MX2014001222A

MX2014001222A - Receptores coestimuladores de cambio.

Info

Publication number: MX2014001222A
Application number: MX2014001222A
Authority: MX
Inventors: Carl H June; Yangbing Zhao
Original assignee: Univ Pennsylvania
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-09-15
Also published as: US20190345219A1; CL2014000195A1; WO2013019615A3; AU2012290342A1; US10981969B2; WO2013019615A2; CN107266584A; EP2736540A2; GT201400015A; EP3915588A1; CN107266584B; JP2021192623A; JP2014524234A; EP3549611A1; IL230496A0; JP2018148896A; US20140219975A1; CN104114233A; ECSP14013186A; CO6862107A2

Abstract

La presente invención se refiere de una manera general a una proteína de fusión que cuando se manifiesta en una célula puede convertir una señal negativa en una señal positiva en la célula. La proteína de fusión es una proteína quimérica caracterizada porque la proteína comprende por lo menos dos dominios, en donde el primer dominio es un polipéptido que está asociado con una señal negativa y el segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva. De este modo, la invención comprende receptores de cambio que son capaces de cambiar las señales negativas a señales positivas para la potenciación de una respuesta inmune.

Description

RECEPTORES CO ESTIM ULADO RES DE CAMBIO Referencia Cruzada a las Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Estadounidense de Serie No. 61 /513,259, presentada el 29 de julio de 201 1 , cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

Antecedentes de la Invención El principio general del sistema inmune es que las células T perciben su microambiente y luego son activadas o inhibidas, dependiendo de las señales que perciben . La familia de genes CD28 está comprendida por 2 genes que transmiten señales positivas, CD28 e ICOS, y 3 genes que proporcionan señales negativas: CTLA4, PD- 1 y BTLA ( Riley et al . , 2005, Blood 1 05 : 1 3-21 ). Los ligandos para PD- 1 son PDL 1 y P FL2. Es bien sabido que los ligandos PD- 1 se expresan a menudo en el microambiente tumoral , y que la conexión de PD- 1 en las células T mediante PDL1 o PDL2 puedan conllevar a la inactivación de la célula T.

En la actualidad el único planteamiento para evitar las señales negativas suministradas por PD-1 o los ligandos BTLA es proporcionar anticuerpos antagonistas o prote ínas de fusión que se unen a PD-1 o BTLA, un planteamiento que ahora está siendo probado en ensayos de fase temprana (Cheever et al . , 2008, I mmunol Rev 222 :357-68) . Otro planteamiento sería proporcionar compuestos de moléculas pequeñas que pueden inhibi r la transducción de la señal PD-1 o la transducción de la señal BTLA. Los actuales planteamientos para evitar la inactivación de la célula T mediante PD-1 es proporcionar un tratamiento sistémico al paciente con anticuerpos antagonistas PD-1.

Los dos planteamiento mencionados tienen limitaciones en el sentido de que las células T que residen tanto en el microambiente tumoral así como en todo el sistema inmune se evita que sean inactivadas mediante el tratamiento sistémico, y se espera que esto conlleve a la autoinmunidad o síndromes inflamatorios sistémicos en algunos pacientes (Beck et al., 2006, J. Clin Oncol 24:2283-9; Blansfield et al., 2005, J. Immunother 28:593-8; Dougan et al., 2009, Annual review of Immunology 27::83-117).

De este modo, existe la necesidad urgente en la técnica de composiciones y métodos para una forma efectiva de una terapia adoptiva. La presente invención se enfoca en esta necesidad.

Breve Resumen de la Invención La presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en donde el primer dominio es un polipéptido que está asociado con una señal negativa y el segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva.

En una modalidad, el primer dominio es por lo menos una porción del dominio extracelular del polipéptido que está asociado con una señal negativa y el segundo dominio es por lo menos una porción del dominio intracelular del polipéptido que está asociado con una señal positiva.

En una modalidad, la proteína de fusión comprende además un dominio de transmembrana. En otra modalidad , el dominio de transmembrana es el dominio de transmembrana del polipéptido que está asociado con una señal negativa o el dominio de transmembrana del polipéptido que está asociado con una señal positiva.

En una modalidad, el polipéptido que está asociado con una señal negativa se selecciona del grupo que consiste de CTLA4, PD- 1 y BTLA.

En una modalidad , el polipéptido que está asociado con una señal positiva se selecciona del grupo que consiste de CD28 e ICOS.

La invención proporciona además una célula diseñada para expresar una prote ína de fusión que comprende un pri mer domi nio y un segundo dominio, en donde el primer dominio es un polipéptido que está asociado con una señal negativa y el segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva.

En una modalidad, la célula comprende además un receptor de antígeno quimérico (CAR) , en donde el CAR comprende un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico y un dominio intracelular de la cadena CD3-zeta.

La invención proporciona además un vector que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en donde el primer dominio es un polipéptido que está asociado con una señal negativa y el segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva.

La invención proporciona un método para tratar un paciente con cáncer. En una modalidad, el método comprende administrar a un paciente una célula T genéticamente diseñada para expresar una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en donde el primer dominio es un polipéptido que está asociado con una señal negativa y el segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva.

En una modalidad , la célula T es además genéticamente diseñada para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico y un dominio intracel ular de la cadena CD3-zeta .

En una modalidad , la cél ula T es un cél ula T autóloga .

Breve Descripción de los Di bu jos La siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención se entenderá mejor cuando se lea conjuntamente con los dibujos que se acompañan. Con la finalidad de ilustrar la invención , se muestran en los dibujos las modalidades que son actualmente preferidas. Deberá entenderse, sin embargo, que la invención no está limitada a los arreglos e instrumentaciones precisos de las modalidades mostradas en los dibujos.

La Figura 1 , que comprende las Figuras 1 A hasta 1 C, es una serie de imágenes que demuestran que la señal BTLA puede converti rse en otras señales en forma de un receptor coestimulador quimérico (CCR) o referido por el contrario como un receptor de cambio. La Figura 1 A es una imagen que ilustra una representación esquemática de receptores de cambio quiméricos. La Figura 1 B es una imagen que demuestra que la expresión de superficie de BTLA fue detectada mediante proteína de fusión HVEM-Fc en un momento diferente como se i ndicó. La Figura 1 C es una imagen que ilustra el I L-2 producido mediante células T sometidas a electroporación que fueron ya sea estimuladas con una l ínea celular negativa de ligando BTLA (KTP 1 oCD86A2) o una l ínea celular positiva HVEM de ligando BTLA (KTP 1 oCD86A2 HVEM). Veinticuatro horas posteriores a la estimulación , se examinó la producción de I L mediante ELISA. Los resultados mostraron que fusionando el dominio extracelular de BTLA con ios dominios intraceiulares de tanto ICOS como CD3 zeta, las cél ulas T pudieron activarse mediante esti mulación de una l ínea celular que expresa HVEM de ligando BTLA, la señal BTLA de indicación podría converti rse en otras señales en forma de un receptor coestimulador qui mérico.

La Figura 2, que comprende las Figuras 2A hasta la 2C, es una serie de imágenes que demuestran que la señal BTLA puede convertirse en una señal CD28 hasta BTLA-CD28 CCR.

La Figura 3, que comprende las Figu ras 3A y 3B, es una serie de imágenes que demuestran que la señal BTLA se puede convertir en señal ICOS hasta BTLA-ICOS CCR. Los resultados mostraron que la señal ICOS convertida a parti r de BTLA-ICOS mejoró la producción de la célula Th 1 7.

La Figura 4, que comprende las Figuras 4A hasta la 4D, es una serie de imágenes que demuestran que las señales PD1 pueden convertirse en señales CD28.

La Figura 5, que comprende las Figuras 5A y 5C, es una serie de imágenes que demuestran la inversión de la inhibición de PD1 mediante co-introducción de PD1-CD28 CCR.

La Figura 6, que comprende las Figuras 6A hasta 6C, es una serie de imágenes que demuestran la conversión de la señal PD1 en señal ICOS.

La Figura 7 es una imagen que demuestra que el efecto inhibidor de PD1wt en la producción de citoquina es rescatado por los constructos quiméricos de PD1.

La Figura 8 es una imagen que demuestra que ios receptores quiméricos de PD-1 no afectan la producción de la granzima B.

La Figura 9 es una imagen que demuestra que las diferencias mínimas se observaron en la actividad de matanza de las células T CD8 en presencia o ausencia de PD1.

La Figura 10 es una imagen que muestra el efecto de los receptores quiméricos de PD-1 en la proliferación de la célula T.

La Figura 11 es una imagen que muestra que el receptor quimérico PD1-CD28 aumenta el número de células T CD8.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere por lo general a un receptor de proteína de fusión que cuando se presenta en una célula puede convertir una señal negativa en una señal positiva para la célula. La proteína de fusión es una proteína quimérica en la que la proteína comprende por lo menos dos dominios, en donde el primer dominio es un polipéptido que está asociado con una señal negativa y el segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva. En una modalidad, el primer dominio se une con un factor de inhibición y activa la proteína de fusión , en donde la señal se envía a través del segundo dominio dando como resultado una señal positiva transmitida a la célula. De esta manera, la prote ína de fusión es capaz de converti r una señal de otro modo negativa en una señal positiva en la célula. De este modo, se puede considerar que la invención abarca una respuesta inmune. La mejora de una respuesta inmune puede tratar una enfermedad asociada con una respuesta inmune inadecuada.

La invención se basa en el descubrimiento de que las células T pueden ser diseñadas de modo que expresen un receptor de cambio para ap rovechar el hecho de que las células T son capaces de percibir su microambiente al ser activadas o inhibidas dependiendo de las señales que perciben. Por ejemplo, la presente invención aprovecha el hecho de que hay ligandos presentes en el microambiente tumoral que inhiben la actividad de las células T. Las células T están diseñadas para expresar un receptor de cambio, en donde el primer dominio es capaz de ser activado por los ligandos inhibidores en el microambiente tumoral y cambia la señal de otra forma inhibidora en una señal positiva a la célula T mediante señalización por el segundo dominio del receptor de cambio. De este modo, la invención proporciona una terapia que proporciona un índice terapéutico mejorado con menos toxicidad así como la capacidad para proporcionar un tratamiento de una sola vez que es efectivo, y evita la necesidad de la administración continua de anticuerpos.

En algunos casos, las células son generalmente modificadas antes de administrarlas a un paciente que las necesita. Preferentemente, la célula puede ser genéticamente modificada para expresar de manera estable un receptor de cambio deseado de la invención. En otros casos, las células se pueden modificar adicionalmente para expresar un dominio de unión a anticuerpo en su superficie, confiriendo una novedosa especificidad de antígeno que es independiente de HC (por ejemplo, receptores de antígeno quimérico (CAR)). El CAR combina un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico con un dominio intracelular de la cadena CD3-zeta o una proteína FcyRI en una única proteína quimérica. En este contexto, la célula es diseñada para expresar tanto un receptor de cambio como un CAR.

Las células modificadas de la invención son capaces de replicarse ¡n vivo dando como resultado una persistencia de largo plazo que puede conllevar al control tumoral sostenido.

La presente invención proporciona además métodos para hacer los presentes receptores de cambio, y los métodos para usar estos receptores de cambio en el estudio y el tratamiento del cáncer.

Definiciones Salvo que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado que el normalmente conocido por una persona de entendimiento común de la técnica a quien se dirige la invención . Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí se pueden usar en la práctica para el examen de la presente invención , los materiales y los métodos preferidos se describen aqu í. Al describi r y reivindicar la presente invención , se usará la siguiente terminolog ía.

Se entenderá además que la terminolog ía usada en la presente es con la finalidad de describi r modalidades particulares solamente , y no pretende ser limitante.

Los artículos "un" y "uno" se usan aqu í para referi rse a uno o a más de uno (es deci r, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo . A modo de ejemplo , "un elemento" se refiere a un elemento o más de un elemento.

"Aproximadamente" se usa en la presente cuando se refiere a un valor mensurable tal como una cantidad , una duración temporal , y similares, abarca variaciones de ±20% o ±1 0%, más preferentemente ±5%, i ncluso más preferentemente ±1 %, e incluso más preferentemente ±0.1 % del valor especificado, en la medida que dichas variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados.

El término "anticuerpo", según se usa en la presente, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente con un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son típicamente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos en la presente invención pueden existir en una variedad de formas incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)2, así como anticuerpos de una sola cadena y anticuerpos humanizados (Harlow et al., 1999, En: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, En: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).

El término "antígeno" o "Ag" según se usa en la presente se define como una molécula que provoca una respuesta inmune. Esta respuesta inmune puede comprender ya sea una producción de anticuerpo, o la activación de las células específicas inmunológicamente competentes, o ambas. El experto en la técnica entenderá que cualquier macromolécula, incluyendo virtualmente todas las proteínas o péptidos, pueden servir como un antígeno. Más aún, los antígenos pueden ser derivados de ADN recombinante o genómico. Un experto en la técnica entenderá que cualquier ADN, que comprenda una secuencia de nucleótido o una secuencia parcial de nucleótido que codifica una proteína que provoca una respuesta inmune codifica por lo tanto un "antígeno", como el término que se usa en la presente. Además, un experto en la técnica entenderá que un antígeno no necesita ser codificado únicamente por una secuencia de nucleótido de longitud completa de un gen. Es fácilmente evidente que la presente invención incluye, pero no se limita a, el uso de secuencias parciales de nucleótido de más de un gen y que estas secuencias de nucleótido están dispuestas en varias combinaciones para provocar la deseada respuesta inmune. Además, un experto en la técnica entenderá que un antígeno no necesita ser codificado por un "gen" en absoluto. Es fácilmente evidente que un antígeno puede ser generado sintetizado o puede derivarse a partir de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, pero no limitarse a una muestra de tejido, una muestra de tumor, una célula o un fluido biológico.

El término "efecto antitumoral" según se usa en la presente, se refiere a un efecto biológico que se puede manifestar mediante una disminución del volumen del tumor, una disminución del número de células tumorales, una disminución del número de metástasis, un aumento de la expectativa de vida, o una mejora de varios síntomas fisiológicos asociados con la condición cancerosa. Un "efecto antitumoral" también se puede manifestar mediante la capacidad de los péptidos, los polinucleótidos, las células y los anticuerpos de la invención en la prevención de la ocurrencia de un tumor en primer lugar.

Según se usa en la presente, el término "autólogo" se puede usar para referirse a cualquier material derivado del mismo individuo a quien este material se va a reintroducir luego.

"Alogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal diferente de la misma especie.

"Xenogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

Según se usa en la presente, "biológicamente activo o inmunológicamente activo" se refiere a proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención que tienen una función estructural similar (pero no necesariamente en al mismo grado), y/o una función reguladora similar (pero no necesariamente al mismo grado) que las proteínas individuales de tipo natural que son los bloques de construcción de las proteínas de fusión de la presente invención.

El término "cáncer", según se usa en la presente, se define como una enfermedad caracterizada por el rápido y descontrolado crecimiento de las células aberrantes. Las células se pueden expandirse localmente o mediante la corriente sanguínea y el sistema linfático hacia otras partes del cuerpo. Ejemplos de varios cánceres incluyen pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares.

Mediante "proteína quimérica" se refiere a una única unidad de polipéptido que comprende dos dominios de polipéptido distintos, en donde los dos dominios no se presentan de manera natural dentro de la misma unidad de polipéptido. Típicamente, dichas proteínas quiméricas se hacen mediante la expresión de un constructor de cADN pero podrían hacerse mediante métodos de síntesis de proteína conocidos en la técnica.

El término "derivado" según se usa en la presente en relación con la secuencia de aminoácido se refiere a la modificación química de una prote ína de fusión de la invención .

"Codificar" se refiere a la propiedad inherente de las secuencias específicas de los nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen , un cADN , o un ARN m , para servir como patrones para la s íntesis de otros pol ímeros y macromoléculas en los procesos biológicos que tienen ya sea una secuencia definida de nucleótidos (es deci r, rARN .tARN y ARN m) o una secuencia definida de ami noácidos y las propiedades biológicas que resultan de las mismas . De este modo, el gen codifica u na proteína si la transcripción y el traslado del ARNm que corresponde con ese gen producen la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena de codificación , cuya secuencia de nucleótido es idéntica a la secuencia del ARNm y se proporciona usualmente en la lista de secuencias , como la cadena que no codifica, usadas como patrón para la transcripción de un gen de cADN , se pueden referir como las que codifican la proteína u otro producto de ese gen o cADN .

Salvo que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido" incluye todas las secuencias de nucleótido que son versiones degeneradas de cada una y que incluyen la misma secuencia de aminoácido. Las secuencias de aminoácido que codifican las proteínas y el ARN pueden incluir intrones.

"Cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se usa en la presente de manera intercambiable, y se refiere a una cantidad de un compuesto, formulación, material, o composición, como se describe aquí efectiva para conseguir un resultado biológico particular. Dichos resultados pueden incluir, pero sin limitación, la inhibición de la infección viral según se determina mediante cualquier medio apropiado en la técnica.

Según se usa en la presente "endógeno" se refiere a cualquier material a partir de o producido dentro de un organismo, célula, tejido o sistema.

Según se usa en la presente, el término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido a partir de o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.

El término "expresión" según se usa en la presente se define como la transcripción y/o traslado de una secuencia de nucleótido particular accionada por su promotor.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende las secuencias de control de expresión operativamente enlazadas con una secuencia de nucleótido que se va a expresar. Un vector de expresión comprende suficiente elementos en cis para la expresión; otros elementos para expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo desn udos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados) que incorporan el polinucleótido recombinante .

Según se usa en la presente, el término "prote ína de fusión" se refiere a prote ínas quiméricas que comprenden secuencias de aminoácido de dos o más proteínas diferentes. Típicamente , las proteínas de fusión son el resultado de técnicas de recombinación in vitro bien conocidas en la técnica.

"Homólogo" como se usa en la presente, se refiere a la identidad secuencia de subunidad entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como, dos moléculas de ADN o dos moléculas de RNA, o entre dos moléculas de polipéptido. Cuando una posición de subunidad en las dos moléculas es ocupada por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homologas en esa posición . La homolog ía entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homologas; por ejemplo , si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un pol ímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homologas, las dos secuencias son 50% homologas , si 90% de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10), son coincidentes u homologas, las dos secuencias son 90% homologas.

El término "reacción inmune", según se usa en la presente, se refiere al resultado detectable de estimular y/o activar una célula inmune.

"Respuesta inmune", según el término que se usa en la presente , se refiere a un proceso que da como resultado la activación y/o invocación de una función efectora en cualquiera de las células T, células B, células asesinas naturales (N K), y/o células que presentan antígeno. De este modo, una respuesta inmune, como lo entendería un experto en la técnica, incluye pero sin limitación, cualquier activación detectable específica de antígeno o alogénica de una respuesta de célula T auxiliares o cél ula T citotóxica, la producción de anticuerpos, la activación mediada por células T de reacciones alérgicas y similares .

"Célula inmune", según el término q ue se usa en la presente, se refiere a cualquier célula involucrada en el montaje de una respuesta inmune. Dicha célula incluye, pero sin limitación , células T, células B, células NK, células que presentan antígeno, y similares.

Según se usa en la presente , un "material de instrucción" incluye una publicación , una grabación , un diagrama, o cualquier otro medio de expresión que se puede usar para comunicar la utilidad de las composiciones y métodos de la invención . El material de instrucción del kit de la invención puede , por ejemplo ser fijado a un recipiente que contiene el ácido nucleico, el péptido y/o la composición de la invención o ser transportado junto con un recipiente que contiene el ácido nucleico, el péptido y/o la composición. Alternativamente, el material de instrucción puede ser transportado de manera separada del recipiente con la intención de que el material de instrucción y el compuesto se usen de manera cooperativa por el receptor.

"Aislado" se refiere alterado o removido del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido que se presenta de manera natural en un animal vivo no es "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural es "aislado". Un ácido nucleico o proteína aislado puede existir en una forma sustanciaimente purificada, o puede existir en un ambiente no natural tal como, por ejemplo, una célula huésped.

En el contexto de la presente invención, se usan las siguientes abreviaciones para las bases de ácido nucleico que se presentan de manera común. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina, y "U" se refiere a uridina.

A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido" incluye todas las secuencias de nucleótido que son versiones degeneradas una de otra y que codifican la misma secuencia de aminoácido. La frase secuencia de nucleótido que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótido que codifica la proteína puede en alguna versión contener un (unos) intrón(es).

Un "lentivirus" según se usa en la presente se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus en ser capaces de infectar células que no se dividen; pueden suministrar una cantidad significativa de información genética en el ADN de la célula huésped, de modo que son uno de los métodos más eficientes de un vector de suministro de gen. HIV, SIV y FIV son todos ejemplos de lentivirus. Los vectores derivados de lentivirus ofrecen los medios para conseguir niveles significativos de transferencia genética in vivo.

El término "que modula" una respuesta inmune, según se usa en la presente, se refiere a mediar un aumento o disminución detectable en el nivel de una respuesta inmune en un mamífero comparado con el nivel de una respuesta inmune en el mamífero en ausencia de un tratamiento o compuesto, y/o comparado con el nivel de una respuesta inmune en un mamífero de otro modo idéntico per no tratado. El término comprende perturbar y/o afectar una señal nativa o respuesta mediando de este modo una respuesta terapéutica beneficiosa en un mamífero, preferentemente, un humano.

"Señal negativa", según se usa en la presente, se refiere a una señal que induce la cascada típica de eventos intracelulares asociados con entre otras cosas, la disminución de la proliferación, diminución de la activación, disminución del proceso celular, y similares.

"Señal positiva", según se usa en la presente, se refiere a una señal que induce la cascada típica de eventos intracelulares asociados con entre otras cosas el aumento de la proliferación, aumento de la activación , aumento del proceso celular, y similares.

El término "unido operativamente" se refiere al enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que da como resultado una expresión de este último. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico se une operativamente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor se une operativamente con una secuencia de codificación si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación . Por lo general , las secuencias de ADN operativamente unidas son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones que codifican la proteína en el mismo marco de lectu ra.

La administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, por ejemplo, inyección subcutánea (s.c) , intravenosa (i .v.) , intramuscular (i . m .) , o intraesternal , o técnicas de infusión .

El término "polinucleótido" según se usa en la presente se define como una cadena de nucleótidos. Más aún, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. De este modo, los ácidos nucleicos y los polinucleótidos según se usan aquí son intercambiables. Un experto en la técnica tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que se pueden hidrolizar en los "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos pueden ser hidrolizados en nucleósidos. Según se usa en la presente, los polinucleótidos incluyen, pero sin limitación , todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen mediante cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, pero sin limitación , medios recombinantes , es decir, la clonación de las secuencias de ácido nucleico a partir de una biblioteca recombinante o un genoma de célula, usando tecnología de clonación común y PCR™, y similares, y mediante medios sintéticos .

Según se usa en la presente, los términos "péptido", "poli péptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable , y se refieren a un compuesto que comprende residuos de aminoácido covalentemente enlazados por enlaces de péptido. Una proteína o péptido tiene que contener por lo menos dos aminoácidos , y no se colocan ninguna limitación en el número máximo de aminoácidos que pueden comprender una secuencia de proteína o de péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces de péptido. Según se usa en la presente , el térmi no se refiere tanto a las cadenas cortas , que comúnmente son referidas en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a las cadenas más largas, que por lo general están referidas en la técnica como proteínas, de las cuales hay muchos tipos . Los "polpéptidos" incluyen , por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos, o una combinación de los mismos.

El término "promotor" según se usa en la presente está definido como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótido.

Según se usa en la presente, el término "promotor/secuencia reguladora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto del gen operativamente unido con el promotor/secuencia reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser el promotor de núcleo y en otros casos, esta secuencia puede incluir además una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto del gen. El promotor/secuencia reguladora puede ser, por ejemplo, aquella que expresa el producto del gen de una manera específica de tejido.

Un promotor "constitutivo" es una secuencia de nucleótido que, se une operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto de gen, hace que se produzca el producto de gen en una célula bajo la mayoría de o todas las condiciones fisiológicas de la célula.

Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótido que, cuando se une operativamente con un polinucleotido que codifica o especifica un producto de gen, hace que se produzca el producto de gen en una célula sustancialmente solo cuando un inductor que corresponde con el promotor está presente en la célula.

Un promotor "específico de tejido" es una secuencia de nucleótido que, cuando se une operativamente con un polinucleotido codificado o especificado por un gen, hace que se produzca el producto de gen en una célula sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo de tejido que corresponde con el promotor.

El término "sujeto" está destinado a incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmune (por ejemplo mamíferos).

Según se usa en la presente, una célula "sustancialmente purificada" es una célula que está esencialmente libre de otros tipos de célula. Una célula sustancialmente purificada se refiere además a una célula que ha sido separada de otros tipos de célula que se asocia normalmente en su estado de presentación natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a la célula que ha sido separada de las células con la que se asocian de manera natural en su estado natural. En algunas modalidades, las células se cultivan in vitro. En otras modalidades, las células no se cultivan in vitro.

El término "terapéutico" según se usa en la presente se refiere a un tratamiento y/o profilaxis. Un efecto terapéutico se obtiene mediante supresión, remisión o erradicación de un estado de enfermedad.

El término "transfectado" o "transformado" o "transducido" según se usa en la presente se refiere a un proceso mediante el cual el ácido nucleico exógeno es transferido o introducido en la célula huésped. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es aquella que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula sujeto primaria y su progenie.

La frase "bajo control transcripcional" o "unido operativamente" según se usa en la presente significa que el promotor está en ia ubicación y orientación correcta en relación con un polinucleótido para controlar la iniciación de la transcripción mediante polimerasa de RNA y la expresión del polinucleótido.

Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado que se puede usar para suministrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Los numerosos vectores son conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. De este modo, el término "vector" incluye un plásmido de replicación autónoma o un virus. El término también debe interpretarse para incluir compuestos no plásmidos y no virales que facilitan la transferencia del ácido nucleico en las células, de modo que, por ejemplo, los compuestos de polilisina, liposomas, y similares. Ejemplos de vectores virales incluyen, pero sin limitación, vectores adenoviral, vectores de virus adeno-asociados, vectores retrovirales, y similares.

Mediante el término "estimulación" se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) con su ligando cognado mediando de este modo un evento de transducción de señal, tal como, pero sin limitación, transducción de señal vía el complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar la expresión alterada de ciertas moléculas, tal como regulación descendente de TGF-ß, y/o reorganización de las estructuras de citoesqueleto, y similares.

"Activación", según se usa en la presente, se refiere al estado de una célula T que ha sido suficientemente estimulada para inducir la proliferación celular detectable. La activación también se puede asociar con una producción de citoquina inducida, y funciones efectoras detectables. El término "células T activadas" se refiere, entre otras cosas, a las células que experimentan división celular. La activación también se puede asociar con la generación de una respuesta inmune (por ejemplo, un mitógeno tal como ConA o PHA), marcadores de superficie detectablemente regulados en forma ascendente, tales como CD25, es decir, el receptor IL2, inicia una cascada de fosforilación que comprende p56lck, origina la liberación de citoquinas e interleucinas, aumenta la síntesis del ADN la cual puede evaluarse, entre otros métodos, evaluando el nivel de incorporación de 3H.timid¡na en hebras de ADN nacientes, y origina que proliferen las células.

El término "se une específicamente", según se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo, o ligando, que reconoce y se une con una pareja de unión cognado (por ejemplo, una molécula estimuladora y/o co-estimuladora presente en una célula T) presente en una muestra, pero cuyo anticuerpo o ligando no reconoce sustancial mente o se une a otras moléculas en la muestra.

Rangos; en toda esta divulgación , se pueden presentar varios aspectos de la invención en un formato de rango. Deberá entenderse que la descripción en un formato de rango es simplemente por conveniencia y brevedad y no deberá interpretarse como una imitación inflexible en el ámbito de la invención. En consecuencia, la descripción de un rango deberá considerarse que ha divulgado espec íficamente todos subrangos posibles así como los valores numéricos individuales dentro de dése rango. Por ejemplo, la descripción de un rango tal como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5 , de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc. , así como los números individuales dentro de ese rango, por ejemplo, 1 , 2 , 2.7 , 3, 4, 5 , 5.3 y 6. Esto se aplica i ndependientemente de la amplitud del rango.

Descri pción La presente invención se refiere al descubrimiento de que un receptor quimérico de cambio puede ser diseñado para cambiar una señal de transducción de señal negativa en una señal positiva. En una modalidad, el receptor de cambio en una proteína quimérica que comprende una primera proteína o fragmento de la misma asociada con una señal negativa y una segunda proteína o fragmento de la misma asociada con una señal positiva. Un ejemplo de proteína asociada con una señal negativa incluye pero sin limitación CTLA-4, PD- 1 , BTLA, y similares . Un ejemplo de una proteína asociada con una señal positiva incluye pero sin limitación CD28 , ICOS , y similares.

La invención se refiere a receptores de cambio quiméricos y las proteínas de fusión relacionadas, y a los métodos para tratar el cáncer con estas proteínas.

En una modalidad, la invención proporciona una célula (por ejemplo, célula T o célula asesina natu ral) diseñada para expresar un receptor de cambio quimérico en donde la cél ula diseñada presenta una propiedad antitumoral . En algunos casos , la cél ula diseñada también está diseñada para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) . En algunos casos , la célula diseñada de la invención presenta una producción mejorada de I L-2 e I FN-?. En algunos casos, la célula diseñada de la invención está polarizada para secretar I L- 1 7. Por lo tanto, la célula diseñada de la invención cuando se infunde en un paciente puede eliminar las células tumorales in vivo en el paciente.

Composiciones La presente invención proporciona, en un aspecto, un receptor de cambio que cuando se expresa en una célula convierte una señal negativa en una señal positiva en la célula. Por ejemplo, este receptor de cambio tiene un primer dominio que comprende un polipéptido que suministra una señal negativa; y un segundo dominio que comprende un polipéptido que suminstra una señal positiva.

En una modalidad, un polipéptido que tiene la capacidad de suministrar una señal negativa incluye pero sin limitación CTLA4 PD-1 , BTLA, y similares.

En una modalidad , un polipéptido que tiene la capacidad de suministrar una señal positiva incl uye pero sin limitación ICOS , CD28, y similares.

Los primeros dominios apropiados en el contexto de un polipéptido que suministra una señal negativa incluyen variantes o derivados de CTLA4 de tipo natural . Preferentemente , el primer dominio de! receptor de esta modalidad es por lo menos una porción del dominio extracelular de la prote ína CTLA, específicamente esa porción del dominio extracelular que es necesaria para la unión al ligando natural de CTLA. Las variantes de tipo natural del dominio extracelular, o la porción del domino extracelular responsable de la unión con el ligando natural de CTLA, también se incluyen en la presente invención , con tal que la variante proporcione un nivel similar de actividad biológica como la proteína de tipo natural .

Los primeros dominios apropiados en el contexto de un polipéptido que suministra una señal negativa incluyen variantes o derivados de PD- 1 de tipo natural . Preferentemente, el primer dominio del receptor de cambio de esta modalidad es por lo menos una porción del dominio extracelular de la proteína PD- 1 , específicamente aquella proteína del dominio extracelular que es necesaria para la unión con el ligando natural de PD-1 . Las variantes de tipo natural del dominio extracelular, o la porción del dominio extracelular responsable de la unión con el ligando natural de PD- 1 también se incluyen en la presente invención , con tal que la variante proporcione un nivel similar de actividad biológica como la proteína de tipo natural .

Los pri meros dominios apropiados en el contexto de un polipéptido que suministra una señal negativa incluyen variantes o derivados de BTLA de tipo natural . Preferentemente, el primer dominio del receptor de cambio de esta modalidad es por lo menos una porción del dominio extracelular de la proteína BTLA, específicamente aquella porción del dominio extracelular que es necesaria para la unión con el ligando natural de BTLA. Las variantes de tipo natu ral del domi nio extracelular, o la porción del dominio extracelular responsable para la unión con el ligando natural de BTLA, también están incluidas en la presente invención , con tal que la variante proporcione un nivel similar de actividad biológica como la proteína de tipo natural .

Los segundos dominios apropiados en el contexto de un polipéptido que suministra una señal positiva incluyen variantes o derivados de la proteína ICOS . Preferentemente, el segundo dominio del receptor de cambio en esta modalidad es por lo menos una porción del dominio intracelular (también referido como un endodominio) de la proteína ICOS, específicamente aquella proteína que es necesaria para activar una señal con los componentes intracelulares de la celular. Las variantes de tipo natural del dominio intracelular de la proteína ICOS, del dominio intracelular de la proteína ICOS, o la porción del domi nio intracelular responsable de la señalización, también se incluyen en la presente i nvención , con tal que la variante proporcione un nivel similar de actividad biológica que la proteína de tipo natural .

Los segundos dominios apropiados en el contexto de un polipéptido que suministra una señal positiva incluyen variantes o derivados de la proteína CD28. Preferentemente , el segundo dominio del receptor de cambio en esta modalidad es por lo menos una porción del dominio intracel ular (también referido como endodominio o citoplásmico) de la proteína CD28, específicamente aquella proteína que es necesaria para la activación de una señal a los componentes intracelulares de la célula. Las variantes de tipo natural del dominio intracelular de la proteína CD28, o la porción del dominio intracelular responsable de la señalización , también se incluyen en la presente invención , con tal que la variante proporcione un nivel similar de actividad biológica a la prote ína de tipo natu ral .

El receptor de cambio de la invención comp rende un polipéptido que corresponde a un dominio citoplásmico, de transmembrana y extracelular, así como polipéptidos que corresponden a porciones más pequeñas del dominio citoplásmico, de transmembrana y extracelular. En una modalidad, el receptor de cambio comprende el dominio de transmembrana del primer polipéptido que suministra una señal negativa. En otra modalidad, el receptor de cambio comprende el dominio de transmembrana del segundo polipéptido que suministra una señal positiva.

En incluso otro aspecto de la presente invención, el primer polipéptido que suministra un componente de señal negativa de cualquiera de los receptores de cambio aquí descritos puede ser sustituido con otra proteína inhibidora, es decir, una proteína que evita la activación de una respuesta inmune y o induce la apoptosis en las células T u otros tipos de célula, tales como las células B, células asesinas naturales (NK), células NKT, células progenitoras linfoides, células dendítricas, monocitos macrófagos, células de linaje de macrófago basado en tejido con capacidad que presenta antígeno, y cualquiera de un número de células no profesionales que presentan un antígeno, por ejemplo, células endoteliales. Ejemplos de proteínas inhibidoras incluyen, pero sin limitación, ligandos a PD-1, CTLA-4, BTLA, CD160, CD161 y CD94; LAG-3, y CD244 (ver 2011, Wherry, Nat Immunol. 131:492-9).

Cualquier primer polipéptido apropiado que suministra una señal negativa se puede usar de acuerdo con la presente invención, siempre que el polipéptido se una con el correspondiente ligando, y mediante esta unión el evento conlleva a una activación del receptor de cambio. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, el compromiso del primer polipéptido que suministra una señal negativa del receptor de cambio con su correspondiente ligando da como resultado la activación del segundo polipéptido que suministra una señal positiva del receptor de cambio. De esta manera, una señal negativa puede convertirse en una señal positiva. Esto es, el primer polipéptido del receptor de cambio de la presente invención puede activar una vía de señalización intracelular, mediante lo cual la activación del segundo polipéptido de la invención da como resultado la conversión de la señal negativa en una señal positiva. De este modo, una única característica del primer polipéptido del receptor de cambio de la presente invención es que esta convierte la señal trans natural que daría como resultado de manera natural una señal negativa a la célula en una señal positiva que induce la célula a presentar características antitumorales .

De manera similar, se puede usar cualquier segundo polipéptido apropiado, siempre que la proteína pueda enviar una señal positiva a una cél ula, que sea distinta de la señal trans asociada con el pri mer componente polipéptido del receptor de cambio. El segundo polipéptido puede ser una prote ína que envía una señal positiva o una señal de activación . Un ejemplo preferido del segundo polipéptido de la invención incluye pero sin limitación C D28, CD27, ICOS, CD 1 37 (4- 1 BB) , y TC Rzeta.

En una modalidad, la invención aprovecha los microambientes donde hay un gran número de ligandos o proteínas que inhiben el sistema inmune en donde la inhibición del sistema inmune da como resultado un estado de enfermedad no deseado. Esto es, el receptor de cambio puede ser diseñado para comprender un primer dominio que se une con el factor inhibidor inmune en el microambiente y convierte la señal naturalmente asociada con el factor inhibidor inmune en una señal positiva donde la señal positiva activa la célula para exhibi r una respuesta inmune potenciada.

Una proteína quimérica preferida de la presente invención es BTLA: ICOS. La quimerización genética de BTLA con secuencias ICOS y expresión recombinante da como resultado un "receptor de cambio" BTLA: ICOS quimérico que demuestra las características estructu rales y funcionales atribuibles tanto a BTLA como I COS . Las células diseñadas para expresar BTLA: ICOS pueden redi rigir la señalización inhibidora a la señal estimuladora y mejorar de este modo la función de la célula T. En algunos casos , las células son diseñadas para expresar el receptor de cambio BTLA COS en combinación con CAR.

Otra proteína quimérica preferida de la presente invención es PD1 :C D28. La qui merización genética de PD1 con las secuencias CD28 y la expresión recombinante da como resultado el "receptor de cambio" quimérico PD1 :CD28 que demuestra las características estructurales y funcionales atribuibles tanto a PD 1 como CD28. Las células diseñadas para expresar PD 1 : CD28 pueden redi rigir la señalización inhibidora a la señal estimuladora y mejorar de este modo la función de la célula T. En algunos casos , las células son diseñadas para expresar el receptor de cambio PD 1 :CD28 en combinación con CAR.

Otra proteína quimérica preferida de la presente invención es CTLA4:CD28. La quimerización genética de CTLA4 con las secuencias CD28 y la expresión recombinante da como resultado el "receptor de cambio" quimérico CTLA4:CD28 que demuestra las características estructurales y funcionales atribuibles tanto a CTLA4 como CD28. Las células diseñadas para expresar CTLA4:CD28 pueden redirigir la señal inhibidora a la señal estimuladora y mejorar de este modo la función de la célula T. En algunos casos, las células son diseñadas para expresar el receptor de cambio CTAL4:CD28 en combi nación con CAR.

Las proteínas presentes pueden existir en numerosas formas . Por ejemplo, las proteínas presentes pueden estar en forma de un polipéptido lineal o ramificado . Las proteínas quimé ricas lineales se pueden produci r mediante tecnolog ía de ADN recombinante . Por ejemplo, los casetes de transcripción quimérica se pueden ensamblar usando una superposición de sitio de restricción de endonucieasa o la extensión de empalme mediante superposición basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PC R).

Las proteínas quiméricas de polipéptido ramificado se pueden produci r fácilmente mediante tecnolog ía de péptido sintético ensamblado con un patrón (TAS P) (Mutter, Trends Biochem Sci . 1 3:260-265 ( 1 988)) . Mediante este proceso, las unidades de péptido se sintetizan separadamente y se acoplan covalentemente con un portador multifuncional, tal como un péptido de núcleo, usando reactivos de acoplamiento químico. Por ejemplo, un análogo de decapéptido cíclico de gramicidina S , en el que dos segmentos de láminas beta antiparalelas (lys-ala-lys) se enlazan mediante dos giros beta, se puede usar como un péptido de núcleo. Las estrategias de condensación de segmento se pueden usar para unir la primera y segunda proteínas con los grupos épsilon-amino de 4 cadenas laterales de lisina.

Las prote ínas presentes también pueden existir como dos o más proteínas separadas enlazadas entre sí mediante un puente, tal como un enlace qu ímico. Por ejemplo, dos o más componentes de proteína se pueden enlazar covalentemente en forma di recta entre sí en estructu ras ramificadas usando reactivos químicos de reticulación tal como ditio-bis)succ¡nimidil proprionato) (DS P) . Mediante esta metodología, por ejemplo, la primera y segunda prote ínas se pueden enlazar directamente.

Los primero y segundo polipéptidos particulares del receptor de cambio quimérico de la invención pueden variar dependiendo de la enfe rmedad que se va a tratar. Típicamente, por ejemplo , cuando se trata el cáncer o las i nfecciones virales , se usan los segundos polipéptidos que estimulan las respuestas de célula inmune. Cuando se trata trastornos del sistema inmune donde existen respuestas inmunes patogénicas, se usa un segundo polipéptido inhibidor. De este modo, para el cáncer y las enfermedades virales , se desean los receptores de cambio que convierten las señales de activación inmune de inhibición a activación . En contraste, para las enfermedades autoinmunes, se desean los receptores de cambio quiméricos que convierten la activación en inhibición las señales inmunes. En esta configuración, el segundo componente de prote ína inmune-i nhibidor puede ser dirigido a diferentes efectores inmunes patogénicos, incluyendo células T, células B , células asesinas naturales y células que presentan antígeno.

En consecuencia, la invención proporciona un receptor de cambio que cuando se expresa en una célula convierte una señal positiva en una señal negativa en la célula. Por ejemplo, este receptor de cambio contiene un primer dominio que comprende un polipéptido que su ministra una señal positiva; y un segundo dominio que comprende un polipéptido que suministra una señal negativa en la célula.

Modifi caci ón Genética La presente invención comprende una célula (por ejemplo, célula T) transducida con un vector lentviral (LV). En una modalidad, el LV codifica el receptor de cambio de la invención que comprende un primer dominio que comprende u n polipéptido que suministra u na señal negativa y un segundo dominio que comprende un polipéptido que suministra una señal positiva .

En una modalidad , la célula puede ser además transfectada con un LV que codifica un receptor qui mérico de antígeno (CAR) que combina un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticue rpo específico con un dominio intracelular de la cadena CD3-zeta o la proteína FcyRI en una única prote ína quimérica.

Los vectores derivados de los retrovirus tales como el lentovi rus son herramientas apropiadas para conseguir una transferencia genética de largo plazo ya que permiten la integración estable de largo plazo de un transgén y su propagación en las células hijas. Los vectores lentivirales tienen la ventaja añadida sobre los vectores derivados de onco-retrovirus tal como los virus de leucemia murina en que pueden transducir células no proliferativas, tales como hepatocitos. Tienen además la ventaja adicional de una baja i nmunogenicidad .

En un breve resumen , la expresión de los ácidos nucleicos natu rales o sintéticos de la invención se consigue típicamente enlazando operativamente un ácido nucleico que codifica el polipéptido deseado o las porciones del mismo con un promotor, y que incorpora el constructo en un vector de expresión . Los vectores pueden ser apropiados para replicación e integración de las eucariotas. Los típicos vectores de clonación contienen terminadores de transcripción y traslado, secuencias de iniciación , y los promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

El ácido nucleico se puede clonar en un número de tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede clonar en un vector que incluye, pero sin limitación un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus de animal y un cósmido. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión , vectores de replicación , vectores de generación de sonda y vectores de secuenciación.

Además, el vector de expresión puede proporcionarse a una célula en forma de un vector viral . La tecnología del vector viral es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenesl -3 (3era. Ed., Cold Spring Harbor Press, NY 2001), y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus, que son útiles como vectores incluyen, pero sin limitación, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector apropiado que contiene un origen de replicación funcional en por lo menos un organismo, una secuencia promotora, sitios convenientes de endonucleasa de restricción, y uno o más marcadores seleccionabas, (por ejemplo, WO 01/96584, WO 01/29058 y Patente Estadounidense No. 6,326,193).

Los elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia de iniciación transcripcional. Típicamente, estos se localizan en la región 30-110 bp corriente arriba del sitio de inicio, aunque se ha demostrado recientemente que un número de promotores contienen elementos funcionales corriente abajo del sitio de inicio también. La separación entre los elemento promotores es frecuentemente flexible, de modo que la función promotora se conserva cuando los elementos se invierten o mueven relativamente uno hacia el otro. En el promotor de timidina quinasa (tk), la separación entre los elementos promotores puede ser incrementada a 50 bp aparte antes de que la actividad comience a declinar. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar ya sea cooperativa o independientemente para activar la transcripción.

Un ejemplo de un promotor es la secuencia promotora de citomegalovirus temprano inmediato (CMV). Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de conducir altos niveles de expresión de cualquier secuencia de polinucleótido operativamente unida a la misma. Sin embargo, otras secuencias promotoras constitutivas también se pueden usar, incluyendo, pero sin limitación promotor temprano de virus de simio 40 (SV40) , virus de tumor mamario de ratón (MMTV), promotor de repetición de terminal largo (LTR) del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), promotor MoMuLV, un promotor de virus de leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores del gen humano tal como, pero sin limitación, el promotor de la actina, el promotor de la miosina, el promotor de la hemoglobina, y el promotor de la creatina quinasa. Además, la invención no deberá limitarse al uso de promotores constitutivos. Los promotores inducibles también son contemplados como parte de la invención. El uso de un promotor inducible proporciona un cambio molecular capaz de conectar la expresión de la secuencia de polinucleótido que está operativamente unida cuando dicha expresión es deseada, o apagar la expresión cuando la expresión no es deseada. Ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero sin limitación, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona, y un promotor de tetraciclina.

Para evaluar la expresión de un polipéptido CAE o porciones del mismo, el vector de expresión que se va a introducir en una célula también puede contener ya sea un gen marcador seleccionable o un gen reportero o ambos para facilitar la identificación y la selección de las células de expresión de la población de células que se busca transfectar o infectar mediante vectores virales. En otros aspectos, el marcador seleccionable puede realizarse en una pieza separada de ADN y se usa en un procedimiento de co-transfección. Ambos marcadores seleccionables y genes reporteros pueden ser flanqueados con secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células huésped. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes resistentes al antibiótico, tales como neo y similares.

Los genes reporteros se usan para identificar las células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen reportero es un gen que no está presente en o se expresa mediante el organismo recipiente o tejido y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta mediante cierta propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. La expresión del gen reportero es examinada en un momento apropiado después que el ADN ha sido introducido en las células receptoras. Los genes reporteros apropiados pueden incluir genes que codifican la luciferasa, la beta-galactosidasa, la cloranfenicol acetiltransferasa, la fosfatasa alcalina secretada, o el gen de la proteína fluorescente verde (por ejemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión apropiados son bien conocidos y se pueden preparar usando técnicas conocidas u obtenerse comercialmente. En general, el constructo con la mínima región de acompañamiento 5' que muestra el nivel más alto de expresión de un gen reportero es identificado como el promotor. Dichas regiones promotoras pueden uni rse a un gen reportero y usarse para evaluar la capacidad de los agentes para modular la transcripción accionada por un promotor.

Los métodos para introduci r y expresar genes en una célula son bien conocidos en la técnica. En el contexto de un vector de expresión , el vector puede i ntroducirse fácilmente en una célula huésped , por ejemplo, en una célula de mam ífero, bacteriana, de levadura o de insecto mediante cualquier método en la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión puede ser transferido a una cél ula huésped mediante medios f ísicos, qu ímicos o biológicos.

Los métodos f ísicos para introducir un pol inucleótido en una célula huésped incluyen precipitación de fosfato de calcio, bombardeo de partículas, microinyección , electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleico exógeno son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al . , MOLECU LAR CLON ING : A LABORATO RY MANUAL volúmenes 1 -3 (3era. ed . , Cold Spring Harbor Press, NY 2001 ).

Los métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula huésped incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y especialmente los vectores retrovirales, se han convertido en los métodos más ampliamente usados para insertar genes en células de mamífero, por ejemplo, humanas. Otros vectores virales pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus I del herpes simple, adenovirus y virus adeno-asociados y similares. Ver, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,35,674 y 5,585,362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromolécula, nanocápsulas, microesferas, perlas, y sistemas basados en lípidos incluyendo emulsiones aceite-en-agua, micelas, micelas mezcladas y liposomas. Un sistema coloidal ejemplar para usar como un vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una ves{icula de membrana artificial).

En el caso cuando un sistema de suministro no viral se utiliza, un vehículo de suministro ejemplar es un liposoma. El uso de formulaciones de lípido es contemplado para la introducción de los ácidos nucleico en una célula huésped (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado con un lípido. El ácido nucleico asociado con un lípido puede ser encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado en una bicapa de lípido o un liposoma, unido a un liposoma vía una molécula de enlace que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, atrapado en un liposoma, formado como complejo con un liposoma, dispersado en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido en forma de una suspensión en un lípido, contenido o formado como un complejo con una micela, o de lo contrario asociado con un l ípido. Las composiciones asociadas con el l ípido, el ADN de lípido o el vector de expresión de l ípido no se limitan a cualquier estructu ra particular en solución . Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de bicapa, como micelas , o con una estructu ra "colapsada". Pueden estar simplemente intercaladas en una solución , formando posiblemente agregados que no son uniformes de tamaño o forma . Los l ípidos son sustancias grasas que pueden ser l ípidos que se presentan de manera natural o sintética. Por ejemplo, los l ípidos incluyen gotitas de grasa que se presentan de manera natural en el citoplasma así como ia clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados , tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, ami noalcohles, y aldeh idos .

Los lípidos apropiados para usar se pueden obtener a partir de vectores comerciales . Por ejemplo, dimi ristil fosfatidilcolina ("DM PC") se puede obtener de Sigma, St. Louis , MO; dicetil fosfato ("DCP") se puede obtener de K & K Laboratories (Plainview, NY) ; colesterol ("Choi") se puede obtener de Calbiochem-Behring; dimiristil fosfatidilglicerol ("DM PG") y otros l ípidos se pueden obtener de Avanti Polar Lipids, I nc. (Birmingham , AL.). Las soluciones stock de los l ípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenar a aproximadamente -20°C. El cloroformo se usa en la presente como el único solvente puesto que se evapora más fácilmente que el metanol. El "liposoma" es un término genérico que comprende una variedad de vehículos de lípido simples y multilaminares formados por la generación de bicapas de lípido o agregados. Los liposomas se pueden caracterizar por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípido y un medio acuoso interior. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas de lípido separadas por un medio acuoso. Estas se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos son suspendidos en un exceso de solución acuosa. Los componentes de lípido experimentan una auto-reordenamiento antes de la formación de las estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas de lípido (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, las composiciones que tienen diferentes estructuras en la solución que la estructura vesicular normal también son comprendidas. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas de lípido. También se contemplan los complejos de ácido lipofectamina-nucleico.

Aplicaciones Terapéuticas La presente invención incluye un tipo de terapia celular en donde las células T son genéticamente modificadas para expresar un receptor de cambio y la célula T diseñada es infundida a un receptor que lo necesita. La célula infundida es capaz de matar las células tumorales en el receptor. A diferencia de las terapias de anticuerpo, las células T diseñadas de la invención son capaces de replicarse in vivo dando como resultado una persistencia de largo plazo que puede conllevar a un control tumoral sostenido.

La presente invención también está dirigida a métodos para tratar un paciente con una enfermedad que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de los receptores de cambio diseñados de la presente invención . Varias enfermedades pueden ser tratadas de acuerdo con los presentes métodos, incluyendo pero sin limitación , cáncer, tal como carcinoma de ovario, carcinoma de mama, carcinoma de colon , glioblastoma multiforme, carcinoma de próstata y leucemia, infecciones virales, tales como infecciones virales crónicas con HBV, HCV, HTLV- 1 , HTLV-I I , EBV, HSV-I , HSV-lí, y KSHV; y enfermedades autoinmunes, tales como artritis, asma, enfermedad de injerto-versus-huésped , rechazo de órgano, psoriasis, eritematosis de l upus sistémico, alergia atópica, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, dermatitis alérgica, síndrome de Sjogren, esclerosis sistémica progresiva, tiroiditis autoinmune, diabetes autoinmune, enfermedades autoinmunes del h ígado, síndromes de médula ósea mielodisplásica.

Ejemplos de cáncer incluyen pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y lentivirus o malignidades linfoides. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de riñon o renal , cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer de célula escamosa (por ejemplo, cáncer de célula escamosa epitelial), cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, tumores del estroma gastrointestinal (GIST), cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, tecomas, arrenoblastomas, hepatoma, malignidades hematológicas que incluyen linfoma no Hodgkins (NHL), mieloma múltiple y malignidades hematológicas agudas, carcinoma endometrial o uterino, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, carcinoma de la glándula salival, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinomas esofágicos, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, carcinoma nasofaringeal, carcinomas laringeal, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, Schwannoma, oligodendroglioma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto urinario, carcinomas de tiroides, tumor de Wilm, así como linfoma de célula B (incluyendo linfoma de bajo grado folicular no Hodgkin (NHL); linfocitos pequeños (SL) NHL; NHI de grado intermedio/folicular; NHL difusa de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de célula no escindida pequeña de alto grado; NHL enfermedad voluminosa; linfoma de célula del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo postransplante (PTLD) , así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales) , y síndrome de Meigs. "Tumor", según se usa en la presente, se refiere a todo el crecimiento celular neoplásico, ya sea malign o benigno, y todas las células pre-cancerosas y cancerosas y tejidos.

En el contexto de la presente invención , "antígeno tumoral" o "antígeno de trastorno hiperproliferativo" o "antígeno asociado con un trastorno hiperproliferativo" se refiere a antígenos que son comunes a los trastornos hiperproliferativos. En ciertos aspectos, fos antígenos de trastorno hiperproliferativo de la presente invención se derivan de cánceres que incluyen pero sin limitación melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón , cáncer de h ígado , linfoma no Hodgkin , linfoma de Hodgkin , leucemias , cáncer uterino, cáncer cervical , cáncer de vejiga, cáncer de riñon y adenocarcinomas tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, y similares.

En una modalidad , el antígeno tumoral de la presente invención comprende uno o más epítopos de cáncer antigénico inmunológicamente reconocidos como linfocitos de infiltración tumoral (TI L) derivados de un tumor de cáncer de un mam ífero.

Los tumores malignos expresan un número de proteínas que pueden servir como antígenos diana para un ataque inmune. Estas moléculas incluyen pero sin limitación antígenos específicos de tejido tales como MART-1, tirosinasa y GP 100 en melanoma y fosfatasa ácida prostática (PAP) y antígeno específico de próstata (PSA) en cáncer de próstata. Otras moléculas diana pertenecen al grupo de moléculas relacionadas con la transformación tales como el oncogén HER-2/Neu/ErbB-2. Incluso otro grupo de antígenos diana son antígenos onco-fetales tales como antígeno carcinoembrionario (CEA). En el linfoma de célula B la inmunoglobulina de itiotipo específico tumoral constituye un antígeno de inmunoglobulina verdaderamente específico tumoral que es único para el tumor individual. Los antígenos de diferenciación de célula B tales como CD19, CD20 y CD37 son otros candidatos para los antígenos diana en el linfoma de célula B. Algunos de estos antígenos (CEA, HER-2, CD 19, CD20, idiotipo) se han usado como dianas para inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales con limitado éxito.

En el contexto del tratamiento del cáncer, los receptores de cambio de la presente invención pueden ser administrados opcionalmente a un paciente en combinación con otros agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos apropiados incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida, alquilsulfonatos tales como busulfán , improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán , novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosu reas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomusti na, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomici na, carzinofilina, cromomicinas , dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonig rina, estreptozoci na, tubercidina, ubeni mex, zi nostatina, zo rubi ci na ; anti -metabol itos tales como metotrexato y 5-fl uorou raci lo (5-FU) ; análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de la purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6- azau ridi na, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxu ridina, 5-FU ; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido f rol ínico; aceglatona; aldofosfamida glucósido, ácido aminolevul ínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan ; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pi rarubicina, ácido podofil ínico; 2-etilhidrazida ; procarbazina; PSK ™; razoxano; sizofiran ; espirogermanio , ácido tenuazónico; triaziquona; 2 , 2' , 2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesína; dacarbazina; manomustina; mltobronitol; mitolactol ; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo, paclitaxel (Taxol™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton , NJ) y docetaxel (Taxotere™, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia) ; clorambucil ; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como el cisplatino y carbop!atino; vinbfastina; platino, etopósido ( VP- 1 6 ) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina ; navelbina; novantrona; teniposide ; daunomicina; aminopterin ; xeloda; ibandronato, CPT-1 1 , inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DM FO) ; ácido retinoico; esperamicinas, capecitabina, y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables.

También se incluyen agentes antitumorales que actúan para regular o inhibi r la acción hormonal en los tumores tal como los anti-estrógenos que incluyen por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazloles que inhiben la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY1 1 701 8, onapristona y toremifeno (Fareston) ; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, goserelina; y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables.

También se incluyen agentes quimioterapéuticos que son capaces de percibir las células tumorales a TRAI L y superar la resistencia a TRAIL, tal como inhibidores de proteasoma e inhibidores de la histona desacetilasa (H DAC) , cicloheximida, mesilato de imatinib y otros inhibidores de la proteína tirosina quinasa, 1 7-al¡lam¡no- 1 7-demetoxigeldanamicina, trióxido de arsénico e inhibidores enlazados con X de antagonistas de molécula pequeña de Prote ína de Apoptosis; y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables.

La información adicional sobre los métodos para el tratamiento del cáncer se proporciona en la Patente Estadounidense No . 7,285 ,522 , incorporada aqu í como referencia en su totalidad .

En consecuencia , en una modal idad prefe rida , los receptores de cambio de la presente invención pueden ser usados para tratar cáncer de mama. En otra modalidad preferida, los receptores de cambio de la invención se pueden usar para tratar cáncer de colon . En otra modalidad , los receptores de cambio de la invención se pueden usar para tratar cáncer de hígado. En otra modalidad preferida, los receptores de cambio de la invención se pueden usar para tratar cáncer de ovario. En otra modalidad, los receptores de cambio de la invención se pueden usar para tratar leucemia. En otra modalidad, los receptores de cambio de la invención se pueden usar para tratar melanoma. En modalidades adicionales, los receptores de cambio de la presente invención se pueden usar para tratar enfermedades aloinmunes, por ejemplo rechazo al injerto, o enfermedad de injerto-versus-huésped o huésped-versus-injerto.

Típicamente, para cada aplicación de enfermedad, una pequeña "biblioteca" de receptores de cambio candidatos se puede generar y evaluar comparativamente en modelos ex vivo e in vivo apropiados y bien establecidos para determinar las eficacias relativas y toxicidades.

Las primera y segunda proteínas particulares usadas en los métodos variarán dependiendo de la enfermedad que se va a tratar. Por lo general, para el cáncer, se desean los receptores de cambio que convierten las señales de trans-activación inmune de inhibidora a activadora. Sin ánimo de limitarse por cualquier teoría particular, la respuesta de inmunidad antitumoral provocada por la célula diseñada de la invención puede ser una respuesta inmune activa o pasiva. La respuesta puede ser parte de un planteamiento de inmunoterapia adoptiva.

Con respecto a la inmunización ex vivo, por lo menos uno de los siguientes se presenta in vitro antes de administrar la célula a un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un receptor de cambio de la invención en las células o Mi) crioconservación de las células.

Los procedimientos ex vivo son bien conocidos en la técnica y se discuten de manera más completa a continuación. En resumen, las células son aisladas de un mamífero (preferentemente un humano) y se modifican genéticamente (es decir, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que expresa un receptor de cambio de la invención . Las células diseñadas pueden ser administradas a un receptor mam ífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor mam ífero puede ser un humano y la célula diseñada puede ser autóloga con respecto al receptor. Alternativamente , las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor.

El procedimiento para la expansión ex vivo del vástago hematopoyético y las células progenitoras se describen en la Patente Estadounidense No. 5 , 1 99,942 , incorporada aquí como referencia, se puede aplicar a las células de la presente invención . Otros métodos apropiados son conocidos en la técnica , por lo tanto la presente invención no está limitada a ni ngú n método particular de expansión ex vivo de las células . En resu men, el cultivo ex vivo y la expansión de las células T comprenden : (1 ) recolectar el vástago hematopoyético CD34+ y las células progenitoras de un mamífero de la cosecha de sangre periférica o explantes de la médula espinal ; y (2) expandir dichas células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en la Patente Estadounidense No . 5 , 1 99,942 , se pueden usar otros factores tales como flt3-L, I L- 1 , I L-3 y ligando c-kit para el cultivo y la expansión de las células.

Además de usar una vacuna basada en células en términos de inmunización ex vivo, la presente invención proporciona además composiciones y métodos para la inmunización in vivo para provocar una respuesta inmune dirigida contra un antígeno en un paciente.

Por lo general , las células activadas y expandidas como se describen aquí pueden ser utilizadas en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos que están inmunocomprometidos . En particular, las células diseñadas de la invención se usan en el tratamiento del cáncer. En ciertas modalidades, las células de la i nvención se usan en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar cáncer. De este modo, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento o la prevención del cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad terapéuticamente efectiva de las células T diseñadas de !a invención.

Las células T diseñadas de la presente invención pueden admi nistrarse ya sea solas , o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como I L-2 u otras citoquinas o poblaciones celulares. En resumen , las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender una población de célula diana como se describe aqu í, en combinación con uno o más portadores , diluyentes o excipentes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada de fosfato y similares ; carbohidratos tales como glucosa, mañosa, sacarosa o dextranos, manitol ; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutationa; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente invención se formulan preferentemente para administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de una manera apropiada a la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y la frecuencia de administración serán determinadas mediante dichos factores según sea la condición del paciente, y el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosificaciones apropiadas se pueden determinar mediante ensayos clínicos.

Cuando "una cantidad inmunológicamente efectiva", "una cantidad antitumoral efectiva", "una cantidad efectiva que inhibe el tumor" o "cantidad terapéutica" está indicada, la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención que se va a administrar puede ser determinada por un médico con consideración de las diferencias individuales de la edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y condición del paciente (sujeto). Se puede establecer por lo general que una composición farmacéutica que comprende las células T aquí descritas se puede administrar a una dosificación de 104 a 109 células/kg de peso corporal, preferentemente 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de esos rangos. Las composiciones de célula T también se pueden administrar varias veces en estas dosificaciones. Las células se pueden administrar usando técnicas de infusión que son comúnmente conocidas en inmunoterapia (ver, por ejemplo, Rosenberg et al. , New Eng. J. of Med. 331 9: 1 676, 1 988). La dosificación óptima y el régimen de tratamiento para un paciente particular pueden ser determinados fácilmente por un experto en la técnica de la medicina monitoreando al paciente sobre los signos de la enfermedad y regulando el tratamiento en consecuencia.

En ciertas modalidades , puede ser conveniente administrar células T activadas y luego posteriormente volver a extraer sangre (o real izar una aféresis) , activar desde all í las células T de acuerdo con la presente invención, y volver a infu ndir al paciente estas células T activadas y expandidas. Este proceso puede realizarse múltiples veces cada pocas semanas . En ciertas modalidades, las células T pueden ser activadas a parti r de extracciones de sangre de 1 0cc a 400cc. En ciertas modalidades , las cél ulas T son activadas a partir de extracciones de sangre de 20cc, 30cc, 40cc. 50cc, 60cc, 70cc, 80 ce 90cc o 1 00cc. Sin limitarse por la teoría, usar este tipo de extracción sanguínea/protocolo de reinfusión múltiple, se puede seleccionar ciertas poblaciones de cél ulas T.

La administración de las composiciones del sujeto puede real izarse de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inhalación por aerosol , inyección , ingestión , transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones aqu í descritas se pueden administrar a un paciente de manera subcutánea, intradérmica, intratumoral , intranodal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa (i.v.), o intraperitoneal. En una modalidad, las composiciones de célula T de la presente invención se administran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En otra modalidad, las composiciones de células T de la presente invención se administran preferentemente mediante inyección i.v. Las composiciones de células T pueden inyectarse directamente en un tumor, nodulo linfático o sitio de la infección.

En ciertas modalidades de la presente invención, las células activadas y expandidas que usan los métodos aquí descritos, u otros métodos conocidos en la técnica donde las células T se expanden a niveles terapéuticos, se administran a un paciente conjuntamente con (por ejemplo, simultáneamente o después) una serie de modalidades de tratamiento relevante, incluyendo pero sin limitación el tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, Citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento con natalizumab para pacientes MS o tratamiento con efalizumab para pacientes con psoriasis, y otros tratamientos para pacientes PML. En otras modalidades, las células T de la invención pueden usarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAM PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpo, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas, e irradiación. Estos fármacos inhiben ya sea calcineurina fosfatase dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al. , Cell 66:807-815, 1 991 ; Henderson et al. , I mmun. 73:31 6-321 , 1 991 ; Bierer et al . , Cu rr. Opin . I mmun . 5:763-773, 1 993; Isoniemi (anterior)). En una modalidad adicional , las composiciones de célula de la presente invención se administran a un paciente conjuntamente con (por ejemplo, antes , sim ultáneamente o después) el trasplante de médula ósea, terapia ablativa de célula T usando ya sea agentes de quimioterapia tales como , f l udarabina, radioterapia de haz externo (XRT) , ciclofosfamida, o anticuerpos tales como OKT3 o CAM PATH . En otra modalidad , las composiciones de células de la presente invención se administran después de una terapia ablativa de célula B tal como los agentes que reaccionan con CD20 , por ejemplo, Rituxan . Por ejemplo, en una modalidad , los sujetos pueden experimentar un tratamiento estándar con quimioterapia de alta dosis seguido por trasplante de célula madre de sangre periférica. En ciertas modalidades, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmune expandidas de la presente invención . En una modalidad adicional , las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

La dosificación de los tratamientos mencionados que se van a administrar a un paciente variarán con la naturaleza precisa de la condición que se va a tratar y el receptor del tratamiento. El ajuste de las dosificaciones para administración humana se puede realizar de acuerdo con las prácticas aceptadas por la técnica. La dosis para CAMPATH , por ejemplo, por lo general estará en el rango de 1 a aproximadamente 1 00 mg para un paciente adulto, usualmente se administra en forma diaria aunque en algunos casos se pueden usar dosis más grandes de hasta 40 mg al día (descrito en la Patente Estadounidense No. 6, 1 20 ,766).

Ejemplos Experimentales La invención se describe además más detalladamente con referencia a los siguientes ejemplos experimentales . Estos ejemplos se proporcionan con fines de instrucción solamente , y no están destinados a ser limitantes salvo que se indique lo contrario . De este modo, la invención no deberá interpretarse de ni nguna manera como limitada a los siguientes ejemplos, sino más bien , deberá interpretarse como aquella que abarca cualquiera y todas las variaciones que se tornen evidentes como resultado del planteamiento aquí proporcionado .

Sin descripción adicional , se considera que un entendido en la técnica, usando la descripción precedente y los siguientes ejemplos ilustrativos, puede hacer y utilizar los compuestos de la presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados. Por lo tanto, los siguientes ejemplos de trabajo señalan específicamente las modalidades preferidas de la presente i nvención , y no deberán interpretarse como limitantes de ni nguna manera en la divulgación. Ejemplo 1 : Receptores de Cambio Los resultados aqu í presentados demuestran que los receptores quiméricos pueden ser diseñados para convertir las señales negativas en señales positivas en las células T. Se diseñaron experimentos para desarrollar un método que evita la inhibición de un factor inhibidor de tumor sistemáticamente y por lo tanto todo el sistema inmune. En resumen, las células T fueron diseñadas para expresar un receptor quimérico que codificó el dominio extracelular PD- 1 (sin el dominio PD-1 inhibidor) y un dominio de señalización CD28 o I COS estimulador. La orientación del receptor quimérico colocó el domin io extracelular PD- 1 fuera de la célula y el dominio estimulador CD28 o ICOS dentro de la célula T. De este modo, la interacción de las células T con los antígenos de tumor en el microambiente tumoral es positivamente influenciada con la disposición de los ligandos PD- 1 porque la señal en la célula es derivada por el endodominio de señalización CD28 o ICOS en lugar del endodominio P D- 1 inhibidor nativo.

Los materiales y los métodos empleados en estos experimentos se describen ahora.

Materiales v Métodos Producción del Receptor de Cambio Los constructos fueron diseñados para el examen del receptor de cambio BTLA. Las siguientes son secuencias de cada constructo que fueron clonadas en un vector IVT basado enpG EM .64A.

BTLA; SEC ID NO : 1 Atgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttcttaatcccatatctgg acatctggaacatccatgggaaagaatcatgtgatgtacagctttatataaagagacaatctgaacac tccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtgaaatactgtgctaacaggcctcatgt gacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgtaaaacttgaagatagacaaacaagttggaagga agagaagaacatttcatttttcattctacattttgaaccagtgcttcctaatgacaatgggtcataccgc tgttctgcaaattttcagtctaatctcattgaaagccactcaacaactctttatgtgacagatgtaaaaa gtgcctcagaacgaccctccaaggacgaaatggcaagcagaccctggctcctgtatagtttacttcc tttggggggattgcctctactcatcactacctgtttctgcctgttctgctgcctgagaaggcaccaagg aaagcaaaatgaactctctgacacagcaggaagggaaattaacctggttgatgctcaccttaagagt gagcaaacagaagcaagcaccaggcaaaattcccaagtactgctatcagaaactggaatttatgat aatgaccctgacctttgtttcaggatgcaggaagggtctgaagtttattctaatccatgcctggaaga aaacaaaccaggcattgtttatgcttccctgaaccattctgtcattggaccgaactcaagactggcaa gaaatgtaaaagaagcaccaacagaatatgcatccatatgtgtgaggagttaa BTLA-BTM-CD28 ; SEC ID NO : 2 Aagcttgccgccatgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttctta atcccatatctggacatctggaacatccatgggaaagaatcatgtgatgtacagctttatataaagag acaatctgaacactccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtgaaatactgtgcta acaggcctcatgtgacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgtaaaacttgaagatagacaaac aagttggaaggaagagaagaacatttcatttttcattctacattttgaaccagtgcttcctaatgacaat gggtcataccgctgttctgcaaattttcagtctaatctcattgaaagccactcaacaactctttatgtga cagatgtaaaaagtgcctcagaacgaccctccaaggacgaaatggcaagcagaccctggctcctg tatagtttacttcctttggggggattgcctctactcatcactacctgtttctgcctgttctgctgcctgga ggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcc cacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcctgataagc ggccgca BTLA-BTM-CD27; SEC ID NO : 3 Aagcttgccgccatgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttctta atcccatatctggacatctggaacatccatgggaaagaatcatgtgatgtacagctttatataaagag acaatctgaacactccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtgaaatactgtgcta acaggcctcatgtgacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgtaaaacttgaagatagacaaac aagttggaaggaagagaagaacatttcatttttcattctacattttgaaccagtgcttcctaatgacaat gggtcataccgctgttctgcaaattttcagtctaatctcattgaaagccactcaacaactctttatgtga cagatgtaaaaagtgcctcagaacgaccctccaaggacgaaatggcaagcagaccctggctcctg ta.ta.gtttacttcctttggggggattgcctctactcatcactacctgtttctgcctgttctgctgcctgga aggaaatatagatcaaacaaaggagaaagtcctgtggagcctgcagagccttgtcgttacagctgc cccagggaggaggagggcagcacc atece c ate caggaggattaccgaaaaccggagcctgcct gctccccctgataagcggccgca BTLA-ITM-CD28; SEC ID NO: 4 Aagcttgccgccatgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttctta atcccatatctggacatctggaacatccatgggaaaga atc atgtgatgtacagctttatataaagag acaatctgaacactccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtgaaatactgtgcta acaggcctcatgtgacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgtaaaacttgaagatagacaaac aagttggaaggaagagaagaacatttcatttttcattctacattttgaaccagtgcttcctaatgacaat gggtcataccgctgttctgcaaattttcagtctaatctc attgaaagcc actcaacaactctttatgtga cagatgtaaaaagtgcctcagaacgacc ctccaaggacga aatggcaagcagaccctggctc ctg tatagti tctggttacccataggatgtgcagcctttgttgtagtctgcattttgggatgcatacttattg aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggc ccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcctgataag cggccgca BTLA-ITM-CD27; SEC ID NO: 5 Aagcttgccgccatgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttctta atcccatatctggacatctggaacatccatgggaaagaatcatgtgatgtacagctttatataaagag acaatctgaacactccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtgaaatactgtgcta acaggcctcatgtgacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgtaaaacttgaagatagacaaac aagttggaaggaagagaagaacatttcatttttcattctacattttgaaccagtgcttcctaatgacaat gggtcataccgctgttctgcaaattttcagtctaatctcattgaaagccactcaacaactctttatgtga cagatgtaaaaagtgcctcagaacgaccctccaaggacgaaatggcaagcagaccctggctcctg tatagtí te tggttacccataggatgtgcagcctttgttgtagtctgcattttgggatgcatacttattg aaggaaatatagatcaaacaaaggagaaagtcctgtggagcctgcagagccttgtcgttacagctg ccccagggaggaggagggcagcaccatccccatccaggaggattaccgaaaaccggagcctgc ctgctccccctgataagcggccgca BTLA-BTM-ICOS ; SEC ID NO : 6 Aagcttgccgccatgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttctta atcccatatctggacatctggaacatccatgggaaagaatcatgtgatgtacagctttatataaagag acaatctgaacactccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtgaaatactgtgcta acaggcctcatgtgacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgtaaaacttgaagatagacaaac aagttggaaggaagagaagaacatttcatttttcattctacattttgaaccagtgcttcctaatgacaat gggtcataccgctgttctgcaaattttcagtctaatctcattgaaagccactcaacaactctttatgtga cagatgtaaaaagtgcctcagaacgaccctccaaggacgaaatggcaagcagaccctggctcctg tatagtttacttcctttggggggattgcctctactcatcactacctgtttctgcctgttctgctgcctgtgt tggcttacaaaaaagaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagag cagtgaacacagccaaaaaatctagactcacagatgtgaccctataagcggccgca BTLA-BTM-ICOS-Z; SEC ID NO: 7 Aagcttgccgccatgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttctta atcccatatctggacatctggaacatccatgggaaagaatcatgtgatgtacagctttatataaagag acaatctgaacactccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtgaaatactgtgcta acaggcctcatgtgacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgtaaaacttgaagatagacaaac aagttggaaggaagagaagaacatttcatttttcattctacattttgaaccagtgcttcctaatgacaat gggtcataccgctgttctgcaaattttcagtctaatctcattgaaagccactcaacaactctttatgtga cagatgtaaaaagtgcctcagaacgaccctccaaggacgaaatggcaagcagaccctggctcctg tatagtttacttcctttggggggattgcctctactcatcactacctgtttctgcctgttctgctgcctgtgt tggcttacaaaaaagaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagag cagtgaacacagccaaaaaatctagactcacagatgtgaccctatgcagagtgaagttcagcagga gcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacg aagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccg agaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcct acagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagg gtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaag cggccgca BTLA-ITM-ICOS; SEC ID NO : 8 Aagcttgccgccatgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttctta atcccatatctggacatctggaacatccatgggaaagaatcatgtgatgtacagctttatataaagag acaatctgaacactccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtgaaatactgtgcta acaggcctcatgtgacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgtaaaacttgaagatagacaaac aagttggaaggaagagaagaacatttcatttttcattctacattttgaaccagtgcttcctaatgacaat gggtcataccgctgttctgcaaattttcagtctaatctcattgaaagccactcaacaactctttatgtga cagatgtaaaaagtgcctcagaacgaccctccaaggacgaaatggcaagcagaccctggctcctg tatagtttctggttacccataggatgtgcagcctttgttgtagtctgcattttgggatgcatacttatttgt tggcttacaaaaaagaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagag cagtgaacacagccaaaaaatctagactcacagatgtgaccctataagcggccgca BTLA-ITM-ICOS-Z; SEC ID NO : 9 aagcttgccgccatgaagacattgcctgccatgcttggaactgggaaattattttgggtcttcttctta atcccatatctggacatctggaacatccatgggaaagaatcatgtgatgtacagctttatataaagag acaatctgaacactccatcttagcaggagatccctttgaactagaatgccctgtgaaatactgtgcta acaggcctcatgtgacttggtgcaagctcaatggaacaacatgtgtaaaacttgaagatagacaaac aagttggaaggaagagaagaacatttcatttttcattctacattttgaaccagtgcttcctaatgacaat gggtcataccgctgttctgcaaattttcagtctaatctcattgaaagccactcaacaactctttatgtga cagatgtaaaaagtgcctcagaacgaccctccaaggacgaaatggcaagcagaccctggctcctg tatagtttacttcctttggggggattgcctctactcatcactacctgtttctgcctgttctgctgcctgtgt tggcttacaaaaaagaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagag cagtgaacacagccaaaaaatctagactcacagatgtgaccctatgcagagtgaagttcagcagga gcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacg aagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccg agaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcct acagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagg gtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaag cggccgca Transducción de las Cél ulas T Los métodos de preparación de las células T usando perlas de poliestireno paramagnéticas recubiertas con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 se han descrito (Laport et al . , 2003, Blood 1 02 :2004201 3) . La transducción lentiviral se realizó como se describe (Levine et al . , 2006, Proc Nati Acad Sci USA 1 03: 1 7372-1 7377). La electroporación de las células T con ARN se ha descrito (201 0 , Zhao et al . , Cáncer Res 70:9062) como un método para expresar estos receptores. El uso de vectores adenovirales se ha descrito (2004, Schroers et al . , Exp Hematol 32 :536) . Una serie de otros planteamientos para expresar proteínas en células T se han descrito (2009, June et al . , Nat Rev Immunol 9:704).

Anál isis de Citoquina La cuantificación de los factores solubles de citoquina se realizó usando la tecnología de formación de perlas Luminex y kits adqui ridos de Life Technologies (Invitrogen). Los ensayos se realizaron según el protocolo del fabricante con una curva estándar de 8 puntos generada usando una serie de dilución de 3 veces.

Los resultados de los experimentos se describen ahora.

Los resultados aqu í presentados demuestran que un receptor quimérico puede ser diseñado y expresado en una célula T donde el receptor quimérico convierte las señales negativas en señales positivas en la célula T. En consecuencia, la invención proporciona un tipo de célula T adoptiva o terapia de célula N K usando células que han sido genéticamente modificadas para expresar los receptores de célula T (TCRs) o los receptores de antígeno quimérico (CARs).

Los experimentos fueron diseñados para desarrollar un método direccionado para evitar le inhibición de PD-1 sistémicamente y por lo tanto todo el sistema i nmune. El método direccionado comprende administrar células T que expresan receptores quiméricos que codifican por ejemplo el domi nio extracelular PD-1 , y antes que el dominio PD- 1 inhibidor, un dominio de señalización estimulador CD28 o ICOS en la parte intracelular de la célula T. De este modo, la interacción de las células T con los antígenos tumorales en el microambiente tumoral , porque la señal en la célula es derivada por el endodominio de señalización CD28 o ICOS, en vez de el endodominio PD- 1 nativo.

Conversión de Señales BTLA En un planteamiento similar, se han construido los receptores quiméricos que codifican BTLA. El BTLA, junto con PD- 1 , también es un miembro de la familia CD28. El BTLA tiene varios ligandos, incluyendo HVEM, que se expresa en las células tumorales y otras células , a menudo en el microambiente tumoral . Es bien sabido que la interacción de BTLA con los ligandos naturales en las células regula negativamente las respuestas inmunes de la célula T (Paulos et al . , 201 0, J Clin Invest 1 20 :76-80; Derré et al . , 201 0 , J Clin I nvest 120 : 1 57-67; Chemnitz et al . , 2006, J I mmunol 1 76:6603- 14) . Para evitar receptores quiméricos comprendidos de BTLA se construyeron el dominio extracelular y los endodominios de señalización intercelular que incluyen los dominios CD28 o ICOS.

En resumen, la clonación molecular se usó para construir los receptores quiméricos ejemplares ilustrados en la Figura 1 . Para examinar si la ligación de BTLA CC R expresado en la superficie de las células T podría expresarse apropiadamente y la transducción de señales mediante el dominio intracel ular ICOS a C D3 zeta, IVT ARNms que codifican BTLA CC R como se indicó se electroporaron en las células T estimuladas y la expresión de superficie de BTLA se detectó mediante proteína de fusión HVEM- Fc en un tiempo diferente como se indicó (Figura 1 B). Las células T electroporadas fueron estimuladas con una l ínea celular negativa del ligando BTLA (KTPolCD86A2) o l ínea celular positiva HVEM del ligando BTLA (KTCD86Flu HVEM) . Veinticuatro horas posterior a la estimulación , el I L-2 producido por las células T fue examinado mediante ELI SA (Figu ra 1 C) . Los resultados mostraron que fusionando el dominio extracelular BTLA con los dominios ¡ ntracelulares de tanto ICOS como CD3 zeta, las células T podrían ser activadas mediante estimulación de la l ínea celular que expresa HVEM del ligando BTLA, la señal BTLA de indicación podría convertirse en otras señales en forma de receptor coestimulador quimérico (CCR) .

El siguiente grupo de experimentos fue diseñado para evaluar si la señal inhibidora de BTLA podía convertirse en una señal coestimuladora de CD28 mediante BTLA-CD28 CC R. Para encontrar la ventana apropiada que podría mostrar la señalización CD28, diferentes dosis de ARN (ug/0.1ml de células T) se electroporaron en las células T y se detectó la expresión CAR (CD19z, CD19-28Z) mediante FACS. El panel superior muestra los histogramas y el porcentaje de la expresión del transgen (Figura 2A). La producción IL2 de las células T electroporadas con ARN como se describe en la Figura 2A se estimuló mediante la línea celular positiva CD19 y la producción de IL-2 se examinó mediante ELISA, como se muestra en la Figura 2B. El panel superior muestra IFN-gamma y el panel inferior muestra la producción de IL-2. Los resultados muestran que la dosis de ARN de 1-5 ug, diferente a las células T electroporadas de ARN CD19-28z, que mostraron sobre 300pg/ml de producción IL-2, no había producción de IL-2 detectable para las células T epectroporadas CD19Z ARN producción de iFN-gamma podría detectarse a niveles similares tanto para las células T electroporadas CD19z como CD19-28Z con la dosis de RNA de 1.5 ug. Por lo tanto, 1.5 ug de ARN se usó como la dosis de ARN para examinar el polipéptido de conversión de señal BTLA-CD28.

Las células T co-electroporadas con 1.5ug de CD19z y BTLA CCR como se indicó y estimuló con K562 que expresa CD19 (K562CD19) o tanto CD19 como HVEM (K562CD19/HVEM). Se usó como controles la mesotelina que expresa las líneas K562 (con o sin HVEM) (Figura 2C). Los resultados muestran que el BTLA de longitud completa (tipo natural) suprimió tanto la producción de IL2 como IFN-gamma. No hubo producción de IL-2 detectable para las células T electroporadas con solamente CD19z cuando se estimuló con la línea celular positiva doble CD19/HVEM, mientras que las células T electroporadas con CD19-28z y estimuladas con la línea celular positiva doble CD19/HVEM produjo más de 400pg/ml IL-2. Sin embargo, cuando las células T fueron electroporadas con tanto CD19z como BTLA-CD28 CCR ARNs, la producción de IL-2 fue 4 veces mayor que las células T electroporadas CD19-28z, cuando se estimuló con la línea celular positiva doble CD19/HVEM. Las células T co-electroporadas con tanto CD19z como BTLA-CD28 CCR ARNs produjeron mayor IFN-gamma que las células T electroporadas CD19z o CD19-28z, cuando sé estimuló con la línea celular positiva doble CD19/HVEM, o CD19 positivo K562 que expresa bajos niveles de HVEM (Figura 2C). Los resultados aquí presentados demuestran que las señales inhibidoras de BTLA podrían convertirse en señales CD28 mediante BTLA-CD28 CCR.

El siguiente grupo de experimentos fue diseñado para examinar si la señal BTLA inhibidora podía convertirse en una señal ICOS coestimuladora mediante BTLA-ICOS CCR. En resumen, la conversión de BTLA en señal ICOS se examinó en un sistema de polarización Th17 como se muestra en la Figura 3A. Las células T CD4 en reposo fueron electroporadas con CCRs CD19z y BTLA como se indica (Tratamiento) y se estimula con la línea celular positiva doble CD19/HVEM (Grupo 1 y 2, duplicados), o las células fueron electroporadas con BTLA-ICOS solo y se estimularon con HVEM-Fc y OKT3 unido con placa (grupo 3). Las perlas CD3/ICOS o las perlas CD3/CD28 se usaron como controles positivo y negativo respectivamente como se describió (201 0, Paulos et al., Science Translational Medicine) . Todos los cultivos se realizaron en presencia de un cóctel de citoquina Th 1 7. En días diferentes (como se indicó) posterior a la estimulación , las células T fueron estimuladas con PMA/lonomicina se detectó I L-1 7A e I FN-gamma mediante tinción de citoqui na intracelular ( Figura 3B) . Los resultados mostraron que la señal ICOS se convirtió de BTLA-ICOS producción de célula Th 1 7 mejorada en presencia de las señales inhibidoras HVEM.

Conversión de PD-1 en Señales CD28 Para examinar si la ligación de PD 1 CCR expresado en la superficie de las células T puede expresarse funcionalmente para íransducir las señales mediante e! dominio intracelular CD28 o CD27 o ICOS , se usaron IVT ARNs que codifican PD 1 CC R (secuencias mostradas a continuación) .

P D1 -I-1COS ; SEC I D N O. 1 0 Atgcagatcccacaggcgccctggccagtcgtctgggcggtgctacaactgggctggcggccag gatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggt gaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaa ctggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagc cagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgag cgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggccccca aggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgc ccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtgttctggttac ccataggatgtgcagcctttgttgtagtctgcattttgggatgcatacttatttgttggcttacaaaaaa gaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagagcagtgaacacagcc aaaaaatctagactcacagatgtgaccctataa PD1 -28-CD28; SEC ID NO. 1 1 Atgcagatcccacaggcgccctggcc agtcgtctgggcggtgctacaactgggctggcggccag gatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggt gaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaa ctggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagc cagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgag cgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctc cctggccccca aggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgc ccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtgttttgggtg ctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctggg tgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccggg cccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcctaa PD1 -CD27; SEC I D NO. 1 2 Atgcagatcccacaggcgccctggccagtcgtctgggcggtgctacaactgggctggcggccag gatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggt gaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaa ctggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagc cagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgag cgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggccccca aggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgc ccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtgatccttgtg atcttctctggaatgttccttgttttcaccctggccggggccctgttcctccatcaacgaaggaaatat agatcaaacaaaggagaaagtcctgtggagcctgcagagccttgtcgttacagctgccccaggga ggaggagggcagcaccatccccatccaggaggattaccgaaaaccggagcctgcctgctccccc taa PD1 CCR como se indicó y CD19z ARN fueron electroporados en células T estimuladas y los transgenes fueron detectados mediante anti-PD1 y anti-CAR Abs en los puntos de tiempo según se indicó (Figura 4A). Las células T co-electroporadas como se describen en la Figura 4A fueron co-cultivadas con Nalm6 (línea de leucemia de célula B humana) que expresa PD-L1 o GFp como control, o K562-CD19 que expresa PD-L1, o ICOSL como control. La producción de IFN-gamma se ensayó 24 horas después del co-cultivo. Las células T co-introducidas con CD19z y PD1-CD28 (PD1-28) mostraron una producción de IFN-gamma significativamente mayor que las células T electroporadas con CD19z solo, o co-electroporadas con PD1 estando el dominio citoplásmico truncado, o PD1-CD27 (PD1-27). Cuando se co-cultivó con líneas celulares positivas doble CD19/PD-L1. Se observó una fuerte inhibición de células T cuando las células T fueron co-electroporadas con CD19z y PD1 (tipo natural) de longitud completa y estimuladas con líneas celulares positivas dobles CD19/PD-L1 (Figura 4B).

Las células T co-electroporadas como se describe en la Figura 4a fueron co-cultivadas con Nalm6 (línea de leucemia de célula B humana) que expresa PD-L1 o GFP como control, o K562-CD19 que expresa PD-L1, o ICOSL como control. La producción de IL-2 fue ensayada 24 horas después del co-cultivo. Las células T cointroducidas con C D19z y PD1-CD28 (PD1-28) mostraron una producción de IL-2 significativamente mayor que las células T electroporadas con CD19z solo, o co-electroporadas con PD1 estando el dominio citoplásmico truncado, o PD1-CD27 (PD1-27). Cuando se co-cultivó con las líneas celulares positivas dobles CD19/PD-L1, se observó una fuerte inhibición de células T cuando las células T se co-electroporaron con CD19z y PD1 de cadena completa y se estimularon con las líneas celulares positivas dobles CD19/PD-L1 (Figura 4C).

Las células T co-electroporadas como se describen en la Figura 4A fueron examinadas en un ensayo CTL basado en ei flujo. Las células T co-introducidas con CD19z y PD1 mostraron una capacidad de matar significativamente reducida contra las dianas Nalm6-PD-L1, mientras no se vieron diferencias significativas para las células T co-electroporadas con PD1 CCRs comparado con las células T electroporadas con CD19Z solo, cuando se usa Nalm6-PD1 como diana. Cuando Nalm6 negativo de ligando PD1 se usó como diana, no se encontraron diferencias significativas para todos los grupos de célula T, incluyendo las células T co-electroporadas con CD19z y PD1.

El siguiente grupo de experimentos fue diseñado para invertir la inhibición de PD1 mediante la co-introducción de PD1-CD28 CCR. Para imitar la del microambiente tumoral o bajo una infección crónica en donde las células T son PD1 positivo, las células T estimuladas con perlas de CD3/CD28 u OKT3/PBMC/IL2 y fueron co-electroporadas con CD19z (1oug) y PD1 (5ug) con PD1 CCR (10ug) adicional como se indicó. CAR y PD1 y/o la expresión PD1 CCR fueron detectados mediante FACS un día posterior a la electroporación (Figura 5A).

Las células T electroporadas como se muestran en la Figura 5A fueron co-cultivadas con Nalm6 o K562-CD19 que expresa PD-L1. La producción de IL-2 fue ensayada después del co-cultivo durante la noche. Los resultados mostraron que había una cantidad disminuida de IL-2 producido por las células T electroporadas con CD19z solo, comparado con las mismas células T co-cultivadas con las líneas celulares positivas CD19 sin PD-L1. Sin embargo, en presencia de PD1, la producción de IL-2 fue completamente bloqueada cuando se co-cultivó con las líneas celulares positivas PD-L1, excepto que las células T co-electroporadas con PD1-CD28 (PD1-28), que mostraron una producción de IL-2 mucho mayor que CD19Z solo de células T, mientras que la expresión PD1 en las células T fueron co-cultivadas con las líneas celulares negativas PD-L1 (Figura 5B).

Las células T electroporadas como se muestra en la Figura 5A se co-cultivaron con Nalm6 o K562-CD19 que expresa PD-L1. La producción de IFN-gamma fue examinada después del co-cultivo durante la noche (Figura 5C). Un perfil de producción similar de citoquina se observó como el de la producción de IL-2 mostrada en la Figura 5B. Los resultados aquí presentados demuestran que PD1- CD28 CCR puede invertir el efecto inhibidor de PD1 y promover las funciones efectoras de la célula T.

Conversión de las Señales PD1 en ICOS Las células T CD4 fueron electroporadas con PD1 (o variantes de PD1) y CD19-Z CAR ARNm (10 ug cada uno). Cuatro horas después de la electroporacion (día 0), las células T se mezclaron células K562 (0.5 : 1 = K562 : célula T) que expresan PD1 y CD19 en medios de cultivo CD10 en presencia de IL1 (lOng/ml), IL6 (10ng/ml), IL23 (20ng/ml), y anticuerpos de neutralización (10ug/ml) contra IL4 e IFNy. En los días indicados (5, 9 y 12 días después de la electroporacion) las células se incubaron durante 4 horas con PMA (3 ug/ml) e ionomicina (1 ug/ml) y GolgiStop para la tinción de citoquina intracelufar. La tinción de la superficie para CD4 se realizó seguida por tinción intracelular para IFN-gamma, IL17 e IL2. Las células T CD4 estimuladas con las perlas anti-CD28/CD3 y las perlas anti-ICOS/CD3 se usaron como controles (Figura 6A). La producción de citoquina fue mejorada, particularmente en el día 9 en las células que expresan PD1-ICOS comparado con el tipo natural de PD1 o PD1 sin cola. La proliferación celular o las células T estimuladas se muestran en la Figura 6C.

Receptores Quiméricos PD-1 El PD-1 es regulado hacia arriba en la superficie de las células T CD8 agotadas en los pacientes con infección viral crónica. El bloqueo de la señal PD-1:PD-L1 restaura la función de PD-1 que expresa las células T CD8 agotadas. Muchos tumores expresan PD-L1 que proporciona un microambiente inmunosupresor.

El propósito de los siguientes experimentos es dirigir las células T adoptivamente transferidas para superar el microambiente tumoral inhibidor introduciendo los receptores quiméricos PD-1 en el sitio del tumor.

Se observó que el efecto inhibidor de PD1wt en la producción de citoquina es rescatada mediante los constructos quiméricos PD1 (Figura 7). Sin embargo, los receptores quiméricos PD1 no afectan la producción de granzima B (Figura 8). De manera similar, se observaron diferencias mínimas en la actividad de eliminación de las células T CD8 en presencia o ausencia de PD1 (Figura 9).

El siguiente grupo de experimentos fue diseñado para evaluar el efecto de los receptores quiméricos PD-1 en la proliferación de células T (Figura 10). Se observó que el receptor quimérico PD1-CD28 aumenta el número de células T CD8 (Figura 11).

En resumen, los resultados aquí presentados demuestran que los constructos quiméricos PD-1 no presentan los efectos inhibidores mostrados por PD-1 wt. El PD1-CD28 parece aumentar la producción de TNFa, IL2 e IFNy en las células T CD4. Los receptores quiméricos PD-1 no mostraron una citotoxicidad incrementada sobre la de las células T que expresan el mismo CD19CARz. El PD1-CD28 aumentó el número de células T sobre el de las células T que expresan el mismo CD19CARz.

Redireccionamiento de la Señalización Co-inhibidora a la Coestimulación Positiva Los resultados aquí presentados demuestran que los receptores de cambio se expresaron en células T mediante electroporación o con vectores lentivirales. Se observó que los CARs y los receptores de cambio se pueden expresar en la misma célula T. Cuando las cél ulas que expresan CARs o TC Rs y los receptores de cambio se exponen a las células tumorales que tienen ligandos para BTLA o PD- 1 , se muestra que las células T tienen una respuesta inmune positiva, más bien que la respuesta inhibidora usual .

Cuando estos receptores quiméricos se expresan en células T, en el caso del receptor de cambio BTLA, con la interacción con su ligando HVEM natural en las células tumorales, se observó que las células T fueron estimuladas y l uego expresaron funciones asociadas con los efectos antitumorales positivos, incluyendo la secreción de I FN-gamma.

Otro resultado importante de estos estudios es que la interacción HVEM-BTLA con el receptor quimérico conllevó a la secreción de I L-7. Esto es un marcador de células TH 1 7, una célula que es conocida por ser útil para la inmunoterapia tumoral (Martin-Orozco et al ., 2009, I mmunity 31 :787-98; Paulos et al . , 201 0, Science Translational Medicine 2:55-78; Garaude et al . , 201 0, Sci Transí Med 2(55) :55ps2) . Por ejemplo , los resultados aqu í presentados demuestran que las células T que expresan los receptores de cambio CARs y BTLA con dominios de señalización ICOS fueron polarizados para secretar grandes cantidades de I L-1 7.

Además, los resultados aqu í presentados muestran que las células T que expresan CARs y los receptores de cambio PD 1 con CD28 , y se evitó que los dominios eliminados tengan inhibición y a cambio eliminaron las células tumorales y secretan citoquinas (I L-2 e I FN-gamma) si expresaron receptores de cambio PD- 1 .

Si ánimo de limitarse por cualquier teoría particular, se considera que expresando los receptores antígenos quiméricos (CARs) con PD- 1 o los receptores de cambio BTLA en las células T que son luego introducidos en el microambiente tumoral , las células T tienen un efecto antitumoral potenciado y muestran el fenotipo TH 1 7. El tipo de transferencia de célula T adoptiva para ¡a inmunoterapia tumoral de la invención también es aplicable en el área de la terapia de la vacuna, tal como para las infecciones vi rales crónicas que incluyen VI H u otros vi rus tales como EBV, HCV o CMV. Esta tecnolog ía podría incorporarse fácilmente en otros ensayos que actualmente están usando células T genéticamente modificadas con TCRs también. Por ejemplo, los receptores de cambio de la invención se pueden usar en el contexto de las células T con TCRs específicos para los antígenos de cáncer tal como MAG E-A3 y NY-ESO- 1 , y se considera que la inclusión de los receptores de cambio con estas cél ulas T aumentarían la potencia de las células T.

Las divulgaciones de cada y toda patente , solicitud de patente y publicación aquí citadas se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Si bien esta invención ha sido divulgada con referencia a las modalidades específicas, es evidente que otras modalidades y variaciones de esta invención pueden ser ideadas por otros expertos en la técnica sin apartarse del verdadero espíritu y ámbito de la invención . Las reivindicaciones que se adjuntan están destinadas a ser i nterpretadas de modo que incluyan todas dichas modalidades y las variaciones equivalentes .

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en donde dicho primer dominio es un polipeptido que está asociado con una señal negativa y dicho segundo domi nio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1 , en donde dicho primer dominio es por lo menos una porción del dominio extracelular del polipéptido que está asociado con una señal negativa y dicho segundo dominio es por lo menos una porción del dominio intracelular del polipéptido que está asociado con una señal positiva.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 , que comprende además un dominio de transmembrana.

4. La prote ína de fusión de la reivindicación 3, en donde dicho dominio de transmembrana es el dominio de transmembrana del polipéptido que está asociado con una señal negativa o el dominio de transmembrana del polipéptido que está asociado con una señal positiva.

5. La proteína de fusión de la reivindicación 1 , en donde dicho polipéptido que está asociado con una señal negativa se selecciona del grupo que consiste de CTLA4, PD-1 y BTLA.

6. La proteína de fusión de la reivindicación 1 , en donde dicho polipéptido que está asociado con una señal positiva se selecciona del grupo que consiste de CD28 e ICOS .

7. Una célula diseñada para expresar una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo domi nio , en donde dicho domi nio es un polipéptido que está asociado con una señal negativa y dicho segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva.

8. La célula de la reivindicación 7 que comprende además un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde dicho CAR comprende un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico y un dominio intracelular de la cadena CD3-zeta.

9. Un vector que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en donde dicho primer dominio es un polipéptido que está asociado con una señal negativa y dicho segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva.

1 0. Un método para tratar a un paciente con cáncer, comprendiendo dicho método administrar a dicho paciente una célula T genéticamente diseñada para expresar una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en donde dicho primer dominio es un polipéptido que está asociado con una señal negativa y dicho segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva.

1 1 . El método de la reivindicación 1 0, en donde dicha célula T está además genéticamente diseñada para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde dicho CAR comprende un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico y un domi nio intracelular de la cadena CD3-zeta .

12. El método de la reivindicación 1 1 , en donde dicha célula T es una célula T autóloga.