるプリン作動性受容体を指し、少なくとも1つのモノマーは、実質的に下記の配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する。
[0126]配列番号1
MPACCSCSDVFQYETNKVTRIQSMNYGTIKWFFHVIIFSYVCFALVSDKLYQRKEPVISSVHTKVKGIAEVKEEIVENGVKKLVHSVFDTADYTFPLQGNSFFVMTNFLKTEGQEQRLCPEYPTRRTLCSSDRGCKKGWMDPQSKGIQTGRCVVYEGNQKTCEVSAWCPIEAVEEAPRPALLNSAENFTVLIKNNIDFPGHNYTTRNILPGLNITCTFHKTQNPQCPIFRLGDIFRETGDNFSDVAIQGGIMGIEIYWDCNLDRWFHHCRPKYSFRRLDDKTTNVSLYPGYNFRYAKYYKENNVEKRTLIKVFGIRFDILVFGTGGKFDIIQLVVYIGSTLSYFGLAAVFIDFLIDTYSSNCCRSHIYPWCKCCQPCVVNEYYYRKKCESIVEPKPTLKYVSFVDESHIRMVNQQLLGRSLQDVKGQEVPRPAMDFTDLSRLPLALHDTPPIPGQPEEIQLLRKEATPRSRDSPVWCQCGSCLPSQLPESHRCLEELCCRKKPGACITTSELFRKLVLSRHVLQFLLLYQEPLLALDVDSTNSRLRHCAYRCYATWRFGSQDMADFAILPSCCRWRIRKEFPKSEGQYSGFKSPY
[0127]P2X7受容体が3つのモノマーから形成される限りにおいて、それは「三量体」または「三量体の」である。「P2X7受容体」は、P2X7受容体の天然に存在するバリアントを包含し、例えば、P2X7単量体はスプライスバリアント、対立遺伝子バリアント、SNP、ならびにP2X7受容体を形成する単量体の天然に存在する切断型または分泌型を含むアイソフォーム(例えば、細胞外ドメイン配列またはその切断型からなる形態)、天然に存在するバリアント型(例えば、選択的スプライス型)および天然に存在する対立遺伝子バリアントである。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に開示される天然配列P2X7モノマーポリペプチドは、配列番号1に示される全長アミノ酸配列を含む成熟または全長天然配列ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、P2X7受容体は、修飾されたアミノ酸配列、例えば、配列番号1に示される配列中の種々のアミノ酸が置換され、欠失され、または残基が挿入され得る。
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[0127]P2X7受容体が3つのモノマーから形成される限りにおいて、それは「三量体」または「三量体の」である。「P2X7受容体」は、P2X7受容体の天然に存在するバリアントを包含し、例えば、P2X7単量体はスプライスバリアント、対立遺伝子バリアント、SNP、ならびにP2X7受容体を形成する単量体の天然に存在する切断型または分泌型を含むアイソフォーム(例えば、細胞外ドメイン配列またはその切断型からなる形態)、天然に存在するバリアント型(例えば、選択的スプライス型)および天然に存在する対立遺伝子バリアントである。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に開示される天然配列P2X7モノマーポリペプチドは、配列番号1に示される全長アミノ酸配列を含む成熟または全長天然配列ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、P2X7受容体は、修飾されたアミノ酸配列、例えば、配列番号1に示される配列中の種々のアミノ酸が置換され、欠失され、または残基が挿入され得る。
[0128]「機能的P2X7受容体」とは、一般的に、ATPに結合するための3つの無傷の結合部位または溝を有する、P2X7受容体の形態を指す。ATPに結合した際、機能的受容体は非選択的なナトリウム/カルシウムチャネルを形成し、これが孔様構造に変換し、最大900Daのカルシウムイオンおよび分子の細胞質への侵入を可能にし、結果の1つは、プログラムされた細胞死の誘導であり得る。正常なホメオスタシスでは、機能的なP2X7受容体の発現は、一般的に、胸腺細胞、樹状細胞、リンパ球、マクロファージおよび単球などのプログラム細胞死を受ける細胞に限定される。また、赤血球および他の細胞型上に、機能的P2X7受容体のいくつかの発現が存在することがある。
[0129]「機能不全P2X7受容体」とは、一般的に、機能的P2X7とは異なる立体配座を有するP2X7受容体の形態を指し、それによって、受容体は、アポトーシス孔を形成することができないが、隣接するモノマー間に位置する単一の機能的ATP結合部位を維持することによって、なおも非選択的チャネルとして操作することができる。1つの例は、1つ以上のモノマーがPro210でシス異性化を有する場合に生じる(配列番号1による)。異性化は、例えば、モノマー一次配列の突然変異または異常な翻訳後プロセシングを含む、モノマーのミスフォールディングにつながる任意の分子事象から生じ得る。異性化の1つの結果は、受容体が三量体上のATP結合部位の1つ、より具体的には2つでATPに結合することができず、結果として、チャネルの開口部を伸ばすことができないということである。このような状況では、受容体は孔を形成することができず、これは、カルシウムイオンが細胞質に入る程度を限定する。機能不全P2X7受容体は、広範囲の上皮がんおよび造血がんに発現する。本明細書で使用される場合、「機能不全P2X7受容体」という用語は、「非機能的P2X7受容体」または「nfP2X7受容体」という用語と互換的に使用することができる。
[0130]「がん関連P2X7受容体」とは、一般的に、がん細胞(前がん性、腫瘍性、悪性、良性または転移性細胞を含む)上に見出されるが、非がん細胞または正常細胞上には見出されないP2X7受容体である。
[0131]「E200エピトープ」とは、一般的に、配列GHNYTTNILPGLNITCを有するエピトープ、およびそのバリアント(例えば、配列番号2~11、15~30および168)を指す。
[0132]「E300エピトープ」とは、一般的に、配列KYYKENNVEKRTLIKを有するエピトープ、およびそのバリアント(配列番号12および13)を指す。
[0133]「複合エピトープ」とは、一般的に、E200およびE300エピトープまたはこれらのエピトープの一部の隣接から形成されるエピトープを指す。E200およびE300エピトープを含む複合エピトープの例は、GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK(配列番号14)である。
[0133]「複合エピトープ」とは、一般的に、E200およびE300エピトープまたはこれらのエピトープの一部の隣接から形成されるエピトープを指す。E200およびE300エピトープを含む複合エピトープの例は、GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK(配列番号14)である。
[0134]「抗体」または「免疫グロブリン」または「Ig」は、血液中、または免疫系において機能して抗原に結合する脊椎動物の他の体液中に見出され、したがって、異物を同定および/または中和するガンマグロブリンタンパク質である。
[0135]抗体は、一般的に、2つの同一の軽(L)鎖および2つの同一の重(H)鎖で構成されるヘテロ四量体の糖タンパク質である。各L鎖は、1つの共有結合ジスルフィド結合によってH鎖に連結される。2つのH鎖は、H鎖のアイソタイプに応じて、1つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各H鎖とL鎖はまた、規則的に離れた鎖内ジスルフィド架橋を有する。
[0136]H鎖およびL鎖は特定のIgドメインを定義する。より具体的には、各H鎖は、N末端に可変ドメイン(VH)を有し、続いてαおよびγ鎖の各々に対して3つの定常ドメイン(CH)を有し、μおよびεアイソタイプに対して4つのCHドメインを有する。各L鎖は、N末端に可変ドメイン(VL)を有し、続いて他端に定常ドメイン(CL)を有する。VLはVHと整列し、CLは重鎖(CH1)の第1の定常ドメインと整列する。
[0137]抗体は、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには、5つのクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称される重鎖を有する。γおよびαクラスは、3/4配列および機能における比較的に小さな相違に基づいてさらにサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラス:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2を発現する。任意の脊椎動物種のL鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパとラムダと呼ばれる2つの明確に異なるタイプのうちの1つに割り当てることができる。
[0138]定常ドメインは、ジスルフィドによって一緒に保持された両方のH鎖のカルボキシ末端部分を含むFc部分を含む。ADCCなどの抗体のエフェクター機能は、Fc領域の配列によって決定されるが、この領域はまた、ある特定のタイプの細胞上に見出されるFc受容体(FcR)によって認識される部分である。
[0139]VHとVLの対合は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを含む「可変領域」または「可変ドメイン」を一緒に形成する。重鎖の可変ドメインは「VH」と呼ばれ得る。軽鎖の可変ドメインは「VL」と呼ばれ得る。Vドメインは抗原結合に影響を与え、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する「抗原結合部位」を含有する。V領域は約110アミノ酸残基におよび、一般的にそれぞれ9~12アミノ酸の長さである「超可変領域」(一般的に約3)と呼ばれる極端な可変性を有する短い領域によって隔てられた、15~30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)(一般的に約4)と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。FRは主にβシート構造をとり、超可変領域はβシート構造を接続するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。
[0140]「超可変領域」とは、配列中で超可変であり、および/または構造的に規定されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は6つの超可変領域;VH中の3つ(H1、H2、H3)およびVL中の3つ(L1、L2、L3)を含む。
[0141]「フレームワーク」または「FR」残基は、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
[0142]「抗原結合部位」とは、一般的に、Vドメインに抗原結合機能を付与するために必要である、少なくとも超可変領域およびフレームワーク領域を含む分子を指す。抗原結合部位は、本明細書に記載される方法において、抗体または抗体断片(例えば、mAb、単一ドメイン(SD)-mAb、dAb、Fab、SD-Fab、Fd、SD-Fv、Fv、F(ab’)2またはscFv)の形態であり得る。
[0142]「抗原結合部位」とは、一般的に、Vドメインに抗原結合機能を付与するために必要である、少なくとも超可変領域およびフレームワーク領域を含む分子を指す。抗原結合部位は、本明細書に記載される方法において、抗体または抗体断片(例えば、mAb、単一ドメイン(SD)-mAb、dAb、Fab、SD-Fab、Fd、SD-Fv、Fv、F(ab’)2またはscFv)の形態であり得る。
[0143]「無傷」または「全体」抗体は、抗原結合部位、ならびにCLおよび少なくとも重鎖定常ドメインであるCH1、CH2およびCH3を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)またはそれらのアミノ酸配列バリアントであり得る。
[0144]「可変ドメインを含む抗体断片全体」は、SD-mAb、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFv断片;ダイアボディ;線状抗体、一本鎖抗体分子;および抗体断片から形成される多特異抗体を含む。
[0145]「Fab断片」は、H鎖の可変領域ドメイン(VH)と、1つの重鎖の最初の定常ドメイン(CH1)とともに、L鎖全体からなる。各Fab断片は、抗原結合に関して一価である、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。
[0146]「Fab’断片」は、抗体ヒンジ領域からの1つ以上のシステインを含むCH1ドメインのカルボキシ末端でさらなる少数の残基を有することによって、Fab断片とは異なる。Fab’-SHは、定常ドメインのシステイン残基(複数可)が遊離チオール基を有するFab’についての本明細書中の呼称である。
[0147]「F(ab’)2断片」は、二価の抗原結合活性を有する2つのジスルフィド結合Fab断片にほぼ対応し、なおも抗原を架橋することができる。
[0148]「Fv」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、密接な非共有結合で結合している、1つの重鎖可変領域ドメインと1つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。
[0148]「Fv」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、密接な非共有結合で結合している、1つの重鎖可変領域ドメインと1つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。
[0149]一本鎖Fv(scFv)種において、1つの重鎖および1つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が、二本鎖Fv種におけるものと類似の「二量体」構造で会合し得るように、可撓性ペプチドリンカーによって共有結合され得る。これら2つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する6つの超可変ループ(H鎖およびL鎖から各々3つのループ)が生じる。
[0150]「一本鎖Fv」はまた、「sFv」または「scFv」と略され、単一のポリペプチド鎖を形成するために接続されたVHおよびVL抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、scFvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。
[0151]「単一可変ドメイン」は、一般的に、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有するFv(抗原に特異的な3つのCDRのみを含む)の半分である。
[0152]「ダイアボディ」とは、2つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖(VH-VL)中の軽鎖可変ドメイン(VL)に接続された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。小さな抗体断片は、Vドメインの鎖内ではなく鎖間対合が達成され、二価断片、すなわち2つの抗原結合部位を有する断片をもたらすように、VHドメインとVLドメインの間に短いリンカー(約5~10残基)を有するsFv断片(前段落を参照されたい)を構築することによって調製される。
[0153]ダイアボディは二価または二重特異性であり得る。二重特異性ダイアボディは、2つの抗体のVHドメインとVLドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する2つの「クロスオーバー」sFv断片のヘテロ二量体である。トリアボディおよびテトラボディはまた、当該技術分野において一般的に公知である。
[0154]「単離された抗体」は、その既存の環境の成分から同定および分離され、ならびに/または回収された抗体である。汚染成分は、抗体の治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。
[0155]「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野において公知である種々の技術を用いて産生することができる。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。
[0156]非ヒト(例えば、げっ歯類)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であり、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域由来の残基で置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FRの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、および典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含んでもよい。
[0157]「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、可能性のある天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、抗原上の単一の抗原部位または決定基に対して向けられる。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加えて、他の抗体によって汚染されずに合成され得るという点で有利である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって調製することができる。「モノクローナル抗体」はまた、分子操作技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
[0158]用語「抗P2X7受容体抗体」または「P2X7受容体に結合する抗体」とは、抗体が、P2X7受容体、典型的には非機能的P2X7受容体またはがん関連Ρ2Χ7受容体を標的化する際の診断薬および/または治療薬として有用であるように、十分な親和性でP2X7受容体に結合し得る抗体を指す。好ましくは、無関係なタンパク質に対するΡ2Χ7受容体抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、Biacorまたはフローサイトメトリーによって測定した場合、P2X7受容体への抗体の結合の約10%未満である。ある特定の実施形態では、P2X7受容体に結合する抗体は、<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、または<0.1nMの解離定数(Kd)を有する。抗nf2X7受容体抗体は、一般的に、これらの血清学的特徴の一部または全部を有し、機能不全P2X7受容体に結合するが、機能的P2X7受容体には結合しない抗体である。
[0159]「親和性成熟した」抗体は、それらの改変(複数可)を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす、1つ以上の超可変領域における1つ以上の改変を伴う抗体である。好ましい親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはピコモル親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当該技術分野において公知の手順によって産生される。
[0160]「ブロッキング抗体」または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または減少させる抗体である。好ましいブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。
[0161]本明細書で使用される場合、「アゴニスト抗体」は、目的とするポリペプチドの機能的活性の少なくとも1つを模倣する抗体である。
[0162]「結合親和性」とは、一般的に、分子(例えば、抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー(例えば、抗体と抗原)間の1:1の相互作用を反映する、内因性結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般的に、解離定数(Kd)で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当該技術分野において公知である一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般的に、ゆっくりと抗原に結合し、容易に解離する傾向があるのに対して、高親和性抗体は一般的に、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当該技術分野において公知であり、そのいずれも本発明の目的のために使用することができる。
[0162]「結合親和性」とは、一般的に、分子(例えば、抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー(例えば、抗体と抗原)間の1:1の相互作用を反映する、内因性結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般的に、解離定数(Kd)で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当該技術分野において公知である一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般的に、ゆっくりと抗原に結合し、容易に解離する傾向があるのに対して、高親和性抗体は一般的に、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当該技術分野において公知であり、そのいずれも本発明の目的のために使用することができる。
[0163]本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、1つ以上の抗体に結合するかまたはその産生を誘発する物質を含むことが意図され、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、脂質、糖質、およびそれらの組合せ、例えば、グリコシル化タンパク質または糖脂質を含むことができる。本明細書で使用される用語「抗原」とは、標的細胞上に発現され得、抗体もしくはTCR、またはトランスジェニックTCR、CAR、scFvもしくはその多量体、Fab-断片もしくはその多量体、抗体もしくはその多量体、一本鎖抗体もしくはその多量体、または高親和性で構造に結合することができる任意の他の分子を含むがこれらに限定されない、適応免疫系によって認識され得る分子実体を指す。
[0164]「エピトープ」とは、一般的に、抗体の抗原結合部位の結合を受ける抗原のその部分を指す。エピトープは、抗原結合部位を形成する抗体CDRの超可変ループが、一次タンパク質構造におけるようなアミノ酸の配列に結合するという意味で「線形」であり得る。ある特定の実施形態では、エピトープは、「立体構造エピトープ」であり、すなわち、CDRの超可変ループが三次または四次タンパク質構造中に存在するときに残基に結合するものである。
[0165]本明細書で使用される用語「標的細胞」とは、機能不全P2X7受容体(例えば、nfP2X7受容体)または架橋分子の標的化部分が結合する細胞表面分子を発現する細胞を指す。標的細胞は、がん細胞または任意の他の疾患細胞であり得る。
[0166]用語「障害」または「状態」とは、がん、自己免疫疾患、またはウイルス、細菌、寄生虫、もしくはその他による感染などの対象における機能的異常または障害を意味する。
[0167]例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同一の核酸もしくはペプチドは「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質はまた、例えば、宿主細胞などの非天然環境中に存在することができる。
[0168]本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、サルまたはヒトなどの哺乳動物を指す。好ましくは、対象はヒトである。対象は、がんなどの障害を患っている対象(患者)であり得るが、対象はまた健康な対象であり得る。
[0169]用語「自己」とは、本明細書で使用される場合、それが後に再導入される同一対象由来の任意の材料を指す。
[0170]用語「同種」とは、本明細書で使用される場合、材料が再導入される対象と同じ種の異なる対象に由来する任意の材料を指す。
[0170]用語「同種」とは、本明細書で使用される場合、材料が再導入される対象と同じ種の異なる対象に由来する任意の材料を指す。
[0171]用語「治療上有効な量」または「治療上有効な集団」とは、例えば、対象において治療上の利益を提供する細胞集団の量を意味する。
[0172]用語「結合する」、「特異的に結合する」、または「に特異的である」は、例えば、本明細書に開示される架橋分子において、または抗原結合ドメインに言及してCARにおいて使用される標的化部分に関して、それが、特異的抗原を認識し、それに結合するが、実質的に、試料中の他の分子を認識せず、またはそれに結合しないことを意味する。ある種由来の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインまたは標的化部分はまた、別の種由来の抗原に結合し得る。この交差種反応性は多くの抗体に典型的であり、したがって、抗原結合ドメインが特異的であるという定義に反するものではない。抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインは、抗原の異なる対立遺伝子型(対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、アイソフォームなど)または同じ遺伝子ファミリー由来のこの抗原の相同性バリアントにも結合し得る。この交差反応性は多くの抗体に典型的であり、したがって抗原結合ドメインが特異的であるという定義に反するものではない。
[0172]用語「結合する」、「特異的に結合する」、または「に特異的である」は、例えば、本明細書に開示される架橋分子において、または抗原結合ドメインに言及してCARにおいて使用される標的化部分に関して、それが、特異的抗原を認識し、それに結合するが、実質的に、試料中の他の分子を認識せず、またはそれに結合しないことを意味する。ある種由来の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインまたは標的化部分はまた、別の種由来の抗原に結合し得る。この交差種反応性は多くの抗体に典型的であり、したがって、抗原結合ドメインが特異的であるという定義に反するものではない。抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインは、抗原の異なる対立遺伝子型(対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、アイソフォームなど)または同じ遺伝子ファミリー由来のこの抗原の相同性バリアントにも結合し得る。この交差反応性は多くの抗体に典型的であり、したがって抗原結合ドメインが特異的であるという定義に反するものではない。
[0173]本明細書で使用される用語「操作された細胞」および「遺伝子修飾細胞」は、互換的に使用することができる。これらの用語は、順に細胞もしくはその子孫の遺伝子型または表現型を修飾する外来遺伝子または核酸配列を含有するおよび/または発現することを意味する。特に、これらの用語は、細胞、優先的に免疫細胞が、当該技術分野において周知である組換え方法によって操作され、自然状態でこれらの細胞において発現されないペプチドまたはタンパク質を安定的にもしくは一時的に発現し得るという事実を指す。例えば、免疫細胞は、それらの細胞表面上にキメラ抗原受容体などの人工構築物を発現するように操作される。例えば、CAR配列は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベース、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクター、またはそれらの任意の他のシュードタイプ化バリエーション、またはCRISPR/Cas9とのエレクトロポレーションもしくはリポフェクションなどの任意の他の遺伝子送達メカニズム、トランスポゾン(例えば、スリーピング-ビューティ)、またはそれらのバリエーションを用いて細胞内に送達され得る。遺伝子送達は、mRNA(一過性)またはDNA(一過性または永久的)の形態であり得る。
[0174]用語「免疫細胞」または「免疫エフェクター細胞」とは、免疫系の一部であり、特定のエフェクター機能を実行する細胞を指し、例えば、アルファ-ベータT細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、Breg細胞、Treg細胞、先天性リンパ系細胞(ILC)、サイトカイン誘導性キラー(CIK)細胞、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞、ガンマ-デルタT細胞、間葉系幹細胞または間葉系間質細胞(MSC)、単球もしくはマクロファージ、または体細胞に成熟もしくは分化し得る多能性幹細胞および初期前駆細胞サブセットなどの任意の造血前駆細胞が挙げられる。細胞は、天然に存在するか、またはサイトカイン曝露、人工/遺伝子修飾細胞(iPSCおよび他の人工細胞型など)によって生成され得る。免疫細胞は、誘導された多能性幹細胞およびそこから成熟した細胞を含む人工細胞サブセットであり得る。好ましい免疫細胞は、アルファ-ベータT細胞、NK細胞、NKT細胞、ILC、CIK細胞、LAK細胞またはガンマ-デルタT細胞などの細胞傷害性エフェクター機能を有する細胞である。「エフェクター機能」とは、細胞の特別な機能を意味し、例えば、T細胞において、エフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー細胞活性であり得る。
[0175]本明細書で使用される用語、障害を「処置する」(その処置)とは、対象が経験する疾患または障害の少なくとも1つの徴候もしくは症状の頻度または重症度を減少させることを意味する。
[0176]本明細書で使用される用語「発現」は、細胞中のそのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳と定義される。
キメラ抗原受容体(CAR)
[0177]がん特異的CAR(T細胞)標的化という用語は、腫瘍細胞の細胞表面上に提示されるが、健康な細胞の表面上に典型的には見出されない標的抗原に結合するためのCAR T細胞の使用を指す。言い換えれば、正常な環境下の正常細胞は、細胞外膜上に標的抗原が存在しないこと(したがって、細胞表面上の抗原の存在は検出できない)によって特徴付けることができる。しかしながら、このような細胞は、細胞内レベルで抗原をコードするmRNAを発現することができる。CAR T細胞は表面発現抗原のみを認識するため、標的化タンパク質の細胞内発現はCARエンゲージメントをもたらさない。
キメラ抗原受容体(CAR)
[0177]がん特異的CAR(T細胞)標的化という用語は、腫瘍細胞の細胞表面上に提示されるが、健康な細胞の表面上に典型的には見出されない標的抗原に結合するためのCAR T細胞の使用を指す。言い換えれば、正常な環境下の正常細胞は、細胞外膜上に標的抗原が存在しないこと(したがって、細胞表面上の抗原の存在は検出できない)によって特徴付けることができる。しかしながら、このような細胞は、細胞内レベルで抗原をコードするmRNAを発現することができる。CAR T細胞は表面発現抗原のみを認識するため、標的化タンパク質の細胞内発現はCARエンゲージメントをもたらさない。
[0178]P2X7受容体の、標的化されるエピトープE200およびE300は、健常組織に見られる受容体の形態では露出しておらず、したがって、これらのエピトープは、がん特異的であるとみなすことができる。言い換えれば、E200およびE300エピトープは、P2X7受容体が、がん(この場合、受容体はnfP2X7受容体と呼ばれる)との関連において起こることなどの、変化した非機能的立体構造を有する場合にのみ露出され、結合するために利用可能である。がん特異的な、標的化されるエピトープの別の例は、スプライスバリアントEGFRvIIIから誘導され得る。さらに別の例は、抗原CLDN6であり、これは、大部分が胚および胎児の生命に限定され、生後初期段階後に健康な細胞において非常に限定された発現を有し、がんにおいて高度に制限され、比較的過剰発現されるとみなされ得る。本発明は、がん特異的標的化のためのnfP2X7、EGFRvIIIおよびCLDN6を含む、任意のこのような腫瘍特異的抗原への結合を意図し、本明細書に記載される架橋分子を介してCAR T細胞をがん関連抗原にエンゲージする。
[0179]一般的に、CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞外ドメイン(細胞外部分)を含み得る。細胞外ドメインは、リンカーによって膜貫通ドメインに連結され得る。細胞外ドメインはまた、シグナルペプチドを含み得る。本発明のCARの細胞外部分は、腫瘍特異的抗原結合ドメインを含む。例えば、腫瘍特異的抗原は、nfP2X7、EGFRvIIIまたはCLDN6を含む、本明細書に記載される任意のものであり得る。
[0180]腫瘍特異的抗原結合ドメインは、本明細書に開示されるように、E200(またはE300またはE200-300複合体)エピトープを認識するnfP2X7結合ドメインであり得る。具体的には、本明細書に開示されるCARは、抗原結合ドメインとして細胞外nfP2X7 E200(またはE300またはE200-300複合体)結合ドメインを有する。あるいは、腫瘍特異的抗原結合ドメインは、25~29位のLEEKKで開始するアミノ酸配列の融合から生じるエピトープを認識し、続いてGの挿入、およびその後のアミノ酸配列298~304のNYVVTDHを認識するEGFRvIII結合ドメインであり得、全エピトープは、配列LEEKKGNYVVTDH(配列番号267)で構成される13マーである。あるいは、腫瘍特異的抗原結合ドメインは、配列番号273、274または275のアミノ酸配列を介して、CLDN6[UniProtKB-P56747(CLDN6_HUMAN)]の第2の細胞外ドメインにおけるエピトープを認識するCLDN6結合ドメインであり得る。
[0181]典型的には、抗原認識ドメインは、腫瘍特異的抗原(機能不全P2X7受容体、EGFRvIIIまたはCLDN6など)に結合する抗体の1つ以上の相補性決定領域(CDR)とのアミノ酸配列相同性を含む結合ポリペプチドを含む。任意の実施形態では、結合ポリペプチドは、腫瘍特異的抗原(機能不全P2X7受容体、EGFRvIIIまたはCLDN6など)に結合する抗体のVHおよび/またはVL鎖のCDR1、2および3ドメインとのアミノ酸配列相同性を含む。
[0182]本発明の特に好ましい実施形態では、CARの抗原認識ドメインは、腫瘍特異的抗原nfP2X7のエピトープに結合する。
[0183]このような実施形態では、結合ポリペプチドは、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、PCT/AU2002/000061またはPCT/AU2002/001204(または対応する米国特許第7,326,415号、米国特許第7,888,473号、米国特許第7,531,171号、米国特許第8,080,635号、米国特許第8,399,617号、米国特許第8,709,425号、米国特許第9,663,584号、または米国特許第10,450,380号)、PCT/AU2007/001540(または対応する米国特許第8,067,550号)、PCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010-0036101号)、PCT/AU2008/001364(または対応する米国特許第8,440,186号、米国特許第9,181,320号、米国特許第9,944,701号または米国特許第10,597,451号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2008/001365(または対応する米国特許第8,293,491号または米国特許第8,658,385号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2009/000869号(または対応する米国特許第8,597,643号、米国特許第9,328,155号または米国特許第10,238,716号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2010/001070(または対応する国際公開第2011/020155号、米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、もしくは米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)、およびPCT/AU2010/001741(または対応する国際公開第2011/075789号もしくは米国特許第8,835,609号のいずれか1つ)のうちのいずれか1つに記載される抗体のVHおよび/またはVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。好ましくは、結合ポリペプチドは、PCT/AU2010/001070(または対応する米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、または米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)に記載される抗体2-2-1、またはPCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010-0036101号)に記載され、アクセッション番号06080101下でEuropean Collection of Cultures(ECACC)に寄託されたハイブリドーマAB253により生成される、国際公開第2013185010A1号または国際公開第2019056023号に記載されるBPM09のVHおよび/またはVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。あるいは、CARの結合ポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2017/041143号(米国出願公開第2019/0365805号としても公開されている)、および国際公開第2019/222796号(米国出願第17/057,060に対応する)に記載される抗体sdAb2-2-3、2-472-2、または2-2-12のCDRのアミノ酸配列を含み得る。
[0183]このような実施形態では、結合ポリペプチドは、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、PCT/AU2002/000061またはPCT/AU2002/001204(または対応する米国特許第7,326,415号、米国特許第7,888,473号、米国特許第7,531,171号、米国特許第8,080,635号、米国特許第8,399,617号、米国特許第8,709,425号、米国特許第9,663,584号、または米国特許第10,450,380号)、PCT/AU2007/001540(または対応する米国特許第8,067,550号)、PCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010-0036101号)、PCT/AU2008/001364(または対応する米国特許第8,440,186号、米国特許第9,181,320号、米国特許第9,944,701号または米国特許第10,597,451号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2008/001365(または対応する米国特許第8,293,491号または米国特許第8,658,385号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2009/000869号(または対応する米国特許第8,597,643号、米国特許第9,328,155号または米国特許第10,238,716号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2010/001070(または対応する国際公開第2011/020155号、米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、もしくは米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)、およびPCT/AU2010/001741(または対応する国際公開第2011/075789号もしくは米国特許第8,835,609号のいずれか1つ)のうちのいずれか1つに記載される抗体のVHおよび/またはVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。好ましくは、結合ポリペプチドは、PCT/AU2010/001070(または対応する米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、または米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)に記載される抗体2-2-1、またはPCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010-0036101号)に記載され、アクセッション番号06080101下でEuropean Collection of Cultures(ECACC)に寄託されたハイブリドーマAB253により生成される、国際公開第2013185010A1号または国際公開第2019056023号に記載されるBPM09のVHおよび/またはVL鎖のCDRのアミノ酸配列を含む。あるいは、CARの結合ポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2017/041143号(米国出願公開第2019/0365805号としても公開されている)、および国際公開第2019/222796号(米国出願第17/057,060に対応する)に記載される抗体sdAb2-2-3、2-472-2、または2-2-12のCDRのアミノ酸配列を含み得る。
[0184]CARの結合ポリペプチドは、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、PCT/AU2002/000061またはPCT/AU2002/001204(または対応する米国特許第7,326,415号、米国特許第7,888,473号、米国特許第7,531,171号、米国特許第8,080,635号、米国特許第8,399,617号、米国特許第8,709,425号、米国特許第9,663,584号、もしくは米国特許第10,450,380号)、PCT/AU2007/001540(または対応する米国特許第8,067,550号)、PCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010-0036101号)、PCT/AU2008/001364(または対応する米国特許第8,440,186号、米国特許第9,181,320号、米国特許第9,944,701号もしくは米国特許第10,597,451号)、PCT/AU2008/001365(または対応する米国特許第8,293,491号もしくは米国特許第8,658,385号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2009/000869(または対応する米国特許第8,597,643号、米国特許第9,328,155号もしくは米国特許第10,238,716号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2010/001070(対応する国際公開第/2011/020155号、米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、もしくは米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)、およびPCT/AU2010/001741(対応する国際公開第2011/075789もしくは米国特許第8,835,609号のうちのいずれか1つ)のうちのいずれか1つに記載される抗体のVHおよび/またはVL鎖のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、結合ポリペプチドは、PCT/AU2010/001070(または対応する米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、または米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)に記載される抗体2-2-1、またはPCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010-0036101号)に記載され、アクセッション番号06080101下でEuropean Collection of Cultures(ECACC)に寄託されたハイブリドーマAB253により生成される、国際公開第2013185010A1号または国際公開第2019056023号に記載されるBPM09のVHおよび/またはVL鎖のアミノ酸配列を含む。あるいは、CARの結合ポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2017/041143号(米国出願公開第2019/0365805号としても公開されている)、および国際公開第2019/222796号(米国出願第17/057,060に対応する)に記載される抗体sdAb2-2-3、2-472-2、または2-2-12のVHおよび/またはVL鎖のアミノ酸配列を含み得る。
[0185]CARの結合ポリペプチドは、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、PCT/AU2002/000061またはPCT/AU2002/001204(または対応する米国特許第7,326,415号、米国特許第7,888,473号、米国特許第7,531,171号、米国特許第8,080,635号、米国特許第8,399,617号、米国特許第8,709,425号、米国特許第9,663,584号、または米国特許第10,450,380号)、PCT/AU2007/001540(または対応する米国特許第8,067,550号)、PCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010-0036101号)、PCT/AU2008/001364(または対応する米国特許第8,440,186号、米国特許第9,181,320号、米国特許第9,944,701号または米国特許第10,597,451号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2008/001365(または対応する米国特許第8,293,491号または米国特許第8,658,385号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2009/000869号(または対応する米国特許第8,597,643号、米国特許第9,328,155号または米国特許第10,238,716号のうちのいずれか1つ)、PCT/AU2010/001070(または対応する国際公開第2011/020155号、米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、もしくは米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)、およびPCT/AU2010/001741(または対応する国際公開第2011/075789号もしくは米国特許第8,835,609号のいずれか1つ)のうちのいずれか1つに記載される抗体またはその断片のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、結合ポリペプチドは、PCT/AU2010/001070(または対応する米国特許第9,127,059号、米国特許第9,688,771号、または米国特許第10,053,508号のうちのいずれか1つ)に記載されるsdAb2-2-1、またはPCT/AU2007/001541(または対応する米国特許出願公開第2010-0036101号)に記載され、アクセッション番号06080101下でEuropean Collection of Cultures(ECACC)に寄託されたハイブリドーマAB253により生成される、国際公開第2013185010A1号または国際公開第2019056023号に記載される抗体BPM09のアミノ酸配列を含む。あるいは、結合ポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2017/041143号(米国出願公開第2019/0365805号としても公開されている)、および国際公開第2019/222796号(米国出願第17/057,060に対応する)に記載されるsdAb2-2-3、2-472-2、または2-2-12のアミノ酸配列を含み得る。
[0186]「シグナルペプチド」とは、細胞内、例えば、ある特定の細胞小器官(例えば、小胞体)および/または細胞表面へのタンパク質の輸送および局在化を方向付けるペプチド配列を指す。
[0187]一般的に、「抗原結合ドメイン」とは、抗原に特異的に結合する(それによって抗原を含む細胞を標的化することができる)CARの領域を指す。本発明のCARは、1つ以上の抗原結合ドメインを含み得る。一般的に、CAR上の標的化領域は細胞外である。抗原結合ドメインは、抗体またはその抗体結合断片を含み得る。抗原結合ドメインは、例えば、全長重鎖、Fab断片、一本鎖Fv(scFv)断片、二価一本鎖抗体またはダイアボディを含み得る。天然に存在する受容体からのアフィボディまたはリガンド結合ドメインなどの、所与の抗原に特異的に結合する任意の分子を抗原結合ドメインとして用いることができる。しばしば抗原結合ドメインはscFvである。通常、scFvにおいて、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域は、可撓性リンカーによって融合され、scFvを形成する。このようなリンカーは、例えば「(G4/S1)3-リンカー」およびそのバリエーションであり得るが、当業者は、種々のリンカー配列およびフォーマットが使用され得ることを理解する。
[0188]場合によっては、抗原結合ドメインが、CARが使用される同一種に由来することが有益である。例えば、それをヒトにおいて治療的に使用することが計画されている場合、CARの抗原結合ドメインが、ヒトもしくはヒト化抗体またはその抗原結合断片を含むことが有益であり得る。ヒトもしくはヒト化抗体またはその抗原結合断片は、当該技術分野において周知である種々の方法によって作製することができる。本明細書に開示されるCARは、抗原結合ドメインとして細胞外リンカー/標識エピトープ結合ドメインを有し、標的細胞上に発現された抗原に本明細書に開示される標的細胞結合分子を介して間接的に結合することを可能にする。
[0189]本明細書で使用される「スペーサー」または「ヒンジ」とは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にある親水性領域を指す。本発明のCARは、細胞外スペーサードメインを含み得るが、このようなスペーサーを除去することも可能である。スペーサーは、例えば、抗体のFc断片もしくはそれらの断片、抗体のヒンジ領域もしくはそれらの断片、抗体のCH2もしくはCH3領域、アクセサリータンパク質、人工スペーサー配列またはそれらの組合せを含み得る。スペーサーの顕著な例は、CD8アルファヒンジである。
[0190]CARの膜貫通ドメインは、このようなドメインの任意の所望の天然または合成源に由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、例えば、CD8アルファまたはCD28に由来し得る。鍵となるシグナル伝達および抗原認識モジュール(ドメイン)が2つ(またはそれをさらに超える)のポリペプチド上にある場合、CARは2つ(またはそれを超える)の膜貫通ドメインを有することができる。鍵となるシグナル伝達および抗原認識モジュールの分割は、CARの各ポリペプチドにおける低分子依存性ヘテロ二量体化ドメインに起因して、CAR細胞発現に対する低分子依存性、滴定可能および可逆的制御を可能にする(Wu et al, 2015, Science 350: 293-303)。
[0191]CARの細胞質ドメイン(または細胞内シグナル伝達ドメイン)は、CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化に関与する。「エフェクター機能」とは、細胞の特別な機能を意味し、例えば、T細胞において、エフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー細胞活性であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達し、CARを発現する細胞に特別な機能を行うように方向付けるタンパク質の一部を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞エフェクター機能を開始または遮断するシグナルを伝達するのに十分な所与のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全な、突然変異したまたは切断された部分を含み得る。
[0192]細胞内ドメインの機能は、プロ炎症性および/または免疫調節性であってもよく、またはそのような組合せであり得る。
[0193]CARにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの顕著な例には、T細胞受容体(TCR)の細胞質シグナル伝達配列および抗原受容体エンゲージメント後にシグナル伝達を開始する共受容体が含まれる。
[0193]CARにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの顕著な例には、T細胞受容体(TCR)の細胞質シグナル伝達配列および抗原受容体エンゲージメント後にシグナル伝達を開始する共受容体が含まれる。
[0194]一般的に、T細胞活性化は、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介され得、第1にTCRを介して抗原依存的な一次活性化を開始するもの(一次細胞質シグナル伝達配列)、第2に抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルを提供するもの(二次細胞質シグナル伝達配列、共刺激シグナル伝達ドメイン)である。したがって、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、1つ以上の一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび/または1つ以上の二次細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。
[0195]刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、ITAM(免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ)シグナル伝達モチーフを含有する可能性がある。
[0196]CARにおいてしばしば使用される一次細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMの例は、TCRゼータ(CD3ゼータ)、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79bおよびCD66dに由来するものである。最も顕著なのはCD3ゼータ由来の配列である。
[0196]CARにおいてしばしば使用される一次細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMの例は、TCRゼータ(CD3ゼータ)、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79bおよびCD66dに由来するものである。最も顕著なのはCD3ゼータ由来の配列である。
[0197]CARの細胞質ドメインは、それ自体で、または任意の他の所望の細胞質ドメイン(複数可)と組み合わせて、CD3-ゼータシグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。CARの細胞質ドメインは、CD3ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの一部を指す。共刺激分子は、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子であり、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要である。共刺激分子の例は、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2CおよびB7-H3である。
[0198]CARの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の順序で、リンカーの有無にかかわらず、互いに連結され得る。好ましくは長さが2~10アミノ酸である短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、連結を形成し得る。顕著なリンカーはグリシン-セリンダブレットである。
[0199]一例として、細胞質ドメインは、CD3-ゼータのシグナル伝達ドメインおよびCD28のシグナル伝達ドメインを含み得る。別の例において、細胞質ドメインは、CD3-ゼータのシグナル伝達ドメインおよびCD27のシグナル伝達ドメインを含み得る。さらなる例において、細胞質ドメインは、CD3-ゼータのシグナル伝達ドメイン、CD28のシグナル伝達ドメイン、およびCD27のシグナル伝達ドメインを含み得る。
[0200]前述のように、CARの細胞外部分または膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインはまた、CARの鍵となるシグナル伝達および抗原認識モジュールを分割する目的のためのヘテロ二量体化ドメインを含み得る。
[0201]本発明に従って使用され得るCARの非限定的な例は、配列番号165~167、266または272に記載される。種々のCAR分子の構造の例はまた、本明細書では図35に提供される。本発明に従って使用され得るCARのさらなる例は、国際公開第2017/041143号(米国特許出願公開第2019/0365805号としても公開されている)、および国際公開第2019/222796号(米国特許出願公開第17/057,060号に対応する)に提供され、参照により本明細書に組み込まれる。
[0202]本発明に従った使用のためのCAR、すなわち、nfP2X7 E200結合ドメインを含むCARは、本明細書に記載される上記ドメインの任意の部分または一部を任意の順序および/または組合せで含むように設計され得、機能的CARがもたらされる。
[0203]本明細書に開示されるCAR、またはそれに由来するポリペプチド(複数可)、上記CARをコードする核酸分子(複数可)もしくは組換え発現ベクター細胞、または上記CARを発現する細胞集団を単離および/または精製することができる。用語「単離された」とは、自然状態から改変または除去されたことを意味する。例えば、単離された細胞集団とは、このような細胞の富化、およびそれらの天然に存在する状態で上記単離された細胞と通常会合している他の細胞からの分離を意味する。単離された細胞集団とは、自然界に見られるよりも均一な細胞集団である実質的に精製された細胞の集団を意味する。好ましくは、富化された細胞集団は、選択された細胞型の少なくとも約90%を含む。特定の態様では、細胞集団は、選択された細胞型の少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはさらには100%を含む。
[0204]CARの機能不全P2X7受容体結合ドメインが架橋分子のnfP2X7認識部位E200に結合する親和性は変化し得るが、一般的に、結合親和性は、100μm、1nM、10nM、または100nM、好ましくは少なくとも約1pMまたは10pM、さらにより好ましくは少なくとも約100pMの範囲であり得る。
[0205]EGFRvIIIに標的化されたCAR T細胞を用いて、固形がんを処置することができる。EGFRvIIIは、EGFRスキッピングエクソン2~7の高頻度スプライスバリアントである。EGFRvIIIは腫瘍特異的であり、正常細胞ではEGFRが厳密に調節されているため、健康な細胞では生じない。EGFRvIIIは一般的に膠芽腫に発現するが、乳がんおよび頭頸部がんにも発現する。この関連におけるEGFRvIII-CAR Tは、配列(配列番号266)を有し得、25~29位のLEEKKから出発するアミノ酸配列の融合から生じるエピトープに標的化され得、続いてGが挿入され、その後のアミノ酸配列298~304のNYVVTDHが続き、全エピトープは、配列LEEKKGNYVVTDH(配列番号267)を含むかまたはそれからなる。完全なEGFR配列はUniProtKB-P00533(EGFR_HUMAN)に見出され、完全なタンパク質はアイソフォーム1の1210アミノ酸を数える。
[0206]EGFRvIII標的化CAR T細胞は、がん細胞上のEGFRvIIIを標的とする従来の方法で膠芽腫を処置するために使用され得るが、また、EGFRvIIIエピトープ部分が架橋分子の配列に組み込まれる場合、本明細書に記載される架橋分子を介して、他のがん関連標的抗原に再方向付けされ得る。次に、EGFRvIII CAR T細胞は、本明細書に記載されるnfP2X7 CAR標的化アプローチに関して概説されるのと同じ方法で用いることができる。ペプチドタグは、配列番号267の13マーのペプチドLEEKKGNYVVTDH、またはその短縮されたかもしくは延長された天然または人工バリアントであり得る。
[0207]CD33およびHer2に標的化されるEGFRvIII CAR適合性架橋分子のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号268および269、ならびに配列番号270および271として表1に記載される。
[0208]CLDN6標的化CAR T細胞は、固形がん、例えば、卵巣がんを処置するために使用され得る。この関連におけるCLDN6-CAR Tは、配列(配列番号272)を有し得、アミノ酸配列[ECD2、>sp|P56747|138-160WTAHAIIRDFYNPLVAEAQKREL(配列番号273)]を介して直接、CLDN6[UniProtKB-P56747(CLD6_HUMAN]細胞の第2の細胞外ドメインに標的化され得するが、また、CLDN6エピトープ部分が架橋分子の配列に組み込まれる場合、本明細書に記載の架橋分子を介して、他のがん関連標的抗原、例えば、CD33またはHer2に再方向付けされ得る。次に、CLDN6 CAR T細胞は、本明細書に記載されるnfP2X7 CAR標的化アプローチに関して概説されるのと同じ方法で使用することができる。ペプチドタグは、23マーのペプチドWTAHAIIRDFYNPLVAEAQKREL、または短縮されたかもしくは延長されたその天然または人工バリアント、例えば、配列番号274または275であり得る。
架橋分子
[0209]架橋分子は、a)標的細胞に結合するための標的化部分、およびb)腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含むという条件で、任意の形態であり得ることが理解される。好ましくは、腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、機能不全P2X7受容体エピトープ部分、EGFRvIIIエピトープ部分またはCLDN6エピトープ部分であるかまたはそれを含み、好ましくは、本発明の方法に従って、エピトープ部分が、再方向付けされている腫瘍特異的CARによって認識されるようになる。
[0209]架橋分子は、a)標的細胞に結合するための標的化部分、およびb)腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含むという条件で、任意の形態であり得ることが理解される。好ましくは、腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、機能不全P2X7受容体エピトープ部分、EGFRvIIIエピトープ部分またはCLDN6エピトープ部分であるかまたはそれを含み、好ましくは、本発明の方法に従って、エピトープ部分が、再方向付けされている腫瘍特異的CARによって認識されるようになる。
[0210]典型的には、標的化部分は、標的化部分が腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分に直接的にまたはリンカーを介して連結される融合タンパク質の形態である。
[0211]架橋分子は、異なる数のアーキテクチャのいずれかを有し得ることが理解される。例えば、および本明細書にさらに記載されるように、標的細胞に結合するための標的化部分は、抗体由来などの任意の適切な結合ドメイン、またはその断片の形態であり得る。標的化部分は、いずれの構造においても、腫瘍特異的抗原エピトープ部分に連結され得る。例えば、腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、標的部分のNまたはC末端に連結され得る。適切なアーキテクチャの例は、本明細書の図に提供される。特に好ましい実施形態では、腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分のN末端領域が腫瘍特異的CARによる結合のために自由にアクセス可能であるように、そのC末端領域を介して標的化部分に連結される。
[0212]標的化部分を腫瘍特異的抗原エピトープ部分に連結するために、任意の適切なリンカーを使用することができる。リンカーは、ポリペプチド、ペプチドまたは化学基を含み得る。
[0213]リンカーは、最大20個のアミノ酸の長さを有するペプチドであり得る。用語「に連結された」または「に融合された」とは、2つの部分の間に形成された共有結合、例えばペプチド結合を指す。したがって、本発明との関連において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22個のアミノ酸の長さを有し得る。例えば、本明細書で提供される架橋分子は、標的化部分と腫瘍特異的抗原エピトープ部分の間のリンカー、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含み得る。このようなリンカーは、融合タンパク質の異なるポリペプチドが独立に折り畳まれ、予想通りに振る舞う可能性を高め得るという利点を有する。
[0214]当業者は、本発明によるリンカーとしての使用に適している、種々のアミノ酸、および種々の長さを含む種々のペプチドリンカーの設計および使用に精通している。リンカーは、反復アミノ酸配列の種々の組合せを含み得る。リンカーは、可撓性リンカー(例えば、グリシンおよびセリン残基の反復を含むもの)、剛性リンカー(例えば、グルタミン酸およびリジン残基、隣接アラニン反復を含むもの)、および/または切断可能なリンカー(例えば、プロテアーゼ切断により感受性である配列)であり得る。
[0215]ペプチドリンカーは、Gly-Ser(GS)、Gly-Gly-Ser(GGS)、Gly-Gly-Gly-Ser(GGGS)、もしくはGly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)、またはそれらのバリエーションのいずれか1つ以上の反復であり得る。任意の実施形態では、リンカーは、配列GGGGSGGGGSGGGGS、すなわち、(G4S)3を含み得るかまたはそれから構成され得る。
[0216]任意の実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列GGGGGS(長さが6アミノ酸のリンカー)またはさらに長いものを含むことができる。リンカーは、異なる長さの一連の繰り返しグリシンおよびセリン残基(GS)、すなわち、(GS)nであり得、nは、1~15またはそれ以上の任意の数である。例えば、リンカーは、(GS)3(すなわち、GSGSGS)もしくはより長い(GS)11またはより長いものであり得る。nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11またはそれ以上を含む任意の数であり得ることが理解される。
[0217]さらなる実施形態では、リンカーは、リジンなどの剛性を提供するアミノ酸の含有を含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、リンカー領域はまた、配列GSGKを含み得る。
[0218]ペプチドリンカーは、反復配列に対してNおよびC末端の1つ以上の追加アミノ酸を含むThr-Pro(TP)の一連の反復からなることができる。例えば、リンカーは、配列GTPTPTPTPTGEF(TP5リンカーとしても公知である)を含み得るかまたはそれからなることができる。さらなる態様では、リンカーは、短いおよび/またはアルファ-螺旋剛性リンカー(例えば、A(EAAAK)3A、PAPAPまたはジペプチド、例えばLEもしくはCC)であり得る。
[0219]さらなる実施形態では、代替として、または上記のグリシン-セリンベースのリンカー領域に加えて、標的化部分は、ヒンジ領域を介して、標的化部分が腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分に連結される融合タンパク質の形態であり得る。標的部分と腫瘍特異的抗原エピトープ部分の間の連結は、ヒンジ領域およびリンカー領域の組合せを含み得る。
[0220]適切なヒンジ領域の例としては、免疫グロブリンに由来するヒンジ領域が挙げられる。ヒンジ領域は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4から誘導され得、(例えば、ジスルフィド架橋形成の可能性を防止または低減するために)1つ以上のアミノ酸置換を含み得る。代替のヒンジ配列は、代替の免疫グロブリンドメイン、CD8A、CD8B、CD4またはCD28、TRAC、TRBC、TRGC、TRDCから誘導することができる。
[0221]下記の表2は、本発明の架橋分子中の標的化部分および腫瘍特異的抗原エピトープ部分を接合する際に使用するための適切なヒンジ領域の非限定的な例を提供する。
[0222]標的化部分は、1を超えるリンカーおよび/または1を超えるヒンジ領域によって腫瘍特異的抗原エピトープ部分に接続され得ることが理解される。例えば、融合タンパク質は、(NからC末端に)標的化部分に直接コンジュゲートされた腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含み得る。あるいは、融合タンパク質は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分、続いてリンカー領域、次に標的化部分を含み得る。さらになお、融合タンパク質は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分、続いてリンカー領域、次にヒンジ領域、次に標的化部分を含み得る。さらなる実施形態ではなお、融合タンパク質は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分、続いてリンカー領域、次にヒンジ領域、さらなるリンカー領域、次に標的化部分を含み得る。当然に、当業者は、代替構造が可能であること(すなわち、腫瘍特異的抗原エピトープ部分が、1つ以上のリンカーおよび/またはヒンジ領域を介して、標的化部分のC末端に接続される)を理解する。
[0222]標的化部分は、1を超えるリンカーおよび/または1を超えるヒンジ領域によって腫瘍特異的抗原エピトープ部分に接続され得ることが理解される。例えば、融合タンパク質は、(NからC末端に)標的化部分に直接コンジュゲートされた腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含み得る。あるいは、融合タンパク質は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分、続いてリンカー領域、次に標的化部分を含み得る。さらになお、融合タンパク質は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分、続いてリンカー領域、次にヒンジ領域、次に標的化部分を含み得る。さらなる実施形態ではなお、融合タンパク質は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分、続いてリンカー領域、次にヒンジ領域、さらなるリンカー領域、次に標的化部分を含み得る。当然に、当業者は、代替構造が可能であること(すなわち、腫瘍特異的抗原エピトープ部分が、1つ以上のリンカーおよび/またはヒンジ領域を介して、標的化部分のC末端に接続される)を理解する。
[0223]
架橋分子の標的化部分
[0224]架橋分子の標的化部分は、標的細胞上の細胞表面分子に結合し得る。細胞表面分子は、抗原を含み得る。細胞表面分子は、タンパク質、脂質部分、糖タンパク質、糖脂質、糖質、多糖、核酸、MHC結合ペプチド、またはそれらの組合せから選択され得る。細胞表面分子は、細菌、ウイルス、および他の微生物の部分(例えば、被膜、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛、および毒素)を含み得る。細胞表面分子は、標的細胞によって発現され得る。細胞表面分子は、標的細胞によって発現されない場合がある。非限定的な例として、細胞表面分子は、標的細胞ではなく、標的細胞または標的細胞の細胞表面分子に結合する細胞によって発現されるリガンドであり得る。また、非限定的な例によって、細胞表面分子は、標的細胞の細胞表面または細胞表面受容体に結合する毒素、外因性分子またはウイルスタンパク質であり得る。
[0224]架橋分子の標的化部分は、標的細胞上の細胞表面分子に結合し得る。細胞表面分子は、抗原を含み得る。細胞表面分子は、タンパク質、脂質部分、糖タンパク質、糖脂質、糖質、多糖、核酸、MHC結合ペプチド、またはそれらの組合せから選択され得る。細胞表面分子は、細菌、ウイルス、および他の微生物の部分(例えば、被膜、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛、および毒素)を含み得る。細胞表面分子は、標的細胞によって発現され得る。細胞表面分子は、標的細胞によって発現されない場合がある。非限定的な例として、細胞表面分子は、標的細胞ではなく、標的細胞または標的細胞の細胞表面分子に結合する細胞によって発現されるリガンドであり得る。また、非限定的な例によって、細胞表面分子は、標的細胞の細胞表面または細胞表面受容体に結合する毒素、外因性分子またはウイルスタンパク質であり得る。
[0225]架橋分子は、複数の標的細胞と相互作用し得る。標的細胞は感染細胞であり得る。標的細胞は、病原性感染細胞であり得る。標的細胞は、罹患細胞であり得る。標的細胞は、遺伝子修飾細胞であり得る。標的細胞は宿主細胞でない場合がある。標的細胞は、侵入した生物(例えば、酵母、線虫、細菌、真菌)に由来し得る。本明細書には、非細胞標的上の分子と相互作用する架橋分子がさらに開示される。非細胞標的は、ウイルスまたはその一部であり得る。非細胞標的は、細胞の断片であり得る。非細胞標的は、細胞外マトリックス成分またはタンパク質であり得る。
[0226]標的細胞は、組織に由来することができる。組織は、脳、食道、乳房、消化管、腸、結腸、肺、グリア、卵巣、子宮、精巣、前立腺、胃腸管、膀胱、肝臓、脾臓、胸腺、骨、脂肪および皮膚から選択され得る。標的細胞は、1つ以上の内分泌腺に由来し得る。あるいは、またはさらに、標的細胞は、1つ以上の内分泌腺に由来することができる。内分泌腺には、リンパ腺、下垂体、甲状腺、副甲状腺、膵臓、生殖腺または松果体であり得る。
[0227]標的細胞は、幹細胞、多能性細胞、造血幹細胞または前駆細胞から選択され得る。標的細胞は循環細胞であり得る。標的細胞は免疫細胞であり得る。
[0228]標的細胞はがん幹細胞であり得る。標的細胞はがん細胞であり得る。がん細胞は、組織に由来することができる。組織は、非限定的な例として、脳、食道、乳房、結腸、肺、グリア、卵巣、子宮、精巣、前立腺、胃腸管、膀胱、肝臓、甲状腺および皮膚から選択され得る。がん細胞は、骨に由来し得る。がん細胞は、血液に由来し得る。がん細胞は、B細胞、T細胞、単球、血小板、白血球、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、造血幹細胞、または内皮細胞前駆細胞に由来し得る。がん細胞は、CD19陽性Bリンパ球に由来し得る。がん細胞は幹細胞に由来し得る。がん細胞は多能性細胞に由来し得る。がん細胞は、1つ以上の内分泌腺に由来し得る。内分泌腺には、リンパ腺、下垂体、甲状腺、副甲状腺、膵臓、生殖腺または松果体であり得る。
[0228]標的細胞はがん幹細胞であり得る。標的細胞はがん細胞であり得る。がん細胞は、組織に由来することができる。組織は、非限定的な例として、脳、食道、乳房、結腸、肺、グリア、卵巣、子宮、精巣、前立腺、胃腸管、膀胱、肝臓、甲状腺および皮膚から選択され得る。がん細胞は、骨に由来し得る。がん細胞は、血液に由来し得る。がん細胞は、B細胞、T細胞、単球、血小板、白血球、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、造血幹細胞、または内皮細胞前駆細胞に由来し得る。がん細胞は、CD19陽性Bリンパ球に由来し得る。がん細胞は幹細胞に由来し得る。がん細胞は多能性細胞に由来し得る。がん細胞は、1つ以上の内分泌腺に由来し得る。内分泌腺には、リンパ腺、下垂体、甲状腺、副甲状腺、膵臓、生殖腺または松果体であり得る。
[0229]標的細胞の細胞表面分子は、受容体であり得る。受容体は細胞外受容体であり得る。受容体は細胞表面受容体であり得る。非限定的な例として、受容体は、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子または細胞認識分子と結合し得る。受容体は膜貫通受容体であり得る。受容体は酵素連結型受容体であり得る。受容体は、G-タンパク質共役受容体(GPCR)であり得る。受容体は、増殖因子受容体であり得る。非限定的な例として、増殖因子受容体は、上皮細胞増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子受容体、神経細胞増殖因子受容体、形質転換増殖因子受容体、骨形成性タンパク質増殖因子受容体、肝細胞増殖因子受容体、血管内皮細胞増殖因子受容体、幹細胞因子受容体、インスリン増殖因子受容体、ソマトメジン受容体、エリスロポエチン受容体、ならびにそれらの相同体および断片から選択され得る。受容体はホルモン受容体であり得る。受容体はインスリン受容体であり得る。非限定的な例として、受容体は、エイコサノイド受容体、プロスタグランジン受容体、エストロゲン受容体、卵胞刺激ホルモン受容体、プロゲステロン受容体、成長ホルモン受容体、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体、それらの相同体およびそれらの断片から選択され得る。受容体はアドレナリン作動性受容体であり得る。受容体はインテグリンであり得る。受容体はEph受容体であり得る。受容体は黄体形成ホルモン受容体であり得る。細胞表面分子は、黄体形成ホルモン受容体に対して少なくとも約50%相同であり得る。受容体は免疫受容体であり得る。非限定的な例として、免疫受容体は、パターン認識受容体、トール様受容体、NOD様受容体、キラー活性化受容体、キラー阻害剤受容体、Fc受容体、B細胞受容体、補体受容体、ケモカイン受容体およびサイトカイン受容体から選択され得る。非限定的な例として、サイトカイン受容体は、インターロイキン受容体、インターフェロン受容体、形質転換増殖因子受容体、腫瘍壊死因子受容体、コロニー刺激因子受容体、それらの相同体、およびそれらの断片から選択され得る。受容体は受容体キナーゼであり得る。受容体キナーゼはチロシンキナーゼ受容体であり得る。受容体キナーゼはセリンキナーゼ受容体であり得る。受容体キナーゼはスレオニンキナーゼ受容体であり得る。非限定的な例として、受容体キナーゼは、Ras、Raf、PI3K、プロテインキナーゼA、プロテインキナーゼB、プロテインキナーゼC、AKT、AMPK、ホスホリパーゼ、それらの相同体およびそれらの断片から選択されるシグナル伝達タンパク質を活性化することができる。受容体キナーゼはMAPK/ERKシグナル伝達経路を活性化し得る。受容体キナーゼは、Jak、StatまたはSmadを活性化し得る。
[0230]細胞表面分子は、非受容体細胞表面タンパク質であり得る。細胞表面分子は、分化タンパク質のクラスターであり得る。非限定的な例として、細胞表面分子は、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD22、CD24、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD56、CD61、CD91、CD114、CD117、CD182、CD200、それらの断片、およびそれらの相同体から選択され得る。
[0231]標的細胞の細胞表面分子は、ペプチドを含まない分子であり得る。細胞表面分子は脂質を含み得る。細胞表面分子は脂質部分または脂質基を含み得る。脂質部分はステロールを含み得る。脂質部分は脂肪酸を含み得る。抗原は糖脂質を含み得る。細胞表面分子は糖質を含み得る。
[0232]標的細胞の細胞表面分子は抗原であり得る。抗原は、細胞上の表面抗原または細胞表面マーカーの少なくとも一部であり得る。抗原は、細胞上の受容体または補助受容体であり得る。抗原は、主要組織適合性複合体(MHC)の結合を受け、T細胞受容体に提示され得る分子または分子断片を指すことができる。また、用語「抗原」とは、免疫原を指すことができる。免疫原は、単独で対象に注入した場合、適応免疫応答を引き起こすことがある。免疫原は、それ自体で免疫応答を誘導することができる。抗原は、スーパー抗原、T依存性抗原、またはT非依存性抗原であり得る。抗原は外因性抗原であり得る。外因性抗原は、典型的には、例えば、吸入、経口摂取、または注射によって体外から体内に入った抗原である。一部の抗原は外因性抗原として出発し、後に内因性となり得る(例えば、細胞内ウイルス)。抗原は内因性抗原であり得る。内因性抗原は、正常な細胞代謝の結果として、または病原性感染(例えば、ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生性)のために細胞内で生成された抗原であり得る。抗原は自己抗原であり得る。自己抗原は、特定の自己免疫疾患を患っている患者の免疫系によって認識される正常なタンパク質またはタンパク質の複合体(および、ときにDNAまたはRNA)であり得る。これらの抗原は、正常な条件下では免疫系の標的ではないが、遺伝的および/または環境的因子のために、これらの患者にはこのような抗原に対する正常な免疫寛容は存在しないはずである。抗原は、状態または疾患のために存在し得るか、または過剰発現され得る。状態または疾患は、がんまたは白血病であり得る。状態は、炎症性疾患または状態であり得る。状態または疾患は代謝性疾患であり得る。状態は遺伝性障害であり得る。
[0233]本発明はまた、例えば、B細胞受容体および/またはT細胞受容体を標的化するための抗イディオタイプ抗体もしくはそれらの断片またはそれらのリガンドを用いて、特異的BまたはT細胞系列関連自己免疫疾患を処置するための適用を見出すことができる。このような疾患には、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、固形臓器移植による超急性拒絶反応、急性拒絶反応、慢性拒絶反応または混合型拒絶反応、骨髄または幹細胞移植による拒絶反応、移植片対宿主病が含まれる。
[0234]標的細胞の細胞表面分子は、腫瘍抗原として指定された抗原であり得る。腫瘍抗原または新生抗原は、腫瘍細胞の表面上のMHC IまたはMHC II分子によって提示される抗原であり得る。これらの抗原は腫瘍細胞によって提示されることがあり、正常な抗原によって提示されることはない。この場合、それらは腫瘍特異的抗原(TSA)と呼ばれ、一般的に、腫瘍特異的突然変異から生じる。より一般的なのは、腫瘍細胞および正常細胞によって提示される抗原であり、それらは腫瘍関連抗原(TAA)と呼ばれる。TAA関連抗原は、腫瘍細胞に固有ではなく、代わりに、抗原に対する免疫寛容状態を誘導しない条件下で正常細胞上にも発現される。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こり得る。TAAは、免疫系が未熟であり、応答することができない場合に胎児発生中に正常細胞上に発現する抗原であり得るか、または正常細胞上に通常は極めて低いレベルで存在するが、腫瘍細胞上ではるかに高いレベルで発現する抗原であり得る。これらの抗原を認識する細胞傷害性Tリンパ球は、増殖または転移する前に腫瘍細胞を破壊することができる。腫瘍抗原はまた、例えば、突然変異した受容体の形態で腫瘍の表面上にあり得、その場合、それらはB細胞によって認識され得る。
[0235]TSAまたはTAA抗原の非限定的な例には、以下:分化抗原、例えばMART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、および腫瘍特異的多系統抗原、例えばMAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15;過剰発現された胎児性抗原、例えばCEA;過剰発現された発がん遺伝子および突然変異した腫瘍抑制遺伝子、例えばp53、Ras、HER-2/neu;染色体転座に起因する固有の腫瘍抗原、例えばBCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR;ならびにウイルス抗原、例えばエプスタインバールウイルス抗原EBVAおよびヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7が含まれる。他の大きなタンパク質ベースの抗原には、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23Hl、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、ベータ-カテニン、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、アルファ-フェトプロテイン、ベータ-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、20 CD68\Pl、C0-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-C0-1、RCASl、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合タンパク質\シクロフィリンC-関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、およびTPSが含まれる。
[0236]標的細胞の細胞表面分子は、任意の表面発現抗原からなる群から選択される抗原であり得る。例示的な標的抗原は、限定されないが、CD33(Siglec-3)、CD123(IL3RA)、CD135(FLT-3)、CD44(HCAM)、CD44V6、CD47、CD184(CXCR4)、CLEC12A(CLL1)、LeY、FRβ、MICA/B、CD305(LAIR-1)、CD366(TIM-3)、CD96(TACTILE)、CD133、CD56、CD29(ITGB1)、CD44(HCAM)、CD47(IAP)、CD66(CEA)、CD112(Nectin2)、CD117(c-Kit)、CD133、CD146(MCAM)、CD155(PVR)、CD171(L1CAM)、CD200(OX-2)、CD221(IGF1)、CD227(MUC1)、CD243(MRD1)、CD246(ALK)、CD271(LNGFR)、CD19、CD20、GD2、およびEGFRを含み得る。他の標的抗原には、TCR、糖、脂質、糖質、または標的細胞の表面上に発現される任意の他の分子が含まれる。抗原は、架橋分子または結合構築物との関連において表1に言及される任意の抗原であり得る。
[0237]好ましい実施形態では、標的細胞はがん細胞であり、がん細胞の細胞表面分子はがんに関連する抗原である。抗原は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原であり得る。抗原は、特定のタイプのがんに関連するものであり得る。例えば、抗原の過剰発現は、特定のがんまたは特定のクラスのがんと関連し得る。例えば、がんが乳がんである場合、抗原は乳がんと関連し得るが、別の型のがんとは関連しない。あるいは、抗原は、固形腫瘍などのがんのクラスと関連し得るが、血液(すなわち、「液性」)腫瘍とは関連せず、またその逆もそうである。抗原は、特定系統のがんと関連し得るが、他のがんとは関連しない。例えば、抗原は肉腫と関連し得るが、リンパ腫またはがん腫とは関連しない。本明細書で使用される場合、がんに関して「関連する」という用語は、抗原の発現(増加するか低下するかにかかわらず)ががんのマーカーであると考えられることを意味すると理解される。抗原の低レベルの発現があり得るが、これは、所与のがんと「関連する」抗原と同等ではないことが理解される。
[0238]架橋分子の標的化部分の結合を受け得る適切ながん抗原には、限定されないが、メソテリン(MSLN)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、前立腺幹細胞抗原(PCSA)、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、癌胎児性抗原(CEA)、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、上皮糖タンパク質(EGP 2)、上皮糖タンパク質-40(EGP-40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体-αおよびβ(FRαおよびβ)、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮細胞増殖因子受容体2(HER-2/ERB2)、HER3、上皮細胞増殖因子受容体vIII(EGFRvIII)、ERB3、ERB4、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、インターロイキン13受容体サブユニットアルファ-2(IL-13Rα2)、κ軽鎖、キナーゼインサートドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1CAM)、黒色腫関連抗原1(黒色腫抗原ファミリーA1、MAGE-A1)、ムチン16(Muc-16)、ムチン1(Muc-1)、NKG2Dリガンド、癌精巣抗原NY-ESO-1、癌胎児抗原(h5T4)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG-72)、血管内皮増殖因子R2(VEGF-R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT-1)、1型チロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体(ROR1)、B7-H3(CD276)、B7-H6(Nkp30)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン-4(CSPG4)、DNAXアクセサリー分子(DNAM-1)、エフリンA型受容体2(EpHA2)、線維芽細胞関連タンパク質(FAP)、Gpl00/HLA-A2、グリピカン3(GPC3)、HA-1H、HERK-V、IL-11Ra、潜伏膜タンパク質1(LMP1)、神経細胞接着分子(N-CAM/CD56)およびトレイル受容体(TRAIL R)が含まれる。これらまたは他のがん抗原は、本発明における架橋分子による標的化に利用することができることが理解される。
[0239]架橋分子の標的化部分は、任意の結合分子、例えば、フルサイズ抗体もしくはその断片、本明細書に記載される任意の抗体もしくはその断片、免疫サイトカイン(サイトカインもしくはその断片に連結された抗体)、リガンド(タンパク質関連ペプチド、糖分子、処理された分子、脂質、サイトカイン、ホルモン)、可溶性T細胞受容体(TcR)、一本鎖(sc)TcR、一本鎖T細胞受容体結合モチーフおよびT細胞受容体様mAb、アプタマー(DNAまたはRNAなど)、ペプチド(例えば、アプタマーもしくは二環式ペプチド)、毒素、脂質または糖質であり得る。
[0240]架橋分子の標的化部分はポリペプチドであり得、標的化抗体または抗体断片であり得る。標的化抗体または抗体断片は、免疫グロブリン(Ig)であり得る。免疫グロブリンは、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、その断片またはその修飾物から選択され得る。免疫グロブリンはIgGであり得る。IgGはIgG1であり得る。IgGはIgG2であり得る。IgGはIgG3であり得る。IgGはIgG4であり得る。IgGは、架橋分子への内因性T細胞FcR結合を調節するための1つ以上のFc突然変異を有し得る。IgGは、FcR陽性細胞のFcRに対するFc結合能力を除去するための1つ以上のFc突然変異を有し得る。1つ以上のFc突然変異は、グリコシル化部位を除去し得る。1つ以上のFc突然変異は、E233P、L234V、L235A、delG236、A327G、A330S、P331S、N297Qおよびそれらの任意の組合せから選択され得る。1つ以上のFc突然変異は、IgG1においてあり得る。IgG1における1つ以上のFc突然変異は、L234A、L235A、またはその両方であり得る。あるいは、またはさらに、IgG1における1つ以上のFc突然変異は、L234A、L235E、またはその両方であり得る。あるいは、またはさらに、IgG1における1つ以上のFc突然変異は、N297Aであり得る。あるいは、またはさらに、1つ以上の突然変異はIgG2においてであり得る。IgG2における1つ以上のFc突然変異は、V234A、V237A、またはその両方であり得る。
[0241]標的化抗体または抗体断片は、Fcヌル免疫グロブリンまたはその断片であり得る。
[0242]本明細書で使用される場合、用語「抗体断片」とは、全長形態以外の任意の形態の抗体を指す。本明細書中の抗体断片には、全長抗体内に存在するより小さな成分である抗体、および操作された抗体が含まれる。抗体断片は、限定されないが、Fv、Fc、Fab、および(Fab’)2、一本鎖Fv(scFv)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二官能性ハイブリッド抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDRの組合せ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、代替の足場非抗体分子、および二特異性抗体が含まれる。特に断らない限り、用語「抗体」または「複数の抗体」を使用する記述および請求項は、「抗体断片」および「複数の抗体断片」を特異的に含むことができる。
[0242]本明細書で使用される場合、用語「抗体断片」とは、全長形態以外の任意の形態の抗体を指す。本明細書中の抗体断片には、全長抗体内に存在するより小さな成分である抗体、および操作された抗体が含まれる。抗体断片は、限定されないが、Fv、Fc、Fab、および(Fab’)2、一本鎖Fv(scFv)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二官能性ハイブリッド抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDRの組合せ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、代替の足場非抗体分子、および二特異性抗体が含まれる。特に断らない限り、用語「抗体」または「複数の抗体」を使用する記述および請求項は、「抗体断片」および「複数の抗体断片」を特異的に含むことができる。
[0243]標的化抗体断片は、ヒト、完全ヒト、ヒト化、ヒト操作、非ヒト、および/またはキメラ抗体であり得る。非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を減少させるためにヒト化され得る。キメラ抗体は、元々別個の抗体についてコードされた2つ以上の抗体遺伝子の接合を介して作製された抗体を指すことができる。キメラ抗体は、第1の抗体からの少なくとも1つのアミノ酸、および第2の抗体からの少なくとも1つのアミノ酸を含み得、第1および第2の抗体は異なる。抗体の少なくとも一部または抗体断片は、ウシ種、ヒト種、またはマウス種由来であり得る。抗体の少なくとも一部または抗体断片は、ラット、ヤギ、モルモットまたはウサギ由来であり得る。抗体の少なくとも一部または抗体断片は、ヒト由来であり得る。抗体の少なくとも一部または抗体断片抗体は、カニクイザル由来であり得る。
[0244]標的化抗体または抗体断片は、哺乳動物、鳥類、魚類、両生類もしくは爬虫類由来の抗体または抗体断片に基づくかまたはそれらに由来し得る。哺乳動物には、限定されないが、肉食動物、げっ歯類、象、有袋類、ウサギ、コウモリ、霊長類、アザラシ、アリクイ、クジラ、奇趾有蹄類、および偶蹄類が含まれる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、またはブタであり得る。
[0245]標的化抗体または抗体断片は、非限定的な例として、CD19、Her2、CLL-1、CD33、EGFRvIII、CD20、CD22、BCMA、またはその断片から選択される抗原を認識し、またはそれに結合することができる。抗原は野生型抗原を含み得る。抗原は、1つ以上の突然変異を含み得る。
[0246]標的化抗体または抗体断片は、抗CD19抗体またはその断片であり得る。標的化ポリペプチドは、抗CD22抗体であり得る。標的化ポリペプチドは、抗BCMA抗体またはその断片であり得る。標的化ポリペプチドは、抗EGFRvIII抗体またはその断片であり得る。標的化ポリペプチドは、抗Her2抗体またはその断片であり得る。標的化ポリペプチドは、抗CD20抗体または抗体断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、リツキシマブを含み得る。標的化ポリペプチドは、抗EGFR抗体または抗体断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CEA抗体または抗体断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CLL-1抗体または抗体断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD33抗体または抗体断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗EpCAM抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD30抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD79B抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD37抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD38抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD70抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD276抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗GD2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD371抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD135抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD105抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD123抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ROR-1抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗PD-L1抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗MET-R抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗PDGFRアルファ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗Her3抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗FRアルファ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗GPC3抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗SLAMf7抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗TNFRSF10B抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗GPNMB抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗VEGFR2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗アルファ4ベータ7/アルファEベータ7抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CSPG4抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD80抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CCR4抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD115抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ENOX-2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD56抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗-huVH1-69抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD117抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD133抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗MUC1抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗MSLN抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ROR-2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗IL13Ra2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗EPHA2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗EGFRvIII抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗PSMA抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CEA抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ルイスY抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗PSCA抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗MUC1抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD181L1CAM抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗EpCAM抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ALK抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗IGF-1R CD221抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ネクチン4抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗FAP抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗AXL抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD138抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CLDN6抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗Her4抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗クラウジン18.2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗O-アセチル化GD2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗GD3抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗GM2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗TM4SF1抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD147抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CEACAM5抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗VEGFR-1抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗PDPN抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗WT1抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗GPC2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗FGFR4抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗EphB4抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗STEAP-1抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗STEAP-2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗MUC1抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗クロロトキシン抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗206抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ILRAP1抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗MICA抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗MAGE-A1 scTcR抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗MAGE-A1sTCR抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗MICA抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗TRBC1/2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗B7-H7抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD34抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD7抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗TIM3抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD191抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD66b抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD11b抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗EMR2抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗MUC16抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗NYESO-1 HLA-A2抗体もしくはその断片、または可溶性TcRもしくはそのバリアントを含み得る。標的化ポリペプチドは、抗スルビビンHLA-A2抗体もしくはその断片、または可溶性TcRもしくはそのバリアントを含み得る。標的化ポリペプチドは、抗CD200抗体またはその断片を含み得る。
[0247]標的化抗体または抗体断片は、任意の市販の抗体から選択することができる。標的化抗体または抗体断片は、トラスツズマブ(Her2結合のため)、アレムツズマブ(CD52結合のため)、ベバシズマブ(VEGF-A結合のため)、ブレンツキシマブ(CD30結合のため)、ゲムツズマブ(CD33結合のため)、イピリムマブ(VTLA-4結合のため)、イブリツモマブ(CD20結合のため)、パニツムマブ(EGFR結合のため)、セツキシマブ(EGFR結合のため)、リツキシマブ(CD20結合のため)、およびそれらの断片から選択され得る。
[0248]標的化抗体または抗体断片は、表1に言及されるいずれかのもの、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%同一である抗原結合断片であり得る。
[0249]架橋分子の標的化部分は、ペプチドMHC複合体を標的とすることができ、このような実施形態では、標的部分は、可溶性TcR分子または一本鎖TcR分子であり得る。
[0250]種々の標的化抗体、またはそれらの抗原結合断片の配列の非限定的な例は、本明細書において表1に提供される。
[0251]架橋分子の標的化部分の選択を含めて、本明細書に記載される架橋分子の適切な設計を決定することができることは、十分に当業者の範囲内である。
[0251]架橋分子の標的化部分の選択を含めて、本明細書に記載される架橋分子の適切な設計を決定することができることは、十分に当業者の範囲内である。
[0252]より具体的には、当業者は、本明細書に記載されるように「再方向付け」を必要とするCARの知識を有することにより、CARが方向付けられるべき代替の標的化部分を選択することができ、処置を必要とするがんまたは疾患の処置を容易にすることができる。
[0253]本明細書に記載されるように、標的化部分は、標的細胞上の任意の細胞表面分子(がん細胞上に発現される腫瘍関連抗原など)への結合のためであり得る。当業者は、処置を必要とする疾患(例、がん)に応じて、適切な細胞表面分子を選択することができる。例えば、疾患がHer2+がんである場合、当業者は、がん細胞上のHer2に特異的に結合することができる標的化部分を選択することができる。同様に、疾患がCD19+がん細胞である場合、当業者は、がん上のCD19に特異的に結合することができる標的化部分を選択することができる。当業者は、標的細胞上に発現される適切な表面分子を同定するために、処置されるがんまたは状態の抗原発現プロファイルを決定する方法に精通している。
[0254]標的細胞上の適切な細胞表面分子(標的抗原)(例えば、CD19、Her2、CLL-1、CD33、EGFRvIII、CD20、CD22、BCMA、または本明細書に記載されるかもしくは標的化のために選択され得る任意の他の腫瘍関連抗原)を同定した場合、当業者は、市販されている抗体、または抗原に結合する公知の抗体の抗原結合ドメインを記載する公開された文献を参照することによることを含めて、上記標的抗原に結合し得る結合ドメインの配列を容易に決定することができる。次に、当業者は、標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分を含む、本明細書に記載される架橋分子(融合タンパク質)の構造を製剤化することができる。架橋分子の残りの成分(例えば、腫瘍特異的抗原エピトープ部分)の組成は、本明細書にさらに記載される。
[0255]最後に、当業者は、本発明の架橋分子に到達するために、標的細胞上の適切な細胞表面分子(標的抗原)および腫瘍特異的抗原エピトープ部分を同定した場合、架橋分子がa)標的細胞に結合するかどうか、b)CAR T細胞に結合するかどうか、およびc)CAR T細胞を標的細胞に首尾よく再方向付けして細胞殺滅を誘導することができるかどうかを、日常的な技術を用いて容易に決定することができる。標的抗原への結合、および細胞傷害性を決定する方法は、当該技術分野において周知である。標的細胞への結合、CAR T細胞、および細胞殺滅の誘導を決定するための非限定的な方法および種々の実験プロトコールは、本明細書中、実施例において詳細に記載されている。
機能不全P2X7受容体エピトープ部分
[0256]本発明は、機能不全P2X7受容体(すなわち、腫瘍特異的抗原が機能不全P2X7受容体である)からのエピトープの形態での腫瘍特異的抗原エピトープ部分の使用を意図する。
[0256]本発明は、機能不全P2X7受容体(すなわち、腫瘍特異的抗原が機能不全P2X7受容体である)からのエピトープの形態での腫瘍特異的抗原エピトープ部分の使用を意図する。
[0257]機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、ATPと結合することができない隣接する正しくパッキングされたモノマー間の界面で形成される3つのATP結合部位のうちの少なくとも1つを有する、機能不全P2X7受容体または機能不全P2X7受容体の断片の形態で提供され得る。このような受容体は、非選択的カルシウムチャネルの開口をアポトーシス孔まで延長することができない。
[0258]機能不全P2X7受容体のペプチド断片の範囲は公知であり、全ての内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、PCT/AU2002/000061(対応する国際公開第2002/057306号、ならびに米国特許第7,326,415号、米国特許第7,888,473号、米国特許第7,531,171号、米国特許第8,080,635号、米国特許第8,399,617号、米国特許第8,709,425号、米国特許第9,663,584号、または米国特許第10,450,380号)、PCT/AU2008/001364(対応する国際公開第2009/033233号、および米国特許第8,440,186号、米国特許第9,181,320号、米国特許第9,944,701号または米国特許第10,597,45号)、およびPCT/AU2009/000869(対応する国際公開第2010/000041、および米国特許第8,597,643号、米国特許第9,328,155号または米国特許第10,238,716号)において検討される。本発明において使用することが意図されるエピトープを含むこれらの明細書内の例示的ペプチドは、以下に記載される。
PCT出願公開 ペプチド配列
国際公開第2002/057306号 GHNYTTRNILPGLNITC(配列番号2)(本明細書では「E200」エピトープとも呼ばれる)
国際公開第2009/033233号 KYYKENNVEKRTLIKVF(配列番号12)(本明細書では「E300」エピトープとも呼ばれる)
国際公開第2010/000041号 GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK(配列番号14)(本明細書では「E200/E300」または「複合」エピトープとも呼ばれる)
[0259]任意の実施形態では、本明細書に記載される任意の架橋分子の機能不全P2X7受容体エピトープ部分のアミノ酸配列は、配列番号2~30、168、および配列番号365~400のいずれかに示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれかなる。好ましくは、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、配列番号11の少なくとも配列を含む。
PCT出願公開 ペプチド配列
国際公開第2002/057306号 GHNYTTRNILPGLNITC(配列番号2)(本明細書では「E200」エピトープとも呼ばれる)
国際公開第2009/033233号 KYYKENNVEKRTLIKVF(配列番号12)(本明細書では「E300」エピトープとも呼ばれる)
国際公開第2010/000041号 GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK(配列番号14)(本明細書では「E200/E300」または「複合」エピトープとも呼ばれる)
[0259]任意の実施形態では、本明細書に記載される任意の架橋分子の機能不全P2X7受容体エピトープ部分のアミノ酸配列は、配列番号2~30、168、および配列番号365~400のいずれかに示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれかなる。好ましくは、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、配列番号11の少なくとも配列を含む。
[0260]機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、任意の官能基、例えば、本明細書中に開示された標的化部分、例えば、カップリングするためにNH2またはSH基を用いて抗体またはその断片にカップリングさせることができるカルボキシル基、活性エステル、アセトアミドまたはマレイミドを有することができる。
[0261]機能不全P2X7受容体エピトープ部分の種々の例が、本明細書において、特に表1に記載される。表1から明らかなように、最小E200配列は、少なくとも配列番号11の配列を含む。好ましい実施形態では、最小E200配列は、少なくとも配列番号2の配列またはそのバリアント、例えば配列番号4の配列を含む。
[0262]ある特定の例において、本発明の架橋分子に包含するためのE200エピトープは、N末端および/またはC末端領域における伸長を含み得る。伸長は、天然に存在するnfP2X7受容体配列に由来することができ、少なくとも1個のアミノ酸残基、少なくとも2個のアミノ酸残基、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個またはそれ以上のアミノ酸残基の伸長を含むことができる。例えば、配列番号4に定義されるE200エピトープは、配列番号1のE200配列の直ぐN末端の3つのアミノ酸残基に対応する配列DFPのN末端伸長を含み得る。さらに、配列番号4に定義されるE200エピトープは、例えば配列番号6および7に示されるように、C末端伸長を含み得る。このようなN末端およびC末端伸長は、架橋分子上のエピトープへのCAR-T細胞の結合の有効性を改善するのに役立ち得ることが理解される。
[0263]任意の実施形態では、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、nfP2X7受容体CARによる結合のための十分なアクセス可能性を可能にするように標的化部分にコンジュゲートされる。したがって、最小の機能不全P2X7受容体エピトープ部分配列は、最小のE200配列 少なくとも配列番号11の配列を含むが、好ましい実施形態では、最小のE200配列は、nfP2X7受容体CARによる結合を可能にするための1つ以上のリンカーまたはヒンジ領域に加えて、少なくとも配列番号2の配列またはそのバリアント、例えば配列番号4の配列を含む。ある特定の実施形態では、機能不全P2X7受容体エピトープ部分の全長(リンカーおよびヒンジ領域を含む)は、長さが少なくとも17アミノ酸、または長さが少なくとも18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50アミノ酸である。好ましくは、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、長さが約100アミノ酸以下、より好ましくは長さが約99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62,61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51または50アミノ酸以下である。
[0264]CD19を標的化するための架橋分子との関連において、好ましくは、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、長さが約35アミノ酸以下、長さが少なくとも20アミノ酸、好ましくは長さが少なくとも21、22、23、24、25または26アミノ酸以下である。
[0265]CD33を標的化するための架橋分子との関連において、好ましくは、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、長さが約45アミノ酸以下、長さが少なくとも20アミノ酸、好ましくは長さが少なくとも21、22、23、24、25または26アミノ酸以下である。
EGFRvIIIエピトープ部分
[0266]任意の実施形態では、本明細書に記載される任意の架橋分子のEGFRvIIIエピトープ部分のアミノ酸配列は、配列番号267のいずれかに示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれかなる。好ましくは、EGFRvIIIエピトープ部分は、少なくとも配列番号267の配列を含む。
[0266]任意の実施形態では、本明細書に記載される任意の架橋分子のEGFRvIIIエピトープ部分のアミノ酸配列は、配列番号267のいずれかに示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれかなる。好ましくは、EGFRvIIIエピトープ部分は、少なくとも配列番号267の配列を含む。
CLDN6エピトープ部分
[0267]任意の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの架橋分子のCLDN6エピトープ部分のアミノ酸配列は、配列番号273、274もしくは275のいずれかに示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれかなる。好ましくは、CLDN6エピトープ部分は、少なくとも配列番号273、274または275の配列を含む。
[0267]任意の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの架橋分子のCLDN6エピトープ部分のアミノ酸配列は、配列番号273、274もしくは275のいずれかに示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれかなる。好ましくは、CLDN6エピトープ部分は、少なくとも配列番号273、274または275の配列を含む。
例示的な架橋分子
[0268]本明細書は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分(例えば、機能不全P2X7受容体エピトープ部分)/標的化部分対の種々の非限定的な例を提供する。
[0268]本明細書は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分(例えば、機能不全P2X7受容体エピトープ部分)/標的化部分対の種々の非限定的な例を提供する。
[0269]本発明の例示的な架橋分子は、表1に記載される。nfP2X7エピトープ部分を含む表1に記載される架橋分子については、本明細書は、それらの架橋を含むが、EGFRvIIIまたはCLDN6エピトープ部分で置換されるnfP2X7エピトープ部分を有する。
[0270]架橋分子がCD19に結合するための標的化部分を含む例では、標的化部分は、配列番号31および32;または143および144(それぞれ重鎖および軽鎖)に示される重鎖および対の軽鎖可変鎖の組合せ、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれかなることができる。
[0271]上記の実施例では、架橋分子は、重鎖にコンジュゲートされた腫瘍特異的抗原エピトープ部分(例えば、機能不全P2X7受容体エピトープ部分)、または軽鎖にコンジュゲートされた腫瘍特異的抗原エピトープ部分(例えば、機能不全P2X7受容体エピトープ部分)を含み得る。好ましくは、腫瘍特異的抗原エピトープ部分(例えば、機能不全P2X7受容体エピトープ部分)は、標的結合部分の軽鎖にコンジュゲートされる。
[0272]架橋分子がCD19結合重鎖/軽鎖対を含む任意の実施形態では、重鎖が機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含むかまたはそれからなる場合、重鎖および軽鎖対の可変配列の配列は、好ましくは、配列番号33および32;34および32、37および32;37および38(それぞれ列挙される重鎖および軽鎖配列)から選択され、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列である。
[0273]架橋分子がCD19結合重鎖/軽鎖対を含む任意の実施形態では、軽鎖が機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含むかまたはそれからなる場合、重鎖および軽鎖対の可変配列の配列は、好ましくは、配列番号31および35;31および36;39および31;52および51;143および145;143および146;143および147;143および148;143および149;143および150;143および151;143および152;143および153;143および154;143および155;143および156;143および157;143および158;143および159;143および160;143および161;143および162;143および163;もしくは143および164(それぞれ列挙される重鎖および軽鎖配列)から選択され、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列である。架橋分子がCD19結合重鎖/軽鎖対を含む別の実施形態では、軽鎖は上記軽鎖のいずれか1つであり、重鎖は配列番号141または142から選択される。
[0274]標的化部分は、重鎖および軽鎖を含むscFvの形態であり得る。
[0275]任意の実施形態では、本発明の架橋分子において使用するためのCD19結合scFvは、配列番号40もしくは41に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を有するものであり得る。scFvとの関連において、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、scFvの軽鎖、例えば配列番号42、43、46、48のいずれか、またはscFvの重鎖、例えば配列番号44、45、47、49、50のいずれかに、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列にコンジュゲートされ得ることが理解される。
[0275]任意の実施形態では、本発明の架橋分子において使用するためのCD19結合scFvは、配列番号40もしくは41に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を有するものであり得る。scFvとの関連において、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は、scFvの軽鎖、例えば配列番号42、43、46、48のいずれか、またはscFvの重鎖、例えば配列番号44、45、47、49、50のいずれかに、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列にコンジュゲートされ得ることが理解される。
[0276]好ましい実施形態では、CD19に結合するための架橋分子は、CD19に特異的に結合するための抗原結合ドメインを含む標的化部分、好ましくは本明細書に記載されるもの(より好ましくは、配列番号52/143または143/144(それぞれ重鎖および軽鎖)に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含む)を含み、配列番号365、371、377、383、389、および395のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含む。
[0277]任意の実施形態では、CD20への結合のための架橋分子は、配列番号53および54、もしくは配列番号55および56(それぞれ列挙する軽鎖および重鎖配列)に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0278]任意の実施形態では、CD22への結合のための架橋分子は、配列番号57および58、もしくは配列番号59および60(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0279]任意の実施形態では、CD79Bへの結合のための架橋分子は、配列番号61および62に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0280]任意の実施形態では、CD37への結合のための架橋分子は、配列番号63および64に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0281]任意の実施形態では、CD38への結合のための架橋分子は、配列番号65および66に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0282]任意の実施形態では、CD70への結合のための架橋分子は、配列番号67および68に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0283]任意の実施形態では、CD30への結合のための架橋分子は、配列番号39および70に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0284]任意の実施形態では、CD33への結合のための架橋分子は、配列番号71および72または73および74に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0285]好ましい実施形態では、CD33に結合するための架橋分子は、CD33に特異的に結合するための抗原結合ドメインを含む標的部分、好ましくは本明細書に記載されるもの(より好ましくは、配列番号73および72または74(それぞれ列挙される軽鎖および重鎖配列)に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含む)を含み、配列番号365、373、377、388、390、および395のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含む。
[0286]任意の実施形態では、Her2への結合のための架橋分子は、配列番号75および75;または77および78に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0287]任意の実施形態では、EGFRへの結合のための架橋分子は、配列番号79および80または81および82または83および84に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0288]任意の実施形態では、CD276への結合のための架橋分子は、配列番号85および86に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0289]任意の実施形態では、GD2への結合のための架橋分子は、配列番号87および88に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0290]任意の実施形態では、BCMAへの結合のための架橋分子は、配列番号89および90に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0291]任意の実施形態では、CD371への結合のための架橋分子は、配列番号91および92に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0292]任意の実施形態では、CD135への結合のための架橋分子は、配列番号93および94に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0293]任意の実施形態では、CD123への結合のための架橋分子は、配列番号95および95に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0294]任意の実施形態では、CD105への結合のための架橋分子は、配列番号97および98に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0295]任意の実施形態では、ROR-1への結合のための架橋分子は、配列番号99および100に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0296]任意の実施形態では、PD-L1への結合のための架橋分子は、配列番号101および102に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0297]任意の実施形態では、MET-Rへの結合のための架橋分子は、配列番号103および104に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0298]任意の実施形態では、PDGFRアルファへの結合のための架橋分子は、配列番号105および106または107および108に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0299]任意の実施形態では、Her3への結合のための架橋分子は、配列番号109および110に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0300]任意の実施形態では、FRアルファへの結合のための架橋分子は、配列番号111および112に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0301]任意の実施形態では、CGPC3への結合のための架橋分子は、配列番号113および114に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0302]任意の実施形態では、SLAMF7への結合のための架橋分子は、配列番号115および116に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0303]任意の実施形態では、TNFRSF10Bへの結合のための架橋分子は、配列番号117および118に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0304]任意の実施形態では、GPNMBへの結合のための架橋分子は、配列番号119および120に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0305]任意の実施形態では、VEGFR2への結合のための架橋分子は、配列番号121および122に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0306]任意の実施形態では、α4β7および/またはαEβ7への結合のための架橋分子は、配列番号123および124;または125および126に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0307]任意の実施形態では、CSPG4への結合のための架橋分子は、配列番号127および128に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0308]任意の実施形態では、CD80への結合のための架橋分子は、配列番号129および130に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0309]任意の実施形態では、CCR4への結合のための架橋分子は、配列番号131および132に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0310]任意の実施形態では、CD115への結合のための架橋分子は、配列番号133および134に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0311]任意の実施形態では、ENOX-2への結合のための架橋分子は、配列番号135および136に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0312]任意の実施形態では、CD56への結合のための架橋分子は、配列番号137および138に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0313]任意の実施形態では、huVH1-69への結合のための架橋分子は、配列番号139および140に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0314]任意の実施形態では、CD117への結合のための架橋分子は、配列番号169および170に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0315]任意の実施形態では、CD133への結合のための架橋分子は、配列番号171および172に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0316]任意の実施形態では、MUC1への結合のための架橋分子は、配列番号173および174に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0317]任意の実施形態では、メソテリンへの結合のための架橋分子は、配列番号175および176に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0318]任意の実施形態では、ROR2への結合のための架橋分子は、配列番号177および178に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0319]任意の実施形態では、IL13Ra2への結合のための架橋分子は、配列番号179および180に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0320]任意の実施形態では、IL13Ra2への結合のための架橋分子は、配列番号181に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0321]任意の実施形態では、EPHA2への結合のための架橋分子は、配列番号182および183に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0322]任意の実施形態では、EGFRvIIIへの結合のための架橋分子は、配列番号184および185に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0323]任意の実施形態では、PSMAへの結合のための架橋分子は、配列番号186および187に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0324]任意の実施形態では、CEAへの結合のための架橋分子は、配列番号188および189に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0325]任意の実施形態では、PSCAへの結合のための架橋分子は、配列番号190および191に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0326]任意の実施形態では、ルイスYへの結合のための架橋分子は、配列番号192および193に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0327]任意の実施形態では、CD171 LICAMへの結合のための架橋分子は、配列番号194および195に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0328]任意の実施形態では、EpCAMへの結合のための架橋分子は、配列番号196および197に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0329]任意の実施形態では、ALKへの結合のための架橋分子は、配列番号198および199に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0330]任意の実施形態では、IGF-1R CD221への結合のための架橋分子は、配列番号200および201に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0331]任意の実施形態では、ネクチン4への結合のための架橋分子は、配列番号202および203に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0332]任意の実施形態では、FAPへの結合のための架橋分子は、配列番号204および205に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0333]任意の実施形態では、AXLへの結合のための架橋分子は、配列番号206および207に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0334]任意の実施形態では、CD138への結合のための架橋分子は、配列番号208および209に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0335]任意の実施形態では、CLDN6への結合のための架橋分子は、配列番号210および211に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0336]任意の実施形態では、Her4への結合のための架橋分子は、配列番号212および213に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0337]任意の実施形態では、クラウジン18.2への結合のための架橋分子は、配列番号214および215に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0338]任意の実施形態では、O-アセチル化GD2への結合のための架橋分子は、配列番号216および217に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0339]任意の実施形態では、GD3への結合のための架橋分子は、配列番号218および219に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0340]任意の実施形態では、GM2への結合のための架橋分子は、配列番号220および221に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0341]任意の実施形態では、TM4SF1への結合のための架橋分子は、配列番号222および223に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0342]任意の実施形態では、CD147への結合のための架橋分子は、配列番号224および225に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0343]任意の実施形態では、CEACAM5への結合のための架橋分子は、配列番号226および227に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0344]任意の実施形態では、VEGFR-1への結合のための架橋分子は、配列番号228および229に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0345]任意の実施形態では、ポドプラニン(PDPN)への結合のための架橋分子は、配列番号230および231に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0346]任意の実施形態では、WT1への結合のための架橋分子は、配列番号232および233に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0347]任意の実施形態では、GPC2への結合のための架橋分子は、配列番号234および235に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0348]任意の実施形態では、FGFR4への結合のための架橋分子は、配列番号236および237に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0349]任意の実施形態では、EphB4への結合のための架橋分子は、配列番号238および239に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0350]任意の実施形態では、STEAP-1への結合のための架橋分子は、配列番号240および241に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0351]任意の実施形態では、STEAP-2への結合のための架橋分子は、配列番号242および243に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0352]任意の実施形態では、IL11Raへの結合のための架橋分子は、配列番号244および245に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0353]任意の実施形態では、CD163への結合のための架橋分子は、配列番号246および247に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0354]任意の実施形態では、クロロトキシンへの結合のための架橋分子は、配列番号248および249に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0355]任意の実施形態では、CD206への結合のための架橋分子は、配列番号250(列挙する重鎖配列)に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0356]任意の実施形態では、IL1RAPへの結合のための架橋分子は、配列番号251および252に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0357]任意の実施形態では、MICAへの結合のための架橋分子は、配列番号253および254に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0358]任意の実施形態では、MAGE-A1への結合のための架橋分子は、配列番号255に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0359]任意の実施形態では、MAGE-A1への結合のための架橋分子は、配列番号256および257に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0360]任意の実施形態では、MAGE-A1への結合のための架橋分子は、配列番号258および259に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0361]任意の実施形態では、TRBC1への結合のための架橋分子は、配列番号260および261に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0362]任意の実施形態では、TRBC2への結合のための架橋分子は、配列番号262および263に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0363]任意の実施形態では、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体(uPAR)への結合のための架橋分子は、配列番号264および265(それぞれ列挙される軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0364]任意の実施形態では、CD33への結合のための架橋分子は、配列番号268および269に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0365]任意の実施形態では、Her2への結合のための架橋分子は、配列番号276および277に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0366]任意の実施形態では、CD33への結合のための架橋分子は、配列番号278および279に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0367]任意の実施形態では、Her2への結合のための架橋分子は、配列番号270および271に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0368]任意の実施形態では、B7-H7(HHLA2)への結合のための架橋分子は、配列番号280および281に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0369]任意の実施形態では、CD34への結合のための架橋分子は、配列番号282および283に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0370]任意の実施形態では、CD7への結合のための架橋分子は、配列番号284および285に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0371]任意の実施形態では、CD7への結合のための架橋分子は、配列番号286に示される配列(重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0372]任意の実施形態では、GPRC5Dへの結合のための架橋分子は、配列番号287および288に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0373]任意の実施形態では、TIM-3への結合のための架橋分子は、配列番号289および290に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0374]任意の実施形態では、CD191(CCR1)への結合のための架橋分子は、配列番号291および292に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0375]任意の実施形態では、CD66b(CEACAM8)への結合のための架橋分子は、配列番号293および294に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0376]任意の実施形態では、CD11b(MAC-1)への結合のための架橋分子は、配列番号295および296に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0377]任意の実施形態では、EMR2(ADGRE2)への結合のための架橋分子は、配列番号297および298に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0378]任意の実施形態では、MUC16への結合のための架橋分子は、配列番号299および300に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0379]任意の実施形態では、NYESO-1 HLA-A2への結合のための架橋分子は、配列番号301および302に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0380]任意の実施形態では、スルビビン HLA-A2への結合のための架橋分子は、配列番号303および304に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0381]任意の実施形態では、BCMAへの結合のための架橋分子は、配列番号305に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0382]任意の実施形態では、BCMAへの結合のための架橋分子は、配列番号306に示される配列、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0383]任意の実施形態では、C200への結合のための架橋分子は、配列番号308および307に示される配列(それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列)、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0384]任意の態様では、本明細書に記載される架橋分子は、HISタグを有しない。また、上述の配列情報表に特定されたアミノ酸配列を含むが、配列に特定されたHISタグを伴わない架橋分子、またはそれと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一である配列を含む架橋分子が意図される。さらに、一実施形態では、架橋分子は、HISタグ以外のタグを含み得るか、または、上述の配列情報表で特定されたアミノ酸配列を含み得るが、配列に指定されたHISタグの位置で異なるタグを有するアミノ酸配列を含み得る。
核酸
[0385]第2の態様では、本発明は、本発明の架橋分子をコードする核酸分子またはその一部を提供する。
[0385]第2の態様では、本発明は、本発明の架橋分子をコードする核酸分子またはその一部を提供する。
[0386]核酸分子は、修飾されていない、もしくは修飾された、RNAまたはDNAであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含み得る。例えば、核酸分子は、一本鎖および/または二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖またはより典型的には二本鎖であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子、または一本鎖および二本鎖領域の混合物を含み得る。さらに、核酸分子は、RNAもしくはDNA、またはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域を含み得る。核酸分子はまた、安定性のために、1つ以上の修飾された塩基、または他の理由のために修飾されたDNAもしくはRNA骨格を含み得る。DNAおよびRNAに対して種々の修飾を行うことができ、したがって、用語「核酸分子」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
[0387]本発明の第2の態様の一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号2~308のいずれか1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。好ましくは、核酸は、上述の重鎖および軽鎖対をコードするヌクレオチド配列を含む。
[0388]さらに、本発明は、本発明の架橋分子をコードする核酸分子またはその一部を含む核酸構築物を提供する。核酸構築物は、さらに、1つ以上の宿主についての複製起点;1つ以上の宿主において活性である選択マーカー遺伝子;および/または1つ以上の転写制御配列のうちの1つ以上を含み得る。
[0389]本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー遺伝子」には、それが発現される細胞上に表現型を付与し、構築物をトランスフェクトまたは形質転換される細胞の同定および/または選択を容易にする任意の遺伝子が含まれる。
[0390]「選択マーカー遺伝子」には、構築物により形質転換された細胞によって発現された場合に、これらの形質転換された細胞の同定および/または選択を容易にする表現型を細胞に付与する任意のヌクレオチド配列が含まれる。適切な選択マーカーをコードする一連のヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知である(例えば、Mortesen, RM. and Kingston RE. Curr Protoc Mol Biol, 2009; Unit 9.5)。選択マーカーをコードする例示的なヌクレオチド配列には、アデノシンデアミナーゼ(ADA)遺伝子;シトシンデアミナーゼ(CDA)遺伝子;ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子;ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(hisD)遺伝子;ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ(PAC)遺伝子;チミジンキナーゼ(TK)遺伝子;キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子;緑色、赤色、黄色または青色蛍光タンパク質をコードする遺伝子などの蛍光レポーター遺伝子;およびルシフェラーゼ遺伝子などの発光ベースのレポーター遺伝子、とりわけ、蛍光活性化細胞選別(FACS)などの技術を使用して細胞の光学的選択を可能にするものが含まれる。
[0391]さらに、選択マーカー遺伝子は、構築物中の別個のオープンリーディングフレームであり得るか、または別のポリペプチド(例えば、CAR)との融合タンパク質として発現され得ることに留意されたい。
[0392]上記のように、核酸構築物はまた、1つ以上の転写制御配列を含み得る。用語「転写制御配列」は、作動可能に接続された核酸の転写に影響する任意の核酸配列を含むことを理解されるべきである。転写制御配列は、例えば、リーダー、ポリアデニル化配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、および転写ターミネーターを含み得る。典型的には、転写制御配列は、少なくともプロモーターを含む。本明細書で使用される用語「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与し、活性化し、または増強する任意の核酸を記載する。
[0393]一部の実施形態では、少なくとも1つの転写制御配列は、本発明の第2の態様の核酸分子に作動可能に接続される。本明細書の目的のために、転写制御配列が核酸分子の転写を促進し、阻害し、または他には調節することができる場合、転写制御配列は、所定の核酸分子に「作動可能に接続された」ものとみなされる。したがって、一部の実施形態では、核酸分子は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターなどの転写制御配列の制御下にある。
[0394]「核酸構築物」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ベクターの形態などの任意の適切な形態であり得、適切な制御エレメントと結合した場合に複製することができ、構築物内に含まれる遺伝子配列を細胞間で移行させることができる。したがって、該用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、核酸構築物はベクターである。一部の実施態様では、ベクターはウイルスベクターである。
[0395]プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、または臓器に関して、構成的に、または差次的に、作動可能に接続された核酸分子の発現を調節することができる。したがって、プロモーターは、例えば、構成性プロモーター、または誘導性プロモーターを含み得る。「構成的プロモーター」は、ほとんどの環境および生理学的条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性プロモーター」は、特定の環境または生理学的条件下で活性であるプロモーターである。本発明は、目的の細胞において活性である任意のプロモーターの使用を意図する。したがって、広範囲のプロモーターは、当業者によって容易に確かめられる。
[0396]哺乳動物の構成プロモーターには、限定されないが、シミアンウイルス40(SV40)、サイトメガロウイルス(CMV)、P-アクチン、ユビキチンC(UBC)、伸長因子-1α(EF1A)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)およびCMV初期エンハンサー/ニワトリβアクチン(CAGG)が含まれ得る。
[0397]誘導性プロモーターには、限定されないが、化学的に誘導性のプロモーターおよび物理的に誘導性のプロモーターが含まれ得る。化学的に誘導性のプロモーターには、アルコール、抗生物質、ステロイド、金属イオンまたは他の化合物などの化合物によって調節される活性を有するプロモーターが含まれる。化学的に誘導性のプロモーターの例としては、とりわけ、テトラサイクリン調節プロモーター(例えば、米国特許第5,851,796号および米国特許第5,464,758号を参照されたい);グルココルチコイド受容体プロモーター(例えば、米国特許第5,512,483号を参照されたい)、エクジソン受容体プロモーター(例えば、米国特許第6,379,945号を参照されたい)などのステロイド応答性プロモーター;およびメタロチオネインプロモーター(例えば、米国特許第4,940,661号、米国特許第4,579,821号および米国特許第4,601,978号)などの金属応答性プロモーターが挙げられる。
[0398]本発明との関連において、架橋分子の発現が誘導性プロモーターの制御下にあることが、ある特定の環境において望ましいことが理解される。これにより、架橋分子をコードする核酸の発現のスイッチオンおよびスイッチオフが可能となる。
[0399]ある特定の実施形態では、および誘導性発現構築物の場合では、CARを発現する免疫細胞は、a)抗原結合受容体をコードする核酸、およびb)架橋分子をコードする誘導性発現構築物を用いて遺伝子修飾され得る。機能不全P2X7受容体が結合すると、免疫細胞は架橋分子をコードする遺伝子の発現を誘導する。ある特定の実施形態では、このような遺伝子の発現は、がんの処置を促進および/または改善する。
[0400]上述したように、制御配列はまた、ターミネーターを含み得る。用語「ターミネーター」とは、転写終結をシグナル伝達する転写単位の末端のDNA配列を指す。ターミネーターは、一般的に、ポリアデニル化シグナルを含む3’非翻訳DNA配列であり、一次転写物の3’末端へのポリアデニル化配列の付加を容易にする。プロモーター配列と同様に、ターミネーターは、それが使用されることが意図されている細胞、組織または臓器において作動可能な任意のターミネーター配列であり得る。適切なターミネーターは当業者に公知である。
[0401]理解されるように、本発明の核酸構築物は、追加の配列、例えば、増強された発現、細胞質または膜輸送、および位置シグナルを可能にする配列をさらに含むことができる。特定の非限定的な例としては、内部リボソーム侵入部位(IRES)または切断部位(例えば、P2A、T2A)が挙げられる。
[0402]本発明は、本質的に本明細書に記載されるように、全ての遺伝子構築物に及ぶ。これらの構築物は、真核生物における遺伝子構築物の維持および/もしくは複製、ならびに/または真核細胞のゲノムへの遺伝子構築物もしくはその一部の組込みのために意図されるヌクレオチド配列をさらに含み得る。
[0403]本発明の第3の態様の核酸構築物などの外因性遺伝物質の真核細胞への意図的な導入(トランスフェクション/形質導入)のための方法は、当該技術分野において公知である。理解されるように、核酸構築物を所望の宿主細胞に導入するのに最も適した方法は、核酸構築物のサイズ、宿主細胞のタイプ、トランスフェクション/形質導入の所望の効率、およびトランスフェクション/形質導入された細胞の最終的な所望の、または必要な生存率などの多くの因子に依存する。このような方法の非限定的な例には、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、またはリポソームおよびデンドリマーなどの構造などの化学物質による化学的トランスフェクション;エレクトロポレーション、ソノポレーション、熱ショックまたは光学的トランスフェクションなどの非化学的方法;「遺伝子銃」送達、磁気フェクション、またはインペールフェクション(impalefection)もしくはウイルス形質導入などの粒子ベースの方法が含まれる。
[0404]核酸構築物は、トランスフェクション/形質導入の所望の方法に応じて選択される。本発明の第3の態様の一部の実施形態では、核酸構築物は、ウイルスベクターであり、宿主細胞に核酸構築物を導入する方法は、ウイルス形質導入である。ウイルス形質導入を利用してPBMCにおけるCARの発現を誘発するための方法(Parker, LL. et al. Hum Gene Ther. 2000;11: 2377-87)、より一般的には哺乳動物細胞の形質導入にレトロウイルス系を利用する方法(Cepko, C. and Pear, W. Curr Protoc Mol Biol. 2001, unit 9.9)が当該技術分野において公知である。他の実施形態では、核酸構築物は、プラスミド、コスミド、人工染色体などであり、当該技術分野において公知である任意の適切な方法によって細胞にトランスフェクトすることができる。
修飾された細胞
[0405]本明細書に記載されるように、本発明は、抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を発現する細胞の使用を含み、抗原認識ドメインは、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原(機能不全P2X7受容体など)を認識する。細胞は、本明細書に記載されるように、「操作された細胞」、「遺伝子修飾細胞」、「免疫細胞」または「免疫エフェクター細胞」であり得る。さらに、細胞は、免疫細胞に分化することができる。免疫細胞に分化することができる細胞(例えば、機能不全P2X7 CARを発現するT細胞)は、幹細胞、多系統前駆細胞、または人工多能性幹細胞であり得る。
修飾された細胞
[0405]本明細書に記載されるように、本発明は、抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を発現する細胞の使用を含み、抗原認識ドメインは、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原(機能不全P2X7受容体など)を認識する。細胞は、本明細書に記載されるように、「操作された細胞」、「遺伝子修飾細胞」、「免疫細胞」または「免疫エフェクター細胞」であり得る。さらに、細胞は、免疫細胞に分化することができる。免疫細胞に分化することができる細胞(例えば、機能不全P2X7 CARを発現するT細胞)は、幹細胞、多系統前駆細胞、または人工多能性幹細胞であり得る。
[0406]任意の実施形態では、細胞は、T細胞であり得、場合により、上記T細胞は、TcRαβ、PD1、CD3またはCD96を発現しない(例えば、遺伝子レベルまたは機能的レベルで、これらの遺伝子のうちの1つをノックダウンまたはノックアウトすることによる)。
[0407]任意の実施形態では、細胞は免疫細胞であり得、場合により、上記細胞は、チェックポイント、消耗またはアポトーシス関連シグナル伝達受容体であり得るアクセサリー分子、ならびにリガンド、例えば、PD-1、LAG-3、TIGIT、CTLA-4、FAS-LおよびFAS-Rを発現しない(例えば、遺伝子レベルまたは機能的レベルでこれらの遺伝子のうちの1つをノックアウトすることによる)。
[0408]一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、2種以上の異なるCARを含む。
[0409]本発明の一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、2種以上の異なるCARをコードする核酸分子または核酸構築物を含む。本発明の一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、各々が異なるCARをコードする2種以上の核酸分子、または2種以上の核酸構築物を含む。
[0409]本発明の一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、2種以上の異なるCARをコードする核酸分子または核酸構築物を含む。本発明の一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、各々が異なるCARをコードする2種以上の核酸分子、または2種以上の核酸構築物を含む。
[0410]本明細書において言及される場合、「遺伝子修飾細胞」には、本発明に包含される非天然および/または導入された核酸分子もしくは核酸構築物を含む任意の細胞が含まれる。導入された核酸分子または核酸構築物は、離散DNA分子として細胞内に維持され得るか、または細胞のゲノムDNAに組み込まれ得る。
[0411]細胞のゲノムDNAは、その最も広い文脈において、細胞の遺伝的補体を構成する全ての内因性DNAを含むように理解されるべきである。したがって、細胞のゲノムDNAは、染色体、ミトコンドリアDNAなどを含むと理解されるべきである。したがって、用語「ゲノム的に統合された」は、染色体組込み、ミトコンドリアDNA組込みなどを意図する。構築物の「ゲノム的に統合された形態」は、構築物の全部または一部であり得る。しかしながら、一部の実施形態では、構築物のゲノム的に統合された形態は、少なくとも、本発明の第2の態様の核酸分子を含む。
[0412]本明細書で使用される場合、用語「異なるCAR」または「異なるキメラ抗原受容体」とは、非同一の抗原認識ドメインおよび/または非同一のシグナル伝達ドメインのいずれかを有する任意の2種以上のCARを指す。1つの例において、「異なるCAR」は、同じ抗原認識ドメインを有する2つのCAR(例えば、両方のCARが機能不全P2X7受容体を認識し得る)を含むが、活性化受容体の一部を伴うシグナル伝達ドメインを有する1つのCAR、および共刺激受容体の一部を伴うシグナル伝達ドメインを有する他のCARなどの異なるシグナル伝達ドメインを有する。理解されるように、この実施形態内の2種以上のCARのうちの少なくとも1つは、機能不全P2X7受容体を認識する抗原認識ドメインを有し、他のCAR(複数可)は、任意の適切な形態をとり得、任意の適切な抗原に対して方向付けられ得る。
[0413]したがって、本発明の一部の実施形態では、2種以上の異なるCARは、異なるシグナル伝達ドメインを有し、同一のまたは異なる抗原認識ドメインを有し得る。具体的には、本発明の遺伝子修飾細胞は、活性化受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第1のキメラ抗原受容体、および共刺激受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第2のキメラ抗原受容体を含み得る。
[0414]一部の実施形態では、活性化受容体(シグナル伝達ドメインの一部が由来する)は、CD3補助受容体複合体であるかまたはFc受容体である。
[0415]一部の実施形態では、共刺激受容体(シグナル伝達ドメインの一部が由来する)は、CD27、CD28、CD-30、CD40、DAP10、OX40、4-1BB(CD137)およびICOSからなる群から選択される。
[0415]一部の実施形態では、共刺激受容体(シグナル伝達ドメインの一部が由来する)は、CD27、CD28、CD-30、CD40、DAP10、OX40、4-1BB(CD137)およびICOSからなる群から選択される。
[0416]一部の実施形態では、共刺激受容体(シグナル伝達ドメインの一部が由来する)は、CD28、OX40または4-1BBからなる群から選択される。
[0417]一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、共刺激受容体を恒常的に発現するようにさらに修飾される。
[0417]一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、共刺激受容体を恒常的に発現するようにさらに修飾される。
[0418]上述のように、細胞性免疫応答は、典型的には、活性化シグナル(典型的には、抗原に応答する)および共刺激シグナルが同時に経験される場合にのみ誘導される。したがって、細胞内活性化シグナルと細胞内共刺激シグナルの両方を組み合わせて提供する2種以上のCARを含む、上記実施形態のうちのいくつかに従う遺伝子修飾細胞を有することによって、十分な免疫応答が、それらの同族抗原のCAR(複数可)による認識に応答して誘導され得ることを確実にする。あるいは、遺伝子修飾細胞は、機能不全P2X7受容体を認識する抗原認識ドメインを有し、共刺激受容体を恒常的に発現することができ、それによって、CARが活性化されると同時に共刺激が提供される可能性を増加させる1つのCARのみを含むことができる。あるいは、遺伝子修飾細胞をさらに修飾して、共刺激受容体(複数可)とその/それらのリガンド(複数可)の両方を恒常的に発現させることができる。このようにして、細胞は、連続的に共刺激を経験し、細胞の免疫活性化のために、活性化受容体からの一部を含むシグナル伝達ドメインとともに、CARの活性化のみを必要とする。
[0419]したがって、一部の実施形態では、CARを発現する遺伝子修飾細胞は、共刺激受容体を恒常的に発現するようにさらに修飾される。さらなる実施形態では、遺伝子修飾細胞は、共刺激受容体のリガンドを発現するようにさらに修飾され、それによって細胞の自己刺激を促進する。共刺激受容体とそれらの同族リガンドの両方を発現もする(自己刺激を誘導するように)CAR発現T細胞の例は、当該技術分野において公知であり、特にStephen MT. et al. Nat Med, 2007; 13: 1440-9に開示されているものを含む。
[0420]CARを含む遺伝子修飾細胞の能力は、サイトカイン、好ましくは炎症誘発性または増殖促進性サイトカインを分泌するように細胞をさらに修飾することによって増強することができる。このサイトカインの分泌は、CARを発現する細胞に対する自己分泌支持を提供するとともに、CARを発現する細胞を取り囲む局所環境を変化させ、免疫系の他の細胞が動員され、活性化されるようにする。結論として、本発明の第4または第5の態様の一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、サイトカインを分泌するようにさらに修飾される。この分泌は構成的であり得るか、またはリガンドの同族抗原のCARの認識によって誘導性であり得る。
[0421]所望の免疫応答に応じて任意の1種以上のサイトカインを選択することができるが、好ましいサイトカインおよび/またはケモカインには、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18およびIL-21、CCL19、CCL21またはそれらの組合せが含まれる。
[0422]本発明の免疫細胞は、任意の適切な免疫細胞、もしくはその前駆細胞であり得るか、または均質もしくは不均質な細胞集団であり得る。一部の実施形態では、細胞は、白血球、末梢血単核細胞(PBMC)、リンパ球、T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーT細胞、またはγδT細胞である。
[0423]免疫細胞はT細胞であり得、場合により、上記T細胞は、TcRαβ、PD1、CD3またはCD96を発現しない(例えば、遺伝的レベルまたは機能的レベルでこれらの遺伝子のうちの1つをノックダウンまたはノックアウトすることによる)。
[0424]免疫細胞は、チェックポイント、消耗またはアポトーシス関連シグナル伝達受容体であり得るアクセサリー分子、ならびにPD-1、LAG-3、TIGIT、CTLA-4、FAS-LおよびFAS-Rなどのリガンドを発現し得ない(例えば、遺伝子レベルまたは機能レベルでこれらの遺伝子の1つをノックアウトまたはノックダウンすることによる)。
処置および投与する方法
[0425]この書類においてさらに検討されるように、本発明は、好ましくはがんの処置においてであるが、種々の状態の処置における適用を見出す。
[0425]この書類においてさらに検討されるように、本発明は、好ましくはがんの処置においてであるが、種々の状態の処置における適用を見出す。
[0426]本発明はまた、本明細書に記載される治療薬の2つの成分の使用のための種々のシナリオを意図する。
[0427]1つのシナリオにおいて、処置を必要とする個体は、CAR T細胞と架橋分子の両方を含む単一組成物が投与される。
[0427]1つのシナリオにおいて、処置を必要とする個体は、CAR T細胞と架橋分子の両方を含む単一組成物が投与される。
[0428]さらなるシナリオにおいて、処置を必要とする個体は、架橋分子をコードする発現ベクターを含むCAR T細胞の集団が投与される。発現ベクターは、架橋分子をコードする核酸配列の構成的または誘導性発現を促進し得る。
[0429]さらに、処置を必要とする個体は、CAR T細胞を投与することができ、後日、架橋分子を含む組成物(例えば、輸液を介する)、または架橋分子をコードする核酸配列を投与することができる。このようなシナリオは、機能不全P2X7受容体に対して陽性であるがんの標的化処置のために個体が最初にCAR T細胞で処置され、その後の架橋分子の投与が、CARを別のがん抗原、または感染性因子に由来し、細胞のMHC IまたはII分子上に提示されるペプチドに再方向付けされる目的である状況において適切であり得る。
[0430]したがって、架橋分子は、対象がCAR T細胞による処置を受ける前、それと同時に、または後に投与することができる。
[0431]架橋分子およびCAR T細胞を同時に対象に投与する場合、それらは、同じ投与経路(単一組成物を含む)を介して、または別法として、異なる投与経路を介して投与することができる。例えば、CAR T細胞は、対象の血流への注射によって投与することができ、一方、架橋分子は、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内などの別の投与経路を介して投与することができる。
[0431]架橋分子およびCAR T細胞を同時に対象に投与する場合、それらは、同じ投与経路(単一組成物を含む)を介して、または別法として、異なる投与経路を介して投与することができる。例えば、CAR T細胞は、対象の血流への注射によって投与することができ、一方、架橋分子は、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内などの別の投与経路を介して投与することができる。
[0432]架橋分子は、架橋分子を自発的に分泌する遺伝子操作された細胞によって、または刺激剤、例えば小分子を介する刺激に際して、体内で生成または発現され得る。あるいは、細胞は、架橋分子を連続的に分泌し、刺激剤、例えば小分子の適用時にそれらの分泌を停止することができる。
[0433]本明細書は、特にヒトにおける適用に言及しているが、本発明はまた獣医学的目的に有用であることは、明確に理解される。したがって、全ての態様では、本発明は、ウシ、ヒツジ、ウマおよび家禽などの家畜;ネコおよびイヌなどのコンパニオン動物;ならびに動物園の動物に有用である。したがって、一般的用語「対象」または「処置される/処置されている対象」は、全ての動物(ヒト、類人猿、イヌ、ネコ、ウマおよびウシなど)を含むものと理解される。
[0434]用語「投与された」とは、個々の細胞を含む上記組成物の治療的に有効な用量の個体への投与を意味する。「治療的に有効な量」とは、それが投与される効果を生じる用量を意味する。正確な用量は、処置の目的に依存し、公知の技術を用いて当業者により確認される。当該技術分野において公知であり、上述したように、全身送達対局所送達、年齢、体重、全身健康、性別、食事、投与時間、薬物相互作用および状態の重症度に対する調整が必要であり、当業者による日常的な実験によって確認することができる。
[0435]処置を必要とする対象には、良性、前がん性、または非転移性腫瘍を既に有する対象、ならびにがんの発生または再発を予防するべき対象が含まれる。対象は、腹水および/またはリンパ節に存在する転移性細胞などの転移性細胞を有し得る。
[0436]処置の目的または結果は、がん細胞数を減少させ;原発腫瘍サイズを減少させ;末梢臓器へのがん細胞浸潤を抑制し(すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させ);腫瘍転移を抑制し(すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させ);腫瘍増殖をある程度抑制し;および/または障害に関連する症状のうちの1つ以上をある程度緩和することであり得る。
[0437]処置の有効性は、生存期間、疾患進行までの時間、奏効率(RR)、奏効期間、および/または生活の質を評価することによって測定することができる。
[0438]本方法は、疾患進行までの期間を延長するのに特に有用である。
[0438]本方法は、疾患進行までの期間を延長するのに特に有用である。
[0439]本方法は、全生存期間および無増悪生存期間を含むヒトの生存期間を延長するのに特に有用である。
[0440]本方法は、治療に対して完全奏効を提供するために特に有用であり、それにより、処置に応答してがんの全ての徴候が消失している。これは必ずしもがんが治癒したというわけではない。
[0440]本方法は、治療に対して完全奏効を提供するために特に有用であり、それにより、処置に応答してがんの全ての徴候が消失している。これは必ずしもがんが治癒したというわけではない。
[0441]本方法は、治療に対する部分的な応答を提供するのに特に有用であり、それによって、処置に応答して、1つ以上の腫瘍もしくは病変の大きさ、または体内のがんの程度において減少する。
[0442]処置の目的または転帰は、以下のうちのいずれか1つ以上であり得る:
-がん細胞の数を減少させること:
-原発腫瘍サイズを減少させること;
-がん細胞の末梢臓器への浸潤を阻害する(すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる)こと;
-腫瘍転移を阻害する(すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる)こと;
-ある程度腫瘍増殖を抑制すること;
-障害に関連する症状のうちの1つ以上をある程度軽減すること。
-がん細胞の数を減少させること:
-原発腫瘍サイズを減少させること;
-がん細胞の末梢臓器への浸潤を阻害する(すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる)こと;
-腫瘍転移を阻害する(すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる)こと;
-ある程度腫瘍増殖を抑制すること;
-障害に関連する症状のうちの1つ以上をある程度軽減すること。
[0443]一実施形態では、処置を必要とする対象には、良性の、前がん性の、非転移性の腫瘍を有する対象が含まれる。
[0444]一実施形態では、がんは前がん性または前腫瘍性である。
[0444]一実施形態では、がんは前がん性または前腫瘍性である。
[0445]一実施形態では、がんは二次がんまたは転移である。二次がんは、任意の臓器または組織、特に肺、肝臓、腎臓、膵臓、腸および脳などの比較的高い血行動態圧を有する臓器または組織に位置することがある。二次がんは、腹水および/またはリンパ節において検出されることがある。
[0446]一実施形態では、がんは実質的に検出不能であり得る。
[0447]「前がん性」または「前腫瘍性」とは、一般的に、典型的にはがんに先行するかまたは発症する状態または増殖を指す。「前がん性」増殖は、異常な細胞周期調節、増殖、または分化によって特徴付けられる細胞を有し得、細胞周期のマーカーによって決定することができる。
[0447]「前がん性」または「前腫瘍性」とは、一般的に、典型的にはがんに先行するかまたは発症する状態または増殖を指す。「前がん性」増殖は、異常な細胞周期調節、増殖、または分化によって特徴付けられる細胞を有し得、細胞周期のマーカーによって決定することができる。
[0448]がんは、固形腫瘍または「液性」腫瘍であり得る。換言すると、がんは、組織内で増殖し得るか(癌腫、肉腫、腺腫など)、または血液もしくは骨髄などの体液中に存在するがんであり得る(例えば、リンパ腫および白血病)。
[0449]ある特定の好ましい実施形態では、処置を必要とするがんは、機能不全P2X7受容体の低レベルの発現によって特徴付けられるがんであり得る。このようながんの例にはバーキットリンパ腫が含まれる。しかしながら、患者の腫瘍生検における機能不全P2X7(nfP2X7)受容体の表面発現の免疫組織化学的分析は、IHCスコアが1+から3+の範囲であることを明らかにした。したがって、低発現の試料は、広範囲の腫瘍型において見出され得る。例は、種々のタイプの固形腫瘍に見られ、限定されないが、神経芽細胞腫、大腸がん、肺がん、腎臓がん、皮膚がん、乳がん、脳がんおよび前立腺がんが挙げられる。異なる組織におけるこのような発現レベルの差は、形質転換の初期状態にある細胞から腫瘍が形成されることに起因する場合がある(最も高い受容体発現を有する組織は、最も高い増殖速度を示す組織であり得る)。
[0450]本発明の方法に従って処置することができるがんの他の例には、芽腫(髄芽腫および網膜芽腫を含む)、肉腫(脂肪肉腫および滑膜細胞肉腫を含む)、神経内分泌腫瘍(カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ、膵島細胞がんを含む)、中皮腫、神経鞘腫(聴神経腫を含む)、髄膜腫、腺がん、黒色腫、白血病またはリンパ系悪性腫瘍、肺がん、例えば小細胞肺がん(SCKC)、非小細胞肺がん(NSCLC)、肺の腺がんおよび肺の扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、胃(gastric)がんまたは胃(stomach)がん、例えば胃腸がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん(転移性乳がんを含む)、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓(kidney)または腎臓(renal)がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌、精巣がん、食道がん、胆道の腫瘍、ならびに頭頸部がんが挙げられる。
[0451]さらなる例において、本発明の範囲内で意図される処置方法は、感染症を処置または予防する方法を含む。したがって、本発明の架橋分子は、CAR T細胞を、追加の表面アクセス可能な抗原、例えば、抗原が、本明細書にさらに記載されるMHC IまたはMHC II分子上に提示された非がん関連病原性抗原である抗原に再方向付けするために利用することができる。
[0452]感染症の処置を必要とする対象は、危険にさらされているか、または疾患と診断されている場合がある。危険にさらされている対象には、免疫不全患者が含まれる。したがって、本発明の方法はまた、治療を受けている個体(例えば、がんを処置するため)において、それらを免疫不全にし、従って感染に感受性にする感染症の発症を予防することを可能にする。
[0453]ペプチドがMHC IまたはMHC II分子上に提示される細胞内病原体の例には、ウイルス感染、細胞内細菌感染、原虫感染、および細胞内真菌感染が含まれる。
[0454]本発明の方法を用いて処置することができるウイルス感染の例には、HIV、肝炎(例えば、A型、B型またはC型肝炎)、コロナウイルス(例えば、SARS-CoV-2)、インフルエンザウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、おたふくかぜウイルスが含まれる。
[0454]本発明の方法を用いて処置することができるウイルス感染の例には、HIV、肝炎(例えば、A型、B型またはC型肝炎)、コロナウイルス(例えば、SARS-CoV-2)、インフルエンザウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、おたふくかぜウイルスが含まれる。
[0455]本発明の方法を用いて処置することができる細胞内細菌感染の例には、マイコバクテリア感染(例えば、結核菌(Mycobacterium tuberculosis))、バルトネラ・ヘンセラエ(Bartonella henselae)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、サルモネラ・チフス(Salmonella Typhi)、ブルセラ(Brucella)、レジオネラ(Legionella)、ノカルジア(Nocardia)、ナイセリア(Neisseria)、ロドコッカス(Rhodococcus)、エルシニア(Yersinia)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、クラミジア(Chlamydia)、リケッチア(Rickettsia)、コキエラ(Coxiella)、およびクラミドフィラ・ニューモニアエ(Chlamydophila pneumoniae)が含まれる。
[0456]真菌病原体による細胞内感染の例:ヒストプラズマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クリプトコッカス・ネオホルマンス(Cryptococcus neoformans)、およびニューモシスチチス・ジロベシイ(Pneumocystitis jirovecii)。
[0457]偏性細胞内原虫病原体の例には、アピコンプレキサンス(Apicomplexans)(プラスモジウム(Plasmodium)属種、トキソプラズマ・ゴンジイ(Toxoplasma gondii)およびクリプトスポリジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum))、ならびにトリパノソーマチド(Trypanosomatids)(リーシュマニア(Leishmania)属種およびトリパノソーマ・クルーズ(Trypanosoma cruzi))が含まれる。
[0458]がんおよび/または自己免疫疾患との関連において免疫系を調節するように標的化され得る免疫細胞は、B細胞(CD19、CD20、CD22)、形質細胞(BCMA、CD38、CD138)、T細胞サブセット(TRBC1またはTRBC2、α4β7およびαEβ7、CD7)、マクロファージおよびTAM(CD163およびCD206)であり得る。同種幹細胞移植との関連において、免疫ベースのコンディショニングは、特に、非悪性疾患、例えば、サラセミアメジャーもしくは鎌状赤血球貧血の場合、および/またはファンコニ貧血のようなDNA修復欠損の場合に、(CD34、CD117、CD133、CD33およびCD38)を標的化することによって行うことができる。
[0459]マーカー(uPAR)を介して老化腫瘍細胞を標的とすることは、休止状態での腫瘍細胞の除去を助け、後期の時点で拡大し、腫瘍を促進するサイトカインを分泌し、新たながん性サブクローンを保護する腫瘍抑制環境を形成することによって、後期でのがん細胞のより速い増殖を促進する可能性が高い。
[0460]CAR T細胞は、他の免疫細胞、例えばTREG CAR T細胞を免疫抑制することができるようにするか、または構築物に対応する誘導性発現カセット[NFAT依存性サイトカイン分泌]およびシグナル伝達を導入することによって、免疫抑制性サイトカイン(TGFベータ、IL10)、およびケモカインを分泌することにより構築され得る。
[0461]本発明の架橋分子は、当業者に公知である技術を用いて対象に投与するために製剤化することができる。架橋分子の製剤は、薬学的に許容される賦形剤(複数可)(担体または希釈剤)を含み得る。一般的に使用される賦形剤の例としては、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および保存剤、浸透圧剤、膨張剤、および潤滑剤が挙げられる。
[0462]架橋分子の製剤は、1つの型の架橋分子、または1つを超える型の架橋分子(すなわち、架橋分子は、同一または異なる標的化および/または機能不全P2X7受容体エピトープ部分を有し得る)を含み得る。
[0463]架橋分子は、当業者に公知であるモードおよび技術を用いて対象に投与することができる。例示的モードには、限定されないが、静脈内、腹腔内、および腫瘍内注射が含まれる。他のモードには、限定されないが、皮内、皮下(s.c、s.q.、サブ-Q、Hypo)、筋肉内(i.m.)、動脈内、髄内、心臓内、関節内(関節)、滑膜内(関節液領域)、頭蓋内、脊髄内、および髄腔内(脊髄液)が含まれる。
[0464]架橋分子を含む製剤は、特定の適応症または障害を処置するのに有効である量で対象に投与される。一般的に、架橋分子の少なくとも約0.01μg/kg~約100mg/kg体重を含む製剤は、処置を必要とする対象に投与することができる。大部分の場合、投与経路、症状等を考慮して、投与量は、架橋分子の約100μg/kg~約10mg/kg体重/日とすることができる。しかしながら、対象に投与される製剤中の架橋分子の量は、障害の位置、供給源、同一性、範囲および重症度、処置される個体の年齢および状態などに依存して、広い限界間で変化し得る。医師は、最終的に、使用すべき適切な用量を決定することができる。架橋分子は、持続注入またはボーラス投与として投与することができる。
[0465]CAR T細胞の投与と架橋分子製剤の間のタイミングは、使用される(免疫)細胞のタイプ、CARの結合特異性、標的化部分の同一性、および標的細胞の同一性、例えば、処置されるがん細胞、対象における標的細胞の位置、対象に製剤を投与するために使用される手段、ならびに処置される対象の健康、年齢および体重を含む因子に依存して広く変わり得る。実際に、TCBM製剤は、遺伝子操作された(免疫)細胞製剤の前、同時、または後に投与することができる。
[0466]本明細書において開示され、定義される発明は、文章または図面から言及されるかまたは明白である2つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組合せに及ぶことが理解される。これらの異なる組合せの全ては、本発明の様々な代替態様を構成する。
実施例1-架橋分子の生成を含む材料および方法
[0467]培養、トランスフェクションおよびタンパク質生成は、ExpiCHO発現システムユーザーガイド(Thermo-ExpiCHO(商標)Expression System USER GUIDE。規定された無血清培地中におけるExpiCHO-S(商標)細胞のトランスフェクションに関しては、カタログ番号A29133、公開番号MAN0014337)に従って行われた。要約すると、ExpiCHOはExpiCHO培地中で日常的に継代され、4~6×106細胞/mL未満で維持された。細胞数が5~7×106細胞/mLの範囲にある場合、mid-log増殖期の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションのために、リポソーム複合体を各1mLの培養について1μgのDNAで調製した。重鎖および軽鎖を別々にコード化したベクターの同時トランスフェクションについては、特に断らない限り、ベクター比を1:1に設定した。「高力価」または「最大力価」発現プロトコールをトランスフェクション後に追跡し、細胞生存率が70%未満に低下した場合に培養物を回収した。回収は、300×gで5分間、20℃での遠心分離によって行われた。細胞を捨て、上清を4000×gで30分間、4℃で再度遠心分離した。回収した上清をPES膜を用いた0.2μmろ過により清澄化した後、保存のために凍結した。
[0467]培養、トランスフェクションおよびタンパク質生成は、ExpiCHO発現システムユーザーガイド(Thermo-ExpiCHO(商標)Expression System USER GUIDE。規定された無血清培地中におけるExpiCHO-S(商標)細胞のトランスフェクションに関しては、カタログ番号A29133、公開番号MAN0014337)に従って行われた。要約すると、ExpiCHOはExpiCHO培地中で日常的に継代され、4~6×106細胞/mL未満で維持された。細胞数が5~7×106細胞/mLの範囲にある場合、mid-log増殖期の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションのために、リポソーム複合体を各1mLの培養について1μgのDNAで調製した。重鎖および軽鎖を別々にコード化したベクターの同時トランスフェクションについては、特に断らない限り、ベクター比を1:1に設定した。「高力価」または「最大力価」発現プロトコールをトランスフェクション後に追跡し、細胞生存率が70%未満に低下した場合に培養物を回収した。回収は、300×gで5分間、20℃での遠心分離によって行われた。細胞を捨て、上清を4000×gで30分間、4℃で再度遠心分離した。回収した上清をPES膜を用いた0.2μmろ過により清澄化した後、保存のために凍結した。
[0468]回収された試料は、5、10または30kDaの公称分子サイズカットオフ値を有するスピンカラムまたはTFFカセットによって濃縮され、緩衝液交換され得る。
[0469]HISタグ化されたカラム精製について、回収された上清は、目的のタンパク質に依存して、公称分子サイズカットオフ値5、10または30kDaのSnakeSkin透析チューブを介して透析された。大規模生成について、上清を、ある特定の分子サイズカットオフ膜を有するTFFカセットを通して洗浄した。所望のカラム充填緩衝液への緩衝液交換はまた、Hisタグ化されたカラム精製用の試料を調製するために、上述の手順を通じて達成された。精製は、HisTrap Excelカラム(Cytiva)またはPureCube 100コンパクトカートリッジNi-INDOGOアフィニティーカラム(Cat#75302、Cube Biotech)または他の同等のカラムのいずれかで行われた。精製は、280nm波長のUV検出器、導電率検出器およびpHプローブを備えたAKTA純粋システム(Cytiva)で行われた。充填および洗浄緩衝液は、50mMリン酸ナトリウム一塩基および0.3M塩化ナトリウム、pH8.0で構成された。溶出緩衝液は500mMイミダゾールを含んだ。溶出されたタンパク質をVivaspin(Sartorius)を用いてPBSに緩衝液交換し、4℃で保存した。
[0469]HISタグ化されたカラム精製について、回収された上清は、目的のタンパク質に依存して、公称分子サイズカットオフ値5、10または30kDaのSnakeSkin透析チューブを介して透析された。大規模生成について、上清を、ある特定の分子サイズカットオフ膜を有するTFFカセットを通して洗浄した。所望のカラム充填緩衝液への緩衝液交換はまた、Hisタグ化されたカラム精製用の試料を調製するために、上述の手順を通じて達成された。精製は、HisTrap Excelカラム(Cytiva)またはPureCube 100コンパクトカートリッジNi-INDOGOアフィニティーカラム(Cat#75302、Cube Biotech)または他の同等のカラムのいずれかで行われた。精製は、280nm波長のUV検出器、導電率検出器およびpHプローブを備えたAKTA純粋システム(Cytiva)で行われた。充填および洗浄緩衝液は、50mMリン酸ナトリウム一塩基および0.3M塩化ナトリウム、pH8.0で構成された。溶出緩衝液は500mMイミダゾールを含んだ。溶出されたタンパク質をVivaspin(Sartorius)を用いてPBSに緩衝液交換し、4℃で保存した。
[0470]280nm波長のNanodropおよび標準ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイによりタンパク質を定量した。SDS PAGEゲル電気泳動によってタンパク質純度を確認した。
[0471]本発明者によって生成され、本明細書に記載される詳細な実験データは、以下を含む広範な架橋分子の生成を含む:
1.複数の抗体形式、例えば、FabおよびscFvで生成された標的化部分;
2.例えば、VLおよびVH上を含む、標的化部分上の機能不全P2X7受容体エピトープ部分の種々の位置決め;
3.標的化部分と機能不全P2X7受容体エピトープ部分の間のリンカーの包含;
4.異なる組織起源の腫瘍細胞に存在する広範囲の細胞表面抗原に結合する標的化部分。
1.複数の抗体形式、例えば、FabおよびscFvで生成された標的化部分;
2.例えば、VLおよびVH上を含む、標的化部分上の機能不全P2X7受容体エピトープ部分の種々の位置決め;
3.標的化部分と機能不全P2X7受容体エピトープ部分の間のリンカーの包含;
4.異なる組織起源の腫瘍細胞に存在する広範囲の細胞表面抗原に結合する標的化部分。
抗体/Fabコンジュゲーション
[0472]BIL03s 2-2-1-Fc(抗nfP2X7受容体抗体)と蛍光色素Alexa Fluor(登録商標)647(AF647)とのコンジュゲーションは、製造業者の指示に従って行われた(Cat# A20186、ThermoFisher)。AF647標識されたBIL03s 2-2-1-Fc抗体を、2mMアジ化ナトリウムを用いてpH7.2のPBS中で再構成した。
[0472]BIL03s 2-2-1-Fc(抗nfP2X7受容体抗体)と蛍光色素Alexa Fluor(登録商標)647(AF647)とのコンジュゲーションは、製造業者の指示に従って行われた(Cat# A20186、ThermoFisher)。AF647標識されたBIL03s 2-2-1-Fc抗体を、2mMアジ化ナトリウムを用いてpH7.2のPBS中で再構成した。
フローサイトメトリーによる架橋分子の細胞への結合試験
[0473]試薬
・抗体およびFab:
・BIL03純粋抗体:PBSにより100ug/mLに予め希釈する
・BIL03-AF647抗体:PBSにより100ug/mLに予め希釈する
・抗His抗体-FITC(1mg/mL)(Abcam Cat# ab1206、Cat# GR3361939-1)
・ウサギIgG-FITCアイソタイプ対照(Abcam Cat# ab3706、Cat# GR3356160-1)
・インハウスで生成され、上清から回収される架橋分子については、下記を参照されたい。
[0473]試薬
・抗体およびFab:
・BIL03純粋抗体:PBSにより100ug/mLに予め希釈する
・BIL03-AF647抗体:PBSにより100ug/mLに予め希釈する
・抗His抗体-FITC(1mg/mL)(Abcam Cat# ab1206、Cat# GR3361939-1)
・ウサギIgG-FITCアイソタイプ対照(Abcam Cat# ab3706、Cat# GR3356160-1)
・インハウスで生成され、上清から回収される架橋分子については、下記を参照されたい。
[0474]結合アッセイのために使用される細胞株:JeKo-1(CD19、CD20、CD79B、CD37、CD22、ROR1、Her2)、MOLM-13(CD33、CD38、CD37、CD135、CD123)、PC3(Her2)、MDA-MB-231(EGFR、PD-L1)、Raji(CD22、CD70、CD79B)、Karpas299(CD30)、U937(CD105)、HL60、RPMI8226(BCMA、CD38、CD33)。
[0475]細胞を5×106細胞/mlの密度で再懸濁し、ウェルあたり100μLアリコートを染色のために使用した(試験用0.5×106/試料)。
手順
[0476]1.染色条件リスト:
・BIL03s抗体に結合する架橋分子結合の染色およびHisタグ抗体検出
[0477]対照条件:
・BIL03s抗体に結合する対照架橋分子の染色およびHisタグ抗体検出
・BIL03s抗体に結合しない架橋分子の染色およびHisタグ抗体検出
・未染色細胞
[0478]2.染色手順
・細胞を氷上で10分間、ヒトFcR遮断薬(20%v/v、Miltenyi)でブロックし、非結合のFCR遮断薬を洗い流す。
[0476]1.染色条件リスト:
・BIL03s抗体に結合する架橋分子結合の染色およびHisタグ抗体検出
[0477]対照条件:
・BIL03s抗体に結合する対照架橋分子の染色およびHisタグ抗体検出
・BIL03s抗体に結合しない架橋分子の染色およびHisタグ抗体検出
・未染色細胞
[0478]2.染色手順
・細胞を氷上で10分間、ヒトFcR遮断薬(20%v/v、Miltenyi)でブロックし、非結合のFCR遮断薬を洗い流す。
・細胞を50μLの粗プレップ上清中でインキュベートし、氷上で15分間染色する。
・細胞懸濁液をFACS緩衝液×2で洗浄する
・細胞懸濁液100μLあたり1μg/mLのBIL03s-AF647および1μLのHis Tag抗体で細胞を染色する。
・細胞懸濁液をFACS緩衝液×2で洗浄する
・細胞懸濁液100μLあたり1μg/mLのBIL03s-AF647および1μLのHis Tag抗体で細胞を染色する。
・細胞をFACS緩衝液×2で洗浄する。
・細胞はMacsQuant16で分析するために用意される。
接着性レンチ-X HEK293T(Takara)細胞およびPEIを用いたレンチウイルスベクターの産生
レンチ-X293T培地
[0479]形質導入前の細胞培養について:
[0480]高グルコース(4.5g/L)、4mMのL-グルタミン、および重炭酸ナトリウム(Sigma-Aldrich、D5796);10%ウシ胎児血清(FBS);1mMピルビン酸ナトリウム(Sigma-Aldrich、S8636)を含む90%ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)。
・細胞はMacsQuant16で分析するために用意される。
接着性レンチ-X HEK293T(Takara)細胞およびPEIを用いたレンチウイルスベクターの産生
レンチ-X293T培地
[0479]形質導入前の細胞培養について:
[0480]高グルコース(4.5g/L)、4mMのL-グルタミン、および重炭酸ナトリウム(Sigma-Aldrich、D5796);10%ウシ胎児血清(FBS);1mMピルビン酸ナトリウム(Sigma-Aldrich、S8636)を含む90%ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)。
[0481]形質導入後の細胞培養について:
[0482]高グルコース(4.5g/L)、4mMのL-グルタミン、および重炭酸ナトリウム(Sigma-Aldrich、D5796);10%ウシ胎児血清(FBS);1mMピルビン酸ナトリウム(Sigma-Aldrich、S8636);および10mMの酪酸ナトリウムを含む90%ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)。
[0482]高グルコース(4.5g/L)、4mMのL-グルタミン、および重炭酸ナトリウム(Sigma-Aldrich、D5796);10%ウシ胎児血清(FBS);1mMピルビン酸ナトリウム(Sigma-Aldrich、S8636);および10mMの酪酸ナトリウムを含む90%ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)。
[0483]プロトコール、第I部 レンチ-X 293T細胞レンチウイルストランスフェクション
[0484]0日目:
1.15cmディッシュあたり1.7×106細胞を播種し、トランスフェクション当日から翌月曜日に約80%コンフルエントになるようにする(約16×106細胞)。
[0484]0日目:
1.15cmディッシュあたり1.7×106細胞を播種し、トランスフェクション当日から翌月曜日に約80%コンフルエントになるようにする(約16×106細胞)。
[0485]1日目:
1.顕微鏡下で細胞をチェックする。細胞は、約75~90%のコンフルエントである必要がある。
1.顕微鏡下で細胞をチェックする。細胞は、約75~90%のコンフルエントである必要がある。
2.培地を穏やかに吸引し、各15cmディッシュに10%FCSを補足した新鮮な20mLのDMEMを添加し、トランスフェクション前に少なくとも2時間インキュベートする。
3.トランスフェクション手順を午後(約2.30~4.30pm)に行う。無血清DMEMのアリコートを37℃に温める。
4.混合物A(プラスミドDNA溶液)と混合物B(PEIpro溶液)を調製する。
4.混合物A(プラスミドDNA溶液)と混合物B(PEIpro溶液)を調製する。
5.下記の表に従って、混合物A中のDMEMおよびプラスミドDNAの必要体積を決定する。
6.必要なプレート数について各プラスミドDNA成分に必要な体積を決定する。15cmディッシュの面積は約175cm2である。
7.混合物B(PEIpro溶液)の各成分に必要な体積を決定する。
各15cmディッシュについて、
各15cmディッシュについて、
8.PEIproを5秒間ボルテックスし、必要に応じてスピンダウンしてチューブの底部に液体を回収する。
9.付加物を含まないDMEM高グルコースにPEIproを添加することにより、混合物B(培地中のPEIpro)を15mLチューブ中に調製する。DMEMにPEIを添加し、数回上下に反転し、速やかに遠心沈殿する。
9.付加物を含まないDMEM高グルコースにPEIproを添加することにより、混合物B(培地中のPEIpro)を15mLチューブ中に調製する。DMEMにPEIを添加し、数回上下に反転し、速やかに遠心沈殿する。
10.培地にDNAを添加することにより、50mLの円錐管に混合物A(培地中のプラスミドDNA希釈)を調製する。上下に反転させて穏やかに混合し、速やかに遠心沈殿する。
11.混合物A(プラスミドDNA希釈)に混合物B(PEIpro溶液)を添加することにより、トランスフェクション混合物(PEIpro/DNA溶液)を混合して調製する。p1000マイクロピペットを用いて、PEIpro溶液をDNA溶液に滴加し、直ちに3~4回反転して混合する。ボルテックスはしない。
12.室温で15分間、30分以内インキュベートする。この間、チューブを撹拌しない。
13.15分間インキュベートした後、細胞および新鮮な培地を含有するフラスコ/ディッシュにトランスフェクション混合物を添加する(可能であれば滴加する)。フラスコ/ディッシュを前後左右の動きで静かに振り混ぜる。
13.15分間インキュベートした後、細胞および新鮮な培地を含有するフラスコ/ディッシュにトランスフェクション混合物を添加する(可能であれば滴加する)。フラスコ/ディッシュを前後左右の動きで静かに振り混ぜる。
14.フラスコ/ディッシュを37℃にて5%CO2で一晩インキュベートする。
[0486]2日目:
15.トランスフェクションから16~18時間後、培地を交換する。1度に2枚のプレートを使用して古い培地を吸引する。25mLピペットを用いて、10%FCSおよび10mM酪酸ナトリウムを補充した15mLの新鮮なDMEMを注意深く添加する。
[0486]2日目:
15.トランスフェクションから16~18時間後、培地を交換する。1度に2枚のプレートを使用して古い培地を吸引する。25mLピペットを用いて、10%FCSおよび10mM酪酸ナトリウムを補充した15mLの新鮮なDMEMを注意深く添加する。
[0487]3日目、培地交換から24時間後に初回回収する:
16.培養フラスコ/ディッシュから上清を50mLファルコンチューブに回収する。各プレートを、10%FCSおよび10mMm酪酸ナトリウムを補充した15mLの新鮮なDMEMで注意深く置換し、プレートをインキュベーターに戻す。
16.培養フラスコ/ディッシュから上清を50mLファルコンチューブに回収する。各プレートを、10%FCSおよび10mMm酪酸ナトリウムを補充した15mLの新鮮なDMEMで注意深く置換し、プレートをインキュベーターに戻す。
17.上清を500×gで4℃、10分間遠心分離する(レンチ-X濃縮器による濃縮用)。超遠心分離について、3800rpmで室温で30分間遠心分離する。
18.ウイルスを含有する上清を20mLシリンジで吸引し、0.45μm PESフィルター(Millipore)を通して新しい50mLファルコンチューブにろ過する。これは、(a)形質導入のための粗調製物として使用するか、または(b)超遠心分離による濃縮、または(c)レンチ-X濃縮器による濃縮に進むことができる。あるいは、粗ウイルス4℃を一晩保存し、48時間の回収でプールする。濃縮したウイルスを-80℃で長期間、アリコートに保存する。
18.ウイルスを含有する上清を20mLシリンジで吸引し、0.45μm PESフィルター(Millipore)を通して新しい50mLファルコンチューブにろ過する。これは、(a)形質導入のための粗調製物として使用するか、または(b)超遠心分離による濃縮、または(c)レンチ-X濃縮器による濃縮に進むことができる。あるいは、粗ウイルス4℃を一晩保存し、48時間の回収でプールする。濃縮したウイルスを-80℃で長期間、アリコートに保存する。
19.プレート、チューブおよびフィルターは、組織培養フードのバイオハザードバッグに入れて廃棄する。バイオハザードバッグをフードから取り出して廃棄する前に密封する。
[0488]4日目、培地交換から48時間後に2回目を回収する:
20.培養フラスコ/ディッシュから上清を50mLファルコンチューブに回収する。
21.上清を2000×gで室温にて30分間遠心分離する。
20.培養フラスコ/ディッシュから上清を50mLファルコンチューブに回収する。
21.上清を2000×gで室温にて30分間遠心分離する。
22.ウイルスを含有する上清を20mLシリンジで吸引し、0.45μmフィルター(Millipore)を通して新しい50mLファルコンチューブにろ過する。これを24時間の回収物と一緒にプールするか、または別々に処理して、(b)超遠心分離による濃縮、または(c)レンチ-X濃縮器による濃縮に進むことができる。
23.プレート、チューブおよびフィルターは、組織培養フードのバイオハザードバッグに入れて廃棄する。バイオハザードバッグをフードから取り出して廃棄する前に密封する。
[0489]第II部 レンチ-X濃縮器によるレンチウイルスの濃縮
24.レンチウイルスを含有する上清を回収する。注意:上清には生レンチウイルスが含まれる。希望に応じて、同様のストックを一緒にプールする。500×gで10分間、短時間遠心分離するか、または0.45μmフィルターでろ過する。
24.レンチウイルスを含有する上清を回収する。注意:上清には生レンチウイルスが含まれる。希望に応じて、同様のストックを一緒にプールする。500×gで10分間、短時間遠心分離するか、または0.45μmフィルターでろ過する。
25.清澄な上清を滅菌容器に移し、レンチ-X濃縮器の1体積と清澄な上清の3体積を合わせる。穏やかに反転させて混合する。より大きな体積は、より大きな(すなわち、250mLまたは500mL)遠心管を使用することによって収容することができる。
26.レンチ-X濃縮器とのインキュベーションを1回行う。回収時(1日後)または2日後(プール回収)のいずれか。少なくとも30分間または一晩インキュベートし、次に、予めインキュベートした流体を遠心分離する。
27.試料を1,500×gで4℃にて45分間遠心分離する。遠心分離後、オフホワイトのペレットを視認する。
28.ペレットを乱さないように注意しながら上清を慎重に除去する。残りの上清は、ピペットチップまたは1,500×gでの短時間の遠心分離のいずれかによって除去することができる。
28.ペレットを乱さないように注意しながら上清を慎重に除去する。残りの上清は、ピペットチップまたは1,500×gでの短時間の遠心分離のいずれかによって除去することができる。
29.完全なDMEM、PBS、またはTNEを用いて、ペレットを元の体積の1/10~1/100に穏やかに再懸濁する。ペレットは、最初はいくぶん粘着性であっても、急速に懸濁状態になる。
30.直ちに試料を滴定するか、または-80℃で使い捨てのアリコートに保存する。
CAR T細胞生成プロトコール
[0490]IL7/IL15を補充したTecsMACS培地(両方とも10ng/mL)中で培養したTransAct(全て製造者の指示に従う)で刺激した磁気活性化細胞選別(MACS)を介したCD4/CD8陽性選択のT細胞のレンチウイルス形質導入(1:1比)によって、nfP2PX7 BRIDGE CAR T細胞を生成した。ドナー供給源は軟膜であった。
CAR T細胞生成プロトコール
[0490]IL7/IL15を補充したTecsMACS培地(両方とも10ng/mL)中で培養したTransAct(全て製造者の指示に従う)で刺激した磁気活性化細胞選別(MACS)を介したCD4/CD8陽性選択のT細胞のレンチウイルス形質導入(1:1比)によって、nfP2PX7 BRIDGE CAR T細胞を生成した。ドナー供給源は軟膜であった。
[0491]CAR T細胞は、まさに同じ方法で処理されたが、nfP2X7 BRIDGE CARを発現するためにレンチウイルス形質導入を受けた。活性化された非形質導入T細胞(aUT)は、EGFRまたはCD33架橋分子とエンゲージすることができるいずれの受容体も発現しない。
[0492]仮説:
[0493]nfP2X7 BRIDGE CAR T細胞は、MOLM-13白血病細胞の細胞表面上のnfP2X7認識を介して直接的にがん細胞に再方向付けされるため、aUTより優れたエフェクター機能を有する。
[0493]nfP2X7 BRIDGE CAR T細胞は、MOLM-13白血病細胞の細胞表面上のnfP2X7認識を介して直接的にがん細胞に再方向付けされるため、aUTより優れたエフェクター機能を有する。
[0494]nfP2X7 BRIDGE CAR T細胞は、MOLM-13白血病細胞の表面のCD33 Fab架橋分子上のnfP2X7 E200由来エピトープを介してがん細胞に間接的に再方向付けされるため、aUTより優れたエフェクター機能を有する。
試薬および装置の用意
[0495]CAR T培地:ヒトIL-7およびIL-15を含むTexMACS。IL-7ストック濃度は100ug/mLであり、各バイアルは55μLであった。IL-15ストック濃度は50μg/mLであり、各バイアルは55μLであった。
[0495]CAR T培地:ヒトIL-7およびIL-15を含むTexMACS。IL-7ストック濃度は100ug/mLであり、各バイアルは55μLであった。IL-15ストック濃度は50μg/mLであり、各バイアルは55μLであった。
[0496]最終濃度10ng/mLのIL-7、5ng/mLのIL-15および3%FBSを含むTexMACSを調製するために、50ulのIL-7、50ulのIL-15ストック、および15mLのFBSを各ボトル(500mL)のTexMACS培地に添加する。培地ボトルにサイトカインを添加した日付を表示する。
[0497]回収日の凍結培地調製:10%DMSO、90%FBS。注釈:以下のDMSOからFBSの順で試薬を50mL falconチューブに添加する。
第I部:T細胞の活性化およびT細胞の形質導入
[0498]1日目:T細胞の活性化
1.CD4+およびCD8+CAR T細胞を全血または軟膜から分離する。PBMC分離ならびにCD4およびCD8細胞分離のプロトコールを参照されたい。
第I部:T細胞の活性化およびT細胞の形質導入
[0498]1日目:T細胞の活性化
1.CD4+およびCD8+CAR T細胞を全血または軟膜から分離する。PBMC分離ならびにCD4およびCD8細胞分離のプロトコールを参照されたい。
2.ファルコンチューブを最大体積まで充填し、300×gで5分間遠心分離することにより、予め加温したTexMACS培地(サイトカインを補充しない)でCD4+およびCD8+細胞を2回洗浄する。上清を完全に吸引する。
3.10ng/mLのIL-7、5ng/mLのIL-15および3%FBSを補充した予め温めたTexMACS培地中で、CD4+およびCD8+細胞を最終濃度10^6細胞/mLに再懸濁する。
4.CD4+細胞およびCD8+細胞を、24ウェルプレート中の各ウェルに0.5mlのCD4+細胞および0.5mlのCD8+細胞を添加することによって1:1の比でプレートする。
5.10μLのT細胞TransActを細胞培養物中の最終希釈液1:100に添加し、注意深く再懸濁する。
6.形質導入前に、5%CO2で37℃にて約36時間インキュベートする。
6.形質導入前に、5%CO2で37℃にて約36時間インキュベートする。
[0499]3日目:T細胞形質導入
7.可能であれば、形質導入には新鮮なウイルスベクターを使用する。そうでなければ、氷上でゆっくり凍結したウイルスベクターを解凍する。
7.可能であれば、形質導入には新鮮なウイルスベクターを使用する。そうでなければ、氷上でゆっくり凍結したウイルスベクターを解凍する。
8.ウェルの側面からP1000ピペットを用いて培地800μLをゆっくりと取り除き、下層の細胞層を破壊しないように注意する。
9.T細胞に150μL(1プレート分のウイルスベクター)または300μL(2プレート分のウイルスベクター)を滴加する。新鮮な補充TexMACS培地でウェルを600μLまで上にし、最終濃度4μg/mLで各ウェルにポリブレンを添加する。この時点以降、T細胞はレンチウイルスの作用のためにのみインキュベーターに入れるべきである。
9.T細胞に150μL(1プレート分のウイルスベクター)または300μL(2プレート分のウイルスベクター)を滴加する。新鮮な補充TexMACS培地でウェルを600μLまで上にし、最終濃度4μg/mLで各ウェルにポリブレンを添加する。この時点以降、T細胞はレンチウイルスの作用のためにのみインキュベーターに入れるべきである。
10.形質導入後、適切なクリーンアップ手順を行うべきである。表面を洗浄し、70%エタノールにより2%Virkon溶液でラインを走行させることにより、バイオセーフティキャビネットと吸引器ラインを除染する。チップおよび血清学的ピペットなどの汚染された廃棄物は、バイオセーフティキャビネット内のバイオハザードバッグに廃棄し、廃棄物を処分のために外に持ち出す前にバッグを密封する。
[0500]4日目以降-T細胞維持
11.形質導入T細胞は、IL-7、IL-15および3%FBSを含有するTexMACS培地中に維持された。
11.形質導入T細胞は、IL-7、IL-15および3%FBSを含有するTexMACS培地中に維持された。
12.24ウェルプレートにおいてT細胞増殖を観察し、形質導入後の2日目に細胞をT75フラスコに移す。
13.CCS分析器を用いて、培地中の乳酸レベルを毎日モニタリングする。乳酸レベルが10mmol/Lを超えた場合、新鮮な培地を補充する;理想的には、乳酸レベルを4mmol/L未満に保持する。
13.CCS分析器を用いて、培地中の乳酸レベルを毎日モニタリングする。乳酸レベルが10mmol/Lを超えた場合、新鮮な培地を補充する;理想的には、乳酸レベルを4mmol/L未満に保持する。
[0501]9日目-T細胞形質導入後の5日目-発現分析
[0502]形質導入T細胞は、フローサイトメーターを用いて5日目に計数される。フローサイトメトリー分析用に試料を採取し、標準的なフローサイトメトリープロトコールに基づいて発現効率を決定する。
[0502]形質導入T細胞は、フローサイトメーターを用いて5日目に計数される。フローサイトメトリー分析用に試料を採取し、標準的なフローサイトメトリープロトコールに基づいて発現効率を決定する。
ルシフェラーゼを発現するがん細胞株の生成
[0503]ウイルスベクター生成に使用されるホタルルシフェラーゼレンチウイルス転移プラスミド:
・pRRLsin18.cPPT.EF1a_ホタル_ルシフェラーゼ_T2A_EGFP.WPRE
・pRRLsin18.cPPT.hPGK_ホタル_ルシフェラーゼ_T2A_EGFP.WPRE
1.24ウェルプレート中の300,000細胞/ウェルの密度の細胞を全体積850μLでプレートする。
[0503]ウイルスベクター生成に使用されるホタルルシフェラーゼレンチウイルス転移プラスミド:
・pRRLsin18.cPPT.EF1a_ホタル_ルシフェラーゼ_T2A_EGFP.WPRE
・pRRLsin18.cPPT.hPGK_ホタル_ルシフェラーゼ_T2A_EGFP.WPRE
1.24ウェルプレート中の300,000細胞/ウェルの密度の細胞を全体積850μLでプレートする。
2.レンチウイルス生成セクションに記載されているように、4プラスミドトランスフェクションプロトコールを用いて、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するウイルスベクターを生成する。可能であれば、形質導入には新鮮な濃縮ウイルスベクターを使用する。そうでなければ、氷上でゆっくり凍結したウイルスベクターを解凍する。
3.細胞に150μL(1プレート分のウイルスベクター)を滴加する。この時点以降、細胞はレンチウイルスの作用のためにのみインキュベーターに入れるべきである。
4.インキュベーター細胞を37℃にて5%CO2でインキュベートする。
4.インキュベーター細胞を37℃にて5%CO2でインキュベートする。
5.形質導入後、適切なクリーンアップ手順を実施すべきである。表面を洗浄し、70%エタノールにより2%Virkon溶液でラインを走行させることにより、バイオセーフティキャビネットと吸引器ラインを除染する。チップおよび血清学的ピペットなどの汚染された廃棄物は、バイオセーフティキャビネット内のバイオハザードバッグに廃棄し、廃棄物を処分のために外に持ち出す前にバッグを密封する。
6.形質導入後の2日目に、細胞をT25フラスコに移す。
7.形質導入後の5日目に、細胞を計数し、フローサイトメトリーによる発現分析のための試料を採取する。
7.形質導入後の5日目に、細胞を計数し、フローサイトメトリーによる発現分析のための試料を採取する。
8.形質導入後7日目に、形質導入された細胞は、生細胞ソーターを用いてeGFP発現に基づいてバルク選別される。
9.拡大後、バルク選別された細胞は、さらに、単一細胞クローンによって選別される。単一の細胞クローンを増殖させ、拡大させ、凍結させてストックを作る。
9.拡大後、バルク選別された細胞は、さらに、単一細胞クローンによって選別される。単一の細胞クローンを増殖させ、拡大させ、凍結させてストックを作る。
機能的アッセイ
[0504]ホタルルシフェラーゼおよびeGFPを構成的に発現する標的細胞(高性能細胞株として定義される単一細胞クローンとして選別および増殖される)は、機能アッセイにおいて、生物発光および/または蛍光を介して生存率を測定するために使用された。発光量は、生物発光における細胞の総数と相関し、フローサイトメトリーを介して同定された蛍光標的細胞は、生存細胞の総数と相関する。
[0504]ホタルルシフェラーゼおよびeGFPを構成的に発現する標的細胞(高性能細胞株として定義される単一細胞クローンとして選別および増殖される)は、機能アッセイにおいて、生物発光および/または蛍光を介して生存率を測定するために使用された。発光量は、生物発光における細胞の総数と相関し、フローサイトメトリーを介して同定された蛍光標的細胞は、生存細胞の総数と相関する。
[0505]エフェクター細胞および標的細胞は、指示されたエフェクター対標的比(ET)に従って播種された。指示されたET比、例えば10:1は、常に、T細胞の総数および標的細胞の総数を参照される。CAR発現分画は、T細胞の総数とは異なるため、CARを発現する細胞に言及されるET比は、別個に示される。標的細胞は、96ウェルプレートあたり25,000または50,000細胞で播種された。
ルシフェラーゼ殺滅アッセイ
[0506]エフェクター細胞および標的細胞は、指示されたエフェクター/標的比(ET)に従って播種された。BRIDGE分子は、指示された形式(Fab、IgG1)で、指示された濃度で添加された。D-ルシフェリンを添加し、生物発光は、インキュベーションを開始した後の指示された時点で、SpectraMaxi3上の37℃および5%CO2でインキュベーター中の標準条件下で測定された。
[0506]エフェクター細胞および標的細胞は、指示されたエフェクター/標的比(ET)に従って播種された。BRIDGE分子は、指示された形式(Fab、IgG1)で、指示された濃度で添加された。D-ルシフェリンを添加し、生物発光は、インキュベーションを開始した後の指示された時点で、SpectraMaxi3上の37℃および5%CO2でインキュベーター中の標準条件下で測定された。
[0507]細胞の生存率は、細胞の連続希釈由来の生物発光活性曲線(100%、75%、50%、25%、10%および0%標的細胞)に従って計算され、生存細胞の割合で示された。一般的に、溶解は(試験条件の生物発光-0%生物発光)/(100%生物発光-0%生物発光)によって計算された。
フローベースの殺滅アッセイ
[0508]エフェクター細胞および標的細胞は、指示されたエフェクター対標的比(ET)に従って播種され、BRIDGE分子は、指示された形式(Fab、IgG1)で指示された濃度で添加された。細胞数は、インキュベーションを開始した後の指示された時点(24時間または48時間)で、標準プロトコールに従って、MACSQuant16フローサイトメーター上の37℃および5%CO2でインキュベーター中の標準条件下で測定された。細胞の染色は、分析から全ての死細胞を排除するための生存色素を含んだ。T細胞はCD3を介してeGFP陽性がん細胞から明確に分化した。さらに、T細胞は、24時間後または48時間後に、標準的なプロトコールに従った特異的T細胞活性化の指標として、CD25およびCD69によって特徴付けられた。最終データ分析はFlowJo10により行われた。
[0508]エフェクター細胞および標的細胞は、指示されたエフェクター対標的比(ET)に従って播種され、BRIDGE分子は、指示された形式(Fab、IgG1)で指示された濃度で添加された。細胞数は、インキュベーションを開始した後の指示された時点(24時間または48時間)で、標準プロトコールに従って、MACSQuant16フローサイトメーター上の37℃および5%CO2でインキュベーター中の標準条件下で測定された。細胞の染色は、分析から全ての死細胞を排除するための生存色素を含んだ。T細胞はCD3を介してeGFP陽性がん細胞から明確に分化した。さらに、T細胞は、24時間後または48時間後に、標準的なプロトコールに従った特異的T細胞活性化の指標として、CD25およびCD69によって特徴付けられた。最終データ分析はFlowJo10により行われた。
[0509]抗体カクテル
サイトカイン分泌のフローベースの獲得
[0510]エフェクター細胞および標的細胞は、指示されたエフェクター対標的比(ET)に従って播種され、BRIDGE分子は、指示された形式(Fab、IgG1)で指示された濃度で添加された。24時間または48時間後に上清を採取し、インキュベーションを開始した後、指示された時点で、Miltenyiサイトカインビーズを用いた標準プロトコールに従って、MACSQuant16フローサイトメーター上で37℃および5%CO2のインキュベーター内の標準条件下で測定した。最終データ分析はFlowJo10により行われた。
[0510]エフェクター細胞および標的細胞は、指示されたエフェクター対標的比(ET)に従って播種され、BRIDGE分子は、指示された形式(Fab、IgG1)で指示された濃度で添加された。24時間または48時間後に上清を採取し、インキュベーションを開始した後、指示された時点で、Miltenyiサイトカインビーズを用いた標準プロトコールに従って、MACSQuant16フローサイトメーター上で37℃および5%CO2のインキュベーター内の標準条件下で測定した。最終データ分析はFlowJo10により行われた。
実施例2-種々の架橋分子の特徴付け
[0511]図4~7の結果は、CD19に結合することができるFabまたはscFv(FMC63クローン;本明細書に記載されるアミノ酸配列)の形態で標的化部分を含む架橋分子は、生細胞の表面上のCD19に結合し、機能不全P2X7受容体エピトープ部分(例えば、E200部分)を提示することができ、その結果、抗P2X7受容体抗体(BIL03s 2-2-1-Fc)によってアクセス可能であることを示す。機能不全P2X7受容体エピトープ部分の位置は変化することができ、標的化部分は依然としてその標的細胞表面抗原に結合することができ、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は抗体に結合するために依然として利用可能である。BIL03s 2-2-1-Fc-AF647/HIS-FITCは、機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含有しない架橋分子を制御するために結合せず、また、抗HIS抗体は、HISタグを含有する架橋分子を制御するために結合しなかったことに留意されたい(データを示さず)。
[0511]図4~7の結果は、CD19に結合することができるFabまたはscFv(FMC63クローン;本明細書に記載されるアミノ酸配列)の形態で標的化部分を含む架橋分子は、生細胞の表面上のCD19に結合し、機能不全P2X7受容体エピトープ部分(例えば、E200部分)を提示することができ、その結果、抗P2X7受容体抗体(BIL03s 2-2-1-Fc)によってアクセス可能であることを示す。機能不全P2X7受容体エピトープ部分の位置は変化することができ、標的化部分は依然としてその標的細胞表面抗原に結合することができ、機能不全P2X7受容体エピトープ部分は抗体に結合するために依然として利用可能である。BIL03s 2-2-1-Fc-AF647/HIS-FITCは、機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含有しない架橋分子を制御するために結合せず、また、抗HIS抗体は、HISタグを含有する架橋分子を制御するために結合しなかったことに留意されたい(データを示さず)。
VH上のFab形式+/-リンカー-エピトープ
[0512]図4は、VHに直接またはリンカーを介して連結した単一のE200エピトープを有するFab形式の架橋分子が、JeKo-1(マントル細胞リンパ腫)細胞株上のCD19に結合し、E200エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
[0512]図4は、VHに直接またはリンカーを介して連結した単一のE200エピトープを有するFab形式の架橋分子が、JeKo-1(マントル細胞リンパ腫)細胞株上のCD19に結合し、E200エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
VH上のscFV形式+/-リンカー-エピトープ
[0513]図5は、VHに直接またはリンカーを介して連結した単一のE200エピトープを有するscFv形式の架橋分子が、JeKo-1(マントル細胞リンパ腫)細胞株上のCD19に結合し、E200エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
[0513]図5は、VHに直接またはリンカーを介して連結した単一のE200エピトープを有するscFv形式の架橋分子が、JeKo-1(マントル細胞リンパ腫)細胞株上のCD19に結合し、E200エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
VL上のFab形式+/-リンカー-エピトープ
[0514]図6は、VLに直接またはリンカーを介して連結した単一のE200エピトープを有するFab形式の架橋分子が、JeKo-1(マントル細胞リンパ腫)細胞株上のCD19に結合し、E200エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
[0514]図6は、VLに直接またはリンカーを介して連結した単一のE200エピトープを有するFab形式の架橋分子が、JeKo-1(マントル細胞リンパ腫)細胞株上のCD19に結合し、E200エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
VL上のscFV形式+/-リンカー-エピトープ
[0515]図7は、VLに直接またはリンカーを介して連結した単一のE200エピトープを有するscFv形式の架橋分子が、JeKo-1(マントル細胞リンパ腫)細胞株上のCD19に結合し、E200エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
[0515]図7は、VLに直接またはリンカーを介して連結した単一のE200エピトープを有するscFv形式の架橋分子が、JeKo-1(マントル細胞リンパ腫)細胞株上のCD19に結合し、E200エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
種々の抗原を標的とする架橋分子
[0516]図8:種々の抗原CD37、CD79B、ROR1、CD33、CD38、CD123、CD135、BCMA、EGFR、PDL1、CD22、CD70およびCD20への架橋分子の結合。(a)、(c)、(e)、(g)、(i)、(k)、(m)、(o)、(q)、(s)、(u)、(w)および(y)は抗HIS抗体結合を示し、(b)、(d)、(f)、(h)、(j)、(l)、(n)、(p)、(r)、(t)、(v)、(x)および(z)は機能不全P2X7受容体エピトープへの抗体の結合を示す。
[0516]図8:種々の抗原CD37、CD79B、ROR1、CD33、CD38、CD123、CD135、BCMA、EGFR、PDL1、CD22、CD70およびCD20への架橋分子の結合。(a)、(c)、(e)、(g)、(i)、(k)、(m)、(o)、(q)、(s)、(u)、(w)および(y)は抗HIS抗体結合を示し、(b)、(d)、(f)、(h)、(j)、(l)、(n)、(p)、(r)、(t)、(v)、(x)および(z)は機能不全P2X7受容体エピトープへの抗体の結合を示す。
[0517]オトレルツズマブ由来のCD37標的化部分、ポラツズマブ由来のCD79B標的化部分、ROR1 APC由来のROR1標的化部分(国際公開第20160344A1_D10v3)、リンツズマブ由来のCD33標的化部分、ダラツムマブ由来のCD38標的化部分、クローン32716由来のCD123標的化部分、4G8由来のCD135標的化部分、クローンCA8 J9M0由来のBCMA標的化部分、ネシツムマブまたはマツズマブ由来のEGFR標的化部分、アテゾリズマブ由来のPDL1標的化部分、m97I-L7由来のCD22標的化部分(またはイノツズマブ(データを示さず))、クサツズマブ由来のCD70標的化部分、タファシタマブ由来のCD19標的化部分、オファツムマブ由来のCD20標的化部分(またはオクレリズマブ(データを示さず))。これらの抗原を標的とし、直前に言及された抗体に由来する架橋分子の例示的なアミノ酸配列は、本明細書中の配列情報表に記載される。
[0518]図8は、JeKo-1(MCL)野生型細胞株(CD37、CD79B、ROR1)Raji(バーキットリンパ腫)野生型細胞株(CD22、CD70、CD19、CD20、CD22)、MOLM-13(AML)野生型細胞株(CD33、CD38、CD123およびCD135)、RPMI8226(多発性骨髄腫)野生型細胞株(CD33、BCMAおよびCD38)、MDA-MB231(乳がん)野生型細胞株(EGFRおよびPDL1)ならびにPC-3(前立腺がん)野生型細胞株(EGFR)への様々な架橋分子の結合を示す。
実施例3-CD19標的化架橋分子による細胞結合の用量依存的な増加
[0519]NCI60パネルの一部としてATCCから購入したJeKo-1(MCL)CRL-3006(商標)野生型細胞株。細胞は、この特定の細胞株についての一般的な推奨および標準に従って培養された。
[0519]NCI60パネルの一部としてATCCから購入したJeKo-1(MCL)CRL-3006(商標)野生型細胞株。細胞は、この特定の細胞株についての一般的な推奨および標準に従って培養された。
[0520]図9は、図示された形式でCD19標的化Fab架橋分子によるJeKo-1の「ペインティング」を示す。
[0521]細胞は、Fab架橋分子とともに指示された濃度でインキュベートされた。CD33標的化Fab架橋分子は、10ng/mLおよび1000ng/mLでJeKo-1において陰性対照として機能した。CD19標的化Fab架橋分子を1ng/mL、10ng/mL、100ng/mLおよび1000ng/mLで使用した。
[0521]細胞は、Fab架橋分子とともに指示された濃度でインキュベートされた。CD33標的化Fab架橋分子は、10ng/mLおよび1000ng/mLでJeKo-1において陰性対照として機能した。CD19標的化Fab架橋分子を1ng/mL、10ng/mL、100ng/mLおよび1000ng/mLで使用した。
[0522]フローサイトメトリー染色は、Fcブロック試薬(Miltenyi)を用いたフローサイトメトリー染色における標準に従って2段階で行われた。最初に標的細胞は、指示された濃度で15分間、Fab架橋分子とともにインキュベートされ、3回洗浄され、次に二次抗体である抗HIS FITCおよび単一ドメイン抗体であるBIL03 2-2-1 AF647を飽和濃度(1ug/mL)で使用して、結合したFab架橋分子上の6×HISおよびnfP2X7 E200由来エピトープを介して標的細胞を間接的に染色した。15分間のインキュベート後、試料を洗浄し、MACSQuant16(Miltenyi)上で分析した。フローデータは、FlowJo v10.7(BD)を介して分析された。
[0523]JeKo-1細胞ではCD33の発現はない。CD19染色は、CD19標的化架橋分子の濃度の増加に伴って発現の増加を示した。
実施例4-CD33標的化架橋分子による細胞結合の用量依存的増加
[0524]NCI60パネルの一部としてATCCから購入したMOLM-13(AML)野生型細胞株。細胞は、この特定の細胞株についての一般的な推奨および標準に従って培養された。
実施例4-CD33標的化架橋分子による細胞結合の用量依存的増加
[0524]NCI60パネルの一部としてATCCから購入したMOLM-13(AML)野生型細胞株。細胞は、この特定の細胞株についての一般的な推奨および標準に従って培養された。
[0525]図10 図示された形式におけるCD33標的化Fab架橋分子によるMOLM-13の「ペインティング」。
[0526]細胞は、Fab架橋分子とともに指示された濃度でインキュベートされた。CD19標的化Fab架橋分子は、10ng/mLおよび1000ng/mLでMOLM-13において陰性対照として機能したが、一方、CD33標的化Fab架橋分子は、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mLおよび1000ng/mLで使用された。
[0526]細胞は、Fab架橋分子とともに指示された濃度でインキュベートされた。CD19標的化Fab架橋分子は、10ng/mLおよび1000ng/mLでMOLM-13において陰性対照として機能したが、一方、CD33標的化Fab架橋分子は、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mLおよび1000ng/mLで使用された。
[0527]フローサイトメトリー染色は、Fcブロック試薬(Miltenyi)を用いたフローサイトメトリー染色における標準に従って2段階で行われた。最初に標的細胞は、指示された濃度で15分間、Fab架橋分子とともにインキュベートされ、3回洗浄され、次に二次抗体である抗HIS FITCおよび単一ドメイン抗体であるBIL03 2-2-1 AF647を飽和濃度(1ug/mL)で使用して、結合したFab架橋分子上の6×HISおよびnfP2X7 E200由来エピトープを介して標的細胞を間接的に染色した。15分間のインキュベート後、試料を洗浄し、次に、MACSQuand16(Miltenyi)上で分析した。フローデータは、FlowJo v10.7(BD)を介して分析された。
[0528]MOLM-13細胞においてはCD19の発現はない。CD33染色は、CD33標的化架橋分子の濃度の増加とともに発現の増加を示した。
実施例5-nfP2X7 E200由来ペプチドおよび架橋分子を介したマーカー遺伝子の検出および直接CAR検出
[0529]nfP2X7標的化架橋CARエフェクター細胞(限定されないが、T細胞またはNK細胞など)は、がん細胞を特異的に認識する。nfP2X7において標的化されるエピトープは、P2X7タンパク質三量体の立体構造変化から生じ、がん細胞上でのみ曝露され、健康な細胞上では曝露されない。
実施例5-nfP2X7 E200由来ペプチドおよび架橋分子を介したマーカー遺伝子の検出および直接CAR検出
[0529]nfP2X7標的化架橋CARエフェクター細胞(限定されないが、T細胞またはNK細胞など)は、がん細胞を特異的に認識する。nfP2X7において標的化されるエピトープは、P2X7タンパク質三量体の立体構造変化から生じ、がん細胞上でのみ曝露され、健康な細胞上では曝露されない。
[0530]基本原理、ならびにnfP2X7 E200由来ペプチドタグ化架橋分子および架橋分子の異なる形式を介したnfPX7 CARを発現するエフェクター細胞のエンゲージメントを図示し、図1~3に概説する。
[0531]したがって、架橋分子の非存在下でnfP2X7 CARを用いると、nfP2X7 CARを発現するエフェクター細胞は、がん特異的標的化を示す。
[0532]nfP2X7の機能的に陰性ながん(nfP2X7に対して非常に低いかまたはおそらく陰性)への適用性を広げるために、nfP2X7 CARを発現するエフェクター細胞は、CD33に図示されるがん関連抗原またはTcR様mAbを介するがん特異的抗原を標的とする架橋分子を介してがん細胞に再方向付けされ得る。架橋分子の特異性は無制限であり、TcR様mAbまたはリガンドを介してMHCペプチド提示(クラスIおよびII)との関連で発現された任意の表面標的抗原または提示された抗原を意味し、nfP2X7架橋CARを発現するエフェクター細胞を同じ作用様式でエンゲージさせることができる。
[0532]nfP2X7の機能的に陰性ながん(nfP2X7に対して非常に低いかまたはおそらく陰性)への適用性を広げるために、nfP2X7 CARを発現するエフェクター細胞は、CD33に図示されるがん関連抗原またはTcR様mAbを介するがん特異的抗原を標的とする架橋分子を介してがん細胞に再方向付けされ得る。架橋分子の特異性は無制限であり、TcR様mAbまたはリガンドを介してMHCペプチド提示(クラスIおよびII)との関連で発現された任意の表面標的抗原または提示された抗原を意味し、nfP2X7架橋CARを発現するエフェクター細胞を同じ作用様式でエンゲージさせることができる。
[0533]ほとんどの場合、nfP2X7架橋CARを発現するエフェクター細胞の二重機能が利用される。これは、シナリオIおよびIIの組合せであり、nfP2X7架橋CARを発現するエフェクター細胞が、がん細胞上に発現されるnfP2X7を介してがん細胞に直接的にエンゲージされ、さらに、CD33に関して図示されるがん関連抗原またはTcR様mAbを介するがん特異的抗原を標的とする架橋分子を介してがん細胞に動員されることを意味する。
実施例6-MOLM-13(AML)野生型細胞株のCD33標的化Fab架橋分子による「ペインティング」
[0534]図11は、CD33標的化Fab架橋分子を介するMOLM-13(AML)細胞の「ペインティング」を示す。フローデータは、アイソタイプ対照(黒)、1ug/mLでのみBIL03s 2-2-1-Fc sd-mAbによる染色(青)、およびCD33標的化Fab架橋分子とBIL03s 2-2-1-Fcの組合せによる染色の増加(緑)を示す。nfP2X7架橋CARを発現するエフェクター細胞によって認識され得る標的分子の増加は、CAR媒介性エフェクター機能につながる。したがって、架橋技術は、がん細胞上の標的化エピトープを増加させることによって、CAR機能を増強する。
[0534]図11は、CD33標的化Fab架橋分子を介するMOLM-13(AML)細胞の「ペインティング」を示す。フローデータは、アイソタイプ対照(黒)、1ug/mLでのみBIL03s 2-2-1-Fc sd-mAbによる染色(青)、およびCD33標的化Fab架橋分子とBIL03s 2-2-1-Fcの組合せによる染色の増加(緑)を示す。nfP2X7架橋CARを発現するエフェクター細胞によって認識され得る標的分子の増加は、CAR媒介性エフェクター機能につながる。したがって、架橋技術は、がん細胞上の標的化エピトープを増加させることによって、CAR機能を増強する。
実施例7-リンツズマブ由来のCD33標的化架橋分子の滴定
[0535]ルシフェラーゼを恒常的に発現するMOLM-13細胞は、増加する濃度の、指示された濃度のCD33標的化Fab架橋分子と共インキュベートされた。しかし、MOLM-13上のCD33に結合したFab架橋分子は、補体依存性細胞毒性(CDC)またはエフェクター細胞(ADCC)の動員に起因する直接毒性を示さない。MOLM-13以外の細胞はアッセイに使用しなかった。CD33標的化Fab架橋分子は、フルサイズ抗体のようなCDCまたはADCCのための機能的部位を有さない。
[0535]ルシフェラーゼを恒常的に発現するMOLM-13細胞は、増加する濃度の、指示された濃度のCD33標的化Fab架橋分子と共インキュベートされた。しかし、MOLM-13上のCD33に結合したFab架橋分子は、補体依存性細胞毒性(CDC)またはエフェクター細胞(ADCC)の動員に起因する直接毒性を示さない。MOLM-13以外の細胞はアッセイに使用しなかった。CD33標的化Fab架橋分子は、フルサイズ抗体のようなCDCまたはADCCのための機能的部位を有さない。
[0536]4時間後の生存率に有意な影響はなく、24時間のインキュベーション後には一貫したまたは用量依存的な毒性は認められなかった。
実施例8-CD33標的化Fab架橋分子によるnfP2X7 CAR-T細胞の活性化
[0537]図12は、非形質導入T細胞(左パネル)、CAR0007_hPGK(中央パネル;CAR0007は本明細書においてCAR7とも称する)およびCAR0007_EF1a(右パネル;CAR0007は本明細書においてCAR7とも称する)を発現するT細胞の直接比較を伴う代表的なフローサイトメトリープロットを示す。いずれのCAR T細胞も、20:1のET比でMOLM-13とインキュベーションした場合に活性化マーカーCD25およびCD69の発現を増加させ、48時間後に1000ng/mLでCD33標的化Fab架橋分子を生成した。
実施例8-CD33標的化Fab架橋分子によるnfP2X7 CAR-T細胞の活性化
[0537]図12は、非形質導入T細胞(左パネル)、CAR0007_hPGK(中央パネル;CAR0007は本明細書においてCAR7とも称する)およびCAR0007_EF1a(右パネル;CAR0007は本明細書においてCAR7とも称する)を発現するT細胞の直接比較を伴う代表的なフローサイトメトリープロットを示す。いずれのCAR T細胞も、20:1のET比でMOLM-13とインキュベーションした場合に活性化マーカーCD25およびCD69の発現を増加させ、48時間後に1000ng/mLでCD33標的化Fab架橋分子を生成した。
[0538]実施例8および9の実験において使用されたCD33 Fab架橋分子はリンツズマブに由来し、およびEGFR標的化架橋分子はネシツムマブに由来する。機能不全P2X7受容体エピトープは、遊離N末端を有するVLに直接的に連結した。
[0539]CAR0007_hPGK CARは、N末端からC末端に以下のドメイン構造を有する:hPGK-CD8a SP-VH BIL03 2-2-1-CD28-CD28T-CD28-CD137-CD3ゼータ-T2A-tEGFR。
[0540]CAR0007_EF1a CARは、N末端からC末端に以下のドメイン構造を有する:EF1a-CD8a SP-VH BIL03 2-2-1-CD28-CD28T-CD28-CD137-CD3ゼータ-T2A-tEGFR。
実施例9-CD33架橋分子の存在下におけるnfP2X7 CAR-T細胞による白血病細胞のクリアランス
[0541]48時間後の20:1ET比でのT細胞およびMOLM-13のフローサイトメトリープロットおよび1000ng/mLでのCD33標的化Fab架橋分子(図12に対応する)は、CAR0007_hPGKおよびCAR0007_EF1aの存在下で白血病細胞の完全なクリアランスを示したが、非形質導入T細胞では白血病細胞数に影響はなかった(図13)。
[0541]48時間後の20:1ET比でのT細胞およびMOLM-13のフローサイトメトリープロットおよび1000ng/mLでのCD33標的化Fab架橋分子(図12に対応する)は、CAR0007_hPGKおよびCAR0007_EF1aの存在下で白血病細胞の完全なクリアランスを示したが、非形質導入T細胞では白血病細胞数に影響はなかった(図13)。
[0542]図14は、48時間後、20:1のET比で、CAR0007_EF1aを含有するT細胞およびMOLM-13の指示されたCD33標的化Fab架橋分子濃度における白血病細胞の用量依存的クリアランスを示すフローサイトメトリープロットを示す。40ng/mLという低濃度が、200および1000ng/mLで白血病細胞のほぼ完全な除去および白血病細胞の完全な除去を示した。
[0543]指示された濃度で、EGFRおよびCD33標的化架橋分子の存在下および非存在下で48時間インキュベート後の20:1のET比でのCAR0007_hPGK T細胞によるMOLM-13白血病細胞の特異的溶解を図15(a)に示す。CD33標的化Fab架橋分子の濃度(40、200および1000ng/mL)の増加について、用量依存的に有意な溶解が見出された。
[0544]指示された濃度で、EGFRおよびCD33標的化架橋分子の存在下および非存在下で48時間インキュベート後の20:1のET比でのCAR0007_hEF1a T細胞によるMOLM-13白血病細胞の特異的溶解を図15(b)に示す。CD33標的化Fab架橋分子の濃度(40、200および1000ng/mL)の増加について、用量依存的に有意な溶解が見出された。
[0545]滴定実験において、EGFRおよびCD33標的化Fab架橋分子を用いて、CAR0007_hPGKによるMOLM-13の殺滅における影響を試験した(図16)。EGFR標的化架橋分子とCD33標的化架橋分子の間の10:1のET比での24時間インキュベーション後のMOLM-13の生存率には、1000ng/mLで有意差があった。統計分析はt検定により行われた。図16からのデータの代替の表現は図17に示される。EGFR架橋分子の滴定に有意差はなかった(データを示さず)。CD33架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析はOne-Way ANOVAおよびpost-hoc検定Tukeyにより行われた。
[0546]滴定実験において、EGFRおよびCD33標的化Fab架橋分子を用いて、MOLM-13の殺滅におけるCAR0007_hPGKの効果を試験した(図18)。EGFR標的化架橋分子とCD33標的化架橋分子の間の20:1のET比での24時間インキュベーション後のMOLM-13の生存率には、200ng/mLと1000ng/mLで有意差があった。統計分析はt検定により行われた。図18からのデータの代替の表現は図19に示される。EGFR架橋分子の滴定に有意差はなかった(データを示さず)。CD33架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析はOne-Way ANOVAおよびpost-hoc検定Tukeyにより行われた。
[0547]滴定実験において、EGFRおよびCD33標的化Fab架橋分子を用いて、CAR0007_hPGKによるMOLM-13の殺滅における影響を試験した(図20)。EGFR標的化架橋分子とCD33標的化架橋分子の間の10:1ET比での48時間インキュベーション後のMOLM-13の生存率には、200ng/mLと1000ng/mLで有意差があった。統計分析はt検定により行われた。
[0548]滴定実験において、EGFRおよびCD33標的化Fab架橋分子を用いて、CAR0007_hPGKによるMOLM-13の殺滅における差を試験した(図21)。EGFR標的化架橋分子とCD33標的化架橋分子の間の20:1ET比での48時間インキュベーション後のMOLM-13の生存率には、200ng/mLと1000ng/mLで有意な影響があった。統計分析はt検定により行われた。
[0549]滴定実験において、EGFRおよびCD33標的化Fab架橋分子を用いて、MOLM-13の殺滅におけるCAR0007_EF1aの効果を試験した(図22)。EGFR標的化架橋分子とCD33標的化架橋分子の間の10:1ET比での24時間インキュベーション後のMOLM-13の生存率には、200ng/mLと1000ng/mLで有意差があった。統計分析はt検定により行われた。図22からのデータの代替の表現は図23に示される。EGFR架橋分子の滴定に有意差はなかった(データを示さず)。CD33架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析はOne-Way ANOVAおよびpost-hoc検定Tukeyにより行われた。
[0550]滴定実験において、EGFRおよびCD33標的化Fab架橋分子を用いて、MOLM-13の殺滅におけるCAR0007_EF1aの効果を試験した(図24)。EGFR標的化架橋分子とCD33標的化架橋分子の間の20:1ET比での24時間インキュベーション後のMOLM-13の生存率には、40ng/mL、200ng/mLおよび1000ng/mLで有意差があった。統計分析はt検定により行われた。図24からのデータの代替の表現が図25に示される。EGFR架橋分子の滴定に有意差はなかった(データを示さず)。CD33架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析はOne-Way ANOVAおよびpost-hoc検定Tukeyにより行われた。
[0551]滴定実験において、EGFRおよびCD33標的化Fab架橋分子を用いて、CAR0007_EF1aによるMOLM-13の殺滅における影響を試験した(図26)。EGFR標的化架橋分子による状態とCD33標的化架橋分子の間の10:1ET比での48時間インキュベーション後のMOLM-13の生存率には、40ng/mL、200ng/mLおよび1000ng/mLで有意な影響があった。統計分析はt検定により行われた。
[0552]滴定実験において、EGFRおよびCD33標的化Fab架橋分子を用いて、MOLM-13の殺滅におけるCAR0007_EF1aの効果を試験した(図27)。EGFR標的化架橋分子とCD33標的化架橋分子の間の20:1ET比での48時間インキュベーション後のMOLM-13の生存率には、40ng/mL、200ng/mLおよび1000ng/mLで有意差があった。統計分析はt検定により行われた。
[0553]滴定実験において、EGFR標的化Fab架橋分子を用いて、24時間のインキュベーション後にET比10:1でMOLM-13の殺滅における非形質導入T細胞、CAR0007_hPGKおよびCAR0007_EF1aエフェクター細胞の効果を試験した。3つのエフェクター細胞集団間でEGFR架橋分子の滴定において有意差はなかった(データを示さず)。
実施例10-CD33標的化Fab架橋分子による種々のnfP2X7 CAR-T細胞の活性化-滴定
[0554]フローベースアッセイにおいて、活性化は、EGFRまたはCD33標的化Fab架橋分子の存在下および非存在下の両方で、48時間インキュベーション後に20:1のET比で、非形質導入T細胞、ならびにCAR0007_hPGKおよびCAR0007_EF1aを発現するT細胞によって誘導されたMOLM-13上のCD25およびCD69発現の上方制御を測定することによって評価された。
[0554]フローベースアッセイにおいて、活性化は、EGFRまたはCD33標的化Fab架橋分子の存在下および非存在下の両方で、48時間インキュベーション後に20:1のET比で、非形質導入T細胞、ならびにCAR0007_hPGKおよびCAR0007_EF1aを発現するT細胞によって誘導されたMOLM-13上のCD25およびCD69発現の上方制御を測定することによって評価された。
[0555]CAR0007_hPGKおよびCAR0007_EF1a発現T細胞はいずれも、非形質導入T細胞と比較して、EGFRおよびCD33架橋分子の存在下で活性化マーカーCD25およびCD69の発現の有意な増加を示した(データを示さず)。
実施例11-CD33標的化Fab架橋分子の存在下における種々のnfP2X7 CAR-T細胞による細胞殺滅-滴定
[0556]細胞殺滅アッセイにおいて、細胞毒性は、対照と比較して、残りの白血病細胞の定量化によって測定された。40、200および1000ng/mLの濃度のEGFR架橋分子で白血病細胞を除去したところ、非形質導入T細胞とCAR T細胞の間に有意差は認められなかった(図28(a))。しかしながら、同濃度の40、200および1000ng/mLのCD33架橋分子の存在下での白血病細胞の除去は、CAR0007形質導入T細胞(hPGKおよびEF1a)と比較して、非形質導入T細胞間で有意差を示した(図28(b))。
[0556]細胞殺滅アッセイにおいて、細胞毒性は、対照と比較して、残りの白血病細胞の定量化によって測定された。40、200および1000ng/mLの濃度のEGFR架橋分子で白血病細胞を除去したところ、非形質導入T細胞とCAR T細胞の間に有意差は認められなかった(図28(a))。しかしながら、同濃度の40、200および1000ng/mLのCD33架橋分子の存在下での白血病細胞の除去は、CAR0007形質導入T細胞(hPGKおよびEF1a)と比較して、非形質導入T細胞間で有意差を示した(図28(b))。
実施例12-CD33標的化Fab架橋分子の存在下における種々のnfP2X7 CAR-T細胞による細胞殺滅-滴定
[0557]滴定実験において、CD33標的化Fab架橋分子を用いて、48時間のインキュベーション後に10:1のET比でMOLM-13の殺滅に対する非形質導入T細胞、CAR0007_hPGKおよびCAR0007_EF1aエフェクター細胞の効果を試験した(図29)。CD33架橋分子を40ng/mL、200ng/mLおよび1000ng/mLの濃度範囲にわたって滴定した結果、3つのエフェクター細胞集団間に一貫した有意差が観察された(図30)。統計分析はOne-Way ANOVAおよびpost-hoc検定Tukeyによって行われ、EGFR架橋分子の濃度と比較して、名付けられた3つのエフェクター細胞型の効果を比較した。
[0557]滴定実験において、CD33標的化Fab架橋分子を用いて、48時間のインキュベーション後に10:1のET比でMOLM-13の殺滅に対する非形質導入T細胞、CAR0007_hPGKおよびCAR0007_EF1aエフェクター細胞の効果を試験した(図29)。CD33架橋分子を40ng/mL、200ng/mLおよび1000ng/mLの濃度範囲にわたって滴定した結果、3つのエフェクター細胞集団間に一貫した有意差が観察された(図30)。統計分析はOne-Way ANOVAおよびpost-hoc検定Tukeyによって行われ、EGFR架橋分子の濃度と比較して、名付けられた3つのエフェクター細胞型の効果を比較した。
[0558]滴定実験において、CD33標的化Fab架橋分子を用いて、48時間のインキュベーション後に20:1のET比でMOLM-13の殺滅における非形質導入T細胞、CAR0007_hPGKおよびCAR0007_EF1aエフェクター細胞の効果を試験した(図31)。CD33架橋分子を40ng/mL、200ng/mLおよび1000ng/mLの濃度範囲にわたって滴定した結果、3つのエフェクター細胞集団間に一貫した有意差が観察された(図32)。統計分析はOne-Way ANOVAおよびpost-hoc検定Tukeyにより行われ、EGFR架橋分子の濃度と比較して、名付けられた3つのエフェクター細胞型の効果を比較した。
実施例13-FabおよびIgG1形式で、種々の機能不全P2X7受容体エピトープ部分を有するCD19標的化架橋分子の存在下でのnfP2X7 CAR-T細胞による細胞殺滅
[0559]架橋分子は、異なる形式、すなわちFabおよびIgG1において、CD19結合標的化部分を用いて生成された。さらに、これらの異なる形式の架橋分子は、異なる機能不全P2X7受容体エピトープ部分により生成された。
[0559]架橋分子は、異なる形式、すなわちFabおよびIgG1において、CD19結合標的化部分を用いて生成された。さらに、これらの異なる形式の架橋分子は、異なる機能不全P2X7受容体エピトープ部分により生成された。
[0560]これらの実験において、nfP2X7 CARはCAR0007_EF1a CARに従っていたが、VH BIL03 2-2-1とCD28TM(本明細書ではCAR10として記載)との間にCD8αスペーサーを有した。
[0561]これらのCD19標的化FabまたはIgG1架橋分子を用いて、CAR10によるJeKo-1の殺滅における影響を試験した(図33;(a)に示されるFab形式、(b)に示されるIgG1形式)。機能不全P2X7受容体エピトープ部分(すなわち、OR19_8、10、および11)を含有する100ng/mLの全CD19標的化架橋分子間の10:1のET比での少なくとも24時間のインキュベーション後、機能不全P2X7受容体エピトープ部分(OR19_7)を持たない対照架橋分子と比較して、JeKo1の生存率に有意差があった。統計分析はOne-Way ANOVAおよびpost-hoc検定Tukeyによって行われた。機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含有するCD19架橋分子の滴定に有意差はなかった。他のnfP2X7CARでも同様の結果が得られた(データを示さず)。
[0562]これらのデータは、CAR-T細胞の細胞殺滅が、標的化部分の形態および機能不全P2X7受容体エピトープ部分に関係なく、架橋分子によって有意に増強され得ることを示す。
実施例14-CD19標的化架橋分子の存在下での、Fab形式および種々の機能不全P2X7受容体エピトープ部分を有するnfP2X7 CAR-T細胞による細胞殺滅
[0563]実施例13において上記したように、同様の実験を行ったが、機能不全P2X7受容体エピトープ部分のより大きなアレイを有するCD19架橋分子を試験した。図34に示されるように、機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含むCD19架橋分子は、標的JeKo-1細胞の細胞生存率を有意に減少させたが、機能不全P2X7受容体エピトープ部分(OR19_7)を持たない対照架橋分子は減少させなかった。
[0563]実施例13において上記したように、同様の実験を行ったが、機能不全P2X7受容体エピトープ部分のより大きなアレイを有するCD19架橋分子を試験した。図34に示されるように、機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含むCD19架橋分子は、標的JeKo-1細胞の細胞生存率を有意に減少させたが、機能不全P2X7受容体エピトープ部分(OR19_7)を持たない対照架橋分子は減少させなかった。
[0564]異なる機能不全P2X7受容体エピトープ部分を有する(または存在しない)種々のFab架橋分子の要約を以下に示す(全てのFab軽鎖は、本明細書に記載されるFab重鎖-CD19、タファシタマブ、B020-2_HC、配列番号52/143と対合される)。
[0565]
実施例15-FabまたはIgG形式のCD19標的化架橋分子の存在下で異なるnfP2X7 CAR-T細胞による細胞殺滅
[0566]3つの異なるCARアーキテクチャのうちの1つを有するCAR-T細胞を用いて、実施例13において上記したように、同様の実験を行った。図35に示されるように、3つの異なるCAR(CAR7、CAR10およびCAR16)は、T細胞上で発現され、機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含むCD19架橋分子と組み合わされた場合、標的JeKo-1細胞の細胞生存率を有意に減少させた。全ての実験において、架橋分子OR19_10を使用した。
[0566]3つの異なるCARアーキテクチャのうちの1つを有するCAR-T細胞を用いて、実施例13において上記したように、同様の実験を行った。図35に示されるように、3つの異なるCAR(CAR7、CAR10およびCAR16)は、T細胞上で発現され、機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含むCD19架橋分子と組み合わされた場合、標的JeKo-1細胞の細胞生存率を有意に減少させた。全ての実験において、架橋分子OR19_10を使用した。
[0567]これらの結果は、異なるCARアーキテクチャを有するCAR-T細胞を使用する場合、架橋分子システムが細胞生存率の減少に有効であることを示す。
実施例16-代替の架橋分子構築物を用いた結合および細胞殺滅
[0568]本発明者らは、今度はE200エピトープを標的化部分に連結する領域内にIgG1ヒンジ領域を含むさらなる世代の架橋分子を開発した。これらの架橋分子の腫瘍特異的抗原エピトープ部分の配列は、配列番号365~400(下記の表4においてB1~B36と呼ばれる架橋のエピトープ結合部分と相関する)に提供される。腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、本明細書における表1に記載されるように、抗CD19または抗CD33 Fabに連結された。
実施例16-代替の架橋分子構築物を用いた結合および細胞殺滅
[0568]本発明者らは、今度はE200エピトープを標的化部分に連結する領域内にIgG1ヒンジ領域を含むさらなる世代の架橋分子を開発した。これらの架橋分子の腫瘍特異的抗原エピトープ部分の配列は、配列番号365~400(下記の表4においてB1~B36と呼ばれる架橋のエピトープ結合部分と相関する)に提供される。腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、本明細書における表1に記載されるように、抗CD19または抗CD33 Fabに連結された。
[0569]次に、架橋分子は、抗nfP2X7 CARと標的細胞(すなわち、標的化部分が設計される抗原を発現する細胞)の両方に結合するそれらの能力について評価された。下記の表に要約するように、全ての抗CD19架橋分子は、Jeko-1細胞(CD19を発現する)およびnfP2X7 CARを発現するT細胞に特異的に結合することができると決定された(データは抗CD19架橋分子のみについて示される)。
[0570]
[0571]
[0572]
[0573]その後、架橋分子の細胞死(細胞毒性)を誘発する能力を機能的に評価した。行われた実験は、実施例11~15に記載されたものと同様であった。
[0574]試験した全ての架橋分子は、細胞殺滅を誘導する能力を示した。したがって、データは、架橋分子が、JeKo-1細胞またはMOLM-13細胞によって発現されたCD19またはCD33抗原のいずれかに、抗nfP2X7 CAR T細胞を再方向付けすることに成功したことを示す。代表的なデータは、図36に示される(A:抗CD19架橋分子+抗nfP2X7 CAR T細胞によるJeKo-1細胞の細胞殺滅を示す;B:抗CD33架橋分子+抗nfP2X7 CAR T細胞によるMOLM-13細胞の細胞殺滅を示す)。
[0574]試験した全ての架橋分子は、細胞殺滅を誘導する能力を示した。したがって、データは、架橋分子が、JeKo-1細胞またはMOLM-13細胞によって発現されたCD19またはCD33抗原のいずれかに、抗nfP2X7 CAR T細胞を再方向付けすることに成功したことを示す。代表的なデータは、図36に示される(A:抗CD19架橋分子+抗nfP2X7 CAR T細胞によるJeKo-1細胞の細胞殺滅を示す;B:抗CD33架橋分子+抗nfP2X7 CAR T細胞によるMOLM-13細胞の細胞殺滅を示す)。
実施例17-本発明の二成分治療システムのインビボ効力
[0575]6~8週齢のNSGマウスに、0日目に尾静脈注射を介して、マウスあたり1×106細胞で単一細胞選別されたレポーター細胞株JeKo-1_LUC_eGFPを接種した。7日目に、マウスは、JeKo-1生着を決定するために生物発光イメージング(BLI)を受けた。さらに、BLIを用いて白血病負荷を定量し、7日目に処置を開始した。
[0575]6~8週齢のNSGマウスに、0日目に尾静脈注射を介して、マウスあたり1×106細胞で単一細胞選別されたレポーター細胞株JeKo-1_LUC_eGFPを接種した。7日目に、マウスは、JeKo-1生着を決定するために生物発光イメージング(BLI)を受けた。さらに、BLIを用いて白血病負荷を定量し、7日目に処置を開始した。
[0576]マウスを以下の処置群に分けた:
1.腫瘍のみ(PBS)
2.活性化された非形質導入T細胞
3.架橋分子(E200エピトープを含むタファシタマブに基づく抗CD19 Fab)
4.活性化された非形質導入T細胞+架橋分子
5.第3世代の抗CD19-CAR(FMC63に由来し、CD8-CD28-41BB-CD3ζという一般的なCARアーキテクチャを有する抗原結合ドメイン)を発現するT細胞
6.抗nfP2X7受容体CAR1(抗原結合ドメイン2-2-1)を発現するT細胞
7.CAR1+架橋分子を発現するT細胞
8.抗nfP2X7受容体CAR2(抗nfP2X7受容体CAR抗原結合ドメイン2-2-1)を発現するT細胞
9.CAR2+架橋分子を発現するT細胞
10.PBS対照(重複)
[0577]7日目、架橋分子の腹腔内投与は、指示された群において、50μg/マウスで週3回の投薬レジメンで開始した。白血病負荷を指示された時間点でBLIを介して評価し、マウス血液を42日目に分析し、循環末梢血中のがん細胞および免疫細胞を検出した。実験設計を図37に示す。
1.腫瘍のみ(PBS)
2.活性化された非形質導入T細胞
3.架橋分子(E200エピトープを含むタファシタマブに基づく抗CD19 Fab)
4.活性化された非形質導入T細胞+架橋分子
5.第3世代の抗CD19-CAR(FMC63に由来し、CD8-CD28-41BB-CD3ζという一般的なCARアーキテクチャを有する抗原結合ドメイン)を発現するT細胞
6.抗nfP2X7受容体CAR1(抗原結合ドメイン2-2-1)を発現するT細胞
7.CAR1+架橋分子を発現するT細胞
8.抗nfP2X7受容体CAR2(抗nfP2X7受容体CAR抗原結合ドメイン2-2-1)を発現するT細胞
9.CAR2+架橋分子を発現するT細胞
10.PBS対照(重複)
[0577]7日目、架橋分子の腹腔内投与は、指示された群において、50μg/マウスで週3回の投薬レジメンで開始した。白血病負荷を指示された時間点でBLIを介して評価し、マウス血液を42日目に分析し、循環末梢血中のがん細胞および免疫細胞を検出した。実験設計を図37に示す。
[0578]使用された架橋分子は、実施例14に記載された分子(すなわち、タファシタマブ由来のFabで構成される標的化部分を有する)と同様のアーキテクチャ、ならびに配列番号143および145に基づくE200ペプチドを含む腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含んだ。
[0579]陽性対照(第5群)は、第3世代の抗CD19 CARを発現するT細胞を含んだ。CARは、本明細書の他の箇所に記載されるFMC63由来の抗原結合ドメイン(例えば、6×HISagを含まない配列番号31、および軽鎖-重鎖の配向の配列番号32)を含み、一般的に使用されている従来のCARドメイン構造であるドメインCD8-CD8TM-CD28-41BB-CD3ゼータを有するFMC63由来の抗原結合ドメインを含んだ。
[0580]2つの異なるnfP2X7受容体CARを発現するT細胞を再方向付けする架橋分子の能力を評価した。簡単に説明すると、nfP2X7受容体CAR1およびnfP2X7受容体CAR2は、実施例8に上記したように、CARの全般的な構造を含んだ(すなわち、E200エピトープと結合することができる2-2-1sdAbを含む抗原結合ドメインを有する)。
[0581]図38は、各処置群の生物発光(腫瘍量のマーカーとして)を示す。結果は、抗nfP2X7受容体CAR+抗CD19架橋分子を発現するT細胞を投与されたマウスは、抗CD19 CARを発現するT細胞を投与されたマウスと比較して、同様に低いレベルの腫瘍量を有することを示す。
[0582]これらの結果は、インビボ設定において、本発明の架橋分子を使用して、CAR T細胞を、代替の標的に結合するように再方向付けすることができることを実証する。この場合では、nfP2X7受容体に方向付けられたCAR T細胞を、がん細胞上のCD19抗原に再方向付けすることに成功し、CD19結合のための抗原結合ドメインを有するCAR T細胞と類似したレベルの治療効率を達成した。
Claims (60)
- (a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む二成分治療薬。 - 腫瘍特異的抗原が固形腫瘍上に発現される抗原である、請求項1に記載の二成分治療薬。
- 腫瘍特異的抗原が、nfP2X7、EGFRvIIIまたはCLDN6のいずれか1つである、請求項1に記載の二成分治療薬。
- (a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む二成分治療薬。 - (a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む組成物。 - (a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含むキット。 - 架橋分子がポリペプチドである、請求項1~6のいずれか一項に記載の治療薬、組成物またはキット。
- ポリペプチドが、免疫細胞またはその前駆体によって発現される、請求項7に記載の治療薬、組成物またはキット。
- 架橋分子がポリペプチドであり、ポリペプチドが治療薬、組成物もしくはキット中において提供されるか、または治療薬、組成物もしくはキット中において提供される核酸によってコードされる、請求項1~6のいずれか一項に記載の治療薬、組成物またはキット。
- (i)第1の腫瘍抗原に結合する抗原認識ドメインを含み、好ましくは、第1の腫瘍抗原が機能不全P2X7受容体である、キメラ抗原受容体と、
(ii)(a)第2の腫瘍抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片と、(b)第1の腫瘍抗原、好ましくは機能不全P2X7受容体のペプチドまたは断片とを含む融合タンパク質の形態で架橋分子をコードする誘導性発現構築物と
を含む免疫細胞またはその前駆体。 - (i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分と、
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分と
を含む架橋分子。 - 分子が融合タンパク質の形態である、請求項11に記載の架橋分子。
- 請求項1~12のいずれか一項に記載の架橋分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
- 標的化部分をコードする第1のヌクレオチド配列、および腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分をコードする第2のヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載の核酸。
- 請求項14に記載の核酸を含むベクターまたは発現構築物。
- 機能不全P2X7受容体に結合する抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸配列をさらに含む、請求項15に記載のベクターまたは発現構築物。
- 対象における障害を処置する方法であって、対象に、
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現する細胞であって、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全P2X7受容体に結合する細胞と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を投与するステップを含み、それによって対象における障害を処置する方法。 - 対象におけるがんを処置する方法であって、
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を投与するステップを含む方法。 - 標的細胞を殺滅する方法であって、標的細胞を
(a)抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全P2X7受容体に結合する、免疫細胞と、
(b)(i)標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的部分;および
(ii)抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全P2X7受容体エピトープ部分
を含む架橋分子
に曝露するステップを含み、
それによって標的細胞を殺滅する方法。 - 標的細胞が、がん細胞、またはMHC IもしくはII分子が感染性因子由来のペプチドを提示する細胞である、請求項19に記載の方法。
- 標的細胞が機能不全P2X7受容体を発現しない、請求項19または20に記載の方法。
- 2種以上の架橋分子が対象に投与され、各架橋分子が標的細胞上の異なる細胞表面分子に結合する標的化部分を含む、請求項17~21のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋分子が、注入を介して対象に送達される、請求項17~22のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋分子が、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞により発現される核酸配列によってコードされるポリペプチドである、請求項17~22のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸配列が、その誘導性発現を可能にするための誘導性プロモーターを含む、請求項24に記載の方法。
- 架橋分子が標的細胞上の1を超えるクラスの細胞表面分子に対する標的化部分を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項10に記載の免疫細胞、請求項11もしくは12に記載の架橋分子、または請求項17~25のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋分子が標的細胞上の同じ細胞表面分子の1を超えるエピトープに対する標的化部分を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項10に記載の免疫細胞、請求項11もしくは12に記載の架橋分子、または請求項17~26のいずれか一項に記載の方法。
- CARの抗原認識ドメインが、機能不全P2X7受容体のアデノシン三リン酸(ATP)結合部位に付随するエピトープに結合する、請求項1~9のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項10に記載の免疫細胞、または請求項17~27のいずれか一項に記載の方法。
- 機能不全P2X7受容体が、機能的P2X7受容体(例えば、野生型配列を有し、ATP結合受容体の立体配座または折り畳みを有する受容体)のATP結合能力と比較して、ATP結合部位でATPに結合する能力が減少している、請求項28に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- 機能不全P2X7受容体がATP結合部位でATPに結合することができない、請求項29に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- 機能不全P2X7受容体が、受容体を機能不全にさせる立体構造変化を有する、請求項28~30のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- 立体構造変化が、トランス立体構造からシス立体構造へのアミノ酸の変化である、請求項31に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- トランス立体構造からシス立体構造に変化したアミノ酸が、機能不全P2X7受容体のアミノ酸位置210でのプロリンである、請求項32に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- 抗原認識ドメインが、機能不全P2X7受容体のアミノ酸位置210にプロリンを含むエピトープに結合する、請求項28~33のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- 抗原認識ドメインが、機能不全P2X7受容体のアミノ酸位置200のグリシンからアミノ酸位置216のシステインまで(両端を含む)広がる1つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する、請求項34に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- CARの抗原認識ドメインが、機能不全P2X7受容体に結合する抗体またはその断片のアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性を含む、請求項28~30のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- 抗原認識ドメインが、機能不全P2X7受容体に結合する抗体の断片-抗原結合(Fab)部分のアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性を有する、請求項36に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- 抗原認識ドメインが、機能不全P2X7受容体に結合する一本鎖可変断片(scFv)、または多価scFvもしくは単一抗体ドメイン(sdAb)を含む、請求項35または37に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- シグナル伝達ドメインが共刺激受容体に由来する部分を含み、シグナル伝達ドメインが活性化受容体に由来する部分および共刺激受容体に由来する部分を含んでもよい、請求項26~35のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- 共刺激受容体が、CD27、CD28、CD30、CD40、DAP10、OX40、4-1BB(CD137)およびICOSからなる群から選択される、請求項36に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- 抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体がキメラ抗原受容体(CAR)である、請求項28~35のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
- 標的細胞上の細胞表面分子に結合する架橋分子の標的化部分が、ペプチドまたは抗体もしくは抗体断片を含むかまたはそれからなる、請求項1~9のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項10に記載の免疫細胞、請求項11もしくは12に記載の架橋分子、または請求項17~25のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋分子の標的部分が、標的細胞表面上に存在するタンパク質もしくは受容体のリガンドまたは結合パートナーを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項10に記載の免疫細胞、請求項11もしくは12に記載の架橋分子、または請求項17~25のいずれか一項に記載の方法。
- 標的化分子の結合を受ける細胞表面分子が、抗原、好ましくは、本明細書に記載される抗原である、請求項1~9のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項10に記載の免疫細胞、請求項11もしくは12に記載の架橋分子、または請求項17~25のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子の結合を受ける細胞表面分子が、タンパク質、脂質部分、糖タンパク質、糖脂質、糖質、多糖、核酸、MHC結合ペプチド、またはそれらの組合せから選択される、請求項1~9のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項10に記載の免疫細胞、請求項11もしくは12に記載の架橋分子、または請求項17~25のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋分子の標的化部分が標的化抗体または抗体断片を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項10に記載の免疫細胞、請求項11もしくは12に記載の架橋分子、または請求項17~25のいずれか一項に記載の方法。
- 標的化抗体または抗体断片が、免疫グロブリン(Ig)であり、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、その断片またはその修飾物から選択されてもよい、請求項46に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
- 標的化抗体またはその断片がIgG1である、請求項46または47に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
- 標的化抗体またはその断片ががん細胞上の抗原に結合する、請求項46~48のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
- がん細胞上の抗原が腫瘍関連抗原である、請求項49に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
- 腫瘍関連抗原が、CD33(Siglec-3)、CD123(IL3RA)、CD135(FLT-3)、CD44(HCAM)、CD44V6、CD47、CD184(CXCR4)、CLEC12A(CLL1)、LeY、FRp、MICA/B、CD305(LAIR-1)、CD366(TIM-3)、CD96(TACTILE)、CD133、CD56、CD29(ITGB1)、CD44(HCAM)、CD47(IAP)、CD66(CEA)、CD112(Nectin2)、CD117(c-Kit)、CD133、CD146(MCAM)、CD155(PVR)、CD171(LI CAM)、CD200(OX-2)、CD221(IGF1)、CD227(MUC1)、CD243(MRD1)、CD246(ALK)、CD271(LNGFR)、CD19、CD20、GD2、およびEGFRからなる群から選択される、請求項47に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
- 架橋分子の機能不全P2X7受容体エピトープ部分が、P2X7受容体、またはATPと結合することができない隣接する正しくパッキングされたモノマー間の界面に形成される3つのATP結合部位のうちの少なくとも1つを有するP2X7受容体の断片の形態で提供される、請求項1~9のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項10に記載の免疫細胞、請求項11もしくは12に記載の架橋分子、または請求項17~25のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋分子の機能不全P2X7受容体エピトープ部分が、機能不全P2X7受容体の断片を含むかまたはそれからなる、請求項1~9のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項10に記載の免疫細胞、請求項11もしくは12に記載の架橋分子、または請求項17~25のいずれか一項に記載の方法。
- 機能不全P2X7受容体の断片が、配列番号2~30および168のいずれか1つに記載のアミノ酸配列から選択される、請求項53に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
- 機能不全P2X7受容体エピトープ部分が、機能不全P2X7受容体に結合する抗体の結合を受けるが、機能的P2X7受容体に結合する抗体の結合を受けない、請求項53または54に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
- 架橋分子が2種以上の機能不全P2X7受容体エピトープ部分を含む、請求項52~55のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
- 2種以上の機能不全P2X7受容体エピトープ部分が、同じ配列もしくは異なる配列を含むかまたはそれからなる、請求項56に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
- 架橋分子が、E200エピトープの形態の機能不全P2X7受容体エピトープ部分と、E300エピトープの形態のさらなる機能不全P2X7受容体エピトープ部分とを含む、請求項57に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
- 架橋分子が、E200エピトープの形態の機能不全P2X7受容体エピトープ部分と、複合エピトープの形態のさらなる機能不全P2X7受容体エピトープ部分とを含む、請求項57に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
- 架橋分子が、E200エピトープの形態の第1の機能不全P2X7受容体エピトープ部分と、E200エピトープの形態のさらなる機能不全P2X7受容体エピトープ部分とを含む、請求項57に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
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