KR20170100517A - 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포의 농축(enriched)을 위한 항체 및 조작된 T 세포의 디플리션에 사용하기 위한 항체의 용도 - Google Patents

외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포의 농축(enriched)을 위한 항체 및 조작된 T 세포의 디플리션에 사용하기 위한 항체의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 임의의 부가적인 선별 마커 유전자 및/또는 임의의 추가 자멸 유전자를 요구하지 않는 외래 면역 수용체를 제공한다. 본 발명은 비접촉 방식으로 농축(enriched)될 수 있는 조작된 T 세포의 생산을 허용한다. 즉, 조작된 T 세포는 임의의 외부 작용제와의 상호 작용을 필요로 하지 않고, 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포를 제거함으로써 선택될 수 있다. 내생 T 세포 수용체와 구별될 수 있는 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포가 제공되며, 외래 면역 수용체를 특이적으로 표적하는 선택적 항체로 제거, 즉 디플리션될 수 있다.

Description

외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포의 농축(enriched)을 위한 항체 및 조작된 T 세포의 디플리션에 사용하기 위한 항체의 용도{USE OF ANTIBODIES FOR ENRICHMENT OF ENGINEERED T CELLS WITH EXOGENOUS IMMUNE RECEPTORS AND ANTIBODIES FOR USE IN DEPLETION OF ENGINEERED T CELLS}
본 발명은 의학 분야에 속한다. 특히 유전 치료 분야에 관한 것으로, 본 발명은 면역학 및 암 치료를 위한 세포 치료와 관한 것이다. 본 발명은 또한 조작된 T 세포의 농축(enriched) 방법에 관한 것이고, 의학적 치료에서 조작된 T 세포의 용도에 관한 것이다.
조작된 항-종양 특이성 또는 항-병원균 특이성을 갖는 T 세포의 양자전이(adoptive transfer)가 개발 중에 있다. 이러한 전략에서, 특정 항-종양 특이성, 또는 특정 항-변원균 특이성을 갖는, 키메라 항원 수용체, 또는 감마 델타 T 세포 수용체, 또는 알파베타 T 세포 수용체와 같은 외래 면역 수용체는, 환자의 자가 T 세포 또는, 예를 들어, 환자에 대한 동종 이계 줄기세포의 이식의 경우, 해당 동종 이계 T 세포로 이식된다. 예를 들어, 혈액 줄기세포 이식을 받는 백혈병 환자는 치료 중에 또한 림프가 제거될 수 있다. 따라서, 이러한 환자는 또한 예를 들어, 특정 항-백혈병 T 세포 수용체를 발현하도록 조작된 공여 T 세포의 주입이 유익하다.
임상 시험이 암 환자에서 TCR-조작 세포의 양자전이의 가치를 입증했지만, 일반적으로 이러한 전략의 임상적 이점은 환자의 일부에서만 관찰된다. TCR-조작 T 세포의 관찰된 제한적인 효능에 대한 한 가지 설은, 새로 도입된 TCR과 내생 TCR 사이에서 CD3 성분에 대한 경쟁에의해 야기되는 치료적 TCR의 차선적인 표면 발현이다(Provasi et al. Nat Med. 2012 May; 18 (5) : 807-15). 더욱이, 예를 들어 동종 이계의 줄기세포 이식과 같은, 동종 이계 줄기세포 이식에서의 이러한 전략의 적용은, 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 발현하는 비-조작 T 세포가, 예를 들어, 동종 이계 줄기세포 이식의 환경에서 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)과 같은, 원치 않는 부작용을 야기하기에, 심각한 안전 문제로 인해 방해 받는다. 따라서, 조작된 T 세포를 선별하는 전략이 개발 중으로, 이는 조작된 T 세포의 양성적인 선별에 초점을 맞추고 있다. 현존하는 전략은 네오마이신 유전자, 또는 형광 단백질 또는 형질 도입된 세포 또는 형질 감염된 세포의 양성적인 선별을 가능하게 하는 여타 추가적인 유전자와 같은, 대용 유전자 마커를 포함시키는 것을 목표로 한다. 그러나, 이러한 전략은 원하는 특이성을 갖는 외래 면역 수용체의 양자전이에 추가하여, 면역원성이 될 수 있는 대게 큰 외래 유전자를 포함시켜야 되는 바, 안정성에 있어서 추가적인 우려점이 존재한다.
또한, 유전적으로 조작된 세포가 환자에게 주입된다는 사실로 인해, 부작용의 경우에 환자로부터 이러한 세포를 선택적으로 제거하는 것이 유익할 수 있다는 것도 당 업계에서 인식되어왔다. 따라서, 조작된 T 세포는 종종 외래 면역 수용체 이외에, 조작된 T 세포의 선택적 제거를 가능하게 하는 추가적인 유전자를 포함한다. 이러한 유전자는 예를 들어, 환자에게 약제를 투여할 때 HSV-TK와 같은 자멸 유전자로 특정 세포를 선택적으로 사멸시키는 자멸 유전자를 포함한다(reviewed in Bondanza et al., Blood 107, 1828-1836 (2006).
따라서, 당해 기술 분야에서, T 세포를 조작하고, 인간 치료와 같은 대상에서 사용하기 위한 전략은, 대상에서 사용되는 조작 세포의 선별을 가능하게 하는 방법으로, 조작된 T 세포에 추가적인 유전자를 포함시키는 것에 초점을 맞추거나, 및/또는 조작된 T 세포가 처치된 대상으로부터 조작된 T 세포의 디플리션을 가능하게 하는 방법에 초점을 맞추고 있다.
본 발명의 목적은 임의의 추가 유전자 도입 없이, 조작된 T 세포의 농축(enriched) 방법을 제공하는 것이고, 이러한 조작된 T 세포를 용이하게 디플리션할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 임의의 추가 유전자 도입 없이, 조작된 T 세포의 농축(enriched)를 가능하게 하는 방법을 제공한다. 또한,이 방법은 조작된 T 세포로의 어떠한 간섭도 필요로 하지않으며, 조작된 T 세포를 선택할 수 있게 한다. 조작된 T 세포는 그대로 유지될 수 있다.
본 발명자들은 예를 들어, 선별 마커를 사용한, 양성적인 선별 방법을 사용하여 조작된 T 세포를 선택함으로써, 여전히 원하는 특이성의 외래 면역 수용체 및 분리 선별 마커를 발현하는 것 이외에 내생 알파 베타 T 세포 수용체의 기능적 수준을 발현하는 조작된 T 세포의 부분 집단(subpopulation)이 존재할 수 있다는 것을 알아내었다. 이러한 부분 집단(아군)은 모든 양성적인 선별 전략에서 선별되며, 조작된 세포 제품의 치료 효능 및 안전성을 제한 할 수 있다. 종래 기술에는 이러한 부분 집단을 제거할 수 있는 어떠한 방법도 제공되지 않는다.
나아가, 예를 들어, 외래 면역 수용체에 결합하는 항체를 사용하는, 조작된 T 세포를 선별하기 위한 양성 선별 방법은 상당한 수의 형질 도입된 세포에서 세포사멸(apoptosis)을 유도 할 수 있다. 또한, 선별 마커를 포함하는 양성 선별 방법은 선별 마커가 전형적으로 비-숙주형(예를 들어, 비-인간형)이므로 바람직하지 않은 면역 반응을 유도할 수 있는 유전자의 첨가를 필요로 하므로, 숙주에 의한 형질 전환된 세포의 제거를 초래하는 이질체인 것으로 인식 될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 조작된 T 세포를 설정하는 것 이외에, 전술한 바와 같이 원하지 않는 부분 집단을 제거할 수 있고, 외래 면역 수용체를 제외하고 조작된 T 세포에 추가의 유전자를 포함시킬 필요가 없고, 조작된 T 세포가 비접촉 채로 유지되는, 신규한 전략을 개발하였다.
본 발명의 조작된 T 세포를 농축(enriched)에 대한 방법은, 임의의 선행 기술 방법과 대조적으로, 음성 선별 단계의 사용을 포함한다. 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포 및 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작되지 않은 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물로부터, 상기 조작되지 않은 알파 베타 T 세포가 상기 혼합물로부터 분리될 수 있다. 이러한 방법은 또한 외래 면역 수용체의 차선적인 발현을 갖고, 상당량의 내생 알파 베타 T 세포 수용체가 여전히 발현될 수 있는 T 세포의 혼합물에 포함되는 임의의 조작된 T 세포의 분리 단계를 포함한다. 또한, 이러한 방법은 조작된 T 세포에 결합하는 항체를 사용하는 포지티브 선택 방법으로 발생할 수 있는 원하지 않은 세포 사멸 유도를 피하면서, T 세포의 혼합물에 포함되는 조작된 T 세포가 비접촉 상태로 유지되도록 허용한다.
상기 방법은 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 선택적 항체의 사용을 포함한다. 따라서, 이들의 세포 표면에 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 포함하는 T 세포의 혼합물 중 임의의 T 세포는 혼합물로부터 분리되어, 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포의 농축(enriched)된 조제물을 얻게 된다. 이러한 선별 항체는 내생 알파 베타 T 세포 수용체와 외래 면역 수용체 사이의 서열 차이를 이용한다. 조작된 T 세포와 동일한 기원의 알파 베타 T 세포 수용체조차도 외래 면역 수용체로 사용될 수 있다. 필요한 것은 내생 αT 세포 수용체에 대한 항체의 결합 부위에 상응하는 외래 알파 베타 T 세포 수용체의 아미노산 서열이 항체가 더 이상 결합할 수 없도록 변형된 것 뿐이다. 추가의 수정이 예를 들어 포함될 수 있다. 예를 들어 T 세포 수용체 기능을 유지 또는 최적화하고, 특이성을 유지하며 및/또는 2개의 사슬의 바람직한 쌍을 도입할 수 있다.
선택적 항체는 MACS, FACS 및 면역 친화도 크로마토 그래피와 같은 분리 기술에 사용될 수 있다. 본 발명으로 수득된 조작된 T 세포가 농축(enriched)된 제조는 특히 의학적 치료에 유용하다. 이러한 치료는 암의 치료일 수 있다. 예를 들어, 백혈병의 치료에서, 동종 이형 줄기세포 이식을 받는 환자는 또한 농축(enriched)된 조작된 T 세포, 즉 본 발명의 임의의 방법에 의해 얻을 수 있고, 예를 들어 환자의 백혈병 세포에 대한 특이성을 갖는 외래 면역 수용체가 제공되는 조작된 T 세포인 동종 이형 조작 T 세포의 제조의 도입으로부터 이점을 가질 수 있다. 이러한 방식으로 치료에서 백혈병의 제거가 더욱 촉진될 수 있는 반면, 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포의 존재로 인한 원하지 않는 부작용을 유발할 위험은 실질적으로 감소되거나 완전히 회피될 수 있다.
유사하게, 본 발명의 다른 측면에서, 조작된 림프구, 즉 조작된 T 세포 또는 조작된 NK 세포는 외래 면역 수용체, 예를 들어 CA 또는 조작된 알파 베타 T 세포 수용체 또는 (조작된) 감마 델타 T 세포 수용체를 제공받을 수 있고, 이와 같은 외래 면역 수용체는 상응하는 내생 알파 베타 T 세포 수용체 또는 내생 감마 델타 T 세포 수용체와 상이하고, 외래 면역 수용체에 대한 항체 특이성은 특징적으로 조작된 T 세포를 제거할 것이다. 본 발명의 이들 측면은 농축(enriched) 방법에 대해서는 도 1에, 디플리션 방법에 대해서는 도 2에 도시된다. 따라서, 임의의 선행 기술 방법과 대조적으로, 조작된 T 세포의 디플리션을 허용하기 위해 외래 면역 수용체를 코딩하는 유전자 이외에, 조작된 T 세포에 임의의 추가 유전자를 포함할 필요가 없다.
따라서, 종래 기술에서 사용된 임의의 선택 방법과 대조적으로, 예를 들어, 선별 마커(selection marker), 또는 임의의 추가 자멸 유전자 및/또는 예를 들어 자멸 유전자를 사용하는 종래 기술에서 사용된 사멸 방법과 대조적으로, 본 발명은 임의의 추가 선별 마커 유전자를 요구하지 않는 외래 면역 수용체를 제공한다. 본 발명은 비접촉 방식으로 농축(enriched)될 수 있는 조작된 T 세포의 생산을 가능하게 한다. 즉, 조작된 T 세포는 임의의 외부 작용제, 예를 들어 항체와의 임의의 결합 또는 상호 작용을 필요로하지 않는다. 또한, 내생 T 세포 수용체로부터 분화될 수 있는 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포는 특이적으로 외래 면역 수용체를 표적으로 하는 선택성 항체로 제거, 즉 디플리션될 수 있다. 농축(enriched) 과정에서 사용된 것과 동일한 수정이 디플리션 과정에 사용될 수 있다. 제1 항체는 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 선택적으로 결합하지만, 농축(enriched) 방법에서 조작된 알파 베타 T 세포 수용체의 변형된 서열에는 결합하지 않는다. 반대로, 제2 항체는 이제 조작된 알파 베타 T 세포 수용체의 상기 변형된 서열에 결합하지만 내생 알파 베타 T 세포 수용체에는 결합하지 않는다. 이러한 방식으로, 최소한으로 변형된 알파 베타 T 세포 수용체는 2개의 상이한 선택 항체와 함께 농축(enriched) 및 생체 디플리션을 허용하는 외래 면역 수용체로서 제공될 수 있다. 외래 면역 수용체 및 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적인 선택적 항체 및/또는 외래 면역 수용체에 특이적인 항체가 모두 요구된다.
따라서, 본 발명은 이제 선택적 항체와 조합된 외래 면역 수용체를 제공하고, 조작된 T 세포의 농축(enriched) 및/또는 디플리션을 위한 임의의 추가의 외래 유전자를 필요로하지 않는다.
본 발명은 임의의 부가적인 선별 마커 유전자 및/또는 임의의 추가 자멸 유전자를 요구하지 않는 외래 면역 수용체를 제공하는 것으로부터, 비접촉 방식으로 농축(enriched)될 수 있는 조작된 T 세포의 생산이 가능하고, 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포를 제거함으로써 T 세포 농축 방법을 제공할 수 있다. 또한, 내생 T 세포 수용체와 구별될 수 있는 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포로부터, 외래 면역 수용체를 특이적으로 표적하는 선택적 항체로 제거가 가능한 바, 조작된 T 세포의 디플리션 방법을 제공할 수 있다.
도 1. 조작된 T 세포를 농축(enriched) 하는(농축(enriched)하는) 기본 원리를 보여주는 개략도이다. A) 내생 알파 베타 T 세포 수용체 (화살표로 표시)에 결합하는 항체가 제공된다. 이 시나리오에서 항체는 불변 영역에 결합한다. B), C), E) 및 F) 제공되는 항체가 결합하지 않는 외래 면역 수용체가 제공된다 (교차 된 화살표로 표시). B)는 가변 영역 (V)이 내생 기원이고 다른 종의 불변 영역인 알파 베타 T 세포 수용체를 나타낸다. 불변 영역의 서열은 항체가 그것에 결합하지 않도록 상이하다. C)는 내생 기원의 알파 베타 T 세포 수용체를 나타내며, 여기서 일정한 베타 사슬의 일부는 다른 종의 상응하는 부분으로 대체된다. E)는 감마 델타 T 세포 수용체를 나타내고, F)는 키메라 항원 수용체를 나타낸다. D)는 제공되는 항체가 결합할 수 있기 때문에 외래 면역 수용체로서 적합하지 않은 내생 기원의 조작된 알파 베타 사슬를 나타낸다.
도 2. 조작된 T 세포의 (생체 내) 디플리션의 기본 원리를 보여주는 도식이다. A)에 묘사된 것처럼 내생 알파 베타 T 세포 수용체가 아니라 B)에 나타낸 외래 알파 베타 T 세포 수용체에 선택적으로 결합하는 (화살표로 표시됨) 항체가 제공된다 (교차 된 화살표로 표시됨). 이러한 항체는 또한 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 실질적으로 상응하는 C)에 나타낸 바와 같은 외래 알파 베타 T 세포 수용체에 결합할 수 있으며, 항체에 대한 결합부위는 단지 작은 영역만을 치환함으로써 베타 사슬에 도입되었다. D)에서 묘사된 바와 같이 항체의 결합을 허용하지 않는 외래 알파 베타 T 세포 수용체에서의 변형은 디플리션 전략에 사용하기에 적합하지 않다. 유사하게, E)에서 나타낸 바와 같이, F)에 나타낸 외래 감마 델타 T 세포 수용체에 선택적으로 결합하고 내생 알파 베타 T 세포 수용체에는 결합하지 않는 항체가 제공된다. 항체는 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 선택적으로 표적으로 하는 반면, A) 및 F)에서 나타낸 바와 같이 내생 T 세포 수용체를 갖는 내생 T 세포는 표적화하지 않는다.
도 3. 실시예 섹션에서 사용된 외래 면역 수용체와 T 세포 수용체 성분을 보여주는 도식이다. 내생 기원인 A)에 외래 알파 베타 T 세포 수용체가 제공된다. 이 외래 알파 베타 T 세포 수용체는 다른 종으로부터 세그먼트(분절)에 의해 그 절편을 교환함으로써 후속적으로 변형되었다. 전체 불변 영역은 B)와 같이 대체되었다. 또는 베타 사슬의 불변 부분의 일부가 C)와 같이 대체되었다. 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 표적으로 하는 항체가 결합하는 서열을 확인하기 위한 각 사슬의 불변 영역의 상이한 영역, 상이한 영역 (D1, D2, D3, D4)을 대체하기 위해 대체 전략을 이용하였다. 각 변형된 사슬은 C)에서 묘사 된 것과 같은 변형되지 않은 사슬과 쌍을 이룬다. 다른 전략에서, 사용된 외래 면역 수용체는 선택된 감마 델타 T 세포 수용체였다.
도 4. 외래 감마 델타 T 세포 수용체로 농축(enriched)된 조작 T 세포 제조의 향상된 항종양 기능을 나타낸다. T 세포 혼합물에서 αβTCR 양성 T 세포의 GMP 등급 디플리션에 의한 γδTCR 조작된 T 세포의 농축(enriched)를 나타낸다. A) pMP71 유동세포 계수의 표현 : γ-T2A-δ는 γδTCR T 세포 분리 (αβ TCR 디플리션) 전과 직후에 αβ T 세포를 형질 도입했다. 농축(enriched)된 T 세포는 γδTCR 발현을 위한 T 세포 확장 동안 추적되었다. T 세포를 pan-γδTCR 및 pan-αβTCR 항체로 염색하고 각 사분면의 세포 백분율을 나타내었다. B) γδTCR은 T 세포 (bulk, 9 % γδTCR +)를 형질 도입하였고, αβ TCR이 디플리션된 (41 % γδTCR +) T 세포를 51Cr을 넣은 Daudi 세포와 4-5 시간 동안 표시된 E : T 비율로 배양하였다. pB : αMDM2 / βp53 형질 도입 세포를 대조 T 세포로 사용하였다. 특이적 용해의 백분율은 세 배의 평균 ± 표준 편차로 표시된다. 통계적 유의성은 양방향성 분산분석(anova)에 의해 계산되었다; ** p <0.01; *** p <0.001. C) γδTCR은 벌크 (6 % γδTCR +)로 형질 도입되었고, αβTCR이 디플리션된 (51 % γδTCR +) T 세포는 IFNγ ELISPOT에 의해 측정된 IFNγ 분비와 다른 종양 표적 세포와 함께 배양되었다. pMP71 : ΔNGFR로 형질 도입된 T 세포를 대조 T 세포로 사용하였다. 15000 T 세포 당 IFNγ 스팟은 (세번의 값)triplicates + SD의 평균으로 나타낸다. T 세포는 IFNγ의 유의한 수준을 생성하지 않았다. 통계적 유의성은 양방향성 분산분석(anova)에 의해 계산되었다; * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001.
도 5. 외래 감마 델타 T 세포 수용체를 가진 농축(enriched)된 조작 T 세포 제조의 동종 반응성 및 보존된 항종양 반응성을 나타낸다. 건강한 기증자 유래 PBMCs는pMP71 : ΔNGFR 또는 pMP71 : γ-T2A-δ로 레트로바이러스로 형질도입되었으며, γδTCR 형질도입된 T 세포 (αβTCR 디플리션 및 65 % γδTCR +)로 농축(enriched)되거나 또는 (대량 및 9 % γδTCR +) 농축(enriched)하지 않고, 설명된 대로 확장시켰다. T 세포는 20 일 이상 동안 자극되지 않았고 지난 6일 동안 IL-2가 결핍되어 T 세포를 쉬는 것으로 간주 되었다. A) 휴지 T 세포를 OPM2 종양 세포 및 미스 매치된 EBV-LCL의 패널과 함께 24시간 동안 공배양 하였다. IFNγ ELISPOT으로 항종양 활성 및 동종 반응성을 측정하였다. 15.000 T 세포 당 IFNγ 스팟은 세번측정(triplicates) + SD의 평균으로 나타내었다.
도 6. αβTCR 일정 도메인의 쥐의 아미노산 서열에 대한 αβTCR-mAb BW242- 항체의 폐기된 결합을 나타낸다. A) pan-αβTCR mAb BW242를 이용한 MACS 음성 선택 후 완전한 쥐 넌센스 (αMDM2 / βp53) αβTCR (αMU / βMU)로 형질 도입된 PBMC의 효율적 농축(enriched)를 나타낸다. 왼쪽 그림은 αβTCR+ T 세포의 존재에 의해 설명된 바와 같이, 형질 감염된 세포와 형질 도입되지 않은 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물을 나타낸다. 오른쪽은 마우스 αβTCR 발현에 대한 양성 세포의 농축된(농축(enriched)된) 세포를 나타낸다. 내생 αβTCR을 발현하는 비 형질 전환 세포는 개체군에서 디플리션 된다.
B) JurMa 세포는 쥐의 불변 도메인을 포함하는 (αMU2 / βp53), 완전히 인간의 NY-ESO-1αβTCRs (αhu / βhu), 완전한 쥐 논센스 αMDM2 / βp53) αβTCRs (αMU / βMU), 또는 NY-ESO-1 키메라 αβTCRs로 형질도입하였다. Vβ4- 염색 및 β 마우스 염색은 발현 수준을 나타내며 백분율로 표시된다. αβTCR-PE로 염색한 것은 임상 등급 pan-αβTCR-mAb BW242의 결합을 나타내며 평균 형광 강도 (Mean Fluorescence Intensity, MFI)로 표시된다. 모든 FACS 플롯의 경우: 데이터는 7번 개별 실험에 대하여 표시한다.
도 7. 인간 및 마우스 알파 및 베타 체인 및 도메인 교환의 배열을 나타낸다.
A) 인간 및 마우스 TCRα 및 TCRβ 불변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. 상자는 사람과 마우스 사이의 모든 아미노산 차이를 포함하는 도메인을 나타낸다. TCRCα에는 3 개의 다른 도메인이 있고, 반면 TCRCβ에는 4 개의 영역이 있다. 아스테릭스는 인간과 쥐 시퀀스 내에서 동일한 아미노산을 나타낸다. B) pMP71- 벡터로 복제된 3개의 다른 TCRα 및 4 개의 상이한 TCRβ 유전자의 개략도이고, 짙은 회색 박스는 밝은 회색 박스로 나타낸 인간 아미노산 서열이 측면에 위치한 머린화(murinized)된 도메인을 나타낸다. TCRCβ는 1-5 번 아미노산 EDLKN으로 시작하며 KDSRG로, 176-180 번 아미노산은 번호가 매겨집니다. 배열된 마우스 TCRCβ의 도메인 3은 돌연변이 Q88H, Y101H, N106E, E108K, T110P, Q111E, D112G, R113S, A114P, I120N, V121I로 인간 도메인 3에 상응한다. 서열 번호 5 및 6의 아미노산 217-250을 또한 참조한다. V: 가변 도메인 및 C: 일정 도메인. 도 A와 B는 Sommermeyer & Uckert, 2010, Journal of Immunology에서 채택하였다.
도 8. 인간 TCRβ 사슬의 도메인 3은 αβTCR-mAb BW242 결합 에피토프의 일부입니다. JurMa 세포는 각각 완전히 인간 NY-ESO-1αβTCRs (αhu / βhu), 키메라 NY-ESO-1 αβTCRs (αhuMU / βhuMU) 또는 상응하는 인간 TCRα- 사슬과 부분적으로 머린화된 TCRβ 사슬의 상이한 조합으로 형질 감염시켰다. 또는 부분적으로 머린화된 TCRα- 사슬와 인간 TCRβ 사슬의 조합 물로 형질전환될 수 있다. TCR의 발현은 Vβ4- 염색에 의해 측정되었고, 모든 TCR- 조합은 유동 세포 계측법에 의해 결정된 바와 같이 αβTCR-mAb BW242에 의한 그의 인식에 대해 시험 되었다. 숫자는 전체 세포 집단의 Vβ4- 양성 세포 분율 및 평균 형광 강도 (MFI)의 백분율을 나타낸다.
도 9. 부분적으로 머린화된 인간 알파 베타 TCR로 형질 전환된 조작된 T 세포의 효율적인 농축(enriched)를 나타낸다.
αM2와 βM3 도메인(αM2 / βM3)의 결합된 머린화로 β-사슬 (αhu / βM3) 또는 αβTCR에서 머린화 도메인 3을 갖는 αβTCR (αβTCRs), 키메라 αβTCRs (αhuMU / βhuMU)를 발현하는 JurMa 세포는 αβTCR 코팅 비드(우측 판넬)를 이용한 MACS 음성 선별에 의한 농축(enriched)에 대하여 시험하였다. 모든 TCR- 체인 변이체는 NY-ESO-1 / HLA-A2 특이적이기 때문에, 세포의 이질적인 모집단(왼쪽 패널 및 중앙 패널)을 유발하는 완전한 인간의 WT1 특이적 αβTCRs를 발현하는 JurMa 세포와 1 : 1 비율로 분류하기 전에 혼합하였다. 디플리션 후, 음성 세포 분획을 수집하고 유동 세포 계측법으로 측정하였다. Vβ4- 양성 분획은 NY-ESO-1 특이적 TCR을 나타내고, Vβ21 분획은 WT1 특이적 TCR을 나타낸다. 숫자는 Vβ4- 또는 Vβ21- 염색에 양성인 세포의 백분율을 나타낸다.
도 10. 인간 및 마우스 TRA, TRB, TRG 및 TRD C-DOMAIN의 TR C-DOMAIN로부터 C-DOMAIN 서열의 실시예 배열을 나타낸다. 서열 및 상응하는 서열 번호. 표 1에 나열되어 있다.
정의
이하의 설명 및 실시예에서 다수의 용어가 사용된다. 해당 용어에 주어진 범위를 포함하여 명세서 및 청구 범위에 대한 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해 다음과 같은 정의가 제공된다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌의 개시는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 방법에 사용된 통상적 인 기술을 수행하는 방법은 당업자에게 자명 할 것이다. 분자 생물학, 생화학, 전산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA, 생물 정보학, 유전체학, 서열 분석 및 관련 분야에서 통상적인 기술의 실행은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 하기 문헌에서 논의되어있다.
참고 문헌 : Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 및주기적인 갱신; 및 시리즈 Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego.
이 명세서와 그 청구항에서 "~을 포함한다"라는 동사는 그 단어 뒤에 오는 항목이 포함되지만 특별히 언급되지 않은 항목은 제외되지 않는다는 것을 의미하는 비 제한적 의미로 사용된다. 그것은 "에서 이루어진"뿐만 아니라 "본질적으로 이루어진"이라는 동사를 포함한다.
본원에서 사용된 단수 형태 "a(하나의)", "an" 및 "the(그, 상기와 같은 지칭)"는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, 상기에서 사용된 바와 같이 "a"DNA 분자를 단리하는 방법은 다수의 분자 (예를 들어, 10, 100, 1000, 10 만, 100 만, 100 만 또는 그 이상의 분자)를 단리하는 것을 포함한다.
배열 및 정렬 : "배열"및 "정렬"이란 용어는 동일한 또는 유사한 뉴클레오타이드의 짧은 또는 긴 줄기의 존재에 기초한 2개 이상의 뉴클레오티드 서열의 비교를 의미한다. 뉴클레오타이드 서열의 정렬을 위한 몇 가지 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 하기에서 더 설명할 것이다. 용어 "배열" 및 "정렬"은 동일하거나 유사한 아미노산의 짧은 또는 긴 줄기의 존재에 기초한 2개 이상의 아미노산 서열의 비교를 의미한다. 아미노산 서열의 배열을 위한 몇 가지 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 이하에서 더 설명 될 것이다.
"유전자의 발현"은 적절한 조절 영역, 특히 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 영역이 생물학적으로 활성인 RNA로 전사되는 즉 생물학적으로 활성인 것으로 번역될 수 있는 방법을 의미한다 단백질 또는 펩타이드 (또는 활성 펩티드 단편) 또는 활성 자체 (예 : 전사 후 유전자 침묵 또는 RNAi). 특정 실시 양태에서 활성 단백질은 구성 활성인 단백질을 지칭한다. 코딩 서열은 바람직하게는 센스 배향으로 존재하고, 원하는 생물학적 활성 단백질 또는 펩타이드, 또는 활성 펩티드 단편을 코딩한다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"이란 용어는 기능적 관계에 있는 폴리 뉴클레오타이드 요소의 연결을 의미한다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓이면 "작동 가능하게 연결" 된다. 예를 들어, 프로모터 또는 전사 조절 서열은 코딩 서열의 전사에 영향을 주면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결된다는 것은 연결된 DNA 서열이 일반적으로 연속적이며, 필요한 경우 두 개 이상의 단백질 인코딩 영역을 연속적으로 연결하고 판독 프레임에 결합시키는 것을 의미한다.
용어 "유전자 구조물"은 적절한 조절 영역 (예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 세포 내의 RNA 분자 (예 : mRNA) 내로 전사되는 영역 (전사된 영역)을 포함하는 DNA 서열을 의미한다. 따라서, 유전자 구조물은 프로모터, 예를 들어 서열 번호 2를 포함하는 5 '리더 서열과 같은 몇몇 작동 가능하게 연결된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, (단백질) 코딩 영역, 스플라이스 도너 및 어셉터 부위, 인트론 및 엑손 (exonic) 서열, 및 3 '비 번역 서열 (3'비 번역 서열 또는 3'UTR로도 공지됨) 전사 종결 서열 사이트를 포함할 수 있다.
"동일성"은 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열의 동일성의 척도이며, 일반적으로 가장 높은 서열 일치가 얻어지도록 서열이 정렬된다. "동일성" 그 자체는 당 업계에 공지된 의미를 가지며 출판된 (COMPUTERAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, New York, 1988, BIOCOMPUTING : 정보 및 유전자 프로젝트, Smith, DW, ed., Academic Press, New York, 1993; 서열 데이터의 분석, 1 부, Griffin, AM 및 Griffin, HG, eds., Humana Press, New Jersey, 1994, 분자 생물학의 서열 분석, von Heinje, G., Academic Press, 1987 및 서열 분석 프라이머; 2개의 폴리 뉴클레오타이드 또는 폴리 펩타이드 서열 사이의 동일성을 측정하는 다수의 방법이 존재하지만, "동일성"이라는 용어는 당업자에게 공지되어있다 [참조 : Gribskov, M. and Devereux, J. eds., M Stockton Press, New York, (Carillo, H. 및 Lipton, D., SIAM J.Applied Math (1988) 48 : 1073) .M 2개의 서열 사이의 동일성 또는 유사성을 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 용어는 문헌 [Guided to Huge Computer, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994] 및 Carillo, H.에 개시된 것들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48 : 1073. 정체성과 유사성을 결정하는 방법은 컴퓨터 프로그램에 성문화되어 있다. 두 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCS 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12 (1) : 387), BLASTP, BLASTN , FASTA (Atschul, SF 등, J. Molec. Biol. (1990) 215 : 403)에 개시되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 유전자의 전사 개시 부위의 전사 방향에 대해 상류에 위치하는 하나 이상의 유전자의 전사를 조절하는 기능을 하는 핵산 서열을 지칭하며, 구조적으로 DNA- 의존성 RNA 폴리머라제, 전사 개시 부위 및 임의의 다른 DNA 서열 (전사 인자 결합 부위, 리프레서 및 활성화 인자 단백질 결합 부위를 포함 하나 이에 한정되지는 않음)에 대한 결합 부위의 존재 및 프로모터로부터의 전사 양을 직접 또는 간접적으로 조절할 수 있는 기술 분야의 조절자를 의미한다. 선택적으로, 용어 "프로모터"는 본원에서 5 'UTR 영역 (5'비 번역 영역)을 포함한다 (예를 들어, 프로모터는 유전자의 번역 개시 코돈의 하나 이상의 부분 상류 (5 ')를 포함할 수 있고, 전사 및/또는 번역을 조절하는 역할을 수행한다).
용어 "아미노산 서열" 또는 "단백질" 또는 "펩타이드"는 특정 작용 방식, 크기, 3 차원 구조 또는 기원과 관련 없이 아미노산 사슬로 구성된 분자를 지칭한다. 따라서 이의 "단편" 또는 "부분"은 여전히 "아미노산 서열" 또는 "단백질" 또는 "펩티드"로 지칭될 수 있다.
본원에서 "조작된 세포"는 예를 들어 외래 핵산 서열의 도입 또는 내생 유전자 서열의 특이적인 변경에 의해 조작된 세포를 지칭한다. 도입되는 외래 핵산 서열은 조작된 세포는 내생 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이, 삽입 및/또는 결손 및/또는 유전자(genome) 내의 외래 핵산 (예를 들어, 유전자 구조물)의 삽입과 같은 유전적 변형을 포함할 수 있다. 조작된 세포는 조작된 바이러스에 감염된 "형질도입된 세포"일 수 있다. 예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있지만, 다른 적합한 바이러스성 벡터는 또한 렌티 바이러스와 같이 고려될 수 있다. DNA 벡터의 형질 감염 또는 전기 천공과 같은 비 바이러스 방법이 또한 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 DNA 벡터는 트랜스포존 벡터 등이 있다. 조작된 세포는 또한 "안정적으로 형질 감염된 세포" 또는 "일시적으로 형질 감염된 세포"일 수 있다. 형질 감염은 DNA (또는 RNA)를 세포에 전달하여 유전자가 발현되도록 하는 비 바이러스성 방법을 의미한다. 트랜스펙션(형질감염) 방법은 칼슘 포스페이트 형질 전환, PEG 트랜스펙션, 및 핵산의 리포좀 또는 리포 플렉스 형질 감염과 같은 당 업계에 널리 공지되어있다. 그러한 형질 감염은 일시적 일 수 있지만, 그들의 게놈에 유전자 구성이 통합된 세포를 선택할 수 있는 안정적인 형질 감염 일 수도 있다.
용어 "선별 마커"는 당업자에게 친숙한 용어이며, 발현시 선택 가능한 마커를 함유하는 세포 또는 세포를 선별하는데 사용될 수 있는 임의의 유전적 실체를 기술하기 위해 본원에서 사용된다. 선별 마커 유전자 산물은 예를 들어 항생제 내성 또는 다른 선택 가능한 형질 또는 영양 요구를 부여한다. 당 업계에 널리 공지된 바와 같은 선택 가능한 마커는 녹색 형광 단백질 (GFP), eGFP, 루시퍼라제, GUS 등을 포함한다.
"αβT 세포" 또는 "알파 베타 T 세포"는 다양한 세포의 표면에 발현되는 MHC 분자 (주요 조직 적합성 복합체)와 결합한 펩타이드를 인식하는 αβTCR을 발현하는 T 림프구로서의 기능과 관련하여 정의될 수 있다. MHC는 세포의 단백질로부터 유래된 펩티드를 나타낸다. 예를 들어 세포가 바이러스에 감염되면 MHC는 바이러스 펩타이드를 나타내고, αβTCR과 MHC- 복합체 간의 상호 작용은 감염된 세포를 제거하기 위해 면역 반응을 시작하는 특정 유형의 T 세포를 활성화 시킨다. 따라서, αβT 세포는 MHC 분자에 결합 된 펩타이드를 인식할 수 있는 세포로서 기능적으로 정의될 수 있다. αβT 세포는 하기 기재되는 바와 같은 αβ T- 세포 수용체에 특이적인 항체(예를 들어, 인간 αβ TCR에 특이적인 BW242 항체)를 사용하여 동정 될 수 있다. αβT 세포는 T 세포의 대다수가 αβTCR을 가지고 있기 때문에, 예를 들어 CD3 항원을 통해 말초 혈액으로부터 선택될 수 있다. 그러한 선택에는 또한 γδT 세포가 포함될 것이다. 그러한 선택된 세포로부터, αT 세포 수용체 사슬 및 βT 세포 수용체 사슬에 상응하는 핵산 (또는 아미노산) 서열이 결정될 수 있다. 따라서, αβT 세포는 또한 αT 세포 수용체 사슬 및/또는 βT 세포 수용체 사슬에 상응하는 핵산 (또는 아미노산) 서열을 포함하는 세포로서 정의될 수 있다.
"γδT 세포" 또는 "감마 델타 T 세포"는 활성화를 유발하는 항원 분자가 거의 알려지지 않은 T 세포의 작은 부분을 나타낸다. 감마 델타 T 세포는 접합 다양성을 생성하기 위해 TCR 유전자를 재배치하고 기억 표현형을 개발한다는 점에서 적응 면역의 구성 요소로 간주 될 수 있다. 그러나, 제한된 TCR이 패턴 인식 수용체로서 사용되는 경우, 다양한 서브 세트는 타고난 면역의 일부로 간주 될 수 있다. 예를 들어, Vγ9 / Vδ2 T 세포는 비펩티드성 인산화 이소프레노이드 전구체 (phosphoantigens)로 총체적으로 특이적으로 신속하게 활성화된다. γδT 세포는 γδ T 세포 수용체에 특이적인 항체를 사용하여 동정될 수 있다. FACS에 적합한 항체는 널리 이용 가능한다. 음성 및/또는 양성 세포의 선택을 허용하는 항체 제조자에 의해 제공되는 것과 같은 조건이 선택된다. 적합한 항체의 예는 BD Pharmingen (BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA), γδTCR-APC (클론 B1, # 555718) 또는 Beckman Coulter, pan-γδTCR-PE (클론 IMMU510, # IM1418U)가 있다. 또한, 이러한 선택된 세포로부터, γT 세포 수용체 사슬 및/또는 δT 세포 수용체 사슬에 상응하는 핵산 (또는 아미노산 서열) 서열을 결정할 수 있다. 따라서, γδT 세포는 γT- 세포 수용체 사슬 및/또는 δ2T- 세포 수용체 사슬에 상응하는 핵산 (또는 아미노산) 서열을 포함하는 세포로 정의될 수도 있다.
T 세포 또는 T 림프구는 세포 매개 면역에 역할을 하는 림프구라는 백혈구 그룹에 속한다. T 세포는 골수에서 조혈 줄기세포에서 유래하고, 흉선에서 성숙하며 (T가 유래 된 곳), 말초 림프 조직에서 완전한 기능을 한다. T 세포 발달 과정에서 CD4와 CD8 공 수용체 모두 음성인 CD4-CD8-T 세포는 초기 β 또는 βδ의 결과로 αβ (알파 베타) 또는 γδ (감마 델타) δTCR 유전자 재배치. 초기 β 사슬 재배열을 거친 세포는 세포 표면에 완전한 β 사슬과 pre-TCRα 사슬로 구성된 pre-TCR 구조를 나타낸다. 이러한 세포는 CD4 + CD8 + 상태로 전환하고, TCRα 사슬 궤적을 재정렬하고, 표면에 αβTCR을 발현한다. β 유전자 재배열 이전에 성공적으로 γ 유전자 재배열을 완료 한 CD4-CD8-T 세포는 γδTCR을 발현하고 CD4-CD8-로 남는다. (Claudio Tripodo 등, Gamm delta T 세포 림프종 Nature Reviews 임상 종양학 6, 707-717 (2009 년 12 월) T 세포 수용체는 CD3 단백질과 결합하여 T 세포 수용체 복합체를 형성한다. T 세포, 즉 αβTCR 또는 γδTCR은 세포 표면에 T 세포 수용체 복합체를 발현한다. γδT 세포는 전체 T 세포 집단의 약 1 내지 5 %를 구성한다. T 세포 수용체 사슬의 세포 외 영역은 가변 영역을 포함한다. T 세포 수용체 사슬의 3 개의 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2, CDR3)이 위치한다. 이들 영역은 일반적으로 가장 가변적이고 TCR 간의 다양성에 기여한다. CDR 영역은 소위 T 세포 수용체 사슬 다양한 TCR을 생성하기 위해 가변성 (V), 다양성 (D) 및 결합 (J) 유전자 단편을 무작위로 결합한다. T 세포 수용체 사슬의 불변 영역, 즉 알파, 베타, 감마 또는 델타 사슬은 실질적으로 변화하지 않는다. 유사하게, f α 세포, 베타 세포, 감마 세포 또는 델타 사슬 중 어느 하나인 T 세포 수용체 사슬의 샘 절제 영역은 실질적으로 변하지 않는다.
자연 살상 세포(NK 세포)는 큰 과립 림프구 (LGL)로 정의되며 B 및 T 림프구를 생성하는 공통 림프 성 전구 세포와는 다른 세 번째 종류의 세포를 구성한다. NK 세포는 골수, 림프절, 비장, 편도선 및 흉선에서 분화되고 성숙하는 것으로 알려져 있다. NK 세포는 T 세포 항원 수용체 (TCR) 또는 Pan T 표지자 CD3 또는 표면 면역 글로불린 (Ig) B 세포 수용체를 발현하지는 않지만, 사람, NK1.1 또는 NK1의 표면 표지자 CD16 (FcγRIII) 및 CD56을 발현한다. C57BL / 6 마우스 2 마리. 인간 NK 세포의 80 %까지도 CD8을 발현한다.
본원에서 사용되고 당 업계에 공지된 바와 같은 용어 "항체"는 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖는 항원 - 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리 펩타이드를 지칭한다. 이 용어는 항체, 단클론 항체, 단일 특이성 항체, 다중 특이성 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, 중사슬 항체, 라마 항체, 단일 도메인 항체 및 나노 바디 (예 : VHH)를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 Fab, F (ab ') 2, Fv, scFv, Fd, dAb 및 항원 결합 기능을 보유하는 CDR을 포함하는 다른 항체 단편 또는 기타 구조물과 같은 면역 글로불린 단편을 포함할 수 있다. 전형적으로, 그러한 단편은 항원 - 결합 도메인을 포함한다. 항체 또는 그 단편은 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4 또는 IgM 클래스와 같은 IgA1 또는 IgA2, IgD, IgE, IgG와 같은 임의의 공지된 항체 이소 형 및 그들의 형태를 포함할 수 있다.
조작된 T 세포의 농축(enriched)
제1 측면에서, 본 발명은 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포 및 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작되지 않은 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물로부터 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 농축(enriched)하는 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다:
a) 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 외래 면역 수용체 및 비 조작 T 세포를 갖는 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물을 제공하는 단계;
b) 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체와 T 세포의 혼합물을 접촉시켜 항체 - 조작되지 않은 T 세포 복합체를 형성시키는 단계;
c) 항체 - 비조작된 T 세포 복합체를 T 세포의 혼합물로부터 분리하여 조작된 T 세포가 농축(enriched)된 제제를 수득하는 단계.
본 발명에 따른 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포는 외래 면역 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포이다. 외래 면역 수용체는 항원 인식 및 T 세포 작용과 관련하여 내생 T 세포 수용체와 동일한 기능을 갖는다. 비 조작 T 세포는 내생 T 세포 수용체를 발현하는 세포입니다. 내생 T 세포 수용체는 γδT 세포 수용체 유형 또는 αβT 세포 수용체 유형 중 하나이다.
본 발명에 따른 외래 면역 수용체는 내생 T 세포 수용체가 아닌 것으로 정의된다. 예를 들어, 외래 면역 수용체는 암의 치료에 유용한 특정 γδT 세포 수용체 일 수 있다. 상기 서열은 내생 γδT 세포 수용체와 유사할 수 있다. 차이점은 외래 면역 수용체가 특정 표적에 대해 의도적으로 선택되었다는 것이다. 외래 면역 수용체는 예를 들어, 내생 좌위에서 유래 된 것이 아니라 도입 유전자 구조로부터 발현된다. 본 발명에 따른 외래 면역 수용체는 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 제공하도록 조작된 T 세포의 기원과 비교하여 다른 기원, 즉 다른 종으로부터 유래 될 수 있다. 외래 면역 수용체는 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 제공하도록 조작된 T 세포의 기원과 비교하여 동일한 기원, 즉 동일한 종으로부터 유래 될 수 있다. 외래 면역 수용체는 조작된 γδT 세포 수용체 또는 조작된 αβT 세포 수용체 일 수도 있다.
조작된 T 세포 수용체는 아미노산 서열이 내생 T 세포 수용체의 상응하는 아미노산 서열과 비교하여 상이한 아미노산 서열을 갖도록 변형된 T 세포 수용체, 즉 적어도 이의 CDRs를 고려하지 않는다. 따라서, 조작된 T 세포 수용체에 존재하는 변형은 최초의 항원 특이성을 방해해서는 안된다. 실시예 섹션에서는 원래 T 세포 수용체가 특이적인 펩타이드 항원이 들어있는 형광 표지된 MHC- 다량체로 조작된 T 세포 수용체와 조작되지 않은 T 세포 수용체 사이의 유사한 염색 수준에 의해 입증된다. 이러한 조작은 예를 들어, T 세포 수용체 사슬 중 하나 또는 둘 모두의 불변 영역에 대한 것이다.
외래 면역 수용체는 또한 키메라 항원 수용체 (CAR) 일 수 있다. 키메라 항원 수용체 (CAR)는 항원 특이적 항체의 특이성을 T 세포의 활성화 기능과 결합시킨 재조합 수용체이다 (최근 Shi 등, Mol Cancer. 2014 Sep 21; 13 : 219). CAR은 면역 세포의 세포 표면에서 항체의 발현뿐만 아니라 세포 내로의 신호 전달을 허용하는 항체와 막간 도메인 사이의 융합 분자일 수 있다.
본 발명의 일면에서, 외래 면역 수용체는 조작된 γδT 세포 수용체, 조작된 αβT 세포 수용체, γδT 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 일면에서, 외래 면역 수용체는 조작된 γδT 세포 수용체, 조작된 αβT 세포 수용체 또는 γδT 세포 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 측면에서, 외래 면역 수용체는 조작된 αβ 또는 γδT 세포 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 방법의 제1 단계에서, 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포 및 내생 αβT 세포 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물이 제공된다. T 세포의 이러한 혼합물은 하기에 추가로 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 이 T 세포 혼합물은 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉하여 항체 - 조작되지 않은 T 세포 복합체의 형성을 허용한다. 상기 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 상기 항체는 외래 면역 수용체에 특이적으로 결합하지 않는다. 따라서, 상기 항체는 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 대해 선택적이다.
알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 예를 들어 T 세포 수용체의 알파 사슬, T 세포 수용체의 베타 사슬, 또는 T 세포 수용체의 알파 및 베타 사슬 모두에 결합한다. 인간 기원의 알파 및 베타 사슬의 세포 외 도메인의 예는 각각 서열 번호 7에 열거되어있다. 1-2. 상기한 바와 같이, 알파 베타 T 세포 수용체는 가변 도메인을 가지며, 가장 가변적인 영역은 알파 및 베타 체인의 CDR로 구성된다. 상기 조작되지 않은 T 세포의 상기 내생 알파 베타 T 세포 수용체가 특이성과 관련하여 이질적이기 때문에, 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 알파 베타 T 세포 수용체의 이종 집단과 결합한다. 따라서, 항체는 알파 베타 T 세포 수용체의 이종 집단에서 발견되는 알파 베타 T 세포 수용체의 영역에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 항체는 알파 베타 T 세포 수용체의 불변 영역에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는 항체는 인간 알파 사슬의 불변 영역 및/또는 인간 베타 사슬의 불변 영역에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 항체는 바람직하게는 SEQ ID NO.1 및도 7A에 기재된 바와 같이 인간 알파 사슬의 불변 영역 및/또는 SEQ ID NO : 1에 대해 열거 된 바와 같이 인간 베타 사슬의 불변 영역에 결합한다. 2 및도 7a에 도시된 바와 같이 형성된다.
알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체의 결합은 예를 들어, FACS 분석을 통해. 예를 들어, 조작되지 않은 T 세포를 대조 항체 또는 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시킨다. 본 발명에 따른 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 유동 세포 계측법에 의해 측정된 바와 같이 대조군 항체와 비교하여 평균 형광 강도 (MFI)의 증가를 초래하는 항체로서 정의될 수 있다. MFI는 선택된 형광 채널 (FITC, PE, PerCP 등)의 형광 강도의 평균입니다. 음성 대조 항체로서, 면역 글로불린 (또는 매우 다른 면역 글로불린)에 결합하지 않는 항체가 사용될 수 있다. 따라서, 당업자는 알파 베타 T 세포 수용체에 대한 항체의 특이적 결합을 결정하기 위한 적절한 조건을 선택할 수 있다. 항체 결합은 특이성 및 친 화성의 관점에서 나타낼 수 있다. 특이성은 어느 항원 또는 그의 에피토프가 항체에 결합되는지를 결정한다. 친화력은 항체와 항원 (Ka) 사이의 결합 강도의 척도이다.
따라서, 당업자는 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 인간 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 Miltenyi (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich-Ebert-Straße 68, 51429 Bergisch Gladbach, Germany)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 이 항체는 마우스 이소 타입 IgG2b 인 세포 클론 BW242 / 412에서 유래한 것이다. BW242 / 412 항체로 표지된 FITC는 Miltenyi로부터 주문 번호. 130-098-688. BW242 / 412 세포 클론 및 BW242 / 412에 의해 발현된 항체는 문헌 [i.a. EP0403156B1에 개시되어있다. 특히, 이러한 항체는 EP0403156B1에서 클론 BMA031에 대해 열거 된 BMA031 중사슬 및 경사슬 서열에 의해 코딩되는 항체이다. 다른 적합한 항체는 예를 들어, 예를 들어 pan-αβTCR-PE (# A39499) 또는 pan-αβTCR-PC5 (# A39500)와 같은 Beckman Coulter, Marseille Cedex, France에서 입수 할 수 있는 항 -αβTCR 항체를 포함한다. 마우스 알파 베타 체인에 더 적합한 것은 BD Pharmingen (BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA)에서 입수 할 수 있는 쥐 TCRβ-PE (클론 H57-597) 항체 - 조작되지 않은 T 세포 복합체의 형성 후, 항체 - 조작되지 않은 T 세포 복합체를 T 세포의 혼합물로부터 분리하여 조작된 T 세포가 농축된 제제를 수득한다. 이렇게 하면 내생 알파 베타 T 세포 수용체가 있는 조작되지 않은 T 세포가 T 세포 혼합물에서 제거된다. 특정 항체를 사용하는 적합한 분리 단계는 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 자기 활성화 세포 선별 (MACS), 형광성 세포 선별 (FACS) 또는 면역 친화 크로마토 그래피는 사용될 수 있는 방법이다. 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 MACS 용 자기 비드에 결합되거나 FACS 용으로 형광 표지되거나 적합한 크로마토 그래피 수지에 결합 될 수 있다. MACS 또는 면역 친 화성 크로마토 그래피를 사용하여 수지에 결합하지 않는 세포를 수득함으로써 조작된 T 세포가 농축된 제제를 얻는다. FACS에서, 표지되지 않은 세포가 얻어지고, 이로써 조작된 T 세포가 농축된 준비물을 얻는다. 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체만을 사용하는 대신, 상기 항체에 특이적인 2차 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체가 마우스 항체 인 경우, 수지 또는 마그네틱 비드에 커플 링 된 염소 - 항 - 마우스 항체가 사용될 수 있다. 항체 - 조작되지 않은 T 세포 복합체는 염소 - 항 - 마우스 항체를 통해 수지 또는 자기 비드에 결합할 것이다. 또는, 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 실시예에 기재된 바와 같은 바이오틴 표지를 지닐 수 있고, 수지 또는 마그네틱 비드에 커플 링 된 항 비오틴 항체를 사용할 수 있다. 따라서, 항체 - 비 조작 T 세포 복합체를 T 세포의 혼합물로부터 분리하여 조작된 T 세포가 농축된 제제를 수득하기에 적합한 많은 분리 방법이 이용 가능하고 당업자에게 잘 알려져 있다.
상기한 바와 같이, T 세포의 혼합물은 외래 면역 수용체의 차선 발현을 가지며 여전히 발현된 내생 알파 베타 T 세포 수용체의 상당한 양을 가질 수 있는 조작된 T 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 제공되는 T 세포의 혼합물은 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포, 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작되지 않은 T 세포 및 외래 면역 수용체 및 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 분리 단계에서, 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작되지 않은 T 세포 및 외래 면역 수용체 및 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작된 T 세포가 혼합물로부터 분리될 수 있다. 따라서, 분리 단계는 내생 알파 베타 T 세포를 혼합물로부터 분리하는 것에만 국한되지 않는다. 따라서, 방법의 단계 a)에서, T 세포의 혼합물이 제공될 때, 이 혼합물은 외래 면역 수용체 및 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 또한 포함할 수 있다. 단계 b)에서 항체 조작된 T 세포 복합체는 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 통해 형성되어 비 조작 T 세포 이외에 단계 c)에서 이들 세포의 분리를 허용할 수 있다. 예를 들어, 도 4A의 좌측도에 도시된 바와 같이, T 세포의 혼합물은 외래 면역 수용체 (γδTCR, 오른쪽 아래 사분면), 내생 알파 베타 T 세포 수용체 (αβTCR, 왼쪽 위 사분면)를 갖는 조작되지 않은 T 세포 ), 외래 면역 수용체 및 내생 알파 베타 T 세포 수용체 (γδTCR 및 αβTCR 모두, 오른쪽 위 사분면)를 갖는 조작된 T 세포를 포함한다. 디플리션되면, αβTCR 양성 세포가 제거되고, γδTCR 및 αβTCR 둘 다로 표시된 세포의 상당 부분이 제거된다. 그러한 세포는 전형적으로 현재 이용 가능한 임의의 표준 위치 선택 방법으로 유지될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에서, 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 외래 면역 수용체 및 비 조작 T 세포를 갖는 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물이 제공된다. 본 발명의 한 구체 예에서, 상기 혼합물을 제공하는 단계는
i. T 세포를 제공하는 단계;
ii. 외래 면역 수용체를 코딩하는 핵산 또는 핵산을 제공하는 단계;
iii. T 세포 내로 핵산 또는 핵산을 도입함으로써, 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포와 외래 면역 수용체 및 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작되지 않은 T 세포의 혼합물을 제공하는 단계를 포함한다.
T 세포를 제공하는 단계는 알파 베타 T 세포를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 이를 사용하여 MACS 선택을 사용하여 셀을 선택함으로써. BW242와 같은 알파 베타 T 세포 수용체 항체. T 세포를 제공하는 단계는 또한 감마 및 델타 T 세포 및 알파 베타 T 세포를 포함하는 T 세포를 포함하는 PBMC를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. T 세포를 제공하는 단계는 또한 알파 베타 T 세포 및 감마 델타 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. CD3 항체가 있는 MACS 선별을 통한 T 림프구를 제공할 수 있다. T 세포는 일차 세포, 예를 들어 인간 대상체와 같은 대상체일 수 있다. 세포 집단 또는 그 상당 부분이 알파 베타 T 세포 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 한, 즉 일차 세포 또는 임의의 다른 세포주인 임의의 세포 유형(예 FACS 정렬)이면 충분하며, 즉 αβT 세포 수용체에 양성이다.
외래 면역 수용체는 예를 들어, 감마인 제1 사슬 및 델타 사슬인 제2 사슬을 포함하는 감마 델타 T 세포 수용체. 이들은 단일 핵산 또는 2개의 분리된 핵산 상에 제공될 수 있다. 제1 사슬을 코딩하는 제1 핵산 및 제2 사슬을 코딩하는 제2 핵산, 또는 제1 사슬 및 제2 사슬 모두를 코딩하는 단일 핵산. 상기 핵산 또는 핵산은 DNA 또는 RNA 일 수 있다. 세포 내로 도입되고 그것이 코딩하는 외래 면역 수용체의 아미노산 서열이 세포 표면 상에 발현되도록 발현되는 한,
바람직하게는, 일 실시 형태에서, 외래 면역 수용체를 코딩하는 핵산은 실시예 섹션에 기재된 바와 같은 외래 면역 수용체를 코딩하며, 여기서 상이한 사슬, 즉 알파 및 베타 사슬 또는 감마 및 델타 사슬은 단일 번역된 단백질 생성물 분리된 사슬이 형성되도록 번역된 단백질의 자가 절단을 초래하는 양 사슬의 코딩 서열 사이에 실시예에 기재된 바와 같은 F2A 또는 T2A 펩타이드 링커 서열을 포함한다.
외래 면역 수용체를 코딩하는 핵산 또는 핵산은 T 세포의 세포질에 도입 될 때 외래 면역 수용체에서 직접 번역될 수 있는 mRNA 일 수 있다. 형질 감염을 통해. 바람직하게는, 핵산 (또는 핵산)은 예를 들어, T 세포 수용체 사슬은 유전자 구조물에 포함된다. 유전자 구조물 (또는 구조물)은 외래 면역 수용체를 코딩하는 mRNA의 발현이 조작된 T 세포의 표면상에 발현되도록 한다. 유전체 구조물은 DNA 벡터 또는 바이러스 벡터에 포함될 수 있다. 핵산 또는 핵산의 도입은 사용되는 핵산 또는 핵산의 유형에 따라 형질 감염 또는 형질 도입 방법을 통해 이루어질 수 있다. 어떤 유형의 유전 구조물 또는 구조물이 사용되는지에 따라, 유전 구조물은 DNA 또는 RNA로 구성될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 유전자 구조물이 레트로바이러스 또는 렌티 바이러스 벡터에 혼입되는 경우, 유전자 구조물은 RNA 벡터 게놈 (즉, 유전자 구조물을 코딩하는 서열)에 포함된다. 레트로바이러스 및 렌티 바이러스 벡터는 세포에 도입될 때 후속적으로 숙주 게놈에 통합되는 DNA로 역전사 되는 RNA 게놈을 갖는 당 업계에 잘 알려져 있다. 역전사는 결과적으로 유전 정보, 즉 유전자 구조물이 RNA로부터 이중 가닥 DNA로 변형되어 그로부터의 발현을 가능하게 한다. 유전체 구조물을 포함하는 바이러스성 벡터 게놈을 유지하면서 형질 전환된 세포의 증식을 가능하게 하기 때문에 통합이 유리하다. 유전자 구조물은 또한 DNA 벡터에 포함될 수 있다. 플라스미드 DNA. 적합한 DNA 벡터는 트랜스포존일 수 있다. 적절한 트랜스포존 시스템 (예 : 클래스 I 또는 클래스 II 기반)은 당 업계에 잘 알려져 있다. 상기한 바와 같이, 외래 면역 수용체가 2개의 사슬를 포함하는 경우, 예를 들어, 감마 및 델타 T 세포 수용체 사슬를 이용하여, 두 개의 분리된 유전자 구조물을 제공할 수 있다. 단일 또는 2개의 분리된 레트로바이러스 또는 DNA 벡터 상에 존재한다. 대안으로, 단일 유전자 구조물은 예를 들어 설명한 바와 같이 두 사슬을 코딩하는 단일 mRNA를 발현할 수도 있다. 그러한 mRNA는 2개의 사슬을 개별적으로 코딩할 수 있다. IRES를 통해 또는 본원에 기술된 바와 같은 자기 분해성 펩타이드 서열을 사용함으로써 수행될 수 있다.
사용되는 핵산 또는 코딩된 핵산은 외래 면역 수용체의 발현을 제공한다. 이는 예를 들어 외래성 면역 수용체의 높은 수준의 발현을 강력하게 유도한다. 높은 발현 수준을 사용하면 실시예 섹션에서 예시된 바와 같이 내생 T 세포 수용체 발현이 억제된다. 내생 T 세포 발현은 또한 대안적인 방법 및 예를 들어 추가 방법을 통해 억제될 수 있다. shRNA 발현을 통한 RNAi, 징크 핑거, CRISPR 또는 TALENS을 통하여 억제될 수 있다.
어쨌든, T 세포 내로 핵산 또는 핵산을 도입하는 것이 효율적일 수 있지만, 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 외래 면역 수용체 및 조작되지 않은 T 세포를 갖는 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물을 제공할 수 있다. 핵산이나 핵산이 도입되지 않은 T 세포를 나타내는 내생 알파 베타 T 세포 수용체가 있는 비 조작 T 세포. 또한, 조작된 T 세포는 T 세포의 혼합물 중에 존재하는 조작된 T 세포의 아군 (subpopulation)을 포함할 수 있으며, 도입은 내생 알파 베타 T 세포 수용체의 (충분한) 억제를 초래하지 않는다. 내생 알파 베타 T 세포 수용체의 (충분한) 억제를 갖지 않는 T 세포의 이러한 아군 (subpopulation)은 또한 항 -α 베타 T 세포 수용체 항체가 이에 결합할 수 있기 때문에 T 세포 혼합물로부터 효율적으로 제거될 수 있다. 그러한 조작된 T 세포의 집단은 외래 면역 수용체 및 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 대해 예를 들어, FACS 분석을 통해 계츨된다.
외래 면역 수용체를 포함하는 조작된 T 세포는 또한 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 선택 가능한 마커는 외래 면역 수용체 이외에 임의의 핵산 서열 및/또는 아미노산 서열로서 정의될 수 있으며, 이로써 이로부터 제공되는 세포를 선택할 수 있다. 예를 들어, 선택 가능한 마커는 네오마이신 또는 퓨로마이신 내성 유전자일 수 있다. 유전자 구성물 및/또는 벡터가 전달된 세포의 선택은 네오마이신 또는 퓨로마이신의 존재하에 항온 처리함으로써 수행될 수 있다. 다른 선택 가능한 마커는 예를 들어 녹색, 적색 및 황색 형광 단백질 중 임의의 하나 일 수 있다. 그 후 선택은 예컨대 FACS를 통해 수행될 수 있다. 상기한 바와 같이, 내생 알파 베타 T 세포 수용체의 불충분한 억제의 결과인 조작되지 않은 T 세포는 유전자 구성물 및 따라서 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 이러한 세포는 바람직하지 않으며 이들을 제거하면 조작된 T 세포가 풍부해진다. 따라서, 농축(enriched) 방법은 또한 양성 선택 방법으로 선별된 선행 기술의 조작된 T 세포에 이점이 있다. 추가 선별 마커를 포함시킴으로써 및/또는 외래 면역 수용체에 대한 항체를 갖는 세포를 선택함으로써 수행할 수 있다.
그러나, 본 발명의 방법은 임의의 선택 가능한 마커를 사용하지 않고 조작되지 않은 세포를 제거 할 수 있기 때문에, 선택 가능한 마커를 가질 필요는 없다. 본 발명에 따르면, 선별 마커는 외래 면역 수용체가 아닌 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 조작된 T 세포는 선택 가능한 마커를 개별적으로 발현하지 않는다. 따라서, 상기 핵산 또는 본 발명에 따른 핵산은 외래 면역 수용체를 코딩하는 것 이외에 별도로 발현된 선별 마커를 코딩할 필요가 없다. 따라서, 일 실시 양태에서, 외래 면역 수용체를 코딩하는 상기 핵산 또는 DNA 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 트랜스포존 등은 선택 마커를 포함하지 않는다. 선택 가능한 마커가 조작된 T 세포에서 기능을 하는 것으로 이해된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 조작되지 않고 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물은 인간 세포이다. 따라서, 이것은 외래 면역 수용체를 코딩하는 핵산 또는 핵산이 인간 T 세포에 도입되어 이러한 T 세포 혼합물을 제공한다는 것을 의미한다. 즉, 이 방법에 사용된 항체는 인간 알파 베타 T 세포 수용체와 특이적으로 결합한다. 본 발명의 추가의 측면에서, 인간 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 BW242 / 412 항체이다. 언급된 바와 같이, 상기 항체는 Miltenyi (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich-Ebert-Straße 68, 51429 Bergisch Gladbach, Germany)로부터 상업적으로 입수 가능하며, i.a. EP0403156B1 호에 개시되어있다.
상기에서 명백한 바와 같이, 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 외래 면역 수용체에 특이적으로 결합하지 않는다. 따라서, 이 선별 기준은 방법에 대해 선택할 수 있는 모든 항체에 적용된다. 따라서, 외래 면역 수용체는 사용된 T 세포에 내생인 알파 베타 T 세포 수용체와 일치하지 않을 수 있지만, 도입 유전자로서 제공된다. 이는 본 발명의 단계 b) 및 c)에서 달리 조작되지 않은 T 세포뿐만 아니라 조작된 T 세포가 또한 제거되기 때문이다. 외래 면역 수용체로서 알파 베타 T 세포 수용체를 사용하는 것이 바람직한 경우, 항체가 더 이상 외래 면역 수용체에 특이적으로 결합하지 않도록 그의 서열을 변형시키는 것이 요구된다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 외래 면역 수용체는 조작된 알파 베타 T 세포 수용체이다.
본 발명의 한 측면에서, 외래 면역 수용체는 감마 델타 T 세포 수용체 또는 조작된 감마 델타 T 세포 수용체 또는 인공 알파 베타 T 세포 수용체이다. 본 발명의 한 측면에서, 외래 면역 수용체는 감마 델타 T 세포 수용체 또는 조작된 감마 델타 T 세포 수용체 또는 조작된 알파 베타 T 세포 수용체이고, 외래 면역 수용체는 T 세포의 혼합물의 동일한 기점을 갖는다. 다른 측면에서, 외래 면역 수용체는 인간 감마 델타 T 세포 수용체 또는 인간 조작된 감마 델타 T 세포 수용체 또는 인간 조작된 알파 베타 T 세포 수용체이다. 알파 베타 T 세포 수용체와는 달리, 감마 델타 T 세포 수용체는 알파 베타 T 세포 수용체와는 다른 서열을 갖는다. 따라서, 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 통상 내생 감마 델타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하지 않는다. 따라서, 외래 면역 수용체로서 사용되는 감마 델타 T 세포 수용체를 변형시킬 필요가 없다. 그럼에도 불구하고, 감마 델타 T 세포 수용체를 변형시키는 것은 다른 이유, 예를 들면, 조작된 T 세포가 생체 내에서 사용될 때, 내생 감마 델타 T 세포와 차별화되어야 한다.
일면으로, 외래 면역 수용체는 서열 번호 3 및 서열 번호 4에 열거된 감마 및 델타 사슬 서열을 포함하는 감마 델타 T 세포 수용체이다. 이들 서열은 G115 및 δ5에 상응한다. 이러한 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포는 예를 들어, BW242 항체에 의해 농축(enriched)될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 조작된 알파 베타 T 세포 수용체 또는 조작된 감마 델타 T 세포 수용체는 변형된 불변 영역을 포함한다. 불변 영역을 변형시키는 것은 가변 영역에 영향을 미칠 수 있는 위험성이 있으므로 항원 특이성 및/또는 친 화성을 피할 수 있기 때문에 유리할 수 있다.
일 구체 예에서, 본 발명에 따른 방법에서, 인간 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 BW242 / 412 항체이고, 외래 면역 수용체는 조작된 인간 알파 베타 T 세포 수용체이다. 바람직하게는, 조작은 인간 알파 베타 T 세포 수용체의 불변 영역의 변형을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 변형 불변 영역은 T 세포 수용체 베타 사슬의 도메인 3의 변형을 포함하며, 바람직하게는 변형은 도메인 3의 뮤린 화를 포함한다. 실시예 부분에서 예시된 바와 같이, BW242 / 412 항체의 결합 부위는 T 세포 수용체 베타 체인의 도메인 3. 따라서, 이 영역만 변형시키는 것은 BW242 / 412 항체가 외래 면역 수용체, 즉 상기 변형된 인간 알파 베타 T 세포 수용체 사슬에 실질적으로 결합하지 않으면서 인간 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 대해 선택성이 되게 한다. 바람직하게는, 알파 베타 T 세포 수용체 사슬은 도 7A에 도시된 바와 같이 인간 베타 T 세포 수용체의 인간 도메인 3 도메인 3 대신 쥐 도메인 3의 상응하는 쥐 아미노산 서열을 포함한다 (참조 문헌의 아미노산 88-121 참조. 인간 서열은 대응하는 마우스 서열과 정렬 됨).
따라서, 상응하는 인간 알파 베타 T 세포 수용체의 특이적 변형과 결합 된 BW242 항체 (또는 BMA031 항체)에 대한 실시예 섹션에 나타낸 바와 같이, 내생 알파 베타 T 세포에 결합하는 항체의 결합 부위 대응하는 인간 알파 베타 T 세포 수용체의 변형이 최소화될 수 있다. 예를 들어, BW242 / 412 항체의 결합 부위는 이제 도메인 3에 매핑되고, 도메인 3의 아미노산을 추가로 선택적으로 변형시키면 BW242 / 412 항체와 상호 작용하는 도메인 3의 아미노산을 확인하게 된다. 이러한 방식으로, 최소한으로 변형된 조작된 인간 알파 베타 T 세포 수용체는 소수의 아미노산만 상이하게 제공될 수 있다. 마찬가지로, BW242 이외의 항체가 내생 알파 베타 T 세포 수용체와 이에 상응하는 조작된 알파 베타 T 세포 수용체 사이에서 선택 될 때 동일한 접근법이 뒤따를 수 있다.
농축(enriched)된 조작된 T 세포 및 그 용도
또 다른 실시 양태에서, 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 방법은 상기 방법 중 어느 하나에 의해 수득 가능한 조작된 T 세포가 농축된 제조를 제공한다. 그러한 제제는 상기 방법에 적용되지 않는 제제와 비교하여 조작된 T 세포의보다 높은 백분율을 포함할 것이다. 상기 방법들 중 임의의 방법에 의해 얻을 수 있는 농축(enriched) 조작된 T 세포의 이러한 제조는 또한 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 비 조작 조작된 T 세포 및 저 조작된 T 세포가 항체를 사용하여 분리된 농축(enriched)된 조작된 T 세포의 제제로 정의될 수 있다 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합한다. 이러한 제제는 농축(enriched)된 조작된 T 세포가 실질적으로 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 포함하지 않는 농축(enriched)된 조작된 T 세포의 제제로 정의될 수도 있다. 이러한 제제는 농축(enriched)된 조작된 T 세포가 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 실질적으로 포함하지 않고 또한 선택 가능한 마커를 포함하지 않는 농축(enriched)된 조작된 T 세포의 제제로 정의될 수 있다. 이러한 제제는 또한 농축(enriched)된 조작된 T 세포가 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 실질적으로 포함하지 않고 또한 선택 가능한 마커를 포함하지 않고 결합하는 항체로 선택되지 않은 농축(enriched)된 조작된 T 세포의 제제로 정의될 수 있고, 외래 면역 수용체와 관련이 있다.
농축(enriched)된 조작된 T 세포의 상기 조제물은 실시예에 나타낸 바와 같이 포지티브 선택 방법을 사용하여 농축(enriched)된 선행 기술의 제제와 비교할 때 암세포의 농축(enriched)된 살상을 나타낸다. 또한 실시예 부분에 도시된 바와 같이, T 세포가 특정 암에 대한 특이성을 제공하는 외래 면역 수용체와 함께 제공되는 경우, 그러한 세포는 상기 조작된 T 세포가 농축된 상기 제제가 대상에 제공될 때 선택적으로 사멸될 것이다. 본 발명에 따라 조작된 T 세포가 농축된 이러한 제제는 의학적 치료에 특히 유용하다. 고려될 수 있는 의학적 치료는 예를 들어, 암 치료. 조작된 T 세포가 더 이상 선택 마커의 발현을 필요로 하지 않기 때문에, 선택 마커의 발현과 관련된 어떠한 부작용도 피할 수 있다. 또한, 농축(enriched) 조작된 T 세포는 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포의 전부는 아니더라도 대부분을 가지고 있으므로 원하지 않는 표적을 일으키는 내생 알파 베타 T 세포 수용체의 위험을 피할 수 있다. 농축(enriched)된 조작된 T 세포는 또한 농축(enriched)된 조작된 T 세포의 품질에 해로울 수 있는 선행 기술 선택 및 농축(enriched) 방법에서 사용되는 것과 같은 외래 면역 수용체에 대한 항체의 결합과 관련된 임의의 세포 사멸을 겪지 않을 것이다.
생체 내에서 (농축(enriched)된) 조작된 T 세포 디플리션
또 다른 실시 양태에서, 상기 정의된 외래 면역 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는, 위의 방법 중 하나 조작된 T 세포가 농축(enriched) 함유된 제제로 치료할 때, 상기 외래 면역 수용체로 치료할 때 부작용을 겪는 대상의 치료에 사용하기 위해 제공된다. 상기 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법 중 어느 하나에 의해 수득 가능한 농축(enriched)된 조작된 T 세포는 의학적 치료에 유용하다. 그럼에도 불구하고, 그러한 치료는 경우에 따라 투여된 농축(enriched)된 조작된 T 세포로 인한 부작용을 야기할 수 있다. 부작용은 통제되지 않은 증식 또는 활성화, 또는 건강한 세포에서 예기치 않은 항원에 대한 활성화 일 수 있다. 피험자의 따라서, 이러한 시나리오에서, 피험자에게 투여된 조작된 T 세포를 선택적으로 제거 (소멸)시키는 것이 바람직하다. 이것은 조작된 T 세포를 특이적으로 표적으로 하는, 즉 외래 면역 수용체를 포함하는 항체를 투여함으로써 달성될 수 있다. 상기 항체는 내생 알파 베타 T 세포 또는 내생 감마 델타 T 세포와 같은 내생 T 세포를 표적으로하지 않는다. 이러한 방식으로, 외래 면역 수용체 이외에 조작된 T 세포에 더 이상 유전자 구조를 코딩하는 것이 요구되지 않는다. 자멸 유전자 또는 조작된 T 세포를 선택적으로 사멸시키는 다른 유전자를 포함할 수 있다.
상기 항체는 내생 T 세포를 표적화 하지 않기 때문에, 내생 T 세포 수용체에 상응하는 기원을 갖는 조작된 알파 베타 T 세포 수용체 또는 조작된 감마 델타 T 세포 수용체가 사용되는 경우, 상기 외래 면역 수용체는 변형, 항체는 단지 외래 면역 수용체만을 표적으로 한다. 예를 들어, 인간 도메인 3 영역이 마우스 도메인 3 영역으로 대체된 외래 면역 수용체가 사용되는 경우, 상기 항체는 예를 들어, HB-218 (ATCC) 유래의 H57- 597 유래는 마우스 도메인 3 부위를 표적으로 하는 것이다. 이 방법으로, 인간 대상에서, 항체는 선택적으로 조작된 외래 면역 수용체를 표적으로 하고 내생 T 세포 수용체를 표적으로 삼지 않을 것이다. 따라서, 예를 들어, 마우스 알파 베타 T 세포 수용체 또는 마우스 감마 델타 T 세포 수용체에 결합하는 항체는 상응하는 인간 T 세포 수용체로 전달될 수 있는 각각의 T 세포 수용체의 특이적 영역 (또는 특이적 항체)을 제공하기 때문에 유용하다. 최적으로, 언급된 항체 BW242 / 412 (농축(enriched)를 위해 사용됨) 및 H57-597 (디플리션을 위해 사용됨)으로 예시 된 바와 같이, 농축(enriched)에 사용된 개질된 영역은 마우스 도메인 3으로부터 유래 된 영역과 같이 디플리션에 사용되는 서열 부위에 도입된다. 이 영역은 특히 면역 원성이 될 잠재성뿐만 아니라 T 세포 수용체에서의 현저한 위치로 인해 흥미로울 수 있다. 마찬가지로, 키메라 항원 수용체가 사용되는 경우, 숙주 단백질과 동일할 수 있는 구성 요소로부터 구축될 수 있다 (예. 항체는 상응하는 숙주 단백질을 표적하지 않고 키메라 항원 수용체만을 표적하는 것으로 선택된다. 알파 베타 TCR에 대해 기재된 바와 동일한 접근법에서, 이러한 숙주 서열은 변형되어, 즉 조작되어, 투여된 항체가 상기 숙주 단백질을 표적하지 않도록 할 수 있다. 따라서, 키메라 항원 수용체가 사용되는 경우, 이는 사용된 항체가 조작된 CAR 및 상응하는 숙주 단백질 서열을 구별할 수 있도록 숙주 서열의 일부가 변형될 수 있는 조작된 키메라 항원 수용체 일 수 있다. 따라서, 예를 들어 마우스 및 인간 서열을 정렬하고, 실시예에 기재된 바와 같은 항체의 결합에 대해 마우스 및 인간 면역 수용체를 비교함으로써, 인간 면역 수용체가 화석화 될 수 있다. 즉, 인간 면역 수용체의 일부는 쥐 수용체의 상응하는 부분으로 교환되었다. 상응하는 부분은 인간 및 마우스 서열을 정렬함으로써 쉽게 수득 될 수 있다. 따라서, 진균 화는 면역 수용체의 서열 일부를 쥐의 기원의 대응 부분으로 대체하는 것을 포함할 수 있으며, 그러한 부분은 면역 반응의 서열의 일부를 쥐의 기원 부분으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 10-50 개의 아미노산의 스트레치일 수 있지만, 일부 (또는 부분)는 또한 상응하는 영역의 일부인 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있으며 두 서열간에 차이가 있다.
바람직하게는, 환자의 치료는 인간의 치료를 포함하며, 바람직하게는 항체는 인간 항체 또는 예를 들어 항체이다. H57-597 항체와 같은 비인간 항체로부터 유래 된 가변 도메인은 인간화를 통해 인간 항체 백본으로 조작된다. 바람직하게는, 인간이 아닌 서열은 예를 들어, 인간 항체를 원하지 않는 반응을 일으킬 수 있기 때문에 인간 항체가 사용된다. 마우스 항체의 경우 바람직하지 않은 인간 - 항 - 마우스 반응이 유발될 수 있다. 인간 항체라는 용어는 또한 인간화 항체를 포함하는 것으로 이해된다.
상기한 바와 같이, 외래 면역 수용체 및 이렇게 조작된 T 세포를 표적으로 하는 항체의 투여는 조작된 T 세포의 선택적 사멸을 유도할 수 있다. 이러한 선택적인 살상은 항체가 외래 면역 수용체에 결합한 후에 사멸을 유도할 수 있다. 그러한 선택적 살인은 직접적으로 또는 간접적으로 유도될 수 있다. 선택적 살균은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC), 보체 의존성 세포 독성 (CDC) 또는 직접 세포 사멸을 포함할 수 있기 때문에 사람의 치료에서 항체 백본의 인간 유래 서열이 바람직하다. 이러한 선택적 살해의 예는 실시예 섹션에 설명되어 있다.
조작된 T 세포를 표적으로 하는 항체의 사용과 관련하여 전술한 바와 같은 의학적 용도와 관련하여, 그러한 의학적 용도는 전술한 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 조작된 T 세포가 농축(enriched)된 제제에만 국한되지 않는다. 그러한 의학적 사용은 사용된 상기 항체가 외래 면역 수용체에 특이적으로 결합하고 CAR에 포함되는 숙주 단백질 또는 숙주 단백질 서열의 면역 수용체가 아니라면 임의의 조작된 T 세포에도 적용될 수 있다. 이러한 조작된 T 세포는 또한 예를 들어, T 세포를 사용하는 선행 기술 방법(선택 마커)을 사용함으로써 농축(enriched)될 수 있다. 또한, 변형된 T 세포를 선택하는 방법이 요구되지 않기 때문에, 상기 사용은 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 NK 세포에도 적용 가능하다.
따라서, 다른 실시 양태에서, 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 림프구로 치료할 때 부작용을 겪는 대상의 치료에 사용하기 위해, 외래 면역 수용체에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 바람직하게는, 상기 외래 면역 수용체는 조작된 면역 수용체이다.
바람직하게는, 상기 환자는 인간이다. 바람직하게는, 상기 조작된 림프구는 인간 조작된 림프구이다. 바람직하게는, 상기 조작된 림프구는 조작된 NK 세포 또는 조작된 T 세포이다. 상기 항체는 가장 바람직하게는 인간 항체 또는 인간화 항체이며, 바람직하게는 상기한 바와 같은 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 림프구의 세포 사멸을 유도한다.
실시예
내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작되지 않은 T 세포 및 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물로부터 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 농축(enriched)시키기 위한 방법으로서, 하기의 단계를 포함한다:
a) 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 외래 면역 수용체 및 비 조작 T 세포를 갖는 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물을 제공하는 단계;
b) 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체와 T 세포의 혼합물을 접촉시켜 항체 - 조작되지 않은 T 세포 복합체를 형성시키는 단계;
c) 항체 - 비 조작된 T 세포 복합체를 T 세포의 혼합물로부터 분리하여 조작된 T 세포가 농축된 제제를 수득하는 단계.
실시예 1에 따른 방법에있어서,
단계 a)는
i. T 세포를 제공하는 단계;
ii. 외래 면역 수용체를 코딩하는 핵산 또는 핵산을 제공하는 단계;
iii. T 세포 내로 핵산 또는 핵산을 도입함으로써, 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포와 외래 면역 수용체 및 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작되지 않은 T 세포의 혼합물을 제공한다.
3. 외래 면역 수용체를 코딩하는 것 이외에 핵산 또는 핵산이 별도로 발현된 선택 마커를 코딩하지 않는 것인, 실시 양태 2에 따른 방법을 제공한다.
4. 실시예 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 조작되지 않고 조작된 T 세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
5. 실시예 4에 따른 방법으로서, 항체는 BW242 / 412인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 외래 면역 수용체가 조작된 알파 베타 T 세포 수용체, 조작된 감마 델타 T 세포 수용체인 것을 특징으로 하는 실시 양태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 방법.
7. 실시예 6에 따른 방법으로, 조작된 알파 베타 T 세포 수용체 또는 조작된 감마 델타 T 세포 수용체는 인간 조작된 알파 베타 T 세포 수용체 또는 인간 조작된 감마 델타 T 세포 수용체이다.
8. 실시예 6 또는 실시예 7에 따른 방법으로서, 조작된 알파 베타 T 세포 수용체 또는 조작된 감마 델타 T 세포 수용체는 변형된 불변 영역을 포함한다.
9. 실시예 5에 따른 방법에있어서, 외래 면역 수용체는 조작된 인간 알파 베타 T 세포 수용체이고, 조작은 T 세포 수용체 베타 사슬의 도메인 3의 변형을 포함하며, 바람직하게는 변형은 도메인 3의 머 라이 닌화를 포함한다.
10. 외래 면역 수용체가 감마 델타 T 세포 수용체, 바람직하게는 인간 감마 델타 T 세포 수용체 인 실시 양태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 방법.
11. 실시 양태 1 내지 9의 방법 중 임의의 하나에 의해 수득 가능한 조작된 T 세포가 농축된 조제물.
12. 의학적 치료에 사용하기 위한, 실시 양태 11에 따른 조작된 T 세포가 농축된(강호된) 제제.
13. 암의 치료에 사용하기 위한, 실시 양태 12에 따른 조작된 T 세포가 농축된 제제.
14. 실시예 1 내지 9 중 어느 하나에 정의 된 바와 같은 외래 면역 수용체에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 외래 면역과 함께 조작된 T 세포가 농축된 제제로 치료할 때 부작용을 겪는 대상의 치료에 사용하기 위한 항체. 실시 양태 1-9의 방법 중 임의의 하나에 의해 수득 가능한 수용체.
15. 실시예 14에 따른 항체, 대상이 인간인 것을 특징으로 하는 항체.
16. 실시예 15에 따른 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체 인 항체.
17. 항체가 조작된 T 세포의 세포 사멸을 유도하는 것 인 실시 양태 14-16 중 어느 하나에 따른 항체.
18. 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 림프구로 치료할 때 부작용을 앓는 환자의 치료에 사용하기 위해 외래 면역 수용체에 특이적으로 결합하는 항체.
19. 실시예 18에 따른 항체에있어서, 상기 환자는 인간인 것인 항체.
20. 조작된 림프구가 인간 조작된 림프구인 것을 특징으로 하는 실시 양태 18 또는 실시 양태 19의 항체.
21. 조작된 림프구가 조작된 NK 세포 또는 조작된 T 세포인 실시 양태 18-20 중 어느 하나에 따른 항체.
22. 항체가 인간 항체 또는 인간화 항체인 실시 양태 18 내지 21 중 어느 하나에 따른 항체.
23. 항체가 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 림프구의 세포 사멸을 유도하는 것인 실시 양태 18-22 중 어느 하나에 따르는 항체.
실시예
실시예 1
외래 면역 수용체, 즉 감마 델타 T 세포 수용체를 갖는 조작된 인간 T 세포를 농축(enriched)함.
세포 및 세포주
Daudi, K562, MDA-MB231, BV173, OPM2 및 Phoenix-Ampho 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 입수 하였다. Niels Bovenschen (University Medical Centre Utrecht, 네덜란드)과 Daudi-Luciferase (Daudi-Luc)의 Anton Martens, SCC9는 OPM2-Luciferase (OPM2-Luc)와 RPMI8226 / S-luc Genmab (위트레흐트, 네덜란드). EBV로 형질 전환 된 림프구 세포주 (EBV-LCL) (Warren et al., Tissue antigens 59, 293-303 (2002))는 Tuna Mutis (University Medical Center, The Netherlands)의 친절한 선물이었다. (암스테르담, 네덜란드) 또는 독일 프랑크푸르트의 수혈 의학 및 면역학 연구소에서 입수 한 AML 환자의 PBMC 샘플은 Matthias Theobald (독일 마인츠)와 University Medical Center Utrecht GCP 및 헬싱키 규정에 따라 수집되었다.
γ9δ2TCR 레트로바이러스 벡터 디자인
고도 종양 반응성 γ9δ2TCR 사슬 유전자, 감마 클론 G115 및 델타 클론 5를 Combinatorial-TCR 사슬 교환, 코돈 최적화 (Geneart Life Technologies, Regensburg, Germany)를 통해 수득하고 레트로바이러스 벡터 pBullet에 단일 TCR 사슬 벡터로서 클로닝 하였다 γ- 사슬 -IRES- 네오 마이신 또는 δ- 사슬 -IRES- 푸로 마이신을 포함한다. G115 및 델타 클론 5는 서열 번호 3 및 4에 열거 된 서열을 포함한다. 또한, 두 개의 상이한 2A 펩타이드 링커 서열, F2A 및 T2A, 및 TCR의 순서를 교환함으로써 TCR 사슬 모두를 함유하는 4 가지 상이한 도입 유전자 카세트를 설계 하였다 (Szymczak et al., Nature biotechnology 22, 589-594 (2004)) 이러한 TCR 카세트 (도 9A-C)는 TCR 카세트를 코딩하는 사슬 (γ9-F2A-δ2; δ2-F2A-γ9; γ9-T2A-δ2; γ9- 두 개의 TCR 사슬을 동시에 발현시키기 위해 최적화 된 레트로바이러스 벡터 pMP71 (Engels 등, Hum Gene Ther 14, 1155-1168 (2003))에 클로닝 하였다 .MDM2 / HLA-A2 TCR로부터 유래 된 알파 사슬로 이루어진 넌센스 마우스 TCR (Stanislawski 등, Nat Immunol 2, 962-970 (2001) 및 p53 / HLA-A2 TCR로부터의 베타 사슬 (Kuball 등, Immunity 22, 117-129 (2005))을 대조 TCR로 사용 하였다 pBullet 및 pMP71 레트로바이러스 벡터 시스템. 또한 pMP71의 절단 된 신경 성장 인자 수용체를 레트로바이러스 형질 도입 실험 (pMP71 : DNGFR)에서 대조군으로 사용 하였다. 로 바이러스 벡터를 표준 방법을 사용하여 형질 도입을 통해 공여자 T 세포에 도입시켰다. F2A 및 T2A 모두 외래 γ9δ2 T 세포 수용체의 발현을 유도하고, 특이적 용해를 유도 할뿐만 아니라, IFN-γ 생산을 유도 할 수 있음이 밝혀졌다. Daudi 또는 OPM2 암세포 주를 표준 분석법을 사용하여 분석 하였다. 펩티드 링커 T2A는 형질 도입 된 공여자 T 세포의 FACS 분석에서 γ9δ2 TCR의 평균 형광 강도를 측정함으로써 결정된 바와 같이 더 높은 발현 수준을 산출하는 것으로 밝혀졌다. 또한, γ9-T2A-δ2는 IFN-γ 생산의 가장 높은 유도를 산출했다. γ9-T2A-δ2 벡터를 추후 실험에 사용 하였다.
조작된 T 세포의 농축(enriched)
αβT 세포에 pMP71 : γ-T2A-δ를 형질 도입하고, 비오틴 표지된 항 -αβTCR 항체 (클론 BW242 / 412, Miltenyi Biotec, Germany)와 함께 항온 배양 한 후, Biotin MicroBeads, Miltenyi Biotec). 다음으로, 세포 현탁액을 LD 칼럼에 적용하고, 제조사의 프로토콜 (Miltenyi Biotec)에 따라 MACS 세포 분리에 의해 αβTCR 양성 T 세포를 디플리션시킨다.
외래 γ9δ2TCR을 가진 농축(enriched)된 인공 T 세포의 동종 반응성 및 보존된 항종양 활성을 제거하였다.
농축(enriched) 후, γδTCR T 세포를 전술 한 T 세포 확장 프로토콜 (Riddell and Greenberg, Journal of immunological methods 128, 189-201 (1990))을 이용하여 확장시켰다. 이 과정으로 단일 αβTCR 양성 T 세포가 거의 완전히 디플리션되었고 (51 %에서 0.4 %로) γδTCR 단일 양성 T 세포가 20 %에서 77 %로 극적으로 증가했습니다 (도 4A). 중요하게도, 남아있는 αβTCR / γδTCR 이중 양성 T 세포는 내생 αβTCR의 상대적으로 낮은 표면 발현을 특징으로 한다. 이 표현형은 T 세포가 고도로 활성화되고 증식하는 자극 후 5 일까지 안정했다. 그러나 표현형은 9 일째 αβTCR / γδTCR 이중 양성 T 세포의 주요 집단 (68 %)으로 변하고 T 세포가 더 쉬는시기에 머물렀을 때 γδTCR 단일 양성 세포 (25 %)의 비율이 감소했다 (도 4A ).
농축(enriched)된 조작된 T 세포의 기능은 선별 및 팽창 10 일 후에 시험되었고 αβTCR 결핍 및 대조 없이 조작된 세포와 비교되었다. αβTCR T 세포 디플리션은 세 가지 종양 세포주 (p <0.001)에 대한 반응으로 IFN-γ 생성뿐만 아니라 Daudi 세포 (p <0.01) (도 4B)의 특이적 용해를 유의적으로 증가시켰다 (도 4C). 조작된 T 세포는 또한 급성 골수성 백혈병 (AML) 환자로부터의 1차 백혈병 세포에 대해 10일째에 시험하였다. 이소필테닐피로포스페이트의 하류에서 메발론산 경로를 차단하기 위해 파미드로네이트로 백혈병 세포를 처리하면 16개의 AML 샘플 중 9개에 응답하여 T 세포에 의한 IFNγ 분비가 일어났다. 테스트한 8개의 시료 중 5개의 시료에서 농축(enriched)된 γδTCR로 조작된 T 세포는 건강한 공여자로부터 분리된 비 조작된 폴리 클론 g9d2T 세포와 비교하여 유의하게 증가 된 IFNγ 수준을 나타냈다.
내생 αβTCR 사슬의 실질적인 재발성 발현으로 생체 내 전달 후 휴식 T 세포를 시뮬레이션하기 위해, 20 일 이상 동안 자극이 결핍된 인공 T 세포를 사용하여 6 일 동안 IL-2가 결핍되었다. 모크 (DNGFR 형질 전환), γδTCR- 조작 및 γδTCR- 조제된 αβTCR 디플리션 된 T 세포를 IFNγ ELISPOT 분석에서 13 개의 미스매치된 EBV-LCL 세포주 또는 건강한 공여체 유래 PBMC 패널에 대해 시험하였다. 모의 T 세포는 9 일 13 개의 EBV-LCL 세포주 γδTCR로 조작된 벌크 T 세포의 알루미늄 - 반응성은 크게 감소되었으며 (9 EBV-LCL 라인 중 8 개에서 유의 한 감소), 더욱 중요하게는 γδTCR- 조작된 αβTCR 디플리션 된 T 세포군 (도 5A)에서도 완전히 제거되었다. 상이한 T 세포 집단이 20 개의 상이한 건강한 제공자 기원 PBMC 패널에 대해 시험되었을 때, γδTCR로 조작된 T 세포의 동등한 반응성이 더욱 명백 해졌다. γδTCR로 형질 전환 된 T 세포 집단에서 동종 반응은 검출되지 않았지만, 모의 T 세포는 10 가지 PBMC 공여체 조합 중 9 가지에 반응하여 IFNγ를 생성 하였다.
최적화된 조작 T 세포 생성물에 의한 생체 내 종양 조절 개선
농축(enriched)된 γδTCR로 조작된 T 세포 생성물의 임상적 효능을 평가하고, pBullet 레트로바이러스 형질 도입 방법 및 항생제 선택 시스템으로 제조된 γδTCR 조작된 T 세포와 비교하였다 (Voss 등, Methods in molecular medicine, 109, 229-256 (2005) 말초 혈액 αβT 세포의 형질 도입 후, 항생제 (pBullet) 또는 농축(enriched)물, 알파 베타 TCR 비드 (pMP71) 및 후속적 T 세포 팽창 제제 모두를 평가한 결과 γδTCR 양성 T 세포 농축(enriched)된 γδTCR T 세포 생성물에 대해 더 높았지만, 세포 당 γδTCR 복합체의 수가 또한 MFI에 의해 측정된 바와 같이 pB : γδTCR T 세포에 비해 2배 이상 증가하였다. 또한, 시험 된 3종의 종양 세포주의 용해는 pB : γδTCR T 세포와 비교하여 pMP71 : γ-T2A-δ 벡터 카세트로 형질 전환 된 농축(enriched)된 γδTCR 조작된 T 세포 제제 시험하기 시험의 항종양 활성 γδTCR 조작된 T 세포의 입양 이전을 위해 인간화 된 마우스 종양 모델에서 생체 내에서 실험을 실시 하였다.@@@@@
방사선 조사된 Rag2 - / - γc - / - 이중 넉 아웃 마우스에게 루시퍼라제 양성 Daudi 종양 세포를 주입하고 γδTCR 또는 모의 TCR 조작된 T 세포를 주입하고 종양 성장을 생물 발광 이미징으로 평가하였다. γδTCR- 조작된 T 세포 제품 모두 모의 TCR T 세포와 비교하여 종양 성장을 유의하게 억제 하였지만, 농축(enriched)된 γδTCR T 세포는 pB : γδTCR T 세포와 비교하여 종양 성장을 지연시키고 생존을 유의하게 증가시켰다. Ragiated Rag2 - / - γc - / - double-knockout mice에 주입 된 Luciferase OPM2 세포를 사용하여 두 번째 종양 모델에서도 비슷한 결과가 얻어졌다. 증대 된 γδTCR 조작된 T 세포 제제를 사용하여 7 마리 중 4 마리에서 종양 성장이 완전히 예방되었다. 첫 번째 종양 및 T 세포 주사 후 120 일 후에 종양이없는 마우스를 사전 조사없이 종양 세포를 2차 주사하여 재차 항원 투여하고 비 조사 된 생쥐를 종양 성장에 대한 대조군으로 사용하였다. 다시 도전 한 생쥐는 종양이 없는 상태로 남아 있었지만 naai 생쥐에서는 종양이 자라났으며 γδTCR T 세포 치료가 생체 내에서 장기적인 종양 보호를 제공한다는 것을 나타냈다.
결론
결과는 알파 베타 T 세포 수용체 (BW242)에 결합하는 항체를 사용하여 조작된 T 세포, 즉 감마 델타 T 세포 수용체 (감마 클론 G115 및 델타 클론 5)가 제공된 T 세포를 농축(enriched)하는 것이 형질 감염되지 않은 세포 . 또한, 발현된 외래 면역 수용체는 내생 알파 베타 T 세포 수용체의 하향 조절을 초래하였다. 이러한 농축(enriched)된 조작된 T 세포 제제는 항종양 효능의 향상 및 동종 반응성의 감소 또는 폐지를 제공한다. 또한, 그러한 농축(enriched)된 조작된 T 세포 제제는 생체 내에서 매우 개선된 종양 조절을 제공한다.
실시예2
외래 면역 수용체, 즉 조작된 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작된 인간 T 세포의 농축(enriched)
외래 면역 수용체, 즉 마우스 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작된 인간 T 세포의 농축(enriched)
종양 특이적인 γδTCR의 도입은 조작된 T 세포에서 내생 αβTCR의 발현을 낮추는 것으로 나타났다 (상기 실시예 1 참조). 결과적으로 조작된 T 세포는 조작되지 않은 αβT 세포와 비교했을 때 표면에 내재적 인 αβTCR의 밀도가 훨씬 낮게 나타난다. 이것은 사용된 외래 면역 수용체의 유형에 국한되지 않는 효과입니다. 마우스 알파 베타 T 세포 수용체는 인간 T 세포를 조작하기 위한 외래 면역 수용체로 사용되었다. 인간 알파 베타 T 세포는 단클론 항체 αβTCR-mAb 클론 BW242를 사용하여 MACS로 제거 하였다. 따라서, MACS에 의한 분리 후, 마우스 αβTCR을 발현하도록 재 유도 된 인간 αβT 세포는 그들의 표면에 내생 αβTCR의 감소 된 수준을 나타낸다 (도 6A, MACS 이전 및 MACS와 비교). 따라서, 인간 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적인 항체를 사용함으로써, 마우스 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작된 T 세포가 농축(enriched)될 수 있다.
BW242 항체는 조작된 인간 알파 베타 T 세포 수용체에 결합하지 않는다
따라서, BW242 항체는 뮤린 알파 베타 T 세포 수용체와 인간 알파 베타 T 세포 수용체 사이에서 선택적이다. 따라서, αβTCR 단일 클론 항체의 결합에 대해 인간 알파 베타 TCR 불변 도메인의 머린화(merinized)가 분석되었다. 머린화(murinization)를 최소화하면 조작된 항원 특이성을 가진 '손길이 닿지 않은'T 세포가 풍부해집니다(강호됩니다). 머린화(merinized)가 최소인 경우, 외래 알파 베타 T 세포 수용체는 내생 T 세포 수용체와 실질적으로 동일하지만 상당량의 알파 베타 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포를 선택적으로 제거할 수 있게한다.
완전 등급 αβTCR에 대한 임상 등급 αβTCR 모노클로날 항체 BW242 (mAb BW242 또는 BW242라고도 함)와 유세포 분석기로 유래 변이형과의 결합을 비교하였다. TCRβ - / - JurMa 세포는 조작된 쥐 난센스 αβTCR (Stanislawski 등, Nat Immunol, 2001.2 (10) : MDM2 특이적 TCR로부터 얻은 α 사슬)을 포함하는 임상적으로 승인된 레트로바이러스 벡터 pMP71로 레트로바이러스로 형질 감염시켰다. (Kuball et al., Immunity, 2005.22 (1) : p.117-29) 또는 NY-ESO-1 / HLA-A2를 사용하여 얻은 β- 사슬 (p-962-70) (αMU / βMU, αhu / βhu 및 αhuMU / βhuMU로 각각 지칭 됨)로 구성된 NY-ESO-1 / HLA-A2 특이적 키메라 αβTCR 또는 트랜스제닉 TCR 발현은 NY-ESO-1 TCRβ- 연사슬의 가변 영역에 대한 항 -Vβ4 또는 MDM2 / p53 뮤린 TCR의 TCRβ- 사슬에 대한 항 -β 마우스로 염색됨으로써 확인되었다. 인간 TCRα 및 β 쥐 등가물에 의한 불변 도메인은 mAb BW242의 결합을 완전히 뮤린 TCR에 대한 결합과 유사한 수준으로 금지시켰다 (도 6B 하부 패널, 비교 패널 6 & 8) 이러한 데이터는 인간 αβTCR의 불변 영역의 머린화(merinized)가 단클론 항체 BW242의 결합을 막기에 충분 함을 나타낸다.
인간과 마우스 αβTCR의 불변 영역 사이의 모든 아미노산 차이를 커버하는 돌연변이 블록을 갖는 하이브리드 -TCRα 및 β- 사슬가 이용 가능하다 (도 7A 및 B 참조) (Sommermeyer et al., J Immunol, 2010.184 (11) : p 6223-31] 참조). 우리는 4개의 NY-ESO-1 TCRβ 사슬과 3 개의 NY-ESO-1 TCRα 사슬 구조를 얻었는데, 각각은 완전한 인간 아미노산 서열이 측면에 있는 하나의 비 상동 쥐 도메인을 포함하고 있다. 이들은 또한도 3에 개략적으로 도시되어있다. 7개의 상이한 TCR 작 제물을 다른 완전한 인간 TCR- 사슬와 함께 JurMa 세포에 도입하고, 발현시키고 단클론 항체 BW242 (도 8)에 의한 인식을 시험하였다. 구조물의 형질 도입 효율은 항 -Vβ4에 의해 측정되었고, 형질 도입은 병행하여 수행되었다. 항 -αβTCR 클론 BW242에 의한인지에 관해서는, 양 사슬의 전체 마우스 불변 도메인 (패널 αhuMu / βhuMu) 및 αhuMu / βM3을 발현하는 세포를 포함하는 αβTCR을 발현하는 세포 만이 단클론 항체 BW242의 결합 감소를 나타냈다. 이는 단클론 항체 BW242의 항체 결합이 쥐과 도메인 3 (βM3)을 포함하는 구조물을 발현하는 세포에서 유의하게 손상되었다는 것을 의미한다. 따라서 베타 사슬 도메인 3이 변형된 인간 알파 베타 T 세포 수용체는 예를 들어 BW242를 이용한 MACS 분리 방법을 사용하여, 마우스 베타 체인의 베타 사슬 도메인 3으로 대체되거나 알파 및 베타 사슬의 전체 불변 영역을 대체함으로써 조작되지 않습니다.
조작된 알파 베타 T 세포 수용체는 특이성을 유지한다.
인간 NY-ESO-1αβTCRs, 키메라 NY-ESO-1αβTCRs 또는 인간 TCRα- 사슬을 갖는 머린화(merinized) 된 βM3를 발현하는 JurMa 세포를 NY-ESO-1 특이적 5 량체로 염색하고 세포 분획의 평균 형광 강도 (Mean Fluorescence Intensity, MFI) 5 량체 결합에 양성인 것을 유세포 분석기로 측정하였다. NY-ESO-1fully 인간 αβTCR, 완전히 마우스 불변 영역을 갖는 키메라 NY-ESO-1 αβTCR 및 인간 TCRα- 사슬을 갖는 머린화(merinized) 된 βM3가 NY-ESO-1 특이적 펜타 머와 모두 결합한다는 것이 밝혀졌다
BW242 항체는 조작된 인간 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 농축(enriched)한다
BW242 MACS 분리 기술이 조작된 인간 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작된 TCR 세포를 농축(enriched)하는데 사용될 수 있는지 여부가 결정되었다. 혼합 된 세포 집단이 사용되었다. 임의의 알파 베타 T 세포 수용체를 발현하지 않는 T 세포, 야생형 알파 베타 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포 및 원하는 특이성을 갖는 알파 베타 T 세포 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 T 세포 모집단 BW242와의 결합을 폐기하기 위해 수정 됨. 따라서 형질 전환 TCR을 발현하는 T 세포 인 NY-ESO-1 / HLA-A2 특이적 αβTCR을 WT1 특이적 인간 αβTCR- 형질 전환 세포와 1 : 1 비율로 혼합 하였다. 이어서, 이들 세포 혼합물의 정제를 αβTCR 단클론 항체 코팅 된 면역 자기 적 구슬을 사용하여 평가하고, 비 결합 세포 분획을 유세포 분석기로 분석 하였다 (도 9). 인간 - 마우스 키메라 αβTCRs, 즉 αhuMU / βhuMU-TCRs, αhu / βM3-TCRs 또는 αM2 / βM3-TCRs로 변형된 세포는 혼합 집단으로부터 효율적으로 농축(enriched)되었다 (Vβ4 염색을 갖는 패널을 참조, 백분율은 13 %에서 42 % ), 완전 인간 NY-ESO-1 또는 WT1- 특이적 αβTCRs를 발현하는 세포는 플로우 스루 분획에서 검출되지 않았다 (Vβ21 염색을 갖는 패널을 보았을 때 백분율은 약 45 %에서 약 1 %로 감소 함). 주목할 것은 TCR 음성 세포는 단클론 항체 BW242에 의해 영향을받지 않기 때문에, 형질 감염되지 않은 세포는 결과 집단에 남아 있었다. 이것은 TCRβ에서 최소 도메인 3의 사체 화가 종양 반응성 αβTCR의 농축(enriched)에 충분함을 보여준다.
유핵화 된 사람 αβTCR로 조작된 T 세포의 선택적 용해
인간 αβTCRs 및 murinized 인간 키메라 αβTCRs을 발현하는 JurMa 세포가 제공되었다 (αhu / βM3). TCR β 사슬, H57-597 (Biolegend Inc., San Diego, CA 92121에서 구입, 카탈로그 번호 109201로 예를 들어 구입)을 특이적으로 표적으로하는 항체가 제공되었다. H57-597은 아르메니아 햄서 IgG1 이소 타입의 것이며, 용해율을 평가 하였다 유핵화 된 인간 αβTCR을 가진 JurMa 세포는 용해가 4 배 증가하여 H57-597이 완전히 인간 αβTCR보다 murinized human αβTCR을 운반하는 JurMa 세포를 선택적으로 사멸한다는 것을 알 수 있다.
서열 목록
SEQ ID NO.1-
하기 4개의 목록은 TCR의 아미노산 서열을 나타낸다.
변수 영역에는 밑줄이 표시되지 않는다. 가변 영역의 이탤릭체 서열은 CDR3 영역에 해당한다. 사슬의 일정(불변) 영역은 밑줄로 표시하였다.
SEQ ID NO.1: 인간 TCRα 사슬 (클론 RA14):
MEKNPLAAPLLILWTHLDCVSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCARNTGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO. 2: 인간 TCRβ 사슬 (클론 RA14):
MGIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSPVTGGIYGYTFGSGTRLTVVEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
SEQ ID NO.3: 인간 TCRγ 사슬 (클론 G115):
MVSLLHASTLAVLGALCVYGAGHLEQPQISSTKTLSKTARLECVVSGITISATSVYWYRERPGEVIQFLVSISYDGTVRKESGIPSGKFEVDRIPETSTSTLTIHNVEKQDIATYYCALWEAQQELGKKIKVFGPGTKLIITDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWEEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS
SEQ ID NO.4 : 인간 TCRδ 사슬 (클론 G115):
MERISSLIHLSLFWAGVMSAIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDTLGMGGEYTDKLIFGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
하기 나열된 서열은 AAT27465, AAK49780, AAT27464, X02883, M64239, M12887, M12888, X02384 (AH002088), X02384 (AH002088), M26057, M22148, M23381, M14996, M15002, M17323, M13340, M12834, M12837, AF021335의 번호하에 NCBI의 Genbank 데이터베이스에서 이용 가능하고, 이는 본 명세서에 참조로 포함된다.
설명 서열
AAT27465 306 aa
T-cell receptor beta chain precursor Mus musculus
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T-cell receptor alpha chain precursor
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T-cell receptor alpha chain precursor
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<110> UMC UTRECHT HOLDING B.V. <120> USE OF ANTIBODIES FOR ENRICHMENT OF ENGINEERED T CELLS WITH EXOGENOUS IMMUNE RECEPTORS AND ANTIBODIES FOR USE IN DEPLETION OF ENGINEERED T CELLS <130> 2017FPI-05-004EP <150> PCT/EP <151> 2015-11-20 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 272 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Glu Lys Asn Pro Leu Ala Ala Pro Leu Leu Ile Leu Trp Thr His 1 5 10 15 Leu Asp Cys Val Ser Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu 20 25 30 His Val Gln Glu Gly Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro Ser 35 40 45 Ser Asn Phe Tyr Ala Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser 50 55 60 Pro Glu Ala Leu Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly Arg Ile Ser Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu 85 90 95 Tyr Ile Lys Gly Ser Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala 100 105 110 Arg Asn Thr Gly Asn Gln Phe Tyr Phe Gly Thr Gly Thr Ser Leu Thr 115 120 125 Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg 130 135 140 Asp 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Glu 50 55 60 Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr 65 70 75 80 Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His 85 90 95 Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val 100 105 110 Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile 115 120 125 Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr 130 135 140 Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr 145 150 155 160 Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser 165 170 <210> 14 <211> 172 <212> PRT <213> mus musculus <400> 14 Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly 35 40 45 Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu 50 55 60 Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr 65 70 75 80 Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His 85 90 95 Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val 100 105 110 Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile 115 120 125 Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr 130 135 140 Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Gly 145 150 155 160 Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys Lys Asn Ser 165 170 <210> 15 <211> 177 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 15 Pro Ser Tyr Thr Gly Gly Tyr Ala Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly 1 5 10 15 Thr Arg Val Thr Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser 20 25 30 Val Phe Val Met Lys Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu 35 40 45 Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile 50 55 60 Thr Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Ala Val Lys Leu Gly Lys Tyr Glu Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser 85 90 95 Val Gln His Asp Asn Lys Thr Val His Ser Thr Asp Phe Glu Val Lys 100 105 110 Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys 115 120 125 Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu 130 135 140 Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe 145 150 155 160 Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe 165 170 175 Leu <210> 16 <211> 152 <212> PRT <213> mus musculus <400> 16 Ser Gln Pro Pro Ala Lys Pro Ser Val Phe Ile Met Lys Asn Gly Thr 1 5 10 15 Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Lys Glu Val Thr Ile 20 25 30 Ser Leu Arg Ser Ser Lys Lys Ile Val Glu Phe Asp Pro Ala Ile Val 35 40 45 Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Ser Ala Val Lys Leu Gly Gln Tyr Gly 50 55 60 Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asn Ser Glu Thr Val 65 70 75 80 His Ser Thr Asp Phe Glu Pro Tyr Ala Asn Ser Phe Asn Asn Glu Lys 85 90 95 Leu Pro Glu Pro Glu Asn Asp Thr Gln Ile Ser Glu Pro Cys Tyr Gly 100 105 110 Pro Arg Val Thr Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr 115 120 125 Val Leu Gly Leu Arg Leu Leu Phe Ala Lys Thr Ile Ala Ile Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Thr Val Lys Leu Phe Phe 145 150 <210> 17 <211> 172 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 17 Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro 1 5 10 15 Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys Leu 20 25 30 Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile His Trp Gln Glu Lys 35 40 45 Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys Thr 50 55 60 Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Lys Ser 65 70 75 80 Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys Asn 85 90 95 Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile 100 105 110 Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu 115 120 125 Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu 130 135 140 Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu 145 150 155 160 Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser 165 170 <210> 18 <211> 109 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 18 Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro 1 5 10 15 Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys Leu 20 25 30 Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Ile Ile Lys Ile His Trp Gln Glu Lys 35 40 45 Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys Thr 50 55 60 Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Glu Ser 65 70 75 80 Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys Asn 85 90 95 Gly Ile Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr 100 105 <210> 19 <211> 204 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 19 Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro 1 5 10 15 Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly Thr Tyr Leu Cys Leu 20 25 30 Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Ile Ile Lys Ile His Trp Gln Glu Lys 35 40 45 Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly Asn Thr Met Lys Thr 50 55 60 Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Glu Ser 65 70 75 80 Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His Glu Asn Asn Lys Asn 85 90 95 Gly Ile Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile Lys Thr Asp Val Thr 100 105 110 Thr Val Asp Pro Lys Asp Ser Tyr Ser Lys Asp Ala Asn Asp Val Thr 115 120 125 Thr Val Asp Pro Lys Tyr Asn Tyr Ser Lys Asp Ala Asn Asp Val Ile 130 135 140 Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Trp Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu 145 150 155 160 Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu 165 170 175 Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu 180 185 190 Gly Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser 195 200 <210> 20 <211> 171 <212> PRT <213> mus musculus <400> 20 Lys Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro 1 5 10 15 Ser Val Ala Glu Thr Asn Leu His Lys Thr Gly Thr Tyr Leu Cys Leu 20 25 30 Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Arg Val Tyr Trp Lys Glu Lys 35 40 45 Asp Gly Asn Thr Ile Leu Asp Ser Gln Glu Gly Asp Thr Leu Lys Thr 50 55 60 Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Arg Ala 65 70 75 80 Met Gly Lys Glu His Arg Cys Ile Val Lys His Glu Asn Asn Lys Gly 85 90 95 Gly Ala Asp Gln Glu Ile Phe Phe Pro Ser Ile Lys Lys Val Ala Val 100 105 110 Ser Thr Lys Pro Thr Thr Cys Trp Gln Asp Lys Asn Asp Val Leu Gln 115 120 125 Leu Gln Phe Thr Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Thr Tyr Leu Leu Leu Leu 130 135 140 Leu Lys Ser Val Ile Tyr Leu Ala Ile Ile Ser Phe Ser Leu Leu Arg 145 150 155 160 Arg Thr Ser Val Cys Gly Asn Glu Lys Lys Ser 165 170 <210> 21 <211> 166 <212> PRT <213> mus musculus <400> 21 Lys Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro 1 5 10 15 Ser Val Ala Glu Thr Asn Leu His Lys Thr Gly Thr Tyr Leu Cys Leu 20 25 30 Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Arg Val Tyr Trp Lys Glu Lys 35 40 45 Asn Gly Asn Thr Ile Leu Asp Ser Gln Glu Gly Asp Thr Leu Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Arg Ala 65 70 75 80 Met Gly Lys Glu His Ser Cys Ile Val Lys His Glu Asn Asn Lys Gly 85 90 95 Gly Ala Asp Gln Glu Ile Phe Phe Pro Ser Ile Lys Lys Val Ala Thr 100 105 110 Thr Cys Trp Gln Asp Lys Asn Asp Val Leu Gln Phe Gln Phe Thr Ser 115 120 125 Thr Ser Ala Tyr Tyr Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Ile 130 135 140 Tyr Leu Ala Ile Ile Ser Phe Ser Leu Leu Arg Arg Thr Ser Val Cys 145 150 155 160 Gly Asn Glu Lys Lys Ser 165 <210> 22 <211> 171 <212> PRT <213> mus musculus <400> 22 Lys Lys Leu Asp Ala Asp Ile Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro 1 5 10 15 Ser Val Ala Glu Thr Asn Leu His Lys Thr Gly Thr Tyr Leu Cys Val 20 25 30 Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Arg Val Tyr Trp Lys Glu Lys 35 40 45 Lys Gly Asn Thr Ile Leu Asp Ser Gln Glu Gly Asp Met Leu Lys Thr 50 55 60 Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Arg Ser 65 70 75 80 Met Gly Lys Glu His Arg Cys Ile Val Lys His Glu Asn Asn Lys Gly 85 90 95 Gly Ala Asp Gln Glu Ile Phe Phe Pro Thr Ile Lys Lys Val Ala Val 100 105 110 Ser Thr Lys Pro Thr Thr Cys Trp Gln Asp Lys Asn Asp Val Leu Gln 115 120 125 Leu Gln Phe Thr Ile Thr Ser Ala Tyr Tyr Thr Tyr Leu Leu Leu Leu 130 135 140 Leu Lys Ser Val Ile Tyr Leu Ala Ile Ile Ser Phe Ser Leu Leu Arg 145 150 155 160 Arg Thr Ser Val Cys Cys Asn Glu Lys Lys Ser 165 170 <210> 23 <211> 166 <212> PRT <213> mus musculus <400> 23 Lys Arg Leu Asp Ala Asp Ile Ser Pro Lys Pro Thr Ile Phe Leu Pro 1 5 10 15 Ser Val Ala Glu Thr Asn Leu His Lys Thr Gly Thr Tyr Leu Cys Leu 20 25 30 Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Arg Val Tyr Trp Lys Glu Lys 35 40 45 Asn Gly Asn Thr Ile Leu Asp Ser Gln Glu Gly Asp Thr Leu Lys Thr 50 55 60 Lys Gly Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr Val Pro Glu Arg Ala 65 70 75 80 Met Gly Lys Glu His Ser Cys Ile Val Lys His Glu Asn Asn Lys Gly 85 90 95 Gly Ala Asp Gln Glu Ile Phe Phe Pro Ser Ile Lys Lys Val Ala Thr 100 105 110 Thr Cys Trp Gln Asp Lys Asn Asp Val Leu Gln Phe Gln Phe Thr Ser 115 120 125 Thr Ser Ala Tyr Tyr Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Ile 130 135 140 Tyr Leu Ala Ile Ile Ser Phe Ser Leu Leu Arg Arg Thr Ser Val Cys 145 150 155 160 Gly Asn Glu Lys Lys Ser 165

Claims (15)

  1. 내생(endogenous) 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작되지 않은 T 세포 및 외래(exogenous) 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물로부터 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포의 농축(enriching) 방법이되, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
    a) 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작되지 않은 T 세포 및 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물을 제공하는 단계;
    b) 상기 내생 알파 베타 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 T 세포의 혼합물을 접촉시켜 항체-조작되지 않은 T 세포 복합체를 형성시키는 단계;
    c) 상기 항체-조작되지 않은 T 세포 복합체를 상기 T 세포의 혼합물로부터 분리하여 조작된 T 세포가 농축된 조제물(prearation)을 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 a)는 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    i. T 세포를 제공하는 단계;
    ii. 외래 면역 수용체를 코딩하는 복수의 핵산 또는 단일 핵산을 제공하는 단계;
    iii. 상기 T 세포로 상기 복수의 핵산 또는 단일 핵산을 도입함으로써, 내생 알파 베타 T 세포 수용체를 갖는 조작된 T 세포 및 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 혼합물을 제공하는 단계.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 복수의 핵산 또는 단일 핵산은 외래 면역 수용체를 코딩하는 것 이외에 별도로 발현된 선별 마커를 코딩하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외래 면역 수용체는 조작된 알파 베타 T 세포 수용체 또는 조작된 감마 델타 T 세포 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작되지 않은 T세포 및 조작된 T 세포는 인간유래이고, 상기 항체는 BW242/412이고, 및 상기 외래 면역 수용체는 인간 감마 델타 T 세포 수용체, 조작된 인간 감마 델타 T 세포 수용체, 또는 조작된 인간 알파 베타 T 세포 수용체이고, 여기서 상기 인간 알파 베타 T 세포 수용체의 조작은 상기 T 세포 수용체 베타 사슬의 도메인 3의 변경을 포함하고, 바람직하게 상기 변경은 도메인 3의 머린화(murinization)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외래 면역 수용체는 감마 델타 T 세포 수용체, 바람직하게는 인간 감마 델타 T 세포 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 조작된 T 세포 농축 조제물(preparation).
  8. 제7항에 있어서,
    의학적 치료용, 바람직하게는 암의 치료용의 조작된 T 세포 농축 조제물(preparation).
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 외래 면역 수용체, 또는 제5항에 정의된 바와 같은 조작된 외래 면역 수용체와 특이적으로 결합하는 항체이되,
    상기 항체는 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득되는 상기 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 T 세포의 농축 조제물로 치료시, 부작용을 앓는 대상의 치료용 항체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 대상은 인간이고, 상기 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체(humanized antibody)인 것을 특징으로하는 항체.
  11. 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 상기 조작된 T 세포의 세포 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 항체.
  12. 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 림프구로 치료될 때 부작용을 앓는 대상의 치료용이고, 상기 외래 면역 수용체에 특이적으로 결합하는 항체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 림프구는 조작된 NK 세포 또는 조작된 T 세포인 것을 특징으로하는 항체.
  14. 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 림프구는 인간 림프구이고, 여기서 바람직하게 상기 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 상기 조작된 외래 면역 수용체를 갖는 조작된 림프구의 세포 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 항체.
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