CN116157415A - 靶向抗rh抗体的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种对基于同种抗体的B细胞受体(BCR)具有特异性的嵌合同种抗体受体(CALAR)，其中所述同种抗体对Rh因子具有特异性。还提供了包含CALAR的组合物、编码CALAR的多核苷酸、包含编码CALAR的多核苷酸的载体、包含CALAR的工程细胞及其使用方法。

Description

靶向抗RH抗体的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年9月3日提交的PCT申请号PCT/CN2020/113184的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开大体上涉及包括用免疫抑制药物治疗的疗法。特别地，本公开涉及用于治疗或预防与抗Rh抗体相关的病症的组合物和方法。

背景技术

Rh血型系统是人类已知的最具多态性和免疫原性的系统之一。Rh系统包括大量Rh抗原，而Rh不相容会给因怀孕或输血而对Rh有同种异体免疫的妇女的胎儿造成严重的并发症。怀有Rh不相容胎儿的妇女在分娩、流产、人工流产、异位妊娠或绒毛膜绒毛取样等事件中与胎儿的血液接触时，有产生针对Rh因子的抗体(抗Rh抗体)的风险。这种母体来源的抗Rh抗体在第一次怀孕时可能影响很小。然而，在下一个Rh不相容胎儿的后续妊娠中，母体来源的抗Rh抗体会通过被动免疫转移穿过胎盘屏障并攻击胎儿红细胞，导致新生儿的溶血性疾病(NDH)。在各种Rh抗原中，RhD抗原(或D抗原)占母体同种异体免疫的大部分。由于RhD抗原不相容导致的NDH在白种人中很普遍，他们的Rh D阴性表型的发生率最高(约15％)，但在黑人和亚洲人中较少见。

为了防止母体对Rh因子的同种异体免疫和抗Rh抗体的产生，可以在妇女可能对Rh抗原产生同种异体免疫的任何事件中对该妇女注射预防性抗Rh免疫球蛋白(如抗RhD免疫球蛋白)。然而，一旦抗Rh抗体形成，这种预防措施就无济于事了，而且目前还没有治疗可以防止母体抗Rh抗体对胎儿红细胞的攻击。因此，需要对母体抗Rh抗体引起的病症进行新颖和有效的治疗。

发明内容

在一个方面，本公开提供了一种编码嵌合同种抗体受体(CALAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，CALAR包含胞外域、跨膜域和胞内信号传导域，所述胞外域包含Rh因子的免疫原性片段，其中所述胞外域与B细胞上表达的针对Rh抗原的B细胞受体(BCR)结合，其中表达所述CALAR的细胞与B细胞上表达的所述BCR结合，或诱导杀伤表达所述BCR的B细胞。

在一些实施方案中，Rh因子的免疫原性片段包含Rh D因子的免疫原性片段。在一些实施方案中，Rh因子的免疫原性片段包含选自表2所列组的序列或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。

在一些实施方案中，CALAR还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含CD8α的信号肽。在一些实施方案中，CD8α的信号肽包含SEQ ID NO:16的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。

在一些实施方案中，跨膜域包含CD8α的跨膜域。在一些实施方案中，CD8α的跨膜域包含SEQ ID NO:17的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。

在一些实施方案中，胞外域通过铰链区连接至跨膜域。在一些实施方案中，铰链区包含CD8α的铰链区或GS连接子。在一些实施方案中，CD8α的铰链区包含SEQ ID NO:18的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，GS连接子包含SEQ ID NO:19的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。

在一些实施方案中，胞内域包含共刺激域和信号传导域。在一些实施方案中，共刺激域包含CD137的胞内域。在一些实施方案中，CD137的胞内域包含SEQ ID NO:20的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。在一些实施方案中，胞内域包含CD3ζ的信号传导域。在一些实施方案中，CD3ζ的信号传导域包含SEQ ID NO:21的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。

在另一个方面，本公开提供了由本文所述的多核苷酸编码的多肽。

在另一个方面，本公开提供了一种包含本文所述的多核苷酸的载体，其中编码CALAR的多核苷酸可操作地连接于至少一个调节性多核苷酸元件以用于表达CALAR。在一些实施方案中，载体是质粒载体、病毒载体、逆转录转座子、定点插入载体或自杀式表达载体。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或AAV载体。

在另一个方面，本公开提供了一种包含本文所述的多核苷酸的工程细胞。在一些实施方案中，工程细胞是T细胞或NK细胞。

在另一个方面，本公开提供了一种治疗或预防与抗Rh抗体相关的病症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的工程细胞。在一些实施方案中，与抗Rh抗体相关的病症是新生儿的溶血性疾病。在一些实施方案中，工程细胞是自体细胞。在一些实施方案中，工程细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括共同施用增加工程细胞的功效的药剂。在一些实施方案中，所述方法还包括共同施用改善与施用工程细胞相关的副作用的药剂。

附图简要说明

并入本文的附图构成本说明书的一部分。与此书面描述一起，附图进一步用于解释本公开的原理，并使相关领域的技术人员能够制造和使用本公开。

图1示出了在工程T细胞上表达的嵌合同种抗体受体(CALAR)靶向某些对Rh抗原具有特异性的B细胞上表达的B细胞受体(BCR)。

图2示出了示例性CALAR构建体的示意图。

图3示出了K562-R593目标细胞的验证。表面IgG BCR通过抗人CD79b抗体和抗人κ轻链抗体证实。

图4示出了RHD CALAR T细胞杀伤K562-R593目标细胞的功效。K562细胞是用作对照的非目标细胞。NT是指未被表达RHD的慢病毒转导的T细胞。

图5示出了RHD CALAR T细胞与K562-R593目标细胞共培养20小时后的INF-γ产生。与仅T细胞、NT或K562对照相比，RHD1或RHD2 CALAR-T细胞与K562-R593目标细胞共培养物中的INF-γ浓度增加。NT是指未被表达RHD的慢病毒转导的T细胞。

具体实施方式

在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可能会有变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于为限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限制。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。

在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物或专利均被具体和单独指示为通过引用并入一般，并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认本公开无权凭借在先公开而早于此类出版物。此外，提供的出版日期可能与可能需要独立确认的实际出版日期不同。

如对本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和说明的个别实施方案中的每一个具有离散的组件和特征，其可以在不脱离本公开的范围或精神的情况下，容易地与其他若干实施方案中的任何一个的特征分离或组合。任何叙述的方法可以按照叙述的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序进行。

定义

提供以下定义以帮助读者。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学或医学术语旨在具有本领域技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚和/或易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括此类定义不一定应被解释为表示与本领域通常理解的术语的定义相比具有实质性差异。

如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数个指代物。

“抗原”是指引起免疫反应的分子。这种免疫反应可以是体液反应，或细胞介导的反应，或两者兼有。本领域技术人员应理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。显而易见，本公开包括充当引发免疫反应的抗原的同种异体抗原。

“抗体”是指与抗原结合的免疫球蛋白(Ig)家族的多肽。例如，天然存在的IgG类型的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区(本文缩写为CL)构成。轻链恒定区由一个域构成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。

“单克隆抗体”是指由相同的免疫细胞制造的抗体，所述免疫细胞是唯一亲本细胞的所有克隆。

“同种异体抗原”是指任何非自身抗原，其仅存在于一个物种的某些个体中，并刺激该物种中那些缺乏该抗原的个体的免疫反应。同种异体抗原是由编码此类抗原的基因的多态性产生的。同种异体抗原的实例包括但不限于血型抗原(例如Rh抗原)和组织相容性抗原。

“同种抗体”是指对同种异体抗原具有特异性的抗体。

“同种异体免疫”是针对同种异体抗原的免疫反应，可以是细胞介导的反应，也可以是抗体介导的反应。当妇女的免疫系统对胎儿血型抗原(例如Rh抗原)敏感时，就会发生母体同种异体免疫，从而刺激同种抗体的产生。

“Rh因子”是指由RH基因编码的红细胞蛋白。Rh因子包括由RHD基因编码的RhD因子和由RHCE基因编码的RhCE因子。RHD和RHCE基因以反向方向极为接近地位于1号染色体上。RhD和RhCE因子都有12次跨膜跨越，N端和C端朝向细胞质，416个氨基酸残基中有32-35个不同(Westhoff CM,Semin Hematol.,2007,44:42-50)。如本文所用，Rh因子旨在涵盖野生型和对抗Rh抗体识别影响最小的变异体。在一些实施方案中，编码Rh因子的多核苷酸经过密码子优化。

“Rh抗原”是指沿Rh因子的表位的集合。RHD和RHCE基因经常携带点突变或有重排和交换，产生大量Rh抗原。至少已鉴定出49种不同的Rh抗原，其中D、C、E、c和e是最重要的。D抗原由RhD因子携带，而C或c抗原与E或e抗原一起由RhCE因子携带。由D和c抗原引起的同种异体免疫可导致重度疾病，而由C、E和e抗原引起的同种异体免疫可导致轻度至中度疾病。D、C、E、c和e抗原在白种人中的出现率分别为85％、68％、29％、80％和98％，在黑人中为92％、27％、22％、96％和98％，在亚洲人中为99％、93％、39％、47％和96％。Rh D阴性表型在白种人中最普遍(15％)，在黑人中较少见(8％)，在亚洲人中罕见(1％)(Reid ME和Lomas-Francis C.The Blood Group Antigen Facts Book.第二版.2004,New York:Elsevier Academic Press.)。

“自体”细胞是指源自同一受试者的任何细胞，所述细胞随后将被重新引入。

“同种异体”细胞是指源自相同物种的不同受试者的任何细胞。

“B细胞受体”或“BCR”是指B细胞表面上识别特定抗原的跨膜免疫球蛋白分子。

“嵌合同种抗体受体”或“CALAR”是指一种工程受体，其能够将针对同种抗体或与同种抗体对应的B细胞受体的所需特异性移植到能够进行细胞介导的细胞毒性的免疫细胞中。通常，CALAR是一种融合多肽，其包含胞外域、跨膜域和胞内域，胞外域引入所需特异性，胞内域在免疫细胞与同种抗体或B细胞受体结合时，将信号传递给免疫细胞。

“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如APC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其与T细胞上的同源共刺激分子特异性结合，从而提供信号，除了由例如TCR/CD3复合物与装载有肽的主要组织相容性复合物(MHC)分子结合而提供的初级信号外，还介导T细胞反应，包括但不限于增殖、激活、分化等。

“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于CD28和4-1-BB。

在免疫细胞的上下文中使用的“效应细胞”是指可被激活以响应刺激而执行效应功能的细胞。效应细胞可包括但不限于NK细胞、细胞毒性T细胞和辅助T细胞。

“有效量”或“治疗有效量”是指有效实现所需生物学结果的在此描述的细胞、组合物、制剂或任何材料的量。此类结果可包括但不限于消除表达特定BCR的B细胞和由此产生的抗体。

“表位”或“免疫原性片段”或“抗原决定簇”是指抗体或其抗原结合片段所识别的抗原的一部分。表位可以是线性的或构象的。

多肽或多核苷酸上下文中的“同一性”或“序列同一性”的百分比是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定的，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可能包括与参考序列(不包括添加或缺失)相比的添加或缺失(即间隙)，以便对两个序列进行最佳比对。如下计算百分比：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数，得出匹配的位置数，用匹配的位置数除以比较窗口中的总位置数，并且将结果乘以100，得出序列同一性的百分比。

“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸序列之间的功能关系。在编码融合蛋白(如本公开的CALAR的多肽链)的多核苷酸的上下文中，该术语是指两个或更多个多核苷酸序列接合，使得这些片段编码的氨基酸序列保持在读框内。在转录或翻译调节的上下文中，该术语是指调节序列与编码序列的功能关系，例如，启动子在编码序列的正确位置和方向上，以便调节转录。

“免疫原性”或“免疫原性的”是指外来物质如抗原在受试者体内引起免疫反应的能力。免疫原性反应通常包括细胞介导的和抗体介导的免疫反应。如在自身抗原的上下文中所使用，“免疫原性片段”是指引发宿主的免疫反应的自身抗原的区域。这种反应可导致产生针对自身抗原的自身抗体，并引起自身免疫性疾病。

“多核苷酸”或“核酸”是指核苷酸链。如本文所用，多核苷酸包括通过本领域可用的任何手段获得的所有多核苷酸序列，所述手段包括但不限于通过重组手段和合成手段。

“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指通过肽键共价连接的氨基酸残基链。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

“T细胞受体”或“TCR”是指T细胞表面上的蛋白质复合物，其负责识别作为与MHC分子结合的肽的抗原片段。

“载体”是指可操作地插入多核苷酸，以便递送、复制或表达多核苷酸的载体。载体可以含有多种调节元件，包括但不限于复制起点、启动子、转录起始序列、增强子、可选标记基因和报告基因。载体还可以包括帮助其进入宿主细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或离子或两亲化合物。

注意，在本公开中，如“包含(comprises/comprised/comprising)”、“含有(contains/containing)”等的术语具有美国专利法中赋予的含义；它们是包容性的或开放式的，并且不排除额外未引用的要素或方法步骤。如“基本上由……组成(consistingessentially of/consists essentially of)”的术语具有美国专利法赋予的含义；它们允许包括不会实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的额外成分或步骤。术语“由……组成(consists of/consisting of)”具有美国专利法赋予它们的含义；即这些术语是封闭式的。

嵌合同种抗体受体

Rh血型系统是人类已知的最具多态性和免疫原性的系统之一。Rh系统包括大量Rh抗原，而Rh不相容会给因怀孕或输血而对Rh有同种异体免疫的妇女的胎儿造成严重的并发症。母体来源的抗Rh抗体会通过被动免疫转移穿过胎盘屏障并攻击胎儿红细胞，导致新生儿的溶血性疾病(NDH)。在各种Rh抗原中，RhD抗原占母体同种异体免疫的50％以上。

在一个方面，本公开涉及嵌合同种抗体受体(CALAR)，其与某些靶向Rh抗原的B细胞上表达的基于同种抗体的B细胞受体(BCR)特异性结合(图1)；激活后，这些B细胞可产生抗Rh抗体，在孕妇体内穿过胎盘屏障后可导致胎儿出现抗Rh抗体相关疾病。当CALAR在效应细胞如T细胞上表达时，CALAR特异性地将效应细胞引导至这些B细胞，诱导直接杀伤表达抗Rh BCR的B细胞和间接杀伤分泌抗Rh抗体的B细胞，但保留不表达和展示抗Rh BCR或分泌抗Rh抗体的B细胞。消除致病性B细胞可以治疗和预防与母体抗Rh抗体相关的疾病，如新生儿溶血病(HDN)。

在一个方面，本公开提供了一种CALAR，其包含胞外域、跨膜域和胞内信号传导域，而胞外域包含Rh蛋白的免疫原性片段。

在另一个方面，本公开提供了编码本文所述的CALAR的多核苷酸。

胞外域

在一些实施方案中，本文所述的CALAR的胞外域包含Rh因子的免疫原性片段。虽然该免疫原性片段被针对Rh因子的同种抗体识别，但该免疫原性片段与表达此类同种抗体的B细胞的BCR特异性结合。

本公开的免疫原性片段可以源自任何Rh因子，例如RhD或RhCE。这些因子的多肽和多核苷酸序列可以从公共数据库，如Uniprot检索。在某些实施方案中，这些因子的多肽和多核苷酸序列在本文中以表1中的序列标识符公开。

表1.Rh蛋白的序列.

SEQ ID NO:1

MSSKYPRSVRRCLPLWALTLEAALILLFYFFTHYDASLEDQKGLVASYQVGQDLTVMAAIGLGFLTSSFRRHSWSSVAFNLFMLALGVQWAILLDGFLSQFPSGKVVITLFSIRLATMSALSVLISVDAVLGKVNLAQLVVMVLVEVTALGNLRMVISNIFNTDYHMNMMHIYVFAAYFGLSVAWCLPKPLPEGTEDKDQTATIPSLSAMLGALFLWMFWPSFNSALLRSPIERKNAVFNTYYAVAVSVVTAISGSSLAHPQGKISKTYVHSAVLAGGVAVGTSCHLIPSPWLAMVLGLVAGLISVGGAKYLPGCCNRVLGIPHSSIMGYNFSLLGLLGEIIYIVLLVLDTVGAGNGMIGFQVLLSIGELSLAIVIALMSGLLTGLLLNLKIWKAPHEAKYFDDQVFWKFPHLAVGF

SEQ ID NO:2

ATGAGCTCTAAGTACCCGCGGTCTGTCCGGCGCTGCCTGCCCCTCTGGGCCCTAACACTGGAAGCAGCTCTCATTCTCCTCTTCTATTTTTTTACCCACTATGACGCTTCCTTAGAGGATCAAAAGGGGCTCGTGGCATCCTATCAAGTTGGCCAAGATCTGACCGTGATGGCGGCCATTGGCTTGGGCTTCCTCACCTCGAGTTTCCGGAGACACAGCTGGAGCAGTGTGGCCTTCAACCTCTTCATGCTGGCGCTTGGTGTGCAGTGGGCAATCCTGCTGGACGGCTTCCTGAGCCAGTTCCCTTCTGGGAAGGTGGTCATCACACTGTTCAGTATTCGGCTGGCCACCATGAGTGCTTTGTCGGTGCTGATCTCAGTGGATGCTGTCTTGGGGAAGGTCAACTTGGCGCAGTTGGTGGTGATGGTGCTGGTGGAGGTGACAGCTTTAGGCAACCTGAGGATGGTCATCAGTAATATCTTCAACACAGACTACCACATGAACATGATGCACATCTACGTGTTCGCAGCCTATTTTGGGCTGTCTGTGGCCTGGTGCCTGCCAAAGCCTCTACCCGAGGGAACGGAGGATAAAGATCAGACAGCAACGATACCCAGTTTGTCTGCCATGCTGGGCGCCCTCTTCTTGTGGATGTTCTGGCCAAGTTTCAACTCTGCTCTGCTGAGAAGTCCAATCGAAAGGAAGAATGCCGTGTTCAACACCTACTATGCTGTAGCAGTCAGCGTGGTGACAGCCATCTCAGGGTCATCCTTGGCTCACCCCCAAGGGAAGATCAGCAAGACTTATGTGCACAGTGCGGTGTTGGCAGGAGGCGTGGCTGTGGGTACCTCGTGTCACCTGATCCCTTCTCCGTGGCTTGCCATGGTGCTGGGTCTTGTGGCTGGGCTGATCTCCGTCGGGGGAGCCAAGTACCTGCCGGGGTGTTGTAACCGAGTGCTGGGGATTCCCCACAGCTCCATCATGGGCTACAACTTCAGCTTGCTGGGTCTGCTTGGAGAGATCATCTACATTGTGCTGCTGGTGCTTGATACCGTCGGAGCCGGCAATGGCATGATTGGCTTCCAGGTCCTCCTCAGCATTGGGGAACTCAGCTTGGCCATCGTGATAGCTCTCATGTCTGGTCTCCTGACAGGTTTGCTCCTAAATCTTAAAATATGGAAAGCACCTCATGAGGCTAAATATTTTGATGACCAAGTTTTCTGGAAGTTTCCTCATTTGGCTGTTGGATTTTAA

SEQ ID NO:3

MSSKYPRSVRRCLPLWALTLEAALILLFYFFTHYDASLEDQKGLVASYQVGQDLTVMAALGLGFLTSNFRRHSWSSVAFNLFMLALGVQWAILLDGFLSQFPPGKVVITLFSIRLATMSAMSVLISAGAVLGKVNLAQLVVMVLVEVTALGTLRMVISNIFNTDYHMNLRHFYVFAAYFGLTVAWCLPKPLPKGTEDNDQRATIPSLSAMLGALFLWMFWPSVNSPLLRSPIQRKNAMFNTYYALAVSVVTAISGSSLAHPQRKISMTYVHSAVLAGGVAVGTSCHLIPSPWLAMVLGLVAGLISIGGAKCLPVCCNRVLGIHHISVMHSIFSLLGLLGEITYIVLLVLHTVWNGNGMIGFQVLLSIGELSLAIVIALTSGLLTGLLLNLKIWKAPHVAKYFDDQVFWKFPHLAVGF

SEQ ID NO:4

ATGAGCTCTAAGTACCCGCGGTCTGTCCGGCGCTGCCTGCCCCTCTGCGCCCTAACACTGGAAGCAGCTCTCATTCTCCTCTTCTATTTTTTTACCCACTATGACGCTTCCTTAGAGGATCAAAAGGGGCTCGTGGCATCCTATCAAGTCGGCCAAGATCTGACCGTGATGGCGGCCCTTGGCTTGGGCTTCCTCACCTCAAATTTCCGGAGACACAGCTGGAGCAGTGTGGCCTTCAACCTCTTCATGCTGGCGCTTGGTGTGCAGTGGGCAATCCTGCTGGACGGCTTCCTGAGCCAGTTCCCTCCTGGGAAGGTGGTCATCACACTGTTCAGTATTCGGCTGGCCACCATGAGTGCTATGTCGGTGCTGATCTCAGCGGGTGCTGTCTTGGGGAAGGTCAACTTGGCGCAGTTGGTGGTGATGGTGCTGGTGGAGGTGACAGCTTTAGGCACCCTGAGGATGGTCATCAGTAATATCTTCAACACAGACTACCACATGAACCTGAGGCACTTCTACGTGTTCGCAGCCTATTTTGGGCTGACTGTGGCCTGGTGCCTGCCAAAGCCTCTACCCAAGGGAACGGAGGATAATGATCAGAGAGCAACGATACCCAGTTTGTCTGCCATGCTGGGCGCCCTCTTCTTGTGGATGTTCTGGCCAAGTGTCAACTCTGCTCTGCTGAGAAGTCCAATCCAAAGGAAGAATGCCATGTTCAACACCTACTATGCTCTAGCAGTCAGTGTGGTGACAGCCATCTCAGGGTCATCCTTGGCTCACCCCCAAAGGAAGATCAGCATGACTTATGTGCACAGTGCGGTGTTGGCAGGAGGCGTGGCTGTGGGTACCTCGTGTCACCTGATCCCTTCTCCGTGGCTTGCCATGGTGCTGGGTCTTGTGGCTGGGCTGATCTCCATCGGGGGAGCCAAGTGCCTGCCGGTGTGTTGTAACCGAGTGCTGGGGATTCACCACATCTCCGTCATGCACTCCATCTTCAGCTTGCTGGGTCTGCTTGGAGAGATCACCTACATTGTGCTGCTGGTGCTTCATACTGTCTGGAACGGCAATGGCATGATTGGCTTCCAGGTCCTCCTCAGCATTGGGGAACTCAGCTTGGCCATCGTGATAGCTCTCACGTCTGGTCTCCTGACAGGTTTGCTCCTAAATCTCAAAATATGGAAAGCACCTCATGTGGCTAAATATTTTGATGACCAAGTTTTCTGGAAGTTTCCTCATTTGGCTGTTGGATTTTAA

在某些实施方案中，Rh因子的免疫原性片段包含D、C、E、c或e抗原的表位。在某些实施方案中，Rh因子的免疫原性片段包含RhD抗原的表位。RhD抗原，占母体同种异体免疫的50％以上，包含整个Rh D因子的30多个表位的集合。那些位于RhD胞外环上的RhD表位是引起同种异体免疫的主要原因(Scott ML,Voak D,Jones JW等人,Astructural model for30Rh D epitopes based on serological and DNA sequence data frompartial Dphenotypes.Transfus Clin Biol.1996,3:391-396.)。在某些实施方案中，Rh因子的免疫原性片段包含RhD蛋白的胞外环。

应注意，当提及Rh因子或Rh因子的任何免疫原性时，除非上下文另有规定，否则也包括包含氨基酸变化的同工型或变异体，这些变化对抗Rh抗体对Rh抗原的识别影响很小。

表2中示出了Rh因子的示例性免疫原性片段。在一些实施方案中，CALAR的胞外域包含一个或多个选自表2所列序列组的序列，或一个或多个与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列，或一个或多个与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。

表2.Rh因子的免疫原性片段.

序列	SEQ ID NO	Rh因子	基因符号	位置
					HYDASLEDQKGLVASYQVGQDLT	5	D,C,c,E,e	RHD,RHCE	胞外环1
FPSGKVVITLFSIRL	6	D,C	RHD,RHCE	胞外环2
					NIFNTDYHMNMMHI	7	D	RHD	胞外环3
WPSFNSALLRSPIERKNAVFN	8	D	RHD	胞外环4
					CHLIPS	9	D,C,c,E,e	RHD,RHCE	胞外环5
VLDTVGAGNGM	10	D	RHD	胞外环6
					FPPGKVVITLFSIRL	11	c	RHCE	胞外环2
NIFNTDYHMNLRHF	12	C,c,E,e	RHCE	胞外环3
					WPSVNSALLRSPIQRKNAMFN	13	e	RHCE	胞外环4
WPSVNSPLLRSPIQRKNAMFN	14	E	RHCE	胞外环4
					VLHTVWNGNGM	15	C,c,E,e	RHCE	胞外环6

在一些实施方案中，本文所述的CALAR的胞外域还包含信号肽。如本文所用，术语“信号肽”是指存在于多肽的N端，通常具有5-30个氨基酸残基的长度，是分泌途径上跨膜转位和控制多肽进入分泌途径所必需的肽。

在一些实施方案中，信号肽包含CD8α的信号肽。在一些实施方案中，CD8α的信号肽包含SEQ ID NO:16的序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，信号肽包含IgG的信号肽。

跨膜域

本文所述的CALAR的跨膜域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，包括但不限于BAFFR、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD11a(CD18、ITGAL、LFA-l)、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD19、CD22、CD27、CD28、CD29、CD33、CD37、CD40、CD45、CD49a、CD49d、CD49f、CD64、CD80、CD84、CD86、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137(4-1BB)、CD150(IPO-3、SLAMF1、SLAM)、CD154、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(Ly9)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD278(ICOS)、CEACAM1、CRT AM、GITR、HYEM(LIGHTR)、IA4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIR、LTBR、OX40、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、T细胞受体的α、β或ζ链、TNFR2、VLA1和VLA-6。

在一个实施方案中，本文所述的CALAR包含CD8α、CD28或ICOS的跨膜域。在某些实施方案中，CD8α的跨膜域具有SEQ ID NO:17的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。

在某些实施方案中，本文所述的CALAR的跨膜域是合成的，例如主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在某些实施方案中，本文所述的CALAR的跨膜域被修饰或设计为避免与相同或不同表面膜蛋白的跨膜域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。

在一些实施方案中，本文所述的CALAR还包含铰链区，其形成CALAR的胞外域和跨膜域之间的连接。铰链和/或跨膜域提供了CALAR的胞外域的细胞表面呈现。

铰链区可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，包括但不限于BAFFR、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD11a(CD18、ITGAL、LFA-l)、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD19、CD22、CD27、CD28、CD29、CD33、CD37、CD40、CD45、CD49a、CD49d、CD49f、CD64、CD80、CD84、CD86、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137(4-1BB)、CD150(IPO-3、SLAMF1、SLAM)、CD154、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(Ly9)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD278(ICOS)、CEACAM1、CRT AM、GITR、HYEM(LIGHTR)、IA4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIR、LTBR、OX40、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、T细胞受体的α、β或ζ链、TNFR2、VLA1和VLA-6。

在一些实施方案中，铰链区包含CD8α的铰链区、人类免疫球蛋白(Ig)的铰链区或富含甘氨酸-丝氨酸的序列。

在一些实施方案中，CALAR包含CD8α、CD28、ICOS或IgG4m的铰链区。在某些实施方案中，铰链区具有SEQ ID NO:18的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。

在一些实施方案中，铰链区包含GS连接子，其包含长度在2至20个氨基酸残基之间的甘氨酸-丝氨酸(GS)双联体。示例性GS GS连接子具有SEQ ID NO:19的序列。

胞内域

本文所述的CALAR的胞内域负责激活CALAR所处的免疫细胞的至少一种正常效应功能。在免疫细胞的上下文中使用的术语“效应功能”是指细胞的专门功能，例如T细胞的细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

众所周知，T细胞的完全激活需要通过T细胞受体(TCR)产生的信号和次级或共刺激信号。因此，T细胞的激活是由两类不同的细胞质信号传导序列介导的：那些通过TCR启动抗原依赖性初级激活的信号传导序列(初级细胞质信号传导序列)和那些以抗原非依赖性方式提供次级或共刺激信号的信号传导序列(次级细胞质信号传导序列)。

CALAR的胞内域可以源自转导效应功能信号并指导细胞执行效应功能的分子，或此类分子的截短部分，只要其转导信号即可。此类蛋白质分子包括但不限于B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(CD18、LFA-1、ITGAL)、CD11b、CD11c、CD11d、CD19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49d、CD49f、CD69、CD79a、CD79b、CD83、CD84、CD86、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD127、CD137(4-1BB)、CD150(SLAM、SLAMF1、IPO-3)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(Ly9)、CD244(SLAMF4、2B4)、CEACAM1、CRTAM、DAP10、DAP12、常见FcRγ、FcRβ(FcεRib)、FcγRIIa、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、ICAM-1、ICOS、LIGHT、LTBR、LAT、NKG2C、NKG2D,NKp44、NKp30、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX40、PD-1、PAG/Cbp、PSGL1、SLP-76、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、T细胞受体(TCR)、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6、其任何衍生物、变异体或片段、具有相同功能的分子的任何合成序列及其任何组合。

在一些实施方案中，胞内域包含共刺激域和信号传导域，其中在CALAR与B细胞上表达的对Rh抗原具有特异性的BCR结合后，共刺激域提供共刺激细胞内信号传导而不需要其原始配体，并且信号传导域提供初级激活信号传导。CALAR的共刺激域和信号传导域可以随机或指定的顺序相互连接。

共刺激域

在一些实施方案中，共刺激域源自共刺激分子的胞内域。

共刺激分子的实例包括B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD4、CD8α、CD8β、CD7、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD 18、CD 19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD83、CD84、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD 127、CD137(4-1BB)、CD150(SLAM、SLAMF1、IPO-3)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(Ly9)、CD244(SLAMF4、2B4)、CEACAM1、CRTAM、CDS、OX40、PD-l、ICOS、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-l、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、LAT、LFA-l、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp44、NKp30、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6、其任何衍生物、变异体或片段、具有相同功能的共刺激分子的任何合成序列及其任何组合。

在一些实施方案中，CALAR的共刺激域包含共刺激分子CD137(4-1BB)、CD28、OX40或ICOS的胞内域。在一些实施方案中，CALAR的共刺激域具有SEQ ID NO:20的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。

信号传导域

TCR复合物的初级激活可以由初级细胞质信号传导序列以刺激性方式或抑制性方式调节。以刺激性方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导基序。在本公开中特别使用的含有ITAM的初级信号传导序列的实例包括那些源自CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcRγ、FCRβ和TCRζ的初级信号传导序列。

在一些实施方案中，本公开的CALAR的信号传导域包含ITAM，其在CALAR与B细胞上表达的对Rh抗原具有特异性的BCR结合后提供刺激性胞内信号传导，而无HLA限制。在一些实施方案中，CALAR的信号传导域包含CD3ζ(CD247)的信号传导域。在一些实施方案中，CALAR的信号传导域包含SEQ ID NO:21的序列，或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。

其他区

在一些实施方案中，CALAR还包含连接子。如本文所提供的术语“连接子”是连接CALAR的各种组分的多肽。

在一些实施方案中，连接子插入跨膜域和胞内域之间。在一些实施方案中，连接子在胞内域的信号传导域和共刺激域之间。

在一些实施方案中，连接子是GS连接子，其包含长度在2至20个氨基酸残基之间的甘氨酸-丝氨酸(GS)双联体。示例性GS连接子具有SEQ ID NO:19中所示的序列。在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码连接子的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本文提供的CALAR从N端到C端包含：CD8α的信号肽、Rh蛋白的免疫原性片段(例如，选自表2的序列或其任何组合)、GS连接子、CD8α的跨膜域、CD137的胞内域和CD3ζ的信号传导域。

在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸编码CALAR，其从N端到C端包含：CD8α的信号肽、Rh因子的免疫原性片段(例如，选自表2的序列或其任何组合)、GS连接子、CD8α的跨膜域、CD137的胞内域和CD3ζ的信号传导域。

在一些实施方案中，CALAR表现出对抗Rh抗体的高亲和力。如本文所用，术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子或其片段与抗原之间的非共价相互作用的强度。结合亲和力可以用Kd值，即解离常数表示，其通过本领域已知的任何方法确定，包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体共振或流式细胞术(如FACS)。在某些实施方案中，CALAR对抗Rh抗体的结合亲和力小于50nM、25nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。

载体

在另一个方面，本公开提供了一种载体，其包含编码本文所述的CALAR的多核苷酸。编码CALAR的多核苷酸可以插入本领域已知的不同类型的载体中，例如质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、来源于动物病毒的病毒载体、粘粒、转座子、定点插入载体(例如CRISPR、锌指核酸酶、TALEN)或自杀式表达载体。在一些实施方案中，载体是DNA或RNA。

在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接于载体中的至少一个调节性多核苷酸元件以用于表达CALAR。典型的载体含有各种调节性多核苷酸元件，例如调节插入的多核苷酸表达的元件(例如转录和翻译终止子、起始序列和启动子)，调节载体在宿主细胞中复制的元件(例如复制起点)，以及调节载体整合到宿主基因组中的元件(例如转座子的末端重复序列)。CALAR的表达可以通过将编码CALAR的多核苷酸可操作地连接于启动子，并将该构建体掺入载体中来实现。组成型启动子(如CMV启动子、SV40启动子和MMTV启动子)或诱导型启动子(如金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子和孕酮启动子)都可考虑用于本公开。在一些实施方案中，载体是表达载体，表达载体包含足够的顺式作用元件用于表达；其他表达元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。

为了评估CALAR的表达，载体还可以包含可选标记基因或报告基因或两者，以用于鉴定和选择引入载体的细胞。有用的可选标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。有用的报告基因包括例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因。

在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体可以来源于例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和慢病毒。有用的病毒载体一般含有在至少一种生物体内起作用的复制起点、启动子、限制性核酸内切酶位点和一个或多个可选标记。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体，如慢病毒载体。慢病毒载体对于将编码CALAR的多核苷酸长期、稳定地整合到非增殖细胞的基因组中特别有用，从而使CALAR在宿主细胞，如宿主T细胞中稳定表达。

在一些实施方案中，载体是mRNA，其可以被电穿孔到宿主细胞中。由于mRNA会随着细胞分裂而被稀释，所以mRNA的表达不会是永久性的。

在一些实施方案中，载体是基于转座子的表达载体。转座子是可以改变其在基因组内位置的DNA序列。在转座子系统中，编码CALAR的多核苷酸侧面是由介导转座子移动的转座酶可识别的末端重复序列。转座酶可以作为蛋白质共递送、与CALAR编码在同一载体上或编码在单独的载体上。转座子系统的非限制性实例包括Sleeping Beauty、Piggyback、Frog Prince和Prince Charming。

载体可以通过本领域已知的任何方法，例如通过物理、化学或生物手段引入宿主细胞，例如哺乳动物细胞中。将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。生物方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，将基因插入哺乳动物，例如人类细胞中。化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒，以及基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。

细胞

在一个方面，本公开提供了一种工程细胞，其包含或表达如本文所述的CALAR。在一些实施方案中，工程细胞包含编码CALAR的多核苷酸或包含CALAR多核苷酸的载体。在一些实施方案中，工程细胞包含多个CALAR，其包含Rh因子的不同免疫原性片段。

如本文所述的工程细胞是经基因修饰的免疫细胞，可用于本公开的免疫细胞包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、不变NK细胞或NKT细胞，以及其他效应细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是原代细胞、来源于原代细胞的扩增细胞或来源于体外分化的干细胞的细胞。

包含或表达CALAR的工程细胞对B细胞表达的基于同种抗体的BCR具有高亲和力是有用的，其中同种抗体特异性结合Rh因子或其免疫源性片段。因此，工程细胞可以诱导直接杀伤抗Rh B细胞或间接杀伤表达抗Rh同种抗体的浆细胞。在一些实施方案中，工程细胞对与Fc受体结合的针对Rh的同种抗体具有低亲和力。

在另一个方面，本公开提供了一种制造表达如本文所述的CALAR的工程细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：从来源获得细胞、培养细胞、激活细胞、扩增细胞和用包含CALAR多核苷酸的载体工程改造细胞。

在另一个方面，本公开提供了一种使用工程细胞进行细胞疗法的方法，其中工程细胞被引入受试者体内。在一些实施方案中，受试者是获得细胞的同一受试者(自体细胞)。

细胞来源

工程细胞可以来源于从受试者，例如人类受试者分离的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是从感兴趣的受试者获得，例如疑似患有特定疾病或病况的受试者，疑似具有特定疾病或病况倾向的受试者，将接受、正在接受或已经接受特定疾病或病况治疗的受试者，作为健康志愿者或健康捐赠者的受试者，或来自血库。因此，细胞对于感兴趣的受试者可以是自体的或同种异体的。同种异体供体细胞可能与人类白细胞抗原(HLA)不相容，因此可以处理同种异体细胞以降低免疫原性。

免疫细胞可以从其在受试者体内驻留的任何位置收集，包括但不限于血液、脐带血、脾脏、胸腺、淋巴结、胸腔积液、脾脏组织和骨髓。分离的免疫细胞可以直接使用，或其可以储存一段时间，如通过冷冻。

在一些实施方案中，工程细胞来源于T细胞。T细胞可以通过本领域技术人员已知的许多技术，如单采血液成分术从受试者采集的血液中获得。

在一些实施方案中，一个或多个T细胞群被富集或耗尽对特定标志物(如表面标志物)呈阳性或呈阴性的细胞。此类标志物是在某些T细胞群上不存在或以相对较低的水平表达，但在某些其他T细胞群上存在或以相对较高的水平表达的标志物。在一些实施方案中，分离出CD4+辅助性和CD8+细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，CD8+和CD4+T细胞被进一步富集或耗尽幼稚、中央记忆、效应记忆和/或中央记忆干细胞，例如通过基于与各自亚群相关的表面抗原的正向或负向选择。

细胞的激活和扩增

在一些实施方案中，免疫细胞在基因修饰之前被激活和扩增。在其他实施方案中，免疫细胞在使用前被激活但没有扩增，或者既没有激活也没有扩增。

激活和扩增免疫细胞的方法已经在本领域中描述，并且可以用于本文描述的方法中。例如，T细胞可以通过与附接有刺激CD3/TCR复合体相关信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来激活和扩增。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。

治疗方法

在一个方面，本公开提供了一种治疗或预防有需要的受试者的与抗Rh抗体相关的病症的方法，其包含有效量的本文所述的工程细胞。在一些实施方案中，与抗Rh抗体相关的病症是新生儿溶血病。在一些实施方案中，与Rh同种抗体相关的病症是迟发性溶血性输血反应(DHTR)。在一些实施方案中，有需要的受试者是血液中具有抗Rh抗体的妇女。

在一些实施方案中，包含或表达CALAR的工程细胞源自从受试者分离、离体扩增、工程改造以包含用于表达CALAR的载体并输入受试者体内的T细胞。工程细胞(例如T细胞)识别表达和呈现基于同种抗体的BCR的B细胞，其中同种抗体特异性靶向Rh因子，并且工程细胞被激活，导致靶向的B细胞被杀伤。在一些实施方案中，工程细胞(例如T细胞)是自体细胞。

在某些实施方案中，治疗方法还包括施用增加工程细胞功效的药剂。例如，将促进本公开的工程细胞的生长和激活的生长因子与细胞同时或随后施用于受试者。生长因子可以是促进免疫细胞生长和活化的任何合适的生长因子。合适的免疫细胞生长因子的实例包括白细胞介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12，它们可以单独使用或以各种组合使用，如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7、IL-12和IL-15，或IL-12和IL2。

在一些实施方案中，治疗方法还包括施用减少或改善与施用工程细胞相关的副作用的药剂。示例性副作用包括细胞因子反应综合征(CRS)和嗜血细胞淋巴组织细胞增生症(HLH，也称为巨噬细胞激活综合征(MAS))。经施用以治疗副作用的药剂可以是中和可溶性因子如IFN-γ、IFN-α、IL-2和IL-6的药剂。此类药剂包括但不限于TNF-α的抑制剂(例如依那西普(entanercept))和IL-6的抑制剂(例如托珠单抗(tocilizumab))。

治疗有效量的工程细胞可以通过多种途径施用，包括肠胃外施用，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、胸骨内或关节内注射或输注。

工程细胞可以按照与有需要的受试者的抗Rh抗体效价一致的治疗方案施用，例如在一至数天内单次或几次给药，或在延长时间内定期给药。制剂中采用的精确剂量也将取决于施用途径，并且应根据医师的判断和每个患者的情况来决定。工程细胞的治疗有效量将取决于所治疗的受试者、病痛的严重程度和类型以及施用方式。在一些实施方案中，可用于治疗人类受试者的剂量范围为至少3.8×10⁴、至少3.8×10⁵、至少3.8×10⁶、至少3.8×10⁷、至少3.8×10⁸、至少3.8×10⁹或至少3.8×10¹⁰个细胞/m2。在某个实施方案中，用于治疗人类受试者的剂量范围为约3.8×10⁹至约3.8×10¹⁰个细胞/m²。在另外的实施方案中，工程细胞的治疗有效量可以在每公斤体重约5×10⁶个细胞至每公斤体重约7.5×10⁸个细胞之间，如每公斤体重约2×10⁷个细胞至约5×10⁸个细胞，或每公斤体重约5×10⁷个细胞至约2×10⁸个细胞。本领域技术人员可以根据受试者的年龄、体重、性别和生理状况容易地确定工程细胞的精确量。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线中推算出来。

在一些实施方案中，包含CALAR的工程细胞可以在用于治疗或预防的额外药剂之前、期间、之后或以任何组合施用。

在另一个方面，本公开还提供了一种药物组合物，其包含工程细胞和药学上可接受的稀释剂和/或载体。示例性的稀释剂和/或载体包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。

表3.CALAR中包含的域的示例性序列

实施例

虽然已经参照具体实施方案(其中一些是优选实施方案)特别显示和描述了本公开，但本领域的技术人员应理解，在不脱离本文所公开的本公开的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式上和细节上的各种改变。

实施例1.

本实施例说明了CALAR T细胞在体外的功效。

RHD CALAR的设计和构建。两个RHD CALAR构建体，命名为RHD1(SEQ ID NO:22的氨基酸序列)和RHD2(SEQ ID NO:23的氨基酸序列)是由Genewiz(中国苏州)设计和合成的。RHD1和RHD2基因被克隆到第三代慢病毒载体中。

慢病毒生产。使用第三代包装系统生产VSV-G假型慢病毒颗粒。293T细胞在汇合度为80％时用转移质粒、包膜质粒、包装质粒和Lipofectamine 3000(Life Technologies)的混合物进行转染。48小时后收获含有慢病毒的上清液，通过0.45微米的PVDF膜过滤，在4℃以1500×g浓缩45分钟并储存在-80℃。

原代人类T细胞的激活和扩增。来自健康供体的人类PBMC用CD3/CD28 Dynabeads(Thermo Fisher Scientific)以1:1的细胞/珠粒比激活24小时。用病毒颗粒转导2×10⁶个T细胞。T细胞在补充有400U/ml IL-2的XF T细胞扩增培养基(STEMCELL Technologies)中培养。每2至3天更换一次培养基。刺激后5天，通过流式细胞仪(Beckman cytoflex)验证阳性CAR-T细胞。

抗RhD特异性目标细胞的产生。为了在体外测试CAR-T的杀伤功能，我们设计了一种表达抗Rh BCR的目标细胞。目标细胞的生成有两个步骤。在第一步中，K562细胞(ATCC：CCL-243)通过慢病毒转导被工程改造为表达表面IgG BCR、CD79a和CD79b共受体。在第二步中，用慢病毒载体转导CD79a/b阳性细胞，使其表面表达人抗RhD克隆R593的IgG。特定目标细胞身份通过流式细胞术确认并命名为K562-R593(图3)。

CALAR T细胞的体外功效测试。将CALAR T细胞(或对照T细胞)与表达抗Rh BCR的细胞(目标细胞)共同培养。目标细胞，如杂交瘤细胞，是内部产生的。细胞毒性是根据目标细胞的裂解百分比来计算的。CALAR T细胞特异性杀伤目标细胞，但不杀伤非目标细胞，表明CALAR T细胞杀伤目标细胞的特异性。K562和K562-R593目标细胞首先用CFSE(1μM)在37℃下染色5分钟，洗涤两次并重新悬浮在补充有400IU/ml IL-2和2％SR(血清替代物)的X-VIVO15培养基中。RHD1 CALAR、RHD2 CALAR或未转导的T细胞(初始激活后8-10天)与负载的目标细胞以1:1的效应:目标(E:T)比共同培育20小时。随后，取200微升的细胞悬浮液并直接用流式细胞仪进行计数。如图4所示，CALAR T细胞(RHD1和RHD2)特异性杀伤K562-R593目标细胞，但没有杀伤K562非目标细胞，表明CALAR T细胞杀伤目标细胞的特异性。裂解(％)＝[(仅目标CFSE+细胞数-共培育的CFSE+细胞数)/仅目标CFSE+细胞数]*100。根据制造商的建议，在200μl中以1:1的效应:目标(E:T)比共培养20小时后，通过ELISA对CALAR T细胞的INF-γ生产进行量化。如图5所示，CALAR T细胞在与K562-R593目标细胞共培养后，产生的INF-γ量增加，但K562非目标细胞没有。

实施例2

本实施例说明了CALAR T细胞在体内的功效。

CALAR T细胞的体内功效测试。在用静脉内免疫球蛋白预处理小鼠以将FcyR介导的对BCR表达细胞的毒性降至最低后，将K562-R593目标细胞(如实施例1中产生的)或作为对照的K562细胞静脉内注射到NSG小鼠体内。几天后，静脉内注射RHD CALAR T细胞(或对照T细胞)。对生物发光和/或针对Rh的血清抗体进行量化，以监测RHD CALAR T细胞的功效。结果显示，RHD CALAR T细胞控制K562-R593目标细胞的生长，但不控制K562非目标细胞的生长，而阴性对照T细胞不控制K562-R593目标细胞的生长。

序列表

<110> 苏州博腾生物制药有限公司

<120> 靶向抗RH抗体的组合物和方法

<130> 077963-8003WO02

<150> PCT/CN2020/113184

<151> 2020-09-03

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 417

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ser Ser Lys Tyr Pro Arg Ser Val Arg Arg Cys Leu Pro Leu Trp

1 5 10 15

Ala Leu Thr Leu Glu Ala Ala Leu Ile Leu Leu Phe Tyr Phe Phe Thr

20 25 30

His Tyr Asp Ala Ser Leu Glu Asp Gln Lys Gly Leu Val Ala Ser Tyr

35 40 45

Gln Val Gly Gln Asp Leu Thr Val Met Ala Ala Ile Gly Leu Gly Phe

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Leu Phe Met Leu Ala Leu Gly Val Gln Trp Ala Ile Leu Leu Asp Gly

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Ile Arg Leu Ala Thr Met Ser Ala Leu Ser Val Leu Ile Ser Val Asp

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Ala Val Leu Gly Lys Val Asn Leu Ala Gln Leu Val Val Met Val Leu

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Val Glu Val Thr Ala Leu Gly Asn Leu Arg Met Val Ile Ser Asn Ile

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Phe Asn Thr Asp Tyr His Met Asn Met Met His Ile Tyr Val Phe Ala

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Ala Tyr Phe Gly Leu Ser Val Ala Trp Cys Leu Pro Lys Pro Leu Pro

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Glu Gly Thr Glu Asp Lys Asp Gln Thr Ala Thr Ile Pro Ser Leu Ser

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Ala Met Leu Gly Ala Leu Phe Leu Trp Met Phe Trp Pro Ser Phe Asn

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Ser Ala Leu Leu Arg Ser Pro Ile Glu Arg Lys Asn Ala Val Phe Asn

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Thr Tyr Tyr Ala Val Ala Val Ser Val Val Thr Ala Ile Ser Gly Ser

245 250 255

Ser Leu Ala His Pro Gln Gly Lys Ile Ser Lys Thr Tyr Val His Ser

260 265 270

Ala Val Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Cys His Leu Ile

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Pro Ser Pro Trp Leu Ala Met Val Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Ile

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Ser Val Gly Gly Ala Lys Tyr Leu Pro Gly Cys Cys Asn Arg Val Leu

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Gly Ile Pro His Ser Ser Ile Met Gly Tyr Asn Phe Ser Leu Leu Gly

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Leu Leu Gly Glu Ile Ile Tyr Ile Val Leu Leu Val Leu Asp Thr Val

340 345 350

Gly Ala Gly Asn Gly Met Ile Gly Phe Gln Val Leu Leu Ser Ile Gly

355 360 365

Glu Leu Ser Leu Ala Ile Val Ile Ala Leu Met Ser Gly Leu Leu Thr

370 375 380

Gly Leu Leu Leu Asn Leu Lys Ile Trp Lys Ala Pro His Glu Ala Lys

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Tyr Phe Asp Asp Gln Val Phe Trp Lys Phe Pro His Leu Ala Val Gly

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Phe

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成

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<212> PRT

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65 70 75 80

Leu Phe Met Leu Ala Leu Gly Val Gln Trp Ala Ile Leu Leu Asp Gly

85 90 95

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<220>

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acctactatg ctctagcagt cagtgtggtg acagccatct cagggtcatc cttggctcac 780

ccccaaagga agatcagcat gacttatgtg cacagtgcgg tgttggcagg aggcgtggct 840

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<212> PRT

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<223> 合成

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660 665 670

Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu

675 680 685

Gly Ile Gly Leu Phe Met

690

Claims (28)

1.一种编码嵌合同种抗体受体(CALAR)的多核苷酸，其中所述CALAR包含胞外域、跨膜域和胞内信号传导域，所述胞外域包含Rh因子的免疫原性片段，其中所述胞外域与B细胞上表达的针对Rh抗原的B细胞受体(BCR)结合，其中表达所述CALAR的细胞与B细胞上表达的所述BCR结合，或诱导杀伤表达所述BCR的B细胞。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述Rh因子的免疫原性片段包含Rh抗原的表位。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述Rh因子的免疫原性片段包含选自表2所列组的序列或与其具有至少90％同一性的序列，或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。

4.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述CALAR还包含信号肽。

5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述信号肽是CD8α的信号肽，包含SEQ IDNO:16的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。

6.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述跨膜域包含CD8α的跨膜域。

7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述CD8α的跨膜域包含SEQ ID NO:17的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。

8.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述胞外域通过铰链区连接至所述跨膜域。

9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述铰链区包含GS连接子或CD8α的铰链区。

10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中所述GS连接子包含SEQ ID NO:19的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。

11.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述胞内域包含共刺激域和信号传导域。

12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所述共刺激域包含CD137的胞内域。

13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述CD137的胞内域包含SEQ ID NO:20的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。

14.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所述胞内域包含CD3ζ的信号传导域。

15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中所述CD3ζ的信号传导域包含SEQ ID NO:21的序列或与其具有至少90％同一性的序列；或与其具有1、2、3、4、5个氨基酸残基差异的序列。

16.一种多肽，其由根据权利要求1至15中任一项所述的多核苷酸编码。

17.一种载体，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的多核苷酸，其中编码所述CALAR的所述多核苷酸可操作地连接于至少一个调节性多核苷酸元件以用于表达所述CALAR。

18.根据权利要求17所述的载体，其中所述载体是质粒载体、病毒载体、逆转录转座子、定点插入载体或自杀式表达载体。

19.根据权利要求18所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或AAV载体。

20.一种工程细胞，其包含根据权利要求1至15中任一项所述的多核苷酸。

21.根据权利要求20所述的工程细胞，其中所述工程细胞是T细胞或NK细胞。

22.一种治疗或预防与Rh同种抗体相关的病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求20或21所述的工程细胞。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述与Rh同种抗体相关的病症是新生儿的溶血性疾病。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述与Rh同种抗体相关的病症是迟发性溶血性输血反应(DHTR)。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述工程细胞是自体细胞。

26.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述工程细胞是同种异体细胞。

27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述方法还包括共同施用增加所述工程细胞的功效的药剂。

28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述方法还包括共同施用改善与施用所述工程细胞相关的副作用的药剂。

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