CN113817044B

CN113817044B - T细胞受体、相关工程化细胞及其应用

Info

Publication number: CN113817044B
Application number: CN202111200159.4A
Authority: CN
Inventors: 于力; 王智鼎
Original assignee: Shenzhen University General Hospital
Current assignee: Shenzhen University General Hospital
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2041-10-14
Also published as: CN113817044A

Abstract

本发明公开了T细胞受体、相关工程化细胞及其应用，所述T细胞受体包含α和/或β链，所述α或β链包含SEQ ID NO.1‑20任一项所述的CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列。本发明还公开了编码T细胞受体的核酸分子、载体、工程化细胞和组合物。

Description

T细胞受体、相关工程化细胞及其应用

技术领域

本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及识别T细胞受体、相关工程化细胞及其应用。

背景技术

T细胞受体(Tcell receptor，TCR)是T细胞表面的一种受体分子，它特异性识别抗原提呈细胞上的抗原肽-MHC复合物，进而触发T细胞免疫应答由于TCR分子决定着T细胞的抗原识别特异性，如果将肿瘤抗原特异性的TCR基因转入普通T细胞中，能够赋予该T细胞肿瘤抗原的识别能力，经体外活化增殖后再转输入患者体内，可以发挥抗肿瘤功效。因此利用TCR基因导入的方法可以方便地获得大量识别特定抗原的T细胞，经TCR基因修饰的T细胞被称为TCR-T，近年来TCR-T已经成为肿瘤免疫治疗中的研究热点，在临床实验中显示了良好的治疗效果。

TCR可以根据组成亚基的不同分为αβTCR，γδTCR，其中大多数为αβTCR。T细胞室的充分活化需要αβTCR对抗原的双信号，即抗原特异性信号：TCR一抗原肽-MHC分子复合物、CD8或CD4-MHC；协同刺激信号：CD28-B7(CD80，CD86)。其中，MHC分子包括MHC I和MHC II，其中MHCI类分子由α链和β2微球蛋白组成，且α链含有三个结构域，远膜端的两个结构域共同组成抗原递呈的结合槽，约容纳8至10个氨基酸残基。MHC II分子由α链与β链组成，每条链包含两个结构域，远膜端的两个结构域形成抗原结合槽，约容纳13至17个氨基酸残基。但是两种MHC分子递呈的抗原肽种类有所区别。MHC II类分子递呈外源性抗原经加工处理的表位肽，且该类pMHC由CD4^十T细胞识别并结合，引发CD4^十T细胞活化，使IFN-γ分泌增加，IFN-γ分泌量的提高又可增强CD8⁺T细胞识别MHCI分子的能力，进一步辅助CD8⁺T细胞破坏肿瘤组织。而MHC I类分子主要递呈内源性的抗原肽，该类pMHC复合物被CD8⁺T细胞识别并结合，引发CD8⁺T细胞活化、增殖转化为效应细胞，并刺激CD8⁺T细胞释放肿瘤坏死因子诱导凋亡配体使靶细胞凋亡，也可以使CD8⁺T细胞产生颗粒酶以及穿孔素杀伤靶细胞。因此，T淋巴细胞对于维持免疫系统平衡以及抵御外来病菌入侵具有重要作用。

自然状态下T细胞受体亲和力比较低下，而且肿瘤细胞存在逃逸机制，比如降低自身MHC I类分子的表达水平，因此，在TCR-T疗法当中，优化TCR的亲和力，寻找具有杀伤功效的TCR成为研究的热点。

发明内容

如本文描述的，本发明涉及一种T细胞受体或其抗原结合片段，其具有较高的亲和力和杀伤肿瘤细胞的效果。具体方案如下：

本发明第一方面提供了一种T细胞受体或其抗原结合片段，包含含有SEQ ID NO：5-7任一所示的氨基酸序列的α链CDR3和/或具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的β链CDR3。

在一些实施方案中，所述T细胞受体还包含具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的α链CDR1和SEQ ID NO：2-4任一所示的CDR2；和/或具有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18氨基酸序列的β链CDR1和CDR2。

在一些实施方案中，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的β链可变区。

在一些实施方案中，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的β链可变区。

在一些实施方案中，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的β链可变区。

在一些实施方案中，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少99％同一性的β链可变区。

在一些实施方案中，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列所示的α链可变区，和/或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列所示的β链可变区。

在一些实施方案中，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列所示的α链可变区，和/或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列所示的β链可变区。

在一些实施方案中，所述T细胞受体是缺乏跨膜结构域的可溶性T细胞受体。

在一些实施方案中，所述T细胞受体结合MHC I和/或MHC II肽复合物。

在一些实施方案中，所述T细胞受体还包含可检测标记。

在一些实施方案中，所述可检测标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质、生物素。

在一些实施方案中，所述T细胞受体还包含治疗剂。

在一些实施方案中，所述α链在一些实施方案中包含α恒定区Cα和/或β链在一些实施方案中包含β恒定区Cβ。

在一些实施方案中，所述Cα和Cβ为小鼠恒定区。

在一些实施方案中，所述Cα和Cβ为人恒定区。

在一些实施方案中，Cα区和/或该Cβ区包含引入一个或多个能够在α链与β链之间形成一个或多个非天然二硫桥键的半胱氨酸。

在一个实施方案中，所述α链与β链进一步包含信号肽。

在一个实施方案中，所述T细胞受体或其抗原结合片段为单链。

在另一个实施方案中，所述T细胞受体或其抗原结合片段为双链。

本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的T细胞受体或其抗原结合片段或其α链或β链。

在一些实施方案中，核苷酸序列经密码子优化。

在一些实施方案中，编码所述α链的所述核苷酸序列和编码所述β链的所述核苷酸序列由引起核糖体跳跃的肽序列隔开。

在一些实施方案中，所述核酸分子为合成的。

在一些实施方案中，所述核酸分子为cDNA。

本发明第三方面提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。

在一些实施方案中，所述载体为表达载体。

在一些实施方案中，所述载体为病毒载体。

在一些实施方案中，所述病毒载体为逆转录病毒载体。

在一些实施方案中，所述病毒载体为慢病毒载体。

本发明第四方面提供了一种工程化细胞，包含

(1)根据本发明第一方面所述的T细胞受体或其抗原结合片段；或

(2)根据本发明第二方面所述的核酸分子或根据本发明第三方面所述的载体。

在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合片段对于所述细胞是异源的。

在一些实施方案中，所述工程化细胞为细胞系。

在一些实施方案中，所述工程化细胞为获自受试者的原代细胞。

在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物受试者。

在一些实施方案中，所述受试者为人。

在一些实施方案中，所述细胞为T细胞。

在一些实施方案中，所述T细胞为CD8⁺。

在一些实施方案中，所述T细胞为CD4⁺。

本发明第五方面提供了一种组合物，包含本发明第一方面所述的T细胞受体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的工程化细胞。

进一步，所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。

本发明第六方面提供了如下任一项所述的方法：

(1)一种用于产生工程化细胞的方法，包括将根据本发明第三方面所述的载体在体外或离体地引入细胞中。

进一步，所述载体为病毒载体且所述引入是通过转导进行的。

(2)用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，包括给对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括本发明第五方面所述的组合物。

本发明第七方面提供了如下任一项所述的应用：

(1)本发明第一方面所述的T细胞受体或其抗原结合片段，本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的组合物在制备过继细胞转移治疗产品中的应用。

在一些实施方案中，所述过继细胞转移为过继T细胞转移。

在一些实施方案中，所述过继T细胞转移是同种异体过继T细胞转移、自体过继T细胞转移或通用的非同种异体反应性过继T细胞转移。

(2)本发明第一方面所述的T细胞受体或其抗原结合片段，本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的组合物在制备肿瘤细胞中肽/MHC诊断评价产品中的应用。

(3)本发明第一方面所述的T细胞受体或其抗原结合片段，本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的组合物在制备靶向产品中的应用，所述靶向产品引导治疗分子至肿瘤部位。

(4)本发明第一方面所述的T细胞受体或其抗原结合片段，本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的组合物在制备增强免疫力的产品中的应用。

(5)本发明第一方面所述的T细胞受体或其抗原结合片段，本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的组合物在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用。

在一些实施方案中，所述疾病为增殖性疾病；

在一些实施方案中，增殖性病症是血液恶性疾病或实体瘤；

在一些实施方案中，所述血液恶性疾病选自下组：急性髓系白血病、慢性髓系白血病、成淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

在一些实施方案中，所述血液恶性疾病是急性髓系白血病。

在一些实施方案中，所述实体瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结直肠癌。

附图说明

图1是TCR-T杀伤白血病细胞HL-60功能检测图。

发明详述

T细胞受体/TCR

“T细胞受体”或“TCR”为含有可变α链和β链(还分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ链和δ链(还分别称为TCRγ和TCRδ)或其抗原结合部分，且能够与抗原特异性结合的分子(例如，结合于MHC分子的抗原或肽表位)。在一些实施方案中，TCR为αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR一般在结构上类似，但表达其的T细胞可具有不同的解剖学位置或功能。TCR可发现在细胞表面上或呈可溶性形式。一般而言，TCR发现在通常负责识别结合于主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原的T细胞(或T淋巴细胞)的表面上。

除非另有说明，否则术语“TCR”应该理解为涵盖全TCR以及其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR为完整的或全长TCR，诸如含有α链和β链的TCR。在一些实施方案中，TCR为小于全长TCR，但与MHC分子中所结合的特异性肽结合(诸如与MHC-肽复合物结合)的抗原结合部分。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含全长或完整TCR的结构域的一部分，但是仍能够结合全TCR所结合的肽表位，诸如MHC-肽复合物。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变域，诸如TCR的可变α(V_α)链和可变β(V_β)链或其足以形成用于与特异性MHC-肽复合物结合的结合位点的抗原结合片段。

在一些实施方案中，TCR的可变域含有互补决定区(CDR)，其通常为肽、MHC和/或MHC-肽复合物的抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，框架区通常在TCR分子中展现出较低的变异性。在一些实施方案中，CDR3为负责抗原结合或特异性的主要CDR或是给定TCR可变区上的三个CDR中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的经加工肽部分的相互作用而言最重要的。在一些情况下，α链的CDR1可以与某些抗原肽的N端部分相互作用。在一些情况下，β链的CDR1可以与肽的C端部分相互作用。在一些情况下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或对该部分的识别贡献最大或是负责这些的主要CDR。在一些实施方案中，β链的可变区可以含有另一高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合，但不参与抗原识别。

一些实施方案中，TCR的α链和/或β链也可以含有恒定域、跨膜域和/或短细胞质尾区(参见例如Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health andDisease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997)。在一些方面中，TCR的各链(例如，α或β)可以具有一个N端免疫球蛋白可变域、一个免疫球蛋白恒定域、跨膜区和在C端末端的短细胞质尾区。在一些实施方案中，TCR，例如经由细胞质尾区，与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。在一些情况下，该结构允许TCR与其他分子(如CD3)或其亚基缔合。例如，含有恒定域与跨膜区的TCR可将蛋白质锚定在细胞膜中且与CD3信号传导器或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3δ链)的细胞内尾区含有一或多个基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM且通常参与TCR复合物的信号传导能力。

确定或鉴定TCR的各种结构域或区域是在本领域技术人员的能力范围内。在一些情况下，结构域或区域的确切基因座可以取决于特定结构或同源性模型化或其他用于描述特定结构域的特征。应当理解，提及氨基酸，包括用于描述TCR的结构域组织的SEQ ID NO所示的特定序列，是出于说明的目的，且不意指限制所提供实施方案的范围。在一些情况下，特定结构域(例如，可变域或恒定域)可以长或短若干个氨基酸(诸如一、二、三或四个)。在一些方面中，TCR的残基为已知的或可以根据国际免疫遗传学信息系统(InternationalImmunogenetics Information System，IMGT)编号系统鉴定。

在一些实施方案中，TCR的α链和β链各自进一步含有恒定域。在一些实施方案中，α链恒定域(Cα)和β链恒定域(Cβ)单独地为哺乳动物的，诸如为人或鼠恒定域。在一些实施方案中，恒定域与细胞膜相邻。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个近膜恒定域和两个远膜可变域，这些可变域各自含有CDR。

在一些方面中，本文中提供含有人恒定区的TCR，诸如含有人Cα区的α链和含有人Cβ的β链。在一些实施方案中，所提供的TCR为全人的。所提供的TCR为含有人恒定区的TCR，诸如全人TCR，其表达和/或活性，诸如当在人细胞，例如人T细胞，诸如原代人T细胞中表达时，不受内源性人TCR的存在的影响或基本上不受其影响。当用人恒定区格式化时，在含有内源性TCR的原代人T细胞中展现实质性活性。在一些实施方案中，含有人恒定区的此类TCR不会被内源性人TCR淘汰，诸如对于CD3复合物的组分。

在一些实施方案中，含有人恒定区的此类TCR当由含有或表达内源性人TCR的人细胞，诸如人T细胞表达时，与相同TCR在类似的、但内源性TCR的表达已减少或消除的人细胞中的表达量、功能活性和/或抗肿瘤活性相比，在细胞表面上的表达量类似或改善，展现类似的或更大的功能活性(例如，细胞溶解活性)和/或展现类似的或更大的抗肿瘤活性。

在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段包含α链和/或β链的变体。在一些实施方案中，变体包含本文所述的TCR中的任一者的氨基酸序列，其在α链或β链的恒定区中含有一、二、三或四个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，包含经取代的氨基酸序列的TCR(或其功能部分)有利地提供以下中的一种或多种：与包含未经取代的氨基酸序列的亲本TCR相比，与内源性TCR链的错误配对减少，宿主细胞的表达增加，和抗肿瘤活性增加。

在一些实施方案中，TCR可为诸如通过一个或多个二硫键连接的两条链α和β的异二聚体。在一些实施方案中，TCR的恒定域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR在α链和β链中的每一者中可以具有额外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定域中含有两个二硫键。在一些实施方案中，恒定域和可变域各自含有由半胱氨酸残基形成的二硫键。

在一些实施方案中，TCR为全长TCR。在一些实施方案中，TCR为抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR为二聚TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR为单链TCR(sc-TCR)。TCR可为细胞结合的或呈可溶性形式。在一些实施方案中，TCR以细胞结合形式在细胞的表面上表达。

在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽，其中与所提供的TCRα链可变区序列对应的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的N端融合；和第二多肽，其中对应于所提供的TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的N端融合，第一多肽和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，该键可以与天然二聚αβTCR中存在的天然链间二硫键对应。在一些实施方案中，不存在天然TCR中的链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一或多个半胱氨酸并入dTCR多肽对之恒定区细胞外序列中。在一些情况下，天然和非天然二硫键均为所期望的。在一些实施方案中，TCR含有跨膜序列以锚定至膜。

在一些实施方案中，TCR为scTCR，其为单一氨基酸链，其含有能够与MHC-肽复合物结合的α链和β链。通常，scTCR可以使用本领域技术人员已知的方法产生。

在一些实施方案中，scTCR含有第一区段，其由与所提供的TCRα链可变区的序列对应的氨基酸序列构成；第二区段，其由与所提供的TCRβ链可变区序列对应的氨基酸序列构成，该序列与对应于TCRβ链恒定域细胞外序列的氨基酸序列的N端融合；和接头序列，其将第一区段的C端连接至第二区段的N端。

在一些实施方案中，scTCR含有第一区段，其由与α链细胞外恒定域序列的N端融合的所提供的α链可变区序列构成；和第二区段，其由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N端融合的所提供的β链可变区序列构成；和任选地，接头序列，其将第一区段的C端连接至第二区段的N端。

在一些实施方案中，scTCR含有第一区段，其由与β链细胞外恒定域序列的N端融合的所提供的TCRβ链可变区序列构成；和第二区段，其由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N端融合的所提供的α链可变区序列构成；和任选地，接头序列，其将第一区段的C端连接至第二区段的N端。

在一些实施方案中，为了使scTCR结合MHC-肽复合物，α链和β链必须配对，使得其可变区序列定向成用于此类结合。促进scTCR中的α和β的配对的各种方法为本领域中所熟知。在一些实施方案中，包括接头序列，其连接α链和β链，以形成单一多肽链。在一些实施方案中，接头应该具有足够的长度以覆盖α链的C端与β链的N端之间的距离或反之亦然，同时也确保接头长度不要太长而使得其阻断或降低scTCR与靶肽-MHC复合物的结合。

在一些实施方案中，所提供的TCR中的任一者，包括dTCR或scTCR，可以与在T细胞的表面上产生活性TCR的信号传导域连接。在一些实施方案中，TCR在细胞的表面上表达。在一些实施方案中，TCR确实含有与跨膜序列对应的序列。在一些实施方案中，跨膜域带正电。在一些实施方案中，跨膜域可为Cα或Cβ跨膜域。在一些实施方案中，跨膜域可以来自非TCR来源，例如来自CD3z、CD28或B7.1的跨膜区。在一些实施方案中，TCR确实含有与细胞质序列对应的序列。在一些实施方案中，TCR含有CD3z信号传导域。在一些实施方案中，TCR能够与CD3形成TCR复合物。

在一些实施方案中，TCR为可溶性TCR。在一些实施方案中，TCR不含与跨膜序列对应的序列，例如以允许膜锚定至在其中表达该TCR的细胞中。在一些实施方案中，TCR不含与细胞质序列对应的序列。

本文提供TCR或其抗原结合片段，此类TCR或其抗原结合片段为含有如单独地描述的α和/或β链可变(Vα或Vβ)区序列中的任一者或此类链的足够的抗原结合部分的TCR或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所提供的TCR或其抗原结合片段含有Vα区序列或其足够的抗原结合部分，其含有如所述的CDR-1、CDR-2和/或CDR-3。在一些实施方案中，所提供的TCR或其抗原结合片段含有Vβ区序列或足够的抗原结合部分，其含有如所述的CDR-1、CDR-2和/或CDR-3。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段含有Vα区序列，其含有如所述的CDR-1、CDR-2和/或CDR-3；且含有Vβ区序列，其含有如所述的CDR-1、CDR-2和/或CDR-3。所提供的TCR也为具有与此类序列至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列的TCR。

在一些实施方案中，T细胞受体或其抗原结合片段被修饰。在某些实施方案中，与本文所述的结合分子(例如TCR)的序列相比，这些结合分子，例如TCR或其抗原结合片段，包括一种或多种氨基酸变化，例如取代、缺失、插入和/或突变。示例性变体包括经设计以改善结合分子的结合亲和力和/或其他生物特性的变体。结合分子的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入编码T细胞受体或抗原结合片段的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如T细胞受体或抗原结合片段的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可制造缺失、插入和取代的任一组合以获得最终构建体，其限制条件为最终构建体具有所期望的特征，例如抗原结合。

在一些实施方案中，使用定向进化法生成具有改变的特性的TCR，诸如对在MHC分子的环境下的特定肽具有更高的亲和力。在一些实施方案中，定向进化通过展示方法实现，包括(但不限于)酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad Sci U S A,97,5387-92)、噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)JImmunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示方法包括工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，参考TCR，诸如本文所提供的任何TCR，可以用作模板用以产生CDR之一或多个残基突变的经突变诱发的TCR，且选择具有所期望的改变的特性的突变体，诸如对在MHC分子的环境下的肽表位具有更高的亲和力。

在某些实施方案中，结合分子，例如TCR或其抗原结合片段，包括一种或多种氨基酸取代，例如与本文所述的结合分子(例如TCR)序列相比和/或与天然谱库，例如人类谱库的序列相比。取代型突变诱发所感兴趣的位点包括CDR、FR和/或恒定区。可将氨基酸取代引入感兴趣的结合分子中且针对所期望的活性筛选产物，所期望的活性例如保留的/改善的抗原亲和力或亲合力、减小的免疫原性、改善的半衰期、CD8非依赖性结合或活性、表面表达、TCR链配对的促进和/或其他改善的特性或功能。

在一些方面中，TCR或其抗原结合片段可以在α链和/或β链中含有一个或多个修饰，使得当TCR或其抗原结合片段在细胞中表达时，TCRα链和β链与内源TCRα链和β链之间的错误配对的频率减小，TCRα链和β链的表达增加，和/或TCRα链和β链的稳定性增加。

在一些实施方案中，表达TCR的细胞进一步包括替代标志物，诸如细胞表面标志物，其可用于确认细胞的转导或工程化以表达TCR，诸如截短型细胞表面受体。在一些方面中，标志物包括CD34、NGFR、Her2或表皮生长因子受体(例如tEGFR)的全部或一部分(例如截短形式)。在一些实施方案中，编码标志物的核酸与编码接头序列的多核苷酸可操作地连接，接头序列诸如可裂解的接头序列，例如T2A。在一些实施方案中，引入编码由T2A、P2A或其他核糖体开关隔开的TCR和替代标志物的构建体可以自同一构建体表达两种蛋白质，使得该替代标志物可用作用以检测表达此类构建体的细胞的标志物。

在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段由经或已经密码子优化和/或修饰以消除隐藏的剪接位点的核苷酸序列编码。本文中其他地方描述示例性密码子优化变体。

核酸、载体、表达方法

本发明还提供编码所提供的结合分子中的任一者的核酸，这些结合分子例如TCR或其抗原结合片段或抗体或其抗原结合片段或含有此类抗体的CAR，诸如本文所述的那些。核酸可以包括包含天然和/或非天然存在的核苷酸和碱基的核酸，例如包括具有骨架修饰的核酸。术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，且是指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸且包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指构成核酸分子或多核苷酸的核苷酸的线性序列。

在一些实施方案中，结合分子(例如TCR)或其抗原结合部分可为以重组方式产生的天然蛋白质或其突变形式，在突变形式中，一种或多种特性，诸如结合特征，已发生改变。在一些方面中，核酸为合成的。在一些情况下，核酸为或含有cDNA。在一些方面中，核酸分子可经修饰以用于本文所述的构建体中，诸如用于密码子优化。在一些情况下，出于克隆至载体中的目的，可以将序列设计成含有末端限制位点序列。

在一些实施方案中，编码结合分子(例如TCR)的核酸分子可以获自多种来源，诸如通过一个或多个给定细胞内的或自其分离的编码核酸的聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，TCR由生物来源获得，诸如从细胞，诸如从T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他公开可用的来源获得。在一些实施方案中，TCR可源自多种动物物种中的一种，诸如人类、小鼠、大鼠或其他哺乳动物，诸如通常源自人类。在一些实施方案中，T细胞可以获自体内经分离细胞，诸如获自正常(或健康)受试者或患病受试者，包括存在于外周血单核细胞(PBMC)中的T细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，T细胞可为经培养的T细胞杂交瘤或克隆。例如，在一些实施方案中，为了产生编码TCR的载体，α链和β链可以从自表达感兴趣的TCR的T细胞克隆分离的总cDNA进行PCR扩增且克隆至表达载体中。在一些实施方案中，α链和β链可以合成方式产生。在一些实施方案中，将α链和β链克隆至相同载体中。

在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可根据对TCR序列的认识以合成方式产生。

在一些实施方案中，核酸分子含有编码α链的核酸序列和/或编码β链的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码α链的核苷酸序列和/或编码β链的核苷酸序列经密码子优化。通常，密码子优化涉及平衡经公开的大量人转移RNA选择的密码子的百分比，使得没有一个超载或为限制性的。在一些情况下，这点是必需的，因为大部分氨基酸是由超过一个密码子编码，且密码子使用因生物体而异。经转染基因与宿主细胞之间的密码子使用差异对核酸构建体的蛋白质表达和免疫原性有影响。一般而言，对于密码子优化，选择密码子以选出与人类使用频率平衡的那些密码子。通常，氨基酸的密码子冗余使得不同密码子编码一个氨基酸。在一些实施方案中，在选择密码子进行替换时，期望所得突变为沉默突变，使得密码子变化不影响氨基酸序列。通常，密码子的最后一个核苷酸可以保持不变，而不影响氨基酸序列。在一些情况下，编码结合分子，例如TCR或其抗原结合片段的核酸序列修饰成使得隐藏剪接位点被移除。

本发明还提供含有本发明中所述核酸分子的载体或构建体。在一些实施方案中，载体或构建体含有一个或多个与编码α链和/或β链的核苷酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，启动子与一个或多于一个核酸分子可操作地连接。

本发明还提供载体，诸如含有本文所述的核酸中的任一者的载体。在一些实施方案中，将编码结合分子(例如TCR)的一条或两条链的一个或多个核酸克隆至一个或多个适合的表达载体中。表达载体可为任何适合的重组表达载体，且可用以转化或转染任何适合的宿主。适合载体包括设计成用于增殖和扩增或用于表达或用于这二者的载体，诸如质粒和病毒。在一些实施方案中，载体为表达载体。

在一些实施方案中，载体可为pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif.)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)或pEX系列(Clontech,Palo Alto,Calif.)的载体。在一些情况下，也可使用噬菌体载体，诸如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体且其包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些情况下，载体为病毒载体。在一些此类方面中，病毒载体为逆转录病毒载体，诸如慢病毒载体。

在一些实施方案中，重组表达载体可以使用标准重组DNA技术制备。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列，诸如转录和翻译起始和终止密码子，适当时且考虑载体是基于DNA还是基于RNA，其对待引入载体的宿主的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性。在一些实施方案中，载体可以含有与编码结合分子，诸如TCR、抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列可操作地连接的非天然启动子。在一些实施方案中，启动子可为非病毒启动子或病毒启动子，诸如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和存在于鼠干细胞病毒的长末端重复序列中的启动子。还涵盖本领域技术人员已知的其他启动子。

本发明还提供结合分子(包括TCR或其抗原结合片段)的构建方法。在一些实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。为了重组产生结合分子，可将编码例如如上所述的结合分子的核酸分离且插入一个或多个载体中进行进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。此类核酸可以使用常规程序容易地分离和测序(例如，通过使用能够与编码TCR的α链和β链或抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。在一些实施方案中，提供结合分子的制造方法，其中该方法包含：在适合于表达结合分子的条件下培养包含编码如以上所提供的结合分子的核酸的宿主细胞；和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收结合分子。

在一个此类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如，已经用该载体转化的宿主细胞)，该载体包含编码包含TCR或其抗原结合片段的Vβ区的氨基酸序列的核酸和编码包含TCR或其抗原结合片段的Vα区的氨基酸序列的核酸。在一些方面中，宿主细胞包含(例如，已经用以下转化的宿主细胞)：第一载体，其包含编码包含TCR或其抗原结合片段的Vα区的氨基酸序列的核酸；和第二载体，其包含编码包含TCR或其抗原结合片段的Vβ区的氨基酸序列的核酸。

除了原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也为结合分子编码载体的适合的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已经修饰以模拟或模仿人细胞中的糖基化途径的真菌和酵母菌株。

可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；PER.细胞；和NSO细胞。在一些实施方案中，特定真核宿主细胞基于其对结合分子进行所期望的翻译后修饰的能力来选择。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生多肽，这些多肽的唾液酸化程度高于293细胞中所产生的相同多肽。在一些实施方案中，结合分子产生于无细胞系统中。

工程化细胞

本发明还提供了细胞，诸如已经工程化为含有本文所述的结合分子的细胞。还提供此类细胞的群体、含有此类细胞和/或此类细胞富集的组合物，诸如其中表达结合分子的细胞占组合物中的总细胞的至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多百分比，或某些类型的细胞，诸如T细胞或CD8⁺或CD4⁺细胞。在一些实施方案中，细胞为原代T细胞。组合物为用于施用，诸如用于过继细胞疗法的药物组合物和配制剂。还提供用于向受试者(例如患者)施用细胞和组合物的治疗方法。

因此还提供表达结合分子的基因工程化细胞。细胞一般为真核细胞，诸如哺乳动物细胞，且通常为人细胞。在一些实施方案中，细胞衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴样器官，为免疫系统细胞，诸如先天性或适应性免疫细胞，例如骨髓样或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，诸如多潜能(multipotent)和多能(pluripotent)干细胞，包括经诱导的多能干细胞(iPSC)。细胞通常为原代细胞，诸如直接从受试者分离和/或从受试者分离且冷冻的细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，诸如完整T细胞群体、CD4⁺细胞、CD8⁺细胞和其亚群，诸如根据以下定义的那些：功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌概况和/或分化程度。提及所治疗的受试者时，细胞可为同种异体细胞和/或自体细胞。这些方法包括现成方法。在一些方面中，诸如在现成技术中，细胞为多能和/或多潜能细胞，诸如干细胞，诸如经诱导的多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，方法包括如本文所述从受试者分离出细胞、对其进行制备、处理、培养和/或工程化，和在冷冻保存之前或之后将其再引入同一患者中。

T细胞和/或CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的亚型和亚群为幼稚T(T_N)细胞、效应T细胞(T_EFF)、记忆T细胞和其亚型，诸如干细胞记忆T(T_SCM)、中枢记忆T(T_CM)、效应记忆T(T_EM)或末期分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关不变T(MAIT)细胞、天然产生和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡性辅助T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。

在一些实施方案中，细胞为自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞为单核球或粒细胞，例如髓样细胞、巨噬细胞、嗜中性白血球、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。

在一些实施方案中，细胞包括经由基因工程所引入的一个或多个核酸且由此表达此类核酸的重组产物或基因工程产物。在一些实施方案中，核酸为异源的，即，通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，诸如从另一生物体或细胞获得的核酸，例如，通常不存在于经工程化的细胞和/或此类细胞所由来的生物体中。在一些实施方案中，核酸并非天然产生的，诸如未在自然界中发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的不同域的核酸的嵌合组合的核酸。

在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入结合分子(例如TCR)的细胞可以从样品分离，诸如生物样品，例如获自或衍生自受试者的生物样品。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者为患有疾病或病状或需要细胞疗法或将施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者为需要特定治疗性干预的人类，特定治疗性干预诸如对细胞进行分离、处理和/或工程化的过继细胞疗法。

因此，在一些实施方案中，细胞为原代细胞，例如原代人细胞。样品包括组织、体液和其他直接从受试者取得的样品，以及由一个或多个处理步骤产生的样品，处理步骤诸如分离、离心、基因工程化(例如，用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育。生物样品可为直接获自生物来源的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于体液，诸如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液；组织和器官样品，包括由其获得的经处理的样品。

在一些方面中，细胞所由来的样品或分离出细胞的样品为血液样品或血源性样品或为或源自单采术或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠道相关淋巴样组织、黏膜相关淋巴样组织、脾脏、其他淋巴样组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰脏、乳腺、骨骼、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官，和/或由其获得的细胞。在细胞疗法，例如过继细胞疗法的情况下，样品包括自体和同种异体来源的样品。

在一些实施方案中，细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞自异种来源获得，例如自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪获得。

在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些实例中，对细胞进行洗涤、离心和/或在一种或多种试剂存在下孵育，以例如移除不需要的组分、富集所需组分、溶解或移除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种特性，诸如密度、黏附特性、大小、敏感性和/或对特定组分的抗性，分离细胞。

在一些实例中，从受试者的循环血液获得细胞，例如通过单采术或白细胞去除术获得。在一些方面中，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他成核白细胞、红细胞和/或血小板，且在一些方面中含有除红细胞和血小板之外的细胞。

组合物和用途

本发明还提供包括TCR或其抗原结合片段和工程化细胞的组合物，包括药物组合物和配制剂，和这些分子和组合物的使用方法和用途，诸如用于预防/治疗疾病，和/或检测、诊断和预后方法。

药物组合物和配制剂通常包括一种或多种任选的药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包括至少一种额外的治疗剂。

术语“药物配制剂”是指以使得容许其中所含活性成分的生物活性有效的形式且不含对该配制剂将施用的受试者具有不可接受毒性的额外组分的制剂。

“药学上可接受的载剂”是指药物配制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些方面中，载剂的选择部分地由特定细胞或结合分子和/或由施用方法决定。因此，存在多种适合的配制剂。例如，药物组合物可含有防腐剂。适合的防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。载剂例如由Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)描述。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下一般对接受者无毒，且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六羟季铵；氯苄烷铵；苄索氯铵；酚醇、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。

在一些方面中，组合物中包括缓冲剂。适合的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及多种其他酸和盐。在一些方面中，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法为已知的。

药物配制剂可包括冻干配制剂和水溶液。配制剂或组合物也可含有超过一种适用于可用TCR或细胞治疗的特定适应症、疾病或病状，优选具有与该TCR或细胞互补的活性的那些适应症、疾病或病状的活性成分，其中各自活性彼此间无不利影响。此类活性成分适合以可有效达成预期目的的量组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物进一步包括其他药物活性剂或药物，诸如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲氨喋呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)等。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段，例如药学上可接受的盐形式施用。适合的药学上可接受的酸加成盐包括衍生自无机酸和有机酸的盐，无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸，有机酸诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、反丁烯二酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸。

可将活性成分包埋在微胶囊、胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳液中。在某些实施方案中，将药物组合物配制为包合络合物，诸如环糊精包合络合物；或配制为脂质体。脂质体可用于使宿主细胞(例如T细胞或NK细胞)靶向特定组织。

在一些方面中，药物组合物可采用定时释放型、延迟释放型和持续释放型递送系统，使得组合物的递送发生在待治疗部位的敏化之前且递送时间足以引起待治疗部位的敏化。多种类型的释放递送系统可供使用且是已知的。此类系统可避免重复施用组合物，从而提高受试者和医师的便利性。

在一些实施方案中，药物组合物含有可有效治疗或预防疾病或病状的量的结合分子和/或细胞，诸如治疗有效量或预防有效量。在一些实施方案中，治疗或预防功效通过定期评定所治疗的受试者来监测。对于经数天或更长时间的重复施用，视病状而定，重复治疗直至出现疾病症状的所期望的抑制为止。然而，其他给药方案可为适用的且可加以确定。所期望的剂量可通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物或通过连续输注施用组合物来递送。

配制剂包括用于经口、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、经皮、肌肉内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些配制剂。在一些实施方案中，细胞群体肠胃外施用。如本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道、颅内、胸内和腹膜内施用。在一些实施方案中，细胞群体使用外周全身性递送，通过静脉内、腹膜内或皮下注射向受试者施用。

如本文所用，“治疗”是指疾病或病状或病症、或症状、副作用或结果、或与其相关的表型的完全或部分改善或减轻。所期望的治疗作用包括但不限于预防疾病发生或复发，缓解症状，减轻疾病的任何直接或间接病理性结果，预防癌转移，减缓疾病进展速率，改善或缓和疾病病况和缓解或改善预后。这些术语不表示疾病的完全治愈或任何症状的完全消除或对所有症状或结果均有作用。

如本文所用，“延迟疾病发展”意指推迟、阻碍、减缓、阻滞、稳定、抑制和/或延迟疾病(诸如癌症)的发展。此延迟可具有不同时间长度，取决于所治疗的疾病和/或个体的病史。如对本领域技术人员显而易见的，足够或显著延迟可实际上涵盖预防，从而使个体不发展疾病。例如，可延迟晚期癌症，诸如癌转移发展。

如本文所用，“预防”包括在某一疾病在受试者中的出现或复发方面提供预防作用，该受试者可能易患该疾病但尚未诊断患有该疾病。在一些实施方案中，所提供的分子和组合物用于延迟疾病发展或减慢疾病进展。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1高通量测序筛选TCR序列

1、RNA提取及质控

收集急性髓系白血病患者的外周血样本，患者无甲肝，乙肝，丙肝，戊肝，艾滋病，梅毒，淋病和结核感染。

在5mL Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min，磁珠分选T细胞。采用TRIzol法对处理的细胞样本进行RNA的提取，对提取后的RNA质量使用Qubit RNA HS Assay kits，经2100生物分析仪(安捷伦)检测RNA完整性。

2、反转录及文库制备

用Repertoire Analysis Kit(Human TCR alpha,beta)进行建库。将所有试剂置于冰上解冻，在配置mix之前，混匀和离心这些试剂。在冰上配置杂交引物需用的mix(表1)。充分混匀后离心，加热反转录引物杂交mix，65℃5min，冰上孵育至少2min。在冰上准备配制反转录mix(表2)，混匀后离心mix。

表1反应体系

组分	体积
		RT dNTP Mixture	1μl
RT Primer H TCRα/β	1μl
		RNA样本(100pg-1000ng)	最多到6.2μl
Nuclease-free water	补足至8.2μl

表2反转录体系

组分	体积
		RT buffer A	4μl
RT buffer B	1μl
		RT buffer C	3.8μl
RT Universal primer	1μl
		RNase inhibitor	1μl
Reverse Transcriptase	1μl
		总体积	11.8μl

将11.8μl的杂交buffer加到上一步反应的杂交RNA中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序(表3)：

表3反应条件

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3、第一步PCR

准备第一步PCR需用的试剂(表4)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第一步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表4第一步PCR反应体系

每管中加入41μl的第一步PCR mix，加入9μl的第一链cDNA产物中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：

表5第一步PCR反应条件

4、第二步PCR

准备第二步PCR需用的试剂(表6)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表6第二步PCR反应体系

组分	体积
		PCR buffer	25μl
PCR dNTP Mixture	10μl
		Nuclease-free water	3μl
DNA polymerase	1μl
		总体积	39μl

准备一个新的PCR管，每管中加入1μl的第二步PCR引物，hTCRα#1-18

(编号：A1-A18)，或者hTCRβ#1-18(编号：B1-B18)。加入39μl第二步反应的mix和10μl的第一步PCR产物混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：

表7第二步PCR反应条件

5、第三步PCR

准备第三步PCR需用的试剂在冰上解冻(表9)，混匀后瞬时离心。在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表8第三步PCR反应体系

准备一个新的PCR管，每管中加入45μl的第三步PCR mix，加入5μl的第二步PCR产物中，用手指肚弹匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：

表9第三步PCR反应条件

6、琼脂糖凝胶电泳

配置1.5％的琼脂糖胶，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。hTCRɑ/β片段在650bp左右。

7、用AGENCOURT AMPure XP(BEACKMAN)磁珠纯化

准备nuclease-free 0.2mL的8连管，按照表10稀释文库。

表10稀释体系

组分	体积
		第三步PCR产物	30μl
Nuclease-free water	20μl
		总体积	50μl

配置DNase-free 70％乙醇(sigma)。磁珠使用前室温平衡30min，将22.5μl的磁珠加到稀释后文库中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单的离心。将8连管放置在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。将所有的上清转移到新的8连管中。再次混匀未使用过的磁珠，加17.5μl的磁珠到上清中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单离心。将8连管放在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。弃85μl的上清，保留5μl的上清以免吸到磁珠。不要将磁珠与磁力架分离。加200μl的70％的乙醇漂洗。室温30s，弃酒精，重复酒精洗涤步骤。弃所有上清，加30μl的10mM Tris-HCl到每个PCR管中，用移液器混匀至少10次。室温孵育2min然后简单离心。将离心管放置在磁力架上室温5min，分离液体和磁珠。将上清20μl转移至新的PCR管中。

8、文库浓度定量及质控

测定文库浓度用Qubit dsDNA HS kit(英潍捷基)，使用设备Qubit 2.0(life)，取2μl的样本用于测定。通常文库浓度集中在5-40ng/μl。如果样本浓度≥1.72ng/μl可用于Miseq测序。

9、文库目标片段质控

人的TCRα/β文库目标片段集中在650bp，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对文库片段进行质控，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。

10、文库混库及质控

文库混样，是按此批次浓度最低的文库为标准，浓度最低文库乘以10μl为基准纳克数，其他文库按照此纳克数进行取样，确保每个文库的总量是一致的，混样后按照纳克与摩尔数之间的换算，稀释到8.58ng/μl(20nM，650bp)。

11、高通量测序

文库使用Miseq(Illumina)进行2×300bp双端测序，对上述混合完成的文库再次使用设备Qubit 2.0(life)进行文库定量，最终稀释到10pM，与10pM denatured PhiX进行混合(PhiX占比30％)，混合后的600μl进行上机测序。

12、数据分析

采用MiXCR进行初级分析，可以对高度个性化的TCR和免疫球蛋白序列进行分析。MiXCR可以针对不同的数据类型在参数上进行调整，并对分析结果和输出进行优化。进一步高级分析多个多样性指数，如香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)、Inverse-Simpson指数和基尼指数(Gini)等。采用VDJtools用于二级TCR profiling分析以及多样性评估。

13、噬菌体展示技术筛选高亲和力的TCR序列。

14、结果

通过噬菌体展示技术筛选出高亲和力的TCR，其α链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：8-16任一所示，其中CDR1的序列如SEQ ID NO：1所示；CDR2的序列如SEQ ID NO：2-4任一所示；CDR3序列分别如SEQ ID NO：5-7任一所示。

TCR的β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，其中，CDR1-3的序列分别如SEQ ID NO：17-19所示。

实施例2 TCR-T的构建

1、利用高通量测序和数据分析结果，全合成相关序列，通过XbaI/SalI限制内切酶切点，连接到pCDH载体中。

2、TCR-T细胞制备

采集健康人外周血，在Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min。磁珠分选T细胞。同时加入CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激，24h及48h后加入病毒感染2次，病毒感染时加入IL-2，培养3-20天，获得TCR-T细胞。

实施例3 TCR-T杀伤功能检测

从本研究中所述的序列构建的TCR-T中任选一个进行功能检测。

计数靶细胞(HL-60)和阴性参照靶细胞(Daudi)，分别标记Celltrace far red和CFSE染色。计数TCR-T(TCR的Vα和Vβ可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO：20所示)细胞作为效应细胞。按照计划效靶比(3：1，9：1，18：1)，重悬效应细胞和靶细胞至相应浓度。

圆底96孔板中每个效靶比分别铺入铺入组1效应细胞、组2靶细胞和组3效应细胞+靶细胞，每组4个复孔。培养2-24h，收细胞样本，分别收管A：组1效应细胞+组2靶细胞，管B：组3效应细胞+靶细胞，多聚甲醛液固定，流式上机。作Killing Rate与E:T Ratio曲线图。其中，

结果如图1所示，TCR-T具有较高的杀伤HL-60细胞系的效果，说明可将TCR-T应用于白血病的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 深圳大学总医院

<120> T细胞受体、相关工程化细胞及其应用

<141> 2021-10-14

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu Leu Phe Trp

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Phe Leu Ser Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Phe Leu Ser Tyr Asn Val Leu Gly Leu Glu Glu

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Phe Leu Ser Tyr Asn Val Leu Ser Gly Leu Glu Glu

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Cys Ala Val Met Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Cys Ala Val Met Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Cys Ala Val Met Asp Ser Gln Tyr Gln Leu Ile Trp

1 5 10

<210> 8

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

35 40 45

Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe

50 55 60

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

65 70 75 80

Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met

85 90 95

Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile

100 105 110

Lys Pro

<210> 9

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

35 40 45

Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe

50 55 60

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

65 70 75 80

Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met

85 90 95

Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile

100 105 110

Lys Pro

<210> 10

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

35 40 45

Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe

50 55 60

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

65 70 75 80

Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met

85 90 95

Asp Ser Gln Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile

100 105 110

Lys Pro

<210> 11

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

35 40 45

Tyr Asn Val Leu Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu

50 55 60

Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met

65 70 75 80

Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met Asp

85 90 95

Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys

100 105 110

Pro

<210> 12

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

35 40 45

Tyr Asn Val Leu Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu

50 55 60

Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met

65 70 75 80

Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met Asp

85 90 95

Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys

100 105 110

Pro

<210> 13

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

35 40 45

Tyr Asn Val Leu Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu

50 55 60

Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met

65 70 75 80

Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met Asp

85 90 95

Ser Gln Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys

100 105 110

Pro

<210> 14

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

35 40 45

Tyr Asn Val Leu Ser Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe

50 55 60

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

65 70 75 80

Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met

85 90 95

Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile

100 105 110

Lys Pro

<210> 15

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

35 40 45

Tyr Asn Val Leu Ser Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe

50 55 60

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

65 70 75 80

Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met

85 90 95

Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile

100 105 110

Lys Pro

<210> 16

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

35 40 45

Tyr Asn Val Leu Ser Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe

50 55 60

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

65 70 75 80

Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met

85 90 95

Asp Ser Gln Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile

100 105 110

Lys Pro

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gln Asp Met Arg Ala Asn Ala Met Tyr

1 5

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Gly Thr Gly Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe

1 5 10 15

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg Ala Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Gly Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala

85 90 95

Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

Claims

1.一种T细胞受体，其特征在于，包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的α链CDR3和SEQID NO：19所示的氨基酸序列的β链CDR3；

所述T细胞受体还包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的α链CDR1和SEQ ID NO：2所示的CDR2； SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18氨基酸序列的β链CDR1和CDR2。

2.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列所示的α链可变区， SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列所示的β链可变区。

3.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体是缺乏跨膜结构域的可溶性T细胞受体。

4.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体结合MHC I和/或MHCII肽复合物。

5.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体还包含可检测标记。

6.根据权利要求5所述的T细胞受体，其特征在于，所述可检测标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质、生物素。

7.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体还包含治疗剂。

8.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述α链进一步包含α恒定区Cα，β链进一步包含β恒定区Cβ。

9.根据权利要求8所述的T细胞受体，其特征在于，所述Cα和Cβ为人恒定区。

10.根据权利要求8所述的T细胞受体，其特征在于，Cα区和/或Cβ区包含引入一个或多个能够在α链与β链之间形成一个或多个非天然二硫桥键的半胱氨酸。

11.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述α链与β链进一步包含信号肽。

12.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-11任一项所述的T细胞受体或其α链或β链。

13.根据权利要求12所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为合成的。

14.根据权利要求12所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为cDNA。

15.一种载体，其特征在于，所述载体包含根据权利要求12-14任一项所述的核酸分子。

16.根据权利要求15所述的载体，其特征在于，所述载体为表达载体。

17.根据权利要求15所述的载体，其特征在于，所述载体为病毒载体。

18.根据权利要求17所述的载体，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒载体。

19.根据权利要求17所述的载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。

20.一种工程化细胞，其特征在于，包含

（1）根据权利要求1-11任一项所述的T细胞受体；或

（2）根据权利要求12-14任一项所述的核酸分子或根据权利要求15-19任一项所述的载体。

21.根据权利要求20所述的工程化细胞，其特征在于，所述TCR对于所述细胞是异源的。

22.根据权利要求20所述的工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞为细胞系。

23.根据权利要求20所述的工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞为获自受试者的原代细胞。

24.根据权利要求23所述的工程化细胞，其特征在于，所述受试者为哺乳动物受试者。

25.根据权利要求23所述的工程化细胞，其特征在于，所述受试者为人。

26.根据权利要求20所述的工程化细胞，其特征在于，所述细胞为T细胞。

27.根据权利要求26所述的工程化细胞，其特征在于，所述T细胞为CD8⁺。

28.根据权利要求26所述的工程化细胞，其特征在于，所述T细胞为CD4⁺。

29.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-11任一项所述的T细胞受体、权利要求12-14任一项所述的核酸分子、权利要求15-19任一项所述的载体、权利要求20-28任一项所述的工程化细胞。

30.根据权利要求29所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。

31.一种用于产生工程化细胞的方法，包括将根据权利要求15-19任一项所述的载体在体外或离体地引入细胞。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述载体为病毒载体且所述引入是通过转导进行的。

33.权利要求1-11任一项所述的T细胞受体，权利要求12-14所述的核酸分子，权利要求15-19任一项所述的载体、权利要求20-28任一项所述的工程化细胞、权利要求29或20所述的组合物在制备过继细胞转移治疗产品中的应用，其中所述的核酸分子、载体、工程化细胞、组合物编码权利要求1-11任一项所述的T细胞受体。

34.根据权利要求33所述的应用，其特征在于，所述过继细胞转移为过继T细胞转移。

35.根据权利要求34所述的应用，其特征在于，所述过继T细胞转移是同种异体过继T细胞转移、自体过继T细胞转移或通用的非同种异体反应性过继T细胞转移。

36.权利要求1-11任一项所述的T细胞受体，权利要求12-14任一项所述的核酸分子，权利要求15-19任一项所述的载体、权利要求20-28任一项所述的工程化细胞、权利要求29或30所述的组合物在制备治疗和/或预防血液恶性疾病急性髓系白血病的药物中的应用；其中，所述的核酸分子、载体、工程化细胞、组合物编码权利要求1-11任一项所述的T细胞受体。