JP2024510739A - 新規な細胞治療システム - Google Patents

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Abstract

本発明は、（ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、（ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的部分；および（ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を含む架橋分子とを含む治療薬、組成物、キットおよび処置方法に関する。【選択図】なし

Description

[0001]本発明は、キメラ抗原受容体、抗原受容体を発現するエフェクター細胞、ならびにがんを含む種々の状態の予防および／または処置のために抗原受容体を使用する方法に関する。
関連出願
[0002]本出願は、各々の内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、オーストラリア仮出願第２０２１９００７０８号、同第２０２１９０２５６５号および同第２０２１９０２８３０号からの優先権を主張する。
[0003]がん免疫療法は急速に成長している分野である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の開発は、養子細胞治療に革命をもたらしている。
[0004]このアプローチの可能性は、臨床試験において実証されており、ＣＡＲ Ｔ細胞が、Ｂ細胞悪性腫瘍、神経芽細胞腫、および肉腫の成人患者および小児患者に注入された。現在まで、６４の異なる腫瘍関連抗原に結合するように標的化されたＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を試験するように設計された５００を超える臨床試験が世界中で出現している。これらのうち、３種のＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞生成物が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫の処置に承認されている。現在まで、ＣＡＲ Ｔ療法の成功の大部分は、いわゆる「液性」腫瘍との関連において、またはＣＡＲがＣＤ１９、ＣＤ２２またはＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に方向付けられる場合において観察されている。
[0005]ＣＡＲ Ｔ細胞治療の臨床応用には、いくつかの課題が残されている。これらには、固形腫瘍との関連において十分な治療応答を達成することが困難であることが含まれ、ＣＡＲ Ｔ細胞の不十分な活性化、拡大および持続、ならびに／または免疫抑制性腫瘍微小環境によるものと考えられる。さらに、ＣＡＲ Ｔ療法の長期臨床応用は、一特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の選択圧、抗原陰性エスケープバリアント、および抗原枯渇によって負の影響を受ける可能性がある。さらに、健常組織における標的抗原の発現レベルが低いと、重度の「オンターゲット、オフ腫瘍」毒性が生じる可能性がある。最後に、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）およびＣＡＲ Ｔ細胞関連脳症症候群（ＣＲＥＳ）は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の副作用として頻繁に観察される。
[0006]結果として、ＣＡＲ療法、好ましくはＣＡＲ－Ｔ療法に対する新しい改善されたアプローチが必要とされている。
[0007]本明細書における先行技術への言及は、この先行技術が、いずれかの管轄区域における技術常識の一部を形成すること、またはこの先行技術が当業者によって関連性があると理解され、関連性があるとみなされ、および／または他の先行技術と組み合わされると合理的に予測され得ることの認識または示唆ではない。
[0008]一態様では、本発明は、
（ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
（ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む二成分治療薬を提供する。
[0009]任意の態様では、腫瘍特異的抗原は、固形腫瘍または液性腫瘍上に発現される抗原である。一実施形態では、腫瘍特異的抗原は、ｎｆＰ２Ｘ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＣＬＤＮ６のいずれか１つである。
[0010]一態様では、本発明は、
（ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
（ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む二成分治療薬を提供する。
[0011]別の態様では、本発明は、
（ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
（ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含む組成物を提供する。
[0012]別の態様では、本発明は、
（ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
（ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を含むキットを提供する。
[0013]任意の実施形態では、架橋分子は、ポリペプチド、または架橋分子、例えば、ＤＮＡアプタマーの機能を有する分子にコンジュゲートされるポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、免疫細胞またはその前駆体によって発現され得る。あるいは、治療薬、組成物またはキットは、ポリペプチド、または上記ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
[0014]さらなる態様では、本発明は
（ｉ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体であって、抗原認識ドメインが第１の腫瘍抗原と結合し、第１の腫瘍抗原が腫瘍特異的抗原（好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体）である受容体、ならびに
（ｉｉ）（ａ）第２の腫瘍抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片と、（ｂ）腫瘍特異的抗原（好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体）のペプチドまたは断片とを含む融合タンパク質の形態で架橋分子をコードする誘導性発現構築物
を含む免疫細胞またはその前駆体を提供する。
[0015]別の態様では、本発明は、
（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分と、
（ｉｉ）受容体の抗原認識ドメインによって認識されるかまたはその結合を受けることができる腫瘍特異的抗原エピトープ部分（好ましくは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分）であって、受容体がキメラ抗原受容体であってもよい、腫瘍特異的抗原エピトープ部分と
を含む架橋分子を提供する。
[0016]架橋分子は、ポリペプチド、例えば、融合タンパク質またはキメラタンパク質であり得る。代替の実施形態では、架橋分子は、連結分子を介して連結されるポリペプチドまたはペプチドを含み得る。
[0017]別の態様では、本発明は、本明細書に記載される架橋分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。好ましくは、核酸は、標的化部分をコードする第１のヌクレオチド配列、および腫瘍特異的抗原エピトープ部分をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分である。
[0018]別の態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターまたは発現構築物を提供する。一態様では、ベクターまたは発現構築物は、抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、抗原認識ドメインは、本明細書に記載される、細胞表面上に発現される機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識する。
[0019]別の態様では、本発明は、対象における障害を処置する方法を提供し、該方法は、対象に、
（ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現する細胞であって、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原（好ましくは、腫瘍特異的抗原は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体である）に結合する細胞と、
（ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を投与することを含み、それによって対象における障害を処置する。
[0020]別の態様では、本発明は、対象においてがんを処置する方法を提供し、該方法は、
（ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する、免疫細胞と、
（ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
を含む架橋分子と
を投与することを含む。
[0021]別の態様において、本発明は、標的細胞を殺滅する方法を提供し、該方法は、標的細胞を
（ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する、免疫細胞と、
（ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
を含む架橋分子
に曝露させることを含み、それによって標的細胞を殺滅する。
[0022]標的細胞は、がん細胞、またはＭＨＣクラス受容体上に感染性因子由来のペプチドを提示することができる細胞であり得る。標的細胞は、腫瘍特異的抗原、例えば、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現しても発現していなくてもよい。
[0023]任意の態様では、標的細胞は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現する任意の細胞、例えばがん細胞であり得る。
[0024]任意の実施形態では、２種以上の架橋分子を対象に投与することができ、各架橋分子は標的細胞上の異なる細胞表面分子に結合する標的化部分を含む。例えば、がんを処置する方法との関連において、投与される各架橋分子は、異なる標的化部分を含み得、したがって、がん細胞上に存在する異なる腫瘍関連抗原に結合し得る。このような実施形態は、単一クラスのＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍抗原上に存在する複数の抗原への再方向付けを容易にし（同時を含む）、したがって、がん細胞を殺滅するための多面的アプローチを提供する。
[0025]したがって、任意の態様において、がんを処置する方法は、２種以上の架橋分子を投与することを含み、各架橋分子は、標的細胞上の異なる細胞表面抗原に結合するための標的化部分を含む。
[0026]さらなる実施形態では、架橋分子は、がん細胞によって発現される同細胞表面抗原上の異なるエピトープに結合し得る。したがって、さらなる実施形態では、本発明の方法は、２種以上の架橋分子を投与することを含み、各架橋分子は、標的細胞上の同細胞表面抗原上の異なるエピトープに結合するための標的化部分を含む。
[0027]さらになお、本発明は、ＣＡＲ Ｔ細胞を異なるがん抗原に再方向付けするための架橋分子を、それを必要とする対象に同期して投与することができる方法を提供する。これは、ＣＡＲ Ｔ細胞が、患者の治療レジメンの経過中の異なる時間に、異なる抗原を介してがん細胞に結合するように方向付けられ得るように、治療アプローチを微調整することを可能にする。
[0028]さらなる実施形態において、単一の架橋分子は、単一の分子が標的細胞上の１を超える細胞表面分子に対する標的化部分を含むように、１を超える標的化部分を含み得る。
[0029]さらになお、単一の架橋分子は、単一の分子が標的細胞上の同じ細胞表面分子に対する標的化部分を含むが、標的化部分が細胞表面分子上の異なるエピトープに結合するように、１を超える標的化部分を含み得る。
[0030]本明細書中の処置方法を対象とする態様の任意の実施形態では、架橋分子は、対象への注入を介して送達され得るか、またはキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞によって発現され得る。架橋分子は、ポリペプチドであり得、免疫細胞に含有される誘導性または構成的な発現構築物中にコードされる。
[0031]任意の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合部位に付随するエピトープに結合する。一部の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体は、機能的Ｐ２Ｘ７受容体（例えば、野生型配列を有し、ＡＴＰ結合受容体の立体構造または折り畳みを有する受容体）のＡＴＰ結合能力と比較して、ＡＴＰ結合部位でＡＴＰに結合する能力が減少している。一部の実施態様では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体は、ＡＴＰ結合部位でＡＴＰに結合することができない。
[0032]任意の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体は、受容体を機能不全にさせる立体構造変化を有する。一部の実施形態では、立体構造変化は、トランス立体構造からシス立体構造へのアミノ酸の変化である。一部の実施形態では、トランス立体構造からシス立体構造に変化したアミノ酸は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置２１０でプロリンである。
[0033]任意の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置２１０にプロリンを含むエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置２００のグリシンからアミノ酸位置２１６のシステインまで（両端を含む）に広がる１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。
[0034]受容体の抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体と相互作用することができ、特異的に結合することができる任意の適切な分子であり得る。しかしながら、一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体またはその断片のアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の断片－抗原結合（Ｆａｂ）部分のアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
[0035]任意の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）または多価ｓｃＦｖのアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性を含む。一部の実施形態では、多価ｓｃＦｖは、二価または三価ｓｃＦｖである。
[0036]任意の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する単一抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）とのアミノ酸配列相同性を含む。
[0037]任意の実施形態では、抗原認識ドメインは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とのアミノ酸配列相同性を含む結合ポリペプチドを含む。任意の実施形態では、結合ポリペプチドは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体のＶＨおよび／またはＶＬ鎖のＣＤＲ１、２および３ドメインとのアミノ酸配列相同性を含む。好ましい実施形態では、結合ポリペプチドは、抗体のＶＨおよび／もしくはＶＬ鎖のＣＤＲのアミノ酸配列、または抗体のＶＨおよび／もしくはＶＬ鎖のアミノ酸配列、または抗体もしくはその断片のアミノ酸配列を含み、抗体またはその断片は、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＡＵ２００２／００００６１またはＰＣＴ／ＡＵ２００２／００１２０４（または対応する米国特許第７，３２６，４１５号、米国特許第７，８８８，４７３号、米国特許第７，５３１，１７１号、米国特許第８，０８０，６３５号、米国特許第８，３９９，６１７号、米国特許第８，７０９，４２５号、米国特許第９，６６３，５８４号、もしくは米国特許第１０，４５０，３８０号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４０（または対応する米国特許第８，０６７，５５０号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４１（または対応する米国特許出願公開第２０１０／００３６１０１号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１３６４（または対応する米国特許第８，４４０，１８６号、米国特許第９，１８１，３２０号、米国特許第９，９４４，７０１号もしくは米国特許第１０，５９７，４５１号のうちのいずれか１つ）、ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１３６５（または対応する米国特許第８，２９３，４９１号もしくは米国特許第８，６５８，３８５号のうちのいずれか１つ）、ＰＣＴ／ＡＵ２００９／０００８６９（または対応する米国特許第８，５９７，６４３号、米国特許第９，３２８，１５５号もしくは米国特許第１０，２３８，７１６号のうちのいずれか１つ）、ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１０７０（対応する国際公開第／２０１１／０２０１５５号、米国特許第９，１２７，０５９号、米国特許第９，６８８，７７１号、もしくは米国特許第１０，０５３，５０８号のうちのいずれか１つ）、およびＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１７４１（対応する国際公開第２０１１／０７５７８９号もしくは米国特許第８，８３５，６０９号のうちのいずれか１つ）に記載される任意の抗体のアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体は、ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１０７０（または対応する米国特許第９，１２７，０５９号、米国特許第９，６８８，７７１号、もしくは米国特許第１０，０５３，５０８号のうちのいずれか１つ）に記載される２－２－１のＣＤＲアミノ酸配列、またはＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４１（または対応する米国特許出願公開第２０１０／００３６１０１号）に記載されるＢＰＭ０９、およびアクセッション番号０６０８０１０１であるＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）で寄託されたハイブリドーマＡＢ２５３によって産生されるものを含む。
[0038]一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態では、活性化受容体は、ＣＤ３補助受容体複合体のメンバーであるか、またはＦｃ受容体である。一部の実施形態では、ＣＤ３補助受容体複合体に由来する部分は、ＣＤ３－ζである。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体に由来する部分は、ＦｃεＲＩまたはＦｃγＲＩである。
[0039]一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、活性化受容体に由来する部分および共刺激受容体に由来する部分を含む。一部の実施形態では、共刺激受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＩＣＯＳからなる群から選択される。
[0040]任意の態様では、抗原受容体を発現する細胞は、免疫細胞、例えば、本明細書に記載される免疫細胞、または免疫細胞に分化することができる細胞（例えば、免疫細胞の前駆体）であり得る。免疫細胞に分化することができる細胞（例えば、機能不全Ｐ２Ｘ７ ＣＡＲを発現するＴ細胞）は、幹細胞、多系統前駆細胞、または人工多能性幹細胞であり得る。
[0041]前述の態様の任意の実施形態では、抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体は、キメラ受容体抗原（ＣＡＲ）である。
[0042]任意の態様では、標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分は、ペプチドまたは抗体もしくは抗体断片を含むかあるいはそれからなる。あるいは、標的化部分は、標的細胞表面上に存在するタンパク質または受容体のためのリガンドまたは結合パートナーを含み得る。
[0043]標的化部分は、可溶性Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）または一本鎖Ｔ細胞受容体結合モチーフまたはＴ細胞受容体様ｍＡｂをさらに含み得る。このような実施形態では、標的化部分は、ＭＨＣ（ＨＬＡ）ＩおよびＩＩ分子を介して細胞表面上に提示される感染性因子由来の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来するペプチドの結合に特に適している。標的化部分はまた、ＭＨＣ分子によって提示されるペプチドの結合に適することができ、ペプチドは、がんに関連する突然変異を含み、例えば、がん精巣抗原（ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥファミリー（例えば、ＰＲＡ１００、ＰＲＡ１４２、ＰＲＡ３００、ＰＲＡ４２５およびその他）、ＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ１２およびその他）、ＣＴ８３、ＳＳＸ２、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＰＡＧＥ）または他のがん特異的突然変異が含まれる。
[0044]任意の実施形態では、細胞表面分子は、抗原、好ましくは本明細書に記載される抗原を含み得る。
[0045]細胞表面分子は、タンパク質、脂質部分、糖タンパク質、糖脂質、糖質、多糖、核酸、ＭＨＣ結合ペプチド、またはそれらの組合せから選択され得る。
[0046]細胞表面分子は、細菌、ウイルス、および他の微生物の部分（例えば、被膜、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛、および毒素）を含み得る。細胞表面分子は、標的細胞によって発現され得る。
[0047]細胞表面分子は、標的細胞によって発現されないことがある。非限定的な例として、細胞表面分子は、標的細胞ではなく、標的細胞または標的細胞の細胞表面分子に結合する細胞によって発現されるリガンドであり得る。また、非限定的な例によって、細胞表面分子は、標的細胞の細胞表面または細胞表面受容体に結合する毒素、外因性分子またはウイルスタンパク質であり得る。
[0048]任意の態様または実施形態では、架橋分子の標的化部分は、受容体の抗原認識と同じ抗原またはエピトープに結合しない。例えば、架橋分子の標的部分は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体、Ｅ２００、Ｅ３００、もしくはＥ２００／Ｅ３００複合エピトープ、または本明細書に記載される機能不全Ｐ２Ｘ７受容体上に存在する任意の他のエピトープに結合しない。
[0049]標的化部分は、標的化抗体または抗体断片であり得る。標的化抗体または抗体断片は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、それらの断片またはそれらの修飾から選択され得る。免疫グロブリンはＩｇＧであり得る。ＩｇＧはＩｇＧ１であり得る。ＩｇＧは任意のＩｇＧサブクラスであり得る。
[0050]任意の実施形態では、本発明の架橋分子は、１を超える標的化部分を含み得る。例えば、ある特定の非限定的な実施形態では、架橋分子は、２つの異なる抗体、またはその断片を含み得る。抗体は、標的細胞上の同一の細胞表面分子の異なるエピトープに結合し得る。あるいは、抗体は、標的細胞上の異なる細胞表面分子のエピトープに結合し得る。
[0051]機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、Ｐ２Ｘ７受容体、またはＡＴＰと結合することができない隣接する正しくパッキングされたモノマー間の界面で形成される３つのＡＴＰ結合部位のうちの少なくとも１つを有するＰ２Ｘ７受容体の断片の形態で提供され得る。このような受容体は、非選択的カルシウムチャネルの開口をアポトーシス孔まで延長することができない。
[0052]任意の態様では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体の断片を含むかまたはそれからなる。例示的な断片には、ＧＨＮＹＴＴＲＮＩＬＰＧＬＮＩＴＣ（配列番号２；本明細書では「Ｅ２００エピトープ」とも称する）およびそのバリアント（例示的なバリアントは配列番号３～１０および１５～３０および１６８に提供される）；ＫＹＹＫＥＮＮＶＥＫＲＴＬＩＫＶＦ（配列番号１２および１３；本明細書では「Ｅ３００」エピトープとも称する）；またはＧＨＮＹＴＴＲＮＩＬＰＧＡＧＡＫＹＹＫＥＮＮＶＥＫ（配列番号１４；本明細書では「Ｅ２００／Ｅ３００」または「複合」エピトープとも称する）が挙げられる。さらなる例は、本明細書の表１に提供される。
[0053]任意の態様では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合するが、機能的Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体には結合しない抗体の結合を受ける。
[0054]任意の態様では、架橋分子は、２種以上の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を含み得る。２種以上の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、同じ配列もしくは異なる配列を含み得るかまたはそれらから構成され得る。例えば、任意の態様では、架橋分子は、Ｅ２００エピトープの形態で機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分と、Ｅ３００エピトープの形態でさらなる機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分とを含み得る。あるいは、任意の態様では、架橋分子は、Ｅ２００エピトープの形態で機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分と、複合エピトープの形態でさらなる機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分とを含み得る。さらになお、任意の態様では、架橋分子は、Ｅ２００エピトープの形態で第１の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分と、Ｅ２００エピトープの形態でさらなる機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分とを含み得る。
[0055]本明細書で使用される場合、文脈上別段の必要がある場合を除く、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および用語の変形、例えば「含んでいる」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、さらなる添加剤、成分、整数または工程を除外することを意図しない。
[0056]本発明のさらなる態様および前段落に記載された態様のさらなる実施形態は、以下の説明から明らかになり、一例として、添付の図面を参照して与えられる。
[0057]例示的な架橋分子の模式図を示す。 [0058]がん、感染および免疫調節関連標的抗原を標的とするｎｆＰ２Ｘ７－ＣＡＲおよびＦａｂベースのＥ２００架橋分子を利用する本発明の例示的な実施形態の概略図を示す。 [0059]がんおよび感染関連ペプチドを標的とするｎｆＰ２Ｘ７－ＣＡＲおよび一本鎖ＴＣＲベースのＥ２００架橋分子を利用する本発明の例示的な実施形態の概略図を示す。 [0060]ＶＨに直接連結したか（（ａ）および（ｂ））またはリンカーを介して連結した（（ｃ）および（ｄ））単一のＥ２００エピトープを有するＦａｂ形式の架橋分子は、ＪｅＫｏ－１（マントル細胞リンパ腫）細胞株のＣＤ１９に結合し、Ｅ２００エピトープは抗体（ＢＩＬ０３＿２－２－１－ＡＦ６４７）への結合のために利用可能である。ＨＩＳタグはＦＩＴＣ抗体によって検出される。（ａ）および（ｃ）は抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）および（ｄ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。 [0061]ＶＨに直接連結したか（（ａ）および（ｂ））またはリンカーを介して連結した（（ｃ）および（ｄ））単一のＥ２００エピトープを有するｓｃＦｖ形式の架橋分子は、ＪｅＫｏ－１（マントル細胞リンパ腫）細胞株のＣＤ１９に結合し、Ｅ２００エピトープは抗体への結合のために利用可能である。（ａ）および（ｃ）は抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）および（ｄ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。 [0062]ＶＬに直接連結したか（（ａ）および（ｂ））またはリンカーを介して連結した（（ｃ）および（ｄ））単一のＥ２００エピトープを有するＦａｂ形式の架橋分子は、ＪｅＫｏ－１（マントル細胞リンパ腫）細胞株のＣＤ１９に結合し、Ｅ２００エピトープは抗体への結合のために利用可能である。（ａ）および（ｃ）は抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）および（ｄ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。 [0063]ＶＬに直接連結したか（（ａ）および（ｂ））またはリンカーを介して連結した（（ｃ）および（ｄ））単一のＥ２００エピトープを有するｓｃＦｖ形式の架橋分子は、ＪｅＫｏ－１（マントル細胞リンパ腫）細胞株のＣＤ１９に結合し、Ｅ２００エピトープは抗体への結合のために利用可能である。（ａ）および（ｃ）は抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）および（ｄ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。 [0064]架橋分子は、種々の抗原ＣＤ３７、ＣＤ７９Ｂ、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＰＤＬ１、ＣＤ２２、ＣＤ７０およびＣＤ２０に結合する。（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｍ）、（ｏ）、（ｑ）、（ｓ）、（ｕ）、（ｗ）および（ｙ）は、抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）、（ｌ）、（ｎ）、（ｐ）、（ｒ）、（ｔ）、（ｖ）、（ｘ）および（ｚ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。 [0064]架橋分子は、種々の抗原ＣＤ３７、ＣＤ７９Ｂ、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＰＤＬ１、ＣＤ２２、ＣＤ７０およびＣＤ２０に結合する。（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｍ）、（ｏ）、（ｑ）、（ｓ）、（ｕ）、（ｗ）および（ｙ）は、抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）、（ｌ）、（ｎ）、（ｐ）、（ｒ）、（ｔ）、（ｖ）、（ｘ）および（ｚ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。 [0064]架橋分子は、種々の抗原ＣＤ３７、ＣＤ７９Ｂ、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＰＤＬ１、ＣＤ２２、ＣＤ７０およびＣＤ２０に結合する。（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｍ）、（ｏ）、（ｑ）、（ｓ）、（ｕ）、（ｗ）および（ｙ）は、抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）、（ｌ）、（ｎ）、（ｐ）、（ｒ）、（ｔ）、（ｖ）、（ｘ）および（ｚ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。 [0064]架橋分子は、種々の抗原ＣＤ３７、ＣＤ７９Ｂ、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＰＤＬ１、ＣＤ２２、ＣＤ７０およびＣＤ２０に結合する。（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｍ）、（ｏ）、（ｑ）、（ｓ）、（ｕ）、（ｗ）および（ｙ）は、抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）、（ｌ）、（ｎ）、（ｐ）、（ｒ）、（ｔ）、（ｖ）、（ｘ）および（ｚ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。 [0064]架橋分子は、種々の抗原ＣＤ３７、ＣＤ７９Ｂ、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＰＤＬ１、ＣＤ２２、ＣＤ７０およびＣＤ２０に結合する。（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｍ）、（ｏ）、（ｑ）、（ｓ）、（ｕ）、（ｗ）および（ｙ）は、抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）、（ｌ）、（ｎ）、（ｐ）、（ｒ）、（ｔ）、（ｖ）、（ｘ）および（ｚ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。 [0064]架橋分子は、種々の抗原ＣＤ３７、ＣＤ７９Ｂ、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＰＤＬ１、ＣＤ２２、ＣＤ７０およびＣＤ２０に結合する。（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｍ）、（ｏ）、（ｑ）、（ｓ）、（ｕ）、（ｗ）および（ｙ）は、抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）、（ｌ）、（ｎ）、（ｐ）、（ｒ）、（ｔ）、（ｖ）、（ｘ）および（ｚ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。 [0064]架橋分子は、種々の抗原ＣＤ３７、ＣＤ７９Ｂ、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＰＤＬ１、ＣＤ２２、ＣＤ７０およびＣＤ２０に結合する。（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｍ）、（ｏ）、（ｑ）、（ｓ）、（ｕ）、（ｗ）および（ｙ）は、抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）、（ｌ）、（ｎ）、（ｐ）、（ｒ）、（ｔ）、（ｖ）、（ｘ）および（ｚ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。 [0065]フローサイトメトリーによって検出した場合、示された形式でのＣＤ１９標的化Ｆａｂ架橋分子によるＪｅＫｏ－１細胞の「ペインティング」を示す図である。細胞をＦａｂ架橋分子とともに所定の濃度でインキュベートした。ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子は、１０ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＪｅＫｏ－１において陰性対照として機能した。ＣＤ１９標的化Ｆａｂ架橋分子は、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬで使用された。 [0066]フローサイトメトリーによって検出した場合、示された形式でのＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子によるＭＯＬＭ－１３細胞の「ペインティング」を示す図である。細胞をＦａｂ架橋分子とともに所定の濃度でインキュベートした。ＣＤ１９標的化Ｆａｂ架橋分子は、１０ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＪｅＫｏ－１において陰性対照として機能した。ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子は、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬで使用された。 [0067]ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を介したＭＯＬＭ－１３（ＡＭＬ）細胞の「ペインティング」を示す図である。フローデータは、黒色でアイソタイプ対照、青色でＢＩＬ０３ ２－２－１ ｓｄ－ｍＡｂによる１ｕｇ／ｍＬでのみの染色、緑色でＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子とＢＩＬ０３ ２－２－１ ｓｄ－ｍＡｂの組合せによる染色の増加を示す。ｎｆＰ２Ｘ７ ＢＲＩＤＧＥ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞によって認識され得る標的分子の増加は、ＣＡＲ媒介性エフェクター機能につながる。架橋分子の使用は、がん細胞上の標的化エピトープを増加させることによって、ＣＡＲ機能を増大させる。 [0067]ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を介したＭＯＬＭ－１３（ＡＭＬ）細胞の「ペインティング」を示す図である。フローデータは、黒色でアイソタイプ対照、青色でＢＩＬ０３ ２－２－１ ｓｄ－ｍＡｂによる１ｕｇ／ｍＬでのみの染色、緑色でＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子とＢＩＬ０３ ２－２－１ ｓｄ－ｍＡｂの組合せによる染色の増加を示す。ｎｆＰ２Ｘ７ ＢＲＩＤＧＥ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞によって認識され得る標的分子の増加は、ＣＡＲ媒介性エフェクター機能につながる。架橋分子の使用は、がん細胞上の標的化エピトープを増加させることによって、ＣＡＲ機能を増大させる。 [0068]非形質導入Ｔ細胞（左パネル）、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫ（中央パネル）およびＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａ（右パネル）を発現するＴ細胞の直接比較を伴う代表的なフローサイトメトリープロットを示す図である。ＣＡＲ Ｔ細胞を含有する条件の両方は、２０：１のＥＴ比でＭＯＬＭ－１３とインキュベーションした場合、４８時間後に１０００ｎｇ／ｍＬでＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子とインキュベーションした場合の活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の発現の有意な増加を示した。 [0069]図１２に対応する２０：１のＥＴ比でのＴ細胞およびＭＯＬＭ－１３、ならびに４８時間後の１０００ｎｇ／ｍＬでのＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子のフローサイトメトリープロットは、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫおよびＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａを含有する条件下で白血病細胞の完全なクリアランスを示したが、非形質導入Ｔ細胞条件下では白血病細胞数における影響はなかった。 [0070]４８時間後、２０：１のＥＴ比で、Ｔ細胞およびＭＯＬＭ－１３を含有するＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａの示されたＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子濃度における白血病細胞の用量依存的クリアランスを示すフローサイトメトリープロットを示す図である。４０ｎｇ／ｍＬという低値は、２００および１０００ｎｇ／ｍＬで白血病細胞のほぼ完全な除去および白血病細胞の完全な除去を示した。 [0071]（ａ）指示された濃度でＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化架橋分子の存在下および非存在下での４８時間インキュベーション後の２０：１のＥＴ比でのＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫ Ｔ細胞によるＭＯＬＭ－１３白血病細胞の特異的溶解を示す。ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の濃度（４０、２００および１０００ｎｇ／ｍＬ）の増加について、用量依存的に有意な溶解が見出された。（ｂ）指示された濃度でＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化架橋分子の存在下および非存在下での４８時間インキュベーション後の２０：１のＥＴ比でのＣＡＲ０００７＿ｈＥＦ１ａ Ｔ細胞によるＭＯＬＭ－１３白血病細胞の特異的溶解を示す。ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の濃度（４０、２００および１０００ｎｇ／ｍＬ）の増加について、用量依存的に有意な溶解が見出された。 [0071]（ａ）指示された濃度でＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化架橋分子の存在下および非存在下での４８時間インキュベーション後の２０：１のＥＴ比でのＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫ Ｔ細胞によるＭＯＬＭ－１３白血病細胞の特異的溶解を示す。ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の濃度（４０、２００および１０００ｎｇ／ｍＬ）の増加について、用量依存的に有意な溶解が見出された。（ｂ）指示された濃度でＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化架橋分子の存在下および非存在下での４８時間インキュベーション後の２０：１のＥＴ比でのＣＡＲ０００７＿ｈＥＦ１ａ Ｔ細胞によるＭＯＬＭ－１３白血病細胞の特異的溶解を示す。ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の濃度（４０、２００および１０００ｎｇ／ｍＬ）の増加について、用量依存的に有意な溶解が見出された。 [0072]ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の滴定実験を用いて、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫによるＭＯＬＭ－１３の殺滅における影響を試験した。ＥＧＦＲ標的化架橋分子を用いた条件と１０００ｎｇ／ｍＬでのＣＤ３３標的化架橋分子との間に、１０：１のＥＴ比で２４時間インキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率において有意な影響があった。統計分析はｔ検定によって行われた。 [0073]図１６からのデータの代替表現を示す図である。ＥＧＦＲ架橋分子の滴定に有意差はなかった（データを示さず）。ＣＤ３３架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析は、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙによって行われた。 [0074]ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の滴定実験を用いて、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫによるＭＯＬＭ－１３の殺滅に対する影響を試験した。ＥＧＦＲ標的化架橋分子による状態と、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３３標的化架橋分子との間の２０：１のＥＴ比での２４時間のインキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存性に有意な影響があった。統計分析はｔ検定によって行われた。 [0075]図１８からのデータの代替表現を示す図である。ＥＧＦＲ架橋分子の滴定に有意差はなかった（データを示さず）。ＣＤ３３架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析は、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙによって行われた。 [0076]ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の滴定実験を用いて、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫによるＭＯＬＭ－１３の殺滅に対する影響を試験した。ＥＧＦＲ標的化架橋分子による状態と、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３３標的化架橋分子との間の１０：１のＥＴ比での４８時間のインキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率に有意な影響があった。統計分析はｔ検定によって行われた。 [0077]ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の滴定実験を用いて、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫによるＭＯＬＭ－１３の殺滅に対する影響を試験した。ＥＧＦＲ標的化架橋分子による状態と、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３３標的化架橋分子との間の２０：１のＥＴ比での４８時間のインキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率に有意な影響があった。統計分析はｔ検定によって行われた。 [0078]ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の滴定実験を用いて、ＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａによるＭＯＬＭ－１３の殺滅に対する影響を試験した。ＥＧＦＲ標的化架橋分子による状態と、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３３標的化架橋分子との間の１０：１のＥＴ比での２４時間インキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率に有意な影響があった。統計分析はｔ検定により行った。 [0079]図２２からのデータの代替表現を示す図である。ＥＧＦＲ架橋分子の滴定に有意差はなかった（データを示さず）。ＣＤ３３架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析は、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙによって行われた。 [0080]ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の滴定実験を用いて、ＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａによるＭＯＬＭ－１３の殺滅に対する影響を試験した。ＥＧＦＲ標的化架橋分子による状態と、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３３標的化架橋分子との間の２０：１のＥＴ比での２４時間のインキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存性に有意な影響があった。統計分析はｔ検定によって行われた。 [0081]図２４からのデータの代替表現を示す図である。ＥＧＦＲ架橋分子の滴定に有意差はなかった（データを示さず）。ＣＤ３３架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析は、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙによって行われた。 [0082]ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の滴定実験を用いて、ＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａによるＭＯＬＭ－１３の殺滅に対する影響を試験した。ＥＧＦＲ標的化架橋分子による状態と、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３３標的化架橋分子との間の１０：１のＥＴ比での４８時間のインキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率に有意な影響があった。統計分析はｔ検定によって行われた。 [0083]ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の滴定実験を用いて、ＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａによるＭＯＬＭ－１３の殺滅に対する影響を試験した。ＥＧＦＲ標的化架橋分子による状態と、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３３標的化架橋分子との間の２０：１のＥＴ比での４８時間のインキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存性に有意な影響があった。統計分析はｔ検定によって行われた。 [0084]（ａ）殺滅アッセイ（細胞傷害性は対照と比較した残存白血病細胞の定量化により測定された）では、ＥＧＦＲ架橋分子濃度４０、２００および１０００ｎｇ／ｍＬにおける白血病細胞の除去は、ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、非形質導入Ｔ細胞間に有意差を示さなかった。（ｂ）ＣＤ３３架橋分子濃度４０、２００および１０００ｎｇ／ｍＬでの白血病細胞の除去は、ＣＡＲ０００７形質導入Ｔ細胞（ｈＰＧＫおよびＥＦ１ａ）と比較して、非形質導入Ｔ細胞間で有意差を示した。 [0085]ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の滴定実験を用いて、４８時間のインキュベーション後、１０：１のＥＴ比で、非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫおよびＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａエフェクター細胞によるＭＯＬＭ－１３の殺滅における効果を試験した。 [0086]図２９における結果の分析を示す図である。ＣＤ３３架橋分子の滴定において、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬで３つのエフェクター細胞集団間に一貫した有意差はなかった。統計分析は、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙによって行われ、ＥＧＦＲ架橋分子の濃度あたり、指定された３つの条件を比較した。 [0086]図２９における結果の分析を示す図である。ＣＤ３３架橋分子の滴定において、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬで３つのエフェクター細胞集団間に一貫した有意差はなかった。統計分析は、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙによって行われ、ＥＧＦＲ架橋分子の濃度あたり、指定された３つの条件を比較した。 [0087]ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の滴定実験を用いて、４８時間のインキュベーション後、２０：１のＥＴ比で、非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫおよびＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａエフェクター細胞によるＭＯＬＭ－１３の殺滅における効果を試験した。 [0088]図３１における結果の分析を示す図である。８ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬでの３つのエフェクター細胞集団間のＣＤ３３架橋分子の滴定に一貫した有意差があった。統計分析は、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙによって行われ、ＥＧＦＲ架橋分子の濃度あたり、指定された３つの条件を比較した。 [0088]図３１における結果の分析を示す図である。８ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬでの３つのエフェクター細胞集団間のＣＤ３３架橋分子の滴定に一貫した有意差があった。統計分析は、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙによって行われ、ＥＧＦＲ架橋分子の濃度あたり、指定された３つの条件を比較した。 [0089]ＦａｂおよびＩｇＧ１形式で、種々の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を有するＣＤ１９標的化架橋分子の存在下でのｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞による細胞殺滅を示す図である。ＣＡＲ１０対ＪｅＫｏ－１エフェクター細胞／標的細胞（ＥＴ）比１０：１。ＣＡＲ１０対標的２．９：１。Ｎ＝１健常ドナー。６回の反復。ＣＡＲ１０発現（ｄ１２）＝２８．６％。有意性は、全てが対照とは有意に異なるグループ対対照（＊＊＊＊）について示される。 [0090]異なる機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を有するＣＤ１９標的化架橋分子の存在下でのｎｆＰ２Ｘ７ＣＡＲ－Ｔ細胞による細胞殺滅を示す図である。ＣＡＲ１０対ＪｅＫｏ－１エフェクター細胞／標的細胞（ＥＴ）比２０：１。Ｎ＝１健常ドナー。１００ｎｇ／ｍＬのＦａｂ ＣＤ１９架橋分子。６回の反復。全てのＣＡＲ条件において、ＣＡＲを発現する細胞は、ＥＴ比１．４８：１に標準化された。有意性は、全てが対照とは有意に異なるグループ対対照（＊＊＊＊）について示される。 [0091]３つの異なるクラスのｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞（すなわち、異なるＣＡＲ構造を有する）による、ＦａｂおよびＩｇＧ１形式のＣＤ１９標的化架橋分子の存在下での細胞殺滅を示す図である。ＣＡＲ７、ＣＡＲ１０およびＣＡＲ１６対ＪｅＫｏ－１エフェクター細胞／標的細胞（ＥＴ）比１０：１。ＣＡＲ７対標的３．３：１；ＣＡＲ１０対標的２．８：１。ＣＡＲ１６対標的２．２：１。Ｎ＝１健常ドナー。６回の反復。ＣＡＲ７発現（ｄ１２）３３．３％；ＣＡＲ１０発現（ｄ１２）＝２８．６％；ＣＡＲ１６発現（ｄ１２）＝２２．６％。有意性は、全てが対照とは有意に異なるグループ対対照（＊＊＊＊）について示される。 [0092]Ａ）Ｆａｂ形式のＣＤ１９標的化架橋分子（ＪｅＫｏ－１細胞の殺滅）、または（ｂ）Ｆａｂ形式のＣＤ３３標的化架橋分子（ＭＯＬＭ－１３細胞の殺滅）の存在下でのｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞による細胞殺滅を示す図である。 [0093]架橋分子のインビボ評価の模式図を示す。 [0094]Ｊｅｋｏ－１＿ＬＵＣ＿ｅＧＦＰ細胞の接種後のマウスにおける腫瘍量の指標としての生物発光（総フラックス、ｐ／ｓ）を示す図である。マウスに以下の処置を行った：グループ１＝処置なし；グループ２＝活性化された非形質導入Ｔ細胞；グループ３＝架橋分子（Ｅ２００エピトープ＋抗ＣＤ１９ Ｆａｂ）；グループ４＝活性化された非形質導入Ｔ細胞＋架橋分子；グループ５＝第３世代の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞；グループ６＝抗ｎｆＰ２Ｘ７受容体ＣＡＲ１を発現するＴ細胞；グループ７＝ＣＡＲ１－Ｔ細胞＋架橋分子；グループ８＝ｎｆＰ２Ｘ７受容体ＣＡＲ２を発現するＴ細胞；グループ９＝ＣＡＲ２－Ｔ細胞＋架橋分子。
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実施形態の詳細な説明
[0095]ここで、本発明のある特定の実施形態を詳細に参照する。本発明を実施形態とともに記載するが、本発明をこれらの実施形態に限定するものではないことが理解される。反対に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物、修飾物、および均等物をカバーすることを意図している。
[0096]当業者は、本発明の実施において使用することができる、本明細書に記載されたものと類似または均等の多くの方法および材料を認識するであろう。本発明は、記載される方法および材料に決して限定されるものではない。
[0097]この明細書において開示され、定義される発明は、テキストまたは図面から言及されまたは明白な２つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組合せに及ぶことが理解される。これらの異なる組合せの全ては、本発明の種々の代替的な態様を構成する。
[0098]本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0099]本発明は、先行技術の欠点のうちの１つ以上に対処することを目的とし、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体などの腫瘍特異的抗原のがん特異的発現を利用することができるという本発明者らの認識に基づいて、以下のことを行う：
ａ）機能不全Ｐ２Ｘ７受容体などの腫瘍特異的抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の標的を拡大する；および／または
ｂ）オンターゲット効果、オフ腫瘍効果を最小限に抑える種々の設定において、標的化細胞殺滅に対する調節可能な「切り替え可能な」アプローチを提供する；ならびに
ｃ）アダプター分子に対する異常な免疫応答を最小限に抑える。
[0100]本発明は、第１の成分および第２の成分を含む新規な処置様式を提供する。第１の成分は、細胞表面上に発現される機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合するＣＡＲ（本明細書では「ｎｆＰ２Ｘ７に方向付けられたＣＡＲ」とも呼ばれる）を含む免疫細胞の投与である。第２の成分は、腫瘍特異的ＣＡＲ（例えば、ｎｆＰ２Ｘ７に方向付けられたＣＡＲ）を、がん関連抗原などの他の細胞表面分子、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＧＤ２、ＭＨＣ ＩおよびＩＩを介してまたはアクセス可能な表面抗原曝露の任意の他のメカニズムを介して種々の長さのペプチドとして提示される細胞内プロセシングされたタンパク質に再方向付けすることができる架橋分子の投与（または発現）である。
[0101]標的化細胞表面分子は、がん（がん細胞の表面上に発現される腫瘍関連抗原など）と関連し得る。さらなる実施形態では、標的化細胞表面分子は、感染と関連し得るか、または任意の他の疾患（自己免疫疾患を含む）と関連し得る。このような実施形態では、分子は、疾患に関連する細胞表面抗原であり得るか、または細胞上に提示されるペプチド／ＨＬＡ複合体を含み得る。ある特定の例では、分子はＢ細胞系列の悪性腫瘍においてＣＤ１９を含み得る。分子は、がん特異的タンパク質（がん精巣抗原などの遺伝子異常およびがん患者に特異的な他のもの）に関する標的化ペプチドを含み得る。分子は、感染性因子、例えば、ウイルス、細菌、原虫、ビリオン、プリオンおよび真菌由来のペプチドを含むペプチド／ＨＬＡ複合体であり得る。分子は、自己免疫疾患に関連するペプチド（例えば、狼瘡に関連するＳｍペプチド）を含むペプチド／ＨＬＡ複合体であり得る。
[0102]さらに、本発明は、既存の「アダプターＣＡＲ」アプローチに優るいくつかの利点を提供する。より詳細には、アダプターＣＡＲ Ｔ細胞技術は、従来のＣＡＲの腫瘍標的化およびシグナル伝達部分を脱共役させるアプローチに基づいており、アダプターＣＡＲおよび可溶性の腫瘍特異的アダプター分子からなる二又系をもたらす。アダプターＣＡＲの基本構造は、従来のＣＡＲ設計に対応するが、細胞外ドメインは、腫瘍関連抗原とは相互作用せず、代わりに、アダプター分子に組み込まれた結合パートナーと相互作用する。二機能的アダプター分子は、順に、標的細胞（腫瘍細胞）特異性を提供し、腫瘍とアダプターＣＡＲ Ｔ細胞との間の界面でリンカーとして作用する。この複合体は、次に、従来のＣＡＲ Ｔ細胞と同様に、抗腫瘍応答を媒介することができる。
[0103]アダプターＣＡＲシステムの二重原理は、アダプターＣＡＲ Ｔ細胞活性を正確に制御するための重要な分子安全スイッチを提供するが、現在までに開発されたシステムではいくつかの限界が同定されている。
[0104]例えば、１つのシステムは、種々の腫瘍特異的アダプター分子にカップリングされる合成色素ＦＩＴＣを標的とするｓｃＦｖベースのα－ＦＩＴＣ ＣＡＲに依存する。α－ＦＩＴＣ ＣＡＲ Ｔ細胞産物の完全なヒト化にもかかわらず、ＦＩＴＣの免疫原性は、治療マウスモデルにおける抗α－ＦＩＴＣ抗体の出現によって強調されるように、臨床移行にとっての一つの懸念である。
[0105]別の例では、アダプター分子は、標準ｓｃＦｖベースのアダプターＣＡＲを再方向付けするための小ペプチドタグを含む。しかしながら、アダプター分子に含まれる小さなペプチドタグの免疫原性に関して、特にタグがヒト以外の配列、またはヒト核タンパク質に由来する配列を含む場合に、懸念が再び提起されている。
[0106]従来技術のアプローチとは対照的に、本発明は、機能不全Ｐ２Ｘ７に結合するＣＡＲの特異性、および機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に由来するエピトープの独特な特性の両方を利用する。
[0107]本発明は、以下の点において、既存のモノ抗原に方向付けられたＣＡＲ Ｔ療法に優る利点を提供する：
・機能的であるＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、ＣＡＲ Ｔ細胞を活性化するためのスイッチ分子の使用の必要性がない）を利用する；
・機能不全Ｐ２Ｘ７受容体はがん細胞の表面のみに露出されるため、健康な細胞に結合しないＣＡＲ Ｔ細胞を利用する；
〇これは、免疫抑制剤の投与の必要性がないことを意味する；
〇これはまた、非がん性細胞にも見出される抗原に結合するＣＡＲの使用を含む他のアプローチと比較して、副作用が有意に減少することを意味する；
・機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に由来するエピトープの形式で、架橋分子上に非免疫原性であり、天然に存在するヒトエピトープを含む。
[0108]したがって、本発明は、ＣＡＲ Ｔ療法とともにアダプター／架橋分子の使用における新しい概念およびアプローチを提供する。
[0109]より詳細には、機能不全ｎｆＰ２Ｘ７受容体に結合するＣＡＲ（本明細書ではｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲとも呼ばれる）の特異性は、機能不全Ｐ２Ｘ７が形質転換細胞の表面のみに露出されるという事実に起因する。さらに、架橋分子中にｎｆＰ２Ｘ７由来のエピトープを含めることによって、ＣＡＲ媒介性認識は、対応する架橋分子を介して、目的とする任意の標的抗原を含むように広げることができる。ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体、例えば、Ｅ２００（またはＥ３００もしくはＥ２００－３００複合体）エピトープのみを認識するが、しかしながら、架橋分子の使用は、細胞表面上に発現される任意のアクセス可能な認識部位によって、無制限の標的化を容易にする。例えば、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲは、細胞表面上のＣＤ１９結合のための標的化部分、およびｎｆＰ２Ｘ７からのＥ２００エピトープを含む架橋分子の使用を介して、ＣＤ１９陽性細胞に結合するようにさらに方向付けられ得る（または再方向付けされ得る）。
[0110]Ｐ２Ｘ７は、ヒト組織、特に免疫細胞および神経細胞において一般的に発現されるヒト受容体タンパク質である。Ｐ２Ｘ７受容体に対する自己免疫応答は報告されておらず、登録されていない。Ｅ２００、Ｅ３００およびＥ２００／Ｅ３００などの例示的な標的化されるエピトープは、遺伝的に規定されているのではなく、Ｐ２Ｘ７の三次構造の立体構造変化に起因するのみである。したがって、これらは、Ｐ２Ｘ７配列の非変化部分である非免疫原性ペプチド配列である。アジュバントおよびコンジュゲートを使用する人工条件下でのみ、標的に対する免疫応答を生成することができる。
[0111]架橋分子中の非免疫原性認識部位、例えば、Ｅ２００もしくはＥ３００のペプチド配列、または複合ペプチドＥ２００－３００の利点は、中和抗体の誘導および／または細胞のＴ細胞媒介性拒絶の誘導なしに、種々の特異性を有する架橋分子の長期適用を容易にする。これは、先行技術に記載された架橋／アダプター分子の設計に優る顕著な利点を表す。
[0112]さらに、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲは、がん組織のみを特異的に標的とし、したがって、本発明のアプローチは、「オンターゲット、オフ腫瘍」効果およびＣＡＲのオフターゲット結合を介した健康な組織への損傷の最小限のリスクを提示する。したがって、本発明は、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲの特異性を２つの方法で活用する：第１に、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲがｎｆＰ２Ｘ７を発現する細胞（がん細胞のみ）のみを標的とするという事実に依存し、第２に、ｎｆＰ２Ｘ７の結合を受けるように操作された架橋分子を使用して、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲを発現する免疫細胞を、スイッチ可能であり、調整可能な方法で他の腫瘍関連抗原および／または特異的標的抗原に再方向付けすることができるという事実に依存する。
[0113]したがって、本発明の架橋分子の使用は、任意の表面発現した標的抗原の標的化のためにｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲを発現する免疫細胞の再方向付けを可能にする。
[0114]本アプローチの具体的な利点は、標的化が、インビボでの架橋分子治療薬が循環中に持続する期間に限定されることである。これは、健常組織における標的抗原の「オンターゲット、オフ腫瘍」発現から生じる任意の毒性が最小限に抑えられることを意味する。これは、架橋分子が一旦体から除去されると、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ細胞は、再び、腫瘍特異的にｎｆＰ２Ｘ７を標的化することができるのみであるためである。言い換えれば、ｎｆＰ２Ｘ７以外の標的抗原の標的化は架橋分子依存性であるため、標的化は架橋分子の適用によって制御することができる。これは、ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｎｆＰ２Ｘ７以外の抗原を介してがん細胞に一時的に方向付けられ得るように、架橋分子の標的化部分の結合を受けた抗原を介してがん細胞の標的化を「スイッチオン」および「スイッチオフ」するための簡単なアプローチを実施することを容易にする。さらに、ＣＡＲ Ｔ細胞が他のがん抗原に再方向付けされる時間の長さは、架橋分子が必要な患者に投与される時間によって調節することができる。
[0115]したがって、本発明は、種々の設定において適用を見出すことは明らかであるべきである。例えば、腫瘍学的処置との関連において、本発明は、がん細胞上に存在する多数の抗原を標的とするために、単一のクラスのＣＡＲ分子（すなわち、がん細胞上に存在する機能不全Ｐ２Ｘ７受容体と結合するための）の使用を可能にする。より具体的には、ＣＤ１９結合のための標的化部分を含む架橋分子を使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体とＣＤ１９の両方において、がん細胞に標的化され得る。これは、複数の部位を標的としているため、がん細胞が殺滅される可能性を最大限にする。さらに、複数の架橋分子、または１を超える標的化部分を含む架橋分子の使用は、ＣＡＲ Ｔ細胞によるがん細胞表面の「ペインティング」を容易にすることは明らかであるべきである。換言すれば、本発明は、種々の異なる架橋分子の使用を提供し、各々は、単一種のＣＡＲ Ｔ細胞の結合を受けるためのエピトープを含むが、ＣＡＲ Ｔ細胞が複数のがん抗原を介してがん細胞に結合するように方向付けられ得るように、異なる標的化部分を含む。このようにして、がん細胞は、複数の部位でＣＡＲ Ｔ細胞によって標的化され、その結合を受けることができ、これは、細胞殺滅の効力を増大させる。
[0116]このアプローチはまた、バーキットリンパ腫または種々の上皮、間葉、神経もしくは胚起源から生じる固形腫瘍のサブカテゴリーなどの機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を低レベルで発現するがんの場合に特に有用である。低発現がん細胞型の別の例は、トリプル陰性乳がん（例えば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株）であり得る。他の例には、ＰＤＸモデルからの組織アレイにおいて試験された固形腫瘍組織が含まれ、そのうちのいくつかは、他のがんよりも低い受容体発現を示す。このような例には、限定されないが、神経芽細胞腫、大腸がん、肺がん、乳がんまたは脳がんが含まれる。
[0117]さらなる例では、本発明は、病原体（好ましくは細胞内病原体）による感染の重症度を予防または最小限にするという関連において適用を見出す。腫瘍学的状況に限定されないが、これは、がん治療を受け、免疫不全（したがって、日和見または他の病原体による感染に感受性）である患者の処置において特に有用であり得る。このように、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合するＣＡＲ Ｔ細胞による処置を受けた（または継続して受けている）患者は、同時に、ＣＡＲ Ｔ細胞を、それらの細胞表面上のＭＨＣ分子上に感染性因子由来のペプチドを提示する細胞に再方向付けすることを容易にする架橋分子を投与することができる。換言すれば、本発明は、がんおよび感染症の同時または連続的処置のためのプラットフォームを提供する。
[0118]基本原理、ならびにｎｆＰ２Ｘ７ Ｅ２００由来のペプチドタグ化された架橋分子および架橋分子の異なるフォーマットを介したｎｆＰＸ７ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞のエンゲージメントを図１～３に図示し、概説する。
[0119]架橋分子の存在なしにｎｆＰ２Ｘ７Ｒ ＣＡＲを用いると、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞は、がん特異的標的化を示す（シナリオＩ、図１１を参照されたい）。
[0120]ｎｆＰ２Ｘ７の機能的に陰性ながん（ｎｆＰ２Ｘ７に対して非常に低いかまたは陰性である）への適用性を広げるために、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞は、ＣＤ３３に例示されるがん関連抗原またはＴｃＲ様ｍＡｂを介するがん特異的抗原を標的とする架橋分子を介してがん細胞に再方向付けされ得る。架橋分子の特異性は、ＴｃＲ様ｍＡｂまたはリガンドを介してＭＨＣペプチド提示（クラスＩおよびＩＩ）との関連において、任意の表面発現標的抗原または提示抗原が、同じ作用様式でｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞をエンゲージし得ることを限定せずに意味する（シナリオＩＩ、図１１を参照されたい）。
[0121]ほとんどの場合、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞の二重機能が利用される（シナリオＩＩＩ、図１１を参照されたい）。これは、シナリオＩとＩＩの組合せであり、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ発現エフェクター細胞が、がん細胞上に発現されるｎｆＰ２Ｘ７を介してがん細胞に直接的にエンゲージされ、さらに、ＣＤ３３に例示されるがん関連抗原またはＴｃＲ様ｍＡｂを介するがん特異的抗原を標的とする架橋分子を介してがん細胞に動員されることを意味する。
定義
[0122]別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
[0123]本明細書を解釈する目的で、以下の定義が一般的に適用され、適宜、単数形で使用される用語はまた複数形を含み、その逆もまた同様である。
[0124]「プリン作動性受容体」とは、一般的に、プリン（例えば、ＡＴＰ）をリガンドとして使用する受容体を指す。
[0125]「Ｐ２Ｘ７受容体」とは、一般的に、３つのタンパク質サブユニットまたはモノマーから形成されるプリン作動性受容体を指し、少なくとも１つのモノマーは、実質的に下記の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
[0126]配列番号１
ＭＰＡＣＣＳＣＳＤＶＦＱＹＥＴＮＫＶＴＲＩＱＳＭＮＹＧＴＩＫＷＦＦＨＶＩＩＦＳＹＶＣＦＡＬＶＳＤＫＬＹＱＲＫＥＰＶＩＳＳＶＨＴＫＶＫＧＩＡＥＶＫＥＥＩＶＥＮＧＶＫＫＬＶＨＳＶＦＤＴＡＤＹＴＦＰＬＱＧＮＳＦＦＶＭＴＮＦＬＫＴＥＧＱＥＱＲＬＣＰＥＹＰＴＲＲＴＬＣＳＳＤＲＧＣＫＫＧＷＭＤＰＱＳＫＧＩＱＴＧＲＣＶＶＹＥＧＮＱＫＴＣＥＶＳＡＷＣＰＩＥＡＶＥＥＡＰＲＰＡＬＬＮＳＡＥＮＦＴＶＬＩＫＮＮＩＤＦＰＧＨＮＹＴＴＲＮＩＬＰＧＬＮＩＴＣＴＦＨＫＴＱＮＰＱＣＰＩＦＲＬＧＤＩＦＲＥＴＧＤＮＦＳＤＶＡＩＱＧＧＩＭＧＩＥＩＹＷＤＣＮＬＤＲＷＦＨＨＣＲＰＫＹＳＦＲＲＬＤＤＫＴＴＮＶＳＬＹＰＧＹＮＦＲＹＡＫＹＹＫＥＮＮＶＥＫＲＴＬＩＫＶＦＧＩＲＦＤＩＬＶＦＧＴＧＧＫＦＤＩＩＱＬＶＶＹＩＧＳＴＬＳＹＦＧＬＡＡＶＦＩＤＦＬＩＤＴＹＳＳＮＣＣＲＳＨＩＹＰＷＣＫＣＣＱＰＣＶＶＮＥＹＹＹＲＫＫＣＥＳＩＶＥＰＫＰＴＬＫＹＶＳＦＶＤＥＳＨＩＲＭＶＮＱＱＬＬＧＲＳＬＱＤＶＫＧＱＥＶＰＲＰＡＭＤＦＴＤＬＳＲＬＰＬＡＬＨＤＴＰＰＩＰＧＱＰＥＥＩＱＬＬＲＫＥＡＴＰＲＳＲＤＳＰＶＷＣＱＣＧＳＣＬＰＳＱＬＰＥＳＨＲＣＬＥＥＬＣＣＲＫＫＰＧＡＣＩＴＴＳＥＬＦＲＫＬＶＬＳＲＨＶＬＱＦＬＬＬＹＱＥＰＬＬＡＬＤＶＤＳＴＮＳＲＬＲＨＣＡＹＲＣＹＡＴＷＲＦＧＳＱＤＭＡＤＦＡＩＬＰＳＣＣＲＷＲＩＲＫＥＦＰＫＳＥＧＱＹＳＧＦＫＳＰＹ
[0127]Ｐ２Ｘ７受容体が３つのモノマーから形成される限りにおいて、それは「三量体」または「三量体の」である。「Ｐ２Ｘ７受容体」は、Ｐ２Ｘ７受容体の天然に存在するバリアントを包含し、例えば、Ｐ２Ｘ７単量体はスプライスバリアント、対立遺伝子バリアント、ＳＮＰ、ならびにＰ２Ｘ７受容体を形成する単量体の天然に存在する切断型または分泌型を含むアイソフォーム（例えば、細胞外ドメイン配列またはその切断型からなる形態）、天然に存在するバリアント型（例えば、選択的スプライス型）および天然に存在する対立遺伝子バリアントである。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に開示される天然配列Ｐ２Ｘ７モノマーポリペプチドは、配列番号１に示される全長アミノ酸配列を含む成熟または全長天然配列ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、Ｐ２Ｘ７受容体は、修飾されたアミノ酸配列、例えば、配列番号１に示される配列中の種々のアミノ酸が置換され、欠失され、または残基が挿入され得る。
[0128]「機能的Ｐ２Ｘ７受容体」とは、一般的に、ＡＴＰに結合するための３つの無傷の結合部位または溝を有する、Ｐ２Ｘ７受容体の形態を指す。ＡＴＰに結合した際、機能的受容体は非選択的なナトリウム／カルシウムチャネルを形成し、これが孔様構造に変換し、最大９００Ｄａのカルシウムイオンおよび分子の細胞質への侵入を可能にし、結果の１つは、プログラムされた細胞死の誘導であり得る。正常なホメオスタシスでは、機能的なＰ２Ｘ７受容体の発現は、一般的に、胸腺細胞、樹状細胞、リンパ球、マクロファージおよび単球などのプログラム細胞死を受ける細胞に限定される。また、赤血球および他の細胞型上に、機能的Ｐ２Ｘ７受容体のいくつかの発現が存在することがある。
[0129]「機能不全Ｐ２Ｘ７受容体」とは、一般的に、機能的Ｐ２Ｘ７とは異なる立体配座を有するＰ２Ｘ７受容体の形態を指し、それによって、受容体は、アポトーシス孔を形成することができないが、隣接するモノマー間に位置する単一の機能的ＡＴＰ結合部位を維持することによって、なおも非選択的チャネルとして操作することができる。１つの例は、１つ以上のモノマーがＰｒｏ２１０でシス異性化を有する場合に生じる（配列番号１による）。異性化は、例えば、モノマー一次配列の突然変異または異常な翻訳後プロセシングを含む、モノマーのミスフォールディングにつながる任意の分子事象から生じ得る。異性化の１つの結果は、受容体が三量体上のＡＴＰ結合部位の１つ、より具体的には２つでＡＴＰに結合することができず、結果として、チャネルの開口部を伸ばすことができないということである。このような状況では、受容体は孔を形成することができず、これは、カルシウムイオンが細胞質に入る程度を限定する。機能不全Ｐ２Ｘ７受容体は、広範囲の上皮がんおよび造血がんに発現する。本明細書で使用される場合、「機能不全Ｐ２Ｘ７受容体」という用語は、「非機能的Ｐ２Ｘ７受容体」または「ｎｆＰ２Ｘ７受容体」という用語と互換的に使用することができる。
[0130]「がん関連Ｐ２Ｘ７受容体」とは、一般的に、がん細胞（前がん性、腫瘍性、悪性、良性または転移性細胞を含む）上に見出されるが、非がん細胞または正常細胞上には見出されないＰ２Ｘ７受容体である。
[0131]「Ｅ２００エピトープ」とは、一般的に、配列ＧＨＮＹＴＴＮＩＬＰＧＬＮＩＴＣを有するエピトープ、およびそのバリアント（例えば、配列番号２～１１、１５～３０および１６８）を指す。
[0132]「Ｅ３００エピトープ」とは、一般的に、配列ＫＹＹＫＥＮＮＶＥＫＲＴＬＩＫを有するエピトープ、およびそのバリアント（配列番号１２および１３）を指す。
[0133]「複合エピトープ」とは、一般的に、Ｅ２００およびＥ３００エピトープまたはこれらのエピトープの一部の隣接から形成されるエピトープを指す。Ｅ２００およびＥ３００エピトープを含む複合エピトープの例は、ＧＨＮＹＴＴＲＮＩＬＰＧＡＧＡＫＹＹＫＥＮＮＶＥＫ（配列番号１４）である。
[0134]「抗体」または「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」は、血液中、または免疫系において機能して抗原に結合する脊椎動物の他の体液中に見出され、したがって、異物を同定および／または中和するガンマグロブリンタンパク質である。
[0135]抗体は、一般的に、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ四量体の糖タンパク質である。各Ｌ鎖は、１つの共有結合ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結される。２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各Ｈ鎖とＬ鎖はまた、規則的に離れた鎖内ジスルフィド架橋を有する。
[0136]Ｈ鎖およびＬ鎖は特定のＩｇドメインを定義する。より具体的には、各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いてαおよびγ鎖の各々に対して３つの定常ドメイン（ＣＨ）を有し、μおよびεアイソタイプに対して４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、続いて他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメインと整列する。
[0137]抗体は、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには、５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称される重鎖を有する。γおよびαクラスは、３／４配列および機能における比較的に小さな相違に基づいてさらにサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。任意の脊椎動物種のＬ鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパとラムダと呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てることができる。
[0138]定常ドメインは、ジスルフィドによって一緒に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含むＦｃ部分を含む。ＡＤＣＣなどの抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決定されるが、この領域はまた、ある特定のタイプの細胞上に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分である。
[0139]ＶＨとＶＬの対合は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを含む「可変領域」または「可変ドメイン」を一緒に形成する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼ばれ得る。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼ばれ得る。Ｖドメインは抗原結合に影響を与え、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する「抗原結合部位」を含有する。Ｖ領域は約１１０アミノ酸残基におよび、一般的にそれぞれ９～１２アミノ酸の長さである「超可変領域」（一般的に約３）と呼ばれる極端な可変性を有する短い領域によって隔てられた、１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）（一般的に約４）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。ＦＲは主にβシート構造をとり、超可変領域はβシート構造を接続するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。
[0140]「超可変領域」とは、配列中で超可変であり、および／または構造的に規定されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は６つの超可変領域；ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。
[0141]「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
[0142]「抗原結合部位」とは、一般的に、Ｖドメインに抗原結合機能を付与するために必要である、少なくとも超可変領域およびフレームワーク領域を含む分子を指す。抗原結合部位は、本明細書に記載される方法において、抗体または抗体断片（例えば、ｍＡｂ、単一ドメイン（ＳＤ）－ｍＡｂ、ｄＡｂ、Ｆａｂ、ＳＤ－Ｆａｂ、Ｆｄ、ＳＤ－Ｆｖ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ）の形態であり得る。
[0143]「無傷」または「全体」抗体は、抗原結合部位、ならびにＣＬおよび少なくとも重鎖定常ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそれらのアミノ酸配列バリアントであり得る。
[0144]「可変ドメインを含む抗体断片全体」は、ＳＤ－ｍＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体、一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多特異抗体を含む。
[0145]「Ｆａｂ断片」は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）と、１つの重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）とともに、Ｌ鎖全体からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価である、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。
[0146]「Ｆａｂ’断片」は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でさらなる少数の残基を有することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書中の呼称である。
[0147]「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片にほぼ対応し、なおも抗原を架橋することができる。
[0148]「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、密接な非共有結合で結合している、１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。
[0149]一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造で会合し得るように、可撓性ペプチドリンカーによって共有結合され得る。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖から各々３つのループ）が生じる。
[0150]「一本鎖Ｆｖ」はまた、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」と略され、単一のポリペプチド鎖を形成するために接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。
[0151]「単一可変ドメイン」は、一般的に、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有するＦｖ（抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む）の半分である。
[0152]「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。小さな抗体断片は、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間対合が達成され、二価断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片をもたらすように、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に短いリンカー（約５～１０残基）を有するｓＦｖ断片（前段落を参照されたい）を構築することによって調製される。
[0153]ダイアボディは二価または二重特異性であり得る。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメインとＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。トリアボディおよびテトラボディはまた、当該技術分野において一般的に公知である。
[0154]「単離された抗体」は、その既存の環境の成分から同定および分離され、ならびに／または回収された抗体である。汚染成分は、抗体の治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。
[0155]「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野において公知である種々の技術を用いて産生することができる。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。
[0156]非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含んでもよい。
[0157]「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、可能性のある天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、抗原上の単一の抗原部位または決定基に対して向けられる。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加えて、他の抗体によって汚染されずに合成され得るという点で有利である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって調製することができる。「モノクローナル抗体」はまた、分子操作技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
[0158]用語「抗Ｐ２Ｘ７受容体抗体」または「Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体」とは、抗体が、Ｐ２Ｘ７受容体、典型的には非機能的Ｐ２Ｘ７受容体またはがん関連Ρ２Χ７受容体を標的化する際の診断薬および／または治療薬として有用であるように、十分な親和性でＰ２Ｘ７受容体に結合し得る抗体を指す。好ましくは、無関係なタンパク質に対するΡ２Χ７受容体抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｂｉａｃｏｒまたはフローサイトメトリーによって測定した場合、Ｐ２Ｘ７受容体への抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体は、＜１μＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、または＜０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。抗ｎｆ２Ｘ７受容体抗体は、一般的に、これらの血清学的特徴の一部または全部を有し、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合するが、機能的Ｐ２Ｘ７受容体には結合しない抗体である。
[0159]「親和性成熟した」抗体は、それらの改変（複数可）を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす、１つ以上の超可変領域における１つ以上の改変を伴う抗体である。好ましい親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはピコモル親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当該技術分野において公知の手順によって産生される。
[0160]「ブロッキング抗体」または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または減少させる抗体である。好ましいブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。
[0161]本明細書で使用される場合、「アゴニスト抗体」は、目的とするポリペプチドの機能的活性の少なくとも１つを模倣する抗体である。
[0162]「結合親和性」とは、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する、内因性結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当該技術分野において公知である一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般的に、ゆっくりと抗原に結合し、容易に解離する傾向があるのに対して、高親和性抗体は一般的に、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当該技術分野において公知であり、そのいずれも本発明の目的のために使用することができる。
[0163]本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、１つ以上の抗体に結合するかまたはその産生を誘発する物質を含むことが意図され、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、脂質、糖質、およびそれらの組合せ、例えば、グリコシル化タンパク質または糖脂質を含むことができる。本明細書で使用される用語「抗原」とは、標的細胞上に発現され得、抗体もしくはＴＣＲ、またはトランスジェニックＴＣＲ、ＣＡＲ、ｓｃＦｖもしくはその多量体、Ｆａｂ－断片もしくはその多量体、抗体もしくはその多量体、一本鎖抗体もしくはその多量体、または高親和性で構造に結合することができる任意の他の分子を含むがこれらに限定されない、適応免疫系によって認識され得る分子実体を指す。
[0164]「エピトープ」とは、一般的に、抗体の抗原結合部位の結合を受ける抗原のその部分を指す。エピトープは、抗原結合部位を形成する抗体ＣＤＲの超可変ループが、一次タンパク質構造におけるようなアミノ酸の配列に結合するという意味で「線形」であり得る。ある特定の実施形態では、エピトープは、「立体構造エピトープ」であり、すなわち、ＣＤＲの超可変ループが三次または四次タンパク質構造中に存在するときに残基に結合するものである。
[0165]本明細書で使用される用語「標的細胞」とは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体（例えば、ｎｆＰ２Ｘ７受容体）または架橋分子の標的化部分が結合する細胞表面分子を発現する細胞を指す。標的細胞は、がん細胞または任意の他の疾患細胞であり得る。
[0166]用語「障害」または「状態」とは、がん、自己免疫疾患、またはウイルス、細菌、寄生虫、もしくはその他による感染などの対象における機能的異常または障害を意味する。
[0167]例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同一の核酸もしくはペプチドは「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質はまた、例えば、宿主細胞などの非天然環境中に存在することができる。
[0168]本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、サルまたはヒトなどの哺乳動物を指す。好ましくは、対象はヒトである。対象は、がんなどの障害を患っている対象（患者）であり得るが、対象はまた健康な対象であり得る。
[0169]用語「自己」とは、本明細書で使用される場合、それが後に再導入される同一対象由来の任意の材料を指す。
[0170]用語「同種」とは、本明細書で使用される場合、材料が再導入される対象と同じ種の異なる対象に由来する任意の材料を指す。
[0171]用語「治療上有効な量」または「治療上有効な集団」とは、例えば、対象において治療上の利益を提供する細胞集団の量を意味する。
[0172]用語「結合する」、「特異的に結合する」、または「に特異的である」は、例えば、本明細書に開示される架橋分子において、または抗原結合ドメインに言及してＣＡＲにおいて使用される標的化部分に関して、それが、特異的抗原を認識し、それに結合するが、実質的に、試料中の他の分子を認識せず、またはそれに結合しないことを意味する。ある種由来の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインまたは標的化部分はまた、別の種由来の抗原に結合し得る。この交差種反応性は多くの抗体に典型的であり、したがって、抗原結合ドメインが特異的であるという定義に反するものではない。抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインは、抗原の異なる対立遺伝子型（対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、アイソフォームなど）または同じ遺伝子ファミリー由来のこの抗原の相同性バリアントにも結合し得る。この交差反応性は多くの抗体に典型的であり、したがって抗原結合ドメインが特異的であるという定義に反するものではない。
[0173]本明細書で使用される用語「操作された細胞」および「遺伝子修飾細胞」は、互換的に使用することができる。これらの用語は、順に細胞もしくはその子孫の遺伝子型または表現型を修飾する外来遺伝子または核酸配列を含有するおよび／または発現することを意味する。特に、これらの用語は、細胞、優先的に免疫細胞が、当該技術分野において周知である組換え方法によって操作され、自然状態でこれらの細胞において発現されないペプチドまたはタンパク質を安定的にもしくは一時的に発現し得るという事実を指す。例えば、免疫細胞は、それらの細胞表面上にキメラ抗原受容体などの人工構築物を発現するように操作される。例えば、ＣＡＲ配列は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベース、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクター、またはそれらの任意の他のシュードタイプ化バリエーション、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９とのエレクトロポレーションもしくはリポフェクションなどの任意の他の遺伝子送達メカニズム、トランスポゾン（例えば、スリーピング－ビューティ）、またはそれらのバリエーションを用いて細胞内に送達され得る。遺伝子送達は、ｍＲＮＡ（一過性）またはＤＮＡ（一過性または永久的）の形態であり得る。
[0174]用語「免疫細胞」または「免疫エフェクター細胞」とは、免疫系の一部であり、特定のエフェクター機能を実行する細胞を指し、例えば、アルファ－ベータＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、Ｂｒｅｇ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、先天性リンパ系細胞（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、間葉系幹細胞または間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、単球もしくはマクロファージ、または体細胞に成熟もしくは分化し得る多能性幹細胞および初期前駆細胞サブセットなどの任意の造血前駆細胞が挙げられる。細胞は、天然に存在するか、またはサイトカイン曝露、人工／遺伝子修飾細胞（ｉＰＳＣおよび他の人工細胞型など）によって生成され得る。免疫細胞は、誘導された多能性幹細胞およびそこから成熟した細胞を含む人工細胞サブセットであり得る。好ましい免疫細胞は、アルファ－ベータＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＩＬＣ、ＣＩＫ細胞、ＬＡＫ細胞またはガンマ－デルタＴ細胞などの細胞傷害性エフェクター機能を有する細胞である。「エフェクター機能」とは、細胞の特別な機能を意味し、例えば、Ｔ細胞において、エフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー細胞活性であり得る。
[0175]本明細書で使用される用語、障害を「処置する」（その処置）とは、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候もしくは症状の頻度または重症度を減少させることを意味する。
[0176]本明細書で使用される用語「発現」は、細胞中のそのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
[0177]がん特異的ＣＡＲ（Ｔ細胞）標的化という用語は、腫瘍細胞の細胞表面上に提示されるが、健康な細胞の表面上に典型的には見出されない標的抗原に結合するためのＣＡＲ Ｔ細胞の使用を指す。言い換えれば、正常な環境下の正常細胞は、細胞外膜上に標的抗原が存在しないこと（したがって、細胞表面上の抗原の存在は検出できない）によって特徴付けることができる。しかしながら、このような細胞は、細胞内レベルで抗原をコードするｍＲＮＡを発現することができる。ＣＡＲ Ｔ細胞は表面発現抗原のみを認識するため、標的化タンパク質の細胞内発現はＣＡＲエンゲージメントをもたらさない。
[0178]Ｐ２Ｘ７受容体の、標的化されるエピトープＥ２００およびＥ３００は、健常組織に見られる受容体の形態では露出しておらず、したがって、これらのエピトープは、がん特異的であるとみなすことができる。言い換えれば、Ｅ２００およびＥ３００エピトープは、Ｐ２Ｘ７受容体が、がん（この場合、受容体はｎｆＰ２Ｘ７受容体と呼ばれる）との関連において起こることなどの、変化した非機能的立体構造を有する場合にのみ露出され、結合するために利用可能である。がん特異的な、標的化されるエピトープの別の例は、スプライスバリアントＥＧＦＲｖＩＩＩから誘導され得る。さらに別の例は、抗原ＣＬＤＮ６であり、これは、大部分が胚および胎児の生命に限定され、生後初期段階後に健康な細胞において非常に限定された発現を有し、がんにおいて高度に制限され、比較的過剰発現されるとみなされ得る。本発明は、がん特異的標的化のためのｎｆＰ２Ｘ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＣＬＤＮ６を含む、任意のこのような腫瘍特異的抗原への結合を意図し、本明細書に記載される架橋分子を介してＣＡＲ Ｔ細胞をがん関連抗原にエンゲージする。
[0179]一般的に、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞外ドメイン（細胞外部分）を含み得る。細胞外ドメインは、リンカーによって膜貫通ドメインに連結され得る。細胞外ドメインはまた、シグナルペプチドを含み得る。本発明のＣＡＲの細胞外部分は、腫瘍特異的抗原結合ドメインを含む。例えば、腫瘍特異的抗原は、ｎｆＰ２Ｘ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＣＬＤＮ６を含む、本明細書に記載される任意のものであり得る。
[0180]腫瘍特異的抗原結合ドメインは、本明細書に開示されるように、Ｅ２００（またはＥ３００またはＥ２００－３００複合体）エピトープを認識するｎｆＰ２Ｘ７結合ドメインであり得る。具体的には、本明細書に開示されるＣＡＲは、抗原結合ドメインとして細胞外ｎｆＰ２Ｘ７ Ｅ２００（またはＥ３００またはＥ２００－３００複合体）結合ドメインを有する。あるいは、腫瘍特異的抗原結合ドメインは、２５～２９位のＬＥＥＫＫで開始するアミノ酸配列の融合から生じるエピトープを認識し、続いてＧの挿入、およびその後のアミノ酸配列２９８～３０４のＮＹＶＶＴＤＨを認識するＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインであり得、全エピトープは、配列ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ（配列番号２６７）で構成される１３マーである。あるいは、腫瘍特異的抗原結合ドメインは、配列番号２７３、２７４または２７５のアミノ酸配列を介して、ＣＬＤＮ６［ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５６７４７（ＣＬＤＮ６＿ＨＵＭＡＮ）］の第２の細胞外ドメインにおけるエピトープを認識するＣＬＤＮ６結合ドメインであり得る。
[0181]典型的には、抗原認識ドメインは、腫瘍特異的抗原（機能不全Ｐ２Ｘ７受容体、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＣＬＤＮ６など）に結合する抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とのアミノ酸配列相同性を含む結合ポリペプチドを含む。任意の実施形態では、結合ポリペプチドは、腫瘍特異的抗原（機能不全Ｐ２Ｘ７受容体、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＣＬＤＮ６など）に結合する抗体のＶＨおよび／またはＶＬ鎖のＣＤＲ１、２および３ドメインとのアミノ酸配列相同性を含む。
[0182]本発明の特に好ましい実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍特異的抗原ｎｆＰ２Ｘ７のエピトープに結合する。
[0183]このような実施形態では、結合ポリペプチドは、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＡＵ２００２／００００６１またはＰＣＴ／ＡＵ２００２／００１２０４（または対応する米国特許第７，３２６，４１５号、米国特許第７，８８８，４７３号、米国特許第７，５３１，１７１号、米国特許第８，０８０，６３５号、米国特許第８，３９９，６１７号、米国特許第８，７０９，４２５号、米国特許第９，６６３，５８４号、または米国特許第１０，４５０，３８０号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４０（または対応する米国特許第８，０６７，５５０号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４１（または対応する米国特許出願公開第２０１０－００３６１０１号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１３６４（または対応する米国特許第８，４４０，１８６号、米国特許第９，１８１，３２０号、米国特許第９，９４４，７０１号または米国特許第１０，５９７，４５１号のうちのいずれか１つ）、ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１３６５（または対応する米国特許第８，２９３，４９１号または米国特許第８，６５８，３８５号のうちのいずれか１つ）、ＰＣＴ／ＡＵ２００９／０００８６９号（または対応する米国特許第８，５９７，６４３号、米国特許第９，３２８，１５５号または米国特許第１０，２３８，７１６号のうちのいずれか１つ）、ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１０７０（または対応する国際公開第２０１１／０２０１５５号、米国特許第９，１２７，０５９号、米国特許第９，６８８，７７１号、もしくは米国特許第１０，０５３，５０８号のうちのいずれか１つ）、およびＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１７４１（または対応する国際公開第２０１１／０７５７８９号もしくは米国特許第８，８３５，６０９号のいずれか１つ）のうちのいずれか１つに記載される抗体のＶＨおよび／またはＶＬ鎖のＣＤＲのアミノ酸配列を含む。好ましくは、結合ポリペプチドは、ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１０７０（または対応する米国特許第９，１２７，０５９号、米国特許第９，６８８，７７１号、または米国特許第１０，０５３，５０８号のうちのいずれか１つ）に記載される抗体２－２－１、またはＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４１（または対応する米国特許出願公開第２０１０－００３６１０１号）に記載され、アクセッション番号０６０８０１０１下でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたハイブリドーマＡＢ２５３により生成される、国際公開第２０１３１８５０１０Ａ１号または国際公開第２０１９０５６０２３号に記載されるＢＰＭ０９のＶＨおよび／またはＶＬ鎖のＣＤＲのアミノ酸配列を含む。あるいは、ＣＡＲの結合ポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０４１１４３号（米国出願公開第２０１９／０３６５８０５号としても公開されている）、および国際公開第２０１９／２２２７９６号（米国出願第１７／０５７，０６０に対応する）に記載される抗体ｓｄＡｂ２－２－３、２－４７２－２、または２－２－１２のＣＤＲのアミノ酸配列を含み得る。
[0184]ＣＡＲの結合ポリペプチドは、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＡＵ２００２／００００６１またはＰＣＴ／ＡＵ２００２／００１２０４（または対応する米国特許第７，３２６，４１５号、米国特許第７，８８８，４７３号、米国特許第７，５３１，１７１号、米国特許第８，０８０，６３５号、米国特許第８，３９９，６１７号、米国特許第８，７０９，４２５号、米国特許第９，６６３，５８４号、もしくは米国特許第１０，４５０，３８０号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４０（または対応する米国特許第８，０６７，５５０号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４１（または対応する米国特許出願公開第２０１０－００３６１０１号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１３６４（または対応する米国特許第８，４４０，１８６号、米国特許第９，１８１，３２０号、米国特許第９，９４４，７０１号もしくは米国特許第１０，５９７，４５１号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１３６５（または対応する米国特許第８，２９３，４９１号もしくは米国特許第８，６５８，３８５号のうちのいずれか１つ）、ＰＣＴ／ＡＵ２００９／０００８６９（または対応する米国特許第８，５９７，６４３号、米国特許第９，３２８，１５５号もしくは米国特許第１０，２３８，７１６号のうちのいずれか１つ）、ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１０７０（対応する国際公開第／２０１１／０２０１５５号、米国特許第９，１２７，０５９号、米国特許第９，６８８，７７１号、もしくは米国特許第１０，０５３，５０８号のうちのいずれか１つ）、およびＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１７４１（対応する国際公開第２０１１／０７５７８９もしくは米国特許第８，８３５，６０９号のうちのいずれか１つ）のうちのいずれか１つに記載される抗体のＶＨおよび／またはＶＬ鎖のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、結合ポリペプチドは、ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１０７０（または対応する米国特許第９，１２７，０５９号、米国特許第９，６８８，７７１号、または米国特許第１０，０５３，５０８号のうちのいずれか１つ）に記載される抗体２－２－１、またはＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４１（または対応する米国特許出願公開第２０１０－００３６１０１号）に記載され、アクセッション番号０６０８０１０１下でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたハイブリドーマＡＢ２５３により生成される、国際公開第２０１３１８５０１０Ａ１号または国際公開第２０１９０５６０２３号に記載されるＢＰＭ０９のＶＨおよび／またはＶＬ鎖のアミノ酸配列を含む。あるいは、ＣＡＲの結合ポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０４１１４３号（米国出願公開第２０１９／０３６５８０５号としても公開されている）、および国際公開第２０１９／２２２７９６号（米国出願第１７／０５７，０６０に対応する）に記載される抗体ｓｄＡｂ２－２－３、２－４７２－２、または２－２－１２のＶＨおよび／またはＶＬ鎖のアミノ酸配列を含み得る。
[0185]ＣＡＲの結合ポリペプチドは、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＡＵ２００２／００００６１またはＰＣＴ／ＡＵ２００２／００１２０４（または対応する米国特許第７，３２６，４１５号、米国特許第７，８８８，４７３号、米国特許第７，５３１，１７１号、米国特許第８，０８０，６３５号、米国特許第８，３９９，６１７号、米国特許第８，７０９，４２５号、米国特許第９，６６３，５８４号、または米国特許第１０，４５０，３８０号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４０（または対応する米国特許第８，０６７，５５０号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４１（または対応する米国特許出願公開第２０１０－００３６１０１号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１３６４（または対応する米国特許第８，４４０，１８６号、米国特許第９，１８１，３２０号、米国特許第９，９４４，７０１号または米国特許第１０，５９７，４５１号のうちのいずれか１つ）、ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１３６５（または対応する米国特許第８，２９３，４９１号または米国特許第８，６５８，３８５号のうちのいずれか１つ）、ＰＣＴ／ＡＵ２００９／０００８６９号（または対応する米国特許第８，５９７，６４３号、米国特許第９，３２８，１５５号または米国特許第１０，２３８，７１６号のうちのいずれか１つ）、ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１０７０（または対応する国際公開第２０１１／０２０１５５号、米国特許第９，１２７，０５９号、米国特許第９，６８８，７７１号、もしくは米国特許第１０，０５３，５０８号のうちのいずれか１つ）、およびＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１７４１（または対応する国際公開第２０１１／０７５７８９号もしくは米国特許第８，８３５，６０９号のいずれか１つ）のうちのいずれか１つに記載される抗体またはその断片のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、結合ポリペプチドは、ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１０７０（または対応する米国特許第９，１２７，０５９号、米国特許第９，６８８，７７１号、または米国特許第１０，０５３，５０８号のうちのいずれか１つ）に記載されるｓｄＡｂ２－２－１、またはＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１５４１（または対応する米国特許出願公開第２０１０－００３６１０１号）に記載され、アクセッション番号０６０８０１０１下でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託されたハイブリドーマＡＢ２５３により生成される、国際公開第２０１３１８５０１０Ａ１号または国際公開第２０１９０５６０２３号に記載される抗体ＢＰＭ０９のアミノ酸配列を含む。あるいは、結合ポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０４１１４３号（米国出願公開第２０１９／０３６５８０５号としても公開されている）、および国際公開第２０１９／２２２７９６号（米国出願第１７／０５７，０６０に対応する）に記載されるｓｄＡｂ２－２－３、２－４７２－２、または２－２－１２のアミノ酸配列を含み得る。
[0186]「シグナルペプチド」とは、細胞内、例えば、ある特定の細胞小器官（例えば、小胞体）および／または細胞表面へのタンパク質の輸送および局在化を方向付けるペプチド配列を指す。
[0187]一般的に、「抗原結合ドメイン」とは、抗原に特異的に結合する（それによって抗原を含む細胞を標的化することができる）ＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメインを含み得る。一般的に、ＣＡＲ上の標的化領域は細胞外である。抗原結合ドメインは、抗体またはその抗体結合断片を含み得る。抗原結合ドメインは、例えば、全長重鎖、Ｆａｂ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二価一本鎖抗体またはダイアボディを含み得る。天然に存在する受容体からのアフィボディまたはリガンド結合ドメインなどの、所与の抗原に特異的に結合する任意の分子を抗原結合ドメインとして用いることができる。しばしば抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。通常、ｓｃＦｖにおいて、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域は、可撓性リンカーによって融合され、ｓｃＦｖを形成する。このようなリンカーは、例えば「（Ｇ４／Ｓ１）３－リンカー」およびそのバリエーションであり得るが、当業者は、種々のリンカー配列およびフォーマットが使用され得ることを理解する。
[0188]場合によっては、抗原結合ドメインが、ＣＡＲが使用される同一種に由来することが有益である。例えば、それをヒトにおいて治療的に使用することが計画されている場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、ヒトもしくはヒト化抗体またはその抗原結合断片を含むことが有益であり得る。ヒトもしくはヒト化抗体またはその抗原結合断片は、当該技術分野において周知である種々の方法によって作製することができる。本明細書に開示されるＣＡＲは、抗原結合ドメインとして細胞外リンカー／標識エピトープ結合ドメインを有し、標的細胞上に発現された抗原に本明細書に開示される標的細胞結合分子を介して間接的に結合することを可能にする。
[0189]本明細書で使用される「スペーサー」または「ヒンジ」とは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にある親水性領域を指す。本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含み得るが、このようなスペーサーを除去することも可能である。スペーサーは、例えば、抗体のＦｃ断片もしくはそれらの断片、抗体のヒンジ領域もしくはそれらの断片、抗体のＣＨ２もしくはＣＨ３領域、アクセサリータンパク質、人工スペーサー配列またはそれらの組合せを含み得る。スペーサーの顕著な例は、ＣＤ８アルファヒンジである。
[0190]ＣＡＲの膜貫通ドメインは、このようなドメインの任意の所望の天然または合成源に由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ８アルファまたはＣＤ２８に由来し得る。鍵となるシグナル伝達および抗原認識モジュール（ドメイン）が２つ（またはそれをさらに超える）のポリペプチド上にある場合、ＣＡＲは２つ（またはそれを超える）の膜貫通ドメインを有することができる。鍵となるシグナル伝達および抗原認識モジュールの分割は、ＣＡＲの各ポリペプチドにおける低分子依存性ヘテロ二量体化ドメインに起因して、ＣＡＲ細胞発現に対する低分子依存性、滴定可能および可逆的制御を可能にする（Ｗｕ ｅｔ ａｌ， ２０１５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５０： ２９３－３０３）。
[0191]ＣＡＲの細胞質ドメイン（または細胞内シグナル伝達ドメイン）は、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」とは、細胞の特別な機能を意味し、例えば、Ｔ細胞において、エフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー細胞活性であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達し、ＣＡＲを発現する細胞に特別な機能を行うように方向付けるタンパク質の一部を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞エフェクター機能を開始または遮断するシグナルを伝達するのに十分な所与のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全な、突然変異したまたは切断された部分を含み得る。
[0192]細胞内ドメインの機能は、プロ炎症性および／または免疫調節性であってもよく、またはそのような組合せであり得る。
[0193]ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの顕著な例には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質シグナル伝達配列および抗原受容体エンゲージメント後にシグナル伝達を開始する共受容体が含まれる。
[0194]一般的に、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介され得、第１にＴＣＲを介して抗原依存的な一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、第２に抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列、共刺激シグナル伝達ドメイン）である。したがって、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の一次細胞質シグナル伝達ドメインおよび／または１つ以上の二次細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。
[0195]刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）シグナル伝達モチーフを含有する可能性がある。
[0196]ＣＡＲにおいてしばしば使用される一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例は、ＴＣＲゼータ（ＣＤ３ゼータ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものである。最も顕著なのはＣＤ３ゼータ由来の配列である。
[0197]ＣＡＲの細胞質ドメインは、それ自体で、または任意の他の所望の細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせて、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子であり、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要である。共刺激分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７－Ｈ３である。
[0198]ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の順序で、リンカーの有無にかかわらず、互いに連結され得る。好ましくは長さが２～１０アミノ酸である短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、連結を形成し得る。顕著なリンカーはグリシン－セリンダブレットである。
[0199]一例として、細胞質ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含み得る。別の例において、細胞質ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含み得る。さらなる例において、細胞質ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含み得る。
[0200]前述のように、ＣＡＲの細胞外部分または膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインはまた、ＣＡＲの鍵となるシグナル伝達および抗原認識モジュールを分割する目的のためのヘテロ二量体化ドメインを含み得る。
[0201]本発明に従って使用され得るＣＡＲの非限定的な例は、配列番号１６５～１６７、２６６または２７２に記載される。種々のＣＡＲ分子の構造の例はまた、本明細書では図３５に提供される。本発明に従って使用され得るＣＡＲのさらなる例は、国際公開第２０１７／０４１１４３号（米国特許出願公開第２０１９／０３６５８０５号としても公開されている）、および国際公開第２０１９／２２２７９６号（米国特許出願公開第１７／０５７，０６０号に対応する）に提供され、参照により本明細書に組み込まれる。
[0202]本発明に従った使用のためのＣＡＲ、すなわち、ｎｆＰ２Ｘ７ Ｅ２００結合ドメインを含むＣＡＲは、本明細書に記載される上記ドメインの任意の部分または一部を任意の順序および／または組合せで含むように設計され得、機能的ＣＡＲがもたらされる。
[0203]本明細書に開示されるＣＡＲ、またはそれに由来するポリペプチド（複数可）、上記ＣＡＲをコードする核酸分子（複数可）もしくは組換え発現ベクター細胞、または上記ＣＡＲを発現する細胞集団を単離および／または精製することができる。用語「単離された」とは、自然状態から改変または除去されたことを意味する。例えば、単離された細胞集団とは、このような細胞の富化、およびそれらの天然に存在する状態で上記単離された細胞と通常会合している他の細胞からの分離を意味する。単離された細胞集団とは、自然界に見られるよりも均一な細胞集団である実質的に精製された細胞の集団を意味する。好ましくは、富化された細胞集団は、選択された細胞型の少なくとも約９０％を含む。特定の態様では、細胞集団は、選択された細胞型の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％を含む。
[0204]ＣＡＲの機能不全Ｐ２Ｘ７受容体結合ドメインが架橋分子のｎｆＰ２Ｘ７認識部位Ｅ２００に結合する親和性は変化し得るが、一般的に、結合親和性は、１００μｍ、１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭ、好ましくは少なくとも約１ｐＭまたは１０ｐＭ、さらにより好ましくは少なくとも約１００ｐＭの範囲であり得る。
[0205]ＥＧＦＲｖＩＩＩに標的化されたＣＡＲ Ｔ細胞を用いて、固形がんを処置することができる。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲスキッピングエクソン２～７の高頻度スプライスバリアントである。ＥＧＦＲｖＩＩＩは腫瘍特異的であり、正常細胞ではＥＧＦＲが厳密に調節されているため、健康な細胞では生じない。ＥＧＦＲｖＩＩＩは一般的に膠芽腫に発現するが、乳がんおよび頭頸部がんにも発現する。この関連におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＣＡＲ Ｔは、配列（配列番号２６６）を有し得、２５～２９位のＬＥＥＫＫから出発するアミノ酸配列の融合から生じるエピトープに標的化され得、続いてＧが挿入され、その後のアミノ酸配列２９８～３０４のＮＹＶＶＴＤＨが続き、全エピトープは、配列ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ（配列番号２６７）を含むかまたはそれからなる。完全なＥＧＦＲ配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ００５３３（ＥＧＦＲ＿ＨＵＭＡＮ）に見出され、完全なタンパク質はアイソフォーム１の１２１０アミノ酸を数える。
[0206]ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化ＣＡＲ Ｔ細胞は、がん細胞上のＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とする従来の方法で膠芽腫を処置するために使用され得るが、また、ＥＧＦＲｖＩＩＩエピトープ部分が架橋分子の配列に組み込まれる場合、本明細書に記載される架橋分子を介して、他のがん関連標的抗原に再方向付けされ得る。次に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ Ｔ細胞は、本明細書に記載されるｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ標的化アプローチに関して概説されるのと同じ方法で用いることができる。ペプチドタグは、配列番号２６７の１３マーのペプチドＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ、またはその短縮されたかもしくは延長された天然または人工バリアントであり得る。
[0207]ＣＤ３３およびＨｅｒ２に標的化されるＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲ適合性架橋分子のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２６８および２６９、ならびに配列番号２７０および２７１として表１に記載される。
[0208]ＣＬＤＮ６標的化ＣＡＲ Ｔ細胞は、固形がん、例えば、卵巣がんを処置するために使用され得る。この関連におけるＣＬＤＮ６－ＣＡＲ Ｔは、配列（配列番号２７２）を有し得、アミノ酸配列［ＥＣＤ２、＞ｓｐ｜Ｐ５６７４７｜１３８－１６０ＷＴＡＨＡＩＩＲＤＦＹＮＰＬＶＡＥＡＱＫＲＥＬ（配列番号２７３）］を介して直接、ＣＬＤＮ６［ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５６７４７（ＣＬＤ６＿ＨＵＭＡＮ］細胞の第２の細胞外ドメインに標的化され得するが、また、ＣＬＤＮ６エピトープ部分が架橋分子の配列に組み込まれる場合、本明細書に記載の架橋分子を介して、他のがん関連標的抗原、例えば、ＣＤ３３またはＨｅｒ２に再方向付けされ得る。次に、ＣＬＤＮ６ ＣＡＲ Ｔ細胞は、本明細書に記載されるｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ標的化アプローチに関して概説されるのと同じ方法で使用することができる。ペプチドタグは、２３マーのペプチドＷＴＡＨＡＩＩＲＤＦＹＮＰＬＶＡＥＡＱＫＲＥＬ、または短縮されたかもしくは延長されたその天然または人工バリアント、例えば、配列番号２７４または２７５であり得る。
架橋分子
[0209]架橋分子は、ａ）標的細胞に結合するための標的化部分、およびｂ）腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含むという条件で、任意の形態であり得ることが理解される。好ましくは、腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分、ＥＧＦＲｖＩＩＩエピトープ部分またはＣＬＤＮ６エピトープ部分であるかまたはそれを含み、好ましくは、本発明の方法に従って、エピトープ部分が、再方向付けされている腫瘍特異的ＣＡＲによって認識されるようになる。
[0210]典型的には、標的化部分は、標的化部分が腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分に直接的にまたはリンカーを介して連結される融合タンパク質の形態である。
[0211]架橋分子は、異なる数のアーキテクチャのいずれかを有し得ることが理解される。例えば、および本明細書にさらに記載されるように、標的細胞に結合するための標的化部分は、抗体由来などの任意の適切な結合ドメイン、またはその断片の形態であり得る。標的化部分は、いずれの構造においても、腫瘍特異的抗原エピトープ部分に連結され得る。例えば、腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、標的部分のＮまたはＣ末端に連結され得る。適切なアーキテクチャの例は、本明細書の図に提供される。特に好ましい実施形態では、腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分のＮ末端領域が腫瘍特異的ＣＡＲによる結合のために自由にアクセス可能であるように、そのＣ末端領域を介して標的化部分に連結される。
[0212]標的化部分を腫瘍特異的抗原エピトープ部分に連結するために、任意の適切なリンカーを使用することができる。リンカーは、ポリペプチド、ペプチドまたは化学基を含み得る。
[0213]リンカーは、最大２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドであり得る。用語「に連結された」または「に融合された」とは、２つの部分の間に形成された共有結合、例えばペプチド結合を指す。したがって、本発明との関連において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸の長さを有し得る。例えば、本明細書で提供される架橋分子は、標的化部分と腫瘍特異的抗原エピトープ部分の間のリンカー、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を含み得る。このようなリンカーは、融合タンパク質の異なるポリペプチドが独立に折り畳まれ、予想通りに振る舞う可能性を高め得るという利点を有する。
[0214]当業者は、本発明によるリンカーとしての使用に適している、種々のアミノ酸、および種々の長さを含む種々のペプチドリンカーの設計および使用に精通している。リンカーは、反復アミノ酸配列の種々の組合せを含み得る。リンカーは、可撓性リンカー（例えば、グリシンおよびセリン残基の反復を含むもの）、剛性リンカー（例えば、グルタミン酸およびリジン残基、隣接アラニン反復を含むもの）、および／または切断可能なリンカー（例えば、プロテアーゼ切断により感受性である配列）であり得る。
[0215]ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＳ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＳ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＳ）、もしくはＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＳ）、またはそれらのバリエーションのいずれか１つ以上の反復であり得る。任意の実施形態では、リンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、すなわち、（Ｇ４Ｓ）３を含み得るかまたはそれから構成され得る。
[0216]任意の実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＧＳ（長さが６アミノ酸のリンカー）またはさらに長いものを含むことができる。リンカーは、異なる長さの一連の繰り返しグリシンおよびセリン残基（ＧＳ）、すなわち、（ＧＳ）ｎであり得、ｎは、１～１５またはそれ以上の任意の数である。例えば、リンカーは、（ＧＳ）３（すなわち、ＧＳＧＳＧＳ）もしくはより長い（ＧＳ）１１またはより長いものであり得る。ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１またはそれ以上を含む任意の数であり得ることが理解される。
[0217]さらなる実施形態では、リンカーは、リジンなどの剛性を提供するアミノ酸の含有を含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、リンカー領域はまた、配列ＧＳＧＫを含み得る。
[0218]ペプチドリンカーは、反復配列に対してＮおよびＣ末端の１つ以上の追加アミノ酸を含むＴｈｒ－Ｐｒｏ（ＴＰ）の一連の反復からなることができる。例えば、リンカーは、配列ＧＴＰＴＰＴＰＴＰＴＧＥＦ（ＴＰ５リンカーとしても公知である）を含み得るかまたはそれからなることができる。さらなる態様では、リンカーは、短いおよび／またはアルファ－螺旋剛性リンカー（例えば、Ａ（ＥＡＡＡＫ）３Ａ、ＰＡＰＡＰまたはジペプチド、例えばＬＥもしくはＣＣ）であり得る。
[0219]さらなる実施形態では、代替として、または上記のグリシン－セリンベースのリンカー領域に加えて、標的化部分は、ヒンジ領域を介して、標的化部分が腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分に連結される融合タンパク質の形態であり得る。標的部分と腫瘍特異的抗原エピトープ部分の間の連結は、ヒンジ領域およびリンカー領域の組合せを含み得る。
[0220]適切なヒンジ領域の例としては、免疫グロブリンに由来するヒンジ領域が挙げられる。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から誘導され得、（例えば、ジスルフィド架橋形成の可能性を防止または低減するために）１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。代替のヒンジ配列は、代替の免疫グロブリンドメイン、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ４またはＣＤ２８、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＴＲＧＣ、ＴＲＤＣから誘導することができる。
[0221]下記の表２は、本発明の架橋分子中の標的化部分および腫瘍特異的抗原エピトープ部分を接合する際に使用するための適切なヒンジ領域の非限定的な例を提供する。
[0222]標的化部分は、１を超えるリンカーおよび／または１を超えるヒンジ領域によって腫瘍特異的抗原エピトープ部分に接続され得ることが理解される。例えば、融合タンパク質は、（ＮからＣ末端に）標的化部分に直接コンジュゲートされた腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含み得る。あるいは、融合タンパク質は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分、続いてリンカー領域、次に標的化部分を含み得る。さらになお、融合タンパク質は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分、続いてリンカー領域、次にヒンジ領域、次に標的化部分を含み得る。さらなる実施形態ではなお、融合タンパク質は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分、続いてリンカー領域、次にヒンジ領域、さらなるリンカー領域、次に標的化部分を含み得る。当然に、当業者は、代替構造が可能であること（すなわち、腫瘍特異的抗原エピトープ部分が、１つ以上のリンカーおよび／またはヒンジ領域を介して、標的化部分のＣ末端に接続される）を理解する。
[0223]
架橋分子の標的化部分
[0224]架橋分子の標的化部分は、標的細胞上の細胞表面分子に結合し得る。細胞表面分子は、抗原を含み得る。細胞表面分子は、タンパク質、脂質部分、糖タンパク質、糖脂質、糖質、多糖、核酸、ＭＨＣ結合ペプチド、またはそれらの組合せから選択され得る。細胞表面分子は、細菌、ウイルス、および他の微生物の部分（例えば、被膜、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛、および毒素）を含み得る。細胞表面分子は、標的細胞によって発現され得る。細胞表面分子は、標的細胞によって発現されない場合がある。非限定的な例として、細胞表面分子は、標的細胞ではなく、標的細胞または標的細胞の細胞表面分子に結合する細胞によって発現されるリガンドであり得る。また、非限定的な例によって、細胞表面分子は、標的細胞の細胞表面または細胞表面受容体に結合する毒素、外因性分子またはウイルスタンパク質であり得る。
[0225]架橋分子は、複数の標的細胞と相互作用し得る。標的細胞は感染細胞であり得る。標的細胞は、病原性感染細胞であり得る。標的細胞は、罹患細胞であり得る。標的細胞は、遺伝子修飾細胞であり得る。標的細胞は宿主細胞でない場合がある。標的細胞は、侵入した生物（例えば、酵母、線虫、細菌、真菌）に由来し得る。本明細書には、非細胞標的上の分子と相互作用する架橋分子がさらに開示される。非細胞標的は、ウイルスまたはその一部であり得る。非細胞標的は、細胞の断片であり得る。非細胞標的は、細胞外マトリックス成分またはタンパク質であり得る。
[0226]標的細胞は、組織に由来することができる。組織は、脳、食道、乳房、消化管、腸、結腸、肺、グリア、卵巣、子宮、精巣、前立腺、胃腸管、膀胱、肝臓、脾臓、胸腺、骨、脂肪および皮膚から選択され得る。標的細胞は、１つ以上の内分泌腺に由来し得る。あるいは、またはさらに、標的細胞は、１つ以上の内分泌腺に由来することができる。内分泌腺には、リンパ腺、下垂体、甲状腺、副甲状腺、膵臓、生殖腺または松果体であり得る。
[0227]標的細胞は、幹細胞、多能性細胞、造血幹細胞または前駆細胞から選択され得る。標的細胞は循環細胞であり得る。標的細胞は免疫細胞であり得る。
[0228]標的細胞はがん幹細胞であり得る。標的細胞はがん細胞であり得る。がん細胞は、組織に由来することができる。組織は、非限定的な例として、脳、食道、乳房、結腸、肺、グリア、卵巣、子宮、精巣、前立腺、胃腸管、膀胱、肝臓、甲状腺および皮膚から選択され得る。がん細胞は、骨に由来し得る。がん細胞は、血液に由来し得る。がん細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、血小板、白血球、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、造血幹細胞、または内皮細胞前駆細胞に由来し得る。がん細胞は、ＣＤ１９陽性Ｂリンパ球に由来し得る。がん細胞は幹細胞に由来し得る。がん細胞は多能性細胞に由来し得る。がん細胞は、１つ以上の内分泌腺に由来し得る。内分泌腺には、リンパ腺、下垂体、甲状腺、副甲状腺、膵臓、生殖腺または松果体であり得る。
[0229]標的細胞の細胞表面分子は、受容体であり得る。受容体は細胞外受容体であり得る。受容体は細胞表面受容体であり得る。非限定的な例として、受容体は、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子または細胞認識分子と結合し得る。受容体は膜貫通受容体であり得る。受容体は酵素連結型受容体であり得る。受容体は、Ｇ－タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であり得る。受容体は、増殖因子受容体であり得る。非限定的な例として、増殖因子受容体は、上皮細胞増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子受容体、神経細胞増殖因子受容体、形質転換増殖因子受容体、骨形成性タンパク質増殖因子受容体、肝細胞増殖因子受容体、血管内皮細胞増殖因子受容体、幹細胞因子受容体、インスリン増殖因子受容体、ソマトメジン受容体、エリスロポエチン受容体、ならびにそれらの相同体および断片から選択され得る。受容体はホルモン受容体であり得る。受容体はインスリン受容体であり得る。非限定的な例として、受容体は、エイコサノイド受容体、プロスタグランジン受容体、エストロゲン受容体、卵胞刺激ホルモン受容体、プロゲステロン受容体、成長ホルモン受容体、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体、それらの相同体およびそれらの断片から選択され得る。受容体はアドレナリン作動性受容体であり得る。受容体はインテグリンであり得る。受容体はＥｐｈ受容体であり得る。受容体は黄体形成ホルモン受容体であり得る。細胞表面分子は、黄体形成ホルモン受容体に対して少なくとも約５０％相同であり得る。受容体は免疫受容体であり得る。非限定的な例として、免疫受容体は、パターン認識受容体、トール様受容体、ＮＯＤ様受容体、キラー活性化受容体、キラー阻害剤受容体、Ｆｃ受容体、Ｂ細胞受容体、補体受容体、ケモカイン受容体およびサイトカイン受容体から選択され得る。非限定的な例として、サイトカイン受容体は、インターロイキン受容体、インターフェロン受容体、形質転換増殖因子受容体、腫瘍壊死因子受容体、コロニー刺激因子受容体、それらの相同体、およびそれらの断片から選択され得る。受容体は受容体キナーゼであり得る。受容体キナーゼはチロシンキナーゼ受容体であり得る。受容体キナーゼはセリンキナーゼ受容体であり得る。受容体キナーゼはスレオニンキナーゼ受容体であり得る。非限定的な例として、受容体キナーゼは、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＰＩ３Ｋ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＢ、プロテインキナーゼＣ、ＡＫＴ、ＡＭＰＫ、ホスホリパーゼ、それらの相同体およびそれらの断片から選択されるシグナル伝達タンパク質を活性化することができる。受容体キナーゼはＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路を活性化し得る。受容体キナーゼは、Ｊａｋ、ＳｔａｔまたはＳｍａｄを活性化し得る。
[0230]細胞表面分子は、非受容体細胞表面タンパク質であり得る。細胞表面分子は、分化タンパク質のクラスターであり得る。非限定的な例として、細胞表面分子は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ９１、ＣＤ１１４、ＣＤ１１７、ＣＤ１８２、ＣＤ２００、それらの断片、およびそれらの相同体から選択され得る。
[0231]標的細胞の細胞表面分子は、ペプチドを含まない分子であり得る。細胞表面分子は脂質を含み得る。細胞表面分子は脂質部分または脂質基を含み得る。脂質部分はステロールを含み得る。脂質部分は脂肪酸を含み得る。抗原は糖脂質を含み得る。細胞表面分子は糖質を含み得る。
[0232]標的細胞の細胞表面分子は抗原であり得る。抗原は、細胞上の表面抗原または細胞表面マーカーの少なくとも一部であり得る。抗原は、細胞上の受容体または補助受容体であり得る。抗原は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の結合を受け、Ｔ細胞受容体に提示され得る分子または分子断片を指すことができる。また、用語「抗原」とは、免疫原を指すことができる。免疫原は、単独で対象に注入した場合、適応免疫応答を引き起こすことがある。免疫原は、それ自体で免疫応答を誘導することができる。抗原は、スーパー抗原、Ｔ依存性抗原、またはＴ非依存性抗原であり得る。抗原は外因性抗原であり得る。外因性抗原は、典型的には、例えば、吸入、経口摂取、または注射によって体外から体内に入った抗原である。一部の抗原は外因性抗原として出発し、後に内因性となり得る（例えば、細胞内ウイルス）。抗原は内因性抗原であり得る。内因性抗原は、正常な細胞代謝の結果として、または病原性感染（例えば、ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生性）のために細胞内で生成された抗原であり得る。抗原は自己抗原であり得る。自己抗原は、特定の自己免疫疾患を患っている患者の免疫系によって認識される正常なタンパク質またはタンパク質の複合体（および、ときにＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。これらの抗原は、正常な条件下では免疫系の標的ではないが、遺伝的および／または環境的因子のために、これらの患者にはこのような抗原に対する正常な免疫寛容は存在しないはずである。抗原は、状態または疾患のために存在し得るか、または過剰発現され得る。状態または疾患は、がんまたは白血病であり得る。状態は、炎症性疾患または状態であり得る。状態または疾患は代謝性疾患であり得る。状態は遺伝性障害であり得る。
[0233]本発明はまた、例えば、Ｂ細胞受容体および／またはＴ細胞受容体を標的化するための抗イディオタイプ抗体もしくはそれらの断片またはそれらのリガンドを用いて、特異的ＢまたはＴ細胞系列関連自己免疫疾患を処置するための適用を見出すことができる。このような疾患には、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、固形臓器移植による超急性拒絶反応、急性拒絶反応、慢性拒絶反応または混合型拒絶反応、骨髄または幹細胞移植による拒絶反応、移植片対宿主病が含まれる。
[0234]標的細胞の細胞表面分子は、腫瘍抗原として指定された抗原であり得る。腫瘍抗原または新生抗原は、腫瘍細胞の表面上のＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ分子によって提示される抗原であり得る。これらの抗原は腫瘍細胞によって提示されることがあり、正常な抗原によって提示されることはない。この場合、それらは腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）と呼ばれ、一般的に、腫瘍特異的突然変異から生じる。より一般的なのは、腫瘍細胞および正常細胞によって提示される抗原であり、それらは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と呼ばれる。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に固有ではなく、代わりに、抗原に対する免疫寛容状態を誘導しない条件下で正常細胞上にも発現される。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟であり、応答することができない場合に胎児発生中に正常細胞上に発現する抗原であり得るか、または正常細胞上に通常は極めて低いレベルで存在するが、腫瘍細胞上ではるかに高いレベルで発現する抗原であり得る。これらの抗原を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球は、増殖または転移する前に腫瘍細胞を破壊することができる。腫瘍抗原はまた、例えば、突然変異した受容体の形態で腫瘍の表面上にあり得、その場合、それらはＢ細胞によって認識され得る。
[0235]ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例には、以下：分化抗原、例えばＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、および腫瘍特異的多系統抗原、例えばＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５；過剰発現された胎児性抗原、例えばＣＥＡ；過剰発現された発がん遺伝子および突然変異した腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；染色体転座に起因する固有の腫瘍抗原、例えばＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えばエプスタインバールウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７が含まれる。他の大きなタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈｌ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３＼ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、２０ ＣＤ６８＼Ｐｌ、Ｃ０－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－Ｃ０－１、ＲＣＡＳｌ、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ－関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳが含まれる。
[0236]標的細胞の細胞表面分子は、任意の表面発現抗原からなる群から選択される抗原であり得る。例示的な標的抗原は、限定されないが、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ－３）、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３５（ＦＬＴ－３）、ＣＤ４４（ＨＣＡＭ）、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＬＥＣ１２Ａ（ＣＬＬ１）、ＬｅＹ、ＦＲβ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ３０５（ＬＡＩＲ－１）、ＣＤ３６６（ＴＩＭ－３）、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１３３、ＣＤ５６、ＣＤ２９（ＩＴＧＢ１）、ＣＤ４４（ＨＣＡＭ）、ＣＤ４７（ＩＡＰ）、ＣＤ６６（ＣＥＡ）、ＣＤ１１２（Ｎｅｃｔｉｎ２）、ＣＤ１１７（ｃ－Ｋｉｔ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ２００（ＯＸ－２）、ＣＤ２２１（ＩＧＦ１）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、ＣＤ２４３（ＭＲＤ１）、ＣＤ２４６（ＡＬＫ）、ＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＧＤ２、およびＥＧＦＲを含み得る。他の標的抗原には、ＴＣＲ、糖、脂質、糖質、または標的細胞の表面上に発現される任意の他の分子が含まれる。抗原は、架橋分子または結合構築物との関連において表１に言及される任意の抗原であり得る。
[0237]好ましい実施形態では、標的細胞はがん細胞であり、がん細胞の細胞表面分子はがんに関連する抗原である。抗原は、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原であり得る。抗原は、特定のタイプのがんに関連するものであり得る。例えば、抗原の過剰発現は、特定のがんまたは特定のクラスのがんと関連し得る。例えば、がんが乳がんである場合、抗原は乳がんと関連し得るが、別の型のがんとは関連しない。あるいは、抗原は、固形腫瘍などのがんのクラスと関連し得るが、血液（すなわち、「液性」）腫瘍とは関連せず、またその逆もそうである。抗原は、特定系統のがんと関連し得るが、他のがんとは関連しない。例えば、抗原は肉腫と関連し得るが、リンパ腫またはがん腫とは関連しない。本明細書で使用される場合、がんに関して「関連する」という用語は、抗原の発現（増加するか低下するかにかかわらず）ががんのマーカーであると考えられることを意味すると理解される。抗原の低レベルの発現があり得るが、これは、所与のがんと「関連する」抗原と同等ではないことが理解される。
[0238]架橋分子の標的化部分の結合を受け得る適切ながん抗原には、限定されないが、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＣＳＡ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、上皮糖タンパク質（ＥＧＰ ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－αおよびβ（ＦＲαおよびβ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２／ＥＲＢ２）、ＨＥＲ３、上皮細胞増殖因子受容体ｖＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＲＢ３、ＥＲＢ４、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ軽鎖、キナーゼインサートドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、黒色腫関連抗原１（黒色腫抗原ファミリーＡ１、ＭＡＧＥ－Ａ１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、癌精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、癌胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、１型チロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６（Ｎｋｐ３０）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン－４（ＣＳＰＧ４）、ＤＮＡＸアクセサリー分子（ＤＮＡＭ－１）、エフリンＡ型受容体２（ＥｐＨＡ２）、線維芽細胞関連タンパク質（ＦＡＰ）、Ｇｐｌ００／ＨＬＡ－Ａ２、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ＨＡ－１Ｈ、ＨＥＲＫ－Ｖ、ＩＬ－１１Ｒａ、潜伏膜タンパク質１（ＬＭＰ１）、神経細胞接着分子（Ｎ－ＣＡＭ／ＣＤ５６）およびトレイル受容体（ＴＲＡＩＬ Ｒ）が含まれる。これらまたは他のがん抗原は、本発明における架橋分子による標的化に利用することができることが理解される。
[0239]架橋分子の標的化部分は、任意の結合分子、例えば、フルサイズ抗体もしくはその断片、本明細書に記載される任意の抗体もしくはその断片、免疫サイトカイン（サイトカインもしくはその断片に連結された抗体）、リガンド（タンパク質関連ペプチド、糖分子、処理された分子、脂質、サイトカイン、ホルモン）、可溶性Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）、一本鎖（ｓｃ）ＴｃＲ、一本鎖Ｔ細胞受容体結合モチーフおよびＴ細胞受容体様ｍＡｂ、アプタマー（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）、ペプチド（例えば、アプタマーもしくは二環式ペプチド）、毒素、脂質または糖質であり得る。
[0240]架橋分子の標的化部分はポリペプチドであり得、標的化抗体または抗体断片であり得る。標的化抗体または抗体断片は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、その断片またはその修飾物から選択され得る。免疫グロブリンはＩｇＧであり得る。ＩｇＧはＩｇＧ１であり得る。ＩｇＧはＩｇＧ２であり得る。ＩｇＧはＩｇＧ３であり得る。ＩｇＧはＩｇＧ４であり得る。ＩｇＧは、架橋分子への内因性Ｔ細胞ＦｃＲ結合を調節するための１つ以上のＦｃ突然変異を有し得る。ＩｇＧは、ＦｃＲ陽性細胞のＦｃＲに対するＦｃ結合能力を除去するための１つ以上のＦｃ突然変異を有し得る。１つ以上のＦｃ突然変異は、グリコシル化部位を除去し得る。１つ以上のＦｃ突然変異は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ｄｅｌＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｎ２９７Ｑおよびそれらの任意の組合せから選択され得る。１つ以上のＦｃ突然変異は、ＩｇＧ１においてあり得る。ＩｇＧ１における１つ以上のＦｃ突然変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、またはその両方であり得る。あるいは、またはさらに、ＩｇＧ１における１つ以上のＦｃ突然変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、またはその両方であり得る。あるいは、またはさらに、ＩｇＧ１における１つ以上のＦｃ突然変異は、Ｎ２９７Ａであり得る。あるいは、またはさらに、１つ以上の突然変異はＩｇＧ２においてであり得る。ＩｇＧ２における１つ以上のＦｃ突然変異は、Ｖ２３４Ａ、Ｖ２３７Ａ、またはその両方であり得る。
[0241]標的化抗体または抗体断片は、Ｆｃヌル免疫グロブリンまたはその断片であり得る。
[0242]本明細書で使用される場合、用語「抗体断片」とは、全長形態以外の任意の形態の抗体を指す。本明細書中の抗体断片には、全長抗体内に存在するより小さな成分である抗体、および操作された抗体が含まれる。抗体断片は、限定されないが、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二官能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組合せ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、代替の足場非抗体分子、および二特異性抗体が含まれる。特に断らない限り、用語「抗体」または「複数の抗体」を使用する記述および請求項は、「抗体断片」および「複数の抗体断片」を特異的に含むことができる。
[0243]標的化抗体断片は、ヒト、完全ヒト、ヒト化、ヒト操作、非ヒト、および／またはキメラ抗体であり得る。非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を減少させるためにヒト化され得る。キメラ抗体は、元々別個の抗体についてコードされた２つ以上の抗体遺伝子の接合を介して作製された抗体を指すことができる。キメラ抗体は、第１の抗体からの少なくとも１つのアミノ酸、および第２の抗体からの少なくとも１つのアミノ酸を含み得、第１および第２の抗体は異なる。抗体の少なくとも一部または抗体断片は、ウシ種、ヒト種、またはマウス種由来であり得る。抗体の少なくとも一部または抗体断片は、ラット、ヤギ、モルモットまたはウサギ由来であり得る。抗体の少なくとも一部または抗体断片は、ヒト由来であり得る。抗体の少なくとも一部または抗体断片抗体は、カニクイザル由来であり得る。
[0244]標的化抗体または抗体断片は、哺乳動物、鳥類、魚類、両生類もしくは爬虫類由来の抗体または抗体断片に基づくかまたはそれらに由来し得る。哺乳動物には、限定されないが、肉食動物、げっ歯類、象、有袋類、ウサギ、コウモリ、霊長類、アザラシ、アリクイ、クジラ、奇趾有蹄類、および偶蹄類が含まれる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、またはブタであり得る。
[0245]標的化抗体または抗体断片は、非限定的な例として、ＣＤ１９、Ｈｅｒ２、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、またはその断片から選択される抗原を認識し、またはそれに結合することができる。抗原は野生型抗原を含み得る。抗原は、１つ以上の突然変異を含み得る。
[0246]標的化抗体または抗体断片は、抗ＣＤ１９抗体またはその断片であり得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ２２抗体であり得る。標的化ポリペプチドは、抗ＢＣＭＡ抗体またはその断片であり得る。標的化ポリペプチドは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはその断片であり得る。標的化ポリペプチドは、抗Ｈｅｒ２抗体またはその断片であり得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ２０抗体または抗体断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、リツキシマブを含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＥＧＦＲ抗体または抗体断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＥＡ抗体または抗体断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＬＬ－１抗体または抗体断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ３３抗体または抗体断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ３０抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ７９Ｂ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ３７抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ３８抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ７０抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ２７６抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＧＤ２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ３７１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ１３５抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ１０５抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ１２３抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＲＯＲ－１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＭＥＴ－Ｒ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＰＤＧＦＲアルファ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗Ｈｅｒ３抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＦＲアルファ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＧＰＣ３抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＳＬＡＭｆ７抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＧＰＮＭＢ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＶＥＧＦＲ２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗アルファ４ベータ７／アルファＥベータ７抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＳＰＧ４抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ８０抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＣＲ４抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ１１５抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＥＮＯＸ－２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ５６抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗－ｈｕＶＨ１－６９抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ１１７抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ１３３抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＭＵＣ１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＭＳＬＮ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＲＯＲ－２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＩＬ１３Ｒａ２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＥＰＨＡ２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＰＳＭＡ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＥＡ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ルイスＹ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＰＳＣＡ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＭＵＣ１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ１８１Ｌ１ＣＡＭ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＡＬＫ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＩＧＦ－１Ｒ ＣＤ２２１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ネクチン４抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＦＡＰ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＡＸＬ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ１３８抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＬＤＮ６抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗Ｈｅｒ４抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗クラウジン１８．２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗Ｏ－アセチル化ＧＤ２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＧＤ３抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＧＭ２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ１４７抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＶＥＧＦＲ－１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＰＤＰＮ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＷＴ１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＧＰＣ２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＦＧＦＲ４抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＥｐｈＢ４抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＳＴＥＡＰ－１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＳＴＥＡＰ－２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＭＵＣ１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗クロロトキシン抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗２０６抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＩＬＲＡＰ１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＭＩＣＡ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＭＡＧＥ－Ａ１ ｓｃＴｃＲ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＭＡＧＥ－Ａ１ｓＴＣＲ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＭＩＣＡ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＴＲＢＣ１／２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗Ｂ７－Ｈ７抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ３４抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ７抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＴＩＭ３抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ１９１抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ６６ｂ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ１１ｂ抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＥＭＲ２抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＭＵＣ１６抗体またはその断片を含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＮＹＥＳＯ－１ ＨＬＡ－Ａ２抗体もしくはその断片、または可溶性ＴｃＲもしくはそのバリアントを含み得る。標的化ポリペプチドは、抗スルビビンＨＬＡ－Ａ２抗体もしくはその断片、または可溶性ＴｃＲもしくはそのバリアントを含み得る。標的化ポリペプチドは、抗ＣＤ２００抗体またはその断片を含み得る。
[0247]標的化抗体または抗体断片は、任意の市販の抗体から選択することができる。標的化抗体または抗体断片は、トラスツズマブ（Ｈｅｒ２結合のため）、アレムツズマブ（ＣＤ５２結合のため）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ－Ａ結合のため）、ブレンツキシマブ（ＣＤ３０結合のため）、ゲムツズマブ（ＣＤ３３結合のため）、イピリムマブ（ＶＴＬＡ－４結合のため）、イブリツモマブ（ＣＤ２０結合のため）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ結合のため）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ結合のため）、リツキシマブ（ＣＤ２０結合のため）、およびそれらの断片から選択され得る。
[0248]標的化抗体または抗体断片は、表１に言及されるいずれかのもの、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である抗原結合断片であり得る。
[0249]架橋分子の標的化部分は、ペプチドＭＨＣ複合体を標的とすることができ、このような実施形態では、標的部分は、可溶性ＴｃＲ分子または一本鎖ＴｃＲ分子であり得る。
[0250]種々の標的化抗体、またはそれらの抗原結合断片の配列の非限定的な例は、本明細書において表１に提供される。
[0251]架橋分子の標的化部分の選択を含めて、本明細書に記載される架橋分子の適切な設計を決定することができることは、十分に当業者の範囲内である。
[0252]より具体的には、当業者は、本明細書に記載されるように「再方向付け」を必要とするＣＡＲの知識を有することにより、ＣＡＲが方向付けられるべき代替の標的化部分を選択することができ、処置を必要とするがんまたは疾患の処置を容易にすることができる。
[0253]本明細書に記載されるように、標的化部分は、標的細胞上の任意の細胞表面分子（がん細胞上に発現される腫瘍関連抗原など）への結合のためであり得る。当業者は、処置を必要とする疾患（例、がん）に応じて、適切な細胞表面分子を選択することができる。例えば、疾患がＨｅｒ２＋がんである場合、当業者は、がん細胞上のＨｅｒ２に特異的に結合することができる標的化部分を選択することができる。同様に、疾患がＣＤ１９＋がん細胞である場合、当業者は、がん上のＣＤ１９に特異的に結合することができる標的化部分を選択することができる。当業者は、標的細胞上に発現される適切な表面分子を同定するために、処置されるがんまたは状態の抗原発現プロファイルを決定する方法に精通している。
[0254]標的細胞上の適切な細胞表面分子（標的抗原）（例えば、ＣＤ１９、Ｈｅｒ２、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、または本明細書に記載されるかもしくは標的化のために選択され得る任意の他の腫瘍関連抗原）を同定した場合、当業者は、市販されている抗体、または抗原に結合する公知の抗体の抗原結合ドメインを記載する公開された文献を参照することによることを含めて、上記標的抗原に結合し得る結合ドメインの配列を容易に決定することができる。次に、当業者は、標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分を含む、本明細書に記載される架橋分子（融合タンパク質）の構造を製剤化することができる。架橋分子の残りの成分（例えば、腫瘍特異的抗原エピトープ部分）の組成は、本明細書にさらに記載される。
[0255]最後に、当業者は、本発明の架橋分子に到達するために、標的細胞上の適切な細胞表面分子（標的抗原）および腫瘍特異的抗原エピトープ部分を同定した場合、架橋分子がａ）標的細胞に結合するかどうか、ｂ）ＣＡＲ Ｔ細胞に結合するかどうか、およびｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞を標的細胞に首尾よく再方向付けして細胞殺滅を誘導することができるかどうかを、日常的な技術を用いて容易に決定することができる。標的抗原への結合、および細胞傷害性を決定する方法は、当該技術分野において周知である。標的細胞への結合、ＣＡＲ Ｔ細胞、および細胞殺滅の誘導を決定するための非限定的な方法および種々の実験プロトコールは、本明細書中、実施例において詳細に記載されている。
機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
[0256]本発明は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体（すなわち、腫瘍特異的抗原が機能不全Ｐ２Ｘ７受容体である）からのエピトープの形態での腫瘍特異的抗原エピトープ部分の使用を意図する。
[0257]機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、ＡＴＰと結合することができない隣接する正しくパッキングされたモノマー間の界面で形成される３つのＡＴＰ結合部位のうちの少なくとも１つを有する、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体または機能不全Ｐ２Ｘ７受容体の断片の形態で提供され得る。このような受容体は、非選択的カルシウムチャネルの開口をアポトーシス孔まで延長することができない。
[0258]機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のペプチド断片の範囲は公知であり、全ての内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＡＵ２００２／００００６１（対応する国際公開第２００２／０５７３０６号、ならびに米国特許第７，３２６，４１５号、米国特許第７，８８８，４７３号、米国特許第７，５３１，１７１号、米国特許第８，０８０，６３５号、米国特許第８，３９９，６１７号、米国特許第８，７０９，４２５号、米国特許第９，６６３，５８４号、または米国特許第１０，４５０，３８０号）、ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１３６４（対応する国際公開第２００９／０３３２３３号、および米国特許第８，４４０，１８６号、米国特許第９，１８１，３２０号、米国特許第９，９４４，７０１号または米国特許第１０，５９７，４５号）、およびＰＣＴ／ＡＵ２００９／０００８６９（対応する国際公開第２０１０／００００４１、および米国特許第８，５９７，６４３号、米国特許第９，３２８，１５５号または米国特許第１０，２３８，７１６号）において検討される。本発明において使用することが意図されるエピトープを含むこれらの明細書内の例示的ペプチドは、以下に記載される。
ＰＣＴ出願公開 ペプチド配列
国際公開第２００２／０５７３０６号 ＧＨＮＹＴＴＲＮＩＬＰＧＬＮＩＴＣ（配列番号２）（本明細書では「Ｅ２００」エピトープとも呼ばれる）
国際公開第２００９／０３３２３３号 ＫＹＹＫＥＮＮＶＥＫＲＴＬＩＫＶＦ（配列番号１２）（本明細書では「Ｅ３００」エピトープとも呼ばれる）
国際公開第２０１０／００００４１号 ＧＨＮＹＴＴＲＮＩＬＰＧＡＧＡＫＹＹＫＥＮＮＶＥＫ（配列番号１４）（本明細書では「Ｅ２００／Ｅ３００」または「複合」エピトープとも呼ばれる）
[0259]任意の実施形態では、本明細書に記載される任意の架橋分子の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分のアミノ酸配列は、配列番号２～３０、１６８、および配列番号３６５～４００のいずれかに示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれかなる。好ましくは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、配列番号１１の少なくとも配列を含む。
[0260]機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、任意の官能基、例えば、本明細書中に開示された標的化部分、例えば、カップリングするためにＮＨ２またはＳＨ基を用いて抗体またはその断片にカップリングさせることができるカルボキシル基、活性エステル、アセトアミドまたはマレイミドを有することができる。
[0261]機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分の種々の例が、本明細書において、特に表１に記載される。表１から明らかなように、最小Ｅ２００配列は、少なくとも配列番号１１の配列を含む。好ましい実施形態では、最小Ｅ２００配列は、少なくとも配列番号２の配列またはそのバリアント、例えば配列番号４の配列を含む。
[0262]ある特定の例において、本発明の架橋分子に包含するためのＥ２００エピトープは、Ｎ末端および／またはＣ末端領域における伸長を含み得る。伸長は、天然に存在するｎｆＰ２Ｘ７受容体配列に由来することができ、少なくとも１個のアミノ酸残基、少なくとも２個のアミノ酸残基、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個またはそれ以上のアミノ酸残基の伸長を含むことができる。例えば、配列番号４に定義されるＥ２００エピトープは、配列番号１のＥ２００配列の直ぐＮ末端の３つのアミノ酸残基に対応する配列ＤＦＰのＮ末端伸長を含み得る。さらに、配列番号４に定義されるＥ２００エピトープは、例えば配列番号６および７に示されるように、Ｃ末端伸長を含み得る。このようなＮ末端およびＣ末端伸長は、架橋分子上のエピトープへのＣＡＲ－Ｔ細胞の結合の有効性を改善するのに役立ち得ることが理解される。
[0263]任意の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、ｎｆＰ２Ｘ７受容体ＣＡＲによる結合のための十分なアクセス可能性を可能にするように標的化部分にコンジュゲートされる。したがって、最小の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分配列は、最小のＥ２００配列 少なくとも配列番号１１の配列を含むが、好ましい実施形態では、最小のＥ２００配列は、ｎｆＰ２Ｘ７受容体ＣＡＲによる結合を可能にするための１つ以上のリンカーまたはヒンジ領域に加えて、少なくとも配列番号２の配列またはそのバリアント、例えば配列番号４の配列を含む。ある特定の実施形態では、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分の全長（リンカーおよびヒンジ領域を含む）は、長さが少なくとも１７アミノ酸、または長さが少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０アミノ酸である。好ましくは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、長さが約１００アミノ酸以下、より好ましくは長さが約９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２，６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１または５０アミノ酸以下である。
[0264]ＣＤ１９を標的化するための架橋分子との関連において、好ましくは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、長さが約３５アミノ酸以下、長さが少なくとも２０アミノ酸、好ましくは長さが少なくとも２１、２２、２３、２４、２５または２６アミノ酸以下である。
[0265]ＣＤ３３を標的化するための架橋分子との関連において、好ましくは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、長さが約４５アミノ酸以下、長さが少なくとも２０アミノ酸、好ましくは長さが少なくとも２１、２２、２３、２４、２５または２６アミノ酸以下である。
ＥＧＦＲｖＩＩＩエピトープ部分
[0266]任意の実施形態では、本明細書に記載される任意の架橋分子のＥＧＦＲｖＩＩＩエピトープ部分のアミノ酸配列は、配列番号２６７のいずれかに示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれかなる。好ましくは、ＥＧＦＲｖＩＩＩエピトープ部分は、少なくとも配列番号２６７の配列を含む。
ＣＬＤＮ６エピトープ部分
[0267]任意の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの架橋分子のＣＬＤＮ６エピトープ部分のアミノ酸配列は、配列番号２７３、２７４もしくは２７５のいずれかに示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれかなる。好ましくは、ＣＬＤＮ６エピトープ部分は、少なくとも配列番号２７３、２７４または２７５の配列を含む。
例示的な架橋分子
[0268]本明細書は、腫瘍特異的抗原エピトープ部分（例えば、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分）／標的化部分対の種々の非限定的な例を提供する。
[0269]本発明の例示的な架橋分子は、表１に記載される。ｎｆＰ２Ｘ７エピトープ部分を含む表１に記載される架橋分子については、本明細書は、それらの架橋を含むが、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＣＬＤＮ６エピトープ部分で置換されるｎｆＰ２Ｘ７エピトープ部分を有する。
[0270]架橋分子がＣＤ１９に結合するための標的化部分を含む例では、標的化部分は、配列番号３１および３２；または１４３および１４４（それぞれ重鎖および軽鎖）に示される重鎖および対の軽鎖可変鎖の組合せ、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれかなることができる。
[0271]上記の実施例では、架橋分子は、重鎖にコンジュゲートされた腫瘍特異的抗原エピトープ部分（例えば、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分）、または軽鎖にコンジュゲートされた腫瘍特異的抗原エピトープ部分（例えば、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分）を含み得る。好ましくは、腫瘍特異的抗原エピトープ部分（例えば、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分）は、標的結合部分の軽鎖にコンジュゲートされる。
[0272]架橋分子がＣＤ１９結合重鎖／軽鎖対を含む任意の実施形態では、重鎖が機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を含むかまたはそれからなる場合、重鎖および軽鎖対の可変配列の配列は、好ましくは、配列番号３３および３２；３４および３２、３７および３２；３７および３８（それぞれ列挙される重鎖および軽鎖配列）から選択され、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列である。
[0273]架橋分子がＣＤ１９結合重鎖／軽鎖対を含む任意の実施形態では、軽鎖が機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を含むかまたはそれからなる場合、重鎖および軽鎖対の可変配列の配列は、好ましくは、配列番号３１および３５；３１および３６；３９および３１；５２および５１；１４３および１４５；１４３および１４６；１４３および１４７；１４３および１４８；１４３および１４９；１４３および１５０；１４３および１５１；１４３および１５２；１４３および１５３；１４３および１５４；１４３および１５５；１４３および１５６；１４３および１５７；１４３および１５８；１４３および１５９；１４３および１６０；１４３および１６１；１４３および１６２；１４３および１６３；もしくは１４３および１６４（それぞれ列挙される重鎖および軽鎖配列）から選択され、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列である。架橋分子がＣＤ１９結合重鎖／軽鎖対を含む別の実施形態では、軽鎖は上記軽鎖のいずれか１つであり、重鎖は配列番号１４１または１４２から選択される。
[0274]標的化部分は、重鎖および軽鎖を含むｓｃＦｖの形態であり得る。
[0275]任意の実施形態では、本発明の架橋分子において使用するためのＣＤ１９結合ｓｃＦｖは、配列番号４０もしくは４１に示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を有するものであり得る。ｓｃＦｖとの関連において、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は、ｓｃＦｖの軽鎖、例えば配列番号４２、４３、４６、４８のいずれか、またはｓｃＦｖの重鎖、例えば配列番号４４、４５、４７、４９、５０のいずれかに、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列にコンジュゲートされ得ることが理解される。
[0276]好ましい実施形態では、ＣＤ１９に結合するための架橋分子は、ＣＤ１９に特異的に結合するための抗原結合ドメインを含む標的化部分、好ましくは本明細書に記載されるもの（より好ましくは、配列番号５２／１４３または１４３／１４４（それぞれ重鎖および軽鎖）に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む）を含み、配列番号３６５、３７１、３７７、３８３、３８９、および３９５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含む。
[0277]任意の実施形態では、ＣＤ２０への結合のための架橋分子は、配列番号５３および５４、もしくは配列番号５５および５６（それぞれ列挙する軽鎖および重鎖配列）に示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0278]任意の実施形態では、ＣＤ２２への結合のための架橋分子は、配列番号５７および５８、もしくは配列番号５９および６０（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0279]任意の実施形態では、ＣＤ７９Ｂへの結合のための架橋分子は、配列番号６１および６２に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0280]任意の実施形態では、ＣＤ３７への結合のための架橋分子は、配列番号６３および６４に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0281]任意の実施形態では、ＣＤ３８への結合のための架橋分子は、配列番号６５および６６に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0282]任意の実施形態では、ＣＤ７０への結合のための架橋分子は、配列番号６７および６８に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0283]任意の実施形態では、ＣＤ３０への結合のための架橋分子は、配列番号３９および７０に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0284]任意の実施形態では、ＣＤ３３への結合のための架橋分子は、配列番号７１および７２または７３および７４に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0285]好ましい実施形態では、ＣＤ３３に結合するための架橋分子は、ＣＤ３３に特異的に結合するための抗原結合ドメインを含む標的部分、好ましくは本明細書に記載されるもの（より好ましくは、配列番号７３および７２または７４（それぞれ列挙される軽鎖および重鎖配列）に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む）を含み、配列番号３６５、３７３、３７７、３８８、３９０、および３９５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含む。
[0286]任意の実施形態では、Ｈｅｒ２への結合のための架橋分子は、配列番号７５および７５；または７７および７８に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0287]任意の実施形態では、ＥＧＦＲへの結合のための架橋分子は、配列番号７９および８０または８１および８２または８３および８４に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0288]任意の実施形態では、ＣＤ２７６への結合のための架橋分子は、配列番号８５および８６に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0289]任意の実施形態では、ＧＤ２への結合のための架橋分子は、配列番号８７および８８に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0290]任意の実施形態では、ＢＣＭＡへの結合のための架橋分子は、配列番号８９および９０に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0291]任意の実施形態では、ＣＤ３７１への結合のための架橋分子は、配列番号９１および９２に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0292]任意の実施形態では、ＣＤ１３５への結合のための架橋分子は、配列番号９３および９４に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0293]任意の実施形態では、ＣＤ１２３への結合のための架橋分子は、配列番号９５および９５に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0294]任意の実施形態では、ＣＤ１０５への結合のための架橋分子は、配列番号９７および９８に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0295]任意の実施形態では、ＲＯＲ－１への結合のための架橋分子は、配列番号９９および１００に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0296]任意の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１への結合のための架橋分子は、配列番号１０１および１０２に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0297]任意の実施形態では、ＭＥＴ－Ｒへの結合のための架橋分子は、配列番号１０３および１０４に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0298]任意の実施形態では、ＰＤＧＦＲアルファへの結合のための架橋分子は、配列番号１０５および１０６または１０７および１０８に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0299]任意の実施形態では、Ｈｅｒ３への結合のための架橋分子は、配列番号１０９および１１０に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0300]任意の実施形態では、ＦＲアルファへの結合のための架橋分子は、配列番号１１１および１１２に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0301]任意の実施形態では、ＣＧＰＣ３への結合のための架橋分子は、配列番号１１３および１１４に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0302]任意の実施形態では、ＳＬＡＭＦ７への結合のための架橋分子は、配列番号１１５および１１６に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0303]任意の実施形態では、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂへの結合のための架橋分子は、配列番号１１７および１１８に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0304]任意の実施形態では、ＧＰＮＭＢへの結合のための架橋分子は、配列番号１１９および１２０に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0305]任意の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２への結合のための架橋分子は、配列番号１２１および１２２に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0306]任意の実施形態では、α４β７および／またはαＥβ７への結合のための架橋分子は、配列番号１２３および１２４；または１２５および１２６に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0307]任意の実施形態では、ＣＳＰＧ４への結合のための架橋分子は、配列番号１２７および１２８に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0308]任意の実施形態では、ＣＤ８０への結合のための架橋分子は、配列番号１２９および１３０に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0309]任意の実施形態では、ＣＣＲ４への結合のための架橋分子は、配列番号１３１および１３２に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0310]任意の実施形態では、ＣＤ１１５への結合のための架橋分子は、配列番号１３３および１３４に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0311]任意の実施形態では、ＥＮＯＸ－２への結合のための架橋分子は、配列番号１３５および１３６に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0312]任意の実施形態では、ＣＤ５６への結合のための架橋分子は、配列番号１３７および１３８に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0313]任意の実施形態では、ｈｕＶＨ１－６９への結合のための架橋分子は、配列番号１３９および１４０に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0314]任意の実施形態では、ＣＤ１１７への結合のための架橋分子は、配列番号１６９および１７０に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0315]任意の実施形態では、ＣＤ１３３への結合のための架橋分子は、配列番号１７１および１７２に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0316]任意の実施形態では、ＭＵＣ１への結合のための架橋分子は、配列番号１７３および１７４に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0317]任意の実施形態では、メソテリンへの結合のための架橋分子は、配列番号１７５および１７６に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0318]任意の実施形態では、ＲＯＲ２への結合のための架橋分子は、配列番号１７７および１７８に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0319]任意の実施形態では、ＩＬ１３Ｒａ２への結合のための架橋分子は、配列番号１７９および１８０に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0320]任意の実施形態では、ＩＬ１３Ｒａ２への結合のための架橋分子は、配列番号１８１に示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0321]任意の実施形態では、ＥＰＨＡ２への結合のための架橋分子は、配列番号１８２および１８３に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0322]任意の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合のための架橋分子は、配列番号１８４および１８５に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0323]任意の実施形態では、ＰＳＭＡへの結合のための架橋分子は、配列番号１８６および１８７に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0324]任意の実施形態では、ＣＥＡへの結合のための架橋分子は、配列番号１８８および１８９に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0325]任意の実施形態では、ＰＳＣＡへの結合のための架橋分子は、配列番号１９０および１９１に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0326]任意の実施形態では、ルイスＹへの結合のための架橋分子は、配列番号１９２および１９３に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0327]任意の実施形態では、ＣＤ１７１ ＬＩＣＡＭへの結合のための架橋分子は、配列番号１９４および１９５に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0328]任意の実施形態では、ＥｐＣＡＭへの結合のための架橋分子は、配列番号１９６および１９７に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0329]任意の実施形態では、ＡＬＫへの結合のための架橋分子は、配列番号１９８および１９９に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0330]任意の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒ ＣＤ２２１への結合のための架橋分子は、配列番号２００および２０１に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0331]任意の実施形態では、ネクチン４への結合のための架橋分子は、配列番号２０２および２０３に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0332]任意の実施形態では、ＦＡＰへの結合のための架橋分子は、配列番号２０４および２０５に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0333]任意の実施形態では、ＡＸＬへの結合のための架橋分子は、配列番号２０６および２０７に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0334]任意の実施形態では、ＣＤ１３８への結合のための架橋分子は、配列番号２０８および２０９に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0335]任意の実施形態では、ＣＬＤＮ６への結合のための架橋分子は、配列番号２１０および２１１に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0336]任意の実施形態では、Ｈｅｒ４への結合のための架橋分子は、配列番号２１２および２１３に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0337]任意の実施形態では、クラウジン１８．２への結合のための架橋分子は、配列番号２１４および２１５に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0338]任意の実施形態では、Ｏ－アセチル化ＧＤ２への結合のための架橋分子は、配列番号２１６および２１７に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0339]任意の実施形態では、ＧＤ３への結合のための架橋分子は、配列番号２１８および２１９に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0340]任意の実施形態では、ＧＭ２への結合のための架橋分子は、配列番号２２０および２２１に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0341]任意の実施形態では、ＴＭ４ＳＦ１への結合のための架橋分子は、配列番号２２２および２２３に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0342]任意の実施形態では、ＣＤ１４７への結合のための架橋分子は、配列番号２２４および２２５に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0343]任意の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ５への結合のための架橋分子は、配列番号２２６および２２７に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0344]任意の実施形態では、ＶＥＧＦＲ－１への結合のための架橋分子は、配列番号２２８および２２９に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0345]任意の実施形態では、ポドプラニン（ＰＤＰＮ）への結合のための架橋分子は、配列番号２３０および２３１に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0346]任意の実施形態では、ＷＴ１への結合のための架橋分子は、配列番号２３２および２３３に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0347]任意の実施形態では、ＧＰＣ２への結合のための架橋分子は、配列番号２３４および２３５に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0348]任意の実施形態では、ＦＧＦＲ４への結合のための架橋分子は、配列番号２３６および２３７に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0349]任意の実施形態では、ＥｐｈＢ４への結合のための架橋分子は、配列番号２３８および２３９に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0350]任意の実施形態では、ＳＴＥＡＰ－１への結合のための架橋分子は、配列番号２４０および２４１に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0351]任意の実施形態では、ＳＴＥＡＰ－２への結合のための架橋分子は、配列番号２４２および２４３に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0352]任意の実施形態では、ＩＬ１１Ｒａへの結合のための架橋分子は、配列番号２４４および２４５に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0353]任意の実施形態では、ＣＤ１６３への結合のための架橋分子は、配列番号２４６および２４７に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0354]任意の実施形態では、クロロトキシンへの結合のための架橋分子は、配列番号２４８および２４９に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0355]任意の実施形態では、ＣＤ２０６への結合のための架橋分子は、配列番号２５０（列挙する重鎖配列）に示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0356]任意の実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰへの結合のための架橋分子は、配列番号２５１および２５２に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0357]任意の実施形態では、ＭＩＣＡへの結合のための架橋分子は、配列番号２５３および２５４に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0358]任意の実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ１への結合のための架橋分子は、配列番号２５５に示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0359]任意の実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ１への結合のための架橋分子は、配列番号２５６および２５７に示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0360]任意の実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ１への結合のための架橋分子は、配列番号２５８および２５９に示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0361]任意の実施形態では、ＴＲＢＣ１への結合のための架橋分子は、配列番号２６０および２６１に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0362]任意の実施形態では、ＴＲＢＣ２への結合のための架橋分子は、配列番号２６２および２６３に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0363]任意の実施形態では、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）への結合のための架橋分子は、配列番号２６４および２６５（それぞれ列挙される軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0364]任意の実施形態では、ＣＤ３３への結合のための架橋分子は、配列番号２６８および２６９に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0365]任意の実施形態では、Ｈｅｒ２への結合のための架橋分子は、配列番号２７６および２７７に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0366]任意の実施形態では、ＣＤ３３への結合のための架橋分子は、配列番号２７８および２７９に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0367]任意の実施形態では、Ｈｅｒ２への結合のための架橋分子は、配列番号２７０および２７１に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0368]任意の実施形態では、Ｂ７－Ｈ７（ＨＨＬＡ２）への結合のための架橋分子は、配列番号２８０および２８１に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0369]任意の実施形態では、ＣＤ３４への結合のための架橋分子は、配列番号２８２および２８３に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0370]任意の実施形態では、ＣＤ７への結合のための架橋分子は、配列番号２８４および２８５に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0371]任意の実施形態では、ＣＤ７への結合のための架橋分子は、配列番号２８６に示される配列（重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0372]任意の実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄへの結合のための架橋分子は、配列番号２８７および２８８に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0373]任意の実施形態では、ＴＩＭ－３への結合のための架橋分子は、配列番号２８９および２９０に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0374]任意の実施形態では、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）への結合のための架橋分子は、配列番号２９１および２９２に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0375]任意の実施形態では、ＣＤ６６ｂ（ＣＥＡＣＡＭ８）への結合のための架橋分子は、配列番号２９３および２９４に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0376]任意の実施形態では、ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ－１）への結合のための架橋分子は、配列番号２９５および２９６に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0377]任意の実施形態では、ＥＭＲ２（ＡＤＧＲＥ２）への結合のための架橋分子は、配列番号２９７および２９８に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0378]任意の実施形態では、ＭＵＣ１６への結合のための架橋分子は、配列番号２９９および３００に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0379]任意の実施形態では、ＮＹＥＳＯ－１ ＨＬＡ－Ａ２への結合のための架橋分子は、配列番号３０１および３０２に示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0380]任意の実施形態では、スルビビン ＨＬＡ－Ａ２への結合のための架橋分子は、配列番号３０３および３０４に示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0381]任意の実施形態では、ＢＣＭＡへの結合のための架橋分子は、配列番号３０５に示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0382]任意の実施形態では、ＢＣＭＡへの結合のための架橋分子は、配列番号３０６に示される配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0383]任意の実施形態では、Ｃ２００への結合のための架橋分子は、配列番号３０８および３０７に示される配列（それぞれ列挙された軽鎖および重鎖配列）、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含むかまたはそれからなることができる。
[0384]任意の態様では、本明細書に記載される架橋分子は、ＨＩＳタグを有しない。また、上述の配列情報表に特定されたアミノ酸配列を含むが、配列に特定されたＨＩＳタグを伴わない架橋分子、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む架橋分子が意図される。さらに、一実施形態では、架橋分子は、ＨＩＳタグ以外のタグを含み得るか、または、上述の配列情報表で特定されたアミノ酸配列を含み得るが、配列に指定されたＨＩＳタグの位置で異なるタグを有するアミノ酸配列を含み得る。
核酸
[0385]第２の態様では、本発明は、本発明の架橋分子をコードする核酸分子またはその一部を提供する。
[0386]核酸分子は、修飾されていない、もしくは修飾された、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含み得る。例えば、核酸分子は、一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、または一本鎖および二本鎖領域の混合物を含み得る。さらに、核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を含み得る。核酸分子はまた、安定性のために、１つ以上の修飾された塩基、または他の理由のために修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して種々の修飾を行うことができ、したがって、用語「核酸分子」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
[0387]本発明の第２の態様の一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号２～３０８のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。好ましくは、核酸は、上述の重鎖および軽鎖対をコードするヌクレオチド配列を含む。
[0388]さらに、本発明は、本発明の架橋分子をコードする核酸分子またはその一部を含む核酸構築物を提供する。核酸構築物は、さらに、１つ以上の宿主についての複製起点；１つ以上の宿主において活性である選択マーカー遺伝子；および／または１つ以上の転写制御配列のうちの１つ以上を含み得る。
[0389]本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー遺伝子」には、それが発現される細胞上に表現型を付与し、構築物をトランスフェクトまたは形質転換される細胞の同定および／または選択を容易にする任意の遺伝子が含まれる。
[0390]「選択マーカー遺伝子」には、構築物により形質転換された細胞によって発現された場合に、これらの形質転換された細胞の同定および／または選択を容易にする表現型を細胞に付与する任意のヌクレオチド配列が含まれる。適切な選択マーカーをコードする一連のヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｍｏｒｔｅｓｅｎ， ＲＭ． ａｎｄ Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００９； Ｕｎｉｔ ９．５）。選択マーカーをコードする例示的なヌクレオチド配列には、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子；シトシンデアミナーゼ（ＣＤＡ）遺伝子；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子；ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）遺伝子；ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）遺伝子；チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子；キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子；緑色、赤色、黄色または青色蛍光タンパク質をコードする遺伝子などの蛍光レポーター遺伝子；およびルシフェラーゼ遺伝子などの発光ベースのレポーター遺伝子、とりわけ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの技術を使用して細胞の光学的選択を可能にするものが含まれる。
[0391]さらに、選択マーカー遺伝子は、構築物中の別個のオープンリーディングフレームであり得るか、または別のポリペプチド（例えば、ＣＡＲ）との融合タンパク質として発現され得ることに留意されたい。
[0392]上記のように、核酸構築物はまた、１つ以上の転写制御配列を含み得る。用語「転写制御配列」は、作動可能に接続された核酸の転写に影響する任意の核酸配列を含むことを理解されるべきである。転写制御配列は、例えば、リーダー、ポリアデニル化配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、および転写ターミネーターを含み得る。典型的には、転写制御配列は、少なくともプロモーターを含む。本明細書で使用される用語「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与し、活性化し、または増強する任意の核酸を記載する。
[0393]一部の実施形態では、少なくとも１つの転写制御配列は、本発明の第２の態様の核酸分子に作動可能に接続される。本明細書の目的のために、転写制御配列が核酸分子の転写を促進し、阻害し、または他には調節することができる場合、転写制御配列は、所定の核酸分子に「作動可能に接続された」ものとみなされる。したがって、一部の実施形態では、核酸分子は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターなどの転写制御配列の制御下にある。
[0394]「核酸構築物」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ベクターの形態などの任意の適切な形態であり得、適切な制御エレメントと結合した場合に複製することができ、構築物内に含まれる遺伝子配列を細胞間で移行させることができる。したがって、該用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、核酸構築物はベクターである。一部の実施態様では、ベクターはウイルスベクターである。
[0395]プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、または臓器に関して、構成的に、または差次的に、作動可能に接続された核酸分子の発現を調節することができる。したがって、プロモーターは、例えば、構成性プロモーター、または誘導性プロモーターを含み得る。「構成的プロモーター」は、ほとんどの環境および生理学的条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性プロモーター」は、特定の環境または生理学的条件下で活性であるプロモーターである。本発明は、目的の細胞において活性である任意のプロモーターの使用を意図する。したがって、広範囲のプロモーターは、当業者によって容易に確かめられる。
[0396]哺乳動物の構成プロモーターには、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｐ－アクチン、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、伸長因子－１α（ＥＦ１Ａ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧＧ）が含まれ得る。
[0397]誘導性プロモーターには、限定されないが、化学的に誘導性のプロモーターおよび物理的に誘導性のプロモーターが含まれ得る。化学的に誘導性のプロモーターには、アルコール、抗生物質、ステロイド、金属イオンまたは他の化合物などの化合物によって調節される活性を有するプロモーターが含まれる。化学的に誘導性のプロモーターの例としては、とりわけ、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、米国特許第５，８５１，７９６号および米国特許第５，４６４，７５８号を参照されたい）；グルココルチコイド受容体プロモーター（例えば、米国特許第５，５１２，４８３号を参照されたい）、エクジソン受容体プロモーター（例えば、米国特許第６，３７９，９４５号を参照されたい）などのステロイド応答性プロモーター；およびメタロチオネインプロモーター（例えば、米国特許第４，９４０，６６１号、米国特許第４，５７９，８２１号および米国特許第４，６０１，９７８号）などの金属応答性プロモーターが挙げられる。
[0398]本発明との関連において、架橋分子の発現が誘導性プロモーターの制御下にあることが、ある特定の環境において望ましいことが理解される。これにより、架橋分子をコードする核酸の発現のスイッチオンおよびスイッチオフが可能となる。
[0399]ある特定の実施形態では、および誘導性発現構築物の場合では、ＣＡＲを発現する免疫細胞は、ａ）抗原結合受容体をコードする核酸、およびｂ）架橋分子をコードする誘導性発現構築物を用いて遺伝子修飾され得る。機能不全Ｐ２Ｘ７受容体が結合すると、免疫細胞は架橋分子をコードする遺伝子の発現を誘導する。ある特定の実施形態では、このような遺伝子の発現は、がんの処置を促進および／または改善する。
[0400]上述したように、制御配列はまた、ターミネーターを含み得る。用語「ターミネーター」とは、転写終結をシグナル伝達する転写単位の末端のＤＮＡ配列を指す。ターミネーターは、一般的に、ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳ＤＮＡ配列であり、一次転写物の３’末端へのポリアデニル化配列の付加を容易にする。プロモーター配列と同様に、ターミネーターは、それが使用されることが意図されている細胞、組織または臓器において作動可能な任意のターミネーター配列であり得る。適切なターミネーターは当業者に公知である。
[0401]理解されるように、本発明の核酸構築物は、追加の配列、例えば、増強された発現、細胞質または膜輸送、および位置シグナルを可能にする配列をさらに含むことができる。特定の非限定的な例としては、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ）が挙げられる。
[0402]本発明は、本質的に本明細書に記載されるように、全ての遺伝子構築物に及ぶ。これらの構築物は、真核生物における遺伝子構築物の維持および／もしくは複製、ならびに／または真核細胞のゲノムへの遺伝子構築物もしくはその一部の組込みのために意図されるヌクレオチド配列をさらに含み得る。
[0403]本発明の第３の態様の核酸構築物などの外因性遺伝物質の真核細胞への意図的な導入（トランスフェクション／形質導入）のための方法は、当該技術分野において公知である。理解されるように、核酸構築物を所望の宿主細胞に導入するのに最も適した方法は、核酸構築物のサイズ、宿主細胞のタイプ、トランスフェクション／形質導入の所望の効率、およびトランスフェクション／形質導入された細胞の最終的な所望の、または必要な生存率などの多くの因子に依存する。このような方法の非限定的な例には、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、またはリポソームおよびデンドリマーなどの構造などの化学物質による化学的トランスフェクション；エレクトロポレーション、ソノポレーション、熱ショックまたは光学的トランスフェクションなどの非化学的方法；「遺伝子銃」送達、磁気フェクション、またはインペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）もしくはウイルス形質導入などの粒子ベースの方法が含まれる。
[0404]核酸構築物は、トランスフェクション／形質導入の所望の方法に応じて選択される。本発明の第３の態様の一部の実施形態では、核酸構築物は、ウイルスベクターであり、宿主細胞に核酸構築物を導入する方法は、ウイルス形質導入である。ウイルス形質導入を利用してＰＢＭＣにおけるＣＡＲの発現を誘発するための方法（Ｐａｒｋｅｒ， ＬＬ． ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０００；１１： ２３７７－８７）、より一般的には哺乳動物細胞の形質導入にレトロウイルス系を利用する方法（Ｃｅｐｋｏ， Ｃ． ａｎｄ Ｐｅａｒ， Ｗ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００１， ｕｎｉｔ ９．９）が当該技術分野において公知である。他の実施形態では、核酸構築物は、プラスミド、コスミド、人工染色体などであり、当該技術分野において公知である任意の適切な方法によって細胞にトランスフェクトすることができる。
修飾された細胞
[0405]本明細書に記載されるように、本発明は、抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を発現する細胞の使用を含み、抗原認識ドメインは、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原（機能不全Ｐ２Ｘ７受容体など）を認識する。細胞は、本明細書に記載されるように、「操作された細胞」、「遺伝子修飾細胞」、「免疫細胞」または「免疫エフェクター細胞」であり得る。さらに、細胞は、免疫細胞に分化することができる。免疫細胞に分化することができる細胞（例えば、機能不全Ｐ２Ｘ７ ＣＡＲを発現するＴ細胞）は、幹細胞、多系統前駆細胞、または人工多能性幹細胞であり得る。
[0406]任意の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり得、場合により、上記Ｔ細胞は、ＴｃＲαβ、ＰＤ１、ＣＤ３またはＣＤ９６を発現しない（例えば、遺伝子レベルまたは機能的レベルで、これらの遺伝子のうちの１つをノックダウンまたはノックアウトすることによる）。
[0407]任意の実施形態では、細胞は免疫細胞であり得、場合により、上記細胞は、チェックポイント、消耗またはアポトーシス関連シグナル伝達受容体であり得るアクセサリー分子、ならびにリガンド、例えば、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＦＡＳ－ＬおよびＦＡＳ－Ｒを発現しない（例えば、遺伝子レベルまたは機能的レベルでこれらの遺伝子のうちの１つをノックアウトすることによる）。
[0408]一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、２種以上の異なるＣＡＲを含む。
[0409]本発明の一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、２種以上の異なるＣＡＲをコードする核酸分子または核酸構築物を含む。本発明の一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、各々が異なるＣＡＲをコードする２種以上の核酸分子、または２種以上の核酸構築物を含む。
[0410]本明細書において言及される場合、「遺伝子修飾細胞」には、本発明に包含される非天然および／または導入された核酸分子もしくは核酸構築物を含む任意の細胞が含まれる。導入された核酸分子または核酸構築物は、離散ＤＮＡ分子として細胞内に維持され得るか、または細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。
[0411]細胞のゲノムＤＮＡは、その最も広い文脈において、細胞の遺伝的補体を構成する全ての内因性ＤＮＡを含むように理解されるべきである。したがって、細胞のゲノムＤＮＡは、染色体、ミトコンドリアＤＮＡなどを含むと理解されるべきである。したがって、用語「ゲノム的に統合された」は、染色体組込み、ミトコンドリアＤＮＡ組込みなどを意図する。構築物の「ゲノム的に統合された形態」は、構築物の全部または一部であり得る。しかしながら、一部の実施形態では、構築物のゲノム的に統合された形態は、少なくとも、本発明の第２の態様の核酸分子を含む。
[0412]本明細書で使用される場合、用語「異なるＣＡＲ」または「異なるキメラ抗原受容体」とは、非同一の抗原認識ドメインおよび／または非同一のシグナル伝達ドメインのいずれかを有する任意の２種以上のＣＡＲを指す。１つの例において、「異なるＣＡＲ」は、同じ抗原認識ドメインを有する２つのＣＡＲ（例えば、両方のＣＡＲが機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識し得る）を含むが、活性化受容体の一部を伴うシグナル伝達ドメインを有する１つのＣＡＲ、および共刺激受容体の一部を伴うシグナル伝達ドメインを有する他のＣＡＲなどの異なるシグナル伝達ドメインを有する。理解されるように、この実施形態内の２種以上のＣＡＲのうちの少なくとも１つは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識する抗原認識ドメインを有し、他のＣＡＲ（複数可）は、任意の適切な形態をとり得、任意の適切な抗原に対して方向付けられ得る。
[0413]したがって、本発明の一部の実施形態では、２種以上の異なるＣＡＲは、異なるシグナル伝達ドメインを有し、同一のまたは異なる抗原認識ドメインを有し得る。具体的には、本発明の遺伝子修飾細胞は、活性化受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第１のキメラ抗原受容体、および共刺激受容体に由来する部分を含むシグナル伝達ドメインを有する第２のキメラ抗原受容体を含み得る。
[0414]一部の実施形態では、活性化受容体（シグナル伝達ドメインの一部が由来する）は、ＣＤ３補助受容体複合体であるかまたはＦｃ受容体である。
[0415]一部の実施形態では、共刺激受容体（シグナル伝達ドメインの一部が由来する）は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ－３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＩＣＯＳからなる群から選択される。
[0416]一部の実施形態では、共刺激受容体（シグナル伝達ドメインの一部が由来する）は、ＣＤ２８、ＯＸ４０または４－１ＢＢからなる群から選択される。
[0417]一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、共刺激受容体を恒常的に発現するようにさらに修飾される。
[0418]上述のように、細胞性免疫応答は、典型的には、活性化シグナル（典型的には、抗原に応答する）および共刺激シグナルが同時に経験される場合にのみ誘導される。したがって、細胞内活性化シグナルと細胞内共刺激シグナルの両方を組み合わせて提供する２種以上のＣＡＲを含む、上記実施形態のうちのいくつかに従う遺伝子修飾細胞を有することによって、十分な免疫応答が、それらの同族抗原のＣＡＲ（複数可）による認識に応答して誘導され得ることを確実にする。あるいは、遺伝子修飾細胞は、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を認識する抗原認識ドメインを有し、共刺激受容体を恒常的に発現することができ、それによって、ＣＡＲが活性化されると同時に共刺激が提供される可能性を増加させる１つのＣＡＲのみを含むことができる。あるいは、遺伝子修飾細胞をさらに修飾して、共刺激受容体（複数可）とその／それらのリガンド（複数可）の両方を恒常的に発現させることができる。このようにして、細胞は、連続的に共刺激を経験し、細胞の免疫活性化のために、活性化受容体からの一部を含むシグナル伝達ドメインとともに、ＣＡＲの活性化のみを必要とする。
[0419]したがって、一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する遺伝子修飾細胞は、共刺激受容体を恒常的に発現するようにさらに修飾される。さらなる実施形態では、遺伝子修飾細胞は、共刺激受容体のリガンドを発現するようにさらに修飾され、それによって細胞の自己刺激を促進する。共刺激受容体とそれらの同族リガンドの両方を発現もする（自己刺激を誘導するように）ＣＡＲ発現Ｔ細胞の例は、当該技術分野において公知であり、特にＳｔｅｐｈｅｎ ＭＴ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ， ２００７； １３： １４４０－９に開示されているものを含む。
[0420]ＣＡＲを含む遺伝子修飾細胞の能力は、サイトカイン、好ましくは炎症誘発性または増殖促進性サイトカインを分泌するように細胞をさらに修飾することによって増強することができる。このサイトカインの分泌は、ＣＡＲを発現する細胞に対する自己分泌支持を提供するとともに、ＣＡＲを発現する細胞を取り囲む局所環境を変化させ、免疫系の他の細胞が動員され、活性化されるようにする。結論として、本発明の第４または第５の態様の一部の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、サイトカインを分泌するようにさらに修飾される。この分泌は構成的であり得るか、またはリガンドの同族抗原のＣＡＲの認識によって誘導性であり得る。
[0421]所望の免疫応答に応じて任意の１種以上のサイトカインを選択することができるが、好ましいサイトカインおよび／またはケモカインには、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１またはそれらの組合せが含まれる。
[0422]本発明の免疫細胞は、任意の適切な免疫細胞、もしくはその前駆細胞であり得るか、または均質もしくは不均質な細胞集団であり得る。一部の実施形態では、細胞は、白血球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはγδＴ細胞である。
[0423]免疫細胞はＴ細胞であり得、場合により、上記Ｔ細胞は、ＴｃＲαβ、ＰＤ１、ＣＤ３またはＣＤ９６を発現しない（例えば、遺伝的レベルまたは機能的レベルでこれらの遺伝子のうちの１つをノックダウンまたはノックアウトすることによる）。
[0424]免疫細胞は、チェックポイント、消耗またはアポトーシス関連シグナル伝達受容体であり得るアクセサリー分子、ならびにＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＦＡＳ－ＬおよびＦＡＳ－Ｒなどのリガンドを発現し得ない（例えば、遺伝子レベルまたは機能レベルでこれらの遺伝子の１つをノックアウトまたはノックダウンすることによる）。
処置および投与する方法
[0425]この書類においてさらに検討されるように、本発明は、好ましくはがんの処置においてであるが、種々の状態の処置における適用を見出す。
[0426]本発明はまた、本明細書に記載される治療薬の２つの成分の使用のための種々のシナリオを意図する。
[0427]１つのシナリオにおいて、処置を必要とする個体は、ＣＡＲ Ｔ細胞と架橋分子の両方を含む単一組成物が投与される。
[0428]さらなるシナリオにおいて、処置を必要とする個体は、架橋分子をコードする発現ベクターを含むＣＡＲ Ｔ細胞の集団が投与される。発現ベクターは、架橋分子をコードする核酸配列の構成的または誘導性発現を促進し得る。
[0429]さらに、処置を必要とする個体は、ＣＡＲ Ｔ細胞を投与することができ、後日、架橋分子を含む組成物（例えば、輸液を介する）、または架橋分子をコードする核酸配列を投与することができる。このようなシナリオは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に対して陽性であるがんの標的化処置のために個体が最初にＣＡＲ Ｔ細胞で処置され、その後の架橋分子の投与が、ＣＡＲを別のがん抗原、または感染性因子に由来し、細胞のＭＨＣ ＩまたはＩＩ分子上に提示されるペプチドに再方向付けされる目的である状況において適切であり得る。
[0430]したがって、架橋分子は、対象がＣＡＲ Ｔ細胞による処置を受ける前、それと同時に、または後に投与することができる。
[0431]架橋分子およびＣＡＲ Ｔ細胞を同時に対象に投与する場合、それらは、同じ投与経路（単一組成物を含む）を介して、または別法として、異なる投与経路を介して投与することができる。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞は、対象の血流への注射によって投与することができ、一方、架橋分子は、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内などの別の投与経路を介して投与することができる。
[0432]架橋分子は、架橋分子を自発的に分泌する遺伝子操作された細胞によって、または刺激剤、例えば小分子を介する刺激に際して、体内で生成または発現され得る。あるいは、細胞は、架橋分子を連続的に分泌し、刺激剤、例えば小分子の適用時にそれらの分泌を停止することができる。
[0433]本明細書は、特にヒトにおける適用に言及しているが、本発明はまた獣医学的目的に有用であることは、明確に理解される。したがって、全ての態様では、本発明は、ウシ、ヒツジ、ウマおよび家禽などの家畜；ネコおよびイヌなどのコンパニオン動物；ならびに動物園の動物に有用である。したがって、一般的用語「対象」または「処置される／処置されている対象」は、全ての動物（ヒト、類人猿、イヌ、ネコ、ウマおよびウシなど）を含むものと理解される。
[0434]用語「投与された」とは、個々の細胞を含む上記組成物の治療的に有効な用量の個体への投与を意味する。「治療的に有効な量」とは、それが投与される効果を生じる用量を意味する。正確な用量は、処置の目的に依存し、公知の技術を用いて当業者により確認される。当該技術分野において公知であり、上述したように、全身送達対局所送達、年齢、体重、全身健康、性別、食事、投与時間、薬物相互作用および状態の重症度に対する調整が必要であり、当業者による日常的な実験によって確認することができる。
[0435]処置を必要とする対象には、良性、前がん性、または非転移性腫瘍を既に有する対象、ならびにがんの発生または再発を予防するべき対象が含まれる。対象は、腹水および／またはリンパ節に存在する転移性細胞などの転移性細胞を有し得る。
[0436]処置の目的または結果は、がん細胞数を減少させ；原発腫瘍サイズを減少させ；末梢臓器へのがん細胞浸潤を抑制し（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させ）；腫瘍転移を抑制し（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させ）；腫瘍増殖をある程度抑制し；および／または障害に関連する症状のうちの１つ以上をある程度緩和することであり得る。
[0437]処置の有効性は、生存期間、疾患進行までの時間、奏効率（ＲＲ）、奏効期間、および／または生活の質を評価することによって測定することができる。
[0438]本方法は、疾患進行までの期間を延長するのに特に有用である。
[0439]本方法は、全生存期間および無増悪生存期間を含むヒトの生存期間を延長するのに特に有用である。
[0440]本方法は、治療に対して完全奏効を提供するために特に有用であり、それにより、処置に応答してがんの全ての徴候が消失している。これは必ずしもがんが治癒したというわけではない。
[0441]本方法は、治療に対する部分的な応答を提供するのに特に有用であり、それによって、処置に応答して、１つ以上の腫瘍もしくは病変の大きさ、または体内のがんの程度において減少する。
[0442]処置の目的または転帰は、以下のうちのいずれか１つ以上であり得る：
－がん細胞の数を減少させること：
－原発腫瘍サイズを減少させること；
－がん細胞の末梢臓器への浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる）こと；
－腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは停止させる）こと；
－ある程度腫瘍増殖を抑制すること；
－障害に関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減すること。
[0443]一実施形態では、処置を必要とする対象には、良性の、前がん性の、非転移性の腫瘍を有する対象が含まれる。
[0444]一実施形態では、がんは前がん性または前腫瘍性である。
[0445]一実施形態では、がんは二次がんまたは転移である。二次がんは、任意の臓器または組織、特に肺、肝臓、腎臓、膵臓、腸および脳などの比較的高い血行動態圧を有する臓器または組織に位置することがある。二次がんは、腹水および／またはリンパ節において検出されることがある。
[0446]一実施形態では、がんは実質的に検出不能であり得る。
[0447]「前がん性」または「前腫瘍性」とは、一般的に、典型的にはがんに先行するかまたは発症する状態または増殖を指す。「前がん性」増殖は、異常な細胞周期調節、増殖、または分化によって特徴付けられる細胞を有し得、細胞周期のマーカーによって決定することができる。
[0448]がんは、固形腫瘍または「液性」腫瘍であり得る。換言すると、がんは、組織内で増殖し得るか（癌腫、肉腫、腺腫など）、または血液もしくは骨髄などの体液中に存在するがんであり得る（例えば、リンパ腫および白血病）。
[0449]ある特定の好ましい実施形態では、処置を必要とするがんは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体の低レベルの発現によって特徴付けられるがんであり得る。このようながんの例にはバーキットリンパ腫が含まれる。しかしながら、患者の腫瘍生検における機能不全Ｐ２Ｘ７（ｎｆＰ２Ｘ７）受容体の表面発現の免疫組織化学的分析は、ＩＨＣスコアが１＋から３＋の範囲であることを明らかにした。したがって、低発現の試料は、広範囲の腫瘍型において見出され得る。例は、種々のタイプの固形腫瘍に見られ、限定されないが、神経芽細胞腫、大腸がん、肺がん、腎臓がん、皮膚がん、乳がん、脳がんおよび前立腺がんが挙げられる。異なる組織におけるこのような発現レベルの差は、形質転換の初期状態にある細胞から腫瘍が形成されることに起因する場合がある（最も高い受容体発現を有する組織は、最も高い増殖速度を示す組織であり得る）。
[0450]本発明の方法に従って処置することができるがんの他の例には、芽腫（髄芽腫および網膜芽腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫および滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ、膵島細胞がんを含む）、中皮腫、神経鞘腫（聴神経腫を含む）、髄膜腫、腺がん、黒色腫、白血病またはリンパ系悪性腫瘍、肺がん、例えば小細胞肺がん（ＳＣＫＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺がんおよび肺の扁平上皮癌、腹膜がん、肝細胞がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がんまたは胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、例えば胃腸がん、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん（転移性乳がんを含む）、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）または腎臓（ｒｅｎａｌ）がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌、精巣がん、食道がん、胆道の腫瘍、ならびに頭頸部がんが挙げられる。
[0451]さらなる例において、本発明の範囲内で意図される処置方法は、感染症を処置または予防する方法を含む。したがって、本発明の架橋分子は、ＣＡＲ Ｔ細胞を、追加の表面アクセス可能な抗原、例えば、抗原が、本明細書にさらに記載されるＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ分子上に提示された非がん関連病原性抗原である抗原に再方向付けするために利用することができる。
[0452]感染症の処置を必要とする対象は、危険にさらされているか、または疾患と診断されている場合がある。危険にさらされている対象には、免疫不全患者が含まれる。したがって、本発明の方法はまた、治療を受けている個体（例えば、がんを処置するため）において、それらを免疫不全にし、従って感染に感受性にする感染症の発症を予防することを可能にする。
[0453]ペプチドがＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ分子上に提示される細胞内病原体の例には、ウイルス感染、細胞内細菌感染、原虫感染、および細胞内真菌感染が含まれる。
[0454]本発明の方法を用いて処置することができるウイルス感染の例には、ＨＩＶ、肝炎（例えば、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎）、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、おたふくかぜウイルスが含まれる。
[0455]本発明の方法を用いて処置することができる細胞内細菌感染の例には、マイコバクテリア感染（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、バルトネラ・ヘンセラエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ・チフス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、コキエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、およびクラミドフィラ・ニューモニアエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が含まれる。
[0456]真菌病原体による細胞内感染の例：ヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、クリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、およびニューモシスチチス・ジロベシイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）。
[0457]偏性細胞内原虫病原体の例には、アピコンプレキサンス（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａｎｓ）（プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属種、トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）およびクリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ））、ならびにトリパノソーマチド（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄｓ）（リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属種およびトリパノソーマ・クルーズ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ））が含まれる。
[0458]がんおよび／または自己免疫疾患との関連において免疫系を調節するように標的化され得る免疫細胞は、Ｂ細胞（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２）、形質細胞（ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ１３８）、Ｔ細胞サブセット（ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２、α４β７およびαＥβ７、ＣＤ７）、マクロファージおよびＴＡＭ（ＣＤ１６３およびＣＤ２０６）であり得る。同種幹細胞移植との関連において、免疫ベースのコンディショニングは、特に、非悪性疾患、例えば、サラセミアメジャーもしくは鎌状赤血球貧血の場合、および／またはファンコニ貧血のようなＤＮＡ修復欠損の場合に、（ＣＤ３４、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ３３およびＣＤ３８）を標的化することによって行うことができる。
[0459]マーカー（ｕＰＡＲ）を介して老化腫瘍細胞を標的とすることは、休止状態での腫瘍細胞の除去を助け、後期の時点で拡大し、腫瘍を促進するサイトカインを分泌し、新たながん性サブクローンを保護する腫瘍抑制環境を形成することによって、後期でのがん細胞のより速い増殖を促進する可能性が高い。
[0460]ＣＡＲ Ｔ細胞は、他の免疫細胞、例えばＴＲＥＧ ＣＡＲ Ｔ細胞を免疫抑制することができるようにするか、または構築物に対応する誘導性発現カセット［ＮＦＡＴ依存性サイトカイン分泌］およびシグナル伝達を導入することによって、免疫抑制性サイトカイン（ＴＧＦベータ、ＩＬ１０）、およびケモカインを分泌することにより構築され得る。
[0461]本発明の架橋分子は、当業者に公知である技術を用いて対象に投与するために製剤化することができる。架橋分子の製剤は、薬学的に許容される賦形剤（複数可）（担体または希釈剤）を含み得る。一般的に使用される賦形剤の例としては、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および保存剤、浸透圧剤、膨張剤、および潤滑剤が挙げられる。
[0462]架橋分子の製剤は、１つの型の架橋分子、または１つを超える型の架橋分子（すなわち、架橋分子は、同一または異なる標的化および／または機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を有し得る）を含み得る。
[0463]架橋分子は、当業者に公知であるモードおよび技術を用いて対象に投与することができる。例示的モードには、限定されないが、静脈内、腹腔内、および腫瘍内注射が含まれる。他のモードには、限定されないが、皮内、皮下（ｓ．ｃ、ｓ．ｑ．、サブ－Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑膜内（関節液領域）、頭蓋内、脊髄内、および髄腔内（脊髄液）が含まれる。
[0464]架橋分子を含む製剤は、特定の適応症または障害を処置するのに有効である量で対象に投与される。一般的に、架橋分子の少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む製剤は、処置を必要とする対象に投与することができる。大部分の場合、投与経路、症状等を考慮して、投与量は、架橋分子の約１００μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることができる。しかしながら、対象に投与される製剤中の架橋分子の量は、障害の位置、供給源、同一性、範囲および重症度、処置される個体の年齢および状態などに依存して、広い限界間で変化し得る。医師は、最終的に、使用すべき適切な用量を決定することができる。架橋分子は、持続注入またはボーラス投与として投与することができる。
[0465]ＣＡＲ Ｔ細胞の投与と架橋分子製剤の間のタイミングは、使用される（免疫）細胞のタイプ、ＣＡＲの結合特異性、標的化部分の同一性、および標的細胞の同一性、例えば、処置されるがん細胞、対象における標的細胞の位置、対象に製剤を投与するために使用される手段、ならびに処置される対象の健康、年齢および体重を含む因子に依存して広く変わり得る。実際に、ＴＣＢＭ製剤は、遺伝子操作された（免疫）細胞製剤の前、同時、または後に投与することができる。
[0466]本明細書において開示され、定義される発明は、文章または図面から言及されるかまたは明白である２つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組合せに及ぶことが理解される。これらの異なる組合せの全ては、本発明の様々な代替態様を構成する。
実施例１－架橋分子の生成を含む材料および方法
[0467]培養、トランスフェクションおよびタンパク質生成は、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムユーザーガイド（Ｔｈｅｒｍｏ－ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＵＳＥＲ ＧＵＩＤＥ。規定された無血清培地中におけるＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞のトランスフェクションに関しては、カタログ番号Ａ２９１３３、公開番号ＭＡＮ００１４３３７）に従って行われた。要約すると、ＥｘｐｉＣＨＯはＥｘｐｉＣＨＯ培地中で日常的に継代され、４～６×１０６細胞／ｍＬ未満で維持された。細胞数が５～７×１０６細胞／ｍＬの範囲にある場合、ｍｉｄ－ｌｏｇ増殖期の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションのために、リポソーム複合体を各１ｍＬの培養について１μｇのＤＮＡで調製した。重鎖および軽鎖を別々にコード化したベクターの同時トランスフェクションについては、特に断らない限り、ベクター比を１：１に設定した。「高力価」または「最大力価」発現プロトコールをトランスフェクション後に追跡し、細胞生存率が７０％未満に低下した場合に培養物を回収した。回収は、３００×ｇで５分間、２０℃での遠心分離によって行われた。細胞を捨て、上清を４０００×ｇで３０分間、４℃で再度遠心分離した。回収した上清をＰＥＳ膜を用いた０．２μｍろ過により清澄化した後、保存のために凍結した。
[0468]回収された試料は、５、１０または３０ｋＤａの公称分子サイズカットオフ値を有するスピンカラムまたはＴＦＦカセットによって濃縮され、緩衝液交換され得る。
[0469]ＨＩＳタグ化されたカラム精製について、回収された上清は、目的のタンパク質に依存して、公称分子サイズカットオフ値５、１０または３０ｋＤａのＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブを介して透析された。大規模生成について、上清を、ある特定の分子サイズカットオフ膜を有するＴＦＦカセットを通して洗浄した。所望のカラム充填緩衝液への緩衝液交換はまた、Ｈｉｓタグ化されたカラム精製用の試料を調製するために、上述の手順を通じて達成された。精製は、ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（Ｃｙｔｉｖａ）またはＰｕｒｅＣｕｂｅ １００コンパクトカートリッジＮｉ－ＩＮＤＯＧＯアフィニティーカラム（Ｃａｔ＃７５３０２、Ｃｕｂｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）または他の同等のカラムのいずれかで行われた。精製は、２８０ｎｍ波長のＵＶ検出器、導電率検出器およびｐＨプローブを備えたＡＫＴＡ純粋システム（Ｃｙｔｉｖａ）で行われた。充填および洗浄緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム一塩基および０．３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０で構成された。溶出緩衝液は５００ｍＭイミダゾールを含んだ。溶出されたタンパク質をＶｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてＰＢＳに緩衝液交換し、４℃で保存した。
[0470]２８０ｎｍ波長のＮａｎｏｄｒｏｐおよび標準ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイによりタンパク質を定量した。ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動によってタンパク質純度を確認した。
[0471]本発明者によって生成され、本明細書に記載される詳細な実験データは、以下を含む広範な架橋分子の生成を含む：
１．複数の抗体形式、例えば、ＦａｂおよびｓｃＦｖで生成された標的化部分；
２．例えば、ＶＬおよびＶＨ上を含む、標的化部分上の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分の種々の位置決め；
３．標的化部分と機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分の間のリンカーの包含；
４．異なる組織起源の腫瘍細胞に存在する広範囲の細胞表面抗原に結合する標的化部分。
抗体／Ｆａｂコンジュゲーション
[0472]ＢＩＬ０３ｓ ２－２－１－Ｆｃ（抗ｎｆＰ２Ｘ７受容体抗体）と蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＡＦ６４７）とのコンジュゲーションは、製造業者の指示に従って行われた（Ｃａｔ＃ Ａ２０１８６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。ＡＦ６４７標識されたＢＩＬ０３ｓ ２－２－１－Ｆｃ抗体を、２ｍＭアジ化ナトリウムを用いてｐＨ７．２のＰＢＳ中で再構成した。
フローサイトメトリーによる架橋分子の細胞への結合試験
[0473]試薬
・抗体およびＦａｂ：
・ＢＩＬ０３純粋抗体：ＰＢＳにより１００ｕｇ／ｍＬに予め希釈する
・ＢＩＬ０３－ＡＦ６４７抗体：ＰＢＳにより１００ｕｇ／ｍＬに予め希釈する
・抗Ｈｉｓ抗体－ＦＩＴＣ（１ｍｇ／ｍＬ）（Ａｂｃａｍ Ｃａｔ＃ ａｂ１２０６、Ｃａｔ＃ ＧＲ３３６１９３９－１）
・ウサギＩｇＧ－ＦＩＴＣアイソタイプ対照（Ａｂｃａｍ Ｃａｔ＃ ａｂ３７０６、Ｃａｔ＃ ＧＲ３３５６１６０－１）
・インハウスで生成され、上清から回収される架橋分子については、下記を参照されたい。
[0474]結合アッセイのために使用される細胞株：ＪｅＫｏ－１（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２）、ＭＯＬＭ－１３（ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３７、ＣＤ１３５、ＣＤ１２３）、ＰＣ３（Ｈｅｒ２）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１）、Ｒａｊｉ（ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９Ｂ）、Ｋａｒｐａｓ２９９（ＣＤ３０）、Ｕ９３７（ＣＤ１０５）、ＨＬ６０、ＲＰＭＩ８２２６（ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ３３）。
[0475]細胞を５×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、ウェルあたり１００μＬアリコートを染色のために使用した（試験用０．５×１０６／試料）。
Figure 2024510739000069
手順
[0476]１．染色条件リスト：
・ＢＩＬ０３ｓ抗体に結合する架橋分子結合の染色およびＨｉｓタグ抗体検出
[0477]対照条件：
・ＢＩＬ０３ｓ抗体に結合する対照架橋分子の染色およびＨｉｓタグ抗体検出
・ＢＩＬ０３ｓ抗体に結合しない架橋分子の染色およびＨｉｓタグ抗体検出
・未染色細胞
[0478]２．染色手順
・細胞を氷上で１０分間、ヒトＦｃＲ遮断薬（２０％ｖ／ｖ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）でブロックし、非結合のＦＣＲ遮断薬を洗い流す。
・細胞を５０μＬの粗プレップ上清中でインキュベートし、氷上で１５分間染色する。
・細胞懸濁液をＦＡＣＳ緩衝液×２で洗浄する
・細胞懸濁液１００μＬあたり１μｇ／ｍＬのＢＩＬ０３ｓ－ＡＦ６４７および１μＬのＨｉｓ Ｔａｇ抗体で細胞を染色する。
・細胞をＦＡＣＳ緩衝液×２で洗浄する。
・細胞はＭａｃｓＱｕａｎｔ１６で分析するために用意される。
接着性レンチ－Ｘ ＨＥＫ２９３Ｔ（Ｔａｋａｒａ）細胞およびＰＥＩを用いたレンチウイルスベクターの産生
レンチ－Ｘ２９３Ｔ培地
[0479]形質導入前の細胞培養について：
[0480]高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）、４ｍＭのＬ－グルタミン、および重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ５７９６）；１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ８６３６）を含む９０％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）。
[0481]形質導入後の細胞培養について：
[0482]高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）、４ｍＭのＬ－グルタミン、および重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ５７９６）；１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ８６３６）；および１０ｍＭの酪酸ナトリウムを含む９０％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）。
[0483]プロトコール、第Ｉ部 レンチ－Ｘ ２９３Ｔ細胞レンチウイルストランスフェクション
[0484]０日目：
１．１５ｃｍディッシュあたり１．７×１０６細胞を播種し、トランスフェクション当日から翌月曜日に約８０％コンフルエントになるようにする（約１６×１０６細胞）。
[0485]１日目：
１．顕微鏡下で細胞をチェックする。細胞は、約７５～９０％のコンフルエントである必要がある。
２．培地を穏やかに吸引し、各１５ｃｍディッシュに１０％ＦＣＳを補足した新鮮な２０ｍＬのＤＭＥＭを添加し、トランスフェクション前に少なくとも２時間インキュベートする。
３．トランスフェクション手順を午後（約２．３０～４．３０ｐｍ）に行う。無血清ＤＭＥＭのアリコートを３７℃に温める。
４．混合物Ａ（プラスミドＤＮＡ溶液）と混合物Ｂ（ＰＥＩｐｒｏ溶液）を調製する。
５．下記の表に従って、混合物Ａ中のＤＭＥＭおよびプラスミドＤＮＡの必要体積を決定する。
６．必要なプレート数について各プラスミドＤＮＡ成分に必要な体積を決定する。１５ｃｍディッシュの面積は約１７５ｃｍ２である。
Figure 2024510739000072
７．混合物Ｂ（ＰＥＩｐｒｏ溶液）の各成分に必要な体積を決定する。
各１５ｃｍディッシュについて、
Figure 2024510739000073
８．ＰＥＩｐｒｏを５秒間ボルテックスし、必要に応じてスピンダウンしてチューブの底部に液体を回収する。
９．付加物を含まないＤＭＥＭ高グルコースにＰＥＩｐｒｏを添加することにより、混合物Ｂ（培地中のＰＥＩｐｒｏ）を１５ｍＬチューブ中に調製する。ＤＭＥＭにＰＥＩを添加し、数回上下に反転し、速やかに遠心沈殿する。
１０．培地にＤＮＡを添加することにより、５０ｍＬの円錐管に混合物Ａ（培地中のプラスミドＤＮＡ希釈）を調製する。上下に反転させて穏やかに混合し、速やかに遠心沈殿する。
１１．混合物Ａ（プラスミドＤＮＡ希釈）に混合物Ｂ（ＰＥＩｐｒｏ溶液）を添加することにより、トランスフェクション混合物（ＰＥＩｐｒｏ／ＤＮＡ溶液）を混合して調製する。ｐ１０００マイクロピペットを用いて、ＰＥＩｐｒｏ溶液をＤＮＡ溶液に滴加し、直ちに３～４回反転して混合する。ボルテックスはしない。
１２．室温で１５分間、３０分以内インキュベートする。この間、チューブを撹拌しない。
１３．１５分間インキュベートした後、細胞および新鮮な培地を含有するフラスコ／ディッシュにトランスフェクション混合物を添加する（可能であれば滴加する）。フラスコ／ディッシュを前後左右の動きで静かに振り混ぜる。
１４．フラスコ／ディッシュを３７℃にて５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。
[0486]２日目：
１５．トランスフェクションから１６～１８時間後、培地を交換する。１度に２枚のプレートを使用して古い培地を吸引する。２５ｍＬピペットを用いて、１０％ＦＣＳおよび１０ｍＭ酪酸ナトリウムを補充した１５ｍＬの新鮮なＤＭＥＭを注意深く添加する。
[0487]３日目、培地交換から２４時間後に初回回収する：
１６．培養フラスコ／ディッシュから上清を５０ｍＬファルコンチューブに回収する。各プレートを、１０％ＦＣＳおよび１０ｍＭｍ酪酸ナトリウムを補充した１５ｍＬの新鮮なＤＭＥＭで注意深く置換し、プレートをインキュベーターに戻す。
１７．上清を５００×ｇで４℃、１０分間遠心分離する（レンチ－Ｘ濃縮器による濃縮用）。超遠心分離について、３８００ｒｐｍで室温で３０分間遠心分離する。
１８．ウイルスを含有する上清を２０ｍＬシリンジで吸引し、０．４５μｍ ＰＥＳフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して新しい５０ｍＬファルコンチューブにろ過する。これは、（ａ）形質導入のための粗調製物として使用するか、または（ｂ）超遠心分離による濃縮、または（ｃ）レンチ－Ｘ濃縮器による濃縮に進むことができる。あるいは、粗ウイルス４℃を一晩保存し、４８時間の回収でプールする。濃縮したウイルスを－８０℃で長期間、アリコートに保存する。
１９．プレート、チューブおよびフィルターは、組織培養フードのバイオハザードバッグに入れて廃棄する。バイオハザードバッグをフードから取り出して廃棄する前に密封する。
[0488]４日目、培地交換から４８時間後に２回目を回収する：
２０．培養フラスコ／ディッシュから上清を５０ｍＬファルコンチューブに回収する。
２１．上清を２０００×ｇで室温にて３０分間遠心分離する。
２２．ウイルスを含有する上清を２０ｍＬシリンジで吸引し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して新しい５０ｍＬファルコンチューブにろ過する。これを２４時間の回収物と一緒にプールするか、または別々に処理して、（ｂ）超遠心分離による濃縮、または（ｃ）レンチ－Ｘ濃縮器による濃縮に進むことができる。
２３．プレート、チューブおよびフィルターは、組織培養フードのバイオハザードバッグに入れて廃棄する。バイオハザードバッグをフードから取り出して廃棄する前に密封する。
[0489]第ＩＩ部 レンチ－Ｘ濃縮器によるレンチウイルスの濃縮
２４．レンチウイルスを含有する上清を回収する。注意：上清には生レンチウイルスが含まれる。希望に応じて、同様のストックを一緒にプールする。５００×ｇで１０分間、短時間遠心分離するか、または０．４５μｍフィルターでろ過する。
２５．清澄な上清を滅菌容器に移し、レンチ－Ｘ濃縮器の１体積と清澄な上清の３体積を合わせる。穏やかに反転させて混合する。より大きな体積は、より大きな（すなわち、２５０ｍＬまたは５００ｍＬ）遠心管を使用することによって収容することができる。
２６．レンチ－Ｘ濃縮器とのインキュベーションを１回行う。回収時（１日後）または２日後（プール回収）のいずれか。少なくとも３０分間または一晩インキュベートし、次に、予めインキュベートした流体を遠心分離する。
２７．試料を１，５００×ｇで４℃にて４５分間遠心分離する。遠心分離後、オフホワイトのペレットを視認する。
２８．ペレットを乱さないように注意しながら上清を慎重に除去する。残りの上清は、ピペットチップまたは１，５００×ｇでの短時間の遠心分離のいずれかによって除去することができる。
２９．完全なＤＭＥＭ、ＰＢＳ、またはＴＮＥを用いて、ペレットを元の体積の１／１０～１／１００に穏やかに再懸濁する。ペレットは、最初はいくぶん粘着性であっても、急速に懸濁状態になる。
３０．直ちに試料を滴定するか、または－８０℃で使い捨てのアリコートに保存する。
ＣＡＲ Ｔ細胞生成プロトコール
[0490]ＩＬ７／ＩＬ１５を補充したＴｅｃｓＭＡＣＳ培地（両方とも１０ｎｇ／ｍＬ）中で培養したＴｒａｎｓＡｃｔ（全て製造者の指示に従う）で刺激した磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を介したＣＤ４／ＣＤ８陽性選択のＴ細胞のレンチウイルス形質導入（１：１比）によって、ｎｆＰ２ＰＸ７ ＢＲＩＤＧＥ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。ドナー供給源は軟膜であった。
[0491]ＣＡＲ Ｔ細胞は、まさに同じ方法で処理されたが、ｎｆＰ２Ｘ７ ＢＲＩＤＧＥ ＣＡＲを発現するためにレンチウイルス形質導入を受けた。活性化された非形質導入Ｔ細胞（ａＵＴ）は、ＥＧＦＲまたはＣＤ３３架橋分子とエンゲージすることができるいずれの受容体も発現しない。
[0492]仮説：
[0493]ｎｆＰ２Ｘ７ ＢＲＩＤＧＥ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＭＯＬＭ－１３白血病細胞の細胞表面上のｎｆＰ２Ｘ７認識を介して直接的にがん細胞に再方向付けされるため、ａＵＴより優れたエフェクター機能を有する。
[0494]ｎｆＰ２Ｘ７ ＢＲＩＤＧＥ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＭＯＬＭ－１３白血病細胞の表面のＣＤ３３ Ｆａｂ架橋分子上のｎｆＰ２Ｘ７ Ｅ２００由来エピトープを介してがん細胞に間接的に再方向付けされるため、ａＵＴより優れたエフェクター機能を有する。
試薬および装置の用意
[0495]ＣＡＲ Ｔ培地：ヒトＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＴｅｘＭＡＣＳ。ＩＬ－７ストック濃度は１００ｕｇ／ｍＬであり、各バイアルは５５μＬであった。ＩＬ－１５ストック濃度は５０μｇ／ｍＬであり、各バイアルは５５μＬであった。
[0496]最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５および３％ＦＢＳを含むＴｅｘＭＡＣＳを調製するために、５０ｕｌのＩＬ－７、５０ｕｌのＩＬ－１５ストック、および１５ｍＬのＦＢＳを各ボトル（５００ｍＬ）のＴｅｘＭＡＣＳ培地に添加する。培地ボトルにサイトカインを添加した日付を表示する。
[0497]回収日の凍結培地調製：１０％ＤＭＳＯ、９０％ＦＢＳ。注釈：以下のＤＭＳＯからＦＢＳの順で試薬を５０ｍＬ ｆａｌｃｏｎチューブに添加する。
第Ｉ部：Ｔ細胞の活性化およびＴ細胞の形質導入
[0498]１日目：Ｔ細胞の活性化
１．ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞を全血または軟膜から分離する。ＰＢＭＣ分離ならびにＣＤ４およびＣＤ８細胞分離のプロトコールを参照されたい。
２．ファルコンチューブを最大体積まで充填し、３００×ｇで５分間遠心分離することにより、予め加温したＴｅｘＭＡＣＳ培地（サイトカインを補充しない）でＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を２回洗浄する。上清を完全に吸引する。
３．１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５および３％ＦＢＳを補充した予め温めたＴｅｘＭＡＣＳ培地中で、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を最終濃度１０＾６細胞／ｍＬに再懸濁する。
４．ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を、２４ウェルプレート中の各ウェルに０．５ｍｌのＣＤ４＋細胞および０．５ｍｌのＣＤ８＋細胞を添加することによって１：１の比でプレートする。
５．１０μＬのＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔを細胞培養物中の最終希釈液１：１００に添加し、注意深く再懸濁する。
６．形質導入前に、５％ＣＯ２で３７℃にて約３６時間インキュベートする。
[0499]３日目：Ｔ細胞形質導入
７．可能であれば、形質導入には新鮮なウイルスベクターを使用する。そうでなければ、氷上でゆっくり凍結したウイルスベクターを解凍する。
８．ウェルの側面からＰ１０００ピペットを用いて培地８００μＬをゆっくりと取り除き、下層の細胞層を破壊しないように注意する。
９．Ｔ細胞に１５０μＬ（１プレート分のウイルスベクター）または３００μＬ（２プレート分のウイルスベクター）を滴加する。新鮮な補充ＴｅｘＭＡＣＳ培地でウェルを６００μＬまで上にし、最終濃度４μｇ／ｍＬで各ウェルにポリブレンを添加する。この時点以降、Ｔ細胞はレンチウイルスの作用のためにのみインキュベーターに入れるべきである。
１０．形質導入後、適切なクリーンアップ手順を行うべきである。表面を洗浄し、７０％エタノールにより２％Ｖｉｒｋｏｎ溶液でラインを走行させることにより、バイオセーフティキャビネットと吸引器ラインを除染する。チップおよび血清学的ピペットなどの汚染された廃棄物は、バイオセーフティキャビネット内のバイオハザードバッグに廃棄し、廃棄物を処分のために外に持ち出す前にバッグを密封する。
[0500]４日目以降－Ｔ細胞維持
１１．形質導入Ｔ細胞は、ＩＬ－７、ＩＬ－１５および３％ＦＢＳを含有するＴｅｘＭＡＣＳ培地中に維持された。
１２．２４ウェルプレートにおいてＴ細胞増殖を観察し、形質導入後の２日目に細胞をＴ７５フラスコに移す。
１３．ＣＣＳ分析器を用いて、培地中の乳酸レベルを毎日モニタリングする。乳酸レベルが１０ｍｍｏｌ／Ｌを超えた場合、新鮮な培地を補充する；理想的には、乳酸レベルを４ｍｍｏｌ／Ｌ未満に保持する。
[0501]９日目－Ｔ細胞形質導入後の５日目－発現分析
[0502]形質導入Ｔ細胞は、フローサイトメーターを用いて５日目に計数される。フローサイトメトリー分析用に試料を採取し、標準的なフローサイトメトリープロトコールに基づいて発現効率を決定する。
ルシフェラーゼを発現するがん細胞株の生成
[0503]ウイルスベクター生成に使用されるホタルルシフェラーゼレンチウイルス転移プラスミド：
・ｐＲＲＬｓｉｎ１８．ｃＰＰＴ．ＥＦ１ａ＿ホタル＿ルシフェラーゼ＿Ｔ２Ａ＿ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥ
・ｐＲＲＬｓｉｎ１８．ｃＰＰＴ．ｈＰＧＫ＿ホタル＿ルシフェラーゼ＿Ｔ２Ａ＿ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥ
１．２４ウェルプレート中の３００，０００細胞／ウェルの密度の細胞を全体積８５０μＬでプレートする。
２．レンチウイルス生成セクションに記載されているように、４プラスミドトランスフェクションプロトコールを用いて、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するウイルスベクターを生成する。可能であれば、形質導入には新鮮な濃縮ウイルスベクターを使用する。そうでなければ、氷上でゆっくり凍結したウイルスベクターを解凍する。
３．細胞に１５０μＬ（１プレート分のウイルスベクター）を滴加する。この時点以降、細胞はレンチウイルスの作用のためにのみインキュベーターに入れるべきである。
４．インキュベーター細胞を３７℃にて５％ＣＯ２でインキュベートする。
５．形質導入後、適切なクリーンアップ手順を実施すべきである。表面を洗浄し、７０％エタノールにより２％Ｖｉｒｋｏｎ溶液でラインを走行させることにより、バイオセーフティキャビネットと吸引器ラインを除染する。チップおよび血清学的ピペットなどの汚染された廃棄物は、バイオセーフティキャビネット内のバイオハザードバッグに廃棄し、廃棄物を処分のために外に持ち出す前にバッグを密封する。
６．形質導入後の２日目に、細胞をＴ２５フラスコに移す。
７．形質導入後の５日目に、細胞を計数し、フローサイトメトリーによる発現分析のための試料を採取する。
８．形質導入後７日目に、形質導入された細胞は、生細胞ソーターを用いてｅＧＦＰ発現に基づいてバルク選別される。
９．拡大後、バルク選別された細胞は、さらに、単一細胞クローンによって選別される。単一の細胞クローンを増殖させ、拡大させ、凍結させてストックを作る。
機能的アッセイ
[0504]ホタルルシフェラーゼおよびｅＧＦＰを構成的に発現する標的細胞（高性能細胞株として定義される単一細胞クローンとして選別および増殖される）は、機能アッセイにおいて、生物発光および／または蛍光を介して生存率を測定するために使用された。発光量は、生物発光における細胞の総数と相関し、フローサイトメトリーを介して同定された蛍光標的細胞は、生存細胞の総数と相関する。
[0505]エフェクター細胞および標的細胞は、指示されたエフェクター対標的比（ＥＴ）に従って播種された。指示されたＥＴ比、例えば１０：１は、常に、Ｔ細胞の総数および標的細胞の総数を参照される。ＣＡＲ発現分画は、Ｔ細胞の総数とは異なるため、ＣＡＲを発現する細胞に言及されるＥＴ比は、別個に示される。標的細胞は、９６ウェルプレートあたり２５，０００または５０，０００細胞で播種された。
ルシフェラーゼ殺滅アッセイ
[0506]エフェクター細胞および標的細胞は、指示されたエフェクター／標的比（ＥＴ）に従って播種された。ＢＲＩＤＧＥ分子は、指示された形式（Ｆａｂ、ＩｇＧ１）で、指示された濃度で添加された。Ｄ－ルシフェリンを添加し、生物発光は、インキュベーションを開始した後の指示された時点で、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３上の３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーター中の標準条件下で測定された。
[0507]細胞の生存率は、細胞の連続希釈由来の生物発光活性曲線（１００％、７５％、５０％、２５％、１０％および０％標的細胞）に従って計算され、生存細胞の割合で示された。一般的に、溶解は（試験条件の生物発光－０％生物発光）／（１００％生物発光－０％生物発光）によって計算された。
フローベースの殺滅アッセイ
[0508]エフェクター細胞および標的細胞は、指示されたエフェクター対標的比（ＥＴ）に従って播種され、ＢＲＩＤＧＥ分子は、指示された形式（Ｆａｂ、ＩｇＧ１）で指示された濃度で添加された。細胞数は、インキュベーションを開始した後の指示された時点（２４時間または４８時間）で、標準プロトコールに従って、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１６フローサイトメーター上の３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーター中の標準条件下で測定された。細胞の染色は、分析から全ての死細胞を排除するための生存色素を含んだ。Ｔ細胞はＣＤ３を介してｅＧＦＰ陽性がん細胞から明確に分化した。さらに、Ｔ細胞は、２４時間後または４８時間後に、標準的なプロトコールに従った特異的Ｔ細胞活性化の指標として、ＣＤ２５およびＣＤ６９によって特徴付けられた。最終データ分析はＦｌｏｗＪｏ１０により行われた。
[0509]抗体カクテル
Figure 2024510739000074
サイトカイン分泌のフローベースの獲得
[0510]エフェクター細胞および標的細胞は、指示されたエフェクター対標的比（ＥＴ）に従って播種され、ＢＲＩＤＧＥ分子は、指示された形式（Ｆａｂ、ＩｇＧ１）で指示された濃度で添加された。２４時間または４８時間後に上清を採取し、インキュベーションを開始した後、指示された時点で、Ｍｉｌｔｅｎｙｉサイトカインビーズを用いた標準プロトコールに従って、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１６フローサイトメーター上で３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーター内の標準条件下で測定した。最終データ分析はＦｌｏｗＪｏ１０により行われた。
実施例２－種々の架橋分子の特徴付け
[0511]図４～７の結果は、ＣＤ１９に結合することができるＦａｂまたはｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３クローン；本明細書に記載されるアミノ酸配列）の形態で標的化部分を含む架橋分子は、生細胞の表面上のＣＤ１９に結合し、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分（例えば、Ｅ２００部分）を提示することができ、その結果、抗Ｐ２Ｘ７受容体抗体（ＢＩＬ０３ｓ ２－２－１－Ｆｃ）によってアクセス可能であることを示す。機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分の位置は変化することができ、標的化部分は依然としてその標的細胞表面抗原に結合することができ、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分は抗体に結合するために依然として利用可能である。ＢＩＬ０３ｓ ２－２－１－Ｆｃ－ＡＦ６４７／ＨＩＳ－ＦＩＴＣは、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を含有しない架橋分子を制御するために結合せず、また、抗ＨＩＳ抗体は、ＨＩＳタグを含有する架橋分子を制御するために結合しなかったことに留意されたい（データを示さず）。
ＶＨ上のＦａｂ形式＋／－リンカー－エピトープ
[0512]図４は、ＶＨに直接またはリンカーを介して連結した単一のＥ２００エピトープを有するＦａｂ形式の架橋分子が、ＪｅＫｏ－１（マントル細胞リンパ腫）細胞株上のＣＤ１９に結合し、Ｅ２００エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
ＶＨ上のｓｃＦＶ形式＋／－リンカー－エピトープ
[0513]図５は、ＶＨに直接またはリンカーを介して連結した単一のＥ２００エピトープを有するｓｃＦｖ形式の架橋分子が、ＪｅＫｏ－１（マントル細胞リンパ腫）細胞株上のＣＤ１９に結合し、Ｅ２００エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
ＶＬ上のＦａｂ形式＋／－リンカー－エピトープ
[0514]図６は、ＶＬに直接またはリンカーを介して連結した単一のＥ２００エピトープを有するＦａｂ形式の架橋分子が、ＪｅＫｏ－１（マントル細胞リンパ腫）細胞株上のＣＤ１９に結合し、Ｅ２００エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
ＶＬ上のｓｃＦＶ形式＋／－リンカー－エピトープ
[0515]図７は、ＶＬに直接またはリンカーを介して連結した単一のＥ２００エピトープを有するｓｃＦｖ形式の架橋分子が、ＪｅＫｏ－１（マントル細胞リンパ腫）細胞株上のＣＤ１９に結合し、Ｅ２００エピトープが抗体に結合するために利用可能であることを示す。
種々の抗原を標的とする架橋分子
[0516]図８：種々の抗原ＣＤ３７、ＣＤ７９Ｂ、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ＰＤＬ１、ＣＤ２２、ＣＤ７０およびＣＤ２０への架橋分子の結合。（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｍ）、（ｏ）、（ｑ）、（ｓ）、（ｕ）、（ｗ）および（ｙ）は抗ＨＩＳ抗体結合を示し、（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｊ）、（ｌ）、（ｎ）、（ｐ）、（ｒ）、（ｔ）、（ｖ）、（ｘ）および（ｚ）は機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープへの抗体の結合を示す。
[0517]オトレルツズマブ由来のＣＤ３７標的化部分、ポラツズマブ由来のＣＤ７９Ｂ標的化部分、ＲＯＲ１ ＡＰＣ由来のＲＯＲ１標的化部分（国際公開第２０１６０３４４Ａ１＿Ｄ１０ｖ３）、リンツズマブ由来のＣＤ３３標的化部分、ダラツムマブ由来のＣＤ３８標的化部分、クローン３２７１６由来のＣＤ１２３標的化部分、４Ｇ８由来のＣＤ１３５標的化部分、クローンＣＡ８ Ｊ９Ｍ０由来のＢＣＭＡ標的化部分、ネシツムマブまたはマツズマブ由来のＥＧＦＲ標的化部分、アテゾリズマブ由来のＰＤＬ１標的化部分、ｍ９７Ｉ－Ｌ７由来のＣＤ２２標的化部分（またはイノツズマブ（データを示さず））、クサツズマブ由来のＣＤ７０標的化部分、タファシタマブ由来のＣＤ１９標的化部分、オファツムマブ由来のＣＤ２０標的化部分（またはオクレリズマブ（データを示さず））。これらの抗原を標的とし、直前に言及された抗体に由来する架橋分子の例示的なアミノ酸配列は、本明細書中の配列情報表に記載される。
[0518]図８は、ＪｅＫｏ－１（ＭＣＬ）野生型細胞株（ＣＤ３７、ＣＤ７９Ｂ、ＲＯＲ１）Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）野生型細胞株（ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２）、ＭＯＬＭ－１３（ＡＭＬ）野生型細胞株（ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３およびＣＤ１３５）、ＲＰＭＩ８２２６（多発性骨髄腫）野生型細胞株（ＣＤ３３、ＢＣＭＡおよびＣＤ３８）、ＭＤＡ－ＭＢ２３１（乳がん）野生型細胞株（ＥＧＦＲおよびＰＤＬ１）ならびにＰＣ－３（前立腺がん）野生型細胞株（ＥＧＦＲ）への様々な架橋分子の結合を示す。
実施例３－ＣＤ１９標的化架橋分子による細胞結合の用量依存的な増加
[0519]ＮＣＩ６０パネルの一部としてＡＴＣＣから購入したＪｅＫｏ－１（ＭＣＬ）ＣＲＬ－３００６（商標）野生型細胞株。細胞は、この特定の細胞株についての一般的な推奨および標準に従って培養された。
[0520]図９は、図示された形式でＣＤ１９標的化Ｆａｂ架橋分子によるＪｅＫｏ－１の「ペインティング」を示す。
[0521]細胞は、Ｆａｂ架橋分子とともに指示された濃度でインキュベートされた。ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子は、１０ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬでＪｅＫｏ－１において陰性対照として機能した。ＣＤ１９標的化Ｆａｂ架橋分子を１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬで使用した。
[0522]フローサイトメトリー染色は、Ｆｃブロック試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いたフローサイトメトリー染色における標準に従って２段階で行われた。最初に標的細胞は、指示された濃度で１５分間、Ｆａｂ架橋分子とともにインキュベートされ、３回洗浄され、次に二次抗体である抗ＨＩＳ ＦＩＴＣおよび単一ドメイン抗体であるＢＩＬ０３ ２－２－１ ＡＦ６４７を飽和濃度（１ｕｇ／ｍＬ）で使用して、結合したＦａｂ架橋分子上の６×ＨＩＳおよびｎｆＰ２Ｘ７ Ｅ２００由来エピトープを介して標的細胞を間接的に染色した。１５分間のインキュベート後、試料を洗浄し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ１６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上で分析した。フローデータは、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．７（ＢＤ）を介して分析された。
[0523]ＪｅＫｏ－１細胞ではＣＤ３３の発現はない。ＣＤ１９染色は、ＣＤ１９標的化架橋分子の濃度の増加に伴って発現の増加を示した。
実施例４－ＣＤ３３標的化架橋分子による細胞結合の用量依存的増加
[0524]ＮＣＩ６０パネルの一部としてＡＴＣＣから購入したＭＯＬＭ－１３（ＡＭＬ）野生型細胞株。細胞は、この特定の細胞株についての一般的な推奨および標準に従って培養された。
[0525]図１０ 図示された形式におけるＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子によるＭＯＬＭ－１３の「ペインティング」。
[0526]細胞は、Ｆａｂ架橋分子とともに指示された濃度でインキュベートされた。ＣＤ１９標的化Ｆａｂ架橋分子は、１０ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬでＭＯＬＭ－１３において陰性対照として機能したが、一方、ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子は、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬで使用された。
[0527]フローサイトメトリー染色は、Ｆｃブロック試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いたフローサイトメトリー染色における標準に従って２段階で行われた。最初に標的細胞は、指示された濃度で１５分間、Ｆａｂ架橋分子とともにインキュベートされ、３回洗浄され、次に二次抗体である抗ＨＩＳ ＦＩＴＣおよび単一ドメイン抗体であるＢＩＬ０３ ２－２－１ ＡＦ６４７を飽和濃度（１ｕｇ／ｍＬ）で使用して、結合したＦａｂ架橋分子上の６×ＨＩＳおよびｎｆＰ２Ｘ７ Ｅ２００由来エピトープを介して標的細胞を間接的に染色した。１５分間のインキュベート後、試料を洗浄し、次に、ＭＡＣＳＱｕａｎｄ１６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上で分析した。フローデータは、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．７（ＢＤ）を介して分析された。
[0528]ＭＯＬＭ－１３細胞においてはＣＤ１９の発現はない。ＣＤ３３染色は、ＣＤ３３標的化架橋分子の濃度の増加とともに発現の増加を示した。
実施例５－ｎｆＰ２Ｘ７ Ｅ２００由来ペプチドおよび架橋分子を介したマーカー遺伝子の検出および直接ＣＡＲ検出
[0529]ｎｆＰ２Ｘ７標的化架橋ＣＡＲエフェクター細胞（限定されないが、Ｔ細胞またはＮＫ細胞など）は、がん細胞を特異的に認識する。ｎｆＰ２Ｘ７において標的化されるエピトープは、Ｐ２Ｘ７タンパク質三量体の立体構造変化から生じ、がん細胞上でのみ曝露され、健康な細胞上では曝露されない。
[0530]基本原理、ならびにｎｆＰ２Ｘ７ Ｅ２００由来ペプチドタグ化架橋分子および架橋分子の異なる形式を介したｎｆＰＸ７ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞のエンゲージメントを図示し、図１～３に概説する。
[0531]したがって、架橋分子の非存在下でｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲを用いると、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞は、がん特異的標的化を示す。
[0532]ｎｆＰ２Ｘ７の機能的に陰性ながん（ｎｆＰ２Ｘ７に対して非常に低いかまたはおそらく陰性）への適用性を広げるために、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲを発現するエフェクター細胞は、ＣＤ３３に図示されるがん関連抗原またはＴｃＲ様ｍＡｂを介するがん特異的抗原を標的とする架橋分子を介してがん細胞に再方向付けされ得る。架橋分子の特異性は無制限であり、ＴｃＲ様ｍＡｂまたはリガンドを介してＭＨＣペプチド提示（クラスＩおよびＩＩ）との関連で発現された任意の表面標的抗原または提示された抗原を意味し、ｎｆＰ２Ｘ７架橋ＣＡＲを発現するエフェクター細胞を同じ作用様式でエンゲージさせることができる。
[0533]ほとんどの場合、ｎｆＰ２Ｘ７架橋ＣＡＲを発現するエフェクター細胞の二重機能が利用される。これは、シナリオＩおよびＩＩの組合せであり、ｎｆＰ２Ｘ７架橋ＣＡＲを発現するエフェクター細胞が、がん細胞上に発現されるｎｆＰ２Ｘ７を介してがん細胞に直接的にエンゲージされ、さらに、ＣＤ３３に関して図示されるがん関連抗原またはＴｃＲ様ｍＡｂを介するがん特異的抗原を標的とする架橋分子を介してがん細胞に動員されることを意味する。
実施例６－ＭＯＬＭ－１３（ＡＭＬ）野生型細胞株のＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子による「ペインティング」
[0534]図１１は、ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を介するＭＯＬＭ－１３（ＡＭＬ）細胞の「ペインティング」を示す。フローデータは、アイソタイプ対照（黒）、１ｕｇ／ｍＬでのみＢＩＬ０３ｓ ２－２－１－Ｆｃ ｓｄ－ｍＡｂによる染色（青）、およびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子とＢＩＬ０３ｓ ２－２－１－Ｆｃの組合せによる染色の増加（緑）を示す。ｎｆＰ２Ｘ７架橋ＣＡＲを発現するエフェクター細胞によって認識され得る標的分子の増加は、ＣＡＲ媒介性エフェクター機能につながる。したがって、架橋技術は、がん細胞上の標的化エピトープを増加させることによって、ＣＡＲ機能を増強する。
実施例７－リンツズマブ由来のＣＤ３３標的化架橋分子の滴定
[0535]ルシフェラーゼを恒常的に発現するＭＯＬＭ－１３細胞は、増加する濃度の、指示された濃度のＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子と共インキュベートされた。しかし、ＭＯＬＭ－１３上のＣＤ３３に結合したＦａｂ架橋分子は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）またはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）の動員に起因する直接毒性を示さない。ＭＯＬＭ－１３以外の細胞はアッセイに使用しなかった。ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子は、フルサイズ抗体のようなＣＤＣまたはＡＤＣＣのための機能的部位を有さない。
[0536]４時間後の生存率に有意な影響はなく、２４時間のインキュベーション後には一貫したまたは用量依存的な毒性は認められなかった。
実施例８－ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子によるｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化
[0537]図１２は、非形質導入Ｔ細胞（左パネル）、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫ（中央パネル；ＣＡＲ０００７は本明細書においてＣＡＲ７とも称する）およびＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａ（右パネル；ＣＡＲ０００７は本明細書においてＣＡＲ７とも称する）を発現するＴ細胞の直接比較を伴う代表的なフローサイトメトリープロットを示す。いずれのＣＡＲ Ｔ細胞も、２０：１のＥＴ比でＭＯＬＭ－１３とインキュベーションした場合に活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の発現を増加させ、４８時間後に１０００ｎｇ／ｍＬでＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を生成した。
[0538]実施例８および９の実験において使用されたＣＤ３３ Ｆａｂ架橋分子はリンツズマブに由来し、およびＥＧＦＲ標的化架橋分子はネシツムマブに由来する。機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープは、遊離Ｎ末端を有するＶＬに直接的に連結した。
[0539]ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫ ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に以下のドメイン構造を有する：ｈＰＧＫ－ＣＤ８ａ ＳＰ－ＶＨ ＢＩＬ０３ ２－２－１－ＣＤ２８－ＣＤ２８Ｔ－ＣＤ２８－ＣＤ１３７－ＣＤ３ゼータ－Ｔ２Ａ－ｔＥＧＦＲ。
[0540]ＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａ ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に以下のドメイン構造を有する：ＥＦ１ａ－ＣＤ８ａ ＳＰ－ＶＨ ＢＩＬ０３ ２－２－１－ＣＤ２８－ＣＤ２８Ｔ－ＣＤ２８－ＣＤ１３７－ＣＤ３ゼータ－Ｔ２Ａ－ｔＥＧＦＲ。
実施例９－ＣＤ３３架橋分子の存在下におけるｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞による白血病細胞のクリアランス
[0541]４８時間後の２０：１ＥＴ比でのＴ細胞およびＭＯＬＭ－１３のフローサイトメトリープロットおよび１０００ｎｇ／ｍＬでのＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子（図１２に対応する）は、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫおよびＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａの存在下で白血病細胞の完全なクリアランスを示したが、非形質導入Ｔ細胞では白血病細胞数に影響はなかった（図１３）。
[0542]図１４は、４８時間後、２０：１のＥＴ比で、ＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａを含有するＴ細胞およびＭＯＬＭ－１３の指示されたＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子濃度における白血病細胞の用量依存的クリアランスを示すフローサイトメトリープロットを示す。４０ｎｇ／ｍＬという低濃度が、２００および１０００ｎｇ／ｍＬで白血病細胞のほぼ完全な除去および白血病細胞の完全な除去を示した。
[0543]指示された濃度で、ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化架橋分子の存在下および非存在下で４８時間インキュベート後の２０：１のＥＴ比でのＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫ Ｔ細胞によるＭＯＬＭ－１３白血病細胞の特異的溶解を図１５（ａ）に示す。ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の濃度（４０、２００および１０００ｎｇ／ｍＬ）の増加について、用量依存的に有意な溶解が見出された。
[0544]指示された濃度で、ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化架橋分子の存在下および非存在下で４８時間インキュベート後の２０：１のＥＴ比でのＣＡＲ０００７＿ｈＥＦ１ａ Ｔ細胞によるＭＯＬＭ－１３白血病細胞の特異的溶解を図１５（ｂ）に示す。ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の濃度（４０、２００および１０００ｎｇ／ｍＬ）の増加について、用量依存的に有意な溶解が見出された。
[0545]滴定実験において、ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を用いて、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫによるＭＯＬＭ－１３の殺滅における影響を試験した（図１６）。ＥＧＦＲ標的化架橋分子とＣＤ３３標的化架橋分子の間の１０：１のＥＴ比での２４時間インキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率には、１０００ｎｇ／ｍＬで有意差があった。統計分析はｔ検定により行われた。図１６からのデータの代替の表現は図１７に示される。ＥＧＦＲ架橋分子の滴定に有意差はなかった（データを示さず）。ＣＤ３３架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析はＯｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙにより行われた。
[0546]滴定実験において、ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を用いて、ＭＯＬＭ－１３の殺滅におけるＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫの効果を試験した（図１８）。ＥＧＦＲ標的化架橋分子とＣＤ３３標的化架橋分子の間の２０：１のＥＴ比での２４時間インキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率には、２００ｎｇ／ｍＬと１０００ｎｇ／ｍＬで有意差があった。統計分析はｔ検定により行われた。図１８からのデータの代替の表現は図１９に示される。ＥＧＦＲ架橋分子の滴定に有意差はなかった（データを示さず）。ＣＤ３３架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析はＯｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙにより行われた。
[0547]滴定実験において、ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を用いて、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫによるＭＯＬＭ－１３の殺滅における影響を試験した（図２０）。ＥＧＦＲ標的化架橋分子とＣＤ３３標的化架橋分子の間の１０：１ＥＴ比での４８時間インキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率には、２００ｎｇ／ｍＬと１０００ｎｇ／ｍＬで有意差があった。統計分析はｔ検定により行われた。
[0548]滴定実験において、ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を用いて、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫによるＭＯＬＭ－１３の殺滅における差を試験した（図２１）。ＥＧＦＲ標的化架橋分子とＣＤ３３標的化架橋分子の間の２０：１ＥＴ比での４８時間インキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率には、２００ｎｇ／ｍＬと１０００ｎｇ／ｍＬで有意な影響があった。統計分析はｔ検定により行われた。
[0549]滴定実験において、ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を用いて、ＭＯＬＭ－１３の殺滅におけるＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａの効果を試験した（図２２）。ＥＧＦＲ標的化架橋分子とＣＤ３３標的化架橋分子の間の１０：１ＥＴ比での２４時間インキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率には、２００ｎｇ／ｍＬと１０００ｎｇ／ｍＬで有意差があった。統計分析はｔ検定により行われた。図２２からのデータの代替の表現は図２３に示される。ＥＧＦＲ架橋分子の滴定に有意差はなかった（データを示さず）。ＣＤ３３架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析はＯｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙにより行われた。
[0550]滴定実験において、ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を用いて、ＭＯＬＭ－１３の殺滅におけるＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａの効果を試験した（図２４）。ＥＧＦＲ標的化架橋分子とＣＤ３３標的化架橋分子の間の２０：１ＥＴ比での２４時間インキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率には、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬで有意差があった。統計分析はｔ検定により行われた。図２４からのデータの代替の表現が図２５に示される。ＥＧＦＲ架橋分子の滴定に有意差はなかった（データを示さず）。ＣＤ３３架橋分子の滴定に有意差があった。統計分析はＯｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙにより行われた。
[0551]滴定実験において、ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を用いて、ＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａによるＭＯＬＭ－１３の殺滅における影響を試験した（図２６）。ＥＧＦＲ標的化架橋分子による状態とＣＤ３３標的化架橋分子の間の１０：１ＥＴ比での４８時間インキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率には、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬで有意な影響があった。統計分析はｔ検定により行われた。
[0552]滴定実験において、ＥＧＦＲおよびＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を用いて、ＭＯＬＭ－１３の殺滅におけるＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａの効果を試験した（図２７）。ＥＧＦＲ標的化架橋分子とＣＤ３３標的化架橋分子の間の２０：１ＥＴ比での４８時間インキュベーション後のＭＯＬＭ－１３の生存率には、４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬで有意差があった。統計分析はｔ検定により行われた。
[0553]滴定実験において、ＥＧＦＲ標的化Ｆａｂ架橋分子を用いて、２４時間のインキュベーション後にＥＴ比１０：１でＭＯＬＭ－１３の殺滅における非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫおよびＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａエフェクター細胞の効果を試験した。３つのエフェクター細胞集団間でＥＧＦＲ架橋分子の滴定において有意差はなかった（データを示さず）。
実施例１０－ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子による種々のｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化－滴定
[0554]フローベースアッセイにおいて、活性化は、ＥＧＦＲまたはＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の存在下および非存在下の両方で、４８時間インキュベーション後に２０：１のＥＴ比で、非形質導入Ｔ細胞、ならびにＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫおよびＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａを発現するＴ細胞によって誘導されたＭＯＬＭ－１３上のＣＤ２５およびＣＤ６９発現の上方制御を測定することによって評価された。
[0555]ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫおよびＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａ発現Ｔ細胞はいずれも、非形質導入Ｔ細胞と比較して、ＥＧＦＲおよびＣＤ３３架橋分子の存在下で活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の発現の有意な増加を示した（データを示さず）。
実施例１１－ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の存在下における種々のｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞による細胞殺滅－滴定
[0556]細胞殺滅アッセイにおいて、細胞毒性は、対照と比較して、残りの白血病細胞の定量化によって測定された。４０、２００および１０００ｎｇ／ｍＬの濃度のＥＧＦＲ架橋分子で白血病細胞を除去したところ、非形質導入Ｔ細胞とＣＡＲ Ｔ細胞の間に有意差は認められなかった（図２８（ａ））。しかしながら、同濃度の４０、２００および１０００ｎｇ／ｍＬのＣＤ３３架橋分子の存在下での白血病細胞の除去は、ＣＡＲ０００７形質導入Ｔ細胞（ｈＰＧＫおよびＥＦ１ａ）と比較して、非形質導入Ｔ細胞間で有意差を示した（図２８（ｂ））。
実施例１２－ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子の存在下における種々のｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞による細胞殺滅－滴定
[0557]滴定実験において、ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を用いて、４８時間のインキュベーション後に１０：１のＥＴ比でＭＯＬＭ－１３の殺滅に対する非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫおよびＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａエフェクター細胞の効果を試験した（図２９）。ＣＤ３３架橋分子を４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にわたって滴定した結果、３つのエフェクター細胞集団間に一貫した有意差が観察された（図３０）。統計分析はＯｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙによって行われ、ＥＧＦＲ架橋分子の濃度と比較して、名付けられた３つのエフェクター細胞型の効果を比較した。
[0558]滴定実験において、ＣＤ３３標的化Ｆａｂ架橋分子を用いて、４８時間のインキュベーション後に２０：１のＥＴ比でＭＯＬＭ－１３の殺滅における非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲ０００７＿ｈＰＧＫおよびＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａエフェクター細胞の効果を試験した（図３１）。ＣＤ３３架橋分子を４０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にわたって滴定した結果、３つのエフェクター細胞集団間に一貫した有意差が観察された（図３２）。統計分析はＯｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙにより行われ、ＥＧＦＲ架橋分子の濃度と比較して、名付けられた３つのエフェクター細胞型の効果を比較した。
実施例１３－ＦａｂおよびＩｇＧ１形式で、種々の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を有するＣＤ１９標的化架橋分子の存在下でのｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞による細胞殺滅
[0559]架橋分子は、異なる形式、すなわちＦａｂおよびＩｇＧ１において、ＣＤ１９結合標的化部分を用いて生成された。さらに、これらの異なる形式の架橋分子は、異なる機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分により生成された。
[0560]これらの実験において、ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲはＣＡＲ０００７＿ＥＦ１ａ ＣＡＲに従っていたが、ＶＨ ＢＩＬ０３ ２－２－１とＣＤ２８ＴＭ（本明細書ではＣＡＲ１０として記載）との間にＣＤ８αスペーサーを有した。
[0561]これらのＣＤ１９標的化ＦａｂまたはＩｇＧ１架橋分子を用いて、ＣＡＲ１０によるＪｅＫｏ－１の殺滅における影響を試験した（図３３；（ａ）に示されるＦａｂ形式、（ｂ）に示されるＩｇＧ１形式）。機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分（すなわち、ＯＲ１９＿８、１０、および１１）を含有する１００ｎｇ／ｍＬの全ＣＤ１９標的化架橋分子間の１０：１のＥＴ比での少なくとも２４時間のインキュベーション後、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分（ＯＲ１９＿７）を持たない対照架橋分子と比較して、ＪｅＫｏ１の生存率に有意差があった。統計分析はＯｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定Ｔｕｋｅｙによって行われた。機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を含有するＣＤ１９架橋分子の滴定に有意差はなかった。他のｎｆＰ２Ｘ７ＣＡＲでも同様の結果が得られた（データを示さず）。
[0562]これらのデータは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞殺滅が、標的化部分の形態および機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分に関係なく、架橋分子によって有意に増強され得ることを示す。
実施例１４－ＣＤ１９標的化架橋分子の存在下での、Ｆａｂ形式および種々の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を有するｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞による細胞殺滅
[0563]実施例１３において上記したように、同様の実験を行ったが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分のより大きなアレイを有するＣＤ１９架橋分子を試験した。図３４に示されるように、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を含むＣＤ１９架橋分子は、標的ＪｅＫｏ－１細胞の細胞生存率を有意に減少させたが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分（ＯＲ１９＿７）を持たない対照架橋分子は減少させなかった。
[0564]異なる機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を有する（または存在しない）種々のＦａｂ架橋分子の要約を以下に示す（全てのＦａｂ軽鎖は、本明細書に記載されるＦａｂ重鎖－ＣＤ１９、タファシタマブ、Ｂ０２０－２＿ＨＣ、配列番号５２／１４３と対合される）。
[0565]
Figure 2024510739000075
Figure 2024510739000076
実施例１５－ＦａｂまたはＩｇＧ形式のＣＤ１９標的化架橋分子の存在下で異なるｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ－Ｔ細胞による細胞殺滅
[0566]３つの異なるＣＡＲアーキテクチャのうちの１つを有するＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて、実施例１３において上記したように、同様の実験を行った。図３５に示されるように、３つの異なるＣＡＲ（ＣＡＲ７、ＣＡＲ１０およびＣＡＲ１６）は、Ｔ細胞上で発現され、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を含むＣＤ１９架橋分子と組み合わされた場合、標的ＪｅＫｏ－１細胞の細胞生存率を有意に減少させた。全ての実験において、架橋分子ＯＲ１９＿１０を使用した。
[0567]これらの結果は、異なるＣＡＲアーキテクチャを有するＣＡＲ－Ｔ細胞を使用する場合、架橋分子システムが細胞生存率の減少に有効であることを示す。
実施例１６－代替の架橋分子構築物を用いた結合および細胞殺滅
[0568]本発明者らは、今度はＥ２００エピトープを標的化部分に連結する領域内にＩｇＧ１ヒンジ領域を含むさらなる世代の架橋分子を開発した。これらの架橋分子の腫瘍特異的抗原エピトープ部分の配列は、配列番号３６５～４００（下記の表４においてＢ１～Ｂ３６と呼ばれる架橋のエピトープ結合部分と相関する）に提供される。腫瘍特異的抗原エピトープ部分は、本明細書における表１に記載されるように、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ３３ Ｆａｂに連結された。
[0569]次に、架橋分子は、抗ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲと標的細胞（すなわち、標的化部分が設計される抗原を発現する細胞）の両方に結合するそれらの能力について評価された。下記の表に要約するように、全ての抗ＣＤ１９架橋分子は、Ｊｅｋｏ－１細胞（ＣＤ１９を発現する）およびｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲを発現するＴ細胞に特異的に結合することができると決定された（データは抗ＣＤ１９架橋分子のみについて示される）。
[0570]
Figure 2024510739000077
Figure 2024510739000078
Figure 2024510739000079
Figure 2024510739000080
[0571]
Figure 2024510739000081
Figure 2024510739000082
[0572]
Figure 2024510739000083
Figure 2024510739000084
[0573]その後、架橋分子の細胞死（細胞毒性）を誘発する能力を機能的に評価した。行われた実験は、実施例１１～１５に記載されたものと同様であった。
[0574]試験した全ての架橋分子は、細胞殺滅を誘導する能力を示した。したがって、データは、架橋分子が、ＪｅＫｏ－１細胞またはＭＯＬＭ－１３細胞によって発現されたＣＤ１９またはＣＤ３３抗原のいずれかに、抗ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ Ｔ細胞を再方向付けすることに成功したことを示す。代表的なデータは、図３６に示される（Ａ：抗ＣＤ１９架橋分子＋抗ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＪｅＫｏ－１細胞の細胞殺滅を示す；Ｂ：抗ＣＤ３３架橋分子＋抗ｎｆＰ２Ｘ７ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＭＯＬＭ－１３細胞の細胞殺滅を示す）。
実施例１７－本発明の二成分治療システムのインビボ効力
[0575]６～８週齢のＮＳＧマウスに、０日目に尾静脈注射を介して、マウスあたり１×１０６細胞で単一細胞選別されたレポーター細胞株ＪｅＫｏ－１＿ＬＵＣ＿ｅＧＦＰを接種した。７日目に、マウスは、ＪｅＫｏ－１生着を決定するために生物発光イメージング（ＢＬＩ）を受けた。さらに、ＢＬＩを用いて白血病負荷を定量し、７日目に処置を開始した。
[0576]マウスを以下の処置群に分けた：
１．腫瘍のみ（ＰＢＳ）
２．活性化された非形質導入Ｔ細胞
３．架橋分子（Ｅ２００エピトープを含むタファシタマブに基づく抗ＣＤ１９ Ｆａｂ）
４．活性化された非形質導入Ｔ細胞＋架橋分子
５．第３世代の抗ＣＤ１９－ＣＡＲ（ＦＭＣ６３に由来し、ＣＤ８－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζという一般的なＣＡＲアーキテクチャを有する抗原結合ドメイン）を発現するＴ細胞
６．抗ｎｆＰ２Ｘ７受容体ＣＡＲ１（抗原結合ドメイン２－２－１）を発現するＴ細胞
７．ＣＡＲ１＋架橋分子を発現するＴ細胞
８．抗ｎｆＰ２Ｘ７受容体ＣＡＲ２（抗ｎｆＰ２Ｘ７受容体ＣＡＲ抗原結合ドメイン２－２－１）を発現するＴ細胞
９．ＣＡＲ２＋架橋分子を発現するＴ細胞
１０．ＰＢＳ対照（重複）
[0577]７日目、架橋分子の腹腔内投与は、指示された群において、５０μｇ／マウスで週３回の投薬レジメンで開始した。白血病負荷を指示された時間点でＢＬＩを介して評価し、マウス血液を４２日目に分析し、循環末梢血中のがん細胞および免疫細胞を検出した。実験設計を図３７に示す。
[0578]使用された架橋分子は、実施例１４に記載された分子（すなわち、タファシタマブ由来のＦａｂで構成される標的化部分を有する）と同様のアーキテクチャ、ならびに配列番号１４３および１４５に基づくＥ２００ペプチドを含む腫瘍特異的抗原エピトープ部分を含んだ。
[0579]陽性対照（第５群）は、第３世代の抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＴ細胞を含んだ。ＣＡＲは、本明細書の他の箇所に記載されるＦＭＣ６３由来の抗原結合ドメイン（例えば、６×ＨＩＳａｇを含まない配列番号３１、および軽鎖－重鎖の配向の配列番号３２）を含み、一般的に使用されている従来のＣＡＲドメイン構造であるドメインＣＤ８－ＣＤ８ＴＭ－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ゼータを有するＦＭＣ６３由来の抗原結合ドメインを含んだ。
[0580]２つの異なるｎｆＰ２Ｘ７受容体ＣＡＲを発現するＴ細胞を再方向付けする架橋分子の能力を評価した。簡単に説明すると、ｎｆＰ２Ｘ７受容体ＣＡＲ１およびｎｆＰ２Ｘ７受容体ＣＡＲ２は、実施例８に上記したように、ＣＡＲの全般的な構造を含んだ（すなわち、Ｅ２００エピトープと結合することができる２－２－１ｓｄＡｂを含む抗原結合ドメインを有する）。
[0581]図３８は、各処置群の生物発光（腫瘍量のマーカーとして）を示す。結果は、抗ｎｆＰ２Ｘ７受容体ＣＡＲ＋抗ＣＤ１９架橋分子を発現するＴ細胞を投与されたマウスは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＴ細胞を投与されたマウスと比較して、同様に低いレベルの腫瘍量を有することを示す。
[0582]これらの結果は、インビボ設定において、本発明の架橋分子を使用して、ＣＡＲ Ｔ細胞を、代替の標的に結合するように再方向付けすることができることを実証する。この場合では、ｎｆＰ２Ｘ７受容体に方向付けられたＣＡＲ Ｔ細胞を、がん細胞上のＣＤ１９抗原に再方向付けすることに成功し、ＣＤ１９結合のための抗原結合ドメインを有するＣＡＲ Ｔ細胞と類似したレベルの治療効率を達成した。

Claims (60)

  1. （ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
    （ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
    （ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分
    を含む架橋分子と
    を含む二成分治療薬。
  2. 腫瘍特異的抗原が固形腫瘍上に発現される抗原である、請求項１に記載の二成分治療薬。
  3. 腫瘍特異的抗原が、ｎｆＰ２Ｘ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＣＬＤＮ６のいずれか１つである、請求項１に記載の二成分治療薬。
  4. （ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
    （ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
    （ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
    を含む架橋分子と
    を含む二成分治療薬。
  5. （ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
    （ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
    （ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
    を含む架橋分子と
    を含む組成物。
  6. （ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する、免疫細胞またはその前駆体と、
    （ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
    （ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
    を含む架橋分子と
    を含むキット。
  7. 架橋分子がポリペプチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の治療薬、組成物またはキット。
  8. ポリペプチドが、免疫細胞またはその前駆体によって発現される、請求項７に記載の治療薬、組成物またはキット。
  9. 架橋分子がポリペプチドであり、ポリペプチドが治療薬、組成物もしくはキット中において提供されるか、または治療薬、組成物もしくはキット中において提供される核酸によってコードされる、請求項１～６のいずれか一項に記載の治療薬、組成物またはキット。
  10. （ｉ）第１の腫瘍抗原に結合する抗原認識ドメインを含み、好ましくは、第１の腫瘍抗原が機能不全Ｐ２Ｘ７受容体である、キメラ抗原受容体と、
    （ｉｉ）（ａ）第２の腫瘍抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片と、（ｂ）第１の腫瘍抗原、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のペプチドまたは断片とを含む融合タンパク質の形態で架橋分子をコードする誘導性発現構築物と
    を含む免疫細胞またはその前駆体。
  11. （ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分と、
    （ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分と
    を含む架橋分子。
  12. 分子が融合タンパク質の形態である、請求項１１に記載の架橋分子。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の架橋分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  14. 標的化部分をコードする第１のヌクレオチド配列、および腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の核酸。
  15. 請求項１４に記載の核酸を含むベクターまたは発現構築物。
  16. 機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１５に記載のベクターまたは発現構築物。
  17. 対象における障害を処置する方法であって、対象に、
    （ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現する細胞であって、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する細胞と、
    （ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
    （ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
    を含む架橋分子と
    を投与するステップを含み、それによって対象における障害を処置する方法。
  18. 対象におけるがんを処置する方法であって、
    （ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する、免疫細胞と、
    （ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的化部分；および
    （ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
    を含む架橋分子と
    を投与するステップを含む方法。
  19. 標的細胞を殺滅する方法であって、標的細胞を
    （ａ）抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体を発現し、抗原認識ドメインが、細胞表面上に発現される腫瘍特異的抗原、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する、免疫細胞と、
    （ｂ）（ｉ）標的細胞上の細胞表面分子に結合する標的部分；および
    （ｉｉ）抗原認識ドメインの結合を受ける腫瘍特異的抗原エピトープ部分、好ましくは機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分
    を含む架橋分子
    に曝露するステップを含み、
    それによって標的細胞を殺滅する方法。
  20. 標的細胞が、がん細胞、またはＭＨＣ ＩもしくはＩＩ分子が感染性因子由来のペプチドを提示する細胞である、請求項１９に記載の方法。
  21. 標的細胞が機能不全Ｐ２Ｘ７受容体を発現しない、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. ２種以上の架橋分子が対象に投与され、各架橋分子が標的細胞上の異なる細胞表面分子に結合する標的化部分を含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 架橋分子が、注入を介して対象に送達される、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 架橋分子が、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞により発現される核酸配列によってコードされるポリペプチドである、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
  25. 核酸配列が、その誘導性発現を可能にするための誘導性プロモーターを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 架橋分子が標的細胞上の１を超えるクラスの細胞表面分子に対する標的化部分を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１もしくは１２に記載の架橋分子、または請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 架橋分子が標的細胞上の同じ細胞表面分子の１を超えるエピトープに対する標的化部分を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１もしくは１２に記載の架橋分子、または請求項１７～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. ＣＡＲの抗原認識ドメインが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合部位に付随するエピトープに結合する、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項１０に記載の免疫細胞、または請求項１７～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 機能不全Ｐ２Ｘ７受容体が、機能的Ｐ２Ｘ７受容体（例えば、野生型配列を有し、ＡＴＰ結合受容体の立体配座または折り畳みを有する受容体）のＡＴＰ結合能力と比較して、ＡＴＰ結合部位でＡＴＰに結合する能力が減少している、請求項２８に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  30. 機能不全Ｐ２Ｘ７受容体がＡＴＰ結合部位でＡＴＰに結合することができない、請求項２９に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  31. 機能不全Ｐ２Ｘ７受容体が、受容体を機能不全にさせる立体構造変化を有する、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  32. 立体構造変化が、トランス立体構造からシス立体構造へのアミノ酸の変化である、請求項３１に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  33. トランス立体構造からシス立体構造に変化したアミノ酸が、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置２１０でのプロリンである、請求項３２に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  34. 抗原認識ドメインが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置２１０にプロリンを含むエピトープに結合する、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  35. 抗原認識ドメインが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体のアミノ酸位置２００のグリシンからアミノ酸位置２１６のシステインまで（両端を含む）広がる１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する、請求項３４に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  36. ＣＡＲの抗原認識ドメインが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体またはその断片のアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性を含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  37. 抗原認識ドメインが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の断片－抗原結合（Ｆａｂ）部分のアミノ酸配列とのアミノ酸配列相同性を有する、請求項３６に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  38. 抗原認識ドメインが、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または多価ｓｃＦｖもしくは単一抗体ドメイン（ｓｄＡｂ）を含む、請求項３５または３７に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  39. シグナル伝達ドメインが共刺激受容体に由来する部分を含み、シグナル伝達ドメインが活性化受容体に由来する部分および共刺激受容体に由来する部分を含んでもよい、請求項２６～３５のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  40. 共刺激受容体が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＩＣＯＳからなる群から選択される、請求項３６に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  41. 抗原認識ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、または方法。
  42. 標的細胞上の細胞表面分子に結合する架橋分子の標的化部分が、ペプチドまたは抗体もしくは抗体断片を含むかまたはそれからなる、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１もしくは１２に記載の架橋分子、または請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
  43. 架橋分子の標的部分が、標的細胞表面上に存在するタンパク質もしくは受容体のリガンドまたは結合パートナーを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１もしくは１２に記載の架橋分子、または請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
  44. 標的化分子の結合を受ける細胞表面分子が、抗原、好ましくは、本明細書に記載される抗原である、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１もしくは１２に記載の架橋分子、または請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
  45. 標的分子の結合を受ける細胞表面分子が、タンパク質、脂質部分、糖タンパク質、糖脂質、糖質、多糖、核酸、ＭＨＣ結合ペプチド、またはそれらの組合せから選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１もしくは１２に記載の架橋分子、または請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
  46. 架橋分子の標的化部分が標的化抗体または抗体断片を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１もしくは１２に記載の架橋分子、または請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 標的化抗体または抗体断片が、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、その断片またはその修飾物から選択されてもよい、請求項４６に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
  48. 標的化抗体またはその断片がＩｇＧ１である、請求項４６または４７に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
  49. 標的化抗体またはその断片ががん細胞上の抗原に結合する、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
  50. がん細胞上の抗原が腫瘍関連抗原である、請求項４９に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
  51. 腫瘍関連抗原が、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ－３）、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３５（ＦＬＴ－３）、ＣＤ４４（ＨＣＡＭ）、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＬＥＣ１２Ａ（ＣＬＬ１）、ＬｅＹ、ＦＲｐ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ３０５（ＬＡＩＲ－１）、ＣＤ３６６（ＴＩＭ－３）、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１３３、ＣＤ５６、ＣＤ２９（ＩＴＧＢ１）、ＣＤ４４（ＨＣＡＭ）、ＣＤ４７（ＩＡＰ）、ＣＤ６６（ＣＥＡ）、ＣＤ１１２（Ｎｅｃｔｉｎ２）、ＣＤ１１７（ｃ－Ｋｉｔ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）、ＣＤ１７１（ＬＩ ＣＡＭ）、ＣＤ２００（ＯＸ－２）、ＣＤ２２１（ＩＧＦ１）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、ＣＤ２４３（ＭＲＤ１）、ＣＤ２４６（ＡＬＫ）、ＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＧＤ２、およびＥＧＦＲからなる群から選択される、請求項４７に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
  52. 架橋分子の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分が、Ｐ２Ｘ７受容体、またはＡＴＰと結合することができない隣接する正しくパッキングされたモノマー間の界面に形成される３つのＡＴＰ結合部位のうちの少なくとも１つを有するＰ２Ｘ７受容体の断片の形態で提供される、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１もしくは１２に記載の架橋分子、または請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
  53. 架橋分子の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分が、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体の断片を含むかまたはそれからなる、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、請求項１０に記載の免疫細胞、請求項１１もしくは１２に記載の架橋分子、または請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
  54. 機能不全Ｐ２Ｘ７受容体の断片が、配列番号２～３０および１６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列から選択される、請求項５３に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
  55. 機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分が、機能不全Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の結合を受けるが、機能的Ｐ２Ｘ７受容体に結合する抗体の結合を受けない、請求項５３または５４に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
  56. 架橋分子が２種以上の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分を含む、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
  57. ２種以上の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分が、同じ配列もしくは異なる配列を含むかまたはそれからなる、請求項５６に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
  58. 架橋分子が、Ｅ２００エピトープの形態の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分と、Ｅ３００エピトープの形態のさらなる機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分とを含む、請求項５７に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
  59. 架橋分子が、Ｅ２００エピトープの形態の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分と、複合エピトープの形態のさらなる機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分とを含む、請求項５７に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
  60. 架橋分子が、Ｅ２００エピトープの形態の第１の機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分と、Ｅ２００エピトープの形態のさらなる機能不全Ｐ２Ｘ７受容体エピトープ部分とを含む、請求項５７に記載の治療薬、組成物もしくはキット、免疫細胞、架橋分子、または方法。
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