CN111718409B - 一种t细胞受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种T细胞受体及其应用，表达该T细胞受体的表达载体和宿主细胞，编码该T细胞受体的核酸；以及用于治疗肿瘤或自身免疫疾病的组合物。

Description

一种T细胞受体及其应用

技术领域

本发明本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种T细胞受体及其应用。

背景技术

T细胞相关免疫疗法在近期的癌症研究中大放异彩，“主力部队”是CAR-T和TCR-T这两种技术。相对于CAR-T细胞疗法，TCR-T疗法的关注度相对低些。

TCR-T疗法通过转导嵌合抗原受体或者TCRα/β异二聚体，来提高特异性识别相关抗原的TCR(T cell receptor，T细胞抗原受体)的亲和力和战斗力，使T淋巴细胞能够重新高效的识别靶细胞。通过输注能够识别特异靶标的基因修饰T淋巴细胞，TCR-T疗法赋予免疫系统以新的非自然免疫活性。这种方法除了能像化疗和靶向治疗一样快速杀灭肿瘤外，还避免了疫苗和T淋巴细胞检查点疗法的延迟效应。

传统的免疫过继治疗，只是增加了效应细胞的数量，对于效应细胞的特异性并没有提高，而且效应细胞即使能和肿瘤细胞结合，其亲和力也比较低。TCR-T疗法直接改造T细胞结合肿瘤抗原的“探头”-TCR，加强了T细胞针对肿瘤细胞的特异性识别过程，而且提高了T淋巴细胞对于肿瘤细胞的亲和力，使得原来无肿瘤识别能力的T细胞能够有效地识别并杀伤肿瘤细胞。TCR-T疗法目前的临床有效率相对较低，因此寻找有效的肿瘤靶抗原高亲和性的TCR受体和优化TCR-T细胞的转化效率是目前的研究重点。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，在于提供一种TCR受体。

本发明的目的之二，在于提供一种TCR修饰的细胞。

本发明的目的之三，在于提供一种包含TCR受体或TCR修饰的细胞的组合物及其在治疗和诊断疾病中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种T细胞受体，所述T细胞受体包含TCRβ链可变域，其具有根据序列SEQ ID NO.7～11中任一个所示的CDR3β氨基酸序列。

进一步，TCRβ链可变域具有根据序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6中的CDR1β、CDR2β氨基酸序列。

进一步，TCRα链可变域具有根据序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3中的CDR1α、CDR2α、CDR3α氨基酸序列。

进一步，TCRα链可变域具有根据序列SEQ ID NO.1中的氨基酸序列。

进一步，TCRβ链可变域具有根据序列SEQ ID NO.12～16中任一个的氨基酸序列。

“T细胞受体”(TCR)是指能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽的免疫球蛋白超家族成员(具有可变结合域、恒定域、跨膜区和短胞质尾区。TCR可以在细胞表面上或呈可溶形式发现，且通常由具有α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)的异二聚体构成。如同免疫球蛋白，TCR链(例如，α链、β链)的胞外部分含有两个免疫球蛋白域、在N端处的一个可变域(例如，α链可变域或Vα，β链可变域或Vβ)，和与细胞膜相邻的一个恒定域(例如，α链恒定域或Cα，基于Kabat通常为氨基酸117至259，β链恒定域或Cβ，基于Kabat通常为氨基酸117至295)。还如同免疫球蛋白，可变域含有由框架区(FR)分隔的互补决定区(CDR)。原始TCR的Vα和Vβ一般具有相似的结构，每个可变域包含四个保守FR和三个CDR。Vα域由两个独立的DNA区段编码，即可变基因区段和连接基因区段(V-J)；Vβ域由三个独立的DNA区段编码，即可变基因区段、多样性基因区段和连接基因区段(V-D-J)。单一Vα或Vβ域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自TCR的Vα或Vβ域分离结合特定抗原的TCR，所述TCR结合抗原以分别筛选互补的Vα或Vβ域的文库。在某些实施方案中，TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现并与CD3复合物缔合。本公开中使用的TCR来源可以来自各种动物物种，诸如人类、小鼠、大鼠、兔或其他哺乳动物。

本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的T细胞受体的核苷酸序列。

核酸可以是呈任何形式的单链或双链DNA、cDNA或RNA，并且可以包括彼此互补的核酸的正链和负链，包括反义DNA、cDNA和RNA。

如本文所用，“核酸”或“核酸分子”或“多核苷酸”是指任何脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸，例如通过聚合酶链式反应(PCR)，或通过体外翻译产生的片段，以及由任何连接、断裂、核酸内切酶作用或核酸外切酶作用产生的片段。在某些实施方案中，通过PCR产生本公开的核酸。核酸可以由作为天然存在的核苷酸(诸如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)的单体、天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的α-对映体形式)或两者的组合构成。经修饰的核苷酸可以具有糖部分或嘧啶或嘌呤碱基部分的修饰或置换。核酸单体可以通过磷酸二酯键或这类键的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等。核酸分子可以是单链或双链。

本发明的第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。“载体”是能够转运另一种核酸分子的核酸分子。载体可以是例如质粒、黏粒、病毒、RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可包括染色体、非染色体、半合成或合成的核酸分子。示例性载体是能够自主复制(附加型载体)或表达与它们连接的核酸分子的载体(表达载体)。

进一步，所述载体是病毒载体。病毒载体包括但不限于逆转录病毒；腺病毒；细小病毒(例如腺病毒相关病毒)；冠状病毒；负链RNA病毒，诸如正粘病毒(例如流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹和仙台)；正链RNA病毒，诸如小核糖核酸病毒和甲病毒；以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(如1型和2型单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。其他病毒包括例如诺沃克病毒(Norwalk virus)、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括禽白血病-肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒。

进一步，所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。

本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第一方面所述的所述的T细胞受体，本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的表达载体。

进一步，所述宿主细胞包括造血祖细胞或免疫系统细胞。“造血祖细胞”是可以衍生自造血干细胞或胎儿组织并且能够进一步分化成成熟细胞类型(例如免疫系统细胞)的细胞。“免疫系统细胞”是指免疫系统的任何细胞，其源自骨髓中的造血干细胞，产生两个主要谱系，即骨髓祖细胞(其产生骨髓细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、巨核细胞和粒细胞)和淋巴祖细胞(其产生淋巴样细胞，诸如T细胞、B细胞和自然杀伤细胞(NK)。

进一步，所述免疫系统细胞CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、树突细胞或它们的任何组合。

进一步，所述T细胞是原始T细胞、中央记忆性T细胞、效应记忆T细胞或它们的任何组合。

“T细胞”是在胸腺中成熟并产生T细胞受体(TCR)的免疫系统细胞。T细胞可以是原始的(不暴露于抗原；与TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA的表达增加，且CD45RO的表达降低)、记忆性T细胞(TM)(经历抗原且长寿命)和效应细胞(经历抗原，具有细胞毒性)。TM可进一步分为中央记忆性T细胞(TCM，与原始T细胞相比，CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和CD95的表达增加，且CD54RA的表达降低)和效应记忆T细胞(TEM，与原始T细胞或TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD45RA的表达降低，且CD127的表达增加)的亚群。效应T细胞(TE)是指经历抗原的CD8+细胞毒性T淋巴细胞，其相比TCM具有降低的CD62L、CCR7、CD28表达，并且对颗粒酶和穿孔素呈阳性。其他示例性T细胞包括调节性T细胞，诸如CD4+CD25+(Foxp3+)调节性T细胞和Treg17细胞，以及Tr1、Th3、CD8+CD28-和Qa-1限制性T细胞。

本发明的第五方面提供方了一种组合物，所述组合物包含本发明第一方面所述的所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体或本发明第四方面所述的宿主细胞。

本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：

(1)本发明第一方面所述的所述的T细胞受体在制备TCR-T中的应用；

(2)本发明第一方面所述的所述的T细胞受体在制备嵌合抗原受体中的应用；

(3)本发明第一方面所述的所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的组合物在制备增强免疫力的产品中的应用；

(4)本发明第一方面所述的所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的组合物在制备治疗疾病的药物中的应用；

(5)本发明第一方面所述的所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的组合物在制备抗原检测产品中的应用。

进一步，所述疾病为自身免疫疾病。

进一步，所述疾病为癌症。

在本发明中，除了载体之外，某些实施方案涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明公开的载体。本领域技术人员容易理解，许多合适的宿主细胞可用于本领域。宿主细胞可包括任何可接受载体或核酸和/或蛋白质掺入的单独细胞或细胞培养物，以及任何子代细胞。该术语还涵盖宿主细胞的子代，无论是遗传上还是表型上相同或不同。合适的宿主细胞取决于载体并可包括哺乳动物细胞、动物细胞、人类细胞、类人猿细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。可以通过使用病毒载体、经由磷酸钙沉淀转化、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射或其他方法诱导这些细胞以掺入载体或其他材料。

可使用任何合适的方法转染或转导细胞(例如T细胞)，或施用本发明方法的核酸或组合物。用于将核酸递送至宿主细胞的已知方法包括例如使用阳离子聚合物、脂质样分子和某些商业产品，诸如IN-VIVO-JET PEI。其他方法包括离体转导、注射、电穿孔、DEAE-葡聚糖、超声处理加载、脂质体介导的转染、受体介导的转导、微粒轰击、转位子介导的转移等。转染或转导宿主细胞的另外其他方法采用载体，本文进一步详细描述。

作为可选择的实施方案，本发明的组合物还包括药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。合适的赋形剂包括水、盐水、右旋糖、甘油等及它们的组合。在实施方案中，包含如本文公开的T细胞受体或宿主细胞的组合物还包含合适的输注培养基。合适的输注培养基可以是任何等渗培养基配制物，通常可以使用生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)、5％葡萄糖水溶液、林格氏乳酸盐(Ringer's lactate)。输注培养基可以补充有人类血清白蛋白或其他人类血清组分。本文所述的组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，诸如密封安瓿或小瓶中。可以冷冻此类容器以保持配制物的稳定性直至输注到患者体内。

组合物的“有效量”是指在必需剂量下并且持续必需的时间足以实现所需治疗结果或有益治疗的量，如本文所述。有效量可以在一次或多次施用中递送。如果向已知或确认患有疾病或疾病状态的受试者施用，则术语“治疗量”可对于治疗使用，而“预防有效量”可用于将向易罹患或处于罹患疾病或疾病状态(例如复发)风险下的受试者施用有效量描述为预防过程。

如医学领域的技术人员所确定，组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病或病症的方式施用。组合物的合适剂量以及合适的持续时间和频率将通过诸如以下的因素确定：患者的健康状况、患者的体型(即体重、质量或体重)、患者病状的类型和严重程度、活性成分的特定形式和施用方法。通常，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处(例如本文所述，包括改善的临床结果，诸如更频繁的完全或部分缓解，或更长时间的无疾病和/或总体生存，或症状严重程度的减轻)的量提供组合物。对于预防用途，剂量应足以预防、延迟疾病或病症相关疾病的发作或减轻其严重性。根据本文所述方法施用的组合物的预防益处可通过进行临床前(包括体外和体内研究)和临床研究并通过适当的统计学、生物学以及临床方法和技术分析从中获得的数据来确定。

开发合适的给药和治疗方案，用于在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物，所述治疗方案包括例如肠胃外或静脉内施用或配制。如果本发明组合物经肠胃外施用，则该组合物还可包括无菌水性或油性溶液或悬浮液。合适的无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂包括水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、等渗盐溶液、1,3-丁二醇、乙醇、丙二醇或聚乙二醇与水的混合物。水溶液或悬浮液可进一步包含一种或多种缓冲剂，诸如乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或酒石酸钠。当然，用于制备任何剂量单位配制物的任何材料应是药学上纯的并且在采用的量下是基本上无毒的。此外，活性化合物可以掺入到缓释制剂和配制物中。如本文使用，剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位可含有预先确定量的经修饰的细胞或活性化合物，其经计算可与合适药物载剂结合产生所需治疗效果。

如本文所用，组合物的施用是指将其递送至受试者，而不论递送的途径或模式如何。给药可以连续或间歇地进行，并且可以肠胃外进行。施用可以用于治疗已经确认患有公认的病状、疾病或疾病状态的受试者，或用于治疗易患或处于罹患这类病状、疾病或疾病状态的受试者。与辅助疗法共同施用可包括按任何顺序并根据任何给药计划表同时和/或依序递送多种药剂(例如，具有一种或多种细胞因子的经修饰的细胞；免疫抑制疗法，诸如钙调磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、微管抑制剂、低剂量霉酚酸前药、HDAC抑制剂、DNA低甲基化药剂，或它们的任何组合)。

附图说明

图1是TCR-T杀伤功能检测图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1高通量测序筛选TCR序列

1、RNA提取及质控

收集急性髓系白血病患者的外周血样本，患者无甲肝，乙肝，丙肝，戊肝，艾滋病，梅毒，淋病和结核感染。

在5mL Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min，磁珠分选T细胞。采用TRIzol法对处理的细胞样本进行RNA的提取，对提取后的RNA质量使用Qubit RNA HS Assay kits，经2100生物分析仪(安捷伦)检测RNA完整性。

2、反转录及文库制备

用Repertoire Analysis Kit(Human TCR alpha,beta)进行建库。将所有试剂置于冰上解冻，在配置mix之前，混匀和离心这些试剂。在冰上配置杂交引物需用的mix(表1)。充分混匀后离心，加热反转录引物杂交mix，65℃5min，冰上孵育至少2min。在冰上准备配制反转录mix(表2)，混匀后离心mix。

表1反应体系

组分	体积
		RT dNTP Mixture	1μl
RT Primer H TCRα/β	1μl
		RNA样本(100pg-1000ng)	最多到6.2μl
Nuclease-free water	补足至8.2μl

表2反转录体系

组分	体积
		RT buffer A	4μl
RT buffer B	1μl
		RT buffer C	3.8μl
RT Universal primer	1μl
		RNase inhibitor	1μl
Reverse Transcriptase	1μl
		总体积	11.8μl

将11.8μl的杂交buffer加到上一步反应的杂交RNA中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序(表3)：

表3反应条件

3、第一步PCR

准备第一步PCR需用的试剂(表4)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第一步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表4第一步PCR反应体系

每管中加入41μl的第一步PCR mix，加入9μl的第一链cDNA产物中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：

表5第一步PCR反应条件

4、第二步PCR

准备第二步PCR需用的试剂(表6)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表6第二步PCR反应体系

组分	体积
		PCR buffer	25μl
PCR dNTP Mixture	10μl
		Nuclease-free water	3μl
DNA polymerase	1μl
		总体积	39μl

准备一个新的PCR管，每管中加入1μl的第二步PCR引物，hTCRα#1-18

(编号：A1-A18)，或者hTCRβ#1-18(编号：B1-B18)。加入39μl第二步反应的mix和10μl的第一步PCR产物混匀，然后离心，在PCR仪(T100，

Bio-RAD)上运行以下程序：

表7第二步PCR反应条件

5、第三步PCR

准备第三步PCR需用的试剂在冰上解冻(表9)，混匀后瞬时离心。在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表8第三步PCR反应体系

组分	体积
		PCR buffer	25μl
PCR dNTP Mixture	10μl
		3rd universal primer	2.5μl
Nuclease-free water	6.5μl
		DNA polymerase	1μl
总体积	45μl

准备一个新的PCR管，每管中加入45μl的第三步PCR mix，加入5μl的第二步PCR产物中，用手指肚弹匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：

表9第三步PCR反应条件

6、琼脂糖凝胶电泳

配置1.5％的琼脂糖胶，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNAmarker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。hTCRɑ/β片段在650bp左右。

7、用AGENCOURT AMPure XP(BEACKMAN)磁珠纯化

准备nuclease-free 0.2mL的8连管，按照表10稀释文库。

表10稀释体系

配置DNase-free 70％乙醇(sigma)。磁珠使用前室温平衡30min，将22.5μl的磁珠加到稀释后文库中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单的离心。将8连管放置在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。将所有的上清转移到新的8连管中。再次混匀未使用过的磁珠，加17.5μl的磁珠到上清中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单离心。将8连管放在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。弃85μl的上清，保留5μl的上清以免吸到磁珠。不要将磁珠与磁力架分离。加200μl的70％的乙醇漂洗。室温30s，弃酒精，重复酒精洗涤步骤。弃所有上清，加30μl的10mM Tris-HCl到每个PCR管中，用移液器混匀至少10次。室温孵育2min然后简单离心。将离心管放置在磁力架上室温5min，分离液体和磁珠。将上清20μl转移至新的PCR管中。

8、文库浓度定量及质控

测定文库浓度用Qubit dsDNA HS kit(英潍捷基)，使用设备Qubit 2.0(life)，取2μl的样本用于测定。通常文库浓度集中在5-40ng/μl。如果样本浓度≥1.72ng/μl可用于Miseq测序。

9、文库目标片段质控

人的TCRα/β文库目标片段集中在650bp，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对文库片段进行质控，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。

10、文库混库及质控

文库混样，是按此批次浓度最低的文库为标准，浓度最低文库乘以10μl为基准纳克数，其他文库按照此纳克数进行取样，确保每个文库的总量是一致的，混样后按照纳克与摩尔数之间的换算，稀释到8.58ng/μl(20nM，650bp)。

11、高通量测序

文库使用Miseq(Illumina)进行2×300bp双端测序，对上述混合完成的文库再次使用设备Qubit 2.0(life)进行文库定量，最终稀释到10pM，与10pMdenatured PhiX进行混合(PhiX占比30％)，混合后的600μl进行上机测序。

12、数据分析

采用MiXCR进行初级分析，可以对高度个性化的TCR和免疫球蛋白序列进行分析。MiXCR可以针对不同的数据类型在参数上进行调整，并对分析结果和输出进行优化。进一步高级分析多个多样性指数，如香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)、Inverse-Simpson指数和基尼指数(Gini)等。采用VDJtools用于二级TCR profiling分析以及多样性评估。

13、噬菌体展示技术筛选高亲和力的TCR序列。

14、结果

通过噬菌体展示技术筛选出高亲和力的TCR，其α链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，其中CDR1-3的序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。

TCR的β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12-16所示，其中，CDR1-2的序列分别如SEQ ID NO.5-6所示，CDR3的序列如SEQ ID NO.7～11任一项所示。

实施例2TCR-T的构建

1、利用高通量测序和数据分析结果，全合成相关序列，通过XbaI/SalI限制内切酶切点，连接到pCDH载体中。

2、TCR-T细胞制备

采集健康人外周血，在Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min。磁珠分选T细胞。同时加入CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激，24h及48h后加入病毒感染2次，病毒感染时加入IL-2，培养3-20天，获得TCR-T细胞。

实施例3TCR-T杀伤功能检测

从本研究中所述的序列构建的TCR-T中任选一个进行功能检测。

计数靶细胞(急性髓系白血病细胞OCI-AMLP2)和阴性参照靶细胞(Daudi)，分别标记Celltrace far red和CFSE染色。计数TCR-T(TCR的Vβ可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示)细胞作为效应细胞。按照计划效靶比(3：1，9：1，18：1)，重悬效应细胞和靶细胞至相应浓度。圆底96孔板中每个效靶比分别铺入铺入组1效应细胞、组2靶细胞和组3效应细胞+靶细胞，每组4个复孔。培养2-24h，收细胞样本，分别收管A：组1效应细胞+组2靶细胞，管B：组3效应细胞+靶细胞，多聚甲醛液固定，流式上机。作Killing Rate与E:T Ratio曲线图。其中，

结果，如图1所示，相比对照组，本申请的TCR-T具有较好的杀伤效果。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 深圳豪石生物科技有限公司

<120> 一种T细胞受体及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Ser Asn Ala Tyr Asn

1 5

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ser Lys Pro

1

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Cys Ala Val Asp Glu Asp Gln Thr Gly Ala Asn Asn Leu Phe Phe

1 5 10 15

<210> 4

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Asp Gln Val Phe Gln Pro Ser Thr Val Ala Ser Ser Glu Gly Ala

1 5 10 15

Val Val Glu Ile Phe Cys Asn His Ser Val Ser Asn Ala Tyr Asn Phe

20 25 30

Phe Trp Tyr Leu His Phe Pro Gly Cys Ala Pro Arg Leu Leu Val Lys

35 40 45

Gly Ser Lys Pro Ser Gln Gln Gly Arg Tyr Asn Met Thr Tyr Glu Arg

50 55 60

Phe Ser Ser Ser Leu Leu Ile Leu Gln Val Arg Glu Ala Asp Ala Ala

65 70 75 80

Val Tyr Tyr Cys Ala Val Asp Glu Asp Gln Thr Gly Ala Asn Asn Leu

85 90 95

Phe Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Val Ile Pro Tyr

100 105

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Lys Gly His Asp Arg

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Phe Asp Val Lys Asp

1 5

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Cys Ala Thr Ser Asp Pro Gly Ser Thr Gly Gly Ser Arg Thr Gly Glu

1 5 10 15

Leu Phe Phe

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Cys Ala Thr Ser Val Gly Thr Ser Gly Asn Leu Tyr Asn Glu Gln Phe

1 5 10 15

Phe

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Cys Ala Thr Ser Asp Phe Ser Arg Gly Arg Ala Gly Thr Asp Thr Gln

1 5 10 15

Tyr Phe

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Cys Ala Thr Ser Ser Arg Gly Gln Gly Val Gly Asp Thr Glu Ala Phe

1 5 10 15

Phe

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Cys Ala Thr Ser Pro Arg Gly Gln Gly Gln Phe Asp Tyr Gly Tyr Thr

1 5 10 15

Phe

<210> 12

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr Lys Thr Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His Asp Arg Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr

35 40 45

Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Trp Tyr

85 90 95

Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp

100 105 110

Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser

115 120 125

Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser Ala Ile Pro

130 135 140

Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Asp Pro Gly Ser Thr

145 150 155 160

Gly Gly Ser Arg Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu

165 170 175

Thr Val Val

<210> 13

<211> 177

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr Lys Thr Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His Asp Arg Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr

35 40 45

Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Trp Tyr

85 90 95

Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp

100 105 110

Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser

115 120 125

Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser Ala Ile Pro

130 135 140

Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Val Gly Thr Ser Gly

145 150 155 160

Asn Leu Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val

165 170 175

Val

<210> 14

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr Lys Thr Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His Asp Arg Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr

35 40 45

Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Trp Tyr

85 90 95

Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp

100 105 110

Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser

115 120 125

Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser Ala Ile Pro

130 135 140

Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Asp Phe Ser Arg Gly

145 150 155 160

Arg Ala Gly Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr

165 170 175

Val Val

<210> 15

<211> 177

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr Lys Thr Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His Asp Arg Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr

35 40 45

Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Trp Tyr

85 90 95

Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp

100 105 110

Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser

115 120 125

Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser Ala Ile Pro

130 135 140

Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Ser Arg Gly Gln Gly

145 150 155 160

Val Gly Asp Thr Glu Ala Phe Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val

165 170 175

Val

<210> 16

<211> 177

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr Lys Thr Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His Asp Arg Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr

35 40 45

Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Trp Tyr

85 90 95

Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp

100 105 110

Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser

115 120 125

Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser Ala Ile Pro

130 135 140

Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Pro Arg Gly Gln Gly

145 150 155 160

Gln Phe Asp Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val

165 170 175

Val

Claims (12)

1.一种T细胞受体，其特征在于，包含TCRβ链可变域和TCRα链可变域，TCRβ链可变域的CDR1β、CDR2β、CDR3β氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5~7所示；TCRα链可变域的CDR1α、CDR2α、CDR3α氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。

2.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，TCRα链可变域的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，TCRβ链可变域的氨基酸序列如SEQID NO.12所示。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码包含权利要求1-3任一项所述的T细胞受体的核苷酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求4所述的核酸分子。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是病毒载体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。

8.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求1-3中任一项所述的T细胞受体，权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5-7任一项所述的表达载体。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括造血祖细胞或免疫系统细胞。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述免疫系统细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、树突细胞或它们的任何组合。

11.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-3中任一项所述的T细胞受体，权利要求5-7任一项所述的表达载体，或权利要求8-10任一项所述的宿主细胞。

12.如下任一项所述的应用：

（1）权利要求1-3任一项所述的T细胞受体在制备TCR-T中的应用；

（2）权利要求1-3任一项所述的T细胞受体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5-7任一项所述的表达载体、权利要求8-10任一项所述的宿主细胞或权利要求11所述的组合物在制备治疗白血病的药物中的应用；

（3）权利要求1-3任一项所述的T细胞受体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5-7任一项所述的表达载体、权利要求8-10任一项所述的宿主细胞或权利要求11所述的组合物在制备抗原检测产品中的应用。

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