ES2932184T3 - Un método para obtener una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos - Google Patents

Un método para obtener una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos Download PDF

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Abstract

La invención actual proporciona ahora receptores inmunitarios exógenos que no requieren ningún gen marcador de selección adicional y/o ningún gen suicida adicional. La invención ahora permite la producción de células T modificadas genéticamente que se pueden enriquecer de manera intacta, es decir, las células T modificadas genéticamente no requieren ninguna interacción con ningún agente externo y se pueden seleccionar eliminando las células T que expresan la alfa beta T endógena. receptor celular. Se proporcionan células T diseñadas con un receptor inmunitario exógeno que se pueden diferenciar del receptor de células T endógeno y ahora se pueden eliminar, es decir, agotar, con un anticuerpo selectivo que se dirige específicamente al receptor inmunitario exógeno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Un método para obtener una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos
Campo de la divulgación
La divulgación es en el campo de la medicina. En particular en el campo de la terapia génica. Se refiere a la inmunología y la terapia celular para el tratamiento de cáncer. La divulgación se refiere además a métodos para el enriquecimiento de células T modificadas por ingeniería genética y al uso de células T modificadas por ingeniería genética en tratamientos médicos.
Antecedentes de la técnica
La transferencia adoptiva de células T con especificidad antitumoral modificada por ingeniería genética o especificidad anti-patógeno está en desarrollo. En tales estrategias, un receptor inmunitario exógeno tal como un receptor de células T alfa beta, o un receptor de células T gamma delta o un receptor de antígeno quimérico que tiene una especificidad antitumoral particular, o una especificidad anti-patógeno particular se transfiere a células T autólogas de un paciente, o, por ejemplo, en caso de un trasplante alogénico de células madre en un paciente, en las células T alogénicas correspondientes. Por ejemplo, un paciente leucémico que se somete a un trasplante de células madre sanguíneas también tendrá agotamiento de linfocitos durante el tratamiento. Por tanto, dicho paciente también puede beneficiarse de, por ejemplo, la infusión de células T de donante que han sido modificadas por ingeniería genética para expresar un receptor de células T antileucémico específico.
Aunque los ensayos clínicos han establecido el valor de la transferencia adoptiva de células modificadas por ingeniería genética con t Cr (T-cell receptor en inglés) en pacientes con cáncer, el beneficio clínico de tales estrategias generalmente se observa solo en una parte de los pacientes. Una explicación de la efectividad limitada observada de las células T modificadas por ingeniería genética con TCR es una expresión superficial subóptima de los TCR terapéuticos provocada por la competencia por los componentes CD3 entre los TCR recién introducidos y los endógenos (Provasi et al. Nat Med. mayo de 2012;18(5):807-15). Por otra parte, la aplicación de tales estrategias en un entorno alogénico, por ejemplo, trasplante alogénico de células madre, se ve obstaculizada por graves problemas de seguridad, ya que las células T no modificadas por ingeniería genética que expresan receptores endógenos de células T alfa beta pueden inducir efectos secundarios no deseados tales como, por ejemplo, enfermedad de injerto contra huésped en un entorno de trasplante alogénico de células madre. Por tanto, se han desarrollado estrategias para seleccionar células T modificadas por ingeniería genética que se centran en una selección positiva de células T modificadas por ingeniería genética. Las estrategias que existen en la actualidad apuntan a incluir marcadores genéticos sustitutos tales como, por ejemplo, un gen de neomicina o, por ejemplo, una proteína fluorescente o algún otro gen adicional que permita una selección positiva de células transducidas o transfectadas. Sin embargo, tales estrategias tienen más problemas de seguridad porque requieren la inclusión de genes extraños generalmente grandes que pueden ser inmunogénicos además de la transferencia adoptiva de un receptor inmunitario exógeno con una especificidad deseada.
Además, también se ha reconocido en la técnica que debido al hecho de que las células modificadas por ingeniería genética se infunden en los pacientes, que puede ser beneficioso eliminar selectivamente estas células de un paciente en caso de un acontecimiento adverso. Por tanto, las células T modificadas por ingeniería genética a menudo también comprenden, además del receptor inmunitario exógeno, genes adicionales que permiten eliminar selectivamente las células T modificadas por ingeniería genética. Dichos genes incluyen, por ejemplo, genes suicidas que, tras la administración de un agente al paciente, destruyen selectivamente las células con el gen suicida tal como HSV-TK (revisado en Bondanza et al., Blood 107, 1828-1836 (2006).
Por tanto, en la técnica, las estrategias para la modificación por ingeniería genética de células T y para su uso en sujetos, tales como en el tratamiento de seres humanos, se han centrado en incluir genes adicionales en células T modificadas por ingeniería genética que permitan la selección de las células modificadas por ingeniería genética para su uso en los sujetos y/o que permitan el agotamiento de las células T modificadas por ingeniería genética de sujetos que están siendo tratados con dichas células T modificadas por ingeniería genética.
Sumario de la invención
La invención es como se expone en las reivindicaciones.
Divulgación adicional
La divulgación actual proporciona ahora métodos adicionales que permiten el enriquecimiento de células T modificadas por ingeniería genética sin requerir la adición de ningún gen adicional. También, el método permite seleccionar las células T modificadas por ingeniería genética que no requiere ninguna interferencia de las células T modificadas por ingeniería genética. La célula T modificada por ingeniería genética puede permanecer intacta.
Los presentes inventores se dieron cuenta de que al seleccionar células T modificadas por ingeniería genética mediante métodos de selección positiva, por ejemplo, usando un marcador de selección, aún así, pueden existir subpoblaciones de células T modificadas por ingeniería genética que expresan niveles funcionales de receptores de células T alfa beta endógenos además de expresar el receptor inmunitario exógeno de la especificidad deseada y el marcador de selección separado. Dichas subpoblaciones se seleccionarán con cualquier estrategia de selección positiva y pueden limitar la eficacia terapéutica y la seguridad de los productos de células modificadas por ingeniería genética. No se proporcionan métodos en la técnica anterior que permitan eliminar dichas subpoblaciones.
Adicionalmente, los métodos de selección positiva para seleccionar células T modificadas por ingeniería genética usando, por ejemplo, un anticuerpo que se une al receptor inmunitario exógeno puede inducir la apoptosis en un número sustancial de células transducidas. Además, los métodos de selección positiva que incluyen marcadores de selección requieren la adición de genes que pueden inducir una respuesta inmunitaria no deseada, ya que dichos marcadores de selección normalmente no son del hospedador (por ejemplo, no humanos) y, por lo tanto, pueden reconocerse como extraños, dando como resultado la eliminación de las células transducidas por el hospedador.
Los presentes inventores por lo tanto se propusieron desarrollar una estrategia novedosa que, además de seleccionar las células T modificadas por ingeniería genética, también pueda eliminar subpoblaciones no deseadas como se describe anteriormente, no requiera que se incluya ningún gen adicional en la célula T modificada por ingeniería genética excepto el receptor inmunitario exógeno y que permita que las células T modificadas por ingeniería genética permanezcan intactas.
Los métodos de la divulgación para enriquecer las células T modificadas por ingeniería genética, en contraste con cualquier método del estado de la técnica anterior, implican el uso de una etapa de selección negativa. A partir de una mezcla de células T que comprende células T modificadas por ingeniería genética con un receptor inmunitario exógeno y células T no modificadas por ingeniería genética con un receptor de células T alfa beta endógeno, las células T alfa beta no modificadas por ingeniería genética pueden separarse de la mezcla. Dichos métodos también incluyen la separación de cualquier célula T modificada por ingeniería genética que esté comprendida en la mezcla de células T que tengan una expresión subóptima del receptor inmunitario exógeno y que aún puedan tener una cantidad sustancial de receptor de células T alfa beta endógeno expresado. Dicho método también permite que las células T modificadas por ingeniería genética que están incluidas en la mezcla de células T permanezcan intactas, evitando, por ejemplo, la inducción no deseada de apoptosis que puede producirse con un método de selección positivo usando anticuerpos que se unen a las células T modificadas por ingeniería genética.
Dichos métodos comprenden el uso de anticuerpos selectivos que se unen específicamente al receptor endógeno de células T alfa beta. Por tanto, cualquier célula T en la mezcla de células T que comprenda receptores de células T alfa beta endógenos en su superficie celular se separará de la mezcla obteniendo de esta manera una preparación enriquecida de células T modificadas por ingeniería genética con el receptor inmunitario exógeno. Dichos anticuerpos selectivos utilizan diferencias de secuencia entre el receptor de células T alfa beta endógeno y el receptor inmunitario exógeno. Incluso un receptor de linfocitos T alfa beta del mismo origen que los linfocitos T modificados por ingeniería genética puede usarse como un receptor inmunitario exógeno. Todo lo que se requiere es que la secuencia de aminoácidos del receptor de células T alfa beta exógeno correspondiente al sitio de unión del anticuerpo al receptor de células T alfa endógeno se modifique de tal manera que el anticuerpo ya no pueda unirse al mismo. Pueden incluirse otras modificaciones, por ejemplo, para mantener u optimizar la función del receptor de células T, mantener la especificidad y/o introducir el emparejamiento preferible de dos cadenas.
Los anticuerpos selectivos pueden usarse en técnicas de separación tales como MACS, FACS y cromatografía de inmunoafinidad. Las preparaciones enriquecidas en células T modificadas por ingeniería genética obtenidas con la divulgación son particularmente útiles en un tratamiento médico. Dicho tratamiento médico puede ser el tratamiento de un cáncer. Por ejemplo, en el tratamiento de leucemia, un paciente que se somete a un trasplante alogénico de células madre también puede beneficiarse de una infusión de una preparación de células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas, es decir, células T modificadas por ingeniería genética alogénicas, que pueden obtenerse mediante cualquiera de los métodos de la divulgación, y que son células T modificadas por ingeniería genética que se proporcionan con un receptor inmunitario exógeno que tiene especificidad, por ejemplo, por las células leucémicas del paciente. De esta forma, la eliminación de la leucemia puede promoverse adicionalmente en el tratamiento mientras que el riesgo de inducir efectos secundarios no deseados debido a la presencia de células T que expresan receptores de células T alfa beta endógenos puede reducirse sustancialmente o incluso evitarse por completo.
De forma similar, en un aspecto diferente de la divulgación, los linfocitos modificados por ingeniería genética, es decir, las células T modificadas por ingeniería genética (o las células NK modificadas por ingeniería genética, no cubiertas por la invención reivindicada) también pueden estar provistas de un receptor inmunitario exógeno, por ejemplo, un CAR o un receptor de células T alfa beta modificado por ingeniería genética o un receptor de células T gamma delta (modificado por ingeniería genética), de tal manera que el receptor inmunitario exógeno difiera de los receptores de células T alfa beta endógenos correspondientes, o de los receptores de células T gamma delta endógenos, de tal manera que un anticuerpo específico para el receptor inmunitario exógeno eliminará específicamente las células T modificadas por ingeniería genética. Estos aspectos de la divulgación se representan en la Figura 1 para el método de enriquecimiento y en la Figura 2 para el método de agotamiento. Por lo tanto, a diferencia de cualquiera de los métodos de la técnica anterior, no es necesario incluir ningún gen adicional en la célula T modificada por ingeniería genética distinto de los genes que codifican el receptor inmunitario exógeno para permitir el agotamiento de las células T modificadas por ingeniería genética.
Por tanto, en contraste con cualquiera de los métodos de selección usados en la técnica anterior que usan, por ejemplo, marcadores de selección, o cualquiera de los métodos de destrucción selectiva usados en la técnica anterior que usan, por ejemplo, genes suicidas, la divulgación actual proporciona ahora receptores inmunitarios exógenos que no requieren ningún gen marcador de selección adicional y/o ningún gen suicida adicional. La divulgación ahora permite la producción de células T modificadas por ingeniería genética que pueden enriquecerse de manera intacta, es decir, las células T modificadas por ingeniería genética no requieren ninguna unión o interacción con ningún agente externo tal como, por ejemplo, un anticuerpo. Además, las células T modificadas por ingeniería genética con un receptor inmunitario exógeno que puede diferenciarse del receptor de células T endógeno pueden eliminarse, es decir, agotarse, con un anticuerpo selectivo dirigido específicamente al receptor inmunitario exógeno. La misma modificación que se usó en el proceso de enriquecimiento puede usarse en el proceso de agotamiento. Un primer anticuerpo se une selectivamente al receptor endógeno de células T alfa beta, mientras que no se une a una secuencia modificada del receptor de células T alfa beta modificado por ingeniería genética en el método de enriquecimiento. Por el contrario, el segundo anticuerpo ahora se une a dicha secuencia modificada del receptor de células T alfa beta modificado por ingeniería genética pero no al receptor de células T alfa beta endógeno. De esta forma, un receptor de células T alfa beta mínimamente modificado puede proporcionarse como un receptor inmunitario exógeno que permita tanto el enriquecimiento como el agotamiento in vivo en combinación con dos anticuerpos selectivos diferentes. Todo lo que se requiere son receptores inmunitarios exógenos y anticuerpos selectivos que sean específicos para un receptor de células T alfa beta endógeno y/o anticuerpos que sean específicos para el receptor inmunitario exógeno.
Por lo tanto, la presente divulgación ahora proporciona receptores inmunitarios exógenos que, combinados con anticuerpos selectivos, no requieren ningún gen exógeno adicional para el enriquecimiento y/o el agotamiento de las células T modificadas por ingeniería genética.
Figuras
Figura 1. Esquema que muestra el principio subyacente de enriquecimiento para células T modificadas por ingeniería genética. A) se proporciona un anticuerpo que se une al receptor endógeno de células T alfa beta (indicado con la flecha). En este escenario el anticuerpo se une a la región constante. B), C), E) y F) se proporcionan receptores inmunitarios exógenos a los que no se une el anticuerpo proporcionado (indicado con la flecha tachada). B) muestra un receptor de células T alfa beta en donde la región variable (V) es de origen endógeno y la región constante de otra especie. La secuencia de la región constante difiere de tal manera que el anticuerpo no se une a la misma. C) muestra un receptor de células T alfa beta de origen endógeno en donde parte de la cadena beta constante se reemplaza por una parte correspondiente de otra especie. E) muestra un receptor de células T gamma delta y F) muestra un receptor de antígeno quimérico. D) muestra una cadena alfa beta modificada por ingeniería genética de origen endógeno que no es adecuada como un receptor inmunitario exógeno ya que el anticuerpo que se proporciona puede unirse a la misma.
Figura 2. Esquema que muestra el principio subyacente del agotamiento (in vivo) de las células T modificadas por ingeniería genética. Se proporciona un anticuerpo que se une selectivamente (indicado con la flecha) al receptor exógeno de células T alfa beta que se muestra en B) y no al receptor de células T alfa beta endógeno como se representa en A) (indicado con la flecha tachada). Un anticuerpo tal también puede unirse a un receptor de células T alfa beta exógeno como se muestra en C) que corresponde sustancialmente a un receptor de células T alfa beta endógeno en donde se ha introducido un sitio de unión para el anticuerpo en la cadena beta reemplazando solo una pequeña región de la cadena beta. Las modificaciones en los receptores exógenos de células T alfa beta tales como los representados en D) que no permiten la unión del anticuerpo no son adecuadas para su uso en la estrategia de agotamiento. De forma similar, se proporciona un anticuerpo que se une selectivamente al receptor de células T gamma delta exógeno que se muestra en F) y no al receptor de células T alfa beta endógeno como se representa en E). El anticuerpo se dirige selectivamente a las células T modificadas por ingeniería genética con los receptores inmunitarios exógenos mientras que no se dirige a las células T endógenas que tienen receptores de células T endógenos como se representa en A) y F).
Figura 3. Esquema que muestra los receptores inmunitarios exógenos y los componentes del receptor de células T como se usa en la sección de ejemplos. En A) se proporciona un receptor exógeno de células T alfa beta que es de origen endógeno. Este receptor exógeno de células T alfa beta se modificó posteriormente intercambiando segmentos del mismo por segmentos de otra especie.
Toda la región constante se reemplazó como se muestra en B). O se reemplazó una parte de la región constante de la cadena beta como se muestra en C). Se utilizó una estrategia de reemplazo para reemplazar diferentes partes, diferentes dominios (D1, D2, D3, D4) de la región constante de cada cadena para identificar la secuencia a la que se une el anticuerpo que se dirige al receptor endógeno de células T alfa beta. Cada cadena modificada se emparejó con una cadena no modificada tal como se representa en C). En otra estrategia, el receptor inmunitario exógeno que se usó fue un receptor de células T gamma delta seleccionado.
Figura 4. Función antitumoral mejorada de una preparación de células T modificadas por ingeniería genética enriquecida con un receptor exógeno de células T gamma delta. Enriquecimiento de células T modificadas por ingeniería genética con y§TCR mediante agotamiento con calidad GMP de células T positivas para apTCR a partir de una mezcla de células T. A) Representación de citometría de flujo de pMP71: células T ap transducidas con y-T2A-8 antes y directamente después de la separación de células T y§Tc R (TCR ap agotado). Los linfocitos T enriquecidos se siguieron durante la expansión de linfocitos T para determinar la expresión de y§TCR. Las células T se tiñeron con un anticuerpo pan-Y§TCR y pan-apTCR y se indicaron los porcentajes de células en cada cuadrante. B) Células T transducidas con y§TCR (a granel, 9 % de y§TCR+) y células T ap TCR agotadas (41 % de y6TCR+) se incubaron con Células Daudi cargadas con 51Cr a las proporciones E:T indicadas durante 4-5 horas. Se usaron células transducidas pB:aMDM2/pp53 como células T de control. El porcentaje de lisis específica se muestra como media de triplicados /-SD. Las significaciones estadísticas se calcularon con anova de dos vías; **p<0,01; ***p<0,001. C) Se incubaron células T transducidas con y§TCR a granel (6 % de y§TCR+) y apTCR agotadas (51 % de y§TCR+) con diferentes células diana tumorales como se indica y se midió la secreción de IFNy mediante IFNy ELlSPOT. Se usaron células T transducidas con pMP71:ANGFR como células T de control. Las manchas de IFNy por 15000 células T se muestran como la media de triplicados SD. Las células T solas no produjeron niveles significativos de IFNy. Las significaciones estadísticas se calcularon con anova de dos vías; *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.
Figura 5. Alorreactividad abolida y reactividad antitumoral conservada de una preparación de células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas con un receptor exógeno de células T gamma delta. Las PBMC derivadas de donantes sanos se transdujeron retrovíricamente con pMP71:ANGFR o pMP71: Y-T2A-8, enriquecido para células T transducidas con y§TCR (apTCR agotado y 65 % de y§TCR+) o no (a granel y 9 % de y§TCR+) y se expandieron como se describe. Las células T no se estimularon durante más de 20 días y se privaron de IL-2 durante los últimos 6 días y se consideraron células T en reposo. A) Las células T en reposo se cocultivaron con células tumorales OPM2 y un panel de EBV-LCL no coincidentes durante 24 horas. La actividad antitumoral y la alorreactividad se midieron mediante IFNy ELISPOT. Las manchas de IFNy por 15.000 células T se muestran como la media de triplicados SD.
Figura 6. Unión anulada del anticuerpo apTCR-mAb BW242 a secuencias de aminoácidos murinos en el dominio constante de apTCR. A) Enriquecimiento eficiente de PBMC transducidas con apTCR (aMU/pMU) completamente murinos sin sentido (aMDM2/pp53) después de la selección negativa de MACS usando pan-apTCR mAb BW242. La figura de la izquierda representa la mezcla de células T que comprende células transducidas y no transducidas, como se ilustra por la presencia de células T apTCR+. La derecha representa la población enriquecida de células positivas para la expresión de apTCR de ratón. Las células no transducidas que expresan apTCR endógenos se agotan de la población. B) Las células JurMa se transdujeron con apTCR (aMU/pMU) completamente murinos sin sentido (aMDM2/pp53), NY-ESO-1 apTCR completamente humanos (ahu/phu) o apTCR NY-ESO-1 quiméricos, incluyendo un dominio constante murino (ahuMU/phuMU). La tinción de Vp4 y la tinción pratón representan niveles de expresión y se indican mediante porcentajes. La tinción con apTCR-PE representa la unión del pan-apTCR-mAb BW242 de grado clínico y está indicada por la Intensidad media de fluorescencia (MFI). Para todas las gráficas FACS: los datos son representativos de siete experimentos individuales.
Figura 7. Alineación de cadenas alfa y beta humanas y de ratón e intercambio de dominios. A) Alineación de secuencias de aminoácidos en regiones constantes de TCRa y TCRp humano y de ratón. Los recuadros indican los dominios que cubren todas las diferencias de aminoácidos entre humanos y ratones; TCRCa tiene tres dominios diferentes, mientras que TCRCp tiene cuatro dominios. Los asteriscos denotan aminoácidos idénticos dentro de secuencias humanas y murinas. B) Resumen esquemático de tres genes TCRa diferentes y cuatro genes TCRp diferentes clonados en vectores pMP71, los recuadros grises oscuros representan dominios murinizados flanqueados por secuencias de aminoácidos humanos, como se ilustra en los recuadros de color gris claro. TCRCp comienza con EDLKN, aminoácidos numerados 1-5, hasta KDSRG, aminoácidos numerados 176-180. El Dominio 3 del TCRCp de ratón alineado corresponde al Dominio 3 humano con mutaciones Q88H, Y101H, N106E, E108K, T110P, Q111E, D112G, R113S, A114P, I120N, V121I. Véanse también los aminoácidos 217-250 de SEQ ID NO.
5 y 6. V: Dominio variable y C: Dominio constante. V: Dominio variable y C: Dominio constante. Las figuras A y B están adaptadas de Sommermeyer & Uckert, 2010, Journal of Immunology.
Figura 8. El dominio 3 en la cadena de TCRp humana es parte del epítopo de unión de apTCR-mAb BW242. Las células JurMa se transdujeron respectivamente con NY-ESO-1 apTCR (ahu/phu) totalmente humanos, NY-ESO-1 apTCR quiméricos (ahuMU/phuMU) o diferentes combinaciones de las cadenas TCRp parcialmente murinizadas con la cadena TCRa humana correspondiente o con combinaciones de las cadenas TCRa parcialmente murinizadas con la cadena TCRp humana. La expresión de los TCR se midió mediante tinción con Vp4 y se analizó el reconocimiento de todas las combinaciones de TCR por apTCR-mAb BW242 según lo determinado por citometría de flujo. Los números indican los porcentajes de fracción de células positivas para Vp4 y la Intensidad de fluorescencia media (MFI) de la población celular total.
Figura 9. Enriquecimiento eficiente de células T modificadas por ingeniería genética transducidas con TCR alfa beta humanos parcialmente murinizados. Las células JurMa que expresan apTCR humanos (ahu/phu), apTCR quiméricos (ahuMU/phuMU), apTCR con el dominio 3 murinizado en la cadena p (ahu/pM3) o apTCR con murinización combinada de los dominios aM2 y pM3 (aM2/pM3) se probaron para el enriquecimiento mediante selección negativa MACS usando perlas recubiertas de apTCR (panel derecho). Dado que todas las variantes de la cadena TCR son específicas de NY-ESO-1/HLA-A2, se mezclaron, antes de clasificar, en una proporción de 1:1 con células JurMa que expresan apTCR específicos de WT1 completamente humanos, simulando una población heterogénea de células (panel izquierdo y panel central). Después del agotamiento, la fracción de células negativas se recogió y se midió por citometría de flujo. Las fracciones positivas para Vp4 representan los TCR específicos de NY-ESO-1 y las fracciones Vp21 son representativas de los TCR específicos de WT1. Los números indican los porcentajes de células positivas para la tinción de Vp4 o Vp21.
Figura l0. Alineación de ejemplos de secuencias C-DOMAIN, de TR C-DOMAIN de TRA humana y de ratón, TRB, TRG y TRD C-DOMAIN. Las secuencias y las SEQ ID NO. correspondientes se enumeran en la tabla 1.
Definiciones
En la siguiente descripción y ejemplos se usa una serie de términos. Para proporcionar una comprensión clara y coherente de las memorias descriptivas y de las reivindicaciones, incluyendo el alcance a dar a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones. A menos que se defina de otro modo en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente divulgación. Las divulgaciones de todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias se incorporan en el presente documento en su totalidad por referencia.
Los métodos para llevar a cabo las técnicas convencionales usadas en los métodos de la divulgación serán evidentes para el experto en la materia. La práctica de técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante, bioinformática, genómica, secuenciación y campos relacionados son bien conocidos por los expertos en la materia y se analizan, por ejemplo, en las siguientes referencias bibliográficas: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987 y actualizaciones periódicas; y la serie Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego.
En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitante para hacer referencia a que se incluyen los artículos que siguen a esta palabra, pero no se excluyen los artículos que no se mencionan específicamente. Abarca los verbos "que consisten esencialmente en" así como "que consisten en".
Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un/uno", "una", y "el/la" incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, un método para aislar "una" molécula de ADN, como se ha usado anteriormente, incluye aislar una pluralidad de moléculas (por ejemplo, decenas, cientos, miles, decenas de miles, cientos de miles, millones o más moléculas).
Alinear y alineación: Con el término "alinear" y "alineación" se entiende la comparación de dos o más secuencias de nucleótidos basándose en la presencia de tramos cortos o largos de nucleótidos idénticos o similares. En la técnica se conocen varios métodos para la alineación de secuencias de nucleótidos, que se explicarán adicionalmente más adelante. Con el término "alinear" y "alineación" también se entiende la comparación de dos o más secuencias de aminoácidos basándose en la presencia de tramos cortos o largos de aminoácidos idénticos o similares. En la técnica se conocen varios métodos para la alineación de secuencias de aminoácidos, que se explicarán adicionalmente más adelante.
"Expresión de un gen" se refiere al proceso en donde una región de ADN, que está unida operativamente a las regiones reguladoras apropiadas, particularmente un promotor, se transcribe en un ARN, que es biológicamente activo, es decir, que es capaz de traducirse en una proteína o péptido biológicamente activo (o fragmento de péptido activo) o que es activo en sí mismo (por ejemplo, en el silenciamiento génico postranscripcional o ARNi). Una proteína activa en ciertas realizaciones se refiere a una proteína que es constitutivamente activa. La secuencia codificante está preferentemente en orientación de sentido y codifica una proteína o péptido deseado biológicamente activo o un fragmento de péptido activo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "unido/a operativamente" se refiere a un enlace de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor, o más bien una secuencia reguladora de la transcripción, está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Unido operativamente significa que las secuencias de ADN que se unen son normalmente contiguas y, cuando sea necesario unir dos o más regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el marco de lectura.
La expresión "construcción genética" significa una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm) en una célula, unida operativamente a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor). Por lo tanto, una construcción genética puede comprender varias secuencias unidas operativamente, tales como un promotor, una secuencia líder en 5' que comprende, por ejemplo, secuencias implicadas en el inicio de la traducción, una región codificante (proteína), sitios donadores y aceptores de corte y empalme, secuencias intrónicas y exónicas, y una secuencia no traducida en 3' (también conocida como secuencia no traducida en 3' o 3'UTR) que comprende, por ejemplo, sitios de la secuencia de terminación de la transcripción.
"Identidad" es una medida de la identidad de secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos. En general, las secuencias se alinean de tal manera que se obtenga la coincidencia de mayor orden. La "identidad" en sí misma tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse usando técnicas publicadas. Véanse, por ejemplo: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PARTE I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y SEQUENCE ANALYSIS PRIMER; Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Si bien existen varios métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido por los expertos en la materia (Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073). Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, aquellos desvelados en GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 y Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas de ordenador. Los ejemplos de métodos de programas de ordenador preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, paquete de programas GCS (Devereux, J., etal., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. (1990) 215:403).
Como se usa en el presente documento, el término "promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, ubicado aguas arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de inicio de la transcripción del gen, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, pero no limitado a los sitios de unión del factor de transcripción, sitios de unión de proteínas represoras y activadoras y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida por un experto en la materia para actuar directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. Opcionalmente el término "promotor" incluye aquí también la región UTR 5' (Región no traducida 5') (por ejemplo, el promotor puede incluir aquí una o más partes en dirección 5' (5') del codón de iniciación de la traducción de un gen, ya que esta región puede tener un papel en la regulación de la transcripción y/o traducción).
Las expresiones "secuencia de aminoácidos" o "proteína" o "péptido" se refieren a moléculas que consisten en una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción específico, tamaño, estructura tridimensional u origen. Un "fragmento" o "porción" del mismo puede, por lo tanto, seguir denominándose como una "secuencia de aminoácidos" o "proteína" o "péptido".
"Células modificadas por ingeniería genética" se refiere en el presente documento a células que han sido modificadas por ingeniería genética, por ejemplo, por la introducción de una secuencia de ácido nucleico exógena o alteración específica de una secuencia de gen endógeno. Una secuencia de ácido nucleico exógena que se introduce puede comprender una secuencia de tipo silvestre de cualquier especie que pueda modificarse. Una célula modificada puede comprender modificaciones genéticas tales como una o más mutaciones, inserciones y/o deleciones en un gen endógeno y/o inserción de un ácido nucleico exógeno (por ejemplo, una construcción genética) en el genoma. Una célula modificada puede referirse a una célula aislada o en cultivo. Las células modificadas por ingeniería genética pueden ser "células transducidas" en donde las células se han infectado con, por ejemplo, un virus modificado por ingeniería genética. Por ejemplo, puede usarse un vector retrovírico, tales como los que se describen en los ejemplos, pero también pueden contemplarse otros vectores víricos adecuados tales como los lentivirus. También pueden usarse métodos no víricos, tales como transfecciones o electroporación de vectores de ADN. Los vectores de ADN que pueden usarse son vectores de transposones. Por lo tanto, las células modificadas por ingeniería genética también pueden ser "células transfectadas de forma estable" o "células transfectadas de forma transitoria". La transfección se refiere a métodos no víricos para transferir ADN (o ARN) a células de tal manera que se exprese un gen. Los métodos de transfección son ampliamente conocidos en la técnica, tales como la transfección de fosfato de calcio, transfección de PEG y transfección liposómica o lipoplex de ácidos nucleicos. Una transfección tal puede ser transitoria, pero también puede ser una transfección estable en donde pueden seleccionarse células que tienen la construcción génica integrada en su genoma.
La expresión "marcador seleccionable" es un término familiar para los expertos en la materia y se usa en el presente documento para describir cualquier entidad genética que, cuando se expresa, puede usarse para seleccionar una célula o células que contengan el marcador seleccionable. Los productos de genes marcadores seleccionables confieren, por ejemplo, resistencia a los antibióticos u otro rasgo seleccionable o un requisito nutricional. Los marcadores seleccionables, tales como los bien conocidos en la técnica, incluyen proteína fluorescente verde (GFP), eGFP, luciferasa, GUS y similares.
Las "células apT" o "células alfa beta T" pueden definirse con respecto a la función como linfocitos T que expresan un apTCR, que reconoce péptidos unidos a moléculas MHC (complejo principal de histocompatibilidad), que se expresan en la superficie de diversas células. Los MHC presentan péptidos derivados de las proteínas de una célula. Cuando, por ejemplo, una célula está infectada con un virus, el MHC presentará péptidos víricos y la interacción entre el apTCR y el complejo MHC activa tipos específicos de células T que inician respuestas inmunitarias para eliminar la célula infectada. Por tanto, las células apT pueden definirse funcionalmente como células capaces de reconocer péptidos unidos a moléculas MHC. Las células T ap pueden identificarse usando un anticuerpo específico para el receptor de células T ap como se describe a continuación (por ejemplo, el anticuerpo BW242 que es específico para un TCR ap humano). Las células apT pueden seleccionarse de sangre periférica, por ejemplo, a través del antígeno CD3, ya que la gran mayoría de las células T tienen el apTCR. Tal selección también incluirá células y8T. A partir de tales células seleccionadas, puede determinarse la secuencia de ácido nucleico (o aminoácido) correspondiente a la cadena del receptor de células aT y la cadena del receptor de células pT. Por tanto, las células apT también pueden definirse como células que comprenden una secuencia de ácido nucleico (o aminoácido) correspondiente a la cadena receptora de células aT y/o la cadena receptora de células pT.
Las "células T y8" o "células T gamma delta" representan un pequeño subconjunto de células T para las que se desconocen en gran medida las moléculas antigénicas que desencadenan su activación. Las células T gamma delta pueden considerarse un componente de la inmunidad adaptativa en el sentido de que reorganizan los genes TCR para producir diversidad de unión y desarrollarán un fenotipo de memoria. Sin embargo, diversos subconjuntos también pueden considerarse parte de la inmunidad innata en la que se usa un TCR restringido como receptor de reconocimiento de patrones. Por ejemplo, las células T Vy9/V82 se activan específica y rápidamente por un conjunto de precursores de isoprenoides fosforilados no peptídicos, denominados colectivamente fosfoantígenos. Las células Y8T pueden identificarse usando un anticuerpo específico para el receptor de células y8T. Los anticuerpos adecuados para FACS están ampliamente disponibles. Se seleccionan las condiciones, tal como lo proporciona el fabricante del anticuerpo que permite la selección de células negativas y/o positivas. Los ejemplos de anticuerpos que pueden ser adecuados están disponibles en BD Pharmingen (BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.), y8TCR-APC (clon B1, #555718) o disponible de Beckman Coulter, pan-Y8TCR-PE (clon IMMU510, n.°IM1418U). También, a partir de tales células seleccionadas, puede determinarse la secuencia de ácido nucleico (o secuencia de aminoácidos) correspondiente a la cadena del receptor de células yT y la cadena del receptor de células 8T. Por tanto, las células Y8T también pueden definirse como células que comprenden una secuencia de ácido nucleico (o aminoácido) correspondiente a la cadena receptora de células yT y/o la cadena receptora de células 82T.
Las células T o linfocitos T, pertenecen a un grupo de glóbulos blancos llamados linfocitos, que juegan un papel en la inmunidad mediada por células. Las células T se originan a partir de células madre hematopoyéticas en la médula ósea, maduran en el timo (que es de donde deriva la T) y adquieren su función completa en los tejidos linfoides periféricos. Durante el desarrollo de las células T, las células T CD4CD8' (negativas tanto para el correceptor CD4 como para el CD8) están comprometidas con un destino ap (alfa beta) o y8 (gamma delta) como resultado de un reordenamiento inicial del gen TCR p o 8. Las células que experimentan un reordenamiento temprano de la cadena p expresan una estructura pre-TCR compuesta por una cadena p completa y una cadena pre-TCRa en la superficie celular. Tales células cambian a un estado CD4+CD8+, reorganizan el locus de la cadena TCRa y expresar un apTCR en la superficie. Las células T CD4'CD8‘ que completan con éxito el reordenamiento del gen y antes del reordenamiento del gen p expresan un y8TCR y siguen siendo CD4'CD8‘. (Claudio Tripodo et al. Gamm delta T cell lymphomas Nature Reviews Clinical Oncology 6, 707-717 (diciembre de 2009). El receptor de células T se asocia a la proteína CD3 para formar un complejo receptor de células T. Las células T, es decir, que expresan un apTCR o un Y8TCR, expresan el complejo receptor de células T en la superficie celular. Las células T y8 constituyen aproximadamente el 1-5 % de la población total de células T. La región extracelular de una cadena de receptores de células T comprende una región variable. En la región variable de una cadena receptora de células T se localizan tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2, CDR3). Estas regiones son en general las más variables y contribuyen a la diversidad entre los TCR. Las regiones CDR se componen durante el desarrollo de una célula T donde los denominados segmentos Variable (V), Diverso (D) y de Unión (J) se combinan aleatoriamente para generar TCR diversos. La región constante de una cadena receptora de células T, es decir, ser una cadena alfa, beta, gamma o delta, no varía sustancialmente. De forma similar, las regiones marco de una cadena receptora de células T, es decir, ser una cadena alfa, beta, gamma o delta, tampoco varían sustancialmente.
Los linfocitos citolíticos naturales (células NK) se definen como linfocitos granulares grandes (LGL) y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas del progenitor linfoide común que genera los linfocitos B y T. Se sabe que las células NK se diferencian y maduran en la médula ósea, el ganglio linfático, el bazo, las amígdalas y el timo, donde a continuación, entran en la circulación. Las células NK no expresan receptores de antígenos de células T (TCR) o el señalizador Pan T CD3 o receptores de células B de inmunoglobulinas (Ig) de superficie, pero suelen expresar los marcadores de superficie CD16 (FcyRIII) y CD56 en seres humanos, NK1.1 o NK1.2 en ratones C57BL/6. Hasta el 80 % de las células NK humanas también expresan CD8.
El término "anticuerpo" como se usa en el presente documento y como se conoce en la técnica se refiere a cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión a antígeno con regiones determinantes de complementariedad (CDR). El término incluye, pero no se limita a anticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos solo de cadena pesada, anticuerpos de llama, anticuerpos y nanocuerpos de un solo dominio (por ejemplo, VHH). El término "anticuerpo" también puede incluir fragmentos de inmunoglobulina tales como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb y otros fragmentos de anticuerpo u otras construcciones que comprenden CDR que retienen la función de unión al antígeno. Normalmente, dichos fragmentos comprenden un dominio de unión a antígeno. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden comprender cualquiera de los isotipos de anticuerpos conocidos y sus conformaciones, por ejemplo, las clases IgA, tales como IgA1 o IgA2, IgD, IgE, IgG, tales como IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4 o IgM.
Descripción detallada de la divulgación
Enriquecimiento de células T modificadas por ingeniería genética
En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para obtener una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos, que comprende las etapas de:
a) proporcionar una mezcla de células T que comprende
- células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos que comprenden una región constante murinizada, en donde se suprime la expresión de receptores endógenos de células T alfa beta; y
- células T no modificadas por ingeniería genética con receptores de células T alfa beta endógenos, en donde la etapa a) comprende la etapa de:
i. proporcionar células T;
ii. proporcionar un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican un receptor inmunitario exógeno; iii. introducir el ácido nucleico o los ácidos nucleicos en las células T para proporcionar de esta manera una mezcla de células T que comprende células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos y células T no modificadas por ingeniería genética con receptores de células T alfa beta endógenos;
b) poner en contacto la mezcla de células T con un anticuerpo que se une específicamente al receptor endógeno de células T alfa beta, para permitir la formación de un complejo de células T de anticuerpos no modificados por ingeniería;
c) retirar el complejo anticuerpo-células T no modificadas por ingeniería genética de la mezcla de células T para obtener de esta manera una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos.
Las células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos de acuerdo con la divulgación son células T que se han modificado por ingeniería genética de manera que expresen un receptor inmunitario exógeno. El receptor inmunitario exógeno tiene la misma función que un receptor de células T endógeno con respecto al reconocimiento del antígeno y la acción de las células T. Las células T no modificadas por ingeniería genética son células que expresan un receptor de células T endógeno. Los receptores de células T endógenos son del tipo de receptor de células T y§ o del tipo de receptor de células T ap.
Un receptor inmunitario exógeno de acuerdo con la divulgación se define como que no es un receptor de células T endógeno. Por ejemplo, un receptor inmunitario exógeno puede ser un receptor de células T y§ seleccionado particular que es útil en el tratamiento de un cáncer. Dicha secuencia puede ser similar a un receptor de células T y§ endógeno. La diferencia es que el receptor inmunitario exógeno se ha seleccionado intencionalmente para una diana específica. El receptor inmunitario exógeno, por ejemplo, se expresa a partir de una construcción transgénica y no a partir de loci endógenos. Un receptor inmunitario exógeno de acuerdo con la divulgación puede ser de un origen diferente, es decir, de otra especie, en comparación con el origen de las células T que fueron modificadas por ingeniería genética para proporcionar células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos. Un receptor inmunitario exógeno puede ser del mismo origen, es decir, de la misma especie, en comparación con el origen de las células T que fueron modificadas por ingeniería genética para proporcionar células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos. Un receptor inmunitario exógeno también puede ser un receptor de células T y6 modificado por ingeniería genética o un receptor de células T ap modificado por ingeniería genética.
Un receptor de células T modificado por ingeniería genética es un receptor de células T cuya secuencia de aminoácidos se ha modificado de tal manera que tiene una secuencia de aminoácidos diferente en comparación con la secuencia de aminoácidos correspondiente de un receptor de células T endógeno, es decir, al menos sin tener en cuenta las CDR de los mismos. Por tanto, la modificación tal como está presente en los receptores de células T modificados por ingeniería genética no debería interferir con la especificidad del antígeno original. En la sección de ejemplos, esto se demuestra mediante niveles de tinción comparables entre receptores de células T modificados por ingeniería genética y no modificados por ingeniería genética por multímeros de MHC marcados con fluorescencia cargados con el antígeno peptídico para el que es específico el receptor de células T original. Dicha modificación por ingeniería genética implica la modificación de la secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, la región constante de una o ambas cadenas de receptores de células T.
Un receptor inmunitario exógeno también puede ser un receptor de antígeno quimérico (CAR). Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) son receptores recombinantes que combinan la especificidad de un anticuerpo específico de antígeno con las funciones de activación de las células T (como revisó recientemente Shi et al., Mol Cancer. 21 de septiembre de 2014;13:219). Un CAR puede ser una molécula de fusión entre un anticuerpo y un dominio transmembrana que permite la expresión de un anticuerpo en la superficie celular de una célula inmunitaria, así como la señalización en la célula.
En un aspecto de la divulgación, un receptor inmunitario exógeno se selecciona del grupo que consiste en un receptor de células T y§ modificado por ingeniería genética, un receptor de células T ap modificado por ingeniería genética, un receptor de células T y§ o un receptor de antígeno quimérico (CAR). En un aspecto de la divulgación, un receptor inmunitario exógeno se selecciona del grupo que consiste en un receptor de células T y§ modificado por ingeniería genética, un receptor de células T ap modificado por ingeniería genética o un receptor de células T y§. En otro aspecto, un receptor inmunitario exógeno se selecciona del grupo que consiste en un receptor de células T ap o y§ modificado por ingeniería genética.
En la primera etapa del método, se proporciona una mezcla de células T que comprende células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos y células T que expresan un receptor de células T ap endógeno. Una mezcla tal de células T puede prepararse como se describe más adelante. Esta mezcla de células T se pone en contacto con un anticuerpo que se une específicamente al receptor endógeno de células T alfa beta, para permitir la formación de un complejo de células T de anticuerpos no modificados por ingeniería genética. Dicho anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta endógeno no se une específicamente al receptor inmunitario exógeno. Por tanto, dicho anticuerpo es selectivo para el receptor endógeno de células T alfa beta.
Un anticuerpo que se une específicamente a un receptor de células T alfa beta se une, por ejemplo, a la cadena alfa del receptor de células T, la cadena beta del receptor de células T o tanto la cadena alfa como la beta del receptor de células T. Los ejemplos de los dominios extracelulares de las cadenas alfa y beta de origen humano se enumeran respectivamente en SEQ ID NO. 1-2. Como se ha dicho, los receptores de células T alfa beta tienen dominios variables, con las regiones más variables constituidas por las CDR de las cadenas alfa y beta. Como dichos receptores endógenos de células T alfa beta de las células T no modificadas por ingeniería genética son heterogéneos con respecto a la especificidad, el anticuerpo que se une específicamente al receptor endógeno de células T alfa beta se une a poblaciones heterogéneas de receptores de células T alfa beta. Por tanto, el anticuerpo se une específicamente a regiones del receptor de células T alfa beta que se encuentran en poblaciones heterogéneas de receptores de células T alfa beta. Preferentemente, el anticuerpo se une específicamente a las regiones constantes del receptor de células T alfa beta. Preferentemente el anticuerpo se une específicamente a la región constante de la cadena alfa humana y/o a la región constante de la cadena beta humana. Preferentemente, el anticuerpo se une preferentemente a la región constante de la cadena alfa humana como se enumera para SEQ ID NO.1 y como se representa en la figura 7A y/o a la región constante de la cadena beta humana, como se enumera para SEQ ID NO.2 y como se representa en la figura 7A.
La unión de un anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta puede detectarse, por ejemplo, mediante análisis FACS. Por ejemplo, las células T no modificadas por ingeniería genética se ponen en contacto con un anticuerpo control o con un anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta. Un anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta de acuerdo con la divulgación puede definirse como un anticuerpo que da como resultado un aumento de la intensidad de fluorescencia media (MFI), en relación con el anticuerpo control, como se determina por citometría de flujo. La MFI es la media de la intensidad de fluorescencia en el canal de fluorescencia elegido (FITC, PE, PerCP, etc.). Como un anticuerpo de control negativo, puede usarse un anticuerpo que no se une a las inmunoglobulinas (o a una inmunoglobulina muy diferente). Por tanto, el experto es muy capaz de seleccionar las condiciones apropiadas para determinar la unión específica de un anticuerpo al receptor de células T alfa beta. La unión de anticuerpos puede expresarse en términos de especificidad y afinidad. La especificidad determina qué antígeno o epítopo del mismo se une al anticuerpo. La afinidad es una medida de la fuerza de la unión entre un anticuerpo y el antígeno (Ka).
Por lo tanto, el experto en la materia es capaz de seleccionar un anticuerpo que se una específicamente al receptor endógeno de células T alfa beta. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta endógeno humano está disponible en el mercado de Miltenyi (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich-Ebert-StraUe 68, 51429 Bergisch Gladbach, Alemania). Este anticuerpo es del clon celular BW242/412 que es del isotipo de ratón IgG2b. Un anticuerpo BW242/412 marcado con FITC está disponible de Miltenyi con el n.° de pedido 130-098-688. El clon celular BW242/412 y el anticuerpo expresado por BW242/412 se describen en detalle i.a. el documento EP0403156B1, que se incorpora por referencia en el presente documento. En particular, tal anticuerpo es un anticuerpo codificado por la secuencia de cadena pesada y ligera de BMA031 como se enumera para el clon BMA031 en el documento EP0403156B1. Otros anticuerpos adecuados son por ejemplo, anticuerpos anti-apTCR disponibles de Beckman Coulter, Marseille Cedex, Francia, por ejemplo pan-apTCR-PE (n.° A39499) o pan-apTCR-PC5 (n.° A39500). Más adecuado para cadenas alfa beta de ratón puede ser el TCRp-PE murino (clon H57-597) disponible de BD Pharmingen (BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ Ee .UU.)
Después de la formación del complejo de células T de anticuerpos no modificados por ingeniería genética, a continuación, el complejo de anticuerpos y células T no modificadas por ingeniería genética se separa de la mezcla de células T para obtener así una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética. De esta forma, las células T no modificadas por ingeniería genética con receptores endógenos de células T alfa beta se eliminan de la mezcla de células T. Las etapas de separación adecuadas que usan anticuerpos específicos son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la clasificación celular activada magnética (MACS), la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o la cromatografía de inmunoafinidad son métodos que pueden usarse. El anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta puede acoplarse a perlas magnéticas para MACS, o marcado fluorescentemente para FACs , o acoplarse a una resina de cromatografía adecuada. Con MACS o cromatografía de inmunoafinidad, las células que no se unen a la resina se obtienen obteniendo así un preparado enriquecido en células T modificadas por ingeniería genética. En FACS, se obtienen las células que no están marcadas, obteniendo de esta manera una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética. Como alternativa al uso exclusivo del anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta, en su lugar, pueden usarse anticuerpos secundarios que son específicos para dicho anticuerpo. Por ejemplo, cuando dicho anticuerpo es un anticuerpo de ratón, puede usarse un anticuerpo de cabra anti-ratón acoplado a una resina o perla magnética. El complejo de células T de anticuerpo no modificado por ingeniería genética se unirá a la resina o a la perla magnética a través del anticuerpo de cabra anti-ratón. O bien, el anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta puede llevar un marcador de biotina tal como se describe en los ejemplos y puede usarse un anticuerpo anti-biotina acoplado a una resina o perla magnética. Por tanto, muchos métodos de separación están disponibles y son bien conocidos por el experto en la materia que pueden ser adecuados para separar el complejo de células T de anticuerpos no modificados por ingeniería genética de la mezcla de células T para obtener de esta manera una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética.
Como se ha dicho, la mezcla de células T también puede comprender células T modificadas por ingeniería genética que tienen una expresión subóptima del receptor inmunitario exógeno y que aún pueden tener una cantidad sustancial de receptor de células T alfa beta endógeno expresado. Por tanto, la mezcla de células T que se proporciona puede comprender células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos, células T no modificadas por ingeniería genética con receptores de células T alfa beta endógenos y células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos y receptores de células T alfa beta endógenos. Por lo tanto, en la etapa de separación, las células T no modificadas por ingeniería genética con receptores de células T alfa beta endógenos y las células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos y receptores de células T alfa beta endógenos pueden separarse también de la mezcla. Por tanto, la etapa de separación no se limita a separar únicamente las células T alfa beta endógenas de la mezcla. Por lo tanto, cuando en la etapa a) del método, se proporciona una mezcla de células T, esta mezcla también puede comprender dichas células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos y receptores de células T alfa beta endógenos. En la etapa b) puede formarse un complejo de células T modificadas por ingeniería genética con anticuerpos a través del receptor endógeno de células T alfa beta para permitir la separación de estas células en la etapa c), además de las células T no modificadas por ingeniería genética. Por ejemplo, como se muestra en el diagrama de la izquierda de la figura 4A, una mezcla de células T comprende células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos (y§TCR, cuadrante inferior derecho), células T no modificadas por ingeniería genética con receptores de células T alfa beta endógenos (apTCR, cuadrante superior izquierdo) y células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos y receptores de células T alfa beta endógenos (tanto y§TCR como apTCR, cuadrante superior derecho). Tras el agotamiento, se eliminan las células positivas para apTCR, incluyendo una gran porción de células marcadas tanto para y§TCR como para apTCR. Por lo general, dichas células también habrían permanecido en cualquier método de selección de posición convencional que esté actualmente disponible.
Como se ha dicho, en el método de la divulgación se proporciona una mezcla de células T que comprende células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos y células T no modificadas por ingeniería genética con receptores de células T alfa beta endógenos. En una realización de la divulgación, proporcionar dicha mezcla comprende las etapas de
i. proporcionar células T;
ii. proporcionar un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican un receptor inmunitario exógeno;
iii. introducir el ácido nucleico o los ácidos nucleicos en las células T para proporcionar de esta manera una mezcla de células T que comprende células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos y células T no modificadas por ingeniería genética con receptores de células T alfa beta endógenos.
La etapa de proporcionar células T puede comprender proporcionar células T alfa beta, por ejemplo, a través de la selección de celdas usando la selección MACS usando, por ejemplo, un anticuerpo receptor de células T alfa beta tal como BW242. La etapa de proporcionar células T también puede comprender proporcionar PBMC que comprenden células T que incluyen células T gamma y delta y células T alfa beta. La etapa de proporcionar células T también puede comprender proporcionar una mezcla de células que comprende células T alfa beta y células T gamma delta, por ejemplo, linfocitos T mediante selección MACS con un anticuerpo CD3. Las células T pueden ser células primarias, por ejemplo, de un sujeto, tal como un sujeto humano. Cualquier tipo de célula, que sea una célula primaria o cualquier otra línea celular será suficiente, siempre que la población celular, o una parte sustancial de la misma, comprenda células que expresan un receptor de células T alfa beta, es decir, sea positiva para el receptor de células apT en, por ejemplo, una clasificación FACs .
Un receptor inmunitario exógeno puede ser, por ejemplo, un receptor de células T gamma delta que comprende una primera cadena que es gamma y una segunda cadena que es la cadena delta. Estos pueden proporcionarse en un solo ácido nucleico o en dos ácidos nucleicos separados. Un primer ácido nucleico que codifica la primera cadena y un segundo ácido nucleico que codifica la segunda cadena, o un único ácido nucleico que codifica tanto la primera como la segunda cadena. Dicho ácido nucleico o ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. Siempre que se introduzca en una célula y se exprese de manera que la secuencia de aminoácidos del receptor inmunitario exógeno que codifica se exprese en la superficie de la célula.
Preferentemente en una realización, el ácido nucleico que codifica el receptor inmunitario exógeno codifica un receptor inmunitario exógeno tal como se describe en la sección de ejemplos en la que las diferentes cadenas, es decir, cadena alfa y beta o cadena gamma y delta, se expresan como un único producto de proteína traducida que comprende la secuencia enlazadora peptídica F2A o T2A, tal como se describe en los ejemplos entre las secuencias codificantes de ambas cadenas, lo que da como resultado la autoescisión de la proteína traducida de tal manera que se forman cadenas separadas.
El ácido nucleico o los ácidos nucleicos que codifican el receptor inmunitario exógeno pueden ser ARNm que puede traducirse directamente en el receptor inmunitario exógeno cuando se introduce en el citoplasma de una célula T, por ejemplo, mediante transfección. Preferentemente, el ácido nucleico (o los ácidos nucleicos) que codifica, por ejemplo, una cadena de receptor de células T está comprendido en una construcción genética. La construcción genética (o las construcciones) permite la expresión de ARNm que codifica el receptor inmunitario exógeno de tal manera que se expresa en la superficie de la célula T modificada por ingeniería genética. Una construcción genética puede estar comprendida en un vector de ADN o en un vector vírico. La introducción del ácido nucleico o ácidos nucleicos puede realizarse mediante métodos de transfección o transducción dependiendo del tipo de ácido nucleico o ácidos nucleicos que se usen. Se entiende que dependiendo de qué tipo de construcción o construcciones genéticas se usen, la construcción genética puede consistir en ADN o ARN. Por ejemplo, cuando se incorpora una construcción genética en un vector retrovírico o lentivírico, la construcción genética está comprendida en un genoma de vector de ARN (es decir, la secuencia que codifica la construcción genética). Los vectores retrovíricos y lentivíricos son bien conocidos en la técnica que tienen un genoma de ARN que, cuando entra en una célula, se transcribe inversamente en ADN que posteriormente se integra en el genoma del hospedador. La transcripción inversa, por lo tanto, da como resultado la información genética, es decir, la construcción genética, transformándose de ARN en ADN bicatenario, permitiendo de esta manera la expresión a partir del mismo. La integración es ventajosa ya que permite la proliferación de células transducidas mientras se mantiene el genoma del vector vírico que comprende la construcción genética. Una construcción genética también puede estar comprendida en un vector de a Dn , por ejemplo, ADN de plásmido. Un vector de ADN adecuado puede ser un transposón. Los sistemas de transposones adecuados (por ejemplo, basados en la clase I o la clase II) son bien conocidos en la técnica. Como se ha dicho, cuando un receptor inmunitario exógeno comprende dos cadenas, por ejemplo una cadena de receptores de células T gamma y delta, pueden proporcionarse dos construcciones genéticas separadas, por ejemplo, en uno o dos vectores retrovíricos o de ADN separados. Como alternativa, una sola construcción genética también puede expresar un solo ARNm que codifica las dos cadenas, tal como se describe en la sección de ejemplos. Un ARNm tal puede codificar las dos cadenas por separado, por ejemplo, a través de un IRES, o mediante el uso de secuencias peptídicas autoescindibles como se describe en el presente documento.
El ácido nucleico o los ácidos nucleicos que se usan proporcionan la expresión del receptor inmunitario exógeno codificado. Esto se logra, por ejemplo, a través de altos niveles de expresión del receptor inmunitario exógeno usando por ejemplo, un promotor fuerte. El uso de altos niveles de expresión da como resultado la supresión de la expresión del receptor de células T endógeno como se ejemplifica en la sección de ejemplos. La expresión de células T endógenas también puede suprimirse a través de métodos alternativos y adicionales tales como por ejemplo, ARNi a través de la expresión de ARNhc, dedos de zinc, CRISPR o TALENS.
En cualquier caso, introducir el ácido nucleico o los ácidos nucleicos en las células T puede ser eficiente pero puede proporcionar una mezcla de células T que comprende células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos y células T no modificadas por ingeniería genética con receptores de células T alfa beta endógenos. Las células T no modificadas por ingeniería genética con receptores endógenos de células T alfa beta representan células T en las que no se introdujo ácido nucleico o ácidos nucleicos. También, como se dijo, las células T modificadas por ingeniería genética también pueden comprender una subpoblación de células T modificadas por ingeniería genética que también está presente en la mezcla de células T en donde la introducción no dio como resultado una supresión (suficiente) de los receptores endógenos de células T alfa beta. Dicha subpoblación de células T que no tienen (suficiente) supresión de los receptores endógenos de células T alfa beta también pueden eliminarse eficazmente de la mezcla de células T porque el anticuerpo anti-receptor de células T alfa beta puede unirse a ella. Tal población de células T modificadas por ingeniería genética puede teñirse positivamente para el receptor inmunitario exógeno y el receptor de células T alfa beta endógeno en, por ejemplo, un análisis FACS.
Las células T modificadas por ingeniería genética que comprenden un receptor inmunitario exógeno también pueden comprender marcadores seleccionables. Un marcador seleccionable puede definirse como cualquier secuencia de ácido nucleico y/o secuencia de aminoácidos además del receptor inmunitario exógeno que permite seleccionar las células que se proporcionan con él. Por ejemplo, los marcadores seleccionables pueden ser genes de resistencia a neomicina o puromicina. La selección de células a las que se ha transferido la construcción genética y/o el vector puede realizarse mediante incubación en presencia de neomicina o puromicina. Otros marcadores seleccionables pueden ser, por ejemplo, cualquiera de las proteínas fluorescentes verde, roja y amarilla. La selección puede realizarse después usando, por ejemplo, FAC. Como se ha dicho anteriormente, las células T no modificadas por ingeniería genética que son el resultado de una supresión insuficiente de los receptores endógenos de células T alfa beta pueden comprender la construcción genética y, por lo tanto, también un marcador seleccionable. Tales células no son deseables y eliminarlas también dará como resultado un enriquecimiento de células T modificadas por ingeniería genética. Por tanto, el método de enriquecimiento también es beneficioso para las células T modificadas por ingeniería genética de la técnica anterior que se han seleccionado con un método de selección positivo, por ejemplo, mediante la inclusión de un marcador de selección adicional y/o mediante la selección de células con un anticuerpo dirigido contra el receptor inmunitario exógeno.
Sin embargo, no es necesario tener un marcador seleccionable, ya que el método de la divulgación permite retirar células no modificadas por ingeniería genética sin usar ningún marcador seleccionable. Se entiende que de acuerdo con la divulgación, el marcador seleccionable no es el receptor inmunitario exógeno. Por lo tanto, en un aspecto de la divulgación, las células T modificadas por ingeniería genética no expresan por separado un marcador seleccionable. En consecuencia, dicho ácido nucleico o ácidos nucleicos de acuerdo con la divulgación no requieren codificar un marcador de selección expresado por separado además de codificar el receptor inmunitario exógeno. Por tanto, en una realización, dicho ácido o ácidos nucleicos, o vectores de ADN, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, transposones o similares, que codifican el receptor inmunitario exógeno no comprenden un marcador seleccionable. Se entiende que los marcadores seleccionables deben ser funcionales en las células T modificadas por ingeniería genética.
En otro aspecto de la divulgación, la mezcla de células T que comprende células T modificadas por ingeniería genética y no modificadas por ingeniería genética son células humanas. Por tanto, esto significa que el ácido nucleico o los ácidos nucleicos que codifican un receptor inmunitario exógeno se introducen en las células T humanas para proporcionar dicha mezcla de células T. Esto significa que el anticuerpo usado en el método se une específicamente al receptor de células T alfa beta humano. En un aspecto adicional de la divulgación, el anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta humano es un anticuerpo BW242/412. Como se ha dicho, dicho anticuerpo está disponible en el mercado de Miltenyi (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich-Ebert-StralJe 68, 51429 Bergisch Gladbach, Alemania) y se describe en detalle i.a. en el documento EP0403156B1, que se incorpora en el presente documento por referencia.
Como es evidente a partir de lo anterior, el anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta endógeno no se une específicamente al receptor inmunitario exógeno. Por tanto, estos criterios de selección se aplican a cualquier anticuerpo que pueda seleccionarse para el método. Por lo tanto, el receptor inmunitario exógeno puede no corresponder a un receptor de células T alfa beta que sea endógeno a las células T utilizadas, sino proporcionado como un transgén. Esto se debe a que, de lo contrario, en las etapas b) y c) de la descripción no solo se retiran las células T no modificadas por ingeniería genética, sino que también se retiran las células T modificadas por ingeniería genética. En caso de que sea deseable utilizar un receptor de células T alfa beta como receptor inmunitario exógeno, se requiere modificar la secuencia del mismo de modo que el anticuerpo ya no se una específicamente al receptor inmunitario exógeno. Por tanto, en un aspecto de la divulgación, el receptor inmunitario exógeno es un receptor de células T alfa beta modificado por ingeniería genética.
En un aspecto de la divulgación el receptor inmunitario exógeno es un receptor de células T gamma delta o un receptor de células T gamma delta modificado por ingeniería genética o un receptor de células T alfa beta modificado por ingeniería genética. En un aspecto de la divulgación el receptor inmunitario exógeno es un receptor de células T gamma delta o un receptor de células T gamma delta modificado por ingeniería genética o un receptor de células T alfa beta modificado por ingeniería genética, en donde el receptor inmunitario exógeno es del mismo origen que la mezcla de células T. En otro aspecto, el receptor inmunitario exógeno es un receptor de células T gamma delta humano o un receptor de células T gamma delta modificado por ingeniería genética humano o un receptor de células T alfa beta modificado por ingeniería genética humano. En contraste con el receptor de células T alfa beta, el receptor de células T gamma delta tiene una secuencia que es diferente del receptor de células T alfa beta. Por tanto, un anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta endógeno normalmente no se une específicamente a ningún receptor de células T gamma delta endógeno. Por tanto, no es necesario modificar un receptor de células T gamma delta que se usa como receptor inmunitario exógeno. Sin embargo, la modificación de un receptor de células T gamma delta puede contemplarse por otras razones, por ejemplo, cuando se usan células T modificadas por ingeniería genética in vivo y deben diferenciarse de las células T gamma delta endógenas, como se explica más adelante.
En una realización, el receptor inmunitario exógeno es un receptor de células T gamma delta que comprende las secuencias de cadena gamma y delta enumeradas en SEQ ID NO.3 y SEQ ID NO.4. Estas secuencias corresponden a G115 y 85. Las células T modificadas por ingeniería genética con este receptor inmunitario exógeno pueden enriquecerse usando, por ejemplo, el anticuerpo BW242.
En otro aspecto de la divulgación, el receptor de células T alfa beta modificado por ingeniería genética o el receptor de células T gamma delta modificado por ingeniería genética comprende una región constante modificada. La modificación de la región constante puede ser ventajosa ya que se puede evitar cualquier riesgo de afectar a la región variable y, por lo tanto, a la especificidad y/o afinidad por el antígeno.
En una realización, en el método de acuerdo con la divulgación, el anticuerpo que se une específicamente al receptor de células T alfa beta humano es un anticuerpo BW242/412 y el receptor inmunitario exógeno es un receptor de células T alfa beta humano modificado por ingeniería genética. Preferentemente, la modificación por ingeniería genética comprende la modificación de la región constante del receptor de células T alfa beta humano. Más preferentemente, la región constante de modificación comprende la modificación del Dominio 3 de la cadena beta del receptor de células T, en donde preferentemente la modificación comprende la murinización del Dominio 3. Como se ejemplifica en la sección de Ejemplos, el sitio de unión del anticuerpo BW242/412 se asignó al Dominio 3 de la cadena beta del receptor de células T. Por tanto, modificar solo esta región permitirá que el anticuerpo BW242/412 sea selectivo para el receptor de células T alfa beta endógeno humano sin unirse sustancialmente al receptor inmunitario exógeno, es decir, dicha cadena de receptor de células T alfa beta humana modificada. Preferentemente, la cadena del receptor de células T alfa beta comprende la secuencia de aminoácidos murina correspondiente del Dominio 3 murino en lugar del Dominio 3 humano Dominio 3 del receptor de células T beta humano como se muestra en la figura 7A (véanse los aminoácidos 88-121 de la secuencia humana alineados con la secuencia de ratón correspondiente).
En consecuencia, como se muestra en la sección de ejemplos para el anticuerpo BW242 (o anticuerpo BMA031) combinado con la modificación específica del receptor de células T alfa beta humano correspondiente, mapeando el sitio de unión del anticuerpo que se une al receptor endógeno de células T alfa beta, la modificación del receptor de células T alfa beta humano correspondiente puede minimizarse. Por ejemplo, el sitio de unión del anticuerpo BW242/412 ahora está asignado al Dominio 3, la modificación adicional selectiva de los aminoácidos del Dominio 3 identificará los aminoácidos del Dominio 3 que interactúan con el anticuerpo BW242/412. De esta forma, puede proporcionarse un receptor de células T alfa beta humano modificado por ingeniería genética mínimamente que difiere solo en unos pocos aminoácidos. Del mismo modo, puede seguirse el mismo enfoque cuando los anticuerpos distintos de BW242 van a ser selectivos entre un receptor de células T alfa beta endógeno y un receptor de células T alfa beta modificado por ingeniería genética correspondiente.
Células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas y sus usos
En otra realización, los métodos de acuerdo con la divulgación, como se describe anteriormente, proporcionan una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética que se puede obtener mediante cualquiera de dichos métodos. Tal preparación comprenderá un mayor porcentaje de células T modificadas por ingeniería genética en comparación con una preparación no sujeta al método. Dicha preparación de células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas que pueden obtenerse mediante cualquiera de dichos métodos también puede definirse como una preparación de células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas de las que se han separado células T no modificadas por ingeniería genética y modificadas por ingeniería genética de forma deficiente con receptores endógenos de células T alfa beta usando un anticuerpo que se une específicamente al receptor endógeno de células T alfa beta. Una preparación tal también puede definirse como una preparación de células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas en donde las células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas no comprenden sustancialmente un receptor de células T alfa beta endógeno. Una preparación tal también puede definirse como una preparación de células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas en donde las células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas no comprenden sustancialmente un receptor de células T alfa beta endógeno y tampoco comprenden un marcador seleccionable. Una preparación tal también puede definirse como una preparación de células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas en donde las células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas no comprenden sustancialmente un receptor de células T alfa beta endógeno y tampoco comprenden un marcador seleccionable y no se han seleccionado con un anticuerpo que se une al receptor inmunitario exógeno.
Dichas preparaciones de células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas muestran una destrucción aumentada de células cancerosas en comparación con las preparaciones de la técnica anterior que se enriquecen usando métodos de selección positiva como se muestra en los ejemplos. Como también se muestra en la sección de ejemplos, cuando a los linfocitos T se les proporciona un receptor inmunitario exógeno que proporciona especificidad para un cáncer particular, dichos linfocitos se destruirán selectivamente cuando se proporciona a un sujeto dicha preparación enriquecida en dichos linfocitos T modificados por ingeniería genética. Tales preparaciones enriquecidas en células T modificadas por ingeniería genética según la descripción son, por lo tanto, particularmente útiles en tratamientos médicos. Los tratamientos médicos que pueden contemplarse son, por ejemplo, el tratamiento de un cáncer. Como las células T modificadas por ingeniería genética ya no requieren la expresión de un marcador de selección, puede evitarse cualquier evento adverso relacionado con la expresión de un marcador de selección. Adicionalmente, las células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas tendrán la mayoría, si no todas, de las células T que expresan receptores de células T alfa beta endógenos retirados y, por lo tanto, puede evitarse cualquier riesgo de que los receptores de células T alfa beta endógenos provoquen un direccionamiento no deseado. Las células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas tampoco sufrirán ninguna muerte celular asociada a la unión de un anticuerpo al receptor inmunitario exógeno, tal como se usa en métodos de selección y enriquecimiento de la técnica anterior que también pueden ser perjudiciales para la calidad del producto de células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas que se administran.
Agotamiento de células T modificadas por ingeniería genética (enriquecidas) in vivo
En otra realización, un anticuerpo que se une específicamente a un receptor inmunitario exógeno como se definió anteriormente, se proporciona para su uso en el tratamiento de sujetos que padecen eventos adversos cuando se tratan con una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética con dicho receptor inmunitario exógeno que puede obtenerse mediante uno cualquiera de los métodos anteriores. Como se explica anteriormente, las células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas que se pueden obtener mediante cualquiera de los métodos de la divulgación son útiles en tratamientos médicos. Sin embargo, dicho tratamiento puede, en algunos casos, provocar efectos secundarios adversos debido a las células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas que se administraron. Los efectos secundarios pueden ser una proliferación o activación descontrolada, o una activación contra antígenos imprevistos en células sanas, por ejemplo, del sujeto. Por tanto, en un escenario tal, es deseable eliminar selectivamente (agotar) las células T modificadas por ingeniería genética que se administraron al sujeto. Esto puede lograrse mediante la administración de un anticuerpo que se dirija específicamente a las células T modificadas por ingeniería genética, es decir, que comprende el receptor inmunitario exógeno. Dicho anticuerpo no se dirige a las células T endógenas, tales como células T alfa beta endógenas o células T gamma delta endógenas. De esta forma, ya no es necesario incluir en las células T modificadas por ingeniería genética además del receptor inmunitario exógeno una construcción genética adicional que codifique, por ejemplo, un gen suicida u otro gen que permita destruir selectivamente las células T modificadas por ingeniería genética.
Como dicho anticuerpo no se dirige a las células T endógenas, en caso de que se utilicen receptores de células T alfa beta modificados por ingeniería genética o receptores de células T gamma delta modificados por ingeniería genética que tengan un origen correspondiente a receptores de células T endógenos, dichos receptores inmunitarios exógenos deben modificarse, es decir, modificarse por ingeniería genética, de tal manera que el anticuerpo solo se dirige al receptor inmunitario exógeno. Por ejemplo, cuando se usa un receptor inmunitario exógeno que tiene la región del Dominio 3 humano reemplazada por la región del Dominio 3 del ratón, dicho anticuerpo, por ejemplo, derivado de H57-597 derivado de HB-218 (ATCC) se dirige a la región del Dominio 3 del ratón. De esta forma, en un sujeto humano, el anticuerpo se dirigirá selectivamente al receptor inmunitario exógeno diseñado y no se dirigirá al receptor de células T endógeno. Por tanto, mapear los sitios de unión de, por ejemplo, los anticuerpos que se unen a los receptores de células T alfa beta de ratón o a los receptores de células T gamma delta de ratón son útiles ya que proporcionarán regiones específicas (o incluso anticuerpos específicos) de los respectivos receptores de células T que pueden transferirse a un receptor de células T humano correspondiente. De manera óptima, como se ejemplifica con los anticuerpos mencionados BW242/412 (usados para el enriquecimiento) y H57-597 (usados para el agotamiento), la región modificada utilizada para el enriquecimiento es idéntica en secuencia a la secuencia usada para el agotamiento tal como la región derivada de la región del Dominio 3 de ratón. Esta región puede ser particularmente interesante debido a su ubicación prominente en el receptor de células T, así como a su potencial para ser inmunogénico, Del mismo modo, cuando se usa un receptor de antígeno quimérico, que puede construirse a partir de componentes que pueden ser idénticos a las proteínas del hospedador (por ejemplo, derivados de anticuerpos del hospedador y/o derivados del CD3 del hospedador), el anticuerpo se selecciona no para dirigirse a las proteínas del hospedador correspondientes sino solo al receptor de antígeno quimérico. En un mismo enfoque que se describe para el TCR alfa beta, tales secuencias del hospedador pueden modificarse, es decir, modificarse por ingeniería genética, así como que el anticuerpo administrado no se dirija a dichas proteínas huésped. Por tanto, en caso de que se use un receptor de antígeno quimérico, puede ser un receptor de antígeno quimérico modificado por ingeniería genética en el sentido de que partes de las secuencias del hospedador pueden modificarse de tal manera que el anticuerpo que se use pueda diferenciar entre el CAR diseñado y las secuencias de proteína del hospedador correspondientes. Por tanto, alineando, por ejemplo, secuencias humanas y de ratón, y comparando receptores inmunitarios humanos y de ratón con respecto a la unión de un anticuerpo tal como se describe en los ejemplos, un receptor inmunitario humano puede murinizarse, es decir, partes del receptor inmunitario humano pueden intercambiarse por una parte correspondiente del receptor murino. La parte correspondiente puede obtenerse fácilmente alineando secuencias humanas y de ratón, tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 10. Por lo tanto, la murinización puede implicar la sustitución de una parte de la secuencia de un receptor inmunitario por una parte correspondiente de origen murino, una parte tal puede, por ejemplo, ser un tramo de 10-50 aminoácidos, pero una parte (o partes) también puede comprender uno o más aminoácidos que forman parte de las regiones que se corresponden y que difieren entre las dos secuencias.
Preferentemente, el tratamiento de los sujetos implica el tratamiento de los seres humanos, en donde preferentemente el anticuerpo es un anticuerpo humano o por ejemplo, dominios variables derivados de anticuerpos no humanos tales como el anticuerpo H57-597, se modifican por ingeniería genética en una estructura principal de anticuerpos humanos a través de la humanización. Preferentemente, se usa un anticuerpo humano porque las secuencias no humanas pueden invocar respuestas no deseadas, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo de ratón, puede desencadenarse una respuesta humana-anti-ratón, lo que no es deseable. Se entiende que la expresión anticuerpo humano también incluye anticuerpos humanizados.
Como se ha dicho, la administración del anticuerpo dirigido al receptor inmunitario exógeno y, por lo tanto, a las células T modificadas por ingeniería genética puede inducir la destrucción selectiva de las células T modificadas por ingeniería genética. Una destrucción selectiva tal puede inducir la muerte después de la unión del anticuerpo al receptor inmunitario exógeno. Una destrucción selectiva tal puede inducirse directa o indirectamente. Se prefieren las secuencias derivadas de humanos del esqueleto del anticuerpo en el tratamiento de humanos porque la muerte selectiva puede incluir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o apoptosis directa. En la sección de ejemplos se describe un ejemplo de dicha destrucción selectiva.
Con respecto a los usos médicos descritos anteriormente con respecto al uso de anticuerpos que se dirigen a las células T modificadas por ingeniería genética, dicho uso médico no está restringido a preparaciones enriquecidas en células T modificadas por ingeniería genética que pueden obtenerse mediante los métodos de la descripción descritos anteriormente. Un uso médico tal también puede aplicarse a cualquier célula T modificada por ingeniería genética, con la condición de que dicho anticuerpo que se use se una específicamente al receptor inmunitario exógeno y no a los receptores inmunitarios del hospedador o secuencias proteicas del hospedador que están comprendidas en un CAR. Dichas células T modificadas por ingeniería genética también pueden enriquecerse usando métodos de la técnica anterior que usan, por ejemplo, un marcador de selección. Adicionalmente, ya que no se requiere el método para seleccionar las células T modificadas, dicho uso también es aplicable en células NK modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos.
Por tanto, en otra realización no cubierta por la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un receptor inmunitario exógeno, para su uso en el tratamiento de sujetos que padecen eventos adversos cuando se tratan con linfocitos modificados por ingeniería genética con el receptor inmunitario exógeno. Preferentemente, dicho receptor inmunitario exógeno es un receptor inmunitario modificado por ingeniería genética.
Preferentemente, dichos sujetos son humanos. Preferentemente, dichos linfocitos modificados por ingeniería genética son linfocitos humanos modificados por ingeniería genética. Preferentemente, dichos linfocitos modificados por ingeniería genética son células NK modificadas por ingeniería genética o células T modificadas por ingeniería genética. Dicho anticuerpo lo más preferentemente es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, que preferentemente induce la muerte celular de los linfocitos modificados por ingeniería genética con el receptor inmunitario exógeno como se ha descrito anteriormente.
Ejemplos
Ejemplo 1
Enriquecimiento de células T humanas modificadas por ingeniería genética con un receptor inmunitario exógeno, es decir, un receptor de células T gamma delta
Células y líneas celulares
Las células Daudi, K562, MDA-MB231, BV173, OPM2 y Phoenix-Ampho se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo. OPM2-Luciferasa (OPM2-Luc) y RPMI8226/S-luc (Rp M i-Luc) fueron proporcionados amablemente por Anton Martens, SCC9 de Niels Bovenschen (ambos del Centro Médico Universitario de Utrecht, Países Bajos) y Daudi-Luciferase (Daudi-Luc) de Genmab (Utrecht, Países Bajos). Las líneas celulares linfoblastoides transformadas por EBV (EBV-LCL) (Warren et al., Tissue antigens 59, 293-303 (2002) fueron un amable regalo de Tuna Mutis (Centro Médico Universitario, Países Bajos). Las PBMC se aislaron de capas leucocitarias obtenidas del Banco de Sangre de Sanquin (Ámsterdam, Países Bajos) o del Instituto de Medicina Transfusional e Inmunohematología, Frankfurt, Alemania. Las muestras de PBMC de pacientes con AML fueron un amable regalo de Matthias Theobald (Mainz, Alemania) y del Biobanco del Centro Médico Universitario de Utrecht y se recolectaron de acuerdo con las normas de GCP y Helsinki.
Diseño del vector retrovírico Y952TCR
Los genes de la cadena Y982TCR altamente reactivos a los tumores, clon gamma G115 y clon delta 5, se obtuvieron a través de Combinatorial-TCR Chain Exchange, codón optimizado (Geneart Life Technologies, Regensburg, Alemania) y se clonaron en el vector retrovírico pBullet como vectores de cadena única de TCR que contenían cadena Y-IRES-neomicina o cadena 8-IRES-puromicina. El G115 y el clon delta 5 comprenden las secuencias enumeradas en SEQ ID NO.3 y 4. Además, se diseñaron cuatro casetes transgénicos diferentes que contenían ambas cadenas de TCR mediante el intercambio de dos secuencias enlazadoras peptídicas 2A diferentes, F2A y T2A, y el orden de las cadenas TCR (y9-F2A-82; 82-P2A-y9; y9-T2A-82; y9-T2A-82) (Figura 1A) (Szymczak et al., Nature biotechnology 22, 589-594 (2004). Estos casetes de TCR se clonaron en el vector retrovírico optimizado pMP71 (Engels et al. Hum Gene Ther 14, 1155-1168 (2003) para expresar ambas cadenas de TCR simultáneamente. Un TCR murino sin sentido, que consiste en la cadena alfa derivada del MDM2/HLA-A2 TCR (Stanislawski et al., Nat Immunol 2, 962-970 (2001) y la cadena beta del p53/HLA-A2 TCR (Kuball et al., Immunity 22, 117-129 (2005) se usó como TCR de control tanto en el sistema de vector retrovírico pBullet como en el pMP71. También se usó el receptor del factor de crecimiento nervioso truncado en pMP71 como control en experimentos de transducción retrovírica (pMP71:DNGFR). Los vectores retrovíricos se introdujeron en las células T del donante mediante transducción usando métodos convencionales. Se descubrió que tanto F2A como T2A dieron como resultado la expresión del receptor exógeno de células T y952 y fueron capaces de inducir lisis específica, así como inducir la producción de IFN-y en por ejemplo, líneas celulares de cáncer Daudi u OPM2, usando ensayos convencionales. Se descubrió que el conector peptídico T2A producía niveles de expresión más altos, según se determinó midiendo la intensidad de fluorescencia media del TCR y952 en un análisis FACS de las células T transducidas del donante. Adicionalmente, el Y9-T2A-82 produjo la mayor inducción de producción de IFN-y. El vector Y9-T2A-82 se usó en otros experimentos.
Enriquecimiento de células T modificadas por ingeniería genética
Las células apT se transdujeron con pMP71: Y-T2A-8 y se incubaron con un anticuerpo anti-apTCR marcado con biotina (clon BW242/412, Miltenyi Biotec, Alemania) seguido de incubación con un anticuerpo anti-biotina acoplado a microesferas magnéticas (anti-biotin MicroBeads, Miltenyi Biotec). A continuación, la suspensión celular se aplicó a una columna LD y las células T positivas para apTCR se agotaron mediante separación celular MACS de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec).
Alorreactividad abolida y actividad antitumoral conservada de células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas con el Y952TCR exógeno
Después del enriquecimiento, las células T y§TCR se expandieron utilizando un protocolo de expansión de células T descrito anteriormente (Riddell y Greenberg, Journal of immunological methods 128, 189-201 (1990)). Este procedimiento resultó en un agotamiento casi completo de las células T positivas individuales para apTCR (del 51 % al 0,4 %) y un aumento espectacular de las células T positivas individuales para y§TCR (del 20 % al 77 %) (Figura 4A). De manera importante, las células T doblemente positivas para apTCRfySTCR que quedaron se caracterizaron por una expresión superficial relativamente baja del apTCR endógeno. Este fenotipo se mantuvo estable hasta el día 5 después de la estimulación, cuando las células T estaban altamente activadas y proliferativas. Sin embargo, el fenotipo cambió en el día 9 hacia una población principal de células T dobles positivas apTCRfySTCR (68 %) y un porcentaje reducido de células positivas individuales y§TCR (25 %) cuando las células T residen en una fase más de reposo (Figura 4A).
La funcionalidad de las células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas se probó 10 días después de la selección y expansión y se comparó con células modificadas por ingeniería genética sin agotamiento de apTCR y un control. El agotamiento de las células T apTCR aumentó significativamente la lisis específica de las células Daudi (p<0,01) (Figura 4B), así como la producción de IFN-y en respuesta a tres líneas de células tumorales diferentes (p<0,001) (Figura 4C). Las células T modificadas por ingeniería genética también se probaron el día 10 frente a un panel de células leucémicas primarias de pacientes con leucemia mieloide aguda (AML). El tratamiento de células leucémicas con pamidronato para bloquear la ruta del mevalonato posterior al pirofosfato de isopentenilo dio como resultado la secreción de IFNy por parte de las células T en respuesta a 9 de 16 muestras de AML. En 5 de las 8 muestras analizadas, las células T modificadas por ingeniería genética con y§TCR enriquecidas produjeron niveles significativamente mayores de IFNy en comparación con las células g9d2T policlonales no modificadas por ingeniería genética y aisladas de un donante sano.
Para simular una célula T en reposo después de la transferencia in vivo con expresión recurrente sustancial de cadenas apTCR endógenas, se usaron células T modificadas por ingeniería genética que carecían de estímulo durante más de 20 días y carecían de IL-2 durante 6 días. Las células T simuladas (transducidas con DNGFR), modificadas por ingeniería genética con y§TCR y agotadas apTCR modificadas por ingeniería genética con y§TCR se analizaron frente a un panel de 13 líneas celulares EBV-LCL no coincidentes o PBMC derivadas de donantes sanos en un ensayo IFNy ELISPOT Las células T simuladas produjeron IFNy en respuesta a 9 de 13 líneas celulares EBV-LCL. La alorreactividad de las células T a granel modificadas por ingeniería genética con y§TCR se redujo en gran medida (reducción significativa para 8 de 9 líneas EBV-LCL) y, lo que es más importante, incluso se eliminó por completo en la población de células T empobrecidas en apTCR modificadas por ingeniería genética con y§TCR (Figura 5A). La alorreactividad reducida de las células T modificadas por ingeniería genética con y§TCR fue más evidente cuando las diferentes poblaciones de células T se analizaron frente a un panel de 20 PBMC derivadas de donantes sanos diferentes. No se detectó alorreactividad en las poblaciones de células T transducidas con y§TCR, pero las células T simuladas produjeron IFNy en respuesta a 9 de 10 combinaciones de donantes de PBMC.
Control tumoral in vivo mejorado mediante un producto de células T modificadas por ingeniería genética optimizadas
La potencia clínica del producto de células T modificadas por ingeniería genética con y§TCR enriquecido se evaluó y comparó con las células T modificadas por ingeniería genética con y§TCR producidas con el método de transducción retrovírica pBullet y el sistema de selección de antibióticos (Voss et al., Methods in molecular medicine 109, 229-256 (2005) denominadas células T pB:Y5TCR. Después de la transducción de células apT de sangre periférica, la selección con antibióticos (pBullet) o el enriquecimiento, con perlas alfa beta TCR (pMP71) y la posterior expansión de células T se evaluaron ambas preparaciones. El porcentaje de células T positivas para y§Tc R fue mayor para el producto de células T y^TCR enriquecido, pero también el número de complejos y§TCR por célula aumentó más de 2 veces en comparación con las células T pB:Y5TCR medidas por MFI. Además, la lisis de tres líneas de células tumorales probadas se mejoró mediante la preparación de células T modificadas por ingeniería genética con y§TCR transducidas con el casete de vector pMP71:Y-T2A-8 en comparación con las células T pB:Y5 TCR. Se probó la actividad antitumoral de estas preparaciones in vivo en un modelo de tumor de ratón humanizado para la transferencia adoptiva de células T modificadas por ingeniería genética con y§TCR.
Se inyectaron ratones con doble inactivación Rag2'/'Yc'/' irradiados con células tumorales Daudi positivas para luciferasa y con y§TCR o linfocitos T modificados con TCR simulado y se evaluó el crecimiento tumoral mediante imágenes de bioluminiscencia. Ambos productos de células T modificadas por ingeniería genética con y§TCR inhibieron significativamente el crecimiento tumoral en comparación con las células T TCR simuladas, pero las células T ySTCR enriquecidas retrasaron aún más el crecimiento tumoral y aumentaron significativamente la supervivencia en comparación con las células T pB:Y6TCR. Se obtuvieron resultados similares en un segundo modelo de tumor usando células Luciferasa OPM2 inyectadas en ratones con doble inactivación Rag2-/-Yc-/- irradiados. El crecimiento tumoral se evitó por completo en 4 de 7 ratones usando la preparación de células T modificadas por ingeniería genética con Y8TCR enriquecidas. 120 días después de las primeras inyecciones de tumor y células T, los ratones libres de tumor se volvieron a exponer a una segunda inyección de células tumorales sin irradiación previa y los ratones sin tratamiento previo no irradiados se usaron como control para el crecimiento del tumor. Los ratones expuestos nuevamente permanecieron libres de tumores, mientras que en los ratones sin tratamiento previo los tumores crecieron, lo que indica que el tratamiento con células T y§TCR proporcionó protección tumoral a largo plazo in vivo.
Conclusión
Los resultados muestran que enriquecer las células T modificadas por ingeniería genética, es decir, células T provistas de un receptor de células T gamma delta (clon gamma G115 y clon delta 5), usando un anticuerpo que se une a los receptores de células T alfa beta (BW242) da como resultado la retirada de células no transducidas. Adicionalmente, el receptor inmunitario exógeno que se expresó dio como resultado una regulación negativa del receptor de células T alfa beta endógeno. Una preparación tal de células T modificadas por ingeniería genética enriquecidas proporciona una mejora de la eficacia antitumoral y una reducción o supresión de la alorreactividad. Adicionalmente, una preparación de células T de ingeniería enriquecida de este tipo proporciona un control tumoral altamente mejorado in vivo.
Ejemplo 2
Enriquecimiento de células T humanas modificadas por ingeniería genética con un receptor inmunitario exógeno, es decir, un receptor de células T alfa beta modificado por ingeniería genética
Enriquecimiento de células T humanas modificadas por ingeniería genética con un receptor inmunitario exógeno, es decir, un receptor de células T alfa beta de ratón
Se ha demostrado que la introducción de y§TCR específicos de tumores regula negativamente la expresión de apTCR endógenos en células T modificadas por ingeniería genética (véase el ejemplo 1 anterior). En consecuencia, las células T modificadas por ingeniería genética muestran una densidad mucho más baja de apTCR endógenos en su superficie en comparación con las células apT no modificadas por ingeniería genética. Este es un efecto que no se limita al tipo de receptor inmunitario exógeno usado. El receptor de células T alfa beta de ratón se usó como un receptor inmunitario exógeno para modificar células T humanas. Las células T alfa beta humanas se retiraron con MACS usando un anticuerpo monoclonal apTCR-mAb Clon BW242. En consecuencia, después del aislamiento por MACS, las células apT humanas redirigidas para expresar apTCR murinos muestran un nivel reducido de apTCR endógenos en su superficie (Figura 6A, comparación antes de MACS y después de MACS). Por tanto, mediante el uso de un anticuerpo específico para los receptores de células T alfa beta humanos, pueden enriquecerse las células T modificadas por ingeniería genética con receptores de células T alfa beta de ratón.
El anticuerpo BW242 no se une a un receptor de células T alfa beta humano modificado por ingeniería genética
El anticuerpo BW242 es por lo tanto selectivo entre un receptor de células T alfa beta murino y un receptor de células T alfa beta humano. Por lo tanto, se analizó la murinización de un dominio constante de TCR alfa beta humano para la unión de anticuerpos monoclonales de apTCR. Minimizar la murinización permite el enriquecimiento de células T "intactas" con especificidad de antígeno modificada. Cuando la murinización es mínima, el receptor de células T alfa beta exógeno es sustancialmente idéntico a un receptor de células T endógeno mientras que permite eliminar selectivamente las células T que expresan una cantidad sustancial de receptor de células T alfa beta.
Se comparó la unión del anticuerpo monoclonal BW242 de apTCR de calidad clínica (también denominado mAb BW242 o BW242) con un apTCR completamente humano y con variantes murinizadas mediante citometría de flujo. Las células TCRp-/-JurMa se transdujeron retrovíricamente con el vector retrovírico pMP71 clínicamente aprobado que contenía un apTCR murino sin sentido (cadena a obtenida de un TCR específico de MDM2 (Stanislawski et al., Nat Immunol, 2001. 2(10): p. 962-70) y cadena p obtenida de un TCR específico de p53 (Kuball et al., Immunity, 2005.
22(1): p. 117-29) o con un apTCR completamente humano específico de NY-ESO-1/HLA-A2, o un apTCR quimérico específico de NY-ESO-1/HLA-A2 compuesto por dominios variables humanos y constantes murinos (también denominados aMU/pMU, ahu/phu y ahuMU/phuMU, respectivamente). La expresión de TCR transgénico se confirmó mediante tinción con anti-Vp4, dirigido contra la región variable de la cadena p de NY-ESO-1 TCR, o anti-pratón, dirigida contra la cadena TCRp del TCR murino MDM2/p53. Reemplazar los dominios constantes TCRa y p humanos por equivalentes murinos anuló la unión de mAb BW242, a niveles similares a la unión a un TCR completamente murino (paneles inferiores de la Figura 6B, compárense los paneles 6 y 8). Estos datos indican que la murinización de la región constante del apTCR humano es suficiente para anular la unión de mAb BW242.
Se dispone de cadenas p y TCRa híbridas con bloques mutacionales que cubren todas las diferencias de aminoácidos entre las regiones constantes de los apTCR humanos y de ratón (Véase la figura 7A y B) (Sommermeyer et al., J Immunol, 2010. 184(11): p. 6223-31). Los presentes inventores obtuvieron cuatro construcciones de cadena NY-ESO-1 TCRp y tres de cadena NY-ESO-1 TCRa, conteniendo cada una un dominio murino no homólogo flanqueado por secuencias de aminoácidos humanas completas. Estos también se representan esquemáticamente en la figura 3. Las 7 construcciones de TCR diferentes se introdujeron junto con la otra cadena de TCR completamente humana en células JurMa y se expresaron y se probaron para reconocimiento por mAb BW242 (Figura 8). La eficiencia de transducción de las construcciones se midió mediante anti-Vp4 y las transducciones se realizaron en paralelo. En cuanto al reconocimiento por el clon anti-apTCR BW242, solo las células que expresan apTCR que incluyen los dominios constantes murinos completos de ambas cadenas (paneles ahuMu/phuMu) y las células que expresan ahuMu/pM3 mostraron una reducción en la unión de mAb BW242. Esto significa que la unión de anticuerpos de mAb BW242 se vio significativamente afectada en células que expresan la construcción que incluye el dominio murino 3 (pM3). Por tanto, los receptores de células T alfa beta humanos modificados por ingeniería genética que tienen el Dominio 3 de la cadena beta modificado, tal como reemplazándolo por una cadena beta Dominio 3 de una cadena beta de ratón o reemplazando toda la región constante de las cadenas alfa y beta, no se seleccionará en por ejemplo, un método de separación MACS usando BW242.
El receptor de células T alfa beta diseñado mantiene la especificidad
Las células JurMa que expresan NY-ESO-1 apTCR humanos, los apTCR quiméricos NY-ESO-1 o los pM3 murinizados con cadena TCRa humana se tiñeron con pentámeros específicos de NY-ESO-1 y la intensidad media de fluorescencia (MFI) de la fracción celular positiva para la unión de pentámeros se midió mediante citometría de flujo. Se demostró que NY-ESO-1 apTCR completamente humanos, NY-ESO-1 apTCR quiméricos que tienen regiones constantes completamente de ratón y el pM3 murinizado con la cadena TCRa humana, todos se unieron con pentámeros específicos de NY-ESO-1
El anticuerpo BW242 permite enriquecer las células T modificadas por ingeniería genética con un receptor de células T alfa beta humano modificado por ingeniería genética
Se determinó si la tecnología de separación BW242 MACS podría usarse para enriquecer las células TCR modificadas por ingeniería genética con un receptor de células T alfa beta humanas modificadas por ingeniería genética. Se usaron poblaciones celulares mixtas. La población de células T que comprende células T que no expresan ningún receptor de células T alfa beta, células T que expresan un receptor de células T alfa beta de tipo silvestre y células que expresan un receptor de células T alfa beta con la especificidad deseada en las que este receptor se modifica opcionalmente para anular la unión con BW242. Por lo tanto, las células T que expresan TCR transgénicos, apTCR específicos de NY-ESO-1/HLA-A2, se mezclaron en una proporción de 1:1 con células transgénicas apTCR humanas específicas de WT1. Posteriormente, la purificación de estas mezclas de células se evaluó usando perlas inmunomagnéticas recubiertas con mAb apTCR y la fracción de células no unidas se analizó mediante citometría de flujo (Figura 9). Las células modificadas con apTCR quiméricos humano-ratón, es decir, ahuMU/phuMU-TCR, ahu/pM3-TCR o aM2/pM3-TCR se enriquecieron eficientemente a partir de la población mixta (véanse los paneles con tinción de Vp4, los porcentajes aumentan del 13 % al 42 %), mientras que las células que expresaban NY-ESO-1 totalmente humano o apTCR específicos de WT1 no fueron detectables en las fracciones de flujo continuo (véanse los paneles con tinción de Vp21, el porcentaje disminuye del 45 % a aproximadamente el 1 %). Cabe destacar que, las células no transducidas permanecieron en la población resultante, ya que el mAb BW242 tampoco afecta a las células TCR negativas. Esto muestra que la murinización de al menos el dominio 3 en TCRp es suficiente para el enriquecimiento de apTCR reactivos con tumores.
Lisis selectiva de células T modificadas por ingeniería genética con un apTCR humano murinizado
Se proporcionaron células JurMa que expresaban apTCR humanos y apTCR quiméricos humanos murinizados (ahu/pM3). Se proporcionó un anticuerpo que se dirige específicamente a la cadena p de TCR, H57-597 (adquirido de Biolegend Inc., San Diego, CA 92121 por ejemplo, bajo el n.° de catálogo 109201. H57-597 es del isotipo Armenio Hamser IgG1. El porcentaje de lisis se evaluó usando un ensayo convencional de liberación de cromo. Las células JurMa con el apTCR humano murinizado mostraron un aumento de cuatro veces en la lisis. Esto indica que el H57-597 destruye selectivamente las células JurMa que llevan apTCR humano murinizado sobre apTCR completamente humano.
Listado de secuencias
SEQ ID NO.1-4 enumera las secuencias de aminoácidos de los TCR. La región variable no está subrayada. La secuencia en cursiva en las regiones variables corresponde a la región CDR3. Las regiones constantes de las cadenas se enumeran subrayadas.
SEQ ID NO.1: Cadena de TCRa humano (clon RA14):
MEKNPLAAPLLILWTHLDCVSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETA KSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCAF/V7G/VQFYFGTG TSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSM DFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVI GFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO. 2: Cadena de TCRp humano (clon RA14):
MGIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPG MGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSP\/7GG/YG y7FGSGTRLTVVEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGK EVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWT QDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVK RKDSRG
SEQ ID NO.3 Cadena de TCRy humano (clon G115):
MVSLLHASTLAVLGALCVYGAGHLEQPQISSTKTLSKTARLECVVSGITISATSVYWYRERPG EVIQFLVSISYDGTVRKESGIPSGKFEVDRIPETSTSTLTIHNVEKQDIATYYCALH/EAQQELG KKIKVFG PGTKLIITDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWEEKKS NTILGSQEGNTMKTNDTYM KFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVIT MDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS
SEQ ID NO.4 Cadena de TCRS humano (clon G115):
MERISSLIHLSLFWAGVMSAIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGN TMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACD7LG/WGGEY7D/<L/ FGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPS GKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKP KAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
A continuación se enumeran (partes de) las secuencias disponibles en la base de datos Genbank del NCBI con los números AAT27465, AAK49780, AAT27464, X02883, M64239, M12887, M12888, X02384(AH002088), M26057, M22148, M23381, M14996, M15002, M17323, M13340, M12834, M12837, AF021335, que se incorporan en el presente documento por referencia.
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Método para obtener una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos, que comprende las etapas de:
a) proporcionar una mezcla de células T que comprende
- células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos que comprenden una región constante murinizada, en donde se suprime la expresión de receptores endógenos de células T alfa beta; y
- células T no modificadas por ingeniería genética con receptores de células T alfa beta endógenos, en donde la etapa a) comprende la etapa de:
i. proporcionar células T;
ii. proporcionar un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican un receptor inmunitario exógeno; iii. introducir el ácido nucleico o los ácidos nucleicos en las células T para proporcionar de esta manera una mezcla de células T que comprende células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos y células T no modificadas por ingeniería genética con receptores de células T alfa beta endógenos;
b) poner en contacto la mezcla de células T con un anticuerpo que se une específicamente al receptor endógeno de células T alfa beta, para permitir la formación de un complejo de células T de anticuerpos no modificados por ingeniería;
c) retirar el complejo anticuerpo-células T no modificadas por ingeniería genética de la mezcla de células T para obtener de esta manera una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética con receptores inmunitarios exógenos.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico o los ácidos nucleicos además de codificar el receptor inmunitario exógeno no codifican un marcador de selección expresado por separado.
3. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el receptor inmunitario exógeno es un receptor de células T alfa beta modificado por ingeniería genética o un receptor de células T gamma delta modificado por ingeniería genética.
4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde las células T modificadas por ingeniería genética y no modificadas por ingeniería genética son células T alfa beta humanas y en donde el anticuerpo es BW242/412.
5. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde las células T modificadas por ingeniería genética tienen un receptor de células T alfa beta humano modificado por ingeniería genética, en donde la modificación por ingeniería genética del receptor de células T alfa beta humano comprende la modificación del Dominio 3 de la cadena beta del receptor de células T, en donde preferentemente la modificación comprende la murinización del Dominio 3.
6. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el receptor inmunitario exógeno es un receptor de células T gamma delta, preferentemente un receptor de células T gamma delta humano.
7. Una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética que se puede obtener mediante el método de la reivindicación 2.
8. Una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética de acuerdo con la reivindicación 7 para su uso en un tratamiento médico, preferentemente para su uso en el tratamiento de un cáncer.
9. Un anticuerpo que se une específicamente a un receptor inmunitario exógeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o un receptor inmunitario exógeno modificado por ingeniería genética como se define en la reivindicación 5, para su uso en el tratamiento de sujetos que padecen eventos adversos cuando se tratan con una preparación enriquecida en células T modificadas por ingeniería genética con dicho receptor inmunitario exógeno que puede obtenerse mediante uno cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1-5.
10. Un anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde los sujetos son humanos y en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.
11. Un anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en donde el anticuerpo induce la muerte celular de las células T modificadas por ingeniería genética.
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